KR20210127917A - 트리루프를 함유하는 이중-가닥의 핵산 억제제 분자 - Google Patents

트리루프를 함유하는 이중-가닥의 핵산 억제제 분자 Download PDF

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KR20210127917A
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Abstract

본원에서는 줄기 루프 구조를 갖는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 갖는 이중-가닥 핵산 억제제 분자가 제공되며, 여기서, 상기 줄기 루프 구조의 루프 부분은 트리루프이다. 또한, 표적 유전자 발현을 감소시키기 위한 방법 및 조성물 및 관심 질환을 치료하기 위한 방법 및 조성물이 제공된다.

Description

트리루프를 함유하는 이중-가닥의 핵산 억제제 분자
본 출원은 2018년 12월 12일에 출원된 미국 가특허 출원 번호 제62/778,759호의 이익을 주장하고 그 출원일에 의존하며, 그 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
올리고뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드 (RNA, DNA 및 이들의 유사체)의 중합체 서열이다. 핵산 억제제 분자는 세포내 (intracellular) RNA 수준을 조절하는 올리고뉴클레오타이드이고, 암, 바이러스 감염 및 유전성 장애의 치료에서 초기 가능성을 보여주었다. 핵산 억제제 분자는 RNA 간섭 (RNAi)을 포함한 다양한 메커니즘을 통해 RNA 발현을 조절할 수 있다.
RNAi는 이중-가닥 RNA 분자 (dsRNA)가 dsRNA에 상보적인 서열을 갖는 표적 유전자의 발현을 억제하는 대부분의 진핵생물에서 발견되는 보존된 경로이다. 전형적인 RNAi 경로에서, 더 긴 dsRNA 분자는 다이서 (Dicer) 효소에 의해 짧은 간섭 RNA ("siRNA")로 불리는 더 짧은 RNA 듀플렉스로 절단된다. siRNA는 다이서, 트랜스-활성 반응 RNA-결합 단백질 (TRBP), 및 Argonaute 2 ("Ago2")와 회합하여 복합체를 형성하는 것으로 나타났으며, 상기 복합체는 종종 RNA-유도 사일런싱 복합체 ("RISC")로 지칭된다. 일단 활성화되면 Ago2는 siRNA의 안티센스 가닥 (가이드 가닥으로도 불림)을 사용하여 표적 mRNA를 절단하여 RISC 복합체의 서열 특이성을 표적 mRNA의 절단으로 유도하는 엔도뉴클레아제이다.
다양한 이중-가닥 RNAi 억제제 분자 구조가 수년에 걸쳐 개발되었다. 예를 들어, RNAi 억제제 분자에 대한 초기 연구는 천연 siRNA를 모방하는 이중-가닥 핵산 분자에 초점을 맞추었고, 이때 각 가닥은 19 내지 25개 뉴클레오타이드의 크기를 가지며 1 내지 5개 뉴클레오타이드의 적어도 하나의 3'-오버행을 갖는다 (예를 들어, 미국 특허 번호 제8,372,968호 참조). 그 후, 활성 RNAi 억제제 분자로 다이서 효소에 의해 생체내에서 처리되는 더 긴 이중-가닥 RNAi 억제제 분자가 개발되었다 (예를 들어, 미국 특허 번호 제8,883,996호 참조). 이후 연구에서는 가닥들 중 하나가 열역학적으로-안정화되는 테트라루프 구조를 포함하는 구조를 포함하는, 적어도 하나의 가닥의 적어도 하나의 말단이 분자의 이중-가닥 표적 영역을 넘어 연장되는 확장된 이중-가닥 핵산 억제제 분자가 개발되었다 (예를 들어, 미국 특허 번호 제8,513,207호, 미국 특허 번호 제8,927,705호, 제WO 2010/033225호, 및 제WO 2016/100401호 참조, 상기 특허 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨).
특정 예에서, 화학적으로 변형된 뉴클레오타이드는 핵산 억제제 분자에 도입되어 특정 조건, 예컨대 생체내 투여 후 경험되는 조건하에 요망될 수 있는 성질을 도입하였다. 그러한 화학적으로 변형된 뉴클레오타이드는, 예를 들어, 올리고 뉴클레오타이드의 구조 또는 활성을 분해 또는 방해하는 뉴클레아제 또는 다른 효소에 대해 안정화시키거나, 올리고뉴클레오타이드의 세포 흡수를 증가시키거나, 올리고 뉴클레오타이드의 약동학적 성질을 개선하도록 설계된 것들을 포함한다.
그러나, 새로운 이중-가닥 핵산 억제제 분자를 개발하고/하거나 그러한 핵산 억제제 분자에 원하는 성질을 부여하기 위해 화학적으로 변형된 뉴클레오타이드를 혼입하기 위한 요구는, 구조 및/또는 화학적으로 변형된 뉴클레오타이드가 (예를 들어, 유전자 표적 녹다운의 효능 또는 기간의 임의의 감소를 최소화하는) 핵산 억제제 분자의 활성에 미칠 수도 있는 임의의 부정적인 영향을 최소화하려는 경쟁적인 요구와 균형을 이루어야 한다.
요약
본원에는 줄기 루프 구조를 갖는 센스 가닥 및 별도의 안티센스 가닥을 갖는 이중-가닥 핵산 억제제 분자가 개시되며, 여기서, 상기 줄기 루프 구조의 루프 부분은 트리루프 (triloop)를 포함한다. 실시예에 나타난 바와 같이, 트리루프를 함유하는 이중-가닥 핵산 억제제는 안정적이고 용량-의존적 방식으로 생체내 표적 mRNA 발현을 감소시킨다. 트리루프 구조가 자연적으로 발생하는 상황에서 제거되고 화학적으로 합성된 이중-가닥 핵산 억제제 분자에 혼입되었을 때 이 트리루프 구조가 열역학적으로 안정적인 배열을 유지할 수 있었다는 것은 놀라웠다. 또한 리간드, 예컨대 GalNAc를 트리루프의 뉴클레오디드에 접합하는 것이 트리루프의 열역학적으로 안정적인 배열을 방해하지 않고 2개의 GalNAc를 트리루프에 접합하는 것이 3개의 GalNAc를 갖는 테트라루프-함유 이중-가닥 핵산 억제제 분자와 비교하여 간세포에서 효능을 감소시키지 않았고, 특정 경우에 실제로 효능이 개선되었음을 발견하는 것은 놀라웠다.
추가로, 트리루프-함유 이중-가닥 핵산 억제제 분자는 바이사이클릭 뉴클레오타이드를 줄기 루프 구조의 줄기 부분에 혼입할 수 있다. 이전에 국제 공개 번호 제WO 2019/200124호에 입증된 바와 같이, Tm-증가 뉴클레오타이드를 줄기 듀플렉스에 혼입하는 것은, 생체내 표적 mRNA 녹다운의 증진된 기간에 의해 일부 입증된 바와 같이 테트라루프-함유 이중-가닥 핵산 억제제 분자에 증가된 안정성을 부여할 수 있다.
또한, 테트라루프 대신 트리루프를 사용하고 바이사이클릭 뉴클레오타이드를 줄기 루프 구조의 줄기 부분에 혼입하는 것은, 이를 포함하는 이중-가닥 핵산 억제제 분자의 효능을 감소시키지 않으면서 더 짧은 센스 가닥의 사용을 허용한다. 더 짧은 센스 가닥의 사용은 제조 공정에 이점을 부여하여 시간과 비용 둘 다를 감소시킨다. 또한, 이의 분자량 감소로 인해 몰 기준으로 더 많은 트리루프-함유 이중-가닥 핵산 억제제 분자를 투여할 수 있기 때문에 투여에 있어 이점을 부여한다.
이중-가닥 핵산 억제제 분자는 센스 가닥 (S)의 제1 영역 (R1)과 안티센스 가닥 (AS) 사이의 제1 듀플렉스 (D1), 및 센스 가닥의 제2 영역 (R2)의 제1 서브영역 (S1)과 제2 서브영역 (S2) 사이의 제2 듀플렉스 (D2)를 포함하고, 여기서, S1 및 S2는 트리루프 (triL)로 연결된다. 도 1a 내지 1d를 참조한다. 추가로, 줄기 루프 구조의 줄기 부분은, 특정 구현예에서, 적어도 하나의 Tm-증가 뉴클레오타이드, 예컨대 4 내지 12개의 Tm-증가 뉴클레오타이드, 예를 들어, 2 내지 6개의 Tm-증가 뉴클레오타이드 염기 쌍, 또는 1 내지 6개의 쌍을 형성하지 않은 Tm-증가 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 줄기 루프 구조는 센스 가닥의 5'- 또는 3'-말단에 위치할 수 있다.
특정 구현예에서, 이중-가닥 핵산 억제제 분자는,
20 내지 65개 뉴클레오타이드를 포함하고 제1 영역 (R1) 및 제2 영역 (R2)을 갖는 센스 가닥;
15 내지 40개 뉴클레오타이드를 포함하는 안티센스 가닥으로서, 여기서, 상기 센스 가닥 및 상기 안티센스 가닥은 별도의 가닥인, 안티센스 가닥; 및
상기 센스 가닥의 제1 영역 및 상기 안티센스 가닥에 의해 형성된 제1 듀플렉스 (D1)로서, 여기서, 상기 제1 듀플렉스는 15 내지 40개 염기 쌍의 길이를 갖는, 제1 듀플렉스 (D1)를 포함하고;
여기서, 상기 센스 가닥의 제2 영역 (R2)은 제1 서브영역 (S1), 제2 서브영역 (S2), 및 상기 제1 영역과 상기 제2 영역을 연결하는 트리루프 (triL)를 포함하고, 여기서, 상기 제1 및 제2 영역은 제2 듀플렉스 (D2)를 형성한다.
특정 구현예에서, 트리루프는 GAA의 뉴클레오타이드 서열을 갖는다.
특정 구현예에서, 센스 가닥은 22 내지 65개 뉴클레오타이드를 갖는다. 특정 구현예에서, 센스 가닥은 25 내지 39개 뉴클레오타이드를 갖는다. 특정 구현예에서, 센스 가닥은 27 내지 35개 뉴클레오타이드를 갖는다.
특정 구현예에서, 안티센스 가닥은 20 내지 24개 뉴클레오타이드를 갖는다. 특정 구현예에서, 안티센스 가닥은 20 내지 22개 뉴클레오타이드를 갖는다.
특정 구현예에서, 트리루프의 5'-말단에 바로 인접한 뉴클레오타이드는 C이고, 트리루프의 3'-말단에 바로 인접한 뉴클레오타이드는 G이다.
특정 구현예에서, 안티센스 가닥은 이의 3'-말단에 1 내지 4개 뉴클레오타이드의 단일 가닥 오버행을 갖는다. 특정 구현예에서, 단일 가닥 오버행은 2개 뉴클레오타이드의 길이이다.
특정 구현예에서, 제1 듀플렉스 (D1)는 18 내지 30개 염기 쌍의 길이를 갖는다. 특정 구현예에서, 제1 듀플렉스 (D1)는 18 내지 24개 염기 쌍의 길이를 갖는다. 특정 구현예에서, 제1 듀플렉스 (D1)는 20 내지 22개 염기 쌍의 길이를 갖는다.
특정 구현예에서, 제2 듀플렉스 (D2)는 2 내지 6개 염기 쌍의 길이를 갖는다. 특정 구현예에서, 제2 듀플렉스는 임의의 Tm-증가 뉴클레오타이드를 포함하지 않으며, 특정 구현예에서, 제2 듀플렉스는 4 내지 10개의 Tm-증가 뉴클레오타이드를 포함하며, 2 내지 5개 염기 쌍의 길이를 갖는다.
특정 구현예에서, 센스 가닥은 25 내지 39개 뉴클레오타이드의 길이이고, 안티센스 가닥은 20 내지 24개 뉴클레오타이드의 길이이고, 제1 듀플렉스는 18 내지 24개 뉴클레오타이드의 길이를 갖고, 제2 듀플렉스는 2 내지 6개 염기 쌍의 길이를 갖는다. 특정 구현예에서, 센스 가닥은 27 내지 35개 뉴클레오타이드의 길이이고, 안티센스 가닥은 20 내지 22개 뉴클레오타이드의 길이이고, 제1 듀플렉스는 18 내지 22개 염기 쌍의 길이를 갖고, 제2 듀플렉스는 2개 또는 3개 염기 쌍의 길이를 갖는다.
특정 구현예에서, 제2 듀플렉스 (D2)는 2개 염기 쌍의 길이를 갖는다. 특정 구현예에서, 제2 듀플렉스 (D2)는 3개 염기 쌍의 길이를 갖는다.
특정 구현예에서, 센스 가닥 (R1)의 제1 영역은 20개 뉴클레오타이드의 길이이고, 센스 가닥의 제2 영역 (R2)은 7 내지 9개 뉴클레오타이드의 길이이고;
여기서, 센스 가닥의 제1 영역 및 안티센스 가닥에 의해 형성된 제1 듀플렉스 (D1)는 20개 염기 쌍의 길이를 갖고;
여기서, 센스 가닥의 제2 영역 (R2)의 제1 서브영역 (S1) 및 서브영역 (S2)에 의해 형성된 제2 듀플렉스 (D2)는 2개 또는 3개 염기 쌍의 길이를 가지고, 제2 듀플렉스는 적어도 하나의 Tm-증가 뉴클레오타이드를 포함하고;
여기서, 안티센스 가닥은 22개 뉴클레오타이드의 길이이고, 이의 3'-말단에서 2개 뉴클레오타이드의 단일-가닥 오버행을 가지고;
여기서, 트리루프는 GAA의 뉴클레오타이드 서열을 갖는다. 특정 구현예에서, R2는 7개 뉴클레오타이드의 길이이고, D2는 2개 염기 쌍의 길이를 갖는다. 특정 구현예에서, R2는 9개 뉴클레오타이드의 길이이고, D2는 3개 염기 쌍의 길이를 갖는다.
특정 구현예에서, 제2 듀플렉스 (D2)에서 각각의 뉴클레오타이드는 Tm-증가 뉴클레오타이드이다. 특정 구현예에서, 트리루프-함유 이중-가닥 핵산 억제제 분자는 제2 듀플렉스 (D2) 외부에 임의의 Tm-증가 뉴클레오타이드를 함유하지 않는다.
특정 구현예에서, Tm-증가 뉴클레오타이드는 바이사이클릭 뉴클레오타이드, 트리사이클릭 뉴클레오타이드, G-클램프 및 이의 유사체, 헥시톨 뉴클레오타이드, 및 변형된 뉴클레오타이드로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서, 상기 변형된 뉴클레오타이드는 2'-F 또는 2'-OMe로 당 모이어티의 2'-탄소에서 변형되지 않는다. 특정 구현예에서, 변형된 뉴클레오타이드는 5-브로모-우라실, 5-요오도-우라실, 5-프로피닐-변형된 피리미딘, 2-아미노 아데닌, 2-티오 우리딘, 5 Me-티오 우리딘, 또는 슈도 우리딘이다.
트리루프-함유 이중-가닥 핵산 억제제 분자가 적어도 하나의 바이사이클릭 뉴클레오타이드를 포함하는 특정 구현예에서, 적어도 하나의 바이사이클릭 뉴클레오타이드는 화학식 I, II, III, IV, Va, 또는 Vb의 구조를 갖는다. 특정 구현예에서, 적어도 하나의 바이사이클릭 뉴클레오타이드는 화학식 Ia, Ib, Ic, Id, Ie, 또는 If 중 하나 이상의 구조를 갖는다. 특정 구현예에서, 적어도 하나의 바이사이클릭 뉴클레오타이드는 화학식 IIa, IIb, IIc, 또는 IId 중 하나 이상의 구조를 갖는다. 특정 구현예에서, 적어도 하나의 바이사이클릭 뉴클레오타이드는 화학식 IIIa 및/또는 IIIb의 구조를 갖는다. 특정 구현예에서, 적어도 하나의 바이사이클릭 뉴클레오타이드는 화학식 IVa 및/또는 IVb의 구조를 갖는다.
특정 구현예에서, 적어도 하나의 바이사이클릭 뉴클레오타이드는 다음 중 하나 이상이다:
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
여기서, B는 핵염기이고, R2는 H 또는 CH3이고, Wa 및 Wb는 각각 독립적으로 H, OH, 하이드록실 보호기, 인 모이어티, 또는 바이사이클릭 뉴클레오타이드를 또 다른 뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드에 부착하는 뉴클레오타이드간 연결기 (internucleotide linking group)이고, 여기서, Wa 또는 Wb 중 적어도 하나는 바이사이클릭 뉴클레오타이드를 올리고뉴클레오타이드에 부착하는 뉴클레오타이드간 연결기이다.
특정 구현예에서, 적어도 하나의 바이사이클릭 뉴클레오타이드는 다음과 같다:
Figure pct00004
여기서, B, Wa, 및 Wb는 상기 기재된 바와 같고, R2는 CH3이다.
특정 구현예에서, 적어도 하나의 바이사이클릭 뉴클레오타이드는 제1 고리를 포함하고, 여기서, 제1 고리는 푸라노실이고, 상기 푸라노실의 2'-탄소와 4'-탄소를 연결하여 브릿지는 제2 고리를 형성한다.
특정 구현예에서, 푸라노실의 2'-탄소와 4'-탄소를 연결하는 브릿지는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다:
a) 예를 들어, 4'-CH2-NH-O-2' (BNANC로도 알려져 있음) 또는 4'-CH2-N(CH3)-O-2' (BNANC[NMe]로도 알려져 있음)를 포함한 4'-CH2-O-N(R)-2' 및 4'-CH2-N(R)-O-2', 여기서, R은 H이고, C1-C12 알킬, 또는 보호기이다;
b) 4'-CH2-2'; 4'-(CH2)2-2'; 4'-(CH2)3-2'; 4'-(CH2)-O-2' (LNA로도 알려져 있음); 4'-(CH2)-S-2'; 4'-(CH2)2-O-2' (ENA로도 알려져 있음); 4'-CH(CH3)-O-2' (cEt로도 알려져 있음); 및 4'-CH(CH2OCH3)-O-2' (cMOE로도 알려져 있음), 및 이들의 유사체;
c) 4'-C(CH3)(CH3)-O-2' 및 이의 유사체;
d) 4'-CH2-N(OCH3)-2' 및 이의 유사체;
e) 4'-CH2-O-N(CH3)-2' 및 이의 유사체;
f) 4'-CH2-C(H)(CH3)-2' 및 이의 유사체; 및
g) 4'-CH2-C(=CH2)-2' 및 이의 유사체.
특정 구현예에서, 트리루프-함유 이중-가닥 핵산 억제제 분자는 제2 듀플렉스 외부에 임의의 Tm-증가 뉴클레오타이드를 포함하지 않는다.
특정 구현예에서, 트리루프는 적어도 하나의 리간드 접합된 뉴클레오타이드를 포함한다. 특정 구현예에서, 트리루프는 2개의 리간드 접합된 뉴클레오타이드를 포함한다. 특정 구현예에서, 트리루프는 3개의 리간드 접합된 뉴클레오타이드를 포함한다. 특정 구현예에서, 리간드는 GalNAc이다. 특정 구현예에서, GalNAc는 당 모이어티의 2'-위치에서 뉴클레오타이드에 접한된다.
특정 구현예에서, 트리루프-함유 이중-가닥 핵산 억제제 분자는 센스 가닥 및/또는 안티센스 가닥의 5'-말단에서 5'-포스페이트 모방체를 추가로 포함한다.
특정 구현예에서, 트리루프-함유 이중-가닥 핵산 억제제 분자는 지질 나노입자로 제형화된다. 특정 구현예에서, 지질 나노입자는 코어 지질 및 외피 지질을 포함하고, 여기서, 코어 지질은 제1 양이온성 지질 및 제1 페길화된 지질을 포함하고, 외피 지질은 제2 양이온성 지질, 중성 지질, 스테롤, 및 제2 페길화된 지질을 포함한다. 특정 구현예에서, 제1 양이온성 지질은 DL-048이고, 제1 페길화된 지질은 DSG-mPEG이고, 제2 양이온성 지질은 DL-103이고, 중성 지질은 DSPC이고, 스테롤은 콜레스테롤이고, 제2 페길화된 지질은 DSPE-mPEG이다.
또 다른 양태는 치료학적 유효량의 본원에 기재된 바와 같은 트리루프-함유 이중-가닥 핵산 억제제 분자 및 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
또 다른 양태는 표적 유전자의 발현을 감소시키기에 충분한 양으로 표적 유전자의 발현 감소를 필요로 하는 대상체에게 트리루프-함유 이중-가닥 핵산 억제제 분자 또는 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하여, 대상체에서 표적 유전자의 발현을 감소시키는 방법에 관한 것이다. 특정 구현예에서, 투여 단계는 정맥내, 근육내, 또는 피하 투여를 포함한다. 특정 구현예에서, 대상체는 인간이다.
본 명세서에 포함되고 이의 일부를 구성하는 첨부 도면들은 특정 구현예를 예시하고, 서면 설명과 함께 본원에 개시된 조성물 및 방법의 특정 원리를 설명하는 역할을 한다.
도 1a는 안티센스 가닥 ("AS") 및 센스 가닥 ("S")을 갖는 예시적인 이중-가닥 핵산 억제제 분자의 개략도를 나타내고, 여기서, 센스 가닥은 줄기 루프 구조를 포함하고, 루프는 트리루프이다.
