ES2907967T3

ES2907967T3 - Vesículas extracelulares modificadas y sus usos

Info

Publication number: ES2907967T3
Application number: ES19731027T
Authority: ES
Inventors: Kevin P Dooley; Rane A Harrison; Ke Xu; Damian J Houde; Sonya Haupt; John D Kulman; Douglas E Williams; Russell E Mcconnell; Madeleine Youniss
Original assignee: Codiak Biosciences Inc
Current assignee: Codiak Biosciences Inc
Priority date: 2018-11-16
Filing date: 2019-05-22
Publication date: 2022-04-27
Anticipated expiration: 2039-05-22
Also published as: MA49971B1; EP3672614B1; EP3672614A1; CY1124897T1; SI3672614T1; RS62863B1; TWI846697B; LT3672614T; WO2020101740A1; PL3672614T3; EP4059510B1; PT3672614T; EP4059510C0; CN121102502A; MX2021005636A; EP4628099A3; HRP20220020T1; AU2019378591A1; DK3672614T3; EP4628099A2

Abstract

Una vesícula extracelular (VE) aislada que comprende una molécula con actividad biológica unida a una proteína de armazón, donde la proteína de armazón comprende un dominio de extremo N (DN) y un dominio efector (DE), donde el DN está asociado con la superficie luminal de la VE y el DE está asociado con la superficie luminal de la VE, donde el DN comprende la secuencia de aminoácidos GGKLSK (SEQ ID NO: 203), pero no comprende una metionina (Met) en el extremo N, donde el DE comprende una lisina (Lys) en su extremo N que se une directamente a la lisina en el extremo C de la SEQ ID NO: 203 en el DN; y donde la molécula biológicamente activa comprende una o más proteínas heterólogas fusionadas con el extremo C de la proteína de armazón.

Description

DESCRIPCIÓN

Vesículas extracelulares modificadas y sus usos

Campo técnico

La presente descripción presenta vesículas extracelulares, por ejemplo, exosomas, ricas en una proteína de armazón que se asocia con la superficie luminal de la vesícula extracelular que puede ser útil como un agente para la profilaxis 0 el tratamiento del cáncer y otras enfermedades.

Antecedentes

Los exosomas son mediadores importantes de la comunicación intercelular. También son biomarcadores importantes en el diagnóstico y pronóstico de muchas enfermedades, como el cáncer. Como vehículos de administración de fármacos, los exosomas ofrecen muchas ventajas con respecto a los métodos tradicionales de administración de fármacos como una nueva modalidad de tratamiento en muchas áreas terapéuticas.

Una característica central de los exosomas es su capacidad para incluir una carga útil con actividad biológica dentro de su espacio interior o lumen. Es bien sabido que los exosomas contienen una carga útil endógena que incluye ARNm, miARN, ADN, proteínas, carbohidratos y lípidos, pero la capacidad de dirigir carga específica de la carga útil terapéutica deseada está actualmente limitada. Los exosomas se pueden cargar mediante la sobreexpresión de cargas útiles terapéuticas deseadas en una célula productora, pero esta carga es a menudo de eficacia limitada debido a la localización estocástica de la carga útil en los centros de procesamiento de exosomas celulares. De manera alternativa, los exosomas purificados se pueden cargar ex vivo mediante, por ejemplo, electroporación. Estos métodos pueden sufrir de baja eficiencia o estar limitados a cargas útiles pequeñas, como los ARNip. Por lo tanto, se necesitan métodos adecuados para generar exosomas con carga altamente eficientes y bien definidos para permitir mejor el uso terapéutico y otras aplicaciones de tecnologías basadas en exosomas.

El documento US 2018/0015182 A1 describe exosomas modificados para el suministro de carga bioactiva usando tetraespaninas transmembrana. El documento WO 2018/112154 A1 se refiere a métodos de medición de exosomas que usan fluorescencia intrínseca. El documento WO 2018/039119 A1 desvela métodos para suprimir el suministro de exosomas al hígado y al bazo. Gyorgy et ál. (Annu Rev Pharmacol Toxicol. 2015; 55: 439-464) analiza aplicaciones terapéuticos de vesículas extracelulares. García-Manrique et ál. (J Extracell Vesicles. 2018; 7(1): 1422676) revisa biomaterials terapéuticos basados en vesículas extracelulares. Li et ál. (PLoS One. 2016; 11(9): e0163043) describe la identificación y caracterización de exosomas procedentes de células 293T. El document WO 2016/138525 A1 se refiere a ensamblajes de polipéptidos y métodos para la producción de los mismos. Ryo Tamura, "A thesis submitted to the Faculty of the Graduate School of the University of Colorado in partial fulfillment of the requirement for the degree of Doctor of Philosophy Department of Chemistry and Biochemistry", 2017, es un studio sobre el dominio efector de proteína MARCKS como un péptido de penetración celular y el desarrollo de los profármacos fotoactivables de doxazolidina.

Breve sumario

La invención proporciona una vesícula extracelular (VE) aislada que comprende una molécula biológicamente activa ligada a una proteína de armazón, en donde la proteína de armazón comprende un dominio N terminal (DN) y un dominio efector (DE), en donde el DN está asociado con la superficie luminal de la VE y el DE está asociado con la superficie luminal de la VE, en donde el DN comprende la secuencia de aminoácidos GGKLSK (SEQ ID NO: 203), pero no comprende una metionina (Met) en el extremo N, en donde el DE comprende una lisina (Lys) en su extremo N que se liga directamente a la lisina en el extremo C de la SEQ ID NO: 203 en el DN; y en donde la molécula biológicamente activa comprende una o más proteínas heterólogoas fusionadas con el extremo C de la proteína de armazón. La invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende una VE de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable. La invención también proporciona una VE de la invención para su uso en la prevención o el tratamiento de una enfermedad en un sujeto que lo necesite. En las reivindicaciones adjuntas, se definen realizaciones adicionales de la invención.

Un aspecto de la presente descripción hace referencia a nuevos métodos para cargar vesículas extracelulares (VE), por ejemplo, exosomas para uso terapéutico. Específicamente, los métodos utilizan marcadores de proteínas que se identificaron recientemente en la superficie luminal de los exosomas. En particular, se identificó un grupo de proteínas (por ejemplo, el sustrato de proteína quinasa C rico en alanina miristoilada (MARCKS, por sus siglas en inglés), el sustrato de proteína quinasa C rico en alanina miristoilada como 1 (MARCKSL1, por sus siglas en inglés) y la proteína 1 soluble en ácido cerebral (BASP1, por sus siglas en inglés)) como altamente enriquecidas en la superficie luminal de los exosomas. Además, se demostró que una secuencia corta del extremo amino de BASP1, por ejemplo, al menos siete aminoácidos, era suficiente para dirigir la carga de alta eficacia de moléculas de proteína fluorescentes en la misma medida que la proteína BASP1 de longitud completa. Este fragmento, que tiene al menos siete aminoácidos y menos de diez aminoácidos, presenta un avance significativo en el campo de la carga de VE modificadas y permite la carga eficiente y reproducible de cualquier molécula con actividad biológica, por ejemplo, una carga útil de proteína terapéutica en el lumen de las VE, por ejemplo, exosomas, sin ningún paso adicional de manipulación ex vivo. La carga de las VE, por ejemplo, exosomas, mediante el uso de proteínas de fusión que se describen en la presente memoria produce VE modificadas, por ejemplo, exosomas modificados, con niveles de carga útil significativamente más altos en comparación con cualquier otro método de ingeniería genética descrito hasta el momento.

Las proteínas y secuencias de péptidos identificadas recientemente a partir de exosomas se utilizan en diversas modalidades de la presente descripción. Por ejemplo, algunas modalidades se relacionan con la generación de una proteína de fusión conjugando la VE, por ejemplo, una proteína exosómica o un fragmento de proteína (es decir, una proteína de armazón) y una molécula con actividad biológica (por ejemplo, una proteína terapéuticamente relevante) y la producción de una VE, por ejemplo, exosoma, que contiene la proteína de fusión en la superficie luminal de la VE. La proteína nativa de longitud completa o un fragmento con actividad biológica de la molécula con actividad biológica (por ejemplo, una proteína relevante desde un punto de vista terapéutico) se puede transportar a la superficie luminal de las VE, por ejemplo, exosomas, al conjugarse con las proteínas ricas en exosomas o fragmentos de proteínas.

La presente descripción hace referencia además a la generación o uso de VE con modificación en el lumen, por ejemplo, exosomas modificados por lumen, modificados para una carga más eficiente, o para cargar una molécula con actividad biológica (por ejemplo, una proteína relevante desde un punto de vista terapéutico) en el lumen de una VE, por ejemplo, exosoma. Por ejemplo, la superficie luminal de las VE se puede modificar para que contenga una concentración más alta de la VE nativa de longitud completa, por ejemplo, proteína exosómica y/o un fragmento o una proteína modificada de la VE nativa, por ejemplo, proteína exosómica en la superficie luminal.

Algunas modalidades de la presente descripción hacen referencia a una célula productora o un método para generar la célula productora para producir dichas VE con modificación en el lumen. Puede introducirse un polinucleótido exógeno de forma transitoria o estable en una célula productora para generar una VE con modificación en el lumen, por ejemplo, exosoma modificado en el lumen, a partir de la célula productora.

Por consiguiente, en un aspecto, la presente descripción proporciona una VE, por ejemplo, un exosoma, que comprende una proteína de armazón, en la que al menos una parte de la proteína de armazón se expresa a partir de una secuencia exógena, y la proteína de armazón comprende MARCKS, MARCKSL1, BASP1 o un fragmento, variante, derivado o una modificación de estas.

En algunos aspectos, la proteína de armazón se encuentra presente en la VE, por ejemplo, un exosoma, a una densidad más alta que una proteína de armazón diferente en una VE diferente, por ejemplo, un exosoma, en la que la proteína de armazón diferente comprende una VE convencional, por ejemplo, proteína exosómica o una variante de esta. En algunas modalidades, la VE convencional, por ejemplo, la proteína exosómica se selecciona del grupo que consiste en CD9, CD63, CD81, PDGFR, proteínas de anclaje GPI, lactadherina, LAMP2, LAMP2B y un fragmento de estas.

En algunas modalidades, la VE, por ejemplo, un exosoma, se produce a partir de una célula genéticamente modificada para que incluya la secuencia exógena, opcionalmente donde la célula es una célula HEK293.

En algunas modalidades, la célula comprende un plásmido que comprende la secuencia exógena.

En algunas modalidades, la secuencia exógena se inserta en un sitio genómico ubicado 3' o 5' con respecto a una secuencia genómica que codifica MARCKS, MARCKSL1 o BASP1. En algunas modalidades, la secuencia exógena se inserta en una secuencia genómica que codifica MARCKS, MARCKSL1 o BASP1.

En algunas modalidades, la proteína de armazón es una proteína de fusión que comprende MARCKS, MARCKSL1, BASP1 o un fragmento de estas, y un péptido terapéutico.

En algunas modalidades, la molécula con actividad biológica comprende un péptido terapéutico que se selecciona del grupo que consiste en un péptido natural, un péptido recombinante, un péptido sintético o un enlazador para un compuesto terapéutico. En algunas modalidades, la molécula con actividad biológica (por ejemplo, un compuesto terapéutico) se selecciona del grupo que consiste en nucleótidos, aminoácidos, lípidos, carbohidratos y moléculas pequeñas. En algunas modalidades, la molécula con actividad biológica (por ejemplo, un péptido terapéutico) es un anticuerpo o un fragmento o una modificación de este. En algunas modalidades, el péptido terapéutico es una enzima, un ligando, un receptor, un factor de transcripción o un fragmento o una modificación de este. En algunas modalidades, el péptido terapéutico es un péptido antimicrobiano o un fragmento o una modificación de este.

En algunas modalidades, la VE, por ejemplo, un exosoma, comprende además una segunda proteína de armazón, donde la segunda proteína de armazón comprende MARCKS, MARCKSL1, BASP1 o un fragmento de estas. En algunas modalidades, la VE, por ejemplo, un exosoma, comprende además una segunda proteína de armazón, donde la segunda proteína de armazón comprende PTGFRN, BSG, IGSF2, IGSF3, IGSF8, ITGB1, ITGA4, SLC3A2, transportador de ATP o un fragmento de estos.

En algunas modalidades, la proteína de armazón comprende una secuencia peptídica correspondiente al patrón (M)(G)(G/A/S)(K/Q)(L/F/S/Q)(S/A)(K)(K) (SEQ ID NO: 118) o dicho patrón sin la (M) N terminal. En algunas modalidades, la proteína de armazón comprende un péptido de (M)(G)(n)(X)(0/n)(n)(+)(+), o el péptido sin la (M) N terminal, donde cada posición entre paréntesis representa un aminoácido, y donde n es cualquier aminoácido que se selecciona del grupo que consiste en (Pro, Gly, Ala, Ser), X es cualquier aminoácido, O es cualquier aminoácido que se selecciona del grupo que consiste en (Val, Ile, Leu, Phe, Trp, Tyr, Met) y (+) es cualquier aminoácido que se selecciona del grupo que consiste en (Lys, Arg, His); y donde la posición cinco no es (+) y la posición seis no es (+) ni (Asp o Glu). En algunas modalidades, la proteína de armazón comprende un péptido de secuencia (M)(G)(n)(^)(O/n)(S/A/G/N)(+)(+), o el péptido sin la (M) N terminal, donde cada posición entre paréntesis representa un aminoácido, y donde n es cualquier aminoácido que se selecciona del grupo que consiste en (Pro, Gly, Ala, Ser), ês cualquier aminoácido que se selecciona del grupo que consiste en (Asn, Gln, Ser, Thr, Asp, Glu, Lys, His, Arg), O es cualquier aminoácido que se selecciona del grupo que consiste en (Val, Ile, Leu, Phe, Trp, Tyr, Met), y (+) es cualquier aminoácido que se selecciona del grupo que consiste en (Lys, Arg, His); y donde la posición cinco no es (+) y la posición seis no es (+) ni (Asp o Glu). Véase R. Aasland et ál., FEBS Letters 513 (2002): 141-144 para la nomenclatura de aminoácidos.

En algunas modalidades, la proteína de armazón comprende un péptido de cualquiera de las SEQ ID NO: 4 a 110. En algunas modalidades, la proteína de armazón comprende un péptido de MGXKLSKKK (SEQ ID NO: 116), o el péptido sin la M N terminal, donde X es cualquier aminoácido. En algunas modalidades, la proteína de armazón comprende un péptido de la SEQ ID NO: 110, o el péptido correspondiente sin la M N terminal. En algunas modalidades, la proteína de armazón comprende el péptido de la SEQ ID NO: 13, o el péptido correspondiente sin la (M) N terminal.

En algunas modalidades, la proteína de armazón comprende además una carga útil, por ejemplo, un péptido.

En otra modalidad, la presente descripción proporciona una composición farmacéutica que comprende una VE de la presente descripción, por ejemplo, un exosoma y un excipiente.

En algunas modalidades, la composición farmacéutica está sustancialmente libre de macromoléculas, donde las macromoléculas se seleccionan de ácidos nucleicos, proteínas exógenas, lípidos, carbohidratos, metabolitos y una combinación de estos.

En incluso otra modalidad, la presente descripción proporciona una población de células para producir la VE, por ejemplo, un exosoma, que se proporciona en la presente memoria.

En algunas modalidades, la población de células comprende una secuencia exógena que codifica la proteína de armazón que comprende MARCKS, MARCKSL1, BASP1 o un fragmento o una modificación de estas. En algunas modalidades, la población de células comprende además una segunda secuencia exógena que codifica una segunda proteína de armazón, donde la segunda proteína de armazón comprende MARCKS, MARCKSL1, BASP1 o un fragmento o una modificación de estas. En algunas modalidades, la población de células comprende además una segunda secuencia exógena que codifica una segunda proteína de armazón, donde la segunda proteína de armazón comprende PTGFRN, BSG, IGSF2, IGSF3, IGSF8, ITGB1, ITGA4, SLC3A2, transportador de ATP o un fragmento de estos.

En algunas modalidades, la secuencia exógena se inserta en una secuencia genómica que codifica MARCKS, MARCKSL1 o BASP1, en la que la secuencia exógena y la secuencia genómica codifican la proteína de armazón. En algunas modalidades, la secuencia exógena se encuentra en un plásmido.

En algunas modalidades, la secuencia exógena codifica una molécula con actividad biológica (por ejemplo, un péptido terapéutico). En algunas modalidades, el péptido terapéutico se selecciona del grupo que consiste en un péptido natural, un péptido recombinante, un péptido sintético o un enlazador para un compuesto terapéutico. En algunas modalidades, el compuesto terapéutico se selecciona del grupo que consiste en nucleótidos, aminoácidos, lípidos, carbohidratos y moléculas pequeñas. En algunas modalidades, el péptido terapéutico es un anticuerpo o un fragmento o una modificación de este. En una modalidad particular, el anticuerpo es un nanocuerpo. Un experto en la técnica comprendería que el anticuerpo utilizado en una VE de la presente descripción puede ser cualquier molécula de unión a antígeno que se conozca en la técnica, incluidos, por ejemplo, formatos de anticuerpos alternativos, conjugados antígeno-fármaco (ADC) o inmunotoxinas.

En algunas modalidades, el péptido terapéutico es una enzima, un ligando, un receptor, un factor de transcripción o un fragmento o una modificación de estos. En algunas modalidades, el péptido terapéutico es un péptido antimicrobiano o un fragmento o una modificación de este.

En algunas modalidades, la secuencia exógena codifica un resto de direccionamiento. En algunas modalidades, el resto de direccionamiento es específico para un órgano, tejido o célula.

En algunas modalidades, la segunda proteína de armazón comprende además un resto de direccionamiento. En algunas modalidades, el resto de direccionamiento es específico para un órgano, tejido o célula.

En una modalidad, la presente descripción proporciona un polipéptido para modificar una VE, por ejemplo, exosoma, que comprende una secuencia de

(i) (M)(G)(G/A/S)(K/Q)(L/F/S/Q)(S/A)(K)(K) (SEQ ID NO: 118), o la secuencia correspondiente sin la (M) N terminal;

(ii) (M)(G)(n)(X)(0/n)(n)(+)(+) o la secuencia correspondiente sin la (M) N terminal, donde cada posición entre paréntesis representa un aminoácido, y donde n es cualquier aminoácido que se selecciona del grupo que consiste en (Pro, Gly, Ala, Ser), X es cualquier aminoácido, O es cualquier aminoácido que se selecciona del grupo que consiste en (Val, Ile, Leu, Phe, Trp, Tyr, Met) y (+) es cualquier aminoácido que se selecciona del grupo que consiste en (Lys, Arg, His); y donde la posición cinco no es (+) y la posición seis no es (+) ni (Asp o Glu); o

(iii) (M)(G)(n)(^)(O/n)(S/A/G/N)(+)(+), o la secuencia correspondiente sin la (M) N terminal, donde cada posición entre paréntesis representa un aminoácido, y donde n es cualquier aminoácido que se selecciona del grupo que consiste en (Pro, Gly, Ala, Ser), ês cualquier aminoácido que se selecciona del grupo que consiste en (Asn, Gln, Ser, Thr, Asp, Glu, Lys, His, Arg), O es cualquier aminoácido que se selecciona del grupo que consiste en (Val, Ile, Leu, Phe, Trp, Tyr, Met), y (+) es cualquier aminoácido que se selecciona del grupo que consiste en (Lys, Arg, His); y donde la posición cinco no es (+) y la posición seis no es (+) ni (Asp o Glu).

En algunas modalidades, el polipéptido del armazón comprende una secuencia de cualquiera de las SEQ ID NO: 4 a 110, o cualquiera de las secuencias correspondientes sin la M N terminal. En algunas modalidades, el polipéptido comprende una secuencia de la SEQ ID NO: 13, o la secuencia correspondiente sin la M N terminal. En algunas modalidades, el polipéptido comprende una secuencia de la SEQ ID NO: 110, o la secuencia correspondiente sin la M N terminal. En algunas modalidades, el polipéptido comprende una secuencia de MGXKLSKKK (SEQ ID NO: 116), donde la X es cualquier aminoácido, o la secuencia correspondiente sin la M N terminal.

En un aspecto, la presente descripción proporciona una construcción polinucleotídica que comprende una secuencia codificante que codifica el polipéptido que se proporciona en la presente memoria. En algunas modalidades, la secuencia codificante tiene codones optimizados.

En otro aspecto, la presente descripción proporciona un método para fabricar una VE modificada, por ejemplo, exosoma, que comprende las etapas de:

a. introducir en una célula una construcción de ácido nucleico que codifica un polipéptido de fusión que comprende (i) una primera secuencia que codifica MARCKS, MARCKSL1, BASP1 o un fragmento o una modificación de estas, y (ii) una segunda secuencia que codifica una carga útil, por ejemplo, una molécula con actividad biológica tal como un péptido terapéutico;

b. mantener la célula en condiciones que permitan que la célula exprese el polipéptido de fusión; y,

c. obtener el exosoma modificado que comprende el polipéptido de fusión de dicha célula.

En algunas modalidades, la primera secuencia comprende una secuencia de

(ii) (M)(G)(n)(X)(O/n)(n)(+)(+), o la secuencia correspondiente sin la (M) N terminal, donde cada posición entre paréntesis representa un aminoácido, y donde n es cualquier aminoácido que se selecciona del grupo que consiste en (Pro, Gly, Ala, Ser), X es cualquier aminoácido, O es cualquier aminoácido que se selecciona del grupo que consiste en (Val, Ile, Leu, Phe, Trp, Tyr, Met) y (+) es cualquier aminoácido que se selecciona del grupo que consiste en (Lys, Arg, His); y donde la posición cinco no es (+) y la posición seis no es (+) ni (Asp o Glu); o

En algunas modalidades, el polinucleótido comprende una secuencia de cualquiera de las SEQ ID NO: 4 a 110, o cualquiera de las secuencias correspondientes sin la M N terminal. En algunas modalidades, el polinucleótido comprende una secuencia de la SEQ ID NO: 13, o la secuencia correspondiente sin la M N terminal. En algunas modalidades, el polinucleótido comprende una secuencia de la SEQ ID NO: 110, o la secuencia correspondiente sin la M N terminal. En algunas modalidades, el polipéptido comprende una secuencia de MGXKLSKKK (SEQ ID NO: 116), o la secuencia correspondiente sin la M N terminal, donde la X es cualquier aminoácido.

En algunas modalidades, el polipéptido de fusión se encuentra presente en la superficie luminal de la VE modificada, por ejemplo, un exosoma modificado, a una densidad más alta que una proteína de armazón diferente en una VE diferente, por ejemplo, un exosoma, donde la proteína de armazón diferente comprende una VE convencional, por ejemplo, proteína exosómica o una variante de esta. En algunas modalidades, el polipéptido de fusión se encuentra presente en una densidad más de 2 veces mayor que la proteína de armazón diferente en la VE diferente, por ejemplo, un exosoma.

En algunas modalidades, el polipéptido de fusión se encuentra presente en una densidad más de 4 veces, 16 veces, 100 veces o 10000 mayor que la proteína de armazón diferente en la VE diferente, por ejemplo, un exosoma.

La presente descripción está dirigida a una vesícula extracelular (VE) aislada que comprende una molécula con actividad biológica unida a una proteína de armazón, donde la proteína de armazón comprende un dominio de extremo N (DN) y un dominio efector (DE), donde el DN y el DE están asociados con la superficie luminal de la VE mediante una interacción iónica, donde el DE comprende al menos dos lisinas contiguas (Lys) en secuencia. En algunas modalidades, el DN está asociado con la superficie luminal de la VE mediante miristoilación. En otras modalidades, el DN tiene Gly en el extremo N.

En algunas modalidades, el DE comprende al menos tres Lys, al menos cuatro Lys, al menos cinco Lys, al menos seis Lys o al menos siete Lys. En otras modalidades, el DE está unido al DN mediante un enlace peptídico. En algunas modalidades, el DE comprende (Lys)n, donde la n es un número entero entre 1 y 10. En otras modalidades, el DE comprende KK, KKK, KKKK (SEQ ID NO: 151), KKKKK (SEQ ID NO: 152), o cualquier combinación de estos.

En otras modalidades, el DN comprende la secuencia de aminoácidos que se expone en G:X2:X3:X4:X5:X6, donde G es una glicina representada como Gly, donde ":" representa un enlace peptídico, donde cada uno de X2 a X6 es independientemente un aminoácido, y donde X6 comprende un aminoácido básico. En algunas modalidades, el X6 se selecciona del grupo que consiste en Lys, Arg e His.

En otras modalidades, la descripción es una vesícula extracelular (VE) aislada que comprende una molécula con actividad biológica unida a una proteína de armazón, donde la proteína de armazón comprende un dominio de extremo N (DN) y un dominio efector (DE), donde el DN comprende la secuencia de aminoácidos que se establece en G:X2:X3:X4:X5:X6, donde G es una glicina, representada por Gly; donde ":" representa un enlace peptídico, donde cada uno de X2 a X6 es independientemente un aminoácido, donde X6 comprende un aminoácido básico, y donde el DE está unido a X6 por un enlace peptídico y comprende al menos una lisina en el extremo N del DE. En algunas modalidades, el DE no comprende un dominio transmembrana o un dominio citoplasmático de un virus. En algunas modalidades, X2 se selecciona del grupo que consiste en Pro, Gly, Ala y Ser. En otras modalidades, X4 se selecciona del grupo que consiste en Pro, Gly, Ala, Ser, Val, Ile, Leu, Phe, Trp, Tyr, Gln y Met. En algunas modalidades, X5 se selecciona del grupo que consiste en Pro, Gly, Ala y Ser.

En algunas modalidades, el DN de la proteína de armazón comprende la secuencia de aminoácidos de G:X2:X3:X4:X5:X6, donde

G representa Gly;

":" representa un enlace peptídico;

X2 es un aminoácido que se selecciona del grupo que consiste en Pro, Gly, Ala y Ser;

X3 es un aminoácido;

X4 es un aminoácido que se selecciona del grupo que consiste en Pro, Gly, Ala, Ser, Val, Ile, Leu, Phe, Trp, Tyr, Gln y Met;

X5 es un aminoácido que se selecciona del grupo que consiste en Pro, Gly, Ala y Ser; y

X6 es un aminoácido que se selecciona del grupo que consiste en Lys, Arg e His.

En algunas modalidades, X3 se selecciona del grupo que consiste en Asn, Gln, Ser, Thr, Asp, Glu, Lys, His y Arg.

En algunas modalidades, el DN y el DE están unidos por un enlazador. En algunas modalidades, el enlazador comprende uno o más aminoácidos.

En algunas modalidades, la descripción se dirige a una vesícula extracelular (VE) aislada que comprende una molécula con actividad biológica unida a una proteína de armazón, donde la proteína de armazón comprende DN-DE, donde:

DN comprende G:X2:X3:X4:X5:X6; donde:

G representa Gly;

":" representa un enlace peptídico;

X3 es un aminoácido;

X4 es un aminoácido que se selecciona del grupo que consiste en Pro, Gly, Ala, Ser, Val, Ile, Leu, Phe, Trp, Tyr, Glu y Met;

X5 es un aminoácido que se selecciona del grupo que consiste en Pro, Gly, Ala y Ser;

"—" es un enlazador opcional que comprende uno o más aminoácidos; y

el DE es un dominio efector que comprende (i) al menos dos lisinas contiguas (Lys), que están unidas a X6 por un enlace peptídico o uno o más aminoácidos o (ii) al menos una lisina, que está directamente ligada a X6 por un enlace peptídico.

En otras modalidades, X2 se selecciona del grupo que consiste en Gly y Ala. En algunas modalidades, X3 es Lys. En algunas modalidades, X4 es Leu o Glu. En algunas modalidades, X5 se selecciona del grupo que consiste en Ser y Ala. En algunas modalidades, X6 es Lys. En otras modalidades, X2 es Gly, Ala o Ser; X3 es Lys o Glu, X4 es Leu, Phe, Ser y Glu, X5 es Ser o Ala, y X6 es Lys.

En algunas modalidades, el DN y el DE están unidos por un enlazador que comprende uno o más aminoácidos. En otras modalidades, el DE comprende (K), KK, KKK, KKKK (SEQ ID NO: 151), KKKKK (SEQ ID NO: 152) o cualquier combinación de estos.

En algunas modalidades, la proteína de armazón comprende una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste en (i) GGKLSKK (SEQ ID NO: 157), (ii) GAKLSKK (SEQ ID NO: 158), (iii) GGKQSKK (SEQ ID NO: 159), (iv) GGKLAKK (SEQ ID NO: 160) o (v) cualquier combinación de estos. En algunas modalidades, la proteína de armazón comprende una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste en (i) GGKLSKKK (SEQ ID NO: 161), (ii) GGKLSKKS (SEQ ID NO: 162), (iii) GAKLSKKK (SEQ ID NO: 163), (iv) GAKLSKKS (SEQ ID NO: 164), (v) GGKQSKKK (SEQ ID NO: 165), (vi) GGKQSKKS (SEQ ID NO: 166), (vii) GGKLAKKK (SEQ ID NO: 167), (viii) GGKLAKKS (SEQ ID NO: 168) y (ix) cualquier combinación de estos. En algunas modalidades, la proteína de armazón tiene al menos aproximadamente 8, al menos aproximadamente 9, al menos aproximadamente 10, al menos aproximadamente 11, al menos aproximadamente 12, al menos aproximadamente 13, al menos aproximadamente 14, al menos aproximadamente 15, al menos aproximadamente 16, al menos aproximadamente 17, al menos aproximadamente 18, al menos aproximadamente 19, al menos aproximadamente 20, al menos aproximadamente 21, al menos aproximadamente 22, al menos aproximadamente 23, al menos aproximadamente 24, al menos aproximadamente 25, al menos aproximadamente 30, al menos aproximadamente 35, al menos aproximadamente 40, al menos aproximadamente 45, al menos aproximadamente 50, al menos aproximadamente 55, al menos aproximadamente 60, al menos aproximadamente 65, al menos aproximadamente 70, al menos aproximadamente 75, al menos aproximadamente 80, al menos aproximadamente 85, al menos aproximadamente 90, al menos aproximadamente 95, al menos aproximadamente 100, al menos aproximadamente 105, al menos aproximadamente 110, al menos aproximadamente 120, al menos aproximadamente 130, al menos aproximadamente 140, al menos aproximadamente 150, al menos aproximadamente 160, al menos aproximadamente 170, al menos aproximadamente 180, al menos aproximadamente 190 o al menos aproximadamente 200 aminoácidos de longitud.

En algunas modalidades, la proteína de armazón comprende (i) GGKLSKKKKGYNVN (SEQ ID NO: 169), (ii) GAKLSKKKKGYNVN (SEQ ID NO: 170), (iii) GGKQSKKKKGYNVN (SEQ ID NO: 171), (iv) GGKLAKKKKGYNVN (SEQ ID NO: 172), (v) GGKLSKKKKGYSGG (SEQ ID NO: 173), (vi) GGKLSKKKKGSGGS (SEQ ID NO: 174), (vii) GGKLSKKKKSGGSG (SEQ ID NO: 175), (viii) GGKLSKKKSGGSGG (SEQ ID NO: 176), (ix) GGKLSKKSGGSGGS (SEQ ID NO: 177), (x) GGKLSKSGGSGGSV (SEQ ID NO: 178), o (xi) GAKKSKKRFSFKKS (SEQ ID NO: 179).

En algunas modalidades, la proteína de armazón no comprende Met en el extremo N. En algunas modalidades, la proteína de armazón comprende un residuo de aminoácido miristoilado en el extremo N de la proteína de armazón. En algunas modalidades, el residuo de aminoácido en el extremo N de la proteína de armazón es Gly. En algunas modalidades, el residuo de aminoácido en el extremo N de la proteína de armazón es sintético. En algunas modalidades, el residuo de aminoácido en el extremo N de la proteína de armazón es un análogo de glicina.

En algunas modalidades, la proteína de armazón comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 70 %, al menos aproximadamente 75 %, al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 85 %, al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 95 %, al menos aproximadamente 96 %, al menos aproximadamente 97 %, al menos aproximadamente 98 %, al menos aproximadamente 99 % o aproximadamente 100 % de identidad de secuencia con respecto a la SEQ ID NO: 1 (MARKS), la SEQ ID NO: 2 (MARCKSL1), o la SEQ ID NO: 3 (BASP1).

En algunas modalidades, la molécula con actividad biológica está en la superficie luminal o lumen de la VE. En algunas modalidades, la proteína de armazón comprende además un dominio transmembrana. En algunas modalidades, el dominio transmembrana se encuentra entre el dominio DE de la proteína de armazón y la molécula con actividad biológica. En algunas modalidades, la proteína de armazón comprende además un dominio extravesicular. En algunas modalidades, la molécula con actividad biológica está unida al dominio extravesicular.

En algunas modalidades, la proteína de armazón se une a la molécula con actividad biológica mediante un enlazador. En algunas modalidades, el dominio DN está vinculado al dominio DE mediante un enlazador. En algunas modalidades, el enlazador comprende uno o más aminoácidos. En algunas modalidades, el enlazador comprende un enlazador escindible. En algunas modalidades, el enlazador comprende un enlazador flexible.

En otras modalidades, la molécula con actividad biológica comprende una proteína, un polipéptido, un péptido, un polinucleótido (ADN y/o ARN), un compuesto químico, un virus, un ionóforo, un portador para un ionóforo, un resto que forma un canal o un poro, o cualquier combinación de estos. En algunas modalidades, la proteína comprende un péptido recombinante, un péptido natural, un péptido sintético, un anticuerpo, una proteína de fusión o cualquier combinación de estos. En algunas modalidades, la proteína comprende una enzima, una citocina, un ligando, un receptor, un factor de transcripción o una combinación de estos. En algunas modalidades, el virus comprende un virus adenoasociado, un parvovirus, un retrovirus, un adenovirus o cualquier combinación de estos.

En otras modalidades, la VE comprende además una segunda proteína de armazón. En algunas modalidades, la segunda proteína de armazón comprende un polipéptido PTGFRN, un polipéptido BSG, un polipéptido IGSF2, un polipéptido IGSF3, un polipéptido IGSF8, un polipéptido ITGB1, un polipéptido ITGA4, un polipéptido SLC3A2, un polipéptido transportador de ATP, un polipéptido de la aminopeptidasa N (ANPEP), un polipéptido del miembro 1 de la familia de pirofosfatasa/fosfodiesterasa de ectonucleótidos (ENPP1), un polipéptido de neprilisina (MME), un polipéptido de neuropilina 1 (NRP1) o un fragmento de estos. En algunas modalidades, la molécula con actividad biológica es un inhibidor de un regulador de punto de control negativo o un inhibidor de una pareja de unión de un regulador de punto de control negativo. En algunas modalidades, el regulador de punto de control negativo se selecciona del grupo que consiste en: proteína 4 asociada a linfocitos T citotóxicos (CTLA-4), proteína 1 de muerte celular programada (PD-1), gen 3 activado por linfocitos (LAG-3), proteína 3 que contiene mucina de inmunoglobulina de linfocitos T (TIM-3), atenuador de linfocitos B y T (BTLA), inmunorreceptor de linfocitos T con dominios Ig e ITIM (TIGIT), supresor Ig de dominio V de la activación de linfocitos T (VISTA), receptor de adenosina A2a (A2aR), receptor similar a inmunoglobulina de células asesinas (KIR), indolamina 2,3-dioxigenasa (IDO), CD20, CD39 y CD73. En algunas modalidades, la molécula con actividad biológica es una proteína inmunogénica.

En otras modalidades, la molécula con actividad biológica es una toxina, toxoide o un mutante no tóxico de una toxina. En algunas modalidades, la toxina es una toxina diftérica. En algunas modalidades, el toxoide es un toxoide tetánico. En algunas modalidades, la molécula con actividad biológica es un mutante no tóxico de la toxina diftérica.

En algunas modalidades, la molécula con actividad biológica es un activador de una molécula coestimuladora positiva o un activador de una pareja de unión de una molécula coestimuladora positiva. En algunas modalidades, la molécula coestimuladora positiva es un miembro de la superfamilia del receptor de TNF. En algunas modalidades, el miembro de la superfamilia del receptor de TNF se selecciona del grupo que consiste en: CD120a, CD120b, CD18, OX40, CD40, receptor Fas, M68, CD27, CD30, 4-1BB, TRAILR1, TRAILR2, TRAILR3, TRAILR4, RANK, OCIF, receptor TWEAK, TACI, receptor BAFF, ATAR, CD271, CD269, AITR, TROY, CD358, TRAMP y XEDAR. En algunas modalidades, el activador de la molécula coestimuladora positiva es un miembro de la superfamilia del receptor de TNF. En algunas modalidades, el miembro de la superfamilia de TNF se selecciona del grupo que consiste en: TNFa, TNF-C, OX40L, CD40L, FasL, LIGHT, TL1A, CD27L, Siva, CD153, ligando 4-1BB, TRAIL, RANKL, TWEAK, APRIL, BAFF, CAMLG, NGF, BDNF, NT-3, NT-4, ligando GITR y EDA-2. En algunas modalidades, la molécula coestimuladora positiva es una molécula coestimuladora de la superfamilia CD28. En algunas modalidades, la molécula coestimuladora de la superfamilia CD28 es ICOS o CD28. En algunas modalidades, el activador para una molécula coestimuladora positiva es ICOSL, CD80 o CD86.

En otras modalidades, la citoquina se selecciona del grupo que consiste en: IL-2, IL-7, IL-10, IL-12 e IL-15. En algunas modalidades, la proteína comprende un receptor de linfocitos T (TCR), un correceptor de linfocitos T, un complejo principal de histocompatibilidad (MHC), un antígeno leucocitario humano (HLA) o un derivado de estos. En algunas modalidades, la proteína comprende un antígeno tumoral. En algunas modalidades, el antígeno tumoral se selecciona del grupo que consiste en: alfa-fetoproteína (AFP), antígeno carcinoembrionario (CEA), antígeno tumoral epitelial (ETA), mucina 1 (MUC1), Tn-MUC1, mucina 16 (MUC16), tirosinasa, antígeno asociado a melanoma (MAGE), proteína ^{tumoral p53 (p53),}Cd4, ^{CD8, CD45, CD80,}Cd86, ^{ligando de muerte programada 1 (PD-L1), ligando de muerte}programada 2 (PD-L2), NY- ESO-1, PSMA, TAG-72, HER2, GD2, cMET, EGFR, mesotelina, VEGFR, receptor de alfafolato, CE7R, IL-3, antígeno de cáncer de testículo, MART-1 gp100 y ligando inductor de apoptosis relacionado con TNF.

En otras modalidades, la VE es un exosoma.

En algunas modalidades, la descripción se dirige a una composición farmacéutica que comprende la VE de la presente descripción y un portador aceptable desde un punto de vista farmacéutico. En algunas modalidades, la descripción se dirige a una célula que produce la VE de la presente descripción. En algunas modalidades, la descripción se dirige a un kit que comprende la VE de la presente descripción y las instrucciones de uso.

En otras modalidades, la descripción se dirige a un método para fabricar VE que comprende cultivar la célula de la presente descripción en condiciones adecuadas y obtener las VE. En algunas modalidades, la descripción se dirige a un método para anclar una molécula con actividad biológica a una vesícula extracelular que comprende unir la molécula con actividad biológica a la proteína de armazón que se describe en la presente memoria.

En otras modalidades, la descripción se dirige a un método para prevenir o tratar una enfermedad en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar la VE de la presente descripción, donde la enfermedad está asociada con el antígeno. En algunas modalidades, la VE se administra por vía parenteral, oral, intravenosa, intramuscular, intratumoral, intranasal, subcutánea o intraperitoneal.

MODALIDADES

E1. Una VE, por ejemplo, un exosoma, que comprende una proteína de armazón, en la que al menos una parte de la proteína de armazón se expresa a partir de una secuencia exógena, y la proteína de armazón comprende MARCKS, MARCKSL1, BASP1 o un fragmento o una modificación de estas.

E2. La VE, por ejemplo, un exosoma, de la modalidad E1, donde la proteína de armazón se encuentra presente en la VE, por ejemplo, un exosoma, a una mayor densidad que una proteína de armazón diferente en una VE diferente, por ejemplo, un exosoma, en la que la proteína de armazón diferente comprende una VE convencional, por ejemplo, exosoma, proteína o una variante de estos.

E3. La VE, por ejemplo, un exosoma, de la modalidad E2, donde la proteína de la VE convencional, por ejemplo, un exosoma, se selecciona del grupo que consiste en CD9, CD63, CD81, PDGFR, proteínas de anclaje g Pi, lactadherina, LAMP2, LAMP2B y un fragmento de estas.

E4. La VE, por ejemplo, un exosoma, de cualquiera de las modalidades E1 a E3, donde la VE, por ejemplo, un exosoma, se produce a partir de una célula modificada genéticamente para que comprenda la secuencia exógena, opcionalmente donde la célula es una célula HEK293.

E5. La VE, por ejemplo, un exosoma, de las modalidades E1 a E4, en la que la célula comprende un plásmido que comprende la secuencia exógena.

E6. La VE, por ejemplo, un exosoma, de las modalidades E1 a E5, donde la célula comprende la secuencia exógena insertada en un genoma de la célula.

E7. La VE, por ejemplo, un exosoma, de las modalidades E1 a E6, donde la secuencia exógena se inserta en un sitio genómico ubicado 3' o 5' con respecto a la secuencia genómica que codifica MARCKS, MARCKSL1 o BASP1. E8. La VE, por ejemplo, un exosoma, de las modalidades E1 a E7, donde la secuencia exógena se inserta en una secuencia genómica que codifica MARCKS, MARCKSL1 o BASP1.

E9. La VE, por ejemplo, exosoma, de cualquiera de las modalidades E1a E8, donde la proteína de armazón es una proteína de fusión que comprende MARCKS, MARCKSL1, BASP1 o un fragmento de estas y un péptido terapéutico. E10. La VE, por ejemplo, un exosoma, de la modalidad E9, donde el péptido terapéutico se selecciona del grupo que consiste en un péptido natural, un péptido recombinante, un péptido sintético o un enlazador para un compuesto terapéutico.

E11. La VE, por ejemplo, un exosoma de la modalidad E9, donde el compuesto terapéutico se selecciona del grupo que consiste en nucleótidos, aminoácidos, lípidos, carbohidratos y moléculas pequeñas.

