DE102018006286B3

DE102018006286B3 - Bioreaktor mit Filtereinheit und Verfahren zur Behandlung einer Zellbrühe

Info

Publication number: DE102018006286B3
Application number: DE102018006286.5A
Authority: DE
Inventors: Martin Leuthold; Alexander Helling; Ulrich Grummert
Original assignee: Sartorius Stedim Biotech GmbH
Current assignee: Sartorius Stedim Biotech GmbH
Priority date: 2018-08-08
Filing date: 2018-08-08
Publication date: 2019-10-10
Anticipated expiration: 2038-08-09
Also published as: WO2020030684A1; KR102517331B1; KR20210044250A; CN112543802A; EP3833733A1; US20210155888A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft einen Bioreaktor (12) mit Filtereinheit (13, 20) und ein Verfahren zur Behandlung einer Zellbrühe (34, 40).

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft einen Bioreaktor mit Filtereinheit und ein Verfahren zur Behandlung einer Zellbrühe.
Die Behandlung von Zellbrühen ist in biochemischen Verfahren, worin biologische Zellen zum Einsatz kommen, von zentraler Bedeutung. Die meisten der vorstehenden Verfahren weisen insbesondere einen oder mehrere Schritte des Waschens, Konzentrierens, Abtrennens und Fraktionierens auf.
Hierbei kommen beispielsweise konventionellen Techniken wie das Zentrifugieren, die alternierende Tangentialflussfiltration (ATF) und das Sedimentieren zum Einsatz. Diese Verfahren haben den Nachteil, dass sie während des Trennschritts (Filtration bzw. Sedimentation) keine direkte Zufuhr von Flüssigkeiten (beispielsweise von frischem Versorgungsmedium) zur Zellbrühe zulassen und dadurch zwei getrennte Verfahrensstufen durchgeführt werden müssen. Hinzu kommt, dass die für diese Verfahren erforderlichen Vorrichtungen viel Raum in Anspruch nehmen (geringe Kompaktheit) und dass die Verfahren mit einem erheblichen Aufwand verbunden sind. Darüber hinaus werden in manchen der bekannten Verfahren die Zellen einer erheblichen Belastung ausgesetzt.
Somit liegt der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Behandlung einer Zellbrühe, welches für eine kontinuierliche Verfahrensführung geeignet sein und die in der Brühe enthaltenen Zellen schonen soll, sowie einen Bioreaktor, der zur Durchführung dieses Verfahrens geeignet sein soll, bereitzustellen.
Die vorstehende Aufgabe wird durch die in den Ansprüchen gekennzeichneten Ausführungsformen gelöst.
In einem ersten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung einen Bioreaktor mit Filtereinheit, wobei der Bioreaktor einen Innenraum aufweist und die Filtereinheit mindestens einen Versorgungskanal, mindestens ein erstes Filtermedium, mindestens einen Retentatkanal, mindestens ein zweites Filtermedium und mindestens einen Permeatkanal, derart angeordnet, dass das erste Filtermedium den Versorgungskanal und den Retentatkanal voneinander abgrenzt und das zweite Filtermedium den Retentatkanal und den Permeatkanal voneinander abgrenzt, aufweist, wobei der Versorgungskanal fluidleitend mit mindestens einem Einlass für ein Versorgungsmedium verbunden ist, der Retentatkanal fluidleitend mit mindestens einem Einlass für eine Zellbrühe und mit mindestens einem Auslass für die Zellbrühe verbunden ist, der Permeatkanal fluidleitend mit mindestens einem Auslass für ein Permeat verbunden ist, und der Innenraum des Reaktors fluidleitend mit dem Einlass für die Zellbrühe und dem Auslass für die Zellbrühe verbunden ist.
In der Filtereinheit des erfindungsgemäßen Bioreaktors können sowohl Zellbrühe als auch Versorgungsmedium laufend zugegeben werden, so dass der Bioreaktor kontinuierlich betrieben werden kann. Dadurch ermöglicht der erfindungsgemäße Bioreaktor eine effiziente und wirtschaftliche Verfahrensführung. Die Erfindung führt insbesondere zu einer Reduzierung der Prozesszeiten und des apparativen Aufwandes. Zudem werden Totzonen (Bereiche, in denen sich ein Teil der Zellbrühe über längere Zeit festsetzt) vermieden, bei gleichzeitiger schonender Behandlung der Zellen. Darüber hinaus ermöglicht der erfindungsgemäße Bioreaktor die Integration mehrerer Schritte (z. B. Zufuhr von frischem Versorgungsmedium und Abtrennung von Produkten aus der Zellbrühe bzw. Abtrennen eines Teils der Zellen (Fraktionierung der Zellen)) zu einem einzigen Schritt.
Als Zellbrühe wird im Allgemeinen ein Gemisch, welches

- Wasser oder ein Kulturmedium und
- (biologische) Zellen und gegebenenfalls deren Zerfallsprodukte (z. B. Zellbruchstücke) sowie
- gegebenenfalls Stoffwechselprodukte der Zellen enthält, verstanden.

