KR20210070233A - 응축물을 조절하여 유전자 전사를 조절하기 위한 방법 및 분석 - Google Patents
응축물을 조절하여 유전자 전사를 조절하기 위한 방법 및 분석 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20210070233A KR20210070233A KR1020207029166A KR20207029166A KR20210070233A KR 20210070233 A KR20210070233 A KR 20210070233A KR 1020207029166 A KR1020207029166 A KR 1020207029166A KR 20207029166 A KR20207029166 A KR 20207029166A KR 20210070233 A KR20210070233 A KR 20210070233A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- condensate
- component
- factor
- agent
- transcription
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 444
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 142
- 230000035897 transcription Effects 0.000 title claims description 78
- 238000013518 transcription Methods 0.000 title claims description 78
- 238000003556 assay Methods 0.000 title claims description 44
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 title claims description 19
- 238000009833 condensation Methods 0.000 title claims description 8
- 230000005494 condensation Effects 0.000 title claims description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims abstract description 195
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 claims abstract description 43
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 claims abstract description 36
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 19
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 claims abstract description 9
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 200
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 173
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 claims description 169
- 108020005497 Nuclear hormone receptor Proteins 0.000 claims description 155
- 108020004017 nuclear receptors Proteins 0.000 claims description 146
- 101000615492 Homo sapiens Methyl-CpG-binding domain protein 4 Proteins 0.000 claims description 145
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 133
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 claims description 132
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 claims description 132
- 108010038795 estrogen receptors Proteins 0.000 claims description 122
- 101000962131 Homo sapiens Mediator of RNA polymerase II transcription subunit 1 Proteins 0.000 claims description 117
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 claims description 99
- 230000011664 signaling Effects 0.000 claims description 97
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims description 87
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims description 84
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 76
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 76
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 claims description 74
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 74
- 102000007399 Nuclear hormone receptor Human genes 0.000 claims description 73
- 229940011871 estrogen Drugs 0.000 claims description 72
- 239000000262 estrogen Substances 0.000 claims description 72
- 108010034791 Heterochromatin Proteins 0.000 claims description 69
- 210000004458 heterochromatin Anatomy 0.000 claims description 69
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 62
- 102000009572 RNA Polymerase II Human genes 0.000 claims description 59
- 108010009460 RNA Polymerase II Proteins 0.000 claims description 59
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 58
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 claims description 53
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 50
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims description 50
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 50
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 claims description 50
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 claims description 49
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 claims description 49
- 102100035423 POU domain, class 5, transcription factor 1 Human genes 0.000 claims description 47
- 101710126211 POU domain, class 5, transcription factor 1 Proteins 0.000 claims description 47
- 238000012226 gene silencing method Methods 0.000 claims description 46
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 46
- 102000015097 RNA Splicing Factors Human genes 0.000 claims description 45
- 108010039259 RNA Splicing Factors Proteins 0.000 claims description 43
- 102000015694 estrogen receptors Human genes 0.000 claims description 43
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims description 42
- 102100021290 Methyl-CpG-binding domain protein 4 Human genes 0.000 claims description 41
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 41
- 108091005625 BRD4 Proteins 0.000 claims description 40
- 102000015735 Beta-catenin Human genes 0.000 claims description 40
- 108060000903 Beta-catenin Proteins 0.000 claims description 40
- 102100029895 Bromodomain-containing protein 4 Human genes 0.000 claims description 40
- -1 SMRT Proteins 0.000 claims description 39
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 claims description 38
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 claims description 38
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims description 38
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 claims description 37
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 claims description 37
- NKANXQFJJICGDU-QPLCGJKRSA-N Tamoxifen Chemical compound C=1C=CC=CC=1C(/CC)=C(C=1C=CC(OCCN(C)C)=CC=1)/C1=CC=CC=C1 NKANXQFJJICGDU-QPLCGJKRSA-N 0.000 claims description 35
- 229960001603 tamoxifen Drugs 0.000 claims description 34
- 101000587430 Homo sapiens Serine/arginine-rich splicing factor 2 Proteins 0.000 claims description 33
- 102000006890 Methyl-CpG-Binding Protein 2 Human genes 0.000 claims description 32
- 108010072388 Methyl-CpG-Binding Protein 2 Proteins 0.000 claims description 32
- 230000001594 aberrant effect Effects 0.000 claims description 32
- 102100029666 Serine/arginine-rich splicing factor 2 Human genes 0.000 claims description 31
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 claims description 30
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 27
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 26
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 26
- 102100038895 Myc proto-oncogene protein Human genes 0.000 claims description 25
- CDKIEBFIMCSCBB-UHFFFAOYSA-N 1-(6,7-dimethoxy-3,4-dihydro-1h-isoquinolin-2-yl)-3-(1-methyl-2-phenylpyrrolo[2,3-b]pyridin-3-yl)prop-2-en-1-one;hydrochloride Chemical compound Cl.C1C=2C=C(OC)C(OC)=CC=2CCN1C(=O)C=CC(C1=CC=CN=C1N1C)=C1C1=CC=CC=C1 CDKIEBFIMCSCBB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- 101100107610 Arabidopsis thaliana ABCF4 gene Proteins 0.000 claims description 24
- 101710143111 Mothers against decapentaplegic homolog 3 Proteins 0.000 claims description 24
- 102100025748 Mothers against decapentaplegic homolog 3 Human genes 0.000 claims description 24
- 108010017324 STAT3 Transcription Factor Proteins 0.000 claims description 24
- 101100068078 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) GCN4 gene Proteins 0.000 claims description 24
- 102100024040 Signal transducer and activator of transcription 3 Human genes 0.000 claims description 24
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 23
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 23
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 22
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 22
- 108091008820 oncogenic transcription factors Proteins 0.000 claims description 21
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims description 20
- 101001023030 Toxoplasma gondii Myosin-D Proteins 0.000 claims description 19
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 19
- 108020001756 ligand binding domains Proteins 0.000 claims description 19
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 19
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 19
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 19
- 102100025064 Cellular tumor antigen p53 Human genes 0.000 claims description 18
- 101001139134 Homo sapiens Krueppel-like factor 4 Proteins 0.000 claims description 18
- 101000829211 Homo sapiens Serine/arginine repetitive matrix protein 1 Proteins 0.000 claims description 18
- 101000663222 Homo sapiens Serine/arginine-rich splicing factor 1 Proteins 0.000 claims description 18
- 102100020677 Krueppel-like factor 4 Human genes 0.000 claims description 18
- 102100023664 Serine/arginine repetitive matrix protein 1 Human genes 0.000 claims description 18
- 102100037044 Serine/arginine-rich splicing factor 1 Human genes 0.000 claims description 18
- 101710106660 Shutoff alkaline exonuclease Proteins 0.000 claims description 18
- CWJNMKKMGIAGDK-UHFFFAOYSA-N amtolmetin guacil Chemical compound COC1=CC=CC=C1OC(=O)CNC(=O)CC(N1C)=CC=C1C(=O)C1=CC=C(C)C=C1 CWJNMKKMGIAGDK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 108010088742 GATA Transcription Factors Proteins 0.000 claims description 17
- 102000009041 GATA Transcription Factors Human genes 0.000 claims description 17
- 102100021455 Histone deacetylase 3 Human genes 0.000 claims description 17
- 101001013208 Homo sapiens Mediator of RNA polymerase II transcription subunit 15 Proteins 0.000 claims description 17
- 102100029663 Mediator of RNA polymerase II transcription subunit 15 Human genes 0.000 claims description 17
- 108010074724 histone deacetylase 3 Proteins 0.000 claims description 17
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 17
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 claims description 17
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 claims description 17
- 102100038885 Histone acetyltransferase p300 Human genes 0.000 claims description 16
- 101150083522 MECP2 gene Proteins 0.000 claims description 16
- 102100039124 Methyl-CpG-binding protein 2 Human genes 0.000 claims description 16
- 238000010276 construction Methods 0.000 claims description 16
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 claims description 16
- 239000005556 hormone Substances 0.000 claims description 16
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 claims description 16
- 101000882390 Homo sapiens Histone acetyltransferase p300 Proteins 0.000 claims description 15
- 101000581507 Homo sapiens Methyl-CpG-binding domain protein 1 Proteins 0.000 claims description 15
- 101000615488 Homo sapiens Methyl-CpG-binding domain protein 2 Proteins 0.000 claims description 15
- 101000615495 Homo sapiens Methyl-CpG-binding domain protein 3 Proteins 0.000 claims description 15
- 101001030211 Homo sapiens Myc proto-oncogene protein Proteins 0.000 claims description 15
- 102100027383 Methyl-CpG-binding domain protein 1 Human genes 0.000 claims description 15
- 102100021299 Methyl-CpG-binding domain protein 2 Human genes 0.000 claims description 15
- 102100021291 Methyl-CpG-binding domain protein 3 Human genes 0.000 claims description 15
- 101000978776 Mus musculus Neurogenic locus notch homolog protein 1 Proteins 0.000 claims description 15
- 230000006870 function Effects 0.000 claims description 15
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 claims description 13
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 13
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 12
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 12
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 12
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 claims description 11
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 claims description 11
- 108020004417 Untranslated RNA Proteins 0.000 claims description 11
- 102000039634 Untranslated RNA Human genes 0.000 claims description 11
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 claims description 11
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 11
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 claims description 10
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 claims description 10
- 230000003081 coactivator Effects 0.000 claims description 10
- 201000007281 estrogen-receptor positive breast cancer Diseases 0.000 claims description 10
- 230000008520 organization Effects 0.000 claims description 10
- 108091027981 Response element Proteins 0.000 claims description 9
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 9
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 claims description 9
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 claims description 9
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 claims description 8
- 101000721661 Homo sapiens Cellular tumor antigen p53 Proteins 0.000 claims description 8
- 230000037011 constitutive activity Effects 0.000 claims description 8
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 claims description 8
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 claims description 8
- 108090000266 Cyclin-dependent kinases Proteins 0.000 claims description 7
- 102000003903 Cyclin-dependent kinases Human genes 0.000 claims description 7
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 claims description 7
- 208000006289 Rett Syndrome Diseases 0.000 claims description 7
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 7
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 claims description 7
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 7
- 108700024542 myc Genes Proteins 0.000 claims description 7
- 108010057466 NF-kappa B Proteins 0.000 claims description 6
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 claims description 6
- 238000006384 oligomerization reaction Methods 0.000 claims description 6
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 claims description 6
- 101000596771 Homo sapiens Transcription factor 7-like 2 Proteins 0.000 claims description 5
- 102000003945 NF-kappa B Human genes 0.000 claims description 5
- 102100023606 Retinoic acid receptor alpha Human genes 0.000 claims description 5
- 102100035101 Transcription factor 7-like 2 Human genes 0.000 claims description 5
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 claims description 5
- 239000012190 activator Substances 0.000 claims description 5
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 claims description 5
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 claims description 5
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 claims description 4
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 claims description 4
- 101000972291 Homo sapiens Lymphoid enhancer-binding factor 1 Proteins 0.000 claims description 4
- 101000653540 Homo sapiens Transcription factor 7 Proteins 0.000 claims description 4
- 101000596772 Homo sapiens Transcription factor 7-like 1 Proteins 0.000 claims description 4
- 102100022699 Lymphoid enhancer-binding factor 1 Human genes 0.000 claims description 4
- 101710143123 Mothers against decapentaplegic homolog 2 Proteins 0.000 claims description 4
- 102100025751 Mothers against decapentaplegic homolog 2 Human genes 0.000 claims description 4
- 101710143112 Mothers against decapentaplegic homolog 4 Proteins 0.000 claims description 4
- 102100025725 Mothers against decapentaplegic homolog 4 Human genes 0.000 claims description 4
- 102000043276 Oncogene Human genes 0.000 claims description 4
- 108010013381 Porins Proteins 0.000 claims description 4
- 102000017033 Porins Human genes 0.000 claims description 4
- 108010044012 STAT1 Transcription Factor Proteins 0.000 claims description 4
- 108010081691 STAT2 Transcription Factor Proteins 0.000 claims description 4
- 102000004265 STAT2 Transcription Factor Human genes 0.000 claims description 4
- 108010019992 STAT4 Transcription Factor Proteins 0.000 claims description 4
- 102000005886 STAT4 Transcription Factor Human genes 0.000 claims description 4
- 101150058731 STAT5A gene Proteins 0.000 claims description 4
- 101150063267 STAT5B gene Proteins 0.000 claims description 4
- 108010011005 STAT6 Transcription Factor Proteins 0.000 claims description 4
- 102100029904 Signal transducer and activator of transcription 1-alpha/beta Human genes 0.000 claims description 4
- 102100024481 Signal transducer and activator of transcription 5A Human genes 0.000 claims description 4
- 102100024474 Signal transducer and activator of transcription 5B Human genes 0.000 claims description 4
- 102100030627 Transcription factor 7 Human genes 0.000 claims description 4
- 102100035097 Transcription factor 7-like 1 Human genes 0.000 claims description 4
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 4
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 4
- 238000009472 formulation Methods 0.000 claims description 4
- 210000004492 nuclear pore Anatomy 0.000 claims description 4
- 230000006712 oncogenic signaling pathway Effects 0.000 claims description 4
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 claims description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 4
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims description 4
- 102000004217 thyroid hormone receptors Human genes 0.000 claims description 4
- 108090000721 thyroid hormone receptors Proteins 0.000 claims description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000004049 epigenetic modification Effects 0.000 claims description 3
- 238000005286 illumination Methods 0.000 claims description 3
- 230000004850 protein–protein interaction Effects 0.000 claims description 3
- 108091008726 retinoic acid receptors α Proteins 0.000 claims description 3
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000037426 transcriptional repression Effects 0.000 claims description 3
- 230000007067 DNA methylation Effects 0.000 claims description 2
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 claims description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 2
- 230000004570 RNA-binding Effects 0.000 claims description 2
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 claims description 2
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 claims description 2
- 102000006612 Transducin Human genes 0.000 claims description 2
- 108010087042 Transducin Proteins 0.000 claims description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 2
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 claims description 2
- 239000000074 antisense oligonucleotide Substances 0.000 claims description 2
- 238000012230 antisense oligonucleotides Methods 0.000 claims description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 2
- 230000001335 demethylating effect Effects 0.000 claims description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 claims description 2
- 230000001035 methylating effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000035699 permeability Effects 0.000 claims description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 claims description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 claims description 2
- 230000035899 viability Effects 0.000 claims description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 102000006290 Transcription Factor TFIID Human genes 0.000 claims 10
- 108010083268 Transcription Factor TFIID Proteins 0.000 claims 10
- 230000029279 positive regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 claims 4
- 101001019104 Homo sapiens Mediator of RNA polymerase II transcription subunit 14 Proteins 0.000 claims 2
- 102100034820 Mediator of RNA polymerase II transcription subunit 14 Human genes 0.000 claims 2
- 102000013968 STAT6 Transcription Factor Human genes 0.000 claims 2
- 102100031785 Endothelial transcription factor GATA-2 Human genes 0.000 claims 1
- 101001066265 Homo sapiens Endothelial transcription factor GATA-2 Proteins 0.000 claims 1
- 101000687905 Homo sapiens Transcription factor SOX-2 Proteins 0.000 claims 1
- 102100024270 Transcription factor SOX-2 Human genes 0.000 claims 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 claims 1
- 239000000306 component Substances 0.000 description 141
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 126
- 102100039204 Mediator of RNA polymerase II transcription subunit 1 Human genes 0.000 description 105
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 87
- 102000006255 nuclear receptors Human genes 0.000 description 87
- 102100038595 Estrogen receptor Human genes 0.000 description 81
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 64
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 63
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 44
- 108091030071 RNAI Proteins 0.000 description 42
- 229920002594 Polyethylene Glycol 8000 Polymers 0.000 description 41
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 41
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 38
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 33
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 30
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 30
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 26
- 238000000942 confocal micrograph Methods 0.000 description 24
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 22
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 21
- 102100026810 Cyclin-dependent kinase 7 Human genes 0.000 description 19
- 101000911952 Homo sapiens Cyclin-dependent kinase 7 Proteins 0.000 description 19
- 238000007451 chromatin immunoprecipitation sequencing Methods 0.000 description 18
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 18
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 17
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 17
- 238000002376 fluorescence recovery after photobleaching Methods 0.000 description 16
- 238000005191 phase separation Methods 0.000 description 16
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 16
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 15
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 14
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 14
- 102100024457 Cyclin-dependent kinase 9 Human genes 0.000 description 13
- 101000980930 Homo sapiens Cyclin-dependent kinase 9 Proteins 0.000 description 13
- 108091006146 Channels Proteins 0.000 description 12
- 108091031881 miR-290 stem-loop Proteins 0.000 description 12
- 238000004088 simulation Methods 0.000 description 12
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 10
- 238000004624 confocal microscopy Methods 0.000 description 10
- 238000009987 spinning Methods 0.000 description 10
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 10
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 9
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 9
- 102100039556 Galectin-4 Human genes 0.000 description 8
- 101000608765 Homo sapiens Galectin-4 Proteins 0.000 description 8
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 8
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 8
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 8
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 8
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 8
- 101150091442 Trim28 gene Proteins 0.000 description 8
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 8
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 8
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 8
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 8
- 238000010867 Hoechst staining Methods 0.000 description 7
- 102000000490 Mediator Complex Human genes 0.000 description 7
- 108010080991 Mediator Complex Proteins 0.000 description 7
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 7
- 238000004061 bleaching Methods 0.000 description 7
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 7
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 7
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 7
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 7
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 7
- 238000012353 t test Methods 0.000 description 7
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 7
- 102100033417 Glucocorticoid receptor Human genes 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 102000001307 androgen receptors Human genes 0.000 description 6
- 108010080146 androgen receptors Proteins 0.000 description 6
- 102000004311 liver X receptors Human genes 0.000 description 6
- 108090000865 liver X receptors Proteins 0.000 description 6
- 238000010587 phase diagram Methods 0.000 description 6
- 230000023603 positive regulation of transcription initiation, DNA-dependent Effects 0.000 description 6
- 238000000116 DAPI staining Methods 0.000 description 5
- 101100239628 Danio rerio myca gene Proteins 0.000 description 5
- 108090000079 Glucocorticoid Receptors Proteins 0.000 description 5
- 108700021430 Kruppel-Like Factor 4 Proteins 0.000 description 5
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 5
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 5
- 230000008045 co-localization Effects 0.000 description 5
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 5
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 5
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 5
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 5
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 5
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- AQGNHMOJWBZFQQ-UHFFFAOYSA-N CT 99021 Chemical compound CC1=CNC(C=2C(=NC(NCCNC=3N=CC(=CC=3)C#N)=NC=2)C=2C(=CC(Cl)=CC=2)Cl)=N1 AQGNHMOJWBZFQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 description 4
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 description 4
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- 108090000375 Mineralocorticoid Receptors Proteins 0.000 description 4
- 102100021316 Mineralocorticoid receptor Human genes 0.000 description 4
- 102000005877 Peptide Initiation Factors Human genes 0.000 description 4
- 108010044843 Peptide Initiation Factors Proteins 0.000 description 4
- RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N Progesterone Chemical compound C1CC2=CC(=O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H](C(=O)C)[C@@]1(C)CC2 RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N 0.000 description 4
- 102000018679 Tacrolimus Binding Proteins Human genes 0.000 description 4
- 108010027179 Tacrolimus Binding Proteins Proteins 0.000 description 4
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 4
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 4
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 4
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 4
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 210000000274 microglia Anatomy 0.000 description 4
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 4
- 108090000468 progesterone receptors Proteins 0.000 description 4
- 102000003998 progesterone receptors Human genes 0.000 description 4
- 238000012552 review Methods 0.000 description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 4
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 4
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 4
- RCTYDUUDOSRQTI-WSZWBAFRSA-N (2s)-1-formyl-n-[(2s)-1-oxopropan-2-yl]pyrrolidine-2-carboxamide;propane Chemical compound CCC.O=C[C@H](C)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C=O RCTYDUUDOSRQTI-WSZWBAFRSA-N 0.000 description 3
- SGKRLCUYIXIAHR-AKNGSSGZSA-N (4s,4ar,5s,5ar,6r,12ar)-4-(dimethylamino)-1,5,10,11,12a-pentahydroxy-6-methyl-3,12-dioxo-4a,5,5a,6-tetrahydro-4h-tetracene-2-carboxamide Chemical compound C1=CC=C2[C@H](C)[C@@H]([C@H](O)[C@@H]3[C@](C(O)=C(C(N)=O)C(=O)[C@H]3N(C)C)(O)C3=O)C3=C(O)C2=C1O SGKRLCUYIXIAHR-AKNGSSGZSA-N 0.000 description 3
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 3
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 3
- 101150099612 Esrrb gene Proteins 0.000 description 3
- 102100029951 Estrogen receptor beta Human genes 0.000 description 3
- 101001033726 Homo sapiens Methyl-CpG-binding protein 2 Proteins 0.000 description 3
- 102000034570 NR1 subfamily Human genes 0.000 description 3
- 108020001305 NR1 subfamily Proteins 0.000 description 3
- 238000003559 RNA-seq method Methods 0.000 description 3
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 3
- 102100034253 Retinoic acid receptor RXR-beta Human genes 0.000 description 3
- 102000034527 Retinoid X Receptors Human genes 0.000 description 3
- 108010038912 Retinoid X Receptors Proteins 0.000 description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 3
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 3
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 3
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 3
- 108050003627 Wnt Proteins 0.000 description 3
- 102000013814 Wnt Human genes 0.000 description 3
- 108010023082 activin A Proteins 0.000 description 3
- 230000000712 assembly Effects 0.000 description 3
- 238000000429 assembly Methods 0.000 description 3
- 230000006399 behavior Effects 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 229960003722 doxycycline Drugs 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 102000049101 human MECP2 Human genes 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 3
- 102000027419 nuclear receptor subfamilies Human genes 0.000 description 3
- 108091008607 nuclear receptor subfamilies Proteins 0.000 description 3
- 230000005937 nuclear translocation Effects 0.000 description 3
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 238000003762 quantitative reverse transcription PCR Methods 0.000 description 3
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 235000004400 serine Nutrition 0.000 description 3
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 3
- 108091008023 transcriptional regulators Proteins 0.000 description 3
- 231100000588 tumorigenic Toxicity 0.000 description 3
- 230000000381 tumorigenic effect Effects 0.000 description 3
- MNULEGDCPYONBU-WMBHJXFZSA-N (1r,4s,5e,5'r,6'r,7e,10s,11r,12s,14r,15s,16s,18r,19s,20r,21e,25s,26r,27s,29s)-4-ethyl-11,12,15,19-tetrahydroxy-6'-[(2s)-2-hydroxypropyl]-5',10,12,14,16,18,20,26,29-nonamethylspiro[24,28-dioxabicyclo[23.3.1]nonacosa-5,7,21-triene-27,2'-oxane]-13,17,23-trio Polymers O([C@@H]1CC[C@@H](/C=C/C=C/C[C@H](C)[C@@H](O)[C@](C)(O)C(=O)[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)/C=C/C(=O)O[C@H]([C@H]2C)[C@H]1C)CC)[C@]12CC[C@@H](C)[C@@H](C[C@H](C)O)O1 MNULEGDCPYONBU-WMBHJXFZSA-N 0.000 description 2
- MNULEGDCPYONBU-DJRUDOHVSA-N (1s,4r,5z,5'r,6'r,7e,10s,11r,12s,14r,15s,18r,19r,20s,21e,26r,27s)-4-ethyl-11,12,15,19-tetrahydroxy-6'-(2-hydroxypropyl)-5',10,12,14,16,18,20,26,29-nonamethylspiro[24,28-dioxabicyclo[23.3.1]nonacosa-5,7,21-triene-27,2'-oxane]-13,17,23-trione Polymers O([C@H]1CC[C@H](\C=C/C=C/C[C@H](C)[C@@H](O)[C@](C)(O)C(=O)[C@H](C)[C@@H](O)C(C)C(=O)[C@H](C)[C@H](O)[C@@H](C)/C=C/C(=O)OC([C@H]2C)C1C)CC)[C@]12CC[C@@H](C)[C@@H](CC(C)O)O1 MNULEGDCPYONBU-DJRUDOHVSA-N 0.000 description 2
- MNULEGDCPYONBU-YNZHUHFTSA-N (4Z,18Z,20Z)-22-ethyl-7,11,14,15-tetrahydroxy-6'-(2-hydroxypropyl)-5',6,8,10,12,14,16,28,29-nonamethylspiro[2,26-dioxabicyclo[23.3.1]nonacosa-4,18,20-triene-27,2'-oxane]-3,9,13-trione Polymers CC1C(C2C)OC(=O)\C=C/C(C)C(O)C(C)C(=O)C(C)C(O)C(C)C(=O)C(C)(O)C(O)C(C)C\C=C/C=C\C(CC)CCC2OC21CCC(C)C(CC(C)O)O2 MNULEGDCPYONBU-YNZHUHFTSA-N 0.000 description 2
- MNULEGDCPYONBU-VVXVDZGXSA-N (5e,5'r,7e,10s,11r,12s,14s,15r,16r,18r,19s,20r,21e,26r,29s)-4-ethyl-11,12,15,19-tetrahydroxy-6'-[(2s)-2-hydroxypropyl]-5',10,12,14,16,18,20,26,29-nonamethylspiro[24,28-dioxabicyclo[23.3.1]nonacosa-5,7,21-triene-27,2'-oxane]-13,17,23-trione Polymers C([C@H](C)[C@@H](O)[C@](C)(O)C(=O)[C@@H](C)[C@H](O)[C@@H](C)C(=O)[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)/C=C/C(=O)OC([C@H]1C)[C@H]2C)\C=C\C=C\C(CC)CCC2OC21CC[C@@H](C)C(C[C@H](C)O)O2 MNULEGDCPYONBU-VVXVDZGXSA-N 0.000 description 2
- MNULEGDCPYONBU-UHFFFAOYSA-N 4-ethyl-11,12,15,19-tetrahydroxy-6'-(2-hydroxypropyl)-5',10,12,14,16,18,20,26,29-nonamethylspiro[24,28-dioxabicyclo[23.3.1]nonacosa-5,7,21-triene-27,2'-oxane]-13,17,23-trione Polymers CC1C(C2C)OC(=O)C=CC(C)C(O)C(C)C(=O)C(C)C(O)C(C)C(=O)C(C)(O)C(O)C(C)CC=CC=CC(CC)CCC2OC21CCC(C)C(CC(C)O)O2 MNULEGDCPYONBU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100038495 Bile acid receptor Human genes 0.000 description 2
- 108091007914 CDKs Proteins 0.000 description 2
- 108010020650 COUP Transcription Factor II Proteins 0.000 description 2
- 102100028228 COUP transcription factor 1 Human genes 0.000 description 2
- 102100028226 COUP transcription factor 2 Human genes 0.000 description 2
- 101710163595 Chaperone protein DnaK Proteins 0.000 description 2
- 108091029461 Constitutive heterochromatin Proteins 0.000 description 2
- 108010043471 Core Binding Factor Alpha 2 Subunit Proteins 0.000 description 2
- 108010014790 DAX-1 Orphan Nuclear Receptor Proteins 0.000 description 2
- 241000255581 Drosophila <fruit fly, genus> Species 0.000 description 2
- 108010007005 Estrogen Receptor alpha Proteins 0.000 description 2
- 102100031855 Estrogen-related receptor gamma Human genes 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710178376 Heat shock 70 kDa protein Proteins 0.000 description 2
- 101710152018 Heat shock cognate 70 kDa protein Proteins 0.000 description 2
- 102000006947 Histones Human genes 0.000 description 2
- 101000603876 Homo sapiens Bile acid receptor Proteins 0.000 description 2
- 101000860854 Homo sapiens COUP transcription factor 1 Proteins 0.000 description 2
- 101000926939 Homo sapiens Glucocorticoid receptor Proteins 0.000 description 2
- 101000615613 Homo sapiens Mineralocorticoid receptor Proteins 0.000 description 2
- 101000978924 Homo sapiens Nuclear receptor subfamily 1 group D member 2 Proteins 0.000 description 2
- 101000603882 Homo sapiens Nuclear receptor subfamily 1 group I member 3 Proteins 0.000 description 2
- 101000633516 Homo sapiens Nuclear receptor subfamily 2 group F member 6 Proteins 0.000 description 2
- 101001109685 Homo sapiens Nuclear receptor subfamily 5 group A member 2 Proteins 0.000 description 2
- 101000633511 Homo sapiens Photoreceptor-specific nuclear receptor Proteins 0.000 description 2
- 101000640876 Homo sapiens Retinoic acid receptor RXR-beta Proteins 0.000 description 2
- 101000640882 Homo sapiens Retinoic acid receptor RXR-gamma Proteins 0.000 description 2
- 101001112293 Homo sapiens Retinoic acid receptor alpha Proteins 0.000 description 2
- 101001132698 Homo sapiens Retinoic acid receptor beta Proteins 0.000 description 2
- 101001132658 Homo sapiens Retinoic acid receptor gamma Proteins 0.000 description 2
- 101000585255 Homo sapiens Steroidogenic factor 1 Proteins 0.000 description 2
- 101000712600 Homo sapiens Thyroid hormone receptor beta Proteins 0.000 description 2
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 2
- 102000042838 JAK family Human genes 0.000 description 2
- 101150039798 MYC gene Proteins 0.000 description 2
- 108010093157 Member 1 Group A Nuclear Receptor Subfamily 4 Proteins 0.000 description 2
- 108010034263 Member 1 Group A Nuclear Receptor Subfamily 6 Proteins 0.000 description 2
- 108010010698 Member 1 Group C Nuclear Receptor Subfamily 2 Proteins 0.000 description 2
- 108010032189 Member 1 Group D Nuclear Receptor Subfamily 1 Proteins 0.000 description 2
- 108010093175 Member 2 Group A Nuclear Receptor Subfamily 4 Proteins 0.000 description 2
- 108010010708 Member 2 Group C Nuclear Receptor Subfamily 2 Proteins 0.000 description 2
- 108010093163 Member 3 Group A Nuclear Receptor Subfamily 4 Proteins 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 102000003979 Mineralocorticoid Receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 2
- 102000038100 NR2 subfamily Human genes 0.000 description 2
- 108020002076 NR2 subfamily Proteins 0.000 description 2
- 102100039019 Nuclear receptor subfamily 0 group B member 1 Human genes 0.000 description 2
- 102100023172 Nuclear receptor subfamily 0 group B member 2 Human genes 0.000 description 2
- 102100023170 Nuclear receptor subfamily 1 group D member 1 Human genes 0.000 description 2
- 102100023171 Nuclear receptor subfamily 1 group D member 2 Human genes 0.000 description 2
- 102100038494 Nuclear receptor subfamily 1 group I member 2 Human genes 0.000 description 2
- 102100038512 Nuclear receptor subfamily 1 group I member 3 Human genes 0.000 description 2
- 102100028470 Nuclear receptor subfamily 2 group C member 1 Human genes 0.000 description 2
- 102100028448 Nuclear receptor subfamily 2 group C member 2 Human genes 0.000 description 2
- 102100029528 Nuclear receptor subfamily 2 group F member 6 Human genes 0.000 description 2
- 102100022679 Nuclear receptor subfamily 4 group A member 1 Human genes 0.000 description 2
- 102100022676 Nuclear receptor subfamily 4 group A member 2 Human genes 0.000 description 2
- 102100022673 Nuclear receptor subfamily 4 group A member 3 Human genes 0.000 description 2
- 102100022669 Nuclear receptor subfamily 5 group A member 2 Human genes 0.000 description 2
- 102100022670 Nuclear receptor subfamily 6 group A member 1 Human genes 0.000 description 2
- 108010016731 PPAR gamma Proteins 0.000 description 2
- 102000002508 Peptide Elongation Factors Human genes 0.000 description 2
- 108010068204 Peptide Elongation Factors Proteins 0.000 description 2
- 102100038831 Peroxisome proliferator-activated receptor alpha Human genes 0.000 description 2
- 102100038825 Peroxisome proliferator-activated receptor gamma Human genes 0.000 description 2
- 102100029533 Photoreceptor-specific nuclear receptor Human genes 0.000 description 2
- 108010001511 Pregnane X Receptor Proteins 0.000 description 2
- 238000012228 RNA interference-mediated gene silencing Methods 0.000 description 2
- 102100034262 Retinoic acid receptor RXR-gamma Human genes 0.000 description 2
- 102100033909 Retinoic acid receptor beta Human genes 0.000 description 2
- 102100033912 Retinoic acid receptor gamma Human genes 0.000 description 2
- 102100025373 Runt-related transcription factor 1 Human genes 0.000 description 2
- 102100023980 Signal transducer and activator of transcription 6 Human genes 0.000 description 2
- 102100036832 Steroid hormone receptor ERR1 Human genes 0.000 description 2
- 102100036831 Steroid hormone receptor ERR2 Human genes 0.000 description 2
- 102100029856 Steroidogenic factor 1 Human genes 0.000 description 2
- 102100033451 Thyroid hormone receptor beta Human genes 0.000 description 2
- 108020004566 Transfer RNA Proteins 0.000 description 2
- 101100459258 Xenopus laevis myc-a gene Proteins 0.000 description 2
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 2
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000003491 array Methods 0.000 description 2
- 230000009172 bursting Effects 0.000 description 2
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 2
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 2
- 238000002487 chromatin immunoprecipitation Methods 0.000 description 2
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 238000010830 demodification reaction Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 230000002124 endocrine Effects 0.000 description 2
- 239000006274 endogenous ligand Substances 0.000 description 2
- 108091008559 estrogen-related receptor alpha Proteins 0.000 description 2
- 108091008558 estrogen-related receptor beta Proteins 0.000 description 2
- 108091008557 estrogen-related receptor gamma Proteins 0.000 description 2
- 238000002073 fluorescence micrograph Methods 0.000 description 2
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 239000003862 glucocorticoid Substances 0.000 description 2
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 2
- 238000001794 hormone therapy Methods 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 2
- 210000004263 induced pluripotent stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 2
- 238000003670 luciferase enzyme activity assay Methods 0.000 description 2
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 2
- 108010003814 member 2 group B nuclear receptor subfamily 0 Proteins 0.000 description 2
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 2
- 239000002395 mineralocorticoid Substances 0.000 description 2
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 description 2
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 2
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 description 2
- 108091027963 non-coding RNA Proteins 0.000 description 2
- 229930191479 oligomycin Natural products 0.000 description 2
- MNULEGDCPYONBU-AWJDAWNUSA-N oligomycin A Polymers O([C@H]1CC[C@H](/C=C/C=C/C[C@@H](C)[C@H](O)[C@@](C)(O)C(=O)[C@@H](C)[C@H](O)[C@@H](C)C(=O)[C@@H](C)[C@H](O)[C@@H](C)/C=C/C(=O)O[C@@H]([C@@H]2C)[C@@H]1C)CC)[C@@]12CC[C@H](C)[C@H](C[C@@H](C)O)O1 MNULEGDCPYONBU-AWJDAWNUSA-N 0.000 description 2
- 238000005192 partition Methods 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 108091008725 peroxisome proliferator-activated receptors alpha Proteins 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 239000000186 progesterone Substances 0.000 description 2
- 229960003387 progesterone Drugs 0.000 description 2
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 2
- 230000006916 protein interaction Effects 0.000 description 2
- 230000000754 repressing effect Effects 0.000 description 2
- 108020004418 ribosomal RNA Proteins 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 230000002463 transducing effect Effects 0.000 description 2
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 2
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 2
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 description 1
- 101150078024 CRY2 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 102100036948 DNA polymerase epsilon subunit 4 Human genes 0.000 description 1
- 101100447432 Danio rerio gapdh-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100016370 Danio rerio hsp90a.1 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 108010041356 Estrogen Receptor beta Proteins 0.000 description 1
- 108010022894 Euchromatin Proteins 0.000 description 1
- 108091007413 Extracellular RNA Proteins 0.000 description 1
- 101150112014 Gapdh gene Proteins 0.000 description 1
- 102100032863 General transcription factor IIH subunit 3 Human genes 0.000 description 1
- 102000003676 Glucocorticoid Receptors Human genes 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 108091007417 HOX transcript antisense RNA Proteins 0.000 description 1
- 102100034051 Heat shock protein HSP 90-alpha Human genes 0.000 description 1
- 102100033636 Histone H3.2 Human genes 0.000 description 1
- 101000804960 Homo sapiens DNA polymerase epsilon subunit 4 Proteins 0.000 description 1
- 101001010910 Homo sapiens Estrogen receptor beta Proteins 0.000 description 1
- 101000666405 Homo sapiens General transcription factor IIH subunit 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000655398 Homo sapiens General transcription factor IIH subunit 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000655391 Homo sapiens General transcription factor IIH subunit 3 Proteins 0.000 description 1
- 101000655406 Homo sapiens General transcription factor IIH subunit 4 Proteins 0.000 description 1
- 101000655402 Homo sapiens General transcription factor IIH subunit 5 Proteins 0.000 description 1
- 101000840266 Homo sapiens Immunoglobulin lambda-like polypeptide 5 Proteins 0.000 description 1
- 101001139112 Homo sapiens Krueppel-like factor 9 Proteins 0.000 description 1
- 101000979001 Homo sapiens Methionine aminopeptidase 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000969087 Homo sapiens Microtubule-associated protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000830411 Homo sapiens Probable ATP-dependent RNA helicase DDX4 Proteins 0.000 description 1
- 101000603402 Homo sapiens Protein NPAT Proteins 0.000 description 1
- 101001072237 Homo sapiens Protocadherin-16 Proteins 0.000 description 1
- 101000597542 Homo sapiens Pyruvate dehydrogenase protein X component, mitochondrial Proteins 0.000 description 1
- 101000819111 Homo sapiens Trans-acting T-cell-specific transcription factor GATA-3 Proteins 0.000 description 1
- 101000976959 Homo sapiens Transcription factor 4 Proteins 0.000 description 1
- 101000711846 Homo sapiens Transcription factor SOX-9 Proteins 0.000 description 1
- 101150101510 Hsp90aa1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100029617 Immunoglobulin lambda-like polypeptide 5 Human genes 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 102100026720 Interferon beta Human genes 0.000 description 1
- 108090000467 Interferon-beta Proteins 0.000 description 1
- 230000004163 JAK-STAT signaling pathway Effects 0.000 description 1
- 102100020684 Krueppel-like factor 9 Human genes 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 206010064912 Malignant transformation Diseases 0.000 description 1
- 102100023174 Methionine aminopeptidase 2 Human genes 0.000 description 1
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 description 1
- 102100030608 Mothers against decapentaplegic homolog 7 Human genes 0.000 description 1
- 208000034578 Multiple myelomas Diseases 0.000 description 1
- 101150012532 NANOG gene Proteins 0.000 description 1
- 108020001364 NR0 subfamily Proteins 0.000 description 1
- 108020000002 NR3 subfamily Proteins 0.000 description 1
- 108020002144 NR4 subfamily Proteins 0.000 description 1
- 108020002397 NR6 subfamily Proteins 0.000 description 1
- 108020004485 Nonsense Codon Proteins 0.000 description 1
- 102400000552 Notch 1 intracellular domain Human genes 0.000 description 1
- 101800001628 Notch 1 intracellular domain Proteins 0.000 description 1
- 102100023050 Nuclear factor NF-kappa-B p105 subunit Human genes 0.000 description 1
- 102100025372 Nuclear pore complex protein Nup98-Nup96 Human genes 0.000 description 1
- 108010047956 Nucleosomes Proteins 0.000 description 1
- 241001400033 Omia Species 0.000 description 1
- 102000023984 PPAR alpha Human genes 0.000 description 1
- 108010028924 PPAR alpha Proteins 0.000 description 1
- 108010015181 PPAR delta Proteins 0.000 description 1
- 102100038824 Peroxisome proliferator-activated receptor delta Human genes 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 108091007412 Piwi-interacting RNA Proteins 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 102100024770 Probable ATP-dependent RNA helicase DDX4 Human genes 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100038870 Protein NPAT Human genes 0.000 description 1
- 241000083513 Punctum Species 0.000 description 1
- 102100035459 Pyruvate dehydrogenase protein X component, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- 101100247004 Rattus norvegicus Qsox1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100035178 Retinoic acid receptor RXR-alpha Human genes 0.000 description 1
- 101710172556 Retinoic acid receptor RXR-alpha Proteins 0.000 description 1
- 101710133530 Retinoic acid receptor RXR-beta Proteins 0.000 description 1
- 101700026522 SMAD7 Proteins 0.000 description 1
- 108091078180 SR family Proteins 0.000 description 1
- 108020004487 Satellite DNA Proteins 0.000 description 1
- 108091007415 Small Cajal body-specific RNA Proteins 0.000 description 1
- 108020004688 Small Nuclear RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000039471 Small Nuclear RNA Human genes 0.000 description 1
- 108020003224 Small Nucleolar RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000042773 Small Nucleolar RNA Human genes 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 102100021386 Trans-acting T-cell-specific transcription factor GATA-3 Human genes 0.000 description 1
- 102100027654 Transcription factor PU.1 Human genes 0.000 description 1
- 102100034204 Transcription factor SOX-9 Human genes 0.000 description 1
- 108010074506 Transfer Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100033364 Vitamin D3 receptor Human genes 0.000 description 1
- 101710203223 Vitamin D3 receptor Proteins 0.000 description 1
- 108091007416 X-inactive specific transcript Proteins 0.000 description 1
- 108091035715 XIST (gene) Proteins 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003098 androgen Substances 0.000 description 1
- 229940030486 androgens Drugs 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 1
- 101150010487 are gene Proteins 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000005784 autoimmunity Effects 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- 201000008275 breast carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 1
- 230000005907 cancer growth Effects 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000008358 core component Substances 0.000 description 1
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000002050 diffraction method Methods 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000632 euchromatin Anatomy 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 239000008394 flocculating agent Substances 0.000 description 1
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 231100000221 frame shift mutation induction Toxicity 0.000 description 1
- 230000037433 frameshift Effects 0.000 description 1
- 230000037440 gene silencing effect Effects 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000003054 hormonal effect Effects 0.000 description 1
- 102000055280 human SRSF2 Human genes 0.000 description 1
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000000644 isotonic solution Substances 0.000 description 1
- 229940043355 kinase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 238000010859 live-cell imaging Methods 0.000 description 1
- 102000027528 liver X receptor-like Human genes 0.000 description 1
- 108091008780 liver X receptor-like Proteins 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 238000003468 luciferase reporter gene assay Methods 0.000 description 1
- 230000036212 malign transformation Effects 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 102000031635 methyl-CpG binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091009877 methyl-CpG binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 1
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 1
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 1
- 230000001617 migratory effect Effects 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 1
- 230000037434 nonsense mutation Effects 0.000 description 1
- 235000012149 noodles Nutrition 0.000 description 1
- 108010054452 nuclear pore complex protein 98 Proteins 0.000 description 1
- 210000001623 nucleosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000006508 oncogene activation Effects 0.000 description 1
- 231100000590 oncogenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002246 oncogenic effect Effects 0.000 description 1
- 102000004164 orphan nuclear receptors Human genes 0.000 description 1
- 108090000629 orphan nuclear receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 238000005453 pelletization Methods 0.000 description 1
- 230000000858 peroxisomal effect Effects 0.000 description 1
- 239000003614 peroxisome proliferator Substances 0.000 description 1
- 230000000865 phosphorylative effect Effects 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 239000003757 phosphotransferase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229940037129 plain mineralocorticoids for systemic use Drugs 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- JWMFYGXQPXQEEM-WZBAXQLOSA-N pregnane Chemical compound C1CC2CCCC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H](CC)[C@@]1(C)CC2 JWMFYGXQPXQEEM-WZBAXQLOSA-N 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000009682 proliferation pathway Effects 0.000 description 1
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 108010008929 proto-oncogene protein Spi-1 Proteins 0.000 description 1
- 102100029526 rRNA 2'-O-methyltransferase fibrillarin Human genes 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 230000008672 reprogramming Effects 0.000 description 1
- 102000003702 retinoic acid receptors Human genes 0.000 description 1
- 108090000064 retinoic acid receptors Proteins 0.000 description 1
- 239000010979 ruby Substances 0.000 description 1
- 229910001750 ruby Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 230000011218 segmentation Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 230000009919 sequestration Effects 0.000 description 1
- 239000002924 silencing RNA Substances 0.000 description 1
- QFJCIRLUMZQUOT-HPLJOQBZSA-N sirolimus Chemical compound C1C[C@@H](O)[C@H](OC)C[C@@H]1C[C@@H](C)[C@H]1OC(=O)[C@@H]2CCCCN2C(=O)C(=O)[C@](O)(O2)[C@H](C)CC[C@H]2C[C@H](OC)/C(C)=C/C=C/C=C/[C@@H](C)C[C@@H](C)C(=O)[C@H](OC)[C@H](O)/C(C)=C/[C@@H](C)C(=O)C1 QFJCIRLUMZQUOT-HPLJOQBZSA-N 0.000 description 1
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 210000001324 spliceosome Anatomy 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 102000005969 steroid hormone receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020003113 steroid hormone receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 230000004654 survival pathway Effects 0.000 description 1
- 230000002889 sympathetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229940037128 systemic glucocorticoids Drugs 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 125000000341 threoninyl group Chemical group [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 102000027529 vitamin D receptor-like Human genes 0.000 description 1
- 108091008781 vitamin D receptor-like Proteins 0.000 description 1
- 102000009310 vitamin D receptors Human genes 0.000 description 1
- 108050000156 vitamin D receptors Proteins 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
- G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
- G01N33/535—Production of labelled immunochemicals with enzyme label or co-enzymes, co-factors, enzyme inhibitors or enzyme substrates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
- A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
- A61K48/0066—Manipulation of the nucleic acid to modify its expression pattern, e.g. enhance its duration of expression, achieved by the presence of particular introns in the delivered nucleic acid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
응축물 형성, 구성, 유지, 용해 및 규제를 조정함으로써, 유전자 규제를 조정하는 조성물들과 방법들이 본원에서 기술된다.
Description
관련된 출원들
본 출원은 2018년 3월 23일자로 제출된 U.S. 가특허 출원 일련 번호. 62/647,613, 2018년 3월 26일자로 제출된 U.S. 가특허 출원 일련 번호. 62/648,377, 2018년 8월 24일자로 제출된 U.S. 가특허 출원 일련 번호. 62/722,825, 2018년 10월 29일자로 제출된 U.S. 가특허 출원 일련 번호. 62/752,332; 2019년 3월 17일자로 제출된 U.S. 가특허 출원 일련 번호. 62/819,662, 그리고 2019년 3월 18일자로 제출된 U.S. 가특허 출원 일련 번호. 62/820,237에 대해 우선권을 주장하며, 이들 출원은 모두 이들 전문이 여기에 참고자료로 편입된다.
정부 지원
본 발명은 National Institutes of Health에 의해 제공되는 지원금 번호 HG002668, CA042063, T32CA009172, GM117370, GM008759, 및 GM123511, 그리고 National Science Foundation에 의해 제공되는 지원금 번호 1743900 하에 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명의 특정 권리를 보유한다.
발명의 배경
유전자 발현을 규제하기 위해서는 전사 장비가 특이적 게놈 부위들로 효율적으로 모집되어야 한다. DNA-결합 전사 인자들 (TFs)은 인헨서 및 프로모터- 근위(proximal)-요소들에서 특이적 DNA 서열들이 점유하고, 그리고 이들 부위들로 상기 전사 기전이 모임으로써, 이러한 특이성을 보장한다. TFs는 전형적으로 하나 또는 그 이상의 DNA-결합 도메인들 (DBD)과 하나 또는 그 이상의 별개의 활성화 도메인들 (AD)로 구성된다. TF DBDs의 구조와 기능이 잘-문서화되어 있지만, ADs의 구조와 이들이 유전자 발현을 유도하기 위해 공동활성화제들(coactivator)과 어떻게 상호 작용하는지에 대해서는 상대적으로 거의 모르고 있다.
TF DBDs의 구조와 동족(cognate) DNA 서열들과의 상호 작용은 많은 TFs의 경우 원자 분해능으로 설명되었으며, TFs는 일반적으로 DBDs의 구조적 특징에 따라 분류된다. 예를 들면, DBDs는 아연-배위, 기본적인 헬릭스-루프-헬릭스, 기본적인-류신 지퍼, 또는 헬릭스-턴-헬릭스 DNA-결합 구조로 구성될 수 있다. 이들 DBDs는 대략적으로 4-12 bp 범위의 특이적 DNA 서열들에게 선택적으로 결합하고, 수백 개의 TFs가 선호하는 DNA 결합 서열들이 기술되었다. 상이한 여러 TF 분자들은 전형적으로 임의의 하나의 인헨서 또는 프로모터-근위 요소에 함께 결합한다. 예를 들면, 적어도 8가지 상이한 TF 분자들은 IFN-β인헨서의 50bp 코어 성분에 결합한다 (Panne et al., 2007).
