KR20210118106A - 사이클로스포린 유사체 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 사이클로스포린 유사체 및 이의 용도를 제공하며, 특히 기증된 장기를 저장하기 위한 미토콘드리아 보호제로서의 화합물 및 이의 용도에 관한 것이다. 상기 화합물은 식 1의 화합물 또는 이의 염이고, 상기 식에서, n은 2-5이고, R₁ 및 R₂는 독립적으로 H 또는 C₁-C₄ 알킬로부터 선택되고, R₁ 및 R₂는 함께 연결되어 C₃-C₅ 헤테로알킬 고리를 형성할 수 있다.

Description

사이클로스포린 유사체 및 이의 용도

본 발명은 사이클로스포린 유사체 및 장기(organ) 기증자에서 미토콘드리아 보호제로서의 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 화합물은 이식 전에, 개체로부터 제거되거나 절단된 장기 또는 기타 신체 부위의 보존을 위해 사용될 수 있다. 특히, 배타적이지는 않지만, 본 발명은 장기 기증자에서 미토콘드리아 보호제로서의 식 1의 사이클로스포린 유사체의 용도에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 신장 기증자에서 미토콘드리아 보호제로서의 화합물 1의 용도에 관한 것이다.

급성 염증은 원래의 손상을 제거하기 위한 PAMP(pathogen-activated molecular patterns) 및 DAMP(damage-activated molecular patterns) 신호에 반응하여 작용하는 다양한 세포(호중구, 대식세포) 및 세포외(보체, 히스타민) 인자들의 복잡한 상호작용에 관여하는 것으로 잘 알려져 있다. 사이클로필린 A(Cyclophilin A)는 염증 반응을 지원하여 백혈구 이동을 촉진하는 케모카인으로서 기능하는 것으로 입증되었으며, 사이클로필린 A 의 차단은 급성 염증 동물 모델에서 유익한 것으로 나타났다. 보다 최근에는 세포 사멸 및 조직 괴사를 동반하는 심각한 형태의 염증이 설명되고 있다. 미토콘드리아 막에서 미토콘드리아 투과성 전이 기공(MPTP: Mitochondrial Permeability Transition Pore)이라고 불리는, 미토콘드리아 막의 기공의 개방이 괴사성 염증의 발병 및 유지에 중요하다는 것을 뒷받침하는 상당한 증거들이 현재 존재한다. 이 MPTP 개방의 주요 조절자는 사이클로필린 D(CypD)이며, CypD의 억제제는 괴사성 염증과 관련된 조직 손상을 예방하는 데 양호한 활성을 보였다. MPTP의 개방과 그에 따른 괴사성 세포 사멸의 개시는 산화 스트레스, 저산소증, 담즙염 독소 등을 포함한 다양한 요인으로 인한 세포 내 칼슘 수치 상승에 의해 유발된다. 특히, CypD의 유전학적 제거 또는 약리학적 억제는 심장 조직의 허혈-재관류 손상으로 인한 조직 분해를 보호하는 것으로 밝혀졌으며, 이는 CypD 억제가 보다 일반적으로 허혈-재관류 손상에 대한 실행가능한 약물 표적임을 시사한다.

신장 허혈(renal ischemia)은 동맥 폐쇄, 쇼크 및 신장 이식의 결과이며 신장 세포 사멸 및 신부전으로 이어질 수 있다. 허혈과 관련된 조직 손상의 추가 원인은 장기 이식 과정에서 발생한다. 기증 장기의 제거 후, 조직은 혈류 손실의 결과로서 필연적으로 산소 결핍에 노출되고, 혈류가 다시 시작되면 허혈성 조직에 손상이 발생한다. 절제 및 재관류 과정에서 조직 손상을 예방할 수 있는 화합물은 이식된 장기의 생존력을 향상시킬 것이다. 조직 보호제로 사용되는 화합물의 바람직한 프로파일은, CypD의 강력한 억제, 허혈성 스트레스에 따른 MPTP 개방의 방지, 및 조직을 보호하기에 충분히 높은 농도로, 장기(organ) 수송 동안 일반적으로 사용되는 보존액에 첨가되기에 충분하고 정맥내 투여하기에 충분한 정도의 용해도를 포함할 것이다.

사이클로필린 D 녹아웃 마우스를 사용하여 수행된 연구와 사이클로필린 억제제를 이용한 약리학 전략을 사용하여 수행된 연구에서, 미토콘드리아 내막의 비특이적 채널인 미토콘드리아 투과성 전이 기공(MPTP)이 다양한 손상으로 인한 세포 사멸에서의 핵심적인 사건이라는 것이 명확하게 입증되었다. 또한, 사이클로필린 D의 억제는 미토콘드리아 기능을 보호하고 세포 생존력을 보존하는 mPTP의 개방을 방지할 수 있다. MPTP를 유발할 수 있는 세포에 대한 독성 손상에는, 허혈, 반응성 산소종(ROS), 담즙염, 알파-시누클레인의 올리고머, 및 세포 내 칼슘 수준의 상승이 포함된다. 기증자에서 제거된 기증된 장기는 괴사성 염증을 일으켜, 수용자에게 배치될 때 조직 손상과 기능 장애를 일으킬 수 있다. 본원에 기술된 화합물은 장기가 수용자에게 이식되기를 기다리면서 보관되는 동안, 제거 후 기증된 장기의 분해를 방지한다.

사이클로스포린 A(Cyclosporin A)는 면역억제 특성으로 잘 알려진 화합물이지만 다른 생물학적 특성들도 설명되어 있다. 사이클로스포린 A의 화학 구조는 다음과 같다:

사이클로스포린 A(CsA)

사이클로스포린 A의 생물학적 활성 유도체들도 제조되었다. 예를 들어, US 6,583,265, EP 0 484 281 및 EP 0 194 972에는 면역억제, 항기생충 및 항바이러스 특성을 포함하여 다양한 특성을 가진 사이클로스포린 유도체들이 기재되어 있다. US 6,583,265에는 사이클로스포린 거대고리의 위치 3에서 변형된 사이클로스포린 유도체들이 기재되어 있다. 특히, US 6,583,265에는 화합물 1이 개시되어 있다:

화합물 1

이 화합물은 특허 US 6,583,265에서 실시예 27로서, 여기에는 고리 주변의 다양한 위치에서 변형을 갖는 수백 개의 명명된 화합물들이 포함된다. 그러나 이 화합물 또는 관련 유사체들에 대한 생물학적 실험 데이터 또는 특정 용도는 개시되어 있지 않다. 본 출원인이 US 6,583,265에서 화합물 27을 제조하는 데 사용된 공지된 경로를 사용하여 상기 화합물을 합성하려고 시도했을 때, 이 방법은 효과적이지 않았다. US 6,583,265에서의 방법론을 재현하려는 많은 시도가 있었지만 큰 성공을 거두지 못했다. 이론에 얽매이지 않고, 디메틸 아미노 그룹(염기성임)은 우선적으로 산 촉매와 반응하는 것으로 여겨진다. 이에 따라 산 촉매가 이탈기의 손실을 활성화시키는 것을 방지하여, 반응의 진행을 억제하였다. 따라서 실시예 27이 이전에 합성되었었는지 여부에 대해 다소의 의구심이 있으며, 따라서 이 선행기술이 실제로 화합물 1의 제조를 가능하게 하는 개시인지에 대한 의구심이 있다.

본 출원인은 미토콘드리아 보호제로서 작용하는 화합물이 이식 전 장기(organ)의 보존을 개선하기 위해 장기 기증자에게 제공될 수 있음을 확인하였다. 이 화합물은 사이클로필린 D 억제를 통해 작용한다. 사이클로필린 D의 임의의 알려진 억제제들이 본 명세서에 기재된 바와 같이 사용될 수 있다. 적합한 억제제는, 예를 들어, US 6,583,265, EP 0 484 281, EP 0 194 972, WO2010/076329 및 WO2014/053834를 포함하는 간행물들에 보고된 것과 같은 사이클로스포린 또는 고리형 뎁시펩티드 유사체를 포함한다.