Eine Zellbrühe kann beispielsweise Zellen sowie ein Kulturmedium, Proteine, Nukleotide, Stoffwechselprodukte der Zellen und/oder Zerfallsprodukte der Zellen enthalten. Gemäß der vorliegenden Erfindung enthält die Zellbrühe vorzugsweise ein Kulturmedium.
Zu „Zellen“ zählen erfindungsgemäß solche, die Menschen, Tiere, Pflanzen, Pilze, Algen und Bakterien als Ursprung haben, aber auch Viren.
Als Kulturmedium wird im Allgemeinen ein Nährmedium bezeichnet, welches zur Kultivierung von Zellen eingesetzt wird. Vorzugsweise ist das Kulturmedium ein wässriges Kulturmedium.
Unter einem Fluid wird erfindungsgemäß ein flüssiges oder gasförmiges Gemisch oder eine flüssige oder gasförmige Verbindung verstanden. Beispielsweise stellt ein Waschpuffer ein Fluid dar. Auch ein Kulturmedium oder dessen flüssige bzw. gasförmige Bestandteile können ein Fluid sein.
Erfindungsgemäß wird unter einem „Bioreaktor“ ein Reaktor verstanden, in dessen Innenraum eine Zellbrühe kultiviert werden kann. Erfindungsgemäß kann der Innenraum geschlossen sein, wobei „geschlossen“ in diesem Zusammenhang bedeutet, dass kein freier Stoffaustausch mit der Umgebung stattfindet. Der Innenraum des Bioreaktors kann aber auch offen sein. Vorzugsweise ist der Innenraum geschlossen.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist die Filtereinheit ein Flachfilter-, Wickel- oder Hohlfasermodul, wobei ein Flachfiltermodul bevorzugt ist. Sofern die Filtereinheit als Flachfiltermodul ausgestaltet ist, haben das erste Filtermedium und das zweite Filtermedium eine flächige Form. Der Begriff „flächig“ zeigt an, dass das jeweilige Filtermedium (Filtermaterial) im Wesentlichen in einer einzigen Ebene liegt. Vorzugsweise liegen alle Filtermedien im Wesentlichen in Ebenen, die weitgehend parallel zueinander sind. Die erfindungsgemäß geeigneten Filtermedien unterliegen keiner besonderen Einschränkung und können beispielsweise Keramikmembranen, Vliese und Polymermembranen sein.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann die Filtereinheit innerhalb oder außerhalb des Innenraums angeordnet sein. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist die Filtereinheit innerhalb des Innenraums des Bioreaktors angeordnet. Bei einer derartigen Anordnung sinkt das Totvolumen aufgrund der kurzen Wege zwischen der Filtereinheit und dem Innenraum des Bioreaktors, sodass die Verweilzeit der Zellen außerhalb des Innenraums kurz ist. Zudem erfordert eine Anordnung innerhalb des Innenraums keine zusätzlichen / separaten Maßnahmen, bspw. zur Temperierung der Zellbrühe bzw. des zugeführten Versorgungsmediums o. ä. Ein weiterer Vorteil dieser Anordnung besteht darin, dass der Platzbedarf reduziert wird.
Vorzugsweise weist der Bioreaktor bei einer Anordnung der Filtereinheit im Innenraum des Bioreaktors einen äußeren Anschluss (16) für das Versorgungsmedium auf. Über den Anschluss (16) kann dem Versorgungskanal von außen Versorgungsmedium zugeführt werden.
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die Filtereinheit außerhalb des Bioreaktors angeordnet. Ein Bioreaktor mit diesem Aufbau ist einfacher und schneller herzustellen, sodass mit hoher Flexibilität verschiedenste Einsatzmöglichkeiten zur Verfügung stehen. Auch für die wiederholte Verwendung (re-use) ist diese Anordnung besonders geeignet. Ein weiterer Vorteil besteht darin, dass ein Bioreaktor mit dieser Anordnung einen Aufbau mit geringer Komplexität aufweist.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der Einlass für das Versorgungsmedium fluidleitend mit einer Pumpe für das Versorgungsmedium verbunden und/oder der Einlass für die Zellbrühe fluidleitend mit einer Pumpe für die Zellbrühe verbunden. Mithilfe dieser Pumpe(n) können Versorgungsmedium und/oder Zellbrühe auf kontrollierte Weise zugegeben werden.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weist der Auslass für die Zellbrühe ein Ventil oder eine Pumpe auf. Durch das Ventil bzw. die Pumpe kann der Filtrationsdruck innerhalb des Retentatkanals und somit der Volumenstrom durch das zweite Filtermedium eingestellt werden.
Des Weiteren ist bevorzugt, dass der Auslass für das Permeat ein Ventil aufweist. Dadurch kann der Permeatauslass geschlossen werden.
Das erste und zweite Filtermedium sind zur Filtration des Versorgungsmediums und der Zellbrühe geeignet. Das erste und zweite Filtermedium sind zumindest teilweise für das Versorgungsmedium und die Zellbrühe durchlässig.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist zumindest das zweite Filtermedium für die in der Zellbrühe enthaltenen Zellen nicht durchlässig. Dadurch und bedingt durch die Strömungsrichtung des Versorgungsmediums (siehe 1 und 2) wird verhindert, dass Zellen von dem Retentatkanal in die benachbarten Kanäle (Permeatkanal und Versorgungskanal) geraten. Vorzugsweise ist auch das erste Filtermedium für die in der Zellbrühe enthaltenen Zellen nicht durchlässig.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das zweite Filtermedium zumindest teilweise für die in der Zellbrühe enthaltenen Zellen und/oder Zellbruchstücke durchlässig. Dadurch kann mit der Filtereinheit des erfindungsgemäßen Bioreaktors eine Fraktionierung der Zellen durchgeführt werden. Auch in dieser Ausführungsform ist vorzugsweise auch das erste Filtermedium für die in der Zellbrühe enthaltenen Zellen nicht durchlässig.
Vorzugsweise weisen das erste Filtermedium und das zweite Filtermedium unabhängig voneinander jeweils eine Porengröße von 0,001 µm bis 1 mm, besonders bevorzugt 0,005 µm bis 10 µm, auf. „Unabhängig voneinander“ bedeutet in diesem Zusammenhang, dass erstes und zweites Filtermedium nicht die gleiche Porengröße und/oder Materialeigenschaften aufweisen müssen.
Zur Bestimmung der Porengröße wird erfindungsgemäß bei Porengrößen von mindestens 0,1 µm, d. h. für Mikrofiltrationsmembranen mit einer mittleren Porengröße von 0,1 bis 10 µm, die Kapillarfluss-Porometrie verwendet. Hierbei handelt es sich um eine Gas/Flüssigkeits-Porosimetrie, bei der die differentiellen Gasdrücke und Flussraten durch eine Membranprobe zuerst im feuchten und anschließend im trockenen Zustand gemessen werden. Die Membranprobe wird vor der Messung mit einer benetzenden Flüssigkeit so in Kontakt gebracht, dass sämtliche vorhandenen Poren mit dieser Flüssigkeit gefüllt sind. Nach dem Füllen der Poren und dem Einbringen der Probe ist die Messzelle zu verschließen und die Messung zu starten. Der Gasdruck wird nach dem Start der Messung automatisch und schrittweise erhöht und die dem anliegenden Druck entsprechenden Porendurchmesser werden durch den Gasdruck entleert. Dies erfolgt solange, bis der relevante Porenbereich erfasst wurde, d. h. bis auch die kleinsten im Messbereich vorhandenen Poren von der Flüssigkeit befreit sind. Danach wird der Druck wieder abgesenkt und die Messung an der nun trockenen Probe automatisch wiederholt. Aus der Differenz beider Druck-Flussrate-Kurven wird die Porengrößenverteilung über die Young-Laplace-Gleichung berechnet (s. auch A. Shrestha, „Characterization of porous membranes via porometry“, 2012, Mechanical Engineering Graduate Theses & Dissertations, Paper 38, University of Colorado at Boulder).
