CN113454221A - 含有三元环的双链核酸抑制剂分子 - Google Patents

含有三元环的双链核酸抑制剂分子 Download PDF

Info

Publication number
CN113454221A
CN113454221A CN201980091916.3A CN201980091916A CN113454221A CN 113454221 A CN113454221 A CN 113454221A CN 201980091916 A CN201980091916 A CN 201980091916A CN 113454221 A CN113454221 A CN 113454221A
Authority
CN
China
Prior art keywords
nucleic acid
stranded nucleic
acid inhibitor
nucleotide
inhibitor molecule
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201980091916.3A
Other languages
English (en)
Inventor
B·D·布朗
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Dicerna Pharmaceuticals Inc
Original Assignee
Dicerna Pharmaceuticals Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Dicerna Pharmaceuticals Inc filed Critical Dicerna Pharmaceuticals Inc
Publication of CN113454221A publication Critical patent/CN113454221A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/549—Sugars, nucleosides, nucleotides or nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/5123—Organic compounds, e.g. fats, sugars
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/321—2'-O-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/322—2'-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/323—Chemical structure of the sugar modified ring structure
    • C12N2310/3231—Chemical structure of the sugar modified ring structure having an additional ring, e.g. LNA, ENA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C12N2310/3515—Lipophilic moiety, e.g. cholesterol
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/50—Physical structure
    • C12N2310/53—Physical structure partially self-complementary or closed
    • C12N2310/531—Stem-loop; Hairpin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

本文提供了具有带茎环结构的有义链以及反义链的双链核酸抑制剂分子，其中所述茎环结构的环部分是三元环。还提供了用于降低靶基因表达的方法和组合物以及用于治疗所关注的疾病的方法和组合物。

