KR20210098473A - 조작된 세포외 소포체 및 이의 용도 - Google Patents

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KR20210098473A
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레니 에이. 하리손
케 쓔
케 o
데미안 제이. 하우드
소냐 하우트
존 디. 쿨만
더글라스 이. 윌리엄스
러셀 이. 매코널
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Abstract

본 개시내용은 엑소솜의 내강 표면에 존재하는 단백질에 풍부한 치료적 엑소솜에 관한 것이다. 본 개시내용은 엑소솜의 내강 표면에 존재하는 단백질에 풍부한 엑소솜을 제조하는 방법, 치료적 펩타이드 또는 단백질을 엑소솜의 내강 표면에 결합시키는 방법 및 사용 방법, 예를 들어, 치료적 또는 진단적 사용 방법을 제공한다. 제조 방법은 야생형 엑소솜, EV, 예를 들어, 엑소솜 단백질의 변형 또는 단편, 또는 EV, 예를 들어, 엑소솜 단백질 및 페이로드, 예를 들어, 치료적 단백질과 같은 생물학적으로 활성인 분자의 융합 단백질에서 관찰된 것보다 더 높은 농도로 하나 이상의 EV, 예를 들어, 엑소솜 단백질을 포함하는 내강-표면-조작된 엑소솜을 생성하는 단계를 포함한다.

Description

조작된 세포외 소포체 및 이의 용도
EFS-웹을 통해 전자적으로 제출된 서열 목록에 대한 참조
본 출원에서 제출된 전자적으로 제출된 서열 목록(명칭: 4000_041PC01_SL_ST25.txt, 크기: 116,344　바이트; 및 생성일: 2019년 5월 22일)의 내용은 그 전체가 참조에 의해 본 명세서에 원용된다.
기술 분야
본 개시내용은 암 및 기타 질환의 예방 또는 치료를 위한 작용제로서 유용할 수 있는 세포외 소포체(extracellular vesicle)의 내강 표면과 관련된 스캐폴드 단백질이 풍부한 세포외 소포체, 예를 들어, 엑소솜(exosome)을 제공한다.
엑소솜은 세포간 통신에 중요한 매개체이다. 이들은 또한 암과 같은 많은 질환의 진단 및 예후 예측에서 중요한 바오마커이다. 약물 전달 비히클로서, 엑소솜은 많은 치료 영역에서 새로운 치료 방식으로 전통적인 약물 전달 방법에 비해 많은 이점을 제공한다.
엑소솜의 핵심 특징은 내부 공간 또는 내강(lumen) 내에 생물학적으로 활성인 페이로드(payload)를 함유하는 능력이다. 엑소솜은 mRNA, miRNA, DNA, 단백질, 탄수화물 및 지질을 포함하는 내인성 페이로드를 함유하지만, 목적하는 치료적 페이로드의 특정 로딩을 지시하는 능력은 현재 제한적이라는 것이 잘 알려져 있다. 엑소솜은 생산자 세포에서 목적하는 치료적 페이로드를 과발현함으로써 로딩될 수 있지만, 이러한 로딩은 종종 세포 엑소솜 처리 센터에의 페이로드의 확률적 국재화(stochastic localization)로 인해 효율성이 제한된다. 대안적으로, 정제된 엑소솜은 예를 들어, 전기천공에 의해 생체외 로딩될 수 있다. 이러한 방법은 효율성이 낮거나 또는 siRNA와 같은 작은 페이로드로 제한될 수 있다. 따라서, 고도로 효율적이고 잘 정의된 로딩된 엑소솜을 생성하기에 적합한 방법은 엑소솜 기반의 기술의 치료적 사용 및 기타 적용을 더 잘할 수 있게 하기 위해 필요하다.
본 개시내용의 양태는 세포외 소포체(EV), 예를 들어, 치료적 용도를 위한 엑소솜을 로딩하는 신규한 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 방법은 엑소솜의 내강 표면에서 새로 확인된 단백질 마커를 사용한다. 특히, 단백질 그룹(예를 들어, 미리스토일화된 알라닌 풍부 단백질 카이네이스 C 기질(myristoylated alanine rich Protein Kinase C substrate: MARCKS); 미리스토일화된 알라닌 풍부 단백질 카이네이스 C 기질 유사 1(myristoylated alanine rich Protein Kinase C substrate like 1: MARCKSL1); 및 뇌의 산 가용성 단백질 1(brain acid soluble protein 1: BASP1))이 엑소솜의 내강 표면에서 매우 풍부한 것으로 확인되었다. 또한, 예를 들어, 적어도 7개의 아미노산의 BASP1의 아미노 말단의 짧은 서열은 전장 BASP1 단백질과 동일한 정도로 형광 단백질 분자의 고효율 로딩을 지시하는데 충분한 것으로 나타났다. 적어도 7개의 아미노산과 10개 미만의 아미노산인 이 단편은 조작된 EV 로딩의 분야에서 상당한 발전을 보여주고 있으며, 생체외 조작의 추가적인 단계 없이 임의의 생물학적으로 활성인 분자, 예를 들어, 치료적 단백질 페이로드의 EV, 예를 들어, 엑소솜의 내강으로의 효율적이고 재현 가능한 로딩을 가능하게 한다. 본 명세서에 기재된 융합 단백질을 사용하는 EV, 예를 들어, 엑소솜의 로딩은 지금까지 기재된 임의의 다른 유전공학 방법에 비해 상당히 높은 페이로드 수준을 갖는 조작된 EV, 예를 들어, 조작된 엑소솜을 생산한다.
엑소솜으로부터 새로 확인된 단백질 및 펩타이드 서열은 본 개시내용의 다양한 실시형태에서 사용된다. 예를 들어, 일부 실시형태는 EV, 예를 들어, 엑소솜 단백질 또는 단백질 단편(즉, 스캐폴드 단백질) 및 생물학적으로 활성인 분자(예를 들어, 치료적으로 관련된 단백질)를 접합하고, EV, 예를 들어, EV의 내강 표면에 융합 단백질을 함유하는 엑소솜을 생성함으로써 융합 단백질을 생성하는 것에 관한 것이다. 천연의 전장 단백질 또는 생물학적으로 활성인 분자(예를 들어, 치료적으로 관련된 단백질)의 생물학적으로 활성인 단편은 엑소솜-풍부 단백질 또는 단백질 단편에 접합됨으로써 EV, 예를 들어, 엑소솜의 내강 표면으로 수송될 수 있다.
본 개시내용은 또한 EV, 예를 들어, 엑소솜의 내강에서 생물학적으로 활성인 분자(예를 들어, 치료적으로 관련된 단백질)의 보다 효율적인 로딩을 위한 또는 로딩을 위해 설계된, 내강-조작된 EV, 예를 들어, 내강-조작된 엑소솜의 생성 또는 사용에 관한 것이다. 예를 들어, EV의 내강 표면은 내강 표면에 더 높은 농도의 천연 전장 EV, 예를 들어, 엑소솜 단백질 및/또는 천연 EV, 예를 들어, 엑소솜 단백질의 단편 또는 변형된 단백질을 함유하도록 변형될 수 있다.
본 개시내용의 일부 실시형태는 생산자 세포 또는 이러한 내강-조작된 EV를 생산하기 위한 생산자 세포를 생성하는 방법에 관한 것이다. 외인성 폴리뉴클레오타이드는 생산자 세포로부터 내강-조작된 EV, 예를 들어, 내강-조작된 엑소솜을 생성하기 위해 일시적으로 또는 안정적으로 생산자 세포에 도입될 수 있다.
따라서, 일 양태에서, 본 개시내용은 스캐폴드 단백질을 포함하는 EV, 예를 들어, 엑소솜을 제공하되, 스캐폴드 단백질의 적어도 일부는 외인성 서열로부터 발현되며, 스캐폴드 단백질은 MARCKS, MARCKSL1, BASP1 또는 이들의 단편, 변이체, 유도체 또는 변형을 포함한다.
일부 양태에서, 스캐폴드 단백질은 상이한 EV, 예를 들어, 엑소솜의 상이한 스캐폴드 단백질보다 더 높은 밀도로 EV, 예를 들어, 엑소솜에 존재하되, 상이한 스캐폴드 단백질은 종래의 EV, 예를 들어, 엑소솜 단백질 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 종래의 EV, 예를 들어, 엑소솜 단백질은 CD9, CD63, CD81, PDGFR, GPI 앵커 단백질, 락타드헤린, LAMP2, LAMP2B 및 이들의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, EV, 예를 들어, 엑소솜은 외인성 서열을 포함하도록 유전적으로 변형된 세포로부터 생산되되, 선택적으로 세포는 HEK293 세포이다.
일부 실시형태에서, 세포는 외인성 서열을 포함하는 플라스미드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 외인성 서열은 MARCKS, MARCKSL1 또는 BASP1을 암호화하는 게놈 서열에 대해 3' 또는 5'에 위치한 게놈 부위 내로 삽입된다. 일부 실시형태에서, 외인성 서열은 MARCKS, MARCKSL1 또는 BASP1을 암호화하는 게놈 서열 내로 삽입된다.
일부 실시형태에서, 스캐폴드 단백질은 MARCKS, MARCKSL1, BASP1 또는 이들의 단편, 및 치료적 펩타이드를 포함하는 융합 단백질이다.
일부 실시형태에서, 생물학적으로 활성인 분자는 천연 펩타이드, 재조합 펩타이드, 합성 펩타이드 또는 치료적 화합물에 대한 링커로 이루어진 군으로부터 선택되는 치료적 펩타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 생물학적으로 활성인 분자(예를 들어, 치료적 화합물)는 뉴클레오타이드, 아미노산, 지질, 탄수화물 및 소분자로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 생물학적으로 활성인 분자(예를 들어, 치료적 펩타이드)는 항체 또는 이의 단편 또는 변형이다. 일부 실시형태에서, 치료적 펩타이드는 효소, 리간드, 수용체, 전사 인자 또는 이들의 단편 또는 변형이다. 일부 실시형태에서, 치료적 펩타이드는 항균성 펩타이드 또는 이들의 단편 또는 변형이다.
일부 실시형태에서, EV, 예를 들어, 엑소솜은 제2 스캐폴드 단백질을 더 포함하되, 제2 스캐폴드 단백질은 MARCKS, MARCKSL1, BASP1 또는 이들의 단편을 포함한다. 일부 실시형태에서, EV, 예를 들어, 엑소솜은 제2 스캐폴드 단백질을 더 포함하되, 제2 스캐폴드 단백질은 PTGFRN, BSG, IGSF2, IGSF3, IGSF8, ITGB1, ITGA4, SLC3A2, ATP 수송자 또는 이들의 단편을 포함한다.
일부 실시형태에서, 스캐폴드 단백질은 패턴 (M)(G)(G/A/S)(K/Q)(L/F/S/Q)(S/A)(K)(K)(서열번호 118) 또는 N-말단 (M)이 없는 상기 패턴에 상응하는 펩타이드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 스캐폴드 단백질은 (M)(G)(π)(X)(Φ/π)(π)(+)(+)의 펩타이드 또는 N-말단 (M)이 없는 펩타이드를 포함하되, 각 괄호의 위치는 아미노산을 나타내고, π는 (Pro, Gly, Ala, Ser)로 이루어진 군으로부터 선택되는 임의의 아미노산이며, X는 임의의 아미노산이고, Φ는 (Val, Ile, Leu, Phe, Trp, Tyr, Met)로 이루어진 군으로부터 선택되는 임의의 아미노산이며, (+)는 (Lys, Arg, His)로 이루어진 군으로부터 선택되는 임의의 아미노산이고; 5번 위치는 (+)가 아니며, 6번 위치는 (+)도 (Asp 또는 Glu)도 아니다. 일부 실시형태에서, 스캐폴드 단백질은 서열 (M)(G)(π)(ξ)(Φ/π)(S/A/G/N)(+)(+)의 펩타이드 또는 N-말단 (M)이 없는 펩타이드를 포함하되, 각 괄호의 위치는 아미노산을 나타내고, π는 (Pro, Gly, Ala, Ser)로 이루어진 군으로부터 선택되는 임의의 아미노산이며, ξ는 (Asn, Gln, Ser, Thr, Asp, Glu, Lys, His, Arg)로 이루어진 군으로부터 선택되는 임의의 아미노산이고, Φ는 (Val, Ile, Leu, Phe, Trp, Tyr, Met)로 이루어진 군으로부터 선택되는 임의의 아미노산이며, (+)는 (Lys, Arg, His)로 이루어진 군으로부터 선택되는 임의의 아미노산이고; 5번 위치는 (+)가 아니며, 6번 위치는 (+)도 (Asp 또는 Glu)도 아니다. 아미노산의 명명법에 대해서 문헌[R. Aasland et al., FEBS Letters 513 (2002): 141-144] 참조.
일부 실시형태에서, 스캐폴드 단백질은 서열번호 4 내지 서열번호 110 중 어느 하나의 펩타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 스캐폴드 단백질은 MGXKLSKKK(서열번호 116)의 펩타이드 또는 N-말단 M이 없는 펩타이드를 포함하되, X는 임의의 아미노산이다. 일부 실시형태에서, 스캐폴드 단백질은 서열번호 110의 펩타이드 또는 N-말단 M이 없는 상응하는 펩타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 스캐폴드 단백질은 서열번호 13의 펩타이드 또는 N-말단 (M)이 없는 상응하는 펩타이드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 스캐폴드 단백질은 페이로드, 예를 들어, 펩타이드를 더 포함한다.
다른 실시형태에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 EV, 예를 들어, 엑소솜 및 부형제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 거대분자가 실질적으로 없되, 거대분자는 핵산, 외인성 단백질, 지질, 탄수화물, 대사 산물 및 이들의 조합으로부터 선택된다.
또 다른 실시형태에서, 본 개시내용은 본 명세서에서 제공되는 EV, 예를 들어, 엑소솜을 생산하기 위한 세포 집단을 제공한다.
일부 실시형태에서, 세포 집단은 MARCKS, MARCKSL1, BASP1, 또는 이들의 단편 또는 변형을 포함하는 스캐폴드 단백질을 암호화하는 외인성 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포 집단은 제2 스캐폴드 단백질을 암호화하는 제2 외인성 서열을 더 포함하되, 제2 스캐폴드 단백질은 MARCKS, MARCKSL1, BASP1, 또는 이들의 단편 또는 변형을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포 집단은 제2 스캐폴드 단백질을 암호화하는 제2 외인성 서열을 더 포함하되, 제2 스캐폴드 단백질은 PTGFRN, BSG, IGSF2, IGSF3, IGSF8, ITGB1, ITGA4, SLC3A2, ATP 수송자 또는 이들의 단편을 포함한다.
일부 실시형태에서, 외인성 서열은 MARCKS, MARCKSL1 또는 BASP1을 암호화하는 게놈 서열에 삽입되되, 외인성 서열 및 게놈 서열은 스캐폴드 단백질을 암호화한다. 일부 실시형태에서, 외인성 서열은 플라스미드에 있다.
일부 실시형태에서, 외인성 서열은 생물학적으로 활성인 분자(예를 들어, 치료적 펩타이드)를 암호화한다. 일부 실시형태에서, 치료적 펩타이드는 천연 펩타이드, 재조합 펩타이드, 합성 펩타이드 또는 치료적 화합물에 대한 링커로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 치료적 화합물은 뉴클레오타이드, 아미노산, 지질, 탄수화물 및 소분자로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 치료적 펩타이드는 항체, 또는 이의 단편 또는 변형이다. 특정 실시형태에서, 항체는 나노바디이다. 당업자는 본 개시내용의 EV에 사용된 항체가 예를 들어, 대안적인 항체 형식, 항원-약물 접합체(antigen-drug conjugate: ADC) 또는 면역독소를 포함하는 당업계에 공지된 임의의 항원-결합 분자일 수 있음을 이해할 것이다.
일부 실시형태에서, 치료적 펩타이드는 효소, 리간드, 수용체, 전사 인자, 또는 이들의 단편 또는 변형이다. 일부 실시형태에서, 치료적 펩타이드는 항균성 펩타이드, 또는 이의 단편 또는 변형이다.
일부 실시형태에서, 외인성 서열은 표적화 모이어티를 암호화한다. 일부 실시형태에서, 표적화 모이어티는 장기, 조직 또는 세포에 특이적이다.
일부 실시형태에서, 제2 스캐폴드 단백질은 표적화 모이어티를 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 표적화 모이어티는 장기, 조직 또는 세포에 특이적이다.
일 실시형태에서, 본 개시내용은 다음의 서열을 포함하는 EV, 예를 들어, 엑소솜을 변형하기 위한 폴리펩타이드를 제공한다:
(i) (M)(G)(G/A/S)(K/Q)(L/F/S/Q)(S/A)(K)(K)(서열번호 118) 또는 N-말단 (M)이 없는 상응하는 서열;
(ii) (M)(G)(π)(X)(Φ/π)(π)(+)(+) 또는 N-말단 (M)이 없는 상응하는 서열, 여기서 각 괄호의 위치는 아미노산을 나타내고, π는 (Pro, Gly, Ala, Ser)로 이루어진 군으로부터 선택되는 임의의 아미노산이며, X는 임의의 아미노산이고, Φ는 (Val, Ile, Leu, Phe, Trp, Tyr, Met)로 이루어진 군으로부터 선택되는 임의의 아미노산이며, (+)는 (Lys, Arg, His)로 이루어진 군으로부터 선택되는 임의의 아미노산이고; 5번 위치는 (+)가 아니며, 6번 위치는 (+)도 (Asp 또는 Glu)도 아니거나; 또는
(iii) (M)(G)(π)(ξ)(Φ/π)(S/A/G/N)(+)(+) 또는 N-말단 (M)이 없는 상응하는 서열, 여기서 각 괄호의 위치는 아미노산을 나타내고, π는 (Pro, Gly, Ala, Ser)로 이루어진 군으로부터 선택되는 임의의 아미노산이며, ξ는 (Asn, Gln, Ser, Thr, Asp, Glu, Lys, His, Arg)로 이루어진 군으로부터 선택되는 임의의 아미노산이고, Φ는 (Val, Ile, Leu, Phe, Trp, Tyr, Met)로 이루어진 군으로부터 선택되는 임의의 아미노산이며, (+)는 (Lys, Arg, His)로 이루어진 군으로부터 선택되는 임의의 아미노산이고; 5번 위치는 (+)가 아니며, 6번 위치는 (+)도 (Asp 또는 Glu)도 아니다.
일부 실시형태에서, 스캐폴드의 폴리펩타이드는 서열번호 4 내지 서열번호 110 중 임의의 서열 또는 N-말단 M이 없는 임의의 상응하는 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 서열번호 13의 서열 또는 N-말단 M이 없는 상응하는 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 서열번호 110의 서열 또는 N-말단 M이 없는 상응하는 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 MGXKLSKKK(서열번호 116)의 서열을 포함하되, X는 임의의 아미노산 또는 N-말단 M이 없는 상응하는 서열이다.
일 양태에서, 본 개시내용은 본 명세서에서 제공되는 폴리펩타이드를 암호화하는 코딩 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 작제물을 제공한다. 일부 실시형태에서, 코딩 서열은 코돈 최적화된다.
다른 양태에서, 본 개시내용은 다음 단계를 포함하는 조작된 EV, 예를 들어, 엑소솜을 제조하는 방법을 제공한다:
a. 세포에 다음을 포함하는 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 작제물을 도입하는 단계,
(i) MARCKS, MARCKSL1, BASP1, 또는 이들의 단편 또는 변형을 암호화하는 제1 서열, 및
(ii) 페이로드, 예를 들어, 치료적 펩타이드와 같은 생물학적으로 활성인 분자를 암호화하는 제2 서열;
b. 세포가 융합 폴리펩타이드를 발현하도록 허용하는 조건하에서 세포를 유지하는 단계; 및
c. 상기 세포로부터 융합 폴리펩타이드를 포함하는 조작된 엑소솜을 얻는 단계.
일부 실시형태에서, 제1 서열은 다음의 서열을 포함한다:
(i) (M)(G)(G/A/S)(K/Q)(L/F/S/Q)(S/A)(K)(K)(서열번호 118) 또는 N-말단 (M)이 없는 상응하는 서열;
(ii) (M)(G)(π)(X)(Φ/π)(π)(+)(+) 또는 N-말단 (M)이 없는 상응하는 서열, 여기서 각 괄호의 위치는 아미노산을 나타내고, π는 (Pro, Gly, Ala, Ser)로 이루어진 군으로부터 선택되는 임의의 아미노산이며, X는 임의의 아미노산이고, Φ는 (Val, Ile, Leu, Phe, Trp, Tyr, Met)로 이루어진 군으로부터 선택되는 임의의 아미노산이며, (+)는 (Lys, Arg, His)로 이루어진 군으로부터 선택되는 임의의 아미노산이고; 5번 위치는 (+)가 아니며, 6번 위치는 (+)도 (Asp 또는 Glu)도 아니거나; 또는
(iii) (M)(G)(π)(ξ)(Φ/π)(S/A/G/N)(+)(+) 또는 N-말단 (M)이 없는 상응하는 서열, 여기서 각 괄호의 위치는 아미노산을 나타내고, π는 (Pro, Gly, Ala, Ser)로 이루어진 군으로부터 선택되는 임의의 아미노산이며, ξ는 (Asn, Gln, Ser, Thr, Asp, Glu, Lys, His, Arg)로 이루어진 군으로부터 선택되는 임의의 아미노산이고, Φ는 (Val, Ile, Leu, Phe, Trp, Tyr, Met)로 이루어진 군으로부터 선택되는 임의의 아미노산이며, (+)는 (Lys, Arg, His)로 이루어진 군으로부터 선택되는 임의의 아미노산이고; 5번 위치는 (+)가 아니며, 6번 위치는 (+)도 (Asp 또는 Glu)도 아니다.
일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 4 내지 서열번호 110 중 임의의 서열 또는 N-말단 M이 없는 임의의 상응하는 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 13의 서열 또는 N-말단 M이 없는 상응하는 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 110의 서열 또는 N-말단 M이 없는 상응하는 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 MGXKLSKKK(서열번호 116)의 서열 또는 N-말단 M이 없는 상응하는 서열을 포함하되, X는 임의의 아미노산이다.
일부 실시형태에서, 융합 폴리펩타이드는 상이한 EV, 예를 들어, 엑소솜의 상이한 스캐폴드 단백질보다 더 높은 밀도로 조작된 EV, 예를 들어, 조작된 엑소솜의 내강 표면에 존재하되, 상이한 스캐폴드 단백질은 종래의 EV, 예를 들어, 엑소솜 단백질 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 융합 폴리펩타이드는 상이한 EV, 예를 들어, 엑소솜의 상이한 스캐폴드 단백질 보다 2배 초과의 더 높은 밀도로 존재한다.
일부 실시형태에서, 융합 폴리펩타이드는 상이한 EV, 예를 들어, 엑소솜의 상이한 스캐폴드 단백질보다 4배, 16배, 100배 또는 10,000배 초과의 더 높은 밀도로 존재한다.
본 개시내용은 스캐폴드 단백질에 연결된 생물학적으로 활성인 분자를 포함하는 단리된 세포외 소포체(EV)체에 관한 것이되, 스캐폴드 단백질은 N-말단 도메인(N-terminus domain: ND) 및 효과기 도메인(effector domain: ED)을 포함하고, ND 및 ED는 이온 상호작용에 의해 EV의 내강 표면과 관련되며, ED는 서열에서 적어도 2개의 인접한 라이신(Lys)을 포함한다. 일부 실시형태에서, ND는 미리스토일화를 통해 EV의 내강 표면과 관련된다. 다른 실시형태에서, ND는 N-말단에 Gly를 갖는다.
일부 실시형태에서, ED는 적어도 3개의 Lys, 적어도 4개의 Lys, 적어도 5개의 Lys, 적어도 6개의 Lys 또는 적어도 7개의 Lys를 포함한다. 다른 실시형태에서, ED는 펩타이드 결합에 의해 ND에 연결된다. 일부 실시형태에서, ED는 (Lys)n을 포함하되, n은 1 내지 10의 정수이다. 다른 실시형태에서, ED는 KK, KKK, KKKK(서열번호 151), KKKKK(서열번호 152) 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
다른 실시형태에서, ND는 G:X2:X3:X4:X5:X6으로 제시되는 아미노산 서열을 포함하되, G는 Gly로 표시되는 글리신이고; ":"는 펩타이드 결합을 나타내며, X2 내지 X6 각각은 독립적으로 아미노산이고; X6은 염기성 아미노산을 포함한다. 일부 실시형태에서, X6은 Lys, Arg 및 His로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 실시형태에서, 개시내용은 스캐폴드 단백질에 연결된 생물학적으로 활성인 분자를 포함하는 단리된 세포외 소포체(EV)이되, 스캐폴드 단백질은 N-말단 도메인(ND) 및 효과기 도메인(ED)을 포함하고, ND는 G:X2:X3:X4:X5:X6으로 제시되는 아미노산 서열을 포함하며, G는 Gly로 표시되는 글리신이고; ":"는 펩타이드 결합을 나타내며, X2 내지 X6 각각은 독립적으로 아미노산이고; X6은 염기성 아미노산을 포함하며, ED는 펩타이드 결합에 의해 X6에 연결되고 ED의 N-말단에 적어도 하나의 라이신을 포함한다. 일부 실시형태에서, ED는 바이러스의 막관통 도메인 또는 세포질 도메인을 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, X2는 Pro, Gly, Ala 및 Ser로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 실시형태에서, X4는 Pro, Gly, Ala, Ser, Val, Ile, Leu, Phe, Trp, Tyr, Gln 및 Met로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, X5는 Pro, Gly, Ala 및 Ser로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 스캐폴드 단백질의 ND는 G:X2:X3:X4:X5:X6의 아미노산 서열을 포함하되,
G는 Gly를 나타내고;
":"는 펩타이드 결합을 나타내며;
X2는 Pro, Gly, Ala 및 Ser로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고;
X3은 아미노산이며;
X4는 Pro, Gly, Ala, Ser, Val, Ile, Leu, Phe, Trp, Tyr, Gln 및 Met로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고;
X5는 Pro, Gly, Ala 및 Ser로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이며; 그리고
X6은 Lys, Arg 및 His로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이다.
일부 실시형태에서, X3은 Asn, Gln, Ser, Thr, Asp, Glu, Lys, His 및 Arg로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, ND 및 ED는 링커에 의해 결합된다. 일부 실시형태에서, 링커는 하나 이상의 아미노산을 포함한다.
일부 실시형태에서, 개시내용은 스캐폴드 단백질에 연결된 생물학적으로 활성인 분자를 포함하는 단리된 세포외 소포체(EV)에 관한 것이되, 스캐폴드 단백질은 ND―ED를 포함하고, 여기서:
ND는 G:X2:X3:X4:X5:X6을 포함하되;
G는 Gly를 나타내고;
":"는 펩타이드 결합을 나타내며;
X2는 Pro, Gly, Ala 및 Ser로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고;
X3은 아미노산이며;
X4는 Pro, Gly, Ala, Ser, Val, Ile, Leu, Phe, Trp, Tyr, Glu 및 Met로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고;
X5는 Pro, Gly, Ala 및 Ser로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이며;
X6은 Lys, Arg 및 His로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고;
"―"는 하나 이상의 아미노산을 포함하는 선택적 링커이며; 그리고
ED는 (i) 펩타이드 결합 또는 하나 이상의 아미노산에 의해 X6에 연결된 적어도 2개의 인접한 라이신(Lys) 또는 (ii) 펩타이드 결합에 의해 X6에 직접 연결된 적어도 하나의 라이신을 포함하는 효과기 도메인이다.
다른 실시형태에서, X2는 Gly 및 Ala로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, X3은 Lys이다. 일부 실시형태에서, X4는 Leu 또는 Glu이다. 일부 실시형태에서, X5는 Ser 및 Ala로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, X6은 Lys이다. 다른 실시형태에서, X2는 Gly, Ala 또는 Ser이고; X3은 Lys 또는 Glu이며, X4는 Leu, Phe, Ser 및 Glu이고, X5는 Ser 또는 Ala이며; X6은 Lys이다.
일부 실시형태에서, ND 및 ED는 하나 이상의 아미노산을 포함하는 링커에 의해 연결된다. 일부 실시형태에서, ED는 Lys(K), KK, KKK, KKKK(서열번호 151), KKKKK(서열번호 152) 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
일부 실시형태에서, 스캐폴드 단백질은 (i) GGKLSKK(서열번호 157), (ii) GAKLSKK(서열번호 158), (iii) GGKQSKK(서열번호 159), (iv) GGKLAKK(서열번호 160) 또는 (v) 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 스캐폴드 단백질은 (i) GGKLSKKK(서열번호 161), (ii) GGKLSKKS(서열번호 162), (iii) GAKLSKKK(서열번호 163), (iv) GAKLSKKS(서열번호 164), (v) GGKQSKKK(서열번호 165), (vi) GGKQSKKS(서열번호 166), (vii) GGKLAKKK(서열번호 167), (viii) GGKLAKKS(서열번호 168) 및 (ix) 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 스캐폴드 단백질은 적어도 약 8개, 적어도 약 9개, 적어도 약 10개, 적어도 약 11개, 적어도 약 12개, 적어도 약 13개, 적어도 약 14개, 적어도 약 15개, 적어도 약 16개, 적어도 약 17개, 적어도 약 18개, 적어도 약 19개, 적어도 약 20개, 적어도 약 21개, 적어도 약 22개, 적어도 약 23개, 적어도 약 24개, 적어도 약 25개, 적어도 약 30개, 적어도 약 35개, 적어도 약 40개, 적어도 약 45개, 적어도 약 50개, 적어도 약 55개, 적어도 약 60개, 적어도 약 65개, 적어도 약 70개, 적어도 약 75개, 적어도 약 80개, 적어도 약 85개, 적어도 약 90개, 적어도 약 95개, 적어도 약 100개, 적어도 약 105개, 적어도 약 110개, 적어도 약 120개, 적어도 약 130개, 적어도 약 140개, 적어도 약 150개, 적어도 약 160개, 적어도 약 170개, 적어도 약 180개, 적어도 약 190 또는 적어도 약 200개의 아미노산 길이이다.
일부 실시형태에서, 스캐폴드 단백질은 (i) GGKLSKKKKGYNVN(서열번호 169), (ii) GAKLSKKKKGYNVN(서열번호 170), (iii) GGKQSKKKKGYNVN(서열번호 171), (iv) GGKLAKKKKGYNVN(서열번호 172), (v) GGKLSKKKKGYSGG(서열번호 173), (vi) GGKLSKKKKGSGGS(서열번호 174), (vii) GGKLSKKKKSGGSG(서열번호 175), (viii) GGKLSKKKSGGSGG(서열번호 176), (ix) GGKLSKKSGGSGGS(서열번호 177), (x) GGKLSKSGGSGGSV(서열번호 178) 또는 (xi) GAKKSKKRFSFKKS(서열번호 179)를 포함한다.
일부 실시형태에서, 스캐폴드 단백질은 N-말단에 Met를 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, 스캐폴드 단백질은 스캐폴드 단백질의 N-말단에 미리스토일화된 아미노산 잔기를 포함한다. 일부 실시형태에서, 스캐폴드 단백질의 N-말단에 있는 아미노산 잔기는 Gly이다. 일부 실시형태에서, 스캐폴드 단백질의 N-말단에 있는 아미노산 잔기는 합성이다. 일부 실시형태에서, 스캐폴드 단백질의 N-말단에 있는 아미노산 잔기는 글리신 유사체이다.
일부 실시형태에서, 스캐폴드 단백질은 서열번호 1(MARKS), 서열번호 2(MARCKSL1) 또는 서열번호 3(BASP1)과 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 생물학적으로 활성인 분자는 EV의 내강 표면 또는 내강에 있다. 일부 실시형태에서, 스캐폴드 단백질은 막관통 도메인을 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 막관통 도메인은 스캐폴드 단백질의 ED 도메인과 생물학적으로 활성인 분자 사이에 있다. 일부 실시형태에서, 스캐폴드 단백질은 소포체외 도메인(extravesicular domain)을 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 생물학적으로 활성인 분자는 소포체외 도메인에 연결된다.
일부 실시형태에서, 스캐폴드 단백질은 링커에 의해 생물학적으로 활성인 분자에 연결된다. 일부 실시형태에서, ND 도메인은 링커에 의해 ED 도메인에 연결된다. 일부 실시형태에서, 링커는 하나 이상의 아미노산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 링커는 절단성 링커를 포함한다. 일부 실시형태에서, 링커는 가요성 링커를 포함한다.
다른 실시형태에서, 생물학적으로 활성인 분자는 단백질, 폴리펩타이드, 펩타이드, 폴리뉴클레오타이드(DNA 및/또는 RNA), 화학적 화합물, 바이러스, 이오노포어(ionophore), 이오노포어를 위한 담체, 채널 또는 기공을 형성하는 모이어티 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시형태에서, 단백질은 재조합 펩타이드, 천연 펩타이드, 합성 펩타이드, 항체, 융합 단백질 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시형태에서, 단백질은 효소, 사이토카인, 리간드, 수용체, 전사 인자 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시형태에서, 바이러스는 아데노-관련 바이러스, 파보바이러스, 레트로바이러스, 아데노바이러스 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
다른 실시형태에서, EV는 제2 스캐폴드 단백질을 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 스캐폴드 단백질은 PTGFRN 폴리펩타이드, BSG 폴리펩타이드, IGSF2 폴리펩타이드, IGSF3 폴리펩타이드, IGSF8 폴리펩타이드, ITGB1 폴리펩타이드, ITGA4 폴리펩타이드, SLC3A2 폴리펩타이드, ATP 수송자 폴리펩타이드, 아미노펩티데이스 N(aminopeptidase N: ANPEP) 폴리펩타이드, 엑토뉴클레오타이드 파이로포스파테이스/포스포다이에스터레이스 패밀리 구성원 1(ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase family member 1: ENPP1) 폴리펩타이드, 네프릴리신(MME) 폴리펩타이드, 뉴로필린-1(NRP1) 폴리펩타이드 또는 이들의 단편을 포함한다. 일부 실시형태에서, 생물학적으로 활성인 분자는 음성 관문 조절자(negative checkpoint regulator)에 대한 저해제 또는 음성 관문 조절자의 결합 파트너에 대한 저해제이다. 일부 실시형태에서, 음성 관문 조절자는 세포독성 T-림프구-관련 단백질 4(cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4: CTLA-4), 세포예정사 단백질 1(programmed cell death protein 1: PD-1), 림프구-활성화 유전자 3(lymphocyte-activated gene 3: LAG-3), T-세포 면역글로불린 뮤신-함유 단백질 3(T-cell immunoglobulin mucin-containing protein 3: TIM-3), B 및 T 림프구 감쇠자(B and T lymphocyte attenuator: BTLA), Ig 및 ITIM 도메인을 갖는 T 세포 면역수용체(T cell immunoreceptor with Ig and ITIM domains: TIGIT), T 세포 활성화의 V-도메인 Ig 억제자(V-domain Ig suppressor of T cell activation: VISTA), 아데노신 A2a 수용체(Adenosine A2a receptor: A2aR), 살해 세포 면역글로불린 유사 수용체(killer cell immunoglobulin like receptor: KIR), 인돌아민 2,3-다이옥시게네이스(indoleamine 2,3-dioxygenase: IDO), CD20, CD39 및 CD73으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 생물학적으로 활성인 분자는 면역원성 단백질이다.
다른 실시형태에서, 생물학적으로 활성인 분자는 독소, 톡소이드 또는 독소의 무독성 돌연변이체이다. 일부 실시형태에서, 독소는 디프테리아 독소이다. 일부 실시형태에서, 톡소이드는 파상풍 톡소이드이다. 일부 실시형태에서, 생물학적으로 활성인 분자는 디프테리아 독소의 무독성 돌연변이체이다.
일부 실시형태에서, 생물학적으로 활성인 분자는 양성 공동-자극 분자에 대한 활성자 또는 양성 공동-자극 분자의 결합 파트너에 대한 활성자이다. 일부 실시형태에서, 양성 공동-자극 분자는 TNF 수용체 슈퍼패밀리 구성원이다. 일부 실시형태에서, TNF 수용체 슈퍼패밀리 구성원은 CD120a, CD120b, CD18, OX40, CD40, Fas 수용체, M68, CD27, CD30, 4-1BB, TRAILR1, TRAILR2, TRAILR3, TRAILR4, RANK, OCIF, TWEAK 수용체, TACI, BAFF 수용체, ATAR, CD271, CD269, AITR, TROY, CD358, TRAMP 및 XEDAR로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 양성 공동-자극 분자에 대한 활성자는 TNF 슈퍼패밀리 구성원이다. 일부 실시형태에서, TNF 슈퍼패밀리 구성원은 TNFα, TNF-C, OX40L, CD40L, FasL, LIGHT, TL1A, CD27L, Siva, CD153, 4-1BB 리간드, TRAIL, RANKL, TWEAK, APRIL, BAFF, CAMLG, NGF, BDNF, NT-3, NT-4, GITR 리간드 및 EDA-2로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 양성 공동-자극 분자는 CD28-슈퍼패밀리 공동-자극 분자이다. 일부 실시형태에서, CD28-슈퍼패밀리 공동-자극 분자는 ICOS 또는 CD28이다. 일부 실시형태에서, 양성 공동-자극 분자에 대한 활성자는 ICOSL, CD80 또는 CD86이다.
다른 실시형태에서, 사이토카인은 IL-2, IL-7, IL-10, IL-12 및 IL-15로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 단백질은 T-세포 수용체(T-cell receptor: TCR), T-세포 공동-수용체, 주조직 적합성 복합체(major histocompatibility complex: MHC), 인간 백혈구 항원(human leukocyte antigen: HLA) 또는 이들의 유도체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 단백질은 종양 항원을 포함한다. 일부 실시형태에서, 종양 항원은 알파-태아단백질(alpha-fetoprotein: AFP), 암배아 항원(carcinoembryonic antigen: CEA), 상피 종양 항원(epithelial tumor antigen: ETA), 뮤신 1(mucin 1: MUC1), Tn-MUC1, 뮤신 16(MUC16), 타이로시네이스, 흑색종-관련 항원(melanoma-associated antigen: MAGE), 종양 단백질 p53(p53), CD4, CD8, CD45, CD80, CD86, 예정사 리간드 1(programmed death ligand 1: PD-L1), 예정사 리간드 2(PD-L2), NY-ESO-1, PSMA, 태그-72, HER2, GD2, cMET, EGFR, 메소텔린, VEGFR, 알파-폴레이트 수용체, CE7R, IL-3, 암-고환 항원, MART-1 gp100 및 TNF-관련 아폽토시스-유도성 리간드로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 실시형태에서, EV는 엑소솜이다.
일부 실시형태에서, 개시내용은 본 개시내용의 EV 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 개시내용은 본 개시내용의 EV를 생산하는 세포에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 개시내용은 본 개시내용의 EV 및 사용 설명서를 포함하는 키트에 관한 것이다.
다른 실시형태에서, 개시내용은 적합한 조건하에 본 개시내용의 세포를 배양하고 EV를 얻는 단계를 포함하는, EV를 제조하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 개시내용은 본 명세서에 개시된 스캐폴드 단백질에 생물학적으로 활성인 분자를 연결시키는 단계를 포함하는, 생물학적으로 활성인 분자를 세포외 소포체에 고정시키는 방법에 관한 것이다.
다른 실시형태에서, 개시내용은 본 개시내용의 EV를 투여하는 단계를 포함하는 질환의 예방 또는 치료를 필요로 하는 대상체에서 질환을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이되, 질환은 항원과 관련된다. 일부 실시형태에서, EV는 비경구로, 경구로, 정맥내로, 근육내로, 종양내로, 비강내로, 피하로 또는 복강내로 투여된다.
실시형태
E1. 스캐폴드 단백질을 포함하는 EV, 예를 들어, 엑소솜으로서, 스캐폴드 단백질의 적어도 일부는 외인성 서열로부터 발현되고, 스캐폴드 단백질은 MARCKS, MARCKSL1, BASP1, 또는 이들의 단편 또는 변형을 포함하는, EV, 예를 들어, 엑소솜.
E2. 실시형태 E1에 있어서, 상기 스캐폴드 단백질은 상이한 EV, 예를 들어, 엑소솜에서의 상이한 스캐폴드 단백질보다 더 높은 밀도로 EV, 예를 들어, 엑소솜에 존재하되, 상이한 스캐폴드 단백질은 종래의 EV, 예를 들어, 엑소솜 단백질 또는 이의 변이체를 포함하는, EV, 예를 들어, 엑소솜.
E3. 실시형태 E2에 있어서, 상기 종래의 EV, 예를 들어, 엑소솜 단백질은 CD9, CD63, CD81, PDGFR, GPI 앵커 단백질, 락타드헤린, LAMP2, LAMP2B 및 이들의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는, EV, 예를 들어, 엑소솜.
E4. 실시형태 E1 내지 E3 중 어느 하나에 있어서, 상기 EV, 예를 들어, 엑소솜은 외인성 서열을 포함하도록 유전적으로 변형된 세포로부터 생산되며, 선택적으로 세포는 HEK293 세포인, EV, 예를 들어, 엑소솜.
E5. 실시형태 E1 내지 E4 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포는 외인성 서열을 포함하는 플라스미드를 포함하는, EV, 예를 들어, 엑소솜.
E6. 실시형태 E1 내지 E5 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포는 세포의 게놈 내로 삽입된 외인성 서열을 포함하는, EV, 예를 들어, 엑소솜.
E7. 실시형태 E1 내지 E6 중 어느 하나에 있어서, 상기 외인성 서열은 MARCKS, MARCKSL1 또는 BASP1을 암호화하는 게놈 서열에 대해 3' 또는 5'에 위치한 게놈 부위 내로 삽입되는, EV, 예를 들어, 엑소솜.
E8. 실시형태 E1 내지 E7 중 어느 하나에 있어서, 상기 외인성 서열은 MARCKS, MARCKSL1 또는 BASP1을 암호화하는 게놈 서열 내로 삽입되는, EV, 예를 들어, 엑소솜.
E9. 실시형태 E1 내지 E8 중 어느 하나에 있어서, 상기 스캐폴드 단백질은 MARCKS, MARCKSL1, BASP1 또는 이들의 단편 및 치료적 펩타이드를 포함하는 융합 단백질인, EV, 예를 들어, 엑소솜.
E10. 실시형태 E9에 있어서, 상기 치료적 펩타이드는 천연 펩타이드, 재조합 펩타이드, 합성 펩타이드 또는 치료적 화합물에 대한 링커로 이루어진 군으로부터 선택되는, EV, 예를 들어, 엑소솜.
E11. 실시형태 E9에 있어서, 상기 치료적 화합물은 뉴클레오타이드, 아미노산, 지질, 탄수화물 및 소분자로 이루어진 군으로부터 선택되는, EV, 예를 들어, 엑소솜.
E12. 실시형태 E9에 있어서, 상기 치료적 펩타이드는 항체, 또는 이의 단편 또는 변형인, EV, 예를 들어, 엑소솜.
E13. 실시형태 E9에 있어서, 상기 치료적 펩타이드는 효소, 리간드, 수용체, 전사 인자, 또는 이들의 단편 또는 변형인, EV, 예를 들어, 엑소솜.
E14. 실시형태 E9에 있어서, 상기 치료적 펩타이드는 항균성 펩타이드, 또는 이의 단편 또는 변형인, EV, 예를 들어, 엑소솜.
E15. 실시형태 E1 내지 E14 중 어느 하나에 있어서, 제2 스캐폴드 단백질을 더 포함하되, 상기 제2 스캐폴드 단백질은 MARCKS, MARCKSL1, BASP1 또는 이들의 단편을 포함하는, EV, 예를 들어, 엑소솜.
E16. 실시형태 E1 내지 E14 중 어느 하나에 있어서, 제2 스캐폴드 단백질을 더 포함하되, 상기 제2 스캐폴드 단백질은 PTGFRN, BSG, IGSF2, IGSF3, IGSF8, ITGB1, ITGA4, SLC3A2, ATP 수송자 또는 이들의 단편을 포함하는, EV, 예를 들어, 엑소솜.
E17. 실시형태 E1 내지 E16 중 어느 하나에 있어서, 상기 스캐폴드 단백질은 서열 (M)(G)(G/A/S)(K/Q)(L/F/S/Q)(S/A)(K)(K)(서열번호 118) 또는 N-말단 (M)이 없는 상응하는 서열의 펩타이드를 포함하는, EV, 예를 들어, 엑소솜.
E18. 실시형태 E1 내지 E17 중 어느 하나에 있어서, 상기 스캐폴드 단백질은 서열 (M)(G)(π)(X)(Φ/π)(π)(+)(+) 또는 N-말단 (M)이 없는 상응하는 서열의 펩타이드를 포함하되, 각 괄호의 위치는 아미노산을 나타내고, π는 (Pro, Gly, Ala, Ser)로 이루어진 군으로부터 선택되는 임의의 아미노산이며, X는 임의의 아미노산이고, Φ는 (Val, Ile, Leu, Phe, Trp, Tyr, Met)로 이루어진 군으로부터 선택되는 임의의 아미노산이며, (+)는 (Lys, Arg, His)로 이루어진 군으로부터 선택되는 임의의 아미노산이고; 5번 위치는 (+)가 아니며, 6번 위치는 (+)도 (Asp 또는 Glu)도 아닌, EV, 예를 들어, 엑소솜.
E19. 실시형태 E1 내지 E18 중 어느 하나에 있어서, 상기 스캐폴드 단백질은 서열 (M)(G)(π)(ξ)(Φ/π)(S/A/G/N)(+)(+) 또는 N-말단 (M)이 없는 상응하는 서열의 펩타이드를 포함하되, 각 괄호의 위치는 아미노산을 나타내고, π는 (Pro, Gly, Ala, Ser)로 이루어진 군으로부터 선택되는 임의의 아미노산이며, ξ는 (Asn, Gln, Ser, Thr, Asp, Glu, Lys, His, Arg)로 이루어진 군으로부터 선택되는 임의의 아미노산이고, Φ는 (Val, Ile, Leu, Phe, Trp, Tyr, Met)로 이루어진 군으로부터 선택되는 임의의 아미노산이며, (+)는 (Lys, Arg, His)로 이루어진 군으로부터 선택되는 임의의 아미노산이고; 5번 위치는 (+)가 아니며, 6번 위치는 (+)도 (Asp 또는 Glu)도 아닌, EV, 예를 들어, 엑소솜.
E20. 실시형태 E18 또는 E19에 있어서, 상기 스캐폴드 단백질은 서열번호 4 내지 서열번호 110 중 어느 하나 또는 N-말단 M이 없는 임의의 상응하는 서열의 펩타이드를 포함하는, EV, 예를 들어, 엑소솜.
E21. 실시형태 E18 또는 E19에 있어서, 상기 스캐폴드 단백질은 MGXKLSKKK(서열번호 116) 또는 N-말단 M이 없는 상응하는 서열의 펩타이드를 포함하되, X는 임의의 아미노산인, EV, 예를 들어, 엑소솜.
E22. 실시형태 E20에 있어서, 상기 스캐폴드 단백질은 서열번호 110 또는 N-말단 M이 없는 상응하는 서열의 펩타이드를 포함하는, EV, 예를 들어, 엑소솜.