도 1b는 도 1a에서와 동일한 예시적인 개략도를 나타낸다. 도 1b에서, 센스 가닥은 안티센스 가닥 (AS)과 듀플렉스를 형성하는 제1 영역 (R1)과, 제1 서브영역 (S1)과 제2 서브영역 (S2)을 연결하는 트리루프 (triL)를 포함하는 제2 영역 (R2)으로 더 나뉘고, 여기서, 본원에서 "줄기" 또는 "줄기 듀플렉스"로 지칭되는 S1 및 S2는 듀플렉스를 형성하기에 서로 충분히 상보적이다.
도 1c는 도 1a 및 1b에서와 동일한 예시적인 개략도를 개략적으로 나타낸다. 도 1c의 개략도는 핵산 억제제 분자에서 제1 듀플렉스 (D1) 및 제2 듀플렉스 (D2)를 도시한다. 제1 듀플렉스 (D1)는 센스 가닥 (R1)의 제1 영역과 안티센스 가닥 (AS) 사이에 형성된다. 제2 듀플렉스 (D2) 또는 "줄기"는 센스 가닥의 제2 영역 (R2)의 제1 서브 영역 (S1)과 제2 서브 영역 (S2) 사이에 형성된다.
도 1d는 제2 듀플렉스 (D2)가 도 1c에 도시된 제2 듀플렉스보다 짧은 예시적인 이중-가닥 핵산 억제제 분자를 개략적으로 나타낸다.
도 2a는 실시예 1에서 논의된 바와 같이 관심 유전자 서열을 표적으로 하는 예시적인 이중-가닥 핵산 억제제 분자 ("작제물 1")의 구조를 개략적으로 나타낸다. 작제물 1의 센스 가닥은 6개 염기 쌍의 줄기 듀플렉스 및 테트라루프를 함유한다. 테트라루프의 4개 뉴클레오타이드 중 3개는 단일 GalNAc 분자에 접합된다.
도 2b는 실시예 1에서 논의된 바와 같이 관심 유전자 서열을 표적으로 하는 예시적인 이중-가닥 핵산 억제제 분자 ("작제물 2")의 구조를 개략적으로 나타낸다. 작제물 2의 센스 가닥은 6개 염기 쌍의 줄기 듀플렉스 및 테트라루프를 포함한다. 작제물 1에서와 같이 4개 중 3개 대신 테트라루프의 4개 뉴클레오타이드 중 2개만이 단일 GalNAc 분자에 접합되는 것을 제외하고는, 작제물 2의 구조는 작제물 1의 구조와 동일하다.
도 2c는 실시예 1에서 논의된 바와 같이 관심 유전자 서열을 표적으로 하는 예시적인 이중-가닥 핵산 억제제 분자 ("작제물 3")의 구조를 개략적으로 나타낸다. 작제물 3의 센스 가닥은 6개 염기 쌍의 줄기 듀플렉스 및 테트라루프를 함유한다. 트리루프의 3개 뉴클레오타이드 중 2개는 단일 GalNAc 분자에 접합된다. 줄기 루프의 루프 부분이 테트라루프 대신 트리루프라는 것을 제외하고는, 작제물 3의 구조는 작제물 2의 구조와 동일하다.
도 2d는 실시예 1에서 논의된 바와 같이 관심 유전자 서열을 표적으로 하는 예시적인 이중-가닥 핵산 억제제 분자 ("작제물 4")의 구조를 개략적으로 나타낸다. 작제물 4의 센스 가닥은 3개 염기 쌍의 줄기 듀플렉스를 포함하고, 여기서 줄기 듀플렉스에서 뉴클레오타이드 각각은 바이사이클릭 뉴클레오타이드 및 트리루프이다. 트리루프의 3개 뉴클레오타이드 중 2개는 단일 GalNAc 분자에 접합된다.
도 2e는 실시예 1에서 논의된 바와 같이 관심 유전자 서열을 표적으로 하는 예시적인 이중-가닥 핵산 억제제 분자 ("작제물 5")의 구조를 개략적으로 나타낸다. 작제물 5의 센스 가닥은 3개 염기 쌍의 줄기 듀플렉스를 포함하고, 여기서 줄기 듀플렉스에서 뉴클레오타이드 각각은 LNA 및 트리루프이다. 트리루프의 3개 뉴클레오타이드 중 2개는 단일 GalNAc 분자에 접합된다.
도 3a는 실시예 1에 설명된 바와 같이 다양한 투여량의 작제물 1 (도 2a 참조)을 CD-1 마우스에 투여한지 4일 후 남아있는 표적 유전자 mRNA의 퍼센트를 나타내는 그래프이다. 도 3a에 나타낸 바와 같이, 유효 용량 (ED50)은 0.5726 mg/kg으로 계산되었다.
도 3b는 실시예 1에 설명된 바와 같이 다양한 투여량의 작제물 2 (도 2b 참조)를 CD-1 마우스에 투여한지 4일 후 남아있는 표적 유전자 mRNA의 퍼센트를 나타내는 그래프이다. 도 3b에 나타낸 바와 같이, ED50은 0.3604 mg/kg으로 계산되었다.
도 3c는 실시예 1에 설명된 바와 같이 다양한 투여량의 작제물 3 (도 2c 참조)을 CD-1 마우스에 투여한지 4일 후 남아있는 표적 유전자 mRNA의 퍼센트를 나타내는 그래프이다. 도 3c에 나타낸 바와 같이, ED50은 0.3144 mg/kg으로 계산되었다.
도 3d는 실시예 1에 설명된 바와 같이 다양한 투여량의 작제물 4 (도 2d 참조)를 CD-1 마우스에 투여한지 4일 후 남아있는 표적 유전자 mRNA의 퍼센트를 나타내는 그래프이다. 도 3d에 나타낸 바와 같이, ED50은 0.3012 mg/kg으로 계산되었다.
도 3e는 실시예 1에 설명된 바와 같이 다양한 투여량의 작제물 5 (도 2e 참조)를 CD-1 마우스에 투여한지 4일 후 남아있는 표적 유전자 mRNA의 퍼센트를 나타내는 그래프이다. 도 3e에 나타낸 바와 같이, ED50은 0.2325 mg/kg으로 계산되었다.
도 4는 실시예 1에 설명된 바와 같이 다양한 투여량의 작제물 1 내지 5 (도 2a 내지 2e 참조)를 CD-1 마우스에 투여한지 4일 후 남아있는 표적 유전자 mRNA의 퍼센트를 나타내는 그래프이다.
도 5는 실시예 1에 설명된 바와 같이 다양한 투여량의 작제물 1 내지 5 (도 2a 내지 2e 참조)를 CD-1 마우스에 투여한지 4일 후 남아있는 표적 유전자 mRNA의 퍼센트를 나타내는 막대 그래프이다.
도 6a는 실시예 2에서 논의된 바와 같이 관심 유전자 서열을 표적으로 하는 예시적인 이중-가닥 핵산 억제제 분자 ("작제물 6")의 구조를 개략적으로 나타낸다. 작제물 6의 센스 가닥은 6개 염기 쌍의 줄기 듀플렉스 및 테트라루프를 함유한다. 테트라루프의 4개 뉴클레오타이드 중 2개는 단일 GalNAc 분자에 접합된다.
도 6b는 실시예 2에서 논의된 바와 같이 관심 유전자 서열을 표적으로 하는 예시적인 이중-가닥 핵산 억제제 분자 ("작제물 7")의 구조를 개략적으로 나타낸다. 작제물 7의 센스 가닥은 6개 염기 쌍의 줄기 듀플렉스 및 테트라루프를 포함한다. 작제물 7이 테트라루프 대신 트리루프를 포함하는 것을 제외하고는, 작제물 7의 구조는 작제물 6의 구조와 동일하다.
도 6c는 실시예 2에서 논의된 바와 같이 관심 유전자 서열을 표적으로 하는 예시적인 이중-가닥 핵산 억제제 분자 ("작제물 8")의 구조를 개략적으로 나타낸다. 작제물 8의 센스 가닥은 3개 염기 쌍의 줄기 듀플렉스를 포함하고, 여기서, 줄기 루프 구조의 줄기 부분에서 각각의 뉴클레오타이드는 BNA, 및 테트라루프이다.
도 6d는 실시예 2에서 논의된 바와 같이 관심 유전자 서열을 표적으로 하는 예시적인 이중-가닥 핵산 억제제 분자 ("작제물 9")의 구조를 개략적으로 나타낸다. 작제물 9의 센스 가닥은 3개 염기 쌍의 줄기 듀플렉스를 포함하고, 여기서, 줄기 루프 구조의 줄기 부분에서 각각의 뉴클레오타이드는 BNA, 및 테트라루프이다. 작제물 9가 테트라루프 대신 트리루프를 포함하는 것을 제외하고는, 작제물 9의 구조는 작제물 8의 구조와 동일하다.
도 6e는 실시예 2에서 논의된 바와 같이 관심 유전자 서열을 표적으로 하는 예시적인 이중-가닥 핵산 억제제 분자 ("작제물 10")의 구조를 개략적으로 나타낸다. 작제물 10의 센스 가닥은 2개 염기 쌍의 줄기 듀플렉스를 포함하고, 여기서, 줄기 루프 구조의 줄기 부분에서 각각의 뉴클레오타이드는 BNA, 및 테트라루프이다.
도 6f는 실시예 2에서 논의된 바와 같이 관심 유전자 서열을 표적으로 하는 예시적인 이중-가닥 핵산 억제제 분자 ("작제물 11")의 구조를 개략적으로 나타낸다. 작제물 11의 센스 가닥은 2개 염기 쌍의 줄기 듀플렉스를 포함하고, 여기서, 줄기 루프 구조의 줄기 부분에서 각각의 뉴클레오타이드는 BNA, 및 테트라루프이다. 작제물 11이 테트라루프 대신 트리루프를 포함하는 것을 제외하고는, 작제물 11의 구조는 작제물 10의 구조와 동일하다.
도 6g는 실시예 2에서 논의된 바와 같이 관심 유전자 서열을 표적으로 하는 예시적인 이중-가닥 핵산 억제제 분자 ("작제물 12")의 구조를 개략적으로 나타낸다. 작제물 12의 센스 가닥은 1개 염기 쌍의 줄기 듀플렉스를 포함하고, 여기서, 줄기 루프 구조의 줄기 부분에서 두 뉴클레오타이드는 BNA, 및 테트라루프이다.
도 6h는 실시예 2에서 논의된 바와 같이 관심 유전자 서열을 표적으로 하는 예시적인 이중-가닥 핵산 억제제 분자 ("작제물 13")의 구조를 개략적으로 나타낸다. 작제물 13의 센스 가닥은 1개 염기 쌍의 줄기 듀플렉스를 포함하고, 여기서, 줄기 루프 구조의 줄기 부분에서 두 뉴클레오타이드는 BNA, 및 트리루프이다. 작제물 13이 테트라루프 대신 트리루프를 포함하는 것을 제외하고는, 작제물 13의 구조는 작제물 12의 구조와 동일하다.
도 7은 실시예 2에 기재된 바와 같이 CD-1 마우스에 작제물 1 (도 2a 참조) 및 작제물 6 내지 13 (도 6a 내지 6h 참조)을 투여한지 4일 후 남아있는 표적 유전자 mRNA의 퍼센트를 나타낸다. 작제물 7, 9, 및 11에서 트리루프를 포함하는 것은 각각 테트라루프 작제물 1, 6, 8, 및 10과 비교하여 유전자 녹다운의 효능을 크게 감소시키지 않았으며 특정 경우에는 실제로 효능이 개선되었다. 줄기 듀플렉스에서 트리루프 및 단일 염기 쌍의 바이사이클릭 뉴클레오타이드를 포함하는 작제물 13은, 작제물 12와 달리, 줄기 듀플렉스에서 테트라루프 및 단일 염기 쌍의 바이사이클릭 뉴클레오타이드를 포함하는 표적 mRNA 발현을 감소시키지 않았으며 표적 mRNA 발현의 강력한 감소를 나타내었다.
도 8은 이중-가닥 핵산 억제제 분자를 제형화하는데 사용될 수 있는 지질 나노입자 (LNP)의 하나의 비제한적인 구현예를 나타낸다. LNP는 다음과 같은 코어 지질: DL-048 (양이온성 지질) 및 DSG-mPEG (페길화된 지질)를 포함하고, 다음과 같은 외피 지질: DL-103 (양이온성 지질), DSPC, 콜레스테롤, 및 DSPE-mPEG (페길화된 지질)를 포함한다.
정의
본 개시내용을 보다 쉽게 이해하기 위해, 특정 용어들이 먼저 아래에서 정의된다. 다음 용어들 및 기타 용어들에 대한 추가 정의는 명세서를 통해 명시될 수 있다. 아래에 명시된 용어의 정의가 참조로 포함된 출원 또는 특허의 정의와 일치하지 않는 경우, 이 출원에 명시된 정의를 사용하여 용어의 의미를 이해해야 한다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용된 바와 같이, 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 문맥상 명백하게 달리 지시하지 않는 한, 복수 언급을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "방법"에 대한 언급은 하나 이상의 방법, 및/또는 본원에 기재된 유형의 단계 및/또는 본 개시내용 등을 판독할 때 당업자에게 명백해질 것이다.
투여 : 본원에 사용된 바와 같이, 대상체에게 조성물을 "투여 (administering)"하는 것은 조성물을 대상체에게 제공하거나 적용하거나 접촉시키는 것을 의미한다. 투여는, 예를 들어, 국소, 경구, 피하, 근육내, 복강내, 정맥 내, 척수강내 및 피내를 포함한 임의의 다수의 경로에 의해 달성될 수 있다.
아실 : 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "아실"은 알킬카보닐, 사이클로알킬카보닐 및 아릴카보닐 모이어티를 지칭한다.
알콕시 : 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "알콕시"는 산소 원자를 통해 분자 모이어티에 부착된 알킬기를 지칭한다.
알케닐 : 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "알케닐"은 적어도 하나의 탄소-탄소 이중 결합을 갖고 약 2 내지 약 20개의 탄소 원자 범위를 갖는 직쇄 또는 분지 쇄 하이드로카빌기를 지칭한다. "치환된 알케닐"은 하나 이상의 치환기를 추가로 갖는 알케닐기를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이, "저급 알케닐"은 2 내지 약 6개의 탄소 원자를 갖는 알케닐 모이어티를 지칭한다.
알킬 : 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "알킬"은 1 내지 약 20개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 분지 쇄 하이드로카빌기를 지칭한다. 본원에 나타날 때마다, 수치 범위, 예컨대 "C 1 -C 6 알킬"은 용어 "알킬"이 또한 탄소 원자의 숫자 범위가 지정되지 않은 경우를 포함하더라도, 알킬기는 최대 6개의 탄소 원자를 포함하여 단지 1개의 탄소 원자, 2개의 탄소 원자, 3개의 탄소 원자 등을 포함할 수 있음을 의미한다. 예를 들어, 용어 "알킬"은 C1-C10 (예를 들어, C1-C6) 사이의 하위 범위를 지칭할 수 있다. "치환된 알킬"은 치환기를 갖는 알킬 모이어티를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이, "저급 알킬"은 1 내지 약 6개의 탄소 원자를 갖는 알킬 모이어티를 지칭한다.
알키닐 : 본원에 사용된 바와 같이, "알키닐"은 적어도 하나의 탄소-탄소 삼중 결합을 갖고 약 2 내지 약 20개의 탄소 원자 범위를 갖는 직쇄 또는 분지 쇄 하이드로카빌기를 지칭한다. "치환된 알키닐"은 하나 이상의 치환기를 추가로 갖는 알키닐기를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이, "저급 알키닐"은 약 2 내지 약 6개의 탄소 원자를 갖는 알키닐 모이어티를 지칭한단.
안티센스 가닥 : 이중-가닥 핵산 억제제 분자는 2개의 올리고뉴클레오타이드 가닥: 안티센스 가닥 및 센스 가닥을 포함한다. 안티센스 가닥 또는 이의 영역은 표적 핵산의 상응하는 영역에 부분적으로, 실질적으로 또는 완전히 상보적이다. 또한, 이중-가닥 핵산 억제제 분자의 안티센스 가닥 또는 이의 영역은 이중-가닥 핵산 억제제 분자의 센스 가닥 또는 이의 영역에 부분적으로, 실질적으로 또는 완전히 상보적이다. 특정 구현예에서, 안티센스 가닥은 또한 표적 핵산 서열에 비-상보적인 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 비-상보적인 뉴클레오타이드는 상보적 서열의 어느 한 측면에 있을 수 있거나, 상보적 서열의 양 측면에 존재할 수 있다. 안티센스 가닥 또는 이의 영역이 센스 가닥 또는 이의 영역에 부분적으로 또는 실질적으로 상보적인 특정 구현예에서, 비-상보적인 뉴클레오타이드는 하나 이상의 상보성 영역 (예를 들어, 하나 이상의 미스매치) 사이에 위치할 수 있다. 이중-가닥 핵산 억제제 분자의 안티센스 가닥은 가이드 가닥으로도 지칭된다.
대략적으로 : 본원에 사용된 바와 같이, 하나 이상의 관심 값에 적용되는 용어 "대략적으로" 또는 "약"은 명시된 참조 값과 유사한 값을 지칭한다. 특정 구현예에서, 용어 "대략적으로" 또는 "약"은 달리 언급되지 않거나 문맥상 명백하지 않는 한 (그러한 숫자가 가능한 값의 100%를 초과하는 경우 제외) 언급된 참조 값을 (초과 또는 미만의) 어느 한 방향으로 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 이하에 속하는 값의 범위를 지칭한다.
아릴 : 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "아릴"은 5 내지 최대 19개의 탄소 원자 범위를 갖는 방향족 모노사이클릭 또는 멀티사이클릭기를 지칭한다. "치환된 아릴"은 하나 이상의 치환기를 추가로 갖는 아릴기를 지칭한다.
바이사이클릭 뉴클레오타이드 : 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "바이사이클릭 뉴클레오타이드"는 바이사이클릭 당 모이어티를 포함하는 뉴클레오타이드를 지칭한다.
바이사이클릭 당 모이어티 : 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "바이사이클릭 당 모이어티"는 4 내지 7원 고리의 2개의 원자를 연결하여 제2 고리를 형성하는 브릿지를 포함하여 바이사이클릭 구조를 형성하는 4 내지 7원 고리 원 고리 (푸라노실을 포함하지만 이에 제한되지 않음)를 포함하는 변형된 당 모이어티를 지칭한다. 전형적으로, 4 내지 7원 고리는 당이다. 일부 구현예에서, 4 내지 7원 고리는 푸라노실이다. 특정 구현예에서, 브릿지는 푸라노실의 2'-탄소와 4'-탄소를 연결한다.
상보적 : 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "상보적"은 2개 뉴클레오타이드가 서로 염기 쌍을 형성하도록 허용하는 2개 뉴클레오타이드 (예를 들어, 2개의 반대 핵산 또는 단일 핵산 가닥의 반대 영역) 간의 구조적 관계를 지칭한다. 예를 들어, 반대 핵산의 피리미딘 뉴클레오타이드에 상보적인 하나의 핵산의 퓨린 뉴클레오타이드는 서로 수소 결합을 형성함으로써 함께 염기 쌍을 형성할 수 있다. 일부 구현예에서, 상보적 뉴클레오타이드는 왓슨-크릭 (Watson-Crick) 방식으로 또는 안정한 듀플렉스의 형성을 허용하는 임의의 다른 방식으로 염기쌍을 형성할 수 있다. " 완전히 상보적 " 또는 100% 상보적은 제1 올리고뉴클레오타이드 가닥 또는 제1 올리고뉴클레오타이드 가닥의 세그먼트의 각각의 뉴클레오타이드 단량체가 제2 올리고뉴클레오타이드 가닥 또는 제2 올리고뉴클레오타이드 가닥의 세그먼트의 각각의 뉴클레오타이드 단량체와 염기 쌍을 형성할 수 있는 상황을 지칭한다. 100% 미만의 상보성은 2개의 올리고뉴클레오타이드 가닥 (또는 2개의 올리고뉴클레오타이드 가닥의 2개의 세그먼트)의 뉴클레오타이드 단량체가 전부는 아니지만 일부가 서로 염기 쌍을 형성할 수 있는 상황을 지칭한다. " 실질적인 상보적 "은 서로에 대해 90% 이상의 상보성을 나타내는 2개의 올리고뉴클레오타이드 가닥 (또는 2개의 올리고뉴클레오타이드 가닥의 세그먼트)을 지칭한다. " 충분히 상보적 "은 표적 mRNA에 의해 암호화되는 단백질의 양이 감소되도록 표적 mRNA와 핵산 억제제 분자 사이의 상보성을 지칭한다.
상보적 가닥 : 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "상보적 가닥"은 다른 가닥에 부분적으로, 실질적으로 또는 완전히 상보적인 이중-가닥 핵산 억제제 분자의 가닥을 지칭한다.
사이클로알킬 : 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "사이클로알킬"은 3 내지 12개의 탄소, 예를 들어, 3 내지 8개의 탄소 및, 예를 들어, 3 내지 6개의 탄소를 포함하는 사이클릭 (즉, 고리-함유) 탄화수소기를 지칭한다. " 치환된 사이클로알킬 "은 하나 이상의 치환기를 추가로 갖는 사이클로알킬기를 지칭한다.