Description

含有三元环的双链核酸抑制剂分子
技术背景
本申请要求2018年12月12日提交的美国临时专利申请号62/778,759的权益，并且依赖于其提交日期，所述申请的全部内容以引用的方式并入本文。
寡核苷酸是核苷酸(RNA、DNA及其类似物)的聚合序列。核酸抑制剂分子是调节细胞内RNA水平的寡核苷酸，并且已经在癌症、病毒感染和遗传病症的治疗中显示出早期前景。核酸抑制剂分子可以通过一系列不同的机制，包括RNA干扰(RNAi)，来调节RNA表达。
RNAi是在大多数真核生物中发现的保守途径，其中双链RNA分子(dsRNA)抑制具有与所述dsRNA互补的序列的靶基因的表达。在典型的RNAi途径中，较长的dsRNA分子被Dicer酶裂解成较短的RNA双链体，称为小干扰RNA(“siRNA”)。siRNA已显示与Dicer、反式激活应答RNA结合蛋白(TRBP)和Argonaute 2(“Ago2”)结合形成复合物，有时称为RNA诱导的沉默复合物(“RISC”)。Ago2一旦被激活，就是一种内切核酸酶，其使用siRNA的反义链(也称为引导链)将RISC复合物的序列特异性引导朝向靶mRNA的裂解来裂解靶mRNA。
这些年来，已经开发出多种双链RNAi抑制剂分子结构。例如，关于RNAi抑制剂分子的早期研究集中在模拟天然siRNA的双链核酸分子上，每条链的大小为19-25个核苷酸，具有至少一个1至5个核苷酸的3'-突出端(参见例如美国专利号8,372,968)。随后，开发出了由Dicer酶在体内加工成活性RNAi抑制剂分子的较长双链RNAi抑制剂分子(参见例如美国专利号8,883,996)。后来的研究开发出了延伸的双链核酸抑制剂分子，其中至少一条链的至少一端延伸超出分子的双链靶向区域，包括其中一条链包含热力学稳定的四元环(tetraloop)结构的结构(参见例如美国专利号8,513,207、美国专利号8,927,705、WO2010/033225和WO 2016/100401，其各自以引用方式整体并入本文)。
在某些情况下，已将化学修饰的核苷酸引入核酸抑制剂分子中以引入在特定条件下(诸如体内施用后经历的条件)可能期望的特性。此类化学修饰的核苷酸包括被设计成，例如，稳定对抗核酸酶或降解或干扰寡核苷酸的结构或活性的其他酶、增加寡核苷酸的细胞摄取或改善寡核苷酸的药代动力学特性的那些核苷酸。
然而，开发新的双链核酸抑制剂分子和/或掺入化学修饰的核苷酸以对此类核酸抑制剂分子赋予期望特性的愿望必须与使结构和/或化学修饰的核苷酸可能对核酸抑制剂分子活性所具有的任何负面影响最小化的竞争愿望相平衡(例如，使基因靶点敲减的效力或持续时间的任何减少最小化)。
发明内容
本文公开了具有带茎环结构的有义链以及单独的反义链的双链核酸抑制剂分子，其中所述茎环结构的环部分含有三元环(triloop)。如实施例所示，含有三元环的双链核酸抑制剂是稳定的，并以剂量依赖性方式降低体内靶mRNA的表达。令人惊讶的是，当这个三元环结构从其天然存在的环境中移除并掺入到化学合成的双链核酸抑制剂分子中时，其能够保持热力学稳定的构型。还令人惊讶地发现，将配体(诸如GalNAc)与三元环中的核苷酸缀合不会破坏三元环的热力学稳定构型，并且与使3个GalNAc与四元环缀合的含四元环的双链核酸抑制剂分子相比，将2个GalNAc与三元环缀合不会降低在肝细胞中的效力，在某些情况下实际上提高了效力。
另外，含有三元环的双链核酸抑制剂分子可以将双环核苷酸掺入到茎环结构的茎部分中。如先前在国际公开号WO 2019/200124中所证明的，将增加Tm的核苷酸掺入到茎双链体中可以对含四元环的双链核酸抑制剂分子赋予增加的稳定性，这部分上由体内靶mRNA敲减的持续时间延长得以证明。
此外，使用三元环替代四元环和将双环核苷酸掺入到茎环结构的茎部分中允许较短有义链的使用而不降低包含所述较短有义链的双链核酸抑制剂分子的效力。使用较短的有义链在制造过程中具有优势，减少时间和成本。它还在给药方面具有优势，因为由于其降低的分子量，可以以摩尔为基础施用更多的含三元环的双链核酸抑制剂分子。
双链核酸抑制剂分子包含：在有义链(S)的第一区域(R1)和反义链(AS)之间的第一双链体(D1)和有义链的第二区域(R2)的第一子区域(S1)和第二子区域(S2)之间的第二双链体(D2)，其中S1和S2由三元环(triL)接合。参见图1A-1D。另外，在某些实施方案中，茎环结构的茎部分可以包含至少一个增加Tm的核苷酸，诸如4-12个增加Tm的核苷酸，例如2-6个增加Tm的核苷酸碱基对，或1-6个未配对的增加Tm的核苷酸。茎环结构可位于有义链的5'-或3'-端。
在某些实施方案中，所述双链核酸抑制剂分子，包含：
有义链，其包含20-65个核苷酸并且具有第一区域(R1)和第二区域(R2)；
反义链，其包含15-40个核苷酸，其中所述有义链和所述反义链是单独的链；
第一双链体(D1)，其由有义链的第一区域和反义链形成，其中所述第一双链体具有15-40个碱基对的长度；
其中有义链的第二区域(R2)包含第一子区域(S1)、第二子区域(S2)以及接合第一区域与第二区域的三元环(triL)，其中第一区域和第二区域形成第二双链体(D2)。
在某些实施方案中，三元环具有GAA的核苷酸序列。
在某些实施方案中，有义链具有22-65个核苷酸。在某些实施方案中，有义链具有25-39个核苷酸。在某些实施方案中，有义链具有27-35个核苷酸。
在某些实施方案中，反义链具有20-24个核苷酸。在某些实施方案中，反义链具有20-22个核苷酸。
在某些实施方案中，紧邻三元环的5'-端的核苷酸是C，并且紧邻三元环的3'-端的核苷酸是G。
在某些实施方案中，反义链在其3'-端具有1-4个核苷酸的单链突出端。在某些实施方案中，单链突出端的长度为2个核苷酸。
在某些实施方案中，第一双链体(D1)具有18-30个碱基对的长度。在某些实施方案中，第一双链体(D1)具有18-24个碱基对的长度。在某些实施方案中，第一双链体(D1)具有20-22个碱基对的长度。
在某些实施方案中，第二双链体(D2)具有2-6个碱基对的长度。
在某些实施方式中，第二双链体不包含任何增加Tm的核苷酸，并且在某些实施方式中，第二双链体包含4-10个增加Tm的核苷酸并且具有2-5个碱基对的长度。
在某些实施方案中，有义链的长度在25-39个核苷酸之间，反义链的长度在20-24个核苷酸之间，第一双链体具有18-24个核苷酸的长度，并且第二双链体具有2-6个碱基对的长度。在某些实施方案中，有义链的长度在27-35个核苷酸之间，反义链的长度在20-22个核苷酸之间，第一双链体具有18-22个碱基对的长度，并且第二双链体具有2-3个碱基对的长度。
在某些实施方案中，第二双链体(D2)具有2个碱基对的长度。在某些实施方案中，第二双链体(D2)具有3个碱基对的长度。
在某些实施方案中，有义链的第一区域(R1)的长度为20个核苷酸，并且有义链的第二区域(R2)的长度为7-9个核苷酸；
其中由有义链的第一区域和反义链形成的第一双链体(D1)具有20个碱基对的长度；
其中由有义链的第二区域(R2)的第一子区域(S1)和第二子区域(S2)形成的第二双链体(D2)具有2或3个碱基对的长度，并且其中第二双链体包含至少一个增加Tm的核苷酸；
其中反义链的长度为22个核苷酸并且在其3’-端处具有两个核苷酸的单链突出端；并且
其中三元环具有GAA的核苷酸序列。在某些实施方案中，R2的长度为7个核苷酸，并且D2具有2个碱基对的长度。在某些实施方案中，R2的长度为9个核苷酸，并且D2具有3个碱基对的长度。
在某些实施方案中，第二双链体(D2)中的每个核苷酸都是增加Tm的核苷酸。在某些实施方案中，含三元环的双链核酸抑制剂分子在第二双链体(D2)之外不包含任何增加Tm的核苷酸。
在某些实施方案中，增加Tm的核苷酸选自由以下组成的组：双环核苷酸、三环核苷酸、G-夹及其类似物、己糖醇核苷酸和修饰的核苷酸，其中修饰的核苷酸在糖部分的2'-碳处未用2'-F或2'-OMe修饰。在某些实施方案中，修饰的核苷酸为5-溴-尿嘧啶、5-碘-尿嘧啶、5-丙炔基修饰的嘧啶、2-氨基腺嘌呤、2-硫代尿苷、5Me-硫代尿苷或假尿苷。
在某些实施方案中，其中含三元环的双链核酸抑制剂分子包含至少一个双环核苷酸，所述至少一个双环核苷酸具有式I、II、III、IV、Va或Vb的结构。在某些实施方案中，所述至少一个双环核苷酸具有式Ia、Ib、Ic、Id、Ie或If中的一个或多个的结构。在某些实施方案中，所述至少一个双环核苷酸具有式IIa、IIb、IIc或IId中的一个或多个的结构。在某些实施方案中，所述至少一个双环核苷酸具有式IIIa和/或IIIb的结构。在某些实施方案中，所述至少一个双环核苷酸具有式IVa和/或IVb的结构。
在某些实施方案中，所述至少一个双环核苷酸是以下中的一个或多个：
Figure BDA0003208444980000061
Figure BDA0003208444980000071
Figure BDA0003208444980000081
其中B是核碱基，R2是H或CH3，并且Wa和Wb各自独立地是H、OH、羟基保护基团、磷部分、或将所述双环核苷酸附接到另一个核苷酸或附接到寡核苷酸的核苷酸间连接基团，其中Wa或Wb中的至少一个是将所述双环核苷酸附接到寡核苷酸的核苷酸间连接基团。
在某些实施方案中，所述至少一个双环核苷酸是：
Figure BDA0003208444980000082
其中B、Wa和Wb如上所述，并且R2是CH3。
在某些实施方案中，所述至少一个双环核苷酸包含第一环，其中所述第一环为呋喃糖基，以及连接呋喃糖基的2'-碳和4'-碳以形成第二环的桥。
在某些实施方案中，连接呋喃糖基的2’-碳和4’-碳的桥选自由以下组成的组：
a)4'-CH2-O-N(R)-2'和4'-CH2-N(R)-O-2'，其中R为H、C1-C12烷基或保护基团，包括例如4'-CH2-NH-O-2'(也称为BNANC)或4'-CH2-N(CH3)-O-2'(也称为BNANC[NMe])；
b)4'-CH2-2'、4'-(CH2)2-2'、4'-(CH2)3-2'、4'-(CH2)-O-2'(也称为LNA)、4'-(CH2)-S-2'、4'-(CH2)2-O-2'(也称为ENA)、4'-CH(CH3)-O-2'(也称为cEt)和4'-CH(CH2OCH3)-O-2'(也称为cMOE)，及其类似物；
c)4'-C(CH3)(CH3)-O-2'及其类似物；
d)4'-CH2-N(OCH3)-2'及其类似物；
e)4'-CH2-O-N(CH3)-2'及其类似物；
f)4'-CH2-C(H)(CH3)-2'及其类似物；和
g)4'-CH2-C(＝CH2)-2'及其类似物。
在某些实施方案中，含三元环的双链核酸抑制剂分子在第二双链体之外不包含任何增加Tm的核苷酸。
在某些实施方案中，三元环包含至少一个配体缀合的核苷酸。在某些实施方案中，三元环包含两个配体缀合的核苷酸。在某些实施方案中，三元环包含三个配体缀合的核苷酸。在某些实施方案中，配体为GalNAc。在某些实施方案中，GalNAc在糖部分的2'-位处与核苷酸缀合。
在某些实施方案中，含三元环的双链核酸抑制剂分子还包含在有义链和/或反义链的5'-末端处的5'-磷酸酯模拟物。
在某些实施方案中，含三元环的双链核酸抑制剂分子与脂质纳米颗粒一起配制。在某些实施方案中，脂质纳米颗粒包含核心脂质和包膜脂质，其中所述核心脂质包含第一阳离子脂质和第一聚乙二醇化脂质，并且其中所述包膜脂质包含第二阳离子脂质、中性脂质、固醇和第二聚乙二醇化脂质。在某些实施方案中，第一阳离子脂质为DL-048，第一聚乙二醇化脂质为DSG-mPEG，第二阳离子脂质为DL-103，中性脂质为DSPC，固醇为胆固醇，并且第二聚乙二醇化脂质为DSPE-mPEG。
另一方面涉及一种药物组合物，其包含治疗有效量的如本文所述的含三元环的双链核酸抑制剂分子和药学上可接受的赋形剂。
另一方面涉及一种用于降低受试者中靶基因表达的方法，所述方法包括以足以降低靶基因表达的量向有需要的受试者施用含三元环的双链核酸抑制剂分子或药物组合物。在某些实施方案中，施用步骤包括静脉内、肌内或皮下施用。在某些实施方案中，受试者是人。
附图说明
并入本说明书并且构成本说明书的一部分的附图说明了某些实施方案，并且连同书面描述一起用来解释本文所公开的组合物和方法的某些原理。
图1A示出了具有反义链(“AS”)和有义链(“S”)的示例性双链核酸抑制剂分子的示意图，其中有义链含有茎环结构并且其中环是三元环。
图1B示出了与图1A相同的示例性示意图。在图1B中，有义链进一步分为与反义链(AS)形成双链体的第一区域(R1)和包括接合第一子区域(S1)与第二子区域(S2)的三元环(triL)的第二区域(R2)，其中S1和S2彼此充分互补以形成双链体，在本文中称为“茎”或“茎双链体”。
图1C示意性地示出了与图1A和图1B相同的示例性示意图。图1C的示意图描绘了核酸抑制剂分子中的第一双链体(D1)和第二双链体(D2)。第一双链体(D1)在有义链的第一区域(R1)和反义链(AS)之间形成。第二双链体(D2)或“茎”在有义链(S)的第二区域(R2)的第一子区域(S1)和第二子区域(S2)之间形成。
图1D示意性地示出了示例性双链核酸抑制剂分子，其中第二双链体(D2)比图1C所示的第二双链体短。
图2A示意性地示出了如实施例1中讨论的靶向所关注的基因序列的示例性双链核酸抑制剂分子(“构建体1”)的结构。构建体1的有义链包括6个碱基对的茎双链体和四元环。四元环的四个核苷酸中的三个与单个GalNAc分子缀合。
图2B示意性地示出了如实施例1中所讨论的靶向所关注的基因序列的示例性双链核酸抑制剂分子(“构建体2”)的结构。构建体2的有义链包括6个碱基对的茎双链体和四元环。构建体2的结构与构建体1的结构相同，除了四元环的四个核苷酸中只有两个与单个GalNAc分子缀合，而不是如构建体1中，四个核苷酸中的三个与单个GalNAc分子缀合。
图2C示意性地示出了如实施例1中所讨论的靶向所关注的基因序列的示例性双链核酸抑制剂分子(“构建体3”)的结构。构建体3的有义链包括6个碱基对的茎双链体和三元环。三元环的三个核苷酸中的两个与单个GalNAc分子缀合。构建体3的结构与构建体2的结构相同，除了茎环的环部分是三元环而不是四元环。
图2D示意性地示出了如实施例1中所讨论的靶向所关注的基因序列的示例性双链核酸抑制剂分子(“构建体4”)的结构。构建体4的有义链包括3个碱基对的茎双链体和三元环，其中茎双链体中的每个核苷酸是双环核苷酸。三元环的三个核苷酸中的两个与单个GalNAc分子缀合。
图2E示意性地示出了如实施例1中所讨论的靶向所关注的基因序列的示例性双链核酸抑制剂分子(“构建体5”)的结构。构建体5的有义链包括3个碱基对的茎双链体和三元环，其中茎双链体中的每个核苷酸是LNA。三元环的三个核苷酸中的两个与单个GalNAc分子缀合。
图3A是显示在向CD-1小鼠施用不同剂量的构建体1(参见图2A)并如实施例1中所解释的4天后剩余靶基因mRNA的百分比的图。如图3A所示，计算出的有效剂量(ED50)为0.5726mg/kg。
图3B是显示在向CD-1小鼠施用不同剂量的构建体2(参见图2B)并如实施例1中所解释的4天后剩余靶基因mRNA的百分比的图。如图3B所示，计算出的ED50为0.3604mg/kg。
图3C是显示在向CD-1小鼠施用不同剂量的构建体3(参见图2C)并如实施例1中所解释的4天后剩余靶基因mRNA的百分比的图。如图3C所示，计算出的ED50为0.3144mg/kg。
图3D是显示在向CD-1小鼠施用不同剂量的构建体4(参见图2D)并如实施例1中所解释的4天后剩余靶基因mRNA的百分比的图。如图3D所示，计算出的ED50为0.3012mg/kg。
图3E是显示在向CD-1小鼠施用不同剂量的构建体5(参见图2E)并如实施例1中所解释的4天后剩余靶基因mRNA的百分比的图。如图3E所示，计算出的ED50为0.2325mg/kg。
图4是显示在向CD-1小鼠施用不同剂量的构建体1-5(参见图2A-2E)并如实施例1中所解释的4天后剩余靶基因mRNA的百分比重叠的图。
图5是显示在向CD-1小鼠施用不同剂量的构建体1-5(参见图2A-2E)并如实施例1中所解释的4天后剩余靶基因mRNA的百分比的条形图。
图6A示意性地示出了如实施例2中所讨论的靶向所关注的基因序列的示例性双链核酸抑制剂分子(“构建体6”)的结构。构建体6的有义链包括6个碱基对的茎双链体和四元环。四元环的四个核苷酸中的两个与单个GalNAc分子缀合。
图6B示意性地示出了如实施例2中所讨论的靶向所关注的基因序列的示例性双链核酸抑制剂分子(“构建体7”)的结构。构建体7的有义链包括6个碱基对的茎双链体和三元环。构建体7的结构与构建体6的结构相同，除了构建体7含有三元环而不是四元环。
图6C示意性地示出了如实施例2中所讨论的靶向所关注的基因序列的示例性双链核酸抑制剂分子(“构建体8”)的结构。构建体8的有义链包括3个碱基对的茎双链体和四元环，其中茎环结构的茎部分中的每个核苷酸是BNA。
图6D示意性地示出了如实施例2中所讨论的靶向所关注的基因序列的示例性双链核酸抑制剂分子(“构建体9”)的结构。构建体9的有义链包括3个碱基对的茎双链体和三元环，其中茎环结构的茎部分中的每个核苷酸是BNA。构建体9的结构与构建体8的结构相同，除了构建体9含有三元环而不是四元环。
图6E示意性地示出了如实施例2中所讨论的靶向所关注的基因序列的示例性双链核酸抑制剂分子(“构建体10”)的结构。构建体10的有义链包括2个碱基对的茎双链体和四元环，其中茎环结构的茎部分中的每个核苷酸是BNA。
图6F示意性地示出了如实施例2中所讨论的靶向所关注基因序列的示例性双链核酸抑制剂分子(“构建体11”)的结构。构建体11的有义链包括2个碱基对的茎双链体和三元环，其中茎环结构的茎部分中的每个核苷酸是BNA。构建体11的结构与构建体10的结构相同，除了构建体11含有三元环而不是四元环。
图6G示意性地示出了如实施例2中所讨论的靶向所关注的基因序列的示例性双链核酸抑制剂分子(“构建体12”)的结构。构建体12的有义链包括1个碱基对的茎双链体和四元环，其中茎环结构的茎部分中的两个核苷酸都是BNA。
图6H示意性地示出了如实施例2中所讨论的靶向所关注的基因序列的示例性双链核酸抑制剂分子(“构建体13”)的结构。构建体13的有义链包括1个碱基对的茎双链体和三元环，其中茎环结构的茎部分中的两个核苷酸都是BNA。构建体13的结构与构建体12的结构相同，除了构建体13含有三元环而不是四元环。
图7示出了在向CD-1小鼠施用构建体1(参见图2A)和构建体6-13(参见图6A-6H)后4天剩余的靶基因mRNA的百分比，如实施例2中所述。分别与四元环构建体1、6、8和10相比，在构建体7、9和11中包含三元环没有显著降低基因敲减的效力，并且在某些情况下实际上提高了效力。在茎双链体中包含三元环和双环核苷酸的单碱基对的构建体13没有降低靶mRNA的表达，而相比之下，在茎双链体中包含四元环和双环核苷酸的单碱基对的构建体12表现出靶mRNA表达的强力降低。
图8示出了可用于配制双链核酸抑制剂分子的脂质纳米颗粒(LNP)的一个非限制性实施方案。LNP包括以下核心脂质：DL-048(阳离子脂质)和DSG-mPEG(聚乙二醇化脂质)，以及以下包膜脂质：DL-103(阳离子脂质)、DSPC、胆固醇和DSPE-mPEG(聚乙二醇化脂质)。
定义
为了使本公开更容易理解，下面首先定义某些术语。针对以下术语和其他术语的另外的定义可在整个说明书中阐述。如果以下阐述的术语的定义与以引用方式并入的申请或专利中的定义不一致，则应使用本申请中阐述的定义来理解所述术语的含义。
如在本说明书和所附权利要求书中所使用，除非上下文另外明确指出，否则单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数指代物。因此，例如，提及“一种方法”包括本文所述类型的和/或在阅读本公开后将对本领域技术人员变得清楚的一种或多种方法和/或步骤等。
施用：如本文所用，将组合物“施用”给受试者意指给予、施加组合物或使组合物与受试者接触。施用可以通过许多途径中的任何途径实现，包括例如局部、口服、皮下、肌内、腹膜内、静脉内、鞘内和皮内。
酰基：如本文所用，术语“酰基”是指烷基羰基、环烷基羰基和芳基羰基部分。
烷氧基：如本文所用，术语“烷氧基”是指通过氧原子与分子部分附接的烷基基团。
烯基：如本文所用，术语“烯基”是指具有至少一个碳-碳双键并且具有约2至约20个碳原子的直链或支链烃基基团。“取代的烯基”是指还携带一个或多个取代基的烯基基团。如本文所用，“低级烯基”是指具有2至约6个碳原子的烯基部分。