E12. La VE, por ejemplo, un exosoma, de la modalidad E9, en la que el péptido terapéutico es un anticuerpo o un fragmento o una modificación de este.

E13. La VE, por ejemplo, un exosoma, de la modalidad E9, donde el péptido terapéutico es una enzima, un ligando, un receptor, un factor de transcripción o un fragmento o una modificación de estos.

E14. La VE, por ejemplo, un exosoma, de la modalidad E9, donde el péptido terapéutico es un péptido antimicrobiano o un fragmento o una modificación de este.

E15. La VE, por ejemplo, exosoma de cualquiera de las modalidades E1 a E14 que comprende además una segunda proteína de armazón, donde la segunda proteína de armazón comprende MARCKS, MARCKSL1, BASP1 o un fragmento de estas.

E16. La VE, por ejemplo, un exosoma, de cualquiera de las modalidades E1 a E14 que comprende además una segunda proteína de armazón, donde la segunda proteína de armazón comprende PTGFRN, BSG, IGSF2, IGSF3, IGSF8, ITGB1, ITGA4, SLC3A2, transportador de ATP o un fragmento de estos.

E17. La VE, por ejemplo, un exosoma, de cualquiera de las modalidades E1 a E16, en la que la proteína de armazón comprende un péptido de secuencia (M)(G)(G/A/S)(K/Q)(L/F/S/Q)(S/A)(K)(K) (SEQ ID NO: 118) o la secuencia correspondiente sin la (M) N terminal.

E18. La VE, por ejemplo, un exosoma, de cualquiera de las modalidades E1 a E17, en la que la proteína de armazón comprende un péptido de la secuencia (M)(G)(n)(X)(0/n)(n)(+)(+), o la secuencia correspondiente sin la (M) N terminal, donde cada posición entre paréntesis representa un aminoácido, y donde n es cualquier aminoácido que se selecciona del grupo que consiste en (Pro, Gly, Ala, Ser), X es cualquier aminoácido, O es cualquier aminoácido que se selecciona del grupo que consiste en (Val, Ile, Leu, Phe, Trp, Tyr, Met) y (+) es cualquier aminoácido que se selecciona del grupo que consiste en (Lys, Arg, His); y donde la posición cinco no es (+) y la posición seis no es (+) ni (Asp o Glu).

E19. La VE, por ejemplo, un exosoma, de cualquiera de las modalidades E1 a E18, donde la proteína de armazón comprende un péptido de la secuencia (M)(G)(n)(^)(O/n)(S/A/G/N)(+)(+), o la secuencia correspondiente sin la (M) N terminal, donde cada posición entre paréntesis representa un aminoácido, y donde n es cualquier aminoácido que se selecciona del grupo que consiste en (Pro, Gly, Ala, Ser), ês cualquier aminoácido que se selecciona del grupo que consiste en (Asn, Gln, Ser, Thr, Asp, Glu, Lys, His, Arg), O es cualquier aminoácido que se selecciona del grupo que consiste en (Val, Ile, Leu, Phe, Trp, Tyr, Met) y (+) es cualquier aminoácido que se selecciona del grupo que consiste en (Lys, Arg, His); y donde la posición cinco no es (+) y la posición seis no es (+) ni (Asp o Glu).

E20. La VE, por ejemplo, un exosoma, de cualquiera de las modalidades E18 o E19, en la que la proteína de armazón comprende un péptido de cualquiera de las SEQ ID NO: 4 a 110, o cualquiera de las secuencias correspondientes sin la M N terminal.

E21. La VE, por ejemplo, exosoma, de cualquiera de las modalidades E18 o E19, donde la proteína de armazón comprende un péptido de MGXKLSKKK (SEQ ID NO: 116), o la secuencia correspondiente sin la M N terminal, donde X es cualquier aminoácido.

E22. La VE, por ejemplo, un exosoma, de la modalidad E20, donde la proteína de armazón comprende un péptido de la SEQ ID NO: 110, o la secuencia correspondiente sin la M N terminal.

E23. La VE, por ejemplo, un exosoma, de la modalidad E20, donde la proteína de armazón comprende el péptido de la SEQ ID NO: 13, o la secuencia correspondiente sin la M N terminal.

E24. La VE, por ejemplo, un exosoma, de cualquiera de las modalidades E1 a E24, donde la proteína de armazón comprende además una carga útil, por ejemplo, una molécula con actividad biológica tal como un péptido.

E25. Una composición farmacéutica que comprende la VE, por ejemplo, exosoma, de cualquiera de las modalidades E1 a E24 y un excipiente.

E26. La composición farmacéutica de la modalidad E25, sustancialmente libre de macromoléculas, donde las macromoléculas se seleccionan de ácidos nucleicos, proteínas exógenas, lípidos, carbohidratos, metabolitos y una combinación de estos.

E27. Una población de células para producir la VE, por ejemplo, exosoma, de cualquiera de las modalidades E1 a E24.

E28. La población de células de la modalidad E27 que comprende una secuencia exógena que codifica la proteína de armazón que comprende MARCKS, MARCKSL1, BASP1 o un fragmento o una modificación de estas.

E29. La población de células de la modalidad E28 que comprende además una segunda secuencia exógena que codifica una segunda proteína de armazón, donde la segunda proteína de armazón comprende MARCKs , MARCKSL1, BASP1 o un fragmento o una modificación de estas.

E30. La población de células de la modalidad E28 que comprende además una segunda secuencia exógena que codifica una segunda proteína de armazón, donde la segunda proteína de armazón comprende PTGFRN, BSG, IGSF2, IGSF3, IGSF8, ITGB1, ITGA4, SLC3A2, transportador de At P o un fragmento de estos.

E31. La población de células de cualquiera de las modalidades E27 a E30, donde la secuencia exógena se inserta en una secuencia genómica que codifica MARCKS, MARCKSL1 o BASP1, donde la secuencia exógena y la secuencia genómica codifican la proteína de armazón.

E32. La población de células de cualquiera de las modalidades E27 a E30, donde la secuencia exógena se encuentra en un plásmido.

E33. La población de células de cualquiera de las modalidades E27 a E32, donde la secuencia exógena codifica una molécula con actividad biológica, por ejemplo, un péptido terapéutico.

E34. La población de células de la modalidad E33, donde el péptido terapéutico se selecciona del grupo que consiste en un péptido natural, un péptido recombinante, un péptido sintético o un enlazador para un compuesto terapéutico. E35. La población de células de la modalidad E33, donde el compuesto terapéutico se selecciona del grupo que consiste en nucleótidos, aminoácidos, lípidos, carbohidratos y moléculas pequeñas.

E36. La población de células de la modalidad E33, donde el péptido terapéutico es un anticuerpo o un fragmento o una modificación de este.

E37. La población de células de la modalidad E33, donde el péptido terapéutico es una enzima, un ligando, un receptor, un factor de transcripción o un fragmento o una modificación de estos.

E38. La población de células de la modalidad E33, donde el péptido terapéutico es un péptido antimicrobiano o un fragmento o una modificación de este.

E39. La población de células de la modalidad E28, donde la secuencia exógena codifica un resto de direccionamiento. E40. La población de células de la modalidad E39, donde el resto de direccionamiento es específico para un órgano, un tejido o una célula.

E41. La población de células de las modalidades E29 o E30, donde la segunda proteína de armazón comprende además un resto de direccionamiento.

E42. La población de células de la modalidad E41, donde el resto de direccionamiento es específico para un órgano, un tejido o una célula.

E43. Un polipéptido para modificar una VE, por ejemplo, exosoma, que comprende una secuencia de

E44. El polipéptido de la modalidad E43, que comprende una secuencia de cualquiera de las SEQ ID NO: 4 a 110, o cualquiera de las secuencias correspondientes sin la M N terminal.

E45. El polipéptido de la modalidad E43, que comprende una secuencia de la SEQ ID NO: 13, o la secuencia correspondiente sin la M N terminal.

E46. El polipéptido de la modalidad E43, que comprende una secuencia de la SEQ ID NO: 110, o la secuencia correspondiente sin la M N terminal.

E47. El polipéptido de la modalidad E43, que comprende una secuencia de MGXKLSKKK (SEQ ID NO: 116), o la secuencia correspondiente sin la M N terminal, donde X es cualquier aminoácido.

E48. El polipéptido de cualquiera de las modalidades E43 a E47, donde el polipéptido se fusiona con una carga útil, por ejemplo, una molécula con actividad biológica tal como un péptido.

E49. El polipéptido de la modalidad E48, donde el polipéptido está fusionado al extremo N del péptido.

E50. Una construcción polinucleotídica que comprende una secuencia codificante que codifica el polipéptido de cualquiera de las modalidades E43 a E49.

E51. La construcción polinucleotídica de la modalidad E50, donde la secuencia codificante tiene codones optimizados. E52. Un método para fabricar una VE modificada, por ejemplo, un exosoma, que comprende las etapas de:

a. introducir en una célula una construcción de ácido nucleico que codifica un polipéptido de fusión que comprende (i) una primera secuencia que codifica MARCKS, MARCKSL1, BASP1 o un fragmento o una modificación de estas, y (ii) una segunda secuencia que codifica una carga útil, por ejemplo, una molécula con actividad biológica tal como un péptido;

b. mantener la célula en condiciones que permitan que la célula exprese el polipéptido de fusión; y, c. obtener la VE modificada, por ejemplo, un exosoma, que comprende el polipéptido de fusión de dicha célula.

E53. El método de la modalidad E52, donde la primera secuencia comprende una secuencia de

E54. El método de cualquiera de las modalidades E52 o E53, donde la primera secuencia comprende cualquiera de las SEQ ID NO: 4 a 110, o cualquiera de las secuencias correspondientes sin la M N terminal.

E55. El método de la modalidad E54, donde la primera secuencia comprende la SEQ ID NO: 13, o la secuencia correspondiente sin la M N terminal.

E56. El método de la modalidad E55, donde la primera secuencia comprende la SEQ ID NO: 110, o la secuencia correspondiente sin la M N terminal.

E57. El método de la modalidad E53, donde la primera secuencia comprende MGXKLSKKK (SEQ ID NO: 116), o la secuencia correspondiente sin la M N terminal, donde X es cualquier aminoácido.

E58. El método de cualquiera de las modalidades E52 a E57, donde el polipéptido de fusión se encuentra presente en la superficie luminal de la VE modificada, por ejemplo, un exosoma, a una densidad más alta que una proteína de armazón diferente en una VE diferente, por ejemplo, exosoma, donde la proteína de armazón diferente comprende una VE convencional, por ejemplo, proteína exosómica o una variante de esta.

E59. El método de la modalidad E58, donde el polipéptido de fusión se encuentra presente en una densidad más de 2 veces mayor que la proteína de armazón diferente en la VE diferente, por ejemplo, exosoma.

E60. El método de la modalidad E59, donde el polipéptido de fusión se encuentra presente en una densidad más de 4 veces, 16 veces, 100 veces o 10000 veces mayor que la proteína de armazón diferente en la VE diferente, por ejemplo, exosoma.

Breve descripción de las figuras

Las figuras representan varios aspectos de la presente descripción solo con fines ilustrativos. Un experto en la técnica reconocerá fácilmente a partir del siguiente análisis que pueden emplearse aspectos alternativos de las estructuras y métodos que se ilustran en la presente memoria sin apartarse de los principios de la descripción que se describe en la presente memoria.

La FIG. 1A muestra las secuencias de proteínas de fusión que comprenden un fragmento de BASP1 fusionado a la etiqueta FLAG® y GFP (SEQ ID NO: 135-142, respectivamente, en orden de aparición). La FIG. 1B muestra los resultados de transferencia de Western anti-FLAG® para exosomas purificados a partir de células que expresan establemente una de las proteínas de fusión en la FIG. 1A. Para ambas FIG. 1A y 1B, las posiciones de aminoácidos, por ejemplo, BASP1, 1 a 30, hacen referencia a un fragmento de BASP-1 que está inicialmente codificado por la construcción génica. La primera Met se escinde durante el procesamiento.

La FIG. 2A muestra las secuencias de un fragmento de BASP1 (1 a 30) (SEQ ID NO: 4) y sus modificaciones (1 a 30-S6D, 1 a 30-S6A, y 1 a 30-L5Q) fusionadas a la etiqueta FLAG® y GFP (SEQ ID NO: 143-145, respectivamente, en orden de aparición).

La FIG. 2B muestra los resultados de transferencia Western anti-FLAG® para exosomas purificados a partir de células que expresan establemente una de las proteínas de fusión en la FIG. 2A. Para ambas FIG. 2A y 2B, las posiciones de aminoácidos, por ejemplo, BASP1, 1 a 30, hacen referencia a un fragmento de BASP-1 que está inicialmente codificado por la construcción génica. La primera Met se escinde durante el procesamiento.

La FIG. 3 muestra una imagen de un gel de proteína teñido con COOMm ASSIE® con muestras de exosomas purificadas a partir de células que expresan de forma estable MARCKSL1 de longitud completa, BASP1 o los aminoácidos 1 a 30 de MARCKS, MARCKSL1 o BASP1, todos fusionados con FLAG®-GFP. Las flechas blancas en la imagen indican las bandas correspondientes a las proteínas de fusión. Para la FIG. 3, las posiciones de aminoácidos, por ejemplo, BASP1, 1 a 30, hacen referencia a un fragmento de BASP-1 que está inicialmente codificado por la construcción génica. La primera Met se escinde durante el procesamiento.

La FIG. 4 muestra un alineamiento de la secuencia de proteínas entre los primeros 28 aminoácidos de BASP1 (región conservada 1), los aminoácidos 1 a 7 y 152 a 173 de MARCKS (región conservada 2) y los aminoácidos 1 a 7 y 87 a 110 de MARCKSL1 (región conservada 3).

La FIG. 5A muestra secuencias de aminoácidos 1 a 30 de BASP1 ("BASP1 a 30") (SEQ ID NO: 4) y proteínas de fusión que comprenden los aminoácidos 1 a 3 de MARCKS o su modificación fusionada al dominio PSD de MARCKS o su modificación ("MARCKS-MG-PSD", "MARCKS-MA-PSD", "MARCKS-MG-PSD-K6S" y "MARCKS-MG-PSD-K6A") (SEQ ID NO: 146 a 149, respectivamente, en orden de aparición). Las mutaciones puntuales introducidas en las secuencias MARCKS están en negrita. Las posiciones de aminoácidos, por ejemplo, aa 1 a 30 de BASP1 o aa 1 a 3 de MARCKS, hacen referencia a un fragmento que inicialmente está codificado por la construcción génica. La primera Met se escinde durante el procesamiento.

La FIG. 5B muestra los resultados de transferencia Western anti-FLAG® de exosomas purificados a partir de células que expresan de manera estable las proteínas de fusión que comprenden las secuencias de aminoácidos de la FIG.

5A y FLAG®.

La FIG. 6 muestra tres secuencias de consenso diferentes (las tres secuencias están representadas por la SEQ ID NO: 118) derivadas de estudios funcionales de MARCKS, MARCKSL1 y BASP1, y los requisitos de aminoácidos de cada una de las secuencias para cargar una carga útil en el lumen de los exosomas mediante fijación a la superficie luminal.

La FIG. 7A muestra la proteína total (parte superior) y una transferencia Western anti-Cas9 (parte inferior) de exosomas nativos o exosomas purificados a partir de células que expresan de manera estable Cas9 fusionado a los aminoácidos 1 a 10 o 1 a 30 de BASP1, así como cantidades decrecientes de Cas9 recombinante. Las posiciones de aminoácidos, por ejemplo, aa 1 a 10 de BASP o aa 1 a 30 de BASP1, hacen referencia a un fragmento que inicialmente está codificado por la construcción génica. La primera Met se escinde durante el procesamiento.

FIG. 7B El panel superior muestra una curva estándar derivada de la densitometría de Cas9 de los resultados de la transferencia Western de la FIG. 7A. El panel inferior proporciona además cantidades de Cas9 cargadas por cada exosoma purificado como proteínas de fusión conjugadas con 1 a 30 aminoácidos o fragmentos de 1 a 10 aminoácidos de BASP1 (2 a 30 aminoácidos o fragmentos de 2 a 10 aminoácidos de BASP1 después del procesamiento (es decir, se escinde la primera Met)), estimado basándose en la curva estándar.

La FIG. 8A muestra imágenes de gel de proteína de exosomas purificados a partir de células transfectadas de forma estable con una construcción que expresa la fusión del extremo N de BASP1 (aminoácidos 1 a 10) con ovoalbúmina ("BASP1 (1 a 10)-OVA") o células transfectadas de manera estable con dos construcciones, una que expresa la fusión de BASP1 de extremo N (aminoácidos 1 a 10) a la ovoalbúmina, y la otra que expresa CD40L fusionado a una proteína transmembrana PTGFr N ("BASP1 (1 a 10)-OVA; 3XCD40L-PTGFRN"). La F iG. 8A muestra además una imagen de las cantidades decrecientes de carga de gel de proteína de OVA recombinante. La numeración de aminoácidos, por ejemplo, los aminoácidos 1 a 10, hace referencia a un fragmento que inicialmente está codificado por la construcción génica. La primera Met se escinde durante el procesamiento.

La FIG. 8B muestra los resultados de la transferencia Western antiovoalbúmina de las muestras de la FIG. 8A. La FIG. 8C muestra los resultados de la transferencia de Western que comparan ova recombinante con ova fusionada a exoTOPE. La FIG. 8D muestra un diagrama de exosoma que comprende (i) exoTOPE unido a ovoalbúmina en el lado luminal del exosoma y (ii) estimulador inmunitario en el lumen del exosoma.

La FIG. 9A muestra la secuencia de un nanoanticuerpo camélido dirigido contra GFP fusionado a los aminoácidos 1 a 10 de BASP1 y una etiqueta FLAG® (SEQ ID NO: 150). La numeración de aminoácidos, por ejemplo, los aminoácidos 1 a 10 de BASP1, hace referencia a un fragmento que inicialmente está codificado por la construcción génica. La primera Met se escinde durante el procesamiento.

La FIG.9B muestra un gel de proteína y resultados de transferencia de Western anti-FLAG® de exosomas purificados a partir de células que expresan de forma estable la proteína de fusión de la FIG. 10A ("BASP1 (1 a 10)-Nanocuerpo") o la proteína que carece de la secuencia BASP1 ("Nanocuerpo"). La numeración de aminoácidos, por ejemplo, BASP1 (1 a 10)-Nanocuerpo, hace referencia a un fragmento que inicialmente está codificado por la construcción génica. La primera Met se escinde durante el procesamiento.

La FIG. 10 muestra un esquema de un sistema de carga de ARNm del exosoma que comprende (i) BASP1 (1 a 30) fusionado a FLAG® y variantes de MCP monoméricas o diméricas (1XMCP (V29I) ("815"; SEQ ID NO: 111), 1XMCP (V29I/N55K) ("817"; SEQ ID NO: 112), 2XMCP (V29I) ("819"; SEQ ID NO: 113) o 2XMCP (V29I/N55K) ("821"; SEQ ID NO: 114) y (ii) un ARNm de luciferasa que contiene 3x bucles de horquilla de MS2 ("ARNm de luciferasa-MS2" o "811"; SEQ ID NO: 115). La numeración de aminoácidos, por ejemplo, BASP1 (1 a 30), hace referencia a un fragmento que inicialmente está codificado por la construcción génica. La primera Met se escinde durante el procesamiento.

La FIG. 11A muestra un gel de proteína de los exosomas que contiene las construcciones de carga de ARNm que se describen en la FIG. 10, un ARNm de luciferasa (811) en combinación con varias proteínas de fusión BASP1 (815, 817 u 819).

La FIG. 11B muestra una transferencia Western anti-FLAG® de las muestras en la FIG. 11A.

La FIG. 12A muestra los resultados de RT-qPCR para la cantidad de ARNm de luciferasa en las células (parte superior) o exosomas (parte inferior) que contienen las construcciones de carga de ARNm que se muestran en la FIG. 10. La FIG. 12B muestra una tabla que cuantifica la cantidad de ARNm de luciferasa en los exosomas purificados a partir de las muestras de la FIG. 12A, incluido el enriquecimiento de veces de la carga estocástica de ARNm de luciferasa. La FIG. 13 muestra diagramas esquemáticos de trímeros CD40L fusionados a fragmentos de extremo N de MARCKS, MARCKSL1 y BASP1 para permitir la presentación en la superficie externa de proteínas transmembrana ancladas a la superficie luminal del exosoma. La numeración de aminoácidos, por ejemplo, MARCKS 1 a 30, MARCKSL1 1 a 30, BASP1 1 a 30, BASP1 1 a 10 ExoTOPE, hace referencia a un fragmento que inicialmente está codificado por la construcción génica. La primera Met se escinde durante el procesamiento.

La FIG. 14A muestra los resultados de la activación de linfocitos B de ratón en cultivos incubados con exosomas de expresión de superficie de CD40L fusionados a fragmentos de extremo N de MARCKS, MARCKSL1 y BASP1. La FIG. 14B muestra los resultados de la activación de linfocitos B humanos en cultivos incubados con exosomas de expresión de superficie de CD40L fusionados a fragmentos de extremo N de MARCKS, MARCKSL1 y BASP1. La FIG. 14C muestra un gráfico de potencia relativa para diferentes exosomas de presentación de superficie de CD40L cuando se fusionan a secuencias de extremo N de MARCKS, MARCKSL1, BASP1 o PTGFRN de longitud completa. La numeración de aminoácidos, por ejemplo, BASP1 1 a 30, hace referencia a un fragmento que inicialmente está codificado por la construcción génica. La primera Met se escinde durante el procesamiento.

La FIG. 15 muestra el número de coincidencias de espectro de péptidos (PSM, por sus siglas en inglés) de proteínas luminales (MARCKS, MARCKSL1 y BASP 1) y VE convencionales, por ejemplo, proteínas exosómicas (CD81 y CD9) en exosomas purificados a partir de varias líneas celulares de diferentes orígenes (HEK293SF, riñón; HT1080, tejido conectivo; K562, médula ósea; MDA-MB-231, mama; Raji, linfoblastos; células madre mesenquimales (MSC), médula ósea).

La FIG. 16 muestra un gel de proteína (a la izquierda) y una transferencia Western anti-FLAG® (derecha) de exosomas solos derivados de células de ovario de hámster chino (CHO) o a partir de células que sobreexpresan fragmentos de extremo N de BASP1 o BASP1 (1 a 30 o 1 a 8) fusionados a FLAG®-GFP. La numeración de aminoácidos, por ejemplo, BASP1 (1 a 30), hace referencia a un fragmento que inicialmente está codificado por la construcción génica. La primera Met se escinde durante el procesamiento.

Descripción detallada

La presente descripción está dirigida a vesículas extracelulares (VE), por ejemplo, exosomas, que comprenden al menos una molécula con actividad biológica unida a la VE, por ejemplo, exosoma, a través de una proteína de armazón, donde la proteína de armazón comprende un dominio de extremo N (DN) y un dominio efector (DE), donde el DN y/o el DE están asociados con la superficie luminal de la VE, por ejemplo, un exosoma, donde el DE comprende (i) una repetición de lisina en el DE o (ii) una repetición de lisina cuando se combina con el DN, por ejemplo, K en el extremo C en el DN y K en el extremo N en el DE, y donde el DN y DE están unidos directamente, es decir, por un enlace peptídico. La presente descripción también proporciona el número mínimo de aminoácidos que son capaces de anclar una carga útil, por ejemplo, una molécula con actividad biológica, a la superficie luminal de la VE, por ejemplo, exosoma, por ejemplo, siete a 15, siete a 14, siete a 13, siete a 12, siete a 11, siete a 10, siete a 9, o siete a 8 fragmentos de aminoácidos. El DN puede asociarse con la superficie luminal de la VE, por ejemplo, un exosoma, ^{mediante miristoilación, mientras que el DE puede asociarse con la superficie luminal de la}Ve, ^{por ejemplo, exosoma,}mediante una interacción iónica, por ejemplo, una interacción electrostática atractiva. En la presente descripción se muestran ejemplos no taxativos de los diversos aspectos.

Antes de que la presente descripción se describa con mayor detalle, debe entenderse que esta descripción no se limita a las composiciones particulares o las etapas del proceso descritas, ya que tales pueden, por supuesto, variar. Como resultará evidente para los expertos en la técnica al leer esta descripción, cada uno de los aspectos individuales que se describen e ilustran en la presente memoria tiene componentes y características distintos que pueden separarse fácilmente o combinarse con las características de cualquiera de los otros aspectos. Cualquier método enumerado puede llevarse a cabo en el orden de los eventos enumerados o en cualquier otro orden que sea lógicamente posible.

Los títulos que se proporcionan en la presente memoria no son limitaciones de los diversos aspectos de la descripción, que pueden definirse mediante esta referencia a la especificación en su conjunto. También debe entenderse que la terminología utilizada en la presente memoria tiene el propósito de describir únicamente aspectos particulares, y no pretende ser limitante.

Por consiguiente, los términos que se definen inmediatamente a continuación se definen más completamente mediante referencia a la especificación en su totalidad.

I. Definiciones

Salvo que se indique lo contrario, todos los términos técnicos y científicos que se utilizan en la presente tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto en la técnica a la que pertenece la presente descripción. Por ejemplo, el Diccionario Conciso de Biomedicina y Biología Molecular [Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology], Juo, Pei-Show, 2.a ed., 2002, CRC Press. El Diccionario de Biología Celular y Molecular [Dictionary of Cell and Molecular Biology], 3.a ed., 1999, Academic Press; y el Diccionario Oxford de Bioquímica y Biología Molecular [Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology], Revisado, 2000, Oxford University Press, proporcionan a los expertos un diccionario general de muchos de los términos que se usan en esta descripción. Como se usa en la presente memoria, los siguientes términos tienen los significados que se les atribuyen a continuación.

Cabe señalar que el término "un/o" o "una" entidad hace referencia a una o más de esa entidad, por ejemplo, se entiende que "una secuencia de nucleótidos" representa una o más secuencias de nucleótidos. Como tal, los términos "un/o" (o "una"), "uno o más" y "al menos uno" se pueden usar indistintamente en la presente memoria. Cabe señalar además que las reivindicaciones pueden redactarse para que excluyan cualquier elemento opcional. Como tal, esta declaración está destinada a servir como base antecedente para el uso de terminología exclusiva como "únicamente", "solamente" y similares en relación con la recitación de elementos de reivindicación o el uso de una limitación negativa.

Además, "y/o", cuando se usa en la presente memoria, debe tomarse como descripción específica de cada una de las dos características o componentes especificados con o sin el otro. Por lo tanto, el término "y/o" tal como se usa en una frase como "A y/o B" en la presente memoria pretende incluir "A y B", "A o B", "A" (solo) y "B" (solo). Asimismo, el término "y/o" como se usa en una frase como "A, B y/o C" pretende abarcar cada uno de los siguientes aspectos: A, B y C; A, B o C; A o C; A o B; B o C; A y C; A y B; B y C; A (solo); B (solo); y C (solo).

Se entiende que siempre que se describan en la presente memoria aspectos con la expresión "que comprende", también se proporcionan aspectos de otro modo análogos descritos en términos de "que consiste en" y/o "que consiste esencialmente en".

Las unidades, los prefijos y los símbolos se indican en su forma aceptada por el Sistema Internacional de Unidades (SI).

Los intervalos numéricos incluyen los números que definen el intervalo. Cuando se enumera un intervalo de valores, debe entenderse que cada valor entero intermedio, y cada fracción de este, entre los límites superior e inferior enumerados de ese intervalo también se describe específicamente, junto con cada subintervalo entre dichos valores. Los límites superior e inferior de cualquier intervalo pueden incluirse o excluirse de forma independiente del intervalo, y cada intervalo donde se incluyen uno, ninguno o ambos límites también se incluye en la descripción.

Por tanto, se entiende que los intervalos enumerados en la presente memoria son una forma abreviada de todos los valores dentro del intervalo, incluidos los puntos finales enumerados. Por ejemplo, se entiende que un intervalo de 1 a 50 incluye cualquier número, combinación de números o subintervalo del grupo que consiste en 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 y 50.

A menos que se indique lo contrario, la referencia a un compuesto que tiene uno o más estereocentros significa cada estereoisómero y todas las combinaciones de estereoisómeros de estos.

Cuando un valor se indica explícitamente, debe entenderse que los valores que son aproximadamente la misma cantidad o número que el valor indicado también están dentro del alcance de la descripción. Cuando se describe una combinación, cada subcombinación de los elementos de esa combinación también se describe específicamente y está dentro del alcance de la descripción. Por el contrario, cuando se describen individualmente diferentes elementos o grupos de elementos, también se describen combinaciones de estos. Cuando se describe cualquier elemento de una descripción como que tiene una pluralidad de alternativas, también se describen en la presente memoria ejemplos de esa descripción en los que cada alternativa se excluye individualmente o en cualquier combinación con las otras alternativas. Más de un elemento de una descripción puede tener tales exclusiones, y se describen en la presente memoria todas las combinaciones de elementos que tienen tales exclusiones.

Se hace referencia a los nucleótidos por sus códigos de una sola letra comúnmente aceptados. A menos que se indique lo contrario, las secuencias de nucleótidos se escriben de izquierda a derecha en orientación 5' a 3'. Los nucleótidos se denominan en la presente memoria por sus símbolos de una letra comúnmente conocidos recomendados por la Comisión de Nomenclatura Bioquímica de IUPAC-IUB. En consecuencia, la A representa la adenina, la C representa la citosina, la G representa la guanina, la T representa la timina, la U representa el uracilo.

Las secuencias de aminoácidos se escriben de izquierda a derecha en orientación de amino a carboxi. En la presente memoria se hace referencia a los aminoácidos por sus símbolos de tres letras comúnmente conocidos o por los símbolos de una letra que la Comisión de Nomenclatura Bioquímica de IUPAC-IUB recomienda.

El término "aproximadamente" se usa en la presente memoria para significar aproximadamente, en torno a, alrededor o en las regiones de. Cuando el término "aproximadamente" se usa junto con un intervalo numérico, este modifica ese intervalo extendiendo los límites por encima y por debajo de los valores numéricos establecidos. En general, el término "aproximadamente" puede modificar un valor numérico por encima y por debajo del valor establecido mediante una variación de, por ejemplo, un 10 por ciento, hacia arriba o hacia abajo (mayor o menor).

Como se usa en la presente memoria, el término "aproximadamente", tal como se aplica a uno o más valores de interés, hace referencia a un valor que es similar a un valor de referencia establecido. En determinados aspectos, el término "aproximadamente" hace referencia a un intervalo de valores que se encuentran dentro del 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 % o menos en cualquier dirección (mayor o menor que) del valor de referencia establecido a menos que se indique lo contrario o sea evidente por el contexto (excepto cuando dicho número exceda el 100 % de un valor posible).

Los términos "administración", "administrar" y sus variantes gramaticales hacen referencia a la introducción de una composición, tal como una VE (por ejemplo, exosoma) de la presente descripción, en un sujeto a través de una ruta aceptable desde un punto de vista farmacéutico. La introducción de una composición, tal como una VE (por ejemplo, exosoma) de la presente descripción, en un sujeto es por cualquier vía adecuada, lo que incluye por vía intratumoral, oral, pulmonar, intranasal, parenteral (intravenosa, intraarterial, intramuscular, intraperitoneal o subcutánea), rectal, intralinfática, intratecal, periocular o tópica. La administración incluye la autoadministración y la administración realizada por otra persona. Una vía de administración adecuada permite que la composición o el agente realice su función deseada. Por ejemplo, si una vía adecuada es la intravenosa, la composición se administra introduciendo la composición o el agente en una vena del sujeto.

Como se usa en la presente memoria, el término "agonista" hace referencia a una molécula que se une a un receptor y activa el receptor para producir una respuesta biológica. Los receptores pueden activarse mediante un agonista endógeno o exógeno. Los ejemplos no taxativos de agonistas endógenos incluyen hormonas, neurotransmisores y dinucleótidos cíclicos. Los ejemplos no taxativos de agonistas exógenos incluyen fármacos, moléculas pequeñas y dinucleótidos cíclicos. El agonista puede ser un agonista total, parcial o inverso.

Como se usa en la presente memoria, el término "antagonista" hace referencia a una molécula que bloquea o amortigua una respuesta mediada por un agonista en lugar de provocar una respuesta biológica en sí misma al unirse a un receptor. Muchos antagonistas alcanzan su potencia compitiendo con ligandos o sustratos endógenos en sitios de unión definidos estructuralmente en los receptores. Los ejemplos no taxativos de antagonistas incluyen alfabloqueantes, betabloqueantes y bloqueadores de los canales de calcio. El antagonista puede ser un antagonista competitivo, no competitivo o anticompetitivo.

Como se usa en la presente memoria, la expresión "vesícula extracelular" o "VE" hace referencia a una vesícula derivada de células que comprende una membrana que delimita un espacio interno (lumen). Las vesículas extracelulares comprenden todas las vesículas unidas a la membrana que tienen un diámetro más pequeño que la célula de la que se derivan. Generalmente, las vesículas extracelulares varían en diámetro de 20 nm a 1000 nm y pueden comprender varias cargas útiles dentro del espacio interno (es decir, el lumen), que se muestran en la superficie externa o en la superficie luminal de la vesícula extracelular y/o que atraviesan la membrana. La carga útil puede comprender, por ejemplo, ácidos nucleicos, proteínas, carbohidratos, lípidos, moléculas pequeñas y/o combinaciones de estos. A modo de ejemplo y de modo no taxativo, las vesículas extracelulares incluyen cuerpos apoptóticos, fragmentos de células, vesículas derivadas de células por manipulación directa o indirecta (por ejemplo, mediante extrusión en serie o tratamiento con soluciones alcalinas), orgánulos vesiculados y vesículas producidas por células vivas (por ejemplo, mediante gemación directa de la membrana plasmática o fusión del endosoma tardío con la membrana plasmática). Las vesículas extracelulares pueden derivarse de un organismo vivo o muerto, tejidos u órganos explantados y/o células cultivadas. En algunos aspectos, la VE comprende una proteína de armazón que se describe en la presente memoria.

Como se usa en la presente memoria, el término "exosoma" hace referencia a una pequeña vesícula extracelular (VE) derivada de una célula (entre 20 y 300 nm de diámetro, más preferiblemente 40 y 200 nm de diámetro) que comprende una membrana que delimita un espacio interno (lumen), y que, en algunos aspectos, se genera a partir de una célula (por ejemplo, una célula productora), por ejemplo, mediante gemación directa de la membrana plasmática o mediante fusión del endosoma tardío con la membrana plasmática. El exosoma es una especie de vesícula extracelular (VE). En algunos aspectos, el exosoma comprende lípidos o ácidos grasos y polipéptidos, y opcionalmente comprende una carga útil (por ejemplo, una molécula con actividad biológica como un agente terapéutico), un receptor (por ejemplo, un resto de direccionamiento), un polinucleótido (por ejemplo, un ácido nucleico, ARN o ADN), un azúcar (por ejemplo, un azúcar simple, polisacárido o glicano) u otras moléculas. El exosoma puede derivarse de una célula productora y aislarse de la célula productora basándose en su tamaño, densidad, parámetros bioquímicos o una combinación de estos. En algunos aspectos, el exosoma comprende una proteína de armazón de la presente descripción. En algunos aspectos, los exosomas de la presente descripción son producidos por células que expresan uno o más productos transgénicos.

Como se usa en la presente memoria, la expresión "proteína del lumen exosómica" hace referencia a una proteína de armazón, es decir, una proteína unida o asociada a la superficie luminal de la VE, por ejemplo, exosoma, como MARCKS, MARKSL1, BASP1, o cualquier fragmento funcional de estas, cualquier variante de estas, cualquier derivado de estas, o cualquier combinación de estas, y que sea adecuada para su uso como un armazón para dirigir una carga útil, por ejemplo, una molécula con actividad biológica (por ejemplo, proteínas terapéuticas) a la superficie luminal de las Ve , por ejemplo, exosomas.

Como se usa en la presente memoria, el término "nanovesícula" hace referencia a una vesícula pequeña derivada de células (entre 20 y 250 nm de diámetro, por ejemplo, 30 y 150 nm de diámetro) que comprende una membrana que rodea un espacio interno, y que se genera a partir de una célula (por ejemplo, célula productora) mediante manipulación directa o indirecta de modo que la nanovesícula no sea producida por la célula productora sin dicha manipulación. Las manipulaciones apropiadas de la célula productora para producir las nanovesículas incluyen, de modo no taxativo, extrusión en serie, tratamiento con soluciones alcalinas, sonicación o combinaciones de estos. La producción de nanovesículas puede, en algunos casos, provocar la destrucción de la célula productora. En algunos aspectos, las poblaciones de nanovesículas que se describen en la presente memoria están sustancialmente libres de vesículas que se derivan de células productoras mediante gemación directa de la membrana plasmática o fusión del endosoma tardío con la membrana plasmática. En algunos aspectos, la nanovesícula comprende lípidos o ácidos grasos y polipéptidos, y opcionalmente comprende una carga útil (por ejemplo, un agente terapéutico), un receptor (por ejemplo, un resto de direccionamiento), un polinucleótido (por ejemplo, un ácido nucleico, ARN o ADN), un azúcar (por ejemplo, un azúcar simple, polisacárido o glicano) u otras moléculas. La nanovesícula, una vez derivada de una célula productora de acuerdo con la manipulación, puede aislarse de la célula productora en función de su tamaño, densidad, parámetros bioquímicos o una combinación de estos. En algunos aspectos, la nanovesícula puede comprender una proteína de armazón que se describe en la presente memoria.

Como se usa en la presente memoria, la expresión "VE con modificación en el lumen" hace referencia a una VE, por ejemplo, un exosoma con la superficie luminal de la membrana o el lumen de la VE, por ejemplo, exosoma, modificada en su composición de modo que la superficie luminal o el lumen de la VE modificada, por ejemplo, exosoma, sea diferente de la VE, por ejemplo, exosoma, antes de la modificación o de la VE de origen natural, por ejemplo, exosoma.

La modificación puede estar directamente en el lumen (es decir, el hueco dentro de la VE) o en la membrana de la VE (por ejemplo, exosoma) en particular la superficie luminal de la VE, de modo que se cambia el lumen y/o la superficie luminal de la VE, por ejemplo, exosoma. Por ejemplo, la membrana se modifica en su composición de una proteína, un lípido, una molécula pequeña, un carbohidrato, etc. De modo que se modifica la superficie luminal de la VE, por ejemplo, exosoma. De manera similar, se puede modificar el contenido del lumen. La composición puede cambiarse por medio de un método químico, físico o biológico o por producirse a partir de una célula previamente modificada por un método químico, físico o biológico. Específicamente, la composición puede cambiarse mediante ingeniería genética o producirse a partir de una célula previamente modificada por ingeniería genética. En algunos aspectos, una VE con modificación en el lumen, por ejemplo, exosoma con modificación en el lumen, comprende una proteína exógena (es ^{decir, una proteína que la}Ve, ^{por ejemplo, exosoma, no expresa naturalmente) o un fragmento o variante de esta que}puede exponerse en la superficie luminal o lumen de la VE, por ejemplo, exosoma, o puede ser un punto de anclaje (unión) para un resto expuesto en la capa interna de la VE, por ejemplo, exosoma. En otros aspectos, una VE con modificación en el lumen, por ejemplo, exosoma con modificación en el lumen, comprende una expresión más alta de una VE natural, por ejemplo, exosoma, proteína (por ejemplo, una proteína de armazón) o un fragmento o variante de estos que se puede exponer al lumen de la VE, por ejemplo, exosoma, o puede ser un punto de anclaje (unión) para ^{un resto expuesto en la superficie luminal de la}Ve, ^{por ejemplo, exosoma.}

Como se usa en la presente memoria, la expresión "VE modificada en la superficie" hace referencia a una VE con la superficie externa de la VE modificada en su composición de modo que la superficie externa de la VE modificada sea diferente de la de la VE antes de la modificación o de la VE de origen natural.

Como se usa en la presente memoria, la expresión "exosoma modificado en la superficie" hace referencia a un exosoma con la superficie externa del exosoma modificado en su composición de modo que la superficie externa del exosoma modificado sea diferente de la del exosoma antes de la modificación o del exosoma de origen natural.

El término "modificado", cuando se usa en el contexto de las VE, por ejemplo, exosomas, que se describen en la presente memoria, hace referencia a una alteración o modificación de una VE, por ejemplo, exosoma y/o su célula productora, de modo que la VE modificada, por ejemplo, exosoma, sea diferente de una VE de origen natural, por ejemplo, exosoma. En algunos aspectos, una VE modificada, por ejemplo, exosoma, que se describe en la presente memoria comprende una membrana que difiere en la composición de una proteína, un lípido, un pequeño molecular, un carbohidrato, etc. en comparación con la membrana de una VE de origen natural, por ejemplo, exosoma. Por ejemplo, la membrana comprende mayor densidad o número de la VE natural, por ejemplo, exosomas, proteínas y/o ^{la membrana comprende proteínas que no se encuentran naturalmente en las}Ve, ^{por ejemplo, exosomas. En}determinados aspectos, tales modificaciones de la membrana cambian la superficie exterior de la VE, por ejemplo, exosoma (por ejemplo, las VE y exosomas modificados en la superficie que se describen en la presente memoria). En determinados aspectos, tales modificaciones de la membrana cambian la superficie luminal de la VE, por ejemplo, exosoma (por ejemplo, las VE y exosomas modificados en el lumen que se describen en la presente memoria).

Por ejemplo, el lumen se modifica en su composición de una proteína, un lípido, una molécula pequeña, un carbohidrato, etc. La composición puede cambiarse por medio de un método químico, físico o biológico o producirse a partir de una célula previamente modificada por un método químico, físico o biológico. Específicamente, la composición puede cambiarse mediante ingeniería genética o produciéndose a partir de una célula previamente modificada por ingeniería genética.

Como se usa en la presente memoria, el término "modificación" de una proteína, por ejemplo, como en "proteína modificada" o "modificación de proteína" o sus variantes gramaticales, hace referencia a una proteína que tiene al menos un 15 % de identidad con la secuencia de aminoácidos no mutante de la proteína. Una modificación de una proteína incluye un fragmento o una variante de la proteína. Una modificación de una proteína puede incluir además una modificación química o física de un fragmento o una variante de la proteína. En algunos aspectos, una proteína modificada conserva al menos una función fisiológica de la proteína no modificada.