Zur Bestimmung von Porengrößen von mehr als 10 µm bis 1 mm kann das in Journal of Membrane Science 372 (2011), Seiten 66 bis 74, beschriebene, auf Bildanalyse (image analysis) beruhende Verfahren verwendet werden.
Bei Porengrößen von weniger als 0,1 µm wird erfindungsgemäß die Flüssig-Flüssig-Verdrängungsmethode angewendet. Diese weist Ähnlichkeiten zur Kapillarfluss-Porometrie auf. Allerdings werden hier nicht die Gasflussraten, sondern die Flussraten der verdrängenden Flüssigkeit in Abhängigkeit der differentiellen Druckerhöhung gemessen (s. auch R. Dävila, „Characterization of ultra and nanofiltration commercial filters by liquid-liquid displacement porosimetry“, 2013).
Für das im Retentatkanal befindliche Gemisch können die Begriffe Zellbrühe und Retentat gleichbedeutend verwendet werden.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das erste Filtermedium eine erste Filtrationsmembran. Das zweite Filtermedium ist vorzugsweise eine zweite Filtrationsmembran. Besonders bevorzugt ist das erste Filtermedium eine erste Filtrationsmembran und das zweite Filtermedium ist eine zweite Filtrationsmembran. Die Filtrationsmembranen können beispielsweise aus Polyvinylidenfluorid, Cellulose und deren Derivaten, Polyethersulfon (PES) oder Polysulfon bestehen, wobei vernetztes Cellulosehydrat besonders bevorzugt ist.
Sofern die Filtereinheit ein Flachfiltermodul ist, ist der Einlass für die Zellbrühe vorzugsweise in einem ersten Randbereich der Filtereinheit angebracht und der Auslass für die Zellbrühe in einem zweiten Randbereich der Filtereinheit, welcher dem ersten Randbereich gegenüberliegt, angebracht. Durch diese Anordnung wird eine weitgehend einheitliche Flussrichtung der Zellbrühe vom Einlass als Startpunkt zum Auslass als Endpunkt definiert. Die Flussrichtung der Zellbrühe erfolgt dadurch weitgehend parallel zum Strömungsweg entlang des Filtermediums, das heißt im Wesentlichen ohne Umlenkungen, wodurch ein stabiler und zuverlässiger Fluss der Zellbrühe durch die Filtereinheit gewährleistet werden kann. Zudem können durch den weitgehend geradlinigen Strömungsverlauf ohne Umlenkungen, Schleifen oder ähnlichem der Druckabfall in der Filtereinheit sowie unerwünschte Einwirkungen nicht geradliniger Strömungen auf in der Zellbrühe enthaltene Zielsubstanzen und insbesondere auf die Zellen minimiert werden. Aus den vorstehenden Gründen ist zudem bevorzugt, dass der Einlass für das Versorgungsmedium im ersten Randbereich der Filtereinheit angebracht ist.
Gemäß einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung ist der Auslass für das Permeat im zweiten Randbereich der Filtereinheit angebracht. Besonders bevorzugt ist sowohl im ersten als auch im zweiten Randbereich der Filtereinheit jeweils mindestens ein Auslass für das Permeat angebracht. In einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung sind die Auslässe für das Permeat alternativ oder ergänzend im dritten und/oder vierten Randbereich der Filtereinheit angebracht. Der dritte Randbereich befindet sich bei einer Draufsicht auf die Filtereinheit von der Seite des Versorgungskanals auf der linken Seite der Flussrichtung. Der vierte Randbereich befindet sich entsprechend auf der rechten Seite und liegt somit dem dritten Randbereich gegenüber. Durch vorstehende Anordnung des Auslasses oder der Auslässe können eine besonders hohe Permeatleistung erzielt und konstruktionstechnische Vorteile erreicht werden.
Vorzugsweise umfasst der erste Randbereich das äußere Drittel der Länge der Filtrationseinheit entgegen der Flussrichtung. Entsprechend umfasst der zweite Randbereich das äußere Drittel der Länge der Filtrationseinheit entlang der Flussrichtung. Entsprechendes gilt für die dritten und vierten Randbereiche. Es ist von Vorteil, die ersten bis vierten Randbereiche so klein wie möglich zu gestalten. Daher umfassen die Randbereiche besonders bevorzugt die jeweiligen äußeren 20%, noch mehr bevorzugt die jeweiligen äußeren 10% und am meisten bevorzugt die jeweiligen äußeren 3%.
Grundsätzlich besteht hinsichtlich der Anbringung der Ein- und Auslässe keine besondere Einschränkung. Zum Beispiel können die Ein- und Auslässe so angebracht sein, dass die Zellbrühe bereits in Flussrichtung in den Retentatkanal eintritt und ihn in Flussrichtung verlässt. Entsprechend kann der Auslass für das Permeat so angebracht sein, dass das Permeat den Permeatkanal in Flussrichtung verlässt und/oder der Einlass für das Versorgungsmedium kann so angebracht sein, dass es in Flussrichtung in den Versorgungskanal eintritt. Vorzugsweise sind die Ein- und Auslässe jedoch so angebracht, dass das Versorgungsmedium senkrecht zur Flussrichtung in den Versorgungskanal eintritt und die Zellbrühe zunächst senkrecht zur Flussrichtung in den Retentatkanal eintritt und diesen senkrecht zur Flussrichtung verlässt. Eine derartige Anbringung der Ein- und Auslässe erleichtert die Anordnung einer Mehrzahl der Filtrationseinheiten zu einer Filterkassette.
Vorzugsweise weist die Filtereinheit mehrere Einlässe für die Zellbrühe, mehrere Auslässe für die Zellbrühe und mehrere Auslässe für das Permeat auf.
Gemäß einer alternativen Ausführungsform ist die Filtereinheit ein Flachfiltermodul, wobei der Einlass für das Versorgungsmedium und der Einlass für die Zellbrühe in einem Bereich in der Mitte der Filtereinheit angebracht sind, sodass das erste und das zweite Filtermedium in einer sich vom Bereich in der Mitte entfernenden Richtung von dem Versorgungsmedium bzw. der Zellbrühe überströmt werden. Vorzugsweise sind in dieser Ausführungsform das erste und das zweite Filtermedium scheibenförmig, damit erstes und zweites Filtermedium gleichmäßig ausgenutzt werden.
In einer bevorzugten Ausgestaltung nimmt das freie Volumen des Versorgungskanals und/oder des Retentatkanals (für das Versorgungsmedium bzw. die Zellbrühe zur Verfügung stehender Raum, Tot- oder Leervolumen) in der Flussrichtung vom Einlass für die Zellbrühe zum Auslass für die Zellbrühe ab. Durch das/die abnehmenden Volumen/Volumina weist die Filtereinheit einen niedrigen Druckverlust und einen im Wesentlichen umlenkungsfreien Strömungsweg des Versorgungsmediums und der Zellbrühe auf. Dadurch ist es möglich, die Flächenleistung der Filtereinheit zu erhöhen und die Filtereinheit im „Single-Pass“-Betrieb zu betreiben (es findet nur ein einziger Durchgang der Zellbrühe ohne Kreislaufführung statt).
In einer weiteren bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung wird die Abnahme des freien Volumens entlang der Flussrichtung dadurch realisiert, dass die Breite des Versorgungskanals und/oder die Breite des Retentatkanals in Flussrichtung abnimmt/abnehmen. Die Breite verläuft entlang des ersten Filtermaterials und senkrecht zur Flussrichtung. Besonders bevorzugt nimmt die Breite der gesamten Filtereinheit in Flussrichtung ab. Vorzugsweise ist der Retentatkanal bzw. die Filtereinheit in einer Draufsicht entlang einer Normalen der Ebene, in der das erste Filtermaterial liegt, trapezförmig. Die Trapez-Grundform des Versorgungskanals und/oder des Retentatkanals bzw. der Filtereinheit kann ungleichschenklig, beispielsweise rechtwinklig, sein und ist vorzugsweise gleichschenklig.
