KR20210073743A - 벤즈히드릴 티오 아세트아미드 화합물을 유효성분으로 포함하는 섬유화 질환의 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 벤즈히드릴 티오 아세트아미드 화합물을 유효성분으로 포함하는 섬유화 질환의 치료용 조성물에 관한 것으로, 좀더 상세하게 설명하면, 세포막에서 K_Ca2.3 채널 단백질의 발현을 억제하며, 특히 간 섬유화 및 폐 섬유화를 치료하는 효능이 우수한 섬유화 질환의 치료용 조성물에 관한 것이다.

Description

벤즈히드릴 티오 아세트아미드 화합물을 유효성분으로 포함하는 섬유화 질환의 치료용 조성물{A composition for treating fibrosis diseases comprising benzhydrylthio acetamide compounds as an active ingredient}

본 발명은 벤즈히드릴 티오 아세트아미드 화합물을 유효성분으로 포함하는 섬유화 질환의 치료용 조성물에 관한 것으로, 좀더 상세하게 설명하면, 세포막에서 K_Ca2.3 채널 단백질의 발현을 억제하며, 특히 간 섬유화 및 폐 섬유화를 치료하는 효능이 우수한 섬유화 질환의 치료용 조성물에 관한 것이다.

생체 조직의 섬유화는 콜라겐 등과 같은 세포외 기질(extracellular matrix)이 과도하게 조직에 축적되는 현상으로, 손상 받은 조직이 회복(injury and repair)되는 과정에서 일어난다. 이러한 섬유화는 체내 모든 장기에서 발생할 수 있으며, 특히 손상이 심하고 광범위할 때와 만성 질환에서와 같이 손상과 회복이 반복될 때 잘 발생한다. 섬유화가 일어나면 손상된 조직이 정상 기능을 할 수 없는 섬유화 조직으로 대체되면서 장기의 기능이 감소한다. 그러므로 섬유화가 광범위하게 발생하면 장기의 기능이 크게 감소하여 각종 질병이 유발된다. 특히 간, 폐, 신장, 심장 등 생명에 직접적인 영향을 주는 내부 장기에서 섬유화가 일어나면 건강에 치명적인 영향을 미칠 수 있다.

일반적으로 섬유화가 일어나는 과정은, 1) 섬유화 유발질환(대개 만성질환) 또는 유발물질에 노출되는 과정과, 2) 그 결과로 발생하는 섬유화 과정(염증, 섬유화, 그리고 혈관신생)으로 나눌 수 있다. 섬유화 유발질환이나 유발물질에 의해 염증 및 손상이 발생하면, 이 과정에 참여하는 세포들에서 분비되는 성장인자(growth factor)와 사이토카인 등에 의해 섬유화와 혈관신생(angiogenesis)이 촉진된다. 그러므로 섬유화 질환은 섬유화 유발원인(질환이나 물질)을 제거하거나, 섬유화 과정을 억제하여 치료할 수 있다.

그런데 섬유화 원인을 완전히 제거하는 것은 사실상 불가능하다. 특발성 폐섬유화증과 같이 원인을 알 수 없는 경우도 있고, 간 섬유화의 주요 원인인 만성 바이러스성 간염과 지방성 간염, 심장 및 콩팥 섬유화를 유발하는 당뇨병, 각종 섬유화 질병이 많이 발생하는 노화 등 대부분 원인들은 완치가 불가능하다. 그러므로 섬유화 질환 치료는 원인 질환에 대한 치료뿐만 아니라, 섬유화 과정(염증, 섬유화, 혈관신생)을 억제하는 치료도 반드시 병행해야 한다. 그런데 아직까지 섬유화 과정을 억제하는 치료제는 개발되지 있지 않다.

섬유화 과정에는 근섬유아세포(myofibroblast)의 형성과 간성상세포(hepatic stellate cell)의 활성화(간에서는 활성화된 간성상세포가 근섬유화세포의 역할을 함)가 매우 중요하다. 간성상세포 활성화를 포함한 근섬유아세포 형성은 섬유아세포(fibroblast) 혹은 평활근세포 등이 활성화되거나 내피세포 등이 내피-중간엽 전이(endothelial- mesenchymal transition)를 통해 일어난다. 그리고 근섬유아세포가 형성되면, 세포 증식이 활발해져서 근섬유아세포의 수가 크게 증가하고 콜라겐 등 세포외 기질 생산이 증가하며, 혈관내피세포 증식도 활발하게 일어나 혈관신생이 촉진된다. 이러한 섬유화 과정, 즉 근섬유아세포 형성(간성상세포 활성화 포함), 근섬유아세포 증식, 세포외 기질 생성, 혈관내피세포의 활성화와 혈관신생 등은 세포 내 Ca²⁺에 의해 활성화되는 경로(Ca²⁺-dependent signaling pathways)를 통해 일어난다. 그러므로 Ca²⁺은 섬유화 과정에서 매우 중요한 역할을 한다.

섬유아세포, 간성상세포, 혈관내피세포에서 Ca²⁺의 증가에는 Ca²⁺-activated K⁺ channels, 즉 ‘K_Ca 채널’이 매우 중요한 역할을 한다. K_Ca 채널이 활성화되면, 막전압을 과분극시켜 Ca²⁺을 유입시키는 동력을 제공하기 때문이다. 이러한 역할을 담당하는 K_Ca 채널에는 K_Ca2.3 채널과 K_Ca3.1 채널이 있다. 이들 두 K⁺ 채널은 구조와 기능이 유사하지만, 분포하는 세포들에서 차이가 있다.

K_Ca2.3 채널은 대부분의 조직 세포에서 mRNA가 발견되어 체내 대부분 조직에 분포해 있을 가능성이 있으며(Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 2004; 369(6):602-15), 간, 신경, 혈관내피세포 등에 많이 분포하고 있다. 반면, K_Ca3.1 채널은 혈관내피세포, 섬유아세포, 면역세포, 적혈구 등에 주로 분포하고 있다(Curr Med Chem. 2007;14(13):1437-57; Expert Opin Ther Targets. 2013;17(10):1203-1220).

이와 같이 세포내 Ca²⁺ 증가를 유발하여 섬유화 진행에 크게 기여할 것으로 생각되는 K_Ca2.3 채널 혹은 K_Ca3.1 채널은 섬유화 질환 치료제의 주요 타킷으로 연구되고 있다. 특히 K_Ca2.3 채널의 선택적 억제제인 아파민(apamin)은 섬유화 과정에 중요한 내피-중간엽 전이에 대한 억제 효과가 있으며, 간 섬유화와 담도 섬유화에 대한 치료 효과가 있다고 보고되었다(Biochem Biophys Res Commun. 2014; 450(1): 195- 201; Int J. Mol Med. 2017;39(5):1188-1194).

지금까지 개발된 이온채널 억제 약물들은 모두 이온채널의 활동도를 억제하는 약물들로 채널 단백질을 통해 이온의 흐름을 억제한다. 그런데 이온 채널을 통한 세포 기능 조절은 이와 같은 채널 활동도를 억제하는 방법 뿐 만 아니라, 세포막에 발현되는 채널 단백질의 수를 감소(채널 단백질의 세포막 발현 억제)시키는 방법으로도 가능하다. 그런데 채널 단백질의 세포막 발현 수준을 조절하는 약물은 아직 개발된 적이 없어서 이러한 방법이 장차 신약 개발을 위한 새로운 해법이 될 것으로 예상된다(Chem Med Chem. 2012;7(10):1741-1755). 특히 섬유화 질환에서는 성장인자들에 의해서 K_Ca2.3 채널의 발현이 증가하므로, K_Ca2.3 채널 단백질들의 발현을 억제하는 약물들이 섬유화 질환 치료제로 개발될 수 있다.

