KR20210115115A - 이소리퀴리티제닌 유도체를 포함하는 갈색 지방 유도화 분화 조성물 - Google Patents
이소리퀴리티제닌 유도체를 포함하는 갈색 지방 유도화 분화 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 이소리퀴리티제닌 유도체 및 이들의 용도에 관한 것으로, 상기 이소리퀴리티제닌 유도체들은 유의미한 세포 독성은 없으면서 갈색 지방화 분화를 유도하고, 이소리퀴리티제닌 유도체를 포함하는 갈색 지방세포 유도용 조성물이 심근 손상을 줄어드는 효과가 있으므로 심장 질환 예방 또는 치료 용도로 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 신규 이소리퀴리티제닌 유도체, 이의 제조방법, 이소리퀴리티제닌 유도체를 포함하는 갈색 지방 유도화 분화 조성물 및 이의 심장 질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
비만, 당뇨, 고지혈 등의 대사성 질환에 대한 발병 기전 및 원인에 관한 연구는 발병률과 비례하게 점차 증가되고 있으며, 특히 비만의 경우 에너지 소모량에 비해 에너지 섭취량이 많아 체내에 지방이 과도하게 축적됨에 따라 발생하는 질병으로 유전적, 환경적, 정신적 요인 등 다양하고 복합적인 작용에 의해 발생함. 이와 같은 이유에서 비만 치료에 대한 새로운 전략이 필요한 것으로 판단하고 새로운 치료 기술로써 갈색지방 조절에 관한 연구가 매우 활발히 진행되어 왔다 (비특허문헌 1~4).
기존 연구에서 인간 epicardial fat에서 갈색 지방의 양상을 확인하였으며, 갓 태어난 양의 심장에서도 paracardial adipose tissue와 epicardial adipose tissue에서의 갈색 지방의 백색 지방화 변화를 확인한 바 있다 (비특허문헌 5~7).
최근 연구 결과에서 백색 지방의 갈색 지방화 유도는 대사성 질환뿐 아니라 심혈관 질환에도 관련이 있음을 보고하였으며, 특히 기존에 밝혀진 여러 갈색지방 유도 인자들뿐만 아니라 TFAM과 같은 미토콘드리아 biogenesis와 관련된 조절 인자들이 중요한 타겟이 될 것으로 언급하였다.
2015년 미국 솔크연구소에서 발표한 논문 (비특허문헌 8)에 의하면 해당 그룹에서 개발한 새로운 약물인 fexaramine이 음식을 섭취하고 있다고 착각하게 만들어서 지방을 연소시키게 만드는 새로운 약물을 개발했다고 보고한 바 있으며 전 세계적으로 천연물을 비롯한 다양한 저분자 화합물에 이르기까지 갈색 지방화 유도에 관한 약물을 탐색하고 개발에 몰두하고 있다.
심장질환을 효과적으로 치료하고 합병증을 예방하기 위해서는 심근세포 주변 환경의 신호전달 인자들과 상호역할에 대해 통합적으로 분석하고 새로운 인자들을 발굴하여 대상 타겟을 이용한 기전 연구 및 네트워크 분석을 통한 상호 통합적 역할 해석이 필요하다.
최근 심장에 분포하는 여러 지방조직들과 특성에 대해 보고되고 있으며, 여러 갈색지방화 유도 인자들에 대한 연구가 진행되고 있으나 초기 단계에 있으며 심장질환과 갈색지방화 인자들의 기전은 여전히 규명되지 않고 있다. (비특허문헌 7).
NFIA co-localizes with PPARγ and transcriptionally controls the brown fat gene program, Nat Cell Biol. 2017 Sep;19(9):1081-1092. doi: 10.1038/ncb3590
BMP4 Gene Therapy in Mature Mice Reduces BAT Activation but Protects from Obesity by Browning Subcutaneous Adipose Tissue, Cell Rep. 2017 Aug 1;20(5):1038-1049.
Cold-Inducible SIRT6 Regulates Thermogenesis of Brown and Beige Fat, Cell Rep. 2017 Jul 18;20(3):641-654
Integrative analyses of translatome and transcriptome reveal important translational controls in brown and white adipose regulated by microRNAs, Sci Rep. 2017, 7, 5681
Adult Epicardial Fat Exhibits Beige Features, J Clin Endocrinol Metab. 2013, 98, E1448-E1455
Gene pathway development in human epicardial adipose tissue during early life, JCI insight. 2016, 1(13), e87460
'Browning' the cardiac and peri-vascular adipose tissues to modulate cardiovascular risk, Int J Cardiol. 2017, 228, 265-274
Intestinal FXR agonism promotes adipose tissue browning and reduces obesity and insulin resistance, Nature Medicine. 2015, 21, 159-165
Dietary Isoliquiritigenin at a Low Dose Ameliorates Insulin Resistance and NAFLD in Diet-Induced Obesity in C57BL/6J Mice, Int. J. Mol. Sci. 2018, 19(10), 3281; doi:10.3390/ijms19103281
본 발명자들은 이소리퀴리티제닌 유도체의 갈색지방화 유도 효과를 확인한 후 이렇게 유도된 갈색 지방세포 분비체가 심근세포 보호 효과 및 심장질환에 대한 치료 효능과 기전을 밝힘으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 신규 이소리퀴리티제닌 유도체, 이의 제조방법, 이소리퀴리티제닌 유도체를 포함하는 갈색 지방화 유도용 조성물, 이를 포함하는 심장 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물, 심장 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물 및 갈색 지방화 유도 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 하기 화학식 13으로 표시되는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 제공한다.
[화학식 13]
본 발명에서 사용되는 용어, "약제학적으로 허용 가능한 이의 염"은 당해 기술분야에서 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있는 것으로, 예를 들면, 염산, 브롬화수소, 황산, 황산수소나트륨, 인산, 탄산 등의 무기산과의 염 또는 개미산, 초산, 옥살산, 벤조산, 시트르산, 타르타르산, 글루콘산, 게스티스산, 푸마르산, 락토비온산, 살리실릭산, 또는 아세틸살리실릭산(아스피린)과 같은 유기산과 함께 약제학적으로 허용 가능한 이들의 산의 염을 형성하거나, 또는 나트륨, 칼륨 등의 알칼리금속이온과 반응하여 이들의 금속염을 형성하거나, 또는 암모늄 이온과 반응하여 또 다른 형태의 약제학적으로 허용 가능한 그의 염을 형성하는 것을 의미한다.
또한, 본 발명은
1-(2,4-디플루오로페닐)에탄-1-온(1-(2,4-Difluorophenyl)ethan-1-one)과 4-하이드록시벤잘데하이드(4-hydroxybenzaldehyde)을 반응시켜 하기 반응식 1과 같이 화학식 13으로 표시되는 화합물을 제조하는 단계;
를 포함하는 화학식 13으로 표시되는 화합물의 제조방법을 제공한다.
[반응식 1]
또한, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 하기 화학식 2로 표시되는 화합물, 하기 화학식 10으로 표시되는 화합물, 하기 화학식 13으로 표시되는 화합물, 이들의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 화합물 또는 혼합물을 유효성분으로 포함하는 갈색 지방화 유도용 조성물을 제공한다.
[화학식 1]
[화학식 2]
[화학식 10]
[화학식 13]
본 발명에서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 (E)-1-(2,4-Dihydroxyphenyl)-3-(4-hydroxyphenyl)prop-2-en-1-one으로 명명되고, 화학식 2로 표시되는 화합물은 7-Hydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)-4H-chromen-4-one으로 명명된다. 상기 화학식 10으로 표시되는 화합물은 (E)-1-(2,4-Dihydroxyphenyl)-3-(3,4,5-trihydroxyphenyl)prop-2-en-1-one으로 명명된다. 또한, 상기 화학식 13으로 표시되는 화합물은 (E)-1-(2,4-difluorophenyl)-3-(4-hydroxyphenyl)prop-2-en-1-one으로 명명되며, 본 발명자들에 의해 신규 합성된 물질이다.