Como se usa en la presente memoria, la expresión "un fragmento" de una proteína (por ejemplo, una molécula con actividad biológica tal como una proteína terapéutica, o una proteína de armazón que se describe en la presente memoria) hace referencia a una proteína que es más corta que la secuencia de origen natural, por ejemplo, con eliminación en el extremo N y/o C en comparación con la proteína de origen natural.

Como se usa en la presente memoria, la expresión "fragmento funcional" hace referencia a un fragmento de proteína que conserva la función de la proteína. Por consiguiente, en algunos aspectos, un fragmento funcional de una proteína de armazón que se describe en la presente memoria como MARCKS, MARCKSL1 o BASP1 conserva la capacidad de anclar una molécula con actividad biológica en la superficie luminal de la VE, por ejemplo, exosoma.

Si un fragmento es un fragmento funcional en ese sentido puede evaluarse mediante cualquier método conocido en la técnica para determinar el contenido proteico de las VE, por ejemplo, exosomas que incluyen transferencias Western, análisis FACS y fusiones de los fragmentos con proteínas autofluorescentes como, por ejemplo, GFP. En un aspecto particular, el fragmento de MARCKS, MARCKSL1 o BASP1 conserva, por ejemplo, al menos aproximadamente 50 %, al menos aproximadamente 55 %, al menos aproximadamente 60 %, al menos aproximadamente 65 %, al menos aproximadamente 70 %, al menos aproximadamente 75 %, al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 85 %, al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 95 %, al menos aproximadamente 99 %, o al menos aproximadamente 100 % de la capacidad de MARCKS, MARCKSL1 o BASP1 de origen natural de anclar una carga útil, por ejemplo, una molécula con actividad biológica, en la superficie luminal o externa de la VE, por ejemplo, exosoma. En un aspecto particular, la capacidad de una variante de MARCKS, MARCKSL1, BASP1 o de un fragmento de MARCKS, MARCKSL1 o BASP1 es al menos aproximadamente 70 %, al menos aproximadamente 75 %, al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 85 %, al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 95 %, al menos aproximadamente 99 % o al menos aproximadamente 100 % de la capacidad de MARCKS, MARCKSL1 y BASP1, respectivamente, de anclar una carga útil, por ejemplo, una molécula con actividad biológica, en la superficie luminal o externa de la VE, por ejemplo, exosoma. Esta capacidad puede evaluarse, por ejemplo, mediante variantes marcadas con fluorescencia, en los ensayos descritos en la sección experimental.

El término "derivado" como se usa en la presente memoria hace referencia a una VE, por ejemplo, exosoma, componente (por ejemplo, una proteína o un lípido), una proteína de armazón de la presente descripción, o a una carga útil, por ejemplo, una molécula con actividad biológica (por ejemplo, un polipéptido, polinucleótido, lípido, carbohidrato, anticuerpo o fragmento de este) que se ha modificado química o enzimáticamente.

Como se usa en la presente memoria, el término "variante" de una proteína hace referencia a una proteína que comparte una determinada identidad estructural (por ejemplo, identidad de secuencia de aminoácidos) y funcional con otra proteína tras la comparación (por ejemplo, mediante alineamiento de secuencia) mediante un método conocido en la técnica. Por ejemplo, una variante de una proteína puede incluir una sustitución, inserción, eliminación, cambio de marco o reordenamiento en otra proteína. En algunos aspectos, una variante de una proteína conserva al menos una función fisiológica de la proteína no variante.

En un aspecto particular, la variante es una proteína variante que tiene al menos un 70 % de identidad con respecto a MARc Ks , MARCKSL1, BASP1 maduras de longitud completa o un fragmento de MARCKS, MARCKSL1 o bAs P1.

En algunos aspectos, las variantes o variantes de fragmentos de MARCKS comparten al menos aproximadamente 70 %, al menos aproximadamente 75 %, al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 85 %, al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 95 %, o al menos aproximadamente 99 % de identidad de secuencia con MARCKS de acuerdo con la SEQ ID NO: 1 o con un fragmento funcional de esta, como se determina, por ejemplo, mediante el alineamiento por pares usando el algoritmo de Needleman-Wunsch.

En algunos aspectos, las variantes o variantes de fragmentos de MARCKSL1 comparten al menos aproximadamente 70 %, al menos aproximadamente 75 %, al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 85 %, al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 95 %, o al menos aproximadamente 99 % de identidad de secuencia con MARCKSL1 de acuerdo con la SEQ ID NO: 2 o con un fragmento funcional de esta, como se determina, por ejemplo, mediante alineamiento por pares usando el algoritmo de Needleman-Wunsch.

En algunos aspectos, las variantes o variantes de fragmentos de BASP1 comparten al menos aproximadamente 70 %, al menos aproximadamente 75 %, al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 85 %, al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 95 %, o al menos aproximadamente 99 % de identidad de secuencia con BASP1 de acuerdo con la SEQ ID NO: 3 o con un fragmento funcional de esta, como se determina, por ejemplo, mediante el alineamiento por pares usando el algoritmo de Needleman-Wunsch.

En algunos aspectos, una variante de una proteína de armazón (por ejemplo, MARCKS, MARCKSL1 o BASP1), un fragmento funcional de una proteína de armazón, o una variante de un fragmento funcional de una proteína de armazón, es un derivado.

En cada uno de los casos anteriores, la variante o variante de un fragmento de una proteína de armazón (por ejemplo, una variante de MARCKS, MARCKSL1, BASP1 o un fragmento de MARCKS, MARCKSL1 o BASP1) conserva la capacidad de anclar la carga útil, por ejemplo, un molécula con actividad biológica, en la superficie luminal o externa de la VE, por ejemplo, exosoma.

La exposición de cualquier proteína proporcionada en la presente memoria abarca una variante funcional de la proteína. La expresión "variante funcional" de una proteína hace referencia a una variante de la proteína que conserva la capacidad de anclar una molécula con actividad biológica en la superficie luminal o externa de la VE, por ejemplo, exosoma. En un aspecto particular, la capacidad de una variante de MARCKS, MARCKSL1, BASP1 o de un fragmento de MARCKS, MARCKSL1 o BASP1 es al menos de aproximadamente 70 %, al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 85 %, al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 95 %, o al menos aproximadamente 99 % de la capacidad de MARCKS, MARCKSL1 y BASP1, respectivamente, de anclar una carga útil, por ejemplo, una molécula con actividad biológica, en la superficie luminal o externa de la VE, por ejemplo, exosoma.

Las variantes de origen natural se denominan "variantes alélicas" y hacen referencia a una de varias formas alternativas de un gen que ocupa un lugar determinado en un cromosoma de un organismo (Genes II, Lewin, B., ed., John Wiley & Sons, Nueva York (1985)). Estas variantes alélicas pueden variar a nivel de polinucleótidos y/o polipéptidos, y se incluyen en la presente descripción. De manera alternativa, se pueden producir variantes no naturales mediante técnicas de mutagénesis o mediante síntesis directa.

Mediante el uso de métodos conocidos de modificación de proteínas y tecnología de ADN recombinante, se pueden generar variantes para mejorar o alterar las características de los polipéptidos. Por ejemplo, se pueden eliminar uno o más aminoácidos del extremo N o C de la proteína secretada sin una pérdida sustancial de la función biológica. Ron et ál., J. Biol. Chem. 268: 2984-2988 (1993), informaron de proteínas KGF variantes que tienen actividad de unión a heparina incluso después de eliminar 3, 8 o 27 residuos de aminoácidos de extremo amino. De manera similar, el interferón gamma mostró una actividad hasta diez veces mayor después de eliminar de 8 a 10 residuos de aminoácidos del extremo carboxi de esta proteína. (Dobeli et ál., J. Biotechnology 7:199-216 (1988)).

Además, una amplia evidencia demuestra que las variantes a menudo conservan una actividad biológica similar a la de la proteína de origen natural. Por ejemplo, Gayle y colaboradores (J. Biol. Chem 268:22105-22111 (1993)) llevaron a cabo un análisis mutacional extenso de la citoquina humana IL-1 a. Ellos utilizaron mutagénesis aleatoria para generar más de 3500 mutantes de IL-1a individuales que promediaron 2,5 de cambios de aminoácidos por variante en toda la longitud de la molécula. Se examinaron múltiples mutaciones en cada posible posición de aminoácidos. Los investigadores descubrieron que "la mayor parte de la molécula podría alterarse con poco efecto sobre [la unión o la actividad biológica]". (Véase el Resumen). De hecho, solo 23 secuencias de aminoácidos únicas, de más de 3500 secuencias de nucleótidos examinadas, produjeron una proteína que difería significativamente en la actividad de la del tipo salvaje.

Como se indicó anteriormente, las variantes o derivados incluyen, por ejemplo, polipéptidos modificados. En algunos aspectos, las variantes o derivados de, por ejemplo, polipéptidos, polinucleótidos, lípidos, glicoproteínas, son el resultado de una modificación química y/o una modificación endógena. En algunos aspectos, las variantes o derivados son el resultado de una modificación in vivo. En algunos aspectos, las variantes o derivados son el resultado de una modificación in vitro. En incluso otros aspectos, las variantes o derivados son el resultado de la modificación intracelular en las células productoras.

Las modificaciones presentes en variantes y derivados incluyen, por ejemplo, acetilación, acilación, ADP-ribosilación, amidación, unión covalente de flavina, unión covalente de un resto hemo, unión covalente de un nucleótido o derivado de nucleótido, unión covalente de un lípido o derivado de lípido, unión covalente de fosfotidilinositol, reticulación, ciclación, formación de enlaces disulfuro, desmetilación, formación de reticulaciones covalentes, formación de cisteína, formación de piroglutamato, formilación, gamma-carboxilación, glicosilación, formación de anclaje GPI, hidroxilación, yodación, metilación, miristoilación, oxidación, pegilación (Mei et ál., Blood 116:270-79 (2010)), procesamiento proteolítico, fosforilación, prenilación, racemización, selenoilación, sulfatación, adición mediada por transferencia de ARN de aminoácidos a proteínas como arginilación y ubiquitinación.

La expresión "sustitución de aminoácidos" hace referencia a reemplazar un residuo de aminoácido presente en una secuencia original o de referencia (por ejemplo, una secuencia de tipo salvaje) con otro residuo de aminoácido. Se puede sustituir un aminoácido en una secuencia original o de referencia (por ejemplo, una secuencia polipeptídica de tipo salvaje), por ejemplo, mediante síntesis química de péptidos o mediante métodos recombinantes conocidos en la técnica. Por consiguiente, una referencia a una "sustitución en la posición X" hace referencia a la sustitución de un aminoácido presente en la posición X con un resto de aminoácido alternativo. En algunos aspectos, los patrones de sustitución se pueden describir de acuerdo con el esquema AnY, donde A es el código de una sola letra correspondiente al aminoácido presente de forma natural u original en la posición n, e Y es el residuo de aminoácido de sustitución. En otros aspectos, los patrones de sustitución se pueden describir de acuerdo con el esquema An(YZ), donde A es el código de una sola letra correspondiente al residuo de aminoácido que sustituye al aminoácido presente de forma natural u original en la posición n, e Y y Z son residuos de aminoácidos de sustituciones alternativas que pueden reemplazar a A.

Como se usa en la presente memoria, el término "anticuerpo" abarca una inmunoglobulina, ya sea natural o producida de forma parcial o totalmente de forma sintética, y fragmentos de esta. El término también cubre cualquier proteína que tenga un dominio de unión que sea homólogo a un dominio de unión a inmunoglobulina. "Anticuerpo" incluye además un polipéptido que comprende una región marco de un gen de inmunoglobulina o fragmentos de este, que se une y reconoce específicamente un antígeno. El uso del término anticuerpo pretende incluir anticuerpos completos, anticuerpos policlonales, monoclonales y recombinantes, fragmentos de estos, y además incluye anticuerpos monocatenarios, anticuerpos humanizados, anticuerpos murinos, monoclonales quiméricos, de ratón-humano, de ratón-primate, de primate-humano, anticuerpos anti-idiotipo, fragmentos de anticuerpos, tales como, por ejemplo, scFv, (scFv)2, Fab, Fab' y F(ab')2, F(ab1)2, Fv, dAb y fragmentos Fd, diacuerpos y polipéptidos relacionados con anticuerpos. El anticuerpo incluye anticuerpos biespecíficos y anticuerpos multiespecíficos siempre que presenten la actividad o función biológica deseada. En algunos aspectos de la presente descripción, la carga útil es una molécula con actividad biológica que comprende un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno de este. En algunos aspectos, el anticuerpo (por ejemplo, una molécula con actividad biológica de la presente descripción) es un nanocuerpo.

Las expresiones "conjugado anticuerpo-fármaco" y "ADC" se utilizan indistintamente y hacen referencia a un anticuerpo unido, por ejemplo, de forma covalente, a un agente terapéutico (a veces denominado en la presente memoria como agente, fármaco o ingrediente farmacéutico activo) o agentes. En algunos aspectos de la presente descripción, la carga útil es una molécula con actividad biológica que comprende un conjugado anticuerpo-fármaco.

Una "sustitución conservadora de aminoácidos" es una sustitución en la cual el residuo de aminoácidos se reemplaza con un residuo de aminoácidos que tiene una cadena lateral similar. Las familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares se han definido en la técnica, incluidas las cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), las cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), las cadenas laterales polares sin carga (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), las cadenas laterales beta ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y las cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Por lo tanto, si un aminoácido en un polipéptido se reemplaza por otro aminoácido de la misma familia de cadenas laterales, la sustitución se considera conservadora. En otro aspecto, una cadena de aminoácidos se puede reemplazar de forma conservadora con una cadena estructuralmente similar que difiere en el orden y/o composición de los miembros de la familia de cadenas laterales.

Como se usa en la presente memoria, el término "conservado" hace referencia a nucleótidos o residuos de aminoácidos de una secuencia polinucleotídica o secuencia polipeptídica, respectivamente, que son los que aparecen inalterados en la misma posición de dos o más secuencias que se están comparando. Los nucleótidos o aminoácidos que están relativamente conservados son aquellos que se conservan entre más secuencias relacionadas que los nucleótidos o aminoácidos que aparecen en otras partes de las secuencias.

En algunos aspectos, se dice que dos o más secuencias están "completamente conservadas" o son " idénticas" si son 100 % idénticas entre sí. En algunos aspectos, se dice que dos o más secuencias están "altamente conservadas" si son al menos 70 % idénticas, al menos 80 % idénticas, al menos 90 % idénticas o al menos 95 % idénticas entre sí.

En algunos aspectos, se dice que dos o más secuencias están "altamente conservadas" si son aproximadamente 70 % idénticas, aproximadamente 80 % idénticas, aproximadamente 90 % idénticas, aproximadamente 95 %, aproximadamente 98 % o aproximadamente 99 % idénticas entre sí. En algunos aspectos, se dice que dos o más secuencias están "conservadas" si son al menos 30 % idénticas, al menos 40 % idénticas, al menos 50 % idénticas, al menos 60 % idénticas, al menos 70 % idénticas, al menos 80 % idénticas, al menos 90 % idénticas o al menos 95 % idénticas entre sí. En algunos aspectos, se dice que dos o más secuencias están "conservadas" si son aproximadamente 30 % idénticas, aproximadamente 40 % idénticas, aproximadamente 50 % idénticas, aproximadamente 60 % idénticas, aproximadamente 70 % idénticas, aproximadamente 80% idénticas, aproximadamente 90 % idénticas, aproximadamente 95 % idénticas, aproximadamente 98 % idénticas o aproximadamente 99 % idénticas entre sí. La conservación de la secuencia puede aplicarse a la longitud completa de un polinucleótido o polipéptido o puede aplicarse a una porción, región o característica de este.

Como se usa en la presente memoria, el término "homología" hace referencia a la relación general entre moléculas poliméricas, por ejemplo, entre moléculas de ácido nucleico (por ejemplo, moléculas de ADN y/o moléculas de ARN) y/o entre moléculas polipeptídicas. Generalmente, el término "homología" implica una relación evolutiva entre dos moléculas. Por lo tanto, dos moléculas homólogas tendrán un ancestro evolutivo común. En el contexto de la presente descripción, el término homología abarca tanto la identidad como la similitud.

En algunos aspectos, las moléculas poliméricas se consideran "homólogas" entre sí si al menos el 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % de los monómeros en la molécula son idénticos (exactamente el mismo monómero) o son similares (sustituciones conservadoras). El término "homólogo" se refiere necesariamente a una comparación entre al menos dos secuencias (secuencias de polinucleótidos o polipéptidos).

En el contexto de la presente descripción, las sustituciones (incluso cuando se denominan sustitución de aminoácidos) se llevan a cabo a nivel de ácido nucleico, es decir, la sustitución de un residuo de aminoácido con un residuo de aminoácido alternativo se realiza sustituyendo el codón que codifica el primer aminoácido con un codón que codifica el segundo aminoácido.

Como se usa en la presente memoria, el término "identidad" hace referencia a la conservación general del monómero entre moléculas poliméricas, por ejemplo, entre moléculas polipeptídicas o moléculas polinucleotídicas (por ejemplo, moléculas de ADN y/o moléculas de ARN). El término "idéntico" sin calificadores adicionales, por ejemplo, la proteína A es idéntica a la proteína B, implica que las secuencias son 100 % idénticas (100 % de identidad de secuencia). Describir dos secuencias como, por ejemplo, "70 % idénticas", es equivalente a describirlas como que tienen, por ejemplo, "70 % de identidad de secuencia".

El cálculo del porcentaje de identidad de dos secuencias polipeptídicas, por ejemplo, se puede realizar alineando las dos secuencias con fines de comparación óptimos (por ejemplo, se pueden introducir espacios en una o ambas primera y segunda secuencias polipeptídicas para un alineamiento óptimo y las secuencias no idénticas pueden descartarse a efectos de comparación). En determinados aspectos, la longitud de una secuencia alineada con fines de comparación es al menos 30 %, al menos 40 %, al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 90 %, al menos al menos 95 % o 100 % de la longitud de la secuencia de referencia. A continuación, se comparan los aminoácidos en las posiciones de aminoácido correspondientes.

Cuando una posición en la primera secuencia es ocupada por el mismo aminoácido que la posición correspondiente en la segunda secuencia, entonces las moléculas son idénticas en esa posición. El porcentaje de identidad entre las dos secuencias está determinado por la cantidad de posiciones idénticas que comparten las secuencias, teniendo en cuenta la cantidad de espacios y la longitud de cada espacio, que se deben introducir para el alineamiento óptimo de las dos secuencias. La comparación de secuencias y determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias puede lograrse mediante el uso de un algoritmo matemático.

Los métodos de alineamiento de secuencias para su comparación son bien conocidos en la técnica. Varios programas y algoritmos de alineamiento se describen en: Smith y Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981); Needleman y Wunsch, J. Mol. Bio. 48: 443 (1970); Pearson y Lipman, Methods in Mol. Biol. 24: 307-31 (1988); Higgins y Sharp, Gene 73: 15237-44 (1988); Higgins y Sharp, CABIOS 5: 151-3 (1989) Corpet et ál., Nuc. Acids Res. 16: 10881-90 (1988); Huang et ál., Comp. Appl. BioSci. 8: 155-65 (1992); y Pearson et ál., Meth. Mol. Biol. 24: 307-31 (1994). La herramienta de búsqueda de alineamiento local básica de Nc BI (BLAST) [Altschul 20 et ál., J. Mol. Biol. 215: 403-10 (1990) J está disponible en varias fuentes, incluido el Centro Nacional de Información Biológica (NBCl, Bethesda, Md.) y en Internet, para su uso en relación con los programas de análisis de secuencias blastp, blastn, blastx, tblastn y tblastx. Se puede acceder a BLAST y una descripción de cómo determinar la secuencia de identificación usando el programa en el sitio web oficial del NCBI (Centro Nacional de Información Biotecnológica) bajo el NIH (Instituto Nacional de Salud).

Otros programas adecuados son, por ejemplo, Needle, Stretcher, Water o Matcher, que forman parte del conjunto de programas de bioinformática EMBOSS y también están disponibles en el Instituto Europeo de Bioinformática (EBI) en www.ebi.ac.uk/Tools/psa. Los alineamientos de secuencia se pueden realizar usando métodos conocidos en la técnica tales como MAFFT, Clustal (ClustalW, Clustal X o Clustal Omega), MUSCLE, etc.

Las diferentes regiones dentro de una única secuencia diana de polinucleótido o polipéptido que se alinea con una secuencia de referencia de polinucleótido o polipéptido pueden tener cada una su propio porcentaje de identidad de secuencia. Se observa que el valor de identidad de secuencia porcentual se redondea al décimo más cercano. Por ejemplo, 80,11, 80,12, 80,13 y 80,14 se redondean a 80,1, mientras que 80,15, 80,16, 80,17, 80,18 y 80,19 se redondean a 80,2. También se observa que el valor de la longitud siempre será un número entero.

En determinados aspectos, el porcentaje de identidad (% de ID) o de una primera secuencia de aminoácidos (o secuencia de ácido nucleico) con respecto a una segunda secuencia de aminoácidos (o secuencia de ácido nucleico) se calcula como % de ID = 100 x (Y/Z), donde Y es la cantidad de residuos de aminoácidos (o nucleobases) puntuados como coincidencias idénticas en el alineamiento de la primera y segunda secuencias (alineadas mediante inspección visual o un programa de alineamiento de secuencias en particular) y Z es la cantidad total de residuos en la segunda secuencia. Si la longitud de una primera secuencia es más larga que la segunda secuencia, el porcentaje de identidad de la primera secuencia con respecto a la segunda secuencia será mayor que el porcentaje de identidad de la segunda secuencia con respecto a la primera secuencia.

Un experto en la técnica apreciará que la generación de un alineamiento de secuencia para el cálculo de un porcentaje de identidad de secuencia no se limita a comparaciones de secuencia-secuencia binaria impulsadas exclusivamente por datos de secuencia primaria. También se apreciará que se pueden generar alineamientos de secuencia integrando datos de secuencia con datos de fuentes heterogéneas tales como datos estructurales (por ejemplo, estructuras de proteínas cristalográficas), datos funcionales (por ejemplo, ubicación de mutaciones) o datos filogenéticos. Un programa adecuado que integra datos heterogéneos para generar un alineamiento de secuencia múltiple es T-Coffee, disponible en www.tcoffee.org, y de manera alternativa disponible, por ejemplo, a través de EBI. También se apreciará que el alineamiento final utilizado para calcular el porcentaje de identidad de secuencia puede curarse de forma automática o manual.

Como se usa en la presente memoria, el término "similitud" hace referencia a la relación general entre moléculas poliméricas, por ejemplo, entre moléculas de polinucleótidos (por ejemplo, moléculas de ADN y/o moléculas de ARN) y/o entre moléculas polipeptídicas. El cálculo del porcentaje de similitud de moléculas poliméricas entre sí se puede realizar de la misma manera que el cálculo del porcentaje de identidad, excepto que el cálculo del porcentaje de similitud tiene en cuenta las sustituciones conservadoras como se entiende en la técnica. Se entiende que el porcentaje de similitud depende de la escala de comparación utilizada, es decir, si los aminoácidos se comparan, por ejemplo, de acuerdo con su proximidad evolutiva, carga, volumen, flexibilidad, polaridad, hidrofobicidad, aromaticidad, punto isoeléctrico, antigenicidad o combinaciones de estos.

Como se usa en la presente memoria, la expresión "célula productora" hace referencia a una célula usada para generar una VE, por ejemplo, exosoma. Una célula productora puede ser una célula cultivada in vitro o una célula in vivo. Una célula productora incluye, de modo no taxativo, una célula que se sabe que es eficaz en la generación de VE, por ejemplo, exosomas, por ejemplo, células HEK293, células de ovario de hámster chino (CHO) y células madre mesenquimales (MSC), fibroblastos de prepucio humano BJ, fibroblastos fHDF, células precursoras neuronales AGE.HN®, amniocitos CAP® células madre mesenquimales adiposas, células RPTEC / TERT1. En determinados aspectos, una célula productora no es una célula presentadora de antígenos. En algunos aspectos, una célula productora no es una célula dendrítica, un linfocito B, un mastocito, un macrófago, un neutrófilo, una célula de Kupffer-Browicz, una célula derivada de cualquiera de estas células o cualquier combinación de estas.

Como se usan en la presente memoria, las expresiones "aislar", "aislado" y "que aísla" o "purificar", "purificado" y "que purifica" así como "extraído" y "que extrae" y variantes gramaticales de estos se usan indistintamente y hacen referencia al estado de una preparación (por ejemplo, una pluralidad de cantidades y/o concentraciones que se conocen o que se desconocen) de VE deseadas, por ejemplo, exosomas, que se han sometido a uno o más procesos de purificación, por ejemplo, una selección o un enriquecimiento de la VE deseada, por ejemplo, exosoma, preparación. En algunas modalidades, aislar o purificar como se usa en la presente memoria es el proceso para eliminar, eliminar parcialmente (por ejemplo, una fracción) de las VE, por ejemplo, exosomas, de una muestra que contiene células productoras. En alguna modalidad, una composición de VE aislada, por ejemplo, exosoma, no tiene actividad indeseada detectable o, de manera alternativa, el nivel o la cantidad de la actividad no deseada está en un nivel o cantidad aceptable o por debajo de este.

En otras modalidades, una composición de VE aislada, por ejemplo, exosoma, tiene una cantidad y/o concentración de VE deseadas, por ejemplo, exosomas, en una cantidad y/o concentración aceptables o por encima de estas. En otros aspectos, la composición de VE aislada, por ejemplo, exosoma, se enriquece en comparación con el material de partida (por ejemplo, preparaciones de células productoras) a partir del cual se obtiene la composición. Este enriquecimiento puede ser de al menos de aproximadamente 10 %, al menos aproximadamente 15 %, al menos aproximadamente 20 %, al menos aproximadamente 25 %, al menos aproximadamente 30 %, al menos aproximadamente 35 %, al menos aproximadamente 40 %, al menos aproximadamente 45 %, al menos aproximadamente 50 %, al menos aproximadamente 55 %, al menos aproximadamente 60 %, al menos aproximadamente 65 %, al menos aproximadamente 70 %, al menos aproximadamente 75 %, al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 85 %, al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 95 %, al menos aproximadamente 96 %, al menos aproximadamente 97 %, al menos aproximadamente 98 %, al menos aproximadamente 99 %, al menos aproximadamente 99,9 %, al menos aproximadamente 99,99 %, al menos aproximadamente 99,999 %, al menos aproximadamente 99,9999 % o más de aproximadamente 99,9999 % en comparación con el material de partida.

En algunos aspectos, las preparaciones de VE aisladas, por ejemplo, exosomas, carecen sustancialmente de productos biológicos residuales (por ejemplo, contaminantes). En algunos aspectos, las preparaciones de VE aisladas, por ejemplo, exosomas, carecen de aproximadamente 100 %, al menos aproximadamente 99 %, al menos aproximadamente 98 %, al menos aproximadamente 97 %, al menos aproximadamente 96 %, al menos aproximadamente 95 %, al menos aproximadamente 94 %, al menos aproximadamente 93 %, al menos aproximadamente 92 %, al menos aproximadamente 91 % o al menos aproximadamente 90 % de cualquier materia biológica contaminante. Los productos biológicos residuales pueden incluir materiales abióticos (incluidos productos químicos) o ácidos nucleicos, proteínas, lípidos o metabolitos no deseados. En determinados aspectos, las preparaciones de VE aisladas, por ejemplo, exosomas, carecen de aproximadamente 100 %, al menos aproximadamente 99 %, al menos aproximadamente 98 %, al menos aproximadamente 97 %, al menos aproximadamente 96 %, al menos aproximadamente 95 %, al menos aproximadamente 94 %, al menos aproximadamente 93 %, al menos aproximadamente 92 %, al menos aproximadamente 91 %, o al menos aproximadamente 90 % de cualquier macromolécula, por ejemplo, de cualquier ácido nucleico, proteínas, lípidos y/o carbohidratos. Sustancialmente libre de productos biológicos residuales también puede significar que la composición de VE, por ejemplo, exosoma, no contiene células productoras detectables y que solo las VE, por ejemplo, exosomas, son detectables.

El término "excipiente" o "portador" hace referencia a una sustancia inerte añadida a una composición farmacéutica para facilitar aún más la administración de un compuesto. Las expresiones "portador aceptable desde un punto de vista farmacéutico", "excipiente aceptable desde un punto de vista farmacéutico" y variantes gramaticales de estos abarcan cualquiera de los agentes aprobados por un organismo regulador del gobierno federal de los EE. UU. o enumerados en la Farmacopea de EE. u U. para su uso en animales, incluidos humanos, así como también cualquier vehículo o diluyente que no cause una irritación significativa a un sujeto y no anule la actividad biológica y las propiedades del compuesto administrado. Se incluyen excipientes y vehículos que son útiles para preparar una composición farmacéutica y generalmente son seguros, no tóxicos y deseables.

Como se usa en la presente memoria, la expresión "carga útil" hace referencia a cualquier molécula que se puede unir a un armazón de la presente descripción y posteriormente se puede anclar a la membrana de una VE, por ejemplo, exosoma, de la presente descripción. En algunas modalidades, la carga útil se une a la superficie luminal de la membrana de la VE, por ejemplo, exosoma. La expresión carga útil abarca moléculas con actividad biológica, por ejemplo, moléculas que pueden tener un efecto terapéutico y/o profiláctico, así como moléculas de diagnóstico. Por consiguiente, la expresión carga útil también abarca restos detectables tales como radionúclidos, moléculas fluorescentes, agentes de contraste, etiquetas o entidades moleculares que pueden ser reconocidos por una fracción detectable, por ejemplo, ligandos o etiquetas.

Como se usa en la presente memoria, la expresión carga útil es equivalente e intercambiable con el término "cargamento". Por consiguiente, "proteína de cargamento" o "péptido de cargamento" hacen referencia a tipos específicos de moléculas de carga útil (proteína y péptidos, respectivamente) unidas a un armazón de la presente descripción.

La expresión "molécula con actividad biológica" como se usa en la presente memoria hace referencia a cualquier molécula que se puede unir a una VE, por ejemplo, exosoma, a través de un armazón de la presente descripción donde la molécula puede tener un efecto terapéutico o profiláctico en un sujeto que lo necesite o afectar a la homeostasis de una célula o tejido en un sujeto. Los ejemplos no taxativos de moléculas con actividad biológica que pueden introducirse en una VE, por ejemplo, exosoma y/o una célula productora incluyen, por ejemplo, agentes terapéuticos como nucleótidos (por ejemplo, nucleótidos que comprenden un resto detectable o una toxina o que interrumpen la transcripción), ácidos nucleicos (por ejemplo, moléculas de ADN o ARNm que codifican un polipéptido, como una enzima, o moléculas de ARN que tienen una función reguladora, como microARN, ADNbc, ARN largos no codificantes y ARNip), aminoácidos (por ejemplo, aminoácidos que comprenden un resto detectable o una toxina o que interrumpe la traducción), polipéptidos (por ejemplo, enzimas o anticuerpos), lípidos, carbohidratos, virus y partículas virales (por ejemplo, virus adenoasociados y partículas virales, retrovirus, adenovirus, etc.) y moléculas pequeñas (por ejemplo, fármacos de molécula pequeña y toxinas), incluidos los agonistas de STING de molécula pequeña que incluyen dinucleótidos cíclicos como ML-RR S2 y 3'-3' cAIMPdFSH). En determinados aspectos, una carga útil comprende un antígeno. En determinados aspectos, la molécula con actividad biológica, por ejemplo, el agente terapéutico, por ejemplo, un agente terapéutico para el ser humano, conserva una función biológica, por ejemplo, una función terapéutica, cuando se fusiona con una proteína de armazón que se describe en la presente memoria. En algunos aspectos, la molécula con actividad biológica puede tener al menos 5 aminoácidos, al menos 6 aminoácidos, al menos 7 aminoácidos, al menos 8 aminoácidos, al menos 9 aminoácidos, al menos 10 aminoácidos, al menos 15 aminoácidos. ácidos, al menos 20 aminoácidos, al menos 25 aminoácidos, al menos 30 aminoácidos, al menos 35 aminoácidos, al menos 40 aminoácidos, al menos 45 aminoácidos, al menos 50 aminoácidos, al menos 55 aminoácidos, al menos 60 aminoácidos, al menos 65 aminoácidos, al menos 70 aminoácidos, al menos 75 aminoácidos, al menos 100 aminoácidos, al menos 150 aminoácidos, al menos 200 aminoácidos, al menos 250 aminoácidos, al menos 300 aminoácidos, al menos 350 aminoácidos, al menos 400 aminoácidos o al menos 500 aminoácidos. En algunos aspectos, la molécula con actividad biológica puede tener al menos 5 aminoácidos. En algunos aspectos, la molécula con actividad biológica puede tener al menos 10 aminoácidos. En algunos aspectos, la molécula con actividad biológica puede tener al menos 50 aminoácidos. En algunos aspectos, la molécula con actividad biológica puede tener al menos 100 aminoácidos. En algunos aspectos, la molécula con actividad biológica puede tener al menos 5 aminoácidos, por ejemplo, 5 a 500, 5 a 450, 5 a 400, 5 a 350, 5 a 300, 5 a 250, 5 a 200, 5 a 150, 5 a 100, 5 a 90, 5 a 80, 5 a 70, 5 a 60, 5 a 50, 5 a 40, 5 a 30, 5 a 20, 5 a 15 o 5 a 10 aminoácidos. En algunos aspectos, la molécula con actividad biológica puede tener al menos 10 aminoácidos, por ejemplo, 10 a 500, 10 a 450, 10 a 400, 10 a 350, 10 a 300, 10 a 250, 10 a 200, 10 a 150, 10 a 100, 10 a 90, 10 a 80, 10 a 70, 10 a 60, 10 a 50, 10 a 40, 10 a 30, 10 a 20 o 10 a 15 aminoácidos. En algunos aspectos, la molécula con actividad biológica puede tener al menos 50 aminoácidos, por ejemplo, 50 a 500, 50 a 450, 50 a 400, 50 a 350, 50 a 300, 50 a 250, 50 a 200, 50 a 150, 50 a 100, 50 a 90, 50 a 80, 50 a 50 o 50 a 60 aminoácidos. En algunos aspectos, la molécula con actividad biológica puede tener al menos 100 aminoácidos, por ejemplo, 100 a 500, 100 a 450, 100 a 400, 100 a 350, 100 a 300, 100 a 250, 100 a 200 o 100 a 150 aminoácidos. En otros aspectos, la molécula con actividad biológica tiene al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho, al menos nueve, al menos diez, al menos 11, al menos 12, al menos 15, al menos 20, al menos 25, al menos 30, al menos 35, al menos 40, al menos 45, al menos 50, al menos 60, al menos 70, al menos 80, al menos 90, al menos 100, al menos 110, al menos 120, al menos 130, al menos 140, al menos 150, al menos 160, al menos 170, al menos 180, al menos 190, al menos 200, al menos 300, al menos 400, o al menos 500 nucleótidos. En otros aspectos, la molécula con actividad biológica tiene al menos dos nucleótidos, por ejemplo, 2 a 1000, 2 a 900, 2 a 500, 2 a 300 o 2 a 50. En otros aspectos, la molécula con actividad biológica tiene al menos 10 nucleótidos, por ejemplo, 10 a 1000, 10 a 900, 10 a 500, 10 a 300 o 10 a 50. En otros aspectos, la molécula con actividad biológica tiene al menos 15 nucleótidos, por ejemplo, 15 a 1000, 15 a 900, 15 a 500, 15 a 300, o 15 a 50. En otros aspectos, la molécula con actividad biológica tiene al menos 20 nucleótidos, por ejemplo, 20 a 1000, 20 a 900, 20 a 500, 20 a 300, o 20 a 50. En otros aspectos, la molécula con actividad biológica tiene al menos 50 nucleótidos, por ejemplo, 50 a 1000, 50 a 900, 50 a 500, 50 a 300 o 50 a 100. En otros aspectos, la molécula con actividad biológica tiene al menos 100 nucleótidos, por ejemplo, 100 a 10000, 100 a 9000, 100 a 5005, 100 a 3000, o 100 a 500. En otros aspectos, la molécula con actividad biológica tiene al menos 200 nucleótidos, por ejemplo, 200 a 10000, 200 a 9000, 200 a 5000, 200 a 3000, o 200 a 500. En otros aspectos, la molécula con actividad biológica tiene al menos 500 nucleótidos, por ejemplo, 500 a 10000, 500 a 9000, 500 a 5000, o 500 a 3000. Como se usa en la presente memoria, el término "antígeno" hace referencia a cualquier agente que cuando se introduce en un sujeto provoca una respuesta inmunitaria (celular o humoral) en sí mismo. En algunos aspectos, las moléculas de carga útil están unidas de forma covalente a la VE, por ejemplo, al exosoma. En otros aspectos, una carga útil comprende un adyuvante.

Un polipéptido o proteína "recombinante" hace referencia a una proteína o polipéptido producido mediante tecnología de ADN recombinante. Para los fines de la descripción, las proteínas y los polipéptidos producidos de forma recombinante expresados en células modificadas se consideran aislados, ya que son polipéptidos naturales o recombinantes que se separaron, fraccionaron, o purificaron de forma parcial o sustancial mediante cualquier técnica adecuada. Los polipéptidos que se describen en la presente memoria se pueden producir de forma recombinante usando métodos conocidos en la técnica. De manera alternativa, las proteínas y péptidos que se describen en la presente memoria se pueden sintetizar químicamente. En algunos aspectos de la presente descripción, las proteínas de armazón presentes en las VE, por ejemplo, los exosomas, se producen de forma recombinante al sobreexpresar las proteínas de armazón en las células productoras, de modo que los niveles de proteínas de armazón en las VE resultantes, por ejemplo, exosomas, aumentan significativamente con respecto a los niveles de proteínas de armazón presentes en las VE, por ejemplo, exosomas, de células productoras que no sobreexpresan tales proteínas de armazón.

Como se usa en la presente memoria, los términos "anclar" o "que ancla" una molécula con actividad biológica en la superficie luminal o externa de una VE (por ejemplo, exosoma) de la presente descripción a través de una proteína de armazón hace referencia a unir de forma covalente la molécula con actividad biológica a la porción de la molécula de armazón que se ubica en la superficie luminal o externa de la VE (por ejemplo, exosoma), respectivamente.

Los términos "asociado", "asociación" y variantes gramaticales de estos se usan indistintamente y hacen referencia a un primer resto, por ejemplo, una primera secuencia de aminoácidos o secuencia de nucleótidos, unida de forma covalente o no covalente a un segundo resto, por ejemplo, una segunda secuencia de aminoácidos o secuencia de nucleótidos, respectivamente. El primer resto puede unirse o yuxtaponerse directamente al segundo resto o, de manera alternativa, un resto intermedio puede unir de forma covalente el primer resto al segundo resto. En algunas modalidades, el término "asociado" incluye miristoilación, interacción iónica o cualquier combinación de estas.

El término "unido" o "fusionado" como se usa en la presente memoria hace referencia a una fusión de un primer resto a un segundo resto en el extremo C o en el extremo N mediante un enlace peptídico o un enlazador de uno o más aminoácidos. El término "enlazado" o "fusionado" también incluye la inserción de todo el primer resto (o el segundo resto) en, por ejemplo, entre dos puntos cualesquiera, por ejemplo, aminoácidos, en el segundo resto (o el primer resto, respectivamente). En un aspecto, el primer resto está unido a un segundo resto mediante un enlace peptídico o un enlazador. El primer resto se puede unir a un segundo resto mediante un enlace fosfodiéster o un enlazador. El enlazador puede ser un péptido o un polipéptido (para cadenas polipeptídicas) o un nucleótido o una cadena nucleotídica (para cadenas nucleotídicas) o cualquier resto químico (para cadenas polipeptídicas o polinucleotídicas o cualquier molécula química). El término "unido" también se puede indicar mediante un guion (-). En algunos aspectos, una proteína de armazón en una VE, por ejemplo, exosoma, puede unirse o fusionarse a una carga útil, por ejemplo, una molécula con actividad biológica.

Como se usa en la presente memoria, "un sujeto mamífero" incluye todos los mamíferos, incluidos, de modo no taxativo, humanos, animales domésticos (por ejemplo, perros, gatos y similares), animales de granja (por ejemplo, vacas, ovejas, cerdos, caballos y similares) y animales de laboratorio (por ejemplo, monos, ratas, ratones, conejos, cobayas y similares).

Los términos "individuo", "sujeto", "huésped" y "paciente" y variantes de estos, se usan indistintamente en la presente memoria y hacen referencia a cualquier sujeto mamífero para el que se desea diagnóstico, tratamiento o terapia, particularmente seres humanos. Los métodos que se describen en la presente memoria son aplicables tanto a aplicaciones veterinarias como a terapias humanas. En algunos aspectos, el sujeto es un mamífero y en otros aspectos el sujeto es un ser humano.

Como se usa en la presente memoria, la expresión "sustancialmente libre" significa que la muestra que comprende las VE, por ejemplo, exosomas, comprende menos del 10 % de macromoléculas, por ejemplo, contaminantes, en concentración porcentual de masa/volumen (m/v). Algunas fracciones pueden contener menos de aproximadamente 0,001 %, menos de aproximadamente 0,01 %, menos de aproximadamente 0,05 %, menos de aproximadamente 0,1 %, menos de aproximadamente 0,2 %, menos de aproximadamente 0,3 %, menos de aproximadamente 0,4 %, menos de aproximadamente 0,5 %, menos de aproximadamente 0,6 %, menos de aproximadamente 0,7 %, menos de aproximadamente 0,8 %, menos de aproximadamente 0,9 %, menos de aproximadamente 1 %, menos de aproximadamente 2 %, menos de aproximadamente 3 %, menos de aproximadamente 4 %, menos de aproximadamente 5 %, menos de aproximadamente 6 %, menos de aproximadamente 7 %, menos de aproximadamente 8 %, menos de aproximadamente 9 % o menos de aproximadamente 10 % (m/v) de macromoléculas.

Como se usa en la presente memoria, el término "macromolécula" significa ácidos nucleicos, proteínas exógenas, lípidos, carbohidratos, metabolitos (por ejemplo, metabolitos poliméricos) o una combinación de estos.