DBD에 의해 그 위치에 고정됨으로써, 상기 AD는 공동활성화제와 상호작용하고, 이는 전사 결과량(output)을 규제하기 위하여 다수의 TFs로부터의 신호를 통합한다. 구조를 갖춘 DBD와 대조적으로, 대부분 TFs의 ADs는 복잡성(complexity)-낮은 아미노산 서열들이며, 이점은 결정학에 적합하지 않다. 따라서, 이러한 본질적으로 무질서한 영역들 또는 도메인들 (IDRs)은 산성, 프롤린-, 세린/트레오닌-, 또는 글루타민-풍부와 같은 이들의 아미노산 프로파일에 의해 분류되거나; 또는 산 얼룩(blobs), 네가티브 누들(noodles), 또는 펩티드 라소(lassos)와 같은 가상 모양 (Hahn and Young, 2011; Mitchell and Tjian, 1989; Roberts, 2000; Sigler, 1988; Staby et al., 2017; Triezenberg, 1995)에 의해 분류된다. 놀랍게도, 수백 개의 TFs는 그중에서도 Mediator 및 p300 등을 포함하는 동일한 작은 공동활성제 복합체 세트와 상호 작용하는 것으로 간주된다. 서열 상동성을 거의 공유하지 않는 ADs는 TFs간에 기능적으로 상호 교환 가능하고; 이러한 상호교환성은 단백질-단백질 상호 작용의 전통적인 락-앤-키(lock-and-key) 모델에 의해 쉽게 설명되지 않는다. 따라서, 수백 개의 서로 다른 TFs의 다양한 활성화 도메인이 유사한 작은 공동활성화제 세트와 어떻게 상호 작용하는 지에 대해서는 여전히 수수께끼다.
인헨서들은 세포 유형-특이적 유전자들의 발현 규제 기능을 하는 전사 인자들과 전사 도구의 다른 성분들에 의해 결합된 유전자 조절 요소들이다. 매우 높은 밀도의 전사 도구가 차지하는 인핸서 클러스터(clusters)인 슈퍼-인핸서 (SEs)는 세포 정체성에 특히 중요한 역할을 하는 유전자들을 규제한다.
초파리의 선구적인 유전 연구에서 전사 인자와 신호전달(signaling) 인자들이 발달 제어에 근본적으로 중요한 역할을 한다는 것을 보여주었다. 이후의 많은 연구에서 각 세포의 정체성을 규정하는 유전자 발현 프로그램은 계통- 및 세포-유형-특이적 마스터 TFs (세포-유형 특이적 인헨서를 설정하고) 그리고 신호전달 인자들(이들 인헨서에 대한 세포외 정보를 운반하는)에 의해 제어된다는 사실을 이해하게 되었다.
전환분화(transdifferentiation) 및 재프로그래밍 실험 결과에서 소수의 마스터 TFs들이 세포-유형 특이적 유전자 발현 제어를 지배한다고 주장한다. 수백 개의 TFs가 각 세포 유형에서 발현되기는 하지만, TF MyoD가 세포를 근육과 유사한 세포로 전환분화시키는 능력(Weintraub, et al (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. 86, 5434-5438) 그리고 섬유모세포들을 유도된 다능성(다분화능) 줄기 세포들로 재프로그래밍하는 TFs Oct4, Nanog, Klf4 및 Myc의 능력 (Takahashi, et al. (2006) Cell 126, 663-676)에 의해 입증된 바와 같이, 세포가 새로운 정체성을 얻도록 하는데는 소수만 필요하다. 이러한 마스터 TFs는 세포 정체성에서 두드러진 역할을 하는 유전자들에서 인핸서 및 종종 수퍼-인핸서라고 하는 인핸서 클러스터를 설정함으로써, 유전자 발현 프로그램의 제어를 지배한다.
세포는 신호전달 경로에 의존하여, 이들의 정체성을 유지하고, 세포외 환경에 반응한다. 포유류 발달 과정의 제어에서 두드러진 역할을 하는 신호전달 경로에는 WNT, TGF-β 및 JAK/STAT 경로가 포함된다. 이러한 각 경로에서, 세포외 리간드는 특이적 수용체에 의해 인지되며, 다른 단백질을 통해 이 신호를 변환시켜 핵에 들어가고, 게놈에 있는 신호 반응 요소들에 결합하는 일련의 신호전달 인자로 변환시킨다. 주어진 세포 유형에서, 이들 신호전달 인자들은 다수의 추정 신호 반응 요소들의 작은 부분 집합에 결합하여, 해당 세포 유형의 활성 인헨서들에서 발생하는 것들에 결합을 선호하고, 따라서, 광범위한 세포 유형 스펙트럼에서 발현되는 신호전달 인자들에 대한 세포 유형-특이적 반응이 허용된다.
RNA 중합효소 II (Pol II)에 의한 pre-mRNA 합성은 전사 개시 복합체의 형성과 신장(elongation) 복합체로의 전이(transition)가 포함된다. Pol II의 큰 하부단위(subunit)는 본질적으로 무질서한 C-말단 도메인 (CTD)을 함유하는데, 이것은 상기 개시에서-신장 전이 과정 동안, 사이클린-의존적 키나제 (CDKs)에 의해 인산화되고, 따라서 개시 또는 RNA 스플라이싱(splicing) 도구의 상이한 성분들과의 CTD의 상호작용에 영향을 끼친다. 최근 관찰에 따르면, 이 모델은 CTD 포스포릴화의 효과에 대한 부분적인 그림만 제공한다.
염색질(chromatin)은 일반적으로 덜 압축되고 유전자-풍부한 진정염색질(euchromatin)과 고도로 압축되고 유전자-poor1 이질성염색질(heterochromatin)의 범주로 분류된다. 구성적(constitutive) 이질성염색질은 이를 테면, 위성 DNA 및 트랜스포존(transposons)과 같은 반복 요소들에서 어셈블리된다. 이질성염색질은 반복 요소들 간에 재조합을 억제하고, 활성 트랜스포존의 전사를 제한시키고, 동원체(centromeric) DNA를 구축하고, 그리고 발달 계통들에 걸쳐 유전자 발현을 억제하는데 중요한 역할을 한다.
TFs 및 신호전달 인자들의 다양성과 관련된 유전자 발현 조절의 메커니즘을 밝히기 위하여, 뿐만 아니라 이질성염색질과 mRNA 개시 및 신장에 대한 추가 연구가 절실하다.
본 발명의 요약
본원에서 설명된 작업으로 다양한 성분을 가지며, 자연-발생 응축물과 합성 또는 인공 응축물을 모두 포함하는 응축물의 존재와 유용성을 확인했다. 본원에는 응축물 및 이들의 성분분, 응축물 구조 및 기능을 조절하는 제제를 확인하는 방법들, 치료 효과를 위해 응축물 기능/활성을 조절하는 방법들, 뿐만 아니라 기타 관련 조성물들 및 방법들이 설명되어 있다.
일반적으로, 본 명세서는 전사 응축물들, 이질성염색질 응축물들, 그리고 mRNA 개시 또는 신장 복합체들과 물리적으로 연합된 응축물들의 조정, 형성 및 용도에 관계한다. 본 명세서는 핵 수용체들, 신호전달 인자들, 그리고 메틸-DNA 결합 인자들이 응축물들과 상호작용하고, 변형시킨다는 발견과 또한 관련된다. 하기 설명으로부터 명백한 바와 같이, 응축물들은 예를 들어, 제제를 사용하여 당해 응축물 성분들의 유형, 양 또는 속성을 변형시킴으로써 조절될 수 있다. 스크리닝(screening) 방법에 응축물 사용은 치료제를 발견하기 위해 세포 내 유전자 발현 제어를 보다 정확하게 반영할 수 있는 유용한 도구를 제공한다.
전사 응축물들은 전사 부위에서 발생되는 별개 다중-분자 어셈블리이며, 전사 인자들, 공동-인자들, 염색질 조절제들, DNA, 넌-코딩 RNA, 발생기(nascent) RNA, 및 RNA 중합효소 II를 포함하는 다수의 성분들의 고-밀도 공조적(cooperative) 어셈블리이다 (도 1). 일부 경우들에서, 전사 응축물들은 슈퍼-인헨서 어셈블리에 의해 형성된다. 많은 질환은 이러한 핵산 및 단백질 성분의 변경으로 인해 발생하거나 또는 이와 관련되며, 응축물들의 전사 결과량을 변경시킴으로써 치료적 개입을 제공할 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, "이질성염색질 응축물들"이란 이질성염색질과 물리적으로 연합된(가령, 여기에서 발생된) 상-분리된(phase-separated) 다중-분자 어셈블리다. 본 명세서의 일부 측면들에서, mRNA 개시 또는 신장 복합체와 물리적으로 연합된 응축물들이 기술된다. 본원에서 사용된 바와 같이, 이들 응축물들 (가령, mRNA 개시 또는 신장 복합체와 물리적으로 연합된 응축물들)은 상이 관련 복합체에서 상-분리된 다중-분자 어셈블리다. 일부 구체예들에서, 신장 복합체와 물리적으로 연합된 응축물은 스플라이싱 인자들을 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 합성 전사 응축물이란 전사 응축물 성분들을 포함하는 비-자연 발생적 응축물을 지칭한다.
본원에서 기술된 결과들은 이 공동활성화제와 상-분리된 응축물들을 만들기 위하여, 전사 인자들이 Mediator와 상호작용하고, 이들 활성화 도메인들의 능력에 의해 유전자를 활성화시키는 모델을 일부 뒷받침한다. 공동활성화제들과 함께 상-분리된 응축물들이 형성되는 이 과정은 자가면역, 암, 및 신경퇴행을 비롯한 많은 질환에서 교란된다. 예를 들면, 악성 형질전환은 다른 과정들중에서 다음에 의해 발생될 수 있다: 세포 생존 또는 증식 경로를 부적절하게 활성화시키는 융합 종양형성 전사 인자들의 생성, 정상 조직에서는 발현되지 않는 전사 인자들의 부적절한 생성, 또는 전사 인자들을 기존의 침묵 종양유전자(oncogene)로 동원하는 인헨서 영역의 돌연변이. 응축물들의 활성화 도메인들 또는 다른 성분들의 기능 교란으로 전사 인자들의 활성을 방해하는 기전이 제공된다.
다른 것들 중에서 전사 응축물 형성, 구성, 유지, 용해 및 규제를 강화 또는 감소시킴으로써 전사를 조절하는 응축물, 검정법 및 방법과 관련될 수 있는 질환들이 본원에서 기술된다. 일부 측면들에서, 상기 전사 응축물들은 핵 수용체들, 예컨데, 동족 리간드 없이 전사를 활성화시키는 핵 호르몬 수용체들 또는 돌연변이 핵 호르몬 수용체들을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 응축물들 (예컨데, mRNA 개시 또는 신장 복합체들과 물리적으로 연합된 전사, 이질성염색질, 및/또는 응축물들)은 신호전달 인자들, 메틸-DNA 결합 단백질들 (예컨데, 메틸 CpG 결합 단백질들), 유전자 침묵화 인자들 (예컨데, 억제제들, 억제성 이질성염색질 인자들), RNA 중합효소 (예컨데, Pol II, 포스포릴화된 Pol II, 탈-포스포릴화된 Pol II), 또는 스플라이싱 인자들을 포함한다. 본 명세서의 일부 측면들은 응축물 형성, 구성, 유지, 용해, 활성, 또는 규제를 조절하는 제제를 투여함으로써 질환 및 병태를 치료하는 것에 관계한다. 본원에서 기술된 방법들의 일부 구체예들에서, 상기 투여된 제제는 표적이 되는 질환의 치료용으로 유용한지에 대하여 알려진 바 없다.
본 명세서의 일부 측면들은 하나 또는 그 이상의 유전자들과 연합된 응축물 (예컨데, 전사 응축물)의 형성, 구성, 유지, 용해, 활성 및/또는 규제를 조절하는 것을 포함하는 하나 또는 그 이상의 유전자들 (예컨데, 세포 안에 하나 또는 그 이상의 유전자들)의 전사를 조정하는 방법에 관계한다. 일부 구체예들에서, 상기 응축물 (예컨데, 전사 응축물)은 당해 응축물과 연합된 성분의 결합가(valency)를 증가 또는 감소시킴으로써 조정된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 구절 "응축물과 연합된 성분" 또는 이와 유사한 것들, 그리고 구절 "응축물 성분" 또는 이와 유사한 것들은 응축물 (예컨데, 전사 응축물)의 일부분이 되거나, 또는 응축물의 일부분이 될 수 있는 역량을 갖춘 펩티드, 단백질, 핵산, 신호전달 분자, 지질, 또는 이와 유사한 것들을 지칭한다. 일부 구체예들에서, 상기 성분은 상기 응축물 안에 있다. 일부 구체예들에서, 상기 성분은 상기 응축물의 표면 상에 있다. 일부 구체예들에서, 상기 성분은 응축물 형성 또는 안정성에 필수적이다. 일부 구체예들에서, 상기 성분은 응축물 형성 또는 안정성에 필수적이지 않다. 일부 구체예들에서, 상기 성분은 단백질 또는 펩티드이며, 하나 또는 그 이상의 본질적으로 정돈된(ordered) 도메인들 (예컨데, 전사 인자의 활성화 도메인의 IDR, 전사 인자의 활성화 도메인의 IDR과 상호작용하는 IDR, 신호전달 인자의 IDR, 메틸-DNA 결합 단백질의 IDR, 유전자 침묵화 인자의 IDR, 중합효소의 IDR, 스플라이싱 인자의 IDR)를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 성분은 응축물의 비-구조적 구성원 (예컨데, 응축물 통합성에 필수적이지 않은)이며, 때때로, 클라이언트(client) 성분으로 불리기도 한다. 일부 구체예들에서, 응축물은 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 그 이상의 성분들을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 필수적으로 구성된다. 일부 구체예들에서, 응축물 (예컨데, 합성 전사 응축물 (합성 전사 응축물은 때때로, 본원에서 "인공적 응축물"로 불림)은 핵산을 포함하지 않는다. 일부 구체예들에서, 응축물 (예컨데, 합성 전사 응축물)은 RNA를 포함하지 않는다. 일부 구체예들에서, 상기 성분은 단백질 또는 핵산의 단편이다.
일부 구체예들에서, 상기 성분은 DNA 서열 (예컨데, 인헨서 DNA 서열, 메틸화된 DNA 서열, 슈퍼-인헨서 DNA 서열, 전사된 유전자의 3' 단부, 신호 반응 요소, 호르몬 반응 요소), 전사 인자, 유전자 침묵화 인자, 스플라이싱 인자, 신장 인자, 개시 인자, 히스톤 (예컨데, 변형된 히스톤), 공동-인자, RNA (예컨데, ncRNA), 매개체, 및 RNA 중합효소 (예컨데, RNA 중합효소 II)로 구성된 군에서 선택된다. 일부 구체예들에서, 상기 공동-인자는 LXXLL 모티프를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 공동-인자는 LXXLL 모티프를 포함하며, 리간드 (예컨데, 동족 리간드, 자연 발생적 리간드, 합성 리간드)에 결합될 때, TF (예컨데, 핵 수용체, 마스터 전사 인자)에 대한 증가된 결합가를 갖는다. LXXLL 모티프를 갖는 공동-인자들은 당분야에 공지되어 있다. 일부 구체예들에서, 상기 성분은 IDR 및 LXXLL 모티프를 포함하는 공동-인자의 단편이다. 일부 구체예들에서, 상기 성분은 핵 수용체 리간드가 아니다. 일부 구체예들에서, 상기 성분은 지질이 아니다. 일부 구체예들에서, 상기 성분은 단백질 또는 핵산이다.
일부 구체예들에서, 상기 응축물은 상기 응축물의 성분의 하나 또는 그 이상의 본질적 무질서 도메인들과 상호작용하는 제제를 당해 응축물에 접촉시킴으로써 조정된다. 일부 구체예들에서, 상기 제제와 접촉된 응축물의 성분은 신호전달 인자, 메틸-DNA 결합 단백질, 유전자 침묵화 인자, RNA 중합효소, 스플라이싱 인자, BRD4, Mediator, 매개체 성분, MED1, MED15, 전사 인자, RNA 중합효소, 또는 핵 수용체 리간드 (예컨데, 호르몬)이다. 일부 구체예들에서, 상기 성분은 표 S1에 열거된 단백질이다.
일부 구체예들에서, 상기 제제와 접촉된 응축물의 성분은 TCF7L2, TCF7, TCF7L1, LEF1, 베타-카테닌, SMAD2, SMAD3, SMAD4, STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5A, STAT5B, STAT6, 그리고 NF-κB로 구성된 군에서 선택된 신호전달 인자다. 일부 구체예들에서, 상기 신호전달 인자는 하나 또는 그 이상의 자체 무질서 도메인들을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 신호전달 인자는 상기 응축물과 연합된 하나 또는 그 이상의 신호 반응 요소들 또는 매개체에 선호적으로 결합한다. 일부 구체예들에서, 상기 응축물은 마스터 전사 인자를 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 제제와 접촉된 응축물의 성분은 메틸화된 DNA에 선호적으로 결합하는 메틸-DNA 결합 단백질이다. 일부 구체예들에서, 상기 메틸-DNA 결합 단백질은 MECP2, MBD1, MBD2, MBD3, 또는 MBD4이다. 일부 구체예들에서, 상기 메틸-DNA 결합 단백질은 유전자 침묵화와 연합된다. 일부 구체예들에서, 상기 성분은 이질성염색질과 연합된 억압제(suppressor)이다. 일부 구체예들에서, 상기 메틸-DNA 결합 단백질은 HP1α, TBL1R (트랜스듀신 베타-유사 단백질), HDAC3 (히스톤 데아세틸라제 3) 또는 SMRT (레티노 및 갑성선 수용체의 침묵화 매개체)이다.
일부 구체예들에서, 상기 제제와 접촉된 응축물의 성분은 mRNA 개시 및 신장과 연합된 RNA 중합효소다. 일부 구체예들에서, 상기 RNA 중합효소는 RNA 중합효소 II 또는 RNA 중합효소 II C-말단 영역이다. 일부 구체예들에서, 상기 RNA 중합효소 II C-말단 영역은 본질적으로 무질서한 영역 (IDR)을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 IDR은 포스포릴화 부위를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 성분은 SRSF2, SRRM1, 또는 SRSF1로부터 선택된 스플라이싱 인자다.
일부 구체예들에서, 상기 제제와 접촉된 응축물의 성분은 전사 인자다. 일부 구체예들에서, 상기 전사 인자는 OCT4, p53, MYC 또는 GCN4, NANOG, MyoD, KLF4, SOX 패밀리 전사 인자, GATA 패밀리 전사 인자, 또는 핵 수용체 (예컨데, 핵 호르몬 수용체, 에스트로겐 수용체, 레티노산 수용체-알파)이다. 본원에서 기술된 방법들의 일부 구체예들에서, 상기 전사 인자는 Lambert, et al., Cell. 2018 Feb 8;172(4):650-665에서 확인된 인간 전사 인자다. 일부 구체예들에서, 상기 핵 수용체는 동족 리간드에 결합될 때, 전사를 활성화시킨다. 일부 구체예들에서, 상기 핵 수용체는 동족 리간드 부재시 전사를 활성화시키고, 또는 천연 리간드 (예컨데, 동족 리간드) 존재 하에서 야생형 핵 수용체보다, 동족 리간드 부재 하에서 더 높은 수준(예컨데, 적어도 1.5-배, 적어도 2-배, 적어도 3-배, 또는 그 이상의)의 전사 활성을 갖는 돌연변이 핵 수용체다. 일부 구체예들에서, 상기 핵 수용체는 동족 리간드 존재 하에서 야생형 핵 수용체와는 상이한 정도로 전사를 조절하는 돌연변이 핵 전사 인자다. 일부 구체예들에서, 상기 전사 인자는 표 S3에 개시된 융합 종양형성 전사 인자 또는 전사 인자다. 일부 구체예들에서, 상기 융합 종양형성 전사 인자는 MLL-재배열, EWS-FLI, ETS 융합, BRD4-NUT, 그리고 NUP98 융합으로부터 선택된다. 상기 종양형성 전사 인자는 당분야에서 확인된 임의의 종양형성 전사 인자일 수 있다.
일부 구체예들에서, 상기 응축물의 성분의 하나 또는 그 이상의 자체 무질서 도메인들과 상호작용하는 제제는 펩티드, 핵산, 또는 소(small) 분자이거나, 이를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 제제는 산성 아미노산에 대하여 풍부한 펩티드 (예컨데, 순(net) 네가티브 전하를 갖는 펩티드, 글루탐산 및/또는 아스파르트산이 풍부한 펩티드)를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 제제는 신호전달 인자 모방체(mimetic)다. 일부 구체예들에서, 상기 제제는 신호전달 인자 길항제(antagonist)다. 일부 구체예들에서, 상기 제제는 저(hypo)-포스포릴화된 RNA 중합효소 II C-말단 도메인 (Pol II CTD) 또는 이의 기능적 단편을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 제제는 저-포스포릴화된 Pol II CTD에 선호적으로 결합한다. 일부 구체예들에서, 상기 제제는 메틸화된 DNA에 결합한다. 일부 구체예들에서, 상기 제제는 메틸-DNA 결합 단백질에 결합한다.
일부 구체예들에서, 상기 제제와의 접촉은 상기 응축물을 안정화시키거나 또는 용해시키고, 이로 인하여 상기 하나 또는 그 이상의 유전자들의 전사를 조정한다. 일부 구체예들에서, 상기 응축물과 연합된 전사 인자가 상기 응축물의 성분 (예컨데, 전사 인자는 아니지만, 당해 응축물과 연합된 성분)으로의 결합을 조정함으로써, 상기 응축물이 조정된다. 일부 구체예들에서, 상기 응축물의 성분은 공동활성화제, 신호전달 인자, 메틸-DNA 결합 단백질, 스플라이싱 인자, 유전자 침묵화 인자, RNA 중합효소, 또는 공동인자다. 일부 구체예들에서, 상기 응축물의 성분은 핵 수용체 리간드 또는 신호전달 인자다. 일부 구체예들에서, 상기 공동활성화제, 신호전달 인자, 메틸-DNA 결합 단백질, 스플라이싱 인자, 유전자 침묵화 인자, RNA 중합효소, 또는 공동인자는 Mediator, 매개체 성분, MED1, MED15, p300, BRD4, β-카테닌, STAT3, SMAD3, NF-kB, MECP2, MBD1, MBD2, MBD3, MBD4, HP1α, TBL1R, HDAC3, SMRT, RNA 중합효소 II, SRSF2, SRRM1, SRSF1, 또는 TFIID이다. 일부 구체예들에서, 상기 핵 수용체 리간드는 호르몬이다. 일부 구체예들에서, 상기 전사 인자는 OCT4, p53, MYC, GCN4, NANOG, MyoD, KLF4, SOX 패밀리 전사 인자, GATA 패밀리 전사 인자, 핵 수용체, 또는 융합 종양형성 전사 인자다. 일부 구체예들에서, 상기 전사 인자의 상기 응축물의 성분으로의 결합은 상기 전사 인자 또는 응축물에 제제 (예컨데, 펩티드, 핵산, 또는 소 분자)를 접촉시킴으로써 조정된다. 일부 구체예들에서, 상기 전사 인자의 응축물의 성분으로의 결합은 상기 전사 인자의 활성화 도메인 (예컨데, 활성화 도메인의 IDR)에 제제 (예컨데, 펩티드, 핵산, 또는 소 분자)를 접촉시킴으로써 조정된다.
일부 구체예들에서, 상기 전사 응축물은 전사 응축물의 일부분, 또는 일부분이 될 수 있는 핵 수용체에 대한 리간드의 결합을 조정함으로써, 조정된다. 일부 구체예들에서, 상기 리간드는 호르몬 (예컨데, 에스트로겐)이다. 일부 구체예들에서, 상기 리간드의 결합은 제제 (예컨데, 펩티드, 핵산, 또는 소 분자)에 의해 조정된다. 일부 구체예들에서, 상기 전사 응축물은 상기 전사 응축물의 성분과 핵 수용체 결합을 조정함으로써, 조정된다. 일부 구체예들에서, 상기 전사 응축물의 성분은 공동활성화제, 공동인자, 또는 핵 수용체 리간드 (예컨데, 호르몬)이다. 일부 구체예들에서, 상기 공동활성화제, 공동인자, 또는 핵 수용체 리간드는 매개체 성분 또는 호르몬이다. 일부 구체예들에서, 상기 핵 수용체 (예컨데, 돌연변이 핵 수용체)는 동족 리간드로의 결합 없이, 전사를 활성화시킨다. 일부 구체예들에서, 상기 성분과 핵 수용체의 연합은 제제에 의해 조정된다. 일부 구체예들에서, 핵 수용체가 또다른 응축물 성분 (예컨데, 매개체 성분)으로의 결합을 조정함으로써, 응축물의 전사 활성이 조정된다.
일부 구체예들에서, 상기 전사 응축물의 성분에 대한 신호전달 인자 결합을 조정함으로써, 상기 응축물 (예컨데, 전사 응축물)이 조정된다. 일부 구체예들에서, 상기 성분은 매개체, 매개체 성분, 또는 전사 인자이다. 일부 구체예들에서, 상기 응축물은 슈퍼-인헨서와 연합된다. 일부 구체예들에서, 상기 응축물의 조정으로 하나 또는 그 이상의 종양유전자의 발현이 조정된다. 일부 구체예들에서, 상기 신호전달 인자는 종양형성 신호전달 경로와 연합된다. 일부 구체예들에서, 상기 응축물은 일탈 수준의 신호전달 인자 (가령, 건강한 세포 또는 비-저항 세포와 비교하였을 때, 증가된 또는 감소된 수준의 신호전달 인자)를 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 응축물의 성분 또는 메틸화된 DNA로 메틸-DNA 결합 단백질의 결합을 조정함으로써, 상기 응축물이 조정된다. 일부 구체예들에서, 상기 응축물의 성분으로의 유전자 침묵화 인자의 결합을 조정함으로써, 상기 응축물이 조정된다. 일부 구체예들에서, 상기 전사 인자의 성분으로의 RNA 중합효소의 결합을 조정함으로써, 상기 응축물이 조정된다. 일부 구체예들에서, 상기 전사 인자의 성분으로의 스플라이싱 인자의 결합을 조정함으로써, 상기 응축물이 조정된다.
일부 구체예들에서, 상기 응축물의 성분 (예컨데, 클라이언트 성분, 비-구조적 성분)의 양을 조정함으로써, 상기 응축물이 조정된다. 일부 구체예들에서, 상기 성분 (예컨데, 전사 성분)은 하나 또는 그 이상의 전사 공동-인자들 및/또는 전사 인자들 (예컨데, 신호전달 인자들) 및/또는 핵 수용체 리간드들 (예컨데, 호르몬)이다. 일부 구체예들에서, 상기 성분은 Mediator, 매개체 성분, MED1, MED15, p300, BRD4, TFIID, β-카테닌, STAT3, SMAD3, NF-KB, MECP2, MBD1, MBD2, MBD3, MBD4, HP1α, TBL1R, HDAC3, SMRT, RNA 중합효소 II, SRSF2, SRRM1, SRSF1, 또는 호르몬이다. 일부 구체예들에서, 상기 성분은 Mediator, 매개체 성분, MED1, MED15, p300, BRD4, TFIID, 또는 핵 수용체 리간드일 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 성분은 전사 인자 (예컨데, OCT4, p53, MYC, GCN4, NANOG, MyoD, KLF4, SOX 패밀리 전사 인자, GATA 패밀리 전사 인자, 핵 수용체, 또는 융합 종양형성 전사 인자)이다.
일부 구체예들에서, 상기 응축물과 연합된 성분의 양은 상기 성분과 상기 응축물과 연합된 다른 성분과의 상호작용을 감소시키거나, 또는 제거하는 제제에 접촉됨으로써 조정된다. 일부 구체예들에서, 상기 제제는 상기 응축물과 연합된 성분의 상호작용 도메인을 표적으로 한다. 일부 구체예들에서, 상기 상호작용 도메인은 본질적으로 무질서한 도메인 또는 영역 (IDR)이다. 일부 구체예들에서, 상기 IDR은 전사 인자의 활성화 도메인 안에 있다.
일부 구체예들에서, 상기 응축물 (예컨데, 전사 응축물)의 조정으로 하나 또는 그 이상의 신호전달 경로가 조정된다. 일부 구체예들에서, 상기 신호전달 경로는 질환 발병기전 (예컨데, 암 발병기전)에 일조한다. 일부 구체예들에서, 상기 신호전달 경로는 호르몬 신호전달과 연루된다. 일부 구체예들에서, 상기 신호전달 경로는 상기 응축물의 성분으로써 신호전달 인자를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 신호전달 인자는 TCF7L2, TCF7, TCF7L1, LEF1, 베타-카테닌, SMAD2, SMAD3, SMAD4, STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5A, STAT5B, STAT6, 및 NF-κB로 구성된 군에서 선택된다. 일부 구체예들에서, 상기 신호전달 경로는 핵 수용체 (예컨데, 핵 호르몬 수용체)와 연루된다. 일부 구체예들에서, 상기 응축물의 조정으로 상기 응축물과 하나 또는 그 이상의 핵 구멍(pore) 단백질들 간의 상호작용이 조정된다. 일부 구체예들에서, 상기 응축물과 하나 또는 그 이상의 핵 구멍 단백질들 간의 상호작용 조정으로 핵 신호전달, mRNA 진출(export), 및/또는 mRNA 해독이 조정될 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 응축물의 조정으로 상기 응축물과 메틸-DNA 결합 단백질들 간의 상호작용이 조정될 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 응축물의 조정으로 상기 응축물과 유전자 침묵화 인자들 간의 상호작용이 조정될 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 응축물의 조정으로 이질성염색질 안에 위치하는 하나 또는 그 이상의 유전자들의 억제(repression) 또는 활성화가 조정된다. 일부 구체예들에서, 상기 응축물의 조정으로 상기 응축물과 스플라이싱 인자들, 개시 인자들 또는 신장 인자 간에 상호작용이 조정된다. 일부 구체예들에서, 상기 응축물의 조정으로 상기 응축물과 RNA 중합효소 간에 상호작용이 조정된다. 일부 구체예들에서, 상기 응축물의 조정으로 mRNA 개시 또는 신장이 조정된다. 일부 구체예들에서, 상기 응축물의 조정으로 mRNA 스플라이싱이 조정된다. 일부 구체예들에서, 상기 응축물의 조정으로 염증성 반응 (예컨데, 바이러스 또는 박테리아에 대한 염증성 반응)이 조정된다. 일부 구체예들에서, 상기 응축물의 조정으로 암의 생존력 또는 성장이 조정(예컨데, 감소 또는 제거된다). 일부 구체예들에서, 응축물의 조정으로 Rett 증후군 또는 MeCP2 과다발현 증후군이 치료 또는 예방된다. 일부 구체예들에서, 응축물의 조정으로 일탈 mRNA 개시, 신장, 또는 스플라이싱과 연합된 병태가 치료 또는 예방된다.
일부 구체예들에서, 상기 응축물과 연합된 뉴클레오티드 서열의 변경에 의해 상기 응축물이 조정된다. 변경(alteration)에는 뉴클레오티드들의 추가 또는 결실, 또는 후성적 변형 (예컨데, DNA 메틸화를 증가 또는 감소 또는 변형)이 포함될 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 뉴클레오티드 서열의 변경에는 당해 뉴클레오티드 서열에 DNA, RNA, 또는 단백질의 테터링(tethering)이 포함된다. 일부 구체예들에서, 촉매적으로 비활성 부위 특이적 엔도뉴클레아제 (예컨데, dCas)를 이용하여 DNA, RNA, 또는 단백질을 당해 뉴클레오티드 서열에 테터링한다. 일부 구체예들에서, DNA, RNA, 또는 단백질을 상기 응축물에 테터링함으로써, 상기 응축물이 조정된다. 일부 구체예들에서, 호르몬 반응성 요소 또는 신호전달 반응성 요소가 변형된다. 일부 구체예들에서, 상기 응축물과 연합된 DNA를 메틸화 또는 탈메틸화시킴으로써, 상기 응축물이 조정된다. 일부 구체예들에서, 성분의 포스포릴화 또는 탈-포스포릴화시킴으로써, 상기 응축물이 조정된다. 일부 구체예들에서, 상기 성분은 RNA 중합효소다.
일부 구체예들에서, 상기 응축물에 외인성 RNA를 접촉시킴으로써, 상기 응축물이 조정된다. 일부 구체예들에서, 상기 응축물 (예컨데, 응축물 성분)과 연합된 하나 또는 그 이상의 RNAs를 안정화시킴으로써, 상기 응축물이 조정된다. 일부 구체예들에서, 상기 응축물과 연합된 RNA 수준을 조정함으로써, 상기 응축물이 조정된다.
일부 측면들에서, 응축물을 변경함으로써, 세포에서 RNA 프로세싱이 변경된다. 일부 구체예들에서, 하나 또는 그 이상의 RNA 프로세싱 도구 응축물들로 상기 전사 응축물 융합을 억압 또는 강화시킴으로써, RNA 프로세싱이 변경된다. 일부 구체예들에서 RNA 프로세싱은 스플라이싱, 5' 캡의 추가, 3' 및/또는 폴리아데닐화를 포함한다. 일부 구체예들에서, 개시 복합체 또는 신장 복합체와 연합된 응축물에 대한 RNA 중합효소 II (Pol II)의 친화력이 조정된다. 일부 구체예들에서, 상기 친화력은 Pol II의 포스포릴화 또는 탈-포스포릴화 (예컨데, Pol II의 본질적으로 무질서한 C-말단 도메인의 포스포릴화 또는 탈-포스포릴화)에 의해 조정된다.
일부 구체예들에서, 응축물과 연합된 슈퍼-인헨서 (예컨데, 응축물 안에 슈퍼-인헨서, 응축물 의존적 전사 활성을 갖는 슈퍼인헨서)의 변형자(modifier)/탈변형자(demodifier) 비율을 조정함으로써, 응축물들이 조정된다. 일부 구체예들에서, 성분의 변경/탈변형 (예컨데, 단백질, 펩티드, DNA, 또는 RNA 성분의 포스포릴화 또는 아세틸화를 조정)을 조정함으로써, 응축물들이 조정된다. 일부 구체예들에서, 변형자/탈변형자의 발현 또는 활성을 억제 또는 강화시킴으로써 (예컨데, 이로 인하여, 응축물 성분의 안정성, 국소화 및/또는 결합 활성이 조정), 응축물들이 조정된다. 예를 들면, 특정 단백질들의 포스포릴화 또는 탈-포스포릴화는 이들이 다른 분자 엔터티 (예컨데, 응축물 성분들)와 상호작용하는 능력에 영향을 줄 수 있다. 일부 구체예들에서, 이러한 변형/탈변형으로 인하여 세포질 안에 남아있게 될 응축물 성분을 단백질로부터 해리되도록 하고, 응축물이 핵으로 전위되도록 하여, 이들 성분들이 응축물에 참여할 수 있도록 한다. 따라서, 일부 구체예들에서, 응축물 형성, 안정성, 구성, 유지, 용해, 또는 활성의 변형은 응축물 성분의 변형자/탈변형자를 억제 또는 활성화시키는 것을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 변형자는 키나제이며, 상기 변형자를 억제시키는 제제는 키나제 억제제다.
일부 구체예들에서, 상기 응축물과 연합된 성분의 본질적으로 무질서한 도메인에 결합하는 제제를 당해 응축물에 접촉시킴으로써, 응축물들은 조정된다. 일부 구체예들에서, 상기 성분은 Mediator, 매개체 성분, MED1, MED15, p300, BRD4, TFIID, β-카테닌, STAT3, SMAD3, NF-KB, MECP2, MBD1, MBD2, MBD3, MBD4, HP1α, TBL1R, HDAC3, SMRT, RNA 중합효소 II, SRSF2, SRRM1, 또는 SRSF1이다. 일부 구체예들에서, 상기 성분은 핵 수용체 리간드 또는 이의 단편 (예컨데, 호르몬)이다. 일부 구체예들에서, 상기 성분은 신호전달 인자 또는 이의 단편이다. 일부 구체예들에서, 상기 성분은 메틸-결합 단백질 또는 억압제, 또는 이의 단편이다. 일부 구체예들에서, 상기 성분은 RNA 중합효소, 스플라이싱 인자, 개시 인자, 신장 인자, 또는 이의 단편이다. 일부 구체예들에서, 상기 성분은 표 S1에 열거되어 있다. 일부 구체예들에서, 상기 성분은 전사 인자 (예컨데, OCT4, p53, MYC, GCN4, NANOG, MyoD, KLF4, SOX 패밀리 전사 인자, GATA 패밀리 전사 인자, 핵 수용체, 또는 융합 종양형성 전사 인자)이다. 일부 구체예들에서, 상기 IDR은 전사 인자의 활성화 도메인에 위치한다. 본원에서 기술된 방법들 및 조성물들의 일부 구체예들에서, 상기 성분은 활성화 도메인, 또는 활성화 도메인 IDR을 포함하는 핵 수용체 또는 핵 수용체의 단편이다. 일부 구체예들에서, 상기 제제는 다가(multivalent))이다. 일부 구체예들에서, 상기 제제는 이가(bivalent)이다. 일부 구체예들에서, 상기 제제는 상기 성분의 비-본질적으로 무질서한 도메인에 추가 결합하거나, 또는 상기 응축물과 연합된 제 2의 성분에 추가 결합한다. 일부 구체예들에서, 상기 제제는 상기 응축물들의 성분들 간의 상호작용을 변경시키거나 또는 파괴시킬 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 제제는 상기 응축물들의 성분들 간의 상호작용을 안정화시키거나 또는 강화시킬 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 제제는 두 개 또는 그 이상의 성분들의 비-무질서한 영역에 결합한다 (예컨데, 상기 성분들의 IDR 상호작용을 강화).
일부 구체예들에서, 하나 또는 그 이상의 응축물 성분들을 게놈 DNA에 테터링시킴으로써, 응축물 형성이 야기되거나, 강화되거나, 또는 안정화될 수 있다. 일부 구체예들에서, 이들 성분들은 DNA, RNA, 및/또는 단백질을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 성분들은 Mediator, 매개체 성분, MED1, MED15, p300, BRD4, 핵 수용체 리간드, 신호전달 인자, β-카테닌, STAT3, SMAD3, NF-KB, MECP2, MBD1, MBD2, MBD3, MBD4, HP1α, TBL1R, HDAC3, SMRT RNA 중합효소 II, SRSF2, SRRM1, SRSF1, 또는 TFIID를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 성분은 전사 인자 (예컨데, OCT4, p53, MYC, GCN4, NANOG, MyoD, KLF4, SOX 패밀리 전사 인자, GATA 패밀리 전사 인자, 핵 수용체, 또는 융합 종양형성 전사 인자)이다. 일부 구체예들에서, 상기 성분들은 촉매적으로 비활성 부위 특이적 엔도뉴클레아제 (예컨데, dCas)에 의해 테터링된다.
일부 구체예들에서, 제 2의 응축물 안에 상기 응축물의 하나 또는 그 이상의 성분들을 격리(sequestration)시킴으로써, 상기 응축물이 조정된다. 일부 구체예들에서, 제 2의 응축물의 형성은 상기 세포에 외인성 펩티드, 핵산 및/또는 단백질을 접촉시킴으로써 유도된다. 일부 구체예들에서, 상기 격리된 성분은 전사 인자 (예컨데, OCT4, p53, MYC, GCN4, NANOG, MyoD, KLF4, SOX 패밀리 전사 인자, GATA 패밀리 전사 인자, 핵 수용체, 또는 융합 종양형성 전사 인자)다. 일부 구체예들에서, 상기 격리된 성분은 Myc이다. 일부 구체예들에서, 상기 격리된 성분은 야생형-단백질의 돌연변이 형태다. 일부 구체예들에서, 상기 격리된 성분은 질환 상태 (예컨데, 암)에서 과다-발현된 성분이다. 일부 구체예들에서, 상기 격리된 성분은 핵 수용체 (예컨데 상기 핵 수용체의 돌연변이 형태, 질환 상태와 연합된 핵 수용체의 돌연변이 형태)이다. 일부 구체예들에서, 상기 격리된 성분은 핵 수용체 리간드, 신호전달 인자, 메틸-DNA 결합 단백질, 스플라이싱 인자, 개시 인자, 신장 인자, 유전자 침묵화 인자, 또는 RNA 중합효소다.
일부 구체예들에서, 상기 응축물 (예컨데, 상기 응축물의 성분)과 연합된 ncRNA의 수준 또는 활성을 조정함으로써, 상기 응축물이 조정된다. 일부 구체예들에서, 상기 ncRNA에 안티-센스 올리고뉴클레오티드, RNase, 또는 ncRNA에 결합하는 화학적 화합물을 접촉시킴으로써, 상기 ncRNA의 수준 또는 활성이 조정된다. 일부 구체예들에서 상기 ncRNA는 인헨서 RNA (eRNA)다. 일부 구체예들에서, 상기 ncRNA는 전달 RNA (tRNA), 리보솜 RNA (rRNA), microRNA, siRNA, piRNA, snoRNA, snRNA, exRNA, scaRNA, Xist 또는 HOTAIR이다.
일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 방법들은 응축물 형성, 구성, 유지, 용해 또는 규제로 인하여 발생되거나, 또는 이에 의존적인 질환 가능성을 치료하거나 또는 감소시킨다. 일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 방법들은 암 가능성을 치료하거나 또는 감소시킨다. 일부 구체예들에서, 상기 암은 응축물 성분 (예컨데, 핵 수용체)에서 돌연변이와 연합된다. 일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 방법들은 핵 수용체 (예컨데, 돌연변이 핵 수용체)와 연합된 질환 가능성을 치료하거나 또는 감소시킨다. 일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 방법들은 일탈 단백질 발현과 연합된 질환 (예컨데, 병적 수준의 단백질을 유발시키는 질환) 가능성을 치료하거나 또는 감소시킨다. 일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 방법들은 일탈 신호전달과 연합된 질환 가능성을 치료하거나 또는 감소시킨다. 일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 방법들은 염증을 감소시킨다. 일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 방법들은 세포 상태를 변형시킨다. 일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 방법들은 세포 생존 또는 증식 경로를 부적절하게 활성화시키는 융합 종양형성 전사 인자들의 생성, 정상 조직에서는 발현되지 않는 전사 인자들의 부적절한 생성, 또는 전사 인자들을 기존의 침묵 종양유전자로 동원하는 인헨서 영역의 돌연변이와 연합된 질환 가능성을 치료하거나 또는 감소시킨다. 일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 방법들은 세포 정체성을 변경시킨다. 일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 방법들은 메틸-DNA 결합 단백질의 일탈 발현 또는 활성 (예컨데, 참조 또는 대조군 수준과 비교하였을 때, 증가된 또는 감소된 수준)과 연합된 질환 가능성을 치료하거나 또는 감소시킨다. 일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 방법들은 일탈 mRNA 개시 또는 신장 (예컨데, 참조 또는 대조군 수준과 비교하였을 때, 증가된 또는 감소된 mRNA 개시 또는 신장)과 연합된 질환 가능성을 치료하거나 또는 감소시킨다. 일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 방법들은 일탈 mRNA 스플라이싱 (예컨데, 참조 또는 대조군 수준과 비교하였을 때, 증가된 또는 감소된 mRNA 스플라이싱 활성)과 연합된 질환 가능성을 치료하거나 또는 감소시킨다.
본 명세서의 일부 측면들은 응축물 형성, 안정성, 활성 (예컨데, mRNA 개시 또는신장 활성, 유전자 침묵화 활성) 또는 응축물 (예컨데, 전사 응축물)의 형태를 조정하는 제제를 식별하는 방법에 관한 것으로써, 이 방법은 응축물을 보유한 세포를 제공하고, 상기 세포에 테스트 제제를 접촉시키고, 이러한 테스트 제제와 접촉으로 당해 응축물의 형성, 안정성, 활성, 또는 형태를 조정하는 지를 결정하는 것을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 응축물은 탐지가능한 테그 (가령, 탐지가능한 라벨)를 보유하고, 이 탐지가능한 테그를 이용하여 상기 테스트 제제와 접촉에 의해 당해 응축물의 형성, 안정성, 활성, 또는 형태가 조정되는 지를 결정한다. 일부 구체예들에서, 상기 탐지가능한 테그는 형광 테그다. 일부 구체예들에서, 상기 탐지가능한 테그는 효소 테그, 예컨데, 루시퍼라제다. 일부 구체예들에서, 상기 탐지가능한 테그는 에피토프 테그다. 일부 구체예들에서, 상기 응축물에 선택적으로 결합하는 항체를 이용하여 상기 테스트 제제와 접촉에 의해 당해 응축물의 형성, 안정성, 활성, 또는 형태가 조정되는 지를 결정한다. 일부 구체예들에서, 상기 테스트 제제와 접촉에 의해 당해 응축물의 형성, 안정성, 활성, 또는 형태가 조정되는 지를 결정하는 단계는 현미경을 이용하여 실행된다. 일부 구체예들에서, 상기 응축물은 돌연변이 성분 (예컨데, 핵 수용체 또는 이의 단편의 돌연변이 형태, 야생형 수용체 또는 이의 단편보다 동족 리간드에 결합될 때 상이한 활성 또는 상이한 수준의 활성을 갖는 핵 수용체의 돌연변이 형태, 돌연변이성 신호전달 인자 또는 이의 단편, 돌연변이성 메틸-DNA 결합 단백질 또는 이의 단편)을 포함한다. 상기의 일부 구체예들에서, 상기 세포는 응축물을 보유하지 않고, 상기 방법은 상기 세포에서 응축물 형성을 일으키는 제제를 식별하는 것을 포함한다. 일부 구체예들에서, 응축물은 상기 세포 안에서 탐지되지 않고, 상기 방법은 이 응축물이 탐지가능하도록 만드는 (예컨데, 상기 응축물이 탐지될 정도로 충분히 크게 됨) 제제를 식별하는 것을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 세포는 응축물을 보유하고, 상기 방법은 또다른 응축물 형성을 일으키는 제제를 식별하는 것을 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 응축물의 성분 (예컨데, 전사 응축물)은 IDR을 포함하는 신호전달 인자 또는 이의 단편이다. 일부 구체예들에서, 상기 응축물은 하나 또는 그 이상의 신호 반응 요소들과 연합된다. 일부 구체예들에서, 상기 신호전달 인자는 질환과 연합된 신호전달 경로와 연합된다. 일부 구체예들에서, 상기 질환은 암이다. 일부 구체예들에서, 상기 응축물은 종양유전자의 전사를 조정한다. 일부 구체예들에서, 상기 응축물은 슈퍼-인헨서와 연합된다. 일부 구체예들에서, 상기 응축물의 성분은 C-말단 IDR을 포함하는 메틸-DNA 결합 단백질 또는 이의 단편, 또는 IDR을 포함하는 억압제 또는 이의 단편이다. 일부 구체예들에서, 상기 응축물은 메틸화된 DNA 또는 이질성염색질과 연합된다. 일부 구체예들에서, 상기 응축물은 일탈 수준 또는 활성의 메틸-DNA 결합 단백질을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 세포는 본원에서 언급된 임의의 유형의 세포다. 일부 구체예들에서, 상기 세포는 신경 세포다. 일부 구체예들에서, 상기 세포는 Rett 증후군 또는 MeCP2 과다발현 증후군을 보유한 대상체로부터 유래된 세포다(가령, 대상체 세포로부터 유래된 유도된 다능성 줄기 세포를 통하여).
일부 구체예들에서, 상기 제제에 의한 상기 응축물과 연합된 유전자들의 발현 억제가 평가된다. 일부 구체예들에서, 상기 응축물의 성분은 IDR을 포함하는 스플라이싱 인자 또는 이의 단편, 또는 IDR을 포함하는 RNA 중합효소 또는 이의 단편이다. 일부 구체예들에서, 상기 응축물은 전사 개시 복합체 또는 신장 복합체와 연합된다. 일부 구체예들에서, 상기 세포는 사이클린 의존적 키나제를 더 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 RNA 중합효소는 RNA 중합효소 II (Pol II)다. 일부 구체예들에서, 상기 제제와의 접촉에 의한 상기 응축물과 연합된 RNA 전사 개시 활성에서의 변화가 평가된다. 일부 구체예들에서, 상기 제제와의 접촉에 의한 상기 응축물과 물리적으로 연합된 RNA 신장 또는 스플라이싱 활성에서의 변화가 평가된다.
