KR20210097876A

KR20210097876A - 흑미강 유래 물질을 포함하는 멀티라멜라리포좀 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR20210097876A
Application number: KR1020200011200A
Authority: KR
Inventors: 권성필; 김홍유; 김지안; 장동철; 박성진
Original assignee: 청담씨디씨제이앤팜 유한책임회사
Priority date: 2020-01-30
Filing date: 2020-01-30
Publication date: 2021-08-10
Also published as: KR102303202B1

Abstract

본 발명은 흑미강 유래 물질을 포함하는 멀티라멜라리포좀에 관한 것으로, 흑미강으로부터 추출된 유효성분을 이용하여 미백, 염증 완화, 중금속 흡착 효과가 있는 화장료 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 흑미강으로부터 추출된 유효성분을 멀티라멜라리포좀에 봉입하여 제형 안정성이 증진되고, 피부 투과도가 개선된 화장료 조성물을 제공한다.

Description

흑미강 유래 물질을 포함하는 멀티라멜라리포좀 및 이의 제조방법{Multi-lamellar liposome with black rice bran derived material and method for preparing same}

본 발명은 흑미강 유래 물질을 포함하는 멀티라멜라리포좀에 관한 것으로, 구체적으로는 흑미강에 함유된 유효성분을 효과적으로 포집할 수 있는 멀티라멜라리포좀에 관한 것이다.

식물 등에 포함된 지용성 물질을 추출하는 방법 중 가장 일반적으로 사용되는 방법은 유기용매추출법이다. 유기용매추출법은 용기에 식물을 넣고 용매를 넣어 식물에 함유된 성분들을 충분히 녹여낸 후 용매를 휘발시켜 추출물을 수득한다. 용매로는 에테르류, 벤젠, 헥산, 기타 알코올류 등이 사용된다.

특히, 콩기름 등 식물성 식용유 제조시 헥산추출방법을 사용하면 더 많은 식용유를 얻을 수 있어 대부분의 기업들은 헥산추출방법을사용하고 있다. 그러나 최근 헥산추출방법에 의해 추출된 추출물에 헥산이 잔류하는 점이 알려지면서 헥산추출방법의 부작용에 대한 우려가 커지고 있다.

헥산(hexane, C₆H₁₄)은 지방족 탄화수소로, 석유로부터 제조되며, 강력접착제, 탈취체, 잉크 등의 원료로 사용되거나, 식물 등에 함유된 지용성 물질을 추출하기 위한 용매로 사용된다. 그러나 사람에게 노출될 경우 호흡기계 자극, 장기 손상, 피부 자극, 눈 자극 등의 위험이 있고, 신경계 손상, 호르몬 분비 변화 등의 부작용을 일으킬 수 있어 위험물질로 알려져 있다.

헥산추출방법을 이용할 경우 저비용으로 대량생산이 가능한 장점이 있으나, 잔류하는 헥산의 위험성 문제를 해결하기 위한 연구 개발이 지속적으로 이루어져야 할 것이다.

대한민국 등록특허 제10-1560575호(2015.10.08.)에는 흑미강 추출물을 유효 성분으로 함유하는 천연 기능성 화장품 조성물이 기재되어 있다. 대한민국 등록특허 제10-1686490호(2016.12.08.)에는 흑미 추출물을 유효성분으로 하는 골대사 질환 예방 또는 치료용 조성물이 기재되어 있다.

본 발명은 헥산추출방법에 따른 부작용을 해결하고자 새로운 추출방법을 제시한다.

또한, 본 발명은 흑미강으로부터 추출된 유효성분을 이용한 화장료 조성물의 제형을 개선하여 제형 안정성이 증진되고, 피부 투과도가 개선된 화장료 조성물을 제공하고자 한다.

본 발명은 지용성 층과 수용성 층이 멀티층으로 구비된 멀티라멜라리포좀을 포함하되, 상기 지용성 층에는 흑미강초임계추출물로부터 유래한 지용성 물질인 올리자놀(γ-oryzanol)과 토코페롤(tocopherol)이 포집되어 있고, 상기 수용성 층에는 상기 흑미강초임계추출물로부터 유래한 수용성 물질인 피틴산(phytic acid)이 포집되는 있는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 화장료 조성물은, 바람직하게는 미백용인 것일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 화장료 조성물은, 바람직하게또는 산화질소(NO) 매개 염증을 완화하는 피부 염증 완화용인 것일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 화장료 조성물은, 바람직하게는 중금속 이온 흡착 제거용인 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 흑미강을 이산화탄소로 초임계추출하여 흑미강초임계추출물을 수득하는 단계 (a); 상기 흑미강초임계추출물로부터 올리자놀(γ-oryzanol)과 토코페롤(tocopherol)을 추출하는 단계 (b); 상기 올리자놀(γ-oryzanol)과 토코페롤(tocopherol)을 추출 뒤 남은 흑미강초임계추출물박에 산 가수분해하여 피틴산(phytic acid)을 추출하는 단계 (c); 상기에서 추출한 올리자놀, 토코페롤을 유기용매와 혼합한 뒤 대두레시틴과 혼합하는 단계 (d); 상기 단계 (d) 후, 상기 단계 (c)에서 추출한 피틴산을 첨가하는 단계 (e); 상기 단계 (e) 후, 감압 농축하여 지질막이 형성되도록 건조하는 단계 (f); 및 상기 생성된 지질막에 수용성 용매를 첨가하고, 균질화하는 단계 (g);를 포함하는 멀티라멜라리포좀의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 단계 (c)의 산 가수분해는, 바람직하게는 0.5~2N 농도의 HCl에 30~180분 동안 20~90℃로 처리하는 것이 좋다.