Como se usa en la presente memoria, la expresión "proteína de VE convencional" significa una proteína que se sabe previamente que es rica en VE.

Como se usa en la presente memoria, el término "VE convencional, por ejemplo, proteína exosómica" significa una proteína que se sabe previamente que es rica en exosomas, lo que incluye, de modo no taxativo, CD9, CD63, CD81, PDGFR, proteínas de anclaje GPI, lactadherina LAMP2 y LAMP2B, un fragmento de estos, o un péptido que se une a estos. Para evitar dudas, PTGFRN, BSG, IGSF2, IGSF3, IGSF8, ITGB1, ITGA4, SLC3A2, transportador de ATP o un fragmento o una variante de estos no son VE convencionales, por ejemplo, proteínas exosómicas.

Como se usa en la presente memoria, la expresión "composición farmacéutica" hace referencia a uno o más de los compuestos que se describen en la presente memoria, como, por ejemplo, una VE, tal como el exosoma de la presente descripción, mezclada o entremezclada o suspendida en uno o más de otros componentes químicos, tales como portadores y excipientes aceptables desde un punto de vista farmacéutico. Un propósito de una composición farmacéutica es facilitar la administración de preparaciones de VE, por ejemplo, exosomas, a un sujeto.

El término "polinucleótido" como se usa en la presente memoria hace referencia a polímeros de nucleótidos de cualquier longitud, incluidos ribonucleótidos, desoxirribonucleótidos, análogos de estos o mezclas de estos. Este término hace referencia a la estructura primaria de la molécula. Por lo tanto, el término incluye ácido desoxirribonucleico ("ADN") de cadena simple, doble y triple, así como el ácido ribonucleico ("ARN") de cadena simple, doble y triple. También incluye formas modificadas, por ejemplo, mediante alquilación y/o por protección, y no modificadas del polinucleótido. Más particularmente, el término "polinucleótido" incluye polidesoxirribonucleótidos (que contienen 2-desoxi-D-ribosa), polirribonucleótidos (que contienen D-ribosa), incluidos ARNt, ARNr, ARNh, ARNip y ARNm, ya sea empalmado o no, cualquier otro tipo de polinucleótido que es un glucósido C o N de una base de purina o pirimidina, y otros polímeros que contienen cadenas principales normucleotídicas, por ejemplo, poliamida (por ejemplo, ácidos nucleicos peptídicos "PNA") y polímeros polimorfolino, y otros polímeros sintéticos de ácidos nucleicos específicos de secuencia siempre que los polímeros contengan nucleobases en una configuración que permita el apareamiento y el apilamiento de bases, como se encuentra en el ADN y el ARN. En aspectos particulares, el polinucleótido comprende un ARNm. En otro aspecto, el ARNm es un ARNm sintético. En algunos aspectos, el ARNm sintético comprende al menos una nucleobase no natural. En algunos aspectos, todas las nucleobases de una determinada clase se han reemplazado con nucleobases no naturales (por ejemplo, todas las uridinas en un polinucleótido que se describe en la presente memoria pueden reemplazarse con una nucleobase no natural, por ejemplo, 5-metoxiuridina). En algunos aspectos de la presente descripción, la molécula con actividad biológica es un polinucleótido.

Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" se utilizan de manera intercambiable en la presente para referirse a polímeros de aminoácidos de cualquier longitud. El polímero puede comprender aminoácidos modificados. Los términos también abarca un polímero de aminoácidos que ha sido modificado naturalmente o mediante intervención, por ejemplo, formación de enlace disulfuro, glicosilación, lipidación, acetilación, fosforilación o cualquier otra manipulación o modificación, tal como conjugación con un componente de marcaje. También se incluyen en la definición, por ejemplo, polipéptidos que contienen uno o más análogos de un aminoácido (incluidos, por ejemplo, aminoácidos no naturales como homocisteína, ornitina, p-acetilfenilalanina, D-aminoácidos y creatina), así como otras modificaciones que se conocen en la técnica. En algunos aspectos de la presente descripción, la carga útil, por ejemplo, una molécula con actividad biológica, unida a la VE, por ejemplo, exosoma, es un polipéptido, por ejemplo, un anticuerpo o un derivado de este, como un ADC, un PROTAc , una toxina, una proteína de fusión o una enzima.

El término "polipéptido", como se usa en la presente memoria, hace referencia a proteínas, polipéptidos y péptidos de cualquier tamaño, estructura o función. Los polipéptidos incluyen productos génicos, polipéptidos de origen natural, polipéptidos sintéticos, homólogos, ortólogos, parálogos, fragmentos y otros equivalentes, variantes y análogos de los anteriores. Un polipéptido puede ser un solo polipéptido o puede ser un complejo multimolecular tal como un dímero, trímero o tetrámero. También pueden comprender polipéptidos monocatenarios o multicatenarios. Los enlaces disulfuro se encuentran más comúnmente en polipéptidos de cadenas múltiples. El término polipéptido también puede aplicarse a polímeros de aminoácidos en los que uno o más residuos de aminoácidos son un análogo químico artificial de un aminoácido de origen natural correspondiente. En algunos aspectos, un "péptido" puede tener una longitud menor o igual a 50 aminoácidos, por ejemplo, aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 aminoácidos de longitud. En algunos aspectos, un "péptido" puede tener al menos aproximadamente 2 a aproximadamente 50, al menos aproximadamente 3 a aproximadamente 50, al menos aproximadamente 4 a aproximadamente 50, al menos aproximadamente 5 a aproximadamente 50, al menos aproximadamente 10 a aproximadamente 50, al menos aproximadamente 15 a aproximadamente 50, al menos aproximadamente 20 a aproximadamente 50, al menos aproximadamente 25 a aproximadamente 50, al menos aproximadamente 30 a aproximadamente 50, al menos aproximadamente 35 a aproximadamente 50, al menos aproximadamente 40 a aproximadamente 50, o al menos aproximadamente 45 a aproximadamente 50 aminoácidos de longitud.

Como se usa en la presente memoria, la expresión "proteína de armazón de la presente descripción", o variantes gramaticales, hace referencia a

(i) una proteína (expresada de forma natural, sintetizada química o enzimáticamente, o producida de forma recombinante) que se localiza en la superficie luminal de las VE, por ejemplo, exosomas, como MARCKS, MARKSL1 o BASP1;

(ii) cualquier fragmento funcional de (i);

(iii) cualquier variante funcional de (i)-(ii);

(iv) cualquier derivado de (i)-(iii);

(v) cualquier péptido correspondiente a un dominio o combinación de estos derivados de una proteína en (i) que pueda unirse a la superficie luminal de las VE, por ejemplo, exosomas, o una molécula que comprenda tal péptido; (vi) cualquier péptido derivado de un motivo derivado de una proteína en (i) que pueda unirse a la superficie luminal de las VE, por ejemplo, exosomas, o una molécula que comprenda tal péptido;

(vii) una molécula de (i) a (vi) que comprende al menos un aminoácido no natural;

(viii) o cualquier combinación de estos,

que es adecuado para su uso como un armazón para dirigir (unir) cargas útiles, por ejemplo, moléculas con actividad biológica (por ejemplo, proteínas terapéuticas) a la superficie luminal de las VE, por ejemplo, exosomas.

Como se usa en la presente memoria, la expresión "VE, por ejemplo, exosoma, de la presente descripción", o variantes gramaticales, hace referencia a una VE, por ejemplo, exosoma, que comprende al menos una proteína de armazón de la presente descripción.

Como se usa en la presente memoria, la expresión "célula productora de la presente descripción", o variantes gramaticales, hace referencia a una célula que puede producir una VE, por ejemplo, exosoma, de la presente descripción.

II. Proteínas de vesículas extracelulares, por ejemplo, proteínas exosómicas

Algunos aspectos de la presente descripción se relacionan con la identificación, el uso y la modificación de VE, por ejemplo, proteínas exosómicas (proteínas de armazón), que son muy ricas en VE, por ejemplo, exosoma, superficies luminales. Dichas proteínas de Ve o proteínas exosómicas (proteínas de armazón) pueden identificarse analizando las VE altamente purificadas, por ejemplo, exosomas, con espectrometría de masas u otros métodos conocidos en la técnica.

Las proteínas de armazón de la presente descripción incluyen varias proteínas luminales o proteínas de membrana, como proteínas transmembrana (es decir, proteínas que atraviesan la membrana de la VE a través de una o más hélices de transmembrana), proteínas integrales y proteínas periféricas (es decir, proteínas en la superficie luminal que interactúan con la superficie a través de interacciones electrostáticas y/o restos de anclaje), enriquecidas en las membranas de las VE, por ejemplo, exosoma. Específicamente, las proteínas de armazón de la presente descripción incluyen, de modo no taxativo,

(1) sustrato de proteína quinasa C rico en alanina miristoilada (MARCKS);

(2) sustrato de proteína quinasa C rico en alanina miristoilada como 1 (MARCKSL1); y

(3) proteína 1 soluble en ácido cerebral (BASP1).

Una o más VE, por ejemplo, exosomas, proteínas identificadas en la presente memoria (proteínas de armazón) pueden usarse selectivamente dependiendo de una célula productora, la condición de producción, los métodos de purificación o la aplicación prevista de los exosomas.

Se pueden identificar y usar las proteínas de VE, por ejemplo, exosoma, enriquecidas en el lumen (por ejemplo, en la superficie luminal de la membrana de VE) de determinadas VE, por ejemplo, exosomas, con un intervalo de tamaño específico, un resto de direccionamiento, una densidad de carga, una carga útil, etc. en algunos aspectos de la presente descripción.

En algunos aspectos, más de una proteína de VE, por ejemplo, exosoma, que se describe en la presente memoria

(por ejemplo, proteínas de armazón como MARCKS, MARKSL1, BASP1, cualquier fragmento, variante o derivado funcional de estas, o cualquier combinación de estas) se puede usar simultánea o posteriormente para la generación y el aislamiento de VE terapéuticas, por ejemplo, exosomas, de la presente descripción.

III. VE con modificación en el lumen, por ejemplo, exosomas

Las vesículas extracelulares (VE), por ejemplo, los exosomas, tienen típicamente entre 20 nm y 1000 nm de diámetro.

Los exosomas, que son pequeñas vesículas extracelulares, tienen típicamente un diámetro de 100 a 200 nm. Las VE, por ejemplo, exosomas, están compuestas por una bicapa lipídica limitante y un conjunto diverso de proteínas y ácidos nucleicos (Maas, SLN, et ál., Trends. Cell Biol. 27(3):172-188 (2017)). Las VE, por ejemplo, exosomas, muestran una captación preferencial en tipos de células y tejidos discretos, y su tropismo puede dirigirse agregando proteínas a su superficie que interactúan con receptores en la superficie de las células diana (Alvarez-Erviti, L., et ál., Nat. Biotechnol.

29(4):341-345 (2011)).

A diferencia de los anticuerpos, las VE, por ejemplo, exosomas, pueden alojar una gran cantidad de moléculas adheridas a su superficie, del orden de miles a decenas de miles de moléculas por VE, por ejemplo, exosoma. Los conjugados o complejos que comprenden VE, por ejemplo, exosomas, y cargas útiles, por ejemplo, moléculas con actividad biológica (por ejemplo, moléculas terapéuticas), por lo tanto, representan una plataforma para administrar una alta concentración de compuesto terapéutico o de diagnóstico a tipos de células discretas, mientras que al mismo tiempo limitan exposición sistémica general al compuesto, que a su vez reduce la toxicidad fuera del objetivo. Además, ^lasVe, ^{por ejemplo, exosomas, ofrecen la posibilidad de alojar múltiples cargas útiles, por ejemplo, moléculas con}actividad biológica, en diferentes compartimentos. Por ejemplo, la VE, por ejemplo, exosoma, puede comprender, por ejemplo, restos de direccionamiento unidos a la superficie externa de la VE que dirigirían la VE a una determinada célula diana (por ejemplo, una célula cancerosa) o tejido diana (por ejemplo, hígado o cerebro), uno o más restos terapéuticos (por ejemplo, fármacos) y/o uno o más restos detectables (por ejemplo, reactivos de contraste o radionúclidos).

La VE, por ejemplo, exosoma, también puede comprender diferentes cargas útiles, por ejemplo, restos terapéuticos

(por ejemplo, fármacos) y/o restos detectables (por ejemplo, reactivos de contraste o radionucleidos) unidos a la superficie luminal de la VE. Además, la VE, por ejemplo, exosoma, también puede comprender una o más cargas útiles, por ejemplo, moléculas con actividad biológica (por ejemplo, agentes terapéuticos, reactivos de diagnóstico, adyuvantes, etc.), en el lumen de la VE, por ejemplo, exosoma.

Por lo tanto, las VE, por ejemplo, exosomas, proporcionan un formato de administración que combina múltiples cargas útiles, por ejemplo, moléculas con actividad biológica, con los mismos o diferentes roles en un solo vehículo de administración, y con una densidad muy alta.

Las VE, por ejemplo, exosomas, que se describen en la presente memoria son vesículas extracelulares con un diámetro de entre aproximadamente 20 y 300 nm. En determinadas modalidades, una VE, por ejemplo, exosoma, de la presente descripción tiene un diámetro de entre aproximadamente 20 y 290 nm, 20 y 280 nm, 20 y 270 nm, 20 y

260 nm, 20 y 250 nm, 20 y 240 nm, 20 y 230 nm, 20 y 220 nm, 20 y 210 nm, 20 y 200 nm, 20 y 190 nm, 20 y 180 nm,

20 y 170 nm, 20 y 160 nm, 20 y 150 nm, 20 y 140 nm, 20 y 130 nm, 20 y 120 nm, 20 y 110 nm, 20 y 100 nm, 20 y 90 nm, 20 y 80 nm, 20 y 70 nm, 20 y 60 nm, 20 y 50 nm, 20 y 40 nm, 20 y 30 nm, 30 y 300 nm, 30 y 290 nm, 30 y 280 nm, 30 y 270 nm, 30 y 260 nm, 30 y 250 nm, 30 y 240 nm, 30 y 230 nm, 30 y 220 nm, 30 y 210 nm, 30 y 200 nm, 30 y 190 nm, 30 y 180 nm, 30 y 170 nm, 30 y 160 nm, 30 y 150 nm, 30 y 140 nm, 30 y 130 nm, 30 y 120 nm, 30 y 110 nm, 30 y 100 nm, 30 y 90 nm, 30 y 80 nm, 30 y 70 nm, 30 y 60 nm, 30 y 50 nm, 30 y 40 nm, 40 y 300 nm, 40 y 290 nm, 40 y 280 nm, 40 y 270 nm, 40 y 260 nm, 40 y 250 nm, 40 y 240 nm, 40 y 230 nm, 40 y 220 nm, 40 y 210 nm, 40 y 200 nm, 40 y 190 nm, 40 y 180 nm, 40 y 170 nm, 40 y 160 nm, 40 y 150 nm, 40 y 140 nm, 40 y 130 nm, 40 y 120 nm, 40 y 110 nm, 40 y 100 nm, 40 y 90 nm, 40 y 80 nm, 40 y 70 nm, 40 y 60 nm, 40 y 50 nm, 50 y 300 nm, 50 y 290 nm, 50 y 280 nm, 50 y 270 nm, 50 y 260 nm, 50 y 250 nm, 50 y 240 nm, 50 y 230 nm, 50 y 220 nm, 50 y 210 nm, 50 y 200 nm, 50 y 190 nm, 50 y 180 nm, 50 y 170 nm, 50 y 160 nm, 50 y 150 nm, 50 y 140 nm, 50 y 130 nm, 50 y 120 nm, 50 y 110 nm, 50 y 100 nm, 50 y 90 nm, 50 y 80 nm, 50 y 70 nm, 50 y 60 nm, 60 y 300 nm, 60 y 290 nm, 60 y 280 nm, 60 y 270 nm, 60 y 260 nm, 60 y 250 nm, 60 y 240 nm, 60 y 230 nm, 60 y 220 nm, 60 y 210 nm, 60 y 200 nm, 60 y 190 nm, 60 y 180 nm, 60 y 170 nm, 60 y 160 nm, 60 y 150 nm, 60 y 140 nm, 60 y 130 nm, 60 y 120 nm, 60 y 110 nm, 60 y 100 nm, 60 y 90 nm, 60 y 80 nm, 60 y 70 nm, 70 y 300 nm, 70 y 290 nm, 70 y 280 nm, 70 y 270 nm, 70 y 260 nm, 70 y 250 nm, 70 y 240 nm, 70 y 230 nm, 70 y 220 nm, 70 y 210 nm, 70 y 200 nm, 70 y 190 nm, 70 y 180 nm,

70 y 170 nm, 70 y 160 nm, 70 y 150 nm, 70 y 140 nm, 70 y 130 nm, 70 y 120 nm, 70 y 110 nm, 70 y 100 nm, 70 y 90 nm, 70 y 80 nm, 80 y 300 nm, 80 y 290 nm, 80 y 280 nm, 80 y 270 nm, 80 y 260 nm, 80 y 250 nm, 80 y 240 nm, 80 y

230 nm, 80 y 220 nm, 80 y 210 nm, 80 y 200 nm, 80 y 190 nm, 80 y 180 nm, 80 y 170 nm, 80 y 160 nm, 80 y 150 nm,

80 y 140 nm, 80 y 130 nm, 80 y 120 nm, 80 y 110 nm, 80 y 100 nm, 80 y 90 nm, 90 y 300 nm, 90 y 290 nm, 90 y 280 nm, 90 y 270 nm, 90 y 260 nm, 90 y 250 nm, 90 y 240 nm, 90 y 230 nm, 90 y 220 nm, 90 y 210 nm, 90 y 200 nm, 90 y 190 nm, 90 y 180 nm, 90 y 170 nm, 90 y 160 nm, 90 y 150 nm, 90 y 140 nm, 90 y 130 nm, 90 y 120 nm, 90 y 110 nm, 90 y 100 nm, 100 y 300 nm, 110 y 290 nm, 120 y 280 nm, 130 y 270 nm, 140 y 260 nm, 150 y 250 nm, 160 y 240 nm, 170 y 230 nm, 180 y 220 nm, o 190 y 210 nm. El tamaño de la VE, por ejemplo, exosoma, que se describe en la presente memoria se puede medir según los métodos descritos, anteriormente.

En algunos aspectos, una VE, por ejemplo, exosoma, de la presente descripción comprende una membrana bilipídica ("membrana de VE, por ejemplo, exosoma"), que comprende una superficie interior y una superficie exterior. En determinadas modalidades, la superficie interior se enfrenta al núcleo interior (es decir, lumen) de la VE, por ejemplo, exosoma. En determinados aspectos, la superficie exterior puede estar en contacto con el endosoma, los cuerpos multivesiculares o la membrana/citoplasma de una célula productora o una célula diana.

En algunos aspectos, la membrana de VE, por ejemplo, el exosoma, comprende lípidos y ácidos grasos. En algunos aspectos, la membrana de VE, por ejemplo, exosoma, comprende fosfolípidos, glicolípidos, ácidos grasos, esfingolípidos, fosfoglicéridos, esteroles, colesteroles y fosfatidilserinas.

En algunos aspectos, la membrana de VE, por ejemplo, exosoma, comprende una valva interior y una valva exterior. La composición de la valva interior y exterior se puede determinar mediante ensayos de distribución transbicapa conocidos en la técnica, véase, por ejemplo, Kuypers et ál., Biohim Biophys Acta 1985819:170. En algunos aspectos, la composición de la valva exterior es de entre aproximadamente 70 y 90 % de fosfolípidos de colina, entre aproximadamente 0 y 15 % de fosfolípidos ácidos y entre aproximadamente 5 y 30 % de fosfatidiletanolamina. En algunos aspectos, la composición de la valva exterior es de entre aproximadamente 15 y 40 % de fosfolípidos de colina, entre aproximadamente 10 y 50 % de fosfolípidos ácidos y entre aproximadamente 30 y 60 % de fosfatidiletanolamina.

En un aspecto, la presente descripción hace referencia a la generación y el uso de VE con modificación en el lumen, por ejemplo, exosomas. Los exosomas modificados en el lumen tienen un espacio interno (la superficie luminal de la VE) modificado en sus composiciones, por ejemplo, modificado con respecto a las composiciones de los exosomas que se encuentran en la naturaleza. Por ejemplo, la composición de la superficie luminal puede modificarse cambiando el contenido de proteína, lípido o glicano de los componentes del lado luminal de la membrana de VE, por ejemplo, exosoma. En algunos aspectos, la superficie luminal de las VE, por ejemplo, exosomas, puede comprender una o más proteínas expresadas de forma recombinante, por ejemplo, proteínas de armazón de la presente descripción, por ejemplo, proteína del lumen exosómica, que no son naturales para las VE, por ejemplo, exosomas. Por consiguiente, la presente descripción proporciona composiciones que permiten el anclaje de una carga útil, por ejemplo, una molécula con actividad biológica, a una VE, por ejemplo, exosoma, que comprenden unir la carga útil, por ejemplo, una molécula con actividad biológica a una proteína de armazón, por ejemplo, proteína del lumen exosómica, de la presente descripción. La presente descripción también proporciona un método para anclar una carga útil, por ejemplo, una molécula con actividad biológica a una VE, por ejemplo, exosoma, que comprende unir la molécula con actividad biológica a una proteína de armazón, por ejemplo, proteína del lumen exosómica, de la presente descripción.

En algunos aspectos, las proteínas de armazón, por ejemplo, la proteína del lumen exosómica, de la presente descripción se unen a la superficie luminal de la VE, por ejemplo, exosoma, mediante lipidación. En algunos aspectos, la proteína de armazón de la presente descripción está acilada con grasa. En algunos aspectos, la proteína de armazón está miristoilada.

La miristoilación es una modificación de la lipidación donde un grupo miristoílo, derivado del ácido mirístico, se une de forma covalente mediante un enlace amida al grupo alfa-amino de una glicina de extremo N. El ácido mirístico es un ácido graso saturado de 14 carbonos (14:4) con el nombre sistemático de ácido n-tetradecanoico. Esta modificación se puede añadir cotraduccional o postraduccionalmente. Durante la adición cotraduccional del grupo miristoílo, la glicina de extremo N se modifica después de la escisión del residuo de metionina de extremo N en el polipéptido en crecimiento de nueva formación. Esto ocurre en aproximadamente el 80 % de las proteínas miristoiladas. La miristoilación postraduccional ocurre típicamente después de un evento de escisión de caspasa que da como resultado la exposición de un residuo interno de glicina, que luego estaría disponible para la adición de ácido mirístico. Además de la miristoilación cotraduccional o postraduccional (realizar in vivo o in vitro, por ejemplo, enzimáticamente), la miristoilación de las proteínas de armazón, por ejemplo, las proteínas del lumen del exosoma, de la presente descripción también puede ocurrir mediante síntesis química, por ejemplo, añadiendo, como paso sintético, el ácido mirístico a una proteína de armazón durante la síntesis química.

En algunas modalidades, el anclaje lipídico a las membranas biológicas no es la palmitoilación (es decir, la unión del ácido palmítico, generalmente a la cisteína y menos frecuentemente a la serina o treonina). En otras modalidades, el anclaje lipídico a las membranas biológicas es prenilación (unión de grupos prenilo) o unión con glicosilfosfatidilinositol (unión con GPI). Las proteínas preniladas son proteínas con polímeros de isopreno hidrófobos unidos de forma covalente (es decir, hidrocarburo ramificado de cinco carbonos) en los residuos de cisteína de la proteína. Las proteínas unidas a GPI se unen a un grupo molecular complejo de GPI a través de un enlace amida al grupo carboxilo de extremo C de la proteína. La unión de GPI se produce mediante la acción del complejo GPI-transamidasa. Las cadenas de ácidos grasos del fosfatidilinositol se insertan en la membrana y, por lo tanto, son las que anclan la proteína a la membrana.

En algunas modalidades, las VE con modificación en el lumen, por ejemplo, exosomas, se generan mediante métodos químicos y/o físicos, tales como fusión inducida por PEG y/o fusión ultrasónica.

En otras modalidades, las VE con modificación en el lumen, por ejemplo, exosomas, se generan mediante ingeniería genética. Los exosomas producidos a partir de una célula productora modificada genéticamente o una progenie de la célula modificada genéticamente pueden contener composiciones de lumen modificadas. En algunas modalidades, las VE con modificación en el lumen, por ejemplo, exosomas, tienen la proteína de VE, por ejemplo, exosoma (por ejemplo, una proteína de armazón, por ejemplo, proteína de lumen exosómica, como MARCKS, MARKSL1, BASP1, o una combinación de estas) en un densidad mayor o menor o incluyen una modificación o un fragmento de la proteína de VE, por ejemplo, exosoma (por ejemplo, cualquier fragmento, variante o derivado funcional de estas, o cualquier combinación de estas).

Por ejemplo, las VE con modificación en el lumen, por ejemplo, exosomas, se pueden producir a partir de una célula transformada con una secuencia exógena que codifica la proteína de VE, por ejemplo, exosoma, o una modificación o un fragmento de la proteína de VE, por ejemplo, exosoma (por ejemplo, una proteína de armazón, por ejemplo, proteína del lumen exosómica, tal como MARCKS, MARKSL1, BASP1, cualquier fragmento, variante o derivado funcional de estas, o cualquier combinación de estas). Las VE, por ejemplo, exosomas, que incluyen proteínas expresadas a partir de la secuencia exógena, pueden incluir composiciones de proteína de superficie luminal modificada (proteína de armazón).

Varias modificaciones o fragmentos de la proteína de VE, por ejemplo, proteína exosómica (por ejemplo, una proteína de armazón, por ejemplo, proteína de lumen exosómica, como MARCKS, MARKSL1, BASP1, cualquier fragmento, variante o derivado funcional de estas, o cualquier combinación de estas), puede usarse para las modalidades de la presente descripción. Por ejemplo, pueden usarse proteínas modificadas para dirigirse más eficazmente a las superficies luminales de la VE, por ejemplo, exosoma. También se pueden usar proteínas modificadas para que incluyan un fragmento mínimo requerido para el direccionamiento específico y efectivo a la superficies luminales de la VE, por ejemplo, exosoma.

En algunos aspectos, la proteína de armazón, por ejemplo, la proteína del lumen exosómica, de la presente descripción comprende la proteína MARCKS, o un fragmento, variante o derivado de esta. La proteína MARCKS (número de acceso de Uniprot P29966) también se conoce como sustrato de proteína quinasa C, proteína de 80 kDa, de cadena ligera. La proteína MARCKS humana de longitud completa tiene 332 aminoácidos de longitud y comprende un dominio de unión a calmodulina en los residuos de aminoácidos 152 a 176. En algunas modalidades, la proteína de armazón de la presente descripción comprende una proteína MARCKS madura (es decir, sin metionina de extremo N). En algunos aspectos, la proteína de armazón de la presente descripción se deriva de una proteína MARCKS madura, es decir, es un fragmento, variante o derivado de una proteína MARCKS madura y, por lo tanto, carece de la metionina de extremo N presente en la proteína no madura.

En algunos aspectos, la proteína de armazón, por ejemplo, la proteína del lumen exosómica, de la presente descripción comprende la proteína MARCKSL1 (número de acceso de Uniprot P49006), también conocida como proteína 1 similar a MARCKS, y sustrato de quinasa C rico en alanina miristoilada de macrófagos. La proteína MARCKSL1 humana de longitud completa tiene 195 aminoácidos de longitud. La proteína MARCKSL1 tiene un dominio efector involucrado en la unión de lípidos y la unión de calmodulina en los residuos de aminoácidos 87 a 110. En algunas modalidades, la proteína de armazón de la presente descripción comprende una proteína MARCKSL1 madura (es decir, sin metionina de extremo N). En algunos aspectos, la proteína de armazón de la presente descripción se deriva de una proteína MARCKSL1 madura, es decir, es un fragmento, variante o derivado de una proteína MARCKSL1 madura y, por lo tanto, carece de la metionina de extremo N presente en la proteína no madura.

En algunos aspectos, el armazón de la presente descripción comprende la proteína BASP1 (número de acceso Uniprot P80723), también conocida como proteína ácida rica en tejido neuronal de 22 kDa o proteína de membrana axonal neuronal NAP-22. La secuencia de proteína BASP1 humana de longitud completa (isómero 1) tiene una longitud de 227 aminoácidos. Un isómero producido por un empalme alternativo carece de los aminoácidos 88 a 141 del isómero 1. En algunas modalidades, la proteína de armazón, por ejemplo, la proteína del lumen exosómica, de la presente descripción comprende una proteína BASP1 madura (es decir, sin metionina de extremo N). En algunos aspectos, la proteína de armazón de la presente descripción se deriva de una proteína BASP1 madura, es decir, es un fragmento, variante o derivado de una proteína BASP1 madura y, por lo tanto, carece de la metionina de extremo N presente en la proteína no madura.

En algunos aspectos, la proteína de armazón, por ejemplo, la proteína del lumen exosómica, de la presente descripción comprende un "dominio de extremo N" (DN) y un "dominio efector", donde el DN y/o el DE están asociados con la superficie luminal de la VE, por ejemplo, exosoma. Como se usa en la presente memoria, la expresión "asociado con" hace referencia a la interacción entre una proteína de armazón de la presente descripción con la superficie luminal de la VE, por ejemplo, exosoma, que no implica la unión covalente a un componente de la membrana. Por ejemplo, los armazones de la presente descripción pueden asociarse con la superficie luminal de la VE, por ejemplo, a través de un ancla lipídica (por ejemplo, ácido mirístico) y/o un dominio polibásico que interactúa electrostáticamente con la cabeza con carga negativa de los fosfolípidos de membrana. En otros aspectos, la proteína de armazón comprende un dominio de extremo N (DN) y un dominio efector (DE), donde el DN está asociado con la superficie luminal de la VE y el DE está asociado con la superficie luminal de la VE mediante una interacción iónica, donde el DE comprende al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis o al menos siete lisinas contiguas (Lys) en secuencia.

En otros aspectos, el DE comprende además una o más regiones de baja complejidad, por ejemplo, un motivo PEST. Una secuencia PEST es una secuencia peptídica rica en prolina (P), ácido glutámico (E), serina (S) y treonina (T). En algunos aspectos, el DE comprende además residuos con carga negativa (por ejemplo, Glu) y muchos Ser y Thr que ^{se someten a fosforilación transitoria (por lo tanto, ambos agregan cargas negativas a las áreas fuera del}dE).

En algunos aspectos, el DN está asociado con la superficie luminal de la VE, por ejemplo, exosoma, mediante lipidación, por ejemplo, mediante miristoilación. En otras modalidades, el DN tiene Gly en el extremo N. En algunas modalidades, la Gly de extremo N está miristoilada. En algunos aspectos, el DN no comprende Met en el extremo N. En otras modalidades, el DN comprende Gly, que está miristoilada, y no comprende Met en el extremo N.

En algunos aspectos, el DE está asociado con la superficie luminal de la VE, por ejemplo, exosoma, mediante una interacción iónica. En algunas modalidades, el DE está asociado con la superficie luminal de la VE, por ejemplo, exosoma, mediante una interacción electrostática, en particular, una interacción electrostática atractiva.

En algunos aspectos, el DE comprende (i) un aminoácido básico (por ejemplo, lisina) o (ii) dos o más aminoácidos básicos (por ejemplo, lisina) uno al lado del otro en una secuencia polipeptídica. En algunos aspectos, el aminoácido básico es lisina (Lys; K), arginina (Arg, R) o Histidina (His, H). En algunas modalidades, el aminoácido básico es (Lys)n, donde n es un número entero entre 1 y 10.

En otros aspectos, el DE comprende al menos una lisina y el DN comprende una lisina en el extremo C si el extremo N del DE está directamente unido a la lisina en el extremo C del DN, es decir, la lisina está en el extremo N del DE y se fusiona con la lisina en el extremo C del DN. En otras modalidades, el DE comprende al menos dos lisinas, al menos tres lisinas, al menos cuatro lisinas, al menos cinco lisinas, al menos seis lisinas, o al menos siete lisinas cuando el extremo N del DE está unido al extremo C del DN medinate un enlazador, por ejemplo, uno o más aminoácidos.

En algunos aspectos, el DE comprende K, KK, KKK, KKKK (SEQ ID NO: 151), KKKKK (SEQ ID NO: 152) o cualquier combinación de estos. La presente descripción también proporciona que, en algunos aspectos, las repeticiones de lisina se pueden reemplazar con argininas. En otros aspectos, las repeticiones de arginina en el DE o en las proteínas del armazón proporcionan una eficacia de carga inferior en comparación con la eficacia de la lisina.

En algunos aspectos, la proteína de armazón, por ejemplo, la proteína del lumen exosómica, útil para la presente descripción, requiere al menos dos lisinas o al menos tres lisinas, repetidas en secuencia en el DE o en el DE junto con el DN, es decir, lisina en el extremo C del DN y K en el extremo N del DE. En algunas modalidades, el DE comprende K, KK, KKK, KKKK (SEQ ID NO: 151), KKKKK (SEQ ID NO: 152) o cualquier combinación de estos. En algunos aspectos, el DN comprende la secuencia de aminoácidos que se establece en G:X2:X3:X4:X5:X6, donde G representa Gly, donde ":" representa un enlace peptídico, donde cada uno de X2 a X6 representa independientemente un aminoácido, y donde X6 comprende un aminoácido básico. En algunos aspectos, el aminoácido X6 se selecciona del grupo que consiste en Lys, Arg e His. En algunos aspectos, el aminoácido X5 se selecciona del grupo que consiste en Pro, Gly, Ala y Ser. En algunas modalidades, X2 se selecciona del grupo que consiste en Pro, Gly, Ala y Ser. En algunos aspectos, X4 se selecciona del grupo que consiste en Pro, Gly, Ala, Ser, Val, Ile, Leu, Phe, Trp, Tyr, Gln y Met. En algunos aspectos, la proteína de armazón no comprende Met en el extremo N, por ejemplo, miristoilada.

En algunos aspectos, la proteína de armazón, por ejemplo, la proteína del lumen exosómica, comprende un DN y un DE, donde el DN comprende la secuencia de aminoácidos que se establece en G:X2:X3:X4:X5:X6, donde G representa Gly; donde ":" representa un enlace peptídico, donde cada uno de X2 a X6 representa independientemente un aminoácido; donde X6 representa un aminoácido básico, el aminoácido X5 se selecciona del grupo que consiste en Pro, Gly, Ala y Ser, X4 se selecciona del grupo que consiste en Pro, Gly, Ala, Ser, Val, Ile, Leu, Phe, Trp, Tyr, Gln y Met, X3 representa un aminoácido y el aminoácido X2 se selecciona del grupo que consiste en Pro, Gly, Ala y Ser, donde el DE comprende al menos un aminoácido, por ejemplo, al menos una Lys, y donde la proteína de armazón no es (i) la secuencia de aminoácidos que comprende las SeQ ^{ID NO: 4 a 114, 116 a 118, 122 a 150 o 180 a 190 o (ii)}la secuencia de aminoácidos codificada por las SEQ ID NO: 115 o 118 a 121.

En algunos aspectos, la proteína de armazón, por ejemplo, la proteína del lumen exosómica, comprende un dominio de extremo N (DN) y un dominio efector (DE), donde el DN comprende la secuencia de aminoácidos como se establece en G:X2:X3:X4:X5:X6, donde G es una glicina, representada como Gly; donde ":" representa un enlace peptídico, donde cada uno de X2 a X6 es independientemente un aminoácido; donde X6 comprende un aminoácido básico, y donde el DE está unido a X6 por un enlace peptídico y comprende al menos una lisina en el extremo N del DE. En algunos aspectos, la proteína de armazón no comprende Met en el extremo N, por ejemplo, miristoilada. En otros aspectos, la proteína de armazón no comprende o no consiste en (i) la secuencia de aminoácidos que comprende las SEQ ID NO: 4 a 114, 116 a 118, 122 a 150 o 180 a 190 o (ii) la secuencia de aminoácidos codificada por las SEQ ID NO: 115 o 118 a 121.

En algunas modalidades, el DN de la proteína de armazón, por ejemplo, proteína del lumen exosómica, comprende la secuencia de aminoácidos de G:X2:X3:X4:X5:X6, donde

a. G representa Gly;

b. ":" representa un enlace peptídico;

c. X2 es un aminoácido que se selecciona del grupo que consiste en Pro, Gly, Ala y Ser;

d. X3 representa cualquier aminoácido;

e. X4 representa un aminoácido que se selecciona del grupo que consiste en Pro, Gly, Ala, Ser, Val, Ile, Leu, Phe, Trp, Tyr, Gln y Met;

f. X5 representa un aminoácido que se selecciona del grupo que consiste en Pro, Gly, Ala y Ser; y g. X6 representa un aminoácido que se selecciona del grupo que consiste en Lys, Arg e His.

En algunos aspectos, la proteína de armazón, por ejemplo, la proteína del lumen exosómica, no comprende Met en el extremo N, por ejemplo, miristoilada. En otros aspectos, la proteína de armazón no comprende o no consiste en (i) la secuencia de aminoácidos que comprende las SEQ ID NO: 4 a 114, 116 a 118, 122 a 150 o 180 a 190 o (ii) la secuencia de aminoácidos codificada por las SEQ ID NO: 115 o 118 a 121. En algunos aspectos, el aminoácido X3 se selecciona del grupo que consiste en Asn, Gln, Ser, Thr, Asp, Glu, Lys, His y Arg.

En algunos aspectos, El DN y DE están unidos por un enlazador. En algunas modalidades, el enlazador comprende uno o más aminoácidos. En algunos aspectos, el término "enlazador" hace referencia a una secuencia peptídica o polipeptídica (por ejemplo, una secuencia peptídica o polipeptídica sintética) o a una no polipeptídica, por ejemplo, una cadena de alquilo. En algunos aspectos, se pueden vincular dos o más enlazadores en tándem. Generalmente, los enlazadores proporcionan flexibilidad o previenen/mejoran los impedimentos estéricos. Normalmente, los enlazadores no se escinden, sin embargo, en determinados aspectos, tal escisión puede ser deseable. Por consiguiente, en algunas modalidades, un enlazador puede comprender uno o más sitios escindibles por proteasa, que pueden estar ubicados dentro de la secuencia del enlazador o que flanquean al enlazador en cualquier extremo de la secuencia enlazadora. Cuando el DN y DE están unidos por un enlazador, el DE comprende al menos dos lisinas, al menos tres lisinas, al menos cuatro lisinas, al menos cinco lisinas, al menos seis lisinas o al menos siete lisinas.

En algunos aspectos, el enlazador es un enlazador peptídico. En algunos aspectos, el enlazador peptídico puede comprender al menos aproximadamente dos, al menos aproximadamente tres, al menos aproximadamente cuatro, al menos aproximadamente cinco, al menos aproximadamente 10, al menos aproximadamente 15, al menos aproximadamente 20, al menos aproximadamente 25, al menos aproximadamente 30, al menos aproximadamente 35, al menos aproximadamente 40, al menos aproximadamente 45, al menos aproximadamente 50, al menos aproximadamente 55, al menos aproximadamente 60, al menos aproximadamente 65, al menos aproximadamente 70, al menos aproximadamente 75, en al menos aproximadamente 80, al menos aproximadamente 85, al menos aproximadamente 90, al menos aproximadamente 95 o al menos aproximadamente 100 aminoácidos.

En algunos aspectos, el enlazador es un enlazador de glicina/serina. En algunas modalidades, el enlazador peptídico es un enlazador de glicina/serina de acuerdo con la fórmula [(Gly)n-Ser]m donde n es cualquier número entero de 1 a 100 y m es cualquier número entero de 1 a 100. En otros aspectos, el enlazador de glicina/serina está de acuerdo con la fórmula [(Gly)x-Sery]z donde x es un número entero de 1 a 4, y es 0 o 1, y z es un número entero de 1 a 50. En algunos aspectos, el enlazador peptídico comprende la secuencia Gn, donde n puede ser un número entero de 1 a 100. En algunos aspectos, el péptido enlazador puede comprender la secuencia (GlyAla)n, donde n es un número entero entre 1 y 100. En otros aspectos, el péptido enlazador puede comprender la secuencia (GlyGlySer)n, donde n es un número entero entre 1 y 100.

En algunos aspectos, el enlazador peptídico es sintético, es decir, de origen no natural. En una modalidad, un enlazador peptídico incluye péptidos (o polipéptidos) (por ejemplo, péptidos de origen natural o no natural) que comprenden una secuencia de aminoácidos que une o fusiona genéticamente una primera secuencia lineal de aminoácidos con una segunda secuencia lineal de aminoácidos al que no está ligado de forma natural o fusionado genéticamente por naturaleza. Por ejemplo, en un aspecto, el enlazador peptídico puede comprender polipéptidos de origen no natural que son formas modificadas de polipéptidos de origen natural (por ejemplo, que comprenden una mutación tal como una adición, sustitución o eliminación).

En otros aspectos, el enlazador peptídico puede comprender aminoácidos de origen no natural. En incluso otros aspectos, el enlazador peptídico puede comprender aminoácidos de origen natural que se encuentran en una secuencia lineal que no se produce en la naturaleza. En otros aspectos más, el enlazador peptídico puede comprender una secuencia polipeptídica de origen natural.

La presente descripción también proporciona una vesícula extracelular (VE) aislada, por ejemplo, exosoma, que comprende una molécula con actividad biológica unida a una proteína de armazón, por ejemplo, proteína del lumen exosómica, donde la proteína de armazón comprende DN-DE, donde:

a. DN comprende G:X2:X3:X4:X5:X6; donde:

i. G representa Gly;

ii. ":" representa un enlace peptídico;

iii. X2 es un aminoácido que se selecciona del grupo que consiste en Pro, Gly, Ala y Ser;

iv. X3 representa cualquier aminoácido;

v. X4 representa un aminoácido que se selecciona del grupo que consiste en Pro, Gly, Ala, Ser, Val, Ile, Leu, Phe, Trp, Tyr, Gln y Met;

vi. X5 representa un aminoácido que se selecciona del grupo que consiste en Pro, Gly, Ala y Ser;

vii. X6 representa un aminoácido que se selecciona del grupo que consiste en Lys, Arg e His.

b. "-" representa un enlazador opcional; y

c. DE es un dominio efector que comprende (i) al menos dos lisinas contiguas (Lys), que están unidas a X6 por un enlace peptídico o uno o más aminoácidos o (ii) al menos una lisina, que está directamente ligada a X6 por un enlace peptídico. En algunos aspectos, la proteína de armazón no comprende Met en el extremo N, por ejemplo, miristoilada. En otros aspectos, la proteína de armazón no comprende o no consiste en (i) la secuencia de aminoácidos que comprende las SEQ ID NO: 4 a 114, 116 a 118, 122 a 150 o 180 a 190 o (ii) la secuencia de aminoácidos codificada por las SEQ ID NO: 115 o 118 a 121.

