KR20210112307A

KR20210112307A - 입사각을 기반으로 한 간섭 필터 보정을 위한 시스템, 방법 및 장치

Info

Publication number: KR20210112307A
Application number: KR1020217018606A
Authority: KR
Inventors: 제프리 메강크; 조슈아 켐프너; 매튜 로얄
Original assignee: 퍼킨엘머 헬스 사이언시즈, 아이엔씨.
Priority date: 2018-11-16
Filing date: 2018-11-19
Publication date: 2021-09-14
Also published as: JP7189344B2; US20200155006A1; CA3120195A1; JP2022507556A; CN113330298A; CA3120195C; US10667693B1; WO2020101714A1; KR102637092B1; AU2018449340A1; EP3881055A1

Abstract

본 개시내용의 양태는 입사각에 기초한 간섭 필터 보정을 위한 시스템, 방법, 장치 및 컴퓨터-판독가능 매체를 제공한다. 일부 예에서, 샘플은 방출 필터에 의해 필터링되는 방출 스펙트럼을 방출하여, 투과 스펙트럼을 제공한다. 방출 스펙트럼은 여러 입사각에서 방출 필터를 조명한다. 상기 입사각은 투과 스펙트럼의 스펙트럼 이동을 초래한다. 이 스펙트럼 이동을 기반으로 투과 스펙트럼의 세기가 보정된다. 보정된 투과 스펙트럼의 세기에 대응하는 이미지가 생성될 수 있다.

Description

입사각을 기반으로 한 간섭 필터 보정을 위한 시스템, 방법 및 장치

교차-참조 섹션

본 출원은 본원에 그의 전체가 참조로 포함된, 발명의 명칭 "입사각에 기반한 간섭 필터 보정을 위한 시스템, 방법 및 장치"의, 2018년 11월 16일에 출원된 미국 비-임시출원 일련 번호 16/193,236에 우선권을 주장한다.

기술분야

본원의 개시내용은 일반적으로 이미징 시스템 및 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 일부 예들에서, 본 개시내용은 입사각에 기반한 간섭 필터 보정에 관한 것이다.

고 처리량 이미징, 예를 들어, 생체 내 이미징은 생물학 및 의학 분야의 용도로 인해 매력적인 연구 분야였다. 고처리량의 이미징은 한 번에 하나 이상의 살아있는 대상체(예를 들어, 마우스)의 이미지를 포함할 수 있으며, 넓은 시야를 포함할 수 있다. 결과적으로, 고처리량의 이미징은 본질적으로 빛의 각도 분산으로 이어질 수 있다. 예를 들어, 샘플에서 반사됨에 따라 방출 필터에 닿는 빛의 입사각에 변동이 있을 수 있다. 불행히도, 이러한 변화는 투과 스펙트럼의 최종 세기에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 입사각이 증가하면 방출 필터를 통과할 수 있는 빛의 파장이 이동될 수 있다. 이는 샘플 이미징의 정확도에 영향을 미칠 수 있고 이미징에서 도출된 관찰 및 결론에 부정적인 영향을 미칠 수 있으므로, 입사각에 따라 투과 스펙트럼을 보정해야 할 필요가 있다. 또한 원시 데이터 자체로 이어지는 메커니즘을 사용하지 않고 사용자가 투과 스펙트럼을 수동으로 보정해야 하는 것은 부담스럽고, 시간이 많이 걸리고, 비효율적이며, 비실용적일 수 있다.

본 개시내용의 다양한 구현은 위에서 설명된 하나 이상의 도전과제들을 해결한다. 예를 들어, 본 개시내용은 입사각에 기반한 간섭 필터 보정을 위한 시스템, 방법, 장치 및 기기를 설명할 수 있다.

본 개시내용의 양태는 방출 스펙트럼이 방출 필터를 조명함으로써 방출 필터로부터의 투과 스펙트럼에서 스펙트럼 이동을 야기하는 입사각에 기반한 간섭 필터 보정을 위한 기술에 관한 것이다.

본 개시내용은 예를 들어 이미지를 생성하는 방법을 제공한다. 투과 스펙트럼은 방출 필터로부터 수신될 수 있다. 투과 스펙트럼은 방출 필터에 의해 필터링된 방출 스펙트럼의 선택된 파장 범위에 해당할 수 있다. 방출 스펙트럼은 방출 필터에 대해 수직 입사각에서 벗어난 것을 포함하는 다중 입사각에서 방출 필터를 조명할 수 있다. 투과 스펙트럼의 세기는 측정 및/또는 저장될 수 있다. 입사각의 함수로서 방출 필터의 스펙트럼 응답에 기초하여, 투과 스펙트럼에 대한 보정된 세기가 얻어질 수 있고, 투과 스펙트럼 및 보정된 세기에 기초한 이미지가 생성될 수 있다.

특정 예에서, 방출 스펙트럼은 샘플의 발광 소스, 예를 들어 형광 소스로부터 방출될 수 있다. 발광 소스는 발광 세포주에 의해 샘플 내에서 발현되는 발광 리포터일 수 있다. 발광 리포터는 외인성으로 투여될 수 있다. 한 예에서, 발광 리포터는 프로브의 성분으로서 샘플에 투여될 수 있다. 샘플은 생물학적(예를 들어, 생 마우스)일 수 있다.

방출 필터는 방출 스펙트럼에 의해 조명되는 시야를 갖는다. 방출 필터의 시야의 위치는 예를 들어, (x, y) 위치 좌표를 사용하여 특성화될 수 있다. 시야 내의 각 위치에 대해, 방출 스펙트럼은 각 입사각에서 방출 필터를 조명할 수 있다. 입사각은 해당 위치에서 방출 필터에서 측정된 투과 스펙트럼의 세기에 영향을 미칠 수 있다.

방출 스펙트럼이 방출 필터를 조명하는 방출 필터의 시야의 각각의 (x, y) 좌표 위치는 대응하는 입사각을 가질 수 있다. 일부 예들에서, 보정된 세기는 투과 스펙트럼의 세기의 개별 세기 값들의 통합에 기초할 수 있다. 각각의 개별 세기 값은 각각의 (x, y) 좌표 위치 및 각각의 (x, y) 좌표 위치에 대한 대응 입사각에 대응할 수 있다.

획득된 이미지는 측정된 투과 스펙트럼의 세기에 기초할 수 있고, 방출 필터의 시야에 대한 방출 스펙트럼의 입사각에 대해 보정될 수 있다. 획득된 이미지는 각 픽셀이 발광 필터가 발광 스펙트럼을 수신하는 발광 필터의 시야의 각 (x, y) 좌표 위치에 대응하는 디지털 픽셀-기반 이미지일 수 있다. 획득된 이미지의 픽셀 값은 방출 필터의 시야의 대응하는 (x, y) 좌표 위치에서 측정된 투과 스펙트럼의 원시 세기에 해당할 수 있다. 특정 (x, y) 좌표 위치에서 투과 스펙트럼의 원시 세기는 특정 입사각에서 방출 필터의 해당 위치를 조명하는 방출 스펙트럼의 부분에 해당할 수 있다.

입사각을 보정하기 위해 보정 이미지가 결정될 수 있다. 보정 이미지는 방출 필터의 시야를 가로 지르는 상이한 입사각으로 인한 변화를 보정하기 위한 데이터를 포함할 수 있다. 보정 정보를 얻기 위해 두 컨볼루션의 적분 비율을 결정할 수 있다. 제1 컨볼루션은 리포터(예를 들어, 형광단)의 알려진 세기를 특성화하는 함수와 특정(x, y) 좌표 위치 및 그의 해당 입사각에 대한 방출 필터의 투과 스펙트럼을 특성화하는 함수에 대해 수행될 수 있다. 제2 컨볼루션은 알려진 리포터의 세기를 특성화하는 함수와 법선(즉, 직교) 입사각에서 방출 필터로부터의 투과 스펙트럼을 특성화하는 함수에 대해 수행될 수 있다. 이러한 컨볼루션의 결과는 상한 및 하한 파장 차단 임계값 사이에 적분될 수 있다(예를 들어, 스펙트럼의 짧은 청색 말단과 스펙트럼의 긴 적색 말단 부위). 이러한 적분 결과 간의 비율은 특정 (x, y) 좌표 위치에서 측정된 투과 스펙트럼의 세기를 보정하는 데 사용되는 보정 정보를 제공할 수 있다. 이 기술을 이용하여 방출 필터의 각 (x, y) 좌표 위치에 대한 보정 정보를 얻을 수 있다.

보정 정보는 방출 필터로부터 투과 스펙트럼의 세기를 측정하여 획득한 원시 이미지에 적용될 수 있는 보정 이미지를 생성하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 획득된 원시 이미지와 보정 이미지의 최종 컨볼루션을 수행하여 보정 이미지를 획득할 수 있다. 보정된 이미지는 각 픽셀의 값이 그 위치에 해당하는 입사각에 대해 보정된 방출 필터의 시야의 해당 (x, y) 좌표 위치에서 투과부의 세기에 해당하는 픽셀-기반 이미지일 수 있다. 따라서, 보정된 이미지는 방출이 방출 스펙트럼을 필터링하여 검출기에 의해 측정된 투과 스펙트럼을 제공할 때 (입사각이 다르기 때문에) 발생하는 스펙트럼 이동을 설명하므로 샘플로부터 방출 스펙트럼을 보다 정확하게 표현할 수 있다.

하기의 개시내용은 또한 다른 구성요소들 중에서, 예를 들어 광원, 하나 이상의 여기 필터(들), 하나 이상의 방출 필터(들) 및 조명 검출기를 포함할 수 있는 이미징 장치를 제공한다. 광원은 여기 스펙트럼을 제공할 수 있는 반면, 여기 필터(들)는 이미지화되는 샘플을 향해 여기 스펙트럼으로부터 선택된 여기 파장 범위를 제공할 수 있다. 방출 필터(들)는 투과 스펙트럼을 제공할 수 있다. 투과 스펙트럼은 샘플로부터 수신되고 방출 필터에 의해 필터링된 방출 스펙트럼의 선택된 방출 파장 범위를 포함할 수 있다. 방출 필터(들)는 방출 필터에 대한 수직 입사각으로부터 벗어난 다중 입사각에서 방출 스펙트럼을 수신할 수 있다. 조도 검출기는 투과 스펙트럼의 세기를 측정할 수 있다. 검출기는 샘플에 있을 수 있고 방출 스펙트럼의 적어도 일부를 방출하는 리포터(예를 들어, 형광단)의 디지털 이미지를 생성하는 데 차례로 사용되는 투과 스펙트럼에 해당하는 신호를 생성할 수 있다. 일부 예들에서, 특별히 프로그래밍된 컴퓨팅 장치는 다양한 입사각의 함수로서 투과 스펙트럼의 스펙트럼 이동에 기초하여 세기를 보정하도록 구성된다. 장치는 샘플과 방출 필터 사이에 위치하는 시준 광학 장치를 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 보정 정보는 획득된 이미지의 각 픽셀에 대한 보정을 나타낼 수 있다.

