KR20230157346A - 세포외 소포체를 로딩하는 방법 - Google Patents
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Abstract
본 개시내용은 페이로드를 EV에 로딩하는 방법에 관한 것이다. 일부 양태에서, 페이로드와 EV는 특정 로딩 조건(예를 들어, 개시된 염 농도, 로딩 온도, 로딩 지속시간, 페이로드 공급물 농도, 및/또는 EV 공급물 농도)에서 혼합되어, EV의 외부 표면과 관련된 페이로드의 양이 증가한다. 또한 세포외 소포체를 생산하는 방법 및 질환 또는 장애를 치료하기 위해 세포외 소포체를 사용하는 방법도 제공된다.
Description
관련 출원에 대한 교차 참조
본 PCT 출원은 2021년 2월 17일에 출원된 미국 가출원 제63/150,497호의 이익을 주장하며, 전체 내용이 참조로 본원에 포함된다.
EFS-WEB을 통해 전자적으로 제출된 서열 목록에 대한 참조
본 출원에 제출된 전자적으로 제출된 서열 목록(명칭: 4000_126PC02_Seqlisting_ST25.txt; 크기: 464,866 바이트; 생성일: 2022년 2월 17일)의 내용은 전체적으로 참조로 본원에 포함된다.
개시 분야
본 개시내용은 페이로드(예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오티드)를 세포외 소포체(EV)에 로딩(loading)하는 방법에 관한 것이다. 일부 양태에서, 방법은 로딩 공정 동안 염 농도, 온도, 로딩 시간 및 공급물 농도 중 하나 이상을 조정하는 것을 포함한다. 본 개시내용은 또한 페이로드를 포함하는 EV(예를 들어, 엑소좀)에 관한 것이며, 여기서 페이로드는 본원에 기재된 방법을 사용하여 로딩된다.
많은 생체활성 화합물은 치료에 도움이 되는 강력한 생물학적 활성을 가지고 있다. 그러나 이들 화합물은 종종 비-표적 기관에 독성을 나타낸다. 비-표적 조직의 노출을 제한하는 한 가지 방법은 소분자를 항체와 같은 친화도 기반 시약에 화학적으로 접합시키는 것인데, 이는 치료 화합물을 특정 세포 유형으로 유도할 수 있지만(Dosio, F. 등, Toxins ( Basel ) 3(7):848-883 (2011)), 이 접근법은 항체에 부착될 수 있는 관심 화합물의 분자 수(전형적으로 항체당 2 내지 6개 분자)에 의해, 그리고 비-표적 세포에는 결합하지 않고 표적화된 관련 질환/이펙터(effector) 세포에 특이적으로 결합하는 항체의 가용성/존재에 의해 제한된다. 이 두 가지 문제는 각각 효능을 감소시키고 전신 독성을 증가시킴으로써 항체-약물 접합체(ADC)의 사용을 제한한다. 따라서, 치료 화합물에 대한 전체 전신 노출을 제한하는 동시에 특정 조직 또는 기관을 선택적으로 표적화할 수 있는 ADC보다 페이로드가 더 높은 전달 시스템이 필요하다.
EV는 세포간 통신의 중요한 매개체이다. 약물 전달 비히클로서, 예를 들어 EV는 많은 치료 영역에서 새로운 치료 방식으로서 기존의 약물 전달 방법(예를 들어, 펩티드 면역화, DNA 백신)에 비해 많은 이점을 제공한다. 그러나 장점에도 불구하고, 많은 EV는 임상적 효험이 제한적이었다. 예를 들어, 수지상 세포 유래 엑소좀(DEX)은 수술이 불가능한 비-소세포 폐암(NSCLC) 환자의 일차 화학요법 후 유지 면역요법으로 2상 임상 시험에서 조사되었다. 그러나 일차 평가변수(화학요법 중단 후 4개월째 무진행 생존율(PFS) 환자의 최소 50%)에 도달하지 못해 임상시험이 종료되었다. Besse, B., 등, Oncoimmunology 5(4):e1071008 (2015).
따라서 EV 기반 기술의 치료적 사용 및 기타 적용을 더 잘 가능하게 하려면 새롭고 보다 효과적인 조작된 EV(예를 들어, 더 큰 페이로드 농도를 포함함)가 필요하다.
약 200 mM, 약 190 mM, 약 180 mM, 약 170 mM, 약 160 mM, 약 150 mM, 약 140 mM, 약 130 mM, 약 120 mM, 또는 약 110 mM 미만의 농도로 염을 포함하는 로딩 완충액에서 페이로드를 세포외 소포체와 혼합하는 단계를 포함하는, 세포외 소포체에 페이로드를 로딩하는 방법이 본원에 제공된다.
일부 양태에서, 염 농도는 약 1 mM 내지 약 150 mM, 약 5 mM 내지 약 150 mM, 약 10 mM 내지 약 150 mM, 약 20 mM 내지 약 150 mM, 약 30 mM 내지 약 150 mM, 약 40 mM 내지 약 150 mM, 약 50 mM 내지 약 150 mM, 약 60 mM 내지 약 150 mM, 약 70 mM 내지 약 150 mM, 약 80 mM 내지 약 150 mM, 약 10 mM 내지 약 130 mM, 약 20 mM 내지 약 130 mM, 약 30 mM 내지 약 130 mM, 약 40 mM 내지 약 130 mM, 약 50 mM 내지 약 130 mM, 약 10 mM 내지 약 120 mM, 약 20 mM 내지 약 120 mM, 약 30 mM 내지 약 120 mM, 약 40 mM 내지 약 120 mM, 약 50 mM 내지 약 120 mM, 약 60 mM 내지 약 120 mM, 약 70 mM 내지 약 120 mM, 약 80 mM 내지 약 120 mM, 약 50 mM 내지 약 100 mM, 약 100 mM 내지 약 150 mM, 또는 약 90 mM 내지 약 110 mM이다. 특정 양태에서, 염 농도는 약 10 mM, 약 20 mM, 약 30 mM, 약 40 mM, 약 50 mM, 약 60 mM, 약 70 mM, 약 80 mM, 약 90 mM, 약 100 mM, 약 110 mM, 약 120 mM, 약 130 mM, 약 140 mM, 약 150 mM, 약 160 mM, 약 170 m, 약 180 mM, 또는 약 190 mM이다. 일부 양태에서, 염 농도는 약 50 mM, 약 60 mM, 약 70 mM, 약 80 mM, 약 90 mM, 약 100 mM, 약 110 mM, 약 120 mM, 약 130 mM, 약 140 mM, 또는 약 150 mM이다.
약 200 mM 내지 약 450 mM의 농도로 염을 포함하는 로딩 완충액에서 페이로드를 세포외 소포체와 혼합하는 단계를 포함하는, 세포외 소포체에 페이로드를 로딩하는 방법이 또한 본원에 제공된다. 일부 양태에서, 염 농도는 약 200 mM, 약 250 mM, 약 300 mM, 약 350 mM, 약 400 mM, 또는 약 450 mM이다.
상기에 제공된 임의의 방법에 대해, 일부 양태에서, 염은 NaCl(염화나트륨), KCl(염화칼륨), PO4(인산염), CaCl2(염화칼슘), MgCl2(염화마그네슘), Mg2SO4(황산마그네슘), ZnCl2(염화아연), MnCl2(염화망간), MnSO4(황산망간), NaSCN(티오시안산나트륨), KSCN(티오시안산칼륨), LiCl(염화리튬), K2HPO4(인산이칼륨), Na2SO4(황산나트륨), NaPO4 (인산나트륨), K2SO4(인산칼륨), 아세트산나트륨, 브롬화나트륨, 요오드화나트륨, 브롬화칼륨, 브롬화리튬, 불화나트륨, 불화칼륨, 불화리튬, 요오드화리튬, 아세트산칼륨, 아세트산리튬, 요오드화칼륨, 황산칼슘, 황산나트륨, 삼염화크롬, 황산크롬, 시트르산나트륨, 염화철(III), 염화이트륨(III), 황산칼륨, 염화제일철, 시트르산칼슘, 인산마그네슘, 염화제이철, 아르기닌-HCl, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 양태에서, 염을 포함하는 완충액은 염이 없거나 염의 농도가 더 낮은 해당 로딩 완충액과 비교하여 EV에 대한 페이로드의 로딩을 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5 배, 적어도 약 6배, 적어도 약 7배, 적어도 약 8배, 적어도 약 9배, 적어도 약 10 배, 적어도 약 12배, 적어도 약 14배, 적어도 약 16배, 적어도 약 18배, 적어도 약 20 배, 적어도 약 25배, 적어도 약 30배, 적어도 약 35배, 적어도 약 40배, 적어도 약 45배, 또는 적어도 약 50배 또는 그 초과까지 증가시킨다.
본 발명은 4℃ 초과의 로딩 온도에서 페이로드를 세포외 소포체와 혼합하는 단계를 포함하는, 세포외 소포체에 페이로드를 로딩하는 방법을 제공한다.
일부 양태에서, 로딩 온도는 약 5℃ 내지 약 40℃, 약 10℃ 내지 약 40℃, 약 15℃ 내지 약 40℃, 약 20℃ 내지 약 40℃, 약 25℃ 내지 약 40℃, 약 30℃ 내지 약 40℃, 약 35℃ 내지 약 40℃, 약 5℃ 내지 약 38℃, 약 10℃ 내지 약 38℃, 약 15℃ 내지 약 38℃, 약 20℃ 내지 약 38℃, 약 25℃ 내지 약 38℃, 약 30℃ 내지 약 38℃, 약 35℃ 내지 약 38℃, 약 5℃ 내지 약 37℃, 약 10℃ 내지 약 37℃, 약 15℃ 내지 약 37℃, 약 20℃ 내지 약 37℃, 약 25℃ 내지 약 37℃, 약 30℃ 내지 약 37℃, 또는 약 35℃ 내지 약 37℃이다. 특정 양태에서, 로딩 온도는 약 5℃, 약 10℃, 약 15℃, 약 20℃, 약 25℃, 약 30℃, 약 35℃, 약 37℃, 약 40℃, 약 50℃, 약 55℃, 약 60℃, 약 65℃, 또는 약 70℃이다.
일부 양태에서, 로딩 온도는 로딩 온도보다 낮은 기준 온도에서의 로딩과 비교하여 EV에 대한 페이로드의 로딩을 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5 배, 적어도 약 6배, 적어도 약 7배, 적어도 약 8배, 적어도 약 9배, 적어도 약 10 배, 적어도 약 12배, 적어도 약 14배, 적어도 약 16배, 적어도 약 18배, 적어도 약 20 배, 적어도 약 15배, 적어도 약 20배, 적어도 약 25배, 적어도 약 30배, 적어도 약 35배, 적어도 약 40배, 적어도 약 45배, 또는 적어도 약 50배 또는 그 초과까지 증가한다.
약 1시간보다 긴 로딩 지속시간 동안 페이로드를 세포외 소포체와 혼합하는 단계를 포함하는, 세포외 소포에 페이로드를 로딩하는 방법이 본원에 제공된다.
일부 양태에서, 로딩 지속시간은 약 1시간 내지 약 48시간, 약 1시간 내지 약 42시간, 약 1시간 내지 약 36시간, 약 1시간 내지 약 30시간, 약 1시간 내지 약 24시간, 약 6시간 내지 약 48시간, 약 6시간 내지 약 42시간, 약 6시간 내지 약 36시간, 약 6시간 내지 약 30시간, 약 6시간 내지 약 24시간, 약 12시간 내지 약 48시간, 약 12시간 내지 약 42시간, 약 12시간 내지 약 36시간, 약 12시간 내지 약 30시간, 또는 약 12시간 내지 약 24 시간이다. 특정 양태에서, 로딩 지속시간은 약 6시간, 약 12시간, 약 24시간, 약 30시간, 약 36시간, 약 42시간, 약 48시간, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일, 또는 약 7일이다.
일부 양태에서, 로딩 지속시간은 로딩 지속시간보다 짧은 기준 지속시간 동안의 로딩과 비교하여 EV에 대한 페이로드의 로딩을 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5 배, 적어도 약 6배, 적어도 약 7배, 적어도 약 8배, 적어도 약 9배, 또는 적어도 약 10 배, 적어도 약 12배, 적어도 약 14배, 적어도 약 16배, 적어도 약 18배, 적어도 약 20 배, 적어도 약 25배, 적어도 약 30배, 적어도 약 35배, 적어도 약 40배, 적어도 약 45배, 또는 적어도 약 50배 또는 그 초과까지 증가한다.
또한, 200 mM 미만의 농도에서, 약 5℃ 내지 약 50℃의 로딩 온도에서, 및 1시간 내지 약 48시간의 로딩 지속시간 동안 염을 포함하는 로딩 완충액에서 페이로드를 세포외 소포체와 혼합하는 단계를 포함하는, 세포외 소포체에 페이로드를 로딩하는 방법이 제공된다.
일부 양태에서, 염 농도는 약 1 mM 내지 약 150 mM, 약 5 mM 내지 약 150 mM, 약 10 mM 내지 약 150 mM, 약 20 mM 내지 약 150 mM, 약 30 mM 내지 약 150 mM, 약 40 mM 내지 약 150 mM, 약 50 mM 내지 약 150 mM, 약 60 mM 내지 약 150 mM, 약 70 mM 내지 약 150 mM, 약 80 mM 내지 약 150 mM, 약 10 mM 내지 약 130 mM, 약 20 mM 내지 약 130 mM, 약 30 mM 내지 약 130 mM, 약 40 mM 내지 약 130 mM, 약 50 mM 내지 약 130 mM, 약 10 mM 내지 약 120 mM, 약 20 mM 내지 약 120 mM, 약 30 mM 내지 약 120 mM, 약 40 mM 내지 약 120 mM, 약 50 mM 내지 약 120 mM, 약 60 mM 내지 약 120 mM, 약 70 mM 내지 약 120 mM, 약 80 mM 내지 약 120 mM, 약 50 mM 내지 약 100 mM, 약 100 mM 내지 약 150 mM, 또는 약 90 mM 내지 약 110 mM이다. 특정 양태에서, 염 농도는 약 10 mM, 약 20 mM, 약 30 mM, 약 40 mM, 약 50 mM, 약 60 mM, 약 70 mM, 약 80 mM, 약 90 mM, 약 100 mM, 약 110 mM, 약 120 mM, 약 130 mM, 약 140 mM, 약 150 mM, 약 160 mM, 약 170 m, 약 180 mM, 또는 약 190 mM이다. 일부 양태에서, 염 농도는 약 50 mM, 약 60 mM, 약 70 mM, 약 80 mM, 약 90 mM, 약 100 mM, 약 110 mM, 약 120 mM, 약 130 mM, 약 140 mM, 또는 약 150 mM이다.
일부 양태에서, 염은 NaCl(염화나트륨), KCl(염화칼륨), PO4(인산염), CaCl2(염화칼슘), MgCl2(염화마그네슘), Mg2SO4(황산마그네슘), ZnCl2(염화아연), MnCl2(염화망간), MnSO4(황산망간), NaSCN(티오시안산나트륨), KSCN(티오시안산칼륨), LiCl(염화리튬), K2HPO4(인산이칼륨), Na2SO4(황산나트륨), NaPO4 (인산나트륨), K2SO4(인산칼륨), 아세트산나트륨, 브롬화나트륨, 요오드화나트륨, 브롬화칼륨, 브롬화리튬, 불화나트륨, 불화칼륨, 불화리튬, 요오드화리튬, 아세트산칼륨, 아세트산리튬, 요오드화칼륨, 황산칼슘, 황산나트륨, 삼염화크롬, 황산크롬, 시트르산나트륨, 염화철(III), 염화이트륨(III), 황산칼륨, 염화제일철, 시트르산칼슘, 인산마그네슘, 염화제이철, 아르기닌-HCl, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
일부 양태에서, 로딩 온도는 약 5℃ 내지 약 40℃, 약 10℃ 내지 약 40℃, 약 15℃ 내지 약 40℃, 약 20℃ 내지 약 40℃, 약 25℃ 내지 약 40℃, 약 30℃ 내지 약 40℃, 약 35℃ 내지 약 40℃, 약 5℃ 내지 약 38℃, 약 10℃ 내지 약 38℃, 약 15℃ 내지 약 38℃, 약 20℃ 내지 약 38℃, 약 25℃ 내지 약 38℃, 약 30℃ 내지 약 38℃, 약 35℃ 내지 약 38℃, 약 5℃ 내지 약 37℃, 약 10℃ 내지 약 37℃, 약 15℃ 내지 약 37℃, 약 20℃ 내지 약 37℃, 약 25℃ 내지 약 37℃, 약 30℃ 내지 약 37℃, 또는 약 35℃ 내지 약 37℃이다. 특정 양태에서, 로딩 온도는 약 5℃, 약 10℃, 약 15℃, 약 20℃, 약 25℃, 약 30℃, 약 35℃, 약 37℃, 약 40℃, 또는 약 50℃이다.
일부 양태에서, 로딩 지속시간은 약 1시간 내지 약 48시간, 약 1시간 내지 약 42시간, 약 1시간 내지 약 36시간, 약 1시간 내지 약 30시간, 약 1시간 내지 약 24시간, 약 6시간 내지 약 48시간, 약 6시간 내지 약 42시간, 약 6시간 내지 약 36시간, 약 6시간 내지 약 30시간, 약 6시간 내지 약 24시간, 약 12시간 내지 약 48시간, 약 12시간 내지 약 42시간, 약 12시간 내지 약 36시간, 약 12시간 내지 약 30시간, 또는 약 12시간 내지 약 24 시간이다. 특정 양태에서, 로딩 지속시간은 약 6시간, 약 12시간, 약 24시간, 약 30시간, 약 36시간, 약 42시간, 또는 약 48시간이다.
일부 양태에서, 염 농도는 약 50 mM 내지 약 150 mM이고, 로딩 온도는 약 30℃ 내지 약 40℃이고, 로딩 지속시간은 약 20시간 내지 약 30시간이다. 일부 양태에서, 염 농도는 약 50 mM 내지 약 150 mM이고, 로딩 온도는 약 30℃ 내지 약 40℃이고, 로딩 지속시간은 약 12시간 내지 약 30시간이다.
본 개시내용은 또한 약 100 mM의 농도에서, 약 37℃의 로딩 온도에서, 및 약 24시간의 로딩 지속시간 동안 염을 포함하는 로딩 완충액에서 페이로드를 세포외 소포체와 혼합하는 단계를 포함하는, 세포외 소포체에 페이로드를 로딩하는 방법을 제공한다.
일부 양태에서, 로딩 지속시간 동안 로딩 온도에서의 염 농도에서의 로딩은 4℃의 온도 및/또는 1시간의 지속시간 동안 염이 없는 로딩과 비교하여 세포외 소포에 대한 페이로드의 로딩을 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5 배, 적어도 약 6배, 적어도 약 7배, 적어도 약 8배, 적어도 약 9배, 적어도 약 10 배, 적어도 약 12배, 적어도 약 14배, 적어도 약 16배, 적어도 약 18배, 적어도 약 20 배, 적어도 약 25배, 적어도 약 30배, 적어도 약 35배, 적어도 약 40배, 적어도 약 45배, 또는 적어도 약 50배 또는 그 초과까지 증가시킨다.
또한, 약 150 mM 내지 약 450 mM의 농도에서, 약 37℃ 내지 약 70℃의 로딩 온도에서, 및 약 24시간 내지 약 7일의 로딩 지속시간 동안 염을 포함하는 로딩 완충액에서 페이로드를 세포외 소포체와 혼합하는 단계를 포함하는, 세포외 소포체에 페이로드를 로딩하는 방법이 제공된다. 일부 양태에서, 염 농도는 약 150 mM, 약 200 mM, 약 250 mM, 약 300 mM, 약 350 mM, 약 400 mM, 또는 약 450 mM이다. 일부 양태에서, 염은 NaCl(염화나트륨), KCl(염화칼륨), PO4(인산염), CaCl2(염화칼슘), MgCl2(염화마그네슘), Mg2SO4(황산마그네슘), ZnCl2(염화아연), MnCl2(염화망간), MnSO4(황산망간), NaSCN(티오시안산나트륨), KSCN(티오시안산칼륨), LiCl(염화리튬), K2HPO4(인산이칼륨), Na2SO4(황산나트륨), NaPO4 (인산나트륨), K2SO4(인산칼륨), 아세트산나트륨, 브롬화나트륨, 요오드화나트륨, 브롬화칼륨, 브롬화리튬, 불화나트륨, 불화칼륨, 불화리튬, 요오드화리튬, 아세트산칼륨, 아세트산리튬, 요오드화칼륨, 황산칼슘, 황산나트륨, 삼염화크롬, 황산크롬, 시트르산나트륨, 염화철(III), 염화이트륨(III), 황산칼륨, 염화제일철, 시트르산칼슘, 인산마그네슘, 염화제이철, 아르기닌-HCl, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
상기 단락에 기재된 방법의 경우, 일부 양태에서 로딩 온도는 약 37℃, 약 40℃, 약 45℃, 약 50℃, 약 55℃, 약 60℃, 약 65℃, 또는 약 70℃이다. 일부 양태에서, 로딩 지속시간은 약 24시간, 약 2일, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일, 또는 약 7일이다.
상기에 제공된 방법 중 임의의 방법에 대해, 일부 양태에서, 방법은 혼합 후에 EV에 로딩된 페이로드의 양을 측정하고 EV의 로드 밀도를 결정하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 하나 이상의 로딩 매개변수는 EV의 로드 밀도를 추가로 증가시키기 위해 조정되고, 여기서 하나 이상의 로딩 매개변수는 로딩 완충액의 염 농도, 로딩 온도, 로딩 지속시간, 페이로드 공급물 농도, EV 공급물 농도, 또는 이들의 조합으로부터 선택된다. 일부 양태에서, EV에 로딩된 페이로드의 양은 입자 계수기, 나노입자 추적 분석(NTA), 자외선 흡착, 가시 흡착, 형광, 근적외선, 적외선, 정적 광산란, 동적 광산란, 암흑화, 라만 분광학, 탁도 또는 이들의 조합을 사용하여 측정된다.
또한 본원에는 본원에 제공된 임의의 로딩 방법(예를 들어, 상기에 제공된 방법)에 따라 페이로드를 EV에 로딩하는 것을 포함하는, EV 로딩 후 세포외 소포(EV)로부터 페이로드의 해리를 감소시키는 방법이 제공된다. 일부 양태에서, EV로부터 페이로드의 해리는 본원에 제공된 임의의 로딩 방법에 따라 페이로드가 EV에 로딩되지 않을 때 관찰된 상응하는 해리와 비교하여 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 또는 약 100% 감소된다.
본원에 제공된 임의의 로딩 방법에 따라 페이로드를 EV에 로딩하는 것을 포함하는, 페이로드가 로딩된 세포외 소포체(EV)의 안정성을 증가시키는 방법이 본원에 제공된다. 일부 양태에서, 페이로드가 로딩된 EV의 안정성은 본 개시내용의 임의의 로딩 방법에 따라 페이로드가 EV에 로딩되지 않을 때 관찰되는 상응하는 안정성과 비교하여 적어도 약 1배, 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5 배, 적어도 약 6배, 적어도 약 7배, 적어도 약 8배, 적어도 약 9배, 적어도 약 10 배, 적어도 약 12배, 적어도 약 14배, 적어도 약 16배, 적어도 약 18배, 적어도 약 20 배, 적어도 약 25배, 적어도 약 30배, 적어도 약 35배, 적어도 약 40배, 적어도 약 45배, 또는 적어도 약 50배 또는 그 초과까지 증가된다.
본 개시내용은 본원에 제공된 임의의 로딩 방법에 따라 EV에 페이로드를 로딩하는 것을 포함하는, 페이로드를 로딩한 후 세포외 소포체의 하나 이상의 특성을 개선하는 방법을 추가로 제공한다. 일부 양태에서, 하나 이상의 특성은 입자간 상호작용, 입자 강성, 입자 크기, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 양태에서, 하나 이상의 특성의 개선은 EV의 여과성을 증가시키는 것을 허용한다.
상기에 제공된 방법 중 임의의 방법에 대해, 일부 양태에서, 로딩 완충액은 하나 이상의 성분을 더 포함한다. 특정 양태에서, 하나 이상의 성분은 트리스, 수크로스, 글루코스, 트레할로스, 만노스, 소르비톨, 만니톨, 글리세롤, 히스티딘, 아르기닌, 메티오닌, 트립토판, 티로신, 인산나트륨, 인산칼륨, 폴리머, 계면활성제 (예를 들어, 폴리소르베이트 80 및 20), 킬레이트제 (예를 들어, EDTA, 시트레이트), 무기 산, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
일부 양태에서, 로딩 완충액은 수크로스를 추가로 포함한다. 특정 양태에서, 수크로스는 농도가 약 10 % w/v 미만, 약 9 % w/v 미만, 약 8 % w/v 미만, 약 7 % w/v 미만, 약 6% w/v 미만, 약 5 % w/v 미만, 약 4 % w/v 미만, 약 3% w/v 미만, 또는 약 2.5 % w/v 미만이다. 일부 양태에서, 수크로스는 농도가 약 1 % w/v 내지 약 10 % w/v, 약 2 % w/v 내지 약 10 % w/v, 약 3 % w/v 내지 약 10 % w/v, 약 4 % w/v 내지 약 10 % w/v, 약 5 % w/v 내지 약 10 % w/v, 약 1 % w/v 내지 약 8 % w/v, 약 2 % w/v 내지 약 8 % w/v, 약 3 % w/v 내지 약 8 % w/v, 약 4 % w/v 내지 약 8 % w/v, 약 5 % w/v 내지 약 8 % w/v, 약 1 % w/v 내지 약 5 % w/v, 약 2 % w/v 내지 약 5 % w/v, 약 3 % w/v 내지 약 5 % w/v, 약 4 % w/v 내지 약 5 % w/v, 또는 약 5 % w/v 내지 약 6 % w/v이다.
일부 양태에서, 로딩 완충액은 삼투질농도 농도가 약 100 내지 약 600 mOsm/kg이다. 일부 양태에서, 로딩 완충액은 삼투질농도 농도가 약 275 내지 약 450, 약 280 내지 약 450, 약 300 내지 약 450, 약 275 내지 약 400, 약 280 내지 약 400, 약 300 내지 약 400, 약 275 내지 약 380, 약 280 내지 약 380, 약 300 내지 약 380, 약 275 내지 약 350, 약 280 내지 약 350, 약 300 내지 약 350, 약 275 내지 약 310, 약 280 내지 약 310, 또는 약 300 내지 약 310 mOsm/kg이다. 특정 양태에서, 로딩 완충액은 삼투질농도 농도가 약 360, 약 370, 약 380, 약 390, 약 395, 또는 약 400 mOsm/kg이다. 일부 양태에서, 로딩 완충액은 삼투질농도 농도가 약 100 내지 약 600 mOsm/kg이다.
일부 양태에서, 로딩 완충액은 pH가 약 6 내지 약 8이다. 특정 양태에서, pH는 약 6 내지 약 7 또는 약 7 내지 약 8이다. 일부 양태에서, pH는 약 6.5 이하이다. 일부 양태에서, 로딩 완충액은 pH가 약 9이다.
일부 양태에서, 본원에 제공된 임의의 로딩 방법을 사용하여 EV에 로딩될 수 있는 페이로드는 펩티드, 소분자, 올리고뉴클레오티드, 안티센스 올리고뉴클레오티드 (ASO), PMO, mRNA, miRNA, lcRNA, 안타고미르(antagomir), tRNA, siRNA, 펩티드 핵산, 세포 침투 펩티드, 보조제, 단백질, 탄수화물, 당, 아미노산, 또는 이들의 임의의 조합이다.
일부 양태에서, 페이로드는 핵산을 포함한다. 일부 양태에서, 핵산은 길이가 약 40 미만, 약 35 미만, 약 30 미만, 약 25 미만, 약 20 미만, 약 19 미만, 약 18 미만, 약 17 미만, 약 16 미만, 또는 약 15 미만 개의 뉴클레오티드인 연속 서열을 포함한다.
제39항에 있어서, 핵산은 길이가 약 10 내지 약 30, 약 14 내지 약 30, 약 15 내지 약 30, 약 16 내지 약 30, 약 17 내지 약 30, 약 18 내지 약 30, 약 19 내지 약 30, 약 20 내지 약 30, 약 10 내지 약 25, 약 14 내지 약 25, 약 15 내지 약 25, 약 16 내지 약 25, 약 17 내지 약 25, 약 18 내지 약 25, 약 19 내지 약 25, 약 20 내지 약 25, 약 10 내지 약 22, 약 14 내지 약 22, 약 15 내지 약 22, 약 16 내지 약 22, 약 17 내지 약 22, 약 18 내지 약 22, 약 19 내지 약 22, 또는 약 20 내지 약 22인 연속 서열을 포함하는, 방법.
일부 양태에서, 페이로드는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 특정 양태에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 유전자에 특이적으로 결합하고 하나 이상의 유전자에 의해 인코딩되는 단백질의 발현을 감소시킨다. 일부 양태에서, 하나 이상의 유전자는 STAT6, Kras, Nras, PMP22, C/ EBPβ, STAT3, NLRP3, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
일부 양태에서, 로딩 완충액 내의 페이로드는 농도가 약 100 μM 내지 약 1000 μM이이다. 일부 양태에서, 로딩 완충액 내의 페이로드는 농도가 약 100 μM 내지 약 200 μM, 약 200 μM 내지 약 300 μM, 약 300 μM 내지 약 400 μM, 약 400 μM 내지 약 500 μM, 약 500 μM 내지 약 600 μM, 약 600 μM 내지 약 700 μM, 약 700 μM 내지 약 800 μM, 약 800 μM 내지 약 900 μM, 또는 약 900 μM 및 1000 μM이다. 특정 양태에서, 로딩 완충액 내 페이로드는 농도가 약 100 μM, 약 200 μM, 약 300 μM, 약 400 μM, 약 500 μM, 약 600 μM, 약 700 μM, 약 800 μM, 약 900 μM, 또는 약 1000 μM이다. 일부 양태에서, 로딩 완충액의 페이로드는 농도가 약 1000 μM 내지 약 2500 μM이다. 일부 양태에서, 페이로드는 서열번호: 41 내지 112 중 어느 하나에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 페이로드의 농도는 약 600 μM이다.
일부 양태에서, 페이로드는 고정 모이어티에 접합된다. 일부 양태에서, 고정 모이어티는 스테롤, GM1, 지질, 비타민, 소분자, 펩티드 또는 이의 임의의 조합을 포함한다.
일부 양태에서, 고정 모이어티는 적어도 6개의 탄소 원자, 적어도 7개의 탄소 원자, 적어도 8개의 탄소 원자, 적어도 9개의 탄소 원자, 적어도 10개의 탄소 원자, 적어도 11개의 탄소 원자, 적어도 12개의 탄소 원자, 적어도 13개의 탄소 원자, 적어도 14개의 탄소 원자, 적어도 15개의 탄소 원자, 적어도 16개의 탄소 원자, 적어도 17개의 탄소 원자, 적어도 18개의 탄소 원자, 적어도 19개의 탄소 원자, 적어도 20개의 탄소 원자, 적어도 25개의 탄소 원자, 적어도 30개의 탄소 원자, 적어도 35개의 탄소 원자, 적어도 40개의 탄소 원자, 적어도 45개의 탄소 원자, 적어도 50개의 탄소 원자, 적어도 55개의 탄소 원자, 적어도 60개의 탄소 원자, 적어도 65개의 탄소 원자, 적어도 70개의 탄소 원자, 적어도 75개의 탄소 원자, 적어도 80개의 탄소 원자, 적어도 85개의 탄소 원자, 또는 적어도 90개의 탄소 원자를 포함한다.
일부 양태에서, 고정 모이어티는 스테롤, 스테로이드, 호파노이드, 하이드록시스테로이드, 세코스테로이드, 이들의 유사체, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 특정 양태에서, 고정 모이어티는 에르고스테롤, 7-디하이드로콜레스테롤, 콜레스테롤, 24S-하이드록시콜레스테롤, 라노스테롤, 사이클로아르테놀, 푸코스테롤, 사린고스테롤, 캄페스테롤, β-시토스테롤, 시토스타놀, 코프로스타놀, 아베나스테롤, 스티그마스테롤, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 양태에서, 고정 모이어티는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 구조를 갖는 콜레스테롤 또는 유도체이다:
일부 양태에서, 고정 모이어티는 디하이드로테스토스테론, 우바올, 헤시게닌, 디오스게닌, 프로게스테론, 코르티솔 또는 이들의 임의의 조합인 스테로이드를 포함한다. 특정 양태에서, 고정 모이어티는 지질을 포함한다.
일부 양태에서, 고정 모이어티는 C2-C60 사슬을 포함한다. 특정 양태에서, 고정 모이어티는 C4-C40, C2-C38, C2-C36, C2-C34, C2-C32, C2-C30, C4-C30, C2-C28, C4-C28, C2- C26, C4-C26, C2-C24, C4-C24, C6-C24, C8-C24, C10-C24, C2-C22, C4-C22, C6-C22, C8-C22, C10-C22, C2-C20, C4-C20, C6-C20, C8-C20, C10-C20, C2-C18, C4-C18, C6-C18, C8-C18, C10-C18, C12-C18, C14-C18, C16-C18, C2-C16, C4-C16, C6-C16, C8-C16, C10-C16, C12-C16, C14-C16, C2-C15, C4-C15, C6-C15, C8-C15, C9-C15, C10-C15, C11-C15, C12-C15, C13-C15, C2-C14, C4-C14, C6-C14, C8-C14, C9-C14, C10-C14, C11-C14, C12-C14, C2-C13, C4-C13, C6-C13, C7-C13, C8-C13, C9-C13, C10-C13, C10-C13, C11-C13, C2-C12, C4-C12, C6-C12, C7-C12, C8-C12, C9-C12, C10-C12, C2-C11, C4-C11, C6-C11, C7-C11, C8-C11, C9-C11, C2-C10, C4-C10, C2-C9, C4-C9, C2-C8, C2-C7, C4-C7, C2-C6, 또는 C4-C6 사슬을 포함한다.
일부 양태에서, 고정 모이어티는 직쇄 지방산, 분지형 지방산, 불포화 지방산, 단일불포화 지방산, 다중불포화 지방산, 하이드록실 지방산, 폴리카복실산, 또는 이의 임의의 조합을 포함한다.
일부 양태에서, 고정 모이어티는 직쇄 지방산을 포함하고, 이는 부티르산, 카프로산, 카프릴산, 카프르산, 라우르산, 미리스트산, 팔미트산, 스테아르산, 아라키드산, 베헨산, 리그노세르산, 헥사코산산, 옥타코산산, 트리아코탄산 및 n-도트리아코탄산, 및 탄소 원자의 홀수를 갖는 것들, 예컨대 프로피온산, n-발레르산, 에난틱산, 펠라르곤산, 헨데칸산, 트리데칸산, 펜타데칸산, 헵타데칸산, 노나데칸산, 헤네이코산산, 트리코산산, 펜타코산산, 헵타코산산, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 양태에서, 고정 모이어티는 분지형 지방산을 포함하고, 이는 이소부티르산, 이소카프로산, 이소카프릴산, 이소카프르산, 이소라우르산, 11-메틸도데칸산, 이소미리스트산, 13-메틸-테트라데칸산, 이소팔미트산, 15-메틸-헥사데칸산, 이소스테아르산, 17-메틸옥타데칸산, 이소아라키드산, 19-메틸-에이코산산, α-에틸-헥산산, α-헥실데칸산, α-헵틸운데칸산, 2-데실테트라데칸산, 2-운데실테트라데칸산, 2-데실펜타데칸산, 2-운데실펜타데칸산, 및 Fine oxocol 1800 산 (Nissan Chemical Industries, Ltd.의 제품), 이소부틸 기로 종결되는 안테이소 지방산, 예컨대 6-메틸-옥탄산, 8-메틸-데칸산, 10-메틸-도데칸산, 12-메틸-테트라데칸산, 14-메틸-헥사데칸산, 16-메틸-옥타데칸산, 18-메틸-에이코산산, 20-메틸-도코산산, 22-메틸-테트라코산산, 24-메틸-헥사코산산, 및 26-메틸옥타코산산, 또는 이들의 임의의 조합이다. 일부 양태에서, 고정 모이어티는 불포화된 지방산을 포함하고, 이는 4-데센산, 카프롤레산, 4-도데센산, 5-도데센산, 라우롤레산, 4-테트라데센산, 5-테트라데센산, 9-테트라데센산, 팔미톨레산, 6-옥타데세노산, 올레산, 9-옥타데세노산, 11-옥타데세노산, 9-에이코세노산, 시스-11-에이코세노산, 세톨레산, 13-도코센산, 15-테트라코센산, 17-헥사코센산, 6,9,12,15-헥사데카테트라엔노산, 리놀레산, 리놀렌산, α-엘레오스테아르산, β-엘레오스테아르산, 푸닉산, 6,9,12,15-옥타데카테트라엔노산, 파리나르산, 5,8,11,14-에이코사테트라엔노산, 5,8,11,14,17-에이코사펜타엔산, 7,10,13,16,19-도코사펜타엔산, 4,7,10,13,16,19-도코사헥사엔산, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 양태에서, 고정 모이어티는 하이드록시 지방산을 포함하고, 이는 α-하이드록시라우르산, α-하이드록시미리스트산, α-하이드록시팔미트산, α-하이드록시스테아르산, ω-하이드록시라우르산, α-하이드록시아라키드산, 9-하이드록시-12-옥타데세노산, 리시놀레산, α-하이드록시베헨산, 9-하이드록시-트랜스-10,12-옥타데카디엔산, 카몰렌산, 이푸롤산, 9,10-디하이드록시스테아르산, 12-하이드록시스테아르산, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 양태에서, 고정 모이어티는 폴리카복실산을 포함하고, 이는 옥살산, 말론산, 석신산, 글루타르산, 아디프산, 피멜산, 수베르산, 아젤라산, 세박산, D,L-말산, 또는 이들의 임의의 조합이다.
일부 양태에서, 고정 모이어티는 인지질을 포함한다. 특정 양태에서, 인지질은 포스파티딜 콜린, 포스파티딜 에탄올아민, 포스파티딜 글리세롤, 포스파티딜 세린, 포스파티드산, 2 라이소포스파티딜 콜린, 스핑고미엘린, 또는 이들의 임의의 조합이다.
일부 양태에서, 고정 모이어티는 비타민을 포함한다. 일부 양태에서, 고정 모이어티는 비타민 D, 비타민 K, 니아신, 피리독신, 비타민 E, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
일부 양태에서, 고정 모이어티는 페이로드와 고정 모이어티 사이에 링커를 추가로 포함한다.
일부 양태에서, 링커는 비절단성 링커를 포함한다. 일부 양태에서, 비절단성 링커는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 글리세롤, 알킬, 포스포로티오에이트, 숙신이미드, 말레이미드, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 양태에서, 비절단성 링커는 식 R3-(O-CH2-CH2)n- 또는 R3-(0-CH2-CH2)n-O-를 특징으로 하는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함하며, 여기서 R3은 수소, 메틸 또는 에틸이고 n은 2 내지 200의 정수이다. 일부 양태에서, 비절단성 링커는 디에틸렌 글리콜, 트리에틸렌 글리콜, 테트라에틸렌 글리콜(TEG), 헥사에틸렌 글리콜(HEG), 펜타에틸렌 글리콜, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 양태에서, 링커는 화학식 ((R3―O―(CH2―CHOH―CH2O)n―)을 갖는 폴리글리세롤(PG)을 포함하며, 여기서 R3은 수소, 메틸 또는 에틸이고, n은 3 내지 200의 정수이다. 일부 양태에서, 링커는 디글리세롤, 트리글리세롤, 테트라글리세롤(TG), 펜타글리세롤, 헥사글리세롤(HG), 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 양태에서, 링커는 알킬을 포함한다.
일부 양태에서, 링커는 절단성 링커를 포함한다. 일부 양태에서, 절단성 링커는 산화환원 절단성 링커, 반응성 산소 종 절단성 링커, pH 의존적 절단성 링커, 효소적 절단성 링커, 프로테아제 절단성 링커, 에스테라제 절단성 링커, 산화환원물절단성 링커, 포스포리파제 절단성 링커, 포스파타제 절단성 링커, 광활성화된 절단성 링커, 자기 희생 링커, 또는 이들의 임의의 조합이다. 일부 양태에서, 절단성 링커는 자기 희생 링커이다. 일부 양태에서, 절단성 링커는 신나밀 기, 나프틸 기, 바이페닐 기, 헤테로사이클릭 고리, 호모방향족 기, 쿠마린, 푸란, 티오펜, 티아졸, 옥사졸, 이속사졸, 피롤, 피라졸, 피리딘, 이미다존, 트리아졸, 또는 이의 임의의 조합을 포함한다.
일부 양태에서, 링커는 하기 화학식을 갖는다:
-Aa-Yy-
여기서 각각의 -A-는 독립적으로 아미노산 단위이고, a는 독립적으로 1 내지 12의 정수이고; -Y-는 스페이서 단위이고, 그리고 y는 0, 1, 또는 2이다. 일부 양태에서, -Aa-는 디펩티드, 트리펩티드, 테트라펩티드, 펜타펩티드 또는 헥사펩티드이다. 일부 양태에서, a는 2이고, -Aa-는 발린-알라닌, 발린-시트룰린, 글루탐산-발린-시트룰린, 페닐알라닌-라이신, N-메틸발린-시트룰린, 글리신-히스티딘-류신-글리신, 사이클로헥실알라닌-라이신, 및 베타-알라닌-라이신으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 양태에서, -Aa-는 발린-알라닌 또는 발린-시트룰린 또는 글루탐산-발린-시트룰린이다. 어떤 양태에서 -Aa-는 아르기닌, 라이신 또는 둘 다이다. 일부 양태에서, y는 1이다. 일부 양태에서, -Y-는 자기 희생 스페이서이다. 일부 양태에서, -Yy-는 하기 식 (V)을 갖는다:
여기서 각각의 R2는 독립적으로 C1-8 알킬, -O-(C1-8 알킬), 할로겐, 니트로 또는 시아노이고; m은 0 내지 4의 정수이다. 일부 양태에서, m은 0, 1, 또는 2이다. 일부 양태에서, m은 0이다. 일부 양태에서, 절단성 링커는 발린-알라닌-p-아미노벤질카바메이트 또는 발린-시트룰린-p-아미노벤질카바메이트이다.
일부 양태에서, 고정 모이어티는 하기를 포함한다:
.
일부 양태에서, 방법은 (i) 서열번호: 41 내지 112 중 어느 하나에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 페이로드, 및 (ii) 표 1 또는 표 2의 링커 조합으로부터 선택된 링커를 포함한다.
일부 양태에서, 페이로드는 콜레스테롤에 접합된다. 일부 양태에서, 페이로드는 5'GbsCbsAbsdAsdGsdAsdTs(5MdC)s(5MdC)s(5MdC)sdGsdGsdAsdTsdTs(5MdC)sdGsGbsTbsCb3'를 포함하며, 여기서 Nb는 LNA이고, dN은 DNA이고, (5MdC)는 5-메틸-dC이고, s는 포스포로티오에이트이고, TEG는 트리에틸렌 글리콜이고, HEG는 헥사에틸렌 글리콜이다. 일부 양태에서, 페이로드는 TEG-HEG에 의해 콜레스테롤에 연결된다.
일부 양태에서, 세포외 소포는 농도가 적어도 약 1x1011, 적어도 약 2x1011, 적어도 약 3x1011, 적어도 약 4x1011, 적어도 약 5x1011, 적어도 약 6x1011, 적어도 약 7x1011, 적어도 약 8x1011, 적어도 약 9x1011, 적어도 약 1x1012, 적어도 약 2x1012, 적어도 약 3x1012, 적어도 약 4x1012, 적어도 약 5x1012, 적어도 약 6x1012, 적어도 약 7x1012, 적어도 약 8x1012, 적어도 약 9x1012, 적어도 약 1x1013, 적어도 약 2x1013, 적어도 약 3x1013, 적어도 약 4x1013, 적어도 약 5x1013, 적어도 약 6x1013, 적어도 약 7x1013, 적어도 약 8x1013, 적어도 약 9x1013, 또는 적어도 약 1x1014개의 입자/mL이다. 일부 양태에서, 세포외 소포는 농도가 약 1x1012 내지 약 5x1013개의 입자/mL, 약 1x1012 내지 약 4x1013개의 입자/mL, 약 1x1012 내지 약 3x1013개의 입자/mL, 약 1x1012 내지 약 2x1013개의 입자/mL, 약 2x1012 내지 약 5x1013개의 입자/mL, 약 2x1012 내지 약 4x1013개의 입자/mL, 약 2x1012 내지 약 3x1013개의 입자/mL, 약 2x1012 내지 약 2x1013개의 입자/mL, 약 3x1012 내지 약 5x1013개의 입자/mL, 약 3x1012 내지 약 4x1013개의 입자/mL, 약 3x1012 내지 약 3x1013개의 입자/mL, 약 3x1012 내지 약 2x1013개의 입자/mL, 약 4x1012 내지 약 5x1013개의 입자/mL, 약 4x1012 내지 약 4x1013개의 입자/mL, 약 4x1012 내지 약 3x1013개의 입자/mL, 약 4x1012 내지 약 2x1013개의 입자/mL, 약 5x1012 내지 약 5x1013개의 입자/mL, 약 5x1012 내지 약 4x1013개의 입자/mL, 약 5x1012 내지 약 3x1013개의 입자/mL, 또는 약 5x1012 내지 약 2x1013개의 입자/mL이다. 일부 양태에서, 세포외 소포는 농도가 약 5x1012 내지 약 2x1013개의 입자/mL이다. 일부 양태에서, 세포외 소포는 농도가 약 1x1013개의 입자/mL이다.
일부 양태에서, 세포외 소포체는 세포외 소포체의 막에 단백질을 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 단백질은 프로스타글란딘 F2 수용체 음성 조절인자 (PTGFRN 단백질); 바시긴 (BSG 단백질); 면역글로불린 슈퍼패밀리 구성원 2 (IGSF2 단백질); 면역글로불린 슈퍼패밀리 구성원 3 (IGSF3 단백질); 면역글로불린 슈퍼패밀리 구성원 8 (IGSF8 단백질); 인테그린 베타-1 (ITGB1 단백질); 인테그린 알파-4 (ITGA4 단백질); 4F2 세포-표면 항원 중쇄 (SLC3A2 단백질); ATP 수송체 단백질의 클래스 (ATP1A1, ATP1A2, ATP1A3, ATP1A4, ATP1B3, ATP2B1, ATP2B2, ATP2B3, ATP2B4 단백질); 이의 기능성 단편; 및 이의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 양태에서, 단백질은 PTGFRN 단백질 또는 이의 기능적 단편을 포함한다.
본원에 개시된 방법 중 어느 하나에 의해 제조된 세포외 소포체가 본원에 제공된다.
본 발명은 세포외 소포체의 외부 표면에 상의 페이로드를 포함하는 세포외 소포체를 제공하며, 여기서 세포외 소포체 표면 상의 페이로드의 수는 적어도 약 1000, 적어도 약 2000, 적어도 약 3000, 적어도 약 4000, 적어도 약 5000, 적어도 약 6000, 적어도 약 7000, 적어도 약 8000, 적어도 약 9000, 적어도 약 10,000, 적어도 약 11,000, 적어도 약 12000, 적어도 약 13,000, 적어도 약 14,000, 적어도 약 15,000, 적어도 약 16,000, 적어도 약 17,000, 적어도 약 18,000, 적어도 약 20,000, 적어도 약 22,000, 적어도 약 24,000, 적어도 약 26,000, 적어도 약 28,000, 적어도 약 30,000, 적어도 약 35,000, 또는 적어도 약 40,000이다. 일부 양태에서, 세포외 소포의 표면 상의 페이로드의 수는 약 5,000 내지 약 20,000, 약 6,000 내지 약 20,000, 약 7,000 내지 약 20,000, 약 8,000 내지 약 20,000, 약 9,000 내지 약 20,000, 약 10,000 내지 약 20,000, 약 5,000 내지 약 18,000, 약 6,000 내지 약 18,000, 약 7,000 내지 약 18,000, 약 8,000 내지 약 18,000, 약 9,000 내지 약 18,000, 약 10,000 내지 약 18,000, 약 5,000 내지 약 15,000, 약 6,000 내지 약 15,000, 약 7,000 내지 약 15,000, 약 8,000 내지 약 15,000, 약 9,000 내지 약 15,000, 또는 약 10,000 내지 약 15,000이다. 일부 양태에서, 세포외 소포의 표면 상의 페이로드의 수는 약 10,000 내지 약 15,000이다. 일부 양태에서, 페이로드는 서열번호: 41 내지 112 중 어느 하나에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 본원에 개시된 세포외 소포의 페이로드는 스테롤, GM1, 지질, 인지질, 비타민, 소분자, 펩티드 또는 이들의 조합에 접합된다. 일부 양태에서, 페이로드는 콜레스테롤에 접합된다. 일부 양태에서 페이로드는 하기 구조를 포함한다: 5'GbsCbsAbsdAsdGsdAsdTs(5MdC)s(5MdC)s(5MdC)sdGsdGsdAsdTsdTs(5MdC)sdGsGbsTbsCb3', 여기서 Nb는 LNA이고, dN은 DNA이고, (5MdC)는 5-메틸-dC이고, s는 포스포로티오에이트이다.
본 개시내용은 본원에 기재된 임의의 세포외 소포체를 포함하는 세포외 소포체 집단을 추가로 제공한다. 일부 양태에서, 세포외 소포체의 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100%는 본원에 기재된 세포외 소포체 중 어느 하나의 세포외 소포체이다.
또한 본원에는 본원에 기재된 임의의 세포외 소포체 또는 세포외 소포체의 집단을 포함하는 조성물이 제공된다. 본원에 기재된 세포외 소포체 또는 세포외 소포체의 집단을 포함하는 약학적 조성물이 본원에 제공된다.
또한, 본원에 기재된 세포외 소포체 또는 세포외 소포체의 집단을 투여하는 단계를 포함하는, 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 병태를 치료하는 방법이 제공된다.
도 1a는 세포외 소포체의 ASO 로딩에 대한 시간 및 온도 증가의 효과를 보여준다. 도 1b는 초원심분리(UC)와 Capto Core 700 수지(CC700)를 사용한 크로마토그래피로 크린업(clean up)한 후 EV에 로드된 ASO의 농도를 보여준다.
도 2a 및 2b는 본원에 개시된 페이로드(예를 들어, ASO)를 접합시키는 데 사용될 수 있는 2개의 예시적인 콜레스테롤 모이어티의 예시를 제공한다. 도 2a는 Chol2의 구조를 제공한다. 도 2b는 Chol4의 구조를 제공한다.
도 3a, 3b, 3c, 3d, 3e, 3f 및 3g는 본원에 제공된 로딩 방법을 사용하여 EV에 로딩할 수 있는 예시적인 ASO에 대한 서열을 나열하는 표를 제공한다. 도 3a에서, ASO는 STAT6 전사체를 표적으로 한다. 도 3b에서, ASO는 KRAS 전사체를 표적으로 한다. 도 3c에서, ASO는 NRAS 전사체를 표적으로 한다. 도 3d에서, ASO는 PMP22 전사체를 표적으로 한다. 도 3e에서, ASO는 C/ EBPβ 전사체를 표적으로 한다. 도 3f에서, ASO는 STAT3 전사체를 표적으로 한다. 도 3g에서, ASO는 NLRP3 전사체를 표적으로 한다.
도 4는 다양한 양의 마우스 및 인간 STAT6 표적화 ASO가 로딩된 EV로 처리한 후 간에서의 STAT6 발현의 녹다운을 보여준다. 다양한 EV의 특정 ASO 밀도는 괄호 안에 표시된다. STAT6 발현은 대조군(PBS 단독 처리 또는 비히클 대조군으로 처리)에 대해 정규화된 것으로 나타난다.
도 5는 상이한 지질-링커로 합성된 4개의 상이한 ASO 서열에 대한 로딩 밀도(EV당 ASO)의 비교를 제공한다. ASO는 녹색 형광 단백질("EGFP"), 반딧불이 루시퍼라제("FFLUC"), 레닐라 루시퍼라제("RLUC") 및 치료 유전자("치료 유전자") 중 하나를 표적으로 하였다. Toco= 토코페롤, Chol = 콜레스테롤, Pal=팔미테이트, C6=헥사메틸렌, C8=옥타메틸렌, TEG =테트라에틸렌 글리콜, HEG = 헥사에틸렌 글리콜.
도 2a 및 2b는 본원에 개시된 페이로드(예를 들어, ASO)를 접합시키는 데 사용될 수 있는 2개의 예시적인 콜레스테롤 모이어티의 예시를 제공한다. 도 2a는 Chol2의 구조를 제공한다. 도 2b는 Chol4의 구조를 제공한다.
도 3a, 3b, 3c, 3d, 3e, 3f 및 3g는 본원에 제공된 로딩 방법을 사용하여 EV에 로딩할 수 있는 예시적인 ASO에 대한 서열을 나열하는 표를 제공한다. 도 3a에서, ASO는 STAT6 전사체를 표적으로 한다. 도 3b에서, ASO는 KRAS 전사체를 표적으로 한다. 도 3c에서, ASO는 NRAS 전사체를 표적으로 한다. 도 3d에서, ASO는 PMP22 전사체를 표적으로 한다. 도 3e에서, ASO는 C/ EBPβ 전사체를 표적으로 한다. 도 3f에서, ASO는 STAT3 전사체를 표적으로 한다. 도 3g에서, ASO는 NLRP3 전사체를 표적으로 한다.
도 4는 다양한 양의 마우스 및 인간 STAT6 표적화 ASO가 로딩된 EV로 처리한 후 간에서의 STAT6 발현의 녹다운을 보여준다. 다양한 EV의 특정 ASO 밀도는 괄호 안에 표시된다. STAT6 발현은 대조군(PBS 단독 처리 또는 비히클 대조군으로 처리)에 대해 정규화된 것으로 나타난다.
도 5는 상이한 지질-링커로 합성된 4개의 상이한 ASO 서열에 대한 로딩 밀도(EV당 ASO)의 비교를 제공한다. ASO는 녹색 형광 단백질("EGFP"), 반딧불이 루시퍼라제("FFLUC"), 레닐라 루시퍼라제("RLUC") 및 치료 유전자("치료 유전자") 중 하나를 표적으로 하였다. Toco= 토코페롤, Chol = 콜레스테롤, Pal=팔미테이트, C6=헥사메틸렌, C8=옥타메틸렌, TEG =테트라에틸렌 글리콜, HEG = 헥사에틸렌 글리콜.
본 개시내용은 EV에(예를 들어, EV의 외부 표면 상에) 페이로드(예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오티드)를 로딩하는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 로딩 공정의 하나 이상의 매개변수(본원에서는 "로딩 매개변수"로 지칭됨)를 조절(예를 들어, 증가 또는 감소)하는 단계를 포함한다. 일부 양태에서, 하나 이상의 매개변수는 염 농도, 로딩 온도, 로딩 지속시간, 페이로드 공급물 농도, EV 공급물 농도, 또는 이들의 조합을 포함한다. 본원에 입증된 바와 같이, 하나 이상의 매개변수를 조절하면 EV에(예를 들어 EV의 외부 표면 상에) 로딩되는 페이로드의 양이 증가할 수 있다. 다양한 양태의 비제한적인 예가 본 개시내용에 제시되어 있다.
본 개시내용을 더 자세히 설명하기 전에, 본 개시내용은 설명된 특정 조성 또는 공정 단계에 제한되지 않고, 물론 다양할 수 있음을 이해해야 한다. 본 개시내용을 읽을 때 당업자에게 명백할 바와 같이, 본원에 기재되고 예시된 개별 양태 각각은 본 발명의 범위 또는 사상을 벗어나지 않으면서 임의의 다른 여러 양태의 특징과 쉽게 분리되거나 조합될 수 있는 별개의 성분및 특징을 갖는다. 임의의 인용 방법은 언급된 사건의 순서나 논리적으로 가능한 다른 순서로 수행될 수 있다.
본원에 제공된 제목은 명세서 전체를 참조하여 정의될 수 있는 본 개시내용의 다양한 양태의 제한이 아니다. 또한, 본 개시내용의 범위는 첨부된 청구범위에 의해서만 제한될 것이기 때문에, 본원에 사용된 용어는 단지 특정 양태를 설명하기 위한 것이며 제한하려는 의도가 아님을 이해하여야 한다.
따라서 바로 아래에 정의된 용어들은 본 명세서 전체를 참조함으로써 보다 완전하게 정의된다.
I. 정의
본 설명을 보다 쉽게 이해할 수 있도록 하기 위해, 특정 용어를 먼저 정의한다. 추가적인 정의는 상세한 설명 전반에 걸쳐 제시된다.
용어 "a" 또는 "an" 독립체는 해당 독립체 중 하나 이상을 지칭하고; 예를 들어, "뉴클레오티드 서열"은 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 나타내는 것으로 이해된다. 이와 같이, 용어 "a"(또는 "an"), "하나 이상" 및 "적어도 하나"는 본원에서 상호교환적으로 사용될 수 있다. 청구범위는 임의의 선택적 요소를 배제하도록 작성될 수 있음에 추가로 유의한다. 이와 같이, 이 진술은 청구항 요소의 인용 또는 "부정적" 제한의 사용과 관련하여 "단독(solely)", "단지(only)" 등과 같은 이러한 배타적 용어 사용에 대한 선행적 근거의 역할을 하기 위한 것이다.
또한, 본원에 사용된 "및/또는"은 다른 두 가지가 있거나 없는 2개의 지정된 특징 또는 성분각각의 특정 개시로 간주되어야 한다. 따라서, 본원에서 "A 및/또는 B"와 같은 어구에서 사용되는 용어 "및/또는"은 "A 및 B," "A 또는 B," "A" (단독), 및 "B" (단독)를 포함하기 위한 것이다. 마찬가지로, "A, B, 및/또는 C"와 같은 어구에서 사용되는 용어 "및/또는"은 다음의 각각의 양태를 포함하는 것으로 의도된다: A, B, 및 C; A, B, 또는 C; 또는 C; 또는 B; B 또는 C; 및 C; 및 B; B 및 C; (단독); B (단독); 및 C (단독).
본원에서 "포함하는(comprising)"이라는 표현으로 양태를 설명할 때마다, 그렇지 않으면 "구성되는" 및/또는 "본질적으로 구성되는"이라는 용어로 설명된 유사한 양태도 제공되는 것으로 이해된다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 개시내용이 관련된 기술분야에 통상의 지식을 갖는 사람에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 예를 들어, 문헌[Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2nd ed., 2002, CRC Press; The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3rd ed., 1999, Academic Press; and the Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Revised, 2000, Oxford University Press]는 당업자에게 본 개시내용에 사용된 많은 용어의 일반 사전을 제공한다.
단위, 접두사 및 기호는 Systeme International de Unites(SI) 허용 형식으로 표시된다. 숫자 범위에는 범위를 한정하는 숫자가 포함된다. 값의 범위가 언급되는 경우, 해당 범위의 언급된 상한과 하한 사이의 각 중간 정수 값 및 각 분수도 해당 값 사이의 각 하위 범위와 함께 구체적으로 개시되는 것으로 이해되어야 한다. 임의의 범위의 상한 및 하한은 독립적으로 범위에 포함되거나 제외될 수 있으며, 어느 하나, 둘 다 포함되지 않거나 둘 다 포함되지 않는 각 범위도 본 개시내용에 포함된다. 따라서, 본원에 언급된 범위는 언급된 종점을 포함하여 범위 내의 모든 값을 약칭하는 것으로 이해된다. 예를 들어, 1 내지 10의 범위는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 및 10으로 구성된 군으로부터 선택된 임의의 숫자, 숫자 조합 또는 하위 범위를 포함하는 것으로 이해된다.
값이 명시적으로 언급된 경우, 언급된 값과 거의 동일한 수량 또는 양의 값도 본 개시내용의 범위 내에 있는 것으로 이해되어야 한다. 조합이 개시되는 경우, 해당 조합 요소의 각 하위 조합도 구체적으로 개시되며 이는 본 개시내용의 범위 내에 있다. 반대로, 상이한 성분 또는 성분들의 기가 개별적으로 개시되는 경우, 이의 조합도 개시된다. 개시내용의 임의의 요소가 복수의 대안을 갖는 것으로 개시되는 경우, 각 대안이 단독으로 또는 다른 대안과의 조합으로 제외되는 개시내용의 예도 이에 의해 개시되고; 개시내용의 하나 초과의 요소는 그러한 제외 사항을 가질 수 있으며, 그러한 제외 사항을 갖는 요소들의 모든 조합이 이에 의해 개시된다.
뉴클레오티드는 일반적으로 허용 가능한 단일 문자 코드로 지칭된다. 달리 표시되지 않는 한, 뉴클레오티드 서열은 5'에서 3' 방향으로 왼쪽에서 오른쪽으로 기록된다. 뉴클레오티드는 IUPAC-IUB 생화학 명명법 위원회(Biochemical Nomenclature Commission)에서 권장하는 일반적으로 알려진 한 문자 기호로 본원에서 지칭된다. 따라서 A는 아데닌, C는 시토신, G는 구아닌, T는 티민, 그리고 U는 우라실을 나타낸다.
아미노산 서열은 아미노에서 카복시 방향으로 왼쪽에서 오른쪽으로 기록된다. 아미노산은 일반적으로 알려진 세 글자 기호 또는 IUPAC-IUB 생화학 명명법 위원회에서 권장하는 한 글자 기호로 본원에서 지칭된다.
용어 "약"은 본원에서 대략, 거의, 약 또는 영역을 의미하는 것으로 사용된다. "약"이라는 용어가 수치 범위와 함께 사용되는 경우, 이는 명시된 수치 값 위아래로 경계를 확장하여 해당 범위를 수정한다. 일반적으로, "약"이라는 용어는 예를 들어 10%, 위 또는 아래(더 높거나 낮음)의 변동에 의해 언급된 값 위 및 아래의 수치를 수정할 수 있다.
용어 "투여", "투여하는" 및 이의 문법적 변형은 본 개시내용의 EV와 같은 조성물을 약제학적으로 허용 가능한 경로를 통해 대상체에게 도입하는 것을 지칭한다. 본 개시내용의 EV와 같은 조성물을 대상체에게 도입하는 것은 종양내로, 경구로, 폐로, 비강내로, 비경구로 (정맥내로, 동맥내로, 근육내로, 복강내로, 또는 피하로), 직장으로, 림프내로, 척추강내로, 안구주위로 또는 국소적으로를 포함하여 임의의 적합한 경로에 의해 이루어진다. 투여에는 자가 투여와 타인에 의한 투여가 포함된다. 적합한 투여 경로는 조성물 또는 제제가 의도된 기능을 수행하도록 허용한다. 예를 들어, 적합한 경로가 정맥내인 경우, 대상체의 정맥에 조성물 또는 제제를 도입함으로써 조성물이 투여된다.
본원에 사용된 용어 "효능제"는 수용체에 결합하고 수용체를 활성화하여 생물학적 반응을 생성하는 분자를 지칭한다. 수용체는 내인성 또는 외인성 효능제에 의해 활성화될 수 있다. 내인성 효능제의 비제한적인 예에는 호르몬, 신경전달물질 및 환형 디뉴클레오티드가 포함된다. 외인성 효능제의 비제한적인 예에는 약물, 소분자 및 환형 디뉴클레오티드가 포함된다. 효능제는 전체, 부분 또는 역효능제일 수 있다.
"아미노산 치환"이라는 용어는 모 서열 또는 참조 서열(예를 들어 야생형 서열)에 존재하는 아미노산 잔기를 다른 아미노산 잔기로 대체하는 것을 지칭한다. 아미노산은 예를 들어 화학적 펩티드 합성을 통해 또는 당업계에 공지된 재조합 방법을 통해 모 서열 또는 참조 서열(예를 들어 야생형 폴리펩티드 서열)에서 치환될 수 있다. 따라서, "X 위치에서의 치환"에 대한 언급은 X 위치에 존재하는 아미노산이 대체 아미노산 잔기로 치환되는 것을 지칭한다. 일부 양태에서, 치환 패턴은 AnY 스키마에 따라 기재될 수 있으며, 여기서 A는 위치 n에 자연적으로 또는 원래 존재하는 아미노산에 상응하는 단일 문자 코드이고, Y는 치환 아미노산 잔기이다. 일부 양태에서, 치환 패턴은 An(YZ) 스키마에 따라 기재될 수 있으며, 여기서 A는 위치 n에 자연적으로 또는 원래 존재하는 아미노산을 치환하는 아미노산 잔기에 해당하는 단일 문자 코드이고, Y와 Z는 A를 대체할 수 있는 대체 치환 아미노산 잔기이다.
"음이온" 및 "양이온"이라는 용어는 각각 음으로 하전된 이온과 양으로 하전된 이온을 지칭한다. "2가" 양이온은 원자가가 2+인 양이온을 지칭한다. 2가 양이온의 예는 Ca2 +, Mg2 +, Co2 +, Ni2 +, Zn2 +, Ba2 +, Sr2 +, Al2 +, Ag2 +, Cu2 +, 및 Mn2 +을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. "1가" 양이온은 원자가가 1+인 양이온을 지칭한다. 1가 양이온의 예는 Li+, K+, Na+, NH4 +, Cu+을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 음이온의 예는 SCN-, Cl-, SO4 -, 및 PO4을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 양태에서, 음이온 및/또는 양이온(예를 들어, 1가 양이온 또는 2가 양이온)은 염, 예를 들어 상보적 원자가의 적어도 하나의 음이온 및 적어도 하나의 양이온의 혼합물에 존재할 수 있다. 본원에 개시된 음이온 또는 양이온을 포함하는 임의의 염은 본원에 개시된 방법에 사용될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "길항제"는 수용체에 결합할 때 생물학적 반응 자체를 유발하기보다는 효능제 매개 반응을 차단하거나 약화시키는 분자를 지칭한다. 많은 길항제는 수용체의 구조적으로 정의된 결합 부위에서 내인성 리간드 또는 기질과 경쟁하여 효능을 얻는다. 길항제의 비제한적인 예에는 알파 차단제, 베타 차단제 및 칼슘 채널 차단제가 포함된다. 길항제는 경쟁적, 비경쟁적(non-competitive), 또는 불경쟁적(uncompetitive) 길항제일 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "항체"는 천연 또는 부분적으로 또는 전적으로 합성적으로 생산되는 면역글로불린 및 이의 단편을 포괄한다. 이 용어는 또한 면역글로불린 결합 도메인과 상동인 결합 도메인을 갖는 임의의 단백질을 포함한다. "항체"는 항원에 특이적으로 결합하고 인식하는 면역글로불린 유전자 또는 이의 단편으로부터의 프레임워크 영역을 포함하는 폴리펩티드를 추가로 포함한다. 용어 항체의 사용은 전체 항체, 다클론성, 단클론성 및 재조합 항체, 이들의 단편을 포함하는 것을 의미하며, 단쇄 항체, 인간화된 항체, 쥣과 항체, 키메라, 마우스-인간, 마우스-영장류, 영장류-인간 단클론 항체, 항-개체특이형 항체, 항체 단편, 예컨대, scFv, (scFv)2, Fab, Fab', 및 F(ab')2, F(ab1)2, Fv, dAb, 및 Fd 단편, 디아바디, 및 항체 관련 폴리펩티드를 추가로 포함한다. 항체는 원하는 생물학적 활성이나 기능을 나타내는 한 이중특이성 항체와 다중특이성 항체를 포함한다. 본 개시내용의 일부 양태에서, 생물학적 활성 분자는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 분자이다.
용어 "항체-약물 접합체" 및 "ADC"는 상호교환적으로 사용되며, 예를 들어 치료제(때때로 본원에서 제제, 약물 또는 활성 약제학적 성분으로 지칭됨) 또는 제제에 공유결합된 항체를 지칭한다. 본 개시내용의 일부 양태에서, 생물학적 활성 분자는 항체-약물 접합체이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "대략"은 하나 이상의 관심 값에 적용되는 것으로서 언급된 참조 값과 유사한 값을 지칭한다. 특정 양태에서, 용어 "대략"은 달리 언급되거나 문맥으로부터 달리 명백하지 않는 한, 언급된 참조 값의 어느 한 방향 (초과 또는 미만)에서 (이러한 수가 가능한 값의 100%를 초과하는 경우는 제외)에서 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 또는 그 미만 내에 속하는 값의 범위를 지칭한다.
"아릴"이라는 용어는 탄소환식 방향족 기를 지칭한다. 아릴 기의 예는 페닐, 나프틸 및 안트라세닐을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 탄소환식 방향족 기는 비치환되거나 -C1-8 알킬, -O-(C1-8 알킬), -아릴, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2-, -NHC(O)R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, -할로겐, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2 및 -CN를 포함하지만 이에 제한되지 않는 하나 이상의 기로 치환될 수 있고, 각각의 R'는 독립적으로 H, -C1-8 알킬, 또는 아릴이다.
"아릴렌"이라는 용어는 2개의 공유 결합을 가지며 다음 구조에 표시된 대로 오르토, 메타 또는 파라 배열일 수 있는 아릴 기를 지칭한다.
여기서 페닐 기는 비치환되거나, 비치환되거나 -C1-8 알킬, -O-(C1-8 알킬), -아릴, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2-, -NHC(O)R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, -할로겐, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2 및 -CN를 포함하지만 이에 제한되지 않는 최대 4개의 기로 치환될 수 있고, 각각의 R'는 독립적으로 H, -C1-8 알킬, 또는 아릴이다.
본원에 사용된 용어 "아릴알킬" 또는 "아랄킬"은 아릴 기 또는 헤테로아릴 기가 알킬 기에 부착되어 -알킬-아릴 및 -알킬-헤테로아릴 라디칼을 생성하는 라디칼을 포함하는 의미이며, 여기서 알킬, 아릴 및 헤테로아릴은 본원에 정의되어 있다. 예시적인 "아릴알킬" 또는 "아랄킬" 기는 벤질, 펜에틸, 피리딜메틸 등을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "아릴옥시"는 -O-아릴 기를 지칭하며, 여기서 아릴은 본원에 정의된 바와 같다. 특정 양태에서, 아릴옥시 기의 아릴 부분은 페닐 또는 나프틸이다.
용어 "헤테로아릴" 또는 "헤테로방향족"은 N, O, S, Si 및 B (예를 들어, N, O 및 S)로부터 선택된 적어도 하나의 헤테로원자 (예를 들어, 1 내지 5 헤테로원자, 예컨대 1-3 헤테로원자) 를 함유하는 다중불포화된, 5-, 6- 또는 7-원 방향족 모이어티 를 지칭하고, 질소 및 황 원자는 선택적으로 산화되고, 질소 원자(들)는 선택적으로 사차화된다. "헤테로아릴" 기는 단일 고리일 수 있거나 다른 아릴, 헤테로아릴, 사이클로알킬 또는 헤테로사이클로알킬 고리(예를 들어, 1 내지 3개의 다른 고리)에 융합될 수 있다. "헤테로아릴" 기가 융합된 아릴, 사이클로알킬 또는 헤테로사이클로알킬 고리를 포함하는 경우, "헤테로아릴" 기는 헤테로아릴 고리를 통해 분자의 나머지에 부착된다. 헤테로아릴 기는 탄소 또는 헤테로원자를 통해 분자의 나머지에 부착될 수 있다.
일부 양태에서, 헤테로아릴 기는 4 내지 10개의 탄소 원자 및 O, S 및 N으로부터 선택된 1 내지 5개의 헤테로원자를 갖는다. 헤테로아릴 기의 비제한적인 예는 피리딜, 피리미디닐, 퀴놀리닐, 벤조티에닐, 인돌릴, 인돌리닐, 피리다지닐, 피라지닐, 이소인돌릴, 이소퀴놀릴, 퀴나졸리닐, 퀴녹살리닐, 프탈라지닐, 이미다졸릴, 이속사졸릴, 피라졸릴, 옥사졸릴, 티아졸릴, 인돌리지닐, 인다졸릴, 벤조티아졸릴, 벤즈이미다졸릴, 벤조푸라닐, 푸라닐, 티에닐, 피롤릴, 옥사디아졸릴, 티아디아졸릴, 트리아졸릴, 테트라졸릴, 이소티아졸릴, 나프티리디닐, 이소크로마닐, 크로마닐, 테트라하이드로이소퀴놀리닐, 이소인돌리닐, 이소벤조테트라하이드로푸라닐, 이소벤조테트라하이드로티에닐, 이소벤조티에닐, 벤즈옥사졸릴, 피리도피리딜, 벤조테트라하이드로푸라닐, 벤조테트라하이드로티에닐, 퓨리닐, 벤조디옥솔릴, 트리아지닐, 프테리디닐, 벤조티아졸릴, 이미다조피리딜, 이미다조티아졸릴, 디하이드로벤즈이속사지닐, 벤즈이속사지닐, 벤즈옥사지닐, 디하이드로벤즈이소티아지닐, 벤조파이라닐, 벤조티오피라닐, 크로모닐, 크로마노닐, 피리딜-N-산화물, 테트라하이드로퀴놀리닐, 디하이드로퀴놀리닐, 디하이드로퀴놀리노닐, 디하이드로이소퀴놀리노닐, 디하이드로쿠마리닐, 디하이드로이소쿠마리닐, 이소인돌리노닐, 벤조디옥사닐, 벤즈옥사졸리노닐, 피롤릴 N-산화물, 피리미디닐 N-산화물, 피리다지닐 N-산화물, 피라지닐 N-산화물, 퀴놀리닐 N-산화물, 인돌릴 N-산화물, 인돌리닐 N-산화물, 이소퀴놀릴 N-산화물, 퀴나졸리닐 N-산화물, 퀴녹살리닐 N-산화물, 프탈라지닐 N-산화물, 이미다졸릴 N-산화물, 이속사졸릴 N-산화물, 옥사졸릴 N-산화물, 티아졸릴 N-산화물, 인돌리지닐 N-산화물, 인다졸릴 N-산화물, 벤조티아졸릴 N-산화물, 벤즈이미다졸릴 N-산화물, 피롤릴 N-산화물, 옥사디아졸릴 N-산화물, 티아디아졸릴 N-산화물, 트리아졸릴 N-산화물, 테트라졸릴 N-산화물, 벤조티오피라닐 S-산화물, 벤조티오피라닐 S,S-디옥사이드를 포함한다. 예시적인 헤테로아릴 기는 이미다졸릴, 피라졸릴, 티아디아졸릴, 트리아졸릴, 이속사졸릴, 이소티아졸릴, 이미다졸릴, 티아졸릴, 옥사디아졸릴, 및 피리딜을 포함한다. 다른 예시적인 헤테로아릴 기는 1-피롤릴, 2-피롤릴, 3-피롤릴, 3-피라졸릴, 2-이미다졸릴, 4-이미다졸릴, 피라지닐, 2-옥사졸릴, 4-옥사졸릴, 2-페닐-4-옥사졸릴, 5-옥사졸릴, 3-이속사졸릴, 4-이속사졸릴, 5-이속사졸릴, 2-티아졸릴, 4-티아졸릴, 5-티아졸릴, 2-퓨릴, 3-퓨릴, 2-티에닐, 3-티에닐, 2-피리딜, 3-피리딜, 피리딘-4-일, 2-피리미딜, 4-피리미딜, 5-벤조티아졸릴, 퓨리닐, 2-벤즈이미다졸릴, 5-인돌릴, 1-이소퀴놀릴, 5-이소퀴놀릴, 2-퀴녹살리닐, 5-퀴녹살리닐, 3-퀴놀릴, 및 6-퀴놀릴을 포함한다. 상기 언급된 아릴 및 헤테로아릴 고리 시스템 각각에 대한 치환기는 아래에 설명된 허용되는 아릴 기 치환기의 군으로부터 선택된다.
본원에 사용된 용어 "알킬"은 그 자체로 또는 다른 치환기의 일부로서 달리 명시되지 않는 한, 지정된 탄소 원자 수(예를 들어 C1-C10은 1 내지 10개의 탄소 원자를 의미)를 갖는 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소 라디칼을 의미한다. 전형적으로, 알킬 기는 1 내지 24개의 탄소 원자, 예를 들어 1 내지 10개의 탄소 원자, 1 내지 8개의 탄소 원자 또는 1 내지 6개의 탄소 원자를 가질 것이다. "저급 알킬" 기는 1 내지 4개의 탄소 원자를 갖는 알킬 기이다. "알킬"이라는 용어에는 2가 및 다가 라디칼이 포함된다. 예를 들어, 용어 "알킬"은 적절한 경우, 예를 들어 화학식이 알킬 기가 2가임을 나타내는 경우 또는 치환기가 연결되어 고리를 형성하는 경우 "알킬렌"을 포함한다. 알킬 라디칼의 비제한적인 예는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소-프로필, n-부틸, tert-부틸, 이소-부틸, sec-부틸, 뿐만 아니라 예를 들어, n-펜틸, n-헥실, n-헵틸 및 n-옥틸의 동형체 및 이성질체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
용어 "알킬렌"은 그 자체로 또는 다른 치환기의 일부로서 2가(디라디칼) 알킬 기를 의미하며, 여기서 알킬은 본원에서 정의된다. "알킬렌"은 -CH2CH2CH2CH2-로 예시되지만 이에 제한되지는 않는다. 일부 양태에서, "알킬렌" 기는 1 내지 24개의 탄소 원자, 예를 들어 10개 이하의 탄소 원자(예를 들어, 1 내지 8개 또는 1 내지 6개의 탄소 원자)를 포함한다. "저급 알킬렌" 기는 1 내지 4개의 탄소 원자를 갖는 알킬렌 기이다.
용어 "알케닐"은 그 자체로 또는 다른 치환기의 일부로서 2 내지 24개의 탄소 원자 및 적어도 하나의 이중 결합을 갖는 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소 라디칼을 지칭한다. 일반적인 알케닐 기는 2 내지 10개의 탄소 원자 및 적어도 하나의 이중 결합을 가지고 있다. 특정 양태에서, 알케닐 기는 2 내지 8개의 탄소 원자 또는 2 내지 6개의 탄소 원자 및 1 내지 3개의 이중 결합을 갖는다. 예시적인 알케닐 기는 비닐, 2-프로페닐, 1-부트-3-에닐, 크로틸, 2-(부타디에닐), 2,4-펜타디에닐, 3-(1,4-펜타디에닐), 2-이소펜테닐, 1-펜트-3-에닐, 1-헥스-5-에닐 등을 포함한다.
용어 "알키닐"은 그 자체로 또는 다른 치환기의 일부로서 2 내지 24개의 탄소 원자 및 적어도 하나의 삼중 결합을 갖는 직쇄 또는 분지쇄, 불포화 또는 다중불포화 탄화수소 라디칼을 지칭한다. 전형적인 "알키닐" 기는 2 내지 10개의 탄소 원자와 적어도 하나의 삼중 결합을 갖는다. 본 개시내용의 한 양태에서, 알키닐 기는 2 내지 6개의 탄소 원자 및 적어도 하나의 삼중 결합을 갖는다. 예시적인 알키닐 기는 프로프-1-이닐, 프로프-2-이닐(즉, 프로파르길), 에티닐 및 3-부티닐을 포함한다.
"알콕시", "알킬아미노" 및 "알킬티오"(또는 티오알콕시)라는 용어는 통상적인 의미로 사용되며, 산소 원자, 아미노 기 또는 황 원자 각각을 통해 분자의 나머지에 부착된 알킬 기를 지칭한다.
용어 "헤테로알킬"은 단독으로 또는 다른 용어와 함께, 명시된 수의 탄소 원자(예를 들어 C2-C10, 또는 C2-C8) 및 예를 들어 N, O, S, Si, B 및 P(특정 양태에서는 N, O와 S)로부터 선택된 적어도 하나의 헤테로원자로 구성된 안정한 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소 라디칼을 지칭하고, 여기서 질소, 황 및 인 원자는 선택적으로 산화되고, 질소 원자(들)는 선택적으로 사차환된다. 헤테로원자(들)는 헤테로알킬 기의 내부 위치에 위치한다. 헤테로알킬 기의 예는 -CH2-CH2-O-CH3, -CH2-CH2-NH-CH3, -CH2-CH2-N(CH3)-CH3, -CH2-S-CH2-CH3, -CH2-CH2-S(O)-CH3, -CH2-CH2-S(O)2-CH3, -CH=CH-O-CH3, -CH2-Si(CH3)3, -CH2-CH=N-OCH3, 및 -CH=CH-N(CH3)-CH3을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 예를 들어 -CH2-NH-OCH3 및 -CH2-O-Si(CH3)3와 같이 최대 2개의 헤테로원자가 연속될 수 있다.
용어 "헤테로알킬렌"은 그 자체로 또는 또 다른 치환기의 일부로서 -CH2-CH2-S-CH2-CH2 및 -CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2로 예시되지만 그에 제한되지 않은 헤테로알킬로부터 유도된 2가 라디칼을 지칭한다. 전형적으로, 헤테로알킬 기는 3 내지 24개의 원자(탄소 및 헤테로원자, 수소 제외)(3- 내지 24-원 헤테로알킬)를 가질 것이다. 또 다른 예에서, 헤테로알킬 기는 총 3 내지 10개의 원자(3- 내지 10-원 헤테로알킬) 또는 3 내지 8개의 원자(3- 내지 8-원 헤테로알킬)를 갖는다. 용어 "헤테로알킬"은 적절한 경우, 예를 들어 화학식이 헤테로알킬 기가 2가임을 나타내는 경우 또는 치환기가 연결되어 고리를 형성하는 경우 "헤테로알킬렌"을 포함한다.
용어 "사이클로알킬"은 단독으로 또는 다른 용어와 조합하여 3 내지 24개의 탄소 원자, 예를 들어 3 내지 12개의 탄소 원자를 갖는 포화 또는 불포화, 비-방향족 탄소환식 라디칼을 나타낸다(예를 들어, C3-C8 사이클로알킬 또는 C3-C6 사이클로알킬). 사이클로알킬의 예는 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 사이클로헵틸, 1-사이클로헥세닐, 3-사이클로헥세닐, 사이클로헵틸 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. "사이클로알킬"이라는 용어에는 노르보르닐, 아다만틸 및 바이사이클로[2.2.1]헵틸과 같은 폴리사이클릭 (예를 들어, 바이사이클릭) 구조도 포함된다. "사이클로알킬" 기는 아릴 (예를 들어, 페닐), 헤테로아릴 (예를 들어, 피리딜) 및 비-방향족 (예를 들어, 탄소환식 또는 헤테로사이클릭) 고리로부터 선택된 적어도 하나의 (예를 들어, 1 내지 3개의) 다른 고리 에 융합될 수 있다. "사이클로알킬" 기가 융합된 아릴, 헤테로아릴 또는 헤테로사이클릭 고리를 포함하는 경우, "사이클로알킬" 기는 탄소환식 고리를 통해 분자의 나머지에 부착된다.
용어 "헤테로사이클로알킬," "헤테로사이클릭," "헤테로사이클," 또는 "헤테로사이클릴," 그 자체로 또는 다른 용어들과 조합하여, 예를 들어, N, O, S, Si, B 및 P (예를 들어, N, O 및 S)로부터 선택된 적어도 1개 및 최대 5개의 헤테로원자를 함유하는 탄소환식, 비-방향족 고리 (예를 들어, 3- 내지 8-원 고리 및 예를 들어, 4-, 5-, 6- 또는 7-원 고리) (여기서 질소, 황 및 인 원자는 선택적으로 산화되고, 질소 원자(들)는 선택적으로 사차화됨(예를 들어, 질소, 산소 및 황로부터 선택된 1 내지 4개의 헤테로원자)), 또는 당업자에게 공지된 안정한 조합으로 또는 적어도 1개 및 최대 10개의 헤테로원자 (예를 들어, N, O 및 S로부터 선택된 1 내지 5개의 헤테로원자)를 함유하는4- 내지 8-원 고리의 융합 고리계를 나타낸다. 예시적인 헤테로사이클로알킬 기는 융합된 페닐 고리를 포함한다. "헤테로사이클릭" 기가 융합된 아릴, 헤테로아릴 또는 사이클로알킬 고리를 포함하는 경우, "헤테로사이클릭" 기는 헤테로사이클을 통해 분자의 나머지에 부착된다. 헤테로원자는 헤테로사이클이 분자의 나머지에 부착되는 위치를 차지할 수 있다.
본원에 사용된 용어 " 내지 과 회합된(associated with)"은 제1 모이어티 (예를 들어, 페이로드)와 제2 모이어티 (예를 들어, EV) 사이의 상호작용을 지칭한다. 예를 들어, 일부 양태에서, 제1 모이어티는 제2 모이어티 내에 캡슐화될 수 있다(예를 들어, 페이로드는 EV의 내강에 있을 수 있음). 일부 양태에서, 제1 모이어티는 제2 모이어티에 연결되거나 융합될 수 있다(예를 들어, 페이로드는 EV의 외부 표면 및/또는 내강 표면에 연결될 수 있음).
본원에서 사용되는 용어 "생물학적 활성 분자"는 고정 모이어티를 통해 EV에 부착될 수 있는 임의의 분자를 지칭하며, 여기서 분자는 필요로 하는 대상체에서 치료 또는 예방 효과를 가질 수 있거나, 또는 진단 목적으로 사용될 수 있다. 일부 양태에서, 이러한 관심 분자는 본원에서 "관심 모이어티"로도 지칭된다. 따라서, 예로서, 생물학적 활성 분자라는 용어는 단백질(예를 들어 항체, 단백질, 폴리펩티드 및 이의 유도체, 단편 및 변이체), 지질 및 이의 유도체, 탄수화물(예를 들어 당단백질 내의 글리칸 부분), 또는 소분자를 포함한다. 일부 양태에서, 생물학적 활성 분자는 항원, 보조제(adjuvant), 면역 조절제, 표적화 모이어티, 또는 이들의 조합을 포함한다. 이러한 생물학적 활성 분자의 비제한적인 예는 예를 들어 WO 2020/0191361 A2에 제공되어 있으며, 이는 전체 내용이 참조로 본원에 포함된다. 특정 양태에서, 생물학적 활성 분자는 페이로드 (예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오티드)이다.
본원에 사용된 용어 "C1-8 알킬"은 1 내지 8개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 분지형 포화 탄화수소를 지칭한다. 대표적인 "C1-8 알킬" 기는 메틸, 에틸, n-프로필, n-부틸, n-펜틸, n-헥실, n-헵틸, n-옥틸, 이소프로필, sec-부틸, 이소부틸, tert-부틸, 이소펜틸, 및 2-메틸부틸을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
"C1-10 알킬렌"이라는 용어는 화학식 -(CH2)1-10-의 포화 직쇄 탄화수소 기를 지칭한다. C1-10 알킬렌의 예는 메틸렌, 에틸렌, 프로필렌, 부틸렌, 펜틸렌, 헥실렌, 헵틸렌, 옥틸렌, 노닐렌, 및 데칼렌을 포함한다.