본 명세서의 일부 측면들은 응축물 형성, 안정성, 또는 형태를 조정하는 제제를 식별해내는 방법에 관한 것이며, 이 방법은 시험관내 응축물을 제공하고, 그리고 이 시험관내 응축물의 하나 또는 그 이상의 물리적 성질을 평가하고, 이 시험관내 응축물에 테스트 제제를 접촉시키고, 그리고 당해 테스트 제제가 이 시험관내 응축물의 하나 또는 그 이상의 물리적 성질의 변화를 야기시키는 지를 평가하는 것을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 하나 또는 그 이상의 물리적 성질은 상기 시험관내 응축물이 세포 안 유전자의 발현을 야기, 또는 증가, 또는 감소시키는 능력과 관련된다. 일부 구체예들에서, 상기 하나 또는 그 이상의 물리적 성질은 상기 시험관내 응축물이 RNA 스플라이싱을 야기, 또는 증가, 또는 감소시키는 능력과 관련된다. 일부 구체예들에서, 상기 하나 또는 그 이상의 물리적 성질은 크기, 농도, 투과성, 형태, 또는 점도를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 테스트 제제는 소 분자, 펩티드, RNA 또는 DNA이거나, 또는 이들을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 시험관내 응축물은 DNA, RNA 그리고 단백질을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 시험관내 응축물은 DNA와 단백질을 포함하거나, 이들로 구성되거나, 또는 필수적으로 구성된다. 일부 구체예들에서, 상기 시험관내 응축물은 RNA와 단백질을 포함하거나, 이들로 구성되거나, 또는 필수적으로 구성된다. 일부 구체예들에서, 상기 시험관내 응축물은 단백질을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 필수적으로 구성된다. 일부 구체예들에서, 상기 시험관내 응축물은 본질적으로 무질서한 영역들 또는 도메인들 (예컨데, 하나 또는 그 이상의 본질적으로 무질서한 영역들 또는 도메인들을 포함하는 단백질들, 펩티드들, 또는 단편 또는 이의 유도체)을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 시험관내 응축물은 약한 단백질-단백질 상호작용 (예컨데, 용이하게 섭동되는 상호작용, 용이하게 섭동되고, 일과적 상호작용, 마이크로 몰 범위의 Kd를 갖는 상호작용, 마이크로 몰 범위의, 그리고 일과적인 Kd를 갖는 상호작용)에 의해 형성된다. 일부 구체예들에서, 상기 시험관내 응축물은 (본질적으로 무질서한 도메인)-(유도성 올리고머화 도메인) 융합 단백질들을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 시험관내 응축물은 세포 안에서 발견되는 전사 응축물을 모방한다(simulates). 일부 구체예들에서, 상기 시험관내 응축물은 이질성염색질 응축물 (예컨데, 이질성염색질 응축물 침묵화 유전자 발현)을 모방한다. 일부 구체예들에서, 상기 시험관내 응축물은 메틸화된 DNA를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 시험관내 응축물은 mRNA 개시 또는 신장 복합체를 모방한다. 일부 구체예들에서, 상기 시험관내 응축물은 신호 응답 요소를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 응축물은 액체 소적 (예컨데, 시험관내, 합성 전사 응축물) 안에 있다.
일부 구체예들에서, 상기 응축물의 성분은 IDR을 포함하는 신호전달 인자 또는 이의 단편이다. 일부 구체예들에서, 상기 응축물은 하나 또는 그 이상의 신호 반응 요소들과 연합된다. 일부 구체예들에서, 상기 신호전달 인자는 질환과 연합된 신호전달 경로와 연합된다. 일부 구체예들에서, 상기 질환은 암이다. 일부 구체예들에서, 상기 응축물은 종양유전자의 전사를 조정한다. 일부 구체예들에서, 상기 응축물은 슈퍼-인헨서와 연합된다. 일부 구체예들에서, 상기 응축물의 성분은 C-말단 IDR을 포함하는 메틸-DNA 결합 단백질 또는 이의 단편, 또는 IDR을 포함하는 억압제 또는 이의 단편이다. 일부 구체예들에서, 상기 응축물은 메틸화된 DNA 또는 이질성염색질과 연합된다. 일부 구체예들에서, 상기 응축물은 일탈 수준 또는 활성의 메틸-DNA 결합 단백질을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 세포는 본원에서 언급된 또는 당분야에 공지된 임의의 유형의 세포다. 일부 구체예들에서, 상기 세포는 신경 세포다. 일부 구체예들에서, 상기 세포는 Rett 증후군 또는 MeCP2 과다발현 증후군을 보유한 대상체로부터 유래된 세포다(가령, 대상체 세포로부터 유래된 유도된 다능성 줄기 세포를 통하여).
일부 구체예들에서, 상기 제제에 의한 상기 응축물과 연합된 유전자들의 발현 억제가 평가된다. 일부 구체예들에서, 상기 응축물의 성분은 IDR을 포함하는 스플라이싱 인자 또는 이의 단편, 또는 IDR을 포함하는 RNA 중합효소 또는 이의 단편이다. 일부 구체예들에서, 상기 응축물은 전사 개시 복합체 또는 신장 복합체와 연합된다. 일부 구체예들에서, 상기 세포는 사이클린 의존적 키나제를 더 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 RNA 중합효소는 RNA 중합효소 II (Pol II)다. 일부 구체예들에서, 상기 제제와의 접촉에 의한 상기 응축물과 연합된 RNA 전사 개시 활성에서의 변화가 평가된다. 일부 구체예들에서, 상기 제제와의 접촉에 의한 상기 응축물과 연합된 RNA 신장 또는 스플라이싱 활성에서의 변화가 평가된다.
본 명세서의 일부 측면들은 응축물 형성, 안정성, 기능, 또는 형태를 조정하는 제제를 식별해내는 방법에 관한 것으로써, 이 방법은 리포터(reporter) 유전자의 발현 의존적 응축물을 갖는 세포를 제공하고, 상기 세포에 테스트 제제를 접촉시키고, 그리고 상기 리포터 유전자의 발현을 평가하는 것을 포함한다.
본원에 기술된 제제를 식별해내는 방법들의 일부 구체예들에서, 상기 응축물은 활성화 도메인 IDR을 포함하는 핵 수용체 (예컨데, 핵 호르몬 수용체) 또는 이의 단편을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 핵 수용체는 동족 리간드에 결합될 때, 전사를 활성화시킨다. 일부 구체예들에서, 상기 핵 수용체는 동족 리간드로의 결합 없이, 전사를 활성화시킨다. 일부 구체예들에서, 상기 핵 수용체 (예컨데, 돌연변이 핵 수용체)에 의해 활성화된 전사 수준은 야생형 핵 수용체 또는 질환 또는 병태와 연합되지 않은 핵 수용체의 형태와는 상이하다 (예컨데, 1.5-배, 2-배, 3-배, 4-배, 5-배 상이함). 일부 구체예들에서, 상기 핵 수용체는 핵 호르몬 수용체다. 일부 구체예들에서, 상기 핵 수용체는 돌연변이를 보유한다. 일부 구체예들에서, 상기 돌연변이는 질환 또는 병태와 연합된다. 일부 구체예들에서, 상기 질환 또는 병태는 암 (예컨데, 유방암 또는 백혈병)이다.
일부 구체예들에서, 핵 수용체와 응축물을 포함하는 본원에서 개시된 방법들은 리간드 (예컨데, 상기 응축물 안의 리간드, 검정법 혼합물 안의 리간드) 존재를 더 포함한다. 일부 구체예들에서, 리간드를 포함하는 검정법을 이용하여 리간드에 의해 촉진될 수 있는 응축물 형성을 저해시키는 제제, 또는 응축물 형성/안정성, 기능, 또는 형태를 촉진시키기 위한 리간드와 부가적 또는 공조적으로 작용하는 제제를 식별해낸다. 리간드는 자연 발생적 내생성 리간드 (예컨데, 동족 리간드)이거나, 또는 자연 발생적 내생성 리간드와는 구조적으로 구별되는 리간드 (예컨데, 합성 리간드)일 수 있다.
본원에 기술된 제제를 식별해내는 방법들의 일부 구체예들에서, 상기 응축물은 한 가지 또는 그 이상의 일탈적인 성질들, 예컨데, 일탈적인 응축물 형성, 안정성, 기능, 또는 형태를 나타내는 돌연변이체 응축물 성분 (예컨데, 돌연변이체 TF, 돌연변이체 NR)을 포함하고, 상기 검정법은 적어도 부분적으로 상기 성질을 정상화시키는 제제를 식별해내는 것을 포함한다. 본원에 기술된 제제를 식별해내는 방법들의 일부 구체예들에서, 상기 응축물은 한 가지 또는 그 이상의 일탈적인 성질들을 나타내는 돌연변이체 NR을 포함하고, 상기 검정법은 상기 NR과 접촉될 때, 이러한 일탈적인 성질들이 현시되도록 만드는 리간드 존재 하에서 실행된다. 상기 검정법은 상기 일탈적 성질들을 정상화시키는 제제를 식별해내는데 이용될 수 있다.
본 명세서의 일부 측면들은 DNA, RNA 그리고 단백질을 포함하는 단리된(isolated) 합성 전사 응축물에 관계한다. 본 명세서의 일부 측면들은 DNA와 단백질을 포함하는 단리된 합성 전사 응축물에 관계한다. 일부 구체예들에서, 액체 소적은 상기 단리된 합성 전사 응축물을 포함한다. 본 명세서의 일부 측면들은 mRNA 개시 또는 신장 복합체와 물리적으로 연합된 이질성염색질 응축물 또는 응축물의 특징적 단백질을 포함하는 단리된 합성 응축물에 관계한다. 본 명세서의 일부 측면들은 mRNA 개시 또는 신장 복합체와 물리적으로 연합된 이질성염색질 응축물 또는 응축물의 특징적 DNA와 단백질을 포함하는 단리된 합성 응축물에 관계한다. 일부 구체예들에서, 액체 소적은 상기 단리된 합성 응축물을 포함한다.
본 명세서의 일부 측면들은 전사 응축물 성분 (예컨데, 전사 인자 또는 이의 단편, 활성화 도메인 또는 활성화 도메인 IDR을 포함하는 전사 인자의 단편)과 유도성 올리고머화를 부여하는 도메인을 포함하는 융합 단백질에 관한 것이다. 본 명세서의 일부 측면들은 이질성염색질 응축물의 성분 또는 mRNA 개시 또는 신장 복합체와 물리적으로 연합된 응축물의 성분을 포함하는 융합 단백질에 관한 것이다. 상기 융합 단백질은 탐지가능한 테그 (예컨데, 형광 테그)를 더 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 유도성 올리고머화를 부여하는 도메인은 소 분자, 단백질, 또는 핵산으로 유도가능한다. 일부 구체예들에서,응축물 형성은 소 분자, 단백질, 핵산, 또는 빛으로 유도가능하다.
본 명세서의 일부 측면들은 탐지 방법들, 예컨데, 응축물들, 예컨데, 전사 응축물들, 이질성염색질 응축물들, mRNA 개시 또는 신장 복합체와 연합된 응축물들을 가시화시키는 방법들에 관한 것이다. 일부 측면들에서, 전사 응축물의 형성, 형태 또는 해체(dissolution)가 가시화될 수 있다. 일부 구체예들에서, 전사 응축물의 가시화는 전술한 응축물을 조정하는 제제의 스크리닝에 유용할 수 있다. 일부 측면들에서, 응축물 (예컨데, 이질성염색질 응축물 또는 mRNA 개시 또는 신장 복합체와 물리적으로 연합된 응축물)의 형성, 형태 또는 해체가 가시화될 수 있다. 일부 구체예들에서, 응축물 (예컨데, 이질성염색질 응축물 또는 mRNA 개시 또는 신장 복합체와 물리적으로 연합된 응축물)의 가시화는 전술한 응축물을 조정하는 제제의 스크리닝에 유용할 수 있다. 일부 구체예들에서, 방법들은 응축물 형성 또는 해체 속도의 모니터링을 포함한다. 일부 구체예들에서, 방법들은 응축물 형성 또는 해체 속도를 증가 또는 감소시키는 제제를 식별해내는 것을 포함한다.
본 명세서의 일부 측면들은 mRNA 개시를 조정하는 방법에 관한 것으로, 이 방법은 mRNA 개시와 물리적으로 연합된 응축물의 형성, 구성, 유지, 해체 및/또는 규제의 조정을 포함한다. 일부 구체예들에서, mRNA 개시의 조정으로 mRNA 신장, 스플라이싱 또는 캡핑(capping)이 또한 조정된다. 일부 구체예들에서, 상기 mRNA 개시와 물리적으로 연합된 응축물의 형성, 구성, 유지, 해체 및/또는 규제를 조정함으로써 mRNA 전사 속도가 조정된다. 일부 구체예들에서, 상기 mRNA 개시와 물리적으로 연합된 응축물의 형성, 구성, 유지, 해체 및/또는 규제를 조정함으로써 유전자 산물의 수준이 조정된다.
일부 구체예들에서, 상기 mRNA 개시와 물리적으로 연합된 응축물의 형성, 구성, 유지, 해체 및/또는 규제는 제제에 의해 조정된다. 상기 제제는 제한적이지 않으며, 본원에서 기술된 임의의 제제일 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 제제는 저(hypo)-포스포릴화된 RNA 중합효소 II C-말단 도메인 (Pol II CTD) 또는 이의 기능적 단편을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 제제는 저-포스포릴화된 Pol II CTD에 선호적으로 결합한다.
본 명세서의 일부 측면들은 mRNA 신장을 조정하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 mRNA 신장 복합체와 물리적으로 연합된 응축물의 형성, 구성, 유지, 해체 및/또는 규제의 조정을 포함한다. 일부 구체예들에서, mRNA 신장의 조정으로 mRNA 개시 또한 조정된다. 일부 구체예들에서, 상기 mRNA 신장 복합체와 물리적으로 연합된 응축물의 형성, 구성, 유지, 해체 및/또는 규제를 조정함으로써 mRNA의 공동-전사 프로세싱이 조정된다. 일부 구체예들에서, 상기 mRNA 신장 복합체와 물리적으로 연합된 응축물의 형성, 구성, 유지, 해체 및/또는 규제를 조정함으로써 mRNA 스플라이스(splice) 변이체들의 수 또는 상대적 비율이 조정된다. 일부 구체예들에서, 상기 mRNA 신장 복합체와 물리적으로 연합된 응축물의 형성, 구성, 유지, 해체 및/또는 규제는 제제에 의해 조정된다. 상기 제제는 제한적이지 않으며, 본원에서 기재된 임의의 제제일 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 제제는 포스포릴화된 또는 저-포스포릴화된 RNA 중합효소 II C-말단 도메인 (Pol II CTD) 또는 이의 기능적 단편을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 제제는 포스포릴화된 또는 저-포스포릴화된 Pol II CTD에 선호적으로 결합한다.
본 명세서의 일부 측면들은 응축물의 형성, 구성, 유지, 해체 및/또는 규제를 조정하는 방법에 관한 것으로, 이 방법은 당해 응축물 성분의 포스포릴화 또는 탈-포스포릴화의 조정을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 성분은 RNA 중합효소 II 또는 RNA 중합효소 II C-말단 영역이다.
본 명세서의 일부 측면들은 일탈적인 mRNA 프로세싱과 연합된 질환 또는 병태의 가능성을 치료 또는 감소시키는 방법에 관한 것으로, 이 방법은 mRNA 신장 복합체와 물리적으로 연합된 응축물의 형성, 구성, 유지, 해체 및/또는 규제의 조정을 포함한다.
본 명세서의 일부 측면들은 응축물의 형성, 안정성, 또는 형태를 조정하는 제제를 식별해내는 방법에 관한 것으로, 이 방법은 응축물을 보유한 세포를 제공하고, 상기 세포에 테스트 제제를 접촉시키고, 그리고 상기 테스트 제제와의 접촉으로 상기 응축물의 형성, 안정성, 또는 형태가 조정되는 지를 결정하는 것을 포함하며, 이때 상기 응축물은 저-포스포릴화된 RNA 중합효소 II C-말단 도메인 (Pol II CTD), 포스포릴화된 RNA 중합효소 II C-말단 도메인 (Pol II CTD), 스플라이싱 인자, 또는 이의 기능적 단편를 포함한다. 질환 또는 병태와 연합된 응축물 (예컨데 일탈적인 수준, 성질, 또는 활성을 갖는)의 형성, 구성, 유지, 해체, 활성, 및/또는 규제를 조정하는 제제를 식별해내는, 또는 제제를 스크리닝하는 본원에서 개시된 방법들의 일부 구체예들에서, 당해 제제는 이 질환 또는 병태를 치료하는데 유용한 것으로 공지된 것이 아니다.
본 명세서의 일부 측면들은 응축물의 형성, 안정성, 또는 형태를 조정하는 제제를 식별해내는 방법에 관한 것으로, 이 방법은 시험관내 응축물을 제공하고, 이 시험관내 응축물의 한 가지 또는 그 이상의 물리적 성질들을 평가하고, 이 시험관내 응축물에 테스트 제제를 접촉시키고, 그리고 이 테스트 제제가 당해 시험관내 응축물의 한 가지 또는 그 이상의 물리적 성질들의 변화를 야기시키는 지를 평가하는 것을 포함하고, 이때 상기 응축물은 저-포스포릴화된 RNA 중합효소 II C-말단 도메인 (Pol II CTD), 포스포릴화된 RNA 중합효소 II C-말단 도메인 (Pol II CTD), 스플라이싱 인자, 또는 이의 기능적 단편을 포함한다.
본 명세서의 일부 측면들은 저-포스포릴화된 RNA 중합효소 II C-말단 도메인 (Pol II CTD) 또는 이의 기능적 단편을 포함하는 단리된 합성 응축물에 관한 것이다. 본 명세서의 일부 측면들은 포스포릴화된 RNA 중합효소 II C-말단 도메인 (Pol II CTD) 또는 이의 기능적 단편을 포함하는 단리된 합성 응축물에 관한 것이다. 본 명세서의 일부 측면들은 스플라이싱 인자 또는 이의 기능적 단편을 포함하는 단리된 합성 응축물에 관한 것이다.
본 명세서의 일부 측면들은 한 가지 또는 그 이상의 유전자 전사를 조정하는 방법에 관한 것으로, 이 방법은 이질성염색질 응축물의 형성, 구성, 유지, 해체 및/또는 규제의 조정을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 이질성염색질 응축물의 조정으로 상기 한 가지 또는 그 이상의 유전자의 전사 억제가 증가되거나, 또는 안정화된다. 일부 구체예들에서, 상기 이질성염색질 응축물의 조정으로 상기 한 가지 또는 그 이상의 유전자의 전사 억제가 감소된다. 일부 구체예들에서, 이질성염색질과 연합된 다수의 유전자의 전사가 조정된다. 일부 구체예들에서, 상기 이질성염색질 응축물의 형성, 구성, 유지, 해체 및/또는 규제는 제제에 의해 조정된다. 일부 구체예들에서, 상기 제제는 펩티드, 핵산, 또는 소 분자를 포함하거나, 이로 구성된다. 일부 구체예들에서, 상기 제제는 메틸화된 DNA, 메틸-DNA 결합 단백질, 또는 유전자 침묵화 인자에 결합한다.
본 명세서의 일부 측면들은 유전자 침묵화를 조정하는 방법에 관한 것으로, 이 방법은 이질성염색질 응축물의 형성, 구성, 유지, 해체 및/또는 규제의 조정을 포함한다. 일부 구체예들에서, 유전자 침묵화는 안정화되거나 또는 증가된다. 일부 구체예들에서, 유전자 침묵화는 감소된다. 일부 구체예들에서, 유전자 침묵화는 제제에 의해 조정된다.
본 명세서의 일부 측면들은 일탈적인 유전자 침묵화 (예컨데, 유전자 침묵화 대조군 수준 또는 참조 수준과 비교하였을 때, 증가 또는 감소된다)와 연합된 질환 또는 병태의 가능성을 치료 또는 감소시키는 방법에 관한 것으로, 이 방법은 이질성염색질 응축물의 형성, 구성, 유지, 해체 및/또는 규제의 조정을 포함한다. 일부 구체예들에서, 일탈적인 유전자 침묵화와 연합된 질환 또는 병태는 메틸-DNA 결합 단백질의 일탈적인 발현 또는 활성과 연합된다. 일부 구체예들에서, 일탈적인 유전자 침묵화와 연합된 질환 또는 병태는 Rett 증후군 또는 MeCP2 과다발현 증후군이다.
본 명세서의 일부 측면들은 응축물의 형성, 안정성, 또는 형태를 조정하는 제제를 식별해내는 방법에 관한 것으로, 이 방법은 응축물을 보유한 세포를 제공하고, 상기 세포에 테스트 제제를 접촉시키고, 그리고 상기 테스트 제제와의 접촉으로 상기 응축물의 형성, 안정성, 또는 형태가 조정되는 지를 결정하는 것을 포함하고, 이때 상기 응축물은 MeCP2 또는 MeCP2의 C-말단 본질적으로 무질서화된 영역을 포함하는 이의 단편, 또는 억압제를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 응축물은 이질성염색질과 연합된다. 일부 구체예들에서, 상기 응축물은 메틸화된 DNA와 연합된다.
본 명세서의 일부 측면들은 응축물의 형성, 안정성, 또는 형태를 조정하는 제제를 식별해내는 방법에 관한 것으로, 이 방법은 시험관내 응축물을 제공하고, 당해 시험관내 응축물의 한 가지 또는 그 이상의 물리적 성질들을 평가하고, 이 시험관내 응축물에 테스트 제제를 접촉시키고, 그리고 당해 테스트 제제가 당해 시험관내 응축물의 한 가지 또는 그 이상의 물리적 성질들의 변경을 야기하는 지를 평가하는 것을 포함하고, 이때 상기 응축물은 MeCP2 또는 MeCP2의 C-말단 본질적으로 무질서화된 영역을 포함하는 이의 단편, 또는 억압제 또는 이의 기능적 단편을 포함한다.
본 명세서의 일부 측면들은 MeCP2 또는 MeCP2의 C-말단 본질적으로 무질서화된 영역을 포함하는 이의 단편을 포함하는 단리된 합성 응축물에 관한 것이다.
본 명세서의 일부 측면들은 억압제 (때때로, 본원에서 유전자-침묵화 인자로 지칭됨) 또는 이의 기능적 단편을 포함하는 단리된 합성 응축물에 관한 것이다.
본 명세서의 일부 측면들은 세포 안에 한 가지 또는 그 이상의 유전자 전사를 조정하는 방법에 관한 것으로, 이 방법은 한 가지 또는 그 이상의 유전자들과 연합된 응축물의 구성, 유지, 해체 및/또는 규제의 조정을 포함하며, 이때 상기 응축물은 에스트로겐 수용체 (ER) 또는 이의 단편, 그리고 MED1 또는 이의 단편을 응축물 성분으로 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 에스트로겐 수용체는 돌연변이체 에스트로겐 수용체다. 일부 구체예들에서, 상기 돌연변이체 에스트로겐 수용체는 에스트로겐 결합에 의존적이지 않은 구성적(constitutive) 활성을 보유한다. 일부 구체예들에서, 상기 에스트로겐 수용체 단편은 리간드 결합 도메인 또는 이의 기능적 단편을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 MED1 단편은 IDR, LXXLL 모티프, 또는 이 둘 모두를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 응축물은 에스트로겐 또는 이의 기능적 단편과 접촉된다. 일부 구체예들에서, 상기 응축물은 선택적 에스트로겐 선택적 조절자 (SERM)와 접촉된다. 일부 구체예들에서, 상기 SERM은 탐옥시펜(tamoxifen)이다. 일부 구체예들에서, 상기 응축물의 조정으로 MYC 종양유전자의 전사가 감소되거나 또는 제거된다. 일부 구체예들에서, 상기 세포는 유방암 세포다. 일부 구체예들에서, 상기 세포는 MED1을 과다-발현시킨다. 일부 구체예들에서, 상기 전사 응축물은 상기 전사 응축물에 제제를 접촉시킴으로써, 조정된다. 일부 구체예들에서, 상기 제제는 ER과 MED1 간의 상호작용을 감소 또는 제거한다. 일부 구체예들에서, 상기 제제는 ER과 에스트로겐 간의 상호작용을 감소 또는 제거한다. 일부 구체예들에서, 상기 응축물은 돌연변이체 ER 또는 이의 단편을 포함하고, 상기 제제는 한 가지 또는 그 이상의 유전자의 전사를 감소시킨다.
본 명세서의 일부 측면들은 응축물의 형성, 안정성, 또는 형태를 조정하는 제제를 식별해내는 방법에 관한 것으로, 이 방법은 세포를 제공하고, 이 세포에 테스트 제제를 접촉시키고, 그리고 이 테스트 제제와의 접촉으로 응축물의 형성, 안정성, 또는 형태가 조정되는 지를 결정하는 것을 포함하고, 이때 상기 응축물은 에스트로겐 수용체 (ER) 또는 이의 단편, 그리고 MED1 또는 이의 단편을 응축물 성분으로써 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 에스트로겐 수용체는 돌연변이체 에스트로겐 수용체다. 일부 구체예들에서, 상기 돌연변이체 에스트로겐 수용체는 에스트로겐 결합에 의존적이지 않은 구성적 활성을 보유한다. 일부 구체예들에서, 상기 에스트로겐 수용체 단편은 리간드 결합 도메인 또는 이의 기능적 단편을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 MED1 단편은 IDR, LXXLL 모티프, 또는 이 둘 모두를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 응축물은 에스트로겐 또는 이의 기능적 단편과 접촉된다. 일부 구체예들에서, 상기 응축물은 선택적 에스트로겐 선택적 조절자 (SERM)와 접촉된다. 일부 구체예들에서, 상기 SERM은 탐옥시펜 또는 이의 활성 대사산물이다. 일부 구체예들에서, 상기 응축물의 조정으로 MYC 종양유전자의 전사가 감소되거나 또는 제거된다. 일부 구체예들에서, 상기 세포는 유방암 세포다. 일부 구체예들에서, 상기 세포는 MED1을 과다-발현시킨다. 일부 구체예들에서, 상기 세포는 ER+ 유방암 세포다. 일부 구체예들에서, 상기 ER+ 유방암 세포는 탐옥시펜 치료에 저항성이다. 일부 구체예들에서, 상기 응축물은 탐지가능한 라벨을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 응축물의 성분은 탐지가능한 라벨을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 ER 또는 이의 단편, 및/또는 상기 MED1 또는 이의 단편은 탐지가능한 라벨을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 한 가지 또는 그 이상의 유전자들은 리포터 유전자를 포함한다.
본 발명의 일부 측면들은 응축물의 형성, 안정성, 또는 형태를 조정하는 제제를 식별해내는 방법에 관한 것으로, 이 방법은 시험관내 응축물을 제공하고, 상기 응축물에 테스트 제제를 접촉시키고, 그리고 상기 테스트 제제와의 접촉으로 상기 응축물의 형성, 안정성, 또는 형태가 조정되는 지를 결정하는 것을 포함하고, 이때 상기 응축물은 에스트로겐 수용체 (ER) 또는 이의 단편, 그리고 MED1 또는 이의 단편을 응축물 성분으로 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 에스트로겐 수용체는 돌연변이체 에스트로겐 수용체다. 일부 구체예들에서, 상기 돌연변이체 에스트로겐 수용체는 에스트로겐 결합에 의존적이지 않은 구성적 활성을 보유한다. 일부 구체예들에서, 상기 에스트로겐 수용체 단편은 리간드 결합 도메인 또는 이의 기능적 단편을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 MED1 단편은 IDR, LXXLL 모티프, 또는 이 둘 모두를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 응축물은 에스트로겐 또는 이의 기능적 단편과 접촉된다. 일부 구체예들에서, 상기 응축물은 선택적 에스트로겐 선택적 조절자 (SERM)와 접촉된다. 일부 구체예들에서, 상기 SERM은 탐옥시펜이다. 일부 구체예들에서, 상기 응축물은 세포로부터 단리된다. 일부 구체예들에서, 상기 세포는 유방암 세포다. 일부 구체예들에서, 상기 세포는 MED1을 과다-발현시킨다. 일부 구체예들에서, 상기 세포는 ER+ 유방암 세포다. 일부 구체예들에서, 상기 ER+ 유방암 세포는 탐옥시펜 치료에 저항성이다. 일부 구체예들에서, 상기 응축물은 탐지가능한 라벨을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 응축물의 성분은 탐지가능한 라벨을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 ER 또는 이의 단편, 및/또는 상기 MED1 또는 이의 단편은 탐지가능한 라벨을 포함한다.
본 명세서의 일부 측면들은 에스트로겐 수용체 (ER) 또는 이의 단편, 그리고 MED1 또는 이의 단편을 응축물 성분으로 포함하는 단리된 합성 전사 응축물에 관한 것이다. 일부 구체예들에서, 상기 에스트로겐 수용체는 돌연변이체 에스트로겐 수용체다. 일부 구체예들에서, 상기 돌연변이체 에스트로겐 수용체는 에스트로겐 결합에 의존적이지 않은 구성적 활성을 보유한다. 일부 구체예들에서, 상기 에스트로겐 수용체 단편은 리간드 결합 도메인 또는 이의 기능적 단편을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 MED1 단편은 IDR, LXXLL 모티프, 또는 이 둘 모두를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 응축물은 에스트로겐 또는 이의 기능적 단편을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 응축물은 선택적 에스트로겐 선택적 조절자 (SERM)를 포함한다.
본 발명의 이러한 특징 및 다른 특징들 첨부된 도면과 함께 다음의 상세한 설명을 참조함으로써 더욱 완전하게 이해될 것이다. 특허 또는 출원 파일에는 컬러로 실행된 도면이 적어도 하나 포함되어 있다. 컬러 도면이 있는 이 특허 또는 특허 출원 간행물의 사본은 요청 및 필요한 요금 지불시, 특허청(Office)에서 제공한다.
도 1- 전사 인자들, 공동-인자들, 염색질 조절제들, DNA, 넌-코딩 RNA, 발생기(nascent) RNA, 그리고 RNA 중합효소 II를 포함하는 다중 성분들의 고-밀도 공조적(cooperative) 어셈블리인 전사 응축물을 도해한다.
도 2A-2B- 전사 응축물 형성, 유지, 해체 또는 규제에 있어서 본질적으로 무질서화된 도메인 또는 영역 (IDR) (서열 식별 번호: 13)의 영향을 보여준다. 도 2A에서, 상기 IDR은 상기 전사 응축물을 안정화시킨다. 도 2B에서, 상기 IDR에 결합하거나 또는 이와 상호작용하는 소 분자의 도입으로 상기 전사 응축물은 불안정하게 된다. 도 2A-2B에 나타낸 모티프 YSPTSPS는 서열 식별 번호: 13이다.
도 3A-3C- 슈퍼-인헨서 및 전형적 인헨서의 모델과 특징들을 보여준다. 도 3A는 전형적 인헨서 및 슈퍼-인헨서에 대한 공조적 고전적 모델의 개략도다. DNA 결합 부위들에 대한 공조적 결합을 통한 고-밀도의 전사 조절제들(''활성제들''로 지칭됨)은 더 높은 전사 결과량과 슈퍼-인헨서에서 활성제 농도에 대한 민감성 증가에 기여라는 것으로 간주된다.
et al. (2013)으로부터 개작된 이미지. 도 3B는 뮤린 배아 줄기 세포에서 POLE4 좌와 miR-290-295 좌에서 RNA 중합효소 II (RNA Pol II), 표시된 전사 공동인자들, 그리고 염색질 조절제들에 대한 염색질 면역침전 서열화 (ChIP-seq) 결합 프로파일을 보여준다. 상기 전사 인자 결합 프로파일은 TFs Oct4, Sox2, 그리고 Nanog의 병합된 ChIP-seq 결합 프로파일이다. rpm/bp, 염기쌍 당 백만 당 판독(reads). Hnisz et al. (2013)으로부터 개작된 이미지. 도 3C는 인간 T 세포에서 H3K27Ac의 ChIP-seq 프로파일 위에 도시된 RUNX1 좌에서의 ChIA-PET 상호작용을 보여준다. 상기 ChIA-PET 상호작용은 RUNX1의 슈퍼-인헨서와 프로모터 안에 있는 H3K27Ac 점유된 영역들 간의 빈번한 물리적 접촉을 나타낸다.
도 4A-4C- 전사 대조군의 단순 상 분리 모델을 보여준다. 도 4A는 슈퍼-인헨서-유전자 좌에서 전사 조절제들의 상-분리된 다중-분자 복합체를 형성할 수 있는 생물학적 시스템의 개략도이다. 도 4B는 상기 생물학적 시스템 및 상 분리로 이어질 수 있는 모델의 매개변수의 단순화시켜 나타낸 것이다. "M"은 변형될 때 가교(cross-links)를 형성할 수 있는 잔기의 변형을 나타낸다. 도 4C는 슈퍼-인헨서 (N = 50개 쇄로 구성), 그리고 전형적 인헨서 (N = 10 쇄로 구성)에 대한 결합가(valency) 매개변수 상에서 전사 활성(TA)의 의존성을 보여준다. 전사 활동 (TA)에 대한 프록시는 가교된 쇄의 최대 클러스터의 크기로 정의되며, 쇄의 총 수에 의해 등급화된다. 상기 결합가는 실제 결합가를 기준 수 3으로 나눠 등급화된다. 50 회 시뮬레이션(simulations)에서 실선은 평균을 나타내고, 점선은 표준 편차(standard deviation)의 두 배를 나타낸다. Keq 값과 변형자/탈변형자 비율은 일정하게 유지시켰다. Hill 계수, HC는 공조적 거동(behavior)을 설명하는 고전적인 계측이다. 삽입된 도면은 시스템에서 체인 또는 구성요소들의 수에 대한 Hill 계수의 의존성을 보여준다.
도 5A-5B- 슈퍼-인헨서 취약성(Vulnerability)을 보여준다. 도 5A는 표시된 농도에서 BRD4 저해제 JQ1로 처리한 후, IGLL5 슈퍼-인헨서 (적색)와 PDHX 전형적 인헨서 (회색) 단편들의 인헨서 활성을 나타낸다. 인헨서 활성은 인간 다발성 골수종 세포들에서 루시퍼라제 리포터 검정법에 의해 측정되었다. 주석: JQ1은 전형적 인헨서에 의해 구동되는 루시퍼라제 발현보다 10-배 더 낮은 농도 (25 nM 대비(versus) 250 nM)에서 슈퍼-인핸서에 의해 구동되는 루시퍼라제 발현의 ~50%를 억제한다.
et al. (2013)으로부터 개작된 이미지 및 데이타. 도 5B는 슈퍼-인헨서 (N = 50개 쇄로 구성), 그리고 전형적 인헨서 (N = 10 쇄로 구성)에 대한 탈변형자/변형자 비율에서 전사 활성(TA)의 의존성을 보여준다. 전사 활동 (TA)에 대한 프록시는 가교된 쇄의 최대 클러스터의 크기로 정의되며, 쇄의 총 수에 의해 등급화된다. 50 회 시뮬레이션에서 실선은 평균을 나타내고, 점선은 표준 편차의 두 배를 나타낸다. Keq 및 f는 일정하게 유지시켰다. 주석: 상기 탈변형자 수준의 증가는 가교 억제 (즉, 결합가를 감소)와 대등하다. TA는 로그 (탈변형자/변형자) = -1.5에서 값으로 정상화시키고, 그리고 좌표는 로그 등급에서 정상화된 TA를 나타낸다.
도 6A-6C-전사 폭발(bursting)을 보여준다. 도 6A는 초파리(Drosophila) 배의 개별 핵에서 전사 활성의 대표적인 흔적이다. 형광 프로브를 이용하여 발생기 RNAs를 가시화함으로써, 전사 활성이 측정되었다. 상단 패널은 약한 인헨서에 의해 생성된 대표적인 흔적을 보여주고, 하단 패널은 강한 인헨서에 의해 생성된 대표적인 흔적을 보여준다. Fukaya et al.(2016)으로부터 개작된 이미지 및 데이터. 도 6B는 약한 인헨서와 강한 인헨서의 폭발(bursting) 거동을 시간 경과에 따라 정리한 슈퍼-인헨서 (N = 50 쇄), 그리고 전형적 인헨서 (N = 10 쇄)의 전사 활성(TA)의 시뮬레이션이다. 도 6C는 공유된(shared) 인헨서에 의한 두 개 유전자 프로모터의 동시발생적 활성화의 모델이다.
도 7- 생체내 전사 대조군 상 분리를 보여준다: 유전자 조절 요소들에서 상-분리된 복합체 모델. 상기 복합체를 형성하는 후보 전사 조절제의 일부가 강조된다. P-CTD는 RNA Pol II의 포스포릴화된 C-말단 도메인을 나타낸다. 뉴클레오좀의 화학적 변형 (아세틸화, Ac; 메틸화, Me) 또한 강조되어 있다. 인헨서와 프로모터에서 발산적(divergent) 전사는 RNA 스플라이싱 인자들에 의해 결합될 수 있는 발생기 RNAs를 만든다. 상기 성분들 간의 잠재적 상호작용은 점선으로 도시된다.
도 8-전사 활성 (TA)은 쇄의 수 (N)에 의존적임을 보여준다. 전사 활동 (TA)에 대한 프록시는 가교된 쇄의 최대 클러스터의 크기로 정의되며, 쇄의 총 수에 의해 등급화된다. 50 회 시뮬레이션에서 실선은 평균을 나타내고, 점선은 표준 편차의 두 배를 나타낸다. 모든 시뮬레이션은 변형자/탈변형자=0.1, Keq=1 및 f=5에서 실행된다. SE 및 전형적 인헨서에 대한 N 값 (또는 성분들의 농도)이 충분히 상이하다면, TA 수준은 매우 상이하다.
도 9- 상기 변형자/탈변형자 발란스(balance)의 급격한 변화 (신호의 변화를 모방) 후, 겔의 분해(disassembly)를 연구하기 위해 수행된 시뮬레이션을 보여준다. 전사 활동 (TA)에 대한 프록시는 가교된 쇄의 최대 클러스터의 크기로 정의되며, 쇄의 총 수에 의해 등급화된다. 삽입도에 나타낸 바와 같이, 변형자/탈변형자 수준의 비율 (τ=25에서)을 0.1에서 0.016로 누르고, TA는 상기 변형자/탈변형자 발란스에서 변화-후 τ=50 타임 유닛(time units post change)에서 산출된다. 모든 시뮬레이션은 N=50 (SE에 대한 모델) 및 Keq=1에서 실행된다. 실선은 결합가 (f)가 변경됨에 따라, 250 회 복제(replicate) 시뮬레이션에서 산출된 TA의 최대 값의 변동을 나타낸다. 변형자/탈변형자 수준에서 변화-후 τ=50 타임 유닛에서 클러스터 형성을 보장하는 역치(threshold valencies) fmin(도 4C 참고), 그리고 강력한 분해를 보장하는 fmax (TA<0.5로 정의됨, 점선)가 확인된다. 변형자/탈변형자 값에서 변화-후 τ=50 타임 유닛의 특정 값은 설명을 목적으로 선택되며, 그리고 fmax 값을 결정한다. 실제적인 시간 등급에서 겔이 분해되지 않는 최대 결합가가 존재한다는 정성적 결과는 이 시간 등급에서 선택된 값의 변화에 확신한다.
도 10A-10B-슈퍼-인헨서와 전형적 인헨서의 노이즈(Noise) 특징을 보여준다. 도 10A는 SEs(N=50)에 대한 결합가 및 전형적 인헨서 (N=10)에서 전사 활성 (TA)의 변동(variance)으로 측정된, 변동 (또는 전사 노이즈)의 의존성을 나타낸다. 전사 활동 (TA)에 대한 프록시는 가교된 쇄의 최대 클러스터의 크기로 정의되며, 쇄의 총 수에 의해 등급화된다. 세로 좌표 정의에서 < > (angular brackets)는 반복 시뮬레이션 50 회 이상에 걸친 평균을 나타낸다. 모든 시뮬레이션은 변형자/탈변형자=0.1, Keq=1에서 실행된다. 상기 노이즈의 정상화된 크기, 그리고 중요한 것으로 이 노이즈가 현시되는 결합가 범위는 전형적 인헨서와 비교하였을 때, SEs에서 더 작다. 주석: 그러나, 상 분리 점 부근의 노이즈의 절대 크기는 N 값이 클수록 더 커진다. 도 10B는 f = 5 (N=50의 경우 클러스터 형성에 필요한 최소 결합가)의 경우 N에 대한 전사 활성(TA)의 변동으로 측정된 변동(또는 전사 노이즈)의 의존성을 보여준다. 모든 시뮬레이션은 변형자/탈변형자=0.1 및 Keq=1에서 실행된다. 전사 활동 (TA)에 대한 프록시는 가교된 쇄의 최대 클러스터의 크기로 정의되며, 쇄의 총 수에 의해 등급화된다. 세로 좌표 정의에서 < >는 반복 시뮬레이션 50 회 이상에 걸친 평균을 나타낸다.
도 11A-11E- BRD4 및 MED1 핵 응축물들을 시각화한 것이다. (도 11A) 마우스 배아 줄기 세포 (mESC)에서 구조 조명 현미경 (SIM)을 이용하여 면역형광 (IF)에 의한 BRD4 및 MED1의 대표 이미지. 이미지는 8개 슬라이스 (각 125nm)의 z-투영도를 나타낸다. 축적 막대, 5 μm. 도 S1C. (도 11B)에서 IgG 대조군. SIM으로 이미지화한 고정된(fixed) mESC에서 이소성(ectopically) 발현된 BRD4-GFP (좌측패널, 녹색)와 MED1에 대한 IF (중앙 패널, 자홍색) 간의 공동-국소화의 대표 이미지. 두 채널의 병합이 우측 패널에 표시되고, 중첩은 흰색으로 표시된다. 핵 윤곽(outline)은 DAPI 착색 (나타내지 않음)에 의해 결정된 파란 색으로 나타낸다. 이미지는 단일 z-슬라이스 (125nm)를 나타낸다. 축적 막대, 5 μm. (도 11C) 고정된 mESC에서 SIM에 의해 이미지화된 BRD4 (상단 좌측 패널, 녹색), HP1a(상단 중앙 패널, 자홍색)에 대한 공동-IF 대표 이미지, 그리고 두 채널(상단 좌측 패널, 중첩은 백색으로)의 병합. 고정된 mESC에서 SIM에 의해 이미지화된 이소성(ectopically) 발현된 HP1a-GFP (하단 우측 패널, 녹색), MED1에 대한 IF (하단 중앙 패널, 자홍색), 그리고 두 채널 (하단 좌측 패널, 중첩, 백색으로)의 병합의 공동-국소화 대표 이미지. 핵 윤곽(outline)은 DAPI 착색 (나타내지 않음)에 의해 결정된 파란 색으로 나타낸다. 이미지는 단일 z-슬라이스 (125nm)를 나타낸다. 축적 막대, 5 μm. (도 11D) 디콘볼루션(deconvolution) 현미경에 의해 이미지화된 공지의 핵 응축물들의 마커, FIB1 (핵소체), NPAT (히스톤 좌 바디(bodies)), 그리고 HP1a(구성적 이질성염색질)에 대한 IF 대표 이미지. 이미지는 8개 슬라이스 (각 125nm)의 z-투영도를 나타낸다. 축적 막대, 5 μm. (도 11E) 핵 응축물들의 전형적인 수 및 크기(직경). 여기에서 생성된 값은 검정색 폰트이며; 문헌(48)에서 수집된 값은 청색 폰트다. 크기 및 수에 대한 값은 FIJI의 3D 물체 카운터 플러그인(object counter plugin)을 사용하여 생성되었다. 축적 막대, 5 μm.
도 12A-12B- BRD4 및 MED1 응축물들은 슈퍼-인헨서-연합된 전사의 부위에서 발생됨을 보여준다. (도 12A) mir290, Esrrb, 그리고 Klf4와 연합된 퍼-인헨서 (SEs)에서 나타낸, 표시된 BRD4, MED1, 그리고 RNA 중합효소 II (RNAPII)의 ChIP-seq 결합 프로파일. 각 세트에 경우, SE (빨간색) 위치 및 연합된 유전자 (검정색)의 위치가 당해 세트 아래에 표시된다. x-축은 게놈 위치를 나타내고, ChIP-seq 신호 강화는 염기쌍 당 백만 개당 판독(rpm/bp)로 y 축을 따라 표시된다. (도 12B) 고정된 mESC에서 면역형광 (IF) 및 형광동소보합법 (FISH)에 의해 표시된 바와 같이, SE-연합된 유전자들, mir290, Esrrb, 또는 Klf4 의 BRD4 또는 MED1과 발생기 RNAs간의 공동-국소화의 대표 이미지. 회전 디스크 공-촛점 현미경(spinning disk confocal microscopy)을 사용하여 샘플을 이미지화했다. 단일 z-슬라이스 (500nm)는 표시된 IF 및 FISH의 경우 개별적으로 제시되며, 두 채널의 병합 (중첩, 백색으로)으로 제시된다. 청색 선은 DAPI 착색(나타내지 않음)으로 지정된 핵 주변을 강조표시한다. IF 및 FISH 공동-국소화 영역은 "병합" 열에서 황색 상자로 강조표시되고, "병합 (줌)" 열에서 확대되어 상세하게 나타낸다. 축적 막대, IF, FISH 및 병합의 경우 5 μm, 병합 (줌)의 경우 0.5 μm.
도 13A-13F- BRD4 및 MED1 응축물들은 액체-유사 FRAP 동역학을 현시한다. (도 13A) BRD4-GFP 응축물의 광표백(photobleaching) 전, 그리고 후 표시된 시간에서 BRD4-GFP-발현시키는 mESC의 대표 이미지. 황색 상자는 광표백된 영역을 강조표시한다. 청색 상자는 비교를 위해 대조군 영역을 강조표시한다. 광표백 (0")에 대한 상대적 시간은 각 이미지의 좌측 하단에 표시된다. 축적 막대, 5 μm. (도 13B) (A)에 표시된 영역의 시간-경과, 근접 영상. 패널 A의 광표백된 영역 (패널 A의 황색 상자)이 상단 열에 표시된다. 광표백에 대한 시간은 각 영상 위에 표시된다. 패널 A의 대조군 영역 (패널 A의 청색 상자)이 하단 열에 표시된다. 축적 막대, 1 μm. (도 13C) 형광의 회복이 정량화되고, 평균화되었다. 광표백 전, 시간에 대한 신호 강도는 y 축에 표시된다. 광표백에 대한 시간은 x 축에 표시된다. 미처리된 세포 (검정 색)와 ATP를 고갈시키기 위하여 올리고마이신(oligomycin)으로 처리된 세포 (ATP-고갈, 적색)에 대한 데이터를 나타낸다. 미처리된 세포의 경우(n=9)와 ATP-고갈됨 세포의 경우(n=3)에 대한 데이터는 평균적인 상대적 강도 ± SEM로 나타낸다. (도 13D)는 (A)와 동일하지만, 그러나 MED1-GFP 발현시키는 mESCs임. 축적 막대, 5 μm. (도 13E)는 (B)와 동일하지만, 그러나 MED1-GFP 발현시키는 mESCs임. 축적 막대, 1 μm. (도 13F)는 (도 13C)와 동일하지만, 그러나 MED1-GFP 발현시키는 mESCs임. 미처리된 세포의 경우(n=5)와 ATP-고갈됨 세포의 경우(n=5)에 대한 데이터는 평균적인 상대적 강도 ± SEM로 나타낸다.
도 14A-14F- BRD4 및 MED1 시험관내 상 분리의 본질적으로 무질서화된 영역 (IDRs)을 보여준다. (도 14A) BRD4 (상단 그래프) 및 MED1 (하단 그래프)에서 아미노산 스트레취에 대한 본질적 무질서 (PONDR VSL2) 점수를 플롯팅한 그래프. PONDR VSL2 점수는 y-축에 나타낸다. 아미노산 위치는 x-축에 나타낸다. 자색 막대는 각 단백질의 본질적으로 무질서화된 C-말단 도메인을 나타낸다. 본질적으로 무질서화된 각 도메인의 시작과 끝 아미노산 위치가 표시된다. (도 14B) 이 원고에 사용된 재조합 GFP 융합 단백질의 개략도. (도 14C) 자색 상자는 나타난 BRD4 (BRD4-IDR) 및 MED1 (MED1-IDR)의 본질적으로 무질서한 도메인을 나타낸다. 소적 형성과 관련된 탁도 증가를 시각적으로 나타냄. BRD4-IDR (좌측 짝), MED1-IDR (중간 짝) 또는 GFP (우측 짝)을 함유하는 튜브를 보여준다. 각 짝의 경우, PEG-8000 (분자 군집제(crowding agent))의 존재(+) 또는 부재(-)를 나타낸다. 대조용으로 상기 쌍 사이에 빈 튜브가 포함된다. (도 14D) 상이한 단백질 농도에서 소적 형성의 대표 이미지. BRD4-IDR (상단 열), MED1-IDR (중간 열) 또는 GFP (하단 열)은 소적 형성 완충제에 표시된 최종 농도로 추가되었다. 용액을 수제(homemade) 챔버에 로드하고, 유리 커버슬립에 촛점을 맞춘 회전 디스크 공-촛점 현미경으로 이미지화했다. 축적 막대, 5 μm. (도 14E) 상이한 염 농도에서 소적 형성의 대표 이미지. 표시된 바와 같이, 50 mM, 125 mM, 200 mM 또는 350 mM의 최종 NaCl 농도와 함께, BRD4-IDR (이미지의 상단 열) 또는 MED1-IDR (이미지의 하단 열)은 소적 형성 완충제에 10 μM 농도가 되도록 추가되었다. 소적은 (도 14D)에서와 같이 가시화되었다. 축적 막대, 5 μm. (도 14F) 소적 가역성 실험의 대표 이미지. 상단 열은 BRD4-IDR의 소적을 나타내는데, 소적 형성 완충제 (20 μM 단백질, 75 mM NaCl)에서 형성 및 그 다음 희석 또는 염 농도 변화와 함께 희석되는 것을 나타낸다. 좌측 컬럼은 원래 용적의 1/3의 대표 소적을 나타낸다. 중간 컬럼은 당해 용적을 등장성 용액으로 1:1 희석시킨 두 번째 2/3을 나타내는 소적을 보여준다. 우측 컬럼은 당해 용적의 최종 1/3의 대표 소적으로, 높은 염 용액으로 1:1로 희석시켜 최종 농도 425 mM의 NaCl이된 소적을 보여준다. 소적은 (도 14D)에서와 같이 가시화되었다. 축적 막대, 5 μm.