이들 4가지 화합물은 이소리퀴리티제닌(isoliquiritigenin, ILG)의 유도체로, 하기 화학식 14로 표시되는 이소리퀴리티제닌(isoliquiritigenin, ILG)은 기존에 C57BL/6J Mice 갈색 지방조직의 미토콘드리아 생성과 세포호흡과 관련된 열 발생 유전자의 발현을 증가시켜 에너지 소비를 증가시키는 것으로 알려져 있으나(비특허문헌 9), 상기 화학식 1, 2, 10 또는 화학식 13으로 표시되는 화합물의 갈색 지방세포 유도 효과는 알려진 바가 없다.
[화학식 14]
본 발명에서 사용되는 용어, "분화(differentiation)"는 상대적으로 특수하지 않은 세포 (예를 들어, 미분화 세포, 예를 들어 다계열-유도성 세포)가 성숙 세포의 특징적인 특수한 구조적 및/또는 기능적 특징을 획득하는 과정을 말한다. 전형적으로, 분화 동안, 세포 구조는 변경되며, 조직-특이적 단백질이 나타난다. "지방세포 형성적 분화"는 미분화 세포가 지방 세포, 예를 들어 갈색 지방 세포의 특징적인 하나 이상의 특성 (예를 들어, 형태적, 생화학적 또는 기능적 특성)을 획득하는 과정이다. 당업자라면 "갈색 지방세포-유사 세포"가 MSC, 지방 세포 전구 세포, 전지방세포 및 동맥-유래 세포로부터 유래된 갈색 지방 세포를 포함함을 알 것이다.
본 발명의 조성물은 갈색 지방세포의 활성을 증가시키거나 UCP-1 또는 PRDM16의 발현을 증가시키는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "갈색 지방세포 (brown adipose tissue, BAT)"는 저체온증(hypothermia) 상황에서 열을 발생시켜 체온을 유지시키는 기능을 수행하며, 에너지를 열로 소비하므로 갈색 지방이 많을수록 체중을 더 많이 줄일 수 있다. 갈색 지방세포는 흰색 지방세포에 비하여 비교적 많은 수의 미토콘드리아가 존재하며, 미토콘드리아에 존재하는 사이토크롬 색소에 의해 갈색을 갖게 된다. 갈색지방세포의 미토콘드리아 내막에는 UCP1(uncoupling protein 1) 단백질이 존재하며, UCP1은 미토콘드리아의 산화적 인산화 과정에서 형성되는 H+전기화학적 농도구배와 ATP 중합효소에 의한 ATP 합성 과정을 짝풀림(uncoupling)하여 화학적 에너지를 열(heat) 형태로 방출한다. 또한, "갈색 지방세포화"라는 용어는 지방 저장형 백색 지방이 지방 연소형 갈색 지방으로의 전이 또는 분화하는 과정 및 얻어진 갈색 지방의 특성을 가지는 세포를 포함하는 것을 말한다. "전이"는 물질이 하나의 상태에서 다른 상태로 변화하는 현상으로, 백색 지방세포가 갈색 지방세포의 특성을 획득하여 갈색 지방세포화 되는 것을 포함한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "분화 유도 조성물"은 초기 단계의 세포가 각 조직으로서의 특성을 갖게 되는 과정을 유도할 수 있는 조성물을 의미하며, 본 발명의 목적상 백색 지방세포에서 갈색 지방세포로 분화 유도할 수 있는 조성물을 의미한다.
본 발명의 갈색 지방세포로의 분화 유도 조성물은 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 하기 화학식 2로 표시되는 화합물, 하기 화학식 10으로 표시되는 화합물, 하기 화학식 13으로 표시되는 화합물, 이들의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 화합물 또는 혼합물을 전체 조성물 총 중량에 대하여 0.0001 내지 10 중량%, 바람직하게는 0.001 내지 1 중량%의 양으로 존재할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 일 구현예에서는 이소리퀴리티제닌(isoliquiritigenin, ILG)의 유도체들을 제조하고, 갈색지방 표지인자 UCP1, PPARγ, PGC1A에 의해 이소리퀴리티제닌(isoliquiritigenin, ILG)의 유도체 4가지를 선별하고, 이 유체들의 처리에 의한 갈색 지방세포의 마커인 UCP-1, PRDM16의 발현 증가를 확인하였다 (실시예 1 참조). 특히, 다른 ILG 유도체들 중에 화학식 13으로 표시되는 화합물(이하, 화합물 13으로 명명)에 의한 UCP-1, PRDM16의 발현에 대한 현저한 효과를 확인하였으며 (실시예 2 참조), 허혈성 심장 질환 동물 모델에서 허혈/재관류에 대해 우수한 심장보호작용을 나타냄을 확인하였다 (실시예 4 참조).
본 발명의 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 상기 약제학적으로 허용 가능한 담체는 생리식염수, 폴리에틸렌글리콜, 에탄올, 식물성 오일, 및 이소프로필미리스테이트 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한 기존에 알려진 줄기세포 배양용 배지, 분화 유도제 등을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은, 비경구 투여를 위한 수용성 용액으로 제조할 수 있으며, 바람직하게는 한스 용액(Hank's solution), 링거 용액(Ringer's solution) 또는 물리적으로 완충된 염수와 같은 완충용액 등을 사용할 수 있다.
수용성 주입(injection) 현탁액은, 소디움 카르복시메틸셀룰로오스, 솔비톨 또는 데스트란과 같이 현탁액의 점도를 증가시킬 수 있는 기질을 첨가할 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물의 바람직한 양태는 멸균 주사용 수성 또는 유성 현탁액의 멸균 주사용 제제의 형태일 수 있다. 상기 현탁액은 적합한 분산제 또는 습윤제(ex. 트윈 80) 및 현탁화제를 사용하여 이 분야에 공지된 기술에 따라 제형화할 수 있다. 멸균 주사용 제제는 또한 무독성의 비경구적으로 허용되는 희석제 또는 용매 중의 멸균 주사 용액 또는 현탁액 (ex. 1,3-부탄디올 중의 용액)일 수 있다. 본 발명에서 사용될 수 있는 비히클 및 용매로는 만니톨, 물, 링거 용액 및 등장성 염화나트륨 용액 등이 있다. 또한, 멸균 비휘발성 오일이 통상적으로 용매 또는 현탁화 매질로서 사용된다. 상기 목적을 위해 합성 모노 또는 디글리세라이드를 포함하여 자극성이 적인 비휘발성 오일은 그 어느 것이라도 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 갈색 지방화 유도용 조성물을 포함하는 심장 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 약학적 조성물에 의한 예방 또는 치료 대상 질병인 "심장 질환"은 관상동맥 혈류장애로 심장에 적절한 혈액공급이 되지 않는 질환을 의미하며, 바람직하게 협심증, 심근경색 또는 심부전증과 같은 허혈성 심장 질환을 포함한다.
본 발명의 약학적 조성물은 약제의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등이 있다.
본 발명의 약학적 조성물을 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘(calcium carbonate), 슈크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있으며, 경구 투여가 바람직하다. 본 발명의 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있으며, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 갈색 지방화 유도용 조성물을 포함하는 심장 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
상기 식품 조성물은 심장 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물과 동일한 성분을 사용하므로 이 둘 사이에 중복되는 내용은 명세서의 과도한 기재를 피하기 위하여 생략한다.
본 발명에서, 상기 식품 조성물은 분말, 과립, 정제, 캡슐, 시럽, 음료 또는 환의 형태로 제공될 수 있으며, 유효성분인 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 화합물 이외에 다른 식품 또는 식품 첨가물과 함께 사용되고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합량은 그의 사용 목적 예를 들어 예방, 건강 또는 치료적 처치에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
상기 식품 조성물에 함유된 유효성분의 유효용량은 상기 약학 조성물의 유효용량에 준해서 사용할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있음은 확실하다.