본 출원인은 상기 선행문헌에서 이전에 제안된 화합물들을 합성했으며, 놀랍게도 이들 화합물의 작은 하위집합이 특히 우수한 사이클로필린 D 억제제임을 발견했다. 따라서 후술되는 이들 화합물은 사이클로필린 D 활성의 억제로부터 혜택을 받는 병태의 치료에 사용될 수 있으며, 생체외(ex-vivo) 장기의 보존을 보조하기 위해 장기 기증자에게 투여될 수 있다. 본 발명의 한 측면에 따르면, 이식 전에, 기증자로부터 제거된 신체 일부 또는 장기의 보존에서 미토콘드리아 보호제로서 사용하기 위한 화합물이 제공된다. 제거된 신체 부위는 사지(limb), 손, 발, 손가락 또는 발가락일 수 있다. 장기는 신장일 수 있다. 기증자는 살아있는 기증자일 수 있다.

식 1

또는 이의 염으로서,

상기 식에서, n은 2-5이고,

R₁ 및 R₂는 독립적으로 H 또는 C₁-C₄ 알킬로부터 선택되며, R₁ 및 R₂는 함께 연결되어 C₃-C₅ 헤테로알킬 고리를 형성할 수 있다.

바람직한 일 구체예에서, 화합물은 다음과 같다:

화합물 1

식 1의 화합물은 절단된 신체 부위 및 장기의 재부착과 관련된 허혈-재관류 손상의 치료에 사용될 수 있다. 도 1 및 2에 그래프로 나타낸, 본원에서 제공된 데이터는, 화합물 1이, 잘 확립된 비교예 사이클로스포린 A, 및 식 1의 범위 내에 있는 것들을 포함하여 밀접하게 관련된 다른 유사체들을 훨씬 능가함을 보여준다. 실제로 30분 동안 장기에서 혈액을 빼낸 챌린징 실험에서, 화합물 1은 놀랍게도 영향을 받는 장기에 예상되는 손상이 거의 완전히 역전되는 것을 실제로 보여주는, 우수한 결과를 나타내었다.

화합물 1은 사이클로필린 D의 억제제로서 놀라운 효능을 보여준다. 표 1에 나타난 바와 같이, 화합물 1(엔트리 4)은 사이클로필린 D에 대해 24 nM의 EC₅₀을 보여준다. N 원자 상의 1개의 메틸 그룹을 H로 치환하면 (엔트리 1은 단순히 NHMe ve NMe₂임)로 교체하면 효능이 약 100배 감소하고 EC₅₀이 >2000 nM 이다. 따라서 화합물 1은 놀랍게도 사이클로필린 D 및 미토콘드리아 투과성 전이(MPT: Mitochondrial Permeability Transition)의 강력한 억제제이다.

일 구체예에서, 상기 본원에 언급된 바와 같은 화합물, 방법 또는 용도에서, 화합물의 용량(dose)은 0.1 내지 10 mg/kg이다. 일 구체예에서, 상기 본원에 언급된 바와 같은 화합물, 방법 또는 용도에서, 화합물의 용량은 1 내지 3 mg/kg이다. 이러한 용량 범위에서 본 발명의 화합물은 특히 효과적이다.

본 발명의 염은 식 1의 화합물, 또는 화합물 1에 산을 첨가함으로써 생성될 수 있다. 생성된 산 부가염은 아세트산, 2,2 디클로로아세트산, 시트르산, 락트산, 만델산, 글리콜산, 아디프산, 알긴산, 아릴 술폰산 (예를 들어, 벤젠술폰산, 나프탈렌-2-술폰산, 나프탈렌-1,5-디술폰산 및 p-톨루엔술폰산), 아스코르브산(예를 들어, L-아스코르브산), L-아스파르트산, 벤조산, 4-아세트아미도벤조산, 부탄산, (+) 캄포르산, 캄포르-술폰산, (+)-(1S)-캄포르-10-술폰산, 카프르산, 카프로산, 카프릴산, 신남산, 시트르산, 사이클람산, 도데실술푸릭산, 에탄-1,2-디술폰산, 에탄술폰산, 2-하이드록시에탄술폰산, 포름산, 푸마르산, 갈락타르산, 겐티신산, 글루코헵톤산, 글루콘산 (예를 들어, D-글루콘산), 글루쿠론산 (예를 들어, D-글루쿠론산), 글루탐산(예를 들어, L-글루탐산), α-옥소글루타르산, 글리콜산, 히푸르산, 브롬화수소산, 염산, 요오드화수소산, 이세티온산, 락트산(예를 들어, (+)-L-락트산 및 (±)-DL-락트산), 락토바이오닉산, 말레산, 말산 (예를 들어, (-)-L-말산), (±)-DL-만델산, 메타인산, 메탄술폰산, 1-히드록시-2-나프토산, 니코틴산, 질산, 올레산, 오로트산, 옥살산, 팔미트산, 팜산, 인산, 프로피온산, L-피로글루탐산, 살리실산, 4-아미노-살리실산, 세바스산, 스테아르산, 숙신산, 황산, 탄닌산, 타르타르산(예를 들어, (+)-L-타르타르산), 티오시안산, 운데실렌산 및 발레르산을 이용해 형성된 염을 포함한다. 특히 산 부가염은 염산, 브롬화수소산, 인산, 메타인산, 질산 및 황산과 같은 무기산; 타르타르산, 아세트산, 시트르산, 말산, 락트산, 푸마르산, 벤조산, 글리콜산, 글루콘산, 숙신산, 아릴술폰산과 같은 유기산으로부터 형성된 염을 포함한다.

본 발명의 화합물은 하나 이상의 추가적인 활성 물질과 함께 투여될 수 있다.

본 발명의 한 측면에 따르면, 새로운 개체에 대한 장기 이식 또는 신체 부위의 재부착 전에, 개체로부터 제거되거나 절단된 신체 부위 또는 장기를 보존하는 데 사용하기 위한 미토콘드리아 보호 화합물이 제공되며, 상기 화합물은 식 1의 화합물 또는 이의 염이다:

식 1

상기 식에서, n은 2-5이고,

R₁ 및 R₂는 독립적으로 H 또는 C₁-C₄ 알킬로부터 선택되며, R₁ 및 R₂는 함께 연결되어 C₃-C₅ 헤테로알킬 고리를 형성할 수 있다.

본원의 한 측면에 따르면, 장기를 식 1의 미토콘드리아 보호제 화합물 또는 이의 염에 노출시키는 것을 포함하는, 장기 이식 또는 재부착 전에, 개체로부터 제거되거나 절단된 장기를 보존하는 방법이 제공된다:

식 1

상기 식에서, n은 2-5이고,

R₁ 및 R₂는 독립적으로 H 또는 C₁-C₄ 알킬로부터 선택되며, R₁ 및 R₂는 함께 연결되어 C₃-C₅ 헤테로알킬 고리를 형성할 수 있다.

본원의 한 측면에 따르면, 이식 또는 재부착 전에, 개체로부터 제거되거나 절단된 신체 부위 또는 장기의 보존을 위한 약제의 제조를 위한 미토콘드리아 보호 화합물의 용도가 제공되며, 상기 화합물은 식 1의 화합물 또는 이의 염이다:

식 1

상기 식에서, n은 2-5이고,

R₁ 및 R₂는 독립적으로 H 또는 C₁-C₄ 알킬로부터 선택되며, R₁ 및 R₂는 함께 연결되어 C₃-C₅ 헤테로알킬 고리를 형성할 수 있다.