Gemäß einer Ausführungsform kann die Höhe des Versorgungskanals und/oder des Retentatkanals bzw. der Filtereinheit in Flussrichtung abnehmen. Beispielsweise können der Versorgungskanal und/oder der Retentatkanal keilförmig ausgestaltet sein. Die Höhe des Versorgungskanals und/oder des Retentatkanals bzw. der Filtereinheit verläuft senkrecht zum ersten Filtermaterial und senkrecht zur Flussrichtung.
Hinsichtlich der Breite, Länge und Höhe der Filtereinheit besteht keine besondere Einschränkung. Die Länge verläuft parallel zur Flussrichtung und entlang des ersten Filtermaterials. Vorzugsweise weist die Filtereinheit eine Länge von mindestens 50 mm, bevorzugt mindestens 150 mm, besonders bevorzugt 500 mm, insbesondere bevorzugt 750 mm oder mehr, auf.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ändert sich das freie Volumen des Permeatkanals in der Flussrichtung. Besonders bevorzugt nimmt das freie Volumen des Permeatkanales in der Flussrichtung ab. Dadurch können beispielsweise die äußeren Dimensionen der vorzugsweise als Filtrationskassette ausgestalteten Filtereinheit beibehalten werden.
Die Erläuterungen zur Ausgestaltung des Retentatkanals gelten entsprechend für den Permeatkanal und umgekehrt.
„In Flussrichtung abnehmendes freies Volumen“ bedeutet, dass eine Querschnittsfläche A₁, welche von dem Versorgungsmedium beziehungsweise der Zellbrühe durchströmt werden kann und die in einer Ebene liegt, welche eine parallel zur Flussrichtung verlaufende Normale aufweist, und eine entsprechende Querschnittsfläche A₂, die parallel zu A₁ ist und weiter vom Einlass für das Versorgungsmedium beziehungsweise die Zellbrühe entfernt ist als A₁, wobei der von dem Versorgungsmedium beziehungsweise der Zellbrühe durchströmbare Flächeninhalt A₁ größer ist als A₂, existieren und keine entsprechend definierten Ebenen A₁' und A₂' existieren, für die der Flächeninhalt von A₁' kleiner als der von A₂' ist.
Die Abnahme des freien Volumens kann stetig (für alle A₁ und A₂ gilt A₁ ≥ A₂) oder kontinuierlich (für alle A₁ und A₂ gilt A₁ > A₂) sein. Es ist auch möglich, dass die Volumenabnahme diskontinuierlich ist, das heißt, dass entlang der Flussrichtung mindestens ein unstetiger Abfall oder Sprung in der Querschnittsfläche auftritt.
Die Änderung des freien Volumens des Retentatkanals in Flussrichtung liegt vorzugsweise im Bereich von 20 zu 1 bis 1,2 zu 1, bevorzugt bei 10 zu 1, abhängig von der Filtrationsaufgabe. Dabei wird unter der „Änderung des freien Volumens des Retentatkanals in Flussrichtung“ das Verhältnis der Querschnittsfläche A₁ am Einlass für die Zellbrühe zur Querschnittsfläche A₂ am Auslass für die Zellbrühe verstanden.
In einer Ausgestaltung der Erfindung nimmt/nehmen die Dicke des Versorgungskanals und/oder die Dicke des Retentatkanals und gegebenenfalls die Dicke des Permeatkanals in Flussrichtung ab.
Der Versorgungskanal, der Retentatkanal und der Permeatkanal werden üblicherweise durch Abstandshalter offengehalten. In einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung ist/sind im Versorgungskanal und/oder im Retentatkanal der Filtereinheit ein flächiger Abstandshalter angebracht, derart, dass das freie Volumen des Retentatkanals in Flussrichtung abnimmt.
Geeignete Abstandshalter für Filtereinheiten sind im Stand der Technik bekannt und können im Versorgungskanal, Retentatkanal und/oder Permeatkanal der Filtereinheit des erfindungsgemäßen Bioreaktors verwendet werden. Vorzugsweise sind die Abstandshalter erfindungsgemäß so modifiziert, dass ihr Volumen in Flussrichtung zunimmt, um eine Volumenabnahme des für das Versorgungsmedium bzw. die Zellbrühe zur Verfügung stehenden freien Volumens zu erzielen. Bevorzugte Abstandshalter können textile Materialien aus organischen oder nicht-organischen Werkstoffen sein, wie Gewebe, Gewirke, Vliese oder extrudierte Netze.
Vorteilhaft kann der Abstandshalter eine nicht ebene Platte sein. Die nicht ebene Platte kann eine Platte sein, die zumindest eine nicht ebene Hauptoberfläche aufweist. Die Hauptoberflächen einer Platte sind die sich gegenüberstehenden Oberflächen mit dem größten Flächeninhalt. Die zumindest eine nicht ebene Hauptoberfläche kann Unebenheiten in Form einer gewellten oder gezackten Oberfläche aufweisen. Daneben kann die unebene Oberfläche vorstehende Elemente wie Kegel(stümpfe), Pyramiden(stümpfe), Noppen oder andere geometrische Figuren aufweisen. Die nicht ebene Platte kann auch ähnlich einem Wellblech in gewellter oder gezackter Form vorliegen, wobei sich die Wellen oder Zacken vorzugsweise parallel zur Flussrichtung erstrecken.
Geeignete Materialien für die nicht ebene Platte sind die gleichen wie nachstehend für Abstandshalter in Form einer offenmaschigen Matrix aufgeführt.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform besteht der Abstandshalter aus einer offenmaschigen Matrix oder aus einem extrudierten Netz. Derartige Abstandshalter sind im Stand der Technik bekannt und wurden beispielsweise in der Veröffentlichung der deutschen Patentanmeldung DE 100 22 259 A1 beschrieben. Wie bereits vorstehend erwähnt, sind die Abstandshalter erfindungsgemäß vorzugsweise so abgewandelt, dass ihr Volumen in Flussrichtung zunimmt, um eine Volumenabnahme des für das Versorgungsmedium bzw. die Zellbrühe zur Verfügung stehenden freien Volumens zu erzielen. Grundsätzlich können in der erfindungsgemäßen Filtereinheit auch gewöhnliche Abstandshalter verbaut werden, beispielsweise im Permeatkanal und/oder im Versorgungskanal oder in allen Kanälen der Filtereinheit mit in Flussrichtung abnehmender Breite. Eine abnehmende Breite kann, wie vorstehend beschrieben, beispielsweise durch eine trapezförmige Ausgestaltung der Kanäle beziehungsweise der Filtereinheit erzielt werden.
In einer Ausgestaltung kann die Maschenweite der offenmaschigen Matrix beziehungsweise des extrudierten Netzes in Flussrichtung abnehmen, um eine Abnahme des freien Volumens entlang der Flussrichtung zu erzielen. Beispielsweise beträgt die Maschenzahl am Einlass für das Versorgungsmedium beziehungsweise am Einlass für die Zellbrühe 5/cm bis 15/cm, in der Mitte zwischen dem Einlass für das Versorgungsmedium beziehungsweise dem Einlass für die Zellbrühe und dem Auslass für die Zellbrühe 10/cm bis 30/cm und am Auslass für die Zellbrühe 20/cm bis 40/cm.
Alternativ oder ergänzend dazu kann die offenmaschige Matrix beziehungsweise das extrudierte Netz aus sich kreuzenden Längs- und Querfäden aufgebaut sein und die Anzahl und/oder Dicke der Längs- und/oder Querfäden in Flussrichtung zunehmen. Die offenmaschige Matrix besteht vorzugsweise aus einem organischen Polymer wie beispielsweise Polypropylen, Polyethylen, Polyester, Polyvinylchlorid oder Polyvinylidenfluorid oder Blends daraus. Ferner ist möglich, dass die offenmaschige Matrix aus Fasern verschiedenartiger Polymere aufgebaut ist.