데옥시리보푸라노실 : 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "데옥시리보푸라노실"은 자연 발생 DNA에서 발견되고 아래에 예시된 바와 같이 2'-탄소에서 수소기를 갖는 푸라노실을 지칭한다:
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데옥시리보뉴클레오타이드 : 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "데옥시리보뉴클레오타이드"는 당 모이어티의 2'-위치에서 수소기를 갖는 천연 뉴클레오타이드 (본원에 정의된 바와 같음) 또는 변형된 뉴클레오타이드 (본원에 정의된 바와 같음)를 지칭한다.
dsRNAi 억제제 분자 : 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "dsRNAi 억제제 분자"는 센스 가닥 (패신저) 및 안티센스 가닥 (가이드)을 갖는 이중-가닥 핵산 억제제 분자를 지칭하며, 여기서, 안티센스 가닥 또는 안티센스 가닥의 일부는 표적 mRNA의 절단에서 Argonaute 2 (Ago2) 엔도뉴클레아제에 의해 사용된다.
듀플렉스 : 본원에 사용된 바와 같이, 핵산 (예를 들어, 올리고뉴클레오타이드)과 관련하여 용어 "듀플렉스"는 뉴클레오타이드의 2개의 역평행 서열의 상보적 염기 쌍을 통해 형성된 구조를 지칭한다.
부형제 : 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "부형제"는, 예를 들어, 원하는 일관성 또는 안정화 효과를 제공하거나 이에 기여하기 위해 조성물에 포함될 수 있는 비-치료제를 지칭한다.
푸라노실 : 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "푸라노실"은 4개의 탄소 원자 및 1개의 산소 원자를 갖는 5원 고리를 포함하는 구조를 지칭한다.
할로 : 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "할로" 및 "할로겐"은 상호 교환 가능하고, 불소, 염소, 브롬 및 요오드로부터 선택된 원자를 지칭한다.
헤테로사이클 : 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "헤테로사이클" 또는 "헤테로사이클릭"은 고리 구조의 일부로서 하나 이상의 헤테로 원자 (예를 들어, N, O, S, 등)를 포함하고 3 내지 최대 14개의 탄소 원자 범위를 갖는 비-방향족 사이클릭기를 지칭한다. " 치환된 헤테로사이클릭 " 또는 " 치환된 헤테로사이클 "은 하나 이상의 치환기를 추가로 갖는 헤테로사이클릭기를 지칭한다.
뉴클레오타이드 간 연결기 : 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "뉴클레오타이드간 연결기" 또는 "뉴클레오타이드간 연결"은 2개 뉴클레오사이드 모이어티를 공유적으로 연결할 수 있는 화학기를 지칭한다. 전형적으로, 화학기는 포스포 또는 포스파이트기를 포함하는 인-함유 연결기이다. 포스포 연결기는 포스포디에스테르 연결, 포스포로디티오에이트 연결, 포스포로티오에이트 연결, 포스포트리에스테르 연결, 티오노알킬포스포네이트 연결, 티온알킬포스포트리에스테르 연결, 포스포르아미다이트 연결, 포스포네이트 연결 및/또는 보라노포스페이트 연결을 포함하는 것을 의미한다. 많은 인-함유 연결은, 예를 들어, 미국 특허 번호 제3,687,808호; 제4,469,863호; 제4,476,301호; 제5,023,243호; 5,177,196호; 제5,188,897호; 제5,264,423호; 제5,276,019호; 제5,278,302호; 제5,286,717호; 제5,321,131호; 제5,399,676호; 제5,405,939호; 제5,453,496호; 제5,455,233호; 제5,466,677호; 제5,476,925호; 제5,519,126호; 제5,536,821호; 제5,541,306호; 제5,550,111호; 제5,563,253호; 제5,571,799호; 제5,587,361호; 제5,194,599호; 제5,565,555호; 제5,527,899호; 제5,721,218호; 제5,672,697호 및 제5,625,050호에 개시된 바와 같이 당업계에 잘 알려져 있다. 다른 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드는 인 원자를 포함하지 않는 하나 이상의 뉴클레오타이드간 연결기, 예컨대 실록산 골격; 설파이드, 설폭사이드 및 설폰 골격; 포름아세틸 및 티오포름아세틸 골격; 메틸렌 포름아세틸 및 티오포름아세틸 골격; 리보아세틸 골격; 알켄 함유 골격; 설파메이트 골격; 메틸렌이미노 및 메틸렌하이드라지노 골격; 설포네이트 및 설폰아미드 골격; 및 아미드 골격을 갖는 것들을 포함하지만 이에 제한되지 않는 단쇄 알킬 또는 사이클로알킬 뉴클레오타이드간 연결, 혼합된 헤테로 원자 및 알킬 또는 사이클로알킬 뉴클레오타이드간 연결, 또는 하나 이상의 단쇄 헤테로 원자 또는 헤테로사이클릭 뉴클레오타이드간 연결을 포함한다. 비-인 함유 연결은, 예를 들어, 미국 특허 번호 제5,034,506호; 제5,166,315호; 제5,185,444호; 제5,214,134호; 제5,216,141호; 제5,235,033호; 제5,264,562호; 제5,264,564호; 제5,405,938호; 제5,434,257호; 제5,466,677호; 제5,470,967호; 제5,489,677호; 제5,541,307호; 제5,561,225호; 제5,596,086호; 제5,602,240호; 제5,610,289호; 제5,602,240호; 제5,608,046호; 제5,610,289호; 제5,618,704호; 제5,623,070호; 제5,663,312호; 제5,633,360호; 제5,677,437호; 제5,792,608호; 제5,646,269호 및 제5,677,439호에 개시된 바와 같이 당업계에 잘 알려져 있다.
루프 : 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "루프"는 핵산의 단일 가닥에 의해 형성된 구조를 지칭하고, 여기서, 특정 단일 가닥 뉴클레오타이드 영역 측면에 있는 상보적 영역은 상보적 영역 사이의 단일 가닥 뉴클레오타이드 영역이 듀플렉스 형성 또는 왓슨-크릭 염기 쌍 형성으로부터 제외되는 방식으로 혼성화된다. 루프는 임의의 길이의 단일 가닥 뉴클레오타이드 영역이다. 루프의 예는 헤어핀, 테트라루프, 및 트리루프로서 그러한 구조에 존재하는 쌍을 형성하지 않은 뉴클레오타이드를 포함한다.
용융 온도 : 본원에 사용된 바와 같이, "용융 온도" 또는 "Tm"은 듀플렉스 핵산의 2개의 가닥이 분리되는 온도를 의미한다. Tm은 종종 두 가닥의 상보적 핵산 또는 이의 일부의 듀플렉스 안정성 또는 결합 친화성의 척도로서 사용된다. Tm은 UV 스펙트럼을 사용하여 하이브리드화의 형성 및 분해 (용융)를 결정함으로써 측정될 수 있다. 혼성화 동안에 발생하는 기본 적층은 UV 흡수의 감소 (흡광감소 (hypochromicity))를 동반한다. 결과적으로, UV 흡수의 감소는 더 높은 Tm을 나타낸다.
변형된 핵염기 : 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "변형된 핵염기"는 천연 핵염기 또는 범용 핵염기가 아닌 임의의 핵염기를 지칭한다. 적합한 변형된 핵염기는 디아미노퓨린 및 이의 유도체, 알킬화 퓨린 또는 피리미딘, 아실화 퓨린 또는 피리미딘 티올화 퓨린 또는 피리미딘 등을 포함한다. 다른 적합한 변형된 핵염기는 퓨린 및 피리미딘의 유사체를 포함한다. 적합한 유사체는 1-메틸아데닌, 2-메틸아데닌, N6-메틸아데닌, N6-이소펜틸아데닌, 2-메틸티오-N6-이소펜틸아데닌, N,N-디메틸아데닌, 8-브로모아데닌, 2-티오시토신, 3-메틸시토신, 5-메틸시토신, 5-에틸시토신, 4-아세틸시토신, 1-메틸구아닌, 2-메틸구아닌, 7-메틸구아닌, 2,2-디메틸구아닌, 8-브로모구아닌, 8-클로로구아닌, 8-아미노구아닌, 8-메틸구아닌, 8-티오구아닌, 5-플루오로우라실, 5-브로모우라실, 5-클로로우라실, 5-요오도우라실, 5-에틸우라실, 5-프로필우라실, 5-메톡시우라실, 5-하이드록시메틸우라실, 5-(카복시하이드록시메틸)우라실, 5-(메틸아미노메틸)우라실, 5-(카복시메틸아미노메틸)-우라실, 2-티오우라실, 5-메틸-2-티오우라실, 5-(2-브로모비닐)우라실, 우라실-5-옥시아세트산, 우라실-5-옥시아세트산 메틸 에스테르, 슈도우라실, 1-메틸슈도우라실, 큐오신, 하이포크산틴, 크산틴, 2-아미노퓨린, 6-하이드록시아미노퓨린, 니트로피롤릴, 니트로인돌릴 및 디플루오로톨릴, 6-티오퓨린 및 2,6-디아미노퓨린 니트로피롤릴, 니트로인돌릴 및 디플루오로톨릴을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 전형적으로, 핵염기는 질소성 염기를 포함한다. 특정 구현예에서, 핵염기는 질소 원자를 포함하지 않는다. 예를 들어, 미국 공개 특허 출원 번호 제20080274462호를 참조한다.
변형된 뉴클레오사이드 : 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "변형된 뉴클레오사이드"는 포스페이트기 또는 변형된 포스페이트기 (본원에 정의된 바와 같음)에 연결되지 않고 하나 이상의 변형된 핵염기 (본원에 정의된 바와 같음), 범용 핵염기 (본원에 정의된 바와 같음) 또는 변형된 당 모이어티 (본원에 정의된 바와 같음)를 포함하는 당 (예를 들어, 데옥시리보스 또는 리보스 또는 이의 유사체)과의 N-글리코시드 연결에서 헤테로사이클릭 질소성 염기를 지칭한다. 변형된 또는 범용 핵염기 (본원에서 염기 유사체로도 지칭됨)는 일반적으로 뉴클레오사이드 당 모이어티의 1'-위치에 위치하고, 1'-위치에서 아데닌, 구아닌, 시토신, 티민 및 우라실 이외의 핵염기를 지칭한다. 특정 구현예에서, 변형된 또는 범용 핵염기는 질소성 염기이다. 특정 구현예에서, 변형된 핵염기는 질소 원자를 포함하지 않는다. 예를 들어, 미국 공개 특허 출원 번호 제20080274462호를 참조한다. 특정 구현예에서, 변형된 뉴클레오타이드는 핵염기 (무염기 (abasic))를 포함하지 않는다. 본원 개시내용의 맥락에서 적합한 변형된 또는 범용 핵염기 또는 변형된 당이 본원에 기재되어 있다.
변형된 뉴클레오타이드 : 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "변형된 뉴클레오타이드"는 포스페이트기 또는 변형된 포스페이트기 (본원에 정의된 바와 같음)에 연결되고 하나 이상의 변형된 핵염기 (본원에 정의된 바와 같음), 범용 핵염기 (본원에 정의된 바와 같음) 또는 변형된 당 모이어티 (본원에 정의된 바와 같음)를 포함하는 당 (예를 들어, 리보스 또는 데옥시리보스 또는 이의 유사체)과의 N-글리코시드 연결에서 헤테로사이클릭 질소성 염기를 지칭한다. 변형된 또는 범용 핵염기 (본원에서 염기 유사체로도 지칭됨)는 일반적으로 뉴클레오사이드 당 모이어티의 1'-위치에 위치하고, 1'-위치에서 아데닌, 구아닌, 시토신, 티민 및 우라실 이외의 핵염기를 지칭한다. 특정 구현예에서, 변형된 또는 범용 핵염기는 질소성 염기이다. 특정 구현예에서, 변형된 핵염기는 질소 원자를 포함하지 않는다. 예를 들어, 미국 공개 특허 출원 번호 제20080274462호를 참조한다. 특정 구현예에서, 변형된 뉴클레오타이드는 핵염기 (무염기)를 포함하지 않는다. 본원 개시내용의 맥락에서 적합한 변형된 또는 범용 핵염기 또는 변형된 당 모이어티 또는 변형된 포스페이트기가 본원에 기재되어 있다.
변형된 포스페이트기 : 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "변형된 포스페이트기"는 천연 뉴클레오타이드에서 발생하지 않는 포스페이트기의 변형을 지칭하고, 인 원자를 포함하는 포스페이트 모방체 및 포스페이트를 포함하지 않는 음이온성 포스페이트 모방체 (예를 들어, 아세테이트)를 포함한, 본원에 기재된 바와 같은 비-자연 발생 포스페이트 모방체를 포함한다. 변형된 포스페이트기는 또한, 예를 들어, 포스포로티오에이트를 포함한 인-함유 뉴클레오타이드간 연결기 및 본원에 기재된 바와 같은 비-인 함유 연결기를 둘 다 포함하는 비-자연 발생 뉴클레오타이드간 연결기를 포함한다.
변형된 당 모이어티 : 본원에 사용된 바와 같이, "변형된 당 모이어티"는 치환된 당 모이어티 (본원에 정의된 바와 같음) 또는 당 유사체 (본원에 정의된 바와 같음)를 지칭한다.
천연 핵염기 : 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "천연 핵염기"는 RNA 및 DNA의 5개의 1차 자연 발생 헤테로사이클릭 핵염기, 즉 퓨린 염기를 지칭한다: 아데닌 (A) 및 구아닌 (G), 및 피리미딘 염기: 티민 (T), 시토신 (C), 및 우라실 (U).
천연 뉴클레오사이드 : 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "천연 뉴클레오사이드"는 포스페이트기에 연결되지 않은 천연 당 모이어티 (본원에 정의된 바와 같음)와 N-글리코시드 연결에서 천연 핵염기 (본원에 정의된 바와 같음)를 지칭한다.
천연 뉴클레오타이드 : 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "천연 뉴클레오타이드"는 포스페이트 그룹에 연결된 천연 당 모이어티 (본원에 정의된 바와 같음)와 N-글리코시드 연결에서 천연 핵염기 (본원에 정의된 바와 같음)를 지칭한다.
천연 당 모이어티 : 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "천연 당 모이어티"는 리보푸라노실 (본원에 정의된 바와 같음) 또는 데옥시리보푸라노실 (본원에 정의된 바와 같음)을 지칭한다.
핵산 억제제 분자 : 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "핵산 억제제 분자"는 표적 유전자의 발현을 감소 또는 제거하는 올리고뉴클레오타이드 분자를 지칭하고, 여기서, 올리고뉴클레오타이드 분자는 표적 유전자 mRNA의 서열을 특이적으로 표적화하는 영역을 포함한다. 전형적으로, 핵산 억제제 분자의 표적화 영역은 핵산 억제제 분자의 효과를 특정 표적 유전자로 유도하기 위해 표적 유전자 mRNA 상의 서열에 충분히 상보적인 서열을 포함한다. 핵산 억제제 분자는 리보뉴클레오타이드, 데옥시리보뉴클레오타이드, 및/또는 변형된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
핵염기 : 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "핵염기"는 천연 핵염기 (본원에 정의된 바와 같음), 변형된 핵염기 (본원에 정의된 바와 같음), 또는 범용 핵염기 (본원에 정의된 바와 같음)를 지칭한다.
뉴클레오사이드 : 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "뉴클레오사이드"는 천연 뉴클레오사이드 (본원에 정의된 바와 같음) 또는 변형된 뉴클레오사이드 (본원에 정의된 바와 같음)를 지칭한다.
뉴클레오타이드: 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "뉴클레오타이드"는 천연 뉴클레오타이드 (본원에 정의된 바와 같음) 또는 변형된 뉴클레오타이드 (본원에 정의된 바와 같음)를 지칭한다.
오버행 : 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "오버행"은 이중-가닥 핵산 억제제 분자의 어느 한 가닥의 어느 한 말단에서 말단 비-염기 쌍 형성 뉴클레오타이드(들)를 지칭한다. 특정 구현예에서, 오버행은 제1 가닥 또는 영역이 듀플렉스를 형성하는 상보적 가닥의 말단을 넘어 연장되는 하나의 가닥 또는 영역으로부터 발생된다. 2개의 올리고뉴클레오타이드 영역 중 하나 또는 둘 다는 염기 쌍의 수소 결합을 통해 듀플렉스를 형성할 수 있고, 2개의 폴리뉴클레오타이드 또는 영역에 의해 공유되는 상보성의 3'- 및/또는 5'-말단을 넘어 연장되는 5'- 및/또는 3'-말단을 가질 수 있다. 듀플렉스의 3'- 및/또는 5'-말단을 넘어 연장되는 단일-가닥 영역은 오버행으로 지칭된다.
약제학적 조성물 : 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "약제학적 조성물"은 약리학적 유효량의 이중-가닥 핵산 억제제 분자 및 약제학적으로 허용되는 부형제 (본원에 정의된 바와 같음)를 포함한다.
약제학적으로 허용되는 부형제 : 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "약제학적으로 허용되는 부형제"는 부형제가 합리적인 이익/위험 비율에 상응하는 과도한 부작용 (예컨대 독성, 자극 및 알레르기 반응) 없이 인간 및/또는 동물과 함께 사용하기에 적합한 것을 의미한다.
포스페이트 모방체 : 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "포스페이트 모방체"는 포스페이트기의 정전기적 및 입체적 성질을 모방하는 올리고뉴클레오타이드의 5'-말단 (terminal end)에 있는 화학적 모이어티를 지칭한다. 올리고뉴클레오타이드의 5'-말단 (end)에 부착될 수 있는 많은 포스페이트 모방체가 개발되었다 (예를 들어, 미국 특허 번호 제8,927,513호; Prakash 등 Nucleic Acids Res., 2015,43 (6): 2993-3011 참조). 전형적으로, 이러한 5'-포스페이트 모방체는 포스파타제-내성 연결을 포함한다. 적합한 포스페이트 모방체는 그 전문이 본원에 참조로 포함된 국제 공개 번호 제WO 2018/045317호에 기재된 바와 같이, 5'-포스포네이트, 예컨대 5'-메틸렌포스포네이트 (5'-MP) 및 5'-(E)-비닐포스포네이트 (5'-VP) 및 올리고뉴클레오타이드의 5'-말단 뉴클레오타이드의 당 모이어티 (예를 들어, 리보스 또는 데옥시리보스 또는 이의 유사체)의 4'-탄소에 결합된 4'-포스페이트 유사체, 예컨대 4'-옥시메틸포스포네이트, 4'-티오메틸포스포네이트, 또는 4'-아미노메틸포스포네이트를 포함한다. 특정 구현예에서, 4'-옥시메틸포스포네이트는 화학식 -O-CH2-PO(OH)2 또는 -O-CH2-PO(OR)2로 표시되며, 여기서 R은 H, CH3, 알킬기 또는 보호기로부터 독립적으로 선택된다. 특정 구현예에서, 알킬기는 CH2CH3이다. 보다 전형적으로, R은 H, CH3, 또는 CH2CH3으로부터 독립적으로 선택된다. 올리고뉴클레오타이드의 5'-말단에 대해 다른 변형이 개발되었다 (예를 들어, 제WO 2011/133871호 참조).
보호기 : 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "보호기"는 원하는 반응의 특정 조건하에 작용기를 가역적으로 비반응성으로 만드는 기로서 통상적인 화학적 의미로 사용된다. 원하는 반응 후에, 보호기를 제거하여 보호된 작용기를 탈보호할 수 있다. 모든 보호기는 합성되는 분자의 상당 부분을 분해하지 않는 조건하에 제거할 수 있어야 한다.
감소하다 : 본원에 사용된 용어 "감소하다("reduces" 또는 "reduces")는 당업계에서 일반적으로 허용되는 의미를 지칭한다. 핵산 억제제 분자와 관련하여, 상기 용어는 일반적으로 유전자 발현, 하나 이상의 단백질 또는 단백질 서브유닛을 암호화하는 RNA 분자 또는 동등한 RNA 분자의 수준, 또는 핵산 억제제 분자의 부재하에 관찰되는 것보다 낮은 하나 이상의 단백질 또는 단백질 서브유닛의 활성 감소를 지칭한다.
리보푸라노실 : 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "리보푸라노실"은 자연 발생 RNA에서 발견되고 아래 예시된 바와 같이 2'-탄소에서 하이드록실기를 갖는 푸라노실을 지칭한다:
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리보뉴클레오타이드 : 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "리보뉴클레오타이드"는 당 모이어티의 2'-위치에 하이드록실기를 갖는 천연 뉴클레오타이드 (본원에 정의된 바와 같음) 또는 변형된 뉴클레오타이드 (본원에 정의된 바와 같음)를 지칭한다.
센스 가닥 : 이중-가닥 핵산 억제제 분자는 2개의 올리고뉴클레오타이드 가닥: 안티센스 가닥 및 센스 가닥을 포함한다. 센스 가닥 또는 이의 영역은 이중-가닥 핵산 억제제 분자의 안티센스 가닥 또는 이의 영역에 부분적으로, 실질적으로 또는 완전히 상보적이다. 특정 구현예에서, 센스 가닥은 안티센스 가닥에 비-상보적인 뉴클레오타이드를 포함할 수도 있다. 비-상보적인 뉴클레오타이드는 상보적 서열의 어느 한 측면에 있을 수 있거나, 상보적 서열의 양 측면에 존재할 수 있다. 센스 가닥 또는 이의 영역이 안티센스 가닥 또는 이의 영역에 부분적으로 또는 실질적으로 상보적인 특정 구현예에서, 비-상보적인 뉴클레오타이드는 하나 이상의 상보성 영역 (예를 들어, 하나 이상의 미스매치) 사이에 위치할 수 있다. 센스 가닥은 또한 패신저 가닥으로도 불린다.
