KR20210077640A - 페디오코쿠스 이노피나투스를 유효성분으로 포함하는 숙취해소용 조성물 - Google Patents

페디오코쿠스 이노피나투스를 유효성분으로 포함하는 숙취해소용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 페디오코쿠스 이노피나투스를 유효성분으로 포함하는 숙취해소용 조성물에 관한 것이다. 상세하게는 페디오코쿠스 이노피나투스 WiKim0108은 세포독성이 없을 뿐만 아니라, 알콜에 섭취에 의해 증가된 혈중 에탄올 및 아세트알데히드의 함량을 감소시키고, 혈중 ADH 및 ALDH 활성을 효과적으로 증가시킬 뿐만 아니라 위장 보호 기능이 있으므로, 본 발명의 조성물은 숙취해소 또는 알콜성 위장질환에 대한 건강기능식품 또는 의약품으로 유용하게 사용할 수 있다.

Description

페디오코쿠스 이노피나투스를 유효성분으로 포함하는 숙취해소용 조성물{Composition for relieving hangover comprising Pediococcus inopinatus as effective component}
본 발명은 페디오코쿠스 이노피나투스를 유효성분으로 포함하는 숙취해소용 조성물에 관한 것이다.
취할 때까지 술을 마시면 알코올 및 그 중간 대사산물인 아세트알데히드의 독성, 탈수, 흡수 장애로 인한 영양소의 결핍(혈당, 무기질 및 비타민 결핍) 등이 나타날 수 있으며, 개인에 따른 편차(유전적 소양), 환경상태(영양상태, 운동상태, 탈수 정도, 건강상태 등)에 따라 그 차이가 매우 심하게 나타난다.
알코올은 간에서 알코올 분해효소(alcohol dehydrogenase; ADH)와 조효소인 NAD+에 의해 아세트알데히드로 산화되며, 아세트알데히드는 알데히드 분해효소(aldehyde dehydrogenase; ALDH)와 NAD+에 의해서 아세트산으로 분해된다. 또한, 사이토크롬, P-450 타입 2E1(CYP2E1)과 카탈라아제에 의해서도 아세트알데히드로 산화되는데, 아세트알데히드와 아세트산은 지질 과산화반응 등을 통해 세포독성, 두통이나 복통, 삼투압 변화에 따른 탈수현상 등을 일으키는 것으로 알려졌을 뿐만 아니라, 과다한 알코올 섭취는 위장질환을 일으킬 수 있는데, 심할 경우, 위염 또는 위궤양을 일으킬 수 있다. 특히 사회적 스트레스에 더해 빈번한 알코올의 섭취는 심각한 위궤양과 함께 간질환을 동반하는 경우가 많아 이를 개선하기 위한 많은 의약품과 건강기능성 식품들이 판매되고 있는데, 주로 ADH 및 ALDH를 활성화시켜 알코올 혈중농도를 낮추기 위한 노력이 집중적으로 이루어지고 있다. 하지만, 알코올 섭취에 따른 알코올분해 촉진 또는 위장질환의 개선에 대한 연구는 미비한 실정이다.