E23. 실시형태 E20에 있어서, 상기 스캐폴드 단백질은 서열번호 13 또는 N-말단 M이 없는 상응하는 서열의 펩타이드를 포함하는, EV, 예를 들어, 엑소솜.
E24. 실시형태 E1 내지 E24 중 어느 하나에 있어서, 상기 스캐폴드 단백질은 페이로드, 예를 들어, 펩타이드와 같은 생물학적으로 활성인 분자를 더 포함하는, EV, 예를 들어, 엑소솜.
E25. 실시형태 E1 내지 E24 중 어느 하나의 EV, 예를 들어, 엑소솜 및 부형제를 포함하는 약제학적 조성물.
E26. 실시형태 E25에 있어서, 거대분자가 실질적으로 없되, 거대분자는 핵산, 외인성 단백질, 지질, 탄수화물, 대사 산물 및 이들의 조합으로부터 선택되는, 약제학적 조성물.
E27. 실시형태 E1 내지 E24 중 어느 하나의 EV, 예를 들어, 엑소솜을 생산하기 위한 세포 집단.
E28. 실시형태 E27에 있어서, MARCKS, MARCKSL1, BASP1, 또는 이들의 단편 또는 변형을 포함하는 스캐폴드 단백질을 암호화하는 외인성 서열을 포함하는, 세포 집단.
E29. 실시형태 E28에 있어서, 제2 스캐폴드 단백질을 암호화하는 제2 외인성 서열을 더 포함하되, 상기 제2 스캐폴드 단백질은 MARCKS, MARCKSL1, BASP1, 또는 이들의 단편 또는 변형을 포함하는, 세포 집단.
E30. 실시형태 E28에 있어서, 제2 스캐폴드 단백질을 암호화하는 제2 외인성 서열을 더 포함하되, 상기 제2 스캐폴드 단백질은 PTGFRN, BSG, IGSF2, IGSF3, IGSF8, ITGB1, ITGA4, SLC3A2, ATP 수송자 또는 이들의 단편을 포함하는, 세포 집단.
E31. 실시형태 E27 내지 E30 중 어느 하나에 있어서, 상기 외인성 서열은 MARCKS, MARCKSL1 또는 BASP1을 암호화하는 게놈 서열에 삽입되되, 외인성 서열 및 게놈 서열은 스캐폴드 단백질을 암호화하는, 세포 집단.
E32. 실시형태 E27 내지 E30 중 어느 하나에 있어서, 상기 외인성 서열은 플라스미드에 있는, 세포 집단.
E33. 실시형태 E27 내지 E32 중 어느 하나에 있어서, 상기 외인성 서열은 생물학적으로 활성인 분자, 예를 들어, 치료적 펩타이드를 암호화하는, 세포 집단.
E34. 실시형태 E33에 있어서, 상기 치료적 펩타이드는 천연 펩타이드, 재조합 펩타이드, 합성 펩타이드 또는 치료적 화합물에 대한 링커로 이루어진 군으로부터 선택되는, 세포 집단.
E35. 실시형태 E33에 있어서, 상기 치료적 화합물은 뉴클레오타이드, 아미노산, 지질, 탄수화물 및 소분자로 이루어진 군으로부터 선택되는, 세포 집단.
E36. 실시형태 E33에 있어서, 상기 치료적 펩타이드는 항체, 또는 이들의 단편 또는 변형인, 세포 집단.
E37. 실시형태 E33에 있어서, 상기 치료적 펩타이드는 효소, 리간드, 수용체, 전사 인자, 또는 이들의 단편 또는 변형인, 세포 집단.
E38. 실시형태 E33에 있어서, 상기 치료적 펩타이드는 항균성 펩타이드, 또는 이들의 단편 또는 변형인, 세포 집단.
E39. 실시형태 E28에 있어서, 상기 외인성 서열은 표적화 모이어티를 암호화하는, 세포 집단.
E40. 실시형태 E39에 있어서, 상기 표적화 모이어티는 장기, 조직 또는 세포에 특이적인, 세포 집단.
E41. 실시형태 E29 또는 E30에 있어서, 상기 제2 스캐폴드 단백질은 표적화 모이어티를 더 포함하는, 세포 집단.
E42. 실시형태 E41에 있어서, 상기 표적화 모이어티는 장기, 조직 또는 세포에 특이적인, 세포 집단.
E43. 다음의 서열을 포함하는 EV, 예를 들어, 엑소솜을 변형하기 위한 폴리펩타이드:
(i) (M)(G)(G/A/S)(K/Q)(L/F/S/Q)(S/A)(K)(K)(서열번호 118) 또는 N-말단 (M)이 없는 상응하는 서열;
(ii) (M)(G)(π)(X)(Φ/π)(π)(+)(+)또는 N-말단 (M)이 없는 상응하는 서열, 여기서 각 괄호의 위치는 아미노산을 나타내고, π는 (Pro, Gly, Ala, Ser)로 이루어진 군으로부터 선택되는 임의의 아미노산이며, X는 임의의 아미노산이고, Φ는 (Val, Ile, Leu, Phe, Trp, Tyr, Met)로 이루어진 군으로부터 선택되는 임의의 아미노산이며, (+)는 (Lys, Arg, His)로 이루어진 군으로부터 선택되는 임의의 아미노산이고; 5번 위치는 (+)가 아니며, 6번 위치는 (+)도 (Asp 또는 Glu)도 아니거나; 또는
(iii) (M)(G)(π)(ξ)(Φ/π)(S/A/G/N)(+)(+) 또는 N-말단 (M)이 없는 상응하는 서열, 여기서 각 괄호의 위치는 아미노산을 나타내고, π는 (Pro, Gly, Ala, Ser)로 이루어진 군으로부터 선택되는 임의의 아미노산이며, ξ는 (Asn, Gln, Ser, Thr, Asp, Glu, Lys, His, Arg)로 이루어진 군으로부터 선택되는 임의의 아미노산이고, Φ는 (Val, Ile, Leu, Phe, Trp, Tyr, Met)로 이루어진 군으로부터 선택되는 임의의 아미노산이며, (+)는 (Lys, Arg, His)로 이루어진 군으로부터 선택되는 임의의 아미노산이고; 5번 위치는 (+)가 아니며, 6번 위치는 (+)도 (Asp 또는 Glu)도 아니다.
E44. 실시형태 E43에 있어서, 서열번호 4 내지 서열번호 110 중 임의의 서열 또는 N-말단 M이 없는 임의의 상응하는 서열을 포함하는, 폴리펩타이드.
E45. 실시형태 E43에 있어서, 서열번호 13의 서열 또는 N-말단 M이 없는 상응하는 서열을 포함하는, 폴리펩타이드.
E46. 실시형태 E43에 있어서, 서열번호 110의 서열 또는 N-말단 M이 없는 상응하는 서열을 포함하는, 폴리펩타이드.
E47. 실시형태 E43에 있어서, MGXKLSKKK(서열번호 116)의 서열 또는 N-말단 M이 없는 상응하는 서열을 포함하되, X는 임의의 아미노산인, 폴리펩타이드.
E48. 실시형태 E43 내지 E47 중 어느 하나에 있어서, 폴리펩타이드는 페이로드, 예를 들어, 펩타이드와 같은 생물학적으로 활성인 분자에 융합되는, 폴리펩타이드.
E49. 실시형태 E48에 있어서, 폴리펩타이드는 펩타이드의 N-말단에 융합되는, 폴리펩타이드.
E50. 실시형태 E43 내지 E49 중 어느 하나에 따른 폴리펩타이드를 암호화하는 코딩 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오타이드 작제물.
E51. 실시형태 E50에 있어서, 상기 코딩 서열은 코돈 최적화되는, 폴리뉴클레오타이드 작제물.
E52. 조작된 EV, 예를 들어, 엑소솜을 제조하는 방법으로서,
a. (i) MARCKS, MARCKSL1, BASP1, 또는 이들의 단편 또는 변형을 암호화하는 제1 서열 및 (ii) 페이로드, 예를 들어, 펩타이드와 같은 생물학적으로 활성인 분자를 암호화하는 제2 서열을 포함하는 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 작제물을 세포로 도입하는 단계;
b. 세포가 융합 폴리펩타이드를 발현하는 것을 허용하는 조건하에 세포를 유지하는 단계; 및
c. 상기 세포로부터의 융합 폴리펩타이드를 포함하는 조작된 EV, 예를 들어, 엑소솜을 얻는 단계
를 포함하는, 조작된 EV, 예를 들어, 엑소솜을 제조하는 방법.
E53. 실시형태 E52에 있어서, 상기 제1 서열은 다음의 서열을 포함하는, 조작된 EV, 예를 들어, 엑소솜을 제조하는 방법:
(i) (M)(G)(G/A/S)(K/Q)(L/F/S/Q)(S/A)(K)(K)(서열번호 118) 또는 N-말단 (M)이 없는 상응하는 서열;
(ii) (M)(G)(π)(X)(Φ/π)(π)(+)(+) 또는 N-말단 (M)이 없는 상응하는 서열, 여기서 각 괄호의 위치는 아미노산을 나타내고, π는 (Pro, Gly, Ala, Ser)로 이루어진 군으로부터 선택되는 임의의 아미노산이며, X는 임의의 아미노산이고, Φ는 (Val, Ile, Leu, Phe, Trp, Tyr, Met)로 이루어진 군으로부터 선택되는 임의의 아미노산이며, (+)는 (Lys, Arg, His)로 이루어진 군으로부터 선택되는 임의의 아미노산이고; 5번 위치는 (+)가 아니며, 6번 위치는 (+)도 (Asp 또는 Glu)도 아니거나; 또는
(iii) (M)(G)(π)(ξ)(Φ/π)(S/A/G/N)(+)(+) 또는 N-말단 (M)이 없는 상응하는 서열, 여기서 각 괄호의 위치는 아미노산을 나타내고, π는 (Pro, Gly, Ala, Ser)로 이루어진 군으로부터 선택되는 임의의 아미노산이며, ξ는 (Asn, Gln, Ser, Thr, Asp, Glu, Lys, His, Arg)로 이루어진 군으로부터 선택되는 임의의 아미노산이고, Φ는 (Val, Ile, Leu, Phe, Trp, Tyr, Met)로 이루어진 군으로부터 선택되는 임의의 아미노산이며, (+)는 (Lys, Arg, His)로 이루어진 군으로부터 선택되는 임의의 아미노산이고; 5번 위치는 (+)가 아니며, 6번 위치는 (+)도 (Asp 또는 Glu)도 아니다.
E54. 실시형태 E52 또는 E53에 있어서, 상기 제1 서열은 임의의 서열번호 4 내지 서열번호 110 또는 N-말단 M이 없는 임의의 상응하는 서열을 포함하는, 조작된 EV, 예를 들어, 엑소솜을 제조하는 방법.
E55. 실시형태 E54에 있어서, 상기 제1 서열은 서열번호 13 또는 N-말단 M이 없는 상응하는 서열을 포함하는, 조작된 EV, 예를 들어, 엑소솜을 제조하는 방법.
E56. 실시형태 E55에 있어서, 상기 제1 서열은 서열번호 110 또는 N-말단 M이 없는 상응하는 서열을 포함하는, 조작된 EV, 예를 들어, 엑소솜을 제조하는 방법.
E57. 실시형태 E53에 있어서, 상기 제1 서열은 MGXKLSKKK(서열번호 116) 또는 N-말단 M이 없는 상응하는 서열을 포함하되, X는 임의의 아미노산인, 조작된 EV, 예를 들어, 엑소솜을 제조하는 방법.
E58. 실시형태 E52 내지 E57 중 어느 하나에 있어서, 상기 융합 폴리펩타이드는 상이한 EV, 예를 들어, 엑소솜에서의 상이한 스캐폴드 단백질보다 더 높은 밀도로 조작된 EV, 예를 들어, 엑소솜의 내강 표면에 존재하되, 상기 상이한 스캐폴드 단백질은 종래의 EV, 예를 들어, 엑소솜 단백질 또는 이의 변이체를 포함하는, 조작된 EV, 예를 들어, 엑소솜을 제조하는 방법.
E59. 실시형태 E58에 있어서, 상기 융합 폴리펩타이드는 상이한 EV, 예를 들어, 엑소솜에서의 상이한 스캐폴드 단백질보다 2배 초과의 더 높은 밀도로 존재하는, 조작된 EV, 예를 들어, 엑소솜을 제조하는 방법.
E60. 실시형태 E59에 있어서, 상기 융합 폴리펩타이드는 상이한 EV, 예를 들어, 엑소솜에서의 상이한 스캐폴드 단백질보다 4배, 16배, 100배 또는 10,000배 초과의 더 높은 밀도로 존재하는, 조작된 EV, 예를 들어, 엑소솜을 제조하는 방법.
도면은 단지 예시의 목적으로 본 개시내용의 다양한 양태를 묘사한다. 당업자는 본 개시내용은 본 명세서에 기재된 원리로부터 벗어나지 않고 본 명세서에 예시된 구조 및 방법의 대안적인 양태가 사용될 수 있다는 것을 다음의 논의로부터 쉽게 인식할 것이다.
도 1a는 FLAG® 태그 및 GFP에 융합된 BASP1 단편을 포함하는 융합 단백질의 서열을 보여준다(각각 나타나 있는 순서대로 서열번호 135 내지 서열번호 142). 도1b는 도 1a의 융합 단백질 중 하나를 안정적으로 발현하는 세포로부터 정제된 엑소솜에 대한 항-FLAG® 웨스턴 블롯 결과를 보여준다. 도 1a 및 도 1b 모두에 대해, 아미노산 위치, 예를 들어, BASP1, 1-30은 유전자 작제물에 의해 초기에 암호화된 BASP-1 단편을 지칭한다. 첫 번째 Met는 처리 중에 절단된다.
도 2a는 FLAG® 태그 및 GFP에 융합된 BASP1 단편(1-30)(서열번호 4) 및 이의 변형(1-30-S6D, 1-30-S6A 및 1-30-L5Q)으로부터의 서열을 보여준다(각각 나타나 있는 순서대로 서열번호 143 내지 서열번호 145).
도 2b는 도 2a의 융합 단백질 중 하나를 안정적으로 발현하는 세포로부터 정제된 엑소솜에 대한 항-FLAG® 웨스턴 블롯 결과를 보여준다. 도 2a 및 도 2b 모두에 대해, 아미노산 위치, 예를 들어, BASP1, 1-30은 유전자 작제물에 의해 초기에 암호화된 BASP-1 단편을 지칭한다. 첫 번째 Met는 처리 중에 절단된다.
도 3은 모두 FLAG®-GFP에 융합된, 전장 MARCKSL1, BASP1 또는 MARCKS, MARCKSL1 또는 BASP1의 아미노산 1-30을 안정적으로 발현하는 세포로부터 정제된 엑소솜 샘플을 사용한 Coomassie® 염색된 단백질 겔의 이미지를 보여준다. 이미지 상의 흰색 화살표는 융합 단백질에 해당하는 밴드를 나타낸다. 도 3의 경우, 아미노산 위치, 예를 들어, BASP1, 1-30은 유전자 작제물에 의해 초기에 암호화된 BASP-1 단편을 지칭한다. 첫 번째 Met는 처리 중에 절단된다.
도 4는 BASP1의 처음 28개의 아미노산(보존된 영역 1), MARCKS의 아미노산 1-7 및 152-173(보존된 영역 2) 및 MARCKSL1의 아미노산 1-7 및 87-110(보존된 영역 3) 간의 단백질 서열 정렬을 보여준다.
도 5a는 BASP1의 아미노산 1-30의 서열("BASP1-30")(서열번호 4), 및 MARCKS의 PSD 도메인 또는 이의 변형("MARCKS-MG-PSD", "MARCKS-MA-PSD", "MARCKS-MG-PSD-K6S" 및 "MARCKS-MG-PSD-K6A")(각각 나타나 있는 순서대로 서열번호 146 내지 서열번호 149)에 융합된 MARCKS의 아미노산 1-3 또는 이의 변형을 포함하는 융합 단백질을 보여준다. MARCKS 서열로 도입된 점 돌연변이는 굵게 표시된다. 아미노산 위치, 예를 들어, BASP1의 aa 1-30 또는 MARCKS의 aa 1-3은 유전자 작제물에 의해 초기에 암호화된 단편을 지칭한다. 첫 번째 Met는 처리 중에 절단된다.
도 5b는 도 5a의 아미노산 서열 및 FLAG®를 포함하는 융합 단백질을 안정적으로 발현하는 세포로부터의 정제된 엑소솜의 항-FLAG® 웨스턴 블로팅 결과를 보여준다.
도 6은 MARCKS, MARCKSL1 및 BASP1의 기능 연구로부터 유래된 3개의 상이한 컨센서스 서열(3개의 서열 모두 서열번호 118로 표시됨) 및 내강 표면에의 부착을 통해 페이로드를 엑소솜의 내강으로 로딩하기 위한 각 서열의 아미노산 요구사항을 보여준다.
도 7a는 BASP1의 아미노산 1-10 또는 1-30에 융합된 Cas9를 안정적으로 발현할 뿐만 아니라 재조합 Cas9의 양을 감소시키는 세포로부터 정제된 천연 엑소솜 또는 엑소솜의 총 단백질(상단) 및 항-Cas9 웨스턴 블롯(하단)을 보여준다. 아미노산 위치, 예를 들어, BASP의 aa 1-10 또는 BASP1의 aa 1-30은 유전자 작제물에 의해 초기에 암호화된 단편을 지칭한다. 첫 번째 Met는 처리 중에 절단된다.
도 7b의 상단 패널은 도 7a의 웨스턴 블로팅 결과의 Cas9 밀도측정(densitometry)으로부터 유래된 표준 곡선을 보여준다. 하단 패널은 표준 곡선에 기초하여 추정된, BASP1의 1-30 아미노산 또는 1-10 아미노산 단편(처리 후 BASP1의 2-30 아미노산 또는 2-10 아미노산 단편(즉, 첫 번째 Met는 절단됨))에 접합된 융합 단백질로서 각각의 정제된 엑소솜당 로딩된 Cas9의 양을 더 제공한다.
도 8a는 오브알부민("BASP1(1-10)-OVA")에 대한 BASP1 N-말단(아미노산 1-10) 융합을 발현하는 작제물로 안정적으로 형질감염된 세포 또는 2개의 작제물로 안정적으로 형질감염된 세포로부터 정제된 엑소솜의 단백질 겔 이미지를 보여주며, 하나는 오브알부민에 대한 BASP1 N-말단(아미노산 1-10) 융합을 발현하고, 다른 하나는 막관통 단백질 PTGFRN("BASP1(1-10)-OVA; 3XCD40L-PTGFRN")에 융합된 CD40L을 발현한다. 도 8a는 재조합 OVA의 양을 감소시키는 단백질 겔 로딩의 이미지를 추가로 보여준다. 아미노산 넘버링, 예를 들어, 아미노산 1-10은 유전자 작제물에 의해 초기에 암호화된 단편을 지칭한다. 첫 번째 Met는 처리 중에 절단된다.
도 8b는 도 8a의 샘플의 항-오브알부민 웨스턴 블롯 결과를 보여준다.
도 8c는 재조합 ova와 exoTOPE에 융합된 난자를 비교한 웨스턴 블롯 결과를 보여준다. 도 8d는 (i) 엑소솜의 내강 측에 있는 오브알부민에 연결된 exoTOPE 및 (ii) 엑소솜의 내강에 있는 면역 자극제를 포함하는 엑소솜의 다이어그램을 보여준다.
도 9a는 BASP1의 아미노산 1-10 및 FLAG® 태그(서열번호 150)에 융합된 GFP에 대해 지시된 낙타과 나노바디의 서열을 보여준다. 아미노산 넘버링, 예를 들어, BASP1의 아미노산 1-10은 유전자 작제물에 의해 초기에 암호화된 단편을 지칭한다. 첫 번째 Met는 처리 중에 절단된다.
도 9b는 도 10a의 융합 단백질("BASP1(1-10)-나노바디") 또는 BASP1의 서열이 없는 단백질("나노바디")을 안정적으로 발현하는 세포로부터 정제된 엑소솜의 단백질 겔 및 항-FLAG® 웨스턴 블로팅 결과를 보여준다. 아미노산 넘버링, 예를 들어, BASP1(1-10)-나노바디는 유전자 작제물에 의해 초기에 암호화된 단편을 지칭한다. 첫 번째 Met는 처리 중에 절단된다.
도 10은 (i) FLAG® 및 단량체 또는 이량체 MCP 변이체(1XMCP(V29I)("815"; 서열번호 111), 1XMCP(V29I/N55K)("817"; 서열번호 112), 2XMCP(V29I)("819"; 서열번호 113) 또는 2XMCP(V29I/N55K))("821"; 서열번호 114)에 융합된 BASP1(1-30) 및 (ii) 3× MS2 헤어핀 루프를 함유하는 루시퍼레이스 mRNA("루시퍼레이스-MS2 mRNA" 또는 "811"; 서열번호 115)를 포함하는 엑소솜 mRNA 로딩 시스템의 도식을 보여준다. 아미노산 넘버링, 예를 들어, BASP1(1-30), 유전자 작제물에 의해 초기에 암호화된 단편을 지칭한다. 첫 번째 Met는 처리 중에 절단된다.
도 11a는 다양한 BASP1 융합 단백질(815, 817 또는 819)과 조합된 루시퍼레이스 mRNA(811)인 도 10에 기재된 mRNA 로딩 작제물을 함유하는 엑소솜의 단백질 겔을 보여준다.
도 11b는 도 11a의 샘플의 항-FLAG® 웨스턴 블롯을 보여준다.
도 12a는 도 10에 도시된 mRNA 로딩 작제물을 함유하는 세포(상단) 또는 엑소솜(하단)에서 루시퍼레이스 mRNA의 양에 대한 RT-qPCR 결과를 보여준다.
도 12b는 루시퍼레이스 mRNA의 확률적 로딩으로부터의 농축 배수(fold-enrichment)를 포함하는, 도 12a의 샘플로부터 정제된 엑소솜에서 루시퍼레이스 mRNA의 양을 정량화한 표를 보여준다.
도 13은 엑소솜의 내강 표면에 고정된 막관통 단백질의 외부 표면 디스플레이를 허용하기 위해 MARCKS, MARCKSL1 및 BASP1의 N-말단 단편에 융합된 CD40L 삼량체의 대략도를 보여준다. 아미노산 넘버링, 예를 들어, MARCKS 1-30, MARCKSL1 1-30, BASP1 1-30, BASP1 1-10 ExoTOPE는 유전자 작제물에 의해 초기에 암호화된 단편을 지칭한다. 첫 번째 Met는 처리 중에 절단된다.
도 14a는 MARCKS, MARCKSL1 및 BASP1의 N-말단 단편에 융합된 CD40L 표면 발현 엑소솜과 인큐베이션된 배양물에서 마우스 B-세포 활성화의 결과를 보여준다.
도 14b는 MARCKS, MARCKSL1 및 BASP1의 N-말단 단편에 융합된 CD40L 표면 발현 엑소솜과 인큐베이션된 배양물에서 인간 B-세포 활성화의 결과를 보여준다.
도 14c는 MARCKS, MARCKSL1, BASP1 또는 전장 PTGFRN의 N-말단 서열에 융합될 때 상이한 CD40L 표면 디스플레이 엑소솜에 대한 상대적 효능의 차트를 보여준다. 아미노산 넘버링, 예를 들어, BASP1 1-30은 유전자 작제물에 의해 초기에 암호화된 단편을 지칭한다. 첫 번째 Met는 처리 중에 절단된다.
도 15는 내강 단백질(MARCKS, MARCKSL1 및 BASP 1) 및 종래의 EV, 예를 들어, 상이한 기원(HEK293SF, 신장; HT1080, 결합 조직; K562, 골수; MDA-MB-231, 유방; Raji, 림프모세포; 간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell: MSC), 골수)의 다양한 세포주로부터 정제된 엑소솜에서의 엑소솜 단백질(CD81 및 CD9)의 펩타이드 스펙트럼 매치(peptide spectrum match: PSM)의 수를 보여준다.
도 16은 차이니스 햄스터 난소(CHO) 세포-유래 엑소솜 단독 또는 FLAG®-GFP에 융합된 BASP1 또는 BASP1 N-말단 단편(1-30 또는 1-8)을 과발현하는 세포로부터의 엑소솜의 단백질 겔(왼쪽) 및 항-FLAG® 웨스턴 블롯(오른쪽)을 보여준다. 아미노산 넘버링, 예를 들어, BASP1(1-30)은 유전자 작제물에 의해 초기에 암호화된 단편을 지칭한다. 첫 번째 Met는 처리 중에 절단된다.
본 개시내용은 스캐폴드 단백질을 통해 EV, 예를 들어, 엑소솜에 연결된 적어도 하나의 생물학적으로 활성인 분자를 포함하는 세포외 소포체(EV), 예를 들어, 엑소솜에 관한 것이되, 스캐폴드 단백질은 N-말단 도메인(ND) 및 효과기 도메인(ED)을 포함하고, ND 및/또는 ED는 EV, 예를 들어, 엑소솜의 내강 표면과 관련되며, ED는 (i) ED에서 라이신 반복 또는 (ii) ND와 결합될 때 라이신 반복, 예를 들어, ND의 C-말단에서의 K 및 ED의 N-말단에서의 K(여기서, ND 및 ED는 직접, 즉, 펩타이드 결합에 의해 연결됨)를 포함한다. 본 개시내용은 또한 페이로드, 예를 들어, 생물학적으로 활성인 분자, 예를 들어, 7 내지 15개, 7 내지 14개, 7 내지 13개, 7 내지 12개, 7 내지 11개, 7 내지 10개, 7 내지 9개 또는 7 내지 8개의 아미노산 단편을 EV, 예를 들어, 엑소솜의 내강 표면에 고정시킬 수 있는 아미노산의 최소한의 수를 제공할 것이다. ND는 미리스토일화를 통해 EV, 예를 들어, 엑소솜과 관련될 수 있는 반면, ED는 이온 상호작용에 의해, 예를 들어, 인력 정전기적 상호작용을 통해 EV, 예를 들어, 엑소솜의 내강 표면과 관련될 수 있다. 다양한 양태의 비제한적인 예가 본 개시내용에 나타나 있다.
본 개시내용이 더 상세히 기재되기 전에, 본 개시내용은 기재된 특정 조성물 또는 방법 단계에 제한되지 않으며, 물론 변할 수 있음을 이해하여야 한다. 본 개시내용을 읽을 때 당업자에게 명백한 바와 같이, 본 명세서에 기재되고 예시된 각각의 개별적인 양태는 본 개시내용의 범위 또는 사상을 벗어나지 않고 다른 여러 양태 중 임의의 특징으로부터 쉽게 분리되거나 또는 이와 조합될 수 있는 별개의 구성 요소 및 특징을 갖는다. 임의의 인용된 방법은 인용된 사건의 순서로 또는 논리적으로 가능한 임의의 다른 순서로 수행될 수 있다.
본 명세서에서 제공되는 표제는 본 명세서를 전체로서 참고하여 정의될 수 있는 개시내용의 다양한 양태의 제한이 아니다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 용어는 특정 양태만을 설명하기 위한 것이며, 본 개시내용의 범위는 첨부된 청구범위에 의해서만 제한되기 때문에 이로 제한하려는 의도는 없다는 것을 이해하여야 한다.
따라서, 바로 아래에 정의되는 용어는 그 전체가 본 명세서에 관하여 더욱 완전하게 정의된다.
I. 정의
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 개시내용이 속하는 기술분야의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 의미를 갖는다. 예를 들어, 문헌[Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2nd ed., 2002, CRC Press; The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3rd ed., 1999, Academic Press; 및 the Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Revised, 2000, Oxford University Press]은 본 개시내용에 사용되는 다수의 용어의 일반적 사전을 당업자에게 제공한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 하기 용어들은 아래에 부여된 의미를 갖는다.
용어 단수 개체는 하나 이상의 개체를 지칭함에 유의하여야 하며; 예를 들어, "뉴클레오타이드 서열"은 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열을 나타내는 것으로 이해된다. 이와 같이, 용어 "하나", "하나 이상" 및 "적어도 하나"는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용될 수 있다. 청구범위는 임의의 선택적 요소를 배제하도록 작성될 수 있음을 추가로 유의하여야 한다. 이와 같이, 이러한 언급은 청구항 요소의 언급 또는 부정적인 제한의 사용과 관련하여, "단독으로(solely)", "유일한(only)" 등과 같은 이러한 배타적인 용어의 사용을 위한 선행사(antecedent basis)의 역할을 하도록 의도된다.
또한, 본 명세서에서 사용되는 "및/또는"은 서로를 포함하거나 포함하지 않는 2개의 구체화된 특징 또는 성분의 구체적인 개시내용으로 간주되어야 한다. 따라서, 본 명세서에서 "A 및/또는 B"와 같은 문구에서 사용된 용어 "및/또는"은 "A 및 B", "A 또는 B", "A"(단독) 및 "B"(단독)를 포함하는 것으로 의도된다. 마찬가지로, "A, B 및/또는 C"와 같은 문구에서 사용된 용어 "및/또는"은 각각 다음의 양태를 포함하는 것으로 의도된다: A, B 및 C; A, B 또는 C; A 또는 C; A 또는 B; B 또는 C; A 및 C; A 및 B; B 및 C; A(단독); B(단독); 및 C(단독).
표현 "포함하는"을 사용하여 본 명세서에서 기재되는 양태마다, "구성되는" 및/또는 "본질적으로 구성되는"의 측면에서 기재된 다른 유사한 양태가 또한 제공됨이 이해된다.
단위, 접두사 및 기호는 이들의 국제 단위체계(SI) 허용 형식으로 표시된다.
수치 범위는 범위를 정의하는 숫자를 포함한다. 값의 범위가 언급되는 경우, 그 범위의 상한 및 하한 사이의 각각의 중간 정수 값 및 이의 각각의 분수가 또한 그러한 값 사이의 각각의 하위 범위와 함께 구체적으로 개시된다는 것을 이해하여야 한다. 임의의 범위의 상한 및 하한은 독립적으로 범위에 포함되거나 또는 이로부터 배제될 수 있으며, 어느 하나 또는 둘 다 포함되지 않는 각 범위 또한 개시내용에 포함된다.
따라서, 본 명세서에서 인용된 범위는 인용된 종점을 포함하여 범위 내의 모든 값에 대한 단축형인 것으로 이해된다. 예를 들어, 1 내지 50의 범위는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 및 50으로 이루어진 군으로부터 임의의 수, 이들 수의 조합 또는 하위 범위를 포함하는 것으로 이해된다.
달리 명시되지 않는 한, 하나 이상의 입체중심을 갖는 화합물에 대한 언급은 각각의 입체이성질체 및 이의 모든 입체이성질체의 조합을 의미한다.
값이 명시적으로 언급되는 경우, 언급된 값과 거의 동일한 양(quantity) 또는 양(amount)인 값도 또한 본 개시내용의 범위 내에 있는 것으로 이해되어야 한다. 조합이 개시되는 경우, 그 조합의 요소의 각 하위조합도 또한 구체적으로 개시되며, 본 개시내용의 범위 내에 있다. 반대로, 상이한 요소 또는 요소의 그룹이 개별적으로 개시되는 경우, 이들의 조합도 또한 개시된다. 개시내용의 임의의 요소가 복수의 대안을 갖는 것으로 개시되는 경우, 각각의 대안이 단독으로 또는 다른 대안과의 임의의 조합으로 배제되는 그 개시내용의 예도 또한 본 명세서에 개시된다; 본 개시내용의 하나 초과의 요소는 그러한 배제를 가질 수 있고, 그러한 배제를 갖는 요소의 모든 조합이 본 명세서에 개시된다.
뉴클레오타이드는 일반적으로 허용되는 단일-문자 코드로 언급된다. 달리 명시되지 않는 한, 뉴클레오타이드 서열은 5'에서 3' 방향으로 왼쪽에서 오른쪽으로 기재된다. 뉴클레오타이드는 IUPAC-IUB 생화학 명명 위원회(IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission)에 의해 권장되는 일반적으로 알려진 1-문자 기호로 본 명세서에 언급된다. 따라서, A는 아데닌을 나타내고, C는 사이토신을 나타내며, G는 구아닌을 나타내고, T는 티민을 나타내며, U는 우라실을 나타낸다.
아미노산 서열은 아미노에서 카복시 방향으로 왼쪽에서 오른쪽으로 기재된다. 아미노산은 IUPAC-IUB 생화학 명명 위원회에 의해 권장되는 일반적으로 알려진 3 문자 기호 또는 1-문자 기호로 본 명세서에서 언급된다.
용어 "약"은 대략, 거의, 약 또는 이의 영역을 의미하도록 본 명세서에서 사용된다. 용어 "약"이 수치 범위와 함께 사용될 때, 이는 제시되는 수치 값 초과 및 미만의 경계로 확장하여 해당 범위를 수정한다. 일반적으로, 용어 "약"은 예를 들어, 위로 또는 아래로(더 높거나 더 낮은) 10 퍼센트의 차이로 언급된 값의 위와 아래의 수치 값을 수정할 수 있다.
관심 있는 하나 이상의 값에 대해 적용되는 본 명세서에서 사용되는 용어 "대략"은 언급된 참조 값과 유사한 값을 지칭한다. 소정의 양태에서, 용어 "대략"은 달리 언급되지 않는 한 또는 문맥으로부터 달리 명확하지 않는 한(이러한 숫자가 가능한 값의 100%를 초과하는 경우를 제외), 언급된 참조 값의 어느 방향에서든(초과 또는 미만) 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 이하 내에 포함되는 값의 범위를 지칭한다.
용어 "투여", "투여하는" 및 이의 문법적 변형은 약제학적으로 허용 가능한 경로를 통해 본 개시내용의 EV(예를 들어, 엑소솜)와 같은 조성물을 대상체에 도입하는 것을 지칭한다. 본 개시내용의 EV(예를 들어, 엑소솜)와 같은 조성물의 대상체로의 도입은 종양내, 경구, 폐, 비강내, 비경구(정맥내, 동맥내, 근육내, 복강내 또는 피하), 직장, 림프내, 척수강내, 안구주위 또는 국부를 포함하는 임의의 적합한 경로에 의한 것이다. 투여는 자가-투여 및 다른 이에 의한 투여를 포함한다. 적합한 투여 경로는 조성물 또는 작용제가 의도된 기능을 수행할 수 있게 한다. 예를 들어, 적합한 경로가 정맥내인 경우, 조성물은 조성물 또는 작용제를 대상체의 정맥으로 도입함으로써 투여된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "효현제(agonist)"는 수용체에 결합하고, 수용체를 활성화하여 생물학적 반응을 생성하는 분자를 지칭한다. 수용체는 내인성 또는 외인성 효현제에 의해 활성화될 수 있다. 내인성 효현제의 비제한적인 예는 호르몬, 신경전달물질 및 고리형 다이뉴클레오타이드를 포함한다. 외인성 효현제의 비제한적인 예는 약물, 소분자 및 고리형 다이뉴클레오타이드를 포함한다. 효현제는 전체, 부분 또는 역 효현제일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "길항제(antagonist)"는 수용체에 결합할 때 생물학적 반응 자체를 유발하기보다는 효현제 매개성 반응을 차단 또는 약화시키는 분자를 지칭한다. 많은 길항제가 수용체의 구조적으로 정의된 결합 부위에서 내인성 리간드 또는 기질과 경쟁함으로써 효능을 달성한다. 길항제의 비제한적인 예는 알파 차단제, 베타-차단제 및 칼슘 채널 차단제를 포함한다. 길항제는 경쟁적, 비-경쟁적 또는 무경쟁적 길항제일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "세포외 소포체" 또는 "EV"는 내부 공간(내강)을 둘러싸는 막을 포함하는 세포-유래 소포체를 지칭한다. 세포외 소포체는 이들이 유래되는 세포보다 더 작은 직경을 갖는 모든 막-결합 소포체를 포함한다. 일반적으로 세포외 소포체의 직경 범위는 20㎚ 내지 1000㎚이며, 세포외 소포체의 외부 표면 또는 내강 표면에 디스플레이되고/되거나 막에 걸쳐 있는 내부 공간(즉, 내강) 내에 다양한 페이로드를 포함할 수 있다. 페이로드는 예를 들어, 핵산, 단백질, 탄수화물, 지질, 소분자 및/또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 예로서 그리고 제한 없이, 세포외 소포체는 직접 또는 간접 조작에 의해(예를 들어, 연속 압출 또는 알칼리성 용액 처리에 의해) 세포로부터 유래된 세포자멸체(apoptotic body), 세포의 단편, 소포체, 살아있는 세포에 의해(예를 들어, 직접 원형질 막 출아(budding) 또는 후기 엔도솜과 원형질 막의 융합에 의해) 생성된 소포형 소기관 및 소포체를 포함한다. 세포외 소포체는 살아 있는 또는 죽은 유기체, 외식된 조직 또는 장기 및/또는 배양된 세포로부터 유래될 수 있다. 일부 양태에서, EV는 본 명세서에 개시된 스캐폴드 단백질을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "엑소솜"은 내부 공간(내강)을 둘러싸며, 일부 양태에서, 예를 들어, 직접 원형질 막 출아 또는 후기 엔도솜과 원형질 막의 융합에 의해 세포(예를 들어, 생산자 세포)로부터 생성되는 막을 포함하는 세포-유래의 작은(직경 20㎚ 내지 300㎚, 더욱 바람직하게는 직경 40㎚ 내지 200㎚) 세포외 소포체(EV)를 지칭한다. 엑소솜은 세포외 소포체(EV)의 한 종이다. 일부 양태에서, 엑소솜은 지질 또는 지방산 및 폴리펩타이드를 포함하며, 선택적으로 페이로드(예를 들어, 치료제와 같은 생물학적으로 활성인 분자), 수용자(receiver)(예를 들어, 표적화 모이어티), 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, 핵산, RNA 또는 DNA), 당(예를 들어, 단순 당, 다당류 또는 글리칸) 또는 기타 분자를 포함한다. 엑소솜은 생산자 세포로부터 유래되고, 그 크기, 밀도, 생화학적 매개변수 또는 이들의 조합에 기초하여 생산자 세포로부터 단리될 수 있다. 일부 양태에서, 엑소솜은 본 개시내용의 스캐폴드 단백질을 포함한다. 일부 양태에서, 본 개시내용의 엑소솜은 하나 이상의 이식유전자 산물을 발현하는 세포에 의해 생산될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "엑소솜 내강 단백질"은 스캐폴드 단백질, 즉, EV, 예를 들어, 엑소솜의 내강 표면, 예컨대 MARCKS, MARKSL1, BASP1, 또는 이들의 임의의 기능적 단편, 이들의 임의의 변이체, 이들의 임의의 유도체, 또는 이들의 임의의 조합에 부착 또는 결합되며, 페이로드, 예를 들어, 생물학적으로 활성인 분자(예를 들어, 치료적 단백질)를 EV, 예를 들어, 엑소솜의 내강 표면으로 표적화하기 위한 스캐폴드로서 사용하기에 적합한 단백질을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "나노소포체"는 내부 공간을 둘러싸고 있는 막을 포함하며, 나노소포체가 직접 또는 간접 조작 없이 생산자 세포에 의해 생산될 수 없는 그러한 조작에 의해 세포로부터 생성되는 세포-유래의 작은(직경 20㎚ 내지 250㎚, 예를 들어, 직경 30㎚ 내지 150㎚) 소포체를 지칭한다. 나노소포체를 생산하기 위한 생산자 세포의 적절한 조작은 연속 압출, 알칼리성 용액 처리, 초음파처리 또는 이들의 조합을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 나노소포체의 생산은 어떤 경우에는 생산자 세포의 파괴를 초래할 수 있다. 일부 양태에서, 본 명세서에 기재된 나노소포체의 생산은 원형질 막으로부터의 직접 출아 또는 후기 엔도솜과 원형질 막의 융합을 통해 생산자 세포로부터 유래되는 소포체가 실질적으로 없다. 일부 양태에서, 나노소포체는 지질 또는 지방산 및 폴리펩타이드를 포함하며, 선택적으로 페이로드(예를 들어, 치료제), 수용자(예를 들어, 표적화 모이어티), 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, 핵산, RNA 또는 DNA), 당(예를 들어, 단순 당, 다당류 또는 글리칸) 또는 기타 분자를 포함한다. 일단 조작에 따라 생산자 세포로부터 유래된 나노소포체는 그 크기, 밀도, 생화학적 매개변수 또는 이들의 조합에 기초하여 생산자 세포로부터 단리될 수 있다. 일부 양태에서, 나노소포체는 본 명세서에 개시된 스캐폴드 단백질을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "내강-조작된 EV"는 조작된 EV, 예를 들어, 엑소솜의 내강 표면 또는 내강이 변형 전 EV, 예를 들어, 엑소솜의 그것 또는 자연 발생적 EV, 예를 들어, 엑소솜의 그것과 상이하도록 그 조성이 변형된 EV, 예를 들어, 엑소솜의 막의 내강 표면 또는 내강을 갖는 EV, 예를 들어, 엑소솜을 지칭한다.
조작은 EV(예를 들어, 엑소솜)의 내강(즉, EV 내의 공동) 또는 막, 특히 EV의 내강 표면에서 직접 이루어질 수 있으므로, EV, 예를 들어, 엑소솜의 내강 및/또는 내강 표면이 변한다. 예를 들어, 막은 단백질, 지질, 소분자, 탄수화물 등의 그 조성이 변형되어 EV, 예를 들어, 엑소솜의 내강 표면이 변형된다. 유사하게는, 내강의 구성 성분(content)이 변형될 수 있다. 조성은 화학적, 물리적 또는 생물학적 방법에 의해 또는 화학적, 물리적 또는 생물학적 방법에 의해 이전에 변형된 세포로부터 생산됨으로써 변할 수 있다. 구체적으로, 조성은 유전 공학에 의해 또는 유전 공학에 의해 이전에 변형된 세포로부터 생산됨으로써 변할 수 있다. 일부 양태에서, 내강-조작된 EV, 예를 들어, 내강-조작된 엑소솜은 외인성 단백질(즉, EV, 예를 들어, 엑소솜이 자연적으로 발현하지 않는 단백질) 또는 EV, 예를 들어, 엑소솜의 내강 표면 또는 내강에 노출될 수 있는 이의 단편 또는 변이체를 포함하거나, 또는 EV, 예를 들어, 엑소솜의 내부 층 상에 노출된 모이어티에 대한 고정 포인트(부착)일 수 있다. 다른 양태에서, 내강-조작된 EV, 예를 들어, 내강-조작된 엑소솜은 천연 EV, 예를 들어, 엑소솜, 단백질(예를 들어, 스캐폴드 단백질) 또는 EV, 예를 들어, 엑소솜의 내강에 노출될 수 있는 이의 단편 또는 변이체의 더 높은 발현을 포함하거나, 또는 EV, 예를 들어, 엑소솜의 내강 표면 상에 노출된 모이어티에 대한 고정 포인트(부착)일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "표면-조작된 EV"는 조작된 EV의 외부 표면이 변형 전 EV의 그것 또는 자연 발생적 EV의 그것과 상이하도록 그 조성이 변형된 EV의 외부 표면을 갖는 EV를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "표면-조작된 엑소솜"은 조작된 엑소솜의 외부 표면이 변형 전 엑소솜의 그것 또는 자연 발생적 엑소솜의 그것과 상이하도록 그 조성이 변형된 엑소솜의 외부 표면을 갖는 엑소솜을 지칭한다.
본 명세서에 기재된 EV, 예를 들어, 엑소솜의 맥락에서 사용될 때 용어 "변형된"은 EV, 예를 들어, 엑소솜 및/또는 이의 생산자 세포의 변경 또는 조작을 지칭하며, 변형된 EV, 예를 들어, 엑소솜은 자연-발생적 EV, 예를 들어, 엑소솜과는 다르다. 일부 양태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 EV, 예를 들어, 엑소솜은 자연-발생적 EV, 예를 들어, 엑소솜의 막과 비교하여 단백질, 지질, 소분자, 탄수화물 등의 조성이 다른 막을 포함한다. 예를 들어, 막은 더 높은 밀도 또는 수의 천연 EV, 예를 들어, 엑소솜, 단백질을 포함하고/하거나 막은 EV, 예를 들어, 엑소솜에서 자연적으로 발견되지 않는 단백질을 포함한다. 소정의 양태에서, 막에 대한 이러한 변화는 EV, 예를 들어, 엑소솜(예를 들어, 본 명세서에 기재된 표면-조작된 EV 및 엑소솜)을 변화시킨다. 소정의 양태에서, 막에 대한 이러한 변화는 EV, 예를 들어, 엑소솜(예를 들어, 본 명세서에 기재된 내강-조작된 EV 및 엑소솜)의 내강 표면을 변화시킨다.
예를 들어, 내강은 단백질, 지질, 소분자, 탄수화물 등의 그 조성이 변형된다. 조성은 화학적, 물리적 또는 생물학적 방법에 의해 또는 화학적, 물리적 또는 생물학적 방법에 의해 이전에 변형된 세포로부터 생산됨으로써 변할 수 있다. 구체적으로, 조성은 유전 공학에 의해 또는 유전 공학에 의해 이전에 변형된 세포로부터 생산됨으로써 변할 수 있다.
예를 들어, "변형된 단백질" 또는 "단백질 변형" 또는 이의 문법적 변형의 경우에서와 같이, 본 명세서에서 사용되는 용어 단백질의 "변형"은 단백질의 비-돌연변이체 아미노산 서열과 적어도 15%의 동일성을 갖는 단백질을 지칭한다. 단백질의 변형은 단백질의 단편 또는 변이체를 포함한다. 단백질의 변형은 단백질의 단편 또는 변이체에 대한 화학적 또는 물리적 변형을 더 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 변형된 단백질은 비-변형된 단백질의 적어도 하나의 생리학적 기능을 유지한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 단백질의 "단편"(예를 들어, 본 명세서에 개시된 치료적 단백질 또는 스캐폴드 단백질과 같은 생물학적으로 활성인 분자)은 자연-발생적 서열보다 짧은, 예를 들어, 자연 발생적 단백질과 비교하여 N- 및/또는 C-말단이 결실된 단백질을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "기능적 단편"은 단백질 기능을 유지하는 단백질 단편을 지칭한다. 따라서, 일부 양태에서, MARCKS, MARCKSL1 또는 BASP1과 같은 본 명세서에 개시된 스캐폴드 단백질의 기능적 단편은 EV, 예를 들어, 엑소솜의 내강 표면 상에 생물학적으로 활성인 분자를 고정시키는 능력을 유지한다.