상기 식품 조성물은 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로텍스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 및 합성 향미제를 사용할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제로 제조되는 경우에는 본 발명의 유효성분 외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙 등을 추가로 포함시킬 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 갈색 지방세포 분화 유도용 조성물을 백색 지방세포에 처리하는 단계를 포함하는 백색 지방세포로부터 갈색 지방세포로의 분화 유도 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 하기 화학식 2로 표시되는 화합물, 하기 화학식 10으로 표시되는 화합물, 하기 화학식 13으로 표시되는 화합물, 이들의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 화합물 또는 혼합물을 포함하는 배지에서 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는 줄기세포에서 갈색 지방화 분화 유도 방법을 포함한다:
[화학식 1]
[화학식 2]
[화학식 10]
[화학식 13]
상기 줄기세포는 개체로부터 자연적 또는 인위적 방법으로 분리된 것을 대상으로 한다. 개체로부터 분리된 상기 세포들은 적절한 배양 조건 하에서 수일 내지 수주 동안 배양될 수 있으며, 경우에 따라서 동결 보관될 수도 있다.
분리된 상기 세포들에 본 발명의 유효성분을 투여하는 방법은 통상의 기술자에게 자명한 사항이며, 바람직하게는 본 명세서의 하기 실시예에 기재된 바를 따를 수 있을 것이다.
본 발명에 따른 이소리퀴리티제닌 유도체들은 단독 또는 병용하여 사용될 수 있으며, 유의미한 세포 독성은 없으면서 갈색 지방화 분화를 유도하고, 이렇게 유도된 갈색 지방세포는 심근 손상을 줄어드는 효과가 있으므로 심장 질환 예방 또는 치료 용도로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 ILG 유도체 #1 내지 #13의 구조식을 나타낸 것이다.
도 2는 인간 줄기세포 (human Adipocyte-derived stem cells)를 지방세포로 분화시키고 ILG을 처리하여 갈색지방으로 유도한 후 Oil Red O staining으로 지방 염색 (A) 및 갈색지방 마커인 UCP1의 발현 (B) 변화를 확인함으로써 갈색지방세포 분화 정도를 확인하였다.
도 3 내지 5는 백색 지방세포에 ILG(#54) 및 이의 유도체(#1~#13)를 각각 처리하고 갈색지방화 유도를 확인하기 위하여 갈색지방 표지인자 (UCP1, PPARγ, PGC1A)를 확인하였으며, 그 결과 유도체 #1, #2, #10, #13을 선별하였다.
도 6은 선별된 ILG 유도체 #1, #2, #10, #13 처리 후 갈색지방 표지 단백질들의 변화를 Western blot 분석법으로 확인하였다.
도 7은 도 6에서 갈색지방 표지 단백질 UCP1의 발현이 가장 높은 것으로 나타난 #1, #13에 대한 세포 생존율을 확인하였으며 세포독성은 없는 것으로 나타났다.
도 8 및 9는 인간 줄기세포, 백색지방세포, 갈색지방세포에서 분비되는 분비체를 Human adipokine array kit을 이용하여 세포간 분비되는 인자들을 비교 분석하였다.
도 10은 MI(myocardial infarction) 손상을 입은 심혈관질환 동물모델에서 줄기세포 (ASCs) 분비체, 백색지방세포 (WAC) 분비체, 갈색지방세포 (BAC) 분비체 처리군을 대조군과 비교하여 갈색지방 분비체의 치료 효과 우수성을 보여주는 결과이다.
도 11은 MI(myocardial infarction) 손상을 입은 심혈관질환(IR) 동물모델에서 ASCs 분비체, WAC 분비체, BAC 분비체 처리군과 대조군의 심기능 개선/회복 효과를 보여주는 결과이다.
도 2는 인간 줄기세포 (human Adipocyte-derived stem cells)를 지방세포로 분화시키고 ILG을 처리하여 갈색지방으로 유도한 후 Oil Red O staining으로 지방 염색 (A) 및 갈색지방 마커인 UCP1의 발현 (B) 변화를 확인함으로써 갈색지방세포 분화 정도를 확인하였다.
도 3 내지 5는 백색 지방세포에 ILG(#54) 및 이의 유도체(#1~#13)를 각각 처리하고 갈색지방화 유도를 확인하기 위하여 갈색지방 표지인자 (UCP1, PPARγ, PGC1A)를 확인하였으며, 그 결과 유도체 #1, #2, #10, #13을 선별하였다.
도 6은 선별된 ILG 유도체 #1, #2, #10, #13 처리 후 갈색지방 표지 단백질들의 변화를 Western blot 분석법으로 확인하였다.
도 7은 도 6에서 갈색지방 표지 단백질 UCP1의 발현이 가장 높은 것으로 나타난 #1, #13에 대한 세포 생존율을 확인하였으며 세포독성은 없는 것으로 나타났다.
도 8 및 9는 인간 줄기세포, 백색지방세포, 갈색지방세포에서 분비되는 분비체를 Human adipokine array kit을 이용하여 세포간 분비되는 인자들을 비교 분석하였다.
도 10은 MI(myocardial infarction) 손상을 입은 심혈관질환 동물모델에서 줄기세포 (ASCs) 분비체, 백색지방세포 (WAC) 분비체, 갈색지방세포 (BAC) 분비체 처리군을 대조군과 비교하여 갈색지방 분비체의 치료 효과 우수성을 보여주는 결과이다.
도 11은 MI(myocardial infarction) 손상을 입은 심혈관질환(IR) 동물모델에서 ASCs 분비체, WAC 분비체, BAC 분비체 처리군과 대조군의 심기능 개선/회복 효과를 보여주는 결과이다.
이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
ILG의 13개 유도체 합성은 다음 제조예로 설명한다.
제조예 1: (
E
)-1-(2,4-Dihydroxyphenyl)-3-(4-hydroxyphenyl)prop-2-en-1-one (1)의 제조
1-(2,4-Dihydroxyphenyl)ethan-1-one (30.4 mg, 0.200 mmol)과 4-hydroxybenzaldehyde (24.4 mg, 0.200 mmol)에 EtOH (0.15 mL)을 가한 후 5분간 교반하였다. 그 후 30% KOH 수용액 (0.8 mL)을 가한 뒤 상온에서 12시간 교반하였다. 반응 용액을 물(1 mL)로 희석하고, 1N HCl 수용액을 사용하여 여액의 pH를 7으로 조절한 후 EtOAc (6 × 1 mL)로 추출하였다. EtOAc 용액을 무수 MgSO4를 사용하여 건조한 뒤, 여과하여 감압 농축하였다. 농축된 반응 생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(EtOAc:Hex=1:2)로 분리하여 원하는 화합물 1 (41.0 mg, 80%)을 노란색 고체로 얻었다.
1H NMR (400 MHz, (CD3)2SO) δ 10.65 (br s, 1H), 10.14 (br s, 1H), 8.16 (d, J = 9.1 Hz, 1H), 7.76-7.74 (m, 4H), 6.84 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 6.40 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 6.27 (d, J = 2.3 Hz, 1H) ppm.
제조예 2: 7-Hydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)-4
H
-chromen-4-one (2)의 제조
(E)-1-(2,4-Dihydroxyphenyl)-3-(4-hydroxyphenyl)prop-2-en-1-one (1) (30.7 mg, 0.12 mmol)에 iodine (20.0 mg, 0.0780 mmol) 와 DMSO (0.4 mL)를 가한 후 100 ℃에서 45분 환류 교반하였다. 반응액을 상온으로 냉각한 후 물(1 mL)로 희석하고 여과하였다. 석출된 고체는 sodium thiosulphate 20% 수용액으로 세척하여 iodine을 제거하고 물로 세척하였다. 남은 반응 생성물을 에탄올로 재결정하여 원하는 화합물 2 (21.7 mg, 71%)를 노란색 고체로 얻었다.