烷基：如本文所用，术语“烷基”是指具有1至约20个碳原子的直链或支链烃基基团。无论何时在本文中出现，数值范围诸如“C1-C6烷基”意指烷基基团可仅包含1个碳原子、2个碳原子、3个碳原子等，至多并包括6个碳原子，尽管术语“烷基”也包括未指定碳原子的数值范围的情况。例如，术语“烷基”可指C1-C10之间的子范围(例如C1-C6)。“取代的烷基”是指携带取代基的烷基部分。如本文所用，“低级烷基”是指具有1至约6个碳原子的烷基部分。
炔基：如本文所用，“炔基”是指具有至少一个碳-碳三键并且具有约2至约20个碳原子的直链或支链烃基基团。“取代的炔基”是指还携带一个或多个取代基的炔基基团。如本文所用，“低级炔基”是指具有约2至约6个碳原子的炔基部分。
反义链：双链核酸抑制剂分子包含两条寡核苷酸链：反义链和有义链。反义链或其区域与靶核酸的对应区域部分、基本上或完全互补。另外，双链核酸抑制剂分子的反义链或其区域与双链核酸抑制剂分子的有义链或其区域部分、基本上或完全互补。在某些实施方案中，反义链还可含有与靶核酸序列非互补的核苷酸。非互补核苷酸可以在互补序列的任一侧，或者可以在互补序列的两侧。在某些实施方案中，当反义链或其区域与有义链或其区域部分或基本上互补时，非互补核苷酸可位于一个或多个互补区域之间(例如，一个或多个错配)。双链核酸抑制剂分子的反义链也称为引导链。
大约：如本文所用，术语“大约”或“约”当应用于一个或多个所关注的值时，是指类似于所述参考值的值。在某些实施方案中，术语“大约”或“约”是指在所述参考值的任一方向上的(大于或小于)25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更小百分比内的值范围，除非另外说明或以另外的方式从上下文显而易见(除了这样的数值将超过可能值的100％的情况)。
芳基：如本文所用，术语“芳基”是指具有5至19个碳原子的芳族单环或多环基团。“取代的芳基”是指还携带一个或多个取代基的芳基基团。
双环核苷酸：如本文所用，术语“双环核苷酸”是指包含双环糖部分的核苷酸。
双环糖部分：如本文所用，术语“双环糖部分”是指包含4至7元环(包括但不限于呋喃糖基)的修饰的糖部分，所述糖部分包含连接4至7元环的两个原子以形成第二环的桥，从而产生双环结构。通常，4至7元环为糖。在一些实施方案中，4至7元环为呋喃糖基。在某些实施方案中，所述桥连接呋喃糖基的2'-碳和4'-碳。
互补：如本文所用，术语“互补”是指两个核苷酸(例如，在两个相对的核酸上或在单个核酸链的相对区域上)之间的结构关系，其允许两个核苷酸彼此形成碱基对。例如，一个核酸的嘌呤核苷酸与相对核酸的嘧啶核苷酸互补，可通过彼此形成氢键而碱基配对在一起。在一些实施方案中，互补核苷酸可以以Watson-Crick方式或以允许形成稳定双链体的任何其他方式进行碱基配对。“完全互补”或100％互补性是指第一寡核苷酸链或第一寡核苷酸链的区段的每个核苷酸单体可与第二寡核苷酸链或第二寡核苷酸链的区段的每个核苷酸单体形成碱基对的情况。小于100％的互补性是指两条寡核苷酸链(或两条寡核苷酸链的两个区段)的一些但非全部核苷酸单体可彼此形成碱基对的情况。“基本互补性”是指两条寡核苷酸链(或两条寡核苷酸链的区段)彼此具有90％或更高的互补性。“充分互补”是指靶mRNA与核酸抑制剂分子之间的互补性，使得靶mRNA所编码的蛋白质的量减少。
互补链：如本文所用，术语“互补链”是指双链核酸抑制剂分子的链，其与另一条链部分、基本上或完全互补。
环烷基：如本文所用，术语“环烷基”是指含有3至12个碳，例如3至8个碳和例如3至6个碳的环状(即，含环)烃基基团。“取代的环烷基”是指还携带一个或多个取代基的环烷基基团。
脱氧呋喃核糖基：如本文所用，术语“脱氧呋喃核糖基”是指存在于天然存在的DNA中并且在2'-碳处具有氢基团的呋喃糖基，如下所示：
Figure BDA0003208444980000171
脱氧核糖核苷酸：如本文所用，术语“脱氧核糖核苷酸”是指天然核苷酸(如本文所定义)或修饰的核苷酸(如本文所定义)，其在糖部分的2'位具有氢基团。
dsRNAi抑制剂分子：如本文所用，术语“dsRNAi抑制剂分子”是指具有有义链(过客链)和反义链(引导链)的双链核酸抑制剂分子，其中反义链或反义链的一部分被Argonaute2(Ago2)内切核酸酶用于裂解靶mRNA。
双链体：如本文所用，关于核酸(例如，寡核苷酸)，术语“双链体”是指通过两个反向平行核苷酸序列的互补碱基配对形成的结构。
赋形剂：如本文所用，术语“赋形剂”是指可以包括在组合物中，例如以提供或有助于期望的稠度或稳定作用的非治疗剂。
呋喃糖基：如本文所用，术语“呋喃糖基”是指包含具有四个碳原子和一个氧原子的5元环的结构。
卤代：如本文所用，术语“卤代”和“卤素”是可互换的并且是指选自氟、氯、溴和碘的原子。
杂环：如本文所用，术语“杂环”或“杂环的”是指含有一个或多个杂原子(例如，N、O、S等)作为环结构的一部分并且具有3至14个碳原子的非芳族环(即，含环)基团。“取代的杂环的”或“取代的杂环”是指还携带一个或多个取代基的杂环基团。
核苷酸间连接基团：如本文所用，术语“核苷酸间连接基团”或“核苷酸间键”是指能够共价连接两个核苷部分的化学基团。通常，化学基团是含有磷酸或亚磷酸酯基团的含磷键基团。磷酸连接基团意在包括磷酸二酯键、二硫代磷酸酯键、硫代磷酸酯键、磷酸三酯键、硫羰烃基膦酸酯(thionoalkylphosphonate)键、硫羰烃基磷酸三酯(thionalkylphosphotriester)键、亚磷酰胺键、膦酸酯键和/或硼烷磷酸酯(boranophosphate)键。许多含磷键是本领域众所周知的，例如在美国专利号3,687,808、4,469,863、4,476,301、5,023,243、5,177,196、5,188,897、5,264,423、5,276,019、5,278,302、5,286,717、5,321,131、5,399,676、5,405,939、5,453,496、5,455,233、5,466,677、5,476,925、5,519,126、5,536,821、5,541,306、5,550,111、5,563,253、5,571,799、5,587,361、5,194,599、5,565,555、5,527,899、5,721,218、5,672,697和5,625,050中所公开的。在其他实施方案中，寡核苷酸含有一个或多个不含有磷原子的核苷酸间连接基团，诸如短链烷基或环烷基核苷酸间键、混合的杂原子和烷基或环烷基核苷酸间键或一个或多个短链杂原子或杂环核苷酸间键，包括但不限于具有以下主链的核苷酸间键：硅氧烷主链；硫化物、亚砜和砜主链；甲醛乙酰基(formacetyl)和硫代甲醛乙酰基主链；亚甲基甲醛乙酰基和硫代甲醛乙酰基主链；核糖乙酰基主链；含烯烃的主链；氨基磺酸酯主链；亚甲基亚氨基和亚甲基肼基主链；磺酸酯和磺酰胺主链；和酰胺主链。不含磷的键是本领域众所周知的，例如在美国专利号5,034,506、5,166,315、5,185,444、5,214,134、5,216,141、5,235,033、5,264,562、5,264,564、5,405,938、5,434,257、5,466,677、5,470,967、5,489,677、5,541,307、5,561,225、5,596,086、5,602,240、5,610,289、5,602,240、5,608,046、5,610,289、5,618,704、5,623,070、5,663,312、5,633,360、5,677,437、5,792,608、5,646,269和5,677,439中所公开的。
环：如本文所用，术语“环”是指由核酸的单一链形成的结构，其中位于特定单链核苷酸区域侧翼的互补区域以如下方式杂交：互补区域之间的单链核苷酸区域排除在双链体形成或Watson-Crick碱基配对之外。环是任何长度的单链核苷酸区域。环的实例包括存在于诸如发夹、四元环和三元环的结构中的未配对核苷酸。
解链温度：如本文所用，“解链温度”或“Tm”是指双链核酸的两条链分开的温度。Tm通常用作双链稳定性或两条互补核酸链或其部分的结合亲和力的量度。可通过使用UV光谱确定杂交的形成和分解(解链)来测量Tm。杂交过程中发生的碱基堆叠伴有UV吸收的降低(减色)。因此，UV吸收的降低指示较高的Tm。
修饰的核碱基：如本文所用，术语“修饰的核碱基”是指不是天然核碱基或通用核碱基的任何核碱基。合适的修饰的核碱基包括二氨基嘌呤及其衍生物、烷基化的嘌呤或嘧啶、酰化的嘌呤或嘧啶、硫醇化的嘌呤或嘧啶等。其他合适的修饰的核碱基包括嘌呤和嘧啶的类似物。合适的类似物包括但不限于1-甲基腺嘌呤、2-甲基腺嘌呤、N6-甲基腺嘌呤、N6-异戊基腺嘌呤、2-甲硫基-N6-异戊基腺嘌呤、N,N-二甲基腺嘌呤、8-溴腺嘌呤、2-硫胞嘧啶、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-乙基胞嘧啶、4-乙酰胞嘧啶、1-甲基鸟嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、2,2-二甲基鸟嘌呤、8-溴鸟嘌呤、8-氯鸟嘌呤、8-氨基鸟嘌呤、8-甲基鸟嘌呤、8-硫鸟嘌呤、5-氟尿嘧啶，5-溴-尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘-尿嘧啶、5-乙基尿嘧啶、5-丙基尿嘧啶、5-甲氧尿嘧啶、5-羟甲基尿嘧啶、5-(羧基羟甲基)尿嘧啶、5-(甲基氨基甲基)尿嘧啶、5-(羧甲基氨基甲基)尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、5-(2-溴乙烯基)尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、假尿嘧啶、1-甲基尿嘧啶、Q核苷(queosine)、次黄嘌呤、黄嘌呤、2-氨基嘌呤、6-羟基氨基嘌呤、硝基吡咯基、硝基吲哚基和二氟甲苯基、6-硫嘌呤和2,6-二氨基嘌呤硝基吡咯基、硝基吲哚基和二氟甲苯基。通常，核碱基含有含氮碱基。在某些实施方案中，核碱基不含有氮原子。参见例如美国公开专利申请号20080274462。
修饰的核苷：如本文所用，术语“修饰的核苷”是指与糖(例如脱氧核糖或核糖或其类似物)的N-糖苷键中的杂环含氮碱基，所述糖不与磷酸酯基团或修饰的磷酸酯基团(如本文所定义)连接，并且含有修饰的核碱基(如本文所定义)、通用核碱基(如本文所定义)或修饰的糖部分(如本文所定义)中的一种或多种。修饰的或通用的核碱基(在本文中也称为碱基类似物)通常位于核苷糖部分的1'位，并且是指1'位的除腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶以外的核碱基。在某些实施方案中，修饰的或通用的核碱基为含氮碱基。在某些实施方案中，修饰的核碱基不含有氮原子。参见例如美国公开专利申请号20080274462。在某些实施方案中，修饰的核苷酸不含有核碱基(无碱基)。本文描述了在本公开的上下文中合适的修饰的或通用的核碱基或修饰的糖。
修饰的核苷酸：如本文所用，术语“修饰的核苷酸”是指与糖(例如核糖或脱氧核糖或其类似物)的N-糖苷键中的杂环含氮碱基，所述糖与磷酸酯基团或修饰的磷酸酯基团(如本文所定义)连接，并含有修饰的核碱基(如本文所定义)、通用核碱基(如本文所定义)或修饰的糖部分(如本文所定义)中的一种或多种。修饰的或通用的核碱基(在本文中也称为碱基类似物)通常位于核苷糖部分的1'位，并且是指1'位的除腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶以外的核碱基。在某些实施方案中，修饰的或通用的核碱基为含氮碱基。在某些实施方案中，修饰的核碱基不含有氮原子。参见例如美国公开专利申请号20080274462。在某些实施方案中，修饰的核苷酸不含有核碱基(无碱基)。本文描述了在本公开的上下文中合适的修饰的或通用的核碱基、修饰的糖部分或修饰的磷酸酯基团。
修饰的磷酸酯基团：“修饰的磷酸酯基团”是指天然核苷酸中不存在并且包括如本文所述的非天然存在的磷酸酯模拟物的磷酸酯基团的修饰，包括含有磷原子的磷酸酯模拟物和不包含磷酸酯的阴离子磷酸酯模拟物(例如乙酸酯)。修饰的磷酸酯基团还包括非天然存在的核苷酸间连接基团，包括含磷的核苷酸间连接基团(包括例如硫代磷酸酯)和不含磷的连接基团两者，如本文所述。
修饰的糖部分：如本文所用，“修饰的糖部分”是指取代的糖部分(如本文所定义)或糖类似物(如本文所定义)。
天然核碱基：如本文所用，术语“天然核碱基”是指RNA和DNA的五种主要的天然存在的杂环核碱基，即嘌呤碱基：腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，以及嘧啶碱基：胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。
天然核苷：如本文所用，术语“天然核苷”是指与未连接到磷酸酯基团的天然糖部分(如本文所定义)的N-糖苷键中的天然核碱基(如本文所定义)。
天然核苷酸：如本文所用，术语“天然核苷酸”是指与连接到磷酸酯基团的天然糖部分(如本文所定义)的N-糖苷键中的天然核碱基(如本文所定义)。
天然糖部分：如本文所用，术语“天然糖部分”是指呋喃核糖基(如本文所定义)或脱氧呋喃核糖基(如本文所定义)。
核酸抑制剂分子：如本文所用，术语“核酸抑制剂分子”是指降低或消除靶基因表达的寡核苷酸分子，其中寡核苷酸分子含有特异性靶向靶基因mRNA中的序列的区域。通常，核酸抑制剂分子的靶向区域包含与靶基因mRNA上的序列充分互补以引导核酸抑制剂分子对指定靶基因的作用的序列。核酸抑制剂分子可包括核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸和/或修饰的核苷酸。
核碱基：如本文所用，术语“核碱基”是指天然核碱基(如本文所定义)、修饰的核碱基(如本文所定义)或通用核碱基(如本文所定义)。
核苷：如本文所用，术语“核苷”是指天然核苷(如本文所定义)或修饰的核苷(如本文所定义)。
核苷酸：如本文所用，术语“核苷酸”是指天然核苷酸(如本文所定义)或修饰的核苷酸(如本文所定义)。
突出端：如本文所用，术语“突出端”是指在双链核酸抑制剂分子的任一链的任一端的末端非碱基配对核苷酸。在某些实施方案中，突出端由延伸超出与第一链或区域形成双链体的互补链的末端的一条链或一个区域产生。能够通过碱基对的氢键形成双链体的两个寡核苷酸区域中的一个或两个可以具有延伸超出由两个多核苷酸或区域共享的互补性的3'-和/或5'-端的5'-和/或3'-端。延伸超出双链体的3'-端和/或5'-端的单链区域称为突出端。
药物组合物：如本文所用，术语“药物组合物”包含药理学有效量的双链核酸抑制剂分子和药学上可接受的赋形剂(如本文所定义)。
药学上可接受的赋形剂：如本文所用，术语“药学上可接受的赋形剂”意指所述赋形剂是一种适用于人和/或动物而没有与合理的效益/风险比相称的过度不良副作用(诸如毒性、刺激和过敏反应)的赋形剂。
磷酸酯模拟物：如本文所用，术语“磷酸酯模拟物”是指在寡核苷酸的5'-末端处的模拟磷酸酯基团的静电和空间特性的化学部分。已经开发出了许多可连接于寡核苷酸的5'-端的磷酸酯模拟物(参见例如美国专利号8,927,513；Prakash等人,Nucleic AcidsRes.,2015,43(6):2993-3011)。通常，这些5'-磷酸酯模拟物含有磷酸酶抗性键。合适的磷酸酯模拟物包括5'-膦酸酯，诸如5'-亚甲基膦酸酯(5'-MP)和5'-(E)-乙烯基膦酸酯(5'-VP)以及与寡核苷酸的5'-末端核苷酸的糖部分(例如，核糖或脱氧核糖或其类似物)的4'-碳结合的4'-磷酸酯类似物，诸如4'-氧甲基膦酸酯、4'-硫代甲基膦酸酯或4'-氨基甲基膦酸酯，如国际公开号WO 2018/045317中所述，所述参考以引用方式整体并入本文。在某些实施方案中，4'-氧甲基膦酸酯由式–O-CH2-PO(OH)2或–O-CH2-PO(OR)2表示，其中R独立地选自H、CH3、烷基基团或保护基团。在某些实施方案中，烷基基团为CH2CH3。更典型地，R独立地选自H、CH3或CH2CH3。对于寡核苷酸的5'-端，已开发了其他修饰(参见例如，WO 2011/133871)。
保护基团：如本文所用，术语“保护基团”在常规化学意义中用作在期望的反应的某些条件下可逆地使官能团不可反应的基团。在期望的反应之后，可除去保护基团以使受保护的官能团脱保护。所有保护基团应在不降解所合成的分子中的大部分的条件下可除去。
降低：如本文所用，术语“降低”(“reduce”或“reduces”)是指其本领域通常接受的含义。关于核酸抑制剂分子，所述术语通常是指将基因的表达、或编码一种或多种蛋白质或蛋白质亚基的RNA分子或等同RNA分子的水平、或一种或多种蛋白质或蛋白质亚基的活性降低，低于在不存在核酸抑制剂分子的情况下观察到的水平。
呋喃核糖基：如本文所用，术语“呋喃核糖基”是指存在于天然RNA中并且在2'-碳处具有羟基基团的呋喃糖基，如下所示：
Figure BDA0003208444980000241
核糖核苷酸：如本文所用，术语“核糖核苷酸”是指天然核苷酸(如本文所定义)或修饰的核苷酸(如本文所定义)，其在糖部分的2'位具有羟基基团。
有义链：双链核酸抑制剂分子包含两条寡核苷酸链：反义链和有义链。有义链或其区域与双链核酸抑制剂分子的反义链或其区域部分、基本上或完全互补。在某些实施方案中，有义链还可含有与反义链不互补的核苷酸。非互补核苷酸可以在互补序列的任一侧，或者可以在互补序列的两侧。在某些实施方案中，当有义链或其区域与反义链或其区域部分或基本上互补时，非互补核苷酸可位于一个或多个互补性的区域之间(例如，一个或多个错配)。有义链也称为过客链。
受试者：如本文所用，术语“受试者”意指任何哺乳动物，包括小鼠、兔和人。在一个实施方案中，受试者为人。术语“个体”或“患者”旨在与“受试者”可互换。
取代基或取代的：如本文所用，术语“取代基”或“取代的”是指给定结构中的氢自由基被取代基的自由基替代。除非另外指明，否则当在给定结构中超过一个位置可被超过一个取代基取代时，在每个位置处的取代基可相同或不同。如本文所用，设想术语“取代的”包括与有机化合物相容的所有可允许的取代基。可允许的取代基包括有机化合物的无环和环状、支链和非支链、碳环和杂环、芳族和非芳族的取代基。本公开并不意图以任何方式受到有机化合物的可允许的取代基的限制。
取代的糖部分：如本文所用，“取代的糖部分”包括含有一个或多个修饰的呋喃糖基。通常，修饰发生在糖的2'-、3'-、4'-或5'-碳位处。在某些实施方案中，取代的糖部分为包含连接呋喃糖基的2'-碳和4-碳的桥的双环糖部分。
糖类似物：如本文所用，术语“糖类似物”是指一种结构，其不包含呋喃糖基并且能够替代核苷酸的天然存在的糖部分以使得所得的核苷酸能够(1)掺入到寡核苷酸中和(2)与互补核苷酸杂交。此类结构通常包括呋喃糖基的相对简单的变化，诸如包含不同数量原子的环(例如，4、6或7元环)；呋喃糖基的氧被非氧原子(例如碳、硫或氮)替代；或者原子数量和氧替代两者的变化。此类结构还可包含与针对取代的糖部分描述的那些对应的取代基。糖类似物还包括更复杂的糖替代物(例如，肽核酸的非环系统)。糖类似物包括但不限于吗啉代、环己烯基和环己六醇。
糖部分：如本文所用，术语“糖部分”是指核苷酸或核苷的天然糖部分或修饰的糖部分。
靶位点：如本文所用，术语“靶位点”、“靶序列”、“靶核酸”、“靶区域”、“靶基因”可互换使用，并且是指被“靶向”的RNA或DNA序列，例如用于由RNAi抑制剂分子介导的裂解，所述RNAi抑制剂分子在其引导/反义区域内含有与所述靶序列部分、基本上或完全或充分互补的序列。
四元环：如本文所用，术语“四元环”是指形成稳定的二级结构的环(单链区域)，所述二级结构有助于相邻Watson-Crick杂交的核苷酸的稳定性。不受理论的限制，四元环可通过堆叠相互作用来稳定相邻的Watson-Crick碱基对。此外，四元环中核苷酸之间的相互作用包括但不限于非Watson-Crick碱基配对、堆叠相互作用、氢键和接触相互作用(Cheong等人,Nature 1990；346(6285):680-2；Heus和Pardi，Science 1991；253(5016):191-4)。四元环使相邻双链体的解链温度(Tm)升高，所述溶解温度高于由随机碱基组成的简单模型环序列的预期。例如，四元环可在10mM NaHPO4中赋予包含长度为至少2个碱基对的双链体的发夹至少50℃、至少55℃、至少56℃、至少58℃、至少60℃、至少65℃或至少75℃的解链温度。四元环可含有核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、修饰的核苷酸以及它们的组合。在某些实施方案中，四元环由四个核苷酸组成。在某些实施方案中，四元环由五个核苷酸组成。