하기에 설명된 기술은 특히 형광 이미지를 생성하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 형광 이미지 데이터, 예를 들어, 형광단의 방출 스펙트럼을 필터링하여 방출 필터에 의해 제공되는 투과 스펙트럼의 측정된 세기에 대응하는 원시 디지털 픽셀-기반 이미지를 획득할 수 있다. 본원에 기재된 기술은 형광 이미지의 픽셀에 대한 보정을 제공할 수 있으며, 보정 정보를 사용하여 보정된 형광 이미지가 생성될 수 있다.

형광단 및 방출 필터는 사용자가 선택할 수 있다. 더욱이, 방출 필터의 광학 성능이 평가될 수 있고, 보정된 이미지를 생성하기 위해 추가 보정이 적용될 수 있다. 이러한 추가 보정에는 예를 들어, 광학 왜곡, 비네팅 및 광학 경로의 판독 바이어스 보정이 포함될 수 있다.

본원에 기재된 다양한 예들의 양태들은 다른 예들의 양태들과 결합 및/또는 대체될 수 있다는 것을 이해해야 한다(예를 들어, 하나의 독립 청구항들에 종속되는 청구항들의 요소들은 다른 독립 청구항들의 구현들을 추가로 지정하기 위해 사용될 수 있다). 본 개시내용의 다른 특징 및 이점은 하기 도면, 상세한 설명 및 청구범위로부터 명백해질 것이다.

본 개시내용의 목적 및 특징은 하기에 설명된 도면 및 청구범위를 참조하여 더 잘 이해될 수 있다. 도면에서, 다양한 도면에 걸쳐 동일한 부분을 나타내기 위해 동일한 번호가 사용된다.

특허 또는 출원 파일은 컬러로 작성된 적어도 하나의 도면을 포함한다. 컬러 도면이 포함된 본 특허 또는 특허 출원 공보의 사본은 요청 및 필요한 비용 지불시 사무국에서 제공할 것이다.
도 1은 광학 이미징 시스템의 예의 다이어그램이다.
도 2a~2c는 방출 필터의 시야에 걸친 각각의 입사각으로부터 발생하는 투과 스펙트럼의 예시적인 측정을 나타내는 그래프이다.
도 3a~3b는 방출 필터의 시야에서 입사각을 보정하기 위한 예시적인 방법 단계를 도시한다.
도 4a는 방출 필터의 시야에서 입사각을 보정하기 위해 수행된 컨볼루션 연산의 입력 및 출력을 나타내는 그래프이다.
도 4b는 보정된 형광 이미지를 얻기 위해 사용될 수 있는 샘플 이미지이다.
도 5는 본 명세서의 개시내용의 양태들이 구현될 수 있는 예시적인 컴퓨팅 하드웨어의 블록도이다.

본 명세서에 설명된 방법, 시스템 및 프로세스는 본 명세서에 설명된 예로부터의 정보를 사용하여 개발된 변형 및 적응을 포함하는 것으로 고려된다.

설명 전반에 걸쳐, 시스템 및 조성물이 특정 성분을 갖거나 포함하거나 포함하는 것으로 기술되거나, 공정 및 방법이 특정 단계를 갖거나 포함하거나 포함하는 것으로 기술되는 경우, 추가로 언급된 구성요소로 본질적으로 구성되거나 이들로 구성되는 본 개시내용의 시스템 및 조성물이 존재하고, 언급된 처리 단계로 본질적으로 구성되거나 이들로 구성되는 본 개시내용의 프로세스 및 방법이 존재하는 것으로 고려된다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "이미지"는 시각적 디스플레이 또는 시각적 디스플레이를 위해 해석될 수 있는 임의의 데이터 표현을 의미하는 것으로 이해된다. 예를 들어, 2차원 이미지는 2개의 공간 차원에서 변하는 주어진 양(예를 들어, 픽셀)의 값의 데이터세트를 포함할 수 있다.

본 명세서에는 이미징 시스템에서 사용되는 필터의 시야를 가로 지르는 각 입사각으로부터 발생하는 각도 분산을 보정하는 기술이 설명되어 있다. 이러한 입사각으로 인해 필터의 투과율은 필터의 시야에 따라 달라진다. 예를 들어, 필터 시야의 가장자리에서 샘플로부터의 빛은 시야 중심 근처보다 더 높은 입사각으로 필터를 조명한다. 본원에 설명된 기술은 이미징 작업 동안 대상체에 의해 방출된 빛의 보다 정확한 이미지를 제공하기 위해 이러한 입사각을 보정한다. 편의상, 필터에 의해 투과되는 조명은 본 명세서에서 투과 스펙트럼으로 지칭된다. 본 명세서에 설명된 기술의 적어도 일부 예는 보정된 세기를 갖는 투과 스펙트럼에 기초하여 이미지를 생성한다. 보정된 세기는 입사각의 변화로 인한 임의의 파장 이동을 설명할 수 있다. 생성된 이미지는 이미징 절차 중에 얻은 정보, 예를 들어 생체 내 이미징 연구 중에 얻은 정량적, 구조적, 기능적 및/또는 분자 정보를 향상시킬 수 있다. 이러한 정확도의 증가는 원시 이미지 데이터(예를 들어, 픽셀-바이-픽셀)를 기준 입사각(예를 들어, 방출 필터에 수직인 입사각)에 해당하는 알려진, 추정된 또는 시뮬레이션된 이미지 데이터로 표준화함으로써 실현될 수 있다.

상술한 바와 같이, 방출 필터에 광이 입사되는 각도가 다르면 투과 스펙트럼에서 스펙트럼 이동이 발생할 수 있다. 예를 들어, 방출 분광법 동안 이러한 스펙트럼 이동은 불균일한 형광 이미지를 생성할 수 있다. 방출 분광법에서, 방출 필터는 다양한 형광단 및 기타 리포터(예를 들어, 광원에 의해 특정 유전자, 단백질 등이 검출/여기될 때 조명하는 태그)를 정확하게 검출하는 데 사용할 수 있다. 예를 들어, 임상 설정에서, 여러 샘플(예를 들어, 동물)을 이미지화하여 처리량을 늘리고 시간을 줄일 수 있다(예를 들어, 한 번에 10마리 마우스 대 한 번에 1마리 마우스). 그러나 여러 샘플을 이미징하는 경우 더 높은 시야가 필요할 수 있으며, 이는 방출 필터에 도달할 때 빛의 각도 분산을 유발하여, 데이터 측정에 영향을 미치는 스펙트럼 이동을 유발할 수 있다. 따라서, 방출 필터에 부딪히는 빛의 각도 분산은 임상, 연구 및/또는 진단 컨텍스트에서 이미징에 문제를 일으킬 수 있다. 본원에 설명된 기술은 이러한 스펙트럼 차이를 보정한다.

일부 예에서, 본 개시내용은 분석 도구의 사용이 입사각에 기초한 간섭 필터 보정에 의해 획득된 이미지에 의존하거나 맞춤화하여 정확도를 개선할 수 있게 한다. 이러한 도구는 간섭 필터 보정에 의해 생성된 이미지를 통해 예를 들어 생체 내 동물 광학 이미징 설정과 관련된 정보를 제공할 수 있다.

도 1은 광학 이미징 시스템(100)의 예이다. 광학 이미징 시스템은 조명 광선이 잠재적으로 비스듬히 부딪힐 수 있는 발광 소스 및 방출 필터를 포함하는 임의의 이미징 장치를 포함할 수 있다. 발광 소스에 의해 방출되는 조명은 가시광 및 비-가시광(예를 들어, 자외선, 적외선)을 모두 포함할 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 광학 이미징은 발광 소스의 생체 내 이미징에 사용될 수 있다. 광학 이미징 시스템(100)은 예를 들어, 방출 분광법과 같은 다양한 유형의 분광법에 사용될 수 있다. 광학 이미징 시스템(100)은 발광 소스에 의해 방출된 광의 측정치를 얻기 위해 사용될 수 있다. 이러한 측정은 예를 들어 발광 소스에 대응하는 이미지를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 발광 소스는 예를 들어 반응의 결과로 빛을 방출하는 물질 또는 단백질일 수 있다.

광학 이미징 시스템은 다양한 유형의 발광 소스를 측정(예를 들어, 이미지)하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 발광 소스는 형광 소스, 생물발광 소스, 인광 소스, 화학발광 소스(예를 들어, 화학 반응의 결과로 빛을 방출하는 소스, 예를 들어 형광 소스), 전기화학발광 소스(예를 들어, 전기화학 반응의 결과로 빛을 방출하는 소스), 리오발광(lyoluminescent) 소스(예를 들어, 액체에서 고체에 용해된 결과로 빛을 방출하는 소스), 칸도발광(candoluminescent) 소스(예를 들어, 온도가 상승할때, 예를 들어, 불꽃에 노출될 때 빛을 방출하는 소스), 결정발광 소스(예를 들어, 결정화 중에 빛을 방출하는 소스), 전계발광 소스(예를 들어, 전류가 통과할 때 빛을 방출하는 소스), 기계발광 소스(예를 들어, 고체에 대한 기계적 작용의 결과로 빛을 방출하는 소스), 광발광 소스(예를 들어, 형광에서와 같이 광자의 흡수의 결과로 빛을 방출하는 소스), 방사성발광 소스(예를 들어, 전리 방사선에 의한 충격의 결과로 빛을 방출하는 소스), 열발광 소스(예를 들어, 물질이 가열될 때 흡수된 에너지의 재방출의 결과로 빛을 방출하는 소스) 또는 이들의 조합일 수 있다. 샘플은 생물학적일 수 있다. 생물학적 샘플은 살아 있거나 사망한 것일 수 있다. 한 예에서, 샘플이 살아있는 대상체(예를 들어, 마우스)인 경우, 발광 소스가 대상체에서 또는 대상체에 통합될 수 있다(예를 들어, 내인성, 섭취, 주사, 주입, 국소 적용 등). 예를 들어, 발광 소스(들)은 형광을 방출하는 생물학적 구조체(예를 들어, 항체, 막 단백질 등)에 결합하는, 예를 들어 생물학적 구조체에 대한 세부사항을 드러내는 데 도움이 되는, 형광단 및 기타 리포터를 포함할 수 있다. 추가 예는 본원에 설명된 추가 개시내용의 이점으로 인식될 것이다.