또한, 본 발명은 상기 멀티라멜라리포좀의 제조방법에 의해 제조한 멀티라멜라리포좀을 포함하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명은 초임계추출방법을 이용하여 유기용매의 잔류에 따른 부작용 위험을 감소시킬 수 있다.

또한, 본 발명은 흑미강으로부터 추출된 유효성분을 이용하여 미백 효과가 있는 화장료 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 흑미강으로부터 추출된 유효성분을 이용하여 산화질소(NO) 매개 염증을 완화하는 피부 염증 완화용 화장료 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 흑미강으로부터 추출된 유효성분을 이용하여 중금속 흡착용 화장료 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 흑미강으로부터 추출된 유효성분을 이용한 화장료 조성물의 제형을 개선하여 제형 안정성이 증진되고, 피부 투과도가 개선된 화장료 조성물을 제공한다.

도 1은 흑미강초임계추출물과 흑미강헥산추출물의 항산화 활성 비를 나타낸 그래프이다.
도 2는 산 가수분해(HCl) 농도에 따른 피틴산의 함량을 나타낸 그래프이다.
도 3은 산 가수분해(HCl) 농도에 따른 총 폴리페놀 함량을 나타낸 그래프이다.
도 4는 산 가수분해(HCl) 농도에 따른 총 플라보노이드 함량을 나타낸 그래프이다.
도 5는 산 가수분해 온도에 따른 피틴산의 함량을 나타낸 그래프이다.
도 6은 산 가수분해 온도에 따른 총 폴리페놀 함량을 나타낸 그래프이다.
도 7은 산 가수분해 온도에 따른 총 플라보노이드 함량을 나타낸 그래프이다.
도 8은 산 가수분해 시간에 따른 피틴산의 함량을 나타낸 그래프이다.
도 9는 산 가수분해 시간에 따른 총 폴리페놀 함량을 나타낸 그래프이다.
도 10은 산 가수분해 시간에 따른 총 플라보노이드 함량을 나타낸 그래프이다.
도 11은 흑미강초임계추출물과 흑미강초임계추출물박(탈지흑미강)을 이용하여 멀티라멜라리포좀을 제조하는 방법을 나타낸 공정도이다.
도 12는 본 발명의 흑미강 유래 물질을 포함하는 멀티라멜라리포좀의 전계방출 투과전자현미경(FE-TEM) 사진이다.
도 13은 본 발명의 흑미강 유래 물질을 포함하는 멀티라멜라리포좀의 제형 안정성을 나타낸 그래프이다.
도 14는 흑미강 유래 물질을 포함하는 멀티라멜라리포좀의 미백 효능을 나타낸 그래프이다.
도 15는 흑미강 유래 물질을 포함하는 멀티라멜라리포좀의 세포 독성을 나타낸 그래프이다.
도 16은 흑미강 유래 물질을 포함하는 멀티라멜라리포좀의 NO 생성 억제능을 나타낸 그래프이다.
도 17은 흑미강 유래 물질을 포함하는 멀티라멜라리포좀 처리 후 잔류하는 중금속 이온의 양을 나타낸 그래프이다.

흑미(black rice)는 안토시아닌이 검은콩에 비해 4배 이상 들어 있으며, 안토시아닌이 풍부하여 검정색을 띤다. 비타민, 철, 아연 등의 무기염류는 일반 쌀의 5배 이상 함유되어 있으며, 체내의 활성산소를 효과적으로 중화시킬 뿐만 아니라 심장 질병, 성인병, 암 예방 효과가 있다고 알려져 있다. 흑미의 미강(흑미강 또는 흑미미강)에는 올리자놀(γ-oryzanol)과 토코페롤(tocopherol), 피틴산(phytic acid), 폴리페놀, 플라보이드 등 다양한 유효성분이 함유되어 있다.

초임계추출은 초임계 유체를 사용하는 추출방법으로, 초임계 유체 추출이라고도 한다. 초임계 유체로서 이산화탄소, 물, 에탄(ethane), 에틸렌(ethylene), 프로판(propane) 등이 사용된다. 그 중에서도 이산화탄소는 임계점(31.1℃, 73.8atm)이 낮고 독성이 없으므로 유용 물질의 추출, 분리가 용이하다.

본 발명의 흑미강초임계추출물은 지용성 성분인 올리자놀(γ-oryzanol)과 토코페롤(tocopherol)이 포함되어 있다. 한편, 헥산을 추출용매로 하여 흑미강헥산추출물을 제조하고, 항산화 활성을 측정한 결과, 본 발명의 흑미강초임계추출물의 항산화 활성은 76.89%로 흑미강헥산추출물의 59.72%보다 높은 항산화 활성을 보였다.

한편, 흑미강초임계추출물로부터 지용성 성분을 추출한 뒤 남은 박(粕)을 흑미강초임계추출물박(탈지흑미강)이라 하는데, 흑미강초임계추출물박(탈지흑미강)에는 수용성 성분인 피틴산(phytic acid)이 포함되어 있다. 하지만, 흑미강초임계추출물박에는 여러 불순물이 혼합되어 있어 고순도의 피틴산을 수득하기 어려운 문제가 있다. 이에 본 발명에서는 흑미강초임계추출물박을 산 가수분해하여 피틴산을 추출하고, 강이온교환 수지를 통해 금속이온을 제거함으로써 고순도의 피틴산을 수득할 수 있었다.

상기 산 가수분해 처리는 바람직하게는 0.5~2N 농도의 HCl에 30~180분 동안 20~90℃로 처리하는 것이 좋다. 흑미강초임계추출물박(탈지흑미강)으로부터 피틴산, 폴리페놀, 플라보노이드를 효율적으로 추출하기 위해서, 더욱 바람직하게는 2N의 HCl로 90℃에서 60분간 추출하는 것이 좋다.

