KR20210085175A - 산수국 추출물을 유효성분으로 포함하는 면역증진용 조성물 - Google Patents

산수국 추출물을 유효성분으로 포함하는 면역증진용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 산수국 추출물을 함유하는 조성물에 관한 것으로서, 산수국 추출물이 면역증진인자인 일산화질소(Nitric Oxide)의 생성, iNOS(inducible nitric oxide synthase), COX-2(Cyclooxygenase-2), IL-1β(Interluekin 1 beta), IL-6(Interleukin 6) IL-12(Interleukin 12), TNF-α(Tumor necrosis factor alpha) 및 MCP-1(Monocyte chemoattractant protein 1)의 발현, 대식세포의 식세포작용을 증가시켜 면역증진 효과를 유도할 수 있어 면역증진을 필요로 하는 질환의 약학적 조성물 또는 면역증진을 위한 건강기능식품으로 용이하게 활용할 수 있다.

Description

산수국 추출물을 유효성분으로 포함하는 면역증진용 조성물 {Composition for immune-enhancing containing Hydrangea serrata}
본 발명은 산수국 추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 면역증진용 조성물에 관한 것이다.
보다 자세하게는 본원발명은 산수국 추출물이 면역증진인자인 일산화질소의 생성, iNOS, COX-2, IL-1β, IL-6, IL-12, TNF-α 및 MCP-1의 발현, 대식세포의 식세포작용을 증가시켜 면역증진 효과를 유도할 수 있기에, 상기 산수국 추출물을 유효성분으로 하여 면역증진을 필요로 하는 질환의 약학적 조성물 또는 면역증진을 위한 건강기능식품에 관한 것이다.
면역계는 자연저항, 비특이성 면역체계 및 특이성 면역체계로 구분할 수 있다. 자연저항(1차 방어선)이란 미생물을 위시한 모든 침입자들을 그들의 종류에 관계없이 막아내는 해부생리학적 요소들을 말하며, 비특이적 면역(2차 방어선)은 자연저항을 돌파하여 체내로 들어온 침입자들을 제거하는 식세포로 구성된 방어체계를, 그리고 특이성 면역계(3차 방어선)는 림프구들로 구성된 면역체계를 말하는데, 이중 특이성 면역계는 기억능 및 자기와 비자기를 구분할 수 있는 능력을 지닌 고도로 발달한 면역체계이다. 또한, 백혈구는 2차 또는 3차 방어선을 구성하여 1차 방어선을 돌파하여 체내에 들어온 이물을 담당하게 되며, 세균, 바이러스 감염 또는 염증 반응 시, 대식세포 및 림프구 활성의 조절은 의약품의 치료 효과 결정에 있어서 중추적인 역할을 한다.
대식세포(Macrophage)는 다양한 기능을 가진 세포로 산화적 스트레스 상황에서 여러 가지 사이토카인(cytokine)과 일산화질소(Nitric Oxide)를 생성하여 면역체계에서 중요한 역할을 한다. 특히 대식세포에서 리포 다당류(Lipopolysaccharide; LPS), 사이토카인, TNF-α와 같은 자극에 의해 발현되는 iNOS는 장시간 동안 다량의 NO를 생산하여, NFκB 활성을 촉진시키는 것으로 알려져 있다.
면역기능조절은 면역기능 증진과 면역기능 억제로 분류된다. 면역기능 증진은 저하된 인체의 면역기능을 증진시키는 데 기여하는 것으로 의미하고, 정상 면역기능을 증진시키는 경우도 포함될 수 있다. 면역기능 억제는 과도한 면역반응을 억제하는 기능이다. LPS와 같은 외부 유해인자의 자극에 의해 대식세포가 과대 생면역인자인 사이토카인과 일산화질소들은 만성염증을 유발하고, 그 결과 만성염증관련 질환을 유발한다고 알려져 있다. 그러나 천연물에 의한 정상상태의 대식세포가 생성하는 면역인자의 증가는 면역력을 증진시키고 면역저하와 관련된 질환을 억제하다고 알려져 있다.
활성화된 대식세포에 의한 슈퍼옥사이드 음이온(superoxide anion, O2-), 과산화수소(hydrogen peroxide, H2O2)와 같은 활성산소종(reactive oxygens pecies; ROS) 및 일산화질소(nitric oxide, NO)의 생산은 비특이적 면역에 있어서 중요한 세포독성 및 세포활성억제기작이다. 또한, 대식세포는 항원을 제시하거나(antigen-presenting), 종양을 없애거나(tumoricidal) 미생물세포를 죽이는 (microbicidal) 세포로서, 세포매개(cell-mediated) 또는 체액성 면역(humoral immunity)에 중심적인 역할을 하는 조절세포로, 활성화된 대식세포에서 생산되는 NO는 비특이적 숙주방어기작인 대식작용을 하고, 세균 및 암세포의 증식억제 활성을 보인다. 뿐만 아니라 대식세포는 많은 라이소솜을 가지고 있고 이들은 산성가수분해효소와 과산화효소를 함유하고 있다. 또한 유리면과 플라스틱 표면에 강하게 부착하는 성질이 있으며 미생물이나 종양세포 등을 활발하게 탐식한다. 상기 세포는 IFN-γ등의 사이토카인 수용체를 가지고 있다. 이들은 보체성분, 인터페론, 인터루킨-1 및 종양괴사인자 같은 사이토카인을 생산하며 T-세포로부터 생산되는 여러 가지 사이토카인에 의해 기능이 증강될 수 있다.
따라서 현재 전 세계적으로 면역력 증강을 통해 건강을 증진시키고자 많은 연구가 진행되고 있고, 최근에는 합성화합물에 대한 부작용 문제점들이 대두되고 있어 천연물로부터 면역증강을 효과적으로 도출할 수 있는 소재의 개발에 연구가 집중되고 있다.
산수국(Hydrangea serrata)은 범의귀과의 잎이 넓고 키가 작은 나무로 식약처에 고시한 식품원재료에 잎 부위가 식용가능부위로 명시되어 있다. 그러나 아직까지 산수국이 면역증진 작용이 있음을 보고한 예가 없다.
이에, 본 발명자들은 산수국 추출물이 갖는 다양한 생리활성을 연구하던 중, 상기 산수국 추출물이 면역세포의 활성을 증가하는 효과가 있어 면역증진용 조성물이나 건강식품으로 이용가능함을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
대한민국 등록특허 제10-2034773호 (발명의 명칭 :진세노사이드 Rh1, 진세노사이드 Rg2 및 수국 추출물을 포함하는 항염증 조성물, 출원인 : 충남대학교산학협력단, 주식회사 샤인앤샤인, 등록일 : 2019년10월15일) 대한민국 공개특허 제10-2019-0072923호 (발명의 명칭 : 식용꽃 추출물의 유산균 발효액을 유효성분으로 함유하는 항산화 및 면역활성 증진 기능성 음료 및 식품 조성물 및 그 제조방법, 출원인 : 주식회사 웰파인, 강원대학교산학협력단, 공개일 : 2019년06월26일) 대한민국 공개특허 제10-2016-0082138호 (발명의 명칭 : 산수국 추출물을 포함하는 피부 상태 개선용 조성물, 출원인 : (주)아모레퍼시픽, 공개일 : 2016년07월08일)
본 발명의 목적은 산수국 추출물을 포함하는 면역증강용 조성물을 제공하는 데에 있다. 보다 자세하게는 본원발명의 목적은 산수국 추출물이 면역증진인자인 일산화질소의 생성, iNOS, COX-2, IL-1β, IL-6, IL-12, TNF-α 및 MCP-1의 발현, 대식세포의 식세포작용을 증가시켜 면역증진 효과를 유도할 수 있어 상기 산수국 추출물을 면역증진을 필요로 하는 질환의 약학적 조성물 또는 면역증진을 위한 건강기능식품으로 제공하는 데에 있다.
본 발명은 산수국(Hydrangea serrata) 추출물을 포함하는 면역증강용 조성물에 관한 것이다.
상기 산수국 추출물은 물, C1~C4 알코올 또는 이들의 혼합용액을 용매로 하여 제조할 수 있다.
상기 산수국 추출물은 일산화질소(Nitric Oxide)의 생성 효능; iNOS(inducible nitric oxide synthase), COX-2(Cyclooxygenase-2), IL-1β(Interluekin 1 beta), IL-6(Interleukin 6), IL-12(Interleukin 12), TNF-α(Tumor necrosis factor alpha), MCP-1(Monocyte chemoattractant protein 1)의 발현 증가 효능; 또는, 대식세포의 식세포작용 증가 효능;이 있는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 산수국 추출물을 포함하는 면역증강용 건강기능식품을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
상기 산수국 추출물은 산수국을 물, C1~C4 알코올 또는 이들의 혼합용액을 용매로 하여 추출할 수 있으며, 상기 C1~C4 알코올은 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올 및 이소부탄올로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
상기 산수국 추출물의 제조시 사용되는 물, C1~C4 알코올 또는 이들의 혼합용액은 산수국 사용 중량 기준 1~40배 부피(1kg 기준 1~40ℓ)를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 5~40배 부피를 사용할 수 있다. 상기 산수국 추출물의 추출조건은 20~100℃에서 24~72시간일 수 있다. 상기 과정은 1~4번까지 반복할 수도 있다.
또한, 당분야의 통상적인 방법으로서 상기 산수국의 물, C1~C4 알코올 또는 이들의 혼합용액 추출물을 물에 녹인 후에 n-헥산, 메틸렌클로라이드, 아세톤, 클로로포름, 에틸아세테이트 및 n-부탄올로 이루어진 군 중에서 선택되는 1종 이상의 용매를 사용하여 추가적으로 분획하여 분획물로 제조할 수 있다.
또다른 방법으로는, 산수국을 물, C1~C4 알코올 또는 이들의 혼합용매로 추출 농축하여 얻은 산수국 추출물에, 물을 가하여 현탁한 후, 바람직하게는 산수국 추출물의 중량의 1~1000배, 더 바람직하게는 1~500배, 가장 바람직하게는 1~50배의 물을 가하여 현탁한 후, 상기 현탁물에 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 및, 부탄올로 이루어진 군에서 선택되는 용매를 가하여 얻은 산수국 분획물로 제조할 수 있다. 상기 산수국 분획물은 바람직하게는, 산수국을 물, C1~C4 알코올 또는 이들의 혼합용매로 추출 농축하여 얻은 산수국 추출물을 물에 현탁한 후 헥산과 혼합하여 얻은 헥산층의 농축물, 상기 헥산층을 제거하고 남은 잔사(물층)에 클로로포름을 혼합하여 얻은 클로로포름층의 농축물, 또는 상기 클로로포름층을 제거하고 남은 잔사(물층)에 에틸아세테이트를 혼합하여 얻은 에틸아세테이트층의 농축물, 상기 에틸아세테이트층을 제거하고 남은 잔사(물층)에 부탄올을 혼합하여 얻은 부탄올층의 농축물, 또는 상기 부탄올층을 제거하고 남은 잔사(물층)의 농축물일 수 있다. 한편, 이 외의 분획조건은 제한되지는 않으나, 상기 산수국 추출물에 산수국 추출물의 중량의 1~50배의 물을 가하여 현탁물을 제조한 후, 상기 물과 동량의 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 및, 부탄올로 이루어진 군에서 선택되는 용매를 가하여 분획할 수 있다. 또한, 헥산층을 제거한 후 남은 잔사에 클로로포름을 가하고, 클로로포름층을 제거하고 남은 잔사에 에틸아세테이트를 가하고, 에틸아세테이트를 제거하고 남은 잔사에 부탄올을 가할 때에도, 단계적으로 이루어 질 때도 역시 잔사와 동량의 각 용매(클로로포름, 에틸아세테이트 또는 부탄올)를 순차적으로 가하여 분획할 수 있다.
상기 추출물 또는 이의 분획물의 제조온도는 20 내지 100℃일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 추출 또는 분획 시간은 특별히 제한되는 것은 아니나, 10분 내지 2일 이내에 추출하는 것이 바람직하며, 추출용 기기로는 통상의 추출기기, 초음파분쇄추출기 또는 분획기를 이용할 수 있다. 이렇게 제조된 산수국 추출물 또는 분획물은 열풍건조, 감압건조 또는 동결건조하여 용매를 제거할 수 있다. 또한, 상기 산수국 추출물 또는 분획물은 컬럼크로마토그래피를 이용하여 정제하여 사용할 수 있다.
상기 산수국 추출물은 상법에 따라, 유기용매(알코올, 에테르, 아세톤 등)에 의한 추출, 헥산과 물의 분배, 컬럼크로마토그래피에 의한 방법 등, 식물체 성분의 분리 추출에 이용되는 공지의 방법을 단독 또는 적합하게 조합한 방법을 이용하여 분획 또는 정제하여 사용할 수 있다.
상기 크로마토그래피는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography), 엘에이취-20 컬럼 크로마토그래피(LH-20 column chromatography), 이온교환수지 크로마토그래피(ion exchange resin chromatography), 중압 액체 크로마토그래피(medium pressure liquid chromatography), 박층 크로마토그래피(TLC; thin layer chromatography), 실리카겔 진공 액체 크로마토그래피(silica gel vacuum liquid chromatography) 및 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography) 중에서 선택될 수 있다.
또한, 본 발명은 산수국 추출물을 함유하는 면역증강용 약학 조성물을 제공한다. 상기 추출물은 본 발명의 약학 조성물에 0.001~30 중량%로 하여 첨가될 수 있다.
상기 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상기 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 투여량은 치료받을 대상의 연령, 성별, 체중과, 치료할 특정 질환 또는 병리 상태, 질환 또는 병리 상태의 심각도, 투여경로 및 처방자의 판단에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자에 기초한 투여량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 일반적으로 투여량은 0.01㎎/㎏/일 내지 대략 2000㎎/㎏/일의 범위이다. 더 바람직한 투여량은 1㎎/㎏/일 내지 500㎎/㎏/일이다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 약학 조성물은 쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 주사에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 추출물은 독성 및 부작용이 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 복용시에도 안심하고 사용할 수 있는 약제이다.
또한, 본 발명은 산수국 추출물 및 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제를 포함하는 면역증강용 건강기능식품을 제공한다. 상기 산수국 추출물은 본 발명의 건강기능식품에 0.001~100 중량%로 하여 첨가될 수 있다. 본 발명의 건강기능식품은 정제, 캡슐제, 환제 또는 액제 등의 형태를 포함하며, 본 발명의 추출물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 드링크제, 육류, 소세지, 빵, 캔디류, 스넥류, 면류, 아이스크림, 유제품, 스프, 이온음료, 음료수, 알코올 음료, 껌, 차 및 비타민 복합제 등이 있다.
본 발명은 산수국 추출물을 함유하는 조성물에 관한 것으로서, 산수국 추출물이 면역증진인자인 일산화질소(Nitric Oxide)의 생성, iNOS(inducible nitric oxide synthase), COX-2(Cyclooxygenase-2), IL-1β(Interluekin 1 beta), IL-6(Interleukin 6) IL-12(Interleukin 12), TNF-α(Tumor necrosis factor alpha) 및 MCP-1(Monocyte chemoattractant protein 1)의 발현, 대식세포의 식세포작용을 증가시켜 면역증진 효과를 유도할 수 있어 면역증진을 필요로 하는 질환의 약학적 조성물 또는 면역증진을 위한 건강기능식품으로 용이하게 활용할 수 있다.
도 1은 본 발명의 실시예 1의 산수국 추출물의 세포독성에 대한 평가 그래프이다.
도 2는 본 발명의 실시예 1의 산수국 추출물이 갖는 면역증진 유도인자인 일산화질소 (NO) 생성 촉진 활성을 보여주는 그래프이다.
도 3은 본 발명의 실시예 1의 산수국 추출물이 갖는 면역증진 유도인자 iNOS, COX-2, IL-1β, IL-6, IL-12, TNF-α 및 MCP-1 발현 촉진 효능을 보여주는 RT-PCR 결과물의 전기영동 이미지 및 이를 수치화하여 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 실시예 1의 산수국 추출물이 갖는 식세포작용 촉진 효능으로 인해 붉게 염색된 세포를 보여주는 현미경 사진과, 붉은색으로 염색된 세포들에서 용출해 낸 염료의 양을 나타낸 그래프이다.
이하 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 내용이 철저하고 완전해지도록, 당업자에게 본 발명의 사상을 충분히 전달하기 위해 제공하는 것이다.
<실시예 1. 산수국 추출물의 제조>
산수국 추출물은 다음과 같은 과정에 의해 제조된다. 우선 경북 영주에서 자생하는 산수국 잎을 증류수로 깨끗이 씻고 동결건조한 다음, 동결건조된 분쇄물 10 g에 대해 20배 중량에 해당하는 물을 가하고 상온(25℃)에서 교반하면서 3일간 추출하여 산수국 추출물을 수득하였다. 이후 추출물을 여과한 후, 동결건조하여 분말 상태의 최종 산수국 추출물(각 도면에서 WHSL로 기재함)을 수득하였다.
<실시예 2. 산수국 추출물의 세포독성 분석>
상기 실시예 1에서 수득한 본 발명의 산수국 추출물이 세포에 대한 독성이 있는지 확인하기 위하여 in vitro 내에서 세포독성 여부를 분석하였다. 이를 위해 murine macrophage 세포주인 RAW 264.7 세포를 KCLB(Korean Cell Line Bank)에서 분양받아 사용하였는데, 세포배양용 플라스크(flask)에 세포를 분주한 후, DMEM(Dulbeco's Modified Eagle's Medium)에 10% FBS(fetal bovine serum) 및 1% penicillin-streptomycin (10,000U/ml)을 첨가하고 37℃, 5% CO2, 95% 습도조건이 유지되는 배양기에서 배양하여 사용하였다.
세포독성 평가는 MTT 분석법을 사용하였는데 상기 방법은 대사 과정이 온전한 세포의 미토콘드리아 내의 탈수소효소가 노란색 수용성 tetrazoliumsalt [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2-5-diphenyltetrazolium bromide] (MTT)를 비수용성의 짙은 자주색 MTT formazan 결정으로 환원시키는 원리를 이용한 것으로 적절한 파장 (주로 500-600 nm)에서 흡광도를 측정하여 세포독성을 평가하는 방법이다.
보다 상세하게 이를 설명하면, RAW 264.7 세포를 1×105 cells/well로 96well에 분주 후 24시간 동안 배양 후, 본 발명의 산수국 추출물을 각각 12.5, 25, 50 μg/mL의 농도로 처리하고 24시간 배양하였다. 다음으로 1 mg/mL 농도의 MTT 용액(Sigma Aldrich, M5655)을 넣고 2시간 동안 37℃ 배양기에서 반응시킨 후 DMSO(dimethyl sulfoxide)를 넣어 microplate reader를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다.
도 1은 그 결과를 보여주는 그래프로, 산수국 추출물이 세포독성을 나타내지 않고 RAW 264.7의 세포 생존율을 증가시키기 때문에 식품 또는 약품 등으로 안전하게 사용할 수 있는 물질임을 확인할 수 있다.
<실시예 3. 산수국 추출물의 일산화질소 (NO) 생성능 분석>
산수국 추출물이 처리된 RAW 264.7 세포실험군을 대상으로 세포 상등액을 수집한 후, 세포 상등액으로 면역세포 활성에 의해 분비되는 물질 중 NO(Nitric Oxide)의 양을 확인하였다. 염증성 매개 물질에 노출된 세포에 의해서 생성된 NO의 생성은 생체 방어와 자유기에 의해 유발된 조직 손상에 기여한다고 알려져 있으며 다양한 염증성 질환이 발병하게 되면 증가하는 것으로 알려져 있다. NO 활성도는 대사산물인 nitrate (NO3 -)와 nitrite (NO2 -)의 생성 농도를 Griess 반응을 통해 확인하였다.
이를 상세히 설명하면, RAW 264.7 세포를 1×105 cells/well로 96well에 분주 후 24시간 동안 배양한 다음, 실시예 1의 산수국 추출물을 0, 12.5, 25, 50 μg/mL의 농도로 처리한 후 37℃, 5% CO2의 조건에서 24시간 배양하였다. 이후 세포 상등액과 세포 상등액 동량에 해당하는 Griess 시약(Sigma Aldrich, G4410)을 첨가하여 15분 반응시키고 microplate reader를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하여 도 2에 나타내었다.
그 결과, 도 2를 참고하면, 면역증진 유도인자인 일산화질소 (NO)가 산수국 추출물의 농도에 의존적으로 증가하는 것이 확인된다.
<실시예 4. 산수국 추출물의 면역증진인자인 iNOS, COX-2, IL-1β, IL-6, IL-12, TNF-α 및 MCP-1의 유전자 발현 촉진능 분석>
RAW 264.7 세포에 산수국 추출물을 처리하고 24시간 배양하여 면역증진인자인 iNOS (inducible nitric oxide synthase), COX-2 (Cyclooxygenase-2), IL-1β (Interluekin 1 beta), IL-6 (Interleukin 6), IL-12(Interleukin 12), TNF-α(Tumor necrosis factor alpha) 및 MCP-1(Monocyte chemoattractant protein 1)의 발현 변화를 RT-PCR을 이용하여 확인하였다.
이를 위하여 산수국 추출물이 처리된 RAW 264.7 세포에서 TRIzol (Invitrogen, San Diego, CA, UsA) 용액을 이용하여 제조사의 매뉴얼에 따라 RNA를 분리하였다. 분리된 RNA로부터 dNTP, oligo dT primer, buffer, dithiothreitol, Superscript II reverse transcriptase 및 RNase inhibitor를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 면역증진 유도에 관여하는 유전자는 합성된 cDNA로부터 하기 표 1의 프라이머를 사용하여 PCR 증폭하였다. PCR 증폭은 95℃에서 30초, 58~60℃에서 30초, 72℃에서 30초의 반응을 30 cycles 이상 반복하였다.
primer name 염기서열
iNOS F 5'-ttgtgcatcgacctaggctggaa-3'
iNOS R 5'-gacctttcgcattagcatggaagc-3'
COX-2 F 5'-gtactggctcatgctggacga-3'
COX-2 R 5'-caccatacactgccaggtcagcaa-3'
IL-1β F 5'-ggcaggcagtatcactcatt-3'
IL-1β R 5'-cccaaggccacaggtattt-3'
IL-6 F 5'-gaggataccactcccaacagacc-3'
IL-6 R 5'-aagtgcatcatcgttgttcataca-3'
IL-12 F 5′-aaccagacccgcccaagaac-3′
IL-12 R 5′-gatcctgagcttgcacgcaga-3
TNF-α F 5'-tggaactggcagaagaggca-3'
TNF-α R 5'-tgctcctccacttggtggtt-3'
MCP-1 F 5'-ggaaaaatggatccacaccttgc-3'
MCP-1 R 5'-tctcttcctccaccaccatgcag-3'
GAPDH F 5'-ggactgtggtcatgagcccttcca-3'
GAPDH R 5'-actcacggcaaattcaacggcac-3'
이 결과는 도 3에 나타내었는데, 도 3의 각 그래프는 PCR 결과 band를 이미지화하여 나타낸 것으로서, 산수국 추출물의 처리에 따라 RAW 264.7 세포에서 농도 의존적으로 면역증진 유도인자인 iNOS, COX-2, IL-1β, IL-6, IL-12, TNF-α 및 MCP-1의 발현이 증가하는 것을 확인할 수 있다.
<실시예 5. 산수국 추출물의 대식세포의 식세포 작용 촉진효능 분석>
RAW 264.7 세포에 산수국 추출물을 처리하고 24시간 배양하여 대식세포 고유의 식세포 작용 촉진효능을 neutral red 염색을 통해 분석하였다.
이를 위하여, RAW 264.7 세포에 산수국 추출물을 처리하고 24시간 배양 후, 세포 배양액을 제거하고 100 ㎕의 0.01% neutral red 염색시약(Sigma Aldrich, N4638)을 처리하고 37℃, 5% CO2의 조건에서 3시간 배양하였다. 3시간 후 1 X PBS (Phosphate buffered saline)로 5회 세척하였다. 세척 후 현미경으로 세포를 관찰하고 용출 버퍼 (ethanol 및 acetic acid의 1:1(v:v) 혼합액)로 neutral red를 용출한 상등액을 microplate reader를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
식세포 기능이 활성화된 세포는 붉은색으로 염색되는데, 도 4의 현미경 사진이 이를 보여주고 있으며, 이 세포들로부터 neutral red 염색약을 용출하여 나타낸 그래프 값이 산수국 추출물의 처리에 따라 농도 의존적으로 대식세포의 식세포 작용이 촉진되었음을 나타낸다.
<제제예 1. 약학적 제제 - 정제의 제조>
본 발명의 실시예 1의 산수국 추출물 200g을 락토오스 175.9g, 감자전분 180g 및 콜로이드성 규산 32g과 혼합하였다. 이 혼합물에 10% 젤라틴 용액을 첨가시킨 후, 분쇄해서 14 메쉬체를 통과시켰다. 이것을 건조시키고 여기에 감자전분 160g, 활석 50g 및 스테아린산 마그네슘 5g을 첨가해서 얻은 혼합물을 정제로 만들었다.
<제제예 2. 식품 제조>
제제예 2-1. 조리용 양념의 제조
본 발명의 실시예 1의 산수국 추출물을 조리용 양념에 1 중량%로 첨가하여 건강 증진용 조리용 양념을 제조하였다.
제제예 2-2. 밀가루 식품의 제조
본 발명의 실시예 1의 산수국 추출물을 밀가루에 0.1 중량%로 첨가하고, 이 혼합물을 이용하여 빵, 케이크, 쿠키, 크래커 및 면류를 제조하여 건강 증진용 식품을 제조하였다.
제제예 2-3. 스프 및 육즙(gravies)의 제조
본 발명의 실시예 1의 산수국 추출물을 스프 및 육즙에 0.1 중량%로 첨가하여 건강 증진용 수프 및 육즙을 제조하였다.
제제예 2-4. 유제품(dairy products)의 제조
본 발명의 실시예 1의 산수국 추출물을 우유에 0.1 중량%로 첨가하고, 상기 우유를 이용하여 버터 및 아이스크림과 같은 다양한 유제품을 제조하였다.
제제예 2-5. 야채주스 제조
본 발명의 실시예 1의 산수국 추출물 0.5g을 토마토주스 또는 당근주스 1,000㎖에 가하여 건강 증진용 야채주스를 제조하였다.
제제예 2-6. 과일주스 제조
본 발명의 실시예 1의 산수국 추출물 0.1g을 사과주스 또는 포도주스 1,000㎖에 가하여 건강 증진용 과일주스를 제조하였다.

Claims (5)

  1. 산수국(Hydrangea serrata) 추출물을 포함하는 것을 특징으로 하는 면역증강용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 산수국 추출물은 물, C1~C4 알코올 또는 이들의 혼합용액을 용매로 하여 제조하는 것을 특징으로 하는 면역증강용 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 산수국 추출물은 일산화질소(Nitric Oxide)의 생성 효능; iNOS(inducible nitric oxide synthase), COX-2(Cyclooxygenase-2), IL-1β(Interluekin 1 beta), IL-6(Interleukin 6), IL-12(Interleukin 12), TNF-α(Tumor necrosis factor alpha), MCP-1(Monocyte chemoattractant protein 1)의 발현 증가 효능; 또는, 대식세포의 식세포작용 증가 효능;이 있는 것을 특징으로 하는 면역증강용 조성물.
  4. 산수국(Hydrangea serrata) 추출물을 포함하는 것을 특징으로 하는 면역증강용 건강기능식품.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 산수국 추출물은 물, C1~C4 알코올 또는 이들의 혼합용액을 용매로 하여 제조하는 것을 특징으로 하는 면역증강용 건강기능식품.
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