한편, 페디오코쿠스 이노피나투스 균주 관련 기술로는 한국등록특허 제1673450호에 콜레스테롤 저하 효과를 가진 Pediococcus pentosaceus KID7 균주 포함 생균제 조성물이 개시되어 있고, 한국등록특허 제1611829호에 비만 및 비만으로 야기된 대사성 질환의 예방 또는 치료를 위한 페디오코커스 펜토사세우스 CBT SL4 균주 및 이를 포함하는 조성물이 개시되어 있으나, 본 발명의 페디오코쿠스 이노피나투스를 유효성분으로 포함하는 숙취해소용 조성물에 대해 개시된 바 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명은 페디오코쿠스 이노피나투스를 유효성분으로 포함하는 숙취해소용 조성물을 제공하고, 페디오코쿠스 이노피나투스 WiKim0108은 세포독성이 없을 뿐만 아니라, 알콜에 섭취에 의해 증가된 혈중 에탄올 및 아세트알데히드의 함량을 감소시키고, 혈중 ADH 및 ALDH 활성을 효과적으로 증가시킬 뿐만 아니라 위장 보호 기능이 있다는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 페디오코쿠스 이노피나투스(Pediococcus inopinatus) Wikim0108 균주(기탁번호: KACC 81091BP), 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축액, 상기 배양물의 건조물 및 상기 배양물의 추출물 중에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 숙취해소 또는 알콜성 위장질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 페디오코쿠스 이노피나투스(Pediococcus inopinatus) WiKim0108 균주(기탁번호: KACC 81091BP), 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축액, 상기 배양물의 건조물 및 상기 배양물의 추출물 중에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 숙취해소 또는 알콜성 위장질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명은 페디오코쿠스 이노피나투스를 유효성분으로 포함하는 숙취해소용 조성물에 관한 것이다. 상세하게는 페디오코쿠스 이노피나투스 WiKim0108은 세포독성이 없을 뿐만 아니라, 알콜에 섭취에 의해 증가된 혈중 에탄올 및 아세트알데히드의 함량을 감소시키고, 혈중 ADH 및 ALDH 활성을 효과적으로 증가시킬 뿐만 아니라 위장 보호 기능이 있으므로, 본 발명의 조성물은 숙취해소 또는 알콜성 위장질환에 대한 건강기능식품 또는 의약품으로 유용하게 사용할 수 있다.
도 1은 홍어김치로부터 분리한 유산균 중에서 채택된 시료 8종의 상대적 ADH 활성을 나타낸 것이다.
도 2는 홍어김치로부터 분리한 유산균 중에서 채택된 시료 8종의 상대적 ALDH 활성을 나타낸 것이다.
도 3은 홍어김치로부터 분리하고, 알콜 및 알데히드 분해효소 활성이 우수한 유산균의 동정결과이다.
도 4는 간암 세포주(HepG2)에 페디오코쿠스 이노피나투스 WiKim0108 균주를 처리한 후 세포생존율을 확인한 결과이다. N은 아무것도 처리하지 않은 정상세포이다.
도 5는 본 발명의 페디오코쿠스 이노피나투스 WiKim0108 균주를 투여하고, 에탄올 투여 2시간 후의 혈청 내 에탄올(A) 및 아세트알데히드(B)의 함량을 확인한 결과이다. G1은 아무것도 처리하지 않은 정상군이고, G2는 에탄올(40% EtOH, 3g/kg) 투여군이며, G3는 에탄올 투여 전에 YM(숙취해소용 시판 물질)을 투여한 양성대조군이고, G4는 에탄올 투여 전에 본 발명의 페디오코쿠스 이노피나투스 WiKim0108 균주를 1×108 CFU/head 투여한 군이다. ###은 정상군 대비 알콜 투여군의 혈청 내 에탄올 또는 아세트알데히드 함량이 통계적으로 유의미하게 증가했다는 것으로, p<0.001이고, *, ***은 알콜 투여군 대비 본 발명의 페디오코쿠스 이노피나투스 WiKim0108 균주 투여군 또는 양성대조군의 혈청 내 에탄올 또는 아세트알데히드 함량이 통계적으로 유의미하게 감소했다는 것으로, *은 p<0.05이고, ***은 p<0.001이다.
도 6은 본 발명의 페디오코쿠스 이노피나투스 WiKim0108 균주를 투여하고, 에탄올 투여 3시간 후의 혈청 내 에탄올 분해효소(ADH)(A) 및 알데히드 분해효소(ALDH)(B)의 활성을 확인한 결과이다. G1은 아무것도 처리하지 않은 정상군이고, G2는 에탄올(40% EtOH, 3g/kg) 투여군이며, G3는 에탄올 투여 전에 YM(숙취해소용 시판 물질)을 투여한 양성대조군이고, G4는 에탄올 투여 전에 본 발명의 페디오코쿠스 이노피나투스 WiKim0108 균주를 1×108 CFU/head 투여한 군이다. ###은 정상군 대비 알콜 투여군의 혈청 내 ADH 또는 ALDH 활성이 통계적으로 유의미하게 감소했다는 것으로, p<0.001이고, **, ***은 알콜 투여군 대비 본 발명의 페디오코쿠스 이노피나투스 WiKim0108 균주 투여군 또는 양성대조군의 혈청 내 ADH 또는 ALDH 활성이 통계적으로 유의미하게 증가했다는 것으로, **은 p<0.01이고, ***은 p<0.001이다.