본 발명의 멀티라멜라리포좀은 다중층라멜라리포좀으로, 지용성 성분과 수용성 성분이 다중층으로 존재하는 라멜라 소포체를 말한다.

본 발명의 멀티라멜라리폼 제조방법에 따라 제조된 멀티라멜라리포좀에는 피틴산이 포집되어 있음을 확인하였으며, 전계방출 투과전자현미경(FE-TEM)으로 관찰 결과 수십 나노 크기의 구형 입자를 확인하였다.

본 발명에 있어서, 상기 단계 (d)의 유기용매는, 일 예로, 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜, 글리세린, 아세톤, 에틸 아세테이트, 클로로포름, 부틸 아세테이트, 디에틸에테르, 디클로로메탄, 헥산 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택되는 추출용매일 수 있다.

본 발명의 멀티라멜라리포좀을 45℃에서 4주간 보관할 경우, 피틴산 포집률이 0주차에 82.3%, 4주차에 81.0%로 나타났으며, 초기 포집률 대비 98.4%로 안정적인 제형을 유지함을 확인하였다.

본 발명의 멀티라멜라리포좀을 포함하는 화장료 조성물은 tyrosine hydroxylase 활성 억제능을 보여 미백효능이 있음을 확인하였으며, 산화질소(NO) 매개 염증을 완화하는 효과가 있음을 확인하였다.

또한, 본 발명의 멀티라멜라리포좀을 포함하는 화장료 조성물의 피부 투과도 실험을 통해 피틴산의 피부 투과도가 우수한 점을 확인하였다.

또한, 본 발명의 멀티라멜라리포좀을 포함하는 화장료 조성물은 중금속 이온을 흡착하여 피부에 잔류하는 중금속 이온량을 감소시키는 점을 확인하였다.

이하, 본 발명의 내용을 하기 실시예 및 실험예에서 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.

[실시예 1 : 흑미강으로부터 초임계 추출을 통해 올리자놀 및 토코페롤 수득]

초임계 유체로 이산화탄소를 이용하여 흑미강 100g을 50℃, 400 bar 조건에서 초임계 추출기를 통해 지용성 성분인 올리자놀(γ-oryzanol)과 토코페롤(tocopherol)이 포함된 흑미강초임계추출물을 수득하였다.

[비교예 1 : 흑미강으로부터 헥산추출을 통해 올리자놀 및 토코페놀 수득]

흑미강 100g에 1L의 n-hexane을 가하여 상온에서 4시간 진탕 추출하고 추출액을 3,500rpm 조건으로 10분간 원심분리 후 상층액을 와트만 필터(No.1)로 여과한 후 증발기(evaporator)로 헥산을 제거 및 농축하여 지용성 성분인 올리자놀(γ-oryzanol)과 토코페롤(tocopherol)이 포함된 흑미강헥산추출물을 수득하였다.

[실험예 1 : 흑미강추출물의 항산화 효과 확인]

본 실험에서는 상기 실시예 1과 비교예 1에서 수득한 흑미강추출물의 항산화 활성을 측정하였다.

에탄올을 이용하여 0.2 mM DPPH(1,1-dipenyl-2-picrylhydrazyl) 용액을 제조하고 180 ㎕ DPPH 용액에 상기 실시예 1 및 비교예 1의 흑미강추출물을 각각 20 ㎕ 가하여 혼합하였다. 상온에서 10분간 반응시킨 후 517 nm에서 흡광도를 측정하고 흡광도 비(%)를 구하여 DPPH 소거능을 통한 항산화 효과를 측정하였다.

도 1에서 보듯이, 흑미강초임계추출물의 항산화 활성은 76.89%로 흑미강헥산추출물의 59.72%보다 높은 항산화 활성을 보였다.

[실시예 2 : 흑미강초임계추출물박으로부터 피틴산 추출]

상기 실시예 1에서 수득한 흑미강초임계추출물의 지용성 성분을 제거한 흑미강초임계추출물박(탈지흑미강)을 열수 추출법과 산 가수분해 추출법을 사용하여 피틴산(phytic acid)을 추출하고자 하였다.

대조군으로 열수 추출법을 이용하여, 흑미강초임계추출물박(탈지흑미강) 100g에 정제수 2L를 첨가하여 80℃에서 1시간 추출하고 추출액을 3,500rpm 조건으로 10분간 원심분리 후 상층액을 와트만 필터(No.1)로 여과하였다. 수득한 추출액을 강이온교환 수지를 통해 금속이온을 제거하였다.

(1) 산 가수분해(HCl) 농도에 따른 피틴산 함량 비교

흑미강초임계추출물박에 20배수의 HCl을 각각 0.5N, 1N, 2N을 가하여 상온에서 30분간 추출하고, 추출액을 3,500rpm 조건으로 10분간 원심분리 후 상층액을 와트만 필터(No.1)로 여과하였다. 수득한 추출액을 강이온교환 수지를 통해 금속이온을 제거하였다.

(2) 산 가수분해 온도에 따른 피틴산 함량 비교

흑미강초임계추출물박에 20배수의 2N HCl을 가하여 각각 30분간 상온, 40℃, 60℃, 90℃에서 추출하고, 추출액을 3,500rpm 조건으로 10분간 원심분리 후 상층액을 와트만 필터(No.1)로 여과하였다. 수득한 추출액을 강이온교환 수지를 통해 금속이온을 제거하였다.

(3) 산 가수분해 시간에 따른 피틴산 함량 비교

흑미강초임계추출물박에 20배수의 2N HCl을 가하여 각각 30분, 60분, 120분, 180분간 90℃에서 추출하고 추출액을 3,500rpm 조건으로 10분간 원심분리 후 상층액을 와트만 필터(No.1)로 여과하였다. 수득한 추출액을 강이온교환 수지를 통해 금속이온을 제거하였다.