단편이 그러한 의미에서 기능적 단편인지 여부는 웨스턴 블롯, FACS 분석 및 예를 들어, GFP와 같은 자가형광 단백질과 단편의 융합을 포함하는 EV, 예를 들어, 엑소솜의 단백질 함량을 결정하기 위해 임의의 당업계에 공지된 방법에 의해 평가될 수 있다. 특정 양태에서, MARCKS, MARCKSL1 또는 BASP1의 단편은 예를 들어, EV, 예를 들어, 엑소솜의 내강 또는 외부 표면 상에 페이로드, 예를 들어, 생물학적으로 활성인 분자를 고정시키는 자연 발생적 MARCKS, MARCKSL1 또는 BASP1의 능력의 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 99% 또는 적어도 약 100%를 유지한다. 특정 양태에서, MARCKS, MARCKSL1, BASP1의 변이체, 또는 MARCKS, MARCKSL1 또는 BASP1의 단편의 능력은 EV, 예를 들어, 엑소솜의 내강 또는 외부 표면 상에 페이로드, 예를 들어, 생물학적으로 활성인 분자를 고정시키는 MARCKS, MARCKSL1 및 BASP1의 각각의 능력의 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 99% 또는 적어도 약 100%이다. 이 능력은 실험 부문에 기재된 검정에서, 예를 들어, 형광 표지된 변이체에 의해 평가될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "유도체"는 화학적으로 또는 효소적으로 변형된 본 개시내용의 스캐폴드 단백질인 EV, 예를 들어, 엑소솜, 구성 요소(예를 들어, 단백질 또는 지질) 또는 페이로드, 예를 들어, 생물학적으로 활성인 분자(예를 들어, 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 지질, 탄수화물, 항체 또는 이들의 단편)를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 단백질의 "변이체"는 당업계에 공지된 방법에 의해(예를 들어, 서열 정렬에 의해) 비교시 다른 단백질과 소정의 구조적(예를 들어, 아미노산 서열 동일성) 및 기능적 동일성을 공유하는 단백질을 지칭한다. 예를 들어, 단백질의 변이체는 다른 단백질에서 치환, 삽입, 결실, 프레임시프트 또는 재배열을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 단백질의 변이체는 비-변이체 단백질의 적어도 하나의 생리학적 기능을 유지한다.
특정 양태에서, 변이체는 전장, 성숙 MARCKS, MARCKSL1, BASP1, 또는 MARCKS, MARCKSL1 또는 BASP1의 단편에 대해 적어도 70%의 동일성을 갖는 변이체 단백질이다.
일부 양태에서, MARCKS의 변이체 또는 단편의 변이체는 예를 들어, Needleman-Wunsch 알고리즘을 사용하여 쌍 정렬(pairwise alignment)에 의해 결정된 바와 같이, 서열번호 1에 따른 MARCKS 또는 이의 기능적 단편과 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95% 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 공유한다.
일부 양태에서, MARCKSL1의 변이체 또는 단편의 변이체는 예를 들어, Needleman-Wunsch 알고리즘을 사용하여 쌍 정렬에 의해 결정된 바와 같이, 서열번호 2에 따른 MARCKSL1 또는 이의 기능적 단편과 적어도 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95% 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 공유한다.
일부 양태에서, BASP1의 변이체 또는 단편의 변이체는 예를 들어, Needleman-Wunsch 알고리즘을 사용하여 쌍 정렬에 의해 결정된 바와 같이, 서열번호 3에 따른 BASP1 또는 이의 기능적 단편과 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95% 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 공유한다.
일부 양태에서, 스캐폴드 단백질의 변이체(예를 들어, MARCKS, MARCKSL1 또는 BASP1), 스캐폴드 단백질의 기능적 단편 또는 스캐폴드 단백질의 기능적 단편의 변이체는 유도체이다.
위의 각각의 경우에 있어서, 스캐폴드 단백질의 변이체 또는 단편의 변이체(예를 들어, MARCKS, MARCKSL1, BASP1, 또는 MARCKS, MARCKSL1 또는 BASP1의 단편의 변이체)는 EV, 예를 들어, 엑소솜의 내강 또는 외부 표면에 페이로드, 예를 들어, 생물학적으로 활성인 분자를 고정시키는 능력을 유지한다.
본 명세서에서 제공되는 임의의 단백질의 인용은 단백질의 기능적 변이체를 포함한다. 용어 단백질의 "기능적 변이체"는 EV, 예를 들어, 엑소솜의 내강 또는 외부 표면에 생물학적으로 활성인 분자를 고정시키는 능력을 유지하는 단백질의 변이체를 지칭한다. 특정 양태에서, MARCKS, MARCKSL1, BASP1, 또는 MARCKS, MARCKSL1 또는 BASP1의 단편의 기능적 변이체는 EV, 예를 들어, 엑소솜의 내강 또는 외부 표면에 페이로드, 예를 들어, 생물학적으로 활성인 분자를 고정시키는 MARCKS, MARCKSL1 및 BASP1의 각각의 능력의 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95% 또는 적어도 약 99%이다.
자연 발생적 변이체는 "대립유전자 변이체"라 하며, 유기체의 염색체 상에 주어진 유전자좌를 차지하는 유전자의 여러 대안적 형태 중 하나를 지칭한다(문헌[Genes II, Lewin, B., ed., John Wiley & Sons, New York(1985)]). 이러한 대립유전자 변이체는 폴리뉴클레오타이드 및/또는 폴리펩타이드 수준에서 다양할 수 있으며, 본 개시내용에 포함된다. 대안적으로, 비-자연 발생적 변이체는 돌연변이유발 기법에 의해 또는 직접 합성에 의해 생산될 수 있다.
단백질 공학 및 재조합 DNA 기술의 공지된 방법을 사용하여, 폴리펩타이드의 특성을 개선 또는 변경하기 위해 변이체가 생성될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 아미노산이 생물학적 기능의 실질적인 손실 없이 분비된 단백질의 N-말단 또는 C-말단으로부터 결실될 수 있다. 그 전문이 참조에 의해 본 명세서에 원용되어 있는 문헌[Ron et al., J. Biol. Chem. 268: 2984-2988(1993)]은 3개, 8개 또는 27개의 아미노-말단 아미노산 잔기가 결실된 후에도 헤파린 결합 활성을 갖는 변이체 KGF 단백질을 보고하였다. 유사하게는, 인터페론 감마는 이 단백질의 카복시 말단으로부터 8개 내지 10개의 아미노산 잔기를 결실시킨 후 최대 10배 더 높은 활성을 나타내었다(문헌[Dobeli et al., J. Biotechnology 7:199-216 (1988)], 그 전문이 참조에 의해 본 명세서에 원용됨).
또한, 변이체가 종종 자연 발생적 단백질과 유사한 생물학적 활성을 유지함을 입증하는 충분한 증거가 있다. 예를 들어, Gayle 및 동료(문헌[J. Biol. Chem 268:22105-22111(1993)], 그 전문이 참조에 의해 본 명세서에 원용됨)는 인간 사이토카인 IL-1a의 광범위한 돌연변이 분석을 수행하였다. 이들은 3,500개 초과의 개별 IL-1a 돌연변이체를 생성하기 위해 무작위 돌연변이유발을 사용하였으며, 이는 분자의 전체 길이에 걸쳐 변이체당 평균 2.5개의 아미노산 변화를 나타내었다. 가능한 모든 아미노산 위치에서 다중 돌연변이가 조사되었다. 연구자들은 "대부분의 분자가 [결합 또는 생물학적 활성]에 거의 영향을 미치지 않으면서 변경될 수 있다"는 것을 발견하였다(초록 참조). 실제로, 조사된 3,500개가 넘는 서열 중에서 단지 23개의 고유한 아미노산 서열만이 야생형과 활성이 현저하게 다른 단백질을 생산하였다.
위에 언급된 바와 같이, 변이체 또는 유도체는 예를 들어, 변형된 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 양태에서, 예를 들어, 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 지질, 당단백질의 변이체 또는 유도체는 화학적 변형 및/또는 내인성 변형의 결과이다. 일부 양태에서, 변이체 또는 유도체는 생체내 변형의 결과이다. 일부 양태에서, 변이체 또는 유도체는 시험관내 변형의 결과이다. 또 다른 양태에서, 변이체 또는 유도체는 생산자 세포에서 세포내 변형의 결과이다.
변이체 및 유도체에 존재하는 변형은 예를 들어, 아세틸화, 지방 아실화, ADP-리보실화, 아미드화, 플라빈의 공유 부착, 헴 모이어티의 공유 부착, 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유도체의 공유 부착, 지질 또는 지질 유도체의 공유 부착, 포스파티딜이노시톨의 공유 부착, 가교 결합, 고리화, 이황화 결합 형성, 탈메틸화, 공유 가교 결합의 형성, 시스테인의 형성, 파이로글루타메이트의 형성, 폼일화, 감마-카복실화, 글리코실화, GPI 앵커 형성, 하이드록실화, 아이오딘화, 메틸화, 미리스토일화, 산화, 페길화(문헌[Mei et al., Blood 116: 270-79(2010)], 그 전문이 참조에 의해 본 명세서에 원용됨), 단백질분해성 처리, 인산화, 프레닐화, 라세미화, 셀레노일화, 황산화, 아르기닐화와 같은 단백질에 대한 운반-RNA 매개성 아미노산 첨가 및 유비퀴틴화를 포함한다.
용어 "아미노산 치환"은 모(parent) 또는 참조 서열(예를 들어, 야생형 서열)에 존재하는 아미노산 잔기를 다른 아미노산 잔기로 대체하는 것을 지칭한다. 아미노산은 예를 들어, 화학적 펩타이드 합성을 통해 또는 당업계에 공지된 재조합 방법을 통해 모 또는 참조 서열(예를 들어, 야생형 폴리펩타이드 서열)에서 치환될 수 있다. 따라서, "위치 X에서의 치환"에 대한 언급은 위치 X에 존재하는 아미노산의 대안적인 아미노산 잔기로의 치환을 지칭한다. 일부 양태에서, 치환 패턴은 스키마(schema) AnY에 따라 기재될 수 있되, A는 위치 n에 자연적으로 또는 원래 존재하는 아미노산에 상응하는 단일 문자 코드이고, Y는 치환 아미노산 잔기이다. 다른 양태에서, 치환 패턴은 스키마 An(YZ)에 따라 기재될 수 있되, A는 위치 n에 자연적으로 또는 원래 존재하는 아미노산을 치환하는 아미노산 잔기에 상응하는 단일 문자 코드이고, Y 및 Z는 A를 대체할 수 있는 대안적인 치환 아미노산 잔기이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "항체"는 천연 또는 부분적으로 또는 전체적으로 합성적으로 생산된 면역글로불린 및 이들의 단편을 포함한다. 용어는 또한 면역글로불린 결합 도메인에 상동인 결합 도메인을 갖는 임의의 단백질을 포함한다. "항체"는 구체적으로 항원에 결합하고 이를 인식하는 면역글로불린 유전자 또는 이들의 단편으로부터의 프레임워크 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 더 포함한다. 용어 항체의 사용은 전체 항체, 다클론, 단일클론 및 재조합 항체, 이들의 단편을 포함하는 것을 의미하며, 단일-사슬 항체, 인간화된 항체, 뮤린 항체, 키메라, 마우스-인간, 마우스-영장류, 영장류-인간 단일클론 항체, 항-유전자형 항체, 항체 단편, 예컨대, 예를 들어, scFv, (scFv)2, Fab, Fab' 및 F(ab')2, F(ab1)2, Fv, dAb 및 Fd 단편, 다이어바디 및 항체-관련 폴리펩타이드를 더 포함한다. 항체는 이들이 목적하는 생물학적 활성 또는 기능을 나타내는 한, 이중특이성 항체 및 다중특이성 항체를 포함한다. 본 개시내용의 일부 양태에서, 페이로드는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 생물학적으로 활성인 분자이다. 일부 양태에서, 항체(예를 들어, 본 개시내용의 생물학적으로 활성인 분자)는 나노바디이다.
용어 "항체-약물 접합체" 및 "ADC"는 상호교환적으로 사용되며, 예를 들어, 치료제(때때로 작용제, 약물 또는 활성 약제학적 성분으로 지칭됨) 또는 작용제에 공유적으로 연결된 항체를 지칭한다. 본 개시내용의 일부 양태에서, 페이로드는 항체-약물 접합체를 포함하는 생물학적으로 활성인 분자이다.
"보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체된 것이다. 염기성 측쇄(예를 들어, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 비하전된 극성 측쇄(예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 타이로신, 시스테인), 비극성 측쇄(예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 아이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지형 측쇄(예를 들어, 트레오닌, 발린, 아이소류신) 및 방향족 측쇄(예를 들어, 타이로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 포함한, 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리가 당업계에 정의되었다. 따라서, 폴리펩타이드에서 아미노산이 동일한 측쇄 패밀리로부터의 또 다른 아미노산으로 대체되는 경우, 치환은 보존적인 것으로 간주된다. 다른 양태에서, 아미노산의 스트링은 측쇄 패밀리 구성원의 순서 및/또는 조성이 다른 구조적으로 유사한 스트링으로 보존적으로 대체될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "보존된"은 각각 비교되는 2개 이상의 서열의 동일한 위치에서 변경되지 않은 상태로 발생하는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 폴리펩타이드 서열의 뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기를 지칭한다. 상대적으로 보존된 뉴클레오타이드 또는 아미노산은 서열의 다른 곳에서 나타나는 뉴클레오타이드 또는 아미노산보다 더 많은 관련 서열 사이에 보존된 것이다.
일부 양태에서, 2개 이상의 서열이 서로 100% 동일한 경우 "완전히 보존된" 또는 "동일한" 것으로 언급된다. 일부 양태에서, 2개 이상의 서열이 서로 적어도 70% 동일, 적어도 80% 동일, 적어도 90% 동일 또는 적어도 95% 동일한 경우 "고도로 보존된" 것으로 언급된다.
일부 양태에서, 2개 이상의 서열이 서로 약 70% 동일, 약 80% 동일, 약 90% 동일, 약 95%, 약 98% 또는 약 99% 동일한 경우 "고도로 보존된" 것으로 언급된다. 일부 양태에서, 2개 이상의 서열이 서로 약 30% 동일, 약 40% 동일, 약 50% 동일, 약 60% 동일, 약 70% 동일, 약 80% 동일, 약 90% 동일 또는 약 95% 동일한 경우 "보존된" 것으로 언급된다. 일부 양태에서, 2개 이상의 서열이 서로 약 30% 동일, 약 40% 동일, 약 50% 동일, 약 60% 동일, 약 70% 동일, 약 80% 동일, 약 90% 동일, 약 95% 동일, 약 98% 동일 또는 약 99% 동일한 경우 "보존된" 것으로 언급된다. 서열의 보존은 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드의 전체 길이에 적용될 수 있거나 또는 이의 일부, 영역 또는 특징에 적용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "상동성"은 중합체 분자 간에, 예를 들어, 핵산 분자(예를 들어, DNA 분자 및/또는 RNA 분자) 간에 및/또는 폴리펩타이드 분자 간에 전체 관련성을 지칭한다. 일반적으로, 용어 "상동성"은 두 분자 간의 진화 관계를 의미한다. 따라서, 상동성인 두 분자는 공통 진화 조상을 가질 것이다. 본 개시내용의 맥락에서, 용어 상동성은 동일성 및 유사성을 모두 포함한다.
일부 양태에서, 중합체 분자는 분자 내 단량체의 적어도 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%가 동일하거나(정확하게 동일한 단량체) 또는 유사한(보존적 치환) 경우 서로 "상동"인 것으로 간주된다. 용어 "상동"은 반드시 적어도 2개의 서열(폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열) 간의 비교를 지칭한다.
본 개시내용의 맥락에서, 치환(아미노산 치환으로 지칭되는 경우에도)은 핵산 수준에서 수행되며, 즉, 아미노산 잔기를 대안적인 아미노산 잔기로 치환하는 것은 제1 아미노산을 암호화하는 코돈을 제2 아미노산을 암호화하는 코돈으로 치환함으로써 수행된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "동일성"은 중합체 분자 사이, 예를 들어, 폴리펩타이드 분자 또는 폴리뉴클레오타이드 분자(예를 들어, DNA 분자 및/또는 RNA 분자) 사이의 전체 단량체 보존을 지칭한다. 임의의 추가적인 수식 어구 없이 용어 "동일한"은 예를 들어, 단백질 A는 단백질 B와 동일하며, 서열이 100% 동일(100% 서열 동일성)함을 의미한다. 예를 들어, "70% 동일한"으로 두 서열을 설명하는 것은 예를 들어, "70% 서열 동일성"을 갖는 것으로 이들을 설명하는 것과 동일하다.
두 폴리펩타이드 서열의 퍼센트 동일성의 계산은 예를 들어, 최적의 비교 목적을 위해 2개의 서열을 정렬시킴으로써 수행될 수 있다(예를 들어, 최적의 정렬을 위해 제1 및 제2 폴리펩타이드 서열 중 하나 또는 둘 다에 갭이 도입될 수 있고, 비-동일한 서열은 비교 목적을 위해 무시될 수 있음). 소정의 양태에서, 비교 목적을 위해 정렬된 서열의 길이는 참조 서열의 길이의 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%이다. 그런 다음, 상응하는 아미노산 위치의 아미노산이 비교된다.
제1 서열에서 위치가 제2 서열에서의 상응하는 위치와 동일한 아미노산에 의해 점유될 때, 분자는 그 위치에서 동일하다. 두 서열 간의 퍼센트 동일성은 2개의 서열의 최적의 정렬을 위해 도입될 필요가 있는 갭의 수 및 각 갭의 길이를 고려하여 서열에 의해 공유되는 동일한 위치의 수의 함수이다. 서열의 비교 및 두 서열 간의 퍼센트 동일성의 결정은 수학적 알고리즘을 이용하여 달성될 수 있다.
비교를 위한 서열 정렬 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 다양한 프로그램 및 정렬 알고리즘이 문헌[Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981); Needleman and Wunsch, J. Mol. Bio. 48: 443 (1970); Pearson and Lipman, Methods in Mol. Biol. 24: 307-31 (1988); Higgins and Sharp, Gene 73: 15 237-44 (1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5: 151-3 (1989) Corpet et al., Nuc. Acids Res. 16: 10881-90 (1988); Huang et al., Comp. Appl. BioSci. 8: 155-65 (1992); 및 Pearson et al., Meth. Mol. Biol. 24: 307-31 (1994)]에 기술되어 있다. NCBI 기본 로컬 정렬 검색 도구(Basic Local Alignment Search Too: BLAST)(문헌[Altschul 20 et al., J. Mol. Biol. 215: 403-10 (1990) J])는 서열 분석 프로그램 blastp, blastn, blastx, tblastn 및 tblastx와 함께 사용하기 위해 국립 생물 정보 센터(National Center for Biological Information: NBCl, 메릴랜드주 베서스다 소재)를 비롯한 여러 소스 및 인터넷 상에서 이용 가능하다. BLAST 및 프로그램을 사용하여 서열의 정체를 결정하는 방법에 대한 설명은 국립 보건원(National Institute of Health: NIH) 산하의 NCBI(National Center for Biotechnology Information)의 공식 웹 사이트에서 액세스할 수 있다.
다른 적합한 프로그램은 예를 들어, Needle, Stretcher, Water 또는 Matcher, 생물정보학 프로그램의 EMBOSS 모음의 일부이며, 이는 또한 www.ebi.ac.uk/Tools/psa에서 유럽 생물정보학 연구소(European Bioinformatics Institute: EBI)에서 입수 가능하다. 서열 정렬은 MAFFT, Clustal(ClustalW, Clustal X 또는 Clustal Omega), MUSCLE 등과 같은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 수행될 수 있다.
폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 참조 서열과 정렬된 단일 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 표적 서열 내의 상이한 영역은 각각 그 자신의 퍼센트 서열 동일성을 가질 수 있다. 퍼센트 서열 동일성 값은 가장 가까운 10분의 1로 반올림 됨에 유의한다. 예를 들어, 80.11, 80.12, 80.13 및 80.14는 80.1로 반올림되는 반면, 80.15, 80.16, 80.17, 80.18 및 80.19는 최대 80.2로 반올림된다. 또한, 길이 값은 항상 정수라는 점에 유의한다.
소정의 양태에서, 제2 아미노산 서열(또는 핵산 서열)에 대한 제1 아미노산 서열(또는 핵산 서열)의 퍼센트 동일성(%ID)은 %ID=100×(Y/Z)으로 계산되며, 여기서 Y는 제1 서열과 제2 서열의 정렬(육안 검사 또는 특정 서열 정렬 프로그램에 의해 정렬됨)에서 동일한 매치로 점수 매겨진 아미노산 잔기의 수(또는 핵염기)이고, Z는 제2 서열에서 잔기의 총 수이다. 제1 서열의 길이가 제2 서열보다 더 긴 경우, 제2 서열에 대한 제1 서열의 퍼센트 동일성은 제1 서열에 대한 제2 서열의 퍼센트 동일성 보다 높을 것이다.
당업자는 퍼센트 서열 동일성의 계산을 위한 서열 정렬의 생성이 일차 서열 데이터에 의해 배타적으로 구동되는 이진 서열-서열 비교로 제한되지 않음을 인식할 것이다. 또한, 서열 정렬은 서열 데이터를 구조적 데이터(예를 들어, 결정학적 단백질 구조), 기능적 데이터(예를 들어, 돌연변이의 위치) 또는 계통발생적 데이터와 같은 이종 소스로부터의 데이터와 통합함으로써 생성될 수 있음이 이해될 것이다. 이종 데이터를 통합하여 다중 서열 정렬을 생성하는 적합한 프로그램은 www.tcoffee.org에서 입수 가능하며, 대안적으로, 예를 들어, EBI로부터 입수 가능한 T-Coffee이다. 퍼센트 서열 동일성을 계산하는데 사용되는 최종 정렬은 자동 또는 수동으로 보조될 수 있음이 또한 이해될 것이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "유사성"은 중합체 분자 간에, 예를 들어 폴리뉴클레오타이드 분자(예를 들어, DNA 분자 및/또는 RNA 분자) 간에 및/또는 폴리펩타이드 분자 간에 전체 관련성을 지칭한다. 중합체 분자의 서로에 대한 퍼센트 유사성의 계산은 퍼센트 동일성의 계산과 동일한 방식으로 수행될 수 있지만, 퍼센트 유사성의 계산은 당업계에서 이해되는 바와 같이 보존적 치환을 고려한다. 유사성의 백분율은 사용되는 비교 척도, 즉, 아미노산이 예를 들어, 이들의 진화적 근접성, 전하, 부피, 가요성, 극성, 소수성, 방향성, 등전점, 항원성 또는 이들의 조합에 따라 비교되는지 여부에 따라 달라지는 것으로 이해된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "생산자 세포"는 EV, 예를 들어, 엑소솜을 생성하는데 사용되는 세포를 지칭한다. 생산자 세포는 시험관내에서 배양된 세포, 또는 생체내 세포일 수 있다. 생산자 세포는 EV, 예를 들어, 엑소솜을 생성하는데 효과적인 것으로 알려진 세포, 예를 들어, HEK293 세포, 차이니스 햄스터 난소(CHO) 세포 및 중간엽 줄기 세포(MSC), BJ 인간 포피 섬유아세포, fHDF 섬유아세포, AGE.HN® 신경 전구 세포, CAP® 양수 세포, 지방 중간엽 줄기 세포, RPTEC/TERT1 세포를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 소정의 양태에서, 생산자 세포는 항원-제시 세포가 아니다. 일부 양태에서, 생산자 세포는 수지상 세포, B 세포, 비만 세포, 대식세포, 호중구, 쿠퍼-브로비츠 세포(Kupffer-Browicz cell), 임의의 이들 세포 또는 이들의 임의의 조합으로부터 유래된 세포가 아니다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "단리하다" "단리된" 및 "단리하는" 또는 "정제하다" "정제된" 및 "정제하는" 뿐만 아니라 "추출된" 및 "추출하는" 및 이들의 문법적 변형은 상호교환적으로 사용되며, 하나 이상의 정제 과정, 예를 들어, 목적하는 EV, 예를 들어, 엑소솜, 제제의 선별 또는 농축을 거친 목적하는 EV, 예를 들어, 엑소솜의 제제 상태(예를 들어, 복수의 알려지거나 또는 알려지지 않은 양 및/또는 농도)를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에서 사용되는 단리 또는 정제는 (예를 들어, 분획) 생산자 세포를 함유하는 샘플로부터 EV, 예를 들어, 엑소솜을 제거, 부분적으로 제거(예를 들어, 분획)하는 과정이다. 일부 실시형태에서, 단리된 EV, 예를 들어, 엑소솜, 조성물은 원치 않는 활성이 검출되지 않거나 또는, 대안적으로, 원치 않는 활성의 수준 또는 양이 허용 가능한 수준 또는 양 또는 그 이하이다.
다른 실시형태에서, 단리된 EV, 예를 들어, 엑소솜, 조성물은 허용 가능한 양 및/또는 농도 이상의 목적하는 EV, 예를 들어, 엑소솜의 양 및/또는 농도를 갖는다. 다른 양태에서, 단리된 EV, 예를 들어, 엑소솜, 조성물은 조성물이 얻어지는 출발 물질(예를 들어, 생산자 세포 제제)과 비교하여 농축된다. 이러한 농축은 출발 물질과 비교하여 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 적어도 약 99.9%, 적어도 약 99.99%, 적어도 약 99.999%, 적어도 약 99.9999% 또는 약 99.9999% 이상 더 클 수 있다.
일부 양태에서, 단리된 EV, 예를 들어, 엑소솜, 제제는 잔여 생물학적 생성물(예를 들어, 오염물질)이 실질적으로 없다. 일부 양태에서, 단리된 EV, 예를 들어, 엑소솜, 제제는 임의의 오염 생물학적 물질이 약 100%, 적어도 약 99%, 적어도 약 98%, 적어도 약 97%, 적어도 약 96%, 적어도 약 95%, 적어도 약 94%, 적어도 약 93%, 적어도 약 92%, 적어도 약 91% 또는 적어도 약 90% 없다. 잔여 생물학적 생성물은 비생물학적 물질(화학물질 포함) 또는 원치 않는 핵산, 단백질, 지질 또는 대사 산물을 포함할 수 있다. 소정의 양태에서, 단리된 EV, 예를 들어, 엑소솜, 제제는 임의의 거대분자, 예를 들어, 임의의 핵산, 단백질, 지질 및/또는 탄수화물이 약 100%, 적어도 약 99%, 적어도 약 98%, 적어도 약 97%, 적어도 약 96%, 적어도 약 95%, 적어도 약 94%, 적어도 약 93%, 적어도 약 92%, 적어도 약 91% 또는 적어도 약 90% 없다. 잔여 생물학적 생성물이 실질적으로 없다는 것은 또한 EV, 예를 들어, 엑소솜, 조성물이 검출 가능한 생산자 세포를 함유하지 않고, EV, 예를 들어, 엑소솜만이 검출 가능함을 의미할 수 있다.
용어 "부형제" 또는 "담체"는 화합물의 투여를 더 용이하게 하기 위해 약제학적 조성물에 첨가되는 비활성 물질을 지칭한다. 용어 "약제학적으로 허용 가능한 담체", "약제학적으로 허용 가능한 부형제" 및 이들의 문법적 변형은 인간을 포함한 동물에 사용하기 위해 미국 연방 정부의 규제 기관에 의해 승인되거나 또는 미국 약전에 열거된 임의의 작용제뿐만 아니라 대상체에 심각한 자극을 유발하지 않고 투여된 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 없애지 않는 임의의 담체 또는 희석제를 포함한다. 약제학적 조성물을 제조하는데 유용하며, 일반적으로 안전하고, 무독성이며 바람직한 부형제 및 담체가 포함된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "페이로드"는 본 개시내용의 스캐폴드에 부착되고 이어서 본 개시내용의 EV, 예를 들어, 엑소솜의 막에 고정될 수 있는 임의의 분자를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 페이로드는 EV의 내강 표면, 예를 들어, 엑소솜, 막에 부착된다. 용어 페이로드는 생물학적으로 활성인 분자, 예를 들어, 치료적 및/또는 예방적 효과를 가질 수 있는 분자뿐만 아니라 진단적 분자를 포함한다. 따라서, 용어 페이로드는 또한 방사성 핵종, 형광 분자, 조영제, 태그와 같은 검출 가능한 모이어티 또는 검출 가능한 모이어티, 예를 들어, 리간드 또는 태그에 의해 인식될 수 있는 분자 물질(molecular entity)을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 페이로드는 용어 "카고(cargo)"와 동일하며, 이와 상호교환적으로 사용 가능하다. 따라서 "카고 단백질" 또는 "카고 펩타이드"는 본 개시내용의 스캐폴드에 부착된 특정 유형의 페이로드 분자(각각 단백질 및 펩타이드)를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "생물학적으로 활성인 분자"는 본 개시내용의 스캐폴드를 통해 EV, 예를 들어, 엑소솜에 부착될 수 있는 임의의 분자를 지칭하되, 분자는 이러한 분자를 필요로 하는 대상체에서 치료 또는 예방 효과를 가지거나 또는 대상체에서 세포 또는 조직의 항상성에 영향을 미칠 수 있다. EV, 예를 들어, 엑소솜 및/또는 생산자 세포로 도입될 수 있는 생물학적으로 활성인 분자의 비제한적인 예는 예를 들어, 뉴클레오타이드(예를 들어, 검출 가능한 모이어티 또는 독소를 포함하거나 또는 전사를 방해하는 뉴클레오타이드), 핵산(예를 들어, 효소와 같은 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 또는 mRNA 분자, 또는 miRNA, dsDNA, lncRNA 및 siRNA와 같은 조절 기능을 갖는 RNA 분자), 아미노산(예를 들어, 검출 가능한 모이어티 또는 독소를 포함하거나 또는 번역을 방해하는 아미노산), 폴리펩타이드(예를 들어, 효소 또는 항체), 지질, 탄수화물, 바이러스 및 바이러스 입자(예를 들어, 아데노-관련 바이러스 및 바이러스 입자, 레트로바이러스, 아데노바이러스 등), 및 ML-RR S2와 3'-3' cAIMPdFSH와 같은 고리형 다이뉴클레오타이드를 비롯한 소분자 STING 효현제를 포함하는 소분자(예를 들어, 소분자 약물 및 독소)와 같은 치료제를 포함한다. 소정의 양태에서, 페이로드는 항원을 포함한다. 소정의 양태에서, 생물학적으로 활성인 분자, 예를 들어, 치료제, 예를 들어, 인간에 대한 치료제는 본 명세서에 개시된 스캐폴드 단백질에 융합될 때, 생물학적 기능, 예를 들어, 치료적 기능을 유지한다. 일부 양태에서, 생물학적으로 활성인 분자는 적어도 5개의 아미노산, 적어도 6개의 아미노산, 적어도 7개의 아미노산, 적어도 8개의 아미노산, 적어도 9개의 아미노산, 적어도 10개의 아미노산, 적어도 15개의 아미노산, 적어도 20개의 아미노산, 적어도 25개의 아미노산, 적어도 30개의 아미노산, 적어도 35개의 아미노산, 적어도 40개의 아미노산, 적어도 45개의 아미노산, 적어도 50개의 아미노산, 적어도 55개의 아미노산, 적어도 60개의 아미노산, 적어도 65개의 아미노산, 적어도 70개의 아미노산, 적어도 75개의 아미노산, 적어도 100개의 아미노산, 적어도 150개의 아미노산, 적어도 200개의 아미노산, 적어도 250개의 아미노산, 적어도 300개의 아미노산, 적어도 350개의 아미노산, 적어도 400개의 아미노산 또는 적어도 500개의 아미노산을 가질 수 있다. 일부 양태에서, 생물학적으로 활성인 분자는 적어도 5개의 아미노산을 가질 수 있다. 일부 양태에서, 생물학적으로 활성인 분자는 적어도 10개의 아미노산을 가질 수 있다. 일부 양태에서, 생물학적으로 활성인 분자는 적어도 50개의 아미노산을 가질 수 있다. 일부 양태에서, 생물학적으로 활성인 분자는 적어도 100개의 아미노산을 가질 수 있다. 일부 양태에서, 생물학적으로 활성인 분자는 적어도 5개의 아미노산, 예를 들어, 5개 내지 500개, 5개 내지 450개, 5개 내지 400개, 5개 내지 350개, 5개 내지 300개, 5개 내지 250개, 5개 내지 200개, 5개 내지 150개, 5개 내지 100개, 5개 내지 90개, 5개 내지 80개, 5개 내지 70개, 5개 내지 60개, 5개 내지 50개, 5개 내지 40개, 5개 내지 30개, 5개 내지 20개, 5개 내지 15개 또는 5개 내지 10개의 아미노산을 가질 수 있다. 일부 양태에서, 생물학적으로 활성인 분자는 적어도 10개의 아미노산, 예를 들어, 10개 내지 500개, 10개 내지 450개, 10개 내지 400개, 10개 내지 350개, 10개 내지 300개, 10개 내지 250개, 10개 내지 200개, 10개 내지 150개, 10개 내지 100개, 10개 내지 90개, 10개 내지 80개, 10개 내지 70개, 10개 내지 60개, 10개 내지 50개, 10개 내지 40개, 10개 내지 30개, 10개 내지 20개 또는 10개 내지 15개의 아미노산을 가질 수 있다. 일부 양태에서, 생물학적으로 활성인 분자는 적어도 50개의 아미노산, 예를 들어, 50개 내지 500개, 50개 내지 450개, 50개 내지 400개, 50개 내지 350개, 50개 내지 300개, 50개 내지 250개, 50개 내지 200개, 50개 내지 150개, 50개 내지 100개, 50개 내지 90개, 50개 내지 80개, 50개 내지 50개 또는 50개 내지 60개의 아미노산을 가질 수 있다. 일부 양태에서, 생물학적으로 활성인 분자는 적어도 100개의 아미노산, 예를 들어, 100개 내지 500개, 100개 내지 450개, 100개 내지 400개, 100개 내지 350개, 100개 내지 300개, 100개 내지 250개, 100개 내지 200개 또는 100개 내지 150개의 아미노산을 가질 수 있다. 다른 양태에서, 생물학적으로 활성인 분자는 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 15개, 적어도 20개, 적어도 25개, 적어도 30개, 적어도 35개, 적어도 40개, 적어도 45개, 적어도 50개, 적어도 60개, 적어도 70개, 적어도 80개, 적어도 90개, 적어도 100개, 적어도 110개, 적어도 120개, 적어도 130개, 적어도 140개, 적어도 150개, 적어도 160개, 적어도 170개, 적어도 180개, 적어도 190개, 적어도 200개, 적어도 300개, 적어도 400개 또는 적어도 500개의 뉴클레오타이드를 갖는다. 다른 양태에서, 생물학적으로 활성인 분자는 적어도 2개, 예를 들어, 2개 내지 1000개, 2개 내지 900개, 2개 내지 500개, 2개 내지 300개 또는 2개 내지 50개의 뉴클레오타이드를 갖는다. 다른 양태에서, 생물학적으로 활성인 분자는 적어도 10개, 예를 들어, 10개 내지 1000개, 10개 내지 900개, 10개 내지 500개, 10개 내지 300개 또는 10개 내지 50개의 뉴클레오타이드를 갖는다. 다른 양태에서, 생물학적으로 활성인 분자는 적어도 15개, 예를 들어, 15개 내지 1000개, 15개 내지 900개, 15개 내지 500개, 15개 내지 300개 또는 15개 내지 50개의 뉴클레오타이드를 갖는다. 다른 양태에서, 생물학적으로 활성인 분자는 적어도 20개, 예를 들어, 20개 내지 1000개, 20개 내지 900개, 20개 내지 500개, 20개 내지 300개 또는 20개 내지 50개의 뉴클레오타이드를 갖는다. 다른 양태에서, 생물학적으로 활성인 분자는 적어도 50개, 예를 들어, 50개 내지 1000개, 50개 내지 900개, 50개 내지 500개, 50개 내지 300개 또는 50개 내지 100개의 뉴클레오타이드를 갖는다. 다른 양태에서, 생물학적으로 활성인 분자는 적어도 100개, 예를 들어, 100개 내지 10000개, 100개 내지 9000개, 100개 내지 5005개, 100개 내지 3000개 또는 100개 내지 500개의 뉴클레오타이드를 갖는다. 다른 양태에서, 생물학적으로 활성인 분자는 적어도 200개, 예를 들어, 200개 내지 10000개, 200개 내지 9000개, 200개 내지 5000개, 200개 내지 3000개 또는 200개 내지 500개의 뉴클레오타이드를 갖는다. 다른 양태에서, 생물학적으로 활성인 분자는 적어도 500개, 예를 들어, 500개 내지 10000개, 500개 내지 9000개, 500개 내지 5000개 또는 500개 내지 3000개의 뉴클레오타이드를 갖는다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "항원"은 대상체에 도입될 때 그 자체로 면역 반응(세포 또는 체액성)을 이끌어내는 임의의 작용제를 지칭한다. 일부 양태에서, 페이로드 분자는 EV, 예를 들어, 엑소솜에 공유적으로 연결된다. 다른 양태에서, 페이로드는 보조제를 포함한다.
"재조합" 폴리펩타이드 또는 단백질은 재조합 DNA 기술을 통해 생산된 폴리펩타이드 또는 단백질을 지칭한다. 조작된 숙주 세포에서 발현된 재조합적으로 생산된 폴리펩타이드 및 단백질은 임의의 적합한 기법에 의해 분리, 분획화 또는 부분적으로 또는 실질적으로 정제된 천연 또는 재조합 폴리펩타이드와 같이 개시내용의 목적을 위해 단리된 것으로 간주된다. 본 명세서에 개시된 폴리펩타이드는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 재조합적으로 생산될 수 있다. 대안적으로, 본 명세서에 개시된 단백질 및 펩타이드는 화학적으로 합성될 수 있다. 본 개시내용의 일부 양태에서, EV, 예를 들어, 엑소솜에 존재하는 스캐폴드 단백질은 생산자 세포에서 스캐폴드 단백질을 과발현함으로써 재조합적으로 생산되므로, 생성된 EV, 예를 들어, 엑소솜에서 스캐폴드 단백질의 수준은 이러한 스캐폴드 단백질을 과발현하지 않는 생산자 세포의 EV, 예를 들어, 엑소솜에 존재하는 스캐폴드 단백질과 관련하여 현저하게 증가한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "앵커(anchor)" 또는 스캐폴드 단백질을 통해 본 개시내용의 EV(예를 들어, 엑소솜)의 내강 또는 외부 표면에 생물학적으로 활성인 분자를 "고정하는(anchoring)"은 생물학적으로 활성인 분자를 EV(예를 들어, 엑소솜)의 내강 또는 외부 표면에 각각 위치한 스캐폴드 분자의 부분에 공유적으로 부착시키는 것을 지칭한다.
용어 "관련된", "관련" 및 이들의 문법적 변형은 상호교환적으로 사용되며, 제2 모이어티, 예를 들어, 제2 아미노산 서열 또는 뉴클레오타이드 서열에 각각 공유적으로 또는 비-공유적으로 연결된 제1 모이어티, 예를 들어, 제1 아미노산 서열 또는 뉴클레오타이드 서열을 지칭한다. 제1 모이어티는 제2 모이어티에 직접 연결 또는 병치될(juxtaposed) 수 있거나, 또는 대안적으로 개재(intervening) 모이어티는 제1 모이어티를 제2 모이어티에 공유적으로 연결할 수 있다. 일부 실시형태에서, 용어 "관련된"은 미리스토일화, 이온 상호작용 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "연결된" 또는 "융합된"은 하나 이상의 아미노산의 펩타이드 결합 또는 링커에 의해 C-말단 또는 N-말단에서의 제1 모이어티와 제2 모이어티의 융합을 지칭한다. 용어 "연결된" 또는 "융합된"은 또한 전체 제1 모이어티(또는 제2 모이어티)를, 예를 들어, 제2 모이어티(또는 각각 제1 모이어티)에서 임의의 2개의 지점, 예를 들어, 아미노산 사이에 삽입하는 것을 포함한다. 일 양태에서, 제1 모이어티는 펩타이드 결합 또는 링커에 의해 제2 모이어티에 연결된다. 제1 모이어티는 포스포다이에스터 결합 또는 링커에 의해 제2 모이어티에 연결될 수 있다. 링커는 펩타이드 또는 폴리펩타이드(폴리펩타이드 사슬의 경우), 또는 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 사슬(뉴클레오타이드 사슬의 경우), 또는 임의의 화학적 모이어티(폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 사슬 또는 임의의 화학적 분자의 경우)일 수 있다. 용어 "연결된"은 또한 하이픈(-)으로 나타낼 수 있다. 일부 양태에서, EV, 예를 들어, 엑소솜 상의 스캐폴드 단백질은 페이로드, 예를 들어, 생물학적으로 활성인 분자에 연결 또는 융합될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "포유 동물 대상체"는 제한 없이 인간, 길들여진 동물(예를 들어, 개, 고양이 등), 농장 동물(예를 들어, 소, 양, 돼지, 말 등) 및 실험실 동물(예를 들어, 원숭이, 래트, 마우스, 토끼, 기니피그 등)을 포함하는 모든 포유 동물을 포함한다.
용어 "개체", "대상체", "숙주" 및 "환자" 및 이들의 변형은 본 명세서에서 상호교환적으로 사용되며, 진단, 치료 또는 요법이 요망되는 임의의 포유 동물 대상체, 특히 인간을 지칭한다. 본 명세서에 기재된 방법은 인간 요법 및 수의학적 응용 둘 다에 적용 가능하다. 일부 양태에서, 대상체는 포유 동물이고, 다른 양태에서 대상체는 인간이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "실질적으로 없는"은 EV, 예를 들어, 엑소솜을 포함하는 샘플이 질량/부피(m/v) 백분율 농도로 10% 미만의 거대분자, 예를 들어, 오염물질을 포함함을 의미한다. 일부 분획은 약 0.001% 미만, 약 0.01% 미만, 약 0.05% 미만, 약 0.1% 미만, 약 0.2% 미만, 약 0.3 % 미만, 약 0.4% 미만, 약 0.5% 미만, 약 0.6% 미만, 약 0.7% 미만, 약 0.8% 미만, 약 0.9% 미만, 약 1% 미만, 약 2% 미만, 약 3% 미만, 약 4% 미만, 약 5% 미만, 약 6% 미만, 약 7% 미만, 약 8% 미만, 약 9% 또는 약 10%(m/v) 미만의 거대분자를 함유할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "거대분자"는 핵산, 외인성 단백질, 지질, 탄수화물, 대사 산물(예를 들어, 중합체 대사 산물) 또는 이들의 조합을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "종래의 EV 단백질"은 이전에 EV가 풍부한 것으로 알려진 단백질을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "종래의 EV, 예를 들어, 엑소솜 단백질"은 CD9, CD63, CD81, PDGFR, GPI 앵커 단백질, 락타드헤린 LAMP2 및 LAMP2B, 이들의 단편 또는 이에 결합하는 펩타이드를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 이전에 엑소솜이 풍부한 것으로 알려진 단백질을 의미한다. 의심의 여지를 피하기 위해, PTGFRN, BSG, IGSF2, IGSF3, IGSF8, ITGB1, ITGA4, SLC3A2, ATP 수송자 또는 이들의 단편 또는 변이체는 종래의 EV, 예를 들어, 엑소솜 단백질이 아니다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "약제학적 조성물"은 예를 들어, EV, 예컨대 약제학적으로 허용 가능한 담체 및 부형제와 같은 하나 이상의 다른 화학적 성분과 혼합되거나 섞이거나 또는 이에 현탁된 본 개시내용의 엑소솜과 같은 하나 이상의 본 명세서에 기재된 화합물을 지칭한다. 약제학적 조성물의 한 가지 목적은 EV, 예를 들어, 엑소솜의 제제를 대상체에 투여하는 것을 용이하게 하기 위한 것이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "폴리뉴클레오타이드"는 리보뉴클레오타이드, 데옥시리보뉴클레오타이드, 이들의 유사체 또는 이들의 혼합물을 포함하는 임의의 길이의 뉴클레오타이드의 중합체를 지칭한다. 이 용어는 분자의 기본적인 구조를 지칭한다. 따라서, 용어는 삼중-, 이중- 및 단일-가닥 데옥시리보핵산("DNA")뿐만 아니라 삼중-, 이중- 및 단일-가닥 리보핵산("RNA")을 포함한다. 이는 또한 예를 들어, 알킬화 및/또는 캡핑에 의한 변형 및 비변형 형태의 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 보다 구체적으로, 용어 "폴리뉴클레오타이드"는 스플라이싱 여부와 관계 없이 tRNA, rRNA, hRNA, siRNA 및 mRNA를 포함하는 폴리데옥시리보뉴클레오타이드(2-데옥시-D-리보스 함유), 폴리리보뉴클레오타이드(D-리보스 함유), 퓨린 또는 피리미딘 염기의 N- 또는 C-글리코시드인 임의의 다른 유형의 폴리뉴클레오타이드 및 정상 뉴클레오타이드 백본(normucleotidic backbone)을 함유하는 기타 중합체, 예를 들어, 폴리아마이드(예를 들어, 펩타이드 핵산 "PNA") 및 폴리모폴리노 중합체 및 기타 합성 서열-특이적 핵산 중합체(단, 중합체는 DNA 및 RNA에서 발견되는 것과 같은 염기 쌍 및 염기 스태킹을 허용하는 배열로 핵염기를 함유함)를 포함한다. 특정 양태에서, 폴리뉴클레오타이드는 mRNA를 포함한다. 다른 양태에서, mRNA는 합성 mRNA이다.
일부 양태에서, 합성 mRNA는 적어도 하나의 비천연 핵염기를 포함한다. 일부 양태에서, 소정의 클래스의 모든 핵염기는 비천연 핵염기로 대체되었다(예를 들어, 본 명세서에 개시된 폴리뉴클레오타이드의 모든 우리딘은 비천연 핵염기, 예를 들어, 5-메톡시우리딘으로 대체될 수 있음). 본 개시내용의 일부 양태에서, 생물학적으로 활성인 분자는 폴리뉴클레오타이드이다.