도 7은 본 발명의 페디오코쿠스 이노피나투스 WiKim0108 균주의 투여에 따른 위장 보호 효과를 확인한 H&E 염색 결과(A) 및 상기 염색결과에서, Gastric pits 세포의 면적(B)과 점막하층(submucosa)의 면적(C)을 정량화한 것이다. #는 정상군(G1) 대비 알콜 투여군(G2)의 Gastric pits 세포 면적이 감소했다는 것으로 p<0.05이며, ##는 정상군(G1) 대비 알콜 투여군(G2)의 점막하층 세포 면적이 증가했다는 것으로 p<0.01이다. *는 알콜 투여군(G2) 대비 본 발명의 페디오코쿠스 이노피나투스 WiKim0108 균주 투여군(G4)의 Gastric pits 세포 면적이 증가하였거나, 점막하층 세포 면적이 감소하였다는 것으로, p<0.05이다.
본 발명은 페디오코쿠스 이노피나투스(Pediococcus inopinatus) Wikim0108 균주(기탁번호: KACC 81091BP), 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축액, 상기 배양물의 건조물 및 상기 배양물의 추출물 중에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 숙취해소 또는 알콜성 위장질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물에 관한 것이다.
상기 페디오코쿠스 이노피나투스 WiKim0108 균주는 홍어 또는 홍어김치로부터 분리된 것이 바람직하며 더 바람직하게는 홍어김치로부터 분리한 것이지만, 이에 한정하는 것은 아니다.
상기 페디오코쿠스 이노피나투스 WiKim0108 균주 배양물의 추출물은 하기의 단계를 포함하는 방법에 의해 제조할 수 있으나, 이에 한정하지 않는다:
(1) 페디오코쿠스 이노피나투스 WiKim0108 균주 배양물에 추출용매를 가하여 추출하는 단계;
(2) 단계 (1)의 추출물을 여과하는 단계; 및
(3) 단계 (2)의 여과한 추출물을 감압 농축하고 건조하여 추출물을 제조하는 단계.
상기 단계 (1)에서 추출용매는 물, C1~C4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합물 중에서 선택하는 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 메탄올이지만 이에 한정하지 않는다.
상기 제조방법에 있어서, 추출방법은 여과법, 열수 추출, 침지 추출, 환류 냉각 추출 및 초음파 추출 등의 당 업계에 공지된 모든 통상적인 방법을 이용할 수 있다. 상기 추출용매는 페디오코쿠스 이노피나투스 WiKim0108 균주 배양물 중량의 1~20배 첨가하여 추출하는 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 5~15배 첨가하는 것이다. 추출온도는 20~110℃인 것이 바람직하지만 이에 한정하지 않는다. 또한, 추출시간은 0.5~10시간인 것이 바람직하지만 이에 한정하지 않는다. 상기 방법에 있어서, 단계 (3)의 감압농축은 진공 감압 농축기 또는 진공회전증발기를 이용하는 것이 바람직하지만, 이에 한정하지 않는다. 또한, 건조는 감압건조, 진공건조, 비등건조, 분무 건조 또는 동결 건조하는 것이 바람직하지만 이에 한정하지 않는다.
본 발명에서 숙취는 술에 몹시 취한 상태에서 알코올을 분해하는 ADH(alcohol dehydrogenase) 또는 아세트알데히드를 분해하는 ALDH(aldehyde dehydrogenase)가 부족하거나, 낮은 활성으로 인하여 알코올이나 아세트알데히드가 인체 내에 축적되어 발생하는 현상으로, 대표적인 증상은 메스꺼움, 현기증, 구토, 갈증, 무기력, 두통, 근육통, 소화불량, 복통 및 설사 중에서 선택된 하나 이상일 수 있다.