대상체 : 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "대상체"는 마우스, 토끼 및 인간을 포함한 임의의 포유류를 의미한다. 일 구현예에서, 대상체는 인간이다. 용어 "개체" 또는 "환자"는 "대상체"와 상호 교환 가능하도록 의도된다.
치환기 또는 치환된 : 본원에 사용된 용어 "치환기" 또는 "치환된"은 주어진 구조에서 수소 라디칼을 치환기의 라디칼로 대체하는 것을 지칭한다. 임의의 주어진 구조에서 하나 초과의 위치가 하나 초과의 치환기로 치환될 수 있는 경우, 치환기는 달리 지시되지 않는 한 모든 위치에서 동일하거나 상이할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "치환된"은 유기 화합물과 양립할 수 있는 모든 허용 가능한 치환기를 포함하는 것으로 고려된다. 허용 가능한 치환기는 유기 화합물의 비환식 및 사이클릭, 분지형 및 비분지형, 카보사이클릭 및 헤테로사이클릭, 방향족 및 비방향족 치환기를 포함한다. 이 개시내용은 유기 화합물의 허용 가능한 치환기에 의해 임의의 방식으로 제한되도록 의도되지 않는다.
치환된 당 모이어티 : 본원에 사용된 바와 같이, "치환된 당 모이어티"는 하나 이상의 변형을 포함하는 푸라노실을 포함한다. 전형적으로, 변형은 당의 2'-, 3'-, 4'- 또는 5'-탄소 위치에서 발생한다. 특정 구현예에서, 치환된 당 모이어티는 푸라노실의 2'-탄소를 4-탄소와 연결하는 브릿지를 포함하는 바이사이클릭 당 모이어티이다.
당 유사체 : 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "당 유사체"는 푸라노실을 포함하지 않고 생성된 뉴클레오타이드가 (1) 올리고뉴클레오타이드로 혼입되고 (2) 상보적 뉴클레오타이드에 혼성화될 수 있도록 뉴클레오타이드의 자연 발생 당 모이어티를 대체할 수 있는 구조를 지칭한다. 그러한 구조는 전형적으로 상이한 수의 원자를 포함하는 고리 (예를 들어, 4, 6, 또는 7원 고리)와 같은 푸라노실에 대한 비교적 단순한 변화; 푸라노실의 산소를 비-산소 원자 (예를 들어, 탄소, 황, 또는 질소)로 대체; 또는 원자 수의 변화와 산소의 대체 둘 다를 포함한다. 그러한 구조는 또한 치환된 당 모이어티에 대해 설명된 것들과 상응하는 치환기를 포함할 수 있다. 당 유사체는 또한 더 복잡한 당 대체물 (예를 들어, 펩티드 핵산의 비-고리 시스템)을 포함한다. 당 유사체는 모르폴리노, 사이클로헥세닐 및 사이클로헥시톨을 제한 없이 포함한다.
당 모이어티 : 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "당 모이어티"는 천연 당 모이어티 또는 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오사이드의 변형된 당 모이어티를 지칭한다.
표적 부위 : 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "표적 부위", "표적 서열", "표적 핵산", "표적 영역", "표적 유전자"는 상호 교환적으로 사용되고, 예를 들어, 그 표적 서열에 부분적으로, 실질적으로 또는 완벽하게 또는 충분히 상보적인 이의 가이드/안티센스 영역 내에 서열을 포함하는 RNAi 억제제 분자에 의해 매개되는 절단을 위해 "표적화"되는 RNA 또는 DNA 서열을 지칭한다.
테트라루프 : 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "테트라루프"는 인접한 왓슨-크릭 혼성화된 뉴클레오타이드의 안정성에 기여하는 안정한 2차 구조를 형성하는 루프 (단일 가닥 영역)를 지칭한다. 이론에 제한되지 않고, 테트라루프는 적층 상호작용에 의해 인접한 왓슨-크릭 염기 쌍을 안정화시킬 수 있다. 또한, 테트라루프에서 뉴클레오타이드 간의 상호작용은 비-왓슨-크릭 염기 쌍 형성, 적층 상호작용, 수소 결합, 및 접촉 상호작용을 포함하지만 이에 제한되지 않는다 (Cheong 등, Nature 1990; 346(6285):680-2; Heus 및 Pardi, Science 1991; 253(5016):191-4). 테트라루프는 랜덤 염기로 이루어진 단순 모델 루프 서열로부터 예상보다 높은 인접 듀플렉스의 용융 온도 (Tm)에서의 증가를 부여한다. 예를 들어, 테트라루프는 10 mM NaHPO4에서 적어도 50℃, 적어도 55℃, 적어도 56℃, 적어도 58℃, 적어도 60℃, 적어도 65℃ 또는 적어도 75℃의 용융 온도를 적어도 2개 염기 쌍의 길이의 듀플렉스를 포함하는 헤어핀에 부여할 수 있다. 테트라루프는 리보뉴클레오타이드, 데옥시리보뉴클레오타이드, 변형된 뉴클레오타이드, 및 이들의 조합을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 테트라루프 4개 뉴클레오타이드로 이루어진다. 특정 구현예에서, 테트라루프는 5개 뉴클레오타이드로 이루어진다.
RNA 테트라루프의 예는 테트라루프의 UNCG 패밀리 (예를 들어, UUCG), 테트라루프의 GNRA 패밀리 (예를 들어, GAAA), 및 CUUG 테트라루프를 포함한 테트라루프의 CUYG 패밀리를 포함한다 (Woese 등, PNAS, 1990, 87(21):8467-71; Antao 등, Nucleic Acids Res., 1991, 19(21):5901-5). RNA 테트라루프의 다른 예는 GANC, A/UGNN, 및 UUUM 테트라루프 패밀리 (Thapar 등, WILEY INTERDISCIP. REV RNA, 2014, 5(1):1-28) 및 GGUG, RNYA, 및 AGNN 테트라루프 패밀리 (Bottaro 등, BIOPHYS J., 2017, 113:257-67)를 포함한다. DNA 테트라루프의 예는 테트라루프의 d(GNNA) 패밀리 (예를 들어, d(GTTA)), 테트라루프의 d(GNRA) 패밀리, 테트라루프의 d(GNAB) 패밀리, 테트라루프의 d(CNNG) 패밀리, 및 테트라루프의 d(TNCG) 패밀리 (예를 들어, d(TTCG))를 포함한다 (Nakano 등 Biochemistry, 2002, 41(48):14281-14292. Shinji 등, Nippon Kagakkai Koen Yokoshu, 2000, 78(2):731).
T m -증가 뉴클레오타이드 : 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "Tm-증가 뉴클레오타이드"는 Tm-증가 뉴클레오타이드가 없는 올리고뉴클레오타이드 듀플렉스에 비해 올리고뉴클레오타이드 듀플렉스의 용융 온도 (Tm)를 증가시키는 뉴클레오타이드를 지칭한다. Tm-증가 뉴클레오타이드는 바이사이클릭 뉴클레오타이드, 트리사이클릭 뉴클레오타이드, G-클램프 및 이의 유사체, 및 헥시톨 뉴클레오타이드를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 변형된 당 모이어티 또는 변형된 핵염기를 갖는 특정 변형된 뉴클레오타이드는 또한 올리고뉴클레오타이드 듀플렉스의 Tm을 증가시키기 위해 사용될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "Tm-증가 뉴클레오타이드"는 특히 2'-OMe 또는 2'-F를 갖는 당 모이어티의 2'-위치에서 변형된 뉴클레오타이드를 제외한다.
치료학적 유효량 : 본원에 사용된 바와 같이, "치료학적 유효량" 또는 "약리학적 유효량"은 의도된 약리학적, 치료적 또는 예방적 결과를 생성하는 데 효과적인 이중-가닥 핵산 억제제 분자의 양을 지칭한다.
트리루프 : 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "트리루프"는 인접한 왓슨-크릭 혼성화된 뉴클레오타이드의 안정성에 기여하고 3개 뉴클레오타이드로 이루어진 안정한 2차 구조를 형성하는 루프 (단일 가닥 영역)를 지칭한다. 이론에 제한되지 않고, 트리루프는 트리루프 내에 뉴클레오타이드의 비-왓슨-크릭 염기 쌍 형성 및 염기-적층 상호작용에 의해 안정화될 수 있다 (Yoshizawa 등, Biochemistry 1997; 36, 4761-4767). 트리루프는 또한 랜덤 염기로 이루어진 간단한 모델 루프 서열로부터 예상했던 것보다 더 높은 인접한 듀플렉스의 용융 온도 (Tm)의 증가를 부여할 수 있다. 트리루프는 리보뉴클레오타이드, 데옥시리보뉴클레오타이드, 변형된 뉴클레오타이드, 및 이들의 조합을 포함할 수 있다. 트리루프의 예는 트리루프의 GNA 패밀리 (예를 들어, GAA, GTA, GCA, 및 GGA)를 포함한다 (Yoshizawa 1997). 특정 구현예에서, 트리루프는 GAA의 뉴클레오타이드 서열을 갖는다.
범용 핵염기 : 본원에 사용된 바와 같이, "범용 핵염기"는 전형적으로 자연 발생 핵산에서 발견되는 염기 중 하나 초과와 쌍을 형성할 수 있고 따라서 듀플렉스에서 그러한 자연 발생 염기를 대체할 수 있는 염기를 지칭한다. 염기는 각각의 자연 발생 염기와 쌍을 형성할 필요가 없다. 예를 들어, 특정 염기는 퓨린과 단독으로 또는 선택적으로, 또는 피리미딘과 단독으로 또는 선택적으로 쌍을 형성한다. 범용 핵염기는 왁슨-크릭 또는 비-왓슨-크릭 상호작용 (예를 들어, Hoogsteen 상호작용)을 통해 수소 결합을 형성하여 염기 쌍을 형성할 수 있다. 대표적인 범용 핵염기는 이노신 및 이의 유도체를 포함한다.
상세한 설명
본 출원은 줄기 루프 구조를 가진 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 갖는 이중-가닥 핵산 억제제 분자를 제공하고, 여기서, 줄기 루프 구조의 루프 부분은 트리루프이다. 이중-가닥 핵산 억제제 분자는 센스 가닥 (S)의 제1 영역 (R1)과 안티센스 가닥 (AS) 사이의 제1 듀플렉스 (D1)와, 센스 가닥의 제2 영역 (R2)의 제1 서브영역 (S1)과 제2 서브영역 (S2) 사이의 제2 듀플렉스 (D2)를 포함하고, 여기서, S1 및 S2는 트리루프 (triL)에 의해 연결된다. 도 1a 내지 도 1d를 참조한다. 추가로, 줄기 루프 구조의 줄기 부분은, 특정 구현예에서, 적어도 하나의 Tm-증가 뉴클레오타이드, 예컨대 4 내지 12개의 Tm-증가 뉴클레오타이드, 예를 들어, 2 내지 6개의 Tm-증가 뉴클레오타이드 염기 쌍을 포함할 수 있다. 줄기 루프 구조는 센스 가닥의 5'- 또는 3'-말단에 위치할 수 있다. 본원에 개시된 바와 같이, 트리루프를 함유하는 이중-가닥 핵산 억제제 분자는 표적 유전자 발현을 감소시키는데 활성이다. 또한, 특정 구현예에서, 트리루프-함유 이중-가닥 핵산 억제제 분자는 이들의 테트라루프-함유 대응물에 비해 표적 유전자 발현의 효능을 증가시킬 수 있다.
또한, 질환을 치료하기 위한 방법 및 조성물을 포함하여 시험관내 또는 생체내 표적 유전자의 수준 또는 발현을 감소시키기 위해 본원에 개시된 트리루프 함유 이중-가닥 핵산 억제제 분자 및 이를 포함하는 조성물을 사용하는 방법이 제공된다.
트리루프를 함유하는 핵산 억제제 분자
본 출원은 줄기 루프 구조를 가진 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 갖는 이중-가닥 핵산 억제제 분자를 제공하고, 여기서, 줄기 루프 구조의 루프 부분은 트리루프이고, 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 각각 5'- 및 3'-말단을 갖고 따라서 연속 올리고뉴클레오타이드를 형성하지 않는 별도의 가닥이다. 전형적인 줄기/루프-함유 이중-가닥 핵산 억제제 분자는 도 1에 나타내는데, 도 1a에는 센스 가닥 ("S") 및 안티센스 가닥 ("AS")이 강조되어 있다.
센스 가닥은 도 1b 및 1c에 나타낸 바와 같이, 안티센스 가닥 (AS)과 제1 듀플렉스 (D1)를 형성하는 제1 영역 (R1)과, 제1 서브영역 (S1)과 제2 서브영역 (S2)을 연결하는 루프 (triL)를 포함하는 제2 영역 (R2)으로 더 나눌 수 있다. S1 및 S2는 서로 충분히 상보적이어서, 줄기 또는 줄기 듀플렉스로도 지칭되는, 제2 듀플렉스 (D2)를 형성한다. 예를 들어, 도 1c 및 도 1d를 참조한다. 본원에 기재된 바와 같이, 루프는 트리루프이다. 전형적으로, 트리루프는 서열 GAA를 갖지만 램덤 염기로 이루어진 단순 모델 루프 서열로부터 예상되는 것보다 더 높은 인접 듀플렉스의 용융 온도 (Tm)의 증가를 부여하는 다른 트리루프 서열을 갖는다. 제2 듀플렉스 (D2)는 적어도 하나의 Tm-증가 뉴클레오타이드를 포함할 수 있고, 특정 구현예에서, 제2 듀플렉스 (D2)에서 모든 뉴클레오타이드는 Tm-증가 뉴클레오타이드일 수 있다. 전형적으로, 이중-가닥 핵산 억제제 분자는 제2 듀플렉스 (D2) 외부에 임의의 Tm-증가 뉴클레오타이드를 포함하지 않는다. 특정 구현예에서, 이중-가닥 핵산 분자는 dsRNAi 억제제 분자이다.
이중-가닥 핵산 억제제 분자의 특정 구현예에서, 센스 가닥은 적어도 하나의 Tm-증가 뉴클레오타이드 및 트리루프 (triL)를 포함하는 줄기 듀플렉스 (D2)를 포함하고, 20 내지 65개 뉴클레오타이드의 길이이다. 특정 구현예에서, 줄기 듀플렉스는 2 내지 6개 염기 쌍의 길이이다. 특정 구현예에서, 안티센스 가닥은 15 내지 40개 뉴클레오타이드의 길이이다.
특정 구현예에서, 센스 가닥은 줄기 듀플렉스 (D2) 및 트리루프 (triL)를 포함하고, 20 내지 65개 뉴클레오타이드의 길이이고, 안티센스 가닥은 15 내지 40개 뉴클레오타이드의 길이이다. 특정 구현예에서, 줄기 듀플렉스 (D2) 및 트리루프 (triL)를 포함하는 센스 가닥의 연장된 부분은 가닥의 3'-말단에 있다. 다른 특정 구현예에서, 줄기 (D2) 및 트리루프 (triL)를 포함하는 센스 가닥의 연장된 부분은 가닥의 5'-말단에 있다.
특정 구현예에서, 이중-가닥 핵산 억제제 분자는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 여기서, 센스 및 안티센스 가닥은 별도의 가닥이고 18 내지 24개 염기 쌍의 제1 듀플렉스 (D1)를 형성하고, 여기서, 센스 가닥은 제2 듀플렉스 (D2) 및 트리루프 (triL)를 포함하고, 27 내지 35개 뉴클레오타이드의 길이이고, 여기서, 안티센스 가닥은 20 내지 24개 뉴클레오타이드의 길이이다. 특정 구현예에서, 센스 가닥은 27 내지 35개 뉴클레오타이드의 길이이다. 특정 구현예에서, 센스 가닥은 27 내지 33개 뉴클레오타이드의 길이이다. 특정 구현예에서, 센스 가닥은 29 내지 31개 뉴클레오타이드의 길이이다. 특정 구현예에서, 제2 듀플렉스 (D2)는 2 내지 6개 염기 쌍의 길이를 갖는다. 특정 구현예에서, 제2 듀플렉스 (D2)는 2개 염기 쌍의 길이를 가지고 Tm-증가 뉴클레오타이드를 포함한다. 특정 구현예에서, 제2 듀플렉스 (D2)는 3개 염기 쌍의 길이를 가지고 Tm-증가 뉴클레오타이드를 포함한다. 특정 구현예에서, 제2 듀플렉스 (D2)는 4개 염기 쌍의 길이를 가지고 Tm-증가 뉴클레오타이드를 포함한다. 특정 구현예에서, 제2 듀플렉스 (D2)는 5개 염기 쌍의 길이를 가지고 Tm-증가 뉴클레오타이드를 포함한다. 특정 구현예에서, 제2 듀플렉스 (D2)는 6개 염기 쌍의 길이를 가지고 어떠한 Tm-증가 뉴클레오타이드도 포함하지 않는다. 특정 구현예에서, 안티센스 가닥은 이의 3'-말단에서 1, 2, 3, 또는 4개 뉴클레오타이드의 단일-가닥 오버행을 갖는다. 전형적으로, 안티센스 가닥의 3'-말단에서 단일-가닥 오버행은 2개 뉴클레오타이드로 이루어진다.
특정 구현예에서, 이중-가닥 핵산 억제제 분자는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 여기서, 센스 및 안티센스 가닥은 별도의 가닥이고 20개 뉴클레오타이드와 같은 18 내지 22개 염기 쌍의 제1 듀플렉스 (D1)를 형성하고, 여기서, 센스 가닥은 제2 듀플렉스 (D2) 및 트리루프 (triL)를 포함하고, 27 내지 35개 뉴클레오타이드의 길이이고, 여기서, 안티센스 가닥은 22개 뉴클레오타이드의 길이와 같은 20 내지 24개 뉴클레오타이드의 길이이다. 특정 구현예에서, D1은 19 내지 21개 염기 쌍의 길이를 갖는다. 특정 구현예에서, 안티센스 가닥은 20 내지 22개 뉴클레오타이드의 길이이다. 특정 구현예에서, 센스 가닥은 29 내지 33개 뉴클레오타이드의 길이이다. 특정 구현예에서, 제2 듀플렉스 (D2)는 2 내지 6개 염기 쌍의 길이를 갖는다. 특정 구현예에서, D2는 2개 염기 쌍의 길이를 가지고 Tm-증가 뉴클레오타이드를 포함한다. 특정 구현예에서, D2는 3개 염기 쌍의 길이를 가지고 Tm-증가 뉴클레오타이드를 포함한다. 특정 구현예에서, D2는 4개 염기 쌍의 길이를 가지고 Tm-증가 뉴클레오타이드를 포함한다. 특정 구현예에서, D2는 5개 염기 쌍의 길이를 가지고 Tm-증가 뉴클레오타이드를 포함한다. 특정 구현예에서, D2는 6개 염기 쌍의 길이를 가지고 어떠한 Tm-증가 뉴클레오타이드도 포함하지 않는다. 특정 구현예에서, 안티센스 가닥은 이의 3'-말단에서 1 내지 5개 뉴클레오타이드의 단일-가닥 오버행을 갖는다. 특정 구현예에서, 안티센스 가닥은 이의 3'-말단에서 1, 2, 3, 또는 4개 뉴클레오타이드의 단일-가닥 오버행을 갖는다. 전형적으로, 안티센스 가닥의 3'-말단에서 단일-가닥 오버행은 2개 뉴클레오타이드로 이루어진다.
특정 구현예에서, 이중-가닥 핵산 억제제 분자는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 여기서, 센스 및 안티센스 가닥은 별도의 가닥이고 19 내지 21개 염기 쌍의 제1 듀플렉스 (D1)를 형성하고, 여기서, 센스 가닥은 19 내지 21개 뉴클레오타이드의 제1 영역 (R1)과, 제1 서브영역 (S1)을 제2 서브영역 (S2)에 연결하는 트리루프 (triL)를 포함하는 7 내지 15개 뉴클레오타이드의 제2 영역 (R2)을 가지고, 여기서, S1 및 S2 각각은 2 내지 6개 뉴클레오타이드의 길이이고, 서로 충분히 상보적이어서 제2 듀플렉스 (D2)를 형성하고, 여기서, 안티센스 가닥은 20 내지 24개 뉴클레오타이드의 길이이다. 특정 구현예에서, 안티센스 가닥은 이의 3'-말단에서 2개 뉴클레오타이드의 단일-가닥 오버행을 갖는다. 특정 구현예에서, S1 및 S2 각각은 2 내지 5개 뉴클레오타이드의 길이이다. 특정 구현예에서, D2는 2개 염기 쌍의 길이를 가지고 Tm-증가 뉴클레오타이드를 포함한다. 특정 구현예에서, D2는 3개 염기 쌍의 길이를 가지고 Tm-증가 뉴클레오타이드를 포함한다. 특정 구현예에서, D2는 4개 염기 쌍의 길이를 가지고 Tm-증가 뉴클레오타이드를 포함한다. 특정 구현예에서, D2는 5개 염기 쌍의 길이를 가지고 Tm-증가 뉴클레오타이드를 포함한다. 특정 구현예에서, D2는 6개 염기 쌍의 길이를 가지고 Tm-증가 뉴클레오타이드를 포함하지 않는다.