용어 "폴리펩타이드", "펩타이드" 및 "단백질"은 임의의 길이의 아미노산 중합체를 지칭하기 위해 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다. 중합체는 변형된 아미노산을 포함할 수 있다. 용어는 또한 자연적으로 또는 개재에 의해; 예를 들어, 이황화 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화 또는 임의의 다른 조작 또는 변형, 예컨대 표지 성분과의 접합에 의해 변형된 아미노산 중합체를 포함한다. 또한, 예를 들어, 아미노산(예를 들어, 호모시스테인, 오르니틴, p-아세틸페닐알라닌, D-아미노산 및 크레아틴과 같은 비천연 아미노산을 포함)의 하나 이상의 유사체뿐만 아니라 당업계에 공지된 기타 변형을 함유하는 폴리펩타이드도 정의 내에 포함된다. 본 개시내용의 일부 양태에서, 페이로드, 예를 들어, EV, 예를 들어 엑소솜에 부착된 생물학적으로 활성인 분자는 폴리펩타이드, 예를 들어, 항체 또는 ADC, PROTAC, 독소, 융합 단백질 또는 효소와 같은 이들의 유도체이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "폴리펩타이드"는 임의의 크기, 구조 또는 기능의 단백질, 폴리펩타이드 및 펩타이드를 지칭한다. 폴리펩타이드는 유전자 산물, 자연 발생적 폴리펩타이드, 합성 폴리펩타이드, 상동체, 오쏘로그, 파라로그, 단편 및 다른 등가물, 전술한 변이체 및 유사체를 포함한다. 폴리펩타이드는 단일 폴리펩타이드일 수 있거나 또는 이량체, 삼량체 또는 사량체와 같은 다-분자 복합체일 수 있다. 이들은 또한 단일 사슬 또는 다중 사슬 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 가장 일반적인 이황화 결합은 다중 사슬 폴리펩타이드에서 발견된다. 용어 폴리펩타이드는 또한 하나 이상의 아미노산 잔기가 상응하는 자연 발생적 아미노산의 인공적 화학적 유사체인 아미노산 중합체에 적용할 수 있다. 일부 양태에서, "펩타이드"는 50개의 아미노산 길이, 예를 들어, 약 5개, 10개, 15개, 20개, 25개, 30개, 35개, 40개, 45개 또는 50개의 아미노산 길이 이하일 수 있다. 일부 양태에서, "펩타이드"는 적어도 약 2 내지 약 50개, 적어도 약 3 내지 약 50개, 적어도 약 4 내지 약 50개, 적어도 약 5 내지 약 50개, 적어도 약 10 내지 약 50개, 적어도 약 15 내지 약 50개, 적어도 약 20 내지 약 50개, 적어도 약 25 내지 약 50개, 적어도 약 30 내지 약 50개, 적어도 약 35 내지 약 50개, 적어도 약 40 내지 약 50개 또는 적어도 약 45 내지 약 50개의 아미노산 길이일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "본 개시내용의 스캐폴드 단백질" 또는 이의 문법적 변형은,
(i) EV, 예를 들어, 엑소솜의 내강 표면에 위치하는 단백질(자연적으로 발현되거나, 화학적으로 또는 효소적으로 합성되거나 또는 재조합적으로 생산됨), 예컨대 MARCKS, MARKSL1 또는 BASP1;
(ii) (i)의 임의의 기능적 단편;
(iii) (i) 내지 (ii)의 임의의 기능적 변이체;
(iv) (i) 내지 (iii)의 임의의 유도체;
(v) EV, 예를 들어, 엑소솜의 내강 표면에 결합할 수 있는 (i)의 단백질로부터 유래된 도메인 또는 이의 조합에 상응하는 임의의 펩타이드 또는 이러한 펩타이드를 포함하는 분자;
(vi) EV, 예를 들어, 엑소솜의 내강 표면에 결합할 수 있는 (i)의 단백질로부터 유래된 모티프로부터 유래되는 임의의 펩타이드 또는 이러한 펩타이드를 포함하는 분자;
(vii) 적어도 하나의 비-천연 아미노산을 포함하는 (i) 내지 (vi)의 분자;
(viii) 또는 이들의 임의의 조합
을 지칭하며, 이는 페이로드, 예를 들어, 생물학적으로 활성인 분자(예를 들어, 치료적 단백질)를 EV, 예를 들어, 엑소솜의 내강 표면에 표적화(부착)하기 위한 스캐폴드로서 사용하기에 적합하다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "본 개시내용의 EV, 예를 들어, 엑소솜" 또는 이의 문법적 변형은 본 개시내용의 적어도 하나의 스캐폴드 단백질을 포함하는 EV, 예를 들어, 엑소솜을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "본 개시내용의 생산자 세포" 또는 이의 문법적 변형은 본 개시내용의 EV, 예를 들어, 엑소솜을 생산할 수 있는 세포를 지칭한다.
II. 세포외 소포체 단백질, 예를 들어, 엑소솜 단백질
본 개시내용의 일부 양태는 EV, 예를 들어, 엑소솜, 내강 표면에서 매우 풍부한 EV, 예를 들어, 엑소솜 단백질(스캐폴드 단백질)의 확인, 사용 및 변형에 관한 것이다. 이러한 EV 단백질 또는 엑소솜 단백질(스캐폴드 단백질)은 질량 분광 분석법 또는 당업계에 공지된 다른 방법을 사용하여 고도로 정제된 EV, 예를 들어, 엑소솜을 분석함으로써 확인될 수 있다.
본 개시내용의 스캐폴드 단백질은 EV, 예를 들어, 엑소솜, 막에 풍부한 다양한 내강 단백질 또는 막 단백질, 예컨대 막관통 단백질(즉, 하나 이상의 막관통 헬릭스를 통해 EV 막에 걸쳐 있는 단백질), 내재 단백질 및 말초 단백질(즉, 정전기적 상호작용을 통해 표면과 상호작용하고/하거나 모이어티를 고정하는 내강 표면 상의 단백질)을 포함한다. 구체적으로, 본 개시내용의 스캐폴드 단백질은 다음을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다:
(1) 미리스토일화된 알라닌 풍부 단백질 카이네이스 C 기질(MARCKS);
(2) 미리스토일화된 알라닌 풍부 단백질 카이네이스 C 기질 유사 1(MARCKSL1); 및
(3) 뇌의 산 가용성 단백질 1(BASP1).
본 명세서에서 확인된 하나 이상의 EV, 예를 들어, 엑소솜, 단백질(스캐폴드 단백질)은 생산자 세포, 생산 조건, 정제 방법 또는 엑소솜의 의도된 적용에 따라 선택적으로 사용될 수 있다.
특정 크기 범위, 표적화 모이어티, 전하 밀도, 페이로드 등을 갖는 소정의 EV, 예를 들어, 엑소솜의 내강(예를 들어, EV 막의 내강 표면)에서 풍부한 EV, 예를 들어, 엑소솜, 단백질은 본 개시내용의 일부 양태에서 확인되고 사용될 수 있다.
일부 양태에서, 본 명세서에 개시된 하나 이상의 EV, 예를 들어, 엑소솜, 단백질(예를 들어, MARCKS, MARKSL1, BASP1과 같은 스캐폴드 단백질, 이들의 임의의 기능적 단편, 변이체 또는 유도체 또는 이들의 임의의 조합)은 본 개시내용의 치료적 EV, 예를 들어, 엑소솜의 생성 및 단리를 위해 동시에 또는 나중에 사용될 수 있다.
III. 내강-조작된 EV, 예를 들어 , 엑소솜
세포외 소포체(EV), 예를 들어, 엑소솜은 전형적으로 직경이 20㎚ 내지 1000㎚이다. 작은 세포외 소포체인 엑소솜은 전형적으로 직경이 100㎚ 내지 200㎚이다. EV, 예를 들어, 엑소솜은 제한 지질 이중충과 다양한 단백질 및 핵산의 세트로 구성된다(문헌[Maas, S.L.N., et al., Trends. Cell Biol. 27(3):172-188 (2017)]). EV, 예를 들어, 엑소솜은 별개의 세포 유형 및 조직에서 우선적인 흡수를 나타내며, 이들의 향성(tropism)은 표적 세포 표면의 수용체와 상호작용하는 단백질을 표면에 첨가함으로써 지시될 수 있다(문헌[Alvarez-Erviti, L., et al., Nat. Biotechnol. 29(4):341-345 (2011)]).
항체와 달리, EV, 예를 들어, 엑소솜은 EV, 예를 들어, 엑소솜당 대략 수천에서 수만 개의 분자 상의 표면에 부착된 다수의 분자를 수용할 수 있다. 따라서, EV, 예를 들어, 엑소솜 및 페이로드, 예를 들어, 생물학적으로 활성인 분자(예를 들어, 치료적 분자)를 포함하는 접합체 또는 복합체는 고농도의 치료적 또는 진단적 화합물을 별개의 세포 유형에 전달함과 동시에 화합물에 대한 전반적인 전신 노출을 제한하여 표적외 독성을 감소시키는 플랫폼을 나타낸다. 또한, EV, 예를 들어, 엑소솜은 상이한 구획에서 다중 페이로드, 예를 들어, 생물학적으로 활성인 분자를 수용할 수 있는 가능성을 제공한다. 예를 들어, EV, 예를 들어, 엑소솜은 예를 들어, EV를 소정의 표적 세포(예를 들어, 암 세포) 또는 표적 조직(예를 들어, 간 또는 뇌), 하나 이상의 치료적 모이어티(예를 들어, 약물) 및/또는 하나 이상의 검출 가능한 모이어티(예를 들어, 조영제 또는 방사성 핵종)로 지시하는 EV의 외부 표면에 부착된 표적화 모이어티를 포함할 수 있다.
EV, 예를 들어, 엑소솜은 또한 EV의 내강 표면에 부착된 상이한 페이로드, 예를 들어, 치료적 모이어티(예를 들어, 약물) 및/또는 검출 가능한 모이어티(예를 들어, 조영제 또는 방사성 핵종)를 포함할 수 있다. 또한, EV, 예를 들어, 엑소솜은 또한 EV, 예를 들어, 엑소솜의 내강에 하나 이상의 페이로드, 예를 들어, 생물학적으로 활성인 분자(예를 들어, 치료제, 진단제, 보조제 등)를 포함할 수 있다.
따라서, EV, 예를 들어, 엑소솜은 단일 전달 비히클에서 동일하거나 상이한 역할 갖는 여러 페이로드, 예를 들어, 생물학적으로 활성인 분자를 매우 높은 밀도로 결합하는 전달 형식을 제공한다.
본 명세서에 기재된 EV, 예를 들어, 엑소솜은 약 20㎚ 내지 300㎚의 직경을 갖는 세포외 소포체이다. 소정의 실시형태에서, 본 개시내용의 EV, 예를 들어, 엑소솜은 약 20㎚ 내지 290㎚, 20㎚ 내지 280㎚, 20㎚ 내지 270㎚, 20㎚ 내지 260㎚, 20㎚ 내지 250㎚, 20㎚ 내지 240㎚, 20㎚ 내지 230㎚, 20㎚ 내지 220㎚, 20㎚ 내지 210㎚, 20㎚ 내지 200㎚, 20㎚ 내지 190㎚, 20㎚ 내지 180㎚, 20㎚ 내지 170㎚, 20㎚ 내지 160㎚, 20㎚ 내지 150㎚, 20㎚ 내지 140㎚, 20㎚ 내지 130㎚, 20㎚ 내지 120㎚, 20㎚ 내지 110㎚, 20㎚ 내지 100㎚, 20㎚ 내지 90㎚, 20㎚ 내지 80㎚, 20㎚ 내지 70㎚, 20㎚ 내지 60㎚, 20㎚ 내지 50㎚, 20㎚ 내지 40㎚, 20㎚ 내지 30㎚, 30㎚ 내지 300㎚, 30㎚ 내지 290㎚, 30㎚ 내지 280㎚, 30㎚ 내지 270㎚, 30㎚ 내지 260㎚, 30㎚ 내지 250㎚, 30㎚ 내지 240㎚, 30㎚ 내지 230㎚, 30㎚ 내지 220㎚, 30㎚ 내지 210㎚, 30㎚ 내지 200㎚, 30㎚ 내지 190㎚, 30㎚ 내지 180㎚, 30㎚ 내지 170㎚, 30㎚ 내지 160㎚, 30㎚ 내지 150㎚, 30㎚ 내지 140㎚, 30㎚ 내지 130㎚, 30㎚ 내지 120㎚, 30㎚ 내지 110㎚, 30㎚ 내지 100㎚, 30㎚ 내지 90㎚, 30㎚ 내지 80㎚, 30㎚ 내지 70㎚, 30㎚ 내지 60㎚, 30㎚ 내지 50㎚, 30㎚ 내지 40㎚, 40㎚ 내지 300㎚, 40㎚ 내지 290㎚, 40㎚ 내지 280㎚, 40㎚ 내지 270㎚, 40㎚ 내지 260㎚, 40㎚ 내지 250㎚, 40㎚ 내지 240㎚, 40㎚ 내지 230㎚, 40㎚ 내지 220㎚, 40㎚ 내지 210㎚, 40㎚ 내지 200㎚, 40㎚ 내지 190㎚, 40㎚ 내지 180㎚, 40㎚ 내지 170㎚, 40㎚ 내지 160㎚, 40㎚ 내지 150㎚, 40㎚ 내지 140㎚, 40㎚ 내지 130㎚, 40㎚ 내지 120㎚, 40㎚ 내지 110㎚, 40㎚ 내지 100㎚, 40㎚ 내지 90㎚, 40㎚ 내지 80㎚, 40㎚ 내지 70㎚, 40㎚ 내지 60㎚, 40㎚ 내지 50㎚, 50㎚ 내지 300㎚, 50㎚ 내지 290㎚, 50㎚ 내지 280㎚, 50㎚ 내지 270㎚, 50㎚ 내지 260㎚, 50㎚ 내지 250㎚, 50㎚ 내지 240㎚, 50㎚ 내지 230㎚, 50㎚ 내지 220㎚, 50㎚ 내지 210㎚, 50㎚ 내지 200㎚, 50㎚ 내지 190㎚, 50㎚ 내지 180㎚, 50㎚ 내지 170㎚, 50㎚ 내지 160㎚, 50㎚ 내지 150㎚, 50㎚ 내지 140㎚, 50㎚ 내지 130㎚, 50㎚ 내지 120㎚, 50㎚ 내지 110㎚, 50㎚ 내지 100㎚, 50㎚ 내지 90㎚, 50㎚ 내지 80㎚, 50㎚ 내지 70㎚, 50㎚ 내지 60㎚, 60㎚ 내지 300㎚, 60㎚ 내지 290㎚, 60㎚ 내지 280㎚, 60㎚ 내지 270㎚, 60㎚ 내지 260㎚, 60㎚ 내지 250㎚, 60㎚ 내지 240㎚, 60㎚ 내지 230㎚, 60㎚ 내지 220㎚, 60㎚ 내지 210㎚, 60㎚ 내지 200㎚, 60㎚ 내지 190㎚, 60㎚ 내지 180㎚, 60㎚ 내지 170㎚, 60㎚ 내지 160㎚, 60㎚ 내지 150㎚, 60㎚ 내지 140㎚, 60㎚ 내지 130㎚, 60㎚ 내지 120㎚, 60㎚ 내지 110㎚, 60㎚ 내지 100㎚, 60㎚ 내지 90㎚, 60㎚ 내지 80㎚, 60㎚ 내지 70㎚, 70㎚ 내지 300㎚, 70㎚ 내지 290㎚, 70㎚ 내지 280㎚, 70㎚ 내지 270㎚, 70㎚ 내지 260㎚, 70㎚ 내지 250㎚, 70㎚ 내지 240㎚, 70㎚ 내지 230㎚, 70㎚ 내지 220㎚, 70㎚ 내지 210㎚, 70㎚ 내지 200㎚, 70㎚ 내지 190㎚, 70㎚ 내지 180㎚, 70㎚ 내지 170㎚, 70㎚ 내지 160㎚, 70㎚ 내지 150㎚, 70㎚ 내지 140㎚, 70㎚ 내지 130㎚, 70㎚ 내지 120㎚, 70㎚ 내지 110㎚, 70㎚ 내지 100㎚, 70㎚ 내지 90㎚, 70㎚ 내지 80㎚, 80㎚ 내지 300㎚, 80㎚ 내지 290㎚, 80㎚ 내지 280㎚, 80㎚ 내지 270㎚, 80㎚ 내지 260㎚, 80㎚ 내지 250㎚, 80㎚ 내지 240㎚, 80㎚ 내지 230㎚, 80㎚ 내지 220㎚, 80㎚ 내지 210㎚, 80㎚ 내지 200㎚, 80㎚ 내지 190㎚, 80㎚ 내지 180㎚, 80㎚ 내지 170㎚, 80㎚ 내지 160㎚, 80㎚ 내지 150㎚, 80㎚ 내지 140㎚, 80㎚ 내지 130㎚, 80㎚ 내지 120㎚, 80㎚ 내지 110㎚, 80㎚ 내지 100㎚, 80㎚ 내지 90㎚, 90㎚ 내지 300㎚, 90㎚ 내지 290㎚, 90㎚ 내지 280㎚, 90㎚ 내지 270㎚, 90㎚ 내지 260㎚, 90㎚ 내지 250㎚, 90㎚ 내지 240㎚, 90㎚ 내지 230㎚, 90㎚ 내지 220㎚, 90㎚ 내지 210㎚, 90㎚ 내지 200㎚, 90㎚ 내지 190㎚, 90㎚ 내지 180㎚, 90㎚ 내지 170㎚, 90㎚ 내지 160㎚, 90㎚ 내지 150㎚, 90㎚ 내지 140㎚, 90㎚ 내지 130㎚, 90㎚ 내지 120㎚, 90㎚ 내지 110㎚, 90㎚ 내지 100㎚, 100㎚ 내지 300㎚, 110㎚ 내지 290㎚, 120㎚ 내지 280㎚, 130㎚ 내지 270㎚, 140㎚ 내지 260㎚, 150㎚ 내지 250㎚, 160㎚ 내지 240㎚, 170㎚ 내지 230㎚, 180㎚ 내지 220㎚ 또는 190㎚ 내지 210㎚의 직경을 갖는다. 본 명세서에 기재된 EV, 예를 들어, 엑소솜의 크기는 아래에 기재된 방법에 따라 측정될 수 있다.
일부 양태에서, 본 개시내용의 EV, 예를 들어, 엑소솜은 내부 표면 및 외부 표면을 포함하는 이중-지질 막("EV, 예를 들어, 엑소솜, 막")을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 내부 표면은 EV, 예를 들어, 엑소솜의 내부 코어(즉, 내강)를 향한다. 소정의 양태에서, 외부 표면은 생산자 세포 또는 표적 세포의 엔도솜, 다중소포체 또는 막/세포질과 접촉할 수 있다.
일부 양태에서, EV, 예를 들어, 엑소솜, 막은 지질 및 지방산을 포함한다. 일부 양태에서, EV, 예를 들어, 엑소솜, 막은 인지질, 당지질, 지방산, 스핑고지질, 포스포글리세라이드, 스테롤, 콜레스테롤 및 포스파티딜세린을 포함한다.
일부 양태에서, EV, 예를 들어, 엑소솜, 막은 내부 리플릿(leaflet) 및 외부 리플릿을 포함한다. 내부 및 외부 리플릿의 조성은 당업계에 공지된 교차이중층 분포 검정에 의해 결정될 수 있으며, 예를 들어, 문헌[Kuypers et al., Biohim Biophys Acta 1985 819:170] 참조. 일부 양태에서, 외부 리플릿의 조성은 대략 70% 내지 90%의 콜린 인지질, 대략 0% 내지 15%의 산성 인지질 및 대략 5% 내지 30%의 포스파티딜에탄올아민이다. 일부 양태에서, 내부 리플릿의 조성은 대략 15% 내지 40%의 콜린 인지질, 대략 10% 내지 50%의 산성 인지질 및 대략 30% 내지 60%의 포스파티딜에탄올아민이다.
일 양태에서, 본 개시내용은 내강-조작된 EV, 예를 들어, 엑소솜의 생성 및 용도에 관한 것이다. 내강-조작된 엑소솜은 조성이 변형된, 예를 들어, 자연에서 발견된 엑소솜의 조성과 관련하여 변형된 내부 공간(EV의 내강 표면)을 갖는다. 예를 들어, 내강 표면의 조성은 EV, 예를 들어, 엑소솜, 막의 내강 측 구성 요소의 단백질, 지질 또는 글리칸 함량을 변경함으로써 달성될 수 있다. 일부 양태에서, EV, 예를 들어, 엑소솜의 내강 표면은 하나 이상의 재조합적으로 발현된 단백질, 예를 들어, 본 개시내용의 스캐폴드 단백질, 예를 들어, EV에 대해 자연적이지 않은 엑소솜 내강 단백질, 예를 들어, 엑소솜을 포함할 수 있다. 따라서, 본 개시내용은 페이로드, 예를 들어, 생물학적으로 활성인 분자를 본 개시내용의 스캐폴드 단백질, 예를 들어, 엑소솜 내강 단백질에 연결하는 단계를 포함하는, 페이로드, 예를 들어, 생물학적으로 활성인 분자를 EV, 예를 들어, 엑소솜에 고정할 수 있게 하는 조성물을 제공한다. 본 개시내용은 또한 생물학적으로 활성인 분자를 본 개시내용의 스캐폴드 단백질, 예를 들어, 엑소솜 내강 단백질에 연결하는 단계를 포함하는, 페이로드, 예를 들어, 생물학적으로 활성인 분자를 EV, 예를 들어, 엑소솜에 고정하는 방법을 제공한다.
일부 양태에서, 본 개시내용의 스캐폴드 단백질, 예를 들어, 엑소솜 내강 단백질은 지질화를 통해 EV, 예를 들어, 엑소솜의 내강 표면에 부착된다. 일부 양태에서, 본 개시내용의 스캐폴드 단백질은 지방 아실화된다. 일부 양태에서, 스캐폴드 단백질은 미리스토일화된다.
미리스토일화는 미리스트산으로부터 유래된 미리스토일기가 N-말단 글리신의 알파-아미노기에 아마이드 결합에 의해 공유적으로 부착되는 지질화 변형이다. 미리스트산은 n-테트라데칸산이라는 체계적인 이름을 가진 14-탄소 포화 지방산(14:4)이다. 이러한 변형은 번역과 동시에 또는 번역 후에 첨가될 수 있다. 번역과 동시에 미리스토일기의 첨가 동안, N-말단 글리신은 새로 형성되고 성장하는 폴리펩타이드에서 N-말단 메티오닌 잔기의 절단 후 변형된다. 이는 미리스토일화된 단백질의 대략 80%에서 발생한다. 번역 후 미리스토일화는 전형적으로 카스페이스 절단 이벤트 후에 발생하여 내부 글리신 잔기의 노출을 초래하며, 이는 이후 미리스트산 첨가에 이용 가능할 것이다. 번역과 동시에 또는 번역 후 미리스토일화(생체내 또는 시험관내에서, 예를 들어, 효소적으로 수행)에 더하여, 본 개시내용의 스캐폴드 단백질, 예를 들어, 엑소솜 내강 단백질의 미리스토일화는 또한 예를 들어, 합성 단계로서 화학적 합성 중에 스캐폴드 단백질에 미리스트산을 추가함으로써 화학적 합성을 통해 발생할 수 있다.
일부 실시형태에서, 생물학적 막에 대한 지질 고정은 팔미토일화가 아니다(즉, 팔미트산, 일반적으로 시스테인에 부착되고, 덜 빈번하게 세린 또는 트레오닌에 부착됨). 다른 실시형태에서, 생물학적 막에 대한 지질 고정은 프레닐화(프레닐기의 부착) 또는 글리코실포스파티딜이노시톨-연결(GPI-연결)이다. 프레닐화된 단백질은 단백질의 시스테인 잔기에 공유적으로 부착된 소수성 아이소프렌 중합체(즉, 분지형 5-탄소 탄화수소)를 갖는 단백질이다. GPI-연결 단백질은 단백질의 C-말단 카복실기에 아마이드 연결을 통해 GPI 복합체 분자 그룹에 부착된다. GPI 부착은 GPI-트랜스아미데이스 복합체의 작용을 통해 발생한다. 포스파티딜이노시톨의 지방산 사슬은 막에 삽입되어 단백질을 막에 고정시킨다.
일부 실시형태에서, 내강-조작된 EV, 예를 들어, 엑소솜은 PEG-유도성 융합 및/또는 초음파 융합과 같은 화학적 및/또는 물리적 방법에 의해 생성된다.
다른 실시형태에서, 내강-조작된 EV, 예를 들어, 엑소솜은 유전 공학에 의해 생성된다. 유전적으로-변형된 생산자 세포 또는 유전적으로-변형된 세포의 자손으로부터 생산된 엑소솜은 변형된 내강 조성물을 함유할 수 있다. 일부 실시형태에서, 내강-조작된 EV, 예를 들어, 엑소솜은 EV, 예를 들어, 엑소솜, 단백질(예를 들어, 스캐폴드 단백질, 예를 들어, 엑소솜 내강 단백질, 예컨대 MARCKS, MARKSL1, BASP1 또는 이들의 조합)을 높거나 낮은 밀도로 갖거나, 또는 EV, 예를 들어, 엑소솜, 단백질의 변형 또는 단편(예를 들어, 이들의 임의의 기능적 단편, 변이체 또는 유도체 또는 이들의 임의의 조합)을 포함한다.
예를 들어, 내강-조작된 EV, 예를 들어, 엑소솜은 EV, 예를 들어, 엑소솜, 단백질 또는 EV, 예를 들어, 엑소솜, 단백질의 변형 또는 단편(예를 들어, 스캐폴드 단백질, 예를 들어, 엑소솜 내강 단백질, 예컨대 MARCKS, MARKSL1, BASP1, 이들의 임의의 기능적 단편, 변이체 또는 유도체 또는 이들의 임의의 조합)을 암호화하는 외인성 서열로 형질전환된 세포로부터 생산될 수 있다. 외인성 서열로부터 발현된 단백질을 포함하는 EV, 예를 들어, 엑소솜은 변형된 내강 표면 단백질(스캐폴드 단백질) 조성을 포함할 수 있다.
EV 단백질, 예를 들어, 엑소솜 단백질의 다양한 변형 또는 단편(예를 들어, 스캐폴드 단백질, 예를 들어, 엑소솜 내강 단백질, 예컨대 MARCKS, MARKSL1, BASP1, 이들의 임의의 기능적 단편, 변이체 또는 유도체 또는 이들의 임의의 조합)이 본 개시내용의 실시형태에 사용될 수 있다. 예를 들어, EV, 예를 들어, 엑소솜, 내강 표면을 보다 효과적으로 표적화하도록 변형된 단백질이 사용될 수 있다. EV, 예를 들어, 엑소솜, 내강 표면에 대한 특이적이고 효과적인 표적화에 필요한 최소한의 단편을 포함하도록 변형된 단백질이 또한 사용될 수 있다.
일부 양태에서, 본 개시내용의 스캐폴드 단백질, 예를 들어, 엑소솜 내강 단백질은 MARCKS 단백질 또는 이들의 단편, 변이체 또는 유도체를 포함한다. MARCKS 단백질(Uniprot 등록번호 P29966)은 또한 단백질 카이네이스 C 기질, 80kDa의 단백질, 경쇄로도 알려져 있다. 전장 인간 MARCKS 단백질은 332개의 아미노산 길이이며, 152번 내지 176번 아미노산 잔기에 칼모듈린-결합 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용 스캐폴드 단백질은 성숙 MARCKS 단백질(즉, N-말단 메티오닌 없음)을 포함한다. 일부 양태에서, 본 개시내용의 스캐폴드 단백질은 성숙 MARCKS 단백질로부터 유래되며, 즉, 이는 MARCKS 단백질의 단편, 변이체 또는 유도체이므로 비-성숙 단백질에 존재하는 N-말단 메티오닌이 결여되어 있다.
일부 양태에서, 본 개시내용의 스캐폴드 단백질, 예를 들어, 엑소솜 내강 단백질은 MARCKS-유사 단백질 1로도 알려진 MARCKSL1 단백질(Uniprot 등록번호 P49006) 및 대식세포 미리스토일화된 알라닌-풍부 C 카이네이스 기질을 포함한다. 전장 인간 MARCKSL1 단백질은 195개의 아미노산 길이이다. MARCKSL1 단백질은 87번 내지 110번 아미노산 잔기에 지질-결합 및 칼모듈린-결합에 관여하는 효과기 도메인을 갖는다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 스캐폴드 단백질은 성숙 MARCKSL1 단백질(즉, N-말단 메티오닌 없음)을 포함한다. 일부 양태에서, 본 개시내용의 스캐폴드 단백질은 성숙 MARCKSL1 단백질로부터 유래되며, 즉, 이는 성숙 MARCKSL1 단백질의 단편, 변이체 또는 유도체이므로 비-성숙 단백질에 존재하는 N-말단 메티오닌이 결여되어 있다.
일부 양태에서, 본 개시내용의 스캐폴드는 22kDa의 신경 조직-풍부 산성 단백질 또는 신경 축삭 막 단백질 NAP-22로도 알려진 BASP1 단백질(Uniprot 등록 번호 P80723)을 포함한다. 전장 인간 BASP1 단백질 서열(이성질체 1)은 227개의 아미노산 길이이다. 대안적 스플라이싱에 의해 생성된 이성질체는 이성질체 1로부터 88번 내지 141번 아미노산이 없다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 스캐폴드 단백질, 예를 들어, 엑소솜 내강 단백질은 성숙 BASP1 단백질(즉, N-말단 메티오닌 없음)을 포함한다. 일부 양태에서, 본 개시내용의 스캐폴드 단백질은 성숙 BASP1 단백질로부터 유래되며, 즉, 이는 성숙 BASP1 단백질의 단편, 변이체 또는 유도체이므로 비-성숙 단백질에 존재하는 N-말단 메티오닌이 결여되어 있다.
일부 양태에서, 본 개시내용의 스캐폴드 단백질, 예를 들어, 엑소솜 내강 단백질은 "N-말단 도메인"(ND) 및 "효과기 도메인"을 포함하되, ND 및/또는 ED는 EV, 예를 들어, 엑소솜의 내강 표면과 관련된다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "관련된"은 막 구성 요소에 대한 공유 연결을 포함하지 않는 EV, 예를 들어, 엑소솜의 내강 표면과 본 개시내용의 스캐폴드 단백질 간의 상호작용을 지칭한다. 예를 들어, 본 개시내용의 스캐폴드는 예를 들어, 지질 앵커(예를 들어, 미리스트산) 및/또는 막 인지질의 음으로 하전된 헤드와 정전기적으로 상호작용하는 다염기성 도메인을 통해 EV의 내강 표면과 관련될 수 있다. 다른 양태에서, 스캐폴드 단백질은 N-말단 도메인(ND) 및 효과기 도메인(ED)을 포함하되, ND는 EV의 내강 표면과 관련되고, ED는 이온 상호작용에 의해 EV의 내강 표면과 관련되며, ED는 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개 또는 적어도 7개의 인접한 라이신(Lys)을 순서대로 포함한다.
다른 양태에서, ED는 하나 이상의 저 복잡성(low complexity) 영역, 예를 들어, PEST 모티프를 더 포함한다. PEST 서열은 프롤린(P), 글루탐산(E), 세린(S) 및 트레오닌(T)이 풍부한 펩타이드 서열이다. 일부 양태에서, ED는 음으로 하전된 잔기(예를 들어, Glu) 및 일시적 인산화를 겪는(따라서, 둘 모두 ED 외부 영역에 음전하를 추가함) 많은 Ser 및 Thr을 더 포함한다.
일부 양태에서, ND는 지질화, 예를 들어, 미리스토일화를 통해 EV, 예를 들어, 엑소솜의 내강 표면과 관련된다. 일부 실시형태에서, ND는 N-말단에 Gly를 갖는다. 일부 실시형태에서, N-말단 Gly는 미리스토일화된다. 일부 양태에서, ND는 N-말단에 Met를 포함하지 않는다. 다른 실시형태에서, ND는 미리스토일화된 Gly를 포함하며, N-말단에 Met를 포함하지 않는다.
일부 양태에서, ED는 이온 상호작용에 의해 EV, 예를 들어, 엑소솜의 내강 표면에 관련된다. 일부 실시형태에서, ED는 정전기적 상호작용, 특히, 인력 정전기적 상호작용에 의해 EV, 예를 들어, 엑소솜의 내강 표면에 관련된다.
일부 양태에서, ED는 (i) 염기성 아미노산(예를 들어, 라이신) 또는 (ii) 폴리펩타이드 서열에서 서로 나란히 있는 2개 이상의 염기성 아미노산(예를 들어, 라이신)을 포함한다. 일부 양태에서, 염기성 아미노산은 라이신(Lys; K), 아르기닌(Arg, R) 또는 히스티딘(His, H)이다. 일부 실시형태에서, 염기성 아미노산은 (Lys)n이되, n은 1 내지 10의 정수이다.
다른 양태에서, ED의 N-말단이 ND의 C-말단에서 라이신에 직접 연결되는 경우, 즉, 라이신이 ED의 N-말단에 있고 ND의 C-말단의 라이신에 융합되는 경우, ED는 적어도 라이신을 포함하고, ND는 C-말단에 라이신을 포함한다. 다른 실시형태에서, ED는 ED의 N-말단이 링커, 예를 들어, 하나 이상의 아미노산에 의해 ND의 C-말단에 연결될 때, 적어도 2개의 라이신, 적어도 3개의 라이신, 적어도 4개의 라이신, 적어도 5개의 라이신, 적어도 6개의 라이신 또는 적어도 7개의 라이신을 포함한다.
일부 양태에서, ED는 K, KK, KKK, KKKK(서열번호 151), KKKKK(서열번호 152) 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 본 개시내용은 또한 일부 양태에서, 라이신 반복이 아르기닌으로 대체될 수 있음을 제공한다. 다른 양태에서, ED 또는 스캐폴드 단백질에서 아르기닌 반복은 라이신 효능에 비해 더 낮은 로딩 효능을 제공한다.
일부 양태에서, 본 개시내용에 유용한 스캐폴드 단백질, 예를 들어, 엑소솜 내강 단백질은 ED에서 또는 ND와 함께 ED에서, 즉, ND의 C-말단의 라이신 및 ED의 N-말단의 K에서 순서대로 반복되는 적어도 2개의 라이신 또는 적어도 3개의 라이신을 필요로 한다. 일부 실시형태에서, ED는 K, KK, KKK, KKKK(서열번호 151), KKKKK(서열번호 152) 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 양태에서, ND는 G:X2:X3:X4:X5:X6으로 제시되는 아미노산 서열을 포함하되, G는 Gly를 나타내고; ":"는 펩타이드 결합을 나타내며, X2 내지 X6 각각은 독립적으로 아미노산을 나타내고; X6은 염기성 아미노산을 나타낸다. 일부 양태에서, X6 아미노산은 Lys, Arg 및 His로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 양태에서, X5 아미노산은 Pro, Gly, Ala 및 Ser로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, X2 아미노산은 Pro, Gly, Ala 및 Ser로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 양태에서, X4는 Pro, Gly, Ala, Ser, Val, Ile, Leu, Phe, Trp, Tyr, Gln 및 Met로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 양태에서, 스캐폴드 단백질은 예를 들어, 미리스토일화된 N-말단에 Met를 포함하지 않는다.
일부 양태에서, 스캐폴드 단백질, 예를 들어, 엑소솜 내강 단백질은 ND 및 ED를 포함하되, ND는 G:X2:X3:X4:X5:X6으로 제시되는 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 G는 Gly를 나타내며; ":"는 펩타이드 결합을 나타내고, X2 내지 X6 각각은 독립적으로 아미노산을 나타내며; X6은 염기성 아미노산을 나타내고, X5 아미노산은 Pro, Gly, Ala 및 Ser로 이루어진 군으로부터 선택되며, X4는 Pro, Gly, Ala, Ser, Val, Ile, Leu, Phe, Trp, Tyr, Gln 및 Met로 이루어진 군으로부터 선택되고, X3은 아미노산을 나타내며, X2 아미노산은 Pro, Gly, Ala 및 Ser로 이루어진 군으로부터 선택되고, ED는 적어도 하나의 아미노산, 예를 들어, 적어도 하나의 Lys를 포함하며, 스캐폴드 단백질은 (i) 서열번호 4 내지 114, 116 내지 118, 122 내지 150 또는 180 내지 190을 포함하는 아미노산 서열 또는 (ii) 서열번호 115 또는 118 내지 121에 의해 암호화되는 아미노산 서열이 아니다.
일부 양태에서, 스캐폴드 단백질, 예를 들어, 엑소솜 내강 단백질은 N-말단 도메인(ND) 및 효과기 도메인(ED)을 포함하되, ND는 G:X2:X3:X4:X5:X6으로 제시되는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 G는 Gly로 표시되는 글리신이고; ":"는 펩타이드 결합을 나타내며, X2 내지 X6 각각은 독립적으로 아미노산이고; 여기서 X6은 염기성 아미노산을 포함하고, ED는 펩타이드 결합에 의해 X6에 연결되며 ED의 N-말단에 적어도 하나의 라이신을 포함한다. 일부 양태에서, 스캐폴드 단백질은 예를 들어, 미리스토일화된 N-말단에 Met를 포함하지 않는다. 다른 양태에서, 스캐폴드 단백질은 (i) 서열번호 4 내지 114, 116 내지 118, 122 내지 150 또는 180 내지 190을 포함하는 아미노산 서열 또는 (ii) 서열번호 115 또는 118 내지 121에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 포함하지 않거나 또는 이로 구성되지 않는다.
일부 실시형태에서, 스캐폴드 단백질, 예를 들어, 엑소솜 내강 단백질의 ND는 G:X2:X3:X4:X5:X6의 아미노산 서열을 포함하되,
a. G는 Gly를 나타내고;
b. ":"는 펩타이드 결합을 나타내며;
c. X2는 Pro, Gly, Ala 및 Ser로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산을 나타내고;
d. X3은 임의의 아미노산을 나타내며;
e. X4는 Pro, Gly, Ala, Ser, Val, Ile, Leu, Phe, Trp, Tyr, Gln 및 Met로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산을 나타내고;
f. X5는 Pro, Gly, Ala 및 Ser로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산을 나타내며; 그리고
g. X6은 Lys, Arg 및 His로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산을 나타낸다.
일부 양태에서, 스캐폴드 단백질, 예를 들어, 엑소솜 내강 단백질은 예를 들어, 미리스토일화된 N-말단에 Met를 포함하지 않는다. 다른 양태에서, 스캐폴드 단백질은 (i) 서열번호 4 내지 114, 116 내지 118, 122 내지 150 또는 180 내지 190을 포함하는 아미노산 서열 또는 (ii) 서열번호 115 또는 118 내지 121에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 포함하지 않거나 또는 이로 구성되지 않는다. 일부 양태에서, X3은 아미노산 Asn, Gln, Ser, Thr, Asp, Glu, Lys, His 및 Arg로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 양태에서, ND 및 ED는 링커에 의해 연결된다. 일부 실시형태에서, 링커는 하나 이상의 아미노산을 포함한다. 일부 양태에서, 용어 "링커"는 펩타이드 또는 폴리펩타이드 서열(예를 들어, 합성 펩타이드 또는 폴리펩타이드 서열) 또는 비-폴리펩타이드, 예를 들어, 알킬 사슬을 지칭한다. 일부 양태에서, 2개 이상의 링커는 탠덤(tandem)으로 연결될 수 있다. 일반적으로, 링커는 가요성을 제공하거나 또는 입체 방해를 방지/개선한다. 링커는 전형적으로 절단되지 않지만; 소정의 양태에서, 이러한 절단이 바람직할 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, 링커는 링커의 서열 내에 위치하거나 또는 링커 서열의 양 말단에서 링커의 측면에 위치할 수 있는 하나 이상의 프로테이스-절단성 부위를 포함할 수 있다. ND 및 ED가 링커에 의해 연결될 때, ED는 적어도 2개의 라이신, 적어도 3개의 라이신, 적어도 4개의 라이신, 적어도 5개의 라이신, 적어도 6개의 라이신 또는 적어도 7개의 라이신을 포함한다.
일부 양태에서, 링커는 펩타이드 링커이다. 일부 양태에서, 펩타이드 링커는 적어도 약 2개, 적어도 약 3개, 적어도 약 4개, 적어도 약 5개, 적어도 약 10개, 적어도 약 15개, 적어도 약 20개, 적어도 약 25개, 적어도 약 30개, 적어도 약 35개, 적어도 약 40개, 적어도 약 45개, 적어도 약 50개, 적어도 약 55개, 적어도 약 60개, 적어도 약 65개, 적어도 약 70개, 적어도 약 75개, 적어도 약 80개, 적어도 약 85개, 적어도 약 90개, 적어도 약 95개 또는 적어도 약 100개의 아미노산을 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 링커는 글리신/세린 링커이다. 일부 실시형태에서, 펩타이드 링커는 공식 [(Gly)n-Ser]m에 따른 글리신/세린 링커이되, n은 1 내지 100의 임의의 정수이고, m은 1 내지 100의 임의의 정수이다. 일부 양태에서, 글리신/세린 링커는 공식 [(Gly)x-Sery]z에 따르되, x는 1 내지 4의 정수이고, y는 0 또는 1이며, z는 1 내지 50의 정수이다. 일부 양태에서, 펩타이드 링커는 서열 Gn을 포함하되, n은 1 내지 100의 정수일 수 있다. 일부 양태에서, 펩타이드 링커는 서열 (GlyAla)n을 포함할 수 있되, n은 1 내지 100의 정수이다. 다른 양태에서, 펩타이드 링커는 서열 (GlyGlySer)n을 포함할 수 있되, n은 1 내지 100의 정수이다.
일부 양태에서, 펩타이드 링커는 합성, 즉, 비-자연 발생적이다. 일 실시형태에서, 펩타이드 링커는 아미노산의 제1 선형 서열을 자연에서 자연적으로 연결되거나 또는 유전적으로 융합되지 않은 아미노산의 제2 선형 서열에 연결하거나 또는 유전적으로 융합시키는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드(또는 폴리펩타이드)(예를 들어, 천연 또는 비-자연 발생적 펩타이드)를 포함한다. 예를 들어, 일 양태에서 펩타이드 링커는 자연 발생적 폴리펩타이드의 변형된 형태(예를 들어, 첨가, 치환 또는 결실과 같은 돌연변이를 포함)인 비-자연 발생적 폴리펩타이드를 포함할 수 있다.
다른 양태에서, 펩타이드 링커는 비-자연 발생적 아미노산을 포함할 수 있다. 또 다른 양태에서, 펩타이드 링커는 자연에서 발생하지 않는 선형 서열에서 발생하는 자연 발생적 아미노산을 포함할 수 있다. 또 다른 양태에서, 펩타이드 링커는 자연 발생적 폴리펩타이드 서열을 포함할 수 있다.
본 개시내용은 또한 스캐폴드 단백질, 예를 들어, 엑소솜 내강 단백질에 연결된 생물학적으로 활성인 분자를 포함하는 단리된 세포외 소포체(EV), 예를 들어, 엑소솜을 제공하되, 스캐폴드 단백질은 ND―ED를 포함하며, 여기서:
a. ND는 G:X2:X3:X4:X5:X6을 포함하되;
i. G는 Gly를 나타내고;
ii. ":"는 펩타이드 결합을 나타내며;
iii. X2는 Pro, Gly, Ala 및 Ser로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산을 나타내고;
iv. X3은 임의의 아미노산을 나타내며;
v. X4는 Pro, Gly, Ala, Ser, Val, Ile, Leu, Phe, Trp, Tyr, Glu 및 Met로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산을 나타내고;
vi. X5는 Pro, Gly, Ala 및 Ser로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산을 나타내며;
vii. X6은 Lys, Arg 및 His로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산을 나타내고;
b. "―"는 선택적 링커를 나타내며; 그리고
c. ED는 (i) 적어도 2개의 인접한 라이신(Lys), 펩타이드 결합에 의해 X6에 연결된 N 말단 라이신 또는 하나 이상의 아미노산 또는 (ii) 펩타이드 결합에 의해 X6에 직접 연결된 적어도 하나의 라이신을 포함하는 효과기 도메인이다. 일부 양태에서, 스캐폴드 단백질은 예를 들어, 미리스토일화된 N-말단에 Met를 포함하지 않는다. 다른 양태에서, 스캐폴드 단백질은 (i) 서열번호 4 내지 114, 116 내지 118, 122 내지 150 또는 180 내지 190을 포함하는 아미노산 서열 또는 (ii) 서열번호 115 또는 118 내지 121에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 포함하지 않거나 또는 이로 구성되지 않는다.
일부 양태에서, X2 아미노산은 Gly 및 Ala로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 양태에서, X3 아미노산은 Lys이다. 일부 양태에서, X4 아미노산은 Leu 또는 Glu이다. 일부 양태에서, X5 아미노산은 Ser 및 Ala로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 양태에서, X6 아미노산은 Lys이다. 일부 양태에서, X2 아미노산은 Gly, Ala 또는 Ser이고; X3 아미노산은 Lys 또는 Glu이며; X4 아미노산은 Leu, Phe, Ser 또는 Glu이고; X5 아미노산은 Ser 또는 Ala이며; X6 아미노산은 Lys이다. 일부 양태에서, ― 링커는 펩타이드 결합 또는 하나 이상의 아미노산을 포함한다.
일부 양태에서, 스캐폴드 단백질, 예를 들어, 엑소솜 내강 단백질에서 ED는 Lys(K), KK, KKK, KKKK(서열번호 151), KKKKK(서열번호 152), Arg(R), RR, RRR, RRRR(서열번호 153); RRRRR(서열번호 154), KR, RK, KKR, KRK, RKK, KRR, RRK, (K/R)(K/R)(K/R)(K/R)(서열번호 155), (K/R)(K/R)(K/R)(K/R)(K/R)(서열번호 156) 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
일부 양태에서, 스캐폴드 단백질, 예를 들어, 엑소솜 내강 단백질은 (i) GGKLSKK(서열번호 157), (ii) GAKLSKK(서열번호 158), (iii) GGKQSKK(서열번호 159), (iv) GGKLAKK(서열번호 160) 또는 (v) 이들의 임의의 조합에 제시되는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 스캐폴드 단백질은 (i) 내지 (v)의 서열에서 N-말단에 Met를 갖는 아미노산 서열을 포함하지 않는다. 다른 양태에서, 스캐폴드 단백질은 (i) 서열번호 4 내지 114, 116 내지 118 또는 122 내지 150을 포함하는 아미노산 서열 또는 (ii) 서열번호 115 또는 118 내지 121에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 구성되지 않는다.
일부 양태에서, 스캐폴드 단백질, 예를 들어, 엑소솜 내강 단백질에서 ND는 (i) GGKLSK(서열번호 203), (ii) GAKLSK(서열번호 204), (iii) GGKQSK(서열번호 205), (iv) GGKLAK(서열번호 206) 또는 (v) 이들의 임의의 조합의 아미노산 서열을 포함하고, 스캐폴드 단백질에서 ED는 (a) K, (b) KK, (c) KKK, (d) KKKG(서열번호 207), (e) KKKGY(서열번호 208), (f) KKKGYN(서열번호 209), (g) KKKGYNV(서열번호 210), (h) KKKGYNVN(서열번호 211), (i) KKKGYS(서열번호 212), (k) KKKGYG(서열번호 213), (l) KKKGYGG(서열번호 214), (m) KKKGS(서열번호 215), (n) KKKGSG(서열번호 216), (o) KKKGSG(서열번호 217), (p) KKKGSGS(서열번호 218), (q) KKKS(서열번호 219), (r) KKKSG(서열번호 220), (s) KKKSGG(서열번호 221), (t) KKKSGGS(서열번호 222), (u) KKKSGGSG(서열번호 223), (v) KKSGGSGG(서열번호 224), (w) KKKSGGSGGS(서열번호 225), (x) KRFSFKKS(서열번호 226) 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 양태에서, 스캐폴드 단백질은 (i) 내지 (v)에서 서열의 N-말단에 Met를 갖는 아미노산 서열을 포함하지 않는다. 일부 양태에서, 스캐폴드 단백질은 (i) 서열번호 4 내지 114, 116 내지 118, 122 내지 150 또는 180 내지 190을 포함하는 아미노산 서열 또는 (ii) 서열번호 115 또는 118 내지 121에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 구성되지 않는다.
일부 양태에서, 본 개시내용의 스캐폴드 단백질, 예를 들어, 엑소솜 내강 단백질의 폴리펩타이드 서열은 (i) GGKLSKK(서열번호 157), (ii) GAKLSKK(서열번호 158), (iii) GGKQSKK(서열번호 159), (iv) GGKLAKK(서열번호 160) 또는 (v) 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 구성된다.
일부 양태에서, 스캐폴드 단백질, 예를 들어, 엑소솜 내강 단백질은 (i) GGKLSKKK(서열번호 161), (ii) GGKLSKKS(서열번호 162), (iii) GAKLSKKK(서열번호 163), (iv) GAKLSKKS(서열번호 164), (v) GGKQSKKK(서열번호 165), (vi) GGKQSKKS(서열번호 166), (vii) GGKLAKKK(서열번호 167), (viii) GGKLAKKS(서열번호 168) 또는 (ix) 이들의 임의의 조합의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 스캐폴드 단백질은 (i) 내지 (ix)에서 서열의 N-말단에 Met를 갖는 아미노산 서열을 포함하지 않는다. 일부 양태에서, 스캐폴드 단백질은 (i) 서열번호 4 내지 114, 116 내지 118, 122 내지 150 또는 180 내지 190을 포함하는 아미노산 서열 또는 (ii) 서열번호 115 또는 118 내지 121에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 구성되지 않는다.