En algunos aspectos, el aminoácido X2 se selecciona del grupo que consiste en Gly y Ala. En algunos aspectos, el aminoácido X3 es Lys. En algunos aspectos, el aminoácido x 4 es Leu o Glu. En algunos aspectos, el aminoácido X5 se selecciona del grupo que consiste en Ser y Ala. En algunos aspectos, el aminoácido X6 es Lys. En algunos aspectos, el aminoácido X2 es Gly, Ala o Ser; el aminoácido X3 es Lys o Glu; el aminoácido X4 es Leu, Phe, Ser o Glu; el aminoácido X5 es Ser o Ala; y el aminoácido X6 es Lys. En algunos aspectos, el enlazador comprende un enlace peptídico o uno o más aminoácidos.

En algunos aspectos, el DE en la proteína de armazón, por ejemplo, la proteína del lumen exosómica, comprende Lys (K), KK, KKK, KKKK (SEQ ID NO: 151), KKKKK (SEQ ID NO: 152), Arg (R), RR, RRR, RRRR (SEQ ID NO: 153);

RRRRR (SEQ ID NO: 154), KR, RK, KKR, KRK, RKK, KRR, RRK, (K/R)(K/R)(K/R)(K/R) (SEQ ID NO: 155),

(K/R)(K/R)(K/R)(K/R)(K/R) (SEQ ID NO: 156), o cualquier combinación de estos.

En algunos aspectos, la proteína de armazón, por ejemplo, la proteína del lumen exosómica, comprende una secuencia de aminoácidos como se establece en (i) GGKlSk K (SEQ ID NO: 157), (ii) GAKLSKK (SEQ ID NO: 158), (iii) GGKQSKK (SEQ ID NO: 159), (iv) GGKLAKK (SEQ ID NO: 160), o (v) cualquier combinación de estos. En algunos aspectos, la proteína de armazón no comprende la secuencia de aminoácidos que tiene Met en el extremo N de la secuencia en (i) a (v). En otros aspectos, la proteína de armazón no comprende o no consiste en (i) la secuencia de aminoácidos que comprende las SEQ ID NO: 4 a 114, 116 a 118, 122 a 150 o (ii) la secuencia de aminoácidos codificada por las SEQ ID NO: 115 o 118 a 121.

En algunos aspectos, el DN en la proteína de armazón, por ejemplo, la proteína del lumen exosómica, comprende una secuencia de aminoácidos de (i) GGKLSK (SEQ ID NO: 203), (ii) GAKLSK (SEQ ID NO: 204), (iii) GGKQSK (SEQ ID NO: 205), (iv) GGKLAK (SEQ iD NO: 206), o (v) cualquier combinación de estos y el DE en la proteína de armazón comprende (a) K, (b) KK, (c) KKK, (d) KKKG (SEQ ID NO: 207), (e) KKKGY (SEQ ID NO: 208), (f) KKKGYN (SEQ ID NO: 209), (g) KKKGYNV (SEQ ID NO: 210), (h) KKKGYNVN (SEQ ID NO: 211), (i) KKKGYS (SEQ ID NO: 212), (k) KKKGYG (SEQ ID NO: 213), (1) KKKGYGG (SEQ ID NO: 214), (m) KKKGS (SEQ ID NO: 215), (n) KKKGSG (SEQ ID NO: 216), (o) KKKGSG (SEQ ID NO: 217), (p) KKKGSGS (SEQ ID NO: 218), (q) KKKS (SEQ ID NO: 219), (r) KKKSG (SEQ ID NO: 220), (s) KKKSGG (SEQ ID NO: 221), (t) KKKSGGS (SEQ ID NO: 222), (u) KKKSGGSG (SEQ ID NO: 223), (v) KKSGGSGG (SEQ ID NO: 224), (w) KKKSGGSGGS (SEQ ID NO: 225), (x) KRFSFKKS (SEQ ID NO: 226), o cualquier combinación de estos. En algunos aspectos, la proteína de armazón no comprende la secuencia de aminoácidos que tiene Met en el extremo N de la secuencia en (i) a (v). En otros aspectos, la proteína de armazón no comprende o no consiste en (i) la secuencia de aminoácidos que comprende las SEQ ID NO: 4 a 114, 116 a 118, 122 a 150 o 180 a 190 o (ii) la secuencia de aminoácidos codificada por las SEQ ID NO: 115 o 118 a 121.

En algunos aspectos, la secuencia polipeptídica de una proteína de armazón, por ejemplo, la proteína del lumen exosómica, de la presente descripción consiste en una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste en (i) GGKLSKK (SEQ ID NO: 157), (ii) GAKLSKK (SEQ ID NO: 158), (iii) GGKQSKK (SEQ ID NO: 159), (iv) GGKLAKK (SEQ ID NO: 160), o (v) cualquier combinación de estos.

En algunos aspectos, la proteína de armazón, por ejemplo, la proteína del lumen exosómica, comprende una secuencia de aminoácidos de (i) GGKLSKKK (SEQ ID NO: 161), (ii) GGKLSKKS (SEQ ID NO: 162), (iii) GAKLSKKK (SEQ ID NO: 163), (iv) GAKLSKKS (SEQ ID NO: 164), (v) GGKQSKKK (SEQ ID NO: 165), (vi) GGKQSKKS (SEQ ID NO: 166), (vii) GGKLAKKK (SEQ ID NO: 167), (viii) GGKLAKKS (SEQ ID NO: 168), o (ix) cualquier combinación de estos. En algunos aspectos, la proteína de armazón no comprende la secuencia de aminoácidos que tiene Met en el extremo N de la secuencia en (i) a (ix). En algunos aspectos, la proteína de armazón no comprende o no consiste en (i) la secuencia de aminoácidos que comprende las SEQ ID NO: 4 a 114, 116 a 118, 122 a 150 o 180 a 190 o (ii) la secuencia de aminoácidos codificada por las SEQ ID NO: 115 o 118 a 121.

En algunos aspectos, la proteína polipeptídica de una proteína de armazón, por ejemplo, la proteína del lumen exosómica de la presente descripción consiste en una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste en (i) GGKLSKKK (SEQ ID NO: 161), (ii) GGKLSKKS (SEQ ID NO: 162), (iii) GAKLSKKK (SEQ ID NO: 163), (iv) GAKLSKKS (SEQ ID NO: 164), (v) GGKQSKKK (SEQ ID NO: 165), (vi) GGKQSKKS (SEQ ID NO: 166), (vii) GGKLAKKK (SEQ ID NO: 167), (viii) GGKLAKKS (SEQ ID NO: 168), y (ix) cualquier combinación de estos.

En algunos aspectos, la proteína de armazón, por ejemplo, la proteína del lumen exosómica, tiene al menos aproximadamente 8, al menos aproximadamente 9, al menos aproximadamente 10, al menos aproximadamente 11, al menos aproximadamente 12, al menos aproximadamente 13, al menos aproximadamente 14, al menos aproximadamente 15, al menos aproximadamente 16, al menos aproximadamente 17, al menos aproximadamente 18, al menos aproximadamente 19, al menos aproximadamente 20, al menos aproximadamente 21, al menos aproximadamente 22, al menos aproximadamente 23, al menos aproximadamente 24, al menos aproximadamente 25, al menos aproximadamente 26, al menos aproximadamente 27, al menos aproximadamente 28, al menos aproximadamente 29, al menos aproximadamente 30, al menos 31, al menos aproximadamente 32, al menos aproximadamente 33, al menos aproximadamente 34, al menos aproximadamente 35, al menos aproximadamente 36, al menos aproximadamente 37, al menos aproximadamente 38, al menos aproximadamente 39, al menos aproximadamente 39, al menos aproximadamente 40, al menos aproximadamente 41, al menos aproximadamente 42, al menos aproximadamente 43, al menos aproximadamente 44, al menos aproximadamente 50, al menos aproximadamente 46, al menos aproximadamente 47, al menos aproximadamente 48, al menos aproximadamente 49, al menos aproximadamente 50, al menos aproximadamente 55, al menos aproximadamente 60, al menos aproximadamente 65, al menos aproximadamente 70, al menos aproximadamente 75, al menos aproximadamente 80, al menos 85, al menos aproximadamente 90, al menos aproximadamente 95, al menos aproximadamente 100, al menos aproximadamente 105, al menos aproximadamente 110, al menos aproximadamente 115, al menos aproximadamente 120, al menos aproximadamente 125, al menos aproximadamente 130, al menos aproximadamente 135, al menos aproximadamente 140, al menos aproximadamente 145, al menos aproximadamente 150, al menos aproximadamente 155, al menos aproximadamente 160, al menos aproximadamente 165, al menos aproximadamente 170, al menos aproximadamente 175, al menos aproximadamente 180, al menos aproximadamente 185, al menos aproximadamente 190, al menos aproximadamente 195, al menos aproximadamente 200, al menos aproximadamente 205, al menos aproximadamente 210, al menos aproximadamente 215, al menos aproximadamente 220, al menos aproximadamente 225, al menos aproximadamente 230, al menos aproximadamente 235, al menos aproximadamente 240, al menos aproximadamente 245, al menos aproximadamente 250, al menos aproximadamente 255, al menos aproximadamente 260, al menos aproximadamente 265, al menos aproximadamente 270, al menos aproximadamente 275, al menos aproximadamente 280, al menos aproximadamente 285, al menos aproximadamente 290, al menos aproximadamente 295, al menos aproximadamente 300, al menos aproximadamente 305, al menos aproximadamente 310, al menos aproximadamente 315, al menos aproximadamente 320, al menos aproximadamente 325, al menos aproximadamente 330, al menos aproximadamente 335, al menos aproximadamente 340, al menos aproximadamente 345, o al menos aproximadamente 350 aminoácidos de longitud.

En algunos aspectos, la proteína de armazón, por ejemplo, la proteína del lumen exosómica, tiene entre aproximadamente 5 y aproximadamente 10, entre aproximadamente 10 y aproximadamente 20, entre aproximadamente 20 y aproximadamente 30, entre aproximadamente 30 y aproximadamente 40, entre aproximadamente 40 y aproximadamente 50, entre aproximadamente 50 y aproximadamente 60, entre aproximadamente 60 y aproximadamente 70, entre aproximadamente 70 y aproximadamente 80, entre aproximadamente 80 y aproximadamente 90, entre aproximadamente 90 y aproximadamente 100, entre aproximadamente 100 y aproximadamente 110, entre aproximadamente 110 y aproximadamente 120, entre aproximadamente 120 y aproximadamente 130, entre aproximadamente 130 y aproximadamente 140, entre aproximadamente 140 y aproximadamente 150, entre aproximadamente 150 y aproximadamente 160, entre aproximadamente 160 y aproximadamente 170, entre aproximadamente 170 y aproximadamente 180, entre aproximadamente 180 y aproximadamente 190, entre aproximadamente 190 y aproximadamente 200, entre aproximadamente 200 y aproximadamente 210, entre aproximadamente 210 y aproximadamente 220, entre aproximadamente 220 y aproximadamente 230, entre aproximadamente 230 y aproximadamente 240, entre aproximadamente 240 y aproximadamente 250, entre aproximadamente 250 y aproximadamente 260, entre aproximadamente 260 y aproximadamente 270, entre aproximadamente 270 y aproximadamente 280, entre aproximadamente 280 y aproximadamente 290, entre aproximadamente 290 y aproximadamente 300, entre aproximadamente 300 y aproximadamente 310, entre aproximadamente 310 y aproximadamente 320, entre aproximadamente 320 y aproximadamente 330, entre aproximadamente 330 y aproximadamente 340, o entre aproximadamente 340 y aproximadamente 250 aminoácidos de longitud.

En algunas modalidades, la proteína de armazón, por ejemplo, la proteína del lumen exosómica, comprende (i) GGKLSKKKKGYNVN (SEQ ID NO: 169), (ii) GAKLSKKKKGYNVN (SEQ ID NO: 170), (iii) GGKQSKKKKGYNVN (SEQ ID NO: 171), (iv) GGKLAKKKKGYNVN (SEQ ID NO: 172), (v) GGKLSKKKKGYSGG (SEQ ID NO: 173), (vi) GGKLSKKKKGSGGS (SEQ ID NO: 174), (vii) GGKLSKKKKSGGSG (SEQ ID NO: 175), (viii) GGKLSKKKSGGSGG (SEQ ID NO: 176), (ix) GGKLSKKSGGSGGS (SEQ ID NO: 177), (x) GGKLSKSGGSGGSV (SEQ ID NO: 178), o (xi) GAKKSKKRFSFKKS (SEQ ID NO: 179). En algunos aspectos, la proteína de armazón no comprende la secuencia de aminoácidos que tiene Met en el extremo N de la secuencia en (i) a (xi). En otros aspectos, la proteína de armazón no comprende o no consiste en (i) la secuencia de aminoácidos que comprende las SEQ ID NO: 4 a 114, 116 a 118, 122 a 150 o 180 a 190 o (ii) la secuencia de aminoácidos codificada por las SEQ ID NO: 115 o 118 a 121.

En algunos aspectos, la secuencia polipeptídica de una proteína de armazón, por ejemplo, la proteína del lumen exosómica, de la presente descripción consiste en (i) GGKLSKKKKg Yn VN (Se Q ID NO: 169), (ii) GAKLSKKKKGYNVN (SEQ ID NO: 170), (iii) GGKQSKKKKGYNVN (SEQ ID NO: 171), (iv) GGKLAKKKKGYNVN (SEQ ID NO: 172), (v) GGKLSKKKKGYSGG (SEQ ID NO: 173), (vi) GGKLSKKKKGSGGS (SEQ ID NO: 174), (vii) GGKLSKKKKSGGSG (SEQ ID NO: 175), (viii) GGKLSKKKSGGSGG (SEQ ID NO: 176), (ix) GGKLSKKSGGSGGS (SEQ ID NO: 177), (x) GGKLSKSGGSGGSV (SEQ ID NO: 178), o (xi) GAKKSKKRFSFKKS (SEQ ID NO: 179). En algunos aspectos, la proteína de armazón no comprende la secuencia de aminoácidos que tiene Met en el extremo N de la secuencia en (i) a (xi). En algunos aspectos, la proteína de armazón no comprende o no consiste en (i) la secuencia de aminoácidos que comprende las SEQ ID n O: 4 a 114, 116 a 118, 122 a 150 o 180 a 190 o (ii) la secuencia de aminoácidos codificada por las SEQ ID NO: 115 o 118 a 121.

En otros aspectos, la proteína de armazón, por ejemplo, la proteína del lumen exosómica, comprende cualquiera de las secuencias que se describen en la presente memoria, pero no comprende la secuencia correspondiente que tiene Met en el extremo N, por ejemplo, las SEQ ID NO: 4 a 109. En algunos aspectos, la proteína de armazón comprende cualquiera de las secuencias en la TABLA 1, pero no comprende o no consiste en (i) la secuencia de aminoácidos que comprende las SEQ ID NO: 4 a 114, 116 a 118, 122 a 150 o 180 a 190 o (ii) la secuencia de aminoácidos codificada por las SEQ ID NO: 115 o 118 a 121.

A continuación, se enumeran ejemplos no taxativos de las proteínas de armazón, por ejemplo, las proteínas del lumen exosómicas, útiles para la presente descripción.

TABLA 1.

continuación

continuación

continuación

En algunos aspectos, la proteína de armazón, por ejemplo, la proteína del lumen exosómica, de la presente descripción consiste o consiste esencialmente en cualquiera de las secuencias en la presente descripción. En algunos aspectos, el armazón de la presente descripción consiste en una secuencia que se describe en la TABLA 1. En algunos aspectos, el armazón de la presente descripción consiste en una secuencia que se describe en la presente memoria, por ejemplo, una secuencia que se describe en la TABLA 1, unida de forma covalente a un anclaje de membrana (por ejemplo, un ácido mirístico). En algunos aspectos, el anclaje a la membrana puede realizarse mediante lipidación. En algunas modalidades, la lipidación puede ser, por ejemplo, acilación grasa. En algunos aspectos, la acetilación grasa puede ser, por ejemplo, miristoilación. En algunos aspectos, el anclaje de membrana está unido de forma covalente al aminoácido de extremo N de una secuencia que se describe en la presente memoria, por ejemplo, una secuencia que se describe en la TABLA 1. En algunos aspectos, el anclaje de membrana está unido de forma covalente a la glicina de extremo N de una secuencia que se describe en la presente memoria, por ejemplo, una secuencia que se describe en la TABLA 1. Por consiguiente, en algunos aspectos, el armazón de la presente descripción consiste en una secuencia descrita, por ejemplo, una secuencia que se describe en la TABLA 1, que ha sido miristoilada en N.

En algunos aspectos, la proteína de armazón, por ejemplo, la proteína del lumen exosómica, de la presente descripción no contiene una Met de extremo N. En algunos aspectos, la proteína de armazón comprende un aminoácido lipidado, por ejemplo, un aminoácido miristoilado, en el extremo N de la proteína del armazón, que funciona como un ancla lipídica. En algunos aspectos, el residuo de aminoácido en el extremo N de la proteína de armazón en Gly. La presencia de una Gly de extremo N es un requisito para la miristoilación en N. En algunos aspectos, el residuo de aminoácido en el extremo N de la proteína de armazón es sintético. En algunos aspectos, el residuo de aminoácido en el extremo N de la proteína de armazón es un análogo de glicina, por ejemplo, alilglicina, butilglicina o propargilglicina.

En algunos aspectos, un ancla lipídica puede unirse mediante síntesis química o enzimáticamente a cualquier aminoácido de extremo N de una proteína de armazón de la presente descripción.

En otros aspectos, el ancla lipídica puede ser cualquier ancla lipídica conocida en la técnica, por ejemplo, ácido palmítico o glicosilfosfatidilinositoles. En circunstancias inusuales, por ejemplo, mediante el uso de un medio de cultivo donde el ácido mirístico es limitante, se pueden unir a la glicina de extremo N algunos otros ácidos grasos, incluidos los insaturados y de cadena más corta. Por ejemplo, en los canales BK, se ha informado de que el miristato se une postraduccionalmente a residuos internos de serina/treonina o tirosina mediante un enlace hidroxiéster. Los anclajes de membrana conocidos en la técnica se presentan en la siguiente tabla.

TABLA 2

Modificación Gru o de modificación

Palmitoilación S

En algunas modalidades, la proteína de armazón, por ejemplo, la proteína del lumen exosómica, comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 70 %, al menos aproximadamente 75 %, al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 85 %, al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 95 %, al menos aproximadamente 96 %, al menos aproximadamente 97 %, al menos aproximadamente 98 %, al menos aproximadamente 99 % o aproximadamente 100 % de identidad de secuencia con la forma madura de la SEQ ID NO: 1 (MARCKS), la SEQ ID NO: 2 (MARCKSL1), o la SEQ ID NO: 3 (BASP1), es decir, sin el aminoácido metionina de extremo N presente en la SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 3.

En algunas modalidades, la proteína de armazón, por ejemplo, la proteína del lumen exosómica, comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 70 %, al menos aproximadamente 75 %, al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 85 %, al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 95 %, al menos aproximadamente 96 %, al menos aproximadamente 97 %, al menos aproximadamente 98 %, al menos aproximadamente 99 % o aproximadamente 100 % de identidad de secuencia con la forma madura de la SEQ ID NO: 1 (MARCKS), la SEQ ID NO: 2 (MARCKSL1), o la SEQ ID NO: 3 (BASP1), es decir, sin el aminoácido metionina de extremo N presente en la SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 2 o la Se Q ID NO: 3.

En algunos aspectos, una molécula con actividad biológica unida a la proteína de armazón de la presente descripción está en el lado luminal de la VE (por ejemplo, un exosoma).

En algunos aspectos, la proteína de armazón, por ejemplo, la proteína del lumen exosómica, comprende además un dominio transmembrana. En algunos aspectos, el dominio transmembrana se interpone entre el dominio DE de la proteína de armazón, que se encuentra en el lado luminal de la VE (por ejemplo, exosoma) y la carga útil, por ejemplo, una molécula con actividad biológica. Por lo tanto, la carga útil, por ejemplo, una molécula con actividad biológica, está anclada a la superficie externa de la VE (por ejemplo, exosoma).

En algunos aspectos, la proteína de armazón, por ejemplo, la proteína del lumen exosómica, comprende además un dominio extravesicular. En algunas modalidades, el dominio extravesicular se interpone entre el dominio transmembrana y la molécula con actividad biológica.

En algunos aspectos, la proteína de armazón se une a la molécula con actividad biológica mediante al menos un enlazador, por ejemplo, un enlazador peptídico. En algunos aspectos, el DN está unido al DE por un enlazador directamente interpuesto entre ambos dominios. En algunos aspectos, el enlazador comprende, por ejemplo, un enlace peptídico o uno o más aminoácidos. En algunos aspectos, el enlazador comprende un enlazador escindible. En algunos aspectos, el enlazador comprende un enlazador flexible. En algunos aspectos, el enlazador comprende un enlazador autoinmolativo.

También se pueden usar fusiones entre una proteína de armazón de la presente descripción y una molécula con actividad biológica (por ejemplo, una molécula que tiene una actividad terapéutica). Por ejemplo, la proteína de fusión puede comprender una proteína de armazón como MARCKS, MARCKSL1, BASP1, o una modificación de estas, en particular un fragmento o variante de estas, y una carga útil, por ejemplo, una molécula con actividad biológica (por ejemplo, un péptido terapéutico). En algunos aspectos, la proteína de fusión comprende una proteína de armazón que comprende un fragmento del extremo amino de BASP1. En algunos aspectos, la molécula con actividad biológica comprende una proteína, un polipéptido, un péptido, un polinucleótido (ADN y/o ARN), un compuesto químico, un virus, un ionóforo, un portador de un ionóforo, un resto que forma un canal o un poro, o cualquier combinación de estos.

La molécula con actividad biológica (por ejemplo, un péptido terapéutico) se puede seleccionar de un grupo que consiste en un péptido natural, un péptido recombinante, un péptido sintético, una proteína de fusión o un enlazador a un compuesto terapéutico. La molécula con actividad biológica (por ejemplo, un compuesto terapéutico) también puede ser un nucleótido, aminoácido, lípido, carbohidrato o una molécula pequeña. La molécula con actividad biológica (por ejemplo, un péptido terapéutico) puede ser un anticuerpo, una enzima, un ligando, un antígeno (por ejemplo, un antígeno tumoral o un antígeno de un agente infeccioso como una bacteria, virus, hongo o protozoo), un receptor, un péptido antimicrobiano, un factor de transcripción o un fragmento o una modificación de estos.

La proteína de fusión que comprende el armazón de la presente descripción fusionada o conjugada a una carga útil, por ejemplo, una molécula con actividad biológica, puede unirse a la superficie luminal de la VE, por ejemplo, exosomas, y proporcionar, por ejemplo, una actividad terapéutica a la VE, por ejemplo, exosoma.

En algunas modalidades, la molécula con actividad biológica (por ejemplo, un péptido terapéutico) es un componente de un complejo de edición del genoma. En algunas modalidades, dicho complejo de edición del genoma es una nucleasa efectora de tipo activador de la transcripción (nucleasa efectora TAL o TALEN); una nucleasa de dedos de cinc (ZFN); una recombinasa; un complejo CRISPR/Cas9, un complejo CRISPR/Cpf1, un complejo CRISPR/C2c1, C2c2 o C2c3, un complejo CRISPR/CasY o CasX, o cualquier otro complejo CRISPR apropiado conocido en la técnica; o cualquier otro complejo de edición del genoma apropiado conocido en la técnica o cualquier combinación de estos.

En algunas modalidades, la molécula con actividad biológica (por ejemplo, un péptido terapéutico) es un péptido transmembrana. Los péptidos transmembrana que se describen en la presente memoria pueden expresarse como proteínas de fusión en cualquiera de las secuencias que se describen en la presente memoria o cualquiera de sus fragmentos o variantes. En algunas modalidades, la proteína transmembrana tiene un primer extremo fusionado a la secuencia luminal en el lumen de la VE, por ejemplo, exosoma, y un segundo extremo expresado en la superficie de la VE, por ejemplo, exosoma.

En algunas modalidades, una VE, por ejemplo, de la presente descripción puede comprender una segunda proteína de armazón. En algunas modalidades, la segunda proteína de armazón comprende una proteína transmembrana que comprende un polipéptido PTGFRN, un polipéptido BSG, un polipéptido IGSF2, un polipéptido IGSF3, un polipéptido IGSF8, un polipéptido ITGB1, un polipéptido ITGA4, un polipéptido SLC3A2, un polipéptido transportador de At P, un polipéptido de la aminopeptidasa N (ANPEP), un polipéptido del miembro 1 de la familia de pirofosfatasa/fosfodiesterasa de ectonucleótidos (ENPP1), un polipéptido de neprilisina (MME), un polipéptido de neuropilina-1 (NRP1) o un fragmento, variante o derivado de estos. Se pueden encontrar ejemplos no taxativos de la segunda proteína de armazón en la patente estadounidense n.° 10.195.290 y la publicación PCT n.° WO 2019/040920.

En algunas modalidades, la molécula con actividad biológica (por ejemplo, un péptido terapéutico) es una proteína de unión a ácido nucleico. En algunas modalidades, la proteína de unión al ácido nucleico es Dicer, una proteína Argonaute, TRBP, proteína de la cubierta del bacteriófago MS2. En algunas modalidades, la proteína de unión a ácidos nucleicos comprende adicionalmente una o más moléculas de ARN o ADN. En algunas modalidades, el uno o más ARN es un miARN, ARNip, ARN guía, ARNlinc, ARNm, ARN antisentido, ARNbc o combinaciones de estos.

En algunas modalidades, la molécula con actividad biológica (por ejemplo, un péptido terapéutico) es parte de un sistema de interacción proteína-proteína. En algunas modalidades, el sistema de interacción proteína-proteína comprende un sistema de interacción FRB-FKBP, por ejemplo, el sistema de interacción FRB-FKBP como se describe en Banaszynski et ál., J Am Chem Soc. 6 de abril de 2005;127(13):4715-21.

Las proteínas de fusión pueden dirigirse a la superficie luminal de las VE, por ejemplo, exosomas, y proporcionar una actividad terapéutica a la VE, por ejemplo, exosoma.

En algunas modalidades, se utilizan proteínas de fusión que tienen un resto de direccionamiento. Por ejemplo, las proteínas de fusión pueden comprender (i) una proteína de armazón tal como MARCKS, MARCKSL1, BASP1, o un fragmento, variante o una modificación de estas, y (ii) un resto de direccionamiento. El resto de direccionamiento se puede usar para dirigir la VE, por ejemplo, exosoma, a un órgano, tejido o célula específicos para un tratamiento usando la VE, por ejemplo, exosoma. En algunas modalidades, el resto de direccionamiento es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de este.

Los anticuerpos y fragmentos de unión a antígenos incluyen anticuerpos completos, anticuerpos policlonales, monoclonales y recombinantes, fragmentos de estos, y además incluye anticuerpos monocatenarios, anticuerpos humanizados, anticuerpos murinos, anticuerpos monoclonales quiméricos, de ratón-humano, de ratón-primate, de primate-humano, anticuerpos contra idiotipo, fragmentos de anticuerpos, tales como, por ejemplo, scFv, (scFv)2, Fab, Fab', y F(ab')2, F(ab1)2, Fv, dAb y fragmentos Fd, diacuerpos, minicuerpos, anticuerpos camélidos y polipéptidos relacionados con anticuerpos.

Los anticuerpos y sus fragmentos de unión a antígenos también incluyen anticuerpos biespecíficos y anticuerpos multiespecíficos siempre que muestren la actividad o función biológica deseada. La arquitectura modular de los anticuerpos se ha aprovechado para crear más de 60 formatos de anticuerpos biespecíficos diferentes. Véase Spiess et ál. (2015) Molecular Immunology 67:95-106. Por consiguiente, en algunas modalidades, el formato de anticuerpo biespecífico se selecciona de crossMab, DAF (Fab de acción dual) (dos en uno), DAF (cuatro en uno), DutaMab, DT-IgG, LC botón en ojal común, ensamble botón en ojal, par de carga, intercambio de rama-Fab, SEEDbody, Triomab, LUZ-Y (anticuerpo biespecífico con una cremallera leucizada que induce la heterodimerización de dos HC), Fcab, KA-cuerpo, Fab ortogonal, DVD-IgG (IgG de dominio variable dual), IgG(H)-scFv, scFv-(H)IgG, IgG(L)-scFv, scFv-(L)IgG, IgG(L,H)-Fv, IgG(H)-V, V(H)-IgG, IgG(L)-V, V(L)-IgG, KIH IgG-scFab, 2scFv-IgG, IgG-2scFv, scFv4-Ig, Zycuerpo, DVI-IgG (cuatro en uno), nanocuerpo, nanocuerpo-HSA, BiTE (captador biespecífico de linfocitos T), Diacuerpo, DART (redireccionamiento de doble afinidad), TandAb (anticuerpo en tándem), scDiacuerpo, scDiacuerpo-CH3, Triple cuerpo, minianticuerpo, minicuerpo, minicuerpo TriBi, scFv-CH3 KIH, Fab-scFv, scFv-CH-CL-scFv, F(ab')2, F(ab')2-ScFv2, scFv-KIH, Fab-scFv-Fc, Ab HC tetravalente, scDiacuerpo-Fc, diacuerpo-Fc, scFv-Fc en tándem, intracuerpo, Dock and Lock, ImmTAC, HSAcuerpo, scDiacuerpo-HSA, toxina-scFv en tándem, IgG-IgG, Cov-X-cuerpo y scFv1-PEG-scFV2. Los anticuerpos biespecíficos pueden ser anticuerpos monoespecíficos modificados para la biespecificidad añadiendo los extremos amino o carboxi de las cadenas ligeras o pesadas con unidades de unión al antígeno adicionales. Las alternativas para estas unidades de unión a antígenos adicionales incluyen anticuerpos de dominio único (VL o VH no apareados), dominios variables de anticuerpos apareados (por ejemplo, Fv o scFv) o armazones proteicos modificados. Se conocen en la técnica numerosas formas de fragmentos biespecíficos que carecen de algunos o todos los dominios constantes de anticuerpos biespecíficos.

En algunas modalidades, la molécula con actividad biológica (por ejemplo, un péptido terapéutico) es una proteína de fusión que comprende una proteína de armazón de la presente descripción y una proteína viral. En algunas modalidades, la proteína viral comprende una cápside viral, una proteína de envoltura o una combinación de estas. En algunas modalidades, las proteínas de fusión permiten el ensamblaje de virus intactos que se conservan en la superficie luminal de una VE, por ejemplo, exosoma.

En algunas modalidades, la molécula con actividad biológica es un inhibidor de un regulador de punto de control negativo o un inhibidor de una pareja de unión de un regulador de punto de control negativo. En algunas modalidades, el regulador de punto de control negativo se selecciona del grupo que consiste en: proteína 4 asociada a linfocitos T citotóxicos (CTLA-4), proteína 1 de muerte celular programada (PD-1), gen 3 activado por linfocitos (LAG-3), proteína 3 que contiene mucina de inmunoglobulina de linfocitos T (TIM-3), atenuador de linfocitos B y T (BTLA), inmunorreceptor de linfocitos T con dominios Ig e ITIM (TIGIT), supresor Ig de dominio V de la activación de linfocitos T (VISTA), receptor de adenosina A2a (A2aR), receptor similar a inmunoglobulina de células asesinas (KIR), indolamina 2,3-dioxigenasa (IDO), CD20, CD39 y CD73.

En algunas modalidades, la molécula con actividad biológica es una proteína inmunogénica. En algunas modalidades, la molécula con actividad biológica es una toxina, toxoide o un mutante no tóxico de una toxina. En algunas modalidades, la toxina es una toxina diftérica. En algunas modalidades, el toxoide es un toxoide tetánico. En algunas modalidades, la toxina diftérica es un mutante no tóxico de la toxina diftérica.

En algunas modalidades, la molécula con actividad biológica es un activador de una molécula coestimuladora positiva o un activador de una pareja de unión de una molécula coestimuladora positiva. En algunas modalidades, la molécula coestumiladora positiva es un miembro de la superfamilia del receptor de TNF que se selecciona del grupo que consiste en: CD120a, CD120b, CD18, OX40, CD40, receptor Fas, M68, CD27, CD30, 4-1BB, TRAILR1, TRAILR2, TRAILR3, TRAILR4, RANK, OCIF, receptor TWEAK, TACI, receptor BAFF, ATAR, CD271, CD269, AITR, TROY, CD358, TRAMP y XEDAR. En algunas modalidades, el activador para una molécula coestumiladora positiva es un miembro de la superfamilia de TNF que se selecciona del grupo que consiste en: TNFa, TNF-C, OX40L, CD40L, FasL, LIGHT, TL1A, CD27L, Siva, CD153, ligando 4-1BB, TRAIL, RANKL, TWEAK, APRIL, BAFF, CAMLG, NGF, BDNF, NT-3, NT-4, ligando GITR y EDA-2. En algunas modalidades, la molécula coestimuladora positiva es una molécula coestimuladora de la superfamilia CD28. En algunas modalidades, la molécula coestimuladora de la superfamilia CD28 es ICOS o CD28. En algunas modalidades, el activador para una molécula coestimuladora positiva es ICOSL, CD80 o CD86.

En algunas modalidades, la molécula con actividad biológica es una citoquina que se selecciona del grupo que consiste en: IL-2, IL-7, IL-10, IL-12 e IL-15. En algunas modalidades, la molécula con actividad biológica es una proteína que comprende un receptor de linfocitos T (TCR), un correceptor de linfocitos T, un complejo principal de histocompatibilidad (MHC), un antígeno leucocitario humano (HLA) o un derivado de estos. En algunas modalidades, la molécula con actividad biológica es una proteína que comprende un antígeno tumoral. En algunas modalidades, el antígeno tumoral se selecciona del grupo que consiste en: alfa-fetoproteína (AFP), antígeno carcinoembrionario (CEA), antígeno tumoral epitelial (ETA), mucina 1 (MUC1), Tn-MUC1, mucina 16 (MUC16), tirosinasa, antígeno asociado a melanoma (MAGE), proteína tumoral p53 (p53), Cd 4, CD8, CD45, CD80, CD86, ligando de muerte programada 1 (PD-L1), ligando de muerte programada 2 (PD-L2), NY-ESO-1, PSMA, TAG-72, HER2, GD2, cMET, EGFR, mesotelina, VEGFR, receptor de alfa-folato, CE7R, IL-3, antígeno de cáncer de testículo, MART-1 gp100 y ligando inductor de apoptosis relacionado con TNF.

En algunos aspectos, las proteínas de fusión que comprenden una molécula con actividad biológica y una proteína de armazón de la presente descripción (por ejemplo, MARCKS, MARCKSL1, BASP1, cualquiera de las SEQ ID NO: 4 a 109, la secuencia correspondiente sin la M N terminal, o cualquier secuencia de proteína de armazón que se describe en la presente memoria (por ejemplo, Tabla 1), o una modificación de esta, en particular un fragmento o variante de esta), da como resultado el enriquecimiento de la molécula con actividad biológica en VE, por ejemplo, exosomas, en comparación con la expresión de la molécula con actividad biológica que carece de la proteína de armazón. En algunos aspectos, las proteínas de fusión que comprenden una molécula con actividad biológica y una proteína de armazón de la presente descripción (por ejemplo, MARCKS, MARCKSL1, BASP1 sin la M N terminal, la secuencia de aminoácidos de las s Eq ID No : 4 a 114, 116 a 118, 122 a 150 o 180 a 190 sin la M N terminal, la secuencia de aminoácidos codificada por las SEQ ID NO: 115, o 118 a 121, o cualquier secuencia de proteína de armazón que se describe en la presente memoria (por ejemplo, Tabla 1) sin la M N terminal) dan como resultado el enriquecimiento de la molécula con actividad biológica en las VE, por ejemplo, exosomas, en comparación con la expresión de la molécula con actividad biológica que carece de la proteína de armazón.

En algunas modalidades, la proteína de armazón útil para la presente descripción comprende cualquiera de las SEQ ID NO: 4 a 109, la secuencia correspondiente sin la M N terminal, o cualquier secuencia que se describe en la TABLA 1. En algunos aspectos, la proteína de armazón útil para la presente descripción comprende cualquiera de las SEQ ID NO: 4 a 109, donde la proteína de armazón no comprende una Met de extremo N. En algunos aspectos, la proteína de armazón comprende una secuencia que se describe en la Tabla 1, donde la proteína de armazón no comprende una Met de extremo N. En algunos aspectos, la proteína de armazón útil para la presente descripción comprende MARCKS, MARCKSL1, BASP1 sin la M N terminal, la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 4 a 114, 116 a 118, 122 a 150 o 180 a 190 sin la M N terminal, la secuencia de aminoácidos codificada por las SEQ ID NO: 115, o 118 a 121, o cualquier secuencia de proteína de armazón que se describe en la presente memoria (por ejemplo, Tabla 1) sin la M N terminal. En algunos aspectos, la proteína de armazón útil para la presente descripción comprende MARCKS, MARCKSL1 o BASP1, donde la proteína de armazón no comprende una Met de extremo N. En algunos aspectos, la proteína de armazón comprende la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 4 a 114, 116 a 118, 122 a 150 o 180 a 190, donde la proteína de armazón no comprende una Met de extremo N. En algunos aspectos, la proteína de armazón comprende la secuencia de aminoácidos codificada por las SEQ ID NO: 115, o 118 a 121, donde la proteína de armazón no comprende una Met de extremo N. En otras modalidades, la proteína de armazón útil para la presente descripción comprende cualquier secuencia que se describe en la presente memoria, pero no es ninguna de las SEQ ID NO: 4-109, la secuencia correspondiente sin la M N terminal, o cualquier secuencia que se describe en la TABLA 1 sin la M N terminal. En otras modalidades, la proteína de armazón útil para la presente descripción comprende cualquier secuencia que se describe en la presente memoria, pero no comprende ninguna de las s Eq ID NO: 4 a 109.

En algunas modalidades, las proteínas de fusión comprenden una proteína de armazón que comprende un péptido con la secuencia MGXKLSKKK, donde X es alanina o cualquier otro aminoácido (SEQ ID NO: 117); o un péptido con secuencia de (M)(G)(n)(^)(0/n)(S/A/G/N)(+)(+), donde la M N terminal se escinde, de modo que la proteína de fusión resultante comprende GXKLSKKK (SEQ ID NO: 425) o (G)(n)($)(0/n)(S/A/G/NX+X+) unido a la molécula con actividad biológica, donde cada posición entre paréntesis representa un aminoácido, y donde n es cualquier aminoácido que se selecciona del grupo que consiste en (Pro, Gly, Ala, Ser), ^ es cualquier aminoácido que se selecciona del grupo que consiste en (Asn, Gln, Ser, Thr, Asp, Glu, Lys, His, Arg), O es cualquier aminoácido que se selecciona del grupo que consiste en (Val, Ile, Leu, Phe, Trp, Tyr, Met) y (+) es cualquier aminoácido que se selecciona del grupo que consiste en (Lys, Arg, His); y donde la posición cinco no es (+) y la posición seis no es (+) ni (Asp o Glu). En algunas modalidades, la proteína de armazón útil para la presente descripción no es MGXKLSKKK, donde X es alanina o cualquier otro aminoácido (SEQ ID NO: 117) o no es un péptido con secuencia de (M)(G)(n)(^)(O/n)(S/A/G/N)(+)(+). En algunas modalidades, la proteína de armazón útil para la presente descripción no comprende MGXKLSKKK, donde X es alanina o cualquier otro aminoácido (SEQ ID NO: 117) o no comprende un péptido con la secuencia de (M)(G)(n)(^)(O/n)(S/A/G/N)(+)(+).

En algunas modalidades, la proteína de fusión comprende una proteína de armazón que comprende un péptido con secuencia de (M)(G)(n)(X)(O/n)(n)(+)(+) o (G)(n)(X)(O/n)(n)(+)(+), donde cada posición entre paréntesis representa un aminoácido, y donde n es cualquier aminoácido que se selecciona del grupo que consiste en (Pro, Gly, Ala, Ser), X es cualquier aminoácido, O es cualquier aminoácido que se selecciona del grupo que consiste en (Val, Ile, Leu, Phe, Trp, Tyr, Met) y (+) es cualquier aminoácido que se selecciona del grupo que consiste en (Lys, Arg, His); y donde la posición cinco no es (+) y la posición seis no es (+) ni (Asp o Glu). En algunas modalidades, la proteína de fusión comprende una proteína de armazón que comprende un péptido con la secuencia de (G)(n)(X)(O/n)(n)(+)(+), donde la proteína de armazón no comprende una M de extremo N (por ejemplo, una metionina de extremo N).

En algunos aspectos, la proteína de fusión comprende una proteína de armazón que comprende un péptido con la secuencia de (G)(n)(X)(O/n)(n)(+)(+), donde cada posición entre paréntesis representa un aminoácido, y donde n es cualquier aminoácido que se selecciona del grupo que consiste en (Pro, Gly, Ala, Ser), X es cualquier aminoácido, O es cualquier aminoácido que se selecciona del grupo que consiste en (Val, Ile, Leu, Phe, Trp, Tyr, Met) y (+) es cualquier aminoácido que se selecciona del grupo que consiste en (Lys, Arg, His); y donde la posición cinco no es (+) y la posición seis no es (+) ni (Asp o Glu), donde la secuencia no es (M)(G)(n)(X)(o/n)(n)(+)(+). En algunos aspectos, la proteína de armazón comprende el péptido con la secuencia de (G)(n)(X)(O/n)(n)(+)(+), donde la proteína de armazón no comprende una Met de extremo N.

En algunas modalidades, la proteína de VE convencional, por ejemplo, exosoma, se selecciona del grupo que consiste en CD9, CD63, CD81, PDGFR, proteínas de anclaje GPI, La Mp2, LAMP2B y un fragmento, variante o derivado de estas.