특정 구현예에서, 이중-가닥 핵산 억제제 분자는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 여기서, 센스 및 안티센스 가닥은 별도의 가닥이고 20개 염기 쌍의 제1 듀플렉스 (D1)를 형성하고, 여기서, 센스 가닥은 20개 뉴클레오타이드의 제1 영역 (R1)과, 제1 서브영역 (S1)을 제2 서브영역 (S2)에 연결하는 트리루프 (triL)를 포함하는 7 내지 9개 뉴클레오타이드의 제2 영역 (R2)을 가지고, 여기서, 안티센스 가닥은 22개 뉴클레오타이드의 길이이고 이의 3'-말단에서 2개 뉴클레오타이드의 단일-가닥 오버행을 가지고, 여기서, S1 및 S2 각각은 바이사이클릭 뉴클레오타이드를 포함한다. 특정 구현예에서, S1 및 S2 각각은 3개 뉴클레오타이드의 길이이고 3개 염기 쌍의 제2 듀플렉스 (D2)를 형성한다. 특정 구현예에서, S1 및 S2 각각은 2개 뉴클레오타이드의 길이이고 2개 염기 쌍의 제2 듀플렉스 (D2)를 형성한다. 특정 구현예에서, 제2 듀플렉스 (D2)에서 각각의 뉴클레오타이드는 Tm-증가 뉴클레오타이드이고, 이중-가닥 핵산 억제제 분자는 제2 듀플렉스 (D2)의 외부에 어떠한 Tm-증가 뉴클레오타이드도 포함하지 않는다.
본원에 기재된 트리루프-함유 이중-가닥 핵산 억제제 분자의 특정 구현예에서, 제2 듀플렉스 (D2)는 2 내지 6개 염기 쌍의 길이를 갖는다. 특정 구현예에서, D2는 2 내지 4개 염기 쌍의 길이를 갖는다. 특정 구현예에서, D2는 2개 염기 쌍의 길이를 갖는다. 특정 구현예에서, D2는 3개 염기 쌍의 길이를 갖는다. 특정 구현예에서, D2는 4개 염기 쌍의 길이를 갖는다. 특정 구현예에서, D2는 5개 염기 쌍의 길이를 갖는다. 특정 구현예에서, D2는 6개 염기 쌍의 길이를 갖는다.
본원에 기재된 트리루프-함유 이중-가닥 핵산 억제제 분자의 특정 구현예에서, 제2 듀플렉스 (D2)는 4 내지 10개의 Tm-증가 뉴클레오타이드를 포함하고 2 내지 5개 염기 쌍의 길이를 갖는다. 특정 구현예에서, D2는 6 내지 8개의 Tm-증가 뉴클레오타이드를 포함하고 3 내지 4개 염기 쌍의 길이를 갖는다. 특정 구현예에서, D2는 6개의 Tm-증가 뉴클레오타이드를 포함하고 3개 염기 쌍의 길이를 갖는다. 특정 구현예에서, D2는 4개의 Tm-증가 뉴클레오타이드를 포함하고 2개 염기 쌍의 길이를 갖는다. 특정 구현예에서, D2에서 각각의 뉴클레오타이드 Tm-증가 뉴클레오타이드이다.
본원에 기재된 트리루프-함유 이중-가닥 핵산 억제제 분자의 특정 구현예에서, 제2 듀플렉스 (D2)는 단일 Tm-증가 뉴클레오타이드를 포함하고 2 내지 6개 염기 쌍의 길이를 갖는다. 본원에 기재된 트리루프-함유 이중-가닥 핵산 억제제 분자의 특정 구현예에서, 제2 듀플렉스 (D2)는 2 내지 6개의 단일 Tm-증가 뉴클레오타이드를 포함하고 2 내지 6개 염기 쌍의 길이를 갖고, 여기서, D2에서 Tm-증가 뉴클레오타이드 중 어느 것도 염기 쌍을 형성하지 않는다. 예를 들어, D2는 2개의 Tm-증가 뉴클레오타이드를 포함하고 2 내지 6개 염기 쌍의 길이를 가질 수 있고, 여기서, 2개의 Tm-증가 뉴클레오타이드는 염기 쌍을 형성하지 않는다. D2는 또한 3개의 Tm-증가 뉴클레오타이드를 포함하고 3 내지 6개 염기 쌍의 길이를 가질 수 있고, 여기서, 3개의 Tm-증가 뉴클레오타이드는 염기 쌍을 형성하지 않는다. D2는 또한 4개의 Tm-증가 뉴클레오타이드를 포함하고 4 내지 6개 염기 쌍의 길이를 가질 수 있고, 여기서, 4개의 Tm-증가 뉴클레오타이드는 염기 쌍을 형성하지 않는다. D2는 또한 5개의 Tm-증가 뉴클레오타이드를 포함하고 5 내지 6개의 염기 쌍의 길이를 가질 수 있고, 여기서, 5개의 Tm-증가 뉴클레오타이드는 염기 쌍을 형성하지 않는다. D2는 또한 6개의 Tm-증가 뉴클레오타이드를 포함하고 6개 염기 쌍의 길이를 가질 수 있고, 여기서, 6개의 Tm-증가 뉴클레오타이드는 염기 쌍을 형성하지 않는다.
특정 구현예에서, 트리루프-함유 이중-가닥 핵산 억제제 분자는 어떠한 Tm-증가 뉴클레오타이드도 포함하지 않는다. 특정 구현예에서, 이중-가닥 핵산 억제제 분자는 센스 가닥 (R1)의 제1 영역 또는 안티센스 가닥에서 임의의 Tm-증가 뉴클레오타이드를 포함하지 않는다. 특정 구현예에서, 이중-가닥 핵산 억제제 분자는 제2 듀플렉스 (D2)의 외부에 어떠한 Tm-증가 뉴클레오타이드도 포함하지 않는다. 특정 구현예에서, 이중-가닥 핵산 억제제 분자는 제2 듀플렉스 (D2)에서 어떠한 Tm-증가 뉴클레오타이드도 포함하지 않는다.
트리루프-함유 이중-가닥 핵산 분자의 제2 듀플렉스 (D2)에서 하나 이상의 Tm-증가 뉴클레오타이드는 본원에 기재된 임의의 Tm-증가 뉴클레오타이드이거나 당업계에서 달리 이용 가능한 것일 수 있다. 특정 구현예에서, 이중-가닥 핵산 분자는 제2 듀플렉스 (D2)에서 적어도 2개의 Tm-증가 뉴클레오타이드를 포함하고, 제2 듀플렉스에서 각각의 Tm-증가 뉴클레오타이드는 동일하다. 특정 구현예에서, 이중-가닥 핵산 분자는 제2 듀플렉스 (D2)에서 적어도 2개의 상이한 Tm-증가 뉴클레오타이드를 포함한다.
본원에 기재된 임의의 트리루프-함유 이중-가닥 핵산 분자에서, 하나 이상의 Tm-증가 뉴클레오타이드는 본원에 기재된 임의의 바이사이클릭 뉴클레오타이드이거나, 당업계에서 달리 이용 가능한 것일 수 있다. 본원에 기재된 임의의 트리루프-함유 이중-가닥 핵산 분자에서, 제2 듀플렉스 (D2)에서 적어도 하나의 바이사이클릭 뉴클레오타이드는 바이사이클릭 당 모이어티를 포함하고, 여기서, 바이사이클릭 당 모이어티는 푸라노실의 2'-탄소와 4'-탄소를 연결하는 브릿지를 포함하는 치환된 푸라노실이다.
본원에 기재된 임의의 트리루프-함유 이중-가닥 핵산 억제제 분자에서, 제2 듀플렉스 (D2)에서 적어도 하나의 바이사이클릭 뉴클레오타이드는 화학식 I, II, III, IV, Va, 또는 Vb의 구조를 갖는다. 예를 들어, 제2 듀플렉스 (D2)에서 적어도 하나의 바이사이클릭 뉴클레오타이드는 화학식 I의 구조를 가질 수 있다. 제2 듀플렉스 (D2)에서 적어도 하나의 바이사이클릭 뉴클레오타이드는 화학식 II의 구조를 가질 수도 있다. 제2 듀플렉스 (D2)에서 적어도 하나의 바이사이클릭 뉴클레오타이드는 화학식 III의 구조를 가질 수도 있다. 제2 듀플렉스 (D2)에서 적어도 하나의 바이사이클릭 뉴클레오타이드는 화학식 IV의 구조를 가질 수도 있다. 제2 듀플렉스 (D2)에서 적어도 하나의 바이사이클릭 뉴클레오타이드는 화학식 Va의 구조를 가질 수도 있다. 제2 듀플렉스 (D2)에서 적어도 하나의 바이사이클릭 뉴클레오타이드는 화학식 Vb의 구조를 가질 수도 있다.
제2 듀플렉스 (D2)에서 적어도 하나의 바이사이클릭 뉴클레오타이드는 화학식 Ia, Ib, Ic, Id, Ie, 또는 If 중 하나 이상의 구조를 가질 수도 있다. 제2 듀플렉스 (D2)에서 적어도 하나의 바이사이클릭 뉴클레오타이드는 화학식 IIa, IIb, IIc, 또는 IId 중 하나 이상의 구조를 가질 수도 있다. 제2 듀플렉스 (D2)에서 적어도 하나의 바이사이클릭 뉴클레오타이드는 화학식 IIIa 및/또는 IIIb의 구조를 가질 수도 있다. 제2 듀플렉스 (D2)에서 적어도 하나의 바이사이클릭 뉴클레오타이드는 화학식 IVa 및/또는 IVb의 구조를 가질 수도 있다.
본원에 기재된 임의의 트리루프-함유 이중-가닥 핵산 분자에서, 제2 듀플렉스 (D2)에서 적어도 하나의 바이사이클릭 뉴클레오타이드 (BN)는 다음 중 하나 이상이다: (a) 메틸렌옥시 BN, (b) 에틸렌옥시 BN, (c) 아미노옥시 BN; (d) 옥시아미노 BN, (e) 메틸(메틸렌옥시) BN (제한된 에틸 또는 cET로도 알려져 있음), (f) 메틸렌-티오 BN, (g) 메틸렌 아미노 BN, (h) 메틸 카보사이클릭 BN, 및 (i) 프로필렌 카보사이클릭 BN. 일 구현예에서, 적어도 하나의 BN은 (a) 메틸렌옥시 BN 또는 (d) 옥시아미노 BN)이고, 여기서, R2는 CH3이다. 예를 들어, D2에서 적어도 하나의 BN은 옥시아미노 BN (d)이고, 여기서, R2는 CH3이다.
바이사이클릭 뉴클레오타이드
본원에 개시된 트리루프-함유 이중-가닥 핵산 억제제 분자는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 특정 구현예에서, 센스 가닥에 존재하는 줄기 루프 구조의 줄기 부분에 적어도 하나의 바이사이클릭 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 바이사이클릭 뉴클레오타이드는 전형적으로 4 내지 7원 고리의 2개의 원자를 연결하여 제2 고리를 형성하여 브릿지를 포함하여 바이사이클릭 구조를 형성하는 브릿지를 포함하는 4 내지 7원 고리 (푸라노실을 포함하지만 이에 제한되지 않음)를 갖는 당 모이어티를 갖는다. 특정 구현예에서, 브릿지는 제1 고리의 2'-탄소와 4'-탄소를 연결하여 제2 고리를 형성한다. 그러한 바이사이클릭 뉴클레오타이드는 바이사이클릭 핵산 및 잠금 핵산 각각에 대한 BNA 및 LNA를 각각 포함하는 다양한 명칭을 갖는다. 바이사이클릭 뉴클레오타이드의 합성 및 핵산 화합물로의 이들의 혼입은 또한, 예를 들어, 문헌 (Singh 등, CHEM. COMMUN., 1998, 4, 455-456; Koshkin 등, TETRAHEDRON, 1998, 54, 3607-3630; Wahlestedt 등, PROC. NATL. ACAD. SCI. U.S.A., 2000, 97, 5633-5638; Kumar 등, BIOORG. MED. CHEM. LETT., 1998, 8, 2219-2222; Singh 등, J. ORG. CHEM., 1998, 63, 10035-10039; 미국 특허 번호 제7,427,672호, 제7,053,207호, 제6,794,499호, 제6,770,748호, 제6,268,490호 및 제6,794,499호; 및 공개된 미국 출원 제20040219565호, 제20040014959호, 제20030207841호, 제20040192918호, 제20030224377호, 제20040143114호 및 제20030082807호; 이들 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)을 포함한 문헌에 보고되었다.
전형적으로, 브릿지는 2 내지 8개의 원자를 포함한다. 특정 구현예에서, 브릿지는 3개의 원자를 포함한다. 특정 구현예에서, 브릿지는 4개의 원자를 포함한다. 특정 구현예에서, 브릿지는 5개의 원자를 포함한다. 특정 구현예에서, 브릿지는 6개의 원자를 포함한다. 특정 구현예에서, 브릿지는 7개의 원자를 포함한다. 특정 구현예에서, 브릿지는 8개의 원자를 포함한다. 특정 구현예에서, 브릿지는 8개 초과의 원자를 포함한다.
특정 구현예에서, 바이사이클릭 당 모이어티는 푸라노실의 2'-탄소와 4'-탄소를 연결하여 제2 고리를 형성하는 브릿지를 포함하는 치환된 푸라노실이다. 특정 구현예에서, 바이사이클릭 뉴클레오타이드는 화학식 I의 구조를 갖는다:
Figure pct00007
화학식 I
여기서, B는 핵염기이고;
G는 H, OH, NH2, C1-C6 알킬, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, 치환된 C1-C6 알킬, 치환된 C2-C6 알케닐, 치환된 C2-C6 알키닐, 아실, 치환된 아실, 치환된 아미드, 티올, 또는 치환된 티오이고;
X는 O, S, 또는 NR1이고, 여기서, R1은 H, C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, 벤젠 또는 피렌이고,
Wa 및 Wb는 각각 독립적으로 H, OH, 하이드록실 보호기, 인 모이어티, 또는 화학식 I로 표시되는 뉴클레오타이드를 또 다른 뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드에 부착하는 뉴클레오타이드간 연결기이고, Wa 또는 Wb 중 적어도 하나는 화학식 I로 표시되는 뉴클레오타이드를 올리고뉴클레오타이드에 부착하는 뉴클레오타이드간 연결기이다.
화학식 I의 특정 구현예에서, G는 H이고, X는 NR1이고, 여기서, R1은 벤젠 또는 피렌이다. 화학식 I의 특정 구현예에서, G는 H이고, X는 S이다.
화학식 I의 특정 구현예에서, G는 H이고, X는 O이다:
Figure pct00008
화학식 Ia
화학식 I의 특정 구현예에서, G는 H이고, X는 NR1이고, 여기서, R1은 H, CH3, 또는 OCH3이다:
Figure pct00009
화학식 Ib
화학식 I의 특정 구현예에서, G는 OH 또는 NH2이고, X는 O이다.
화학식 I의 특정 구현예에서, G는 OH이고, X는 O이다:
Figure pct00010
화학식 Ic
화학식 I의 특정 구현예에서, G는 NH2이고, X는 O이다:
Figure pct00011
화학식 Id
화학식 I의 특정 구현예에서, G는 CH3 또는 CH2OCH3이고, X는 O이다. 화학식 I의 특정 구현예에서, G는 CH3이고, X는 O이다:
Figure pct00012
화학식 Ie
화학식 I의 특정 구현예에서, G는 CH2OCH3이고, X는 O이다:
Figure pct00013
화학식 If
특정 구현예에서, 바이사이클릭 뉴클레오타이드는 화학식 II의 구조를 갖는다:
Figure pct00014
화학식 II
여기서, B는 핵염기이고;
Q1은 CH2 또는 O이고;
X는 CH2, O, S, 또는 NR1이고, 여기서, R1은 H, C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, 벤젠 또는 피렌이고;
Q1이 O이면, X는 CH2이고;
Q1이 CH2이면, X는 CH2, O, S, 또는 NR1이고, 여기서, R1은 H, C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, 벤젠 또는 피렌이고;
Wa 및 Wb는 각각 독립적으로 H, OH, 하이드록실 보호기, 인 모이어티, 또는 화학식 II로 표시되는 뉴클레오타이드를 또 다른 뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드에 부착하는 뉴클레오타이드간 연결기이고, Wa 또는 Wb 중 적어도 하나는 화학식 II로 표시되는 뉴클레오타이드를 올리고뉴클레오타이드에 부착하는 뉴클레오타이드간 연결기이다.
화학식 II의 특정 구현예에서, Q1은 O이고, X는 CH2이다:
Figure pct00015
화학식 IIa
화학식 II의 특정 구현예에서, Q1은 CH2이고, X는 O이다:
Figure pct00016
화학식 IIb
화학식 II의 특정 구현예에서, Q1은 CH2이고, X는 NR1이고, 여기서, R1은 H, CH3 또는 OCH3이다:
Figure pct00017
화학식 IIc
화학식 II의 특정 구현예에서, Q1은 CH2이고, X는 NH이다:
Figure pct00018
화학식 IId
특정 구현예에서, 바이사이클릭 뉴클레오타이드는 화학식 III의 구조를 갖는다:
Figure pct00019
화학식 III
여기서, B는 핵염기이고;
Q2는 O 또는 NR1이고, 여기서, R1은 H, C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, 벤젠 또는 피렌이고;
X는 CH2, O, S, 또는 NR1이고, 여기서, R1은 H, C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, 벤젠 또는 피렌이고;
Q2가 O이면, X는 NR1이고;
Q2가 NR1이면, X는 O 또는 S이고;
Wa 및 Wb는 각각 독립적으로 H, OH, 하이드록실 보호기, 인 모이어티, 또는 화학식 III으로 표시되는 뉴클레오타이드를 또 다른 뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드에 부착하는 뉴클레오타이드간 연결기이고, Wa 또는 Wb 중 적어도 하나는 화학식 III으로 표시되는 뉴클레오타이드를 올리고뉴클레오타이드에 부착하는 뉴클레오타이드간 연결기이다.
화학식 III의 특정 구현예에서, Q2는 O이고, X는 NR1이다. 화학식 III의 특정 구현예에서, Q2는 O이고, X는 NR1이고, 여기서, R1은 C1-C6 알킬이다. 화학식 III의 특정 구현예에서, Q2는 O이고, X는 NR1이고, R1은 H 또는 CH3이다.
화학식 III의 특정 구현예에서, Q2는 O이고, X는 NR1이고, R1은 CH3이다:
Figure pct00020
화학식 IIIa
화학식 III의 특정 구현예에서, Q2는 NR1이고, X는 O이다. 화학식 III의 특정 구현예에서, Q2는 NR1이고, 여기서, R1은 C1-C6 알킬이고, X는 O이다.
화학식 III의 특정 구현예에서, Q2는 NCH3이고, X는 O이다:
Figure pct00021
화학식 IIIb
특정 구현예에서, 바이사이클릭 뉴클레오타이드는 화학식 IV의 구조를 갖는다:
Figure pct00022
화학식 IV
여기서, B는 핵염기이고;
P1 및 P3은 CH2이고, P2는 CH2 또는 O이고, P4는 O이고;
Wa 및 Wb는 각각 독립적으로 H, OH, 하이드록실 보호기, 인 모이어티, 또는 화학식 IV로 표시되는 뉴클레오타이드를 또 다른 뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드에 부착하는 뉴클레오타이드간 연결기이고, Wa 또는 Wb 중 적어도 하나는 화학식 IV로 표시되는 뉴클레오타이드를 올리고뉴클레오타이드에 부착하는 뉴클레오타이드간 연결기이다.
화학식 IV의 특정 구현예에서, P1, P2, 및 P3은 CH2이고, P4는 O이다:
Figure pct00023
화학식 IVa
화학식 IV의 특정 구현예에서, P1 및 P3은 CH2이고, P2는 O이고, P4는 O이다:
Figure pct00024
화학식 IVb
특정 구현예에서, 바이사이클릭 뉴클레오타이드는 화학식 Va 또는 Vb의 구조를 갖는다:
Figure pct00025
화학식 Va
Figure pct00026
화학식 Vb
여기서, B는 핵염기이고;
r1, r2, r3, 및 r4는 각각 독립적으로 H, 할로겐, C1-C12 알킬, 치환된 C1-C12 알킬, C2-C12 알케닐, 치환된 C2-C12 알케닐, C2-C12 알키닐; 치환된 C2-C12 알키닐; C1-C12 알콕시; 치환된 C1-C12 알콕시, OT1, ST1, SOT1, SO2T1, NT1T2, N3, CN, C(=O)OT1, C(=O)NT1T2 , C(=O)T1, O-C(=O)NT1T2, N(H)C(=NH)NT1T2, N(H)C(=O)NT1T2 또는 N(H)C(=S)NT1T2이고, 여기서, 각각의 T1 및 T2는 독립적으로 H, C1-C6 알킬, 또는 치환된 C1-C16 알킬이거나;
r1 및 r2 또는 r3 및 r4는 함께 =C(r5)(r6)이고, 여기서, r5 및 r6은 각각 독립적으로 H, 할로겐, C1-C12 알킬, 또는 치환된 C1-C12 알킬이고;
Wa 및 Wb는 각각 독립적으로 H, OH, 하이드록실 보호기, 인 모이어티, 또는 화학식 V로 표시되는 뉴클레오타이드를 또 다른 뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드에 부착하는 뉴클레오타이드간 연결기이고, Wa 또는 Wb 중 적어도 하나는 화학식 V로 표시되는 뉴클레오타이드를 올리고뉴클레오타이드에 부착하는 뉴클레오타이드간 연결기이다.