본원의 한 측면에 따르면, 이식 또는 재부착 전에, 개체로부터 제거되거나 절단된 신체 부위 또는 장기의 보존을 위한 미토콘드리아 보호 화합물의 용도가 제공되며, 상기 화합물은 식 1의 화합물 또는 이의 염이다:

식 1

상기 식에서, n은 2-5이고,

R₁ 및 R₂는 독립적으로 H 또는 C₁-C₄ 알킬로부터 선택되며, R₁ 및 R₂는 함께 연결되어 C₃-C₅ 헤테로알킬 고리를 형성할 수 있다.

일 구체예에서, 화합물은 장기 기증자에서 미토콘드리아 보호제로서 사용될 수 있으며, 상기 화합물은 기증자로부터 장기를 제거하기 전에 장기를 보호하기 위해 기증자에게 투여된다.

추가 구체예에서, 미토콘드리아 보호제 화합물은 사이클로필린 억제제이다.

일 구체예에서, 화합물은 장기 기증자에서 미토콘드리아 보호제로서 사용될 수 있으며, 상기 화합물은 상기 기증자로부터 장기를 제거하기 전에 장기를 보호하기 위해 장기 기증자에게 투여되고, 상기 화합물은 식 1의 화합물 또는 이의 염이다:

식 1

상기 식에서, n은 2-5이고,

R₁ 및 R₂는 독립적으로 H 또는 C₁-C₄ 알킬로부터 선택되며, R₁ 및 R₂는 함께 연결되어 C₃-C₅ 헤테로알킬 고리를 형성할 수 있다.

일 구체예에서, 식 1의 화합물은 장기 기증자에서 미토콘드리아 보호제로서 사용될 수 있으며, 상기 장기는 신장이다.

일 구체예에서, 식 1의 화합물은 신장을 보존하기 위해 사용될 수 있다.

본 발명의 또다른 측면에 따르면, 장기 기증자로부터 장기를 제거하기 전에 미토콘드리아 보호 화합물을 기증자에게 투여하는 단계를 포함하는, 장기 기증자의 장기를 보존하는 방법이 제공된다.

일 구체예에서, 신장 기증자로부터 신장을 제거하기 전에 기증자에게 미토콘드리아 보호 화합물을 투여하는 단계를 포함하는, 신장 기증자의 신장을 보존하는 방법이 제공된다.

일 구체예에서, 신장 기증자로부터 신장을 제거하기 전에 기증자에게 미토콘드리아 보호 화합물을 투여하는 단계를 포함하는, 신장 기증자의 신장을 보존하는 방법이 제공되며, 상기 화합물은 식 1의 화합물이다.

일 구체예에서, 식 1의 화합물은 장기 이식 전에 살아있는 기증자에게 투여된다.

바람직한 일 구체예에서, 식 1의 화합물은 신장 이식 전에 살아있는 신장 기증자에게 투여된다.

일 구체예에서, 신장 기증자로부터 신장을 제거하기 전에 기증자에게 미토콘드리아 보호 화합물을 투여하는 단계를 포함하는, 신장 기증자의 신장을 보존하는 방법이 제공되며, 상기 화합물은 화합물 1이다:

화합물 1

일 구체예에서, 화합물은 장기 기증자에서 미토콘드리아 보호제로서 사용될 수 있으며, 상기 화합물은 기증자로부터 장기를 제거하기 전에 장기를 보호하기 위해 기증자에게 투여되며, 상기 화합물은 화합물 1이다.

바람직한 구체예에서, 화합물 1은 신장을 보존하기 위해 사용될 수 있다.

일 구체예에서, 신장 기증자로부터 신장을 제거하기 전에 기증자에게 미토콘드리아 보호제 화합물을 투여하는 단계를 포함하는, 신장 기증자에서 신장을 보존하는 방법이 제공되며, 상기 화합물은 화합물 1이다. 바람직한 일 구체예에서, 화합물 1은 신장 이식 전에 살아있는 신장 기증자에게 투여된다.

본 발명의 한 측면에 따르면, 신장 보존용 약제의 제조를 위한 미토콘드리아 보호 화합물의 용도가 제공된다. 일 구체예에서, 신장 보존용 약제의 제조를 위한 미토콘드리아 보호제 화합물의 용도가 제공되며, 상기 화합물은 식 1의 화합물이다. 일 구체예에서, 신장 보존용 약제의 제조를 위한 미토콘드리아 보호제 화합물의 용도가 제공되며, 상기 화합물은 화합물 1이다.

본 발명의 한 측면에 따르면, 기증자에게 화합물 1을 처치하는 단계를 포함하는, 신장을 보존하는 방법이 제공된다. 바람직한 일 구체예에서, 장기 또는 신장 기증자는 살아있는 기증자이다.

허혈성 손상은 조직 영역으로의 혈액 공급이 차단될 때 발생한다. 심근경색, 뇌졸중 및 기타 혈전성 사건 등의 허혈성 손상의 발생률은 매우 높으며, 미국에서만 매년 130만명 이상의 사람들에게 발생한다. 또한 수술 중 혈관이 교차-클램프되는 경우와 장기 이식시에도 허혈성 손상이 발생한다. 조직이 산소 결핍에서 생존할 수 있는 시간은 다양하지만, 결국 허혈성 조직은 괴사된다.

재관류(재산소화) 손상은 일정 기간의 허혈 또는 산소 부족(무산소, 저산소증) 후에 혈액 공급이 조직으로 되돌아갈 때 발생하는 조직 손상이다. 이론에 얽매이지 않고, 허혈 기간 동안 혈액으로부터 산소 및 영양소의 부재는, 순환의 회복이 염증 및 산화적 손상을 초래하는 병태를 생성하는 것으로 여겨진다.

장기 이식에서는, 기증자의 혈액 공급으로부터 장기를 제거한 때부터 기증자의 장기를 수용자의 혈액 공급에 다시 연결할 때까지 일정 기간이 존재한다. 이 기간 동안 허혈-재관류 손상의 가능성이 있다. 일부 경우에는, 장기를 수술 장소까지 장거리 수송해야 하므로 장기 손상의 가능성이 높아진다.

사지 절단과 관련된 사고의 경우, 혈액 공급으로부터 신체 일부가 절단된 때부터 신체 일부가 혈액 공급에 다시 연결될 때까지 일정 기간이 존재한다. 이 기간 동안 허혈-재관류 손상의 가능성이 있다. 일부 경우에는, 신체 부위와 환자를 수술 장소까지 장거리 수송해야 할 수 있으며, 이는 재부착 전, 재부착 도중 및 재부착 후에 손상 가능성을 높인다.

본 발명은, 특히 기증자의 혈액 공급에서 신체 일부 또는 장기를 제거한 때부터 수용자의 혈액 공급에 다시 연결될 때까지의 기간에, 또는 신체 부위 절단과 재부착의 경우에, 신체 부위 및 장기에 대한 이러한 손상을 방지하기 위한 본 발명의 미토콘드리아 보호 화합물의 투여를 위해 제공된다. 당업자는 본 발명의 화합물이 신체 일부 또는 장기를 제거하기 전에 개인(장기 기증자 또는 사고 피해자)에게 투여되거나 또는 개인으로부터 제거된 신체 부위 또는 장기에 투여될 수 있는 방법을 알고 있을 것이다. 예를 들어, 본 발명의 화합물은 신체 부위 또는 장기를 제거하기 전에 기증자 또는 사고 피해자에게 정맥내 투여되거나, 장기가 위치하는 유체에 첨가될 수 있고(또는 이에 포함될 수 있고); 및/또는 본 발명의 화합물은 장기/신체 부분 내에서 또는 이를 통해 재순환되는 유체에 첨가될 수 있다(또는 이에 포함될 수 있다).