일부 양태에서, 본 개시내용의 스캐폴드 단백질, 예를 들어, 엑소솜 내강 단백질의 폴리펩타이드 서열은 (i) GGKLSKKK(서열번호 161), (ii) GGKLSKKS(서열번호 162), (iii) GAKLSKKK(서열번호 163), (iv) GAKLSKKS(서열번호 164), (v) GGKQSKKK(서열번호 165), (vi) GGKQSKKS(서열번호 166), (vii) GGKLAKKK(서열번호 167), (viii) GGKLAKKS(서열번호 168) 및 (ix) 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 구성된다.
일부 양태에서, 스캐폴드 단백질, 예를 들어, 엑소솜 내강 단백질은 적어도 약 8, 적어도 약 9, 적어도 약 10, 적어도 약 11, 적어도 약 12, 적어도 약 13, 적어도 약 14, 적어도 약 15, 적어도 약 16, 적어도 약 17, 적어도 약 18, 적어도 약 19, 적어도 약 20, 적어도 약 21, 적어도 약 22, 적어도 약 23, 적어도 약 24, 적어도 약 25, 적어도 약 26, 적어도 약 27, 적어도 약 28, 적어도 약 29, 적어도 약 30, 적어도 31, 적어도 약 32, 적어도 약 33, 적어도 약 34, 적어도 약 35, 적어도 약 36, 적어도 약 37, 적어도 약 38, 적어도 약 39, 적어도 약 39, 적어도 약 40, 적어도 약 41, 적어도 약 42, 적어도 약 43, 적어도 약 44, 적어도 약 50, 적어도 약 46, 적어도 약 47, 적어도 약 48, 적어도 약 49, 적어도 약 50, 적어도 약 55, 적어도 약 60, 적어도 약 65, 적어도 약 70, 적어도 약 75, 적어도 약 80, 적어도 85, 적어도 약 90, 적어도 약 95, 적어도 약 100, 적어도 약 105, 적어도 약 110, 적어도 약 115, 적어도 약 120, 적어도 약 125, 적어도 약 130, 적어도 약 135, 적어도 약 140, 적어도 약 145, 적어도 약 150, 적어도 약 155, 적어도 약 160, 적어도 약 165, 적어도 약 170, 적어도 약 175, 적어도 약 180, 적어도 약 185, 적어도 약 190, 적어도 약 195, 적어도 약 200, 적어도 약 205, 적어도 약 210, 적어도 약 215, 적어도 약 220, 적어도 약 225, 적어도 약 230, 적어도 약 235, 적어도 약 240, 적어도 약 245, 적어도 약 250, 적어도 약 255, 적어도 약 260, 적어도 약 265, 적어도 약 270, 적어도 약 275, 적어도 약 280, 적어도 약 285, 적어도 약 290, 적어도 약 295, 적어도 약 300, 적어도 약 305, 적어도 약 310, 적어도 약 315, 적어도 약 320, 적어도 약 325, 적어도 약 330, 적어도 약 335, 적어도 약 340, 적어도 약 345 또는 적어도 약 350개의 아미노산 길이이다.
일부 양태에서, 스캐폴드 단백질, 예를 들어, 엑소솜 내강 단백질은 약 5개 내지 약 10개, 약 10개 내지 약 20개, 약 20개 내지 약 30개, 약 30개 내지 약 40개, 약 40개 내지 약 50개, 약 50개 내지 약 60개, 약 60개 내지 약 70개, 약 70개 내지 약 80개, 약 80개 내지 약 90개, 약 90개 내지 약 100개, 약 100개 내지 약 110개, 약 110개 내지 약 120개, 약 120개 내지 약 130개, 약 130개 내지 약 140개, 약 140개 내지 약 150개, 약 150개 내지 약 160개, 약 160개 내지 약 170개, 약 170개 내지 약 180개, 약 180개 내지 약 190개, 약 190개 내지 약 200개, 약 200개 내지 약 210개, 약 210개 내지 약 220개, 약 220개 내지 약 230개, 약 230개 내지 약 240개, 약 240개 내지 약 250개, 약 250개 내지 약 260개, 약 260개 내지 약 270개, 약 270개 내지 약 280개, 약 280개 내지 약 290개, 약 290개 내지 약 300개, 약 300개 내지 약 310개, 약 310개 내지 약 320개, 약 320개 내지 약 330개, 약 330개 내지 약 340개 또는 약 340개 내지 약 250개의 아미노산 길이이다.
일부 양태에서, 스캐폴드 단백질, 예를 들어, 엑소솜 내강 단백질은 (i) GGKLSKKKKGYNVN(서열번호 169), (ii) GAKLSKKKKGYNVN(서열번호 170), (iii) GGKQSKKKKGYNVN(서열번호 171), (iv) GGKLAKKKKGYNVN(서열번호 172), (v) GGKLSKKKKGYSGG(서열번호 173), (vi) GGKLSKKKKGSGGS(서열번호 174), (vii) GGKLSKKKKSGGSG(서열번호 175), (viii) GGKLSKKKSGGSGG(서열번호 176), (ix) GGKLSKKSGGSGGS(서열번호 177), (x) GGKLSKSGGSGGSV(서열번호 178) 또는 (xi) GAKKSKKRFSFKKS(서열번호 179)를 포함한다. 일부 양태에서, 스캐폴드 단백질은 (i) 내지 (xi)에서 서열의 N-말단에 Met를 갖는 아미노산 서열을 포함하지 않는다. 일부 양태에서, 스캐폴드 단백질은 (i) 서열번호 4 내지 114, 116 내지 118, 122 내지 150 또는 180 내지 190을 포함하는 아미노산 서열 또는 (ii) 서열번호 115 또는 118 내지 121에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 구성되지 않는다.
일부 양태에서, 본 개시내용의 스캐폴드 단백질, 예를 들어, 엑소솜 내강 단백질의 폴리펩타이드 서열은 (i) GGKLSKKKKGYNVN(서열번호 169), (ii) GAKLSKKKKGYNVN(서열번호 170), (iii) GGKQSKKKKGYNVN(서열번호 171), (iv) GGKLAKKKKGYNVN(서열번호 172), (v) GGKLSKKKKGYSGG(서열번호 173), (vi) GGKLSKKKKGSGGS(서열번호 174), (vii) GGKLSKKKKSGGSG(서열번호 175), (viii) GGKLSKKKSGGSGG(서열번호 176), (ix) GGKLSKKSGGSGGS(서열번호 177), (x) GGKLSKSGGSGGSV(서열번호 178) 또는 (xi) GAKKSKKRFSFKKS(서열번호 179)로 구성된다. 일부 양태에서, 스캐폴드 단백질은 (i) 내지 (xi)에서 서열의 N-말단에 Met를 갖는 아미노산 서열을 포함하지 않는다. 일부 양태에서, 스캐폴드 단백질은 (i) 서열번호 4 내지 114, 116 내지 118, 122 내지 150 또는 180 내지 190을 포함하는 아미노산 서열 또는 (ii) 서열번호 115 또는 118 내지 121에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 구성되지 않는다.
다른 양태에서, 스캐폴드 단백질, 예를 들어, 엑소솜 내강 단백질은 본 명세서에 개시된 서열 서열 중 어느 하나를 포함하지만, N-말단에 Met를 갖는 상응하는 서열, 예를 들어, 서열번호 4 내지 109를 포함하지 않는다. 일부 양태에서, 스캐폴드 단백질은 표 1의 서열 중 어느 하나를 포함하지만, (i) 서열번호 4 내지 114, 116 내지 118, 122 내지 150 또는 180 내지 190을 포함하는 아미노산 서열 또는 (ii) 서열번호 115 또는 118 내지 121에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 구성되지 않는다.
본 개시내용에 유용한 스캐폴드 단백질, 예를 들어, 엑소솜 내강 단백질의 비제한적인 예는 아래에 열거되어 있다.
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
일부 양태에서, 본 개시내용의 스캐폴드 단백질, 예를 들어, 엑소솜 내강 단백질은 본 개시내용의 임의의 서열로 구성되거나 또는 본질적으로 구성된다. 일부 양태에서, 본 개시내용의 스캐폴드는 표 1에 개시된 서열로 구성된다. 일부 양태에서, 본 개시내용의 스캐폴드는 본 명세서에 개시된 서열, 예를 들어, 막 앵커(예를 들어, 미리스트산)에 공유적으로 부착된 표 1에 개시된 서열로 구성된다. 일부 양태에서, 막 고정은 지질화를 통해 수행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 지질화는 예를 들어, 지방 아실화일 수 있다. 일부 양태에서, 지방 아실화는 예를 들어, 미리스토일화일 수 있다. 일부 양태에서, 막 앵커는 본 명세서에 개시된 서열, 예를 들어, 표 1에 개시된 서열의 N-말단 아미노산에 공유적으로 부착된다. 일부 양태에서, 막 앵커는 본 명세서에 개시된 서열, 예를 들어, 표 1에 개시된 서열의 N-말단 글리신에 공유적으로 부착된다. 따라서, 일부 양태에서, 본 개시내용의 스캐폴드는 개시된 서열, 예를 들어, N-미리스토일화된 표 1에 개시된 서열로 구성된다.
일부 양태에서, 본 개시내용의 스캐폴드 단백질, 예를 들어, 엑소솜 내강 단백질은 N-말단 Met를 함유하지 않는다. 일부 양태에서, 스캐폴드 단백질은 지질 앵커로서 기능하는, 스캐폴드 단백질의 N-말단에서 지질화된 아미노산, 예를 들어, 미리스토일화된 아미노산을 포함한다. 일부 양태에서, Gly에서 스캐폴드 단백질의 N-말단에 있는 아미노산 잔기. N-말단 Gly의 존재는 N-미리스토일화의 필요 조건이다. 일부 양태에서, 스캐폴드 단백질의 N-말단에 있는 아미노산 잔기는 합성이다. 일부 양태에서, 스캐폴드 단백질의 N-말단에 있는 아미노산 잔기는 글리신 유사체, 예를 들어, 알릴글리신, 뷰틸글리신 또는 프로파길글리신이다.
일부 양태에서, 지질 앵커는 본 개시내용의 스캐폴드 단백질의 임의의 N-말단 아미노산에 화학적 합성에 의해 또는 효소적으로 부착될 수 있다.
다른 양태에서, 지질 앵커는 당업계에 공지된 임의의 지질 앵커, 예를 들어, 팔미트산 또는 글리코실포스파티딜이노시톨일 수 있다. 예를 들어, 미리스트산이 제한되는 배양 배지를 사용하는 특수한 상황에서, 더 짧은-사슬 및 불포화를 포함하는 일부 다른 지방산은 N-말단 글리신에 부착될 수 있다. 예를 들어, BK 채널에서, 미리스테이트는 하이드록시에스터 연결을 통해 내부 세린/트레오닌 또는 타이로신 잔기에 번역 후 부착되는 것으로 보고되었다. 당업계에 공지된 막 앵커는 아래 표에 제시되어 있다.
Figure pct00005
일부 실시형태에서, 스캐폴드 단백질, 예를 들어, 엑소솜 내강 단백질은 서열번호 1(MARCKS), 서열번호 2(MARCKSL1) 또는 서열번호 3(BASP1)의 성숙 형태(즉, 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3에 존재하는 N-말단 메티오닌 아미노산이 없음)와 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 스캐폴드 단백질, 예를 들어, 엑소솜 내강 단백질은 서열번호 1(MARCKS), 서열번호 2(MARCKSL1) 또는 서열번호 3(BASP1)의 성숙 형태(즉, 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3에 존재하는 N-말단 메티오닌 아미노산 없음)의 기능적 단편과 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 본 개시내용의 스캐폴드 단백질에 부착된 생물학적으로 활성인 분자는 EV(예를 들어, 엑소솜)의 내강 측에 있다.
일부 양태에서, 스캐폴드 단백질, 예를 들어, 엑소솜 내강 단백질은 막관통 도메인을 더 포함한다. 일부 양태에서, 막관통 도메인은 EV(예를 들어, 엑소솜)의 내강 측에 위치한 스캐폴드 단백질의 ED 도메인과 페이로드, 예를 들어, 생물학적으로 활성인 분자 사이에 개재된다. 따라서, 페이로드, 예를 들어, 생물학적으로 활성인 분자는 EV(예를 들어, 엑소솜)의 외부 표면에 고정된다.
일부 양태에서, 스캐폴드 단백질, 예를 들어, 엑소솜 내강 단백질은 소포체외 도메인을 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 소포체외 도메인은 막관통 도메인과 생물학적으로 활성인 분자 사이에 개재된다.
일부 양태에서, 스캐폴드 단백질은 적어도 하나의 링커, 예를 들어, 펩타이드 링커를 통해 생물학적으로 활성인 분자에 연결된다. 일부 양태에서, ND는 두 도메인 사이에 직접 개재된 링커에 의해 ED에 연결된다. 일부 양태에서, 링커는 예를 들어, 펩타이드 결합 또는 하나 이상의 아미노산을 포함한다. 일부 양태에서, 링커는 절단성 링커를 포함한다. 일부 양태에서, 링커는 가요성 링커를 포함한다. 일부 양태에서, 링커는 자기-희생 링커(self-immolative linker)를 포함한다.
본 개시내용의 스캐폴드 단백질과 생물학적으로 활성인 분자(예를 들어, 치료적 활성을 갖는 분자) 사이의 융합이 또한 사용될 수 있다. 예를 들어, 융합 단백질은 MARCKS, MARCKSL1, BASP1과 같은 스캐폴드 단백질 또는 이들의 변형, 특히 이들의 단편 또는 변이체, 및 페이로드, 예를 들어, 생물학적으로 활성인 분자(예를 들어, 치료적 펩타이드)를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 융합 단백질은 BASP1의 아미노 말단의 단편을 포함하는 스캐폴드 단백질을 포함한다. 일부 양태에서, 생물학적으로 활성인 분자는 단백질, 폴리펩타이드, 펩타이드, 폴리뉴클레오타이드(DNA 및/또는 RNA), 화학적 화합물, 바이러스, 이오노포어, 이오노포어의 담체, 채널 또는 기공을 형성하는 모이어티 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
생물학적으로 활성인 분자(예를 들어, 치료적 펩타이드)는 천연 펩타이드, 재조합 펩타이드, 합성 펩타이드, 융합 단백질 또는 치료적 화합물에 대한 링커로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 생물학적으로 활성인 분자(예를 들어, 치료적 화합물)는 또한 뉴클레오타이드, 아미노산, 지질, 탄수화물 또는 소분자일 수 있다. 생물학적으로 활성인 분자(예를 들어, 치료적 펩타이드)는 항체, 효소, 리간드, 항원(예를 들어, 종양 항원 또는 세균, 바이러스, 진균 또는 원생동물과 같은 감염원으로부터의 항원), 수용체, 항균성 펩타이드, 전사 인자 또는 이들의 단편 또는 변형일 수 있다.
페이로드, 예를 들어, 생물학적으로 활성인 분자에 융합 또는 접합된 본 개시내용의 스캐폴드를 포함하는 융합 단백질은 EV, 예를 들어, 엑소솜의 내강 표면에 부착되고, EV, 예를 들어, 엑소솜에, 예를 들어, 치료적 활성을 제공할 수 있다.
일부 실시형태에서, 생물학적으로 활성인 분자(예를 들어, 치료적 펩타이드)는 게놈 편집 복합체의 구성 요소이다. 일부 실시형태에서, 상기 게놈 편집 복합체는 전사 활성자-유사 효과기 뉴클리에이스(TAL-효과기 뉴클리에이스 또는 TALEN); 아연 핑거 뉴클리에이스(ZFN); 재조합효소; CRISPR/Cas9 복합체, CRISPR/Cpf1 복합체, CRISPR/C2c1, C2c2 또는 C2c3 복합체, CRISPR/CasY 또는 CasX 복합체 또는 당업계에 공지된 임의의 다른 적절한 CRISPR 복합체; 또는 당업계에 공지된 임의의 다른 적절한 게놈 편집 복합체 또는 이들의 임의의 조합이다.
일부 실시형태에서, 생물학적으로 활성인 분자(예를 들어, 치료적 펩타이드)는 막관통 펩타이드이다. 본 명세서에 기재된 막관통 펩타이드는 본 명세서에 기재된 임의의 서열 또는 이의 임의의 단편 또는 변이체에 대한 융합 단백질로서 발현될 수 있다. 일부 실시형태에서, 막관통 단백질은 EV, 예를 들어, 엑소솜의 내강의 내강 서열에 융합된 제1 말단 및 EV, 예를 들어, 엑소솜의 표면 상에 발현된 제2 말단을 갖는다.
일부 실시형태에서, 예를 들어, 본 개시내용의 EV는 제2 스캐폴드 단백질을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 제2 스캐폴드 단백질은 PTGFRN 폴리펩타이드, BSG 폴리펩타이드, IGSF2 폴리펩타이드, IGSF3 폴리펩타이드, IGSF8 폴리펩타이드, ITGB1 폴리펩타이드, ITGA4 폴리펩타이드, SLC3A2 폴리펩타이드, ATP 수송자 폴리펩타이드, 아미노펩티데이스 N(ANPEP) 폴리펩타이드, 엑토뉴클레오타이드 파이로포스파테이스/포스포다이에스터레이스 패밀리 1(ENPP1) 폴리펩타이드, 네프릴리신 (MME) 폴리펩타이드, 뉴로필린-1(NRP1) 폴리펩타이드 또는 이들의 단편, 변이체 또는 유도체를 포함하는 막관통 단백질을 포함한다. 제2 스캐폴드 단백질의 비제한적인 예는 미국 특허 제10,195,290호 및 PCT 공개 WO 2019/040920에서 찾을 수 있으며, 이들은 그 전문이 참조에 의해 본 명세서에 원용되어 있다.
일부 실시형태에서, 생물학적으로 활성인 분자(예를 들어, 치료적 펩타이드)는 핵산 결합 단백질이다. 일부 실시형태에서, 핵산 결합 단백질은 다이서(Dicer), 아르고노트 단백질(Argonaute protein), TRBP, MS2 박테리오파지 외피 단백질이다. 일부 실시형태에서, 핵산 결합 단백질은 하나 이상의 RNA 또는 DNA 분자를 추가적으로 포함한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 RNA는 miRNA, siRNA, 가이드 RNA, lincRNA, mRNA, 안티센스 RNA, dsRNA 또는 이들의 조합이다.
일부 실시형태에서, 생물학적으로 활성인 분자(예를 들어, 치료적 펩타이드)는 단백질-단백질 상호작용 시스템의 일부이다. 일부 실시형태에서, 단백질-단백질 상호작용 시스템은 FRB-FKBP 상호작용 시스템, 예를 들어, 문헌[Banaszynski et al., J Am Chem Soc. 2005 Apr 6;127(13):4715-21]에 기술되어 있는 바와 같은 FRB-FKBP 상호작용 시스템을 포함한다.
융합 단백질은 EV, 예를 들어, 엑소솜의 내강 표면에 대해 표적화되고, EV, 예를 들어, 엑소솜에 치료적 활성을 제공할 수 있다.
일부 실시형태에서, 표적화 모이어티를 갖는 융합 단백질이 사용된다. 예를 들어, 융합 단백질은 (i) MARCKS, MARCKSL1, BASP1과 같은 스캐폴드 단백질 또는 이의 단편, 변이체 또는 변형 및 (ii) 표적화 모이어티를 포함할 수 있다. 표적화 모이어티는 EV, 예를 들어, 엑소솜을 사용하는 치료를 위해 EV, 예를 들어, 엑소솜을 특정 장기, 조직 또는 세포로 표적화하는데 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적화 모이어티는 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다.
항체 및 이의 항원-결합 단편은 전체 항체, 다클론, 단일클론 및 재조합 항체, 이의 단편을 포함하며, 단일-사슬 항체, 인간화된 항체, 뮤린 항체, 키메라, 마우스-인간, 마우스-영장류, 영장류-인간 단일클론 항체, 항-유전자형 항체, 예를 들어, scFv, (scFv)2, Fab, Fab' 및 F(ab')2, F(ab1)2, Fv, dAb 및 Fd 단편과 같은 항체 단편, 다이어바디, 미니바디, 낙타과 항체 및 항체-관련 폴리펩타이드를 더 포함한다.
항체 및 이의 항원-결합 단편은 또한 목적하는 생물학적 활성 또는 기능을 나타내는 한 이중특이성 항체 및 다중특이성 항체를 포함한다. 항체의 모듈식 구조는 60개를 초과하는 상이한 이중특이성 항체 형식을 생성하는데 이용되었다. 그 전문이 참조에 의해 본 명세서에 원용되어 있는 문헌[Spiess et al. (2015) Molecular Immunology 67:95-106] 참조. 따라서, 일부 실시형태에서, 이중특이성 항체 형식은 crossMab, DAF(이중 작용 Fab)(투-인-원), DAF(포-인-원), DutaMab, DT-IgG, 놉-인-홀 공통 LC(Knobs-in-hole common LC), 놉-인-홀 어셈블리(Knobs-in-holes assembly), 전하 쌍, Fab-암(arm) 교환, SEED바디, Triomab, LUZ-Y(2개의 HC의 이종이량체화를 유도하는 류신 지퍼를 갖는 이중특이성 항체), Fcab, Kλ-바디, 직교 Fab, DVD-IgG(이중 가변 도메인 IgG), IgG(H)-scFv, scFv-(H)IgG, IgG(L)-scFv, scFv-(L)IgG, IgG(L,H)-Fv, IgG(H)-V, V(H)-IgG, IgG(L)-V, V(L)-IgG, KIH IgG-scFab, 2scFv-IgG, IgG-2scFv, scFv4-Ig, Zy바디, DVI-IgG(포-인-원), 나노바디, 나노바디-HSA, BiTE(이중특이성 T 세포 관여항체(engager)), 다이어바디, DART(이중-친화성-재표적화), TandAb(탠덤 항체), sc다이어바디, sc다이어바디-CH3, 트리플 바디, 미니항체, 미니바디, TriBi 미니바디, scFv-CH3 KIH, Fab-scFv, scFv-CH-CL-scFv, F(ab')2, F(ab')2-ScFv2, scFv-KIH, Fab-scFv-Fc, 4가 HC Ab, sc다이어바디-Fc, 다이어바디-Fc, 탠덤 scFv-Fc, 인트라바디, 닥앤락(Dock and Lock), ImmTAC, HSA바디, sc다이어바디-HSA, 탠덤 scFv-독소, IgG-IgG, Cov-X-바디 및 scFv1-PEG-scFV2로부터 선택된다. 이중특이성 항체는 경쇄 또는 중쇄의 아미노 또는 카복시 말단에 추가적인 항원-결합 단위를 추가함으로써 이중특이성에 대해 조작된 단일특이성 항체일 수 있다. 이러한 추가적인 항원-결합 단위에 대한 대안은 단일 도메인 항체(쌍을 이루지 않은 VL 또는 VH), 쌍을 이룬 항체 가변 도메인(예를 들어, Fv 또는 scFv) 또는 조작된 단백질 스캐폴드를 포함한다. 이중특이성 항체 불변 도메인의 일부 또는 전부가 결여된 다수의 이중특이성 단편 형태가 당업계에 공지되어 있다.
일부 실시형태에서, 생물학적으로 활성인 분자(예를 들어, 치료적 펩타이드)는 본 개시내용의 스캐폴드 단백질 및 바이러스 단백질을 포함하는 융합 단백질이다. 일부 실시형태에서, 바이러스 단백질은 바이러스 캡시드, 외피 단백질 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시형태에서, 융합 단백질은 EV, 예를 들어, 엑소솜의 내강 표면 상에 유지되는 온전한 바이러스의 어셈블리를 허용한다.
일부 실시형태에서, 생물학적으로 활성인 분자는 음성 관문 조절자에 대한 저해제 또는 음성 관문 조절자의 결합 파트너에 대한 저해제이다. 일부 실시형태에서, 음성 관문 조절자는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: 세포독성 T-림프구-관련 단백질 4(CTLA-4), 세포예정사 단백질 1(PD-1), 림프구-활성화 유전자 3(LAG-3), T-세포 면역글로불린 뮤신-함유 단백질 3(TIM-3), B 및 T 림프구 감쇠자(BTLA), Ig 및 ITIM 도메인을 갖는 T 세포 면역수용체(TIGIT), T 세포 활성화의 V-도메인 Ig 억제자(VISTA), 아데노신 A2a 수용체(A2aR), 살해 세포 면역글로불린 유사 수용체(KIR), 인돌아민 2,3-다이옥시게네이스(IDO), CD20, CD39 및 CD73.
일부 실시형태에서, 생물학적으로 활성인 분자는 면역원성 단백질이다. 일부 실시형태에서, 생물학적으로 활성인 분자는 독소, 톡소이드 또는 독소의 무독성 돌연변이체이다. 일부 실시형태에서, 독소는 디프테리아 독소이다. 일부 실시형태에서, 톡소이드는 파상풍 톡소이드이다. 일부 실시형태에서, 디프테리아 독소는 디프테리아 독소의 무독성 돌연변이체이다.
일부 실시형태에서, 생물학적으로 활성인 분자는 양성 공동-자극 분자에 대한 활성자 또는 양성 공동-자극 분자의 결합 파트너에 대한 활성자이다. 일부 실시형태에서, 양성 공동-자극 분자는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 TNF 수용체 슈퍼패밀리 구성원이다: CD120a, CD120b, CD18, OX40, CD40, Fas 수용체, M68, CD27, CD30, 4-1BB, TRAILR1, TRAILR2, TRAILR3, TRAILR4, RANK, OCIF, TWEAK 수용체, TACI, BAFF 수용체, ATAR, CD271, CD269, AITR, TROY, CD358, TRAMP 및 XEDAR. 일부 실시형태에서, 양성 공동-자극 분자에 대한 활성자는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 TNF 슈퍼패밀리 구성원이다: TNFα, TNF-C, OX40L, CD40L, FasL, LIGHT, TL1A, CD27L, Siva, CD153, 4-1BB 리간드, TRAIL, RANKL, TWEAK, APRIL, BAFF, CAMLG, NGF, BDNF, NT-3, NT-4, GITR 리간드 및 EDA-2. 일부 실시형태에서, 양성 공동-자극 분자는 CD28-슈퍼패밀리 공동-자극 분자이다. 일부 실시형태에서, CD28-슈퍼패밀리 공동-자극 분자는 ICOS 또는 CD28이다. 일부 실시형태에서, 양성 공동-자극 분자에 대한 활성자는 ICOSL, CD80 또는 CD86이다.
일부 실시형태에서, 생물학적으로 활성인 분자는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 사이토카인이다: IL-2, IL-7, IL-10, IL-12 및 IL-15. 일부 실시형태에서, 생물학적으로 활성인 분자는 T-세포 수용체(TCR), T-세포 공동-수용체, 주조직 적합성 복합체(MHC), 인간 백혈구 항원(HLA) 또는 이들의 유도체를 포함하는 단백질이다. 일부 실시형태에서, 생물학적으로 활성인 분자는 종양 항원을 포함하는 단백질이다. 일부 실시형태에서, 종양 항원은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: 알파-태아단백질(AFP), 암배아 항원(CEA), 상피 종양 항원(ETA), 뮤신 1(MUC1), Tn-MUC1, 뮤신 16(MUC16), 타이로시네이스, 흑색종-관련 항원(MAGE), 종양 단백질 p53(p53), CD4, CD8, CD45, CD80, CD86, 예정사 리간드 1(PD-L1), 예정사 리간드 2(PD-L2), NY-ESO-1, PSMA, 태그-72, HER2, GD2, cMET, EGFR, 메소텔린, VEGFR, 알파-폴레이트 수용체, CE7R, IL-3, 암-고환 항원, MART-1 gp100 및 TNF-관련 아폽토시스-유도성 리간드.
일부 양태에서, 생물학적으로 활성인 분자 및 본 개시내용의 스캐폴드 단백질(예를 들어, MARCKS, MARCKSL1, BASP1, 임의의 서열번호 4 내지 109, N-말단 M이 없는 상응하는 서열, 또는 본 명세서에 개시된 임의의 스캐폴드 단백질 서열(예를 들어, 표 1) 또는 이들의 변형, 특히 이들의 단편 또는 변이체)을 포함하는 융합 단백질은 스캐폴드 단백질이 결여되어 있는 생물학적으로 활성인 분자의 발현과 비교하여 EV, 예를 들어, 엑소솜에서 생물학적으로 활성인 분자의 농축을 초래한다. 일부 양태에서, 생물학적으로 활성인 분자 및 본 개시내용의 스캐폴드 단백질(예를 들어, N-말단 M이 없는 MARCKS, MARCKSL1, BASP1, N-말단 M이 없는 서열번호 4 내지 114, 116 내지 118, 122 내지 150 또는 180 내지 190의 아미노산 서열, 서열번호 115 또는 118 내지 121에 의해 암호화되는 아미노산 서열, 또는 N-말단 M이 없는 본 명세서에 개시된 임의의 스캐폴드 단백질 서열(예를 들어, 표 1))을 포함하는 융합 단백질은 스캐폴드 단백질이 결여되어 있는 생물학적으로 활성인 분자의 발현과 비교하여 EV, 예를 들어, 엑소솜에서 생물학적으로 활성인 분자의 농축을 초래한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용에 유용한 스캐폴드 단백질은 임의의 서열번호 4 내지 109, N-말단 M이 없는 상응하는 서열 또는 표 1에 개시된 임의의 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 본 개시내용에 유용한 스캐폴드 단백질은 임의의 서열번호 4 내지 109를 포함하되, 스캐폴드 단백질은 N-말단 Met를 포함하지 않는다. 일부 양태에서, 스캐폴드 단백질은 표 1에 개시된 서열을 포함하되, 스캐폴드 단백질은 N-말단 Met를 포함하지 않는다. 일부 양태에서, 본 개시내용에 유용한 스캐폴드 단백질은 N-말단 M이 없는 MARCKS, MARCKSL1, BASP1, N-말단 M이 없는 서열번호 4 내지 114, 116 내지 118, 122 내지 150 또는 180 내지 190의 아미노산 서열, 서열번호 115 또는 118 내지 121에 의해 암호화되는 아미노산 서열, 또는 N-말단 M이 없는 본 명세서에 개시된 임의의 스캐폴드 단백질 서열(예를 들어, 표 1)을 포함한다. 일부 양태에서, 본 개시내용에 유용한 스캐폴드 단백질은 MARCKS, MARCKSL1 또는 BASP1을 포함하되, 스캐폴드 단백질은 N-말단 Met를 포함하지 않는다. 일부 양태에서, 스캐폴드 단백질은 서열번호 4 내지 114, 116 내지 118, 122 내지 150 또는 180 내지 190의 아미노산 서열을 포함하되, 스캐폴드 단백질은 N-말단 Met를 포함하지 않는다. 일부 양태에서, 스캐폴드 단백질은 서열번호 115 또는 118 내지 121에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 포함하되, 스캐폴드 단백질은 N-말단 Met를 포함하지 않는다. 다른 실시형태에서, 본 개시내용에 유용한 스캐폴드 단백질은 임의의 본 명세서에 개시된 서열을 포함하지만, 서열번호 4 내지 109 중 어느 하나, N-말단 M이 없는 상응하는 서열 또는 N-말단 M이 없는 표 1에 개시된 임의의 서열이 아니다. 다른 실시형태에서, 본 개시내용에 유용한 스캐폴드 단백질은 임의의 본 명세서에 개시된 서열을 포함하지만, 서열번호 4 내지 109 중 어느 하나를 포함하지 않는다.
일부 실시형태에서, 융합 단백질은 서열 MGXKLSKKK를 갖는 펩타이드(여기서, X는 알라닌 또는 임의의 다른 아미노산(서열번호 117)임); 또는 (M)(G)(π)(ξ)(Φ/π)(S/A/G/N)(+)(+)의 서열을 갖는 펩타이드(여기서, N-말단 M은 절단되어, 생성된 융합 단백질은 생물학적으로 활성인 분자에 연결된 GXKLSKKK(서열번호 425) 또는 (G)(π)(ξ)(Φ/π)(S/A/G/N)(+)(+)를 포함하고, 각 괄호의 위치는 아미노산을 나타내되, π는 (Pro, Gly, Ala, Ser)로 이루어진 군으로부터 선택되는 임의의 아미노산이고, ξ는 (Asn, Gln, Ser, Thr, Asp, Glu, Lys, His, Arg)로 이루어진 군으로부터 선택되는 임의의 아미노산이며, Φ는 (Val, Ile, Leu, Phe, Trp, Tyr, Met)로 이루어진 군으로부터 선택되는 임의의 아미노산이고, (+)는 (Lys, Arg, His)로 이루어진 군으로부터 선택되는 임의의 아미노산이며; 5번 위치는 (+)가 아니고, 6번 위치는 (+)도 (Asp 또는 Glu)도 아님)를 포함하는 스캐폴드 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용에 유용한 스캐폴드 단백질은 MGXKLSKKK가 아니되, X는 알라닌 또는 임의의 다른 아미노산(서열번호 117)이거나 또는 (M)(G)(π)(ξ)(Φ/π)(S/A/G/N)(+)(+)의 서열을 갖는 펩타이드가 아니다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용에 유용한 스캐폴드 단백질은 MGXKLSKKK를 포함하지 않되, X는 알라닌 또는 임의의 다른 아미노산(서열번호 117)이거나 또는 (M)(G)(π)(ξ)(Φ/π)(S/A/G/N)(+)(+)의 서열을 갖는 펩타이드를 포함하지 않는다.
일부 실시형태에서, 융합 단백질은 (M)(G)(π)(X)(Φ/π)(π)(+)(+) 또는 (G)(π)(X)(Φ/π)(π)(+)(+)의 서열을 갖는 펩타이드를 포함하는 스캐폴드 단백질을 포함하되, 각 괄호의 위치는 아미노산을 나타내고, π는 (Pro, Gly, Ala, Ser)로 이루어진 군으로부터 선택되는 임의의 아미노산이며, X는 임의의 아미노산이고, Φ는 (Val, Ile, Leu, Phe, Trp, Tyr, Met)로 이루어진 군으로부터 선택되는 임의의 아미노산이며, (+)는 (Lys, Arg, His)로 이루어진 군으로부터 선택되는 임의의 아미노산이고; 5번 위치는 (+)가 아니며, 6번 위치는 (+)도 (Asp 또는 Glu)도 아니다. 일부 실시형태에서, 융합 단백질은 (G)(π)(X)(Φ/π)(π)(+)(+)의 서열을 갖는 펩타이드를 포함하는 스캐폴드 단백질을 포함하되, 스캐폴드 단백질은 N-말단 M(예를 들어, N-말단 메티오닌)을 포함하지 않는다.
일부 양태에서, 융합 단백질은 (G)(π)(X)(Φ/π)(π)(+)(+)의 서열을 갖는 펩타이드를 포함하는 스캐폴드 단백질을 포함하되, 각 괄호의 위치는 아미노산을 나타내고, π는 (Pro, Gly, Ala, Ser)로 이루어진 군으로부터 선택되는 임의의 아미노산이며, X는 임의의 아미노산이고, Φ는 (Val, Ile, Leu, Phe, Trp, Tyr, Met)로 이루어진 군으로부터 선택되는 임의의 아미노산이며, (+)는 Lys, Arg, His로 이루어진 군으로부터 선택되는 임의의 아미노산이고; 5번 위치는 (+)가 아니며, 6번 위치는 (+)도 (Asp 또는 Glu)도 아니고, 서열은 (M)(G)(π)(X)(Φ/π)(π)(+)(+)가 아니다. 일부 양태에서, 스캐폴드 단백질은 (G)(π)(X)(Φ/π)(π)(+)(+)의 서열을 갖는 펩타이드를 포함하되, 스캐폴드 단백질은 N-말단 Met를 포함하지 않는다.
일부 실시형태에서, 종래의 EV, 예를 들어, 엑소솜, 단백질은 CD9, CD63, CD81, PDGFR, GPI 앵커 단백질, LAMP2, LAMP2B 및 이들의 단편, 변이체 또는 유도체로 이루어진 목록으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 엑소솜에서 MARCKS, MARCKSL1, BASP1 또는 임의의 서열번호 4 내지 109를 포함하는 융합 단백질의 농축은 MARCKS, MARCKSL1, BASP1, 임의의 서열번호 4 내지 109가 결여되어 있는 융합 단백질보다 또는 종래의 EV, 예를 들어, 엑소솜, 단백질을 포함하는 융합 단백질과 비교하여 2-배 초과, 4-배 초과, 8-배 초과, 16-배 초과, 25-배 초과, 50-배 초과, 100-배 초과, 200-배 초과, 500-배 초과, 750-배 초과, 1,000-배 초과, 2,000-배 초과, 5,000-배 초과, 7,500-배 초과, 10,000-배 초과 더 높다. 일부 양태에서, 엑소솜에서 N-말단 M이 없는 MARCKS, MARCKSL1, BASP1, N-말단 M이 없는 임의의 서열번호 4 내지 109 또는 N-말단 M이 없는 임의의 본 명세서, 예를 들어, 표 1에 개시된 서열을 포함하는 융합 단백질의 농축은 N-말단 M이 없는 MARCKS, MARCKSL1, BASP1, N-말단 M이 없는 임의의 서열번호 4 내지 109 또는 N-말단 M이 없는 임의의 본 명세서, 예를 들어, 표 1에 개시된 서열이 결여되어 있는 융합 단백질보다 또는 종래의 EV, 예를 들어, 엑소솜, 단백질을 포함하는 융합 단백질과 비교하여 2-배 초과, 4-배 초과, 8-배 초과, 16-배 초과, 25-배 초과, 50-배 초과, 100-배 초과, 200-배 초과, 500-배 초과, 750-배 초과, 1,000-배 초과, 2,000-배 초과, 5,000-배 초과, 7,500-배 초과, 10,000-배 초과 더 높다.
일부 실시형태에서, 엑소솜에서 MARCKS, MARCKSL1, BASP1, 임의의 서열번호 4 내지 109, N-말단 M이 없는 상응하는 서열 또는 N-말단 M이 없는 본 명세서에 개시된 임의의 스캐폴드 단백질 서열(예를 들어, 표 1)을 포함하는 융합 단백질의 농축은 MARCKS, MARCKSL1, BASP1, 임의의 서열번호 4 내지 109, N-말단 M이 없는 상응하는 서열 또는 N-말단 M이 없는 본 명세서에 개시된 임의의 스캐폴드 단백질 서열(예를 들어, 표 1)이 결여되어 있는 융합 단백질보다 또는 종래의 EV, 예를 들어, 엑소솜, 단백질을 포함하는 융합 단백질과 비교하여 적어도 약 2-배, 적어도 약 4-배, 적어도 약 6-배, 적어도 약 8-배, 적어도 약 10-배, 적어도 약 12-배, 적어도 약 14-배, 적어도 약 16-배, 적어도 약 18-배, 적어도 약 20-배, 적어도 약 25-배, 적어도 약 30-배, 적어도 약 35-배, 적어도 약 40-배, 적어도 약 45-배, 적어도 약 50-배, 적어도 약 60-배, 적어도 약 70-배, 적어도 약 80-배, 적어도 약 90-배, 적어도 약100-배, 적어도 약 200-배, 적어도 약 300-배, 적어도 약 400-배, 적어도 약 500-배, 적어도 약 750-배, 적어도 약 1,000-배, 적어도 약 1,500-배, 적어도 약 2,000-배, 적어도 약 2,500-배, 적어도 약 3,000-배, 적어도 약 3,500-배, 적어도 약 4,000-배, 적어도 약 4,500-배, 적어도 약 5,000-배, 적어도 약 5,500-배, 적어도 약 6,000-배, 적어도 약 6,500-배, 적어도 약 7,000-배, 적어도 약 7,500-배, 적어도 약 8,000-배, 적어도 약 8,500-배, 적어도 약 9,000-배, 적어도 약 9,500-배 또는 적어도 약 10,000-배 더 높다.
일부 실시형태에서, 임의의 서열번호 1 내지 109의 단백질 서열, N-말단 M이 없는 상응하는 서열 또는 N-말단 M이 없는 본 명세서에 개시된 임의의 스캐폴드 단백질 서열(예를 들어, 표 1)은 EV, 예를 들어, 엑소솜을 융합 단백질에 로딩하기에 충분하다.