"C3-8 카보사이클"이란 용어는 3원, 4원, 5원, 6원, 7원 또는 8원 포화 또는 불포화 비-방향족 탄소환식 고리를 지칭한다. 대표적인 C3-8 카보사이클은 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로펜타디에닐, 사이클로헥실, 사이클로헥세닐, 1,3-사이클로헥사디에닐, 1,4-사이클로헥사디에닐, 사이클로헵틸, 1,3-사이클로헵타디에닐, 1,3,5-사이클로헵타트리에닐, 사이클로옥틸, 및 -사이클로옥타디에닐을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. C3-8 카보사이클 기는 비치환되거나 -C1-8 알킬, -O-(C1-8 알킬), 아릴, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2-, NHC(O)R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, -할로겐, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2 및 -CN를 포함하지만 이에 제한되지 않는 하나 이상의 기로 치환될 수 있고, 각각의 R'는 독립적으로 H, -C1-8 알킬, 또는 아릴이다.
용어 "C3-8 카보사이클로"는 카보사이클의 수소 원자 중 하나 이상이 결합으로 대체된 상기에 정의된 C3-8 카보사이클 기를 지칭한다.
"C3-8 헤테로사이클"이라는 용어는 고리 탄소 원자 중 1 내지 4개가 독립적으로 O, S 및 N으로 구성된 군으로부터 선택된 헤테로원자로 대체된 방향족 또는 비-방향족 C3-8 카보사이클을 지칭한다. C3-8 헤테로사이클은 벤조푸라닐, 벤조티오펜, 인돌릴, 벤조피라졸릴, 쿠마리닐, 이소퀴놀리닐, 피롤릴, 티오페닐, 푸라닐, 티아졸릴, 이미다졸릴, 피라졸릴, 트리아졸릴, 퀴놀리닐, 피리미디닐, 피리디닐, 피리도닐, 피라지닐, 피리다지닐, 이소티아졸릴, 이속사졸릴 및 테트라졸릴을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. C3-8 헤테로사이클은 비치환되거나, 비치환되거나 -C1-8 알킬, -O-(C1-8 알킬), -아릴, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2-, -NHC(O)R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, -할로겐, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2 및 -CN를 포함하지만 이에 제한되지 않는 최대 7개의 기로 치환될 수 있고, 각각의 R'는 독립적으로 H, -C1-8 알킬, 또는 아릴이다.
용어 "C3-8 헤테로사이클로"는 헤테로사이클 기의 수소 원자 중 1개가 결합으로 대체된 상기 정의된 C3-8 헤테로사이클 기를 지칭한다. C3-8 헤테로사이클로는 비치환되거나, 비치환되거나 -C1-8 알킬, -O-(C1-8 알킬), -아릴, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2-, -NHC(O)R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, -할로겐, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2 및 -CN를 포함하지만 이에 제한되지 않는 최대 6개의 기로 치환될 수 있고, 각각의 R'는 독립적으로 H, -C1-8 알킬, 또는 아릴이다.
"보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체되는 것이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리는 염기성 측쇄 (예를 들어, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄 (예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 무전하 극성 측쇄 (예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 무극성 측쇄 (예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지형 측쇄 (예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄 (예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)을 포함하여 당업계에 정의되어 있다. 따라서 폴리펩티드의 아미노산이 동일한 측쇄 패밀리로부터 다른 아미노산으로 대체되면 치환은 보존적인 것으로 간주된다. 특정 양태에서, 아미노산의 스트링은 측쇄 패밀리 구성원의 순서 및/또는 조성이 다른 구조적으로 유사한 스트링으로 보존적으로 대체될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "보존된"은 비교되는 2개 이상의 서열의 동일한 위치에서 변경되지 않은 채 발생하는 폴리뉴클레오티드 서열 또는 폴리펩티드 서열 각각의 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기를 지칭한다. 상대적으로 보존된 뉴클레오티드 또는 아미노산은 서열의 다른 곳에 나타나는 뉴클레오티드 또는 아미노산보다 더 관련된 서열 사이에서 보존되는 것이다.
일부 양태에서, 2개 이상의 서열은 서로 100% 동일한 경우 "완전히 보존된" 또는 "동일한" 것으로 간주된다. 일부 양태에서, 2개 이상의 서열은 서로 적어도 70% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 90% 동일한, 또는 적어도 95% 동일한 경우 "고도로 보존된" 것으로 간주된다. 일부 양태에서, 2개 이상의 서열은 서로 약 70% 동일한, 약 80% 동일한, 약 90% 동일한, 약 95%, 약 98%, 또는 약 99% 동일한 경우 "고도로 보존된" 것으로 간주된다. 일부 양태에서, 2개 이상의 서열은 서로 적어도 30% 동일한, 적어도 40% 동일한, 적어도 50% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 90% 동일한, 또는 적어도 95% 동일한 경우 "보존된" 것으로 간주된다. 일부 양태에서, 2개 이상의 서열은 서로 약 30% 동일한, 약 40% 동일한, 약 50% 동일한, 약 60% 동일한, 약 70% 동일한, 약 80% 동일한, 약 90% 동일한, 약 95% 동일한, 약 98% 동일한, 또는 약 99% 동일한 경우 "보존된" 것으로 간주된다. 서열 보존은 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 전장에 적용될 수 있거나 이의 부분, 영역 또는 특징에 적용될 수 있다.
용어 "부형제" 및 "담체"는 상호교환적으로 사용되며, 화합물의 투여를 더욱 용이하게 하기 위해 약제학적 조성물에 첨가되는 불활성 물질을 지칭한다.
본원에 사용되는 용어 "세포외 소포체", "EV" 및 이의 문법적 변형은 상호교환적으로 사용되며, 내부 공간을 둘러싸는 막을 포함하는 세포 유래 소포체를 지칭한다. 세포외 소포는 이들이 유래된 세포보다 더 작은 직경을 갖는 모든 막 결합 소포(예를 들어, 엑소좀, 나노소포체)를 포함한다. 일부 양태에서, 세포외 소포는 직경이 20 nm 내지 1000 nm 범위이고, 내부 공간(즉, 내강) 내에, 세포외 소포의 외부 표면 상에 표시되고/되거나 막을 가로지르는 다양한 거대분자 페이로드를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 페이로드는 핵산, 단백질, 탄수화물, 지질, 소분자 및/또는 이의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 특정 양태에서, 세포외 비히클은 엑소좀 단백질을 포함한다. 예로서 그리고 제한 없이, 세포외 소포체는 아폽토시스 바디, 세포의 단편, 직접 또는 간접 조작(예를 들어, 연속 압출 또는 알칼리 용액으로의 처리)에 의해 세포로부터 유래된 소포, 소포형성된 세포소기관, 및 살아있는 세포에 의해 (예를 들어, 직접적인 원형질막 발아 또는 후기 엔도좀과 원형질막과의 융합에 의해) 생산된 소포를 포함한다. 세포외 소포는 살아있는 유기체 또는 죽은 유기체, 외식된 조직 또는 기관, 원핵 또는 진핵 세포, 및/또는 배양된 세포로부터 유래될 수 있다. 일부 양태에서, 세포외 소포체는 하나 이상의 이식유전자 생산물을 발현하는 세포에 의해 생산된다. 달리 명시되지 않는 한, EV는 엑소좀, 나노소포체, 마이크로솜, 미세소포체, 세포외체, 세포사멸체, 또는 이들의 조합을 포함한다. 특정 양태에서, 본 개시내용의 유용한 EV는 엑소좀이다.
본원에서 사용되는 용어 "엑소좀"은 직경이 20 내지 300 nm(예를 들어, 40 내지 200 nm)인 세포외 소포체를 지칭한다. 엑소좀은 내부 공간(즉, 내강)을 둘러싸는 막을 포함하고, 일부 양태에서, 직접 원형질막 발아 또는 후기 엔도좀과 원형질막의 융합에 의해 세포(예를 들어, 생산자 세포)로부터 생산될 수 있다. 특정 양태에서, 엑소좀은 엑소좀 단백질을 포함한다. 하기 기재된 바와 같이, 엑소좀은 생산자 세포로부터 유래될 수 있고, 크기, 밀도, 생화학적 매개변수 또는 이의 조합에 기초하여 생산자 세포로부터 단리될 수 있다. 일부 양태에서, 본 개시내용의 엑소좀은 하나 이상의 이식유전자 산물을 발현하는 세포에 의해 생산된다.
본원에서 사용되는 "기능적 단편"이라는 용어는 단백질 기능을 유지하는 단백질 단편을 지칭한다. 예를 들어, 일부 양태에서, 엑소좀 단백질, 예를 들어, PTGFRN의 기능성 단편은 생물학적 활성 분자를 내강 표면 또는 EV의 외부 표면에 고정하는 능력을 유지한다.
단편이 기능성 단편인지 여부는 EV의 단백질 함량을 결정하기 위한 임의의 공지된 방법, 예를 들어 웨스턴 블롯을 포함하는 엑소좀, FACS 분석 및 단편과 예를 들어 GFP와 같은 자가형광 단백질과의 융합에 의해 평가될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 본 개시내용의 EV의 내강 또는 외부 표면 상의 생물학적 활성 분자를 "고정"시키는 것은 생물학적 활성 분자를 각각 EV의 내강 또는 외부 표면에 공유적으로 부착시키는 것을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "상동성"은 중합체성 분자 사이, 예를 들어 핵산 분자(예를 들어 DNA 분자 및/또는 RNA 분자) 사이 및/또는 폴리펩티드 분자 사이의 전반적인 관련성을 지칭한다. 일반적으로 "상동성"이라는 용어는 두 분자 간의 진화적 관계를 암시한다. 따라서 상동성인 두 분자는 공통의 진화 조상을 갖게 된다. 본 개시내용의 문맥에서, 상동성이라는 용어는 동일성 및 유사성 모두를 포괄한다.
일부 양태에서, 분자 내 모노머의 적어도 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%가 동일하거나(정확히 동일한 모노머) 유사한 경우(보존적 치환), 폴리머 분자는 서로 "상동성"인 것으로 간주된다. "상동성"이라는 용어는 반드시 적어도 2개의 서열(폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열) 간의 비교를 지칭한다.
본 개시내용의 문맥에서, 치환(아미노산 치환으로 지칭되는 경우에도)은 핵산 수준에서 수행되고, 즉, 아미노산 잔기를 대체 아미노산 잔기로 치환하는 것은 제1 아미노산을 인코딩하는 코돈을 제2 아미노산을 인코딩하는 코돈으로 치환함으로써 수행된다.
본원에 사용된 용어 "동일성"은 폴리머 분자 사이, 예를 들어 폴리펩티드 분자 또는 폴리뉴클레오티드 분자(예를 들어 DNA 분자 및/또는 RNA 분자) 사이의 전체 모노머 보존을 지칭한다. 예를 들어, 단백질 A가 단백질 B와 동일하다는 추가 수식어가 없는 "동일"이라는 용어는 서열이 100% 동일함(100% 서열 동일성)을 의미한다. 예를 들어, 두 서열을 "70% 동일함"으로 기재하는 것은 예를 들어 "70% 서열 동일성"을 갖는 것으로 기재하는 것과 동일하다.
예를 들어, 두 폴리펩티드 서열의 동일성 백분율 계산은 최적의 비교 목적을 위해 두 서열을 정렬함으로써 수행될 수 있다(예를 들어, 최적의 정렬을 위해 제1 및 제1 폴리펩티드 서열 중 하나 또는 둘 모두에 갭이 도입될 수 있으며 비교 목적을 위해 동일하지 않은 서열은 무시될 수 있다). 특정 양태에서, 비교 목적을 위해 정렬된 서열의 길이는 기준 서열 길이의 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%이다. 그 다음 해당 아미노산 위치의 아미노산을 비교한다.
제1 서열의 위치가 제2 서열의 해당 위치와 동일한 아미노산으로 점유되면 분자는 해당 위치에서 동일하다. 2개의 서열 사이의 퍼센트 동일성은 2개의 서열의 최적 정렬을 위해 도입될 필요가 있는 갭의 수 및 각각의 갭의 길이를 고려하여, 서열에 의해 공유되는 동일한 위치의 수의 함수이다. 두 서열 사이의 서열 비교 및 동일성 백분율 결정은 수학적 알고리즘을 사용하여 달성될 수 있다.
적합한 소프트웨어 프로그램은 다양한 소스에서 사용할 수 있으며 단백질 및 뉴클레오티드 서열 모두의 정렬에 사용할 수 있다. 서열 동일성 퍼센트을 결정하기 위한 하나의 적절한 프로그램은 미국 정부의 국립 생명공학 정보 센터 BLAST 웹 사이트(blast.ncbi.nlm.nih.gov)에서 이용 가능한 프로그램의 BLAST 제품군의 일부인 bl2seq이다. Bl2seq는 BLASTN 또는 BLASTP 알고리즘을 사용하여 두 서열 간의 비교를 수행한다. BLASTN은 핵산 서열을 비교하는 데 사용하는 반면, BLASTP는 아미노산 서열을 비교하는 데 사용한다. 다른 적합한 프로그램은 예를 들어 EMBOSS 생물정보학 프로그램 제품군의 일부인 Needle, Stretcher, Water 또는 Matcher이며 유럽 생물정보학 연구소(EBI)(worldwideweb.ebi.ac.uk/Tools/psa)에서도 입수할 수 있다.
서열 정렬은 MAFFT, Clustal(ClustalW, Clustal X 또는 Clustal Omega), MUSCLE 등과 같은 당업계에 알려진 방법을 사용하여 수행될 수 있다.
폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 참조 서열과 정렬되는 단일 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 표적 서열 내의 상이한 영역은 각각 자신의 서열 동일성 퍼센트을 가질 수 있다. 서열 동일성 퍼센트 값은 가장 가까운 10분의 1로 반올림됨에 주목한다. 예를 들어 80.11, 80.12, 80.13, 및 80.14는 80.1로 반내림되고 80.15, 80.16, 80.17, 80.18, 및 80.19는 80.2로 반올림된다. 또한 길이 값은 항상 정수임에 주목한다.
특정 양태에서, 제2 아미노산 서열(또는 핵산 서열)에 대한 제1 아미노산 서열(또는 핵산 서열)의 동일성 백분율(%ID)은 %ID = 100 x (Y/Z)로서 계산되고, 여기서 Y는 Y는 (육안 검사 또는 특정 서열 정렬 프로그램에 의해 정렬된 바와 같이) 제1 및 제2 서열의 정렬에서 동일한 일치로 점수가 매겨진 아미노산 잔기(또는 핵염기)의 수이고 Z는 제2 서열에 있는 잔기의 총 수이다. 제1 서열의 길이가 제2 서열보다 긴 경우, 제2 서열에 대한 제1 서열의 동일성 퍼센트는 제1 서열에 대한 제2 서열의 동일성 퍼센트보다 높을 것이다.
당업자는 서열 동일성 퍼센트의 계산을 위한 서열 정렬의 생성이 일차 서열 데이터에 의해 배타적으로 구동되는 이원 서열-서열 비교에 제한되지 않는다는 것을 이해할 것이다. 구조적 데이터(예를 들어, 결정학적 단백질 구조), 기능적 데이터(예를 들어, 돌연변이의 위치), 또는 계통발생학적 데이터와 같은 이종 소스로부터의 데이터와 서열 데이터를 통합함으로써 서열 정렬이 생성될 수 있음이 또한 이해될 것이다. 다중 서열 정렬을 생성하기 위해 이종 데이터를 통합하는 적합한 프로그램은 T-Coffee이며, www.tcoffee.org에서 이용 가능하고 대안적으로 예를 들어 EBI에서 이용 가능하다. 또한 서열 동일성 퍼센트을 계산하는 데 사용되는 최종 정렬은 자동 또는 수동으로 선별될 수 있음을 이해할 것이다.
본원에 사용된 "면역 반응"은 외래 제제 또는 비정상, 예를 들어 암성 세포에 대한 척추동물 내의 생물학적 반응을 의미하며, 이러한 반응은 이러한 제제 및 이들에 의해 발생하는 질환으로부터 유기체를 보호한다. 면역 반응은 면역계의 하나 이상의 세포(예를 들어, T 림프구, B 림프구, 자연살해(NK) 세포, 대식세포, 호산구, 비만 세포, 수지상 세포 또는 호중구) 및 이들 세포 또는 간에서 생산된 가용성 거대분자(항체, 사이토카인 및 보체 포함)의 작용에 의해 매개되고, 이는 척추동물의 몸에 침입한 병원체, 병원체에 감염된 세포나 조직, 암성 세포 또는 기타 비정상 세포 또는 자가면역 또는 병리학적 염증의 경우 정상적인 인간 세포 또는 조직를 선택적으로 표적화하고, 이에 결합하고, 손상을 입히고, 파괴 및/또는 제거하는 결과를 초래한다. 면역 반응은 T 세포, 예를 들어, 이펙터 T 세포, Th 세포, CD4+ 세포, CD8+ T 세포, 또는 Treg 세포의 활성화 또는 억제, 또는 면역계의 임의의 다른 세포, 예를 들어, NK 세포의 활성화 또는 억제를 포함한다. 따라서 면역 반응은 체액성 면역 반응(예를 들어 B 세포에 의해 매개됨), 세포성 면역 반응(예를 들어 T 세포에 의해 매개됨), 또는 체액성 면역 반응과 세포성 면역 반응 모두를 포함할 수 있다. 본 개시내용의 일부 양태에서, 생물학적 활성 분자는 면역 반응을 유도할 수 있는 분자이다.
일부 양태에서, 면역 반응은 "억제성" 면역 반응이다. 억제성 면역 반응은 자극(예를 들어, 항원)의 효과를 차단하거나 감소시키는 면역 반응이다. 특정 양태에서, 억제성 면역 반응은 자극에 대한 억제성 항체의 생산을 포함한다. 일부 양태에서, 면역 반응은 "자극성" 면역 반응이다. 자극성 면역 반응은 표적 항원(예를 들어, 종양 항원 또는 바이러스)을 파괴하고 제거할 수 있는 이펙터 세포(예를 들어, 세포독성 T 림프구)를 생성하는 면역 반응이다.
본원에 사용된 용어 "단리된", "정제된", "추출된" 및 이들의 문법적 변형은 상호교환적으로 사용되며 원하는 EV(예를 들어, 알려지거나 알려지지 않은 양 및/또는 농도의 복수의 EV)의 제조 상태를 지칭하고, 이는 원하는 EV 제제의 정제, 예를 들어 선택 또는 풍부화 중 하나의 과정을 거친다. 일부 양태에서, 본원에 사용된 바와 같은 단리 또는 정제는 생산자 세포를 함유하는 샘플로부터 EV(예를 들어, 분획)를 제거, 부분적으로 제거하는 과정이다. 일부 양태에서, 단리된 EV 조성물은 검출가능한 바람직하지 않은 활성을 갖지 않거나, 대안적으로 바람직하지 않은 활성의 수준 또는 양은 허용가능한 수준 또는 양 이하이다. 일부 양태에서, 단리된 EV 조성물은 허용가능한 양 및/또는 농도 이상의 원하는 EV의 양 및/또는 농도를 갖는다. 일부 양태에서, 단리된 EV 조성물은 조성물이 얻어지는 출발 물질(예를 들어, 생산자 세포 제제)에 비해 풍부해진다. 이러한 풍부화는 출발 물질과 비교하여 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 적어도 약 99.9%, 적어도 약 99.99%, 적어도 약 99.999%, 적어도 약 99.9999%, 또는 99.9999% 초과까지 일 수 있다. 일부 양태에서, 격리된 EV 제제에는 잔류 생물학적 제품이 실질적으로 없다. 일부 양태에서, 단리된 EV 제제는 임의의 오염된 생물학적 물질의 100% 유리, 적어도 약 99% 유리, 적어도 약 98% 유리, 적어도 약 97% 유리, 적어도 약 96% 유리, 적어도 약 95% 유리, 적어도 약 94% 유리, 적어도 약 93% 유리, 적어도 약 92% 유리, 적어도 약 91% 유리, 또는 적어도 약 90% 유리된다. 잔류 생물학적 제품에는 비생물학적 물질(화학 물질 포함) 또는 원치 않는 핵산, 단백질, 지질 또는 대사 산물이 포함될 수 있다. 잔류 생물학적 제품이 실질적으로 없다는 것은 EV 조성물은 검출 가능한 생산자 세포가 함유되어 있지 않고 EV만 검출 가능하다는 것을 의미할 수도 있다.
용어 "연결된", "융합된" 및 이의 문법적 변형은 상호교환적으로 사용되며 제2 모이어티, 예를 들어, 제2 아미노산 서열, 또는 뉴클레오티드 서열 각각에 공유적으로 또는 비-공유적으로 결합된 제1 모이어티, 예를 들어, 제1 아미노산 서열 또는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 제1 모이어티는 제2 모이어티에 직접 연결되거나 병치될 수 있거나, 대안적으로 개재 모이어티는 제1 모이어티를 제2 모이어티에 공유적으로 연결할 수 있다. "연결된"이란 용어는 C-말단 또는 N-말단에서 제1 모이어티가 제2 모이어티에 융합되는 것을 의미할 뿐만 아니라 전체 제1 모이어티(또는 제2 모이어티)를 제2 모이어티(또는 각각 제1 모이어티)의 임의의 두 지점, 예를 들어 아미노산에 삽입하는 것을 포함한다. 한 양태에서, 제1 모이어티는 펩티드 결합 또는 링커에 의해 제2 모이어티에 연결된다. 제1 모이어티는 포스포디에스테르 결합 또는 링커에 의해 제2 모이어티에 연결될 수 있다. 링커는 펩티드 또는 폴리펩티드(폴리펩티드 사슬의 경우), 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 사슬(뉴클레오티드 사슬의 경우) 또는 임의의 화학 잔기(폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 사슬 또는 임의의 화학 분자의 경우)일 수 있다. "연결된"이라는 용어는 하이픈(-)으로도 표시된다.
본원에 사용된 용어 "로딩" 또는 "로딩된"은 관심 모이어티가 EV와 회합되도록 관심 모이어티(예를 들어, 페이로드, 예를 들어 ASO)을 EV에 도입하거나 EV와 회합시키는 것을 의미한다. 본원에 기재된 바와 같이, 일부 양태에서, 페이로드가 로딩된 EV는 페이로드가 EV의 외부 표면에 연결되거나 접합된 EV를 의미한다.
"로딩 효율"이라는 용어는 용액(예를 들어, 페이로드 로딩된/페이로드 전체) 내 전체 페이로드(예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오티드)와 비교하여 EV에 로딩된 페이로드(예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오티드)의 비율을 의미한다. 본 개시내용으로부터 명백한 바와 같이, 일부 양태에서, 로딩 효율의 증가는 기준값(예를 들어, 본 개시내용과 다른 로딩 방법으로 관찰된 로딩 효율)과 비교하여 용액(EV와 페이로드의 혼합을 포함함) 내의 페이로드(예를 들어, ASO)의 더 많은 부분이 EV에 로딩되었음을 의미한다. 명시하지 않는 한, "로딩 효율" 및 "로딩 밀도"라는 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "내강 조작된 EV"는 조작된 EV의 내강 표면 또는 내강이 변형 전 EV 또는 천연 발생 EV의 내강과 상이하도록 막의 내강 표면 또는 조성이 변경된 EV의 내강을 갖는 EV를 의미한다.
조작은 내강(즉, EV 내의 공동) 또는 EV의 막, 특히 EV의 내강 표면에서 직접 이루어질 수 있으므로 EV의 내강 및/또는 내강 표면이 변경된다. 예를 들어, 막은 단백질, 지질, 소분자, 탄수화물 등의 조성이 변형되어 EV의 내강 표면이 변형된다. 마찬가지로 내강의 내용도 변형될 수 있다. 상기 조성은 화학적, 물리적 또는 생물학적 방법에 의해 변경되거나 화학적, 물리적 또는 생물학적 방법에 의해 이전에 변형된 세포로부터 생산될 수 있다. 구체적으로, 상기 조성은 유전공학에 의해 변경되거나 이전에 유전공학에 의해 변형된 세포로부터 생산됨으로써 변경될 수 있다. 일부 양태에서, 내강 조작된 EV는 EV의 내부 층에 노출될 수 있거나 EV의 내강 표면 또는 내강에 노출된 모이어티에 대한 고정점(부착)일 수 있는 외인성 단백질(즉, EV가 자연적으로 발현하지 않는 단백질) 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "거대분자"는 핵산, 단백질, 지질, 탄수화물, 대사산물 또는 이의 조합을 지칭한다.
예를 들어 본원에 기재된 EV와 관련하여 사용되는 경우, "변형된"이라는 용어는 예를 들어, 변형된 EV, 예를 들어, 엑소좀은 천연 발생 EV와 상이하도록 EV 및/또는 이의 생산자 세포의 변경 또는 조작을 지칭한다. 일부 양태에서, 본원에 기재된 변형된 EV는 천연 발생 EV의 막과 비교하여 단백질, 지질, 소분자, 탄수화물 등의 조성이 다른 막을 포함한다. 예를 들어, 본원에 입증된 바와 같이, 본원에 기재된 EV는 EV에서 자연적으로 발견되지 않는 증가된 양의 페이로드(예를 들어 안티센스 올리고뉴클레오티드)를 포함하도록 변형되었다. 특정 양태에서, 막에 대한 이러한 변형은 EV(예를 들어, 표면 조작된 EV)의 외부 표면을 변화시킨다. 특정 양태에서, 막에 대한 이러한 변형은 EV(예를 들어, 본원에 기재된 내강 조작된 EV)의 내강 표면을 변화시킨다.
본원에 사용된 용어 "변형된 단백질" 또는 "단백질 변형"은 단백질의 비-돌연변이 아미노산 서열과 적어도 15% 동일성을 갖는 단백질을 지칭한다. 단백질의 변형에는 단백질의 단편 또는 변이체가 포함된다. 단백질의 변형은 단백질의 단편 또는 변이체에 대한 화학적 또는 물리적 변형을 추가로 포함할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "조절하다", "변형시키는" 및 그 문법적 변형은 일반적으로 예를 들어 길항제 또는 효능제로 작용하는 것과 같이 특정 농도, 수준, 발현, 기능 또는 행동을 증가 또는 감소함으로써, 예를 들어 직접 또는 간접적으로 촉진/자극/상향 조절 또는 방해/억제/하향 조절함으로써 특정 농도, 수준, 표현, 기능 또는 행동에 적용될 때 변경하는 능력을 지칭한다. 일부 예에서, 조절제는 대조군에 대해, 또는 일반적으로 예상되는 평균 활동 수준에 대해 또는 활동의 대조군 수준에 대해 특정 농도, 수준, 활동 또는 기능을 증가 및/또는 감소시킬 수 있다.
본원에서 사용되는 "나노소포체"라는 용어는 직경이 20 내지 250 nm 사이(예를 들어, 30 내지 150 nm 사이)인 세포외 소포체를 지칭하며, 나노소포체가 조작 없이는 세포에 의해 생산되지 않도록 직접 또는 간접적인 조작에 의해 세포(예를 들어 생산자 세포)로부터 생산된다. 나노소포체를 생산하기 위한 세포의 적절한 조작은 연속 압출, 알칼리 용액으로의 처리, 초음파처리 또는 이의 임의의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 양태에서, 나노소포체의 생산은 생산자 세포의 파괴를 초래할 수 있다. 일부 양태에서, 본원에 기재된 나노소포체의 개체군은 원형질막으로부터의 직접적인 발아 또는 후기 엔도좀과 원형질막의 융합에 의해 세포로부터 유래된 엑소좀이 실질적으로 없다. 일단 생산자 세포로부터 유도된 나노소포체는 크기, 밀도, 생화학적 파라미터 또는 이의 조합에 기초하여 생산자 세포로부터 단리될 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "페이로드"는 본원에 개시된 EV와 접촉된 표적(예를 들어 표적 세포)에 작용하는 생물학적 활성 분자(예를 들어 치료제)를 지칭한다 EV, 예를 들어, 엑소좀에 도입될 수 있는 페이로드의 비-제한적인 예는 치료제 예컨대, 뉴클레오티드 (예를 들어, 검출가능 분체 또는 독소를 포함하거나 전사를 파괴하는 뉴클레오티드), 핵산 (예를 들어, 폴리펩티드 예컨대 효소를 인코딩하는 DNA 또는 mRNA 분자, 또는 조절 기능을 갖는 RNA 분자 예컨대 miRNA, dsDNA, lncRNA, siRNA, 포스포로디아미데이트 모폴리노 올리고머 (PMO), 펩티드-접합된 포스포로디아미데이트 모폴리노 올리고머 (PPMO), 및 안티센스 올리고뉴클레오티드), 아미노산 (예를 들어, 검출가능 분체 또는 독소를 포함하거나 번역을 파괴하는 아미노산), 폴리펩티드 (예를 들어, 효소), 지질, 탄수화물, 및 소분자 (예를 들어, 소분자 약물 및 독소)를 포함한다. 일부 양태에서, 페이로드는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
용어들 "약제학적으로-허용 가능한 담체," "약제학적으로-허용 가능한 부형제," 및 이의 문법적 변형은 미국 연방 정부의 규제 기관에 의해 승인되거나 인간을 포함한 동물에 사용하기 위해 미국 약전에 등재된 제제 중 임의의 것, 뿐만 아니라 대상체에 대한 조성물의 투여를 금지할 정도로 바람직하지 않은 생리학적 효과를 생성하지 않고 투여된 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 임의의 담체 또는 희석제를 포괄한다. 약제학적 조성물을 제조하는데 유용하고 일반적으로 안전하고 무독성이며 바람직한 부형제 및 담체가 포함된다.
본원에 사용된 용어 "약제학적 조성물"은 예를 들어 약학적으로 허용 가능한 담체 및 부형제와 같은 하나 이상의 다른 화학 성분과 혼합되거나 섞이거나 현탁된, 본원에 기재된 하나 이상의 화합물(예를 들어, EV)을 지칭한다. 약제학적 조성물의 한 목적은 EV 제제를 대상체에게 투여하는 것을 용이하게 하는 것이다.
본원에 사용된 용어 "폴리뉴클레오티드"는 리보뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오티드, 이의 유사체, 또는 그의 혼합물을 포함하는 임의의 길이의 뉴클레오티드 폴리머를 지칭한다. 이 용어는 분자의 일차 구조를 지칭한다. 따라서, 이 용어는 삼중, 이중 및 단일 가닥의 데옥시리보핵산("DNA")뿐만 아니라 삼중, 이중 및 단일 가닥의 리보핵산("RNA")를 포함한다. 이는 또한 예를 들어 알킬화 및/또는 캡핑에 의해 변형된 형태와 변형되지 않은 형태의 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 특정 양태에서, "폴리뉴클레오티드"라는 용어는 스플라이싱되거나 스플라이싱되지 않든지 tRNA, rRNA, hRNA, siRNA 및 mRNA를 포함하는 폴리데옥시리보뉴클레오티드 (2-데옥시-D-리보스 함유), 폴리리보뉴클레오티드 (D-리보스 함유), 퓨린 또는 피리미딘 염기의 N- 또는 C-글리코시드인 임의의 다른 유형의 폴리뉴클레오티드, 및 정상핵산 백본을 함유하는 기타 폴리머, 폴리아미드 (예를 들어, 펩티드 핵산 "PNA") 및 폴리모폴리노 폴리머, 및 다른 합성 순서 특정 핵산 폴리머을 포함하고, 단, 폴리머는 DNA와 RNA에서 발견되는 것과 같은 염기쌍 형성과 염기 스태킹을 허용하는 배열의 핵염기를 함유한다. 특정 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 mRNA를 포함한다. 특정 양태에서, mRNA는 합성 mRNA이다. 일부 양태에서, 합성 mRNA는 적어도 하나의 비-천연 핵염기를 포함한다. 일부 양태에서, 특정 부류의 모든 핵염기는 비-천연 핵염기로 대체되었다(예를 들어, 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드의 모든 우리딘은 비-천연 핵염기, 예를 들어 5-메톡시우리딘으로 대체될 수 있음). 본 개시내용의 일부 양태에서, 생물학적 활성 분자는 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오티드)이다.
용어 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 임의의 길이의 아미노산의 폴리머를 지칭하기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 중합체는 변형된 아미노산을 포함할 수 있다. 용어는 또한 천연적으로 또는 개입; 예를 들어, 디설파이드 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 또는 임의의 다른 조작 또는 변형, 예컨대 표지 성분을 갖는 접합에 의해 변형된 아미노산 폴리머를 포괄한다. 또한 예를 들어, 아미노산 (예를 들어, 비-천연 아미노산 예컨대 호모시스테인, 오르니틴, p-아세틸페닐알라닌, D-아미노산, 및 크레아틴 포함)의 하나 이상의 유사체를 함유하는 폴리펩티드, 뿐만 당업계에서 알려진 다른 변형이 정의 내에 포함된다.
본원에 사용된 용어 "폴리펩티드"는 임의의 크기, 구조 또는 기능의 단백질, 폴리펩티드 및 펩티드를 지칭한다. 폴리펩티드는 유전자 산물, 자연 발생 폴리펩티드, 합성 폴리펩티드, 동형체, 오쏘로그, 파라로그, 전술한 것의 단편 및 다른 등가물, 변이체, 및 유사체을 포함한다. 폴리펩티드는 단일 폴리펩티드일 수 있거나 이량체, 삼량체 또는 사량체와 같은 다중 분자 복합체일 수 있다. 이는 또한 단일 사슬 또는 다중 사슬 폴리펩티드를 포함할 수도 있다. 가장 일반적으로 이황화 연결은 다중 사슬 폴리펩티드에서 발견된다. 폴리펩티드라는 용어는 또한 하나 이상의 아미노산 잔기가 해당 자연 발생 아미노산의 인공 화학적 유사체인 아미노산 폴리머에도 적용될 수 있다. 일부 양태에서, "펩티드"는 50개 아미노산 길이 이하, 예를 들어 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50개 아미노산 길이일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "예방하다", "예방하는" 및 이의 변형은 질환, 장애 및/또는 병태의 발병을 부분적으로 또는 완전히 지연시키는 것; 특정 질환, 장애 및/또는 병태의 하나 이상의 증상, 특징 또는 임상 징후의 발병을 부분적으로 또는 완전히 지연시키는 것; 특정 질환, 장애 및/또는 병태의 하나 이상의 증상, 특징 또는 징후의 발병을 부분적으로 또는 완전히 지연시키는 것; 특정 질환, 장애 및/또는 병태로부터의 진행을 부분적으로 또는 완전히 지연시키는 것; 및/또는 질환, 장애, 및/또는 병태와 관련된 병리가 발생할 위험을 감소시키는 것을 지칭한다. 일부 양태에서 결과 예방은 예방적 치료를 통해 달성된다.
본원에서 "생산자 세포"라는 용어는 EV를 생산하는 데 사용되는 세포를 지칭한다. 생산자 세포는 시험관 내에서 배양된 세포 또는 생체 내 세포일 수 있다. 생산자 세포는 EV를 생산하는 데 효과적인 것으로 알려진 세포, 예를 들어, HEK293 세포, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, 중간엽 줄기 세포 (MSCs), BJ 인간 포피 섬유아세포, fHDF 섬유아세포, AGE.HN® 뉴런 전구 세포, CAP® 양수 세포, 지방질 중간엽 줄기 세포, RPTEC/TERT1 세포를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다 특정 양태에서, 생산자 세포는 항원 제시 세포가 아니다. 일부 양태에서, 생산자 세포는 수지상 세포, B 세포, 비만 세포, 대식세포, 호중구, Kupffer-Browicz 세포, 이들 세포 중 어느 것으로부터 유도된 세포, 또는 이의 임의의 조합이 아니다.
본원에 사용된 "예방적"은 질환 또는 병태의 발병을 예방하거나 질환 또는 병태와 연련된 증상을 예방 또는 지연시키기 위해 사용되는 치료 또는 작용 과정을 지칭한다.
본원에 사용된 "예방"은 건강을 유지하고 출혈 에피소드의 개시를 예방 또는 지연시키거나, 질환 또는 병태와 연관된 증상을 예방 또는 지연시키기 위해 취해진 조치를 지칭한다.
"재조합" 폴리펩티드 또는 단백질은 재조합 DNA 기술을 통해 생산된 폴리펩티드 또는 단백질을 지칭한다. 조작된 숙주 세포에서 발현된 재조합적으로 생산된 폴리펩티드 및 단백질은 임의의 적합한 기술에 의해 분리, 분획화되거나 부분적으로 또는 실질적으로 정제된 천연 또는 재조합 폴리펩티드와 마찬가지로 본 개시내용의 목적을 위해 단리된 것으로 간주된다. 본원에 개시된 폴리펩티드는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 재조합적으로 생산될 수 있다. 대안적으로, 본원에 개시된 단백질 및 펩티드는 화학적으로 합성될 수 있다. 본 개시내용의 일부 양태에서, EV에 존재하는 엑소좀 단백질은 생성된 EV 내의 엑소좀 단백질 수준이 그러한 엑소좀 단백질을 과발현하지 않는 생산자 세포의 EV에 존재하는 엑소좀 단백질의 수준과 관련하여 상당히 증가하도록 생산자 세포에서 엑소좀 단백질을 과발현함으로써 재조합적으로 생산된다.
본원에서 사용된 용어 "엑소좀 단백질"은 EV의 표면에서 확인된 EV 단백질을 지칭한다. 예를 들어, 전체 내용이 참조로 본원에 포함된 미국 특허 제10,195,290호를 참조한다. 엑소좀 단백질의 비제한적 예는 프로스타글란딘 F2 수용체 음성 조절인자 ("PTGFRN"); 바시긴 ("BSG"); 면역글로불린 슈퍼패밀리 구성원 2 ("IGSF2"); 면역글로불린 슈퍼패밀리 구성원 3 ("IGSF3 "); 면역글로불린 슈퍼패밀리 구성원 8 ("IGSF8"); 인테그린 베타-1 ("ITGB1"); 인테그린 알파-4 ("ITGA4 "); 4F2 세포-표면 항원 중쇄 ("SLC3A2"); 및 ATP 수송체 단백질의 클래스 ("ATP1A1," "ATP1A2," "ATP1A3," "ATP1A4," "ATP1B3," "ATP2B1," "ATP2B2," "ATP2B3," "ATP2B")을 포함한다. 일부 양태에서, 엑소좀 단백질은 전체 단백질 또는 이의 단편(예를 들어, 기능성 단편, 예를 들어 EV의 외부 표면 또는 내강 표면에 다른 모이어티를 고정할 수 있는 가장 작은 단편)일 수 있다. 일부 양태에서, 엑소좀 단백질은 생물학적 활성 분자를 EV의 외부 표면 또는 내강에 고정할 수 있다. 본 개시내용과 함께 사용될 수 있는 다른 엑소좀 단백질의 비-제한적인 예는 다음을 포함한다: 아미노펩티다제 N (CD13); 네프릴라이신, AKA 막 메탈로엔도펩티다제 (MME); 엑토뉴클레오티드 파이로포스파타제/포스포디에스테라제 계열 구성원 1 (ENPP1); 뉴로필린-1 (NRP1); CD9, CD63, CD81, PDGFR, GPI 앵커 단백질, 락타드헤린, LAMP2, 및 LAMP2B.
E의 내강 내에서 확인된 추가적인 엑소좀 단백질. 예를 들어, 미국 공개 제2020/0347112 A1호(본원에 그 전체 내용이 참조로 포함됨) 참고. 엑소좀 단백질의 비제한적 예는 다음을 포함한다: 미리스토일화 알라닌 풍부 단백질 키나제 C 기질 ("MARCKS"); 미리스토일화 알라닌 풍부 단백질 키나제 C 기질 유사 1 ("MARCKSL1"); 및 뇌 산 가용성 단백질 1 ("BASP1") 일부 양태에서, 엑소좀 단백질은 전체 단백질 또는 이의 단편(예를 들어, 기능적 단편, 예를 들어, 모이어티를 EV의 내강 표면에 고정시킬 수 있는 가장 작은 단편)일 수 있다. 일부 양태에서, 엑소좀은 EV의 내강 표면에 모이어티를 고정할 수 있다. 본 개시내용의 일부 양태에서, 모이어티는 엑소좀에 공유적으로 부착될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "유사성"은 중합체성 분자 사이, 예를 들어 폴리뉴클레오티드 분자(예를 들어 DNA 분자 및/또는 RNA 분자) 사이 및/또는 폴리펩티드 분자 사이의 전반적인 관련성을 지칭한다. 폴리머 분자들 간의 유사성 퍼센트 계산은 동일성 퍼센트 계산과 동일한 방식으로 수행될 수 있지만, 유사성 퍼센트 계산은 당업계에서 이해되는 보존적 치환을 고려한다. 유사성의 백분율은 사용된 비교 척도, 즉 아미노산이 진화적 근접성, 전하, 부피, 가요성, 극성, 소수성, 방향성, 등전점, 항원성, 또는 이들의 조합에 따라 비교되는지 여부에 따라 달라지는 것으로 이해된다.
본원에 사용된 용어 "스페이서"는 2개의 이격된 모이어티(예를 들어 절단성 링커 및 생물학적 활성 분자)을 함께 일반적으로 안정한 이분 분자(dipartate molecule) 공유적으로 연결할 수 있는 이중작용성 화학적 모이어티를 지칭한다.
달리 명시하지 않는 한, 하나 이상의 입체중심을 갖는 화합물에 대한 언급은 각각의 입체이성질체, 및 이의 입체이성질체의 모든 조합을 의도한다.
"대상체", "환자", "개체" 및 "숙주"라는 용어 및 이의 변형은 본원에서 상호교환적으로
사용되며 인간, 가축(예를 들어, 개, 고양이 등), 농장 동물 (예를 들어, 암소, 양, 피그, 말 등), 및 실험실 동물 (예를 들어, 원숭이, 랫트, 마우스, 토끼, 기니아 피그 등), 진단, 치료 또는 요법이 필요한 대상체, 특히 인간을 비제한적으로 포함하는 임의의 포유류 대상체를 지칭한다. 본원에 기재된 방법은 인간 치료 및 수의학 적용 모두에 적용가능하다.
본원에서 사용되는 용어 "실질적으로 없는"은 EV를 포함하는 샘플이 질량/부피(m/v) 퍼센트 농도로 10% 미만의 거대분자, 예를 들어, 오염물을 포함한다는 것을 의미한다. 일부 분획은 0.001% 미만, 0.01% 미만, 0.05% 미만, 0.1% 미만, 0.2% 미만, 0.3% 미만, 0.4% 미만, 0.5% 미만, 0.6% 미만, 0.7% 미만, 0.8% 미만, 0.9% 미만, 1% 미만, 2% 미만, 3% 미만, 4% 미만, 5% 미만, 6% 미만, 7% 미만, 8% 미만, 9% 미만, 또는 10% (m/v) 미만의 거대분자를 함유할 수 있다.
본원에 사용되는 "표면 조작된 EV"는 막을 갖는 EV 또는 표면의 조성이 변형된 EV를 지칭하고, 이로써 조작된 EV의 표면은 변형 전의 EV 또는 천연 발생 EV의 표면과 다르다.
본원에 사용되는 "표면 조작된 엑소좀"은 막을 갖는 엑소좀 또는 표면의 조성이 변형된 엑소좀 (외부 표면 또는 내강 표면)을 지칭하고, 이로써 조작된 엑소좀의 표면은 변형 전의 엑소좀 또는 천연 발생 엑소좀의 표면과 다르다.
조작은 EV의 표면 및/또는 막에서 수행되어 EV의 표면이 변경될 수 있다. 예를 들어, 막은 예를 들어 단백질, 지질, 소분자, 탄수화물, 또는 이의 조합의 조성으로 변형될 수 있다. 상기 조성은 화학적, 물리적 또는 생물학적 방법에 의해 변경되거나 화학적, 물리적 또는 생물학적 방법에 의해 이전에 또는 동시에 변형된 세포로부터 생산될 수 있다. 구체적으로, 상기 조성은 유전공학에 의해 변경되거나 이전에 유전공학에 의해 변형된 세포로부터 생산됨으로써 변경될 수 있다. 일부 양태에서, 표면 조작된 EV는 EV의 표면에 노출될 수 있거나 EV의 표면에 노출된 모이어티에 대한 고정점(부착)일 수 있는 외인성 단백질(즉, EV가 자연적으로 발현하지 않는 단백질) 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함한다. 다른 양태에서, 표면 조작된 EV는 EV 표면에 노출될 수 있거나 EV 표면에 노출된 모이어티에 대한 고정점(부착)이 될 수 있는, 천연 EV, 예를 들어 엑소좀 단백질(예를 들어, PTGFRN) 또는 이의 단편 또는 변이체의 더 높은 발현(예를 들어, 더 높은 수)을 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "치료 유효량"은 필요로 하는 대상체에 대한 원하는 치료 효과, 약리학적 및/또는 생리학적 효과를 생성하기에 충분한, 본원에 개시된 EV를 포함하는 시약 또는 약제학적 화합물의 양이다. 예방이 요법으로 간주될 수 있으므로 치료 유효량은 "예방 유효량"일 수 있다.
본원에 사용되는 용어 "치료하다", "치료" 또는 "치료하는"은 예를 들어 반드시 질환 또는 병태를 치유하지 않고도 질환 또는 병태의 중증도 감소; 질환 경과 지속시간의 감소; 질환 또는 병태와 관련된 하나 이상의 증상의 개선 또는 제거; 질환 또는 병태가 있는 대상체에게 유익한 효과를 제공하는 것을 지칭한다. 이 용어는 또한 질환 또는 병태 또는 이의 증상의 예방(prophylaxis) 또는 방지(prevention)를 포함한다. 한 양태에서, 용어 "치료하는" 또는 "치료"는 항원에 대해 대상체에서 면역 반응을 유도하는 것을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "변이체"의 분자(예를 들어, 기능적 분자, 항원, 또는 엑소좀 단백질)는 당업계에 공지된 방법에 의해 비교 시 또 다른 분자와 특정 구조적 및 기능적 동일성을 공유하는 분자를 지칭한다. 예를 들어, 단백질의 변이체는 또 다른 단백질의 치환, 삽입, 결실, 틀이동 또는 재배열을 포함할 수 있다.
자연 발생 변이체를 "대립유전자 변이체"라고 하며 유기체의 염색체에서 주어진 좌위를 차지하는 유전자의 여러 교대 형태 중 하나를 나타낸다(Genes II, Lewin, B., ed., John Wiley & Sons, New York). (1985)). 이들 대립형질 변이체는 폴리뉴클레오티드 및/또는 폴리펩티드 수준에서 변할 수 있고 본 개시내용에 포함된다. 대안적으로, 비-자연 발생 변이체는 돌연변이유발 기술 또는 직접 합성에 의해 생산될 수 있다.
단백질 공학 및 재조합체 DNA 기술의 알려진 방법을 사용하여, 변이체를 생성하여 폴리펩티드의 특성을 개선하거나 변경할 수 있다. 예를 들어, 생물학적 기능의 실질적인 손실 없이 분비 단백질의 N-말단 또는 C-말단에서 하나 이상의 아미노산이 결실될 수 있다. 문헌[Ron 등, J. Biol . Chem . 268: 2984-2988 (1993)]은 그 전문이 본원에 참조로 포함되어 있으며, 3, 8 또는 27개의 아미노-말단 아미노산 잔기를 결실한 후에도 헤파린 결합 활성을 갖는 변이체 KGF 단백질을 보고하였다. 마찬가지로, 인터페론 감마는 이 단백질의 카복시 말단에서 8 내지 10개의 아미노산 잔기를 결실한 후 최대 10배 더 높은 활성을 나타내었다. (Dobeli 등, J. Biotechnology 7:199-216 (1988), 전문이 본원에 참조로 포함됨)
또한 변이체는 종종 자연 발생 단백질과 유사한 생물학적 활성을 유지한다는 충분한 증거가 있다. 예를 들어, Gayle과 동료(J. Biol. Chem 268:22105-22111 (1993), 전문이 본원에 참조로 포함됨)은 인간 사이토카인 IL-1a의 광범위한 돌연변이 분석을 수행하였다. 그들은 분자의 전장에 걸쳐 변이체당 평균 2.5개의 아미노산 변화가 있는 3,500개 초과의 개별 IL-1a 돌연변이를 생성하기 위해 무작위 돌연변이 유발을 사용하였다. 가능한 모든 아미노산 위치에서 다중 돌연변이를 검사하였다. 조사자들은 "[m]대부분의 분자가 [결합 또는 생물학적 활성]에 거의 영향을 미치지 않고 변경될 수 있음"을 발견하였다. (초록 참조). 실제로 검사된 3,500개 초과의 뉴클레오티드 서열 중 23개의 고유한 아미노산 서열만이 야생형과 활성이 크게 다른 단백질을 생산하였다.
전술한 바와 같이, 변이체 또는 유도체는 예를 들어 변형된 폴리펩티드를 포함한다. 일부 양태에서, 예를 들어 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 지질, 당단백질의 변이체 또는 유도체는 화학적 변형 및/또는 내인성 변형의 결과이다. 일부 양태에서, 변이체 또는 유도체는 생체 내 변형의 결과이다. 일부 양태에서, 변이체 또는 유도체는 시험관 내 변형의 결과이다. 또 일부 양태에서, 변이체 또는 유도체는 생산자 세포의 세포내 변형의 결과이다.
II.
페이로드의
로딩 방법
본원에서는 EV의 로딩 효율이 증가되도록 페이로드를 EV에 로딩하는 방법이 기재된다.
일부 양태에서, EV를 생산하는 방법은 하나 이상의 관심 모이어티(예를 들어 페이로드)를 EV에 직접 도입함으로써 단리된 EV를 변형시키는 단계를 포함한다. 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이, 예를 들어 본원에 기재된 로딩 조건 하에서 페이로드를 EV와 혼합함으로써 페이로드(예를 들어 ASO)가 EV에 도입될 수 있다. 일부 양태에서, 페이로드는 콜레스테롤과 접합되어, 페이로드와 EV와의 혼합은 콜레스테롤이 EV의 지질막과 상호작용할 수 있게 하여 페이로드를 EV의 외부 표면에 부착시킨다. 본원에서 사용된 용어 "혼합"은 페이로드와 EV를 더 가깝게 가져오는 과정을 의미하며, 이로써 EV는 페이로드와 함께 로딩될 수 있으며, 예를 들어 페이로드는 EV의 외부 표면과 연관되고(예를 들어, 결합되고), 페이로드는 EV의 내강 표면과 연관되고, 페이로드는 EV의 내강 내에 있거나, 이들의 임의의 조합이다. 달리 명시되지 않는 한, 혼합은 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 일부 양태에서 혼합은 회분식에서 일어날 수 있다(예를 들어, 페이로드 및 EV는 혼합 공정 시작 시 추가됨). 일부 양태에서, 혼합은 연속 공정에서 일어날 수 있다(예를 들어, 페이로드 및 EV는 혼합 공정의 과정 동안, 예를 들어 연속 교반 탱크 반응기(CSTR)에서 혼합물에 연속적으로 첨가된다). 일부 양태에서, 혼합은 반회분식으로 일어날 수 있다. 일부 양태에서, 혼합은 반연속식으로 일어날 수 있다.
특정 양태에서, 하나 이상의 모이어니(예를 들어 페이로드)은 형질감염에 의해 EV에 도입된다. 일부 양태에서, 하나 이상의 모이어티(예를 들어 페이로드)는 양이온성 지질 및 중합체와 같은 합성 거대분자를 사용하여 EV에 도입될 수 있다(Papapetrou 등, Gene Therapy 12: S118-S130(2005)). 특정 양태에서, 인산칼슘, 사이클로덱스트린 또는 폴리브렌과 같은 화학물질을 사용하여 EV에 하나 이상의 모이어티(예를 들어 페이로드)를 도입할 수 있다.
일부 양태에서, 하나 이상의 모이어티(예를 들어 페이로드)은 EV의 표면에 접합될 수 있다(즉, EV의 외부 표면 또는 EV의 내강 표면에 직접 접합되거나 연결됨). 접합은 당업계에 공지된 방법에 의해 화학적으로 또는 효소적으로 달성될 수 있다.
일부 양태에서, EV는 화학적으로 접합된 하나 이상의 모이어티(예를 들어 페이로드)를 포함한다. 화학적 접합은 본원에 개시된 링커 또는 친화성 리간드를 사용하거나 사용하지 않고 하나 이상의 모이어티(예를 들어 페이로드 및/또는 표적화 모이어티)를 다른 분자에 공유 결합함으로써 달성될 수 있다. 이러한 접합체의 형성은 당업자의 기술 내에 있으며 접합을 달성하기 위한 다양한 기술이 공지되어 있으며, 특정 기술의 선택은 접합될 물질에 따라 결정된다. 특정 양태에서, 폴리펩티드는 EV에 접합된다. 일부 양태에서, 지질, 탄수화물, 핵산 및 소분자와 같은 비폴리펩티드가 EV에 접합된다.
본원에 기재된 바와 같이, 본원에 제공된 방법을 사용하여 EV에 페이로드를 로딩하는 것은 로딩 효율을 증가시킬 뿐만 아니라 EV의 하나 이상의 추가 특성을 개선할 수도 있다. 본원에 입증된 바와 같이(예를 들어 실시예 6 참조), 일부 양태에서, 본원에 제공된 로딩 매개변수(예를 들어, 염 농도, 로딩 온도, 로딩 지속시간, 페이로드 공급물 농도, EV 공급물 농도)는 페이로드 로딩 후 EV의 안정성을 개선할 수 있다. 본원에 사용된 용어 "안정성"은 저장수명 전체에 걸쳐 특정 한계 내에서 화학적, 물리적, 미생물학적 및/또는 생물의학적 특성을 유지하는 화합물(예를 들어, 본원에 기재된 것과 같은 페이로드가 로딩된 EV)의 능력을 지칭한다. 예를 들어, 일부 양태에서 페이로드가 로딩된 EV는 다중(예를 들어 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 또는 적어도 5개) 동결 및 해동 처리 후에도 안정적으로 유지된다. 일부 양태에서 페이로드가 로딩된 EV는 안정적으로 유지되며 후속 정제 단계에서 응집될 가능성이 적다. 어느 한 이론에 얽매이지 않고 안정성이 증가되었기 때문에, 페이로드는 일단 EV에 로딩되면 EV와 회합된 상태로 유지된다. 따라서, 일부 양태에서, 본원에 제공된 로딩 방법은 EV 로딩 후에 EV로부터 페이로드의 해리를 줄이는 데 도움이 될 수 있다. 그리고, 본 개시내용으로부터 명백한 바와 같이, 일부 양태에서, 증가된 로딩 효율은 EV의 효능을 개선할 수 있다(예를 들어 실시예 4 참조).
II.A. 염 농도
일부 양태에서, 본 개시내용은 염을 포함하는 완충액(본원에서는 "로딩 완충액"라고도 함)에서 페이로드를 EV와 혼합하는 것을 포함하는 페이로드를 EV에 로딩하는 방법을 제공하며, 여기서 염의 농도는 ("염 농도")는 기준 완충액(예를 들어, 염을 포함하지 않거나 본 개시내용의 로딩 완충액보다 낮은 염 농도를 갖는 상응하는 완충액)와 비교하여 증가된다. 일부 양태에서, 로딩 완충액의 염 농도는 기준 완충액의 염 농도와 비교하여 약 0.1배 초과, 약 0.2배 초과, 약 0.3배 초과, 약 0.4배 초과, 약 0.5배 초과, 약 0.6배 초과, 약 0.7배 초과, 약 0.8배 초과, 약 0.9배 초과, 약 1배 초과, 약 2배 초과, 약 3배 초과, 약 4배 초과, 약 5배 초과, 약 6배 초과, 약 7배 초과, 약 8배 초과, 약 9배 초과, 약 10배 초과, 약 15배 초과, 약 20배 초과, 약 25배 초과, 약 30배 초과, 약 35배 초과, 약 40배 초과, 약 45배 초과, 또는 약 50배 초과이다.
일부 양태에서, 로딩 완충액의 염 농도는 적어도 약 1 mM, 적어도 약 5 mM, 적어도 약 10 mM, 적어도 약 20 mM, 적어도 약 30 mM, 적어도 약 40 mM, 적어도 약 50 mM, 적어도 약 60 mM, 적어도 약 70 mM, 적어도 약 80 mM, 적어도 약 90 mM, 적어도 약 100 mM, 적어도 약 110 mM, 적어도 약 120 mM, 적어도 약 130 mM, 적어도 약 140 mM, 적어도 약 150 mM, 적어도 약 160 mM, 적어도 약 170 mM, 적어도 약 180 mM, 적어도 약 190 mM, 적어도 약 200 mM, 적어도 약 225 mM, 적어도 약 250 mM, 적어도 약 275 mM, 적어도 약 300 mM, 적어도 약 325 mM, 적어도 약 350 mM, 적어도 약 375 mM, 적어도 약 400 mM, 적어도 약 425 mM, 적어도 약 450 mM, 적어도 약 475 mM, 또는 적어도 약 500 mM이다. 일부 양태에서, 로딩 완충액의 염 농도는 약 500 mM 미만, 약 475 mM 미만, 약 450 mM 미만, 약 425 mM 미만, 약 400 mM 미만, 약 375 mM 미만, 약 350 mM 미만, 약 325 mM 미만, 또는 약 300 mM 미만이다. 일부 양태에서, 로딩 완충액의 염 농도는 약 200 mM 미만, 약 190 mM 미만, 약 180 mM 미만, 약 170 mM 미만, 약 160 mM 미만, 약 150 mM 미만, 약 140 mM 미만, 약 130 mM 미만, 약 120 mM 미만, 또는 약 110 mM 미만이다.
일부 양태에서, 로딩 완충액의 염 농도는 약 1 mM 내지 약 150 mM, 약 5 mM 내지 약 150 mM, 약 10 mM 내지 약 150 mM, 약 20 mM 내지 약 150 mM, 약 30 mM 내지 약 150 mM, 약 40 mM 내지 약 150 mM, 약 50 mM 내지 약 150 mM, 약 60 mM 내지 약 150 mM, 약 70 mM 내지 약 150 mM, 약 80 mM 내지 약 150 mM, 약 10 mM 내지 약 140 mM, 약 20 mM 내지 약 140 mM, 약 30 mM 내지 약 140 mM, 약 40 mM 내지 약 140 mM, 약 50 mM 내지 약 140 mM, 약 10 mM 내지 약 130 mM, 약 20 mM 내지 약 130 mM, 약 30 mM 내지 약 130 mM, 약 40 mM 내지 약 130 mM, 약 50 mM 내지 약 130 mM, 약 10 mM 내지 약 120 mM, 약 20 mM 내지 약 120 mM, 약 30 mM 내지 약 120 mM, 약 40 mM 내지 약 120 mM, 약 50 mM 내지 약 120 mM, 약 60 mM 내지 약 120 mM, 약 70 mM 내지 약 120 mM, 약 80 mM 내지 약 120 mM, 약 50 mM 내지 약 100 mM, 약 100 mM 내지 약 150 mM, 또는 약 90 mM 내지 약 110 mM이다.
일부 양태에서, 로딩 완충액의 염 농도는 약 10 mM, 약 20 mM, 약 30 mM, 약 40 mM, 약 50 mM, 약 60 mM, 약 70 mM, 약 80 mM, 약 90 mM, 약 100 mM, 약 110 mM, 약 120 mM, 약 130 mM, 약 140 mM, 약 150 mM, 약 160 mM, 약 170 m, 약 180 mM, 또는 약 190 mM이다. 특정 양태에서, 로딩 완충액의 염 농도는 약 50 mM, 약 60 mM, 약 70 mM, 약 80 mM, 약 90 mM, 약 100 mM, 약 110 mM, 약 120 mM, 약 130 mM, 약 140 mM, 또는 약 150 mM이다. 특정 양태에서, 로딩 완충액의 염 농도는 약 100 mM이다. 특정 양태에서, 로딩 완충액의 염 농도는 약 110 mM이다. 특정 양태에서, 로딩 완충액의 염 농도는 약 120 mM이다. 일부 양태에서, 로딩 완충액의 염 농도는 약 130 mM이다. 일부 양태에서, 로딩 완충액의 염 농도는 약 140 mM이다. 일부 양태에서, 로딩 완충액의 염 농도는 약 150 mM이다. 특정 양태에서, 로딩 완충액의 염 농도는 약 90 mM이다. 특정 양태에서, 로딩 완충액의 염 농도는 약 80 mM이다.
일부 양태에서, 로딩 완충액의 염 농도는 약 25 mM 내지 약 500 mM이다. 일부 양태에서, 염 농도는 약 150 mM 내지 약 450 mM이다. 일부 양태에서, 로딩 완충액의 염 농도는 약 150 mM 이상이다. 예를 들어, 일부 양태에서, 로딩 완충액의 염 농도는 약 175 mM이다. 일부 양태에서, 로딩 완충액의 염 농도는 약 200 mM이다. 일부 양태에서, 로딩 완충액의 염 농도는 약 225 mM이다. 일부 양태에서, 로딩 완충액의 염 농도는 약 250 mM이다. 일부 양태에서, 로딩 완충액의 염 농도는 약 275 mM이다. 일부 양태에서, 로딩 완충액의 염 농도는 약 300 mM이다. 일부 양태에서, 로딩 완충액의 염 농도는 약 325 mM이다. 일부 양태에서, 로딩 완충액의 염 농도는 약 350 mM이다. 일부 양태에서, 로딩 완충액의 염 농도는 약 375 mM이다. 일부 양태에서, 로딩 완충액의 염 농도는 약 400 mM이다. 일부 양태에서, 로딩 완충액의 염 농도는 약 425 mM이다. 일부 양태에서, 로딩 완충액의 염 농도는 약 450 mM이다. 일부 양태에서, 로딩 완충액의 염 농도는 약 475 mM이다. 일부 양태에서, 로딩 완충액의 염 농도는 약 500 mM이다.
본원에서 입증된 바와 같이, 로딩 완충액의 염 농도는 EV에서 페이로드(예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오티드)의 로딩 효율에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 출원인은 로딩 완충액의 염 농도(예를 들어, 특히 본원에 개시된 염 농도 범위 내)의 증가가 EV의 로딩 효율을 증가시킬 수 있음을 확인하였다. 따라서, 일부 양태에서, 본원에 개시된 염 농도 중 하나 이상을 포함하는 로딩 완충액에서 페이로드(예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오티드)를 EV와 혼합하면, (예를 들어 염을 포함하지 않거나 염을 포함하지만 더 낮은 농도로 포함하는) 기준 완충액의 EV에 페이로드를 로드하는 것과 비교하여 (예를 들어 외부 표면 상에서, 내강 표면 상에서 및/또는 내강 내에서) EV의 페이로드 로딩을 적어도 약 0.5배, 적어도 약 1배, 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 6배, 적어도 약 7배, 적어도 약 8배, 적어도 약 9배, 적어도 약 10배, 적어도 약 15배, 적어도 약 20배, 적어도 약 25배, 적어도 약 30배, 적어도 약 35배, 적어도 약 40배, 적어도 약 45배, 또는 적어도 약 50배 이상까지 증가시킵니다. 본 개시내용으로부터 명백한 바와 같이, 페이로드의 로딩 증가는 EV의 페이로드 농도의 증가를 초래한다.
예를 들어, 일부 양태에서, 증가된 염 농도(예를 들어, 본원에 기재된 염 농도의 범위)를 갖는 로딩 완충액에서 페이로드와 EV를 혼합하면, EV의 외부 표면과 연관된 페이로드의 양(예를 들어 안티센스 올리고뉴클레오티드의 수)이 증가한다. 일부 양태에서, EV의 외부 표면과 회합된 페이로드의 양은 기준 양(예를 들어, 페이로드가 기준 완충액과 함께 로딩될 때 EV 외부 표면 상의 페이로드 양)과 비교하여 적어도 약 1배, 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 6배, 적어도 약 7배, 적어도 약 8배, 적어도 약 9배, 적어도 약 10배, 적어도 약 15배, 적어도 약 20배, 적어도 약 25배, 적어도 약 30배, 적어도 약 35배, 적어도 약 40배, 적어도 약 45배, 또는 적어도 약 50배 이상까지 증가된다. 일부 양태에서, 염 농도가 증가된 로딩 완충액에서 페이로드와 EV를 혼합하면 EV의 내강 표면과 회합된 페이로드의 양이 증가한다. 일부 양태에서, EV의 내강 표면과 회합된 페이로드의 양은 기준 양(예를 들어, 페이로드가 기준 완충액과 함께 로딩될 때 EV 내강 표면 상의 페이로드 양)과 비교하여 적어도 약 1배, 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 6배, 적어도 약 7배, 적어도 약 8배, 적어도 약 9배, 적어도 약 10배, 적어도 약 15배, 적어도 약 20배, 적어도 약 25배, 적어도 약 30배, 적어도 약 35배, 적어도 약 40배, 적어도 약 45배, 또는 적어도 약 50배 이상까지 증가된다. 일부 양태에서, 염 농도가 증가된 로딩 완충액에서 페이로드와 EV를 혼합하면 EV의 내강과 회합된 페이로드의 양이 증가한다. 일부 양태에서, EV의 내강과 회합된 페이로드의 양은 기준 양(예를 들어, 페이로드가 기준 완충액과 함께 로딩될 때 EV 내강 내의 페이로드 양)과 비교하여 적어도 약 1배, 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 6배, 적어도 약 7배, 적어도 약 8배, 적어도 약 9배, 적어도 약 10배, 적어도 약 15배, 적어도 약 20배, 적어도 약 25배, 적어도 약 30배, 적어도 약 35배, 적어도 약 40배, 적어도 약 45배, 또는 적어도 약 50배 이상까지 증가된다. 일부 양태에서, 증가된 염 농도를 갖는 로딩 완충액 내의 페이로드와 EV를 혼합하는 것은 EV의 외부 표면, EV의 내강 표면, EV의 내강, 또는 이들의 임의의 조합과 회합된 페이로드의 양을 증가시킨다.
본원에 기재된 로딩 완충액은 당업계에 공지된 임의의 적합한 염을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 염은 1가 염, 2가 염, 3가 염, 또는 이들의 조합을 포함한다. 특정 양태에서, 염은 1가 염을 포함한다. 일부 양태에서, 염은 2가 염을 포함한다. 일부 양태에서, 염은 3가 염을 포함한다. 이러한 염의 비제한적인 예는 아래에 추가로 제공된다. 일부 양태에서, 염은 NaCl(염화나트륨), KCl(염화칼륨), PO4(인산염), CaCl2(염화칼슘), MgCl2(염화마그네슘), Mg2SO4(황산마그네슘), ZnCl2(염화아연), MnCl2(염화망간), MnSO4(황산망간), NaSCN(티오시안산나트륨), KSCN(티오시안산칼륨), LiCl(염화리튬), K2HPO4(인산이칼륨), Na2SO4(황산나트륨), NaPO4 (인산나트륨), K2SO4(인산칼륨), 아세트산나트륨, 브롬화나트륨, 요오드화나트륨, 브롬화칼륨, 브롬화리튬, 불화나트륨, 불화칼륨, 불화리튬, 요오드화리튬, 아세트산칼륨, 아세트산리튬, 요오드화칼륨, 황산칼슘, 황산나트륨, 삼염화크롬, 황산크롬, 시트르산나트륨, 염화철(III), 염화이트륨(III), 황산칼륨, 염화제일철, 시트르산칼슘, 인산마그네슘, 염화제이철, 아르기닌-HCl, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 양태에서, 염은 NaCl을 포함한다.
일부 양태에서, 증가된 로딩 효율은 하기 중 임의의 것에 의해 달성될 수 있다: 염 또는 염 농도 변경, pH 변경, 유기 개질제, 유기 용매, 소분자, 세제, 쯔비터이온, 아미노산, 폴리머, 폴리올 (예를 들어, 수크로스, 글루코스, 트레할로스, 만노스, 소르비톨, 만니톨, 글리세롤, 등) 항산화제 (예를 들어, 메티오닌), EDTA, EGTA, 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 및/또는 우레아 첨가, 용액의 극성을 변경하는 부형제 첨가, EV의 구조를 조절하는 부형제 첨가, 또는 이들의 임의의 조합.
일부 양태에서, 증가된 로딩 효율 1가 염(예를 들어, 염화나트륨, 염화칼륨, 브롬화나트륨, 염화리튬, 요오드화나트륨, 브롬화칼륨, 브롬화리튬, 불화나트륨, 불화칼륨, 불화리튬, 요오드화리튬, 아세트산나트륨, 아세트산칼륨, 아세트산리튬, 및 요오드화 칼륨), 2가 또는 3가 염(예를 들어, 염화칼슘, 염화마그네슘, 황산칼슘, 황산나트륨, 황산마그네슘, 삼염화크롬, 황산크롬, 구연산나트륨, 염화철(III), 염화이트륨(III), 칼륨 인산염, 황산칼륨, 인산나트륨, 염화제일철, 구연산칼슘, 인산마그네슘 및 염화제이철), 또는 이들의 임의의 조합의 농도를 증가시킴으로써 달성될 수 있다.
II.B. 로딩 온도
본원에서 입증된 바와 같이, 출원인은 페이로드와 EV가 혼합되는 온도(본원에서는 "로딩 온도"라고도 함)를 증가시키는 것이 EV의 로딩 효율을 또한 증가시킬 수 있음을 추가로 확인하였다. 따라서, 일부 양태에서, 본 개시내용은 약 0℃ 초과 (예를 들어, 약 2℃ 초과 또는 약 4℃ 초과)인 로딩 온도에서 페이로드를 EV와 혼합하는 단계를 포함하는, 페이로드를 EV에 로딩하는 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 로딩 온도는 적어도 약 0℃, 적어도 약 1℃, 적어도 약 2℃, 적어도 약 3℃, 적어도 약 4℃, 적어도 약 5℃, 적어도 약 10℃, 적어도 약 15℃, 적어도 약 20℃, 적어도 약 25℃, 적어도 약 30℃, 적어도 약 35℃, 적어도 약 37℃, 적어도 약 40℃, 적어도 약 45℃, 적어도 약 50℃, 적어도 약 55℃, 적어도 약 60℃, 적어도 약 65℃, 적어도 약 70℃, 적어도 약 75℃, 또는 적어도 약 80℃이다. 특정 양태에서, 로딩 온도는 약 0℃ 내지 약 40℃, 약 1℃ 내지 약 40℃, 약 2℃ 내지 약 40℃, 약 3℃ 내지 약 40℃, 약 4℃ 내지 약 40℃, 약 5℃ 내지 약 40℃, 약 10℃ 내지 약 40℃, 약 15℃ 내지 약 40℃, 약 20℃ 내지 약 40℃, 약 25℃ 내지 약 40℃, 약 30℃ 내지 약 40℃, 약 35℃ 내지 약 40℃, 약 5℃ 내지 약 38℃, 약 10℃ 내지 약 38℃, 약 15℃ 내지 약 38℃, 약 20℃ 내지 약 38℃, 약 25℃ 내지 약 38℃, 약 30℃ 내지 약 38℃, 약 35℃ 내지 약 38℃, 약 5℃ 내지 약 37℃, 약 10℃ 내지 약 37℃, 약 15℃ 내지 약 37℃, 약 20℃ 내지 약 37℃, 약 25℃ 내지 약 37℃, 약 30℃ 내지 약 37℃, 또는 약 35℃ 내지 약 37℃이다. 일부 양태에서, 로딩 온도는 약 0℃, 약 1℃, 약 2℃, 약 3℃, 약 4℃, 약 5℃, 약 10℃, 약 15℃, 약 20℃, 약 25℃, 약 30℃, 약 35℃, 약 37℃, 약 40℃, 약 45℃, 약 50℃, 약 55℃, 약 60℃, 약 65℃, 약 70℃, 약 75℃, 또는 약 80℃이다.
일부 양태에서, 로딩 온도는 약 0℃ 내지 약 80℃이다. 일부 양태에서, 로딩 온도는 약 37℃ 내지 약 90℃이다. 일부 양태에서, 로딩 온도는 약 37℃이다. 일부 양태에서, 로딩 온도는 약 40℃이다. 일부 양태에서, 로딩 온도는 약 45℃이다. 일부 양태에서, 로딩 온도는 약 50℃이다. 일부 양태에서, 로딩 온도는 약 55℃이다. 일부 양태에서, 로딩 온도는 약 60℃이다. 일부 양태에서, 로딩 온도는 약 65℃이다. 일부 양태에서, 로딩 온도는 약 70℃이다. 일부 양태에서, 로딩 온도는 약 75℃이다. 일부 양태에서, 로딩 온도는 약 80℃이다.
일부 양태에서, 본원에 기재된 로딩 온도에서 페이로드와 EV를 혼합하는 것은 기준 온도(예를 들어, 로딩 온도 미만)에서 EV 내의 페이로드를 로딩하는 것과 비교하여 (예를 들어, 외부 표면 상에서, 내강 표면 상에서, 및/또는 내강 내에서) EV 내의 페이로드의 로딩을 적어도 약 0.5배, 적어도 약 1배, 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 6배, 적어도 약 7배, 적어도 약 8배, 적어도 약 9배, 적어도 약 10배, 적어도 약 15배, 적어도 약 20배, 적어도 약 25배, 적어도 약 30배, 적어도 약 35배, 적어도 약 40배, 적어도 약 45배, 또는 적어도 약 50배 이상까지 증가시킨다. 본 개시내용으로부터 명백한 바와 같이, 페이로드의 로딩 증가는 EV의 페이로드 농도의 증가를 초래한다.
일부 양태에서, 페이로드와 EV가 혼합되는 로딩 온도의 증가는 EV의 외부 표면과 회합된 페이로드의 양(예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오티드의 수)을 증가시킨다. 일부 양태에서, EV의 외부 표면과 회합된 페이로드의 양은 기준 양(예를 들어, 페이로드가 기준 온도에서 로딩될 때 EV 외부 표면 상의 페이로드 양)과 비교하여 적어도 약 1배, 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 6배, 적어도 약 7배, 적어도 약 8배, 적어도 약 9배, 적어도 약 10배, 적어도 약 15배, 적어도 약 20배, 적어도 약 25배, 적어도 약 30배, 적어도 약 35배, 적어도 약 40배, 적어도 약 45배, 또는 적어도 약 50배 이상까지 증가된다. 일부 양태에서, 페이로드와 EV가 혼합되는 로딩 온도를 증가시키는 것은 EV의 내강 표면과 회합된 페이로드의 양을 증가시킨다. 일부 양태에서, EV의 내강 표면과 회합된 페이로드의 양은 기준 양(예를 들어, 페이로드가 기준 온도에서 로딩될 때 EV 내강 표면 상의 페이로드 양)과 비교하여 적어도 약 1배, 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 6배, 적어도 약 7배, 적어도 약 8배, 적어도 약 9배, 적어도 약 10배, 적어도 약 15배, 적어도 약 20배, 적어도 약 25배, 적어도 약 30배, 적어도 약 35배, 적어도 약 40배, 적어도 약 45배, 또는 적어도 약 50배 이상까지 증가된다. 일부 양태에서, 페이로드와 EV가 혼합되는 로딩 온도를 증가시키는 것은 EV의 내강과 회합된 페이로드의 양을 증가시킨다. 일부 양태에서, EV의 내강과 회합된 페이로드의 양은 기준 양(예를 들어, 페이로드가 기준 온도에서 로딩될 때 EV 내강 내의 페이로드 양)과 비교하여 적어도 약 1배, 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 6배, 적어도 약 7배, 적어도 약 8배, 적어도 약 9배, 적어도 약 10배, 적어도 약 15배, 적어도 약 20배, 적어도 약 25배, 적어도 약 30배, 적어도 약 35배, 적어도 약 40배, 적어도 약 45배, 또는 적어도 약 50배 이상까지 증가된다. 일부 양태에서, 페이로드와 EV가 혼합되는 로딩 온도를 증가시키는 것은 EV의 외부 표면, EV의 내강 표면, EV의 내강, 또는 이들의 임의의 조합과 회합된 페이로드의 양을 증가시킨다.
II.C. 로딩 지속시간
본원에 입증된 바와 같이, 일부 양태에서 페이로드와 EV가 혼합되도록 허용되는 시간(본원에서는 "로딩 지속시간"이라고도 함)을 증가시키는 것은 또한 EV 내의 페이로드(예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오티드)의 로딩 효율을 증가시킬 수 있다. 일부 양태에서, 본 개시내용은 적어도 약 5분(예를 들어, 적어도 약 1시간)의 로딩 지속시간에서 페이로드를 EV와 혼합하는 단계를 포함하는, 페이로드를 EV에 로딩하는 방법을 제공한다. 특정 양태에서, 로딩 지속시간은 약 5분 내지 약 48시간, 약 5분 내지 약 42시간, 약 5분 내지 약 36시간, 약 5분 내지 약 40시간, 약 5분 내지 약 24시간, 약 10분 내지 약 48시간, 약 10분 내지 약 42시간, 약 10분 내지 약 36시간, 약 10분 내지 약 30시간, 약 10분 내지 약 24시간, 약 20분 내지 약 48시간, 약 20분 내지 약 42시간, 약 20분 내지 약 36시간, 약 20 분 약 30시간, 약 20분 내지 약 24시간, 약 30분 내지 약 48시간, 약 30분 내지 약 42시간, 약 30분 내지 약 36시간, 약 30분 내지 약 30시간, 약 30분 내지 약 24시간, 약 1시간 내지 약 48시간, 약 1시간 내지 약 42시간, 약 1시간 내지 약 36시간, 약 1시간 내지 약 30시간, 약 1시간 내지 약 24시간, 약 6시간 내지 약 48시간, 약 6시간 내지 약 42시간, 약 6시간 내지 약 36시간, 약 6시간 내지 약 30시간, 약 6시간 내지 약 24시간, 약 12시간 내지 약 48시간, 약 12시간 내지 약 42시간, 약 12시간 내지 약 36시간, 약 12시간 내지 약 30시간, 또는 약 12시간 내지 약 24 시간이다. 특정 양태에서, 로딩 지속시간은 약 6시간, 약 12시간, 약 24시간, 약 30시간, 약 36시간, 약 42시간, 또는 약 48시간이다.
일부 양태에서, 로딩 지속시간은 약 1시간 내지 약 10일이다. 일부 양태에서, 로딩 지속시간은 약 24시간 내지 약 7일이다. 일부 양태에서, 로딩 시간이 약 1시간이다. 일부 양태에서, 로딩 시간은 약 6시간이다. 일부 양태에서, 로딩 시간이 약 12시간이다. 일부 양태에서, 로딩 지속시간이 약 24시간이다. 일부 양태에서, 로딩 지속시간이 약 2일이고, 일부 양태에서, 로딩 지속시간이 약 3일이다. 일부 양태에서, 로딩 지속시간이 약 4일이고, 일부 양태에서, 로딩 지속시간이 약 5일이다. 일부 양태에서, 로딩 지속시간은 약 6일이다. 일부 양태에서, 로딩 지속시간은 약 7일이다. 일부 양태에서, 로딩 지속시간은 약 8일이다. 일부 양태에서, 로딩 지속시간이 약 9일이다. 일부 양태에서, 로딩 지속시간이 약 10일이다.
일부 양태에서, 본원에 기재된 로딩 지속시간(예를 들어, 적어도 약 24시간)에서 페이로드와 EV를 혼합하면, 기준 지속시간(예를 들어, 로딩 지속시간 미만)에서 EV 내의 페이로드를 로딩하는 것과 비교하여 (예를 들어, 외부 표면 상에서, 내강 표면 상에서, 및/또는 내강 내에서) EV 내의 페이로드의 로딩을 적어도 약 0.5배, 적어도 약 1배, 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 6배, 적어도 약 7배, 적어도 약 8배, 적어도 약 9배, 적어도 약 10배, 적어도 약 15배, 적어도 약 20배, 적어도 약 25배, 적어도 약 30배, 적어도 약 35배, 적어도 약 40배, 적어도 약 45배, 또는 적어도 약 50배 이상까지 증가시킨다. 본 개시내용으로부터 명백한 바와 같이, 페이로드의 로딩 증가는 EV의 페이로드 농도의 증가를 초래한다.
일부 양태에서, 로딩 지속시간의 증가는 EV의 외부 표면과 회합된 페이로드의 양(예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오티드의 수)을 증가시킨다. 일부 양태에서, EV의 외부 표면과 회합된 페이로드의 양은 기준 양(예를 들어, 기준 지속시간 동안 페이로드가 EV와 혼합될 때 EV의 외부 표면 상의 페이로드 양)과 비교하여 적어도 약 1배, 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 6배, 적어도 약 7배, 적어도 약 8배, 적어도 약 9배, 적어도 약 10배, 적어도 약 15배, 적어도 약 20배, 적어도 약 25배, 적어도 약 30배, 적어도 약 35배, 적어도 약 40배, 적어도 약 45배, 또는 적어도 약 50배 이상까지 증가된다. 일부 양태에서, 로딩 지속시간을 증가시키는 것은 EV의 내강 표면과 회합된 페이로드의 양을 증가시킨다. 일부 양태에서, EV의 내강 표면과 회합된 페이로드의 양은 기준 양(예를 들어, 기준 지속시간 동안 페이로드가 EV와 혼합될 때 EV의 내강 표면 상의 페이로드 양)과 비교하여 적어도 약 1배, 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 6배, 적어도 약 7배, 적어도 약 8배, 적어도 약 9배, 적어도 약 10배, 적어도 약 15배, 적어도 약 20배, 적어도 약 25배, 적어도 약 30배, 적어도 약 35배, 적어도 약 40배, 적어도 약 45배, 또는 적어도 약 50배 이상까지 증가된다. 일부 양태에서, 로딩 지속시간을 증가시키는 것은 EV의 내강과 회합된 페이로드의 양을 증가시킨다. 일부 양태에서, EV의 내강과 회합된 페이로드의 양은 기준 양(예를 들어, 기준 지속시간 동안 페이로드가 EV와 혼합될 때 EV의 내강 표면 상의 페이로드 양)과 비교하여 적어도 약 1배, 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 6배, 적어도 약 7배, 적어도 약 8배, 적어도 약 9배, 적어도 약 10배, 적어도 약 15배, 적어도 약 20배, 적어도 약 25배, 적어도 약 30배, 적어도 약 35배, 적어도 약 40배, 적어도 약 45배, 또는 적어도 약 50배 이상까지 증가된다. 일부 양태에서, 로딩 지속시간을 증가시키는 것은 EV의 외부 표면, EV의 내강 표면, EV의 내강, 또는 이들의 임의의 조합과 회합된 페이로드의 양을 증가시킨다.
II.D. 페이로드 공급물 농도
일부 양태에서, 본원에 제공된 페이로드(예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오티드)를 EV에 로딩하는 방법은 EV와 페이로드가 혼합되는 페이로드 공급물 농도를 증가시키는 것을 포함하며, 여기서 페이로드 공급물 농도의 증가는 페이로드의 로딩 효율을 향상시킨다. 본원에 사용된 용어 "페이로드 공급물 농도"는 본원에 기재된 로딩 방법에서 EV와 혼합되는 페이로드의 양을 지칭한다.
일부 양태에서, 페이로드 공급물 농도는 적어도 약 10 μM, 적어도 약 20 μM, 적어도 약 30 μM, 적어도 약 40 μM, 적어도 약 50 μM, 적어도 약 60 μM, 적어도 약 70 μM, 적어도 약 80 μM, 적어도 약 90 μM, 적어도 약 100 μM, 적어도 약 150 μM, 적어도 약 200 μM, 적어도 약 250 μM, 적어도 약 300 μM, 적어도 약 350 μM, 적어도 약 400 μM, 적어도 약 450 μM, 적어도 약 500 μM, 적어도 약 550 μM, 적어도 약 600 μM, 적어도 약 650 μM, 적어도 약 700 μM, 적어도 약 750 μM, 적어도 약 800 μM, 적어도 약 850 μM, 적어도 약 900 μM, 적어도 약 950 μM, 적어도 약 1000 μM, 적어도 약 1050 μM, 적어도 약 1100 μM, 적어도 약 1150 μM, 적어도 약 1200 μM, 적어도 약 1250 μM, 적어도 약 1300 μM, 적어도 약 1350 μM, 적어도 약 1400 μM, 적어도 약 1450 μM, 적어도 약 1500 μM, 적어도 약 1600 μM, 적어도 약 1700 μM, 적어도 약 1800 μM, 적어도 약 1900 μM, 적어도 약 2000 μM, 적어도 약 2100 μM, 적어도 약 2200 μM, 적어도 약 2300 μM, 적어도 약 2400 μM, 적어도 약 2500 μM, 적어도 약 2600 μM, 적어도 약 2700 μM, 적어도 약 2800 μM, 적어도 약 2900 μM, 또는 적어도 약 3000 μM이다. 일부 양태에서, 페이로드 공급물 농도는 약 600 μM이다. 일부 양태에서, 페이로드 공급물 농도는 약 800 μM이다.
일부 양태에서, 페이로드 공급물 농도는 약 50 μM 내지 약 1000 μM, 약 100 μM 내지 약 1000 μM, 약 200 μM 내지 약 1000 μM, 약 300 μM 내지 약 1000 μM, 약 400 μM 내지 약 1000 μM, 약 500 μM 내지 약 1000 μM, 약 50 μM 내지 약 900 μM, 약 100 μM 내지 약 900 μM, 약 200 μM 내지 약 900 μM, 약 300 μM 내지 약 900 μM, 약 400 μM 내지 약 900 μM, 약 500 μM 내지 약 900 μM, 약 50 μM 내지 약 800 μM, 약 100 μM 내지 약 800 μM, 약 200 μM 내지 약 800 μM, 약 300 μM 내지 약 800 μM, 약 400 μM 내지 약 800 μM, 약 500 μM 내지 약 800 μM, 약 50 μM 내지 약 700 μM, 약 100 μM 내지 약 700 μM, 약 200 μM 내지 약 700 μM, 약 300 μM 내지 약 700 μM, 약 400 μM 내지 약 700 μM, 또는 약 500 μM 내지 약 700이다. 일부 양태에서, 페이로드 공급물 농도는 약 1000 μM 내지 약 1100 μM, 약 1200 μM 내지 약 1300 μM, 약 1300 μM 내지 약 1400 μM, 약 1400 μM 내지 약 1500 μM, 약 1500 μM 내지 약 1600 μM, 약 1600 μM 내지 약 1700 μM, 약 1700 μM 내지 약 1800 μM, 약 1800 μM 내지 약 1900 μM, 약 1900 μM 내지 약 2000 μM, 약 2000 μM 내지 약 2100 μM, 약 2100 μM 내지 약 2200 μM, 약 2200 μM 내지 약 2300 μM, 약 2300 μM 내지 약 2400 μM, 약 2400 μM 내지 약 2500 μM, 약 2500 μM 내지 약 2600 μM, 약 2600 μM 내지 약 2700 μM, 약 2700 μM 내지 약 2800 μM, 약 2800 μM 내지 약 2900 μM, 또는 약 2900 μM 내지 약 3000 μM이다.