RNA四元环的实例包括UNCG家族四元环(例如UUCG)、GNRA家族四元环(例如GAAA)和CUYG家族四元环，包括CUUG四元环。(Woese等人,PNAS,1990,87(21):8467-71；Antao等人,Nucleic Acids Res.,1991,19(21):5901-5)。RNA四元环的其他实例包括GANC、A/UGNN和UUUM四元环家族(Thapar等人,WILEY INTERDISCIP.REV RNA,2014,5(1):1-28)以及GGUG、RNYA和AGNN四元环家族(Bottaro等人,BIOPHYS J.,2017,113:257-67)。DNA四元环的实例包括d(GNNA)家族四元环(例如d(GTTA)、d(GNRA))家族四元环、d(GNAB)家族四元环、d(CNNG)家族四元环和d(TNCG)家族四元环(例如d(TTCG))。(Nakano等人,Biochemistry,2002,41(48):14281-14292。Shinji等人,Nippon Kagakkai Koen Yokoshu,2000,78(2):731)。
增加Tm的核苷酸：如本文所用，术语“增加Tm的核苷酸”是指与没有增加Tm的核苷酸的寡核苷酸双链体相比增加寡核苷酸双链体的解链温度(Tm)的核苷酸。增加Tm的核苷酸包括但不限于双环核苷酸、三环核苷酸、G-夹及其类似物，以及己糖醇核苷酸。具有修饰的糖部分或修饰的核碱基的某些修饰的核苷酸也可用于增加寡核苷酸双链体的Tm。如本文所用，术语“增加Tm的核苷酸”具体地排除在糖部分的2'-位处用2'-OMe或2'-F修饰的核苷酸。
治疗有效量：如本文所用，“治疗有效量”或“药理学有效量”是指有效产生预期的药理学、治疗或预防性结果的双链核酸抑制剂分子的量。
三元环：如本文所用，术语“三元环”是指形成稳定的二级结构并且由三个核苷酸组成的环(单链区域)，所述二级结构有助于相邻Watson-Crick杂交的核苷酸的稳定性。不受理论的限制，三元环可通过三元环内核苷酸的非Watson-Crick碱基配对和碱基堆叠相互作用来稳定。(Yoshizawa等人,Biochemistry 1997；36,4761-4767)。三元环也能够使相邻双链体的解链温度(Tm)升高，其高于根据由随机碱基组成的简单模型环序列所预期的。三元环可含有核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、修饰的核苷酸以及它们的组合。三元环的实例包括GNA家族三元环(例如，GAA、GTA、GCA和GGA)。(Yoshizawa 1997)。在某些实施方案中，三元环具有GAA的核苷酸序列。
通用核碱基：如本文所用，“通用核碱基”是指可与通常存在于天然存在的核酸中的超过一个碱基配对的碱基，并且因此可在双链体中替代此类天然存在的碱基。所述碱基不需要能够与每个天然存在的碱基配对。例如，某些碱基仅或选择性地与嘌呤配对，或仅或选择性地与嘧啶配对。通用核碱基可通过经由Watson-Crick或非Watson-Crick相互作用(例如，Hoogsteen相互作用)形成氢键来进行碱基配对。代表性的通用核碱基包括肌苷及其衍生物。
具体实施方式
本申请提供了具有带茎环结构的有义链和反义链的双链核酸抑制剂分子，其中所述茎环结构的环部分是三元环。双链核酸抑制剂分子包含：在有义链(S)的第一区域(R1)和反义链(AS)之间的第一双链体(D1)和有义链的第二区域(R2)的第一子区域(S1)和第二子区域(S2)之间的第二双链体(D2)，其中S1和S2由三元环(triL)接合。参见图1A-1D。另外，在某些实施方案中，茎环结构的茎部分可以包含至少一个增加Tm的核苷酸，诸如4-12个增加Tm的核苷酸，例如2-6个增加Tm的核苷酸碱基对。茎环结构可位于有义链的5'-或3'-端。如本文所公开，含有三元环的双链核酸抑制剂分子在降低靶基因表达方面具有活性。此外，在某些实施方案中，与其含有四元环的对应物相比，含有三元环的双链核酸抑制剂分子可以增加靶基因表达的效力。
还提供了使用本文公开的含有三元环的双链核酸抑制剂分子和包含其的组合物在体外或体内降低靶基因的水平或表达的方法，包括用于治疗疾病的方法和组合物。
含有三元环的核酸抑制剂分子
本申请公开了具有带有茎环结构的有义链和反义链的双链核酸抑制剂分子，其中茎环结构的环部分是三元环并且其中有义链和反义链是各自具有5'-端和3'-端的单独的链，因此不形成连续的寡核苷酸。典型的含茎/环的双链核酸抑制剂分子示于图1A中，其中突出显示了有义链(“S”)和反义链(“AS”)。
有义链可进一步分为与反义链(AS)形成第一双链体(D1)的第一区域(R1)和包括接合第一子区域(S1)与第二子区域(S2)的环(triL)的第二区域(R2)，如图1B和图1C所示。S1和S2彼此充分互补以形成第二双链体(D2)，也称为茎或茎双链体。参见例如图1C和1D。如本文所述，环是三元环。通常，三元环具有序列GAA，但可以使用其他三元环序列，这些三元环序列能够使相邻双链体的解链温度(Tm)增加，其高于根据由随机碱基组成的简单模型环序列所预期的。第二双链体(D2)可以包含至少一个增加Tm的核苷酸，并且在某些实施方案中，第二双链体(D2)中的所有核苷酸可以是增加Tm的核苷酸。通常，双链核酸抑制剂分子在第二双链体(D2)之外不含任何增加Tm的核苷酸。在某些实施方案中，双链核酸分子为dsRNAi抑制剂分子。
在双链核酸抑制剂分子的某些实施方案中，有义链含有茎双链体(D2)和环(triL)并且长度为20-65个核苷酸，所述茎双链体含有至少一个增加Tm的核苷酸。在某些实施方案中，茎双链体的长度为2-6个碱基对。在某些实施方案中，反义链的长度为15-40个核苷酸。
在某些实施方案中，有义链含有茎双链体(D2)和三元环(triL)并且长度为20-65个核苷酸，并且反义链的长度为15-40个核苷酸。在某些实施方案中，有义链的含有茎双链体(D2)和三元环(triL)的延伸部分在所述链的3'-端。在某些其他实施方案中，有义链的含有茎(D2)和三元环(triL)的延伸部分在所述链的5'-端。
在某些实施方案中，双链核酸抑制剂分子包含有义链和反义链，其中有义链和反义链是单独的链并形成18-24个碱基对的第一双链体(D1)，其中有义链包含第二双链体(D2)和三元环(triL)并且长度为27-35个核苷酸，并且其中反义链的长度为20-24个核苷酸。在某些实施方案中，有义链的长度为27-35个核苷酸。在某些实施方案中，有义链的长度为27-33个核苷酸。在某些实施方案中，有义链的长度为29-31个核苷酸。在某些实施方案中，第二双链体(D2)具有2-6个碱基对的长度。在某些实施方案中，第二双链体(D2)具有2个碱基对的长度并且含有增加Tm的核苷酸。在某些实施方案中，第二双链体(D2)具有3个碱基对的长度并且含有增加Tm的核苷酸。在某些实施方案中，第二双链体(D2)具有4个碱基对的长度并且含有增加Tm的核苷酸。在某些实施方案中，第二双链体(D2)具有5个碱基对的长度并且含有增加Tm的核苷酸。在某些实施方案中，第二双链体(D2)具有6个碱基对的长度并且不含有任何增加Tm的核苷酸。在某些实施方案中，反义链在其3'-端具有1、2、3或4个核苷酸的单链突出端。通常，在反义链的3'-端处的单链突出端由2个核苷酸组成。
在某些实施方案中，双链核酸抑制剂分子包含有义链和反义链，其中有义链和反义链是单独的链并形成18-22个碱基对的第一双链体(D1)，诸如20个核苷酸，其中有义链包含第二双链体(D2)和三元环(triL)并且长度为27-35个核苷酸，并且其中反义链的长度为20-24个核苷酸，诸如长度为22个核苷酸。在某些实施方案中，D1具有19-21个碱基对的长度。在某些实施方案中，反义链的长度为20-22个核苷酸。在某些实施方案中，有义链的长度为29-33个核苷酸。在某些实施方案中，第二双链体(D2)具有2-6个碱基对的长度。在某些实施方案中，D2具有2个碱基对的长度并且含有增加Tm的核苷酸。在某些实施方案中，D2具有3个碱基对的长度并且含有增加Tm的核苷酸。在某些实施方案中，D2具有4个碱基对的长度并且含有增加Tm的核苷酸。在某些实施方案中，D2具有5个碱基对的长度并且含有增加Tm的核苷酸。在某些实施方案中，D2具有6个碱基对的长度并且不含有任何增加Tm的核苷酸。在某些实施方案中，反义链在其3'-端具有1-5个核苷酸的单链突出端。在某些实施方案中，反义链在其3'-端具有1、2、3或4个核苷酸的单链突出端。通常，在反义链的3'-端处的单链突出端由2个核苷酸组成。
在某些实施方案中，双链核酸抑制剂分子包含有义链和反义链，其中有义链和反义链是单独的链并形成19-21个碱基对的第一双链体(D1)，其中有义链具有19-21个核苷酸的第一区域(R1)和7-15个核苷酸的第二区域(R2)，所述第二区域包含接合第一子区域(S1)与第二子区域(S2)的三元环(triL)，其中S1和S2中的每一个的长度为2-6个核苷酸并且彼此充分互补以形成第二双链体(D2)，并且其中反义链的长度为20-24个核苷酸。在某些实施方案中，反义链在其3'末端具有两个核苷酸的单链突出端。在某些实施方案中，S1和S2中的每一个的长度为2-5个核苷酸。在某些实施方案中，D2具有2个碱基对的长度并且含有增加Tm的核苷酸。在某些实施方案中，D2具有3个碱基对的长度并且含有增加Tm的核苷酸。在某些实施方案中，D2具有4个碱基对的长度并且含有增加Tm的核苷酸。在某些实施方案中，D2具有5个碱基对的长度并且含有增加Tm的核苷酸。在某些实施方案中，D2具有6个碱基对的长度并且不含有增加Tm的核苷酸。
在某些实施方案中，双链核酸抑制剂分子包含有义链和反义链，其中有义链和反义链是单独的链并形成20个碱基对的第一双链体(D1)，其中有义链具有20个核苷酸的第一区域(R1)和7-9个核苷酸的第二区域(R2)，所述第二区域包含接合第一子区域(S1)与第二子区域(S2)的三元环(triL)，其中反义链的长度为22个核苷酸并且在其3'-端具有两个核苷酸的单链突出端，并且其中S1和S2中的每一个都包含双环核苷酸。在某些实施方案中，S1和S2中的每一个的长度为3个核苷酸并且形成三个碱基对的第二双链体(D2)。在某些实施方案中，S1和S2中的每一个的长度为2个核苷酸并且形成两个碱基对的第二双链体(D2)。在某些实施方案中，第二双链体(D2)中的每个核苷酸都是增加Tm的核苷酸，并且双链核酸抑制剂分子在第二双链体(D2)之外不包含任何增加Tm的核苷酸。
在本文所述的含有三元环的双链核酸抑制剂分子的某些实施方案中，第二双链体(D2)具有2-6个碱基对的长度。在某些实施方案中，D2具有2-4个碱基对的长度。在某些实施方案中，D2具有2个碱基对的长度。在某些实施方案中，D2具有3个碱基对的长度。在某些实施方案中，D2具有4个碱基对的长度。在某些实施方案中，D2具有5个碱基对的长度。在某些实施方案中，D2具有6个碱基对的长度。
在本文所述的含有三元环的双链核酸抑制剂分子的某些实施方案中，第二双链体(D2)含有4-10个增加Tm的核苷酸并且具有2-5个碱基对的长度。在某些实施方案中，D2含有6-8个增加Tm的核苷酸并且具有3-4个碱基对的长度。在某些实施方案中，D2含有6个增加Tm的核苷酸并且具有3个碱基对的长度。在某些实施方案中，D2含有4个增加Tm的核苷酸并且具有2个碱基对的长度。在某些实施方案中，D2中的每个核苷酸都是增加Tm的核苷酸。
在本文所述的含有三元环的双链核酸抑制剂分子的某些实施方案中，第二双链体(D2)含有单个增加Tm的核苷酸并且具有2-6个碱基对的长度。在本文所述的含有三元环的双链核酸抑制剂分子的某些实施方案中，第二双链体(D2)含有2-6个单个增加Tm的核苷酸并且具有2-6个碱基对的长度，其中D2中没有一个增加Tm的核苷酸形成碱基对。例如，D2可以包含2个增加Tm的核苷酸并且具有2-6个碱基对的长度，其中2个增加Tm的核苷酸不形成碱基对。D2也可以包含3个增加Tm的核苷酸并且具有3-6个碱基对的长度，其中3个增加Tm的核苷酸不形成碱基对。D2也可以包含4个增加Tm的核苷酸并且具有4-6个碱基对的长度，其中4个增加Tm的核苷酸不形成碱基对。D2也可以包含5个增加Tm的核苷酸并且具有5-6个碱基对的长度，其中5个增加Tm的核苷酸不形成碱基对。D2也可以包含6个增加Tm的核苷酸并且具有6个碱基对的长度，其中6个增加Tm的核苷酸不形成碱基对。
在某些实施方案中，含三元环的双链核酸抑制剂分子不包含任何增加Tm的核苷酸。在某些实施方案中，双链核酸抑制剂分子在有义链的第一区域(R1)或反义链中不含任何增加Tm的核苷酸。在某些实施方案中，双链核酸抑制剂分子在第二双链体(D2)之外不含任何增加Tm的核苷酸。在某些实施方案中，双链核酸抑制剂分子在第二双链体(D2)中不含任何增加Tm的核苷酸。
含三元环的双链核酸分子的第二双链体(D2)中的一个或多个增加Tm的核苷酸可以是本文所述或本领域中以其他方式可用的增加Tm的核苷酸中的任一种。在某些实施方案中，双链核酸分子在第二双链体(D2)中含有至少两个增加Tm的核苷酸，并且第二双链体中的每个增加Tm的核苷酸是相同的。在某些实施方案中，双链核酸抑制剂分子在第二双链体(D2)中含有至少两个不同的增加Tm的核苷酸。
在本文所述的任何含有三元环的双链核酸分子中，一个或多个增加Tm的核苷酸可以是本文所述的或本领域以其他方式可获得的任何双环核苷酸。在本文所述的任何含三元环的双链核酸分子中，第二双链体(D2)中的至少一个双环核苷酸包含双环糖部分，其中双环糖部分是取代的呋喃糖基，其包含连接呋喃糖基的2'-碳和4'-碳的桥。
在本文所述的任何含有三元环的双链核酸抑制剂分子中，第二双链体(D2)中的至少一个双环核苷酸具有式I、II、III、IV、Va或Vb的结构。在某些实施方案中，第二双链体(D2)中的至少一个双环核苷酸可以具有式I的结构。第二双链体(D2)中的至少一个双环核苷酸也可以具有式II的结构。第二双链体(D2)中的至少一个双环核苷酸也可以具有式III的结构。第二双链体(D2)中的至少一个双环核苷酸也可以具有式IV的结构。第二双链体(D2)中的至少一个双环核苷酸也可以具有式Va的结构。第二双链体(D2)中的至少一个双环核苷酸也可以具有式Vb的结构。
第二双链体(D2)中的至少一个双环核苷酸也可以具有式Ia、Ib、Ic、Id、Ie或If中的一个或多个的结构。第二双链体(D2)中的至少一个双环核苷酸也可以具有式IIa、IIb、IIc或IId中的一个或多个的结构。第二双链体(D2)中的至少一个双环核苷酸也可以具有式IIIa和/或IIIb的结构。第二双链体(D2)中的至少一个双环核苷酸也可以具有式IVa和/或IVb的结构。
在本文所述的任何含有三元环的双链核酸分子中，第二双链体(D2)中的至少一个双环核苷酸(BN)为以下中的一个或多个：(a)亚甲氧基BN，(b)亚乙氧基BN，(c)氨氧基BN；(d)氧氨基BN，(e)甲基(亚甲氧基)BN(也称为约束乙基或cET)，(f)亚甲基-硫代BN，(g)亚甲基氨基BN，(h)甲基碳环BN，以及(i)亚丙基碳环BN。在一个实施方案中，至少一个BN为(a)亚甲氧基BN或(d)氧氨基BN，其中R2为CH3。例如，D2中的至少一个BN为氧氨基BN(d)，其中R2为CH3。
双环核苷酸
本文公开的含三元环的双链核酸抑制剂分子含有有义链和反义链，并且在某些实施方案中，在有义链中存在的茎环结构的茎部分中可以含有至少一个双环核苷酸。双环核苷酸通常具有含4至7元环的糖部分(包括但不限于呋喃糖基)，所述糖部分包含连接4至7元环的两个原子以形成第二环的桥，从而产生双环结构。在某些实施方案中，桥连接第一环的2'-碳和4'-碳以形成第二环。此类双环核苷酸具有各种名称，包括分别用于双环核酸和锁核酸的BNA和LNA。双环核苷酸的合成及其在核酸化合物中的掺入也已在文献中报道，包括例如，Singh等人,CHEM.COMMUN.,1998,4,455-456；Koshkin等人,TETRAHEDRON,1998,54,3607-3630；Wahlestedt等人,PROC.NATL.ACAD.SCI.U.S.A.,2000,97,5633-5638；Kumar等人,BIOORG.MED.CHEM.LETT.,1998,8,2219-2222；Singh等人,J.ORG.CHEM.,1998,63,10035-10039；美国专利号7,427,672、7,053,207、6,794,499、6,770,748、6,268,490和6,794,499；以及已公布的美国申请20040219565、20040014959、20030207841、20040192918、20030224377、20040143114和20030082807；其各自以引用方式整体并入本文。
通常，桥含有2至8个原子。在某些实施方案中，桥含有3个原子。在某些实施方案中，桥含有4个原子。在某些实施方案中，桥含有5个原子。在某些实施方案中，桥含有6个原子。在某些实施方案中，桥含有7个原子。在某些实施方案中，桥含有8个原子。在某些实施方案中，桥含有超过8个原子。
在某些实施方案中，双环糖部分为取代的呋喃糖基，所述呋喃糖基包含连接呋喃糖基的2'-碳和4'-碳以形成第二环的桥。在某些实施方案中，双环核苷酸具有式I的结构：
Figure BDA0003208444980000341
其中B为核碱基；
其中G为H、OH、NH2、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、取代的C1-C6烷基、取代的C2-C6烯基、取代的C2-C6炔基、酰基、取代的酰基、取代的酰胺、硫醇基或取代的硫代；
其中X为O、S或NR1，其中R1为H、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、苯或芘；并且
其中Wa和Wb各自独立地为H、OH、羟基保护基团、磷部分或将由式I表示的核苷酸附接到另一个核苷酸或寡核苷酸的核苷酸间连接基团，并且其中Wa或Wb中的至少一个为将由式I表示的核苷酸附接到寡核苷酸的核苷酸间连接基团。
在式I的某些实施方案中，G为H并且X为NR1，其中R1为苯或芘。在式I的某些实施方案中，G为H并且X为S。
在式I的某些实施方案中，G为H并且X为O：
Figure BDA0003208444980000351
在式I的某些实施方案中，G为H并且X为NR1，其中R1为H、CH3或OCH3：
Figure BDA0003208444980000352
在式I的某些实施方案中，G为OH或NH2并且X为O。
在式I的某些实施方案中，G为OH并且并且X为O：
Figure BDA0003208444980000361
在式I的某些实施方案中，G为NH2并且X为O：
Figure BDA0003208444980000362
在式I的某些实施方案中，G为CH3或CH2OCH3并且X为O。在式I的某些实施方案中，G为CH3并且X为O：
Figure BDA0003208444980000363
在式I的某些实施方案中，G为CH2OCH3并且X为O：
Figure BDA0003208444980000371
在某些实施方案中，双环核苷酸具有式II的结构：
Figure BDA0003208444980000372
其中B为核碱基；
其中Q1为CH2或O；
其中X为CH2、O、S或NR1，其中R1为H、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、苯或芘；
其中如果Q1为O，则X为CH2；
其中如果Q1为CH2，则X为CH2、O、S或NR1，其中R1为H、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、苯或芘；
其中Wa和Wb各自独立地为H、OH、羟基保护基团、磷部分或将由式II表示的核苷酸附接到另一个核苷酸或寡核苷酸的核苷酸间连接基团，并且其中Wa或Wb中的至少一个为将由式II表示的核苷酸附接到寡核苷酸的核苷酸间连接基团。
在式II的某些实施方案中，Q1为O并且X为CH2：
Figure BDA0003208444980000381
在式II的某些实施方案中，Q1为CH2并且X为O：