일부 실시형태에서, 외인성 서열(예를 들어, 생물학적으로 활성인 분자)을 함유하는 융합 단백질을 포함하는 내강-조작된 EV, 예를 들어, 엑소솜 및 본 명세서에서 새로 확인된 EV, 예를 들어, 엑소솜, 내강 단백질(스캐폴드 단백질)은 당업계에 공지된 종래의 EV, 예를 들어, 엑소솜, 단백질(예를 들어, CD9, CD63, CD81, PDGFR, GPI 앵커 단백질, 락타드헤린, LAMP2 및 LAMP2B, 이들의 단편 또는 이에 결합하는 펩타이드)에 접합된 외인성 서열을 포함하는 유사하게 조작된 EV, 예를 들어, 엑소솜보다 더 높은 밀도의 융합 단백질을 갖는다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에서 새로 확인된 EV, 예를 들어, 엑소솜, 내강 단백질(스캐폴드 단백질)을 함유하는 융합 단백질은 종래의 EV, 예를 들어, 엑소솜, 단백질을 사용하여 유사하게 변형된 다른 EV, 예를 들어, 엑소솜, 내강 표면에서의 융합 단백질보다 2-배, 4-배, 8-배, 16-배, 32-배, 64-배, 100-배, 200-배, 400-배, 800-배, 1,000-배 또는 더 높은 밀도로 EV, 예를 들어, 엑소솜, 내강 표면에 존재한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에서 새로 확인된 EV, 예를 들어, 엑소솜, 내강 단백질(스캐폴드 단백질)을 함유하는 융합 단백질은 종래의 EV, 예를 들어, 엑소솜, 단백질을 사용하여 유사하게 변형된 다른 EV, 예를 들어, 엑소솜, 내강 표면에서의 융합 단백질보다 2 내지 4-배, 4 내지 8-배, 8 내지 16-배, 16 내지 32-배, 32 내지 64-배, 64 내지 100-배, 100 내지 200-배, 200 내지 400-배, 400 내지 800-배, 800 내지 1,000-배 또는 더 높은 밀도로 EV, 예를 들어, 엑소솜, 내강 표면에 존재한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 스캐폴드 단백질, 예를 들어, 엑소솜 내강 단백질(예를 들어, MARCKS, 변이체, 단편, 단편의 변이체 또는 이들의 변형)을 포함하는 융합 단백질은 CD9를 사용하여 유사하게 변형된 EV, 예를 들어, 엑소솜보다 2-배, 4-배, 8-배, 16-배, 32-배, 64-배, 100-배, 200-배, 400-배, 800-배, 1,000-배 또는 더 높은 밀도로 존재한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 스캐폴드 단백질, 예를 들어, 엑소솜 내강 단백질(예를 들어, MARCKS, 변이체, 단편, 단편의 변이체 또는 이들의 변형)을 포함하는 융합 단백질은 CD63을 사용하여 유사하게 변형된 EV, 예를 들어, 엑소솜보다 2-배, 4-배, 8-배, 16-배, 32-배, 64-배, 100-배, 200-배, 400-배, 800-배, 1,000-배 또는 더 높은 밀도로 존재한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 스캐폴드 단백질, 예를 들어, 엑소솜 내강 단백질(예를 들어, MARCKS, 변이체, 단편, 단편의 변이체 또는 이들의 변형)을 포함하는 융합 단백질은 CD81을 사용하여 유사하게 변형된 EV, 예를 들어, 엑소솜보다 2-배, 4-배, 8-배, 16-배, 32-배, 64-배, 100-배, 200-배, 400-배, 800-배, 1,000-배 또는 더 높은 밀도로 존재한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 스캐폴드 단백질, 예를 들어, 엑소솜 내강 단백질(예를 들어, MARCKS, 변이체, 단편, 단편의 변이체 또는 이들의 변형)을 포함하는 융합 단백질은 PDGFR을 사용하여 유사하게 변형된 EV, 예를 들어, 엑소솜보다 2-배, 4-배, 8-배, 16-배, 32-배, 64-배, 100-배, 200-배, 400-배, 800-배, 1,000-배 또는 더 높은 밀도로 존재한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 스캐폴드 단백질, 예를 들어, 엑소솜 내강 단백질(예를 들어, MARCKS, 변이체, 단편, 단편의 변이체 또는 이들의 변형)을 포함하는 융합 단백질은 GPI 앵커 단백질을 사용하여 유사하게 변형된 EV, 예를 들어, 엑소솜보다 2-배, 4-배, 8-배, 16-배, 32-배, 64-배, 100-배, 200-배, 400-배, 800-배, 1,000-배 또는 더 높은 밀도로 존재한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 스캐폴드 단백질, 예를 들어, 엑소솜 내강 단백질(예를 들어, MARCKS, 변이체, 단편, 단편의 변이체 또는 이들의 변형)을 포함하는 융합 단백질은 락타드헤린을 사용하여 유사하게 변형된 EV, 예를 들어, 엑소솜보다 2-배, 4-배, 8-배, 16-배, 32-배, 64-배, 100-배, 200-배, 400-배, 800-배, 1,000-배 또는 더 높은 밀도로 존재한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 스캐폴드 단백질, 예를 들어, 엑소솜 내강 단백질(예를 들어, MARCKS, 변이체, 단편, 단편의 변이체 또는 이들의 변형)을 포함하는 융합 단백질은 LAMP2를 사용하여 유사하게 변형된 EV, 예를 들어, 엑소솜보다 2-배, 4-배, 8-배, 16-배, 32-배, 64-배, 100-배, 200-배, 400-배, 800-배, 1,000-배 또는 더 높은 밀도로 존재한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 스캐폴드 단백질, 예를 들어, 엑소솜 내강 단백질(예를 들어, MARCKS, 변이체, 단편, 단편의 변이체 또는 이들의 변형)을 포함하는 융합 단백질은 LAMP2B를 사용하여 유사하게 변형된 EV, 예를 들어, 엑소솜보다 2-배, 4-배, 8-배, 16-배, 32-배, 64-배, 100-배, 200-배, 400-배, 800-배, 1,000-배 또는 더 높은 밀도로 존재한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 스캐폴드 단백질, 예를 들어, 엑소솜 내강 단백질(예를 들어, MARCKS, 변이체, 단편, 단편의 변이체 또는 이들의 변형)을 포함하는 융합 단백질은 종래의 단백질을 사용하여 유사하게 변형된 EV, 예를 들어, 엑소솜보다 2-배, 4-배, 8-배, 16-배, 32-배, 64-배, 100-배, 200-배, 400-배, 800-배, 1,000-배 또는 더 높은 밀도로 존재한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 스캐폴드 단백질, 예를 들어, 엑소솜 내강 단백질(예를 들어, MARCKS, 변이체, 단편, 단편의 변이체 또는 이들의 변형)을 포함하는 융합 단백질은 종래의 EV, 예를 들어, 엑소솜, 단백질의 변이체를 사용하여 유사하게 변형된 EV, 예를 들어, 엑소솜보다 2-배, 4-배, 8-배, 16-배, 32-배, 64-배, 100-배, 200-배, 400-배, 800-배, 1,000-배 또는 더 높은 밀도로 존재한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 스캐폴드 단백질, 예를 들어, 엑소솜 내강 단백질(예를 들어, MARCKSL1, 변이체, 단편, 단편의 변이체 또는 이들의 변형)을 포함하는 융합 단백질은 CD9를 사용하여 유사하게 변형된 EV, 예를 들어, 엑소솜보다 2-배, 4-배, 8-배, 16-배, 32-배, 64-배, 100-배, 200-배, 400-배, 800-배, 1,000-배 또는 더 높은 밀도로 존재한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 스캐폴드 단백질, 예를 들어, 엑소솜 내강 단백질(예를 들어, MARCKSL1, 변이체, 단편, 단편의 변이체 또는 이들의 변형)을 포함하는 융합 단백질은 CD63을 사용하여 유사하게 변형된 EV, 예를 들어, 엑소솜보다 2-배, 4-배, 8-배, 16-배, 32-배, 64-배, 100-배, 200-배, 400-배, 800-배, 1,000-배 또는 더 높은 밀도로 존재한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 스캐폴드 단백질, 예를 들어, 엑소솜 내강 단백질(예를 들어, MARCKSL1, 변이체, 단편, 단편의 변이체 또는 이들의 변형)을 포함하는 융합 단백질은 CD81을 사용하여 유사하게 변형된 EV, 예를 들어, 엑소솜보다 2-배, 4-배, 8-배, 16-배, 32-배, 64-배, 100-배, 200-배, 400-배, 800-배, 1,000-배 또는 더 높은 밀도로 존재한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 스캐폴드 단백질, 예를 들어, 엑소솜 내강 단백질(예를 들어, MARCKSL1, 변이체, 단편, 단편의 변이체 또는 이들의 변형)을 포함하는 융합 단백질은 PDGFR을 사용하여 유사하게 변형된 EV, 예를 들어, 엑소솜보다 2-배, 4-배, 8-배, 16-배, 32-배, 64-배, 100-배, 200-배, 400-배, 800-배, 1,000-배 또는 더 높은 밀도로 존재한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 스캐폴드 단백질, 예를 들어, 엑소솜 내강 단백질(예를 들어, MARCKSL1, 변이체, 단편, 단편의 변이체 또는 이들의 변형)을 포함하는 융합 단백질은 GPI 앵커 단백질을 사용하여 유사하게 변형된 EV, 예를 들어, 엑소솜보다 2-배, 4-배, 8-배, 16-배, 32-배, 64-배, 100-배, 200-배, 400-배, 800-배, 1,000-배 또는 더 높은 밀도로 존재한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 스캐폴드 단백질, 예를 들어, 엑소솜 내강 단백질(예를 들어, MARCKSL1, 변이체, 단편, 단편의 변이체 또는 이들의 변형)을 포함하는 융합 단백질은 락타드헤린을 사용하여 유사하게 변형된 EV, 예를 들어, 엑소솜보다 2-배, 4-배, 8-배, 16-배, 32-배, 64-배, 100-배, 200-배, 400-배, 800-배, 1,000-배 또는 더 높은 밀도로 존재한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 스캐폴드 단백질, 예를 들어, 엑소솜 내강 단백질(예를 들어, MARCKSL1, 변이체, 단편, 단편의 변이체 또는 이들의 변형)을 포함하는 융합 단백질은 LAMP2를 사용하여 유사하게 변형된 EV, 예를 들어, 엑소솜보다 2-배, 4-배, 8-배, 16-배, 32-배, 64-배, 100-배, 200-배, 400-배, 800-배, 1,000-배 또는 더 높은 밀도로 존재한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 스캐폴드 단백질, 예를 들어, 엑소솜 내강 단백질(예를 들어, MARCKSL1, 변이체, 단편, 단편의 변이체 또는 이들의 변형)을 포함하는 융합 단백질은 LAMP2B를 사용하여 유사하게 변형된 EV, 예를 들어, 엑소솜보다 2-배, 4-배, 8-배, 16-배, 32-배, 64-배, 100-배, 200-배, 400-배, 800-배, 1,000-배 또는 더 높은 밀도로 존재한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 스캐폴드 단백질, 예를 들어, 엑소솜 내강 단백질(예를 들어, MARCKSL1, 변이체, 단편, 단편의 변이체 또는 이들의 변형)을 포함하는 융합 단백질은 종래의 단백질을 사용하여 유사하게 변형된 EV, 예를 들어, 엑소솜보다 2-배, 4-배, 8-배, 16-배, 32-배, 64-배, 100-배, 200-배, 400-배, 800-배, 1,000-배 또는 더 높은 밀도로 존재한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 스캐폴드 단백질, 예를 들어, 엑소솜 내강 단백질(예를 들어, MARCKSL1, 변이체, 단편, 단편의 변이체 또는 이들의 변형)을 포함하는 융합 단백질은 종래의 EV, 예를 들어, 엑소솜, 단백질의 변이체를 사용하여 유사하게 변형된 EV, 예를 들어, 엑소솜보다 2-배, 4-배, 8-배, 16-배, 32-배, 64-배, 100-배, 200-배, 400-배, 800-배, 1,000-배 또는 더 높은 밀도로 존재한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 스캐폴드 단백질, 예를 들어, 엑소솜 내강 단백질(예를 들어, BASP1, 변이체, 단편, 단편의 변이체 또는 이들의 변형)을 포함하는 융합 단백질은 CD9를 사용하여 유사하게 변형된 EV, 예를 들어, 엑소솜보다 2-배, 4-배, 8-배, 16-배, 32-배, 64-배, 100-배, 200-배, 400-배, 800-배, 1,000-배 또는 더 높은 밀도로 존재한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 스캐폴드 단백질, 예를 들어, 엑소솜 내강 단백질(예를 들어, BASP1, 변이체, 단편, 단편의 변이체 또는 이들의 변형)을 포함하는 융합 단백질은 CD63을 사용하여 유사하게 변형된 EV, 예를 들어, 엑소솜보다 2-배, 4-배, 8-배, 16-배, 32-배, 64-배, 100-배, 200-배, 400-배, 800-배, 1,000-배 또는 더 높은 밀도로 존재한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 스캐폴드 단백질, 예를 들어, 엑소솜 내강 단백질(예를 들어, BASP1, 변이체, 단편, 단편의 변이체 또는 이들의 변형)을 포함하는 융합 단백질은 CD81을 사용하여 유사하게 변형된 EV, 예를 들어, 엑소솜보다 2-배, 4-배, 8-배, 16-배, 32-배, 64-배, 100-배, 200-배, 400-배, 800-배, 1,000-배 또는 더 높은 밀도로 존재한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 스캐폴드 단백질, 예를 들어, 엑소솜 내강 단백질(예를 들어, BASP1, 변이체, 단편, 단편의 변이체 또는 이들의 변형)을 포함하는 융합 단백질은 PDGFR을 사용하여 유사하게 변형된 EV, 예를 들어, 엑소솜보다 2-배, 4-배, 8-배, 16-배, 32-배, 64-배, 100-배, 200-배, 400-배, 800-배, 1,000-배 또는 더 높은 밀도로 존재한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 스캐폴드 단백질, 예를 들어, 엑소솜 내강 단백질(예를 들어, BASP1, 변이체, 단편, 단편의 변이체 또는 이들의 변형)을 포함하는 융합 단백질은 GPI 앵커 단백질을 사용하여 유사하게 변형된 EV, 예를 들어, 엑소솜보다 2-배, 4-배, 8-배, 16-배, 32-배, 64-배, 100-배, 200-배, 400-배, 800-배, 1,000-배 또는 더 높은 밀도로 존재한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 스캐폴드 단백질, 예를 들어, 엑소솜 내강 단백질(예를 들어, BASP1, 변이체, 단편, 단편의 변이체 또는 이들의 변형)을 포함하는 융합 단백질은 락타드헤린을 사용하여 유사하게 변형된 EV, 예를 들어, 엑소솜보다 2-배, 4-배, 8-배, 16-배, 32-배, 64-배, 100-배, 200-배, 400-배, 800-배, 1,000-배 또는 더 높은 밀도로 존재한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 스캐폴드 단백질, 예를 들어, 엑소솜 내강 단백질(예를 들어, BASP1, 변이체, 단편, 단편의 변이체 또는 이들의 변형)을 포함하는 융합 단백질은 LAMP2를 사용하여 유사하게 변형된 EV, 예를 들어, 엑소솜보다 2-배, 4-배, 8-배, 16-배, 32-배, 64-배, 100-배, 200-배, 400-배, 800-배, 1,000-배 또는 더 높은 밀도로 존재한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 스캐폴드 단백질, 예를 들어, 엑소솜 내강 단백질(예를 들어, BASP1, 변이체, 단편, 단편의 변이체 또는 이들의 변형)을 포함하는 융합 단백질은 LAMP2B를 사용하여 유사하게 변형된 EV, 예를 들어, 엑소솜보다 2-배, 4-배, 8-배, 16-배, 32-배, 64-배, 100-배, 200-배, 400-배, 800-배, 1,000-배 또는 더 높은 밀도로 존재한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 스캐폴드 단백질, 예를 들어, 엑소솜 내강 단백질(예를 들어, BASP1, 변이체, 단편, 단편의 변이체 또는 이들의 변형)을 포함하는 융합 단백질은 종래의 단백질을 사용하여 유사하게 변형된 EV, 예를 들어, 엑소솜보다 2-배, 4-배, 8-배, 16-배, 32-배, 64-배, 100-배, 200-배, 400-배, 800-배, 1,000-배 또는 더 높은 밀도로 존재한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 스캐폴드 단백질, 예를 들어, 엑소솜 내강 단백질(예를 들어, BASP1, 변이체, 단편, 단편의 변이체 또는 이들의 변형)을 포함하는 융합 단백질은 종래의 EV, 예를 들어, 엑소솜 단백질의 변이체를 사용하여 유사하게 변형된 EV, 예를 들어, 엑소솜보다 2-배, 4-배, 8-배, 16-배, 32-배, 64-배, 100-배, 200-배, 400-배, 800-배, 1,000-배 또는 더 높은 밀도로 존재한다.
일부 실시형태에서, 임의의 서열번호 1 내지 109, N-말단 M이 없는 상응하는 서열 또는 N-말단 M이 없는 본 명세서에 개시된 임의의 스캐폴드 단백질 서열(예를 들어, 표 1)을 포함하는 융합 단백질은 CD9를 사용하여 유사하게 변형된 EV, 예를 들어, 엑소솜보다 2-배, 4-배, 8-배, 16-배, 32-배, 64-배, 100-배, 200-배, 400-배, 800-배, 1,000-배 또는 더 높은 밀도로 존재한다. 일부 양태에서, EV, 예를 들어, 엑소솜은 임의의 서열번호 1 내지 109를 포함하는 융합 단백질을 포함하되, 융합 단백질은 N-말단 Met를 포함하지 않으며, 융합 단백질은 CD9를 사용하여 유사하게 변형된 EV, 예를 들어, 엑소솜보다 2-배, 4-배, 8-배, 16-배, 32-배, 64-배, 100-배, 200-배, 400-배, 800-배, 1,000-배 또는 더 높은 밀도로 존재한다.
일부 실시형태에서, 임의의 서열번호 1 내지 109, N-말단 M이 없는 상응하는 서열 또는 N-말단 M이 없는 본 명세서에 개시된 임의의 스캐폴드 단백질 서열(예를 들어, 표 1)을 포함하는 융합 단백질은 CD63을 사용하여 유사하게 변형된 EV, 예를 들어, 엑소솜보다 2-배, 4-배, 8-배, 16-배, 32-배, 64-배, 100-배, 200-배, 400-배, 800-배, 1,000-배 또는 더 높은 밀도로 존재한다. 일부 양태에서, EV, 예를 들어, 엑소솜은 임의의 서열번호 1 내지 109를 포함하는 융합 단백질을 포함하되, 융합 단백질은 N-말단 Met를 포함하지 않으며, 융합 단백질은 CD63을 사용하여 유사하게 변형된 EV, 예를 들어, 엑소솜보다 2-배, 4-배, 8-배, 16-배, 32-배, 64-배, 100-배, 200-배, 400-배, 800-배, 1,000-배 또는 더 높은 밀도로 존재한다.
일부 실시형태에서, 임의의 서열번호 1 내지 109, N-말단 M이 없는 상응하는 서열 또는 N-말단 M이 없는 본 명세서에 개시된 임의의 스캐폴드 단백질 서열(예를 들어, 표 1)을 포함하는 융합 단백질은 CD81을 사용하여 유사하게 변형된 EV, 예를 들어, 엑소솜보다 2-배, 4-배, 8-배, 16-배, 32-배, 64-배, 100-배, 200-배, 400-배, 800-배, 1,000-배 또는 더 높은 밀도로 존재한다. 일부 양태에서, EV, 예를 들어, 엑소솜은 임의의 서열번호 1 내지 109를 포함하는 융합 단백질을 포함하되, 융합 단백질은 N-말단 Met를 포함하지 않으며, 융합 단백질은 CD81을 사용하여 유사하게 변형된 EV, 예를 들어, 엑소솜보다 2-배, 4-배, 8-배, 16-배, 32-배, 64-배, 100-배, 200-배, 400-배, 800-배, 1,000-배 또는 더 높은 밀도로 존재한다.
일부 실시형태에서, 임의의 서열번호 1 내지 109, N-말단 M이 없는 상응하는 서열 또는 N-말단 M이 없는 본 명세서에 개시된 임의의 스캐폴드 단백질 서열(예를 들어, 표 1)을 포함하는 융합 단백질은 PDGFR을 사용하여 유사하게 변형된 EV, 예를 들어, 엑소솜보다 2-배, 4-배, 8-배, 16-배, 32-배, 64-배, 100-배, 200-배, 400-배, 800-배, 1,000-배 또는 더 높은 밀도로 존재한다. 일부 양태에서, EV, 예를 들어, 엑소솜은 임의의 서열번호 1 내지 109를 포함하는 융합 단백질을 포함하되, 융합 단백질은 N-말단 Met를 포함하지 않으며, 융합 단백질은 PDGFR을 사용하여 유사하게 변형된 EV, 예를 들어, 엑소솜보다 2-배, 4-배, 8-배, 16-배, 32-배, 64-배, 100-배, 200-배, 400-배, 800-배, 1,000-배 또는 더 높은 밀도로 존재한다.
일부 실시형태에서, 임의의 서열번호 1 내지 109, N-말단 M이 없는 상응하는 서열 또는 N-말단 M이 없는 본 명세서에 개시된 임의의 스캐폴드 단백질 서열(예를 들어, 표 1)을 포함하는 융합 단백질은 GPI 앵커 단백질을 사용하여 유사하게 변형된 EV, 예를 들어, 엑소솜보다 2-배, 4-배, 8-배, 16-배, 32-배, 64-배, 100-배, 200-배, 400-배, 800-배, 1,000-배 또는 더 높은 밀도로 존재한다. 일부 양태에서, EV, 예를 들어, 엑소솜은 임의의 서열번호 1 내지 109를 포함하는 융합 단백질을 포함하되, 융합 단백질은 N-말단 Met를 포함하지 않으며, 융합 단백질은 GPI 앵커 단백질을 사용하여 유사하게 변형된 EV, 예를 들어, 엑소솜보다 2-배, 4-배, 8-배, 16-배, 32-배, 64-배, 100-배, 200-배, 400-배, 800-배, 1,000-배 또는 더 높은 밀도로 존재한다.
일부 실시형태에서, 임의의 서열번호 1 내지 109, N-말단 M이 없는 상응하는 서열 또는 N-말단 M이 없는 본 명세서에 개시된 임의의 스캐폴드 단백질 서열(예를 들어, 표 1)을 포함하는 융합 단백질은 락타드헤린을 사용하여 유사하게 변형된 EV, 예를 들어, 엑소솜보다 2-배, 4-배, 8-배, 16-배, 32-배, 64-배, 100-배, 200-배, 400-배, 800-배, 1,000-배 또는 더 높은 밀도로 존재한다. 일부 양태에서, EV, 예를 들어, 엑소솜은 임의의 서열번호 1 내지 109를 포함하는 융합 단백질을 포함하되, 융합 단백질은 N-말단 Met를 포함하지 않으며, 융합 단백질은 락타드헤린을 사용하여 유사하게 변형된 EV, 예를 들어, 엑소솜보다 2-배, 4-배, 8-배, 16-배, 32-배, 64-배, 100-배, 200-배, 400-배, 800-배, 1,000-배 또는 더 높은 밀도로 존재한다.
일부 실시형태에서, 임의의 서열번호 1 내지 109, N-말단 M이 없는 상응하는 서열 또는 N-말단 M이 없는 본 명세서에 개시된 임의의 스캐폴드 단백질 서열(예를 들어, 표 1)을 포함하는 융합 단백질은 LAMP2를 사용하여 유사하게 변형된 EV, 예를 들어, 엑소솜보다 2-배, 4-배, 8-배, 16-배, 32-배, 64-배, 100-배, 200-배, 400-배, 800-배, 1,000-배 또는 더 높은 밀도로 존재한다. 일부 양태에서, EV, 예를 들어, 엑소솜은 임의의 서열번호 1 내지 109를 포함하는 융합 단백질을 포함하되, 융합 단백질은 N-말단 Met를 포함하지 않으며, 융합 단백질은 LAMP2를 사용하여 유사하게 변형된 EV, 예를 들어, 엑소솜보다 2-배, 4-배, 8-배, 16-배, 32-배, 64-배, 100-배, 200-배, 400-배, 800-배, 1,000-배 또는 더 높은 밀도로 존재한다.
일부 실시형태에서, 임의의 서열번호 1 내지 109, N-말단 M이 없는 상응하는 서열 또는 N-말단 M이 없는 본 명세서에 개시된 임의의 스캐폴드 단백질 서열(예를 들어, 표 1)을 포함하는 융합 단백질은 LAMP2B를 사용하여 유사하게 변형된 EV, 예를 들어, 엑소솜보다 2-배, 4-배, 8-배, 16-배, 32-배, 64-배, 100-배, 200-배, 400-배, 800-배, 1,000-배 또는 더 높은 밀도로 존재한다. 일부 양태에서, EV, 예를 들어, 엑소솜은 임의의 서열번호 1 내지 109를 포함하는 융합 단백질을 포함하되, 융합 단백질은 N-말단 Met를 포함하지 않으며, 융합 단백질은 LAMP2Bt를 사용하여 유사하게 변형된 EV, 예를 들어, 엑소솜보다 2-배, 4-배, 8-배, 16-배, 32-배, 64-배, 100-배, 200-배, 400-배, 800-배, 1,000-배 또는 더 높은 밀도로 존재한다.
일부 실시형태에서, 임의의 서열번호 1 내지 109, N-말단 M이 없는 상응하는 서열 또는 N-말단 M이 없는 본 명세서에 개시된 임의의 스캐폴드 단백질 서열(예를 들어, 표 1)을 포함하는 융합 단백질은 종래의 단백질을 사용하여 유사하게 변형된 EV, 예를 들어, 엑소솜보다 2-배, 4-배, 8-배, 16-배, 32-배, 64-배, 100-배, 200-배, 400-배, 800-배, 1,000-배 또는 더 높은 밀도로 존재한다. 일부 양태에서, EV, 예를 들어, 엑소솜은 임의의 서열번호 1 내지 109를 포함하는 융합 단백질을 포함하되, 융합 단백질은 N-말단 Met를 포함하지 않으며, 융합 단백질은 종래의 단백질을 사용하여 유사하게 변형된 EV, 예를 들어, 엑소솜보다 2-배, 4-배, 8-배, 16-배, 32-배, 64-배, 100-배, 200-배, 400-배, 800-배, 1,000-배 또는 더 높은 밀도로 존재한다.
일부 실시형태에서, 임의의 서열번호 1 내지 109, N-말단 M이 없는 상응하는 서열 또는 N-말단 M이 없는 본 명세서에 개시된 임의의 스캐폴드 단백질 서열(예를 들어, 표 1)을 포함하는 융합 단백질은 종래의 EV 단백질, 예를 들어, 엑소솜 단백질의 변이체를 사용하여 유사하게 변형된 EV, 예를 들어, 엑소솜보다 2-배, 4-배, 8-배, 16-배, 32-배, 64-배, 100-배, 200-배, 400-배, 800-배, 1,000-배 또는 더 높은 밀도로 존재한다. 일부 양태에서, EV, 예를 들어, 엑소솜은 임의의 서열번호 1 내지 109를 포함하는 융합 단백질을 포함하되, 융합 단백질은 N-말단 Met를 포함하지 않으며, 융합 단백질은 종래의 EV 단백질, 예를 들어, 엑소솜 단백질을 사용하여 유사하게 변형된 EV, 예를 들어, 엑소솜보다 2-배, 4-배, 8-배, 16-배, 32-배, 64-배, 100-배, 200-배, 400-배, 800-배, 1,000-배 또는 더 높은 밀도로 존재한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 내강-조작된 EV, 예를 들어, 엑소솜은 당업계에 공지된 내강-조작된 EV, 예를 들어, 엑소솜과 비교하여 우수한 특성을 보여준다. 예를 들어, 본 명세서에서 제공되는 새로 확인된 EV, 예를 들어, 엑소솜, 단백질을 사용하여 생성된 내강-조작된 EV, 예를 들어, 엑소솜은 선행 기술에서 EV, 예를 들어, 엑소솜, 예를 들어, 종래의 EV, 예를 들어, 엑소솜, 단백질을 사용하여 생성된 것과 비교하여 그 내강 표면에 훨씬 더 풍부한 변형된 단백질을 함유한다.
또한, 본 개시내용의 내강-조작된 EV, 예를 들어, 엑소솜은 당업계에 공지된 내강-조작된 EV, 예를 들어, 엑소솜과 비교하여 더 크고, 더 특이적이거나 더 제어된 생물학적 활성을 가질 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 EV, 예를 들어, 엑소솜, 단백질 또는 이들의 단편(예를 들어, 본 개시내용의 스캐폴드, 예컨대 BASP1 또는 이들의 단편, 변이체 또는 유도체)에 융합된 페이로드, 예를 들어, 치료적 또는 생물학적으로 관련된 외인성 서열을 포함하는 내강-조작된 EV, 예를 들어, 엑소솜은 당업계에 공지된 스캐폴드에 대한 융합보다는 목적하는 조작된 특성을 더 많이 가질 수 있다.
당업계에 공지된 스캐폴드 단백질은 테트라스패닌 분자(예를 들어, CD63, CD81, CD9 등), 라이소솜-관련 막 단백질 2(LAMP2 및 LAMP2B), 혈소판-유래 성장 인자 수용체(PDGFR), GPI 앵커 단백질, 락타드헤린 및 이들의 단편 및 임의의 이들 단백질 또는 이들의 단편에 대해 친화성을 갖는 펩타이드를 포함한다. 의심의 여지를 피하기 위해, PTGFRN, BSG, IGSF2, IGSF3, IGSF8, ITGB1, ITGA4, SLC3A2, ATP 수송자 또는 이들의 단편 또는 변이체는 종래의 EV, 예를 들어, 엑소솜, 단백질이 아니다. 이전에는, 외인성 단백질의 과발현은 내강-조작된 엑소솜을 생산하기 위해 외인성 단백질의 엑소솜으로의 확률적 또는 무작위 배치에 의존하였다. 이는 엑소솜에서 외인성 단백질의 낮은-수준의, 예측 불가능한 밀도를 초래하였다. 따라서, 본 명세서에 기재된 EV, 예를 들어, 엑소솜 단백질 및 이들의 단편은 신규한 EV, 예를 들어, 엑소솜 조성물 및 이의 제조 방법에 중요한 발전을 제공한다.
본 명세서에서 제공되는 융합 단백질은 본 개시내용의 스캐폴드 단백질, 예를 들어, 엑소솜 내강 단백질, 예컨대 MARCKS, MARCKSL1, BASP1 또는 이들의 단편, 변이체 또는 유도체, 및 추가적인 펩타이드를 포함할 수 있다. 추가적인 펩타이드는 EV, 예를 들어, 엑소솜, 단백질(스캐폴드 단백질) 또는 이들의 단편, 변이체 또는 유도체의 N-말단 또는 C-말단에 부착될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 융합 단백질은 본 개시내용의 스캐폴드 단백질, 예컨대 MARCKS, MARCKSL1, BASP1 또는 이들의 단편, 변이체 또는 유도체, 및 2개의 추가적인 펩타이드를 포함한다. 2개의 추가적인 펩타이드 모두 EV, 예를 들어, 엑소솜, 단백질(스캐폴드 단백질) 또는 이들의 단편, 변이체 또는 유도체의 N-말단 또는 C-말단에 부착될 수 있다. 일부 실시형태에서, 2개의 추가적인 펩타이드 중 하나는 EV, 예를 들어, 엑소솜, 단백질(스캐폴드 단백질) 또는 이들의 단편, 변이체 또는 유도체의 N-말단에 부착되고, 2개의 추가적인 펩타이드 중 다른 하나는 C-말단에 부착된다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 내강-조작된 세포외 소포체를 생성하는 조성물 및 방법은 나노소포체를 포함한다.
IV. 내강-조작된 EV, 예를 들어, 엑소솜의 생산을 위한 생산자 세포
본 개시내용의 EV, 예를 들어, 엑소솜은 시험관내에서 성장한 세포 또는 대상체의 체액으로부터 생산될 수 있다. EV, 예를 들어, 엑소솜이 시험관내 세포 배양물로부터 생산될 때, 다양한 생산자 세포, 예를 들어, HEK293 세포가 본 개시내용을 위해 사용될 수 있다. 본 명세서에 기재된 내강-조작된 EV, 예를 들어, 엑소솜의 생산을 위해 사용될 수 있는 추가적인 세포 유형은 제한 없이 중간엽 줄기 세포, T-세포, B-세포, 수지상 세포, 대식세포 및 암 세포주를 포함한다.
따라서, 본 개시내용은 본 개시내용의 EV, 예를 들어, 엑소솜을 생산하는 세포를 제공한다. 일부 실시형태에서, 이는 하나 이상의 벡터를 포함하되, 벡터는 스캐폴드 단백질 및 페이로드, 예를 들어, 생물학적으로 활성인 분자를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산 서열은 스캐폴드 단백질을 암호화하고, 제2 핵산 서열은 페이로드, 예를 들어, 생물학적으로 활성인 분자를 암호화한다. 일부 실시형태에서, 스캐폴드 단백질을 암호화하는 핵산 서열 및 페이로드, 예를 들어, 생물학적으로 활성인 분자를 암호화하는 핵산 서열은 단일 오픈 리딩 프레임에 있으며; 따라서, 발현 산물은 페이로드, 예를 들어, 생물학적으로 활성인 분자에 융합된 스캐폴드 단백질을 포함하는 융합 단백질일 수 있다. 일부 실시형태에서, 핵산 서열은 프로모터에 작동 가능하게 연결된다.
생산자 세포는 내강-조작된 EV, 예를 들어, 엑소솜을 생산하기 위해 하나 이상의 외인성 서열을 포함하도록 유전적으로 변형될 수 있다. 유전적으로-변형된 생산자 세포는 일시적 또는 안정한 형질전환에 의해 외인성 서열을 함유할 수 있다. 외인성 서열은 플라스미드로 형질전환될 수 있다. 외인성 서열은 표적화된 부위 또는 무작위 부위에서 생산자 세포의 게놈 서열에 안정적으로 통합될 수 있다. 일부 실시형태에서, 안정한 세포주는 내강-조작된 EV, 예를 들어, 엑소솜의 생산을 위해 생성된다.
외인성 서열은 내인성 EV를 암호화하는 서열, 예를 들어, 엑소솜, 단백질의 상류(5'-말단) 또는 하류(3'-말단) 내에 위치한 생산자 세포의 게놈 서열에 삽입될 수 있다. 외인성 서열을 생산자 세포에 도입하기 위해 당업계에 공지된 다양한 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 다양한 유전자 편집 방법(예를 들어, 상동 재조합, 트랜스포존-매개성 시스템, loxP-Cre 시스템, CRISPR/Cas9 또는 TALEN을 사용하는 방법)을 사용하여 변형된 세포는 본 개시내용의 범위 내에 있다.
외인성 서열은 본 개시내용의 스캐폴드 단백질(예를 들어, EV, 예를 들어, 엑소솜, 단백질 또는 EV, 예를 들어, 엑소솜, 단백질의 변형 또는 단편)을 암호화하는 서열을 포함할 수 있다. 스캐폴드 단백질(예를 들어, EV, 예를 들어, 엑소솜, 단백질)을 암호화하는 서열의 추가의 카피가 더 높은 밀도의 EV, 예를 들어, 엑소솜, 단백질을 갖는 내강-조작된 EV, 예를 들어, 엑소솜을 생산하기 위해 도입될 수 있다. EV, 예를 들어, 엑소솜, 단백질의 변형 또는 단편을 암호화하는 외인성 서열은 EV, 예를 들어, 엑소솜, 단백질의 변형 또는 단편을 함유하는 내강-조작된 EV, 예를 들어, 엑소솜을 생산하기 위해 도입될 수 있다. 친화성 태그를 암호화하는 외인성 서열이 EV, 예를 들어, 엑소솜, 단백질에 부착된 친화성 태그를 포함하는 융합 단백질을 함유하는 내강-조작된 EV, 예를 들어, 엑소솜을 생산하기 위해 도입될 수 있다.
일부 실시형태에서, 내강-조작된 EV, 예를 들어, 엑소솜은 동일하거나 유사한 생산자 세포 유형으로부터 단리된 천연 EV, 예를 들어, 엑소솜보다 더 높은 밀도의 EV, 예를 들어, 엑소솜, 단백질(스캐폴드 단백질)을 갖는다. 일부 실시형태에서, 상기 EV, 예를 들어, 엑소솜, 단백질(스캐폴드 단백질)은 천연 EV, 예를 들어, 엑소솜보다 상기 내강-조작된 EV, 예를 들어, 엑소솜에서 2-배, 4-배, 8-배, 16-배, 32-배, 64-배, 100-배, 200-배, 400-배, 800-배, 1,000-배 또는 더 높은 밀도로 존재한다. 일부 실시형태에서, EV, 예를 들어, 엑소솜, 단백질(스캐폴드 단백질)은 천연 EV, 예를 들어, 엑소솜보다 내강-조작된 EV, 예를 들어, 엑소솜에서 2 내지 4-배, 4 내지 8-배, 8 내지 16-배, 16 내지 32-배, 32 내지 64-배, 64 내지 100-배, 100 내지 200-배, 200 내지 400-배, 400 내지 800-배, 800 내지 1,000-배 또는 더 높은 밀도로 존재한다. 일부 실시형태에서, EV, 예를 들어, 엑소솜, 단백질(스캐폴드 단백질)을 포함하는 융합 단백질은 천연 EV, 예를 들어, 엑소솜 상의 비변형 EV, 예를 들어, 엑소솜, 단백질(스캐폴드 단백질)보다 상기 내강-조작된 EV, 예를 들어, 엑소솜에서 2 내지 4-배, 4 내지 8-배, 8 내지 16-배, 16 내지 32-배, 32 내지 64-배, 64 내지 100-배, 100 내지 200-배, 200 내지 400-배, 400 내지 800-배, 800 내지 1,000-배 또는 더 높은 밀도로 존재한다. 일부 실시형태에서, EV, 예를 들어, 엑소솜, 단백질(스캐폴드 단백질)의 단편 또는 변이체는 천연 EV, 예를 들어, 엑소솜 상의 비변형 EV, 예를 들어, 엑소솜, 단백질(스캐폴드 단백질)보다 내강-조작된 EV, 예를 들어, 엑소솜에서 2 내지 4-배, 4 내지 8-배, 8 내지 16-배, 16 내지 32-배, 32 내지 64-배, 64 내지 100-배, 100 내지 200-배, 200 내지 400-배, 400 내지 800-배, 800 내지 1,000-배 또는 더 높은 밀도로 존재한다.
특정 실시형태에서, MARCKS, MARCKS의 단편 또는 변이체 또는 이의 변형은 상기 천연 EV, 예를 들어, 엑소솜 상의 비변형 MARCKS보다 상기 내강-조작된 EV, 예를 들어, 엑소솜에서 2 내지 4-배, 4 내지 8-배, 8 내지 16-배, 16 내지 32-배, 32 내지 64-배, 64 내지 100-배, 100 내지 200-배, 200 내지 400-배, 400 내지 800-배, 800 내지 1,000-배 또는 더 높은 밀도로 존재한다. 일부 실시형태에서, MARCKSL1, MARCKSL1의 단편 또는 변이체 또는 이의 변형은 상기 천연 EV, 예를 들어, 엑소솜 상의 비변형 MARCKSL1보다 상기 내강-조작된 EV, 예를 들어, 엑소솜에서 2 내지 4-배, 4 내지 8-배, 8 내지 16-배, 16 내지 32-배, 32 내지 64-배, 64 내지 100-배, 100 내지 200-배, 200 내지 400-배, 400 내지 800-배, 800 내지 1,000-배 또는 더 높은 밀도로 존재한다. 일부 실시형태에서, BASP1, BASP1의 단편 또는 변이체 또는 이의 변형은 천연 EV, 예를 들어, 엑소솜 상의 비변형 BASP1보다 상기 내강-조작된 EV, 예를 들어, 엑소솜에서 2 내지 4-배, 4 내지 8-배, 8 내지 16-배, 16 내지 32-배, 32 내지 64-배, 64 내지 100-배, 100 내지 200-배, 200 내지 400-배, 400 내지 800-배, 800 내지 1,000-배 또는 더 높은 밀도로 존재한다.
일부 실시형태에서, 생산자 세포는 추가적인 외인성 서열을 포함하도록 추가로 변형된다. 예를 들어, 추가적인 외인성 서열은 내인성 유전자 발현을 조절하거나 또는 페이로드로서 소정의 폴리펩타이드를 포함하는 엑소솜을 생산하도록 포함될 수 있다. 일부 실시형태에서, 생산자 세포는 2개의 외인성 서열을 포함하도록 변형되며, 하나는 EV, 예를 들어, 엑소솜, 단백질(스캐폴드 단백질) 또는 EV, 예를 들어, 엑소솜, 단백질(스캐폴드 단백질)의 변형 또는 단편을 암호화하고, 다른 하나는 페이로드를 암호화한다.
보다 구체적으로, 내강-조작된 EV, 예를 들어, 엑소솜은 (1) 미리스토일화된 알라닌 풍부 단백질 카이네이스 C 기질(MARCKS); (2) 미리스토일화된 알라닌 풍부 단백질 카이네이스 C 기질 유사 1(MARCKSL1); 및 (3) 뇌의 산 가용성 단백질 1(BASP1)을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 하나 이상의 엑소솜 내강 단백질(스캐폴드 단백질)을 암호화하는 서열로 형질전환된 세포로부터 생산될 수 있다. 임의의 본 명세서에 기재된 하나 이상의 EV, 예를 들어, 엑소솜, 내강 단백질(스캐폴드 단백질)은 플라스미드, 게놈에 삽입된 외인성 서열 또는 합성 메신저 RNA(mRNA)와 같은 다른 외인성 핵산으로부터 발현될 수 있다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 EV, 예를 들어, 엑소솜, 내강 단백질(스캐폴드 단백질)은 이의 전장의 내인성 형태를 암호화하는 외인성 서열로 형질전환된 세포에서 발현된다. 일부 실시형태에서, 이러한 외인성 서열은 서열번호 1의 MARCKS 단백질 또는 N-말단 M이 없는 상응하는 서열을 암호화한다. 소정의 양태에서, 이러한 외인성 서열은 서열번호 1의 MARCKS 단백질을 암호화한다. 일부 실시형태에서, 이러한 외인성 서열은 서열번호 1의 MARCKS 단백질을 암호화하되, 외인성 서열에 의해 암호화된 MARKS 단백질은 N-말단 Met를 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, 이러한 외인성 서열은 서열번호 2의 MARCKSL1 단백질 또는 N-말단 M이 없는 상응하는 서열을 암호화한다. 소정의 양태에서, 이러한 외인성 서열은 서열번호 2의 MARCKSL1 단백질을 암호화한다. 일부 실시형태에서, 이러한 외인성 서열은 서열번호 2의 MARCKSL1 단백질을 암호화하되, 외인성 서열에 의해 암호화된 MARCKSL1 단백질은 N-말단 Met를 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, 이러한 외인성 서열은 서열번호 3의 BASP1 단백질 또는 N-말단 M이 없는 상응하는 서열을 암호화한다. 소정의 양태에서, 이러한 외인성 서열은 서열번호 3의 BASP1 단백질을 암호화한다. 일부 실시형태에서, 이러한 외인성 서열은 서열번호 3의 BASP1 단백질을 암호화하되, 외인성 서열에 의해 암호화된 BASP1 단백질은 N-말단 Met를 포함하지 않는다.
내강-조작된 EV, 예를 들어, 엑소솜은 (1) 미리스토일화된 알라닌 풍부 단백질 카이네이스 C 기질(MARCKS); (2) 미리스토일화된 알라닌 풍부 단백질 카이네이스 C 기질 유사 1(MARCKSL1); 및 (3) 뇌의 산 가용성 단백질 1(BASP1)을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 하나 이상의 EV, 예를 들어, 엑소솜, 내강 단백질(스캐폴드 단백질)의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열로 형질전환된 세포로부터 생산될 수 있다.
일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 서열은 천연 단백질의 N-말단으로부터 적어도 5개, 10개, 50개, 100개, 200개 또는 300개의 아미노산이 결여되어 있는 EV, 예를 들어, 엑소솜, 내강 단백질(예를 들어, 스캐폴드 단백질, 예컨대 MARCKS, MARCKSL1 또는 BASP1)의 단편을 암호화한다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 서열은 천연 단백질의 C-말단으로부터 적어도 5개, 10개, 50개, 100개, 200개 또는 300개의 아미노산이 결여되어 있는 EV, 예를 들어, 엑소솜, 내강 단백질(예를 들어, 스캐폴드 단백질, 예컨대 MARCKS, MARCKSL1 또는 BASP1)의 단편을 암호화한다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 서열은 천연 단백질의 N-말단 및 C-말단 모두에서 적어도 5개, 10개, 50개, 100개, 200개 또는 300개의 아미노산이 결여되어 있는 EV, 예를 들어, 엑소솜, 내강 단백질(예를 들어, 스캐폴드 단백질, 예컨대 MARCKS, MARCKSL1 또는 BASP1)의 단편을 암호화한다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 서열은 천연 단백질의 하나 이상의 기능적 또는 구조적 도메인이 결여되어 있는 EV, 예를 들어, 엑소솜, 내강 단백질(예를 들어, 스캐폴드 단백질, 예컨대 MARCKS, MARCKSL1 또는 BASP1)의 단편을 암호화한다.
일부 실시형태에서, 융합 단백질은 서열번호 4 내지 109의 펩타이드, N-말단 M이 없는 상응하는 서열 또는 N-말단 M이 없는 본 명세서에 개시된 임의의 스캐폴드 단백질 서열(예를 들어, 표 1)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 융합 단백질은 서열번호 4 내지 109의 펩타이드 또는 본 명세서에 개시된 임의의 스캐폴드 단백질 서열(예를 들어, 표 1)을 포함하되, 융합 단백질은 N-말단 Met를 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, 융합 단백질은 서열번호 13의 펩타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 융합 단백질은 서열번호 13의 펩타이드를 포함하되, 융합 단백질은 N-말단 Met를 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, 융합 단백질은 서열 MGXKLSKKK(서열번호 117) 또는 GXKLSKKK(서열번호 425)를 갖는 펩타이드를 포함하는 스캐폴드 단백질, 예를 들어, 엑소솜 내강 단백질을 포함하되, X는 알라닌 또는 임의의 다른 아미노산이다. 일부 실시형태에서, 융합 단백질은 서열 GXKLSKKK(서열번호 425)를 갖는 펩타이드를 포함하는 스캐폴드 단백질, 예를 들어, 엑소솜 내강 단백질을 포함하되, X는 알라닌 또는 임의의 다른 아미노산이고, 스캐폴드 단백질, 예를 들어, 엑소솜 내강 단백질은 N-말단 Met를 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, 융합 단백질은 서열 GXKLSKKK(서열번호 425)를 갖는 펩타이드를 포함하는 스캐폴드 단백질, 예를 들어, 엑소솜 내강 단백질을 포함하되, X는 알라닌 또는 임의의 다른 아미노산이고, 융합 단백질은 N-말단 Met를 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, 융합 단백질은 GXKLSKKK(서열번호 425)의 아미노산 서열을 포함하는 스캐폴드 단백질을 포함하되, X는 알라닌 또는 임의의 다른 아미노산이고, 스캐폴드 단백질은 아미노산 서열의 N-말단에 Met를 포함하지 않으며, 예를 들어, MGXKLSKKK(서열번호 117)를 포함한다. 다른 실시형태에서, 융합 단백질은 GXKLSKKK(서열번호 425)의 아미노산 서열을 포함하는 스캐폴드 단백질, 예를 들어, 엑소솜 내강 단백질을 포함하되, 융합 단백질은 MGXKLSKKK를 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, 융합 단백질은 (M)(G)(π)(ξ)(Φ/π)(S/A/G/N)(+)(+) 또는 (G)(π)(ξ)(Φ/π)(S/A/G/N)(+)(+)의 서열을 갖는 펩타이드를 포함하는 스캐폴드 단백질을 포함하되, 각 괄호의 위치는 아미노산을 나타내고, π는 (Pro, Gly, Ala, Ser)로 이루어진 군으로부터 선택되는 임의의 아미노산이며, ξ는 (Asn, Gln, Ser, Thr, Asp, Glu, Lys, His, Arg)로 이루어진 군으로부터 선택되는 임의의 아미노산이고, Φ는 (Val, Ile, Leu, Phe, Trp, Tyr, Met)로 이루어진 군으로부터 선택되는 임의의 아미노산이며, (+)는 (Lys, Arg, His)로 이루어진 군으로부터 선택되는 임의의 아미노산이고; 5번 위치는 (+)가 아니며, 6번 위치는 (+)도 (Asp 또는 Glu)도 아니다. 일부 실시형태에서, 융합 단백질은 스캐폴드 단백질, 예를 들어, 엑소솜 내강 단백질은 (G)(π)(ξ)(Φ/π)(S/A/G/N)(+)(+)의 아미노산 서열을 포함하되, 융합 단백질은 (M)(G)(π)(ξ)(Φ/π)(S/A/G/N)(+)(+)를 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, 융합 단백질은 (M)(G)(π)(X)(Φ/π)(π)(+)(+) 또는 (G)(π)(X)(Φ/π)(π)(+)(+)의 서열을 갖는 펩타이드를 포함하는 스캐폴드 단백질, 예를 들어, 엑소솜 내강 단백질을 포함하되, 각 괄호의 위치는 아미노산을 나타내고, π는 (Pro, Gly, Ala, Ser)로 이루어진 군으로부터 선택되는 임의의 아미노산이며, X는 임의의 아미노산이고, Φ는 (Val, Ile, Leu, Phe, Trp, Tyr, Met)로 이루어진 군으로부터 선택되는 임의의 아미노산이며, (+)는 (Lys, Arg, His)로 이루어진 군으로부터 선택되는 임의의 아미노산이고; 5번 위치는 (+)가 아니며, 6번 위치는 (+)도 (Asp 또는 Glu)도 아니다. 다른 실시형태에서, 융합 단백질은 (G)(π)(X)(Φ/π)(π)(+)(+)의 아미노산 서열을 포함하는 스캐폴드 단백질, 예를 들어, 엑소솜 내강 단백질을 포함하되, 융합 단백질은 (M)(G)(π)(X)(Φ/π)(π)(+)(+)를 포함하지 않는다.
일부 실시형태에서, 내강-조작된 EV, 예를 들어, 엑소솜은 하나 이상의 이종성 단백질에 융합된 EV를 암호화하는 서열, 예를 들어, 엑소솜, 단백질(예를 들어, 스캐폴드 단백질 예를 들어, 엑소솜 내강 단백질, 예컨대 MARCKS, MARCKSL1 또는 BASP1) 또는 이들의 단편 또는 변형으로 형질전환된 세포로부터 생산될 수 있다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 이종성 단백질은 EV, 예를 들어, 엑소솜, 단백질(예를 들어, 스캐폴드 단백질, 예컨대 MARCKS, MARCKSL1 또는 BASP1) 또는 이의 변형, 특히 이의 단편 또는 변이체의 N-말단에 융합된다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 이종성 단백질은 EV, 예를 들어, 엑소솜, 단백질(예를 들어, 스캐폴드 단백질, 예컨대 MARCKS, MARCKSL1 또는 BASP1) 또는 이의 변형, 특히 이의 단편 또는 변이체의 C-말단에 융합된다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 이종성 단백질은 EV, 예를 들어, 엑소솜, 단백질(예를 들어, 스캐폴드 단백질, 예컨대 MARCKS, MARCKSL1 또는 BASP1) 또는 이의 변형, 특히 이의 단편 또는 변이체의 N-말단 및 C-말단에 융합된다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 이종성 단백질은 포유 동물 단백질이다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 이종성 단백질은 인간 단백질이다.
일부 실시형태에서, 내강-조작된 EV, 예를 들어, 엑소솜은
(1) 미리스토일화된 알라닌 풍부 단백질 카이네이스 C 기질(MARCKS);
(2) 미리스토일화된 알라닌 풍부 단백질 카이네이스 C 기질 유사 1(MARCKSL1); 및
(3) 뇌의 산 가용성 단백질 1(BASP1)
을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 천연 EV, 예를 들어, 엑소솜, 내강 단백질(스캐폴드 단백질)의 전체 길이 또는 단편과 동일하거나 유사한 서열의 폴리펩타이드를 암호화하는 서열로 형질전환된 세포로부터 생산된다.