본원에 기재된 바와 같이, 일부 양태에서, 페이로드 공급물 농도의 증가는 (예를 들어, 외부 표면 상에서, 내강 표면 상에서, 및/또는 내강 내에서) EV 내 페이로드의 로딩을 기준 페이로드 공급물 농도(예를 들어, 본원에 기재된 페이로드 공급물 농도 미만)와 비교하여 적어도 약 0.5배, 적어도 약 1배, 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 6배, 적어도 약 7배, 적어도 약 8배, 적어도 약 9배, 적어도 약 10배, 적어도 약 15배, 적어도 약 20배, 적어도 약 25배, 적어도 약 30배, 적어도 약 35배, 적어도 약 40배, 적어도 약 45배, 또는 적어도 약 50배 이상까지 증가시킨다. 본 개시내용으로부터 명백한 바와 같이, 페이로드의 로딩 증가는 EV의 페이로드 농도의 증가를 초래한다.
일부 양태에서, 페이로드 공급물 농도의 증가는 EV의 외부 표면과 회합된 페이로드의 양(예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오티드의 수)을 증가시킨다. 일부 양태에서, EV의 외부 표면과 회합된 페이로드의 양은 기준 양(예를 들어, 기준 페이로드 공급물 농도에서 페이로드가 EV와 혼합될 때 EV의 외부 표면 상의 페이로드 양)과 비교하여 적어도 약 1배, 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 6배, 적어도 약 7배, 적어도 약 8배, 적어도 약 9배, 적어도 약 10배, 적어도 약 15배, 적어도 약 20배, 적어도 약 25배, 적어도 약 30배, 적어도 약 35배, 적어도 약 40배, 적어도 약 45배, 또는 적어도 약 50배 이상까지 증가된다. 일부 양태에서, 페이로드 공급물 농도의 증가는 EV의 내강 표면과 회합된 페이로드의 양을 증가시킨다. 일부 양태에서, EV의 내강 표면과 회합된 페이로드의 양은 기준 양(예를 들어, 기준 페이로드 공급물 농도에서 페이로드가 EV와 혼합될 때 EV의 외부 표면 상의 페이로드 양)과 비교하여 적어도 약 1배, 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 6배, 적어도 약 7배, 적어도 약 8배, 적어도 약 9배, 적어도 약 10배, 적어도 약 15배, 적어도 약 20배, 적어도 약 25배, 적어도 약 30배, 적어도 약 35배, 적어도 약 40배, 적어도 약 45배, 또는 적어도 약 50배 이상까지 증가된다. 일부 양태에서, 페이로드 공급물 농도의 증가는 EV의 내강과 회합된 페이로드의 양을 증가시킨다. 일부 양태에서, EV의 내강과 회합된 페이로드의 양은 기준 양(예를 들어, 기준 페이로드 공급물 농도에서 페이로드가 EV와 혼합될 때 EV의 외부 표면 상의 페이로드 양)과 비교하여 적어도 약 1배, 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 6배, 적어도 약 7배, 적어도 약 8배, 적어도 약 9배, 적어도 약 10배, 적어도 약 15배, 적어도 약 20배, 적어도 약 25배, 적어도 약 30배, 적어도 약 35배, 적어도 약 40배, 적어도 약 45배, 또는 적어도 약 50배 이상까지 증가된다. 일부 양태에서, 페이로드 공급물 농도의 증가는 EV의 외부 표면, EV의 내강 표면, EV의 내강, 또는 이들의 임의의 조합과 회합된 페이로드의 양을 증가시킨다.
II.E. EV 공급물 농도
일부 양태에서, 본 개시내용은 증가된 EV 공급물 농도에서 페이로드와 EV를 혼합하는 것을 포함하는, 페이로드(예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오티드)를 EV에 로딩하는 방법을 제공하고, 여기서 EV 공급물 농도의 증가는 페이로드의 로딩 효율을 향상시킨다. 본원에서 사용되는 용어 "EV 공급물 농도"는 본 개시내용의 로딩 방법에서 페이로드와 혼합되는 EV의 양을 지칭한다.
일부 양태에서, EV 공급물 농도는 적어도 약 1x1011개의 입자/mL (p/mL), 적어도 약 2x1011 p/mL, 적어도 약 3x1011 p/mL, 적어도 약 4x1011 p/mL, 적어도 약 5x1011 p/mL, 적어도 약 6x1011 p/mL, 적어도 약 7x1011 p/mL, 적어도 약 8x1011 p/mL, 적어도 약 9x1011 p/mL, 적어도 약 0.1x1013 p/mL, 적어도 약 0.2x1013 p/mL, 적어도 약 0.3x1013 p/mL, 적어도 약 0.4x1013 p/mL, 적어도 약 0.5x1013 p/mL, 적어도 약 0.6x1013 p/mL, 적어도 약 0.7x1013 p/mL, 적어도 약 0.8x1013 p/mL, 적어도 약 0.9x1013 p/mL, 적어도 약 1.0x1013 p/mL, 적어도 약 1.1x1013 p/mL, 적어도 약 1.2x1013 p/mL, 적어도 약 1.3x1013 p/mL, 적어도 약 1.4x1013 p/mL, 적어도 약 1.5x1013 p/mL, 적어도 약 1.6x1013 p/mL, 적어도 약 1.7x1013 p/mL, 적어도 약 1.8x1013 p/mL, 적어도 약 1.9x1013 p/mL, 적어도 약 2.0x1013 p/mL, 적어도 약 2.1x1013 p/mL, 적어도 약 2.2x1013 p/mL, 적어도 약 2.3x1013 p/mL, 적어도 약 2.4x1013 p/mL, 적어도 약 2.5x1013 p/mL, 적어도 약 2.6x1013 p/mL, 적어도 약 2.7x1013 p/mL, 적어도 약 2.8x1013 p/mL, 적어도 약 2.9x1013 p/mL, 적어도 약 3.0x1013 p/mL, 적어도 약 4x1013 p/mL, 적어도 약 5x1013 p/mL, 적어도 약 6x1013 p/mL, 적어도 약 7x1013 p/mL, 적어도 약 8x1013 p/mL, 적어도 약 9x1013 p/mL, 또는 적어도 약 1x1014 p/mL이다. 특정 양태에서, EV 공급물 농도는 약 1.0x1013 p/mL이다. 일부 양태에서, EV 공급물 농도는 약 1.4x1013 p/mL이다. 일부 양태에서, EV 공급물 농도는 약 6.0x1012 p/mL이다.
일부 양태에서, EV 공급물 농도는 약 0.2x1013 p/mL 내지 약 2.0x1013 p/mL, 약 0.4x1013 p/mL 내지 약 2.0x1013 p/mL, 약 0.6x1013 p/mL 내지 약 2.0x1013 p/mL, 약 0.8x1013 p/mL 내지 약 2.0x1013 p/mL, 약 1.0x1013 p/mL 내지 약 2.0x1013 p/mL, 약 0.2x1013 p/mL 내지 약 1.8x1013 p/mL, 약 0.4x1013 p/mL 내지 약 1.8x1013 p/mL, 약 0.6x1013 p/mL 내지 약 1.8x1013 p/mL, 약 0.8x1013 p/mL 내지 약 1.8x1013 p/mL, 약 1.0x1013 p/mL 내지 약 1.8x1013 p/mL, 약 0.2x1013 p/mL 내지 약 1.6x1013 p/mL, 약 0.4x1013 p/mL 내지 약 1.6x1013 p/mL, 약 0.6x1013 p/mL 내지 약 1.6x1013 p/mL, 약 0.8x1013 p/mL 내지 약 1.6x1013 p/mL, 약 1.0x1013 p/mL 내지 약 1.6x1013 p/mL, 약 0.2x1013 p/mL 내지 약 1.4x1013 p/mL, 약 0.4x1013 p/mL 내지 약 1.4x1013 p/mL, 약 0.6x1013 p/mL 내지 약 1.4x1013 p/mL, 약 0.8x1013 p/mL 내지 약 1.4x1013 p/mL, 약 1.0x1013 p/mL 내지 약 1.4x1013 p/mL, 약 0.2x1013 p/mL 내지 약 1.2x1013 p/mL, 약 0.4x1013 p/mL 내지 약 1.2x1013 p/mL, 약 0.6x1013 p/mL 내지 약 1.2x1013 p/mL, 약 0.8x1013 p/mL 내지 약 1.2x1013 p/mL, 또는 약 1.0x1013 p/mL 내지 약 1.2x1013 p/mL이다. 일부 양태에서, EV 공급물 농도는 약 2x1013 p/mL 내지 약 1x1014 p/mL, 약 3x1013 p/mL 내지 약 1x1014 p/mL, 약 4x1013 p/mL 내지 약 1x1014 p/mL, 약 5x1013 p/mL 내지 약 1x1014 p/mL, 약 6x1013 p/mL 내지 약 1x1014 p/mL, 약 7x1013 p/mL 내지 약 1x1014 p/mL, 약 8x1013 p/mL 내지 약 1x1014 p/mL, 또는 약 9x1013 p/mL 내지 약 1x1014 p/mL이다.
일부 양태에서, EV 공급물 농도의 증가는 (예를 들어, 외부 표면 상에서, 내강 표면 상에서, 및/또는 내강 내에서) EV 내 페이로드의 로딩을 기준 EV 공급물 농도(예를 들어, 본원에 기재된 공급물 농도 미만)와 비교하여 적어도 약 0.5배, 적어도 약 1배, 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 6배, 적어도 약 7배, 적어도 약 8배, 적어도 약 9배, 적어도 약 10배, 적어도 약 15배, 적어도 약 20배, 적어도 약 25배, 적어도 약 30배, 적어도 약 35배, 적어도 약 40배, 적어도 약 45배, 또는 적어도 약 50배 이상까지 증가시킨다. 본 개시내용으로부터 명백한 바와 같이, 페이로드의 로딩 증가는 EV의 페이로드 농도의 증가를 초래한다.
일부 양태에서, EV 공급물 농도의 증가는 EV의 외부 표면과 회합된 페이로드의 양(예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오티드의 수)을 증가시킨다. 일부 양태에서, EV의 외부 표면과 회합된 페이로드의 양은 기준 양(예를 들어, 기준 EV 공급물 농도에서 페이로드가 EV와 혼합될 때 EV의 외부 표면 상의 페이로드 양)과 비교하여 적어도 약 1배, 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 6배, 적어도 약 7배, 적어도 약 8배, 적어도 약 9배, 적어도 약 10배, 적어도 약 15배, 적어도 약 20배, 적어도 약 25배, 적어도 약 30배, 적어도 약 35배, 적어도 약 40배, 적어도 약 45배, 또는 적어도 약 50배 이상까지 증가된다. 일부 양태에서, EV 공급물 농도의 증가는 EV의 내강 표면과 회합된 페이로드의 양을 증가시킨다. 일부 양태에서, EV의 내강 표면과 회합된 페이로드의 양은 기준 양(예를 들어, 기준 EV 공급물 농도에서 페이로드가 EV와 혼합될 때 EV의 외부 표면 상의 페이로드 양)과 비교하여 적어도 약 1배, 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 6배, 적어도 약 7배, 적어도 약 8배, 적어도 약 9배, 적어도 약 10배, 적어도 약 15배, 적어도 약 20배, 적어도 약 25배, 적어도 약 30배, 적어도 약 35배, 적어도 약 40배, 적어도 약 45배, 또는 적어도 약 50배 이상까지 증가된다. 일부 양태에서, EV 공급물 농도의 증가는 EV의 내강과 회합된 페이로드의 양을 증가시킨다. 일부 양태에서, EV의 내강과 회합된 페이로드의 양은 기준 양(예를 들어, 기준 EV 공급물 농도에서 페이로드가 EV와 혼합될 때 EV의 외부 표면 상의 페이로드 양)과 비교하여 적어도 약 1배, 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 6배, 적어도 약 7배, 적어도 약 8배, 적어도 약 9배, 적어도 약 10배, 적어도 약 15배, 적어도 약 20배, 적어도 약 25배, 적어도 약 30배, 적어도 약 35배, 적어도 약 40배, 적어도 약 45배, 또는 적어도 약 50배 이상까지 증가된다. 일부 양태에서, EV 공급물 농도의 증가는 EV의 외부 표면, EV의 내강 표면, EV의 내강, 또는 이들의 임의의 조합과 회합된 페이로드의 양을 증가시킨다.
본 개시내용으로부터 명백한 바와 같이, 일부 양태에서, 본 개시내용의 로딩 방법은 본원에 기재된 것과 같은 다중(예를 들어, 2개 이상의) 로딩 매개변수를 조절하는 것을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 염 농도, 로딩 온도, 로딩 지속시간, 페이로드 공급 농도, EV 공급 농도, 또는 이들의 조합이 증가된다.
예를 들어, 일부 양태에서, 본원에 제공된 페이로드로 EV를 로딩하는 방법은 로딩 완충액의 염 농도(예를 들어, 약 150 mM 이상)와 로딩 온도(예를 들어, 약 37℃ 이상)를 모두 증가시키는 것을 포함한다. 일부 양태에서, 페이로드와 EV가 이러한 조건 하에서 혼합되는 경우, 로딩 효율은 (i) 염 농도가 감소된 로딩 완충액에서; (ii) 감소된 로딩 온도에서; 또는 (iii) 염 농도가 감소하고 로딩 온도가 감소된 로딩 완충액에서 페이로드와 EV가 혼합될 때 관찰된 로딩 효율과 비교하여 적어도 약 0.5배, 적어도 약 1배, 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 6배, 적어도 약 7배, 적어도 약 8배, 적어도 약 9배, 적어도 약 10배, 적어도 약 15배, 적어도 약 20배, 적어도 약 25배, 적어도 약 30배, 적어도 약 35배, 적어도 약 40배, 적어도 약 45배, 또는 적어도 약 50배 이상까지 증가된다.
일부 양태에서, 본원에 제공된 로딩 방법은 EV 내의 페이로드의 로딩 효율을 증가시키기 위해 다중 로딩 매개변수를 조절하는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 양태에서, 본원에 제공된 페이로드로 EV를 로딩하는 방법은 로딩 완충액의 염 농도 (예를 들어, 약 150 mM 이상) 및 로딩 지속시간 (예를 들어, 적어도 약 24시간 동안)를 모두 증가시키는 것을 포함한다. 일부 양태에서, 방법은 로딩 온도 (예를 들어, 약 37℃ 이상) 및 로딩 지속시간 (예를 들어, 적어도 약 24시간 동안)을 모두 증가시키는 것을 포함한다. 일부 양태에서, 본원에 제공된 로딩 방법은 로딩 완충액의 염 농도의 증가 (예를 들어, 약 150 mM 이상), 로딩 온도의 증가 (예를 들어, 약 37℃ 이상), 및 로딩 지속시간 (예를 들어, 적어도 약 24시간 동안)의 증가를 포함한다. 일부 양태에서, 페이로드와 EV가 이러한 조건 하에서 혼합되는 경우, 로딩 효율은 (i) 염 농도가 감소된 로딩 완충액에서; (ii) 감소된 로딩 온도에서; (iii) 더 짧은 로딩 지속시간 동안; 또는 (iv) (i) 내지 (iii)의 임의의 조합에서 페이로드와 EV가 혼합될 때 관찰된 로딩 효율과 비교하여 적어도 약 0.5배, 적어도 약 1배, 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 6배, 적어도 약 7배, 적어도 약 8배, 적어도 약 9배, 적어도 약 10배, 적어도 약 15배, 적어도 약 20배, 적어도 약 25배, 적어도 약 30배, 적어도 약 35배, 적어도 약 40배, 적어도 약 45배, 또는 적어도 약 50배 이상까지 증가된다.
일부 양태에서, 본원에 제공된 로딩 방법은 로딩 완충액의 염 농도(예를 들어, 약 150 mM 이상) 및 페이로드 공급물 농도(예를 들어, 약 800 μM 이상)를 모두 증가시키는 것을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 로딩 방법은 로딩 온도(예를 들어, 약 37℃ 이상) 및 페이로드 공급물 농도(예를 들어, 약 800 μM 이상)를 모두 증가시키는 것을 포함한다. 일부 양태에서, 본원에 제공된 페이로드를 EV에 로딩하는 방법은 로딩 지속시간(예를 들어, 적어도 약 24시간 동안) 및 페이로드 공급물 농도(예를 들어, 약 800 μM 이상)를 모두 증가시키는 것을 포함한다. 일부 양태에서, 로딩 효율을 증가시키기 위해, 본원에 제공된 로딩 방법은 로딩 완충액의 염 농도의 증가 (예를 들어, 약 150 mM 이상), 로딩 온도의 증가 (예를 들어, 약 37℃ 이상), 로딩 지속시간 (예를 들어, 적어도 약 24시간 동안)의 증가, 및 페이로드 공급물 농도의 증가 (예를 들어, 약 800 μM 이상)를 포함한다. 일부 양태에서, 페이로드와 EV가 이러한 조건 하에서 혼합되는 경우, 로딩 효율은 (i) 염 농도가 감소된 로딩 완충액에서; (ii) 감소된 로딩 온도에서; (iii) 더 짧은 로딩 지속시간 동안; (iv) 감소된 페이로드 공급물 농도로; 또는 (v) (i) 내지 (iv)의 임의의 조합에서 페이로드와 EV가 혼합될 때 관찰된 로딩 효율과 비교하여 적어도 약 0.5배, 적어도 약 1배, 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 6배, 적어도 약 7배, 적어도 약 8배, 적어도 약 9배, 적어도 약 10배, 적어도 약 15배, 적어도 약 20배, 적어도 약 25배, 적어도 약 30배, 적어도 약 35배, 적어도 약 40배, 적어도 약 45배, 또는 적어도 약 50배 이상까지 증가된다.
일부 양태에서, 본원에 제공된 페이로드로 EV를 로딩하는 방법은 로딩 완충액의 염 농도 (예를 들어, 약 150 mM 이상) 및 EV 공급물 농도 (예를 들어, 약 1.4x1013 p/mL 이상)를 모두 증가시키는 것을 포함한다. 일부 양태에서, 로딩 방법은 로딩 온도 (예를 들어, 약 37℃ 이상) 및 EV 공급물 농도 (예를 들어, 약 1.4x1013 p/mL 이상)를 모두 증가시키는 것을 포함한다. 일부 양태에서, 로딩 방법은 로딩 지속시간 (예를 들어, 적어도 약 24시간 동안) 및 EV 공급물 농도 (예를 들어, 약 1.4x1013 p/mL 이상)를 모두 증가시키는 것을 포함한다. 일부 양태에서, 로딩 방법은 페이로드 공급물 농도 (예를 들어, 약 800 μM 이상) 및 EV 공급물 농도 (예를 들어, 약 1.4x1013 p/mL 이상)를 모두 증가시키는 것을 포함한다. 일부 양태에서, 본원에 기재된 EV 로딩 방법은 로딩 완충액의 염 농도의 증가 (예를 들어, 약 150 mM 이상), 로딩 온도의 증가 (예를 들어, 약 37℃ 이상), 로딩 지속시간 (예를 들어, 적어도 약 24시간 동안)의 증가, 페이로드 공급물 농도의 증가 (예를 들어, 약 800 μM 이상), 및 , 및 EV 공급물 농도의 증가 (예를 들어, 약 1.4x1013 p/mL 이상)를 포함한다. 일부 양태에서, 페이로드와 EV가 이러한 조건 하에서 혼합되는 경우, 로딩 효율은 (i) 염 농도가 감소된 로딩 완충액에서; (ii) 감소된 로딩 온도에서; (iii) 더 짧은 로딩 지속시간 동안; (iv) 감소된 페이로드 공급물 농도로; (v) 감소된 EV 공급물 농도로; 또는 (vi) (i) 내지 (v)의 임의의 조합에서 페이로드와 EV가 혼합될 때 관찰된 로딩 효율과 비교하여 적어도 약 0.5배, 적어도 약 1배, 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 6배, 적어도 약 7배, 적어도 약 8배, 적어도 약 9배, 적어도 약 10배, 적어도 약 15배, 적어도 약 20배, 적어도 약 25배, 적어도 약 30배, 적어도 약 35배, 적어도 약 40배, 적어도 약 45배, 또는 적어도 약 50배 이상까지 증가된다.
본원에서 입증된 바와 같이, EV의 로딩 효율을 증가시키기 위해 상기에 제공된 모든 로딩 매개변수(염 농도, 로딩 온도, 로딩 지속시간, 페이로드 공급물 농도 및 EV 공급물 농도)를 조정(예를 들어 증가)할 필요는 없다. 일부 양태에서, 본원에 기재된 로딩 매개변수 중 하나 이상을 증가시키는 것은 로딩 효율에 부정적인 영향을 주지 않고 다른 로딩 매개변수가 일정하게 유지되거나 감소되도록 허용할 수 있다. 예를 들어, 일부 양태에서, 염 농도, 로딩 온도, 페이로드 공급물 농도 및/또는 EV 공급물 농도는 (예를 들어, 본원에 언급된 범위로) 증가될 수 있지만, 로딩 지속시간은 본원에 제공된 값보다 적다(예를 들어, 섹션 II.C 참조). 따라서, 본원에 기재된 로딩 매개변수 중 하나 이상(예를 들어, 염 농도, 로딩 온도, 페이로드 공급물 농도 및/또는 EV 공급물 농도)이 증가하는 경우, 로딩 지속시간은 약 1시간 미만이 될 수 있다. 특정 양태에서, 로딩 지속시간은 약 30 초, 약 1분, 약 2분, 약 3분, 약 4분, 약 5분, 약 10분, 약 15분, 약 20분, 약 25분, 약 30분, 약 35분, 약 40분, 약 45분, 약 50분, 약 55분, 또는 약 1시간일 수 있다. 유사하게, 로딩 지속시간을 늘리면 다른 로딩 매개변수(예를 들어, 염 농도, 로딩 온도, 페이로드 공급물 농도, 및/또는 EV 공급물 농도)가 로딩 효율성에 부정적인 영향을 주지 않고 일정하게 유지되거나 감소될 수 있다는 것이 본원에 제공된 개시내용에 기초하여 당업자에게 명백할 것이다.
일부 양태에서, 페이로드(예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오티드)를 EV에 로딩하는 방법이 본원에 제공되고, 방법은 (i) 적어도 약 1 mM의 염 농도를 갖는 로딩 완충액에서, (ii) 약 4℃ 초과의 로딩 온도에서, 및 (iii) 적어도 약 1시간의 로딩 지속시간 동안 페이로드를 EV와 혼합하는 것을 포함한다. 일부 양태에서, (i) 로딩 완충액의 염 농도는 약 200 mM 미만이고, (ii) 로딩 온도는 약 5℃ 내지 약 40℃이고, 그리고 (iii) 로딩 지속시간은 약 1시간 내지 약 48 시간이다. 특정 양태에서, (i) 염 농도는 약 50 mM 내지 약 150 mM이고, (ii) 로딩 온도는 약 15℃ 내지 약 40℃이고, 그리고 (iii) 로딩 지속시간은 약 12시간 내지 약 36시간이다. 특정 양태에서, (i) 염 농도는 약 100 mM이고, (ii) 로딩 온도는 약 37℃이고, 그리고 (iii) 로딩 지속시간은 약 24시간이다. 일부 양태에서, (i) 염 농도는 약 1 mM 내지 약 500 mM이고, (ii) 로딩 온도는 약 0℃ 내지 약 80℃이고, 그리고 (iii) 로딩 지속시간은 약 5분 내지 약 10일이다. 일부 양태에서, (i) 염 농도는 약 150 mM 내지 약 450 mM이고, (ii) 로딩 온도는 약 37℃ 내지 약 70℃이고, (iii) 로딩 지속시간은 약 24시간 내지 약 7일이다.
일부 양태에서, 상기 예시적인 방법은 페이로드 공급물 농도, EV 공급물 농도, 또는 둘 모두를 증가시키는 단계를 추가로 포함한다. 따라서, 특정 양태에서, (i) 로딩 완충액의 염 농도는 약 200 mM 미만이고, (ii) 로딩 온도는 약 5℃ 내지 약 40℃이고, (iii) 로딩 지속시간은 약 1시간 내지 약 48시간이고, (iv) 페이로드 공급물 농도는 약 50 μM 내지 약 1000 μM이고, (v) EV 공급물 농도는 약 0.2x1013 p/mL 내지 약 2.0x1013 p/mL이다. 특정 양태에서, (i) 염 농도는 약 50 mM 내지 약 150 mM이고, (ii) 로딩 온도는 약 15℃ 내지 약 40℃이고, (iii) 로딩 지속시간은 약 12시간 내지 약 36시간이고, (iv) 페이로드 공급물 농도는 약 100 μM에서 약 1000 μM 사이이고, 그리고 (v) EV 공급물 농도는 약 0.5x1013 p/mL 내지 약 2.0x1013 p/mL이다. 일부 양태에서, (i) 염 농도는 약 100 mM이고, (ii) 로딩 온도는 약 37℃이고, (iii) 로딩 지속시간은 약 24시간이고, (iv) 페이로드 공급물 농도는 약 600 μM이고, 그리고 (v) EV 공급물 농도는 약 1.0x1013 p/mL이다. 일부 양태에서, (i) 염 농도는 약 1 mM 내지 약 500 mM이고, (ii) 로딩 온도는 약 0℃ 내지 약 80℃이고, (iii) 로딩 지속시간은 약 5분 내지 약 10일이고, (iv) 페이로드 공급물 농도는 약 10 μM에서 약 2500 μM 사이이고, 그리고 (v) EV 공급물 농도는 약 1x1011 p/mL 내지 약 1x1014 p/mL이다. 일부 양태에서, (i) 염 농도는 약 150 mM 내지 약 450 mM이고, (ii) 로딩 온도는 약 37℃ 내지 약 70℃이고, (iii) 로딩 지속시간은 약 24시간 내지 약 7일이고, 그리고 (iv) 페이로드 공급물 농도는 약 6x1012 p/mL 내지 약 1.4x1013 p/mL이다.
일부 양태에서, 상기 인용된 염 농도, 로딩 온도, 로딩 지속시간, 페이로드 공급물 농도, 및/또는 EV 공급물 농도를 사용하여 페이로드(예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오티드)를 EV에 로딩하는 것은 감소된 염 농도 (예를 들어, 완충액은 염을 포함하지 않음), 줄어든 로딩 온도 (예를 들어, 약 4℃ 또는 그 미만), 더 짧은 로딩 지속시간 (예를 들어, 약 1시간 이하), 감소된 페이로드 공급물 농도 (예를 들어, 약 50 μM 미만), 및/또는 감소된 EV 공급물 농도 (예를 들어, 약 0.5x1013 p/mL 미만)를 갖는 페이로드의 로딩과 비교하여 (예를 들어, 외부 표면 상에서, 내강 표면 상에서, 및/또는 내강 내에서) EV 내의 페이로드의 로딩을 적어도 약 0.5배, 적어도 약 1배, 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 6배, 적어도 약 7배, 적어도 약 8배, 적어도 약 9배, 적어도 약 10배, 적어도 약 15배, 적어도 약 20배, 적어도 약 25배, 적어도 약 30배, 적어도 약 35배, 적어도 약 40배, 적어도 약 45배, 또는 적어도 약 50배 이상까지 증가시킨다
일부 양태에서, 상기 인용된 염 농도, 로딩 온도, 로딩 지속시간, 페이로드 공급물 농도, 및/또는 EV 공급물 농도를 사용하는 것은 기준 양 (예를 들어, 감소된 염 농도 (예를 들어, 완충액은 염을 포함하지 않음), 줄어든 로딩 온도 (예를 들어, 약 4℃ 또는 그 미만), 더 짧은 로딩 지속시간 (예를 들어, 약 1시간 이하), 감소된 페이로드 공급물 농도 (예를 들어 약 50 μM 미만), 및/또는 감소된 EV 공급물 농도 (예를 들어 약 0.5x1013 p/mL 미만)을 사용하여 로딩될 때 EV의 외부 표면 상의 페이로드의 양)과 비교하여 EV의 외부 표면과 회합된 페이로드의 양 (예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오티드의 수)를, 예를 들어, 적어도 약 1배, 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 6배, 적어도 약 7배, 적어도 약 8배, 적어도 약 9배, 적어도 약 10배, 적어도 약 15배, 적어도 약 20배, 적어도 약 25배, 적어도 약 30배, 적어도 약 35배, 적어도 약 40배, 적어도 약 45배, 또는 적어도 약 50배 이상까지 증가시킨다. 일부 양태에서, 상기 인용된 염 농도, 로딩 온도, 로딩 지속시간, 페이로드 공급물 농도, 및/또는 EV 공급물 농도를 사용하는 것은 기준 양 (예를 들어, 감소된 염 농도 (예를 들어, 완충액은 염을 포함하지 않음), 줄어든 로딩 온도 (예를 들어, 약 4℃ 또는 그 미만), 더 짧은 로딩 지속시간 (예를 들어, 약 1시간 이하), 감소된 페이로드 공급물 농도 (예를 들어 약 50 μM 미만), 및/또는 감소된 EV 공급물 농도 (예를 들어 약 0.5x1013 p/mL 미만)을 사용하여 로딩될 때 EV의 내강 표면 상의 페이로드의 양)과 비교하여 EV의 내강 표면과 회합된 페이로드의 양 (예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오티드의 수)를, 예를 들어, 적어도 약 1배, 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 6배, 적어도 약 7배, 적어도 약 8배, 적어도 약 9배, 적어도 약 10배, 적어도 약 15배, 적어도 약 20배, 적어도 약 25배, 적어도 약 30배, 적어도 약 35배, 적어도 약 40배, 적어도 약 45배, 또는 적어도 약 50배 이상까지 증가시킨다. 일부 양태에서, 상기 인용된 염 농도, 로딩 온도, 로딩 지속시간, 페이로드 공급물 농도, 및/또는 EV 공급물 농도를 사용하는 것은 기준 양 (예를 들어, 감소된 염 농도 (예를 들어, 완충액은 염을 포함하지 않음), 줄어든 로딩 온도 (예를 들어, 약 4℃ 또는 그 미만), 더 짧은 로딩 지속시간 (예를 들어, 약 1시간 이하), 감소된 페이로드 공급물 농도 (예를 들어 약 50 μM 미만), 및/또는 감소된 EV 공급물 농도 (예를 들어 약 0.5x1013 p/mL 미만)을 사용하여 로딩될 때 EV의 내강 내의 페이로드의 양)과 비교하여 EV의 내강과 회합된 페이로드의 양 (예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오티드의 수)를, 예를 들어, 적어도 약 1배, 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 6배, 적어도 약 7배, 적어도 약 8배, 적어도 약 9배, 적어도 약 10배, 적어도 약 15배, 적어도 약 20배, 적어도 약 25배, 적어도 약 30배, 적어도 약 35배, 적어도 약 40배, 적어도 약 45배, 또는 적어도 약 50배 이상까지 증가시킨다.
II.F. 기타 로딩 매개변수
II.F.1. 수크로스 농도
일부 양태에서, 본원에 기재된 로딩 방법은 로딩 공정 동안 하나 이상의 추가적인 매개변수를 조절하는 단계를 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 양태에서, 본 개시내용에 유용한 로딩 완충액(예를 들어, 본원에 인용된 농도 범위 내의 염을 포함함)는 하나 이상의 성분을 추가로 포함한다. 이러한 하나 이상의 성분의 비제한적인 예는 수크로스, 히스티딘, 아르기닌, 메티오닌, 인산나트륨, 인산칼륨, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
일부 양태에서, 본 개시내용과 함께 사용될 수 있는 로딩 완충액은 수크로스를 추가로 포함한다. 특정 양태에서, 로딩 완충액 중 수크로스의 농도는 적어도 약 1 % w/v, 적어도 약 2 % w/v, 적어도 약 3% w/v, 적어도 약 4% w/v, 적어도 약 5% w/v, 적어도 약 6% w/v, 적어도 약 7% w/v, 적어도 약 8% w/v, 적어도 약 9% w/v, 또는 적어도 약 10% w/v이다. 일부 양태에서, 수크로스의 농도는 약 10% w/v, 약 9% w/v, 약 8% w/v, 약 7% w/v, 약 6% w/v, 약 5% w/v, 약 4% w/v, 약 3% w/v, 약 2% w/v 또는 약 1% w/v이다.
일부 양태에서, 로딩 완충액 중 수크로스의 농도는 약 1 % w/v 내지 약 10 % w/v, 약 2 % w/v 내지 약 10 % w/v, 약 3 % w/v 내지 약 10 % w/v, 약 4 % w/v 내지 약 10 % w/v, 약 5 % w/v 내지 약 10 % w/v, 약 1% w/v 내지 약 9% w/v, 약 2% w/v 내지 약 9% w/v, 약 3% w/v 내지 약 9% w/v, 약 4% w/v 내지 약 9% w/v, 약 5% w/v 내지 약 9% w/v, 약 1% w/v 내지 약 8% w/v, 약 2% w/v 내지 약 8% w/v, 약 3% w/v 내지 약 8% w/v, 약 4% w/v 내지 약 8% w/v, 약 5% w/v 내지 약 8% w/v, 약 1% w/v 내지 약 7% w/v, 약 2% w/v 내지 약 7% w/v, 약 3% w/v 내지 약 7% w/v, 약 4% w/v 내지 약 7% w/v, 약 5% w/v 내지 약 7% w/v, 약 1% w/v 내지 약 6% w/v, 약 2% w/v 내지 약 6% w/v, 약 3% w/v 내지 약 6% w/v, 약 4% w/v 내지 약 6% w/v, 또는 약 5% w/v 내지 약 6% w/v이다. 특정 양태에서, 로딩 완충액의 수크로스 농도는 약 5% w/v이다.
II.F.2. 삼투질농도
일부 양태에서, 본원에 기재된 로딩 방법은 본원에 기재된 바와 같이 페이로드와 EV를 혼합하는 데 사용되는 로딩 완충액의 삼투질농도를 조절하는 단계를 포함한다. 특정 양태에서, 로딩 완충액의 삼투질농도 농도는 약 100 mOsm/kg 내지 약 600 mOsm/kg(예를 들어, 약 250 mOsm/kg 내지 약 500 mOsm/kg)이다. 특정 양태에서, 로딩 완충액의 삼투질농도는 약 275 mOsm/kg 내지 약 450 mOsm/kg, 약 280 mOsm/kg 내지 약 450 mOsm/kg, 약 300 mOsm/kg 내지 약 450 mOsm/kg, 약 275 mOsm/kg 내지 약 400 mOsm/kg, 약 280 mOsm/kg 내지 약 400 mOsm/kg, 약 300 mOsm/kg 내지 약 400 mOsm/kg, 약 275 mOsm/kg 내지 약 380 mOsm/kg, 약 280 mOsm/kg 내지 약 380 mOsm/kg, 약 300 mOsm/kg 내지 약 380 mOsm/kg, 약 275 mOsm/kg 내지 약 350 mOsm/kg, 약 280 mOsm/kg 내지 약 350 mOsm/kg, 약 300 mOsm/kg 내지 약 350 mOsm/kg, 약 275 mOsm/kg 내지 약 310 mOsm/kg, 약 280 mOsm/kg 내지 약 310 mOsm/kg, 또는 약 300 mOsm/kg 내지 약 310 mOsm/kg이다.
일부 양태에서, 로딩 완충액의 삼투질농도는 약 360 mOsm/kg, 약 370 mOsm/kg, 약 380 mOsm/kg, 약 390 mOsm/kg, 약 395 mOsm/kg, 또는 약 400 mOsm/kg이다. 일부 양태에서, 로딩 완충액의 삼투질농도는 약 395 mOsm/kg이다.
II.F.3. pH
일부 양태에서, 본 개시내용과 함께 사용될 수 있는(예를 들어 페이로드를 EV와 혼합하기 위해) 로딩 완충액은 약 6 내지 약 8의 pH를 갖는다. 특정 양태에서, 로딩 완충액의 pH는 약 6 내지 약 7 또는 약 7 내지 약 8이다. 일부 양태에서, pH는 약 6, 약 6.1, 약 6.2, 약 6.3, 약 6.4, 약 6.5, 약 6.6, 약 6.7, 약 6.8, 약 6.9, 약 7, 약 7.1, 약 7.2, 약 7.3, 약 7.4, 약 7.5, 약 7.6, 약 7.7, 약 7.8, 약 7.9, 또는 약 8이다. 특정 양태에서, 로딩 완충액의 pH는 약 7.2이다. 일부 양태에서, 본 개시내용에 유용한 로딩 완충액은 약 9의 pH를 갖는다.
II.G. 페이로드
당업자에게 명백한 바와 같이, 본원에 제공된 로딩 방법은 기술 분야에 알려진 임의의 적합한 페이로드로 EV를 로딩하는 데 사용될 수 있다. 본원에 기재된 방법을 사용하여 EV에 로딩될 수 있는 페이로드의 비제한적인 예는 펩티드, 소분자, 올리고뉴클레오티드, 안티센스 올리고뉴클레오티드 (ASO), 포스포로디아미데이트 모폴리노 올리고머 (PMO), mRNA, miRNA, lcRNA, 안타고미르, tRNA, siRNA, 펩티드 핵산, 세포 침투 펩티드, 보조제, 단백질, 탄수화물, 당, 아미노산, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 양태에서, 페이로드는 핵산을 포함한다. 일부 양태에서, 페이로드는 펩티드를 포함한다. 일부 양태에서, 페이로드는 소분자를 포함한다. 특정 양태에서, 페이로드는 안티센스 올리고뉴클레오티드(ASO)(본원에서는 "안티센스 ASO" 및 "올리고머"라고도 함)를 포함한다. 일부 양태에서, 페이로드는 mRNA를 포함한다. 일부 양태에서, 페이로드는 miRNA를 포함한다. 일부 양태에서, 페이로드는 lcRNA를 포함한다. 일부 양태에서, 페이로드는 안타고미르를 포함한다. 일부 양태에서, 페이로드는 tRNA를 포함한다. 일부 양태에서, 페이로드는 siRNA를 포함한다. 일부 양태에서, 페이로드는 펩티드 핵산을 포함한다. 일부 양태에서, 페이로드는 세포 침투 펩티드를 포함한다. 일부 양태에서, 페이로드는 보조제를 포함한다. 일부 양태에서, 페이로드는 단백질을 포함한다. 일부 양태에서, 페이로드는 탄수화물을 포함한다. 일부 양태에서, 페이로드는 당을 포함한다. 일부 양태에서, 페이로드는 아미노산을 포함한다. 특정 양태에서, 페이로드는 페이로드의 용해도를 증가시키도록 설계된 도메인(예를 들어 하전된 치환기)을 포함한다. 이러한 도메인의 비제한적인 예는 세포 침투 펩티드, 다중음이온 (예를 들어, 폴리글루탐산), 다중양이온 (예를 들어, 폴리라이신, 폴리아르기닌, 폴리에틸렌이민), 및 그의 조합을 포함한다. 따라서, 본원에 기재된 로딩 방법은 EV의 외부 표면과 회합된 ASO의 수를 증가시키는 데 사용될 수 있다.
일부 양태에서, 본 개시내용에 유용한 페이로드(예를 들어, ASO)는 약 10 내지 약 30, 예컨대 10 내지 20, 14 내지 20, 16 내지 20, 또는 15 내지 25개의 뉴클레오티드 길이의 연속 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 양태에서, 페이로드는 길이가 20개의 뉴클레오티드이다. 특정 양태에서, 페이로드는 길이가 18개의 뉴클레오티드이다. 특정 양태에서, 페이로드는 길이가 19개의 뉴클레오티드이다. 특정 양태에서, 페이로드는 길이가 17개의 뉴클레오티드이다. 특정 양태에서, 페이로드는 길이가 16개의 뉴클레오티드이다. 특정 양태에서, 페이로드는 길이가 15개의 뉴클레오티드이다. 일부 양태에서, 페이로드는 길이가 14개의 뉴클레오티드이다. 일부 양태에서, 페이로드는 길이가 13개의 뉴클레오티드이다. 특정 양태에서, 페이로드는 길이가 12개의 뉴클레오티드이다. 일부 양태에서, 페이로드는 길이가 11개의 뉴클레오티드이다. 추가 양태에서, 페이로드는 길이가 10개의 뉴클레오티드이다.
일부 양태에서, 페이로드는 약 10 내지 약 50개, 예를 들어, 약 10 내지 약 45, 약 10 내지 약 40, 약 10 또는 약 35, 또는 약 10 내지 약 30개의 뉴클레오티드 길이의 연속 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 양태에서, 페이로드는 길이가 21개의 뉴클레오티드이다. 특정 양태에서, 페이로드는 길이가 22개의 뉴클레오티드이다. 특정 양태에서, 페이로드는 길이가 23개의 뉴클레오티드이다. 특정 양태에서, 페이로드는 길이가 24개의 뉴클레오티드이다. 특정 양태에서, 페이로드는 길이가 25개의 뉴클레오티드이다. 특정 양태에서, 페이로드는 길이가 26개의 뉴클레오티드이다. 특정 양태에서, 페이로드는 길이가 27개의 뉴클레오티드이다. 특정 양태에서, 페이로드는 길이가 28개의 뉴클레오티드이다. 특정 양태에서, 페이로드는 길이가 29개의 뉴클레오티드이다. 특정 양태에서, 페이로드는 길이가 30개의 뉴클레오티드이다. 특정 양태에서, 페이로드는 길이가 31개의 뉴클레오티드이다. 특정 양태에서, 페이로드는 길이가 32개의 뉴클레오티드이다. 특정 양태에서, 페이로드는 길이가 33개의 뉴클레오티드이다. 특정 양태에서, 페이로드는 길이가 34개의 뉴클레오티드이다. 특정 양태에서, 페이로드는 길이가 35개의 뉴클레오티드이다. 특정 양태에서, 페이로드는 길이가 36개의 뉴클레오티드이다. 특정 양태에서, 페이로드는 길이가 37개의 뉴클레오티드이다. 특정 양태에서, 페이로드는 길이가 38개의 뉴클레오티드이다. 특정 양태에서, 페이로드는 길이가 39개의 뉴클레오티드이다. 특정 양태에서, 페이로드는 길이가 40개의 뉴클레오티드이다. 특정 양태에서, 페이로드는 길이가 41개의 뉴클레오티드이다. 특정 양태에서, 페이로드는 길이가 42개의 뉴클레오티드이다. 특정 양태에서, 페이로드는 길이가 43개의 뉴클레오티드이다. 특정 양태에서, 페이로드는 길이가 44개의 뉴클레오티드이다. 특정 양태에서, 페이로드는 길이가 45개의 뉴클레오티드이다. 특정 양태에서, 페이로드는 길이가 46개의 뉴클레오티드이다. 특정 양태에서, 페이로드는 길이가 47개의 뉴클레오티드이다. 특정 양태에서, 페이로드는 길이가 48개의 뉴클레오티드이다. 특정 양태에서, 페이로드는 길이가 49개의 뉴클레오티드이다. 특정 양태에서, 페이로드는 길이가 50개의 뉴클레오티드이다.
다양한 양태에서, 본 개시내용의 페이로드(예를 들어, ASO)는 RNA(단위)를 포함하지 않는다. 일부 양태에서, 페이로드는 하나 이상의 DNA 단위를 포함한다. 특정 양태에서, 본 개시내용에 유용한 페이로드는 선형 분자이거나 선형 분자로서 합성된다. 일부 양태에서, 페이로드는 단일 가닥 분자이고, 예를 들어, 동일한 페이로드(즉, 듀플렉스) 내의 등이 영역에 상보적인 적어도 3, 4 또는 5개의 연속 뉴클레오티드의 짧은 영역을 포함하지 않는다 - 이와 관련하여 페이로드는 (본질적으로) 이중 가닥이 아니다. 일부 양태에서, 페이로드는 본질적으로 이중 가닥이 아니다. 일부 양태에서, 페이로드는 siRNA가 아니다. 다양한 양태에서, 본원에 기재된 로딩 방법과 함께 사용될 수 있는 페이로드는 연속 뉴클레오티드 영역으로 완전히 구성된다. 따라서 일부 양태에서, 페이로드는 실질적으로 자기 상보적이지 않다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 페이로드(예를 들어, ASO)의 단편을 포함한다. 예를 들어, 본 개시내용은 본원에 개시된 페이로드(예를 들어, ASO)의 적어도 1개의 뉴클레오티드, 적어도 2개의 연속 뉴클레오티드, 적어도 3개의 연속 뉴클레오티드, 적어도 4개의 연속 뉴클레오티드, 적어도 5개의 연속 뉴클레오티드, 적어도 6개의 연속 뉴클레오티드, 적어도 7개의 연속 뉴클레오티드, 적어도 8개의 연속 뉴클레오티드, 또는 적어도 9개의 연속 뉴클레오티드를 포함한다. 본원에 개시된 임의의 서열의 단편은 개시내용의 일부로서 고려된다.
일부 양태에서, 본 개시내용에 유용한 페이로드는 하나 이상의 뉴클레오시드 유사체를 포함한다. 특정 양태에서, 뉴클레오시드 유사체 중 하나 이상은 2'-O-알킬-RNA; 2'-O-메틸 RNA (2'-OMe); 2'-알콕시-RNA; 2'-O-메톡시에틸-RNA (2'-MOE); 2'-아미노-DNA; 2'-플루로-RNA; 2'-플루오로-DNA; 아라비노 핵산 (ANA); 2'-플루오로-ANA; 바이사이클릭 뉴클레오시드 유사체 (LNA), 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 특정 양태에서, 뉴클레오시드 유사체 중 하나 이상은 당 변형 뉴클레오시드이다. 추가 양태에서, 당-변형 뉴클레오시드는 친화성 강화 2' 당 변형 뉴클레오시드이다. 일부 양태에서, 뉴클레오시드 유사체 중 하나 이상은 이환 당을 포함하는 뉴클레오시드를 포함한다. 특정 양태에서, 뉴클레오시드 유사체 중 하나 이상은 LNA를 포함한다. 추가 양태에서, 뉴클레오시드 유사체 중 하나 이상은 구속 에틸 뉴클레오시드 (cEt), 2',4' 구속 2'-O-메톡시에틸 (cMOE), α-L-LNA, β-D-LNA, 2'-O,4'-C-에틸렌-가교된 핵산 (ENA), 아미노-LNA, 옥시-LNA, 티오-LNA, 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 양태에서, 본원에 제공된 로딩 방법을 사용하여 EV에 로딩될 수 있는 페이로드는 포스포로디아미데이트 모폴리노 올리고머(PMO), 펩티드 접합 포스포로디아미데이트 모폴리노 올리고머(PPMO), 또는 둘 다를 포함한다.
II.G.1. 표적
당업자에게 명백한 바와 같이, 관심 있는 임의의 특정 분자(예를 들어, 유전자)를 표적으로 하는 페이로드가 본 개시내용과 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 양태에서, 본원에 제공된 로딩 방법은 분자에 특이적으로 결합하는 페이로드(예를 들어, ASO)가 생성될 수 있는 임의의 분자(예를 들어, 유전자)에 대해 사용될 수 있다. 따라서, 일부 양태에서, 본 개시내용에 유용한 페이로드(예를 들어, ASO)는 세포에서 관심 있는 임의의 유전자 또는 단백질의 발현을 하향 조절(예를 들어, 감소 또는 억제)할 수 있다. 이러한 표적의 비제한적인 예는 아래에서 추가로 기재된다.
II.G.1.a. STAT6
일부 양태에서, 본원에 제공된 페이로드(예를 들어, ASO)는 세포에서 관심 있는 임의의 유전자 또는 단백질의 발현을 하향 조절(예를 들어, 감소 또는 억제)할 수 있다. 특정 양태에서, 본원에 기재된 페이로드(예를 들어, 본 개시내용의 로딩 방법을 사용하여 EV에 로딩될 수 있음)는 STAT6 프리-mRNA(pre-mRNA)의 하나 이상의 영역(예를 들어, 인트론 영역, 엑손 영역 및/또는 엑손-인트론 접합부 영역)을 표적으로 한다. 일부 양태에서, 페이로드는 STAT6 단백질의 모든 동형(isoform)을 표적으로 할 수 있다. 특정 양태에서, 페이로드는 특정 STAT6 동형(예를 들어, 동형 1 및 동형 2, 동형 1 및 동형 3, 및 동형 2 및 동형 3)을 표적으로 한다. 달리 나타내지 않는 한, 본원에 사용되는 "STAT6"이라는 용어는 하나 이상의 종(예를 들어, 인간, 비-인간 영장류, 개, 고양이, 기니아 피그, 토끼, 랫트, 마우스, 말, 소, 및 곰)의 STAT6을 지칭할 수 있다.
STAT6(STAT6)은 신호 변환자 및 전사 활성자 6로도 알려져 있다. STAT6/STAT6의 동의어는 알려져 있으며 IL-4 STAT; STAT, 인터루킨4 유도; 전사 인자 IL-4 STAT; STAT6B; STAT6C; 및 D12S1644를 포함한다. 인간 STAT6 유전자에 대한 서열은 공개적으로 이용 가능한 GenBank 수탁 번호 NC_000012.12:c57111413-57095404에서 찾을 수 있다. 인간 STAT6 유전자는 염색체 위치 12q13.3, 57111413-57095404, 보체에서 찾는다.
인간 STAT6 프리-mRNA 전사체(서열번호: 2)에 대한 서열은 염색체 12q13.3의 잔기 57111413-57095404, 보체의 역보체에 해당한다. STAT6 mRNA 서열(GenBank 수탁 번역 NM_001178078.1)은 서열번호: 4에 제공되지만, 서열번호: 4의 뉴클레오티드 "t"는 mRNA에서 "u"로 표시된다. 인간 STAT6 단백질의 서열은 공개적으로 이용가능한 수탁 번호: P42226-1, (정규 서열, 서열번호: 3), P42226-2 (서열번호: 5), 및 P42226-3 (서열번호: 5) 하에서 찾을 수 있고, 이들 각각은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
인간 STAT6 유전자 산물의 천연 변이체가 알려져 있다. 예를 들어, 인간 STAT6 단백질의 천연 변이체는 M118R, D419N 및 이들의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 치환을 함유할 수 있다. 대체 스플라이싱으로 인한 인간 STAT6 단백질의 추가 변이체도 당업계에 알려져 있다. STAT6 동형 2(식별자: UniProt의 P42226-2)는 다음과 같이 정규 서열(서열변호: 4)과 상이하다: 잔기 1-174이 결실됨 및 서열변호: 4에 대해 175PSE177이 175MEQ177로 치환. STAT6 동형 3(식별자: P42226-3)의 서열은 다음과 같이 정규 서열(서열변호 4)과 상이하다: 서열번호: 4에 대해 잔기 1-110이 결실됨. 따라서, 본원에 기재된 페이로드(예를 들어, ASO)는 STAT6 단백질의 천연 변이체의 발현을 감소시키거나 억제하도록 설계될 수 있다.
페이로드(예를 들어, ASO)의 표적 핵산 서열의 예는 STAT6 프리-mRNA이다. 서열번호: 12는 인간 STAT6 게놈 서열(즉, 뉴클레오티드 57111413-57095404의 역보체, 염색체 12q13.3의 보체)을 나타낸다. 서열번호: 12는 서열번호: 12의 뉴클레오티드 "t"가 프리-mRNA에서 "u"로 표시된다는 점을 제외하면 STAT6 프리-mRNA 서열과 동일하다. 특정 양태에서, "표적 핵산"은 NLRP6 단백질 인코딩 핵산 또는 이의 천연 발생 변이체, 및 그로부터 유래된 RNA 핵산, 예를 들어 프리-mRNA의 인트론을 포함한다. 일부 양태에서, "표적 핵산"은 NLRP6 단백질 인코딩 핵산 또는 이의 천연 발생 변이체, 및 그로부터 유래된 RNA 핵산, 예를 들어 프리-mRNA의 엑손 영역을 포함한다. 일부 양태에서, "표적 핵산"은 STAT6 단백질 인코딩 핵산 또는 이의 천연 발생 변이체, 및 그로부터 유래된 RNA 핵산, 예를 들어 프리-mRNA의 엑손-인트론 접합부을 포함한다. 일부 양태에서, 예를 들어 연구 또는 진단에 사용되는 경우, "표적 핵산"은 cDNA 또는 상기 DNA 또는 RNA 핵산 표적에서 유래된 합성 올리고뉴클레오티드일 수 있다. STAT6 프리-mRNA에 의해 인코딩된 인간 STAT6 단백질 서열은 서열번호: 3으로 표시된다. 일부 양태에서, 표적 핵산은 STAT6 단백질 인코딩 핵산 또는 이의 천연 발생 변이체, 예를 들어, 5' UTR, 3' UTR, 또는 둘 다의 비번역된 영역을 포함한다.
일부 양태에서, 본 개시내용의 페이로드(예를 들어, ASO)는 STAT6 전사체, 예를 들어, 서열번호: 11의 인트론 내의 영역에 혼성화된다. 특정 양태에서, 페이로드는 STAT6 전사체, 예를 들어, 서열번호 11의 엑손 내의 영역에 혼성화된다. 일부 양태에서, 페이로드는 STAT6 전사체, 예를 들어, 서열번호 11의 엑손-인트론 접합부 내의 영역에 혼성화된다. 일부 양태에서, 페이로드는 STAT6 전사체, 예를 들어, 서열번호 11 내의 영역(예를 들어, 인트론, 엑손 또는 엑손-인트론 접합부)에 혼성화된다.
일부 양태에서, 본원에 개시된 STAT6 전사체를 표적으로 하는 페이로드를 STAT6 인코딩 mRNA 전사체에 결합시키는 것은 STAT6의 발현 수준 및/또는 활성 수준을 감소시킬 수 있다.
일부 양태에서, 페이로드는 STAT6 전사체를 특이적으로 표적화할 수 있는 ASO를 포함한다. 일부 양태에서, ASO의 뉴클레오티드 서열 또는 이의 연속 뉴클레오티드 서열은 서열번호: 41 내지 50 중 어느 하나에 제시된 서열(즉, 도 3a의 서열)과 적어도 약 80%의 서열 동일성, 예컨대 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96% 서열 동일성, 적어도 약 97% 서열 동일성, 적어도 약 98% 서열 동일성, 적어도 약 99% 서열 동일성, 예컨대 약 100% 서열 동일성을 갖는다.
일부 양태에서 ASO (또는 이의 연속 뉴클레오티드 부분)는 서열번호: 41 내지 50 또는 이의 적어도 10개의 연속 뉴클레오티드 영역으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열 중 하나로부터 선택되거나 이를 포함하고, 여기서 ASO (또는 이의 연속 뉴클레오티드 부분)은 해당하는 STAT6 전사체와 비교할 때 1, 2, 3 또는 4개의 불일치를 선택적으로 포함할 수 있다.
일부 양태에서, ASO는 서열번호: 41에 제시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, ASO는 서열번호: 42에 제시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, ASO는 서열번호: 43에 제시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, ASO는 서열번호: 44에 제시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, ASO는 서열번호: 45에 제시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, ASO는 서열번호: 46에 제시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, ASO는 서열번호: 47에 제시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, ASO는 서열번호: 48에 제시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, ASO는 서열번호: 49에 제시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, ASO는 서열번호: 50에 제시된 서열을 포함한다.
일부 양태에서, ASO는 서열번호: 41 내지 50에 제시된 서열과 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 동일한 서열을 포함하거나 이로 구성된다. 일부 양태에서, ASO (또는 이의 연속 뉴클레오티드 부분)는 서열번호: 41 내지 50으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열 중 하나 또는 그의 적어도 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개의 인접 뉴클레오티드의 영역으로부터 선택되거나 이를 포함한다. 일부 양태에서 ASO (또는 이의 연속 뉴클레오티드 부분)는 서열번호: 41 내지 50 또는 이의 적어도 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개의 연속 뉴클레오티드 영역으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열 중 하나로부터 선택되거나 이를 포함하고, 여기서 ASO (또는 이의 연속 뉴클레오티드 부분)은 해당하는 STAT6 전사체와 비교할 때 1, 2, 3 또는 4개의 불일치를 선택적으로 포함할 수 있다. 일부 양태에서, ASO(또는 이의 연속 뉴클레오티드 부분)는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 치환을 제외하고 서열번호: 41 내지 50으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열 중 하나로부터 선택되거나 이를 포함하고, 치환된 ASO는 STAT6 전사체에 결합할 수 있다. 일부 양태에서, ASO (또는 이의 연속 뉴클레오티드 부분)는 서열번호: 41 내지 50 또는 이의 적어도 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개의 연속 뉴클레오티드 영역으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열 중 하나로부터 선택되거나 이를 포함하고, 여기서 ASO (또는 이의 연속 뉴클레오티드 부분)은 상응하는 STAT6 전사체에 상보적인 1개, 2개, 3개 또는 4개의 추가 5' 및/또는 3' 뉴클레오티드를 선택적으로 포함할 수 있다.
II.G
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1.b
KRAS
일부 양태에서, 본원에 제공된 페이로드(예를 들어, ASO)는 예를 들어 세포에서 KRAS mRNA 또는 KRAS 단백질의 발현을 하향 조절(예를 들어, 감소 또는 억제)할 수 있다. 특정 양태에서, 본원에 기재된 페이로드(예를 들어, 본 개시내용의 로딩 방법을 사용하여 EV에 로딩될 수 있음)는 KRAS 프리-mRNA의 하나 이상의 영역(예를 들어, 인트론 영역, 엑손 영역 및/또는 엑손-인트론 접합부 영역)을 표적으로 한다. 일부 양태에서, 페이로드는 KRAS 단백질의 모든 동형을 표적으로 할 수 있다. 특정 양태에서, 페이로드는 특정 KRAS 동형을 표적으로 한다. 달리 나타내지 않는 한, 본원에 사용되는 "KRAS"이라는 용어는 하나 이상의 종(예를 들어, 인간, 비-인간 영장류, 개, 고양이, 기니아 피그, 토끼, 랫트, 마우스, 말, 소, 및 곰)의 KRAS를 지칭할 수 있다.
KRAS는 업계에서 다양한 명칭으로 알려져 있다. 이러한 명칭은 하기를 포함한다: KRAS 원종양유전자, GTPase; V-Ki-Ras2 커스틴(Kirsten) 랫트 육종 2 바이러스 종양유전자 동족체; GTPase KRas; C-Ki-Ras; K-Ras 2; KRAS2; RASK2; V-Ki-Ras2 커스틴 랫트 육종 바이러스 종양유전자 동족체; 커스틴 랫트 육종 바이러스 원종양유전자; 세포 변환시키는 원종양유전자; 세포 C-Ki-Ras2 원종양유전자; 변환시키는 단백질 P21; PR310 C-K-Ras 종양유전자; C-커스틴-Ras 단백질; K-Ras P21 단백질; 및 종양유전자 KRAS2.
인간 KRAS 유전자의 서열은 염색체 위치 12p12.1 및 공개적으로 이용가능한 GenBank 수탁 번호 NC_000012 (25,204,789 - 25,250,936)에서 찾을 수 있다. 인간 야생형 KRAS 전사체의 게놈 서열은 NC_000012 (서열번호: 11)의 잔기 25,204,789 - 25,250,936의 역보체에 해당한다. 서열번호: 7에 제공된 KRAS G12D 게놈 서열은 뉴클레오티드 위치 5,587에 구아닌에서 아데닌으로의 치환이 있다는 점에서 서열번호: 11과 상이하다. 예시적인 KRAS G12D mRNA 서열은 서열번호: 9의 뉴클레오티드 "t"가 mRNA에서 "u"로 표시된 것을 제외하고는 서열번호: 33에 제공된다. 서열번호: 9에 제공된 KRAS G12D mRNA는 뉴클레오티드 위치 225에 구아닌에서 아데닌으로의 치환이 있다는 점에서 야생형 mRNA 서열(예를 들어, GenBank 수탁 번호 NM_004985.5; 서열번호: 13)과 상이하다. 인간 KRAS 단백질의 서열은 공개적으로 이용가능한 수탁 번호: P01116 (정규 서열), A8K8Z5, B0LPF9, P01118, 및 Q96D10에서 찾을 수 있으며, 이들 각각은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
인간 KRAS 단백질(P01116)에는 대체 스플라이싱으로 인해 2개의 동형이 있다. 동형 2A(수탁 번호: P01116-1; 서열번호: 14)은 정규 서열이다. K-Ras4A라고도 한다. 동형형 2B(수탁 번호: P01116-2; K-Ras4B로도 알려짐; 서열번호: 12)는 다음과 같이 정규 서열과 상이하다: (i) 151-153: RVE → GVD; 및 (ii) 165-189: QYRLKKISKEEKTPGCVKIKKCIIM (서열번호:15) → KHKEKMSKDGKKKKKKSKTKCVIM (서열번호:16). 일부 양태에서, 본원에 개시된 페이로드는 KRAS 단백질 동형 2A, 동형 2B, 또는 둘 다의 발현을 감소시키거나 억제할 수 있다.
인간 KRAS 유전자 산물의 천연 변이체가 알려져 있다. 예를 들어, 인간 KRAS 단백질의 천연 변이체는 하기로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 치환을 함유할 수 있다: K5E, K5N, G10GG, G10V, G12A, G12C, G12F, G12I, G12L, G12R, G12S, G12V, G13C, G13D, G13E, G13R, G13V, V14I, L19F, T20M, Q22E, Q22H, Q22K, Q22R, Q25H, N26Y, F28L, E31K, D33E, P34L, P34Q, P34R, I36M, R41K, D57N, T58I, A59T, G60D, G60R, G60S, G60V, Q61A, Q61H, Q61K, Q61L, Q61P, Q61R, E63K, S65N, R68S, Y71H, T74A, L79I, R97I, Q99E, M111L, K117N, K117R, D119G, S122F, T144P, A146P, A146T, A146V, K147E, K147T, R149K, L159S, I163S, R164Q, I183N, I84M, 또는 이의 조합. KRAS 단백질 동형 2B에 특이적인 천연 변이체는 하기로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다: V152G, D153V, F156I, F156L 또는 이의 조합. 본 개시내용의 페이로드는 KRAS 단백질의 변이체 중 하나 이상(예를 들어, 당업계에 공지된 임의의 변이체)의 발현을 감소시키거나 억제하도록 설계될 수 있다. 일부 양태에서, KRAS 돌연변이체는 G12D의 아미노산 치환을 갖는다. 일부 양태에서, 본 개시내용의 페이로드는 하나 이상의 KRAS 돌연변이체를 표적으로 한다. 특정 양태에서, 페이로드가 표적화하는 KRAS 돌연변이체는 KRAS G12D(서열번호: 8)이다. KRAS G12D mRNA 및 KRAS G12D 단백질에 대한 예시적인 서열은 각각 서열번호: 9 및 서열번호: 8에 제공된다.
일부 양태에서, 본원에 개시된 페이로드(예를 들어, ASO)의 표적 핵산 서열은 KRAS 프리-mRNA의 하나 이상의 영역을 포함한다. 예를 들어, 서열번호: 7(위에 기술됨)은 서열번호: 7의 뉴클레오티드 "t"가 프리-mRNA에서 "u"로 표시된 것을 제외하고는 KRAS 프리-mRNA 서열과 동일하다. 본원에 사용된 용어 "표적 핵산 서열"은 본원에 개시된 페이로드에 상보적인 핵산 서열을 지칭한다. 특정 양태에서, 표적 핵산 서열은 KRAS 단백질 인코딩 핵산 또는 이의 자연 발생 변이체, 및 그로부터 유래된 RNA 핵산, 예를 들어 프리-mRNA의 엑손 영역을 포함한다. 일부 양태에서, 표적 핵산 서열은 KRAS 단백질 인코딩 핵산 또는 이의 자연 발생 변이체, 및 그로부터 유래된 RNA 핵산, 예를 들어 프리-mRNA의 인트론을 포함한다. 또 다른 양태에서, 표적 핵산 서열은 KRAS 단백질 인코딩 핵산 또는 이의 자연 발생 변이체, 및 그로부터 유래된 RNA 핵산, 예를 들어 프리-mRNA의 엑손-인트론 접합부을 포함한다. 일부 양태에서, 예를 들어 연구 또는 진단에 사용되는 경우, "표적 핵산"은 본원에 기재된 cDNA 또는 DNA 또는 RNA 핵산 표적에서 유래된 합성 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 일부 양태에서, 표적 핵산은 KRAS 단백질 인코딩 핵산 또는 이의 자연 발생 변이체, 예를 들어, 5' UTR, 3' UTR, 또는 둘 다의 비번역된 영역을 포함한다.
따라서, 일부 양태에서, 본원에 개시된 페이로드(예를 들어, ASO)는 KRAS 전사체의 엑손 영역, 예를 들어 서열번호: 7 또는 서열번호: 9에 혼성화한다. 일부 양태에서, 본 개시내용의 페이로드는 KRAS 전사체의 인트론 영역, 예를 들어 서열번호: 7에 혼성화한다. 일부 양태에서, 페이로드는 KRAS 전사체의 엑손-인트론 접합부, 예를 들어 서열번호: 7에 혼성화한다. 일부 양태에서, 본 개시내용의 페이로드는 KRAS 전사체(예를 들어, 인트론, 엑손 또는 엑손-인트론 접합부) 내의 영역, 예를 들어 서열번호: 7에 혼성화하며, 여기서 페이로드는 본원의 다른 곳에 기재된 바와 같은 설계를 갖는다.
일부 양태에서, 본 명세서에 개시된 페이로드의 표적 핵산 서열은 KRAS mRNA, 예를 들어 서열번호: 9이다. 따라서, 특정 양태에서, 본원에 개시된 페이로드는 KRAS mRNA의 하나 이상의 영역에 혼성화할 수 있다. 일부 양태에서, 본 개시내용의 페이로드는 KRAS 단백질의 특정 동형을 인코딩하는 mRNA를 표적으로 한다. 특정 양태에서, 본원에 개시된 페이로드는 임의의 변이체(예를 들어, 본원에 기재된 것)를 포함하여 KRAS 단백질의 모든 동형을 표적으로 할 수 있다. 일부 양태에서, 본 개시내용의 페이로드에 의해 표적화될 수 있는 KRAS 단백질은 G12D 아미노산 치환을 포함한다.
일부 양태에서, 페이로드는 KRAS 전사체를 특이적으로 표적화할 수 있는 ASO를 포함한다. 일부 양태에서, ASO의 뉴클레오티드 서열 또는 이의 연속 뉴클레오티드 서열은 서열번호: 51 내지 61 중 어느 하나에 제시된 서열(즉, 도 3b의 서열)과 적어도 약 80%의 서열 동일성, 예컨대 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96% 서열 동일성, 적어도 약 97% 서열 동일성, 적어도 약 98% 서열 동일성, 적어도 약 99% 서열 동일성, 예컨대 약 100% 서열 동일성을 갖는다.
일부 양태에서 ASO (또는 이의 연속 뉴클레오티드 부분)는 서열번호: 51 내지 60 또는 이의 적어도 10개의 연속 뉴클레오티드 영역으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열 중 하나로부터 선택되거나 이를 포함하고, 여기서 ASO (또는 이의 연속 뉴클레오티드 부분)은 해당하는 KRAS 전사체와 비교할 때 1, 2, 3 또는 4개의 불일치를 선택적으로 포함할 수 있다.
일부 양태에서, ASO는 서열번호: 51에 제시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, ASO는 서열번호: 52에 제시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, ASO는 서열번호: 53에 제시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, ASO는 서열번호: 54에 제시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, ASO는 서열번호: 55에 제시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, ASO는 서열번호: 56에 제시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, ASO는 서열번호: 57에 제시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, ASO는 서열번호: 58에 제시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, ASO는 서열번호: 59에 제시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, ASO는 서열번호: 60에 제시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, ASO는 서열번호: 61에 제시된 서열을 포함한다.
일부 양태에서, ASO는 서열번호: 51 내지 61에 제시된 서열과 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 동일한 서열을 포함하거나 이로 구성된다. 일부 양태에서, ASO (또는 이의 연속 뉴클레오티드 부분)는 서열번호: 51 내지 61으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열 중 하나 또는 그의 적어도 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개의 인접 뉴클레오티드의 영역으로부터 선택되거나 이를 포함한다. 일부 양태에서 ASO (또는 이의 연속 뉴클레오티드 부분)는 서열번호: 51 내지 60 또는 이의 적어도 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개의 연속 뉴클레오티드 영역으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열 중 하나로부터 선택되거나 이를 포함하고, 여기서 ASO (또는 이의 연속 뉴클레오티드 부분)은 해당하는 KRAS 전사체와 비교할 때 1, 2, 3 또는 4개의 불일치를 선택적으로 포함할 수 있다. 일부 양태에서, ASO(또는 이의 연속 뉴클레오티드 부분)는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 치환을 제외하고 서열번호: 51 내지 61로 이루어진 군으로부터 선택된 서열 중 하나로부터 선택되거나 이를 포함하고, 치환된 ASO는 KRAS 전사체에 결합할 수 있다. 일부 양태에서, ASO (또는 이의 연속 뉴클레오티드 부분)는 서열번호: 51 내지 61 또는 이의 적어도 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개의 연속 뉴클레오티드 영역으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열 중 하나로부터 선택되거나 이를 포함하고, 여기서 ASO (또는 이의 연속 뉴클레오티드 부분)은 상응하는 KRAS 전사체에 상보적인 1개, 2개, 3개 또는 4개의 추가 5' 및/또는 3' 뉴클레오티드를 선택적으로 포함할 수 있다.
II.G
.
1.c
NRAS
일부 양태에서, 본원에 제공된 페이로드(예를 들어, ASO)는 예를 들어 세포에서 NRas mRNA 또는 NRas 단백질의 발현을 하향 조절(예를 들어, 감소 또는 억제)할 수 있다. 특정 양태에서, 본원에 기재된 페이로드(예를 들어, 본 개시내용의 로딩 방법을 사용하여 EV에 로딩될 수 있음)는 NRas 프리-mRNA의 하나 이상의 영역(예를 들어, 인트론 영역, 엑손 영역 및/또는 엑손-인트론 접합부 영역)을 표적으로 한다. 일부 양태에서, 페이로드는 NRas 단백질의 모든 동형을 표적으로 할 수 있다. 특정 양태에서, 페이로드는 특정 NRas 동형을 표적으로 한다. 달리 나타내지 않는 한, 본원에 사용되는 "NRas"이라는 용어는 하나 이상의 종(예를 들어, 인간, 비-인간 영장류, 개, 고양이, 기니아 피그, 토끼, 랫트, 마우스, 말, 소, 및 곰)의 NRas를 지칭할 수 있다.
NRas는 골지체와 원형질막 사이를 왕복하는 막 단백질을 인코딩하는 종양유전자이다. NRas 인코딩 게놈 DNA는 염색체 위치 1p13.2(즉, GenBank 수탁 번호 NG_007572의 뉴클레오티드 5001 내지 17438)에서 찾을 수 있다. 구체적으로, 시간 경과 현미경검사 및 광표백 기술의 조합은 팔미토일화가 없는 경우 GFP 태그 부착된 N-Ras가 사이토졸과 ER/골지막 사이에서 빠른 교환을 겪고 야생형 GFP-N-Ras가 비소포성 메커니즘에 의해 골지 복합체로 재활용됨을 밝혔다. N-ras 돌연변이는 흑색종, 갑상선 암종, 기형암종, 섬유육종, 신경교세포종, 횡문근육종, 버킷 림프종, 급성 전골수구성 백혈병, T 세포 백혈병, 만성 골수성 백혈병에서 기재되었다. 종양원성 N-Ras는 마우스에서 급성 골수성 백혈병(AML) 또는 만성 골수단구성 백혈병(CMML)과 유사한 질환을 유발할 수 있다.
신경교세포종 RAS 바이러스성 종양유전자(NRas)는 당업계에 다양한 명칭으로 알려져 있다. 이러한 명칭은 하기를 포함한다: GTPase NRas, N-ras 단백질 파트 4, 신경교세포종 RAS 바이러스 (v-ras) 종양유전자 동족체 신경교세포종 RAS 바이러스 종양유전자 동족체, 변환 단백질 N-Ras, 및 v-ras 신경교세포종 RAS 바이러스 종양유전자 동족체.
NRAS 유전자는 주로 세포 분열 조절에 관여하는 N-Ras라는 단백질을 만드는 지침을 제공한다. 인간 NRAS를 인코딩하는 mRNA 서열은 NCBI 참조 서열 NM_002524.5에서 찾을 수 있으며 코딩 서열(서열번호: 19)에 의해 제시된다.
인간 NRas 유전자 산물의 천연 변이체가 알려져 있다. 예를 들어, 인간 NRas 단백질의 천연 변이체는 G12D, G13D, T50I, G60E, 및 이들의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 치환을 함유할 수 있다. 하기와 같은, 대체 스플라이싱으로 인한 인간 NRas 단백질의 추가 변이체도 당업계에 알려져 있다: G13R, Q61K, Q61R, 및 P34L. 따라서, 본 개시내용의 페이로드는 NRas 단백질의 천연 변이체의 발현을 감소시키거나 억제하도록 설계될 수 있다.
서열번호: 17은 서열번호: 17의 뉴클레오티드 "t"가 프리-mRNA에서 "u"로 표시된다는 점을 제외하면 NRas 프리-mRNA 서열과 동일하다. 특정 양태에서, "표적 핵산"은 NRas 단백질 인코딩 핵산 또는 이의 천연 발생 변이체, 및 그로부터 유래된 RNA 핵산, 예를 들어 프리-mRNA의 인트론을 포함한다. 특정 양태에서, "표적 핵산"은 NRas 단백질 인코딩 핵산 또는 이의 천연 발생 변이체, 및 그로부터 유래된 RNA 핵산, 예를 들어 프리-mRNA의 엑손 영역을 포함한다. 특정 양태에서, "표적 핵산"은 NRas 단백질 인코딩 핵산 또는 이의 천연 발생 변이체, 및 그로부터 유래된 RNA 핵산, 예를 들어 프리-mRNA의 엑손-인트론 접합부를을 포함한다. 일부 양태에서, 예를 들어 연구 또는 진단에 사용되는 경우, "표적 핵산"은 cDNA 또는 상기 DNA 또는 RNA 핵산 표적에서 유래된 합성 올리고뉴클레오티드일 수 있다. NRas 프리-mRNA에 의해 인코딩된 인간 NRas 단백질 서열은 서열번호: 18로 표시된다. 특정 양태에서, 표적 핵산은 NRas 단백질 인코딩 핵산 또는 이의 천연 발생 변이체, 예를 들어, 5' UTR, 3' UTR, 또는 둘 다의 비번역된 영역을 포함한다.
특정 양태에서, 본 개시내용의 페이로드는 또한 NRas mRNA 또는 단백질의 발현을 하향 조절(예를 들어, 감소 또는 제거)할 수 있다. 이와 관련하여, 본 개시내용의 페이로드는 전형적으로 종양 세포와 같은 인간 세포와 같은 포유동물 세포에서 NRas mRNA 수준의 감소를 통해 NRas 단백질의 간접적인 억제에 영향을 미칠 수 있다. 특히, 본 개시내용은 NRas 프리-mRNA의 하나 이상의 영역(예를 들어, 인트론 영역, 엑손 영역 및/또는 엑손-인트론 접합부 영역)을 표적으로 하는 페이로드에 관한 것이다. 달리 나타내지 않는 한, 본원에 사용되는 "NRas"이라는 용어는 하나 이상의 종(예를 들어, 인간, 비-인간 영장류, 개, 고양이, 기니아 피그, 토끼, 랫트, 마우스, 말, 소, 및 곰)의 NRas를 지칭할 수 있다.
일부 양태에서, 본 개시내용의 페이로드는 NRas 전사체의 인트론 내의 영역, 예를 들어, 서열번호: 17 또는 서열번호: 19에 혼성화한다. 특정 양태에서, 본 개시내용의 페이로드는 NRas 전사체의 엑손 내의 영역, 예를 들어, 서열번호: 17 또는 서열번호: 19에 혼성화한다. 특정 양태에서, 본 개시내용의 페이로드는 NRas 전사체의 엑손-인트론 내의 영역, 예를 들어, 서열번호: 17 또는 서열번호: 19에 혼성화한다. 일부 양태에서, 본 개시내용의 페이로드는 NRAS 전사체(예를 들어, 인트론, 엑손 또는 엑손-인트론 접합부) 내의 영역, 예를 들어 서열번호: 17 또는 서열번호: 19에 혼성화한다.
일부 양태에서, 본 개시내용의 페이로드는 NRas 전사체 (예를 들어, 게놈 서열, 서열번호: 17) 내의 다중 표적 영역에 혼성화한다. 일부 양태에서, 페이로드는 NRas 전사체 내의 2개의 상이한 표적 영역에 혼성화한다. 일부 양태에서, 페이로드는 NRas 전사체 내의 3개의 상이한 표적 영역에 혼성화한다. 일부 양태에서, NRas 전사체(예를 들어, 게놈 서열, 서열번호: 17) 내의 여러 영역에 혼성화하는 페이로드는 NRas NLRP3 전사체(예를 들어, 게놈 서열, 서열번호: 17) 내의 단일 영역에 혼성화하는 페이로드와 비교하여 발현을 감소시키는 데 더 강력하다(예를 들어, EC50이 더 낮음).
일부 양태에서, 페이로드(예를 들어, ASO)는 NRAS 단백질의 특정 동형(예를 들어, 동형 1, NCBI ID: NP_001229821.1)을 인코딩하는 mRNA를 표적으로 한다. 일부 양태에서, 페이로드는 NRas 단백질의 모든 동형을 표적으로 한다. 특정 양태에서, 페이로드는 NRas 단백질의 2개의 동형 (예를 들어, 동형 1 및 동형 2 (NCBI ID:NP_009089.4), 동형 2 및 동형 3(NCBI ID: NP_001123995), 및 동형 3 및 동형 4(NCBI ID: NP_001229820.1))을 표적으로 한다.
본 개시내용의 페이로드는 NRas 전사체 영역의 보체에 해당하는 연속 뉴클레오티드 서열, 예를 들어 서열번호: 17에 해당하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 본원에 개시된 NRas 전사체를 표적으로 하는 페이로드(예를 들어, ASO)를 NRas 인코딩 mRNA 전사체에 결합시키는 것은 NRas의 발현 수준 및/또는 활성 수준을 감소시킬 수 있다.
일부 양태에서, 페이로드는 NRas 전사체를 특이적으로 표적화할 수 있는 ASO를 포함한다. 일부 양태에서, ASO의 뉴클레오티드 서열 또는 이의 연속 뉴클레오티드 서열은 서열번호: 62 내지 71 중 어느 하나에 제시된 서열(즉, 도 3c의 서열)과 적어도 약 80%의 서열 동일성, 예컨대 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96% 서열 동일성, 적어도 약 97% 서열 동일성, 적어도 약 98% 서열 동일성, 적어도 약 99% 서열 동일성, 예컨대 약 100% 서열 동일성을 갖는다.
일부 양태에서 ASO (또는 이의 연속 뉴클레오티드 부분)는 서열번호: 61 내지 71 또는 이의 적어도 10개의 연속 뉴클레오티드 영역으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열 중 하나로부터 선택되거나 이를 포함하고, 여기서 ASO (또는 이의 연속 뉴클레오티드 부분)은 해당하는 NRas 전사체와 비교할 때 1, 2, 3 또는 4개의 불일치를 선택적으로 포함할 수 있다.
일부 양태에서, ASO는 서열번호: 62에 제시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, ASO는 서열번호: 63에 제시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, ASO는 서열번호: 64에 제시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, ASO는 서열번호: 65에 제시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, ASO는 서열번호: 66에 제시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, ASO는 서열번호: 67에 제시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, ASO는 서열번호: 68에 제시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, ASO는 서열번호: 69에 제시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, ASO는 서열번호: 70에 제시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, ASO는 서열번호: 71에 제시된 서열을 포함한다.
일부 양태에서, ASO는 서열번호: 62 내지 71에 제시된 서열과 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 동일한 서열을 포함하거나 이로 구성된다. 일부 양태에서, ASO (또는 이의 연속 뉴클레오티드 부분)는 서열번호: 62 내지 71으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열 중 하나 또는 그의 적어도 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개의 인접 뉴클레오티드의 영역으로부터 선택되거나 이를 포함한다. 일부 양태에서 ASO (또는 이의 연속 뉴클레오티드 부분)는 서열번호: 61 내지 71 또는 이의 적어도 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개의 연속 뉴클레오티드 영역으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열 중 하나로부터 선택되거나 이를 포함하고, 여기서 ASO (또는 이의 연속 뉴클레오티드 부분)은 해당하는 NRas 전사체와 비교할 때 1, 2, 3 또는 4개의 불일치를 선택적으로 포함할 수 있다. 일부 양태에서, ASO(또는 이의 연속 뉴클레오티드 부분)는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 치환을 제외하고 서열번호: 62 내지 71로 이루어진 군으로부터 선택된 서열 중 하나로부터 선택되거나 이를 포함하고, 치환된 ASO는 NRas 전사체에 결합할 수 있다. 일부 양태에서, ASO (또는 이의 연속 뉴클레오티드 부분)는 서열번호: 62 내지 71 또는 이의 적어도 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개의 연속 뉴클레오티드 영역으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열 중 하나로부터 선택되거나 이를 포함하고, 여기서 ASO (또는 이의 연속 뉴클레오티드 부분)은 상응하는 NRas 전사체에 상보적인 1개, 2개, 3개 또는 4개의 추가 5' 및/또는 3' 뉴클레오티드를 선택적으로 포함할 수 있다.
II.G
.
1.d
PMP22
일부 양태에서, 본원에 제공된 페이로드(예를 들어, ASO)는 예를 들어 세포에서 PMP22 mRNA 또는 PMP22 단백질의 발현을 하향 조절(예를 들어, 감소 또는 억제)할 수 있다. 특정 양태에서, 본원에 기재된 페이로드(예를 들어, 본 개시내용의 로딩 방법을 사용하여 EV에 로딩될 수 있음)는 PMP22 프리-mRNA의 하나 이상의 영역(예를 들어, 인트론 영역, 엑손 영역 및/또는 엑손-인트론 접합부 영역)을 표적으로 한다. 일부 양태에서, 페이로드는 PMP22 단백질의 모든 동형을 표적으로 할 수 있다. 특정 양태에서, 페이로드는 특정 PMP22 동형을 표적으로 한다. 달리 나타내지 않는 한, 본원에 사용되는 "PMP22"이라는 용어는 하나 이상의 종(예를 들어, 인간, 비-인간 영장류, 개, 고양이, 기니아 피그, 토끼, 랫트, 마우스, 말, 소, 및 곰)의 STAT6을 지칭할 수 있다.
말초 수초 단백질 22(PMP22)는 성장 정지 특이적 단백질 3(GAS-3)으로도 알려져 있으며 PMP22 유전자에 의해 인코딩된다. PMP22는 160개의 아미노산으로 구성된 22 kDa 막관통 당단백질로 말초신경계의 슈반 세포에서 주로 발현된다. 슈반 세포는 PMP22의 높은 발현을 나타내며, PMP22는 컴팩트(compact) 수초에서 전체 단백질 함량의 2 내지 5%를 구성할 수 있다. 컴팩트 수초은 뉴런 축삭에 전기 절연을 제공하는 보호 지방층인 말초 뉴런의 수초 외피의 대부분이다. PMP22 발현 수준은 성인의 중추신경계에서 상대적으로 낮다.
인간의 경우, PMP22 유전자는 염색체 17p11.2에 위치하며 약 40kb에 이른다. 유전자는 인간과 설치류 모두에서 보존된 6개의 엑손을 함유하고, 그 중 2개는 5' 비번역 엑손(1a 및 1b)이며 동일한 코딩 서열을 갖는 2개의 상이한 RNA 전사체를 생성한다. 2개의 전사체는 5' 비번역 영역이 다르며 자체 프로모터 조절 발현을 가지고 있다. 나머지 엑손(2 내지 5)은 PMP22 유전자의 코딩 영역을 포함하며 전사 후 변형(즉, 대체 스플라이싱) 후에 함께 결합된다. PMP22 단백질은 4개의 막관통 도메인, 2개의 세포외 루프(ECL1 및 ECL2) 및 1개의 세포내 루프를 특징으로 한다. ECL1은 2개의 PMP22 단백질 사이의 동종친화성 상호작용을 매개하는 것으로 제안된 반면, ECL2는 PMP22 단백질과 수초 단백질 제로(MPZ 또는 MP0) 사이의 이종친화성 상호작용을 매개하는 것으로 밝혀졌다.
PMP22는 컴팩트 수초의 형성과 유지에 필수적인 역할을 한다. 슈반 세포가 뉴런 축삭과 접촉하면 PMP22의 발현이 상당히 상향 조절되는 반면, 축삭 변성 또는 절개 동안에 PMP22가 하향 조절된다. PMP22는 다른 세포 및 세포외 기질과의 접착에 관여하고 수초 기능을 지원하는 단백질인 조눌라-오클루덴 1 및 오클루딘과의 연관성을 보여주었다. 세포 접착 기능과 함께, PMP22는 슈반 세포 증식 중에도 상향 조절되는데, 이는 세포 주기 조절에서의 역할을 시사한다. PMP22는 비신경 조직에서 검출 가능하며, 여기서 그 발현은 성장 정지 특이적(gas-3) 기능으로 작용하는 것으로 밝혀졌다.
PMP22 유전자의 부적절한 유전자 복용량은 비정상적인 단백질 합성과 수초 외피 기능을 유발할 수 있다. 수초의 성분은 화학양론적으로 설정되어 있으므로, 성분의 불규칙한 발현은 수초의 탈안정화 및 신경병증 장애를 유발할 수 있다. PMP22 유전자 발현의 변화는 샤르코-마리-투스(Charcot-Marie-Tooth) 1A형(CMT1A), 데제린-소타스(Dejerine-Sottas)병, 압력 마비에 취약한 유전성 신경병증(HNPP)과 같은 다양한 신경병증과 관련이 있다. PMP22가 너무 많으면(예를 들어 유전자 복제로 인해 발생), CMT1A가 발생한다. PMP22의 유전자 중복은 PMP22의 과잉 생산으로 인해 다중 신호 전달 경로에 결함이 생기고 KNOX20, SOX10 및 EGR2와 같은 전사 인자의 기능 장애는 발생하는 CMT의 가장 일반적인 유전적 원인이다.