본원에 설명된 기술은 가시광선을 사용하는 다양한 이미징 시스템에서 사용될 수 있다.

예시적인 광학 이미징 시스템(100)의 구성요소는 여기 광이 샘플에서 발광 소스(예를 들어, 형광단)를 여기하는 데 사용되고, 발광 소스로부터의 방출 광이 측정되는 방출 분광법의 맥락에서 예로서 아래에서 설명된다. 그러나, 다른 유형의 광학 이미징 시스템은 추가 및 대체 구성요소를 포함할 수 있음을 인식해야 한다. 예시적인 광학 이미징 시스템(100)의 구성요소는 광이 전형적인 동작, 즉 광학 경로를 따라 유래되고 그들을 통과하는 순서로 제공된다. 이 예에서, 광학 이미징 시스템(100)은 광원(102), 여기 필터(104), 섬유 다발 스위치(106), 샘플(110), 주 대물 렌즈(114), 방출 필터(116), 보조 초점 렌즈(118) 및 검출기(120)를 포함한다.

광원(102)은 샘플을 향해 조명을 제공하기 위해 빛을 생성하는 임의의 장치(예를 들어, 램프)일 수 있다. 빛은 인간의 눈에 보이거나 보이지 않을 수 있다(예를 들어, 자외선, 적외선 등). 광원(102)으로부터의 조명은 편의상 본원에서 여기 스펙트럼으로 언급된다. 방출 분광법을 위해, 광원(102)은 제논(Xe) 전구를 갖는 광대역 램프를 포함할 수 있다. 유사하게는, 및 또한 편의상, 여기 스펙트럼에 반응하여 샘플에 의해 방출되는 여기된 빛은 본원에서 방출 스펙트럼으로 지칭된다.

여기 필터(104)는 여기 스펙트럼에서 선택된 파장 또는 파장 범위가 샘플(110)에 도달하도록 광원(102)에서 샘플(110)을 향해 이동할 때 빛을 필터링하는 광학 장치일 수 있다. 광학 이미징 시스템(100)은 선택할 여러 여기 필터를 제공하고 사용자는 사용할 여기 필터를 선택할 수 있다.

섬유 다발 스위치(106)는 예를 들어 광섬유 케이블을 통해 샘플(110)의 다양한 지점을 향해 여기 필터(104)를 빠져 나갈 때 빛을 전환시키는 것을 도울 수 있다. 일부 구현에서, 레이저 검류계(112)는 내부 구조체에 빛을 제공하고/하거나 샘플(110)의 표면 지형을 드러내는 데 사용될 수 있다. 또한, 스테이지(108)는 샘플의 이미징을 위해 여기 광 집속 광학을 2차원(예를 들어, x 및 y차원)으로 변환할 수 있다.

광학 이미징 시스템(100)은 샘플(110)과 방출 필터(116) 사이에 위치하는 시준 광학장치를 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, 장치(100)는 시준 광학장치를 생략할 수 있다. 시준 광학장치는 예를 들어 방출 필터(116)에 도달하기 전에 방출 스펙트럼의 광선을 정렬하는 하나 이상의 렌즈를 포함할 수 있다.

방출 필터(116)는 선택된 파장 또는 파장 범위가 검출기에 도달하도록 샘플(110)에서 검출기(120)를 향해 이동할 때 빛(예를 들어, 방출 스펙트럼)을 필터링하는 광학 장치일 수 있다. 방출 필터(116)에 의해 투과된 광(즉, 방출 필터를 통과하도록 허용된 방출 스펙트럼으로부터의 광)은 편의상 본원에서는 투과 스펙트럼으로 지칭된다. 전술한 바와 같이, 방출 필터(116)는 방출 필터에 대한 수직선(예를 들어, 직교)의 기준 입사각에서 벗어나는 복수의 입사각에서 방출 스펙트럼을 수신할 수 있다. 광학 이미징 시스템(100)은 선택할 수 있는 다중 방출 필터를 제공할 수 있으며, 사용자는 필터 휠(117)을 통해 사용할 방출 필터를 선택할 수 있다. 선택된 여기 및 방출 필터(들)에 기초하여, 빛의 파장은 발광 소스에 의존하는 방식(예를 들어, 형광 리포터)으로 이동할 수 있다. 그러나, 본원에 설명된 바와 같이, 방출 필터(116)에 대한 수직선 또는 기준 입사각에 대하여 광이 방출 필터(116)에 부딪히는 각도는 또한 투과 스펙트럼에 영향을 미칠 수 있다.

광학 이미징 시스템(100)은 또한 방출 및 투과 스펙트럼을 집중시키기 위해 하나 이상의 대물 렌즈를 포함할 수 있다. 예를 들어, 광학 이미징 시스템(100)은 방출 스펙트럼을 포커싱하기 위해 샘플(110)과 방출 필터(116) 사이에 위치하는 1차 대물 렌즈(114)를 포함할 수 있다. 광학 이미징 시스템(100)은 투과 스펙트럼을 포커싱하기 위해 방출 필터(116)와 검출기(120) 사이에 위치된 2차 포커싱 렌즈(118)를 또한 포함할 수 있다. 렌즈는 사용자가 조정할 수 있다.

광학 이미징 시스템(100)은 투과 스펙트럼의 세기를 측정할 수 있는 검출기(예를 들어, 형광 검출기)를 포함할 수 있다. 검출기(120)는 수신된 광을 이미지 데이터로 변환하는 감광성 장치일 수 있다. 예를 들어, 검출기(120)는 전하 결합 장치CCD) 검출기일 수 있다. CCD 검출기 또는 기타 유사한 검출기는 빛의 세기에 기초하여 전하를 축적할 수 있는 다양한 검출기 요소를 포함할 수 있다. 본 개시내용의 일부 양태에서, 전자기 방사선의 다른 검출기, 예를 들어 광전자증배관, 포토다이오드 및 애벌랜치 포토다이오드 등이 사용될 수 있다. 이미지 데이터는 광학 이미징 시스템(100)의 컴퓨팅 장치에 의해 수신될 수 있다.

도 5를 참조하여 후술하는 바와 같이, 광학 이미징 시스템(100)은 입사각에 기초한 간섭 필터 보정을 위해 프로그래밍된 컴퓨팅 장치를 포함할 수 있다. 예를 들어, 컴퓨팅 장치는 광이 방출 필터(116)에 도달하는 다양한 입사각의 함수로서 투과 스펙트럼의 스펙트럼 이동에 기초하여 투과 스펙트럼의 측정된 세기를 보정하도록 프로그래밍될 수 있다.

도 2a~2c는 예를 들어 파장에 대해 관찰된 입사각의 변화에 의해 야기되는 투과 스펙트럼의 변화를 나타내는 예시적인 결과의 그래프를 도시한다. 위에서 논의한 바와 같이, 샘플로부터의 빛이 방출 필터에 부딪히는 입사각의 변화는 방출 필터를 통과할 수 있는 빛의 파장의 이동을 유발할 수 있다. 이러한 이동은 투과 스펙트럼의 측정된 세기에 영향을 미칠 수 있다. 이것은 샘플(110)의 이미징의 정확성에 영향을 미칠 수 있고, 이미징으로부터 도출된 관찰 및 결론에 악영향을 미칠 수 있으므로, 따라서 입사각에 기초하여 투과 스펙트럼의 측정을 보정할 필요가 있다.

도 2a는 다양한 여기 및 방출 필터(208), 예를 들어 605 나노미터(nm)에서의 여기(EX) 필터 및 660 nm에서의 방출(EM) 필터에 대한 방출 필터의 시야 중심으로부터 방사형 위치(204)의 함수로서 최대 형광 효율로부터의 평균 형광 효율(202)의 백분율 편차를 나타내는 그래프를 도시한다. 형광 효율은 예를 들어, 방출 필터로부터 투과된 광자의 수와 예를 들어 샘플에 의해 광원으로부터 흡수된 광자의 수의 비율에 기초할 수 있다. 방사상 위치는 중심으로부터의 거리, 예를 들어 중심으로부터 수평 중심선을 따라 표현될 수 있다. 따라서, 방사상 위치(204)는 방출 필터의 시야의 수평 중심선을 따른 위치에 대응하고, 0의 위치는 방출 필터의 시야의 중심을 나타낼 수 있다. 방출 필터의 시야의 중심에서 입사각은 시야에 대해 수직일 수 있으며, 즉, 수직(직교) 입사각에 해당할 수 있다. 중심에서 멀리 떨어진 방출 필터의 시야의 위치는 방출 필터의 시야의 중심에서 가장 먼 위치에 해당하는 가장 극단적인 입사각과 함께 정상 입사각에서 벗어나는 입사각에 해당할 수 있다. 도 2a에서 볼 수 있는 바와 같이, 방사상 위치(204)는 최대 형광 효율로부터의 형광 효율의 백분율 편차와 관련된다. 평균 형광 효율(202)에서의 백분율 편차는 시야에서 주어진 위치에 대한 투과 스펙트럼의 세기의 변화를 나타낼 수 있다. 예를 들어, 특정 수평 위치에서의 큰 편차는 방사상 위치(예를 들어, 방출 필터의 시야의 중심으로부터의 위치)에서 방사 필터에 닿는 광의 특정 입사각으로 인해 투과 스펙트럼의 세기가 크게 증가 또는 감소함을 나타낼 수 있다. 투과 스펙트럼의 세기의 증가 또는 감소는 광학 리포터의 피크 파장에 대한 필터 곡선의 위치와 관련될 수 있다.

도 2a는 최대로부터의 평균 형광 효율의 백분율 편차가 여기 필터 및 방출 필터에 걸쳐 균일하지 않음을 보여준다. 예를 들어, 곡선(206)은 675 nm 여기 필터 및 720 nm 방출 필터(즉, 675 EX, 720 EM 필터 쌍)에 해당한다. 도 2a에서 볼 수 있는 바와 같이, 675 EX, 720 EM 필터 쌍은 수평 중심선을 따라 약 12 센티미터(cm)에서 약 27%의 피크 편차와, 수평 중심선을 따라 약 2 cm 및 약 23 cm에서 최소 편차(예를 들어, 약 0%)를 생성한다. 대조적으로, 605 EX, 660 EM 필터 쌍에 해당하는 곡선(207)은 수평 중심선을 따라 약 2 cm 및 약 23 cm에서 약 30%의 피크 편차와, 수평 중심선을 따라 약 12 cm에서 최소 편차(예를 들어, 약 0%)를 생성한다.