Figure BDA0003208444980000382
在式II的某些实施方案中，Q1为CH2并且X为NR1，其中R1为H、CH3或OCH3：
Figure BDA0003208444980000383
在式II的某些实施方案中，Q1为CH2并且X为NH：
Figure BDA0003208444980000384
在某些实施方案中，双环核苷酸具有式III的结构：
Figure BDA0003208444980000391
其中B为核碱基；
其中Q2为O或NR1，其中R1为H、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、苯或芘；
其中X为CH2、O、S或NR1，其中R1为H、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、苯或芘；
其中如果Q2为O，则X为NR1；
其中如果Q2为NR1，则X为O或S；
其中Wa和Wb各自独立地为H、OH、羟基保护基团、磷部分或将由式III表示的核苷酸附接到另一个核苷酸或寡核苷酸的核苷酸间连接基团，并且其中Wa或Wb中的至少一个为将由式III表示的核苷酸附接到寡核苷酸的核苷酸间连接基团。
在式III的某些实施方案中，Q2为O并且X为NR1。在式III的某些实施方案中，Q2为O并且X为NR1，其中R1是C1-C6烷基。在式III的某些实施方案中，Q2为O并且X为NR1并且R1为CH3。
在式III的某些实施方案中，Q2为O并且X为NR1并且R1为CH3：
Figure BDA0003208444980000401
在式III的某些实施方案中，Q2为NR1并且X为O。在式III的某些实施方案中，Q2为NR1，其中R1为C1-C6烷基并且X为O。
在式III的某些实施方案中，Q2为NCH3并且X为O：
Figure BDA0003208444980000402
在某些实施方案中，双环核苷酸具有式IV的结构：
Figure BDA0003208444980000403
其中B为核碱基；
其中P1和P3为CH2，P2为CH2或O并且P4为O；并且
其中Wa和Wb各自独立地为H、OH、羟基保护基团、磷部分或将由式IV表示的核苷酸附接到另一个核苷酸或寡核苷酸的核苷酸间连接基团，并且其中Wa或Wb中的至少一个为将由式IV表示的核苷酸附接到寡核苷酸的核苷酸间连接基团。
在式IV的某些实施方案中，P1、P2和P3为CH2，并且P4为O：
Figure BDA0003208444980000411
在式IV的某些实施方案中，P1和P3为CH2，P2为O并且P4为O：
Figure BDA0003208444980000412
在某些实施方案中，双环核苷酸具有式Va或Vb的结构：
Figure BDA0003208444980000413
其中B为核碱基；
其中r1、r2、r3和r4各自独立地为H、卤素、C1-C12烷基、取代的C1-C12烷基、C2-C12烯基、取代的C2-C12烯基、C2-C12炔基、取代的C2-C12炔基、C1-C12烷氧基、取代的C1-C12烷氧基、OT1、ST1、SOT1、SO2T1、NT1T2、N3、CN、C(＝O)OT1、C(＝O)NT1T2、C(＝O)T1、O─C(＝O)NT1T2、N(H)C(＝NH)NT1T2、N(H)C(＝O)NT1T2或N(H)C(＝S)NT1T2，其中T1和T2各自独立地为H、C1-C6烷基或取代的C1-C16烷基；或
r1和r2或r3和r4一起为＝C(r5)(r6)，其中r5和r6各自独立地为H、卤素、C1-C12烷基或取代的C1-C12烷基；并且
其中Wa和Wb各自独立地为H、OH、羟基保护基团、磷部分或将由式V表示的核苷酸附接到另一个核苷酸或寡核苷酸的核苷酸间连接基团，并且其中Wa或Wb中的至少一个为将由式V表示的核苷酸附接到寡核苷酸的核苷酸间连接基团。
在某些实施方案中，双环糖部分是包含桥的取代的呋喃糖基，所述桥连接呋喃糖基的2'-碳和4'-碳以形成第二环，其中连接呋喃糖基的2'-碳和4'-碳的桥包括但不限于：
a)4'-CH2-O-N(R)-2'和4'-CH2-N(R)-O-2'，其中R为H、C1-C12烷基或保护基团，包括例如4'-CH2-NH-O-2'(也称为BNANC)、4'-CH2-N(CH3)-O-2'(也称为BNANC[NMe])，(如美国专利号7,427,672中所述，其据此以引用方式整体并入)；
b)4'-CH2-2'、4'-(CH2)2-2'、4'-(CH2)3-2'、4'-(CH2)-O-2'(也称为LNA)、4'-(CH2)-S-2'、4'-(CH2)2-O-2'(也称为ENA)、4'-CH(CH3)-O-2'(也称为cEt)和4'-CH(CH2OCH3)-O-2'(也称为cMOE)，及其类似物(如美国专利号7,399,845中所述，其据此以引用方式整体并入)；
c)4'-C(CH3)(CH3)-O-2'及其类似物(如美国专利号8,278,283中所述，其据此以引用方式整体并入)；
d)4'-CH2-N(OCH3)-2'及其类似物(如美国专利号8,278,425中所述，其据此以引用方式整体并入)；
e)4'-CH2-O-N(CH3)-2'及其类似物(如美国专利公开号2004/0171570，其据此以引用方式整体并入)；
f)4'-CH2-C(H)(CH3)-2'及其类似物(如Chattopadhyaya等人,J.Org.Chem.,2009,74,118-34中所述，其据此以引用方式整体并入)；以及
g)4'-CH2-C(＝CH2)-2'及其类似物(如美国专利号8278426中所述，其据此以引用方式整体并入)。
在某些实施方案中，双环核苷酸(BN)是以下中的一种或多种：(a)亚甲氧基BN，(b)亚乙氧基BN，(c)氨氧基BN；(d)氧氨基BN，(e)甲基(亚甲氧基)BN(也称为约束乙基或cET)，(f)亚甲基-硫代BN，(g)亚甲基氨基BN，(h)甲基碳环BN，以及(i)亚丙基碳环BN，如下所示。
Figure BDA0003208444980000431
Figure BDA0003208444980000441
Figure BDA0003208444980000451
在上述(a)至(i)的双环核苷酸中，B是核碱基，R2是H或CH3，并且Wa和Wb各自独立地是H、OH、羟基保护基团、磷部分、或将所述双环核苷酸附接到另一个核苷酸或附接到寡核苷酸的核苷酸间连接基团，其中Wa或Wb中的至少一个是将所述双环核苷酸附接到寡核苷酸的核苷酸间连接基团。
在氧氨基BN(d)的一个实施方案中，R2为CH3，如下(也称为BNANC[NMe])：
Figure BDA0003208444980000452
在某些实施方案中，双环糖部分和掺入了此类双环糖部分的双环核苷酸由异构构型进一步定义。在某些实施方案中，双环糖部分或核苷酸为α-L构型。在某些实施方案中，双环糖部分或核苷酸为β-D构型。例如，在某些实施方案中，双环糖部分或核苷酸包含呈α-L构型(α-L LNA)的2'O,4'-C-亚甲基桥(2'-O-CH2-4')。在某些实施方案中，双环糖部分或核苷酸为R构型。在某些实施方案中，双环糖部分或核苷酸为S构型。例如，在某些实施方案中，双环糖部分或核苷酸包含呈S-构型的4'-CH(CH3)-O-2'桥(即，cEt)。
三环核苷酸
在某些实施方案中，增加Tm的核苷酸可以是三环核苷酸。三环核苷酸的合成及其向核酸化合物中的掺入也已在文献中报道，所述文献包括例如，Steffens等人，J.AM.CHEM.SOC.1997；119:11548-11549；Steffens等人，J.ORG.CHEM.1999；121(14):3249-3255；Renne berg等人，J.AM.CHEM.SOC.2002；124:5993-6002；Ittig等人，NUC LEIC ACIDSRES.2004；32(1):346-353；Scheidegger等人，Chemistry 2006；12:8014-8023；Ivanova等人，OLIGONUCLEOTIDES 2007；17:54-65；这些文献中的每一个各自据此以引用方式整体并入本文。
在某些实施方案中，三环核苷酸是三环的核苷酸(也称为三环的DNA)，其中3'-碳和5'-碳中心通过与环丙烷环稠合的亚乙基连接，如例如在Leumann CJ,Bioorg.Med.Chem.2002；10:841-854以及已公布的美国申请2015/0259681和2018/0162897中所述的，所述参考各自据此以引用方式并入。在某些实施方案中，三环核苷酸包含取代的呋喃糖基环和第三稠合环，所述呋喃糖基环包含连接呋喃糖基的2'-碳和4'-碳以形成第二环的桥，所述第三稠合环由将5'-碳连接到桥(所述桥连接呋喃糖基的2'-碳和4'-碳)的亚甲基的基团产生，如例如在已公布的美国申请2015/0112055中所述的，所述参考据此以引用方式并入本文。
其他增加Tm的核苷酸
除双环和三环核苷酸外，其他增加Tm的核苷酸可在本文所述的核酸抑制剂分子中使用。例如，在某些实施方案中，增加Tm的核苷酸为G-夹、胍G-夹或其类似物(Wilds等人,Chem,2002；114:123和Wilds等人,Chim Acta 2003；114:123)、己糖醇核苷酸(Herdewijn,Chem.Biodiversity 2010；7:1-59)或修饰的核苷酸。修饰的核苷酸可具有修饰的核碱基，如本文所述，包括例如5-溴-尿嘧啶、5-碘-尿嘧啶、5-丙炔基修饰的嘧啶或2-氨基腺嘌呤(也称为2,6-二氨基嘌呤)(Deleavey等人,Chem.&Biol.2012；19:937-54)或2-硫代尿苷、5Me-硫代尿苷和假尿苷。修饰的核苷酸还可具有修饰的糖部分，如例如美国专利号8,975,389中所述，所述参考据此以引用方式并入，或如本文所述，除了增加Tm的核苷酸在糖部分的2'-碳处未用2'-F或2'-OMe修饰。
在某些实施方案中，增加Tm的核苷酸为双环核苷酸。在某些实施方案中，增加Tm的核苷酸为三环核苷酸。在某些实施方案中，增加Tm的核苷酸为G-夹、胍G-夹或其类似物。在某些实施方案中，增加Tm的核苷酸为己糖醇核苷酸。在某些实施方案中，增加Tm的核苷酸为双环或三环核苷酸。在某些实施方案中，增加Tm的核苷酸为双环核苷酸、三环核苷酸或G-夹、胍G-夹或其类似物。在某些实施方案中，增加Tm的核苷酸为双环核苷酸、三环核苷酸、G-夹、胍G-夹或其类似物、或己糖醇核苷酸。
在某些实施方案中，增加Tm的核苷酸的每次掺入使核酸抑制剂分子的第二双链体(D2)的Tm增加至少2℃。在某些实施方案中，增加Tm的核苷酸的每次掺入使D2的Tm增加至少3℃。在某些实施方案中，增加Tm的核苷酸的每次掺入使D2的Tm增加至少4℃。在某些实施方案中，增加Tm的核苷酸的每次掺入使D2的Tm增加至少5℃。
其他修饰
本文所述的双链核酸抑制剂分子除第二双链体(D2)中的至少一个增加Tm的核苷酸以外，还可含有其他核苷酸修饰。通常，双链核酸抑制剂分子的多个核苷酸被修饰以改善分子的各种特性，诸如对核酸酶的抗性或降低的免疫原性。参见例如，Bramsen等人,(2009),Nucleic Acids Res.,37,2867-2881。许多核苷酸修饰已用于寡核苷酸领域，特别是用于核酸抑制剂分子。可在核苷酸的包括糖部分、磷酸二酯键和核碱基的任何部分上进行此类修饰。核苷酸修饰的典型实例包括但不限于2'-F、2'-O-甲基(“2'-OMe”或“2'-OCH3”)和2'-O-甲氧基乙基(“2'-MOE”或“2'-OCH2CH2OCH3”)。如本文所述，修饰也可发生在核苷酸的糖部分的其他部分，诸如5'-碳处。
在某些实施方案中，双链核酸抑制剂分子还可在1'-位处包括除腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶以外的一种或多种如本领域已知和如本文所述的修饰的核碱基。在某些实施方案中，修饰的或通用的核碱基为含氮碱基。在某些实施方案中，修饰的核碱基不含有氮原子。参见例如美国公开专利申请号20080274462。在某些实施方案中，修饰的核苷酸不含有核碱基(无碱基)。修饰的核碱基的典型实例为5'-甲基胞嘧啶。
RNA和DNA的天然存在的核苷酸间键为3'-至5'-磷酸二酯键。修饰的磷酸二酯键包括非天然存在的核苷酸间连接基团，包括如本领域已知和如本文所述的含有磷原子的核苷酸间键和不含磷原子的核苷酸间键。通常，如本文所述，双链核酸抑制剂分子含有一个或多个含磷核苷酸间连接基团。在其他实施方案中，如本文所述，双链核酸抑制剂分子的核苷酸间连接基团中的一个或多个为非含磷键。在某些实施方案中，双链核酸抑制剂分子含有一个或多个含磷核苷酸间连接基团和一个或多个不含磷核苷酸间连接基团。
在某些实施方案中，双链核酸抑制剂分子含有至少一个硫代磷酸酯核苷酸间连接基团。在某些实施方案中，双链核酸抑制剂分子含有少于10个，诸如少于5个硫代磷酸酯核苷酸间连接基团。在某些实施方案中，双链核酸抑制剂分子含有4个硫代磷酸酯核苷酸间连接基团。
双链核酸抑制剂分子的有义链和/或反义链的5'-端可包括天然取代基，诸如羟基或磷酸酯基团。在某些实施方案中，羟基基团附接到双链核酸抑制剂分子的有义链和/或反义链的5'-末端。在某些实施方案中，磷酸酯基团附接到双链核酸抑制剂分子的有义链和/或反义链的5'-末端。通常，在寡核苷酸合成之前将磷酸酯加入单体中。在其他实施方案中，在将核酸抑制剂分子引入到细胞质中之后，例如通过胞质Clp1激酶自然地实现5'-磷酸化。在一些实施方案中，5'-末端磷酸酯为磷酸酯基团，诸如5'-单磷酸酯[(HO)2(O)P-O-5']、5'-二磷酸酯[(HO)2(O)P-O-P(HO)(O)-O-5']或5'-三磷酸酯[(HO)2(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-0-5']。
双链核酸抑制剂分子的有义链和/或反义链的5'-端也可被修饰。例如，在一些实施方案中，双链核酸抑制剂分子的有义链和/或反义链的5'-端附接至氨基磷酸酯[(HO)2(O)P-NH-5'，(HO)(NH2)(O)P-O-5']。在某些实施方案中，双链核酸抑制剂分子的有义链和/或反义链的5'-末端附接至磷酸酯模拟物。合适的磷酸酯模拟物包括5'-膦酸酯，诸如5'-亚甲基膦酸酯(5'-MP)，5'-(E)-乙烯基膦酸酯(5'-VP)。Lima等人,Cell,2012,150-883-94；WO2014/130607。其他合适的磷酸酯模拟物包括与寡核苷酸的5'-末端核苷酸的糖部分(例如，核糖或脱氧核糖或其类似物)的4'-碳结合的4-磷酸酯类似物，如国际公开号WO 2018/045317中所述，所述参考据此以引用方式整体并入。例如，在一些实施方案中，双链核酸抑制剂分子的有义链和/或反义链的5'-端附接至氧甲基膦酸酯，其中氧甲基的氧原子与糖部分或其类似物的4'-碳结合。在其他实施方案中，磷酸酯类似物是硫代甲基膦酸酯或氨基甲基膦酸酯，其中硫代甲基的硫原子或氨基甲基的氮原子与糖部分或其类似物的4'-碳结合。
在某些实施方案中，双链核酸抑制剂分子包括一个或多个脱氧核糖核苷酸。通常，双链核酸抑制剂分子含有少于5个脱氧核糖核苷酸。在某些实施方案中，双链核酸抑制剂分子包括一个或多个核糖核苷酸。在某些实施方案中，双链核酸抑制剂分子的所有核苷酸都是核糖核苷酸。
在某些实施方案中，在双链核酸抑制剂分子的茎(第二双链体或D2)之外的一个或多个核苷酸含有具有修饰的环结构的糖部分，包括但不限于如本文所述的存在于双环或三环核苷酸中的修饰的环结构，以及解锁核酸(“UNA”)(参见，例如，Snead等人(2013),Molecular Therapy–Nucleic Acids,2,e103(doi:10.1038/mtna.2013.36))。
在某些实施方案中，双链核酸抑制剂分子的一个或两个核苷酸被谷胱甘肽敏感部分可逆地修饰。通常，谷胱甘肽敏感部分位于糖部分的2'-碳处并且包含磺酰基。在某些实施方案中，谷胱甘肽敏感部分与亚磷酰胺寡核苷酸合成方法相容，如国际公开号WO 2018/045317中所述，所述参考据此以引用方式整体并入。在某些实施方案中，双链核酸抑制剂分子的超过两个核苷酸被谷胱甘肽敏感部分可逆地修饰。在某些实施方案中，核苷酸中的大多数被谷胱甘肽敏感部分可逆地修饰。在某些实施方案中，双链核酸抑制剂分子的所有或基本上所有核苷酸被谷胱甘肽敏感部分可逆地修饰。
所述至少一个谷胱甘肽敏感部分通常位于双链核酸抑制剂分子的有义链或反义链的5'-末端或3'-末端核苷酸处。然而，所述至少一个谷胱甘肽敏感部分可位于双链核酸抑制剂分子中任何所关注的核苷酸处。
在某些实施方案中，双链核酸抑制剂分子被完全修饰，其中有义链和反义链的每个核苷酸均被修饰；通常，每个核苷酸在糖部分的2'-位被修饰。在某些实施方案中，完全修饰的核酸抑制剂分子不含可逆修饰。在一些实施方案中，双链核酸抑制剂分子的有义链的至少一个，诸如至少两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36个核苷酸被修饰。在一些实施方案中，双链核酸抑制剂分子的反义链的至少一个诸如至少两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24个核苷酸被修饰。
在某些实施方案中，完全修饰的核酸抑制剂分子被一个或多个可逆的谷胱甘肽敏感部分修饰。在某些实施方案中，双链核酸抑制剂分子的基本上所有的核苷酸均被修饰。在某些实施方案中，双链核酸抑制剂分子的超过一半的核苷酸被除可逆修饰以外的化学修饰修饰。在某些实施方案中，双链核酸抑制剂分子的少于一半的核苷酸被除可逆修饰以外的化学修饰修饰。修饰可在核酸抑制剂分子上的基团中发生，或者可散布不同的修饰核苷酸。
在双链核酸抑制剂分子的某些实施方案中，从一个至每个核苷酸在2'-碳处被修饰。在某些实施方案中，双链核酸抑制剂分子用2'-F、2'-OMe和/或2'-MOE部分或完全修饰。在双链核酸抑制剂分子的某些实施方案中，从一个至每个磷原子被修饰并且从一个至每个核苷酸在糖部分的2'-碳处被修饰。
在双链核酸抑制剂分子的某些实施方案中，有义链和反义链上的每个核苷酸在糖部分的2'-碳处被修饰。在双链核酸抑制剂分子的某些实施方案中，除了在有义链的第二区域(R2)中的核苷酸之外，有义链和反义链上的每个核苷酸在糖部分的2'-碳处用2'-F或2'-OMe修饰。在双链核酸抑制剂分子的某些实施方案中，除了在茎(第二双链体或D2)中增加Tm的核苷酸之外，有义链和反义链上的每个核苷酸在糖部分的2'-碳处用2'-F或2'-OMe修饰。在双链核酸抑制剂分子的某些实施方案中，除了茎(第二双链体或D2)中增加Tm的核苷酸和三元环中与配体部分(诸如GalNAc)缀合的核苷酸之外，有义链和反义链上的每个核苷酸在糖部分的2'-碳处用2'-F或2'-OMe修饰。
降低靶基因表达的方法
如本文所述，含三元环的双链核酸抑制剂分子可在降低所关注的任何靶基因的靶mRNA表达的方法中使用。通常，降低mRNA表达的方法包括以足以降低靶基因的mRNA表达的量向样本或有需要的受试者施用如本文所述的双链核酸抑制剂分子。所述方法可在体外或体内进行。
靶RNA的水平或活性可通过本领域目前已知的或以后开发的合适的方法来确定。可以理解，用于测量靶RNA和/或靶基因的“表达”的方法可取决于靶基因及其编码的RNA的性质。例如，在靶RNA序列编码蛋白质的情况下，术语“表达”可指来源于靶基因(基因组或外源来源)的蛋白质或靶RNA/转录物。在此类情况下，靶RNA的表达可通过直接测量靶RNA/转录物的量或通过测量由靶RNA/转录物编码的蛋白质的量来确定。蛋白质可在蛋白质分析中测量，诸如通过染色或免疫印迹，或者如果所述蛋白质催化可被测量的反应，则通过测量反应速率来测量。所有此类方法是本领域已知的并且可以使用。在将要测量靶RNA水平的情况下，可使用本领域公认的用于检测RNA水平的方法(例如RT-PCR、Northern印迹等)。上述测量可在细胞、细胞提取物、组织、组织提取物或其他合适的源材料上进行。
药物组合物
本公开提供了药物组合物，所述药物组合物包含治疗有效量的如本文所述的含三元环的双链核酸抑制剂分子和药学上可接受的赋形剂。
这些药物组合物可通过常规的灭菌技术来灭菌或可被无菌过滤。所得水性溶液可按原样或冻干形式被包装以供使用，冻干制剂在施用之前与无菌水性赋形剂组合。所述制剂的pH通常将在3到11之间，更优选地在5到9之间或在6到8之间，并且最优选在7到8之间，诸如7至7.5。
