TW202038993A - 工程化細胞外囊泡及其用途 - Google Patents

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Abstract

本發明關於富集存在於胞外體之腔表面(luminal surface)的蛋白質之治療性胞外體。本發明提供製造富集存在於胞外體之腔表面的蛋白質的胞外體之方法，令治療性肽或蛋白質與胞外體之腔表面締合之方法，及使用方法，例如治療或診斷使用之方法。該製造方法包含產生腔表面工程化胞外體，其包括EV(例如胞外體蛋白質濃度比野生型胞外體中所觀察者更高、EV之修飾物或片段(例如胞外體蛋白質)或EV之融合蛋白質(例如胞外體蛋白質)中之一或多者及酬載(例如生物活性分子，諸如治療性蛋白質)。

Description

工程化細胞外囊泡及其用途
本發明提供富集與細胞外囊泡之腔表面(luminal surface)締合之支架蛋白質的細胞外囊泡，例如胞外體，其可用作為預防或治療癌症及其他疾病之藥劑。 [1]令本申請案提交的經電子方式提交之序列表的內容(名稱：4000_041PC01_SL_ST25.txt，大小：116,344位元組；及創建日期：2019年5月22日)其全文以引用方式併入本文。
胞外體為細胞間通訊的重要媒介。胞外體亦為許多疾病(諸如癌症)診斷及預後之重要的生物標誌物。作為藥物遞送媒劑之胞外體提供許多超越傳統的藥物遞送方法的優點，成為許多治療領域中的新治療模式。
胞外體的核心特徵為其內部空間或腔內含有生物活性酬載之其能力。熟知胞外體含有內源酬載，包括mRNA、miRNA、DNA、蛋白質、碳水化合物及脂質，但是引導特異性裝載所欲治療酬載的能力目前受到限制。胞外體可藉由在生產子細胞(producer cell)中過度表現所欲治療酬載而裝載，但是由於酬載隨機定位於細胞的胞外體處理中心而使此裝載的效率通常有限。另一選擇地，經純化之胞外體可藉由例如電穿孔而於活體外裝載。該等方法可能經歷低效率或受限於小的酬載，諸如siRNA。因此，對適合於產生高效率且明確限定的經裝載之胞外體之方法有需求，更好地賦予基於胞外體技術之治療用途及其他應用。
本發明的態樣關於以治療用途而裝載細胞外囊泡(EV)(例如胞外體)之新穎方法。特定言之，該方法係使用自胞外體之腔表面最新鑑定之蛋白質標誌物。特別地，蛋白質群組(例如肉豆蔻醯基化丙胺酸富集之蛋白激酶C受質(MARCKS)、肉豆蔻醯基化丙胺酸富集之蛋白激酶C受質樣1 (MARCKSL1)及腦酸可溶性蛋白質1 (BASP1))經鑑定高度富集在胞外體之腔表面上。此外，BASP1之胺基端的短序列(例如至少七個胺基酸)已顯示足夠引導螢光蛋白質分子達到與全長BASP1蛋白質相同程度的高效率裝載。具有至少七個胺基酸及少於十個胺基酸的此片段在工程化EV裝載領域中出現重大進展且容許任何生物活性分子(例如治療性蛋白質酬載)有效、可再現地裝載至EV (例如胞外體)之腔內，而無需額外的活體外操控步驟。與迄今所述之任何其他的基因工程方法相比，使用本文所述之融合蛋白質裝載EV (例如胞外體)生產具有顯著更高的酬載水平之工程化EV (例如工程化胞外體)。
自胞外體最新鑑定之蛋白質及肽序列被用於本發明的各種實施態樣中。例如，一些實施態樣關於產生融合蛋白質，其係藉由令EV (例如胞外體)蛋白質或蛋白質片段(亦即支架蛋白質)與生物活性分子(例如治療性相關蛋白質)共軛及生產含有融合蛋白質於EV之腔表面上的EV (例如胞外體)。生物活性分子(例如治療性相關蛋白質)之原始全長蛋白質或生物活性片段可藉由與經胞外體富集之蛋白質或蛋白質片段共軛而轉運至EV (例如胞外體)之腔表面。
本發明進一步關於產生或使用經設計更有效裝載或經設計用於裝載生物活性分子(例如治療性相關蛋白質)於EV (例如胞外體)之腔內的經腔工程化之EV (例如經腔工程化之胞外體)。例如，EV之腔表面可經修飾而含有更高濃度的原始全長EV (例如胞外體)蛋白質及/或原始EV (例如胞外體)蛋白質之片段或經修飾之蛋白質於腔表面上。
本發明的一些實施態樣關於生產子細胞或產生用於生產經腔工程化之EV的生產子細胞之方法。外源多核苷酸可瞬間地或穩定地引入生產子細胞中而自生產子細胞產生經腔工程化之EV (例如經腔工程化之胞外體)。
因此，在一態樣中，本發明提供EV (例如胞外體)，其包含支架蛋白質，其中至少一部分的支架蛋白質係自外源序列表現，且支架蛋白質包含MARCKS、MARCKSL1、BASP1或其片段、變異體、衍生物或修飾物。
在一些態樣中，支架蛋白質係存在於EV (例如胞外體)中，其密度比不同的EV (例如胞外體)中之不同的支架蛋白質更高，其中不同的支架蛋白質包含習知的EV (例如胞外體)蛋白質或其變異體。在一些實施態樣中，習知的EV (例如胞外體)蛋白質係選自由下列者所組成之群組：CD9、CD63、CD81、PDGFR、GPI錨蛋白質、乳凝集素(lactadherin)、LAMP2、LAMP2B及其片段。
在一些實施態樣中，EV (例如胞外體)係自基因修飾之細胞生產以包含外源序列，其中細胞視需要為HEK293細胞。
在一些實施態樣中，細胞包含質體，其包含外源序列。
在一些實施態樣中，外源序列係插入定位在相對於編碼MARCKS、MARCKSL1或BASP1之基因組序列的3’或5’之基因組位點中。在一些實施態樣中，外源序列係插入編碼MARCKS、MARCKSL1或BASP1之基因組序列中。
在一些實施態樣中，支架蛋白質為包含MARCKS、MARCKSL1、BASP1或其片段之融合蛋白質，及治療性肽。
在一些實施態樣中，生物活性分子包含選自由下列者所組成之群組的治療性肽：天然肽、重組肽、合成肽或連結至治療性化合物之連結子。在一些實施態樣中，生物活性分子(例如治療性化合物)係選自由下列者所組成之群組：核苷酸、胺基酸、脂質、碳水化合物和小分子。在一些實施態樣中，生物活性分子(例如治療性肽)為抗體或其片段或修飾物。在一些實施態樣中，治療性肽為酵素、配體、受體、轉錄因子或其片段或修飾物。在一些實施態樣中，治療性肽為抗微生物肽或其片段或修飾物。
在一些實施態樣中，EV (例如胞外體)進一步包含第二支架蛋白質，其中第二支架蛋白質包含MARCKS、MARCKSL1、BASP1或其片段。在一些實施態樣中，EV (例如胞外體)進一步包含第二支架蛋白質，其中第二支架蛋白質包含PTGFRN、BSG、IGSF2、IGSF3、IGSF8、ITGB1、ITGA4、SLC3A2、ATP轉運子或其片段。
在一些實施態樣中，支架蛋白質包含相應於樣式(M)(G)(G/A/S)(K/Q)(L/F/S/Q)(S/A)(K)(K)(SEQ ID NO：118)或沒有N端(M)的該樣式之肽序列。在一些實施態樣中，支架蛋白質包含(M)(G)(π)(X)(Φ/π)(π)(+)(+)之肽或沒有N端(M)之肽，其中各括號位置表示胺基酸，且其中π為選自由下列者所組成之群組的任何胺基酸：(Pro、Gly、Ala、Ser)，X為任何胺基酸，Φ為選自由下列者所組成之群組的任何胺基酸：(Val、Ile、Leu、Phe、Trp、Tyr、Met)，且(+)為選自由下列者所組成之群組的任何胺基酸：(Lys、Arg、His)；且其中位置五不為(+)，及位置六既不為(+)，亦不為(Asp或Glu)。在一些實施態樣中，支架蛋白質包含序列(M)(G)(π)(ξ)(Φ/π)(S/A/G/N)(+)(+)之肽或沒有N端(M)之肽，其中各括號位置表示胺基酸，且其中π為選自由下列者所組成之群組的任何胺基酸：(Pro、Gly、Ala、Ser)，ξ為選自由下列者所組成之群組的任何胺基酸：(Asn、Gln、Ser、Thr、Asp、Glu、Lys、His、Arg)，Φ為選自由下列者所組成之群組的任何胺基酸：(Val、Ile、Leu、Phe、Trp、Tyr、Met)，且(+)為選自由下列者所組成之群組的任何胺基酸：(Lys、Arg、His)；且其中位置五不為(+)，及位置六既不為(+)，亦不為(Asp或Glu)。參見R. Aasland等人之FEBS Letters 513 (2002): 141-144 for the nomenclature of amino acids。
在一些實施態樣中，支架蛋白質包含SEQ ID NO：4至110中任一者之肽。在一些實施態樣中，支架蛋白質包含MGXKLSKKK (SEQ ID NO：116)之肽或沒有N端M之肽，其中X為任何胺基酸。在一些實施態樣中，支架蛋白質包含SEQ ID NO：110之肽或沒有N端M之相應肽。在一些實施態樣中，支架蛋白質包含SEQ ID NO：13之肽或沒有N端(M)之相應肽。
在一些實施態樣中，支架蛋白質進一步包含酬載，例如肽。
在另一實施態樣中，本發明提供醫藥組成物，其包含本發明的EV (例如胞外體)及賦形劑。
在一些實施態樣中，醫藥組成物實質上沒有巨分子，其中巨分子係選自核酸、外源蛋白質、脂質、碳水化合物、代謝物及其組合。
在又另一實施態樣中，本發明提供用於生產本文所提供的EV (例如胞外體)之細胞族群。
在一些實施態樣中，細胞族群包含編碼支架蛋白質之外源序列，該支架蛋白質包含MARCKS、MARCKSL1、BASP1或其片段或修飾物。在一些實施態樣中，細胞族群進一步包含編碼第二支架蛋白質之第二外源序列，其中第二支架蛋白質包含MARCKS、MARCKSL1、BASP1或其片段或修飾物。在一些實施態樣中，細胞族群進一步包含編碼第二支架蛋白質之第二外源序列，其中第二支架蛋白質包含PTGFRN、BSG、IGSF2、IGSF3、IGSF8、ITGB1、ITGA4、SLC3A2、ATP轉運子或其片段。
在一些實施態樣中，外源序列係插入編碼MARCKS、MARCKSL1或BASP1之基因組序列中，其中外源序列及基因組序列編碼支架蛋白質。在一些實施態樣中，外源序列係於質體中。
在一些實施態樣中，外源序列編碼生物活性分子(例如治療性肽)。在一些實施態樣中，治療性肽係選自由下列者所組成之群組：天然肽、重組肽、合成肽或連結至治療性化合物之連結子。在一些實施態樣中，治療性化合物係選自由下列者所組成之群組：核苷酸、胺基酸、脂質、碳水化合物和小分子。在一些實施態樣中，治療性肽為抗體或其片段或修飾物。在特定的實施態樣中，抗體為奈米抗體。一般熟習本技術領域者應理解在本發明的EV中所使用的抗體可為本技術中已知的任何抗原結合分子，包括例如交替的抗體模式、抗原-藥物共軛物(ADC)或免疫毒素。
在一些實施態樣中，治療性肽為酵素、配體、受體、轉錄因子或其片段或修飾物。在一些實施態樣中，治療性肽為抗微生物肽或其片段或修飾物。
在一些實施態樣中，外源序列編碼靶定部分。在一些實施態樣中，靶定部分對器官、組織或細胞具有特異性。
在一些實施態樣中，第二支架蛋白質進一步包含靶定部分。在一些實施態樣中，靶定部分對器官、組織或細胞具有特異性。
在一個實施態樣中，本發明提供用於修飾EV (例如胞外體)之多肽，其包含下列序列： (i)  (M)(G)(G/A/S)(K/Q)(L/F/S/Q)(S/A)(K)(K)(SEQ ID NO：118)或沒有N端(M)之相應序列； (ii) (M)(G)(π)(X)(Φ/π)(π)(+)(+)或沒有N端(M)之相應序列，其中各括號位置表示胺基酸，且其中π為選自由下列者所組成之群組的任何胺基酸：(Pro、Gly、Ala、Ser)，X為任何胺基酸，Φ為選自由下列者所組成之群組的任何胺基酸：(Val、Ile、Leu、Phe、Trp、Tyr、Met)，且(+)為選自由下列者所組成之群組的任何胺基酸：(Lys、Arg、His)；且其中位置五不為(+)，及位置六既不為(+)，亦不為(Asp或Glu)；或 (iii) (M)(G)(π)(ξ)(Φ/π)(S/A/G/N)(+)(+)或沒有N端(M)之相應序列，其中各括號位置表示胺基酸，且其中π為選自由下列者所組成之群組的任何胺基酸：(Pro、Gly、Ala、Ser)，ξ為選自由下列者所組成之群組的任何胺基酸：(Asn、Gln、Ser、Thr、Asp、Glu、Lys、His、Arg)，Φ為選自由下列者所組成之群組的任何胺基酸：(Val、Ile、Leu、Phe、Trp、Tyr、Met)，且(+)為選自由下列者所組成之群組的任何胺基酸：(Lys、Arg、His)；且其中位置五不為(+)，及位置六既不為(+)，亦不為(Asp或Glu)。
在一些實施態樣中，支架蛋白質之多肽包含SEQ ID NO：4至110中任一者之序列或沒有N端M之相應序列中任一者。在一些實施態樣中，多肽包含SEQ ID NO：13之序列或沒有N端M之相應序列。在一些實施態樣中，多肽包含SEQ ID NO：110之序列或沒有N端M之相應序列。在一些實施態樣中，多肽包含MGXKLSKKK (SEQ ID NO：116)之序列(其中X為任何胺基酸)或沒有N端M之相應序列。
在一個態樣中，本發明提供多核苷酸構築體，其包含編碼本文所提供的多肽之編碼序列。在一些實施態樣中，編碼序列為最優化之密碼子。
在另一態樣中，本發明提供製造工程化EV (例如胞外體)之方法，其包含步驟： a.令編碼融合多肽之核酸構築體引入細胞中，該融合多肽包含 (i) 編碼MARCKS、MARCKSL1、BASP1或其片段或修飾物之第一序列，及 (ii) 編碼酬載(例如生物活性分子，諸如治療性肽)之第二序列； b.令細胞維持在容許細胞表現融合多肽的條件下；且 c.獲得包含來自該細胞的融合多肽之工程化胞外體。
在一些實施態樣中，第一序列包含下列序列： (i) (M)(G)(G/A/S)(K/Q)(L/F/S/Q)(S/A)(K)(K)(SEQ ID NO：118)或沒有N端(M)之相應序列； (ii) (M)(G)(π)(X)(Φ/π)(π)(+)(+)或沒有N端(M)之相應序列，其中各括號位置表示胺基酸，且其中π為選自由下列者所組成之群組的任何胺基酸：(Pro、Gly、Ala、Ser)，X為任何胺基酸，Φ為選自由下列者所組成之群組的任何胺基酸：(Val、Ile、Leu、Phe、Trp、Tyr、Met)，且(+)為選自由下列者所組成之群組的任何胺基酸：(Lys、Arg、His)；且其中位置五不為(+)，及位置六既不為(+)，亦不為(Asp或Glu)；或 (iii) (M)(G)(π)(ξ)(Φ/π)(S/A/G/N)(+)(+)或沒有N端(M)之相應序列，其中各括號位置表示胺基酸，且其中π為選自由下列者所組成之群組的任何胺基酸：(Pro、Gly、Ala、Ser)，ξ為選自由下列者所組成之群組的任何胺基酸：(Asn、Gln、Ser、Thr、Asp、Glu、Lys、His、Arg)，Φ為選自由下列者所組成之群組的任何胺基酸：(Val、Ile、Leu、Phe、Trp、Tyr、Met)，且(+)為選自由下列者所組成之群組的任何胺基酸：(Lys、Arg、His)；且其中位置五不為(+)，及位置六既不為(+)，亦不為(Asp或Glu)。
在一些實施態樣中，多核苷酸包含SEQ ID NO：4至110中任一者之序列或沒有N端M之相應序列中任一者。在一些實施態樣中，多核苷酸包含SEQ ID NO：13之序列或沒有N端M之相應序列。在一些實施態樣中，多核苷酸包含SEQ ID NO：110之序列或沒有N端M之相應序列。在一些實施態樣中，多核苷酸包含MGXKLSKKK (SEQ ID NO：116)之序列或沒有N端M之相應序列，其中X為任何胺基酸。
在一些實施態樣中，融合多肽係存在於工程化EV (例如工程化胞外體)之腔表面上，其密度比不同的EV (例如胞外體)中之不同的支架蛋白質更高，其中不同的支架蛋白質包含習知的EV (例如胞外體)蛋白質或其變異體。在一些實施態樣中，融合多肽係以比不同的EV (例如胞外體)中之不同的支架蛋白質高2倍以上的密度存在。
在一些實施態樣中，融合多肽係以比不同的EV (例如胞外體)中之不同的支架蛋白質高4倍、16倍、100倍或10,000倍以上的密度存在。
本發明係指向經單離之細胞外囊泡(EV)，其包含連結至支架蛋白質之生物活性分子，其中支架蛋白質包含N端結構域(ND)及效應子結構域(ED)，其中ND及ED係藉由離子相互作用與EV之腔表面締合，其中ED包含至少兩個按序鄰接的離胺酸(Lys)。在一些實施態樣中，ND係經由肉豆蔻醯基化與EV之腔表面締合。在其他的實施態樣中，ND之N端上具有Gly。
在一些實施態樣中，ED包含至少三個Lys、至少四個Lys、至少五個Lys、至少六個Lys或至少七個Lys。在其他的實施態樣中，ED係藉由肽鍵連結至ND。在一些實施態樣中，ED包含(Lys)n，其中n為介於1與10之間的整數。在其他的實施態樣中，ED包含KK、KKK、KKKK (SEQ ID NO：151)、KKKKK (SEQ ID NO：152)或其任何組合。
在其他的實施態樣中，ND包含如以G:X2:X3:X4:X5:X6所列之胺基酸序列，其中G為以Gly表示之甘胺酸；其中「:」表示肽鍵，其中X2至X6中之各者獨立為胺基酸；且其中X6包含鹼性胺基酸。在一些實施態樣中，X6係選自由下列者所組成之群組：Lys、Arg和His。
在其他的實施態樣中，本發明為經單離之細胞外囊泡(EV)，其包含連結至支架蛋白質之生物活性分子，其中支架蛋白質包含N端結構域(ND)及效應子結構域(ED)，其中ND包含如以G:X2:X3:X4:X5:X6所列之胺基酸序列，其中G為以Gly表示之甘胺酸；其中「:」表示肽鍵，其中X2至X6中之各者獨立為胺基酸；其中X6包含鹼性胺基酸，且其中ED係藉由肽鍵連結至X6，且包含至少一個離胺酸在ED之N端上。在一些實施態樣中，ED不包含病毒之跨膜結構域或細胞質結構域。在一些實施態樣中，X2係選自由下列者所組成之群組：Pro、Gly、Ala和Ser。在其他的實施態樣中，X4係選自由下列者所組成之群組：Pro、Gly、Ala、Ser、Val、Ile、Leu、Phe、Trp、Tyr、Gln和Met。在一些實施態樣中，X5係選自由下列者所組成之群組：Pro、Gly、Ala和Ser。
在一些實施態樣中，支架蛋白質之ND包含G:X2:X3:X4:X5:X6之胺基酸序列，其中 G表示Gly； 「:」表示肽鍵； X2為選自由下列者所組成之群組的胺基酸：Pro、Gly、Ala和Ser； X3為胺基酸； X4為選自由下列者所組成之群組的胺基酸：Pro、Gly、Ala、Ser、Val、Ile、Leu、Phe、Trp、Tyr、Gln和Met； X5為選自由下列者所組成之群組的胺基酸：Pro、Gly、Ala和Ser；且 X6為選自由下列者所組成之群組的胺基酸：Lys、Arg和His。
在一些實施態樣中，X3係選自由下列者所組成之群組：Asn、Gln、Ser、Thr、Asp、Glu、Lys、His和Arg。
在一些實施態樣中，ND與ED係藉由連結子接合。在一些實施態樣中，連結子包含一或多個胺基酸。
在一些實施態樣中，本發明係指向經單離之細胞外囊泡(EV)，其包含連結至支架蛋白質之生物活性分子，其中支架蛋白質包含ND-ED，其中： ND包含G:X2:X3:X4:X5:X6；其中： G表示Gly； 「:」表示肽鍵； X2為選自由下列者所組成之群組的胺基酸：Pro、Gly、Ala和Ser； X3為胺基酸； X4為選自由下列者所組成之群組的胺基酸：Pro、Gly、Ala、Ser、Val、Ile、Leu、Phe、Trp、Tyr、Glu和Met； X5為選自由下列者所組成之群組的胺基酸：Pro、Gly、Ala和Ser； X6為選自由下列者所組成之群組的胺基酸：Lys、Arg和His； 「-」為視需要之連結子，其包含一或多個胺基酸；且 ED為效應子結構域，其包含(i)至少兩個鄰接的離胺酸(Lys)，其係藉由肽鍵或一或多個胺基酸連結至X6，或(ii)至少一個離胺酸，其係藉由肽鍵直接連結至X6。
在其他的實施態樣中，X2係選自由下列者所組成之群組：Gly和Ala。在一些實施態樣中，X3為Lys。在一些實施態樣中，X4為Leu或Glu。在一些實施態樣中，X5係選自由下列者所組成之群組：Ser和Ala。在一些實施態樣中，X6為Lys。在其他的實施態樣中，X2為Gly、Ala或Ser；X3為Lys或Glu，X4為Leu、Phe、Ser和Glu，X5為Ser或Ala；且X6為Lys。
在一些實施態樣中，ND與ED係藉由包含一或多個胺基酸之連結子連結。在一些實施態樣中，ED包含Lys (K)、KK、KKK、KKKK (SEQ ID NO：151)、KKKKK (SEQ ID NO：152)或其任何組合。
在一些實施態樣中，支架蛋白質包含選自由下列者所組成之群組的胺基酸序列：(i) GGKLSKK (SEQ ID NO：157)，(ii) GAKLSKK (SEQ ID NO：158)，(iii) GGKQSKK (SEQ ID NO：159)，(iv) GGKLAKK (SEQ ID NO：160)，或(v)其任何組合。在一些實施態樣中，支架蛋白質包含選自由下列者所組成之群組的胺基酸序列：(i) GGKLSKKK (SEQ ID NO：161)，(ii) GGKLSKKS (SEQ ID NO：162)，(iii) GAKLSKKK (SEQ ID NO：163)，(iv) GAKLSKKS (SEQ ID NO：164)，(v) GGKQSKKK (SEQ ID NO：165)，(vi) GGKQSKKS (SEQ ID NO：166)，(vii) GGKLAKKK (SEQ ID NO：167)，(viii) GGKLAKKS (SEQ ID NO：168)，且(ix)其任何組合。在一些實施態樣中，支架蛋白質為至少約8個、至少約9個、至少約10個、至少約11個、至少約12個、至少約13個、至少約14個、至少約15個、至少約16個、至少約17個、至少約18個、至少約19個、至少約20個、至少約21個、至少約22個、至少約23個、至少約24個、至少約25個、至少約30個、至少約35個、至少約40個、至少約45個、至少約50個、至少約55個、至少約60個、至少約65個、至少約70個、至少約75個、至少約80個、至少約85個、至少約90個、至少約95個、至少約100個、至少約105個、至少約110個、至少約120個、至少約130個、至少約140個、至少約150個、至少約160個、至少約170個、至少約180個、至少約190個或至少約200個胺基酸長度。
在一些實施態樣中，支架蛋白質包含(i) GGKLSKKKKGYNVN (SEQ ID NO：169)，(ii) GAKLSKKKKGYNVN (SEQ ID NO：170)，(iii) GGKQSKKKKGYNVN (SEQ ID NO：171)，(iv) GGKLAKKKKGYNVN (SEQ ID NO：172)，(v) GGKLSKKKKGYSGG (SEQ ID NO：173)，(vi) GGKLSKKKKGSGGS (SEQ ID NO：174)，(vii) GGKLSKKKKSGGSG (SEQ ID NO：175)，(viii) GGKLSKKKSGGSGG (SEQ ID NO：176)，(ix) GGKLSKKSGGSGGS (SEQ ID NO：177)，(x) GGKLSKSGGSGGSV (SEQ ID NO：178)，或(xi) GAKKSKKRFSFKKS (SEQ ID NO：179)。
在一些實施態樣中，支架蛋白質之N端上不包含Met。在一些實施態樣中，支架蛋白質包含肉豆蔻醯基化胺基酸殘基在支架蛋白質之N端上。在一些實施態樣中，在支架蛋白質之N端上的胺基酸殘基為Gly。在一些實施態樣中，在支架蛋白質之N端上的胺基酸殘基為合成的。在一些實施態樣中，在支架蛋白質之N端上的胺基酸殘基為甘胺酸類似物。
在一些實施態樣中，支架蛋白質包含與SEQ ID NO：1 (MARKS)、SEQ ID NO：2 (MARCKSL1)或SEQ ID NO：3 (BASP1)具有至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%之序列一致性的胺基酸序列。
在一些實施態樣中，生物活性分子係在EV之腔表面或腔上。在一些實施態樣中，支架蛋白質進一步包含跨膜結構域。在一些實施態樣中，跨膜結構域係在支架蛋白質之ED結構域與生物活性分子之間。在一些實施態樣中，支架蛋白質進一步包含囊泡外結構域。在一些實施態樣中，生物活性分子係連結至囊泡外結構域。
在一些實施態樣中，支架蛋白質係藉由連結子連結至生物活性分子。在一些實施態樣中，ND結構域係藉由連結子連結至ED結構域。在一些實施態樣中，連結子包含一或多個胺基酸。在一些實施態樣中，連結子包含可切割的連結子。在一些實施態樣中，連結子包含可撓性連結子。
在其他的實施態樣中，生物活性分子包含蛋白質、多肽、肽、多核苷酸(DNA及/或RNA)、化學化合物、病毒、親離子基團、用於親離子基團之載體、形成通道或孔之部分或其任何組合。在一些實施態樣中，蛋白質包含重組肽、天然肽、合成肽、抗體、融合蛋白質或其任何組合。在一些實施態樣中，蛋白質包含酵素、細胞激素、配體、受體、轉錄因子或其組合。在一些實施態樣中，病毒包含腺相關病毒、小病毒、反轉錄病毒、腺病毒或其任何組合。
在其他的實施態樣中，EV進一步包含第二支架蛋白質。在一些實施態樣中，第二支架蛋白質包含PTGFRN多肽、BSG多肽、IGSF2多肽、IGSF3多肽、IGSF8多肽、ITGB1多肽、ITGA4多肽、SLC3A2多肽、ATP轉運子多肽、胺肽酶N (ANPEP)多肽、外核苷酸焦磷酸酶(ectonucleotide pyrophosphatase)/磷酸二酯酶家族成員1 (ENPP1)多肽、腦啡肽酶(neprilysin)(MME)多肽、神經纖毛蛋白(neuropilin)-1 (NRP1)多肽或其片段。在一些實施態樣中，生物活性分子為陰性檢查點調節子(negative checkpoint regulator)之抑制劑或陰性檢查點調節子的結合伴體之抑制劑。在一些實施態樣中，陰性檢查點調節子係選自由下列者所組成之群組：細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白質4 (CTLA-4)、程式性細胞死亡蛋白質1 (PD-1)、淋巴細胞活化型基因3 (LAG-3)、含T細胞免疫球蛋白黏蛋白之蛋白質3 (TIM-3)、B和T淋巴細胞衰減因子(BTLA)、具有Ig及ITIM結構域之T細胞免疫受體(TIGIT)、T細胞活化之V結構域Ig抑制因子(VISTA)、腺苷酸A2a受體(A2aR)、殺手細胞免疫球蛋白樣受體(KIR)、吲哚胺2,3-二氧酶(IDO)、CD20、CD39和CD73。在一些實施態樣中，生物活性分子為免疫性蛋白質。
在其他的實施態樣中，生物活性分子為毒素、類毒素或毒素之無毒性突變體。在一些實施態樣中，毒素為白喉毒素。在一些實施態樣中，類毒素為破傷風類毒素。在一些實施態樣中，生物活性分子為白喉毒素之無毒性突變體。
在一些實施態樣中，生物活性分子為陽性共刺激分子之活化物或陽性共刺激分子的結合伴體之活化物。在一些實施態樣中，陽性共刺激分子為TNF受體超家族成員。在一些實施態樣中，TNF受體超家族成員係選自由下列者所組成之群組：CD120a、CD120b、CD18、OX40、CD40、Fas受體、M68、CD27、CD30、4-1BB、TRAILR1、TRAILR2、TRAILR3、TRAILR4、RANK、OCIF、TWEAK受體、TACI、BAFF受體、ATAR、CD271、CD269、AITR、TROY、CD358、TRAMP和XEDAR。在一些實施態樣中，陽性共刺激分子之活化物為TNF超家族成員。在一些實施態樣中，TNF超家族成員係選自由下列者所組成之群組：TNFα、TNF-C、OX40L、CD40L、FasL、LIGHT、TL1A、CD27L、Siva、CD153、4-1BB配體、TRAIL、RANKL、TWEAK、APRIL、BAFF、CAMLG、NGF、BDNF、NT-3、NT-4、GITR配體和EDA-2。在一些實施態樣中，陽性共刺激分子為CD28-超家族共刺激分子。在一些實施態樣中，CD28-超家族共刺激分子為ICOS或CD28。在一些實施態樣中，陽性共刺激分子之活化物為ICOSL、CD80或CD86。
在其他的實施態樣中，細胞激素係選自由下列者所組成之群組：IL-2、IL-7、IL-10、IL-12和IL-15。在一些實施態樣中，蛋白質包含T細胞受體(TCR)、T細胞共受體、主要組織相容複合體(MHC)、人類白血球抗原(HLA)或其衍生物。在一些實施態樣中，蛋白質包含腫瘤抗原。在一些實施態樣中，腫瘤抗原係選自由下列者所組成之群組：α-胎兒蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、上皮腫瘤抗原(ETA)、黏蛋白1 (MUC1)、Tn-MUC1、黏蛋白16 (MUC16)、酪胺酸酶、黑色素瘤相關抗原(MAGE)、腫瘤蛋白質 p53 (p53)、CD4、CD8、CD45、CD80、CD86、程式性死亡配體1 (PD-L1)、程式性死亡配體2 (PD-L2)、NY-ESO-1、PSMA、TAG-72、HER2、GD2、cMET、EGFR、間皮素(Mesothelin)、VEGFR、α-葉酸受體、CE7R、IL-3、癌-睪丸抗原、MART-1 gp100和TNF相關細胞凋亡誘導配體。
在其他的實施態樣中，EV為胞外體。
在一些實施態樣中，本發明係指向醫藥組成物，其包含本發明的EV及醫藥上可接受之載劑。在一些實施態樣中，本發明係指向生產本發明的EV之細胞。在一些實施態樣中，本發明係指向包含本發明的EV及用法說明之套組。
在其他的實施態樣中，本發明係指向製造EV之方法，其包含在適合的條件下培養本發明的細胞及獲得EV。在一些實施態樣中，本發明係指向錨定生物活性分子至細胞外囊泡之方法，其包含令生物活性分子連結至本文所揭示之支架蛋白質。
在其他的實施態樣中，本發明係指向預防或治療有其需要之個體的疾病之方法，其包含投予本發明的EV，其中疾病係與抗原相關。在一些實施態樣中，EV係經胃腸外、經口、靜脈內、肌肉內、腫瘤內、鼻內、皮下或腹膜內投予。 實施態樣
E1. 一種EV (例如胞外體)，其包含支架蛋白質，其中至少一部分的支架蛋白質係自外源序列表現，且支架蛋白質包含MARCKS、MARCKSL1、BASP1或其片段或修飾物。
E2. 實施態樣E1之EV (例如胞外體)，其中支架蛋白質係存在於EV (例如胞外體)中，其密度比不同的EV (例如胞外體)中之不同的支架蛋白質更高，其中不同的支架蛋白質包含習知的EV (例如胞外體)蛋白質或其變異體。
E3. 實施態樣E2之EV (例如胞外體)，其中習知的EV (例如胞外體)蛋白質係選自由下列者所組成之群組：CD9、CD63、CD81、PDGFR、GPI錨蛋白質、乳凝集素、LAMP2、LAMP2B及其片段。
E4. 實施態樣E1至E3中任一者之EV (例如胞外體)，其中EV (例如胞外體)係自基因修飾之細胞生產以包含外源序列，其中細胞視需要為HEK293細胞。
E5. 實施態樣E1至E4中任一者之EV (例如胞外體)，其中細胞包含質體，其包含外源序列。
E6. 實施態樣E1至E5中任一者之EV (例如胞外體)，其中細胞包含插入細胞之基因組中的外源序列。
E7. 實施態樣E1至E6中任一者之EV (例如胞外體)，其中外源序列係插入定位在相對於編碼MARCKS、MARCKSL1或BASP1之基因組序列的3’或5’之基因組位點中。
E8. 實施態樣E1至E7中任一者之EV (例如胞外體)，其中外源序列係插入編碼MARCKS、MARCKSL1或BASP1之基因組序列中。
E9. 實施態樣E1至E8中任一者之EV (例如胞外體)，其中支架蛋白質為包含MARCKS、MARCKSL1、BASP1或其片段之融合蛋白質，及治療性肽。
E10. 實施態樣E9之EV (例如胞外體)，其中治療性肽係選自由下列者所組成之群組：天然肽、重組肽、合成肽或連結至治療性化合物之連結子。
E11. 實施態樣E9之EV (例如胞外體)，其中治療性化合物係選自由下列者所組成之群組：核苷酸、胺基酸、脂質、碳水化合物和小分子。
E12. 實施態樣E9之EV (例如胞外體)，其中治療性肽為抗體或其片段或修飾物。
E13. 實施態樣E9之EV (例如胞外體)，其中治療性肽為酵素、配體、受體、轉錄因子或其片段或修飾物。
E14.實施態樣E9之EV (例如胞外體)，其中治療性肽為抗微生物肽或其片段或修飾物。
E15. 實施態樣E1至E14中任一者之EV (例如胞外體)，其進一步包含第二支架蛋白質，其中第二支架蛋白質包含MARCKS、MARCKSL1、BASP1或其片段。
E16. 實施態樣E1至E14中任一者之EV (例如胞外體)，其進一步包含第二支架蛋白質，其中第二支架蛋白質包含PTGFRN、BSG、IGSF2、IGSF3、IGSF8、ITGB1、ITGA4、SLC3A2、ATP轉運子或其片段。
E17. 實施態樣E1至E16中任一者之EV (例如胞外體)，其中支架蛋白質包含序列(M)(G)(G/A/S)(K/Q) (L/F/S/Q)(S/A)(K)(K)(SEQ ID NO：118)之肽或沒有N端(M)之相應序列。
E18. 實施態樣E1至E17中任一者之EV (例如胞外體)，其中支架蛋白質包含序列(M)(G)(π)(X)(Φ/π)(π)(+)(+)之肽或沒有N端(M)之相應序列，其中各括號位置表示胺基酸，且其中π為選自由下列者所組成之群組的任何胺基酸：(Pro、Gly、Ala、Ser)，X為任何胺基酸，Φ為選自由下列者所組成之群組的任何胺基酸：(Val、Ile、Leu、Phe、Trp、Tyr、Met)，且(+)為選自由下列者所組成之群組的任何胺基酸：(Lys、Arg、His)；且其中位置五不為(+)，及位置六既不為(+)，亦不為(Asp或Glu)。