도 2b는 파장 범위(212)(예를 들어, 600~700 nm)에 걸쳐 예시적인 형광단(예를 들어, Alexa Fluor 635) 및 예시적인 방출 필터(예를 들어, 640/20 nm 단일-대역 대역통과 필터)의 투과율(210)을 나타내는 그래프이다. 실선(216)(집합적으로)은 파장 범위(212) 내의 다양한 입사각(214)(예를 들어, 0° 내지 23°)에서 방출 필터로부터의 투과 스펙트럼에 대한 투과율을 나타낸다. 점선 곡선(218)은 파장 범위(212) 내의 형광단의 방출 스펙트럼의 투과율을 나타낸다. 도 2b에 도시된 바와 같이, 방출 필터로부터의 투과 스펙트럼은 입사각이 증가함에 따라 크게 이동한다. 예를 들어, 이 예에서 가장 극단적인 입사각(예를 들어, 23°)에 대한 투과 스펙트럼에 해당하는 곡선 216a는 왼쪽으로(예를 들어, 약 610~640 nm로) 이동했으며, 이는 이 예에서 사용된 640/20 nm 필터에 대한 수직 입사각(0°)에서의 투과 스펙트럼(예를 들어, 약 620~660 nm)에 해당하는 곡선 216b에서 상당한 편차이다. 입사각이 증가함에 따라 더 짧은 파장을 향한 이러한 왼쪽으로의 이동을 청색 이동으로 지칭할 수 있다. 도 2에 도시된 바와 같이, 이러한 청색 이동은 형광단의 방출 스펙트럼에 대응하는 곡선(218)이 방출 필터의 투과 스펙트럼에 대응하는 곡선(216)의 점점 더 적게 중첩되게 한다. 다시 말해서, 형광단의 방출 스펙트럼은 더 작은 입사각(예를 들어, 0°)에서 더 많은 곡선(216b)과 더 큰 입사각(예를 들어, 23°)에서 더 적은 곡선(216a)과 중첩된다. 이 효과는 도 2c에 예시되어 있다.

도 2c는 기준(예를 들어, 수직) 입사각에서의 방출 필터에 대한 투과 스펙트럼의 그래프(230) 및 축외 입사각(즉, 기준 입사각에서 벗어난 입사각)에서의 방출 필터에 대한 투과 스펙트럼의 그래프(240)를 도시한다. 각 그래프는 두 그래프에서 일정하게 유지되는 형광단(즉, 형광단 방출 곡선)의 방출 스펙트럼에 대응하는 곡선(250)을 포함한다. 각 그래프는 또한 기준 및 축외 입사각에서 방출 필터로부터 측정된 투과 스펙트럼에 대응하는 각각의 곡선(252a 및 252b)을 포함한다(즉, 기준 각도 투과 곡선 및 축외 각도 투과 곡선). 그래프(230)에서 음영 영역(260a)에 의해 표시된 바와 같이, 기준 각도 투과 곡선(252a)은 형광단 방출 곡선(250)과 중첩한다. 축외 각도 투과 곡선(252b)은 그래프(240)에서 음영 영역(260b)으로 표시된 바와 같이 형광단 방출 곡선(250)과 유사하게 중첩한다. 효과에서, 음영 영역(260a 및 260b)은 형광단 곡선(250) 및 투과 곡선(252a 및 252b)의 중첩 영역의 각각의 적분을 나타낸다. 그러나 2개의 음영 영역(260a 및 260b)의 면적은 상이하다: 기준 입사각에 대한 음영 영역(260a)은 축외 입사각에 대한 음영 영역(260b)보다 크다. 음영 영역(260a 및 260b)에서의 이러한 차이는 입사각이 기준(예를 들어, 수직) 입사각에서 벗어남에 따라 방출 필터로부터의 투과 스펙트럼 이동의 결과이다. 즉, 이 차이는 서로 다른 입사각에서 방출 필터에 의해 투과된 방출 스펙트럼으로부터의 빛의 다른 양으로 설명될 수 있다. 방출 필터는 시야 중심 근처(즉, 수직 입사각 근처)에서 상대적으로 더 많은 빛을 투과하고, 입사각이 더 극단적인 시야 가장자리 근처에서는 상대적으로 적은 빛을 투과한다. 그 결과, 중첩 영역(예를 들어, 음영 영역 260a 및 260b)의 각 적분은 방출 필터로부터의 투과 스펙트럼의 이동으로 인해 변경된다. 차례로, 투과 곡선(252a 및 252b)을 갖는 형광단 곡선(250)의 각각의 컨볼루션은 또한 입사각이 변경됨에 따라 변경될 것이다. 즉, 방출 필터로부터 측정된 투과 스펙트럼과 형광단 곡선의 컨볼루션의 적분은 방출 필터에서 방출 스펙트럼의 입사각과 상관 관계가 있다.

본 개시내용은 방출 필터의 시야 내에서 방출 스펙트럼의 입사각의 편차의 결과로서 방출 필터로부터의 투과 스펙트럼의 파장에서의 이러한 이동을 보정하는 기술을 제공한다. 이러한 기술은 더 극단적인 입사각에서의 방출 필터에서 수신된 상대적으로 희미한 빛의 양을 방출 필터의 시야 중심에서 수신된 빛의 양으로 표준화한다. 이러한 기술은 방출 필터로부터 측정된 투과 스펙트럼에 적용하기 위해 표준화 값을 제공할 수 있다. 이러한 표준화 값은 방출 필터의 중앙에서 수직 입사각에 더 가깝거나 더 먼 입사각으로 인한 세기 차이를 보정할 수 있다. 따라서, 이러한 표준화 값은 보정 값으로도 지칭될 수 있다.

일부 예에서, 방출 필터로부터 측정된 투과 스펙트럼에 대응하는 2차원 픽셀-기반 이미지가 생성될 수 있다. 이 획득된 이미지의 각 픽셀은 방출 필터 시야의 해당 위치에서 투과 스펙트럼의 세기에 대응할 수 있다. 상이한 입사각으로 인한 세기 차이를 보정하기 위해, 보정 이미지가 생성될 수 있다. 보정 이미지는 방출 필터의 시야에 걸쳐 측정된 세기를 방출 필터의 시야의 중심에 대응하는 세기 값(예를 들어, "1")으로 표준화하는 보정 값을 포함할 수 있다. 즉, 보정 이미지는 방출 필터 시야의 중심에서 투과 스펙트럼의 세기에 대한 각 입사각에서 측정된 투과 스펙트럼의 세기를 나타내는 보정 값을 제공할 수 있다. 보정 이미지를 사용하는 이 기술은 하기에 더 자세히 설명될 것이다.

도 3a~3b는 각각 간섭 필터 보정을 위한 예시적인 방법 단계의 흐름도(300A 및 300B)이다. 일부 예에서, 방법(300A 및 300B)은 광학 이미징 시스템의 컴퓨팅 시스템 또는 장치("컴퓨팅 장치")에 의해 수행될 수 있다. 이 컴퓨팅 장치는 광학 이미징 시스템의 다른 구성요소와 관련하여 국소적으로 또는 원격으로(예를 들어, 네트워크를 통해 액세스할 수 있는 원격-위치 서버) 위치할 수 있다.

예를 들어, 도 3a는 보정된 이미지를 생성하고 그로부터 측정을 가능하게 하는 획득된 이미지에 대한 간섭 필터 보정 방법(300)을 설명한다. 도 3b에 도시된 바와 같은, 방법(300B)의 하나 이상의 단계는 하나 이상의 프로세서(예를 들어, 도 5의 컴퓨팅 장치(500))를 사용하는 특별히 프로그래밍된 컴퓨팅 장치에 의해 수행될 수 있다. 본원에 설명된 단계는 방출 분광법을 위해 수행될 수 있는 예시적인 단계이지만, 다른 유형의 광학 이미징 프로세스를 위해 추가 또는 대안 단계가 수행될 수 있다. 편의상, 방법(300)은 준비 단계, 측정 단계 및 보정 단계의 세 단계를 갖는 것으로 이해될 수 있다. 준비 단계는 일반적으로 측정 단계에서 얻은 원시 이미지에 보정 단계 동안 보정을 적용하는 데 필요한 정보를 수집하는 데 사용될 수 있다. 따라서, 준비 단계에서 원시 형광 이미지를 획득할 수 있다(단계 302). 원시 이미지는 위에서 설명한 구성요소를 사용하여 광학 이미징 시스템에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, (1) 광원은 여기 스펙트럼으로 샘플을 조명할 수 있으며, (2) 샘플의 리포터(예를 들어, 형광단)는 여기 스펙트럼에 의해 조명되고 방출 스펙트럼을 방출할 때 여기될 수 있으며, (3) 방출 스펙트럼은 방출 필터에 의해 필터링될 수 있고, (4) 검출기(예를 들어, CCD)는 방출 필터에 의해 투과된 투과 스펙트럼을 검출하여 원시 형광 이미지를 생성할 수 있다. 위에서 언급한 바와 같이, 포커싱 및 시준 광학장치는 방출 필터 및 검출기에서 방출 스펙트럼 및 투과 스펙트럼을 각각 포커싱 및 정렬하는 데 사용될 수 있다. 또한, 위에서 언급한 바와 같이, 이미지화되는 샘플에 의해 방출되는 방출 스펙트럼은 방출 필터에 대해 수직(예를 들어, 직교)이 아닌 각도에서 방출 필터에 부딪힐 수 있으며, 본원에 제시된 방법을 사용하여 원시 이미지 데이터를 보정할 수 있다. 일부 예들에서, 특정 입사각에서의 필터에 대한 투과 스펙트럼은 일반적으로 알려져 있을 수 있고, 방출 필터의 제조자로부터 수신될 수 있다. 원시 이미지 데이터는 디지털화되어, 검출기로부터 컴퓨팅 장치에 의해 수신될 수 있다. 원시 이미지 데이터는 사용자가 관찰할 수 있는 샘플의 최종 이미지를 구성하는 데 사용될 수 있다.