상기 알코올성 위장질환은 메스꺼움, 구토, 복통, 소화불량, 알코올성 위염 또는 알코올성 위궤양인 것이 바람직하지만 이에 한정하는 것은 아니다. 상기 유효성분은 혈액 내 알코올 및 아세트알데히드(acetaldehyde)의 분해를 촉진시키며, 알콜 분해효소(alcohol dehydrogenase) 또는 알데히드 분해효소(aldehyde dehydrogenase)의 활성을 증가시킬 수 있다.
상기 유효성분은 분말, 과립, 환, 정제, 캡슐, 캔디, 시럽 및 음료 중에서 선택된 어느 하나의 제형으로 제조되는 것이 바람직하지만 이에 한정하지 않는다.
본 발명의 균주 또는 이의 배양액 등을 건강기능식품 조성물로 사용할 경우, 상기 균주 또는 이의 배양액을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용할 수 있으며, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분은 그 사용 목적 (예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
본 발명의 건강기능식품 조성물은, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되고 식품학적으로 허용되는 성분을 더 포함할 수 있다. 예컨대, 음료수로 제조되는 경우에는 본 발명의 균주 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙 등에서 하나 이상의 성분을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 건강기능식품 조성물의 유효성분으로 포함될 수 있는 양은 숙취해소 또는 알콜성 위장질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 원하는 사람의 연령, 성별, 체중, 상태, 질병의 증상에 따라 적절히 선택될 수 있으며, 바람직하게는 성인기준 1일 0.01~10.0g 정도로 포함되는 것이 좋으며, 이러한 함량을 갖는 식품을 섭취함으로써 숙취해소 또는 알콜성 위장질환의 예방 또는 개선 효과를 얻을 수 있다.
또한, 본 발명은 페디오코쿠스 이노피나투스(Pediococcus inopinatus) WiKim0108 균주(기탁번호: KACC 81091BP), 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축액, 상기 배양물의 건조물 및 상기 배양물의 추출물 중에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 숙취해소 또는 알콜성 위장질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
상기 약학 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제 중에서 선택된 하나 이상을 더 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 상기 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 상기 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 포함한 다양한 화합물 혹은 혼합물을 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 상기 균주 또는 상기 균주 유래 소포체에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있는데, 본 발명의 용어 '약제학적으로 유효한 양'이란 의학적 예방 또는 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 예방 또는 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 질환의 중증도, 약물의 활성, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 사용된 본 발명 조성물의 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 사용된 본 발명의 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하다.
본 발명의 조성물의 투여 빈도는 특별히 이에 제한되지 않으나, 1일 1회 투여하거나 또는 용량을 분할하여 수회 투여할 수 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
상기 약학적 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여도 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 특별히 이에 제한되지 않으나, 경구 투여, 직장 내 투여 등의 경로를 통해 투여할 수 있으며 경우에 따라 목적에 따라 다른 경로로도 투여될 수 있다. 다만, 경구 투여 시에는 위산에 의하여 상기 WiKim0108 균주가 변성될 수 있기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 되어야 한다. 또한, 상기 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
이하, 실시예를 이용하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다.
실시예 1. 페디오코쿠스 이노피나투스( Pediococcus inopinatus ) WiKim0108의 분리 및 동정
(1) 신균주 분리
전라남도 나주시 영산포 홍어 영농조합법인으로부터 구입한 홍어김치(10g)를 취하여 멸균 생리 식염수로 십진 희석한 후, MRS 유산균 분리용 고체배지에 도말하여 30℃에서 48시간 동안 배양 후에 집락의 형태에 따라 서로 다른 미생물을 분리하였다. 분리한 각각의 균주를 MRS 액체배지에서 30℃의 조건으로 48시간 동안 배양하였다.
(2) 알코올 분해효소(Alcohol dehydrogenase)의 활성 분석
배양한 분리 균주를 대상으로 알코올 분해효소의 활성을 확인하기 위하여, 각각의 분리 균주를 혐기적 조건으로, 30℃에서 24시간 동안 MRS 액체배지에서 배양하고 원심분리(4,000×15분, 4℃)한 후 배양 상등액을 분리하였다.