한편, 미국특허 US 4,066,686 및 US 4,177,290에는, 본 발명에 속하는 벤즈히드릴 설피닐 아세트아미드 유도체(benzhydryl sulfinyl acetamide derivatives)가 중추신경계 장애를 치료하는 약물로 제시되어 있고, 이 화합물은 프랑스 라폰사(Lafon)에 의해서 기면증 치료제로 개발되어 ‘모다피닐(modafinil)’이라는 일반명으로 판매되고 있다. 상기 모다피닐 전구체로 알려진 아드라피닐(adrafinil), 즉 디페닐메틸티오 아세토히드록사믹 산(diphenylmethyl-thioacetohydroxamic acid)도 모다피닐과 동일한 효능을 갖는 약물로 개발되어 있다(CNS Drug Reviews Vol5, No.3 193-212, 1999).

또한, US 4,927,855에는 라폰(Lafon)사에 의해서 모다피닐의 R-이성체인 (-)-벤즈히드릴 설피닐 아세트아미드[(-)-benzhydryl sulfinyl acetamide]가 항우울증(anti-depressant), 과다수면증(hypersomnia) 및 알츠하이머에 대한 치료 효과가 있다고 공지되어 있고, US 6,180,678에는 R-모다피닐이 프랑스의 베토퀴놀사에 의해 노화된 개의 행동문제 처치, 학습효과 증진, 방광조절, 기억증가에 관련한 효과가 있다고도 보고된 바 있으며, US 9,637,447에는 라플루마이드(lauflumide)라는 일반명으로 알려진 2-[비스(4-플루오로페닐)메탄설피닐]아세트아미드가 과잉행동 장애(ADHD), 기면증, 간질, 무기력증에 대해서 효과가 있다고 소개되어 있다.

그리고 본 발명자는 대한민국 특허 KR 10-1345860 및 KR 10-1414831과, 이에 대응하는 미국특허 US 9,259,412에서 모다피닐 및 그 유도체들이 cAMP를 증가시켜 혈관을 이완시키며, 또한 K_Ca3,1 전류를 억제하여 혈관질환과 K_Ca3.1 채널 매개 질환, 즉 암, 자가면역 질환 등의 치료제로 사용될 수 있다고 보고한 바 있다.

미국특허 US 4,066,686 미국특허 US 4,177,290 미국특허 US 4,927,855 미국특허 US 6,180,678 미국특허 US 9,637,447 미국특허 US 9,259,412

본 발명자들은 벤즈히드릴 설피닐 아세트아미드 유도체들을 포함하는 벤즈히드릴 티오 아세트아미드 화합물들에 대한 약물학적 활성을 연구하는 과정에서 이러한 화합물들이 놀랍게도 K_Ca2.3 채널의 세포막 발현을 억제하고, 나아가 마우스 모델에서 섬유화 질환에 대한 치료효과가 있다는 사실을 발견하였다.

이에 본 발명의 목적은 벤즈히드릴 티오 아세트아미드 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 새로운 섬유화 질환의 치료용 조성물을 제공하는 것이다. 참고로 본 발명에서 ‘벤즈히드릴 티오 아세트아미드 화합물’은 ‘벤즈히드릴 설피닐 아세트아미드 화합물’을 포함하는 개념으로 사용한다.

본 발명에 따른 섬유화 질환 치료용 조성물은 하기 화학식 A로 표시되는 벤즈히드릴 티오 아세트아미드 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 한다.

[화학식 A]

[상기 화학식 A에서, X₁~X₁₀은 수소(H) 또는 불소(F)로서 모두 같을 수도 있고 서로 다를 수도 있으며; Y는 황(S) 또는 설폭사이드(S=O)이고, * 는 키랄체를 의미하며; R₁은 수소, 메틸기, 에틸기, 메톡시기, 에톡시기, 수산기, 탄소수 3 내지 6의 탄소 화합물 중 어느 하나를 의미한다. ]

상기 화학식 A 화합물은, X₁~X₁₀이 수소(H) 또는 불소(F)이고, Y는 황(S)이며, R₁은 수소(H)인 것을 특징으로 한다.

상기 화학식 A 화합물은, X₁~X₁₀이 수소(H) 또는 불소(F)이고, Y는 설폭사이드(S=O)이며, R₁은 수소(H)인 것을 특징으로 한다.

상기 화학식 A 화합물은, 세포막에서 KCa2.3 채널 단백질의 발현을 억제하는 효능을 갖는 것을 특징으로 한다.

상기 화학식 A 화합물은, 특히 간 섬유화 및 폐 섬유화를 치료하는 효능을 갖는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 벤즈히드릴 티오 아세트아미드 화합물은 배양세포를 대상으로 한 생체외 실험에서 K_Ca2.3 채널 단백질의 발현을 억제하는 효과가 있고, 나아가 간 및 폐 질환이 유발된 마우스 모델에 대한 생체내 실험에서도 염증 및 섬유화를 억제하고 간 기능을 개선하는 효과가 있는 것으로 확인되었다.

따라서 본 발명의 벤즈히드릴 티오 아세트아미드 화합물은 인체 내에서 발생하는 각종 염증 및 섬유화 질환, 특히 간과 폐의 염증 및 섬유화 질환의 치료를 위한 약학적 조성물로 유용하게 사용될 수 있으며, 필요에 따라서는 동물용 약품으로 개발될 수도 있을 것을 기대된다.

도 1a 내지 도 1c는 PDGF, TGF_β, 그리고 본 발명의 화학식 A1 화합물이 혈관내피세포, 섬유아세포, 간성상세포에서 K_Ca2.3 및 K_Ca3.1 채널의 발현에 미치는 효과를 나타낸 것이다.
도 2a 및 도 2b는 K_Ca2.3 채널의 발현 증가 및 섬유화를 유발하는 TGF_β에 노출시킨 섬유아세포에서 화학식 A1 화합물이 섬유화 마커의 발현(도 2a)과 세포 증식에 미치는 효과(도 2b)를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 화학식 A1 내지 A9 화합물이 간성상세포에서 K_Ca2.3 채널 발현에 미치는 효과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 화학식 A2 내지 A4, A9 화합물에 24시간 노출시켜 K_Ca2.3 채널 발현을 감소시킨 간성상세포에서 K_Ca2.3 전류를 기록한 것이다.
도 5는 섬유화를 유발하는 TGF_β 혹은 PDGF에 24시간 노출시킨 섬유아세포에서 본 발명의 화학식 A2 내지 A5, A8, A9 화합물이 세포 증식에 미치는 효과를 나타낸 것이다.
도 6a 내지 도 6d는 TAA에 의한 간질환 마우스 모델에서 본 발명의 화학식 A1 화합물 및 그 이성체의 염증 및 섬유화 억제 효과를 조직학적 혹은 조직면역학적 방법으로 나타낸 것이다.
도 7a 및 도 7b는 TAA(도 7a) 혹은 서양식이(도 7b)에 의해 간질환 마우스 모델에서, 본 발명의 화학식 A1 내지 A5 화합물의 투여 유무에 따른 간기능 검사결과를 나타낸 것이다.
도 8a 및 도 8b는 TAA에 의한 간질환 마우스 모델에서 본 발명의 화학식 A1, A2 내지 A5 화합물의 투여에 따른 염증유발 사이토카인의 mRNA 발현 변화를 나타낸 것이고, 도 8c는 서양식이(WD)에 의한 간질환 마우스 모델에서 화학식 A1 화합물의 투여에 따른 염증 유발 사이토카인의 mRNA 발현 변화를 나타낸 것이다.
도 9는 TAA에 의한 간질환 마우스 모델에서 화학식 A1 화합물의 투여 유무에 따라 섬유화 마커의 mRNA 발현 변화를 나타낸 것이다.
도 10a 및 도 10b는 TAA에 의한 간질환 마우스 모델에서 화학식 A1 화합물의 R-이성질체 및 S-이성질체가 염증 마커(도 10a) 및 섬유화 마커(도 10b) 단백질의 발현에 미치는 영향을 나타낸 것이다.
도 11은 TAA에 의한 간질환 마우스 모델에서 화학식 A1 화합물의 R-이성질체 및 S-이성질체가 K_Ca2.3 채널 단백질의 발현에 미치는 영향을 나타낸 것이다.
도 12는 블레오마이신(bleomycin)에 의한 폐 섬유화 마우스 모델에서 화학식 A9 화합물이 폐 염증 및 섬유화에 미치는 효과를 나타낸 것이다.
도 13a 및 도 13b는 블레오마이신에 의한 폐섬유화 마우스 모델에서 화학식 A9 화합물이 염증 마커(도 13a) 및 섬유화 마커(도 13b) 단백질의 발현에 미치는 영향을 나타낸 것이다.