특정 구현예에서, 바이사이클릭 당 모이어티는 푸라노실의 2'-탄소와 4'-탄소를 연결하여 제2 고리를 형성하는 브릿지를 포함하는 치환된 푸라노실이고, 여기서, 푸라노실의 2'-탄소와 4'-탄소를 연결하는 브릿지는 다음을 포함하지만 이로 제한되지 않는다:
a) 예를 들어, 4'-CH2-NH-O-2' (BNANC로도 알려져 있음), 4'-CH2-N(CH3)-O-2' (BNANC[NMe]로도 알려져 있음)를 포함한 4'-CH2-O-N(R)-2' 및 4'-CH2-N(R)-O-2', 여기서, R은 H이고, C1-C12 알킬, 또는 보호기이다 (그 전문이 본원에 참조로 포함된 미국 특허 번호 제7,427,672호에 기재된 바와 같음);
b) 4'-CH2-2'; 4'-(CH2)2-2'; 4'-(CH2)3-2'; 4'-(CH2)-O-2' (LNA로도 알려져 있음); 4'-(CH2)-S-2'; 4'-(CH2)2-O-2' (ENA로도 알려져 있음); 4'-CH(CH3)-O-2' (cEt로도 알려져 있음); 및 4'-CH(CH2OCH3)-O-2' (cMOE로도 알려져 있음), 및 이들의 유사체 (그 전문이 본원에 참조로 포함된 미국 특허 번호 제7,399,845호에 기재된 바와 같음);
c) 4'-C(CH3)(CH3)-O-2' 및 이의 유사체 (그 전문이 본원에 참조로 포함된 미국 특허 번호 제8,278,283호에 기재된 바와 같음);
d) 4'-CH2-N(OCH3)-2' 및 이의 유사체 (그 전문이 본원에 참조로 포함된 미국 특허 번호 제8,278,425호에 기재된 바와 같음);
e) 4'-CH2-O-N(CH3)-2' 및 이의 유사체 (그 전문이 본원에 참조로 포함된 미국 특허 공개 번호 제2004/0171570호에 기재된 바와 같음);
f) 4'-CH2-C(H)(CH3)-2' 및 이의 유사체 (그 전문이 본원에 참조로 포함된 문헌 Chattopadhyaya 등, J. Org. Chem., 2009, 74, 118-34)에 기재된 바와 같음); 및
g) 4'-CH2-C(=CH2)-2' 및 이의 유사체 (그 전문이 본원에 참조로 포함된 미국 특허 번호 제8,278,426호에 기재된 바와 같음).
특정 구현예에서, 바이사이클릭 뉴클레오타이드 (BN)는 아래에 나타낸 바와 같이 다음 중 하나 이상이다: (a) 메틸렌옥시 BN, (b) 에틸렌옥시 BN, (c) 아미노옥시 BN; (d) 옥시아미노 BN, (e) 메틸(메틸렌옥시) BN (제한된 에틸 또는 cET로도 알려져 있음), (f) 메틸렌-티오 BN, (g) 메틸렌 아미노 BN, (h) 메틸 카보사이클릭 BN, 및 (i) 프로필렌 카보사이클릭 BN.
Figure pct00027
Figure pct00028
Figure pct00029
상기 (a) 내지 (i)의 바이사이클릭 뉴클레오타이드에서, B는 핵염기이고, R2는 H 또는 CH3이고, Wa 및 Wb는 각각 독립적으로 H, OH, 하이드록실 보호기, 인 모이어티, 또는 바이사이클릭 뉴클레오타이드를 또 다른 뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드에 부착하는 뉴클레오타이드간 연결기이고, 여기서, Wa 또는 Wb 중 적어도 하나는 바이사이클릭 뉴클레오타이드를 올리고뉴클레오타이드에 부착하는 뉴클레오타이드간 연결기이다.
옥시아미노 BN (d)의 일 구현예에서, R2는 다음과 같이 (BNANC[NMe]로도 알려져 있음) CH3이다:
Figure pct00030
특정 구현예에서, 바이사이클릭 당 모이어티 및 그러한 바이사이클릭 당 모이어티를 혼입하는 바이사이클릭 뉴클레오타이드는 이성체 배열에 의해 추가로 정의된다. 특정 구현예에서, 바이사이클릭 당 모이어티 또는 뉴클레오타이드는 α-L 배열로 있다. 특정 구현예에서, 바이사이클릭 당 모이어티 또는 뉴클레오타이드는 β-D 배열로 있다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 바이사이클릭 당 모이어티 또는 뉴클레오타이드는 α-L 배열 (α-L LNA)로 2'O,4'-C-메틸렌 브릿지 (2'O-CH2-4')를 포함한다. 특정 구현예에서, 바이사이클릭 당 모이어티 또는 뉴클레오타이드는 R 배열로 있다. 특정 구현예에서, 바이사이클릭 당 모이어티 또는 뉴클레오타이드는 S 배열로 있다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 바이사이클릭 당 모이어티 또는 뉴클레오타이드는 S-배열로 4'-CH(CH3)-O-2' 브릿지 (즉, cEt)를 포함한다.
트리사이클릭 뉴클레오타이드
특정 구현예에서, Tm-증가 뉴클레오타이드는 트리사이클릭 뉴클레오타이드일 수 있다. 트리사이클릭 뉴클레오타이드의 합성 및 핵산 화합물로의 이들의 혼입은 또한, 예를 들어, 문헌 Steffens 등, J. AM. CHEM. SOC. 1997;119:11548-11549; Steffens 등, J. ORG. CHEM. 1999;121(14):3249-3255; Renneberg 등, J. AM. CHEM. SOC. 2002;124:5993-6002; Ittig 등, NUCLEIC ACIDS RES. 2004;32(1):346-353; Scheidegger 등, Chemistry 2006;12:8014-8023; Ivanova 등, OLIGONUCLEOTIDES 2007;17:54-65; 이들 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함한 문헌에 보고되었다.
특정 구현예에서, 예를 들어, 각각은 참조로 본원에 포함된 문헌 Leumann CJ, Bioorg . Med . Chem . 2002; 10:841-854 및 공개된 미국 출원 제2015/0259681호 및 제2018/0162897호에 논의된 바와 같이, 트리사이클릭 뉴클레오타이드는 3'-탄소 및 5'-탄소 중심이 사이클로프로판 고리에 융합된 에틸렌에 의해 연결된 트리사이클로 뉴클레오타이드 (트리사이클로 DNA로도 불림)이다. 특정 구현예에서, 예를 들어, 본원에 참조로 포함된 공개된 미국 출원 제2015/0112055호에서 논의된 바와 같이, 트리사이클릭 뉴클레오타이드는 푸라노실의 2'-탄소와 4'-탄소를 연결하여 제2 고리를 형성하는 브릿지를 포함하는 치환된 푸라노실 고리와, 푸라노실의 2'-탄소와 4'-탄소를 연결하는 브릿지의 메틸렌기에 5'-탄소를 연결하는 기로부터 생성되는 제3 융합 고리를 포함한다.
기타 T m -증가 뉴클레오타이드
바이사이클릭 및 트리사이클릭 뉴클레오타이드 이외에, 기타 Tm-증가 뉴클레오타이드가 본원에 기재된 핵산 억제제 분자에 사용될 수 있다. 예를 들어, 특정 구현예에서, Tm-증가 뉴클레오타이드는 G-클램프, 구아니딘 G-클램프 또는 이의 유사체 (Wilds 등, Chem, 2002;114:123 및 Wilds 등, Chim Acta 2003;114:123), 헥시톨 뉴클레오타이드 (Herdewijn, Chem . Biodiversity 2010;7:1-59), 또는 변형된 뉴클레오타이드이다. 변형된 뉴클레오타이드는, 예를 들어, 5-브로모-우라실, 5-요오도-우라실, 5-프로피닐-변형된 피리미딘, 또는 2-아미노 아데닌 (2,6-디아미노퓨린으로도 불림) (Deleavey 등, Chem . & Biol . 2012;19:937-54) 또는 2-티오 우리딘, 5 Me-티오 우리딘, 및 슈도 우리딘을 포함한 본원에 기재된 바와 같은 변형된 핵염기를 가질 수 있다. 변형된 뉴클레오타이드는 또한, Tm-증가 뉴클레오타이드가 2'-F 또는 2'-OMe로 당 모이어티의 2'-탄소에서 변형되지 않는 것을 제외하고는, 예를 들어, 본원에 참조로 포함되거나 본원에 기재된 바와 같은 미국 특허 번호 제8,975,389호에 기재된 바와 같은 변형된 당 모이어티를 가질 수 있다.
특정 구현예에서, Tm-증가 뉴클레오타이드는 바이사이클릭 뉴클레오타이드이다. 특정 구현예에서, Tm-증가 뉴클레오타이드는 트리사이클릭 뉴클레오타이드이다. 특정 구현예에서, Tm-증가 뉴클레오타이드는 G-클램프, 구아니딘 G-클램프 또는 이의 유사체이다. 특정 구현예에서, Tm-증가 뉴클레오타이드는 헥시톨 뉴클레오타이드이다. 특정 구현예에서, Tm-증가 뉴클레오타이드는 바이사이클릭 또는 트리사이클릭 뉴클레오타이드이다. 특정 구현예에서, Tm-증가 뉴클레오타이드는 바이사이클릭 뉴클레오타이드, 트리사이클릭 뉴클레오타이드, 또는 G-클램프, 구아니딘 G-클램프 또는 이의 유사체이다. 특정 구현예에서, Tm-증가 뉴클레오타이드는 바이사이클릭 뉴클레오타이드, 트리사이클릭 뉴클레오타이드, G-클램프, 구아니딘 G-클램프 또는 이의 유사체, 또는 헥시톨 뉴클레오타이드이다.
특정 구현예에서, Tm-증가 뉴클레오타이드는 핵산 억제제 분자의 제2 듀플렉스 (D2)의 Tm을 혼입 당 적어도 2℃만큼 증가시킨다. 특정 구현예에서, Tm-증가 뉴클레오타이드는 D2의 Tm을 혼입 당 적어도 3℃만큼 증가시킨다. 특정 구현예에서, Tm-증가 뉴클레오타이드는 D2의 Tm을 혼입 당 적어도 4℃만큼 증가시킨다. 특정 구현예에서, Tm-증가 뉴클레오타이드는 D2의 Tm을 혼입 당 적어도 5℃만큼 증가시킨다.
기타 변형
본원에 기재된 이중-가닥 핵산 억제제 분자는 제2 듀플렉스 (D2)에서 적어도 하나의 Tm-증가 뉴클레오타이드 이외에 다른 뉴클레오타이드 변형을 포함할 수 있다. 전형적으로, 이중-가닥 핵산 억제제 분자의 다중 뉴클레오타이드는 뉴클레아제에 대한 내성 또는 저하된 면역원성과 같은 분자의 다양한 특성을 개선하기 위해 변형된다. 예를 들어, 문헌 Bramsen 등 (2009), Nucleic Acids Res., 37, 2867-2881을 참조한다. 많은 뉴클레오타이드 변형은 올리고뉴클레오타이드 분야, 특히 핵산 억제제 분자에 사용되었다. 그러한 변형은 당 모이어티, 포스포디에스테르 연결, 및 핵염기를 포함한 뉴클레오타이드의 임의의 부분에서 이루어질 수 있다. 뉴클레오타이드 변형의 전형적인 예는 2'-F, 2'-O-메틸 ("2'-OMe" 또는 "2'-OCH3) 및 2'-O-메톡시에틸 ("2'-MOE" 또는 "2'-OCH2CH2OCH3)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 변형은 또한 본원에 기재된 바와 같이 5'-탄소와 같은 뉴클레오타이드의 당 모이어티의 다른 부분에서 발생할 수 있다.
특정 구현예에서, 이중-가닥 핵산 억제제 분자는 또한 당업계에 알려져 있고 본원에 기재된 바와 같이, 1'-위치에서 아데닌, 구아닌, 시토신, 티민 및 우라실 이외에 하나 이상의 변형된 핵염기를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 변형된 또는 범용 핵염기는 질소성 염기이다. 특정 구현예에서, 변형된 핵염기는 질소 원자를 포함하지 않는다. 예를 들어, 미국 공개 특허 출원 번호 제20080274462호를 참조한다. 특정 구현예에서, 변형된 뉴클레오타이드는 핵염기 (무염기)를 포함하지 않는다. 변형된 핵염기의 전형적인 예는 5'-메틸시토신이다.
RNA와 DNA의 자연 발생 뉴클레오타이드간 연결은 3'- 내지 5'-포스포디에스테르 연결이다. 변형된 포스포디에스테르 연결은 당업계에 알려져 있고 본원에 기재된 바와 같이, 인 원자를 함유하는 뉴클레오타이드간 연결 및 인 원자를 함유하지 않는 뉴클레오타이드간 연결을 포함하는 비-자연 발생 뉴클레오타이드간 연결기를 포함한다. 전형적으로, 이중-가닥 핵산 억제제 분자는 본원에 기재된 바와 같이 하나 이상의 인-함유 뉴클레오타이드간 연결기를 포함한다. 다른 구현예에서, 이중-가닥 핵산 억제제 분자의 뉴클레오타이드간 연결기 중 하나 이상은 본원에 기재된 바와 같이 비-인 함유 연결이다. 특정 구현예에서, 이중-가닥 핵산 억제제 분자는 하나 이상의 인-함유 뉴클레오타이드간 연결기 및 하나 이상의 비-인 함유 뉴클레오타이드간 연결기를 포함한다.
특정 구현예에서, 이중-가닥 핵산 억제제 분자는 적어도 하나의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 연결기를 포함한다. 특정 구현예에서, 이중-가닥 핵산 억제제 분자는 10개 미만, 예컨대 5개 미만의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 연결기를 포함한다. 특정 구현예에서, 이중-가닥 핵산 억제제 분자는 4개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 연결기를 포함한다.
이중-가닥 핵산 억제제 분자의 센스 및/또는 안티센스 가닥의 5'-말단은 천연 치환기, 예컨대 하이드록실 또는 포스페이트기를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 하이드록실기는 이중-가닥 핵산 억제제 분자의 센스 및/또는 안티센스 가닥의 5'-말단에 부착된다. 특정 구현예에서, 포스페이트기는 이중-가닥 핵산 억제제 분자의 센스 및/또는 안티센스 가닥의 5'-말단에 부착된다. 전형적으로, 포스페이트는 올리고뉴클레오타이드 합성 전에 단량체에 첨가된다. 다른 구현예에서, 5'-인산화는 핵산 억제제 분자가, 예를 들어, 세포질 Clp1 키나아제에 의해 세포질에 도입된 후 자연적으로 달성된다. 일부 구현예에서, 5'-말단 포스페이트는 포스페이트기, 예컨대 5'-모노포스페이트 [(HO)2(O)P-O-5'], 5'-디포스페이트 [(HO)2(O)P-O-P(HO)(O)-O-5'] 또는 5'-트리포스페이트[(HO)2(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-0-5']이다.
이중-가닥 핵산 억제제 분자의 센스 및/또는 안티센스 가닥의 5'-말단 또한 변형될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 이중-가닥 핵산 억제제 분자의 센스 및/또는 안티센스 가닥의 5'-말단은 포스포르아미데이트 [(HO)2(O)P-NH-5', (HO)(NH2)(O)P-O-5']에 부착된다. 특정 구현예에서, 이중-가닥 핵산 억제제 분자의 센스 및/또는 안티센스 가닥의 5'-말단은 포스페이트 모방체에 모방된다. 적합한 포스페이트 모방체는 5'-포스포네이트, 예컨대 5'-메틸렌포스포네이트 (5'-MP), 5'-(E)-비닐포스포네이트 (5'-VP)를 포함한다. Lima 등, Cell, 2012, 150-883-94; WO 2014/130607. 다른 적합한 포스페이트 모방체는 그 전체가 본원에 참조로 포함된 국제 공개 번호 제WO 2018/045317에 기재된 바와 같이 올리고뉴클레오타이드의 5'-말단 뉴클레오타이드의 당 모이어티 (예를 들어, 리보스 또는 데옥시리보스 또는 이의 유사체)의 4'-탄소에 결합된 4-포스페이트 유사체를 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 이중-가닥 핵산 억제제 분자의 센스 및/또는 안티센스 가닥의 5'-말단은 옥시메틸포스포네이트에 부착되고, 여기서, 옥시메틸기의 산소 원자는 당 모이어티 또는 이의 유사체의 4'-탄소에 결합된다. 다른 구현예에서, 포스페이트 유사체는 티오메틸포스포네이트 또는 아미노메틸포스포네이트이고, 여기서, 티오메틸기의 황 원자 또는 아미노메틸기의 질소 원자는 당 모이어티 또는 이의 유사체의 4'-탄소에 결합된다.
특정 구현예에서, 이중-가닥 핵산 억제제 분자는 하나 이상의 데옥시리보뉴클레오타이드를 포함한다. 전형적으로, 이중-가닥 핵산 억제제 분자는 5개 미만의 데옥시리보뉴클레오타이드를 포함한다. 특정 구현예에서, 이중-가닥 핵산 억제제 분자는 하나 이상의 리보뉴클레오타이드를 포함한다. 특정 구현예에서, 이중-가닥 핵산 억제제 분자의 모든 뉴클레오타이드는 리보뉴클레오타이드이다.
특정 구현예에서, 이중-가닥 핵산 억제제 분자의 줄기 (제2 듀플렉스 또는 D2) 외부의 하나 이상의 뉴클레오타이드는 본원에 기재된 바와 같이 바이사이클릭 또는 트리사이클릭 뉴클레오타이드에 존재하는 변형된 고리 구조 및 잠금 해제된 핵산 ("UNA")을 포함하지만 이에 제한되지 않는 변형된 고리 구조를 갖는 당 모이어티를 포함한다 (예를 들어, Snead 등 (2013), Molecular Therapy - Nucleic Acids, 2,e103(doi: 10.1038/mtna.2013.36) 참조).
특정 구현예에서, 이중-가닥 핵산 억제제 분자의 1개 또는 2개 뉴클레오타이드는 글루타티온-민감성 모이어티로 가역적으로 변형된다. 전형적으로, 글루타티온-민감성 모이어티는 당 모이어티의 2'-탄소에 위치하며 설포닐기를 포함한다. 특정 구현예에서, 글루타티온-민감성 모이어티는 국제 공개 번호 제WO 2018/045317호에 기재된 바와 같이 포스포아미다이트 올리고뉴클레오타이드 합성 방법과 양립할 수 있으며, 상기 특허는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 특정 구현예에서, 이중-가닥 핵산 억제제 분자의 2개 초과의 뉴클레오타이드는 글루타티온-민감성 모이어티로 가역적으로 변형된다. 특정 구현예에서, 대부분의 뉴클레오타이드는 글루타티온-민감성 모이어티로 가역적으로 변형된다. 특정 구현예에서, 이중-가닥 핵산 억제제 분자의 모든 또는 실질적으로 모든 뉴클레오타이드는 글루타티온-민감성 모이어티로 가역적으로 변형된다.
적어도 하나의 글루타티온-민감성 모이어티는 전형적으로 이중-가닥 핵산 억제제 분자의 센스 가닥 또는 안티센스 가닥의 5'- 또는 3'-말단 뉴클레오타이드에 위치한다. 그러나, 적어도 하나의 글루타티온-민감성 모이어티는 이중-가닥 핵산 억제제 분자에서 임의의 관심 뉴클레오타이드에 위치할 수 있다.
특정 구현예에서, 이중-가닥 핵산 억제제 분자는 완전히 변형되고, 여기서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥의 모든 뉴클레오타이드가 변형되고; 전형적으로 모든 뉴클레오타이드는 당 모이어티의 2'-위치에서 변형된다. 특정 구현예에서, 완전히 변형된 핵산 억제제 분자는 가역적 변형을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 이중-가닥 핵산 억제제 분자의 센스 가닥의 적어도 하나, 예컨대 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 또는 36개 뉴클레오타이드가 변형된다. 일부 구현예에서, 이중-가닥 핵산 억제제 분자의 안티센스 가닥의 적어도 하나, 예컨대 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 또는 24개 뉴클레오타이드가 변형된다.
특정 구현예에서, 완전히 변형된 핵산 억제제 분자는 하나 이상의 가역적, 글루타티온-민감성 모이어티로 변형된다. 특정 구현예에서, 이중-가닥 핵산 억제제 분자의 뉴클레오타이드의 실질적으로 모든 뉴클레오타이드가 변형된다. 특정 구현예에서, 이중-가닥 핵산 억제제 분자의 뉴클레오타이드의 절반 초과는 가역적 변형 이외의 화학적 변형으로 변형된다. 특정 구현예에서, 이중-가닥 핵산 억제제 분자의 뉴클레오타이드의 절반 미만이 가역적 변형 이외의 화학적 변형으로 변형된다. 변형은 핵산 억제제 분자 상의 기에서 발생할 수 있거나 상이한 변형된 뉴클레오타이드가 배치되어 (interspersed) 있을 수 있다.
이중-가닥 핵산 억제제 분자의 특정 구현예에서, 1개 내지 모든 뉴클레오타이드는 2'-탄소에서 변형된다. 특정 구현예에서, 이중-가닥 핵산 억제제 분자는 2'-F, 2'-OMe 및/또는 2'-MOE로 부분적으로 또는 완전히 변형된다. 이중-가닥 핵산 억제제 분자의 특정 구현예에서, 1개 내지 모든 인 원자는 변형되고 1개 내지 모든 뉴클레오타이드는 당 모이어티의 2'-탄소에서 변형된다.