이제 준비 단계를 참조하면, 본원에 설명된 단계를 사용하여 기준 정보를 수집하고, 보정 정보를 생성하여 보정 단계에서 보정을 측정 단계에서 얻은 원시 이미지 데이터에 적용할 수 있다. 예를 들어, 단계 304B는 선택된 리포터에 대한 방출 스펙트럼을 특성화하는 정보를 수신하는 것을 포함할 수 있다. 방출 스펙트럼은 획득된 이미지 데이터의 선택된 파장에 걸쳐 있을 수 있다. 리포터 방출 스펙트럼은 리포터의 선택을 나타내는 수신된 사용자 입력에 기초할 수 있다(단계 304A). 예를 들어, 사용자는 상업적으로 이용 가능한 형광단, 예를 들어 AF 635에 대한 리포터 방출 스펙트럼을 선택할 수 있다. 방출 스펙트럼을 특성화하는 정보는 일반적으로 알려져 있을 수 있다. 따라서, 정보는 라이브러리(예를 들어, 데이터베이스)로부터, 또는 외부 네트워크를 통해 외부 소스로부터 검색될 수 있다.

필터의 광학 성능을 특성화하는 정보가 획득될 수 있다(단계 306A). 이 정보는 입사각이 변함에 따라 방출 필터로부터의 투과 스펙트럼 파장이 어떻게 이동(예를 들어, "청색이동", "적색이동" 등)되는지를 나타낼 수 있다. 광학 성능을 특성화하는 정보는 사용되는 특정 필터(들)에 대해 알려져 있을 수 있다. 따라서, 정보는 필터에 대한 광학 성능 정보의 데이터 라이브러리(예를 들어, 데이터베이스)로부터 수신(예를 들어, 필터 제조업체에 의해 제공됨)될 수 있다. 일부 예에서, 정보는 분석적으로 필터에 대해 결정될 수 있다. 예를 들어, 정보는 사용된 리포터, 사용된 방출 및 여기 필터의 유형, 이미지화된 샘플과 관련된 기타 특성(예를 들어, 시야, 광원, 초점, 편향 등)을 기반으로 할 수 있다.

준비 단계는 또한 특정 입사각에 대한 방출 필터의 기준 투과 스펙트럼을 (예를 들어, 결정을 통해) 얻는 것을 포함할 수 있다(단계 306B). 입사각은 방출 필터에 대한 것이며, 투과 스펙트럼의 변화를 유발하는 것으로 설명된 입사각의 변화를 설명하기 위해 수직 입사각(예를 들어, 직교) 및 경사(예를 들어, 예각, 둔각) 입사각을 모두 포함할 수 있다. 특정 입사각에 대한 투과 스펙트럼을 특성화하는 정보를 알 수 있으며, 필터 제조업체로부터 수신하거나 분석적으로 결정할 수 있다. 일부 예에서, 하나 이상의 프로세서는 투과 스펙트럼, 이미지에 속하는 특성 및 관련 입사각을 포함하는 데이터 라이브러리(예를 들어, 데이터베이스)를 사용할 수 있다. 일부 예들에서, 검출기가 방출 필터로부터 수신한 투과 스펙트럼에 기초하여 원시 이미지 데이터를 생성하는 경우, 컴퓨팅 장치는 검출기를 사용하여 원시 이미지 데이터와 연관된 투과 스펙트럼을 소급적으로 수신할 수 있다.

입사각에 기초하여 선택된 리포터 및 방출 필터에 대한 보정 정보가 생성될 수 있다(단계 308). 이것은 리포터 방출 스펙트럼(단계 304B)을 방출 필터의 투과 스펙트럼과 컨벌루션하는 것을 포함할 수 있다(단계 306B). 보정 정보는 단계 302에서 획득된 원시 이미지의 픽셀에 적용할 보정 값을 갖는 보정 이미지(예를 들어, C(x, y))일 수 있다. 보정 이미지의 보정 값 C(c, y)은 픽셀일 수도 있다. 픽셀은 그들의 x 및 y 좌표(예를 들어, (x, y))로 이미지에 위치할 수 있다. 보정 정보의 생성은 도 3b를 참조하여 하기에서 더 상세히 논의된다.

준비 단계 동안, 광학 이미징 시스템 및 광학 경로의 광학적 특성이 또한 결정될 수 있다. 여기에는 참조 형광 이미지 획득(예를 들어, 단계 314에서와 같음), 비네팅 및 판독 바이어스 측정(예를 들어, 단계 312에서와 같음), 광학 왜곡을 특성화하는 정보 획득 및 다항식 보정 정보 결정(예를 들어, 단계 310에서와 같음)이 포함될 수 있다.

보정 단계에서, 보정된 이미지를 획득하기 위해 측정 단계 동안 획득된 원시 이미지에 다양한 보정이 적용될 수 있다(단계 316). 보정은 보정 단계 동안 생성된 보정 정보에 기초할 수 있다. 예를 들어, 선택된 리포터 및 방출 필터에 대해 획득된 보정 정보(단계 308)는 전술한 바와 같이 원시 이미지에 적용될 수 있다. 예를 들어 비네팅, 판독 바이어스, 광학 왜곡 등과 같은 준비 단계(단계 310~314) 동안 획득된 정보에 기초하여 다른 보정이 적용될 수도 있다. 예를 들어, 비네팅은 참조 대상체(예를 들어, 빈 필드)에서 비네팅 함수를 추정하고 획득한 이미지 데이터 내에서 비네팅을 표준화하는 함수를 사용하여 보정할 수 있다. 사용자는 보정된 이미지 상의 데이터(예를 들어, 형광 데이터)를 측정하거나 컴퓨팅 장치가 측정치를 제공할 수 있다(단계 318). 보정된 이미지는 컴퓨팅 장치의 디스플레이에 표시되고, 메모리에 저장되고, 로컬 및/또는 광역 네트워크를 통해 전송되고, 하드카피로 인쇄되는 등의 작업을 수행할 수 있다.

비록 도 3a의 일부 단계가 3개의 단계(예를 들어, "준비 단계"의 단계 304A~314) 중 하나에 있는 것으로 설명되고 있지만, 흐름도는 단계 또는 스테이지에 대한 임의의 특정 순서를 암시하도록 의도되지 않는다. 또한, 준비 단계에 있는 것으로 확인된 일부 단계는 원시 형광 이미지를 얻은 후에 수행할 수 있다. 예를 들어, 방출 스펙트럼을 투과 스펙트럼과 컨볼루션함으로써 보정 정보를 생성(단계 310)하는 것은 예를 들어 원시 형광 이미지가 획득된 후 언제든지 수행될 수 있다.

이제 도 3b를 참조하면, 방출 필터의 시야에서 입사각을 보정하는 데 사용되는 보정 정보를 생성하기 위한 예시적인 방법 단계(도 3a의 단계 308)의 흐름도(300B)가 도시되어 있다. 전술한 바와 같이, 이러한 입사각의 결과로 방출 필터에 의해 제공되는 투과 스펙트럼의 스펙트럼 이동을 보정하기 위해 보정 정보가 원시 형광 이미지에 적용될 수 있다. 하기에서 더 자세히 설명하는 바와 같이, 보정 정보를 생성하는 것은 (i) 선택된 리포터(예를 들어, 형광단)에 대한 방출 스펙트럼 및 방출 필터의 시야의 각 위치에 대한 선택된 방출 필터의 투과 스펙트럼의 컨볼루션을 수행하는 것, (ii) 상부 및 하부 파장 컷오프 사이의 결과를 적분하는 것, 및 (iii) 기준 입사각(예를 들어, 0°)에서 방출 스펙트럼과 투과 스펙트럼의 컨볼루션을 적분하여 결과를 표준화하는 것을 포함할 수 있다. 전술한 바와 같이, 보정 정보를 생성하는 것은 이미지의 각 픽셀이 방출 필터의 시야의 각 위치에 대응하고 그 위치에서 투과 스펙트럼의 측정된 세기에 대한 보정을 나타내는 2차원(2D) 픽셀-기반 보정 이미지를 생성하는 것을 포함할 수 있다.

도 3b에서 볼 수 있는 바와 같이, 선택된 리포터에 대한 방출 스펙트럼을 특성화하는 정보가 획득될 수 있다(단계 322A). 정보는 파장 범위에 걸친 방출 스펙트럼의 세기의 함수일 수 있다. 이 함수는 지정된 파장 λ에 대한 방출 스펙트럼의 세기를 제공하는 S(λ)로 식별될 수 있다. 예를 들어, 도 2b의 점선 곡선(218)은 리포터 AF 635에 대한 샘플 방출 스펙트럼을 도시한다. 선택된 리포터는 샘플의 이미징에 사용되는 리포터일 수 있다(예를 들어, 알려진 형광 염료).

추가로, 다중 입사각에서 선택된 방출 필터에 대한 투과 스펙트럼을 특성화하는 정보가 획득될 수 있다(단계 322B). 정보는 각각의 입사각 θ에 대해, 그 입사각에 대해 선택된 파장 범위에 걸친 투과 스펙트럼의 함수를 포함할 수 있다. 이 함수는 지정된 입사각 θ에서 지정된 파장 λ에 대한 투과 스펙트럼의 세기를 제공하는 T(λ, θ)로 식별될 수 있다. 방출 필터의 시야의 다중 위치 각각에 대해 투과 스펙트럼이 수신될 수 있다. 방출 필터의 시야에서 각 위치(x, y)는 특정 입사각에 대응한다. 따라서, 해당 입사각에서 위치에 대한 투과 스펙트럼의 세기를 제공하는 함수는 T(λ, θ(x, y))로 식별될 수 있으며, 여기서 θ(x, y)는 입사각 θ이며, 위치(x, y)에서 발생하는 광선에서 발생한다. 예를 들어, 도 2b의 실선 곡선(216)은 640/20 nm 대역통과 필터에 대한 다양한 입사각(예를 들어, 0°, 5°, 10°,.., 23°)에 대한 샘플 투과 스펙트럼을 도시한다.

선택된 리포터에 대한 방출 스펙트럼을 특성화하는 정보를 얻고 다양한 입사각에서 선택된 방출 필터에 대한 투과 스펙트럼을 특성화하는 정보를 얻은 후, 보정 이미지 C(x, y)를 얻기 위한 방출 필터의 시야에서 각 위치(x, y)에 대한 보정 정보를 얻을 수 있다(단계 324~330).

특정 입사각 θ에서의 위치(x, y)에 대해, 그 위치(x, y) 및 입사각에 대해 투과 스펙트럼의 세기가 결정될 수 있다. 각 위치(x, y)는 빛이 방출 필터에 닿는 특정 입사각에 대응하므로 해당 위치에 대응하는 특정 입사각에 대한 파장 범위에 걸친 투과 스펙트럼의 함수를 사용하여 세기 값을 결정할 수 있다.