1H NMR (400 MHz, (CD3)2SO) δ 10.78 (br s, 1H), 10.27 (br s, 1H), 7.91 (d, J = 9.1 Hz, 2H), 7.86 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 6.97-6.89 (m, 4H), 6.72 (s, 1H) ppm.
제조예 3: (
E
)-1-(2,4-Dihydroxyphenyl)-3-(4-fluorophenyl)prop-2-en-1-one (3)과 2-(4-Fluorophenyl)-7-hydroxy-4
H
-chromen-4-one (4)의 제조
1-(2,4-Dihydroxyphenyl)ethan-1-one (15.2 mg, 0.100 mmol)과 4-fluorobenzaldehyde (18.6 mg, 0.150 mmol)에 EtOH (0.1 mL)을 가한 후 5분간 교반하였다. 그 후 60% KOH 수용액(1 mL)을 가한 뒤 100 ℃에서 5시간 교반하였다. 반응 용액을 물(1 mL)로 희석하고, 1N HCl 수용액을 사용하여 여액의 pH를 7으로 조절한 후 EtOAc (6 × 1 mL)로 추출하였다. EtOAc용액을 무수 MgSO4를 사용하여 건조한 뒤, 여과하여 감압 농축하였다. 농축된 반응 생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(EtOAc:Hex=1:2)로 정제하여 원하는 화합물 3 (9.00 mg, 35%)과 화합물 4 (7.7 mg, 30%)를 각각 노란색 고체로 얻었다.
화합물 3의 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 13.24 (s, 1H), 7.88-7.83 (m 2H), 7.68-7.64 (m, 2H), 7.51 (d, J = 15.6 Hz, 1H), 7.13 (t, J = 8.5 Hz, 2H), 6.66 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 6.60 (dd, J = 8.7, 2.3 Hz, 1H), 5.24 (s, 1H) ppm.
화합물 4의 1H NMR (400 MHz, (CD3)2SO) δ 7.88 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.46 (dd, J = 8.5, 5.3 Hz, 2H), 7.13 (t, J = 8.5 Hz, 2H), 6.56 (dd, J = 8.7, 2.3 Hz, 1H), 6.47 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 5.46 (dd, J = 13.3, 2.7 Hz, 1H), 5.39 (s, 1H), 3.02 (dd, J = 16.9, 13.3 Hz, 1H), 2.83 (dd, J = 10.1, 3.2 Hz, 1H) ppm.
제조예 4: (
E
)-1-(2,4-Dihydroxyphenyl)-3-(4-(dimethylamino)phenyl)prop-2-en-1-one (5)의 제조
1-(2,4-Dihydroxyphenyl)ethan-1-one (183 mg, 1.20 mmol)과 4-(dimethylamino)-benzaldehyde (149 mg, 1.0 mmol)에 EtOH (1.0 mL)을 가한 후 5분간 교반하였다. 그 후 60% KOH 수용액(2 mL)을 가한 뒤 100 ℃에서 5시간 교반하였다. 반응 용액을 물(2 mL)로 희석하고, 1N HCl 수용액을 사용하여 여액의 pH를 7으로 조절한 후 EtOAc (6 × 2 mL)로 추출하였다. EtOAc용액을 무수 MgSO4를 사용하여 건조한 뒤, 여과하여 감압 농축하였다. 농축된 반응 생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(EtOAc:Hex=1:1 with 1% Et3N)로 분리하여 원하는 화합물 5 (90.0 mg, 32%)를 노란색 고체로 얻었다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 12.69 (s, 1H), 9.75 (s, 1H), 7.96 (d, J = 15.1 Hz, 1H), 7.90-7.81 (m, 4H), 7.38 (d, J = 15.1 Hz, 1H), 6.73-6.65 (m, 3H), 3.07 (s, 6H) ppm.
제조예 5: (
E
)-1-(2,4-Dihydroxyphenyl)-3-(4-nitrophenyl)prop-2-en-1-one (6)의 제조
1-(2,4-Bis(ethoxymethoxy)phenyl)ethan-1-one (80.4 mg, 0.300 mmol)과 4-nitrobenzaldehyde (45.3 mg, 0.300 mmol)에 EtOH (0.3 mL)을 가한 후 5분간 교반하였다. 그 후 30% KOH 수용액 (0.8 mL)을 가한 뒤 22 ℃에서 12시간 교반하였다. 반응액을 물(1 mL)로 희석하고, 1N HCl 수용액을 사용하여 여액의 pH를 7으로 조절한 후 EtOAc (6 × 1 mL)로 추출하였다. EtOAc용액을 무수 MgSO4를 사용하여 건조한 뒤, 여과하여 감압 농축하였다. 농축된 반응 생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(EtOAc:Hex=1:2)로 분리하여 (E)-1-(2,4-Bis(ethoxymethoxy)phenyl)-3-(4-nitrophenyl)prop-2-en-1-one (6a, 89.6 mg, 80%)를 노란색 고체로 얻었다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.26 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 7.77-7.66 (m, 5H), 6.89 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 6.8 (dd, J = 8.7, 2.3 Hz, 1H), 5.32 (s, 2H), 5.28 (s, 2H), 3.77-3.72 (m, 4H), 1.24 (t, J = 7.4 Hz, 6H) ppm.
(E)-1-(2,4-bis(ethoxymethoxy)phenyl)-3-(4-nitrophenyl)prop-2-en-1-one (6a, 20 mg, 0.0500 mmol)에 MeOH (0.3 mL)을 가한 후 3 N HCl 수용액(0.0200 mL, 1.80 mmol)을 천천히 가한 뒤 70 ℃에서 30분 환류 교반하였다. 반응액을 농축시킨 후 생성물을 EtOAc (1 mL)와 물(1 mL)로 희석하고 수용액층을 EtOAc (6 Х 1 mL)로 추출하였다. EtOAc 용액을 무수 MgSO4를 사용하여 건조한 뒤, 여과하여 감압 농축하였다. 농축된 반응 생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(EtOAc:Hex=1:1)로 분리하여 원하는 화합물 6 (11.4 mg, 80%)을 노란색 고체로 얻었다.
1H NMR (400 MHz, (CD3)2SO) δ 10.62 (s, 1H), 8.13 (d, J = 15.6 Hz, 1H), 7.77-7.65 (m, 4H), 7.33 (d, J = 15.6 Hz, 1H), 6.80-6.74 (m, 3H) ppm.
제조예 6: (
E
)-1-(2,4-Dihydroxyphenyl)-3-(4-(trifluoromethyl)phenyl)prop-2-en-1-one (7)의 제조
1-(2,4-Dihydroxyphenyl)ethan-1-one (152 mg, 1.00 mmol)과 4-(trifluoromethyl)benzaldehyde (261 mg, 1.50 mmol)에 EtOH (1.0 mL)을 가한 후 5분간 교반하였다. 그 후 60% KOH 수용액(2 mL)을 가한 뒤 100 ℃에서 5시간 교반하였다. 반응액을 물(1 mL)로 희석하고, 1N HCl 수용액을 사용하여 여액의 pH를 7으로 조절한 후 EtOAc (6 × 1 mL)로 추출하였다. EtOAc용액을 무수 MgSO4를 사용하여 건조한 뒤, 여과하여 감압 농축하였다. 농축된 반응 생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(EtOAc:Hex=1:2)로 분리하여 원하는 화합물 7 (70.9 mg, 23%)을 노란색 고체로 얻었다.
1H NMR (400 MHz, (CD3)2SO) δ 13.27 (s, 1H), 7.90-7.82 (m, 2H), 7.79-7.63 (m, 3H), 7.35 (d, J = 9.1 Hz, 2H), 6.45 (dd, J = 9.1, 2.3 Hz, 1H), 6.32 (s, 1H) ppm.