本公开的药物组合物应用于治疗用途。因此，本公开的一个方面提供了一种药物组合物，其可通过向受试者(包括但不限于患有疾病或病症的人)施用治疗有效量的本公开的药物组合物来用于治疗所述受试者。在某些实施方案中，所述疾病或病状为癌症，如本文所述。
在某些实施方案中，本公开特征在于治疗有效量的如本文所述的药物组合物用于制造治疗有需要的受试者的药物的用途。在某些实施方案中，如本文所述，受试者患有癌症。
药学上可接受的赋形剂
可用于本公开的药学上可接受的赋形剂通常是常规的。Remington’sPharmaceutical Sciences,E.W.Martin,Mack Publishing Co.,Easton,PA，第15版(1975)描述了适合于一种或多种治疗组合物的药物递送的组合物和制剂。可充当药学上可接受的赋形剂的材料的一些实例包括：糖，诸如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，诸如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，诸如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；麦芽；明胶；赋形剂，诸如可可脂和栓剂蜡；油，诸如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；缓冲剂，诸如氢氧化镁和氢氧化铝；(等渗盐水；林格氏溶液)；乙醇；pH缓冲溶液；多元醇，诸如甘油、丙二醇、聚乙二醇等；以及药物制剂中使用的其他无毒相容物质。
剂型
药物组合物可与常规赋形剂一起配制用于任何预期的施用途径，其可根据常规实践进行选择。
在一个实施方案中，药物组合物含有如本文所述的含三元环的双链核酸抑制剂分子，并且适合于肠胃外施用，例如通过皮下、肌内、静脉内或硬膜外注射。通常，本公开的药物组合物被配制成用于肠胃外施用的液体形式。
适合于胃肠外施用的剂型通常包括一种或多种适合于胃肠外施用的媒介物，包括例如无菌水性溶液、盐水、低分子量醇(诸如丙二醇、聚乙二醇)、植物油、明胶、脂肪酸酯(诸如油酸乙酯)等。肠胃外制剂可含有糖类、醇类、抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、使制剂与预期接受者的血液等渗的溶质、或悬浮剂或增稠剂。例如，可以通过表面活性剂的使用来保持适当的流动性。含有双链核酸抑制剂的液体制剂可被冻干并储存，以便以后在用无菌注射溶液重构时使用。
药物组合物也可使用众所周知的技术配制用于其他施用途径，包括局部或透皮施用、直肠或阴道施用、眼内施用、鼻内施用、颊内施用或舌下施用。
递送剂
如本文所述的含三元环的双链核酸抑制剂分子可与其他分子、分子结构或化合物的混合物混合、包封、缀合或以其他方式结合以有助于摄取、分布或吸收，所述其他分子、分子结构或化合物的混合物包括例如脂质体和脂质，诸如美国专利号6,815,432、6,586,410、6,858,225、7,811,602、7,244,448和8,158,601中公开的那些；聚合物材料，诸如美国专利号6,835,393、7,374,778、7,737,108、7,718,193、8,137,695和美国公布专利申请号2011/0143434、2011/0129921、2011/0123636、2011/0143435、2011/0142951、2012/0021514、2011/0281934、2011/0286957和2008/0152661中公开的那些；衣壳、类壳体或受体靶向分子。
在某些实施方案中，含三元环的双链核酸抑制剂分子在脂质纳米颗粒(LNP)中配制。脂质-核酸纳米颗粒通常在脂质与核酸混合以形成复合物时自发形成。根据所期望的粒度分布，可以使用例如热筒挤出机(诸如
Figure BDA0003208444980000541
挤出机(Northern Lipids,Inc))将所得的纳米颗粒混合物任选地通过聚碳酸酯膜挤出(例如100nm截止值)。为了制备用于治疗用途的脂质纳米颗粒，可能需要除去用于形成纳米颗粒的溶剂(例如，乙醇)和/或交换缓冲液，这可通过例如透析或切向流过滤来实现。制备含有核酸干扰分子的脂质纳米颗粒的方法是本领域已知的，如例如在美国公布的专利申请号2015/0374842和2014/0107178中所公开的。
在某些实施方案中，LNP包含含有阳离子脂质体和聚乙二醇化脂质的核心脂质组分。LNP还可包含一种或多种包膜脂质，诸如阳离子脂质、结构或中性脂质、固醇、聚乙二醇化脂质、或它们的混合物。
用于LNP的阳离子脂质是本领域已知的，如例如在美国公布的专利申请号2015/0374842和2014/0107178中所讨论的。通常，阳离子脂质是在生理pH下具有净正电荷的脂质。在某些实施方案中，阳离子脂质体为DODMA、DOTMA、DL-048或DL-103。在某些实施方案中，结构脂质或中性脂质为DSPC、DPPC或DOPC。在某些实施方案中，固醇为胆固醇。在某些实施方案中，聚乙二醇化脂质为DMPE-PEG、DSPE-PEG、DSG-PEG、DMPE-PEG2K、DSPE-PEG2K、DSG-PEG2K或DSG-mPEG。在一个实施方案中，阳离子脂质为DL-048，聚乙二醇化脂质为DSG-mPEG，并且一种或多种包膜脂质为DL-103、DSPC、胆固醇和DSPE-mPEG。参见例如，图8，其示出了可用于配制双链核酸抑制剂分子的LNP的一个非限制性实施方案。
在某些实施方案中，含三元环的双链核酸抑制剂分子与配体共价缀合，所述配体引导寡核苷酸至所关注的组织的递送。已经探究了许多此类配体。参见，例如，Winkler,Ther.Deliv.4(7):791-809(2013)。例如，可将双链核酸抑制剂分子与一个或多个糖配体部分(例如，N-乙酰半乳糖胺(GalNAc))缀合，以引导寡核苷酸进入肝脏中的摄取。参见，例如，美国专利号5,994,517、美国专利号5,574,142、WO2016/100401。在某些实施方案中，一个或多个配体与双链核酸抑制剂分子的三元环中的一个或多个核苷酸缀合。
在某些实施方案中，双链核酸抑制剂分子与三元环中的两个或三个糖配体部分缀合。在一个实施方案中，三元环中的两个核苷酸与糖配体部分缀合。在另一个实施方案中，三元环中的三个核苷酸与糖配体部分缀合。在某些实施方案中，糖配体部分为GalNAc。在一个实施方案中，糖配体部分缀合为GalNAc并且与三元环中的两个核苷酸缀合。在一个实施方案中，GalNAc与GAA三元环的AA核苷酸缀合。可使用的其他配体包括但不限于甘露糖-6-磷酸、胆固醇、叶酸、转铁蛋白和半乳糖(对于其他特定的示例性配体参见例如WO2012/089352)。
配体可与核苷酸的任何部分缀合，只要它能够引导寡核苷酸向所关注的组织的递送即可。在某些实施方案中，配体(例如，GalNAc)在糖部分的2'-位处与核苷酸缀合。
施用/治疗的方法
一个实施方案涉及治疗病症的方法，所述方法包括向受试者施用包含治疗有效量的如本文所述的含三元环的双链核酸抑制剂分子的药物组合物。
在某些实施方案中，本文公开的药物组合物可用于治疗或预防与增殖性、炎性、自身免疫性、神经性、眼、呼吸、代谢、皮肤、听觉、肝、肾或感染性疾病相关的症状。一个实施方案涉及治疗增殖性、炎性、自身免疫性、神经性、眼、呼吸、代谢、皮肤、听觉、肝、肾或感染性疾病的方法，所述方法包括向受试者施用包含治疗有效量的如本文所述的双链核酸抑制剂分子的药物组合物。
在某些实施方案中，所述病症为罕见疾病、慢性肝病、慢性肾病、心血管疾病或病毒感染性疾病。在某些实施方案中，所述病症为高草酸尿症，包括原发性高草酸尿症(PH1、PH2或PH3)或特发性高草酸尿症。在某些实施方案中，所述病症为慢性肾病症(CKD)。在某些实施方案中，所述病症为丙酮酸脱氢酶缺乏症。在某些实施方案中，所述病症为α-1抗胰蛋白酶(A1AT)缺乏症。
在某些实施方案中，所述病症为癌症。此类癌症的非限制性实例包括胆道癌、膀胱癌、移行细胞癌、尿路上皮癌、脑癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、乳腺癌、化生性癌、宫颈癌、宫颈鳞状细胞癌、直肠癌、结直肠癌、结肠癌、遗传性非息肉病结直肠癌、结直肠腺癌、胃肠道间质瘤(GIST)、子宫内膜癌、子宫内膜间质肉瘤、食道癌、食道鳞状细胞癌、食道腺癌、眼黑素瘤、葡萄膜黑素瘤、胆囊癌、胆囊腺癌、肾细胞癌、透明细胞肾细胞癌、移行细胞癌、尿路上皮癌、威尔姆氏肿瘤、白血病、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、急性髓样白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性髓样白血病(CML)、慢性骨髓单核细胞白血病(CMML)、肝癌(liver cancer)、肝癌瘤(liver carcinoma)、肝细胞瘤、肝细胞癌、胆管癌、肝母细胞瘤、肺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、间皮瘤、B细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、前体T成淋巴细胞性淋巴瘤/白血病、外周T细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、鼻咽癌(NPC)、神经母细胞瘤、口咽癌、口腔鳞状细胞癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、胰腺导管腺癌、假乳头状赘生物、腺泡细胞癌。前列腺癌、前列腺腺癌、皮肤癌、黑素瘤、恶性黑素瘤、皮肤黑素瘤、小肠癌、胃癌(stomach cancer)、胃癌瘤(gastric carcinoma)、胃肠道间质瘤(GIST)、子宫癌或子宫肉瘤。通常，本公开的特征在于通过施用治疗有效量的如本文所述的药物组合物来治疗肝癌、肝癌瘤、肝细胞瘤、肝细胞癌、胆管癌和肝母细胞瘤的方法。
在一些实施方案中，本公开提供了用于降低受试者中靶基因表达的方法，所述方法包括以足以降低靶基因表达的量向有需要的受试者施用药物组合物，其中所述药物组合物包含如本文所述的含三元环的双链核酸抑制剂分子和也如本文所述的药学上可接受的赋形剂。
靶基因可以是来自任何哺乳动物的靶基因，诸如人靶基因。根据本发明的方法可使任何靶基因沉默。在某些实施方案中，靶基因与慢性肝病或慢性肾病相关，包括例如AGXT、GRHPR、HOGA1、HAO1、SERPINA1或LDHA。在某些实施方案中，靶基因与病毒感染性疾病相关，包括例如HBV基因或HCV基因。在某些实施方案中，靶基因与心血管疾病相关，包括例如APOC3或PCSK9。在某些实施方案中，靶基因与酒精代谢和肝功能相关，包括例如ALDH2。
其他示例性靶基因包括但不限于KRAS、因子VII、Eg5、PCSK9、TPX2、apoB、SAA1、TTR、PDGFβ基因、Erb-B基因、Src基因、CRK基因、GRB2基因、RAS基因、MEKK基因、JNK基因、RAF基因、Erk1/2基因、PCNA(p21)基因、MYB基因、JUN基因、FOS基因、BCL-2基因、细胞周期蛋白D基因、VEGF基因、EGFR基因、细胞周期蛋白A基因、细胞周期蛋白E基因、WNT-1基因、β-连环蛋白基因、c-MET基因、PKC基因、NFKB基因、STAT3基因、存活素基因、Her2/Neu基因、拓扑异构酶I基因、拓扑异构酶IIα基因、p73基因、p21(WAF1/CIP1)基因、p27(KIP1)基因、PPM1D基因、RAS基因、小窝蛋白I基因、MIB I基因、MTAI基因、M68基因、肿瘤抑制基因突变、p53肿瘤抑制基因以及它们的组合。
给药和时间表
通常，双链核酸抑制剂分子是肠胃外施用的(诸如经由静脉内、肌内或皮下施用)。在其他实施方案中，药物组合物经由局部施用或全身施用来递送。然而，本文公开的药物组合物也可通过本领域已知的任何方法施用，包括例如含服、舌下、直肠、阴道、尿道内、局部、眼内、鼻内和/或耳内，所述施用可包括片剂、胶囊、颗粒、水性悬浮液、凝胶、喷剂、栓剂、药膏、软膏等。
在某些实施方案中，双链核酸抑制剂分子以每天每千克接受者体重20微克至10毫克、每千克100微克至5毫克、每千克0.1毫克至5.0毫克、每千克0.25毫克至5.0毫克或每千克0.2毫克至3.0毫克的剂量施用。通常，双链核酸抑制剂分子以每天每千克接受者体重约0.25毫克至2.0毫克的剂量施用，诸如每天每千克接受者体重0.3毫克、每天每千克接受者体重0.5毫克，或每天每千克接受者体重1毫克。
本公开的药物组合物可每天或间歇地施用。例如，双链核酸抑制剂分子的间歇施用可以是每周1-6天、每月1-6天、每周一次、隔周一次、每月一次、隔月一次、每三月一次或每年一次或两次施用，或分为多个年、月、周或日剂量。在一些实施方案中，间歇给药可意指在初始双链核酸抑制剂分子施用后有休息期的循环中施用，在休息期中不施用长达至多一周、至多一个月、至多两个月、至多三个月或至多六个月或更长时间)，或者间歇给药可意指在隔数天、数周、数月或数年施用。
双链核酸抑制剂分子的治疗有效量可取决于施用途径和患者的身体特征，诸如受试者的大小和体重、疾病进展或侵入的程度、受试者的年龄、健康状况和性别，并且可根据这些因素和其他因素进行必要的调整。
实施例
实施例1：含有三元环和四元环的双链核酸抑制剂分子的体内剂量反应
在剂量-反应研究中评估了除不同茎长外还含有四元环和三元环的双链核酸抑制剂分子。将CD-1雌性小鼠分成多个研究组并给予分配给所述组的测试核酸抑制剂分子。对四只CD-1雌性小鼠分别给予0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.4mg/kg、0.8mg/kg、1.6mg/kg和3.2mg/kg的五种测试核酸抑制剂分子中的每一种。另外，对四只对照CD-1小鼠给予安慰剂(PBS)，因此总样本量为124只小鼠。给药是皮下和单次给药，并且在给药后4天处死小鼠。进行了药效动力学研究，并采集了肝脏样品用于RT-qPCR。在
Figure BDA0003208444980000591
Lysis Reagent中使用TissueLyser II(Qiagen,Valencia,CA)使组织样品匀化。然后根据制造商说明(ThermoFisher Scientific,Waltham,MA)使用MagMAX Technology纯化RNA。使用高容量cDNA逆转录试剂盒(ThermoFisher Scientific,Waltham,MA)制备cDNA。靶序列的引物用于在CFX384 Real-Time PCR Detection System(Bio-Rad Laboratories,Inc.,Hercules,CA)上的PCR。
实施例1中使用的五种测试核酸抑制剂分子(构建体1-5)示于图2A-2E中。除了环中与GalNAc缀合的核苷酸和双环核苷酸之外，所述测试核酸抑制剂分子中的每个其他核苷酸在糖部分的2'-位处用2'-OMe或2'-F修饰。所述测试核酸抑制剂分子在以下方面有所不同：环部分的长度(四元环对三元环)、茎部分的长度(6个碱基对对3个碱基对)、双环核苷酸的存在或不存在以及环中GalNAc的数量(2对3)。图2A-2E中的核酸抑制剂分子总结于下表中：
表1：图1中的测试核酸抑制剂
Figure BDA0003208444980000601
长茎(6个碱基对)四元环构建体1和2是相同的，唯一的区别是环中GalNAc的数量(3对2)。长茎构建体2与长茎构建体3相同，不同的是构建体2具有四元环，而构建体3具有三元环。长茎构建体3与短茎(3个碱基对)构建体4相同，不同的是构建体3具有6个碱基对的茎双链体且没有双环核苷酸，而构建体4具有3个碱基对的茎双链体，其中茎双链体中的所有核苷酸都是双环核苷酸。短茎构建体4和5是相同的，唯一的区别是在构建体4的茎中存在6个BNANC[NMe]，而构建体5的茎中存在6个LNA双环核苷酸。在构建体4中使用的双环核苷酸是BNANC[NMe]，其中连接双环核苷酸的2'-碳和4'-碳的桥是4'-CH2-N(CH3)-O-2'。在构建体5中使用的双环核苷酸为LNA，其中连接双环核苷酸的2'-碳和4'-碳的桥为4'-(CH2)-O-2'。
使用非线性回归分析(GraphPad Prism软件)，相对于log[mg/kg]，基于相对于PBS的50％靶基因剩余百分比计算有效剂量(ED50)曲线。将四元环长茎(6个碱基对)核酸分子与三元环长茎核酸分子进行比较。另外，将含有BNANC[NMe]的三元环短茎(3个碱基对)核酸抑制剂分子与对应的含有LNA的三元环短茎核酸分子进行比较。还将它们与没有双环核苷酸的三元环和四元环较长茎(茎中6个碱基对)的核酸分子进行了比较。如图3和图4所示，与含有2或3个GalNAc的对应的四元环核酸分子(构建体1和2)相比，三元环较长茎的核酸抑制剂分子(构建体3)和在短茎中含有双环核苷酸的三元环较短茎的核酸分子(构建体4和5)都显示出相似的靶基因敲减效力。
实施例2：含有四元环和三元环的双链核酸抑制剂分子对于靶基因敲减的体内效力
将CD-1雌性小鼠分成多个研究组并给予分配给所述组的测试核酸抑制剂分子。实施例2中使用的测试核酸抑制剂分子(构建体6-13)示于图6A-6H中。还使用了构建体1(参见图2A)。除了环中与GalNAc缀合的核苷酸和双环核苷酸之外，所述测试核酸抑制剂分子中的每个其他核苷酸在糖部分的2'-位处用2′-OMe或2′-F修饰。所述测试核酸抑制剂分子在以下方面有所不同：环部分的长度(四元环对三元环)、茎部分的长度(6个碱基对、3个碱基对、2个碱基对和1个碱基对)以及双环核苷酸的存在或不存在。图6A-6H中的核酸抑制剂分子总结于下表中：
表2：图6中的测试核酸抑制剂
图号 名称 环长度 茎长度 双环核苷酸
6A 构建体6 4 6个碱基对 无
6B 构建体7 3 6个碱基对 无
6C 构建体8 4 3个碱基对 BNA
6D 构建体9 3 3个碱基对 BNA
6E 构建体10 4 2个碱基对 BNA
6F 构建体11 3 2个碱基对 BNA
6G 构建体12 4 1个碱基对 BNA
6H 构建体13 3 1个碱基对 BNA
长茎(6个碱基对)构建体6和7是相同的，唯一的区别是环中核苷酸的数量(四元环对三元环)。构建体1与构建体6相同，不同的是构建体1含有3个与四元环缀合的GalNAc，而构建体6含有2个与四元环缀合的GalNAc。构建体8(3个碱基对的茎)与构建体9(3个碱基对的茎)相同，不同的是构建体8具有四元环，而构建体9具有三元环。构建体10和11(2个碱基对的茎)是相同的，唯一的区别是构建体10具有四元环，而构建体11具有三元环。构建体12和13(1个碱基对的茎)是相同的，唯一的区别是构建体12具有四元环，而构建体13具有三元环。在构建体8-13中使用的双环核苷酸为BNANC[NMe]。
以单次0.5mg/kg剂量向动物皮下给予所分配的测试核酸抑制剂分子，并在给药后4天处死小鼠。通过进行两次4mm穿刺活检来收集肝组织，将其储存在InvitrogenTMRNAlaterTM溶液(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA)中用于随后的mRNA分析。在
Figure BDA0003208444980000621
Lysis Reagent中使用TissueLyser II(Qiagen,Valencia,CA)使组织样品匀化。然后根据制造商说明(ThermoFisher Scientific,Waltham,MA)使用MagMAX Technology纯化RNA。使用高容量cDNA逆转录试剂盒(ThermoFisher Scientific,Waltham,MA)制备cDNA。靶序列的引物用于在CFX384 Real-Time PCR Detection System(Bio-Rad Laboratories,Inc.,Hercules,CA)上的PCR。
将三元环测试核酸抑制剂分子(构建体7、9、11和13)与测试核酸分子的对应四元环型式(分别为构建体1、6、8、10和12)进行比较。如图7所示，与6个碱基对、3个碱基对和2个碱基对构建体的对应的四元环测试核酸分子相比，含有三元环的测试核酸抑制剂分子显示出相似的靶基因mRNA的敲减。包含与2个GalNAc缀合的三元环并在茎中具有2个碱基对的构建体11，具有比包含与3个GalNAc缀合的三元环和在茎中具有6个碱基对的构建体1更高的效力。包含在茎中具有1个碱基对的三元环的构建体13，没有表现出靶基因mRNA的敲减，而包含四元环和茎中1个碱基对的构建体12显示出靶基因mRNA的明显敲减。