일 구체예에서, 상기 본원에 언급된 바와 같은 화합물, 방법 또는 용도에서, 본 발명의 화합물은 개체로부터 장기를 제거한 후 이식 또는 재부착 전에 장기에 투여된다. 대안적으로, 또는 추가로, 본 발명의 화합물은 기증자 장기의 제거 전에 기증자 개체에게 투여된다. 예를 들어, 본 발명의 화합물은 전신 투여될 수 있다. 주사는 본 발명의 화합물의 전신 투여량을 투여하는 한가지 방법이다. 본 발명의 화합물은 또한 장기 이식 후 수용자에게 또는 재부착 후 사고 피해자에게 투여될 수 있다.

본 발명의 화합물의 전신 용량(systemic dose)이 장기 제거 전에 장기 기증자에게 투여될 수 있다. 이것은 장기가 제거 전에 화합물의 보호 용량을 투여받을 수 있게 하여, 제거 동안 및 수용자에게 이식하는 과정까지 및 과정 동안, 손상으로부터 장기를 보호함으로써 장기를 보존한다. 기증자에게서 하나 이상의 장기가 제거되는 경우, 이 전신 용량은 각 장기가 화합물의 용량을 투여받도록 한다. 전신 용량은 또한 이식될 장기 조직에 균일한 용량의 화합물을 제공할 가능성이 더 높다. 기증자가 법적으로 사망한 경우, 용량은 살아있는 개체에게 일반적으로 주어지는 것보다 더 클 수 있다.

화합물은 장기 제거 수술 직전 또는 장기 제거 수술 중에 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 화합물은 수술 전 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1시간 전에 투여될 수 있다.

추가로, 또는 대안적으로, 장기 수용자 또는 사고 피해자는 장기를 수용하거나 재부착 수술을 받기 전에 본 발명의 화합물의 용량을 투여받을 수 있으며, 이로써 이들의 혈액 공급은 본 발명의 화합물의 보호 용량을 포함하므로, 이식되거나 재부착된 신체 부위를 수술 후 손상으로부터 보호한다.

신체 부위는 개인으로부터 절단되어 동일한 개인에 재부착되거나, 이식을 통해 두 번째 개인에게 제공될 수 있다. 신체 부위가 개체로부터 절단되는 경우, 절단은 전체 또는 부분적일 수 있다. 부분 절단은, 예를 들어 혈액 공급의 절단일 수 있지만, 신체 부위는 예를 들어 피부, 뼈 또는 근육 조직을 통해 부착된 채로 남아 있다. 화합물은 (i) 절단된 신체 부위에; 및/또는 (ii) 신체 부위를 재부착하기 전에 개체에게; 및/또는 (iii) 신체 부위를 재부착하는 동안 또는 재부착 후에 개체에게 투여될 수 있다.

본 발명은 또한 비-인간 개체, 예를 들어 고양이, 개, 말, 돼지에 적용될 수 있다. 본 발명은 또한 형질전환 동물(예를 들어, 형질전환 돼지)에 적용되며, 이러한 동물은 인간 이식에 적합한 장기를 갖는다.

일 구체예에서, 상기 본원에 언급된 바와 같은 방법 또는 용도에서, 화합물은 화합물 1이다:

화합물 1

화합물 1은 본 출원에서 효과적인 미토콘드리아 보호제로 밝혀졌다.

표 1에 표시된 결과는, 당업계에 공지된 유사한 유사체(엔트리 1-3 및 5-7)에 비해 화합물 1(엔트리 4)의 예상치 못한 높은 사이클로필린 D 억제 및 MPT를 입증한다. 다른 밀접하게 관련된 3가지 화합물(엔트리 1, 5 및 7)에 비해 MPT에서 100배 개선이 관찰되었으며, 다음으로 가장 우수한 성능을 보이는 유사체(엔트리 3)에 비해 25배 이상 개선이 관찰되었다. 화합물 1은 또한 테스트된 다른 모든 유사체들에 비해 50배 이상 개선된 우수한 사이클로필린 D 억제를 나타냈다.

일 구체예에서, 상기 본원에 언급된 바와 같은 화합물, 방법 또는 용도에서, 장기는 신장, 췌장, 간, 심장, 폐 또는 장일 수 있다. 절단된 신체 부위의 경우, 신체 부위는 사지, 손, 발, 손가락 또는 발가락일 수 있다.

일 구체예에서, 상기 본원에 언급된 바와 같은 화합물, 방법 또는 용도에서, 화합물의 용량은 0.1 내지 10 mg/kg이고; 선택적으로 1 내지 3 mg/kg이다. 장기 또는 신체 부위가 본 발명의 화합물을 함유하는 유체에 담가져 있거나 이 유체가 재순환되는 경우, 화합물의 농도는 필요에 따라 더 높거나 낮을 수 있다.

일 구체예에서, 상기 본원에 언급된 바와 같은 화합물, 방법 또는 용도에서, 화합물은 크레모포어 (폴리에톡실화 피마자유)/식염수/DMSO(디메틸 설폭사이드) 중에서 제형화된다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 구리 트리플레이트 및 식 2의 아미노 알코올을 포함하는 생성물 형성 반응을 포함하는 식 1의 화합물의 제조 방법이 제공된다:

식 2

상기 식에서, n은 2-5이고,

R₁ 및 R₂는 독립적으로 H 또는 C₁-C₄ 알킬로부터 선택되며, R₁ 및 R₂는 함께 연결되어 C₃-C₅ 헤테로알킬 고리를 형성할 수 있다.

놀랍게도, 본 발명의 화합물은 상기 언급된 방법에 의해 용이하게 입수가능하게 되는 것으로 밝혀졌다. 예를 들어, 본 출원인은 US 6,583,265에 개시된 방법론을 재현하려는 많은 시도에 실패했고, 결국 US 6,583,265의 접근법은 실행 불가능하여 포기하였다.

일 구체예에서, 상기 반응은 건조제를 포함하고/하거나 실질적으로 무수 조건 하에 수행된다. 선택적으로, 건조제는 분자체(molecular sieve)이다. 선택적으로, 분자체는 3A 분자체이다. 일 구체예에서, 아미노 알코올은 N,N-디메틸아미노에탄올이다. 이 아미노 알코올은 화합물 1을 제공한다. 일 구체예에서, 아미노 알코올은 불안정기(labile group)를 포함하는 사이클로스포린 전구체 화합물과 반응하며, 상기 불안정기는 반응 중에 손실된다. 선택적으로, 불안정기는 -S- 결합에 의해 전구체 화합물에 결합된다. 또한 선택적으로, 불안정기는 티오피리딜(thiopyridyl) 기 또는 메르캅토벤조티아졸-2-일티오(mercaptobenzothiazole-2-ylthio) 기이다.

도 1은 혈청 크레아티닌 농도 측정에 의한, 랫트에서 유도된 급성 신장 손상에 대한 화합물 1 및 비교 화합물 CsA의 억제 및/또는 보호 효과를 나타낸다.
도 2는 혈액 요소 질소(BUN: measuring Blood Urea Nitrogen) 농도 측정에 의한, 랫트에서 유도된 급성 신장 손상에 대한 화합물 1 및 비교 화합물 CsA의 억제 및/또는 보호 효과를 나타낸다.
도 3은 LPS 유도 급성 신장 손상에 대한 화합물 1의 억제 및/또는 보호 효과를 나타낸다.
도 4는 신장 기능에 대한 화합물 1의 효과를 나타낸다. 화합물 1로 처리된 동물에 대한 더 낮은 크레아티닌 및 혈액 요소 질소 수준은, 신장 손상의 감소된 수준과 일치한다.
도 5-7은 제거 후 생체 외(ex-vivo) 신장 보존을 보여주는 데이터를 나타낸다. 대조군으로, 신장 관류 전 보호 화합물의 정맥 투여(i.v.) 가 없는 4개의 신장을 사용하고, 5개의 신장이 신장 관류 1시간 전 5 mg/kg C4066 (화합물 1) 을 정맥 투여 받았다. 데이터는 제거 후 0, 6, 24 및 48시간째에 연구된 신장 전체의 평균 점수를 보여준다. HE 점수 기준: 경증에서 중증까지 염증 정도에 따라 반-정량적 점수가 뒤따르며, 병변이 매우 작거나 없는 경우 음성 "-" 0; 경미하거나 작은 경우 "+" 1; 중간 또는 중간 크기의 경우 "+" 2; 심각하거나 큰 경우 "++" 3; 매우 심각하거나 큰 경우 "+++" 4. 도 5는 염증 점수, 도 6은 신피막(renal capsule)의 확장(dilatation), 도 7은 신세뇨관 확장(Renal tubular dilatation)을 나타낸다.