ADH 활성 분석을 위한 반응용액은 0.15㎖의 ADH(1unit, Sigma Chem. Co., USA), 0.75㎖의 Tris-HCl 완충용액(1M, pH 8.8), 0.3㎖의 NAD+(20mM), 0.1㎖의 시료(배양한 각각의 분리 균주) 및 1.4㎖의 증류수를 혼합하여 제조하였다.
제조된 반응용액을 30℃의 항온수조에 넣고, 이후, 0.3㎖의 에탄올을 반응용액에 분주하여 5분 동안 반응시키고, 분광기를 이용하여 340nm에서 흡광도를 측정하였다.
대조군의 경우 시료 대신 동량의 증류수를 첨가하였다. 효소의 상대적 활성은 다음의 식에 따라 계산하여 g/ℓ의 농도를 산출하였다.
식 (1): ADH의 활성(g/ℓ)={(시료의 흡광도-블랭크의 흡광도)/(대조군의 흡광도-블랭크의 흡광도)}×표준농도(g/ℓ)×F
상기 식 (1)에서, F는 희석 비율이다.
(3) 알데히드 분해효소(Aldehyde dehydrogenase; ALDH)의 활성
배양한 분리 균주를 대상으로 알데히드 분해효소의 활성을 확인하기 위하여, 각각의 분리 균주를 혐기적 조건으로, 30℃에서 24시간 동안 MRS 액체배지에서 배양하고 원심분리(4,000×15분, 4℃)한 후 배양 상등액을 분리하였다.
ALDH 활성 측정을 위한 반응용액은 0.1㎖의 ALDH(1unit, Sigma Chem. Co., USA), 0.3㎖의 Tris-HCl 완충용액(1M, pH 8.8), 0.1㎖의 NAD+(20mM), 0.1㎖의 KCl(3M), 0.33M의 2-메르캅토에탄올(2-Mercaptoethanol), 0.1㎖의 시료(배양한 각각의 분리 균주) 및 2.1㎖의 증류수를 혼합하여 제조하였다.
제조된 반응용액을 30℃의 항온수조에 위치시킨 후 0.1㎖의 아세트알데히드(1M)를 반응용액에 분주하여 5분 동안 반응시킨 후, 분광기를 이용하여 흡광도의 변화를 340nm에서 측정하였다.
대조군의 경우 시료 대신 동량의 증류수를 첨가하여 반응을 실시하였다. 효소의 상대적 활성은 다음의 식에 따라 계산하여 g/ℓ의 농도를 산출하였다.
식 (2): ALDH의 활성(g/ℓ)={(시료의 흡광도-블랭크의 흡광도)/(대조군의 흡광도-블랭크의 흡광도)}×표준농도(g/ℓ)×F
상기 식 (2)에서, F는 희석 비율이다.
그 결과, 도 1에 상기 홍어김치로부터 분리한 유산균 중에서 알코올 분해효소(alcohol dehydrogenase; ADH) 활성이 우수한 1차 선발군의 분석 결과를 개시하였고, 도 2에 알데히드 분해효소(aldehyde dehydrogenase; ALDH) 활성 분석 결과를 개시하였다. 시료번호 32, 52, 64, 113 및 125(WiKim0108) 균주는 대조군(MRS broth)이나 다른 유산균에 대비하여 상대적으로 우수한 ADH 증가 활성을 나타냈고, 아세트알데히드 분해 활성은 시료번호 118 및 125(WiKim0108)가 우수하였다. 최종적으로, 알코올 분해 효소 및 알데히드 분해효소 둘 다에 대한 활성이 우수한 시료번호 125(WiKim0108)를 채택하였다.
(4) 유산균의 동정
상기 알코올 및 아세트알데히드 분해활성이 우수한 125번 균주에 대한 16S ribosomal DNA 유전자 서열분석을 이용하여 동정을 실시하였다.