본 발명에 따른 상기 화학식 A의 벤즈히드릴 티오 아세트아미드 화합물은 구체적으로 다음 화학식 A1 내지 화학식 A9 화합물을 포함한다.

[화학식 A1]

상기 화학식 A1 화합물은 '모다피닐(modafinil)'이라는 일반명칭으로 공지되어 있으며, 현재 기면증 치료제로 사용되고 있고, 다른 정신과 질환의 치료에 이용하기 위한 임상실험이 진행 중이다. 상기 모다피닐의 화학명은 2-(벤즈히드릴설피닐)아세트아미드이며, 공지의 방법으로 합성하거나 상용화된 것을 구입하여 사용할 수 있다.

[화학식 A2]

[화학식 A3]

[화학식 A4]

[화학식 A5]

[화학식 A6]

[화학식 A7]

[화학식 A8]

[화학식 A9]

상기 화학식 A2 내지 화학식 A9 화합물은 모두 상기 모다피닐과 동일한 기전에 따라 세포막에서 K_Ca2.3 채널 단백질의 발현을 억제하는 효능을 가지며, 나아가 인체의 섬유화 질환에 대한 치료 효능을 갖는다. 이 중에서 상기 A9 화합물은 라플루마이드(lauflumide)라는 일반명칭으로 알려져 있다.

상기 화학식 A1~A9 화합물의 화학명은 다음과 같다. 각 화학명 말미의 괄호 안에 기재된 코드명은 본 발명자들이 하기 실시예에서 사용한 코드명이다.

1) 화학식 A1; 2-(벤즈히드릴설피닐)아세트아미드(CBM-N1)

2) 화학식 A2; 2-(벤즈히드릴티오)-N-[(테트라히드로퓨란-2-일)메틸]아세트아미드(CBM-N2)

3) 화학식 A3; 2-(벤즈히드릴티오)-N-페닐아세트아미드(CBM-N3)

*4) 화학식 A4; 2-(벤즈히드릴설피닐)-N-메틸아세트아미드(CBM-N4)

5) 화학식 A5; 2-(벤즈히드릴설피닐)-N-[(테트라히드로퓨란-2-일)메틸]아세트아미드(CBM-N5)

6) 화학식 A6; 2-(벤즈히드릴티오)-엔-메틸아세트아미드(CBM-N6)

7) 화학식 A7; 2-[비스(2-플루오로페닐)메탄설피닐]아세트아미드(CBM-N7)

8) 화학식 A8; 2-[비스(3-플루오로페닐)메탄설피닐]아세트아미드(CBM-N8)

9) 화학식 A9; 2-[비스(4-플루오로페닐)메탄설피닐]아세트아미드(CBM-N9)

상기 화학식 A2 내지 A6 화합물은 대한민국 특허 KR 10-1345860 등에 개시된 방법에 의해 합성하거나, 또는 상용화된 것을 구입하여 사용할 수 있으나, 상기 화학식 A7 내지 A9 화합물에 대해서는 아직 효율적인 제조방법이 알려져 있지 않다.

그래서 본 발명에서는 상기 화학식 A7 내지 A9 화합물의 제조방법을 실시예로 기재하였다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 상기 화학식 A 화합물의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다. 여기서 '약학적으로 허용 가능한 염'은 통상적으로 금속염, 유기염기와의 염, 무기산과의 염, 유기산과의 염, 염기성 또는 산성 아미노산과의 염 등이 포함될 수 있다. 또한 본 발명에 따른 약학적 조성물은 상기 화학식 A 화합물의 용매화물 및 수화물을 모두 포함하고, 가능한 모든 입체이성체도 포함하며, 나아가 각 화합물의 결정형태 또는 비결정 형태를 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 통상적인 방법에 따라 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 에어로졸, 멸균 주사 용액 등의 형태로 제형화될 수 있다. 또한 사용목적에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여시 피부 외용 또는 복강 내 주사, 직장 내 주사, 피하주사, 정맥주사, 근육 내 주사 또는 흉부 내 주사 주입방식을 선택할 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도에 따라 달라질 수 있다.

바람직한 일일 투여량은 유효성분 기준으로 0.2 내지 20 mg/kg, 더욱 바람직하기로는 0.5 내지 10 mg/kg이고, 하루 1회 내지 2회 투여될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

[ 실시예 ]

1) 화합물의 합성

1-1) 화학식 A9 화합물의 합성

하기 반응식을 참조하여 화학식 A9 화합물(lauflumide)의 합성방법을 설명한다. 둥근 플라스크 500ml에 4,4’-비스플루오로 벤즈히드롤 (I) 24g을 투입하고, 여기에 트리플루오로 아세트산 150ml을 첨가하여 용해한 후, 티골릭산(Thigolic acid) 12.05g을 첨가하고 약 2시간 교반을 하여 박층 크로마토그램으로 반응종결을 확인하였다. 반응물을 감암증류 하여 트리플루오로 아세트산을 제거하고, 중화 한 후 에틸아세트이트 유기용매로 추출하고 마그네슘 설페이트로 건조하여 끈적한 노란색 오일 형태의 화합물 (II) 34.8g을 정량적 수율로 얻었다.

상기 화합물 (II) 34.8g을 취하여 무수 에탄올 250ml에 용해하고, 진한 황산 4.2g을 가한 후, 8시간 동안 환류 하였다. 이어 실온으로 냉각, 농축하여 에탄올을 제거하고, 메틸렌클로라이드 용매로 용해한 후, 물로 2회 세척하였다. 다시 5% NaHCO₃ 용액으로 세척하고, 무수마그네슘 설페이트로 건조하여 노란색 오일 형태의 화합물 (III) 39.1g을 정량적 수율로 얻었다.

상기 화합물 (III) 34.3g을 둥근 플라스크(500ml)에 넣고, 메탄올 210ml을 첨가한 다음, 산촉매 21.4ml(산촉매는 4g의 황산을 90ml의 이소프로필알코올에 용해하여 제조)를 가하고, 35% H₂O₂ 용액을 천천히 첨가한 후, 밤새 실온에서 교반하였다. 이어 염화클로라이드(NaCl) 70g을 가하고 메틸렌클로라이드 용액으로 3회 추출하여 무수마그네슘 설페이트로 건조한 후, 농축하여 화합물 (IV)을 정량적 수율로 얻었다.

상기 화합물 (IV) 5.1g을 메탄올 13ml와 함께 둥근 플라스크(100ml)에 넣고, 의 암모늄클로라이드(NH₄Cl) 1.3g을 가한 후, 98ml의 진한 암모늄 히드록사이드 용액 (NH₄OH)을 첨가 하였다. 밤새 교반한 후, 흰색 에멀젼 상태의 용액을 여과하여 고체 분말을 4g을 수득하였다. 상기 고체 분말 4g을 이소프로필알코올 28g에 용해하고, 환류를 한 후, 실온으로 냉각하여 흰색 결정 상태의 화학식 A9 화합물, 즉 2-[비스(4-플루오로페닐)메탄설피닐]아세트아미드 2.1g을 얻었다.

¹H NMR(DMSO-d6): δ 7.68 (bs, 1H); 7.56-7.51 (m, 4H), 7.33 (bs, 1H), 7.29-7.24 (m, 4H), 5.4 (s, 1H); 3.4 (d, J = 13.6 Hz, 1H); 3.16 (d, J =13.6 Hz, 1H)

1-2) 화학식 A8 화합물의 합성

공지의 방법으로 3,3’-비스플루오로 벤즈히드롤(3,3‘-bisfluoro benzhydrol)을 합성을 하였다(Tetrahedron Lett, vol 58, 442, 2017, EP 1,433,744, J. Med. Chem. vol 40, 851, 1997). 이 화합물을 출발물질로 사용하고, 상기 화학식 A9 화합물의 합성 방법을 이용하여 화학식 A8 화합물, 즉 2-[비스(3-플루오로페닐)메탄설피닐]아세트아미드를 합성 하였다.