[실험예 2 : 상기 실시예 2에서 수득한 추출액의 피틴산, 폴리페놀, 플라보노이드 함량 측정]

본 실험에서는 상기 실시예 2에서 수득한 흑미강초임계추출물박(탈지흑미강)에 포함된 피틴산, 폴리페놀, 플라보노이드의 함량을 측정하였다.

피틴산 함량 측정방법은 다음과 같다. 시료를 끓는 물에 5분간 가열한 뒤 상온에서 냉각한 후 10분간 5,000rpm 조건으로 원심분리 하였다. 상등액을 취하여 맴브레인 필터(0.45㎛)로 여과하여 시험용액으로 사용하였다. 시험용액 150㎕를 취하여 wade reagent(0.03% 염화제이철과 0.3% 설포살릭실릭산) 50㎕를 가한 후 vortex mixer를 이용하여 5초간 혼합하였다. 혼합액을 3,000rpm 조건으로 10분간 원심분리한 후 상등액을 취하여 500nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준용액의 조제를 위해 1,000ppm 농도의 피틴산 용액을 제조하고 증류수로 희석하여 1, 5, 10, 20, 50, 100ppm의 농도로 검량선용 표준용액을 제조하였다.

폴리페놀 함량 측정방법은 Folin-Denis법에 의하였다. 시료 5㎕에 Folin-Ciocalteau phenol reagent 10㎕와 증류수 100㎕를 가한 후 3분간 실온에서 혼합하였다. 혼합액에 20% Na₂CO₃용액 100㎕를 가한 다음 실온에서 1시간 반응 후 spectrophotometer를 이용하여 725 nm에서 흡광도를 측정하였다. Gallic acid를 25~800 ㎍/mL 농도 범위로 제조하여 시료와 동일한 방법으로 분석하여 얻은 표준 검량선으로 부터 시료의 총 페놀 함량을 산출하였다.

플라보노이드 함량 측정 방법은 Moreno 등의 방법에 의하였다. 시료 25㎕에 에탄올 75㎕, 증류수 140㎕, 1M 초산칼륨 5㎕ 및 10% aluminum nitrate 5㎕를 차례로 가하여 혼합하고 실온에서 40분간 반응 후 415 nm에서 흡광도를 측정하였다. Quercetin(Sigma Co., USA)를 표준물질로 하여 1~250 ㎍/mL의 농도 범위에서 얻어진 표준 검량선으로 부터 추출물의 총 플라보노이드 함량을 계산하였다.

상기와 같은 실험방법에 의해 HCl 농도에 따른 피틴산, 폴리페놀, 플라보노이드 함량을 측정한 결과를 아래 표 1 내지 3과 도 2 내지 10에 나타내었다.

(1) 산 가수분해(HCl) 농도에 따른 피틴산 함량 비교

용매	피틴산 (㎍/g)	총 폴리페놀 (mg/g)	총 플라보노이드 (mg/g)
열수추출물	404.31	12.19	4.30
0.5 N HCl	3549.27	16.19	4.42
1 N HCl	4079.57	17.04	4.46
2 N HCl	4309.24	17.81	4.52

상기 표 1에서 보듯이, 피틴산 함량은 HCl의 농도가 높아질수록 증가하는 경향을 보였다. 특히, 2N의 HCl로 산 가수분해 한 경우 4309.24 ㎍/g의 피틴산이 함유되어 있어, 열수 추출한 경우의 404.31 ㎍/g에 비해 높은 피틴산 함량을 확인하였다(도 2).

총 폴리페놀의 함량은 HCl 농도가 높아질수록 증가하는 경향을 보였다. 특히, 2N의 HCl로 산 가수분해 한 경우 17.81 mg/g의 폴리페놀이 함유되어 있어, 열수 추출한 경우의 12.19 mg/g에 비해 5.62 mg/g 증가하는 것을 확인하였다(도 3).

총 플라보노이드 함량은 HCl 농도가 높아질수록 증가하는 경향을 보였다. 특히, 2N의 HCl로 산 가수분해 한 경우 4.52 mg/g의 플라보노이드가 함유되어 있어, 열수 추출한 경우의 4.30 mg/g에 비해 0.22 mg/g 증가하는 것을 확인하였다(도 4).

(2) 산 가수분해 온도에 따른 피틴산 함량 비교

온도	피틴산 (㎍/g)	총 폴리페놀 (mg/g)	총 플라보노이드 (mg/g)
상온	4106.94	17.04	4.46
40℃	4234.14	18.85	4.52
60℃	4315.62	20.81	4.67
90℃	4406.25	22.65	4.78

상기 표 2에서 보듯이, 피틴산(도 5), 총 폴리페놀(도 6), 총 플라보노이드(도 7) 함량은 산 가수분해 온도가 높아질수록 증가하는 경향을 보였다. 특히, 90℃로 산 가수분해 할 경우 피틴산 4406.25 ㎍/g, 총 폴리페놀 22.65 mg/g, 총 플라보노이드 4.78 mg/g으로 가장 높은 함량을 보였다.

(3) 산 가수분해 시간에 따른 피틴산 함량 비교

시간	피틴산 (㎍/g)	총 폴리페놀 (mg/g)	총 플라보노이드 (mg/g)
30 min	4354.58	17.00	4.50
60 min	4575.32	22.19	4.76
120 min	4245.61	20.27	4.67
180 min	4057.94	18.54	4.65

상기 표 3에서 보듯이, 피틴산 함량은 60분 산 가수분해 한 경우 4354.58 ㎍/g으로 가장 높은 함량을 보였고(도 8),총 폴리페놀 함량은 60분 산 가수분해 한 경우 22.19 mg/g으로 가장 높은 함량을 보였으며(도 9), 총 플라보노이드 함량도 60분 산 가수분해 한 경우 4.76mg/g으로 가장 높은 함량을 보였다(도 10).