In einer weiteren bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung sind im Retentatkanal mehrere Lagen textiler Materialien derart übereinander angeordnet, dass das freie Kanalvolumen in Flussrichtung abnimmt. Dies kann beispielsweise dadurch erreicht werden, dass die übereinander angeordneten Lagen in Flussrichtung versetzt beginnen. Die übereinander angeordneten Lagen erstrecken sich vorzugsweise bis zum zweiten Randbereich. Dadurch wird im Retentatkanal in Flussrichtung ein zunehmendes Volumen von den textilen Materialien in Anspruch genommen, sodass das freie Volumen in Flussrichtung abnimmt. Die textilen Materialien, wie Gewebe, Gewirke, Vliese oder extrudierte Netze, können aus organischen oder nicht-organischen Werkstoffen bestehen.
Die hier dargestellten Ausgestaltungen zur Realisierung der Abnahme des freien Volumens des Versorgungskanals bzw. Retentatkanals sind beliebig miteinander kombinierbar.
Erfindungsgemäß wird der Retentatkanal von einem ersten Filtermaterial und einem zweiten Filtermaterial begrenzt. Der Versorgungskanal wird durch mindestens ein erstes Filtermaterial begrenzt. Der Permeatkanal wird durch mindestens ein zweites Filtermaterial begrenzt. Einem Retentatkanal ist ein Versorgungskanal und ein Permeatkanal benachbart. Bevorzugt besteht die Filtereinheit des erfindungsgemäßen Bioreaktors aus einer Mehrzahl übereinandergestapelter Anordnungen von Versorgungskanal, erstem Filtermaterial, Retentatkanal, zweitem Filtermaterial, Permeatkanal, zweitem Filtermaterial, Retentatkanal und erstem Filtermaterial, vorzugsweise abgeschlossen von einem weiteren Versorgungskanal, sodass die gestapelten Anordnungen zu einer Filterkassette zusammengefasst sind. Geeignete Ausgestaltungen für Filterkassetten sind im Stand der Technik bekannt. Vorzugsweise ist jeder Versorgungskanal dieser Anordnungen an beiden Seiten durch jeweils ein Filtermaterial, welches dem ersten Filtermaterial entspricht, von zwei Retentatkanälen abgegrenzt. Entsprechend ist vorzugsweise jeder Permeatkanal dieser Anordnungen an beiden Seiten durch jeweils ein Filtermaterial, welches dem zweiten Filtermaterial entspricht, von zwei Retentatkanälen abgegrenzt. Die ersten Filtermedien und zweiten Filtermedien können jeweils voneinander verschieden sein. Das heißt, es können grundsätzlich verschiedenartige erste Filtermedien und verschiedenartige zweite Filtermedien verwendet werden. Vorzugsweise werden gleichartige erste Filtermedien und/oder gleichartige zweite Filtermedien verwendet.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform weisen die ersten und zweiten Filtermedien unabhängig voneinander eine jeweils weitgehend einheitliche Dicke von vorzugsweise 50 µm bis 10000 µm, insbesondere bevorzugt 150 µm bis 1000 µm, auf. Sofern die Begrenzung des Versorgungskanals durch das erste Filtermaterial und die weitere Begrenzung des Versorgungskanals und/oder die Begrenzungen des Retentatkanals durch das erste und zweite Filtermaterial nicht parallel zueinander verlaufen, kann das freie Volumen des Versorgungskanals und/oder des Retentatkanals keilförmig ausgestaltet werden, so dass in Flussrichtung das freie Volumen abnimmt. Besonders bevorzugt sind der Versorgungskanal, der Retentatkanal und der Permeatkanal beidseitig von weitgehend parallelen Flächen begrenzt.
Die Form der Filtereinheit des erfindungsgemäßen Bioreaktors unterliegt keiner besonderen Einschränkung. Die Filtereinheit kann beispielsweise quaderförmig oder zylinderförmig sein.
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Behandlung einer Zellbrühe, umfassend die Schritte (A) Bereitstellen einer Filtereinheit, wobei die Filtereinheit mindestens einen Versorgungskanal, mindestens ein erstes Filtermedium, mindestens einen Retentatkanal, mindestens ein zweites Filtermedium und mindestens einen Permeatkanal, derart angeordnet, dass das erste Filtermedium den Versorgungskanal und den Retentatkanal voneinander abgrenzt und das zweite Filtermedium den Retentatkanal und den Permeatkanal voneinander abgrenzt, aufweist, wobei der Versorgungskanal fluidleitend mit mindestens einem Einlass für ein Versorgungsmedium verbunden ist, der Retentatkanal fluidleitend mit mindestens einem Einlass für die Zellbrühe und mit mindestens einem Auslass für die Zellbrühe verbunden ist, der Permeatkanal fluidleitend mit mindestens einem Auslass für ein Permeat verbunden ist; (B) Zuführen des Versorgungsmediums in den Einlass für das Versorgungsmedium; (C) Zuführen der Zellbrühe in den Einlass für die Zellbrühe; (D) Abführen der Zellbrühe aus dem Auslass für die Zellbrühe; und (E) Abführen des Permeats aus dem Auslass für das Permeat.
Die Erläuterungen in Bezug auf den Bioreaktor, dessen Filtereinheit und das Verfahren zur Behandlung einer Zellbrühe sind wechselseitig aufeinander anwendbar.
Das Versorgungsmedium unterliegt keiner besonderen Einschränkung und kann ein Fluid oder eine Suspension sein. Vorzugsweise enthält das Versorgungsmedium Wasser und gegebenenfalls ein gasförmiges Fluid. Beispiele für erfindungsgemäß geeignete gasförmige Fluide sind Sauerstoff, Stickstoff, Luft und Edelgase wie Argon. Besonders bevorzugt ist das Versorgungsmedium eine wässrige Suspension oder eine wässrige Lösung. Konkrete Ausführungsbeispiele für das Versorgungsmedium sind wässrige Kulturmedien (Nährlösung), (Wasch)pufferlösungen, Wasser, welches gegebenenfalls entmineralisiert oder destilliert sein kann.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Behandlung der Zellbrühe eine Wäsche der Zellen, ein Zugeben oder ein Austauschen eines Kulturmediums, eine Konzentrationsänderung der Zellen in der Zellbrühe, eine Fraktionierung der Zellen und/oder eine Zellbegasung.
Besonders bevorzugt ist die Behandlung eine Wäsche der Zellen (Zellwäsche). „Zellwäsche“ bedeutet erfindungsgemäß, dass zumindest ein Bestandteil der Zellbrühe, abgesehen von den Zellen, zumindest teilweise entfernt wird. Beispielsweise kann bei einer Zellwäsche eine Zellbrühe, welche ein Kulturmedium und (biologische) Zellen sowie Stoffwechselprodukte der Zellen und/oder Verunreinigungen enthält, zumindest teilweise von den Stoffwechselprodukten und/oder den Verunreinigungen befreit werden. Dabei wird das Kulturmedium der in Schritt (C) zugeführten Zellbrühe zumindest teilweise durch das Versorgungsmedium ersetzt. Die Stoffwechselprodukte der Zellen und/oder die Verunreinigungen verlassen die Filtereinheit als Bestandteile des Permeats. Für den Fall, dass die Zellbehandlung eine Zellwäsche darstellt, ist das Versorgungsmedium vorzugsweise eine Waschflüssigkeit wie beispielsweise eine Waschpufferlösung (z. B. eine Kochsalzlösung), eine stabilisierende Pufferlösung (z. B. Natriumphosphat-, Citrat-, Acetatpuffer) oder (gegebenenfalls entmineralisiertes oder destilliertes) Wasser. Im Fall der Zellwäsche kann das Versorgungsmedium allerdings auch ein Nährmedium sein.