일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 천연 EV, 예를 들어, 엑소솜, 내강 단백질(스캐폴드 단백질)의 전체 길이 또는 단편과 적어도 약 50% 동일하며, 예를 들어, 서열번호 1 내지 3 또는 N-말단 M이 없는 임의의 상응하는 서열과 50% 동일하다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 천연 EV, 예를 들어, 엑소솜, 내강 단백질(스캐폴드 단백질)의 전체 길이 또는 단편과 적어도 약 55% 동일하며, 예를 들어, 서열번호 1 내지 3 또는 N-말단 M이 없는 임의의 상응하는 서열과 적어도 약 50% 동일하다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 천연 EV, 예를 들어, 엑소솜, 내강 단백질(스캐폴드 단백질)의 전체 길이 또는 단편과 적어도 약 60% 동일하며, 예를 들어, 서열번호 1 내지 3 또는 N-말단 M이 없는 임의의 상응하는 서열과 적어도 약 60% 동일하다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 천연 EV, 예를 들어, 엑소솜, 내강 단백질(스캐폴드 단백질)의 전체 길이 또는 단편과 적어도 약 65% 동일하며, 예를 들어, 서열번호 1 내지 3 또는 N-말단 M이 없는 임의의 상응하는 서열과 적어도 약 65% 동일하다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 천연 EV, 예를 들어, 엑소솜, 내강 단백질(스캐폴드 단백질)의 전체 길이 또는 단편과 적어도 약 70% 동일하며, 예를 들어, 서열번호 1 내지 3 또는 N-말단 M이 없는 임의의 상응하는 서열과 적어도 약 70% 동일하다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 천연 EV, 예를 들어, 엑소솜, 내강 단백질(스캐폴드 단백질)의 전체 길이 또는 단편과 적어도 약 75% 동일하며, 예를 들어, 서열번호 1 내지 3 또는 N-말단 M이 없는 임의의 상응하는 서열과 적어도 약 75% 동일하다. 일부 실시형태에서, 상기 폴리펩타이드는 천연 EV, 예를 들어, 엑소솜, 내강 단백질(스캐폴드 단백질)의 전체 길이 또는 단편과 적어도 약 80% 동일하며, 예를 들어, 서열번호 1 내지 3 또는 N-말단 M이 없는 임의의 상응하는 서열과 적어도 약 80% 동일하다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 천연 EV, 예를 들어, 엑소솜, 내강 단백질(스캐폴드 단백질)의 전체 길이 또는 단편과 적어도 약 85% 동일하며, 예를 들어, 서열번호 1 내지 3 또는 N-말단 M이 없는 임의의 상응하는 서열과 적어도 약 85% 동일하다. 일부 실시형태에서, 상기 폴리펩타이드는 천연 EV, 예를 들어, 엑소솜, 내강 단백질(스캐폴드 단백질)의 전체 길이 또는 단편과 적어도 약 90% 동일하며, 예를 들어, 서열번호 1 내지 3 또는 N-말단 M이 없는 임의의 상응하는 서열과 적어도 약 90% 동일하다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 천연 EV, 예를 들어, 엑소솜, 내강 단백질(스캐폴드 단백질)의 전체 길이 또는 단편과 적어도 약 95% 동일하며, 예를 들어, 서열번호 1 내지 3 또는 N-말단 M이 없는 임의의 상응하는 서열과 적어도 약 95% 동일하다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 천연 EV, 예를 들어, 엑소솜, 내강 단백질(스캐폴드 단백질)의 전체 길이 또는 단편과 적어도 약 99% 동일하며, 예를 들어, 서열번호 1 내지 3 또는 N-말단 M이 없는 임의의 상응하는 서열과 적어도 약 99% 동일하다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 천연 EV, 예를 들어, 엑소솜, 내강 단백질(스캐폴드 단백질)의 전체 길이 또는 단편과 적어도 약 99.9% 동일하며, 예를 들어, 서열번호 1 내지 3 또는 N-말단 M이 없는 임의의 상응하는 서열과 적어도 약 99.9% 동일하다.
일부 실시형태에서, 세포로부터 생산된 내강-조작된 EV, 예를 들어, 엑소솜은 뇌의 산 가용성 단백질 1(BASP1)의 단편과 동일하거나 유사한 서열의 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 BASP1의 전체 길이 또는 단편과 적어도 약 50% 동일하며, 예를 들어, 서열번호 4 내지 109, N-말단 M이 없는 상응하는 서열 또는 N 말단 M이 없는 본 명세서, 예를 들어, 표 1에 기재된 임의의 BASP1 서열과 적어도 약 50% 동일하다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 BASP1의 전체 길이 또는 단편과 적어도 약 55% 동일하며, 예를 들어, 서열번호 4 내지 109, N-말단 M이 없는 상응하는 서열 또는 N 말단 M이 없는 본 명세서, 예를 들어, 표 1에 기재된 임의의 BASP1 서열과 적어도 약 50% 동일하다. 일부 실시형태에서, 상기 폴리펩타이드는 BASP1의 전체 길이 또는 단편과 적어도 약 60% 동일하며, 예를 들어, 서열번호 4 내지 109, N-말단 M이 없는 상응하는 서열 또는 N 말단 M이 없는 본 명세서, 예를 들어, 표 1에 기재된 임의의 BASP1 서열과 적어도 약 60% 동일하다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 BASP1의 전체 길이 또는 단편과 적어도 약 65% 동일하며, 예를 들어, 서열번호 4 내지 109, N-말단 M이 없는 상응하는 서열 또는 N 말단 M이 없는 본 명세서, 예를 들어, 표 1에 기재된 임의의 BASP1 서열과 적어도 약 65% 동일하다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 BASP1의 전체 길이 또는 단편과 적어도 약 70% 동일하며, 예를 들어, 서열번호 4 내지 109, N-말단 M이 없는 상응하는 서열 또는 N 말단 M이 없는 본 명세서, 예를 들어, 표 1에 기재된 임의의 BASP1 서열과 적어도 약 70% 동일하다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 BASP1의 전체 길이 또는 단편과 적어도 약 75% 동일하며, 예를 들어, 서열번호 4 내지 109, N-말단 M이 없는 상응하는 서열 또는 N 말단 M이 없는 본 명세서, 예를 들어, 표 1에 기재된 임의의 BASP1 서열과 적어도 약 75% 동일하다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 BASP1의 전체 길이 또는 단편과 적어도 약 80% 동일하며, 예를 들어, 서열번호 4 내지 109, N-말단 M이 없는 상응하는 서열 또는 N 말단 M이 없는 본 명세서, 예를 들어, 표 1에 기재된 임의의 BASP1 서열과 적어도 약 80% 동일하다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 BASP1의 전체 길이 또는 단편과 적어도 약 85% 동일하며, 예를 들어, 서열번호 4 내지 109, N-말단 M이 없는 상응하는 서열 또는 N 말단 M이 없는 본 명세서, 예를 들어, 표 1에 기재된 임의의 BASP1 서열과 적어도 약 85% 동일하다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 BASP1의 전체 길이 또는 단편과 적어도 약 90% 동일하며, 예를 들어, 서열번호 4 내지 109, N-말단 M이 없는 상응하는 서열 또는 N 말단 M이 없는 본 명세서, 예를 들어, 표 1에 기재된 임의의 BASP1 서열과 적어도 약 90% 동일하다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 BASP1의 전체 길이 또는 단편과 적어도 약 95% 동일하며, 예를 들어, 서열번호 4 내지 109, N-말단 M이 없는 상응하는 서열 또는 N 말단 M이 없는 본 명세서, 예를 들어, 표 1에 기재된 임의의 BASP1 서열과 적어도 약 95% 동일하다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 BASP1의 전체 길이 또는 단편과 적어도 약 99% 동일하며, 예를 들어, 서열번호 4 내지 109, N-말단 M이 없는 상응하는 서열 또는 N 말단 M이 없는 본 명세서, 예를 들어, 표 1에 기재된 임의의 BASP1 서열과 적어도 약 99% 동일하다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 BASP1의 전체 길이 또는 단편과 적어도 약 99.9% 동일하며, 예를 들어, 서열번호 4 내지 109, N-말단 M이 없는 상응하는 서열 또는 N 말단 M이 없는 본 명세서, 예를 들어, 표 1에 기재된 임의의 BASP1 서열과 적어도 약 99.9% 동일하다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 BASP1의 단편과 약 100% 동일하며, 예를 들어, 4 내지 109, N-말단 M이 없는 상응하는 서열 또는 N 말단 M이 없는 본 명세서, 예를 들어, 표 1에 기재된 임의의 BASP1 서열과 약 100% 동일하다.
일부 실시형태에서, 세포로부터 생산된 내강-조작된 EV, 예를 들어, 엑소솜은 뇌의 산 가용성 단백질 1(BASP1)의 단편과 동일하거나 유사한 서열의 폴리펩타이드를 포함하되, 폴리펩타이드 N-말단은 Met를 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 BASP1의 전체 길이 또는 단편과 적어도 약 50% 동일하며, 예를 들어, 서열번호 4 내지 109 또는 본 명세서, 예를 들어, 표 1에 기재된 임의의 BASP1 서열과 적어도 약 50% 동일하되, 폴리펩타이드 N-말단은 Met를 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 BASP1의 전체 길이 또는 단편과 적어도 약 55% 동일하며, 예를 들어, 서열번호 4 내지 109 또는 본 명세서, 예를 들어, 표 1에 기재된 임의의 BASP1 서열과 적어도 약 50% 동일하되, 폴리펩타이드 N-말단은 Met를 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, 상기 폴리펩타이드는 BASP1의 전체 길이 또는 단편과 적어도 약 60% 동일하며, 예를 들어, 서열번호 4 내지 109 또는 본 명세서, 예를 들어, 표 1에 기재된 임의의 BASP1 서열과 적어도 약 60% 동일하되, 폴리펩타이드 N-말단은 Met를 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 BASP1의 전체 길이 또는 단편과 적어도 약 65% 동일하며, 예를 들어, 서열번호 4 내지 109 또는 본 명세서, 예를 들어, 표 1에 기재된 임의의 BASP1 서열과 적어도 약 65% 동일하되, 폴리펩타이드 N-말단은 Met를 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 BASP1의 전체 길이 또는 단편과 적어도 약 70% 동일하며, 예를 들어, 서열번호 4 내지 109 또는 본 명세서, 예를 들어, 표 1에 기재된 임의의 BASP1 서열과 적어도 약 70% 동일하되, 폴리펩타이드 N-말단은 Met를 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 BASP1의 전체 길이 또는 단편과 적어도 약 75% 동일하며, 예를 들어, 서열번호 4 내지 109 또는 본 명세서, 예를 들어, 표 1에 기재된 임의의 BASP1 서열과 적어도 약 75% 동일하되, 폴리펩타이드 N-말단은 Met를 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 BASP1의 전체 길이 또는 단편과 적어도 약 80% 동일하며, 예를 들어, 서열번호 4 내지 109 또는 본 명세서, 예를 들어, 표 1에 기재된 임의의 BASP1 서열과 적어도 약 80% 동일하되, 폴리펩타이드 N-말단은 Met를 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 BASP1의 전체 길이 또는 단편과 적어도 약 85% 동일하며, 예를 들어, 서열번호 4 내지 109 또는 본 명세서, 예를 들어, 표 1에 기재된 임의의 BASP1 서열과 적어도 약 85% 동일하되, 폴리펩타이드 N-말단은 Met를 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 BASP1의 전체 길이 또는 단편과 적어도 약 90% 동일하며, 예를 들어, 서열번호 4 내지 109 또는 본 명세서, 예를 들어, 표 1에 기재된 임의의 BASP1 서열과 적어도 약 90% 동일하되, 폴리펩타이드 N-말단은 Met를 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 BASP1의 전체 길이 또는 단편과 적어도 약 95% 동일하며, 예를 들어, 서열번호 4 내지 109 또는 본 명세서, 예를 들어, 표 1에 기재된 임의의 BASP1 서열과 적어도 약 95% 동일하되, 폴리펩타이드 N-말단은 Met를 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 BASP1의 전체 길이 또는 단편과 적어도 약 99% 동일하며, 예를 들어, 서열번호 4 내지 109 또는 본 명세서, 예를 들어, 표 1에 기재된 임의의 BASP1 서열과 적어도 약 99% 동일하되, 폴리펩타이드 N-말단은 Met를 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 BASP1의 전체 길이 또는 단편과 적어도 약 99.9% 동일하며, 예를 들어, 서열번호 4 내지 109 또는 본 명세서, 예를 들어, 표 1에 기재된 임의의 BASP1 서열과 적어도 약 99.9% 동일하되, 폴리펩타이드 N-말단은 Met를 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 BASP1의 단편과 약 100% 동일하며, 예를 들어, 4-109 또는 본 명세서, 예를 들어, 표 1에 기재된 임의의 BASP1 서열과 약 100% 동일하되, 폴리펩타이드 N-말단은 Met를 포함하지 않는다.
VI. 제조 방법
본 개시내용의 EV(예를 들어, 엑소솜)는 화학적 합성, 재조합 DNA 기술, 더 큰 분자의 생화학적 또는 효소적 단편화, 전술한 것들의 조합에 의해 또는 임의의 다른 방법에 의해 생산될 수 있다. 일 실시형태에서, 본 개시내용은 생물학적으로 활성인 분자를 EV(예를 들어, 엑소솜)에 접합시키는 방법을 제공한다. 방법은 위에 기재된 바와 같이 생물학적으로 활성인 분자를 EV(예를 들어, 엑소솜)에 연결하는 단계를 포함한다.
본 개시내용의 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 EV, 예를 들어, 엑소솜은 위에 기재된 바와 같은 생산자 세포를 사용하여 제조될 수 있다. 따라서, 본 개시내용은 적합한 조건하에 본 명세서에 개시된 생산자 세포를 배양하는 단계 및 본 개시내용의 EV, 예를 들어, 엑소솜을 얻는 단계를 포함하는 EV, 예를 들어, 엑소솜을 제조하는 방법을 제공한다.
다른 실시형태에서, 본 개시내용의 스캐폴드 단백질, 예를 들어, 엑소솜 내강 단백질은 재조합적으로 생산되고, 이후에 본 개시내용의 EV, 예를 들어, 엑소솜에 통합될 수 있다. 다른 실시형태에서, 스캐폴드 단백질의 폴리펩타이드 부분만이 재조합적으로 생산된다. 일부 실시형태에서, 재조합적으로 생산된 스캐폴드 단백질의 폴리펩타이드 부분은 이후에 막 앵커(예를 들어, N-말단 미리스트산)를 포함시키기 위해, 예를 들어, 화학적으로 또는 효소적으로 변형된다. 일부 실시형태에서, 반-재조합적으로(즉, 폴리펩타이드 부분의 재조합 산물의 결합에 이어 화학적 또는 효소적 변형이 뒤따름) 생산된 스캐폴드 단백질은 이후에 본 개시내용 EV, 예를 들어, 엑소솜에 통합된다.
다른 실시형태에서, 본 개시내용의 스캐폴드 단백질, 예를 들어, 엑소솜 내강 단백질은 화학적으로, 예를 들어, 고체상 펩타이드 합성을 사용하여 생산되고, 이후에 본 개시내용의 EV, 예를 들어, 엑소솜에 통합될 수 있다. 다른 실시형태에서, 스캐폴드 단백질의 폴리펩타이드 부분만이 합성적으로 생산된다. 일부 실시형태에서, 합성적으로 생산된 스캐폴드 단백질의 폴리펩타이드 부분은 이후에 막 앵커(예를 들어, N-말단 미리스트산)를 포함시키기 위해, 예를 들어, 화학적으로 또는 효소적으로 변형된다. 일부 실시형태에서, 반-합성적으로(즉, 폴리펩타이드 부분의 합성 산물의 결합에 이어 화학적 또는 효소적 변형이 뒤따름) 생산된 스캐폴드 단백질은 이후에 본 개시내용의 EV, 예를 들어, 엑소솜에 통합된다.
다른 실시형태에서, 본 개시내용의 스캐폴드 단백질, 예를 들어, 엑소솜 내강 단백질은 예를 들어, 망상적혈구 시스템과 같은 무세포 발현을 사용하여 시험관내에서 생산되고, 이후에 본 개시내용의 EV, 예를 들어, 엑소솜에 통합될 수 있다. 다른 실시형태에서, 스캐폴드 단백질의 폴리펩타이드 부분만이 시험관내, 예를 들어, 무세포계에서 생산된다. 일부 실시형태에서, 시험관내, 예를 들어, 무세포계에서 생산된 스캐폴드 단백질의 폴리펩타이드 부분은 이후에 막 앵커(예를 들어, N-말단 미리스트산)를 포함시키기 위해, 예를 들어, 화학적으로 또는 효소적으로 변형된다. 일부 실시형태에서, 반-시험관내(즉, 폴리펩타이드 부분의 시험관내 산물의 결합에 이어 화학적 또는 효소적 변형이 뒤따름)에서 생산된 스캐폴드 단백질은 이후에 본 개시내용의 EV, 예를 들어, 엑소솜에 통합된다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법은 생산 및 정제 동안 각각 수집된 분획에 함유된 EV, 예를 들어, 엑소솜을 특성화하는 단계를 더 포함한다. 일부 실시형태에서, EV, 예를 들어, 엑소솜의 내용물이 연구 및 특성화를 위해 추출될 수 있다. 일부 실시형태에서, EV, 예를 들어, 엑소솜은 단리되고, 크기, 모양, 형태 또는 핵산, 단백질, 대사 산물 및 지질과 같은 분자 조성물을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 메트릭(metric)에 의해 특성화된다.
VII. 약제학적 조성물 및 투여 방법
본 개시내용은 또한 대상체에 투여하기에 적합한 본 명세서에 기재된 EV(예를 들어, 엑소솜)를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 약제학적 조성물은 일반적으로 복수의 EV(예를 들어, 엑소솜)에 공유적으로 또는 비-공유적으로 연결된 적어도 하나의 페이로드, 예를 들어, 생물학적으로 활성인 분자를 포함하는 복수의 EV(예를 들어, 엑소솜), 및 약제학적으로 허용 가능한 부형제 또는 담체를 대상체에 투여하기에 적합한 형태로 포함한다.
약제학적으로 허용 가능한 부형제 또는 담체는 투여되는 특정 조성물뿐만 아니라 조성물을 투여하기 위해 사용되는 특정 방법에 의해 부분적으로 결정된다. 따라서, 복수의 EV(예를 들어, 엑소솜)를 포함하는 약제학적 조성물의 매우 다양한 적합한 제형이 존재한다. (예를 들어, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa. 18th ed.(1990)] 참조). 약제학적 조성물은 일반적으로 멸균으로 제형화되며, 미국 식품의약국의 모든 우수의약품 제조관리 기준(Good Manufacturing Practice: GMP)의 규정을 완전히 준수한다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 예를 들어, 본 명세서에 기재된 EV(예를 들어, 엑소솜)에 공유적으로 연결된 소분자와 같은 하나 이상의 화학적 화합물을 포함한다.
일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 하나 이상의 치료제 또는 진단제 및 본 명세서에 기재된 EV(예를 들어, 엑소솜)를 포함한다. 소정의 실시형태에서, EV(예를 들어, 엑소솜)는 약제학적으로 허용 가능한 담체에서 하나 이상의 추가적인 치료제 또는 진단제와 함께 공동-투여된다. 일부 실시형태에서, EV(예를 들어, 엑소솜)를 포함하는 약제학적 조성물은 추가적인 치료제 또는 진단제의 투여 전에 투여된다. 다른 실시형태에서, EV(예를 들어, 엑소솜)를 포함하는 약제학적 조성물은 추가적인 치료제 또는 진단제의 투여 후에 투여된다. 추가의 실시형태에서, EV(예를 들어, 엑소솜)를 포함하는 약제학적 조성물은 추가적인 치료제 또는 진단제와 동시에 투여된다.
목적하는 정도의 순도를 갖는 본 개시내용의 EV(예를 들어, 엑소솜)를 포함하는 약제학적 조성물 및 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제가 대상체에 투여하기에 적합한 형태로 본 명세서에서 제공된다. 약제학적으로 허용 가능한 부형제 또는 담체는 투여되는 특정 조성물뿐만 아니라 조성물을 투여하기 위해 사용되는 특정 방법에 의해 부분적으로 결정될 수 있다. 따라서, 복수의 세포외 소포체를 포함하는 약제학적 조성물의 매우 다양한 적합한 제형이 존재한다. (예를 들어, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa. 21st ed.(2005)] 참조). 약제학적 조성물은 일반적으로 멸균으로 제형화되며, 미국 식품의약국의 모든 우수의약품 제조관리 기준(GMP)의 규정을 완전히 준수한다.
일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 하나 이상의 치료제 또는 진단제 및 본 명세서에 기재된 EV(예를 들어, 엑소솜)를 포함한다. 소정의 실시형태에서, EV(예를 들어, 엑소솜)는 약제학적으로 허용 가능한 담체에서 하나 이상의 추가적인 치료제 또는 진단제와 공동-투여된다. 일부 실시형태에서, EV(예를 들어, 엑소솜)를 포함하는 약제학적 조성물은 추가적인 치료제 또는 진단제의 투여 전에 투여된다. 다른 실시형태에서, EV(예를 들어, 엑소솜)를 포함하는 약제학적 조성물은 추가적인 치료제 또는 진단제의 투여 후에 투여된다. 추가의 실시형태에서, EV(예를 들어, 엑소솜)를 포함하는 약제학적 조성물은 추가적인 치료제 또는 진단제와 동시에 투여된다.
허용 가능한 담체, 부형제 또는 안정화제는 이용되는 용량 및 농도에서 수용자(예를 들어, 동물 또는 인간)에게 비독성이며, 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기산과 같은 완충액; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 보존제(예컨대, 옥타데실다이메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤잘코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 뷰틸 또는 벤질 알코올; 메틸 또는 프로필 파라벤과 같은 알킬 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 사이클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저 분자량(약 10개 잔기 미만) 폴리펩타이드; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린과 같은 단백질; 폴리바이닐피롤리돈과 같은 친수성 중합체; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 라이신과 같은 아미노산; 단당류, 이당류, 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함하는 기타 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트제; 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨과 같은 당; 소듐과 같은 염-형성 반대-이온; 금속 복합체(예를 들어, Zn-단백질 복합체); 및/또는 TWEEN™, PLURONICS™ 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 비-이온성 계면활성제를 포함한다.
담체 또는 희석제의 예는 물, 식염수, 링거 용액, 덱스트로스 용액 및 5% 인간 혈청 알부민을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 약제학적으로 활성인 물질에 대한 이러한 매질 및 화합물의 사용은 당업계에 잘 알려져 있다. 임의의 종래의 매질 또는 화합물이 본 명세서에 기재된 세포외 소포체와 양립할 수 없는 경우를 제외하고는, 조성물에서 이들의 사용이 상정된다. 보충적 치료제가 또한 조성물에 포함될 수 있다. 전형적으로, 약제학적 조성물은 의도된 투여 경로와 상용적이도록 제형화된다. 본 개시내용의 EV(예를 들어, 엑소솜)는 비경구, 국부, 정맥내, 경구, 피하, 동맥내, 피내, 경피, 직장, 두개내, 복강내, 비강내, 종양내, 근육내 경로에 의해 또는 흡입제로 투여될 수 있다. 소정의 실시형태에서, EV(예를 들어, 엑소솜)를 포함하는 약제학적 조성물은 예를 들어, 주사에 의해 정맥내로 투여된다. EV(예를 들어, 엑소솜)는 선택적으로 EV(예를 들어, 엑소솜)를 대상으로 하는 질환, 장애 또는 병태를 치료하는데 적어도 부분적으로 효과적인 다른 치료제와 조합하여 투여될 수 있다.
용액 또는 현탁액은 다음의 성분을 포함할 수 있다: 물, 식염수 용액, 고정유, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 합성 용매와 같은 멸균 희석제; 벤질 알코올 또는 메틸 파라벤과 같은 항균성 화합물; 아스코르브산 또는 소듐 바이설파이트와 같은 항산화제; 에틸렌다이아민테트라아세트산(EDTA)과 같은 킬레이트 화합물; 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트와 같은 완충액 및 소듐 클로라이드 또는 덱스트로스와 같은 긴장성(tonicity) 조정을 위한 화합물. pH는 염산 또는 수산화나트륨과 같은 산 또는 염기로 조절될 수 있다. 제제는 유리 또는 플라스틱으로 만들어진 앰풀, 1회용 주사기 또는 다중 용량 바이알에 밀봉될 수 있다.
주사용으로 적합한 약제학적 조성물은 멸균 수용액(수용성인 경우) 또는 분산액 및 멸균 분말을 포함한다. 정맥내 투여의 경우, 적합한 담체는 생리학적 식염수, 정균수(bacteriostatic water), Cremophor EL™(바스프(BASF), 뉴저지 주 파시패니 소재) 또는 포스페이트 완충 식염수(PBS)를 포함한다. 조성물은 일반적으로 멸균이며, 쉽게 주사할 수 있을 정도로 유동적이다. 담체는 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜, 등) 및 이들의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은 레시틴과 같은 코팅의 사용에 의해, 분산액의 경우에 필요한 입자 크기의 유지에 의해 그리고 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물 작용의 예방은 다양한 항균성 및 항진균성 화합물, 예를 들어, 파라벤, 클로로뷰탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로살, 등에 의해 달성될 수 있다. 원하는 경우, 등장성 화합물, 예를 들어, 설탕, 만니톨, 소르비톨 및 소듐 클로라이드와 같은 폴리알코올이 조성물에 첨가될 수 있다. 주사용 조성물의 연장된 흡수는 조성물에 흡수를 지연시키는 화합물, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 포함시킴으로써 일어날 수 있다.
멸균 주사용 용액은 본 개시내용의 EV(예를 들어, 엑소솜)를 유효량으로, 그리고 원하는 대로 본 명세서에 열거된 성분 중 하나 또는 이들의 조합과 함께 적절한 용매에 혼입시킴으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 EV(예를 들어, 엑소솜)를 염기성 분산 매질 및 임의의 목적하는 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클에 혼입시킴으로써 제조된다. 멸균 주사용 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우에, 제조 방법은 활성 성분의 분말과 이전에 멸균-여과된 용액으로부터의 임의의 추가적인 목적하는 성분을 생성하는 진공 건조 및 동결 건조이다. EV(예를 들어, 엑소솜)은 데포 주사 또는 EV(예를 들어, 엑소솜)의 지속 또는 박동성 방출을 허용하는 방식으로 제형화될 수 있는 임플란트 제제의 형태로 투여될 수 있다.
본 개시내용의 EV(예를 들어, 엑소솜)을 포함하는 조성물의 전신 투여는 또한 점막경유 수단에 의한 것일 수 있다. 점막경유 투여의 경우, 침투될 장벽에 적절한 침투제가 제형에 사용된다. 이러한 침투제는 일반적으로 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, 점막경유 투여의 경우, 세제, 담즙염 및 푸시드산 유도체를 포함한다. 점막경유 투여는 예를 들어, 비강 스프레이의 사용을 통해 달성될 수 있다.
소정의 실시형태에서, 본 개시내용의 EV(예를 들어, 엑소솜)를 포함하는 약제학적 조성물은 약제학적 조성물로부터 혜택을 받을 수 있는 대상체에 정맥내로 투여된다. 소정의 다른 실시형태에서, 조성물은 예를 들어, 림프내 주사 또는 결절내(intranodal) 주사(예를 들어, 문헌[Senti et al., PNAS 105( 46): 17908 (2008)] 참조), 또는 근육내 주사, 피하 투여, 종양내 주사, 흉선 또는 간으로의 직접 주사에 의해 림프계에 투여된다.
소정의 실시형태에서, 본 개시내용의 EV(예를 들어, 엑소솜)를 포함하는 약제학적 조성물은 액체 현탁액으로 투여된다. 소정의 실시형태에서, 약제학적 조성물은 투여 후 데포를 형성할 수 있는 제형으로 투여된다. 소정의 바람직한 실시형태에서, 데포는 EV(예를 들어, 엑소솜)를 순환으로 천천히 방출하거나 또는 데포 형태로 유지된다.
전형적으로, 약제학적으로 허용 가능한 조성물은 오염 물질이 없도록 고도로 정제되며, 생체 적합성이며, 독성이 없고, 대상체에 투여하기에 적합하다. 물이 담체의 구성 요소인 경우, 물은 고도로 정제되며 오염물질, 예를 들어, 내독소가 없도록 처리된다.
약제학적으로 허용 가능한 담체는 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 소르비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 검, 칼슘 포스페이트, 알기네이트, 젤라틴, 칼슘 실리케이트, 미세결정질 셀룰로스, 폴리바이닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸하이드록시 벤조에이트, 프로필하이드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및/또는 미네랄 오일일 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다. 약제학적 조성물은 윤활제, 습윤제, 감미제, 풍미 증강제, 유화제, 현탁제 및/또는 보존제를 더 포함할 수 있다.
본 명세서에 기재된 약제학적 조성물은 본 명세서에 기재된 EV(예를 들어, 엑소솜) 및 선택적으로 약제학적 활성제 또는 치료제 및/또는 진단제를 포함한다. 치료제는 생물학적 작용제, 소분자 작용제 또는 핵산 작용제일 수 있다. 진단제는 예를 들어, 조영제일 수 있다.
본 명세서에 기재된 EV(예를 들어, 엑소솜)를 포함하는 약제학적 조성물을 포함하는 투여 형태가 제공된다. 일부 실시형태에서, 투여 형태는 정맥내 주사를 위한 액체 현탁액으로 제형화된다. 일부 실시형태에서, 투여 형태는 종양내 주사를 위한 액체 현탁액으로 제형화된다.
소정의 실시형태에서, 본 개시내용의 EV(예를 들어, 엑소솜)의 제제는 남은 복제-가능 핵산에 손상을 주기 위해 방사선, 예를 들어, X선, 감마선, 베타 입자, 알파 입자, 중성자, 양성자, 원소 핵, UV선 처리된다.
소정의 실시형태에서, 본 개시내용의 EV(예를 들어, 엑소솜)의 제제는 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 또는 100kGy 이상의 조사량을 사용하여 감마선 조사된다.
소정의 실시형태에서, 본 개시내용의 EV(예를 들어, 엑소솜)의 제제는 0.1, 0.5, 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000 이상의 조사량을 사용하여 X-선 조사된다.
본 개시내용의 EV(예를 들어, 엑소솜)는 다른 약물과 동시에 사용될 수 있다. 구체적으로, 본 개시내용의 EV(예를 들어, 엑소솜)은 호르몬 치료제, 화학치료제, 면역치료제와 같은 약제, 세포 성장 인자 또는 세포 성장 인자 수용체 등의 작용을 억제하는 약제와 함께 사용될 수 있다.
VIII. 치료적 용도
본 개시내용은 본 개시내용의 EV(예를 들어, 엑소솜)를 포함하는 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 질환 또는 병태의 치료를 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 병태를 치료하는 방법을 제공한다. 본 개시내용은 또한 본 개시내용의 EV(예를 들어, 엑소솜)를 포함하는 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 질환 또는 병태의 증상의 예방 또는 개선을 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 병태의 증상을 예방 또는 개선하는 방법을 제공한다. 본 개시내용의 EV(예를 들어, 엑소솜)를 포함하는 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 질환 또는 병태의 진단을 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 병태를 진단하는 방법이 또한 제공된다. 또한, 요법에 사용하기 위한, 약제로서 사용하기 위한, 질환 또는 병태의 치료를 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 병태를 치료하는데 사용하기 위한, 질환 또는 병태의 증상의 예방 또는 개선을 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 병태의 증상을 예방 또는 개선하는데 사용하기 위한 또는 질환 또는 병태의 진단을 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 병태를 진단하기 위한 본 개시내용의 EV(예를 들어, 엑소솜)가 제공된다.
일 실시형태에서, 질환 또는 장애는 암, 염증성 질환, 신경퇴행성 장애, 중추 신경 질환 또는 대사 질환이다.
본 개시내용은 또한 본 명세서에 개시된 EV(예를 들어, 엑소솜)를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 질환 또는 장애의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 장애를 예방 및/또는 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 방법을 사용하여 치료될 수 있는 질환 또는 장애는 암, 이식편-대-숙주 질환(GvHD), 자가면역 질환, 감염성 질환 또는 섬유증 질환을 포함한다. 일부 실시형태에서, 치료는 예방적이다. 다른 실시형태에서, 본 개시내용에 대한 EV(예를 들어, 엑소솜)는 면역 반응을 유도하는데 사용된다. 다른 실시형태에서, 본 개시내용에 대한 EV(예를 들어, 엑소솜)는 대상체를 예방 접종하기 위해 사용된다. 일부 실시형태에서, 질환 또는 장애는 암이다.
일부 실시형태에서, 질환 또는 장애는 감염성 질환이다. 소정의 실시형태에서, 질환 또는 장애는 종양 형성 바이러스이다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용으로 치료될 수 있는 감염성 질환은 인간 감마 헤르페스 바이러스 4(엡스타인 바 바이러스), 인플루엔자 바이러스, 인플루엔자 B 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 스타필로코커스 아우레우스(staphylococcus aureus), 마이코박테리움 튜버쿨로시스(mycobacterium tuberculosis), 클라미디아 트라코마티스(chlamydia trachomatis), HIV-1, HIV-2, 코로나바이러스(예를 들어, MERS-CoV 및 SARS CoV), 필로바이러스(예를 들어, 마르부르크(Marburg) 및 에볼라(Ebola)), 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes), 스트렙토코커스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoniae), 플라스모디아 종(Plasmodia species)(예를 들어, 비박스(vivax) 및 팔시파룸(falciparum)), 치쿵바이러스, 인간 유두종 바이러스(Human Papilloma virus: HPV), 간염 B, 간염 C, 인간 헤르페스 바이러스 8, 단순 포진 바이러스 2(herpes simplex virus 2: HSV2), 클렙시엘 종, 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 엔테로코커스 종(Enterococcus sp.), 프로테우스 종(Proteus sp.), 엔테로박터 종(Enterobacter sp.), 악티노박터 종(Actinobacter sp.), 코아귤레이스-음성 스타필로코키(coagulase-negative staphylococci: CoNS), 마이크로플라즈마 종(Mycoplasma sp.) 또는 이들의 조합을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
일부 실시형태에서, EV(예를 들어, 엑소솜)는 대상체의 순환계의 정맥내로 투여된다. 일부 실시형태에서, EV(예를 들어, 엑소솜)는 적합한 액체에 주입되어 대상체의 정맥으로 투여된다.
일부 실시형태에서, EV(예를 들어, 엑소솜)는 대상체의 순환계의 동맥내로 투여된다. 일부 실시형태에서, EV(예를 들어, 엑소솜)는 적합한 액체에 주입되어 대상체의 동맥으로 투여된다.
일부 실시형태에서, EV(예를 들어, 엑소솜)는 척수강내 투여에 의해 대상체에 투여된다. 일부 실시형태에서, EV(예를 들어, 엑소솜)는 뇌척수액(CSF)에 도달하도록 척수관 또는 지주막하 공간으로의 주사를 통해 투여된다.
일부 실시형태에서, EV(예를 들어, 엑소솜)는 대상체의 하나 이상의 종양에 종양내로 투여된다.
일부 실시형태에서, EV(예를 들어, 엑소솜)는 비강내 투여에 의해 대상체에 투여된다. 일부 실시형태에서, EV(예를 들어, 엑소솜)은 국부 투여 또는 전신 투여의 형태로 코를 통해 흡입될 수 있다. 소정의 실시형태에서, EV(예를 들어, 엑소솜)는 비강 스프레이로 투여된다.
일부 실시형태에서, EV(예를 들어, 엑소솜)는 복강내 투여에 의해 대상체에 투여된다. 일부 실시형태에서, EV(예를 들어, 엑소솜)는 적합한 액체에 주입되어 대상체의 복막으로 주입된다. 일부 실시형태에서, 복강내 투여는 림프관에 EV(예를 들어, 엑소솜)의 분포를 초래한다. 일부 실시형태에서, 복강내 투여는 흉선, 비장 및/또는 골수에 EV(예를 들어, 엑소솜)의 분포를 초래한다. 일부 실시형태에서, 복강내 투여는 하나 이상의 림프절에 EV(예를 들어, 엑소솜)의 분포를 초래한다. 일부 실시형태에서, 복강내 투여는 경추 림프절, 사타구니 림프절, 중격동 림프절 또는 흉골 림프절 중 하나 이상에 EV(예를 들어, 엑소솜)의 분포를 초래한다. 일부 실시형태에서, 복강내 투여는 췌장에 EV(예를 들어, 엑소솜)의 분포를 초래한다.
일부 실시형태에서, EV(예를 들어, 엑소솜)는 안구주위 투여에 의해 대상체에 투여된다. 일부 실시형태에서, EV(예를 들어, 엑소솜)는 안구주위 조직으로 주사된다. 안구주위 약물 투여는 결막하, 전방 안각 건하(anterior sub-Tenon's), 후방 안각 건하(posterior sub-Tenon's) 및 안구뒤 투여 경로를 포함한다.
IX. 키트
본 개시내용은 또한 하나 이상의 본 개시내용의 EV(예를 들어, 엑소솜) 및 선택적으로 사용 설명서를 포함하는 키트 또는 제조 제품을 제공한다. 일부 실시형태에서, 키트 또는 제조 제품은 적어도 하나의 본 개시내용의 EV(예를 들어, 엑소솜) 및 사용 설명서를 포함하는 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물을 포함한다.
일부 실시형태에서, 키트 또는 제조 제품은 하나 이상의 용기에 적어도 하나의 본 개시내용의 EV(예를 들어, 엑소솜) 또는 EV(예를 들어, 엑소솜)를 포함하는 약제학적 조성물을 포함한다. 당업자는 본 개시내용의 EV(예를 들어, 엑소솜), 본 개시내용의 EV(예를 들어, 엑소솜)를 포함하는 약제학적 조성물 또는 이들의 조합이 당업계에 잘 알려진 확립된 키트 형식 중 하나에 용이하게 포함될 수 있음을 쉽게 인식할 것이다.
일부 실시형태에서, 키트 또는 제조 제품은 (i) EV(예를 들어, 엑소솜), (ii) 하나 이상의 페이로드, 예를 들어, 생물학적으로 활성인 분자, (ii) 하나 이상의 페이로드, 예를 들어, 생물학적으로 활성인 분자를 EV(예를 들어, 엑소솜)에 공유적으로 부착하는 시약 또는 (iv) 하나 이상의 페이로드, 예를 들어, 생물학적으로 활성인 분자를 EV(예를 들어, 엑소솜)에 공유적으로 부착하기 위한 반응을 수행하기 위한 이들의 임의의 조합 및 설명서를 포함한다.
일부 실시형태에서, 키트는 페이로드, 예를 들어, 생물학적으로 활성인 분자를 EV(예를 들어, 엑소솜)에 접합하기 위한 시약 및 접합을 수행하기 위한 설명서를 포함한다.
본 개시내용의 실시는, 달리 명시되지 않는 한, 당업계의 기술 내에 있는 세포 생물학, 세포 배양, 분자 생물학, 형질전환 생물학, 미생물학, 재조합 DNA 및 면역학의 종래의 기법을 사용할 것이다. 이러한 기법은 문헌에 자세히 설명되어 있다. 예를 들어, 문헌[Sambrook et al., ed. (1989) Molecular Cloning A Laboratory Manual (2nd ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press); Sambrook et al., ed. (1992) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Cold Springs Harbor Laboratory, NY); D. N. Glover ed., (1985) DNA Cloning, Volumes I and II; Gait, ed. (1984) Oligonucleotide Synthesis; Mullis et al. 미국 특허 제4,683,195; Hames and Higgins, eds. (1984) Nucleic Acid Hybridization; Hames and Higgins, eds. (1984) Transcription And Translation; Freshney (1987) Culture Of Animal Cells (Alan R. Liss, Inc.); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press) (1986); Perbal (1984) A Practical Guide To Molecular Cloning; the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Miller and Calos eds. (1987) Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells, (Cold Spring Harbor Laboratory); Wu et al., eds., Methods In Enzymology, Vols. 154 and 155; Mayer and Walker, eds. (1987) Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Academic Press, London); Weir and Blackwell, eds., (1986) Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV; Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1986); ); Crooke, Antisense drug Technology: Principles, Strategies and Applications, 2nd Ed. CRC Press (2007) 및 Ausubel et al. (1989) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, Baltimore, Md.)] 참조.
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실시예
다음 실시예는 당업자에게 본 개시내용을 제조하고 사용하는 방법에 관한 완전한 개시 및 설명을 제공하기 위해 제안되고, 그리고 본 개시내용으로서 간주되는 것의 범위를 한정하는 것으로 의도되지 않으며, 또한 이들은 아래 실험이 수행된 모든 또는 유일한 실험이라는 것을 나타내는 것으로 의도되지 않는다. 사용되는 숫자(예를 들어, 양, 온도 등)에 대한 정확성을 보장하기 위한 노력이 이루어졌지만, 일부 실험 오차 및 편차를 고려하여야 한다.
달리 나타내지 않는 한, 부는 중량부이고, 분자량은 중량 평균 분자량이며, 온도는 섭씨 온도이고, 압력은 대기압 또는 대기압 부근이다. 표준 약어는 예를 들어, bp, 염기쌍(들); kb, 킬로베이스(들); pl, 피코리터(들); s 또는 sec, 초(들); min, 분(들); h 또는 hr, 시간(들); aa, 아미노산(들); nt, 뉴클레오타이드(들); 등이 사용될 수 있다.
본 개시내용의 실시는, 달리 명시되지 않는 한, 당업계의 기술 내에서 단백질 화학, 생화학, 재조합 DNA 기법 및 약리학의 종래의 방법을 사용할 것이다. 이러한 기법은 문헌에 자세히 설명되어 있다. 예를 들어, 문헌[T.E. Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W.H. Freeman and Company, 1993); AL. Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., current addition); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989); Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.); Remington's Pharmaceutical Sciences, 21th Edition (Easton, Pennsylvania: Mack Publishing Company, 2005); Carey and Sundberg Advanced Organic Chemistry 3rd Ed. (Plenum Press) Vols A and B(l992)] 참조.
실시예 1
내강 엑소솜 페이로드를 로딩하기에
충분한 최소 단백질 서열의 확인
위에 나타낸 바와 같이 로딩을 용이하게 하는 12개의 아미노산 절단과 로딩을 용이하게 하는데 실패한 6개의 아미노산 절단 사이의 최소 BASP1 아미노산 서열을 확인하기 위해, FLAG® 태그 및 GFP에 융합된 BASP1의 N-말단의 개별 절단 돌연변이체를 생성하고, HEK293SF 세포에서 안정적으로 발현시켰다(도 1a). 위에 기재된 바와 같이 안정한 세포 배양물로부터 엑소솜을 정제하였다. 7개 내지 12개의 아미노산의 BASP1 서열은 엑소솜에서 고밀도로 GFP를 로딩할 수 있는 반면, 처음 6개의 아미노산은 그렇지 않았다(도 1b). 이러한 데이터는 6번 위치 이후에 적어도 하나의 라이신 잔기가 BASP1의 N-말단을 갖는 엑소솜의 내강 로딩에, 즉, 엑소솜의 내강 표면에 부착하기 위해 필요하다는 것을 보여준다.
BASP1의 6번 위치의 세린은 종과 MARCKS 및 MARCKSL1에 걸쳐 고도로 보존된다. 이 아미노산이 엑소솜으로의 페이로드 로딩에 필요한지 여부를 결정하기 위해, HEK293SF 세포를 점 돌연변이체를 포함하는 BASP1 1-30-FLAG® GFP 또는 BASP1 1-30-FLAG® GFP를 암호화하는 발현 플라스미드로 안정적으로 형질감염시키고, 6번 위치의 세린을 아스파르트산(S6D; 극성 하전 치환) 또는 알라닌(S6A; 작은 비극성 치환)으로 대체하였다. 또한, 5번 위치의 라이신을 여러 막-관련 단백질의 미리스토일화, 팔미토일화 및 기타 막 기능을 조절하는데 있어서 이 위치의 잠재적 역할을 테스트하기 위해 글루탐산(L5Q)으로 돌연변이시켰다(문헌[Gottlieb-Abraham et al., Mol. Biol. Cell. 2016 Dec 1;27(24):3926-3936])(도 2a). BASP1 S6D는 GFP의 엑소솜으로의 로딩을 완전히 폐기(abrogate)한 반면, S6A은 로딩을 변경하지 않았다. BASP1 L5Q는 내강 로딩에도 영향을 미치지 않았으며, 이는 6번 위치의 음전하가 로딩을 방해하는 반면, 5번 위치의 극성 아미노산 치환은 잘 견딤을 나타낸다(도 2b).
BASP1의 처음 30개의 아미노산은 위에서 확인된 N-말단 리더 서열에 이어서 라이신-풍부한 아미노산 스트레치를 포함한다. MARCKS 및 MARCKSL1 N-말단이 BASP1과 유사하게 엑소솜을 로딩할 수 있는지 여부를 이해하기 위하여, HEK293SF 세포를 MARCKS 및 MARCKSL1 전장 단백질 또는 FLAG® GFP에 융합된 아미노산 1-30으로 안정적으로 형질감염시켰다. 로딩의 정도를 결정하기 위해, 정제된 엑소솜을 SDS PAGE 및 COOMASSIE® 염색에 의해 분석하였다. 전장 MARCKS 및 MARCKSL1은 GFP를 갖는 엑소솜을 로딩할 수 있었지만, 아미노산 1-30은 전장 단백질보다 못하여 로딩에 필요한 MARCKS 및 MARCKSL1 단백질의 원위 영역에 추가적인 구조적 또는 서열 특징이 있음을 시사한다(도 3). MARCKS 및 MARCKSL1의 서열 분석은 BASP1의 N-말단에 잠재적인 서열 상동성을 갖는 영역을 나타내었다.
MARCKS의 아미노산 152-173 및 MARCKSL1의 87-110은 개재된 페닐알라닌 및 세린 잔기로 라이신-풍부하고, 인산화 부위 도메인(PSD) 또는 효과기 도메인(ED)일 것으로 예측된다(도 4). HEK293SF 세포를 MARCKS의 아미노산 1-3을 PSD 도메인(MG-PSD)에 융합시키는 플라스미드 작제물로 안정적으로 형질감염시켰다. 엑소솜을 로딩하는데 있어서 이들 잔기의 역할을 결정하기 위해, 개별 점 돌연변이를 예측된 미리스토일화 부위(MA-PSD) 및 6번 위치(K6S 및 K6A)에 생성하였다(도 5a). 정제된 엑소솜의 웨스턴 블로팅은 BASP1 1-30의 양성대조군과 비교하여, MG-PSD나 MA-PSD 모두 엑소솜을 효율적으로 로딩할 수 없었음을 보여주었다. 흥미롭게도, K6A 및 K6S 돌연변이는 로딩의 개선을 가져왔으며, 이는 6번 위치의 양전하가 엑소솜 페이로드의 로딩을 방지하고 및 MARCKS의 PSD가 내인성 N-말단 서열을 기능적으로 보완할 수 있음을 시사한다(도 5b). 종합하면, 이들 연구는 페이로드를 엑소솜으로 로딩하기에 충분한 여러 모티프의 확인을 가능하게 하였다(도 6).
가장 좁은 모티프인 모티프 1은 (M)(G)(G/A/S)(K/Q)(L/F/S/Q)(S/A)(K)(K)(서열번호 118) 또는 첫 번째 Met이 없는 (G)(G/A/S)(K/Q)(L/F/S/Q)(S/A)(K)(K)(서열번호 202)의 단백질 서열을 허용하며, 여기서 각각의 괄호 문자 또는 문자 그룹은 아미노산 위치이되, 추가적으로 5번 위치는 양으로 하전된 아미노산(K/R/H)이 될 수 없고, 6번 위치는 음으로 하전된 아미노산(D/E)이 될 수 없다.