E19. 實施態樣E1至E18中任一者之EV (例如胞外體)，其中支架蛋白質包含序列(M)(G)(π)(ξ)(Φ/π) (S/A/G/N)(+)(+)之肽或沒有N端(M)之相應序列，其中各括號位置表示胺基酸，且其中π為選自由下列者所組成之群組的任何胺基酸：(Pro、Gly、Ala、Ser)，ξ為選自由下列者所組成之群組的任何胺基酸：(Asn、Gln、Ser、Thr、Asp、Glu、Lys、His、Arg)，Φ為選自由下列者所組成之群組的任何胺基酸：(Val、Ile、Leu、Phe、Trp、Tyr、Met)，且(+)為選自由下列者所組成之群組的任何胺基酸：(Lys、Arg、His)；且其中位置五不為(+)，及位置六既不為(+)，亦不為(Asp或Glu)。
E20. 實施態樣E18或E19中任一者之EV (例如胞外體)，其中支架蛋白質包含SEQ ID NO：4至110中任一者之肽或沒有N端M之相應序列中任一者。
E21. 實施態樣E18或E19中任一者之EV (例如胞外體)，其中支架蛋白質包含MGXKLSKKK (SEQ ID NO：116)之肽或沒有N端M之相應序列，其中X為任何胺基酸。
E22. 實施態樣E20之EV (例如胞外體)，其中支架蛋白質包含SEQ ID NO：110之肽或沒有N端M之相應序列。
E23. 實施態樣E20之EV (例如胞外體)，其中支架蛋白質包含SEQ ID NO：13之肽或沒有N端M之相應序列。
E24. 實施態樣E1至E24中任一者之EV (例如胞外體)，其中支架蛋白質進一步包含酬載，例如生物活性分子，諸如肽。
E25. 一種醫藥組成物，其包含實施態樣E1至E24中任一者之EV (例如胞外體)及賦形劑。
E26. 實施態樣E25之醫藥組成物，其實質上沒有巨分子，其中巨分子係選自核酸、外源蛋白質、脂質、碳水化合物、代謝物及其組合。
E27. 一種細胞族群，其係用於生產實施態樣E1至E24中任一者之EV (例如胞外體)。
E28. 實施態樣E27之細胞族群，其包含編碼包含MARCKS、MARCKSL1、BASP1或其片段或修飾物之支架蛋白質的外源序列。
E29. 實施態樣E28之細胞族群，其進一步包含編碼第二支架蛋白質之第二外源序列，其中第二支架蛋白質包含MARCKS、MARCKSL1、BASP1或其片段或修飾物。
E30. 實施態樣E28之細胞族群，其進一步包含編碼第二支架蛋白質之第二外源序列，其中第二支架蛋白質包含PTGFRN、BSG、IGSF2、IGSF3、IGSF8、ITGB1、ITGA4、SLC3A2、ATP轉運子或其片段。
E31. 實施態樣E27至E30中任一者之細胞族群，其中外源序列係插入編碼MARCKS、MARCKSL1或BASP1之基因組序列中，其中外源序列及基因組序列編碼支架蛋白質。
E32. 實施態樣E27至E30中任一者之細胞族群，其中外源序列係於質體中。
E33. 實施態樣E27至E32中任一者之細胞族群，其中外源序列編碼生物活性分子，例如治療性肽。
E34. 實施態樣E33之細胞族群，其中治療性肽係選自由下列者所組成之群組：天然肽、重組肽、合成肽或連結至治療性化合物之連結子。
E35. 實施態樣E33之細胞族群，其中治療性化合物係選自由下列者所組成之群組：核苷酸、胺基酸、脂質、碳水化合物和小分子。
E36. 實施態樣E33之細胞族群，其中治療性肽為抗體或其片段或修飾物。
E37. 實施態樣E33之細胞族群，其中治療性肽為酵素、配體、受體、轉錄因子或其片段或修飾物。
E38. 實施態樣E33之細胞族群，其中治療性肽為抗微生物肽或其片段或修飾物。
E39. 實施態樣E28之細胞族群，其中外源序列編碼靶定部分。
E40. 實施態樣E39之細胞族群，其中靶定部分對器官、組織或細胞具有特異性。
E41. 實施態樣E29或E30之細胞族群，其中第二支架蛋白質進一步包含靶定部分。
E42. 實施態樣E41之細胞族群，其中靶定部分對器官、組織或細胞具有特異性。
E43. 一種用於修飾EV (例如胞外體)之多肽，其包含下列序列 (i)  (M)(G)(G/A/S)(K/Q)(L/F/S/Q)(S/A)(K)(K)(SEQ ID NO：118)或沒有N端(M)之相應序列； (ii) (M)(G)(π)(X)(Φ/π)(π)(+)(+)或沒有N端(M)之相應序列，其中各括號位置表示胺基酸，且其中π為選自由下列者所組成之群組的任何胺基酸：(Pro、Gly、Ala、Ser)，X為任何胺基酸，Φ為選自由下列者所組成之群組的任何胺基酸：(Val、Ile、Leu、Phe、Trp、Tyr、Met)，且(+)為選自由下列者所組成之群組的任何胺基酸：(Lys、Arg、His)；且其中位置五不為(+)，及位置六既不為(+)，亦不為(Asp或Glu)；或 (iii) (M)(G)(π)(ξ)(Φ/π)(S/A/G/N)(+)(+)或沒有N端(M)之相應序列，其中各括號位置表示胺基酸，且其中π為選自由下列者所組成之群組的任何胺基酸：(Pro、Gly、Ala、Ser)，ξ為選自由下列者所組成之群組的任何胺基酸：(Asn、Gln、Ser、Thr、Asp、Glu、Lys、His、Arg)，Φ為選自由下列者所組成之群組的任何胺基酸：(Val、Ile、Leu、Phe、Trp、Tyr、Met)，且(+)為選自由下列者所組成之群組的任何胺基酸：(Lys、Arg、His)；且其中位置五不為(+)，及位置六既不為(+)，亦不為(Asp或Glu)。
E44. 實施態樣E43之多肽，其包含SEQ ID NO：4至110中任一者之序列或沒有N端M之相應序列中任一者。
E45. 實施態樣E43之多肽，其包含SEQ ID NO：13之序列或沒有N端M之相應序列。
E46. 實施態樣E43之多肽，其包含SEQ ID NO：110之序列或沒有N端M之相應序列。
E47. 實施態樣E43之多肽，其包含MGXKLSKKK (SEQ ID NO：116)之序列或沒有N端M之相應序列，其中X為任何胺基酸。
E48. 實施態樣E43至E47中任一者之多肽，其中多肽經融合至酬載，例如生物活性分子，諸如肽。
E49. 實施態樣E48之多肽，其中多肽經融合至肽之N端。
E50. 一種多核苷酸構築體，其包含編碼實施態樣E43至E49中任一者之多肽的編碼序列。
E51. 實施態樣E50之多核苷酸構築體，其中編碼序列為最優化密碼子。
E52. 一種製造工程化EV (例如胞外體)之方法，其包含步驟： a.   令編碼融合多肽之核酸構築體引入細胞中，該融合多肽包含(i)編碼MARCKS、MARCKSL1、BASP1或其片段或修飾物之第一序列，及(ii)編碼酬載(例如生物活性分子，諸如肽)之第二序列； b.   令細胞維持在容許細胞表現融合多肽的條件下；且 c.    獲得工程化EV (例如胞外體)，其包含來自該細胞之融合多肽。
E53. 實施態樣E52之方法，其中第一序列包含下列序列 (i) (M)(G)(G/A/S)(K/Q)(L/F/S/Q)(S/A)(K)(K)(SEQ ID NO：118)或沒有N端(M)之相應序列； (ii) (M)(G)(π)(X)(Φ/π)(π)(+)(+)或沒有N端(M)之相應序列，其中各括號位置表示胺基酸，且其中π為選自由下列者所組成之群組的任何胺基酸：(Pro、Gly、Ala、Ser)，X為任何胺基酸，Φ為選自由下列者所組成之群組的任何胺基酸：(Val、Ile、Leu、Phe、Trp、Tyr、Met)，且(+)為選自由下列者所組成之群組的任何胺基酸：(Lys、Arg、His)；且其中位置五不為(+)，及位置六既不為(+)，亦不為(Asp或Glu)；或 (iii) (M)(G)(π)(ξ)(Φ/π)(S/A/G/N)(+)(+)或沒有N端(M)之相應序列，其中各括號位置表示胺基酸，且其中π為選自由下列者所組成之群組的任何胺基酸：(Pro、Gly、Ala、Ser)，ξ為選自由下列者所組成之群組的任何胺基酸：(Asn、Gln、Ser、Thr、Asp、Glu、Lys、His、Arg)，Φ為選自由下列者所組成之群組的任何胺基酸：(Val、Ile、Leu、Phe、Trp、Tyr、Met)，且(+)為選自由下列者所組成之群組的任何胺基酸：(Lys、Arg、His)；且其中位置五不為(+)，及位置六既不為(+)，亦不為(Asp或Glu)。
E54. 實施態樣E52或E53中任一者之方法，其中第一序列包含SEQ ID NO：4至110中任一者或沒有N端M之相應序列中任一者。
E55. 實施態樣E54之方法，其中第一序列包含SEQ ID NO：13或沒有N端M之相應序列。
E56. 實施態樣E55之方法，其中第一序列包含SEQ ID NO：110或沒有N端M之相應序列。
E57. 實施態樣E53之方法，其中第一序列包含MGXKLSKKK (SEQ ID NO：116)或沒有N端M之相應序列，其中X為任何胺基酸。
E58.實施態樣E52至E57中任一者之方法，其中融合多肽係存在於工程化EV (例如胞外體)之腔表面上，其密度比不同的EV (例如胞外體)中之不同的支架蛋白質更高，其中不同的支架蛋白質包含習知的EV (例如胞外體)蛋白質或其變異體。
E59. 實施態樣E58之方法，其中融合多肽係以比不同的EV (例如胞外體)中之不同的支架蛋白質高2倍以上的密度存在。
E60. 實施態樣E59之方法，其中融合多肽係以比不同的EV (例如胞外體)中之不同的支架蛋白質高4倍、16倍、100倍或10,000倍以上的密度存在。
詳細說明
本發明係指向細胞外囊泡(EV)(例如胞外體)，其包含至少一種經由支架蛋白質連結至EV (例如胞外體)之生物活性分子，其中支架蛋白質包含N端結構域(ND)及效應子結構域(ED)，其中ND及/或ED係與EV (例如胞外體)之腔表面締合，其中ED包含(i)在ED中的離胺酸複製體或(ii)當與ND組合時的離胺酸複製體，例如在ND之C端上的K及在ED之N端上的K，其中ND與ED係直接連結，亦即藉由肽鍵。本發明亦提供能夠錨定酬載(例如生物活性分子)至EV (例如胞外體)之腔表面的最少數量之胺基酸，例如7至15、7至14、7至13、7至12、7至11、7至10、7至9或7至8個胺基酸片段。ND可經由肉豆蔻醯基化與EV (例如胞外體)之腔表面締合，而ED可藉由離子相互作用與EV (例如胞外體)之腔表面締合，例如經由相吸的靜電相互作用。各種態樣的非限制性實例顯示於本發明中。
在更詳細地說明本發明之前，應理解本發明不受限於所述之特定的組成物或方法步驟，因此當然可以改變。如那些熟習本技術領域者在閱讀本發明時所明白，本文所述且例證之每一個別的態樣具有獨特的組分及特徵，其可輕易地與其他許多態樣中任一者的特徵分隔或組合而不脫離本發明的範疇或精神。任何列舉之方法可以列舉之事件的順序或以邏輯上可能的任何其他順序進行。
本文所提供的標題不是限制本發明的各種態樣，其可以藉由參考整個說明書來定義。亦應理解本文所使用之術語僅以說明特定的態樣為目的，且不意欲為限制，因為本發明的範疇僅受限於所附之申請專利範圍。
因此，即將於下文定義之術語係以參考整個說明書而更完整地定義。 I. 定義
除非另有其他的定義，否則本文使用之所有技術及科學術語具有熟習本發明所屬技術領域者通常理解的含義。例如，Juo, Pei-Show於2002年第2版the Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology，CRC出版社；1999年第3版The Dictionary of Cell and Molecular Biology，Academic出版社；及2000年修訂的the Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology，Oxford University出版社對技術人員提供在本發明中所使用之許多術語的通用字典。如本文所使用之下列術語具有於下文歸屬於彼等之含意。
應注意術語「一(a)」或「一(an)」實體係指該實體中之一或多者；例如應理解「一核苷酸序列」表示一或多個核苷酸序列。就此而論，術語「一(a)」(或「一(an)」)、「一或多者」及「至少一者」在本文可交換使用。應進一步注意可撰寫申請專利範圍以排除任何視需要的元件。就此而論，此聲明旨在當作為使用與申請專利範圍要素之列舉或否定限制之使用有關的「單獨」、「僅」及類似者的此等專用術語之先行基礎。
此外，本文所使用之「及/或」被視為兩個指定的特徵或組分中之各者具有或不具有另一者之具體揭示。因此，如詞組中所使用之術語「及/或」(諸如「A及/或B」)在本文旨在包括「A及B」、「A或B」、「A」(單獨)及「B」(單獨)。同樣地，如詞組中所使用之術語「及/或」(諸如「A、B及/或C」旨在包含下列態樣中之各者：A、B及C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A及C；A及B；B及C；A (單獨)；B (單獨)；及C (單獨)。
應理解在本文以語言「包含」說明態樣的任何情況下，亦提供以術語「由...所組成」及/或「基本上由...所組成」所說明之另外其他類似的態樣。
單位、前綴及符號皆以其國際單位制(Système International de Unites)(SI)可接受之形式表示。
數值範圍包括限定該範圍之數值。在列舉值之範圍時，應理解亦具體地揭示在該範圍所列舉之上限與下限之間的各個中間整數值及其各個分數，連同在此等值之間的各個子範圍。任何範圍的上限及下限可獨立地包括在其中或自該範圍排除，且其中包括任一個、無任一個或兩個限度之各個範圍亦涵蓋在本發明內。
因此，應理解本文所列舉之範圍為針對範圍內的所有值之縮寫，包括所列舉之端點。例如，應理解1至50之範圍包括來自由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49及50所組成之群組的任何數值、數值之組合或子範圍。
除非另有其他指示，否則具有一或多個立體中心之化合物的述及意欲為各個立體異構體及其立體異構體的所有組合。
在明確地列舉出值的情況下，應理解與所列舉之值大約相同的數量或量的值亦在本發明的範圍內。在揭示組合的情況下，亦具體地揭示該組合之要素的各個子組合且在本發明的範圍內。相反地，在個別揭示不同的要素或要素群組的情況下，亦揭示其組合。在揭示內容的任何要素經揭示具有複數個替代物的情況下，亦特此揭示其中各個替代物單獨或與其他替代物之任何組合經排除之該揭示內容的實例；揭示內容中不止一個要素可具有此等排除，且特此揭示具有此等排除之要素的所有組合。
核苷酸係以彼等一般經認可之單字母代碼述及。除非另有其他指示，否則核苷酸序列係以5'至3'之方向自左書寫至右。核苷酸在本文係以IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission建議之彼等一般已知的單一字母符號述及。因此，A表示腺嘌呤，C表示胞嘧啶，G表示鳥嘌呤，T表示胸嘧啶，U表示尿嘧啶。
胺基酸序列係以胺基至羧基方向自左書寫至右。胺基酸在本文係以彼等一般已知的三個字母符號或以IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission建議之單一字母符號述及。
本文所使用之術語「約」意指近似、大致、約莫或大約。當術語「約」係與數值範圍聯合使用時，其係藉由擴展邊界高於及低於所列出之數值來修飾該範圍。術語「約」通常可藉由例如向上或向下(較高或較低) 10%之變化來修飾數值高於或低於所述之值。
如本文所使用之術語「近似」在應用於一或多個關注之值時，其係指類似於述之參考值的值。在特定的態樣中，術語「近似」係指在任一方向上落在所述之參考值的10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或更少之內(更大或更小)的值範圍，除非另有其他陳述或另外自上下文顯而易見(除了此數值會超過可能值的100%之情況下)。
術語「投予(administration)」、「投予(administering)」及其語法變型係指經由醫藥上可接受之途徑引入本發明的組成物，諸如EV (例如胞外體)至個體中。以任何適合的途徑引入本發明的組成物，諸如EV (例如胞外體)至個體中，包括經腫瘤內、經口、經肺、鼻內、經胃腸外(靜脈內、動脈內、肌肉內、腹膜內或皮下)、直腸、淋巴管內、鞘內、眼週或局部。投予包括自行投予及他人投予。適合的投予途徑容許組成物或藥劑執行其意欲功能。例如，若適合的途徑為靜脈內，則組成物係藉由引入組成物或藥劑至個體靜脈內而投予。
如本文所使用之術語「促效劑」係指結合至受體且活化受體以產生生物反應之分子。受體可經內源或外源促效劑活化。內源促效劑的非限制性實例包括激素、神經傳遞質和環狀二核苷酸。外源促效劑的非限制性實例包括藥物、小分子和環狀二核苷酸。促效劑可為完全、部分或反向促效劑。
如本文所使用之術語「拮抗劑」係指在結合至受體時阻斷或抑制經促效劑媒介之反應而不激發其本身的生物反應之分子。許多拮抗劑係藉由在受體上以結構限定之結合位點上與內源配體或受質競爭而達到其效力。拮抗劑的非限制性實例包括α阻斷劑、β阻斷劑和鈣離子阻斷劑。拮抗劑可為競爭性、無競爭性或非競爭性拮抗劑。
如本文所使用之術語「細胞外囊泡」或「EV」係指自細胞衍生之囊泡，其包含圍住內部空間(腔)的膜。細胞外囊泡包含所有經膜結合之囊泡，其具有小於衍生其之細胞的直徑。細胞外囊泡的直徑範圍通常為20 nm至1000 nm，且可包含在內部空間(亦即腔)內、顯現在細胞外囊泡之外部表面或腔表面上及/或跨越膜的各種酬載。酬載可包含例如核酸、蛋白質、碳水化合物、脂質、小分子及/或其組合。以實例說明且非限制的細胞外囊泡包括細胞凋亡體、細胞片段、藉由直接或間接操控(例如藉由連續擠出或以鹼性溶液處理)而自細胞衍生之囊泡、泡囊化之細胞器及藉由活細胞產生之囊泡(例如藉由直接的漿膜芽殖或晚期胞內體(late endosome)與漿膜之融合)。細胞外囊泡可自活或死的有機體、外植之組織或器官及/或經培養之細胞衍生。在一些態樣中，EV包含本文所揭示之支架蛋白質。
如本文所使用之術語「胞外體」係指自細胞衍生之小型(介於20至300 nm之間的直徑，更佳為40至200 nm直徑)細胞外囊泡(EV)，其包含圍住內部空間(腔)的膜且其在一些態樣中自細胞(例如生產子細胞)產生，例如藉由直接的漿膜芽殖或藉由晚期胞內體與漿膜之融合。胞外體為細胞外囊泡(EV)的種類。在一些態樣中，胞外體包含脂質或脂肪酸及多肽，且視需要地包含酬載(例如生物活性分子，諸如治療劑)、接受體(例如靶定部分)、多核苷酸(例如核酸、RNA或DNA)、糖(例如單糖、多糖或聚糖)或其他分子。胞外體可自生產子細胞衍生且基於其大小、密度、生物化學參數或其組合而自生產子細胞單離。在一些態樣中，胞外體包含本發明的支架蛋白質。在一些態樣中，本發明的胞外體係藉由表現一或多種轉基因產物之細胞來生產。
如本文所使用之術語「胞外體腔蛋白質」係指支架蛋白質，亦即附著或締合至EV (例如胞外體)之腔表面的蛋白質，諸如MARCKS、MARKSL1、BASP1或其任何功能性片段、其任何變異體、其任何衍生物或其任何組合，且其適合用作為靶定酬載，例如生物活性分子(例如治療性蛋白質)至EV (例如胞外體)之腔表面的支架。
如本文所使用之術語「奈米囊泡」係指自細胞衍生之小型(介於20至250 nm之間的直徑，例如30至150 nm直徑)囊泡，其包含圍住內部空間的膜且其係藉由直接或間接操控而自細胞(例如生產子細胞)產生，以至於不以此等操控不可能以生產子細胞生產奈米囊泡。以生產子細胞生產奈米囊泡之適當的操控包括但不限於連續擠出、以鹼性溶液處理、超聲波處理或其組合。生產奈米囊泡在一些情況中可導致生產子細胞的破壞。在一些態樣中，本文所述之奈米囊泡族群實質上沒有以直接自漿膜芽殖或以晚期胞內體與質膜之融合的方式而自生產子細胞衍生之囊泡。在一些態樣中，奈米囊泡包含脂質或脂肪酸及多肽，且視需要地包含酬載(例如治療劑)、接受體(例如靶定部分)、多核苷酸(例如核酸、RNA或DNA)、糖(例如單糖、多糖或聚糖)或其他分子。一經根據操控而自生產子細胞衍生出奈米囊泡時，則可基於其大小、密度、生物化學參數或其組合而自生產子細胞單離。在一些態樣中，奈米囊泡可包含本文所揭示之支架蛋白質。
如本文所使用之術語「經腔工程化之EV」係指具有EV (例如胞外體)的膜之腔表面或腔的其組成經修飾之EV (例如胞外體)，使得工程化EV (例如胞外體)之腔表面或腔不同於修飾前之EV (例如胞外體)或天然生成之EV (例如胞外體)。
工程化可直接於EV (例如胞外體)之腔中(亦即在EV內的空穴)或膜中，特別在EV之腔表面中，使得EV (例如胞外體)之腔及/或腔表面改變。例如，膜的蛋白質、脂質、小分子、碳水化合物等的其組成經修飾，使得EV (例如胞外體)之腔表面經修飾。同樣地可修飾腔之內容物。組成可藉由化學、物理或生物方法或藉由自先前經化學、物理或生物方法修飾之細胞生產而改變。特定言之，組成可藉由基因工程或藉由自先前經基因工程修飾之細胞生產而改變。在一些態樣中，經腔工程化之EV (例如經腔工程化之胞外體)包含外源蛋白質(亦即EV (例如胞外體)不天然表現之蛋白質)或其片段或變異體，其可暴露於EV (例如胞外體)之腔表面或腔或可為暴露於EV (例如胞外體)之內層上的部分之錨定點(附著)。在其他態樣中，經腔工程化之EV (例如經腔工程化之胞外體)包含表現更高的天然EV (例如胞外體)、蛋白質(例如支架蛋白質)或其片段或變異體，其可暴露於EV (例如胞外體)之腔或可為暴露於EV (例如胞外體)之腔表面上的部分之錨定點(附著)。
如本文所使用之術語「經表面工程化之EV」係指具有EV之外部表面的其組成經修飾之EV，使得工程化EV之外部表面不同於修飾前之EV或天然生成之EV。
如本文所使用之術語「經表面工程化之胞外體」係指具有胞外體之外部表面的其組成物經修飾之胞外體，使得工程化胞外體之外部表面不同於修飾前之胞外體或天然生成之胞外體。
當本文所述之EV (例如胞外體)的上下文中使用術語「經修飾」時，其係指EV (例如胞外體)及/或其生產子細胞的改變或工程化，使得經修飾之EV (例如胞外體)不同於天然生成之EV (例如胞外體)。在一些態樣中，與天然生成之EV (例如胞外體)的膜相比，本文所述之經修飾之EV (例如胞外體)包含不同的蛋白質、脂質、小分子、碳水化合物等之組成的膜。例如，膜包含更高密度或數量的天然EV (例如胞外體)蛋白質及/或膜包含不天然存在於EV (例如胞外體)中的蛋白質。在特定的態樣中，對膜的此等修飾改變EV (例如胞外體)之外部表面(例如本文所述的經表面工程化之EV及胞外體)。在特定的態樣中，對膜的此等修飾改變EV (例如胞外體)之腔表面(例如本文所述的經腔工程化之EV及胞外體)。
例如，腔係以蛋白質、脂質、小分子、碳水化合物等的其組成經修飾。組成可藉由化學、物理或生物方法或藉由自先前經化學、物理或生物方法修飾之細胞生產而改變。特定言之，組成可藉由基因工程或藉由自先前經基因工程修飾之細胞生產而改變。
如本文所使用之術語蛋白質之「修飾」，例如「經修飾之蛋白質」或「蛋白質修飾」或其語法變型係指與蛋白質之未突變的胺基酸序列具有至少15%之一致性的蛋白質。蛋白質之修飾包括蛋白質之片段或變異體。蛋白質之修飾可進一步包括對蛋白質之片段或變異體的化學或物理修飾。在一些態樣中，經修飾之蛋白質保留未經修飾之蛋白質的至少一種生理功能。
如本文所使用之術語蛋白質(例如生物活性分子，諸如治療性蛋白質，或本文所揭示之支架蛋白質)之「片段」係指比天然生成之序列更短的蛋白質，例如與天然生成之蛋白質相比而缺失之N端及/或C端。
如本文所使用之術語「功能性片段」係指保留蛋白質功能之蛋白質片段。因此，在一些態樣中，本文所揭示之支架蛋白質(諸如MARCKS、MARCKSL1或BASP1)的功能性片段保留錨定生物活性分子至EV (例如胞外體)之腔表面上的功能。
片段是否為此種意義上的功能片段可以任何本技術已知的方法來評定，以測定EV (例如胞外體)的蛋白質含量，該方法包括西方墨點轉漬法、FACS分析及片段與自體螢光蛋白質(例如GFP)之融合。在特別的態樣中，MARCKS、MARCKSL1或BASP1之片段保留例如天然生成之MARCKS、MARCKSL1或BASP1錨定酬載(例如生物活性分子)至EV (例如胞外體)之腔上或外部表面上的能力之至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約99%或至少約100%。在特別的態樣中，MARCKS、MARCKSL1、BASP1之變異體或MARCKS、MARCKSL1或BASP1之片段的變異體的能力為MARCKS、MARCKSL1和BASP1分別錨定酬載(例如生物活性分子)至 EV (例如胞外體)之腔上或外部表面上的能力之至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約99%或至少約100%。此能力可例如藉由實驗章節中所述之檢定法經螢光標記之變異體評定。
如本文所使用之術語「衍生物」係指已經化學或酵素催化修飾之本發明的EV (例如胞外體)、組分(例如蛋白質或脂質)、支架蛋白質，或酬載，例如生物活性分子(例如多肽、多核苷酸、脂質、碳水化合物、抗體或其片段)。
如本文所使用之術語蛋白質之「變異體」係指以本技術中已知的方法相比時(例如藉由序列比對)而與另一蛋白質共享特定的結構(例如胺基酸序列一致性)及功能一致性之蛋白質。例如，蛋白質之變異體可包括在另一蛋白質中的取代、插入、缺失、移碼或重排。在一些態樣中，蛋白質之變異體保留非變異性蛋白質的至少一種生理功能。
在特別的態樣中，變異體可為與全長、成熟MARCKS、MARCKSL1、BASP1，或MARCKS、MARCKSL1或BASP1之片段具有至少70%之一致性的變異性蛋白質。
在一些態樣中，MARCKS之變異體或MARCKS之片段的變異體與根據SEQ ID NO：1之MARCKS或其功能性片段共享至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%或至少約99%之序列一致性，如例如使用尼德曼-溫思科(Needleman-Wunsch)演算法之雙序列比對所測定。
在一些態樣中，MARCKSL1的變異體或MARCKSL1之片段的變異體與根據SEQ ID NO：2之MARCKSL1或其功能性片段共享至少70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%或至少約99%之序列一致性，如例如使用尼德曼-溫思科演算法之雙序列比對所測定。
在一些態樣中，BASP1的變異體或BASP1之片段的變異體與根據SEQ ID NO：3之BASP1或其功能性片段共享至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%或至少約99%之序列一致性，如例如使用尼德曼-溫思科演算法之雙序列比對所測定。
在一些態樣中，支架蛋白質(例如MARCKS、MARCKSL1或BASP1)之變異體、支架蛋白質之功能性片段或支架蛋白質之功能性片段的變異體為衍生物。
在每一上述例子中，支架蛋白質之變異體或支架蛋白質之片段的變異體(例如MARCKS、MARCKSL1、BASP1之變異體或MARCKS、MARCKSL1或BASP1之片段的變異體)保留錨定酬載(例如生物活性分子)至EV (例如胞外體)之腔上或外部表面上的能力。
本文所提供列舉之任何蛋白質包含蛋白質之功能性變異體。術語蛋白質之「功能性變異體」係指保留錨定生物活性分子至EV (例如胞外體)之腔上或外部表面上的能力之蛋白質之變異體。在特別的態樣中，MARCKS、MARCKSL1、BASP1之功能性變異體或MARCKS、MARCKSL1或BASP1之片段的功能性變異體的能力分別為MARCKS、MARCKSL1和BASP1分別錨定酬載(例如生物活性分子)至EV (例如胞外體)之腔上或外部表面上的能力之至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%或至少約99%。
天然生成之變異體被稱為「對偶基因變異體」，且係指佔據有機體的染色體上給定之基因座的基因之數種替代形式中之一者(Genes II、Lewin、B.編輯，John Wiley & Sons、New York (1985))。該等對偶基因變異體可在多核苷酸及/或多肽水平上不同且被納入本發明中。另一選擇地，非天然生成之變異體可藉由突變誘導技術或直接合成來生產。
變異體可使用已知的蛋白質工程化及重組DNA技術方法產生，以改進或改變多肽的特徵。例如，經分泌之蛋白質的N端或C端可缺失一或多個胺基酸而沒有實質的生物功能損失。以全文併入本文以供參考的Ron等人之J. Biol. Chem. 268: 2984-2988 (1993)報導即使在缺失3、8或27個胺基端胺基酸殘基後仍具有肝素結合活性之變異性KGF蛋白質。同樣地，干擾素γ在此蛋白質之羧基端缺失8至10個胺基酸殘基後仍展現最多高10倍的活性。(Dobeli等人之J. Biotechnology 7 :199-216 (1988)，以其全文併入本文以供參考)。
而且，充足的證據證明變異體時常保留類似於天然生成之蛋白質的生物活性。例如，Gayle及同事(J. Biol. Chem 268 :22105-22111 (1993)，以其全文併入本文以供參考)進行廣泛的人類細胞激素IL-1a突變分析。彼等使用隨機突變誘導以產生超過3,500種個別的IL-1a突變體，每一變異體在分子總長度上具有平均2.5個胺基酸變化。檢查在每個可能的胺基酸位置上的多種突變。研究者發現「[大多數]分子可能改變，對[結合或生物活性]的影響很少」。(參見摘要。)實際上，在所檢查之3,500個以上的核苷酸序列中，僅23個獨特的胺基酸序列生產與野生型顯著不同的活性之蛋白質。
如上文所述，變異體或衍生物包括例如經修飾之多肽。在一些態樣中，例如多肽、多核苷酸、脂質、糖蛋白質之變異體或衍生物為化學修飾及/或內源修飾的結果。在一些態樣中，變異體或衍生物為活體內修飾的結果。在一些態樣中，變異體或衍生物為試管內修飾的結果。在又其他的態樣中，變異體或衍生物為生產子細胞中之細胞內修飾的結果。
出現在變異體及衍生物中的修飾包括例如乙醯化、醯化、ADP-核糖基化、醯胺化、黃素之共價附著、原血紅素部分之共價附著、核苷酸或核苷酸衍生物之共價附著、脂質或脂質衍生物之共價附著、磷脂醯肌醇之共價附著、交聯、環化、形成二硫鍵、去甲基化、形成共價交聯、形成半胱胺酸、形成焦麩胺酸、甲醯化、γ-羧基化、糖基化、形成GPI錨定物、羥基化、碘化、甲基化、肉豆蔻醯基化、氧化、聚乙二醇化(Mei等人之Blood 116: 270-79 (2010)，以其全文併入本文以供參考)、蛋白水解加工、磷酸化、異戊二烯化、消旋化、硒碸化(selenoylation)、硫酸化、胺基酸至蛋白質之轉移-RNA媒介加成(諸如精胺醯基化)及泛素化。