이중-가닥 핵산 억제제 분자의 특정 구현예에서, 센스 및 안티센스 가닥 상의 모든 뉴클레오타이드는 당 모이어티의 2'-탄소에서 변형된다. 이중-가닥 핵산 억제제 분자의 특정 구현예에서, 센스 및 안티센스 가닥 상의 모든 뉴클레오타이드는 센스 가닥의 제2 영역 (R2)에서 뉴클레오타이드를 제외하고는 2'-F 또는 2'-OMe로 당 모이어티의 2'-탄소에서 변형된다. 이중-가닥 핵산 억제제 분자의 특정 구현예에서, 센스 및 안티센스 가닥 상의 모든 뉴클레오타이드는 줄기에서의 Tm-증가 뉴클레오타이드 (제2 듀플렉스 또는 D2)를 제외하고는 2'-F 또는 2'-OMe로 당 모이어티의 2'-탄소에서 변형된다. 이중-가닥 핵산 억제제 분자의 특정 구현예에서, 센스 및 안티센스 가닥 상의 모든 뉴클레오타이드는 줄기에서의 Tm-증가 뉴클레오타이드 (제2 듀플렉스 또는 D2)와 GalNAc와 같은 리간드 모이어티에 접합된 트리루프에서의 뉴클레오타이드를 제외하고는 2'-F 또는 2'-OMe로 당 모이어티의 2'-탄소에서 변형된다.
표적 유전자 발현을 감소시키는 방법
본원에 기재된 바와 같이 트리루프-함유 이중-가닥 핵산 억제제 분자는 임의의 관심 표적 유전자의 표적 mRNA 발현을 감소시키는 방법에 사용될 수 있다. 전형적으로, mRNA 발현을 감소시키는 방법은 본원에 기재된 바와 같은 이중-가닥 핵산 억제제 분자를 표적 유전자의 mRNA 발현을 감소시키기에 충분한 양으로 이를 필요로 하는 샘플 또는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 시험관내 또는 생체내에서 수행될 수 있다.
표적 RNA의 수준 또는 활성은 현재 당업계에 알려져 있거나 나중에 개발될 적합한 방법에 의해 결정될 수 있다. 표적 RNA 및/또는 표적 유전자의 "발현"을 측정하는 데 사용되는 방법은 표적 유전자 및 이의 암호화된 RNA의 특성에 따라 달라질 수 있음을 이해할 수 있다. 예를 들어, 표적 RNA 서열이 단백질을 암호화하는 경우, 용어 "발현"은 표적 유전자 (게놈 또는 외인성 기원)로부터 유래된 단백질 또는 표적 RNA/전사체를 지칭할 수 있다. 그러한 경우에, 표적 RNA의 발현은 표적 RNA/전사체의 양을 직접 측정하거나 표적 RNA/전사체에 의해 암호화된 단백질의 양을 측정함으로써 결정될 수 있다. 단백질은 예컨대 염색 또는 면역블롯팅에 의해 단백질 검정에서 측정될 수 있거나, 단백질이 측정될 수 있는 반응을 촉매하는 경우, 반응 속도를 측정하여 측정될 수 있다. 그러한 모든 방법은 당업계에 알려져 있으며 사용될 수 있다. 표적 RNA 수준이 측정되어야 하는 경우, RNA 수준을 검출하기 위해 당업계에서 인지된 방법이 사용될 수 있다 (예를 들어, RT-PCR, 노던 블랏 (Northern Blotting) 등). 상기 측정은 세포, 세포 추출물, 조직, 조직 추출물 또는 또 다른 적합한 공급원 물질에 대해 이루어질 수 있다.
약제학적 조성물
본원 개시내용은 치료학적 유효량의 본원에 기재된 바와 같은 트리루프-함유 이중-가닥 핵산 억제제 분자 및 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
이들 약제학적 조성물은 통상적인 멸균 기술에 의해 멸균되거나 멸균 여과될 수 있다. 생성된 수용액은 그대로 사용하기 위해 패키징되거나 동결건조될 수 있고, 동결건조된 제제는 투여 전에 멸균 수성 부형제와 조합된다. 제제의 pH는 전형적으로 3 내지 11, 보다 바람직하게는 5 내지 9 또는 6 내지 8, 가장 바람직하게는 7 내지 8, 예컨대 7 내지 7.5일 것이다.
본원 개시내용의 약제학적 조성물은 치료 용도로 적용된다. 따라서, 본원 개시내용의 한 양태는 치료학적 유효량의 본원 개시내용의 약제학적 조성물을 상기 대상체에게 투여함으로써 질환 또는 병태를 앓고 있는 인간을 포함하지만 이에 제한되지 않는 대상체를 치료하는데 사용될 수 있는 약제학적 조성물을 제공한다. 특정 구현예에서, 상기 질환 또는 병태는 본원에 기재된 바와 같은 암이다.
특정 구현예에서, 본원 개시내용은 이를 필요로 하는 대상체의 치료를 위한 약제 제조를 위한 본원에 기재된 바와 같은 치료학적 유효량의 약제학적 조성물의 용도를 특징으로 한다.
약제학적으로-허용되는 부형제
본원 개시내용에 유용한 약제학적으로-허용되는 부형제는 전형적으로 통상적이다. 문헌 Remington's Pharmaceutical Sciences, by E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 15th Edition (1975)은 하나 이상의 치료 조성물의 약제학적 전달에 적합한 조성물 및 제형을 기술한다. 약제학적으로-허용되는 부형제로서 작용할 수 있는 물질의 일부 예는 다음을 포함한다: 당, 예컨대 락토스, 글루코스 및 슈크로스; 전분, 예컨대 옥수수 전분 및 감자 전분; 셀룰로오스 및 이의 유도체, 예컨대 나트륨 카복시메틸 셀룰로오스, 에틸 셀룰로오스 및 셀룰로오스 아세테이트; 맥아; 젤라틴; 부형제, 예컨대 코코아 버터 및 좌약 왁스; 오일, 예컨대 땅콩유, 면실유, 홍화유, 참기름, 올리브유, 옥수수유 및 대두유; 완충제, 예컨대 수산화마그네슘 및 수산화알루미늄; (등장 식염수; 링거 용액); 에틸 알코올; pH 완충 용액; 폴리올, 예컨대 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등; 및 약제학적 제형에 사용되는 기타 무독성의 양립할 수 있는 물질.
투여 형태
약제학적 조성물은 임의의 의도된 투여 경로를 위한 통상적인 부형제와 함께 제형화될 수 있으며, 이는 통상적인 관행에 따라 선택될 수 있다.
일 구현예에서, 약제학적 조성물은 본원에 기재된 바와 같이 트리루프-함유 이중-가닥 핵산 억제제 분자를 함유하고, 예를 들어, 피하, 근육내, 정맥 내 또는 경막외 주사에 의한 비경구 투여에 적합하다. 전형적으로, 본원 개시내용의 약제학적 조성물은 비경구 투여를 위해 액체 형태로 제형화된다.
비경구 투여에 적합한 투여 형태는 전형적으로, 예를 들어, 멸균 수용액, 식염수, 저분자량 알코올, 예컨대 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물성 오일, 젤라틴, 지방산 에스테르, 예컨대 에틸 올레이트 등을 포함한 비경구 투여에 적합한 하나 이상의 비히클을 포함한다. 비경구 제형은 당, 알코올, 항산화제, 완충제, 제균제 (bacteriostat), 용질을 함유할 수 있고, 이는 제형이 의도된 수용자의 혈액 또는 현탁제 또는 증점제와 등장성이 되도록 한다. 적절한 유동성은, 예를 들어, 계면활성제를 사용하여 유지될 수 있다. 이중-가닥 핵산 억제제를 함유하는 액체 제형은 동결건조되고 멸균 주사 가능한 용액으로 재구성될 때 나중에 사용하기 위해 보관될 수 있다.
약제학적 조성물은 또한 국소 또는 경피 투여, 직장 또는 질 투여, 안구 투여, 비강 투여, 협측 투여, 또는 잘 알려진 기술을 사용한 설하 투여를 포함하는 다른 투여 경로를 위해 제형화될 수 있다.
전달제
본원에 기재된 바와 같은 트리루프-함유 이중-가닥 핵산 억제제 분자는, 혼합, 캡슐화, 접합 또는 달리 다른 분자, 분자 구조 또는 화합물의 혼합물과 회합될 수 있으며, 예를 들어, 미국 특허 번호 제6,815,432호, 제6,586,410호, 제6,858,225호, 제7,811,602호, 제7,244,448호 및 제8,158,601호에 개시된 것들과 같은 리포좀 및 지질; 미국 특허 번호 제6,835,393호, 제7,374,778호, 제7,737,108호, 제7,718,193호, 제8,137,695호 및 미국 공개 특허 출원 번호 제2011/0143434호, 제2011/0129921호, 제2011/0123636호, 제2011/0143435호, 제2011/0142951호, 제2012/0021514호, 제2011/0281934호, 제2011/0286957호 및 제2008/0152661호에 개시된 것들과 같은 중합체 물질; 흡수, 분포 또는 흡수를 돕기 위한 캡시드, 캡소 이드 또는 수용체 표적 분자를 포함한다.
특정 구현예에서, 트리루프-함유 이중-가닥 핵산 억제제 분자는 지질 나노입자 (LNP)로 제형화된다. 지질-핵산 나노입자는 전형적으로 지질과 핵산을 혼합하여 복합체를 형성할 때 자발적으로 형성된다. 원하는 입자 크기 분포에 따라, 생성된 나노입자 혼합물은, 예를 들어, 열 배럴 압출기 (thermobarrel extruder), 예컨대 LIPEX® 압출기 (Northern Lipids, Inc)를 사용하여 폴리카보네이트 막 (예를 들어, 100 nm 컷-오프)을 통해 임의로 압출될 수 있다. 치료용 지질 나노입자를 제조하기 위해, 예를 들어, 투석 또는 접선 유동 여과 (tangential flow filtration)에 의해 달성될 수 있는 나노입자 및/또는 교환 완충제를 형성하는 데 사용되는 용매 (예를 들어, 에탄올)를 제거하는 것이 바람직할 수 있다. 핵산 간섭 분자를 함유하는 지질 나노입자를 제조하는 방법은, 예를 들어, 미국 공개 특허 출원 번호 제2015/0374842호 및 제2014/0107178호에 개시된 바와 같이 당업계에 알려져 있다.
특정 구현예에서, LNP는 양이온성 리포솜 및 페길화된 지질을 포함하는 코어 지질 성분을 포함한다. LNP는 하나 이상의 외피 지질, 예컨대 양이온성 지질, 구조적 또는 중성 지질, 스테롤, 페길화된 지질, 또는 이들의 혼합물을 추가로 포함할 수 있다.
LNP에 사용하기 위한 양이온성 지질은, 예를 들어, 미국 공개 특허 출원 번호 제2015/0374842호 및 제2014/0107178호에서 논의된 바와 같이 당업계에 알려져 있다. 전형적으로, 양이온성 지질은 생리학적 pH에서 순 (net) 양전하를 갖는 지질이다. 특정 구현예에서, 양이온성 리포솜은 DODMA, DOTMA, DL-048 또는 DL-103이다. 특정 구현예에서, 구조적 또는 중성 지질은 DSPC, DPPC 또는 DOPC이다. 특정 구현예에서, 스테롤은 콜레스테롤이다. 특정 구현예에서, 페길화된 지질은 DMPE-PEG, DSPE-PEG, DSG-PEG, DMPE-PEG2K, DSPE-PEG2K, DSG-PEG2K, 또는 DSG-mPEG이다. 일 구현예에서, 양이온성 지질은 DL-048이고, 페길화된 지질은 DSG-mPEG이고, 하나 이상의 외피 지질은 DL-103, DSPC, 콜레스테롤, 및 DSPE-mPEG이다. 예를 들어, 이중-가닥 핵산 억제제 분자를 제형화하는 데 사용될 수 있는 LNP의 비-제한적인 구현예를 나타내는 도 8을 참조한다.
특정 구현예에서, 트리루프-함유 이중-가닥 핵산 억제제 분자는 관심 조직으로 올리고뉴클레오타이드의 전달을 지시하는 리간드에 공유적으로 접합된다. 그러한 많은 리간드가 탐구되었다. 예를 들어, Winkler, Ther. Deliv. 4(7): 791-809 (2013)을 참조한다. 예를 들어, 이중-가닥 핵산 억제제 분자는 하나 이상의 당 리간드 모이어티 (예를 들어, N-아세틸갈락토사민 (GalNAc))에 접합되어 올리고뉴클레오타이드의 간으로의 흡수를 지시할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 제5,994,517호; 미국 특허 번호 제5,574,142호; 제WO 2016/100401호를 참조한다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 리간드는 이중-가닥 핵산 억제제 분자의 트리루프에서 하나 이상의 뉴클레오타이드에 접합된다.
특정 구현예에서, 이중-가닥 핵산 억제제 분자는 트리루프의 2개 또는 3개의 당 리간드 모이어티에 접합된다. 일 구현예에서, 트리루프의 2개 뉴클레오타이드는 당 리간드 모이어티에 접합된다. 또 다른 구현예에서, 트리루프의 3개 뉴클레오타이드는 당 리간드 모이어티에 접합된다. 특정 구현예에서, 당 리간드 모이어티는 GalNAc이다. 일 구현예에서, 당 리간드 모이어티는 GalNAc이고, 트리루프에서 2개 뉴클레오타이드에 접합된다. 일 구현예에서, GalNAc는 GAA 트리루프의 AA 뉴클레오타이드에 접합된다. 사용될 수 있는 다른 리간드는 만노스-6-포스페이트, 콜레스테롤, 폴레이트, 트랜스페린 및 갈락토스를 포함하지만 이에 제한되지 않는다 (다른 특정 예시적 리간드에 대해서는, 예를 들어, 제WO 2012/089352호 참조).
리간드는 관심 조직으로 올리고뉴클레오타이드의 전달을 지시할 수 있는 한 뉴클레오타이드의 임의의 부분에 접합될 수 있다. 특정 구현예에서, 리간드 (예를 들어, GalNAc)는 당 모이어티의 2'-위치에서 뉴클레오타이드에 접합된다.
투여/치료 방법
한 구현예는 치료학적 유효량의 본원에 기재된 바와 같은 트리루프-함유 이중-가닥 핵산 억제제 분자를 포함하는 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하여, 장애를 치료하는 방법에 관한 것이다.
특정 구현예에서, 본원에 개시된 약제학적 조성물은 증식성, 염증성, 자가면역, 신경계, 안구, 호흡기, 대사성, 피부, 청각, 간, 콩팥 또는 감염성 질환과 관련된 증상의 치료 또는 예방에 유용할 수 있다. 한 구현예는 치료학적 유효량의 본원에 기재된 바와 같은 이중-가닥 핵산 억제제 분자를 포함하는 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하여, 증식성, 염증성, 자가면역, 신경계, 안구, 호흡기, 대사성, 피부과, 청각, 간, 콩팥 또는 감염성 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다.
특정 구현예에서, 상기 장애는 희귀 질환, 만성 간 질환, 만성 콩팥 질환, 심혈관 질환 또는 바이러스 감염 질환이다. 특정 구현예에서, 상기 장애는 원발성 고수산뇨증 (PH1, PH2, 또는 PH3) 또는 특발성 고수산뇨증을 포함한 고수산뇨증이다. 특정 구현예에서, 상기 장애는 만성 콩팥 장애 (CKD)이다. 특정 구현예에서, 상기 장애는 피루베이트 탈수소효소 결핍증이다. 특정 구현예에서, 상기 장애는 알파-1 항트립신 (A1AT) 결핍증이다.
특정 구현예에서, 상기 장애는 암이다. 그러한 암의 비제한적인 예는 담도암, 방광암, 이행 세포 암종, 요로상피 세포 암종, 뇌암, 신경교종, 성상 세포종, 유방 암종, 화생 암종, 자궁 경부암, 자궁 경부 편평 세포 암종, 직장암, 결장직장 암종, 결장암, 유전성 비폴립성 결장직장암, 결장직장 선암, 위장관 기질 종양 (GIST), 자궁내막 암종, 자궁내막 기질 육종, 식도암, 식도 편평 세포 암종, 식도 선암, 안구 흑색종, 포도막 흑색종, 담낭 암종, 담낭 선암, 신장 세포 암종, 투명 세포 신장 세포 암종, 이행 세포 암종, 요로상피 세포 암종, 윌름스 종양, 백혈병, 급성 림프구성 백혈병 (ALL), 급성 골수성 백혈병 (AML), 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 만성 골수성 백혈병 (CML), 만성 골수단구성 백혈병 (CMML), 간암, 간 암종, 간세포암, 간세포 암종, 담광암종, 간모세포종, 폐암, 비-소세포 폐암 (NSCLC), 중피종, B-세포 림프종, 비호지킨 림프종, 미만성 거대 B-세포 림프종, 맨틀 세포 림프종, T-세포 림프종, 비호지킨 림프종, 전구체 T-림프모세포 림프종/백혈병, 말초 T-세포 림프종, 다발성 골수종, 비인두 암종 (NPC), 신경모세포종, 구인두암, 구강 편평 세포 암종, 골육종, 난소 암종, 췌장암, 췌관 선암, 가유두상 신생물, 선포 세포 암종, 전립선암, 전립선 선암, 피부암, 흑색종, 악성 흑색종, 피부 흑색종, 소장 암종, 위암, 위 암종, 위장 기질 종양 (GIST), 자궁암, 또는 자궁 육종을 포함한다. 전형적으로, 본원 개시내용은 본원에 기재된 바와 같은 치료학적 유효량의 약제학적 조성물을 투여함으로써 간암, 간 암종, 간세포암, 간세포 암종, 담관암 및 간모세포종을 치료하는 방법을 특징으로 한다.
일부 구현예에서, 본원 개시내용은 표적 유전자의 발현을 감소시키기에 충분한 양으로 이를 필요로 하는 대상체에게 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하여, 대상체에서 표적 유전자의 발현을 감소시키는 방법을 제공하고, 여기서, 상기 약제학적 조성물은 본원에 기재된 바와 같은 트리루프-함유 이중-가닥 핵산 억제제 분자 및 본원에 또한 기재된 바와 같은 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함한다.
표적 유전자는 임의의 포유류, 예컨대 인간 표적 유전자로부터의 표적 유전자일 수 있다. 임의의 표적 유전자는 본 방법에 따라 사일런싱될 수 있다. 특정 구현예에서, 표적 유전자는, 예를 들어, AGXT, GRHPR, HOGA1, HAO1, SERPINA1, 또는 LDHA를 포함한 만성 간 질환 또는 만성 콩팥 질환과 관련된다. 특정 구현예에서, 표적 유전자는, 예를 들어, HBV 유전자 또는 HCV 유전자를 포함한 바이러스 감염성 질환과 관련된다. 특정 구현예에서, 표적 유전자는, 예를 들어, APOC3 또는 PCSK9를 포함한 심혈관 질환과 관련된다. 특정 구현예에서, 표적 유전자는, 예를 들어, ALDH2를 포함한 알코올 대사 및 간 기능과 관련된다.
다른 예시적인 표적 유전자는 KRAS, 인자 VII, Eg5, PCSK9, TPX2, apoB, SAA1, TTR, PDGF 베타 유전자, Erb-B 유전자, Src 유전자, CRK 유전자, GRB2 유전자, RAS 유전자, MEKK 유전자, JNK 유전자, RAF 유전자, Erk1/2 유전자, PCNA(p21) 유전자, MYB 유전자, JUN 유전자, FOS 유전자, BCL-2 유전자, 사이클린 (Cyclin) D 유전자, VEGF 유전자, EGFR 유전자, 사이클린 A 유전자, 사이클린 E 유전자, WNT-1 유전자, 베타-카테닌 유전자, c-MET 유전자, PKC 유전자, NFKB 유전자, STAT3 유전자, 서비빈 (survivin) 유전자, Her2/Neu 유전자, 토포이소머라제 I 유전자, 토포이소머라제 II 알파 유전자, p73 유전자, p21(WAF1/CIP1) 유전자, p27(KIP1) 유전자, PPM1D 유전자, RAS 유전자, 카베올린 (caveolin) I 유전자, MIB I 유전자, MTAI 유전자, M68 유전자, 종양 억제 유전자에서의 돌연변이, p53 종양 억제 유전자, 및 이들의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
투약 및 스케쥴
전형적으로, 이중-가닥 핵산 억제제 분자는 비경구 (예컨대, 정맥내, 근육내, 또는 피하 투여를 통해)로 투여된다. 다른 구현예에서, 약제학적 조성물은 국소 투여 또는 전신 투여를 통해 전달된다. 그러나, 본원에 개시된 약제학적 조성물은 또한, 예를 들어, 협측, 설하, 직장, 질, 요도내, 국소, 안구내, 비강내 및/또는 귀내 (intraauricular)를 포함한 당업계에 알려진 임의의 방법에 의해 투여될 수 있는데, 투여는 정제, 캡슐, 과립, 수성 현탁액, 겔, 스프레이, 좌약, 연고 (salve), 연고 (ointment) 등을 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 이중-가닥 핵산 억제제 분자는 1일 당 수용자의 체중 킬로그램 당 20 마이크로그램 내지 10 밀리그램, 킬로그램 당 100 마이크로그램 내지 5 밀리그램, 킬로그램 당 0.1 밀리그램 내지 5.0 밀리그램, 킬로그램 당 0.25 밀리그램 내지 5.0 밀리그램, 또는 킬로그램 당 0.2 밀리그램 내지 3.0 밀리그램의 투여량으로 투여된다. 전형적으로, 이중-가닥 핵산 억제제 분자는 1일당 수용자의 체중 킬로그램 당 약 0.25 밀리그램 내지 2.0 밀리그램, 예컨대 1일 당 수용자의 체중 킬로그램 당 0.3 밀리그램, 1일 당 수용자의 체중 킬로그램 당 0.5 밀리그램, 또는 1일 당 수용자의 체중 킬로그램 당 1 밀리그램의 투여량으로 투여된다.