모티프 1의 하위-모티프는 제한 없이 다음의 단백질 서열:
(M)(G)(G)(K/Q)(L/F/S/Q)(S/A)(K)(K) (서열번호 180),
(G)(G)(K/Q)(L/F/S/Q)(S/A)(K)(K) (서열번호 191),
(M)(G)(A)(K/Q)(L/F/S/Q)(S/A)(K)(K) (서열번호 181),
(G)(A)(K/Q)(L/F/S/Q)(S/A)(K)(K) (서열번호 192),
(M)(G)(S)(K/Q)(L/F/S/Q)(S/A)(K)(K) (서열번호 182),
(G)(S)(K/Q)(L/F/S/Q)(S/A)(K)(K) (서열번호 193),
(M)(G)(G/A/S)(K)(L/F/S/Q)(S/A)(K)(K) (서열번호 183),
(G)(G/A/S)(K)(L/F/S/Q)(S/A)(K)(K) (서열번호 194),
(M)(G)(G/A/S)(Q)(L/F/S/Q)(S/A)(K)(K) (서열번호 184),
(G)(G/A/S)(Q)(L/F/S/Q)(S/A)(K)(K) (서열번호 195),
(M)(G)(G/A/S)(K/Q)(L)(S/A)(K)(K) (서열번호 185),
(G)(G/A/S)(K/Q)(L)(S/A)(K)(K) (서열번호 196),
(M)(G)(G/A/S)(K/Q)(F)(S/A)(K)(K) (서열번호 186),
(G)(G/A/S)(K/Q)(F)(S/A)(K)(K) (서열번호 197),
(M)(G)(G/A/S)(K/Q)(S)(S/A)(K)(K) (서열번호 187),
(G)(G/A/S)(K/Q)(S)(S/A)(K)(K) (서열번호 198),
(M)(G)(G/A/S)(K/Q)(Q)(S/A)(K)(K) (서열번호 188),
(G)(G/A/S)(K/Q)(Q)(S/A)(K)(K) (서열번호 199),
(M)(G)(G/A/S)(K/Q)(L/F/S/Q)(S)(K)(K) (서열번호 189),
(G)(G/A/S)(K/Q)(L/F/S/Q)(S)(K)(K) (서열번호 200),
(M)(G)(G/A/S)(K/Q)(L/F/S/Q)(A)(K)(K) (서열번호 190), 및
(G)(G/A/S)(K/Q)(L/F/S/Q)(A)(K)(K) (서열번호 201)
을 포함하며, 여기서 5번 위치는 양으로 하전된 아미노산(K/R/H)이 될 수 없고, 6번 위치는 음으로 하전된 아미노산(D/E)이 될 수 없다.
더 넓은 모티프인 모티프 2는 (M)(G)(π)(ξ)(Φ/π)(S/A/G/N)(+)(+) 또는 첫 번째 Met이 없는 (G)(π)(ξ)(Φ/π)(S/A/G/N)(+)(+)로 발현될 수 있되, 각 괄호의 위치는 아미노산을 나타내고, π는 (Pro, Gly, Ala, Ser)로 이루어진 군으로부터 선택되는 임의의 아미노산이며, ξ는 (Asn, Gln, Ser, Thr, Asp, Glu, Lys, His, Arg)로 이루어진 군으로부터 선택되는 임의의 아미노산이고, Φ는 (Val, Ile, Leu, Phe, Trp, Tyr, Met)로 이루어진 군으로부터 선택되는 임의의 아미노산이며, (+)는 (Lys, Arg, His)로 이루어진 군으로부터 선택되는 임의의 아미노산이고; 5번 위치는 (+)가 아니며, 6번 위치는 (+)도 (Asp 또는 Glu)도 아니다. 아미노산의 명명법에 대해 문헌[R. Aasland et al., FEBS Letters 513 (2002): 141-144] 참조.
가장 넓은 모티프인 모티프 3은 (M)(G)(π)(X)(Φ/π)(π)(+)(+) 또는 첫 번째 Met이 없는 (G)(π)(X)(Φ/π)(π)(+)(+)으로 발현될 수 있되, 각 괄호의 위치는 아미노산을 나타내고, π는 (Pro, Gly, Ala, Ser)로 이루어진 군으로부터 선택되는 임의의 아미노산이며, X는 임의의 아미노산이고, Φ는 (Val, Ile, Leu, Phe, Trp, Tyr, Met)로 이루어진 군으로부터 선택되는 임의의 아미노산이며, (+)는 (Lys, Arg, His)로 이루어진 군으로부터 선택되는 임의의 아미노산이고; 5번 위치는 (+)가 아니며, 6번 위치는 (+)도 (Asp 또는 Glu)도 아니다. 모티프 1 내지 3의 모든 경우에, 서열은 하나의 아미노산으로 절단되어 총 7개의 아미노산 길이가 될 수 있다(즉, 모티프 1 내지 3에 제시된 순서대로 아미노산 1-7로 구성됨). 임의의 모티프 1, 2 또는 3(또는 아미노산 7이 결여되어 있는 이러한 모티프)으로부터 유래된 임의의 서열을 사용하여 전장 BASP1 또는 BASP1의 천연 절단 서열과 동일하거나 또는 이에 필적할 정도로 페이로드를 엑소솜으로 로딩할 수 있다. 아미노산 서열-구조-기능의 이러한 심층 분석은 생물학적으로 발현된 페이로드를 생산자 세포에 의해 엑소솜으로 유도하기 위한 요구 사항에 대한 새로운 통찰력을 제공한다.
실시예 2
BASP1의 N-말단은 다양한 종류의
단백질을 로딩하기에 충분하다
실시예 1의 결과는 BASP1의 N-말단이 생산자 세포로부터 직접 내강으로 로딩된 엑소솜을 생성하기 위한 유용한 공학적 스캐폴드일 수 있음을 시사한다. 이 가설을 테스트하기 위해, 안정한 HEK293SF 세포를 생성하여, BASP1의 아미노산 1-30 또는 1-10에 융합된 코돈 최적화로 전장 Cas9 단백질을 발현하였다(문헌[Zetsche B, Volz SE, Zhang F. A split-Cas9 architecture for inducible genome editing and transcription modulation. Nat Biotechnol. 2015 Feb;33(2):139-42]에 기재된 바와 같음). 엑소솜을 위에 기재된 바와 같은 세포 배양물로부터 정제하고, 항-Cas9 항체(압캠(Abcam); 카타로그 번호 ab191468, 클론 7A9-3A3)를 사용하여 SDS-PAGE 및 웨스턴 블로팅에 의해 분석하였다. 도 7a에 나타낸 바와 같이, BASP1 1-30 및 1-10 둘 다 엑소솜에 Cas9를 로딩하기에 충분하였다. 재조합 Cas9 단백질을 웨스턴 블로팅에 대한 양성 대조군으로 사용하였다. 웨스턴 블로팅 실험으로부터 얻은 다양한 양의 재조합 Cas9 및 BASP1-Cas9 엑소솜 레인의 밀도측정 정량화 및 비교는 엑소솜당 4개 내지 5개의 Cas9 분자로 로딩되었음을 나타내었다(도 7b). 질량이 약 160kDa인 이 Cas9 효소는 위에 나타낸 GFP 실험과 비교하여 페이로드 크기가 현저하게 증가하였다.
BASP1의 N-말단에 대한 융합으로 로딩될 수 있는 페이로드 단백질의 다양성에 대한 추가적인 검증으로서, 오브알부민을 BASP1의 아미노산 1-10에 융합하여("BASP1(1-10)-OVA") HEK293SF 세포에서 안정적으로 발현시켰다. 별도의 세포주를 동일한 플라스미드 및 제2 선별 마커를 사용하여 엑소솜-특이적 표면 당단백질 PTGFRN("3xCD40L-PTGFRN")에 융합된 삼량체 CD40L을 암호화하는 제2 플라스미드로 공동-형질감염시켰다. 엑소솜을 두 형질감염된 세포 배양물로부터 정제하고, SDS-PAGE(도 8a) 및 항-오브알부민 웨스턴 블로팅(압캠; 카타로그 번호 ab17293, 클론 6C8)(도 8b)에 의해 분석하였다. 대조군으로서, 재조합 오브알부민(인비보젠(InvivoGen); 카타로그 번호 vac-pova)을 별도의 겔에서 적정하였다. 오브알부민은 단일 작제물로서 BASP1의 아미노산 1-10에 융합될 때 또는 추가적인 과발현 플라스미드(3xCD40L-PTGFRN)와 조합될 때 엑소솜에 강력하게 로딩되었다. 이 결과는 엑소솜이 내강 페이로드 및 별개의 전사체로부터의 동시 표면 페이로드(예를 들어, PTGFRN) 둘 다를 사용하여 결합에 관하여 조작될 수 있음을 보여준다.
치료적 엑소솜의 맥락에서 유용할 수 있는 다른 클래스의 단백질은 항체 및 항체 단편이다. 단일 사슬 낙타과 나노바디 표적화 GFP(문헌[Caussinus E, Kanca O, Affolter M. Fluorescent fusion protein knockout mediated by anti-GFP nanobody. Nat Struct Mol Biol. 2011 Dec 11;19(1):117-21]에 기재된 바와 같음)를 BASP1의 아미노산 1-10 및 FLAG® 태그("BASP1(1-10)-나노바디") 또는 FLAG® 태그 단독("나노바디")에 대한 융합 단백질로서 HEK293SF 세포에서 안정적으로 발현시켰다(도 9a). 정제된 엑소솜을 SDS-PAGE 및 항-FLAG® 웨스턴 블로팅에 의해 분석하였으며, 이는 나노바디가 BASP1의 N-말단에 융합되었을 때 동일한 양의 총 로딩된 단백질을 갖는 나노바디의 실질적인 농축을 보여준다(도 9b). 이러한 결과는 다양한 클래스의 단백질 페이로드가 발현되고, BASP1의 N-말단으로부터 유래된 매우 짧은 단백질 서열, 즉, 스캐폴드를 사용하여 생산자 세포에 의해 엑소솜으로 패키징될 수 있음을 보여준다.
실시예 3
BASP1의 N-말단은 엑소솜의 내강에
핵산을 로딩하는데 사용될 수 있다
핵산 및 특히 RNA(예를 들어, mRNA, siRNA, miRNA)는 치료적 엑소솜의 내강에 로딩되는 치료적 페이로드의 매력적인 클래스이다. RNA의 엑소솜 로딩은 세포외 환경에서의 분해로부터 RNA를 보호할 수 있고, 로딩된 엑소솜은 추가적인 수준의 엑소솜 공학, 예를 들어, 표적화 작제물의 표면 발현을 통해 소정의 세포 및/또는 조직으로 지시될 수 있다. 위에서 확인된 EV, 예를 들어, 엑소솜 단백질(또는 단백질 단편)이 mRNA-로딩된 엑소솜을 생성하는데 사용될 수 있는지 이해하기 위하여, 조합된 조작된 엑소솜을 생성하였다. 도 10에 나타낸 바와 같이, BASP1의 아미노산 1-30은 FLAG®과 파지 단백질 MCP의 변이체에 대한 융합으로 발현되었다. MCP는 mRNA 및 다른 RNA에 대한 전사 융합으로 발현될 수 있는 MS2라 불리는 mRNA 스템 루프를 인식하고 이에 결합하여, MCP 융합 단백질과 관심 있는 MS2 융합 RNA 사이의 물리적 결합을 유도한다. 돌연변이 분석은 이전에 MCP에서 MS2에 대한 치환성을 증가시키는 2개의 위치를 확인하였다; 위치 29번 위치에서 발린에서 아이소류신으로의 치환(V29I; 문헌[Lim & Peabody, RNA. Nucleic Acids Res. 1994 Sep 11;22(18):3748-52]) 및 위치 55번 위치에서 아스파라긴에서 라이신으로의 치환(N55K; 문헌[Lim et al., J Biol Chem. 1994 Mar 25;269(12):9006-10]). BASP1 1-30을 단량체 또는 이량체 MCP 변이체에 융합하였으며, 여기서 각각의 MCP는 V29I 또는 이중 돌연변이된 V29I/N55K였다. 루시퍼레이스 리포터 작제물은 별도의 플라스미드로부터의 3개의 MS2 스템 루프에 대한 융합으로 발현되었다. 루시퍼레이스-MS2 단독(#811) 또는 각각의 BASP1-MCP 변이체(#815, 817, 819 또는 821)와 조합하여 5개의 안정한 HEK293SF 세포주를 생성하였다(도 10). 추가적인 대조군으로서, HEK293SF 세포를 FLAG-태그된 BASP1 1-27로 안정적으로 형질감염시켰다. 엑소솜을 단리하고, BENZONASE®로 처리하여 임의의 외부-관련 mRNA를 제거하고, 위의 방법에 따라 정제하였다. 정제된 엑소솜을 SDS-PAGE(도 11a) 및 항-FLAG® 웨스턴 블로팅(도 11b)에 의해 분석하였으며, 이는 각 엑소솜 제제에서 동일한 양의 총 단백질 및 유사한 수준의 BASP1-FLAG® 융합을 보여준다. 중요하게는, BASP1-MCP 융합이 MCP 단백질이 결여되어 있는 BASP1 1-27 FLAG 융합과 유사한 수준으로 발현되었으며, 이는 MCP 단량체 또는 이량체의 첨가가 엑소솜에서 BASP1-매개성 단백질의 로딩을 방해하지 않음을 보여준다.
BASP1-MCP 및 루시퍼레이스-MS2 mRNA를 안정적으로 발현하는 세포를 단리하고, 총 루시퍼레이스 mRNA를 RT-qPCR(FWD 프라이머: 5'-TGGAGGTGCTCAAAGAGTTG-3'(서열번호 119); REV 프라이머: 5'-TTGGGCGTGCACTTGAT-3'(서열번호 120); PROBE: 5'-/56-FAM/CAGCTTTCC/ZEN/GGGCATTGGCTTC/3IABkFQ/-3'(서열번호 121))에 의해 정량화하였다. 형질감염되지 않은 세포는 유사한 수준의 루시퍼레이스를 발현하는 모든 811-발현 세포보다 낮은 수준의 루시퍼레이스를 발현하였다(도 12a, 상단). 각각의 안정한 세포주로부터의 정제된 엑소솜을 또한 RT-qPCR에 의해 분석하였다. 천연 엑소솜은 루시퍼레이스 MS2의 수준이 검출되지 않은 반면, 811만을 발현하는 세포는 검출 가능하지만 루시퍼레이스 MS2의 수준이 매우 낮았다. 중요하게는, 각각의 BASP1-MCP 융합 단백질은 더 많은 양의 루시퍼레이스-MS2 mRNA를 함유하였으며, 이는 mRNA의 엑소솜으로의 로딩을 용이하게 하는 MCP와 MS2 사이의 결합의 중요성을 보여준다(도 12a, 하단). 그룹 간의 상대적 mRNA의 정량화는 811 단독에 비해 모든 BASP1-MCP 융합에 대해 약 30 내지 60-배의 농축을 보여주었다(도 12b). 이량체 MCP V29I/N55K를 포함하는 BASP1-MCP 작제물 821은 MS2 mRNA에 대해 가장 큰 친화성을 가질 것으로 예상되며, 실제로 이 실험에서 가장 많은 양의 루시퍼레이스-MS2를 포함하였다. 이러한 결과는 BASP1 단편이 핵산을 포함한 다양한 페이로드를 갖는 엑소솜의 내강을 로딩하기 위한 강력하고 다양한 스캐폴드 단백질임을 보여준다.
실시예 4
BASP1, MARCKS 및 MARCKSL1은 표면-장식된
엑소솜을 생성하기 위해 사용될 수 있다
이전 실험에서의 결과는 MARCKS, MARCKSL1 및 BASP1의 전체 길이 및 N-말단 영역을 사용하여 내강으로 로딩된 엑소솜을 생성할 수 있음을 보여준다. 엑소솜 공학에 대한 이들 단백질의 잠재력을 추가로 탐구하기 위해, MARCKS, MARCKSL1 및 BASP1의 아미노산 1-30 또는 BASP1의 아미노산 1-10을 동종 삼량체로 발현된 CD40L의 내인성 막관통 영역에 융합시켰다. 리간드가 다른 종의 동족 수용체와 교차 반응하지 않기 때문에 CD40L의 인간 및 마우스 서열 모두에 대해 작제물을 제조하였다(도 13). 엑소솜을 CD40L 발현 작제물 중 하나로 안정적으로 형질감염된 HEK293SF 세포로부터 정제하고, 마우스 또는 인간 B 세포에서 인큐베이션하였다. 엑소솜에 대한 투입 CD40L의 양을 CD40L ELISA(인간 CD40L의 측정을 위해, 알앤디 시스템즈(R&D Systems), 카타로그 번호 DCDL40, Lot # P168248; 및 마우스 CD40L의 측정을 위해, 압캠, 카타로그 번호 ab119517, Lot # GR3218850-2를 사용함)에 의해 정량화하고, B 세포를 B-세포 마커를 사용하여 정량화하고, CD19 및 B 세포 활성화를 CD69에 양성인 게이트 세포의 백분율로 측정하였다. 종-매칭된 배양물에서 마우스(도 14a) 또는 인간(도 14b) 엑소솜 CD40L의 용량 적정 곡선은 입자-대-입자 기준(왼쪽 그래프 및 아래의 표) 또는 서로 비교하였을 때 작제물과 CD40L 몰 기준으로 동일한 양의 재조합 단백질(오른쪽 그래프 및 아래의 표) 간에 유사한 활성을 나타내었다. CD40L 작제물이 단량체로 발현되었을 때 유사한 활성이 관찰되었을 뿐만 아니라, 고-밀도 엑소솜 디스플레이 스캐폴드인 PTGFRN의 N-말단에서 발현된 삼량체 CD40L보다 약간 덜 강력하였다(예를 들어, 국제 특허 PCT/US2018/048026 참조)(도 14c). 이러한 결과는 MARCKS, MARCKSL1 및 BASP1이 인간 및 동물 응용 분야에서 사용하기 위한 다양한 클래스의 조작된 엑소솜의 생성에 유용한 다양하고 강력한 스캐폴드임을 보여준다.
실시예 5
다양한 세포 유형이
BASP1, MARCKS 및/또는 MARCKSL1을 발현한다
기원이 상이한 조직으로부터의 세포주(HEK293, 신장; HT1080, 결합 조직; K562, 골수; MDA-MB-231, 유방; Raji, 림프모세포)를 대수기까지 성장시키고, 화학적으로-정의된 배지에서 성장시킨 HEK293 세포를 제외하고 약 6일 동안 엑소솜-고갈 혈청이 보충된 배지로 옮겼다. 골수-유래 중간엽 줄기 세포(MSC)를 3D 미립담체(microcarrier)에서 5일 동안 성장시키고, 무혈청 배지에서 3일 동안 보충하였다. 각 세포주 배양물로부터의 상청액을 단리하고, 엑소솜을 위에 기재된 OPTIPREP™ 밀도-구배 초원심분리 방법을 사용하여 정제하였다. 정제된 엑소솜 제제 각각을 위에 기재된 바와 같이 LC-MS/MS에 의해 분석하고, BASP1, MARCKS 및 MARCKSL1, 2개의 널리 연구된 EV, 예를 들어, 엑소솜 단백질(CD81 및 CD9)에 대한 펩타이드 스펙트럼 매치(PSM)의 수를 정량화하였다. 테트라스패닌 CD81 및 CD9는 대부분의 정제된 엑소솜 집단에서 검출할 수 있었지만, 일부 경우에 내강 EV, 예를 들어, 엑소솜, 단백질과 같거나 더 낮았다(예를 들어, CD9를 BASP1 또는 MARCKSL1과 비교)(도 15). 이러한 발견은 새로 확인된 내강 엑소솜 마커가 상이한 조직으로부터 유래된 여러 관련이 없는 세포주로부터 조작된 엑소솜을 생성하는데 적합한 융합 단백질일 수 있음을 나타낸다.
실시예 6
BASP1을 과발현하는 비-인간 세포는
내강 조작된 엑소솜을 생산한다
실시예 5에서의 결과는 수많은 인간-유래 세포가 BASP1 및 다른 신규한 EV를 자연적으로 발현함을 보여준다. BASP1가 보편적인 엑소솜 스캐폴드 단백질로 사용될 수 있는지 여부를 결정하기 위하여, 차이니스 햄스터 난소(CHO) 세포를 FLAG® 태그 및 GFP에 융합된 전장 BASP1을 발현하는 플라스미드("BASP1-GFP-FLAG"), FLAG® 태그 및 GFP에 융합된 BASP1의 아미노산 1-30을 발현하는 플라스미드("BASP1(1-30)-GFP-FLAG") 또는 FLAG® 태그 및 GFP에 융합된 BASP1의 아미노산 1-8을 발현하는 플라스미드("BASP1(1-8)-GFP-FLAG")로 안정적으로 형질감염시켰다. 엑소솜을 이들 BASP1 플라스미드 중 하나로 형질감염된 야생형 CHO 세포 및 CHO 세포로부터 정제하였다. 도 16a 내지 도 16b에 나타낸 바와 같이, BASP1 및 BASP1 단편 융합 단백질은 CHO 세포에서 성공적으로 과발현되고, 무염색 PAGE(도 16a) 및 FLAG®에 대한 항체를 사용한 웨스턴 블로팅에 의해 검출된 바와 같이 엑소솜에 로딩되었다(도 16b). 이러한 결과는 CHO 세포와 같은 비-인간 세포가 인간 BASP1 단편을 과발현하는 엑소솜을 생산할 수 있으며, 이 과발현이 페이로드 단백질을 고밀도로 엑소솜의 내강에 유도할 수 있음을 보여준다. 이러한 결과는 BASP1이 많은 상이한 세포 유형 및 종으로부터 조작된 엑소솜을 생성하기 위한 보편적인 스캐폴드 단백질임을 나타낸다.
***
상세한 설명 부문은 청구항을 해석하는데 사용되는 것으로 의도되지만 개요 및 요약 부문은 그렇지 않은 것으로 이해된다. 개요 및 요약 부문은 발명자(들)에 의해 상정되는 바와 같이 본 개시내용의 하나 이상의 그러나 모두는 아닌 예시적인 실시형태를 제시할 수 있으므로, 본 개시내용 및 첨부된 청구범위를 어떠한 식으로도 제한하려는 의도는 아니다.
본 개시내용은 특정 기능 및 이들 관계의 실행을 설명하는 기능적 빌딩 블록의 보조로 앞서 설명되었다. 이러한 기능적 빌딩 블록의 경계는 설명의 편의를 위해 본 명세서에서 임의적으로 정의되었다. 대안적인 경계는 특정 기능 및 이들 관계가 적절하게 수행되기만 하면 정의될 수 있다.
참조에 의한 원용
본 출원에서 인용된 모든 간행물, 특허, 특허 출원 및 다른 문헌은 각각의 개별 간행물, 특허, 특허 출원 또는 다른 문헌이 모든 목적을 위해 참조에 의해 원용되는 것으로 개별적으로 표시된다면 동일한 정도까지 모든 목적을 위해 그 전체가 참조에 의해 본 명세서에 원용된다.
균등물
본 개시내용은 특히, EV, 예를 들어, 엑소솜에서 외인성 단백질의 농축에 사용하기 위한 변형된 외인성 단백질 및 펩타이드를 함유하는 EV, 예를 들어, 엑소솜의 조성물을 제공한다. 본 개시내용은 또한 풍부한 EV, 예를 들어, 엑소솜을 생산하는 방법을 제공한다. 다양한 특정 실시형태가 예시되고 기재되어 있지만, 상기 명세서는 제한하는 것이 아니다. 본 개시내용의 범위 및 범주는 임의의 상기-기재된 예시적인 실시형태에 의해 제한되어서는 안되지만, 하기의 청구범위 및 이의 동등물에 따라서만 정의되어야 한다. 본 개시내용(들)의 사상 및 범주로부터 벗어나지 않고 다양한 변경이 이루어질 수 있음이 이해될 것이다. 본 명세서의 검토시에 많은 변경이 당업자들에게 명백해질 것이다.
본 출원은 2018년 11월 16일자로 출원된 국제 출원 PCT/US2018/061679 및 2019년 4월 17일자로 출원된 미국 가출원 제62/835,430호의 우선권을 주장하며, 이들은 그 전문이 참조에 의해 본 명세서에 원용된다.
SEQUENCE LISTING <110> CODIAK BIOSCIENCES <120> ENGINEERED EXTRACELLULAR VESICLES AND USES THEREOF <130> WO 2020/101740 <140> PCT/US2018/061679 <141> 2018-11-16 <150> US 62/835,430 <151> 2019-04-17 <160> 425 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 332 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MARCKS protein <400> 1 Met Gly Ala Gln Phe Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala 1 5 10 15 Glu Arg Pro Gly Glu Ala Ala Val Ala Ser Ser Pro Ser Lys Ala Asn 20 25 30 Gly Gln Glu Asn Gly His Val Lys Val Asn Gly Asp Ala Ser Pro Ala 35 40 45 Ala Ala Glu Ser Gly Ala Lys Glu Glu Leu Gln Ala Asn Gly Ser Ala 50 55 60 Pro Ala Ala Asp Lys Glu Glu Pro Ala Ala Ala Gly Ser Gly Ala Ala 65 70 75 80 Ser Pro Ser Ala Ala Glu Lys Gly Glu Pro Ala Ala Ala Ala Ala Pro 85 90 95 Glu Ala Gly Ala Ser Pro Val Glu Lys Glu Ala Pro Ala Glu Gly Glu 100 105 110 Ala Ala Glu Pro Gly Ser Pro Thr Ala Ala Glu Gly Glu Ala Ala Ser 115 120 125 Ala Ala Ser Ser Thr Ser Ser Pro Lys Ala Glu Asp Gly Ala Thr Pro 130 135 140 Ser 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PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> scaffold protein <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa = G, A, S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa = L, F, S, Q <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa = S, A <400> 195 Gly Xaa Gln Xaa Xaa Lys Lys 1 5 <210> 196 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> scaffold protein <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa= G, A, S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa= K, Q <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa= S, A <400> 196 Gly Xaa Xaa Leu Xaa Lys Lys 1 5 <210> 197 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> scaffold protein <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa = G, A, S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa = K, Q <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa = S, A <400> 197 Gly Xaa Xaa Phe Xaa Lys Lys 1 5 <210> 198 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> scaffold protein <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa = G, A, S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa = K, Q <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa = S, A <400> 198 Gly Xaa Xaa Ser Xaa Lys Lys 1 5 <210> 199 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> scaffold protein <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa = G, A, S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa = K, Q <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa = S, A <400> 199 Gly Xaa Xaa Gln Xaa Lys Lys 1 5 <210> 200 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> scaffold protein <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa = G, A, S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa = K, Q <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa = L, F, S, Q <400> 200 Gly Xaa Xaa Xaa Ser Lys Lys 1 5 <210> 201 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> scaffold protein <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa = G, A, S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa = K, Q <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa = L, F, S, Q <400> 201 Gly Xaa Xaa Xaa Ala Lys Lys 1 5 <210> 202 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> scaffold protein <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa = G, A, S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa = K, Q <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa = L, F, S, Q <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa = S, A <400> 202 Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Lys Lys 1 5 <210> 203 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N-terminus domain <400> 203 Gly Gly Lys Leu Ser Lys 1 5 <210> 204 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N-terminus domain <400> 204 Gly Ala Lys Leu Ser Lys 1 5 <210> 205 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N-terminus domain <400> 205 Gly Gly Lys Gln Ser Lys 1 5 <210> 206 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N-terminus domain <400> 206 Gly Gly Lys Leu Ala Lys 1 5 <210> 207 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence 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fusion protein <400> 385 Gly Gly Lys Gln Ala Lys 1 5 <210> 386 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fusion protein <400> 386 Gly Gly Gln Leu Ser Lys 1 5 <210> 387 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fusion protein <400> 387 Gly Gly Gln Leu Ala Lys 1 5 <210> 388 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fusion protein <400> 388 Gly Gly Gln Phe Ser Lys 1 5 <210> 389 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fusion protein <400> 389 Gly Gly Gln Phe Ala Lys 1 5 <210> 390 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fusion protein <400> 390 Gly Gly Gln Ser Ser Lys 1 5 <210> 391 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fusion protein <400> 391 Gly Gly Gln Ser Ala Lys 1 5 <210> 392 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fusion protein <400> 392 Gly Gly Gln Gln Ser Lys 1 5 <210> 393 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fusion protein <400> 393 Gly Gly Gln Gln Ala Lys 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Gly Ser Lys Leu Ala Lys 1 5 <210> 411 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fusion protein <400> 411 Gly Ser Lys Phe Ser Lys 1 5 <210> 412 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fusion protein <400> 412 Gly Ser Lys Phe Ala Lys 1 5 <210> 413 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fusion protein <400> 413 Gly Ser Lys Ser Ser Lys 1 5 <210> 414 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fusion protein <400> 414 Gly Ser Lys Ser Ala Lys 1 5 <210> 415 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fusion protein <400> 415 Gly Ser Lys Gln Ser Lys 1 5 <210> 416 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fusion protein <400> 416 Gly Ser Lys Gln Ala Lys 1 5 <210> 417 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fusion protein <400> 417 Gly Ser Gln Leu Ser Lys 1 5 <210> 418 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fusion protein <400> 418 Gly Ser Gln Leu Ala Lys 1 5 <210> 419 <211> 6 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Claims (82)

  1. 스캐폴드 단백질에 연결된 생물학적으로 활성인 분자를 포함하는 단리된 세포외 소포체(extracellular vesicle: EV)로서, 상기 스캐폴드 단백질은 N-말단 도메인(ND) 및 효과기 도메인(ED)을 포함하되, 상기 ND는 EV의 내강 표면과 관련되고, 상기 ED는 이온 상호작용에 의해 EV의 내강 표면과 관련되며, 상기 ED는적어도 2개의 인접한 라이신(Lys)을 순서대로 포함하는, EV.
  2. 제1항에 있어서, 상기 ND는 미리스토일화를 통해 EV의 내강 표면과 관련되는, EV.
  3. 제2항에 있어서, 상기 ND는 N-말단에 Gly를 갖는, EV.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ED는 적어도 3개의 Lys, 적어도 4개의 Lys, 적어도 5개의 Lys, 적어도 6개의 Lys 또는 적어도 7개의 Lys를 포함하는, EV.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ED는 펩타이드 결합에 의해 상기 ND에 연결되는, EV.
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서, 상기 ED는 (Lys)n을 포함하되, n은 1 내지 10의 정수인, EV.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ED는 KK, KKK, KKKK(서열번호 151), KKKKK(서열번호 152) 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, EV.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ND는 G:X2:X3:X4:X5:X6으로 제시되는 아미노산 서열을 포함하되, G는 Gly로 표시되는 글리신이고; ":"는 펩타이드 결합을 나타내며, 상기 X2 내지 X6 각각은 독립적으로 아미노산이고; 상기 X6은 염기성 아미노산을 포함하는, EV.
  9. 제8항에 있어서, 상기 X6은 Lys, Arg 및 His로 이루어진 군으로부터 선택되는, EV.
  10. 스캐폴드 단백질에 연결된 생물학적으로 활성인 분자를 포함하는 단리된 세포외 소포체(EV)로서, 상기 스캐폴드 단백질은 N-말단 도메인(ND) 및 효과기 도메인(ED)을 포함하되, 상기 ND는 G:X2:X3:X4:X5:X6으로 제시되는 아미노산 서열을 포함하고, G는 Gly로 표시되는 글리신이고; ":"는 펩타이드 결합을 나타내며, 상기 X2 내지 X6 각각은 독립적으로 아미노산이고; 상기 X6은 염기성 아미노산을 포함하며, 상기 ED는 펩타이드 결합에 의해 X6에 연결되고, ED의 N-말단에 적어도 하나의 라이신을 포함하는, EV.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ED는 바이러스의 막관통 도메인 또는 세포질 도메인을 포함하지 않는, EV.
  12. 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 X2는 Pro, Gly, Ala 및 Ser로 이루어진 군으로부터 선택되는, EV.
  13. 제8항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 X4는 Pro, Gly, Ala, Ser, Val, Ile, Leu, Phe, Trp, Tyr, Gln 및 Met로 이루어진 군으로부터 선택되는, EV.
  14. 제8항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 X5는 Pro, Gly, Ala 및 Ser로 이루어진 군으로부터 선택되는, EV.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 스캐폴드 단백질의 ND는 G:X2:X3:X4:X5:X6의 아미노산 서열을 포함하되,
    (i) G는 Gly를 나타내고;
    (ii) ":"는 펩타이드 결합을 나타내며;
    (iii) 상기 X2는 Pro, Gly, Ala 및 Ser로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고;
    (iv) 상기 X3은 아미노산이며;
    (v) 상기 X4는 Pro, Gly, Ala, Ser, Val, Ile, Leu, Phe, Trp, Tyr, Gln 및 Met로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고;
    (vi) 상기 X5는 Pro, Gly, Ala 및 Ser로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이며; 그리고
    (vii) 상기 X6은 Lys, Arg 및 His로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산인, EV.
  16. 제8항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 X3은 Asn, Gln, Ser, Thr, Asp, Glu, Lys, His 및 Arg로 이루어진 군으로부터 선택되는, EV.
  17. 제1항 내지 제9항 및 제11항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ND 및 ED는 링커에 의해 연결되는, EV.
  18. 제17항에 있어서, 상기 링커는 펩타이드 결합 또는 하나 이상의 아미노산을 포함하는, EV.
  19. 스캐폴드 단백질에 연결된 생물학적으로 활성인 분자를 포함하는 단리된 세포외 소포체(EV)로서, 상기 스캐폴드 단백질은 ND―ED를 포함하되,
    a. ND는 G:X2:X3:X4:X5:X6을 포함하고;
    i. G는 Gly를 나타내고;
    ii. ":"는 펩타이드 결합을 나타내며;
    iii. 상기 X2는 Pro, Gly, Ala 및 Ser로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고;
    iv. 상기 X3은 아미노산이며;
    v. 상기 X4는 Pro, Gly, Ala, Ser, Val, Ile, Leu, Phe, Trp, Tyr, Glu 및 Met로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고;
    vi. 상기 X5는 Pro, Gly, Ala 및 Ser로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이며;
    vii. 상기 X6은 Lys, Arg 및 His로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고;
    b. "―"는 하나 이상의 아미노산을 포함하는 선택적 링커이며; 그리고
    c. ED는 (i) 펩타이드 결합 또는 하나 이상의 아미노산에 의해 상기 X6에 연결된 적어도 2개의 인접한 라이신(Lys) 또는 (ii) 펩타이드 결합에 의해 상기 X6에 직접 연결된 적어도 하나의 라이신을 포함하는 효과기 도메인인, EV.
  20. 제8항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 X2는 Gly 및 Ala로 이루어진 군으로부터 선택되는, EV.
  21. 제8항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 X3은 Lys인, EV.
  22. 제8항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 X4는 Leu 또는 Glu인, EV.
  23. 제8항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 X5는 Ser 및 Ala로 이루어진 군으로부터 선택되는, EV.
  24. 제8항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 X6은 Lys인, EV.
  25. 제8항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 X2는 Gly, Ala 또는 Ser이고; 상기 X3은 Lys 또는 Glu이며, 상기 X4는 Leu, Phe, Ser 또는 Glu이고, 상기 X5는 Ser 또는 Ala이며; 상기 X6은 Lys인, EV.
  26. 제19항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ND 및 ED는 하나 이상의 아미노산을 포함하는 링커에 의해 연결되는, EV.
  27. 제19항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ED는 Lys(K), KK, KKK, KKKK(서열번호 151), KKKKK(서열번호 152) 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, EV.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 스캐폴드 단백질은 (i) GGKLSKK(서열번호 157), (ii) GAKLSKK(서열번호 158), (iii) GGKQSKK(서열번호 159), (iv) GGKLAKK(서열번호 160) 또는 (v) 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, EV.
  29. 제28항에 있어서, 상기 스캐폴드 단백질은 (i) GGKLSKKK(서열번호 161), (ii) GGKLSKKS(서열번호 162), (iii) GAKLSKKK(서열번호 163), (iv) GAKLSKKS(서열번호 164), (v) GGKQSKKK(서열번호 165), (vi) GGKQSKKS(서열번호 166), (vii) GGKLAKKK(서열번호 167), (viii) GGKLAKKS(서열번호 168) 및 (ix) 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, EV.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 스캐폴드 단백질은 적어도 약 8, 적어도 약 9, 적어도 약 10, 적어도 약 11, 적어도 약 12, 적어도 약 13, 적어도 약 14, 적어도 약 15, 적어도 약 16, 적어도 약 17, 적어도 약 18, 적어도 약 19, 적어도 약 20, 적어도 약 21, 적어도 약 22, 적어도 약 23, 적어도 약 24, 적어도 약 25, 적어도 약 30, 적어도 약 35, 적어도 약 40, 적어도 약 45, 적어도 약 50, 적어도 약 55, 적어도 약 60, 적어도 약 65, 적어도 약 70, 적어도 약 75, 적어도 약 80, 적어도 약 85, 적어도 약 90, 적어도 약 95, 적어도 약 100, 적어도 약 105, 적어도 약 110, 적어도 약 120, 적어도 약 130, 적어도 약 140, 적어도 약 150, 적어도 약 160, 적어도 약 170, 적어도 약 180, 적어도 약 190 또는 적어도 약 200개의 아미노산 길이인, EV.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 스캐폴드 단백질은 (i) GGKLSKKKKGYNVN(서열번호 169), (ii) GAKLSKKKKGYNVN(서열번호 170), (iii) GGKQSKKKKGYNVN(서열번호 171), (iv) GGKLAKKKKGYNVN(서열번호 172), (v) GGKLSKKKKGYSGG(서열번호 173), (vi) GGKLSKKKKGSGGS(서열번호 174), (vii) GGKLSKKKKSGGSG(서열번호 175), (viii) GGKLSKKKSGGSGG(서열번호 176), (ix) GGKLSKKSGGSGGS(서열번호 177), (x) GGKLSKSGGSGGSV(서열번호 178) 또는 (xi) GAKKSKKRFSFKKS(서열번호 179)를 포함하는, EV.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 스캐폴드 단백질은 N-말단에 Met를 포함하지 않는, EV.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 스캐폴드 단백질은 상기 스캐폴드 단백질의 N-말단에 미리스토일화된 아미노산 잔기를 포함하는, EV.
  34. 제33항에 있어서, 상기 스캐폴드 단백질의 N-말단에 있는 아미노산 잔기는 Gly인, EV.
  35. 제33항 또는 제34항에 있어서, 상기 스캐폴드 단백질의 N-말단에 있는 아미노산 잔기는 합성인, EV.
  36. 제33항 또는 제35항에 있어서, 상기 스캐폴드 단백질의 N-말단에 있는 아미노산 잔기는 글리신 유사체인, EV.
  37. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 스캐폴드 단백질은 서열번호 1(MARKS), 서열번호 2(MARCKSL1) 또는 서열번호 3(BASP1)과 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, EV.
  38. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물학적으로 활성인 분자는 상기 EV의 내강 표면 또는 내강에 있는, EV.
  39. 제1항 및 제8항에 있어서, 상기 스캐폴드 단백질은 막관통 도메인을 더 포함하는, EV.
  40. 제39항에 있어서, 상기 막관통 도메인은 상기 스캐폴드 단백질의 ED 도메인과 상기 생물학적으로 활성인 분자 사이에 있는, EV.
  41. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 스캐폴드 단백질은 소포체외 도메인(extravesicular domain)을 더 포함하는, EV.
  42. 제41항에 있어서, 상기 생물학적으로 활성인 분자는 상기 소포체외 도메인에 연결되는, EV.
  43. 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 스캐폴드 단백질은 링커에 의해 상기 생물학적으로 활성인 분자에 연결되는, EV.
  44. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ND 도메인은 링커에 의해 상기 ED 도메인에 연결되는, EV.
  45. 제43항 또는 제44항에 있어서, 상기 링커는 펩타이드 결합 또는 하나 이상의 아미노산을 포함하는, EV.
  46. 제17항 내지 제19항, 제26항 및 제43항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 링커는 절단성 링커를 포함하는, EV.
  47. 제17항 내지 제19항, 제26항 및 제43항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 링커는 가요성 링커를 포함하는, EV.
  48. 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물학적으로 활성인 분자는 단백질, 폴리펩타이드, 펩타이드, 폴리뉴클레오타이드(DNA 및/또는 RNA), 화학적 화합물, 바이러스, 이오노포어, 이오노포어의 담체, 채널 또는 기공을 형성하는 모이어티 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, EV.
  49. 제48항에 있어서, 상기 단백질은 재조합 펩타이드, 천연 펩타이드, 합성 펩타이드, 항체, 융합 단백질 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, EV.
  50. 제48항에 있어서, 상기 단백질은 효소, 사이토카인, 리간드, 수용체, 전사 인자 또는 이들의 조합을 포함하는, EV.
  51. 제48항에 있어서, 상기 바이러스는 아데노-관련 바이러스, 파보바이러스, 레트로바이러스, 아데노바이러스 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, EV.
  52. 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 EV는 제2 스캐폴드 단백질을 더 포함하는, EV.
  53. 제52항에 있어서, 상기 제2 스캐폴드 단백질은 PTGFRN 폴리펩타이드, BSG 폴리펩타이드, IGSF2 폴리펩타이드, IGSF3 폴리펩타이드, IGSF8 폴리펩타이드, ITGB1 폴리펩타이드, ITGA4 폴리펩타이드, SLC3A2 폴리펩타이드, ATP 수송자 폴리펩타이드, 아미노펩티데이스 N(ANPEP) 폴리펩타이드, 엑토뉴클레오타이드 파이로포스파테이스/포스포다이에스터레이스 패밀리 구성원 1(ENPP1) 폴리펩타이드, 네프릴리신(MME) 폴리펩타이드, 뉴로필린-1(NRP1) 폴리펩타이드 또는 이들의 단편을 포함하는, EV.
  54. 제1항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물학적으로 활성인 분자는 음성 관문 조절자에 대한 저해제 또는 음성 관문 조절자의 결합 파트너에 대한 저해제인, EV.
  55. 제54항에 있어서, 상기 음성 관문 조절자는 세포독성 T-림프구-관련 단백질 4(CTLA-4), 세포예정사 단백질 1(PD-1), 림프구-활성화 유전자 3(LAG-3), T-세포 면역글로불린 뮤신-함유 단백질 3(TIM-3), B 및 T 림프구 감쇠자(BTLA), Ig 및 ITIM 도메인을 갖는 T 세포 면역수용체(TIGIT), T 세포 활성화의 V-도메인 Ig 억제자(VISTA), 아데노신 A2a 수용체(A2aR), 살해 세포 면역글로불린 유사 수용체(KIR), 인돌아민 2,3-다이옥시게네이스(IDO), CD20, CD39 및 CD73으로 이루어진 군으로부터 선택되는, EV.
  56. 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물학적으로 활성인 분자는 면역원성 단백질인, EV.
  57. 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물학적으로 활성인 분자는 독소, 톡소이드 또는 독소의 무독성 돌연변이체인, EV.
  58. 제57항에 있어서, 상기 독소는 디프테리아 독소인, EV.
  59. 제57항에 있어서, 상기 톡소이드는 파상풍 톡소이드인, EV.
  60. 제57항에 있어서, 상기 생물학적으로 활성인 분자는 디프테리아 독소의 무독성 돌연변이체인, EV.
  61. 제1항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물학적으로 활성인 분자는 양성 공동-자극 분자에 대한 활성자 또는 양성 공동-자극 분자의 결합 파트너에 대한 활성자인, EV.
  62. 제61항에 있어서, 상기 양성 공동-자극 분자는 TNF 수용체 슈퍼패밀리 구성원인, EV.
  63. 제62항에 있어서, 상기 TNF 수용체 슈퍼패밀리 구성원은 CD120a, CD120b, CD18, OX40, CD40, Fas 수용체, M68, CD27, CD30, 4-1BB, TRAILR1, TRAILR2, TRAILR3, TRAILR4, RANK, OCIF, TWEAK 수용체, TACI, BAFF 수용체, ATAR, CD271, CD269, AITR, TROY, CD358, TRAMP 및 XEDAR로 이루어진 군으로부터 선택되는, EV.
  64. 제63항에 있어서, 상기 양성 공동-자극 분자에 대한 활성자는 TNF 슈퍼패밀리 구성원인, EV.
  65. 제64항에 있어서, 상기 TNF 슈퍼패밀리 구성원은 TNFα, TNF-C, OX40L, CD40L, FasL, LIGHT, TL1A, CD27L, Siva, CD153, 4-1BB 리간드, TRAIL, RANKL, TWEAK, APRIL, BAFF, CAMLG, NGF, BDNF, NT-3, NT-4, GITR 리간드 및 EDA-2로 이루어진 군으로부터 선택되는, EV.
  66. 제61항에 있어서, 상기 양성 공동-자극 분자는 CD28-슈퍼패밀리 공동-자극 분자인, EV.
  67. 제66항에 있어서, 상기 CD28-슈퍼패밀리 공동-자극 분자는 ICOS 또는 CD28인, EV.
  68. 제67항에 있어서, 상기 양성 공동-자극 분자에 대한 활성자는 ICOSL, CD80 또는 CD86인, EV.
  69. 제50항에 있어서, 상기 사이토카인 IL-2, IL-7, IL-10, IL-12 및 IL-15로 이루어진 군으로부터 선택되는, EV.
  70. 제48항에 있어서, 상기 단백질은 T-세포 수용체(TCR), T-세포 공동-수용체, 주조직 적합성 복합체(MHC), 인간 백혈구 항원(HLA) 또는 이들의 유도체를 포함하는, EV.
  71. 제48항에 있어서, 상기 단백질은 종양 항원을 포함하는, EV.
  72. 제71항에 있어서, 상기 종양 항원은 알파-태아단백질(AFP), 암배아 항원(CEA), 상피 종양 항원(ETA), 뮤신 1(MUC1), Tn-MUC1, 뮤신 16(MUC16), 타이로시네이스, 흑색종-관련 항원(MAGE), 종양 단백질 p53(p53), CD4, CD8, CD45, CD80, CD86, 예정사 리간드 1(programmed death ligand 1: PD-L1), 예정사 리간드 2(PD-L2), NY-ESO-1, PSMA, 태그-72, HER2, GD2, cMET, EGFR, 메소텔린, VEGFR, 알파-폴레이트 수용체, CE7R, IL-3, 암-고환 항원, MART-1 gp100 및 TNF-관련 아폽토시스-유도성 리간드로 이루어진 군으로부터 선택되는, EV.
  73. 제1항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 EV는 엑소솜인, EV.
  74. 약제학적 조성물로서, 제1항 내지 제73항 중 어느 한 항에 따른 EV 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  75. 세포로서, 제1항 내지 제73항 중 어느 한 항에 따른 EV를 생산하는, 세포.
  76. 하나 이상의 벡터를 포함하는 세포로서, 상기 벡터는 제1항 내지 제73항 중 어느 한 항에 따른 스캐폴드 단백질을 암호화하는 핵산 서열 및 생물학적으로 활성인 분자를 포함하는, 세포.
  77. 제76항에 있어서, 상기 핵산 서열은 프로모터에 작동 가능하게 연결된, 세포.
  78. 키트로서, 제1항 내지 제73항 중 어느 한 항에 따른 EV 및 사용 설명서를 포함하는, 키트.
  79. EV를 제조하는 방법으로서, 적합한 조건하에 제75항 내지 제77항 중 어느 한 항에 따른 세포를 배양하는 단계 및 상기 EV를 얻는 단계를 포함하는, 방법.
  80. 생물학적으로 활성인 분자를 세포외 소포체에 고정시키는 방법으로서, 제1항 내지 제73항 중 어느 한 항에 따른 생물학적으로 활성인 분자를 제1항 내지 제73항 중 어느 한 항에 따른 스캐폴드 단백질에 연결하는 단계를 포함하는, 방법.
  81. 질환의 예방 또는 치료를 필요로 하는 대상체에서 질환을 예방 또는 치료하는 방법으로서, 제1항 내지 제73항 중 어느 한 항에 따른 EV를 투여하는 단계를 포함하되, 상기 질환은 항원과 관련이 있는, 방법.
  82. 제81항에 있어서, 상기 EV는 비경구로, 경구로, 정맥내로, 근육내로, 종양내로, 비강내로, 피하로 또는 복강내로 투여되는, 방법.
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