컨볼루션은 (i) 방출 스펙트럼을 특성화하는 함수, S(λ) 및 (ii) 위치(x, y), T(λ, θ(x, y))에 대응하는 입사각 θ에 대한 투과 스펙트럼을 특성화하는 함수로 수행될 수 있다. 컨볼루션(연산이 "*"기호로 표현됨)은 S(λ)*T(λ, θ(x, y))로 식별할 수 있다.

이 컨볼루션의 결과는 각각 상위 및 하위 파장 컷오프 임계값 λ_s1 및 λ_s2 사이에 적분될 수 있다(단계 328). 파장 컷오프 임계값은 선택된 리포터에 대한 방출 스펙트럼 또는 선택된 방출 필터에 대한 투과 스펙트럼이 획득되는 파장 범위의 종점이거나 그 범위 내에 있을 수 있다. 예를 들어, 파장 컷오프 임계값은 선택된 리포터에 대한 방출 스펙트럼 및 선택된 방출 필터의 투과 스펙트럼의 중첩된 영역의 파장 범위 종점일 수 있다. 예를 들어, 도 2c는 예시적인 중첩 영역(260a 및 260b)을 도시한다. 중첩된 영역(260a)의 경우, 파장 컷오프 임계값을 형성하는 데 종점이 사용될 수 있는 파장 범위는 대략 650 nm 및 675 nm에 대응한다. 따라서 적분된 결과는

로 식별될 수 있으며, 여기서 (x, y)는 방출 필터의 시야 내의 위치 및 차례로, 획득된 원시 이미지 내의 픽셀 위치에 대응하는 좌표 위치이며; S(λ)는 리포터의 방출 스펙트럼 세기를 특성화하는 함수이며; T(λ, θ(x, y))는 위치 (x, y)에 대응하는 입사각 θ에 대한 방출 필터로부터의 투과 스펙트럼의 세기를 특성화하는 함수이며, λ_s1 및 λ_s2는 각각 하한 및 상한 파장 컷오프 임계값이다.

적분된 결과는 입사각의 변화에 영향을 받는 투과 스펙트럼을 기반으로 하기 때문에, 적분된 결과는 기준 입사각(예를 들어, 방출 필터의 시야에 직각인 입사각)에서 방출 필터의 투과 스펙트럼과의 관계를 정량적으로 나타내기 위해 "표준화"될 수 있다. 표준화는 적분된 결과를 표준화 인자로 나누는 것을 포함할 수 있다. 표준화 인자는 리포터의 방출 스펙트럼을 특성화하는 함수 S(λ)와 기준 입사각 θ ₀에서 방출 필터의 투과 스펙트럼을 특성화하는 함수의 컨볼루션의 적분일 수 있다. 기준 입사각에서 방출 필터의 투과 스펙트럼을 특성화하는 함수는 T(λ, θ ₀)로 식별할 수 있다. 이 후자의 컨볼루션의 결과는 마찬가지로 파장 컷오프 임계값 λ_s1 및 λ_s2 사이에 적분될 수 있다. 따라서, 적분의 결과(단계 328)는 두 함수 S(λ)와 T(λ, θ ₀)의 컨볼루션 결과의 적분으로 표준화될 수 있다. 기준 입사각 θ ₀에서의 투과 스펙트럼은 방출 필터의 시야의 중심이 될 수직 (즉, 0°) 입사각에서의 투과 스펙트럼의 세기일 수 있다. 이 표준화는 방출 필터의 시야의 중심에서 벗어나는 각 입사각에서 투과 스펙트럼의 세기에 대한 각 관계의 표시를 제공한다. 따라서, 세기 보정은 특정 입사각(단계 328)을 포함하는 첫 번째 적분의 결과를 표준화 인자, 예를 들어 기준 입사각을 포함하는 두 번째 적분의 결과(단계 330)로 나눔으로써 얻어질 수 있다. 위에서 언급한 바와 같이, 단계 324 내지 330은 방출 스펙트럼의 시야에서 각 위치(x, y)에 대해 수행될 수 있다.

특정 입사각에 대응하는 방출 필터의 시야의 각 위치(x, y)에 대해 상술한 표준화를 수행하여 보정 이미지 C(x, y)가 얻어질 수 있다(단계 332). 명확성을 위해, 보정 이미지 C(x, y)는 방출 필터 시야의 각 위치(x, y)에 대한 "세기 보정"을 갖는 것으로 설명될 수 있다. 획득된 원시 이미지(도 3a의 단계 302)는 또한 보정된 이미지를 형성하기 위해 "보정 이미지"의 "세기 보정"을 사용하여 보정될 수 있는, 방출 필터의 시야의 각 위치(x, y)에서 "원시 세기", "원래 세기" 또는 "보정되지 않은 세기"를 갖는 것으로 설명될 수 있다. 일 예에서, 보정 이미지는 다양한 입사각으로 인한 투과 스펙트럼의 변화를 보정하기 위해 시야의 각 위치에서 표시(예를 들어, 백분율)를 포함하는 이미지 또는 이미지 데이터일 수 있다.

따라서, 위치(x, y)에 대한 세기 보정은 함수, S(λ) 및 T(λ, θ ₀)(단계 330)의 적분된 컨볼루션과 함께, 함수 S(λ) 및 T(λ, θ(x, y))의 적분된 컨볼루션의 비율일 수 있다(단계 328). 따라서, 보정 이미지 C(x, y)는 하기와 같이 계산될 수 있다.

여기서 (x, y)는 방출 필터의 시야에서의 위치에 대응하고 이어서 획득된 원시 이미지에서의 픽셀 위치에 대응하는 좌표 위치이고; S(λ)는 특정 파장 λ에서 리포터의 방출 스펙트럼 세기를 특성화하는 함수이며; T(λ, θ(x, y))는 위치(x, y)에 대응하고 파장 λ에서 입사각 θ에 대한 방출 필터의 투과 스펙트럼 세기를 특성화하는 함수이며; T(λ, θ ₀)는 파장 λ에서 수직(0°) 입사각에서 방출 필터로부터의 투과 스펙트럼 세기를 특성화하는 함수이며; λ_s1 및 λ_s2는 각각 하한 및 상한 파장 컷오프 임계값이다.

위의 방정식은 도 3a의 흐름도(300A)의 단계 302에서 획득된 원시 이미지 I_획득됨(x, y)의 각 (x, y) 픽셀 위치에 대한 세기 보정을 결정하는 데 사용될 수 있다. 따라서, 보정 이미지의 위치 C(x, y)와 획득한 원시 이미지 I_획득됨(x, y)의 픽셀 위치 간에 일대일 대응이 있다. 따라서, 보정 이미지 C(x, y)는 보정 이미지 I_보정됨(x, y)를 생성하는 데 사용될 수 있다.

보정된 이미지 I_보정됨(x, y)를 획득하기 위해, 획득한 원시 이미지 I_획득됨(x, y)와 보정 이미지 C(x, y)의 컨볼루션이 수행될 수 있으며, 예를 들어 I _보정됨 (x, y) = I _획득됨 (x, y) * C(x, y), 여기서 I _획득됨 (x, y)는 획득한 이미지이며, "*"는 컨볼루션 연산을 나타내며, I _보정됨 (x, y)는 보정된 이미지이며, C(x, y)는 각 위치 (x, y)에 대한 세기 보정으로 구성된 보정 이미지이다.

도 4a는 수직(0°) 입사각에서 형광단의 방출 스펙트럼 및 방출 필터에 대한 투과 스펙트럼에 대해 수행된 예시적인 컨볼루션 연산의 결과를 나타내는 그래프(400 및 450)를 도시한다. 컨볼루션은 두 함수(예를 들어, 방출 필터의 투과 스펙트럼을 특성화하는 함수 및 리포터의 방출 스펙트럼을 특성화하는 함수)에 대해 수행되는 수학적 연산이며, 한 함수의 모양이 다른 함수에 의해 어떻게 수정되는지를 표현하는 세 번째 함수를 생성한다. 예를 들어, 그래프(400)은 방출 필터의 투과 스펙트럼의 세기 곡선(402) 및 리포터(예를 들어, 형광단)의 방출 스펙트럼의 세기 곡선(404)을 보여 주며, 그들의 파장의 함수(예를 들어, 도 4a에서 720 nm 내지 900 nm)로 플롯된다. 그래프(450)는 투과 스펙트럼에 대한 곡선(402) 및 방출 스펙트럼의 곡선(404)의 컨볼루션을 나타내는 곡선(406)을 도시한다. 그래프(450)에서 볼 수 있는 바와 같이, 두 곡선(402 및 404)의 컨볼루션으로 인한 곡선(406)의 파장 범위는 약 805 나노미터 내지 약 830 나노미터이며, 이는 그래프(400)의 곡선(402 및 404)의 중첩 영역의 파장 범위에 대응한다. 일부 구현에서, 컨볼루션 이외의 수학적 연산(예를 들어, 곡선 곱셈의 다른 수치 구현)은 방출 필터의 투과 스펙트럼이 리포터의 방출 스펙트럼에 의해 수정될 수 있는 방법을 보여주는 그래프를 표현하는 데 사용될 수 있다. 또한, 적분 또는 합산을 근사화하는 방법은 적용 가능한 경우 적분으로 설명된 작업을 수행하기 위해 대안적으로 사용될 수 있다.

도 4b는 본 명세서에 기재된 기술을 사용하여 보정된 형광 이미지를 얻기 위해 사용될 수 있는 예시적인 이미지 세트를 도시한다.

왼쪽 상단 이미지(408)는 이미지의 중앙에서 가장자리까지 위치된 웰 세트의 획득된 원시 형광 이미지의 예를 도시한다. 이 예에서는 웰의 색상(및/또는 음영)이 균일해야 한다. 그러나, 이미지 408에 도시된 바와 같이, 웰의 색상(및/또는 음영)은 획득한 원시 형광 이미지의 중앙에서 가장자리로(예를 들어, 중앙의 녹색(및/또는 약간 더 어두운 음영)에서 가장자리의 황색(및/또는 약간 더 밝은 음영)으로 변한다. 이러한 색상(및/또는 음영)의 변화는 방출 필터의 시야의 가장자리 근처에서 일반적인 입사각에서 벗어난 다양한 입사각으로 인한 세기 변화 때문이다.