본 발명은 이제 하기 실시예에 의해 설명될 것이다.

실험 방법 및 결과

당업자는 식 1의 화합물이 다양한 방식으로 제조될 수 있음을 인식할 것이다. 아래 경로는 화합물 1의 합성에 사용할 수 있는 방법의 일 예일 뿐이다. 즉, US 6,583,265에서 화합물 1을 제조하는 데 사용된 경로는 효과적이지 않았다. US 6,583,265에서 방법론을 재현하려는 많은 시도가 있었지만 큰 성공을 거두지 못했다. 이론에 얽매이지 않고, 디메틸 아미노 그룹(염기성임)은 우선적으로 산 촉매와 반응하는 것으로 여겨진다. 이에 의해 산 촉매가 이탈기의 손실을 활성화시키는 것을 방지하여 반응의 진행을 억제하였다.

식 1의 화합물은 여러 경로를 사용하여 용이하게 제조할 수 있다. 일 예시에서(반응식 1), R이 저급 알킬인 화합물 2와 카르보닐 화합물 및 환원제의 반응은 환원성 아민화 공정을 수행하여 원하는 화합물을 제공할 수 있다. 바람직하게는 상기 카르보닐 화합물은 저급 알킬 알데히드 또는 케톤이고, 환원제는 금속 보로하이드라이드이다. 보다 바람직하게는 알데히드는 포름알데히드, 아세트알데히드 또는 프로피온알데히드이고, 케톤은 아세톤 또는 2-부탄온 등이다. 바람직하게는 환원제는 나트륨 트리아세톡시보로하이드라이드 또는 나트륨 시아노보로하이드라이드이다.

아민 화합물 2는, 3 (이때 R은 수소 또는 저급 알킬임)과 같은 적합하게 보호된 에탄올아민 화합물로부터 상기 화합물을 보호기를 제거하는 것으로 알려진 조건으로 처리하고 유리 아민 화합물을 생성함으로써 편리하게 제조될 수 있다. 분자 내의 다른 작용기의 존재 하에 제거될 수 있는 적절한 보호기는 tert-부톡시카르보닐(BOC), 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐(FMOC) 등을 포함한다. 바람직하게는 보호기는 tert-부톡시카르보닐(BOC)이고 BOC 기의 제거에 사용되는 조건은 트리플루오로아세트산과 같은 산으로 처리하는 것을 포함한다.

단계 1: [2'-(2-티오피리딜)-Sar] ³ -사이클로스포린 A의 제조

[2'-(2-티오피리딜)-Sar] ³ -사이클로스포린 A (1a)

건조 1L 플라스크에 사이클로스포린 A (20g, 16.6mmol), 무수 염화리튬(21.1g, 499mmol) 및 건조 THF(500mL)를 첨가하고, 플라스크를 아르곤으로 플러싱하고 혼합물을 -45℃로 냉각시켰다. 별도의 플라스크에서, 디이소프로필아민(13.5g, 133mmol)을 건조 THF(120mL)에 용해시키고 -78℃로 냉각시켰다. 이 플라스크에 n-부틸리튬(2.5M 용액 53.2mL, 133mmol)을 첨가하고 생성된 용액을 -78℃에서 20분 동안 교반하였다. 캐뉼라를 사용하여 리튬 디이소프로필아미드 용액을 사이클로스포린 용액으로 옮기고 생성된 혼합물을 -45℃에서 90분 동안 교반하였다. 건조 THF(20mL) 중 2-피리딜디설파이드(11g, 49.9mmol)의 용액을 적가하고 생성된 혼합물을 밤새 실온으로 가온되도록 하였다. 포화 NaCl 용액(200mL)을 조심스럽게 첨가하여 반응을 켄칭하고, 생성된 유기 층을 분리하였다. 수성 층을 에틸 아세테이트(3 x 100mL)로 추출하고 합한 유기 분획을 3N NaOH(2 x 100mL), 포화 NH₄Cl(100mL) 및 포화 NaCl(100mL)로 세척한 다음 무수 Na₂SO₄로 건조 및 증발시켰다. 표제 화합물을 실리카겔 크로마토그래피에 의해 고체로서 단리하였다 (7.18g). ¹H NMR (400 MHz, CHLOROFORM-d) d 8.45 (ddd, J=0.88, 1.73, 4.90 Hz, 1H), 7.98 (d, J=9.66 Hz, 1H), 7.65-7.73 (m, 1H), 7.59 (dt, J=1.85, 7.71 Hz, 1H), 7.51 (ddd, J=0.76, 1.68, 6.44 Hz, 0H), 7.45 (d, J=8.54 Hz, 1H), 7.35 (ddd, J=1.73, 6.97, 8.77 Hz, 0H), 7.25 (s, 0H), 7.17 (d, J=7.96 Hz, 1H), 7.09-7.15 (m, 2H), 6.72 (dt, J=1.17, 6.71 Hz, 0H), 5.70 (dd, J=4.29, 10.88 Hz, 1H), 5.50 (d, J=6.39 Hz, 1H), 5.32-5.38 (m, 1H), 5.28 (dd, J=3.88, 11.74 Hz, 1H), 5.13 (d, J=10.88 Hz, 1H), 4.97-5.11 (m, 2H), 4.84 (dq, J=7.03, 7.24 Hz, 1H), 4.69 (t, J=9.15 Hz, 1H), 4.54 (quin, J=7.31 Hz, 1H), 4.13 (q, J=7.16 Hz, 0H), 3.81 (dt, J=1.00, 5.75 Hz, 1H), 3.59-3.72 (m, 1H), 3.50 (s, 2H), 3.38 (s, 2H), 3.26 (s, 2H), 3.13 (s, 5H), 2.70 (d, J=1.07 Hz, 5H), 2.34-2.54 (m, 1H), 1.92-2.23 (m, 4H), 1.55-1.85 (m, 11H), 1.19-1.54 (m, 11H), 1.12 (d, J=6.54 Hz, 2H), 0.78-1.07 (m, 30H), 0.73 (d, 3H).

단계 2: [2'-(2-디메틸아미노에톡시)-Sar] ³ -사이클로스포린 A (화합물 1 ) 의 제조

[2'-(2-디메틸아미노에톡시)-Sar] ³ -사이클로스포린 A(1)