¹H NMR(DMSO-d6): δ 7.68 (bs, 1H); 7.5-7.2 (m, 9H), 5.4 (s, 1H); 3.4 (d, 1H); 3.16 (d, Hz, 1H)

1-3) 화학식 A7 화합물의 합성

공지의 방법으로 2,2’-비스플루오로 벤즈히드롤(2,2’-bisfluoro benzhydrol)을 합성을 하였다(EP 1,661,930, J. Med. Chem. vol 51, #4, 976, 2008). 이 화합물을 출발물질로 사용하고, 상기 화학식 A9 화합물의 합성 방법을 이용하여 화학식 A7 화합물, 즉 2-[비스(2-플루오로페닐)메탄설피닐]아세트아미드를 합성을 하였다.

¹H NMR(DMSO-d6): δ 7.68 (bs, 1H); 7.5-7.2 (m, 9H), 7.33 (bs, 1H), 5.4 (s, 1H); 3.4 (d, 1H); 3.16 (d, 1H)

2) 실험 방법

2-1) 세포 배양

섬유아세포(CRL-2795; American Type Culture Collection, VA)는 둘베코 배지(Dulbecco's Modified Eagle Medium, Hyclone, Logan, UT)에서 배양 하였고, 사람 유래 혈관내피세포(human uterine microvascular endothelial cells; PromoCell GmbH, Heidelberg, Germany)는 MV2 배지 (PromoCell GmbH)에서 배양 하였으며, 사람유래 간성상세포(human hepatic stellate cells; Innoprot, Bizkia, Spain)는 P60126 배지(Innoprot)에서 각각 배양하였다.

모든 세포는 5% 이산화탄소 습식 조건에서 37℃로 유지하였다. 이렇게 배양한 세포는 PDGF, TGF_β, 본 발명의 화학식 A1 내지 A9 화합물(CBM-N1 ~ N9)에 각각 24시간 노출시킨 후 실험을 실시하였다.

2-2) 간질환 마우스 모델 구축

본 발명의 화학식 A1 내지 A5 화합물(CBM-N1 ~ N5)이 간 염증 및 섬유화에 미치는 치료 효과를 확인하기 위하여 C57BL/6 자연형 마우스(오리엔탈 바이오에서 구입)를 대상으로 하여 다음 실험을 실시하였다. 먼저 마우스에서 간질환을 유발하기 위해 티오아세트아미드(thioacetamide, TAA)를 투여(A 실험)하거나, 지방성 간질환을 유발하는 서양식이로 사육(B 실험)하였다. 상기 마우스들은 정상대조군, 질환유발군, 약물투여군으로 구분하고, 이들 3 그룹에 대하여 A 실험에서는 각각 15~100마리의 마우스를, B 실험에서는 각각 10마리의 마우스를 사용하였다, 각 그룹의 마우스에 대한 약물처리 방식은 다음과 같다.

(1) 정상대조군; 상기 A 실험의 정상대조군은 질환유발군에서 TAA를 주입 할 때 사용한 TAA 용매를 동일한 양으로 주 3회 복강내 주입하였고, 상기 B 실험의 정상대조군은 정상식이로 사육하였다. A 실험과 B 실험 모두 CBM-N1 용매는 CBM-N1 투여 때와 동일한 양을 오랄 튜브를 이용하여 주 5회 투여하였다. 상기 TAA 용매는 증류수이며, CBM-N1과 그 유도체의 용매는 DMSO와 증류수를 1:1의 비율로 섞은 것이다. 첨부 도면에서 C 혹은 Control은 정상대조군을 의미한다.

(2) 질환유발군; 상기 A 실험의 질환유발군은 TAA를 100 mg/kg씩 주 3회 복강 내 주입하였고, 상기 B 실험의 질환유발군은 서양식이(western diet, WD, 45% 포화지방, 0.2% 콜레스테롤, 과당 및 포도당을 함유하는 물)로 사육하였다. A 실험과 B 실험 모두 CBM-N1 용매는 CBM-N1 투여 때와 동일한 양을 오랄 튜브를 이용하여 주 5회 투여하였다. 첨부 도면에서 TAA는 TAA에 의한 질환유발군을 의미하고, WD는 서양식이에 의한 질환유발군을 의미한다.

(3) 약물투여군; 상기 A 실험에서는 TAA(100 mg/kg, 3번/주)와 함께 상기 화학식 1~5 화합물(50mg/kg/day, 5회/주)을 투여하였고, 상기 B 실험에서는 서양식이와 함께 CBM-N1 ~ N5(50mg/kg/day, 5번/주)를 투여하였다. 이러한 방법으로 16주간 처리한 마우스는 마취제를 과다 투여하여 즉사시킨 후, 간과 혈액을 적출하였다. 첨부 도면에서 TAA+ CBM-N1, TAA+CBM-N2, TAA+CBM-N3, TAA+CBM-N4 및 TAA+CBM-N5는 각각 화학식 A1 내지 A5 화합물을 투여한 질환유발군을 의미한다.

2-3) 폐염 및 폐섬유화 마우스 모델 구축

본 발명의 화학식 A9 화합물(CBM-N9)이 블레오마이신(bleomycin)에 의한 폐염 및 폐섬유화에 미치는 치료 효과를 확인하기 위하여 C57BL/6 자연형 마우스를 대상으로 다음 실험을 실시하였다. 우선 상기 마우스들을 정상대조군, 질환유발군, 약물투여군으로 구분하고, 이들 3 그룹에 대하여 각각 10마리의 마우스를 사용하였다, 각 그룹의 마우스에 대한 약물처리 방식은 다음과 같다.

(1) 정상대조군: 질환유발군에서 상기 블레오마이신 주입 때와 동일한 양의 증류수를 기도 내에 주입하였다. 그리고 CBM-N9 용매는 하기 질환유발군에서 CBM-N9 투여 할 때 동일한 양으로 주 5회 복강 내 주사하였다.

(2) 질환유발군: 블레오마이신 1.5 unit를 기도 내에 주입하였다. 그리고 CBM-N9 용매는 CBM-N9 투여 때와 동일한 양을 주 5회 복강 내 주사하였다.

(3) 약물투여군; 블레오마이신 1.5 unit를 기도 내에 주입하였다. 그리고 CBM-N9(50 mg/kg)을 주 5회 복강 내 주사하였다.

상기와 같은 방법으로 4주간 약물 처리를 한 마우스들은 마취제를 과다 투여하여 즉사시킨 후, 폐를 적출하였다.

2-4) 간 및 폐 조직의 파라핀 조직 표본 제작 및 형태학적 변화 관찰

마우스 모델에서 각각 화학식 A1 화합물(CBM-N1) 혹은 화학식 A9 화합물(CBM-N9)의 치료 효과를 조직학적으로 확인하기 위해 파라핀 조직 표본을 제작하였다. 간 및 폐 조직을 파라포름 알데하이드 용액으로 고정시키고, 1 내지 2 mm의 두께로 절단하였다. 절단한 조직을 파라핀에 포매(embedding)하고 4 μm 두께로 잘라서 자일렌으로 파라핀을 제거한 후, 에탄올로 자일렌을 제거하고 수돗물로 세척하였다. 이와 같은 처리한 조직에 대하여 헤마톡실린 및 에오신 염색을 실시하거나, 조직면역학적 염색(immunohistochemistry)을 하였다.

(1) 헤마톡실린-에오신 염색: 해리스 헤마톡실린 염색 용액으로 5분간 처치하여 핵을 먼저 염색(청색)한 후 에오신 용액으로 대조염색(분홍색)을 실시하였다.

(2) 염증 마커들에 대한 조직면역학적 염색: 특이 항체를 사용하여 염증 마커(CD82, CD45)를 염색하였으며 림프양세포(lymphoid cell)이 갈색으로 염색된다.

(3) 섬유화 마커들에 대한 조직면역학적 염색: Masson's trichrome 염색법을 이용하여 콜라겐을 염색하거나, Reticulin 염색법으로 reticulin 섬유를 염색하였다.