도 15A-15H- MED1의 상기 IDR이 세포에서 상 분리에 참여함을 보여준다. (도 15A) 청색 광에 노출된 세포에서 발현된 선별된 본질적으로 무질서화된 도메인 (자색), mCherry (적색) 및 Cry2 (오렌지)을 갖는 재조합 단백질을 도시하는 optoIDR 검정법의 개략도. (도 15B) mCherry-Cry2 재조합 단백질을 발현시키고, 0 초 (좌측 패널) 또는 200 초 (우측 패널) 동안 매 2초 마다 488nm 레이져 여기(excitation)를 겪은 NIH3T3 세포들의 대표 이미지. 축적 막대, 10 μm. (도 15C) mCherry-Cry2 (MED1-optoIDR)에 융합된 MED1 IDR (MED1의 아미노산 948-1157)를 발현시키고, 0 초 (좌측 패널), 60 초 (중간 패널) 또는 200 초 (우측 패널) 동안 매 2초 마다 488nm 레이져 여기(excitation)를 겪은 NIH3T3 세포들의 대표 이미지. 10 μm. (도 15D) MED1-optoIDR을 발현시키고, 표시된 시간 동안 매 2초 마다 488nm 레이져 여기(excitation)를 겪은 NIH3T3 세포 핵에 촛점을 둔 시간-경과 이미지. 축적 막대, 5 μm. 황색 상자는 융합 이벤트가 발생하는 여러 영역 중 하나를 강조표시한다. (도 15E) 소적 융합의 시간-경과 및 근접-영상. 패널 D의 황색 상자로 강조표시된 이미지 영역은 확장된 시간 프레임에 대해 표시된다. 프레임들은 각 프레임의 좌측 하단에 표시된 시간에 촬용된다. 축적 막대, 1 μm. (도 15F) 청색광 여기(excitation) 없이 optoDroplets의 광표백 전(좌측 패널), 광표백 동안(중앙 패널) 그리고 광표백 후(우측 패널), MED1-optoIDR optoDroplets의 대표 이미지. 황색 상자는 광표백된 영역을 강조표시한다. 청색 상자는 비교를 위해 대조군 영역을 강조표시한다. 광표백 (0")에 대한 상대적 시간은 각 이미지의 좌측 하단에 표시된다. 축적 막대, 5 μm. (도 15G) 형광의 회복이 정량화되고, 평균화되었다. 광표백 전, 시간에 대한 신호 강도는 y 축에 표시된다. 광표백에 대한 시간은 x 축에 표시된다. n=15에서 데이터는 평균 상대적 강도 ± SD로 나타낸다. (도 15H) (도 15F)에서 강조표시된 영역은 소적 회수의 사건-경과 및 근접-영상. 광표백에 대한 시간은 영상 위에 표시된다. 축적 막대, 1 μm.
도 16A-16C- BRD4 및 MED1 핵 응축물들을 시각화한 것이다 (도 16A) 두 좌에서 표시된 바와 같이, BRD4 및 MED1에 대한 ChIP-seq 결합 프로파일. 각 패널의 경우, 염색체 좌표는 하단에 표시되고, 축적 막대는 좌측 상단에 포함된다. X-축은 게놈 위치를 나타내며, ChIP-seq 신호 풍도(enrichment)는 백만분 당 판독 (rpm)으로 y 축을 따라 표시된다. (도 16B) mESCs에서 BRD4- 또는 MED1-결합된 부위들에서 BRD4 (좌측 패널) 및 MED1 (우측 패널)의 점유(occupancy)를 보여주는 히트 맵(heat map) 각 패널은 각 BRD4- 또는 MED1-결합된 영역 (열)에 대하여 BRD4- 또는 MED-1 결합된 영역의 피크에 지중된 4kb 윈도우를 보여준다. 적색은 ChIP-seq 신호의 존재를 나타낸다. 검정 색은 배경을 나타낸다. (도 16C) 마우스 배아 줄기 세포 (mESCs)에서 구조 조명 현미경 (SIM)을 이용하여 2차 IgG 항체를 이용한 면역형광 탐지. IgG (좌측 패널), DAPI (중앙 패널)을 이용한 착색 및 병합된 영상 (우측 패널)을 나타낸다. 축적 막대, 5 μm.
도 17A-17D- BRD4 및 MED1 응축물들은 슈퍼-인헨서-연합된 전사 부위들에서 일어남을 보여준다. (도 17A) Nanog 좌에서 나타낸, 표시된 바와 같은 BRD4, MED1, 그리고 RNA 중합효소 II (RNAPII)에 대한 ChIP-seq 결합 프로파일. x-축은 게놈 위치를 나타내고, ChIP-seq 신호 강화는 염기쌍 당 백만 개당 판독(rpm/bp)로 y 축을 따라 표시된다. (도 17B) 고정된 mESC에서 표시된 바와 같이, 면역형광 (IF) 및 형광동소보합법 (FISH)에 의해 표시된 바와 같이, SE-연합된 유전자 Nanog의 BRD4 또는 MED1과 발생기 RNAs간의 공동-국소화의 대표 이미지. 회전 디스크 공-촛점 현미경(spinning disk confocal microscopy)을 사용하여 샘플을 이미지화했다. 상단 열은 BRD4에 대한 비교를 나타낸다. 하단 열은 MED1에 대한 비교를 나타낸다. 각 열에서, 단일 z-슬라이스 (500nm)는 개별적으로 IF (좌측 패널) 및 FISH (중앙 패널), 그 다음 두 채널의 병합 (우측 패널)을 나타낸다. 청색 선은 DAPI 착색(나타내지 않음)으로 지정된 핵 주변을 강조표시한다. IF 및 FISH 공동-국소화 영역은 황색으로 강조표시되며, 강조표시된 영역의 근접-영상은 최-우측 패널에 나타낸다. 축적 막대, IF, FISH 및 병합의 경우 5 μm, 병합 (줌)의 경우 0.5 μm. (도 17C) IF 및 FISH 좌 간에 거리의 정략화를 나타내는 개략도. 가장 가까운 촛점 분석 (상단 패널)을 위하여, FISH 신호와 가장 가까운 IF 특징간의 거리가 선택되었다. 확률적 촛점 분석 (하단 패널)을 위하여, 5 μm 반경 내에서 FISH 신호와 무작위 IF 특징간의 거리가 선택되었다. (도 17D) 각 상자 세트의 상단에 표시된 유전자에 대해 특정된 바의 가장 근접한 또는 확률적 FISH 신호 (도 17C)에 대한 BRD4 (상단 열) 또는 MED1 (하단 열)에 대한 IF 촛점 사이의 거리를 나타내는 상자그림(boxplots). 각 세트의 좌측 상단에는 가장 근접한 그리고 확률을 비교하는 p-값 (t-테스트), 분석된 RNA-FISH 촛점 수 및 독립적인 복제 수가 보고된다.
도 18A-18C- BRD4 및 MED1 응축물들은 액체-유사 FRAP 동역학을 현시함을 보여준다. (도 18A) 이들 연구에서 광표백으로부터 복구(recovery)의 반감기 (T_반감기) 및 BRD4 및 MED1에 대한 겉보기 확산 속도를 나타내는 표. 비교를 위해, DDX4 및 NICD에 대한 기존 게시된 정보가 표시된다. (도 18B) 형광의 복구는 정량화되고 평균화되었습니다. 광표백 전, 시간에 대한 신호 강도는 y 축에 표시된다. 광표백에 대한 시간은 x 축에 표시된다. 상기 세포를 고정시키고, 광-표백-후 확산을 제한하기 위하여, PFA로 처리된 BRD-GFP-발현시키는 세포 (청색)와 MED1-GFP-발현시키는 세포 (적색)에 대한 데이터를 나타낸다. 데이터는 평균 상대적 강도 ± SEM로 나타낸다. (도 18C) 포도당 소진 및 올리고마이신을 이용한 치료에 대한 함수로써, ATP 소진의 정량호.
도 19A-19D- BRD4 및 MED1 시험관내 상 분리의 본질적으로 무질서화된 영역 (IDRs)을 보여준다. (도 19A) BRD4-IDR 및 MED1-IDR의 소적에 대한 종횡비(aspect ratios) 분포를 보여주는 상자 도면. 검사된 소적의 수와 평균 종횡비가 표시된다. 상자 도면은 10-90 번째 백분위 수를 나타낸다. (도 19B) BRD4-IDR (좌측 패널) 또는 MED1-IDR (우측 패널)에 대한 단백질 농도와 소적 크기 간의 상관관계를 나타내는 점 도표. 단백질 농도 (μM)는 x-축에 나타내며, 2-D 이미지에서 면적에 대한 함수로써 소적 크기는 y-축에 나타낸다. (도 19C) 낮은 단백질 농도에서 작은 소적 존재를 보여주는 이미지. (도 19D) BRD4-IDR (좌측 패널) 또는 MED1-IDR (우측 패널)에 대한 염 농도와 소적 크기 간의 상관관계를 나타내는 점 도표. 염 농도 (mM)는 x-축에 나타내며, 2-D 이미지에서 면적에 대한 함수로써 소적 크기는 y-축에 나타낸다.
도 20에서는 OCT4 및 Mediator는 생체내 슈퍼-인헨서를 점유함을 보여준다. SEs에서 ESCs 안의 OCT4 및 MED1의 ChIP-seq 트랙(좌측 컬럼)과 동시 RNA-FISH와 OCT4 IF는 Esrrb, Nanog, Trim28 및 Mir290에서 OCT4의 점유를 실증한다 Hoechst 착색을 이용하여 핵 주변을 결정하는데, 청색으로 강조표시된다. 두 개의 최 우측 컬럼들은 적어도 11개 이미지로부터 RNA-FISH 촛점에 집중된 평균 RNA FISH 신호 및 평균 OCT4 IF 신호를 나타낸다. 무작위로 선별된 핵 위치에서 평균 OCT4 IF 신호는 도 27에 나타낸다.
도 21A-21I에서는 MED1 응축물들이 생체내 OCT4 결합에 의존적임을 보여준다. (도 21A) OCT4 붕괴(degradation)의 개략도. OCT4의 C-말단은 FKBP 단백질로 내생적으로 이중-대립유전적(biallelically)으로 테그되며; 소 분자 dTag에 노출될 때, OCT4는 산재적으로 그리고 신속하게 붕괴된다. (도 21B) DMSO 또는 dTAG로 24 시간 동안 처리된, OCT4 FKBP 테그를 휴대하는 ESCs에서 슈퍼-인헨서 (SE)- 또는 전형적 인헨서 (TE)-구동된 유전자들의 OCT4 및 MED1 ChIP-seq 판독 및 RNA-seq 판독에서 로그2 배수 변화를 현시하는 박스 도면. (도 21C) Nanog 좌에서 OCT4 (녹색) 및 MED1 (황색) ChIP-seq 데이터의 게놈 브라우져 영상 Nanog SE (적색)은 OCT4 붕괴 후, OCT4 및 MED1 결합이 90% 감소됨을 보여준다. (도 21D) Nanog mRNA의 정상화된 RNA-seq 판독 수는 OCT4 붕괴 시, 60% 감소를 보여준다. (도 21E) DMSO 또는 dTAG로 처리되고, OCT4 FKBP 테그를 휴대하는 ESCs에서 Nanog 좌에 대한 DNA FISH와 함께 OCT4 및 MED1 IF의 공-촛점 현미경 이미지. 삽입 도면은 황색 상자를 확대한 것을 나타낸다. 병합 영상은 3가지 채널 (OCT4 IF, MED1 IF 및 Nanog DNA FISH) 모두를 함께 나타낸다. (도 21F) ESCs 및 분화된 세포들 (Diff)에서 Mir290 SE에 대한 OCT4 ChIP-qPCR. ESCs에서 신호에 대하여 대조군 대비 풍도를 나타낸다. 오차 막대는 두 개의 생물학적 복제에서 평균 표준 오차를 나타낸다. (도 21G) ESCs 및 분화된 세포들 (Diff)에서 Mir290 SE에 대한 MED1 ChIP-qPCR. ESCs에서 신호에 대하여 대조군 대비 풍도를 나타낸다. 오차 막대는 두 개의 생물학적 복제에서 SEM을 나타낸다. (도 21H) ESCs 또는 분화된 세포들 (Diff)에서 Mir290 miRNA의 정상화된 RNA-seq 판독 카운트. 오차 막대는 두 개의 생물학적 복제에서 SEM을 나타낸다. (도 21I) ESCs 및 분화된 세포들에서 Mir290 게놈 좌에 대한 MED1 IF 및 DNA FISH의 공촛점 현미경 이미지. 병합 (줌)은 병합된 채널에서 황색 상자를 확대한 것을 나타낸다.
도 22A-22E에서는 OCT4가 시험관내 MED1로 액체 소적을 형성함을 보여준다. (도 22A) VSL2 알고리즘 (www.pondr.com)에 의해 산출된 OCT4의 본질적 무질서 그래프다. DNA 결합 도메인 (DBD) 및 활성화 도메인 (ADs)은 무질서 득점 그래프 상에 표시된다(Brehm et al., 1997). (도 22B) 125mM NaCl 및 10% PEG-8000과 함께 소적 형성 완충제에서 표시된 농도의 OCT4-GFP (상단 열) 및 MED1-IDR-GFP (하단 열)의 소적 형성을 나타내는 대표 이미지. (도 22C) 125mM NaCl 및 10% PEG-8000과 함께 소적 형성 완충제에서 GFP 또는 OCT4-GFP 각 10uM와 혼합된 MED1-IDR-mCherry의 소적 형성을 나타내는 대표 이미지. (도 22D) OCT4-GFP 및 MED1-IDR-mCherry의 이형성(heterotypic) 소적의 FRAP. 공촛점 이미지는 광표백에 관련 표시된 시점 (0)에서 취하였다. (도 22E) 염과 10% PEG-8000의 농도를 변화시키면서, 소적 형성 완충제 안에 10uM MED1-IDR-mCherry 및 OCT4-GFP의 소적 형성을 나타내는 대표 이미지.
도 23A-23E에서는 MED1과 함께 OCT4 상 분리가 특이적 상호작용에 의존적임을 보여준다. (도 23A) ADs에서 아미노산 빈도에 따라 정렬된 아미노산 풍도 분석 (상단 패널). OCT4의 아미노산 잔기 당 순-전하(Net charge) 분석 (하단 패널). (도 23B) Poly-E 펩티드가 MED1-IDR 소적으로 통합됨을 보여주는 소적 형성의 대표 이미지. MED1-GFP 및 TMR 라벨된 프롤린 또는 글루탐산 데카펩티드 (차례로, Poly-P 및 Poly-E)는 각 10uM에서 125mM NaCl 및 10% PEG-8000의 소적 형성 완충제에 추가된다. (도 23C) (상단 패널) OCT4 단백질의 도해, AD에서 수평선은 산성 D 잔기 (청색) 및 산성 E 잔기 (적색)을 표시한다. N-AD에서 17개의 모든 산성 잔기와 C-AD에서 6개 산성 잔기는 알라닌으로 돌연변이되어, OCT4-산성 돌연변이체를 만들었다. (하단 패널) OCT4 산성 돌연변이체가 MED1-IDR 소적 안으로 집중되는 능력이 감쇠됨(attenuated)을 보여주는 소적 형성의 대표 공촛점 이미지 10uM의 MED1-IDR-mCherry 및 OCT4-GFP 또는 OCT4-산성 돌연변이체-GFP는 125mM NaCl 및 10% PEG-8000의 소적 형성 완충제에 추가되었다. (도 23D) (상단 패널) OCT4는 Mediator 복합체 소적에 통합되지만, 그러나 OCT4 산성 돌연변이체는 이 소적에 통합되지 않음을 보여주는 소적 형성의 대표 이미지. 정제된 Mediator 복합체는 140mM NaCl 및 10% PEG-8000의 소적 형성 완충제에서 10uM GFP, OCT4-GFP 또는 OCT4-산성 돌연변이체-GFP와 혼합되었다. (하단 패널) Mediator 복합체 소적에서 GFP, OCT4-GFP 또는 OCT4-산성 돌연변이체-GFP의 풍도 비율. N>20, 오차 막대는 10 번째 백분위 수와 90 번째 백분위 수 사이의 분포를 나타낸다. (도 23E) (상단 패널) GAL4 활성화 검정법 도해. GAL4 루시퍼라제 리포터 플라스미드를 GAL4-DBD 융합 단백질용 발현 벡터와 함께 마우스 ES 세포에 형질감염시켰다. (하단 패널) GAL4-DBD, GAL-OCT4-CAD 또는 GAL-OCT4-CAD-산성 돌연변이체로 형질감염시킨 마우스 ES 세포의 루시퍼라제 활성에 의해 AD 활성이 측정되었다.
도 24A-24C에서는 Mediator 소적으로 다중 TFs 상 분리를 보여준다. (도 24A) (좌측 그래프) 다양한 단백질 클래서의 무질서 백분율(x 축)이 당해 클래서의 무질서화된 단백질들의 누적 분취(fraction)에 대하여 플롯팅됨 (y 축). (우측 그래프) 전사 인자 (TF) DNA-결합 도메인 (DBD) 및 추정(putative) 활성화 도메인 (ADs)의 무질서 함량(content). (도 24B) 표시된 TFs의 상동형(homotypic) 소적 형성을 검정하는 소적 형성 대표 이미지. 재조합 MYC-GFP (12uM), p53-GFP (40uM), NANOG-GFP (10uM), SOX2-GFP (40uM), RARa-GFP (40uM), GATA-2-GFP (40uM), 그리고 ER-GFP (40uM)는 125mM NaCl 및 10% PEG-8000의 소적 형성 완충제에 추가되었다. (도 24C) 테스트된 모든 TFs들이 MED1-IDR 소적으로 통합됨을 보여주는 소적 형성의 대표 이미지. 10uM의 MED1-IDRmCherry와 다중중(MYC-GFP, p53-GFP, NANOG-GFP, SOX2-GFP, RARa-GFP, GATA-2-GFP, 또는 ER-GFP) 임의의 것의 10uM이 125mM NaCl 및 10% PEG-8000의 소적 형성 완충제에 추가되었다.
도 25A-25E에서는 에스트로겐이 MED1와 함께 에스트로겐 수용체의 상 분리를 자극함을 보여준다. (도 25A) 에스트로겐에 의해 자극된 유전자 활성화를 보여주는 도해. 에스트로겐은 상기 MED1-IDR 안에 LXXLL 모티프에 대한 결합 포켓을 노출시킴으로써, ER의 리간드 결합 도메인 (LBD)의 결합에 의해 ER이 Mediator와 RNAPII의 상호작용을 용이하게 한다. (도 25B) 재조합 단백질 생산에 이용되는 상기 MED1-IDRXL, 그리고 MED1-IDR의 도해 영상 (도 25C) ER-GFP 및 MED1-IDRXL-mCherry의 상동형 소적 형성을 검정하는 소적 형성 대표 이미지. 125mM NaCl 및 10% PEG-8000의 소적 형성 완충제에서 표시된 단백질 농도로 실행됨. (도 25D) ER은 MED1-IDRXL 소적에 통합되며, 에스트로겐의 추가로 이형성(heterotypic) 소적 형성이 상당히 강화되었음을 보여주는 소적 형성의 대표 공촛점 이미지. ER-GFP, ER-GFP (에스트로겐 존재 하에서) 또는 GFP는 MED1-IDRXL와 혼합된다. 10uM의 각 표시된 단백질이 125mM NaCl 및 10% PEG-8000의 소적 형성 완충제로 추가되었다. (도 25E) ER-GFP, ER-GFP (에스트로겐 존재 하에서) 또는 GFP의 MED1-IDRXL 소적 풍도 비율. N>20, 오차 막대는 10 번째 백분위 수와 90 번째 백분위 수 사이의 분포를 나타낸다.
도 26A-26G에서는 TF-공동활성제 상 분리가 전사활성화(transactivation)에 필요한 잔기에 의존적임을 보여준다. (도 26A) 125mM NaCl 및 10% PEG-8000의 소적 형성 완충제에 추가된 GCN4-GFP 또는 MED15-mCherry의 소적 형성을 나타내는 대표 이미지. (도 26B) GCN4가 MED15와 소적을 형성함을 보여주는 소적 형성을 나타내는 대표 이미지. 125mM NaCl 및 10% PEG-8000의 소적 형성 완충액에 10uM로 GCN4-GFP 및 mCherry 또는 GCN4-GFP 및 MED15-mCherry가 추가되었고, 표시된 필터를 갖춘 형광 현미경 상에서의 이미지. (도 26C) 활성화 도메인 (AD) 및 DNA-결합 도메인 (DBD)을 포함하는 GCN4 단백질의 도해 (상단 열). AD의 소수성 패치에 있는 방향족 잔기들은 청색 선으로 표시된다. 상기 소수성 패치에 있는 11개의 모든 방향족 잔기들은 알라닌 (A)으로 돌연변이되어, GCN4-방향족 돌연변이체를 만들었다. (하단 열) GCN4-방향족 돌연변이체가 MED15와의 소적을 형성하는 능력이 감쇠됨을 됨을 보여주는 소적 형성을 나타내는 대표 이미지. GCN4-GFP 또는 GCN4-방향족-돌연변이체-GFP 및 MED15-mCherry는 125mM NaCl 및 10% PEG-8000의 소적 형성에 각 10uM 씩 추가되었다. (도 26D) (상단 패널) GCN4 야생형은 Mediator 복합체 소적에 통합되지만, 그러나 GCN4 방향족 돌연변이체는 이 소적에 통합되지 않음을 보여주는 소적 형성의 대표 이미지. 10uM의 GCN4-GFP 또는 GCN4-방향족-돌연변이체-GFP는 125mM NaCl 및 10% PEG-8000의 소적 형성 완충제에서 정제된 Mediator 복합체와 혼합되었다. (도 26E) (좌측 패널) Lac 검정법의 도해. 상기 Lac 오페론의 50,000개 반복부를 품고 있는 U2OS 세포는 Lac 결합 도메인-CFP-AD 융합 단백질로 형질감염된다. (우측 패널) 상기 표시된 Lac 결합 단백질 구조체로 형질감염된 Lac-U2OS 세포들에서 MED1의 IF. (도 26F) GAL4 활성화 검정법. 293T 세포에서 루시퍼라제 활성 측정에 의해 GAL4 DBD에 융합된 표시된 활성화 도메인의 전사 결과량. (도 26G) 유전자 활성화를 구동시키기 위하여 슈퍼-인헨서에서 상-분리된 응축물들을 형성하는 전사 인자들 및 공동활성제들을 보여주는 모델. 이 모델에서, 전사 응축물들은 역동적이며, 구조화된 상호작용으로 통합된다.
도 27은 랜덤 촛점 분석을 보여준다. 표시된 RNA FISH 촛점으로 집중된 평균 형광 (상단 패널) 대비 X와 Y에서 무작위로 분포된 IF 촛점 +/- 1.5 미크론 (하단 패널). 색깔 축적 막대는 형광 강도의 임의 단위(arbitrary units)를 나타낸다.
도 28A-28F에서는 OCT4 붕괴 및 ES 세포 분화를 보여준다. (도 28A) Oct4-FKBP 세포-공작 전략의 도해. 선별용으로 BFP 또는 RFP와 함께, 녹-인(knock-in) 좌를 만들기 위한 복구 벡터 및 Cas9 발현시키는 플라스미드로 V6.5 마우스 ES 세포들을 형질감염시켰다 (좌측). 크기에서의 예상된 변위(shift)를 보여주는 WT 또는 OCT4에 대하여 블랏된 미처리된 OCT4-dTAG ES 세포, HA (FKBP 상에), 그리고 ACTIN (우측). (도 28B) dTag47 또는 비히클 (DMSO)로 처리된, OCT4 (좌측 패널), MED1 (우측 패널), 그리고 베타-액틴(OCT4 degron 라인에서 (dTAG))에 대한 웨스턴 블랏. (도 28C) DMSO 처리된 것 대비 dTAG 처리된 OCT4-degron 세포들에서 Nanog DNA FISH 촛점 안에 MED1 면역형광 신호의 평균 강도. N=5개 이미지, 오차 막대는 10 번째 백분위 수와 90 번째 백분위 수 사이의 분포를 나타낸다. (도 28D) 분화된 ES 세포의 MiR290 좌에서 OCT4 (P1) 및 MED1 (P2) ChIP-qPCR를 위하여 이용된 프라이머들의 위치를 보여주는 도해. (도 28E) ES 세포, 또는 LIF 철회(withdrawal)에 의해 분화된 세포에서 MED1 및 베타-액틴에 대한 웨스턴 블랏. (도 28F) ES 세포 대비 LIF 철회에 의해 분화된 세포에서 MiR290 DNA FISH 촛점 안에 MED1 면역형광 신호의 평균 강도. N=5개 이미지, 오차 막대는 10 번째 백분위 수와 90 번째 백분위 수 사이의 분포를 나타낸다.
도 29A-29F에서는 MED1 및 OCT4 소적 형성을 보여준다. (도 29A) 10% PEG-8000의 소적 형성 완충제에서 형성된 MED1-IDR-mCherry 소적 안에서 의 125mM NaCl에서 GFP 대비 OCT4-GFP의 풍도 비율. N>20, 오차 막대는 10 번째 백분위 수와 90 번째 백분위 수 사이의 분포를 나타낸다. (도 29B) 10uM의 각 단백질과 함께 10% PEG-8000, 125mM 염에서 형성된 MED1-IDR-OCT4 소적의 면적(마이크로미터-제곱). (도 29C) 10uM의 각 단백질과 함께, 10% PEG-8000, 125mM에서 형성된 MED1-IDR-OCT4 소적의 종횡 비율. N>20, 오차 막대는 10 번째 백분위 수와 90 번째 백분위 수 사이의 분포를 나타낸다. (도 29D) 10uM의 각 단백질과 함께 10% PEG-8000, 125mM, 225uM, 또는 300uM 염에서 형성된 MED1-IDR-OCT4 소적의 면적(마이크로미터-제곱). (도 29E) 표시된 단백질 또는 단백질들의 조합 (각 10uM에서)에 대하여 50mM NaCl에서 군집제 없이 소적 형성에 대하여 패널 상단에 표시된 채널에서 이미지화된 형광 현미경 이미지. (도 29F) 50mM NaCl에서 군집제 없이 형성된 MED1-IDR-mCherry 소적에서 GFP 대비 OCT4-GFP의 풍도 비율. N>20, 오차 막대는 10 번째 백분위 수와 90 번째 백분위 수 사이의 분포를 나타낸다.
도 30A-30E에서는 돌연변이체 OCT4의 상 분리를 보여준다. (도 30A) 10% PEG-8000 및 125mM NaCl의 소적 형성 완충제에서 표시된 농도에서 표시된 TMR-라벨된 폴리펩티드의 형광 현미경. (도 30B) MED1-IDR-mCherry 소적 안에 표시된 폴리펩티드의 풍도 비율. N>20, 오차 막대는 10 번째 백분위 수와 90 번째 백분위 수 사이의 분포를 나타낸다. (도 30C) MED1-IDR-mCherry 소적 안에 표시된 단백질의 풍도 비율. N>20, 오차 막대는 10 번째 백분위 수와 90 번째 백분위 수 사이의 분포를 나타낸다. (도 30D) (상단 패널) OCT4 단백질의 도해, 활성화 도메인 (ADs)에서 방향족 잔기들은 청색 수평선으로 표시됨. N-말단 활성화 도메인 (N-AD)의 9개 방향족 잔기 모두와 C-말단 활성화 도메인 (C-AD)에서 10개 방향족 잔기는 알라닌으로 돌연변이되어, OCT4-방향족 돌연변이체를 만들었다. (하단 패널) OCT4 방향족 돌연변이체는 MED1-IDR 소적 안으로 여전히 통합됨을 보여주는 소적 형성의 대표 공촛점 이미지. MED1-IDR-mCherry와 OCT4-GFP 또는 MED1-IDR-mCherry와 OCT4-방향족 돌연변이체-GFP는 각 10uM으로 125mM NaCl와 10% PEG-8000의 소적 형성 완충액에 추가되었으며, 표시된 필터를 갖춘 형광 현미경 상에서 가시화되었다. (도 30E) 무손상(intact) Mediator 복합체의 소적들은 펠렛화에 의해 수집되었으며, 동일 용적의 입력(input), 상청액, 그리고 펠렛들이 SDS-PAGE 겔 상에서 이동되었으며, 사이프로 루비(sypro ruby)에 의해 착색되었다. 상기 펠렛에 존재하는 Mediator 하위단위(subunits)들은 최우측 컬럼 상에 표시된다.
도 31A-31B에서는 Mediator의 다양한 TFs 상 분리를 보여준다. (도 31A) MED1-IDR-mCherry 소적 안에 표시된 GFP-융합된 TF의 풍도 비율. N>20, 오차 막대는 10 번째 백분위 수와 90 번째 백분위 수 사이의 분포를 나타낸다. (도 31B) 10% PEG-8000 및 125mM NaCL의 소적 형성 완충제에서 형성된 이형성(heterotypic) p53-GFP/MED1-IDR-mCherry 소적의 FRAP(30초 동안 매 초마다 이미지화됨).
도 32A에서는 MED1의 에스트로겐 수용체 상 분리를 보여준다. 10uM 에스트로겐의 존재 또는 부재 하에서 MED1-IDR-mCherry 소적에서 ER-GFP의 풍도 비율. 125mM NaCl와 함께, 10% PEG-8000에서 소적이 형성되었다. N>20, 오차 막대는 10 번째 백분위 수와 90 번째 백분위 수 사이의 분포를 나타낸다.
도 33A-33G에서는 GCN4와 MED15가 상 분리된 소적을 형성한다는 것을 보여준다. (도 33A) 10% PEG-8000의 소적 형성 완충제 및 125mM NaCl에서 GCN4-GFP 소적에서 mCherry 또는 MED15-mCherry의 풍도 비율. N>20, 오차 막대는 10 번째 백분위 수와 90 번째 백분위 수 사이의 분포를 나타낸다. (도 33B) 10% PEG-8000 및 125mM NaCL의 소적 형성 완충제에서 형성된 이형성(heterotypic) GCN4-GFP/MED15-IDR-mCherry 소적의 FRAP(30초 동안 매 초마다 이미지화됨). (도 33C) 10% PEG-8000 및 125mM 염의 소적 형성 완충제로 표시된 농도로 추가된 GCN4-GFP 및 MED15-mCherry의 상 다이어그램(diagram). (도 33D) 도 33C에서 GCN4 소적의 풍도 비율. N>20, 오차 막대는 10 번째 백분위 수와 90 번째 백분위 수 사이의 분포를 나타낸다. (도 33E) 10% PEG-8000 및 125mM NaCl에서 표시된 농도의 GCN4-GFP 또는 GCN4-GFP의 방향족 돌연변이체의 형광 이미지. GFP 채널로부터의 이미지를 보여준다. (도 33F) 10% PEG-8000의 소적 형성 완충제 및 125mM 염에서 형성된 MED15-mCherry 소적에서 GCN4-GFP 또는 GCN4-GFP의 방향족 돌연변이체의 풍도 비율. N>20, 오차 막대는 10 번째 백분위 수와 90 번째 백분위 수 사이의 분포를 나타낸다. (도 33G) Mediator 복합체 소적에서 GFP, GCN4-GFP 또는 GCN4-방향족 돌연변이체-GFP의 풍도 비율. N>20, 오차 막대는 10 번째 백분위 수와 90 번째 백분위 수 사이의 분포를 나타낸다.
도 34에서는 탐옥시펜이 ER 중재된 유전자 활성화 및 ER 및 MED1의 상 분리를 억제시킴을 보여준다. 상단 좌측에서는 탐옥시펜이 에스트로겐 수용체 (ER)의 리간드 결합 도메인 (LBD)에 결합한다는 것을 보여준다. 하단 우측에서는 GAL4 전사활성화 검정법에서, ER 중재된 유전자 활성화의 전사 결과량은 에스트로겐 의존적이며, 탐옥시펜에 의해 차단됨을 보여주고 있다. 좌측 부분은 GFP 라벨된 ER, 그리고 LXXL 결합 포켓 (MED1-IDRXL)을 함유하는 mCherry 라벨된 MED1-IDR이 에스트로겐 존재 하에서 응축물을 형성함을 보여주는 공촛점 현미경 이미지인데, 그러나 이러한 에스트로겐 의존적 응축물 형성은 탐옥시펜에 의해 차단된다.
도 35에서는 ER은 에스트로겐 자극 시에 슈퍼-인헨서를 확립한다는 것은 공지되어 있으며, MED1은 ER+ 유방암에서 과다발현됨 (상단 우측 그래프)을 보여준다. MED1은 ER 기능 및 ER+ 유방암 종양생성에 필요하다.
도 36에서는 리간드 결합된 NHRs (핵 호르몬 수용체들 (예컨데, 핵 수용체들))가 유도성 슈퍼-인헨서에서 전사 응축물들 (TCs)을 확립한다는 것을 보여준다. 이러한 TCs의 변경이 종양생성 기전이다. 진화하는 종양형성적 응축물들은 세포가 암에서 약물 저항성을 발달시키는 기전이며, 기존 항-신생물 약물들은 종양형성적 전사 응축물들을 표적으로 할 수 있다. 이 관점에서, TCs는 종양형성적-전사-인자-중재된 질환에 대한 근거있는 표적이다.
도 37에서는 ER 응축물들 (좌측 컬럼-녹색), MED1-IDRXL 응축물들 (중간 컬럼-적색), 그리고 MED1-IDRXL/ER 응축물들 (우측 컬럼-오렌지색)의 공촛점 현미경 이미지를 보여준다. 하단 우측 패널에서는 에스트로겐 (10 uM)은 MED1-IDRXL 응축물들로의 ER 통합을 자극함을 보여준다. 이러한 통합은 MED-IDR에서 LXXL 포켓의 존재에 의존적이다.
도 38에서는 ER 응축물들 (좌측 컬럼-녹색), MED1-IDRXL 응축물들 (중간 컬럼-적색), 그리고 MED1-IDRXL/ER 응축물들 (우측 컬럼-오렌지색)의 공촛점 현미경 이미지를 보여준다. 중간 우측 패널에서는 에스트로겐이 MED1-IDRXL 응축물들로의 ER 통합을 자극함을 보여준다. 하단 우측 패널에서는 탐옥시펜 (100 uM)이 에스트로겐 (10 uM) 존재 하에서 MED1-IDRXL 응축물들로의 ER 통합을 감쇠시킴을 보여준다
도 39에서는 야생형 에스트로겐 수용체 LBD-중재된 Med1 응축(condensation) 및 유전자 활성화는 에스트로겐에 의해 자극되며, 탐옥시펜에 의해 감쇠됨을 보여준다. Lac 결합 도메인-CFP-ER 활성화 도메인 융합 단백질은 Lac 오페론 어레이(array)를 품고 있는 U2OS 세포로 도입되었다. 공촛점 현미경 이미지의 상단 세트는 CFP 신호들이 상기 융합 단백질을 나타낸다는 것을 보여주는 이미지들이며, 패널의 하단 세포는 Mediator에 대한 면역 형광을 보여준다. 10 nM 에스트로겐 (+E)을 45분 동안 도입시키면 LBD-중재된 Med1 응축이 증가되는 한편, 1 uM 탐옥시펜 (+T)을 45분 동안 도입시키면 LBD-중재된 Med1 응축은 감쇠된다. 하단 막대 그래프에서는 루시퍼라제 활성 측정에 의해 GAL4 DBD에 융합된 표시된 활성화 도메인의 전사 결과량을 보여준다. 10 nM 에스트로겐 (+E)의 도입은 리포터 전사 결과량을 증가시키는 한편, 10 nM 탐옥시펜 (+T)의 도입으로는 리포터 전사 결과량이 증가되지 않는다. 상기 검정법에서, 2일 동안 세포로부터 에스트로겐을 빼내었고, 그 다음 24 시간 동안 에스트로겐 또는 탐옥시펜으로 처리되었다.
도 40에서는 엔도크린-저항적 환자 돌연변이는 에스트로겐-독립적 Med1 응축 및 유전자 활성화를 모두 시킬 수 있음을 보여준다. Lac 결합 도메인-CFP-ER 활성화 도메인 (ER) 융합 단백질, Lac 결합 도메인-CFP-돌연변이체 (Y537S) ER 활성화 도메인 융합 단백질, 또는 Lac 결합 도메인-CFP-ER 돌연변이체 (D538G) 활성화 도메인 융합 단백질은 Lac 오페론 어레이를 품고 있는 U2OS 세포로 도입되었다. 공촛점 현미경 이미지의 상단 세트에서 CFP 신호는 에스트로겐의 존재 (E+) 또는 부재 (E-) 하에서 융합 단백질의 존재를 나타냄을 보여준다. 에스트로겐은 야생형 ER에 대한 응축물 형성을 상당히 증가시켰지만, 그러나 어느 하나의(either) 돌연변이체에 대한 응축물 형성은 유의적으로 영향을 주지 못하였다. 공촛점 현미경 이미지의 하단 세트에서는 에스트로겐의 존재 (E+) 또는 부재 (E-) 하에서 매개체 면역형광을 보여준다. 에스트로겐은 야생형 ER에 대한 응축물 형성을 상당히 증가시켰지만, 그러나 어느 하나의(either) 돌연변이체에 대한 응축물 형성은 유의적으로 영향을 주지 못하였다. 하단 막대 그래프에서 에스트로겐의 존재 (E+) 또는 부재 (E-) 하에서 루시퍼라제 활성 측정에 의해 GAL4 DBD에 융합된 표시된 활성화 도메인의 전사 결과량을 보여준다. 에스트로겐은 어느 하나의 돌연변이체와 비교하여 WT ER 활성화 도메인에서의 전사 결과량에 반드시 더 큰 증가를 일으켰다. 도 39와 동일한 실험 조건.
도 41에서는 엔도크린 저항적 ER 환자 돌연변이들은 리간드-독립적 응축물 형성을 현시함을 보여준다. 공촛점 현미경 이미지의 상단 두 개 열에서는 에스트로겐 존재 하에서 MED1/ER 응축물 형성을 보여준다. 이 응축물 형성은 탐옥시펜의 추가 첨가에 의해 감쇠된다. 하단 두 개 열에서는 MED1/돌연변이체 ER (Y537S) 응축물 형성은 상기 탐옥시펜의 첨가에 의해 영향을 받지 않음을 보여준다.
도 42에서는 에스트로겐이 MYC 종양유전자에서 MED1 응축물 형성을 자극함을 보여준다. 공촛점 현미경 이미지의 상단 열에서 MED1 및 Myc은 에스트로겐 부재에서 공동-국소화되지 않음을 보여준다. 현미경사진의 하단 열에서는 에스트로겐 존재 상태에서 MYC에서의 MED1 응축물 형성을 보여준다.
도 43A-43I에서는 액체-유사 이질성염색질 응축물들에서 MeCP2와 HP1α잔기를 보여준다. (도 43A) 뮤린 ESCs에서 내생성 테그된 MeCP2-GFP 및 Hoechst DNA 착색의 생-세포 공촛점 현미경. (도 43B) 뮤린 ESCs에서 내생성 테그된 HP1α-mCherry 및 Hoechst DNA 착색의 생-세포 공촛점 현미경. (도 43C) 뮤린 ESCs에서 이중-내생성 테그된 MeCP2-GFP 및 HP1α-mCherry의 생-세포 이미지. (도 43D) 내생성으로 테그된 MeCP2-GFP 뮤린 ESCs을 이용한 FRAP 실험의 공촛점 현미경 이미지. 표백-후 이미지에서는 광표백 사건 후 12초 시점의 복구를 보여준다. (도 43E) MeCP2-GFP 이질성염색질 응축물들에 대한 FRAP 데이터의 정량화. 광표백 사건은
에서 발생한다. 일곱 가지 경우의 사건에 대한 평균 및 표준 오차를 도시한다. (도 43F) 내생성으로 테그된 HP1α-mCherry 뮤린 ESCs을 이용한 FRAP 실험의 공촛점 현미경 이미지. 표백-후 이미지에서는 광표백 사건 후 12초 시점의 복구를 보여준다. (도 43G) HP1α-mCherry 이질성염색질 응축물들의 FRAP 데이터의 정량화. 광표백 사건은 
에서 발생한다. 일곱 가지 경우의 사건에 대한 평균 및 표준 오차를 도시한다. (도 43H) 그래프는 MeCP2와 HP1α 이질성염색질 응축물들의 광표백 복구의 하프-타임을 도시한다. 일곱 가지 경우의 사건에 대한 평균 및 표준 오차를 도시한다. (도 43I) 그래프는 이질성염색질 응축물들 안에서 MeCP2와 HP1α의 이동 분취를 도시한다. 일곱 가지 경우의 사건에 대한 평균 및 표준 오차를 도시한다.
도 44A-44J에서는 MeCP2가 시험관내 상-분리된 액체 소적을 형성함을 보여준다. (도 44A) 인간 MeCP2 단백질의 도해. 구조화된 메틸-결합 도메인 (MBD) 및 본질적으로 무질서화된 영역 (IDR-1 및 IDR-2)이 표시된다. PONDR VSL2 알고리즘을 이용하여 이들 단백질들에 따른 예측되는 무질서 득점들이 산출되었다. 5개 아미노산 슬라이딩 윈도우(sliding window)를 이용하여 잔기 당 순-전하가 산출되었다. (도 44B) MeCP2-GFP의 농도를 증가시키면서 소적 형성 검정법의 공촛점 현미경. (도 44C) MeCP2-GFP의 농도 증가에 따른 소적 면적의 분포를 나타내는 점 도표(dot plot). 각 조건의 경우에, 400개 소적이 분석되었다. (도 44D) 소적에서 단백질 농도의 농도 증가에 따른 MeCP2-GFP의 응축된 단백질 분취를 나타내는 막대 도표. 10개 이미지에 대한 평균 및 표준 편차가 도시된다. (도 44E) 시험관내 MeCP2-GFP 소적 융합에 따른 시간 경과 이미지. (도 44F) 시험관내 MeCP2-GFP 소적 FRAP의 이미지. (도 44G) 소적 형성 반응에서 염 농도를 증가시키면서 실행된 MeCP2-GFP의 소적 형성 검정법의 공촛점 현미경. (도 44H) NaCl의 농도를 증가시키면서 소적 형성 반응에서 소적 면적 분포를 나타내는 점 도표. 각 조건의 경우에, 400개 소적이 분석되었다. (도 44I) 소적에서 염 농도의 농도 증가에 따른 MeCP2-GFP의 응축된 단백질 분취를 나타내는 막대 도표. 10개 이미지에 대한 평균 및 표준 편차가 도시된다. (도 44J) 단백질 및 염 농도에 대한 함수로써 MeCP2-GFP 소적 형성의 상 다이어그램. 양성 조건은 채워진 원(filled in circles)으로 표시된다.
도 45A-45E에서는 MeCP2 응축물 형성이 C-말단 IDR 상에 따라 달라짐을 보여준다. (도 45A) MBD, IDR-1, IDR-2를 나타내는 MeCP2 단백질의 도해로써, 시험관내 소적 형성 및 생-세포 이미징 검정법에 이용된 전장 (FL)의 그리고 상이한 두 개의 절두(truncation) 단백질을 나타낸다. 막대 차트는 MeCP2를 따라 각 아미노산 위치에 대하여 RettBASE 데이터베이스에서 발견된 Rett 증후군 여성 환자들에서의 MECP2 코딩 돌연변이의 수를 도시한다. MeCP2 단백질 도메인의 도해 아래에는 넌센스(nonsense) 돌연변이, 프레임시프트(frameshift) 돌연변이, 그리고 미스센스(missense) 돌연변이의 위치를 나타낸다. (도 45B) MeCP2-GFP 전장 (FL) 및 IDR 절두 돌연변이체 (ΔIDR-1 및 ΔIDR-2)의 소적 형성 검정법의 공촛점 현미경. (도 45C) 뮤린 ESCs에서 만들어진 상이한 3가지 내생성으로 테그된 MeCP2-GFP 계통의 생-세포 공촛점 현미경. FL: 전장 MeCP2-GFP, ΔIDR-1: IDR-1 결손, 그리고 ΔIDR-2: IDR-2 결손. (도 45D) 상이한 내생성으로 테그된 계통에 대하여 핵실에 대하여 이질성염색질 바디(bodies)에서의 MeCP2-GFP 분할(partition) 계수의 정량화. 10개 세포에 대한 균 및 표준 편차를 도시한다. (도 45E) 전장 (FL), ΔIDR-1, 그리고 ΔIDR-2을 갖는 뮤린 ESCs에서 주요 새틀라이트(satellite) 반복부 발현의 RT-qPCR. 발현은 FL 및 Gapdh에 대해 정상화된다. 3개 복제의 평균 및 표준 편차를 도시한다.
도 46A-46D에서는 MeCP2 응축물들이 이질성염색질 인자들을 구획화할 수 있음(compartmentalize)을 보여준다. (도 46A) 핵 추출물(extract) 소적 형성 검정법의 도해. (도 46B) MeCP2-mCherry 및 MeCP2-ΔIDR-2-mCherry를 함유하는 핵 추출물 소적 형성 검정법의 공촛점 현미경 이미지. 추출물의 염 농도를 150 mM NaCl로 감소시킴으로써, 소적 형성이 개시되었다. (도 46C) 투입(input) 물질의 10% 및 2700 x g에서 원심분리 후, 핵 추출물 소적 형성 검정법의 펠렛 분취에서 발견되는 상대적 단백질 양을 도시하는, 표시된 단백질들에 대한 면역블랏(immunoblots). (도 46D) 도 46C에서의 면역블랏의 정량화. 각 단백질의 경우 각 소적 형성 반응에서 상기 펠렛 분취에서 발견되는 투입(input) 백분율을 검사한 막대 그래프를 나타낸다.
도 47A-47D에서는 MeCP2-IDR-2가 선호적으로 이질성염색질 응축물들을 분할함을 보여준다. (도 47A) MeCP2 IDR 분할 실험의 밑그림. 세포들은 mCherry-MeCP2-IDR-2 또는 mCherry 단독에 대한 발현 구조체로 형질감염되었다. 이질성염색질 응축물에 집중하는 능력은 핵질과 비교하여 이질성염색질 응축물로 선택적으로 분할되는 능력으로 평가되었다. (도 47B) MeCP2-IDR-2 또는 mCherry 대조군의 과다-발현을 하는 뮤린 ESCs의 생-세포 공촛점 현미경 이미지. 상자는 이질성염색질 응축물을 나타낸다. (도 47C) MeCP2-IDR-2 또는 mCherry 대조군의 과다-발현을 하는 뮤린 ESCs에서 이질성염색질 응축물들의 추가적인 줌-인(zoom-in) 실시예들. 축적 막대는 1 μm을 나타낸다. (도 47D) 핵질에 대하여 상대적으로 이질성염색질 응축물들에서 분할 계수의 정량화. 5개 복제의 평균 및 표준 편차를 도시한다.
도 48A-48F에서는 MeCP2가 마우스 뇌의 뉴런의 이질성염색질에 집중됨을 보여준다. (도 48A) 고-등급(high grade) 키메라 MeCP2-GFP 마우스의 내생성으로 테그된 MeCP2-GFP 뇌 섹션(sections)의 고정-세포(fixed cell) 공촛점 현미경. 뉴런 및 미세아교세포를 식별해내기 위하여 차례로 MAP2 및 PU.1에 대한 면역착색을 이용하였다. 2-월령 마우스로부터 10 μm 두께의 뇌 섹션을 수거하였다. (도 48B) 뉴런 및 미세아교세포에서 세포당 MeCP2-GFP 응축물 수의 정량화. 데이터는 3개 세포의 평균± 표준 편차로 나타낸다. (도 48C) 뉴런 및 미세아교세포에서 세포당 MeCP2-GFP 응축물 수의 정량화. 데이터는 뉴런의 경우 18개 응축물, 미세아교세포의 경우 28개 응축물의 평균 ± 표준 편차로 나타낸다. (도 48D) 내생성으로 테그된 MeCP2-GFP 키메라 마우스(2-월령)로부터 취한 급성 뇌 슬라이스에서 실행된 FRAP 실험의 생-세포 공촛점 현미경 이미지. 표백-후 이미지는 광표백 사건 후 12초 시점의 복구를 보여준다. (도 48E) 살아있는 뇌에서 MeCP2-GFP 이질성염색질 응축물들의 FRAP 데이터의 정량화. 광표백 사건은
에서 발생한다. 세 가지 경우의 사건에 대한 평균 및 표준 오차를 도시한다. (도 48F) 고-등급(high grade) 키메라 MED-GFP 마우스의 내생성으로 테그된 MED1-GFP 뇌 섹션(sections)의 고정-세포 공촛점 현미경. 2-월령 마우스로부터 10 μm 두께의 뇌 섹션을 수거하였다.