구리 트리플레이트(0.291g, 0.8mmol) 및 3 옹스트롬 분자체를 플라스크에 첨가하고, 건조 THF(3mL)를 첨가하고, 플라스크를 아르곤으로 플러싱하였다. 별도의 플라스크에서, 건조 THF(2 mL) 중의 [2'-(2-티오피리딜)-Sar]³-사이클로스포린 A(1a)(0.293g, 0.223mmol), 디메틸아미노에탄올 (0.086g, 0.96mmol) 및 3A 분자체의 혼합물을 30분 동안 교반한 다음 구리 트리플레이트 용액에 첨가하였다. 반응물을 실온에서 밤새 교반되도록 하였다. NaHCO₃의 포화 용액(10 mL)을 첨가하고 혼합물을 셀라이트를 통해 여과하였다. 셀라이트를 에틸 아세테이트(3 x 25mL)로 세척하고 여액에 첨가했다. 유기층을 분리하였다; 수성 층을 EtOAc(2 x 25 mL)로 추출하고, 합한 유기 분획을 무수 Na₂SO₄로 건조하고 증발시켰다. 실리카겔 상에서 조 추출물을 정제하여 표제 화합물 86.4 mg을 수득하였다. ¹H NMR (400 MHz, CHLOROFORM-d) d 7.92 (d, J=9.61 Hz, 1H), 7.75 (d, J=7.32 Hz, 1H), 7.22 (d, J=8.15 Hz), 7.15 (d, J=7.86 Hz,), 6.01 (s, 1H), 5.70 (dd, J=4.22, 10.86 Hz, 1H), 5.46 (d, J=6.10 Hz, 1H), 5.35 (q, J=4.77 Hz, 1H), 5.27 (dd, J=4.15, 11.42 Hz, 1H), 5.14 (d, J=10.83 Hz, 1H), 5.05-5.11 (m, 1H), 4.94-5.04 (m, 1H), 4.77-4.90 (m, 1H), 4.73 (s), 4.66 (t, J=8.83 Hz, 1H), 4.46-4.57 (m, 1H), 3.71-3.81 (m, 1H), 3.58-3.67 (m, J=5.15, 5.64, 5.64, 5.83 Hz, 1H), 3.53-3.58 (m, 1H), 3.51 (s, 2H), 3.24 (s, 2H), 3.20 (s, 2H), 3.13 (d, J=2.10 Hz, 3H), 2.71 (d, J=6.54 Hz, 3H), 2.49-2.67 (m, 2H), 2.33-2.46 (m, 1H), 2.27 (s, 4H), 1.88-2.20 (m, 4H), 1.74 (d, J=0.29 Hz, 6H), 1.57-1.68 (m, 5H), 1.38-1.52 (m, 2H), 1.35 (d, J=7.27 Hz, 3H), 1.26 (d, J=2.88 Hz, 4H), 0.77-1.12 (m, 30H), 0.70 (d, 2H).

당업자는 예를 들어 화합물 1의 유사체가 상이한 아미노 알코올 시약을 사용하여 제조될 수 있음을 이해할 것이다. 예를 들어, 알코올과 아민 기 사이의 탄소 원자의 수는 증가 또는 감소될 수 있다 (연결 기의 예로는, 메틸렌, 에틸렌, 프로필렌, 부틸렌, 펜탈렌을 포함하고, 이소-프로필렌, sec-부틸렌, tert 부틸렌, 2-메틸부틸렌, 2,2-디메틸프로필렌과 같은 분지형 버전을 포함할 수 있음). 대안적으로 또는 추가로, 아미노 알코올 상의 N 아미노 치환기는 또한 화합물 1의 추가 유사체를 제공하도록 변경될 수 있다 (N-아미노 치환기의 예로는, 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, n-부틸, sec-부틸, tert-부틸, 부틸을 포함한다).

[2'-(2-N-Boc-아미노에톡시)-Sar] ³ -사이클로스포린 A의 제조

구리 트리플레이트(4.95g, 13.7mmol) 및 3A 분자체를 무수 THF (50mL) 중에 현탁시키고 아르곤 하에 30분 동안 교반하였다. 무수 THF(10 mL) 중 [2'-(2-티오피리딜)-Sar]³-사이클로스포린 A(1a) (5.0g, 3.82mmol) 및 N-Boc-에탄올아민 (2.64g, 16.4mmol)을 3A 분자체 상에서 30분 동안 건조시킨 후 구리 트리플레이트 현탁액에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 포화 NaHCO₃ (2 x 50 mL)를 첨가하고 혼합물을 셀라이트를 통해 여과하였다. 셀라이트를 EtOAc(4 x 100 mL)로 세척하고 유기층을 분리하였다. 수성 상을 EtOAc(2 x 50mL)로 추출하고, 합한 유기 분획을 포화 NaCl(50mL)로 세척하고, 무수 Na₂SO₄로 건조하고 증발시켰다. 조 생성물을 실리카 상에서 정제하여 표제 화합물 4.18g을 수득하였다. ¹H NMR (400 MHz, CHLOROFORM-d) d ppm 0.72 (ddd, 2 H) 0.91 (m, 31 H) 1.32 (m, 8 H) 1.48 (dddd, J=3.95, 3.07, 2.23, 0.95 Hz, 2 H) 1.69 (m, 10 H) 2.10 (m, 4 H) 2.39 (m, 1 H) 2.70 (m, 4 H) 2.95 (m, 2 H) 3.12 (d, J=7.42 Hz, 4 H) 3.17 (d, J=9.37 Hz, 1 H) 3.20 (s, 2 H) 3.25 (s, 2 H) 3.29 (m, J=6.69, 3.02, 1.45, 0.76, 0.63 Hz, 1 H) 3.41 (m, 1 H) 3.51 (s, 2 H) 3.61 (m, 1 H) 3.75 (dddd, J=7.73, 1.54, 1.02, 0.73 Hz, 1 H) 4.13 (q, J=7.11 Hz, 1 H) 4.50 (m, 1 H) 4.65 (dd, J=18.06, 0.44 Hz, 1 H) 4.98 (m, 4 H) 5.30 (m, 2 H) 5.47 (m, 1 H) 5.70 (m, 1 H) 5.93 (d, J=0.34 Hz) 7.21 (m, 1 H) 7.71 (m) 8.03 (m).

[ 2'-(2-아미노에톡시)-Sar] ³ -사이클로스포린 A의 제조

건조 CH₂Cl₂ (30mL) 중의 [2'-(2-N-Boc-아미노에톡시)-Sar]³-사이클로스포린 A (3) (3.0g, 2.2mmol)의 용액을 0℃로 냉각시키고 트리플루오로아세트산(6.54 mL, 10.03 g, 88 mmol)을 적가하고 혼합물을 30분 동안 교반하였다. 용매를 증발시키고 조 생성물을 실리카 상에서 정제하여 표제 화합물 1.99g을 전달하였다.

[2'-(2-디메틸아미노에톡시)-Sar] ³ -사이클로스포린 A(2)의 제조

[2'-(2-아미노에톡시)-Sar]³-사이클로스포린 A (0.273g, 0.216mmol)를 CH₂Cl₂(5mL)에 용해시키고 포름알데히드(37% 수용액, 0.048mL, 0.69mmol)와 NaB(OAc)₃H(0.138g, 0.649mmol) 를 첨가한 다음 반응물을 약 실온에서 18시간 동안 교반되도록 하였다. 반응 혼합물을 90:9:1 CH₂Cl₂:MeOH:진한 NH₄OH(5 x 100 mL)로 세척한 작은 실리카 겔 패드를 통해 여과하였다. 용매를 증발시키고 생성물을 실리카겔 상에서 크로마토그래피로 단리하여 표제 화합물 0.214g을 수득하였다.

사이클로필린 억제 결합 측정

본원에 개시된 화합물의 사이클로필린 억제 결합 활성을 Quesniaux et al. (Eur. J Immunol., 1987, 17:1359-1365)에 기재된 방법에서 채택된 경쟁적 ELISA를 사용하여 결정하였다. D-Lys⁸-사이클로스포린 A(D-Lys8-Cs)에 결합된 숙시닐 스페이서의 활성화된 에스테르는 위치 8의 D-리실 잔기를 통해 소 혈청 알부민(BSA)에 커플링하였다. BSA는 0.1M 붕산염 완충액, pH 9.0 (1.4ml 중 4mg)에 용해시켰다. 디메틸 포름아미드 (0.6ml)에 용해된 100배 몰 과량의 D-Lys⁸-Cs 를 격렬한 교반 하에 BSA에 적가하였다. 커플링 반응은 실온에서 온화한 교반 하에 2 내지 3시간 동안 수행하고, 수득한 접합체는 인산완충식염수(PBS, pH 7.4)에 대해 광범위하게 투석하였다. 접합된 단백질의 분취량의 아세톤 침전 후, 공유 결합된 D-Lys⁸-C가 아세톤 용액에 남아 있지 않게한 다음 사이클로스포린 공유 결합의 정도를 계산하였다.