En algunas modalidades, el enriquecimiento de la proteína de fusión que comprende MARCKS, MARCKSL1, BASP1 o cualquiera de las SEQ ID NO: 4 a 109 en exosomas es > 2 veces, > 4 veces, > 8 veces, > 16 veces, > 25 veces, > 50 veces, > 100 veces, > 200 veces, > 500 veces, > 750 veces, > 1000 veces, > 2000 veces, > 5000 veces, > 7500 veces, > 10000 veces mayor que la proteína de fusión que carece de MARCKS, MARCKSL1, BASP1, cualquiera de las SEQ ID NO: 4 a 109 o en comparación con proteínas de fusión que comprenden VE convencionales, por ejemplo, exosomas, proteínas. En algunos aspectos, el enriquecimiento de la proteína de fusión que comprende MARCKS, MARCKSL1, BASP1 sin la M N terminal, cualquiera de las SEQ ID NO: 4 a 109 sin la M N terminal o cualquier secuencia que se describe en la presente memoria, por ejemplo, TABLA 1, sin la M N terminal en los exosomas es > 2 veces, > 4 veces, > 8 veces, > 16 veces, > 25 veces, > 50 veces, > 100 veces, > 200 veces, > 500 veces, > 750 veces, > 1000 veces, > 2000 veces, > 5000 veces, > 7500 veces, > 10000 veces mayor que la proteína de fusión que carece de MARCKS, MARCKSL1, BASP1 sin la M N terminal, cualquiera de las SEQ ID n O: 4 a 109 sin la M N terminal o cualquier secuencia que se describe en la presente memoria, por ejemplo, TABLA 1, sin la M N terminal o en comparación con proteínas de fusión que comprenden VE convencionales, por ejemplo, exosoma, proteínas.

En algunas modalidades, el enriquecimiento de la proteína de fusión que comprende MARCKS, MARCKSL1, BASP1, cualquiera de las SEQ ID NO: 4 a 109, la secuencia correspondiente sin la M N terminal, o cualquier secuencia de proteína de armazón que se describe en la presente memoria (por ejemplo, Tabla 1) sin la M N terminal en los exosomas es al menos aproximadamente 2 veces, al menos aproximadamente 4 veces, al menos aproximadamente 6 veces, al menos aproximadamente 8 veces, al menos aproximadamente 10 veces, al menos aproximadamente 12 veces, al menos aproximadamente 14 veces, al menos aproximadamente 16 veces, al menos aproximadamente 18 veces, al menos aproximadamente 20 veces, al menos aproximadamente 25 veces, al menos aproximadamente 30 veces, al menos aproximadamente 35 veces, al menos aproximadamente 40 veces, al menos aproximadamente 45 veces, al menos aproximadamente 50 veces, al menos aproximadamente 60 veces, al menos aproximadamente 70 veces, al menos aproximadamente 80 veces, al menos aproximadamente 90 veces, al menos aproximadamente 100 veces, al menos aproximadamente 200 veces, al menos aproximadamente 300 veces, al menos aproximadamente 400 veces, al menos aproximadamente 500 veces, al menos aproximadamente 750 veces, al menos aproximadamente 1000 veces, al menos aproximadamente 1500 veces, al menos aproximadamente 2000 veces, al menos aproximadamente 2500 veces, al menos aproximadamente 3000 veces, al menos aproximadamente 3500 veces, al menos aproximadamente 4000 veces, al menos aproximadamente 4500 veces, al menos aproximadamente 5000 veces, al menos aproximadamente 5500 veces, al menos aproximadamente 6000 veces, al menos aproximadamente 6500 veces, al menos aproximadamente 7000 veces, al menos aproximadamente 7500 veces, al menos aproximadamente 8000 veces, al menos aproximadamente 8500 veces, al menos aproximadamente 9000 veces, al menos aproximadamente 9500 veces o al menos aproximadamente 10000 veces mayor que la proteína de fusión que carece de MARCKS, MARCKSL1, BASP1, cualquiera de las SEQ ID NO: 4 a 109, la secuencia correspondiente sin la M N terminal, o cualquier secuencia de proteína de armazón que se describe en la presente memoria (por ejemplo, Tabla 1) sin la M N terminal, o en comparación con las proteínas de fusión que comprenden proteínas de VE convencionales, por ejemplo, exosoma.

En algunas modalidades, la secuencia de proteína de cualquiera de las SEQ ID NO: 1 a 109, la secuencia correspondiente sin la M N terminal, o cualquier secuencia de proteína de armazón que se describe en la presente memoria (por ejemplo, Tabla 1) sin la M N terminal es suficiente para cargar las VE, por ejemplo, exosomas, con la proteína de fusión.

En algunas modalidades, la VE con modificación en el lumen, por ejemplo, exosoma, que comprende una proteína de fusión que contiene una secuencia exógena (por ejemplo, una molécula con actividad biológica) y una proteína de VE, por ejemplo, exosoma, del lumen (proteína de armazón) recientemente identificada en la presente memoria tiene una mayor densidad de la proteína de fusión que las VE modificadas de manera similar, por ejemplo, exosomas, que comprenden una secuencia exógena conjugada con una proteína de VE convencional, por ejemplo, exosoma, conocida en la técnica (por ejemplo, CD9, CD63, CD81, PDGFR, proteínas de anclaje GPI, lactadherina, LAMP2 y LAMP2B, un fragmento de estas, o un péptido que se une a estas).

En algunas modalidades, la proteína de fusión que contiene una proteína de VE, por ejemplo, exosoma, del lumen (proteína de armazón) recientemente identificada en la presente memoria se encuentra presente en 2, 4, 8, 16, 32, 64, 100, 200, 400, 800, 1000 veces o una densidad mayor en la VE, por ejemplo, exosoma, superficie luminal que las proteínas de fusión en otras superficies luminales de VE, por ejemplo, exosoma, modificadas de manera similar usando una VE convencional, por ejemplo, exosoma, proteína.

En algunas modalidades, la proteína de fusión que contiene una proteína de VE, por ejemplo, exosoma, del lumen (proteína de armazón) recientemente identificada en la presente memoria se encuentra presente de 2 a 4 veces, 4 a 8 veces, 8 a 16 veces, 16 a 32 veces, 32 a 64 veces, 64 a 100 veces, 100 a 200 veces, 200 a 400 veces, 400 a 800 veces, 800 a 1000 veces o con una densidad mayor en la superficie luminal de VE, por ejemplo, exosoma, que las proteínas de fusión en otras superficies luminales de VE, por ejemplo, exosoma, modificadas de manera similar usando una VE convencional, por ejemplo, exosoma, proteína.

En algunas modalidades, una proteína de fusión que comprende una proteína de armazón, por ejemplo, proteína del lumen exosómica, de la presente descripción (por ejemplo, MARCKS, una variante, un fragmento, una variante de un fragmento o una modificación de esta) se encuentra presente en 2, 4, 8, 16, 32, 64, 100, 200, 400, 800, 1000 veces o una densidad mayor que en las VE, por ejemplo, exosomas, modificadas de manera similar usando CD9.

En algunas modalidades, una proteína de fusión que comprende una proteína de armazón, por ejemplo, proteína del lumen exosómica, de la presente descripción (por ejemplo, MARCKS, una variante, un fragmento, una variante de un fragmento o una modificación de esta) se encuentra presente en 2, 4, 8, 16, 32, 64, 100, 200, 400, 800, 1000 veces o una densidad mayor que en las VE, por ejemplo, exosomas, modificadas de manera similar usando CD63.

En algunas modalidades, una proteína de fusión que comprende una proteína de armazón, por ejemplo, proteína del lumen exosómica, de la presente descripción (por ejemplo, MARCKS, una variante, un fragmento, una variante de un fragmento o una modificación de esta) se encuentra presente en 2, 4, 8, 16, 32, 64, 100, 200, 400, 800, 1000 veces o una densidad mayor que en las VE, por ejemplo, exosomas, modificadas de manera similar usando CD81.

En algunas modalidades, una proteína de fusión que comprende una proteína de armazón, por ejemplo, proteína del lumen exosómica, de la presente descripción (por ejemplo, MARCKS, una variante, un fragmento, una variante de un fragmento o una modificación de esta) se encuentra presente en 2, 4, 8, 16, 32, 64, 100, 200, 400, 800, 1000 veces o una densidad mayor que en las VE, por ejemplo, exosomas, modificadas de manera similar usando PDGFR.

En algunas modalidades, una proteína de fusión que comprende una proteína de armazón, por ejemplo, proteína del lumen exosómica, de la presente descripción (por ejemplo, MARCKS, una variante, un fragmento, una variante de un fragmento o una modificación de esta) se encuentra presente en 2, 4, 8, 16, 32, 64, 100, 200, 400, 800, 1000 veces o una densidad mayor que en las VE, por ejemplo, exosomas, modificadas de manera similar usando proteínas de anclaje a GPI.

En algunas modalidades, una proteína de fusión que comprende una proteína de armazón, por ejemplo, proteína del lumen exosómica, de la presente descripción (por ejemplo, MARCKS, una variante, un fragmento, una variante de un fragmento o una modificación de esta) se encuentra presente en 2, 4, 8, 16, 32, 64, 100, 200, 400, 800, 1000 veces o una densidad mayor que en las VE, por ejemplo, exosomas, modificadas de manera similar usando lactadherina.

En algunas modalidades, una proteína de fusión que comprende una proteína de armazón, por ejemplo, proteína del lumen exosómica, de la presente descripción (por ejemplo, MARCKS, una variante, un fragmento, una variante de un fragmento o una modificación de esta) se encuentra presente en 2, 4, 8, 16, 32, 64, 100, 200, 400, 800, 1000 veces o una densidad mayor que en las VE, por ejemplo, exosomas, modificadas de manera similar usando LAMP2.

En algunas modalidades, una proteína de fusión que comprende una proteína de armazón, por ejemplo, proteína del lumen exosómica, de la presente descripción (por ejemplo, MARCKS, una variante, un fragmento, una variante de un fragmento o una modificación de esta) se encuentra presente en 2, 4, 8, 16, 32, 64, 100, 200, 400, 800, 1000 veces o una densidad mayor que en las VE, por ejemplo, exosomas, modificadas de manera similar usando LAMP2B.

En algunas modalidades, una proteína de fusión que comprende una proteína de armazón, por ejemplo, proteína del lumen exosómica, de la presente descripción (por ejemplo, MARCKS, una variante, un fragmento, una variante de un fragmento o una modificación de esta) se encuentra presente en 2, 4, 8, 16, 32, 64, 100, 200, 400, 800, 1000 veces o una densidad mayor que en las VE, por ejemplo, exosomas, modificadas de manera similar usando una proteína convencional.

En algunas modalidades, una proteína de fusión que comprende una proteína de armazón, por ejemplo, proteína del lumen exosómica, de la presente descripción (por ejemplo, MARCKS, una variante, un fragmento, una variante de un fragmento o una modificación de esta) se encuentra presente en 2, 4, 8, 16, 32, 64, 100, 200, 400, 800, 1000 veces o una densidad mayor que en las VE, por ejemplo, exosomas, modificadas de manera similar usando una variante de una proteína de VE convencional, por ejemplo, exosoma.

En algunas modalidades, una proteína de fusión que comprende una proteína de armazón, por ejemplo, proteína del lumen exosómica, de la presente descripción (por ejemplo, MARCKSL1, una variante, un fragmento, una variante de un fragmento o una modificación de esta) se encuentra presente en 2, 4, 8, 16, 32, 64, 100, 200, 400, 800, 1000 veces o una densidad mayor que en las VE, por ejemplo, exosomas, modificadas de manera similar usando CD9.

En algunas modalidades, una proteína de fusión que comprende una proteína de armazón, por ejemplo, proteína del lumen exosómica, de la presente descripción (por ejemplo, MARCKSL1, una variante, un fragmento, una variante de un fragmento o una modificación de esta) se encuentra presente en 2, 4, 8, 16, 32, 64, 100, 200, 400, 800, 1000 veces o una densidad mayor que en las VE, por ejemplo, exosomas, modificadas de manera similar usando CD63.

En algunas modalidades, una proteína de fusión que comprende una proteína de armazón, por ejemplo, proteína del lumen exosómica, de la presente descripción (por ejemplo, MARCKSL1, una variante, un fragmento, una variante de un fragmento o una modificación de esta) se encuentra presente en 2, 4, 8, 16, 32, 64, 100, 200, 400, 800, 1000 veces o una densidad mayor que en las VE, por ejemplo, exosomas, modificadas de manera similar usando CD81.

En algunas modalidades, una proteína de fusión que comprende una proteína de armazón, por ejemplo, proteína del lumen exosómica, de la presente descripción (por ejemplo, MARCKSL1, una variante, un fragmento, una variante de un fragmento o una modificación de esta) se encuentra presente en 2, 4, 8, 16, 32, 64, 100, 200, 400, 800, 1000 veces o una densidad mayor que en las VE, por ejemplo, exosomas, modificadas de manera similar usando PDGFR.

En algunas modalidades, una proteína de fusión que comprende una proteína de armazón, por ejemplo, proteína del lumen exosómica, de la presente descripción (por ejemplo, MARCKSL1, una variante, un fragmento, una variante de un fragmento o una modificación de esta) se encuentra presente en 2, 4, 8, 16, 32, 64, 100, 200, 400, 800, 1000 veces o una densidad mayor que en las VE, por ejemplo, exosomas, modificadas de manera similar usando proteínas de anclaje a GPI.

En algunas modalidades, una proteína de fusión que comprende una proteína de armazón, por ejemplo, proteína del lumen exosómica, de la presente descripción (por ejemplo, MARCKSL1, una variante, un fragmento, una variante de un fragmento o una modificación de esta) se encuentra presente en 2, 4, 8, 16, 32, 64, 100, 200, 400, 800, 1000 veces o una densidad mayor que en las VE, por ejemplo, exosomas, modificadas de manera similar usando lactadherina.

En algunas modalidades, una proteína de fusión que comprende una proteína de armazón, por ejemplo, proteína del lumen exosómica, de la presente descripción (por ejemplo, MARCKSL1, una variante, un fragmento, una variante de un fragmento o una modificación de esta) se encuentra presente en 2, 4, 8, 16, 32, 64, 100, 200, 400, 800, 1000 veces o una densidad mayor que en las VE, por ejemplo, exosomas, modificadas de manera similar usando LAMP2.

En algunas modalidades, una proteína de fusión que comprende una proteína de armazón, por ejemplo, proteína del lumen exosómica, de la presente descripción (por ejemplo, MARCKSL1, una variante, un fragmento, una variante de un fragmento o una modificación de esta) se encuentra presente en 2, 4, 8, 16, 32, 64, 100, 200, 400, 800, 1000 veces o una densidad mayor que en las VE, por ejemplo, exosomas, modificadas de manera similar usando LAMP2B.

En algunas modalidades, una proteína de fusión que comprende una proteína de armazón, por ejemplo, proteína del lumen exosómica, de la presente descripción (por ejemplo, MARCKSL1, una variante, un fragmento, una variante de un fragmento o una modificación de esta) se encuentra presente en 2, 4, 8, 16, 32, 64, 100, 200, 400, 800, 1000 veces o una densidad mayor que en las VE, por ejemplo, exosomas, modificadas de manera similar usando una proteína convencional.

En algunas modalidades, una proteína de fusión que comprende una proteína de armazón, por ejemplo, proteína del lumen exosómica, de la presente descripción (por ejemplo, MARCKSL1, una variante, un fragmento, una variante de un fragmento o una modificación de esta) se encuentra presente en 2, 4, 8, 16, 32, 64, 100, 200, 400, 800, 1000 veces o una densidad mayor que en las VE, por ejemplo, exosomas, modificadas de manera similar usando una variante de una proteína de VE convencional, por ejemplo, exosoma.

En algunas modalidades, una proteína de fusión que comprende una proteína de armazón, por ejemplo, proteína del lumen exosómica, de la presente descripción (por ejemplo, BASP1, una variante, un fragmento, una variante de un fragmento o una modificación de esta) se encuentra presente en 2, 4, 8, 16, 32, 64, 100, 200, 400, 800, 1000 veces o una densidad mayor que en las VE, por ejemplo, exosomas, modificadas de manera similar usando CD9.

En algunas modalidades, una proteína de fusión que comprende una proteína de armazón, por ejemplo, proteína del lumen exosómica, de la presente descripción (por ejemplo, BASP1, una variante, un fragmento, una variante de un fragmento o una modificación de esta) se encuentra presente en 2, 4, 8, 16, 32, 64, 100, 200, 400, 800, 1000 veces o una densidad mayor que en las VE, por ejemplo, exosomas, modificadas de manera similar usando CD63.

En algunas modalidades, una proteína de fusión que comprende una proteína de armazón, por ejemplo, proteína del lumen exosómica, de la presente descripción (por ejemplo, BASP1, una variante, un fragmento, una variante de un fragmento o una modificación de esta) se encuentra presente en 2, 4, 8, 16, 32, 64, 100, 200, 400, 800, 1000 veces o una densidad mayor que en las VE, por ejemplo, exosomas, modificadas de manera similar usando CD81.

En algunas modalidades, una proteína de fusión que comprende una proteína de armazón, por ejemplo, proteína del lumen exosómica, de la presente descripción (por ejemplo, BASP1, una variante, un fragmento, una variante de un fragmento o una modificación de esta) se encuentra presente en 2, 4, 8, 16, 32, 64, 100, 200, 400, 800, 1000 veces o una densidad mayor que en las VE, por ejemplo, exosomas, modificadas de manera similar usando PDGFR.

En algunas modalidades, una proteína de fusión que comprende una proteína de armazón, por ejemplo, proteína del lumen exosómica, de la presente descripción (por ejemplo, BASP1, una variante, un fragmento, una variante de un fragmento o una modificación de esta) se encuentra presente en 2, 4, 8, 16, 32, 64, 100, 200, 400, 800, 1000 veces o una densidad mayor que en las VE, por ejemplo, exosomas, modificadas de manera similar usando proteínas de anclaje a GPI.

En algunas modalidades, una proteína de fusión que comprende una proteína de armazón, por ejemplo, proteína del lumen exosómica, de la presente descripción (por ejemplo, BASP1, una variante, un fragmento, una variante de un fragmento o una modificación de esta) se encuentra presente en 2, 4, 8, 16, 32, 64, 100, 200, 400, 800, 1000 veces o una densidad mayor que en las VE, por ejemplo, exosomas, modificadas de manera similar usando lactadherina.

En algunas modalidades, una proteína de fusión que comprende una proteína de armazón, por ejemplo, proteína del lumen exosómica, de la presente descripción (por ejemplo, BASP1, una variante, un fragmento, una variante de un fragmento o una modificación de esta) se encuentra presente en 2, 4, 8, 16, 32, 64, 100, 200, 400, 800, 1000 veces o una densidad mayor que en las VE, por ejemplo, exosomas, modificadas de manera similar usando LAMP2.

En algunas modalidades, una proteína de fusión que comprende una proteína de armazón, por ejemplo, proteína del lumen exosómica, de la presente descripción (por ejemplo, BASP1, una variante, un fragmento, una variante de un fragmento o una modificación de esta) se encuentra presente en 2, 4, 8, 16, 32, 64, 100, 200, 400, 800, 1000 veces o una densidad mayor que en las VE, por ejemplo, exosomas, modificadas de manera similar usando LAMP2B.

En algunas modalidades, una proteína de fusión que comprende una proteína de armazón, por ejemplo, proteína del lumen exosómica, de la presente descripción (por ejemplo, BASP1, una variante, un fragmento, una variante de un fragmento o una modificación de esta) se encuentra presente en 2, 4, 8, 16, 32, 64, 100, 200, 400, 800, 1000 veces o una densidad mayor que en las VE, por ejemplo, exosomas, modificadas de manera similar usando una proteína convencional.

En algunas modalidades, una proteína de fusión que comprende una proteína de armazón, por ejemplo, proteína del lumen exosómica, de la presente descripción (por ejemplo, BASP1, una variante, un fragmento, una variante de un fragmento o una modificación de esta) se encuentra presente en 2, 4, 8, 16, 32, 64, 100, 200, 400, 800, 1000 veces o una densidad mayor que en las VE, por ejemplo, exosomas, modificadas de manera similar usando una variante de una proteína de VE convencional, por ejemplo, exosoma.

En algunas modalidades, una proteína de fusión que comprende cualquiera de las SEQ ID NO: 1 a 109, la secuencia correspondiente sin la M N terminal o cualquier secuencia de proteína de armazón que se describe en la presente memoria (por ejemplo, Tabla 1) sin la M N terminal se encuentra presente en 2, 4, 8, 16, 32, 64, 100, 200, 400, 800, 1000 veces o una densidad más alta que en las VE, por ejemplo, exosomas, modificadas de manera similar usando CD9. En algunos aspectos, la VE, por ejemplo, el exosoma, comprende una proteína de fusión que comprende cualquiera de las SEQ ID NO: 1 a 109, donde la proteína de fusión no comprende una Met de extremo N, y donde la proteína de fusión se encuentra presente en 2, 4, 8, 16, 32, 64, 100, 200, 400, 800, 1000 veces o una densidad mayor que en las VE, por ejemplo, exosomas, modificadas de manera similar usando CD9.

En algunas modalidades, una proteína de fusión que comprende cualquiera de las SEQ ID NO: 1 a 109, la secuencia correspondiente sin la M N terminal o cualquier secuencia de proteína de armazón que se describe en la presente memoria (por ejemplo, Tabla 1) sin la M N terminal se encuentra presente en 2, 4, 8, 16, 32, 64, 100, 200, 400, 800, 1000 veces o una densidad más alta que en las VE, por ejemplo, exosomas, modificadas de manera similar usando CD63. En algunos aspectos, la VE, por ejemplo, el exosoma, comprende una proteína de fusión que comprende cualquiera de las SEQ ID NO: 1 a 109, donde la proteína de fusión no comprende una Met de extremo N, y donde la proteína de fusión se encuentra presente en 2, 4, 8, 16, 32, 64, 100, 200, 400, 800, 1000 veces o una densidad mayor que en las VE, por ejemplo, exosomas, modificadas de manera similar usando CD63.

En algunas modalidades, una proteína de fusión que comprende cualquiera de las SEQ ID NO: 1 a 109, la secuencia correspondiente sin la M N terminal o cualquier secuencia de proteína de armazón que se describe en la presente memoria (por ejemplo, Tabla 1) sin la M N terminal se encuentra presente en 2, 4, 8, 16, 32, 64, 100, 200, 400, 800, 1000 veces o una densidad más alta que en las VE, por ejemplo, exosomas, modificadas de manera similar usando CD81. En algunos aspectos, la VE, por ejemplo, el exosoma, comprende una proteína de fusión que comprende cualquiera de las SEQ ID NO: 1 a 109, donde la proteína de fusión no comprende una Met de extremo N, y donde la proteína de fusión se encuentra presente en 2, 4, 8, 16, 32, 64, 100, 200, 400, 800, 1000 veces o una densidad mayor que en las VE, por ejemplo, exosomas, modificadas de manera similar usando CD81.

En algunas modalidades, una proteína de fusión que comprende cualquiera de las SEQ ID NO: 1 a 109, la secuencia correspondiente sin la M N terminal o cualquier secuencia de proteína de armazón que se describe en la presente memoria (por ejemplo, Tabla 1) sin la M N terminal se encuentra presente en 2, 4, 8, 16, 32, 64, 100, 200, 400, 800, 1000 veces o una densidad más alta que en las VE, por ejemplo, exosomas, modificadas de manera similar usando PDGFR. En algunos aspectos, la VE, por ejemplo, el exosoma, comprende una proteína de fusión que comprende cualquiera de las SEQ ID NO: 1 a 109, donde la proteína de fusión no comprende una Met de extremo N, y donde la proteína de fusión se encuentra presente en 2, 4, 8, 16, 32, 64, 100, 200, 400, 800, 1000 veces o una densidad mayor que en las VE, por ejemplo, exosomas, modificadas de manera similar usando PDGFR.

En algunas modalidades, una proteína de fusión que comprende cualquiera de las SEQ ID NO: 1 a 109, la secuencia correspondiente sin la M N terminal o cualquier secuencia de proteína de armazón que se describe en la presente memoria (por ejemplo, Tabla 1) sin la M N terminal se encuentra presente en 2, 4, 8, 16, 32, 64, 100, 200, 400, 800, 1000 veces o una densidad más alta que en las VE, por ejemplo, exosomas, modificadas de manera similar usando proteínas de anclaje a GPI. En algunos aspectos, la VE, por ejemplo, el exosoma, comprende una proteína de fusión que comprende cualquiera de las SEQ ID NO: 1 a 109, donde la proteína de fusión no comprende una Met de extremo N, y donde la proteína de fusión se encuentra presente en 2, 4, 8, 16, 32, 64, 100, 200, 400, 800, 1000 veces o una densidad mayor que en las VE, por ejemplo, exosomas, modificadas de manera similar usando proteínas de anclaje a GPI.

En algunas modalidades, una proteína de fusión que comprende cualquiera de las SEQ ID NO: 1 a 109, la secuencia correspondiente sin la M N terminal o cualquier secuencia de proteína de armazón que se describe en la presente memoria (por ejemplo, Tabla 1) sin la M N terminal se encuentra presente en 2, 4, 8, 16, 32, 64, 100, 200, 400, 800, 1000 veces o una densidad más alta que en las VE, por ejemplo, exosomas, modificadas de manera similar usando lactadherina. En algunos aspectos, la VE, por ejemplo, el exosoma, comprende una proteína de fusión que comprende cualquiera de las SEQ ID NO: 1 a 109, donde la proteína de fusión no comprende una Met de extremo N, y donde la proteína de fusión se encuentra presente en 2, 4, 8, 16, 32, 64, 100, 200, 400, 800, 1000 veces o una densidad mayor que en las VE, por ejemplo, exosomas, modificadas de manera similar usando lactadherina.

En algunas modalidades, una proteína de fusión que comprende cualquiera de las SEQ ID NO: 1 a 109, la secuencia correspondiente sin la M N terminal o cualquier secuencia de proteína de armazón que se describe en la presente memoria (por ejemplo, Tabla 1) sin la M N terminal se encuentra presente en 2, 4, 8, 16, 32, 64, 100, 200, 400, 800, 1000 veces o una densidad más alta que en las VE, por ejemplo, exosomas, modificadas de manera similar usando LAMP2. En algunos aspectos, la VE, por ejemplo, el exosoma, comprende una proteína de fusión que comprende cualquiera de las SEQ ID NO: 1 a 109, donde la proteína de fusión no comprende una Met de extremo N, y donde la proteína de fusión se encuentra presente en 2, 4, 8, 16, 32, 64, 100, 200, 400, 800, 1000 veces o una densidad mayor que en las VE, por ejemplo, exosomas, modificadas de manera similar usando LAMP2.

En algunas modalidades, una proteína de fusión que comprende cualquiera de las SEQ ID NO: 1 a 109, la secuencia correspondiente sin la M N terminal o cualquier secuencia de proteína de armazón que se describe en la presente memoria (por ejemplo, Tabla 1) sin la M N terminal se encuentra presente en 2, 4, 8, 16, 32, 64, 100, 200, 400, 800, 1000 veces o una densidad más alta que en las VE, por ejemplo, exosomas, modificadas de manera similar usando LAMP2B. En algunos aspectos, la VE, por ejemplo, el exosoma, comprende una proteína de fusión que comprende cualquiera de las SEQ ID NO: 1 a 109, donde la proteína de fusión no comprende una Met de extremo N, y donde la proteína de fusión se encuentra presente en 2, 4, 8, 16, 32, 64, 100, 200, 400, 800, 1000 veces o una densidad mayor que en las VE, por ejemplo, exosomas, modificadas de manera similar usando LAMP2Bt.

En algunas modalidades, una proteína de fusión que comprende cualquiera de las SEQ ID NO: 1 a 109, la secuencia correspondiente sin la M N terminal o cualquier secuencia de proteína de armazón que se describe en la presente memoria (por ejemplo, Tabla 1) sin la M N terminal se encuentra presente en 2, 4, 8, 16, 32, 64, 100, 200, 400, 800, 1000 veces o una densidad más alta que en las VE, por ejemplo, exosomas, modificadas de manera similar usando una proteína convencional. En algunos aspectos, la VE, por ejemplo, el exosoma, comprende una proteína de fusión que comprende cualquiera de las SEQ ID NO: 1 a 109, donde la proteína de fusión no comprende una Met de extremo N, y donde la proteína de fusión se encuentra presente en 2, 4, 8, 16, 32, 64, 100, 200, 400, 800, 1000 veces o una densidad mayor que en las VE, por ejemplo, exosomas, modificadas de manera similar usando una proteína convencional.

En algunas modalidades, una proteína de fusión que comprende cualquiera de las SEQ ID NO: 1 a 109, la secuencia correspondiente sin la M N terminal o cualquier secuencia de proteína de armazón que se describe en la presente memoria (por ejemplo, Tabla 1) sin la M N terminal se encuentra presente en 2, 4, 8, 16, 32, 64, 100, 200, 400, 800, 1000 veces o una densidad más alta que en las VE, por ejemplo, exosomas, modificadas de manera similar usando una variante de una proteína de VE convencional, por ejemplo, la proteína exosómica. En algunos aspectos, la VE, por ejemplo, el exosoma, comprende una proteína de fusión que comprende cualquiera de las SEQ ID NO: 1 a 109, donde la proteína de fusión no comprende una Met de extremo N, y donde la proteína de fusión se encuentra presente en 2, 4, 8, 16, 32, 64, 100, 200, 400, 800, 1000 veces o una densidad mayor que en las VE, por ejemplo, exosomas, modificadas de manera similar usando una proteína de VE convencional, por ejemplo, la proteína exosómica.

En algunas modalidades, las VE con modificación en el lumen, por ejemplo, exosomas, que se describen en la presente memoria, demuestran características superiores en comparación con las VE con modificación en el lumen, por ejemplo, exosomas conocidos en la técnica. Por ejemplo, las VE con modificación en el lumen, por ejemplo, exosomas, producidas mediante el uso de las proteínas de la VE, por ejemplo, exosoma, recién identificadas que se proporcionan en la presente memoria contienen proteínas modificadas más ricas en su superficie luminal en comparación con las VE, por ejemplo, los exosomas en la técnica anterior, por ejemplo, las producidas usando VE convencionales, por ejemplo, exosomas, proteínas.

Además, las VE con modificación en el lumen, por ejemplo, los exosomas, de la presente descripción pueden tener una actividad biológica mayor, más específica o más controlada en comparación con las VE con modificación en el lumen, por ejemplo, los exosomas, que se conocen en la técnica. Por ejemplo, una VE con modificación en el lumen, por ejemplo, el exosoma, que comprende una carga útil, por ejemplo, una secuencia exógena terapéutica o biológicamente relevante fusionada a una proteína de VE, por ejemplo, exosoma, o un fragmento de este que se describe en la presente memoria (por ejemplo, un armazón de la presente descripción tal como BASP1 o un fragmento, variante o derivado de este) puede tener más características modificadas deseadas que la fusión a armazones que se conocen en la técnica.

Las proteínas de armazón que se conocen en la técnica incluyen moléculas de tetraspanina (por ejemplo, CD63, CD81, CD9 y otras), proteína de membrana asociada al lisosoma 2 (LAMP2 y LAMP2B), receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFR), proteínas de anclaje GPI, lactadherina y fragmentos. de estos, y péptidos que tienen afinidad con cualquiera de estas proteínas o fragmentos de estas. Para evitar dudas, PTGFRN, BSG, IGSF2, IGSF3, IGSF8, ITGB1, ITGA4, SLC3A2, transportador de ATP o un fragmento o una variante de estos no son VE convencionales, por ejemplo, exosomas, proteínas. Anteriormente, la sobreexpresión de proteínas exógenas se basaba en la disposición estocástica o aleatoria de las proteínas exógenas en el exosoma para producir exosomas con modificación en el lumen. Esto resultó en una densidad impredecible de bajo nivel de las proteínas exógenas en los exosomas. Por tanto, las proteínas de VE, por ejemplo, exosoma y sus fragmentos que se describen en la presente memoria, proporcionan importantes avances en las nuevas composiciones de VE, por ejemplo, exosoma y los métodos para prepararlas.

Las proteínas de fusión que se proporcionan en la presente memoria pueden comprender una proteína de armazón, por ejemplo, una proteína del lumen exosómica, de la presente descripción, tal como MARCKS, MARCKSL1, BASP1, o un fragmento, una variante o un derivado de estas, y un péptido adicional. El péptido adicional se puede unir al extremo N o al extremo C de la proteína de la VE, por ejemplo, exosoma, (proteína de armazón) o un fragmento, una variante o un derivado de este.

En algunas modalidades, las proteínas de fusión que se proporcionan en la presente memoria pueden comprender una proteína de armazón de la presente descripción, tal como MARCKS, MARCKSL1, BASP1, o un fragmento, una variante o un derivado de estas, y dos péptidos adicionales. Ambos péptidos adicionales se pueden unir al extremo N o al extremo C de la proteína de VE, por ejemplo, exosoma, (proteína de armazón) o un fragmento, una variante o un derivado de este. En algunas modalidades, uno de los dos péptidos adicionales se une al extremo N y el otro de los dos péptidos adicionales se une al extremo C de la proteína de VE, por ejemplo, exosoma, (proteína de armazón) o un fragmento, una variante, o un derivado de esta.

En algunas modalidades, las composiciones y métodos para generar vesículas extracelulares con modificación en el lumen que se describen en la presente memoria comprenden nanovesículas.

IV. Célula productora para la producción de VE con modificación en el lumen, por ejemplo, exosomas

Las VE, por ejemplo, exosomas, de la presente descripción se pueden producir a partir de una célula cultivada in vitro o un fluido corporal de un sujeto. Cuando se producen las VE, por ejemplo, exosomas, a partir de un cultivo celular in vitro, se pueden usar varias células productoras, por ejemplo, las células HEK293, para la presente descripción. Los tipos de células adicionales que se pueden usar para la producción de las VE con modificación en el lumen, por ejemplo, exosomas, que se describen en la presente memoria incluyen, de modo no taxativo, células madre mesenquimales, linfocitos T, linfocitos B, células dendríticas, macrófagos y líneas celulares cancerosas.

Por consiguiente, la presente descripción proporciona células que producen las VE, por ejemplo, exosomas, de la presente descripción. En algunas modalidades, comprende uno o más vectores, en los que los vectores comprenden una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de armazón y la carga útil, por ejemplo, una molécula con actividad biológica. En algunas modalidades, una secuencia de ácido nucleico codifica la proteína de armazón y una segunda secuencia de ácido nucleico codifica la carga útil, por ejemplo, una molécula con actividad biológica. En algunas modalidades, la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de armazón y la secuencia de ácido nucleico que codifica la carga útil, por ejemplo, una molécula con actividad biológica, están en un único marco de lectura abierto, por lo tanto, el producto de expresión sería una proteína de fusión que comprende la proteína de armazón fusionada a la carga útil, por ejemplo, una molécula con actividad biológica. En algunas modalidades, la secuencia de ácido nucleico está unida de forma operativa a un promotor.

La célula productora se puede modificar genéticamente para que comprenda una o más secuencias exógenas para producir las VE con modificación en el lumen, por ejemplo, exosomas. La célula productora modificada genéticamente puede contener la secuencia exógena mediante transformación transitoria o estable. La secuencia exógena se puede transformar como un plásmido. Las secuencias exógenas se pueden integrar de forma estable en una secuencia genómica de la célula productora, en un sitio objetivo o en un sitio aleatorio. En algunas modalidades, se genera una línea celular estable para la producción de VE con modificación en el lumen, por ejemplo, exosomas.

Las secuencias exógenas se pueden insertar en una secuencia genómica de la célula productora, ubicada corriente arriba (extremo 5') o corriente abajo (extremo 3') o dentro de una secuencia endógena que codifica la proteína de VE, por ejemplo, exosoma. Se pueden usar varios métodos conocidos en la técnica para la introducción de las secuencias exógenas en la célula productora. Por ejemplo, las células modificadas usando varios métodos de edición de genes (por ejemplo, métodos que usan una recombinación homóloga, sistema mediado por transposones, sistema loxP-Cre, CRISPR/Cas9 o TALEN) se encuentran dentro del alcance de la presente descripción.

Las secuencias exógenas pueden comprender una secuencia que codifica una proteína de armazón de la presente descripción (por ejemplo, una proteína de VE, por ejemplo, exosoma, o una modificación o un fragmento de la proteína de VE, por ejemplo, exosoma). Se puede introducir una copia extra de la secuencia que codifica la proteína de armazón (por ejemplo, una proteína de VE, por ejemplo, exosoma,) para producir una VE con modificación en el lumen, por ejemplo, exosoma, que tiene una mayor densidad de la proteína de VE, por ejemplo, exosoma. Se puede introducir una secuencia exógena que codifica una modificación o un fragmento de la proteína de VE, por ejemplo, exosoma, para producir una VE con modificación en el lumen, por ejemplo, exosoma, que contiene la modificación o el fragmento de la proteína de VE, por ejemplo, exosoma. Se puede introducir una secuencia exógena que codifica una etiqueta de afinidad para producir una VE con modificación en el lumen, por ejemplo, exosoma, que contiene una proteína de fusión que comprende la etiqueta de afinidad unida a la proteína de VE, por ejemplo, exosoma.

En algunas modalidades, una VE con modificación en el lumen, por ejemplo, exosoma, tiene una mayor densidad de la proteína de VE, por ejemplo, exosoma, (proteína de armazón) que las VE nativas, por ejemplo, exosomas, aisladas de este tipo de células productoras o similares. En algunas modalidades, dicha proteína de VE, por ejemplo, exosoma, (proteína de armazón) se encuentra presente a una densidad de 2, 4, 8, 16, 32, 64, 100, 200, 400, 800, 1000 veces o a una mayor en dicha VE con modificación en el lumen, por ejemplo, exosoma, que la VE nativa < por ejemplo, exosoma. En algunas modalidades, la proteína de VE, por ejemplo, exosoma, (proteína de armazón) se encuentra presente a una densidad de 2 a 4 veces, 4 a 8 veces, 8 a 16 veces, 16 a 32 veces, 32 a 64 veces, 64 a 100 veces, 100 a 200 veces, 200 a 400 veces, 400 a 800 veces, 800 a 1000 veces o a una mayor en la VE con modificación en el lumen, por ejemplo, exosoma, que la VE nativa, por ejemplo, exosoma. En algunas modalidades, una proteína de fusión que comprende la proteína de VE, por ejemplo, exosoma, (proteína de armazón) se encuentra presente a una densidad de 2 a 4 veces, 4 a 8 veces, 8 a 16 veces, 16 a 32 veces, 32 a 64 veces, 64 a 100 veces, 100 a 200 veces, 200 a 400 veces, 400 a 800 veces, 800 a 1000 veces o a una mayor en dicha VE con modificación en el lumen, por ejemplo, exosoma, que en la proteína de VE sin modificar, por ejemplo, exosoma, (proteína de armazón) en la VE nativa, por ejemplo, exosoma. En algunas modalidades, un fragmento o variante de la proteína de VE, por ejemplo, exosoma, (proteína de armazón) se encuentra presente a una densidad de 2 a 4 veces, 4 a 8 veces, 8 a 16 veces, 16 a 32 veces, 32 a 64 veces, 64 a 100 veces, 100 a 200 veces, 200 a 400 veces, 400 a 800 veces, 800 a 1000 veces o a una mayor en la VE con modificación en el lumen, por ejemplo, exosoma, que en la proteína de VE sin modificar, por ejemplo, exosoma, (proteína de armazón) en la VE nativa, por ejemplo, exosoma.

En modalidades particulares, MARCKS, un fragmento o una variante de MARCKS, o una modificación de esta, se encuentra presente a una densidad de 2 a 4 veces, 4 a 8 veces, 8 a 16 veces, 16 a 32 veces, 32 a 64 veces, de 64 a 100 veces, de 100 a 200 veces, de 200 a 400 veces, de 400 a 800 veces, de 800 a 1000 veces o a una mayor en dicha VE con modificación en el lumen, por ejemplo, exosoma, que la MARCKS no modificada en dicha VE nativa, por ejemplo, exosoma. En algunas modalidades, MARCKSL1, un fragmento o una variante de MARCKSL1, o una modificación de esta, se encuentra presente a una densidad de 2 a 4 veces, 4 a 8 veces, 8 a 16 veces, 16 a 32 veces, 32 a 64 veces, de 64 a 100 veces, de 100 a 200 veces, de 200 a 400 veces, de 400 a 800 veces, de 800 a 1000 veces o a una mayor en dicha VE con modificación en el lumen, por ejemplo, exosoma, que la MARCKSL1 no modificada en dicha VE nativa, por ejemplo, exosoma. En algunas modalidades, BASP1, un fragmento o una variante de BASP1, o una modificación de esta, se encuentra presente a una densidad de 2 a 4 veces, 4 a 8 veces, 8 a 16 veces, 16 a 32 veces, 32 a 64 veces, de 64 a 100 veces, de 100 a 200 veces, de 200 a 400 veces, de 400 a 800 veces, de 800 a 1000 veces o a una mayor en dicha VE con modificación en el lumen, por ejemplo, exosoma, que la BASP1 no modificada en dicha VE nativa, por ejemplo, exosoma.

En algunas modalidades, la célula productora se modifica adicionalmente para que incluya una secuencia exógena adicional. Por ejemplo, se puede incluir una secuencia exógena adicional para modular la expresión génica endógena o producir un exosoma que incluya un determinado polipéptido como carga útil. En algunas modalidades, la célula productora se modifica para que incluya dos secuencias exógenas, una que codifica la proteína de VE, por ejemplo, exosoma, (proteína de armazón) o una modificación o un fragmento de la proteína de VE, por ejemplo, exosoma, (proteína de armazón) y la otra codifica una carga útil.

Más específicamente, las VE con modificación en el lumen, por ejemplo, exosomas, se pueden producir a partir de una célula transformada con una secuencia que codifica una o más proteínas del lumen exosómicas (proteínas de armazón) que incluyen, de modo no taxativo, (1) sustrato de proteína quinasa C rico en alanina miristoilada (MARCKS); (2) sustrato de proteína quinasa C rico en alanina miristoilada como 1 (MARCKSL1); y (3) proteína 1 soluble en ácido cerebral (BASP1). Cualquiera de una o más proteínas de VE, por ejemplo, exosoma, de lumen (proteínas de armazón) que se describen en la presente memoria se pueden expresar a partir de un plásmido, una secuencia exógena insertada en el genoma u otro ácido nucleico exógeno tal como un ARN mensajero (ARNm) sintético.