도 49A-49B 에서는 MeCP2-GFP 및 HP1α-mCherry 응축물 수 및 용적을 나타낸다. (도 49A) 세포당 MeCP2-GFP 및 HP1α-mCherry 응축물 수의 정량화. n=5개 세포. (도 49B) MeCP2-GFP 및 HP1α-mCherry 응축물 용적의 정량화. MeCP2, n = 45개 응축물.
도 50A-50D에서는 MeCP2가 시험관내 상-분리된 액체 소적을 형성함을 보여준다. (도 50A) MeCP2의 아미노산 구성을 나타내는 잔기 당 인간 MeCP2 단백질 서열의 진화적(evolutionary) 보존을 나타내는 선 플롯과 함께, 인간 MeCP2 단백질의 확장 도해. 보존은 Jensen-Shannon 분산(divergence)으로 산출되었는데, 값이 클수록 서열 보존이 크다. (도 50B) 160 nM MeCP2-GFP의 소적 형성 검정법에 의한 공촛점 현미경 이미지. (도 50C) 10 μM HP1α-mCherry의 소적 형성 검정법에 의한 공촛점 현미경 이미지. (도 50D) 단백질 및 염 농도에 대한 함수로써 MeCP2-GFP 소적 형성의 상 다이어그램의 이미지.
도 51은 핵에서 신호전달 인자들과 전사 응축물 상호작용을 도시한다.
도 52A-52D에서는 신호전달 인자들이 생체내 슈퍼-인헨서에서 신호전달 의존적 응축물들을 형성함을 보여준다. (도 52A) Nanog 발생기 RNA에 대한 동시 RNA-FISH와 함께, β-카테닌, STAT3, SMAD3 및 MED1 의 면역형광에서 mES 세포 안에 Nanog 슈퍼-인헨서에서 신호전달 인자들의 응축된 핵 촛점의 존재를 실증한다. 고정화(fixation) 이전 24 시간에 WNT, JAK/STAT 및 TGF-β 신호전달 경로를 활성화시키기 위하여, 차례로 CHIR99021, LIF 및 액티빈(Activin) A 존재 하에서 24 시간 동안 세포들을 성장시켰다. Hoechst 착색을 이용하여 상기 핵 주변부(periphery)를 결정하였으며, 이 핵 주변부는 점선으로 강조표시되었다. 스피닝 디스크(spinning disk) 공촛점 현미경 상에서 이미징화에 100x 대물렌즈가 이용되었다. 적어도 10개 이미지로부터 각 신호전달 인자에 대한 RNA-FISH 촛점 상에 집중된 평균 RNA-FISH 신호 및 평균 IF 신호를 나타낸다. 무작위로 선별된 핵 위치들의 주변 평균 신호전달 인자 IF 신호는 최 우측 패널에 도시된다. 축적 막대는 5 μm을 나타낸다. (도 52B) Nanog 유전자와 연합된 슈퍼-인헨서에서 β-카테닌, STAT3, SMAD3 및 MED1의 점유를 도시하는 ChIP-seq 트랙. 판독 밀도는 빈(bin) 당 백만개당 판독 (rpm/bin)으로 도시되며, 슈퍼-인헨서는 적색 막대로 표시된다. (도 52C) 자극받지 않은 상태 또는 자극받은 상태에서 신호전달 인자들 β-카테닌, STAT3 및 SMAD3에 대한 mES 세포의 면역형광. 고정화 이전 24 시간에 WNT, JAK/STAT 및 TGF-β 신호전달 경로를 활성화시키기 위하여, 차례로 CHIR99021, LIF 또는 액티빈 A 존재 하에서 24 시간 동안 세포들을 자극시켰다. Hoechst 착색을 이용하여 상기 핵 주변부를 결정하였으며, 이 핵 주변부는 점선으로 강조표시되었다. 스피닝 디스크 공촛점 현미경 상에서 이미징화에 100x 대물렌즈가 이용되었다. 축적 막대는 5 μm을 나타낸다. (도 52D) 좌측: mEGFP-β-카테닌 공작된 HCT116 세포의 FRAP 실험의 대표 이미지. 황색 박스는 표적화된 표백을 겪은 누점(punctum)을 강조표시한다. 우측: mEGFP-β-카테닌 푼차(puncta)에 대한 FRAP 데이터의 정량화. 표백화(bleaching) 사건은 t = 0s에서 발생한다. 표백된 지역 및 표백안된 대조군의 경우, 배경-차감된 형광 강도는 표백-전 시점 (t = -4s)에 대하여 플롯된다. 데이터는 평균 +/- SEM (N=9)으로 플롯된다. Airyscan 검출기 및 63x 대물렌즈를 갖춘, Zeiss LSM 880 공촛점 현미경을 이용하여 이미지를 찍었다. 축적 막대는 2 μm를 나타낸다.
도 53A-53C에서는 정제된 신호전달 인자들은 시험관내에서 응축물들을 형성할 수 있음을 보여준다. (도 53A) 이 원고(manuscript)에 사용된 신호전달 인자들의 도메인 구조. DBD: DNA 결합 도메인, PID: 단백질 상호작용 도메인, CC: 코일드 코일(coiled coil) 도메인, DD: 이량체화 도메인, SH2: Src 상동성(homology) 도메인 2. 예측되는 본질적으로 무질서화된 영역 (IDR)은 적색 괄호로 표시된다. (도 53B) mEGFP-β-카테닌, mEGFP-STAT3 및 mEGFP-SMAD3의 상동형 소적 형성을 테스트하는 소적 형성 검정법의 일련의 농도의 대표 공촛점 이미지. 대조군으로써 mEGFP 단독이 포함된다 (좌측 패널). 상기 신호전달 인자들에 대한 분할 비율의 정량화 (우측 패널). 분할 비율은 테스트된 모든 농도에서 획득된 적어도 10개의 이미지에 대하여 소적 내부의 평균 형광 신호를 소적 외부의 평균 형광 신호로 나눔으로써 산출되었다. 모든 검정법은 125mM NaCl 존재 하에서 실행되었으며, 10% PEG-8000은 군집제로 이용되었다. 축적 막대는 2 μm를 나타낸다. (도 53C) 상기 신호전달 인자들에 대한 희석 소적 검정법. 최초 소적은 1.25μM에서 형성되었으며, 이미지화되었다. 그 다음, 남아있는 반응 혼합물은 4M NaCl를 함유하는 반응 완충제로 2-배 희석시켜, 2M NaCl의 최종 염 농도를 얻는다. 희석 전과 후의 소적의 대표 이미지를 도시한다.
도 54A-54D에서는 정제된 신호전달 인자들이 시험관내 Mediator 응축물들로 통합됨을 보여준다. (도 54A) 이미-존재하는 MED1-IDR 소적으로 신호전달 인자의 첨가를 현시하는 도해. mCherry-MED1-IDR 소적이 형성되며, 유리 접시에서 두었고, mEGFP-테그된 신호전달 인자들의 추가 전과 후를 이미지화하였다. (도 54B) MED-IDR 소적으로의 신호전달 인자 통합의 대표 이미지. 총 10분 동안 mEGFP-테그된 신호전달 인자 용액의 추가 전과 후의 실행된 mCherry-MED1-IDR 소적이 이미지화되었다. 이미징 획득이 시작된 후 30초에 신호전달 인자가 첨가되었다. 도시된 마지막 이미지는 이러한 이미지화 종료 시점에 대응한다. PEG-8000 존재 하에서 10μM의 MED1-IDR-mCherry는 소적 형성에 이용되었으며, 10uM의 mEGFP-β-카테닌, mEGFP-SMAD3 또는 mEGFP-STAT3은 PEG-8000 부재하에 첨가되었다. 축적 막대는 2 μm를 나타낸다. (도 54C) B와 동일한 조건을 이용하여, 희석된 GFP-테그된 신호전달 인자와 혼합된 사전-형성된 MED1-IDR-mCherry 소적에 대한 분할 비율이 산출되었다. 정량화를 위하여 적어도 10개의 이미지가 이용되었다. 소적은 당해 소적의 외부 지역의 강도와 비교하였을 때, 당해 소적의 내부 지역에서 GFP-테그된 인자에 대한 병합된 채널 및 신호 강도에서 요청되었다. 별표는 t-테스트, < 0.05로 획득한 p-값을 나타낸다. (도 54D) 생리학적 농도에 근접한 β-카테닌, STAT3 및 SMAD3을 이용한 제한된(limited) 희석 소적 검정법. 표시된 농도의 신호전달 인자들은 소적 형성 완충제 단독(125mM NaCL 및 10% PEG-8000) 또는 10 μM MED1-IDR와 복합된 소적 형성 완충제에 추가되었다. 축적 막대는 2 μm를 나타낸다.
도 55A-55E에서는 β-카테닌의 상 분리는 방향족 아미노산에 의존적임을 보여준다. (도 55A) 테스트된, 상이한 mEGFP-β-카테닌 절두된 단백질의 다이어그램. (도 55B) mEGFP-β-카테닌, mEGFP-N-말단-IDR, mEGFP-Armadillo 및 GFP-C-말단-IDR에 대한 상동형 소적 형성을 테스트하는 일련의 농도의 소적 형성 검정법의 대표 공촛점 이미지. 소적 검정법은 125mM NaCL 및 10% PEG-8000에서 실행되었다. (도 55C) 야생형 mEGFP-β-카테닌, 방향족 돌연변이체 mEGFP-β-카테닌 및 mEGFP의 상동형 소적 형성 능력을 테스트하는 일련의 농도의 소적 형성 검정법의 대표 공촛점 이미지. 소적 검정법은 125mM NaCL 및 10% PEG-8000에서 실행되었다. 축적 막대는 1 μm를 나타낸다. 상기에서 보여준 설명된 실험에 이용된 야생형 mEGFP-β-카테닌, 그리고 방향족에서 알라닌으로의 돌연변이체의 도메인 구조의 도해. (도 55D) 10 μM MED1-IDR-mCherry를 10μM의 야생형 mEGFP-β-카테닌 또는 방향족 돌연변이체 mEGFP-β-카테닌과 혼합시킨 이형성(heterotypic) 소적 형성 검정법의 대표 공촛점 이미지. 축적 막대는 1 μm를 나타낸다. (도 55E) 각각 적어도 10개 이미지에 대하여 인자들의 분할 비율이 정량화되었다. 소적은 당해 소적의 외부 지역의 강도와 비교하였을 때, 당해 소적의 내부 지역에서 인자에 대한 병합된 채널 및 신호 강도에서 요청되었다.
도 56A-56C에서는 표적 유전자들의 β-카테닌 및 활성화 처리는 방향족 아미노산에 의존적임을 보여준다. (도 56A) ChIP 실험의 도해. TdTomato-테그된 야생형 또는 방향족 돌연변이체 β-카테닌은 독시사이클린-유도성 프로모터 하에서 mES 세포에 안정적으로 통합되었다. 독시사이클린은 가교(crosslinking) 전 24시간 시점에 상기 배지에 첨가되었다. TdTomato에 대항하는 항체를 이용하여 ChIP를 실행하였다. TRE = 테트라사이클린 반응성 요소. (도 56B) (상단) Myc, Sp5, 그리고 Klf4 인헨서에서 이소성(ectopically)-발현된 야생형 또는 방향족 돌연변이체 β-카테닌의 ChIP-qPCR. 오차 막대는 3 회 복제(replicates)의 표준 편차를 나타낸다. 별표는 t-테스트 < 0.05로 획득된 p-값을 나타낸다. (하단) Myc, Sp5, 그리고 Klf4의 야생형 또는 방향족 돌연변이체 β-카테닌의 이소성(ectopic) 발현 후 mRNA 수준의 RT-qPCR. 오차 막대는 3 회 복제물(replicates)의 표준 편차를 나타낸다. 별표는 t-테스트 < 0.05로 획득된 p-값을 나타낸다. (도 56C) 컨센수스(consensus) TCF/LEF 모티프 10개 카피(copies)를 내포하는 합성 WNT-리포터를 이용한 루시퍼라제 검정법에서 야생형 또는 방향족 돌연변이체 β-카테닌은 HEK293T 세포에서 과다발현되었다. 3개 생물학적 복제물의 평균을 나타낸다. 오차 막대는 표준 편차를 보여준다. 별표는 t-테스트, < 0.05로 획득한 p-값을 나타낸다.
도 57A-57E에서는 β-카테닌-응축물 상호작용이 TCF 인자들과 독립적으로 발생할 수 있음을 보여준다. (도 57A) Lac 결합 도메인-CFP 또는 Lac 결합 도메인-CFP-MED1-IDR 구조체로 형질감염된 Lac-U2OS 세포들에서 β-카테닌의 면역형광, 스피닝 디스크 공촛점 현미경 상에서 100x 대물렌즈로 이미지화됨. Hoechst 착색을 이용하여 핵 주변을 결정하는데, 점선으로 강조표시된다. 정량화는 CFP 촛점에서 β-카테닌의 상대적 강도를 보여준다. 축적 막대는 5μm를 나타낸다. (도 57B) Lac 결합 도메인-CFP-MED1-IDR 구조체로 형질감염된 Lac-U2OS 세포에서 TCF4의 IF. 스피닝 디스크 공촛점 현미경에서 100x 대물렌즈를 이용하여 이미지를 획득하였다. 축적 막대는 5μm를 나타낸다. (도 57C) Lac 결합 도메인-CFP 또는 Lac 결합 도메인-CFP-MED1-IDR 구조체로 공동-형질감염된 U2OS 2-6-3 세포에서 과다발현된 TdTomato-테그된 야생형 또는 방향족 돌연변이체 β-카테닌의 형광 이미지, 스피닝 디스크 공촛점 현미경 상에서 100x 대물렌즈로 이미지화됨. Hoechst 착색을 이용하여 핵 주변을 결정하는데, 점선으로 강조표시된다. 정량화는 호출(called) CFP 촛점에서 과다-발현된 β-카테닌 형태의 상대적 강도를 보여준다. 축적 막대는 5μm를 나타낸다. (도 57D) HEK293T 세포에서 SOX9, SMAD7, KLF9 또는 GATA3의 인헨서에서 β-카테닌-GFP-키메라에 대한 ChIP-qPCR. 오차 막대는 평균의 표준 편차를 보여준다. 별표는 t-테스트 < 0.05로 획득된 p-값을 나타낸다. (도 57E) 컨센수스 TCF/LEF 모티프 10개 카피를 함유하는 합성 WNT-리포터와 복합된 β-카테닌-mEGFP-키메라를 과다-발현시키는 세포의 루시퍼라제 검정법. 3개 생물학적 복제물의 평균을 나타낸다. 오차 막대는 표준 편차를 보여준다. 별표는 t-테스트 < 0.05로 획득된 p-값을 나타낸다.
도 58A-58D에서는 신호전달 인자들이 생체내 슈퍼-인헨서에서 신호전달 의존적 응축물들을 형성함을 보여준다. (도 58A) miR290 유전자의 슈퍼-인헨서에서 β-카테닌, STAT3, SMAD3 및 MED1의 점유를 도시하는 ChIP-seq 트랙. 판독 밀도는 빈(bin) 당 백만개당 판독 (rpm/bin)으로 도시되며, 슈퍼-인헨서는 적색 막대로 표시된다. (도 58B) miR290 발생기 RNA에 대한 동시 RNA-FISH와 함께, β-카테닌, STAT3, SMAD3 및 MED1 의 면역형광에서 mES 세포 안에 miR290 슈퍼-인헨서에서 신호전달 인자들의 응축된 핵 촛점의 존재를 실증한다. 고정화에 앞서, CHIR99021, LIF 또는 액티빈 A 존재 하에 24 시간 동안 세포를 성장시켰다. Hoechst 착색을 이용하여 핵 주변을 결정하는데, 점선으로 강조표시된다. 스피닝 디스크 공촛점 현미경에서 이미지화에 100x 대물렌즈가 이용되었다. 적어도 10개 이미지로부터 각 신호전달 인자에 대한 RNA-FISH 촛점 상에 집중된 평균 RNA-FISH 신호 및 평균 IF 신호를 나타낸다. 무작위로 선별된 핵 위치들의 주변 평균 신호전달 인자 IF 신호는 최 우측 패널에 도시된다. 축적 막대는 5 μm을 나타낸다. (도 58C) Nanog에 대한 동시 DNA-FISH와 함께, β-카테닌에 대한 면역형광은 C2C12 세포에서 Nanog 슈퍼-인헨서에서 신호전달 인자들의 핵 촛점 부재를 실증한다. 고정화에 앞서, CHIR99021 존재 하에서 24 시간 동안 세포를 성장시켰다. Hoechst 착색을 이용하여 상기 핵 주변부를 결정하였으며, 이 핵 주변부는 점선으로 강조표시되었다. 스피닝 디스크 공촛점 현미경 상에서 이미징화에 100x 대물렌즈가 이용되었다. 적어도 10개 이미지로부터 각 신호전달 인자에 대한 DNA-FISH 촛점 상에 집중된 평균 DNA-FISH 신호 및 평균 IF 신호를 나타낸다. 무작위로 선별된 핵 위치들의 주변 평균 신호전달 인자 IF 신호는 최 우측 패널에 도시된다. 축적 막대는 5 μm를 나타낸다. (도 58D) HCT116 세포에서 내생성 β-카테닌과 비교하여 내생성으로 테그된 mEGFP-β-카테닌의 수준을 보여주는 웨스턴 블랏.
도 59에서는 β-카테닌, STAT3 및 SMAD3의 도메인 구조를 보여준다. DBD: DNA 결합 도메인, PID: 단백질 상호작용 도메인, CC: 코일드 코일(coiled coil) 도메인, DD: 이량체화 도메인, SH2: Src 상동성(homology) 도메인 2. 예측되는 본질적으로 무질서화된 영역 (IDR)은 적색으로 표시된다. 아미노산 당 PONDR VL3 득점을 이용하여 무질서를 예측하고, 아래에 플롯시켰다. 바코드 도표는 아래에 다른 아미노산의 위치를 나타낸다. 적색 상자는 단백질의 예측되는 IDRs에서 상단 3 개의 과다-제시된 아미노산을 나타낸다. 맨 아래 패널에서는 표시된 단백질에 대한 잔기 당 순-전하(NCPR)를 보여준다.
도 60A는 독시사이클린 유도성 프로모터 하에서 mES 세포에 통합된 야생형 및 돌연변이체 β-카테닌의 발현 수준을 보여주는 웨스턴 블랏이다. 1μg/ml 독시사이클린으로 세포를 24 시간 동안 유도하였고, TdTomato-테그된 β-카테닌의 발현에 대하여 FACS를 분류하고, 개별 콜로니들을 찍어내어 성장시킴으로써, 클론 세포 계통을 생성하였다.
도 61A-61B에서는 표적 유전자들의 β-카테닌 및 활성화 처리는 방향족 아미노산에 의존적임을 보여준다. (도 61A) Lac 결합 도메인-CFP-MED1-IDR 구조체로 형질감염된 U2OS2-6-3 세포에서 HP1α의 IF. 스피닝 디스크 공촛점 현미경에서 100x 대물렌즈를 이용하여 이미지를 획득하였다. 축적 막대는 5μm를 나타낸다. (도 61BB) HEK293T 세포에서 야생형 β-카테닌 또는 IDR-mEGFP-IDR 키메라 단백질의 수준을 보여주는 웨스턴 블랏. 히스톤 H3은 로딩(loading) 대조군으로 이용되었다.
도 62A-62F에서는 Pol II의 CTD가 Mediator 응축물들로 통합되고, 농축된다는 것을 보여준다. (도 62A) 전사 개시에서부터 신장으로의 전이 및 이 전이에서 Pol II CTD 포스포릴화의 역할을 묘사하는 모델. 개시 동안, 저-포스포릴화된 CTD를 갖는 Pol II는 Mediator와 상호작용한다. 상기 CTD의 CDK7 포스포릴화로 인하여 개시 부위의 하류 대략적으로 50-100bp에 있는 멈춘(paused) Pol II의 형성으로 이어지고, 후속적인 CDK9 포스포릴화는 방출 및 신장의 중지로 이어진다. 단순화를 위해, 우리는 CTD를 포스포릴화하여, 신장을 유도하는 CDK7 및 CDK9를 보여준다. 신장 동안, 포스포릴화된 CTD를 갖는 Pol II는 각종 RNA 프로세싱 인자들과 상호작용한다. (도 62B) GFP (GFP-CTD52)에 융합된 52개 헵타펩티드 반복부를 갖는 재조합 전장의 인간 CTD는 인간 Mediator 복합체 소적으로 통합됨을 보여주는 소적 실험의 대표 이미지. 정제된 인간 Mediator 복합체 (~200-300 nM; 방법 참고)는 135 mM 단가(monovalent) 염 및 10% PEG-8000 또는 16% Ficoll-400의 소적 형성 완충제에서 10 uM GFP 또는 GFP-CTD52와 혼합되었고, 표시된 필터를 갖춘 형광 현미경 상에서 가시화되었다. (도 62C) GFP-CTD52가 MED1-IDR 소적으로 통합됨을 보여주는 소적 실험의 대표 이미지. mCherry (mCherry-MED1-IDR)에 10 uM에서 융합된 정제된 인간 MED1-IDR은 125 mM NaCl 및 10% PEG-8000 또는 16% Ficoll-400의 소적 형성 완충제에서 3.3 uM GFP 또는 GFP-CTD52와 혼합되었고, 표시된 필터를 갖춘 형광 현미경 상에서 가시화되었다. (도 62D) 상기 CTD는 당해 CTD 반복 길이에 의존적으로, MED1-IDR 소적으로 농축된다. 26개 (GFP-CTD26) 또는 10개 (GFP-CTD10) 헵타펩티드 반복부를 갖는 CTD 절두 돌연변이체에 융합된 10 uM의 GFP, GFP-CTD52, 또는 GFP는 125 mM NaCl 및 16% Ficoll-400의 소적 형성 완충제에서 10 uM mCherry- MED1-IDR과 혼합되었고, 표시된 필터를 갖춘 형광 현미경 상에서 가시화되었다. (도 62E) 두 개의 전장의 CTD/MED1-IDR 소적 간의 융합 사건의 이미지. 소적 형성 조건은 도 62D와 동일하다. (도 62F) GFP-CTD52 및 MED1-IDR-mCherry의 이형성(heterotypic) 소적의 FRAP. 소적 형성 조건은 도 62D와 동일하다.
도 63A-63D에서는 상기 CTD의 포스포릴화에 의해 시험관내 MED1-IDR 응축물로 CTD 통합이 감소됨을 보여준다. (도 63A) CDK7-중재된 CTD 포스포릴화 (방법 참고)는 MED1-IDR 응축물로 통합될 수 있는 CTD 능력의 상실을 야기시킨다는 것을 보여주는 대표 이미지. (좌측) 10 uM의 mCherry-MED1-IDR은 125 mM NaCl 및 16% Ficoll-400의 소적 형성 완충제에서 3.3 uM GFP, GFP-CTD52 또는 GFP-포스포-CTD52와 혼합되었고, 표시된 필터를 갖춘 형광 현미경 상에서 가시화되었다. (우측) CDK7-중재된 포스포릴화와 함께, 또는 없이, MED1-IDR 소적에서 GFP-CTD52의 풍도 비율 (방법 참고). GFP의 풍도 비율은 1로 설정된다. 상자 그림에서 상자는 25 번째 백분위 수에서 75 번째 백분위 수로 확장된다. 상자 중앙의 선은 중앙값에 플롯된다. 위스커(whiskers)는 가장 작은 값으로 내려 가고, 가장 큰 값으로 올라간다. p-값은 양-단(two-tailed) Student t-검정에 의해 결정된다. (도 63B) CDK7-중재된 CTD 포스포릴화는 MED1-IDR 응축물로 통합될 수 있는 CTD 능력의 상실을 야기시킨다는 것을 보여주는 대표 이미지. (좌측) 10 uM의 mCherry-MED1- IDR은 125 mM NaCl 및 10% PEG-8000의 소적 형성 완충제에서 3.3 uM GFP, GFP-CTD52 또는 GFP-포스포-CTD52와 혼합되었고, 표시된 필터를 갖춘 형광 현미경 상에서 가시화되었다. (우측) 2a에서 도시된 바와 같이, CDK7-중재된 포스포릴화와 함께, 또는 없이, MED1-IDR 소적에서 GFP-CTD52의 풍도 비율. (도 63C) CDK9-중재된 CTD 포스포릴화는 MED1-IDR 응축물로 통합될 수 있는 CTD 능력의 상실을 야기시킨다(방법 참고)는 것을 보여주는 대표 이미지. (좌측) 10 uM의 mCherry-MED1-IDR은 125 mM NaCl 및 16% Ficoll-400의 소적 형성 완충제에서 10 uM GFP, GFP-CTD52 또는 GFP-포스포-CTD52와 혼합되었고, 표시된 필터를 갖춘 형광 현미경 상에서 가시화되었다. (우측) 도 63A에서 도시된 바와 같이, CDK9-중재된 포스포릴화와 함께, 또는 없이, MED1-IDR 소적에서 GFP-CTD52의 풍도 비율. (도 63D) CDK9-중재된 CTD 포스포릴화는 MED1-IDR 응축물로 통합될 수 있는 CTD 능력의 상실을 야기시킨다는 것을 보여주는 대표 이미지. (좌측) 10 uM의 mCherry-MED1-IDR은 125 mM NaCl 및 10% PEG-8000의 소적 형성 완충제에서 10 uM GFP, GFP-CTD52 또는 GFP-포스포-CTD52와 혼합되었고, 표시된 필터를 갖춘 형광 현미경 상에서 가시화되었다. (우측) 도 63A에서 도시된 바와 같이, CDK9-중재된 포스포릴화와 함께, 또는 없이, MED1-IDR 소적에서 GFP-CTD52의 풍도 비율.
도 64A-64B에서는 스플라이싱 응축물들은 활성 슈퍼-인헨서 구동된 유전자들에서 발생함을 보여준다. (도 64A) 고정된 마우스 배아 줄기 세포 (mESCs)에서 Nanog 및 Trim28의 발생기 RNA의 RNA FISH에 연결된 SRSF2의 대표 면역형광 (IF) 이미징. 우측에 있는 처음 두개 컬럼에서는 RNA FISH 촛점에 집중된 평균 RNA FISH 신호 및 평균 스플라이싱 인자 IF 신호를 보여준다 (97개 Nanog 촛점, 115개 Trim28 촛점이 이용되었다). 최 우측 컬럼에서는 무작위로 선별된 핵 위치에 집중된 스플라이싱 인자에 대한 평균 IF 신호를 보여준다 (방법 참고). Nanog 및 Trim28 용으로 이용된 RNA FISH 프로브의 위치는 이들의 각 유전자 모델에서 보여진다. (도 64B) 고정된 mESCs에서 Nanog 및 Trim28의 발생기 RNA의 RNA FISH에 연결된 SRRM1 및 SRSF1의 스플라이싱 인자들의 대표 IF 이미지. 우측에 있는 처음 두개 컬럼에서는 RNA FISH 촛점에 집중된 평균 RNA FISH 신호 및 평균 스플라이싱 인자 IF 신호를 보여준다(SRRM1의 경우, 137개 Nanog 촛점, 209개 Trim28 촛점이 이용되었고; SRSF1의 경우, 109개 Nanog 촛점, 248개 Trim28 촛점이 이용되었다). 최 우측 컬럼에서는 무작위로 선별된 핵 위치에 집중된 스플라이싱 인자에 대한 평균 IF 신호를 보여준다.
도 65A-65F에서는 포스포릴화된 CTD는 mESCs에서 SRSF2와 함께 공동국소화되며, 시험관내 SRSF2 소적으로 통합, 농축됨을 보여준다. (도 65A) mESCs의 Nanog 및 Trim28 좌에서 MED1, SRSF2 및 Pol II의 두 가지 상이한 포스포-형태 (포스포릴화안된 또는 세린 2 포스포릴화된)의 대표 ChIP-seq 트랙. y-축은 백만 당 판독을 나타낸다. (도 65B) 전사 시작 부위 (TSS)에서 전사 종료 부위 (TES)까지 유전자 바디(bodies)에 걸친 MED1, SRSF2 및 Pol II의 상이한 두 가지 포스포-형태 (포스포릴화안된 또는 세린 2 포스포릴화된)에 대한 백만 당 평균 ChIP-seq 판독 (RPM)의 Metagene 플롯, 상위 20% 가장 고도로 발현된 유전자들에서 TSS의 상류 2kb 및 TES의 하류 2kb. (도 65C) CTD가 CDK7에 의해 포스포릴화될 때, 당해 CTD는 SRSF2 소적으로 효과적으로 통합됨을 보여주는 소적 실험의 대표 이미지. (좌측) mCherry (mCherry-SRSF2)에 융합된 정제된 2.4 uM의 인간 SRSF2는 100 mM NaCl 및 16% Ficoll-400의 소적 형성 완충제에서 3.3 uM GFP, GFP-CTD52 또는 GFP-포스포-CTD52와 혼합되었고, 표시된 필터를 갖춘 형광 현미경 상에서 가시화되었다. (우측) CDK7-중재된 포스포릴화와 함께, 또는 없이, SRSF2 소적에서 GFP-CTD52의 풍도 비율 (방법 참고). GFP의 풍도 비율은 1로 설정된다. 상자 그림에서 상자는 25 번째 백분위 수에서 75 번째 백분위 수로 확장된다. 상자 중앙의 선은 중앙값에 플롯된다. 위스커는 가장 작은 값으로 내려 가고, 가장 큰 값까지 올라간다. p-값은 양-단 Student t-검정에 의해 결정된다. (도 65D) CTD가 CDK7에 의해 포스포릴화될 때, 당해 CTD는 SRSF2 소적으로 효과적으로 통합됨을 보여주는 소적 실험의 대표 이미지. (좌측) 2.4 uM의 mCherry-SRSF2은 100 mM NaCl 및 10% PEG-8000의 소적 형성 완충제에서 3.3 uM GFP, GFP-CTD52 또는 GFP-포스포-CTD52와 혼합되었고, 표시된 필터를 갖춘 형광 현미경 상에서 가시화되었다. (우측) 4c에서 도시된 바와 같이, CDK7-중재된 포스포릴화와 함께, 또는 없이, SRSF2 소적에서 GFP-CTD52의 풍도 비율. (도 65E) CTD가 CDK9에 의해 포스포릴화될 때, 당해 CTD는 SRSF2 소적으로 효과적으로 통합됨을 보여주는 소적 실험의 대표 이미지. (좌측) 2.4 uM의 mCherry-SRSF2은 120 mM NaCl 및 16% Ficoll-400의 소적 형성 완충제에서 10 uM GFP, GFP-CTD52 또는 GFP-포스포-CTD52와 혼합되었고, 표시된 필터를 갖춘 형광 현미경 상에서 가시화되었다. (우측) 도 65C에서 도시된 바와 같이, CDK9-중재된 포스포릴화와 함께, 또는 없이, SRSF2 소적에서 GFP-CTD52의 풍도 비율. (도 65F) CTD가 CDK9에 의해 포스포릴화될 때, 당해 CTD는 SRSF2 소적으로 효과적으로 통합됨을 보여주는 소적 실험의 대표 이미지. (좌측) 2.4 uM의 mCherry-SRSF2은 120 mM NaCl 및 10% PEG-8000의 소적 형성 완충제에서 10 uM GFP, GFP-CTD52 또는 GFP-포스포-CTD52와 혼합되었고, 표시된 필터를 갖춘 형광 현미경 상에서 가시화되었다. (우측) 도 65C에서 도시된 바와 같이, CDK9-중재된 포스포릴화와 함께, 또는 없이, SRSF2 소적에서 GFP-CTD52의 풍도 비율.
도 66A-66C에서는 CDK7 및 CDK9-중재된 시험관내 CTD 포스포릴화, 그리고 CDK7에 중재된 MED1-IDR 소적으로의 CTD 통합 상실은 ATP 의존적임을 보여준다. (도 66A) CDK7에 의한 Ser5 및 Ser2 잔기에서 GFP-CTD52의 포스포릴화를 보여주는 웨스턴 블랏. 항-GFP 항체에 의해 나타난 바와 같이, 각 조건에는 동량의 GFP-CTD52가 이용되었다. (도 66B) CDK9에 의한 Ser5 및 Ser2 잔기에서 GFP-CTD52의 포스포릴화를 보여주는 웨스턴 블랏. 항-GFP 항체에 의해 나타난 바와 같이, 각 조건에는 동량의 GFP-CTD52가 이용되었다. (도 66C) MED1-IDR 소적으로의 CTD 통합 상실에는 CDK7 및 ATP가 필요함을 보여주는 대표 이미지. 재조합 CDK7 및/또는 ATP (방법 참고)와 함께 항온처리된 10 uM의 GFP-CTD52는 125 mM NaCl 및 16% Ficoll-400의 소적 형성 완충제에서 10 uM mCherry-MED1-IDR과 혼합되었고, 표시된 필터를 갖춘 형광 현미경 상에서 가시화되었다.
도 67A-67C에서는 SRSF2가 포스포-CTD 상호작용 인자이며, CDK7에 의해 중재되는 SRSF2 소적으로의 CTD의 강화된 통합은 ATP 의존적임을 보여준다. (도 67A) 상기 CTD의 상이한 포스포-형태를 이용하여 풀-다운(pull-down)에 의해 농축된 상이한 Mediator 하위단위, SR 패밀리 스플라이싱 인자들, 그리고 스플라이스좀(spliceosome)의 성분들에 대한 질량분석법(mass spectrometry)으로부터 평균 iBAQ (강도-기반 절대 정량화) 풍도 득점을 보여주는 히스토그램(histogram). 상이한 모듈(modules)로부터의 Mediator 하위단위를 보여준다. 상기 스플라이싱 인자들의 경우, Ebmeier et al., (Cell Rep 20, 1173-1186 (2017))에서 탐지된 정본(canonical) SR 단백질 및 Pol II와 상호작용하는 것으로 간주되는 스플라이스좀 성분들을 나타낸다. 간략하게 설명하자면, 모든 샘플에 걸쳐 iBAQ 득점은 Ebmeier et al (2017)으로부터 내려받았다. 포스포릴화안된 전장 CTD (포스포안됨(Unphos)), TFIIH 포스포릴화된 전장 CTD (포스포 CDK7), 또는 p-TEFb 포스포릴화된 전장 CTD (포스포 CDK9)를 이용한 풀-다운에 대하여 다중 복제물로부터의 득점을 평균하였다. 각 단백질에 대한 평균 iBAQ 득점은 y-축 상에 플롯된다. (도 67B) 대조군 siRNA (좌측), 또는 표시된 인자에 대항하는 siRNA (우측)로 형질감염된 C2C12 세포에서 스플라이싱 인자들 SRSF2, SRRM1, 그리고 SRSF1의 대표 면역형광 (IF) 이미지. (도 67C) SRSF2 응축물로의 강화된 CTD 통합에는 CDK7 및 ATP가 필요함을 보여주는 대표 이미지. 재조합 CDK7 및/또는 ATP (방법 참고)와 함께 항온처리된 3.3 uM의 GFP-CTD52는 100 mM NaCl 및 10% PEG-8000의 소적 형성 완충제에서 1.2 uM mCherry-SRSF2와 혼합되었고, 표시된 필터를 갖춘 형광 현미경 상에서 가시화되었다.
도 68A-68D에서는 MYC 종양유전자는 종양 조직 및 암 세포들에서 Mediator 응축물들에 의해 점유됨을 보여준다. (도 68A) (좌측) 헤마토실린 및 에오신 착색된 ER+ 인간 침습성 유방의 관내 암종 (우측) ER+ 인간 유방암 조직에서 MYC 좌에 대한 MED1 또는 ER IF 및 RNA FISH의 공촛점 현미경 이미지. (도 68B) (좌측) 에스트로겐 존재 하에서 성장된 유방암 세포 계통 MCF7에서 MYC 좌에 대한 RNA FISH와 함께, ER 또는 MED1 IF의 공촛점 현미경 이미지. (우측) MCF7 세포의 MYC RNA FISH 촛점에서 MED1 (상단, n=23) 또는 ER (하단, n=18) IF의 풍도 분석 및 랜덤 촛점 분석. (도 68C) MCF7 세포에서 mEGFP-테그된 MED1의 FRAP. 우측에는 정량화를 나타냄, n=3, 평균 (녹색 선), 최적 선 (단일 흑색), 그리고 95% 신뢰 구간 (흑색 점선). (도 68D) 표시된 암 세포 계통에서 MYC 좌에 대한 MED1 IF 및 RNA FISH의 공촛점 현미경 이미지.
도 69A-69F에서는 ER이 Mediator와 함께, 에스트로겐-의존적, 탐옥시펜-민감성 응축물들을 형성함을 보여준다. (도 69A) (좌측) 비자극, 에스트로겐 자극, 또는 탐옥시펜 처리된 MCF7 세포들에서 MYC 좌에 대한 DNA FISH와 함께, MED1 IF의 공촛점 현미경 이미지. (우측) 에스트로겐 반응성 종양유전자에서 Mediator 응축물 상에서 에스트로겐 및 탐옥시펜 치료 효과를 보여주는 모델. (도 69B) MCF7 세포에서 표시된 조건에서의 MYC 발현의 RT-qPCR. (도 69C) (좌측) U2OS 세포에서 Lac 어레이의 도해. (상단 우측) 표시된 리간드의 MED1 IF와 함께 나타낸 Lac-CFP-ER-LBD 융합 단백질의 공촛점 현미경 이미지. (하단 우측) Lac 어레이에서 MED1 풍도의 정량화, n≥8. (도 69D) (상단) LAC-mCherry-ER-LBD로 형질감염되었으며, 탐옥시펜으로 처리된 mEGFP-MED1 내생성으로 테그된 U2OS 세포의 생-세포 이미지, 0분 및 30 분에서 이미지화됨. (하단) 30분 시점에서 표시된 리간드와 함께 Lac 어레이에서 풍도 비율의 정량화, n=3. (도 69E) (좌측) 시험관내 소적 검정법의 도해. (상단 우측) 표시된 리간드와 함께, ER-GFP 및 MED1-mCherry의 시험관내 소적 검정법의 공촛점 이미지. (하단 우측) 소적 거동의 도해. (도 69F) ER-MED1 소적 형성의 상(phase) 다이어그램 도해.
도 70A-70G에서는 호르몬 요법-저항적 ER 돌연변이들이 Mediator와 함께 구성적으로 응축됨을 보여준다. (도 70A) ER-MED1 소적 형성의 상(phase) 다이어그램 도해. (도 70B) 환자-유래된 ER 점 돌연변이 및 전좌(translocations)의 도해. (도 70C-도 70D) 표시된 리간드와 함께, GFP 및 MED1-mCherry에 융합된 표시된 ER 돌연변이체의 시험관내 소적 검정법. (도 70E) GAL4 전사활성화 검정법의 도해. (도 70F-도 70G) 표시된 리간드와 함께, GAL4-DBD ER LBD 야생형 또는 돌연변이체 단백질의 전사활성화의 활성, n=9, 별표는 에스트로겐 없이 ER에 대한 p<0.01을 나타낸다.
도 71A-71G에서는 MED1 과다발현은 Mediator 응축을 촉진시킴을 보여준다. (도 71A) ER-MED1 소적 형성의 상(phase) 다이어그램 도해. (도 71B) MCF7 세포들 또는 확립된 탐옥시펜 저항적 MCF7 세포 계통에서 MED1의 웨스턴 블랏. (도 71C) 표시된 리간드 존재 하에서 MED1의 저-농도(200nM) 또는 고-농도(1600nM)에서의 ER-GFP 및 MED1-mCherry의 소적 형성 검정법-MED1 채널에서 가시화됨. 하기에는 정량화를 나타낸다, n>20. (도 71D) Lac-ER-LBD 융합 단백질로 형질감염되고 (상단 열), MED1 IF를 거친 (하단 열), U2OS 세포의 공촛점 현미경 이미지. 하기에는 정량화를 나타낸다, n≥8. (도 71E) 탐옥시펜 존재 하에서 낮은 수준의 또는 높은 수준의 MED1에서 실행된 GAL4-ER LBD의 전사활성화 검정법, n=9. (도 71F) WT 또는 높은 수준의 MED1을 갖는 MCF7 세포를 탐옥시펜 처리에 의한 생존. 하기에는 정량화를 나타낸다, n=4. (도 71G) 높은 수준의 MED1 존재 하에서 에스트로겐-독립적 응축물 형성 및 종양유전자 활성화의 도해.
도 72A-72C에서는 MYC 종양유전자는 종양 조직 및 암 세포들에서 Mediator 응축물들에 의해 점유됨을 보여준다. (도 72A) 생검체된 유방암 표본으로부터 임상 데이터. (도 72B) 상기 ER+ 유방 암종 생검체 상에서 MED1 IF 및 DAPI 착색의 공촛점 현미경 이미지, MED1 푼차(puncta)가 보여진다. (도 72C) MCF7 MED1-mEGFP 세포 계통에서 MED1 수준의 웨스턴 블랏.
도 73A-73C에서는 ER이 Mediator와 함께, 에스트로겐-의존적, 탐옥시펜-민감성 응축물들을 형성함을 보여준다. (도 73A) mEGFP-MED1 U2OS Lac 세포를 생성시키기 위한 녹-인(knockin) 전략의 도해. (도 73B) U2OS-Lac 세포에서 mEGFP-테그된 MED1의 존재를 실증하는 웨스턴 블랏. (도 73C) 도 2E에 나타낸 시험관내 소적 검정법의 정량화, n>20.
도 74A-74C에서는 호르몬 요법-저항적 ER 돌연변이들이 Mediator와 함께 구성적으로 응축됨을 보여준다. (도 74A) 핫스팟 537 및 538을 갖는 ER 돌연변이의 빈도, cBioPortal 데이터베이스에서 220명의 환자로부터 얻은 데이터. (도 74B) 표시된 리간드와 함께, MED1 소적으로의 ER 돌연변이체 단백질의 정량화, n>20. (도 74C) ER 점 돌연변이체의 MED1 IF에 의한 Lac 검정법. 하기에는 풍도의 정량화를 나타낸다, n≥8.
도 75A-75B에서는 MED1 과다발현은 Mediator 응축을 촉진시킴을 보여준다. (도 75A) 표시된 리간드와 함께, MED1의 농도를 증가시킬 때, ER-GFP 및 MED1-mCherry의 소적 형성 검정법. (도 75B) 리간드 없이, 낮은 수준의 또는 높은 수준의 MED1 존재 하에서 실행된 GAL4-ER LBD의 전사활성화 검정법.
도 1- 전사 인자들, 공동-인자들, 염색질 조절제들, DNA, 넌-코딩 RNA, 발생기(nascent) RNA, 그리고 RNA 중합효소 II를 포함하는 다중 성분들의 고-밀도 공조적(cooperative) 어셈블리인 전사 응축물을 도해한다.
도 2A-2B- 전사 응축물 형성, 유지, 해체 또는 규제에 있어서 본질적으로 무질서화된 도메인 또는 영역 (IDR) (서열 식별 번호: 13)의 영향을 보여준다. 도 2A에서, 상기 IDR은 상기 전사 응축물을 안정화시킨다. 도 2B에서, 상기 IDR에 결합하거나 또는 이와 상호작용하는 소 분자의 도입으로 상기 전사 응축물은 불안정하게 된다. 도 2A-2B에 나타낸 모티프 YSPTSPS는 서열 식별 번호: 13이다.
도 3A-3C- 슈퍼-인헨서 및 전형적 인헨서의 모델과 특징들을 보여준다. 도 3A는 전형적 인헨서 및 슈퍼-인헨서에 대한 공조적 고전적 모델의 개략도다. DNA 결합 부위들에 대한 공조적 결합을 통한 고-밀도의 전사 조절제들(''활성제들''로 지칭됨)은 더 높은 전사 결과량과 슈퍼-인헨서에서 활성제 농도에 대한 민감성 증가에 기여라는 것으로 간주된다.
도 4A-4C- 전사 대조군의 단순 상 분리 모델을 보여준다. 도 4A는 슈퍼-인헨서-유전자 좌에서 전사 조절제들의 상-분리된 다중-분자 복합체를 형성할 수 있는 생물학적 시스템의 개략도이다. 도 4B는 상기 생물학적 시스템 및 상 분리로 이어질 수 있는 모델의 매개변수의 단순화시켜 나타낸 것이다. "M"은 변형될 때 가교(cross-links)를 형성할 수 있는 잔기의 변형을 나타낸다. 도 4C는 슈퍼-인헨서 (N = 50개 쇄로 구성), 그리고 전형적 인헨서 (N = 10 쇄로 구성)에 대한 결합가(valency) 매개변수 상에서 전사 활성(TA)의 의존성을 보여준다. 전사 활동 (TA)에 대한 프록시는 가교된 쇄의 최대 클러스터의 크기로 정의되며, 쇄의 총 수에 의해 등급화된다. 상기 결합가는 실제 결합가를 기준 수 3으로 나눠 등급화된다. 50 회 시뮬레이션(simulations)에서 실선은 평균을 나타내고, 점선은 표준 편차(standard deviation)의 두 배를 나타낸다. Keq 값과 변형자/탈변형자 비율은 일정하게 유지시켰다. Hill 계수, HC는 공조적 거동(behavior)을 설명하는 고전적인 계측이다. 삽입된 도면은 시스템에서 체인 또는 구성요소들의 수에 대한 Hill 계수의 의존성을 보여준다.
도 5A-5B- 슈퍼-인헨서 취약성(Vulnerability)을 보여준다. 도 5A는 표시된 농도에서 BRD4 저해제 JQ1로 처리한 후, IGLL5 슈퍼-인헨서 (적색)와 PDHX 전형적 인헨서 (회색) 단편들의 인헨서 활성을 나타낸다. 인헨서 활성은 인간 다발성 골수종 세포들에서 루시퍼라제 리포터 검정법에 의해 측정되었다. 주석: JQ1은 전형적 인헨서에 의해 구동되는 루시퍼라제 발현보다 10-배 더 낮은 농도 (25 nM 대비(versus) 250 nM)에서 슈퍼-인핸서에 의해 구동되는 루시퍼라제 발현의 ~50%를 억제한다.
도 6A-6C-전사 폭발(bursting)을 보여준다. 도 6A는 초파리(Drosophila) 배의 개별 핵에서 전사 활성의 대표적인 흔적이다. 형광 프로브를 이용하여 발생기 RNAs를 가시화함으로써, 전사 활성이 측정되었다. 상단 패널은 약한 인헨서에 의해 생성된 대표적인 흔적을 보여주고, 하단 패널은 강한 인헨서에 의해 생성된 대표적인 흔적을 보여준다. Fukaya et al.(2016)으로부터 개작된 이미지 및 데이터. 도 6B는 약한 인헨서와 강한 인헨서의 폭발(bursting) 거동을 시간 경과에 따라 정리한 슈퍼-인헨서 (N = 50 쇄), 그리고 전형적 인헨서 (N = 10 쇄)의 전사 활성(TA)의 시뮬레이션이다. 도 6C는 공유된(shared) 인헨서에 의한 두 개 유전자 프로모터의 동시발생적 활성화의 모델이다.
도 7- 생체내 전사 대조군 상 분리를 보여준다: 유전자 조절 요소들에서 상-분리된 복합체 모델. 상기 복합체를 형성하는 후보 전사 조절제의 일부가 강조된다. P-CTD는 RNA Pol II의 포스포릴화된 C-말단 도메인을 나타낸다. 뉴클레오좀의 화학적 변형 (아세틸화, Ac; 메틸화, Me) 또한 강조되어 있다. 인헨서와 프로모터에서 발산적(divergent) 전사는 RNA 스플라이싱 인자들에 의해 결합될 수 있는 발생기 RNAs를 만든다. 상기 성분들 간의 잠재적 상호작용은 점선으로 도시된다.
도 8-전사 활성 (TA)은 쇄의 수 (N)에 의존적임을 보여준다. 전사 활동 (TA)에 대한 프록시는 가교된 쇄의 최대 클러스터의 크기로 정의되며, 쇄의 총 수에 의해 등급화된다. 50 회 시뮬레이션에서 실선은 평균을 나타내고, 점선은 표준 편차의 두 배를 나타낸다. 모든 시뮬레이션은 변형자/탈변형자=0.1, Keq=1 및 f=5에서 실행된다. SE 및 전형적 인헨서에 대한 N 값 (또는 성분들의 농도)이 충분히 상이하다면, TA 수준은 매우 상이하다.
도 9- 상기 변형자/탈변형자 발란스(balance)의 급격한 변화 (신호의 변화를 모방) 후, 겔의 분해(disassembly)를 연구하기 위해 수행된 시뮬레이션을 보여준다. 전사 활동 (TA)에 대한 프록시는 가교된 쇄의 최대 클러스터의 크기로 정의되며, 쇄의 총 수에 의해 등급화된다. 삽입도에 나타낸 바와 같이, 변형자/탈변형자 수준의 비율 (τ=25에서)을 0.1에서 0.016로 누르고, TA는 상기 변형자/탈변형자 발란스에서 변화-후 τ=50 타임 유닛(time units post change)에서 산출된다. 모든 시뮬레이션은 N=50 (SE에 대한 모델) 및 Keq=1에서 실행된다. 실선은 결합가 (f)가 변경됨에 따라, 250 회 복제(replicate) 시뮬레이션에서 산출된 TA의 최대 값의 변동을 나타낸다. 변형자/탈변형자 수준에서 변화-후 τ=50 타임 유닛에서 클러스터 형성을 보장하는 역치(threshold valencies) fmin(도 4C 참고), 그리고 강력한 분해를 보장하는 fmax (TA<0.5로 정의됨, 점선)가 확인된다. 변형자/탈변형자 값에서 변화-후 τ=50 타임 유닛의 특정 값은 설명을 목적으로 선택되며, 그리고 fmax 값을 결정한다. 실제적인 시간 등급에서 겔이 분해되지 않는 최대 결합가가 존재한다는 정성적 결과는 이 시간 등급에서 선택된 값의 변화에 확신한다.