術語「胺基酸取代」係指以另一胺基酸殘基置換存在於親體或參考序列(例如野生型序列)中的胺基酸殘基。在親體或參考序列(例如野生型多肽序列)中的胺基酸可例如經由化學肽合成或通過本技術中已知的重組方法取代。因此，述及之「在位置X上取代」係指存在於位置X上的胺基酸經替代的胺基酸殘基取代。在一些態樣中，取代樣式可根據模式AnY說明，其中A為相應於天然或原來存在於位置n上的胺基酸之單字母代碼，且Y為取代胺基酸殘基。在其他的態樣中，取代樣式可根據模式An(YZ)，其中A為相應於取代天然或原來存在於位置n上的胺基酸之胺基酸殘基的單字母代碼，且Y及Z為可置換A之替代的取代胺基酸殘基。 [2] 如本文所使用之術語「抗體」包含不論是否為天然或部分或完全合成生產之免疫球蛋白及其片段。該術語亦涵蓋具有與免疫球蛋白結合結構域同源的結合結構域之任何蛋白質。「抗體」進一步包括多肽，其包含來自特異性結合及識別抗原之免疫球蛋白基因或其片段的框架區。術語抗體之使用意謂著包括全抗體、多株、單株和重組抗體、其片段，且進一步包括單鏈抗體、人源化抗體、鼠類抗體、嵌合抗體、小鼠-人類抗體、小鼠-靈長類動物抗體、靈長類動物-人類單株抗體、抗個體基因型(idiotype)抗體、抗體片段(諸如scFv、(scFv)2 、Fab、Fab'和F(ab')2 、F(ab1)2 、Fv、dAb和Fd片段)、雙功能抗體及抗體相關多肽。抗體包括雙特異性抗體及多特異性抗體，只要彼等展現所欲生物活性或功能。在本發明的一些態樣中，酬載為包含抗體或其抗原結合片段之生物活性分子。在一些態樣中，抗體(例如本發明的生物活性分子)為奈米抗體。 [3] 術語「抗體-藥物共軛物」及「ADC」可交換使用，且係指經例如共價連結至治療劑(在本文有時被稱為藥劑、藥物或活性醫藥成分)或治療劑類之抗體。在本發明的一些態樣中，酬載為包含抗體-藥物共軛物之生物活性分子。 [4] 「保守性胺基酸取代」為其中胺基酸殘基經具有類似的側鏈之胺基酸殘基置換之取代。具有類似的側鏈之胺基酸殘基家族已於本技術中定義，包括鹼性側鏈(例如離胺酸、精胺酸、組胺酸)、酸性側鏈(例如天冬胺酸、麩胺酸)、不帶電極性側鏈(例如甘胺酸、天冬醯胺、麩醯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸)、非極性側鏈(例如丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸、色胺酸)、β分支側鏈(例如蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸)及芳族側鏈(例如酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸)。因此，若多肽中的胺基酸係經來自相同的側鏈家族之另一胺基酸置換，則取代被認為是保守性。在另一態樣中，一串胺基酸可經與側鏈家族成員在順序及/或組成上不同的結構上類似的一串胺基酸保守性置換。 [5] 如本文所使用之術語「保守」係指那些分別在相比的二或更多個序列之相同位置上未發生改變的多核苷酸序列或多肽序列之核苷酸或胺基酸殘基。相對保守之核苷酸或胺基酸為那些比序列中別處出現之核苷酸或胺基酸更相關的序列中保守之核苷酸或胺基酸。 [6] 在一些態樣中，若二或更多個序列彼此為100%一致，則該等序列據稱為「完全保守」或「一致」。在一些態樣中，若二或更多個序列彼此為至少70%一致、至少80%一致、至少90%一致或至少95%一致，則該等序列據稱為「高度保守」。 [7] 在一些態樣中，若二或更多個序列彼此為約70%一致、約80%一致、約90%一致、約95%一致、約98%一致或約99%一致，則該等序列據稱為「高度保守」。在一些態樣中，若二或更多個序列彼此為至少30%一致、至少40%一致、至少50%一致、至少60%一致、至少70%一致、至少80%一致、至少90%一致或至少95%一致，則該等序列據稱為「保守」。在一些態樣中，若二或更多個序列彼此為約30%一致、約40%一致、約50%一致、約60%一致、約70%一致、約80%一致、約90%一致、約95%一致、約98%一致或約99%一致，則該等序列據稱為「保守」。序列之保守性可應用於全長多核苷酸或多肽或可應用於其一部分、區域或特徵。 [8] 如本文所使用之術語「同源性」係指聚合性分子之間，例如核酸分子(例如DNA分子及/或RNA分子)之間及/或多肽分子之間的整體相關性。術語「同源性」通常意味著兩個分子之間的進化關係。因此，兩個同源分子具有共同的進化祖先。在本發明的上下文中，術語同源性包含一致性及相似性二者。 [9] 在一些態樣中，若分子中的單體之至少25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%為一致的(完全相同的單體)或相似的(保守性取代)，則聚合性分子彼此被認為是「同源的」。術語「同源的」必然是指至少兩個序列(多核苷酸或多肽序列)之間的比較。 [10] 在本發明的上下文中，取代(甚至當其被稱為胺基酸取代時)係在核酸水平下進行，亦即以替代的胺基酸殘基取代胺基酸殘基係藉由以編碼第二胺基酸之密碼子取代編碼第一胺基酸之密碼子來進行。 [11] 如本文所使用之術語「一致性」係指在聚合性分子之間，例如在多肽分子或多核苷酸分子(例如DNA分子及/或RNA分子)之間的整體單體保守性。沒有任何額外修飾語的術語「一致」(例如蛋白質A與蛋白質B一致)意味著序列為100%一致(100%之序列一致性)。以例如「70%一致」說明兩個序列相當於說明彼等具有例如「70%之序列一致性」。 [12] 兩個多肽序列之一致性百分比的計算例如可藉由出於最優化比較的目的比對兩個序列來執行(例如可在用於最優化比較的第一及第二多肽序列中之一或二者中引入空穴，且可出於比較的目的忽略不一致的序列)。在特定的態樣中，出於比較的目的比對之序列的長度為參考序列的長度之至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或100%。接著比較在相應的胺基酸位置上的胺基酸。 [13] 當第一序列中的位置經與第二序列中的相應位置相同的胺基酸佔據時，則分子在該位置上為一致的。在考慮到必須引入用於兩個序列的最優化比對之空穴數量及各空穴長度的情況下，在兩個序列之間的一致性百分比為以序列共享之一致位置的數量之函數。在兩個序列之間的序列比較及一致性百分比的測定可使用數學演算法確定。
用於比較的序列比對方法為本技術中所熟知。各種程式及比對算則說明於下列中：Smith和Waterman之Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981)；Needleman和Wunsch之J. Mol. Bio. 48: 443 (1970)；Pearson和Lipman之Methods in Mol. Biol. 24: 307-31 (1988)；Higgins和Sharp之Gene 73: 15 237-44 (1988)；Higgins和Sharp之CABIOS 5: 151-3 (1989)；Corpet等人之Nuc. Acids Res. 16: 10881-90 (1988)；Huang等人之Comp. Appl. BioSci. 8: 155-65 (1992)；及Pearson等人之Meth. Mol. Biol. 24: 307-31 (1994)。NCBI基礎局部比對搜尋工具(Basic Local Alignment Search Tool)(BLAST) [Altschul 20等人之J. Mol. Biol. 215: 403-10 (1990) J可取自許多來源，包括National Center for Biological Information (NBCl, Bethesda, Md.)及用於連接序列分析程式blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx的網際網路。BLAST及如何使用程序測定序列一致性的說明可在NIH (國家衛生研究院)的NCBI (國家生物技術資訊中心)之官方網站上獲得。 [14] 其他適合的程式為例如Needle、Stretcher、Water或Matcher，生物資訊程式的EMBOSS套件之一部分，且亦可自www.ebi.ac.uk/Tools/psa的歐洲生物資訊中心(EBI)取得。序列比對可使用本技術中已知的方法進行，諸如MAFFT、Clustal (ClustalW、Clustal X或Clustal Omega)、MUSCLE等。 [15] 與多核苷酸或多肽參考序列比對的單一多核苷酸或多肽靶序列內的不同區域可各自具有其自身的序列一致性百分比。應注意序列一致性百分比值係經四捨五入至最接近的十分之一。例如，80.11、80.12、80.13及80.14四捨五入至80.1，而80.15、80.16、80.17、80.18及80.19四捨五入至80.2。亦應注意長度值永遠為整數。 [16] 在特定的態樣中，第一胺基酸序列(或核酸序列)對第二胺基酸序列(或核酸序列)之一致性百分比(%ID)係以%ID=100 x (Y/Z)計算，其中Y為第一及第二序列的比對中成為一致匹配而計分之胺基酸殘基(或核鹼基)數量(如藉由視覺檢查或特定的序列比對程序來比對)，且Z為第二序列中的殘基總數量。若第一序列的長度大於第二序列，則第一序列對第二序列之一致性百分比大於第二序列對第一序列之一致性百分比。 [17] 熟習本技術領域者應意識到用於計算序列一致性百分比之序列比對的產生不受限於僅由一級序列數據驅動之二元序列-序列比較。亦應意識到序列比對可藉由整合序列數據與來自異質來源的數據而產生，諸如結構數據(例如結晶蛋白質結構)、功能數據(例如突變位置)或系統發育數據。整合異質數據以產生多序列比對之適合的程式為T-Coffee，可在www.tcoffee.org取得，且另一選擇地例如自EBI取得。亦應意識到用於計算序列一致性百分比之最終比對可以自動或手動策劃。 [18] 如本文所使用之術語「相似性」係指聚合性分子之間，例如多核苷酸分子(例如DNA分子及/或RNA分子)之間及/或多肽分子之間的整體相關性。聚合性分子彼此的相似性百分比之計算可以與一致性百分比之計算相同的方式執行，除了相似性百分比之計算考慮到如本技術中所理解的保守性取代。應理解相似性百分比係取決於所使用的比較量表而定，亦即是否比較胺基酸，例如根據其進化近似度、電荷、體積、可撓性、極性、疏水性、芳香性、等電點、抗原性或其組合。
如本文所使用之術語「生產子細胞」係指用於產生EV (例如胞外體)之細胞。生產子細胞可為試管內培養之細胞或活體內細胞。生產子細胞包括但不限於已知為有效產生EV (例如胞外體)之細胞，例如HEK293細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞和間質幹細胞(MSC)、BJ人類包皮纖維母細胞、fHDF纖維母細胞、AGE.HN® 神經元前驅細胞、CAP® 羊水細胞、脂肪間質幹細胞、RPTEC/TERT1細胞。在特定的態樣中，生產子細胞不為抗原呈現細胞。在一些態樣中，生產子細胞不為樹狀細胞、B細胞、肥胖細胞、巨噬細胞、嗜中性球、庫弗-伯威茲(Kupffer-Browicz)細胞、自該等細胞中任一者衍生之細胞或其任何組合。
如本文所使用之術語「單離(isolated)、(isolated)和(isolating)」或「純化(purify)、(purified)和(purifying)」，以及「提取(extracted)和(extracting)」及其語法變型可交換使用，且係指已經歷一或多個純化過程的所欲EV (例如胞外體)之製劑狀態(例如複數個已知或未知的量及/或濃度)，例如所欲EV (例如胞外體)製劑之選擇或富集。在一些實施態樣中，如本文所使用之單離或純化為自含有生產子細胞之樣本移除、部分移除(例如一部分) EV (例如胞外體)之過程。在一些實施態樣中，經單離之EV (例如胞外體)組成物不具有可檢測的非所欲活性，或另一選擇地，非所欲活性的水平或量係等於或低於可接受的水平或量。
在其他的實施態樣中，經單離之EV (例如胞外體)組成物具有等於或高於可接受的量及/或濃度之所欲EV (例如胞外體)的量及/或濃度。在其他的態樣中，與獲得組成物之起始材料(例如生產子細胞製劑)相比，富集經單離之EV (例如胞外體)組成物。與起始材料相比，此富集可為至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、至少約99.9%、至少約99.99%、至少約99.999%、至少約99.9999%或大於約99.9999%。
在一些態樣中，經單離之EV (例如胞外體)製劑實質上沒有殘餘的生物產物(例如污染物)。在一些態樣中，經單離之EV (例如胞外體)製劑為約100%沒有、至少約99%沒有、至少約98%沒有、至少約97%沒有、至少約96%沒有、至少約95%沒有、至少約94%沒有、至少約93%沒有、至少約92%沒有、至少約91%沒有或至少約90%沒有任何污染生物物質。殘餘的生物產物可包括非生物性材料(包括化學品)或不想要的核酸、蛋白質、脂質或代謝物。在特定的態樣中，經單離之EV (例如胞外體)製劑為約100%沒有、至少約99%沒有、至少約98%沒有、至少約97%沒有、至少約96%沒有、至少約95%沒有、至少約94%沒有、至少約93%沒有、至少約92%沒有、至少約91%沒有或至少約90%沒有任何巨分子，例如任何核酸、蛋白質、脂質及/或碳水化合物。實質上沒有殘餘的生物產物亦可意指EV (例如胞外體)組成物不含有可檢測的生產子細胞，且僅可檢測出EV (例如胞外體)。
術語「賦形劑」或「載劑」係指添加至醫藥組成物中而進一步促成化合物投予之惰性物質。術語「醫藥上可接受之載劑」、「醫藥上可接受之賦形劑」及其語法變型包含經美國聯邦政府管理局批准或在美國藥典中列出之用於動物(包括人類)的劑中任一者，以及不對個體造成顯著的刺激且不消除所投予之化合物的生物活性及特性的任何載劑或稀釋劑。包括有用於製備醫藥組成物且通常為安全、無毒及期望的賦形劑及載劑。 [19] 如本文所使用之術語「酬載」係指可附著至本發明的支架且隨後錨定至本發明的EV (例如胞外體)之膜的任何分子。在一些實施態樣中，酬載係附著至EV (例如胞外體)膜之腔表面。術語酬載包含生物活性分子(例如可具有治療及/或預防效應之分子)，以及診斷分子。因此，術語酬載亦包含可檢測的部分，諸如放射性核種、螢光分子、對比劑、標籤或可以可檢測的部分識別之分子實體(例如配體或標籤)。 [20] 如本文所使用之術語酬載相當於術語「貨物(cargo)」且可交換使用。因此，「貨物蛋白質」或「貨物肽」係指附著至本發明的支架之特定類型的酬載分子(分別為蛋白質及肽)。 [21] 如本文所使用之術語「生物活性分子」係指可經由本發明的支架附著至EV (例如胞外體)的任何分子，其中分子在有其需要之個體中可具有治療或預防效應或影響個體的細胞或組織之體內恆定。可引入EV (例如胞外體)及/或生產子細胞中之生物活性分子的非限制性實例包括例如治療劑，諸如核苷酸(例如包含可檢測的部分或毒素或破壞轉錄之核苷酸)、核酸(例如編碼多肽之DNA或mRNA分子，諸如酵素，或具有調節功能之RNA分子，諸如miRNA、dsDNA、lncRNA和siRNA)、胺基酸(例如包含可檢測的部分或毒素或破壞轉譯之胺基酸)、多肽(例如酵素或抗體)、脂質、碳水化合物、病毒和病毒粒子(例如腺相關病毒和病毒粒子、反轉錄病毒、腺病毒等)及小分子(例如小分子藥物和毒素)，包括小分子STING促效劑(包括環狀二核苷酸，諸如ML-RR S2和3’-3’cAIMPdFSH)。在特定的態樣中，酬載包含抗原。在特定的態樣中，生物活性分子，例如治療劑，例如對人類之治療劑在融合至本文所揭示之支架蛋白質時保留生物功能，例如治療功能。在一些態樣中，生物活性分子可具有至少5個胺基酸、至少6個胺基酸、至少7個胺基酸、至少8個胺基酸、至少9個胺基酸、至少10個胺基酸、至少15個胺基酸、至少20個胺基酸、至少25個胺基酸、至少30個胺基酸、至少35個胺基酸、至少40個胺基酸、至少45個胺基酸、至少50個胺基酸、至少55個胺基酸、至少60個胺基酸、至少65個胺基酸、至少70個胺基酸、至少75個胺基酸、至少100個胺基酸、至少150個胺基酸、至少200個胺基酸、至少250個胺基酸、至少300個胺基酸、至少350個胺基酸、至少400個胺基酸或至少500個胺基酸。在一些態樣中，生物活性分子可具有至少5個胺基酸。在一些態樣中，生物活性分子可具有至少10個胺基酸。在一些態樣中，生物活性分子可具有至少50個胺基酸。在一些態樣中，生物活性分子可具有至少100個胺基酸。在一些態樣中，生物活性分子可具有至少5個胺基酸，例如5至500、5至450、5至400、5至350、5至300、5至250、5至200、5至150、5至100、5至90、5至80、5至70、5至60、5至50、5至40、5至30、5至20、5至15或5至10個胺基酸。在一些態樣中，生物活性分子可具有至少10個胺基酸，例如10至500、10至450、10至400、10至350、10至300、10至250、10至200、10至150、10至100、10至90、10至80、10至70、10至60、10至50、10至40、10至30、10至20或10至15個胺基酸。在一些態樣中，生物活性分子可具有至少50個胺基酸，例如50至500、50至450、50至400、50至350、50至300、50至250、50至200、50至150、50至100、50至90、50至80、50至50或50至60個胺基酸。在一些態樣中，生物活性分子可具有至少100個胺基酸，例如100至500、100至450、100至400、100至350、100至300、100至250、100至200或100至150個胺基酸。在其他的態樣中，生物活性分子具有至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個、至少六個、至少七個、至少八個、至少九個、至少十個、至少11個、至少12個、至少15個、至少20個、至少25個、至少30個、至少35個、至少40個、至少45個、至少50個、至少60個、至少70個、至少80個、至少90個、至少100個、至少110個、至少120個、至少130個、至少140個、至少150個、至少160個、至少170個、至少180個、至少190個、至少200個、至少300個、至少400個或至少500個核苷酸。在其他的態樣中，生物活性分子具有至少兩個核苷酸，例如2至1000、2至900、2至500、2至300或2至50個。在其他的態樣中，生物活性分子具有至少10個核苷酸，例如10至1000、10至900、10至500、10至300或10至50個。在其他的態樣中，生物活性分子具有至少15個核苷酸，例如15至1000、15至900、15至500、15至300或15至50個。在其他的態樣中，生物活性分子具有至少20個核苷酸，例如20至1000、20至900、20至500、20至300或20至50個。在其他的態樣中，生物活性分子具有至少50個核苷酸，例如50至1000、50至900、50至500、50至300或50至100個。在其他的態樣中，生物活性分子具有至少100個核苷酸，例如100至10000、100至9000、100至5005、100至3000或100至500個。在其他的態樣中，生物活性分子具有至少200個核苷酸，例如200至10000、200至9000、200至5000、200至3000或200至500個。在其他的態樣中，生物活性分子具有至少500個核苷酸，例如500至10000、500至9000、500至5000或500至3000個。如本文所使用之術語「抗原」係指當引入個體中時誘出對其本身之免疫反應(細胞或體液)的任何劑。在一些態樣中，酬載分子係經共價連結至EV (例如胞外體)。在其他的態樣中，酬載包含佐劑。 [22] 「重組」多肽或蛋白質係指經由重組DNA技術生產之多肽或蛋白質。表現在工程化宿主細胞中的經重組生產之多肽及蛋白質係出於本發明的目的而被視為經單離的，如同已藉由任何適合的技術單離、分級分離或部分或實質上純化之原始或重組多肽。本文所揭示之多肽可使用本技術中已知的方法重組生產。另一選擇地，本文所揭示之蛋白質及肽可經化學合成。在本發明的一些態樣中，在EV (例如胞外體)中存在的支架蛋白質係藉由過度表現生產子細胞中的支架蛋白質而重組生產，使所得EV (例如胞外體)中的支架蛋白質水平相對於未過度表現此等支架蛋白質的生產子細胞之EV (例如胞外體)中存在的支架蛋白質水平而顯著地增加。
如本文所使用之術語經由支架蛋白質「錨定(anchor)或(anchoring)」生物活性分子至本發明的EV (例如胞外體)之腔或外部表面上係指生物活性分子分別經共價附著至位於EV (例如胞外體)之腔或外部表面上的支架分子之一部分。
術語「締合(associated)、(association)」及其語法變型可交換使用，且係指分別經共價或經非共價接合至第二部分(例如第二胺基酸序列或核苷酸序列)的第一部分(例如第一胺基酸序列或核苷酸序列)。第一部分可直接接合至第二部分或與第二部分並置，或另一選擇地中間部分可經共價接合第一部分至第二部分。在一些實施態樣中，術語「締合」包括肉豆蔻醯基化、離子相互作用或其任何組合。
如本文所使用之術語「連結」或「融合」係指藉由肽鍵或一或多個胺基酸的連結子在C端或N端上融合第一部分至第二部分。術語「連結」或「融合」亦包括分別以整個第一部分(或第二部分)插入例如第二部分(或第一部分)中的任何兩個點(例如胺基酸)之間。在一個態樣中，第一部分係藉由肽鍵或連結子連結至第二部分。第一部分可藉由磷酸二酯鍵或連結子連結至第二部分。連結子可為肽或多肽(用於多肽鏈)或核苷酸或核苷酸鏈(用於核苷酸鏈)或任何化學部分(用於多肽或多核苷酸鏈或任何化學分子)。術語「連結」亦可由連字號(-)表示。在一些態樣中，在EV (例如胞外體)上的支架蛋白質可連結或融合至酬載，例如生物活性分子。
如本文所使用之「哺乳動物個體」包括所有的哺乳動物，包括而不限於人類、家畜動物(例如狗、貓及類似者)、農場動物(例如牛、羊、豬、馬及類似者)及實驗室動物(例如猴子、大鼠、小鼠、兔子、天竺鼠及類似者)。
術語「個人」、「個體」、「宿主」和「患者」及其變型在本文可交換使用，且係指需要診斷、治療或治療法的任何哺乳動物個體，特別為人類。本文所述之方法可應於人類治療法及獸醫應用二者。在一些態樣中，個體為哺乳動物，及在其他的態樣中，個體為人體。
如本文所使用之術語「實質上沒有」意指包含EV (例如胞外體)之樣本包含以質量/體積(m/v)百分比濃度計少於10%之巨分子(例如污染物)。一些部分組可含有少於約0.001%、少於約0.01%、少於約0.05%、少於約0.1%、少於約0.2%、少於約0.3%、少於約0.4%、少於約0.5%、少於約0.6%、少於約0.7%、少於約0.8%、少於約0.9%、少於約1%、少於約2%、少於約3%、少於約4%、少於約5%、少於約6%、少於約7%、少於約8%、少於約9%或少於約10% (m/v)之巨分子。
如本文所使用之術語「巨分子」意指核酸、外源蛋白質、脂質、碳水化合物、代謝物(例如聚合性代謝物)或其組合。
如本文所使用之術語「習知的EV蛋白質」意指先前已知富集於EV中的蛋白質。
如本文所使用之術語「習知的EV (例如胞外體)蛋白質」意指先前已知富集於胞外體中的蛋白質，其包括但不限於CD9、CD63、CD81、PDGFR、GPI錨蛋白質、乳凝集素LAMP2及LAMP2B、其片段或結合至其之肽。為了避免疑惑，PTGFRN、BSG、IGSF2、IGSF3、IGSF8、ITGB1、ITGA4、SLC3A2、ATP轉運子或其片段或變異體不為習知的EV (例如胞外體)蛋白質。
如本文所使用之術語「醫藥組成物」係指與一或多種其他的化學組分(諸如醫藥上可接受之載劑及賦形劑)混合或攙和或懸浮於其中之本文所述的化合物中之一或多者，諸如本發明的EV (諸如胞外體)。醫藥組成物的一個目的為促成EV (例如胞外體)之製劑投予個體。
如本文所使用之術語「多核苷酸」係指任何長度的核苷酸之聚合體，包括核糖核苷酸、去氧核糖核苷酸、其類似物或其混合物。此術語係指分子的初級結構。因此，術語包括三股、雙股和單股去氧核糖核酸(「DNA」)，以及三股、雙股和單股核糖核酸(「RNA」)。其亦包括多核苷酸的經修飾(例如藉由烷基化及/或封端)及未經修飾形式。更特別地，術語「多核苷酸」包括多去氧核糖核苷酸(含有2-去氧-D-核糖)、多核糖核苷酸(含有D-核糖)(包括無論是否經剪接或未經剪接之tRNA、rRNA、hRNA、siRNA和mRNA)、任何其他類型的多核苷酸，其為嘌呤或嘧啶鹼之N-或C-糖苷、及含有非核苷酸(normucleotidic)主鏈之其他聚合體(例如聚醯胺(例如肽核酸「PNA」)和聚嗎啉聚合體)、及其他的合成序列特異性核酸聚合體，其先決條件為聚合體含有容許鹼基配對及鹼基堆疊之核鹼基於構型中，諸如在DNA及RNA中所見。在特別的態樣中，多核苷酸包含mRNA。在其他的態樣中，mRNA為合成mRNA。在一些態樣中，合成mRNA包含至少一種非天然核鹼基。在一些態樣中，特定類別的所有核鹼基皆經非天然核鹼基置換(例如在本文所揭示之多核苷酸中的所有尿苷皆可經非天然核鹼基置換，例如5-甲氧基尿苷)。在本發明的一些態樣中，生物活性分子為多核苷酸。
術語「多肽」、「肽」及「蛋白質」在本文可交換使用，其係指任何長度的胺基酸之聚合體。聚合體可包含經修飾之胺基酸。術語亦包含經天然或經干預修飾之胺基酸聚合體，例如形成二硫鍵、糖化、脂化、乙醯化、磷酸化或任何其他操控或修飾，諸如與標記組分共軛。在此定義內亦包括例如含有胺基酸之一或多種類似物(包括例如非天然胺基酸，諸如高半胱胺酸、鳥胺酸、對乙醯基苯丙胺酸、D-胺基酸和肌酸)，以及本技術中已知的其他修飾物之多肽。在本發明的一些態樣中，附著至EV (例如胞外體)之酬載(例如生物活性分子)為多肽，例如抗體或其衍生物，諸如ADC、PROTAC、毒素、融合蛋白質或酵素。
如本文所使用之術語「多肽」係指任何大小、結構或功能之蛋白質、多肽及肽。多肽包括基因產物、天然生成之多肽、合成多肽、同源物、異種同源物、旁系同源物、片段及前述者之其他等效物、變異體和類似物。多肽可為單一多肽或可為多分子複合體，諸如二聚體、三聚體或四聚體。多肽亦可包含單一鏈或多鏈多肽。最常見的二硫鍵聯可見於多鏈多肽中。術語多肽亦可適用於其中一或多個胺基酸殘基為相應天然生成之胺基酸的人造化學類似物之胺基酸聚合體。在一些態樣中，「肽」可為少於或等於50個胺基酸長度，例如約5、10、15、20、25、30、35、40、45或50個胺基酸長度。在一些態樣中，「肽」可為至少約2至約50、至少約3至約50、至少約4至約50、至少約5至約50、至少約10至約50、至少約15至約50、至少約20至約50、至少約25至約50、至少約30至約50、至少約35至約50、至少約40至約50或至少約45至約50個胺基酸長度。
如本文所使用之術語「本發明的支架蛋白質」或語法變型係指 (i)   位於EV (例如胞外體)之腔表面的蛋白質(經天然表現、經化學或酵素催化合成或經重組生產)，諸如MARCKS、MARKSL1或BASP1； (ii)  (i)之任何功能性片段； (iii) (i)至(ii)之任何功能性變異體； (iv) (i)至(iii)之任何衍生物； (v)  相應於自(i)中的蛋白質衍生之功能域的任何肽或其組合，其可結合至EV (例如胞外體)之腔表面，或包含此等肽之分子； (vi) 自(i)中的蛋白質衍生之模體所衍生的任何肽，其可結合至EV (例如胞外體)之腔表面，或包含此等肽之分子； (vii) 包含至少一種非天然胺基酸的(i)至(vi)之分子； (viii)或其任何組合， 其適合用於作為靶定(附著)酬載(例如生物活性分子(例如治療性蛋白質))至EV (例如胞外體)之腔表面的支架。
如本文所使用之術語「本發明的EV (例如胞外體)」或語法變型係指包含本發明的至少一種支架蛋白質之EV (例如胞外體)。
如本文所使用之術語「本發明的生產子細胞」或語法變型係指可生產本發明的EV (例如胞外體)之細胞。 II. 細胞外囊泡蛋白質，例如胞外體蛋白質
本發明的一些態樣關於高度富集在EV (例如胞外體)腔表面中的EV (例如胞外體)蛋白質(支架蛋白質)之鑑定、用途及修飾。此等EV蛋白質或胞外體蛋白質(支架蛋白質)可藉由以質譜術或本技術中已知的其他方法分析高度純化之EV (例如胞外體)來鑑定。
本發明的支架蛋白質包括富集在EV (例如胞外體)膜上的各種腔蛋白質或膜蛋白質，諸如跨膜蛋白質(亦即通過一或多個跨膜螺旋跨越EV膜之蛋白質)、整合蛋白質和周邊蛋白質(亦即在腔表面上經由靜電相互作用與表面相互作用之蛋白質及/或錨定部分)。特定言之，本發明的支架蛋白質包括但不限於 (1) 肉豆蔻醯基化丙胺酸富集之蛋白激酶C受質(MARCKS)； (2) 肉豆蔻醯基化丙胺酸富集之蛋白激酶C受質樣1 (MARCKSL1)；及 (3) 腦酸可溶性蛋白質1 (BASP1)。
本文鑑定之一或多種EV (例如胞外體)蛋白質(支架蛋白質)可取決於胞外體之生產子細胞、生產條件、純化方法或意欲應用而選擇地使用。
本發明的一些態樣中，可鑑定及使用富集在特定的EV (例如胞外體)之腔中(例如在EV膜之腔表面上)的EV (例如胞外體)蛋白質，其具有特定的大小範圍、靶定部分、電荷密度、酬載等。
在一些態樣中，可同時或接續使用本文所揭示之一種以上的EV (例如胞外體)蛋白質(例如支架蛋白質，諸如MARCKS、MARKSL1、BASP1，其任何功能性片段、變異體或衍生物或其任何組合)以產生及單離本發明的治療性EV (例如胞外體)。 III. 經腔工程化之EV (例如胞外體)
細胞外囊泡(EV)(例如胞外體)通常具有20 nm至1000 nm直徑。小型細胞外囊泡之胞外體通常具有100至200 nm直徑。EV (例如胞外體)係由限制性脂質雙層及多樣設定的蛋白質與核酸所組成(Maas, S.L.N.等人之Trends. Cell Biol. 27(3) :172-188 (2017))。EV (例如胞外體)在個別的細胞類型及組織中展現優先攝取，且其趨性可藉由添加與靶細胞表面上的受體相互作用之蛋白質至其表面來引導(Alvarez-Erviti, L.,等人之Nat. Biotechnol. 29(4) :341-345 (2011))。
與抗體不同，EV (例如胞外體)可容納大量附著至其表面的分子，每一EV (例如胞外體)大約數千至數萬個分子。包含EV (例如胞外體)及酬載(例如生物活性分子)(例如治療性分子)之共軛物或複合體因此相當於遞送高濃度治療性或診斷性化合物至個別的細胞類型之平台，且同時限制整個系統暴露於化合物，其依次降低脫靶毒性。此外，EV (例如胞外體)提供容納多種酬載(例如生物活性分子)於不同的室中之可能性。例如，EV (例如胞外體)可包含例如附著至EV之外部表面的靶定部分(其會引導EV至特定的靶細胞(例如癌細胞)或靶組織(例如肝或腦))、一或多種治療部分(例如藥物)及/或一或多種可檢測的部分(例如比對試劑或放射性核種)。
EV (例如胞外體)亦可包含附著至EV之腔表面的不同酬載，例如治療部分(例如藥物)及/或可檢測的部分(例如比對試劑或放射性核種)。另外，EV (例如胞外體)亦可包含在EV (例如胞外體)之腔中的一或多種酬載，例如生物活性分子(例如治療劑、診斷試劑、佐劑等)。
因此，EV (例如胞外體)提供令具有相同或不同角色的多種酬載(例如生物活性分子)組合在單一遞送媒劑中及在非常高密度下的遞送模式。
本文所述之EV (例如胞外體)為具有直徑介於約20至300 nm之間的細胞外囊泡。在特定的實施態樣中，本發明的EV (例如胞外體)具有介於約20至290 nm、20至280 nm、20至270 nm、20至260 nm、20至250 nm、20至240 nm、20至230 nm、20至220 nm、20至210 nm、20至200 nm、20至190 nm、20至180 nm、20至170 nm、20至160 nm、20至150 nm、20至140 nm、20至130 nm、20至120 nm、20至110 nm、20至100 nm、20至90 nm、20至80 nm、20至70 nm、20至60 nm、20至50 nm、20至40 nm、20至30 nm、30至300 nm、30至290 nm、30至280 nm、30至270 nm、30至260 nm、30至250 nm、30至240 nm、30至230 nm、30至220 nm、30至210 nm、30至200 nm、30至190 nm、30至180 nm、30至170 nm、30至160 nm、30至150 nm、30至140 nm、30至130 nm、30至120 nm、30至110 nm、30至100 nm、30至90 nm、30至80 nm、30至70 nm、30至60 nm、30至50 nm、30至40 nm、40至300 nm、40至290 nm、40至280 nm、40至270 nm、40至260 nm、40至250 nm、40至240 nm、40至230 nm、40至220 nm、40至210 nm、40至200 nm、40至190 nm、40至180 nm、40至170 nm、40至160 nm、40至150 nm、40至140 nm、40至130 nm、40至120 nm、40至110 nm、40至100 nm、40至90 nm、40至80 nm、40至70 nm、40至60 nm、40至50 nm、50至300 nm、50至290 nm、50至280 nm、50至270 nm、50至260 nm、50至250 nm、50至240 nm、50至230 nm、50至220 nm、50至210 nm、50至200 nm、50至190 nm、50至180 nm、50至170 nm、50至160 nm、50至150 nm、50至140 nm、50至130 nm、50至120 nm、50至110 nm、50至100 nm、50至90 nm、50至80 nm、50至70 nm、50至60 nm、60至300 nm、60至290 nm、60至280 nm、60至270 nm、60至260 nm、60至250 nm、60至240 nm、60至230 nm、60至220 nm、60至210 nm、60至200 nm、60至190 nm、60至180 nm、60至170 nm、60至160 nm、60至150 nm、60至140 nm、60至130 nm、60至120 nm、60至110 nm、60至100 nm、60至90 nm、60至80 nm、60至70 nm、70至300 nm、70至290 nm、70至280 nm、70至270 nm、70至260 nm、70至250 nm、70至240 nm、70至230 nm、70至220 nm、70至210 nm、70至200 nm、70至190 nm、70至180 nm、70至170 nm、70至160 nm、70至150 nm、70至140 nm、70至130 nm、70至120 nm、70至110 nm、70至100 nm、70至90 nm、70至80 nm、80至300 nm、80至290 nm、80至280 nm、80至270 nm、80至260 nm、80至250 nm、80至240 nm、80至230 nm、80至220 nm、80至210 nm、80至200 nm、80至190 nm、80至180 nm、80至170 nm、80至160 nm、80至150 nm、80至140 nm、80至130 nm、80至120 nm、80至110 nm、80至100 nm、80至90 nm、90至300 nm、90至290 nm、90至280 nm、90至270 nm、90至260 nm、90至250 nm、90至240 nm、90至230 nm、90至220 nm、90至210 nm、90至200 nm、90至190 nm、90至180 nm、90至170 nm、90至160 nm、90至150 nm、90至140 nm、90至130 nm、90至120 nm、90至110 nm、90至100 nm、100至300 nm、110至290 nm、120至280 nm、130至270 nm、140至260 nm、150至250 nm、160至240 nm、170至230 nm、180至220 nm或190至210 nm之間的直徑。本文所述之EV (例如胞外體)的大小可根據下文所述之方法測量。