제조예 7: (
E
)-3-(3,4-Difluorophenyl)-1-(2,4-dihydroxyphenyl)prop-2-en-1-one (8)의 제조
1-(2,4-Bis(methoxymethoxy)phenyl)ethan-1-one (72.1 mg, 0.300 mmol)과 3,4-difluorobenzaldehyde (63.9 mg, 0.450 mmol)에 EtOH (1.0 mL)을 가한 후 5분간 교반하였다. 그 후 30% KOH 수용액 (4.0 mL)을 가한 뒤 22 ℃에서 12시간 교반하였다. 반응액을 물(2 mL)로 희석하고, 1N HCl 수용액을 사용하여 여액의 pH를 7으로 조절한 후 EtOAc (3 × 5 mL)로 추출하였다. EtOAc용액을 무수 MgSO4를 사용하여 건조한 뒤, 여과하여 감압 농축하였다. 농축된 반응 생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(EtOAc:Hex=1:2)로 정제하여 (E)-1-(2,4-bis(methoxymethoxy)phenyl)-3-(3,4-difluorophenyl)prop-2-en-1-one (8a, 82.0 mg, 75%)를 노란색 고체로 얻었다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.71 (d, J = 8.7 Hz, 1H). 7.57 (d, J = 16.0 Hz, 1H), 7.43-7.38 (m, 2H), 7.33-7.30 (m, 1H), 7.23-7.16 (m, 1H), 6.86 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 6.79 (dd, J = 8.7, 2.3 Hz, 1H), 5.25 (q, J = 15.1 Hz, 4H), 3.51 (s, 3H), 3.51 (s, 3H) ppm.
(E)-1-(2,4-Bis(methoxymethoxy)phenyl)-3-(3,4-difluorophenyl)prop-2-en-1-one (8a, 20.0 mg, 0.0540 mmol)에 MeOH (0.3 mL)을 가한 후 3 N HCl 수용액(0.02 mL, 1.80 mmol)을 천천히 가한 뒤 70 ℃에서 30분 환류 교반하였다. 반응액을 농축시킨 후 잔사를 EtOAc (1 mL)와 물(1 mL)로 희석하고 수용액층을 EtOAc (6 × 1 mL)로 추출하였다. EtOAc 용액을 무수 MgSO4를 사용하여 건조한 뒤, 여과하여 감압 농축하였다. 농축된 반응 생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(EtOAc:Hex=1:1)로 분리하여 목적 화합물 8 (12.7 mg, 85%)을 노란색 고체로 얻었다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.84-7.77 (m, 2H), 7.51-7.47 (m, 2H), 7.40-7.38 (m, 1H), 7.25-7.22 (m, 1H), 6.67 (d, J = 2.3, 1H), 6.61 (dd, J = 9.1, 2.3 Hz, 1H) ppm.
제조예 8: (
E
)-1-(2,4-Dihydroxyphenyl)-3-(4-hydroxy-3,5-dimethoxyphenyl)prop-2-en-1-one (9)의 제조
1-(2,4-Bis(ethoxymethoxy)phenyl)ethan-1-one (53.7 mg, 0.200 mmol)과 4-hydroxy-3,5-dimethoxybenzaldehyde (43.7 mg, 0.240 mmol)에 EtOH (1.0 mL)을 가한 후 5분간 교반하였다. 그 후 30% KOH 수용액(4.0 mL)을 가한 뒤 22 ℃에서 12시간 교반하였다. 반응액을 물(2 mL)로 희석하고, 1N HCl 수용액을 사용하여 여액의 pH를 7으로 조절한 후 EtOAc (3 × 5 mL)로 추출하였다. EtOAc용액을 무수 MgSO4를 사용하여 건조한 뒤, 여과하여 감압 농축하였다. 농축된 반응 생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(EtOAc:Hex=1:1)로 분리하여 (E)-1-(2,4-bis(ethoxymethoxy)phenyl)-3-(4-hydroxy-3,5-dimethoxyphenyl)prop-2-en-1-one (9a, 63.1 mg, 73%)을 노란색 고체로 얻었다.
1H NMR (400 MHz, (CD3)2SO) δ 7.40 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.27 (d, J = 15.1 Hz, 1H), 6.79 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 6.71-6.64 (m, 4H), 5.27 (s, 2H), 5.26 (s, 2H), 3.72-3.64 (m, 4H), 3.60 (s, 6H), 1.16-1.10 (m, 6H) ppm.
(E)-1-(2,4-Bis(ethoxymethoxy)phenyl)-3-(4-hydroxy-3,5-dimethoxyphenyl)prop-2-en-1-one (9a, 20.0 mg, 0.0460 mmol)에 MeOH (0.3 mL)을 가한 후 3 N HCl 수용액(0.015 mL, 1.80 mmol)을 천천히 가한 뒤 70 ℃에서 30분 환류 교반하였다. 반응액을 농축시킨 후 잔사를 EtOAc (1 mL)과 물(1 mL)로 희석하고 수용액층을 EtOAc (6 × 1 mL)로 추출하였다. EtOAc 용액을 무수 MgSO4를 사용하여 건조한 뒤, 여과하여 감압 농축하였다. 농축된 반응 생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(EtOAc:Hex=1:1)로 분리하여 목적화합물 9 (11.8 mg, 81%)를 노란색 고체로 얻었다.
1H NMR (400 MHz, (CD3)2SO) δ 10.82 (s, 1H), 10.32 (s, 1H), 8.09 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.99 (d, J = 15.6 Hz, 1H), 7.75 (d, J = 15.6 Hz, 1H), 7.05 (s, 2H), 6.61 (s, 1H), 6.47 (dd, J = 8.2, 2.3 Hz, 1H), 6.37 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 3.87 (s, 6H) ppm.
제조예 10: (
E
)-1-(2,4-Dihydroxyphenyl)-3-(3,4,5-trihydroxyphenyl)prop-2-en-1-one (10)의 제조
(E)-1-(2,4-Dihydroxyphenyl)-3-(4-hydroxy-3,5-dimethoxyphenyl)prop-2-en-1-one (9, 31.6 mg, 0.100 mmol)에 CH2Cl2 (1.0 mL)을 넣고 0 ℃에서 BBr3 (150 mg, 0.600 mmol)을 가한 뒤 상온에서 24시간 교반하였다. 그 후 0 ℃에서 MeOH (2 mL)를 넣었다. 반응액을 40 ℃에서 2시간 환류 교반한 후 물 (2 mL)로 희석하고, EtOAc (6 Х 1 mL)로 추출하였다. EtOAc용액을 무수 MgSO4를 사용하여 건조한 뒤, 여과하여 감압 농축하였다. 잔사를 EtOH로 재결정하여 원하는 화합물 10 (14.4 mg, 50%)을 노란색 고체로 얻었다.
1H NMR (400 MHz, (CD3)2SO) δ 10.72 (s, 1H), 8.11 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.99 (d, J = 15.6 Hz, 1H), 7.75 (d, J = 15.6 Hz, 1H), 6.78 (s, 2H), 6.47 (dd, J = 8.2, 2.3 Hz, 1H), 6.37 (d, J = 2.3 Hz, 1H) ppm.
제조예 10: (
E
)-1-(2,4-Dihydroxyphenyl)-3-(3,4,5-trimethoxyphenyl)prop-2-en-1-one (11)의 제조
1-(2,4-Dihydroxyphenyl)ethan-1-one (152 mg, 1.00 mmol)과 3,4,5-trimethoxybenzaldehyde (253 mg, 1.20 mmol)에 EtOH (1.0 mL)을 가한 후 5분간 교반하였다. 그 후 60% KOH 수용액(2 mL)을 가한 뒤 100 ℃에서 5시간 교반하였다. 반응액을 물(1 mL)로 희석하고, 1N HCl 수용액을 사용하여 여액의 pH를 7으로 조절한 후 EtOAc (6 × 1 mL)로 추출하였다. EtOAc용액을 무수 MgSO4를 사용하여 건조한 뒤, 여과하여 감압 농축하였다. 농축된 반응 생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(EtOAc:Hex=1:2)로 분리하여 목적 화합물 11 (92.5 mg, 28%)을 노란색 고체로 얻었다.