이에 따라, 흑미강초임계추출물박(탈지흑미강) 추출액으로부터 피틴산, 폴리페놀, 플라보노이드를 효율적으로 추출하기 위한 산 가수분해 조건은 2N의 HCl로 90℃에서 60분간 추출하는 것이 바람직함을 확인하였다.

[실시예 3 : 흑미강 유래 물질을 포함하는 멀티라멜라리포좀의 제조]

뱅함법(Bangham method, BM)은 레시틴을 지용성 성분을 함유한 유기용매에 녹여 교반하고 감압농축기로 감압 조건으로 건조하여 플라스크의 내부에 지질 막(lipid film)이 형성되도록 하는 방법이다. 본 발명은 뱅함법을 이용하여 지질막을 형성하고, 이후 수용성 성분을 녹인 증류수 또는 버퍼(buffer)용액으로 수화한 후 균질화하여 멀티라멜라리포좀을 제조하였다.

리포좀 제조에 사용된 인지질은 대두(soybean)에서 추출한 지질을 수소 첨가시켜 불포화 성분을 제거한 레시틴으로 phosphatidyl choline 성분이 95%이상인 Emulmetik 950 (Lucas Meyer사)을 사용하였다. 인지질과 sodium deoxycholate를 9:1 비율로 혼합한 후 동량의 에탄올과 지용성 추출물(상기 실시예 1의 흑미강초임계추출물)을 첨가하여 60 ℃ 항온조에서 완전히 용해시켜 투명한 졸 용액을 제조하였다. 이를 상온에 굳힌 후 다시 60 ℃ 항온조에 가져가 투명한 졸 용액이 되면 수용성 추출물(상기 실시예 2의 흑미강초임계추출물박(탈지흑미강)을 2N의 HCl로 90℃에서 60분간 추출한 것)을 넣고 10 min 이상 자석 교반시켰다. 감압농축기로 50 ℃에서 감압 조건으로 플라스크 내부에 지질막(lipid film)이 형성되도록 완전히 건조한 뒤, 지질막에 증류수를 첨가하여 수화한 후 homogenizing 2000 rpm, 10 min 동안 균질화하여 최종 인지질 함량 2%의 멀티라멜라리포좀을 완성하였다. 본 발명의 멀티라멜라리포좀 제조방법을 도 11에 간략하게 나타내었다.

상기 방법에 따라 제조한 멀티라멜라리포좀의 피틴산 포집 효율을 측정하기 위해, 리포좀 현탁액의 일정량을 취하여 0.1㎛ 시린지 필터(syringe filter)를 이용하여 리포좀을 제거하였다. 리포좀에 포집되지 않은 피틴산의 함량과 초기 추출물의 피틴산의 함량을 측정하여 포집 효율을 확인하였다. 포집 효율은 피틴산의 함량 값을 하기 수학식 1에 따라 계산하였다.

[수학식 1]

초기 추출물의 피틴산 함량은 342.1 ㎍/ml이며, 리포좀에 포집되지 않은 피틴산의 함량은 60.41 ㎍/ml로, 포집 효율은 82.34%로 계산되었다.

본 실시예에서 제조한 멀티라멜라리포좀을 전계방출 투과전자현미경(FE-TEM)으로 입자의 크기와 형태를 관찰한 결과, 도 12에서 보듯이 수십 나노 크기의 구형 입자를 확인하였다.

[실험예 3 : 흑미강 유래 물질을 포함하는 멀티라멜라리포좀의 안정성 평가]

본 실험에서는 상기 실시예 3에서 제조한 흑미강 유래 물질을 포함하는 멀티라멜라리포좀의 제형 안정성을 평가하고자 하였다.

상기 실시예 3에서 제조한 멀티라멜라리포좀과 흑미강추출물(상기 실시예 2의 흑미강초임계추출물박(탈지흑미강)을 2N의 HCl로 90℃에서 60분간 추출한 것)을 각각 보관 튜브에 차광하여 45℃에서 보관하며 4주간 안정성을 확인하였다. 0.1㎛ 시린지 필터(syringe filter)를 이용하여 리포좀을 제거한 후 여과액에 존재하는 피틴산의 함량을 측정하여 흑미강추출물의 피틴산 함량의 변화와 비교하였다. 피틴산 함량은 상기 실험예 2와 동일하게 측정하였다.

도 13에서 보듯이, 흑미강추출물의 피틴산 함량은 시간이 경과할수록 점차 감소하는 경향을 보인 반면, 멀티라멜라리포좀의 경우 피틴산 포집률이 0주차에 82.3%, 4주차에 81.0%로 나타났으며, 초기 포집률 대비 98.4%로 안정적인 제형을 유지함을 확인하였다.

[실험예 4 : 흑미강 유래 물질을 포함하는 멀티라멜라리포좀의 미백 효능 평가]

본 실험에서는 상기 실시예 3에서 제조한 흑미강 유래 물질을 포함하는 멀티라멜라리포좀의 미백 효능을 평가하고자 하였다.

Tyrosine을 수산화(hydroxylation)시켜 3,4-dihydroxyphenylalanine (DOPA)로 변화하는 티로시나아제(tyrosinase)의 tyrosine hydroxylase 활성 저해능을 평가하였다. 흑미 미강 추출물을 함유한 멀티라멜라리포좀을 0.1 M phosphate buffer (pH 7.0)에 희석하여 0.5%, 1%, 2% 및 5% 농도의 시험액을 각각 준비하였다. 96-well plate에 0.1 M phosphate buffer (pH 7.0) 170㎕, 다양한 농도로 희석한 시험액 10㎕, 2000unit/mL mushroom tyrosinase 10㎕ 및 10 mM L-DOPA 10㎕를 순차적으로 넣은 후 혼합하여 37℃에서 15분 동안 반응시킨 후 475 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 공시험액의 흡광도는 시험액 대신 0.1 M phosphate buffer (pH 7.0)를 넣어 동일한 방법으로 반응하여 측정하였다. 효소 활성 억제율은 아래의 수학식 2에 따라 산출하였다.