선발된 균주를 취하고, 멸균된 생리 식염수에 균체를 2회 세척한 후, DNeasy 조직키트(Qiagen, Valecia, CA, USA)를 사용하여 DNA를 추출하였다. 추출된 DNA의 16S ribosomal DNA 유전자 증폭을 위하여 유니버설 프라이머; 27F(5'-AGAGTTTGAT CATGGCTCAG-3')(서열번호 1)와 1492R(5'-GGATACCTTGTTACGACTT-3')(서열번호 2) 프라이머를 사용하였다. PCR 반응시 0.4mM dNTP, 0.5units Taq 폴리머라아제(polymerase), 4mM Mg2+이 함유된 다카라 퍼펙트 프리믹스(Takara Perfect Premix) 10㎕에 DNA 템플레이트(20㎍/㎖) 1㎕, 1.0μM 정방향 프라이머와 1.0μM 역방향 프라이머를 각각 1㎕씩 넣고 나머지는 증류수를 첨가하여 총 부피가 20㎕가 되도록 제조하였다. PCR 증폭은 Mastercycler gradient(Eppendorf, Hamburg, Germany)으로 수행하였다. PCR 반응은 95℃에서 5분(initial denaturation), 94℃에서 45초(denaturation), 52℃에서 45초(annealing), 72℃에서 1분(extension)을 30 사이클 실시하였고, 72℃에서 5분간 최종 extension을 실시하였다.
증폭된 1359bp의 단편(fragment)을 T 벡터(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)에 결합시킨 후 형질전환하였다. T 벡터 서열화 프라이머를 이용하여 염기서열 결정을 수행하였으며 그 결과에 대한 BLAST 조사(http://www.ncbi.nlm.nih.gov) 프로그램을 이용하여 GenBank (NCBI, Bethesda,MD, USA)의 ribosomal DNA 유전자 서열과 비교하여 동정하였다. 결정된 염기서열은 Clustal_W 및 BioEdit 프로그램으로 정렬하였고 발생한 갭(gap)은 이후 분석과정에서 결여 형질로 처리하였다. 염기서열 간의 유전적 거리 계산, 인접-결합(neighbor-joining) 방법, 최대공산(Maximum-likelihood) 및 최대절약(Maximum-parsimony) 계통수의 제작은 메가(Mega) 프로그램을 사용하여 수행하였고 계통군의 지지도를 알아보기 위해 위의 세 가지 분석에 대해 각각 동일한 사양으로 부트스트랩(bootstrap) 분석하였다(1,000 반복).
그 결과, 홍어김치에서 분리한 알코올 및 아세트알데히드 분해활성이 우수한 균주 시료번호 125(WiKim0108)의 16S rRNA로부터 총 1359bp의 염기서열을 결정하였고(서열번호 3), 상기 신균주 125(WiKim0108)은 페디오코쿠스 이노피나투스(Pediococcus inopinatus) 표준 균주 BT와 97% 일치하는 것이 확인되어, '페디오코쿠스 이노피나투스(Pediococcus inopinatus) WiKim0108'로 명명하였다(도 3). 이를 국립농업과학원 농업유전자원센터에 2019년 3월 8일자로 기탁하여, 기탁번호 KACC 81091BP를 부여받았다.
실시예 2. 페디오코쿠스 이노피나투스 ( Pediococcus inopinatus ) WiKim0108 균주의 세포 독성 확인
간암 세포주(HepG2)는 ATCC(American Type Culture Collection)에서 구입하여 사용하였다. 간암 세포주(HepG2)는 10% FBS, 1% 페니실린-스트렙토마이신이 포함된 DMEM-F12(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 배지로 배양하였다. 상기 세포는 37℃, 5% CO2 조건으로 배양하였고, 배양된 세포는 24웰 플레이트에 일정한 수의 세포(1×105 세포/웰)를 분주하여 실험하였다. 24웰 플레이트에 세포를 분주한 후, 세포가 24웰에 완전히 붙어 세포의 모양을 갖춘 후 세포가 75%의 포화도(confluence)에 도달했을 때 사용하였다.