미세역가 플레이트를 D-Lys⁸-Cs-BSA 접합체(4℃에서 24시간 동안 PBS 중 2μg/ml)로 코팅하였다. 적정 플레이트는 Tween®/PBS로 및 PBS 단독으로 세척하였다. 비특이적 결합을 차단하기 위해, 2% BSA/PBS(pH 7.4)를 웰에 첨가하고 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션 하였다. 별도의 마이크로타이터 플레이트에서 에탄올 중에 테스트할 화합물의 5배 희석 시리즈를 만들었다. 인간 재조합 사이클로필린을 사용한 분석의 경우 시작 농도는 0.1 mg/mL 였다. 0.1 μg/mL 사이클로필린 용액 198 μL 을 마이크로타이터 플레이트에 즉시 첨가한 다음 2 μL의 희석된 사이클로스포린 A (기준 화합물로 사용됨) 또는 본 발명의 화합물을 첨가하였다. 코팅된 BSA-Cs 접합체, 유리 사이클로스포린 A 및 사이클로필린 사이의 반응을 4℃에서 밤새 평형화되도록 하였다. 사이클로필린은 1% BSA가 포함된 PBS에 희석된 항-사이클로필린 토끼 혈청으로 검출하고 4℃에서 밤새 인큐베이션 하였다. 적정 플레이트는 전술한 바와 같이 세척하였다. 결합된 토끼 항체는 알칼리성 포스파타제에 접합된 염소 항-토끼 IgG에 의해 검출하였고 1% BSA-PBS에 희석하고 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션 하였다. 적정 플레이트는 전술한 바와 같이 세척하였다. 4-니트로페닐 포스페이트 (디에탄올아민 완충액 중 1 g/l, pH 9.8)와 함께 37℃에서 1~2시간 배양한 후, 분광광도계를 사용하여 405 nm에서 분광학적으로 효소 반응을 측정하였다. 그 결과를 50% 억제를 달성하는 데 필요한 본 발명의 화합물의 농도인 EC₅₀으로 표시하였다. 화합물 1은 사이클로필린 A, B 및 D에 대해 100nM 미만의 EC₅₀ 값을 가졌다.

PPIase 억제

본 분석은 기본적으로 Jankowski et al. {Jankowski et al. Anal. Biochem. (1997), 252:299-307}에 의해 '비결합 분석'으로 설명된 대로 Agilent 8453 분광광도계를 사용하여 수행하였다. 35mM HEPES pH 7.8 및 50μM DTT로 구성된 분석 완충액을 정밀 유리 큐벳에서 10℃로 (교반하면서) 냉각하고100% DMSO 스톡 용액으로부터 억제제를 첨가했다. 블랭크 스펙트럼을 얻은 다음, His 태그가 붙은 정제된 재조합 인간 사이클로필린 효소(f/c 2 nM) 및 테트라 펩타이드 기질(트리플루오로에탄올(Bachem, f/c 60 μM) 중 0.5 M LiCl 용액에 용해된 Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-para-니트로아닐리드)을 첨가하고 330 nM에서 5분에 걸쳐 흡광도 변화를 측정했다. 일차 속도식을 흡광도 데이터에 맞춰 속도 상수를 얻었다(처음 10~15초는 혼합으로 인해 제거됨). 촉매 속도는 효소 속도에서 배경 속도를 뺀 값에서 계산되었다. 억제제에 대한 K _i 는 억제제 농도에 대해 플롯팅된 속도 상수로부터 얻었다.

미토콘드리아 투과성 전이

미토콘드리아 투과성 전이(MPT)는 Ca²⁺에 의해 유도된 미토콘드리아의 팽창을 측정하여 결정된다. 그 절차는 Blattner et al., 2001, Analytical Biochem, 295:220에 설명된 방법에서 채택했다. 미토콘드리아는 혈액을 제거하기 위해 인산완충식염수(PBS)로 관류된 랫트 간에서 준비되며, 수크로스 기반 완충액에서 부드러운 균질화 후 차등 원심분리로 먼저 세포 파편을 제거한 다음 미토콘드리아를 침전시키는 표준 방법을 사용하였다. 팽창은 150 마이크로몰 Ca²⁺ (CaCl₂의 농축 용액으로부터 추가)에 의해 유도하고 535-540 nm에서 산란을 측정하여 모니터링하였다. 대표적인 화합물들을 팽윤이 유도되기 5분 전에 첨가하였다. EC₅₀은 본원에 개시된 화합물이 있는 경우와 없는 경우의 팽윤을 비교하여 결정하였다. 화합물 1은 0.2 μM 미만의 EC₅₀ 으로 미토콘드리아 팽창을 억제하였다.

[표 1]

사이클로필린 A 억제, 사이클로필린 D 억제 및 미토콘드리아 투광성 전이(MPT)에 대한 측정 결과.

표 1에 표시된 결과는 유사한 유사체(엔트리 1-3 및 5-7)에 비해 화합물 1(엔트리 4)의 예상치 못하게 높은 사이클로필린 D 억제 및 MPT를 입증한다. 3개의 다른 화합물(엔트리 1, 5 및 7)에 비해 MPT에서 100배 개선이 관찰되었으며, 두번째로 우수한 성능을 보이는 유사체(엔트리 3)에 비해 25배 이상 개선이 관찰되었다. 화합물 1은 또한 시험된 다른 모든 유사체들에 비해 50배 이상 개선된 우수한 사이클로필린 D 억제를 나타냈다.

장기 손상 동물 모델에서 화합물 1의 보호 효과

신장 허혈-재관류 손상에 의한 급성 신장 손상

화합물 1 및 사이클로스포린 A 제형들은 이들 화합물을 크레모포어/식염수/DMSO와 혼합하여 제조하였다.

Sprague-Dawley 쥐를 6개의 그룹으로 나누었다: 그룹 (i) 활성 성분 없이 크레모포어/식염수/DMSO가 투여된 허위군(sham group); 그룹 (ii) 활성 성분 없이 크레모포어/식염수/DMSO가 투여된 대조군; 그룹 (iii) 화합물 1 (3 mg/kg)이 투여된 군; 그룹 (iv) CsA (3 mg/kg)이 투여된 군; 그룹 (v) 화합물 1 (10 mg/kg)이 투여된 군; 그룹 (vi) CsA(10 mg/kg)가 투여된 군. 그룹 (i), 즉 '허위군'을 제외하고, 신장 허혈-재관류 유도 급성 신장 손상(AKI)은 30분 동안 양측 신장 동맥을 결찰(ligation)한 후 결찰을 해제하여 랫트에서 유도되었다.

대조군 및 처리군의 동물에게 3회(결찰 전 1시간, 결찰 후 4시간 및 8시간) 복강내 주사를 투여하였다. 결찰/방출 절차 24시간 후 동물로부터 혈액을 채취하고, 신장 손상의 척도로서 혈청 크레아티닌 및 혈액 요소 질소(BUN: Blood Urea Nitrogen) 농도에 대해 분석했다.

이러한 실험 결과는 아래에 나타내었으며, 도 1과 2에 그래프로 표시하였다.

[표 2]

그룹 (i) ~ (vi)의 혈청 크레아티닌 및 BUN 농도 측정 결과

결과 논의

도 1에서 혈청 크레아티닌 농도는 신장 손상을 나타낸다. '허위군(sham group)'은 AKI가 유도되지 않은 랫트이다. '대조군'은 AKI가 유도된 쥐를 나타내며, 처리되지 않았다. 따라서, AKI 유도는 25μmol/ml(그룹 i)에서 195μmol/ml 그룹(그룹 ii)으로 증가된 혈청 크레아티닌 수준을 초래함을 알 수 있다. 3 mg/kg의 CsA(그룹 iv)로 AKI 유도된 쥐를 치료하면, 그룹 ii와 비교하여 크레아티닌 수준이 195 μmol/ml에서 115 μmol/ml로 떨어졌다. 따라서, CsA는 허혈-재관류 손상을 예방하는 작용을 하는 것으로 이해된다.