在一些態樣中，本發明的EV (例如胞外體)包含雙脂質膜(「EV (例如胞外體)膜」)，其包含內部表面及外部表面。在特定的實施態樣中，內部表面向EV (例如胞外體)之內核(亦即腔)。在特定的態樣中，外部表面可與生產子細胞或靶細胞之胞內體、多囊泡體或膜/細胞質接觸。
在一些態樣中，EV (例如胞外體)膜包含脂質及脂肪酸。在一些態樣中，EV (例如胞外體)膜包含磷脂質、糖脂質、脂肪酸、鞘脂質、磷酸甘油酯、固醇、膽固醇及磷脂醯絲胺酸。
在一些態樣中，EV (例如胞外體)膜包含內小葉及外小葉。內及外小葉之組成物可藉由本技術中已知的跨雙層分布(transbilayer distribution)檢定法測定，參見例如Kuypers等人之Biohim Biophys Acta 1985 819:170。在一些態樣中，外小葉之組成物為介於約70至90%之膽鹼磷脂質、介於約0至15%之酸性磷脂質及介於約5至30%之間的磷脂醯乙醇胺。在一些態樣中，內小葉之組成物為介於15至40%之膽鹼磷脂質、介於約10至50%之酸性磷脂質及介於約30至60%之磷脂醯乙醇胺。
在一個態樣中，本發明關於經腔工程化之EV (例如胞外體)生產及用途。經腔工程化之胞外體具有其組成物經修飾之內部空間(EV之腔表面)，例如關於天然發現之胞外體的組成物之修飾。例如，腔表面之組成物可藉由改變EV (例如胞外體)膜之腔面的組分之蛋白質、脂質或聚糖含量來修飾。在一些態樣中，EV (例如胞外體)之腔表面可包含一或多種對EV (例如胞外體)不為天然的經重組表現之蛋白質，例如本發明的支架蛋白質，例如胞外體腔蛋白質。因此，本發明提供容許錨定酬載(例如生物活性分子)至EV (例如胞外體)之組成物，其包含連結酬載(例如生物活性分子)至本發明的支架蛋白質，例如胞外體腔蛋白質。本發明亦提供錨定酬載(例如生物活性分子)至EV (例如胞外體)之方法，其包含連結生物活性分子至本發明的支架蛋白質，例如胞外體腔蛋白質。
在一些態樣中，本發明的支架蛋白質(例如胞外體腔蛋白質)係經由脂質化附著至EV (例如胞外體)之腔表面。在一些態樣中，本發明的支架蛋白質係經脂肪醯化。在一些態樣中，支架蛋白質係經由肉豆蔻醯基化。
肉豆蔻醯基化為脂質化修飾，其中自肉豆蔻酸衍生之肉豆蔻醯基係藉由醯胺鍵共價附著至N端甘胺酸之α-胺基。肉豆蔻酸為14個碳飽和脂肪酸(14:4)，具有正十四酸之系統名稱。此修飾可經共轉譯或轉譯後加入。在共轉譯加入肉豆蔻醯基期間，N端甘胺酸係在切割新形成之生長多肽中的N端甲硫胺酸殘基後修飾。此發生在約80%之肉豆蔻醯基化蛋白質。轉譯後的肉豆蔻醯基化通常發生在半胱天冬酶(caspase)切割事件後，導致外部甘胺酸殘基的暴露，其接著可用於肉豆蔻酸加入。除了共轉譯或轉譯後的肉豆蔻醯基化(於活體內或試管內進行，例如經酵素催化)以外，本發明的支架蛋白質(例如胞外體腔蛋白質)之肉豆蔻醯基化亦可經由化學合成而發生，例如藉由在化學合成期間附接肉豆蔻酸至支架蛋白質作為合成步驟。
在一些實施態樣中，脂質錨定至生物膜不為棕櫚醯基化(亦即棕櫚酸通常附著至半胱胺酸且較不常附著至絲胺酸或蘇胺酸)。在其他的實施態樣中，脂質錨定至生物膜為異戊二烯化(附著異戊二烯基)或糖基磷脂醯肌醇連結(GPI連結)。經異戊二烯化之蛋白質為在蛋白質之半胱胺酸殘基上具有經共價附著之疏水性異戊二烯聚合體(亦即5個碳的支鏈烴)的蛋白質。經GPI連結之蛋白質係經由到達蛋白質之C端羧基的醯胺鍵聯而附著至GPI複合體分子基團。GPI附著係通過GPI-轉醯胺酶複合體的作用而發生。令磷脂醯肌醇之脂肪酸鏈插入膜中且因此使蛋白質錨定至膜。
在一些實施態樣中，經腔工程化之EV (例如胞外體)係藉由化學及/或物理方法產生，諸如經PEG誘導之融合及/或超聲波融合。
在其他的實施態樣中，經腔工程化之EV (例如胞外體)係藉由基因工程化而產生。自經基因修飾之生產子細胞或經基因修飾之細胞的後裔所生產之胞外體可含有經修飾之腔組成物。在一些實施態樣中，經腔工程化之EV (例如胞外體)具有較高或較低密度的EV (例如胞外體)蛋白質(例如支架蛋白質，例如胞外體腔蛋白質，諸如MARCKS、MARKSL1、BASP1或其組合)，或包括EV (例如胞外體)蛋白質之修飾物或片段(例如其任何功能性片段、變異體或衍生物，或其任何組合)。
例如，經腔工程化之EV (例如胞外體)可自以編碼EV (例如胞外體)蛋白質或EV (例如胞外體)蛋白質之修飾物或片段(例如支架蛋白質，例如胞外體腔蛋白質，諸如MARCKS、MARKSL1、BASP1，其任何功能性片段、變異體或衍生物或其任何組合)之外源序列轉變的細胞生產。自外源序列表現之EV (例如胞外體)(包括蛋白質)可包括經修飾之腔表面蛋白質(支架蛋白質)組成物。
EV蛋白質(例如胞外體蛋白質)之各種修飾物或片段(例如支架蛋白質，例如胞外體腔蛋白質，諸如MARCKS、MARKSL1、BASP1，其任何功能性片段、變異體或衍生物或其任何組合)可用於本發明的實施態樣。例如，可使用經修飾而更有效地靶定至EV (例如胞外體)腔表面之蛋白質。亦可使用經修飾而包含用於特異性及有效靶定至EV (例如胞外體)腔表面所需之最少片段的蛋白質。
在一些態樣中，本發明的支架蛋白質(例如胞外體腔蛋白質)包含MARCKS蛋白質或其片段、變異體或衍生物。MARCKS蛋白質(Uniprot登錄號P29966)亦稱為蛋白質激酶C受質，80 kDa蛋白質，輕鏈。全長人類MARCKS蛋白質為332個胺基酸長度，且包含在胺基酸殘基152至176上的調鈣素結合結構域。在一些實施態樣中，本發明的支架蛋白質包含成熟MARCKS蛋白質(亦即沒有N端甲硫胺酸)。在一些態樣中，本發明的支架蛋白質係衍生自成熟MARCKS蛋白質，亦即其為成熟MARCKS蛋白質之片段、變異體或衍生物，且因此其缺乏存在於不成熟蛋白質中的N端甲硫胺酸。
在一些態樣中，本發明的支架蛋白質(例如胞外體腔蛋白質)包含MARCKSL1蛋白質(Uniprot登錄號P49006)，亦稱為MARCKS樣蛋白質1及巨噬細胞肉豆蔻醯基化丙胺酸富集之C激酶受質。全長人類MARCKSL1蛋白質為195個胺基酸長度。MARCKSL1蛋白質具有涉入在胺基酸殘基87至110上的脂質結合及調鈣素結合之效應子結構域。在一些實施態樣中，本發明的支架蛋白質包含成熟MARCKSL1蛋白質(亦即沒有N端甲硫胺酸)。在一些態樣中，本發明的支架蛋白質系衍生自成熟MARCKSL1蛋白質，亦即其為成熟MARCKSL1蛋白質之片段、變異體或衍生物，且因此其缺乏存在於不成熟蛋白質中的N端甲硫胺酸。
在一些態樣中，本發明的支架包含BASP1蛋白質(Uniprot登錄號P80723)，亦稱為22 kDa神經元組織富集之酸性蛋白質或神經元突軸膜蛋白質NAP-22。全長人類BASP1蛋白質序列(異構體1)為227個胺基酸長度。藉由交替剪接而生產之異構體遺失來自異構體1的胺基酸88至141。在一些實施態樣中，本發明的支架蛋白質(例如胞外體腔蛋白質)包含成熟BASP1蛋白質(亦即沒有N端甲硫胺酸)。在一些態樣中，本發明的支架蛋白質係衍生自成熟BASP1蛋白質，亦即其為成熟BASP1蛋白質之片段、變異體或衍生物，且因此其缺乏存在於不成熟蛋白質中的N端甲硫胺酸。
在一些態樣中，本發明的支架蛋白質(例如胞外體腔蛋白質)包含「N端結構域」(ND)及「效應子結構域」，其中ND及/或ED係與EV (例如胞外體)之腔表面締合。如本文所使用之術語「與…締合」係指在本發明的支架蛋白質與EV (例如胞外體)之腔表面之間的相互作用，其不涉及共價連結至膜組分。例如，本發明的支架可例如經由與膜磷脂質帶負電荷之頭端經靜電相互作用的脂質錨定物(例如肉豆蔻酸)及/或多鹼結構域與EV之腔表面締合。在其他的態樣中，支架蛋白質包含N端結構域(ND)及效應子結構域(ED)，其中ND係與EV之腔表面締合，且ED係藉由離子相互作用與EV之腔表面締合，其中ED包含至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個、至少六個或至少七個按序鄰接的離胺酸(Lys)。
在其他的態樣中，ED進一步包含一或多個低複雜性區段，例如PEST模體。PEST序列為富集脯胺酸(P)、麩胺酸(E)、絲胺酸(S)及蘇胺酸(T)的肽序列。在一些態樣中，ED進一步包含帶負電荷之殘基(例如Glu)及經歷瞬間磷酸化的許多Ser和Thr (因此二者添加負電荷至ED以外的區域)。
在一些態樣中，ND係經由脂質化(例如經由肉豆蔻醯基化)與EV (例如胞外體)之腔表面締合。在一些實施態樣中，ND在N端上具有Gly。在一些實施態樣中，N端Gly係經肉豆蔻醯基化。在一些態樣中，ND在N端上不包含Met。在其他的實施態樣中，ND包含經肉豆蔻醯基化之Gly，且在N端上不包含Met。
在一些態樣中，ED係藉由離子相互作用與EV (例如胞外體)之腔表面締合。在一些實施態樣中，ED係藉由靜電相互作用(特別為相吸的靜電相互作用)與EV (例如胞外體)之腔表面締合。
在一些態樣中，ED包含(i)鹼性胺基酸(例如離胺酸)，或(ii)在多肽序列中彼此相鄰的二或更多個鹼性胺基酸(例如離胺酸)。在一些態樣中，鹼性胺基酸為離胺酸(Lys；K)、精胺酸(Arg，R)或組胺酸(His，H)。在一些實施態樣中，鹼性胺基酸為(Lys)n，其中n為介於1與10之間的整數。
在其他的態樣中，若ED之N端係直接連結至ND之C端上的離胺酸，則ED包含至少離胺酸及ND包含在C端上的離胺酸，亦即離胺酸係在ED之N端中且融合至ND之C端中的離胺酸。在其他的實施態樣中，當ED之N端係藉由連結子(例如一或多個胺基酸)連結至ND之C端時，則ED包含至少兩個離胺酸、至少三個離胺酸、至少四個離胺酸、至少五個離胺酸、至少六個離胺酸或至少七個離胺酸。
在一些態樣中，ED包含K、KK、KKK、KKKK (SEQ ID NO：151)、KKKKK (SEQ ID NO：152)或其任何組合。在一些態樣中，本發明亦提供離胺酸複製體，其可經精胺酸置換。在其他的態樣中，在ED或支架蛋白質中的精胺酸複製體提供與離胺酸功效相比而較低的裝載功效。
在一些態樣中，可用於本發明的支架蛋白質(例如胞外體腔蛋白質)需要至少兩個離胺酸或至少三個離胺酸按序重複在ED中或與ND一起的ED中，亦即離胺酸在ND之C端上及K在ED之N端中。在一些實施態樣中，ED包含K、KK、KKK、KKKK (SEQ ID NO：151)、KKKKK (SEQ ID NO：152)或其任何組合。在一些態樣中，ND包含以G:X2:X3:X4:X5:X6所列之胺基酸序列，其中G表示Gly；其中「:」表示肽鍵，其中X2至X6中之各者獨立地表示胺基酸；且其中X6表示鹼性胺基酸。在一些態樣中，X6胺基酸係選自由下列者所組成之群組：Lys、Arg和His。在一些態樣中，X5胺基酸係選自由下列者所組成之群組：Pro、Gly、Ala和Ser。在一些實施態樣中，X2胺基酸係選自由下列者所組成之群組：Pro、Gly、Ala和Ser。在一些態樣中，X4係選自由下列者所組成之群組：Pro、Gly、Ala、Ser、Val、Ile、Leu、Phe、Trp、Tyr、Gln和Met。在一些態樣中，支架蛋白質在N端上不包含Met，例如經肉豆蔻醯基化。
在一些態樣中，支架蛋白質(例如胞外體腔蛋白質)包含ND及ED，其中ND包含以G:X2:X3:X4:X5:X6 所列之胺基酸序列，其中G表示Gly；其中「:」表示肽鍵，其中X2至X6中之各者獨立地表示胺基酸；其中X6表示鹼性胺基酸，X5胺基酸係選自由下列者所組成之群組： Pro、Gly、Ala和Ser，X4係選自由下列者所組成之群組： Pro、Gly、Ala、Ser、Val、Ile、Leu、Phe、Trp、Tyr、Gln和Met，X3表示胺基酸，且X2胺基酸係選自由下列者所組成之群組：Pro、Gly、Ala和Ser，其中ED包含至少一個胺基酸，例如至少一個Lys，且其中支架蛋白質不為(i)包含SEQ ID NO：4至114、116至118、122至150或180 至190之胺基酸序列，或(ii)以SEQ ID NO：115或118至121 編碼之胺基酸序列。
在一些態樣中，支架蛋白質(例如胞外體腔蛋白質)包含N端結構域(ND)及效應子結構域(ED)，其中ND包含以G:X2:X3:X4:X5:X6所列之胺基酸序列，其中G為以Gly表示之甘胺酸；其中「:」表示肽鍵，其中X2至X6中之各者獨立為胺基酸；其中X6包含鹼性胺基酸，且其中ED係藉由肽鍵與X6連結，且包含至少一個離胺酸在ED之N端上。在一些態樣中，支架蛋白質在N端上不包含Met，例如經肉豆蔻醯基化。在其他的態樣中，支架蛋白質不包含下列者或不由下列者所組成：(i)包含SEQ ID NO：4至114、116至118、122至150或180至190之胺基酸序列，或(ii)以SEQ ID NO：115或118至121編碼之胺基酸序列。
在一些實施態樣中，支架蛋白質(例如胞外體腔蛋白質)之ND包含G:X2:X3:X4:X5:X6之胺基酸序列，其中 a.    G表示Gly； b.   「:」表示肽鍵； c.    X2表示選自由下列者所組成之群組的胺基酸：Pro、Gly、Ala和Ser； d.   X3表示任何胺基酸； e.    X4表示選自由下列者所組成之群組的胺基酸：Pro、Gly、Ala、Ser、Val、Ile、Leu、Phe、Trp、Tyr、Gln和Met； f.    X5表示選自由下列者所組成之群組的胺基酸：Pro、Gly、Ala和Ser；及 g.   X6表示選自由下列者所組成之群組的胺基酸：Lys、Arg和His。
在一些態樣中，支架蛋白質(例如胞外體腔蛋白質)在N端上不包含Met，例如經肉豆蔻醯基化。在其他的態樣中，支架蛋白質不包含下列者或不由下列者所組成：(i)包含SEQ ID NO：4至114、116至118、122至150或180至190之胺基酸序列或(ii)以SEQ ID NO：115或118至121編碼之胺基酸序列。在一些態樣中，X3胺基酸係選自由下列者所組成之群組：Asn、Gln、Ser、Thr、Asp、Glu、Lys、His和Arg。
在一些態樣中，ND及ED係藉由連結子連結。在一些實施態樣中，連結子包含一或多個胺基酸。在一些態樣中，術語「連結子」係指肽或多肽序列(例如合成肽或多肽序列)或非多肽，例如烷基鏈。在一些態樣中，二或更多個連結子可以串接連結。連結子通常提供可撓性或防止/改善空間位阻。連結子通常未經切割；然而在特定的態樣中，可能希望此等切割。因此，在一些實施態樣中，連結子可包含一或多個蛋白酶可切割位點，其可位於連結子序列內或側接在連結子序列之任一末端上的連結子。當ND及ED係藉由連結子接合時，則ED包含至少兩個離胺酸、至少三個離胺酸、至少四個離胺酸、至少五個離胺酸、至少六個離胺酸或至少七個離胺酸。
在一些態樣中，連結子為肽連結子。在一些態樣中，肽連結子可包含至少約2個、至少約3個、至少約4個、至少約5個、至少約10個、至少約15個、至少約20個、至少約25個、至少約30個、至少約35個、至少約40個、至少約45個、至少約50個、至少約55個、至少約60個、至少約65個、至少約70個、至少約75個、至少約80個、至少約85個、至少約90個、至少約95個或至少約100個胺基酸。 [23] 在一些態樣中，連結子為甘胺酸/絲胺酸連結子。在一些實施態樣中，肽連結子為根據式[(Gly)n-Ser]m之甘胺酸/絲胺酸連結子，其中n為1至100的任何整數，且m為1至100的任何整數。在其他的態樣中，甘胺酸/絲胺酸連結子係根據式[(Gly)x-Sery]z，其中x為1至4的整數，y為0或1，且z為1至50的整數。在一些態樣中，肽連結子包含序列Gn，其中n可為1至100的整數。在一些態樣中，肽連結子可包含序列(GlyAla)n，其中n為介於1與100之間的整數。在其他的態樣中，肽連結子可包含序列(GlyGlySer)n，其中n為介於1與100之間的整數。 [24] 在一些態樣中，肽連結子為合成的，亦即非天然生成的。在一個實施態樣中，肽連結子包括肽(或多肽)(例如天然或非天然生成之肽)，其包含連結或經基因融合胺基酸之第一線性序列至本質上不經天然連結或基因融合的胺基酸之第二線性序列的胺基酸序列。例如，在一個態樣中，肽連結子可包含非天然生成之多肽，其為天然生成之多肽的修飾形式(例如包含突變，諸如加入、取代或缺失)。 [25] 在其他的態樣中，肽連結子可包含非天然生成之胺基酸。在又其他的態樣中，肽連結子可包含出現在本質上不存在的線性序列中的天然生成之胺基酸。在還有的其他態樣中，肽連結子可包含天然生成之多肽序列。 [26] 本發明亦提供經單離之細胞外囊泡(EV)(例如胞外體)，其包含連結至支架蛋白質(例如胞外體腔蛋白質)之生物活性分子，其中支架蛋白質包含ND-ED，其中： a.    ND包含G:X2:X3:X4:X5:X6；其中： i.    G表示Gly； ii.   「:」表示肽鍵； iii.  X2表示選自由下列者所組成之群組的胺基酸：Pro、Gly、Ala和Ser； iv.   X3表示任何胺基酸； v.   X4表示選自由下列者所組成之群組的胺基酸：Pro、Gly、Ala、Ser、Val、Ile、Leu、Phe、Trp、Tyr、Glu和Met； vi.  X5表示選自由下列者所組成之群組的胺基酸：Pro、Gly、Ala和Ser； vii. X6表示選自由下列者所組成之群組的胺基酸：Lys、Arg和His； b.   "-" 表示視需要的連結子；且 c.    ED為效應子結構域，其包含(i)至少兩個鄰接的離胺酸(Lys)，N端離胺酸係藉由肽鍵或一或多個胺基酸連結至X6，或(ii)至少一個離胺酸，其係藉由肽鍵直接連結至X6。在一些態樣中，支架蛋白質在N端上不包含Met，例如經肉豆蔻醯基化。在其他的態樣中，支架蛋白質不包含下列者或不由下列者所組成：(i)包含SEQ ID NO：4至114、116至118、122至150或180至190之胺基酸序列或(ii)以SEQ ID NO：115或118至121編碼之胺基酸序列。 [27] 在一些態樣中，X2胺基酸係選自由下列者所組成之群組：Gly和Ala。在一些態樣中，X3胺基酸為Lys。在一些態樣中，X4胺基酸為Leu或Glu。在一些態樣中，X5胺基酸係選自由下列者所組成之群組：Ser和Ala。在一些態樣中，X6胺基酸為Lys。在一些態樣中，X2胺基酸為Gly、Ala或Ser；X3胺基酸為Lys或Glu；X4胺基酸為Leu、Phe、Ser或Glu；X5胺基酸為Ser或Ala；及X6胺基酸為Lys。在一些態樣中，-連結子包含肽鍵或一或多個胺基酸。 [28] 在一些態樣中，在支架蛋白質(例如胞外體腔蛋白質)中的ED包含Lys (K)、KK、KKK、KKKK (SEQ ID NO：151)、KKKKK (SEQ ID NO：152)、Arg (R)、RR、RRR、RRRR (SEQ ID NO：153)、RRRRR (SEQ ID NO：154)、KR、RK、KKR、KRK、RKK、KRR、RRK、(K/R)(K/R)(K/R)(K/R)(SEQ ID NO：155)、(K/R)(K/R)(K/R)(K/R)(K/R)(SEQ ID NO：156)或其任何組合。 [29] 在一些態樣中，支架蛋白質(例如胞外體腔蛋白質)包含以下所列之胺基酸序列：(i) GGKLSKK (SEQ ID NO：157)，(ii) GAKLSKK (SEQ ID NO：158)，(iii) GGKQSKK (SEQ ID NO：159)，(iv) GGKLAKK (SEQ ID NO：160)，或(v)其任何組合。在一些態樣中，支架蛋白質不包含在(i)至(v)之序列的N端上具有Met之胺基酸序列。在其他的態樣中，支架蛋白質不包含下列者或不由下列者所組成：(i)包含SEQ ID NO：4至114、116至118或122至150之胺基酸序列或(ii)以SEQ ID NO：115或118至121編碼之胺基酸序列。 [30] 在一些態樣中，在支架蛋白質(例如胞外體腔蛋白質)中的ND包含下列的胺基酸序列：(i) GGKLSK (SEQ ID NO：203)，(ii) GAKLSK (SEQ ID NO：204)，(iii) GGKQSK (SEQ ID NO：205)，(iv) GGKLAK (SEQ ID NO：206)，或(v)其任何組合，且在支架蛋白質中的ED包含(a) K，(b) KK，(c) KKK，(d) KKKG (SEQ ID NO：207)，(e) KKKGY (SEQ ID NO：208)，(f) KKKGYN (SEQ ID NO：209)，(g) KKKGYNV (SEQ ID NO：210)，(h) KKKGYNVN (SEQ ID NO：211)，(i) KKKGYS (SEQ ID NO：212)，(k) KKKGYG (SEQ ID NO：213)，(l) KKKGYGG (SEQ ID NO：214)，(m) KKKGS (SEQ ID NO：215)，(n) KKKGSG (SEQ ID NO：216)，(o) KKKGSG (SEQ ID NO：217)，(p) KKKGSGS (SEQ ID NO：218)，(q) KKKS (SEQ ID NO：219)，(r) KKKSG (SEQ ID NO：220)，(s) KKKSGG (SEQ ID NO：221)，(t) KKKSGGS (SEQ ID NO：222)，(u) KKKSGGSG (SEQ ID NO：223)，(v) KKSGGSGG (SEQ ID NO：224)，(w) KKKSGGSGGS (SEQ ID NO：225)，(x) KRFSFKKS (SEQ ID NO：226)或其任何組合。在一些態樣中，支架蛋白質不包含在(i)至(v)之序列的N端上具有Met之胺基酸序列。在一些態樣中，支架蛋白質不包含下列者或不由下列者所組成：(i)包含SEQ ID NO：4至114、116至118、122至150或180至190之胺基酸序列，或(ii)以SEQ ID NO：115或118至121編碼之胺基酸序列。 [31] 在一些態樣中，本發明的支架蛋白質(例如胞外體腔蛋白質)之多肽序列係由選自由下列者所組成之群組的胺基酸序列所組成：(i) GGKLSKK (SEQ ID NO：157)，(ii) GAKLSKK (SEQ ID NO：158)，(iii) GGKQSKK (SEQ ID NO：159)，(iv) GGKLAKK (SEQ ID NO：160)，或(v)其任何組合。 [32] 在一些態樣中，支架蛋白質(例如胞外體腔蛋白質)包含下列的胺基酸序列：(i) GGKLSKKK (SEQ ID NO：161)，(ii) GGKLSKKS (SEQ ID NO：162)，(iii) GAKLSKKK (SEQ ID NO：163)，(iv) GAKLSKKS (SEQ ID NO：164)，(v) GGKQSKKK (SEQ ID NO：165)，(vi) GGKQSKKS (SEQ ID NO：166)，(vii) GGKLAKKK (SEQ ID NO：167)，(viii) GGKLAKKS (SEQ ID NO：168)，或(ix)其任何組合。在一些態樣中，支架蛋白質不包含在(i)至(ix)之序列的N端上具有Met之胺基酸序列。在一些態樣中，支架蛋白質不包含下列者或不由下列者所組成：(i)包含SEQ ID NO：4至114、116至118、122至150或180至190之胺基酸序列或(ii)以SEQ ID NO：115或118至121編碼之胺基酸序列。 [33] 在一些態樣中，本發明的支架蛋白質(例如胞外體腔蛋白質)之多肽序列係由選自由下列者所組成之群組的胺基酸序列所組成：(i) GGKLSKKK (SEQ ID NO：161)，(ii) GGKLSKKS (SEQ ID NO：162)，(iii) GAKLSKKK (SEQ ID NO：163)，(iv) GAKLSKKS (SEQ ID NO：164)，(v) GGKQSKKK (SEQ ID NO：165)，(vi) GGKQSKKS (SEQ ID NO：166)，(vii) GGKLAKKK (SEQ ID NO：167)，(viii) GGKLAKKS (SEQ ID NO：168)，及(ix)其任何組合。
在一些態樣中，支架蛋白質(例如胞外體腔蛋白質)為至少約8個、至少約9個、至少約10個、至少約11個、至少約12個、至少約13個、至少約14個、至少約15個、至少約16個、至少約17個、至少約18個、至少約19個、至少約20個、至少約21個、至少約22個、至少約23個、至少約24個、至少約25個、至少約26個、至少約27個、至少約28個、至少約29個、至少約30個、至少31個、至少約32個、至少約33個、至少約34個、至少約35個、至少約36個、至少約37個、至少約38個、至少約39個、至少約39個、至少約40個、至少約41個、至少約42個、至少約43個、至少約44個、至少約50個、至少約46個、至少約47個、至少約48個、至少約49個、至少約50個、至少約55個、至少約60個、至少約65個、至少約70個、至少約75個、至少約80個、至少85個、至少約90個、至少約95個、至少約100個、至少約105個、至少約110個、至少約115個、至少約120個、至少約125個、至少約130個、至少約135個、至少約140個、至少約145個、至少約150個、至少約155個、至少約160個、至少約165個、至少約170個、至少約175個、至少約180個、至少約185個、至少約190個、至少約195個、至少約200個、至少約205個、至少約210個、至少約215個、至少約220個、至少約225個、至少約230個、至少約235個、至少約240個、至少約245個、至少約250個、至少約255個、至少約260個、至少約265個、至少約270個、至少約275個、至少約280個、至少約285個、至少約290個、至少約295個、至少約300個、至少約305個、至少約310個、至少約315個、至少約320個、至少約325個、至少約330個、至少約335個、至少約340個、至少約345或至少約350個胺基酸長度。
在一些態樣中，支架蛋白質(例如胞外體腔蛋白質)為介於約5與約10個之間、介於約10與約20個之間、介於約20與約30個之間、介於約30與約40個之間、介於約40與約50個之間、介於約50與約60個之間、介於約60與約70個之間、介於約70與約80個之間、介於約80與約90個之間、介於約90與約100個之間、介於約100與約110個之間、介於約110與約120個之間、介於約120與約130個之間、介於約130與約140個之間、介於約140與約150個之間、介於約150與約160個之間、介於約160與約170個之間、介於約170與約180個之間、介於約180與約190個之間、介於約190與約200個之間、介於約200與約210個之間、介於約210與約220個之間、介於約220與約230個之間、介於約230與約240個之間、介於約240與約250個之間、介於約250與約260個之間、介於約260與約270個之間、介於約270與約280個之間、介於約280與約290個之間、介於約290與約300個之間、介於約300與約310個之間、介於約310與約320個之間、介於約320與約330個之間、介於約330與約340或介於約340與約250個之間的胺基酸長度。
在一些態樣中，支架蛋白質(例如胞外體腔蛋白質)包含(i) GGKLSKKKKGYNVN (SEQ ID NO：169)，(ii) GAKLSKKKKGYNVN (SEQ ID NO：170)，(iii) GGKQSKKKKGYNVN (SEQ ID NO：171)，(iv) GGKLAKKKKGYNVN (SEQ ID NO：172)，(v) GGKLSKKKKGYSGG (SEQ ID NO：173)，(vi) GGKLSKKKKGSGGS (SEQ ID NO：174)，(vii) GGKLSKKKKSGGSG (SEQ ID NO：175)，(viii) GGKLSKKKSGGSGG (SEQ ID NO：176)，(ix) GGKLSKKSGGSGGS (SEQ ID NO：177)，(x) GGKLSKSGGSGGSV (SEQ ID NO：178)，或(xi) GAKKSKKRFSFKKS (SEQ ID NO：179)。在一些態樣中，支架蛋白質不包含在(i)至(xi)之序列的N端上具有Met之胺基酸序列。在一些態樣中，支架蛋白質不包含下列者或不由下列者所組成：(i)包含SEQ ID NO：4至114、116至118、122至150或180至190之胺基酸序列或(ii)以SEQ ID NO：115或118至121編碼之胺基酸序列。
在一些態樣中，本發明的支架蛋白質(例如胞外體腔蛋白質)之多肽序列係由下列者所組成：(i) GGKLSKKKKGYNVN (SEQ ID NO：169)，(ii) GAKLSKKKKGYNVN (SEQ ID NO：170)，(iii) GGKQSKKKKGYNVN (SEQ ID NO：171)，(iv) GGKLAKKKKGYNVN (SEQ ID NO：172)，(v) GGKLSKKKKGYSGG (SEQ ID NO：173)，(vi) GGKLSKKKKGSGGS (SEQ ID NO：174)，(vii) GGKLSKKKKSGGSG (SEQ ID NO：175)，(viii) GGKLSKKKSGGSGG (SEQ ID NO：176)，(ix) GGKLSKKSGGSGGS (SEQ ID NO：177)，(x) GGKLSKSGGSGGSV (SEQ ID NO：178)或(xi) GAKKSKKRFSFKKS (SEQ ID NO：179)。在一些態樣中，支架蛋白質不包含在(i)至(xi)之序列的N端上具有Met之胺基酸序列。在一些態樣中，支架蛋白質不包含下列者或不由下列者所組成：(i)包含SEQ ID NO：4至114、116至118、122至150或180至190之胺基酸序列或(ii)以SEQ ID NO：115或118至121編碼之胺基酸序列。
在其他的態樣中，支架蛋白質(例如胞外體腔蛋白質)包含本文所揭示的序列中任一者，但不包含在N端上具有Met之相應序列，例如SEQ ID NO：4至109。在一些態樣中，支架蛋白質包含表1的序列中任一者，但不包含下列者或不由下列者所組成：(i)包含SEQ ID NO：4至114、116至118、122至150或180至190之胺基酸序列或(ii)以SEQ ID NO：115或118至121編碼之胺基酸序列。
可用於本發明的支架蛋白質(例如胞外體腔蛋白質)之非限制性實例列示於下文。
Figure 02_image001
Figure 02_image003
Figure 02_image005
Figure 02_image007
在一些態樣中，本發明的支架蛋白質(例如胞外體腔蛋白質)係由或基本上由本發明的序列中任一者所組成。在一些態樣中，本發明的支架係由表1中所揭示的序列所組成。在一些態樣中，本發明的支架係由本文所揭示的序列所組成，例如表1中所揭示的序列，其經共價附著至膜錨定物(例如肉豆蔻酸)。在一些態樣中，膜錨定可經由脂質化進行。在一些實施態樣中，脂質化可為例如脂肪醯化。在一些態樣中，脂肪乙醯化可為例如肉豆蔻醯基化。在一些態樣中，膜錨定物係經由共價附著至本文所揭示的序列之N端胺基酸，例如表1中所揭示的序列。在一些態樣中，膜錨定物係經由共價附著至本文所揭示的序列之N端甘胺酸，例如表1中所揭示的序列。因此，在一些態樣中，本發明的支架係由所揭示的序列所組成，例如表1中所揭示的序列，其已經N-肉豆蔻醯基化。
在一些態樣中，本發明的支架蛋白質(例如胞外體腔蛋白質)不含有N端Met。在一些態樣中，支架蛋白質包含在支架蛋白質之N端上的脂質化胺基酸，例如肉豆蔻醯基化胺基酸，其係作為脂質錨定物起作用。在一些態樣中，在支架蛋白質之N端上的胺基酸殘基於Gly。N端Gly的存在為N-肉豆蔻醯基化所必要的。在一些態樣中，在支架蛋白質之N端上的胺基酸殘基為合成的。在一些態樣中，在支架蛋白質之N端上的胺基酸殘基為甘胺酸類似物，例如烯丙基甘胺酸、丁基甘胺酸或炔丙基甘胺酸。
在一些態樣中，脂質錨定物可藉由化學合成或酵素催化而附著至本發明的支架蛋白質之任何N端胺基酸。
在其他的態樣中，脂質錨定物可為本技術中已知的任何脂質錨定物，例如棕櫚酸或糖基磷脂醯肌醇。在不尋常的情況下，例如藉由使用其中肉豆蔻酸受限之培養基，一些其他的脂肪酸(包括更短鏈及不飽和脂肪酸)可附著至N端甘胺酸。例如，在BK通道中，據報導肉豆蔻酸酯係經由羥基酯鍵聯經轉譯後附著至內部絲胺酸/蘇胺酸或酪胺酸殘基。在本技術中已知的膜錨定物呈現於下表中。
Figure 02_image009
在一些實施態樣中，支架蛋白質(例如胞外體腔蛋白質)包含與SEQ ID NO：1 (MARCKS)、SEQ ID NO：2 (MARCKSL1)或SEQ ID NO：3 (BASP1)之成熟形式(亦即在SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3中沒有N端甲硫胺酸胺基酸的存在)具有至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%之序列一致性的胺基酸序列。