도 10A-10B-슈퍼-인헨서와 전형적 인헨서의 노이즈(Noise) 특징을 보여준다. 도 10A는 SEs(N=50)에 대한 결합가 및 전형적 인헨서 (N=10)에서 전사 활성 (TA)의 변동(variance)으로 측정된, 변동 (또는 전사 노이즈)의 의존성을 나타낸다. 전사 활동 (TA)에 대한 프록시는 가교된 쇄의 최대 클러스터의 크기로 정의되며, 쇄의 총 수에 의해 등급화된다. 세로 좌표 정의에서 < > (angular brackets)는 반복 시뮬레이션 50 회 이상에 걸친 평균을 나타낸다. 모든 시뮬레이션은 변형자/탈변형자=0.1, Keq=1에서 실행된다. 상기 노이즈의 정상화된 크기, 그리고 중요한 것으로 이 노이즈가 현시되는 결합가 범위는 전형적 인헨서와 비교하였을 때, SEs에서 더 작다. 주석: 그러나, 상 분리 점 부근의 노이즈의 절대 크기는 N 값이 클수록 더 커진다. 도 10B는 f = 5 (N=50의 경우 클러스터 형성에 필요한 최소 결합가)의 경우 N에 대한 전사 활성(TA)의 변동으로 측정된 변동(또는 전사 노이즈)의 의존성을 보여준다. 모든 시뮬레이션은 변형자/탈변형자=0.1 및 Keq=1에서 실행된다. 전사 활동 (TA)에 대한 프록시는 가교된 쇄의 최대 클러스터의 크기로 정의되며, 쇄의 총 수에 의해 등급화된다. 세로 좌표 정의에서 < >는 반복 시뮬레이션 50 회 이상에 걸친 평균을 나타낸다.
도 11A-11E- BRD4 및 MED1 핵 응축물들을 시각화한 것이다. (도 11A) 마우스 배아 줄기 세포 (mESC)에서 구조 조명 현미경 (SIM)을 이용하여 면역형광 (IF)에 의한 BRD4 및 MED1의 대표 이미지. 이미지는 8개 슬라이스 (각 125nm)의 z-투영도를 나타낸다. 축적 막대, 5 μm. 도 S1C. (도 11B)에서 IgG 대조군. SIM으로 이미지화한 고정된(fixed) mESC에서 이소성(ectopically) 발현된 BRD4-GFP (좌측패널, 녹색)와 MED1에 대한 IF (중앙 패널, 자홍색) 간의 공동-국소화의 대표 이미지. 두 채널의 병합이 우측 패널에 표시되고, 중첩은 흰색으로 표시된다. 핵 윤곽(outline)은 DAPI 착색 (나타내지 않음)에 의해 결정된 파란 색으로 나타낸다. 이미지는 단일 z-슬라이스 (125nm)를 나타낸다. 축적 막대, 5 μm. (도 11C) 고정된 mESC에서 SIM에 의해 이미지화된 BRD4 (상단 좌측 패널, 녹색), HP1a(상단 중앙 패널, 자홍색)에 대한 공동-IF 대표 이미지, 그리고 두 채널(상단 좌측 패널, 중첩은 백색으로)의 병합. 고정된 mESC에서 SIM에 의해 이미지화된 이소성(ectopically) 발현된 HP1a-GFP (하단 우측 패널, 녹색), MED1에 대한 IF (하단 중앙 패널, 자홍색), 그리고 두 채널 (하단 좌측 패널, 중첩, 백색으로)의 병합의 공동-국소화 대표 이미지. 핵 윤곽(outline)은 DAPI 착색 (나타내지 않음)에 의해 결정된 파란 색으로 나타낸다. 이미지는 단일 z-슬라이스 (125nm)를 나타낸다. 축적 막대, 5 μm. (도 11D) 디콘볼루션(deconvolution) 현미경에 의해 이미지화된 공지의 핵 응축물들의 마커, FIB1 (핵소체), NPAT (히스톤 좌 바디(bodies)), 그리고 HP1a(구성적 이질성염색질)에 대한 IF 대표 이미지. 이미지는 8개 슬라이스 (각 125nm)의 z-투영도를 나타낸다. 축적 막대, 5 μm. (도 11E) 핵 응축물들의 전형적인 수 및 크기(직경). 여기에서 생성된 값은 검정색 폰트이며; 문헌(48)에서 수집된 값은 청색 폰트다. 크기 및 수에 대한 값은 FIJI의 3D 물체 카운터 플러그인(object counter plugin)을 사용하여 생성되었다. 축적 막대, 5 μm.
도 12A-12B- BRD4 및 MED1 응축물들은 슈퍼-인헨서-연합된 전사의 부위에서 발생됨을 보여준다. (도 12A) mir290, Esrrb, 그리고 Klf4와 연합된 퍼-인헨서 (SEs)에서 나타낸, 표시된 BRD4, MED1, 그리고 RNA 중합효소 II (RNAPII)의 ChIP-seq 결합 프로파일. 각 세트에 경우, SE (빨간색) 위치 및 연합된 유전자 (검정색)의 위치가 당해 세트 아래에 표시된다. x-축은 게놈 위치를 나타내고, ChIP-seq 신호 강화는 염기쌍 당 백만 개당 판독(rpm/bp)로 y 축을 따라 표시된다. (도 12B) 고정된 mESC에서 면역형광 (IF) 및 형광동소보합법 (FISH)에 의해 표시된 바와 같이, SE-연합된 유전자들, mir290, Esrrb, 또는 Klf4 의 BRD4 또는 MED1과 발생기 RNAs간의 공동-국소화의 대표 이미지. 회전 디스크 공-촛점 현미경(spinning disk confocal microscopy)을 사용하여 샘플을 이미지화했다. 단일 z-슬라이스 (500nm)는 표시된 IF 및 FISH의 경우 개별적으로 제시되며, 두 채널의 병합 (중첩, 백색으로)으로 제시된다. 청색 선은 DAPI 착색(나타내지 않음)으로 지정된 핵 주변을 강조표시한다. IF 및 FISH 공동-국소화 영역은 "병합" 열에서 황색 상자로 강조표시되고, "병합 (줌)" 열에서 확대되어 상세하게 나타낸다. 축적 막대, IF, FISH 및 병합의 경우 5 μm, 병합 (줌)의 경우 0.5 μm.
도 13A-13F- BRD4 및 MED1 응축물들은 액체-유사 FRAP 동역학을 현시한다. (도 13A) BRD4-GFP 응축물의 광표백(photobleaching) 전, 그리고 후 표시된 시간에서 BRD4-GFP-발현시키는 mESC의 대표 이미지. 황색 상자는 광표백된 영역을 강조표시한다. 청색 상자는 비교를 위해 대조군 영역을 강조표시한다. 광표백 (0")에 대한 상대적 시간은 각 이미지의 좌측 하단에 표시된다. 축적 막대, 5 μm. (도 13B) (A)에 표시된 영역의 시간-경과, 근접 영상. 패널 A의 광표백된 영역 (패널 A의 황색 상자)이 상단 열에 표시된다. 광표백에 대한 시간은 각 영상 위에 표시된다. 패널 A의 대조군 영역 (패널 A의 청색 상자)이 하단 열에 표시된다. 축적 막대, 1 μm. (도 13C) 형광의 회복이 정량화되고, 평균화되었다. 광표백 전, 시간에 대한 신호 강도는 y 축에 표시된다. 광표백에 대한 시간은 x 축에 표시된다. 미처리된 세포 (검정 색)와 ATP를 고갈시키기 위하여 올리고마이신(oligomycin)으로 처리된 세포 (ATP-고갈, 적색)에 대한 데이터를 나타낸다. 미처리된 세포의 경우(n=9)와 ATP-고갈됨 세포의 경우(n=3)에 대한 데이터는 평균적인 상대적 강도 ± SEM로 나타낸다. (도 13D)는 (A)와 동일하지만, 그러나 MED1-GFP 발현시키는 mESCs임. 축적 막대, 5 μm. (도 13E)는 (B)와 동일하지만, 그러나 MED1-GFP 발현시키는 mESCs임. 축적 막대, 1 μm. (도 13F)는 (도 13C)와 동일하지만, 그러나 MED1-GFP 발현시키는 mESCs임. 미처리된 세포의 경우(n=5)와 ATP-고갈됨 세포의 경우(n=5)에 대한 데이터는 평균적인 상대적 강도 ± SEM로 나타낸다.
도 14A-14F- BRD4 및 MED1 시험관내 상 분리의 본질적으로 무질서화된 영역 (IDRs)을 보여준다. (도 14A) BRD4 (상단 그래프) 및 MED1 (하단 그래프)에서 아미노산 스트레취에 대한 본질적 무질서 (PONDR VSL2) 점수를 플롯팅한 그래프. PONDR VSL2 점수는 y-축에 나타낸다. 아미노산 위치는 x-축에 나타낸다. 자색 막대는 각 단백질의 본질적으로 무질서화된 C-말단 도메인을 나타낸다. 본질적으로 무질서화된 각 도메인의 시작과 끝 아미노산 위치가 표시된다. (도 14B) 이 원고에 사용된 재조합 GFP 융합 단백질의 개략도. (도 14C) 자색 상자는 나타난 BRD4 (BRD4-IDR) 및 MED1 (MED1-IDR)의 본질적으로 무질서한 도메인을 나타낸다. 소적 형성과 관련된 탁도 증가를 시각적으로 나타냄. BRD4-IDR (좌측 짝), MED1-IDR (중간 짝) 또는 GFP (우측 짝)을 함유하는 튜브를 보여준다. 각 짝의 경우, PEG-8000 (분자 군집제(crowding agent))의 존재(+) 또는 부재(-)를 나타낸다. 대조용으로 상기 쌍 사이에 빈 튜브가 포함된다. (도 14D) 상이한 단백질 농도에서 소적 형성의 대표 이미지. BRD4-IDR (상단 열), MED1-IDR (중간 열) 또는 GFP (하단 열)은 소적 형성 완충제에 표시된 최종 농도로 추가되었다. 용액을 수제(homemade) 챔버에 로드하고, 유리 커버슬립에 촛점을 맞춘 회전 디스크 공-촛점 현미경으로 이미지화했다. 축적 막대, 5 μm. (도 14E) 상이한 염 농도에서 소적 형성의 대표 이미지. 표시된 바와 같이, 50 mM, 125 mM, 200 mM 또는 350 mM의 최종 NaCl 농도와 함께, BRD4-IDR (이미지의 상단 열) 또는 MED1-IDR (이미지의 하단 열)은 소적 형성 완충제에 10 μM 농도가 되도록 추가되었다. 소적은 (도 14D)에서와 같이 가시화되었다. 축적 막대, 5 μm. (도 14F) 소적 가역성 실험의 대표 이미지. 상단 열은 BRD4-IDR의 소적을 나타내는데, 소적 형성 완충제 (20 μM 단백질, 75 mM NaCl)에서 형성 및 그 다음 희석 또는 염 농도 변화와 함께 희석되는 것을 나타낸다. 좌측 컬럼은 원래 용적의 1/3의 대표 소적을 나타낸다. 중간 컬럼은 당해 용적을 등장성 용액으로 1:1 희석시킨 두 번째 2/3을 나타내는 소적을 보여준다. 우측 컬럼은 당해 용적의 최종 1/3의 대표 소적으로, 높은 염 용액으로 1:1로 희석시켜 최종 농도 425 mM의 NaCl이된 소적을 보여준다. 소적은 (도 14D)에서와 같이 가시화되었다. 축적 막대, 5 μm.
도 15A-15H- MED1의 상기 IDR이 세포에서 상 분리에 참여함을 보여준다. (도 15A) 청색 광에 노출된 세포에서 발현된 선별된 본질적으로 무질서화된 도메인 (자색), mCherry (적색) 및 Cry2 (오렌지)을 갖는 재조합 단백질을 도시하는 optoIDR 검정법의 개략도. (도 15B) mCherry-Cry2 재조합 단백질을 발현시키고, 0 초 (좌측 패널) 또는 200 초 (우측 패널) 동안 매 2초 마다 488nm 레이져 여기(excitation)를 겪은 NIH3T3 세포들의 대표 이미지. 축적 막대, 10 μm. (도 15C) mCherry-Cry2 (MED1-optoIDR)에 융합된 MED1 IDR (MED1의 아미노산 948-1157)를 발현시키고, 0 초 (좌측 패널), 60 초 (중간 패널) 또는 200 초 (우측 패널) 동안 매 2초 마다 488nm 레이져 여기(excitation)를 겪은 NIH3T3 세포들의 대표 이미지. 10 μm. (도 15D) MED1-optoIDR을 발현시키고, 표시된 시간 동안 매 2초 마다 488nm 레이져 여기(excitation)를 겪은 NIH3T3 세포 핵에 촛점을 둔 시간-경과 이미지. 축적 막대, 5 μm. 황색 상자는 융합 이벤트가 발생하는 여러 영역 중 하나를 강조표시한다. (도 15E) 소적 융합의 시간-경과 및 근접-영상. 패널 D의 황색 상자로 강조표시된 이미지 영역은 확장된 시간 프레임에 대해 표시된다. 프레임들은 각 프레임의 좌측 하단에 표시된 시간에 촬용된다. 축적 막대, 1 μm. (도 15F) 청색광 여기(excitation) 없이 optoDroplets의 광표백 전(좌측 패널), 광표백 동안(중앙 패널) 그리고 광표백 후(우측 패널), MED1-optoIDR optoDroplets의 대표 이미지. 황색 상자는 광표백된 영역을 강조표시한다. 청색 상자는 비교를 위해 대조군 영역을 강조표시한다. 광표백 (0")에 대한 상대적 시간은 각 이미지의 좌측 하단에 표시된다. 축적 막대, 5 μm. (도 15G) 형광의 회복이 정량화되고, 평균화되었다. 광표백 전, 시간에 대한 신호 강도는 y 축에 표시된다. 광표백에 대한 시간은 x 축에 표시된다. n=15에서 데이터는 평균 상대적 강도 ± SD로 나타낸다. (도 15H) (도 15F)에서 강조표시된 영역은 소적 회수의 사건-경과 및 근접-영상. 광표백에 대한 시간은 영상 위에 표시된다. 축적 막대, 1 μm.
도 16A-16C- BRD4 및 MED1 핵 응축물들을 시각화한 것이다 (도 16A) 두 좌에서 표시된 바와 같이, BRD4 및 MED1에 대한 ChIP-seq 결합 프로파일. 각 패널의 경우, 염색체 좌표는 하단에 표시되고, 축적 막대는 좌측 상단에 포함된다. X-축은 게놈 위치를 나타내며, ChIP-seq 신호 풍도(enrichment)는 백만분 당 판독 (rpm)으로 y 축을 따라 표시된다. (도 16B) mESCs에서 BRD4- 또는 MED1-결합된 부위들에서 BRD4 (좌측 패널) 및 MED1 (우측 패널)의 점유(occupancy)를 보여주는 히트 맵(heat map) 각 패널은 각 BRD4- 또는 MED1-결합된 영역 (열)에 대하여 BRD4- 또는 MED-1 결합된 영역의 피크에 지중된 4kb 윈도우를 보여준다. 적색은 ChIP-seq 신호의 존재를 나타낸다. 검정 색은 배경을 나타낸다. (도 16C) 마우스 배아 줄기 세포 (mESCs)에서 구조 조명 현미경 (SIM)을 이용하여 2차 IgG 항체를 이용한 면역형광 탐지. IgG (좌측 패널), DAPI (중앙 패널)을 이용한 착색 및 병합된 영상 (우측 패널)을 나타낸다. 축적 막대, 5 μm.
도 17A-17D- BRD4 및 MED1 응축물들은 슈퍼-인헨서-연합된 전사 부위들에서 일어남을 보여준다. (도 17A) Nanog 좌에서 나타낸, 표시된 바와 같은 BRD4, MED1, 그리고 RNA 중합효소 II (RNAPII)에 대한 ChIP-seq 결합 프로파일. x-축은 게놈 위치를 나타내고, ChIP-seq 신호 강화는 염기쌍 당 백만 개당 판독(rpm/bp)로 y 축을 따라 표시된다. (도 17B) 고정된 mESC에서 표시된 바와 같이, 면역형광 (IF) 및 형광동소보합법 (FISH)에 의해 표시된 바와 같이, SE-연합된 유전자 Nanog의 BRD4 또는 MED1과 발생기 RNAs간의 공동-국소화의 대표 이미지. 회전 디스크 공-촛점 현미경(spinning disk confocal microscopy)을 사용하여 샘플을 이미지화했다. 상단 열은 BRD4에 대한 비교를 나타낸다. 하단 열은 MED1에 대한 비교를 나타낸다. 각 열에서, 단일 z-슬라이스 (500nm)는 개별적으로 IF (좌측 패널) 및 FISH (중앙 패널), 그 다음 두 채널의 병합 (우측 패널)을 나타낸다. 청색 선은 DAPI 착색(나타내지 않음)으로 지정된 핵 주변을 강조표시한다. IF 및 FISH 공동-국소화 영역은 황색으로 강조표시되며, 강조표시된 영역의 근접-영상은 최-우측 패널에 나타낸다. 축적 막대, IF, FISH 및 병합의 경우 5 μm, 병합 (줌)의 경우 0.5 μm. (도 17C) IF 및 FISH 좌 간에 거리의 정략화를 나타내는 개략도. 가장 가까운 촛점 분석 (상단 패널)을 위하여, FISH 신호와 가장 가까운 IF 특징간의 거리가 선택되었다. 확률적 촛점 분석 (하단 패널)을 위하여, 5 μm 반경 내에서 FISH 신호와 무작위 IF 특징간의 거리가 선택되었다. (도 17D) 각 상자 세트의 상단에 표시된 유전자에 대해 특정된 바의 가장 근접한 또는 확률적 FISH 신호 (도 17C)에 대한 BRD4 (상단 열) 또는 MED1 (하단 열)에 대한 IF 촛점 사이의 거리를 나타내는 상자그림(boxplots). 각 세트의 좌측 상단에는 가장 근접한 그리고 확률을 비교하는 p-값 (t-테스트), 분석된 RNA-FISH 촛점 수 및 독립적인 복제 수가 보고된다.
도 18A-18C- BRD4 및 MED1 응축물들은 액체-유사 FRAP 동역학을 현시함을 보여준다. (도 18A) 이들 연구에서 광표백으로부터 복구(recovery)의 반감기 (T_반감기) 및 BRD4 및 MED1에 대한 겉보기 확산 속도를 나타내는 표. 비교를 위해, DDX4 및 NICD에 대한 기존 게시된 정보가 표시된다. (도 18B) 형광의 복구는 정량화되고 평균화되었습니다. 광표백 전, 시간에 대한 신호 강도는 y 축에 표시된다. 광표백에 대한 시간은 x 축에 표시된다. 상기 세포를 고정시키고, 광-표백-후 확산을 제한하기 위하여, PFA로 처리된 BRD-GFP-발현시키는 세포 (청색)와 MED1-GFP-발현시키는 세포 (적색)에 대한 데이터를 나타낸다. 데이터는 평균 상대적 강도 ± SEM로 나타낸다. (도 18C) 포도당 소진 및 올리고마이신을 이용한 치료에 대한 함수로써, ATP 소진의 정량호.
도 19A-19D- BRD4 및 MED1 시험관내 상 분리의 본질적으로 무질서화된 영역 (IDRs)을 보여준다. (도 19A) BRD4-IDR 및 MED1-IDR의 소적에 대한 종횡비(aspect ratios) 분포를 보여주는 상자 도면. 검사된 소적의 수와 평균 종횡비가 표시된다. 상자 도면은 10-90 번째 백분위 수를 나타낸다. (도 19B) BRD4-IDR (좌측 패널) 또는 MED1-IDR (우측 패널)에 대한 단백질 농도와 소적 크기 간의 상관관계를 나타내는 점 도표. 단백질 농도 (μM)는 x-축에 나타내며, 2-D 이미지에서 면적에 대한 함수로써 소적 크기는 y-축에 나타낸다. (도 19C) 낮은 단백질 농도에서 작은 소적 존재를 보여주는 이미지. (도 19D) BRD4-IDR (좌측 패널) 또는 MED1-IDR (우측 패널)에 대한 염 농도와 소적 크기 간의 상관관계를 나타내는 점 도표. 염 농도 (mM)는 x-축에 나타내며, 2-D 이미지에서 면적에 대한 함수로써 소적 크기는 y-축에 나타낸다.
도 20에서는 OCT4 및 Mediator는 생체내 슈퍼-인헨서를 점유함을 보여준다. SEs에서 ESCs 안의 OCT4 및 MED1의 ChIP-seq 트랙(좌측 컬럼)과 동시 RNA-FISH와 OCT4 IF는 Esrrb, Nanog, Trim28 및 Mir290에서 OCT4의 점유를 실증한다 Hoechst 착색을 이용하여 핵 주변을 결정하는데, 청색으로 강조표시된다. 두 개의 최 우측 컬럼들은 적어도 11개 이미지로부터 RNA-FISH 촛점에 집중된 평균 RNA FISH 신호 및 평균 OCT4 IF 신호를 나타낸다. 무작위로 선별된 핵 위치에서 평균 OCT4 IF 신호는 도 27에 나타낸다.
도 21A-21I에서는 MED1 응축물들이 생체내 OCT4 결합에 의존적임을 보여준다. (도 21A) OCT4 붕괴(degradation)의 개략도. OCT4의 C-말단은 FKBP 단백질로 내생적으로 이중-대립유전적(biallelically)으로 테그되며; 소 분자 dTag에 노출될 때, OCT4는 산재적으로 그리고 신속하게 붕괴된다. (도 21B) DMSO 또는 dTAG로 24 시간 동안 처리된, OCT4 FKBP 테그를 휴대하는 ESCs에서 슈퍼-인헨서 (SE)- 또는 전형적 인헨서 (TE)-구동된 유전자들의 OCT4 및 MED1 ChIP-seq 판독 및 RNA-seq 판독에서 로그2 배수 변화를 현시하는 박스 도면. (도 21C) Nanog 좌에서 OCT4 (녹색) 및 MED1 (황색) ChIP-seq 데이터의 게놈 브라우져 영상 Nanog SE (적색)은 OCT4 붕괴 후, OCT4 및 MED1 결합이 90% 감소됨을 보여준다. (도 21D) Nanog mRNA의 정상화된 RNA-seq 판독 수는 OCT4 붕괴 시, 60% 감소를 보여준다. (도 21E) DMSO 또는 dTAG로 처리되고, OCT4 FKBP 테그를 휴대하는 ESCs에서 Nanog 좌에 대한 DNA FISH와 함께 OCT4 및 MED1 IF의 공-촛점 현미경 이미지. 삽입 도면은 황색 상자를 확대한 것을 나타낸다. 병합 영상은 3가지 채널 (OCT4 IF, MED1 IF 및 Nanog DNA FISH) 모두를 함께 나타낸다. (도 21F) ESCs 및 분화된 세포들 (Diff)에서 Mir290 SE에 대한 OCT4 ChIP-qPCR. ESCs에서 신호에 대하여 대조군 대비 풍도를 나타낸다. 오차 막대는 두 개의 생물학적 복제에서 평균 표준 오차를 나타낸다. (도 21G) ESCs 및 분화된 세포들 (Diff)에서 Mir290 SE에 대한 MED1 ChIP-qPCR. ESCs에서 신호에 대하여 대조군 대비 풍도를 나타낸다. 오차 막대는 두 개의 생물학적 복제에서 SEM을 나타낸다. (도 21H) ESCs 또는 분화된 세포들 (Diff)에서 Mir290 miRNA의 정상화된 RNA-seq 판독 카운트. 오차 막대는 두 개의 생물학적 복제에서 SEM을 나타낸다. (도 21I) ESCs 및 분화된 세포들에서 Mir290 게놈 좌에 대한 MED1 IF 및 DNA FISH의 공촛점 현미경 이미지. 병합 (줌)은 병합된 채널에서 황색 상자를 확대한 것을 나타낸다.
도 22A-22E에서는 OCT4가 시험관내 MED1로 액체 소적을 형성함을 보여준다. (도 22A) VSL2 알고리즘 (www.pondr.com)에 의해 산출된 OCT4의 본질적 무질서 그래프다. DNA 결합 도메인 (DBD) 및 활성화 도메인 (ADs)은 무질서 득점 그래프 상에 표시된다(Brehm et al., 1997). (도 22B) 125mM NaCl 및 10% PEG-8000과 함께 소적 형성 완충제에서 표시된 농도의 OCT4-GFP (상단 열) 및 MED1-IDR-GFP (하단 열)의 소적 형성을 나타내는 대표 이미지. (도 22C) 125mM NaCl 및 10% PEG-8000과 함께 소적 형성 완충제에서 GFP 또는 OCT4-GFP 각 10uM와 혼합된 MED1-IDR-mCherry의 소적 형성을 나타내는 대표 이미지. (도 22D) OCT4-GFP 및 MED1-IDR-mCherry의 이형성(heterotypic) 소적의 FRAP. 공촛점 이미지는 광표백에 관련 표시된 시점 (0)에서 취하였다. (도 22E) 염과 10% PEG-8000의 농도를 변화시키면서, 소적 형성 완충제 안에 10uM MED1-IDR-mCherry 및 OCT4-GFP의 소적 형성을 나타내는 대표 이미지.
도 23A-23E에서는 MED1과 함께 OCT4 상 분리가 특이적 상호작용에 의존적임을 보여준다. (도 23A) ADs에서 아미노산 빈도에 따라 정렬된 아미노산 풍도 분석 (상단 패널). OCT4의 아미노산 잔기 당 순-전하(Net charge) 분석 (하단 패널). (도 23B) Poly-E 펩티드가 MED1-IDR 소적으로 통합됨을 보여주는 소적 형성의 대표 이미지. MED1-GFP 및 TMR 라벨된 프롤린 또는 글루탐산 데카펩티드 (차례로, Poly-P 및 Poly-E)는 각 10uM에서 125mM NaCl 및 10% PEG-8000의 소적 형성 완충제에 추가된다. (도 23C) (상단 패널) OCT4 단백질의 도해, AD에서 수평선은 산성 D 잔기 (청색) 및 산성 E 잔기 (적색)을 표시한다. N-AD에서 17개의 모든 산성 잔기와 C-AD에서 6개 산성 잔기는 알라닌으로 돌연변이되어, OCT4-산성 돌연변이체를 만들었다. (하단 패널) OCT4 산성 돌연변이체가 MED1-IDR 소적 안으로 집중되는 능력이 감쇠됨(attenuated)을 보여주는 소적 형성의 대표 공촛점 이미지 10uM의 MED1-IDR-mCherry 및 OCT4-GFP 또는 OCT4-산성 돌연변이체-GFP는 125mM NaCl 및 10% PEG-8000의 소적 형성 완충제에 추가되었다. (도 23D) (상단 패널) OCT4는 Mediator 복합체 소적에 통합되지만, 그러나 OCT4 산성 돌연변이체는 이 소적에 통합되지 않음을 보여주는 소적 형성의 대표 이미지. 정제된 Mediator 복합체는 140mM NaCl 및 10% PEG-8000의 소적 형성 완충제에서 10uM GFP, OCT4-GFP 또는 OCT4-산성 돌연변이체-GFP와 혼합되었다. (하단 패널) Mediator 복합체 소적에서 GFP, OCT4-GFP 또는 OCT4-산성 돌연변이체-GFP의 풍도 비율. N>20, 오차 막대는 10 번째 백분위 수와 90 번째 백분위 수 사이의 분포를 나타낸다. (도 23E) (상단 패널) GAL4 활성화 검정법 도해. GAL4 루시퍼라제 리포터 플라스미드를 GAL4-DBD 융합 단백질용 발현 벡터와 함께 마우스 ES 세포에 형질감염시켰다. (하단 패널) GAL4-DBD, GAL-OCT4-CAD 또는 GAL-OCT4-CAD-산성 돌연변이체로 형질감염시킨 마우스 ES 세포의 루시퍼라제 활성에 의해 AD 활성이 측정되었다.
도 24A-24C에서는 Mediator 소적으로 다중 TFs 상 분리를 보여준다. (도 24A) (좌측 그래프) 다양한 단백질 클래서의 무질서 백분율(x 축)이 당해 클래서의 무질서화된 단백질들의 누적 분취(fraction)에 대하여 플롯팅됨 (y 축). (우측 그래프) 전사 인자 (TF) DNA-결합 도메인 (DBD) 및 추정(putative) 활성화 도메인 (ADs)의 무질서 함량(content). (도 24B) 표시된 TFs의 상동형(homotypic) 소적 형성을 검정하는 소적 형성 대표 이미지. 재조합 MYC-GFP (12uM), p53-GFP (40uM), NANOG-GFP (10uM), SOX2-GFP (40uM), RARa-GFP (40uM), GATA-2-GFP (40uM), 그리고 ER-GFP (40uM)는 125mM NaCl 및 10% PEG-8000의 소적 형성 완충제에 추가되었다. (도 24C) 테스트된 모든 TFs들이 MED1-IDR 소적으로 통합됨을 보여주는 소적 형성의 대표 이미지. 10uM의 MED1-IDRmCherry와 다중중(MYC-GFP, p53-GFP, NANOG-GFP, SOX2-GFP, RARa-GFP, GATA-2-GFP, 또는 ER-GFP) 임의의 것의 10uM이 125mM NaCl 및 10% PEG-8000의 소적 형성 완충제에 추가되었다.
도 25A-25E에서는 에스트로겐이 MED1와 함께 에스트로겐 수용체의 상 분리를 자극함을 보여준다. (도 25A) 에스트로겐에 의해 자극된 유전자 활성화를 보여주는 도해. 에스트로겐은 상기 MED1-IDR 안에 LXXLL 모티프에 대한 결합 포켓을 노출시킴으로써, ER의 리간드 결합 도메인 (LBD)의 결합에 의해 ER이 Mediator와 RNAPII의 상호작용을 용이하게 한다. (도 25B) 재조합 단백질 생산에 이용되는 상기 MED1-IDRXL, 그리고 MED1-IDR의 도해 영상 (도 25C) ER-GFP 및 MED1-IDRXL-mCherry의 상동형 소적 형성을 검정하는 소적 형성 대표 이미지. 125mM NaCl 및 10% PEG-8000의 소적 형성 완충제에서 표시된 단백질 농도로 실행됨. (도 25D) ER은 MED1-IDRXL 소적에 통합되며, 에스트로겐의 추가로 이형성(heterotypic) 소적 형성이 상당히 강화되었음을 보여주는 소적 형성의 대표 공촛점 이미지. ER-GFP, ER-GFP (에스트로겐 존재 하에서) 또는 GFP는 MED1-IDRXL와 혼합된다. 10uM의 각 표시된 단백질이 125mM NaCl 및 10% PEG-8000의 소적 형성 완충제로 추가되었다. (도 25E) ER-GFP, ER-GFP (에스트로겐 존재 하에서) 또는 GFP의 MED1-IDRXL 소적 풍도 비율. N>20, 오차 막대는 10 번째 백분위 수와 90 번째 백분위 수 사이의 분포를 나타낸다.
도 26A-26G에서는 TF-공동활성제 상 분리가 전사활성화(transactivation)에 필요한 잔기에 의존적임을 보여준다. (도 26A) 125mM NaCl 및 10% PEG-8000의 소적 형성 완충제에 추가된 GCN4-GFP 또는 MED15-mCherry의 소적 형성을 나타내는 대표 이미지. (도 26B) GCN4가 MED15와 소적을 형성함을 보여주는 소적 형성을 나타내는 대표 이미지. 125mM NaCl 및 10% PEG-8000의 소적 형성 완충액에 10uM로 GCN4-GFP 및 mCherry 또는 GCN4-GFP 및 MED15-mCherry가 추가되었고, 표시된 필터를 갖춘 형광 현미경 상에서의 이미지. (도 26C) 활성화 도메인 (AD) 및 DNA-결합 도메인 (DBD)을 포함하는 GCN4 단백질의 도해 (상단 열). AD의 소수성 패치에 있는 방향족 잔기들은 청색 선으로 표시된다. 상기 소수성 패치에 있는 11개의 모든 방향족 잔기들은 알라닌 (A)으로 돌연변이되어, GCN4-방향족 돌연변이체를 만들었다. (하단 열) GCN4-방향족 돌연변이체가 MED15와의 소적을 형성하는 능력이 감쇠됨을 됨을 보여주는 소적 형성을 나타내는 대표 이미지. GCN4-GFP 또는 GCN4-방향족-돌연변이체-GFP 및 MED15-mCherry는 125mM NaCl 및 10% PEG-8000의 소적 형성에 각 10uM 씩 추가되었다. (도 26D) (상단 패널) GCN4 야생형은 Mediator 복합체 소적에 통합되지만, 그러나 GCN4 방향족 돌연변이체는 이 소적에 통합되지 않음을 보여주는 소적 형성의 대표 이미지. 10uM의 GCN4-GFP 또는 GCN4-방향족-돌연변이체-GFP는 125mM NaCl 및 10% PEG-8000의 소적 형성 완충제에서 정제된 Mediator 복합체와 혼합되었다. (도 26E) (좌측 패널) Lac 검정법의 도해. 상기 Lac 오페론의 50,000개 반복부를 품고 있는 U2OS 세포는 Lac 결합 도메인-CFP-AD 융합 단백질로 형질감염된다. (우측 패널) 상기 표시된 Lac 결합 단백질 구조체로 형질감염된 Lac-U2OS 세포들에서 MED1의 IF. (도 26F) GAL4 활성화 검정법. 293T 세포에서 루시퍼라제 활성 측정에 의해 GAL4 DBD에 융합된 표시된 활성화 도메인의 전사 결과량. (도 26G) 유전자 활성화를 구동시키기 위하여 슈퍼-인헨서에서 상-분리된 응축물들을 형성하는 전사 인자들 및 공동활성제들을 보여주는 모델. 이 모델에서, 전사 응축물들은 역동적이며, 구조화된 상호작용으로 통합된다.
도 27은 랜덤 촛점 분석을 보여준다. 표시된 RNA FISH 촛점으로 집중된 평균 형광 (상단 패널) 대비 X와 Y에서 무작위로 분포된 IF 촛점 +/- 1.5 미크론 (하단 패널). 색깔 축적 막대는 형광 강도의 임의 단위(arbitrary units)를 나타낸다.
도 28A-28F에서는 OCT4 붕괴 및 ES 세포 분화를 보여준다. (도 28A) Oct4-FKBP 세포-공작 전략의 도해. 선별용으로 BFP 또는 RFP와 함께, 녹-인(knock-in) 좌를 만들기 위한 복구 벡터 및 Cas9 발현시키는 플라스미드로 V6.5 마우스 ES 세포들을 형질감염시켰다 (좌측). 크기에서의 예상된 변위(shift)를 보여주는 WT 또는 OCT4에 대하여 블랏된 미처리된 OCT4-dTAG ES 세포, HA (FKBP 상에), 그리고 ACTIN (우측). (도 28B) dTag47 또는 비히클 (DMSO)로 처리된, OCT4 (좌측 패널), MED1 (우측 패널), 그리고 베타-액틴(OCT4 degron 라인에서 (dTAG))에 대한 웨스턴 블랏. (도 28C) DMSO 처리된 것 대비 dTAG 처리된 OCT4-degron 세포들에서 Nanog DNA FISH 촛점 안에 MED1 면역형광 신호의 평균 강도. N=5개 이미지, 오차 막대는 10 번째 백분위 수와 90 번째 백분위 수 사이의 분포를 나타낸다. (도 28D) 분화된 ES 세포의 MiR290 좌에서 OCT4 (P1) 및 MED1 (P2) ChIP-qPCR를 위하여 이용된 프라이머들의 위치를 보여주는 도해. (도 28E) ES 세포, 또는 LIF 철회(withdrawal)에 의해 분화된 세포에서 MED1 및 베타-액틴에 대한 웨스턴 블랏. (도 28F) ES 세포 대비 LIF 철회에 의해 분화된 세포에서 MiR290 DNA FISH 촛점 안에 MED1 면역형광 신호의 평균 강도. N=5개 이미지, 오차 막대는 10 번째 백분위 수와 90 번째 백분위 수 사이의 분포를 나타낸다.
도 29A-29F에서는 MED1 및 OCT4 소적 형성을 보여준다. (도 29A) 10% PEG-8000의 소적 형성 완충제에서 형성된 MED1-IDR-mCherry 소적 안에서 의 125mM NaCl에서 GFP 대비 OCT4-GFP의 풍도 비율. N>20, 오차 막대는 10 번째 백분위 수와 90 번째 백분위 수 사이의 분포를 나타낸다. (도 29B) 10uM의 각 단백질과 함께 10% PEG-8000, 125mM 염에서 형성된 MED1-IDR-OCT4 소적의 면적(마이크로미터-제곱). (도 29C) 10uM의 각 단백질과 함께, 10% PEG-8000, 125mM에서 형성된 MED1-IDR-OCT4 소적의 종횡 비율. N>20, 오차 막대는 10 번째 백분위 수와 90 번째 백분위 수 사이의 분포를 나타낸다. (도 29D) 10uM의 각 단백질과 함께 10% PEG-8000, 125mM, 225uM, 또는 300uM 염에서 형성된 MED1-IDR-OCT4 소적의 면적(마이크로미터-제곱). (도 29E) 표시된 단백질 또는 단백질들의 조합 (각 10uM에서)에 대하여 50mM NaCl에서 군집제 없이 소적 형성에 대하여 패널 상단에 표시된 채널에서 이미지화된 형광 현미경 이미지. (도 29F) 50mM NaCl에서 군집제 없이 형성된 MED1-IDR-mCherry 소적에서 GFP 대비 OCT4-GFP의 풍도 비율. N>20, 오차 막대는 10 번째 백분위 수와 90 번째 백분위 수 사이의 분포를 나타낸다.
도 30A-30E에서는 돌연변이체 OCT4의 상 분리를 보여준다. (도 30A) 10% PEG-8000 및 125mM NaCl의 소적 형성 완충제에서 표시된 농도에서 표시된 TMR-라벨된 폴리펩티드의 형광 현미경. (도 30B) MED1-IDR-mCherry 소적 안에 표시된 폴리펩티드의 풍도 비율. N>20, 오차 막대는 10 번째 백분위 수와 90 번째 백분위 수 사이의 분포를 나타낸다. (도 30C) MED1-IDR-mCherry 소적 안에 표시된 단백질의 풍도 비율. N>20, 오차 막대는 10 번째 백분위 수와 90 번째 백분위 수 사이의 분포를 나타낸다. (도 30D) (상단 패널) OCT4 단백질의 도해, 활성화 도메인 (ADs)에서 방향족 잔기들은 청색 수평선으로 표시됨. N-말단 활성화 도메인 (N-AD)의 9개 방향족 잔기 모두와 C-말단 활성화 도메인 (C-AD)에서 10개 방향족 잔기는 알라닌으로 돌연변이되어, OCT4-방향족 돌연변이체를 만들었다. (하단 패널) OCT4 방향족 돌연변이체는 MED1-IDR 소적 안으로 여전히 통합됨을 보여주는 소적 형성의 대표 공촛점 이미지. MED1-IDR-mCherry와 OCT4-GFP 또는 MED1-IDR-mCherry와 OCT4-방향족 돌연변이체-GFP는 각 10uM으로 125mM NaCl와 10% PEG-8000의 소적 형성 완충액에 추가되었으며, 표시된 필터를 갖춘 형광 현미경 상에서 가시화되었다. (도 30E) 무손상(intact) Mediator 복합체의 소적들은 펠렛화에 의해 수집되었으며, 동일 용적의 입력(input), 상청액, 그리고 펠렛들이 SDS-PAGE 겔 상에서 이동되었으며, 사이프로 루비(sypro ruby)에 의해 착색되었다. 상기 펠렛에 존재하는 Mediator 하위단위(subunits)들은 최우측 컬럼 상에 표시된다.
도 31A-31B에서는 Mediator의 다양한 TFs 상 분리를 보여준다. (도 31A) MED1-IDR-mCherry 소적 안에 표시된 GFP-융합된 TF의 풍도 비율. N>20, 오차 막대는 10 번째 백분위 수와 90 번째 백분위 수 사이의 분포를 나타낸다. (도 31B) 10% PEG-8000 및 125mM NaCL의 소적 형성 완충제에서 형성된 이형성(heterotypic) p53-GFP/MED1-IDR-mCherry 소적의 FRAP(30초 동안 매 초마다 이미지화됨).
도 32A에서는 MED1의 에스트로겐 수용체 상 분리를 보여준다. 10uM 에스트로겐의 존재 또는 부재 하에서 MED1-IDR-mCherry 소적에서 ER-GFP의 풍도 비율. 125mM NaCl와 함께, 10% PEG-8000에서 소적이 형성되었다. N>20, 오차 막대는 10 번째 백분위 수와 90 번째 백분위 수 사이의 분포를 나타낸다.
도 33A-33G에서는 GCN4와 MED15가 상 분리된 소적을 형성한다는 것을 보여준다. (도 33A) 10% PEG-8000의 소적 형성 완충제 및 125mM NaCl에서 GCN4-GFP 소적에서 mCherry 또는 MED15-mCherry의 풍도 비율. N>20, 오차 막대는 10 번째 백분위 수와 90 번째 백분위 수 사이의 분포를 나타낸다. (도 33B) 10% PEG-8000 및 125mM NaCL의 소적 형성 완충제에서 형성된 이형성(heterotypic) GCN4-GFP/MED15-IDR-mCherry 소적의 FRAP(30초 동안 매 초마다 이미지화됨). (도 33C) 10% PEG-8000 및 125mM 염의 소적 형성 완충제로 표시된 농도로 추가된 GCN4-GFP 및 MED15-mCherry의 상 다이어그램(diagram). (도 33D) 도 33C에서 GCN4 소적의 풍도 비율. N>20, 오차 막대는 10 번째 백분위 수와 90 번째 백분위 수 사이의 분포를 나타낸다. (도 33E) 10% PEG-8000 및 125mM NaCl에서 표시된 농도의 GCN4-GFP 또는 GCN4-GFP의 방향족 돌연변이체의 형광 이미지. GFP 채널로부터의 이미지를 보여준다. (도 33F) 10% PEG-8000의 소적 형성 완충제 및 125mM 염에서 형성된 MED15-mCherry 소적에서 GCN4-GFP 또는 GCN4-GFP의 방향족 돌연변이체의 풍도 비율. N>20, 오차 막대는 10 번째 백분위 수와 90 번째 백분위 수 사이의 분포를 나타낸다. (도 33G) Mediator 복합체 소적에서 GFP, GCN4-GFP 또는 GCN4-방향족 돌연변이체-GFP의 풍도 비율. N>20, 오차 막대는 10 번째 백분위 수와 90 번째 백분위 수 사이의 분포를 나타낸다.
도 34에서는 탐옥시펜이 ER 중재된 유전자 활성화 및 ER 및 MED1의 상 분리를 억제시킴을 보여준다. 상단 좌측에서는 탐옥시펜이 에스트로겐 수용체 (ER)의 리간드 결합 도메인 (LBD)에 결합한다는 것을 보여준다. 하단 우측에서는 GAL4 전사활성화 검정법에서, ER 중재된 유전자 활성화의 전사 결과량은 에스트로겐 의존적이며, 탐옥시펜에 의해 차단됨을 보여주고 있다. 좌측 부분은 GFP 라벨된 ER, 그리고 LXXL 결합 포켓 (MED1-IDRXL)을 함유하는 mCherry 라벨된 MED1-IDR이 에스트로겐 존재 하에서 응축물을 형성함을 보여주는 공촛점 현미경 이미지인데, 그러나 이러한 에스트로겐 의존적 응축물 형성은 탐옥시펜에 의해 차단된다.
도 35에서는 ER은 에스트로겐 자극 시에 슈퍼-인헨서를 확립한다는 것은 공지되어 있으며, MED1은 ER+ 유방암에서 과다발현됨 (상단 우측 그래프)을 보여준다. MED1은 ER 기능 및 ER+ 유방암 종양생성에 필요하다.
도 36에서는 리간드 결합된 NHRs (핵 호르몬 수용체들 (예컨데, 핵 수용체들))가 유도성 슈퍼-인헨서에서 전사 응축물들 (TCs)을 확립한다는 것을 보여준다. 이러한 TCs의 변경이 종양생성 기전이다. 진화하는 종양형성적 응축물들은 세포가 암에서 약물 저항성을 발달시키는 기전이며, 기존 항-신생물 약물들은 종양형성적 전사 응축물들을 표적으로 할 수 있다. 이 관점에서, TCs는 종양형성적-전사-인자-중재된 질환에 대한 근거있는 표적이다.
도 37에서는 ER 응축물들 (좌측 컬럼-녹색), MED1-IDRXL 응축물들 (중간 컬럼-적색), 그리고 MED1-IDRXL/ER 응축물들 (우측 컬럼-오렌지색)의 공촛점 현미경 이미지를 보여준다. 하단 우측 패널에서는 에스트로겐 (10 uM)은 MED1-IDRXL 응축물들로의 ER 통합을 자극함을 보여준다. 이러한 통합은 MED-IDR에서 LXXL 포켓의 존재에 의존적이다.
도 38에서는 ER 응축물들 (좌측 컬럼-녹색), MED1-IDRXL 응축물들 (중간 컬럼-적색), 그리고 MED1-IDRXL/ER 응축물들 (우측 컬럼-오렌지색)의 공촛점 현미경 이미지를 보여준다. 중간 우측 패널에서는 에스트로겐이 MED1-IDRXL 응축물들로의 ER 통합을 자극함을 보여준다. 하단 우측 패널에서는 탐옥시펜 (100 uM)이 에스트로겐 (10 uM) 존재 하에서 MED1-IDRXL 응축물들로의 ER 통합을 감쇠시킴을 보여준다
도 39에서는 야생형 에스트로겐 수용체 LBD-중재된 Med1 응축(condensation) 및 유전자 활성화는 에스트로겐에 의해 자극되며, 탐옥시펜에 의해 감쇠됨을 보여준다. Lac 결합 도메인-CFP-ER 활성화 도메인 융합 단백질은 Lac 오페론 어레이(array)를 품고 있는 U2OS 세포로 도입되었다. 공촛점 현미경 이미지의 상단 세트는 CFP 신호들이 상기 융합 단백질을 나타낸다는 것을 보여주는 이미지들이며, 패널의 하단 세포는 Mediator에 대한 면역 형광을 보여준다. 10 nM 에스트로겐 (+E)을 45분 동안 도입시키면 LBD-중재된 Med1 응축이 증가되는 한편, 1 uM 탐옥시펜 (+T)을 45분 동안 도입시키면 LBD-중재된 Med1 응축은 감쇠된다. 하단 막대 그래프에서는 루시퍼라제 활성 측정에 의해 GAL4 DBD에 융합된 표시된 활성화 도메인의 전사 결과량을 보여준다. 10 nM 에스트로겐 (+E)의 도입은 리포터 전사 결과량을 증가시키는 한편, 10 nM 탐옥시펜 (+T)의 도입으로는 리포터 전사 결과량이 증가되지 않는다. 상기 검정법에서, 2일 동안 세포로부터 에스트로겐을 빼내었고, 그 다음 24 시간 동안 에스트로겐 또는 탐옥시펜으로 처리되었다.
도 40에서는 엔도크린-저항적 환자 돌연변이는 에스트로겐-독립적 Med1 응축 및 유전자 활성화를 모두 시킬 수 있음을 보여준다. Lac 결합 도메인-CFP-ER 활성화 도메인 (ER) 융합 단백질, Lac 결합 도메인-CFP-돌연변이체 (Y537S) ER 활성화 도메인 융합 단백질, 또는 Lac 결합 도메인-CFP-ER 돌연변이체 (D538G) 활성화 도메인 융합 단백질은 Lac 오페론 어레이를 품고 있는 U2OS 세포로 도입되었다. 공촛점 현미경 이미지의 상단 세트에서 CFP 신호는 에스트로겐의 존재 (E+) 또는 부재 (E-) 하에서 융합 단백질의 존재를 나타냄을 보여준다. 에스트로겐은 야생형 ER에 대한 응축물 형성을 상당히 증가시켰지만, 그러나 어느 하나의(either) 돌연변이체에 대한 응축물 형성은 유의적으로 영향을 주지 못하였다. 공촛점 현미경 이미지의 하단 세트에서는 에스트로겐의 존재 (E+) 또는 부재 (E-) 하에서 매개체 면역형광을 보여준다. 에스트로겐은 야생형 ER에 대한 응축물 형성을 상당히 증가시켰지만, 그러나 어느 하나의(either) 돌연변이체에 대한 응축물 형성은 유의적으로 영향을 주지 못하였다. 하단 막대 그래프에서 에스트로겐의 존재 (E+) 또는 부재 (E-) 하에서 루시퍼라제 활성 측정에 의해 GAL4 DBD에 융합된 표시된 활성화 도메인의 전사 결과량을 보여준다. 에스트로겐은 어느 하나의 돌연변이체와 비교하여 WT ER 활성화 도메인에서의 전사 결과량에 반드시 더 큰 증가를 일으켰다. 도 39와 동일한 실험 조건.