본원 개시내용의 약제학적 조성물은 매일 또는 간헐적으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 이중-가닥 핵산 억제제 분자의 간헐적 투여는 1주 당 1 내지 6일, 1개월 당 1 내지 6일, 주 1회, 격주 1회, 월 1회, 격월 1회, 3개월마다 1회, 또는 1년 당 1회 또는 2회 또는 매년, 매월, 매주, 또는 1일 용량으로 나누어 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 간헐적 투여는 초기 이중-가닥 핵산 억제제 분자 투여로 주기적으로 평균 투여한 후 최대 1주, 최대 1개월, 최대 2개월, 최대 3개월 또는 최대 6개월 동안 투여하지 않은 휴식 기간을 의미할 수 있거나, 격일, 격주, 격월 또는 격년으로 투여함을 의미할 수 있다.
치료학적 유효량의 이중-가닥 핵산 억제제 분자는 투여 경로 및 환자의 신체적 특성, 예컨대 대상체의 크기 및 체중, 질환 진행 또는 침투 정도, 대상체의 연령, 건강 및 성별에 따라 달라질 수 있고, 이들 및 기타 요인에 따라 필요에 따라 조정될 수 있다.
실시예
실시예 1: 트리루프 및 테트라루프를 함유하는 이중-가닥 핵산 억제제 분자의 생체내 용량 반응
다양한 줄기 길이 이외에 테트라루프 및 트리루프를 함유하는 이중-가닥 핵산 억제제 분자는 용량-반응 연구에서 평가되었다. CD-1 암컷 마우스를 연구 그룹으로 나누고 그 그룹에 할당된 시험 핵산 억제제 분자를 투여하였다. 4마리의 CD-1 암컷 마우스에게 각각 0.1 mg/kg, 0.2 mg/kg, 0.4 mg/kg, 0.8 mg/kg, 1.6 mg/kg, 및 3.2 mg/kg의 5개의 시험된 핵산 억제제 분자를 각각 투여하였다. 추가로, 4마리의 대조군 CD-1 마우스에게 위약 (PBS)을 투여하여 총 샘플 크기가 124마리였다. 투여는 피하 및 단일 용량이었고, 마우스는 투여 4일 후 희생시켰다. 약력학 연구를 수행하고, RT-qPCR을 위해 간 샘플을 취하였다. 조직 샘플은 TissueLyser II (Qiagen, Valencia, CA)를 사용하여 QIAzol® 용해 시약에서 균질화하였다. 이어서, RNA는 제조사 지침 (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA)에 따라 MagMAX 기술을 사용하여 정제되었다. 고용량 cDNA 역전사 키트 (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA)를 사용하여 cDNA를 제조하였다. CFX384 실시간 PCR 검출 시스템 (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA)에서 PCR을 위해 표적 서열에 대한 프라이머를 사용하였다.
실시예 1에 사용된 5개의 시험 핵산 억제제 분자 (작제물 1 내지 5)는 도 2a 내지 2e에 나타낸다. GalNAc 및 바이사이클릭 뉴클레오타이드에 접합된 루프의 뉴클레오타이드를 제외하고, 시험 핵산 억제제 분자에서 다른 모든 뉴클레오타이드는 2'-F 또는 2'-OMe로 당 모이어티의 2'-위치에서 변형된다. 시험 핵산 억제제 분자는 다음과 같은 점에서 상이하였다: 루프 부분의 길이 (테트라루프 대 트리루프); 줄기 부분의 길이 (6개 염기 쌍 대 3개 염기 쌍); 바이사이클릭 뉴클레오타이드의 존재 또는 부재; 및 루프의 GalNAcs의 수 (2 대 3). 도 2a 내지 2e의 핵산 억제제 분자는 다음 표에 요약되어 있다.
표 1: 도 1의 시험 핵산 억제제
Figure pct00031
긴 줄기 (6개 염기 쌍) 테트라루프 작제물 1 및 2는 동일한데, 유일한 차이점은 루프의 수 (3 대 2)이다. 긴 줄기 작제물 2는 작제물 2가 테트라루프를 갖는 반면 작제물 3이 루프를 갖는다는 것을 제외하고는, 긴 줄기 작제물 3과 동일하다. 긴 줄기 작제물 3은 작제물 3이 6개 염기 쌍의 줄기 듀플렉스를 갖고 바이사이클릭 뉴클레오타이드를 갖지 않는 반면 작제물 4는 3개 염기 쌍의 줄기 듀플렉스를 갖는 것을 제외하고는 짧은 줄기 (3개 염기 쌍) 작제물 4와 동일하고, 여기서, 줄기 듀플렉스의 모든 뉴클레오타이드는 바이사이클릭 뉴클레오타이드이다. 짧은 줄기 작제물 4 및 5는 동일한데, 작제물 4의 줄기에 6개의 BNANC[NMe]가 존재하고 작제물 5의 줄기에 6개의 LNA 바이사이클릭 뉴클레오타이드가 존재하는 것이 단지 다르다. 작제물 4에 사용된 바이사이클릭 뉴클레오타이드는 BNANC[NMe]이고, 여기서, 바이사이클릭 뉴클레오타이드의 2'-탄소와 4'-탄소를 연결하는 브릿지는 4'-CH2-N(CH3)-O-2'이다. 작제물 5에 사용된 바이사이클릭 뉴클레오타이드는 LNA이고, 여기서, 바이사이클릭 뉴클레오타이드의 2'-탄소와 4'-탄소를 연결하는 브릿지는 4'-(CH2)-O-2'이다.
유효 용량 (ED50) 곡선은 비선형 회귀 분석 (GraphPad Prism 소프트웨어)을 사용하여 로그 [mg/kg]에 걸쳐 PBS 대비 남아있는 50% 표적 유전자를 기반으로 계산되었다. 테트라루프 긴 줄기 (6개 염기 쌍) 핵산 분자는 트리루프 긴 줄기 핵산 분자와 비교되었다. 추가로, BNANC[NMe]를 포함하는 트리루프 짧은 줄기 (3개 염기 쌍) 핵산 억제제 분자를 LNA를 포함하는 상응하는 트리루프 짧은 줄기 핵산 분자와 비교하였다. 이들은 또한 바이사이클릭 뉴클레오타이드 없이 트리루프 및 테트라루프 긴 줄기 (줄기의 6개 염기 쌍) 핵산 분자와 비교하였다. 도 3 및 4에 나타낸 바와 같이, 짧은 줄기에 바이사이클릭 뉴클레오타이드를 포함하는 트리루프 긴 줄기 핵산 억제제 분자 (작제물 3) 및 트리루프 짧은 줄기 핵산 분자 (작제물 4 및 5)는 2개 또는 3개의 GalNAc를 포함하는 상응하는 테트라루프 핵산 분자 (작제물 1 및 2)와 비교하여 표적 유전자 녹다운의 유사한 효능을 나타냈다.
실시예 2: 표적 유전자 녹다운을 위한 테트라루프 및 트리루프를 함유하는 이중-가닥 핵산 억제제 분자의 생체내 효능
CD-1 암컷 마우스를 연구 그룹으로 나누고, 그 그룹에 할당된 시험 핵산 억제제 분자를 투여하였다. 실시예 2에 사용된 시험 핵산 억제제 분자 (작제물 6 내지 13)는 도 6a 내지 6h에 나타낸다. 작제물 1 (도 2a 참조) 또한 사용되었다. GalNAc 및 바이사이클릭 뉴클레오타이드에 접합된 루프의 뉴클레오타이드를 제외하고, 시험 핵산 억제제 분자에서 다른 모든 뉴클레오타이드는 2'-OMe 또는 2'-F로 당 모이어티의 2'-위치에서 변형된다. 시험 핵산 억제제 분자는 다음과 같은 점에서 상이하였다: 루프 부분의 길이 (테트라루프 대 트리루프); 줄기 부분의 길이 (6개 염기 쌍, 3개 염기 쌍, 2개 염기 쌍, 및 1개 염기 쌍); 바이사이클릭 뉴클레오타이드의 존재 또는 부재. 도 6a 내지 6h의 핵산 억제제 분자는 다음 표에 요약되어 있다.
표 2: 도 6의 시험 핵산 억제제
Figure pct00032
긴 줄기 (6개 염기 쌍) 작제물 6 및 7은 동일한데, 루프에서 GalNAc의 수 (테트라루프 대 트리루프)가 단지 다르다. 작제물 1은 테트라루프에 접합된 3개의 GalNAc를 포함하는 반면 작제물 6은 테트라루프에 접합된 2개의 GalNAc를 포함하는 것을 제외하고는, 작제물 1은 작제물 6과 동일하다. 작제물 8은 테트라루프를 갖는 반면 작제물 9는 트리루프를 갖는 것을 제외하고는, 작제물 8 (3개 염기 쌍 줄기)은 작제물 9 (3개 염기 쌍 줄기)와 동일하다. 작제물 10 및 11 (2 염기 쌍 줄기)은 동일한데, 작제물 10이 테트라루프를 갖는 반면 작제물 11이 트리루프를 갖는 것이 단지 다르다. 작제물 12 및 13 (1개 염기 쌍 줄기)은 동일한데, 작제물 12가 테트라루프를 갖는 반면 작제물 13이 트리루프를 갖는 것이 단지 다르다. 작제물 8 내지 13에 사용된 바이사이클릭 뉴클레오타이드는 BNANC[NMe]이다.
동물에게 할당된 시험 핵산 억제제 분자의 단일 0.5 mg/kg 용량을 피하 투여하고, 투여 4일 후에 마우스를 희생시켰다. 이 후, mRNA 분석을 위해 Invitrogen™ RNAlater™ 용액 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)에 보관된 2개의 4 mm 펀치 생검을 취하여 간 조직을 수집하였다. 조직 샘플은 TissueLyser II (Qiagen, Valencia, CA)를 사용하여 QIAzol® 용해 시약에서 균질화하였다. 이어서, RNA는 제조사 지침 (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA)에 따라 MagMAX 기술을 사용하여 정제되었다. 고용량 cDNA 역전사 키트 (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA)를 사용하여 cDNA를 제조하였다. CFX384 실시간 PCR 검출 시스템 (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA)에서 PCR을 위해 표적 서열에 대한 프라이머를 사용하였다.
트리루프 시험 핵산 억제제 분자 (작제물 7, 9, 11, 및 13)는 시험 핵산 분자 (각각 작제물 1, 6, 8, 10, 및 12)의 상응하는 테트라루프 버전과 비교하였다. 도 7에 입증된 바와 같이, 트리루프를 함유하는 시험 핵산 억제제 분자는 6개 염기 쌍, 3개 염기 쌍 및 2개 염기 쌍 작제물에 대한 상응하는 테트라루프 시험 핵산 분자와 비교하여 표적 유전자 mRNA의 유사한 녹다운을 나타냈다. 2개 GalNAc에 접합된 트리루프를 함유하고 줄기에 2개 염기 쌍을 갖는 작제물 11은 줄기에서 3개 GalNAc 및 6개 염기 쌍에 접합된 트리루프를 함유하는 작제물 1보다 더 높은 효능을 가졌다. 트리루프를 함유하고 줄기에 1개 염기 쌍을 갖는 작제물 13은 표적 유전자 mRNA의 녹다운을 나타내지 않는 반면, 테트라루프 및 줄기의 1개 염기 쌍을 함유하는 작제물 12는 표적 유전자 mRNA의 상당한 녹다운을 나타냈다.

Claims (29)

  1. 이중-가닥 핵산 억제제 분자로서,
    20 내지 65개 뉴클레오타이드를 포함하고 제1 영역 (R1) 및 제2 영역 (R2)을 갖는 센스 가닥;
    15 내지 40개 뉴클레오타이드를 포함하는 안티센스 가닥으로서, 여기서, 상기 센스 가닥 및 상기 안티센스 가닥은 별도의 가닥인, 안티센스 가닥; 및
    상기 센스 가닥의 제1 영역 및 상기 안티센스 가닥에 의해 형성된 제1 듀플렉스 (D1)로서, 여기서, 상기 제1 듀플렉스는 15 내지 40개 염기 쌍의 길이를 갖는, 제1 듀플렉스 (D1)를 포함하고;
    여기서, 상기 센스 가닥의 제2 영역은 제1 서브영역 (S1), 제2 서브영역 (S2), 및 상기 제1 영역과 상기 제2 영역을 연결하는 트리루프 (triloop) (triL)를 포함하고, 여기서, 상기 제1 영역과 제2 영역은 제2 듀플렉스 (D2)를 형성하는, 이중-가닥 핵산 억제제 분자.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 트리루프는 GAA의 뉴클레오타이드 서열을 갖는, 이중-가닥 핵산 억제제 분자.
  3. 청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 센스 가닥은 22 내지 65개, 25 내지 39개, 또는 27 내지 35개 뉴클레오타이드를 갖는, 이중-가닥 핵산 억제제 분자.
  4. 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 상기 안티센스 가닥은 20 내지 24개 또는 20 내지 22개 뉴클레오타이드를 갖는, 이중-가닥 핵산 억제제 분자.
  5. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 트리루프의 5'-말단에 바로 인접한 뉴클레오타이드는 C이고, 상기 트리루프의 3'-말단에 바로 인접한 뉴클레오타이드는 G인, 이중-가닥 핵산 억제제 분자.
  6. 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항에 있어서, 상기 안티센스 가닥은 이의 3'-말단에 1 내지 4개 뉴클레오타이드의 단일 가닥 오버행을 갖는, 이중-가닥 핵산 억제제 분자.
  7. 청구항 6에 있어서, 상기 단일 가닥 오버행은 2개 뉴클레오타이드의 길이인, 이중-가닥 핵산 억제제 분자.
  8. 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 듀플렉스는 18 내지 30개, 18 내지 24개, 또는 20 내지 22개 염기 쌍의 길이를 갖는, 이중-가닥 핵산 억제제 분자.
  9. 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 듀플렉스는 2 내지 6개 염기 쌍의 길이를 갖는, 이중-가닥 핵산 억제제 분자.
  10. 청구항 1 내지 9 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 듀플렉스는 바이사이 클릭 뉴클레오타이드와 같은 적어도 하나의 Tm-증가 뉴클레오타이드를 포함하는, 이중-가닥 핵산 억제제 분자.
  11. 청구항 1 내지 10 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 듀플렉스는 2개 또는 3개 염기 쌍의 길이를 갖는, 이중-가닥 핵산 억제제 분자.
  12. 청구항 1 내지 11 중 어느 한 항에 있어서, 상기 센스 가닥의 제1 영역은 20개 뉴클레오타이드의 길이이고, 상기 센스 가닥의 제2 영역은 7 내지 15개 뉴클레오타이드의 길이이고;
    여기서, 상기 센스 가닥의 제1 영역 및 상기 안티센스 가닥에 의해 형성된 상기 제1 듀플렉스는 20개 염기 쌍의 길이를 갖고;
    여기서, 상기 센스 가닥의 제2 영역의 제1 및 제2 핵산에 의해 형성된 상기 제2 듀플렉스는 2 내지 6개 염기 쌍의 길이를 갖고;
    여기서, 상기 안티센스 가닥은 22개 뉴클레오타이드의 길이를 갖고, 이의 3'-말단에서 2개 뉴클레오타이드의 단일-가닥 오버행을 갖는, 이중-가닥 핵산 억제제 분자.
  13. 청구항 1 내지 12 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 듀플렉스에서 각각의 뉴클레오타이드는 Tm-증가 뉴클레오타이드, 예컨대 바이사이클릭 뉴클레오타이드인, 이중-가닥 핵산 억제제 분자.
  14. 청구항 13에 있어서, 상기 제2 듀플렉스는 6개 염기 쌍의 길이를 갖는, 이중-가닥 핵산 억제제 분자.
  15. 청구항 1 내지 14 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 듀플렉스는 적어도 하나의 Tm-증가 뉴클레오타이드를 포함하고, 상기 Tm-증가 뉴클레오타이드는 다음 중 하나 이상으로부터 선택되는 바이사이클릭 뉴클레오타이드인, 이중-가닥 핵산 억제제 분자:
    Figure pct00033

    Figure pct00034

    Figure pct00035

    여기서, B는 핵염기이고, R2는 H 또는 CH3이고, Wa 및 Wb는 각각 독립적으로 H, OH,
    하이드록실 보호기, 인 모이어티, 또는 상기 바이사이클릭 뉴클레오타이드를 또 다른 뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드에 부착하는 뉴클레오타이드간 연결기 (internucleotide linking group)이고, 여기서, Wa 또는 Wb 중 적어도 하나는 상기 바이사이클릭 뉴클레오타이드를 올리고뉴클레오타이드에 부착하는 뉴클레오타이드간 연결기이다.
  16. 청구항 1 내지 15 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 듀플렉스는 제1 고리를 포함하는 적어도 하나의 바이사이클릭 뉴클레오타이드를 포함하고, 여기서, 상기 제1 고리는 푸라노실이고, 상기 푸라노실의 2'-탄소와 4'-탄소를 연결하는 브릿지는 제2 고리를 형성하는, 이중-가닥 핵산 억제제 분자.
  17. 청구항 16에 있어서, 상기 푸라노실의 2'-탄소와 4'-탄소를 연결하는 브릿지는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 이중-가닥 핵산 억제제 분자:
    a) 예를 들어, 4'-CH2-NH-O-2' (BNANC로도 알려져 있음) 또는 4'-CH2-N(CH3)-O-2' (BNANC[NMe]로도 알려져 있음)를 포함한 4'-CH2-O-N(R)-2' 및 4'-CH2-N(R)-O-2', 여기서, R은 H, C1-C12 알킬, 또는 보호기이다;
    b) 4'-CH2-2'; 4'-(CH2)2-2'; 4'-(CH2)3-2'; 4'-(CH2)-O-2' (LNA로도 알려져 있음); 4'-(CH2)-S-2'; 4'-(CH2)2-O-2' (ENA로도 알려져 있음); 4'-CH(CH3)-O-2' (cEt로도 알려져 있음); 및 4'-CH(CH2OCH3)-O-2' (cMOE로도 알려져 있음), 및 이들의 유사체;
    c) 4'-C(CH3)(CH3)-O-2' 및 이의 유사체;
    d) 4'-CH2-N(OCH3)-2' 및 이의 유사체;
    e) 4'-CH2-O-N(CH3)-2' 및 이의 유사체;
    f) 4'-CH2-C(H)(CH3)-2' 및 이의 유사체; 및
    g) 4'-CH2-C(=CH2)-2' 및 이의 유사체.
  18. 청구항 1 내지 17 중 어느 한 항에 있어서, 상기 트리루프는 적어도 하나의 리간드 접합된 뉴클레오타이드를 포함하는, 이중-가닥 핵산 억제제 분자.
  19. 청구항 1 내지 18 중 어느 한 항에 있어서, 상기 트리루프는 적어도 2개의 리간드 접합된 뉴클레오타이드를 포함하는, 이중-가닥 핵산 억제제 분자.
  20. 청구항 18 또는 19에 있어서, 상기 리간드는 GalNAc인, 이중-가닥 핵산 억제제 분자.
  21. 청구항 20에 있어서, 상기 GalNAc는 당 모이어티의 2'-위치에서 상기 뉴클레오타이드에 접합되는, 이중-가닥 핵산 억제제 분자.
  22. 청구항 1 내지 21 중 어느 한 항에 있어서, 상기 센스 가닥 및/또는 상기 안티센스 가닥의 5'-말단에서 5'-포스페이트 모방체를 추가로 포함하는, 이중-가닥 핵산 억제제 분자.
  23. 청구항 1 내지 22 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이중 가닥 핵산 억제제 분자는 지질 나노입자로 제형화되는, 이중-가닥 핵산 억제제 분자.
  24. 청구항 23에 있어서, 상기 지질 나노입자는 코어 지질 및 외피 지질을 포함하고, 여기서, 상기 코어 지질은 제1 양이온성 지질 및 제1 페길화된 지질을 포함하고, 상기 외피 지질은 제2 양이온성 지질, 중성 지질, 스테롤, 및 제2 페길화된 지질을 포함하는, 이중-가닥 핵산 억제제 분자.
  25. 청구항 24에 있어서, 상기 제1 양이온성 지질은 DL-048이고, 상기 제1 페길화된 지질은 DSG-MPEG이고, 상기 제2 양이온성 지질은 DL-103이고, 상기 중성 지질은 DSPC이고, 상기 스테롤은 콜레스테롤이고, 상기 제2 페길화된 지질은 DSPE-MPEG인, 이중-가닥 핵산 억제제 분자.
  26. 치료학적 유효량의 청구항 1 내지 25 중 어느 한 항의 이중-가닥 핵산 억제제 분자 및 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물.
  27. 표적 유전자의 발현을 감소시키기에 충분한 양으로 표적 유전자의 발현 감소를 필요로 하는 대상체에게 청구항 1 내지 26 중 어느 한 항의 이중-가닥 핵산 억제제 분자 또는 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하여, 대상체에서 표적 유전자의 발현을 감소시키는 방법.
  28. 청구항 27에 있어서, 상기 투여는 정맥내, 근육내, 또는 피하 투여를 포함하는, 방법.
  29. 청구항 27 또는 28에 있어서, 상기 대상체는 인간인, 방법.
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