在一些實施態樣中，支架蛋白質(例如胞外體腔蛋白質)包含與SEQ ID NO：1 (MARCKS)、SEQ ID NO：2 (MARCKSL1)，或SEQ ID NO：3 (BASP1)之成熟形式(亦即在SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3中沒有N端甲硫胺酸胺基酸的存在)的功能性片段具有至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%之序列一致性的胺基酸序列。
在一些態樣中，附著至本發明的支架蛋白質之生物活性分子係於EV (例如胞外體)之腔面上。
在一些態樣中，支架蛋白質(例如胞外體腔蛋白質)進一步包含跨膜結構域。在一些態樣中，跨膜結構域係插入支架蛋白質位於EV (例如胞外體)之腔面上的ED結構域與酬載(例如生物活性分子)之間。因此，酬載(例如生物活性分子)係錨定至EV (例如胞外體)之外部表面。
在一些態樣中，支架蛋白質(例如胞外體腔蛋白質)進一步包含囊泡外結構域。在一些實施態樣中，囊泡外結構域係插入跨膜結構域與生物活性分子之間。
在一些態樣中，支架蛋白質係經由至少一個連結子(例如肽連結子)連結至生物活性分子。在一些態樣中，ND係藉由直接插入兩個結構域之間的連結子連結至ED。在一些態樣中，連結子包含例如肽鍵或多個胺基酸中之一者。在一些態樣中，連結子包含可切割的連結子。在一些態樣中，連結子包含可撓性連結子。在一些態樣中，連結子包含自毀型連結子。
亦可使用在本發明的支架蛋白質與生物活性分子(例如具有治療活性之分子)之間的融合物。例如，融合蛋白質可包含支架蛋白質(諸如MARCKS、MARCKSL1、BASP1或其修飾物，特別為其片段或變異體)及酬載，例如生物活性分子(例如治療性肽)。在一些態樣中，融合蛋白質包含支架蛋白質，其包含BASP1之胺基端的片段。在一些態樣中，生物活性分子包含蛋白質、多肽、肽、多核苷酸(DNA及/或RNA)、化學化合物、病毒、親離子基團、親離子基團之載體、形成通道或孔之部分或其任何組合。
生物活性分子(例如治療性肽)可選自由下列者所組成之群組：天然肽、重組肽、合成肽、融合蛋白質或連結至治療性化合物之連結子。生物活性分子(例如治療性化合物)亦可為核苷酸、胺基酸、脂質、碳水化合物或小分子。生物活性分子(例如治療性肽)可為抗體、酵素、配體、抗原(例如腫瘤抗原或來自傳染媒介物，諸如細菌、病毒、真菌或原生動物之抗原)、受體、抗微生物肽、轉錄因子或其片段或修飾物。
包含融合或共軛至酬載(例如生物活性分子)之本發明的支架之融合蛋白質可附著至EV (例如胞外體)之腔表面，且對EV (例如胞外體)提供例如治療活性。
在一些實施態樣中，生物活性分子(例如治療性肽)為基因組編輯複合體之組分。在一些實施態樣中，該基因組編輯複合體為轉錄活化物樣效應子核酸酶(TAL-效應子核酸酶或TALEN)、鋅指核酸酶(ZFN)、重組酶、CRISPR/Cas9複合體、CRISPR/Cpf1複合體、CRISPR/ C2c1、C2c2或C2c3複合體、CRISPR/CasY或CasX複合體、或本技術中已知的任何其他適當的CRISPR複合體、或本技術中已知的任何其他適當的基因組編輯複合體或其任何組合。
在一些實施態樣中，生物活性分子(例如治療性肽)為跨膜肽。本文所述之跨膜肽可以融合至本文所述之序列中任一者或其任何片段或變異體之融合蛋白質表現。在一些實施態樣中，跨膜蛋白質具有融合至EV (例如胞外體)之腔中的腔序列之第一末端及表現在EV (例如胞外體)之表面上的第二末端。
在一些實施態樣中，例如本發明的EV可包含第二支架蛋白質。在一些實施態樣中，第二支架蛋白質包含跨膜蛋白質，其包含PTGFRN多肽、BSG多肽、IGSF2多肽、IGSF3多肽、IGSF8多肽、ITGB1多肽、ITGA4多肽、SLC3A2多肽、ATP轉運子多肽、胺肽酶N (ANPEP)多肽、外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶家族1 (ENPP1)多肽、腦啡肽酶(MME)多肽、神經纖毛蛋白-1 (NRP1)多肽或其片段、變異體或衍生物。第二支架蛋白質的非限制性實例可見於美國專利第10,195,290號及PCT發表案第WO 2019/040920號中，以其全文併入本文以供參考。
在一些實施態樣中，生物活性分子(例如治療性肽)為核酸結合蛋白質。在一些實施態樣中，核酸結合蛋白質為切丁酶(Dicer)、Argonaute蛋白質、TRBP、MS2噬菌體外套蛋白質。在一些實施態樣中，核酸結合蛋白質另外包含一或多種RNA或DNA分子。在一些實施態樣中，一或多種RNA為miRNA、siRNA、導引RNA、lincRNA、mRNA、反義股RNA、dsRNA或其組合。
在一些實施態樣中，生物活性分子(例如治療性肽)為蛋白質-蛋白質相互作用系統的一部分。在一些實施態樣中，蛋白質-蛋白質相互作用系統包含FRB-FKBP相互作用系統，例如在Banaszynski等人之J Am Chem Soc. 2005 Apr 6;127(13):4715-21中所述之FRB-FKBP相互作用系統。
融合蛋白質可靶定至EV (例如胞外體)之腔表面，且對EV (例如胞外體)提供治療活性。
在一些實施態樣中，使用具有靶定部分之融合蛋白質。例如，融合蛋白質可包含(i)支架蛋白質，諸如MARCKS、MARCKSL1、BASP1或其片段、變異體或修飾物，及(ii)靶定部分。靶定部分可用於靶定EV (例如胞外體)至使用EV (例如胞外體)治療之特定器官、組織或細胞。在一些實施態樣中，靶定部分為抗體或其抗原結合片段。
抗體及其抗原結合片段包括全抗體、多株抗體、單株抗體和重組抗體、其片段，且進一步包括單鏈抗體、人源化抗體、鼠類抗體、嵌合抗體、小鼠-人類抗體、小鼠-靈長類動物抗體、靈長類動物-人類單株抗體、抗個體基因型抗體、抗體片段(諸如scFv、(scFv)2 、Fab、Fab'和F(ab')2 、F(ab1)2 、Fv、dAb和Fd片段)、雙功能抗體、微型體(minibody)、駱駝抗體及抗體相關多肽。
抗體及其抗原結合片段亦包括雙特異性抗體及多特異性抗體，只要其展現所欲生物活性或功能。已利用抗體之模組化架構創建超過60種不同的雙特異性抗體模式。參見Spiess等人之(2015) Molecular Immunology 67:95-106，以其全文併入本文以供參考。因此，在一些實施態樣中，雙特異性抗體模式係選自crossMab、DAF (雙重作用Fab)(二合一)、DAF (四合一)、DutaMab、DT-IgG、孔中球形突起(Knobs-in-holes)共有的LC、孔中球形突起組裝體、電荷配對(Charge pair)、Fab-臂交換(arm exchange)、SEEDbody、Triomab、LUZ-Y (經兩個HC的白胺酸拉鍊(leucize zipper)誘導之異源二聚化的雙特異性抗體)、Fcab、Kλ-body、正交Fab、DVD-IgG (雙重可變結構域IgG)、IgG(H)-scFv、scFv-(H)IgG、IgG(L)-scFv、scFv-(L)IgG、IgG(L,H)-Fv、IgG(H)-V、V(H)-IgG、IgG(L)-V、V(L)-IgG、KIH IgG-scFab、2scFv-IgG、IgG-2scFv、scFv4-Ig、Zybody、DVI-IgG (四合一)、奈米抗體、奈米抗體-HSA、BiTE (雙特異性T細胞接合子)、雙功能抗體(Diabody)、DART (雙重親和性再靶定(dual-affinity-retargeting))、TandAb (串接抗體)、sc雙功能抗體、sc雙功能抗體-CH3、三功能抗體、微型抗體、微型體、TriBi微型體、scFv-CH3 KIH、Fab-scFv、scFv-CH-CL-scFv、F(ab')2、F(ab')2-ScFv2、scFv-KIH、Fab-scFv-Fc、四價HC Ab、sc雙功能抗體-Fc、雙功能抗體-Fc、串接scFv-Fc、胞內抗體(intrabody)、對接鎖定(Dock and Locck)、ImmTAC、HSAbody、sc雙功能抗體-HSA、串接scFv-毒素、IgG-IgG、Cov-X-Body及scFv1-PEG-scFV2。雙特異性抗體可為藉由以附加的抗原結合單元附接輕鏈或重鏈之胺基端或羧基端而進行雙特異性工程化之單特異性抗體。該等附加的抗原結合單元之替代物包括單結構域抗體(未經配對之VL或VH)、經配對之抗體可變結構域(例如Fv或scFv)或工程化蛋白質支架。缺乏某些或所有的雙特異性抗體恆定結構域的許多雙特異性片段形式為本技術中已知。
在一些實施態樣中，生物活性分子(例如治療性肽)為融合蛋白質，其包含本發明的支架蛋白質及病毒蛋白質。在一些實施態樣中，病毒蛋白質包含病毒殼體、套膜蛋白質或其組合。在一些實施態樣中，融合蛋白質容許組裝完整病毒，使其保留在EV (例如胞外體)之腔表面上。
在一些實施態樣中，生物活性分子為陰性檢查點調節子之抑制劑或陰性檢查點調節子的結合伴體之抑制劑。在一些實施態樣中，陰性檢查點調節子係選自由下列者所組成之群組：細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白質4 (CTLA-4)、程式性細胞死亡蛋白質1 (PD-1)、淋巴細胞活化型基因3 (LAG-3)、含T細胞免疫球蛋白黏蛋白之蛋白質3 (TIM-3)、B和T淋巴細胞衰減因子(BTLA)、具有Ig及ITIM結構域之T細胞免疫受體(TIGIT)、T細胞活化之V結構域Ig抑制因子(VISTA)、腺苷酸A2a受體(A2aR)、殺手細胞免疫球蛋白樣受體(KIR)、吲哚胺2,3-二氧酶(IDO)、CD20、CD39和CD73。
在一些實施態樣中，生物活性分子為免疫性蛋白質。在一些實施態樣中，生物活性分子為毒素、類毒素或毒素之無毒性突變體。在一些實施態樣中，毒素為白喉毒素。在一些實施態樣中，類毒素為破傷風類毒素。在一些實施態樣中，白喉毒素為白喉毒素之無毒性突變體。
在一些實施態樣中，生物活性分子為陽性共刺激分子之活化物或陽性共刺激分子的結合伴體之活化物。在一些實施態樣中，陽性共刺激分子為TNF受體超家族成員，其係選自由下列者所組成之群組：CD120a、CD120b、CD18、OX40、CD40、Fas受體、M68、CD27、CD30、4-1BB、TRAILR1、TRAILR2、TRAILR3、TRAILR4、RANK、OCIF、TWEAK受體、TACI、BAFF受體、ATAR、CD271、CD269、AITR、TROY、CD358、TRAMP和XEDAR。在一些實施態樣中，陽性共刺激分子之活化物為TNF超家族成員，其係選自由下列者所組成之群組：TNFα、TNF-C、OX40L、CD40L、FasL、LIGHT、TL1A、CD27L、Siva、CD153、4-1BB配體、TRAIL、RANKL、TWEAK、APRIL、BAFF、CAMLG、NGF、BDNF、NT-3、NT-4、GITR配體和EDA-2。在一些實施態樣中，陽性共刺激分子為CD28-超家族共刺激分子。在一些實施態樣中，CD28-超家族共刺激分子為ICOS或CD28。在一些實施態樣中，陽性共刺激分子之活化物為ICOSL、CD80或CD86。
在一些實施態樣中，生物活性分子為細胞激素，其係選自由下列者所組成之群組：IL-2、IL-7、IL-10、IL-12和IL-15。在一些實施態樣中，生物活性分子為包含T細胞受體(TCR)、T細胞共受體、主要組織相容複合體(MHC)、人類白血球抗原(HLA)或其衍生物之蛋白質。在一些實施態樣中，生物活性分子為包含腫瘤抗原之蛋白質。在一些實施態樣中，腫瘤抗原係選自由下列者所組成之群組：α-胎兒蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、上皮腫瘤抗原(ETA)、黏蛋白1 (MUC1)、Tn-MUC1、黏蛋白16 (MUC16)、酪胺酸酶、黑色素瘤相關抗原(MAGE)、腫瘤蛋白質 p53 (p53)、CD4、CD8、CD45、CD80、CD86、程式性死亡配體1 (PD-L1)、程式性死亡配體2 (PD-L2)、NY-ESO-1、PSMA、TAG-72、HER2、GD2、cMET、EGFR、間皮素、VEGFR、α-葉酸受體、CE7R、IL-3、癌-睪丸抗原、MART-1 gp100和TNF相關細胞凋亡誘導配體。
在一些態樣中，與缺乏支架蛋白質之生物活性分子的表現相比，包含生物活性分子及本發明的支架蛋白質(例如MARCKS、MARCKSL1、BASP1、SEQ ID NO：4至109中任一者、沒有N端M之相應序列、或本文所揭示的任何支架蛋白質序列(例如表1)或其修飾物，特別為其片段或變異體)之融合蛋白質導致生物活性分子富集在EV (例如胞外體)中。在一些態樣中，與缺乏支架蛋白質之生物活性分子的表現相比，包含生物活性分子及本發明的支架蛋白質(例如沒有N端M之MARCKS、MARCKSL1、BASP1、沒有N端M之SEQ ID NO：4至114、116至118、122至150或180至190之胺基酸序列、以SEQ ID NO：115或118至121編碼之胺基酸序列、或沒有N端M之本文所揭示的任何支架蛋白質序列(例如表1))之融合蛋白質導致生物活性分子富集在EV (例如胞外體)中。
在一些實施態樣中，可用於本發明的支架蛋白質包含SEQ ID NO：4至109中任一者、沒有N端M之相應序列、或表1中所揭示的任何序列。在一些態樣中，可用於本發明的支架蛋白質包含SEQ ID NO：4至109中任一者，其中支架蛋白質不包含N端Met。在一些態樣中，支架蛋白質包含表1中所揭示的序列，其中支架蛋白質不包含N端Met。在一些態樣中，可用於本發明的支架蛋白質包含沒有N端M之MARCKS、MARCKSL1、BASP1、沒有N端M之SEQ ID NO：4至114、116至118、122至150或180至190之胺基酸序列、以SEQ ID NO：115或118至121編碼之胺基酸序列、或沒有N端M之本文所揭示的任何支架蛋白質序列(例如表1)。在一些態樣中，可用於本發明的支架蛋白質包含MARCKS、MARCKSL1或BASP1，其中支架蛋白質不包含N端Met。在一些態樣中，支架蛋白質包含SEQ ID NO：4至114、116至118、122至150或180至190之胺基酸序列，其中支架蛋白質不包含N端Met。在一些態樣中，支架蛋白質包含以SEQ ID NO：115或118至121編碼之胺基酸序列，其中支架蛋白質不包含N端Met。在其他的實施態樣中，可用於本發明的支架蛋白質包含本文所揭示的任何序列，但不為SEQ ID NO：4至109中任一者、沒有N端M之相應序列、或沒有N端M之表1中所揭示的任何序列。在其他的實施態樣中，可用於本發明的支架蛋白質包含本文所揭示的任何序列，但不包含SEQ ID NO：4至109中任一者。
在一些實施態樣中，融合蛋白質包含支架蛋白質，其包含具有序列MGXKLSKKK之肽，其中X為丙胺酸或任何其他的胺基酸(SEQ ID NO：117)；或具有序列(M)(G)(π)(ξ)(Φ/π)(S/A/G/N)(+)(+)之肽，其中N端M經切割，使所得融合蛋白質包含接合至生物活性分子之GXKLSKKK (SEQ ID NO：425)或(G)(π)(ξ)(Φ/π)(S/A/G/N) (+)(+)，其中各括號位置表示胺基酸，且其中π為選自由下列者所組成之群組的任何胺基酸：(Pro、Gly、Ala、Ser)，ξ為選自由下列者所組成之群組的任何胺基酸：(Asn、Gln、 Ser、Thr、Asp、Glu、Lys、His、Arg)，Φ為選自由下列者所組成之群組的任何胺基酸：(Val、Ile、Leu、Phe、 Trp、Tyr、Met)，且(+)為選自由下列者所組成之群組的任何胺基酸：(Lys、Arg、His)；且其中位置五不為(+)，及位置六既不為(+)，亦不為(Asp或Glu)。在一些實施態樣中，可用於本發明的支架蛋白質不為MGXKLSKKK，其中X為丙胺酸或任何其他的胺基酸(SEQ ID NO：117)或不為具有序列(M)(G)(π)(ξ)(Φ/π)(S/A/G/N) (+)(+)之肽。在一些實施態樣中，可用於本發明的支架蛋白質不包含MGXKLSKKK，其中X為丙胺酸或任何其他的胺基酸(SEQ ID NO：117)，或不包含具有序列(M)(G)(π) (ξ)(Φ/π)(S/A/G/N)(+)(+)之肽。
在一些實施態樣中，融合蛋白質包含支架蛋白質，其包含具有序列(M)(G)(π)(X)(Φ/π)(π)(+)(+)或(G)(π)(X)(Φ/π)(π)(+)(+)之肽，其中各括號位置表示胺基酸，且其中π為選自由下列者所組成之群組的任何胺基酸：(Pro、Gly、Ala、Ser)，X為任何胺基酸，Φ為選自由下列者所組成之群組的任何胺基酸：(Val、Ile、Leu、Phe、Trp、Tyr、Met)，且(+)為選自由下列者所組成之群組的任何胺基酸：(Lys、Arg、His)；且其中位置五不為(+)，及位置六既不為(+)，亦不為(Asp或Glu)。在一些實施態樣中，融合蛋白質包含支架蛋白質，其包含具有序列(G)(π)(X)(Φ/π)(π)(+)(+)之肽，其中支架蛋白質不包含N端M (例如N端甲硫胺酸)。
在一些態樣中，融合蛋白質包含支架蛋白質，其包含具有序列(G)(π)(X)(Φ/π)(π)(+)(+)之肽，其中各括號位置表示胺基酸，且其中π為選自由下列者所組成之群組的任何胺基酸：(Pro、Gly、Ala、Ser)，X為任何胺基酸，Φ為選自由下列者所組成之群組的任何胺基酸：(Val、Ile、Leu、Phe、Trp、Tyr、Met)，且(+)為選自由下列者所組成之群組的任何胺基酸：(Lys、Arg、His)；且其中位置五不為(+)，及位置六既不為(+)，亦不為(Asp或Glu)，其中序列不為(M)(G)(π)(X)(Φ/π)(π)(+)(+)。在一些態樣中，支架蛋白質包含具有序列(G)(π)(X)(Φ/π)(π)(+)(+)之肽，其中支架蛋白質不包含N端Met。
在一些實施態樣中，習知的EV (例如胞外體)蛋白質係選自由下列者所組成之列示：CD9、CD63、CD81、PDGFR、GPI錨蛋白質、LAMP2、LAMP2B及其片段、變異體或衍生物。
在一些實施態樣中，富集在胞外體中的包含MARCKS、MARCKSL1、BASP1、或SEQ ID NO：4至109中任一者之融合蛋白質比缺乏MARCKS、MARCKSL1、BASP1、SEQ ID NO：4至109中任一者之融合蛋白質或與包含習知的EV (例如胞外體)蛋白質之融合蛋白質相比而高＞2倍、＞4倍、＞8倍、＞16倍、＞25倍、＞50倍、＞100倍、＞200倍、＞500倍、＞750倍、＞1,000倍、＞2,000倍、＞5,000倍、＞7,500倍、＞10,000倍。在一些態樣中，富集在胞外體中的包含沒有N端M 之MARCKS、MARCKSL1、BASP1、沒有N端M之SEQ ID NO：4至109中任一者、或沒有N端M之本文所揭示的任何序列(例如表1)之融合蛋白質比缺乏沒有N端M 之MARCKS、MARCKSL1、BASP1、沒有N端M之SEQ ID NO：4至109中任一者、或沒有N端M之本文所揭示的任何序列(例如表1)之融合蛋白質或與包含習知的EV (例如胞外體)蛋白質之融合蛋白質相比而高＞2倍、＞4倍、＞8倍、＞16倍、＞25倍、＞50倍、＞100倍、＞200倍、＞500倍、＞750倍、＞1,000倍、＞2,000倍、＞5,000倍、＞7,500倍、＞10,000倍。
在一些實施態樣中，富集在胞外體中的包含MARCKS、MARCKSL1、BASP1、SEQ ID NO：4至109中任一者、沒有N端M之相應序列、或沒有N端M之本文所揭示的任何支架蛋白質序列(例如表1)之融合蛋白質比缺乏MARCKS、MARCKSL1、BASP1、SEQ ID NO：4至109中任一者、沒有N端M之相應序列、或沒有N端M之本文所揭示的任何支架蛋白質序列(例如表1)之融合蛋白質或與包含習知的EV (例如胞外體)蛋白質之融合蛋白質相比而高至少約2倍、至少約4倍、至少約6倍、至少約8倍、至少約10倍、至少約12倍、至少約14倍、至少約16倍、至少約18倍、至少約20倍、至少約25倍、至少約30倍、至少約35倍、至少約40倍、至少約45倍、至少約50倍、至少約60倍、至少約70倍、至少約80倍、至少約90倍、至少約100倍、至少約200倍、至少約300倍、至少約400倍、至少約500倍、至少約750倍、至少約1,000倍、至少約1,500倍、至少約2,000倍、至少約2,500倍、至少約3,000倍、至少約3,500倍、至少約4,000倍、至少約4,500倍、至少約5,000倍、至少約5,500倍、至少約6,000倍、至少約6,500倍、至少約7,000倍、至少約7,500倍、至少約8,000倍、至少約8,500倍、至少約9,000倍、至少約9,500倍或至少約10,000倍。
在一些實施態樣中，SEQ ID NO：1至109中任一者之蛋白質序列、沒有N端M之相應序列、或沒有N端M之本文所揭示的任何支架蛋白質序列(例如表1)足夠以融合蛋白質裝載EV (例如胞外體)。
在一些實施態樣中，包含含有外源序列(例如生物活性分子)及本文最新鑑定之EV (例如胞外體)腔蛋白質(支架蛋白質)之融合蛋白質的經腔工程化之EV (例如胞外體)具有比包含共軛至本技術中已知之習知的EV (例如胞外體)蛋白質(例如CD9、CD63、CD81、PDGFR、GPI錨蛋白質、乳凝集素、LAMP2和LAMP2B、其片段或結合至其之肽)之外源序列的類似工程化EV (例如胞外體)更高的融合蛋白質密度。
在一些實施態樣中，含有本文最新鑑定之EV (例如胞外體)腔蛋白質(支架蛋白質)之融合蛋白質係以比使用習知的EV (例如胞外體)蛋白質經類似修飾之其他的EV (例如胞外體)腔表面中之融合蛋白質高2、4、8、16、32、64、100、200、400、800、1,000倍或更高的密度存在於EV (例如胞外體)腔表面中。
在一些實施態樣中，含有本文最新鑑定之EV (例如胞外體)腔蛋白質(支架蛋白質)之融合蛋白質係以比使用習知的EV (例如胞外體)蛋白質經類似修飾之其他的EV (例如胞外體)腔表面中之融合蛋白質高2至4倍、4至8倍、8至16倍、16至32倍、32至64倍、64至100倍、100至200倍、200至400倍、400至800倍、800至1,000倍或更高的密度存在於EV (例如胞外體)腔表面中。
在一些實施態樣中，包含本發明的支架蛋白質(例如胞外體腔蛋白質)(例如MARCKS、變異體、片段、片段之變異體或其修飾物)之融合蛋白質係以比使用CD9經類似修飾之EV (例如胞外體)高2、4、8、16、32、64、100、200、400、800、1,000倍或更高的密度存在。
在一些實施態樣中，包含本發明的支架蛋白質(例如胞外體腔蛋白質)(例如MARCKS、變異體、片段、片段之變異體或其修飾物)之融合蛋白質係以比使用CD63經類似修飾之EV (例如胞外體)高2、4、8、16、32、64、100、200、400、800、1,000倍或更高的密度存在。
在一些實施態樣中，包含本發明的支架蛋白質(例如胞外體腔蛋白質)(例如MARCKS、變異體、片段、片段之變異體或其修飾物)之融合蛋白質係以比使用CD81經類似修飾之EV (例如胞外體)高2、4、8、16、32、64、100、200、400、800、1,000倍或更高的密度存在。
在一些實施態樣中，包含本發明的支架蛋白質(例如胞外體腔蛋白質)(例如MARCKS、變異體、片段、片段之變異體或其修飾物)之融合蛋白質係以比使用PDGFR經類似修飾之EV (例如胞外體)高2、4、8、16、32、64、100、200、400、800、1,000倍或更高的密度存在。
在一些實施態樣中，包含本發明的支架蛋白質(例如胞外體腔蛋白質)(例如MARCKS、變異體、片段、片段之變異體或其修飾物)之融合蛋白質係以比使用GPI錨蛋白質經類似修飾之EV (例如胞外體)高2、4、8、16、32、64、100、200、400、800、1,000倍或更高的密度存在。
在一些實施態樣中，包含本發明的支架蛋白質(例如胞外體腔蛋白質)(例如MARCKS、變異體、片段、片段之變異體或其修飾物)之融合蛋白質係以比使用乳凝集素經類似修飾之EV (例如胞外體)高2、4、8、16、32、64、100、200、400、800、1,000倍或更高的密度存在。
在一些實施態樣中，包含本發明的支架蛋白質(例如胞外體腔蛋白質)(例如MARCKS、變異體、片段、片段之變異體或其修飾物)之融合蛋白質係以比使用LAMP2經類似修飾之EV (例如胞外體)高2、4、8、16、32、64、100、200、400、800、1,000倍或更高的密度存在。
在一些實施態樣中，包含本發明的支架蛋白質(例如胞外體腔蛋白質)(例如MARCKS、變異體、片段、片段之變異體或其修飾物)之融合蛋白質係以比使用LAMP2B經類似修飾之EV (例如胞外體)高2、4、8、16、32、64、100、200、400、800、1,000倍或更高的密度存在。
在一些實施態樣中，包含本發明的支架蛋白質(例如胞外體腔蛋白質)(例如MARCKS、變異體、片段、片段之變異體或其修飾物)之融合蛋白質係以比使用習知的蛋白質經類似修飾之EV (例如胞外體)高2、4、8、16、32、64、100、200、400、800、1,000倍或更高的密度存在。
在一些實施態樣中，包含本發明的支架蛋白質(例如胞外體腔蛋白質)(例如MARCKS、變異體、片段、片段之變異體或其修飾物)之融合蛋白質係以比使用習知的EV (例如胞外體)蛋白質之變異體經類似修飾之EV (例如胞外體)高2、4、8、16、32、64、100、200、400、800、1,000倍或更高的密度存在。
在一些實施態樣中，包含本發明的支架蛋白質(例如胞外體腔蛋白質)(例如MARCKSL1、變異體、片段、片段之變異體或其修飾物)之融合蛋白質係以比使用CD9經類似修飾之EV (例如胞外體)高2、4、8、16、32、64、100、200、400、800、1,000倍或更高的密度存在。
在一些實施態樣中，包含本發明的支架蛋白質(例如胞外體腔蛋白質)(例如MARCKSL1、變異體、片段、片段之變異體或其修飾物)之融合蛋白質係以比使用CD63經類似修飾之EV (例如胞外體)高2、4、8、16、32、64、100、200、400、800、1,000倍或更高的密度存在。
在一些實施態樣中，包含本發明的支架蛋白質(例如胞外體腔蛋白質)(例如MARCKSL1、變異體、片段、片段之變異體或其修飾物)之融合蛋白質係以比使用CD81經類似修飾之EV (例如胞外體)高2、4、8、16、32、64、100、200、400、800、1,000倍或更高的密度存在。
在一些實施態樣中，包含本發明的支架蛋白質(例如胞外體腔蛋白質)(例如MARCKSL1、變異體、片段、片段之變異體或其修飾物)之融合蛋白質係以比使用PDGFR經類似修飾之EV (例如胞外體)高2、4、8、16、32、64、100、200、400、800、1,000倍或更高的密度存在。
在一些實施態樣中，包含本發明的支架蛋白質(例如胞外體腔蛋白質)(例如MARCKSL1、變異體、片段、片段之變異體或其修飾物)之融合蛋白質係以比使用GPI錨蛋白質經類似修飾之EV (例如胞外體)高2、4、8、16、32、64、100、200、400、800、1,000倍或更高的密度存在。
在一些實施態樣中，包含本發明的支架蛋白質(例如胞外體腔蛋白質)(例如MARCKSL1、變異體、片段、片段之變異體或其修飾物)之融合蛋白質係以比使用乳凝集素經類似修飾之EV (例如胞外體)高2、4、8、16、32、64、100、200、400、800、1,000倍或更高的密度存在。
在一些實施態樣中，包含本發明的支架蛋白質(例如胞外體腔蛋白質)(例如MARCKSL1、變異體、片段、片段之變異體或其修飾物)之融合蛋白質係以比使用LAMP2經類似修飾之EV (例如胞外體)高2、4、8、16、32、64、100、200、400、800、1,000倍或更高的密度存在。
在一些實施態樣中，包含本發明的支架蛋白質(例如胞外體腔蛋白質)(例如MARCKSL1、變異體、片段、片段之變異體或其修飾物)之融合蛋白質係以比使用LAMP2B經類似修飾之EV (例如胞外體)高2、4、8、16、32、64、100、200、400、800、1,000倍或更高的密度存在。
在一些實施態樣中，包含本發明的支架蛋白質(例如胞外體腔蛋白質)(例如MARCKSL1、變異體、片段、片段之變異體或其修飾物)之融合蛋白質係以比使用習知的蛋白質經類似修飾之EV (例如胞外體)高2、4、8、16、32、64、100、200、400、800、1,000倍或更高的密度存在。
在一些實施態樣中，包含本發明的支架蛋白質(例如胞外體腔蛋白質)(例如MARCKSL1、變異體、片段、片段之變異體或其修飾物)之融合蛋白質係以比使用習知的EV (例如胞外體)蛋白質之變異體經類似修飾之EV (例如胞外體)高2、4、8、16、32、64、100、200、400、800、1,000倍或更高的密度存在。
在一些實施態樣中，包含本發明的支架蛋白質(例如胞外體腔蛋白質)(例如BASP1、變異體、片段、片段之變異體或其修飾物)之融合蛋白質係以比使用CD9經類似修飾之EV (例如胞外體)高2、4、8、16、32、64、100、200、400、800、1,000倍或更高的密度存在。
在一些實施態樣中，包含本發明的支架蛋白質(例如胞外體腔蛋白質)(例如BASP1、變異體、片段、片段之變異體或其修飾物)之融合蛋白質係以比使用CD63經類似修飾之EV (例如胞外體)高2、4、8、16、32、64、100、200、400、800、1,000倍或更高的密度存在。
在一些實施態樣中，包含本發明的支架蛋白質(例如胞外體腔蛋白質)(例如BASP1、變異體、片段、片段之變異體或其修飾物)之融合蛋白質係以比使用CD81經類似修飾之EV (例如胞外體)高2、4、8、16、32、64、100、200、400、800、1,000倍或更高的密度存在。
在一些實施態樣中，包含本發明的支架蛋白質(例如胞外體腔蛋白質)(例如BASP1、變異體、片段、片段之變異體或其修飾物)之融合蛋白質係以比使用PDGFR經類似修飾之EV (例如胞外體)高2、4、8、16、32、64、100、200、400、800、1,000倍或更高的密度存在。
在一些實施態樣中，包含本發明的支架蛋白質(例如胞外體腔蛋白質)(例如BASP1、變異體、片段、片段之變異體或其修飾物)之融合蛋白質係以比使用GPI錨蛋白質經類似修飾之EV (例如胞外體)高2、4、8、16、32、64、100、200、400、800、1,000倍或更高的密度存在。
在一些實施態樣中，包含本發明的支架蛋白質(例如胞外體腔蛋白質)(例如BASP1、變異體、片段、片段之變異體或其修飾物)之融合蛋白質係以比使用乳凝集素經類似修飾之EV (例如胞外體)高2、4、8、16、32、64、100、200、400、800、1,000倍或更高的密度存在。
在一些實施態樣中，包含本發明的支架蛋白質(例如胞外體腔蛋白質)(例如BASP1、變異體、片段、片段之變異體或其修飾物)之融合蛋白質係以比使用LAMP2經類似修飾之EV (例如胞外體)高2、4、8、16、32、64、100、200、400、800、1,000倍或更高的密度存在。
在一些實施態樣中，包含本發明的支架蛋白質(例如胞外體腔蛋白質)(例如BASP1、變異體、片段、片段之變異體或其修飾物)之融合蛋白質係以比使用LAMP2B經類似修飾之EV (例如胞外體)高2、4、8、16、32、64、100、200、400、800、1,000倍或更高的密度存在。
在一些實施態樣中，包含本發明的支架蛋白質(例如胞外體腔蛋白質)(例如BASP1、變異體、片段、片段之變異體或其修飾物)之融合蛋白質係以比使用習知的蛋白質經類似修飾之EV (例如胞外體)高2、4、8、16、32、64、100、200、400、800、1,000倍或更高的密度存在。
在一些實施態樣中，包含本發明的支架蛋白質(例如胞外體腔蛋白質)(例如BASP1、變異體、片段、片段之變異體或其修飾物)之融合蛋白質係以比使用習知的EV (例如胞外體)蛋白質之變異體經類似修飾之EV (例如胞外體)高2、4、8、16、32、64、100、200、400、800、1,000倍或更高的密度存在。
在一些實施態樣中，包含SEQ ID NO：1至109中任一者、沒有N端M之相應序列、或沒有N端M之本文所揭示的任何支架蛋白質序列(例如表1)之融合蛋白質係以比使用CD9經類似修飾之EV (例如胞外體)高2、4、8、16、32、64、100、200、400、800、1,000倍或更高的密度存在。在一些態樣中，EV (例如胞外體)包含融合蛋白質(其包含SEQ ID NO：1至109中任一者)，其中融合蛋白質不包含N端Met，且其中融合蛋白質係以比使用CD9經類似修飾之EV (例如胞外體)高2、4、8、16、32、64、100、200、400、800、1,000倍或更高的密度存在。
在一些實施態樣中，包含SEQ ID NO：1至109中任一者、沒有N端M之相應序列、或沒有N端M之本文所揭示的任何支架蛋白質序列(例如表1)之融合蛋白質係以比使用CD63經類似修飾之EV (例如胞外體)高2、4、8、16、32、64、100、200、400、800、1,000倍或更高的密度存在。在一些態樣中，EV (例如胞外體)包含融合蛋白質(其包含SEQ ID NO：1至109中任一者)，其中融合蛋白質不包含N端Met，且其中融合蛋白質係以比使用CD63經類似修飾之EV (例如胞外體)高2、4、8、16、32、64、100、200、400、800、1,000倍或更高的密度存在。