도 41에서는 엔도크린 저항적 ER 환자 돌연변이들은 리간드-독립적 응축물 형성을 현시함을 보여준다. 공촛점 현미경 이미지의 상단 두 개 열에서는 에스트로겐 존재 하에서 MED1/ER 응축물 형성을 보여준다. 이 응축물 형성은 탐옥시펜의 추가 첨가에 의해 감쇠된다. 하단 두 개 열에서는 MED1/돌연변이체 ER (Y537S) 응축물 형성은 상기 탐옥시펜의 첨가에 의해 영향을 받지 않음을 보여준다.
도 42에서는 에스트로겐이 MYC 종양유전자에서 MED1 응축물 형성을 자극함을 보여준다. 공촛점 현미경 이미지의 상단 열에서 MED1 및 Myc은 에스트로겐 부재에서 공동-국소화되지 않음을 보여준다. 현미경사진의 하단 열에서는 에스트로겐 존재 상태에서 MYC에서의 MED1 응축물 형성을 보여준다.
도 43A-43I에서는 액체-유사 이질성염색질 응축물들에서 MeCP2와 HP1α잔기를 보여준다. (도 43A) 뮤린 ESCs에서 내생성 테그된 MeCP2-GFP 및 Hoechst DNA 착색의 생-세포 공촛점 현미경. (도 43B) 뮤린 ESCs에서 내생성 테그된 HP1α-mCherry 및 Hoechst DNA 착색의 생-세포 공촛점 현미경. (도 43C) 뮤린 ESCs에서 이중-내생성 테그된 MeCP2-GFP 및 HP1α-mCherry의 생-세포 이미지. (도 43D) 내생성으로 테그된 MeCP2-GFP 뮤린 ESCs을 이용한 FRAP 실험의 공촛점 현미경 이미지. 표백-후 이미지에서는 광표백 사건 후 12초 시점의 복구를 보여준다. (도 43E) MeCP2-GFP 이질성염색질 응축물들에 대한 FRAP 데이터의 정량화. 광표백 사건은
도 44A-44J에서는 MeCP2가 시험관내 상-분리된 액체 소적을 형성함을 보여준다. (도 44A) 인간 MeCP2 단백질의 도해. 구조화된 메틸-결합 도메인 (MBD) 및 본질적으로 무질서화된 영역 (IDR-1 및 IDR-2)이 표시된다. PONDR VSL2 알고리즘을 이용하여 이들 단백질들에 따른 예측되는 무질서 득점들이 산출되었다. 5개 아미노산 슬라이딩 윈도우(sliding window)를 이용하여 잔기 당 순-전하가 산출되었다. (도 44B) MeCP2-GFP의 농도를 증가시키면서 소적 형성 검정법의 공촛점 현미경. (도 44C) MeCP2-GFP의 농도 증가에 따른 소적 면적의 분포를 나타내는 점 도표(dot plot). 각 조건의 경우에, 400개 소적이 분석되었다. (도 44D) 소적에서 단백질 농도의 농도 증가에 따른 MeCP2-GFP의 응축된 단백질 분취를 나타내는 막대 도표. 10개 이미지에 대한 평균 및 표준 편차가 도시된다. (도 44E) 시험관내 MeCP2-GFP 소적 융합에 따른 시간 경과 이미지. (도 44F) 시험관내 MeCP2-GFP 소적 FRAP의 이미지. (도 44G) 소적 형성 반응에서 염 농도를 증가시키면서 실행된 MeCP2-GFP의 소적 형성 검정법의 공촛점 현미경. (도 44H) NaCl의 농도를 증가시키면서 소적 형성 반응에서 소적 면적 분포를 나타내는 점 도표. 각 조건의 경우에, 400개 소적이 분석되었다. (도 44I) 소적에서 염 농도의 농도 증가에 따른 MeCP2-GFP의 응축된 단백질 분취를 나타내는 막대 도표. 10개 이미지에 대한 평균 및 표준 편차가 도시된다. (도 44J) 단백질 및 염 농도에 대한 함수로써 MeCP2-GFP 소적 형성의 상 다이어그램. 양성 조건은 채워진 원(filled in circles)으로 표시된다.
도 45A-45E에서는 MeCP2 응축물 형성이 C-말단 IDR 상에 따라 달라짐을 보여준다. (도 45A) MBD, IDR-1, IDR-2를 나타내는 MeCP2 단백질의 도해로써, 시험관내 소적 형성 및 생-세포 이미징 검정법에 이용된 전장 (FL)의 그리고 상이한 두 개의 절두(truncation) 단백질을 나타낸다. 막대 차트는 MeCP2를 따라 각 아미노산 위치에 대하여 RettBASE 데이터베이스에서 발견된 Rett 증후군 여성 환자들에서의 MECP2 코딩 돌연변이의 수를 도시한다. MeCP2 단백질 도메인의 도해 아래에는 넌센스(nonsense) 돌연변이, 프레임시프트(frameshift) 돌연변이, 그리고 미스센스(missense) 돌연변이의 위치를 나타낸다. (도 45B) MeCP2-GFP 전장 (FL) 및 IDR 절두 돌연변이체 (ΔIDR-1 및 ΔIDR-2)의 소적 형성 검정법의 공촛점 현미경. (도 45C) 뮤린 ESCs에서 만들어진 상이한 3가지 내생성으로 테그된 MeCP2-GFP 계통의 생-세포 공촛점 현미경. FL: 전장 MeCP2-GFP, ΔIDR-1: IDR-1 결손, 그리고 ΔIDR-2: IDR-2 결손. (도 45D) 상이한 내생성으로 테그된 계통에 대하여 핵실에 대하여 이질성염색질 바디(bodies)에서의 MeCP2-GFP 분할(partition) 계수의 정량화. 10개 세포에 대한 균 및 표준 편차를 도시한다. (도 45E) 전장 (FL), ΔIDR-1, 그리고 ΔIDR-2을 갖는 뮤린 ESCs에서 주요 새틀라이트(satellite) 반복부 발현의 RT-qPCR. 발현은 FL 및 Gapdh에 대해 정상화된다. 3개 복제의 평균 및 표준 편차를 도시한다.
도 46A-46D에서는 MeCP2 응축물들이 이질성염색질 인자들을 구획화할 수 있음(compartmentalize)을 보여준다. (도 46A) 핵 추출물(extract) 소적 형성 검정법의 도해. (도 46B) MeCP2-mCherry 및 MeCP2-ΔIDR-2-mCherry를 함유하는 핵 추출물 소적 형성 검정법의 공촛점 현미경 이미지. 추출물의 염 농도를 150 mM NaCl로 감소시킴으로써, 소적 형성이 개시되었다. (도 46C) 투입(input) 물질의 10% 및 2700 x g에서 원심분리 후, 핵 추출물 소적 형성 검정법의 펠렛 분취에서 발견되는 상대적 단백질 양을 도시하는, 표시된 단백질들에 대한 면역블랏(immunoblots). (도 46D) 도 46C에서의 면역블랏의 정량화. 각 단백질의 경우 각 소적 형성 반응에서 상기 펠렛 분취에서 발견되는 투입(input) 백분율을 검사한 막대 그래프를 나타낸다.
도 47A-47D에서는 MeCP2-IDR-2가 선호적으로 이질성염색질 응축물들을 분할함을 보여준다. (도 47A) MeCP2 IDR 분할 실험의 밑그림. 세포들은 mCherry-MeCP2-IDR-2 또는 mCherry 단독에 대한 발현 구조체로 형질감염되었다. 이질성염색질 응축물에 집중하는 능력은 핵질과 비교하여 이질성염색질 응축물로 선택적으로 분할되는 능력으로 평가되었다. (도 47B) MeCP2-IDR-2 또는 mCherry 대조군의 과다-발현을 하는 뮤린 ESCs의 생-세포 공촛점 현미경 이미지. 상자는 이질성염색질 응축물을 나타낸다. (도 47C) MeCP2-IDR-2 또는 mCherry 대조군의 과다-발현을 하는 뮤린 ESCs에서 이질성염색질 응축물들의 추가적인 줌-인(zoom-in) 실시예들. 축적 막대는 1 μm을 나타낸다. (도 47D) 핵질에 대하여 상대적으로 이질성염색질 응축물들에서 분할 계수의 정량화. 5개 복제의 평균 및 표준 편차를 도시한다.
도 48A-48F에서는 MeCP2가 마우스 뇌의 뉴런의 이질성염색질에 집중됨을 보여준다. (도 48A) 고-등급(high grade) 키메라 MeCP2-GFP 마우스의 내생성으로 테그된 MeCP2-GFP 뇌 섹션(sections)의 고정-세포(fixed cell) 공촛점 현미경. 뉴런 및 미세아교세포를 식별해내기 위하여 차례로 MAP2 및 PU.1에 대한 면역착색을 이용하였다. 2-월령 마우스로부터 10 μm 두께의 뇌 섹션을 수거하였다. (도 48B) 뉴런 및 미세아교세포에서 세포당 MeCP2-GFP 응축물 수의 정량화. 데이터는 3개 세포의 평균± 표준 편차로 나타낸다. (도 48C) 뉴런 및 미세아교세포에서 세포당 MeCP2-GFP 응축물 수의 정량화. 데이터는 뉴런의 경우 18개 응축물, 미세아교세포의 경우 28개 응축물의 평균 ± 표준 편차로 나타낸다. (도 48D) 내생성으로 테그된 MeCP2-GFP 키메라 마우스(2-월령)로부터 취한 급성 뇌 슬라이스에서 실행된 FRAP 실험의 생-세포 공촛점 현미경 이미지. 표백-후 이미지는 광표백 사건 후 12초 시점의 복구를 보여준다. (도 48E) 살아있는 뇌에서 MeCP2-GFP 이질성염색질 응축물들의 FRAP 데이터의 정량화. 광표백 사건은
도 49A-49B 에서는 MeCP2-GFP 및 HP1α-mCherry 응축물 수 및 용적을 나타낸다. (도 49A) 세포당 MeCP2-GFP 및 HP1α-mCherry 응축물 수의 정량화. n=5개 세포. (도 49B) MeCP2-GFP 및 HP1α-mCherry 응축물 용적의 정량화. MeCP2, n = 45개 응축물.
도 50A-50D에서는 MeCP2가 시험관내 상-분리된 액체 소적을 형성함을 보여준다. (도 50A) MeCP2의 아미노산 구성을 나타내는 잔기 당 인간 MeCP2 단백질 서열의 진화적(evolutionary) 보존을 나타내는 선 플롯과 함께, 인간 MeCP2 단백질의 확장 도해. 보존은 Jensen-Shannon 분산(divergence)으로 산출되었는데, 값이 클수록 서열 보존이 크다. (도 50B) 160 nM MeCP2-GFP의 소적 형성 검정법에 의한 공촛점 현미경 이미지. (도 50C) 10 μM HP1α-mCherry의 소적 형성 검정법에 의한 공촛점 현미경 이미지. (도 50D) 단백질 및 염 농도에 대한 함수로써 MeCP2-GFP 소적 형성의 상 다이어그램의 이미지.
도 51은 핵에서 신호전달 인자들과 전사 응축물 상호작용을 도시한다.
도 52A-52D에서는 신호전달 인자들이 생체내 슈퍼-인헨서에서 신호전달 의존적 응축물들을 형성함을 보여준다. (도 52A) Nanog 발생기 RNA에 대한 동시 RNA-FISH와 함께, β-카테닌, STAT3, SMAD3 및 MED1 의 면역형광에서 mES 세포 안에 Nanog 슈퍼-인헨서에서 신호전달 인자들의 응축된 핵 촛점의 존재를 실증한다. 고정화(fixation) 이전 24 시간에 WNT, JAK/STAT 및 TGF-β 신호전달 경로를 활성화시키기 위하여, 차례로 CHIR99021, LIF 및 액티빈(Activin) A 존재 하에서 24 시간 동안 세포들을 성장시켰다. Hoechst 착색을 이용하여 상기 핵 주변부(periphery)를 결정하였으며, 이 핵 주변부는 점선으로 강조표시되었다. 스피닝 디스크(spinning disk) 공촛점 현미경 상에서 이미징화에 100x 대물렌즈가 이용되었다. 적어도 10개 이미지로부터 각 신호전달 인자에 대한 RNA-FISH 촛점 상에 집중된 평균 RNA-FISH 신호 및 평균 IF 신호를 나타낸다. 무작위로 선별된 핵 위치들의 주변 평균 신호전달 인자 IF 신호는 최 우측 패널에 도시된다. 축적 막대는 5 μm을 나타낸다. (도 52B) Nanog 유전자와 연합된 슈퍼-인헨서에서 β-카테닌, STAT3, SMAD3 및 MED1의 점유를 도시하는 ChIP-seq 트랙. 판독 밀도는 빈(bin) 당 백만개당 판독 (rpm/bin)으로 도시되며, 슈퍼-인헨서는 적색 막대로 표시된다. (도 52C) 자극받지 않은 상태 또는 자극받은 상태에서 신호전달 인자들 β-카테닌, STAT3 및 SMAD3에 대한 mES 세포의 면역형광. 고정화 이전 24 시간에 WNT, JAK/STAT 및 TGF-β 신호전달 경로를 활성화시키기 위하여, 차례로 CHIR99021, LIF 또는 액티빈 A 존재 하에서 24 시간 동안 세포들을 자극시켰다. Hoechst 착색을 이용하여 상기 핵 주변부를 결정하였으며, 이 핵 주변부는 점선으로 강조표시되었다. 스피닝 디스크 공촛점 현미경 상에서 이미징화에 100x 대물렌즈가 이용되었다. 축적 막대는 5 μm을 나타낸다. (도 52D) 좌측: mEGFP-β-카테닌 공작된 HCT116 세포의 FRAP 실험의 대표 이미지. 황색 박스는 표적화된 표백을 겪은 누점(punctum)을 강조표시한다. 우측: mEGFP-β-카테닌 푼차(puncta)에 대한 FRAP 데이터의 정량화. 표백화(bleaching) 사건은 t = 0s에서 발생한다. 표백된 지역 및 표백안된 대조군의 경우, 배경-차감된 형광 강도는 표백-전 시점 (t = -4s)에 대하여 플롯된다. 데이터는 평균 +/- SEM (N=9)으로 플롯된다. Airyscan 검출기 및 63x 대물렌즈를 갖춘, Zeiss LSM 880 공촛점 현미경을 이용하여 이미지를 찍었다. 축적 막대는 2 μm를 나타낸다.
도 53A-53C에서는 정제된 신호전달 인자들은 시험관내에서 응축물들을 형성할 수 있음을 보여준다. (도 53A) 이 원고(manuscript)에 사용된 신호전달 인자들의 도메인 구조. DBD: DNA 결합 도메인, PID: 단백질 상호작용 도메인, CC: 코일드 코일(coiled coil) 도메인, DD: 이량체화 도메인, SH2: Src 상동성(homology) 도메인 2. 예측되는 본질적으로 무질서화된 영역 (IDR)은 적색 괄호로 표시된다. (도 53B) mEGFP-β-카테닌, mEGFP-STAT3 및 mEGFP-SMAD3의 상동형 소적 형성을 테스트하는 소적 형성 검정법의 일련의 농도의 대표 공촛점 이미지. 대조군으로써 mEGFP 단독이 포함된다 (좌측 패널). 상기 신호전달 인자들에 대한 분할 비율의 정량화 (우측 패널). 분할 비율은 테스트된 모든 농도에서 획득된 적어도 10개의 이미지에 대하여 소적 내부의 평균 형광 신호를 소적 외부의 평균 형광 신호로 나눔으로써 산출되었다. 모든 검정법은 125mM NaCl 존재 하에서 실행되었으며, 10% PEG-8000은 군집제로 이용되었다. 축적 막대는 2 μm를 나타낸다. (도 53C) 상기 신호전달 인자들에 대한 희석 소적 검정법. 최초 소적은 1.25μM에서 형성되었으며, 이미지화되었다. 그 다음, 남아있는 반응 혼합물은 4M NaCl를 함유하는 반응 완충제로 2-배 희석시켜, 2M NaCl의 최종 염 농도를 얻는다. 희석 전과 후의 소적의 대표 이미지를 도시한다.
도 54A-54D에서는 정제된 신호전달 인자들이 시험관내 Mediator 응축물들로 통합됨을 보여준다. (도 54A) 이미-존재하는 MED1-IDR 소적으로 신호전달 인자의 첨가를 현시하는 도해. mCherry-MED1-IDR 소적이 형성되며, 유리 접시에서 두었고, mEGFP-테그된 신호전달 인자들의 추가 전과 후를 이미지화하였다. (도 54B) MED-IDR 소적으로의 신호전달 인자 통합의 대표 이미지. 총 10분 동안 mEGFP-테그된 신호전달 인자 용액의 추가 전과 후의 실행된 mCherry-MED1-IDR 소적이 이미지화되었다. 이미징 획득이 시작된 후 30초에 신호전달 인자가 첨가되었다. 도시된 마지막 이미지는 이러한 이미지화 종료 시점에 대응한다. PEG-8000 존재 하에서 10μM의 MED1-IDR-mCherry는 소적 형성에 이용되었으며, 10uM의 mEGFP-β-카테닌, mEGFP-SMAD3 또는 mEGFP-STAT3은 PEG-8000 부재하에 첨가되었다. 축적 막대는 2 μm를 나타낸다. (도 54C) B와 동일한 조건을 이용하여, 희석된 GFP-테그된 신호전달 인자와 혼합된 사전-형성된 MED1-IDR-mCherry 소적에 대한 분할 비율이 산출되었다. 정량화를 위하여 적어도 10개의 이미지가 이용되었다. 소적은 당해 소적의 외부 지역의 강도와 비교하였을 때, 당해 소적의 내부 지역에서 GFP-테그된 인자에 대한 병합된 채널 및 신호 강도에서 요청되었다. 별표는 t-테스트, < 0.05로 획득한 p-값을 나타낸다. (도 54D) 생리학적 농도에 근접한 β-카테닌, STAT3 및 SMAD3을 이용한 제한된(limited) 희석 소적 검정법. 표시된 농도의 신호전달 인자들은 소적 형성 완충제 단독(125mM NaCL 및 10% PEG-8000) 또는 10 μM MED1-IDR와 복합된 소적 형성 완충제에 추가되었다. 축적 막대는 2 μm를 나타낸다.
도 55A-55E에서는 β-카테닌의 상 분리는 방향족 아미노산에 의존적임을 보여준다. (도 55A) 테스트된, 상이한 mEGFP-β-카테닌 절두된 단백질의 다이어그램. (도 55B) mEGFP-β-카테닌, mEGFP-N-말단-IDR, mEGFP-Armadillo 및 GFP-C-말단-IDR에 대한 상동형 소적 형성을 테스트하는 일련의 농도의 소적 형성 검정법의 대표 공촛점 이미지. 소적 검정법은 125mM NaCL 및 10% PEG-8000에서 실행되었다. (도 55C) 야생형 mEGFP-β-카테닌, 방향족 돌연변이체 mEGFP-β-카테닌 및 mEGFP의 상동형 소적 형성 능력을 테스트하는 일련의 농도의 소적 형성 검정법의 대표 공촛점 이미지. 소적 검정법은 125mM NaCL 및 10% PEG-8000에서 실행되었다. 축적 막대는 1 μm를 나타낸다. 상기에서 보여준 설명된 실험에 이용된 야생형 mEGFP-β-카테닌, 그리고 방향족에서 알라닌으로의 돌연변이체의 도메인 구조의 도해. (도 55D) 10 μM MED1-IDR-mCherry를 10μM의 야생형 mEGFP-β-카테닌 또는 방향족 돌연변이체 mEGFP-β-카테닌과 혼합시킨 이형성(heterotypic) 소적 형성 검정법의 대표 공촛점 이미지. 축적 막대는 1 μm를 나타낸다. (도 55E) 각각 적어도 10개 이미지에 대하여 인자들의 분할 비율이 정량화되었다. 소적은 당해 소적의 외부 지역의 강도와 비교하였을 때, 당해 소적의 내부 지역에서 인자에 대한 병합된 채널 및 신호 강도에서 요청되었다.
도 56A-56C에서는 표적 유전자들의 β-카테닌 및 활성화 처리는 방향족 아미노산에 의존적임을 보여준다. (도 56A) ChIP 실험의 도해. TdTomato-테그된 야생형 또는 방향족 돌연변이체 β-카테닌은 독시사이클린-유도성 프로모터 하에서 mES 세포에 안정적으로 통합되었다. 독시사이클린은 가교(crosslinking) 전 24시간 시점에 상기 배지에 첨가되었다. TdTomato에 대항하는 항체를 이용하여 ChIP를 실행하였다. TRE = 테트라사이클린 반응성 요소. (도 56B) (상단) Myc, Sp5, 그리고 Klf4 인헨서에서 이소성(ectopically)-발현된 야생형 또는 방향족 돌연변이체 β-카테닌의 ChIP-qPCR. 오차 막대는 3 회 복제(replicates)의 표준 편차를 나타낸다. 별표는 t-테스트 < 0.05로 획득된 p-값을 나타낸다. (하단) Myc, Sp5, 그리고 Klf4의 야생형 또는 방향족 돌연변이체 β-카테닌의 이소성(ectopic) 발현 후 mRNA 수준의 RT-qPCR. 오차 막대는 3 회 복제물(replicates)의 표준 편차를 나타낸다. 별표는 t-테스트 < 0.05로 획득된 p-값을 나타낸다. (도 56C) 컨센수스(consensus) TCF/LEF 모티프 10개 카피(copies)를 내포하는 합성 WNT-리포터를 이용한 루시퍼라제 검정법에서 야생형 또는 방향족 돌연변이체 β-카테닌은 HEK293T 세포에서 과다발현되었다. 3개 생물학적 복제물의 평균을 나타낸다. 오차 막대는 표준 편차를 보여준다. 별표는 t-테스트, < 0.05로 획득한 p-값을 나타낸다.
도 57A-57E에서는 β-카테닌-응축물 상호작용이 TCF 인자들과 독립적으로 발생할 수 있음을 보여준다. (도 57A) Lac 결합 도메인-CFP 또는 Lac 결합 도메인-CFP-MED1-IDR 구조체로 형질감염된 Lac-U2OS 세포들에서 β-카테닌의 면역형광, 스피닝 디스크 공촛점 현미경 상에서 100x 대물렌즈로 이미지화됨. Hoechst 착색을 이용하여 핵 주변을 결정하는데, 점선으로 강조표시된다. 정량화는 CFP 촛점에서 β-카테닌의 상대적 강도를 보여준다. 축적 막대는 5μm를 나타낸다. (도 57B) Lac 결합 도메인-CFP-MED1-IDR 구조체로 형질감염된 Lac-U2OS 세포에서 TCF4의 IF. 스피닝 디스크 공촛점 현미경에서 100x 대물렌즈를 이용하여 이미지를 획득하였다. 축적 막대는 5μm를 나타낸다. (도 57C) Lac 결합 도메인-CFP 또는 Lac 결합 도메인-CFP-MED1-IDR 구조체로 공동-형질감염된 U2OS 2-6-3 세포에서 과다발현된 TdTomato-테그된 야생형 또는 방향족 돌연변이체 β-카테닌의 형광 이미지, 스피닝 디스크 공촛점 현미경 상에서 100x 대물렌즈로 이미지화됨. Hoechst 착색을 이용하여 핵 주변을 결정하는데, 점선으로 강조표시된다. 정량화는 호출(called) CFP 촛점에서 과다-발현된 β-카테닌 형태의 상대적 강도를 보여준다. 축적 막대는 5μm를 나타낸다. (도 57D) HEK293T 세포에서 SOX9, SMAD7, KLF9 또는 GATA3의 인헨서에서 β-카테닌-GFP-키메라에 대한 ChIP-qPCR. 오차 막대는 평균의 표준 편차를 보여준다. 별표는 t-테스트 < 0.05로 획득된 p-값을 나타낸다. (도 57E) 컨센수스 TCF/LEF 모티프 10개 카피를 함유하는 합성 WNT-리포터와 복합된 β-카테닌-mEGFP-키메라를 과다-발현시키는 세포의 루시퍼라제 검정법. 3개 생물학적 복제물의 평균을 나타낸다. 오차 막대는 표준 편차를 보여준다. 별표는 t-테스트 < 0.05로 획득된 p-값을 나타낸다.
도 58A-58D에서는 신호전달 인자들이 생체내 슈퍼-인헨서에서 신호전달 의존적 응축물들을 형성함을 보여준다. (도 58A) miR290 유전자의 슈퍼-인헨서에서 β-카테닌, STAT3, SMAD3 및 MED1의 점유를 도시하는 ChIP-seq 트랙. 판독 밀도는 빈(bin) 당 백만개당 판독 (rpm/bin)으로 도시되며, 슈퍼-인헨서는 적색 막대로 표시된다. (도 58B) miR290 발생기 RNA에 대한 동시 RNA-FISH와 함께, β-카테닌, STAT3, SMAD3 및 MED1 의 면역형광에서 mES 세포 안에 miR290 슈퍼-인헨서에서 신호전달 인자들의 응축된 핵 촛점의 존재를 실증한다. 고정화에 앞서, CHIR99021, LIF 또는 액티빈 A 존재 하에 24 시간 동안 세포를 성장시켰다. Hoechst 착색을 이용하여 핵 주변을 결정하는데, 점선으로 강조표시된다. 스피닝 디스크 공촛점 현미경에서 이미지화에 100x 대물렌즈가 이용되었다. 적어도 10개 이미지로부터 각 신호전달 인자에 대한 RNA-FISH 촛점 상에 집중된 평균 RNA-FISH 신호 및 평균 IF 신호를 나타낸다. 무작위로 선별된 핵 위치들의 주변 평균 신호전달 인자 IF 신호는 최 우측 패널에 도시된다. 축적 막대는 5 μm을 나타낸다. (도 58C) Nanog에 대한 동시 DNA-FISH와 함께, β-카테닌에 대한 면역형광은 C2C12 세포에서 Nanog 슈퍼-인헨서에서 신호전달 인자들의 핵 촛점 부재를 실증한다. 고정화에 앞서, CHIR99021 존재 하에서 24 시간 동안 세포를 성장시켰다. Hoechst 착색을 이용하여 상기 핵 주변부를 결정하였으며, 이 핵 주변부는 점선으로 강조표시되었다. 스피닝 디스크 공촛점 현미경 상에서 이미징화에 100x 대물렌즈가 이용되었다. 적어도 10개 이미지로부터 각 신호전달 인자에 대한 DNA-FISH 촛점 상에 집중된 평균 DNA-FISH 신호 및 평균 IF 신호를 나타낸다. 무작위로 선별된 핵 위치들의 주변 평균 신호전달 인자 IF 신호는 최 우측 패널에 도시된다. 축적 막대는 5 μm를 나타낸다. (도 58D) HCT116 세포에서 내생성 β-카테닌과 비교하여 내생성으로 테그된 mEGFP-β-카테닌의 수준을 보여주는 웨스턴 블랏.
도 59에서는 β-카테닌, STAT3 및 SMAD3의 도메인 구조를 보여준다. DBD: DNA 결합 도메인, PID: 단백질 상호작용 도메인, CC: 코일드 코일(coiled coil) 도메인, DD: 이량체화 도메인, SH2: Src 상동성(homology) 도메인 2. 예측되는 본질적으로 무질서화된 영역 (IDR)은 적색으로 표시된다. 아미노산 당 PONDR VL3 득점을 이용하여 무질서를 예측하고, 아래에 플롯시켰다. 바코드 도표는 아래에 다른 아미노산의 위치를 나타낸다. 적색 상자는 단백질의 예측되는 IDRs에서 상단 3 개의 과다-제시된 아미노산을 나타낸다. 맨 아래 패널에서는 표시된 단백질에 대한 잔기 당 순-전하(NCPR)를 보여준다.
도 60A는 독시사이클린 유도성 프로모터 하에서 mES 세포에 통합된 야생형 및 돌연변이체 β-카테닌의 발현 수준을 보여주는 웨스턴 블랏이다. 1μg/ml 독시사이클린으로 세포를 24 시간 동안 유도하였고, TdTomato-테그된 β-카테닌의 발현에 대하여 FACS를 분류하고, 개별 콜로니들을 찍어내어 성장시킴으로써, 클론 세포 계통을 생성하였다.
도 61A-61B에서는 표적 유전자들의 β-카테닌 및 활성화 처리는 방향족 아미노산에 의존적임을 보여준다. (도 61A) Lac 결합 도메인-CFP-MED1-IDR 구조체로 형질감염된 U2OS2-6-3 세포에서 HP1α의 IF. 스피닝 디스크 공촛점 현미경에서 100x 대물렌즈를 이용하여 이미지를 획득하였다. 축적 막대는 5μm를 나타낸다. (도 61BB) HEK293T 세포에서 야생형 β-카테닌 또는 IDR-mEGFP-IDR 키메라 단백질의 수준을 보여주는 웨스턴 블랏. 히스톤 H3은 로딩(loading) 대조군으로 이용되었다.
도 62A-62F에서는 Pol II의 CTD가 Mediator 응축물들로 통합되고, 농축된다는 것을 보여준다. (도 62A) 전사 개시에서부터 신장으로의 전이 및 이 전이에서 Pol II CTD 포스포릴화의 역할을 묘사하는 모델. 개시 동안, 저-포스포릴화된 CTD를 갖는 Pol II는 Mediator와 상호작용한다. 상기 CTD의 CDK7 포스포릴화로 인하여 개시 부위의 하류 대략적으로 50-100bp에 있는 멈춘(paused) Pol II의 형성으로 이어지고, 후속적인 CDK9 포스포릴화는 방출 및 신장의 중지로 이어진다. 단순화를 위해, 우리는 CTD를 포스포릴화하여, 신장을 유도하는 CDK7 및 CDK9를 보여준다. 신장 동안, 포스포릴화된 CTD를 갖는 Pol II는 각종 RNA 프로세싱 인자들과 상호작용한다. (도 62B) GFP (GFP-CTD52)에 융합된 52개 헵타펩티드 반복부를 갖는 재조합 전장의 인간 CTD는 인간 Mediator 복합체 소적으로 통합됨을 보여주는 소적 실험의 대표 이미지. 정제된 인간 Mediator 복합체 (~200-300 nM; 방법 참고)는 135 mM 단가(monovalent) 염 및 10% PEG-8000 또는 16% Ficoll-400의 소적 형성 완충제에서 10 uM GFP 또는 GFP-CTD52와 혼합되었고, 표시된 필터를 갖춘 형광 현미경 상에서 가시화되었다. (도 62C) GFP-CTD52가 MED1-IDR 소적으로 통합됨을 보여주는 소적 실험의 대표 이미지. mCherry (mCherry-MED1-IDR)에 10 uM에서 융합된 정제된 인간 MED1-IDR은 125 mM NaCl 및 10% PEG-8000 또는 16% Ficoll-400의 소적 형성 완충제에서 3.3 uM GFP 또는 GFP-CTD52와 혼합되었고, 표시된 필터를 갖춘 형광 현미경 상에서 가시화되었다. (도 62D) 상기 CTD는 당해 CTD 반복 길이에 의존적으로, MED1-IDR 소적으로 농축된다. 26개 (GFP-CTD26) 또는 10개 (GFP-CTD10) 헵타펩티드 반복부를 갖는 CTD 절두 돌연변이체에 융합된 10 uM의 GFP, GFP-CTD52, 또는 GFP는 125 mM NaCl 및 16% Ficoll-400의 소적 형성 완충제에서 10 uM mCherry- MED1-IDR과 혼합되었고, 표시된 필터를 갖춘 형광 현미경 상에서 가시화되었다. (도 62E) 두 개의 전장의 CTD/MED1-IDR 소적 간의 융합 사건의 이미지. 소적 형성 조건은 도 62D와 동일하다. (도 62F) GFP-CTD52 및 MED1-IDR-mCherry의 이형성(heterotypic) 소적의 FRAP. 소적 형성 조건은 도 62D와 동일하다.
도 63A-63D에서는 상기 CTD의 포스포릴화에 의해 시험관내 MED1-IDR 응축물로 CTD 통합이 감소됨을 보여준다. (도 63A) CDK7-중재된 CTD 포스포릴화 (방법 참고)는 MED1-IDR 응축물로 통합될 수 있는 CTD 능력의 상실을 야기시킨다는 것을 보여주는 대표 이미지. (좌측) 10 uM의 mCherry-MED1-IDR은 125 mM NaCl 및 16% Ficoll-400의 소적 형성 완충제에서 3.3 uM GFP, GFP-CTD52 또는 GFP-포스포-CTD52와 혼합되었고, 표시된 필터를 갖춘 형광 현미경 상에서 가시화되었다. (우측) CDK7-중재된 포스포릴화와 함께, 또는 없이, MED1-IDR 소적에서 GFP-CTD52의 풍도 비율 (방법 참고). GFP의 풍도 비율은 1로 설정된다. 상자 그림에서 상자는 25 번째 백분위 수에서 75 번째 백분위 수로 확장된다. 상자 중앙의 선은 중앙값에 플롯된다. 위스커(whiskers)는 가장 작은 값으로 내려 가고, 가장 큰 값으로 올라간다. p-값은 양-단(two-tailed) Student t-검정에 의해 결정된다. (도 63B) CDK7-중재된 CTD 포스포릴화는 MED1-IDR 응축물로 통합될 수 있는 CTD 능력의 상실을 야기시킨다는 것을 보여주는 대표 이미지. (좌측) 10 uM의 mCherry-MED1- IDR은 125 mM NaCl 및 10% PEG-8000의 소적 형성 완충제에서 3.3 uM GFP, GFP-CTD52 또는 GFP-포스포-CTD52와 혼합되었고, 표시된 필터를 갖춘 형광 현미경 상에서 가시화되었다. (우측) 2a에서 도시된 바와 같이, CDK7-중재된 포스포릴화와 함께, 또는 없이, MED1-IDR 소적에서 GFP-CTD52의 풍도 비율. (도 63C) CDK9-중재된 CTD 포스포릴화는 MED1-IDR 응축물로 통합될 수 있는 CTD 능력의 상실을 야기시킨다(방법 참고)는 것을 보여주는 대표 이미지. (좌측) 10 uM의 mCherry-MED1-IDR은 125 mM NaCl 및 16% Ficoll-400의 소적 형성 완충제에서 10 uM GFP, GFP-CTD52 또는 GFP-포스포-CTD52와 혼합되었고, 표시된 필터를 갖춘 형광 현미경 상에서 가시화되었다. (우측) 도 63A에서 도시된 바와 같이, CDK9-중재된 포스포릴화와 함께, 또는 없이, MED1-IDR 소적에서 GFP-CTD52의 풍도 비율. (도 63D) CDK9-중재된 CTD 포스포릴화는 MED1-IDR 응축물로 통합될 수 있는 CTD 능력의 상실을 야기시킨다는 것을 보여주는 대표 이미지. (좌측) 10 uM의 mCherry-MED1-IDR은 125 mM NaCl 및 10% PEG-8000의 소적 형성 완충제에서 10 uM GFP, GFP-CTD52 또는 GFP-포스포-CTD52와 혼합되었고, 표시된 필터를 갖춘 형광 현미경 상에서 가시화되었다. (우측) 도 63A에서 도시된 바와 같이, CDK9-중재된 포스포릴화와 함께, 또는 없이, MED1-IDR 소적에서 GFP-CTD52의 풍도 비율.
도 64A-64B에서는 스플라이싱 응축물들은 활성 슈퍼-인헨서 구동된 유전자들에서 발생함을 보여준다. (도 64A) 고정된 마우스 배아 줄기 세포 (mESCs)에서 Nanog 및 Trim28의 발생기 RNA의 RNA FISH에 연결된 SRSF2의 대표 면역형광 (IF) 이미징. 우측에 있는 처음 두개 컬럼에서는 RNA FISH 촛점에 집중된 평균 RNA FISH 신호 및 평균 스플라이싱 인자 IF 신호를 보여준다 (97개 Nanog 촛점, 115개 Trim28 촛점이 이용되었다). 최 우측 컬럼에서는 무작위로 선별된 핵 위치에 집중된 스플라이싱 인자에 대한 평균 IF 신호를 보여준다 (방법 참고). Nanog 및 Trim28 용으로 이용된 RNA FISH 프로브의 위치는 이들의 각 유전자 모델에서 보여진다. (도 64B) 고정된 mESCs에서 Nanog 및 Trim28의 발생기 RNA의 RNA FISH에 연결된 SRRM1 및 SRSF1의 스플라이싱 인자들의 대표 IF 이미지. 우측에 있는 처음 두개 컬럼에서는 RNA FISH 촛점에 집중된 평균 RNA FISH 신호 및 평균 스플라이싱 인자 IF 신호를 보여준다(SRRM1의 경우, 137개 Nanog 촛점, 209개 Trim28 촛점이 이용되었고; SRSF1의 경우, 109개 Nanog 촛점, 248개 Trim28 촛점이 이용되었다). 최 우측 컬럼에서는 무작위로 선별된 핵 위치에 집중된 스플라이싱 인자에 대한 평균 IF 신호를 보여준다.
도 65A-65F에서는 포스포릴화된 CTD는 mESCs에서 SRSF2와 함께 공동국소화되며, 시험관내 SRSF2 소적으로 통합, 농축됨을 보여준다. (도 65A) mESCs의 Nanog 및 Trim28 좌에서 MED1, SRSF2 및 Pol II의 두 가지 상이한 포스포-형태 (포스포릴화안된 또는 세린 2 포스포릴화된)의 대표 ChIP-seq 트랙. y-축은 백만 당 판독을 나타낸다. (도 65B) 전사 시작 부위 (TSS)에서 전사 종료 부위 (TES)까지 유전자 바디(bodies)에 걸친 MED1, SRSF2 및 Pol II의 상이한 두 가지 포스포-형태 (포스포릴화안된 또는 세린 2 포스포릴화된)에 대한 백만 당 평균 ChIP-seq 판독 (RPM)의 Metagene 플롯, 상위 20% 가장 고도로 발현된 유전자들에서 TSS의 상류 2kb 및 TES의 하류 2kb. (도 65C) CTD가 CDK7에 의해 포스포릴화될 때, 당해 CTD는 SRSF2 소적으로 효과적으로 통합됨을 보여주는 소적 실험의 대표 이미지. (좌측) mCherry (mCherry-SRSF2)에 융합된 정제된 2.4 uM의 인간 SRSF2는 100 mM NaCl 및 16% Ficoll-400의 소적 형성 완충제에서 3.3 uM GFP, GFP-CTD52 또는 GFP-포스포-CTD52와 혼합되었고, 표시된 필터를 갖춘 형광 현미경 상에서 가시화되었다. (우측) CDK7-중재된 포스포릴화와 함께, 또는 없이, SRSF2 소적에서 GFP-CTD52의 풍도 비율 (방법 참고). GFP의 풍도 비율은 1로 설정된다. 상자 그림에서 상자는 25 번째 백분위 수에서 75 번째 백분위 수로 확장된다. 상자 중앙의 선은 중앙값에 플롯된다. 위스커는 가장 작은 값으로 내려 가고, 가장 큰 값까지 올라간다. p-값은 양-단 Student t-검정에 의해 결정된다. (도 65D) CTD가 CDK7에 의해 포스포릴화될 때, 당해 CTD는 SRSF2 소적으로 효과적으로 통합됨을 보여주는 소적 실험의 대표 이미지. (좌측) 2.4 uM의 mCherry-SRSF2은 100 mM NaCl 및 10% PEG-8000의 소적 형성 완충제에서 3.3 uM GFP, GFP-CTD52 또는 GFP-포스포-CTD52와 혼합되었고, 표시된 필터를 갖춘 형광 현미경 상에서 가시화되었다. (우측) 4c에서 도시된 바와 같이, CDK7-중재된 포스포릴화와 함께, 또는 없이, SRSF2 소적에서 GFP-CTD52의 풍도 비율. (도 65E) CTD가 CDK9에 의해 포스포릴화될 때, 당해 CTD는 SRSF2 소적으로 효과적으로 통합됨을 보여주는 소적 실험의 대표 이미지. (좌측) 2.4 uM의 mCherry-SRSF2은 120 mM NaCl 및 16% Ficoll-400의 소적 형성 완충제에서 10 uM GFP, GFP-CTD52 또는 GFP-포스포-CTD52와 혼합되었고, 표시된 필터를 갖춘 형광 현미경 상에서 가시화되었다. (우측) 도 65C에서 도시된 바와 같이, CDK9-중재된 포스포릴화와 함께, 또는 없이, SRSF2 소적에서 GFP-CTD52의 풍도 비율. (도 65F) CTD가 CDK9에 의해 포스포릴화될 때, 당해 CTD는 SRSF2 소적으로 효과적으로 통합됨을 보여주는 소적 실험의 대표 이미지. (좌측) 2.4 uM의 mCherry-SRSF2은 120 mM NaCl 및 10% PEG-8000의 소적 형성 완충제에서 10 uM GFP, GFP-CTD52 또는 GFP-포스포-CTD52와 혼합되었고, 표시된 필터를 갖춘 형광 현미경 상에서 가시화되었다. (우측) 도 65C에서 도시된 바와 같이, CDK9-중재된 포스포릴화와 함께, 또는 없이, SRSF2 소적에서 GFP-CTD52의 풍도 비율.
도 66A-66C에서는 CDK7 및 CDK9-중재된 시험관내 CTD 포스포릴화, 그리고 CDK7에 중재된 MED1-IDR 소적으로의 CTD 통합 상실은 ATP 의존적임을 보여준다. (도 66A) CDK7에 의한 Ser5 및 Ser2 잔기에서 GFP-CTD52의 포스포릴화를 보여주는 웨스턴 블랏. 항-GFP 항체에 의해 나타난 바와 같이, 각 조건에는 동량의 GFP-CTD52가 이용되었다. (도 66B) CDK9에 의한 Ser5 및 Ser2 잔기에서 GFP-CTD52의 포스포릴화를 보여주는 웨스턴 블랏. 항-GFP 항체에 의해 나타난 바와 같이, 각 조건에는 동량의 GFP-CTD52가 이용되었다. (도 66C) MED1-IDR 소적으로의 CTD 통합 상실에는 CDK7 및 ATP가 필요함을 보여주는 대표 이미지. 재조합 CDK7 및/또는 ATP (방법 참고)와 함께 항온처리된 10 uM의 GFP-CTD52는 125 mM NaCl 및 16% Ficoll-400의 소적 형성 완충제에서 10 uM mCherry-MED1-IDR과 혼합되었고, 표시된 필터를 갖춘 형광 현미경 상에서 가시화되었다.
도 67A-67C에서는 SRSF2가 포스포-CTD 상호작용 인자이며, CDK7에 의해 중재되는 SRSF2 소적으로의 CTD의 강화된 통합은 ATP 의존적임을 보여준다. (도 67A) 상기 CTD의 상이한 포스포-형태를 이용하여 풀-다운(pull-down)에 의해 농축된 상이한 Mediator 하위단위, SR 패밀리 스플라이싱 인자들, 그리고 스플라이스좀(spliceosome)의 성분들에 대한 질량분석법(mass spectrometry)으로부터 평균 iBAQ (강도-기반 절대 정량화) 풍도 득점을 보여주는 히스토그램(histogram). 상이한 모듈(modules)로부터의 Mediator 하위단위를 보여준다. 상기 스플라이싱 인자들의 경우, Ebmeier et al., (Cell Rep 20, 1173-1186 (2017))에서 탐지된 정본(canonical) SR 단백질 및 Pol II와 상호작용하는 것으로 간주되는 스플라이스좀 성분들을 나타낸다. 간략하게 설명하자면, 모든 샘플에 걸쳐 iBAQ 득점은 Ebmeier et al (2017)으로부터 내려받았다. 포스포릴화안된 전장 CTD (포스포안됨(Unphos)), TFIIH 포스포릴화된 전장 CTD (포스포 CDK7), 또는 p-TEFb 포스포릴화된 전장 CTD (포스포 CDK9)를 이용한 풀-다운에 대하여 다중 복제물로부터의 득점을 평균하였다. 각 단백질에 대한 평균 iBAQ 득점은 y-축 상에 플롯된다. (도 67B) 대조군 siRNA (좌측), 또는 표시된 인자에 대항하는 siRNA (우측)로 형질감염된 C2C12 세포에서 스플라이싱 인자들 SRSF2, SRRM1, 그리고 SRSF1의 대표 면역형광 (IF) 이미지. (도 67C) SRSF2 응축물로의 강화된 CTD 통합에는 CDK7 및 ATP가 필요함을 보여주는 대표 이미지. 재조합 CDK7 및/또는 ATP (방법 참고)와 함께 항온처리된 3.3 uM의 GFP-CTD52는 100 mM NaCl 및 10% PEG-8000의 소적 형성 완충제에서 1.2 uM mCherry-SRSF2와 혼합되었고, 표시된 필터를 갖춘 형광 현미경 상에서 가시화되었다.
도 68A-68D에서는 MYC 종양유전자는 종양 조직 및 암 세포들에서 Mediator 응축물들에 의해 점유됨을 보여준다. (도 68A) (좌측) 헤마토실린 및 에오신 착색된 ER+ 인간 침습성 유방의 관내 암종 (우측) ER+ 인간 유방암 조직에서 MYC 좌에 대한 MED1 또는 ER IF 및 RNA FISH의 공촛점 현미경 이미지. (도 68B) (좌측) 에스트로겐 존재 하에서 성장된 유방암 세포 계통 MCF7에서 MYC 좌에 대한 RNA FISH와 함께, ER 또는 MED1 IF의 공촛점 현미경 이미지. (우측) MCF7 세포의 MYC RNA FISH 촛점에서 MED1 (상단, n=23) 또는 ER (하단, n=18) IF의 풍도 분석 및 랜덤 촛점 분석. (도 68C) MCF7 세포에서 mEGFP-테그된 MED1의 FRAP. 우측에는 정량화를 나타냄, n=3, 평균 (녹색 선), 최적 선 (단일 흑색), 그리고 95% 신뢰 구간 (흑색 점선). (도 68D) 표시된 암 세포 계통에서 MYC 좌에 대한 MED1 IF 및 RNA FISH의 공촛점 현미경 이미지.
도 69A-69F에서는 ER이 Mediator와 함께, 에스트로겐-의존적, 탐옥시펜-민감성 응축물들을 형성함을 보여준다. (도 69A) (좌측) 비자극, 에스트로겐 자극, 또는 탐옥시펜 처리된 MCF7 세포들에서 MYC 좌에 대한 DNA FISH와 함께, MED1 IF의 공촛점 현미경 이미지. (우측) 에스트로겐 반응성 종양유전자에서 Mediator 응축물 상에서 에스트로겐 및 탐옥시펜 치료 효과를 보여주는 모델. (도 69B) MCF7 세포에서 표시된 조건에서의 MYC 발현의 RT-qPCR. (도 69C) (좌측) U2OS 세포에서 Lac 어레이의 도해. (상단 우측) 표시된 리간드의 MED1 IF와 함께 나타낸 Lac-CFP-ER-LBD 융합 단백질의 공촛점 현미경 이미지. (하단 우측) Lac 어레이에서 MED1 풍도의 정량화, n≥8. (도 69D) (상단) LAC-mCherry-ER-LBD로 형질감염되었으며, 탐옥시펜으로 처리된 mEGFP-MED1 내생성으로 테그된 U2OS 세포의 생-세포 이미지, 0분 및 30 분에서 이미지화됨. (하단) 30분 시점에서 표시된 리간드와 함께 Lac 어레이에서 풍도 비율의 정량화, n=3. (도 69E) (좌측) 시험관내 소적 검정법의 도해. (상단 우측) 표시된 리간드와 함께, ER-GFP 및 MED1-mCherry의 시험관내 소적 검정법의 공촛점 이미지. (하단 우측) 소적 거동의 도해. (도 69F) ER-MED1 소적 형성의 상(phase) 다이어그램 도해.
도 70A-70G에서는 호르몬 요법-저항적 ER 돌연변이들이 Mediator와 함께 구성적으로 응축됨을 보여준다. (도 70A) ER-MED1 소적 형성의 상(phase) 다이어그램 도해. (도 70B) 환자-유래된 ER 점 돌연변이 및 전좌(translocations)의 도해. (도 70C-도 70D) 표시된 리간드와 함께, GFP 및 MED1-mCherry에 융합된 표시된 ER 돌연변이체의 시험관내 소적 검정법. (도 70E) GAL4 전사활성화 검정법의 도해. (도 70F-도 70G) 표시된 리간드와 함께, GAL4-DBD ER LBD 야생형 또는 돌연변이체 단백질의 전사활성화의 활성, n=9, 별표는 에스트로겐 없이 ER에 대한 p<0.01을 나타낸다.