인간 PMP22 유전자의 서열은 NCBI RefSeq 수탁 번호 NM_000304로 공개적으로 이용 가능하다. 대체 RefSeq mRNA 전사체에는 각각 수탁 번호 NM_001281455, NM-001281456, NM-153321 및 NM_153322가 있다. 인간 PMP22 유전자는 염색체 위치 17p12의 15,229,777-15,265,326에서 발견된다.
인간 PMP22 프리-mRNA 전사체(서열번호: 20)에 대한 서열은 염색체 위치 17p12의 잔기 15,229,777-15,265,326의 역보체에 해당한다. PMP22 mRNA 서열(GenBank 수탁 번호 NM_000304.4)은 서열번호: 21에 제공된다. 인간 PMP22 단백질의 서열은 공개적으로 이용 가능한 Uniprot 수탁 번호 Q01453(정규 서열, 서열번호: 23)에서 찾을 수 있다. 잠재적인 PMP22 동형에는 각각 Uniprot 수탁 번호 A8MU75, J3KQW0, A0A2R8Y5L5, J3KT36 및 J3QS08이 있다. 본원에 개시된 수탁 번호에 해당하는 데이터베이스 항목의 공개적으로 이용 가능한 내용은 그 전체가 참조로 포함된다.
인간 PMP22 유전자 산물의 천연 변이체가 알려져 있다. 예를 들어, 인간 PMP22 단백질의 천연 변이체는 L16P, S22F, Δ25-26, D37V, V65F, S72L, S79C, G93R, L105R, G107V, T118N, L147R, H12Q, L16P, L19P, M69K, L71P, S72L, S72P, S72W, S76I, S79P, L80P, L80R, Δ84, G100E, G100R, L105R, C109R, S149R, G150C, G150D, R157W, S22F, V30M, A67T, S23T, W28R, A67P, Δ115-118, 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 치환을 함유할 수 있다.
본 개시내용의 페이로드는 PMP22 단백질의 천연 변이체의 발현을 감소시키거나 억제하도록 설계될 수 있다.
페이로드의 표적 핵산 서열의 예는 PMP22 프리-mRNA이다. 서열번호: 20은 인간 PMP22 게놈 서열(즉, 뉴클레오티드 15,229,777-15,265,326의 역보체, 염색체 17p12의 보체)을 나타낸다. 서열번호: 20은 서열번호: 20의 뉴클레오티드 "t"가 프리-mRNA에서 "u"로 표시된다는 점을 제외하면 PMP22 프리-mRNA 서열과 동일하다.
일부 양태에서, 연속 뉴클레오티드 서열은 PMP22 전사체 내의 핵산 서열에 대해 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 약 100% 상보적이다. 일부 양태에서, 페이로드는 인간 세포(예를 들어, 슈반 세포)에서 PMP22 단백질 발현을 감소시킬 수 있고, 인간 세포는 PMP22 단백질을 발현한다.
일부 양태에서, 본 개시내용의 페이로드(예를 들어, ASO)는 PMP22 전사체의 인트론 내의 영역, 예를 들어, 서열번호: 20에 혼성화한다. 특정 양태에서, 본 개시내용의 페이로드는 PMP22 전사체의 엑손 내의 영역, 예를 들어, 서열번호: 20에 혼성화한다. 특정 양태에서, 본 개시내용의 페이로드는 PMP22 전사체의 엑손-인트론 접합부 내의 영역, 예를 들어, 서열번호: 20에 혼성화한다.
일부 양태에서, 본 개시내용의 페이로드는 PMP22 전사체 (예를 들어, 게놈 서열, 서열번호: 20) 내의 다중 표적 영역에 혼성화한다. 일부 양태에서, 페이로드는 PMP22 전사체 내의 2개의 상이한 표적 영역에 혼성화한다. 일부 양태에서, 페이로드는 PMP22 전사체 내의 3개의 상이한 표적 영역에 혼성화한다. 일부 양태에서, PMP22 전사체(예를 들어, 게놈 서열, 서열번호: 20) 내의 여러 영역에 혼성화하는 페이로드는 PMP22 전사체(예를 들어, 게놈 서열, 서열번호: 20) 내의 단일 영역에 혼성화하는 페이로드와 비교하여 PMP22 발현을 감소시키는 데 더 강력하다(예를 들어, EC50이 더 낮음).
일부 양태에서, 본원에 개시된 PMP22 전사체를 표적으로 하는 페이로드(예를 들어, ASO)를 PMP22 인코딩 mRNA 전사체에 결합시키는 것은 PMP22의 발현 수준 및/또는 활성 수준을 감소시킬 수 있다.
일부 양태에서, 페이로드는 PMP22 전사체를 특이적으로 표적화할 수 있는 ASO를 포함한다. 일부 양태에서, ASO의 뉴클레오티드 서열 또는 이의 연속 뉴클레오티드 서열은 서열번호: 72 내지 81 중 어느 하나에 제시된 서열(즉, 도 3d의 서열)과 적어도 약 80%의 서열 동일성, 예컨대 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96% 서열 동일성, 적어도 약 97% 서열 동일성, 적어도 약 98% 서열 동일성, 적어도 약 99% 서열 동일성, 예컨대 약 100% 서열 동일성을 갖는다.
일부 양태에서, ASO (또는 이의 연속 뉴클레오티드 부분)는 서열번호: 72 내지 81 또는 이의 적어도 10개의 연속 뉴클레오티드 영역으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열 중 하나로부터 선택되거나 이를 포함하고, 여기서 ASO (또는 이의 연속 뉴클레오티드 부분)은 해당하는 PMP22 전사체와 비교할 때 1, 2, 3 또는 4개의 불일치를 선택적으로 포함할 수 있다.
일부 양태에서, ASO는 서열번호: 72에 제시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, ASO는 서열번호: 73에 제시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, ASO는 서열번호: 74에 제시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, ASO는 서열번호: 75에 제시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, ASO는 서열번호: 76에 제시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, ASO는 서열번호: 77에 제시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, ASO는 서열번호: 78에 제시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, ASO는 서열번호: 79에 제시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, ASO는 서열번호: 80에 제시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, ASO는 서열번호: 81에 제시된 서열을 포함한다.
일부 양태에서, ASO는 서열번호: 72 내지 81에 제시된 서열과 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 동일한 서열을 포함하거나 이로 구성된다. 일부 양태에서, ASO (또는 이의 연속 뉴클레오티드 부분)는 서열번호: 71 내지 81으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열 중 하나 또는 그의 적어도 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개의 인접 뉴클레오티드의 영역으로부터 선택되거나 이를 포함한다. 일부 양태에서, ASO (또는 이의 연속 뉴클레오티드 부분)는 서열번호: 72 내지 81 또는 이의 적어도 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개의 연속 뉴클레오티드 영역으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열 중 하나로부터 선택되거나 이를 포함하고, 여기서 ASO (또는 이의 연속 뉴클레오티드 부분)은 해당하는 PMP22 전사체와 비교할 때 1, 2, 3 또는 4개의 불일치를 선택적으로 포함할 수 있다. 일부 양태에서, ASO(또는 이의 연속 뉴클레오티드 부분)는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 치환을 제외하고 서열번호: 72 내지 81로 이루어진 군으로부터 선택된 서열 중 하나로부터 선택되거나 이를 포함하고, 치환된 ASO는 PMP22 전사체에 결합할 수 있다. 일부 양태에서, ASO (또는 이의 연속 뉴클레오티드 부분)는 서열번호: 72 내지 81 또는 이의 적어도 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개의 연속 뉴클레오티드 영역으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열 중 하나로부터 선택되거나 이를 포함하고, 여기서 ASO (또는 이의 연속 뉴클레오티드 부분)은 상응하는 PMP22 전사체에 상보적인 1개, 2개, 3개 또는 4개의 추가 5' 및/또는 3' 뉴클레오티드를 선택적으로 포함할 수 있다.
II.G
.
1.e
C/
EBPβ
일부 양태에서, 본원에 제공된 페이로드(예를 들어, ASO)는 예를 들어 세포에서 C/EBPβ mRNA 또는 CEBP/β 단백질의 발현을 하향 조절(예를 들어, 감소 또는 억제)할 수 있다. 특정 양태에서, 본원에 기재된 페이로드(예를 들어, 본 개시내용의 로딩 방법을 사용하여 EV에 로딩될 수 있음)는 CEBP /β 프리-mRNA의 하나 이상의 영역(예를 들어, 인트론 영역, 엑손 영역 및/또는 엑손-인트론 접합부 영역)을 표적으로 한다. 일부 양태에서, 페이로드는 CEBP /β 단백질의 모든 동형을 표적으로 할 수 있다. 특정 양태에서, 페이로드는 특정 CEBP /β 동형을 표적으로 한다. 달리 나타내지 않는 한, 본원에 사용되는 "CEBP/β"이라는 용어는 하나 이상의 종(예를 들어, 인간, 비-인간 영장류, 개, 고양이, 기니아 피그, 토끼, 랫트, 마우스, 말, 소, 및 곰)의 CEBP/β를 지칭할 수 있다.
CEBP/β(CEBP /β)는 CCAAT/인핸서 결합 단백질 베타라고도 알려져 있다. CEBP/β/CEBP/β의 동의어는 알려져 있으며 C/EBP 베타; 간 활성자 단백질; LAP; 간에 풍부한 억제성 단백질; LIP; 핵 인자 NF-IL6; 전사 인자 5; TCF-5; CEBPB ; CEBPb ; CEBPβ ; CEBP /B; 및 TCF5를 포함한다. 인간 CEBP/β 유전자에 대한 서열은 공개적으로 이용 가능한 GenBank 수탁 번호 NC_000020.11 (50190583..50192690)에서 찾을 수 있다. 인간 CEBP/β 유전자는 염색체 위치 20q13.13의 50190583-50192690에서 발견된다.
인간 CEBP /β 프리-mRNA 전사체에 대한 서열(서열번호: 251)은 염색체 20q13.13의 잔기 50190583-50192690의 역보체에 해당한다. CEBP /β mRNA 서열(GenBank 수탁 번역 NM_001285878.1)은 서열번호: 27에 제공되지만, 서열번호: 27의 뉴클레오티드 "t"는 mRNA에서 "u"로 표시된다. 인간 CEBP/β 단백질의 서열은 공개적으로 이용가능한 수탁 번호: P17676, (정규 서열, 서열번호: 26), P17676-2 (서열번호: 28), 및 P17676-3 (서열번호: 29) 하에서 찾을 수 있고, 이들 각각은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
인간 CEBP /β 유전자 산물의 천연 변이체가 알려져 있다. 예를 들어, 인간 CEBP/β 단백질의 천연 변이체는 A241P, A253G, G195S 및 이들의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 치환을 함유할 수 있다. 대체 스플라이싱으로 인한 인간 CEBP/β 단백질의 추가 변이체도 당업계에 알려져 있다. CEBP/β 동형 2(식별자: UniProt의 P17676-2)는 다음과 같이 정규 서열(서열변호: 27)과 상이하다: 서열번호: 27에 대해 잔기 1-23이 결실됨. CEBP/β 동형형 3(식별자: P17676-3)의 서열은 다음과 같이 정규 서열(서열번호: 23)과 상이하다: 서열번호: 27에 대해 잔기 1-198이 결실됨. 따라서, 본원에 기재된 페이로드(예를 들어, ASO)는 단백질의 천연 변이체의 발현을 감소시키거나 억제하도록 설계될 수 있다.
페이로드의 표적 핵산 서열의 예는 CEBP /β 프리-mRNA이다. 서열번호: 25는 인간 CEBP /β 게놈 서열(즉, 염색체 20q13.13의 뉴클레오티드 50190583-50192690의 역보체)을 나타낸다. 서열번호: 25는 서열번호: 25의 뉴클레오티드 "t"가 프리-mRNA에서 "u"로 표시된다는 점을 제외하면 CEBP /β 프리-mRNA 서열과 동일하다. 특정 양태에서, "표적 핵산"은 CEBP/β 단백질 인코딩 핵산 또는 이의 자연 발생 변이체, 및 그로부터 유래된 RNA 핵산, 예를 들어 프리-mRNA의 인트론을 포함한다. 특정 양태에서, "표적 핵산"은 CEBP/β 단백질 인코딩 핵산 또는 이의 천연 발생 변이체, 및 그로부터 유래된 RNA 핵산, 예를 들어 프리-mRNA의 엑손 영역을 포함한다. 특정 양태에서, "표적 핵산"은 CEBP/β 단백질 인코딩 핵산 또는 이의 천연 발생 변이체, 및 그로부터 유래된 RNA 핵산, 예를 들어 프리-mRNA의 엑손-인트론 접합부를 포함한다. 일부 양태에서, 예를 들어 연구 또는 진단에 사용되는 경우, "표적 핵산"은 cDNA 또는 상기 DNA 또는 RNA 핵산 표적에서 유래된 합성 올리고뉴클레오티드일 수 있다. CEBP /β 프리-mRNA에 의해 인코딩된 인간 CEBP/β 단백질 서열은 서열번호: 26으로 표시된다. 특정 양태에서, 표적 핵산은 CEBP/β 단백질 인코딩 핵산 또는 이의 천연 발생 변이체, 예를 들어, 5' UTR, 3' UTR, 또는 둘 다의 비번역된 영역을 포함한다.
일부 양태에서, 본 개시내용의 페이로드(예를 들어, ASO)는 CEBP /β 전사체의 인트론 내의 영역, 예를 들어, 서열번호: 25에 혼성화한다. 특정 양태에서, 본 개시내용의 페이로드는 CEBP /β 전사체의 엑손 내의 영역, 예를 들어, 서열번호: 251에 혼성화한다. 특정 양태에서, 본 개시내용의 ASO는 CEBP /β 전사체의 엑손-인트론 접합부 내의 영역, 예를 들어, 서열번호: 20에 혼성화한다. 일부 양태에서, 본 개시내용의 페이로드는 CEBP /β 전사체(예를 들어, 인트론, 엑손 또는 엑손-인트론 접합부) 내의 영역, 예를 들어 서열번호: 25에 혼성화하며, 여기서 페이로드는 본 명세서의 다른 곳에 기재된 바와 같이 식: 5' A-B-C 3'에 따른 설계를 갖는다.
일부 양태에서, 페이로드는 CEBP /β 단백질의 특정 동형(예를 들어, 동형 1)을 인코딩하는 mRNA를 표적으로 한다. 일부 양태에서, 페이로드는 CEBP/β 단백질의 모든 동형을 표적으로 한다. 특정 양태에서, 페이로드는 CEBP/β 단백질의 2개의 동형(예를 들어, 동형 1 및 동형 2, 동형 1 및 동형 3, 및 동형 2 및 동형 3)을 표적으로 한다.
일부 양태에서, 본원에 개시된 CEBPb 전사체를 표적으로 하는 페이로드(예를 들어, ASO)를 CEBPb 인코딩 mRNA 전사체에 결합시키는 것은 CEBPb의 발현 수준 및/또는 활성 수준을 감소시킬 수 있다.
일부 양태에서, 페이로드는 CEBPb 전사체를 특이적으로 표적화할 수 있는 ASO를 포함한다. 일부 양태에서, ASO의 뉴클레오티드 서열 또는 이의 연속 뉴클레오티드 서열은 서열번호: 82 내지 91 중 어느 하나에 제시된 서열(즉, 도 3e의 서열)과 적어도 약 80%의 서열 동일성, 예컨대 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96% 서열 동일성, 적어도 약 97% 서열 동일성, 적어도 약 98% 서열 동일성, 적어도 약 99% 서열 동일성, 예컨대 약 100% 서열 동일성을 갖는다.
일부 양태에서, ASO (또는 이의 연속 뉴클레오티드 부분)는 서열번호: 82 내지 91 또는 이의 적어도 10개의 연속 뉴클레오티드 영역으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열 중 하나로부터 선택되거나 이를 포함하고, 여기서 ASO (또는 이의 연속 뉴클레오티드 부분)은 해당하는 CEBPb 전사체와 비교할 때 1, 2, 3 또는 4개의 불일치를 선택적으로 포함할 수 있다.
일부 양태에서, ASO는 서열번호: 82에 제시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, ASO는 서열번호: 83에 제시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, ASO는 서열번호: 84에 제시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, ASO는 서열번호: 85에 제시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, ASO는 서열번호: 86에 제시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, ASO는 서열번호: 87에 제시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, ASO는 서열번호: 88에 제시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, ASO는 서열번호: 89에 제시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, ASO는 서열번호: 90에 제시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, ASO는 서열번호: 91에 제시된 서열을 포함한다.
일부 양태에서, ASO는 서열번호: 82 내지 91에 제시된 서열과 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 동일한 서열을 포함하거나 이로 구성된다. 일부 양태에서, ASO (또는 이의 연속 뉴클레오티드 부분)는 서열번호: 82 내지 91으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열 중 하나 또는 그의 적어도 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개의 인접 뉴클레오티드의 영역으로부터 선택되거나 이를 포함한다. 일부 양태에서, ASO (또는 이의 연속 뉴클레오티드 부분)는 서열번호: 82 내지 91 또는 이의 적어도 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개의 연속 뉴클레오티드 영역으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열 중 하나로부터 선택되거나 이를 포함하고, 여기서 ASO (또는 이의 연속 뉴클레오티드 부분)은 해당하는 CEBPb 전사체와 비교할 때 1, 2, 3 또는 4개의 불일치를 선택적으로 포함할 수 있다. 일부 양태에서, ASO(또는 이의 연속 뉴클레오티드 부분)는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 치환을 제외하고 서열번호: 82 내지 91로 이루어진 군으로부터 선택된 서열 중 하나로부터 선택되거나 이를 포함하고, 치환된 ASO는 CEBPb 전사체에 결합할 수 있다. 일부 양태에서, ASO (또는 이의 연속 뉴클레오티드 부분)는 서열번호: 82 내지 91 또는 이의 적어도 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개의 연속 뉴클레오티드 영역으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열 중 하나로부터 선택되거나 이를 포함하고, 여기서 ASO (또는 이의 연속 뉴클레오티드 부분)은 상응하는 CEBPb 전사체에 상보적인 1개, 2개, 3개 또는 4개의 추가 5' 및/또는 3' 뉴클레오티드를 선택적으로 포함할 수 있다.
II.G
.
1.f
STAT3
일부 양태에서, 본원에 제공된 페이로드(예를 들어, ASO)는 세포에서 관심 있는 임의의 유전자 또는 단백질의 발현을 하향 조절(예를 들어, 감소 또는 억제)할 수 있다. 특정 양태에서, 본원에 기재된 페이로드(예를 들어, 본 개시내용의 로딩 방법을 사용하여 EV에 로딩될 수 있음)는 STAT3 프리-mRNA(pre-mRNA)의 하나 이상의 영역(예를 들어, 인트론 영역, 엑손 영역 및/또는 엑손-인트론 접합부 영역)을 표적으로 한다. 일부 양태에서, 페이로드는 STAT3 단백질의 모든 동형(isoform)을 표적화할 수 있다. 특정 양태에서, 페이로드는 특정 STAT3 동형을 표적으로 한다. 달리 나타내지 않는 한, 본원에 사용되는 "STAT3"이라는 용어는 하나 이상의 종(예를 들어, 인간, 비-인간 영장류, 개, 고양이, 기니아 피그, 토끼, 랫트, 마우스, 말, 소, 및 곰)의 STAT3을 지칭할 수 있다.
신호 변환자 및 전사 활성자 3(STAT3)는 당업계에 다양한 명칭으로 알려져 있다. 이러한 명칭에는 DNA 결합 단백질 APRF 및 급성기 반응 인자가 포함된다. 인간 STAT3을 인코딩하는 mRNA는 Genbank 수탁 번호 NM_003150.3에서 찾을 수 있고, 서열(서열번호: 32)로 제시된다.
인간 STAT3 유전자 산물의 천연 변이체가 알려져 있다. 예를 들어, 인간 STAT3 단백질의 천연 변이체는 R382L, R382Q, OR R382W, 및 이들의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 치환을 함유할 수 있다. 하기와 같은, 대체 스플라이싱으로 인한 인간 STAT3 단백질의 추가 변이체도 당업계에 알려져 있다: R382W, F384L, F384S, T389I, N395Y, R423Q, N425Y, H437Y, Del-463, S611N, F621V, T622I, V637L, V637M, Del-644, Y657C, P330S, K392R, N646K, K658N, Del-701, 또는 T716M. 따라서, 본 개시내용의 페이로드는 STAT3 단백질의 천연 변이체의 발현을 감소시키거나 억제하도록 설계될 수 있다.
서열번호: 30은 서열번호: 30의 뉴클레오티드 "t"가 프리-mRNA에서 "u"로 표시된다는 점을 제외하면 STAT3 프리-mRNA 서열과 동일하다. 특정 양태에서, "표적 핵산"은 STAT3 단백질 인코딩 핵산 또는 이의 천연 발생 변이체, 및 그로부터 유래된 RNA 핵산, 예를 들어 프리-mRNA의 인트론을 포함한다. 특정 양태에서, "표적 핵산"은 STAT3 단백질 인코딩 핵산 또는 이의 천연 발생 변이체, 및 그로부터 유래된 RNA 핵산, 예를 들어 프리-mRNA의 엑손 영역을 포함한다. 특정 양태에서, "표적 핵산"은 STAT3 단백질 인코딩 핵산 또는 이의 천연 발생 변이체, 및 그로부터 유래된 RNA 핵산, 예를 들어 프리-mRNA의 엑손-인트론 접합부를을 포함한다. 일부 양태에서, 예를 들어 연구 또는 진단에 사용되는 경우, "표적 핵산"은 cDNA 또는 상기 DNA 또는 RNA 핵산 표적에서 유래된 합성 올리고뉴클레오티드일 수 있다. STAT3 프리-mRNA에 의해 인코딩된 인간 STAT3 단백질 서열은 서열번호: 31으로 표시된다. 특정 양태에서, 표적 핵산은 STAT3 단백질 인코딩 핵산 또는 이의 천연 발생 변이체, 예를 들어, 5' UTR, 3' UTR, 또는 둘 다의 비번역된 영역을 포함한다.
일부 양태에서, "표적 핵산"은 STAT3 단백질 인코딩 핵산 또는 이의 천연 발생 변이체, 및 그로부터 유래된 RNA 핵산, 예를 들어 프리-mRNA의 엑손-인트론 접합부를을 포함한다. 일부 양태에서, 예를 들어 연구 또는 진단에 사용되는 경우, "표적 핵산"은 cDNA 또는 상기 DNA 또는 RNA 핵산 표적에서 유래된 합성 올리고뉴클레오티드일 수 있다. STAT3 프리-mRNA에 의해 인코딩된 인간 STAT3 단백질 서열은 서열번호: 32로 표시된다. 특정 양태에서, 표적 핵산은 STAT3 단백질 인코딩 핵산 또는 이의 천연 발생 변이체, 예를 들어, 5' UTR, 3' UTR, 또는 둘 다의 비번역된 영역을 포함한다.
일부 양태에서, 페이로드(예를 들어, ASO)는 STAT3 전사체의 인트론 내의 영역, 예를 들어, 서열번호: 30 또는 서열번호: 32에 혼성화한다. 특정 양태에서, 본 개시내용의 페이로드는 STAT3 전사체의 엑손 내의 영역, 예를 들어, 서열번호: 41 또는 서열번호: 32에 혼성화한다. 특정 양태에서, 본 개시내용의 페이로드는 STAT3 전사체의 엑손-인트론 내의 영역, 예를 들어, 서열번호: 30 또는 서열번호: 32에 혼성화한다. 일부 양태에서, 본 개시내용의 페이로드는 STAT3 전사체(예를 들어, 인트론, 엑손 또는 엑손-인트론 접합부) 내의 영역, 예를 들어 서열번호: 30 또는 서열번호: 32에 혼성화한다.
일부 양태에서, 페이로드는 STAT3 단백질의 특정 동형(예를 들어, 동형 1)을 인코딩하는 mRNA를 표적으로 한다. 일부 양태에서, 페이로드는 STAT3 단백질의 모든 동형을 표적으로 한다. 특정 양태에서, 페이로드는 STAT3 단백질의 2개의 동형(예를 들어, 동형 1 (UniProt ID: P40763-1) 및 동형 2 (UniProt ID: P40763-2), 동형 2 및 동형 3 (UniProt ID: P40763-3)을 표적으로 한다.
일부 양태에서, 본 개시내용의 페이로드는 STAT3 전사체의 인트론 내의 영역, 예를 들어, 서열번호: 30 또는 서열번호: 32에 혼성화한다. 특정 양태에서, 본 개시내용의 페이로드는 STAT3 전사체의 엑손 내의 영역, 예를 들어, 서열번호: 30 또는 서열번호: 32에 혼성화한다. 특정 양태에서, 본 개시내용의 페이로드는 STAT3 전사체의 엑손-인트론 내의 영역, 예를 들어, 서열번호: 30 또는 서열번호: 32에 혼성화한다. 일부 양태에서, 본 개시내용의 페이로드는 STAT3 전사체(예를 들어, 인트론, 엑손 또는 엑손-인트론 접합부) 내의 영역, 예를 들어 서열번호: 30 또는 서열번호: 32에 혼성화하며, 여기서 페이로드는 본 명세서의 다른 곳에 기재된 바와 같이 식: 5' A-B-C 3'에 따른 설계를 갖는다.
일부 양태에서, 본 개시내용의 페이로드는 STAT3 전사체 (예를 들어, 게놈 서열, 서열번호: 30) 내의 다중 표적 영역에 혼성화한다. 일부 양태에서, 페이로드는 STAT3 전사체 내의 2개의 상이한 표적 영역에 혼성화한다. 일부 양태에서, 페이로드는 STAT3 전사체 내의 3개의 상이한 표적 영역에 혼성화한다. 일부 양태에서, STAT3 전사체(예를 들어, 게놈 서열, 서열번호: 30) 내의 여러 영역에 혼성화하는 페이로드는 STAT3 전사체(예를 들어, 게놈 서열, 서열번호: 30) 내의 단일 영역에 혼성화하는 페이로드와 비교하여 PMP22 발현을 감소시키는 데 더 강력하다(예를 들어, EC50이 더 낮음).
본 개시내용의 페이로드는 STAT3 전사체 영역의 보체에 해당하는 연속 뉴클레오티드 서열, 예를 들어 서열번호: 30에 해당하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 본원에 개시된 STAT3 전사체를 표적으로 하는 페이로드를 STAT3 인코딩 mRNA 전사체에 결합시키는 것은 STAT3의 발현 수준 및/또는 활성 수준을 감소시킬 수 있다.
일부 양태에서, 페이로드는 STAT3 전사체를 특이적으로 표적화할 수 있는 ASO를 포함한다. 일부 양태에서, ASO의 뉴클레오티드 서열 또는 이의 연속 뉴클레오티드 서열은 서열번호: 92 내지 101 중 어느 하나에 제시된 서열(즉, 도 3f의 서열)과 적어도 약 80%의 서열 동일성, 예컨대 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96% 서열 동일성, 적어도 약 97% 서열 동일성, 적어도 약 98% 서열 동일성, 적어도 약 99% 서열 동일성, 예컨대 약 100% 서열 동일성을 갖는다.
일부 양태에서 ASO (또는 이의 연속 뉴클레오티드 부분)는 서열번호: 92 내지 101 또는 이의 적어도 10개의 연속 뉴클레오티드 영역으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열 중 하나로부터 선택되거나 이를 포함하고, 여기서 ASO (또는 이의 연속 뉴클레오티드 부분)은 해당하는 STAT3 전사체와 비교할 때 1, 2, 3 또는 4개의 불일치를 선택적으로 포함할 수 있다.
일부 양태에서, ASO는 서열번호: 92에 제시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, ASO는 서열번호: 93에 제시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, ASO는 서열번호: 94에 제시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, ASO는 서열번호: 95에 제시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, ASO는 서열번호: 96에 제시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, ASO는 서열번호: 97에 제시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, ASO는 서열번호: 98에 제시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, ASO는 서열번호: 99에 제시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, ASO는 서열번호: 100에 제시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, ASO는 서열번호: 101에 제시된 서열을 포함한다.
일부 양태에서, ASO는 서열번호: 92 내지 101에 제시된 서열과 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 동일한 서열을 포함하거나 이로 구성된다. 일부 양태에서, ASO (또는 이의 연속 뉴클레오티드 부분)는 서열번호: 92 내지 101으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열 중 하나 또는 그의 적어도 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개의 인접 뉴클레오티드의 영역으로부터 선택되거나 이를 포함한다. 일부 양태에서 ASO (또는 이의 연속 뉴클레오티드 부분)는 서열번호: 92 내지 101 또는 이의 적어도 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개의 연속 뉴클레오티드 영역으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열 중 하나로부터 선택되거나 이를 포함하고, 여기서 ASO (또는 이의 연속 뉴클레오티드 부분)은 해당하는 STAT3 전사체와 비교할 때 1, 2, 3 또는 4개의 불일치를 선택적으로 포함할 수 있다. 일부 양태에서, ASO(또는 이의 연속 뉴클레오티드 부분)는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 치환을 제외하고 서열번호: 92 내지 101로 이루어진 군으로부터 선택된 서열 중 하나로부터 선택되거나 이를 포함하고, 치환된 ASO는 STAT3 전사체에 결합할 수 있다. 일부 양태에서, ASO (또는 이의 연속 뉴클레오티드 부분)는 서열번호: 92 내지 101 또는 이의 적어도 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개의 연속 뉴클레오티드 영역으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열 중 하나로부터 선택되거나 이를 포함하고, 여기서 ASO (또는 이의 연속 뉴클레오티드 부분)은 상응하는 STAT3 전사체에 상보적인 1개, 2개, 3개 또는 4개의 추가 5' 및/또는 3' 뉴클레오티드를 선택적으로 포함할 수 있다.
II.G
.
1.g
NLRP3
일부 양태에서, 본원에 제공된 페이로드(예를 들어, ASO)는 세포에서 관심 있는 임의의 유전자 또는 단백질의 발현을 하향 조절(예를 들어, 감소 또는 억제)할 수 있다. 특정 양태에서, 본원에 기재된 페이로드(예를 들어, 본 개시내용의 로딩 방법을 사용하여 EV에 로딩될 수 있음)는 NLRP3 프리-mRNA(pre-mRNA)의 하나 이상의 영역(예를 들어, 인트론 영역, 엑손 영역 및/또는 엑손-인트론 접합부 영역)을 표적으로 한다. 일부 양태에서, 페이로드는 NLRP3 단백질의 모든 동형(isoform)을 표적화할 수 있다. 특정 양태에서, 페이로드는 특정 NLRP3 동형을 표적으로 한다. 달리 나타내지 않는 한, 본원에 사용되는 "NLRP3"이라는 용어는 하나 이상의 종(예를 들어, 인간, 비-인간 영장류, 개, 고양이, 기니아 피그, 토끼, 랫트, 마우스, 말, 소, 및 곰)의 STAT6을 지칭할 수 있다.
NLRP3(NLRP3)은 NLR 계열 피린 도메인 함유 3으로도 알려져 있다. 달리 나타내지 않는 한, 본원에 사용되는 "NLRP3"이라는 용어는 하나 이상의 종(예를 들어, 인간, 비-인간 영장류, 개, 고양이, 기니아 피그, 토끼, 랫트, 마우스, 말, 소, 및 곰)의 NLRP3을 지칭할 수 있다. NLRP3/NLRP3의 동의어는 알려져 있으며 NLRP3; C1orf7; CIAS1; NALP3; PYPAF1; 뉴클레오티드 결합 올리고머화 도메인, 류신 풍부 반복체 및 피린 도메인 함유 3; 냉 유도 자가염증 증후군 1 단백질; 크리오피인; NACHT, LRR 및 PYD 도메인 함유 단백질 3; 안지오텐신/바소프레신 수용체 AII/AVP 유사; 애벌레 단백질 1.1; CLR1.1; 냉(cold) 유도 자가염증 증후군 1 단백질; 및 PYRIN 함유 APAF1 유사 단백질 1을 함유한다. 인간 NLRP3 유전자에 대한 서열은 공개적으로 이용 가능한 GenBank 수탁 번호 NC_000001.11:247416156-247449108에서 찾을 수 있다. 인간 NLRP3 유전자는 염색체 위치 1q44의 247,416,156-247,449,108에서 발견된다.
인간 NLRP3 프리-mRNA 전사체에 대한 서열(서열번호: 33)은 염색체 1q44의 잔기 247,416,156-247,449,108의 역보체에 해당한다. NLRP3 mRNA 서열(GenBank 수탁 번역 NM_001079821.2)은 서열번호: 35에 제공되지만, 서열번호: 35의 뉴클레오티드 "t"는 mRNA에서 "u"로 표시된다. 인간 NLRP3 단백질에 대한 서열은 공개적으로 이용가능한 수득 번호: Q96P20, (정규 서열, 서열번호: 34), Q96P20-2 (서열번호: 36), Q96P20-3 (서열번호: 37), Q96P20-4 (서열번호: 38), Q96P20-5 (서열번호: 39), 및 Q96P20-6 (서열번호: 40) 하에 찾을 수 있고, 이들 각각은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
인간 NLRP3 유전자 산물의 천연 변이체가 알려져 있다. 예를 들어, 인간 NLRP3 단백질의 천연 변이체는 D21H, I174T, V200M, R262L, 4262P, R262W, L266H, D305G, D305N, L307P, Q308K, F311S, T350M, A354V, L355P, E356D, H360R, T407P, T438I, T438N, A441T, A441V, R490K, F525C, F525L, G571R, Y572C, F575S, E629G, L634F, M664T, Q705K, Y861C, 및 R920Q, 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 치환을 함유할 수 있다. 대체 스플라이싱으로 인한 인간 NLRP3 단백질의 추가 변이체도 당업계에 알려져 있다. NLRP3 동형 1(식별자: UniProt의 Q96P20-2)는 다음과 같이 정규 서열(서열변호: 35)과 상이하다: 서열번호: 35에 대해 잔기 721-777 및 836-892이 결실됨. NLRP3 동형 3(식별자: Q96P20-3)의 서열은 다음과 같이 정규 서열(서열변호: 35)과 상이하다: 서열번호: 35에 대해 잔기 720-1036이 결실됨. NLRP3 동형 4(식별자: Q96P20-4)의 서열은 다음과 같이 정규 서열(서열변호: 35)과 상이하다: 서열번호: 35에 대해 잔기 721-777이 결실됨. NLRP3 동형 5(식별자: Q96P20-5)의 서열은 다음과 같이 정규 서열(서열변호: 35)과 상이하다: 서열번호: 35에 대해 잔기 836-892이 결실됨. NLRP3 동형 6(식별자: Q96P20-6)의 서열은 다음과 같이 정규 서열(서열변호: 35)과 상이하다: 서열번호: 35에 대해 잔기 776-796이 결실됨. 따라서, 본 개시내용의 페이로드는 NLRP3 단백질의 천연 변이체의 발현을 감소시키거나 억제하도록 설계될 수 있다.
페이로드의 표적 핵산 서열의 예는 NLRP3 프리-mRNA이다. 서열번호: 33은 인간 NLRP3 게놈 서열(즉, 염색체 1q44의 뉴클레오티드 247,416,156-247,449,108의 역보체)을 나타낸다. 서열번호: 33은 서열번호: 33의 뉴클레오티드 "t"가 프리-mRNA에서 "u"로 표시된다는 점을 제외하면 NLRP3 프리-mRNA 서열과 동일하다. 특정 양태에서, "표적 핵산"은 NLRP3 단백질 인코딩 핵산 또는 이의 자연 발생 변이체, 및 그로부터 유래된 RNA 핵산, 예를 들어 프리-mRNA의 인트론을 포함한다. 특정 양태에서, "표적 핵산"은 NLRP3 단백질 인코딩 핵산 또는 이의 자연 발생 변이체, 및 그로부터 유래된 RNA 핵산, 예를 들어 프리-mRNA의 엑손 영역을 포함한다. 특정 양태에서, "표적 핵산"은 NLRP3 단백질 인코딩 핵산 또는 이의 천연 발생 변이체, 및 그로부터 유래된 RNA 핵산, 예를 들어 프리-mRNA의 엑손-인트론 접합부를을 포함한다. 일부 양태에서, 예를 들어 연구 또는 진단에 사용되는 경우, "표적 핵산"은 cDNA 또는 상기 DNA 또는 RNA 핵산 표적에서 유래된 합성 올리고뉴클레오티드일 수 있다. NLRP3 프리-mRNA에 의해 인코딩된 인간 NLRP3 단백질 서열은 서열번호: 5로 표시된다. 특정 양태에서, 표적 핵산은 NLRP3 단백질 인코딩 핵산 또는 이의 천연 발생 변이체, 예를 들어, 5' UTR, 3' UTR, 또는 둘 다의 비번역된 영역을 포함한다.
일부 양태에서, 페이로드(예를 들어, ASO)는 NLRP3 전사체의 인트론 내의 영역, 예를 들어, 서열번호: 33에 혼성화한다. 특정 양태에서, 본 개시내용의 페이로드는 NLRP3 전사체의 엑손 내의 영역, 예를 들어, 서열번호: 33에 혼성화한다. 특정 양태에서, 본 개시내용의 페이로드는 NLRP3 전사체의 엑손-인트론 접합부 내의 영역, 예를 들어, 서열번호: 33에 혼성화한다. 일부 양태에서, 본 개시내용의 페이로드는 NLRP3 전사체(예를 들어, 인트론, 엑손 또는 엑손-인트론 접합부) 내의 영역, 예를 들어 서열번호: 33에 혼성화한다.
일부 양태에서, 페이로드는 NLRP3 단백질의 특정 동형(예를 들어, 동형 1)을 인코딩하는 mRNA를 표적으로 한다. 일부 양태에서, 페이로드는 NLRP3 단백질의 모든 동형을 표적으로 한다. 특정 양태에서, 페이로드는 NLRP3 단백질의 2개의 동형(예를 들어, 동형 1 및 동형 2, 동형 3 및 동형 4, 및 동형 5 및 동형 6)을 표적으로 한다.
일부 양태에서, 본원에 개시된 NLRP3 전사체를 표적으로 하는 페이로드를 NLRP3 인코딩 mRNA 전사체에 결합시키는 것은 NLRP3의 발현 수준 및/또는 활성 수준을 감소시킬 수 있다.
일부 양태에서, 페이로드는 NLRP3 전사체를 특이적으로 표적화할 수 있는 ASO를 포함한다. 일부 양태에서, ASO의 뉴클레오티드 서열 또는 이의 연속 뉴클레오티드 서열은 서열번호: 102 내지 112 중 어느 하나에 제시된 서열(즉, 도 3g의 서열)과 적어도 약 80%의 서열 동일성, 예컨대 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96% 서열 동일성, 적어도 약 97% 서열 동일성, 적어도 약 98% 서열 동일성, 적어도 약 99% 서열 동일성, 예컨대 약 100% 서열 동일성을 갖는다.
일부 양태에서 ASO (또는 이의 연속 뉴클레오티드 부분)는 서열번호: 102 내지 112 또는 이의 적어도 10개의 연속 뉴클레오티드 영역으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열 중 하나로부터 선택되거나 이를 포함하고, 여기서 ASO (또는 이의 연속 뉴클레오티드 부분)은 해당하는 NLRP3 전사체와 비교할 때 1, 2, 3 또는 4개의 불일치를 선택적으로 포함할 수 있다.
일부 양태에서, ASO는 서열번호: 102에 제시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, ASO는 서열번호: 103에 제시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, ASO는 서열번호: 104에 제시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, ASO는 서열번호: 105에 제시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, ASO는 서열번호: 106에 제시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, ASO는 서열번호: 107에 제시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, ASO는 서열번호: 108에 제시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, ASO는 서열번호: 109에 제시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, ASO는 서열번호: 110에 제시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, ASO는 서열번호: 111에 제시된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, ASO는 서열번호: 112에 제시된 서열을 포함한다.
일부 양태에서, ASO는 서열번호: 102 내지 112에 제시된 서열과 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 동일한 서열을 포함하거나 이로 구성된다. 일부 양태에서, ASO (또는 이의 연속 뉴클레오티드 부분)는 서열번호: 102 내지 112로 이루어진 군으로부터 선택된 서열 중 하나 또는 그의 적어도 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개의 인접 뉴클레오티드의 영역으로부터 선택되거나 이를 포함한다. 일부 양태에서, ASO (또는 이의 연속 뉴클레오티드 부분)는 서열번호: 102 내지 112 또는 이의 적어도 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개의 연속 뉴클레오티드 영역으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열 중 하나로부터 선택되거나 이를 포함하고, 여기서 ASO (또는 이의 연속 뉴클레오티드 부분)은 해당하는 NLRP3 전사체와 비교할 때 1, 2, 3 또는 4개의 불일치를 선택적으로 포함할 수 있다. 일부 양태에서, ASO(또는 이의 연속 뉴클레오티드 부분)는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 치환을 제외하고 서열번호: 102 내지 112로 이루어진 군으로부터 선택된 서열 중 하나로부터 선택되거나 이를 포함하고, 치환된 ASO는 NLRP3 전사체에 결합할 수 있다. 일부 양태에서, ASO (또는 이의 연속 뉴클레오티드 부분)는 서열번호: 102 내지 112 또는 이의 적어도 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개의 연속 뉴클레오티드 영역으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열 중 하나로부터 선택되거나 이를 포함하고, 여기서 ASO (또는 이의 연속 뉴클레오티드 부분)은 상응하는 NLRP3 전사체에 상보적인 1개, 2개, 3개 또는 4개의 추가 5' 및/또는 3' 뉴클레오티드를 선택적으로 포함할 수 있다.
II.G
.2 고정
모이어티
하나 이상의 고정 모이어티(AM)을 사용하여 페이로드(또는 관심 있는 다른 모이어티)를 EV(예를 들어, 엑소좀)에 고정할 수 있다. 일부 양태에서, 페이로드는 고정 모이어티에 직접 연결된다. 일부 양태에서, 페이로드는 본원에 기재된 것과 같은 링커를 통해 고정 모이어티에 연결된다. 일부 양태에서, 페이로드는 "반응성 기 "(RG; 예를 들어, 아민, 티올, 하이드록시, 카복실산 또는 아지드)와 "반응성 모이어티"(RM; 예를 들어, 말레이미드, 석시네이트, NHS) 사이의 반응을 통해 고정 모이어티 및/또는 링커에 부착될 수 있다. 몇 가지 잠재적인 합성 경로가 예를 들면 구상된다:
[AM]-/반응성 모이어티/ + /반응성 기/-[페이로드]
[AM]-[링커]n-/반응성 모이어티/ + /반응성 기/-[페이로드]
[AM]-/반응성 모이어티/ + /반응성 기/-[링커]n-[페이로드]
[AM]- [링커]n-/반응성 모이어티/ + /반응성 기/-[링커]n-[페이로드]
고정 모이어티는 EV의 지질 이중층에 삽입되어 페이로드의 로딩을 허용할 수 있다. 일부 양태에서, 고정 모이어티는 페이로드에 화학적으로 접합되어 소수성 특성을 향상시킬 수 있으며, 이에 따라 페이로드로 EV의 로딩을 향상시킬 수 있다. 일부 양태에서, 고정 모이어티는 스테롤(예를 들어, 콜레스테롤), GM1, 지질, 비타민, 소분자, 펩티드 또는 이의 조합을 포함한다.
일부 양태에서, 고정 모이어티는 지질이다. 당업계에 공지된 임의의 적합한 지질이 고정 모이어티(예를 들어, 팔미트산 또는 글리코실포스파티딜이노시톨)로 사용될 수 있다. 일부 양태에서, 고정 모이어티는 스테롤, 예를 들어 콜레스테롤이다. 추가적인 소수성 모이어티는 예를 들어 인지질, 라이소인지질, 지방산 또는 비타민(예를 들어 비타민 D 또는 비타민 E)을 포함한다.
일부 양태에서, 고정 모이어티는 화학적으로 부착된다. 특정 양태에서, 고정 모이어티는 페이로드(예를 들어 ASO)에 효소적으로 부착될 수 있다. 일부 양태에서, 고정 모이어티는 세포 배양 조건의 변형을 통해 페이로드에 부착될 수 있다. 예를 들어, 미리스트산이 제한되는 배양 배지를 사용함으로써, 더 짧은 사슬 및 불포화 지방산을 포함한 일부 다른 지방산이 N-말단 글리신에 부착될 수 있다. 예를 들어, BK 채널에서, 미리스테이트는 하이드록시에스테르 연결을 통해 내부 세린/트레오닌 또는 티로신 잔기에 번역 후 부착되는 것으로 보고되었다.
고정 모이어티는 임의의 화학적으로 실현가능한 위치, 예를 들어 페이로드의 5' 및/또는 3' 말단에서 링커 조합을 통해 직접 또는 간접적으로 페이로드에 접합될 수 있다. 특정 양태에서, 고정 모이어티는 페이로드의 3' 말단에만 접합된다. 특정 양태에서, 고정 모이어티는 페이로드의 5' 말단에만 접합된다. 일부 양태에서, 고정 모이어티는 페이로드의 3' 말단 또는 5' 말단이 아닌 위치에서 접합된다.
고정 모이어티 (구조 포함)의 비제한적인 예가 아래에 제공된다:
일부 양태에서, 본 개시내용에 유용한 고정 모이어티는 본원에 개시된 2개 이상의 유형의 고정 모이어티를 포함한다. 예를 들어, 일부 양태에서, 고정 모이어티는 2개의 지질, 예를 들어 인지질 및 지방산, 또는 2개의 인지질, 또는 2개의 지방산, 또는 지질 및 비타민, 또는 콜레스테롤 및 비타민 등을 포함할 수 있고, 이는 함께 합쳐져서 6 내지 80개의 탄소 원자를 갖는다(즉, 6 내지 80의 동등 탄소수(ECN)).
일부 양태에서, 고정 모이어티의 조합, 예를 들어 지질(예를 들어, 지방산)의 조합은 6-80, 8-80, 10-80, 12-80, 14-80, 16-80, 18-80, 20-80, 22-80, 24-80, 26-80, 28-80, 30-80, 4-76, 6-76, 8-76, 10-76, 12-76, 14-76, 16-76, 18-76, 20-76, 22-76, 24-76, 26-76, 28-76, 30-76, 6-72, 8-72, 10-72, 12-72, 14-72, 16-72, 18-72, 20-72, 22-72, 24-72, 26-72, 28-72, 30-72, 6-68, 8-68, 10-68, 12-68, 14-68, 16-68, 18-68, 20-68, 22-68, 24-68, 26-68, 28-68, 30-68, 6-64, 8-64, 10-64, 12-64, 14-64, 16-64, 18-64, 20-64, 22-64, 24-64, 26-64, 28-64, 30-64, 6-60, 8-60, 10-60, 12-56, 14-56, 16-56, 18-56, 20-56, 22-56, 24-56, 26-56, 28-56, 30-56, 6-52, 8-52, 10-52, 12-52, 14-52, 16-52, 18-52, 20-52, 22-52, 24-52, 26-52, 28-52, 30-52, 6-48, 8-48, 10-48, 12-48, 14-48, 16-48, 18-48, 20-48, 22-48, 24-48, 26-48, 28-48, 30-48, 6-44, 8-44, 10-44, 12-44, 14-44, 16-44, 18-44, 20-44, 22-44, 24-44, 26-44, 28-44, 30-44, 6-40, 8-40, 10-40, 12-40, 14-40, 16-40, 18-40, 20-40, 22-40, 24-40, 26-40, 28-40, 30-40, 6-36, 8-36, 10-36, 12-36, 14-36, 16-36, 18-36, 20-36, 22-36, 24-36, 26-36, 28-36, 30-36, 6-32, 8-32, 10-32, 12-32, 14-32, 16-32, 18-32, 20-32, 22-32, 24-32, 26-32, 28-32, 또는 30-32의 ECN을 갖는다.
II.G
.
1.a
. 콜레스테롤 및 기타 스테롤
일부 양태에서, 고정 모이어티는 스테롤, 스테로이드, 호파노이드, 하이드록시스테로이드, 세코스테로이드 또는 친유성 특성을 갖는 이들의 유사체를 포함한다. 일부 양태에서, 고정 모이어티는 파이토스테롤, 마이코스테롤 또는 주스테롤과 같은 스테롤을 포함한다. 예시적인 주스테롤은 콜레스테롤 및 24S-하이드록시콜레스테롤을 포함하고; 예시적인 파이토스테롤은 에르고스테롤(마이코스테롤), 캄페스테롤, 시토스테롤 및 스티그마스테롤을 포함한다. 일부 양태에서, 스테롤은 에르고스테롤, 7-데하이드로콜레스테롤, 콜레스테롤, 24S-하이드록시콜레스테롤, 라노스테롤, 사이클로아르테놀, 푸코스테롤, 사린고스테롤, 캄페스테롤, β-시토스테롤, 시토스타놀, 코프로스타놀, 아베나스테롤 또는 스티그마스테롤로부터 선택된다. 스테롤은 유리 스테롤, 아실화(스테롤 에스테르), 알킬화(스테릴 알킬 에테르), 황산화(스테롤 설페이트)로서 찾을 수 있거나, 그 자체가 아실화될 수 있는(아실화 스테롤 글리코시드) 글리코시드 모이어티(스테릴 글리코시드)에 연결된다.
일부 양태에서, 고정 모이어티는 스테로이드를 포함한다. 일부 양태에서, 스테로이드는 디하이드로테스토스테론, 우바올, 헤시게닌, 디오스게닌, 프로게스테론 또는 코르티솔로부터 선택된다.
예를 들어, 스테롤은 직접적으로 또는 스테롤의 이용 가능한 -OH 기에서 링커 조합을 통해 페이로드(예를 들어, ASO)에 접합될 수 있다. 예시적인 스테롤은 하기에 나타낸 일반적인 백본을 갖는다:
추가 예로서, 에르고스테롤은 하기 구조를 갖는다:
콜레스테롤은 아래와 같은 구조를 가지고 있다.
따라서, 일부 양태에서, 스테롤 또는 스테로이드의 유리 -OH 기는 페이로드를 직접적으로 또는 링커 조합을 통해 스테롤(예를 들어, 콜레스테롤) 또는 스테로이드에 접합시키는 데 사용된다. 일부 양태에서, 본원에 기재된 페이로드(예를 들어, ASO)를 접합시키는 데 사용될 수 있는 콜레스테롤은 도 2a에 도시된 구조를 갖는다. 일부 양태에서, 본원에 기재된 페이로드(예를 들어, ASO)를 접합시키는 데 사용될 수 있는 콜레스테롤은 도 2b에 도시된 구조를 갖는다. 본원에 기재된 바와 같이, 도 2a에 도시된 콜레스테롤은 링커, 예를 들어 트리에틸렌 글리콜(본원에서는 "chol2"로 지칭됨)에 부착될 수 있다. 일부 양태에서, 도 2b에 도시된 콜레스테롤은 링커, 예를 들어 테트라에틸렌 글리콜(본원에서는 "chol4"로 지칭됨)에 부착될 수 있다.
II.G
.
2.b
. 지방산
일부 양태에서, 고정 모이어티는 지방산이다. 일부 양태에서, 지방산은 단쇄, 중간 쇄 또는 장쇄 지방산이다. 일부 양태에서, 지방산은 포화 지방산이다. 일부 양태에서, 지방산은 불포화 지방산이다. 일부 양태에서, 지방산은 단일불포화 지방산이다. 일부 양태에서, 지방산은 오메가-3 또는 오메가-6 지방산과 같은 다중불포화 지방산이다.
일부 양태에서, 지질, 예를 들어 지방산은 C2-C60 사슬을 갖는다. 일부 양태에서, 지질, 예를 들어 지방산은 C2-C28 사슬을 갖는다. 일부 양태에서, 지방산은 C2-C40 사슬을 갖는다. 일부 양태에서, 지방산은 C2-C12 또는 C4-C12 사슬을 갖는다. 일부 양태에서, 지방산은 C4-C40 사슬을 갖는다. 일부 양태에서, 지방산은 C4-C40, C2-C38, C2-C36, C2-C34, C2-C32, C2-C30, C4-C30, C2-C28, C4-C28, C2- C26, C4-C26, C2-C24, C4-C24, C6-C24, C8-C24, C10-C24, C2-C22, C4-C22, C6-C22, C8-C22, C10-C22, C2-C20, C4-C20, C6-C20, C8-C20, C10-C20, C2-C18, C4-C18, C6-C18, C8-C18, C10-C18, C12-C18, C14-C18, C16-C18, C2-C16, C4-C16, C6-C16, C8-C16, C10-C16, C12-C16, C14-C16, C2-C15, C4-C15, C6-C15, C8-C15, C9-C15, C10-C15, C11-C15, C12-C15, C13-C15, C2-C14, C4-C14, C6-C14, C8-C14, C9-C14, C10-C14, C11-C14, C12-C14, C2-C13, C4-C13, C6-C13, C7-C13, C8-C13, C9-C13, C10-C13, C10-C13, C11-C13, C2-C12, C4-C12, C6-C12, C7-C12, C8-C12, C9-C12, C10-C12, C2-C11, C4-C11, C6-C11, C7-C11, C8-C11, C9-C11, C2-C10, C4-C10, C2-C9, C4-C9, C2-C8, C2-C7, C4-C7, C2-C6, 또는 C4-C6 사슬을 갖는다. 일부 양태에서, 지방산은 C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C19, C20, C21, C22, C23, C24, C25, C26, C27, C28, C29, C30, C31, C32, C33, C34, C35, C36, C37, C38, C39, C40, C41, C42, C43, C44, C45, C46, C47, C48, C49, C50, C51, C52, C53, C54, C55, C56, C57, C58, C59, 또는 C60 사슬을 갖는다.
일부 양태에서, 고정 모이어티는 2개의 지방산을 포함하고, 이들 각각은 탄소 원자의 상기 범위 또는 수 중 임의의 하나를 갖는 사슬을 갖는 지방산으로부터 독립적으로 선택된다. 일부 양태에서, 지방산 중 하나는 독립적으로 C6-C21 사슬을 갖는 지방산이고, 하나는 독립적으로 C12-C36 사슬을 갖는 지방산이다. 일부 양태에서, 각각의 지방산은 독립적으로 11, 12, 13, 14, 15, 16, 또는 17개의 탄소 원자의 사슬을 갖는다.
적합한 지방산은 포화 직쇄 지방산, 포화 분지형 지방산, 불포화 지방산, 하이드록시 지방산 및 폴리카복실산을 포함한다. 일부 양태에서, 이러한 지방산은 최대 32개의 탄소 원자를 갖는다.
유용한 포화 직쇄 지방산의 예는 탄소 원자의 짝수를 갖는 것, 예컨대 부티르산, 카프로산, 카프릴산, 카프르산, 라우르산, 미리스트산, 팔미트산, 스테아르산, 아라키드산, 베헨산, 리그노세르산, 헥사코산산, 옥타코산산, 트리아코탄산 및 n-도트리아코탄산, 및 탄소 원자의 홀수를 갖는 것들, 예컨대 프로피온산, n-발레르산, 에난틱산, 펠라르곤산, 헨데칸산, 트리데칸산, 펜타데칸산, 헵타데칸산, 노나데칸산, 헤네이코산산, 트리코산산, 펜타코산산, 및 헵타코산산을 포함한다.
적합한 포화 분지형 지방산의 예는 이소부티르산, 이소카프로산, 이소카프릴산, 이소카프르산, 이소라우르산, 11-메틸도데칸산, 이소미리스트산, 13-메틸-테트라데칸산, 이소팔미트산, 15-메틸-헥사데칸산, 이소스테아르산, 17-메틸옥타데칸산, 이소아라키드산, 19-메틸-에이코산산, α-에틸-헥산산, α-헥실데칸산, α-헵틸운데칸산, 2-데실테트라데칸산, 2-운데실테트라데칸산, 2-데실펜타데칸산, 2-운데실펜타데칸산, 및 Fine oxocol 1800 산 (Nissan Chemical Industries, Ltd.의 제품)을 포함한다. 적합한 포화 홀수-탄소 분지형 지방산은 이소부틸 기로 종결되는 안테이소 지방산, 예컨대 6-메틸-옥탄산, 8-메틸-데칸산, 10-메틸-도데칸산, 12-메틸-테트라데칸산, 14-메틸-헥사데칸산, 16-메틸-옥타데칸산, 18-메틸-에이코산산, 20-메틸-도코산산, 22-메틸-테트라코산산, 24-메틸-헥사코산산, 및 26-메틸옥타코산산을 포함한다.
적합한 불포화 지방산의 예는 4-데센산, 카프롤레산, 4-도데센산, 5-도데센산, 라우롤레산, 4-테트라데센산, 5-테트라데센산, 9-테트라데센산, 팔미톨레산, 6-옥타데세노산, 올레산, 9-옥타데세노산, 11-옥타데세노산, 9-에이코세노산, 시스-11-에이코세노산, 세톨레산, 13-도코센산, 15-테트라코센산, 17-헥사코센산, 6,9,12,15-헥사데카테트라엔노산, 리놀레산, 리놀렌산, α-엘레오스테아르산, β-엘레오스테아르산, 푸닉산, 6,9,12,15-옥타데카테트라엔노산, 파리나르산, 5,8,11,14-에이코사테트라엔노산, 5,8,11,14,17-에이코사펜타엔산, 7,10,13,16,19-도코사펜타엔산, 4,7,10,13,16,19-도코사헥사엔산, 등을 포함한다.
적합한 하이드록시 지방산의 예는 α-하이드록시라우르산, α-하이드록시미리스트산, α-하이드록시팔미트산, α-하이드록시스테아르산, ω-하이드록시라우르산, α-하이드록시아라키드산, 9-하이드록시-12-옥타데세노산, 리시놀레산, α-하이드록시베헨산, 9-하이드록시-트랜스-10,12-옥타데카디엔산, 카몰렌산, 이푸롤산, 9,10-디하이드록시스테아르산, 12-하이드록시스테아르산 등을 포함한다.
적합한 폴리카복실산의 예는 옥살산, 말론산, 석신산, 글루타르산, 아디프산, 피멜산, 수베르산, 아젤라산, 세박산, D,L-말산 등을 포함한다.
일부 양태에서, 각각의 지방산은 프로피온산, 부티르산, 발레르산, 카프로산, 에난틱산, 카프릴산, 펠라르곤산, 카프르산, 운데실산, 라우르산, 트리데실산, 미리스트산, 펜타데실산, 팔미트산, 마르가르산, 스테아르산, 노나데실산, 아라키드산, 헤네이코실산, 베헨산, 트리코실산, 리그노세르산, 펜타코실산, 세로트산, 헵타코실산, 몬탄산, 노나코실산, 멜리스산, 헤나트리아콘틸산, 라세로익산, 프실산, 게드산, 세로플라스틱산, 헥사트리아콘틸산, 헵타트리아코탄산, 또는 옥타트리아코탄산으로부터 독립적으로 선택된다.
일부 양태에서, 각각의 지방산은 α-리놀렌산, 스테아리돈산, 에이코사펜타엔산, 도코사헥사엔산, 리놀레산, 감마-리놀레산, 디호모-감마-리놀레산, 아라키돈산, 도코사테트라엔노산, 팔미톨레산, 박센산, 폴린산, 올레산, 엘라이드산, 곤도산, 에루스산, 네르본산, 미드산, 아드렌산, 보세오펜타엔산, 오즈본도산, 사딘산, 헤링산, 도코사헥사엔산, 또는 테트라코사놀펜타엔산, 또는 또 다른 단일불포화 또는 다중불포화 지방산으로부터 독립적으로 선택된다.
일부 양태에서, 지방산 중 하나 또는 둘 모두는 필수 지방산이다. 특정 필수 지방산의 유익한 건강 효과의 관점에서, 개시된 치료-로딩된 엑소좀의 치료적 이점은 이러한 지방산을 치료제에 포함시킴으로써 증가될 수 있다. 일부 양태에서, 필수 지방산은 리놀렌산, 감마-리놀렌산, 디호모-감마-리놀렌산, 아라키돈산, 아드렌산, 도코사펜타엔산 n-6 산, 알파-리놀렌산, 스테아리돈산, 20:4n-3 산, 에이코사펜타엔산, 도코사펜타엔산 n-3 산, 또는 도코사헥사엔산으로 이루어진 군으로부터 선택된 n-6 또는 n-3 필수 지방산이다.
일부 양태에서, 각각의 지방산은 올-시스-7,10,13-헥사데카트리엔산, α-리놀렌산, 스테아리돈산, 에이코사트리엔산, 에이코사테트라엔노산, 에이코사펜타엔산 (EPA), 도코사펜타엔산, 도코사헥사엔산 (DHA), 테트라코사펜타엔산, 테트라코사헥사엔산, 또는 리포산으로부터 독립적으로 선택된다. 일부 양태에서, 지방산은 에이코사펜타엔산, 도코사헥사엔산 또는 리포산으로부터 선택된다. 지방산의 다른 예는 올-시스-7,10,13-헥사데카트리엔산, α-리놀렌산 (ALA 또는 올-시스-9,12,15-옥타데카트리엔산), 스테아리돈산 (STD 또는 올-시스-6,9,12,15-옥타데카테트라엔노산), 에이코사트리엔산 (ETE 또는 올-시스-11,14,17-에이코사트리엔산), 에이코사테트라엔노산 (ETA 또는 올-시스-8,11,14,17-에이코사테트라엔노산), 에이코사펜타엔산 (EPA), 도코사펜타엔산 (DPA, 클루파노돈산 또는 올-시스-7,10,13,16,19-도코사펜타엔산), 도코사헥사엔산 (DHA 또는 올-시스-4,7,10,13,16,19-도코사헥사엔산), 테트라코사펜타엔산 (올-시스-9,12,15,18,21-도코사헥사엔산), 또는 테트라코사헥사엔산 (니신산 또는 올-시스-6,9,12,15,18,21-테트라코센산)을 포함한다. 일부 양태에서, 지방산은 리포산과 같은 중간 사슬 지방산이다.
지방산 사슬은 사슬 길이가 크게 다르며 사슬 길이에 따라 짧은 것부터 매우 긴 것까지 분류할 수 있다. 단쇄 지방산(SCFA)은 약 5개 이하의 탄소 사슬을 갖는 지방산이다(예를 들어, 부티르산). 일부 양태에서, 지방산은 SCFA이다. 중간 사슬 지방산(MCFA)은 중간 사슬 트리글리세리드를 형성할 수 있는 약 6 내지 12개의 탄소 사슬을 갖는 지방산을 포함한다. 일부 양태에서, 지방산은 MCFA이다. 긴 사슬 지방산(LCFA)에는 13 내지 21개의 탄소 사슬을 갖는 지방산이 포함된다. 일부 양태에서, 지방산은 LCFA이다. 일부 양태에서, 지방산은 LCFA이다. 초장쇄 지방산(VLCFA)에는 22 내지 60, 22 내지 50 또는 22 내지 40개의 탄소와 같이 22개 이상의 탄소 사슬을 갖는 지방산이 포함된다. 일부 양태에서, 지방산은 VLCFA이다.
II.G
.
2.c
. 인지질
일부 양태에서, 고정 모이어티는 인지질을 포함한다. 인지질은 모든 세포막의 주요 성분인 지질의 한 부류이다. 양친매성 특성 때문에 지질 이중층을 형성할 수 있다. 인지질 분자의 구조는 일반적으로 인산염 기로 구성된 2개의 소수성 지방산 "꼬리"와 친수성 "머리"로 구성된다. 예를 들어, 인식질은 다음 식에 따라 지질일 수 있다.
여기서 Rp는 인식질 모이어티를 나타내고 R1 및 R2는 동일하거나 상이할 수 있는 불포화가 있거나 없는 지방산 모이어티를 나타낸다.
인지질 모이어티는 예를 들어 포스파티딜 콜린, 포스파티딜 에탄올아민, 포스파티딜 글리세롤, 포스파티딜 세린, 포스파티드산, 2 라이소포스파티딜 콜린, 및 스핑고미엘린으로 이루어진 비제한적 군으로부터 선택될 수 있다.
특정 인식질은 지질 이중층, 예를 들어 엑소좀 막의 지질 이중층에 대한 융합을 촉진할 수 있다. 예를 들어, 양이온성 인식질은 막의 하나 이상의 음으로 하전된 인식질과 상호 작용할 수 있다. 막에 대한 인식질의 융합은 지질 함유 조성물의 하나 이상의 요소가 막에 결합하거나 막을 통과하게 할 수 있다.
지방산 모이어티는 예를 들어 라우르산, 미리스트산, 미리스트올레산, 팔미트산, 팔미톨레산, 스테아르산, 올레산, 리놀레산, 알파-리놀렌산, 에루스산, 파이탄산, 아라키드산, 아라키돈산, 에이코사펜타엔산, 베헨산, 도코사펜타엔산, 및 도코사헥사엔산으로 이루어진 비제한적인 군으로부터 선택될 수 있다.
본 개시내용에서 고정 모이어티로 사용되는 인지질은 천연 또는 비-천연 인지질일 수 있다. 분지화, 산화, 고리화 및 알킨을 포함하는 변형 및 치환을 갖는 천연 종을 포함하는 비-천연 인식질 종도 고려된다. 예를 들어, 인식질은 하나 이상의 알킨(예를 들어, 적어도 하나의 이중 결합이 삼중 결합으로 대체된 알케닐 기)으로 관능화되거나 가교될 수 있다. 적절한 반응 조건 하에서, 알킨 기는 아지드에 노출되면 구리 촉매 고리화첨가를 겪을 수 있다.
인지질은 글리세로인지질 예컨대 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨, 포스파티디 글리세롤, 및 포스파티드산을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
II.G
.
2.d
.
라이소지질
(예를 들어,
라이소인지질
)
일부 양태에서, 고정 모이어티는 라이소지질, 예를 들어 라이소인지질을 포함한다. 라이소지질은 일반적으로 가수분해에 의해 지방 아실 사슬 중 하나 또는 둘 모두가 제거된 지질의 유도체이다. 라이소인지질은 지방 아실 사슬 중 하나 또는 둘 모두가 가수분해에 의해 제거된 인지질의 유도체이다.
일부 양태에서, 고정 모이어티는 위에 개시된 임의의 인지질을 포함하며, 여기서 아실 사슬 중 하나 또는 둘 다는 가수분해를 통해 제거되고, 따라서 생성된 라이소인지질은 지방산 아실 사슬을 하나 포함하거나 포함하지 않는다.
일부 양태에서, 고정 모이어티는 라이소글리세로인지질, 라이소글리코스핑고지질, 라이소포스파티딜콜린, 라이소포스파티딜에탄올아민, 라이소포스파티딜이노시톨, 또는 라이소포스파티딜세린을 포함한다.
II.G
.
2.e
. 비타민
일부 양태에서, 고정 모이어티는 친유성 비타민, 예를 들어 폴산, 비타민 A, 비타민 E, 피리독손, 니아신 또는 비타민 K를 포함한다.
일부 양태에서, 고정 모이어티는 비타민 A를 포함한다. 비타민 A는 레티놀, 레티날, 레티노산 및 여러 프로비타민 A 카로테노이드(가장 두드러지게 베타-카로틴)를 포함하는 불포화 영양 유기 화합물의 기이다. 일부 양태에서, 고정 모이어티는 레티놀를 포함한다. 일부 양태에서, 고정 모이어티는 레티노이드를 포함한다. 레티노이드는 비타민 A의 비타민이거나 비타민 A와 화학적으로 관련된 화합물의 한 부류이다. 일부 양태에서, 고정 모이어티는 1세대 레티노이드 (예를 들어, 레티놀, 트레티노인, 이소트레아티노인, 또는 알리트레티노인), 2세대 레티노이드 (예를 들어, 에트레티네이트 또는 아시트레틴), 3세대 레티노이드 (예를 들어, 아다팔렌, 벡사로텐, 또는 타자로텐), 또는 이의 임의의 조합을 포함한다.
II.G
.3 링커 조합
일부 양태에서, 페이로드(예를 들어, ASO)(또는 본원에 기재된 관심 있는 임의의 다른 모이어티)는 링커 조합을 통해 본원에 개시된 고정 모이어티에 연결된다. 특정 양태에서, 링커 조합은 다중(예를 들어, 2개 이상)의 절단성 링커를 포함한다. 특정 양태에서, 링커 조합은 다중(예를 들어, 2개 이상)의 비절단성 링커를 포함한다. 일부 양태에서, 링커 조합은 다중(예를 들어, 2개 이상)의 비절단성 링커 및 절단성 링커를 포함한다.
링커는 절단("절단성 링커")에 민감하여 생물학적 활성 분자(예를 들어, 페이로드)의 방출을 촉진할 수 있다. 따라서, 일부 양태에서, 본원에 개시된 링커 조합은 절단성 링커를 포함할 수 있다. 이러한 절단성 링커는 생물학적 활성 분자(예를 들어,: 페이로드, 예를 들어, ASO)가 활성 상태를 유지하는 조건에서, 예를 들어 산 유도 절단, 광 유도 절단, 펩티다제 유도 절단, 에스테라제 유도 절단, 반응성 산소 종 유도 절단, 디셀레나이드 결합 절단, 및 디설파이드 결합 절단에 민감할 수 있다. 대안적으로, 링커는 절단에 대해 실질적으로 저항성일 수 있다("비절단성 링커"). 일부 양태에서, 절단성 링커는 스페이서를 포함한다. 일부 양태에서, 스페이서는 PEG이다.
일부 양태에서, 링커 조합은 본원에 개시된 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 또는 적어도 6 또는 그 초과 개의 상이한 링커를 포함한다. 일부 양태에서, 링커 조합 내의 링커는 에스테르 연결(예를 들어, 포스포디에스테르 또는 포스포로티오에이트 에스테르)에 의해 연결될 수 있다.
일부 측면에서, 링커는 고정 모이어티와 페이로드(예를 들어 ASO) 사이의 직접적인 결합이다.
II.G
.
3.a
비절단성
링커
일부 양태에서, 링커 조합은 "비절단성 링커"를 포함한다. 비절단성 링커는 본 개시내용의 변형된 생물학적 활성 분자의 2개 이상의 성분을 연결할 수 있는 임의의 화학적 모이어티(예를 들어, 생물학적 활성 분자 및 고정 모이어티; 생물학적 활성 분자 및 절단성 링커; 고정 모이어티 및 절단성 링커)를 안정적이고 공유 결합 방식으로 결합하며 절단성 링커에 대해 위에 나열된 범주에 속하지 않는다. 따라서 비절단성 링커는 산 유도 절단, 광 유도 절단, 펩티다제 유도 절단, 에스테라아제 유도 절단 및 이황화 결합 절단에 대해 실질적으로 내성이 있다.
또한, 비절단성이란, 고리형 디뉴클레오티드 및/또는 항체가 그 활성을 잃지 않는 조건에서, 링커 내, 또는 산, 광불안정성 절단제, 펩티다제, 에스테라제, 또는 디설파이드를 절단하는 화학적 또는 생리학적 화합물에 의해 유도된 절단을 견디는 링커에 인접하는 화학 결합의 능력을 말한다. 사이클릭 다이뉴클레오티드 및/또는 항체가 활성을 잃지 않는 조건에서 결합한다. 일부 양태에서, 생물학적 활성 분자는 다른 링커, 예를 들어 자기 희생 링커를 통해 링커에 부착된다.
일부 양태에서, 링커 조합은 예를 들어 테트라에틸렌 글리콜 (TEG), 헥사에틸렌 글리콜 (HEG), 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 석신이미드, 또는 이의 임의의 조합을 포함하는 비절단성 링커를 포함한다. 일부 양태에서, 비절단성 링커는 생물학적 활성 분자를 비절단성 링커에 연결하기 위한 스페이서 단위를 포함한다.
일부 양태에서, 하나 이상의 비절단성 링커는 함께 연결된 더 작은 단위(예를 들어, HEG, TEG, 글리세롤, C2 내지 C12 알킬 등)를 포함한다. 한 양태에서, 연결은 에스테르 연결(예를 들어, 포스포디에스테르 또는 포스포로티오에이트 에스테르) 또는 다른 연결이다.
II.G
.
3.a
.1
에틸렌 글리콜
(
HEG
,
TEG
, PEG)
일부 양태에서, 링커 조합은 비절단성 링커를 포함하고, 여기서 비절단성 링커는 화학식 R3-(O-CH2-CH2)n- 또는 R3-(0-CH2-CH2)n-O-(여기서 R3은 수소, 메틸 또는 에틸이고 n은 2 내지 200의 값을 가짐)을 특징으로 하는
폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함한다. 일부 양태에서, 링커는 스페이서를 포함하고, 여기서 스페이서는 PEG이다.
일부 양태에서, PEG 링커는 올리고-에틸렌 글리콜, 예를 들어, 디에틸렌 글리콜, 트리에틸렌 글리콜, 테트라 에틸렌 글리콜 (TEG), 펜타에틸렌 글리콜, 또는 헥사에틸렌 글리콜 (HEG) 링커이다.
일부 양태에서, n은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17,18,19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 189, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 또는 200의 값을 갖는다.
일부 양태에서, n은 2 내지 10, 10 내지 20, 20 내지 30, 30 내지 40, 40 내지 50, 50 내지 60, 60 내지 70, 70 내지 80, 80 내지 90, 90 내지 100, 100 내지 110, 110 내지 120, 120 내지 130, 130 내지 140, 140 내지 150, 150 내지 160, 160 내지 170, 170 내지 180, 180 내지 190, 또는 190 내지 200이다.
일부 특정 양태에서, n은 3 내지 200, 3 내지 20, 10 내지 30, 또는 9 내지 45의 값을 갖는다.
일부 양태에서, PEG는 분지형 PEG이다. 분지형 PEG에는 중심 코어 그룹으로부터 나오는 3 내지 10개의 PEG 사슬이 있다.
특정 양태에서, PEG 모이어티는 단분산 폴리에틸렌 글리콜이다. 본 개시내용의 문맥에서, 단분산 폴리에틸렌 글리콜(mdPEG)은 정의된 단일 사슬 길이 및 분자량을 갖는 PEG이다. mdPEG는 전형적으로 크로마토그래피에 의해 중합 혼합물로부터 분리되어 생성된다. 특정 식에서, 단분산 PEG 모이어티는 약어 mdPEG로 지정된다.
일부 양태에서, PEG는 성상(star) PEG이다. 성상 PEG는 중심 코어 그룹에서 나오는 10 내지 15개의 PEG 사슬을 가지고 있다.
일부 양태에서, PEG는 빗형(comb) PEG이다. 빗형 PEG에는 일반적으로 폴리머 백본에 그라프팅된 여러 개의 PEG 사슬이 있다.
특정 양태에서, PEG는 100 g/mol 내지 3000 g/mol, 특히 100 g/mol 내지 2500 g/mol, 보다 특히 약 100 g/mol 내지 2000 g/mol의 몰 질량을 갖는다. 특정 양태에서, PEG는 200 g/mol 내지 3000 g/mol, 특히 300 g/mol 내지 2500 g/mol, 보다 특히 약 400 g/mol 내지 2000 g/mol의 몰 질량을 갖는다.
일부 양태에서, PEG는 PEG100, PEG200, PEG300, PEG400, PEG500, PEG600 , PEG700, PEG800, PEG900, PEG1000, PEG1100, PEG1200, PEG1300, PEG1400, PEG1500, PEG1600, PEG1700, PEG1800, PEG1900, PEG2000, PEG2100, PEG2200, PEG2300, PEG2400, PEG2500, PEG1600, PEG1700, PEG1800, PEG1900, PEG2000, PEG2100, PEG2200, PEG2300, PEG2400, PEG2500, PEG2600, PEG2700, PEG2800, PEG2900, 또는 PEG3000이다. 특정 양태에서, PEG는 PEG400이다. 특정 양태에서, PEG는 PEG2000이다.
일부 양태에서, 본 개시내용의 링커 조합은 여러 PEG 링커, 예를 들어 PEG, HEG 또는 TEG 링커에 의해 측접된 절단성 링커를 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 링커 조합은 (HEG)n 및/또는 (TEG)n을 포함하며, 여기서 n은 1 내지 50의 정수이고, 각각의 단위는 예를 들어 포스페이트 에스테르 링커, 포스포로티오에이트 에스테르 결합, 또는 이의 조합을 통해 연결된다.
II.G
.
3.a
.2. 글리세롤 및
폴리글리세롤
(
PG
)
일부 양태에서, 링커 조합은 식 ((R3―O―(CH2―CHOH―CH2O)n―) (R3은 수소, 메틸 또는 에틸이고, n은 3 내지 200의 값을 가짐)으로 표시되는 글리세롤 단위 또는 폴리글리세롤(PG)을 포함하는 비절당성 링커를 포함한다. 일부 양태에서, n은 3 내지 20의 값을 갖는다. 일부 양태에서, n은 10 내지 30의 값을 갖는다.
일부 양태에서, PG 링커는 디글리세롤, 트리글리세롤, 테트라글리세롤(TG), 펜타글리세롤 또는 헥사글리세롤(HG) 링커이다.
일부 양태에서, n은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17,18,19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 189, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 또는 200의 값을 갖는다.
일부 양태에서, n은 2 내지 10, 10 내지 20, 20 내지 30, 30 내지 40, 40 내지 50, 50 내지 60, 60 내지 70, 70 내지 80, 80 내지 90, 90 내지 100, 100 내지 110, 110 내지 120, 120 내지 130, 130 내지 140, 140 내지 150, 150 내지 160, 160 내지 170, 170 내지 180, 180 내지 190, 또는 190 내지 200이다.
이들 양태의 일부 대안에서, n은 9 내지 45의 값을 갖는다. 일부 양태에서, 이종 모이어티는 식 (R3―O―(CH2―CHOR5―CH2―O)n―) (R5는 수소임)으로 표시되는 분지형 폴리글리세롤 또는 (R3―O―(CH2―CHOH―CH2―O)n―) (R3은 수소, 메틸 또는 에틸임)으로 표시되는 선형 글리세롤 사슬이다. 일부 양태에서, 이종 모이어티는 식 (R3―O―(CH2―CHOR5―CH2―O)n―) (R5는 수소임)으로 표시되는 하이퍼분지형 폴리글리세롤, 또는 식 (R3―O―(CH2―CHOR6―CH2―O)n―) (R6은 수소임)으로 표시되는 글리세롤 사슬, 또는 식 (R3―O―(CH2―CHOR7―CH2―O)n―) (R7은 수소임)으로 표시되는 글리세롤 사슬, 또는 식 (R3―O―(CH2―CHOH―CH2―O)n―) (R3은 수소, 메틸 또는 에틸임)으로 표시되는 선형 글리세롤 사슬이다. 하이퍼분지형 글리세롤 및 이의 합성 방법은 문헌[Oudshorn 등 (2006) Biomaterials 27:5471-5479; Wilms 등 (20100 Acc. Chem. Res. 43, 129-41] 및 여기에 인용된 참고문헌에 기재되어 있다.
특정 양태에서, PG는 100 g/mol 내지 3000 g/mol, 특히 100 g/mol 내지 2500 g/mol, 보다 특히 약 100 g/mol 내지 2000 g/mol의 몰 질량을 갖는다. 특정 양태에서, PG는 200 g/mol 내지 3000 g/mol, 특히 300 g/mol 내지 2500 g/mol, 보다 특히 약 400 g/mol 내지 2000 g/mol의 몰 질량을 갖는다.
일부 양태에서, PG는 PG100, PG200, PG300, PG400, PG500, PG600, PG700, PG800, PG900, PG1000, PG1100, PG1200, PG1300, PG1400, PG1500, PG1600, PG1700, PG1800, PG1900, PG2000, PG2100, PG2200, PG2300, PG2400, PG2500, PG1600, PG1700, PG1800, PG1900, PG2000, PG2100, PG2200, PG2300, PG2400, PG2500, PG2600, PG2700, PG2800, PG2900, 또는 PG3000이다. 한 특정 양태에서, PG는 PG400이다. 또 다른 특정 양태에서, PG는 PG2000이다.
일부 양태에서, 링커 조합은 (글리세롤)n, 및/또는 (HG)n을 포함하며, 여기서 n은 1 내지 50의 정수이고, 각각의 단위는 예를 들어 포스페이트 에스테르 링커, 포스포로티오에이트 에스테르 결합, 또는 이의 조합을 통해 연결된다.
II.G
.
3.a
.3. 지방족 (
알킬
) 링커
일부 양태에서, 링커 조합은 적어도 하나의 지방족 (알킬) 링커, 예를 들어, 프로필, 부틸, 헥실, 또는 C2-C12 알킬, 예컨대 C2-C10 알킬 또는 C2-C6 알킬을 포함한다.
일부 양태에서, 링커 조합은 알킬 사슬, 예를 들어 비치환된 알킬을 포함한다. 일부 양태에서, 링커 조합은 치환된 또는 비치환된 알케닐, 치환된 또는 비치환된 알키닐, 아릴알킬, 아릴알케닐, 아릴알키닐, 헤테로아릴알킬, 헤테로아릴알케닐, 헤테로아릴알키닐, 헤테로사이클릴알킬, 헤테로사이클릴알케닐, 헤테로사이클릴알키닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클릴, 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 알킬아릴알킬, 알킬아릴알케닐, 알킬아릴알키닐, 알케닐아릴알킬, 알케닐 레일 알케닐, 알케닐 아릴 알키닐, 알키닐 아릴 알킬, 알키닐 아릴 알케닐, 알키닐 아릴 알키닐, 알킬 헤테로아릴 알킬, 알킬 헤테로아릴 알킬, 알킬 헤테로아릴 알케닐, 알킬 헤테로아릴 알키닐, 알케닐 헤테로아릴 알킬, 알케닐 헤테로아릴 알케닐, 알케닐 헤테로아릴 알키닐, 알키닐 헤테로아릴알킬, 알키닐헤테로아릴알케닐, 알키닐헤테로아릴알키닐, 알킬헤테로사이클릴알킬, 알킬헤테로사이클릴알케닐, 알킬헤테로사이클릴알키닐, 알케닐헤테로사이클릴알킬, 알케닐헤테로사이클릴알케닐, 또는 알케닐헤테로사이클릴알키닐을 포함한다.
선택적으로 이러한 성분은 치환된다. 치환기는 알코올, 알콕시 (예컨대 메톡시, 에톡시, 및 프로폭시), 직쇄 또는 분지쇄 알킬 (예컨대 C1-C12 알킬), 아민, 아미노알킬 (예컨대 아미노 C1-C12 알킬), 포스포르아미다이트, 포스페이트, 포스포르아미데이트, 포스포로디티오에이트, 티오포스페이트, 하이드라자이드, 하이드라진, 할로겐, (예컨대 F, Cl, Br, 또는 I), 아미드, 알킬아미드 (예컨대 아미드 C1-C12 알킬), 카복실산, 카복실 에스테르, 카복실 무수물, 카복실산 할라이드, 에테르, 설포닐 할라이드, 이미데이트 에스테르, 이소시아네이트, 이소티오시아네이트, 할로포르메이트, 카보디이미드 부가물, 알데하이드, 케톤, 설프하이드릴, 할로아세틸, 알킬 할라이드, 알킬 설포네이트, C(=O)CH=CHC(=O) (말레이미드), 티오에테르, 시아노, 당 (예컨대 만노스, 갈락토스, 및 글루코스), α,β-불포화 카보닐, 알킬 머큐리얼, 또는 α,β-불포화 설폰을 포함한다.
지방족 링커의 예는 다음 구조를 포함한다:
n1은 1 내지 40(예를 들어, 2 내지 20 또는 2 내지 12)의 정수이고; n2는 1 내지 20(예를 들어, 1 내지 10 또는 1 내지 6)의 정수이고; n3 및 n4는 동일하거나 상이할 수 있으며 1 내지 20(예를 들어, 1 내지 10 또는 1 내지 6)의 정수이다.
일부 양태에서, 링커 조합은 (C3)n, (C4)n, (C5)n, (C6)n, (C7)n 또는 (C8)n, 또는 이의 조합을 포함하며, 여기서 n은 1 내지 50의 정수이고, 각 단위는 예를 들어 포스페이트 에스테르 링커, 포스포로티오에이트 에스테르 결합, 또는 이들의 조합을 통해 연결된다.
II.G.3.b. 절단성 링커
일부 양태에서, 링커 조합은 절단성 링커를 포함한다. 절단성 링커라는 용어는 파손되거나 절단될 수 있는 적어도 하나의 연결 또는 화학 결합을 포함하는 링커를 지칭한다. 절단은 예를 들어 뉴클레아제, 펩티다제, 프로테아제, 포스파타제, 옥시다제, 에스테라제 또는 환원효소에 의해, 또는 예를 들어 특정 물리화학적 조건, 예를 들어 산화환원 환경, pH, 반응성 산소 종의 존재 또는 특정 광 파장에 의해 매개될 수 있다.
일부 양태에서, 절단성 링커는 디뉴클레오티드 또는 트리뉴클레오티드 또는 테트라펩티드 링커, 디설파이드, 디셀레나이드, 이민, 베타-카복실 아미드, 티오케탈, val-cit 디펩티드, 글루탐산-발린-시트룰린 트리펩티드, 글리신-히스티딘-류신-글리신 테트라펩티드, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 양태에서, 절단성 링커는 발린-알라닌-p-아미노벤질카바메이트 또는 발린-시트룰린-p-아미노벤질카바메이트를 포함한다.
II.B.4. 구체적인 예 및 토폴로지
본 개시내용의 특정 양태에서, 링커 조합은 하기 식의 링커로 구성된다:
[알킬 링커]m-[PEG1]n-[PEG2]o
여기서 m, n 및 o는 0 또는 1이고, m, n 또는 o 중 적어도 하나는 0이 아니다. 이러한 식에 따른 예시적인 링커 조합은 C6-TEG-HEG, C6-HEG, C6-TEG, C6, TEG-HEG, TEG, C8-TEG-HEG, C8-HEG, C8-TEG, 및 C8이다.
일부 양태에서, 링커 조합은 하나 이상의 절단성 링커, 예를 들어 효소 절단성 링커 및 자기 희생 링커와 조합된 비절단성 링커(예를 들어, TEG 또는 HEG)를 포함한다.
특정 양태에서, 링커 조합은 하기 나타낸 바와 같은 링커 조합 TEG(비절단성 링커)-Val-Cit(절단성 링커)-pAB(자기 희생 링커)를 포함한다.
.
고정 모이어티 및 링커 조합의 특정 조합이 아래 표에 예시되어 있다.