在一些實施態樣中，包含SEQ ID NO：1至109中任一者、沒有N端M之相應序列、或沒有N端M之本文所揭示的任何支架蛋白質序列(例如表1)之融合蛋白質係以比使用CD81經類似修飾之EV (例如胞外體)高2、4、8、16、32、64、100、200、400、800、1,000倍或更高的密度存在。在一些態樣中，EV (例如胞外體)包含融合蛋白質(其包含SEQ ID NO：1至109中任一者)，其中融合蛋白質不包含N端Met，且其中融合蛋白質係以比使用CD81經類似修飾之EV (例如胞外體)高2、4、8、16、32、64、100、200、400、800、1,000倍或更高的密度存在。
在一些實施態樣中，包含SEQ ID NO：1至109中任一者、沒有N端M之相應序列、或沒有N端M之本文所揭示的任何支架蛋白質序列(例如表1)之融合蛋白質係以比使用PDGFR經類似修飾之EV (例如胞外體)高2、4、8、16、32、64、100、200、400、800、1,000倍或更高的密度存在。在一些態樣中，EV (例如胞外體)包含融合蛋白質(其包含SEQ ID NO：1至109中任一者)，其中融合蛋白質不包含N端Met，且其中融合蛋白質係以比使用PDGFR經類似修飾之EV (例如胞外體)高2、4、8、16、32、64、100、200、400、800、1,000倍或更高的密度存在。
在一些實施態樣中，包含SEQ ID NO：1至109中任一者、沒有N端M之相應序列、或沒有N端M之本文所揭示的任何支架蛋白質序列(例如表1)之融合蛋白質係以比使用GPI錨蛋白質經類似修飾之EV (例如胞外體)高2、4、8、16、32、64、100、200、400、800、1,000倍或更高的密度存在。在一些態樣中，EV (例如胞外體)包含融合蛋白質(其包含SEQ ID NO：1至109中任一者)，其中融合蛋白質不包含N端Met，且其中融合蛋白質係以比使用GPI錨蛋白質經類似修飾之EV (例如胞外體)高2、4、8、16、32、64、100、200、400、800、1,000倍或更高的密度存在。
在一些實施態樣中，包含SEQ ID NO：1至109中任一者、沒有N端M之相應序列、或沒有N端M之本文所揭示的任何支架蛋白質序列(例如表1)之融合蛋白質係以比使用乳凝集素經類似修飾之EV (例如胞外體)高2、4、8、16、32、64、100、200、400、800、1,000倍或更高的密度存在。在一些態樣中，EV (例如胞外體)包含融合蛋白質(其包含SEQ ID NO：1至109中任一者)，其中融合蛋白質不包含N端Met，且其中融合蛋白質係以比使用乳凝集素經類似修飾之EV (例如胞外體)高2、4、8、16、32、64、100、200、400、800、1,000倍或更高的密度存在。
在一些實施態樣中，包含SEQ ID NO：1至109中任一者、沒有N端M之相應序列、或沒有N端M之本文所揭示的任何支架蛋白質序列(例如表1)之融合蛋白質係以比使用LAMP2經類似修飾之EV (例如胞外體)高2、4、8、16、32、64、100、200、400、800、1,000倍或更高的密度存在。在一些態樣中，EV (例如胞外體)包含融合蛋白質(其包含SEQ ID NO：1至109中任一者)，其中融合蛋白質不包含N端Met，且其中融合蛋白質係以比使用LAMP2經類似修飾之EV (例如胞外體)高2、4、8、16、32、64、100、200、400、800、1,000倍或更高的密度存在。
在一些實施態樣中，包含SEQ ID NO：1至109中任一者、沒有N端M之相應序列、或沒有N端M之本文所揭示的任何支架蛋白質序列(例如表1)之融合蛋白質係以比使用LAMP2B經類似修飾之EV (例如胞外體)高2、4、8、16、32、64、100、200、400、800、1,000倍或更高的密度存在。在一些態樣中，EV (例如胞外體)包含融合蛋白質(其包含SEQ ID NO：1至109中任一者)，其中融合蛋白質不包含N端Met，且其中融合蛋白質係以比使用LAMP2Bt經類似修飾之EV (例如胞外體)高2、4、8、16、32、64、100、200、400、800、1,000倍或更高的密度存在。
在一些實施態樣中，包含SEQ ID NO：1至109中任一者、沒有N端M之相應序列、或沒有N端M之本文所揭示的任何支架蛋白質序列(例如表1)之融合蛋白質係以比使用習知的蛋白質經類似修飾之EV (例如胞外體)高2、4、8、16、32、64、100、200、400、800、1,000倍或更高的密度存在。在一些態樣中，EV (例如胞外體)包含融合蛋白質(其包含SEQ ID NO：1至109中任一者)，其中融合蛋白質不包含N端Met，且其中融合蛋白質係以比使用習知的蛋白質經類似修飾之EV (例如胞外體)高2、4、8、16、32、64、100、200、400、800、1,000倍或更高的密度存在。
在一些實施態樣中，包含SEQ ID NO：1至109中任一者、沒有N端M之相應序列、或沒有N端M之本文所揭示的任何支架蛋白質序列(例如表1)之融合蛋白質係以比使用習知的EV蛋白質(例如胞外體蛋白質)之變異體經類似修飾之EV (例如胞外體)高2、4、8、16、32、64、100、200、400、800、1,000倍或更高的密度存在。在一些態樣中，EV (例如胞外體)包含融合蛋白質(其包含SEQ ID NO：1至109中任一者)，其中融合蛋白質不包含N端Met，且其中融合蛋白質係以比使用習知的EV蛋白質(例如胞外體蛋白質)之變異體經類似修飾之EV (例如胞外體)高2、4、8、16、32、64、100、200、400、800、1,000倍或更高的密度存在。
在一些實施態樣中，與本技術中已知的經腔工程化之EV (例如胞外體)相比，本文所述的經腔工程化之EV (例如胞外體)證明卓越的特徵。例如，與例如那些使用習知的EV (例如胞外體)蛋白質生產之先前技術中的EV (例如胞外體)相比，藉由使用本文所提供的最新鑑定之EV (例如胞外體)蛋白質生產之經腔工程化之EV (例如胞外體)含有更高度富集在其腔表面上的經修飾之蛋白質。
而且，與本技術中已知的經腔工程化之EV (例如胞外體)相比，本發明的經腔工程化之EV (例如胞外體)可具有更大、更特異性或更受控的生物活性。例如，包含融合至本文所述之EV (例如胞外體)蛋白質或其片段(例如本發明的支架，諸如BASP1或其片段、變異體或衍生物)之酬載(例如治療或生物相關外源序列)的經腔工程化之EV (例如胞外體)可具有比融合至本技術中已知的支架之融合物更期望的工程化特徵。
在本技術中已知的支架蛋白質包括四跨膜蛋白(tetraspanin)分子(例如CD63、CD81、CD9和其他)、溶酶體相關膜蛋白質2 (LAMP2和LAMP2B)、血小板衍生型生長因子受體(PDGFR)、GPI錨蛋白質、乳凝集素和其片段及對該等蛋白質或其片段中任一者具有親和性之肽。為了避免疑惑，PTGFRN、BSG、IGSF2、IGSF3、IGSF8、ITGB1、ITGA4、SLC3A2、ATP轉運子或其片段或變異體不為習知的EV (例如胞外體)蛋白質。外源蛋白質的過度表現於先前係依賴於外源蛋白質隨機或任意配置於胞外體中以生產經腔工程化之胞外體。這導致胞外體中的外源蛋白質之低水平、不可預測的密度。因此，本文所述之EV (例如胞外體)蛋白質及其片段對新穎EV (例如胞外體)組成物及其製造方法提供重要的進展。
本文所提供的融合蛋白質可包含本發明的支架蛋白質(例如胞外體腔蛋白質)(諸如MARCKS、MARCKSL1、BASP1或其片段、變異體或衍生物)及附加肽。附加肽可附著至EV (例如胞外體)蛋白質(支架蛋白質)或其片段、變異體或衍生物之N端或C端。
在一些實施態樣中，本文所提供的融合蛋白質包含本發明的支架蛋白質(諸如MARCKS、MARCKSL1 、BASP1或其片段、變異體或衍生物)及兩種附加肽。兩種附加肽皆可附著至EV (例如胞外體)蛋白質(支架蛋白質)或其片段、變異體或衍生物之N端或C端。在一些實施態樣中，兩種附加肽中之一者係附著至EV (例如胞外體)蛋白質(支架蛋白質)或其片段、變異體或衍生物之N端及兩種附加肽中之另一者係附著至其C端。
在一些實施態樣中，產生本文所述的經腔工程化之細胞外囊泡的組成物及方法包含奈米囊泡。 IV. 用於生產經腔工程化之EV (例如胞外體)的生產子細胞
本發明的EV (例如胞外體)可自試管內生長之細胞或自個體的體液生產。當EV (例如胞外體)係自試管內細胞培養物生產時，可於本發明使用各種生產子細胞，例如HEK293細胞。可用於生產本文所述的經腔工程化之EV (例如胞外體)的額外細胞類型包括而不限於間質幹細胞、T細胞、B細胞、樹狀細胞、巨噬細胞和癌細胞株。
因此，本發明提供生產本發明的EV (例如胞外體)之細胞。在一些實施態樣中，包含一或多種載體，其中載體包含編碼支架蛋白質及酬載(例如生物活性分子)的核酸序列。在一些實施態樣中，核酸序列編碼支架蛋白質及第二核酸序列編碼酬載(例如生物活性分子)。在一些實施態樣中，編碼支架蛋白質之核酸序列及編碼酬載(例如生物活性分子)之核酸序列係於單一開放閱讀框中；因此，表現產物可為包含融合至酬載(例如生物活性分子)的支架蛋白質之融合蛋白質。在一些實施態樣中，核酸序列可操作地連結至啟動子。
生產子細胞可經基因修飾以包含一或多種用於生產經腔工程化之EV (例如胞外體)之外源序列。經基因修飾之生產子細胞可藉由瞬間或穩定的轉變而含有外源序列。外源序列可轉變為質體。外源序列可在靶定之位點上或任意的位點中穩定地整合至生產子細胞之基因組序列中。在一些實施態樣中，產生穩定的細胞株以生產經腔工程化之EV (例如胞外體)。
外源序列可插入位於編碼EV (例如胞外體)蛋白質之內源序列的上游(5’-末端)或下游(3’-末端)內的生產子細胞之基因組序列中。可使用本技術中已知的各種方法引入外源序列至生產子細胞中。例如，使用各種基因編輯方法(例如使用同源性重組、轉位子媒介系統、loxP-Cre系統、CRISPR/Cas9或TALEN之方法)修飾之細胞係在本發明的範疇內。
外源序列可包含編碼本發明的支架蛋白質(例如EV (例如胞外體)蛋白質或EV (例如胞外體)蛋白質之修飾物或片段)之序列。可引入編碼支架蛋白質(例如EV (例如胞外體)蛋白質)之序列的額外拷貝以生產具有更高密度的EV (例如胞外體)蛋白質的經腔工程化之EV (例如胞外體)。可引入編碼EV (例如胞外體)蛋白質之修飾物或片段的外源序列以生產含有EV (例如胞外體)蛋白質之修飾物或片段的經腔工程化之EV (例如胞外體)。可引入編碼親和性標籤之外源序列以生產含有包含附著至EV (例如胞外體)蛋白質的親和性標籤之融合蛋白質的經腔工程化之EV (例如胞外體)。
在一些實施態樣中，經腔工程化之EV (例如胞外體)具有比自相同或類似的生產子細胞類型單離之原始EV (例如胞外體)更高密度的EV (例如胞外體)蛋白質(支架蛋白質)。在一些實施態樣中，該EV (例如胞外體)蛋白質(支架蛋白質)係以比原始EV (例如胞外體)高2、4、8、16、32、64、100、200、400、800、1,000倍或更高的密度存在於該經腔工程化之EV (例如胞外體)上。在一些實施態樣中，EV (例如胞外體)蛋白質(支架蛋白質)係以比原始EV (例如胞外體)高2至4倍、4至8倍、8至16倍、16至32倍、32至64倍、64至100倍、100至200倍、200至400倍、400至800倍、800至1,000倍或更高的密度存在於經腔工程化之EV (例如胞外體)上。在一些實施態樣中，包含EV (例如胞外體)蛋白質(支架蛋白質)之融合蛋白質係以比原始EV (例如胞外體)上的未經修飾之EV (例如胞外體)蛋白質(支架蛋白質)高2至4倍、4至8倍、8至16倍、16至32倍、32至64倍、64至100倍、100至200倍、200至400倍、400至800倍、800至1,000倍或更高的密度存在於該經腔工程化之EV (例如胞外體)上。在一些實施態樣中，EV (例如胞外體)蛋白質(支架蛋白質)之片段或變異體係以比原始EV (例如胞外體)上的未經修飾之EV (例如胞外體)蛋白質(支架蛋白質)高2至4倍、4至8倍、8至16倍、16至32倍、32至64倍、64至100倍、100至200倍、200至400倍、400至800倍、800至1,000倍或更高的密度存在於經腔工程化之EV (例如胞外體)上。
在特別的實施態樣中，MARCKS、MARCKS之片段或變異體或其修飾物係以比該原始EV (例如胞外體)上的未經修飾之MARCKS高2至4倍、4至8倍、8至16倍、16至32倍、32至64倍、64至100倍、100至200倍、200至400倍、400至800倍、800至1,000倍或更高的密度存在於該經腔工程化之EV (例如胞外體)上。在一些實施態樣中，MARCKSL1、MARCKSL1之片段或變異體或其修飾物係以比該原始EV (例如胞外體)上的未經修飾之MARCKSL1高2至4倍、4至8倍、8至16倍、16至32倍、32至64倍、64至100倍、100至200倍、200至400倍、400至800倍、800至1,000倍或更高的密度存在於該經腔工程化之EV (例如胞外體)上。在一些實施態樣中，BASP1、BASP1之片段或變異體或其修飾物係以比該原始EV (例如胞外體)上的未經修飾之BASP1高2至4倍、4至8倍、8至16倍、16至32倍、32至64倍、64至100倍、100至200倍、200至400倍、400至800倍、800至1,000倍或更高的密度存在於該經腔工程化之EV (例如胞外體)上。
在一些實施態樣中，生產子細胞進一步經修飾以包含附加的外源序列。例如，可包括附加的外源序列以調控內源基因表現或生產包括特定的多肽作為酬載之胞外體。在一些實施態樣中，生產子細胞係經修飾以包含兩種外源序列，一種編碼EV (例如胞外體)蛋白質(支架蛋白質)或EV (例如胞外體)蛋白質(支架蛋白質)之修飾物或片段及另一種編碼酬載。
更特定言之，經腔工程化之EV (例如胞外體)可自以編碼一或多種包括但不限於下列的胞外體腔蛋白質(支架蛋白質)之序列轉變之細胞生產：(1)肉豆蔻醯基化丙胺酸富集之蛋白激酶C受質(MARCKS)；(2)肉豆蔻醯基化丙胺酸富集之蛋白激酶C受質樣1 (MARCKSL1)；及(3)腦酸可溶性蛋白質1 (BASP1)。本文所述之一或多種EV (例如胞外體)腔蛋白質(支架蛋白質)中任一者可自質體、插入基因組中的外源序列或其他的外源核酸(諸如合成信使RNA (mRNA))表現。
在一些實施態樣中，一或多種EV (例如胞外體)腔蛋白質(支架蛋白質)係表現在以編碼其全長內源形式的外源序列轉變之細胞中。在一些實施態樣中，此種外源序列編碼SEQ ID NO：1或沒有N端M之相應序列之MARCKS蛋白質。在特定的態樣中，此種外源序列編碼SEQ ID NO：1之MARCKS蛋白質。在一些實施態樣中，此種外源序列編碼SEQ ID NO：1之MARCKS蛋白質，其中以外源序列編碼之MARKS蛋白質不包含N端Met。在一些實施態樣中，此種外源序列編碼SEQ ID NO：2或沒有N端M之相應序列之MARCKSL1蛋白質。在特定的態樣中，此種外源序列編碼SEQ ID NO：2之MARCKSL1蛋白質。在一些實施態樣中，此種外源序列編碼SEQ ID NO：2之MARCKSL1蛋白質，其中以外源序列編碼之MARCKSL1蛋白質不包含N端Met。在一些實施態樣中，此種外源序列編碼SEQ ID NO：3或沒有N端M之相應序列之BASP1蛋白質。在特定的態樣中，此種外源序列編碼SEQ ID NO：3之BASP1蛋白質。在一些實施態樣中，此種外源序列編碼SEQ ID NO：3之BASP1蛋白質，其中以外源序列編碼之BASP1蛋白質不包含N端Met。
經腔工程化之EV (例如胞外體)可自以編碼一或多種包括但不限於下列的胞外體腔蛋白質(支架蛋白質)之片段的多核苷酸序列轉變之細胞生產：(1)肉豆蔻醯基化丙胺酸富集之蛋白激酶C受質(MARCKS)；(2)肉豆蔻醯基化丙胺酸富集之蛋白激酶C受質樣1 (MARCKSL1)；及(3)腦酸可溶性蛋白質1 (BASP1)。
在一些實施態樣中，多核苷酸序列編碼自原始蛋白質之N端缺乏至少5、10、50、100、200或300個胺基酸的EV (例如胞外體)腔蛋白質(例如支架蛋白質，諸如MARCKS、MARCKSL1或BASP1)之片段。在一些實施態樣中，多核苷酸序列編碼自原始蛋白質之C端缺乏至少5、10、50、100、200或300個胺基酸的EV (例如胞外體)腔蛋白質(例如支架蛋白質，諸如MARCKS、MARCKSL1或BASP1)之片段。在一些實施態樣中，多核苷酸序列編碼自原始蛋白質之N端及C端二者缺乏至少5、10、50、100、200或300個胺基酸的EV (例如胞外體)腔蛋白質(例如支架蛋白質，諸如MARCKS、MARCKSL1或BASP1)之片段。在一些實施態樣中，多核苷酸序列編碼缺乏原始蛋白質之一或多個功能性或結構性結構域的EV (例如胞外體)腔蛋白質(例如支架蛋白質，諸如MARCKS、MARCKSL1或BASP1)之片段。
在一些實施態樣中，融合蛋白質包含SEQ ID NO：4至109、沒有N端M之相應序列、或沒有N端M之本文所揭示的任何支架蛋白質序列(例如表1)之肽。在一些實施態樣中，融合蛋白質包含SEQ ID NO：4至109或本文所揭示之任何支架蛋白質序列(例如表1)之肽，其中融合蛋白質不包含N端Met。在一些實施態樣中，融合蛋白質包含SEQ ID NO：13之肽。在一些實施態樣中，融合蛋白質包含SEQ ID NO：13之肽，其中融合蛋白質不包含N端Met。在一些實施態樣中，融合蛋白質包含支架蛋白質(例如胞外體腔蛋白質)，其包含具有序列MGXKLSKKK (SEQ ID NO：117)或GXKLSKKK (SEQ ID NO:425)之肽，其中X為丙胺酸或任何其他的胺基酸。在一些實施態樣中，融合蛋白質包含支架蛋白質(例如胞外體腔蛋白質)，其包含具有序列GXKLSKKK (SEQ ID NO:425)之肽，其中X為丙胺酸或任何其他的胺基酸，且其中支架蛋白質(例如胞外體腔蛋白質)不包含N端Met。在一些實施態樣中，融合蛋白質包含支架蛋白質(例如胞外體腔蛋白質)，其包含具有序列GXKLSKKK (SEQ ID NO:425)之肽，其中X為丙胺酸或任何其他的胺基酸，且其中融合蛋白質不包含N端Met。在一些實施態樣中，融合蛋白質包含支架蛋白質，其包含GXKLSKKK (SEQ ID NO:425)之胺基酸序列，其中X為丙胺酸或任何其他的胺基酸，其中支架蛋白質在胺基酸序列之N端上不具有Met，例如其不包含MGXKLSKKK (SEQ ID NO：117)。在其他的實施態樣中，融合蛋白質包含支架蛋白質(例如胞外體腔蛋白質)，其包含GXKLSKKK (SEQ ID NO：425)之胺基酸序列，其中融合蛋白質不包含MGXKLSKKK。在一些實施態樣中，融合蛋白質包含支架蛋白質，其包含具有序列(M)(G)(π)(ξ)(Φ/π)(S/A/G/N)(+)(+)或(G)(π)(ξ)(Φ/π)(S/A/G/N)(+)(+)之肽，其中各括號位置表示胺基酸，且其中π為選自由下列者所組成之群組的任何胺基酸：(Pro、Gly、Ala、Ser)，ξ為選自由下列者所組成之群組的任何胺基酸：(Asn、Gln、Ser、Thr、Asp、Glu、Lys、His、Arg)，Φ為選自由下列者所組成之群組的任何胺基酸：(Val、Ile、Leu、Phe、Trp、Tyr、Met)，且(+)為選自由下列者所組成之群組的任何胺基酸：(Lys、Arg、His)；且其中位置五不為(+)，及位置六既不為(+)，亦不為(Asp或Glu)。在一些實施態樣中，融合蛋白質包含支架蛋白質(例如胞外體腔蛋白質)，其包含(G)(π)(ξ)(Φ/π) (S/A/G/N)(+)(+)之胺基酸序列，其中融合蛋白質不包含(M)(G)(π)(ξ)(Φ/π)(S/A/G/N)(+)(+)。在一些實施態樣中，融合蛋白質包含支架蛋白質(例如胞外體腔蛋白質)，其包含具有序列(M)(G)(π)(X)(Φ/π)(π)(+)(+)或(G)(π)(X)(Φ/π) (π)(+)(+)之肽，其中各括號位置表示胺基酸，且其中π為選自由下列者所組成之群組的任何胺基酸：(Pro、Gly、Ala、Ser)，X為任何胺基酸，Φ為選自由下列者所組成之群組的任何胺基酸：(Val、Ile、Leu、Phe、Trp、Tyr、Met)，且(+)為選自由下列者所組成之群組的任何胺基酸：(Lys、Arg、His)；且其中位置五不為(+)，及位置六既不為(+)，亦不為(Asp或Glu)。在其他的實施態樣中，融合蛋白質包含支架蛋白質(例如胞外體腔蛋白質)，其包含(G)(π)(X)(Φ/π)(π)(+)(+)之胺基酸序列，其中融合蛋白質不包含(M)(G)(π)(X)(Φ/π)(π)(+)(+)。
在一些實施態樣中，經腔工程化之EV (例如胞外體)可自以編碼融合至一或多種異源蛋白質之EV (例如胞外體)蛋白質(例如支架蛋白質，例如胞外體腔蛋白質，諸如MARCKS、MARCKSL1或BASP1)或其片段或修飾物之序列轉變之細胞生產。在一些實施態樣中，一或多種異源蛋白質係融合至EV (例如胞外體)蛋白質(例如支架蛋白質，諸如MARCKS、MARCKSL1或BASP1)或其修飾物(特別為其片段或變異體)之N端。在一些實施態樣中，一或多種異源蛋白質係融合至EV (例如胞外體)蛋白質(例如支架蛋白質，諸如MARCKS、MARCKSL1或BASP1)或其修飾物(特別為其片段或變異體)之C端。在一些實施態樣中，一或多種異源蛋白質係融合至EV (例如胞外體)蛋白質(例如支架蛋白質，諸如MARCKS、MARCKSL1或BASP1)或其修飾物(特別為其片段或變異體)之N端及C端。在一些實施態樣中，一或多種異源蛋白質為哺乳動物蛋白質。在一些實施態樣中，一或多種異源蛋白質為人類蛋白質。
在一些實施態樣中，經腔工程化之EV (例如胞外體)係自以編碼與包括但不限於下列的原始EV (例如胞外體)腔蛋白質(支架蛋白質)之全長或片段相同或類似的序列之多肽的序列轉變之細胞生產： (1) 肉豆蔻醯基化丙胺酸富集之蛋白激酶C受質 (MARCKS)； (2) 肉豆蔻醯基化丙胺酸富集之蛋白激酶C受質樣1 (MARCKSL1)；及 (3) 腦酸可溶性蛋白質1 (BASP1)。
在一些實施態樣中，多肽與原始EV (例如胞外體)腔蛋白質(支架蛋白質)之全長或片段為至少約50%一致的，例如與SEQ ID NO：1至3或沒有N端M之相應序列中任一者為50%一致的。在一些實施態樣中，多肽與原始EV (例如胞外體)腔蛋白質(支架蛋白質)之全長或片段為至少約55%一致的，例如與SEQ ID NO：1至3或沒有N端M之相應序列中任一者為至少約55%一致的。在一些實施態樣中，多肽與原始EV (例如胞外體)腔蛋白質(支架蛋白質)之全長或片段為至少約60%一致的，例如與SEQ ID NO：1至3或沒有N端M之相應序列中任一者為至少約60%一致的。在一些實施態樣中，多肽與原始EV (例如胞外體)腔蛋白質(支架蛋白質)之全長或片段為至少約65%一致的，例如與SEQ ID NO：1至3或沒有N端M之相應序列中任一者為至少約65%一致的。在一些實施態樣中，多肽與原始EV (例如胞外體)腔蛋白質(支架蛋白質)之全長或片段為至少約70%一致的，例如與SEQ ID NO：1至3或沒有N端M之相應序列中任一者為至少約70%一致的。在一些實施態樣中，多肽與原始EV (例如胞外體)腔蛋白質(支架蛋白質)之全長或片段為至少約75%一致的，例如與SEQ ID NO：1至3或沒有N端M之相應序列中任一者為至少約75%一致的。在一些實施態樣中，該多肽與原始EV (例如胞外體)腔蛋白質(支架蛋白質)之全長或片段為至少約80%一致的，例如與SEQ ID NO：1至3或沒有N端M之相應序列中任一者為至少約80%一致的。在一些實施態樣中，多肽與原始EV (例如胞外體)腔蛋白質(支架蛋白質)之全長或片段為至少約85%一致的，例如與SEQ ID NO：1至3或沒有N端M之相應序列中任一者為至少約85%一致的。在一些實施態樣中，該多肽與原始EV (例如胞外體)腔蛋白質(支架蛋白質)之全長或片段為至少約90%一致的，例如與SEQ ID NO：1至3或沒有N端M之相應序列中任一者為至少約90%一致的。在一些實施態樣中，多肽與原始EV (例如胞外體)腔蛋白質(支架蛋白質)之全長或片段為至少約95%一致的，例如與SEQ ID NO：1至3或沒有N端M之相應序列中任一者為至少約95%一致的。在一些實施態樣中，多肽與原始EV (例如胞外體)腔蛋白質(支架蛋白質)之全長或片段為至少約99%一致的，例如與SEQ ID NO：1至3或沒有N端M之相應序列中任一者為至少約99%一致的。在一些實施態樣中，多肽與原始EV (例如胞外體)腔蛋白質(支架蛋白質)之全長或片段為至少約99.9%一致的，例如與SEQ ID NO：1至3或沒有N端M之相應序列中任一者為至少約99.9%一致的。
在一些實施態樣中，自細胞生產之經腔工程化之EV (例如胞外體)包含與腦酸可溶性蛋白質1 (BASP1)之片段相同或類似的序列之多肽。在一些實施態樣中，多肽與BASP1之全長或片段為至少約50%一致的，例如與SEQ ID NO：4至109、沒有N端M之相應序列、或沒有N端M的本文所述之任何BASP1序列(例如表1)為至少約50%一致的。在一些實施態樣中，多肽與BASP1之全長或片段為至少約55%一致的，例如與SEQ ID NO：4至109、沒有N端M之相應序列、或沒有N端M的本文所述之任何BASP1序列(例如表1)為至少約50%一致的。在一些實施態樣中，該多肽與BASP1之全長或片段為至少約60%一致的，例如與SEQ ID NO：4至109、沒有N端M之相應序列、或沒有N端M的本文所述之任何BASP1序列(例如表1)為至少約60%一致的。在一些實施態樣中，多肽與BASP1之全長或片段為至少約65%一致的，例如與SEQ ID NO：4至109、沒有N端M之相應序列、或沒有N端M的本文所述之任何BASP1序列(例如表1)為至少約65%一致的。在一些實施態樣中，多肽與BASP1之全長或片段為至少約70%一致的，例如與SEQ ID NO：4至109、沒有N端M之相應序列、或沒有N端M的本文所述之任何BASP1序列(例如表1)為至少約70%一致的。在一些實施態樣中，多肽與BASP1之全長或片段為至少約75%一致的，例如與SEQ ID NO：4至109、沒有N端M之相應序列、或沒有N端M的本文所述之任何BASP1序列(例如表1)為至少約75%一致的。在一些實施態樣中，多肽與BASP1之全長或片段為至少約80%一致的，例如與SEQ ID NO：4至109、沒有N端M之相應序列、或沒有N端M的本文所述之任何BASP1序列(例如表1)為至少約80%一致的。在一些實施態樣中，多肽與BASP1之全長或片段為至少約85%一致的，例如與SEQ ID NO：4至109、沒有N端M之相應序列、或沒有N端M的本文所述之任何BASP1序列(例如表1)為至少約85%一致的。在一些實施態樣中，多肽與BASP1之全長或片段為至少約90%一致的，例如與4至109、沒有N端M之相應序列、或沒有N端M的本文所述之任何BASP1序列(例如表1)為至少約90%一致的。在一些實施態樣中，多肽與BASP1之全長或片段為至少約95%一致的，例如與SEQ ID NO：4至109、沒有N端M之相應序列、或沒有N端M的本文所述之任何BASP1序列(例如表1)為至少約95%一致的。在一些實施態樣中，多肽與BASP1之全長或片段為至少約99%一致的，例如與SEQ ID NO：4至109、沒有N端M之相應序列、或沒有N端M的本文所述之任何BASP1序列(例如表1)為至少約99%一致的。在一些實施態樣中，多肽與BASP1之全長或片段為至少約99.9%一致的，例如與SEQ ID NO：4至109、沒有N端M之相應序列、或沒有N端M的本文所述之任何BASP1序列(例如表1)為至少約99.9%一致的。在一些實施態樣中，多肽與BASP1之片段為約100%一致的，例如與4至109、沒有N端M之相應序列、或沒有N端M的本文所述之任何BASP1序列(例如表1)為約100%一致的。
在一些實施態樣中，自細胞生產之經腔工程化之EV (例如胞外體)包含與腦酸可溶性蛋白質1 (BASP1)之片段相同或類似的序列之多肽，其中多肽不包含N端Met。在一些實施態樣中，多肽與BASP1之全長或片段為至少約50%一致的，例如與SEQ ID NO：4至109或本文所述之任何BASP1序列(例如表1)為至少約50%一致的，其中多肽不包含N端Met。在一些實施態樣中，多肽與BASP1之全長或片段為至少約55%一致的，例如與SEQ ID NO：4至109或本文所述之任何BASP1序列(例如表1)為至少約55%一致的，其中多肽不包含N端Met。在一些實施態樣中，該多肽與BASP1之全長或片段為至少約60%一致的，例如與SEQ ID NO：4至109或本文所述之任何BASP1序列(例如表1)為至少約60%一致的，其中多肽不包含N端Met。在一些實施態樣中，多肽與BASP1之全長或片段為至少約65%一致的，例如與SEQ ID NO：4至109或本文所述之任何BASP1序列(例如表1)為至少65約%一致的，其中多肽不包含N端Met。在一些實施態樣中，多肽與BASP1之全長或片段為至少約70%一致的，例如與SEQ ID NO：4至109或本文所述之任何BASP1序列(例如表1)為至少約70%一致的，其中多肽不包含N端Met。在一些實施態樣中，多肽與BASP1之全長或片段為至少約75%一致的，例如與SEQ ID NO：4至109或本文所述之任何BASP1序列(例如表1)為至少約75%一致的，其中多肽不包含N端Met。在一些實施態樣中，多肽與BASP1之全長或片段為至少約80%一致的，例如與SEQ ID NO：4至109或本文所述之任何BASP1序列(例如表1)為至少約80%一致的，其中多肽不包含N端Met。在一些實施態樣中，多肽與BASP1之全長或片段為至少約85%一致的，例如與SEQ ID NO：4至109或本文所述之任何BASP1序列(例如表1)為至少約85%一致的，其中多肽不包含N端Met。在一些實施態樣中，多肽與BASP1之全長或片段為至少約90%一致的，例如與SEQ ID NO：4至109或本文所述之任何BASP1序列(例如表1)為至少約90%一致的，其中多肽不包含N端Met。在一些實施態樣中，多肽與BASP1之全長或片段為至少約95%一致的，例如與SEQ ID NO：4至109或本文所述之任何BASP1序列(例如表1)為至少約95%一致的，其中多肽不包含N端Met。在一些實施態樣中，多肽與BASP1之全長或片段為至少約99%一致的，例如與SEQ ID NO：4至109或本文所述之任何BASP1序列(例如表1)為至少約99%一致的，其中多肽不包含N端Met。在一些實施態樣中，多肽與BASP1之全長或片段為至少約99.9%一致的，例如與SEQ ID NO：4至109或本文所述之任何BASP1序列(例如表1)為至少約99.9%一致的，其中多肽不包含N端Met。在一些實施態樣中，多肽與BASP1之片段為約100%一致的，例如與SEQ ID NO：4至109或本文所述之任何BASP1序列(例如表1)為約100%一致的，其中多肽不包含N端Met。 VI. 製造方法 [34] 本發明的EV (例如胞外體)係以化學合成、重組DNA技術、較大分子的生物化學或酵素催化片段化、前述之組合或任何其他方法生產。在一個實施態樣中，本發明提供令生物活性分子共軛至EV (例如胞外體)之方法。該方法包含令生物活性分子連結至如上述之EV (例如胞外體)。 [35] 在本發明的一些實施態樣中，本發明的EV (例如胞外體)可使用如上述之生產子細胞製造。因此，本發明提供製造EV (例如胞外體)之方法，其包含令本文所揭示之生產子細胞在適合的條件下培養及獲得本發明的EV (例如胞外體)。 [36] 在其他的實施態樣中，本發明的支架蛋白質(例如胞外體腔蛋白質)可經重組生產且隨後併入本發明的EV (例如胞外體)中。在其他的實施態樣中，支架蛋白質的僅多肽部分係經重組生產。在一些實施態樣中，經重組生產之支架蛋白質的多肽部分隨後經修飾(例如經化學或酵素催化)以併入膜錨定物(例如N端肉豆蔻酸)。在一些實施態樣中，經半重組生產之支架蛋白質(亦即組合多肽部分之重組產物，繼而經化學或酵素催化修飾)隨後併入本發明的EV (例如胞外體)中。 [37] 在其他的實施態樣中，本發明的支架蛋白質(例如胞外體腔蛋白質)可經化學生產，例如使用固相肽合成，且隨後併入本發明的EV (例如胞外體)中。在其他的實施態樣中，支架蛋白質的僅多肽部分係經合成生產。在一些實施態樣中，經合成生產之支架蛋白質的多肽部分隨後經修飾(例如經化學或酵素催化)以併入膜錨定物(例如N端肉豆蔻酸)。在一些實施態樣中，經半合成生產之支架蛋白質(亦即組合多肽部分之合成產物，繼而經化學或酵素催化修飾)隨後併入本發明的EV (例如胞外體)中。 [38] 在其他的實施態樣中，本發明的支架蛋白質(例如胞外體腔蛋白質)可於試管內生產，例如使用無細胞表現的此種網狀紅血球系統，及隨後併入本發明的EV (例如胞外體)中。在其他的實施態樣中，支架蛋白質的僅多肽部分係於試管內生產(例如以無細胞株統)。在一些實施態樣中，經試管內生產(例如以無細胞株統)之支架蛋白質的多肽部分隨後經修飾(例如經化學或酵素催化)以併入膜錨定物(例如N端肉豆蔻酸)。