놀랍게도, AKI 유도된 랫트가 3 mg/kg의 화합물 1(그룹 iii)로 처리될 때, 이는 크레아티닌 수준이 195 umol/ml에서 60 umol/ml로 떨어진(그룹 ii와 비교) 매우 현저한 감소를 제공하는데, 이는 '허위군'(그룹 i), 즉 AKI 유도되지 않은 쥐에서 볼 수 있는 크레아티닌 수준에 접근하고 있다. 화합물 1 및 CsA의 용량이 3 mg/ml (그룹 iii 및 iv)에서 10 mg/ml (그룹 v 및 vi)로 증가하면, CsA 및 화합물 1의 이점이 감소되는 것으로 보이며, 화합물 1이 여전히 CsA 보다 성능이 좋은 것으로 나타났다.

도 2에서 혈액 요소 질소(BUN) 농도는 신장 손상을 나타낸다.

도 2는 도 1과 같은 경향성을 보인다. 즉, 3 mg/kg의 CsA는 BUN 수준의 감소를 초래하는 반면(그룹 ii와 비교시 그룹 iv), 3 mg/kg의 화합물 1은 BUN 수준에서 매우 현저한 감소를 나타내어(그룹 ii와 비교시 그룹 iii) '허위군'(그룹 i)에서 볼 수 있는 BUN 수준에 근접한다. 화합물 1 및 CsA의 농도를 3 mg/kg(그룹 iii 및 v)에서 10 mg/kg(그룹 v 및 vi)으로 증가시키는 것은 덜 효과적인 것으로 판명되었다. 이 결과는 도 1의 결과를 뒷받침한다.

지질다당류(LPS) 챌린지로 유발된 급성 신장 손상

LPS 유도 급성 신장 손상(AKI)은 LPS(15 mg/kg)의 복강내 주사에 의해 마우스(C57)에서 유도되었다. 20마리의 마우스를 무작위로 두 그룹으로 나누었다. 대조군의 동물들은 비히클(크레모포어/식염수/DMSO)을 투여받았고, 처리군은 화합물 1(크레모포어/식염수/DMSO 중 3 mg/kg)을 각각 복강내 투여받았다. 동물에게 비히클 또는 화합물 1을 3회(LPS 주사 1시간 전, 및 LPS 주사 4시간 및 8시간 후) 투여하고 LPS 주사 12시간 후에 동물로부터 혈액을 채취하였다. 화합물의 활성은 증가된 생존율(도 3)과 신장 기능 마커의 평가(도 4)에 의해 결정하였다.

[표 3]

결과 논의

도 3에서 동물 생존의 관점에서 화합물 1의 보호 효과가 제시되었다. 3 mpk의 용량 수준에서, 화합물 1 투여는 화합물 1을 투여받지 않은 대조군의 동물 10마리 중 단 4마리가 생존한 것과 비교하여 그룹의 모든 동물들의 생존을 초래하였다.

도 4는 이 실험에서 신장 기능에 대한 화합물 1의 효과를 보여준다. 화합물 1로 처리된 동물에 대한 더 낮은 크레아티닌 및 혈액 요소 질소 수준은, 신장 손상의 감소된 수준과 일치한다.

장기 기증자에게 투여함에 의한, 이식 중 장기 보호.

이식 조건의 장기에 대한 화합물 1의 보호 효과를 돼지 신장을 사용하여 예시하였다. 수행된 실험에서, 화합물 1의 단일 용량을 신장 절제 1시간 전에 정맥내 전달을 통해 5 mg/kg으로 돼지에게 투여하였다. 신장을 절제하고, 표준 고장성 시트르산 아데닌(HCA: hypertonic citrate adenine) 보존액을 관류한 후 저온(0℃-4℃)에서 HCA 용액에 보존하였다. 절제 절차 후 여러 시점에 걸쳐 염증 마커의 조직학적 평가 및 측정에 의해 손상을 기록하기 위해 장기를 모니터링했다.

· 영점

· 6시간 (6h)

· 24시간 (24h)

· 48시간 (48h).

데이터는 도 5-7에 나타내었다.

조직학적 평가는 염증 정도에 따른 점수 기준을 이용하여 헤모톡실린 및 에오신(HE) 염색 후 이루어졌다. 반정량적 점수 시스템에서, "0 에서 4"로, 즉 병변이 매우 작거나 없는 경우 "0"; 경미하거나 작음은 "1"로 지정되고; 중간은 "2"로 지정되고; 심각은 "3"으로 지정되고; 매우 심한 경우 "4"로 지정된다.

실험은 총 9개의 돼지 신장으로 수행되었는데, 대조군으로 보호제 화합물 없이 4개의 신장이 사용되었고, 5개의 신장이 신장 절제 1시간 전에 5 mg/kg 화합물 1 을 정맥내 투여(i.v.)를 받았다. 데이터는 제거 후 시점들에서 연구된 신장 전체의 평균을 보여준다.

도 5는 평균 염증 점수의 결과를 나타낸다.

도 6은 신피막(renal capsule)의 확장에 대한 효과를 나타낸다.

도 7은 신세뇨관 확장에 대한 효과를 나타낸다.

결과 논의

전체적으로 요약하면, 화합물 1은 허혈-재관류 손상의 치료 또는 예방에서 놀랍게도 효과적인 것으로 밝혀졌고, 특히 더 낮은 농도 수준에서 효과적이었다. 이 화합물은 또한 (수용자에게 후속 이식을 위해) 장기를 제거하기 전에 장기 기증자에게 투여하는 데 특히 효과적이다. 도 5 내지 7은 장기 제거 전에 화합물을 기증자에게 투여함으로써 장기가 생체외에서 보존될 수 있음을 보여준다.

Claims (10)

1. 장기(organ) 보존을 위한 미토콘드리아 보호 화합물의 용도로서, 상기 화합물은 장기 기증자로부터 장기를 제거하기 전에 장기를 보호하기 위해 상기 기증자에게 투여되는 것인, 용도.
2. 제1항에 있어서, 화합물이 사이클로필린 D 억제제인, 용도.
3. 제2항에 있어서, 화합물이 하기 식 1의 화합물 또는 이의 염인, 용도:
   

   

   
   식 1
   상기 식에서,
   n은 2-5이고,
   R₁ 및 R₂는 독립적으로 H 또는 C₁-C₄ 알킬로부터 선택되며, R₁ 및 R₂는 함께 연결되어 C₃-C₅ 헤테로알킬 고리를 형성할 수 있음.
4. 제3항에 있어서, 화합물이 화합물 1 또는 이의 염인, 용도:
   

   

   
   화합물 1
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 장기가 신장인 용도.
6. 신장 기증자로부터 신장을 제거하기 전에 상기 기증자에게 화합물을 투여하는 단계를 포함하는, 신장 기증자로부터 신장을 보존하는 방법으로서, 상기 화합물은 화합물 1 또는 이의 염인, 방법:
   

   

   
   화합물 1
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 기증자가 살아있는 기증자인, 방법 또는 용도.
8. 신장 보존을 위해 살아있는 기증자에게 투여하기 위한 약제의 제조를 위한 미토콘드리아 보호 화합물의 용도로서, 상기 화합물이 화합물 1 또는 이의 염인, 용도:
   

   

   
   화합물 1
9. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 화합물의 용량이 0.1 내지 10 mg/kg인, 방법 또는 용도.
10. 제9항에 있어서, 화합물의 용량이 1 내지 3 mg/kg인, 방법 또는 용도.

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