본 개시내용에 유용한 특정 페이로드(예를 들어, ASO)는 아래에 예시되어 있다:
[콜레스테롤]-[TEG]-[HEG]-[ASO]
[콜레스테롤]-[SMal]-[Val-Cit]-[pAB]-[ASO]
[콜레스테롤]-[TEG]-[Val-Cit]-[C6]-[ASO]
[콜레스테롤]-[TEG]-[SS]-[C6]-[ASO]
여기서 [콜레스테롤]은 콜레스테롤 고정 모이어티이고, [TEG]는 TEG 비절단성 링커이고, [HEG]는 HEG 비절단성 링커이고, [SS]는 디설파이드 산화환원 절단성 링커이고, [C6]은 알킬 비절단성 링커이고, [SMal]은 S-말레이미드이고, [Val-Cit]는 발린-시트룰린 절단성 링커이고, 그리고 [pAB]는 pAB 자기 희생 링커이다. 일부 양태에서, 페이로드(예를 들어 ASO)는 상기에 제공된 예시적인 구조에 따른 구조를 가지며, 여기서 하나 이상의 성분은 예에서 묘사된 것과 동일한 부류의 성분으로 대체되었다. 예를 들어, [콜레스테롤] 고정 모이어티는 본원에 개시된 또 다른 고정 모이어티에 의해 치환될 수 있고, [TEG]는 본원에 개시된 또 다른 폴리머 비절단성 링커(예를 들어, HEG, PEG, PG)에 의해 치환될 수 있고, [Val-Cit ]는 또 다른 펩티다제 절단성 링커에 의해 치환될 수 있거나, [pAB]는 또 다른 자기 희생 링커에 의해 치환될 수 있다.
III. EV
일부 양태에서, 본 개시내용은 증가된 양의 관심 모이어티(예를 들어 페이로드, 예를 들어 안티센스 올리고뉴클레오티드)를 포함하도록 변형된 EV를 제공한다. 예를 들어, 본 개시내용의 다른 곳에서 추가로 기재된 바와 같이, 본원에 기재된 로딩 조건(예를 들어, 인용된 염 농도, 로딩 온도, 로딩 지속시간, 페이로드 공급물 농도, 및/또는 EV 공급물 농도)에서 페이로드(예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오티드)를 EV에 로딩하는 것은 EV 내의 페이로드의 로딩을 증가시킬 수 있다. 따라서, 일부 양태에서, 본원에 기재된 EV는 페이로드를 포함하고, EV의 외부 표면과 회합된 페이로드의 양(예를 들어, 페이로드 농도)은 기준 EV(예를 들어, 본원에 기재된 로딩 방법을 사용하여 변형되지 않은 EV)와 비교하여 적어도 약 1배, 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 6배, 적어도 약 7배, 적어도 약 8배, 적어도 약 9배, 적어도 약 10배, 적어도 약 15배, 적어도 약 20배, 적어도 약 25배, 적어도 약 30배, 적어도 약 35배, 적어도 약 40배, 적어도 약 45배, 또는 적어도 약 50배 이상까지 증가된다.
일부 양태에서, 본 개시내용의 EV는 EV 외부 표면 상의 페이로드를 포함하며, 여기서 EV 외부 표면 상의 페이로드의 수는 적어도 약 1,000, 적어도 약 2,000, 적어도 약 3,000, 적어도 약 4,000, 적어도 약 5,000, 적어도 약 6,000, 적어도 약 7,000, 적어도 약 8,000, 적어도 약 9,000, 적어도 약 10,000, 적어도 약 11,000, 적어도 약 12,000, 적어도 약 13,000, 적어도 약 14,000, 적어도 약 15,000, 적어도 약 16,000, 적어도 약 17,000, 적어도 약 18,000, 적어도 약 19,000, 적어도 약 20,000, 적어도 약 21,000, 적어도 약 22,000, 적어도 약 23,000, 적어도 약 24,000, 적어도 약 25,000, 적어도 약 30,000, 적어도 약 35,000, 적어도 약 40,000, 적어도 약 45,000, 또는 적어도 약 50,000이다. 일부 측면에서, EV 외부 표면 상의 페이로드 수는 약 5,000 내지 약 20,000, 약 6,000 내지 약 20,000, 약 7,000 내지 약 20,000, 약 8,000 내지 약 20,000, 약 9,000 내지 약 20,000, 약 10,000 내지 약 20,000, 약 5,000 내지 약 18,000, 약 6,000 내지 약 18,000, 약 7,000 내지 약 18,000, 약 8,000 내지 약 18,000, 약 9,000 내지 약 18,000, 약 10,000 내지 약 18,000, 약 5,000 내지 약 15,000, 약 6,000 내지 약 15,000, 약 7,000 내지 약 15,000, 약 8,000 내지 약 15,000, 약 9,000 내지 약 15,000, 또는 약 10,000 내지 약 15,000이다. 일부 양태에서, EV 외부 표면 상의 페이로드 수는 약 10,000 내지 약 15,000이다.
일부 양태에서, EV 외부 표면 상의 각 페이로드는 동일하다. 일부 양태에서, EV 외부 표면 상의 페이로드 중 하나 이상은 상이하다. 본원에 기재된 바와 같이, 일부 양태에서, 본 개시내용의 EV는 하나 이상의 추가 페이로드를 포함할 수 있다. 특정 양태에서, 하나 이상의 추가 페이로드는 EV의 내강(즉, 캡슐화됨)에 있을 수 있고, EV의 외부 표면과 회합되거나, EV의 내강 표면과 회합되거나, 이들의 조합일 수 있다.
본원에 기재된 바와 같이, 본 개시내용에 유용한 EV는 약 20 내지 300 nm의 직경을 가질 수 있다. 특정 양태에서, 본 개시내용의 EV는 약 20 내지 290 nm, 20 내지 280 nm, 20 내지 270 nm, 20 내지 260 nm, 20 내지 250 nm, 20 내지 240 nm, 20 내지 230 nm, 20 내지 220 nm, 20 내지 210 nm, 20 내지 200 nm, 20 내지 190 nm, 20 내지 180 nm, 20 내지 170 nm, 20 내지 160 nm, 20 내지 150 nm, 20 내지 140 nm, 20 내지 130 nm, 20 내지 120 nm, 20 내지 110 nm, 20 내지 100 nm, 20 내지 90 nm, 20 내지 80 nm, 20 내지 70 nm, 20 내지 60 nm, 20 내지 50 nm, 20 내지 40 nm, 20 내지 30 nm, 30 내지 300 nm, 30 내지 290 nm, 30 내지 280 nm, 30 내지 270 nm, 30 내지 260 nm, 30 내지 250 nm, 30 내지 240 nm, 30 내지 230 nm, 30 내지 220 nm, 30 내지 210 nm, 30 내지 200 nm, 30 내지 190 nm, 30 내지 180 nm, 30 내지 170 nm, 30 내지 160 nm, 30 내지 150 nm, 30 내지 140 nm, 30 내지 130 nm, 30 내지 120 nm, 30 내지 110 nm, 30 내지 100 nm, 30 내지 90 nm, 30 내지 80 nm, 30 내지 70 nm, 30 내지 60 nm, 30 내지 50 nm, 30 내지 40 nm, 40 내지 300 nm, 40 내지 290 nm, 40 내지 280 nm, 40 내지 270 nm, 40 내지 260 nm, 40 내지 250 nm, 40 내지 240 nm, 40 내지 230 nm, 40 내지 220 nm, 40 내지 210 nm, 40 내지 200 nm, 40 내지 190 nm, 40 내지 180 nm, 40 내지 170 nm, 40 내지 160 nm, 40 내지 150 nm, 40 내지 140 nm, 40 내지 130 nm, 40 내지 120 nm, 40 내지 110 nm, 40 내지 100 nm, 40 내지 90 nm, 40 내지 80 nm, 40 내지 70 nm, 40 내지 60 nm, 40 내지 50 nm, 50 내지 300 nm, 50 내지 290 nm, 50 내지 280 nm, 50 내지 270 nm, 50 내지 260 nm, 50 내지 250 nm, 50 내지 240 nm, 50 내지 230 nm, 50 내지 220 nm, 50 내지 210 nm, 50 내지 200 nm, 50 내지 190 nm, 50 내지 180 nm, 50 내지 170 nm, 50 내지 160 nm, 50 내지 150 nm, 50 내지 140 nm, 50 내지 130 nm, 50 내지 120 nm, 50 내지 110 nm, 50 내지 100 nm, 50 내지 90 nm, 50 내지 80 nm, 50 내지 70 nm, 50 내지 60 nm, 60 내지 300 nm, 60 내지 290 nm, 60 내지 280 nm, 60 내지 270 nm, 60 내지 260 nm, 60 내지 250 nm, 60 내지 240 nm, 60 내지 230 nm, 60 내지 220 nm, 60 내지 210 nm, 60 내지 200 nm, 60 내지 190 nm, 60 내지 180 nm, 60 내지 170 nm, 60 내지 160 nm, 60 내지 150 nm, 60 내지 140 nm, 60 내지 130 nm, 60 내지 120 nm, 60 내지 110 nm, 60 내지 100 nm, 60 내지 90 nm, 60 내지 80 nm, 60 내지 70 nm, 70 내지 300 nm, 70 내지 290 nm, 70 내지 280 nm, 70 내지 270 nm, 70 내지 260 nm, 70 내지 250 nm, 70 내지 240 nm, 70 내지 230 nm, 70 내지 220 nm, 70 내지 210 nm, 70 내지 200 nm, 70 내지 190 nm, 70 내지 180 nm, 70 내지 170 nm, 70 내지 160 nm, 70 내지 150 nm, 70 내지 140 nm, 70 내지 130 nm, 70 내지 120 nm, 70 내지 110 nm, 70 내지 100 nm, 70 내지 90 nm, 70 내지 80 nm, 80 내지 300 nm, 80 내지 290 nm, 80 내지 280 nm, 80 내지 270 nm, 80 내지 260 nm, 80 내지 250 nm, 80 내지 240 nm, 80 내지 230 nm, 80 내지 220 nm, 80 내지 210 nm, 80 내지 200 nm, 80 내지 190 nm, 80 내지 180 nm, 80 내지 170 nm, 80 내지 160 nm, 80 내지 150 nm, 80 내지 140 nm, 80 내지 130 nm, 80 내지 120 nm, 80 내지 110 nm, 80 내지 100 nm, 80 내지 90 nm, 90 내지 300 nm, 90 내지 290 nm, 90 내지 280 nm, 90 내지 270 nm, 90 내지 260 nm, 90 내지 250 nm, 90 내지 240 nm, 90 내지 230 nm, 90 내지 220 nm, 90 내지 210 nm, 90 내지 200 nm, 90 내지 190 nm, 90 내지 180 nm, 90 내지 170 nm, 90 내지 160 nm, 90 내지 150 nm, 90 내지 140 nm, 90 내지 130 nm, 90 내지 120 nm, 90 내지 110 nm, 90 내지 100 nm, 100 내지 300 nm, 110 내지 290 nm, 120 내지 280 nm, 130 내지 270 nm, 140 내지 260 nm, 150 내지 250 nm, 160 내지 240 nm, 170 내지 230 nm, 180 내지 220 nm, 또는 190 내지 210 nm의 직경을 갖는다. 본원에 기재된 EV의 크기는 당업계에 공지된 방법에 따라 측정될 수 있다.
일부 측면에서, 본원에 기술된 EV는 내부(내강) 표면과 외부 표면을 포함하는 이중 지질막을 포함한다. 특정 양태에서, 내부(내강) 표면은 EV의 내부 코어(즉, 내강)을 향한다. 특정 양태에서, 외부 표면(exterior surface)(본원에서 "외부 표면(external surface)"으로도 지칭됨)은 생산자 세포 또는 표적 세포의 엔도좀, 다소포체, 막/세포질과 접촉할 수 있다.
일부 양태에서, EV 막은 지질과 지방산을 포함한다. 일부 양태에서, EV 막은 인지질, 당지질, 지방산, 스핑고지질, 포스포글리세리드, 스테롤, 콜레스테롤 및 포스파티딜세린을 포함한다.
일부 양태에서, EV 막은 내부 소엽 및 외부 소엽을 포함한다. 내부 및 외부 소엽의 조성은 당업계에 공지된 이중층 분포 검정에 의해 결정될 수 있다(예를 들어, Kuypers 등, Biohim Biophys Acta 819:170 (1985) 참조). 일부 양태에서, 외부 소엽의 조성은 대략 70 내지 90% 콜린 인지질, 대략 0 내지 15% 산성 인지질, 및 대략 5 내지 30% 포스파티딜에탄올아민이다. 일부 양태에서, 내부 소엽의 조성은 대략 15 내지 40% 콜린 인지질, 대략 10 내지 50% 산성 인지질, 및 대략 30 내지 60% 포스파티딜에탄올아민이다.
일부 양태에서, EV 막은 글리칸과 같은 하나 이상의 다당류를 포함한다. EV 표면의 글리칸은 말레이미드 모이어티 또는 글리칸과 말레이미드 모이어티를 연결하는 링커에 대한 부착 역할을 할 수 있다. 글리칸은 EV 표면 상의 하나 이상의 단백질, 예를 들어 PTGFRN 폴리펩티드 또는 EV의 지질막에 존재할 수 있다.
III.A
. EV
막관통
단백질
일부 양태에서, 본 개시내용에 유용한 EV는 하나 이상의 EV 막관통 단백질(본원에서는 "엑소좀 단백질" 또는 "EV 단백질"이라고도 함)을 포함한다.
특정 양태에서, 하나 이상의 막관통 단백질은 (형질감염에 의해) EV에 도입된다. 일부 양태에서, 하나 이상의 막관통 단백질은 양이온성 지질 및 중합체와 같은 합성 거대분자를 사용하여 EV에 도입될 수 있다(Papapetrou 등, Gene Therapy 12: S118-S130(2005)). 특정 양태에서, 인산칼슘, 사이클로덱스트린 또는 폴리브렌과 같은 화학물질을 사용하여 EV에 하나 이상의 막관통 단백질을 도입할 수 있다.
일부 양태에서, 하나 이상의 막관통 단백질은 CD47, CD55, CD49, CD40, CD133, CD59, 글리피칸-1, CD9, CD63, CD81, 인테그린, 셀렉틴, 렉틴, 카드헤린, 당업자에게 공지된 기타 유사한 폴리펩티드, 또는 이의 임의의 조합일 수 있다.
일부 양태에서, 하나 이상의 막관통 단백질은 생산자 세포에서 막관통 단백질을 재조합적으로 발현함으로써 EV의 막에서 발현된다. 생산자 세포로부터 얻은 EV는 말레이미드 모이어티 또는 링커에 접합되도록 추가로 변형될 수 있다.
막관통 단백질의 예는 PTGFRN, BSG, IGSF2, IGSF3, IGSF8, ITGB1, ITGA4, SLC3A2, ATP 수송체, 또는 단편 또는 그의 변이체)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 양태에서, 막관통 단백질은 CD9, CD63, CD81, PDGFR, GPI 앵커 단백질, 락타드헤린, LAMP2, 또는 LAMP2B, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 본 개시내용과 함께 사용될 수 있는 다른 막관통 단백질의 비-제한적인 예는 다음을 포함한다: 아미노펩티다제 N (CD13); 네프릴라이신, AKA 막 메탈로엔도펩티다제 (MME); 엑토뉴클레오티드 파이로포스파타제/포스포디에스테라제 계열 구성원 1 (ENPP1); 뉴로필린-1 (NRP1); 또는 이의 임의의 조합.
일부 양태에서, 막관통 단백질의 추가 예는 2019년 2월 5일에 발행된 미국 특허 제10,195,290호, 2020년 2월 18일에 발행된 미국 특허 제10,561,740호, 및 2018년 8월 24일에 출원된 국제 출원 번호 PCT/US2018/048026(공개 Wo 2019/040920A1)에서 찾아볼 수 있고, 이는 그 전체 내용이 참조로 본원에 포함된다.
일부 양태에서, 본 개시내용의 EV는 천연 발생 EV의 공간과 상이한 내부 공간(즉, 내강)을 포함한다. 예를 들어, EV는 EV의 내강 표면의 조성이 천연 발생 EV와 다른 단백질, 지질 또는 글리칸 함량을 갖도록 변경될 수 있다.
일부 양태에서, 조작된 EV는 하나 이상의 엑소좀 단백질을 인코딩하는 외인성 서열, 또는 엑소좀의 내강 표면의 조성 또는 함량을 변화시키는 엑소좀 단백질의 변형 또는 단편으로 형질전환된 세포로부터 생산될 수 있다. EV의 내강 표면에서 발현될 수 있는 EV 단백질의 다양한 변형 또는 단편이 본 개시내용의 양태를 위해 사용될 수 있다.
일부 양태에서, EV의 내강 표면을 변화시킬 수 있는 EV 단백질은 MARCKS 단백질, MARCKSL1 단백질, BASP1 단백질, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 일부 양태에서, 엑소좀 단백질은 뇌산(Brain Acid) 가용성 단백질 1(BASP1 단백질)을 포함한다. BASP1 단백질은 22 kDa 신경 조직이 풍부한 산성 단백질 또는 신경 축삭 막 단백질 NAP-22로도 알려져 있다. 전체 길이의 인간 BASP1 단백질 서열(이성질체 1)은 아래와 같다. 엑소좀 단백질의 비제한적인 예는 2018년 11월 16일에 출원된 국제 출원 번호 PCT/US2018/061679((공개 Wo 2019/099942A1)) 및 2019년 5월 22일에 출원된 PCT/US2019/033629(공개 Wo 2020/101740A1) 포함하지만 이에 제한되지 않고, 이는 전체 내용이 참고로 본원에 포함된다.
IV. EV 생산 방법
일부 양태에서, 본 개시내용에 유용한 EV를 생산하는 방법은 하나 이상의 관심 모이어티(예를 들어, EV 막관통 단백질)으로 생산자 세포를 변형시키는 것을 포함한다.
일부 양태에서, 생산자 세포는 포유동물 세포주, 식물 세포주, 곤충 세포주, 진균 세포주 또는 원핵 세포주일 수 있다. 특정 양태에서, 생산자 세포는 포유동물 세포주이다. 포유동물 세포주의 비제한적 예는 인간 배아 신장 (HEK) 세포주, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포주, HT-1080 세포주, HeLa 세포주, PERC-6 세포주, CEVEC 세포주, 섬유아세포주, 양수세포 세포주, 상피 세포주, 중간엽 줄기 세포 (MSC) 세포주, 및 그의 조합을 포함한다. 특정 양태에서, 포유동물 세포주는 HEK-293 세포, BJ 인간 포피 섬유아세포, fHDF 섬유아세포, AGE.HN® 뉴런 전구 세포, CAP® 양수세포 세포, 지방질 중간엽 줄기 세포, RPTEC/TERT1 세포, 또는 그의 조합을 포함한다 . 일부 양태에서, 생산자 세포는 일차 세포이다. 특정 양태에서, 일차 세포는 일차 포유동물 세포, 일차 식물 세포, 일차 곤충 세포, 일차 진균 세포, 또는 일차 원핵 세포일 수 있다.
일부 양태에서, 생산자 세포는 면역 세포, 예컨대 항원 제시 세포, T 세포, B 세포, 자연 살해 세포 (NK 세포), 대식세포, T 헬퍼 세포, 또는 조절 T 세포 (Treg 세포)가 아니다. 일부 양태에서, 생산자 세포는 항원 제시 세포(예를 들어, 수지상 세포, 대식세포, B 세포, 비만 세포, 호중구, 쿠퍼-브로비츠(Kupffer-Browicz) 세포, 또는 임의의 이러한 세포로부터 유래된 세포)가 아니다. 일부 양태에서, 생산자 세포는 자연적으로 존재하는 항원 제시 세포가 아니다(즉, 변형되었다). 일부 양태에서, 생산자 세포는 자연적으로 존재하는 수지상 세포, B 세포, 비만 세포, 대식세포, 호중구, Kupffer-Browicz 세포, 이들 세포 중 어느 것으로부터 유도된 세포, 또는 이의 임의의 조합이 아니다.
일부 양태에서, 하나 이상의 관심 모이어티(예를 들어, EV 막관통 단백질)은 당업자에게 공지된 생산자 세포 방법에 도입될 수 있다. 예를 들어, 전체 내용이 참조로 본원에 포함된 WO 2020/191369 A1을 참조한다.
IV.A. EV 단리
일부 양태에서, 본원에 개시된 EV를 생산하는 방법은 생산자 세포로부터 EV를 단리하는 것을 포함한다. 특정 양태에서, EV는 생산자 세포에 의해 세포 배양 배지로 방출된다. EV의 모든 공지된 단리 방식은 본원에서 사용하기에 적합한 것으로 간주된다. 예를 들어, 전하를 기준으로 한 분리(예를 들어, 전기 영동 분리), 크기(예를 들어, 여과, 분자 체질 등), 밀도(예를 들어, 일반 또는 구배 원심분리), Svedberg 상수(예를 들어, 외력이 있거나 없는 침강 등)를 포함하여 EV의 물리적 특성을 사용하여 매체 또는 기타 소스 물질로부터 EV를 분리할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 단리는 하나 이상의 생물학적 특성을 기반으로 할 수 있으며 표면 마커(예를 들어, 침전, 고상으로의 가역적 결합, FACS 분리, 특정 리간드 결합, 비특이적 리간드 결합, 친화성 정제 등)를 이용할 수 있는 방법을 포함한다.
단리 및 풍부화(enrichment)는 일반적으로 연속 원심분리를 포함하여 일반적이고 비선택적인 방식으로 수행할 수 있다. 대안적으로, EV 또는 생산자 세포 특이적 표면 마커를 사용하는 등 보다 구체적이고 선택적인 방식으로 단리 및 풍부화를 수행할 수 있다. 예를 들어, 특정 표면 마커는 면역침전, FACS 분류, 친화성 정제 및 비드 결합 리간드를 갖는 자성 분리에 사용될 수 있다.
일부 양태에서, 크기 배제 크로마토그래피를 활용하여 EV를 단리할 수 있다. 크기 배제 크로마토그래피 기술은 당업계에 공지되어 있다. 예시적이고 비제한적인 기술이 본원에 제공된다. 일부 양태에서 공동 부피 분율은 단리되어 관심 EV를 포함한다. 추가로, 일부 양태에서, EV는 당업계에 일반적으로 공지된 바와 같이 (하나 이상의 크로마토그래피 분획의) 원심분리 기술에 의한 크로마토그래피 분리 후에 추가로 단리될 수 있다. 일부 양태에서, 예를 들어, 밀도 구배 원심분리는 세포외 소포체를 추가로 단리하는 데 활용될 수 있다. 특정 양태에서는 생산자 세포 유래 EV를 다른 기원의 EV와 추가로 분리하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 생산자 세포 유래 EV는 생산자 세포에 특이적인 항원 항체를 사용한 면역흡착 포획에 의해 비생산자 세포 유래 EV와 분리될 수 있다.
일부 양태에서, EV의 단리는 차등 원심분리, 크기 기반 막 여과, 면역침강, FACS 분류 및 자성 분리를 포함하지만 이에 제한되지 않는 방법의 조합을 수반할 수 있다.
본원에 기재된 증가된 로딩 효율 외에도, 상이한 로딩 매개변수(예를 들어, 염 농도) 중 하나 이상을 조정하면 로딩 및 정제(예를 들어, 크로마토그래피 정제) 후 EV로부터 관심 모이어티(예를 들어, 페이로드, 예를 들어 ASO)의 해리를 크게 감소시킬 수 있다. 본원(예를 들어, 실시예 4 참조)에서 입증된 바와 같이, 정제 단계 동안 높은 염 농도(예를 들어, 약 100 mM 초과)를 유지하면, 낮은 염 농도(예를 들어 약 100 mM 미만)에서 로딩된 EV를 정제할 때 관찰되는 해리와 비교하여 EV로부터 관심 모이어티의 해리를 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 또는 약 100%까지 감소시킬 수 있다.
V. 치료적 용도
본원에 기재된 바와 같이, 본원에 기재된 EV는 광범위한 질환 및 장애를 치료하는 데 유용할 수 있는 다양한 관심 부분(예를 들어 페이로드, 예를 들어 안티센스 올리고뉴클레오티드)을 포함하도록 신속하게 조작될 수 있다. 따라서, 일부 양태에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 EV를 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 치료를 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 병태를 치료하는 방법을 제공한다.
일부 양태에서, 본 EV로 치료될 수 있는 질환 또는 장애는 암을 포함한다. 본 개시내용으로 치료될 수 있는 암의 비제한적 예는 결장직장암, 폐암 (예를 들어, 비-소세포 폐암 (NSCLC)), 췌장암 (예를 들어, 췌장 관상 선암종 (PDAC)), 백혈병, 자궁암, 난소암, 방광암, 담도암, 위암, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 양태에서, 암은 결장 선암종, 직장 선암종, 췌장 선암종, 췌장 관상 선암종 (PDAC), 난소 장액성 낭샘암종, 급성 골수성 백혈병, 고환 생식 세포 종양, 폐 선암종, 뇌 저급 신경교종, 다형상 교모세포종, 포도막 흑색종, 갑상선 암종, 자궁 체부 자궁내막암종, 자궁 암육종, 크롬친화세포종, 부신경절종, 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된다. 특정 양태에서, 암은 골수 풍부 암이다. 일부 양태에서, 암은 간암을 포함한다. 일부 양태에서, 암은 간세포암(HCC)을 포함한다. 일부 양태에서, 암은 췌장관 선암종(PDAC)을 포함하고, 일부 양태에서 암은 결장직장 암종(CRC)을 포함한다. 일부 양태에서, 암은 난소암을 포함한다. 일부 양태에서, 암은 연수막암을 포함한다.
암이 있는 대상체에게 투여될 때, 특정 양태에서, 본 개시내용의 EV는 면역 반응을 상향조절하고 대상체의 면역계의 종양 표적화를 향상시킬 수 있다. 일부 양태에서, 치료되는 암은 종양 미세환경으로의 백혈구(T-세포, B-세포, 대식세포, 수지상 세포, 단핵구)의 침윤, 또는 소위 "뜨거운 종양" 또는 "염증성 종양"을 특징으로 한다. 일부 양태에서, 치료되는 암은 종양 미세환경으로의 백혈구 침윤의 낮은 수준 또는 검출 불가능한 수준, 또는 소위 "차가운 종양" 또는 "비-염증성 종양"을 특징으로 한다. 일부 양태에서, EV는 "차가운 종양"을 "뜨거운 종양"으로 전환시키기에 충분한 양 및 시간 동안 투여되고, 즉, 상기 투여로 인해 백혈구(예를 들어, T -세포)를 종양 미세환경으로 침윤시킨다. 특정 양태에서, 암은 방광암, 자궁경부암, 신장 세포 암, 고환암, 결장직장암, 폐암, 두경부암, 및 난소암, 림프종, 간암, 교모세포종, 흑색종, 골수종, 백혈병, 췌장암, 또는 이의 조합을 포함한다. 다른 용어로 용어 "원위 종양" 또는 "원거리 종양"은 원래(또는 원발성) 종양으로부터 원거리 기관 또는 원거리 조직, 예를 들어 림프절로 퍼진 종양을 지칭한다. 일부 양태에서, 본 개시내용의 EV는 전이성 확산 후 종양을 치료한다.
일부 양태에서, EV는 대상체의 순환계에 정맥내로 투여된다. 일부 양태에서, EV는 적합한 액체에 주입되고 대상체의 정맥으로 투여된다.
일부 양태에서, EV는 대상체의 순환계에 동맥 내로 투여된다. 일부 양태에서, EV는 적합한 액체에 주입되고 대상체의 동맥으로 투여된다.
일부 양태에서, EV는 척수강내 투여에 의해 대상체에게 투여된다.
일부 양태에서, EV는 뇌척수액(CSF)에 도달하도록 척추관 또는 지주막하 공간으로의 주사를 통해 투여된다.
일부 양태에서, EV는 대상체의 하나 이상의 종양에 종양내로 투여된다.
일부 양태에서, EV는 비강내 투여에 의해 대상체에게 투여된다. 일부 양태에서, EV는 국소 투여 또는 전신 투여의 형태로 코를 통해 흡입될 수 있다. 특정 양태에서, EV는 비강 분무로 투여된다.
일부 양태에서, EV는 복강내 투여에 의해 대상체에게 투여된다. 일부 양태에서, EV는 적합한 액체에 주입되고 대상체의 복막으로 주입된다. 일부 양태에서, 복강내 투여는 EV의 림프관으로 분배를 초래한다. 일부 양태에서, 복강내 투여는 EV를 흉선, 비장 및/또는 골수로 분포시킨다. 일부 양태에서, 복강내 투여는 EV를 하나 이상의 림프절로 분배하는 결과를 초래한다. 일부 양태에서, 복강내 투여는 경부 림프절, 서혜 림프절, 종격동 림프절 또는 흉골 림프절 중 하나 이상으로의 EV의 분포를 초래한다. 일부 양태에서, 복강내 투여는 EV를 췌장으로 분포시킨다.
일부 양태에서, EV는 안구주위 투여에 의해 대상체에게 투여된다. 일부 양태에서, s는 안구주위 조직으로 주사된다. 안구주위 약물 투여 경로에는 결막하, 전방 테논낭하, 후방 테논낭하 및 안구뒤 투여 경로가 포함된다.
본 개시내용의 특정 양태는 치료를 필요로 하는 대상체에서 뇌종양을 치료하는 방법에 관한 것이다. 일부 양태에서, 방법은 대상체에게 본원에 기재된 EV의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함한다. 일부 양태에서, EV는 뇌종양을 치료하기 위해 CNS에 페이로드(예를 들어 ASO)의 표적 전달이 가능하다. 일부 양태에서, EV는 대상체의 면역 반응을 상향 조절하여 신경면역 장애에 대한 대상체의 면역 반응을 향상시킬 수 있다. 일부 양태에서, 조성물은 대상체에게 종양내 또는 척수강내로 투여된다.
또한 대상체에서 뇌종양의 전이를 예방하는 방법이 본원에 제공된다. 방법은 대상체에게 본원에 개시된 조성물의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하며, 여기서 조성물은 대상체의 한 위치에서 뇌종양이 대상체의 다른 위치에서 하나 이상의 종양의 성장을 촉진하는 것을 예방할 수 있다. 일부 양태에서, 조성물은 한 위치의 제1 종양에서 종양내로 또는 척수강내로 투여되고, 제1 종양에 투여된 조성물은 제2 위치에서 하나 이상의 종양의 전이를 예방한다.
VI. 약제학적 조성물 및 투여 방법
본 개시내용은 또한 대상체에게 투여하기에 적합한 본원에 기재된 EV를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 약제학적 조성물은 일반적으로 말레이미드 모이어티를 통해 복수의 EV에 공유결합된 생물학적 활성 분자를 포함하는 복수의 EV 및 약제학적으로 허용 가능한 부형제 또는 담체를 대상체에게 투여하기에 적합한 형태로 포함한다. 약제학적으로 허용 가능한 부형제 또는 담체는 투여되는 특정 조성물뿐만 아니라 조성물을 투여하는 데 사용되는 특정 방법에 의해 부분적으로 결정된다. 따라서, 복수의 EV를 포함하는 약제학적 조성물의 매우 다양한 적합한 제형이 존재한다. (예를 들어, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa. 18판 (1990)] 참조). 약제학적 조성물은 일반적으로 멸균되고 미국 식품의약국의 모든 GMP(Good Manufacturing Practice) 규정을 완전히 준수하여 제형화된다. 일부 양태에서, 약제학적 조성물은 예를 들어 본원에 기재된 EV에 공유결합으로 연결된 소분자와 같은 하나 이상의 화학적 화합물을 포함한다.
일부 양태에서, 약제학적 조성물은 하나 이상의 치료제 및 본원에 기재된 EV을 포함한다. 특정 양태에서, EV는 약제학적으로 허용 가능한 담체에서 하나 이상의 추가 치료제와 공동 투여된다. 일부 양태에서, EV를 포함하는 약제학적 조성물은 추가 치료제)의 투여 전에 투여된다. 일부 양태에서, EV를 포함하는 약제학적 조성물은 추가 치료제)의 투여 후에 투여된다. 추가 양태에서, EV를 포함하는 약제학적 조성물은 추가 치료제와 동시에 투여된다.
원하는 정도의 순도를 갖는 본 개시내용의 EV 및 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 대상체에게 투여하기에 적합한 형태로 포함하는 약제학적 조성물이 본원에서 제공된다. 약제학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 부형제는 투여되는 특정 조성물뿐만 아니라 조성물을 투여하는 데 사용되는 특정 방법에 의해 부분적으로 결정될 수 있다. 따라서, 복수의 세포외 소포를 포함하는 약제학적 조성물의 매우 다양한 적합한 제형이 있다. (예를 들어, 문헌Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa. 21판 (2005)] 참조). 약제학적 조성물은 일반적으로 멸균되고 미국 식품의약국의 모든 GMP(Good Manufacturing Practice) 규정을 완전히 준수하여 제형화된다.
일부 양태에서, 약제학적 조성물은 하나 이상의 치료제 및 본원에 기재된 EV을 포함한다. 특정 양태에서, EV는 약제학적으로 허용 가능한 담체에서 하나 이상의 추가 치료제와 공동 투여된다. 일부 양태에서, EV를 포함하는 약제학적 조성물은 추가 치료제)의 투여 전에 투여된다. 일부 양태에서, EV를 포함하는 약제학적 조성물은 추가 치료제)의 투여 후에 투여된다. 추가 양태에서, EV를 포함하는 약제학적 조성물은 추가 치료제와 동시에 투여된다.
허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용된 복용량 및 농도에서 수령체 (예를 들어, 동물 또는 인간)에게 무독성이며, 완충액, 예컨대, 포스페이트, 시트레이트, 및 다른 유기산; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함한 항산화제; 보존제 (예컨대, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드; 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 사이클로헥산올; 3-펜탈올; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10 개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 이뮤노글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 리신; 단당류, 이당류, 및 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린을 포함한 다른 탄수화물; 킬레이트화제, 예컨대 EDTA; 당, 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 카운터-이온, 예컨대 나트륨; 금속 착체 (예를 들어, Zn-단백질 착체); 및/또는 비-이온성 계면활성제 예컨대 TWEENTM, PLURONICSTM 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함한다.
담체 또는 희석제의 바람직한 예는 물, 식염수, 링거 용액, 덱스트로스 용액, 및 5% 인간 혈청 알부민을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 약제학적 활성 물질을 위한 이러한 매질 및 화합물의 용도는 당업계에 잘 알려져 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 화합물이 본원에 기재된 세포외 소포와 양립할 수 없는 경우를 제외하고, 조성물에서의 그의 사용이 고려된다. 보충 치료제가 또한 조성물에 혼입될 수 있다. 전형적으로, 약제학적 조성물은 의도된 투여 경로와 양립할 수 있도록 제형화된다. 본 개시내용의 EV은 비경구, 국부, 정맥내, 경구, 피하, 동맥내, 진피내, 경피, 직장, 두개내, 복강내, 비강내, 종양내, 근육내 경로에 의해 또는 흡입제로서 투여될 수 있다. 특정 양태에서, EV를 포함하는 약제학적 조성물은 예를 들어 주사에 의해 정맥내로 투여된다. EV는 선택적으로 EV가 의도하는 질환, 장애 또는 병태를 치료하는데 적어도 부분적으로 효과적인 다른 치료제와 함께 투여될 수 있다.
양태에서, 용액 또는 현탁액은 하기 성분을 포함할 수 있다: 멸균 희석제 예컨대 물, 식염수, 고정유, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 합성 용매; 항균 화합물 예컨대 벤질 알코올 또는 메틸 파라벤; 항산화제 예컨대 아스코르브산 또는 중아황산나트륨; 킬레이팅 화합물 예컨대 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA); 완충액 예컨대 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트, 및 염화나트륨 또는 덱스트로스와 같은 등장성 조정용 화합물. pH는 염산 또는 수산화나트륨과 같은 산 또는 염기로 조정할 수 있다. 제제는 유리 또는 플라스틱으로 만들어진 앰플, 일회용 주사기 또는 다중 용량 바이알에 봉입될 수 있다.
주사용으로 적합한 약제학적 조성물은 멸균 수용액(수용성인 경우) 또는 분산액 및 멸균 분말을 포함한다. 정맥내 투여를 위해, 적합한 담체는 생리 식염수, 정균수, Cremophor ELTM(BASF, Parsippany, N.J.) 또는 인산염 완충 식염수(PBS)를 포함한다. 조성물은 일반적으로 쉽게 주사할 수 있는 정도까지 멸균 및 유동적이다. 담체는 용매, 또는 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 적합한 이들의 혼합물을 함유한 분산 배지일 수도 있다. 적절한 유동성은 예를 들어 레시틴과 같은 코팅의 사용, 분산액의 경우 필요한 입자 크기의 유지 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물 작용의 예방은 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로살 등과 같은 다양한 항균 및 항진균 화합물에 의해 달성될 수 있다. 원하는 경우, 등장성 화합물, 예를 들어 당, 폴리알코올 예컨대 만니톨, 소르비톨, 및 염화나트륨을 조성물에 첨가할 수 있다. 주사가능한 조성물의 연장된 흡수는 흡수를 지연시키는 화합물, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 조성물에 포함함으로써 야기될 수 있다.
멸균 주사 가능한 용액은 필요에 따라 본 개시내용의 EV를 유효량으로 그리고 적절한 용매에 본원에 열거된 하나 이상의 성분 조합과 함께 혼입함으로써 제조될 수 있다. 일반적으로 분산액은 기본 분산 매질 및 원하는 기타 성분을 함유하는 멸균 비히클에 EV를 통합하여 제조된다. 멸균 주사가능 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 제조 방법은 사전 멸균 여과된 용액으로부터 활성 성분과 임의의 추가의 원하는 성분의 분말을 생성하는 진공 건조 및 냉동 건조이다. EV은 데포 주사 또는 EV의 지속 또는 박동성 방출을 허용하는 방식으로 제형화될 수 있는 임플란트 제제의 형태로 투여될 수 있다.
본 개시내용의 EV를 포함하는 조성물의 전신 투여는 또한 경점막 수단에 의한 것일 수 있다. 경점막 투여의 경우, 침투되는 장벽에 적합한 침투제가 제형에 사용된다. 이러한 침투제는 일반적으로 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 경점막 투여용 세제, 담즙산염 및 후시드산 유도체를 포함한다. 경점막 투여는 예를 들어 비강 스프레이를 사용하여 달성할 수 있다.
특정 양태에서, 본 개시내용의 EV를 포함하는 약제학적 조성물은 약제학적 조성물로부터 이익을 얻을 대상체에게 정맥내 투여된다. 특정 양태에서, 조성물은 예를 들어 림프내 주사 또는 결절내 주사(예를 들어, Senti 등, PNAS 105(46): 17908 (2008) 참조), 또는 근육내 주사, 피하 투여, 종양 내 주사, 흉선 또는 간에 직접 주사에 의해 림프계에 투여된다.
특정 양태에서, 본 개시내용의 EV를 포함하는 약제학적 조성물은 액체 현탁액으로 투여된다. 특정 양태에서, 약제학적 조성물은 투여 후 데포(depot)를 형성할 수 있는 제형으로 투여된다. 특정 바람직한 양태에서, 데포는 EV를 순환계로 천천히 방출하거나 데포 형태로 유지한다.
전형적으로, 약제학적으로 허용 가능한 조성물은 오염물이 없도록 고도로 정제되고, 생체적합성이며 독성이 없고, 대상체에게 투여하기에 적합하다. 물이 담체의 성분인 경우, 물은 고도로 정제되고 예를 들어 내독소와 같은 오염 물질이 없도록 처리된다.
약제학적으로 허용 가능한 담체는 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 소르비톨, 만니톨, 전분, 아카시아검, 인산칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 칼슘 실리케이트, 마이크로-결정성 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로오스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸하이드록시 벤조에이트, 프로필하이드록시 벤조에이트, 탈크, 스테아르산마그네슘, 및/또는 미네랄 오일일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 약제학적 조성물은 윤활제, 습윤제, 감미제, 풍미 증진제, 유화제, 현탁화제 및/또는 보존제를 추가로 포함할 수 있다.
본원에 기재된 약제학적 조성물은 본원에 기재된 EV 및 선택적으로 약제학적 활성 제제 또는 치료제를 포함한다. 치료제는 생물 제제, 소분자 제제 또는 핵산 제제일 수 있다.
본원에 기재된 EV를 포함하는 약제학적 조성물을 포함하는 복용 형태가 제공된다. 일부 양태에서, 복용 형태는 정맥내 주사를 위한 액체 현탁액으로 제형화된다. 일부 양태에서, 제형은 종양내 주사를 위한 액체 현탁액으로 제형화된다.
본 개시내용의 EV는 다른 약물과 동시에 사용될 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 EV는 호르몬 치료제, 화학요법제, 면역치료제, 세포 성장 인자 또는 세포 성장 인자 수용체의 작용을 억제하는 약제 등과 같은 약제와 함께 사용될 수 있다.
VII. 키트
본 개시내용은 또한 본 개시내용의 하나 이상의 EV 및 선택적으로 사용 지침을 포함하는 키트 또는 제조 제품을 제공한다. 일부 양태에서, 키트 또는 제조 제품은 본 개시내용의 적어도 하나의 EV를 포함하는 본원에 기재된 약제학적 조성물 및 사용 지침을 함유한다. 일부 양태에서, 키트 또는 제조 제품은 하나 이상의 용기에 본 개시내용의 적어도 하나의 EV 또는 EV를 포함하는 약제학적 조성물을 포함한다. 당업자는 본 개시내용의 EV, 본 개시내용의 EV를 포함하는 약제학적 조성물, 또는 그의 조합이 당업계에 잘 알려져 있는 확립된 키트 형식 중 하나로 쉽게 통합될 수 있음을 인식할 것이다.
일부 양태에서, 키트 또는 제조 제품은 EV, 하나 이상의 생물학적 활성 분자, 하나 이상의 생물학적 활성 분자를 EV에 공유 부착시키기 위한 시약, 또는 이들의 임의의 조합, 및 EV에 대한 하나 이상의 생물학적 활성 분자를 공유 부착시키기 위한 반응을 수행하기 위한 지침을 포함한다.
일부 양태에서, 키트는 생물학적 활성 분자를 EV에 접합시키기 위한 시약 및 접합을 수행하기 위한 지침을 포함한다.
본 개시내용의 실시는 달리 나타내지 않는 한 당업계의 기술 내에 있는 세포 생물학, 세포 배양, 분자 생물학, 트랜스제닉 생물학, 미생물학, 재조합 DNA 및 면역학의 통상적인 기술을 이용할 것이다. 이러한 기술은 문헌에 충분히 설명되어 있다. 예를 들어 문헌[Sambrook 등, ed. (1989) Molecular Cloning A Laboratory Manual (2판; Cold Spring Harbor Laboratory Press); Sambrook 등, ed. (1992) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Cold Springs Harbor Laboratory, NY); D. N. Glover ed., (1985) DNA Cloning, Volumes I and II; Gait, ed. (1984) Oligonucleotide Synthesis; Mullis 등 미국 특허 제4,683,195호; Hames and Higgins, eds. (1984) Nucleic Acid Hybridization; Hames and Higgins, eds. (1984) Transcription And Translation; Freshney (1987) Culture Of Animal Cells (Alan R. Liss, Inc.); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press) (1986); Perbal (1984) A Practical Guide To Molecular Cloning; the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Miller and Calos eds. (1987) Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells, (Cold Spring Harbor Laboratory); Wu 등, eds., Methods In Enzymology, Vols. 154 and 155; Mayer and Walker, eds. (1987) Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Academic Press, London); Weir 및 Blackwell, eds., (1986) Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV; Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1986);); Crooke, Antisense drug Technology: Principles, Strategies and Applications, 2판 CRC Press (2007) 및 Ausubel 등 (1989) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, Baltimore, Md.)] 참조.
상기 인용된 모든 참고문헌뿐만 아니라 본원에 인용된 모든 참고문헌은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
다음 실시예는 설명을 위해 제공되며 제한하지 않는다.
실시예
실시예 1 - EV 로딩에 대한 염 농도의 영향
페이로드 로딩 효율을 향상시키는 데 중요한 상이한 로딩 매개변수를 식별하기 시작하기 위해, ASO(예를 들어, 표적화 STAT6)를 상이한 NaCl (25 mM, 50 mM, 100 mM, 또는 150 mM) 및 수크로스 농도 (2.5%, 3.75%, 또는 5%)을 포함하는 로딩 완충액에서 EV와 혼합하였다. ASO와 EV를 37℃에서 24시간 동안 혼합하였다. 그 후, 혼합물을 상온으로 냉각시킨 후, 0.45 μm(PVDF) 여과를 사용하여 여과하였다. 여액을 샘플링하고 AEX-UHPLC(ASO 함량) 및 나노입자 추적 분석(NTA)(EV 함량)에 대해 테스트하여 크로마토그래피 크린업 전에 ASO 로딩 효율을 결정하였다. ASO 함량을 측정하기 위한 대체 방법의 비제한적인 예는 (1) Quant-iTTM RiboGreenTM RNA 시약(예를 들어, 용액 내 RNA 정량화를 위한 형광 염료), (2) 260 nm에서의 UV 흡광도를 포함한다. EV 함량을 결정하기 위한 대체 방법의 비제한적인 예는 (1) 동적 광산란의 강도 및 (2) 405 nm에서의 UV 흡광도를 포함한다. 예를 들어, 전체 내용이 참조로 본원에 포함된 WO 2019/246591 A1을 참조한다.
아래 표 3에 나타난 바와 같이, NaCl 농도가 증가하면 엑소좀 외부 표면에 ASO가 더 많이 로딩되는 결과를 가져왔다. 테스트한 상이한 NaCl 농도 중에서, 수크로스 농도에 관계없이 150 mM에서 가장 큰 ASO 로딩 효율이 관찰되었다. 이러한 결과는 로딩 완충액의 염 농도를 조절하는 것이 EV의 로딩 효율성을 향상시키는 데 유용할 수 있음을 시사한다.
실시예 2 - EV 로딩에 대한 시간과 온도의 영향
다음으로, 로딩 시간과 로딩 온도가 EV의 ASO 로딩에 미치는 영향을 특성화하기 위해, EV를 5℃, 22℃, 37℃에서 최대 48시간 동안 ASO와 혼합하였다. 이어서, 혼합물을 냉각시키고, 여과하고, 여과액을 실시예 1에 기재된 바와 같이 ASO 및 EV 함량에 대해 분석하였다.
도 1a에서 볼 수 있듯이, ASO와 EV가 5℃(다이아몬드)에서 혼합된 경우 로딩 시간은 영향을 미치지 않았다. 대조적으로, ASO와 EV가 22℃ 또는 37℃에서 혼합된 경우, 로딩 시간의 증가는 ASO 로딩 효율에 긍정적인 영향을 미쳤다(각각 도 1a의 정사각형 및 삼각형 기호 참조). 22℃에서는, 약 24시간부터 로딩 안정기(즉, EV의 ASO 농도가 더 이상 증가하지 않음)가 관찰되었다. 37℃에서는, 로딩 시간이 증가함에 따라 EV의 ASO 농도가 지속적으로 증가하였다.
위의 결과는 로딩 시간과 온도가 EV의 로딩 효율에 영향을 미칠 수 있음을 보여준다. 로딩 시간과 온도를 모두 증가시키면 결과는 더 강력한 EV(즉, 다량의의 로딩 페이로드를 포함함)를 생산할 수 있음을 시사한다.
실시예 3 - EV 로딩에 대한 염 농도, 로딩시간, EV 공급물 농도 및 페이로드 공급물 농도 조절의 영향
상이한 로딩 매개변수(예를 들어, 본원에 기재된 것)가 EV의 로딩 효율에 미치는 영향을 추가로 평가하기 위해, ASO와 EV를 다음 두 가지 로딩 조건 중 하나에서 혼합하였다: (i) 로딩 완충액: 20 mM PO4, 50 mM NaCl, 5.0% 수크로스, pH 7.2, 혼합 온도는 실온, 1시간 동안("로딩 조건 #1"); 및 (ii) 로딩 완충액: 20 mM PO4, 100mM NaCl, 2.5% 수크로스, pH 7.2, 혼합 온도는 실온, 24시간 동안("로딩 조건 #2"). 추가 변수로, EV와 ASO를 상이한 농도로 혼합물에 첨가하였다. 특히 EV를 1.4x1013, 1.0x1013, 또는 6.0x1012의 공급물 농도로 첨가하였다. ASO는 800 μM, 600 μM, 400 μM, 200 μM 또는 100 μM의 공급물 농도로 첨가되었다. 이후, 앞선 실시예와 같이 ASO 및 EV 함량을 측정하였다.
표 4 및 5(아래)에서 볼 수 있듯이, ASO 로딩 효율은 EV 공급물 농도 증가 및 ASO 농도 증가와 양의 상관 관계가 있다. 예를 들어, EV 공급물 농도와 ASO 농도가 모두 가장 높을 때(즉, 각각 1.4x1013 및 800 μM) 가장 높은 로딩 효율(즉, EV의 가장 높은 ASO 농도)이 관찰되었다. 두 로딩 조건 사이에서, 로딩 조건 #2에서 ASO와 EV를 혼합한 경우 ASO 로딩 효율이 약 4배 증가하였다.
상기 결과는 염 농도와 로딩 시간의 증가가 EV의 로딩 효율에 긍정적인 영향을 미친다는 것을 확인시켜 준다. 결과는 EV 공급물 농도와 ASO 공급물 농도 모두 로딩 효율에 영향을 미칠 수 있음을 추가로 입증한다.
실시예 4 - EV 효능에 대한 로딩 매개변수 분석
EV 로딩 효율에 대한 상이한 로딩 매개변수의 효과를 더 자세히 이해하기 위해, 2개의 상이한 항-STAT6 ASO가 페이로드로 사용되었다: 하나는 인간 STAT6("인간 ASO")을 표적으로 하고 다른 하나는 마우스 STAT6("마우스 ASO")을 표적으로 하였다. 마우스 ASO는 마우스 STAT6 전사체와 상보적인 서열을 함유하고, 인간 ASO는 인간 STAT6 전사체와 상보적이다. 마우스 및 인간 STAT6 전사체의 전체 길이가 다르다는 것은 당업자에게 명백할 것이다. 이전 실시예에서 제공된 방법과 유사하게, 마우스 및 인간 ASO를 150 mM 농도의 NaCl을 포함하는 로딩 완충액에서 EV와 독립적으로 혼합하였다. 마우스 ASO를 100 mM, 800 mM 또는 950 mM의 공급물 농도 중 하나로 첨가하였다. 이간 ASO를 100 mM, 800 mM 또는 1000 mM의 공급물 농도 중 하나로 첨가하였다. 추가 로딩 조건은 다음과 같았다: 1x1013 p/mL의 EV 공급물 농도에서 24시간 동안 37℃. 이후, 앞선 실시예와 같이 ASO 및 EV 함량을 측정하였다.
표 6에서 볼 수 있듯이, 이전 데이터(예를 들어 실시예 3 참조)와 일치하여 ASO 공급물 농도의 증가는 EV 기준으로 ASO의 더 큰 로딩을 초래하였다. 이는 마우스와 인간 ASO 모두에서 관찰되었으며, 이는 본원에 제공된 로딩 방법이 서열 길이가 다양한 ASO에 대한 로딩 효율을 증가시키는 데 사용될 수 있음을 나타낸다. 다른 표적을 표적으로 하고 상이한 지질 링커에 접합된 ASO에서도 유사한 결과(적어도 로딩 밀도에 관해서)가 관찰되었다. 예를 들어, 도 5에서 볼 수 있듯이, 본원에 제공된 로딩 방법을 사용하면 대조 로딩 조건과 비교하여 평균적으로 ASO 로딩의 10 내지 14배 증가가 관찰되었다.
다음으로, 생성된 EV의 효능을 확인하기 위해, 마우스 또는 인간 ASO가 로딩된 EV를 사용하여 간 세포에서 STAT6 발현을 녹다운하였다. 도 4에서 볼 수 있듯이, ASO의 전체 질량을 투여한 경우, STAT6 발현의 녹다운에 유의미한 차이가 없었으며, 이는 ASO의 증가된 로딩 밀도가 더 적은 수의 EV를 사용하여 동일한 치료 효과를 달성할 수 있음을 입증하였다.
상기 결과는 본원에 제공된 로딩 방법이 더 강력한 EV의 생성을 허용하고, 이를 통해 생산된 특정 배치의 EV가 더 많은 환자를 치료할 수 있음을 시사한다.
실시예 5 - 크로마토그래피 정제 후 EVS의 ASO 농도에 대한 로딩 온도, 나트륨 농도 및 수크로스 농도의 영향
본원에 기재된 상이한 로딩 매개변수가 정제 후 EV의 ASO 농도에 영향을 미치는지 이해하기 위해, 고 염 및 저 수크로스(150 mM NaCl 및 2.5% 수크로스) 또는 저 염 및 고 수크로스 (50 mM NaCl 및 5% 수크로스) 농도를 포함하는 로딩 완충액을 사용하여 EV와 ASO를 혼합하였다. 로딩 온도는 24℃(즉, 실온) 또는 37℃였다. EV를 1x1013 p/mL의 공급물 농도로 혼합물에 첨가하였다. ASO를 650 μM의 공급물 농도로 첨가하였다. 그 후, EV와 ASO의 혼합물을 여과하고, 로딩된 EV를 Capto Core 700 수지를 사용한 크로마토그래피로 크린업시켰다. RiboGreen 형광을 통해 EV 로딩 ASO 및 유리 ASO에 대해 통과액을 측정하였다.
표 7(아래)에서 볼 수 있듯이, EV와 ASO를 염 농도가 높은 로딩 완충액과 37℃ 로딩 온도에서 혼합했을 때 EV의 ASO 농도가 가장 높았다. 동일한 로딩 조건에서도 가장 적은 양의 자유 ASO가 관찰되었다. 낮은 염 농도 로딩 완충액를 사용하면, 테스트된 두 로딩 온도 모두에서 ASO가 로딩된 EV가 줄어들었고 통과액에서 더 많은 유리 ASO가 관찰되었다. 로딩 온도(37℃ 대 24℃)은 낮은 염 농도 로딩 완충액으로 관찰된 로딩 효율을 개선했지만, 37℃ 로딩 온도에서 높은 염 농도로 관찰된 것보다 여전히 낮았다.
상기 결과는 염 농도와 로딩 온도의 증가가 EV의 로딩 효율에 긍정적인 영향을 미친다는 것을 추가로 확인시켜 준다. 결과는 또한 Capto Core가 로딩 온도 및 염 농도와 관계없이 유리 ASO를 크린업할 수 있음을 보여주어 강력한 크린업 기능을 나타낸다.
실시예 6 - 크로마토그래피 정제 후 EVS로부터의 ASO 해리에 대한 상이한 로딩 매개변수의 영향
다음으로, 상이한 로딩 조건에서 ASO가 로딩된 EV에서 크로마토그래피 정제 후 ASO 해리를 평가하였다. 간략하게, EV와 ASO를 다음 두 로딩 완충액 중 하나를 사용하여 혼합하였다: (i) CEF(20 mM PO4, 50 mM NaCl, 5% 수크로스); 및 (ii) Hi(20 mM PO4, 150 mM NaCl, 2.5% 수크로스). EV와 ASO를 실온(약 24℃) 또는 37℃에서 하였다. 그 다음, ASO가 로딩된 EV를 Capto Core 700 수지를 사용한 크로마토그래피로 크린업시켰다. Capto Core 700으로 세정한 후 EV에서 해리되는 ASO에 대한 희석 인자, 희석제 및 희석 물질의 유지 시간의 영향을 평가하고 결과를 표 8에 나타낸다.
유리 백분율은 낮은 염 농도를 함유하는 로딩 완충액에 로딩되고 크린업된 물질을 희석할 때 더 많은 ASO가 EV에서 해리된다는 것을 나타낸다. 희석 인자가 증가함에 따라 해리는 더욱 극심해졌다. 그러나 로딩 완충액(150 mM NaCl)을 함유한 더 높은 염에서 물질을 희석할 때 ASO의 해리가 관찰되지 않았다. 희석된 크린업 물질을 실온에서 20시간 동안 방치한 경우, 희석제에 더 낮은 염 농도(50 mM)가 함유된 경우에만 추가 해리가 관찰되었다. 희석제를 함유한 더 높은 염의 경우, 희석된 물질을 실온에서 20시간 동안 유지했을 때 해리가 관찰되지 않았다. 이 데이터는 염 농도를 유지함으로써 로딩된 엑소좀의 안정성을 최적화할 수 있음을 나타낸다.
실시예 7 - ASO EV 로딩 공정의 스케일링(scaling)
상기 개시내용으로부터 명백한 바와 같이, 본원에 제공된 로딩 방법은 다양한 규모의 페이로드가 로딩된 EV를 생성하는 데 유용할 수 있다. 표 9(아래)는 실험실 규모, 비-GMP 및 GMP 생산을 위한 예시적인 로딩 매개변수를 제공한다.
***
요약 및 요약 섹션이 아닌 상세한 설명 섹션이 청구범위를 해석하는 데 사용되도록 의도된 것임을 이해해야 한다. 요약 및 요약 섹션은 발명자(들)가 고려한 본 개시내용의 하나 이상의 예시적인 양태을 설명할 수 있지만, 모든 예시적인 측면은 아니며, 따라서 본 개시내용과 첨부된 청구범위를 어떤 방식으로든 제한하려는 의도는 없다.
본 개시내용은 명시된 기능 및 그 관계의 구현을 설명하는 기능성 구성 요소의 도움으로 위에서 설명되었다. 이러한 기능성 구성 요소의 경계는 설명의 편의를 위해 본원에서 임의로 정의되었다. 명시된 기능과 그 관계가 적절하게 수행되는 한 대체 경계를 정의할 수 있다.
특정 양태에 대한 전술한 설명은 본 개시내용의 일반적인 개념을 벗어나지 않고 과도한 실험 없이 다른 사람들이 기술 내에서 지식을 적용함으로써 그러한 특정 양태을 다양한 적용에 대해 쉽게 수정 및/또는 적용할 수 있도록 본 개시내용의 일반적인 성격을 완전히 드러낼 것이다. 따라서, 그러한 적응 및 번형은 본원에 제시된 교시 및 지침에 기초하여 개시된 양태의 등가물의 의미 및 범위 내에 있도록 의도된다. 본원의 어법 또는 용어는 설명을 위한 것이지 제한을 위한 것이 아니므로, 본 명세서의 용어 또는 어법은 교시 및 안내에 비추어 당업자에 의해 해석되어야 한다는 것이 이해되어야 한다.
본 개시내용의 폭과 범위는 전술한 예시적인 양태 중 임의의 것에 의해 제한되어서는 안 되며, 다음의 청구범위 및 그 등가물에 따라서만 정의되어야 한다.
본 출원 전반에 걸쳐 인용될 수 있는 모든 인용 참고문헌(참고문헌, 특허, 특허 출원 및 웹사이트 포함)의 내용은 본원에 인용된 참고문헌과 마찬가지로 어떤 목적으로든 전체 내용이 참고문헌으로 명시적으로 포함되어 있다.
SEQUENCE LISTING
<110> Codiak BioSciences, Inc.
<120> METHODS OF LOADING EXTRACELLULAR VESICLES
<130> 4000.126PC02/C-K/DKC
<150> US 63/150,497
<151> 2021-02-17
<160> 112
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<400> 1
000
<210> 2
<211> 16010
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> STAT6 pre-mRNA transcript
<400> 2
agagctccag ggagggacct gggtagaagg agaagccgga aacagcgggc tggggcagcc 60
actgcttaca ctgaagaggg aggacgggag aggagtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt 120
gtgtatgtat gtgtgtgctt tatcttattt ttctttttgg tggtggtggt ggaagggggg 180
aggtgctagc agggccagcc ttgaactcgc tggacagagc tacagaccta tggggcctgg 240
aagtgcccgc tgagaaaggg agaagacagc agaggggttg ccgaggtgag gggttgcctc 300
cgaggtgggt gcgggggcct ctatgagtgc atgggggtgg attcgtgggg ggagctctcg 360
ggatcctccc ctggctgggt ggatggtccc caagagatgg tttcagctag tgttggtggc 420
tggtggcact gggttttagc agtttcgaac tcctggagga atctgggagg gtccaggcct 480
cagtactccc ctcccccatg ggtcacgttt tcacagcctc acccctgcac ccccagggcc 540
atggaaagtc agggaaagga ggtgaaggag tgcccctctg ccctgagtcg ggggaagtgg 600
ccgcccctcc ctggaaggtt gatgccagag ggcagtggat ccttgttaaa cccctatcct 660
gccctccact aaaggttcct gttcaagggt gtggctgggg cgtgagcaag ccccagatgt 720
agacctcatg gtggcccaga cgagggggaa tttccccctc aaaactgctc cacgcttggc 780
tgctgtagac gctgagattt cccagcggcg gcgccgagtt aaccctcctc gtgctgaact 840
ggctccacct ccccgcctgc ccccaccgcc acattcacgc attgggcaac tcagagaagc 900
tgttttaact ttcgatcctg tggtcccaca atcagaggac tcgggcagat aggggttgag 960
ataagcgagt ttaggccacc aagcgggcgg acgaggatcc cagaccttgc gcttcccttc 1020
tgagtttggg aggtaacact ggccccgccc ctcacgccgt ggctcctccc tcccttcccc 1080
ttcaaggggc tgaagacaaa aggtgcccct gtcctggtca agccaatcga cccagccttg 1140
ttatgggttg gggtggggag aaatgtgtcc tcctgatggc tggggaagaa gaggggttgg 1200
atatttctag ccagggccat gccaggaggc tggtcactct gcaaggggat gcagaggaaa 1260
gcggtgccca ctcactccag aggacctttc tctcttgggc tagagaaagg cctattggag 1320
gaacctgagc aggaggggta aggattctgc cttgaggaga aaagagctgg ggtaagtggg 1380
cactggagga aagaggggca tgaaggtctt ggagcagaaa cgtccagaga agggacctct 1440
ccattttcca tccctctgag aggcctggga gaggtgagag gctgaacgtg caacaggagg 1500
acttggggtt actgggtttg gggagacctg gggagttgtc atcccatcct ctccctcatc 1560
tctgggagag ggatattatg agaaacgtga actgagaggc ccctgggaaa ccactggtta 1620
cccagtcctc cctgaacctg gaaatgggga tgcaaccccc tcttctactt ccctgtcccc 1680
tcctctcctt tctacctgtt ttcgtctctc atctttgcct tctagccctc cagcttcctc 1740
tctcttctag gctctttcct cctagcttac taaacccgcc ttttttccag tctcttccat 1800
cctcttcctt agttctctct actttccttt tccacctctc ctccttcaag tctcctccca 1860
ccttccccca cttcttagga tgatcagatt tgcccctgga agggatccta acaacacagt 1920
gcgatggtta atccccactc agattcaaag cctgctttcc aaactcactt actgagtggc 1980
cttgggcaga gtagagaaac tccttaagcc tcagtttctt catctataaa atgggatatt 2040
atatatttta aaaagtgtcg tgaggcctga aggagataat acactgagtg taatgcctca 2100
tacacagtaa gtgcttaaca aatagtagct gttattactc tcccatcctc ttcatcatct 2160
agccttgtgg ttttcatttt tattttattt catttattta tttatttatt ttgaggcaga 2220
gtctctctct gtcgcccagg ctggagtgca gtggctcgat ctctgctcac tgcaagctcc 2280
gccccccagg ttcacgccat tctgtcacct cagcctcccc agtagctggg actacaggcg 2340
ctcgccacca cgccctgcta attttgtttt tgtattttta gtagagatgg ggtttcactg 2400
tgttagccag gatggtcttg atctcctgac ctcgtgatct gcccgcctcg gcctcccaaa 2460
gcgctgggat tacaggcatg agccactgcg cctggccgag ccttgtggtt ttcaaattat 2520
ctcatggagt cctagaattt tgagaggttt gtctagggat gcctttggcg tcaggaggtg 2580
gggagaggga agtagaagca gtcgagtttc aggctttcca tgcttgcttt caacagggca 2640
tcttcggttt cgtacctttt atgtaattga gattccacag attaaaagct gacattgcct 2700
accgctttaa aaagtttgga aagttttcca ctcatctaac actcatattt tatagatgag 2760
aagatcgaag cccacaaagg gaaggctctt tgcccacaga accagagcca ggtctagagc 2820
tgcaactaaa tcctctgcca ctctaagaga gctctcgctc tactgccctg tctccctttg 2880
cctccccatc cctctggcta cagctcagct cttcccaccc ctgtgtctat cactgaagga 2940
gttaccccca tctcaggcat tgactcagga tgcccctggt ttaaggtggt ctggccatga 3000
gtggtggtgg ggacggtccc taggagggct atctatggga ggtccctggc tgccccagga 3060
gataggccaa gtttcttggg cacccctcag agtggcctta tttttctcct ccaggcaacc 3120
tccaagtccc agatcatgtc tctgtggggt ctggtctcca agatgccccc agaaaaagtg 3180
cagcggctct atgtcgactt tccccaacac ctgcggcatc ttctgggtga ctggctggag 3240
agccagccct ggtgagtcct ggctgctccc tgctggtccc ccaagtcttc cctaactcat 3300
cttccttctc cttagatttt tctcccctca cccatggatt cagaacttga gacctgttat 3360
tccatgtgta gtgacctaga tttagcaggg agtctgtgcc ccatcaagac caggctatga 3420
atgttgacag atggagaccc catctcttag gaggctgagc cgaagaggag gggggtttgg 3480
gctgggacaa aggcacttct cataacagct agaagactgg gaaacaaggc gcatgggtga 3540
aagctacaga gggcctagat ggagaataag gagcgagaaa ggaactgctg agcttttggc 3600
tgtggggtaa agggtcagga gagctgagga agccctggcc tgaggtagcc tcatcctgat 3660
cttcctgcag ggagttcctg gtcggctccg acgccttctg ctgcaacttg gctagtgccc 3720
tactttcaga cactgtccag caccttcagg cctcggtggg agagcagggg gaggggagca 3780
ccatcttgca acacatcagc acccttgagg tggggcagga ggggagggga caaggctggg 3840
tggggctgag gttgaactgg gttgagcatt gggccctgga agaaaattgg ttggatgctg 3900
gaagcaaatt ggtgttcctg tggttaactg ctagctagca ggcaaattag attttaaaag 3960
catgcaaatg cacaaaaact tctggagtct acagttgtgc ttccttatag tatatgtgtg 4020
aatgcaggcc tggggattgg agggattgaa ggacatgggt aagagcaaag ctcactgttt 4080
accaccctca tttctgtaga gcatatatca gagggacccc ctgaagctgg tggccacttt 4140
cagacaaata cttcaaggag agaaaaaagc tgttatggaa caggtattgt gatattccac 4200
ctcccacccc aactcaatcc cctgagactt tggcctgagc catgacaaac tagaaagaat 4260
ttgaacctca gtaaaggctc agtgttctag gcccaggaat gaccaaagga ggttcctagg 4320
gtcagagtga accccaagtc aagctcaggg aatctttcta tgagggactg aaggtaagag 4380
gccggggaga acagagcaag ggataaggag ctgattctgc taggagcaag gtcttatctc 4440
cacgatattc caaaaggtca ggaagaactg ccaaagggga gaggggaaca agaaaacgct 4500
atctgcagag cagagagtgg aggccaggta tagagggatg agcagagtgt ttcacttctt 4560
ggcatctgtc cttcctgtgt agttccgcca cttgccaatg cctttccact ggaagcagga 4620
agaactcaag tttaagacag gcttgcggag gctgcagcac cgagtagggg agatccacct 4680
tctccgagaa gccctgcaga agggggctga ggctggccaa ggtgggggcc agggtggttc 4740
tggggagtgt gtaggagtgg ttgcctcttg gatctcaacc ttatctgaac ctctaatctg 4800
tctgcaccct tgatttctgc ccccaaccct cagtgtctct gcacagcttg atagaaactc 4860
ctgctaatgg gactgggcca agtgaggtga gtaatgggct gacaggtgga gaccttggtc 4920
aaagtgcagc tggagggatg gaagctagac ctcagaaaga cacaggctga agtagggcaa 4980
gggaatgcca gaggagtgag aaaaagagcc gtatcccagg agctgggtgt ggaggcagcg 5040
tgaggccctg gctcaggccc ctctctgccc ataggccctg gccatgctac tgcaggagac 5100
cactggagag ctagaggcag ccaaagccct agtgctgaag aggatccaga tttggaaacg 5160
gcagcagcag ctggcaggga atggcgcacc gtttgaggag agcctggccc cactccagga 5220
gaggttgggc tagggctgat ggggaagagg gggcaagctg ggggtgggca gctgaccctg 5280
ctgaaggccc tacaggtgag agaaagaagc caggcgggag ggccttggag tggaccaaga 5340
tgcataaaag ccagttccag cggggctgtg cacactgtcg ttcaggtcgc atcctgtaca 5400
agtgggccta gtggaggggc acaagcgggg actcatccaa cccaggcttc tctcctcaag 5460
ccccatgcct agaggaatag gagggctttt ccatttggtt tattgggtgg gaacactttc 5520
caatttgcca caaagcactg taagtggtgg cagttgtcct gggtgcaaga gccgtcgggg 5580
gagaggcagc tgggtttcca cagggggtgt aggcactgag aatgaacctc ccacccagac 5640
cctaggccaa cagatcacag aacccccttc agcccaggtg ccttgcagcc acacccacta 5700
cccaccccac ttctccacac atgatagcct ttctccctgg gtatagggga agggggtctg 5760
ggccggagca agcagcctta atcctgtgcc ccctgaccac tgtcctggcc ccaggtgtga 5820
aagcctggtg gacatttatt cccagctaca gcaggaggta ggggcggctg gtggggagct 5880
tgagcccaag acccgggcat cgctgactgg ccggctggat gaagtcctga gaaccctcgt 5940
caccaggtat tccccgggag ctcccagtct ggcctagaac agacctcggg aagaaaagaa 6000
gggggctaga gctgtgggga gggcaccagc agggacctag cccccaactc cccttgtgtc 6060
ctcctcactc ccagttgctt cctggtggag aagcagcccc cccaggtact gaagactcag 6120
accaagttcc aggctggagt tcgattcctg ttgggcttga ggttcctggg ggccccagcc 6180
aagcctccgc tggtcagggc cgacatggtg acagagaagc aggcgcggga gctgagtgtg 6240
cctcagggtc ctggggctgg agcgtaagct gggattggac ctggggttgg agaagggctg 6300
ttagggtgat ggaggcagcc tggagggctg gcactgaaaa gagcaaggga tggggaggga 6360
gggccatggg atgtggagac cctgaatggt caaggcagag gaaagggagg gacccattta 6420
gggctggaat ggggtggggg catcatgatt tggccaagat ggggactcct cccttaagaa 6480
cccaaacaga gacatggaga tttagggctg gtgacagtgg gtagtctaca ctcacccatg 6540
cactcgccac acctgacgac agtgagatga gctcgttcac actctgacct cccctggcag 6600
agaaagcact ggagaaatca tcaacaacac tgtgcccttg gagaacagca ttcctgggaa 6660
ctgctgctct gccctgttca agaacctggt gaggggcttt ggggtgcagt gaggggggca 6720
ccactaggag actgtgggac tctccttgga gaggatgtca ggaagcccag gaggagcggt 6780
ctctgtcctc atgacctcgc ccttgctctc cctcacccca cccacagctt ctcaagaaga 6840
tcaagcggtg tgagcggaag ggcactgagt ctgtcacaga ggagaagtgc gctgtgctct 6900
tctctgccag cttcacactt ggccccggca aactccccat ccagctccag gtgaaccgtg 6960
gcccagccct gccccaatct gggaccccga gtcctcctcc aatgccacac acaagggccc 7020
tggaccctca cctcttgtga ctgccccata ccccatgtgt ctgggattca tgcacactgg 7080
ggcccgggtg agtgggggtg agcaagagca tggagtgcac agggcaggga atggtagtgg 7140
atagcagcaa acacttcgga agcacttcct atagaccagg gcactctatt aaatgataca 7200
tacgcacatg cgtgccagca cacacacgtc tggttttcac aataacatta tgaggtaggc 7260
agtattatca gcctcatttt atagataagg acattgagac agagagttta agtagtttgt 7320
cccagtcaca cagctaagtg ttggagctgg tatttgaaac ctggaggtct ggttccatag 7380
cgatgactaa taaccacttc tctacggtga ggccctgatt gagcttcaga acgcatttaa 7440
taacatggca tgagcttttt gattatgatg tgtgagtcca ataacttctc tgagtgctca 7500
gagccagtcc cctgaggaaa cttcttgctt cactaagaaa cccctgtccg gctgggcatg 7560
gtggctcaag cctgtaatcc cagcactttg ggaggccgag gtgggtagat cacaaggtca 7620
ggagttcaag accagcctgg ccaatatggt gaaaccccgt ctccactaaa aatacaaaaa 7680
ttagctgggc gtggtggtgc aggcctgtag tcccagctgc tcgggaggct aagcaggaga 7740
atcgcttgaa cccaggaggc ggaggttgca gtgagccaag attgcgccac tgcccttcag 7800
cctgggcgac agagcaagac tatgtctcaa aaacaaaaca aaacaactca gcactttggg 7860
aggccaaggt aggaggatcg cttgagcctg caagtttaag accagcctgg gctacatagg 7920
gagatccaat ctctacaaaa aataaaaaat tggccgggca tggtggctca cgcctgtaat 7980
cccagcactt tgggaggcca aggcgggcgg atcatgaggt caggaaatcg agaccatcct 8040
ggctaacacg gtgaaacctc gtatctacta aaaatacaaa aaattagcca ggcatggtgg 8100
cgggcgcctg agtcccagct actcgggagg ctgaagcagg agaatggcgt gaacctggga 8160
gggagagctt gcagtgagcc aagatcgcgc cactgcactc cagcctgagt gacagagcga 8220
gactctgtct caaaaataaa taaataaata attagctgga ttaggtggta catttctgta 8280
gttccagcta ttcaggaggc tgaggtggaa ggatcacttg agccctgaag gctgaggctg 8340
cagtgagctg agattgcact actgcactcc agcctgggca acagagtgag atactatcta 8400
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaagg aaagaaagaa 8460
agaaaagaaa cccctgtcct caccctcttc aggccctgtc tctgcccctg gtggtcatcg 8520
tccatggcaa ccaagacaac aatgccaaag ccactatcct gtgggacaat gccttctctg 8580
agatggtgag gaaagtcctg gagttggagg gaacaggggc agggtgggtt ctaacatggg 8640
cagtggtgca ggcctgctga tggggtggtg ggcatgttta aatgggtgtg accttaacac 8700
tttctcatgg gcctgctttc gtgcttctga cctcttttca ccccagtctt aacaactatc 8760
aggccacagc actgtaacct agaaaaaaca gcatgtttgt gagcgatatc aggggctgtg 8820
gaggggtagg ccacaggcag gtgggaggga tgaaggccgg cccgaggaat aacaagacgg 8880
tagcctgcag tgctctcttc ttcccccttc tccccaggac cgcgtgccct ttgtggtggc 8940
tgagcgggtg ccctgggaga agatgtgtga aactctgaac ctgaagttca tggctgaggt 9000
ggggaccaac cgggggctgc tcccagagca cttcctcttc ctggcccaga agatcttcaa 9060
tgacaacagc ctcagtatgg aggccttcca gcaccgttct gtgtcctggt cgcagttcaa 9120
caaggtcatt ctcctgccct ttggacctcc cacccccaag ctcttcatcc ctggggcact 9180
cagggcctgc tcagcctcca tgcagggacc ttccactgga ttctccacag tgccccctca 9240
ggtcctttag gaaggcctgt catggaccag ggaggaaaaa ccccaggcct gggggttggc 9300
tctggagatg cgttctctga catccctgag gttttggtct gggggccatc tgtccttcct 9360
ctttaccagt gacttgcatg actcacccag gttgtgtgta aacagagctc tgattcaaag 9420
tgactttgac ctgttggaaa aatagttcct ggccgggcac agcggctcat gcctgtaatc 9480
ccagtctttg acatgccggg gtgggtggat cacctgaggt caggagtttg agaccagcct 9540
ggccaacatg gtgaaactcc atctctacta aaaatacaaa aattagccag ttgcggtggc 9600
acatgcctgt aatcccagct acatgggagg ctgacgcagg agaattgctt gaacccagga 9660
ggtggaggtt gcagtgagct gagatcatac cactgcactc aagcctgggt gacagagcaa 9720
gactctgtct caaaaaaaaa aaaaaaaaaa ggccaggcat ggtggttcat gcctgtaatc 9780
ccagcacttt gggaggccga gacggataga tcacctgagg tcaggagttc gagaccagcc 9840
tggccaacat ggcaaaaccc cgtctctact aaaaacaaaa aaatagccag gagtggtcgt 9900
ttgcgtctgt aatcccagct actcggctga ggcaggaggt gaacccagga ggtagaggct 9960
gcagggaaga tgaaaccatt gcactccagc ctgggcaaga ctctgtatca aaaaaaaaaa 10020
aaaaaaaggc taggtgtggt ggctcacacc tgtaatccca gcactttggg aggctgaggc 10080
gggcggatca caaggtcaag agatcgagac catcctgacc aacatggtga aaccccgtct 10140
ctactaaaaa tacaaaaatt acctgggcat ggtggcgcat gcctgtagtc ccaactactc 10200
gggaggctga ggcaggagaa tcacttgaac ctgggaggca gaggttgcag cgagccaaga 10260
ttgtgccact gcactccagc ctgccaacag aatgagattc tgtctaaaaa aaaaaagaaa 10320
gaaagaaaga aagaaaaaga attcctgttg caaaaactga acaaaatccc acagggacat 10380
gtgcagtaat accagctacc acgtgttgac agcttatatg ccaggcgctg tgcttaacac 10440
cttatgtatg ttatctcact taatcctccc aacatctctt tgaggtagat actattatta 10500
tccccatttt acagatgagg aatctgatgc tcagagggtt atgtagtttg ttcaagttcc 10560
caaagcaggt gagtgccatg gctaggagag aaccacatat ttctgactct tgctctttta 10620
ttttatgtta tattatgtta ttttatgttt tggttttttt ttcttttctt tctttctttc 10680
tttctttctt tctttctttc tttctttctt tctctttctt tctttctttc tttctttctt 10740
tctttctttc tttctttctt tctttctttc tttctctttc tctttctctc tttttctttc 10800
ttttgtgtga gacagaatct ttaaagagaa gaaagaaatg ctcatgtgac cagagggtgt 10860
gttagctaaa gggagcaaga cagtcacacc cagcaggtta ccttcctttg ggcgtcacct 10920
ctgccacacc tccttaggga gagggtgtag catagtagtt aagaggggct ccagggccag 10980
aatgcctggg tttaaatcct agctctgcct cttaccagct atgtagacct gggcaagtca 11040
ttcgacgttt ttggacttcc atttcttcat ctgtaagatg gaattattat aatccctact 11100
tccatagcct ggtaaagagc aaataaatat atggaaaggc ttgaaatagt ggctggcacg 11160
tgtaagcatt aggattggtc gttgtcattg atggagtctc aggttcggtc tgatcctcag 11220
ccctgtgatt ctgtcgtgag ggcactcaca gctcactgcc tgccctaaac aggctccagc 11280
tctggccctc cctcggctca cacctttccc cctctccccc taggagatcc tgctgggccg 11340
tggcttcacc ttttggcagt ggtttgatgg tgtcctggac ctcaccaaac gctgtctccg 11400
gagctactgg tctgaccggt gagtccccac cctgggtagt ctgagcagcc atacaccagt 11460
cacctccata ctcactgccc atgccccatc ctctccttca tcccggccag gctgatcatt 11520
ggcttcatca gcaaacagta cgttactagc cttcttctca atgagcccga cggaaccttt 11580
ctcctccgct tcagcgactc agagattggg ggcatcacca ttgcccatgt catccggggc 11640
caggatggtg aggccacccc agccagtcct ctgtctctgt gcctgtgccc tctggggttt 11700
cttctgggaa tgaaatgtcc tgaccttcct gatgccgatc ctgatcttca ggaagttctt 11760
ccagcttctc ttcttccttc tgtggtctaa atgttcacct tctcactgtg agctctgtgg 11820
gaacggagac tagtgggtct ctctccctca ggagccccac cctaggtcct ctctcccttg 11880
ccttggtgga gtgagaacag gtcttatggt aggggttggg gaaggggaag aaagtccgga 11940
cagagggatc tcagggtctc cttcctacca taggctctcc acagatagag aacatccagc 12000
cattctctgc caaagacctg tccattcgct cactggggga ccgaatccgg gatcttgctc 12060
agctcaaaaa tctctatccc aagaagccca aggatgaggc tttccggagc cactacaagc 12120
gtgagctgga actggcagct ctgattcctt cctgtcaccc acttcctccc tgctccccgc 12180
tgccctcctc tccctgcccg cgtgtcatcc tgatgtcact ccctatttca tagctgtgct 12240
tctcttactt ccccatgatc catgcccacc ttttccacct cccttcctcc ctaaccccag 12300
agcactccat ggctgtcttt tccttctcac aacagctgaa cagatgggta aggatggcag 12360
gggttatgtc ccagctacca tcaagatgac cgtggaaagg tgagtgtggt ggtatggaca 12420
gtgggtaggt caggggctta gtgcttatct gcaggaagga ggggtggcat caacccttgg 12480
tcagtcacat gtacctcctt ccctcctcca gggaccaacc acttcctacc ccagagctcc 12540
agatgcctac catggtgcct tcttatgacc ttggaatggc ccctgattcc tccatgagca 12600
tgcagcttgg cccagatatg gtgtaaggag ctggaaagac aggaatggga gtggtctgtg 12660
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agggctggca tcagggggtc tgttttcttt ccccaggccc caggtgtacc caccacactc 12840
tcactccatc cccccgtatc aaggcctctc cccagaagaa tcagtcaacg tgttgtcagc 12900
cttccaggag taagtgaaaa acctcatggg gataccatcc cactctaagg gggtgggcat 12960
ttgaattgtt agaagaggct cttctgtgag aaaggagcag caaatgctaa cagcctgtct 13020
tcttctcttc tgtccactct aatgaggggg tagtagttaa gatctggact gcctaggttt 13080
gaattctagc tccaccactt actggtttgg ggcaaattac ttagcctttg gtgccttatc 13140
tgcacaatgg gggataataa tgctaataat aataacctac ctcactgcat tattgtggag 13200
attaaatgag ttcataacac ttaaaaagct gagcatagtg catggctcat agcaaaagct 13260
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ctgaggctat attgtgtagc ctattgatcc tagctttaaa cccgagcagc atgatactgt 13440
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gcttgattat aatttttttt ttttgagaca gggtctcact cactggagtg cagtggtgcg 13560
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cccccagtga gtgacaaagc ccctcctgac cccatgtgcc tcttctttcc tggccttgcc 14400
ccgctctcct tatttccatt gctggttcct ggcaggggcc tgctgccgtg ccagcctcag 14460
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cctcactaag cttctcctgg aggggcaagg ggagtcgggg ggagggtcct tgggggcaca 14760
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<213> Artificial Sequence
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Trp Leu Glu Ser Gln Pro Trp Glu Phe Leu Val Gly Ser Asp Ala Phe
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Cys Cys Asn Leu Ala Ser Ala Leu Leu Ser Asp Thr Val Gln His Leu
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Gln Ala Ser Val Gly Glu Gln Gly Glu Gly Ser Thr Ile Leu Gln His
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Ile Ser Thr Leu Glu Ser Ile Tyr Gln Arg Asp Pro Leu Lys Leu Val
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Glu Val Gly Ala Ala Gly Gly Glu Leu Glu Pro Lys Thr Arg Ala Ser
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Leu Thr Gly Arg Leu Asp Glu Val Leu Arg Thr Leu Val Thr Ser Cys
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Thr Gly Glu Ile Ile Asn Asn Thr Val Pro Leu Glu Asn Ser Ile Pro
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Lys Arg Cys Glu Arg Lys Gly Thr Glu Ser Val Thr Glu Glu Lys Cys
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450 455 460
Thr Asn Arg Gly Leu Leu Pro Glu His Phe Leu Phe Leu Ala Gln Lys
465 470 475 480
Ile Phe Asn Asp Asn Ser Leu Ser Met Glu Ala Phe Gln His Arg Ser
485 490 495
Val Ser Trp Ser Gln Phe Asn Lys Glu Ile Leu Leu Gly Arg Gly Phe
500 505 510
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Leu Arg Phe Ser Asp Ser Glu Ile Gly Gly Ile Thr Ile Ala His Val
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Ser Ala Lys Asp Leu Ser Ile Arg Ser Leu Gly Asp Arg Ile Arg Asp
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Phe Arg Ser His Tyr Lys Pro Glu Gln Met Gly Lys Asp Gly Arg Gly
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Tyr Val Pro Ala Thr Ile Lys Met Thr Val Glu Arg Asp Gln Pro Leu
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cacacctcca atgctgcctg ggagccaggg tgagagtctg ggtccaggcc tggccatgtg 3780
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Lys Gln Ala Arg Glu Leu Ser Val Pro Gln Gly Pro Gly Ala Gly Ala
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Ile Pro Gly Asn Cys Cys Ser Ala Leu Phe Lys Asn Leu Leu Leu Lys
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Lys Ile Lys Arg Cys Glu Arg Lys Gly Thr Glu Ser Val Thr Glu Glu
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Gln Val Ser Leu His Ser Leu Ile Glu Thr Pro Ala Asn Gly Thr Gly
50 55 60
Pro Ser Glu Ala Leu Ala Met Leu Leu Gln Glu Thr Thr Gly Glu Leu
65 70 75 80
Glu Ala Ala Lys Ala Leu Val Leu Lys Arg Ile Gln Ile Trp Lys Arg
85 90 95
Gln Gln Gln Leu Ala Gly Asn Gly Ala Pro Phe Glu Glu Ser Leu Ala
100 105 110
Pro Leu Gln Glu Arg Cys Glu Ser Leu Val Asp Ile Tyr Ser Gln Leu
115 120 125
Gln Gln Glu Val Gly Ala Ala Gly Gly Glu Leu Glu Pro Lys Thr Arg
130 135 140
Ala Ser Leu Thr Gly Arg Leu Asp Glu Val Leu Arg Thr Leu Val Thr
145 150 155 160
Ser Cys Phe Leu Val Glu Lys Gln Pro Pro Gln Val Leu Lys Thr Gln
165 170 175
Thr Lys Phe Gln Ala Gly Val Arg Phe Leu Leu Gly Leu Arg Phe Leu
180 185 190
Gly Ala Pro Ala Lys Pro Pro Leu Val Arg Ala Asp Met Val Thr Glu
195 200 205
Lys Gln Ala Arg Glu Leu Ser Val Pro Gln Gly Pro Gly Ala Gly Ala
210 215 220
Glu Ser Thr Gly Glu Ile Ile Asn Asn Thr Val Pro Leu Glu Asn Ser
225 230 235 240
Ile Pro Gly Asn Cys Cys Ser Ala Leu Phe Lys Asn Leu Leu Leu Lys
245 250 255
Lys Ile Lys Arg Cys Glu Arg Lys Gly Thr Glu Ser Val Thr Glu Glu
260 265 270
Lys Cys Ala Val Leu Phe Ser Ala Ser Phe Thr Leu Gly Pro Gly Lys
275 280 285
Leu Pro Ile Gln Leu Gln Ala Leu Ser Leu Pro Leu Val Val Ile Val
290 295 300
His Gly Asn Gln Asp Asn Asn Ala Lys Ala Thr Ile Leu Trp Asp Asn
305 310 315 320
Ala Phe Ser Glu Met Asp Arg Val Pro Phe Val Val Ala Glu Arg Val
325 330 335
Pro Trp Glu Lys Met Cys Glu Thr Leu Asn Leu Lys Phe Met Ala Glu
340 345 350
Val Gly Thr Asn Arg Gly Leu Leu Pro Glu His Phe Leu Phe Leu Ala
355 360 365
Gln Lys Ile Phe Asn Asp Asn Ser Leu Ser Met Glu Ala Phe Gln His
370 375 380
Arg Ser Val Ser Trp Ser Gln Phe Asn Lys Glu Ile Leu Leu Gly Arg
385 390 395 400
Gly Phe Thr Phe Trp Gln Trp Phe Asp Gly Val Leu Asp Leu Thr Lys
405 410 415
Arg Cys Leu Arg Ser Tyr Trp Ser Asp Arg Leu Ile Ile Gly Phe Ile
420 425 430
Ser Lys Gln Tyr Val Thr Ser Leu Leu Leu Asn Glu Pro Asp Gly Thr
435 440 445
Phe Leu Leu Arg Phe Ser Asp Ser Glu Ile Gly Gly Ile Thr Ile Ala
450 455 460
His Val Ile Arg Gly Gln Asp Gly Ser Pro Gln Ile Glu Asn Ile Gln
465 470 475 480
Pro Phe Ser Ala Lys Asp Leu Ser Ile Arg Ser Leu Gly Asp Arg Ile
485 490 495
Arg Asp Leu Ala Gln Leu Lys Asn Leu Tyr Pro Lys Lys Pro Lys Asp
500 505 510
Glu Ala Phe Arg Ser His Tyr Lys Pro Glu Gln Met Gly Lys Asp Gly
515 520 525
Arg Gly Tyr Val Pro Ala Thr Ile Lys Met Thr Val Glu Arg Asp Gln
530 535 540
Pro Leu Pro Thr Pro Glu Leu Gln Met Pro Thr Met Val Pro Ser Tyr
545 550 555 560
Asp Leu Gly Met Ala Pro Asp Ser Ser Met Ser Met Gln Leu Gly Pro
565 570 575
Asp Met Val Pro Gln Val Tyr Pro Pro His Ser His Ser Ile Pro Pro
580 585 590
Tyr Gln Gly Leu Ser Pro Glu Glu Ser Val Asn Val Leu Ser Ala Phe
595 600 605
Gln Glu Pro His Leu Gln Met Pro Pro Ser Leu Gly Gln Met Ser Leu
610 615 620
Pro Phe Asp Gln Pro His Pro Gln Gly Leu Leu Pro Cys Gln Pro Gln
625 630 635 640
Glu His Ala Val Ser Ser Pro Asp Pro Leu Leu Cys Ser Asp Val Thr
645 650 655
Met Val Glu Asp Ser Cys Leu Ser Gln Pro Val Thr Ala Phe Pro Gln
660 665 670
Gly Thr Trp Ile Gly Glu Asp Ile Phe Pro Pro Leu Leu Pro Pro Thr
675 680 685
Glu Gln Asp Leu Thr Lys Leu Leu Leu Glu Gly Gln Gly Glu Ser Gly
690 695 700
Gly Gly Ser Leu Gly Ala Gln Pro Leu Leu Gln Pro Ser His Tyr Gly
705 710 715 720
Gln Ser Gly Ile Ser Met Ser His Met Asp Leu Arg Ala Asn Pro Ser
725 730 735
Trp
<210> 7
<211> 32730
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> KRAS G12D genomic sequence
<400> 7
gattttccta ggcggcggcc gcggcggcgg aggcagcagc ggcggcggca gtggcggcgg 60
cgaaggtggc ggcggctcgg ccagtactcc cggcccccgc catttcggac tgggagcgag 120
cgcggcgcag gcactgaagg cggcggcggg gccagaggct cagcggctcc caggtgcggg 180
agagaggtac ggagcggacc acccctcctg ggcccctgcc cgggtcccga ccctctttgc 240
cggcgccggg cggggccggc ggcgagtgaa tgaattaggg gtccccggag gggcgggtgg 300
ggggcgcggg cgcggggtcg gggcgggctg ggtgagaggg gtctgcaggg gggaggcgcg 360
cggacgcggc ggcgcgggga gtgaggaatg ggcggtgcgg ggctgaggag ggtgaggctg 420
gaggcggtcg ccgctggtgc tgcttcctgg acggggaacc ccttccttcc tcctccccga 480
gagccgcggc tggaggcttc tggggagaaa ctcgggccgg gccggctgcc cctcggagcg 540
gtggggtgcg gtggaggtta ctcccgcggc gccccggcct cccctccccc tctccccgct 600
cccgcacctc ttgcctccct ttccagcact cggctgcctc ggtccagcct tccctgctgc 660
atttggcatc tctaggacga aggtataaac ttctccctcg agcgcaggct ggacggatag 720
tggtcctttt ccgtgtgtag gggatgtgtg agtaagaggg gaggtcacgt tttggaagag 780
cataggaaag tgcttagaga ccactgtttg aggttattgt gtttggaaaa aaatgcatct 840
gcctccgagt tcctgaatgc tcccctcccc catgtatggg ctgtgacatt gctgtggcca 900
caaaggagga ggtggaggta gagatggtgg aagaacaggt ggccaacacc ctacacgtag 960
agcctgtgac ctacagtgaa aaggaaaaag ttaatcccag atggtctgtt ttgcttggtc 1020
aagttaaacc cgaagaaaac ccgcagagca gaagcaaggc tttttccttg ctagttgagt 1080
gtagacagca atagcaaaaa tagtacttga agtttaattt acctgttctt gtcctttccc 1140
ctatttctta tgtattaccc tcatcccctc gtctctttta tactaccctc attttgcaga 1200
tgtgttctac atctcaagag ttattacagt actccaaaac agcacttaca tgatttttta 1260
aacttacaga ggaattgtag caatccacca gctaaccgcc tgaaatagac ttaaacatgt 1320
gcatctcctt tttttttttt tttttgagac acagtctcgc tctgttgccc aggctggagt 1380
gcaatggcgc ggtatcggct cactgaaacc tccgcctcct gggttcaagc aattctcctg 1440
cctcagcctc ccgagtagct gggactagta ggtgcacgcc accatgccca gctaattttt 1500
gtatttttag tagagacaga gtttcatcat gttggtcagg atggtctcca tctgctctgt 1560
tgcccaggct ggagtgcagt ggcgccgtct cggctcactg caacctctgc ctcctgcatt 1620
caagcaattc tcctgcctca gcctcccgaa taactgggat tacaggtgtc tgctgccatg 1680
cccggctaat tttttgtatt tttagtagag acgggggttt caccatgttg gtcaggctgg 1740
tctagaactc ctgacctcgt gatctgcccg cctcggcctc ccacagtggc atgtgcatct 1800
tatagctgaa gtctaagcct tcttaaatct tgagatccat caaaacagac aggttttcta 1860
attgttatac aatgtatatg ttatgtttat aatagaaatc attttacaaa taagttataa 1920
atgggaaagg tctatttgta attatcagct cagaattaac cataaaactg gtgtcactga 1980
agtgactgag gtccaaaatg ctgactctgc atgttataga ctacagatat caaatatggt 2040
tgctaacaat agtttacttt gagactgtag ccatccacag tatatttgct tttaagagat 2100
ggtagatggt aattcagttt tatgaaaaat aaaaatgaat tttcttccat tacaaaattg 2160
ttggattcga gtccagtcca ctccttacta gcttttctaa ctctcggtga gggatcccct 2220
cccagcccat gatcttcatt tggtaagact cctttggaac ccagttctct ctagtggatt 2280
taaatgtgat ttggttttaa aaatctcatt caaggaattt tttttttttc tggaaacaac 2340
caccgcataa acaagtaaac cggaagatac atgtggctct gaattcatat atatacacaa 2400
actctaatcc aatgtctgtc cacagtattt cctaggctag taaacttttt ggccttaacg 2460
acccctctac cctctttgtt tttttgagag agagagtctc actctgtcac ccaggccgga 2520
atgcagtggc gcgatctcgg cccgctacta cctccgactc tcaggctcaa gcgattctcc 2580
cgcctcagct tcccgagtag ccgggattac aggctcccgc caccgggcta attgtatttt 2640
tagatacggg atttcaccat gttggccagg ctggtctcga cctcctgacc tcaggtgatc 2700
cgcccgccta agcctcccaa agtgctggga ttacaggcca ccacacccgg cctacactct 2760
taaaaattat cgaaggggcc gggcacattg gctcttatct gtaatcccag cactttggga 2820
gactgaggcg ggaggatcgc ttgaggccag gagttggaga ccagcgtact caacatagtg 2880
agaccttgtt ataaagaaaa aaaaaatcca ggattaaaaa aaatctttga tttgtttggg 2940
atttattaat atttaccgta ttggaaatta aaacaatttt ttaaaatgta ttcatttaaa 3000
aataataagc ccattacttg gtaacatgaa taaaatattt tatgaaaaat aactattttc 3060
caaaacaaaa ccaaaactta gaaaagtggt attgtttcac acttcagtaa atctctttaa 3120
tgatgtggct taatagaaga tatggattct tatatctgca tctgcattca atctattatg 3180
atcacacatc tggaaaactt gtgaaagaat gggagttaaa agggtaaagg acatcttaat 3240
gttattatga aaacagtttt gacctcttgc acaccagaaa agtcttagta acctgagggg 3300
ttcctagacc acattttgag aactgtttta ggctatgcaa actggttggg gggaggttgg 3360
ggtaggcaga gagctagaag atacatttta gtgtaattct cctcatctat tcctaattgc 3420
tttggcctac atttgaaata aagcgtggag gcaaacggga taagatacat gtttgtagtg 3480
gttgttaact tcaccctaga caagcagcca ataagtctag gtagagcaga gtaaggcggg 3540
gaactatgcc gtgaccgtgt gtgatacaat ttttctagcc tgtggtgctt tttgcggcag 3600