在一些實施態樣中，經半試管內生產之支架蛋白質(亦即組合多肽部分之試管內產物，繼而經化學或酵素催化修飾)隨後併入本發明的EV (例如胞外體)中。 [39] 在一些實施態樣中，本文所述之方法進一步包含使生產及純化期間於各收集之部分組中含有的EV (例如胞外體)特徵化的步驟。在一些實施態樣中，可提取EV (例如胞外體)的內含物用於研究及特徵化。在一些實施態樣中，EV (例如胞外體)經單離且以度量特徵化，包括但不限於大小、形狀、形態學或分子組成物，諸如核酸、蛋白質、代謝物和脂質。 VII. 醫藥組成物及投予方法 [40] 本發明亦提供醫藥組成物，其包含適合投予個體的本文所述之EV (例如胞外體)。醫藥組成物通常包含複數種EV (例如胞外體)(其包含至少一種經共價或未經共價連結至複數種EV (例如胞外體)之酬載(例如生物活性分子))及具有適合投予個體之形式的醫藥上可接受之賦形劑或載劑。 [41] 醫藥上可接受之賦形劑或載劑部分係由欲投予之特定組成物以及用於投予組成物之特定方法來決定。因此，包含複數種EV (例如胞外體)之醫藥組成物有各種廣泛適合的配製物。(參見例如Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa.，第18版(1990))。醫藥組成物通常經無菌配製，且完全符合美國食品及藥物管理局的所有良好製造規範(GMP)規定。在一些實施態樣中，醫藥組成物包含一或多種經共價連結至本文所述之EV (例如胞外體)的化學化合物，諸如例如小分子。 [42] 在一些實施態樣中，醫藥組成物包含一或多種治療劑或診斷劑及本文所述之EV (例如胞外體)。在特定的實施態樣中，EV (例如胞外體)係與一或多種附加的治療劑或診斷劑於醫藥上可接受之載劑中共同投予。在一些實施態樣中，包含EV (例如胞外體)之醫藥組成物係在投予附加的治療劑或診斷劑前投予。在其他的實施態樣中，包含EV (例如胞外體)之醫藥組成物係在投予附加的治療劑或診斷劑後投予。在進一步的實施態樣中，包含EV (例如胞外體)之醫藥組成物係與附加的治療劑或診斷劑同時投予。 [43] 本文提供包含具有所欲純度之本發明的EV (例如胞外體)及醫藥上可接受之載劑或賦形劑的醫藥組成物，其具有適合投予個體的形式。醫藥上可接受之賦形劑或載劑部分可由欲投予之特定組成物以及用於投予組成物之特定方法來決定。因此，包含複數種細胞外囊泡之醫藥組成物有各種廣泛適合的配製物。(參見例如Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa. 21st ed. (2005))。醫藥組成物通常經無菌配製，且完全符合美國食品及藥物管理局的所有良好生產規範(GMP)規定。 [44] 在一些實施態樣中，醫藥組成物包含一或多種治療劑或診斷劑及本文所述之EV (例如胞外體)。在特定的實施態樣中，EV (例如胞外體)係與一或多種附加的治療劑或診斷劑於醫藥上可接受之載劑中共同投予。在一些實施態樣中，包含EV (例如胞外體)之醫藥組成物係在投予附加的治療劑或診斷劑前投予。在其他的實施態樣中，包含EV (例如胞外體)之醫藥組成物係在投予附加的治療劑或診斷劑後投予。在進一步的實施態樣中，包含EV (例如胞外體)之醫藥組成物係與附加的治療劑或診斷劑同時投予。 [45] 可接受之載劑、賦形劑或穩定劑在所使用之劑量及濃度下對接受者(例如動物或人類)無毒，且包括緩衝劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其他的有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸和甲硫胺酸；防腐劑(諸如氯化十八烷基二甲基苯甲基銨、氯化六甲雙銨(hexamethonium chloride)、氯化苯二甲羥銨(benzalkonium chloride)、陽性皂(benzethonium chloride)、苯酚、丁醇和苯甲醇、對羥基苯甲酸烷酯，諸如對羥基苯甲酸甲酯或丙酯、兒茶酚、間苯二酚、環己醇、3-戊醇和間甲酚)；低分子量(少於約10個殘基)多肽；蛋白質，諸如血清白蛋白、白明膠或免疫球蛋白；親水性聚合體，諸如聚乙烯基吡咯啶酮；胺基酸，諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA；糖，諸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；形成鹽之相對離子，諸如鈉；金屬複合體(例如Zn-蛋白質複合體)；及/或非離子界面活性劑，諸如TWEEN™、PLURONICS™或聚乙二醇(PEG)。 [46] 載劑或稀釋劑的實例包括但不限於水、食鹽水、林格氏溶液、右旋糖溶液及5%之人類血清白蛋白。此等介質及化合物於醫藥活性物質的用途為本技術中所熟知。除非任何習知的介質或化合物與本文所述之細胞外囊泡不相容，否則考慮其用於組合物中。輔助性治療劑亦可併入組成物中。醫藥組成物通常經配製而與其意欲投予途徑可相容。本發明的EV (例如胞外體)可經胃腸外、局部、靜脈內、經口、皮下、動脈內、皮內、經皮、直腸、頭顱內、腹膜內、鼻內、腫瘤內、肌肉內途徑或作為吸入劑投予。在特定的實施態樣中，包含EV (例如胞外體)之醫藥組成物係經靜脈內投予，例如藉由注射。EV (例如胞外體)可視需要地與至少部分有效治療意欲以EV (例如胞外體)治療之疾病、疾患或症狀的其他治療劑組合投予。 [47] 溶液或懸浮液可包括下列組分：無菌稀釋劑，諸如水、食鹽水溶液、不揮發油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶劑；抗菌化合物，諸如苯甲醇或對羥基苯甲酸甲酯；抗氧化劑，諸如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合化合物，諸如乙二胺四乙酸(EDTA)；緩衝劑，諸如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽；及用於調整滲性之化合物，諸如氯化鈉或右旋糖。pH可以酸或鹼調整，諸如氫氯酸或氫氧化鈉。製劑可封入以玻璃或塑料製成的安瓿、可棄式注射器或多劑量小瓶中。 [48] 適合於注射使用之醫藥組成物包括無菌水性溶液(若呈水溶性)或分散液及無菌粉末。適合於靜脈內投予之載劑包括生理食鹽水、制菌水、Cremophor EL™ (BASF，Parsippany, N.J.)或磷酸鹽緩衝食鹽水(PBS)。組成物通常為無菌且以易注射性程度存在的流體。載體可為溶劑或含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液態聚乙二醇及類似者)及適合的其混合物之分散介質。適當的流動性可例如藉由使用包膜(諸如卵磷脂)、在分散液的例子中藉由維持所需之粒徑及藉由使用界面活性劑來維持。阻止微生物的作用可以各種抗細菌及抗真菌化合物達成，例如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗壞血酸、硫柳汞(thimerosal)及類似者。若需要時，可令等滲性化合物(例如糖、多元醇，諸如甘露醇、山梨醇和氯化鈉)添加至組成物中。可注射組成物之延長吸收可藉由令延長吸收之化合物(例如單硬脂酸鋁和白明膠)包括在組成物中而達成。 [49] 無菌可注射溶液可藉由併入有效量及適當溶劑中之本發明的EV (例如胞外體)與如需要的本文所列舉的成分之一或組合而製備。分散液通常係藉由併入EV (例如胞外體)至含有基本分散介質及任何所欲其他成分之無菌媒劑中而製備。在用於製備無菌可注射溶液之無菌粉末的例子中，製備方法為真空乾燥及冷凍乾燥，其得到來自其先前無菌過濾之溶液的活性成分加上任何附加的所欲成分之粉末。EV (例如胞外體)可以儲積注射液或植入製劑的形式投予，其可以此方式配製以允許EV (例如胞外體)的持續或脈衝式釋放。 [50] 包含本發明的EV (例如胞外體)之組成物的全身性投予亦可藉由經黏膜裝置。使用適合於滲透障壁的穿透劑用於經黏膜投予之配製物中。此等穿透劑通常為本技術中已知，且包括例如用於經黏膜投予之淨化劑、膽鹼和梭鏈孢酸衍生物。經黏膜投予可通過使用例如鼻噴劑來完成。 [51] 在特定的實施態樣中，包含本發明的EV (例如胞外體)之醫藥組成物係經靜脈內投予可受益於醫藥組成物之個體。在特定的其他實施態樣中，組成物係經淋巴系統投予，例如經淋巴內注射或經節結內注射(參見例如Senti等人之PNAS 105( 46): 17908 (2008))，或藉由肌肉內注射、皮下投予、腫瘤內注射、直接注射至胸腺或肝中而投予。 [52] 在特定的實施態樣中，包含本發明的EV (例如胞外體)之醫藥組成物係作為液體懸浮液投予。在特定的實施態樣中，醫藥組成物係在投予後能夠形成儲積物之配製物投予。在特定的較佳實施態樣中，儲積物緩慢釋放EV (例如胞外體)至循環中或保持儲積物形式。 [53] 醫藥上可接受之組成物通常經高度純化而沒有污染物、為可生物相容的及無毒性，且適合投予個體。若水為載劑的成分，則水經高度純化及處理而沒有污染物(例如內毒素)。 [54] 醫藥上可接受之載劑可為乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、澱粉、阿拉伯膠、磷酸鈣、藻酸鹽、白明膠、矽酸鈣、微晶纖維素、聚乙烯基吡咯啶酮、纖維素、水、糖漿、甲基纖維素、羥基苯甲酸甲酯、羥基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸鎂及/或礦物油，但不限於此。醫藥組成物可進一步包括潤滑劑、潤濕劑、甜味劑、增味劑、乳化劑、懸浮劑及/或防腐劑。 [55] 本文所述之醫藥組成物包含本文所述之EV (例如胞外體)及視需要的醫藥活性劑或治療劑及/或診斷劑。治療劑可為生物劑、小分子劑或核酸劑。診斷劑可為例如比對試劑。 [56] 提供包含醫藥組成物之劑型，該醫藥組成物包含本文所述之EV (例如胞外體)。在一些實施態樣中，劑型經配製成用於靜脈內注射之液體懸浮液。在一些實施態樣中，劑型經配製成用於腫瘤內注射之液體懸浮液。 [57] 在特定的實施態樣中，本發明的EV (例如胞外體)之製劑接受輻射，例如X射線、γ射線、β粒子、α粒子、中子、質子、元素核、UV射線，以便破壞殘留複製能力的核酸。 [58] 在特定的實施態樣中，本發明的EV (例如胞外體)之製劑接受使用超過1、5、10、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100或超過100 kGy之照射劑量的γ照射。 [59] 在特定的實施態樣中，本發明的EV (例如胞外體)之製劑接受使用超過0.1、0.5、1、5、10、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000或之照射劑量的X-射線照射。 [60] 本發明的EV (例如胞外體)可與其他的藥物同時使用。具體地說，本發明的EV (例如胞外體)可與下列藥劑一起使用：諸如激素治療劑、化學治療劑、免疫治療劑、抑制細胞生長因子或細胞生長因子受體作用之藥劑及類似者。 VIII. 治療用途 [61] 本發明提供治療有其需要之個體的疾病或症狀之方法，其包含對個體投予包含本發明的EV (例如胞外體)之組成物。本發明亦提供預防或改善有其需要之個體的疾病或症狀病徵之方法，其包含對個體投予包含本發明的EV (例如胞外體)之組成物。亦提供診斷有其需要之個體的疾病或症狀之方法，其包含對個體投予包含本發明的EV (例如胞外體)之組成物。亦提供用於治療法、用作為藥劑、用於治療有其需要之個體的疾病或症狀、用於預防或改善有其需要之個體的疾病或症狀病徵或用於診斷有其需要之個體的疾病或症狀之本發明的EV (例如胞外體)。 [62] 在一個實施態樣中，疾病或疾患為癌症、發炎性疾病、神經退化性疾患、中樞神經疾病或代謝疾病。 [63] 本發明亦提供預防及/或治療有其需要之個體的疾病或疾患之方法，其包含對個體投予本文所揭示之EV (例如胞外體)。在一些實施態樣中，可以本發明的方法治療之疾病或疾患包含癌症、移植物抗宿主疾病(GvHD)、自體免疫疾病、感染性疾病或纖維變性疾病。在一些實施態樣中，治療為預防性。在其他的實施態樣中，使用本發明的EV (例如胞外體)誘導免疫反應。在其他的實施態樣中，使用本發明的EV (例如胞外體)接種個體。在一些實施態樣中，疾病或疾患為癌症。 [64] 在一些實施態樣中，疾病或疾患為感染性疾病。在特定的實施態樣中，疾病或疾患為致癌病毒。在一些實施態樣中，可以本發明治療之感染性疾病包括但不限於人類γ皰疹病毒4 (艾司坦巴爾(Epstein Barr)病毒)、A型流感病毒、B型流感B病毒、細胞巨大病毒、金黃色葡萄球菌、結核分枝桿菌、沙眼披衣菌、HIV-1、HIV-2、冠狀病毒(例如MERS-CoV和SARS CoV)、絲狀病毒(例如馬堡(Marburg)病毒和伊波拉(Ebola)病毒)、化膿鏈球菌、肺炎鏈球菌、瘧原蟲物種(例如間日瘧原蟲(vivax)和惡性瘧原蟲(falciparum))、屈公病毒(Chikunga virus)、人類乳頭狀瘤病毒(HPV)、B型肝炎、C型肝炎、人類皰疹病毒8、皰疹單純型病毒2 (HSV2)、克雷白氏菌屬(Klebsiella sp.)、綠膿桿菌、腸球菌屬、變形桿菌屬、腸內桿菌屬、放線菌屬、凝固酶陰性葡萄球菌(CoNS)、黴漿菌屬或其組合。 [65] 在一些實施態樣中，EV (例如胞外體)係經靜脈內投予個體的循環系統。在一些實施態樣中，EV (例如胞外體)係於適合的液體中輸注且投予個體的靜脈內。 [66] 在一些實施態樣中，EV (例如胞外體)係經動脈內投予個體的循環系統。在一些實施態樣中，EV (例如胞外體)係於適合的液體中輸注且投予個體的動脈內。 [67] 在一些實施態樣中，EV (例如胞外體)係藉由鞘內投予而投予個體。在一些實施態樣中，EV (例如胞外體)係經由注射至脊髓管中或注射至蛛膜下腔而投予，使得其到達腦脊髓液(CSF)。 [68] 在一些實施態樣中，EV (例如胞外體)係經腫瘤內投予個體的一或多個腫瘤內。 [69] 在一些實施態樣中，EV (例如胞外體)係藉由鼻內投予而投予個體。在一些實施態樣中，EV (例如胞外體)可以局部投予或全身性投予形式通過鼻子吹入。在特定的實施態樣中，EV (例如胞外體)可作為鼻噴劑投予。 [70] 在一些實施態樣中，EV (例如胞外體)係藉由腹膜內投予而投予個體。在一些實施態樣中，EV (例如胞外體)係於適合的液體中輸注且注射至投予個體的腹膜內。在一些實施態樣中，腹膜內投予導致EV (例如胞外體)分布至淋巴管。在一些實施態樣中，腹膜內投予導致EV (例如胞外體)分布至胸腺、脾臟及/或骨髓。在一些實施態樣中，腹膜內投予導致EV (例如胞外體)分布至一或多個淋巴結。在一些實施態樣中，腹膜內投予導致EV (例如胞外體)分布至頸淋巴結、腹股溝淋巴結、縱隔淋巴結或胸骨淋巴結中之一或多者。在一些實施態樣中，腹膜內投予導致EV (例如胞外體)分布至胰臟。 [71] 在一些實施態樣中，EV (例如胞外體)係藉由眼週投予而投予個體)。在一些實施態樣中，EV (例如胞外體)係注射至眼週組織內。眼週藥物投予包括結膜下、前筋膜囊下(anterior sub-Tenon)，後筋膜囊下和眼球後投予途徑。 IX. 套組 [72] 本發明亦提供製造套組或產品，其包含本發明的一或多種EV (例如胞外體)及視需要的用法說明。在一些實施態樣中，製造套組或產品含有本文所述之醫藥組成物，其包含本發明的至少一種EV (例如胞外體)及用法說明。 [73] 在一些實施態樣中，製造套組或產品包含本發明的至少一種EV (例如胞外體)或包含EV (例如胞外體)之醫藥組成物於一或多個容器中。熟習本技術領域者可輕易地識別本發明的EV (例如胞外體)、包含本發明的EV (例如胞外體)之醫藥組成物或其組合可輕易地併入本技術中熟知的經確立之套組模式之一者中。 [74] 在一些實施態樣中，製造套組或產品包含(i) EV (例如胞外體)，(ii)一或多種酬載，例如生物活性分子，(ii)使一或多種酬載(例如生物活性分子)共價附著至EV (例如胞外體)之試劑或(iv)其任何組合，及進行使一或多種酬載(例如生物活性分子)共價附著至EV (例如胞外體)之反應的用法說明。 [75] 在一些實施態樣中，套組包含使酬載(例如生物活性分子)共軛至EV (例如胞外體)之試劑及進行共軛之用法說明。 [76] 本發明的實施係使用在本技術領域內的細胞生物學、細胞培養、分子生物學、轉基因生物學、微生物學、重組DNA及免疫學之習知技術，除非另有其他指示。此等技術完整地解釋於文獻中。參見例如Sambrook等人編輯之(1989) Molecular Cloning A Laboratory Manual (第2編輯版；Cold Spring Harbor Laboratory Press)；Sambrook等人編輯之(1992) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Cold Springs Harbor Laboratory, NY)；D. N. Glover編輯之(1985) DNA Cloning，第I和II冊；Gait編輯之(1984) Oligonucleotide Synthesis；Mullis等人之美國專利案第4,683,195號；Hames和Higgins編輯之(1984) Nucleic Acid Hybridization；Hames和Higgins編輯之(1984) Transcription And Translation；Freshney之 (1987) Culture Of Animal Cells (Alan R. Liss, Inc.)；Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press)(1986)；Perbal之(1984) A Practical Guide To Molecular Cloning; the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.)；Miller和Calos編輯之(1987) Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells, (Cold Spring Harbor Laboratory)；Wu等人編輯之Methods In Enzymology，第154和155冊；Mayer和Walker編輯之(1987) Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Academic Press, London)；Weir和Blackwell編輯之(1986) Handbook Of Experimental Immunology第I-IV冊，Manipulating the Mouse Embryo，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1986)；Crooke之Antisense drug Technology: Principles, Strategies and Applications，第2編輯版，CRC Press (2007)；及Ausubel等人之(1989) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons，Baltimore, Md.)。
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實施例
下列實施例係為了那些一般熟習此項技術領域者提供如何進行及使用本發明的完整揭示及說明而發佈，且不意欲限制被發明者視作其揭示內容之範疇，亦不意欲表示下文實驗為所執行之所有或僅有實驗。已致力於確保關於所使用之數字(例如量、溫度等)的準確性，但應考慮一些實驗誤差及偏差。
除非另有其他的指示，否則份為重量份，分子量為重量平均分子量，溫度為攝氏度，且壓力為或接近大氣壓。可使用標準縮寫，例如bp，鹼基對；kb，千鹼基(kilobase)；pl，皮升；s或sec，秒；min，分鐘；h或hr，小時；aa，胺基酸；nt，核苷酸；及類似者。
本發明的實施係使用在本技術領域內的蛋白質化學、生物化學、重組DNA及藥理學之習知方法，除非另有其他指示。此等技術完整地解釋於文獻中。參見例如T.E. Creighton之Proteins: Structures and Molecular Properties (W.H. Freeman and Company，1993)；AL. Lehninger之Biochemistry (Worth Publishers, Inc., current addition)；Sambrook等人之Molecular Cloning: A Laboratory Manual (第2編輯版，1989)；Methods In Enzymology (S. Colowick和N. Kaplan編輯，Academic Press, Inc.)；Remington's Pharmaceutical Sciences，第21版(Easton, Pennsylvania: Mack Publishing Company, 2005)；Carey和Sundberg之Advanced Organic Chemistry第3版(Plenum Press)，第A和B冊(l992)。 實施例1 足夠裝載腔胞外體酬載的最少蛋白質序列之鑑定
為了鑑定在促成裝載的12個胺基酸截斷與無法促成裝載的6個胺基酸截斷之間最少的BASP1胺基酸序列，如上文所示，所以產生了融合至FLAG®標籤及GFP的BASP1之N端的個別截斷突變物且令其穩定地表現在HEK293SF細胞中(圖1A)。胞外體係如上述自穩定的細胞培養物純化。7至12個胺基酸之BASP1序列能夠以高密度裝載GFP於胞外體中，而前6個胺基酸則不能(圖1B)。該等數據證明在位置6之後需要至少一個離胺酸殘基用於以BASP1之N端的胞外體之腔裝載，亦即附著至胞外體之腔表面。
在BASP1之位置6上的絲胺酸在跨物種之間 及在MARCKS和MARCKSL1中高度保守。為了測定是否需要此胺基酸裝載酬載至胞外體中，令HEK293SF細胞以編碼BASP1 1至30-FLAG®-GFP或BASP1 1至30-FLAG®-GFP之表現質體轉染，其包括以天冬胺酸(S6D；經極性電荷取代)或丙胺酸(S6A；小型非極性取代)置換位置6上的絲胺酸之點突變體。另外，在位置5上的離胺酸突變成麩胺酸(L5Q)以測試此位置調控肉豆蔻醯基化、棕櫚醯基化及數個膜相關蛋白質之其他膜功能的潛在角色(Gottlieb-Abraham等人之Mol. Biol. Cell. 2016 Dec 1;27(24):3926-3936)(圖2A)。BASP1 S6D完全消除GFP裝載至胞外體中，而S6A未改變裝載。BASP1 L5Q亦不影響腔裝載，表示在位置6上的負電荷破壞裝載，而在位置5上的極性胺基酸取代具有良好的耐受性(圖2B)。
BASP1之前30個胺基酸含有上文鑑定之N端前導序列，隨後為離胺酸富集之胺基酸延伸段。為了理解MARCKS及MARCKSL1 N端是否可以類似於BASP1來裝載胞外體，令HEK293SF細胞以MARCKS及MARCKSL1全長蛋白質或融合至FLAG®-GFP之胺基酸1至30穩定地轉染。令經純化之胞外體以SDS PAGE及COOMASSIE®染色分析以測定裝載程度。全長MARCKS及MARCKSL1能夠與GFP裝載胞外體，但胺基酸1至30比全長蛋白質差，示意對於裝載需要MARCKS及MARCKSL1蛋白質的遠端區域中之附加結構或序列特徵(圖3)。MARCKS及MARCKSL1之序列分析揭露與BASP1之N端具有潛在的序列同源性之區域。
MARCKS之胺基酸152至173及MARCKSL1之胺基酸87至110為富集賴胺酸與散佈的苯丙胺酸及絲胺酸殘基，且預測為磷酸化位點結構域(PSD)或效應子結構域(ED)(圖4)。令HEK293SF細胞以融合MARCKS之胺基酸1至3至PSD結構域(MG-PSD)之質體構築體穩定地轉染。在預測之肉豆蔻醯基化位點(MA-PSD)及位置6(K6S和K6A)上產生個別的點突變以測定該等殘基在裝載胞外體之角色(圖5A)。與BASP1 1至30之陽性對照物相比，經純化之胞外體的西方墨點轉漬法證明MG-PSD或MA-PSD皆不能有效地裝載胞外體。有趣的是K6A及K6S突變導致裝載的改進，示意在位置6上的正電荷防止胞外體酬載之裝載且MARCKS之PSD能在功能上與內源N端序列互補(圖5B)。總之，該等研究容許鑑定出數個足夠裝載酬載至胞外體中的模體(圖6)。
最窄的模體，模體1容許(M)(G)(G/A/S)(K/Q) L/F/S/Q)(S/A)(K)(K)(SEQ ID NO：118)或沒有第一個Met之(G)(G/A/S)(K/Q)(L/F/S/Q)(S/A)K)(K)(SEQ ID NO：202)之蛋白質序列，其中各括號字母或字母群組為胺基酸位置，且其中另外位置五不可為帶正電荷之胺基酸(K/R/H)及位置六不可為帶負電荷之胺基酸(D/E)。
模體1之子模體包括而不限於下列的蛋白質序列：
Figure 02_image033
Figure 02_image035
其中位置五不可為帶正電荷之胺基酸(K/R/H)及位置六不可為帶負電荷之胺基酸(D/E)。
模體2，較寬的模體可表示為(M)(G)(π)(ξ) (Φ/π)(S/A/G/N)(+)(+)或沒有第一個Met之(G)(π)(ξ)(Φ/π) (S/A/G/N)(+)(+)，其中各括號位置表示胺基酸，且其中π為選自由下列者所組成之群組的任何胺基酸：(Pro、Gly、Ala、Ser)，ξ為選自由下列者所組成之群組的任何胺基酸：(Asn、Gln、Ser、Thr、Asp、Glu、Lys、His、Arg)，Φ為選自由下列者所組成之群組的任何胺基酸：(Val、Ile、Leu、Phe、Trp、Tyr、Met)，且(+)為選自由下列者所組成之群組的任何胺基酸：(Lys、Arg、His)；且其中位置五不為(+)，及位置六既不為(+)，亦不為(Asp或Glu)。參見R. Aasland等人之FEBS Letters 513 (2002): 141-144關於胺基酸的命名。
模體3，最寬的模體可表示為(M)(G)(π)(X) (Φ/π)(π)(+)(+)或沒有第一個Met之(G)(π)(X)(Φ/π)(π)(+)(+)，其中各括號位置表示胺基酸，且其中π為選自由下列者所組成之群組的任何胺基酸：(Pro、Gly、Ala、Ser)，X為任何胺基酸，Φ為選自由下列者所組成之群組的任何胺基酸：(Val、Ile、Leu、Phe、Trp、Tyr、Met)，且(+)為選自由下列者所組成之群組的任何胺基酸：(Lys、Arg、His)；且其中位置五不為(+)，及位置六既不為(+)，亦不為(Asp或Glu)。在模體1至3的所有例子中，序列可經一個胺基酸截斷而為長度是七個總胺基酸(亦即由模體1至3呈現之順序的胺基酸1至7所組成)。可使用自模體1、2或3中任一者(或缺乏胺基酸7的該等模體)所衍生之序列中任一者與全長BASP1或BASP1之天然截斷序列相同或可相比的程度裝載酬載至胞外體中。胺基酸序列結構功能的此深入分析對藉由生產子細胞引導經生物表現之酬載至胞外體中的需求提供新穎的見解。 實施例2 BASP1之N端足夠裝載多樣類別的蛋白質
實施例1結果示意BASP1之N端可為有用的工程化支架，其用於直接自生產子細胞產生經腔裝載之胞外體。為了測試此假設，所以產生了穩定的HEK293SF細胞以表現融合至BASP1之胺基酸1至30或1至10之具有密碼子最優化之全長Cas9蛋白質(如在Zetsche B, Volz SE, Zhang F.之A split-Cas9 architecture for inducible genome editing and transcription modulation. Nat Biotechnol. 2015 Feb;33(2):139-42中所述)。胞外體係如上述自細胞培養物純化且以SDS-PAGE及使用抗Cas9抗體(Abcam；目錄# ab191468，洗殖株7A9-3A3)之西方墨點轉漬法分析。如圖7A中所示，BASP1 1至30及1至10二者足夠裝載Cas9於胞外體中。重組Cas9蛋白質被用作為西方墨點轉漬法之陽性對照物。以來自西方墨點轉漬法實驗之重組Cas9及BASP1-Cas9胞外體泳道的各種量之密度測定法定量及比較揭露胞外體係以每一胞外體4至5個Cas9分子裝載(圖7B)。與上文所示之GFP實驗相比，為~160kDa質量的此Cas9酵素呈現酬載大小顯著增加。
令卵白蛋白作為BASP1之胺基酸1至10的融合物(「BASP1(1至10)-OVA」)穩定地表現在HEK293SF細胞中，作為可經裝載為BASP1之N端的融合物之酬載蛋白質的多樣性之額外驗證。令單獨的細胞株以相同的質體及使用第二個可選擇的標誌物編碼融合至胞外體特異性表面糖蛋白質PTGFRN之三聚體CD40L (「3xCD40L-PTGFRN」)的第二質體共轉染。胞外體係自兩個經轉染之細胞培養物純化且以SDS-PAGE (圖8A)及抗卵白蛋白西方墨點轉漬法(Abcam；目錄# ab17293，選殖株6C8)(圖8B)分析。作為對照物，重組卵白蛋白(InvivoGen；目錄# vac-pova)係於單獨的凝膠中滴定。當融合至BASP1之胺基酸1至10而成為單一構築體時或與附加的過度表現質體組合(3xCD40L-PTGFRN)時，卵白蛋白堅固地裝載於胞外體中。此結果證明胞外體可與腔酬載及與來自單獨的轉錄體之同時存在的表面酬載(例如PTGFRN)二者組合地工程化。
可用於治療性胞外體之情況中的另一蛋白質類別為抗體及抗體片段。靶定GFP之單鏈駱駝奈米抗體(如Caussinus E, Kanca O, Affolter M.之Fluorescent fusion protein knockout mediated by anti-GFP nanobody. Nat Struct Mol Biol. 2011 Dec 11;19(1):117-21中所述)係作為BASP1之胺基酸1至10及FLAG®標籤(「BASP1(1至10)-奈米抗體」)或單獨的FLAG®標籤(「奈米抗體」)之融合蛋白質穩定地表現在HEK293SF細胞中(圖9A)。令純化之胞外體以SDS-PAGE及抗FLAG®西方墨點轉漬法分析，其證明當奈米抗體融合至BASP1之N端時，有實質上富集之奈米抗體具有等量的總裝載之蛋白質(圖9B)。該等結果證明多樣化類別的蛋白質酬載可藉由生產子細胞使用自BASP1之N端衍生之非常短的蛋白質序列(亦即支架)表現及包裝至胞外體中。 實施例3 可使用BASP1之N端裝載核酸於胞外體之腔中
核酸，且特別為RNA (例如mRNA、siRNA、miRNA)為欲裝載於治療性胞外體之腔中的治療性酬載之有吸引力的類別。RNA之胞外體裝載可保護RNA免於細胞外環境中的降解且經裝載之胞外體可通過額外的胞外體工程化程度(例如靶定構築體之表面表現)引導至特定的細胞及/或組織。為了理解上文鑑定之EV (例如胞外體)蛋白質(或蛋白質片段)是否可用於產生經mRNA裝載之胞外體，所以產生了組合式工程化胞外體。如圖10中所示，BASP1之胺基酸1至30係以FLAG®及噬菌體蛋白質MCP之變異體的融合物表現。MCP識別且結合至稱為MS2之mRNA莖環，其可以mRNA及其他RNA之轉錄融合物表現，因此驅動在MCP融合蛋白質與關注的MS2融合物RNA之間的物理締合。突變分析於先前鑑定出在MCP(增加對MS2之親和性)中的兩個位置；在位置29以纈胺酸取代為異白胺酸(V29I；Lim & Peabody之RNA. Nucleic Acids Res. 1994 Sep 11;22(18):3748-52)及在位置55以天冬醯胺取代為離胺酸(N55K；Lim等人之J Biol Chem. 1994 Mar 25;269(12):9006-10)。BASP1 1至30係與單體或二聚體MCP變異體融合，其中各MCP為V29I或雙重突變之V29I/N55K。螢光素酶報導子構築體係以3種來自單獨質體的MS2莖環之融合物表現。產生5種穩定的HEK293SF細胞株，單獨(#811)或與BASP1-MCP變異體(#815、817、819或821)中之各者組合的螢光素酶-MS2 (圖10)。令HEK293SF細胞以經FLAG標籤化之BASP1 1至27穩定地轉染，作為額外的對照物。胞外體經單離且以BENZONASE®處理以移除任何經外部締合之mRNA，且根據上述方法純化。令純化之胞外體以SDS-PAGE (圖11A)及抗FLAG®西方墨點轉漬法(圖11B)分析，其證明在各胞外體製劑中等量的總蛋白質及可相比的BASP1-FLAG®融合物水平。重要的是BASP1-MCP融合物表現至與缺乏MCP蛋白質之BASP1 1至27 FLAG融合物可相比的量，其證明MCP單體或二聚體的添加不破壞在胞外體中的經BASP1媒介之蛋白質裝載。