대조적으로, 좌측 하단 이미지(414)는 상이한 입사각으로 인해 원시 형광 이미지(408)에서 관찰된 스펙트럼 이동을 설명하도록 보정된, 보정된 이미지의 예를 도시한다. 이미지(414)에서 볼 수 있는 바와 같이, 색상(및/또는 음영)은 웰이 예상대로 이미지의 중앙에서 가장자리까지 더 균일한 색상(및/또는 음영)을 나타내도록 보정되었다. 이미지(408)의 색상(및/또는 음영)의 변화와 대조적으로, 이미지(414)의 색상(및/또는 음영)의 상대적인 균일도는 방출 필터로부터의 투과 스펙트럼의 세기를 방출 스펙트럼이 방출 필터를 비추는 입사각에 따라 보정하여 달성할 수 있다.

하단-중간 이미지(416)는 획득된 원시 형광 이미지의 또 다른 예를 도시한다. 이미지 416에서 볼 수 있듯이, 시야는 평면이다. 시야 내의 각 위치(x, y)는 빛이 방출 필터에 닿는 특정 입사각과 대응한다. 따라서, 수직(즉, 직교) 입사각(예를 들어, 0°)은 시야의 중심에 대응한다. 이미지(416)의 중심으로부터 멀어지는 색상(및/또는 음영)의 이동에 의해 표시된 바와 같이, 시야의 중심을 벗어난 위치에 대한 입사각이 변경됨에 따라 투과 스펙트럼의 세기가 이동한다. 즉, 이미지(416)에 예로서 도시된 바와 같이, 입사각이 시야에 직교하는 이미지(416)의 중심에서 더 강한 세기가 있을 수 있고, 입사각이 더 극단적인 이미지의 가장자리 근처에서 더 약할 수 있다.

우측 하단 이미지(418)는 전술한 바와 같은 보정 이미지의 예를 도시한다. 이미지(416)와 같이, 이미지(418)의 보정 이미지는 평면이며, 각 위치(x, y)는 원시 이미지(416)의 위치에 대응한다. 보정 이미지 C(x, y)는 각 위치(x, y)에서 세기 보정을 포함하여, 해당 위치에 대응하는 특정 입사각을 설명한다. 보정 이미지에 걸친 세기 보정은 보정 이미지(418)의 위치(x, y)에 대응하는 각각의 입사각에 기초하여 변할 수 있다.

도 3a를 참조하여 전술한 바와 같이, 광학 이미징 시스템 및 광학 경로의 광학적 특성이 결정되거나 획득될 수 있다(예를 들어, 필터 제조업체로부터). 이러한 광학적 특성은 다양한 입사각으로 인한 변화를 보정하는 것 외에도 원시 이미지를 보정하는 데 사용할 수 있다. 예를 들어, 상단-중간 이미지(410) 및 상단-우측 이미지(412)는 각각 준비 단계 동안 획득될 수 있는 이미지를 나타낸다. 예를 들어, 상단 중간 이미지(410)는 참조 이미지의 예이고, 상단-우측 이미지는 광학 이미징 시스템에 대한 판독 바이어스를 제공하는 이미지의 예이다.

도 5는 본 개시내용의 양태들을 구현하기 위해 사용될 수 있는 컴퓨팅 환경(500)을 예시한다. 도 1을 참조하여 전술한 바와 같이, 조명 소스(들)(502)는 샘플(504)을 조명할 수 있으며, 이는 리포터(506)(예를 들어, 형광단)를 여기시켜 샘플(504)이 여과되고 검출기(508)(예를 들어, CCD)에서 수신될 수 있는 방출 스펙트럼을 방출하게 한다. 검출기(508)는 검출된 스펙트럼에 대응하는 신호를 컴퓨팅 장치(550)의 입력 장치(551)에 제공할 수 있다.

본 개시내용의 시스템은 하나 이상의 기기의 동작을 제어하고/하거나 시스템에 의해 획득된 데이터를 처리하는 소프트웨어를 실행하는 컴퓨팅 장치(550)를 포함할 수 있다. 소프트웨어는 예를 들어 자기 디스크, 자기 테이프, CD-ROM 및 반도체 메모리와 같은 기계-판독가능 매체에 기록된 하나 이상의 모듈을 포함할 수 있다. 기계-판독가능 매체는 컴퓨터 내에 상주하거나 네트워크 I/O(557)(예를 들어, 외부 네트워크(570)를 통한 액세스)에 의해 컴퓨터에 연결될 수 있다. 그러나, 대안적인 예들에서, 소프트웨어를 위한 하드와이어 로직의 형태로 컴퓨터 인스트럭션들을 대체할 수 있거나, 소프트웨어 대신 펌웨어(즉, PROM, EPROMS, EEPROM 등과 같은 장치에 기록된 컴퓨터 인스트럭션들)를 대체할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 기계 판독-가능 인스트럭션들이라는 용어는 소프트웨어, 하드와이어 로직, 펌웨어, 대상체 코드 등을 포함하도록 의도된다.

컴퓨팅 장치(550)는 본원에 설명된 다양한 이미지 처리 동작을 수행하기 위한 특정 인스트럭션으로 프로그래밍될 수 있다. 컴퓨터는 예를 들어 특별히 프로그래밍된 임베디드 컴퓨터, 퍼스널 컴퓨터, 예컨대 랩톱 또는 데스크톱 컴퓨터, 또는 소프트웨어를 실행하고 적절한 제어 명령을 내리고/내리거나 정보를 실시간 기록할 수 있는 다른 유형의 컴퓨터일 수 있다. 컴퓨터는 기기의 조작자에게 정보를 보고하기 위한 디스플레이(556)(예를 들어, 원시 형광 이미지, 보정 이미지, 보정된 이미지 등을 표시), 오퍼레이터가 정보 및 명령을 입력할 수 있도록 하기 위한 입력 장치(551)(예를 들어, 키보드, 마우스, 광학 이미징 시스템과의 인터페이스 등) 및/또는 시스템에 의해 수행된 측정의 인쇄 출력 또는 영구 기록을 제공하고 이미지를 인쇄하기 위한 프린터(556)를 포함할 수 있다. 키보드에 입력된 일부 명령은 사용자가 특정 데이터 처리 작업을 수행할 수 있도록 한다. 일부 구현에서, 데이터 수집 및 데이터 처리는 자동화되고 시스템 초기화 후 사용자 입력이 거의 또는 전혀 필요하지 않다.

컴퓨팅 장치(550)는 본원에 설명된 기능 중 임의의 것을 수행하기 위해 컴퓨터 프로그램의 인스트럭션을 실행할 수 있는 하나 이상의 프로세서(560)를 포함할 수 있다. 인스트럭션은 읽기 전용 메모리(ROM)(552), 랜덤 액세스 메모리(RAM)(553), 이동식 미디어(554)(예를 들어, USB 드라이브, 컴팩트 디스크(CD), 디지털 다용도 디스크(DVD))에, 및/또는 임의의 다른 유형의 컴퓨터-판독가능 매체 또는 메모리(총괄적으로 "전자 저장 매체"라고 함)에 저장될 수 있다. 인스트럭션은 또한 부착된(또는 내부) 하드 드라이브(555) 또는 다른 유형의 저장 매체에 저장될 수 있다. 컴퓨팅 장치(550)는 (예를 들어, 생성된 이미지를 보기 위한) 디스플레이 장치(556) 및 프린터(558)와 같은 하나 이상의 출력 장치를 포함할 수 있고, 본원에 설명된 작업을 수행하기 위한 이미지 프로세서와 같은 하나 이상의 출력 장치 컨트롤러(555)를 포함할 수 있다. 하나 이상의 사용자 입력 장치(551)는 원격 제어, 키보드, 마우스, 터치 스크린(디스플레이 장치(556)와 통합될 수 있음) 등을 포함할 수 있다. 컴퓨팅 장치(550)는 또한 하나 이상의 네트워크 인터페이스, 예컨대 외부 네트워크(570)와 통신하기 위한 네트워크 입력/출력(I/O) 인터페이스(557)(예를 들어, 네트워크 카드)를 포함할 수 있다. 네트워크 I/O 인터페이스(557)는 유선 인터페이스(예를 들어, 전기, RF(동축을 통해), 광(광섬유 사용)), 무선 인터페이스 또는 이 둘의 조합일 수 있다. 네트워크 I/O 인터페이스(557)는 외부 네트워크(570)를 통해 통신하도록 구성된 모뎀을 포함할 수 있다. 외부 네트워크는 예를 들어, 근거리 통신망, 네트워크 제공자의 무선, 동축, 광섬유 또는 하이브리드 광섬유/동축 분배 시스템(예를 들어, DOCSIS 네트워크) 또는 기타 원하는 네트워크를 포함할 수 있다.

컴퓨팅 장치(550)의 요소 중 하나 이상은 소프트웨어 또는 하드웨어와 소프트웨어의 조합으로 구현될 수 있다. 컴퓨팅 장치(550)의 구성요소를 추가, 제거, 결합, 분할 등을 위해 수정이 이루어질 수 있다. 또한, 도 5에 도시된 요소들은 본원에 설명된 것과 같은 동작을 수행하도록 특별히 구성되고 프로그래밍된 컴퓨팅 장치 및 구성요소를 사용하여 구현될 수 있다. 예를 들어, 컴퓨팅 장치(550)의 메모리는 프로세서(560) 및/또는 컴퓨팅 장치(550)의 하나 이상의 다른 프로세서에 의해 실행될 때 컴퓨팅 장치(550)가 본원에 설명된 하나, 일부 또는 모든 작업을 수행하도록 하는 컴퓨터-실행가능한 인스트럭션을 저장할 수 있다. 그러한 메모리 및 프로세서(들)는 또한 또는 대안적으로 하나 이상의 집적 회로(IC)를 통해 구현될 수 있다. 예를 들어, IC는 ROM에 저장된 및/또는 IC에 하드와이어된 프로그래밍 인스트럭션 또는 기타 데이터에 액세스하는 마이크로프로세서일 수 있다. 예를 들어, IC는 게이트 및/또는 본원에 설명된 계산 및 기타 동작 전용의 다른 로직을 갖는 특정 용도 주문형 집적회로(ASIC)를 포함할 수 있다. IC는 ROM 또는 RAM에서 읽은 프로그래밍 인스트럭션의 실행을 기반으로 일부 작업을 수행할 수 있으며, 다른 작업은 게이트 또는 기타 로직에 하드와이어된다. 또한, IC는 디스플레이 버퍼에 이미지 데이터를 출력하도록 구성될 수 있다.