ggcttaggag taaggttagt atgttatcat ttgggaaacc aaattattat tttgggtctt 3660
cagtcaatta tgatgctgtg tatatttagt gtttatctac aatatatgca cattcattaa 3720
tttggagcta ctcatcctat aataaatagt tgtgcattta ctcccatttt tttctgcatt 3780
tctctcctta tttataatta tgtgttacat gagggaaagg aggtgaaatt aaacattcat 3840
attatttcaa aaaatttgaa acaactaact aaaaaatatg ttttattttc tgtatggtgt 3900
ttgttataca atctgtcaat attcatgcac ctcttgggag acagtgtatg aaaagcaaag 3960
agtaacagtc acatggatta ctgattactg agatatattc acttgcatct tttttttttt 4020
ttgagacgga gtggctctgt cgcccaggct ggagtgcagt ggcgtgatct cggctcactg 4080
caagctccgc ctcctgggtt cacgccattc ttctgcctca gcctcccaag tagctgggac 4140
tacaggcgcc cgccaccacg cccggctaat ttttttatat ttttagtaga gacggggttt 4200
caccgggtta gccaggatgg tcttgatctc ctgacctcgt gatccaccct cctcggcctc 4260
ccaaagtgct aggattatag gcgtgagcca ccgtgcccgg ctcacttgca tctcttaaca 4320
gctgttttct tactaaaaac agtgtttatc tctaatcttt ttgtttgttt gtttgttttg 4380
agatggagtc ttactccgtc acccaatctg gagtgcagtg gcgtgatctg ggctcactgc 4440
aacctctgcc tcccgggttc aagtgattct ccttcctcag cctccccagt agctaggact 4500
acaggagagc gccaccacgc ctgattaatt tttgtatttt tagtagagag agggtttcac 4560
catattggcc aggctggtct tgaactcctg gcctcaggtg atccacccgc cttggcctct 4620
gaaagtgctg ggattacagg catgagccgc cgcacccggc tttctaatct ttatcttttt 4680
ttgtgcagcg gtgatacagg attatgtatt gtactgaaca gttaattcgg agttctcttg 4740
gtttttagct ttattttccc cagagatttt tttttttttt tttttttttg agacggagtc 4800
ttgctctatc gccaggctgg agtgcagtgg cgccatctcg gctcattgca acctcggact 4860
cctattttcc ccagagatat ttcacacatt aaaatgtcgt caaatattgt tcttctttgc 4920
ctcagtgttt aaatttttat ttccccatga cacaatccag ctttatttga cactcattct 4980
ctcaactctc atctgattct tactgttaat atttatccaa gagaactact gccatgatgc 5040
tttaaaagtt tttctgtagc tgttgcatat tgacttctaa cacttagagg tgggggtcca 5100
ctaggaaaac tgtaacaata agagtggaga tagctgtcag caacttttgt gagggtgtgc 5160
tacagggtgt agagcactgt gaagtctcta catgagtgaa gtcatgatat gatcctttga 5220
gagcctttag ccgccgcaga acagcagtct ggctatttag atagaacaac ttgattttaa 5280
gataaaagaa ctgtctatgt agcatttatg catttttctt aagcgtcgat ggaggagttt 5340
gtaaatgaag tacagttcat tacgatacac gtctgcagtc aactggaatt ttcatgattg 5400
aattttgtaa ggtattttga aataattttt catataaagg tgagtttgta ttaaaaggta 5460
ctggtggagt atttgatagt gtattaacct tatgtgtgac atgttctaat atagtcacat 5520
tttcattatt tttattataa ggcctgctga aaatgactga atataaactt gtggtagttg 5580
gagctgatgg cgtaggcaag agtgccttga cgatacagct aattcagaat cattttgtgg 5640
acgaatatga tccaacaata gaggtaaatc ttgttttaat atgcatatta ctggtgcagg 5700
accattcttt gatacagata aaggtttctc tgaccatttt catgagtact tattacaaga 5760
taattatgct gaaagttaag ttatctgaaa tgtaccttgg gtttcaagtt atatgtaacc 5820
attaatatgg gaactttact ttccttggga gtatgtcagg gtccatgatg ttcactctct 5880
gtgcattttg attggaagtg tatttcagag tttcgtgaga gggtagaaat ttgtatccta 5940
tctggaccta aaagacaatc tttttattgt aacttttatt tttatgggtt tcttggtatt 6000
gtgacatcat atgtaaaggt tagatttaat tgtactagtg aaatataatt gtttgatggt 6060
tgattttttt aaacttcatc agcagtattt tcctatcttc ttctcaacat tagagaacct 6120
acaactaccg gataaatttt acaaaatgaa ttatttgcct aaggtgtggt ttatataaag 6180
gtactattac caactttacc tttgctttgt tgtcattttt aaatttactc aaggaaatac 6240
taggatttaa aaaaaaattc cttgagtaaa tttaaattgt tatcatgttt ttgaggatta 6300
ttttcagatt tttttagttt aatgaaaatt taccaaagta aagaccagca gcagaatgat 6360
aagtaaagac ctgtaagaca ccttgaaggt catggagtag aacttccatc ccaagcagat 6420
gaggatttat ttaatctcaa agacctccag gaggggacat tccccaactg tccttgttaa 6480
ctcattttca gaacatattt attagcatat tttacatgta atttggatct tcatgttaaa 6540
tttaacatca gtggagatgg aaaataagca tatcgccttg tctttgaaat agccctatat 6600
tgttagattg tttcttaggc ttctttaccc tgggttaagc agtcctaata ctttagcatt 6660
tattctacat ctagtgtact aatttaaaaa aatcagttct gaaaaatttc taagaacttt 6720
cttcaagttc caagctgtga aatctagaac aggtcaaagt gccttattaa cgtactgtac 6780
tgtgtagtgt cttgaagaga cactttgcgc tgaggcaagt tctgagggca ttgggtggcc 6840
ttgggaagat atttatgcag tttagaacct ggagaattga ttagataact aatcataagg 6900
aaacgtcaca tatttttggt actataaaaa agtggagaaa taatgcctat ttgcaaagat 6960
ttgatttaaa catagaaaca actttatttg gcttccaatt ttaagaattt acagcagtaa 7020
aggggaacag tctaattgaa gtagactgcc tatgcaatag tctctgtata tttacttttg 7080
acaagttaat tcaatgtgta ctatagtttt gtttctttga agaggtttga atagtgcacc 7140
cattttaatc tgtattgcaa attcagggtt acttggcaga ctctactatt taaatcagat 7200
gtaaaaggaa gttttaatat aattcacttt atgcctgaaa gttttcctgg gattttggaa 7260
ggtgatttta ctggaaatgc tgtctgtctt ccctgaaaat ctgagaaatt ccattacact 7320
ttgtttccaa tcagaggtca tgagtgctat atgagtatat acagcatgac gtcatgaatg 7380
tgataaagtg ggttaggaaa ccttttgcta atgattgtta aaatgcaata taaatgttga 7440
agaaataaag ctaacagtta agcctttatt tgggcggaag gctgaaaaag tttataaact 7500
taaacctata actctgctta tgatttctgc caaaccagaa gacttgactc tgggaagcat 7560
tggttacctg tgaactttga aactgacggt ccctgacgta gtttagtcac ctgggaaaag 7620
gtatctgaga ttatctctta tctcccaagt tacagtgagt ctctgaggga actgacacat 7680
tacattaagt tcttggtgta gttaaactgt aagaaaggca ggagaactta gtagttaaat 7740
agttggttaa atggaaatgc tgactccatg ttattgtaaa aagttaaaaa tttaggagga 7800
tatggggatt tcactgccat tgcaggtttt gattggtatt taccaatccg tgtgggtcag 7860
agagaaaatt agaaaggata tgactgcaca ttttggaatt attagcagtt tttctacatt 7920
taaaatggaa ataaattttt taaaaattta aatcaagtaa tactgtattt tttggtgatt 7980
tagatttttc aaaatttaca ctaagagata gtaaggaggg tggctattgt ttctttcaat 8040
aatgtctctg agaggttgta actcatctaa ggatacgtag ctaataagtg gtaggatttc 8100
aatttaaatt ctctgagacc aagttaagta gaatttgcac tgtactcttg tataactttt 8160
taaaactgaa aattagctat ctttcaaatt aagaaaatat ttactaatgg agactaattc 8220
agatttgtaa gtataccaaa atttgaactt agcctgctat ctaatggcaa cttagtggca 8280
gaggtatgat gtaaaatcat tcaggtatga cacatagatg gagtatgttt gtattcgagg 8340
ctgtgcacat aatcaccttt acttgtattg tgaagtatat attgttatct tttatgaagc 8400
ccactaaaga gataatgaaa tacctcgtta ttagggcaag attattgaaa actcaaaata 8460
gcccccaaac acaatacttg gctagaaata tataccttta tagttcagag atcatttatt 8520
atcaaaaccc tgaagttttt tttctaaggt aaaatttggt ggaagaggaa aagtctcgtt 8580
ttaaaaaaat gtaggtagtt acagagatca gaatgattag ttgatcactt accaaatata 8640
tattaagtat ctactgtata taatatgcta gtaagaataa atatagcagg aagtattttt 8700
tcccaggctc taattgtttg acatcagcat gcttttattg tggcacttat aattcagttc 8760
aagtattatg cccctctttg atggaacagt ttcctattca gtaaggaaga ccagattaat 8820
cattggattg gtttgtttca tctttagtgt tctgagctgt agagtattta tttaccaagg 8880
tttattttaa tttttatttt atttttattt ttccatgttc attgtagaat tcattttacc 8940
tacgaatgaa gtatgtagat tatagagaga aaatttgtaa aattaaactg atactgaaga 9000
ctggtataag aaaagcctta tgtaatttgt aagctgctat tcttctgagt ttatacatat 9060
atctttagta atcaatgagg gatggttggg tgactgccct ccaggggaca tttggcaaca 9120
tctggagatg tttttggttg ccacaacttg gggagagagt actgctactg gcatctattg 9180
agtagatgct attactttaa atggcaaagc tgcagttacc tttgcaccaa cctaatatta 9240
aacttcctgc agtgcacggg aaagccccca caacagggtt atctgacccc aaacctcaat 9300
ggtgttaaga tccaaacctt gatatgttaa cctgtagctt taaacatcct ttaaattgtc 9360
aaattcatgt ccctgacata aggtttatgt tagattttca agtataacaa agatttaaac 9420
tttaactttt gtacgttaat gatatgttag cttactccag tcttctatta aaacattctg 9480
tttttaaaat cagagacaca cagcaatttt ataaatcatt tctcttcaag gctgtgaagc 9540
tctccccact tttgtgagtg ccctctactg gtcaaattat ttgctttata acaagtaaca 9600
gtgaaatcct aagtttgtgt agtttcgctg tttaaattat gggtggcatc aatttataaa 9660
tatattcgtt ttatttaaaa gtcttatatg attgatttcg tatcattttt gctctctgct 9720
aatattaata taaagattac tgtctgtatt agttaggcct aactaagtag gtgagtatag 9780
tgaactaaga aaggaaacga ggcagtatat aagaaaatag ggtggttcag ttgttaacac 9840
ttactgagct tactttgttg aagggactaa aaggcagcag tgtggctctc tgagcttctt 9900
tgcatgcact caggagctgc ttaatggagt ccaaggcttg gtggtgtgtt acaggggatg 9960
ataggagggt cctattcaga agtggcaaat tgtgaaagtg cacattttgt agagttttat 10020
aggactgtag aatagttgtg agcacctgat ttttagaata aacagaaaac tcaggtactg 10080
tatttaggtc aaattaagaa taagtattta ttaagacctg aatataaaac tttactggtc 10140
atggtttttt tctaccttgg gtttttataa atccaaagat ttaaaaacat acaaatggaa 10200
gttggtaatg gaattaagtg aaaggaaaaa atgattttat ggtttggaat ctcctaagat 10260
tctggtttta acaatacaac taattcctta atcctagaaa tgttcttcac tgcccacttt 10320
gtaccatgca gtcttcctgt gggctagaga tacactgagg cgcaaaacag accagattcc 10380
tgccttcatg gagcttatta gttttaggta tctctagatt tcttgtaata cctattacaa 10440
tgcctgcaca tcagttcatt catgtgggtt caacgtagta ctcagtacat ggcaaattca 10500
agttttactt ttcggaactt catggatttt tttcctcaga atatctttta tccataattg 10560
gttgaatctg tagatgcagt acccatggat atggatggcc cactttattt tgaagagcag 10620
tgtttctagg caatcatgct aattatatat gacttaattt agaggcttta tacttaagag 10680
cattacattt ctggcgtctc ttaaccatta ttatttcata atgtgtaggt tatggaacag 10740
ttaaattatt gggatcttaa tatagaaatt agtagaaata agccagatat ggtggctcat 10800
gcctgtaatc ttagcacttt gggaggctga ggctattcgc tgtactattt tttactactt 10860
ttctataggt ttgaaatttt ttcaaaataa aacattgaaa aaagtaaggt aggtagtgtg 10920
tccctcctta atcctttcaa atattttatt ttcactattt ctattaattt ttttttttgt 10980
ttttgagatg gagtctcgct ctgttgccca ggctggagtg cagtggcgcg atcttggctc 11040
actgcagcct ccacctcctg ggttccagcc attctcctgc ctcagcctcc tgggtagctg 11100
gtattacagg catgcaccac cacacccaat tactttttgt atttttagta gagacggggt 11160
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gtgtcactgc ttctagaccg ttttcaaggc acagagctta gaaatgcatg ttactaagaa 11280
atcaagagtt aactattttt caccttcttt ctcccgcagt gagaaccctg gttctaccct 11340
gtttctcctt gtgtaaattt taatgctaaa ctatacactt gtgaaataaa aatgataatg 11400
tcattcttaa attatggatc ttgcagtgtt atctaagtaa catagattga gtgatttaac 11460
tttaggtttc cttatttgtg gaatttggat aaatattttt cacccttgag aaaagtgaga 11520
ctcctttctc atcatcagag tatccttaaa ccattaaggc aaacatttgg gaaaaaactg 11580
agctatctgg ctgcataaaa attaagtttt ctttaacaaa gatagaagac aaatgaaaac 11640
ctagaaaaac catttggttc aagtaacagg aagctatctt atatatgaat tagagaaaag 11700
caaacacaca aatagaaaaa aagggatggg gggtactaaa gatataaata gcttgtctac 11760
caaaaaagaa ataaaataaa taacatgaac atataaaaag acacttactt catgaatgtg 11820
atgcaagttc aaacaataaa taacatttct gtactttcat attggctaag gttaaaatga 11880
taactgctag gaagggtatg gagaagtgtg cgccttgcac tgtagtggga gtatagaccc 11940
tcagacttta tggaggtcag tctggaaata tgtttcaaaa tgtaaactac atgtcctttg 12000
accaggtaat tcaacttctt gaaatttatc caaggattta attggataaa tgtttaagat 12060
gtatatataa gaatgtttac tgcagtgttg tttatgattt taaaaaaatg gaaatcatct 12120
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atagttgttg gaaatattag gtagatttag atatactgat gttcaaaaat gtccattatg 12240
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gattttgtca ttgtgcaaac atcatagaat atacttacac aaaccttggt agtataacct 26160
actatacacc tgggatatgt agtatagtct cttgccccag ggatacaaac ctgtacagta 26220
tgtaactgta ctaatgacta taaggcaatt gttaacacaa tggtaagttt tgtgtgtcta 26280
aacctacact tgggctaccc taagtttata tattttttta aatttctgtt caataataaa 26340
ttaaccttac tttactgtaa ctttttaaac tttttaattt ttcctaacat tttgactttt 26400
gtaatacagc ttaaaacaca cattatacag ctatacaaat ttttctttcc ttatatcttt 26460
attctgtaag cttttttcca tatttaaaat tttttgtttg tttttactta ttaaactttt 26520
ttgttaaaaa ctaagacatg catgcacatt aacctaggcc tacacagggt caggaccatc 26580
aatatcattg tcttccactt ccacatcttg tcccactgga agatcttcag gggcagtaac 26640
acacgtggag ctgtcatctc ctataataac attgccttct tttggaatac ctcctgaagg 26700
acctatccaa ggctgtttat agttaacttt tttttttttt tttttttttt tttagtaaat 26760
aggaggagta cactataaaa taacaatata ggtgctatac cattatacaa ctgacagtgc 26820
agtaggtttg tttacaccag catcaccaca aacacgtgag caatgtgtcg tactacagtg 26880
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ggaccactat cacatatgca atctcctgtg gaccaaaatg tcattatgtg gtacatgact 27000
gtactaagaa attgatccat ctatattcca tcaatttgtt tagggctttt tctggttaca 27060
tttacctgtg agcccagaaa accagttttg tagaaattaa cttctgtaat gctaggagtt 27120
aaaaaaaatt gctgaacaac ttttacattg ttaaacattt aaaaacaagc gttctagaag 27180
tttatcaaat ttcataaagg tgcaaaaatg taaatgtaaa tcattatcca gctaatatat 27240
atgttgtatt tccctagtag gagagcatat gtacctcttc ctagttatac aaatttgata 27300
tatagtaaag aaacagtaaa ttctacttca agtcattttg ggaggattaa aaactgaatt 27360
tctctagttt gaccattgta cagatttatc tggcaatttt actaaaacct gatttatagg 27420
ttaaacttgg tgtatatcat atatcacttt actttagagg aattaagatt tcacataaat 27480
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tggtacttgg accatacttt gagtagaaaa gcagtagagg acataaaaag agtcttgtta 28020
gtcccacttt gttgctgtcc acttctcatt tgataatatc ctaaaatagc tgtgtctcct 28080
ttttggtggt tgtatgatta ctacctcaga agtactaatt gattcttgct atttgacctt 28140
aatactttaa tataacacag cattcatatt tgatcagaaa actatctggc ttccttttat 28200
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tttgaaggta tataatatgt aagtagataa acaaatttga tttgtagaca tttttatgtg 28320
gatcatctaa ttaaaaatgg agggatacag tatgaaagaa tacttgtact tcttaacaga 28380
gcactcaacc tttcttttac atcctgtttc actgatgtta ttatgtaatt tatgttgcta 28440
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<210> 8
<211> 188
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> KRAS G12D protein Isoform B
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Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Asp Gly Val Gly Lys
1 5 10 15
Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Ile Gln Asn His Phe Val Asp Glu Tyr
20 25 30
Asp Pro Thr Ile Glu Asp Ser Tyr Arg Lys Gln Val Val Ile Asp Gly
35 40 45
Glu Thr Cys Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Gln Glu Glu Tyr
50 55 60
Ser Ala Met Arg Asp Gln Tyr Met Arg Thr Gly Glu Gly Phe Leu Cys
65 70 75 80
Val Phe Ala Ile Asn Asn Thr Lys Ser Phe Glu Asp Ile His His Tyr
85 90 95
Arg Glu Gln Ile Lys Arg Val Lys Asp Ser Glu Asp Val Pro Met Val
100 105 110
Leu Val Gly Asn Lys Cys Asp Leu Pro Ser Arg Thr Val Asp Thr Lys
115 120 125
Gln Ala Gln Asp Leu Ala Arg Ser Tyr Gly Ile Pro Phe Ile Glu Thr
130 135 140
Ser Ala Lys Thr Arg Gln Gly Val Asp Asp Ala Phe Tyr Thr Leu Val
145 150 155 160
Arg Glu Ile Arg Lys His Lys Glu Lys Met Ser Lys Asp Gly Lys Lys
165 170 175
Lys Lys Lys Lys Ser Lys Thr Lys Cys Val Ile Met
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<211> 5306
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> KRAS G12D mRNA
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cttttggtgc atgcagttga ttacttctta tttttcttac caattgtgaa tgttggtgtg 1080
aaacaaatta atgaagcttt tgaatcatcc ctattctgtg ttttatctag tcacataaat 1140
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tatagcaacc attttggggc tatatttaca tgctactaaa tttttataat aattgaaaag 1560
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taaaataaaa ataaaaacaa tccttttgat aaatttaaaa tgttacttat tttaaaataa 2220
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tattccattt acataaggat acacttattt gtcaagctca gcacaatctg taaattttta 2460
acctatgtta caccatcttc agtgccagtc ttgggcaaaa ttgtgcaaga ggtgaagttt 2520
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cctaccttcc acatgcccca tgacttgatg cagttttaat acttgtaatt cccctaacca 2640
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ctgtaatatc ttactaaggc ctttggtata cgacccagag ataacacgat gcgtatttta 3480
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ttaaaaatga ccactctttt aattgaaatt aacttttaaa tgtttatagg agtatgtgct 5220
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<211> 189
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> KRAS G12D protein Isoform A
<400> 10
Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Asp Gly Val Gly Lys
1 5 10 15
Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Ile Gln Asn His Phe Val Asp Glu Tyr
20 25 30
Asp Pro Thr Ile Glu Asp Ser Tyr Arg Lys Gln Val Val Ile Asp Gly
35 40 45
Glu Thr Cys Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Gln Glu Glu Tyr
50 55 60
Ser Ala Met Arg Asp Gln Tyr Met Arg Thr Gly Glu Gly Phe Leu Cys
65 70 75 80
Val Phe Ala Ile Asn Asn Thr Lys Ser Phe Glu Asp Ile His His Tyr
85 90 95
Arg Glu Gln Ile Lys Arg Val Lys Asp Ser Glu Asp Val Pro Met Val
100 105 110
Leu Val Gly Asn Lys Cys Asp Leu Pro Ser Arg Thr Val Asp Thr Lys
115 120 125
Gln Ala Gln Asp Leu Ala Arg Ser Tyr Gly Ile Pro Phe Ile Glu Thr
130 135 140
Ser Ala Lys Thr Arg Gln Arg Val Glu Asp Ala Phe Tyr Thr Leu Val
145 150 155 160
Arg Glu Ile Arg Gln Tyr Arg Leu Lys Lys Ile Ser Lys Glu Glu Lys
165 170 175
Thr Pro Gly Cys Val Lys Ile Lys Lys Cys Ile Ile Met
180 185
<210> 11
<211> 32729
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Genomic Sequence for KRAS Wild-Type
<400> 11
gattttccta ggcggcggcc gcggcggcgg aggcagcagc ggcggcggca gtggcggcgg 60
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gtggggtgcg gtggaggtta ctcccgcggc gccccggcct cccctccccc tctccccgct 600
cccgcacctc ttgcctccct ttccagcact cggctgcctc ggtccagcct tccctgctgc 660
atttggcatc tctaggacga aggtataaac ttctccctcg agcgcaggct ggacggatag 720
tggtcctttt ccgtgtgtag gggatgtgtg agtaagaggg gaggtcacgt tttggaagag 780
cataggaaag tgcttagaga ccactgtttg aggttattgt gtttggaaaa aaatgcatct 840
gcctccgagt tcctgaatgc tcccctcccc catgtatggg ctgtgacatt gctgtggcca 900
caaaggagga ggtggaggta gagatggtgg aagaacaggt ggccaacacc ctacacgtag 960
agcctgtgac ctacagtgaa aaggaaaaag ttaatcccag atggtctgtt ttgcttggtc 1020
aagttaaacc cgaagaaaac ccgcagagca gaagcaaggc tttttccttg ctagttgagt 1080
gtagacagca atagcaaaaa tagtacttga agtttaattt acctgttctt gtcctttccc 1140
ctatttctta tgtattaccc tcatcccctc gtctctttta tactaccctc attttgcaga 1200
tgtgttctac atctcaagag ttattacagt actccaaaac agcacttaca tgatttttta 1260
aacttacaga ggaattgtag caatccacca gctaaccgcc tgaaatagac ttaaacatgt 1320
gcatctcctt tttttttttt tttttgagac acagtctcgc tctgttgccc aggctggagt 1380
gcaatggcgc ggtatcggct cactgaaacc tccgcctcct gggttcaagc aattctcctg 1440
cctcagcctc ccgagtagct gggactagta ggtgcacgcc accatgccca gctaattttt 1500
gtatttttag tagagacaga gtttcatcat gttggtcagg atggtctcca tctgctctgt 1560
tgcccaggct ggagtgcagt ggcgccgtct cggctcactg caacctctgc ctcctgcatt 1620
caagcaattc tcctgcctca gcctcccgaa taactgggat tacaggtgtc tgctgccatg 1680
cccggctaat tttttgtatt tttagtagag acgggggttt caccatgttg gtcaggctgg 1740
tctagaactc ctgacctcgt gatctgcccg cctcggcctc ccacagtggc atgtgcatct 1800
tatagctgaa gtctaagcct tcttaaatct tgagatccat caaaacagac aggttttcta 1860
attgttatac aatgtatatg ttatgtttat aatagaaatc attttacaaa taagttataa 1920
atgggaaagg tctatttgta attatcagct cagaattaac cataaaactg gtgtcactga 1980
agtgactgag gtccaaaatg ctgactctgc atgttataga ctacagatat caaatatggt 2040
tgctaacaat agtttacttt gagactgtag ccatccacag tatatttgct tttaagagat 2100
ggtagatggt aattcagttt tatgaaaaat aaaaatgaat tttcttccat tacaaaattg 2160
ttggattcga gtccagtcca ctccttacta gcttttctaa ctctcggtga gggatcccct 2220
cccagcccat gatcttcatt tggtaagact cctttggaac ccagttctct ctagtggatt 2280
taaatgtgat ttggttttaa aaatctcatt caaggaattt tttttttttc tggaaacaac 2340
caccgcataa acaagtaaac cggaagatac atgtggctct gaattcatat atatacacaa 2400
actctaatcc aatgtctgtc cacagtattt cctaggctag taaacttttt ggccttaacg 2460
acccctctac cctctttgtt tttttgagag agagagtctc actctgtcac ccaggccgga 2520
atgcagtggc gcgatctcgg cccgctacta cctccgactc tcaggctcaa gcgattctcc 2580
cgcctcagct tcccgagtag ccgggattac aggctcccgc caccgggcta attgtatttt 2640
tagatacggg atttcaccat gttggccagg ctggtctcga cctcctgacc tcaggtgatc 2700
cgcccgccta agcctcccaa agtgctggga ttacaggcca ccacacccgg cctacactct 2760
taaaaattat cgaaggggcc gggcacattg gctcttatct gtaatcccag cactttggga 2820
gactgaggcg ggaggatcgc ttgaggccag gagttggaga ccagcgtact caacatagtg 2880
agaccttgtt ataaagaaaa aaaaaatcca ggattaaaaa aaatctttga tttgtttggg 2940
atttattaat atttaccgta ttggaaatta aaacaatttt ttaaaatgta ttcatttaaa 3000
aataataagc ccattacttg gtaacatgaa taaaatattt tatgaaaaat aactattttc 3060
caaaacaaaa ccaaaactta gaaaagtggt attgtttcac acttcagtaa atctctttaa 3120
tgatgtggct taatagaaga tatggattct tatatctgca tctgcattca atctattatg 3180
atcacacatc tggaaaactt gtgaaagaat gggagttaaa agggtaaagg acatcttaat 3240
gttattatga aaacagtttt gacctcttgc acaccagaaa agtcttagta acctgagggg 3300
ttcctagacc acattttgag aactgtttta ggctatgcaa actggttggg gggaggttgg 3360
ggtaggcaga gagctagaag atacatttta gtgtaattct cctcatctat tcctaattgc 3420
tttggcctac atttgaaata aagcgtggag gcaaacggga taagatacat gtttgtagtg 3480
gttgttaact tcaccctaga caagcagcca ataagtctag gtagagcaga gtaaggcggg 3540
gaactatgcc gtgaccgtgt gtgatacaat ttttctagcc tgtggtgctt tttgcggcag 3600
ggcttaggag taaggttagt atgttatcat ttgggaaacc aaattattat tttgggtctt 3660
cagtcaatta tgatgctgtg tatatttagt gtttatctac aatatatgca cattcattaa 3720
tttggagcta ctcatcctat aataaatagt tgtgcattta ctcccatttt tttctgcatt 3780
tctctcctta tttataatta tgtgttacat gagggaaagg aggtgaaatt aaacattcat 3840
attatttcaa aaaatttgaa acaactaact aaaaaatatg ttttattttc tgtatggtgt 3900
ttgttataca atctgtcaat attcatgcac ctcttgggag acagtgtatg aaaagcaaag 3960
agtaacagtc acatggatta ctgattactg agatatattc acttgcatct tttttttttt 4020
ttgagacgga gtggctctgt cgcccaggct ggagtgcagt ggcgtgatct cggctcactg 4080
caagctccgc ctcctgggtt cacgccattc ttctgcctca gcctcccaag tagctgggac 4140
tacaggcgcc cgccaccacg cccggctaat ttttttatat ttttagtaga gacggggttt 4200
caccgggtta gccaggatgg tcttgatctc ctgacctcgt gatccaccct cctcggcctc 4260
ccaaagtgct aggattatag gcgtgagcca ccgtgcccgg ctcacttgca tctcttaaca 4320
gctgttttct tactaaaaac agtgtttatc tctaatcttt ttgtttgttt gtttgttttg 4380
agatggagtc ttactccgtc acccaatctg gagtgcagtg gcgtgatctg ggctcactgc 4440
aacctctgcc tcccgggttc aagtgattct ccttcctcag cctccccagt agctaggact 4500
acaggagagc gccaccacgc ctgattaatt tttgtatttt tagtagagag agggtttcac 4560
catattggcc aggctggtct tgaactcctg gcctcaggtg atccacccgc cttggcctct 4620
gaaagtgctg ggattacagg catgagccgc cgcacccggc tttctaatct ttatcttttt 4680
ttgtgcagcg gtgatacagg attatgtatt gtactgaaca gttaattcgg agttctcttg 4740
gtttttagct ttattttccc cagagatttt tttttttttt tttttttttg agacggagtc 4800
ttgctctatc gccaggctgg agtgcagtgg cgccatctcg gctcattgca acctcggact 4860
cctattttcc ccagagatat ttcacacatt aaaatgtcgt caaatattgt tcttctttgc 4920
ctcagtgttt aaatttttat ttccccatga cacaatccag ctttatttga cactcattct 4980
ctcaactctc atctgattct tactgttaat atttatccaa gagaactact gccatgatgc 5040
tttaaaagtt tttctgtagc tgttgcatat tgacttctaa cacttagagg tgggggtcca 5100
ctaggaaaac tgtaacaata agagtggaga tagctgtcag caacttttgt gagggtgtgc 5160
tacagggtgt agagcactgt gaagtctcta catgagtgaa gtcatgatat gatcctttga 5220
gagcctttag ccgccgcaga acagcagtct ggctatttag atagaacaac ttgattttaa 5280
gataaaagaa ctgtctatgt agcatttatg catttttctt aagcgtcgat ggaggagttt 5340
gtaaatgaag tacagttcat tacgatacac gtctgcagtc aactggaatt ttcatgattg 5400
aattttgtaa ggtattttga aataattttt catataaagg tgagtttgta ttaaaaggta 5460
ctggtggagt atttgatagt gtattaacct tatgtgtgac atgttctaat atagtcacat 5520
tttcattatt tttattataa ggcctgctga aaatgactga atataaactt gtggtagttg 5580
gagctggtgg cgtaggcaag agtgccttga cgatacagct aattcagaat cattttgtgg 5640
acgaatatga tccaacaata gaggtaaatc ttgttttaat atgcatatta ctggtgcagg 5700
accattcttt gatacagata aaggtttctc tgaccatttt catgagtact tattacaaga 5760
taattatgct gaaagttaag ttatctgaaa tgtaccttgg gtttcaagtt atatgtaacc 5820
attaatatgg gaactttact ttccttggga gtatgtcagg gtccatgatg ttcactctct 5880
gtgcattttg attggaagtg tatttcagag tttcgtgaga gggtagaaat ttgtatccta 5940
tctggaccta aaagacaatc tttttattgt aacttttatt tttatgggtt tcttggtatt 6000
gtgacatcat atgtaaaggt tagatttaat tgtactagtg aaatataatt gtttgatggt 6060
tgattttttt aaacttcatc agcagtattt tcctatcttc ttctcaacat tagagaacct 6120
acaactaccg gataaatttt acaaaatgaa ttatttgcct aaggtgtggt ttatataaag 6180
gtactattac caactttacc tttgctttgt tgtcattttt aaatttactc aaggaaatac 6240
taggatttaa aaaaaaattc cttgagtaaa tttaaattgt tatcatgttt ttgaggatta 6300
ttttcagatt tttttagttt aatgaaaatt taccaaagta aagaccagca gcagaatgat 6360
aagtaaagac ctgtaagaca ccttgaaggt catggagtag aacttccatc ccaagcagat 6420
gaggatttat ttaatctcaa agacctccag gaggggacat tccccaactg tccttgttaa 6480
ctcattttca gaacatattt attagcatat tttacatgta atttggatct tcatgttaaa 6540
tttaacatca gtggagatgg aaaataagca tatcgccttg tctttgaaat agccctatat 6600
tgttagattg tttcttaggc ttctttaccc tgggttaagc agtcctaata ctttagcatt 6660
tattctacat ctagtgtact aatttaaaaa aatcagttct gaaaaatttc taagaacttt 6720
cttcaagttc caagctgtga aatctagaac aggtcaaagt gccttattaa cgtactgtac 6780
tgtgtagtgt cttgaagaga cactttgcgc tgaggcaagt tctgagggca ttgggtggcc 6840
ttgggaagat atttatgcag tttagaacct ggagaattga ttagataact aatcataagg 6900
aaacgtcaca tatttttggt actataaaaa agtggagaaa taatgcctat ttgcaaagat 6960
ttgatttaaa catagaaaca actttatttg gcttccaatt ttaagaattt acagcagtaa 7020
aggggaacag tctaattgaa gtagactgcc tatgcaatag tctctgtata tttacttttg 7080
acaagttaat tcaatgtgta ctatagtttt gtttctttga agaggtttga atagtgcacc 7140
cattttaatc tgtattgcaa attcagggtt acttggcaga ctctactatt taaatcagat 7200
gtaaaaggaa gttttaatat aattcacttt atgcctgaaa gttttcctgg gattttggaa 7260
ggtgatttta ctggaaatgc tgtctgtctt ccctgaaaat ctgagaaatt ccattacact 7320
ttgtttccaa tcagaggtca tgagtgctat atgagtatat acagcatgac gtcatgaatg 7380
tgataaagtg ggttaggaaa ccttttgcta atgattgtta aaatgcaata taaatgttga 7440
agaaataaag ctaacagtta agcctttatt tgggcggaag gctgaaaaag tttataaact 7500
taaacctata actctgctta tgatttctgc caaaccagaa gacttgactc tgggaagcat 7560
tggttacctg tgaactttga aactgacggt ccctgacgta gtttagtcac ctgggaaaag 7620
gtatctgaga ttatctctta tctcccaagt tacagtgagt ctctgaggga actgacacat 7680
tacattaagt tcttggtgta gttaaactgt aagaaaggca ggagaactta gtagttaaat 7740
agttggttaa atggaaatgc tgactccatg ttattgtaaa aagttaaaaa tttaggagga 7800
tatggggatt tcactgccat tgcaggtttt gattggtatt taccaatccg tgtgggtcag 7860
agagaaaatt agaaaggata tgactgcaca ttttggaatt attagcagtt tttctacatt 7920
taaaatggaa ataaattttt taaaaattta aatcaagtaa tactgtattt tttggtgatt 7980
tagatttttc aaaatttaca ctaagagata gtaaggaggg tggctattgt ttctttcaat 8040
aatgtctctg agaggttgta actcatctaa ggatacgtag ctaataagtg gtaggatttc 8100
aatttaaatt ctctgagacc aagttaagta gaatttgcac tgtactcttg tataactttt 8160
taaaactgaa aattagctat ctttcaaatt aagaaaatat ttactaatgg agactaattc 8220
agatttgtaa gtataccaaa atttgaactt agcctgctat ctaatggcaa cttagtggca 8280
gaggtatgat gtaaaatcat tcaggtatga cacatagatg gagtatgttt gtattcgagg 8340
ctgtgcacat aatcaccttt acttgtattg tgaagtatat attgttatct tttatgaagc 8400
ccactaaaga gataatgaaa tacctcgtta ttagggcaag attattgaaa actcaaaata 8460
gcccccaaac acaatacttg gctagaaata tataccttta tagttcagag atcatttatt 8520
atcaaaaccc tgaagttttt tttctaaggt aaaatttggt ggaagaggaa aagtctcgtt 8580
ttaaaaaaat gtaggtagtt acagagatca gaatgattag ttgatcactt accaaatata 8640
tattaagtat ctactgtata taatatgcta gtaagaataa atatagcagg aagtattttt 8700
tcccaggctc taattgtttg acatcagcat gcttttattg tggcacttat aattcagttc 8760
aagtattatg cccctctttg atggaacagt ttcctattca gtaaggaaga ccagattaat 8820
cattggattg gtttgtttca tctttagtgt tctgagctgt agagtattta tttaccaagg 8880
tttattttaa tttttatttt atttttattt ttccatgttc attgtagaat tcattttacc 8940
tacgaatgaa gtatgtagat tatagagaga aaatttgtaa aattaaactg atactgaaga 9000
ctggtataag aaaagcctta tgtaatttgt aagctgctat tcttctgagt ttatacatat 9060
atctttagta atcaatgagg gatggttggg tgactgccct ccaggggaca tttggcaaca 9120
tctggagatg tttttggttg ccacaacttg gggagagagt actgctactg gcatctattg 9180
agtagatgct attactttaa atggcaaagc tgcagttacc tttgcaccaa cctaatatta 9240
aacttcctgc agtgcacggg aaagccccca caacagggtt atctgacccc aaacctcaat 9300
ggtgttaaga tccaaacctt gatatgttaa cctgtagctt taaacatcct ttaaattgtc 9360
aaattcatgt ccctgacata aggtttatgt tagattttca agtataacaa agatttaaac 9420
tttaactttt gtacgttaat gatatgttag cttactccag tcttctatta aaacattctg 9480
tttttaaaat cagagacaca cagcaatttt ataaatcatt tctcttcaag gctgtgaagc 9540
tctccccact tttgtgagtg ccctctactg gtcaaattat ttgctttata acaagtaaca 9600
gtgaaatcct aagtttgtgt agtttcgctg tttaaattat gggtggcatc aatttataaa 9660
tatattcgtt ttatttaaaa gtcttatatg attgatttcg tatcattttt gctctctgct 9720
aatattaata taaagattac tgtctgtatt agttaggcct aactaagtag gtgagtatag 9780
tgaactaaga aaggaaacga ggcagtatat aagaaaatag ggtggttcag ttgttaacac 9840
ttactgagct tactttgttg aagggactaa aaggcagcag tgtggctctc tgagcttctt 9900
tgcatgcact caggagctgc ttaatggagt ccaaggcttg gtggtgtgtt acaggggatg 9960
ataggagggt cctattcaga agtggcaaat tgtgaaagtg cacattttgt agagttttat 10020
aggactgtag aatagttgtg agcacctgat ttttagaata aacagaaaac tcaggtactg 10080
tatttaggtc aaattaagaa taagtattta ttaagacctg aatataaaac tttactggtc 10140
atggtttttt tctaccttgg gtttttataa atccaaagat ttaaaaacat acaaatggaa 10200
gttggtaatg gaattaagtg aaaggaaaaa atgattttat ggtttggaat ctcctaagat 10260
tctggtttta acaatacaac taattcctta atcctagaaa tgttcttcac tgcccacttt 10320
gtaccatgca gtcttcctgt gggctagaga tacactgagg cgcaaaacag accagattcc 10380
tgccttcatg gagcttatta gttttaggta tctctagatt tcttgtaata cctattacaa 10440
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cattacattt ctggcgtctc ttaaccatta ttatttcata atgtgtaggt tatggaacag 10740
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ttttgagatg gagtctcgct ctgttgccca ggctggagtg cagtggcgcg atcttggctc 11040
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gtattacagg catgcaccac cacacccaat tactttttgt atttttagta gagacggggt 11160
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gcaaaattat ttcaactgta ggtgcccagt gattttgtaa ggagaagata ctgtttctga 13080
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attaatctat gtataaagtc ctgtatgcag ttttacctac tttcacagct gaaggaacaa 13260
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ctgagcacca gacatgtatg tatatcaaga tgcctgcagg tcatatccac caggacaacc 13440
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agccttagag atcctctaag cctttgagat ccccaaaccc tggactgcgg actggtaccc 14880
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tgcccatgca aggatctagg ttgcatactc cttaggagaa tctaactaat gcttgatggt 15060
ctgaggtgaa acagtttcat cctgaaatca cccccaactc ggtccttgga aaaattgtct 15120
tccacgaaac tggtccctga tgccggaaaa gttggggacc gctgttctaa gctaaagtta 15180
tatggagctc cttggttctg tgtcctcaac atgctgttct atgtttttta cattctgttt 15240
gctccttcct gcttggaatg tccttcccct ccccgtcttt cttaatgcat acaaagttga 15300
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agcctgggcg acagagcgag actccatctc aaaaaaaaaa aaaaaagata cattaatact 21180
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tatccttgtt gtattttatc ggcaagttgt tttatgccct aacttttggg gtcttgatca 29160
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tcatttagaa gttctcatcc atgtaaatca gaggctggca aatattttct gtaaagggcc 29280
aagatagtaa atgttttagg ctttgagggc cacaagtggt atctgttgca ttttttttta 29340
attatgaccc tttaaaatgc aaaaatcgtt gttagcttgt gcatagtata aaaataggct 29400
ggccgcatgc tgtggctcat gcctgtaatc ccagaaatga ggtgggaagc cgaggtgggc 29460
acaccacctg aggtcaggag ttcgaggcca gcctggccaa cgtggttgaa accccgtctc 29520
tactaaaaat acaaaactta gccaggcgtg gtggcgggtg cctgttatcc tggctactca 29580
aggggctgag gcagtagaat tgcttgaacc tgagaggcag aggctgtagt gagcccagat 29640
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aaggctgtgg ctgcatttgg tccattggct gtaatatgct gattcctaat tctctgggta 29760
actttagtgt ttgattagct actagaagtt aggttaaact tttgtatttt acaggctaac 29820
tttaataatc ttaaagtaaa acttaacata gttcatggaa aggaaataga aattttaccc 29880
tagtactctt tttttttttt tttttttttt ttgaggcaga gtctccctct gtcacccagg 29940
ctggagtgca gtggtgggat cttggctgat tgcaacctcc tcctcctggg ttcaagcaat 30000
tcttgtgcct cagcctcccg agcagctggg actacaggca cgcaccacca cacctgactg 30060
atttttgtat ttttagtaga gacagggttt cgccatgttg gccaggctgg tcttgaactc 30120
ctggcatcaa gtgatcctcc catctgagcc tcccagtgtg ctgggattac agacgtgagt 30180
cactgtgcct ggtctctagt attttttttt tttttgagac ggtctcactg ttgccaggct 30240
ggagtgcagt ggcgcgatcc tggctcactg caacctccgc ttcccggatt caagcgattt 30300
tcctgcctca gcctcctgag tagctgggac tatgggtgca caccaccacg cccagctaat 30360
ttttgtattt ttagtagaga cggggtttca ccatgttggc caatatggtc tcaatctctt 30420
gacctcgtga tctgcccgtc tcggcctccc aaagtgctgg gattacaggc gtgagccact 30480
gtgcccagct gtacttttta agataagaat tgcagggtat atatttttac caacttaata 30540
acttataatt ttaaaaagct aattacttgg ctagaatata atgcgttaca tattctttac 30600
actcagttca gtccatatct gaaaggcaaa tagaattatt ttctgctagt acattgtgta 30660
gtccctatgt tcctagtgta taaggactgt tacctagttc acatttatct gggttgttga 30720
cagattttcc tggtcccttt ggacagtgca tggccatgtt ggcaaaagct gtcaaaattg 30780
aaacattgac accatgagaa ttgtgtgttt tccagtctgc taaaatcaaa agtgggaggg 30840
ttcagtaagg tgaataacag aagcagagtt ttcggggtat ctgttactcc tcattcggct 30900
tttctgctct ctgggggtct caatttaaat ataatgtgaa aattagtttt acgaacctaa 30960
aaatgttgag tgattcattt cctggttttg ttgttaattt ctagatattt aaattaattg 31020
ttagaagaac cccgttaaag aatgctttgc aaaacaacct ccttatgtgc tatgtctctg 31080
tttaatagta gttgagtttg tgtacatgag atcaatattt tgaactatag ctttttatga 31140
gttaaaaatt gacggaacag ttactgtgca cttgctgtgc accatggtag tctcccaagt 31200
agtggttttt ctgcatttca atagtacatg agataggctg tgggtggcaa ggtttcttga 31260
gaaagtgagg gatgcacagt tgggttttag aatacatctt gttcctccat gcccttcccc 31320
accaaaaggc tggtagtctt gcatttgtat atagttaggg tatttgatgt gttgcttcct 31380
tgacagagtt ttgcaagaat ttgcagattt aacaggaaca aaaacttact taaaacaaaa 31440
tctcttagta aaagcatagt ctagcaagat ttagaatgat actttggcta acagtacttt 31500
ctctatatgg agtgctttgt ttccatagcc tcacaagtat gttttcagat aatagttgag 31560
ttgaaaatgt tgtcaatctc ttgattttaa aaaatttaca tatttaaagt tgtatacttt 31620
tgttcctacg tattttcagt tgttcttaaa gtttaataag tgacatttga aaatgagtat 31680
atgtgtataa aaacaaaagt aggctaggca cggtggctca tgcctataat cctagcactt 31740
tgggaggctg aggcaggcgg atcacaaggt caggagtttg agaccagcct gggcaatatg 31800
gtgaaacccc cctctactaa aaatacaaaa attagctggg tgtggtggtg catgcctgta 31860
gtcccagcta ctcaggaggc tgaggcagga gaatcgcttg aacccggagg tggcggttgc 31920
agtgagccga gattgcacca ctgcagtcca gcctgggcgg cagagcgaga ctccatctca 31980
aaaaaaaaaa acaaaaaaag aaaaagttaa aaaaaaacaa aaaaccccca caaaatgagt 32040
atatgtggca acaagtccta ttctcaaaaa aattattgtg tgctagttaa gagcttaatg 32100
agtagccagt cggtattaaa tatctgtttc agctatattt tatctttaaa aattatctac 32160
agattttgga atgtgaaaaa ctagtgtttt gtttcatagg tatatactgt aggcatttta 32220
aaaataagag ccagtgccag tggtttacag tgtacacaag gataatgttc tcatgttctc 32280
ttgatgtcag tatgacttta aagcatatta tcaagaaata actaagtctg aaaaactgtg 32340
gtaaataact ggtactctaa aacctaagtt tcttattact aaaaataaga aatggtaaaa 32400
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aaaatcatat atttcactat tggtggtggg gatgctgtca ctgaaaaagt agacacattc 32580
atattgattt tagaaataag ttaaaatcaa aatttgcttc tgctaaatta gtagaggacc 32640
aatactgttt ttctccttca tagtatgttt tggtacttct acattgacat tataactttt 32700
ttttttttaa acagaaatag aagtttaca 32729
<210> 12
<211> 188
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> KRAS Wild-type protein Isoform 2B
<400> 12
Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Gly Gly Val Gly Lys
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Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Ile Gln Asn His Phe Val Asp Glu Tyr
20 25 30
Asp Pro Thr Ile Glu Asp Ser Tyr Arg Lys Gln Val Val Ile Asp Gly
35 40 45
Glu Thr Cys Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Gln Glu Glu Tyr
50 55 60
Ser Ala Met Arg Asp Gln Tyr Met Arg Thr Gly Glu Gly Phe Leu Cys
65 70 75 80
Val Phe Ala Ile Asn Asn Thr Lys Ser Phe Glu Asp Ile His His Tyr
85 90 95
Arg Glu Gln Ile Lys Arg Val Lys Asp Ser Glu Asp Val Pro Met Val
100 105 110
Leu Val Gly Asn Lys Cys Asp Leu Pro Ser Arg Thr Val Asp Thr Lys
115 120 125
Gln Ala Gln Asp Leu Ala Arg Ser Tyr Gly Ile Pro Phe Ile Glu Thr
130 135 140
Ser Ala Lys Thr Arg Gln Gly Val Asp Asp Ala Phe Tyr Thr Leu Val
145 150 155 160
Arg Glu Ile Arg Lys His Lys Glu Lys Met Ser Lys Asp Gly Lys Lys
165 170 175
Lys Lys Lys Lys Ser Lys Thr Lys Cys Val Ile Met
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<210> 13
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> KRAS Wild-type mRNA
<400> 13
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ctttctttgt gtatttgcca taaataatac taaatcattt gaagatattc accattatag 480
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aaaattacaa ggcaatggaa actattataa ggccatttcc ttttcacatt agataaatta 1440
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taaaataaaa ataaaaacaa tccttttgat aaatttaaaa tgttacttat tttaaaataa 2220
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tcatgttaaa agaagtcatc tcaaactctt agtttttttt ttttacaact atgtaattta 2400
tattccattt acataaggat acacttattt gtcaagctca gcacaatctg taaattttta 2460
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gacctaatca ctaattttca ggtggtggct gatgctttga acatctcttt gctgcccaat 2820
ccattagcga cagtaggatt tttcaaacct ggtatgaata gacagaaccc tatccagtgg 2880
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actcctggta acagtaatac attccattgt tttagtaacc agaaatcttc atgcaatgaa 3000
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gaactcctga cctcaagtga ttcacccacc ttggcctcat aaacctgttt tgcagaactc 3300
atttattcag caaatattta ttgagtgcct accagatgcc agtcaccaca caaggcactg 3360
ggtatatggt atccccaaac aagagacata atcccggtcc ttaggtagtg ctagtgtggt 3420
ctgtaatatc ttactaaggc ctttggtata cgacccagag ataacacgat gcgtatttta 3480
gttttgcaaa gaaggggttt ggtctctgtg ccagctctat aattgttttg ctacgattcc 3540
actgaaactc ttcgatcaag ctactttatg taaatcactt cattgtttta aaggaataaa 3600
cttgattata ttgttttttt atttggcata actgtgattc ttttaggaca attactgtac 3660
acattaaggt gtatgtcaga tattcatatt gacccaaatg tgtaatattc cagttttctc 3720
tgcataagta attaaaatat acttaaaaat taatagtttt atctgggtac aaataaacag 3780
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ttgctatgtg aaactacaga tctttggaac actgtttagg tagggtgtta agacttacac 3900
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taattacctt tatgtgaact ttgaatggtt taacaaaaga tttgtttttg tagagatttt 4080
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ccttgttgaa gtttttttaa aaaaagctaa attacataga cttaggcatt aacatgtttg 4200
tggaagaata tagcagacgt atattgtatc atttgagtga atgttcccaa gtaggcattc 4260
taggctctat ttaactgagt cacactgcat aggaatttag aacctaactt ttataggtta 4320
tcaaaactgt tgtcaccatt gcacaatttt gtcctaatat atacatagaa actttgtggg 4380
gcatgttaag ttacagtttg cacaagttca tctcatttgt attccattga tttttttttt 4440
cttctaaaca ttttttcttc aaacagtata taactttttt taggggattt ttttttagac 4500
agcaaaaact atctgaagat ttccatttgt caaaaagtaa tgatttcttg ataattgtgt 4560
agtaatgttt tttagaaccc agcagttacc ttaaagctga atttatattt agtaacttct 4620
gtgttaatac tggatagcat gaattctgca ttgagaaact gaatagctgt cataaaatga 4680
aactttcttt ctaaagaaag atactcacat gagttcttga agaatagtca taactagatt 4740
aagatctgtg ttttagttta atagtttgaa gtgcctgttt gggataatga taggtaattt 4800
agatgaattt aggggaaaaa aaagttatct gcagatatgt tgagggccca tctctccccc 4860
cacaccccca cagagctaac tgggttacag tgttttatcc gaaagtttcc aattccactg 4920
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gtgaagtgat ctaaaatttg taatattttt gtcatgaact gtactactcc taattattgt 5280
aatgtaataa aaatagttac agtgac 5306
<210> 14
<211> 189
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> KRAS Wild-type protein Isoform 2A
<400> 14
Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Gly Gly Val Gly Lys
1 5 10 15
Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Ile Gln Asn His Phe Val Asp Glu Tyr
20 25 30
Asp Pro Thr Ile Glu Asp Ser Tyr Arg Lys Gln Val Val Ile Asp Gly
35 40 45
Glu Thr Cys Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Gln Glu Glu Tyr
50 55 60
Ser Ala Met Arg Asp Gln Tyr Met Arg Thr Gly Glu Gly Phe Leu Cys
65 70 75 80
Val Phe Ala Ile Asn Asn Thr Lys Ser Phe Glu Asp Ile His His Tyr
85 90 95
Arg Glu Gln Ile Lys Arg Val Lys Asp Ser Glu Asp Val Pro Met Val
100 105 110
Leu Val Gly Asn Lys Cys Asp Leu Pro Ser Arg Thr Val Asp Thr Lys
115 120 125
Gln Ala Gln Asp Leu Ala Arg Ser Tyr Gly Ile Pro Phe Ile Glu Thr
130 135 140
Ser Ala Lys Thr Arg Gln Arg Val Glu Asp Ala Phe Tyr Thr Leu Val
145 150 155 160
Arg Glu Ile Arg Gln Tyr Arg Leu Lys Lys Ile Ser Lys Glu Glu Lys
165 170 175
Thr Pro Gly Cys Val Lys Ile Lys Lys Cys Ile Ile Met
180 185
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<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> KRAS fragment
<400> 15
Gln Tyr Arg Leu Lys Lys Ile Ser Lys Glu Glu Lys Thr Pro Gly Cys
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20 25
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<211> 24
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> KRAS fragment
<400> 16
Lys His Lys Glu Lys Met Ser Lys Asp Gly Lys Lys Lys Lys Lys Lys
1 5 10 15
Ser Lys Thr Lys Cys Val Ile Met
20
<210> 17
<211> 12303
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NRas Genomic Sequence
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ggggccggaa gtgccgctcc ttggtggggg ctgttcatgg cggttccggg gtctccaaca 60
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tgaagtttct aaaacctgtc cagtttttaa cagttctgta aactattgca aactcagtgt 960
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tagtagcgag actgtctgat tgtatgggag ataataggat ggagataaag gattcagaga 1080
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gtagcaagaa cttgagattt ttagtcttta tgcctaggat tttggtccct gtttgcagtt 1200
tatttagttg tgtgatattg agcaactgaa tctctcccaa cctcattttc ctcatgtttt 1260
aaattaccat aaacttgtcc tgcctaccac acagggatgt tatggaaagt taaataatat 1320
atttaagtta tttatgaatg gtaaagcact atgtaatagt acttagggat tctattgtta 1380
ttatgagagt tcatggtaca gattgtcttc agtaagtggc acctaaggct ctttaaataa 1440
agggttttgc cggacacggt ggctcacgcc tgtaatccca gcactttggg aggctgaggc 1500
aggcggatca caaggtcagg agttcaagac cagcctgatc aacatggtga aaccccgtct 1560
ctactaaaaa tacaaaaatt agctgggtgt ggtggcaggc acctgtaatc ccagctactc 1620
aggaggctga ggcaggagaa tcgcttgaac cagaggcaga gggtgcagtg agccgagatc 1680
acaccacaga cctccagcct gggcaacaga gcgagacttc gtctcaaaaa ataaataaat 1740
agataaataa ataaagggtt ttgtaatttt gttcagttta gaaatgccta actttagaga 1800
ttattttaat caacacctgg cctccctacc atctggctac tcgtgtttaa ttgatgaaaa 1860
ctaactctaa tgtagccact ataaaaaatt ggttgctaac ccttggcaaa atctttattt 1920
tgagcttaac agctttaata ttttacatga aatgtttaat attttaatta aatattttta 1980
aatgtttgat ttattgagca atttacataa gtaaaataca taaattttat gtctacagcc 2040
cagtgctttt tgcgtttcta tatagtcatg tagctaccac ccagataaca gtatagagca 2100
cttccagtac tccagagagt tctccaagtg tgatgacatt aaaatacaag taaaagtcct 2160
gttgccataa aaccaaaatg aaagtatttt ttatatgatc tatgcatgtt tgtcttcctg 2220
agaaattaaa cataactata ccttgtttgg aacctttaag aatttgattc aggaatattt 2280
cccaaaggta catctgtcat gataaaaaaa aaaccttctc tgaaacaaag gtatttgtat 2340
atttagtcat aaacacaaat gatgtatata gggccaggtt ataattggtg gaggtatgtt 2400
tagatttctt taagtaaaat aaacagcaca aataaaacag tccagttcat agcttagtga 2460
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ccctccctgc ccccttaccc tccacacccc caggattctt acagaaaaca agtggttata 2820
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aaaagatagg ccaggcacag tggctcacac ctggaatgtc agtgctttgg gaggccaagg 3360
cgggaggatc actttcagcc caggagttgg agaccagcct gggcaacaga gcaagaccct 3420
gtctctacaa aaataaaaat aaaaaaatta gtcacacatg gtggcagcta ctcgggaggc 3480
agaggtggga ggatcacgtg agctcaggag gtcgaggcat gctcactcca ctgcactgct 3540
gcactccagc ctaatcaaca gagcaagatt ctgtctccaa aaaaaataaa aaataaaatg 3600
ataggagtaa gcaaatagga agtccataaa gatgaaaaca aagcaaggga acataaagat 3660
agactttgtc catagaacca taaagtttca aagctagatt ggaccataaa aattctagta 3720
caatattctt attttgcaga atcagaaaca gagttcagaa tgtcgtttgt taggttttgg 3780
agtcaggatt gttattagta gcagagccag gaccaaaaac ccaaagctcc tttttcttag 3840
cacagtgttc ttaaacagaa taatataatg gttaagaatg agaactctgc ctggattgaa 3900
acctagctct gtttattagc gacgtgactc aggggctatg tggctttcct aacctataat 3960
atggaaataa taatacctac ctcatagagt tgtgaagatt acagttttaa taaatacgca 4020
aatcactcag aatagtgcct ggcacacagt aaatgctact taagtgttct gcctaaaggc 4080
ttgagtcttg gcttattttc tatccatgtg aagatgtctg ctctcaaaag cagattggtc 4140
caacactgaa ttcaagtgtt cttttcctaa cctgttgtac ttcccatttt ttttttgtct 4200
aaaagtaata gcagtactta ataaaatgcc cacacttggc atgcatctaa taaatgtttt 4260
ttgaatttct agaagtcatt tttcttcttt cttacaagaa atttattcat ttttctatat 4320
gccttagctc aaaccaaaga gtatttaaaa catcttatga aaatgcatat agtagagcaa 4380
gataagatta atgaaaaata ggcttaagtg agaccaaaaa aataagggta aaataaacaa 4440
atttaggagt gagcatattc tgtgattgtg catgaagttc cagtggcttt ctaaaggtgg 4500
actacaaatt tggtcactgt tgtgaaaagg aaagtagcca gctgaaagat tcagtatctg 4560
tatgctgaaa gccgttaagt tgctcggact agaaggaaat tttcccatgg atcctcaaag 4620
aggcttgttt aatgtaaaaa tcagtagtaa cctgacagtg acatggtcca ggtactttag 4680
gctgtcttat cccttaatgt aggctattac catcaagcac agttttgcaa atagccagtg 4740
gaatgtagtt cagatacatg actttgtggg taatccaggg gtagagacta aaacagtact 4800
gtgcagtatg tggttattta cagttaatta agattaaata aaatttaaaa attagttcct 4860
tgactaccaa atgctcaata gccactagta ggtaccatgt tgaacagtac agatatagac 4920
catttccatc atcacataaa gtactgttgg attgtgttgg tcaagacaat ctaaagcaat 4980
tgtttcccag gtgtgctgtg tggtgtgcct tacatgtcat tgaaaggggt gctgtcagga 5040
gttctagatg cttcagcctc cctttactaa gagcagttct tatgttttct attttatcgc 5100
ttgggcttcc agatacaatg ttttgtttta ggtttgtttt ttttgtttgt ttgttttttt 5160
ttttttgaga cggagttttg ctctggttgc ccaagctgga tggagtacgg tggtgcgatc 5220
gcggctcact gcaacctccg cctcccgggt tcgagagatt ctcctgcctc agcttcccga 5280
gtagctggaa ttacaggcgt ccaccaccat gcctgactaa ttttttttgt atttttagta 5340
gacttggggt ttcaccatgt tggccgggct ggtttcaaac tcctgacctc aggtgatcca 5400
cccgcctcgg cctcccagag ggctgggatt acaggtgtga accaccgtgc ccggcctgtt 5460
ttagtttttt agagatggag tctccctctg ttgcccaagc cagagtgcgg tggcatgaca 5520
ctctcagggt tcaacctctc agggatcaag ggatcctccc acctcagctt cctgagtagc 5580
tggaaccaca ggcacatgtg ccaccatgcc cagctaattt ttgtattttt tgtagaagca 5640
aggtttcacc atgttgccca ggctggtctc ggactcctag gtcaagtgat cctcccacct 5700
caatctccta gagtgctaag actataggcg ggagtcacca tgcccagctt catctacaat 5760
ttatttgaag aaaatgtttg agcaccaccc atcttgaaaa gtgatagact gccttccatt 5820
aaatactgtc acacctagtt atttagcagc agtgagcttc actttttata ctttagacct 5880
taatctaaag ggtgatttct agttgccagt taaatccaga gccaagctct ttggagaatc 5940
caggagcctc actaggtcat gtatcaggat aaaataccca tccactccca ttagaaggtg 6000
agcttgtact tatggcttcc tgatggctgc tgcaacaagt ctaaagcagt ctccttagta 6060
tacaatgtct tctctaagtg gtagaaaaaa gcaaaaatac tacaagttaa tagggctaca 6120
taaaatttgc tagtttcttt tttgccctag ccatttattc cttcctgaaa tcttgtctct 6180
ctctcgctct ctctttctct cgctctcact ttctttctct ttttcttttc tcttttcttt 6240
tctttcttcc ctttcttttc tttctttttt cctgttgccc aggctggagt gcagtggaac 6300
aattatggct cactgcagcc ttgacctttc tggacccagg tgatcctccc acctcagtct 6360
cccaattagc tgggactaca ggcatgcgcc accacaccca gctataatat atattgtata 6420
tatatttttt atttataaat atatataaat atatatttat atgtgtaaat tatatatatt 6480
tatatattat aaattatata taaatatata tttatatata atatatataa tatatattta 6540
tttttatata ttttatatat attttttggg gggggttggg ggggatggag tctcactctg 6600
tcgcccaggc tagagtgtag tggcgtgatc ttggctcact gcaatcttcg cctcccaggt 6660
tcaagcgatt ctcctgcctc agcttcccga gtagctggga ctataggcgc ctgccaccac 6720
acctggctaa tttttgtatt tttagtagag atggggtttc accatattgg ccaggctggt 6780
cttcaactcc tgaccttgtg atctgcccac ctcaacctcc caaagtgctg ggaatacagg 6840
catgagccac tgcacccagc ctaatctttg tatttttttg tagagaccgg gttttgccat 6900
gttgcccagg ctaatctcaa actcctgggt tcaagcagtc tgccctcctc agcctcccaa 6960
agtgctgaga ttgcaggcat gagccactgt acccagccta atcttgtttt tcttatgttc 7020
tgataatata ttcccgtttt tagggagcag attaagcgag taaaagactc ggatgatgta 7080
cctatggtgc tagtgggaaa caagtgtgat ttgccaacaa ggacagttga tacaaaacaa 7140
gcccacgaac tggccaagag ttacgggatt ccattcattg aaacctcagc caagaccaga 7200
caggtatggt acagctttca gcatttgtgc aagagtttgc atcagttgat taactctggt 7260
agagatgtga tccatattca tattctttgt tgttatgcat ttttttcatt tttatttttt 7320
tattttttat ttttttttag gcagagtctc actctatctt ctaagctgga gtgcagtggt 7380
gtgatctcag ctcactgcag cctctgtctc ttgggttcaa gtgattctcc tgcctcagcc 7440
tcccaagtag ctgggactac gggcacatca tcatgcccgg ctaatttttg tacttttagt 7500
agagacaggg ttttaccatg ttgcccaggc tggtctcgaa ctcctggcct caagcaatcc 7560
tcccacctgg gcctcccaga gtgctgggat tacaggtgtg agccaccacg cccagcctgt 7620
tgttaggcat ttttagtagt gttctttttc ttaacgcttg tttaaaccca aaatgaactt 7680
actaatattc tgttatggca tgtttactcc tgcattaaca tccacaaata tttcttggga 7740
agatccttga ctaaaaatat ttataaacat tagttatttc tctgtcaaca ccagcccgtt 7800
tatggcttaa gcctcctgaa tggagtcttt agtttaatgt agttttgttc cgtgtttctc 7860
acattaccct tttcctttgc atgaatgttt atttggcaaa atgtgccatt tttatatcag 7920
cctgttcttg tgattcaata ggaatgtgaa atttagtgtt ctcttcctta aatcaccata 7980
ttttatttta tcagctattc gtttagtaat tggaatctta tgtccacata aagagataca 8040
aatgcaagag agcttataat ttggattgtg tccgttgagc tagctctctc attttttttc 8100
attttttcct tttatagggt gttgaagatg ctttttacac actggtaaga gaaatacgcc 8160
agtaccgaat gaaaaaactc aacagcagtg atgatgggac tcagggttgt atgggattgc 8220
catgtgtggt gatgtaacaa ggtgagcata tggtttcttg gcataattac aaatcttagt 8280
atatagtatt gggcaatttg gaggagtgct ggtgttattg tctatatgtt ttttgagttt 8340
ctgcctatcc tcttctgcac attttccata tgacaccctt tctgaaagta ctgaggtcta 8400
aagtgtttaa aacatttgat tattccacag gtatctttat atttttggta acattagaaa 8460
ttataagaca ttatttatga aatgtaggca taccctattc ctggcaatga ccaggaattt 8520
gaaggatcac tactttgaaa ctagttaata aggacatggt ttctgttctt tttttacaga 8580
tacttttaaa gttttgtcag aaaagagcca ctttcaaggt aggacaagtt tggaaatgta 8640
ttctcattcc tgttaatttt gtatatttgt ttttcttata ctctgaatgt gtcacttata 8700
caaattctgt ttctatttca gctgcactga caccctggtc ctgacttccc tggaggagaa 8760
gtattcctgt tgctgtcttc agtctcacag agaagctcct gctacttccc cagctctcag 8820
tagtttagta caataatctc tatttgagaa gttctcagaa taactacctc ctcacttggc 8880
tgtctgacca gagaatgcac ctcttgttac tccctgttat ttttctgccc tgggttcttc 8940
cacagcacaa acacacctct gccaccccag gtttttcatc tgaaaagcag ttcatgtctg 9000
aaacagagaa ccaaaccgca aacgtgaaat tctattgaaa acagtgtctt gagctctaaa 9060
gtagcaactg ctggtgattt tttttttctt tttactgttg aacttagaac tatgctaatt 9120
tttggagaaa tgtcataaat tactgttttg ccaagaatat agttattatt gctgtttggt 9180
ttgtttataa tgttatcggc tctattctct aaactggcat ctgctctaga ttcataaata 9240
caaaaatgaa tactgaattt tgagtctatc ctagtcttca caactttgac gtaattaaat 9300
ccaactttca cagtgaagtg cctttttcct agaagtggtt tgtagacttc ctttataata 9360
tttcagtgga atagatgtct caaaaatcct tatgcatgaa atgaatgtct gagatacgtc 9420
tgtgacttat ctaccattga aggaaagcta tatctatttg agagcagatg ccattttgta 9480
catgtatgaa attggttttc cagaggcctg ttttggggct ttcccaggag aaagatgaaa 9540
ctgaaagcac atgaataatt tcacttaata atttttacct aatctccact tttttcatag 9600
gttactacct atacaatgta tgtaatttgt ttcccctagc ttactgataa acctaatatt 9660
caatgaactt ccatttgtat tcaaatttgt gtcataccag aaagctctac atttgcagat 9720
gttcaaatat tgtaaaactt tggtgcattg ttatttaata gctgtgatca gtgattttca 9780
aacctcaaat atagtatatt aacaaattac attttcactg tatatcatgg tatcttaatg 9840
atgtatataa ttgccttcaa tccccttctc accccaccct ctacagcttc ccccacagca 9900
ataggggctt gattatttca gttgagtaaa gcatggtgct aatggaccag ggtcacagtt 9960
tcaaaacttg aacaatccag ttagcatcac agagaaagaa attcttctgc atttgctcat 10020
tgcaccagta actccagcta gtaattttgc taggtagctg cagttagccc tgcaaggaaa 10080
gaagaggtca gttagcacaa accctttacc atgactggaa aactcagtat cacgtattta 10140
aacatttttt tttcttttag ccatgtagaa actctaaatt aagccaatat tctcatttga 10200
gaatgaggat gtctcagctg agaaacgttt taaattctct ttattcataa tgttctttga 10260
agggtttaaa acaagatgtt gataaatcta agctgatgag tttgctcaaa acaggaagtt 10320
gaaattgttg agacaggaat ggaaaatata attaattgat acctatgagg atttggaggc 10380
ttggcatttt aatttgcaga taataccctg gtaattctca tgaaaaatag acttggataa 10440
cttttgataa aagactaatt ccaaaatggc cactttgttc ctgtctttaa tatctaaata 10500
cttactgagg tcctccatct tctatattat gaattttcat ttattaagca aatgtcatat 10560
taccttgaaa ttcagaagag aagaaacata tactgtgtcc agagtataat gaacctgcag 10620
agttgtgctt cttactgcta attctgggag ctttcacagt actgtcatca tttgtaaatg 10680
gaaattctgc ttttctgttt ctgctccttc tggagcagtg ctactctgta attttcctga 10740
ggcttatcac ctcagtcatt tcttttttaa atgtctgtga ctggcagtga ttctttttct 10800
taaaaatcta ttaaatttga tgtcaaatta gggagaaaga tagttactca tcttgggctc 10860
ttgtgccaat agcccttgta tgtatgtact tagagttttc caagtatgtt ctaagcacag 10920
aagtttctaa atggggccaa aattcagact tgagtatgtt ctttgaatac cttaagaagt 10980
tacaattagc cgggcatggt ggcccgtgcc tgtagtccca gctacttgag aggctgaggc 11040
aggagaatca cttcaaccca ggaggtggag gttacagtga gcagagatcg tgccactgca 11100
ctccagcctg ggtgacaaga gagacttgtc tccaaaaaaa aagttacacc taggtgtgaa 11160
ttttggcaca aaggagtgac aaacttatag ttaaaagctg aataacttca gtgtggtata 11220
aaacgtggtt tttaggctat gtttgtgatt gctgaaaaga attctagttt acctcaaaat 11280
ccttctcttt ccccaaatta agtgcctggc cagctgtcat aaattacata ttccttttgg 11340
tttttttaaa ggttacatgt tcaagagtga aaataagatg ttctgtctga aggctaccat 11400
gccggatctg taaatgaacc tgttaaatgc tgtatttgct ccaacggctt actatagaat 11460
gttacttaat acaatatcat acttattaca atttttacta taggagtgta ataggtaaaa 11520
ttaatctcta ttttagtggg cccatgttta gtctttcacc atcctttaaa ctgctgtgaa 11580
tttttttgtc atgacttgaa agcaaggata gagaaacact ttagagatat gtggggtttt 11640
tttaccattc cagagcttgt gagcataatc atatttgctt tatatttata gtcatgaact 11700
cctaagttgg cagctacaac caagaaccaa aaaatggtgc gttctgcttc ttgtaattca 11760
tctctgctaa taaattataa gaagcaagga aaattaggga aaatatttta tttggatggt 11820
ttctataaac aagggactat aattcttgta cattattttt catctttgct gtttctttga 11880
gcagtctaat gtgccacaca attatctaag gtatttgttt tctataagaa ttgttttaaa 11940
agtattcttg ttaccagagt agttgtatta tatttcaaaa cgtaagatga tttttaaaag 12000
cctgagtact gacctaagat ggaattgtat gaactctgct ctggagggag gggaggatgt 12060
ccgtggaagt tgtaagactt ttattttttt gtgccatcaa atataggtaa aaataattgt 12120
gcaattctgc tgtttaaaca ggaactattg gcctccttgg ccctaaatgg aagggccgat 12180
attttaagtt gattatttta ttgtaaatta atccaaccta gttcttttta atttggttga 12240
atgttttttc ttgttaaatg atgtttaaaa aataaaaact ggaagttctt ggcttagtca 12300
taa 12303
<210> 18
<211> 189
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NRas Amino Acid Sequence
<400> 18
Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Gly Gly Val Gly Lys
1 5 10 15
Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Ile Gln Asn His Phe Val Asp Glu Tyr
20 25 30
Asp Pro Thr Ile Glu Asp Ser Tyr Arg Lys Gln Val Val Ile Asp Gly
35 40 45
Glu Thr Cys Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Gln Glu Glu Tyr
50 55 60
Ser Ala Met Arg Asp Gln Tyr Met Arg Thr Gly Glu Gly Phe Leu Cys
65 70 75 80
Val Phe Ala Ile Asn Asn Ser Lys Ser Phe Ala Asp Ile Asn Leu Tyr
85 90 95
Arg Glu Gln Ile Lys Arg Val Lys Asp Ser Asp Asp Val Pro Met Val
100 105 110
Leu Val Gly Asn Lys Cys Asp Leu Pro Thr Arg Thr Val Asp Thr Lys
115 120 125
Gln Ala His Glu Leu Ala Lys Ser Tyr Gly Ile Pro Phe Ile Glu Thr
130 135 140
Ser Ala Lys Thr Arg Gln Gly Val Glu Asp Ala Phe Tyr Thr Leu Val
145 150 155 160
Arg Glu Ile Arg Gln Tyr Arg Met Lys Lys Leu Asn Ser Ser Asp Asp
165 170 175
Gly Thr Gln Gly Cys Met Gly Leu Pro Cys Val Val Met
180 185
<210> 19
<211> 4326
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NRas mRNA
<400> 19
ggggccggaa gtgccgctcc ttggtggggg ctgttcatgg cggttccggg gtctccaaca 60
tttttcccgg ctgtggtcct aaatctgtcc aaagcagagg cagtggagct tgaggttctt 120
gctggtgtga aatgactgag tacaaactgg tggtggttgg agcaggtggt gttgggaaaa 180
gcgcactgac aatccagcta atccagaacc actttgtaga tgaatatgat cccaccatag 240
aggattctta cagaaaacaa gtggttatag atggtgaaac ctgtttgttg gacatactgg 300
atacagctgg acaagaagag tacagtgcca tgagagacca atacatgagg acaggcgaag 360
gcttcctctg tgtatttgcc atcaataata gcaagtcatt tgcggatatt aacctctaca 420
gggagcagat taagcgagta aaagactcgg atgatgtacc tatggtgcta gtgggaaaca 480
agtgtgattt gccaacaagg acagttgata caaaacaagc ccacgaactg gccaagagtt 540
acgggattcc attcattgaa acctcagcca agaccagaca gggtgttgaa gatgcttttt 600
acacactggt aagagaaata cgccagtacc gaatgaaaaa actcaacagc agtgatgatg 660
ggactcaggg ttgtatggga ttgccatgtg tggtgatgta acaagatact tttaaagttt 720
tgtcagaaaa gagccacttt caagctgcac tgacaccctg gtcctgactt ccctggagga 780
gaagtattcc tgttgctgtc ttcagtctca cagagaagct cctgctactt ccccagctct 840
cagtagttta gtacaataat ctctatttga gaagttctca gaataactac ctcctcactt 900
ggctgtctga ccagagaatg cacctcttgt tactccctgt tatttttctg ccctgggttc 960
ttccacagca caaacacacc tctgccaccc caggtttttc atctgaaaag cagttcatgt 1020
ctgaaacaga gaaccaaacc gcaaacgtga aattctattg aaaacagtgt cttgagctct 1080
aaagtagcaa ctgctggtga tttttttttt ctttttactg ttgaacttag aactatgcta 1140
atttttggag aaatgtcata aattactgtt ttgccaagaa tatagttatt attgctgttt 1200
ggtttgttta taatgttatc ggctctattc tctaaactgg catctgctct agattcataa 1260
atacaaaaat gaatactgaa ttttgagtct atcctagtct tcacaacttt gacgtaatta 1320
aatccaactt tcacagtgaa gtgccttttt cctagaagtg gtttgtagac ttcctttata 1380
atatttcagt ggaatagatg tctcaaaaat ccttatgcat gaaatgaatg tctgagatac 1440
gtctgtgact tatctaccat tgaaggaaag ctatatctat ttgagagcag atgccatttt 1500
gtacatgtat gaaattggtt ttccagaggc ctgttttggg gctttcccag gagaaagatg 1560
aaactgaaag cacatgaata atttcactta ataattttta cctaatctcc acttttttca 1620