2-5) 간 기능 검사

간질환 마우스 모델에서 채취한 혈액을 이용하여 아스파르트산 아미노기 전달효소(AST, GOT)와 알라닌 아미노기 전달효소(ALT, GPT), 전체 빌리루빈, 알부민 농도를 측정하였다. 간기능 검사방법은 다음 표 1과 같다.

검사항목	알부민	AST(SGOT)	ALT(SGPT)	전체 빌리루빈
검사방법	비색법 (BCG 방법)	변형된 IFCC UV (피리독살 포스페이트 및 샘플 블랭크 없음)	변형된 IFCC UV (피리독살 포스페이트 및 샘플 블랭크 없음)	비색 분석법
Kit 상품명/제조사/제조국	ALB2/로슈/독일	IFCC에 대한 아스파르트산 아미노전이효소/ 로슈/독일	IFCC에 대한 알리닌 아미노 전이효소/ 로슈/독일	빌리루빈 전체 Gen.3/로슈/독일
분석기 이름 및 모델명/제조사/ 제조국	코바스 8000c 702/로슈/독일	코바스 8000c 702/로슈/독일	코바스 8000c 702/로슈/독일	코바스 8000c 702/로슈/독일

2-6) 실시간 중합효소 연쇄반응(Real time PCR) 분석

적출한 간 조직에서 염증 혹은 섬유화 인자들의 mRNA 발현 정도를 실시간 중합효소 연쇄반응으로 측정하였다. 상기 간 조직의 RNA를 TRIzol 시약(Molecular Research Center, Cincinnati, OH)으로 분리하고, BcaBEST 중합효소(TakaraShuzo)를 사용하여 단일가닥 cDNA를 합성한 다음, 중합효소 연쇄반응을 수행하였다.

이때 사용한 염증 유발 사이토카인 및 섬유화 마커의 프라이머 서열(서열번호 1 내지 30)은 하기의 표 2 내지 표 4와 같다.

K_Ca2.3 채널 프라이머 서열

구분	센스	서열번호	안티-센스	서열번호
KCa2.3	F-CCCGGCTCCTCTCCTGGCTT	1	R-GAAGTGGGGGCCCTGAACGC	2
mGAPDH	F-CCGTATTGGGCGCCTGG TCA	3	R-CCGGCCTTCTCCATGGTGGT	4

염증 유발 사이토카인 프라이머 서열

구분	센스	서열번호	안티-센스	서열번호
TNFα	F-CCCCAAAGGGATGAGAAGTT	5	R-CACTTGGTGGTTTGCTACGA	6
CCL2	F-CCCCAAGAAGGAATGGGTCC	7	R-TGCTTGAGGTGTTTGTGGAA	8
TGF	F-TGGAGCAACATGTGGAACTC	9	R-TGCCGTACAACTCCAGTGAC	10
IL1α	F-GAGCCGGGTGACAGTATCAG	11	R-ACTTCTGCCTGACGAGCTTC	12
IL6	F-ACCAGAGGAAATTTTCAATAGGC	13	R-TGATGCACTTGCAGAAAACA	14
MIP-2	F-AGACAGAAGTCATAGCCA CTCTCAAG	15	R-CCTCCTTTCCAGGTCAGTTAGC	16
IL-12	F-CAGTTGGCCAGGGTCATTC	17	R-GATGTCTTCAGCAGTGCAGG	18
mGAPDH	F-CCGTATTGGGCGCCTGGTCA	19	R-CCGGCCTTCTCCATGGTGGT	20

섬유화 마커 프라이머 서열

구분	센스	서열번호	안티-센스	서열번호
Col1α	F-ACAGTCCAGTTCTTCATTGC	21	R-GCACTCTTCTCCTGGTCCTG	22
Col3α	F-GCACAGCAGTCCAACGT AGA	23	R-TCTCCAAATGGGATCTCTGG	24
Col4α	F-AACAACGTCTGCAACTT CGC	25	R-ACCGCACACCTGCTAATGAA	26
TGFR1	F-AGCTCCTCATCGTGTTGG TG	27	R-TGCAGTGGTCCTGATTGCAG	28
TGFR2	F-ACGTTCCCAAGTCGGATG TG	29	R-TGCAGTGGTCCTGATTGCAG	30
α-SMA	F-CTGACAGAGGCACCACTG AA	31	R-CATCTCCAGAGTCCAGCACA	32
mGAPDH	F-CCGTATTGGGCGCCTGG TCA	33	R-CCGGCCTTCTCCATGGTGGT	34

2-7) 웨스턴 블롯 분석

세포를 단백질 추출 완충액으로 용해하고, 상등액에서 단백질 농도를 브래드포드(Bradford) 분석으로 결정한 후, 단백질 30 μg을 SDS-PAGE에 가하고 니트로셀룰로스 막에 옮겼다. 상기 니트로셀룰로스 막을 5% BSA를 포함한 TBST(10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, and 0.1%(v/v) Tween-20, pH 7.6)로 실온에서 1시간 동안 차단하였다. 블롯은 1차 항체와 밤새 인큐베이션한 후 홍당무 과산화효소-결합(horseradish peroxidase- conjugated) 2차 항체에 1시간 동안 인큐베이션하였다. 밴드를 화학발광에 의해 시각화하였다. 데이터 수집과 처리는 발광영상 분석기(Image analyzer LAS-3000)와 IMAGE GAUSE 소프트웨어(Fuji film, Japan)를 사용하여 수행하였다.

2-8) MTT 세포 증식 시험법

세포를 96-웰 플레이트(96-well plates)에 2×10⁴ 개/웰 정도로 뿌린 다음, 세포 증식을 촉진하는 TGF_β에 24시간 노출시켰다. 그리고 각 웰에 MTT 0.1 mg을 첨가한 다음 4 시간 동안 37 ^oC에서 노출시켰다. 그런 다음 배양액을 제거하고, 디메칠 설폭시드(dimethyl sulfoxide)로 세포를 분해한 다음 측정기를 이용하여 590nm에서 흡광도를 측정하였다.

2-9) 전기생리학적 분석

분리 배양한 단일 세포에서 세포막을 통한 전류(whole cell current)를 조각 집게법(pach-clamp technique)으로 측정하였다. 전세포 전압 고정(whole-cell voltage clamp) 세포에서 미세유리전극을 통해 -100 mV에서 +100 mV까지의 전압 램프(voltage ramp)를 가하고 발생하는 전류를 증폭기(EPC-10, HEKA, Lambrecht, Germany)로 증폭한 다음 1 내지 4 kHz의 표본 추출률로 기록하였다.

표준 외용액은 150 mM NaCl, 6 mM KCl, 1.5 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, 10 mM HEPES, 10 mM 글루코스, pH 7.4(NaOH로 적정)을 포함하고, 미세 유리전극(피펫) 용액은 40 mM KCl, 100 mM K-aspartate, 2 mM MgCl₂, 0.1 mM EGTA, 4 mM Na₂ATP, 10 mM HEPES, pH 7.2(KOH로 적정)을 포함하였다. 피펫 용액 중 자유 Ca²⁺ 농도는 5 mM EGTA 존재하에 적당량의 Ca²⁺을 가하여 1 μM로 조절하였다(CaBuf로 계산; G. Droogmans, Leuven, Belgium).

K_Ca2.3 전류는 다음과 같은 방법으로 분리하였다. 전세포 전압 고정된 세포에 유리전극을 통해 1 μM Ca²⁺를 주입하고 K_Ca2.3 전류를 활성화시키는 1-에틸-2-벤즈이미다졸리논(1-ethyl-2-benzimidazolinone; 1-EBIO, 100 μM)를 가하여 기록한 전류에서 K_Ca2.3 채널 억제제인 아파민(200 nM)에 의해 억제되는 전류를 K_Ca2.3 전류로 판정하였으며, 기록된 전류는 세포 정전용량으로 나누어 표준화하였다.

2-10) 통계적 분석

실험결과는 평균값±표준오차(S.E.M)로 표현하였다. 통계적인 분석은 Student's t-test로 하였으며, 유의 수준 0.05 이하를 유의한 차이가 있는 것으로 판정하였다.