Claims (29)

1.一种双链核酸抑制剂分子，其包含：
有义链，其包含20-65个核苷酸并且具有第一区域(R1)和第二区域(R2)；
反义链，其包含15-40个核苷酸，其中所述有义链和所述反义链是单独的链；和
第一双链体(D1)，其由所述有义链的所述第一区域和所述反义链形成，其中所述第一双链体具有15-40个碱基对的长度；
其中所述有义链的所述第二区域包含第一子区域(S1)、第二子区域(S2)以及接合所述第一区域与所述第二区域的三元环(triL)，其中所述第一区域和所述第二区域形成第二双链体(D2)。
2.如权利要求1所述的双链核酸抑制剂分子，其中所述三元环具有GAA的核苷酸序列。
3.如权利要求1或2所述的双链核酸抑制剂分子，其中所述有义链具有22-65、25-39或27-35个核苷酸。
4.如前述权利要求中任一项所述的双链核酸抑制剂分子，其中所述反义链具有20-24或20-22个核苷酸。
5.如前述权利要求中任一项所述的双链核酸抑制剂分子，其中紧邻所述三元环的5'-端的核苷酸是C，并且紧邻所述三元环的3'-端的核苷酸是G。
6.如前述权利要求中任一项所述的双链核酸抑制剂分子，其中所述反义链在其3'-端处具有1-4个核苷酸的单链突出端。
7.如权利要求6所述的双链核酸抑制剂分子，其中所述单链突出端的长度为2个核苷酸。
8.如前述权利要求中任一项所述的双链核酸抑制剂分子，其中所述第一双链体具有18-30、18-24或20-22个碱基对的长度。
9.如前述权利要求中任一项所述的双链核酸抑制剂分子，其中所述第二双链体具有2-6个碱基对的长度。
10.如前述权利要求中任一项所述的双链核酸抑制剂分子，其中所述第二双链体包含至少一个增加Tm的核苷酸，诸如双环核苷酸。
11.如前述权利要求中任一项所述的双链核酸抑制剂分子，其中所述第二双链体具有2或3个碱基对的长度。
12.如前述权利要求中任一项所述的双链核酸抑制剂分子，其中所述有义链的所述第一区域的长度为20个核苷酸，并且所述有义链的所述第二区域的长度为7-15个核苷酸；
其中由所述有义链的所述第一区域和所述反义链形成的所述第一双链体具有20个碱基对的长度；
其中由所述有义链的所述第二区域的所述第一核酸和所述第二核酸形成的所述第二双链体具有2-6个碱基对的长度；并且
其中所述反义链的长度为22个核苷酸并且在其3-’端处具有两个核苷酸的单链突出端。
13.如前述权利要求中任一项所述的双链核酸抑制剂分子，其中所述第二双链体中的每个核苷酸为增加Tm的核苷酸，诸如双环核苷酸。
14.如权利要求13所述的双链核酸抑制剂分子，其中所述第二双链体具有6个碱基对的长度。
15.如前述权利要求中任一项所述的双链核酸抑制剂分子，其中所述第二双链体包含至少一个增加Tm的核苷酸，其为选自以下中的一个或多个的双环核苷酸：
Figure FDA0003208444970000031
Figure FDA0003208444970000041
其中B为核碱基，R2为H或CH3并且Wa和Wb各自独立地为H、OH、羟基保护基团、磷部分、或将所述双环核苷酸附接到另一个核苷酸或附接到寡核苷酸的核苷酸间连接基团，并且其中Wa或Wb中的至少一个为将所述双环核苷酸附接到寡核苷酸的核苷酸间连接基团。
16.如前述权利要求中任一项所述的双链核酸抑制剂分子，其中所述第二双链体包含至少一个双环核苷酸，所述双环核苷酸包含第一环，其中所述第一环是呋喃糖基，以及连接所述呋喃糖基的2'-碳和4'-碳以形成第二环的桥。
17.如权利要求16所述的双链核酸抑制剂分子，其中所述连接所述呋喃糖基的2'-碳和4'-碳的桥选自由以下组成的组：
a)4'-CH2-O-N(R)-2'和4'-CH2-N(R)-O-2'，其中R为H、C1-C12烷基或保护基团，包括例如4'-CH2-NH-O-2'(也称为BNANC)或4'-CH2-N(CH3)-O-2'(也称为BNANC[NMe])；
b)4'-CH2-2'、4'-(CH2)2-2'、4'-(CH2)3-2'、4'-(CH2)-O-2'(也称为LNA)、4'-(CH2)-S-2'、4'-(CH2)2-O-2'(也称为ENA)、4'-CH(CH3)-O-2'(也称为cEt)和4'-CH(CH2OCH3)-O-2'(也称为cMOE)，及其类似物；
c)4'-C(CH3)(CH3)-O-2'及其类似物；
d)4'-CH2-N(OCH3)-2'及其类似物；
e)4'-CH2-O-N(CH3)-2'及其类似物；
f)4'-CH2-C(H)(CH3)-2'及其类似物；和
g)4'-CH2-C(═CH2)-2'及其类似物。
18.如前述权利要求中任一项所述的双链核酸抑制剂分子，其中所述三元环包含至少一个与配体缀合的核苷酸。
19.如前述权利要求中任一项所述的双链核酸抑制剂分子，其中所述三元环包含至少两个与配体缀合的核苷酸。
20.如前述权利要求18或19所述的双链核酸抑制剂分子，其中所述配体为GalNAc。
21.如权利要求20所述的双链核酸抑制剂分子，其中所述GalNAc在所述糖部分的2'-位处与所述核苷酸缀合。
22.如前述权利要求中任一项所述的双链核酸抑制剂分子，其还包含在所述有义链和/或所述反义链的5'-末端处的5'-磷酸酯模拟物。
23.如前述权利要求中任一项所述的双链核酸抑制剂分子，其中所述双链核酸抑制剂分子与脂质纳米颗粒一起配制。
24.如权利要求23所述的双链核酸抑制剂分子，其中所述脂质纳米颗粒包含核心脂质和包膜脂质，其中所述核心脂质包含第一阳离子脂质和第一聚乙二醇化脂质，并且其中所述包膜脂质包含第二阳离子脂质、中性脂质、固醇和第二聚乙二醇化脂质。
25.如权利要求24所述的双链核酸抑制剂分子，其中所述第一阳离子脂质为DL-048，所述第一聚乙二醇化脂质为DSG-MPEG，所述第二阳离子脂质为DL-103，所述中性脂质为DSPC，所述固醇为胆固醇，并且所述第二聚乙二醇化脂质为DSPE-MPEG。
26.一种药物组合物，其包含治疗有效量的如前述权利要求中任一项所述的双链核酸抑制剂分子和药学上可接受的赋形剂。
27.一种用于降低受试者中靶基因表达的方法，所述方法包括以足以降低所述靶基因表达的量向有需要的受试者施用如前述权利要求中任一项所述的双链核酸抑制剂分子或药物组合物。
28.如权利要求27所述的方法，其中所述施用包括静脉内、肌内或皮下施用。
29.如权利要求27或28所述的方法，其中所述受试者为人。
CN201980091916.3A 2018-12-12 2019-11-13 含有三元环的双链核酸抑制剂分子 Pending CN113454221A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201862778759P 2018-12-12 2018-12-12
US62/778759 2018-12-12
PCT/US2019/061241 WO2020123083A1 (en) 2018-12-12 2019-11-13 Double-stranded nucleic acid inhibitor molecules containing a triloop