1H NMR (400 MHz, (CD3)2SO) δ 8.11 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.85 (d, J = 15.5 Hz, 1H), 7.42 (d, J = 15.1 Hz, 1H), 6.89 (s, 2H), 6.71-6.63 (m, 2H), 3.98 (s, 3H), 3.95 (s, 6H) ppm.
제조예 11: (
E
)-3-(4-Hydroxyphenyl)-1-(2,4,6-trihydroxyphenyl)prop-2-en-1-one (12)의 제조
1-(4-Hydroxy-2,6-bis(methoxymethoxy)phenyl)ethan-1-one (76.9 mg, 0.300 mmol)과 4-hydroxybenzaldehyde (36.6 mg, 0.300 mmol)에 EtOH (0.3 mL)을 가한 후 5분간 교반하였다. 그 후 30% KOH 수용액(0.8 mL)을 가한 뒤 22 ℃에서 12시간 교반하였다. 반응액을 물(1 mL)로 희석하고, 1N HCl 수용액을 사용하여 여액의 pH를 7으로 조절한 후 EtOAc (6 × 1 mL)로 추출하였다. EtOAc용액을 무수 MgSO4를 사용하여 건조한 뒤, 여과하여 감압 농축하였다. 농축된 반응 생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(EtOAc:Hex=1:2)로 정제하여 (E)-1-(4-hydroxy-2,6-bis(methoxymethoxy)phenyl)-3-(4-hydroxyphenyl)prop-2-en-1-one (12a, 82.6 mg, 76%)을 노란색 고체로 얻었다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.84-7.76 (m, 3H), 7.51 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 7.15 (s, 1H), 6.89 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 6.26 (s, 2H), 5.30 (s, 2H), 5.19 (s, 2H), 3.54 (s, 3H), 3.49 (s, 3H) ppm.
(E)-1-(4-Hydroxy-2,6-bis(methoxymethoxy)phenyl)-3-(4-hydroxyphenyl)prop-2-en-1-one (12a, 20.0 mg, 0.0550 mmol)에 MeOH (0.3 mL)을 가한 후 3 N HCl 수용액 (0.02 mL, 1.80 mmol)을 천천히 가한 뒤 70 ℃에서 30분 환류 교반하였다. 반응액을 농축시킨 후 잔사를 EtOAc (1 mL)과 물(1 mL)로 희석하고 수용액층을 EtOAc (6 × 1 mL)로 추출하였다. EtOAc 용액을 무수 MgSO4를 사용하여 건조한 뒤, 여과하여 감압 농축하였다. 농축된 반응 생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(EtOAc:Hex=1:1)로 분리하여 목적 화합물 12 (9.40 mg, 63%)를 노란색 고체로 얻었다.
1H NMR (400 MHz, (CD3)2SO) δ 10.70 (s, 1H), 8.99 (s, 3H), 7.95 (d, J = 15.5 Hz, 1H), 7.75 (d, J = 15.5 Hz, 1H), 6.94 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 6.70 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 5.66 (s, 2H) ppm.
제조예 12: (
E
)-1-(2,4-Difluorophenyl)-3-(4-hydroxyphenyl)prop-2-en-1-one (13)의 제조
1-(2,4-Difluorophenyl)ethan-1-one (156 mg, 1.00 mmol)과 4-hydroxybenzaldehyde (122 mg, 1.00 mmol)에 EtOH (1.0 mL)을 가한 후 5분간 교반하였다. 그 후 60% KOH 수용액(2 mL)을 가한 뒤 100 ℃에서 5시간 교반하였다. 반응액을 물(1 mL)로 희석하고, 1N HCl 수용액을 사용하여 여액의 pH를 7으로 조절한 후 EtOAc (6 × 1 mL)로 추출하였다. EtOAc용액을 무수 MgSO4를 사용하여 건조한 뒤, 여과하여 감압 농축하였다. 농축된 반응 생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(EtOAc:Hex=1:2)로 분리하여 목적 화합물 13 (75.5 mg, 29%)을 노란색 고체로 얻었다.
1H NMR (400 MHz, (CD3)2SO) δ 10.03 (s, 1H), 8.31 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.82 (d, J = 15.6 Hz, 1H), 7.70 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.67 (d, J = 15.6 Hz, 1H), 7.65-6.60 (m, 3H) ppm.
이에 ILG의 유도체 중에서 (2E)-1-(2,4-Dihydroxyphenyl)-3-(4-fluorophenyl)-2-propen-1-one (이하, 유도체 1로 기재함)과 롭테인(robtein, 2',3,4,4',5-pentahydroxychalcone; 이하, 유도체 2로 기재함)의 효과를 하기 실시예 1 내지 5에서 확인하였다.
실시예 1: 이소리퀴티제닌 유도체의 갈색 지방화 유도 확인
백색 지방세포의 갈색 지방세포 유도 분화는 미국 세포주 은행 (ATCC)에서 구매한 지방 유래 줄기세포 (adipose-derived stem cells: ASCs)를 이용하여 진행하였으며 분화하기 위한 세포수는 plate (6 well plate: 1×104 cells/cm2, 60mm dish: 2×105 cells/cm2, 100mm dish: 1×106 cells/cm2)에 맞추어 적용하고 80% 정도 자라게 되면 induction을 실시하기 위하여 DMEM/F-12 배지에 insulin (Sigma, I9278; 5 ug/ml), 3,3',5-Triiodo-L-thyronine (T3, Sigma, T2877;1 nM), Indomethasone (Sigma, I7378; 125uM), Dexamethasone (Sigma, D1756; 2 ug/ml), 3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX, Sigma, I5879; 0.5 mM) 그리고 Rosiglitazone(Sigma, R2408; 0.5 uM)을 첨가하여 4일동안 배양하였다. 이후 maturation을 실시하였으며 해당 배지에는 MEM/F-12 배지에 insulin (Sigma, I9278; 10 ug/ml)과 ILG 유도체 13개 각각을 첨가하고 2일에 한번씩 교체하여 3번의 maturation 배지를 교환하였다.
분화된 지방세포 내 지방 축적량을 시각적으로 확인하기 위해 Oil Red O 염색을 실시하였다. 배지를 제거하고 1 x PBS로 2회 세척한 후 상온에서 4% 포르말린으로 1시간 동안 세포를 고정하였다. 포르말린을 제거하고 3차 증류수로로 세척한 후 Oil red O 용액 (0.5 g oil red O/100 mL propylene glycol, Sigma)으로 20분간 염색하였다. 3차 증류수로 세척한 후 광학현미경을 이용하여 세포 내 지방을 관찰하였다. 미분화 대조군을 제외하고는 육안으로 분화한 모든 실험군에서 동그란 거품 모양의 지방 덩어리가 관찰되어 지방세포가 분화된 확인하였다 (도 2). 관찰을 마친 세포의 지방을 정량하기 위하여 염색한 세포에 Propylen Gycol (Duksan, Ansan, Korea)을 가하여 색소를 용출시키고 회수한 다음 450nm에서 microplate reader(Molecular Devices, USA)로 흡광도를 측정하였다.