Erfindungsgemäß schließen die Stoffwechselprodukte sowohl unerwünschte bzw. nicht benötigte Stoffwechselprodukte als auch durch die Zellen hergestellte erwünschte Stoffwechselprodukte ein. Ein erwünschtes Stoffwechselprodukt der Zellen kann beispielsweise ein pharmazeutischer Wirkstoff sein.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird in Schritt (A) der vorstehend beschriebene erfindungsgemäße Bioreaktor mit Filtereinheit bereitgestellt; in Schritt (C) die Zellbrühe aus dem Innenraum des Bioreaktors in den Einlass für die Zellbrühe zugeführt; und in Schritt (D) die Zellbrühe aus dem Auslass für die Zellbrühe in den Innenraum des Bioreaktors abgeführt. Diese Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ermöglicht es, ein Verfahren, welches sich Zellen zu Nutze macht und worin eine Zellbehandlung erforderlich ist, kontinuierlich zu betreiben.
Durch Einstellen des Verhältnisses des Volumenstroms des in Schritt (B) zugeführten Versorgungsmediums zu dem Volumenstrom der in Schritt (C) zugeführten Zellbrühe kann im Falle einer Fraktionierung der Zellen bei konstantem Volumenstrom am Auslass für die Zellbrühe das Verhältnis der Anzahl von Zellen im Permeat zur Anzahl von Zellen, die in der Zellbrühe verbleiben, (Separationsgrad) eingestellt werden.
Über vorstehendes Volumenstromverhältnis kann im Falle einer Zellwäsche das Austauschverhältnis der Zellbrühe (Volumenanteil der zugeführten Zellbrühe, der durch das Versorgungsmedium ersetzt wird) eingestellt werden. Vorzugsweise beträgt das Verhältnis des Volumenstroms des in Schritt (B) zugeführten Versorgungsmediums zu dem Volumenstrom der in Schritt (C) zugeführten Zellbrühe 1 : 10 bis 10 : 1.
Durch Einstellen des Verhältnisses des Volumenstroms der in Schritt (C) zugeführten Zellbrühe zu dem Volumenstrom der in Schritt (D) abgeführten Zellbrühe kann die Konzentration der Zellen in der abgeführten Zellbrühe eingestellt werden. Somit ermöglicht das erfindungsgemäße Verfahren eine Absenkung als auch eine Erhöhung der Zellkonzentration in der abgeführten Zellbrühe. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform beträgt das Verhältnis des Volumenstroms der in Schritt (C) zugeführten Zellbrühe zu dem Volumenstrom der in Schritt (D) abgeführten Zellbrühe 1 : 10 bis 10 : 1.
Sofern das erfindungsgemäße Verfahren zur Behandlung einer Zellbrühe eine Erhöhung der Konzentration der Zellen in der Zellbrühe einschließt, beträgt die Konzentration der in Schritt (D) abgeführten Zellbrühe vorzugsweise das 2- bis 10-fache der Konzentration der in Schritt (C) zugeführten Zellbrühe.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens können in Schritt (B) zu verschiedenen Zeitpunkten verschiedene Versorgungsmedien zugeführt werden. Das heißt, die Zusammensetzung des in Schritt (B) zugeführten Versorgungsmediums kann zeitlich variieren. So kann beispielsweise zwischen einem Waschpuffer und einem Kulturmedium (Nährlösung) gewechselt werden. Das heißt, in einer ersten Phase des erfindungsgemäßen Verfahrens kann ein erstes Versorgungsmedium (z. B. frisches Kulturmedium) zugegeben werden und in einer zweiten Phase ein zweites Versorgungsmedium (z. B. ein Waschpuffer), wobei sich gegebenenfalls erste und zweite Phasen abwechseln können. Sofern in einer der beiden Phasen Kulturmedium als Versorgungsmedium zugegeben wird, wird vorzugsweise der Auslass für das Permeat geschlossen, damit kein zugegebenes Kulturmedium verloren geht. Sobald wieder Waschpuffer als Versorgungsmedium zugegeben wird, kann zum Zweck der Zellwäsche der Permeatkanal wieder geöffnet werden.
In einer bevorzugten Ausgestaltung des Verfahrens wird das Versorgungsmedium mit einem Druck von 0,1 bis 4 bar zugeführt. Besonders bevorzugt wird das Versorgungsmedium mit einem Druck zugeführt, der größer ist als der Retentatausgangsdruck.
Weiterhin beträgt der Druck zwischen Retentatkanal und Permeatkanal vorzugsweise 0,1 bis 1,5 bar.
Vorzugsweise wird das erfindungsgemäße Verfahren kontinuierlich betrieben, das heißt unter konstanter/kontinuierlicher Zugabe des Versorgungsmediums und der Zellbrühe, wodurch ein besonders effizientes und wirtschaftliches Verfahren zur Behandlung einer Zellbrühe bereitgestellt werden kann. Erfindungsgemäß wird unter einem „kontinuierlichen“ Verfahren zur Behandlung einer Zellbrühe ein Verfahren verstanden, in dem sowohl das Versorgungsmedium als auch die Zellbrühe kontinuierlich zugegeben werden.
In einer bevorzugten Ausgestaltung des Verfahrens werden in Schritt (A) mehrere voneinander unabhängige Filtereinheiten bereitgestellt und so in Reihe geschaltet, dass der Auslass für die Zellbrühe der jeweiligen vorgeschalteten Filtereinheit fluidleitend mit dem Einlass für die Zellbrühe einer nachgeschalteten Filtereinheit verbunden ist. In dieser Ausgestaltung wird zudem in Schritt (C) die Zellbrühe in den Einlass für die Zellbrühe derjenigen Filtereinheit, welcher keine andere Filtereinheit vorgeschaltet ist (erste Filtereinheit), zugeführt und in Schritt (D) die Zellbrühe aus dem Auslass für die Zellbrühe derjenigen Filtereinheit, welcher keine andere Filtereinheit nachgeschaltet ist (letzte Filtereinheit), abgeführt. Somit durchläuft die Zellbrühe die in Reihe geschalteten Filtereinheiten von der ersten bis zur letzten. Vorzugsweise werden 2 bis 10, besonders bevorzugt 2 bis 5 Filtereinheiten in Reihe geschaltet. Das Versorgungsmedium wird in dieser Ausgestaltung jeder der in Reihe geschalteten Filtereinheiten getrennt zugeführt. Es ist zwar möglich, verschiedenartige Versorgungsmedien zu verwenden, wobei jedoch bevorzugt ist, jeder der Filtereinheiten das gleiche Versorgungsmedium zuzuführen. Vorzugsweise liegt jede der in Reihe geschalteten Filtereinheiten, wie vorstehend beschrieben, in Form einer Filterkassette vor.
In einer bevorzugten Ausgestaltung des Verfahrens werden in Schritt (A) mehrere erfindungsgemäße und voneinander unabhängige Filtereinheiten bereitgestellt und parallelgeschaltet. Parallel- und Reihenschaltung können miteinander kombiniert werden.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens wird das in Schritt (D) abgeführte Retentat (Zellbrühe) zumindest teilweise direkt in den Einlass für die Zellbrühe zurückgeführt. Durch einen Kreislaufprozess kann, sofern ein einziger Durchlauf durch die Filtereinheit nicht ausreicht, ein verbessertes Ergebnis des Verfahrens erzielt werden. Die Zugabe des Versorgungsmediums und die Entnahme des Permeats erfolgen hierbei ohne Rückführung. Sind mehrere Filtereinheiten in Serie geschaltet, kann grundsätzlich jeder Retentatstrom zu jedem Einlass für die Zellbrühe zurückgeführt werden. Vorzugsweise wird hierbei die Zellbrühe jeder einzelnen Filtereinheit zum Einlass für die Zellbrühe derselben Filtereinheit zurückgeführt.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird vorzugsweise unter den folgenden Bedingungen betrieben:

P_EVK ≥ P_ER;
x = V_EVK/V_ER, vorzugsweise ist x ≥ 1, besonders bevorzugt 3 bis 10; und
k = VER/VAR, vorzugsweise ist k ≥ 1;

_EVK

_ER

_AR

_EVK

1 bis 4 zeigen schematisch bevorzugte Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Behandlung einer Zellbrühe bzw. eine (Filtereinheit einer) bevorzugte(n) Ausführungsform des erfindungsgemäßen Bioreaktors, wobei Stoffströme bzw. Fließrichtungen mit Pfeilen angezeigt sind.
1 und 2 zeigen Filtereinheiten bzw. Verfahren zur Behandlung einer Zellbrühe und den Versuchsaufbau des nachstehenden Beispiels. Das zweite Filtermedium (5, unten) hält die Zellen (10) zurück und lässt Verunreinigungen (11) passieren, so dass die Zellbrühe den Retentatkanal (1) gereinigt verlässt. Über den Einlass (7) zum Retentatkanal (1) wird die Zellbrühe in die Filtereinheit zugeführt. Über den Einlass (6) zum Versorgungskanal (2) wird ein Fluid (Flüssigkeit/Gas) in die Filtereinheit gepumpt. Das Fluid (Versorgungsmedium) wird über einen Druckgradienten in den Retentatkanal (1) eingebracht, zeitgleich findet über den Druckgradienten zwischen Retentatkanal (1) und Permeatkanal (3) eine Filtration in den Permeatkanal (3) statt. Der Druckgradient kann beispielsweise über ein Ventil bzw. eine Pumpe am Auslass (8) des Retentatkanals gesteuert werden. Über die Auswahl einer geeigneten Trenngrenze des zweiten Filtermediums werden die Zellen (10) zurückgehalten und passieren das zweite Filtermedium nicht. Kleinere Moleküle wie Proteine hingegen passieren das Filtermedium. Gleiches gilt auch für das Kulturmedium (Versorgungsmedium). Über den Permeatauslass (9) werden kleinere Komponenten (Bestandteile der Zellbrühe und des Versorgungsmediums, welche das zweite Filtermaterial passieren können) abgeführt. Dadurch nimmt die Konzentration an kleineren Komponenten in der Zellbrühe / im Retentat in Richtung Retentatauslass (8) entsprechend ab.
3 und 4 zeigen bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung.
5 zeigt eine Explosionsansicht eines möglichen Aufbaus einer für den erfindungsgemäßen Bioreaktor (12) und das erfindungsgemäße Verfahren geeigneten Filtereinheit mit flächigem ersten Filtermedium (4) und flächigem zweiten Filtermedium (5), wobei die Ströme von Versorgungsmedium (38), Zellbrühe (34, 40) und Permeat (36) durch Pfeile veranschaulicht sind. Der Versorgungskanal (2), der Retentatkanal (1) und der Permeatkanal (3) werden durch Abstandshalter (32) für Versorgungsmedium (38), Zellbrühe (34, 40) bzw. Permeat (36) offengehalten. In der Explosionsdarstellung von 5 sind die Komponenten der Filtereinheit zur besseren Erkennbarkeit gegeneinander verschoben. In der Realität sind die Komponenten/Schichten dieser Ausführungsform derart übereinander angeordnet, dass die Löcher (Durchgangsöffnungen) in den Randbereichen Kanäle bilden.

Im Folgenden werden die in 3 und 4 dargestellten bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung erläutert. In der Ausführungsform von 3 befindet sich die Filtereinheit (13) innerhalb des Innenraums des Bioreaktors (12). In der Ausführungsform von 4 befindet sich die Filtereinheit (20) außerhalb des Innenraums eines Tanks (19).
Filtereinheit, integriert in einem Bioreaktor zur Gewinnung monoklonaler Antikörper und Kulturmediumaustausch
Diese bevorzugte Ausführungsform ist in 3 dargestellt.
Filtereinheit (13) ist in einen Bioreaktor (12) (beispielsweise in einen Perfusionsbioreaktor zur Herstellung eines monoklonalen Antikörpers (=Produkt) mittels Eierstockzellen des chinesischen Zwerghamsters) integriert. Die Zellbrühe (34, 40) im Bioreaktor (12) wird über eine Pumpe (14) in den Retentatkanal (1) der Filtereinheit (13) zugeführt und verlässt diesen wieder direkt in den Perfusionsbioreaktor (12) über den Retentatauslass (15). Dabei passieren die Zellen (10) nur den Retentatkanal (1), ohne in den Versorgungs- oder Permeatkanal (3) zu gelangen. Das Produkt und Kontaminanten passieren das Filtermedium in den Permeatkanal (3).
Über einen Anschluss (16) an den Perfusionsbiorektor wird/werden wahlweise Kulturmedium und/oder Waschpuffer zugeführt. Die Prozessführung ermöglicht auch den Wechsel der zugeführten Medien in unterschiedlichen Phasen über Anschluss (16). Wahlweise kann der Permeatauslass (18) geschlossen werden, z. B. in der Phase der Zuführung von frischem Kulturmedium. In einer weiteren Phase wird der Permeatauslass (18) wieder geöffnet und Waschpuffer zugeführt.
Über ein Ventil (17) oder eine Pumpe (in 3 nicht dargestellt) am Auslass (15) des Retentatkanals wird der Filtrationsdruck eingestellt. Über den Permeatauslass (18) werden Produkt und Kontaminanten (Nebenprodukte, Zellbestandteile usw.) zur weiteren Aufarbeitung abgeleitet.
Verfahren zur Aufkonzentration und zum Waschen einer Zellbrühe
Diese bevorzugte Ausführungsform ist in 4 dargestellt.
Der Retentatkanal (1) der Filtereinheit (20) wird über eine Pumpe (21) mit einen Tank (19), der eine Zellbrühe enthält, verbunden. Die Zellbrühe aus dem Tank (19) wird dem Retentatkanal (1) der Filtereinheit (20) zugeführt. Über ein Ventil (22) oder eine Pumpe (in 4 nicht dargestellt) am Auslass des Retentatkanals (23) wird der Filtrationsdruck eingestellt sowie der Volumenstrom am Auslass (23) im Verhältnis zum Eingangsvolumenstrom geregelt. Über den Anschluss (24) wird eine Lösung dem Versorgungskanal (2) als Versorgungsmedium (38) zugeführt. Über den Permeatauslass (25) werden Kontaminanten sowie der überwiegende Teil der Lösung abgeführt. Über den Retentatauslass (23) können Zellen (10) im Retentat dem nächsten Schritt bzw. einem weiteren Tank zugeführt oder in den ursprünglichen Tank (19) zurückgeführt werden. Bevorzugt wird die Zellbrühe 2- bis 10-fach konzentriert.
Die vorliegende Erfindung wird durch das folgende Beispiel erläutert, ohne darauf beschränkt zu sein.
Beispiel
Zellwäsche einer Hefezellsuspension mit Rinderserumalbumin als Produkt