En algunas modalidades, la una o más proteína de VE, por ejemplo, exosoma, de lumen (proteína de armazón) se expresa en una célula transformada con una secuencia exógena que codifica su forma endógena de longitud completa. En algunas modalidades, dicha secuencia exógena codifica la proteína MARCKS de la SEQ ID NO: 1 o la secuencia correspondiente sin la M N terminal. En determinados aspectos, dicha secuencia exógena codifica la proteína MARCKS de la SEQ ID NO: 1. En algunas modalidades, dicha secuencia exógena codifica la proteína MARCKS de la SEQ ID NO: 1, donde la proteína MARKS codificada por la secuencia exógena no comprende una Met de extremo N. En algunas modalidades, dicha secuencia exógena codifica la proteína MARCKSL1 de la SEQ ID NO: 2 o la secuencia correspondiente sin la M N terminal. En determinados aspectos, dicha secuencia exógena codifica la proteína MARCKSL1 de la SEQ ID NO: 2. En algunas modalidades, dicha secuencia exógena codifica la proteína MARCKSL1 de la SEQ ID NO: 2, donde la proteína MARCKSL1 codificada por la secuencia exógena no comprende una Met de extremo N. En algunas modalidades, dicha secuencia exógena codifica la proteína BASP1 de la SEQ ID NO: 3 o la secuencia correspondiente sin la M N terminal. En determinados aspectos, dicha secuencia exógena codifica la proteína BASP1 de la SEQ ID NO: 3. En algunas modalidades, dicha secuencia exógena codifica la proteína BASP1 de la SEQ ID NO: 3, donde la proteína BASP1 codificada por la secuencia exógena no comprende una Met de extremo N.

Las VE con modificación en el lumen, por ejemplo, exosomas, se pueden producir a partir de una célula transformada con una secuencia de polinucleótidos que codifica un fragmento de una o más proteínas de VE, por ejemplo, exosoma, del lumen (proteínas de armazón) que incluyen, de modo no taxativo, (1) sustrato de proteína quinasa C rico en alanina miristoilada (MARCKS); (2) sustrato de proteína quinasa C rico en alanina miristoilada como 1 (MARCKSL1); y (3) proteína 1 soluble en ácido cerebral (BASP1).

En algunas modalidades, la secuencia de polinucleótidos codifica un fragmento de la proteína de VE, por ejemplo, exosoma, de lumen (por ejemplo, una proteína de armazón como MARCKS, MARCKSL1 o BASP1) que carece de al menos 5, 10, 50, 100, 200 o 300 aminoácidos del extremo N de la proteína nativa. En algunas modalidades, la secuencia de polinucleótidos codifica un fragmento de la proteína de VE, por ejemplo, exosoma, de lumen (por ejemplo, una proteína de armazón como MARCKS, MARCKSL1 o BASP1) que carece de al menos 5, 10, 50, 100, 200 o 300 aminoácidos del extremo C de la proteína nativa. En algunas modalidades, la secuencia de polinucleótidos codifica un fragmento de la proteína de VE, por ejemplo, exosoma, de lumen (por ejemplo, una proteína de armazón como MARCKS, MARCKSL1 o BASP1) que carece de al menos 5, 10, 50, 100, 200 o 300 aminoácidos del extremo N y el extremo C de la proteína nativa. En algunas modalidades, la secuencia de polinucleótidos codifica un fragmento de la proteína de VE, por ejemplo, exosoma, de lumen (por ejemplo, una proteína de armazón como MARCKS, MARCKSL1 o BASP1) que carece de uno o más dominios funcionales o estructurales de la proteína nativa.

En algunas modalidades, la proteína de fusión comprende un péptido de las SEQ ID NO: 4 a 109, la secuencia correspondiente sin la M N terminal, o cualquier secuencia de proteína de armazón que se describe en la presente memoria (por ejemplo, Tabla 1) sin la M N terminal. En algunas modalidades, la proteína de fusión comprende un péptido de las SEQ ID NO: 4 a 109 o cualquier secuencia de proteína de armazón que se describe en la presente memoria (por ejemplo, Tabla 1), donde la proteína de fusión no comprende una Met de extremo N. En algunas modalidades, la proteína de fusión comprende el péptido de la SEQ ID NO: 13. En algunas modalidades, la proteína de fusión comprende el péptido de la s Eq ID NO: 13, donde la proteína de fusión no comprende una Met de extremo N. En algunas modalidades, la proteína de fusión comprende una proteína de armazón, por ejemplo, proteína del lumen exosómica, que comprende un péptido con la secuencia MGXKLSKKK (SEQ ID NO: 117) o GXKLSKKK (SEQ ID NO: 425), donde X es alanina o cualquier otro aminoácido. En algunas modalidades, la proteína de fusión comprende una proteína de armazón, por ejemplo, proteína del lumen exosómica, que comprende un péptido con la secuencia GXKLSKKK (SEQ ID NO: 425), donde X es alanina o cualquier otro aminoácido, y donde la proteína de armazón, por ejemplo, proteína del lumen exosómica, no comprende una Met de extremo N. En algunas modalidades, la proteína de fusión comprende una proteína de armazón, por ejemplo, proteína del lumen exosómica, que comprende un péptido con la secuencia GXKLSKKK (SEQ ID NO: 425), donde X es alanina o cualquier otro aminoácido, y donde la proteína de fusión no comprende una Met de extremo N. En algunas modalidades, la proteína de fusión comprende una proteína de armazón que comprende la secuencia de aminoácidos de GXKLSKKK (SEQ ID NO: 425), donde X es alanina o cualquier otro aminoácido, donde la proteína de armazón no tiene Met en el extremo N de la secuencia de aminoácidos, por ejemplo, comprende MGXKLSKKK (SEQ ID NO: 117). En otras modalidades, la proteína de fusión comprende una proteína de armazón, por ejemplo, proteína del lumen exosómica, que comprende una secuencia de aminoácidos de GXKLSKKK (SEQ ID NO: 425), donde la proteína de fusión no comprende MGXKLSKKK. En algunas modalidades, la proteína de fusión comprende una proteína de armazón que comprende un péptido con la secuencia de (M)(G)(n)($)(O/n)(S/A/G/N)(+)(+) o (G)(n)($)(O/n)(S/A/G/N)(+)(+), donde cada posición entre paréntesis representa un aminoácido, y donde n es cualquier aminoácido que se selecciona del grupo que consiste en (Pro, Gly, Ala, Ser), ês cualquier aminoácido que se selecciona del grupo que consiste en (Asn, Gln, Ser, Thr, Asp, Glu, Lys, His, Arg), O es cualquier aminoácido que se selecciona del grupo que consiste en (Val, Ile, Leu, Phe, Trp, Tyr, Met) y (+) es cualquier aminoácido que se selecciona del grupo que consiste en (Lys, Arg, His); y donde la posición cinco no es (+) y la posición seis no es (+) ni (Asp o Glu). En algunas modalidades, la proteína de fusión comprende una proteína de armazón, por ejemplo, proteína del lumen exosómica, una secuencia de aminoácidos de (G)(n)(^)(O/n)(S/A/G/N)(+)(+), donde la proteína de fusión no comprende (M)(G)(n)(^)(O/n)(S/A/G/N)(+)(+). En algunas modalidades, la proteína de fusión comprende una proteína de armazón, por ejemplo, proteína del lumen exosómica, que comprende un péptido con secuencia de (M)(O)(n)(X)(O/n)(n)(+)(+) o (G)(n)(X)(O/n)(n)(+)(+), donde cada posición entre paréntesis representa un aminoácido, y donde n es cualquier aminoácido que se selecciona del grupo que consiste en (Pro, Gly, Ala, Ser), X es cualquier aminoácido, O es cualquier aminoácido que se selecciona del grupo que consiste en (Val, Ile, Leu, Phe, Trp, Tyr, Met) y (+) es cualquier aminoácido que se selecciona del grupo que consiste en (Lys, Arg, His); y donde la posición cinco no es (+) y la posición seis no es (+) ni (Asp o Glu). En otras modalidades, la proteína de fusión comprende una proteína de armazón, por ejemplo, proteína del lumen exosómica, que comprende una secuencia de aminoácidos de (G)(n)(X)(O/n)(n)(+)(+), donde la proteína de fusión no comprende (M)(G)(n)(X)(O/n)(n)(+)(+).

En algunas modalidades, las VE con modificación en el lumen, por ejemplo, exosomas, se pueden producir a partir de una célula transformada con una secuencia que codifica una proteína de VE, por ejemplo, exosoma, (por ejemplo, una proteína de armazón, por ejemplo, proteína del lumen exosómica, como MARCKs , MARCKSL1, o BASP1) o un fragmento o una modificación de este fusionado a una o más proteínas heterólogas. En algunas modalidades, la una o más proteínas heterólogas se fusionan al extremo N de la proteína de VE, por ejemplo, exosoma, (por ejemplo, una proteína de armazón como MARCKS, MARCKSL1 o BASP1) o una modificación de esta, en particular un fragmento o variante de esta. En algunas modalidades, la una o más proteínas heterólogas se fusionan al extremo C de la proteína de VE, por ejemplo, exosoma, (por ejemplo, una proteína de armazón tal como MARCKS, MARCKSL1, o BASP1) o una modificación de esta, en particular un fragmento o variante de esta. En algunas modalidades, la una o más proteínas heterólogas se fusionan con el extremo N y el extremo C de la proteína de VE, por ejemplo, exosoma, (por ejemplo, una proteína de armazón tal como MARCKs , MARCKSL1, o BASP1) o una modificación de esta, en particular un fragmento o variante de esta. En algunas modalidades, una o más proteínas heterólogas son proteínas de mamífero. En algunas modalidades, la una o más proteínas heterólogas son proteínas humanas.

En algunas modalidades, las VE con modificación en el lumen, por ejemplo, exosomas, se producen a partir de una célula transformada con una secuencia que codifica un polipéptido de una secuencia idéntica o similar a una VE de longitud completa o un fragmento de una VE nativa, por ejemplo, exosoma, proteína del lumen (proteína de armazón) que incluyen, de modo no taxativo,

(1) sustrato de proteína quinasa C rico en alanina miristoilada (MARCKS);

(2) similar a sustrato de proteína quinasa C rico en alanina miristoilada 1 (MARCKSL1); y

(3) proteína 1 soluble en ácido cerebral (BASP1).

En algunas modalidades, el polipéptido es al menos aproximadamente 50 % idéntico a una proteína del lumen de VE nativa, por ejemplo, exosoma, de longitud completa o un fragmento de esta (proteína de armazón), por ejemplo, 50 % idéntico a las SEQ ID NO: 1 a 3 o cualquiera de las secuencias correspondientes sin la M N terminal. En algunas modalidades, el polipéptido es al menos aproximadamente 55 % idéntico a una proteína del lumen de VE nativa, por ejemplo, exosoma, de longitud completa o un fragmento de esta (proteína de armazón), por ejemplo, al menos aproximadamente 55 % idéntico a las SEQ ID NO: 1 a 3 o cualquiera de las secuencias correspondientes sin la M N terminal. En algunas modalidades, el polipéptido es al menos aproximadamente 60 % idéntico a una proteína del lumen de VE nativa, por ejemplo, exosoma, de longitud completa o un fragmento de esta (proteína de armazón), por ejemplo, al menos aproximadamente 60 % idéntico a las SEQ ID NO: 1 a 3 o cualquiera de las secuencias correspondientes sin la M N terminal. En algunas modalidades, el polipéptido es al menos aproximadamente 65 % idéntico a una proteína del lumen de VE nativa, por ejemplo, exosoma, de longitud completa o un fragmento de esta (proteína de armazón), por ejemplo, al menos aproximadamente 65 % idéntico a las SEQ ID NO: 1a 3 o cualquiera de las secuencias correspondientes sin la M N terminal. En algunas modalidades, el polipéptido es al menos aproximadamente 70 % idéntico a una proteína del lumen de VE nativa, por ejemplo, exosoma, de longitud completa o un fragmento de esta (proteína de armazón), por ejemplo, al menos aproximadamente 70 % idéntico a las SEQ ID NO: 1 a 3 o cualquiera de las secuencias correspondientes sin la M N terminal. En algunas modalidades, el polipéptido es al menos aproximadamente 75 % idéntico a una proteína del lumen de VE nativa, por ejemplo, exosoma, de longitud completa o un fragmento de esta (proteína de armazón), por ejemplo, al menos aproximadamente 75 % idéntico a las SEQ ID NO: 1 a 3 o cualquiera de las secuencias correspondientes sin la M N terminal. En algunas modalidades, dicho polipéptido es al menos aproximadamente 80 % idéntico a una proteína del lumen de VE nativa, por ejemplo, exosoma, de longitud completa o un fragmento de esta (proteína de armazón), por ejemplo, al menos aproximadamente 80 % idéntico a las SEQ ID NO: 1 a 3 o cualquiera de las secuencias correspondientes sin la M N terminal. En algunas modalidades, el polipéptido es al menos aproximadamente 85 % idéntico a una proteína del lumen de VE nativa, por ejemplo, exosoma, de longitud completa o un fragmento de esta (proteína de armazón), por ejemplo, al menos aproximadamente 85 % idéntico a las SEQ ID NO: 1 a 3 o cualquiera de las secuencias correspondientes sin la M N terminal. En algunas modalidades, dicho polipéptido es al menos aproximadamente 90 % idéntico a una proteína del lumen de VE nativa, por ejemplo, exosoma, de longitud completa o un fragmento de esta (proteína de armazón), por ejemplo, al menos aproximadamente 90 % idéntico a las SEQ ID NO: 1 a 3 o cualquiera de las secuencias correspondientes sin la M N terminal. En algunas modalidades, el polipéptido es al menos aproximadamente 95 % idéntico a una proteína del lumen de VE nativa, por ejemplo, exosoma, de longitud completa o un fragmento de esta (proteína de armazón), por ejemplo, al menos aproximadamente un 95 % idéntica a las SEQ ID NO: 1 a 3 o cualquiera de las secuencias correspondientes sin la M N terminal. En algunas modalidades, el polipéptido es al menos aproximadamente 99 % idéntico a una proteína del lumen de VE nativa, por ejemplo, exosoma, de longitud completa o un fragmento de esta (proteína de armazón), por ejemplo, al menos aproximadamente 99 % idéntico a las SEQ ID NO: 1 a 3 o cualquiera de las secuencias correspondientes sin la M N terminal. En algunas modalidades, el polipéptido es al menos aproximadamente 99,9 % idéntico a una proteína del lumen de VE nativa, por ejemplo, exosoma, de longitud completa o un fragmento de esta (proteína de armazón), por ejemplo, al menos aproximadamente 99,9 % idéntico a las SEQ ID NO: 1 a 3 o cualquiera de las secuencias correspondientes sin la M N terminal.

En algunas modalidades, las VE con modificación en el lumen, por ejemplo, exosomas, producidas a partir de la célula comprenden un polipéptido de una secuencia idéntica o similar a un fragmento de proteína 1 soluble en ácido cerebral (BASP1). En algunas modalidades, el polipéptido es al menos aproximadamente 50 % idéntico a una BASP1 de longitud completa o un fragmento de esta, por ejemplo, al menos aproximadamente 50 % idéntico a las SEQ ID NO: 4 a 109, la secuencia correspondiente sin la M N terminal, o cualquier secuencia de BASP1 que se describe en la presente memoria, por ejemplo, TABLA 1, sin la M N terminal. En algunas modalidades, el polipéptido es al menos aproximadamente 55 % idéntico a una BASP1 de longitud completa o un fragmento de esta, por ejemplo, al menos aproximadamente 50 % idéntico a las SEQ ID NO: 4 a 109, la secuencia correspondiente sin la M N terminal, o cualquier secuencia de BASP1 que se describe en la presente memoria, por ejemplo, TABLA 1, sin la M N terminal. En algunas modalidades, dicho polipéptido es al menos aproximadamente 60 % idéntico a una BASP1 de longitud completa o un fragmento de esta, por ejemplo, al menos aproximadamente 60 % idéntico a las SEQ ID NO: 4 a 109, la secuencia correspondiente sin la M N terminal, o cualquier secuencia de BASP1 que se describe en la presente memoria, por ejemplo, TABLA 1, sin la M N terminal. En algunas modalidades, el polipéptido es al menos aproximadamente 65 % idéntico a una BASP1 de longitud completa o un fragmento de esta, por ejemplo, al menos aproximadamente 65 % idéntico a las SEQ ID NO: 4 a 109, la secuencia correspondiente sin la M N terminal, o cualquier secuencia de BASP1 que se describe en la presente memoria, por ejemplo, TABLA 1, sin la M N terminal. En algunas modalidades, el polipéptido es al menos aproximadamente 70 % idéntico a una BASP1 de longitud completa o un fragmento de esta, por ejemplo, al menos aproximadamente 70 % idéntico a las SEQ ID NO: 4 a 109, la secuencia correspondiente sin la M N terminal, o cualquier secuencia de BASP1 que se describe en la presente memoria, por ejemplo, TABLA 1, sin la M N terminal. En algunas modalidades, el polipéptido es al menos aproximadamente 75 % idéntico a una BASP1 de longitud completa o un fragmento de esta, por ejemplo, al menos aproximadamente 75 % idéntico a las SEQ ID NO: 4 a 109, la secuencia correspondiente sin la M N terminal, o cualquier secuencia de BASP1 que se describe en la presente memoria, por ejemplo, TABLA 1, sin la M N terminal. En algunas modalidades, el polipéptido es al menos aproximadamente 80 % idéntico a una BASP1 de longitud completa o un fragmento de esta, por ejemplo, al menos aproximadamente 80 % idéntico a las SEQ ID NO: 4 a 109, la secuencia correspondiente sin la M N terminal, o cualquier secuencia de BASP1 que se describe en la presente memoria, por ejemplo, TABLA 1, sin la M N terminal. En algunas modalidades, el polipéptido es al menos aproximadamente 85 % idéntico a una BASP1 de longitud completa o un fragmento de esta, por ejemplo, al menos aproximadamente 85 % idéntico a las SEQ ID NO: 4 a 109, la secuencia correspondiente sin la M N terminal, o cualquier secuencia de BASP1 que se describe en la presente memoria, por ejemplo, TABLA 1, sin la M N terminal. En algunas modalidades, el polipéptido es al menos aproximadamente 90 % idéntico a una BASP1 de longitud completa o un fragmento de esta, por ejemplo, al menos aproximadamente 90 % idéntico a las SEQ ID NO: 4 a 109, la secuencia correspondiente sin la M N terminal, o cualquier secuencia de BASP1 que se describe en la presente memoria, por ejemplo, TABLA 1, sin la M N terminal. En algunas modalidades, el polipéptido es al menos aproximadamente 95 % idéntico a una BASP1 de longitud completa o un fragmento de esta, por ejemplo, al menos aproximadamente 95 % idéntico a las SEQ ID NO: 4 a 109, la secuencia correspondiente sin la M N terminal, o cualquier secuencia de BASP1 que se describe en la presente memoria, por ejemplo, TABLA 1, sin la M N terminal. En algunas modalidades, el polipéptido es al menos aproximadamente 99 % idéntico a una BASP1 de longitud completa o un fragmento de esta, por ejemplo, al menos aproximadamente 99 % idéntico a las SEQ ID NO: 4 a 109, la secuencia correspondiente sin la M N terminal, o cualquier secuencia de BASP1 que se describe en la presente memoria, por ejemplo, TABLA 1, sin la M N terminal. En algunas modalidades, el polipéptido es al menos aproximadamente 99,9 % idéntico a una BASP1 de longitud completa o un fragmento de esta, por ejemplo, al menos aproximadamente 99,9 % idéntico a las SEQ ID NO: 4 a 109, la secuencia correspondiente sin la M N terminal, o cualquier secuencia de BASP1 que se describe en la presente memoria, por ejemplo, TABLA 1, sin la M N terminal. En algunas modalidades, el polipéptido es aproximadamente 100 % idéntico a un fragmento de BASP1, por ejemplo, aproximadamente 100 % idéntico a 4 a 109, la secuencia correspondiente sin la M N terminal, o cualquier secuencia de BASP1 que se describe en la presente memoria, por ejemplo, TABLA 1, sin la M N terminal.

En algunas modalidades, las VE con modificación en el lumen, por ejemplo, exosomas, producidas a partir de la célula comprenden un polipéptido de una secuencia idéntica o similar a un fragmento de la proteína 1 soluble en ácido cerebral (BASP1), donde el polipéptido no comprende una Met de extremo N. En algunas modalidades, el polipéptido es al menos aproximadamente 50 % idéntico a una BASP1 de longitud completa o un fragmento de esta, por ejemplo, al menos aproximadamente 50 % idéntico a las SEQ ID NO: 4 a 109 o cualquier secuencia de BASP1 que se describe en la presente memoria, por ejemplo, TABLA 1, donde el polipéptido no comprende una Met de extremo N. En algunas modalidades, el polipéptido es al menos aproximadamente 55 % idéntico a una BASP1 de longitud completa o un fragmento de esta, por ejemplo, al menos aproximadamente 50 % idéntico a las SEQ ID NO: 4 a 109 o cualquier secuencia de BASP1 que se describe en la presente memoria, por ejemplo, TABLA 1, donde el polipéptido no comprende una Met de extremo N. En algunas modalidades, dicho polipéptido es al menos aproximadamente 60 % idéntico a una BASP1 de longitud completa o un fragmento de esta, por ejemplo, al menos aproximadamente 60 % idéntico a las SEQ ID NO: 4 a 109 o cualquier secuencia de BASP1 que se describe en la presente memoria, por ejemplo, TABLA 1, donde el polipéptido no comprende una Met de extremo N. En algunas modalidades, el polipéptido es al menos aproximadamente 65 % idéntico a una BASP1 de longitud completa o un fragmento de esta, por ejemplo, al menos aproximadamente 65 % idéntico a las SEQ ID NO: 4 a 109 o cualquier secuencia de BASP1 que se describe en la presente memoria, por ejemplo, TABLA 1, donde el polipéptido no comprende una Met de extremo N. En algunas modalidades, el polipéptido es al menos aproximadamente 70 % idéntico a una BASP1 de longitud completa o un fragmento de esta, por ejemplo, al menos aproximadamente 70 % idéntico a las SEQ ID NO: 4 a 109 o cualquier secuencia de BASP1 que se describe en la presente memoria, por ejemplo, TABLA 1, donde el polipéptido no comprende una Met de extremo N. En algunas modalidades, el polipéptido es al menos aproximadamente un 75 % idéntico a una BASP1 de longitud completa o un fragmento de esta, por ejemplo, al menos aproximadamente un 75 % idéntico a las SEQ ID NO: 4 a 109 o cualquier secuencia de BASP1 que se describe en la presente memoria, por ejemplo, TABLA 1, donde el polipéptido no comprende una Met de extremo N. En algunas modalidades, el polipéptido es al menos aproximadamente 80 % idéntico a una BASP1 de longitud completa o un fragmento de esta, por ejemplo, al menos aproximadamente 80 % idéntico a las SEQ ID NO: 4 a 109 o cualquier secuencia de BASP1 que se describe en la presente memoria, por ejemplo, TABLA 1, donde el polipéptido no comprende una Met de extremo N. En algunas modalidades, el polipéptido es al menos aproximadamente 85 % idéntico a una BASP1 de longitud completa o un fragmento de esta, por ejemplo, al menos aproximadamente 85 % idéntico a las SEQ ID NO: 4 a 109 o cualquier secuencia de BASP1 que se describe en la presente memoria, por ejemplo, TABLA 1, donde el polipéptido no comprende una Met de extremo N. En algunas modalidades, el polipéptido es al menos aproximadamente 90 % idéntico a una BASP1 de longitud completa o un fragmento de esta, por ejemplo, al menos aproximadamente 90 % idéntico a las SEQ ID NO: 4 a 109 o cualquier secuencia de BASP1 que se describe en la presente memoria, por ejemplo, TABLA 1, donde el polipéptido no comprende una Met de extremo N. En algunas modalidades, el polipéptido es al menos aproximadamente 95 % idéntico a una BASP1 de longitud completa o un fragmento de esta, por ejemplo, al menos aproximadamente 95 % idéntico a las SEQ ID NO: 4 a 109 o cualquier secuencia de BASP1 que se describe en la presente memoria, por ejemplo, TABLA 1, donde el polipéptido no comprende una Met de extremo N. En algunas modalidades, el polipéptido es al menos aproximadamente 99 % idéntico a una BASP1 de longitud completa o un fragmento de esta, por ejemplo, al menos aproximadamente 99 % idéntico a las SEQ ID NO: 4 a 109 o cualquier secuencia de BASP1 que se describe en la presente memoria, por ejemplo, TABLA 1, donde el polipéptido no comprende una Met de extremo N. En algunas modalidades, el polipéptido es al menos aproximadamente 99,9 % idéntico a una BASP1 de longitud completa o un fragmento de esta, por ejemplo, al menos aproximadamente 99,9 % idéntico a las SEQ ID NO: 4 a 109 o cualquier secuencia de BASP1 que se describe en la presente memoria, por ejemplo, TABLA 1, donde el polipéptido no comprende una Met de extremo N. En algunas modalidades, el polipéptido es al menos aproximadamente 100 % idéntico a un fragmento de BASP1, por ejemplo, aproximadamente 100 % idéntico a las 4 a 109 o cualquier secuencia de BASP1 que se describe en la presente memoria, por ejemplo, TABLA 1, donde el polipéptido no comprende una Met de extremo N.

VI. Métodos de fabricación

Las VE (por ejemplo, exosomas) de la presente descripción pueden producirse mediante síntesis química, tecnología de ADN recombinante, fragmentación bioquímica o enzimática de moléculas más grandes, combinaciones de los anteriores o mediante cualquier otro método. En una modalidad, la presente descripción proporciona un método para conjugar una molécula con actividad biológica con una VE (por ejemplo, exosoma). El método comprende unir una molécula con actividad biológica a una VE (por ejemplo, exosoma) como se describió anteriormente.

En algunas modalidades de la presente descripción, las VE, por ejemplo, los exosomas de la presente descripción se pueden fabricar usando células productoras como se describió anteriormente. Por consiguiente, la presente descripción proporciona un método para fabricar VE, por ejemplo, exosomas, que comprende cultivar una célula productora que se describe en la presente memoria en condiciones adecuadas y obtener las VE, por ejemplo, los exosomas de la presente descripción.

En otras modalidades, las proteínas de armazón, por ejemplo, proteínas del lumen exosómicas, de la presente descripción pueden producirse de forma recombinante y posteriormente incorporarse en una VE, por ejemplo, exosoma, de la presente descripción. En otras modalidades, solo la porción polipeptídica de la proteína de armazón se produce de forma recombinante. En algunas modalidades, la porción polipeptídica de la proteína de armazón producida de forma recombinante se modifica posteriormente, por ejemplo, química o enzimáticamente, para incorporar un ancla de membrana (por ejemplo, un ácido mirístico de extremo N). En algunas modalidades, la proteína de armazón producida de forma semirrecombinante (es decir, combinando el producto recombinante de la porción polipeptídica seguida de modificación química o enzimática) se incorpora posteriormente en una VE, por ejemplo, exosoma, de la presente descripción.

En otras modalidades, las proteínas de armazón, por ejemplo, proteínas del lumen exosómicas, de la presente descripción pueden producirse químicamente, por ejemplo, usando síntesis de péptidos en fase sólida, y posteriormente incorporarse en una VE, por ejemplo, exosoma, de la presente descripción. En otras modalidades, solo la porción polipeptídica de la proteína de armazón se produce de forma sintética. En algunas modalidades, la porción polipeptídica de la proteína de armazón producida de forma sintética se modifica posteriormente, por ejemplo, química o enzimáticamente, para incorporar un ancla de membrana (por ejemplo, un ácido mirístico de extremo N). En algunas modalidades, la proteína de armazón producida de forma semirrecombinante (es decir, combinando el producto recombinante de la porción polipeptídica seguida de modificación química o enzimática) se incorpora posteriormente en una VE, por ejemplo, exosoma, de la presente descripción.

En otras modalidades, las proteínas de armazón, por ejemplo, proteínas del lumen exosómicas, de la presente descripción se pueden producir in vitro, por ejemplo, usando una expresión libre de células tal como un sistema de reticulocitos, y posteriormente incorporarse en una VE, por ejemplo, exosoma, de la presente descripción. En otras modalidades, solo la porción polipeptídica de la proteína de armazón se produce in vitro, por ejemplo, en un sistema libre de células. En algunas modalidades, la porción polipeptídica de la proteína de armazón producida in vitro, por ejemplo, en un sistema libre de células se modifica posteriormente, por ejemplo, química o enzimáticamente, para incorporar un ancla de membrana (por ejemplo, un ácido mirístico de extremo N). En algunas modalidades, la proteína de armazón producida de forma semi in vitro (es decir, combinando el producto in vitro de la porción polipeptídica seguida de modificación química o enzimática) se incorpora posteriormente en una VE, por ejemplo, exosoma, de la presente descripción.

En algunas modalidades, los métodos que se describen en la presente memoria comprenden además la etapa de caracterizar las VE, por ejemplo, exosomas, que se incluyen en cada fracción recogida durante su producción y purificación. En algunas modalidades, el contenido de las VE, por ejemplo, exosomas, puede extraerse para su estudio y caracterización. En algunas modalidades, las VE, por ejemplo, exosomas, se aíslan y caracterizan por métricas que incluyen, de modo no taxativo, tamaño, forma, morfología o composiciones moleculares tales como ácidos nucleicos, proteínas, metabolitos y lípidos.

VII. Composiciones farmacéuticas y métodos de administración

La presente descripción también proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden VE (por ejemplo, exosomas) que se describen en la presente memoria que son adecuadas para la administración a un sujeto. Las composiciones farmacéuticas generalmente comprenden una pluralidad de VE (por ejemplo, exosomas) que comprenden al menos una carga útil, por ejemplo, una molécula con actividad biológica, unida de forma covalente o no covalente a la pluralidad de VE (por ejemplo, exosomas) y un excipiente o portador aceptable desde un punto de vista farmacéutico en una forma adecuada para la administración a un sujeto.

Los portadores o excipientes aceptables desde un punto de vista farmacéutico se determinan en parte mediante las composiciones particulares que se administran, así como mediante el método particular usado para administrar la composición. Por consiguiente, hay una amplia variedad de formulaciones adecuadas de composiciones farmacéuticas que comprenden una pluralidad de VE (por ejemplo, exosomas). (Véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa. 18.a ed. (1990)). Las composiciones farmacéuticas se formulan estériles generalmente y en pleno cumplimiento con todas las regulaciones de las buenas prácticas de fabricación (BPF) de la Administración de Medicamentos y Alimentos de Estados Unidos. En algunas modalidades, la composición farmacéutica comprende uno o más compuestos químicos, tales como, por ejemplo, moléculas pequeñas unidas de forma covalente a una VE (por ejemplo, exosoma) que se describe en la presente memoria.

En algunas modalidades, una composición farmacéutica comprende uno o más agentes terapéuticos o de diagnóstico y una VE (por ejemplo, exosoma) que se describe en la presente memoria. En determinadas modalidades, las VE (por ejemplo, exosomas) se administran conjuntamente con uno o más agentes terapéuticos o de diagnóstico adicionales, en un portador aceptable desde un punto de vista farmacéutico. En algunas modalidades, la composición farmacéutica que comprende la VE (por ejemplo, exosoma) se administra antes de la administración de los agentes terapéuticos o de diagnóstico adicionales. En otras modalidades, la composición farmacéutica que comprende la VE (por ejemplo, exosoma) se administra después de la administración de los agentes terapéuticos o de diagnóstico adicionales. En modalidades adicionales, la composición farmacéutica que comprende la VE (por ejemplo, exosoma) se administra al mismo tiempo que los agentes terapéuticos o de diagnóstico adicionales.

En la presente memoria se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden una VE (por ejemplo, exosoma) de la presente descripción que tiene el grado de pureza deseado y un portador o excipiente aceptable desde un punto de vista farmacéutico, en una forma adecuada para la administración a un sujeto. Los portadores o excipientes aceptables desde un punto de vista farmacéutico se determinan en parte mediante las composiciones particulares que se administran, así como mediante el método particular usado para administrar la composición. Por consiguiente, hay una gran variedad de formulaciones adecuadas de composiciones farmacéuticas que comprenden una multiplicidad de vesículas extracelulares. (Véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa. 21.a ed. (2005)). Las composiciones farmacéuticas se formulan estériles generalmente y en pleno cumplimiento con todas las regulaciones de las buenas prácticas de fabricación (BPF) de la Administración de Medicamentos y Alimentos de Estados Unidos.

Los portadores, excipientes o estabilizantes aceptables no son tóxicos para los receptores (por ejemplo, animales o humanos) en las dosificaciones y concentraciones empleadas e incluyen soluciones amortiguadoras tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencil amonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; alcohol fenólico, butílico o bencílico; alquilparabenos, tales como metil o propilparabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (inferior a aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como seroalbúmina, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos que incluyen glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; azúcares tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sales tales como sodio; complejos metálicos (por ejemplo, complejos de proteína-Zn) y/o tensioactivos no iónicos tales como TWEEN™, PLURONICS™ o polietilenglicol (PEG).

Los ejemplos de portadores o diluyentes incluyen, de modo no taxativo, agua, solución salina, soluciones de Ringer, solución de dextrosa y seroalbúmina humana al 5 %. El uso de tales medios y compuestos para sustancias farmacéuticamente activas es bien conocido en la técnica. Excepto en la medida en que cualquier medio o compuesto convencional sea incompatible con las vesículas extracelulares que se describen en la presente memoria, se contempla su uso en las composiciones. También se pueden incorporar agentes terapéuticos complementarios en las composiciones. Comúnmente, una composición farmacéutica se formula para que sea compatible con su vía de administración prevista. Las VE (por ejemplo, exosomas) de la presente descripción pueden administrarse por vía parenteral, tópica, intravenosa, oral, subcutánea, intraarterial, intradérmica, transdérmica, rectal, intracraneal, intraperitoneal, intranasal, intratumoral, intramuscular o como inhalantes. En determinadas modalidades, la composición farmacéutica que comprende VE (por ejemplo, exosomas) se administra por vía intravenosa, por ejemplo, mediante inyección. Las VE (por ejemplo, exosomas) se pueden administrar opcionalmente en combinación con otros agentes terapéuticos que son al menos parcialmente eficaces en el tratamiento de la enfermedad, trastorno o afección para los que están destinadas las VE (por ejemplo, exosomas).

Las soluciones o suspensiones pueden incluir los siguientes componentes: un diluyente estéril tal como agua, solución salina, aceites fijos, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros disolventes sintéticos; compuestos antibacterianos tales como alcohol bencílico o parabenos de metilo; antioxidantes tales como ácido ascórbico o bisulfito de sodio; compuestos quelantes tales como ácido etilendiaminotetraacético (EDTA); amortiguadores tales como acetatos, citratos o fosfatos y compuestos para el ajuste de la tonicidad tal como cloruro de sodio o dextrosa. El pH se puede ajustar con ácidos o bases, tales como ácido clorhídrico o hidróxido de sodio. La preparación puede incluirse en ampollas, jeringas desechables o múltiples viales de dosis hechos de vidrio o plástico.

Las composiciones farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones acuosas estériles (si son hidrosolubles) o dispersiones y polvos estériles. Para la administración intravenosa, los portadores adecuados incluyen solución salina fisiológica, agua bacteriostática, Cremophor EL™ (BASF, Parsippany, NJ) o solución salina tamponada con fosfato (PBS). La composición es generalmente estéril y fluida en la medida que puede inyectarse de forma fácil. El portador puede ser un disolvente o medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido y similares) y mezclas adecuadas de estos. La fluidez adecuada se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como una lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula en el caso de la dispersión y mediante el uso de tensioactivos. La prevención de la acción de microorganismos se puede lograr por medio de diversos compuestos antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal y similares. Si se desea, los compuestos isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbito y cloruro de sodio se pueden agregar a la composición. La absorción prolongada de las composiciones inyectables se puede lograr al incluir en la composición un compuesto que retrasa la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

Pueden prepararse soluciones inyectables estériles incorporando las VE (por ejemplo, exosomas) de la presente descripción en una cantidad eficaz y en un disolvente apropiado con uno o una combinación de los ingredientes enumerados en la presente memoria, según se desee. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando las VE (por ejemplo, exosomas) en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y cualquier otro ingrediente deseado. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos de preparación son el secado al vacío y el liofilizado que produce un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente adicional deseado de una solución previamente esterilizada filtrada de este. Las VE (por ejemplo, exosomas) se pueden administrar en forma de una inyección de depósito o preparación de implante que se puede formular de tal manera que permita una liberación sostenida o pulsátil de las VE (por ejemplo, exosomas).

La administración sistémica de las composiciones que comprenden VE (por ejemplo, exosomas) de la presente descripción también puede ser por medios transmucosos. Para la administración transmucosa, se usan en la formulación penetrantes adecuados para la barrera que se va a permear. Dichos penetrantes se conocen generalmente en la técnica e incluyen, por ejemplo, para la administración transmucosa, detergentes, sales biliares y derivados de ácidos fusídicos. La administración transmucosa se puede lograr a través del uso, por ejemplo, de aerosoles nasales.

En determinadas modalidades, la composición farmacéutica que comprende las VE (por ejemplo, exosomas) de la presente descripción se administra por vía intravenosa a un sujeto que se beneficiaría de la composición farmacéutica. En otras determinadas modalidades, la composición se administra al sistema linfático, por ejemplo, mediante inyección intralinfática o mediante inyección intranodal (véase, por ejemplo, Senti et ál., PNAS 105 (46): 17908 (2008)), o mediante inyección intramuscular, mediante administración subcutánea, por inyección intratumoral, por inyección directa en el timo o en el hígado.

En determinadas modalidades, la composición farmacéutica que comprende las VE (por ejemplo, exosomas) de la presente descripción se administra como una suspensión líquida. En determinadas modalidades, la composición farmacéutica se administra como una formulación que es capaz de formar un depósito después de la administración. En determinadas modalidades preferidas, el depósito libera lentamente las VE (por ejemplo, exosomas) a la circulación o permanece en forma de depósito.

Normalmente, las composiciones aceptables desde un punto de vista farmacéutico se purifican en gran medida para que estén libres de contaminantes, sean biocompatibles y no tóxicas, y sean adecuadas para la administración a un sujeto. Si el agua es un constituyente del portador, el agua se purifica y procesa en gran medida para que no contenga contaminantes, por ejemplo, endotoxinas.

El portador aceptable desde un punto de vista farmacéutico puede ser lactosa, dextrosa, sacarosa, sorbitol, manitol, almidón, goma arábiga, fosfato de calcio, alginatos, gelatina, silicato de calcio, celulosa microcristalina, polivinilpirrolidona, celulosa, agua, jarabe, metilcelulosa, metilhidroxibenzoato y propilhidroxibenzoatos, talco, estearato de magnesio y/o aceite mineral, pero no se limita a estos. La composición farmacéutica puede incluir además un lubricante, un agente humectante, un edulcorante, un potenciador del sabor, un agente emulsionante, un agente de suspensión y/o un conservante.

Las composiciones farmacéuticas que se describen en la presente memoria comprenden las VE (por ejemplo, exosomas) que se describen en la presente memoria y, opcionalmente, un agente terapéutico o farmacéuticamente activo y/o un agente de diagnóstico. El agente terapéutico puede ser un agente biológico, un agente de molécula pequeña o un agente de ácido nucleico. El agente de diagnóstico puede ser, por ejemplo, un reactivo de contraste.

Se proporcionan formas farmacéuticas que comprenden una composición farmacéutica que comprende las VE (por ejemplo, exosomas) que se describen en la presente memoria. En algunas modalidades, la forma farmacéutica se formula como una suspensión líquida para inyección intravenosa. En algunas modalidades, la forma farmacéutica se formula como una suspensión líquida para inyección intratumoral.

En determinadas modalidades, la preparación de las VE (por ejemplo, exosomas) de la presente descripción se somete a radiación, por ejemplo, rayos X, rayos gamma, partículas beta, partículas alfa, neutrones, protones, núcleos elementales, rayos Uv para dañar los ácidos nucleicos competentes para la replicación residuales.

En determinadas modalidades, la preparación de las VE (por ejemplo, exosomas) de la presente descripción se somete a irradiación gamma usando una dosis de irradiación de más de 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 o más de 100 kGy.

En determinadas modalidades, la preparación de las VE (por ejemplo, exosomas) de la presente descripción se somete a irradiación de rayos X usando una dosis de irradiación de más de 0,1, 0,5, 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000.

Las VE (por ejemplo, exosomas) de la presente descripción se pueden usar al mismo tiempo que otros fármacos. Para ser específicos, las VE (por ejemplo, exosomas) de la presente descripción pueden usarse junto con medicamentos tales como agentes terapéuticos hormonales, agentes quimioterapéuticos, agentes inmunoterapéuticos, medicamentos que inhiben la acción de factores de crecimiento celular o receptores de factores de crecimiento celular y similares.

VIII. Usos terapéuticos

La presente descripción proporciona métodos para tratar una enfermedad o afección en un sujeto que lo necesita, que comprenden administrar una composición que comprende VE (por ejemplo, exosomas) de la presente descripción al sujeto. La presente descripción también proporciona métodos para prevenir o mejorar los síntomas de una enfermedad o afección en un sujeto que lo necesita, que comprenden administrar una composición que comprende VE (por ejemplo, exosomas) de la presente descripción al sujeto. Además, se proporcionan métodos para diagnosticar una enfermedad o afección en un sujeto que lo necesita, que comprenden administrar una composición que comprende VE (por ejemplo, exosomas) de la presente descripción al sujeto. También se proporcionan VE (por ejemplo, exosomas) de la presente descripción para su uso en terapia, para su uso como medicamento, para su uso en el tratamiento de una enfermedad o afección en un sujeto que lo necesita, para su uso en la prevención o mejora de los síntomas de una enfermedad o afección en un sujeto que lo necesite, o para diagnosticar una enfermedad o afección en un sujeto que lo necesite.

En una modalidad, la enfermedad o trastorno es un cáncer, una enfermedad inflamatoria, un trastorno neurodegenerativo, una enfermedad del sistema nervioso central o una enfermedad metabólica.