3) 배양 세포를 이용한 실험 결과

본 발명의 화학식 A1 내지 A9 화합물(CBM-N1~N9)에 대하여 in vitro에서 K_Ca2.3 채널 발현에 미치는 영향을 밝히고, 섬유화를 억제하는지를 규명하기 위해 본 실험을 수행하였다.

3-1) K_Ca2.1 및 K_Ca3.1 채널에 미치는 성장인자들과 CBM-N1의 효과

첨부 도 1a는 혈관내피세포에서 PDGF, TGF_β, CBM-N1가 각각 K_Ca2.3 채널 혹은 K_Ca3.1 채널의 발현에 미치는 효과를 나타낸 것이다. 혈관내피세포를 PDGF(20 ng/ml) 혹은 TGF_β(5 ng/ml)에 24시간 노출시키면 K_Ca2.3 채널 mRNA(왼쪽 패널)와 단백질(중간 패널)의 발현을 증가하였다. 반면 K_Ca3.1 채널의 발현은 PDGF 처치에 의해 증가하지 않았다(오른쪽 패널). 그리고 PDGF로 K_Ca2.3 채널 단백질의 발현을 증가시킨 세포에 CBM-N1을 24시간 처치하면 K_Ca2.3 채널 단백질 발현이 유의하게 감소하였다(중간 패널).

첨부 도 1b는 섬유아세포(왼쪽 패널) 혹은 간성상세포(오른쪽 패널)에서 CBM-N1이 K_Ca2.3 채널 단백질의 발현에 미치는 효과를 나타낸 것이다. 시험결과, CBM-N1의 처치에 의해 안정상태의 K_Ca2.3 채널 발현 수준이 섬유아세포에서 감소하였으며, 간성상세포에서는 농도 의존적으로 감소하였다.

첨부 도 1c는 간성상세포에서 CBM-N1에 의한 K_Ca2.3 채널 발현 억제가 K_Ca2.3 전류에 미치는 영향을 나타낸 것이다. CBM-N1에 24시간 노출시킨 세포와 노출시키지 않은 세포 간에 K_Ca2.3 전류 크기를 비교하였다. K_Ca2.3 전류의 크기는 CBM-N1에 노출시키지 않은 세포에서 18.98±4.17 pA/pF, 노출시킨 세포에서 7.77±2.65 mV/pF 인 것으로 나타났다. 즉, CBM-N1에 의한 K_Ca2.3 채널 발현 억제로 인해 K_Ca2.3 전류가 유의하게 감소하였다. 이와 같이 CBM-N1에 의해 K_Ca2.3 채널 단백질의 발현이 감소한 세포들에서 K_Ca2.3 전류가 감소함은 CBM-N1에 의해 이 채널 단백질의 세포막 발현이 감소함을 의미한다.

3-2) CBM-N1의 섬유화 억제 효과

첨부 도 2는 섬유아세포에서 TGF_β에 의해 유발된 섬유화에 대하여 CBM-N1의 억제효과를 나타낸 것이다. TGF_β에 의한 섬유화 유발 효과는 섬유화 마커의 단백질 발현정도(도 2a)와 세포증식 유발효과(도 2b)로 판정하였다, 섬유아세포를 TGF_β(5 ng/ml)에 24시간 노출시키면 섬유화 마커인 α-smooth muscle actin(α-SMA), collagen 1α(Col1α), collagen 3α(Col3α) 단백질의 양이 증가하고 세포 증식이 촉진되었다. 그러나 상기 섬유아세포를 TGF_β+CBM-N1에 24시간 노출시키면 섬유화 마커의 발현정도가 감소하고 세포증식이 억제되었다. 이 결과들은 CBM-N1이 섬유화 유발인자에 의한 섬유화를 억제한다는 것을 의미한다.

3-3) CBM-N1 내지 CBM-N9이 K_Ca2.3 채널발현과 세포증식에 미치는 효과

첨부 도 3은 간성상세포에서 CBM-N1 유도체들이 K_Ca2.3 채널 단백질의 발현에 미치는 영향을 나타낸 것이다. 구체적으로 상기 세포들을 CBM-N2, CBM-N5, CBM-N8 및 CBM-N9에 24시간 노출시킨 결과, K_Ca2.3 채널의 발현이 유의하게 감소하였다.

첨부 도 4는 간성상세포에서 CBM-N2 내지 CBM-N4, CBM-N9에 의한 K_Ca2.3 채널의 발현 억제가 K_Ca2.3 전류에 미치는 효과를 나타낸 것이다. 상기 화합물에 각각 24시간 노출시켜 K_Ca2.3 채널 발현을 억제시킨 세포와 상기 화합물에 노출시키지 않은 세포 간에 K_Ca2.3 전류 크기를 비교한 결과, CBM-N2 내지 CBM-N4, CBM-N9에 대한 노출로 K_Ca2.3 채널 발현이 감소한 세포에서 K_Ca2.3 전류의 크기가 유의하게 감소하였다.

첨부 도 5는 섬유아세포에서 TGF_β 혹은 PDGF에 의한 세포 증식에 미치는 CBM-N2 내지 CBM-N5, CBM-N8, CBM-N9의 효과를 나타낸 것이다. 상기 세포를 섬유화 유발인자인 TGF_β(5 ng/ml) 혹은 PDGF(20 ng/ml)에 24시간 노출시키면 섬유아세포의 증식이 크게 증가하였으며, 이러한 세포 증식은 CBM-N2 내지 CBM-N5, CBM-N8, CBM-N9에 의해 크게 감소하였다.

4) 간질환 마우스 모델에 대한 실험결과

간질환 마우스 모델에서 본 발명의 화학식 A1 내지 A5 화합물(CBM-N1 내지 CBM-N5)의 치료 효과를 규명하기 위해 본 실험을 수행하였다.

4-1) 조직학적 혹은 면역조직학적 분석

첨부 도 6a는 상기 간 조직의 헤마톡실린-에오신 염색 결과를 나타낸 것으로, 위 패널에 점선으로 표시한 부분을 확대하여 아래 패널에 나타내었다. 질환유발군(TAA)의 경우, TAA에 의해서 중심정맥(central vein, CV)을 중심으로 인근 부위에 염증이 일어나는데, 중심정맥 근처에 많이 모여 있는 핵이 큰 염증 세포들로 이를 확인할 수 있었다(도 6a의 화살표). 특히 정상대조군(Control)에 비해 질환유발군에서 염증세포들이 크게 증가하였으며, 약물투여군(TAA+CBM-N1)에서는 질환 유발군에 비해 염증 세포들의 수가 크게 감소한 것으로 확인되었다.

첨부 도 6b는 상기 간 조직의 염증마커인 CD82의 염색결과를 나타낸 것으로, 정상대조군(Control)의 간 조직에서는 갈색으로 염색되는 세포가 없어서 림프양세포(lymphoid cell)이 없음을 확인하였다. 반면 TAA에 의한 질환유발군(TAA)의 간 조직에서는 중심정맥과 중심정맥 사이에서 갈색으로 염색되는 세포가 많이 발견되었다. 반면 TAA와 CBM-N1 R-이성질체 혹은 S-이성질체를 함께 투여한 약물투여군의 간 조직(TAA+CBM-N1(R) 혹은 TAA+CBM-N1(S))에서는 갈색으로 염색되는 세포들이 아주 미약하게 관찰되고 있다.

첨부 도 6c는 상기 간 조직의 콜라겐 섬유에 대한 Masson's trichrome 염색결과를 나타낸 것으로, 콜라겐이 청색으로 염색되었다. 정상대조군(Control)의 간 조직은 아직 섬유화가 진행되지 않은 건강한 상태인데 비해서 질환유발군(TAA)의 간 조직은 중심정맥 주변과 중심정맥과 중심정맥 사이에 청색으로 염색(화살표 부분)되고 있어 섬유화가 진행되고 있음을 확인하였다. 그런데 TAA와 CBM-N1 R-이성질체 혹은 S-이성질체를 같이 투여한 약물투여군(TAA+CBM-N1(R), TAA+ CBM-N1(S))의 간 조직에서는 중심정맥 근처에서 아주 경미하게 섬유화가 관찰되었다.