[수학식 2]

리포좀이 미백 효능에 미치는 영향을 조사하기 위해 티로시나아제(tyrosinase)의 활성 억제능을 측정하였다. 도 14에서 보듯이, 양성 대조군인 ascorbic acid 100μM 농도의 tyrosine hydroxylase 활성 억제능인 75.6%와 리포좀 1% 시료에서 74.5%로 유사한 수준의 효능을 보였으며, 멀티라멜라리포좀의 tyrosine hydroxylase 활성 억제능은 농도 의존적으로 증가함을 확인하였다.

[실험예 5 : 흑미강 유래 물질을 포함하는 멀티라멜라리포좀의 세포 생존률 및 NO 생성 억제능 평가]

본 실험에서는 상기 실시예 3에서 제조한 흑미강 유래 물질을 포함하는 멀티라멜라리포좀의 세포 생존율 및 NO 생성 억제능을 평가하고자 하였다.

(1) 세포 생존률 측정

마우스대식세포인 RAW 264.7 세포는 한국세포주은행에서 분양받아 사용하였다. RAW 264.7 세포의 생존율은 MTT Assay (Denizot F and Lang R. J Immunological Method 89: 271-277, 1986)를 실시하여 측정하였다. RAW 264.7 세포를 1 × 10⁵ cells/well이 되도록 96 well plate에 분주하여 24시간 동안 배양하였다. 세포를 24시간 배양한 후 리포좀 제형을 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5% 및 10% 농도로 함유한 배양액으로 세포배양액을 교환하여 세포를 24시간 배양한 후 배양액을 제거하고 1 mg/mL MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide, Amresco) 용액을 첨가하여 2시간 추가 배양하였다. MTT 용액을 제거한 후 MTT가 미토콘드리아 dehydrogenase에 의해 환원되어 생성된 푸른색의 formazan을 isopropanol을 첨가하여 용해한 다음 570 nm에서 흡광도를 측정하였다.

도 15에서 보듯이, 리포좀 10% 농도에서 세포 독성을 보였으며 5% 이하의 농도에서는 90%이상의 세포 생존률을 확인하였다. 이하 5% 이하의 농도에서 NO 생성 억제능을 평가하였다.

(2) NO 생성 억제능 평가

NO의 농도는 배양액 내의 NO농도를 griess reagent system을 이용하여 측정하였으며, RAW 264.7 세포를 96 well plate에 1.5×10⁵ cells/well로 분주하여 24 시간 동안 배양하였다. 배양 후 새로운 배양액으로 교체한 후 리포좀 제형을 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4% 및 5% 농도로 처리하였고 LPS 1μg/ml의 농도를 처리하여 다시 24 h 동안 배양하였다. 배양액 100 μl에 N1 buffer 50 μl를 각 well에 처리하여 10 min간 상온에서 반응 한 후, N2 buffer 50 μl를 각 well에 처리하고 10 min간 반응시킨 후 540 nm에서 흡광도를 측정하였고, Nitrite standard의 농도별 표준곡선을 이용하여 배양액의 NO 농도를 결정하였다.

도 16에서 보듯이, LPS 처리군과 비교하여 NO 생성이 감소하는 것을 확인하였으며, 리포좀의 농도가 증가함에 따라 NO 생성이 감소하는 경향을 확인하였다.

[실험예 6 : 흑미강 유래 물질을 포함하는 멀티라멜라리포좀의 피부투과도 확인]

본 실험에서는 상기 실시예 3에서 제조한 흑미강 유래 물질을 포함하는 멀티라멜라리포좀의 피부 투과도를 평가하고자 하였다.

피부 투과도 시험 방법은 skin pampa 테스트로 수행하였다. 프리즈마 버퍼(prisma buffer)로 블랭크(blank)를 준비하고 분석(reading)하였다. Deep well plate에 샘플을 준비하는 과정으로, deep well plate에 프리즈마 버퍼(prisma buffer) 1,000㎕를 pH-map에 따라 넣고, 스톡 플레이트(stock plate)의 뚜껑을 열고 8 channel pipette을 이용하여 샘플을 5㎕ 취하여 deep well plate로 옮겼다. 그 후, pipette을 500㎕로 맞춘 후 4~6번 섞고, 솔루션(Solution)의 농도를 측정하거나 계산하여 에세이(asaay)의 <reference>로써 결과를 이용하였다.

스킨 테스트 에세이(skin test assay)를 위해 도너 플레이트(donor plate)를 준비하는 과정으로, deep well plate로부터 샘플 용액(sample solution) 200㎕를 도너판(donor plate)을 옮기고, 뚜껑을 덮었다. 이때, PAMPA 샌드위치(PAMPA sandwich)의 상판(top plate)은 어셉터 플레이트(acceptor plate)이고, PAMPA 샌드위치(PAMPA sandwich)의 하판(bottom plate)은 도너판(donor plate)이다.