RNA 분리, 역전사 PCR, 정량적 실시간 PCR (qPCR)을 위해, RNA는 TRIzol Reagent solution (Live Technologies, Frderick, Maryland, USA)으로 분리하였고, Oligo dT-primed cDNA는 Maxime RT PreMix kit (iNtRON Biotechnology, Seongnam, Korea)를 이용하여 합성하였다. 각 유전자의 발현은 SYBR Green Dye system (SYBR Premix Ex Taq(Tli RNase Plus) and ROX reference dye (Takara Bio Inc. Foster City, CA, USA)으로 조사하였다. 각 전사체량은 GAPDH 전사체 수준으로 보정하였고 PCR에 사용된 프라이머는 다음 표 1과 같다.
PCR 조건은 다음과 같다.
Holding stage (65℃, 30초), Cycling stage (95℃, 5초 → 60℃, 30초, 40 cycles)
| 유전자 | 프라이머 서열 (5'→3') | |
| UCP1 | Forward | GTGTCGGCTCTTATCGCTGG |
| Reverse | CCAAGTCGCAAGAAGGAAGG | |
| PPARG | Forward | GCAAACCCCTATTCCATGCTG |
| Reverse | ACGGAGCTGATCCCAAAGTT | |
| PPARGC (PGC1A) |
Forward | TGACCCCGTCTCTCTGAAGT |
| Reverse | CTCAGAGTCCTGGTTGCACAT | |
| GAPDH | Forward | CATGGGTGTGAACCATGAGA |
| Reverse | GGTCATGAGTCCTTCCACGA |
본 발명자가 합성한 ILG 유도체 13개 (도 1) 그리고 구입한 ILG (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. 제품번호: I0822)[화학식 14]을 ASCs에서 백색지방 분화 유도 후 3개의 다른 농도 (0.025, 0.05, 0.1 uM)로 각각 24시간 처리한 후 qRT-PCR을 이용하여 갈색지방 분화 특이적 마커 (UCP1, PPARG, PPARGC(PGC1A)) 발현 정도를 조사하였다 (도 3 ~ 5).
그 중 UCP1 발현 증가가 우수한 ILG 유도체 #1, #2, #10, #13 처리에 따른 갈색 지방 표지인자 (UCP1, PRDM16, PPARG)의 단백질 발현 변화를 Western blot 분석방법으로 추가 검증하였다 (도 6).
그 결과, ILG 유도체 #13이 처리된 그룹에서 갈색 지방 표지 인자 UCP1과 PRDM16 발현이 가장 높은 것을 관찰하였다. 이 결과를 통해서 ILG 유도체 #13이 선별된 다른 유도체 (#1, #2, #10)에 비해 가장 우수한 갈색 지방화 유도 효과를 보인 것으로 확인되었다.
실시예 2: 이소리퀴티제닌 유도체의 세포 생존율 확인
ILG 유도체 1 및 13의 독성을 확인하기 위하여 EZ-Cytox (Daeillab, Korea)를 이용하여 다음과 같이 실험하였다.
구체적으로, 96 well plate에 지방 유래 줄기세포 (adipose-derived stem cells: ASCs)을 5×104 cells/cm2 농도로 분주한 후 ILG과 ILG 유도체 #1, #13 각각을 농도별 (0, 0.25, 0.5, 1uM)로 처리하고, 48시간 후 well 당 10 ul의 EZ-Cytox를 넣고 1~4시간 동안 반응 후 450 nm 흡광도에서 Cell viability를 측정하였다.
도 7에 나타낸 바와 같이 ILG 유도체 (#13)의 농도별 세포 독성이 없는 것으로 확인되었다.
실시예 3: 세포 분비체 제조
<줄기세포 분비체 제조>
줄기세포 분비체 제조를 위해 미국 세포주 은행 (ATCC)에서 구매한 지방 유래 줄기세포 (adipose-derived stem cells: ASCs)를 이용하여 진행하였으며 세포 수는 plate (6 well plate: 1×104 cells/cm2, 60mm dish: 2×105 cells/cm2, 100mm dish: 1×106 cells/cm2)에 맞추어 적용하고 DMEM/F-12 (serum free DMEM/F-12) 배지에 혈청 10%와 100,0000 uinit/L penicillin을 첨가하여 배양하였다. 줄기세포 분비체는 배양액을 제거하고 1X PBS로 줄기세포를 세척한 후, 혈청이 들어 있지 않은 DMEM/F-12 (serum free DMEM/F-12) 배지로 교환하여 37 ℃에서 2시간 배양하였다. 2시간 후, 세포를 배양한 배지 (conditioned medium)를 모은 후 ultrafree 15 centrifuge filter unit (Millipore, Braford, MA, USA)을 이용하여 약 50배 농축하였다.
<백색 지방세포 분비체 제조>
백색 지방세포의 분화는 미국 세포주 은행 (ATCC)에서 구매한 지방 유래 줄기세포 (adipose-derived stem cells: ASCs)를 이용하여 진행하였으며 분화하기 위한 세포수는 plate (6 well plate: 1×104 cells/cm2, 60mm dish: 2×105 cells/cm2, 100mm dish: 1×106 cells/cm2)에 맞추어 적용하고 80% 정도 자라게 되면 induction을 실시하기 위하여 DMEM/F-12 배지에 insulin (Sigma, I9278; 5 ug/ml), 3,3',5-Triiodo-L-thyronine (T3, Sigma, T2877;1 nM), Indomethasone (Sigma, I7378; 125uM), Dexamethasone (Sigma, D1756; 2 ug/ml), 3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX, Sigma, I5879; 0.5 mM) 그리고 Rosiglitazone(Sigma, R2408; 0.5 uM)을 첨가하여 4일 동안 배양하였다. 이후 maturation을 실시하였으며 해당 배지에는 MEM/F-12 배지에 insulin (Sigma, I9278; 10 ug/ml) 첨가하고 2일에 한번씩 교체하여 3번의 maturation 배지를 교환하였다. 이와 같이 분화시킨 백색 지방세포로부터 분비체를 얻기 위해 배양액을 제거하고 1X PBS로 백색 지방세포를 세척한 후, 혈청이 들어 있지 않은 DMEM/F-12 (serum free DMEM/F-12) 배지로 교환하여 37℃에서 2시간 배양하였다. 2시간 후, 세포를 배양한 배지 (conditioned medium)를 모은 후 ultrafree 15 centrifuge filter unit (Millipore, Braford, MA, USA)을 이용하여 약 50배 농축하였다.
<ILG 유도체에 의해 분화 유도된 갈색 지방세포 분비체 제조>
실시예 1에서 ILG 유도체 13에 의해 분화 유도된 갈색 지방세포를 이용하여 다음과 같이 갈색 지방세포 분비체를 제조하였다.
갈색 지방세포 분화는 미국 세포주 은행 (ATCC)에서 구매한 지방 유래 줄기세포 (adipose-derived stem cells: ASCs)를 이용하여 진행하였으며 분화하기 위한 세포수는 plate (6 well plate: 1×104 cells/cm2, 60mm dish: 2×105 cells/cm2, 100mm dish: 1×106 cells/cm2)에 맞추어 적용하고 80% 정도 자라게 되면 induction을 실시하기 위하여 DMEM/F-12 배지에 insulin (Sigma, I9278; 5 ug/ml), 3,3',5-Triiodo-L-thyronine (T3, Sigma, T2877;1 nM), Indomethasone (Sigma, I7378; 125uM), Dexamethasone (Sigma, D1756; 2 ug/ml), 3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX, Sigma, I5879; 0.5 mM) 그리고 Rosiglitazone(Sigma, R2408; 0.5 uM)을 첨가하여 4일 동안 배양하였다. 이후 maturation을 실시하였으며 해당 배지에는 MEM/F-12 배지에 insulin (Sigma, I9278; 5 ug/ml), 3,3',5-Triiodo-L-thyronine (T3, Sigma, T2877;1 nM), 그리고 Rosiglitazone(Sigma, R2408; 1 uM)을 첨가하고 2일에 한번씩 교체하여 3번의 maturation 배지를 교환하였다. 이와 같이 분화시킨 갈색 지방세포의 분비체는 배양액을 제거하고 1X PBS로 갈색 지방세포를 세척한 후, 혈청이 들어 있지 않은 DMEM/F-12 (serum free DMEM/F-12) 배지로 교환하여 37℃에서 2시간 배양하였다. 2시간 후, 세포를 배양한 배지 (conditioned medium)를 모은 후 ultrafree 15 centrifuge filter unit (Millipore, Braford, MA, USA)을 이용하여 약 50배 농축하였다.