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN113454221A true CN113454221A (zh) 2021-09-28

Family

ID=71076672

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201980091916.3A Pending CN113454221A (zh) 2018-12-12 2019-11-13 含有三元环的双链核酸抑制剂分子

Country Status (13)

Country Link
US (1) US20220064640A1 (zh)
EP (1) EP3894560A4 (zh)
JP (2) JP7535047B2 (zh)
KR (1) KR20210127917A (zh)
CN (1) CN113454221A (zh)
AU (1) AU2019397247A1 (zh)
BR (1) BR112021011294A2 (zh)
CA (1) CA3122930A1 (zh)
CL (1) CL2021001552A1 (zh)
IL (1) IL283775A (zh)
MX (1) MX2021007001A (zh)
SG (1) SG11202106046XA (zh)
WO (1) WO2020123083A1 (zh)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113795581A (zh) * 2019-05-03 2021-12-14 迪克纳制药公司 具有缩短的有义链的双链核酸抑制剂分子
JP2024528697A (ja) 2021-07-20 2024-07-30 エイジーエス・セラピューティクス・ソシエテ・パール・アクシオン・サンプリフィエ 微細藻類由来の細胞外小胞、その調製および使用
WO2023144127A1 (en) 2022-01-31 2023-08-03 Ags Therapeutics Sas Extracellular vesicles from microalgae, their biodistribution upon administration, and uses
US20230374522A1 (en) * 2022-04-15 2023-11-23 Dicerna Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for modulating scap activity
WO2023232976A1 (en) 2022-06-03 2023-12-07 Ags Therapeutics Sas Extracellular vesicles from genetically-modified microalgae containing endogenously-loaded cargo, their preparation, and uses
WO2024088808A1 (en) 2022-10-24 2024-05-02 Ags Therapeutics Sas Extracellular vesicles from microalgae, their biodistribution upon intranasal administration, and uses thereof

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006125977A2 (en) * 2005-05-25 2006-11-30 The University Of York Hybrid interfering rna
WO2010033225A2 (en) * 2008-09-22 2010-03-25 Dicerna Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for the specific inhibition of gene expression by dsrna possessing modifications
US20110245481A1 (en) * 2008-10-23 2011-10-06 The University Of Tokyo METHOD FOR INHIBITING FUNCTION OF micro-RNA
CN111050776A (zh) * 2017-06-29 2020-04-21 迪克纳制药公司 用于抑制hmgb1表达的组合物和方法
CN111971051A (zh) * 2018-04-13 2020-11-20 迪克纳制药公司 用增加tm的核苷酸修饰的双链核酸抑制剂分子

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3358014B1 (en) * 2010-04-19 2020-12-23 TAGCyx Biotechnologies Inc. Method for stabilizing functional nucleic acids
US20150011745A1 (en) * 2011-11-16 2015-01-08 Osaka City University Nucleic acid molecule for inhibiting activity of rnai molecule
EP3569711B1 (en) 2014-12-15 2021-02-03 Dicerna Pharmaceuticals, Inc. Ligand-modified double-stranded nucleic acids
AU2017232496B2 (en) 2016-03-16 2022-11-24 Dicerna Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for the treatment of a beta-catenin-associated disease or disorder
CA3033756A1 (en) * 2016-09-02 2018-03-08 Dicerna Pharmaceuticals, Inc. 4'-phosphate analogs and oligonucleotides comprising the same

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006125977A2 (en) * 2005-05-25 2006-11-30 The University Of York Hybrid interfering rna
WO2010033225A2 (en) * 2008-09-22 2010-03-25 Dicerna Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for the specific inhibition of gene expression by dsrna possessing modifications
US20110245481A1 (en) * 2008-10-23 2011-10-06 The University Of Tokyo METHOD FOR INHIBITING FUNCTION OF micro-RNA
CN111050776A (zh) * 2017-06-29 2020-04-21 迪克纳制药公司 用于抑制hmgb1表达的组合物和方法
CN111971051A (zh) * 2018-04-13 2020-11-20 迪克纳制药公司 用增加tm的核苷酸修饰的双链核酸抑制剂分子

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SIMON J ALLISON等: "RNA Interference by Single- and Double-stranded siRNA With a DNA Extension Containing a 3′ Nuclease-resistant Mini-hairpin Structure", pages 1 - 12 *

Also Published As

Publication number Publication date
CL2021001552A1 (es) 2021-11-26
EP3894560A1 (en) 2021-10-20
KR20210127917A (ko) 2021-10-25
EP3894560A4 (en) 2022-10-19
IL283775A (en) 2021-07-29
JP2024109582A (ja) 2024-08-14
JP2022521877A (ja) 2022-04-13
SG11202106046XA (en) 2021-07-29
AU2019397247A1 (en) 2021-06-24
MX2021007001A (es) 2021-10-13
JP7535047B2 (ja) 2024-08-15
WO2020123083A1 (en) 2020-06-18
BR112021011294A2 (pt) 2021-08-31
CA3122930A1 (en) 2020-06-18
US20220064640A1 (en) 2022-03-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7535047B2 (ja) トリループを含む二本鎖核酸インヒビター分子
KR102530513B1 (ko) 가역적으로 변형된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물 및 그의 용도
JP2023515862A (ja) オリゴヌクレオチド組成物及びその方法
US11873488B2 (en) Double-stranded nucleic acid inhibitor molecules modified with Tm-increasing nucleotides
KR20220010579A (ko) 4'-포스페이트 유사체 및 이를 포함하는 올리고뉴클레오타이드
TW201505657A (zh) 用於增強的細胞攝取之化合物及方法
US20220177880A1 (en) Double-stranded nucleic acid inhibitor molecules with shortened sense strands
JP2023539341A (ja) Ｄｕｘ４阻害剤およびその使用方法
TW202126809A (zh) 具有最小氟含量之小干擾rna的化學修飾
TW202321449A (zh) 用於寡核苷酸劑的基於寡核苷酸的遞送載體及其使用方法
JP2019527549A (ja) 転写プロセシングの調節のための化合物及び方法
JP2024535869A (ja) Ｗｆｄｃ２の発現を調節するアンチセンス化合物
EP4403634A1 (en) Antisense compound that regulates expression of wfdc2
KR20240138996A (ko) Wfdc2의 발현을 조절하는 안티센스 화합물을 포함하는 간질환 예방 또는 치료용 약학 조성물
WO2019074071A1 (ja) 核酸分子発現の調節

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination