KR20210084785A - 신규한 유산균 Pediococcus acidilactici DU. LAB. K-1(KCTC 13963BP)를 이용하여 설포라판 및 쿼세틴이 증강된 새싹브로콜리 유산균 발효물 및 이의 제조방법 - Google Patents

신규한 유산균 Pediococcus acidilactici DU. LAB. K-1(KCTC 13963BP)를 이용하여 설포라판 및 쿼세틴이 증강된 새싹브로콜리 유산균 발효물 및 이의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 신규한 유산균 Pediococcus acidilactici DU. LAB. K-1(KCTC 13963BP)를 이용하여 설포라판 및 쿼세틴이 증강된 새싹브로콜리 유산균 발효물 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는, 새싹브로콜리 추출물에 신규한 유산균 Pediococcus acidilactici DU. LAB. K-1(KCTC 13963BP)를 접종한 접종 조성액을 최적의 발효조건 하에서 발효시켜 설포라판 및 쿼세틴이 증강된 새싹브로콜리 유산균 발효물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 신규한 유산균 Pediococcus acidilactici DU. LAB. K-1(KCTC 13963BP)를 이용하여 설포라판 및 쿼세틴이 증강된 새싹브로콜리 유산균 발효물의 제조방법은 새싹브로콜리 추출물과 과채혼합농축액을 혼합한 혼합물을 가열살균하여 가열 살균액을 제조하는 제1단계;와 상기 가열 살균액에 신규한 유산균 Pediococcus acidilactici DU. LAB. K-1(KCTC 13963BP)을 접종하여 접종 조성액을 제조하는 제2단계;와 상기 접종 조성액을 발효하는 제3단계;를 포함한다.

Description

신규한 유산균 Pediococcus acidilactici DU. LAB. K-1(KCTC 13963BP)를 이용하여 설포라판 및 쿼세틴이 증강된 새싹브로콜리 유산균 발효물 및 이의 제조방법{Broccoli Sprouts Fermentation Composition with Enhanced Sulforaphane and Quercetin using Pediococcus acidilactici DU. LAB. K-1(KCTC 13963BP) of novel lactic acid bacteria and Manufacturing Method thereof}
본 발명은 신규한 유산균 Pediococcus acidilactici DU. LAB. K-1(KCTC 13963BP)를 이용하여 설포라판 및 쿼세틴이 증강된 새싹브로콜리 유산균 발효물 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는, 새싹브로콜리 추출물에 신규한 유산균 Pediococcus acidilactici DU. LAB. K-1(KCTC 13963BP)를 접종한 접종 조성액을 최적의 발효조건 하에서 발효시켜 설포라판 및 쿼세틴이 증강된 새싹브로콜리 유산균 발효물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
브로콜리(Brasica oleracea var. italica Plenck)는 십자화과에 속하는 채소로 잎과 줄기는 모두 버려지고 작은 꽃봉오리가 다발로 이루어진 꽃만을 식용하며, 한 줄기에서 꽃이 4∼5개 정도 맺히고, 잎은 10∼15장 이상 나와 매우 무성하게 된다.
브로콜리는 항산화 물질로 알려진 아스코빅산(ascorbic acid), 베타카로틴(β-carotene), 루틴(rutin), 셀레늄(selenium), 쿼세틴(quercetin) 및 글루타치온(glutathione) 등이 다량 함유되어 있으며, 암세포증식억제 및 해독 효소의 유도 효과가 크다고 알려져 많은 연구가 진행되고 있다.
특히, 브로콜리에는 신체의 자연 치유력을 증강 시켜 암 발행의 위험성을 줄여주는 물질인 설포라판(sulforaphane, S-methylsulfinylbutylisothiocyanate)이 함유되어 있다고 알려져 있는데, 설포라판은 최근 연구에서 발암물질로 전처리한 생쥐의 유선에서 종양발생을 억제하고, 전립선암의 예방에도 유효한 것으로 보고되었다. 또한, in vitro 실험에서 설포라판이 암 예방 효과뿐만 아니라 헬리코박터에 대한 강력한 살균 효과가 있음이 보고되었다.
종래 새싹브로콜리와 관련한 특허문헌으로, 한국등록특허 제10-1666021호는 회전식 새싹 재배 장치를 이용하여 생산된 브로콜리 새싹을 설포라판 농축액에 침지시킨 후 원적외선 볶음 장치에서 볶아 그 영양성분을 향상시킨 브로콜리 새싹을 이용한 기능성 차와 그의 제조방법을 제시하고 있으며, 한국등록특허 제10-1965391호는 브 콜리 종자에 포졸란 혼합액을 공급하면서 발아 및 새싹을 수득하고, 수득된 브로콜리 새싹을 감압 건조하여 설포라판이 증가된 브로콜리 새싹 추출물을 제시하고 있다.
또한, 한국공개특허 제10-2019-0097741호는 용암해수가 함유된 용수하에서 브로콜리 종자를 발아시키고 발아된 브로콜리 종자에 상기 용암해수가 함유된 용수를 공급하여 제조되는 성장률 및 설포라판 함량이 증가된 브로콜리 새싹 및 이의 생산방법을 제시하고 있으며, 한국등록특허 제10-1807367호는 글루코스 및 프룩토스 중 어느 하나의 당과 브로콜릭 새싹을 혼합한 당 혼합물에 에탄올을 첨가한 후 분획한 브로콜리 새싹 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화 조성물 및 그의 제조방법을 제시하고 있다.
본 발명자는 새싹브로콜리에 포함된 유효성분인 설포라판 및 쿼세틴을 증강시키기 위한 연구의 일환으로 새싹브로콜리 추출물에 신규한 유산균 Pediococcus acidilactici DU. LAB. K-1(KCTC 13963BP)를 접종한 접종 조성액을 최적의 발효조건 하에서 발효시킨 새싹브로콜리 유산균 발효물을 개발하였으며, 상기 새싹브로콜리 유산균 발효물로부터 설포라판 및 쿼세틴이 증강되었음을 확인하여 본 발명에 이르게 되었다.
한국등록특허 제10-1666021호 한국등록특허 제10-1965391호 한국공개특허 제10-2019-0097741호 한국등록특허 제10-1807367호
상기와 같은 문제점을 해결하기 위한 본 발명의 목적은 새싹브로콜리 추출물에 신규한 유산균 Pediococcus acidilactici DU. LAB. K-1(KCTC 13963BP)를 접종한 접종 조성액을 최적의 발효조건 하에서 발효시켜 설포라판 및 쿼세틴이 증강된 새싹브로콜리 유산균 발효물 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다.
상기 과제를 해결하기 위한 본 발명의 신규한 유산균 Pediococcus acidilactici DU. LAB. K-1(KCTC 13963BP)를 이용하여 설포라판 및 쿼세틴이 증강된 새싹브로콜리 유산균 발효물의 제조방법은 새싹브로콜리 추출물과 과채혼합농축액을 혼합한 혼합물을 가열살균하여 가열 살균액을 제조하는 제1단계;와 상기 가열 살균액에 신규한 유산균 Pediococcus acidilactici DU. LAB. K-1(KCTC 13963BP)을 접종하여 접종 조성액을 제조하는 제2단계;와 상기 접종 조성액을 발효하는 제3단계;를 포함한다.
상기 제1단계의 새싹브로콜리 추출물은 분쇄액, 농축액, 건조물, 분말 및 이들의 조합 중 어느 하나를 포함한다.
상기 제1단계의 과채혼합농축액은 바나나 농축액, 복숭아농축액, 망고농축액, 딸기농축액, 토마토농축액, 당근농축액 및 이들의 조합 중 어느 하나이며, 1 내지 90 °Brix를 갖는 것을 특징으로 한다.
상기 제1단계는 새싹브로콜리 추출물 100 부피부에 대하여 과채혼합농축액 0.1 내지 20 부피부를 첨가하는 것을 특징으로 한다.
상기 과채혼합농축액은 갈락토올리고당, 말토올리고당, 프락토올리고당, 이소말토올리고당 및 이들의 조합 중 어느 하나의 당을 더 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기 제2단계에서는 가열 살균액 100중량부에 대하여 신규한 유산균 Pediococcus acidilactici DU. LAB. K-1(KCTC 13963BP)을 0.1 내지 50중량부 접종하는 것을 특징으로 한다.
상기 제3단계에서는 접종 조성액을 20 내지 50℃에서 6 내지 96시간 발효하는 것을 특징으로 한다.
상술한 바와 같이, 본 발명에 따른 신규한 유산균 Pediococcus acidilactici DU. LAB. K-1(KCTC 13963BP)를 이용하여 설포라판 및 쿼세틴이 증강된 새싹브로콜리 유산균 발효물 및 이의 제조방법에 의하면, 균주의 활성도와 베타글로코시데이즈(β-glucosidase) 활성이 높은 분리 동정된 신규한 유산균 Pediococcus acidilactici DU. LAB. K-1(KCTC 13963BP)을 새싹브로콜리 추출물에 첨가 및 최적의 발효조건 하에서 발효시켜 새싹브로콜리 내 배당체 성분인 루틴(rutin)을 장내 흡수율이 높은 비배당체인 쿼세틴(quercetin)로 효율적으로 전환 또는 부분적 전환하고, 새싹브로콜리 유효성분인 설포라판(sulforaphane)의 함량을 높인 효과가 있다.
도 1은 본 발명에 따른 신규한 유산균으로 발효되어 설포라판(sulforaphane)과 쿼세틴(quercetin)의 함량이 증강된 새싹브로콜리 유산균 발효물 제조단계를 개략적으로 나타낸 흐름도.
도 2는 각종 발효식품으로부터 분리된 유산균.
도 3은 분리 유산균의 베타-글루코시데이즈(β-glucosidase)활성을 보이는 에스큘린(esculin) 고체배지 상 그림.
도 4는 최종 선별 균주 Pediococcus acidilactici DU. LAB. K-1의 뉴클레오타이드 염기서열.
도 5는 최종 선별 균주 Pediococcus acidilactici DU. LAB. K-1(KCTC 13963BP)의 16S rRNA의 계통수 분석.
도 6은 발효시간, 브로콜리 농도 및 발효 부원료 농도에 따른 새싹브로콜리 발효물의 유산균수(12.2-13.2-14.2 Log10 CFU/mL)에 대한 반응표면도.
도 7은 발효시간, 브로콜리 농도 및 발효 부원료 농도에 따른 새싹브로콜리 발효물의 유산함량(12.0-12.5-13.0 mg/mL)에 대한 반응표면도.
도 8은 발효시간, 브로콜리 농도 및 발효 부원료 농도에 따른 새싹브로콜리 발효물의 sulforaphane 증가함량(11-12-13 ㎍/mL)에 대한 반응표면도.
도 9는 발효시간, 브로콜리 농도 및 발효 부원료 농도에 따른 새싹브로콜리 발효물의 rutin 감소함량(8-10-12 ㎍/mL)에 대한 반응표면도.
도 10은 발효시간, 브로콜리 농도 및 발효 부원료 농도에 따른 새싹브로콜리 발효물의 quercetin 증가함량(1.0-1.1-1.2 ㎍/mL)에 대한 반응표면도.
도 11은 발효시간과 브로콜리 농도 및 발효 부원료 농도에 따른 새싹브로콜리 발효물의 유산균수, lactic acid 함량, sulforaphane 증가함량, lutin 감소함량 및 quercetin 증가함량의 발효조건 최적화를 위한 수퍼임포징된(superimposed) 반응표면.
도 12는 새싹브로콜리 유효성분 설포라판(sulforaphan)의 HPLC분석 크로마토 그램. (A); 설포라판(sulforaphan) 표준물질 크로마토 그램, (B); 발효전 새싹브로콜리 추출물의 설포라판 크로마토 그램, (C); 새싹브로콜리 발효물의 설포라판 크로마토 그램
도 13은 새싹브로콜리 유효성분 루틴(rutin)과 쿼세틴(quercetin)의 HPLC분석 크로마토 그램. (A); 루틴(rutin)과 쿼세틴(quercetin) 표준물질 크로마토 그램, (B); 발효전 새싹브로콜리 추출물의 루틴(rutin)과 쿼세틴(quercetin) 크로마토 그램, (C); 새싹브로콜리 발효물의 루틴(rutin)과 쿼세틴(quercetin) 크로마토 그램
본 발명의 구체적 특징 및 이점들은 이하에서 첨부도면을 참조하여 상세히 설명한다. 이에 앞서 본 발명에 관련된 기능 및 그 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 구체적인 설명을 생략하기로 한다.
본 발명은 신규한 유산균 Pediococcus acidilactici DU. LAB. K-1(KCTC 13963BP)를 이용하여 설포라판 및 쿼세틴이 증강된 새싹브로콜리 유산균 발효물 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는, 새싹브로콜리 추출물에 신규한 유산균 Pediococcus acidilactici DU. LAB. K-1(KCTC 13963BP)를 접종한 접종 조성액을 최적의 발효조건 하에서 발효시켜 설포라판 및 쿼세틴이 증강된 새싹브로콜리 유산균 발효물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
도 1은 본 발명에 따른 신규한 유산균 Pediococcus acidilactici DU. LAB. K-1(KCTC 13963BP)를 이용하여 설포라판 및 쿼세틴이 증강된 새싹브로콜리 유산균 발효물의 제조방법을 보여주는 순서도이다.
본 발명에 따른 신규한 유산균 Pediococcus acidilactici DU. LAB. K-1(KCTC 13963BP)를 이용하여 설포라판 및 쿼세틴이 증강된 새싹브로콜리 유산균 발효물의 제조방법은 새싹브로콜리 추출물과 과채혼합농축액을 혼합한 혼합물을 가열살균하여 가열 살균액을 제조하는 제1단계와 상기 가열 살균액에 신규한 유산균 Pediococcus acidilactici DU. LAB. K-1(KCTC 13963BP)을 접종하여 접종 조성액을 제조하는 제2단계와 상기 접종 조성액을 발효하는 제3단계를 포함한다.
상기 제1단계에서는 새싹브로콜리 추출물과 과채혼합농축액을 혼합한 혼합물을 살균온도 60 내지 135℃ 에서 1 내지 60분간 가열살균하여 가열 살균액을 제조한다
상기 새싹브로콜리 추출물은 새싹브로콜리의 분쇄액, 농축액, 건조물, 분말 및 이들의 조합 중 어느 하나를 포함하며, 바람직하게는, 분쇄 새싹브로콜리에 5 내지 10배수의 증류수를 가하여 50 내지 80℃에서 6 내지 12시간 추출 후 원심분리된 상등액을 10 내지 15 °Brix를 갖도록 감압농축한 것을 사용할 수 있다.
상기 과채혼합농축액은 바나나 농축액, 복숭아농축액, 망고농축액, 딸기농축액, 토마토농축액, 당근농축액 및 이들의 조합 중 어느 하나를 사용할 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다.
이때, 상기 과채혼합농축액은 1 내지 90 °Brix를 갖는 것을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 50 내지 80 °Brix를 사용하며, 더욱 바람직하게는, 60°Brix 인 것을 사용할 수 있다.
상기 제1단계는 새싹브로콜리 추출물 100 부피부에 대하여 과채혼합농축액 0.1 내지 20 부피부를 첨가할 수 있으며, 바람직하게는 5 내지 18 부피부를 첨가할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 10 부피부를 첨가할 수 있다.
또한, 상기 과채혼합농축액은 갈락토올리고당, 말토올리고당, 프락토올리고당, 이소말토올리고당 및 이들의 조합 중 어느 하나의 당을 더 포함할 수 있다.
제2단계에서는 상기 가열 살균액에 신규한 유산균 Pediococcus acidilactici DU. LAB. K-1(KCTC 13963BP)을 접종하여 접종 조성액을 제조한다.
신규한 유산균 Pediococcus acidilactici DU. LAB. K-1(KCTC 13963BP)은 김치 수십 종 및 침채류 등의 발효식품으로부터 분리한 것으로, 베타글루코시데이스 활성을 가지며, MRS broth 배지에서 6 내지 24시간 전배양된 전배양액을 사용한다.
상기 제2단계에서는 가열 살균액 100중량부에 대하여 신규한 유산균 Pediococcus acidilactici DU. LAB. K-1(KCTC 13963BP)을 0.1 내지 50중량부 접종하며, 바람직하게는 1 내지 10 중량부를 첨가할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 2중량부를 첨가할 수 있다.
상기 제3단계에서는 접종 조성액을 발효하는데 접종 조성액을 20 내지 50℃에서 6 내지 96시간 발효하며, 바람직하게는 30 내지 45℃에서 40 내지 70시간 발효할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 37℃에서 55시간 동안 발효할 수 있다.
본 발명에 따른 신규한 유산균 Pediococcus acidilactici DU. LAB. K-1(KCTC 13963BP)를 이용하여 설포라판 및 쿼세틴이 증강된 새싹브로콜리 유산균 발효물의 제조방법은 상기 3단계 수행 후, 새싹브로콜리 유산군 발효물을 살균온도 60 내지 135℃ 에서 1 내지 60분간 가열살균처리하는 4단계와 10 마이크로 필터 여과기를 통과시켜 여과하는 제5단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 신규한 유산균 Pediococcus acidilactici DU. LAB. K-1(KCTC 13963BP)를 이용하여 설포라판 및 쿼세틴이 증강된 새싹브로콜리 유산균 발효물은상술된 제조방법에 의해 제조되며, 이에 관한 상세한 설명은 생략하도록 한다.
이하, 본 발명에 따른 신규한 유산균 Pediococcus acidilactici DU. LAB. K-1(KCTC 13963BP)를 이용하여 설포라판 및 쿼세틴이 증강된 새싹브로콜리 유산균 발효 음료의 제조방법(이하, 새싹브로콜리 유산균 발효 음료의 제조방법)을 설명하도록 한다.
본 발명에 따른 새싹브로콜리 유산균 발효 음료의 제조방법은 새싹브로콜리 유산균 발효물을 포함하는 것으로서, 상술된 새싹브로콜리 유산균 발효물의 제조방법의 또한, 상기 제4단계를 거친 가열살균처리된 발효물 또는 상기 제5단계를 거친 여과처리된 여과물 100 중량부에 기호도 향상을 위하여 과실추출물 0.1 내지 99.9 중량부를 첨가하는 6단계를 더 포함할 수 있다.
상기 과실추출물은 착즙액, 농축액, 분쇄액, 분말 및 이들의 조합 중 어느 하나의 형태로 첨가될 수 있으며, 사과, 감, 블루베리, 블랙베리, 블랙커런트, 아사이베리, 복분자, 석류, 포도, 배, 복숭아, 바나나, 딸기, 토마토, 당근, 자두, 매실, 앵두, 다래, 오디, 머루, 키위, 참외, 귤, 오렌지, 자몽, 귤, 멜론, 체리, 멜론, 블랙수퍼베리, 망고, 레몬, 파인애플 및 이들의 조합 중 어느 하나로부터 추출되는 추출물을 사용할 수 있으나, 기호도 향상을 위한 것이라면 이에 한정하는 것은 아니다.
본 발명에 따른 새싹브로콜리 유산균 발효 음료는 상술된 새싹브로콜리 유산균 발효 음료의 제조방법에 의해 제조되며, 이에 관한 상세한 설명은 생략하도록 한다.
본 발명에서는 새싹브로콜리 유산균 발효물은 장내 흡수율이 높은 비배당체성분인 쿼세틴(quercetin)과 새싹브로콜리 유효성분인 설포라판(sulforaphane)의 함량이 높아 음료뿐만 아니라 건강보조식품, 건강기능식품 등에 다양한 제품 및 제형의 형태로 활용될 수 있다.
이하, 본 발명의 실시예 및 실험예를 들어 상세히 설명한다. 단, 하기의 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예는 한정되는 것은 아니다.
실험재료와 방법
1. 유산균
1-1. 유산균의 분리
유산균 분리에 사용한 발효식품 시료는 가정집 및 음식점에서 담근 김치 수십 종 및 침채류 등을 수집하여 유산균 분리 시료액으로 사용하였으며, 각 시료액을 멸균증류수로 10-1 ∼ 10-5으로 희석한 후 0.004% 브로모크레졸퍼플(BCP)가 첨가된 시판용 MRS 한천배지에 100 μl 씩 분주 도말하고, 37℃에서 24시간 배양 후 나타난 독립된 콜로니 중 균주의 크기, 색, 모양, 투명도 등을 관찰하여 유산균의 특징적인 콜로니를 순수 분리하였다. 순수 분리한 유산균은 MRS 한천사면배지에 접종하여 37℃에서 24시간 배양한 후 4℃ 냉장보관하면서 사용하였다.
1-2. 베타글루코시데이스(β-Glucosidase) 활성 균주 선발
베타글루코시데이스 활성을 갖는 균주의 선발을 위해 에스쿨린 한천(esculin 0.1%, peptones 1.8%, ferric citrate 0.1%, agar 2%)법을 이용하여 에스쿨린(esculin)이 함유된 에스쿨린 한천배지에 균주를 접종하여 배지 내에서의 색깔 변화를 관찰하였다. 에스쿨린은 베타글루코시데이스에 의하여 글루코스(glucose)와 에스쿨린으로 분리되며 에스쿨린은 페릭 암모니움 시트레이트(ferric ammonium citrate)와 반응하여 콜로니주위에 검은색 반점(black complex)를 형성하게 된다. 따라서 에스쿨린 한천배지에서 배양된 콜로니주위에 검은색 반점를 형성하는 균주를 베타글루코시데이스 활성을 가지는 균주로 판단하여 선별하였다.
1-3. 베타글루코시데이스(β-Glucosidase) 활성능 측정
베타글루코시데이스 활성 측정은 1% 카르복시메칠셀루로스(carboxymethyl cellulose, CMC)가 첨가된 시판용 MRS 배지에 12시간 전배양한 균주를 접종하여 37℃에서 24시간 배양 후, 배양액을 4℃에서 6000 rpm으로 15분간 원심분리하여 세포를 제거하고, 상층액 0.5 ml를 취하여 1 ml의 5 mM 파라-니트로페닐-베타-디-글루코피라노사이드(ρ-nitrophenyl-β-D-glucopynanoside, ρ-NPG)용액과 혼합한 후 37℃에서 30분간 반응시켰다. 반응액은 1 ml의 1 M 탄산나트륨(Na2CO3)용액을 첨가하여 반응을 중지시키고, 생성된 파라-니트로페놀(p-nitrophenol, ρ-NP)를 405 nm에서 흡광도를 측정한 후 파라-니트로페놀의 검량곡선을 이용하여 농도를 환산하였다.
1-4. 분리 유산균주의 새싹브로콜리 추출액 농도에 따른 균 생장실험
새싹브로콜리 추출액을 농도별로 (5, 10, 15, 20, 50 및 100%) 첨가한 MRS agar에 분리 균주를 획선 도말하여 37℃에서 24시간 배양 후 균의 생장정도를 관찰하였다.
1-5. 새싹채소 추출액의 유산발효 검토
분리균주의 새싹브로콜리에 대한 발효능을 조사하기 위해 새싹브로콜리 10%를 첨가하여 추출한 추출물을 기본 배지로 하여 위에서 선별된 유산균 3종을 MRS broth 배지에 12시간 전배양 후 2% 접종 후 발효시간을 달리하여 발효하였다.
1-6. 최종선별균주의 염기서열분석과 계통분류
최종 선별된 균주의 16S rRNA 유전자는 시퀀싱(sequencing) 을 통하여 분석하였으며, NCBI 데이터베이스(database)를 이용하여 분리된 균주와 데이터베이스상의 표준균주(type strain)와의 유사성(similarity, %)을 확인하였다.
2. 새싹브로콜리 추출물
2-1. 새싹브로콜리 추출물의 준비
본 발명에서 사용된 새싹브로콜리 원료는 2018년에 7월에 수확된 것 중 길이가 10 cm 전후의 것을 구입한 후, 일정한 크기로 잘라 10배수의 물을 가하여 67℃에서 7시간 추출하였다. 이들 추출물을 감압농축하여 최종 농도를 15 °Brix로 하여 유산발효를 위한 원료로 사용하였다.
2-2. 새싹브로콜리 유산발효조건 최적화
새싹브로콜리의 유산발효조건을 최적화하기 위하여 반응표면분석법(repose surface methodology, RSM)을 이용하였다. 발효조건은 중심합성계획법(Central Composite Design, CCD)을 이용하였다. 새싹브로콜리의 발효조건은 표 1, 2와 같이 세 개의 독립변수를 5수준으로 발효시간(X1 : 24, 36, 48, 60, 72 hr) 및 새싹브로콜리 추출물의 농도(X2 : 4, 6, 8, 10, 12 °Brix), 부원료인 과채혼합 농축액(60 °Brix) 농도 (X3 : 2, 4, 6, 8, 10 °Brix)로 하였고, 종속변수는 유산발효 후 유산균수(Log10 CFU/mL), pH 감소량, 산도증가량, lactic acid 함량, 유효성분(rutin, quercetin 및 sulforaphan)의 함량을 측정하였다. 또한, 유산발효 조건이 새싹브로콜리 추출물의 종속변수(발효특성 및 유효성분 함량 변화)에 미치는 영향을 예측된 모델식을 바탕으로 Mathematica program을 이용하여 4차원 반응표면분석으로 해석하였다.
Figure pat00001
Figure pat00002
1)중심합성계획에 의한 실험조건 번호.
3. 유산균 발효추출물
3-1. 발효
새싹브로콜리 추출물을 기본 배지로 하여 실험계획에 따라 부원료인 과채혼합 농축액(60 °Brix)의 첨가량을 달리하여, MRS 액체배지에서 12시간 전배양된 신규한 유산균 Pediococcus acidilactici DU. LAB. K-1(KCTC 13963BP)을 종균으로 하여 2% 접종 후 발효시간을 달리하여 발효하였다.
3-2. 발효물의 생육도, pH 및 산도 측정
발효물의 유산균 생육도는 분광광도계(Optizen 2120UV, Mecasys co., Ltd., Korea)로 660nm에서 흡광도를 측정하였다. pH는 pH미터(Metter Toledo Group, Switzerland)를 사용하여, 산도는 0.1 N NaOH용액으로 pH 8.3으로 중화 적정하여 소비된 0.1 N NaOH용액을 유산함량(%)으로 환산하였다.
3-3. 유산(Lactic acid) 함량 측정
Lactic acid 함량 분석을 위해 추출물 및 발효물 시료를 0.45 ㎛ 막여과지로 여과하여 HPLC로 분석하였다. Lactic acid 함량 분석조건은 컬럼 Aminex®HPX-87H(7.5×300 mm, 9㎛, BIO-RAD Laboratories, USA)를 사용하여 5 mM 황산(sulfuric acid)을 유속 0.6mL/min의 조건으로 검출기 PDA 214 nm에서 분석하였다. 모든 표준물질은 시그마사(Sigma-Aldrich Co., USA) 제품으로 사용하였다.
3-4. 유효성분 함량 측정
유효성분 함량은 새싹브로콜리 추출물 및 발효물 시료 용액을 0.45 ㎛ 막여과지로 여과한 후, HPLC시스템(Alliance e2695, Waters Co., USA)로 분석하였다. 분석조건은 표 3에 나타내었다. 표준품은 설포라판(Sulforaphane), 루틴(Rutin ), 쿼세틴(quercetin) 등(Sigma-Aldrich Co., USA)을 이용하여 표준 검량선을 작성한 후 각각의 함량을 계산하였다.
Figure pat00003
실험결과
4. 신규한 유산균의 분리 동정
4-1. 발효식품으로부터 유산균 분리
발효식품(김치) 시료로부터 11종의 유산균을 분리하였다. 일부 발효식품에서는 숙성에 따라 유산균이 거의 검출되지 않는 시료도 있었다. 발효식품으로부터 분리한 균주는 DU. La. B-1∼7과 DU. LAB. K-1∼3로 명명하였으며, 분리한 균주는 계대배양을 실시하여 단독 colony를 순수분리하였다. 발효식품의 종류와 숙성도에 따른 colony의 분포는 달랐으며 희석배수가 10-3~10-5 일 때 균주의 분리가 가장 용이하였다(도 2).
4-2. 베타-글루코시데이즈(β-glucosidase) 활성 균주 선발
β-glucosidase 활성 균주를 선발하고자 esculin agar법을 사용하였다. 분리 유산균들이 esculin에 의해 black complex의 생성 여부에 따른 결과는 도 3과 같으며, black complex 길이는 표 4와 같다. Esculin agar에서 black complex 생성은 DU. La. B-1균주를 제외한 모든 분리유산균에서 colony 주변에 black coomplex를 형성하여 β-glucosidase 활성이 있는 것으로 나타났으며, DU. LAB. K-3 균주가 black complex 길이가 가장 크게 나타났다(도 3). 또한, 분리된 11종의 유산균에 대한 β-glucosidase활성을 측정한 결과는 표 4와 같이 esculin agar에서 black complex 생성하지 않은 DU. La. B-1균주의 β-glucosidase 활성이 2.74 mU/mL로 가장 낮게 나타났으며, DU. La. B-7균주가 β-glucosidase 활성이 5.85 mU/mL로 가장 높은 활성을 나타내었다.
Figure pat00004
4-3. 분리 균주의 새싹채소 추출액 농도에 따른 균 생장실험
새싹브로콜리 추출액 단독으로 5, 10, 15, 20, 50, 100% 함유한 고체배지에서 분리 유산균주의 생육능을 검토한 결과는 표 5와 같다. DU. La. B-1과 DU, LAB. K-7균주를 제외한 모든 분리 유산균들은 새싹브로콜리 추출액이 100% 함유된 배지에서 colony가 뚜렷하게 생성된 것을 알 수 있었다.
Figure pat00005
상대적 성장도: +; 성장도 약함, ++; 성장도 중간, +++; 성장도 강함
4-4. 최종균주 선별
분리한 유산 균주에 대한 새싹브로콜리 발효 여부를 검토하기 위하여 표 4에서 β-glucosidase 활성능이 좋은 3종의 균주(DU. La. B-7. B-8, DU. LAB. K-1)를 배양하여 10 °Brix의 새싹브로콜리 추출액에 접종하여 37℃ incubator에서 48시간 배양하여 생균수, pH, 산도를 측정하여 균주의 생장 및 발효능을 확인하였다(표 6). 그 결과 3종의 균주 모두가 새싹브로콜리에서 생장이 가능한 것으로 나타났으며, 세 균주 모두가 24시간 내에 왕성하게 증식하는 것으로 보였으며, 발효 종료 후 DU. LAB. K-1에서 가장 많은 균수 증가량을 보였다. pH의 경우는 모든 균주에서 발효시간이 경과할수록 감소하는 것으로 나타났으며, DU. LAB. K-1 균주에서 가장 낮은 pH 값이 측정되었다. 산도의 경우는 균주 간에 큰 차이가 없는 것으로 나타났으며, 발효 24시간 동안 산도가 많이 증가하는 경향을 보였으며, 24시간 후 48시간까지는 산도의 변화가 거의 없는 것으로 나타났다. 따라서 새싹브로콜리의 발효를 위해서는 유산균수 증가량과 pH 감소폭이 가장 큰 DU. LAB. K-1 균주를 발효균주로 최종선정하였다.
Figure pat00006
4-5. 최종 선발균주(DU. LAB. K-1)의 동정
최종 분리된 균주 중 베타-글루코시데이즈 활성능과 발효력이 가장 높은 1균주인 DU. LAB. K-1를 16s rDNA 유전자의 염기서열을 분석하여 NCBI blast DB와 비교한 결과(표 7), Pediococcus속에 속하는 Pediococcus acidilactici과 98~99% 상동성을 보였다. NCBI Blast 검색를 통해 Pediococcus속 내에 DU. LAB. K-1균주와 유연관계가 가까운 종들을 찾고 Pediococcus acidilactici DU. LAB. K-1 뉴클레오타이드 염기서열(도 4) 검색을 통하여 동일 균주들의 염기서열을 조사하였다. Bioedit program과 Clustal X program을 이용하여 염기서열을 alignment한 후 근연관계를 조사해 본 결과 도 5와 같으며 Pediococcus acidilactici DSM 20284와 Pediococcus acidilactici NGRI 0510Q와 각각 99%와 98% 상동성을 보였다. 따라서 분리균주 DU. LAB. K-1균주를 Pediococcus acidilactici DU. LAB. K-1으로 명명하였으며 국제미생물 기탁기관인 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC) 2019년 9월 30일자로 특허기탁 하였으며 기탁번호 KCTC 13963BP를 부여받았다.
Figure pat00007
5. 새싹브로콜리 추출물의 유산발효조건 최적화
5-1. 유산발효조건에 따른 발효적 특성 및 유효성분 함량
새싹브로콜리 추출물의 최적 유산발효 조건을 설정하기 위해 발효시간, 새싹브로콜리 추출물 농도 및 부원료(과채혼합 농축물) 농도를 독립변수로 하여 중심합성계획에 의해 설계된 19구의 발효조건에서 얻어진 발효물의 특성은 표 8과 같다. 각각의 결과를 이용하여 반응표면분석을 실시하고, 유산균수, lactic acid 함량, sulforaphane함량, rutin 및 quercetin 함량값에 대한 회귀식을 얻었다(표 9). 또한 변수별 최적발효조건과 발효 특성값을 예측하여 표 10에 나타냈으며, 이들의 4차원 반응표면을 발효시간, 새싹브로콜리 추출물농도, 및 부원료 농도를 독립변수로 하여 도 6∼도 9에 나타내었다.
중심합성계획법에 따라 표 1과 같은 각 독립변수의 범위를 설정한 후, Design Expert를 이용하여 표 2와 같이 19가지의 발효 조건을 설정하고 새싹브로콜리 추출물을 유산발효하였다. 발효조건에 따른 새싹브로콜리 발효물의 유산균 수는 11.41∼14.55 Log10 CFU/mL의 범위로 나타났으며(표 8), 이를 바탕으로 한 회귀식은 표 9와 같다. 유산균수에 대한 R2값은 0.9786으로 높은 신뢰도를 보였으며, P-value는 1% 이내 유의수준을 보였다. 효소처리 조건에 대한 영향에서 환원당 함량의 경우 발효시간 > 새싹브로콜리 추출물 농도 > 부원료 농도 순으로 세 가지 조건 모두에서 영향을 크게 받는 것으로 나타났다(표 10). 한편 lack of fit(적합결여검정) 값은 model의 적합도를 검정하는 통계량으로 P값이 0.05보다 작을 때 model의 적합성에 문제가 있으며, 이보다 클 때 model이 적합하다고 판단하는 통계값이다. 유산균수 값의 ANOVA 분석을 통한 모형에 대한 적합성을 검증한 적합결여도(lack of fit)의 P-value는 0.0535로 나타나 model이 적합한 것으로 나타났다(표 9). 발효조건에 따라 반응표면모델로 예측된 회귀분석 결과 정상점은 최대점으로 나타났으며, 최적점을 산출한 결과 유산균수의 최댓값은 14.99 Log10 CFU/mL이고 이때의 발효조건은 발효시간 70.85 hr, 새싹브로콜리 추출물 농도 8.64 °Brix 및 부원료 농도 7.03 °Brix로 나타났다(표 10). 실험조건에 따라 얻은 발효물의 유산균수에 대한 4차원 반응표면은 도 6 같이 최대점의 형태를 나타내었으며, 새싹브로콜리 추출물 농도가 높고, 발효시간이 길수록 증가하는 것으로 나타났다.
Figure pat00008
1)중심합성계획법에 의한 실험번호
Figure pat00009
Figure pat00010
*Significant at 10% level; **significant at 5% level; ***significant at 1% level.
Figure pat00011
유산발효조건에 따른 새싹브로콜리 발효물에 대한 lactic acid 함량은 10.76∼14.05 mg/mL의 범위로 나타났으며(표 8), 이를 바탕으로 한 lactic acid 함량의 회귀식은 표 9와 같고 R2값은 0.8762로 1% 이내의 수준에서 유의성이 확인되었다. ANOVA 분석을 통한 lactic acid 함량의 모형에 대한 적합성을 검증을 위한 적합결여도(lack of fit)의 P-value은 0.2174로 나타나 model이 적합한 것으로 나타났다(표 9). 유산발효조건에 대한 영향은 표 10에서와 같이 새싹브로콜리 추출물 농도에 영향이 가장 크며, 그 다음으로 발효시간, 부원료 농도 순으로 영향을 받는 것으로 나타났다. 유산발효조건에 따라 반응표면모델로 예측된 정상점은 최대점으로 최대값이 13.99 mg/mL이었고, 이때 발효 시간은 58.51 hr, 새싹브로콜리농도 11.47 °Brix 및 부원료 농도 6.90 °Brix이었다(표 11). 4차원 반응표면을 통한 유산발효조건에 따른 lactic acid 함량의 변화는 도 7와 같이 새싹브로콜리 추출물 농도가 높을수록 lactic acid 함량이 증가하는 것으로 나타났다.
발효조건에 따른 새싹브로콜리 발효물의 sulforaphane 증가함량은 8.97∼12.34 ㎍/mL의 범위로 나타났으며(표 8), 이를 바탕으로 한 회귀식은 표 9와 같다. Sulforaphane 함량에 대한 R2값은 0.8471로 높은 신뢰도를 보였으며, P-value는 1% 이내 유의수준을 보였다. 한편 sulforaphane함량의 model에 대한 ANOVA 분석을 통한 모형에 대한 적합성을 검증을 위한 적합결여도(lack of fit)의 P-value는 0.2147로 나타나 model이 적합한 것으로 나타났다(표 9). 발효조건에 대한 영향에서 sulforaphane 함량의 경우 새싹브로콜리 추출물 농도 > 발효시간 순으로 영향을 크게 받는 것으로 나타났으며, 부원료 농도에서는 영향을 받지 않는 것을 알 수 있었다(표 10). 발효조건에 따라 반응표면모델로 예측된 회귀분석 결과 정상점은 안장점으로 나타났으며, 능선분석을 하여 최적점을 산출한 결과 sulforaphane 함량의 최댓값은 13.41 ㎍/mL이고 이때의 발효조건은 발효시간 56.79hr, 새싹브로콜리 추출물 농도 4.48 °Brix 및 부원료 농도 7.20 °Brix로 나타났다(표 11). 실험조건에 따라 얻은 발효물의 sulforaphane 함량에 대한 4차원 반응표면은 도 8과 같이 안장점의 형태를 나타내었으며, 새싹브로콜리 추출물 농도가 낮고, 발효시간이 길수록 증가하는 것으로 나타났다.
발효조건에 따른 새싹브로콜리 발효물의 rutin 감소 함량은 2.89∼12.64 ㎍/mL의 범위로 나타났으며(표 8), 이를 바탕으로 한 회귀식은 표 9와 같으며, 이 모델에 대한 회귀식의 R2 값은 0.9767로 1% 이내의 유의성이 인정되었다. ANOVA 분석을 통한 모형에 대한 적합성을 검증을 위한 적합결여도(lack of fit)의 P-value는 0.0506으로 나타나 model이 적합한 것으로 나타났다(표 9). Rutin 감소 함량은 새싹브로콜리 추출물 농도와 발효시간에 영향을 크게 받는 것으로 나타났다(표 10). 표 11과 같이 rutin 함량의 예측된 정상점은 안장점으로 나타났으며, 능선분석을 하여 최대값을 산출한 결과 rutin 함량의 최댓값이 12.765 ㎍/mL이었고, 이때 발효시간 53.50 시간, 새싹브로콜리 추출물 농도 11.76 °Brix 및 부원료 농도 6.98 °Brix이었다. 새싹브로콜리 발효물의 rutin 함량은 발효조건에 따른 4차원 반응표면에서 볼 때 새싹브로콜리 추출물 농도가 높을수록 rutin 감소 함량이 증가하는 것으로 나타났다(도 9). 이는 추출몰의 rutin이 발효에 사용된 유산균의 β-glucosidase의 활성에 의하여 배당체인 rutin이 비배당체인 quercetin으로 전환되므로 rutin은 감소되고 quercetin은 증가되는 것을 알 수 있다.
발효조건에 따른 새싹브로콜리 발효물의 quercetin 증가 함량 범위는 0.85∼1.62 ㎍/mL의 범위로 나타났으며(표 8), 이를 바탕으로 한 회귀식은 표 9와 같다. 이 모델에 대한 회귀식의 R2 값은 0.9120로 1% 이내의 유의성이 인정되었으며, Quercetin 증가 함량의 model에 대한 ANOVA 분석을 통한 모형에 대한 적합성을 검증을 위한 적합결여도(lack of fit)의 P-value는 0.0843으로 나타나 model이 적합한 것으로 나타났다(표 9). 새싹브로콜리 농도, 부원료 농도, 발효시간 순으로 모두에서 영향을 받는 것으로 나타났다(표 10). 유산발효조건에 따라 반응표면모델로 예측된 정상점이 안장점으로 나타났으며, 최적점을 산출한 결과 quercetin 증가 함량의 최대값은 1.65 ㎍/mL이었고, 이때 발효 시간은 37.05 hr, 새싹브로콜리 농도 4.51 °Brix 및 부원료농도 5.25 °Brix이었다 (표 11). 4차원 반응표면을 통한 유산발효조건에 따른 quercetin 증가 함량의 변화는 도 10에 나타내었다.
5-2. 새싹브로콜리 추출물의 최적 유산발효조건 예측 및 실증실험
새싹브로콜리 추출물의 발효조건을 설정하기 위하여 유산균 수, lactic acid 함량, sulforaphane 증가 함량, rutin 감소함량 및 quercetin 증가 함량의 결과에 대하여 4차원 반응표면을 superimposing(겹침)하여 도 11의 겹쳐진 부분으로써 최적 발효조건을 나타내었다(표 12). 즉, 새싹브로콜리 추출물의 최적 발효조건 범위는 발효시간 50~60 시간, 새싹브로콜리 추출물 농도 8~12 °Brix 및 부원료 농도 4~7 °Brix로 나타났다. 따라서 이와 같은 예측결과에 대한 모델식의 신뢰성을 확인하기 위하여 예측된 최적 조건의 범위 내에서 임의의 조건 즉, 발효시간 55시간, 새싹브로콜리 추출물 농도 10 °Brix 및 부원료 농도 6 °Brix을 대입하여 실제 유산발효를 실시하여 발효 특성을 분석하였다(표 13).
Figure pat00012
Figure pat00013
1)반응변수에 대한 예측식으로 부터 계산된 값.
2)독립변수의 최적조건 : 발효시간 55 hr, 새싹 브로콜리 농도 9 °Brix, 부원료 농도 6 °Brix
*) 평균값은 3반복 표준편차.