따라서, 본원에 기술된 시스템 및 방법은 상이한 입사각으로 인한 방출 필터로부터 투과 스펙트럼의 측정된 세기의 변화를 보정함으로써 보다 정확한 이미지(예를 들어, 형광 이미지)를 생성하는 데 사용될 수 있다. 보다 정확한 이미징은 사용자가 보다 정확한 생체 내 이미지를 분석하고 질병 영역을 식별하고 특성화하여 감지하기 어려운 종양 가장자리를 감지하는 등 질병이 있는 조직과 정상 조직을 구분하는 데 도움이 되는 엄청난 이점을 가질 수 있다. 또한, 정확한 이미지는 여러 라이브 대상체를 포함하는 고 처리량 이미징에 특히 유용하다.

본 개시내용이 예시적인 구현을 참조하여 특히 도시되고 설명되었지만, 청구된 주제의 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서 형태 및 세부 사항에 있어서 다양한 변경이 이루어질 수 있다는 것을 당업자는 이해해야 한다.

Claims

이미지를 생성하는 방법으로서,
방출 필터로부터, 방출 스펙트럼의 선택된 파장 범위에 대응하는 투과 스펙트럼을 수신하는 단계로서, 상기 방출 스펙트럼은 상기 방출 필터에 대한 수직 입사각에서 벗어난 복수의 입사각에서 상기 방출 필터를 조명하는, 상기 수신하는 단계;
상기 투과 스펙트럼의 세기를 측정하는 단계;
상기 복수의 입사각의 함수로서 상기 방출 필터의 스펙트럼 응답에 기초하여, 상기 투과 스펙트럼에 대한 보정된 세기를 얻는 단계; 및
상기 투과 스펙트럼 및 상기 보정된 세기를 기반으로 이미지를 생성하는 단계를 포함하는, 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 방출 스펙트럼이 샘플의 발광 소스로부터 방출되고, 상기 발광 소스는,
형광 소스,
생물발광 소스,
인광 소스, 및
화학발광 소스 중 하나를 포함하는, 방법.
청구항 2에 있어서, 상기 샘플은 생물학적인, 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 보정된 세기를 얻는 단계는,
상기 방출 필터의 시야의 하나 이상의 위치들에 대해 (i) 리포터의 알려진 방출 스펙트럼을 특성화하는 함수; 및 (ii) 상기 하나 이상의 위치들 중 한 위치에 대응하는 입사각에 대해 알려진 투과 스펙트럼을 특성화하는 함수의 컨볼루션을 수행하여 컨볼루션 함수를 얻는 단계를 포함하는, 방법.
청구항 4에 있어서,
상기 보정된 세기를 얻는 단계는:
하한 파장 임계값과 상한 파장 임계값 사이의 컨볼루션 함수를 적분하여 적분된 컨볼루션 함수를 얻는 단계를 더 포함하는, 방법.
청구항 5에 있어서, 상기 보정된 세기를 얻는 단계는,
기준 입사각에서 상기 방출 필터에 대한 알려진 투과 스펙트럼의 세기를 기반으로 상기 적분된 컨볼루션 함수를 표준화하는 단계를 더 포함하는, 방법.
청구항 6에 있어서, 상기 기준 입사각은 상기 방출 필터에 수직인 입사각인, 방법.
청구항 6에 있어서, 상기 표준화하는 단계는,
상기 알려진 방출 스펙트럼을 특성화하는 상기 함수와 상기 기준 입사각에서 상기 방출 필터에 대한 상기 알려진 투과 스펙트럼을 특성화하는 함수의 컨볼루션을 수행함으로써 기준 컨볼루션 함수를 얻는 단계;
상기 하한 파장 임계값과 상기 상한 파장 임계값 사이의 상기 기준 컨볼루션 함수를 적분하여 적분된 기준 컨볼루션 함수를 얻는 단계; 및
상기 적분된 컨볼루션 함수를 상기 적분된 기준 컨볼루션 함수로 나누는 단계를 포함하는, 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 보정된 세기를 얻는 단계는,
상기 방출 필터의 시야의 하나 이상의 위치들에 대해, 하나 이상의 위치들 중 한 위치에서 측정된 상기 투과 스펙트럼의 세기에 대한 보정을 포함하는 보정 이미지를 생성하는 단계를 포함하는, 방법.
청구항 9에 있어서, 상기 이미지를 생성하는 단계는,
상기 방출 필터의 시야의 하나 이상의 위치들에 대해, 상기 투과 스펙트럼의 측정된 원시 세기를 포함하는 원시 이미지를 획득하는 단계; 및
상기 원시 이미지와 상기 보정 이미지의 컨볼루션을 수행하는 단계를 포함하는, 방법.
형광 이미징용 시스템으로서,
여기 스펙트럼을 제공하는 광원;
상기 여기 스펙트럼으로부터 선택된 여기 파장 범위를 샘플쪽으로 제공하는 여기 필터;
상기 샘플로부터 수신된 방출 스펙트럼의 선택된 방출 파장 범위를 포함하는 투과 스펙트럼을 제공하는 방출 필터로서, 상기 방출 필터는 상기 방출 필터에 대해 수직 입사각에서 벗어나는 복수의 입사각에서 상기 방출 스펙트럼을 수신하는, 상기 방출 필터;
상기 방출 필터의 시야에 걸쳐 상기 투과 스펙트럼의 세기를 측정하는 형광 검출기; 및
컴퓨팅 장치로서, 상기 컴퓨팅 장치의 하나 이상의 프로세서에 의해 실행 시, 복수의 입사각의 함수로서 상기 투과 스펙트럼의 스펙트럼 이동에 기초하여 상기 세기를 보정하는 인스트럭션들을 저장하는, 상기 컴퓨팅 장치를 포함하는, 형광 이미징용 시스템.
청구항 11에 있어서, 상기 샘플과 상기 방출 필터 사이에 위치하는 시준 광학장치를 더 포함하는, 장치.
청구항 11에 있어서,
상기 인스트럭션들은, 실행 시, 복수의 픽셀을 포함하는 디지털 이미지를 생성하고;
각 픽셀은 상기 방출 필터의 상기 시야의 복수 위치들의 각각의 위치에 대응하고;
각 픽셀은 상기 방출 필터의 상기 시야의 상기 각각의 위치에서 측정된 상기 투과 스펙트럼의 상기 세기에 대응하는 값을 포함하고;
각각의 위치는 상기 복수의 입사각 중 한 입사각에 대응하는, 장치.
청구항 13에 있어서,
상기 인스트럭션들은, 실행 시, 상기 복수의 픽셀 중 한 픽셀에 대해, 상기 픽셀에 대응하는 상기 방출 필터의 상기 시야의 상기 각각의 위치의 상기 입사각에 기초하여 상기 투과 스펙트럼의 상기 세기에 대응하는 상기 값을 수정함으로써 상기 ㄴ세기를 보정하는, 장치.
청구항 14에 있어서,
상기 인스트럭션들은, 실행 시, 상기 픽셀에 보정을 적용하여 상기 픽셀을 수정하고;
상기 인스트럭션들은, 실행 시,
상기 방출 필터의 상기 시야의 상기 복수의 위치들에 대해, (i) 리포터의 알려진 방출 스펙트럼을 특성화하는 함수 및 (ii) 복수의 위치들 중 한 위치에 대응하는 상기 복수의 입사각 중 한 입사각에 대해 알려진 투과 스펙트럼을 특성화하는 함수의 컨볼루션을 수행하여 컨볼루션 함수를 얻고;
(i) 리포터의 알려진 방출 스펙트럼을 특성화하는 상기 함수 및 (ii) 상기 방출 필터에 수직인 입사각에서 상기 투과 스펙트럼을 특성화하는 함수를 특성화하는 함수의 컨볼루션을 수행하여 기준 컨볼루션 함수를 얻고;
하한 파장 임계값과 상한 파장 임계값 사이의 상기 컨볼루션 함수와 상기 기준 컨볼루션 함수를 각각 적분하여 적분된 컨볼루션 함수 및 적분된 기준 컨볼루션 함수를 얻는 단계; 및
상기 적분된 컨볼루션 함수를 상기 적분된 기준 컨볼루션 함수로 나눔으로써, 상기 픽셀에 적용할 상기 보정을 얻는, 장치.
청구항 15에 있어서, 상기 인스트럭션들은, 실행 시,
상기 픽셀에 적용할 상기 보정을 포함하는 보정 이미지를 생성하고;
상기 디지털 이미지와 상기 보정 이미지의 컨볼루션을 수행하여 상기 픽셀에 상기 보정을 적용하는, 장치
형광 이미지 생성 방법으로서, 상기 방법은,
복수의 픽셀을 포함하는 형광 이미지 데이터를 획득하는 단계로서, 각 픽셀은 방출 스펙트럼에 의해 조명되는 방출 필터의 시야의 위치에서 측정된 투과 스펙트럼의 각 세기에 대응하고, 상기 방출 스펙트럼은 복수의 입사각에서 상기 시야를 조명하는, 상기 형광 이미지 데이터를 획득하는 단계;
형광단의 알려진 방출 스펙트럼에 기초하고 상기 복수의 입사각의 함수로서 상기 투과 스펙트럼의 스펙트럼 이동에 기초하여, 복수의 보정 값을 포함하는 보정 이미지를 생성하는 단계;
상기 복수의 보정 값을 상기 형광 이미지 데이터에 적용하여 복수의 보정된 픽셀을 획득하는 단계로서, 각 보정된 픽셀은 상기 투과 스펙트럼의 각각의 보정된 세기에 대응하는, 상기 복수의 보정된 픽셀을 획득하는 단계; 및
상기 복수의 보정된 픽셀을 사용하여 상기 형광 이미지를 생성하는 단계를 포함하는, 방법.
청구항 17에 있어서, 상기 형광단의 선택을 지시하고 상기 방출 필터의 선택을 지시하는 사용자 입력을 수신하는 단계를 더 포함하는, 방법.
청구항 17에 있어서, 상기 복수의 보정 값은,
(a) (i) 상기 형광단의 알려진 방출 스펙트럼을 특성화하는 함수 및 (ii) 상기 방출 필터의 시야의 위치에 대응하는 입사각에 대해 알려진 투과 스펙트럼을 특성화하는 함수의 컨볼루션의 제1 적분과,
(b) (i) 상기 형광단의 상기 알려진 방출 스펙트럼을 특성화하는 상기 함수 및 (ii) 수직 입사각에서 상기 방출 필터에 대해 알려진 투과 스펙트럼을 특성화하는 함수의 컨볼루션의 제2 적분의 비율에 기초하는 방법.
청구항 19에 있어서, 상기 제1 적분 및 상기 제2 적분은 하한 파장 임계값과 상한 파장 임계값 사이에서 적분되는, 방법.