Der zugrunde liegende Versuchsaufbau ist in 1 und 2 gezeigt. Als erstes (4) und zweites (5) Filtermedium wurde jeweils eine Membran aus PES mit einer Porengröße von 0,1 µm verwendet. Die Membranfläche betrug jeweils 0,216 m². In den Einlass (7) wurde eine Zellbrühe (30 g/L Bäckerhefe, 10.6 g/L Rinderserumalbumin (Protein) und 0.9%-ige NaCI-Lösung in Wasser) zugeführt. In den Versorgungskanal (2) wurde Leitungswasser als Versorgungsmedium zugeführt. Die Proteinkonzentration und -masse des jeweiligen Gesamtvolumens der Zellbrühe vor und nach der Wäsche sowie des Permeats wurden bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabellen 1 und 2 aufgeführt. Tabelle 1

t	P_ER	V_AR	V_AP	V_EVK	V_ER	V_ER : V_AR	V_EVK: V_ER
[min]	[bar]	[mL/min]	[mL/min]	[mL/min]	[mL/min]	[-]	[-]
5	0,12	64	64	61	64	1,0	1,0
12	0,13	66	66	62	65	1,0	1,0
20	0,17	66	66	71	62	0,9	0,9
30	0,24	66	66	61	69	1,0	1,1
50	0,37	66	64	61	68	1,0	1,1
t Zeitpunkt der Messung P_ER Druck, mit dem die Zellbrühe zugegeben wurde V_AR Volumenstrom am Auslass des Retentatkanals V_AP Volumenstrom am Auslass des Permeatkanals V_EVK Volumenstrom am Einlass des Versorgungskanals V_ER Volumenstrom am Einlass des Retentatkanals

Tabelle 2

	Leitfähigkeit	Volumen	Massenkonzentration (Protein)	Masse (Protein)
	[mS/cm]	[L]	[g/L]	[g]
Zellbrühe vor Wäsche	14,55	5	10,6	53,0
Permeat	10,52	5,1	6,72	34,3
Zellbrühe nach Wäsche	3,93	4,95	3,1	15,3

Das Ergebnis zeigt eine Abnahme der NaCI- und Proteinkonzentration in der Zellsuspension (Retentat).
Bezugszeichenliste

1: Retentatkanal
2: Versorgungskanal
3: Permeatkanal
4: Erstes Filtermedium
5: Zweites Filtermedium
6: Einlass für Versorgungsmedium
7: Einlass für Zellbrühe
8, 15, 23: Auslass für Zellbrühe
9, 18, 25: Auslass für Permeat
10: Zellen
11: Verunreinigungen
12: (Perfusions-)bioreaktor
13, 20: Filtereinheit
14,21: Pumpe
16: Anschluss an Einlass für Versorgungsmedium
17,22: Ventil
19: Tank
24: Anschluss für Versorgungsmedium
32: Abstandshalter
34, 40: Zellbrühe
36: Permeat
38: Versorgungsmedium

Claims

Bioreaktor (12) mit Filtereinheit (13, 20), wobei der Bioreaktor (12) einen Innenraum aufweist und die Filtereinheit (13, 20) mindestens einen Versorgungskanal (2), mindestens ein erstes Filtermedium (4), mindestens einen Retentatkanal (1), mindestens ein zweites Filtermedium (5) und mindestens einen Permeatkanal (3), derart angeordnet, dass das erste Filtermedium (4) den Versorgungskanal (2) und den Retentatkanal (1) voneinander abgrenzt und das zweite Filtermedium (5) den Retentatkanal (1) und den Permeatkanal (3) voneinander abgrenzt, aufweist, wobei der Versorgungskanal (2) fluidleitend mit mindestens einem Einlass (6) für ein Versorgungsmedium (38) verbunden ist, der Retentatkanal (1) fluidleitend mit mindestens einem Einlass (7) für eine Zellbrühe (40) und mit mindestens einem Auslass (8, 15, 23) für die Zellbrühe (34) verbunden ist, der Permeatkanal (3) fluidleitend mit mindestens einem Auslass (9, 18, 25) für ein Permeat (36) verbunden ist, und der Innenraum des Reaktors fluidleitend mit dem Einlass (7) für die Zellbrühe (40) und dem Auslass (8, 15, 23) für die Zellbrühe (34) verbunden ist.
Bioreaktor (12) nach Anspruch 1, wobei die Filtereinheit (13, 20) innerhalb oder außerhalb des Innenraums angeordnet ist.
Bioreaktor (12) nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Filtereinheit (13, 20) ein Flachfilter-, Wickelfaser- oder Hohlfasermodul ist.
Bioreaktor (12) nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Einlass (6) für das Versorgungsmedium (38) fluidleitend mit einer Pumpe für das Versorgungsmedium (38) verbunden ist und/oder der Einlass (7) für die Zellbrühe (40) fluidleitend mit einer Pumpe (14, 21) für die Zellbrühe (40) verbunden ist.
Bioreaktor (12) nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der Auslass (8, 15, 23) für die Zellbrühe (34) ein Ventil (17, 22) oder eine Pumpe aufweist.
Verfahren zur Behandlung einer Zellbrühe (34, 40), umfassend die Schritte (A) Bereitstellen einer Filtereinheit (13, 20), wobei die Filtereinheit (13, 20) mindestens einen Versorgungskanal (2), mindestens ein erstes Filtermedium (4), mindestens einen Retentatkanal (1), mindestens ein zweites Filtermedium (5) und mindestens einen Permeatkanal (3), derart angeordnet, dass das erste Filtermedium (4) den Versorgungskanal (2) und den Retentatkanal (1) voneinander abgrenzt und das zweite Filtermedium (5) den Retentatkanal (1) und den Permeatkanal (3) voneinander abgrenzt, aufweist, wobei der Versorgungskanal (2) fluidleitend mit mindestens einem Einlass (6) für ein Versorgungsmedium (38) verbunden ist, der Retentatkanal (1) fluidleitend mit mindestens einem Einlass (7) für die Zellbrühe (40) und mit mindestens einem Auslass (8, 15, 23) für die Zellbrühe (34) verbunden ist, der Permeatkanal (3) fluidleitend mit mindestens einem Auslass (9, 18, 25) für ein Permeat (36) verbunden ist; (B) Zuführen des Versorgungsmediums (38) in den Einlass (6) für das Versorgungsmedium (38); (C) Zuführen der Zellbrühe (40) in den Einlass (7) für die Zellbrühe (40); (D) Abführen der Zellbrühe (34) aus dem Auslass (8, 15, 23) für die Zellbrühe (34); und (E) Abführen des Permeats (36) aus dem Auslass (9, 18, 25) für das Permeat (36).
Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Behandlung der Zellbrühe (34, 40) eine Wäsche der Zellen (10), ein Zugeben oder ein Austauschen eines Kulturmediums, eine Konzentrationsänderung der Zellen (10) in der Zellbrühe (34, 40), eine Fraktionierung der Zellen (10) und/oder eine Zellbegasung umfasst.
Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, wobei in Schritt (A) der Bioreaktor (12) mit Filtereinheit (13, 20) nach einem der Ansprüche 1 bis 5 bereitgestellt wird; in Schritt (C) die Zellbrühe (40) aus dem Innenraum des Bioreaktors (12) in den Einlass (7) für die Zellbrühe (40) zugeführt wird; und in Schritt (D) die Zellbrühe (34) aus dem Auslass (8, 15, 23) für die Zellbrühe (34) in den Innenraum des Bioreaktors (12) abgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 8, wobei das Verhältnis des Volumenstroms des in Schritt (B) zugeführten Versorgungsmediums (38) zu dem Volumenstrom der in Schritt (C) zugeführten Zellbrühe (40) 1 : 10 bis 10 : 1 beträgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 9, wobei das Verhältnis des Volumenstroms der in Schritt (C) zugeführten Zellbrühe (40) zu dem Volumenstrom der in Schritt (D) abgeführten Zellbrühe (34)1 : 10 bis 10 : 1 beträgt.