상기 배양한 HepG2 세포에 24시간 동안 페디오코쿠스 이노피나투스(Pediococcus inopinatus) WiKim0108 균주를 농도별로 희석하여 처리하고, MTS 어세이 (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophynyl)-2H-tetrazolium, inner salt; MTS, Promega Co.Madison, WI, USA) 기법으로 마이크로플레이트 리더(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)로 490nm에서 세포생존율을 측정하였다.
그 결과 도 4에 개시한 바와 같이, 본 발명의 페디오코쿠스 이노피나투스 WiKim0108 균주를 처리하였을 때의 세포생존율은 정상군(N)과 거의 유사한 수준으로 나타났다. 따라서 본 발명의 페디오코쿠스 이노피나투스 WiKim0108 균주는 세포독성이 거의 없다는 것을 알 수 있었다.
실시예 3. 에탄올 섭취에 따른 혈중 에탄올 및 아세트알데히드 함량 분석, ADH 및 ALDH의 활성 분석
[실험동물]
SD 랫트를 오리엔트바이오에서 공급받아 7일 동안 순화시킨 후, 본 발명의 페디오코쿠스 이노피나투스 WiKim0108 균주의 에탄올 섭취에 따른 숙취해소 및 알콜성 위장질환에 대한 효과를 확인하기 위한 실험에 사용하였다. 순화 및 실험기간 동안 설치류용 폴리카보네이트 사육상자 (W235×L380×H175mM)에서 3마리/사육상자에서 사육하였다.
[환경조건]
온도: 23±3℃
상대습도: 55±15%
환기횟수: 10~20회/hr
조명시간: 12시간(오전 8시 점등~오후 8시 소등)
조도: 150~300Lux
사육기간 중 동물실의 온도, 습도, 환기횟수 및 조도는 주 1회 측정하였다.
시험군의 구성(G1: 정상군, G2: 대조군, G3: 양성대조군, G4: 시험군)
군 성별 동물수
(마리)		 에탄올
투여여부		 시험물질
투여시기		 투여물질 투여량
(CFU/head) ㎖/head
G1 M 5 N _ - - 0.5
G2 M 5 Y _ - - 0.5
G3 M 5 Y 에탄올 투여 전 YM - 0.5
G4 M 5 Y 에탄올 투여 전 WiKim0108 1×108 0.1
G1(정상군)을 제외한 모든 실험군에는 에탄올(40%, 3g/kg)을 경구투여하였고, 약물은 알콜 투여 30분 전에 단회 경구투여하였다.
모든 동물은 시험물질 투여 전 16시간 이상 절식을 실시하여 실험종료시까지 사료를 제공하지 않았다.
채혈은 경정맥을 통하여 실시하였고, 시료(페디오코쿠스 이노피나투스 WiKim0108) 및 양성대조물질(YM: 숙취해소용 시판 물질) 투여 전 및 투여 후(에탄올 섭취 후 2시간째, 및 3시간째), 약 1㎖을 채혈하여 혈액응고 촉진제가 들어 있는 진공채혈 튜브에 주입하고 15~20분 동안 실온에 방치하여 응고시킨 후, 3,000rpm으로 10분 동안 원심분리하여 혈청을 취하였다. 획득한 혈청은 에탄올 및 아세트알데히드 함량 분석과, ADH 및 ALDH의 활성 분석 전까지 약 -70℃에서 보관하였다.
혈청 내 에탄올 및 아세트알데히드 함량은 Megazyme 사의 ELISA 분석키트를 이용하여 분석하였고, ADH 및 ALSH의 활성 분석은 시그마 사의 ADH(MAK053-1KT) 및 ALDH(MAK082-1KT)의 활성 분석키트를 이용하였다.
그 결과, 도 5에 개시한 바와 같이, 에탄올 섭취 2시간 후, 본 발명의 페디오코쿠스 이노피나투스 균주를 투여한 군에서의 혈청 내 에탄올 및 아세트알데히드의 함량이 대조군에 비해 감소한 것을 확인하였다.