taggttacta cctatacaat gtatgtaatt tgtttcccct agcttactga taaacctaat 1680
attcaatgaa cttccatttg tattcaaatt tgtgtcatac cagaaagctc tacatttgca 1740
gatgttcaaa tattgtaaaa ctttggtgca ttgttattta atagctgtga tcagtgattt 1800
tcaaacctca aatatagtat attaacaaat tacattttca ctgtatatca tggtatctta 1860
atgatgtata taattgcctt caatcccctt ctcaccccac cctctacagc ttcccccaca 1920
gcaatagggg cttgattatt tcagttgagt aaagcatggt gctaatggac cagggtcaca 1980
gtttcaaaac ttgaacaatc cagttagcat cacagagaaa gaaattcttc tgcatttgct 2040
cattgcacca gtaactccag ctagtaattt tgctaggtag ctgcagttag ccctgcaagg 2100
aaagaagagg tcagttagca caaacccttt accatgactg gaaaactcag tatcacgtat 2160
ttaaacattt ttttttcttt tagccatgta gaaactctaa attaagccaa tattctcatt 2220
tgagaatgag gatgtctcag ctgagaaacg ttttaaattc tctttattca taatgttctt 2280
tgaagggttt aaaacaagat gttgataaat ctaagctgat gagtttgctc aaaacaggaa 2340
gttgaaattg ttgagacagg aatggaaaat ataattaatt gatacctatg aggatttgga 2400
ggcttggcat tttaatttgc agataatacc ctggtaattc tcatgaaaaa tagacttgga 2460
taacttttga taaaagacta attccaaaat ggccactttg ttcctgtctt taatatctaa 2520
atacttactg aggtcctcca tcttctatat tatgaatttt catttattaa gcaaatgtca 2580
tattaccttg aaattcagaa gagaagaaac atatactgtg tccagagtat aatgaacctg 2640
cagagttgtg cttcttactg ctaattctgg gagctttcac agtactgtca tcatttgtaa 2700
atggaaattc tgcttttctg tttctgctcc ttctggagca gtgctactct gtaattttcc 2760
tgaggcttat cacctcagtc atttcttttt taaatgtctg tgactggcag tgattctttt 2820
tcttaaaaat ctattaaatt tgatgtcaaa ttagggagaa agatagttac tcatcttggg 2880
ctcttgtgcc aatagccctt gtatgtatgt acttagagtt ttccaagtat gttctaagca 2940
cagaagtttc taaatggggc caaaattcag acttgagtat gttctttgaa taccttaaga 3000
agttacaatt agccgggcat ggtggcccgt gcctgtagtc ccagctactt gagaggctga 3060
ggcaggagaa tcacttcaac ccaggaggtg gaggttacag tgagcagaga tcgtgccact 3120
gcactccagc ctgggtgaca agagagactt gtctccaaaa aaaaagttac acctaggtgt 3180
gaattttggc acaaaggagt gacaaactta tagttaaaag ctgaataact tcagtgtggt 3240
ataaaacgtg gtttttaggc tatgtttgtg attgctgaaa agaattctag tttacctcaa 3300
aatccttctc tttccccaaa ttaagtgcct ggccagctgt cataaattac atattccttt 3360
tggttttttt aaaggttaca tgttcaagag tgaaaataag atgttctgtc tgaaggctac 3420
catgccggat ctgtaaatga acctgttaaa tgctgtattt gctccaacgg cttactatag 3480
aatgttactt aatacaatat catacttatt acaattttta ctataggagt gtaataggta 3540
aaattaatct ctattttagt gggcccatgt ttagtctttc accatccttt aaactgctgt 3600
gaattttttt gtcatgactt gaaagcaagg atagagaaac actttagaga tatgtggggt 3660
ttttttacca ttccagagct tgtgagcata atcatatttg ctttatattt atagtcatga 3720
actcctaagt tggcagctac aaccaagaac caaaaaatgg tgcgttctgc ttcttgtaat 3780
tcatctctgc taataaatta taagaagcaa ggaaaattag ggaaaatatt ttatttggat 3840
ggtttctata aacaagggac tataattctt gtacattatt tttcatcttt gctgtttctt 3900
tgagcagtct aatgtgccac acaattatct aaggtatttg ttttctataa gaattgtttt 3960
aaaagtattc ttgttaccag agtagttgta ttatatttca aaacgtaaga tgatttttaa 4020
aagcctgagt actgacctaa gatggaattg tatgaactct gctctggagg gaggggagga 4080
tgtccgtgga agttgtaaga cttttatttt tttgtgccat caaatatagg taaaaataat 4140
tgtgcaattc tgctgtttaa acaggaacta ttggcctcct tggccctaaa tggaagggcc 4200
gatattttaa gttgattatt ttattgtaaa ttaatccaac ctagttcttt ttaatttggt 4260
tgaatgtttt ttcttgttaa atgatgttta aaaaataaaa actggaagtt cttggcttag 4320
tcataa 4326
<210> 20
<211> 35550
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Pmp22 genomic sequence
<400> 20
agttacaggg agcaccacca gggaacatct cggggagcct ggttggaagc tgcaggctta 60
gtctgtcggc tgcgggtctc tgactgccct gtggggaggg tcttgcctta acatcccttg 120
catttggctg caaagaaatc tgcttggaag aaggggttac gctgtttggc cgggtgagtt 180
ttattggcaa actgtgcctc tgggtgatgt gtgcctatgc tttacaagaa ttgcctaatt 240
tcccaccccc tgcaagccgc aaatgaaaag gattgcagga gagatggtgc atttgtgttg 300
gaattgactg gagattcaga gggcttttta tatccttggt taaaaggtgg atatatactc 360
tggctgggga ggtggggggc catctgagag catctagaaa ccctaatgca tccagattga 420
aaggaagaaa ggaatctaga tgctttttcc cccatggaaa atagctgtgc acacacagct 480
ggcaggtggc cttggtaagc aggttaggga gaagctgcca cctgtggcag agccttggcc 540
agccgggctc tgggtgtggc aagcctggtc agcaggcact gagtagcact tcctctgcca 600
ccattgagaa ccaggcagga ggccagaggc agtgagggac agatgggttg ggtttacctg 660
tctggcagta tatggtgtgg ctgtgacctg ggtggttatt gattaaacta ttgggttcaa 720
aagaaaggaa gaagcgagct gtagcaccca atatatgcac ttttctgtat gtgtattaga 780
ctttattaaa aagtttattt gaaaatcaca aaggaaggga aagaaaaccc tgagttagat 840
atgctcatat ttctaaagtg cttacttaga acagtcctga gtatgttgtg atcacataag 900
tgttggttaa ataaataaat gtccaaatgg cataaaacaa agtaataatt tctagagcaa 960
atctaactta taaaatgacc tgtggaggaa agaaaacact gccatgtctt tagacttttt 1020
tttctacttg catatgcact ttcatttata aatctttatc tatctatcta tatctatcta 1080
tctatctatc tatctaccta cctacctacc tacctatcag agttacaagc tactttagtg 1140
cagaggtggt caggtcttcc ctgaaaggtt gatgtgagag ttaaatgtga tataataata 1200
gtggtggcaa tttgggcact gggcccttat tatgttgcag acacgatgtt aactgctttg 1260
tacatattgt ctccttcaat caccaccata aacctttaaa gcaggcatta ctatttcctt 1320
ttgcacctga gaaaactgaa gctcagtgaa cttgagaaat tgcccaaatt cacaacaaaa 1380
gtaagcaggg tgattaggtt tgttggagcc cagagccaga gtgcctaacc actgcaccat 1440
actgcctctc acagaccatg catataaagt ccaggcaaag tgcttggcat ataacgggca 1500
ctgtaaatgc agtgtttaca agtacacttc attttaatct gataacacga tagttttaaa 1560
aagatcattg tttgaagatc tttttcaaat ttatttttac ttaccgtaag aatatacaat 1620
tagctaaaat agcagctcct ttcaaatcgt aaaataatat agaattattt gaatcattga 1680
gagtgatgag cttctatgac acagtacact agaggtaggg aagtgtgtgt gtgtgtgtgt 1740
gtgcgcgcgc gtgcgtgaac tgctgcattt tcaggcagaa acctttaaca tccacattcc 1800
tgctccctgt cccgtgcctc aaggctggcc tgcgcacggg agtctcagtt gggcgcgcct 1860
ctgccaagcc gagactgaag ggggctagcc tctctccctg taacgctggg cgggccacgt 1920
taggaggcta tgaatcagct gatttccttg gctgctccaa ccccacctca aatggccacc 1980
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actgctgcag gaacactttg cctagagctt attcggtggt agtctggttt tgcctaggct 2100
aggaggagcc caatcccaga ccatgctatc cagtagtcgg ccggactttt cttcccctaa 2160
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tcgtaggtgc agacagtaat agcggggacc ggcgcggggc aggtgtgtcc ggctaagacg 2280
ccaggacagg gcaggggctc caggacccga gaggagaggg acttcttcca gcgctcaagc 2340
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tcccagagtg ggctgaggag ccagtttctc ggtcaacact aggtctccac ggggccaggg 2520
gagaagggag gtgggaggtg agaaagctca gccgcctctg gtttcgagta aaagtcgccg 2580
cggttttgca gggaccgact ttttcttgag gcgcatttaa ggccaagtga ctgtctcctg 2640
ccctccctct ctcctgcccc ctctcctccc tgagtcccgc cctcccgcac acgctgaccc 2700
agggacacac cctactgcag cgacgcaaac agggcgttgt tcccgttaaa ggggaacgcc 2760
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tgtgggcatc ttccagtgag ggtgccagaa agcgcagcgc aggcgcgggg ctttggccag 3000
ctccctgggg cttctgttta ggggcacagg gtcccctgtg tgtcctgttt ccctccaatg 3060
ggtcttggag taatacaacg aggagagcct ttatggtcta taagacctta cagggcaagg 3120
gtgatggtgc tggtgtctgg atagcggata agggcggccc agttctcgcc ttgctgaaga 3180
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ggactcctgt ggttccccag ttcccagcct cctgccatcg gcttaattca aaccctctgg 3300
gagtcatcag aaatccttgt ttatttcttc cagtgcattc cagagtttct ttgaatgtga 3360
tgcttgtgga gaggaacaga ggggcctggg attgggtact ttccaaactg ggttattgaa 3420
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aatgaggggc gaggaccgca ttacttggga taaatgtcct gccggctctg accggctgaa 3600
attctcggac tcagcctttt accctctgtc tctctctccc gtccgctgga catctactcc 3660
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ggggttcgtg tcctggcttt gagtgcctgg ggtgcagact ggacccctag gcgagcacgt 3780
gggtctagcg caagagcaga atgccccctg accccagggg ctgcctgggg aagcgcgcgg 3840
tggacgggaa gcgcagggtc cgggcaaccc tctcgagcca ttcttttctt tccacactac 3900
tctggctctg caccacctct ccggagccgc cagagtctgc gcgaggctga gctggggcca 3960
ggaccgttcc tctacgctgg cagagttggg tggaaacttg gagacaaacg gaatgcggag 4020
agcactgggg tctgggaaac cagcctcctc gccgctgtct cccccaccgc atgccacggc 4080
tgtctccagg tctcagacgg aaatctgggc acctactccc ctcaccccta cctccacccc 4140
ataggggaat tcaccatctg aaccggggtc tcggagaacg tgacctctca ccttccaggg 4200
aggtcgccgg gaggtgcttg gggtgggtgg aagcgtgcag tggcctctgc tcatattttc 4260
tggaaacccc tccgttccct gggtggtttt agacgtgcga accgcttgtt ttgtttccaa 4320
aagcaaaaga tgttccgttg caggcgggcc cggctgggcg ctgggcactg ggcgctggtc 4380
ctgcaggcgg ctgctgcccc ctctcggcgg caggcggcgc gaaggctcct gacccgcgcg 4440
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cgcaggcaga aactccgctg agcagaactt gccgccagaa tgctcctcct gttgctgagt 4620
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aacttcagag ccgatctagg gtccccgacc ttcatttgac aagattgttt aacttttttt 4980
tttcttgatg cagcctcgtt gaagaagagg agtatttatg attttttttt ctccaaacca 5040
tagtcagatg ggtgaattaa tttataaaac acccttttag gacttgaaat tggaaagtta 5100
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aaactgtcca gcccattaga tcttaaagtt attttcttgg cgatgaagat gagcagacat 5280
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tttctttttc gttttctttt cttttctttt cttttttttt ttttttttga gatggagtct 5400
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ttccgggttc aagccattct cctgcctcag cctgggatta caggtgcccg ccaccacgcc 5520
tggctaattt tttttttttt tgtattttta gtagagacgg ggtttcacta tgttggccag 5580
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tacaggtgtg agccaccgtg cccggcctgt aagcatgatt ttctagtctc tgtgagaaat 5700
aattatgttg gggatttgtg acttagttta acatttacaa gcatcttcac agtatctcca 5760
ttgtgcctgg tgatgatgat atcagactga taggagctat aaacaaggaa atagactgag 5820
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gtctaaggtt gagttcatgg ctccttctac tatagtaaac atctctgcac ataatcgttt 5940
ctgtgtgcat gtggaacttc tccatttaca aggtgctttt aagtcataaa acgttggctc 6000
ttaccatgca ggggtgggcg gtgtggctag gtggatgcgg gtgcttttcg ccatccctgg 6060
gcctttctcc ttcccctttt ccttcactcc tccctccctc cctgactcag gatatctatc 6120
tgattctctc tagcaatgga tcgtgggcaa tggacacgca actgatctct ggcagaactg 6180
tagcacctct tcctcaggaa atgtccacca ctgtttctca tcatcaccaa acggtgaggc 6240
tggttttgtg ctccatgagc ttgtcctcag acgcctgtaa cacgtttctc agcccagagc 6300
tggaaacgct tattggaaga cacaagccag aatgtcgttg ctggggtggg gtgggatgtg 6360
acagggagcc atgagtccag ggaaaatggg aggggtggtg atctcgctgg ggaagctgag 6420
atcctgggca tcattgtgat tcactctacc tagagacatg cccttagtgc cctcctgatc 6480
acttaggata atgctttttg tgattgaaaa aaatatcgac ctgggagctg tgaaggtggt 6540
atgatagcta agcctttggc agaccccctt gggacattgg atcaaacgtg tatctttggt 6600
ttggtggctg tctctattca gaaatgtcct gcccctttct gctgcagtga cagtggggct 6660
agctcactgc accgtcagtt acatggacac aagactggct gcctttccag gtcttgggcc 6720
tcagtgatgc cacctagcat caaaaccttt gaatgtttcc ttgttgcaag atggggactt 6780
gaagctattt gcaaaaccct aagctaagcc ttggggtcct taatccagaa gatcgtattt 6840
ctcctctgtc ctcagcatct ttgcttgtga gatatggaag ccaggcttca tgagggtcaa 6900
attaagggat aattggcagc agaagcacca actaggtacc caaggcaccc agagggaaag 6960
gaacacccag ccaggagccc tgtgtgtttg gatgcagaca ggtggaggta aacaggatga 7020
gctgttttgg tggctgggta ggccatagcg attgatgtta agagcccgtg gacctggatc 7080
cacatgatct tttgttccag aagatgtgtc ctcaggctgg aaggacctag agatacagca 7140
gagctttcct aacatcctgg gtttaaaagg ccacggaaat acagctttaa atgttgctgg 7200
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agttgctttg ctggactttc cctcttacag ctcagtaccc agtaataccc aagcatgtcc 7380
ccagctgaag cattataaac caaattcctt gaaccacagt acaaatagaa actgctaaaa 7440
taataatttg gtaatttaca tggagaagat acgcaaggag tagaaaaccc tgctttatgt 7500
ttttaccttc tgggttgggg agggagcaga gaaaaggtcc cagtcctatt ggagtgagaa 7560
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cctggtggtt acaagtagtg actcagcccg aaaagggcag gctttggtgc tcacaggcgc 7860
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tagaagcaga tctcaaagag gcactagggt tattttaatc aggaaacttc ttatctctca 8160
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agacaataag ctgaaaaaaa tgtgtacttt ttaaaacatt atactgtctt tacaaatgaa 8580
ctatgctcat tgcgaaccat ttaacttgtc tgtatttgct cttagaaagt atatttgaaa 8640
aaaaatactt gttaagtaat caaaagtaat ttgttattga catcgatttg tgaagaatat 8700
gttgcaagtg tgaaaaaata aatagtggtg caatctcggc tgactacaac ctccacctcc 8760
tgggttcaag cgattttcct gcctcagcct cccgagtagc tgggattata ggcgcccaac 8820
accacgcctg gctaattttt gtatttttag tagagagggg tttcatcatg ttgggcaggc 8880
tggtctcgaa ctcctgacct caggagatcc acccacctca cctcccaaag tgctgggatt 8940
agaggtgtga gccactgcgc catgtgactt ggtatttttt tctgaaagga ctcatttttc 9000
tggtgcatga ccatgacact tcacctctct ctgggggttg ccactcatgt tgttttctac 9060
atgaatgggg cctcctggca tcgtgccatg aggcagtcta acatctaggt tgtgtagttt 9120
gaaagagaca caccagatct tgcccccagg ctacatctta atattagaaa tagttttaga 9180
tttttaacta actgactttg actccgcctg ccttctcgtt tttctaaatg tgtttgtata 9240
ctttctggca ccccctcctt atctgcctcg tgtgggcaga ggtaagagag gcttagtgtg 9300
gggatattcg ttatgatatt gtatccagtg cctctccggc ccagggaata caaggatctg 9360
gaatgcatgg gccttgcctt gatggtcccg agcctggtcg aagagtcagg agatagatat 9420
ggaagggtga atcactccct tggaaggcag agcaggccag gtgcccaaag ggaggcaggc 9480
agacagcgtc tgagttcagg gaggaagcgg atgggaaatc tctggtggga ggtagaatct 9540
gatccatcct ccaaaggatg ggcaggattt aagtcaatac aggcaacggg gaggagaata 9600
ttccctgtga cctaaggtaa gggtagaaca aggcagggga tggggtagac tggttggcta 9660
gtgttctggt taggattagg attgattgtg tataagagaa catcttcaaa tgataggggc 9720
ttaagtaaga tcatttattt ttctctcttt tcaaagaagt ctggaagtag gtagcctgag 9780
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tctcatccat gattcaagca gtagggtgga gaaaggaggt ggggaagaat gaatctcctt 9960
ttcttttaat gaaatgtgac atggtcacac ctacacctat ttacaagaga ggctgagaaa 10020
tatagtcatt cggccttggg ggaagcatgg cttttcaaat catagaaacc tggcagcaaa 10080
tacctctctg taagcctggt gtggaatact ttccttgagg gtttgaccat cccctcccat 10140
acccaatcat actcttttgc aatagctcag ttgggcccta tgcagttcca taagtcccag 10200
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tatttctacc acctctccag gtataagtaa gtcttattat tattattgag acagagtttc 10380
actcttgttg cccaggctgg agttcagtgg cgccatcttg gctcactgca acctccgctt 10440
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ccaccacgct tggctaattt tttgtatttt tagtagagac gggctttctc catgttggtc 10560
aggctggtct cgaactcccg acctcaggtg atccacctgc ctcagcctcc caaagtgctg 10620
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tctcttctga atcccagacc tgtttatcca gctgtctcct ggccacttcc cttgggatat 10740
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tccctcaggc caccccattg ttccaatgcc tgttgcccac ctgtggtcac gctgcttcct 10980
cgtttgtcag aggcgccagg gcagcctcct aactagtttg cctgaaccct ttcttgctcc 11040
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gttcatgttt tacattttaa aatcttcgtg gctccctcag ccaacccata atctctaccc 13260
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gagccacaga cccctctgca atatgcctac cacatgttca tcctaccact gatggggaac 13800
ttattacctt caagagagcc tcttttgttt ttgaagagct aatagtgaga tccattcatg 13860
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gctgtggtac tgagaaggac agttgggaca tcattgaagg gttttaagca gaagagtgtc 14340
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ctttatcccc tttacatcta gctgcttacg tctcatgaaa ctgaattttc agttatctgt 28320
tggtccacat ttgaataaga aattatcttg aatttgaaat gctgagctgt aatagcagtt 28380
gtaatttgta agtcctgaga gtgtcctgtc ctccgttgtt aatcccagtc aagatcatct 28440
gagagttggt ctccagggaa cctcagatct ctaggatgtt gcactggaaa tggctgcagg 28500
atctttccac taattctgag aactgaaaga gttaggaact ctatttggag agttcctggt 28560
tcccttatcg tgtgacagtt ctaagtcaat tttgtcatgt ggttttctga ctcacagact 28620
agtaagaagt tagtaattag agagctaagt agattagggt tgttggagat gagaaaccca 28680
cgttttggga aaacctggca agtgacaact taacatcaag gaagtagtca gaaaagctaa 28740
aactgacaaa cagaaggtag aagaaagtag ctccacactc atgggatgtg aaatctacaa 28800
gcgtgcatgc ccggcaaatg cctctccaat gcactggagc gttttaagtg gaaaccacta 28860
gaatctctgt gtagtctccg gaagtggctg tgagggctgc attatctctg cacagcttcc 28920
tcttggtggg cccagctgtg atctttatgg atggcacaca tcagctttca ggaaaagcac 28980
atgaaaggtg ctagggctct tggagctgac tgtaggtttg ggagttgtct gtctccttgc 29040
tctagattac agctctgtgt gttgtgtggg gtctccatgg tttgccaaat tatctcttcc 29100
tcacttagcc acaaggctga cagttaggaa ctatctcttc ttgattgcat taggttggct 29160
gcttcctgaa tgcatatcaa aaggctcctt cctttagttc agtgctttca acctgagctg 29220
tgcatcagaa tcacctgagg tcctttaaaa aaaaaaaaaa gacagtgggc ggggcgcagt 29280
ggctcacgcc tgtaatccca gcactttggg aggctgaggt gggcagatca cttgaggtca 29340
ggagttcaag accagcccgg ccaacatggt gaaaccctgt ctctactaaa aataaaaata 29400
aaaaaatagc caggcgtggt ggtgcgtgcc tgtagtccca gctacttggg aaactgaggc 29460
agagaagaat cacttgaacc taggaggtgg aggttgcagt gagccaagat catgccactg 29520
cactccagcc tgggggtgac agagtaagac tgtctcaaaa aaaaagaaaa aagaaaagaa 29580
aaaagacagt attcaggtct catccctgga gactctcatt taatagttgt gggatggatc 29640
cactgcctag gtgactctga tgtgcattta gggttgggaa ccactgacat agccattaaa 29700
ctgtccctaa tcccactgta aggttttcta ggatattttc ccagaaataa ctaaaccacc 29760
ttcttagaga aggaacatcc tgatcctgcg tctggacttt ggagtcattc ttattttcag 29820
aacctatagc catctattcc ttgacaagat ctgttgggtt gggttgcact agactggaaa 29880
acatcaagaa attaatctag acacagacct aaaaggaaga tttgcacgtt ttgatttatt 29940
ttactgctta cacccagcat caagctccat gtggggcaca tagaggagcc tgaataaaac 30000
tattattggt tggatgatta gataattgtg tttcctcggc agaatcaaac tcaagtcaaa 30060
tgtgtggtta ccgggattaa gaacagaaag aatagagggg actcctgagt gagtttcact 30120
ttctctctct ttttgttatt gttgttcatt tgttttgtta atagaaagat caatatagct 30180
atagagcatt taaaataaaa ggatttgggc caggtgtggt ggcgaatgcc tgtaatccca 30240
acactttgaa agactgaggt gagaggattg cttaaagcca ggagttcaag accagcctgg 30300
gcaacaaagc gagatgccat ctctacaaaa aatgatttaa aaattagtgg ggtgccttgg 30360
agcacgcctg tggtcccagc tattcaggag gctgaggcag gaggattgct tgaggctgag 30420
aggtcaagac tacagtgaac tatgatcagg cccctgcact tgctccagcc tggtgacaga 30480
gtgagaccct gcctctctag gaaaaaaaaa aaaagaattt ggtggggggg gattaataaa 30540
agttcagtgc catcctgttc agagtgattc aaaggtggct taagtcaaat accacattta 30600
gaaatttttg ttagggacgg atgattatgg atgtctcact ggccatgccc aaatcagagt 30660
caatgctatg ggtggctttc taggcagcaa tggtcatttg gatactgaaa atgtaaaagg 30720
agtgggcttc aatcacagaa acacagagaa gtctcttgct ttcagaggaa caggcctcac 30780
agccccttcc tgccctccct tgttgccctg aggatgaagt gggagggaga aaaaggcacc 30840
cactcatcaa cccaacatca tagctgcacc ttccagtgac caccctggtg gtctcactga 30900
catccctttc cagccaactt ctctctgact tctgccccag gctctcaaat gaaagtgctt 30960
ttgcgaggtt accaaagtac actttgaagt ctttaatttg ttggatcact ctgctccttt 31020
caatactgtt agctacttac tctttgaagc tctattcccc tggcttctga gacatcgctg 31080
tgttcccact tgcctgagtg aacacaccag gcggtcatgc tggcctctcc tctctccctc 31140
accccacagc cagccttcta ctgaatcctg catttgggta gcatcctccg taggcattac 31200
gcccatttct ttgtcttgac tcactaaccc cagtgcagct atgcaaaggc ctcctcatgc 31260
accttccagc tacctgcctt gtccctgccc ctgaatccat tttctgcacc atggccagag 31320
tgatcattct aaaacgtgcg tctgatcatg tttctcctct gctgaagttt cctcagaggc 31380
ttctcatcac agcttcctta acatgtcatg taaggccctc tctttcctga cccttagtga 31440
gctaatcagc ctattatatg agagtccgtg tggcttctcc agttctccag tttggactca 31500
gcgcccgtct atgctcttgg ggcatctggt gcatttcctt ccctctctcg aaattccatc 31560
gaactatatt gaaattatat gcaaatgtct gtcttctaga cacacagtcc ttaaggtagg 31620
agccatgtct cacttatctt ggtacatcta gagcagcagc tagaacaggg cccgcatgca 31680
ataggcactc attaaatgtt cactgaacca aagggaatgg agatgataag gatgtactgg 31740
gaattccctc agctacttcc tttgaccttg gccccttggg tgcttccttc cagaggctct 31800
gggctctaat cactctcatg gggttgcagt cactgttaaa ggagcttaag actttctctt 31860
caaaagggct ttaggcagaa cttgcaggaa gttgttgcag acctacccat cctgagacag 31920
ggagaaactc ttgtaagttg aatgctcagc acatttgtat tgtctggaca gggtcagtgt 31980
ccttctgctt aaagatgacc tatgctccca gactcaggcc cctaccaggg agtcccggtc 32040
attgccaaag agcagaacat ctgcctgtgc ctcagggcct cacttaccct tgccacaggg 32100
acctggtgat acatctccac ctactggttg ctgagaaagt gagtcacagt ccacttacta 32160
ggggtatttg gcttttggag atgactactg gatgacatta actgtcttgg gttgcagaca 32220
gagggaaccc agccaaagaa tcatcctttt ctctatttca gggtacatct attgctttac 32280
atgcagacaa tcttgtaata atatattccc taaaacatca gtctcatgac aacaatcata 32340
taaagtgtgt atcctctctt tggctttgta gatatctaag tttactgctt atcacggtta 32400
agcttagagt cattcacttc tgagattcta ctaagatgaa agtcatacac attaagctgt 32460
gtagttagtc gctgcacttc tctatactgc ctctttctat ccctcttgtt caaggatgga 32520
atctggtatc tcctcttagt cagtgaaatc ggggagtagc tggtccactc agctcctgag 32580
gcatttctca tgccagatct ggttagacag cccatttggg agccctgcct gcatgatgat 32640
aagtgttgtc ctgccctgct agcactctgt taacaccttt ctctctgcca aggtcatgtt 32700
tcctttttta tagccctgcc ttcattagat aagtcagaca gagcccaaga gacaacttca 32760
gtatttctta aagacaagag ttagcacttt ggagatgcaa gccgtggaag agtggggcaa 32820
gataattaag gatcctggac ctcaaggcaa ataaagtgtg tccccagcag atcaaaactg 32880
ctgttttctg caatcaacaa ttaacccgca atgatttcgc tcctgacatg gccatctttg 32940
ctgtcttctg aacttcctgt aggtggcagg tcctggatgc tgtcccattt tggttccaag 33000
actattgtgt ggctctcttg acaggggcca gtcaagtggc agttttctcc tctgagttgc 33060
aggaggacag gcttaacagg gtggttcatg tggcgtattc ccacttctgc actgtcttca 33120
aacaaagttg cagtgtccag taaaacagca gcccaaatag cagtgaggtt agatgtaggt 33180
ggccgggcgg tgggggggcg cgggtgcatt gggaactctg gaactgcatg aatcccacac 33240
ggcatactgg atttataata gagtcactca gagcttctca aagaccctgt tttcagggag 33300
gaaacagacc aggctttgtg cagctccagg ctggggtgct gacatcactg gacccctcct 33360
tgtgggggga cgctgtctgt cacgtgagct ggggccatca gtttgagcgt ggctgctcca 33420
cagggcccaa gatggaggct tttcttctct ttccaacacc gaagggctgc attggtgggc 33480
cagggagggt ggcctgaccc acctgcatat ccagtgccct ttagccttct ttgggcttca 33540
aatgcaacct tggggcaccc agggaaatgg agcttgcctt tgatcatctt ccccctctgc 33600
agcgtggctt cccagtcata ctgtcggctg catccttatt cctcactttc tttttccctc 33660
tccacacatt tctttgtctg tttggcagtg cccataggca ttgcttgctt cacctggtat 33720
gtggcaactc tgttaggggg accataggcc cctgtggtct gcatggagct taatcctttt 33780
accatggcgt gactccaata atggtaaaat gtcacttcac ttccattggc tttaggtaat 33840
gccaccactc acttgtagag tggcatatag atttccaggg gtttccatac ccaaccaccc 33900
ttggaaagag acaggtaggt ttttcttgca gcctgaatgc ctgctggcca tgtagtgtgg 33960
cctgggaatt ggtgacagtg aaagaaagag aaatagggca gaaaatgtaa agaaaaccct 34020
caggtattaa ggcctaggtg gccaagattg gaaatagaga gcaagttgtt ttccttgttc 34080
ccatattttt gtgctacctc ctttcaattc tggacctgga agcagatttc cttccagagg 34140
tagaaatgtt cttcctaccc agcaattgtc agcatccggg gtggcggaga gggggccgct 34200
ctgccatgga ctctccgtca cccagcttgt ccctctcctt ccccaggtct gtgcgtgatg 34260
agtgctgcgg ccatctacac ggtgaggcac ccggagtggc atctcaactc ggattactcc 34320
tacggtttcg cctacatcct ggcctgggtg gccttccccc tggcccttct cagcggtgtc 34380
atctatgtga tcttgcggaa acgcgaatga ggcgcccaga cggtctgtct gaggctctga 34440
gcgtacatag ggaagggagg aagggaaaac agaaagcaga caaagaaaaa agagctagcc 34500
caaaatccca aactcaaacc aaaccaaaca gaaagcagtg gaggtggggg ttgctgttga 34560
ttgaagatgt atataatatc tccggtttat aaaacctatt tataacactt tttacatata 34620
tgtacatagt attgtttgct ttttatgttg accatcagcc tcgtgttgag ccttaaagaa 34680
gtagctaagg aactttacat cctaacagta taatccagct cagtattttt gttttgtttt 34740
ttgtttgttt gttttgtttt acccagaaat aagataactc catctcgccc cttccctttc 34800
atctgaaaga agatacctcc ctcccagtcc acctcattta gaaaaccaaa gtgtgggtag 34860
aaaccccaaa tgtccaaaag cccttttctg gtgggtgacc cagtgcatcc aacagaaaca 34920
gccgctgccc gaacctctgt gtgaagcttt acgcgcacac ggacaaaatg cccaaactgg 34980
agcccttgca aaaacacggc ttgtggcatt ggcatacttg cccttacagg tggagtatct 35040
tcgtcacaca tctaaatgag aaatcagtga caacaagtct ttgaaatggt gctatggatt 35100
taccattcct tattatcact aatcatctaa acaactcact ggaaatccaa ttaacaattt 35160
tacaacataa gatagaatgg agacctgaat aattctgtgt aatataaatg gtttataact 35220
gcttttgtac ctagctaggc tgctattatt actataatga gtaaatcata aagccttcat 35280
cactcccaca tttttcttac ggtcggagca tcagaacaag cgtctagact ccttgggacc 35340
gtgagttcct agagcttggc tgggtctagg ctgttctgtg cctccaagga ctgtctggca 35400
atgacttgta ttggccacca actgtagatg tatatatggt gcccttctga tgctaagact 35460
ccagaccttt tgtttttgct ttgcattttc tgattttata ccaactgtgt ggactaagat 35520
gcattaaaat aaacatcaga gtaactcact 35550
<210> 21
<211> 1828
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Pmp22 mRNA
<400> 21
agttacaggg agcaccacca gggaacatct cggggagcct ggttggaagc tgcaggctta 60
gtctgtcggc tgcgggtctc tgactgccct gtggggaggg tcttgcctta acatcccttg 120
catttggctg caaagaaatc tgcttggaag aaggggttac gctgtttggc cgggcagaaa 180
ctccgctgag cagaacttgc cgccagaatg ctcctcctgt tgctgagtat catcgtcctc 240
cacgtcgcgg tgctggtgct gctgttcgtc tccacgatcg tcagccaatg gatcgtgggc 300
aatggacacg caactgatct ctggcagaac tgtagcacct cttcctcagg aaatgtccac 360
cactgtttct catcatcacc aaacgaatgg ctgcagtctg tccaggccac catgatcctg 420
tcgatcatct tcagcattct gtctctgttc ctgttcttct gccaactctt caccctcacc 480
aaggggggca ggttttacat cactggaatc ttccaaattc ttgctggtct gtgcgtgatg 540
agtgctgcgg ccatctacac ggtgaggcac ccggagtggc atctcaactc ggattactcc 600
tacggtttcg cctacatcct ggcctgggtg gccttccccc tggcccttct cagcggtgtc 660
atctatgtga tcttgcggaa acgcgaatga ggcgcccaga cggtctgtct gaggctctga 720
gcgtacatag ggaagggagg aagggaaaac agaaagcaga caaagaaaaa agagctagcc 780
caaaatccca aactcaaacc aaaccaaaca gaaagcagtg gaggtggggg ttgctgttga 840
ttgaagatgt atataatatc tccggtttat aaaacctatt tataacactt tttacatata 900
tgtacatagt attgtttgct ttttatgttg accatcagcc tcgtgttgag ccttaaagaa 960
gtagctaagg aactttacat cctaacagta taatccagct cagtattttt gttttgtttt 1020
ttgtttgttt gttttgtttt acccagaaat aagataactc catctcgccc cttccctttc 1080
atctgaaaga agatacctcc ctcccagtcc acctcattta gaaaaccaaa gtgtgggtag 1140
aaaccccaaa tgtccaaaag cccttttctg gtgggtgacc cagtgcatcc aacagaaaca 1200
gccgctgccc gaacctctgt gtgaagcttt acgcgcacac ggacaaaatg cccaaactgg 1260
agcccttgca aaaacacggc ttgtggcatt ggcatacttg cccttacagg tggagtatct 1320
tcgtcacaca tctaaatgag aaatcagtga caacaagtct ttgaaatggt gctatggatt 1380
taccattcct tattatcact aatcatctaa acaactcact ggaaatccaa ttaacaattt 1440
tacaacataa gatagaatgg agacctgaat aattctgtgt aatataaatg gtttataact 1500
gcttttgtac ctagctaggc tgctattatt actataatga gtaaatcata aagccttcat 1560
cactcccaca tttttcttac ggtcggagca tcagaacaag cgtctagact ccttgggacc 1620
gtgagttcct agagcttggc tgggtctagg ctgttctgtg cctccaagga ctgtctggca 1680
atgacttgta ttggccacca actgtagatg tatatatggt gcccttctga tgctaagact 1740
ccagaccttt tgtttttgct ttgcattttc tgattttata ccaactgtgt ggactaagat 1800
gcattaaaat aaacatcaga gtaactca 1828
<210> 22
<211> 483
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Pmp22 Coding sequence
<400> 22
atgctcctcc tgttgctgag tatcatcgtc ctccacgtcg cggtgctggt gctgctgttc 60
gtctccacga tcgtcagcca atggatcgtg ggcaatggac acgcaactga tctctggcag 120
aactgtagca cctcttcctc aggaaatgtc caccactgtt tctcatcatc accaaacgaa 180
tggctgcagt ctgtccaggc caccatgatc ctgtcgatca tcttcagcat tctgtctctg 240
ttcctgttct tctgccaact cttcaccctc accaaggggg gcaggtttta catcactgga 300
atcttccaaa ttcttgctgg tctgtgcgtg atgagtgctg cggccatcta cacggtgagg 360
cacccggagt ggcatctcaa ctcggattac tcctacggtt tcgcctacat cctggcctgg 420
gtggccttcc ccctggccct tctcagcggt gtcatctatg tgatcttgcg gaaacgcgaa 480
tga 483
<210> 23
<211> 160
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Pmp protein sequence
<400> 23
Met Leu Leu Leu Leu Leu Ser Ile Ile Val Leu His Val Ala Val Leu
1 5 10 15
Val Leu Leu Phe Val Ser Thr Ile Val Ser Gln Trp Ile Val Gly Asn
20 25 30
Gly His Ala Thr Asp Leu Trp Gln Asn Cys Ser Thr Ser Ser Ser Gly
35 40 45
Asn Val His His Cys Phe Ser Ser Ser Pro Asn Glu Trp Leu Gln Ser
50 55 60
Val Gln Ala Thr Met Ile Leu Ser Ile Ile Phe Ser Ile Leu Ser Leu
65 70 75 80
Phe Leu Phe Phe Cys Gln Leu Phe Thr Leu Thr Lys Gly Gly Arg Phe
85 90 95
Tyr Ile Thr Gly Ile Phe Gln Ile Leu Ala Gly Leu Cys Val Met Ser
100 105 110
Ala Ala Ala Ile Tyr Thr Val Arg His Pro Glu Trp His Leu Asn Ser
115 120 125
Asp Tyr Ser Tyr Gly Phe Ala Tyr Ile Leu Ala Trp Val Ala Phe Pro
130 135 140
Leu Ala Leu Leu Ser Gly Val Ile Tyr Val Ile Leu Arg Lys Arg Glu
145 150 155 160
<210> 24
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> proviso seq
<400> 24
atcttcaatc aacagc 16
<210> 25
<211> 2108
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CEBPb NC_000020.11:c50192690-50190583
<400> 25
ttactgcccc caaaaggctt tgtaaccatt ctcaaaaaaa agtttattaa aagtgttctt 60
aatgcttgaa acggaaaaga ttcccaaaat atacagacgc ctcttttctc atagaaatag 120
attatttttt ataatacaaa aaaagaccaa aaaacaaaac aaaacaaaac atcaacagca 180
acaagcccgt aggaacatct ttaagcgatt actcagggcc cggctgacag ttacacgtgg 240
gttgcgtcag tcccgtgtac acacgcgttc agccatgttt aaaccgattg catcaacttc 300
gaaaccggcc cgcccgccgg cgcctggaga ggggcagagg gagaagcaga gagtttatca 360
ttcatctgta cacatagacg tttcttcttt aaataacacc acgggcggga gccccatctg 420
catgtgcggt tggtttggac aaaaatatag atatatatat ataataaaat attaaaatta 480
ccgacgggct ccccgcgctg ccaagtgccc cagtgccaaa gttttgccgg cgccgccggg 540
ggcgggggcg agggcgcggg cgcgggcgct ccccggagtc tcagccccgg ccggcagggg 600
gacgcgcgcg ggggccgcgc tagcagtggc cggaggaggc gagcaggggc tcgggcagct 660
gcttgaacaa gttccgcagg gtgctgagct cgcgcgacag ctgctccacc ttcttctgca 720
gccgctcgtt ctcggccgtg agctccagga ccttgtgctg cgtctccagg ttgcgcatct 780
tggccttgtc gcggctcttg cgcacggcga tgttgttgcg ctcgcgccgg atcttgtact 840
cgtcgctgtg cttgtccacg gtcttcttgg ccttgctctt gacctgcgag ggcgccggcg 900
cggcccccgc gtagcaggcg gtcgggggcg ccttggcgtc agcggggctc ggcgtgccgg 960
gcgggctgga cgaggaggac gtggagaggc tcccgctgct gccgctcggc accgcctggt 1020
agccgaggta agcgcgcagc gcgtacggga agcccgccgc catgcctgcg ccgccgcccg 1080
gcgccccggc ctcctccttc cgcttgcagt ccgcgggctc gaagcccggc tccgccttga 1140
gctcggcggg cggcggcggc ggcgggggcg gtgggtgcag gggcgcgaag cagccggggt 1200
gcagcgcgcc cttggcggcc cccaggcgcc ccaggctcac gtagccgtac tcggccggct 1260
tcttgcagtt cttgcccccg tagtcgtcgg agaagaggtc ggagaggaag tcgtggtgct 1320
gcccggagga ggcgggcgcg ggggcgggcg cgggcggagc cgcctcgaag gtgtccgtgg 1380
ccgtggcggg cgccggggcc tgcggcgcgc ccagcggctc caggtacggg ctgaagtcga 1440
tggcgcgctc gtggtcgccg atgctgccca gctcgccggc gggggggcgc ggcccgggtc 1500
tggccgcggg gggcgccgcg ggggccgcct tgccgccgta cgcagcagcc aagcagtccg 1560
cctcgtagta gaagttggcc acttccatgg atttaaaggc aggcggcggc ggcggcaggg 1620
ggagacatgc tgggtcccag gccaccaggc gttgcatgaa cgcgggtgcc cggggagggg 1680
gcctggggct gcccgctccg gccggcccgc aggtggcgcg gcctccctgc tctgagctgt 1740
cgccgctgcg tcgctgctgc tgctgccgcc gctgccgggg tggccgctat tagtgagggg 1800
gctggtggct ggaccctcgg gtgggtcccc ttcccagtcc cgtgcgcggc tctgactcgc 1860
taaagtttct cctgagcccg gttatttata agggcggccc gtagcaaccg ctgcgtcacg 1920
ccggcccctc ccgccgcgcc gccgggacgc gaaggacacg gccgcggccg cccgagaccc 1980
ccgggaggac ggcggcaggg cgcagcggag ggaccgggca cccggagcgc gttttcgggg 2040
ggcccccggg acgcaggggc ggcctcacgc cccctgccca cccccgcccg gccgccccgg 2100
gattggga 2108
<210> 26
<211> 345
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CEBPn Amino Acid
<400> 26
Met Gln Arg Leu Val Ala Trp Asp Pro Ala Cys Leu Pro Leu Pro Pro
1 5 10 15
Pro Pro Pro Ala Phe Lys Ser Met Glu Val Ala Asn Phe Tyr Tyr Glu
20 25 30
Ala Asp Cys Leu Ala Ala Ala Tyr Gly Gly Lys Ala Ala Pro Ala Ala
35 40 45
Pro Pro Ala Ala Arg Pro Gly Pro Arg Pro Pro Ala Gly Glu Leu Gly
50 55 60
Ser Ile Gly Asp His Glu Arg Ala Ile Asp Phe Ser Pro Tyr Leu Glu
65 70 75 80
Pro Leu Gly Ala Pro Gln Ala Pro Ala Pro Ala Thr Ala Thr Asp Thr
85 90 95
Phe Glu Ala Ala Pro Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Ser Ser Gly
100 105 110
Gln His His Asp Phe Leu Ser Asp Leu Phe Ser Asp Asp Tyr Gly Gly
115 120 125
Lys Asn Cys Lys Lys Pro Ala Glu Tyr Gly Tyr Val Ser Leu Gly Arg
130 135 140
Leu Gly Ala Ala Lys Gly Ala Leu His Pro Gly Cys Phe Ala Pro Leu
145 150 155 160
His Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Ala Glu Leu Lys Ala Glu
165 170 175
Pro Gly Phe Glu Pro Ala Asp Cys Lys Arg Lys Glu Glu Ala Gly Ala
180 185 190
Pro Gly Gly Gly Ala Gly Met Ala Ala Gly Phe Pro Tyr Ala Leu Arg
195 200 205
Ala Tyr Leu Gly Tyr Gln Ala Val Pro Ser Gly Ser Ser Gly Ser Leu
210 215 220
Ser Thr Ser Ser Ser Ser Ser Pro Pro Gly Thr Pro Ser Pro Ala Asp
225 230 235 240
Ala Lys Ala Pro Pro Thr Ala Cys Tyr Ala Gly Ala Ala Pro Ala Pro
245 250 255
Ser Gln Val Lys Ser Lys Ala Lys Lys Thr Val Asp Lys His Ser Asp
260 265 270
Glu Tyr Lys Ile Arg Arg Glu Arg Asn Asn Ile Ala Val Arg Lys Ser
275 280 285
Arg Asp Lys Ala Lys Met Arg Asn Leu Glu Thr Gln His Lys Val Leu
290 295 300
Glu Leu Thr Ala Glu Asn Glu Arg Leu Gln Lys Lys Val Glu Gln Leu
305 310 315 320
Ser Arg Glu Leu Ser Thr Leu Arg Asn Leu Phe Lys Gln Leu Pro Glu
325 330 335
Pro Leu Leu Ala Ser Ser Gly His Cys
340 345
<210> 27
<211> 2113
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CEBP NM_005194.3
<400> 27
tcccaatccc ggggcggccg ggcgggggtg ggcagggggc gtgaggccgc ccctgcgtcc 60
cgggggcccc ccgaaaacgc gctccgggtg cccggtccct ccgctgcgcc ctgccgccgt 120
cctcccgggg gtctcgggcg gccgcggccg tgtccttcgc gtcccggcgg cgcggcggga 180
ggggccggcg tgacgcagcg gttgctacgg gccgccctta taaataaccg ggctcaggag 240
aaactttagc gagtcagagc cgcgcacggg actgggaagg ggacccaccc gagggtccag 300
ccaccagccc cctcactaat agcggccacc ccggcagcgg cggcagcagc agcagcgacg 360
cagcggcgac agctcagagc agggaggccg cgccacctgc gggccggccg gagcgggcag 420
ccccaggccc cctccccggg cacccgcgtt catgcaacgc ctggtggcct gggacccagc 480
atgtctcccc ctgccgccgc cgccgcctgc ctttaaatcc atggaagtgg ccaacttcta 540
ctacgaggcg gactgcttgg ctgctgcgta cggcggcaag gcggcccccg cggcgccccc 600
cgcggccaga cccgggccgc gcccccccgc cggcgagctg ggcagcatcg gcgaccacga 660
gcgcgccatc gacttcagcc cgtacctgga gccgctgggc gcgccgcagg ccccggcgcc 720
cgccacggcc acggacacct tcgaggcggc tccgcccgcg cccgcccccg cgcccgcctc 780
ctccgggcag caccacgact tcctctccga cctcttctcc gacgactacg ggggcaagaa 840
ctgcaagaag ccggccgagt acggctacgt gagcctgggg cgcctggggg ccgccaaggg 900
cgcgctgcac cccggctgct tcgcgcccct gcacccaccg cccccgccgc cgccgccgcc 960
cgccgagctc aaggcggagc cgggcttcga gcccgcggac tgcaagcgga aggaggaggc 1020
cggggcgccg ggcggcggcg caggcatggc ggcgggcttc ccgtacgcgc tgcgcgctta 1080
cctcggctac caggcggtgc cgagcggcag cagcgggagc ctctccacgt cctcctcgtc 1140
cagcccgccc ggcacgccga gccccgctga cgccaaggcg cccccgaccg cctgctacgc 1200
gggggccgcg ccggcgccct cgcaggtcaa gagcaaggcc aagaagaccg tggacaagca 1260
cagcgacgag tacaagatcc ggcgcgagcg caacaacatc gccgtgcgca agagccgcga 1320
caaggccaag atgcgcaacc tggagacgca gcacaaggtc ctggagctca cggccgagaa 1380
cgagcggctg cagaagaagg tggagcagct gtcgcgcgag ctcagcaccc tgcggaactt 1440
gttcaagcag ctgcccgagc ccctgctcgc ctcctccggc cactgctagc gcggcccccg 1500
cgcgcgtccc cctgccggcc ggggctgaga ctccggggag cgcccgcgcc cgcgccctcg 1560
cccccgcccc cggcggcgcc ggcaaaactt tggcactggg gcacttggca gcgcggggag 1620
cccgtcggta attttaatat tttattatat atatatatct atatttttgt ccaaaccaac 1680
cgcacatgca gatggggctc ccgcccgtgg tgttatttaa agaagaaacg tctatgtgta 1740
cagatgaatg ataaactctc tgcttctccc tctgcccctc tccaggcgcc ggcgggcggg 1800
ccggtttcga agttgatgca atcggtttaa acatggctga acgcgtgtgt acacgggact 1860
gacgcaaccc acgtgtaact gtcagccggg ccctgagtaa tcgcttaaag atgttcctac 1920
gggcttgttg ctgttgatgt tttgttttgt tttgtttttt ggtctttttt tgtattataa 1980
aaaataatct atttctatga gaaaagaggc gtctgtatat tttgggaatc ttttccgttt 2040
caagcattaa gaacactttt aataaacttt tttttgagaa tggttacaaa gccttttggg 2100
ggcagtaaaa aaa 2113
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<211> 322
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CEBPb Iso 2
<400> 28
Met Glu Val Ala Asn Phe Tyr Tyr Glu Ala Asp Cys Leu Ala Ala Ala
1 5 10 15
Tyr Gly Gly Lys Ala Ala Pro Ala Ala Pro Pro Ala Ala Arg Pro Gly
20 25 30
Pro Arg Pro Pro Ala Gly Glu Leu Gly Ser Ile Gly Asp His Glu Arg
35 40 45
Ala Ile Asp Phe Ser Pro Tyr Leu Glu Pro Leu Gly Ala Pro Gln Ala
50 55 60
Pro Ala Pro Ala Thr Ala Thr Asp Thr Phe Glu Ala Ala Pro Pro Ala
65 70 75 80
Pro Ala Pro Ala Pro Ala Ser Ser Gly Gln His His Asp Phe Leu Ser
85 90 95
Asp Leu Phe Ser Asp Asp Tyr Gly Gly Lys Asn Cys Lys Lys Pro Ala
100 105 110
Glu Tyr Gly Tyr Val Ser Leu Gly Arg Leu Gly Ala Ala Lys Gly Ala
115 120 125
Leu His Pro Gly Cys Phe Ala Pro Leu His Pro Pro Pro Pro Pro Pro
130 135 140
Pro Pro Pro Ala Glu Leu Lys Ala Glu Pro Gly Phe Glu Pro Ala Asp
145 150 155 160
Cys Lys Arg Lys Glu Glu Ala Gly Ala Pro Gly Gly Gly Ala Gly Met
165 170 175
Ala Ala Gly Phe Pro Tyr Ala Leu Arg Ala Tyr Leu Gly Tyr Gln Ala
180 185 190
Val Pro Ser Gly Ser Ser Gly Ser Leu Ser Thr Ser Ser Ser Ser Ser
195 200 205
Pro Pro Gly Thr Pro Ser Pro Ala Asp Ala Lys Ala Pro Pro Thr Ala
210 215 220
Cys Tyr Ala Gly Ala Ala Pro Ala Pro Ser Gln Val Lys Ser Lys Ala
225 230 235 240
Lys Lys Thr Val Asp Lys His Ser Asp Glu Tyr Lys Ile Arg Arg Glu
245 250 255
Arg Asn Asn Ile Ala Val Arg Lys Ser Arg Asp Lys Ala Lys Met Arg
260 265 270
Asn Leu Glu Thr Gln His Lys Val Leu Glu Leu Thr Ala Glu Asn Glu
275 280 285
Arg Leu Gln Lys Lys Val Glu Gln Leu Ser Arg Glu Leu Ser Thr Leu
290 295 300
Arg Asn Leu Phe Lys Gln Leu Pro Glu Pro Leu Leu Ala Ser Ser Gly
305 310 315 320
His Cys
<210> 29
<211> 147
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CEBPb Iso 3
<400> 29
Met Ala Ala Gly Phe Pro Tyr Ala Leu Arg Ala Tyr Leu Gly Tyr Gln
1 5 10 15
Ala Val Pro Ser Gly Ser Ser Gly Ser Leu Ser Thr Ser Ser Ser Ser
20 25 30
Ser Pro Pro Gly Thr Pro Ser Pro Ala Asp Ala Lys Ala Pro Pro Thr
35 40 45
Ala Cys Tyr Ala Gly Ala Ala Pro Ala Pro Ser Gln Val Lys Ser Lys
50 55 60
Ala Lys Lys Thr Val Asp Lys His Ser Asp Glu Tyr Lys Ile Arg Arg
65 70 75 80
Glu Arg Asn Asn Ile Ala Val Arg Lys Ser Arg Asp Lys Ala Lys Met
85 90 95
Arg Asn Leu Glu Thr Gln His Lys Val Leu Glu Leu Thr Ala Glu Asn
100 105 110
Glu Arg Leu Gln Lys Lys Val Glu Gln Leu Ser Arg Glu Leu Ser Thr
115 120 125
Leu Arg Asn Leu Phe Lys Gln Leu Pro Glu Pro Leu Leu Ala Ser Ser
130 135 140
Gly His Cys
145
<210> 30
<211> 75245
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> STAT3 Genomic Sequence
<400> 30
gaattatgca tgacggcgtg cctcggccag gctggggctg ggcgaggatt ggctgaaggg 60
gctgtaattc agcggtttcc ggagctgcgg cggcgcagac tgggaggggg agccgggggt 120
tccgacgtcg cagccgaggg aacaagcccc aaccggatcc tggacaggca ccccggcttg 180
gcgctgtctc tccccctcgg ctcggagagg cccttcggcc tgagggagcc tcgccgcccg 240
tccccggcac acgcgcagcc ccggcctctc ggcctctgcc ggagaaacag gtgaaggggg 300
tgcagggtgg ggccgttggg gaggcctggg gacccggggg ctccgcagcg gcagggggcc 360
tctgggacct tggggatgtt gtgatggacg ctgcagtggg gccgggagag atgaagagac 420
gcggagggtc gccctgaggg aagactcttc gggatgacag gagcgggcct cggaagggac 480
tcggggcgct ggagggaagt ttcgttcttc ggagaaacag aacgcgctcg agggggcacc 540
gtggggcgag ggcgcactcg gttgcggcgg caggagtgag ggacagtccc ccgatttcct 600
gctccctggg gccctgggga cgttccggcc accggagcga ctgtcacgcc gacggggatc 660
accggcgcga gtggggggtc ggaaagcgcc tcctccccgc ccggtcggcg gctcccgctg 720
agccacttcc tccgcttgcc ctgttcccgc tccttcagga gacagctgtg cccttttgga 780
ggcaggaata ggtgtgtctg tcgcctgcag ccttacgggc tggctggtcg tgggtaggct 840
ttattgcata agaatcaagt ttcctgtagg gaaattgaca gaccggtact ctttctaaat 900
tccctcgcat ctttttctag gttaaattat gctcccccca cgtccccgcc ttgtaaaaaa 960
gagaaaaaaa gacaaaataa aatccccatc aacccgtcaa gccagctcta gagagagaaa 1020
taaacctctt gacattgtcc ttttccaaat acctggtaaa gtcggccaga agataaataa 1080
ttgagccatt gcatttactg gattgtggtg ttgcttaatt gcataggacg gaatgaacca 1140
attgagagtg ggagttttct gtctcagagc caagatcttg ggtaaatgca gaggagaggg 1200
aaacaaagac aggctggcct tgaaaaaacc atgtgtgcaa actttacatg catttggggg 1260
gtgtggttgc actgaagtta acaagattca aaccgtcgcc caagttggta tttccatgtt 1320
tggtacacat cactctgtgc catatcaggt cgttgttaag tgtggtgaca aaatcagtgg 1380
ttagtcattt ttttaattaa aaatgtgtat agtgtgtacc tgctggtctt actgtatgtg 1440
caactaaagg tttacatagt ctgtgtatgg gttgtaaatt tttggctggc tgtgctgata 1500
aagcattggg cttgaataaa gcaaagcaga aaatcatctc aatcttttat atgtggattt 1560
agactgtgtt atgacttggt tcagccagtt ttctatctta ttttatatta aatatgtctg 1620
tgttctctga gtcagcacat ttatttcctt attacatgtt ccagacagga gtgctagccc 1680
agtttttgtt cagtttgcac agtgggatgg ggaaacaagt ctggaattta aaaaaaaatg 1740
ttttagaggt tggagccttg attttagtct ctatattagc acatccatca caaagaacca 1800
ttagtaaatt catgaatctt ttgtttttta tgtagttcat ttgagaagaa taatcactta 1860
gaaatatcca cagtgccagg catggtggtg cacacctctg atcccagcta attgaaggct 1920
gaggtgggag gattccttga gtccaggagt tgagtctggt ctgggcaaca tggtgagagg 1980
ccaggaattg ggtctagagt ctagtctaag caccataatg agaacccatc tttaagaaag 2040
aaagaaagga aaggaggaag aaaggaaaga aaaagaaata cccacagcac agttatgaat 2100
taacccacaa aggacttgtg aggtgggtag ttcacataac aattacccta atatcgtaga 2160
taagaaaatt gaggccaaag gatcaagaca cttggccaac gcagcagagt gccatagtgg 2220
tggaatttgt gcctccttct gtatattttg tgaaaagtat cagtgaaatt cttttttttt 2280
ttttttttga gtcagagtct tgctctgttg cccaggctag agtgcagtgg cgcaatcttg 2340
gctcactgca acctctgcct cctgggttca agcgattctc ctgcctcagc ctcccaagta 2400
gctgggacta caggcgtgcg ccaccacgcc cagctaattt ttgtattttt agtagagacc 2460
ggggttttac catattggcc aggctggtct tgaactcctg accttgtgat ttgcccacct 2520
ctatctccca aagtgctggg attacaggtg tgagccaccg cgcccagtaa gtatcagtga 2580
aattctaaca tatatctgaa cagtaaaata ccaccaatag gctgaaagac ttcatgggag 2640
gtaaatattc aataaacagg tgaaaaaaga aatacaaatg gagcttgctt agattatttt 2700
tctaattgct atgtctaact tgggaagtga ggaactgttt ttggtcagca taatttacca 2760
tcagaattta gctatttact aatgaaaaga aatactaatc taggtttgtt ttagattaag 2820
gacagtcatg acctaaatgt catttaaacc agagtgcatt gtggcttgat cagtggtcat 2880
ttctgtctct agaaagttgc tttaacttct ctgcctctac gtgtctcttg acattcagat 2940
atgaggtggg gtagaggtgg tgaccaactt tccagacgcc tgagtccaaa ccttcttagc 3000
ttatggtttt cttaggtgat gtgcaaatca acaaatatat actttttttt tttttttttt 3060
gagttggagt tgcactctat cacccaggct ggagtgcagt ggcatgatcg tggctcactg 3120
caacctcctc ctcccgggtt caagtgattc tcgcacctca gcctcctgag tagctgggat 3180
tacaggtgcc cgccactacg cccggctaat ttttgtattt ttagtagaga taaggtttca 3240
ctatattgac caggctggtc tcaaactcct gacctcaaga gatctgccca cctcagcctc 3300
ccaaagtgct gggattacag gcgtgaacca ccttgcctgg ccaacatata tatacctttt 3360
gcaactttgt cagagttgct atgaagaata agttgtatct tgttcacaga aattgcagtc 3420
tactggggga gctgataaat gttttaacca tccaatgtaa catgttgtca tcaaagagat 3480
ggtgagactt tacacttgtg ctaacaaggt agctgttcta cataaaagaa catacagtac 3540
agatgtagaa cttttctgtt atcatagaac gttctattgg acagtgctag gctgaatgct 3600
acagatcttc agagaaagga gaggttatga ggcctggagt tgtctagaaa gtctttttgc 3660
caaagaggga tttcaactgg gtcccaaata atgggtggaa tttgataggt gtaaagaatt 3720
tgcggtggtt tatgcctgta atcccagcac tttgggaggc tgaggcagga ggattgcttg 3780
agcccaggag tttgagacca gcttgggcaa cgtggtaaaa ctccctctcc cctaaaaata 3840
aaaaaaatta gccaggcctg gtggcgtgga cctgtagtcc cagctactgg tgagactaag 3900
gtgggaggat cacccaagcc ccgggggtta aggctgcagt gagccgtgat cccgccaccg 3960
cactccagcc tgggtgacag agtgagaccc tgtctccaaa aaaaaaaaaa attcctggta 4020
gcccggtaga ctaggagggt aagtagggga gaagtgatta cttacaaaag acattgaata 4080
caggaccaag gaatttcagt tctgttcttt tgtaggggaa gcttttaaaa ctttcggggc 4140
gccgggcgcg gtggctcacg cctgtaatcc cagcactttg ggaggcccag acgcgcggat 4200
cacgaggcca ggagatcgag accatcctgg ctaacacggt gaaaccccat ctctactaaa 4260
aatacaaaaa aaagtagccg ggcgttgtgg cgggcgtctg tagtcccagc tactcgggag 4320
gctgaggcag gagaagagcg tgaactcggg aggcggagct tgcagtgagc cgatatcgca 4380
ccactgcact ccagcctggg cgacagagcg agactccgtc tcaaaaaaaa aaaaaataaa 4440
taaataaata aataaataaa actttggagc cgaagcactg atgtttaatc atagagtgct 4500
tactatgtgt taggcacagg cctgattgcc tgatgctggt taatttgtac aaagtaaatc 4560
agtgcatatg ccctctgccc taggggagtt attaactgga gtctgacatt gtacaaaggt 4620
aggtatcctg actagtttga tttggtactt tgggtgaaaa aagtatagtg tgcttaagtg 4680
cagaagtgtt ttttgaggat ttttgattgg atacaaacca ccactcatat tttatgtctt 4740
tggcacttaa aaatttcacc ataacttttg agtcatttat aaaaaccact gaaagagtac 4800
ttgagggaca tccccgaatc ctgaagaact tctggtgttc tggagcagcc tcagtgagat 4860
ccaggaggat ggcattgctg ggctggccca gcccttattg attatggtgt aaagaattaa 4920
tatggtggtt atatactctt tgttagacac cttggcttac aagacgtaag cgtaaagtgt 4980
agtgcgcttt agtcagtatg gccacatggt cctttggtgg taaattgttt gagatgcctc 5040
cagtttttaa aaggagtagc atatcgggcc aggagcagtg gctcatgcct ataatcccag 5100
cactttggaa ggccgaggca agaggattgc ttgagcccag gagttcaaga ccagcctggg 5160
caacatagtg agaccacttt gtttctttaa aaaaaaaaaa aaggcaaaaa caggctgggc 5220
atggtggctg atgcctgtaa tcccagcgct ttgtgaggca gaggtgagcg gatcacttga 5280
ggtcaggagt ttgagaccag cctggccaac atggtaaaac cccgtctcta ctaaaaatac 5340
aaaaattagc caggtgtggt ggcacacgcc tgtagttcca gctactctgg aggctgagcc 5400
aggagaattg cttgaacctg ggaggtggag gctgcagtga gccaagatcc tgccactgca 5460
ctccagactg ggggacagag tgagacattc tgacagtgct acactgaatg ctacatgtct 5520
tcagaggaag gagaggttat gaggcctggg aataacatat ggaagaatga atttctgtta 5580
tggtcagttc tcatttgtca tgttaggatt actgcaactc ttacccagcc gggtgtggtg 5640
gctcatgcct gtaattccag cactttggga ggctgtgggc ggatcacgag gtcaggagat 5700
cgagaccatc ctggctaaca cggtgaaact ccgcctctac taaaaataca aaaaattagc 5760
ccagcgtggt ggcagacgcc tgtagtccca gctactcagg aggctgaggc aggagaatgg 5820
catgagtcct ggaggcggag cttgcagtga gctgagatcg tgccactgca ctccagcctg 5880
ggcaacagag tgggactcca tctcaaaaaa aaaagaaaaa aaaaaggatt accgcaactc 5940
tttaattcag atcagcaaac atgttgagag ccaggtattg cgtcaggcag gatccaagga 6000
taatgaaata ttgtccgttt tcatgaaact ggagatgttg cagggaccga ggtgtgtgct 6060
atgccagtat ggaagtagga caggggagac gacagggcag tgagtggttc aagactctgg 6120
ctctgaagtc aaacagatct gggactgaat cctggatctg ccacttccta gtcagaatct 6180
gagcctctat tttcttatct gtaaaagaag attataacag tgcttatctt gtaggtactg 6240
ttgacgattc aataagataa tgtggataaa atgcttagca tagtgcctgg cacatagtaa 6300
gagctcggta aatctaagtt cttactaaat atccaagaaa agagattaat tcttttcagg 6360
agtgagagaa agtcatcatt attgaggggc tttatcagat gggaacacct gaatagggtt 6420
ttataggatg aataggaatt ctttccacga agttgcgtta caaaaagttg cattcaaggc 6480
tgaaggaaca tgagggtgca gaggcttaaa acagccttgt gtgttcaggg agctataagt 6540
agaagttctt aatttaggag aactaaacca aggggaaagg aggccaagga accacagttc 6600
ttatcccttt tctgttaata attgggttta aatgtcatta aaataagtta ttttgtcctt 6660
tttagaaaag taataacatg ctattataaa aaaaaagact tgtaggaata taaaatgtgt 6720
gttttacatg tatcctgtta attgacttgc ttttattcag attttttgca gccctttctg 6780
tttaccaggt tatcttggag acatatttat tccaaattcc tttttttttt tttttttgag 6840
atggagtctc gctctgtcgc ccaggctgga gtgcagtggc gctatcttgg ctcattgcaa 6900
gctccgcctc ccgggttcac gccactctcc tgcctcagcc tcccgagtag ctgggactac 6960
aggcgcccgc caccacgccc agctaatgtt ttttttttta tatttttagt agcgacaggg 7020
tttcaccgtg ttagccagga tggtctcaat ctcctcacat tgtgatccgc ctgcctcggc 7080
ctcccaaagt gctgggatta caggcgtgag ccagcacgcc tggccttcca aattcctttt 7140
aacagcctag caaaagaata ataaggaagg taaatctgcc cctacaagaa aataatgctt 7200
cgacgatccg gctttccttc ctgctacccc cagccataag aataaatgac cttgctcatc 7260
actgaaattt tacctgacct ttgaattttt aactgcgtca gccaaagaac ttatattttg 7320
agtattccta aggtgattgc tattgtagtt ttgaaacact tggttggtat gtttgagggt 7380
ttcatggtcc aaagttacta tagcagttaa aagagtggac tatcaggtca gacctattgg 7440
gctttaatcc cagttctgcc ttctcttaga ccttgggcct gttgttttca cttctctggt 7500
tttcagtttc tctgtccaca attgtggaaa cgaggtccac ttgtagagta attgagagga 7560
tgaagcaaga tgatgcatat caagtacttt gcatagtgcc gggcagacag gtaacattca 7620
agtgctaata attactatta ttactattta ttttttgaga caggttctca ctctgtcacc 7680
taggctggag tgcagcggtg agatcacagc tcatgacagc cttgacctcc taggctcaag 7740
tgatcctcct gcctcagcct tcggggtagc tggggctaca ggtgtgtgct accaccctca 7800
gctaattttc taattttttt gagtcaggat ctcgtcacgt tgcctaggct gaattactct 7860
tattaaaaac tataatatca ggccgagtgc ggtggctcac gcctgtaatc ccagcacttt 7920
gggaggccaa ggcgggtgga tcacctgagg tcaggagttc aagaccagcc tgcccaacag 7980
agtgagaccc cccccgtctc tactaaaaat ataaaaatta gccagttgtg gtggtgggca 8040
cctgtaatcc cagctactcg ggaggctgag gcaggataat cgcttgaacc cgggaggcgg 8100
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cactttggga ggccgaggcg ggtcaggagt tcaagaccag cctgcccaac atagtgagac 8340
cccgtctcta ctaaaaatat aaaatttagc ctgttgtggt ggcgggtgcc tgtagtccca 8400
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acaaaaaaca aaaaactgtc atatcaaaaa ctaaactaaa atggtaatat ctgttagata 8580
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tttgattgat ttgattagtt tgtggtattc tgacctctca tttttattac aagagttgga 9600
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tcacattttt tctcatgttc attttgtttt gctttttagc aaacactttt tctgacagaa 9720
tctaaaagca ttagactttt cttgttttcc ccttctctcc ccacaatgta atcttgaaaa 9780
cccaaatgtt agctgtgtaa attacctctc ccgtaaacca aacaaagtgc aatattgcat 9840
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aaaaaatggg cagttttctc tgagatgacc tagctgtagg ttccatgatc tttccttccc 66060
atgtcctgtg acaggtaaga cccagatcca gtccgtggaa ccatacacaa agcagcagct 66120
gaacaacatg tcatttgctg aaatcatcat gggctataag atcatggatg ctaccaatat 66180
cctggtgtct ccactggtct atctctatcc tgacattccc aaggaggagg cattcggaaa 66240
gtattgtcgg ccagagagcc aggagcatcc tgaagctgac ccaggtagtt gttgattttc 66300
catgttcctg gcatttaatt tttgggaaaa gttggaaatt ttgggatcct tggaggatag 66360
ataggcaaat gcctgaataa cctgggggat aattatttct ccttatggga aagaattgta 66420
gtgagtgctt ttgttggggt gaccgatggg atttgagagg agaatcagaa tcacttagag 66480
tagtgtagtt cctgctccac agagagtgca tgagtctaaa gaggggatac agcctgggca 66540
atatggtgaa acctcgtctc tacaaaaaat ccaaaaaaat tacccggtgt ggtggcacgc 66600
atttgtagtc gtagctactt gggaggctga ggtgggagga tcacctgagc caaggagttc 66660
aaggctgtag tgagcggtga tcatgccacc gcactccagc ctggctgata gagtgagata 66720
ctgtgtcaaa aaataaaaat aaagagggga tcaatacaca tacgtccccc aaaacatgcc 66780
tgaaacacga gaagggaaag tgagggcagt taacaggatg ccctgctggc acagtgcttc 66840
ttagtagatg ctagaaggtt tgaggcccag atttcagccc agcatatggc tttttgcctg 66900
taactgaacc atgtcagtgt gccagatggt ctgaagaaag ggtttctgga ggaaattatt 66960
attagctgca tgggagtatg gtttacacta gagtagaaga gctgggagca tcacgtttga 67020
aggggaagac agtgactggg tggaggggca agggattagt atttagagtg tgcaactatt 67080
gaaaataagg tatattttaa tgtgtaagag gacatgtact tatatgttat atataaatta 67140
ttttagctgg gtgaagtggc tcatgcctat agtcctagca ctttgggagg cccaggcggg 67200
aggatcactt gagcctggga gtttgagaac agcctagaca acatagtgag accctatcta 67260
tacaaaaata atttttttta aattagccac gtgtggtggt ttgtgcctgt agtcctagct 67320
actcgggagg ctgaggtggg aggattgctt aagcccagga ggttgaggct gcagtgagcc 67380
atgatcgcac cactgcactc cagcctgggt gacagagcaa gaccttgact caccaaaaaa 67440
aaaaaaaaaa aaaagagaga gaaattaaaa atactgtaat ctcagctggg catgggggtt 67500
cacacctgca gtcctagcac tttgggaggc tgaagcagga ggatcacttg aggccaggaa 67560
ctcaagacca gcctggcaac atagcaagac cccactacac acacacacac acacacacac 67620
aaagaagaga aagaaaaaaa cgaaacaaaa ctgtaatctc tgcagctgtc ctcagtgtgg 67680
agggggtagc cctgtctgtt ccccttcagc acttgctgtt ttgactctct gggttctttg 67740
tgcaggtctt gatggggagt ctctggtttg ccattctttg tttgatttaa ctttctgtaa 67800
tcataaagcc aatgatgggc tttttttttt tttttttttt tagactaagt cttgctctat 67860
cacccaagct ggagtgcagt ggcaccatct cggctcactg caacctccac ctcccggttc 67920
aagcaattct cctgcctcag cctcccgagt agctgggatt atgggcttgt gccaccatgc 67980
ccagctgatt tttgtatttt ttgtagagaa agggtttcgc catgttggcc aggctggcct 68040
cgaactcctg acctcaggtg atctgcccac ttcagcctcc caaagtgctg ggattacagg 68100
cgtgagccac tgtgcctggc ctaatgatgg gctctttaat gtgatccttt agggttggcg 68160
ccttgcccta gttgctgttg aaaaaactat ttttgtccaa atagcacaca cacagaaacc 68220
taccaacttc cctcccactt tttcctagga attccttctg agggatttct tgagatgggg 68280
cagaatgggg cttggaagag ggagttggag ctaattgacc gttgcctttc tcctttgttg 68340
gggtcctgag tcttgttcct gctgtaagag ttactcactt cctgtctgcc acctatctcc 68400
ctttgcatgt gtgcttcagt tgggagatct gtttatcagc ccctgccaca cggctctttg 68460
ttccttctgc agaggacgtt ggggtcccac ggctggtcct tttgactcat tttgctttca 68520
aggtcccacc tcccagtctg aggctgcatc ctccattacc atcgcccttc ctgtgggctg 68580
ggaggccagg tcctttcctg cccagcgatg tcagcgtttc ctcaggggcc aggcactcat 68640
caggagaaag gaactaatta cttgagtaat ttgccttgcc ttgctgagag gagtgtgccc 68700
tgagggactc catgtgagtg tggtgacggg tgtgggggtg tccctgtgtt attttaaaat 68760
gggtgccttc aggacgatga gcatgtgacc atttcctctc tatttccatc acaagagtat 68820
tatggtatga gggtctcagg ttagattatc ctcccaagac tcttctctct tccttctcta 68880
ctggaagccc acatagcatt tccttatggc ttgagggaga ggttcggagc cacttacaaa 68940
ttagataaag tacatttaca atcttgtaca aagccacaca atgaagtcat ttttctcagc 69000
tttttttttt tttttttttt tttttttgag cctgagtctc gctctatcgt ccagactgga 69060
gtgcagtggc gcgatcttgc ttcactgaaa cctctgcctc ccaggttcaa gagattctca 69120
tacctcagcc tcctgagtag ctgggattac agacatgcac cactatgcct ggctaatttt 69180
tggattttta gtagagaccg ggtttcaccc tgttggccag gctggtctcg aacccctgac 69240
ctcaagtgat cttcccgcct gggcctccca aagtgctggg attataggtg tgagccacag 69300
tgcccagcct tgtttttgtt tttgttttgt tttgacagtc tgtcactctg tcacccaggc 69360
tggagtgcag tggtgcgatc tcacctcact tcagcctctg cctcccaggt tcaagtgatt 69420
ctcctgtctc agcctcctga gtagctggga ttacaggcgt gccaccacgc ccagctattt 69480
ttgtaatttc attaaagaca gggtttcccc atgttggtga ggctggtctt gaactcctgg 69540
cctcaagtga tccacctgct tcagcctccc aaagtgcagg gattacaggc atgagccact 69600
gtgcctggcc tcagctatct tgaatgctgg agaattaaat ccttttctgt ctagggtgtc 69660
agctccctaa gggctgggcc aaaacagttg gatttataag acactagagt cttgcctcag 69720
tagctccttt gaattctgca ctgaattgat cagtttcttg gcccaaagta aactcagatg 69780
gcagcccaag agccactctg cagtgccttc tttcacatgg tcatcatgct ctctgatccc 69840
tcaggttctg tctaagcctc atgttttatg accgtgctgt tctcagccca cctcaccctg 69900
ccccatgcct tctcaatggt ttgttcacct gaattcccca gatttcatgc cagtatcccc 69960
aaggttcctt gacctcttgg tgtaagcatt cagcatctaa aattcatttt attcccgtca 70020
acgcatttct aactgtagaa caagaattat aaatgacaaa gctcatagaa aattggcacc 70080
ttgtcttccc cctccctctt attttataca taaaagagaa tatgggctgg gcattgtggc 70140
caaggctggg catgatagct catacttgta atccagcact ttgggagggt gaggcagatg 70200
gatcacctga ggtcaggagt tcaagaccag cctggccaac atggtgaaac ctcatctcta 70260
ctaaaattac aaaaaaaaaa ttagctaggc atggtggcag atgcctgtaa tccagctact 70320
caggaggctg atgaaggaga atcacttgaa ccctggaggc agaggttgta gagagccaag 70380
atggcgctac tgcactccaa cctgggcgaa agagagcaag actccgtctc aaaaaaaaaa 70440
aagacaaaaa ttagccaggc atggtggtgc cacctgtagt cccagctgct tgggagccta 70500
aggcaggaga atcgttttga cctgggagta ggaggttgcg gtaaccgaga ttgtgccact 70560
gcacttgagc ctgggcaaca gagtgagact ctgtctcaaa acaataagaa caacagcaac 70620
aaaagagaga gaccatgcct tgctccaggt ctcttagcta ttgaagatgt acctggaccc 70680
aggtctccgg tcttctagtt gaagcaattg tactgcctta caaagtcaca ttctctttgg 70740
tgctttttga ttgacgtatt tatccaacta gaaagttact catgccctca tccaaaaatg 70800
tggtagaggc cagattagtg ctggtaggaa taagagatat aacctttggc tttggaacca 70860
caagcattag cagtctccat gttctttaaa gacttggtga tattggtatt taggctggac 70920
accatgcaaa gactacacag gctcggttcc tgcatgcaga gaagttatct aagagatatg 70980
accaggccgg aatagaatgc tcagaccacg tggaggctgt taaactttta cataatctag 71040
ggaaagaagg gacacaaggt ggcattagtc tagggtcagg tgggaaaagg ttatgctgaa 71100
aagtctctgc agctcaggac agctttgtgc aaagaactga agttcacagc tgctagtgcc 71160
tgggagatca aatagtataa atgagggcag acaaccctga ggggcagatg gagctttcca 71220
gacaatcttg gcatgaggat gagtgagttt caaatcagtc ctgccgaggc agatggcttc 71280
ctccagctct gcttactgaa tgcgaagtca cagtcagtaa gaaaactggt tttcttcttc 71340
ccaggcgctg ccccatacct gaagaccaag tttatctgtg tgacaccgta agtggcttcc 71400
tttccccgtt ttgccttcat ttctaatatc ctcagttatc cctgggaatg ggacactggg 71460
tgagagttaa tctgccaaag gttggaagcc cctgggctat gtttagtact caaagtgacc 71520
ttgtgtgttt aaaaagcttg agcttttatt tttctgttgg agaccagagt ttgatggctt 71580
gtgtgtgtgt gttttgttct tttttttttt tccattgtgt cttgtcaacc ccccgtttcc 71640
cctcctgctg ccccccattt cctacagaac gacctgcagc aataccattg acctgccgat 71700
gtccccccgc actttagatt cattgatgca gtttggaaat aatggtgaag gtgctgaacc 71760
ctcagcagga gggcagtttg gtgagtattt ggttgacaga ctttgtccct ataagggaag 71820
ttggtcccct ttgtgtgatg ctctcacatg tacacaccga gagctggtca ctcggaatgg 71880
taggagattc tagagctttg ctttccaaaa gagatggtat gaatgccaca tgtgtgagta 71940
taaatcttct agcagccaca ctggaaatag acgaacttaa tttttacaat atattttatt 72000
taacccacta aatccaacat actctcaatt taacatttca gaaaaagttg aggctgggtg 72060
agtggctcat gcctgtaatc ccagcacttt gggaggccga ggtgggtgga tcacttgagg 72120
tcaggagttc gagaccagtc tgaccaaaat ctctaaaata taaaaattag ctgggcatgg 72180
tggcgcatac ctgtaatccc agctactcaa gaagctgagg tgggaggatc gcttgagcct 72240
gggaggtgga ggttgcagtg agcagagatc gtgccactgc actccagcct gggcgacaga 72300
gtgagactcc atctcaaata aacaaaacta aactaaaaag aaaaagttga gacctttttt 72360
tattcttttt tttcatacta agcctttaaa atccagtggg cttttgacag ccacagcaca 72420
gctcagtttg gacaaaccaa atctcaaatg cttggtggcc acgtgtgtct cggggctcct 72480
gaattaaaca gtagatcaag ggcagaagat ctcaggacag ccttagagct tctgtaaaca 72540
tggagctctg ggaatcagtt aaggtgggaa tgagaaagga cccttcccga ggcagggtcc 72600
tccagggagg agggtaaatc tggcttttct gaccatccct gggccttaag gggcaggaga 72660
ttggatagca gtggtagcct gggccctgtc ctctgaaggg ctgggggcgt ggcctgccag 72720
ttgcagaggg tggacaactg aactagtttt ccctgtctgt ccctccagag tccctcacct 72780
ttgacatgga gttgacctcg gagtgcgcta cctcccccat gtgaggagct gagaacggaa 72840
gctgcagaaa gatacgactg aggcgcctac ctgcattctg ccacccctca cacagccaaa 72900