다음으로, 세포 분비체의 심혈관 질환 개선 효과를 확인하기 위해 우선 각 세포별 분비체를 Human adipokine array (R&D systems, 제품번호 ARY024)를 이용하여 비교 분석하였다 (도 8~9).
해당 adipokine array를 통해 58가지의 질환과 관련된 지방세포 분비인자들을 분석하였으며 줄기세포와 비교하여 백색지방 또는 갈색지방에서 특이적으로 발현이 높거나 낮은 분비인자들을 분석하였다 (도 8). 분석된 해당 adipokine array의 58가지 리스트들 중 변화된 단백질들을 붉은색 상자로 표시하였다 (도 9).
실시예 4: ILG 유도체에 의해 분화 유도된 갈색지방세포 분비체의 심장 질환 치료 효과 확인
체중 220g 가량의 생후 8주된 수컷 Sprague-Dawley계 흰 쥐 25마리를 5군 (Sham, IR, ASC, WAC, BAC)으로 분류하여 상기 실시예 3에서 제조된 줄기세포 분비체, 백색지방세포 분비체, 갈색지방세포 분비체를 경색(infartion) 부분의 경계(boder zone)에 투입(injection)하였다.
MI (myocardial infarction) 손상을 입은 IR (Ischemic Reperfusion) 동물 모델은 미리 혼합한 마취용액(Zoletil 50mg/kg body weight + Xylazine HCl (Rompun) 10 mg/kg body weight)을 rat의 대퇴부 근육에 주사하여 전신 마취시키고 마취 후 기도 삽관을 시행하였으며 설치류 인공 호흡기(Harvard Rodent Ventilator Model 683, Harvard, USA)를 이용하여 분당 75회 인공 호흡을 시행하였다. 모든 군에서 흉골 중앙을 따라 절개하여 개흉한 후 심장막을 제거하였다. 심장막을 제거한 후 Sham군을 제외한 군에 6-0 Silk suture로 LAD (left anterior descending)의 혈류를 차단하였다. 1시간 허혈을 유발하게 한 후에 재관류를 시행하여 MI 손상을 입은 IR 동물 모델을 제작하였다.
5개의 모든 실험 군을 수술 48시간 후에 마취용액(Zoletil 50mg/kg body weight + Xylazine HCl (Rompun) 10 mg/kg body weight)을 rat의 대퇴부 근육에 주사하여 전신 마취시켰다. 우측 경동맥을 박리하고 박리된 우측 경동맥을 통하여 좌심실에 Millar Mikro-Tip 2F pressure transducer (model no. SPR-838; Millar Instruments, USA)을 삽입하고 5분간 안정시킨 후에 심 기능을 측정하였다. 도관 끝은 대동맥 판막을 통과하여 좌심실 압력 파형이 나타나는 시점에서 도관이 좌심실 벽을 자극할 때 나타나는 스파이크 파형이 없어지는 시점 사이에 고정하였다. 심 기능을 측정하기 위해 디지털 분석 시스템 Labchart v8.1.5 software (Millar)에 연결하고 컴퓨터 자동 분석 프로그램을 이용하여 좌심실 박출률 (Ejection Fraction, EF), 수축기말용적 (End-systolic Volume, Ves), 수축기 최소 좌심실 압력 순간 변화율(V@dP/dt min) 분당 심박수를 측정하였다.
심 기능을 측정하기 위해 디지털 분석 시스템 Labchart v8.1.5 softwar (Miller)에 연결하고 컴퓨터 자동 분석 프로그램을 이용하여 좌심실 수축기 기능지표인 좌심실 박출률 (Ejection Fraction, EF), 수축기말용적 (End-systolic Volume, Ves), 수축기 최소 좌심실 용적 순간 변화율 (V@dP/dt min), 수축기 최소 용적 (Minimum Volume, Vmin), 분당 심박수를 측정하였다.
그 결과, 좌심실 박출률 (Ejection Fraction, EF)은 Sham군에 비하여 IR군, 줄기세포 분비체, 백색지방세포 분비체를 투입한 군에서 크게 감소하였지만, 갈색지방세포 분비체를 투입한 군에서는 다른 군에 비해 적게 감소하였다. 또한 수축기말용적 (End-systolic Volume, Ves), 수축기 최소 좌심실 용적 순간 변화율 (V@dP/dt min), 수축기 최소 용적 (Minimum Volume, Vmin)에서 IR군, 줄기세포 분비체, 백색지방세포 분비체를 투입한 군에서 증가하였지만, 갈색지방세포 분비체를 투입한 군에서는 증가하지 않았다 (도 10).
Sham군, IR(Ischemic Reperfusion) 군, ASC 군, WAC군 및 BAC군 각 실험군에 해당하는 심장을 적출하고 심장막과 혈관을 제거하여 수평으로 2mm 두께의 절편으로 자른 후 37℃ 수조에서 1% TTC (Sigma Chemicals) 용액에 15분간 두었다. formalin용액에 옮겨 담고 다음날 infarction 크기를 평가하였다(도 11). TTC는 미토콘드리아의 탈수소효소를 염색하기 때문에 세포 사멸이 진행되었을 경우 미토콘드리아에서 탈수소효소를 분비할 수 없으므로 염색이 되지 않아 하얗게 나타나는 것을 통해 심근경색에 의한 손상 부위 및 크기를 확인할 수 있다.
도 11에 나타난 바와 같이, 손상을 입은 IR(Ischemic Reperfusion) 군과 비교하였을 때 ASC 분비체를 주입한 그룹에서 차이가 크지 않았지만 갈색지방세포 분비체 주입 그룹에서는 염색이 많이 된 것을 보아 심근 손상이 줄어든 것을 확인할 수 있다.
Claims (10)
- 하기 화학식 13으로 표시되는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염.
[화학식 13]
- 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 하기 화학식 2로 표시되는 화합물, 하기 화학식 10으로 표시되는 화합물, 하기 화학식 13으로 표시되는 화합물, 이들의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 화합물 또는 혼합물을 유효성분으로 포함하는 갈색 지방화 유도용 조성물.
[화학식 1]
[화학식 2]
[화학식 10]
[화학식 13]
- 제 2 항의 조성물을 포함하는 심장 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제 3 항에 있어서,
상기 심장 질환은 허혈성 심장 질환인, 심장 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제 4 항에 있어서,
허혈성 심장 질환은 부정맥, 협심증 또는 심근경색인, 심장 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제 2 항의 조성물을 포함하는 심장 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물.
- 제 6 항에 있어서,
상기 심장 질환은 허혈성 심장 질환인, 포함하는 심장 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물.
- 제 7 항에 있어서,
허혈성 심장 질환은 부정맥, 협심증 또는 심근경색인, 심장 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물.
- 제 2 항의 조성물을 백색 지방세포에 처리하는 단계를 포함하는 백색 지방세포로부터 갈색 지방세포로의 분화 유도 방법.
- 1-(2,4-디플루오로페닐)에탄-1-온(1-(2,4-Difluorophenyl)ethan-1-one)과 4-하이드록시벤잘데하이드(4-hydroxybenzaldehyde)을 반응시켜 하기 반응식 1과 같이 화학식 13으로 표시되는 화합물을 제조하는 단계;
를 포함하는 화학식 13으로 표시되는 화합물의 제조방법.
[반응식 1]
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