令穩定地表現BASP1-MCP及螢光素酶-MS2 mRNA之細胞單離，且令總螢光素酶mRNA以RT-qPCR (FWD引子：5’-TGGAGGTGCTCAAAGAGTTG-3’(SEQ ID NO：119)；REV引子：5’-TTGGGCGTGCACTTGAT-3’ (SEQ ID NO：120)；探針：5’-/56-FAM/CAGCTTTCC/ZEN/GGGCATTGGCTTC/ IABkFQ/-3’ (SEQ ID NO：121)) 定量。未經轉染之細胞表現比所有的811表現細胞(彼等表現出可相比的螢光素酶量)低的螢光素酶量(圖12A，上圖)。來自穩定的細胞株中之各者的經純化之胞外體亦以RT-qPCR分析。原始胞外體沒有可檢測的螢光素酶MS2量，而表現單獨的811細胞具有可檢測但非常低的螢光素酶MS2量。重要的是，BASP1-MCP融合蛋白質中之各者含有更大量的螢光素酶-MS2 mRNA，其證明在MCP與MS2之間結合的重要性，以促成mRNA裝載至胞外體中(圖12A，下圖)。在組別之間相對的mRNA定量證明所有的BASP1-MCP融合物比單獨的811超過~30至60倍富集(圖12B)。預測含有二聚體MCP V29I/N55K之BASP1-MCP構築體821對MS2 mRNA具有最大的親和性，且在此實驗中確實含有最大量的螢光素酶-MS2。該等結果證明BASP1片段為堅固且多用途的支架蛋白質，其用於以多樣性酬載(包括核酸)裝載胞外體之腔。 實施例4 可使用BASP1、MARCKS及MARCKSL1產生經表面裝飾之胞外體
在先前實驗中的結果證明可使用MARCKS、MARCKSL1和BASP1之全長及N端區域產生經腔內裝載之胞外體。為了進一步探索該等蛋白質用於胞外體工程化的潛力，令MARCKS、MARCKSL1和BASP1之胺基酸1至30或BASP1之胺基酸1至10融合至以同源三聚體(homotrimer)表現之CD40L的內源跨膜區域。製備CD40L之人類及小鼠序列二者之構築體，因為配體不與其他物種上的同族受體交叉反應(圖13)。胞外體係自以CD40L表現構築體中之一者穩定地轉染之HEK293SF細胞純化且在小鼠或人類B細胞中培育。在胞外體上的輸入物CD40L之量係以CD40L ELISA定量(使用R&D Systems，目錄# DCDL40，批號# P168248測量人類CD40L；及使用Abcam，目錄# ab119517，批號# GR3218850-2測量小鼠CD40L)，B細胞係使用B細胞標誌物定量，CD19及B細胞活化係以對CD69呈陽性之閘控細胞的百分比測量。在物種匹配之培養物中的小鼠(圖14A)或人類(圖14B)胞外體CD40L之劑量滴定曲線顯示在構築體之間以粒子對粒子為基礎的可相比活性(左圖及下表)或如彼此及等量的重組蛋白質以CD40L莫耳為基礎相比的可相比活性(右圖及下表)。當CD40L構築體亦以單體表現及效力僅略少於表現在高密度胞外體展示支架PTGFRN之N端上的三聚體CD40L時，則觀察到可相比的活性(參見例如國際專利申請案第PCT/US2018/048026號)(圖14C)。該等結果證明MARCKS、MARCKSL1和BASP1為可用於產生用於人類及動物應用之各種類別的工程化胞外體之多樣性堅固的支架。 實施例5 多樣性細胞類型表現BASP1、MARCKS及/或 MARCKSL1
令來自不同的組織來源(HEK293，腎臟；HT1080，結締組織；K562，骨髓；MDA-MB-231，乳房；Raji，淋巴胚細胞)之細胞株經~6天生長至對數期且轉移至胞外體耗乏之血清補充的培養基中，除了在經化學限定之培養基中生長的HEK293細胞以外。令經骨髓衍生之間質幹細胞(MSC)在3D微載劑上生長五天，且在無血清培養基中補充三天。令來自各細胞株培養物的上清液單離且令胞外體使用上述Optiprep™密度梯度超速離心法純化。經純化之胞外體製劑中之各者係如上述之LC-MS/MS分析，且定量BASP1、MARCKS和MARCKSL1及兩種廣泛研究之EV (例如胞外體)蛋白質(CD81及CD9)之肽光譜匹配(PSM)數量。四跨膜蛋白CD81及CD9可於大部分的經純化之胞外體族群中檢測出，但在一些例子中等於或少於腔EV (例如胞外體)蛋白質(例如以CD9與BASP1或MARCKSL1相比)(圖15)。此發現表明最新鑑定之腔胞外體標誌物可為自不同的組織衍生之許多不相關細胞株產生工程化胞外體之適合融合蛋白質。 實施例6 過度表現BASP1之非人類細胞產生經腔工程化之胞外體
在實施例5中的結果證明許多人類衍生之細胞天然地表現BASP1及其他新穎的EV。為了測定BASP1是否可用作為通用的胞外體支架蛋白質，令中國倉鼠卵巢(CHO)細胞以表現融合至FLAG®標籤及GFP的全長BASP1 (「BASP1-GFP-FLAG」)之質體、表現融合至FLAG®標籤及GFP的BASP1之胺基酸1至30 (「BASP1(1至30)-GFP-FLAG」)之質體或表現融合至FLAG®標籤及GFP的BASP1之胺基酸1至8 (「BASP1(1至8)-GFP-FLAG」)之質體穩定地轉染。胞外體係自野生型CHO細胞及以三種BASP1質體中之一者轉染之CHO細胞純化。如圖16A至B中所示，BASP1及BASP1片段融合蛋白質成功地過度表現在CHO細胞中且裝載於胞外體中，如以未染色之PAGE (圖16A)及以對抗FLAG®之抗體的西方墨點轉漬法(圖16B)所檢測。此結果證明非人類細胞(諸如CHO細胞)可生產過度表現人類BASP1片段之胞外體，且此過度表現可驅動酬載蛋白質以高密度至胞外體之腔中。此結果表明BASP1為用於自許多不同的細胞類型及物種產生工程化胞外體之通用的支架蛋白質。 ***
應理解意欲以詳細的說明章節而不是概要及摘要章節用於解釋申請專利範圍。概要及摘要章節可闡述由發明者設想之本發明的一或多個但不是全部的示例性實施態樣，且因此不意欲以任何方式限制本發明及所附之申請專利範圍。
本發明已藉助於例證實現特定的功能及其關係之功能建構區塊於上文說明。該等功能建構區塊的界限係出於方便說明已於本文任意地定義。可定義替代的界限，只要能適當地執行特定的功能及其關係。 併入以供參考
本申請案中所引用之所有公開案、專利案、專利申請案及其他文件係以出於所有目的而特此併入其全文以供參考，其程度如同每一個別的公開案、專利案、專利申請案及其他文件經個別地指示以出於所有目的而併入以供參考。 等效物
本發明尤其提供含有經修飾之外源蛋白質及用於EV (例如胞外體)中的外源蛋白質富集之肽的EV (例如胞外體)之組成物。本發明亦提供生產富集之EV (例如胞外體)的方法及方法類。雖然已例證及說明各種特定的實施態樣，但是以上說明書不具有限制性。本發明的廣度及範疇不應受限於上述示例性實施態樣中任一者，而僅應依照下列的申請專利範圍及其等效物予以限定。應理解可進行各種改變而不脫離本發明的精神及範疇。一旦閱覽本說明時，許多變化對那些熟習本技術領域者變得顯而易見。
本申請案主張在2018年11月16日申請之國際申請案第PCT/US2018/061679號及在2019年4月17日申請之美國臨時申請案第62/835,430號之權益，其全文以引用方式併入本文。
圖式僅出於例證的目的來描述本發明的各種態樣。熟習本技術領域者係自下列的討論可輕易地識別可使用本文所例證的結構及方法之替代態樣而不脫離本文所述之揭示內容的原理。
圖1A顯示包含融合至FLAG® 標籤及GFP (分別為SEQ ID NO：135至142，按出現的順序)之BASP1片段的融合蛋白質之序列。圖1B顯示自穩定地表現圖1A中的融合蛋白質中之一者的細胞純化之胞外體的抗FLAG® 西方墨點轉漬法結果。圖1A和1B二者之胺基酸位置(例如BASP1，1至30)係指最初以基因構築體編碼之BASP-1片段。第一個Met係在處理期間被切割。
圖2A顯示來自融合至FLAG® 標籤及GFP (分別為SEQ ID NO：143至145，按出現的順序)之BASP1片段(1至30)(SEQ ID NO：4)及其修飾物(1至30-S6D、1至30-S6A和1至30-L5Q)之序列。
圖2B顯示自穩定地表現圖2A中的融合蛋白質中之一者的細胞純化之胞外體的抗FLAG® 西方墨點轉漬法結果。圖2A和2B二者之胺基酸位置(例如BASP1，1至30)係指最初以基因構築體編碼之BASP-1片段。第一個Met係在處理期間被切割。
圖3顯示自穩定地表現全長MARCKSL1、BASP1或MARCKS、MARCKSL1或BASP1之胺基酸1至30 (全部皆融合至FLAG® -GFP)的細胞純化之胞外體樣本之Coommassie® 染色之蛋白質凝膠的影像。在影像上的白色箭頭表示相應於融合蛋白質之譜帶。圖3之胺基酸位置(例如BASP1，1至30)係指最初以基因構築體編碼之BASP-1片段。第一個Met係在處理期間被切割。
圖4顯示在BASP1的前28個胺基酸(保守區域1)、MARCKS的胺基酸1至7和152至173 (保守區域2)及MARCKSL1的胺基酸1至7和87至110 (保守區域3)之間的蛋白質序列比對。
圖5A顯示BASP1之胺基酸1至30 (「BASP1至30」)(SEQ ID NO：4)及包含融合至MARCKS或其修飾物之PSD結構域(「MARCKS-MG-PSD」、「MARCKS-MA-PSD」、「MARCKS-MG-PSD-K6S」和「MARCKS-MG-PSD-K6A」)(分別為SEQ ID NO：146至149，按出現的順序)的MARCKS或其修飾物之胺基酸1至3的融合蛋白質之序列。引入MARCKS序列之點突變係以黑體表示。胺基酸位置(例如BASP1之aa 1至30或MARCKS之aa 1至3)係指最初以基因構築體編碼之片段。第一個Met係在處理期間被切割。
圖5B顯示自穩定地表現包含圖5A之胺基酸序列及FLAG® 之融合蛋白質的細胞純化之胞外體的抗FLAG® 西方墨點轉漬法結果。
圖6顯示自MARCKS、MARCKSL1和BASP1的功能性研究導出之三種不同的共有序列(所有三種序列皆以SEQ ID NO：118表示)及用於經由附著至腔表面而裝載酬載至胞外體之腔內的序列中之各者的胺基酸需求。
圖7A顯示原始胞外體或自穩定地表現融合至BASP1之胺基酸1至10或1至30之Cas9的細胞純化之胞外體，以及減量的重組Cas9之總蛋白質(上圖)及抗Cas9西方墨點轉漬法(下圖)。胺基酸位置(例如BASP之aa 1至10或BASP1之aa 1至30)係指最初以基因構築體編碼之片段。第一個Met係在處理期間被切割。
圖7B，上圖顯示自圖7A的西方墨點轉漬法結果的Cas9密度測定法導出之標準曲線。下圖進一步提供當融合蛋白質與BASP1之1至30個胺基酸或1至10個胺基酸片段(在處理後(亦即第一個Met被切割)，BASP1之2至30個胺基酸或2至10個胺基酸片段)共軛時每一各個純化之胞外體裝載之Cas9的量，其係基於標準曲線估算。
圖8A顯示自以表現融合至卵白蛋白之BASP1 N端(胺基酸1至10)的構築體(「BASP1 (1至10)-OVA」)穩定地轉染之細胞或自以一個表現融合至卵白蛋白之BASP1 N端(胺基酸1至10)及另一個表現融合至跨膜蛋白質PTGFRN之CD40L的兩個構築體(「BASP1 (1至10)-OVA；3XCD40L-PTGFRN」)穩定地轉染之細胞純化之胞外體的蛋白質凝膠影像。圖8A進一步顯示裝載減量之重組OVA的蛋白質凝膠影像。胺基酸編號(例如胺基酸1至10)係指最初以基因構築體編碼之片段。第一個Met係在處理期間被切割。
圖8B顯示來自圖8A的樣本之抗卵白蛋白西方墨點轉漬法結果。
圖8C顯示比較重組ova與融合至exoTOPE之ova的西方墨點轉漬法結果。圖8D顯示包含(i)連結至胞外體之腔面中的卵白蛋白之exoTOPE，及(ii)在胞外體之腔中的免疫刺激物之胞外體的圖式。
圖9A顯示針對融合至BASP1之胺基酸1至10及FLAG® 標籤(SEQ ID NO：150)之GFP的駱駝奈米抗體之序列。胺基酸編號(例如BASP1之胺基酸1至10)係指最初以基因構築體編碼之片段。第一個Met係在處理期間被切割。
圖9B顯示自穩定地表現圖10A之融合蛋白質(「BASP1(1至10)-奈米抗體」)或缺少BASP1序列之蛋白質(「奈米抗體」)的細胞純化之胞外體的蛋白質凝膠及抗FLAG® 西方墨點轉漬法結果。胺基酸編號(例如BASP1 (1至10)-奈米抗體)係指最初以基因構築體編碼之片段。第一個Met係在處理期間被切割。
圖10顯示胞外體mRNA裝載系統之示意圖，該系統包含(i)融合至FLAG® 及單體或二聚體MCP變異體(1XMCP(V29I)(「815」；SEQ ID NO：111)、1XMCP (V29I/N55K) (「817」；SEQ ID NO：112)、2XMCP(V29I)(「819」；SEQ ID NO：113)或2XMCP(V29I/N55K)(「821」；SEQ ID NO：114)之BASP1 (1至30)，及(ii)含有3x MS2髮夾環之螢光素酶mRNA (「螢光素酶-MS2 mRNA」或「811」；SEQ ID NO：115)。胺基酸編號(例如BASP1 (1至30))係指最初以基因構築體編碼之片段。第一個Met係在處理期間被切割。
圖11A顯示含有與各種BASP1融合蛋白質(815、817或819)組合之圖10中所述之mRNA裝載構築體、螢光素酶mRNA (811)之胞外體的蛋白質凝膠。
圖11B顯示圖11A中的樣本之抗FLAG® 西方墨點轉漬法。
圖12A顯示在細胞中(上圖)或含有圖10中所示之mRNA裝載構築體之胞外體中(下圖)的螢光素酶mRNA量之RT-qPCR結果。
圖12B顯示定量來自圖12A之樣本的經純化之胞外體中的螢光素酶mRNA量之表格，包括來自螢光素酶mRNA之隨機裝載的倍數富集。
圖13顯示融合至MARCKS、MARCKSL1和BASP1之N端片段的CD40L三聚體，容許錨定至胞外體之腔表面的跨膜蛋白質外部表面展示之示意圖。胺基酸編號(例如MARCKS 1至30、MARCKSL1 1至30、BASP1 1至30、BASP1 1至10 ExoTOPE)係指最初以基因構築體編碼之片段。第一個Met係在處理期間被切割。
圖14A顯示與融合至MARCKS、MARCKSL1和BASP1之N端片段的CD40L表面表現胞外體培育之培養物中的小鼠B細胞活化的結果。
圖14B顯示與融合至MARCKS、MARCKSL1和BASP1之N端片段的CD40L表面表現胞外體培育之培養物中的人類B細胞活化的結果。
圖14C顯示當融合至MARCKS、MARCKSL1、BASP1或全長PTGFRN之N端序列時對不同的CD40L表面展示胞外體之相對效力的圖表。胺基酸編號(例如BASP1 1至30)係指最初以基因構築體編碼之片段。第一個Met係在處理期間被切割。
圖15顯示自不同來源(HEK293SF，腎；HT1080，結締組織；K562，骨髓；MDA-MB-231，乳房；Raji，淋巴胚細胞；間質幹細胞(MSC)、骨髓)的各種細胞株純化之胞外體中的腔蛋白質(MARCKS、MARCKSL1和BASP 1)及習知的EV (例如胞外體)蛋白質(CD81和CD9)之肽光譜匹配(PSM)數量。
圖16顯示單獨的自中國倉鼠卵巢(CHO)細胞衍生之胞外體或來自過度表現融合至FLAG® -GFP 之BASP1或BASP1 N端片段(1至30或1至8)的細胞的蛋白質凝膠(左圖)及抗FLAG® 西方墨點轉漬法(右圖)。胺基酸編號(例如BASP1 (1至30))係指最初以基因構築體編碼之片段。第一個Met係在處理期間被切割。
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Claims (82)

  1. 一種經單離之細胞外囊泡(EV)，其包含連結至支架蛋白質之生物活性分子，其中該支架蛋白質包含N端結構域(ND)及效應子結構域(ED)，其中該ND係與該EV之腔表面締合及該ED係藉由離子相互作用與該EV之腔表面締合，其中該ED包含至少兩個按序鄰接的離胺酸(Lys)。
  2. 根據申請專利範圍第1項之EV，其中該ND係經由肉豆蔻醯基化(myristoylation)與該EV之腔表面締合。
  3. 根據申請專利範圍第2項之EV，其中該ND在N端上具有Gly。
  4. 根據申請專利範圍第1至3項中任一項之EV，其中該ED包含至少三個Lys、至少四個Lys、至少五個Lys、至少六個Lys或至少七個Lys。
  5. 根據申請專利範圍第1至4項中任一項之EV，其中該ED係藉由肽鍵連結至該ND。
  6. 根據申請專利範圍第4或5項之EV，其中該ED包含(Lys)n，其中n為介於1與10之間的整數。
  7. 根據申請專利範圍第1至6項中任一項之EV，其中該ED包含KK、KKK、KKKK (SEQ ID NO：151)、KKKKK (SEQ ID NO：152)或其任何組合。
  8. 根據申請專利範圍第1至7項中任一項之EV，其中該ND包含如以G:X2:X3:X4:X5:X6所列之胺基酸序列，其中G為以Gly表示之甘胺酸；其中「:」表示肽鍵，其中X2至X6中之各者獨立為胺基酸；且其中該X6包含鹼性胺基酸。
  9. 根據申請專利範圍第8項之EV，其中該X6係選自由下列者所組成之群組：Lys、Arg和His。
  10. 一種經單離之細胞外囊泡(EV)，其包含連結至支架蛋白質之生物活性分子，其中該支架蛋白質包含N端結構域(ND)及效應子結構域(ED)，其中該ND包含如以G:X2:X3: X4:X5:X6所列之胺基酸序列，其中G為以Gly表示之甘胺酸；其中「:」表示肽鍵，其中X2至X6中之各者獨立為胺基酸；其中該X6包含鹼性胺基酸，且其中該ED係藉由肽鍵連結至X6，且包含至少一個離胺酸在該ED之N端上。
  11. 根據申請專利範圍第1至10項中任一項之EV，其中該ED不包含病毒之跨膜結構域或細胞質結構域。
  12. 根據申請專利範圍第8至11項中任一項之EV，其中該X2係選自由下列者所組成之群組：Pro、Gly、Ala和Ser。
  13. 根據申請專利範圍第8至12項中任一項之EV，其中該X4係選自由下列者所組成之群組：Pro、Gly、Ala、Ser、Val、Ile、Leu、Phe、Trp、Tyr、Gln和Met。
  14. 根據申請專利範圍第8至13項中任一項之EV，其中該X5係選自由下列者所組成之群組：Pro、Gly、Ala和Ser。
  15. 根據申請專利範圍第1至14項中任一項之EV，其中該支架蛋白質之該ND包含G:X2:X3:X4:X5:X6之胺基酸序列，其中 (i)   G表示Gly； (ii)  「:」表示肽鍵； (iii) 該X2為選自由下列者所組成之群組的胺基酸：Pro、Gly、Ala和Ser； (iv) 該X3為胺基酸； (v)  該X4為選自由下列者所組成之群組的胺基酸：Pro、Gly、Ala、Ser、Val、Ile、Leu、Phe、Trp、Tyr、Gln和Met； (vi) 該X5為選自由下列者所組成之群組的胺基酸：Pro、Gly、Ala和Ser；且 (vii) 該X6為選自由下列者所組成之群組的胺基酸：Lys、Arg和His。
  16. 根據申請專利範圍第8至15項中任一項之EV，其中該X3係選自由下列者所組成之群組：Asn、Gln、Ser、Thr、Asp、Glu、Lys、His和Arg。
  17. 根據申請專利範圍第1至9及11至16項中任一項之EV，其中該ND與該ED係以連結子接合。
  18. 根據申請專利範圍第17項之EV，其中該連結子包含肽鍵或一或多個胺基酸。
  19. 一種經單離之細胞外囊泡(EV)，其包含連結至支架蛋白質之生物活性分子，其中該支架蛋白質包含ND-ED，其中： a.    ND包含G:X2:X3:X4:X5:X6；其中： i.    G表示Gly； ii.   「:」表示肽鍵； iii.  該X2為選自由下列者所組成之群組的胺基酸：Pro、Gly、Ala和Ser； iv.   該X3為胺基酸； v.   該X4為選自由下列者所組成之群組的胺基酸：Pro、Gly、Ala、Ser、Val、Ile、Leu、Phe、Trp、Tyr、Glu和Met； vi.  該X5為選自由下列者所組成之群組的胺基酸：Pro、Gly、Ala和Ser； vii. 該X6為選自由下列者所組成之群組的胺基酸：Lys、Arg和His； b.   「-」為視需要之連結子，其包含一或多個胺基酸；且 c.    ED為效應子結構域，其包含(i)至少兩個鄰接的離胺酸(Lys)，其係藉由肽鍵或一或多個胺基酸連結至該X6，或(ii)至少一個離胺酸，其係藉由肽鍵直接連結至該X6。
  20. 根據申請專利範圍第8至19項中任一項之EV，其中該X2係選自由下列者所組成之群組：Gly和Ala。
  21. 根據申請專利範圍第8至20項中任一項之EV，其中該X3為Lys。
  22. 根據申請專利範圍第8至21項中任一項之EV，其中該X4為Leu或Glu。
  23. 根據申請專利範圍第8至22項中任一項之EV，其中該X5係選自由下列者所組成之群組：Ser和Ala。
  24. 根據申請專利範圍第8至23項中任一項之EV，其中該X6為Lys。
  25. 根據申請專利範圍第8至24項中任一項之EV，其中該X2為Gly、Ala或Ser；該X3為Lys或Glu；該X4為Leu、Phe、Ser和Glu；該X5為Ser或Ala；且該X6為Lys。
  26. 根據申請專利範圍第19至25項中任一項之EV，其中該ND與該ED係藉由包含一或多個胺基酸之連結子連結。
  27. 根據申請專利範圍第19至26項中任一項之EV，其中該ED包含Lys (K)、KK、KKK、KKKK (SEQ ID NO：151)、KKKKK (SEQ ID NO：152)或其任何組合。
  28. 根據申請專利範圍第1至27項中任一項之EV，其中該支架蛋白質包含選自由下列者所組成之群組的胺基酸序列：(i) GGKLSKK (SEQ ID NO：157)、(ii) GAKLSKK (SEQ ID NO：158)、(iii) GGKQSKK (SEQ ID NO：159)、(iv) GGKLAKK (SEQ ID NO：160)或(v)其任何組合。
  29. 根據申請專利範圍第28項之EV，其中該支架蛋白質包含選自由下列者所組成之群組的胺基酸序列：(i) GGKLSKKK (SEQ ID NO：161)、(ii) GGKLSKKS (SEQ ID NO：162)、(iii) GAKLSKKK (SEQ ID NO：163)、(iv) GAKLSKKS (SEQ ID NO：164)、(v) GGKQSKKK (SEQ ID NO：165)、(vi) GGKQSKKS (SEQ ID NO：166)、(vii) GGKLAKKK (SEQ ID NO：167)、(viii) GGKLAKKS (SEQ ID NO：168)及(ix)其任何組合。
  30. 根據申請專利範圍第1至29項中任一項之EV，其中該支架蛋白質為至少約8個、至少約9個、至少約10個、至少約11個、至少約12個、至少約13個、至少約14個、至少約15個、至少約16個、至少約17個、至少約18個、至少約19個、至少約20個、至少約21個、至少約22個、至少約23個、至少約24個、至少約25個、至少約30個、至少約35個、至少約40個、至少約45個、至少約50個、至少約55個、至少約60個、至少約65個、至少約70個、至少約75個、至少約80個、至少約85個、至少約90個、至少約95個、至少約100個、至少約105個、至少約110個、至少約120個、至少約130個、至少約140個、至少約150個、至少約160個、至少約170個、至少約180個、至少約190個或至少約200個胺基酸長度。
  31. 根據申請專利範圍第1至30項中任一項之EV，其中該支架蛋白質包含(i) GGKLSKKKKGYNVN (SEQ ID NO：169)、(ii) GAKLSKKKKGYNVN (SEQ ID NO：170)、(iii) GGKQSKKKKGYNVN (SEQ ID NO：171)、(iv) GGKLAKKKKGYNVN (SEQ ID NO：172)、(v) GGKLSKKKKGYSGG (SEQ ID NO：173)、(vi) GGKLSKKKKGSGGS (SEQ ID NO：174)、(vii) GGKLSKKKKSGGSG (SEQ ID NO：175)、(viii) GGKLSKKKSGGSGG (SEQ ID NO：176)、(ix) GGKLSKKSGGSGGS (SEQ ID NO：177)、(x) GGKLSKSGGSGGSV (SEQ ID NO：178)或(xi) GAKKSKKRFSFKKS (SEQ ID NO：179)。
  32. 根據申請專利範圍第1至31項中任一項之EV，其中該支架蛋白質在N端上不包含Met。
  33. 根據申請專利範圍第1至32項中任一項之EV，其中該支架蛋白質在該支架蛋白質之N端上包含肉豆蔻醯基化胺基酸殘基。
  34. 根據申請專利範圍第33項之EV，其中在該支架蛋白質之N端上的該胺基酸殘基為Gly。
  35. 根據申請專利範圍第33或34項之EV，其中在該支架蛋白質之N端上的該胺基酸殘基為合成的。
  36. 根據申請專利範圍第33或35項之EV，其中在該支架蛋白質之N端上的該胺基酸殘基為甘胺酸類似物。
  37. 根據申請專利範圍第1至36項中任一項之EV，其中該支架蛋白質包含與SEQ ID NO：1 (MARKS)、SEQ ID NO：2 (MARCKSL1)或SEQ ID NO：3 (BASP1)具有至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%之序列一致性的胺基酸序列。
  38. 根據申請專利範圍第1至37項中任一項之EV，其中該生物活性分子係在該EV之腔表面或腔上。
  39. 根據申請專利範圍第1及8項中任一項之EV，其中該支架蛋白質進一步包含跨膜結構域。
  40. 根據申請專利範圍第39項之EV，其中該跨膜結構域係在該支架蛋白質之該ED結構域與該生物活性分子之間。
  41. 根據申請專利範圍第1至40項中任一項之EV，其中該支架蛋白質進一步包含囊泡外結構域。
  42. 根據申請專利範圍第41項之EV，其中該生物活性分子係連結至該囊泡外結構域。
  43. 根據申請專利範圍第1至42項中任一項之EV，其中該支架蛋白質係藉由連結子連結至該生物活性分子。
  44. 根據申請專利範圍第1至43項中任一項之EV，其中該ND結構域係藉由連結子連結至該ED結構域。
  45. 根據申請專利範圍第43或44項之EV，其中該連結子包含肽鍵或一或多個胺基酸。
  46. 根據申請專利範圍第17至19、26及43至45項中任一項之EV，其中該連結子包含可切割的連結子。
  47. 根據申請專利範圍第17至19、26及43至45項中任一項之EV，其中該連結子包含可撓性連結子。
  48. 根據申請專利範圍第1至47項中任一項之EV，其中該生物活性分子包含蛋白質、多肽、肽、多核苷酸(DNA及/或RNA)、化學化合物、病毒、親離子基團、親離子基團之載體、形成通道或孔之部分或其任何組合。
  49. 根據申請專利範圍第48項之EV，其中該蛋白質包含重組肽、天然肽、合成肽、抗體、融合蛋白質或其任何組合。
  50. 根據申請專利範圍第48項之EV，其中該蛋白質包含酵素、細胞激素、配體、受體、轉錄因子或其組合。
  51. 根據申請專利範圍第48項之EV，其中該病毒包含腺相關病毒、小病毒、反轉錄病毒、腺病毒或其任何組合。
  52. 根據申請專利範圍第1至51項中任一項之EV，其中該EV進一步包含第二支架蛋白質。
  53. 根據申請專利範圍第52項之EV，其中該第二支架蛋白質包含PTGFRN多肽、BSG多肽、IGSF2多肽、IGSF3多肽、IGSF8多肽、ITGB1多肽、ITGA4多肽、SLC3A2多肽、ATP轉運子多肽、胺肽酶N (ANPEP)多肽、外核苷酸焦磷酸酶(ectonucleotide pyrophosphatase)/磷酸二酯酶家族成員1 (ENPP1)多肽、腦啡肽酶(neprilysin)(MME)多肽、神經纖毛蛋白(neuropilin)-1 (NRP1)多肽或其片段。
  54. 根據申請專利範圍第1至53項中任一項之EV，其中該生物活性分子為陰性檢查點調節子(negative checkpoint regulator)之抑制劑或陰性檢查點調節子的結合伴體之抑制劑。
  55. 根據申請專利範圍第54項之EV，其中該陰性檢查點調節子係選自由下列者所組成之群組：細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白質4 (CTLA-4)、程式性細胞死亡蛋白質1 (PD-1)、淋巴細胞活化型基因3 (LAG-3)、含T細胞免疫球蛋白黏蛋白之蛋白質3 (TIM-3)、B和T淋巴細胞衰減因子(BTLA)、具有Ig及ITIM結構域之T細胞免疫受體(TIGIT)、T細胞活化之V結構域Ig抑制因子(VISTA)、腺苷酸A2a受體(A2aR)、殺手細胞免疫球蛋白樣受體(KIR)、吲哚胺2,3-二氧酶(IDO)、CD20、CD39和CD73。
  56. 根據申請專利範圍第1至47項中任一項之EV，其中該生物活性分子為免疫性蛋白質。
  57. 根據申請專利範圍第1至47項中任一項之EV，其中該生物活性分子為毒素、類毒素或毒素之無毒性突變體。
  58. 根據申請專利範圍第57項之EV，其中該毒素為白喉毒素。
  59. 根據申請專利範圍第57項之EV，其中該類毒素為破傷風類毒素。
  60. 根據申請專利範圍第57項之EV，其中該生物活性分子為白喉毒素之無毒性突變體。
  61. 根據申請專利範圍第1至60項中任一項之EV，其中該生物活性分子為陽性共刺激分子之活化物或陽性共刺激分子的結合伴體之活化物。
  62. 根據申請專利範圍第61項之EV，其中該陽性共刺激分子為TNF受體超家族成員。
  63. 根據申請專利範圍第62項之EV，其中該TNF受體超家族成員係選自由下列者所組成之群組：CD120a、CD120b、CD18、OX40、CD40、Fas受體、M68、CD27、CD30、4-1BB、TRAILR1、TRAILR2、TRAILR3、TRAILR4、RANK、OCIF、TWEAK受體、TACI、BAFF受體、ATAR、CD271、CD269、AITR、TROY、CD358、TRAMP和XEDAR。
  64. 根據申請專利範圍第63項之EV，其中該陽性共刺激分子之活化物為TNF超家族成員。
  65. 根據申請專利範圍第64項之EV，其中該TNF超家族成員係選自由下列者所組成之群組：TNFα、TNF-C、OX40L、CD40L、FasL、LIGHT、TL1A、CD27L、Siva、CD153、4-1BB配體、TRAIL、RANKL、TWEAK、APRIL、BAFF、CAMLG、NGF、BDNF、NT-3、NT-4、GITR配體和EDA-2。
  66. 根據申請專利範圍第61項之EV，其中該陽性共刺激分子為CD28-超家族共刺激分子。
  67. 根據申請專利範圍第66項之EV，其中該CD28-超家族共刺激分子為ICOS或CD28。
  68. 根據申請專利範圍第67項之EV，其中該陽性共刺激分子之活化物為ICOSL、CD80或CD86。
  69. 根據申請專利範圍第50項之EV，其中該細胞激素係選自由下列者所組成之群組：IL-2、IL-7、IL-10、IL-12和IL-15。
  70. 根據申請專利範圍第48項之EV，其中該蛋白質包含T細胞受體(TCR)、T細胞共受體、主要組織相容複合體(MHC)、人類白血球抗原(HLA)或其衍生物。
  71. 根據申請專利範圍第48項之EV，其中該蛋白質包含腫瘤抗原。
  72. 根據申請專利範圍第71項之EV，其中該腫瘤抗原係選自由下列者所組成之群組：α-胎兒蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、上皮腫瘤抗原(ETA)、黏蛋白1 (MUC1)、Tn-MUC1、黏蛋白16 (MUC16)、酪胺酸酶、黑色素瘤相關抗原(MAGE)、腫瘤蛋白質p53 (p53)、CD4、CD8、CD45、CD80、CD86、程式性死亡配體1 (PD-L1)、程式性死亡配體2 (PD-L2)、NY-ESO-1、PSMA、TAG-72、HER2、GD2、cMET、EGFR、間皮素(Mesothelin)、VEGFR、α-葉酸受體、CE7R、IL-3、癌-睪丸抗原、MART-1 gp100和TNF相關細胞凋亡誘導配體。
  73. 根據申請專利範圍第1至72項中任一項之EV，其中該EV為胞外體。
  74. 一種醫藥組成物，其包含根據申請專利範圍第1至73項中任一項之EV及醫藥上可接受之載劑。
  75. 一種細胞，生產根據申請專利範圍第1至73項中任一項之EV。
  76. 一種細胞，包含一或多種載體，其中該載體包含編碼根據申請專利範圍第1至73項中任一項之該支架蛋白質及該生物活性分子之核酸序列。
  77. 根據申請專利範圍第76項之細胞，其中該核酸序列可操作地連結至啟動子。
  78. 一種套組，其包含根據申請專利範圍第1至73項中任一項之EV及用法說明。
  79. 一種製造EV之方法，其包含在適合的條件下培養根據申請專利範圍第75至77項中任一項之細胞及獲得該EV。
  80. 一種錨定生物活性分子至細胞外囊泡之方法，其包含令根據申請專利範圍第1至73項中任一項之該生物活性分子連結至根據申請專利範圍第1至73項中任一項之該支架蛋白質。
  81. 一種預防或治療有其需要之個體的疾病之方法，其包含投予根據申請專利範圍第1至73項中任一項之EV，其中該疾病係與抗原相關。
  82. 根據申請專利範圍第81項之方法，其中該EV係經胃腸外、經口、靜脈內、肌肉內、腫瘤內、鼻內、皮下或腹膜內投予。
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