ccccagatca tctgaaacta ctaactttgt ggttccagat tttttttaat ctcctacttc 72960
tgctatcttt gagcaatctg ggcactttta aaaatagaga aatgagtgaa tgtgggtgat 73020
ctgcttttat ctaaatgcaa ataaggatgt gttctctgag acccatgatc aggggatgtg 73080
gcggggggtg gctagaggga gaaaaaggaa atgtcttgtg ttgttttgtt cccctgccct 73140
cctttctcag cagctttttg ttattgttgt tgttgttctt agacaagtgc ctcctggtgc 73200
ctgcggcatc cttctgcctg tttctgtaag caaatgccac aggccaccta tagctacata 73260
ctcctggcat tgcacttttt aaccttgctg acatccaaat agaagatagg actatctaag 73320
ccctaggttt ctttttaaat taagaaataa taacaattaa agggcaaaaa acactgtatc 73380
agcatagcct ttctgtattt aagaaactta agcagccggg catggtggct cacgcctgta 73440
atcccagcac tttgggaggc cgaggcggat cataaggtca ggagatcaag accatcctgg 73500
ctaacacggt gaaaccccgt ctctactaaa agtacaaaaa attagctggg tgtggtggtg 73560
ggcgcctgta gtcccagcta ctcgggaggc tgaggcagga gaatcgcttg aacctgagag 73620
gcggaggttg cagtgagcca aaattgcacc actgcacact gcactccatc ctgggcgaca 73680
gtctgagact ctgtctcaaa aaaaaaaaaa aaaaaaagaa acttcagtta acagcctcct 73740
tggtgcttta agcattcagc ttccttcagg ctggtaattt atataatccc tgaaacgggc 73800
ttcaggtcaa acccttaaga catctgaagc tgcaacctgg cctttggtgt tgaaatagga 73860
aggtttaagg agaatctaag cattttagac ttttttttat aaatagactt attttccttt 73920
gtaatgtatt ggccttttag tgagtaaggc tgggcagagg gtgcttacaa ccttgactcc 73980
ctttctccct ggacttgatc tgctgtttca gaggctaggt tgtttctgtg ggtgccttat 74040
cagggctggg atacttctga ttctggcttc cttcctgccc caccctcccg accccagtcc 74100
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agccagtttc ttggtgatat ccagtggcac ttgtaatggc gtcttcattc agttcatgca 74340
gggcaaaggc ttactgataa acttgagtct gccctcgtat gagggtgtat acctggcctc 74400
cctctgaggc tggtgactcc tccctgctgg ggccccacag gtgaggcaga acagctagag 74460
ggcctccccg cctgcccgcc ttggctggct agctcgcctc tcctgtgcgt atgggaacac 74520
ctagcacgtg ctggatgggc tgcctctgac tcagaggcat ggccggattt ggcaactcaa 74580
aaccaccttg cctcagctga tcagagtttc tgtggaattc tgtttgttaa atcaaattag 74640
ctggtctctg aattaagggg gagacgacct tctctaagat gaacagggtt cgccccagtc 74700
ctcctgcctg gagacagttg atgtgtcatg cagagctctt acttctccag caacactctt 74760
cagtacataa taagcttaac tgataaacag aatatttaga aaggtgagac ttgggcttac 74820
cattgggttt aaatcatagg gacctagggc gagggttcag ggcttctctg gagcagatat 74880
tgtcaagttc atggccttag gtagcatgta tctggtctta actctgattg tagcaaaagt 74940
tctgagagga gctgagccct gttgtggccc attaaagaac agggtcctca ggccctgccc 75000
gcttcctgtc cactgccccc tccccatccc cagcccagcc gagggaatcc cgtgggttgc 75060
ttacctacct ataaggtggt ttataagctg ctgtcctggc cactgcattc aaattccaat 75120
gtgtacttca tagtgtaaaa atttatatta ttgtgaggtt ttttgtcttt tttttttttt 75180
tttttttttg gtatattgct gtatctactt taacttccag aaataaacgt tatataggaa 75240
ccgtc 75245
<210> 31
<211> 770
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> STAT3 Amino Acid Sequence
<400> 31
Met Ala Gln Trp Asn Gln Leu Gln Gln Leu Asp Thr Arg Tyr Leu Glu
1 5 10 15
Gln Leu His Gln Leu Tyr Ser Asp Ser Phe Pro Met Glu Leu Arg Gln
20 25 30
Phe Leu Ala Pro Trp Ile Glu Ser Gln Asp Trp Ala Tyr Ala Ala Ser
35 40 45
Lys Glu Ser His Ala Thr Leu Val Phe His Asn Leu Leu Gly Glu Ile
50 55 60
Asp Gln Gln Tyr Ser Arg Phe Leu Gln Glu Ser Asn Val Leu Tyr Gln
65 70 75 80
His Asn Leu Arg Arg Ile Lys Gln Phe Leu Gln Ser Arg Tyr Leu Glu
85 90 95
Lys Pro Met Glu Ile Ala Arg Ile Val Ala Arg Cys Leu Trp Glu Glu
100 105 110
Ser Arg Leu Leu Gln Thr Ala Ala Thr Ala Ala Gln Gln Gly Gly Gln
115 120 125
Ala Asn His Pro Thr Ala Ala Val Val Thr Glu Lys Gln Gln Met Leu
130 135 140
Glu Gln His Leu Gln Asp Val Arg Lys Arg Val Gln Asp Leu Glu Gln
145 150 155 160
Lys Met Lys Val Val Glu Asn Leu Gln Asp Asp Phe Asp Phe Asn Tyr
165 170 175
Lys Thr Leu Lys Ser Gln Gly Asp Met Gln Asp Leu Asn Gly Asn Asn
180 185 190
Gln Ser Val Thr Arg Gln Lys Met Gln Gln Leu Glu Gln Met Leu Thr
195 200 205
Ala Leu Asp Gln Met Arg Arg Ser Ile Val Ser Glu Leu Ala Gly Leu
210 215 220
Leu Ser Ala Met Glu Tyr Val Gln Lys Thr Leu Thr Asp Glu Glu Leu
225 230 235 240
Ala Asp Trp Lys Arg Arg Gln Gln Ile Ala Cys Ile Gly Gly Pro Pro
245 250 255
Asn Ile Cys Leu Asp Arg Leu Glu Asn Trp Ile Thr Ser Leu Ala Glu
260 265 270
Ser Gln Leu Gln Thr Arg Gln Gln Ile Lys Lys Leu Glu Glu Leu Gln
275 280 285
Gln Lys Val Ser Tyr Lys Gly Asp Pro Ile Val Gln His Arg Pro Met
290 295 300
Leu Glu Glu Arg Ile Val Glu Leu Phe Arg Asn Leu Met Lys Ser Ala
305 310 315 320
Phe Val Val Glu Arg Gln Pro Cys Met Pro Met His Pro Asp Arg Pro
325 330 335
Leu Val Ile Lys Thr Gly Val Gln Phe Thr Thr Lys Val Arg Leu Leu
340 345 350
Val Lys Phe Pro Glu Leu Asn Tyr Gln Leu Lys Ile Lys Val Cys Ile
355 360 365
Asp Lys Asp Ser Gly Asp Val Ala Ala Leu Arg Gly Ser Arg Lys Phe
370 375 380
Asn Ile Leu Gly Thr Asn Thr Lys Val Met Asn Met Glu Glu Ser Asn
385 390 395 400
Asn Gly Ser Leu Ser Ala Glu Phe Lys His Leu Thr Leu Arg Glu Gln
405 410 415
Arg Cys Gly Asn Gly Gly Arg Ala Asn Cys Asp Ala Ser Leu Ile Val
420 425 430
Thr Glu Glu Leu His Leu Ile Thr Phe Glu Thr Glu Val Tyr His Gln
435 440 445
Gly Leu Lys Ile Asp Leu Glu Thr His Ser Leu Pro Val Val Val Ile
450 455 460
Ser Asn Ile Cys Gln Met Pro Asn Ala Trp Ala Ser Ile Leu Trp Tyr
465 470 475 480
Asn Met Leu Thr Asn Asn Pro Lys Asn Val Asn Phe Phe Thr Lys Pro
485 490 495
Pro Ile Gly Thr Trp Asp Gln Val Ala Glu Val Leu Ser Trp Gln Phe
500 505 510
Ser Ser Thr Thr Lys Arg Gly Leu Ser Ile Glu Gln Leu Thr Thr Leu
515 520 525
Ala Glu Lys Leu Leu Gly Pro Gly Val Asn Tyr Ser Gly Cys Gln Ile
530 535 540
Thr Trp Ala Lys Phe Cys Lys Glu Asn Met Ala Gly Lys Gly Phe Ser
545 550 555 560
Phe Trp Val Trp Leu Asp Asn Ile Ile Asp Leu Val Lys Lys Tyr Ile
565 570 575
Leu Ala Leu Trp Asn Glu Gly Tyr Ile Met Gly Phe Ile Ser Lys Glu
580 585 590
Arg Glu Arg Ala Ile Leu Ser Thr Lys Pro Pro Gly Thr Phe Leu Leu
595 600 605
Arg Phe Ser Glu Ser Ser Lys Glu Gly Gly Val Thr Phe Thr Trp Val
610 615 620
Glu Lys Asp Ile Ser Gly Lys Thr Gln Ile Gln Ser Val Glu Pro Tyr
625 630 635 640
Thr Lys Gln Gln Leu Asn Asn Met Ser Phe Ala Glu Ile Ile Met Gly
645 650 655
Tyr Lys Ile Met Asp Ala Thr Asn Ile Leu Val Ser Pro Leu Val Tyr
660 665 670
Leu Tyr Pro Asp Ile Pro Lys Glu Glu Ala Phe Gly Lys Tyr Cys Arg
675 680 685
Pro Glu Ser Gln Glu His Pro Glu Ala Asp Pro Gly Ser Ala Ala Pro
690 695 700
Tyr Leu Lys Thr Lys Phe Ile Cys Val Thr Pro Thr Thr Cys Ser Asn
705 710 715 720
Thr Ile Asp Leu Pro Met Ser Pro Arg Thr Leu Asp Ser Leu Met Gln
725 730 735
Phe Gly Asn Asn Gly Glu Gly Ala Glu Pro Ser Ala Gly Gly Gln Phe
740 745 750
Glu Ser Leu Thr Phe Asp Met Glu Leu Thr Ser Glu Cys Ala Thr Ser
755 760 765
Pro Met
770
<210> 32
<211> 4953
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> STAT3 mRNA NM_003150.3
<400> 32
ggtttccgga gctgcggcgg cgcagactgg gagggggagc cgggggttcc gacgtcgcag 60
ccgagggaac aagccccaac cggatcctgg acaggcaccc cggcttggcg ctgtctctcc 120
ccctcggctc ggagaggccc ttcggcctga gggagcctcg ccgcccgtcc ccggcacacg 180
cgcagccccg gcctctcggc ctctgccgga gaaacaggat ggcccaatgg aatcagctac 240
agcagcttga cacacggtac ctggagcagc tccatcagct ctacagtgac agcttcccaa 300
tggagctgcg gcagtttctg gccccttgga ttgagagtca agattgggca tatgcggcca 360
gcaaagaatc acatgccact ttggtgtttc ataatctcct gggagagatt gaccagcagt 420
atagccgctt cctgcaagag tcgaatgttc tctatcagca caatctacga agaatcaagc 480
agtttcttca gagcaggtat cttgagaagc caatggagat tgcccggatt gtggcccggt 540
gcctgtggga agaatcacgc cttctacaga ctgcagccac tgcggcccag caagggggcc 600
aggccaacca ccccacagca gccgtggtga cggagaagca gcagatgctg gagcagcacc 660
ttcaggatgt ccggaagaga gtgcaggatc tagaacagaa aatgaaagtg gtagagaatc 720
tccaggatga ctttgatttc aactataaaa ccctcaagag tcaaggagac atgcaagatc 780
tgaatggaaa caaccagtca gtgaccaggc agaagatgca gcagctggaa cagatgctca 840
ctgcgctgga ccagatgcgg agaagcatcg tgagtgagct ggcggggctt ttgtcagcga 900
tggagtacgt gcagaaaact ctcacggacg aggagctggc tgactggaag aggcggcaac 960
agattgcctg cattggaggc ccgcccaaca tctgcctaga tcggctagaa aactggataa 1020
cgtcattagc agaatctcaa cttcagaccc gtcaacaaat taagaaactg gaggagttgc 1080
agcaaaaagt ttcctacaaa ggggacccca ttgtacagca ccggccgatg ctggaggaga 1140
gaatcgtgga gctgtttaga aacttaatga aaagtgcctt tgtggtggag cggcagccct 1200
gcatgcccat gcatcctgac cggcccctcg tcatcaagac cggcgtccag ttcactacta 1260
aagtcaggtt gctggtcaaa ttccctgagt tgaattatca gcttaaaatt aaagtgtgca 1320
ttgacaaaga ctctggggac gttgcagctc tcagaggatc ccggaaattt aacattctgg 1380
gcacaaacac aaaagtgatg aacatggaag aatccaacaa cggcagcctc tctgcagaat 1440
tcaaacactt gaccctgagg gagcagagat gtgggaatgg gggccgagcc aattgtgatg 1500
cttccctgat tgtgactgag gagctgcacc tgatcacctt tgagaccgag gtgtatcacc 1560
aaggcctcaa gattgaccta gagacccact ccttgccagt tgtggtgatc tccaacatct 1620
gtcagatgcc aaatgcctgg gcgtccatcc tgtggtacaa catgctgacc aacaatccca 1680
agaatgtaaa cttttttacc aagcccccaa ttggaacctg ggatcaagtg gccgaggtcc 1740
tgagctggca gttctcctcc accaccaagc gaggactgag catcgagcag ctgactacac 1800
tggcagagaa actcttggga cctggtgtga attattcagg gtgtcagatc acatgggcta 1860
aattttgcaa agaaaacatg gctggcaagg gcttctcctt ctgggtctgg ctggacaata 1920
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attcctgtct tcaatgcact ggaatctgct tctcacgtac tttctgtact tcttacggta 25260
atctacggca aagacaggaa gttaggggga aagtatacac acatccacct gagatgcgct 25320
ctcagctggg gcctgtcatc ggaagcgagt ggtaaccgga atggagaaat ggaaggtgca 25380
gctcctcccc actgggtagg aaaggtgccg agaatctctg gtgtcaagtt tttaagatac 25440
acagctgagc agaaggccca tctctatgtg tagctaccag cccaaagatc atttgaatca 25500
atcttattcc tttaagtaat ctgcatccta tgccttatca aacttgaaac gcttaatcac 25560
cgccgctggc tctgggactg caagagccac acaaacatga atttgtttct tcaactgaca 25620
atggatttcc tgagacaggc ctttgcattc caaagagcag gaacctatag tatggccaag 25680
ttacccagct gctcagcttc ccagagcctc ctgaaccagg tcttaaaact caactagaag 25740
caccacccca gtcgcttacc tttcttcatt ttacaaatag agattctcga aaggtactcc 25800
agtaaaccca tccactcctc ttcaatgctg tcttcctggc atatcacagt gggattcgaa 25860
acacgtgcat tatctgaacc taaaagggaa aaaaaaggtg tcaaaaccca gaactattat 25920
cacagaggat gcaattgaaa cctggcctaa tatttggcat gagagaggag accccaaaca 25980
tcccccaaat caaaacatgg ctctgagttg cagaggacag gtatccagtc aaaagtctgg 26040
ttgggagcat ttctgcactc ctagtttcaa aacaacttct gctgtccacc tgccaagcat 26100
gtgttcccac tgtccccagt ctcagaatct cttcctcagg cctggaaatc aatcagcaaa 26160
catgcgaagc aggctaagtt tcttttaccc tcgtttgctt ttgcctgccc ctggcagcct 26220
gattgtgagg gcatctccaa gctctcctat atccccaaca cggctgtggg ctaagaaagg 26280
tcacccttcc ctgaccgcag ttccctgcaa tccattttac acacgtcttc tattgtcaag 26340
tctagatgtc tggttcttca agagtgagaa cgaccagtct atttcgtgcc taatctagtg 26400
gttgggaatc ctggctgact ttagaatcac ccaggaagct ttaaaaatat ggacttcagg 26460
actgcacgcc cagaggttct ttttcagtcc ctctgaggtg aggcccagga accatcacat 26520
actaaaagct cccaggtgat tccaacatgc atctgtgttg agaatcacaa atccaaacag 26580
tcactagata gcatatctta agaaggcatt ctataggaga aattcaggtt aggtaaaaca 26640
agagttagtc actaggggaa atatataaga cagataactt caggtgggca ggaatctaca 26700
agtaacataa atgatttttt tttttttttt gagacagggc ctcactctat tgcccaggct 26760
ggagtgcaat gacacaatca tggctccctg cagcctcaac ctcctgggct caagtgatcc 26820
tcccacctca gcctccagaa cagctgggac tattgacacg tgccaccaca cctaactaat 26880
gtttgcattt tttgtagaga caggttctca ctatgttgcc caggctggtc tcaaactcct 26940
gggctcaagc aatcctccca tcttggcctc ctgaagtgct gggattacag gcataagcca 27000
ctgcgcccag cccataaaag acctctgaca gctgtctact tggtaaccat atcacaaaat 27060
aaaatccaaa aaatctaagc caaaaccaaa atcttattct ttttttttaa gagacagagt 27120
cttgctttgt ttccaaagct ggagggcagt ggcatggtca tagctcactc cagcctggaa 27180
ctcctgagct caagtgatgc acccacttca gccacctgag taactgggac tcaggtagga 27240
gccatgacag taaattagcc aaagtctatt acctaaaacc taaccccacc ccaggaaaca 27300
aacaaacaaa cttctaaccc tagttataac ttttctgcct caaaatccag atatggaagc 27360
aaagacggtg tagtggttaa gagccaggct ttgatcagag acatgccctg ctttttaccc 27420
cagctctggt tatggctaga aataaaccat gggccagtta ggatctcttc caggctcacc 27480
tcattcactt gcaggaggga taataccaga agctgtttca tgggtttctt gaatgtgcca 27540
taaaatccat aaaaactgct tagcaaagta cttctacagt tgtgattatg acactttcat 27600
ttgggtatgt gagtatataa gtactgacac aatgataatt gctttattta cttagagatg 27660
aggtctccct atgttgctca ggctggtttt gagctcctgg gctcaagcga tcctcctgcc 27720
ttagcctcct gagtagctgg gactacaggt gagagccatt gcagcaactg gtttctgacc 27780
tcccccggct gcacactgct gtctgtttcc ccagtgtcat tacacccaca ctgctgccct 27840
gccttaacat gtgtctccct atccactgac tcatttgtac tcctccttcc catcaccacc 27900
agctctacat catcatcctg caataccctg cccttctctg agccctacct ttgcctagaa 27960
cacaagacaa aagaaagaac cttatcccca atgtgtacat ggggattaag agaatttctt 28020
ttacattcca attcccaaag tggtggtgaa aggaaaggct tctgccccaa actccacggt 28080
tcttcaagga gagaggctgc cctctgggcc ataggaagca gaggcccaag cctgctgacc 28140
acacagcaga tactggacaa aacatgtggt ctgagaagct ggatggagaa ttggaggcag 28200
gtctaggcac tgctgagatt cagataaaga gggactaatc atggcaggtg cccagggggt 28260
aggtacagtc tgcatcagct ttttaaagga gttagagaaa gcaaacagtt tgcctccacc 28320
ttctcatagc actaccgtga gaggggaaaa gagaaaaaac caagacaata caagaaaaaa 28380
aaattttttt ttgaaacagg gtcttgctct ttagcccagg ctggagtgcc gtggtgcaat 28440
ctcagctcac tgcaacctcc actccccatg ttcaagcaat tctcctacct cagcctcctg 28500
agtagctggg attacaggtg cccaccacca cacccggcta attttttttg tatttttagt 28560
agagatgggg ttttgccatg ttggccaggc tggtgttgaa ctcctgacct caggtgatcc 28620
acccacctca gcctcacaaa gtgctggaat tacaggcatg agccaccatg cccggccatg 28680
atttaaaaaa aaaaaaatca tactaacttc tgtgcatcaa aggacacagt taaccaaatg 28740
aaaagacaac ccacagaata ggagaaaata tttgtaaatc atatatctga tatggggtta 28800
atatctagaa tacataaaga actcctacaa ggcaacaaca aaagccaaac ctggtctgaa 28860
aatgagaaaa gaacttgaac agaactttct ctgaagaagc tctataaatg gccaacaagc 28920
agtgaaaatg tgctcagcat cacttatcat tagggaaacg gaaatcaaaa ctacagtgag 28980
ataccacctc acactcatta gaatggctac tataaaaaag aaaaaataaa taaaaataac 29040
gtgttcttag gatatggaga aattggaacc cttgtgtgct gttggtggga aatggtgcag 29100
atggtatcta aaacagtaga gcagttcttc aaaatattta acagaattac cgtatgattc 29160
agaaatttca cttctgagta tataccccag agaattcaaa gcagggtctt gaagagatat 29220
ttgtgcacca acactcataa cagcattaac aataacaaaa aggtagaagt aatccaggtg 29280
ttcatcaaca gataactaaa caaaatttgg tatatggtac catggagtat ttatacagtc 29340
ttttttaaag gaagggaatt ccgacacatg ctacaacata gttgaacccg gaggacatta 29400
tgctgagtga aataaactac tcataaagga aaaaatgctg tatgtttcca cttatatgag 29460
gtacccagag tagtaagatt cacagagatg gcaaatagaa tggtggttac cagggctggg 29520
agaatgaggc aatgaggagt tatcattcaa tgggtgagga gtttcagttt tgcaagatga 29580
aaacagttct ggagactggt tgcacaatgt gagtgtacct aacactactg aactgtacat 29640
ttaaaaatta ttacggccgg gcgcggtggc tcacacctgt aattccagca ctttgcgagg 29700
ccgaggcggg tggatcacct gaggtcggga gtttgagacc aacctgacca acatggagaa 29760
accccatctc tactaaaaat acaaaattag ccgggcgtgg aggtgcaatg cctgtaatcc 29820
cagctacttg ggaggctgag gcaggaaaat cgcttgaacc cgggaggtgg aggttgcagt 29880
gagccaagat ctcaccattg cactccagcc tgggcaacaa gagcaactcc gtctcaaaaa 29940
aaaatatata tatatatata tataaagatg gaaaattgta cactatgtgc acttggccac 30000
aatttttttt aaaagtcttc cttccactca ccccacttcg gctcatctct ttttgctttc 30060
tcataaaggt ctctcctgtt gatcgcagcg aagatccaca cggccatggc ccacgccttc 30120
tcctccccat tgaagtcgat cattagcgtg gctagatcca catggtctgc cttctctgtc 30180
tgacccctcg ggagggggat gcagcccttc tggggaggat agtcctctaa gtgcatctta 30240
aatttcttca agtccacatc ctccaggtcc tccaggtacc tggccagctt gcagcgggtg 30300
cttgccatct tcatctgcag ctgttttcag ggtccttagg cttcggtcca cactaagata 30360
ccaggcagtg aacacggcac acggatgagt cttttttaaa gtctccactt tgagagatat 30420
aaattatcaa aaactcagca aacagaaaga aaaaaatgtc acatgactgt aacaagtcaa 30480
aatctttaat tttgaaaagt tagccaaggc cgggcacagt ggctcacgcc tgtaatccca 30540
gcactttgag aggccaaggc aggcagatca cctgagctga ggaattcaag accagcctgg 30600
ccaacatggc aaaactgtgt ctctactaaa agtacaaaaa tgagccgggt gtggtggcgg 30660
gcgcctgtaa tcccagctac tcaggaagtt gaggtaggag aattgattga acccgggaag 30720
tggaggctgc agtgagccaa gatcacgcca ctgcactcca gcctaggcga cacagcaaga 30780
ctccatctca aaaaaaaaaa agttagccaa atgcttacca gaaagttctc ctgttggctc 30840
gatccaggag tgtgtcctga gccatggaag aaaggtttcc ctatggaggg aaaaatatgc 30900
aaacaaatcc ataaacagga ttgtattaca gtttacggtg aacaaccact tcacgatgcc 30960
atcttgaccc atcagcaaga aaatttttgt cccgttgatt acggggctat gacattggac 31020
aaactcttca ctattcctca acttcagttt cctcatctac aaaatgagaa agcagaagag 31080
aatgttttca gttcctccaa actgaaggct ctggctcttt gcttctgttt ttgtgaggga 31140
agagggatga gagacaatag aaggagaagg ccaggaggtg agtaagtgtg ttgataacag 31200
aacaggacgt ggctagggag agaggagaga gaacataaaa gcttgcagag gaggggacag 31260
tctttgactg cacttctatc aaccagtgga ttgaagtgag atgaagctgg gagtgcataa 31320
tggagaataa taaaaacata catccctgta atcccagcac tttgggaggc cgaggtgggc 31380
ggatcacctg aggtcaggag ttggagacca ggctcaccaa acaacaggga gaaatcccgt 31440
ctctactaaa aatacaaaaa ttaaccgggc atggtaccag gcacctgtaa tcccagctac 31500
tcgggaggct gaggcaggag aatcgcttga acccaggagg cggaggttgc gatgagccaa 31560
gatcacacca ctgcactcca gcctgggcaa taagagcaaa actccatctc aaaaaataaa 31620
atagaataaa ataaaataaa taaaaacata catcctttaa tgtctccttg caaaattcgc 31680
aattgttatc attataattc acattaattt agagctttcc acaggctagg cactcactga 31740
tgtttttccc catctaacct gcacagagct ctatgaggtg cacctattcc tagccccatt 31800
ttatagatgc ataaactgag tcttaggggg actaggaagc ctgccgaggg gtttagaacc 31860
aggaaggaac agagccagga ttttgaccag agatatgaga ccatgtcttc catcacttgt 31920
ttcagtcaga caaagacaaa gacaacaaaa tagatgacta aaagacacac ttccccagca 31980
tttatcacag gtgtatcact gcagcattca ccaacatagt cttcccaact agactgtgag 32040
ttccacaaaa actagcaatc acctgctgta tctttagatc ttccatatct cctagagtcc 32100
ggatggatga acaagttggc tttgtttgga attgttccct ccttgatccc ttgattatac 32160
tctatttggc aaagcacctc aacctaaagc cataaataac actcaaggga ggcagagagc 32220
ctggaaaacg gtggagctct ccaaattgga atttctgtga ctgcagttca atgtcaagat 32280
gcctcagact cactcatctc tcccgtccca tctccattcc tgcctatcta ctcctcgcct 32340
cctgagccct gcaaacccag ccctgtgcat cctgaggtga ctgctctcca gacagcccta 32400
ttagctccgc ataccctccc agctcctgcc catcctgagg tgactgctct ccagacagcc 32460
ctattagctc cgcataccct cccagctcct gccccatcag tccttccatc tgcatcagga 32520
ttctgccttt cttctgtgct ccttccaccc taacaccagc acaaaaatct gctgcccttt 32580
ggtctttaag gaggtttgtt tccttctgta tatcccatcc atcttctccc ctgggaggga 32640
tactgggcaa atctgctgaa gtcgtgggtg taaactatgg ttgctgccgc tgtcctcccc 32700
gcttcccccc gccacataca cacacacga 32729
<210> 34
<211> 1036
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NLRP3 Canonical
<400> 34
Met Lys Met Ala Ser Thr Arg Cys Lys Leu Ala Arg Tyr Leu Glu Asp
1 5 10 15
Leu Glu Asp Val Asp Leu Lys Lys Phe Lys Met His Leu Glu Asp Tyr
20 25 30
Pro Pro Gln Lys Gly Cys Ile Pro Leu Pro Arg Gly Gln Thr Glu Lys
35 40 45
Ala Asp His Val Asp Leu Ala Thr Leu Met Ile Asp Phe Asn Gly Glu
50 55 60
Glu Lys Ala Trp Ala Met Ala Val Trp Ile Phe Ala Ala Ile Asn Arg
65 70 75 80
Arg Asp Leu Tyr Glu Lys Ala Lys Arg Asp Glu Pro Lys Trp Gly Ser
85 90 95
Asp Asn Ala Arg Val Ser Asn Pro Thr Val Ile Cys Gln Glu Asp Ser
100 105 110
Ile Glu Glu Glu Trp Met Gly Leu Leu Glu Tyr Leu Ser Arg Ile Ser
115 120 125
Ile Cys Lys Met Lys Lys Asp Tyr Arg Lys Lys Tyr Arg Lys Tyr Val
130 135 140
Arg Ser Arg Phe Gln Cys Ile Glu Asp Arg Asn Ala Arg Leu Gly Glu
145 150 155 160
Ser Val Ser Leu Asn Lys Arg Tyr Thr Arg Leu Arg Leu Ile Lys Glu
165 170 175
His Arg Ser Gln Gln Glu Arg Glu Gln Glu Leu Leu Ala Ile Gly Lys
180 185 190
Thr Lys Thr Cys Glu Ser Pro Val Ser Pro Ile Lys Met Glu Leu Leu
195 200 205
Phe Asp Pro Asp Asp Glu His Ser Glu Pro Val His Thr Val Val Phe
210 215 220
Gln Gly Ala Ala Gly Ile Gly Lys Thr Ile Leu Ala Arg Lys Met Met
225 230 235 240
Leu Asp Trp Ala Ser Gly Thr Leu Tyr Gln Asp Arg Phe Asp Tyr Leu
245 250 255
Phe Tyr Ile His Cys Arg Glu Val Ser Leu Val Thr Gln Arg Ser Leu
260 265 270
Gly Asp Leu Ile Met Ser Cys Cys Pro Asp Pro Asn Pro Pro Ile His
275 280 285
Lys Ile Val Arg Lys Pro Ser Arg Ile Leu Phe Leu Met Asp Gly Phe
290 295 300
Asp Glu Leu Gln Gly Ala Phe Asp Glu His Ile Gly Pro Leu Cys Thr
305 310 315 320
Asp Trp Gln Lys Ala Glu Arg Gly Asp Ile Leu Leu Ser Ser Leu Ile
325 330 335
Arg Lys Lys Leu Leu Pro Glu Ala Ser Leu Leu Ile Thr Thr Arg Pro
340 345 350
Val Ala Leu Glu Lys Leu Gln His Leu Leu Asp His Pro Arg His Val
355 360 365
Glu Ile Leu Gly Phe Ser Glu Ala Lys Arg Lys Glu Tyr Phe Phe Lys
370 375 380
Tyr Phe Ser Asp Glu Ala Gln Ala Arg Ala Ala Phe Ser Leu Ile Gln
385 390 395 400
Glu Asn Glu Val Leu Phe Thr Met Cys Phe Ile Pro Leu Val Cys Trp
405 410 415
Ile Val Cys Thr Gly Leu Lys Gln Gln Met Glu Ser Gly Lys Ser Leu
420 425 430
Ala Gln Thr Ser Lys Thr Thr Thr Ala Val Tyr Val Phe Phe Leu Ser
435 440 445
Ser Leu Leu Gln Pro Arg Gly Gly Ser Gln Glu His Gly Leu Cys Ala
450 455 460
His Leu Trp Gly Leu Cys Ser Leu Ala Ala Asp Gly Ile Trp Asn Gln
465 470 475 480
Lys Ile Leu Phe Glu Glu Ser Asp Leu Arg Asn His Gly Leu Gln Lys
485 490 495
Ala Asp Val Ser Ala Phe Leu Arg Met Asn Leu Phe Gln Lys Glu Val
500 505 510
Asp Cys Glu Lys Phe Tyr Ser Phe Ile His Met Thr Phe Gln Glu Phe
515 520 525
Phe Ala Ala Met Tyr Tyr Leu Leu Glu Glu Glu Lys Glu Gly Arg Thr
530 535 540
Asn Val Pro Gly Ser Arg Leu Lys Leu Pro Ser Arg Asp Val Thr Val
545 550 555 560
Leu Leu Glu Asn Tyr Gly Lys Phe Glu Lys Gly Tyr Leu Ile Phe Val
565 570 575
Val Arg Phe Leu Phe Gly Leu Val Asn Gln Glu Arg Thr Ser Tyr Leu
580 585 590
Glu Lys Lys Leu Ser Cys Lys Ile Ser Gln Gln Ile Arg Leu Glu Leu
595 600 605
Leu Lys Trp Ile Glu Val Lys Ala Lys Ala Lys Lys Leu Gln Ile Gln
610 615 620
Pro Ser Gln Leu Glu Leu Phe Tyr Cys Leu Tyr Glu Met Gln Glu Glu
625 630 635 640
Asp Phe Val Gln Arg Ala Met Asp Tyr Phe Pro Lys Ile Glu Ile Asn
645 650 655
Leu Ser Thr Arg Met Asp His Met Val Ser Ser Phe Cys Ile Glu Asn
660 665 670
Cys His Arg Val Glu Ser Leu Ser Leu Gly Phe Leu His Asn Met Pro
675 680 685
Lys Glu Glu Glu Glu Glu Glu Lys Glu Gly Arg His Leu Asp Met Val
690 695 700
Gln Cys Val Leu Pro Ser Ser Ser His Ala Ala Cys Ser His Gly Leu
705 710 715 720
Val Asn Ser His Leu Thr Ser Ser Phe Cys Arg Gly Leu Phe Ser Val
725 730 735
Leu Ser Thr Ser Gln Ser Leu Thr Glu Leu Asp Leu Ser Asp Asn Ser
740 745 750
Leu Gly Asp Pro Gly Met Arg Val Leu Cys Glu Thr Leu Gln His Pro
755 760 765
Gly Cys Asn Ile Arg Arg Leu Trp Leu Gly Arg Cys Gly Leu Ser His
770 775 780
Glu Cys Cys Phe Asp Ile Ser Leu Val Leu Ser Ser Asn Gln Lys Leu
785 790 795 800
Val Glu Leu Asp Leu Ser Asp Asn Ala Leu Gly Asp Phe Gly Ile Arg
805 810 815
Leu Leu Cys Val Gly Leu Lys His Leu Leu Cys Asn Leu Lys Lys Leu
820 825 830
Trp Leu Val Ser Cys Cys Leu Thr Ser Ala Cys Cys Gln Asp Leu Ala
835 840 845
Ser Val Leu Ser Thr Ser His Ser Leu Thr Arg Leu Tyr Val Gly Glu
850 855 860
Asn Ala Leu Gly Asp Ser Gly Val Ala Ile Leu Cys Glu Lys Ala Lys
865 870 875 880
Asn Pro Gln Cys Asn Leu Gln Lys Leu Gly Leu Val Asn Ser Gly Leu
885 890 895
Thr Ser Val Cys Cys Ser Ala Leu Ser Ser Val Leu Ser Thr Asn Gln
900 905 910
Asn Leu Thr His Leu Tyr Leu Arg Gly Asn Thr Leu Gly Asp Lys Gly
915 920 925
Ile Lys Leu Leu Cys Glu Gly Leu Leu His Pro Asp Cys Lys Leu Gln
930 935 940
Val Leu Glu Leu Asp Asn Cys Asn Leu Thr Ser His Cys Cys Trp Asp
945 950 955 960
Leu Ser Thr Leu Leu Thr Ser Ser Gln Ser Leu Arg Lys Leu Ser Leu
965 970 975
Gly Asn Asn Asp Leu Gly Asp Leu Gly Val Met Met Phe Cys Glu Val
980 985 990
Leu Lys Gln Gln Ser Cys Leu Leu Gln Asn Leu Gly Leu Ser Glu Met
995 1000 1005
Tyr Phe Asn Tyr Glu Thr Lys Ser Ala Leu Glu Thr Leu Gln Glu
1010 1015 1020
Glu Lys Pro Glu Leu Thr Val Val Phe Glu Pro Ser Trp
1025 1030 1035
<210> 35
<211> 4470
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pyrin
<400> 35
gtagatgagg aaactgaagt tgaggaatag tgaagagttt gtccaatgtc atagccccgt 60
aatcaacggg acaaaaattt tcttgctgat gggtcaagat ggcatcgtga agtggttgtt 120
caccgtaaac tgtaatacaa tcctgtttat ggatttgttt gcatattttt ccctccatag 180
ggaaaccttt cttccatggc tcaggacaca ctcctggatc gagccaacag gagaactttc 240
tggtaagcat ttggctaact tttttttttt tgagatggag tcttgctgtg tcgcctaggc 300
tggagtgcag tggcgtgatc ttggctcact gcagcctcca cttcccgggt tcaatcaatt 360
ctcctacctc aacttcctga gtagctggga ttacaggcgc ccgccaccac acccggctca 420
tttttgtact tttagtagag acacagtttt gccatgttgg ccaggctggt cttgaattcc 480
tcagctcagg tgatctgcct gccttggcct ctcaaagtgc tgggattaca ggcgtgagcc 540
actgtgcccg gccttggcta acttttcaaa attaaagatt ttgacttgtt acagtcatgt 600
gacatttttt tctttctgtt tgctgagttt ttgataattt atatctctca aagtggagac 660
tttaaaaaag actcatccgt gtgccgtgtt cactgcctgg tatcttagtg tggaccgaag 720
cctaaggacc ctgaaaacag ctgcagatga agatggcaag cacccgctgc aagctggcca 780
ggtacctgga ggacctggag gatgtggact tgaagaaatt taagatgcac ttagaggact 840
atcctcccca gaagggctgc atccccctcc cgaggggtca gacagagaag gcagaccatg 900
tggatctagc cacgctaatg atcgacttca atggggagga gaaggcgtgg gccatggccg 960
tgtggatctt cgctgcgatc aacaggagag acctttatga gaaagcaaaa agagatgagc 1020
cgaagtgggg ttcagataat gcacgtgttt cgaatcccac tgtgatatgc caggaagaca 1080
gcattgaaga ggagtggatg ggtttactgg agtacctttc gagaatctct atttgtaaaa 1140
tgaagaaaga ttaccgtaag aagtacagaa agtacgtgag aagcagattc cagtgcattg 1200
aagacaggaa tgcccgtctg ggtgagagtg tgagcctcaa caaacgctac acacgactgc 1260
gtctcatcaa ggagcaccgg agccagcagg agagggagca ggagcttctg gccatcggca 1320
agaccaagac gtgtgagagc cccgtgagtc ccattaagat ggagttgctg tttgaccccg 1380
atgatgagca ttctgagcct gtgcacaccg tggtgttcca gggggcggca gggattggga 1440
aaacaatcct ggccaggaag atgatgttgg actgggcgtc ggggacactc taccaagaca 1500
ggtttgacta tctgttctat atccactgtc gggaggtgag ccttgtgaca cagaggagcc 1560
tgggggacct gatcatgagc tgctgccccg acccaaaccc acccatccac aagatcgtga 1620
gaaaaccctc cagaatcctc ttcctcatgg acggcttcga tgagctgcaa ggtgcctttg 1680
acgagcacat aggaccgctc tgcactgact ggcagaaggc cgagcgggga gacattctcc 1740
tgagcagcct catcagaaag aagctgcttc ccgaggcctc tctgctcatc accacgagac 1800
ctgtggccct ggagaaactg cagcacttgc tggaccatcc tcggcatgtg gagatcctgg 1860
gtttctccga ggccaaaagg aaagagtact tcttcaagta cttctctgat gaggcccaag 1920
ccagggcagc cttcagtctg attcaggaga acgaggtcct cttcaccatg tgcttcatcc 1980
ccctggtctg ctggatcgtg tgcactggac tgaaacagca gatggagagt ggcaagagcc 2040
ttgcccagac atccaagacc accaccgcgg tgtacgtctt cttcctttcc agtttgctgc 2100
agccccgggg agggagccag gagcacggcc tctgcgccca cctctggggg ctctgctctt 2160
tggctgcaga tggaatctgg aaccagaaaa tcctgtttga ggagtccgac ctcaggaatc 2220
atggactgca gaaggcggat gtgtctgctt tcctgaggat gaacctgttc caaaaggaag 2280
tggactgcga gaagttctac agcttcatcc acatgacttt ccaggagttc tttgccgcca 2340
tgtactacct gctggaagag gaaaaggaag gaaggacgaa cgttccaggg agtcgtttga 2400
agcttcccag ccgagacgtg acagtccttc tggaaaacta tggcaaattc gaaaaggggt 2460
atttgatttt tgttgtacgt ttcctctttg gcctggtaaa ccaggagagg acctcctact 2520
tggagaagaa attaagttgc aagatctctc agcaaatcag gctggagctg ctgaaatgga 2580
ttgaagtgaa agccaaagct aaaaagctgc agatccagcc cagccagctg gaattgttct 2640
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agattgagat caatctctcc accagaatgg accacatggt ttcttccttt tgcattgaga 2760
actgtcatcg ggtggagtca ctgtccctgg ggtttctcca taacatgccc aaggaggaag 2820
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Leu Ser Thr Ser Gln Ser Leu Thr Glu Leu Asp Leu Ser Asp Asn Ser
740 745 750
Leu Gly Asp Pro Gly Met Arg Val Leu Cys Glu Thr Leu Gln His Pro
755 760 765
Gly Cys Asn Ile Arg Arg Leu Trp Leu Gly Arg Cys Gly Leu Ser His
770 775 780
Glu Cys Cys Phe Asp Ile Ser Leu Val Leu Ser Ser Asn Gln Lys Leu
785 790 795 800
Val Glu Leu Asp Leu Ser Asp Asn Ala Leu Gly Asp Phe Gly Ile Arg
805 810 815
Leu Leu Cys Val Gly Leu Lys His Leu Leu Cys Asn Leu Lys Lys Leu
820 825 830
Trp Leu Val Asn Ser Gly Leu Thr Ser Val Cys Cys Ser Ala Leu Ser
835 840 845
Ser Val Leu Ser Thr Asn Gln Asn Leu Thr His Leu Tyr Leu Arg Gly
850 855 860
Asn Thr Leu Gly Asp Lys Gly Ile Lys Leu Leu Cys Glu Gly Leu Leu
865 870 875 880
His Pro Asp Cys Lys Leu Gln Val Leu Glu Leu Asp Asn Cys Asn Leu
885 890 895
Thr Ser His Cys Cys Trp Asp Leu Ser Thr Leu Leu Thr Ser Ser Gln
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Ser Leu Arg Lys Leu Ser Leu Gly Asn Asn Asp Leu Gly Asp Leu Gly
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Val Met Met Phe Cys Glu Val Leu Lys Gln Gln Ser Cys Leu Leu Gln
930 935 940
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<213> Artificial Sequence
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Leu Glu Asp Val Asp Leu Lys Lys Phe Lys Met His Leu Glu Asp Tyr
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Pro Pro Gln Lys Gly Cys Ile Pro Leu Pro Arg Gly Gln Thr Glu Lys
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Arg Asp Leu Tyr Glu Lys Ala Lys Arg Asp Glu Pro Lys Trp Gly Ser
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100 105 110
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130 135 140
Arg Ser Arg Phe Gln Cys Ile Glu Asp Arg Asn Ala Arg Leu Gly Glu
145 150 155 160
Ser Val Ser Leu Asn Lys Arg Tyr Thr Arg Leu Arg Leu Ile Lys Glu
165 170 175
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210 215 220
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Leu Asp Trp Ala Ser Gly Thr Leu Tyr Gln Asp Arg Phe Asp Tyr Leu
245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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325 330 335
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340 345 350
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435 440 445
Ser Leu Leu Gln Pro Arg Gly Gly Ser Gln Glu His Gly Leu Cys Ala
450 455 460
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Lys Ile Leu Phe Glu Glu Ser Asp Leu Arg Asn His Gly Leu Gln Lys
485 490 495
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500 505 510
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530 535 540
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Glu Lys Lys Leu Ser Cys Lys Ile Ser Gln Gln Ile Arg Leu Glu Leu
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Gly Leu Lys His Leu Leu Cys Asn Leu Lys Lys Leu Trp Leu Val Ser
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850 855 860
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Cys Ser Ala Leu Ser Ser Val Leu Ser Thr Asn Gln Asn Leu Thr His
885 890 895
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915 920 925
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Leu Gly Asp Leu Gly Val Met Met Phe Cys Glu Val Leu Lys Gln Gln
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Ser Cys Leu Leu Gln Asn Leu Gly Leu Ser Glu Met Tyr Phe Asn Tyr
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<223> NLRP3 Antisense Oligonucleotide
<400> 107
cgagagtgtt gcctcgcagg 20
<210> 108
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NLRP3 Antisense Oligonucleotide
<400> 108
atcgcagcga agatccacac 20
<210> 109
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NLRP3 Antisense Oligonucleotide
<400> 109
atcttaatgg gactcacggg 20
<210> 110
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NLRP3 Antisense Oligonucleotide
<400> 110
gatctccaca tgccgaggat 20
<210> 111
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NLRP3 Antisense Oligonucleotide
<400> 111
tccgagagtg ttgcctcgca 20
<210> 112
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NLRP3 Antisense Oligonucleotide
<400> 112
tggttgctgc tgaggaccaa 20
Claims (138)
- 세포외 소포체에 페이로드를 로딩하는 방법으로서, 약 200 mM, 약 190 mM, 약 180 mM, 약 170 mM, 약 160 mM, 약 150 mM, 약 140 mM, 약 130 mM, 약 120 mM, 또는 약 110 mM 미만의 농도로 염을 포함하는 로딩 완충액에서 페이로드를 세포외 소포체와 혼합하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제1항에 있어서, 염 농도는 약 1 mM 내지 약 150 mM, 약 5 mM 내지 약 150 mM, 약 10 mM 내지 약 150 mM, 약 20 mM 내지 약 150 mM, 약 30 mM 내지 약 150 mM, 약 40 mM 내지 약 150 mM, 약 50 mM 내지 약 150 mM, 약 60 mM 내지 약 150 mM, 약 70 mM 내지 약 150 mM, 약 80 mM 내지 약 150 mM, 약 10 mM 내지 약 130 mM, 약 20 mM 내지 약 130 mM, 약 30 mM 내지 약 130 mM, 약 40 mM 내지 약 130 mM, 약 50 mM 내지 약 130 mM, 약 10 mM 내지 약 120 mM, 약 20 mM 내지 약 120 mM, 약 30 mM 내지 약 120 mM, 약 40 mM 내지 약 120 mM, 약 50 mM 내지 약 120 mM, 약 60 mM 내지 약 120 mM, 약 70 mM 내지 약 120 mM, 약 80 mM 내지 약 120 mM, 약 50 mM 내지 약 100 mM, 약 100 mM 내지 약 150 mM, 또는 약 90 mM 내지 약 110 mM인, 방법.
- 제1항에 있어서, 염 농도는 약 10 mM, 약 20 mM, 약 30 mM, 약 40 mM, 약 50 mM, 약 60 mM, 약 70 mM, 약 80 mM, 약 90 mM, 약 100 mM, 약 110 mM, 약 120 mM, 약 130 mM, 약 140 mM, 약 150 mM, 약 160 mM, 약 170 m, 약 180 mM, 또는 약 190 mM인, 방법.
- 제1항에 있어서, 염 농도는 약 50 mM, 약 60 mM, 약 70 mM, 약 80 mM, 약 90 mM, 약 100 mM, 약 110 mM, 약 120 mM, 약 130 mM, 약 140 mM, 또는 약 150 mM인, 방법.
- 세포외 소포체에 페이로드를 로딩하는 방법으로서, 약 200 mM 내지 약 450 mM의 농도로 염을 포함하는 로딩 완충액에서 페이로드를 세포외 소포체와 혼합하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제5항에 있어서, 염 농도는 약 200 mM, 약 250 mM, 약 300 mM, 약 350 mM, 약 400 mM, 또는 약 450 mM인, 방법.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 염은 NaCl(염화나트륨), KCl(염화칼륨), PO4(인산염), CaCl2(염화칼슘), MgCl2(염화마그네슘), Mg2SO4(황산마그네슘), ZnCl2(염화아연), MnCl2(염화망간), MnSO4(황산망간), NaSCN(티오시안산나트륨), KSCN(티오시안산칼륨), LiCl(염화리튬), K2HPO4(인산이칼륨), Na2SO4(황산나트륨), NaPO4 (인산나트륨), K2SO4(인산칼륨), 아세트산나트륨, 브롬화나트륨, 요오드화나트륨, 브롬화칼륨, 브롬화리튬, 불화나트륨, 불화칼륨, 불화리튬, 요오드화리튬, 아세트산칼륨, 아세트산리튬, 요오드화칼륨, 황산칼슘, 황산나트륨, 삼염화크롬, 황산크롬, 시트르산나트륨, 염화철(III), 염화이트륨(III), 황산칼륨, 염화제일철, 시트르산칼슘, 인산마그네슘, 염화제이철, 아르기닌-HCl, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 염을 포함하는 로딩 완충액은 염이 없거나 염의 농도가 더 낮은 해당 로딩 완충액과 비교하여 EV에 대한 페이로드의 로딩을 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5 배, 적어도 약 6배, 적어도 약 7배, 적어도 약 8배, 적어도 약 9배, 적어도 약 10 배, 적어도 약 15배, 적어도 약 20배, 적어도 약 25배, 적어도 약 30배, 적어도 약 35배, 적어도 약 40배, 적어도 약 45배, 또는 적어도 약 50배 또는 그 초과까지 증가시키는, 방법.
- 세포외 소포체에 페이로드를 로딩하는 방법으로서, 4℃ 초과의 로딩 온도에서 페이로드를 세포외 소포체와 혼합하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제9항에 있어서, 로딩 온도는 약 5℃ 내지 약 40℃, 약 10℃ 내지 약 40℃, 약 15℃ 내지 약 40℃, 약 20℃ 내지 약 40℃, 약 25℃ 내지 약 40℃, 약 30℃ 내지 약 40℃, 약 35℃ 내지 약 40℃, 약 5℃ 내지 약 38℃, 약 10℃ 내지 약 38℃, 약 15℃ 내지 약 38℃, 약 20℃ 내지 약 38℃, 약 25℃ 내지 약 38℃, 약 30℃ 내지 약 38℃, 약 35℃ 내지 약 38℃, 약 5℃ 내지 약 37℃, 약 10℃ 내지 약 37℃, 약 15℃ 내지 약 37℃, 약 20℃ 내지 약 37℃, 약 25℃ 내지 약 37℃, 약 30℃ 내지 약 37℃, 또는 약 35℃ 내지 약 37℃인, 방법.
- 제9항 또는 제10항에 있어서, 로딩 온도는 약 5℃, 약 10℃, 약 15℃, 약 20℃, 약 25℃, 약 30℃, 약 35℃, 약 37℃, 약 40℃, 약 50℃, 약 55℃, 약 60℃, 약 65℃, 또는 약 70℃인, 방법.
- 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 로딩 온도는 로딩 온도보다 낮은 기준 온도에서의 로딩과 비교하여 EV에 대한 페이로드의 로딩을 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5 배, 적어도 약 6배, 적어도 약 7배, 적어도 약 8배, 적어도 약 9배, 적어도 약 10 배, 적어도 약 15배, 적어도 약 20배, 적어도 약 25배, 적어도 약 30배, 적어도 약 35배, 적어도 약 40배, 적어도 약 45배, 또는 적어도 약 50배 또는 그 초과까지 증가시키는, 방법.
- 세포외 소포에 페이로드를 로딩하는 방법으로서, 약 1시간보다 긴 로딩 지속시간 동안 페이로드를 세포외 소포체와 혼합하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제13항에 있어서, 로딩 지속시간은 약 1시간 내지 약 48시간, 약 1시간 내지 약 42시간, 약 1시간 내지 약 36시간, 약 1시간 내지 약 30시간, 약 1시간 내지 약 24시간, 약 6시간 내지 약 48시간, 약 6시간 내지 약 42시간, 약 6시간 내지 약 36시간, 약 6시간 내지 약 30시간, 약 6시간 내지 약 24시간, 약 12시간 내지 약 48시간, 약 12시간 내지 약 42시간, 약 12시간 내지 약 36시간, 약 12시간 내지 약 30시간, 또는 약 12시간 내지 약 24 시간인, 방법.
- 제13항 또는 제14항에 있어서, 로딩 지속시간은 약 6시간, 약 12시간, 약 24시간, 약 30시간, 약 36시간, 약 42시간, 약 48시간, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일, 또는 약 7일인, 방법.
- 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 로딩 지속시간은 로딩 지속시간보다 짧은 기준 기간에 대한 로딩과 비교하여 EV에 대한 페이로드의 로딩을 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5 배, 적어도 약 6배, 적어도 약 7배, 적어도 약 8배, 적어도 약 9배, 적어도 약 10 배, 적어도 약 15배, 적어도 약 20배, 적어도 약 25배, 적어도 약 30배, 적어도 약 35배, 적어도 약 40배, 적어도 약 45배, 또는 적어도 약 50배 또는 그 초과까지 증가시키는, 방법.
- 세포외 소포체에 페이로드를 로딩하는 방법으로서, 200 mM 미만의 농도에서, 약 5℃ 내지 약 50℃의 로딩 온도에서, 및 1시간 내지 약 48시간의 로딩 지속시간 동안 염을 포함하는 로딩 완충액에서 페이로드를 세포외 소포체와 혼합하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제17항에 있어서, 염 농도는 약 1 mM 내지 약 150 mM, 약 5 mM 내지 약 150 mM, 약 10 mM 내지 약 150 mM, 약 20 mM 내지 약 150 mM, 약 30 mM 내지 약 150 mM, 약 40 mM 내지 약 150 mM, 약 50 mM 내지 약 150 mM, 약 60 mM 내지 약 150 mM, 약 70 mM 내지 약 150 mM, 약 80 mM 내지 약 150 mM, 약 10 mM 내지 약 130 mM, 약 20 mM 내지 약 130 mM, 약 30 mM 내지 약 130 mM, 약 40 mM 내지 약 130 mM, 약 50 mM 내지 약 130 mM, 약 10 mM 내지 약 120 mM, 약 20 mM 내지 약 120 mM, 약 30 mM 내지 약 120 mM, 약 40 mM 내지 약 120 mM, 약 50 mM 내지 약 120 mM, 약 60 mM 내지 약 120 mM, 약 70 mM 내지 약 120 mM, 약 80 mM 내지 약 120 mM, 약 50 mM 내지 약 100 mM, 약 100 mM 내지 약 150 mM, 또는 약 90 mM 내지 약 110 mM인, 방법.
- 제17항 또는 제18항에 있어서, 염 농도는 약 10 mM, 약 20 mM, 약 30 mM, 약 40 mM, 약 50 mM, 약 60 mM, 약 70 mM, 약 80 mM, 약 90 mM, 약 100 mM, 약 110 mM, 약 120 mM, 약 130 mM, 약 140 mM, 약 150 mM, 약 160 mM, 약 170 m, 약 180 mM, 또는 약 190 mM인, 방법.
- 제19항에 있어서, 염 농도는 약 50 mM, 약 60 mM, 약 70 mM, 약 80 mM, 약 90 mM, 약 100 mM, 약 110 mM, 약 120 mM, 약 130 mM, 약 140 mM, 또는 약 150 mM인, 방법.
- 제17항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 염은 NaCl(염화나트륨), KCl(염화칼륨), PO4(인산염), CaCl2(염화칼슘), MgCl2(염화마그네슘), Mg2SO4(황산마그네슘), ZnCl2(염화아연), MnCl2(염화망간), MnSO4(황산망간), NaSCN(티오시안산나트륨), KSCN(티오시안산칼륨), LiCl(염화리튬), K2HPO4(인산이칼륨), Na2SO4(황산나트륨), NaPO4 (인산나트륨), K2SO4(인산칼륨), 아세트산나트륨, 브롬화나트륨, 요오드화나트륨, 브롬화칼륨, 브롬화리튬, 불화나트륨, 불화칼륨, 불화리튬, 요오드화리튬, 아세트산칼륨, 아세트산리튬, 요오드화칼륨, 황산칼슘, 황산나트륨, 삼염화크롬, 황산크롬, 시트르산나트륨, 염화철(III), 염화이트륨(III), 황산칼륨, 염화제일철, 시트르산칼슘, 인산마그네슘, 염화제이철, 아르기닌-HCl, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 방법.
- 제17항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서서, 로딩 온도는 약 5℃ 내지 약 40℃, 약 10℃ 내지 약 40℃, 약 15℃ 내지 약 40℃, 약 20℃ 내지 약 40℃, 약 25℃ 내지 약 40℃, 약 30℃ 내지 약 40℃, 약 35℃ 내지 약 40℃, 약 5℃ 내지 약 38℃, 약 10℃ 내지 약 38℃, 약 15℃ 내지 약 38℃, 약 20℃ 내지 약 38℃, 약 25℃ 내지 약 38℃, 약 30℃ 내지 약 38℃, 약 35℃ 내지 약 38℃, 약 5℃ 내지 약 37℃, 약 10℃ 내지 약 37℃, 약 15℃ 내지 약 37℃, 약 20℃ 내지 약 37℃, 약 25℃ 내지 약 37℃, 약 30℃ 내지 약 37℃, 또는 약 35℃ 내지 약 37℃인, 방법.
- 제17항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 로딩 온도는 약 5℃, 약 10℃, 약 15℃, 약 20℃, 약 25℃, 약 30℃, 약 35℃, 약 37℃, 약 40℃, 또는 약 50℃인, 방법.
- 제17항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 로딩 지속시간은 약 1시간 내지 약 48시간, 약 1시간 내지 약 42시간, 약 1시간 내지 약 36시간, 약 1시간 내지 약 30시간, 약 1시간 내지 약 24시간, 약 6시간 내지 약 48시간, 약 6시간 내지 약 42시간, 약 6시간 내지 약 36시간, 약 6시간 내지 약 30시간, 약 6시간 내지 약 24시간, 약 12시간 내지 약 48시간, 약 12시간 내지 약 42시간, 약 12시간 내지 약 36시간, 약 12시간 내지 약 30시간, 또는 약 12시간 내지 약 24 시간인, 방법.
- 제17항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 로딩 지속시간은 약 6시간, 약 12시간, 약 24시간, 약 30시간, 약 36시간, 약 42시간, 또는 약 48시간인, 방법.
- 제17항에 있어서, 염 농도는 약 50 mM 내지 약 150 mM이고, 로딩 온도는 약 30℃ 내지 약 40℃이고, 로딩 지속시간은 약 20시간 내지 약 30시간인, 방법.
- 제17항에 있어서, 염 농도는 약 50 mM 내지 약 150 mM이고, 로딩 온도는 약 30℃ 내지 약 40℃이고, 로딩 지속시간은 약 12시간 내지 약 30시간인, 방법.
- 세포외 소포체에 페이로드를 로딩하는 방법으로서, 약 100 mM의 농도에서, 약 37℃의 로딩 온도에서, 및 약 24시간의 로딩 지속시간 동안 염을 포함하는 로딩 완충액에서 페이로드를 세포외 소포체와 혼합하는 단계를 포함하는, 방법.
- 세포외 소포체에 페이로드를 로딩하는 방법으로서, 약 150 mM 내지 약 450 mM의 농도에서, 약 37℃ 내지 약 70℃의 로딩 온도에서, 및 약 24시간 내지 약 7일의 로딩 지속시간 동안 염을 포함하는 로딩 완충액에서 페이로드를 세포외 소포체와 혼합하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제29항에 있어서, 염 농도는 약 150 mM, 약 200 mM, 약 250 mM, 약 300 mM, 약 350 mM, 약 400 mM, 또는 약 450 mM인, 방법.
- 제29항 또는 제30항에 있어서, 염은 NaCl(염화나트륨), KCl(염화칼륨), PO4(인산염), CaCl2(염화칼슘), MgCl2(염화마그네슘), Mg2SO4(황산마그네슘), ZnCl2(염화아연), MnCl2(염화망간), MnSO4(황산망간), NaSCN(티오시안산나트륨), KSCN(티오시안산칼륨), LiCl(염화리튬), K2HPO4(인산이칼륨), Na2SO4(황산나트륨), NaPO4 (인산나트륨), K2SO4(인산칼륨), 아세트산나트륨, 브롬화나트륨, 요오드화나트륨, 브롬화칼륨, 브롬화리튬, 불화나트륨, 불화칼륨, 불화리튬, 요오드화리튬, 아세트산칼륨, 아세트산리튬, 요오드화칼륨, 황산칼슘, 황산나트륨, 삼염화크롬, 황산크롬, 시트르산나트륨, 염화철(III), 염화이트륨(III), 황산칼륨, 염화제일철, 시트르산칼슘, 인산마그네슘, 염화제이철, 아르기닌-HCl, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 방법.
- 제29항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 로딩 온도는 37℃, 약 40℃, 약 45℃, 약 50℃, 약 55℃, 약 60℃, 약 65℃, 또는 약 70℃인, 방법.
- 제29항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 로딩 지속시간은 약 24시간, 약 2일, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일, 또는 약 7일인, 방법.
- 제17항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 로딩 지속시간 동안 로딩 온도에서의 염 농도에서의 로딩은 4℃의 온도 및/또는 1시간의 지속시간 동안 염이 없는 로딩과 비교하여 세포외 소포에 대한 페이로드의 로딩을 적어도 약 1배, 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5 배, 적어도 약 6배, 적어도 약 7배, 적어도 약 8배, 적어도 약 9배, 적어도 약 10 배, 적어도 약 12배, 적어도 약 14배, 적어도 약 16배, 적어도 약 18배, 적어도 약 20 배, 적어도 약 25배, 적어도 약 30배, 적어도 약 35배, 적어도 약 40배, 적어도 약 45배, 또는 적어도 약 50배 또는 그 초과까지 증가시키는, 방법.
- 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 혼합 후에 EV에 로딩된 페이로드의 양을 측정하고 EV의 로드 밀도를 결정하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
- 제35항에 있어서, 하나 이상의 로딩 매개변수는 EV의 로드 밀도를 추가로 증가시키기 위해 조정되고, 여기서 하나 이상의 로딩 매개변수는 로딩 완충액의 염 농도, 로딩 온도, 로딩 지속시간, 페이로드 공급물 농도, EV 공급물 농도, 또는 이들의 조합으로부터 선택되는, 방법.
- 제35항 또는 제36항에 있어서, EV에 로딩된 페이로드의 양은 입자 계수기, NTA, 자외선 흡착, 가시 흡착, 형광, 근적외선, 적외선, 정적 광산란, 동적 광산란, 암흑화, 라만 분광학, 탁도 또는 이들의 조합을 사용하여 측정되는, 방법.
- 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 혼합은 회분식, 반-회분식, 반-연속식, 또는 연속식으로 일어나는, 방법.
- EV 로딩 후 세포외 소포 (EV)로부터 페이로드의 해리를 감소시키는 방법으로서, 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항의 방법에 따라 EV에 페이로드를 로딩하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제39항에 있어서, EV로부터 페이로드의 해리는 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항의 방법에 따라 페이로드가 EV에 로딩되지 않을 때 관찰된 상응하는 해리와 비교하여 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 또는 약 100% 감소되는, 방법.
- 페이로드가 로딩된 세포외 소포체(EV)의 안정성을 증가시키는 방법으로서, 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항의 방법에 따라 페이로드를 EV에 로딩하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제41항에 있어서, 페이로드가 로딩된 EV의 안정성은 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항의 방법에 따라 페이로드가 EV에 로딩되지 않을 때 관찰되는 상응하는 안정성과 비교하여 적어도 약 1배, 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5 배, 적어도 약 6배, 적어도 약 7배, 적어도 약 8배, 적어도 약 9배, 적어도 약 10 배, 적어도 약 12배, 적어도 약 14배, 적어도 약 16배, 적어도 약 18배, 적어도 약 20 배, 적어도 약 25배, 적어도 약 30배, 적어도 약 35배, 적어도 약 40배, 적어도 약 45배, 또는 적어도 약 50배 또는 그 초과까지 증가되는, 방법.
- 페이로드 로딩 후 세포외 소포체의 하나 이상의 특성을 개선하는, 방법으로서, 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항의 방법에 따라 EV에 페이로드를 로딩하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제43항에 있어서, 하나 이상의 특성은 입자간 상호작용, 입자 강성, 입자 크기, 또는 이들의 조합을 포함하는, 방법.
- 제43항 또는 제44항에 있어서, 하나 이상의 특성의 개선은 EV의 여과성을 증가시키는, 방법.
- 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 로딩 완충액은 하나 이상의 성분을 추가로 포함하는, 방법.
- 제46항에 있어서, 하나 이상의 성분은 트리스, 수크로스, 글루코스, 트레할로스, 만노스, 소르비톨, 만니톨, 글리세롤, 히스티딘, 아르기닌, 메티오닌, 트립토판, 티로신, 인산나트륨, 인산칼륨, 폴리머, 계면활성제 (예를 들어, 폴리소르베이트 80 및 20), 킬레이트제 (예를 들어, EDTA, 시트레이트), 무기 산, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 방법.
- 제47항에 있어서, 하나 이상의 성분은 수크로스인, 방법.
- 제48항에 있어서, 수크로스는 농도가 약 10 % w/v 미만, 약 9 % w/v 미만, 약 8 % w/v 미만, 약 7 % w/v 미만, 약 6% w/v 미만, 약 5 % w/v 미만, 약 4 % w/v 미만, 약 3% w/v 미만, 또는 약 2.5 % w/v 미만인, 방법.
- 제48항에 있어서, 수크로스는 농도가 약 1 % w/v 내지 약 10 % w/v, 약 2 % w/v 내지 약 10 % w/v, 약 3 % w/v 내지 약 10 % w/v, 약 4 % w/v 내지 약 10 % w/v, 약 5 % w/v 내지 약 10 % w/v, 약 1 % w/v 내지 약 8 % w/v, 약 2 % w/v 내지 약 8 % w/v, 약 3 % w/v 내지 약 8 % w/v, 약 4 % w/v 내지 약 8 % w/v, 약 5 % w/v 내지 약 8 % w/v, 약 1 % w/v 내지 약 5 % w/v, 약 2 % w/v 내지 약 5 % w/v, 약 3 % w/v 내지 약 5 % w/v, 약 4 % w/v 내지 약 5 % w/v, 또는 약 5 % w/v 내지 약 6 % w/v인, 방법.
- 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 로딩 완충액은 삼투질농도 농도가 약 100 내지 약 600 mOsm/kg인, 방법.
- 제51항에 있어서, 로딩 완충액은 삼투질농도 농도가 약 275 내지 약 450, 약 280 내지 약 450, 약 300 내지 약 450, 약 275 내지 약 400, 약 280 내지 약 400, 약 300 내지 약 400, 약 275 내지 약 380, 약 280 내지 약 380, 약 300 내지 약 380, 약 275 내지 약 350, 약 280 내지 약 350, 약 300 내지 약 350, 약 275 내지 약 310, 약 280 내지 약 310, 또는 약 300 내지 약 310 mOsm/kg인, 방법.
- 제51항 또는 제52항에 있어서, 로딩 완충액은 삼투질농도 농도가 약 360, 약 370, 약 380, 약 390, 약 395, 또는 약 400 mOsm/kg인, 방법.
- 제1항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 로딩 완충액은 pH가 약 6 내지 약 8인, 방법.
- 제54항에 있어서, pH는 약 6 내지 약 7 또는 약 7 내지 약 8인, 방법.
- 제54항에 있어서, pH는 약 6, 약 7, 또는 약 8인, 방법.
- 제1항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 로딩 완충액은 pH가 약 9인, 방법.
- 제1항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 페이로드는 펩티드, 소분자, 올리고뉴클레오티드, 안티센스 올리고뉴클레오티드 (ASO), PMO, mRNA, miRNA, lcRNA, 안타고미르, tRNA, siRNA, 펩티드 핵산, 세포 침투 펩티드, 보조제, 단백질, 탄수화물, 당, 아미노산, 또는 이들의 임의의 조합인, 방법.
- 제1항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 페이로드는 핵산을 포함하는, 방법.
- 제59항에 있어서, 핵산은 길이가 약 40 미만, 약 35 미만, 약 30 미만, 약 25 미만, 약 20 미만, 약 19 미만, 약 18 미만, 약 17 미만, 약 16 미만, 또는 약 15 미만 개의 뉴클레오티드인 연속 서열을 포함하는, 방법.
- 제59항 또는 제60항에 있어서, 핵산은 길이가 약 10 내지 약 30, 약 14 내지 약 30, 약 15 내지 약 30, 약 16 내지 약 30, 약 17 내지 약 30, 약 18 내지 약 30, 약 19 내지 약 30, 약 20 내지 약 30, 약 10 내지 약 25, 약 14 내지 약 25, 약 15 내지 약 25, 약 16 내지 약 25, 약 17 내지 약 25, 약 18 내지 약 25, 약 19 내지 약 25, 약 20 내지 약 25, 약 10 내지 약 22, 약 14 내지 약 22, 약 15 내지 약 22, 약 16 내지 약 22, 약 17 내지 약 22, 약 18 내지 약 22, 약 19 내지 약 22, 또는 약 20 내지 약 22인 연속 서열을 포함하는, 방법.
- 제59항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산은 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 방법.
- 제62항에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 유전자에 특이적으로 결합하고 하나 이상의 유전자에 의해 인코딩되는 단백질의 발현을 감소시키는, 방법.
- 제63항에 있어서, 하나 이상의 유전자는 STAT6, Kras, Nras, PMP22, C/ EBPβ, STAT3, NLRP3, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 로딩 완충액 내의 페이로드는 약 100 내지 약 1000 μM의 농도인, 방법.
- 제65항에 있어서, 로딩 완충액 내의 페이로드는 농도가 약 100 μM 내지 약 200 μM, 약 200 μM 내지 약 300 μM, 약 300 μM 내지 약 400 μM, 약 400 μM 내지 약 500 μM, 약 500 μM 내지 약 600 μM, 약 600 μM 내지 약 700 μM, 약 700 μM 내지 약 800 μM, 약 800 μM 내지 약 900 μM, 또는 약 900 μM 및 1000 μM인, 방법.
- 제65항에 있어서, 로딩 완충액 내의 페이로드는 농도가 약 100 μM, 약 200 μM, 약 300 μM, 약 400 μM, 약 500 μM, 약 600 μM, 약 700 μM, 약 800 μM, 약 900 μM, 또는 약 1000 μM인, 방법.
- 제1항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 로딩 완충액 내의 페이로드는 약 1000 내지 약 2500 μM의 농도인, 방법.
- 제65항에 있어서, 페이로드는 서열번호: 41 내지 112 중 어느 하나에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 페이로드의 농도는 약 600 μM인, 방법.
- 제69항에 있어서, 페이로드는 고정 모이어티에 접합되는, 방법.
- 제70항에 있어서, 고정 모이어티는 스테롤, GM1, 지질, 인지질, 비타민, 소분자, 펩티드, 또는 이들의 조합을 포함하는, 방법.
- 제70항 또는 제71항에 있어서, 고정 모이어티는 적어도 6개의 탄소 원자, 적어도 7개의 탄소 원자, 적어도 8개의 탄소 원자, 적어도 9개의 탄소 원자, 적어도 10개의 탄소 원자, 적어도 11개의 탄소 원자, 적어도 12개의 탄소 원자, 적어도 13개의 탄소 원자, 적어도 14개의 탄소 원자, 적어도 15개의 탄소 원자, 적어도 16개의 탄소 원자, 적어도 17개의 탄소 원자, 적어도 18개의 탄소 원자, 적어도 19개의 탄소 원자, 적어도 20개의 탄소 원자, 적어도 25개의 탄소 원자, 적어도 30개의 탄소 원자, 적어도 35개의 탄소 원자, 적어도 40개의 탄소 원자, 적어도 45개의 탄소 원자, 적어도 50개의 탄소 원자, 적어도 55개의 탄소 원자, 적어도 60개의 탄소 원자, 적어도 65개의 탄소 원자, 적어도 70개의 탄소 원자, 적어도 75개의 탄소 원자, 적어도 80개의 탄소 원자, 적어도 85개의 탄소 원자, 또는 적어도 90개의 탄소 원자를 포함하는, 방법.
- 제71항 또는 제72항에 있어서, 고정 모이어티는 스테롤, 스테로이드, 호파노이드, 하이드록시스테로이드, 세코스테로이드, 이들의 유사체, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 방법.
- 제71항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 고정 모이어티는 에르고스테롤, 7-디하이드로콜레스테롤, 콜레스테롤, 24S-하이드록시콜레스테롤, 라노스테롤, 사이클로아르테놀, 푸코스테롤, 사린고스테롤, 캄페스테롤, β-시토스테롤, 시토스타놀, 코프로스타놀, 아베나스테롤, 스티그마스테롤, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 방법.
- 제74항에 있어서, 고정 모이어티는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 구조를 갖는 콜레스테롤 또는 유도체인, 방법:
- 제71항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 고정 모이어티는 디하이드로테스토스테론, 우바올, 헤시게닌, 디오스게닌, 프로게스테론, 코르티솔 또는 이들의 임의의 조합인 스테로이드를 포함하는, 방법.
- 제71항에 있어서, 고정 모이어티는 지질을 포함하는, 방법.
- 제71항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 고정 모이어티는 C2-C60 사슬을 포함하는, 방법.
- 제78항에 있어서, 고정 모이어티는 C4-C40, C2-C38, C2-C36, C2-C34, C2-C32, C2-C30, C4-C30, C2-C28, C4-C28, C2- C26, C4-C26, C2-C24, C4-C24, C6-C24, C8-C24, C10-C24, C2-C22, C4-C22, C6-C22, C8-C22, C10-C22, C2-C20, C4-C20, C6-C20, C8-C20, C10-C20, C2-C18, C4-C18, C6-C18, C8-C18, C10-C18, C12-C18, C14-C18, C16-C18, C2-C16, C4-C16, C6-C16, C8-C16, C10-C16, C12-C16, C14-C16, C2-C15, C4-C15, C6-C15, C8-C15, C9-C15, C10-C15, C11-C15, C12-C15, C13-C15, C2-C14, C4-C14, C6-C14, C8-C14, C9-C14, C10-C14, C11-C14, C12-C14, C2-C13, C4-C13, C6-C13, C7-C13, C8-C13, C9-C13, C10-C13, C10-C13, C11-C13, C2-C12, C4-C12, C6-C12, C7-C12, C8-C12, C9-C12, C10-C12, C2-C11, C4-C11, C6-C11, C7-C11, C8-C11, C9-C11, C2-C10, C4-C10, C2-C9, C4-C9, C2-C8, C2-C7, C4-C7, C2-C6, 또는 C4-C6 사슬을 포함하는, 방법.
- 제71항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 고정 모이어티는 직쇄 지방산, 분지형 지방산, 불포화 지방산, 단일불포화 지방산, 다중불포화 지방산, 하이드록실 지방산, 폴리카복실산, 또는 이의 임의의 조합을 포함하는, 방법.
- 제80항에 있어서, 고정 모이어티는 직쇄 지방산을 포함하고, 이는 부티르산, 카프로산, 카프릴산, 카프르산, 라우르산, 미리스트산, 팔미트산, 스테아르산, 아라키드산, 베헨산, 리그노세르산, 헥사코산산, 옥타코산산, 트리아코탄산 및 n-도트리아코탄산, 및 탄소 원자의 홀수를 갖는 것들, 예컨대 프로피온산, n-발레르산, 에난틱산, 펠라르곤산, 헨데칸산, 트리데칸산, 펜타데칸산, 헵타데칸산, 노나데칸산, 헤네이코산산, 트리코산산, 펜타코산산, 헵타코산산, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 방법.
- 제71항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 고정 모이어티는 분지형 지방산, 이소부티르산, 이소카프로산, 이소카프릴산, 이소카프르산, 이소라우르산, 11-메틸도데칸산, 이소미리스트산, 13-메틸-테트라데칸산, 이소팔미트산, 15-메틸-헥사데칸산, 이소스테아르산, 17-메틸옥타데칸산, 이소아라키드산, 19-메틸-에이코산산, α-에틸-헥산산, α-헥실데칸산, α-헵틸운데칸산, 2-데실테트라데칸산, 2-운데실테트라데칸산, 2-데실펜타데칸산, 2-운데실펜타데칸산, 및 Fine oxocol 1800 산 (Nissan Chemical Industries, Ltd.의 제품), 이소부틸 기로 종결되는 안테이소 지방산, 6-메틸-옥탄산, 8-메틸-데칸산, 10-메틸-도데칸산, 12-메틸-테트라데칸산, 14-메틸-헥사데칸산, 16-메틸-옥타데칸산, 18-메틸-에이코산산, 20-메틸-도코산산, 22-메틸-테트라코산산, 24-메틸-헥사코산산, 및 26-메틸옥타코산산, 또는 이들의 임의의 조합인, 방법.
- 제71항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 고정 모이어티는 불포화된 지방산을 포함하고, 이는 4-데센산, 카프롤레산, 4-도데센산, 5-도데센산, 라우롤레산, 4-테트라데센산, 5-테트라데센산, 9-테트라데센산, 팔미톨레산, 6-옥타데세노산, 올레산, 9-옥타데세노산, 11-옥타데세노산, 9-에이코세노산, 시스-11-에이코세노산, 세톨레산, 13-도코센산, 15-테트라코센산, 17-헥사코센산, 6,9,12,15-헥사데카테트라엔노산, 리놀레산, 리놀렌산, α-엘레오스테아르산, β-엘레오스테아르산, 푸닉산, 6,9,12,15-옥타데카테트라엔노산, 파리나르산, 5,8,11,14-에이코사테트라엔노산, 5,8,11,14,17-에이코사펜타엔산, 7,10,13,16,19-도코사펜타엔산, 4,7,10,13,16,19-도코사헥사엔산, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 방법.
- 제71항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 고정 모이어티는 하이드록시 지방산을 포함하고, 이는 α-하이드록시라우르산, α-하이드록시미리스트산, α-하이드록시팔미트산, α-하이드록시스테아르산, ω-하이드록시라우르산, α-하이드록시아라키드산, 9-하이드록시-12-옥타데세노산, 리시놀레산, α-하이드록시베헨산, 9-하이드록시-트랜스-10,12-옥타데카디엔산, 카몰렌산, 이푸롤산, 9,10-디하이드록시스테아르산, 12-하이드록시스테아르산, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 방법.
- 제71항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 고정 모이어티는 폴리카복실산을 포함하고, 이는 옥살산, 말론산, 석신산, 글루타르산, 아디프산, 피멜산, 수베르산, 아젤라산, 세박산, D,L-말산, 또는 이들의 임의의 조합인, 방법.
- 제71항에 있어서, 고정 모이어티는 인지질을 포함하는, 방법.
- 제86항에 있어서, 인지질은 포스파티딜 콜린, 포스파티딜 에탄올아민, 포스파티딜 글리세롤, 포스파티딜 세린, 포스파티드산, 2 라이소포스파티딜 콜린, 스핑고미엘린, 또는 이들의 임의의 조합인, 방법.
- 제71항에 있어서, 고정 모이어티는 비타민을 포함하는, 방법.
- 제88항에 있어서, 고정 모이어티는 비타민 D, 비타민 K, 니아신, 피리독손, 비타민 E, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 방법.
- 제70항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 고정 모이어티는 페이로드와 고정 모이어티 사이에 링커를 추가로 포함하는, 방법.
- 제90항에 있어서, 링커는 비절단성 링커를 포함하는, 방법.
- 제91항에 있어서, 비절단성 링커는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 글리세롤, 알킬, 포스포로티오에이트, 숙신이미드, 말레이미드, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 방법.
- 제91항에 있어서, 비절단성 링커는 식 R3-(O-CH2-CH2)n- 또는 R3-(0-CH2-CH2)n-O-를 특징으로 하는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함하며, 여기서 R3은 수소, 메틸 또는 에틸이고 n은 2 내지 200의 정수인, 방법.
- 제91항에 있어서, 비절단성 링커는 디에틸렌 글리콜, 트리에틸렌 글리콜, 테트라에틸렌 글리콜(TEG), 헥사에틸렌 글리콜(HEG), 펜타에틸렌 글리콜, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 방법.
- 제90항 또는 제91항에 있어서, 링커는 화학식 ((R3―O―(CH2―CHOH―CH2O)n―)을 갖는 폴리글리세롤(PG)을 포함하며, 여기서 R3은 수소, 메틸 또는 에틸이고, n은 3 내지 200의 정수인, 방법.
- 제90항 또는 제91항에 있어서, 링커는 디글리세롤, 트리글리세롤, 테트라글리세롤(TG), 펜타글리세롤, 헥사글리세롤(HG), 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 방법.
- 제90항 또는 제91항에 있어서, 링커는 알킬을 포함하는, 방법.
- 제90항에 있어서, 링커는 절단성 링커를 포함하는, 방법.
- 제98항에 있어서, 절단성 링커는 산화환원 절단성 링커, 반응성 산소 종 절단성 링커, pH 의존적 절단성 링커, 효소적 절단성 링커, 프로테아제 절단성 링커, 에스테라제 절단성 링커, 산화환원물절단성 링커, 포스포리파제 절단성 링커, 포스파타제 절단성 링커, 광활성화된 절단성 링커, 자기 희생 링커, 또는 이들의 임의의 조합인, 방법.
- 제99항에 있어서, 절단성 링커는 자기 희생 링커인, 방법.
- 제99항에 있어서, L3은 신나밀 기, 나프틸 기, 바이페닐 기, 헤테로사이클릭 고리, 호모방향족 기, 쿠마린, 푸란, 티오펜, 티아졸, 옥사졸, 이속사졸, 피롤, 피라졸, 피리딘, 이미다존, 트리아졸, 또는 이의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 절단성 링커를 포함하는, 방법.
- 제99항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서, 링커는 하기 화학식을 갖는, 방법:
-Aa-Yy-
여기서 각각의 -A-는 독립적으로 아미노산 단위이고, a는 독립적으로 1 내지 12의 정수이고; -Y-는 스페이서 단위이고, 그리고 y는 0, 1, 또는 2이다. - 제102항에 있어서, -Aa-는 디펩티드, 트리펩티드, 테트라펩티드, 펜타펩티드 또는 헥사펩티드인, 방법.
- 제102항에 있어서, a는 2이고, -Aa-는 발린-알라닌, 발린-시트룰린, 글루탐산-발린-시트룰린, 페닐알라닌-라이신, N-메틸발린-시트룰린, 글리신-히스티딘-류신-글리신, 사이클로헥실알라닌-라이신, 및 베타-알라닌-라이신으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
- 제102항에 있어서, -Aa-는 발린-알라닌, 발린-시트룰린 또는 글루탐산-발린-시트룰린인, 방법.
- 제102항에 있어서, -Aa-는 아르기닌, 라이신, 또는 둘 다인, 방법.
- 제102항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서, y는 1인, 방법.
- 제102항 내지 제107항 중 어느 한 항에 있어서, -Y-는 자기 희생 스페이서인, 방법.
- 제108항에 있어서, -Yy-는 하기 화학식 V를 갖는, 방법:
여기서 각각의 R2는 독립적으로 C1-8 알킬, -O-(C1-8 알킬), 할로겐, 니트로 또는 시아노이고; m은 0 내지 4의 정수이다. - 제109항에 있어서, m은 0, 1 또는 2인, 방법.
- 제110항에 있어서, m은 0인, 방법.
- 제110항에 있어서, 절단성 링커는 발린-알라닌-p-아미노벤질카바메이트 또는 발린-시트룰린-p-아미노벤질카바메이트인, 방법.
- 제70항에 있어서, 고정 모이어티는 하기를 포함하는, 방법:
. - 제70항에 있어서, (i) 서열번호: 41 내지 112 중 어느 하나에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 페이로드, 및 (ii) 표 1 또는 표 2의 링커 조합으로부터 선택된 링커를 포함하는, 방법.
- 제114항에 있어서, 페이로드는 콜레스테롤에 접합되는, 방법.
- 제115항에 있어서, 페이로드는 5'GbsCbsAbsdAsdGsdAsdTs(5MdC)s(5MdC)s(5MdC)sdGsdGsdAsdTsdTs(5MdC)sdGsGbsTbsCb3'를 포함하며, 여기서 Nb는 LNA이고, dN은 DNA이고, (5MdC)는 5-메틸-dC이고, s는 포스포로티오에이트이고, TEG는 트리에틸렌 글리콜이고, HEG는 헥사에틸렌 글리콜인, 방법.
- 제114항 또는 제115항에 있어서, 페이로드는 TEG-HEG에 의해 콜레스테롤에 연결되는, 방법.
- 제1항 내지 제117항 중 어느 한 항에 있어서, 세포외 소포는 농도가 적어도 약 1x1011, 적어도 약 2x1011, 적어도 약 3x1011, 적어도 약 4x1011, 적어도 약 5x1011, 적어도 약 6x1011, 적어도 약 7x1011, 적어도 약 8x1011, 적어도 약 9x1011, 적어도 약 1x1012, 적어도 약 2x1012, 적어도 약 3x1012, 적어도 약 4x1012, 적어도 약 5x1012, 적어도 약 6x1012, 적어도 약 7x1012, 적어도 약 8x1012, 적어도 약 9x1012, 적어도 약 1x1013, 적어도 약 2x1013, 적어도 약 3.0x1013 p/mL, 적어도 약 4x1013 p/mL, 적어도 약 5x1013 p/mL, 적어도 약 6x1013 p/mL, 적어도 약 7x1013 p/mL, 적어도 약 8x1013 p/mL, 적어도 약 9x1013 p/mL, 또는 적어도 약 1x1014개의 입자/mL인, 방법.
- 제1항 내지 제118항 중 어느 한 항에 있어서, 세포외 소포는 농도가 약 1x1012 내지 약 5x1013개의 입자/mL, 약 1x1012 내지 약 4x1013개의 입자/mL, 약 1x1012 내지 약 3x1013개의 입자/mL, 약 1x1012 내지 약 2x1013개의 입자/mL, 약 2x1012 내지 약 5x1013개의 입자/mL, 약 2x1012 내지 약 4x1013개의 입자/mL, 약 2x1012 내지 약 3x1013개의 입자/mL, 약 2x1012 내지 약 2x1013개의 입자/mL, 약 3x1012 내지 약 5x1013개의 입자/mL, 약 3x1012 내지 약 4x1013개의 입자/mL, 약 3x1012 내지 약 3x1013개의 입자/mL, 약 3x1012 내지 약 2x1013개의 입자/mL, 약 4x1012 내지 약 5x1013개의 입자/mL, 약 4x1012 내지 약 4x1013개의 입자/mL, 약 4x1012 내지 약 3x1013개의 입자/mL, 약 4x1012 내지 약 2x1013개의 입자/mL, 약 5x1012 내지 약 5x1013개의 입자/mL, 약 5x1012 내지 약 4x1013개의 입자/mL, 약 5x1012 내지 약 3x1013개의 입자/mL, 또는 약 5x1012 내지 약 2x1013개의 입자/mL인, 방법.
- 제1항 내지 제119항 중 어느 한 항에 있어서, 세포외 소포는 농도가 약 5x1012 내지 약 2x1013개의 입자/mL인, 방법.
- 제1항 내지 제120항 중 어느 한 항에 있어서, 세포외 소포체는 농도가 약 1x1013개의 입자/mL의 농도인, 방법.
- 제1항 내지 제121항 중 어느 한 항에 있어서, 세포외 소포체는 세포외 소포체의 막에 단백질을 추가로 포함하는, 방법.
- 제122항에 있어서, 단백질은 프로스타글란딘 F2 수용체 음성 조절인자 (PTGFRN 단백질); 바시긴 (BSG 단백질); 면역글로불린 슈퍼패밀리 구성원 2 (IGSF2 단백질); 면역글로불린 슈퍼패밀리 구성원 3 (IGSF3 단백질); 면역글로불린 슈퍼패밀리 구성원 8 (IGSF8 단백질); 인테그린 베타-1 (ITGB1 단백질); 인테그린 알파-4 (ITGA4 단백질); 4F2 세포-표면 항원 중쇄 (SLC3A2 단백질); ATP 수송체 단백질의 클래스 (ATP1A1, ATP1A2, ATP1A3, ATP1A4, ATP1B3, ATP2B1, ATP2B2, ATP2B3, ATP2B4 단백질); 이의 기능성 단편; 및 이의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
- 제123항에 있어서, 단백질은 PTGFRN 단백질 또는 이의 기능성 단편을 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제124항 중 어느 한 항의 방법으로 제조된 세포외 소포체.
- 세포외 소포체의 외부 표면에 상의 페이로드를 포함하는 세포외 소포체로서, 세포외 소포체 표면 상의 페이로드의 수는 적어도 약 1,000, 적어도 약 2,000, 적어도 약 3,000, 적어도 약 4000, 적어도 약 5000, 적어도 약 6000, 적어도 약 7000, 적어도 약 8000, 적어도 약 9000, 적어도 약 10,000, 적어도 약 11,000, 적어도 약 12000, 적어도 약 13,000, 적어도 약 14,000, 적어도 약 15,000, 적어도 약 16,000, 적어도 약 17,000, 적어도 약 18,000, 적어도 약 20,000, 적어도 약 25,000, 또는 적어도 약 30,000인, 세포외 소포체.
- 제126항에 있어서, 세포외 소포의 표면 상의 페이로드의 수는 약 5,000 내지 약 20,000, 약 6,000 내지 약 20,000, 약 7,000 내지 약 20,000, 약 8,000 내지 약 20,000, 약 9,000 내지 약 20,000, 약 10,000 내지 약 20,000, 약 5,000 내지 약 18,000, 약 6,000 내지 약 18,000, 약 7,000 내지 약 18,000, 약 8,000 내지 약 18,000, 약 9,000 내지 약 18,000, 약 10,000 내지 약 18,000, 약 5,000 내지 약 15,000, 약 6,000 내지 약 15,000, 약 7,000 내지 약 15,000, 약 8,000 내지 약 15,000, 약 9,000 내지 약 15,000, 또는 약 10,000 내지 약 15,000인, 세포외 소포체.
- 제126항에 있어서, 세포외 소포의 표면 상의 페이로드의 수는 약 10,000 내지 약 15,000인, 세포외 소포체.
- 제126항 내지 제128항 중 어느 한 항에 있어서, 페이로드는 서열번호: 41 내지 112 중 어느 하나에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 방법.
- 제129항에 있어서, 페이로드는 스테롤, GM1, 지질, 인지질, 비타민, 소분자, 펩티드, 또는 이들의 조합에 접합되는, 방법.
- 제130항에 있어서, 페이로드는 콜레스테롤과 접합되는, 세포외 소포체.
- 제126항 내지 제131항 중 어느 한 항에 있어서, 페이로드는 5'GbsCbsAbsdAsdGsdAsdTs(5MdC)s(5MdC)s(5MdC)sdGsdGsdAsdTsdTs(5MdC)sdGsGbsTbsCb3'(서열번호: 48)를 포함하며, 여기서 Nb는 LNA이고, dN은 DNA이고, (5MdC)는 5-메틸-dC이고, s는 포스포로티오에이트인, 세포외 소포체.
- 제132항에 있어서, 페이로드는 TEG-HEG에 의해 콜레스테롤과 연결되는, 세포외 소포체.
- 제125항 내지 제133항 중 어느 한 항의 세포외 소포체를 포함하는 세포외 소포체 집단.
- 제134항에 있어서, 세포외 소포체의 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100%는 제126항 내지 제133항 중 어느 한 항의 세포외 소포체 중 어느 하나의 세포외 소포체인, 세포외 소포체 집단.
- 제125항 내지 제133항 중 어느 한 항의 세포외 소포체 또는 제134항 또는 제135항 중 어느 한 항의 세포외 소포체 집단을 포함하는 조성물.
- 제125항 내지 제133항 중 어느 한 항의 세포외 소포체 또는 제134항 또는 제135항 중 어느 한 항의 세포외 소포체 집단을 포함하는 약제학적 조성물.
- 치료가 필요한 대상체에서 질환 또는 병태를 치료하는 방법으로서, 제125항 내지 제133항 중 어느 한 항의 세포외 소포체 또는 제134항 또는 제135항 중 어느 한 항의 세포외 소포체 집단을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
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