첨부 도 6d는 상기 간 조직의 Reticulin 섬유의 염색결과를 나타낸 것으로, Reticulin 섬유가 검은 색으로 염색되었다. 정상대조군(Control)의 간 조직에서는 Reticulin 섬유가 관찰되지 않았던 반면, 질환유발군(TAA)의 간 조직은 중심정맥 주변과 중심정맥과 중심정맥 사이에서 Reticulin 섬유(화살표 부분)를 확인할 수 있었다. 그리고 TAA와 CBM-N1 R-이성질체 혹은 S-이성질체를 같이 투여한 약물투여군의 간 조직(TAA+CBM-N1(R) 혹은 (TAA+CBM-N1(S))에서는 Reticulin 섬유가 아주 경미하게 중심정맥 근처에서만 관찰되었다.

4-2) 혈중 ALT, AST 분석을 통한 간기능 검사

첨부 도 7a은 정상대조군과, TAA에 의한 질환유발군, 그리고 CBM-N1 내지 CBM-N5로 처리한 약물투여군에 대하여 시행한 간 기능을 검사 결과이다. 정상대조군(Control), 질환유발군(TAA), 약물투여군(TAA+CBM-N1, TAA+CBM-N2, TAA +CBM-N3, TAA+CBM-N4, TAA+CBM-N5)에서 ALT은 각각 41.6±7.9 units/L, 209.0±42.4 units/L, 70.3±14.7 units/L, 113.4±7.9 units/L, 103.0± 6.9 units/L, 114.1±8.8 units/L, 106.4±12.8 units/L 였으며, AST 혈중 수준은 각각 60.4±7.5 units/L, 211.1±22.4 units/L, 62.7±11.6 units/L, 83.6±14.8 units/L, 73.4±7.4 units/L, 66.6±9.4 units/L, 67.7±10.2 units/L 인 것으로 나타났다.

그리고 도 7b는 서양식이에 의한 질환유발군의 시험 결과를 나타낸 것으로, 정상 대조군(Control), 서양식이에 의한 질환유발군(WD), 약물투여군(WD+CBM-N1)에서 ALT은 각각 38.7±9.7 units/L, 189.8±37.6 units/L, 87.2±24.7 units/L 였으며, AST 혈중 수준은 각각 47.4±18.2 units/L, 173.5±31.5 units/L, 71.4±19.8 units/L 인 것으로 나타났다.

상기의 시험결과로부터, TAA 또는 서양식이에 의해서 유발된 간 기능 저하는 본 발명의 화학식 A1 내지 화학식 A5 화합물(50 mg/kg/day)에 의해 유의성 있게 회복함을 알 수 있다.

4-3) 염증 마커에 대한 mRNA 검사

첨부 도 8에 정상대조군, 질환유발군, 약물투여군에서 염증 유발 사이토카인 mRNA 발현을 비교한 결과를 나타내었다. 염증 마커로는 염증이 일어났을 때 증가하는 TNFα(tumor necrosis factor alpha), CCL2(chemoattractant protein-1), IL12(interleukin-12), TGF(transforming growth factor), IL1α, IL6, MIP-2(macrophage inflammatory protein-2)를 사용하였다. 염증인자 mRNA 수준은 질환유발군(TAA)에서 정상대조군(Control)에 비해 증가하였으며, CBM-N1 투여군(TAA+CBM-N1)에서는 질환유발군(TAA)에 비해 감소하였다(도 8a).

또한 CBM-N2 내지 CBM-N5 투여군(TAA+CBM-N2, TAA+CBM-N3, TAA+CBM- N4, TAA+CBM-N5)에서도 질환유발군에 비해 감소하였다(도 8b). 따라서 본 발명의 화학식 A1 내지 화학식 A5 화합물은 염증 유발 사이토카인의 발현을 감소시켜 TAA에 의한 염증성 간 질환에 치료효과가 있음을 알 수 있다.

그리고 도 8c는 정상대조군(Control), 서양식이에 의한 질환유발군(WD), 약물투여군(WD+CBM-N1)에서 염증 유발 사이토카인 mRNA 발현을 비교한 결과이다. 이때 염증 유발 사이토카인으로 CCL2, IL6, IL1α를 측정하였다. 이러한 염증인자 mRNA 발현 수준은 질환 유발군에서 정상대조군에 비해 증가하였으며, 약물투여군에서는 질환유발군에 비해 감소하였다.

4-4) 섬유화 마커에 대한 mRNA 검사

첨부 도 9는 정상대조군, 질환유발군, 약물투여군에서 섬유화 마커 mRNA 발현 수준을 비교한 결과를 나타낸 것이다. 섬유화 마커로는 Col1α, Col3α, Col4α, α-SMA, TGFR2(transforming growth factor receptor 2)를 사용하였다. 상기 섬유화 마커들은 질환유발군(TAA)에서 정상대조군(Control)에 비해 증가하고 있어 염증에 의해 섬유화가 진행되고 있음을 알 수 있다. 그런데 CBM-N1 투여군(TAA+CBM-N1)에서는 이러한 섬유화 인자들의 수준이 감소함을 확인하였다.

4-5) 염증 마커 또는 섬유화 마커 단백질 발현에 미치는 효과

첨부 도 10a는 TAA에 의한 간질환 생쥐모델에서 CBM-N1의 R-이성질체 및 S-이성질체가 염증 마커의 단백질 발현에 미치는 영향을 나타낸 것이다. 정상 대조군(Control)에 비해 질환유발군(TAA)의 간 조직에서 TIMP-2와 CCR2의 단백질 발현 수준이 크게 증가하여 염증이 진행된 것으로 나타났다. 그러나, CBM-N1 R-이성질체 또는 S-이성질체 투여군[TAA+CBM-N1(R), TAA+CBM-N1(S)]에서는 TIMP-2과 CCR2의 단백질 발현 수준이 감소하여 염증이 억제됨을 확인하였다.

첨부 도 10b에는 TAA에 의한 간질환 생쥐모델에서 CBM-N1의 R-이성질체 또는 S-이성질체가 섬유화 마커의 단백질 발현에 미치는 영향을 나타내었다. 정상 대조군(Control)에 비해 질환유발군(TAA)의 간조직에서 α-SMA와 Col1α의 단백질 발현 수준이 크게 증가하여 섬유화가 진행된 것으로 나타났다. 그러나, CBM-N1 R-이성질체 또는 S-이성질체 투여군에서는 α-SMA와 Col1α의 단백질 발현 수준이 크게 감소하여 섬유화가 억제됨을 확인하였다.

4-6) K_Ca2.3 채널 단백질 발현에 미치는 효과

첨부 도 11에 TAA에 의한 간질환 생쥐모델에서 CBM-N1의 R-이성질체 또는 S-이성질체가 K_Ca2.3 채널 단백질 발현에 미치는 영향을 나타내었다. 정상 대조군(Control)에 비해 질환유발군(TAA)의 간조직에서 K_Ca2.3 채널 단백질 발현 수준이 크게 증가하였다. 그러나, CBM-N1의 R-이성질체 혹은 S-이성질체 투여군에서는 K_Ca2.3 채널 단백질 발현 수준이 크게 감소하였다. 이러한 결과는 TAA에 의한 간질환은 K_Ca2.3 발현 증가와 관련되고, CBM-N1의 치료 효과는 K_Ca2.3 발현 감소와 관련이 있음을 시사한다.

5) 폐질환 마우스 모델에 대한 CBM-N9의 실험결과

블레오마이신에 의한 폐질환 마우스 모델에서 본 발명의 화학식 A9 화합물(CBM-N9)의 치료 효과를 규명하기 위해 본 실험을 수행하였다.

5-1) 조직학적 혹은 면역조직학적 분석

첨부 도 12는 폐 조직에서 헤마톡실린-에오신 염색, CD45(leukocyte common antigen, LCA 염색)에 대한 조직면역학적 염색(immunohistochemistry), 콜라겐에 대한 매슨 트라이크롬(Masson’s trichrome) 염색 결과를 나타낸 것이다. 염증 및 섬유화 정도가 정상대조군에 비해 질환유발군(Bleomycin)에서 증가하였으며, CBM-N9 투여군(Bleomycin+CBM-N9)에서 질환유발군에 비해 감소한 것으로 확인되었다.