La presente descripción también proporciona métodos para prevenir y/o tratar una enfermedad o trastorno en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar una VE (por ejemplo, exosoma) que se describe en la presente memoria al sujeto. En algunas modalidades, una enfermedad o trastorno que puede tratarse con los presentes métodos comprende un cáncer, enfermedad de injerto contra huésped (GvHD), enfermedad autoinmune, enfermedades infecciosas o enfermedades fibróticas. En algunas modalidades, el tratamiento es profiláctico. En otras modalidades, las VE (por ejemplo, exosomas) de la presente descripción se utilizan para inducir una respuesta inmunitaria. En otras modalidades, las VE (por ejemplo, exosomas) de la presente descripción se utilizan para vacunar a un sujeto. En algunas modalidades, la enfermedad o trastorno es un cáncer.

En algunas modalidades, la enfermedad o trastorno es una enfermedad infecciosa. En determinadas modalidades, la enfermedad o trastorno es un virus oncogénico. En algunas modalidades, las enfermedades infecciosas que pueden tratarse con la presente descripción incluyen, de modo no taxativo, virus del herpes gamma humano 4 (virus de Epstein Barr), virus de la gripe A, virus de la gripe B, citomegalovirus, Staphylococcus aureus, Mycobacterium tuberculosis, Chlamydia trachomatis, VIH-1, VIH-2, coronavirus (por ejemplo, MERS-CoV y SARS CoV), filovirus (por ejemplo, Marburg y Ébola), Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, especies de Plasmodia (por ejemplo, vivax y falciparum), virus Chikunga, Virus del papiloma humano (VPH), hepatitis B, hepatitis C, virus del herpes humano 8, virus del herpes simple 2 (HSV2), Klebsiella sp., Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus sp., Proteus sp., Enterobacter sp., Actinobacter sp., estafilococos negativos para la coagulasa (CoNS), Mycoplasma sp., o combinaciones de estos.

En algunas modalidades, las VE (por ejemplo, exosomas) se administran por vía intravenosa al sistema circulatorio del sujeto. En algunas modalidades, las VE (por ejemplo, exosomas) se infunden en un líquido adecuado y se administran en una vena del sujeto.

En algunas modalidades, las VE (por ejemplo, exosomas) se administran por vía intraarterial al sistema circulatorio del sujeto. En algunas modalidades, las VE (por ejemplo, exosomas) se infunden en un líquido adecuado y se administran en una arteria del sujeto.

En algunas modalidades, las VE (por ejemplo, exosomas) se administran al sujeto mediante administración intratecal. En algunas modalidades, las VE (por ejemplo, exosomas) se administran mediante una inyección en el canal espinal o en el espacio subaracnoideo para que llegue al líquido cefalorraquídeo (LCR).

En algunas modalidades, las VE (por ejemplo, exosomas) se administran por vía intratumoral en uno o más tumores del sujeto.

En algunas modalidades, las VE (por ejemplo, exosomas) se administran al sujeto mediante administración intratecal. En algunas modalidades, las VE (por ejemplo, exosomas) pueden insuflarse a través de la nariz en forma de administración tópica o sistémica. En determinadas modalidades, las VE (por ejemplo, exosomas) se administran en forma de aerosol nasal.

En algunas modalidades, las VE (por ejemplo, exosomas) se administran al sujeto mediante administración intraperitoneal. En algunas modalidades, las VE (por ejemplo, exosomas) se infunden en un líquido adecuado y se inyectan en el peritoneo del sujeto. En algunas modalidades, la administración intraperitoneal da como resultado la distribución de las VE (por ejemplo, exosomas) a los linfáticos. En algunas modalidades, la administración intraperitoneal da como resultado la distribución de las VE (por ejemplo, exosomas) al timo, bazo y/o médula ósea. En algunas modalidades, la administración intraperitoneal da como resultado la distribución de las VE (por ejemplo, exosomas) a uno o más ganglios linfáticos. En algunas modalidades, la administración intraperitoneal da como resultado la distribución de las VE (por ejemplo, exosomas) a uno o más del ganglio linfático cervical, el ganglio linfático inguinal, el ganglio linfático mediastínico o el ganglio linfático esternal. En algunas modalidades, la administración intraperitoneal da como resultado la distribución de las VE (por ejemplo, exosomas) al páncreas.

En algunas modalidades, las VE (por ejemplo, exosomas) se administran al sujeto mediante administración periocular. En algunas modalidades, las VE (por ejemplo, exosomas) se inyectan en los tejidos perioculares. La administración de fármacos periocular incluye las vías de administración subconjunctival, de subtenon anterior, de subtenon posterior y retrobulbar.

IX. Kits

La presente descripción también proporciona kits o productos de fabricación que comprenden una o más VE (por ejemplo, exosomas) de la presente descripción y, opcionalmente, instrucciones de uso. En algunas modalidades, el kit o producto de fabricación contiene una composición farmacéutica que se describe en la presente memoria que comprende al menos una VE (por ejemplo, exosoma) de la presente descripción e instrucciones de uso.

En algunas modalidades, el kit o producto de fabricación comprende al menos una VE (por ejemplo, exosoma) de la presente descripción o una composición farmacéutica que comprende las VE (por ejemplo, exosomas) en uno o más recipientes. Un experto en la técnica reconocerá fácilmente que las VE (por ejemplo, exosomas) de la presente descripción, la composición farmacéutica que comprende las VE (por ejemplo, exosomas) de la presente descripción o combinaciones de estos pueden incorporarse fácilmente en uno de los formatos de kit establecidos que son bien conocidos en la técnica.

En algunas modalidades, el kit o producto de fabricación comprende (i) VE (por ejemplo, exosomas), (ii) una o más cargas útiles, por ejemplo, moléculas con actividad biológica, (ii) reactivos para unir de forma covalente una o más cargas útiles, por ejemplo, moléculas con actividad biológica, a las VE (por ejemplo, exosomas), o (iv) cualquier combinación de estos, e instrucciones para realizar la reacción para unir de forma covalente una o más cargas útiles, por ejemplo, moléculas con actividad biológica a las VE (por ejemplo, exosomas).

En algunas modalidades, el kit comprende reactivos para conjugar una carga útil, por ejemplo, una molécula con actividad biológica con una VE (por ejemplo, exosoma), e instrucciones para realizar la conjugación.

La práctica de la presente descripción empleará, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de biología celular, cultivo celular, biología molecular, biología transgénica, microbiología, ADN recombinante e inmunología, que se encuentran dentro de los conocimientos de la técnica. Estas técnicas se explican completamente en la bibliografía. Véase, por ejemplo, Sambrook et ál., Ed. (1989) Molecular Cloning A Laboratory Manual (2.a ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press); Sambrook et ál., ed. (1992) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Cold Springs Harbor Laboratory, Ny ); D. N. Glover ed., (1985) Dn A Cloning, Volúmenes I y II; Gait, ed. (1984) Oligonucleotide Synthesis; Mullis et ál. patente estadounidense n.° 4.683.195; Hames y Higgins, eds. (1984) Nucleic Acid Hybridization; Hames y Higgins, eds. (1984) Transcription And Translation; Freshney (1987) Culture Of Animal Cells (Alan R. Liss, Inc.); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press) (1986); Perbal (1984) A Practical Guide To Molecular Cloning; the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Miller y Calos eds. (1987) Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells, (Cold Spring Harbor Laboratory); Wu et ál., eds., Methods In Enzymology, Vols. 154 y 155; Mayer y Walker, eds. (1987) Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Academic Press, Londres); Weir y Blackwell, eds., (1986) Handbook Of Experimental Immunology, Volúmenes I-IV; Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1986);); Crooke, Antisense drug Technology: Principles, Strategies and Applications, 2.a Ed. CRC Press (2007) y en Ausubel et ál. (1989) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, Baltimore, Md.).

SECUENCIAS

continuación

continuación

continuación

continuación

continuación

continuación

continuación

continuación

continuación

EJEMPLOS

Los siguientes ejemplos se presentan para proporcionar a los expertos en la técnica una divulgación y descripción completas de cómo hacer y utilizar la presente descripción, y no pretenden limitar el alcance de lo que los inventores consideran su descripción ni tienen la intención de representar que los experimentos a continuación son todos o los únicos experimentos realizados. Se han realizado esfuerzos por asegurar la precisión con respecto a los número usados (por ejemplo, cantidades, temperatura, etc.) pero algunos errores experimentales y desviaciones deben contabilizarse.

A menos que se indique de otro modo, las partes son partes en peso, el peso molecular es el peso molecular promedio, la temperatura es en grados Celsius y la presión es la atmosférica o cerca de esta. Se pueden usar abreviaturas estándar, por ejemplo, pb, par/es de bases; kb, kilobase/s; pl, picolitro/s; s o seg, segundo/s; min, minuto/s; h o hr, hora/s; aa, aminoácido/s; nt, nucleótido/s y similares.

La práctica de la presente descripción empleará, a menos que se indique lo contrario, métodos convencionales de química de proteínas, bioquímica, técnicas de ADN recombinante y farmacología, dentro de los conocimientos de la técnica. Estas técnicas se explican en su totalidad en la bibliografía. Véase, por ejemplo, T.E. Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W.H. Freeman and Company, 1993); AL. Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., edición actual); Sambrook, et ál., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2.a edición, 1989); Methods In Enzymology (S. Colowick y N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.); Pharmaceutical Sciences de Remington, 21.a edición (Easton, Pensilvania: Mack Publishing Company, 2005); Carey y Sundberg Advanced Organic Chemistry 3.a Ed. (Plenum Press) Volúmenes A y B (1992).

Ejemplo 1

identificación de un secuencia proteica mínima suficiente para cargar cargas útiles exosómicas luminales Para identificar la secuencia mínima de aminoácidos de BASP1 entre el truncamiento de doce aminoácidos que facilitó la carga y el truncamiento de seis aminoácidos que no pudo facilitar la carga como se muestra anteriormente, los mutantes de truncamiento individuales del extremo N de BASP1 se fusionaron con una etiqueta FLAG® y se generaron y expresaron GFP de forma estable en células HEK293SF (FIG. 1A). Se purificaron exosomas a partir de cultivos celulares estables como se describió anteriormente. Las secuencias de BASP1 de siete a doce aminoácidos fueron capaces de cargar GFP en exosomas a una gran densidad, mientras que no lo hicieron los primeros seis aminoácidos (FIG. 1B). Estos datos demuestran que se requiere al menos un residuo de lisina después de la posición seis para la carga luminal de exosomas con el extremo N de BASP1, es decir, para la unión a la superficie luminal del exosoma.

La serina en la posición 6 de BASP1 está muy conservada en las especies y en MARCKS y MARCKSL1. Para determinar si este aminoácido se requirió para cargar la carga útil en los exosomas, las células HEK293SF se transfectaron de forma estable con los plásmidos de expresión que codifican BASP1 1 a 30- FLAG®-GFP o BASP1 1 a 30- FLAG®-GFP incluido un mutante puntual, que reemplazan la serina seis con ácido aspártico (S6D; sustitución con carga polar) o alanina (S6A; sustitución no polar pequeña). Además, la lisina en la posición cinco se mutó en un ácido glutámico (L5Q) para probar el posible papel de esta posición en la modulación de la miristoilación, palmitoilación y otras funciones de la membrana de varias proteínas asociadas a la membrana (Gottlieb-Abraham et ál., Mol. Biol. Cell. 1 de diciembre de 2016;27(24):3926-3936) (FIG. 2A). BASP1 S6D anuló completamente la carga de GFP en los exosomas, mientras que S6A no alteró la carga. BASP1 L5Q tampoco impactó en la carga luminal, lo que indica que una carga negativa en la posición seis interrumpe la carga, mientras que una sustitución de aminoácidos polar en la posición cinco se tolera bien (FIG. 2B).

Los primeros treinta aminoácidos de BASP1 contienen la secuencia líder de extremo N que se identificó anteriormente, seguida de un tramo de aminoácidos rico en lisina. Para comprender si los extremos N de MARCKS y MARCKSL1 pueden cargar exosomas de forma similar a BASP1, las células HEK293SF se transfectaron de forma estable con proteínas de longitud completa de MARCKS y MARCKSL1 o aminoácidos 1 a 30 fusionados a FLAG®-GFP. Los exosomas purificados se analizaron mediante SDS PAGE y tinción con COOMASSIE® para determinar la extensión de la carga. MARCKS y MARCKSL1 de longitud completa pudieron cargar exosomas con GFP, pero los aminoácidos 1 a 30 fueron inferiores a las proteínas de longitud completa, lo que sugiere que no hubo características de secuencia o estructurales adicionales en las regiones distales de las proteínas MARCKS y MARCKSL1 requeridas para la carga (FIG. 3). El análisis de secuencia de MARCKS y MARCKSL1 reveló regiones con homología de secuencia potencial con el extremo N de BASP1.

Los aminoácidos 152 a 173 de MARCKS y 87 a 110 de MARCKSL1 son ricos en lisina con restos de fenilalanina y serina intercalados y se predice que son dominios del sitio de fosforilación (PSD) o dominios efectores (DE) (FIG. 4). Las células HEK293SF se transfectaron de forma estable con construcciones de plásmido que se fusionan a los aminoácidos 1 a 3 de MARCKS al dominio PSD (MG-PSD). Se generaron mutaciones puntuales individuales en el sito de miristoilación previsto (MA-PSD) y la posición seis (K6S y K6A) para determinar el papel de estos residuos en la carga de exosomas (FIG. 5A). La transferencia de Western de exosomas purificados demostró que en comparación con el control positivo de BASP1 1 a 30, ni MG-PSD ni MA-PSD pudieron cargar eficientemente los exosomas. Curiosamente, las mutaciones K6A y K6S condujeron a mejoras en la carga, lo que sugiere que una carga positiva en la posición 6 evita la carga de una carga útil exosómica y que el PSD de MARCKS podría complementar funcionalmente la secuencia de extremo N endógena (FIG. 5B). Juntos, estos estudios permitieron la identificación de varios motivos suficientes para cargar una carga útil en los exosomas (FIG. 6).

El motivo más estrecho, el Motivo 1, permite una secuencia de proteína de (M)(G)(G/A/S)(K/Q)(L/F/S/Q)(S/A)(K)(K) (SEQ ID NO: 118) o (G)(G/A/S)(K/Q)(L/F/S/Q)(S/A)(K)(K) (SEQ ID NO: 202) sin la primera Met, donde cada letra o grupo de letras entre paréntesis es una posición del aminoácido y donde la posición cinco de forma adicional no puede ser un aminoácido con carga positiva (K/R/H) y la posición seis no puede ser un aminoácido con carga negativa (D/E).

Los submotivos del Motivo 1 incluyen, de modo no taxativo, las secuencias de proteínas:

(M)(G)(G)(K/Q)(L/F/S/Q)(S/A)(K)(K) (SEQ ID NO: 180),

(G)(G)(K/Q)(L/F/S/Q)(S/A)(K)(K) (SEQ ID NO: 191)

(M)(G)(A)(K/Q)(L/F/S/Q)(S/A)(K)(K) (SEQ ID NO: 181),

(G)(A)(K/Q)(L/F/S/Q)(S/A)(K)(K) (SEQ ID NO: 192),

(M)(G)(S)(K/Q)(L/F/S/Q)(S/A)(K)(K) (SEQ ID NO: 182),

(G)(S)(K/Q)(L/F/S/Q)(S/A)(K)(K) (SEQ ID NO: 193),

(M)(G)(G/A/S)(K)(L/F/S/Q)(S/A)(K)(K) (SEQ ID NO: 183),

(G)(G/A/S)(K)(L/F/S/Q)(S/A)(K)(K) (SEQ ID NO: 194),

(M)(G)(G/A/S)(Q)(L/F/S/Q)(S/A)(K)(K) (SEQ ID NO: 184),

(G)(G/A/S)(Q)(L/F/S/Q)(S/A)(K)(K) (SEQ ID NO: 195),

(M)(G)(G/A/S)(K/Q)(L)(S/A)(K)(K) (SEQ ID NO: 185),

(G)(G/A/S)(K/Q)(L)(S/A)(K)(K) (SEQ ID NO: 196),

(M)(G)(G/A/S)(K/Q)(F)(S/A)(K)(K) (SEQ ID NO: 186),

(G)(G/A/S)(K/Q)(F)(S/A)(K)(K) (SEQ ID NO: 197),

(M)(G)(G/A/S)(K/Q)(S)(S/A)(K)(K) (SEQ ID NO: 187),

(G)(G/A/S)(K/Q)(S)(S/A)(K)(K) (SEQ ID NO: 198),

(M)(G)(G/A/S)(K/Q)(Q)(S/A)(K)(K) (SEQ ID NO: 188),

(G)(G/A/S)(K/Q)(Q)(S/A)(K)(K) (SEQ ID NO: 199),

(M)(G)(G/A/S)(K/Q)(L/F/S/Q)(S)(K)(K) (SEQ ID NO: 189),

(G)(G/A/S)(K/Q)(L/F/S/Q)(S)(K)(K) (SEQ ID NO: 200),

(M)(G)(G/A/S)(K/Q)(L/F/S/Q)(A)(K)(K) (SEQ ID NO: 190), y

(G)(G/A/S)(K/Q)(L/F/S/Q)(A)(K)(K) (SEQ ID NO: 201),

donde la posición cinco no puede ser un aminoácido con carga positiva (K/R/H) y la posición seis no puede ser un aminoácido con carga negativa (D/E).

El Motivo 2, un motivo más amplio, se puede expresar como (M)(G)(n)(^)(0/n)(S/A/G/N)(+)(+) o (G)(n)(^)(0/n)(S/A/G/N)(+)(+) sin la primera Met, donde cada posición entre paréntesis representa un aminoácido, y donde n es cualquier aminoácido que se selecciona del grupo que consiste en (Pro, Gly, Ala, Ser), ^ es cualquier aminoácido que se selecciona del grupo que consiste en (Asn, Gln, Ser, Thr, Asp, Glu, Lys, His, Arg), Ó es cualquier aminoácido que se selecciona del grupo que consiste en (Val, Ile, Leu, Phe, Trp, Tyr, Met), y (+) es cualquier aminoácido que se selecciona del grupo que consiste en (Lys, Arg, His); y donde la posición cinco no es (+) y la posición seis no es (+) ni (Asp o Glu). Véase R. Aasland et ál., FEBS Letters 513 (2002): 141 a 144 para la nomenclatura de aminoácidos.

El Motivo 3, el motivo más amplio, se puede expresar como (M)(G)(n)(X)(Ó/n)(n)(+)(+) o (G)(n)(X)(Ó/n)(n)(+)(+) sin la primera Met, donde cada posición entre paréntesis representa un aminoácido, y donde n es cualquier aminoácido que se selecciona del grupo que consiste en (Pro, Gly, Ala, Ser), X es cualquier aminoácido, Ó es cualquier aminoácido que se selecciona del grupo que consiste en (Val, Ile, Leu, Phe, Trp, Tyr, Met), y (+) es cualquier aminoácido que se selecciona del grupo que consiste en (Lys, Arg, His); y donde la posición cinco no es (+) y la posición seis no es (+) ni (Asp o Glu). En todos los casos de los Motivos 1 a 3, la secuencia puede truncarse por un aminoácido para que sean siete aminoácidos totales de longitud (es decir, que consiste en aminoácidos 1 a 7 en el orden que se presenta en los Motivos 1 a 3). Se puede usar cualquiera de las secuencias derivadas de cualquiera de los Motivos 1, 2 o 3 (o estos motivos que carecen del aminoácido 7) para cargar una carga útil en los exosomas en la misma medida que BASP1 de longitud completa o en comparación con esta, o secuencias de truncamiento naturales de BASP1. Este análisis profundo de secuencia de aminoácidos-estructura-función proporciona nuevas perspectivas de los requisitos para dirigir la carga útil expresada de forma biológica hacia los exosomas mediante células productoras.

Ejemplo 2

El extremo N de BASP1 es suficiente para cargar diversas clases de proteínas

Los resultados del Ejemplo 1 sugieren que el extremo N de BASP1 puede ser un armazón de modificación útil para generar exosomas con carga luminal directamente a partir de células productoras. Para probar esta hipótesis, se generaron células HEK293SF estables para expresar la proteína Cas9 de longitud completa con optimización de codones (como se describe en Zetsche B, Volz SE, Zhang F. A split-Cas9 architecture for inducible genome editing and transcription modulation. Nat Biotechnol. Febrero de 2015;33(2):139-42) fusionado a aminoácidos 1 a 30 o 1 a 10 de BASP1. Los exosomas se purificaron a partir del cultivo celular como se describió anteriormente y se analizó mediante SDS-PAGE y transferencia de Western usando un anticuerpo contra Cas9 (Abcam; Catálogo # ab191468, clon 7A9-3A3). Como se muestra en la FIG. 7A, tanto BASP1 1 a 30 como 1 a 10 fueron suficientes para cargar Cas9 en los exosomas. La proteína Cas9 recombinante se usó como un control positivo para la transferencia de Western. La cuantificación por densitometría y la comparación de varias cantidades de Cas9 recombinante y los carriles de exosomas de BASP1-Cas9 de los experimentos de transferencia de Western revelaron que los exosomas se cargaron con 4 a 5 moléculas Cas9 por exosoma (FIG. 7B). Esta enzima Cas9, que es de ~160 kDa en masa, representa un aumento considerable en el tamaño de la carga útil en comparación con los experimentos de GFP que se mostraron anteriormente.

Como validación adicional de la diversidad de proteínas de carga útil que se pueden cargar como una fusión al extremo N de BASP1, la ovoalbúmina se expresó de manera estable en las células HEK293SF como una fusión con los aminoácidos 1 a 10 de BASP1 ("BASP1(1 a 10)-OVA"). Se cotransfectó una línea celular separada con el mismo plásmido y un segundo plásmido que codifica el CD40L trimérico fusionado a una glicoproteína de superficie específica para el exosoma PTGFRN ("3xCD40L-PTGFRN") mediante el uso de un segundo marcador seleccionable. Los exosomas se purificaron a partir de los dos cultivos de células transfectadas y se analizaron mediante SDS-PAGE (FIG. 8A) y transferencia de western contra la ovoalbúmina (Abcam; Catálogo # ab17293, clon 6C8) (FIG. 8B). Como control, la ovoalbúmina recombinante (InvivoGen; Catalog # vac-pova) se valoró en un gel separado. La ovoalbúmina se cargó enérgicamente en los exosomas cuando se fusiona con los aminoácidos 1 a 10 de BASP1 como una única construcción o cuando está en combinación con un plásmido de sobreexpresión adicional (3xCD40L-PTGFRN). Este resultado demuestra que los exosomas se pueden modificar de forma combinatoria, tanto con una carga útil luminal como con una carga útil de superficie simultánea (por ejemplo, PTGFRN) de una transcripción separada.

Otra clase de proteínas que puede ser útil en el contexto de exosomas terapéuticos son anticuerpos y fragmentos de anticuerpos. Un nanocuerpo de camélido de cadena única que se dirige a GFP (como se describe en Caussinus E, Kanca O, Affolter M. Fluorescent fusión protein knockout mediated by anti-GFP nanobody. Nat Struct Mol Biol. 11 de diciembre de 2011; 19(1):117-21) se expresó de forma estable en las células HEK293SF como una proteína de fusión a los aminoácidos 1 a 10 de BASP1 y una etiqueta FLAG® ("BASP1(1 a 10)-Nanocuerpo") o una etiqueta FLAG® sola ("Nanocuerpo") (FIG. 9A). Los exosomas purificados se analizaron mediante SDS-PAGE y transferencia de Western anti-FLAG®, lo que demuestra que hubo un enriquecimiento sustancial del nanocuerpo con cantidades iguales de proteína cargada total cuando el nanocuerpo se fusionó al extremo N de BASP1 (FIG. 9B). Estos resultados demuestran que las cargas útiles de proteínas de diversas clases pueden expresarse y empaquetarse en exosomas por medio de las células productoras utilizando una secuencia de proteínas muy corta derivada del extremo N de BASP1, es decir, un armazón.

Ejemplo 3

El extremo N de BASP1 se puede utilizar para cargar ácidos nucleicos en el lumen de los exosomas

Los ácidos nucleicos, y en particular los ARN (por ejemplo, ARNm, ARNip, microARN) son una clase atractiva de carga útil terapéutica que se cargará en el lumen de los exosomas terapéuticos. La carga exosómica de ARN puede proteger al a Rn de la degradación en el entorno extracelular y el exosoma cargado puede dirigirse a determinadas células y/o tejidos mediante niveles adicionales de ingeniería de exosomas, por ejemplo, expresión superficial de una construcción de direccionamiento. Para comprender si las proteínas (o fragmentos de proteínas) de VE, por ejemplo, exosoma, identificadas anteriormente, se puede usar para generar exosomas cargados de ARNm, se generaron exosomas modificados por ingeniería combinatoria. Como se muestra en la FIG. 10, los aminoácidos 1 a 30 de BASP1 se expresaron en función de FLAG® y variantes de la proteína de fagos MCP. El MCP reconoce y se une a un bucle de tallo de ARNm llamado MS2, que se puede expresar como una fusión transcripcional a ARNm y otros ARN, lo que conduce, por ende, a la asociación física entre las proteínas de fusión MCP y los ARN de fusión MS2 de interés. El análisis mutacional identificó previamente dos posiciones en MCP que aumenta la afinidad a MS2; una sustitución de valina a isoleucina en la posición 29 (V29I; Lim y Peabody, RNA. Nucleic Acids Res. 11 de septiembre de 1994;22(18):3748-52) y una sustitución de asparagina a lisina en la posición 55 (N55K; Lim et ál., J Biol Chem. 25 de marzo de 1994;269(12):9006-10). BASP1 1 a 30 se fusionó a variantes monoméricas o diméricas MCP, donde cada MCP fue V29I o V29I/N55K doblemente mutado. Una construcción indicadora de luciferasa se expresó como una fusión a 3 bucles de tallo MS2 de un plásmido separado. Se generaron cinco líneas celulares HEK293SF estables, ya sea Luciferasa-MS2 solo (#811) o en combinación con cada una de las variantes de BASP1-MCP (#815, 817, 819 o 821) (FIG. 10). Como un control adicional, las células HEK293SF se transfectaron de forma estable con BASP1 1 a 27 etiquetado con FLAG. Se aislaron los exosomas y se trataron con BENZONASE® para quitar cualquier ARN asociado de forma externa y se purificaron de acuerdo con los métodos anteriores. Los exosomas purificados se analizaron mediante SDS-pAg E (FIG. 11A) y transferencia de Western anti-FLAG® (FIG. 11B), lo que demuestra cantidades iguales de proteína total y niveles comparables de fusiones de BASP1-FLAG® en cada preparación de exosomas. Lo que es más importante, las fusiones de BASP1-MCP se expresaron a niveles comparables como una fusión de BASP1 1 a 27 FLAG que carece de una proteína MCP, lo que demuestra que la adición de monómeros o dímeros de MCP no interrumpe la carga mediada por BASP1 de proteínas en exosomas.

Las células que expresan de forma estable el BASP1-MCP y el ARNm de Luciferasa-MS2 se aislaron y se cuantificó la ARNm de luciferasa total mediante RT-qPCR (Cebador directo: 5'-TGGAGGTGCTCAAAGAGTTG-3' (SEQ ID NO: 119); Cebador inverso: 5'-TT GGGCGTGCACTTGAT-3' (SEQ ID NO: 120); SONDA: 5'-/56-FAM/CAGCTTTCC/ZEN/GGGCATTGGCTTC/3IABkFQ/-3' (SEQ ID NO: 121)). Las células no transfectadas expresaron niveles más bajos de Luciferasa que todas las células que expresan 811, que expresaron niveles comparables de Luciferasa (FIG. 12A, parte superior). Los exosomas purificados de cada línea celular estable también se analizaron mediante RT-qPCR. Los exosomas nativos no tuvieron niveles detectables de Luciferasa MS2, mientras que las células que expresan 811 solas tuvieron niveles detectables pero muy bajos de Luciferasa MS2. Lo que es más importante, cada una de las proteínas de fusión de BASP1-MCP contenía mayores cantidades de ARNm de Luciferasa-MS2, lo que demuestra la importancia de la unión entre MCP y MS2 para facilitar la carga del ARNm en los exosomas (FIG. 12A, parte inferior). La cuantificación de ARNm relativa entre los grupos demostró un enriquecimiento de ~30 a 60 veces para todas las fusiones de BASP1-MCP por encima de 811 solo (FIG. 12B). La construcción 821 de BASP1-MCP, que incluyó MCP V29I/N55K dimérico está previsto para que tenga la afinidad más grande para los ARNm de MS2 y de hecho incluyó la cantidad más grande de Luciferasa-MS2 en este experimento. Estos resultados demuestran que los fragmentos de BASP1 son proteínas de armazón robustas y versátiles para cargar el lumen de los exosomas con diversas cargas útiles, incluidos los ácidos nucleicos.

Ejemplo 4

BASP1, MARCKS y MARCKSL1 se pueden usar para generar exosomas decorados en la superficie

Los resultados de los experimentos anteriores demuestran que las regiones de extremo N y longitud completa de MARCKS, MARCKSL1 y BASP1 pueden usarse para generar exosomas con carga luminal. Para explorar adicionalmente el potencial de estas proteínas para modificar exosomas, los aminoácidos 1 a 30 de MARCKS, MARCKSL1 y BASP1, o los aminoácidos 1 a 10 de BASP1 se fusionaron a la región transmembrana endógena de CD40L expresado como un homotrímero. Las construcciones se prepararon para secuencias humanas y de ratón de CD40L porque los ligandos no tienen reacción cruzada con el receptor afín en las otras especies (FIG. 13). Los exosomas se purificaron a partir de células HEK293SF transfectadas de forma estable con una de las construcciones de expresión de CD40L y se incubaron en los linfocitos B de ratón y humanos. Las cantidades de CD40L de entrada en los exosomas se cuantificaron mediante ELISA CD40L (para la medición de CD40L humano, R&D Systems, Catálogo # DCDL40, lote # P168248, y se usaron para la medición de CD40L de ratón, Abcam, Catálogo # ab119517, lote # GR3218850-2), los linfocitos B se cuantificaron usando un marcador de linfocitos B, CD19, y se midió la activación de linfocitos B mediante el porcentaje de células separadas positivas para CD69. Las curvas de titulación de dosis de CD40L exosómico, de ratón (FIG. 14A) o humano (FIG. 14B) en cultivos emparejados por especie mostraron actividad comparable entre las construcciones de partícula-partícula (gráficas de la izquierda y tabla que sigue a continuación) o en comparación entre sí y cantidades iguales de proteína recombinante en base molar de CD40L (gráficas de la derecha y la tabla que sigue a continuación). Se observó una actividad comparable cuando las construcciones de CD40L también se expresaron como monómeros, y fueron solo ligeramente menos potentes que el CD40L trimérico expresado en el extremo N de PTGFRN, un armazón de presentación de exosomas de alta densidad (véase, por ejemplo, la solicitud de patente internacional n.° PCT/US2018/048026) (FIG. 14C). Estos resultados demuestran que MARCKS, MARCKSL1 y BASP1 son armazones diversos y robustos útiles para la generación de diversas clases de exosomas modificados para su uso en aplicaciones humanas y animales.

Ejemplo 5

Tipos de células diversas expresan BASP1, MARCKS y/o MARCKSL1

Las líneas celulares de diferentes tejidos de origen (HEK293, riñón; HT1080, tejido conectivo; K562, médula ósea; MDA-MB-231, mama; Raji, linfoblasto) se cultivaron hasta la fase logarítmica y se transfirieron a medios complementados con suero con reducción de exosoma durante ~6 días excepto para las células HEK293, que se cultivaron en medios definidos de forma química. Las células madre mesenquimales (MSC) derivadas de la médula ósea se cultivaron en microportadores 3D durante cinco días y se complementaron en medios sin suero durante tres días. El sobrenadante de cada cultivo de línea celular se aisló y los exosomas se purificaron usando el método de ultracentrifugación de gradiente por densidad OPTIPREP™ que se describió anteriormente. Cada una de las preparaciones de exosomas purificados se analizó mediante LC-MS/MS como se describió anteriormente, y se cuantificó el número de coincidencias del espectro de péptidos (PSM) para BASP1, MARCKS y MARCKSL1 y dos proteínas de VE ampliamente estudiadas, por ejemplo, exosómicas (CD81 y CD9). Las tetraspaninas CD81 y CD9 fueron detectables en la mayoría de las poblaciones de exosomas purificados, pero fueron, en algunos casos, iguales o inferiores a la VE luminal, por ejemplo, exosomas, proteínas (por ejemplo, comparar CD9 con BASP1 o MARCKSL1) (FIG. 15). Este hallazgo indica que los marcadores de exosomas luminales recientemente identificados pueden ser proteínas de fusión adecuadas para generar exosomas modificados a partir de varias líneas celulares no relacionadas de diferentes tejidos.

Ejemplo 6

Células no humanas que sobreexpresan BASP1 producen exosomas modificados de forma luminal

Los resultados en el Ejemplo 5 demuestran que numerosas células derivadas humanas expresan naturalmente BASP1 y las otras VE nuevas. Para determinar si BASP1 puede usarse como una proteína de armazón de exosoma universal, se transfectaron de manera estable células de ovario de hámster chino (CHO) con un plásmido que expresa BASP1 de longitud completa fusionado con una etiqueta FLAG® y GFP ("BASP1-GFP-FLAG"), un plásmido que expresa los aminoácidos 1 a 30 de BASP1 fusionado a una etiqueta FLAG® y GFP ("BASP1(1 a 30)-g Fp -FLAG") o un plásmido que expresa los aminoácidos 1 a 8 de BASP1 fusionado a una etiqueta FlAG® y GFP ("BASP1(1 a 8) -GFP-FLAG"). Los exosomas se purificaron a partir de células CHO de tipo salvaje y las células CHO transfectadas con uno de los tres plásmidos BASP1. Como se muestra en las FIG. 16A-B, BASP1 y las proteínas de fusión del fragmento BASP1 se sobreexpresaron con éxito en las células CHO y se cargaron en exosomas según se detecta mediante PAGE sin tinción (FIG. 16A) y transferencia de Western con un anticuerpo contra FLAG® (FIG. 16B). Este resultado demuestra que las células no humanas pueden producir exosomas que sobreexpresan fragmentos BASP1 humanos y que esta sobreexpresión puede conducir a una proteína de carga útil hacia el lumen de exosomas a gran densidad. Este resultado indica que BASP1 es una proteína de armazón universal para generar exosomas modificados a partir de muchos tipos y especies de células diferentes.

La presente descripción se ha descrito anteriormente con la ayuda de componentes básicos funcionales que ilustran la implementación de funciones específicas y sus relaciones. Los límites de estos componentes básicos funcionales se han definido arbitrariamente en la presente memoria por conveniencia de la descripción. Los límites alternativos se pueden definir siempre que las funciones especificadas y las relaciones de estas se lleven a cabo de forma adecuada.

Equivalentes

La presente descripción proporciona, entre otras cosas, composiciones de VE, por ejemplo, exosomas que contienen

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una vesícula extracelular (VE) aislada que comprende una molécula con actividad biológica unida a una proteína de armazón,

donde la proteína de armazón comprende un dominio de extremo N (DN) y un dominio efector (DE),

donde el DN está asociado con la superficie luminal de la VE y el DE está asociado con la superficie luminal de la VE, donde el DN comprende la secuencia de aminoácidos GGKLSK (SEQ ID NO: 203), pero no comprende una metionina (Met) en el extremo N,

donde el DE comprende una lisina (Lys) en su extremo N que se une directamente a la lisina en el extremo C de la SEQ ID NO: 203 en el DN; y

donde la molécula biológicamente activa comprende una o más proteínas heterólogas fusionadas con el extremo C de la proteína de armazón.

2. La VE de la reivindicación 1, donde el DE comprende KK, KKK, KKKK (SEQ ID NO: 151), KKKKK (SEQ ID NO: 152), o cualquier combinación de estos.

3. La VE de la reivindicación 1 o 2, donde la proteína de armazón se une a la molécula biológicamente activa por un enlazador.

4. La VE de la reivindicación 3, donde el enlazador comprende un enlazador escindible.

5. La VE de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde la proteína de armazón comprende GGKLSKKK (SEQ ID NO: 161) o GGKLSKKS (SEQ ID NO: 162).

6. La VE de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde la proteína de armazón es de al menos aproximadamente 8 aminoácidos de longitud.

7. La VE de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde la molécula con actividad biológica está en la superficie luminal o en el lumen de la VE.

8. La VE de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde la proteína de armazón comprende además:

(i) un dominio transmembrana,

(ii) un dominio extravesicular o

(iii) tanto (i) como (ii).

9. La VE de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde la proteína de armazón comprende además un dominio transmembrana y un dominio extravesicular y:

(i) el dominio transmembrana se encuentra entre el dominio DE de la proteína de armazón y la molécula con actividad biológica, y

(ii) la molécula con actividad biológica está unida al dominio extravesicular.

10. La VE de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, donde la molécula con actividad biológica comprende:

(a) una proteína, donde la proteína comprende opcionalmente

(i) un péptido recombinante, un péptido natural, un péptido sintético, un anticuerpo, una proteína de fusión o cualquier combinación de estos;

(ii) una enzima, una citocina, un ligando, un receptor, un factor de transcripción o una combinación de estos;

(iii) un receptor de linfocitos T (TCR), un correceptor de linfocitos T, un complejo principal de histocompatibilidad (MHC), un antígeno leucocitario humano (HLA) o un derivado de estos;

(iv) un antígeno tumoral que se selecciona del grupo que consiste en alfa-fetoproteína (AFP), antígeno carcinoembrionario (CEA), antígeno tumoral epitelial (eTa ), mucina 1 (MUC1), Tn-MUC1, mucina 16 (MUC16), tirosinasa, antígeno asociado a melanoma (MAGE), proteína tumoral p53 (p53), CD4, CD8, CD45, CD80, CD86, ligando de muerte programada 1 (PD-L1), ligando de muerte programada 2 (p D-L2), NY-ESO-1, PSMA, TAG-72, HER2, GD2, cMET, EGFR, mesotelina, v Eg FR, receptor de alfa-folato, CE7R, IL-3, antígeno de cáncer de testículo, MART-1 gp100 y ligando inductor de apoptosis relacionado con TNF;

(b) un polipéptido;

(c) un péptido;

(d) un polinucleótido (ADN y/o ARN);

(e) un compuesto químico;

(f) un virus, donde el virus comprende opcionalmente un virus adenoasociado, un parvovirus, un retrovirus, un adenovirus o cualquier combinación de estos;

(g) un ionóforo;

(h) un portador para un ionóforo;

(i) un resto que forma un canal o un poro; o

(j) cualquier combinación de estos.

11. La VE de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, donde la VE comprende además una segunda proteína de armazón donde la segunda proteína de armazón comprende opcionalmente un polipéptido PTGFRN, un polipéptido BSG, un polipéptido IGSF2, un polipéptido IGSF3, un polipéptido IGSF8, un polipéptido ITGB1, un polipéptido ITGA4, un polipéptido SLC3A2, un polipéptido transportador de a Tp , un polipéptido de la aminopeptidasa N (ANPEP), un polipéptido del miembro 1 de la familia de pirofosfatasa/fosfodiesterasa de ectonucleótidos (ENPP1), un polipéptido de neprilisina (MME), un polipéptido de neuropilina 1 (NRP1) o un fragmento de estos.

12. La VE de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, donde la molécula con actividad biológica es:

(a) un inhibidor de un regulador de punto de control negativo o un inhibidor de un socio de unión de un regulador de punto de control negativo, donde el regulador de punto de control negativo se selecciona del grupo que consiste en:

(i) proteína 4 asociada a linfocitos T citotóxicos (CTLA-4),

(ii) proteína 1 de muerte celular programada (PD-1),

(iii) gen 3 activado por linfocitos (LAG-3),

(iv) proteína 3 que contiene mucina de inmunoglobulina de linfocitos T (TIM-3),

(v) atenuador de linfocitos B y T (BTLA),

(vi) inmunorreceptor de linfocitos T con dominios Ig e ITIM (TIGIT),

(vii) supresor Ig de dominio V de la activación de linfocitos T (VISTA),

(viii) receptor de adenosina A2a (A2aR),

(ix) receptor similar a inmunoglobulina de células asesinas (KIR),

(x) indolamina 2,3-dioxigenasa (IDO),

(xi) CD20,

(xii) CD39 y

(xiii) CD73;

(b) una proteína inmunogénica;

(c) una toxina, toxoide o un mutante no tóxico de una toxina, donde

(i) la toxina es opcionalmente una toxina diftérica, o

(ii) la toxina es opcionalmente un toxoide tetánico;

(d) un activador de una molécula coestimuladora positiva o un activador de una pareja de unión de una molécula coestimuladora positiva, donde la molécula coestimuladora positiva se selecciona opcionalmente del grupo que consiste en:

(i) un miembro de la superfamilia del receptor de TNF opcionalmente seleccionado del grupo que consiste en: CD120a, CD120b, CD18, OX40, CD40, receptor Fas, M68, CD27, CD30, 4-1BB, TRAILR1, TRAILR2, TRAILR3, TRAILR4, RANK, OCIF, receptor TWEAK, TACI, receptor BAFF, ATAR, CD271, CD269, AITR, TROY, CD358, TRAMP y XEDAR, opcionalmente donde el activador para la molécula coestimuladora positiva es un miembro de la superfamilia de TNF opcionalmente seleccionado del grupo que consiste en: TNFa, TNF-C, OX40L, CD40L, FasL, LIg Ht , TL1A, CD27L, Siva, CD153, ligando 4-1BB, TRAIL, RANKL, TWEAK, APRIL, BAFF, CAMLG, NGF, BDNF, NT-3, NT-4, ligando GITR y EDA-2; y

(ii) una molécula coestimuladora de la superfamilia CD28 opcionalmente seleccionada de ICOS y CD28, opcionalmente donde el activador para la molécula coestimuladora positiva es ICOSL, CD80 o CD86.

13. La VE de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, donde la VE es un exosoma.

14. Una composición farmacéutica que comprende la VE de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 y un portador aceptable desde un punto de vista farmacéutico.

15. La VE de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 para su uso en la prevención o el tratamiento de una enfermedad en un sujeto que lo necesita.