6. 유산균 발효 전후 새싹브로콜리의 유효성분 함량 비교
본 발명이 추구한 새싹브로콜리 추출물을 신규한 유산균 Pediococcus acidilactici DU. LAB. K-1(KCTC 13963BP)에 의하여 최적발효 조건으로 발효되었을 때 발효 전후의 새싹브로콜리의 유효성분 변화를 조사한 결과는 표 14와 같다. 또한, 이들을 HPLC로 분석한 크로마토그램은 도 12와 같다. 발효 특성상 lactic acid의 경우 원료인 새싹브로콜리 추출물은 전혀 검출되지 않았으나 발효물은 유산발효에 의하여 13.43 mg/mL로 나타나 최적조건에서 유산균 발효가 적절한 발효가 일어났음을 알 수 있다. 유효성분의 경우도 새싹브로콜리 원료내 함량보다 대부분 그 함량이 변화 된 것을 볼 수 있었다. sulforaphan함량의 경우, 새싹브로콜리 추출물 원료대비 약 341%가 증가하였다. 루틴(rutin)의 경우 새싹브로콜리 추출물 원료 대비 발효물은 약 60.4%가 감소하였다. 또한, quercetin 함량의 경우 새싹브로콜리 추출물 대비 발효물이 약 49.1%가 증가하였다. 이는 새싹 브로콜리 원료의 배당체인 rutin성분이 유산균 발효에 의하여 β-glucosidase의 작용으로 비배당체인 quercetin성분으로 생물전환된 결과로 나타나, 본 발명의 발효처리가 효과적인 처리인 것으로 보인다.
Figure pat00014
이상과 같이 본 발명은 첨부된 도면을 참조하여 바람직한 실시예를 중심으로 설명하였지만 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 본 발명의 특허청구범위에 기재된 기술적 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 또는 변형하여 실시할 수 있다. 따라서 본 발명의 범주는 이러한 많은 변형의 예들을 포함하도록 기술된 청구범위에 의해서 해석되어야 한다.
기탁기관명 : 한국생명공학연구원
수탁번호 : KCTC13963BP
수탁일자 : 20190930

Claims (10)

  1. 새싹브로콜리 추출물과 과채혼합농축액을 혼합한 혼합물을 가열살균하여 가열 살균액을 제조하는 제1단계;와
    상기 가열 살균액에 신규한 유산균 Pediococcus acidilactici DU. LAB. K-1(KCTC 13963BP)을 접종하여 접종 조성액을 제조하는 제2단계;와
    상기 접종 조성액을 발효하는 제3단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는
    신규한 유산균 Pediococcus acidilactici DU. LAB. K-1(KCTC 13963BP)를 이용하여 설포라판 및 쿼세틴이 증강된 새싹브로콜리 유산균 발효물의 제조방법.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 제1단계의 새싹브로콜리 추출물은
    분쇄액, 농축액, 건조물, 분말 및 이들의 조합 중 어느 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는
    신규한 유산균 Pediococcus acidilactici DU. LAB. K-1(KCTC 13963BP)를 이용하여 설포라판 및 쿼세틴이 증강된 새싹브로콜리 유산균 발효물의 제조방법.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 제1단계의 과채혼합농축액은
    바나나 농축액, 복숭아농축액, 망고농축액, 딸기농축액, 토마토농축액, 당근농축액 및 이들의 조합 중 어느 하나이며, 1 내지 90 °Brix를 갖는 것을 특징으로 하는
    신규한 유산균 Pediococcus acidilactici DU. LAB. K-1(KCTC 13963BP)를 이용하여 설포라판 및 쿼세틴이 증강된 새싹브로콜리 유산균 발효물의 제조방법.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 제1단계는
    새싹브로콜리 추출물 100 부피부에 대하여 과채혼합농축액 0.1 내지 20 부피부를 첨가하는 것을 특징으로 하는
    신규한 유산균 Pediococcus acidilactici DU. LAB. K-1(KCTC 13963BP)를 이용하여 설포라판 및 쿼세틴이 증강된 새싹브로콜리 유산균 발효물의 제조방법.
  5. 제 1항 또는 제 3항에 있어서,
    상기 과채혼합농축액은
    갈락토올리고당, 말토올리고당, 프락토올리고당, 이소말토올리고당 및 이들의 조합 중 어느 하나의 당을 더 포함하는 것을 특징으로 하는
    신규한 유산균 Pediococcus acidilactici DU. LAB. K-1(KCTC 13963BP)를 이용하여 설포라판 및 쿼세틴이 증강된 새싹브로콜리 유산균 발효물의 제조방법.
  6. 제 1항에 있어서,
    상기 제2단계에서는
    가열 살균액 100중량부에 대하여 신규한 유산균 Pediococcus acidilactici DU. LAB. K-1(KCTC 13963BP)을 0.1 내지 50중량부 접종하는 것을 특징으로 하는
    신규한 유산균 Pediococcus acidilactici DU. LAB. K-1(KCTC 13963BP)를 이용하여 설포라판 및 쿼세틴이 증강된 새싹브로콜리 유산균 발효물의 제조방법.
  7. 제 1항에 있어서,
    상기 제3단계에서는
    접종 조성액을 20 내지 50℃에서 6 내지 96시간 발효하는 것을 특징으로 하는
    신규한 유산균 Pediococcus acidilactici DU. LAB. K-1(KCTC 13963BP)를 이용하여 설포라판 및 쿼세틴이 증강된 새싹브로콜리 유산균 발효물의 제조방법.
  8. 신규한 유산균 Pediococcus acidilactici DU. LAB. K-1(기탁번호 KCTC 13963BP).
  9. 제 1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 제조방법에 의해 제조되는 신규한 유산균 Pediococcus acidilactici DU. LAB. K-1(KCTC 13963BP)를 이용하여 설포라판 및 쿼세틴이 증강된 새싹브로콜리 유산균 발효물.
  10. 제 9항의 새싹브로콜리 유산균 발효물을 포함하는 신규한 유산균 Pediococcus acidilactici DU. LAB. K-1(KCTC 13963BP)를 이용하여 설포라판 및 쿼세틴이 증강된 새싹브로콜리 유산균 발효음료조성물.







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