5-2) 염증 또는 섬유화 마커 단백질 발현에 대한 분석

도 13a에는 폐질환 생쥐모델에서 CBM-N9이 염증 마커 단백질 발현에 미치는 영향을 나타내었다. 정상대조군(Control)에 비해 질환유발군(Bleomycin)의 폐 조직에서 염증 마커인 TIMP-2과 CCR2의 단백질 발현 수준이 크게 증가하여 염증이 진행된 것으로 나타났다. CBM-N9 약물투여군(Bleomycin+CBM-N9)에서는 TIMP-2과 CCR2의 단백질 발현 수준이 크게 감소하여 염증이 억제됨을 확인하였다.

도 13b에는 폐질환 생쥐모델에서 CBM-N9이 섬유화 마커 단백질 발현에 미치는 영향을 나타내었다. 정상대조군(Control)에 비해 질환유발군(Bleomycin)의 폐 조직에서 섬유화 마커인 α-SMA과 Col1α의 단백질 발현 수준이 크게 증가하여 폐 섬유화가 진행된 것으로 나타났다. 반면 약물투여군(Bleomycin+CBM-N9)에서는 TIMP-2과 CCR2의 단백질 발현 수준이 크게 감소하여 섬유화가 억제됨을 확인하였다.

6) 평가 및 결론

이상 살핀 바와 같이, 본 발명에 따른 화학식 A1 내지 A9 화합물은 배양세포를 대상으로 하는 생체외 실험에서 상기 화합물들을 장기간(24시간 혹은 16주) 투여하는 경우, K_Ca2.3 채널 단백질의 발현 감소를 통해 섬유화를 억제하는 효능이 있는 것으로 나타났다. 구체적으로, 배양한 간성상세포, 섬유아세포, 혈관내피세포를 화학식 A1 내지 A9 화합물에 24시간 노출하는 경우, K_Ca2.3 채널의 세포막 발현을 억제하고, 섬유화를 유발하는 성장인자에 의한 섬유화 관련 인자(α-SMA, Col1α 등)들의 발현과 세포 증식을 억제하는 것으로 확인되었다.

또한 본 발명의 화학식 A1 내지 A9 화합물은 마우스 모델을 대상으로 하는 생체내 시험에서도 간질환 유발군에서 염증 및 섬유화 억제 효과가 있는 것으로 확인되었다. 구체적으로, 간질환 혹은 폐질환 마우스 모델에 대하여 16주 동안 상기 화학식 A1 내지 A9 화합물들을 투여한 결과, 염증 및 섬유화가 유의하게 억제되는 것으로 나타났다.

한편, 본 발명자들이 대한민국 특허 KR 10-1345860 및 KR 10-1414831와 이에 대응하는 미국특허 US 9,259,412에서 밝힌 바와 같이, 본 발명의 화학식 A1 내지 A5 화합물은 cAMP에 의한 K_Ca3,1 채널 인산화를 유발하여 K_Ca3.1 채널 활동도를 억제하는 효능이 있다. 그런데 이처럼 cAMP 증가에 의해 K_Ca3.1 채널의 활동도를 억제하는 것은 섬유화 치료에는 거의 효과를 갖지 못할 것으로 사료된다.

상기 특허는 화학식 A1 내지 A5 화합물에 단기간(수분 이내) 노출한 경우에 나타나는 효과에 대한 것으로, 이들 화합물들에 의한 cAMP 증가는 20분 정도에 최고에 도달한 다음 급격히 감소하여 3시간 내에 약물투여 이전과 비슷해진다(Endocrinology 144(4):1292-1300). 그러므로 cAMP를 통한 효과는 길어야 1시간 정도의 짧은 시간 동안에만 지속되며, 본 발명의 경우와 같이, 24시간 혹은 16주 동안 지속할 가능성은 없기 때문이다.

그리고 본 발명의 도 1a에서 확인되는 바와 같이, 섬유화 유발 인자인 PDGF에 24시간 노출하는 경우, K_Ca2.3 채널 발현은 크게 증가하는 반면, K_Ca3.1 채널 발현은 증가하지 않았다. 이러한 결과는 섬유화 과정에서는 K_Ca2.3 채널 발현 증가가 매우 중요한 요소이며, 본 발명에 따른 화학식 A1 내지 A9 화합물의 섬유화 억제 효과는 K_Ca2.3 채널 발현 감소를 통해 나타난 결과로 결론지을 수 있다.

한편, 본 발명에서는 현실적인 한계로 인해서 상기 화학식 A 화합물에 속하는 모든 화합물에 대하여 상기와 같은 실험을 실시하지 못하였으나, 상기 화학식 A 화합물들의 화학적 활성과 생체 내에서의 대사 메카니즘 등을 고려해 볼 때 상기 화학식 A 화합물들은 모두 상기 화학식 A1 내지 A9 화합물과 동일 또는 유사한 약리학적 효능을 가질 것을 추측된다.

Claims (8)

1. 하기 화학식 A로 표시되는 벤즈히드릴 티오 아세트아미드 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 섬유화 질환의 치료용 조성물.
   [화학식 A]
   

   

   
   [상기 화학식 A에서, X₁~X₁₀은 수소(H) 또는 불소(F)로서 모두 같을 수도 있고 서로 다를 수도 있으며; Y는 황(S) 또는 설폭사이드(S=O)이고, * 는 키랄체를 의미하며; R₁은 수소, 메틸기, 에틸기, 메톡시기, 에톡시기, 수산기, 탄소수 3 내지 6의 탄소 화합물 중 어느 하나를 의미한다. ]
   
2. 제1항에 있어서, 상기 화학식 A 화합물은, X₁~X₁₀이 수소(H) 또는 불소(F)이고, Y는 황(S)이며, R₁은 수소(H)인 것을 특징으로 하는, 섬유화 질환의 치료용 조성물.
   
3. 제1항에 있어서, 상기 화학식 A 화합물은, X₁~X₁₀이 수소(H) 또는 불소(F)이고, Y는 설폭사이드(S=O)이며, R₁은 수소(H)인 것을 특징으로 하는, 섬유화 질환의 치료용 조성물.
   
4. 제1항에 있어서, 상기 화학식 A 화합물은, 2-(벤즈히드릴술피닐)아세트아미드, 2-(벤즈히드릴티오)-N-[(테트라히드로퓨란-2-일)메틸]아세트아미드, 2-(벤즈히드릴티오)-N-페닐아세트아미드, 2-(벤즈히드릴술피닐)-N-메틸아세트아미드, 2-(벤즈히드릴술피닐)-N-[(테트라히드로퓨란-2-일)메틸]아세트아미드, 2-(벤즈히드릴티오)-엔-메틸아세트아미드, 2-[비스(2-플루오로페닐)메탄술피닐]아세트아미드, 2-[비스(3-플루오로페닐)메탄술피닐]아세트아미드, 2-[비스(4-플루오로페닐)메탄술피닐]아세트아미드 중에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 간 또는 폐의 염증 및 섬유화 질환의 치료용 조성물.
   
5. 제1항에 있어서, 상기 화학식 A 화합물은, 2-(벤즈히드릴술피닐)아세트아미드(modafinil)인 것을 특징으로 하는, 섬유화 질환의 치료용 조성물.
   
6. 제1항에 있어서, 상기 화학식 A 화합물은, 2-[비스(4-플루오로페닐)메탄술피닐]아세트아미드(lauflumide)인 것을 특징으로 하는, 섬유화 질환의 치료용 조성물.
   
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학식 A 화합물은, 세포막에서 KCa2.3 채널 단백질의 발현을 억제하는 효능을 갖는 것을 특징으로 하는, 섬유화 질환의 치료용 조성물.
   
8. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학식 A 화합물은, 간 섬유화 및 폐 섬유화를 치료하는 효능을 갖는 것을 특징으로 하는, 섬유화 질환의 치료용 조성물.

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