어셉터 플레이트(acceptor plate)와 PAMPA 샌드위치를 준비하는 과정으로, 8 channel pipette을 200㎕로 맞추고, 웰(Well)을 수화(hydration)하고 도너 플레이트(donor plate)의 에세이(assay)를 준비한 후, 상판(top plate)을 수화 용액 저장고(hydration solution reservoir)로부터 서포트 플레이트(support plate)로 옮겼다. 그리고 어셉터 플레이트(acceptor plate)의 각 웰(well)에 pH 7.4의 프리즈마 버퍼(prisma buffer) 200㎕를 넣고, 도너 플레이트(donor plate)의 뚜껑을 벗긴 후, 버블(bubble)이 생기지 않게 주의하면서 acceptor plate bottom row(H)부터 도너 플레이트(donor plate) 위에 천천히 올려놓았다. 이 때, 샌드위치(sandwich)가 만들어지고 나면 어셉터 플레이트(acceptor plate) 위에 뚜껑을 덮고, 스킨 멤브레인(skin membrane)이 마르는 것을 방지하기 위하여 4~5분 이내에 끝내고 실험을 시작하여야 한다. 그리고 증발을 최소화하기 위하여 높은 상대 습도를 유지하기 위한 젖은 스펀지가 있는 습도 챔버(humidity chamber)나 gut-box에 샌드위치(sandwich)를 놓되, 샌드위치 플레이트(sandwich plate)은 절대로 기울이면 안 된다. 그리고 RT에서 5hr 동안 휘젓지 않은 상태로 배양(incubation)하였다.

다음으로 도너(Donor)/어셉터(acceptor) 분석(reading)하는 과정으로서, 배양(incubation)을 끝내고, 습도 챔버(humidity chamber)로부터 PAMPA 샌드위치(PAMPA sandwich)를 꺼낸 후 덮개(lid)를 열고 8 channel pipettor를 이용하여 어셉터 판(acceptor plate)으로부터 150㎕ 씩 UV 플레이트(UV plate)으로 옮긴 후 스펙트로포토미터(spectrophotometer)에서 250~498nm 범위로 설정하고 분석(reading)하였다.

상기 실시예 3에서 제조한 멀티라멜라리포좀과 흑미강추출물(상기 실시예 2의 흑미강초임계추출물박(탈지흑미강)을 2N의 HCl로 90℃에서 60분간 추출한 것)의 피부 투과도를 확인하기 위해 상기 skin pampa system을 이용하였다. 투과전 흑미강추출물의 피틴산함량 및 투과 후 흑미강추출물과 멀티라멜라리포좀의 피틴산 함량을 비교하여 투과율(%)을 아래 표 4에 나타내었다.

	피틴산 (㎍/ml)	투과율(%)
투과전 흑미강추출물	342.1
투과후 흑미강추출물	6.64	1.94
투과후 멀티라멜라리포좀	10.19	2.98

상기 표 4에서 보듯이, 멀티라멜라리포좀의 투과율은 2.98%로, 흑미강추출물의 투과율인 1.94%보다 투과율이 1.04% 증가하는 점을 확인하였다.

[실험예 7 : 흑미강 유래 물질을 포함하는 멀티라멜라리포좀의 중금속 흡착효능 평가]

본 실험에서는 상기 실시예 3에서 제조한 멀티라멜라리포좀의 중금속 흡착효능을 평가하고자 돼지피부를 사용하여 피부흡수 실험을 통해 잔류하는 중금속을 측정하였다.

당일 냉장 유통되는 피하지방이 제거된 돼지 피부를 구입하여 가로×세로가 5×5 cm² 면적이 되도록 일정크기로 자른 후, 피부 표면에 중금속 표준 용액을 1ml 골고루 도포한 후 상온에서 5시간 건조하였다. 중금속 표준 용액은 Pb, Cd, Zn, As을 사용하여, 중금속 이온 농도가 1,000ppm이 되도록 제조한 것을 이용하였다. 건조된 돼지 피부에 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4% 및 5% 농도의 멀티라멜라리포좀 1ml를 각각 고르게 도포한 후 2시간 뒤에 피부 표면을 흐르는 물로 깨끗이 씻고 물기를 닦아 건조하였다. 상피 피부를 분리하기 위해 60℃에서 1~2분간 반응시킨 후 핀셋을 이용하여 상피를 분리하였다. 상피에 잔류하는 중금속이온을 ICM/MS로 분석하여 중금속 양을 정량하였다.

도 17에서 보듯이, 본 발명의 멀티라멜라리포좀을 처리하지 않은 대조군 대비 중금속 이온량이 감소하는 점을 확인하였다. 본 발명의 멀티라멜라리포좀이 0.5% 농도일 경우 잔류 중금속 이온은 22.4%였으며, 멀티라멜라리포좀의 농도가 5%일 경우 10.7%로 나타나, 본 발명의 멀티라멜라리포좀의 농도가 증가할수록 잔류 중금속 이온량이 감소하는 점을 확인하였다.

[제조예 1 : 흑미강 유래 물질을 포함하는 멀티라멜라리포좀을 포함하는 화장료 조성물]

상기 실시예 3에서 제조한 멀티라멜라리포좀을 포함하는 화장료 조성물로 토너 제형을 제조하였다.

하기 표 5를 참고하여, A상을 비커에 칭량하고 아지믹서로 20분간 용해하고, 다른 비커에서 B상을 50℃로 가열하여 완전히 용해한 뒤 B상이 상온으로 냉각된 후 C상을 첨가하였다. B상과 C상 혼합 후, 이를 A상에 첨가하여 아지믹서로 10분간 혼합하였다.