한편, 도 6에 개시한 바와 같이, 에탄올 섭취 3시간 후, 본 발명의 페디오코쿠스 이노피나투스 균주를 투여한 군에서의 에탄올 분해효소(ADH) 및 아세트알데히드분해효소(ALDH)의 활성은 대조군에 비해 증가한 것을 확인하였다.
실시예 4. 위장 보호 효과 확인
알콜 섭취에 따른 위장 손상에 대한 본 발명의 페디오코쿠스 이노피나투스 WiKim0108 균주의 위장 보호 효과를 확인하기 위하여, 상기 실시예 3에서 채혈 후, 동물을 희생시켜 위 조직을 채취하여, H&E 염색을 실시하였다.
그 결과, 도 7에 개시한 바와 같이, 정상군(G1) 대비 알콜 투여군(G2)의 gastrci pits 세포가 차지하는 면적이 통계적으로 유의미하게 감소하였고, 알콜 투여군 대비 본 발명의 페디오코쿠스 이노피나투스 WiKim0108 균주를 투여한 군에서는 gastrci pits 세포가 차지하는 면적이 통계적으로 유의미하게 증가하였다. 또한 점막하층(submucosa)의 면적은 정상군(G1) 대비 알콜 투여군(G2)의 점막하층(submucosa)의 면적이 통계적으로 유의미하게 증가하였고, 알콜 투여군 대비 본 발명의 페디오코쿠스 이노피나투스 WiKim0108 균주를 투여한 군에서는 점막하층(submucosa)의 면적이 통계적으로 유의미하게 감소하였다.
[통계처리]
본 실험의 결과에 대하여 자료의 정규성을 가정하고 일원분산분석 (One-way ANOVA)을 적용하며, 그 결과가 유의하였을 경우, 던컨의 다중 비교 테스트(Dunnett's multiple comparison test)를 이용하여 사후검정을 실시하였다. 통계학적 분석은 프리즘 5.03(GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA)을 이용하며, p값이 0.05 미만일 경우, 통계학적으로 유의한 것으로 판정하였다.
농업생명공학연구원 KACC81091BP 20190308
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Claims (8)

  1. 페디오코쿠스 이노피나투스(Pediococcus inopinatus) Wikim0108 균주(기탁번호: KACC 81091BP), 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축액, 상기 배양물의 건조물 및 상기 배양물의 추출물 중에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 숙취해소 또는 알콜성 위장질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 페디오코쿠스 이노피나투스(Pediococcus inopinatus) WiKim0108 균주 배양물의 추출물의 추출용매는 물, C1~C4의 저급 에탄올 또는 이들의 혼합물인 것을 특징으로 하는 숙취해소 또는 알콜성 위장질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 유효성분은 혈액 내 에탄올 및 아세트알데히드의 분해를 촉진시키는 것을 특징으로 하는 숙취해소 또는 알콜성 위장질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 분말, 과립, 환, 정제, 캡슐, 캔디, 시럽 및 음료 중에서 선택된 어느 하나의 제형으로 제조되는 것을 특징으로 하는 숙취해소 또는 알콜성 위장질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 알콜성 위장질환은 메스꺼움, 구토, 복통, 소화불량, 알코올성 위염 및 알코올성 위궤양 중에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 숙취해소 또는 알콜성 위장질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
  6. 페디오코쿠스 이노피나투스(Pediococcus inopinatus) WiKim0108 균주(기탁번호: KACC 81091BP), 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축액, 상기 배양물의 건조물 및 상기 배양물의 추출물 중에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 숙취해소 또는 알콜성 위장질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 유효성분 이외에 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 숙취해소 또는 알콜성 위장질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  8. 제6항에 있어서, 상기 조성물은 캡슐제, 산제, 과립제, 정제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 중에서 선택된 어느 하나의 제형으로 제조되는 것을 특징으로 하는 숙취해소 또는 알콜성 위장질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
KR1020200177172A 2019-12-17 2020-12-17 페디오코쿠스 이노피나투스를 유효성분으로 포함하는 숙취해소용 조성물 KR102500854B1 (ko)

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