	원료명	함량(%)
A	정제수	70.87	64.87	66.33	70.87	72.79
	흑미강 함유 리포좀	5.00	5.00	5.00	5.00	5.00
	녹차추출물	4.00	4.00	5.00	4.00	4.00
	병풀추출물	3.00	3.00	2.00	3.00	3.00
	프로폴리스추출물	3.00	10.00	5.00	3.00	3.00
	글리세린	1.00	5.00	5.00	1.00	1.00
	소듐PCA	1.00	1.00	0.50	1.00	0.05
	소듐락테이트	1.00	1.00	0.00	1.00	0.05
	알로에베라잎추출물	0.01	0.01	0.00	0.01	0.01
	소듐파이테이트	0.03	0.03	0.00	0.03	0.03
B	흑미강추출물	10.00	10.00	10.00	10.00	10.00
B	폴리쿼터늄-51	0.01	0.01	0.05	0.01	0.01
C	히아루론산	0.01	0.01	0.05	0.01	0.01
	판테놀	0.01	0.01	0.01	0.01	0.01
	1,2-헥산다이올	1.00	1.00	1.00	1.00	1.00
	에칠헥실글리세린	0.02	0.02	0.02	0.02	0.02
	시트릭애씨드	0.04	0.04	0.04	0.04	0.02
합계		100.00	100.00	100.00	100.00	100.00
합계		제조예 1-1	제조예 1-2	제조예 1-3	제조예 1-4	제조예 1-5

상기 방법에 따라 제조된 화장료 조성물의 사용감 실험 결과, 제조예 1-4의 보습력이 가장 우수하였으며, 클렌징 후 화장솜에 제조예 1-4의 토너를 적셔 피부를 닦아낼 경우, 잔여물 제거 효과가 가장 우수하였다.

[제조예 2 : 흑미강 유래 물질을 포함하는 멀티라멜라리포좀을 포함하는 화장료 조성물]

상기 실시예 3에서 제조한 멀티라멜라리포좀을 포함하는 화장료 조성물로 클렌징 폼 제형을 제조하였다.

하기 표 6을 참고하여, B상을 비커에 칭량하고 아지믹서로 20분간 용해한 뒤, B상에 A상의 원료를 칭량하여 80℃에서 1시간 가열하여 완전히 용해하고 상온까지 냉각시킨 다음 C상의 원료를 투입하여 서서히 용해하였다.

	원료명	함량(%)
A	정제수	27.80	37.80	27.80	32.80	27.80
	라우릴글루코사이드	10.00	5.00	10.00	10.00	20.00
	코코글루코사이드	20.00	10.00	20.00	10.00	10.00
	데실글루코사이드	10.00	15.00	10.00	10.00	10.00
	소듐 코코암포아세테이트	10.00	10.00	10.00	15.00	10.00
	글리세린	2.00	2.00	2.00	2.00	2.00
	꿀	1.00	1.00	1.00	1.00	1.00
	카렌듈라꽃추출물	1.00	1.00	1.00	1.00	1.00
	글리세릴카프릴레이트	0.50	0.50	0.50	0.50	0.50
B	흑미강추출물	10.00	10.00	10.00	10.00	10.00
B	셀룰로오스검	0.50	0.50	0.50	0.50	0.50
C	씨트릭애씨드	1.10	1.10	1.10	1.10	1.10
	호호바씨오일	0.60	0.60	0.60	0.60	0.60
	오렌지오일	0.50	0.50	0.50	0.00	0.00
	라벤더오일	0.00	0.00	0.00	0.50	0.00
	유칼립투스오일	0.00	0.00	0.00	0.00	0.50
	흑미강 함유 리포좀	5.00	5.00	5.00	5.00	5.00
합계		100.00	100.00	100.00	100.00	100.00
합계		제조예 2-1	제조예 2-2	제조예 2-3	제조예 2-4	제조예 2-5

상기 방법에 따라 제조된 화장료 조성물의 사용감 실험 결과, 제조예 2-3의 거품발생효과가 가장 우수하였으며, 부드러운 사용감을 보였다. 또한, 클렌징폼의 세정력 및 피부 보습력이 가장 우수하였다.

Claims

지용성 층과 수용성 층이 멀티층으로 구비된 멀티라멜라리포좀을 포함하되,
상기 지용성 층에는 흑미강초임계추출물로부터 유래한 지용성 물질인 올리자놀(γ-oryzanol)과 토코페롤(tocopherol)이 포집되어 있고, 상기 수용성 층에는 상기 흑미강초임계추출물로부터 유래한 수용성 물질인 피틴산(phytic acid)이 포집되는 있는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 화장료 조성물은,
미백용인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 화장료 조성물은,
산화질소(NO) 매개 염증을 완화하는 피부 염증 완화용인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 화장료 조성물은,
중금속 이온 흡착 제거용인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
흑미강을 이산화탄소로 초임계추출하여 흑미강초임계추출물을 수득하는 단계 (a);
상기 흑미강초임계추출물로부터 올리자놀(γ-oryzanol)과 토코페롤(tocopherol)을 추출하는 단계 (b);
상기 올리자놀(γ-oryzanol)과 토코페롤(tocopherol)을 추출 뒤 남은 흑미강초임계추출물박에 산 가수분해하여 피틴산(phytic acid)을 추출하는 단계 (c);
상기에서 추출한 올리자놀, 토코페롤을 유기용매와 혼합한 뒤 대두레시틴과 혼합하는 단계 (d);
상기 단계 (d) 후, 상기 단계 (c)에서 추출한 피틴산을 첨가하는 단계 (e);
상기 단계 (e) 후, 감압 농축하여 지질막이 형성되도록 건조하는 단계 (f); 및
상기 생성된 지질막에 수용성 용매를 첨가하고, 균질화하는 단계 (g);를 포함하는 멀티라멜라리포좀의 제조방법.
제5항에 있어서,
상기 단계 (c)의 산 가수분해는,
0.5~2N 농도의 HCl에 30~180분 동안 20~90℃로 처리하는 것을 특징으로 하는 멀티라멜라리포좀의 제조방법.
제5항의 방법으로 제조한 멀티라멜라리포좀을 포함하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제7항에 있어서,
상기 화장료 조성물은,
미백용인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제7항에 있어서,
상기 화장료 조성물은,
산화질소(NO) 매개 염증을 완화하는 피부 염증 완화용인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제7항에 있어서,
상기 화장료 조성물은,
중금속 이온 흡착 제거용인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.