도 71A-71G에서는 MED1 과다발현은 Mediator 응축을 촉진시킴을 보여준다. (도 71A) ER-MED1 소적 형성의 상(phase) 다이어그램 도해. (도 71B) MCF7 세포들 또는 확립된 탐옥시펜 저항적 MCF7 세포 계통에서 MED1의 웨스턴 블랏. (도 71C) 표시된 리간드 존재 하에서 MED1의 저-농도(200nM) 또는 고-농도(1600nM)에서의 ER-GFP 및 MED1-mCherry의 소적 형성 검정법-MED1 채널에서 가시화됨. 하기에는 정량화를 나타낸다, n>20. (도 71D) Lac-ER-LBD 융합 단백질로 형질감염되고 (상단 열), MED1 IF를 거친 (하단 열), U2OS 세포의 공촛점 현미경 이미지. 하기에는 정량화를 나타낸다, n≥8. (도 71E) 탐옥시펜 존재 하에서 낮은 수준의 또는 높은 수준의 MED1에서 실행된 GAL4-ER LBD의 전사활성화 검정법, n=9. (도 71F) WT 또는 높은 수준의 MED1을 갖는 MCF7 세포를 탐옥시펜 처리에 의한 생존. 하기에는 정량화를 나타낸다, n=4. (도 71G) 높은 수준의 MED1 존재 하에서 에스트로겐-독립적 응축물 형성 및 종양유전자 활성화의 도해.
도 72A-72C에서는 MYC 종양유전자는 종양 조직 및 암 세포들에서 Mediator 응축물들에 의해 점유됨을 보여준다. (도 72A) 생검체된 유방암 표본으로부터 임상 데이터. (도 72B) 상기 ER+ 유방 암종 생검체 상에서 MED1 IF 및 DAPI 착색의 공촛점 현미경 이미지, MED1 푼차(puncta)가 보여진다. (도 72C) MCF7 MED1-mEGFP 세포 계통에서 MED1 수준의 웨스턴 블랏.
도 73A-73C에서는 ER이 Mediator와 함께, 에스트로겐-의존적, 탐옥시펜-민감성 응축물들을 형성함을 보여준다. (도 73A) mEGFP-MED1 U2OS Lac 세포를 생성시키기 위한 녹-인(knockin) 전략의 도해. (도 73B) U2OS-Lac 세포에서 mEGFP-테그된 MED1의 존재를 실증하는 웨스턴 블랏. (도 73C) 도 2E에 나타낸 시험관내 소적 검정법의 정량화, n>20.
도 74A-74C에서는 호르몬 요법-저항적 ER 돌연변이들이 Mediator와 함께 구성적으로 응축됨을 보여준다. (도 74A) 핫스팟 537 및 538을 갖는 ER 돌연변이의 빈도, cBioPortal 데이터베이스에서 220명의 환자로부터 얻은 데이터. (도 74B) 표시된 리간드와 함께, MED1 소적으로의 ER 돌연변이체 단백질의 정량화, n>20. (도 74C) ER 점 돌연변이체의 MED1 IF에 의한 Lac 검정법. 하기에는 풍도의 정량화를 나타낸다, n≥8.
도 75A-75B에서는 MED1 과다발현은 Mediator 응축을 촉진시킴을 보여준다. (도 75A) 표시된 리간드와 함께, MED1의 농도를 증가시킬 때, ER-GFP 및 MED1-mCherry의 소적 형성 검정법. (도 75B) 리간드 없이, 낮은 수준의 또는 높은 수준의 MED1 존재 하에서 실행된 GAL4-ER LBD의 전사활성화 검정법.
발명의 상세한 설명
달리 명시되지 않는 한, 본 발명의 실시는 기술 범위 내에 있는 세포 생물학, 세포 배양, 분자 생물학, 트랜스 제닉 생물학, 미생물학, 재조합 핵산 (가령, DNA) 기술, 면역학 및 RNA 간섭 (RNAi)의 통상적인 기술을 전형적으로 사용할 것이다. 이러한 특정 기술에 대한 비-제한적인 설명은 다음 간행물에서 찾을 수 있다: Ausubel, F., et al., (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols in Immunology, Current Protocols in Protein Science, and Current Protocols in Cell Biology, all John Wiley & Sons, N.Y., edition as of December 2008; Sambrook, Russell, and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 2001; Harlow, E. and Lane, D., Antibodies - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1988; Freshney, R.I., "Culture of Animal Cells, A Manual of Basic Technique", 5th ed., John Wiley & Sons, Hoboken, NJ, 2005. 치료제 및 인간 질환에 대한 정보는 Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 11th Ed., McGraw Hill, 2005, Katzung, B. (ed.) Basic and Clinical Pharmacology, McGraw-Hill/Appleton & Lange; 10th ed. (2006) 또는 11th edition (July 2009)에서 볼 수 있지만, 이에 국한되지 않는다. 유전자들 및 유전자 무질서에 대한 정보는 McKusick, V.A.: Mendelian Inheritance in Man. A Catalog of Human Genes and Genetic Disorders. Baltimore: Johns Hopkins University Press, 1998 (12th edition) 또는 더 최근 온라인 데이터베이스: Online Mendelian Inheritance in Man, OMIM™. McKusick-Nathans Institute of Genetic Medicine, Johns Hopkins University (Baltimore, MD) and National Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine (Bethesda, MD), as of May 1, 2010, ncbi.nlm.nih.gov/omim/ and in Online Mendelian Inheritance in Animals (OMIA), a database of genes, inherited disorders and traits in animal species (other than human and mouse), omia.angis.org.au/contact.shtml.에서 볼 수 있지만, 이에 국한되지 않는다. 여기에 언급된 모든 특허, 특허 출원 및 기타 간행물 (가령, 과학 기사, 서적, 웹 사이트 및 데이터베이스)은 그 전체가 참조로 편입된다. 명세서와 통합된 참고 문헌 사이에 충돌이 있는 경우, 명세서 (통합된 참조를 기반으로 할 수 있는 수정 사항 포함)가 우선한다. 달리 명시되지 않는 한, 용어의 표준 기술에서 허용되는 의미가 본원에서 사용된다. 다양한 용어에 대한 표준 약어가 여기에서 사용된다.
응축물들의 성분들을 표적화함으로써 전사 조정
응축물 단백질
전사 응축물들의 단백질 성분들중 많은 것들이 본질적 무질서 영역-일명, 본질적 (또는 본질적으로) 무질서화된 영역 (IDR) 또는 본질적 (또는 본질적으로) 무질서화된 도메인을 갖는다. 이들 용어 각각은 본 명세서 전체에서 상호 호환적으로 사용된다. mRNA 개시 또는 신장 복합체와 물리적으로 연합된 이질성염색질 응축물들 및 응축물들의 많은 성분들은 또한 IDRs을 갖는다. IDR은 안정적인 2차 및 3차 구조가 결여되어 있다. 일부 구체예들에서, IDR은 Ali, M., & Ivarsson, Y. (2018)에서 기술된 방법들에 의해 식별될 수 있다. High-throughput discovery of functional disordered regions. Molecular Systems Biology, 14(5), e8377.
본원에서 기술된 구성 및 방법들의 일부 구체예들에서, 응축물 성분은 전사 인자다. 본원에서 사용된 바와 같이, "전사 인자" (TF)란 특이적 DNA 서열에 결합함으로써 전사를 조절하는 단백딜이다. TFs는 일반적으로 DNA 결합 도메인 및 활성화 도메인을 함유한다. 일부 구체예들에서, 상기 전사 인자는 활성화 도메인 안에 IDR를 보유한다. 일부 구체예들에서, 상기 전사 인자 (TF)는 OCT4, p53, MYC 또는 GCN4, NANOG, MyoD, KLF4, SOX 패밀리 전사 인자, 또는 GATA 패밀리 전사 인자다. 일부 구체예들에서, 상기 TF는 신호전달 인자 (예컨데, TF와 신호전달 인자와의 상호작용에 의해 전사가 조정된다)에 의해 조정된다. 일부 구체예들에서, 상기 TF는 핵 수용체 (예컨데, 핵 호르몬 수용체, 에스트로겐 수용체, 레티노산 수용체-알파)이다. 핵 수용체들은 5개 내지 6개 상동성 도메인 (N-말단에서부터 C-말단 방향으로 A부터 F로 지정)으로 구성된 특징적인 모듈(modular) 구조를 나타내는 진화적으로 관련된 DNA-결합 인자의 거대한 슈퍼패밀리의 구성원이다. NRs의 활성은 리간드-결합 도메인 안의 포켓으로 다양한 소 분자 리간드의 결합에 의해 적어도 부분적으로 조정된다. 인간 게놈은 약 50개 NRs를 인코드한다. NR 슈퍼패밀리의 구성원에는 글루코코르티코이드, 미네랄로코르티코이드, 프로게스테론, 안드로겐, 그리고 에스트로겐 수용체들, 페록시좀 증식제-활성화된 (PPAR) 수용체들, 갑상샘 호르몬 수용체들, 레티노산 수용체들, 레티노이드 X 수용체들, NR1H 및 NR1I 수용체들, 그리고 올펀(orphan) 핵 수용체들 (즉, 특정 날짜까지 리간드가 식별되지 않은 수용체들)이 포함된다. 일부 구체예들에서, 핵 수용체 (NR)는 핵 수용체 하위패밀리 0 구성원, 핵 수용체 하위패밀리 1 구성원, 핵 수용체 하위패밀리 2 구성원, 핵 수용체 하위패밀리 3 구성원, 핵 수용체 하위패밀리 4 구성원, 핵 수용체 하위패밀리 5 구성원, 또는 핵 수용체 하위패밀리 6 구성원이다. 일부 구체예들에서,핵 수용체는 NR1D1 (핵 수용체 하위패밀리 1, 그룹 D, 구성원 1), NR1D2 (핵 수용체 하위패밀리 1, 그룹 D, 구성원 2), NR1H2 (핵 수용체 하위패밀리 1, 그룹 H, 구성원 2; 동의어: 간 X 수용체 베타), NR1H3 (핵 수용체 하위패밀리 1, 그룹 H, 구성원 3; 동의어: 간 X 수용체 알파), NR1H4 (핵 수용체 하위패밀리 1, 그룹 H, 구성원 4), NR1I2 (핵 수용체 하위패밀리 1, 그룹 I, 구성원 2; 동의어: 프레그난 X 수용체), NR1I3 (핵 수용체 하위패밀리 1, 그룹 I, 구성원 3; 동의어: 구성적 안드로스탄 수용체), NR1I4 (핵 수용체 하위패밀리 1, 그룹 I, 구성원 4), NR2C1 (핵 수용체 하위패밀리 2, 그룹 C, 구성원 1), NR2C2 (핵 수용체 하위패밀리 2, 그룹 C, 구성원 2), NR2E1 (핵 수용체 하위패밀리 2, 그룹 E, 구성원 1), NR2E3 (핵 수용체 하위패밀리 2, 그룹 E, 구성원 3), NR2F1 (핵 수용체 하위패밀리 2, 그룹 F, 구성원 1), NR2F2 (핵 수용체 하위패밀리 2, 그룹 F, 구성원 2), NR2F6 (핵 수용체 하위패밀리 2, 그룹 F, 구성원 6), NR3C1 (핵 수용체 하위패밀리 3, 그룹 C, 구성원 1; 동의어: 글루코코르티코이드 수용체), NR3C2 (핵 수용체 하위패밀리 3, 그룹 C, 구성원 2; 동의어: 알도스테론 수용체, 미네랄로코르티코이드 수용체), NR4A1 (핵 수용체 하위패밀리 4, 그룹 A, 구성원 1), NR4A2 (핵 수용체 하위패밀리 4, 그룹 A, 구성원 2), NR4A3 (핵 수용체 하위패밀리 4, 그룹 A, 구성원 3), NR5A1 (핵 수용체 하위패밀리 5, 그룹 A, 구성원 1), NR5A2 (핵 수용체 하위패밀리 5, 그룹 A, 구성원 2), NR6A1 (핵 수용체 하위패밀리 6, 그룹 A, 구성원 1), NR0B1 (핵 수용체 하위패밀리 0, 그룹 B, 구성원 1), NR0B2 (핵 수용체 하위패밀리 0, 그룹 B, 구성원 2), RARA (레티노산 수용체, 알파), RARB (레티노산 수용체, 베타), RARG (레티노산 수용체, 감마), RXRA (레티노이드 X 수용체, 알파; 동의어: 핵 수용체 하위패밀리 2 그룹 B 구성원 1), RXRB (레티노이드 X 수용체, 베타; 동의어: 핵 수용체 하위패밀리 2 그룹 B 구성원 2), RXRG (레티노이드 X 수용체, 감마; 동의어: 핵 수용체 하위패밀리 2 그룹 B 구성원 3), THRA (갑상샘 호르몬 수용체, 알파), THRB (갑상샘 호르몬 수용체, 베타), AR (안드로겐 수용체), ESR1 (에스트로겐 수용체 1), ESR2 (에스트로겐 수용체 2; 동의어: ER 베타), ESRRA (에스트로겐-관련된 수용체 알파), ESRRB (에스트로겐-관련된 수용체 베타), ESRRG (에스트로겐-관련된 수용체 감마), PGR (프로게스테론 수용체), PPARA (페록시좀 증식제-활성화된 수용체 알파), PPARD (페록시좀 증식제-활성화된 수용체 델타), PPARG (페록시좀 증식제-활성화된 수용체 감마), VDR (비타민 D (1,25-디하이드록시비타민 D3) 수용체)이다.
일부 구체예들에서, 상기 핵 수용체는 단백질가수분해성 절단에 의해 생성된 핵 수용체의 자연 발생적 절두된 형태, 이를 테면, 절두된 RXR 알파, 또는 절두된 에스트로겐 수용체다. 일부 구체예들에서, 수용체, 예컨데, NR은 HSP70 클라이언트(client)다. 예를 들면, 안드로겐 수용체 (AR) 및 글루코코르티코이드 수용체 (GR)는 HSP70 클라이언트다. NRs에 관련된 방대한 정보는 Germain, P., et al., Pharmacological Reviews, 58:685-704, 2006에서 찾아볼 수 있는데, 여기에서는 핵 수용체 명명법 및 구조와 관련된 리뷰, 그리고 NR 하위패밀리의 검토용 Pharmacological Reviews의 동일한 주제에서 다른 논문을 제공한다). 일부 구체예들에서, HSP90A 클라이언트는 스테로이드 호르몬 수용체 (예컨데, 에스트로겐, 프로게스테론, 글루코코르티코이드, 미네랄로코르티코이드, 또는 안드로겐 수용체), PPAR 알파, 또는 PXR이다. 일부 구체예들에서, 상기 핵 수용체 (NR)는 리간드-의존적 NR이다. 리간드-의존적 NR은 당해 NR에 리간드의 결합으로 당해 NR의 활성이 조정되는 것을 특징으로 한다. 일부 구체예들에서, 리간드-의존적 NF에 리간드의 결합으로 당해 NR의 형태학적 변화가 야기되고, 이로써 예컨데, 당해 NR의 핵 전좌, 당해 NR로부터 한 가지 또는 그 이상의 단백질의 해리, 당해 NR의 활성화, 또는 당해 NR의 억제(repressesion)이 발생된다. 일부 구체예들에서, 상기 NR은 리간드 결합 시에 야생형 NR이 가지는 한 가지 또는 그 이상의 활성 (예컨데, 당해 NR의 핵 전좌, 당해 NR로부터 한 가지 또는 그 이상의 단백질의 해리, 당해 NR의 활성화, 또는 당해 NR의 억제)이 결여된 돌연변이체다. 일부 구체예들에서, 상기 NR은 야생형 NR에서 리간드 의전적인 리간드-결합 독립적 활성 (예컨데, 당해 NR의 핵 전좌, 당해 NR로부터 한 가지 또는 그 이상의 단백질의 해리, 당해 NR의 활성화, 또는 당해 NR의 억제)을 갖는 돌연변이체다. 일부 구체예들에서, 상기 핵 수용체는 동족 리간드에 결합될 때, 전사를 활성화시킨다. 일부 구체예들에서, 상기 핵 수용체는 동족 리간드의 부재 하에서 전사를 활성화시키는 돌연변이 핵 수용체다.
NRs는 광범위한 생물학적 프로세스, 그 중에서도 이를 테면, 발생, 분화, 생식, 면역 반응, 대사 규제, 그리고 생체이물성 대사(xenobiotic metabolism), 뿐만 아니라 다양한 병인적 상태에서 중요한 역할을 한다. NRs는 약물 표적의 주용한 부류를 나타낸다. NRs의 약물학적 조절(modulation) (예컨데, NRs를 함유하는 전사 응축물들의 조절에 의해)는 암, 자가면역, 대사, 그리고 염증성/면역 시스템 장애 (예컨데, 관절염, 천식, 알레르기) 뿐만 아니라 거부 가능성을 줄이기 위한 이식 후 면역 억제. 이식-후 면역억압울 포함하는 다양한 장애에 유용할 수 있다. 내생성 및/또는 외인성 소 분자 리간드(들)과의 상호작용에 추가하여, NRs는 다양한 내생성 단백질들, 이를 테면, 이들의 활성을 조정할 수 있는 이량체화 짝(partners), 공동활성제들, 공동억제제, 유비퀴틴 라이게이즈(ligases), 키나제(kinases), 포스파타제(phosphatases)와 상호작용할 수 있다.
핵 수용체 리간드들은 일부 NRs의 활성을 조정한다. 일부 리간드들은 NR 활성을 자극한다. 이러한 리간드를 "작용제(agonist)"라고 지칭할 수 있다. 일부 리간드들은 작용제의 부재 하에서 NR의 활성 또는 다른 리간드-의존적 TF의 활성에 영향을 주지 않는다. 그러나, "길항제(antagonist)"로 지칭될 수 있는 상기 리간드는 예컨데, 단백질에서 상기 작용제와 동일한 결합 부위에 경쟁적 결합을 통하여, 또는 당해 단백질의 상이한 부위에 결합함으로써, 이 작용제의 효과를 저해시킬 수 있다. 특정 NRs는 작용제의 부재 하에서 낮은 수준의 유전자 전사를 촉진시킨다 (이 또한 기본적 또는 구성적 활성이라고 지칭됨). 핵 수용체들에서 기저 수준의 활성을 감소시키는 리간드들을 역(inverse) 작용제로 지칭될 수 있다.
일부 구체예들에서, 상기 전사 인자는 표 S3에 열거된 전사 인자다. 일부 구체예들에서, 상기 전사 인자는 매개체 성분 (예컨데, 표 S3에 열거된 매개체 성분)과 상호작용하는 전사 인자다.
일부 구체예들에서, 상기 TF는 신호전달 인자에 의해 조절되는 활성을 보유한 TF이다. 일부 구체예들에서, 상기 신호전달 인자는 IDR을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 신호전달 인자는 TCF7L2, TCF7, TCF7L1, LEF1, 베타-카테닌, SMAD2, SMAD3, SMAD4, STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5A, STAT5B, STAT6, 또는 NF-κB이다. 본원에서 기술된 구성 및 방법들의 일부 구체예들에서, 신호전달 인자는 NF-kB, FOXO1, FOXO2, FOXO4, IKK알파, CREB, Mdm2, YAP, BAD, p65, p50, GLI1, GLI2, GLI3, YAP, TAZ, TEAD1, TEAD2, TEAD3, TEAD4, STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5A, STAT5B, STAT6, AP-1, C-FOS, CREB, MYC, JUN, CREB, ELK1, SRF, NOTCH1, NOTCH2, NOTCH3, NOTCH4, RBPJ, MAML1, SMAD2, SMAD3, SMAD4, IRF3, ERK1, ERK2, MYC, TCF7L2, TCF7, TCF7L1, LEF1, 또는 베타-카테닌일 수 있다.
본원에서 기술된 구성 및 방법들의 일부 구체예들에서, 응축물 성분은 표 S1에 열거된 단백질이다. 일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 임의의 구성 또는 방법들에서 응축물 성분은 표 S1에 열거된 단백질의 IDR을 포함한다. 일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 임의의 구성 또는 방법들에서 응축물 성분은 표 S1에 열거된 단백질과 연합된다. 일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 임의의 구성 또는 방법들에서 응축물 성분은 표 S1에 열거된 단백질의 IDR과 연합된다. 일부 구체예들에서, 응축물 성분은 표 S3에서 열거된 매개체 성분이다.
표 S1, "IDR 길이 (aa)"는 무질서%에 당해 단백질의 총 길이를 곱하여 산출하였다. Potenza, et al., "MobiDB 2.0: an improved database of intrinsically disordered and mobile proteins," Nucleic Acids Res. 2015 Jan;43 (Database issue):D315-20 (이는 본원의 참고자료에 편입됨)에서 제시된 방법을 이용하여 주어진 단백질에 대한 무질서%를 구할 수 있다.
이들 무질서화된 영역에서의 아미노산 서열 모티프 또는 편향(biases)의 수가 확인되었다. .
이들 모티프는 응축물 형성, 유지, 해체 또는 규제에 참여한다고 제한된다. (도 2A). 단백질 모티프의 임의의 하나의 유형과 특이적으로 상호작용하는 펩티드, 핵산 또는 화학적 소 분자는 응축물 형성, 구성, 유지, 해체 또는 규제에 영향을 줄 수 있고, 따라서 이러한 모티프를 이용하는 응축물들의 전사 결과량에도 변경이 있을 것으로 예측될 것이다(도 2B). 따라서, 전사 응축물을 조절함으로써 한 가지 또는 그 이상의 유전자들의 발현이 영향을 받을 수 있다.
예를 들자면, 일부 구체예들에서, 전사 응축물을 조절함으로써 인헨서 또는 슈퍼-인헨서 (SE)에 의해 제어되는 유전자들의 발현이 조절될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, "슈퍼-인헨서"란 매우 높은 밀도의 전사 도구에 의해 점유된 인헨서 클러스터이며, 특정 SEs는 세포 정체성(예컨데, 세포 성장, 세포 분화)에 특히 중요한 역할을 하는 유전자들을 규제한다. 본원에서는 임의의 인헨서 또는 슈퍼-인헨서의 조절를 고려한다. 예시적인 슈퍼-인헨서는 2013년 10월 25일자로 제출된, PCT 국제 출원 번호. PCT/US2013/066957 (대리인 서류 번호. WIBR-137-WO1)(이의 전문이 본원의 참고자료에 편입된다)에 개시된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 구절 "슈퍼-인헨서 성분(super-enhancer component)"이란 정상적인 인헨서 또는 슈퍼-인헨서 이외의 인헨서와 반대로, 슈퍼-인헨서에서는 더 높은 국소 농도를 갖거나, 또는 더 높은 점유를 나타내는, 성분, 이를 테면, 단백질을 지칭하는데, 구체예들에서, 연합된 유전자의 발현 증가에 기여한다. 한 구체예에서, 상기 슈퍼-인헨서 성분은 핵산 (예컨데, RNA, 예컨데, 상기 슈퍼-인헨서로부터 전사된 eRNA, 즉, eRNA)이다. 한 구체예에서, 상기 핵산은 염색체 핵산이 아니다. 한 구체예에서, 상기 슈퍼-인헨서 성분은 전사의 활성화 또는 규제에 관련된다. 일부 구체예들에서, 상기 슈퍼-인헨서 성분은 RNA 중합효소 II, Mediator, 코헤신(cohesin), Nipbl, p300, CBP, Chd7, Brd4, 그리고 esBAF의 성분들 (Brg1) 또는 Lsd1-Nurd 복합체 (예컨데, RNA 중합효소 II)를 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 슈퍼-인헨서 성분은 전사 인자이다. 일부 구체예들에서, 상기 전사 인자는 OCT4, p53, MYC, 또는 GCN4이다. 일부 구체예들에서, 상기 전사 인자는 IDR (예컨데, 상기 전사 인자의 활성화 도메인 안에 IDR)을 갖는다. 일부 구체예들에서, 상기 전사 인자는 표 S3에서 열거된 전사 인자의 활성화 도메인을 갖는다. 일부 구체예들에서, 상기 전사 인자는 표 S3에서 열거된 전사 인자의 IDR을 갖는다. 일부 구체예들에서, 상기 전사 인자는 표 S3에서 열거되어 있다. 일부 구체예들에서, 상기 전사 인자는 매개체 성분 (예컨데, 표 S3에 열거된 매개체 성분)과 상호작용하는 전사 인자다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "전사 인자(transcription factor)"란 DNA 결합 도메인을 이용하여 DNA의 특정 부분에 결합하고, DNA로부터 RNA로 유전자 정보의 전달(또는 전사)를 제어하는 시스템의 일부인 단백질을 지칭한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 전사 활성제 도메인 (AD)이란 전사 인자의 영역이며, 이 영역은 DNA 결합 도메인과 함께 프로모터로부터 전사를 활성화시킬 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 AD는 상기 전사 인자 DNA-결합 도메인을 포함하지 않는다. 일부 구체예들에서, 상기 AD는 Violaine Saint-
et al., Gen Res, 2015에서 특정된 인간 전사 인자로부터 유래된다. 일부 구체예들에서, 상기 AD는 IDR을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 IDR은 적어도 약 5개, 10개, 15개, 20개, 30개, 40개, 50개, 60개, 75개, 100개, 150개, 또는 그 이상의 무질서화된 아미노산 (예컨데, 인접(contiguous) 무질서화된 아미노산)이다. 일부 구체예들에서, D2P2 (Oates et al., 2013)를 이용한 알고리즘의 적어도 75%가 당해 잔기가 무질서화될 것으로 예상한다면, 이 아미노산은 무질서화된 아미노산으로 간주된다. 일부 구체예들에서, 식별된 전장 AD의 활성화 수용력(capacity)에서 예를 들면, 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 그 이상을 유지하는 당해 AD의 단편이 선별될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "인헨서"란 유전자의 전사를 강화시키기 위하여 단백질(예컨데, 전사 인자들)이 결합하는 DNA의 짧은 영역을 지칭한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "전사 공동활성제(transcriptional coactivator)"란 유전자의 전사를 촉진시키기 위하여, 전사 인자들과 상호작용하는 단백질 또는 단백질들의 복합체를 지칭한다. 일부 구체예들에서, 상기 전사 공동활성제는 Mediator이다. 일부 구체예들에서, 상기 전사 공동활성제는 Med1 (Gene ID: 5469) 또는 MED15이다. 일부 구체예들에서, 상기 전사 공동활성제는 Mediator 성분이다. 본원에서 사용된 바와 같이, "Mediator 성분"이란 자연 발생적 Mediator 복합체 폴리펩티드의 아미노산 서열과 동일한아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함하거나, 또는 이 폴리펩티드로 구성된다. 상기 자연 발생적 Mediator 복합체 폴리펩티드는 세포에서 발생하거나, 또는 세포로부터 정제된 Mediator 복합체에서 발견된 예컨데, 대략적으로 30개의 폴리펩티드중 임의의 것일 수 있다 (예컨데, Conaway et al., 2005; Kornberg, 2005; Malik and Roeder, 2005 참고). 일부 구체예들에서, 자연 발생적 Mediator 성분은 Med1 - Med 31 중 임의의 것, 또는 당분야에 공지된 자연 발생적 Mediator 폴리펩티드 중 임의의 것이다. 예를 들면, 자연 발생적 Mediator 복합체 폴리펩티드는 Med6, Med7, Med10, Med12, Med14, Med15, Med17, Med21, Med24, Med27, Med28 또는 Med30일 수 있다. 일부 구체예들에서, Mediator 폴리펩티드는 Med11, Med17, Med20, Med22, Med 8, Med 18, Med 19, Med 6, Med 30, Med 21, Med 4, Med 7, Med 31, Med 10, Med 1, Med 27, Med 26, Med14, Med15 복합체에서 볼 수 있는 하위단위(subunit)다. 일부 구체예들에서, Mediator 폴리펩티드는 Med12/Med13/CDK8/사이클린(cyclin) 복합체에서 볼 수 있는 하위단위다. Mediator에 관한 더 상세한 내용은 PCT 국제 출원 번호. WO 2011/100374에 기술되며, 이의 교시 내용은 본 명세서에 전문이 참고자료에 편입된다.
응축물 형성에 참여하는 단백질내 임의의 하나의 유형의 모티프와 특이적으로 상호작용하는 펩티드, 핵산 또는 화학적 소 분자 (예컨데, 본원에서 기술된 화합물, 소 분자, 제제)는 당해 응축물에서 당해 화합물의 선호적인 축적을 야기시킬 수 있고, 이로써 응축물 연합된 기능의 거동에 선호적으로 영향을 주도록 작용될 수 있다. 예를 들면, 상기 화합물은 상기 응축물을 안정화시키거나, 또는 해체시키고, 따라서 전사가 조절된다. 일부 구체예들에서, 상기 화합물은 상기 응축물을 안정화시킬 수 있거나, 또는 해체시킬 수 있고, 따라서 유전자 침묵화가 조절된다. 일부 구체예들에서, 상기 화합물 상기 응축물을 안정화시킬 수 있거나, 또는 해체시킬 수 있고, 따라서 mRNA 개시 또는 신장 (예컨데, 스플라이싱)이 조절된다. 일부 측면들에서, 방법은 표 S2에 열거된 모티프와 물리적으로 연합된 화합물을 식별해내는 것을 포함한다. 일부 측면들에서, 방법은 핵 수용체 AD의 IDR과 물리적으로 연합된 화합물을 식별해내는 것을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 핵 수용체는 질환과 연합된 돌연변이 핵 수용체이다. 일부 구체예들에서, 상기 돌연변이 핵 수용체는 유방암과 연합된다. 본원에서 기술된 방법들 및 화합물들의 일부 구체예들에서, 상기 핵 수용체는 돌연변이체 에스트로겐 수용체 (예컨데, 에스트로겐 수용체 알파) (예컨데, Y537S ESR1, D538G ESR1)이다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 이질성염색질 또는 유전자 침묵화 응축물의 성분 (예컨데, 슈퍼-인헨서 안에 메틸화된 DNA, 메틸-DNA 결합 단백질, 억압제, 또는 메틸화된 DNA와 상호작용하는 화합물)과 상호작용하는 화합물을 식별해내는 것을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 개시 또는 신장 복합체와 물리적으로 연합된 응축물과 선호적으로 상호작용하는 화합물을 식별해내는 것을 포함한다.
따라서, 본 발명의 일부 측면들은 세포에서 한 가지 또는 그 이상의 유전자 전사를 조정하는 방법에 관계하며, 이 방법은 한 가지 또는 그 이상의 유전자들과 연합된 응축물 (예컨데, 전사 응축물)의 형성, 구성, 유지, 해체를 조절하는 것을 포함한다. 본 발명의 일부 측면들은 유전자 침묵화를 조정하는 방법 (예컨데, 한 가지 또는 그 이상의 유전자들의 전사 억압, 이질성염색질에서 한 가지 또는 그 이상의 유전자들의 전사 억압)에 관계하며, 이 방법은 한 가지 또는 그 이상의 유전자들과 연합된 응축물의 형성, 구성, 유지, 해체 및/또는 규제를 조절하는 것을 포함한다. 본 명세서의 일부 측면들은 mRNA 개시 또는 신장의 조정에 관한 것이며, 이는 개시 또는 신장 복합체와 물리적으로 연합된 응축물의 형성, 구성, 유지, 해체 및/또는 규제의 조정을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이 "조절(modulating)" (그리고 이의 동사 형태, 이를 테면, "조절하다")이란 정성적 또는 정량적 변화(change), 변경(alteration), 또는 변형(modification)을 야기하거나, 또는 용이하게 한다는 것을 의미한다. 이러한 변화는 정성적 또는 정량적 측면의 증가 또는 감소일 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
용어 "증가된", "증가하다" 또는 "강화하다"란 예를 들면, 통계학적으로 상당한 양이 증가 또는 강화일 수 있다. 일부 경우들에서, 예를 들면, 참조 수준 (예컨데, 대조군)과 비교하였을 때 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 100% 요소들이 증가되거나 또는 감소될 수 있으며, 그리고 이들 범위는 간결함을 위해 완전히 열거되지 않은 임의의 정수 범위 (가령, 2%, 14%, 28% 등)을 포함하는 것으로 이해될 것이다. 다른 경우들에서, 참조 수준과 비교하였을 때, 요소는 적어도 약 2-배, 적어도 약 3-배, 적어도 약 4-배, 적어도 약 5-배 적어도 약 10-배 또는 그 이상으로 증가되거나, 또는 강화될 수 있다.
용어 "감소하다(decrease)", "축소하다(reduce)", "축소되다", "축소(reduction)", 및 "저해하다(inhibit)"란 예를 들면, 참조 (예컨데, 대조군)에 비교하였을 때, 통계학적으로 유의적인 양으로 감소하거나 또는 축소된다는 것을 의미할 수 있다. 일부 경우들에서, 요소는 참조 수준과 비교하였을 때, 예를 들면, 감소된다 또는 축소되다 적어도 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 감소되거나 또는 축소된 것일 수 있고, 최대로 예를 들면, 당해 요소의 완전한 부재도 포함된다. 이러한 범위는 간결함을 위해 완전하게 나열되지 않은 임의의 정수 범위(예컨데, 6%, 18%, 26% 등)를 포함하는 것으로 이해될 것이다.
예를 들면, 유전자의 전사 조절에는 유전자 전사의 속도 또는 빈도의 증가 또는 감소가 포함하며; 응축물 형성의 조절에는 당해 응축물 형성 속도의 증가 또는 감소, 또는 형성이 일어나거나 또는 일어나지 않는 것이 포함되며; 응축물의 구성 조절에는 당해 응축물과 연합된 성분 수준의 증가 또는 감소가 포함되며; 응축물 유지의 조절에는 당해 응축물 유지 속도의 증가 또는 감소가 포함되며; 상기 응축물 해체의 조절에는 당해 응축물 해체 속도의 증가 또는 감소, 및 당해 응축물 해체의 방지 또는 억압이 포함되며; 조절 응축물 규제의 조절에는 응축물들의 세포 규제 변형이 포함된다. 유전자 침묵화 조절에는 당해 유전자의 전사 억제의 증가 또는 감축이 포함된다. mRNA 개시 또는 전사의 조정에는 mRNA 전사 개시, mRNA 신장, 그리고 mRNA 스플라이싱 활성의 증가 또는 감소가 포함된다. 본원에서 사용된 바와 같이, 응축물 조절에는 당해 응축물의 형성, 구성, 유지, 해체 및/또는 규제의 조절중 하나, 둘, 셋, 넷, 또는 다섯개 모두가 포함된다. 일부 구체예들에서, 응축물 조절에는 상기 응축물의 형태 또는 모양의 변화가 포함된다.
본원에서 사용된 바와 같이, "유전자 침묵화(gene silencing)" (또한 때때로, 유전자 전사 억제로도 불림)란 유전자의 전사 감축 또는 제거를 지칭한다. 상기 유전자의 전사는 참조 수준 (예컨데, 미처리된 대조군 세포 또는 응축물)과 비교하였을 때, 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 99.5%, 99.9%, 또는 그 이상으로 축소될 수 있다. 일부 구체예들에서, 유전자 침묵화는 이질성염색질 또는 메틸화된 게놈 DNA와 연합된다. 일부 구체예들에서, 유전자 침묵화는 메틸-DNA 결합 단백질들이 메틸화된 DNA에 결합하는 것을 포함한다. 일부 구체예들에서, 유전자 침묵화는 염색질의 변형을 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "이질성염색질(heterochromatin)"이란 당해 유전자들의 활성이 변형되거나, 또는 억압되는, 정상과는 상이한 밀도 (통상적으로 더 큰)의 염색체 물질을 지칭한다. 본원의 방법들 및 구성들의 일부 구체예들에서, 이질성염색질란 특이적 발생학적 또는 환경적 신호전달 신호 하에서, 이의 응축된 구조를 상실하고, 그리고 전사적으로 활성화가 되는 조건적(facultative) 이질성염색질을 지칭한다.
일부 구체예들에서, 상기 조절된 한 가지 또는 그 이상의 유전자는 종양유전자를 포함한다. 예시적인 종양유전자들에는 MYC, SRC, FOS, JUN, MYB, RAS, ABL, HOXI1, HOXI1 1L2, TAL1/SCL, LMO1, LMO2, EGFR, MYCN, MDM2, CDK4, GLI1, IGF2, 활성화된 EGFR, 돌연변이된 유전자들, 이를 테면, FLT3-ITD, 돌연변이된 TP53, PAX3, PAX7, BCR/ABL, HER2/NEU, FLT3R, FLT6-ITD, SRC, ABL, TAN1, PTC, B-RAF, PML-RAR-알파, E2A-PRX1, 그리고 NPM-ALK, 뿐만 아니라 PAX 및 FKHR 유전자 패밀리 구성원의 융합이 포함된다. 예시적인 다른 종양유전자들 또한 당분야에 잘 공지되어 있다. 일부 구체예들에서, 상기 종양유전자는 c-MYC 및 IRF4로 구성된 군에서 선택된다. 일부 구체예들에서, 상기 유전자는 종양형성적 융합 단백질, 예컨데, MLL 재배열, EWS-FLI, ETS 융합, BRD4-NUT, NUP98 융합을 인코드한다.
일부 구체예들에서, 상기 한 가지 또는 그 이상의 유전자들은 질환, 이를 테면, 암 (예컨데, 유방암)의 각인(hallmark)과 연합된다. 일부 구체예들에서, 상기 한 가지 또는 그 이상의 유전자들은 DNA 서열 변이(variation), 이를 테면, SNP와 연합된 질환과 연합된다. 일부 구체예들에서, 상기 질환은 Alzheimer 질환이며, 상기 유전자들은 BIN1 (예컨데, DNA 서열 변이, 이를 테면, SNP와 연합된 질환을 갖는)를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 질환은 유형 1 당뇨병이며, 상기 한 가지 또는 그 이상의 유전자들은 원발성(primary) Th 세포 (예컨데, DNA 서열 변이, 이를 테면, SNP와 연합된 질환을 갖는)와 연합된다. 일부 구체예들에서, 상기 질환은 전신 홍반 루프스이며, 상기 한 가지 또는 그 이상의 유전자들은 B 세포 생물학 (예컨데, DNA 서열 변이, 이를 테면, SNP와 연합된 질환을 갖는)에 주요 역할을 한다. 일부 구체예들에서, 상기 한 가지 또는 그 이상의 유전자들은 핵 수용체 (예컨데, 핵 호르몬 수용체, 리간드 의존적 핵 수용체)를 인코딩하는 유전자에서 돌연변이와 연합된 질환 또는 병태와 연합된다. 일부 구체예들에서, 상기 한 가지 또는 그 이상의 유전자들은 상기 세포의 특징적 각인과 연합된다. 일부 구체예들에서, 상기 한 가지 또는 그 이상의 유전자들은 일탈적으로 발현되거나, 또는 DNA 변이 이를 테면, SNP와 연합된다. "일탈적으로 발현된(aberrantly expressed)" 이란 한 가지 또는 그 이상의 세포들 또는 시험관내 관심대상의 응축물들에서 유전자 발현이 정상적인 세포들 (예컨데, 동일한 세포 유형의 정상 세포, 또는 배양된 세포들의 경우, 필적가능한 조건 하에서 배양된 세포들) 또는 테스트 치료 또는 조건을 겪지 않은 응축물들 (예컨데, 세포에서 단리된 응축물들의 경우 동일한 세포 유형의 정상 세포에서 단리된 응축물들, 또는 배양된 세포의 경우 필적가능한 조건 하에서 배양된 세포들)에서 전형적으로 볼 수 있는 대조군 수준과는 탐지가능한 수준으로 상이하다. 일부 구체예들에서, 상기 한 가지 또는 그 이상의 유전자들은 세포 안 일탈적인 신호전달 (예컨데, WNT, TGF-β 또는 JAK/STAT 경로와 연합된 일탈적인 신호전달)과 연합된다. 일부 구체예들에서, 상기 한 가지 또는 그 이상의 유전자들은 일탈적인 mRNA 개시 또는 신장 (예컨데, 일탈적인 스플라이싱)을 갖는 유전자들을 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "일탈적인 mRNA 개시 또는 신장"이란 대조군 세포 또는 대상체 (예컨데, 건강한 세포 또는 대상체, 또는 전형적 mRNA 개시 또는 신장을 특징으로 하는 질환 또는 병태가 없는 세포 또는 대상체와 비교하여 (예컨데, 더 높거나 또는 더 낮음))에 비하여 mRNA 개시 또는 신장이 탐지가능하게 또는 유의적으로 상이한 수준이다. 일부 구체예들에서, 상기 한 가지 또는 그 이상의 유전자들은 질환 또는 병태의 특징적인 스플라이싱 변이체들 (예컨데, 상기 질환 또는 병태가 없는 대조군 대상체의 mRNA 서열보다 더 많거나 또는 더 적은 mRNA 서열을 포함하는 스플라이싱 변이체)과 연합된다. 일부 구체예들에서, 상기 한 가지 또는 그 이상의 유전자들은 일탈적인 유전자 침묵화 (예컨데, 건강한 세포 또는 건강한 대상체 (예컨데, 대조군 세포 또는 대상체)에서의 유전자 침묵화와 비교하였을 때, 유전자 침묵화가 증가 또는 감소)와 연합된 질환 또는 장애와 연합된다. 일부 구체예들에서, 상기 일탈적인 유전자 침묵화와 연합된 질환 또는 장애는 Rett 증후군, MeCP2 과다-발현 증후군 또는 MeCP2 과소-발현 또는 활성이다. MeCP2란 메틸 CpG 결합 단백질 2 (Human UniProt ID: P51608)를 지칭한다. 일부 구체예들에서, 상기 한 가지 또는 그 이상의 유전자들은 포유류 세포, 예컨데, 인간 세포; 태아 세포; 배아 줄기 세포 또는 배아 줄기 세포-유사 세포, 예컨데, 탯줄 정맥에서 유래된 세포, 예컨데, 탯줄 정맥에서 유래된 내피 세포; 근육, 예컨데, 근관, 태아 근육; 혈액 세포, 예컨데, 암성(cancerous) 혈액 세포, 태아 혈액 세포, 단핵구; B 세포, 예컨데, Pro-B 세포; 뇌, 예컨데, 성상교 세포, 뇌의 모이랑(angular gyrus), 뇌의 전방 꼬리(anterior caudate), 뇌의 띠이랑(cingulate gyrus), 뇌의 해마, 뇌의 하위 측두엽, 뇌의 중간 전두엽, 뇌 암 세포; T 세포, 예컨데, 나이브(
) T 세포, 기억 T 세포; CD4 양성 세포; CD25 양성 세포; CD45RA 양성 세포; CD45RO 양성 세포; IL-17 양성 세포; PMA로 자극받은 세포; Th 세포; Th17 세포; CD255 양성 세포; CD127 양성 세포; CD8 양성 세포; CD34 양성 세포; 십이지장, 예컨데, 십이지장의 평활근 조직; 골격근 조직; 근모세포; 위, 예컨데, 위의 평활근 조직, 예컨데, 위장 세포; CD3 양성 세포; CD14 양성 세포; CD19 양성 세포; CD20 양성 세포; CD34 양성 세포; CD56 양성 세포; 전립선, 예컨데, 전립선 암; 결장, 예컨데, 결장직장의 암 세포; 움(crypt) 세포, 예컨데, 결장 움 세포; 내장, 예컨데, 대장; 예컨데, 태아 내장; 뼈, 예컨데, 골아세포; 췌장, 예컨데, 췌장 암; 지방 조직; 부신; 방광; 식도; 심장, 예컨데, 좌측 심실, 우측 심실, 좌측 심방, 우측 심방, 대동맥; 폐, 예컨데, 폐 암 세포; 피부, 예컨데, 섬유아세포 세포; 난소; 요근 근육; S자(sigmoid) 결장; 소장; 비장; 흉선, 예컨데, 태아 흉선; 유방, 예컨데, 유방암; 자궁 경관, 예컨데, 경부 암; 유방 상피; 간, 예컨데, 간 암; DND41 세포; GM12878 세포; H1 세포; H2171 세포; HCC1954 세포; HCT-116 세포; HeLa 세포; HepG2 세포; HMEC 세포; HSMM 관 세포; HUVEC 세포; IMR90 세포; Jurkat 세포; K562 세포; LNCaP 세포; MCF-7 세포; MM1S 세포; NHLF 세포; NHDF-Ad 세포; RPMI-8402 세포; U87 세포; VACO 9M 세포; VACO 400 세포; 또는 VACO 503 세포에서 발견된다.
일부 구체예들에서, 상기 한 가지 또는 그 이상의 유전자들은 류마티스 관절염, 다발성 경화증, 전신피부 경화증, 원발성 쓸개관 간경화증, Crohn 질환, Graves 질환, 백반증 및 심방세동에 관련된 질환-연합된 변이다. 일부 구체예들에서, 상기 한 가지 또는 그 이상의 유전자들은 발생적 장애와 연합된다. 일부 구체예들에서, 상기 한 가지 또는 그 이상의 유전자들은 신경적 장애 또는 발생적 신경적 장애와 연합된다.
일부 구체예들에서, 상기 한 가지 또는 그 이상의 유전자들은 세포 유형 특이적으로 간주된다. 세포 유형 특이적 유전자는 단일 세포 유형에서만 발현될 필요는 없으며, 예컨데, 대략적으로 200개의 통상적으로 인지되는 (예컨데, 표준 조직학 교본에서) 및/또는 성인 척추동물, 예컨데, 포유류, 예컨데, 인간에서 가장 풍부한 세포 유형중 최대 약 5개, 또는 약 10개의 상이한 세포 유형에서도 발현될 수 있다. 일부 구체예들에서, 세포 유형 특이적 유전자는 이의 발현 수준을 이용하여 세포, 예컨데, 본원에서 개시된 세포, 이를 테면, 세포 유형의 세포들로부터 다음 유형중 하나의 세포를 구별해낼 수 있다: 지방세포 (예컨데, 백색 지방 세포 또는 갈색 지방 세포), 심장 근육세포, 연골세포, 내피 세포, 외분비선 세포, 섬유아세포, 교질 세포, 간세포, 케라틴세포, 대식세포, 단핵구, 멜라닌세포, 뉴런, 호중구, 골아세포, 파골세포, 췌장 섬(islet) 세포 (예컨데, 베타 세포), 골격 근세포, 평활근 세포, B 세포, 혈장 세포, T 세포 (예컨데, 조절, 세포독성, 헬퍼), 또는 수지상 세포. 일부 구체예들에서, 세포 유형 특이적 유전자는 계통 특이적, 예컨데, 특정 계통 (예컨데, 조혈성, 신경, 근육, 등등)에 특이적이다. 일부 구체예들에서, 세포-유형 특이적 유전자는 대부분 (예컨데, 적어도 80%, 적어도 90%) 또는 모든 다른 세포 유형들에서보다 주어진 세포 유형에서 훨씬 더 많이 발현되는 유전자다. 따라서, 특이성은 발현 수준과 관련될 수 있는데, 예컨데, 대부분 낮은 수준으로 발현되지만, 특정 세포 유형에서 높은 수준으로 발현되는 유전자는 당해 높은 수준으로 발현되는 세포 유형에 대하여 세포 유형 특이적으로 간주될 수 있다. 일부 구체예들에서, 세포-유형 특이적 유전자는 대부분 (예컨데, 적어도 80%, 적어도 90%) 또는 모든 다른 세포 유형들에서보다 주어진 세포 유형에서 더 적게 발현되거나, 또는 발현되지 않는 유전자다. 따라서, 특이성은 발현 수준과 관련될 수 있는데, 예컨데, 광범위한 수준으로 발현되지만, 특정 세포 유형에서 훨씬 적은 수준으로 발현되는 유전자는 당해 적은 수준으로 발현되는 또는 전혀 발현되지 않는 세포 유형에 대하여 세포 유형 특이적으로 간주될 수 있다. 발현은 총 mRNA 발현 (임의선택적으로 miRNA 전사체, 긴 넌-코딩 RNA 전사체, 및/또는 기타 RNA 전사체를 포함)에 기반되거나 및/또는 세포에서 하우스킵핑(housekeeping) 유전자의 발현이 기반될 수 있음을 이해할 것이다. 일부 구체예들에서, 당해 종의 성체 세포 유형, 또는 대표 세포 유형 세트의 평균적으로 적어도 25%, 적어도 50%, 적어도 75%, 적어도 90% 또는 그 이상의 세포에서 적어도 2개, 5배, 또는 적어도 10-배 이상 더 많이 또는 더 적은 수준으로 발현된다면, 이 유전자는 당해 특정 세포 유형에 대하여 세포 유형 특이적이라고 간주된다. 당업자는 각종 세포 유형에 대한 발현 데이터를 내포하는데이터베이스를 인지할 것이며, 이를 이용하여 세포 유형 특이적 유전자들을 선별할 수 있다. 일부 구체예들에서, 세포 유형 특이적 유전자는 전사 인자다. 일부 구체예들에서, 세포 유형 특이적 유전자는 배아, 태아, 또는 출산-후 발생과 연합된다.
일부 구체예들에서, 상기 전사 응축물은 당해 응축물 연합된 성분 (즉, 응축물 성분)의 결합가의 증가 또는 감소에 의해 조절된다. 일부 구체예들에서, 상기 이질성염색질 응축물 또는 mRNA 개시 또는 신장 복합체 물리적으로 연합된 응축물은 당해 응축물 연합된 성분 (즉, 응축물 성분)의 결합가의 증가 또는 감소에 의해 조절된다. 본원에서 사용된 바와 같이, "결합가(valency)"란 성분에 대한 상이한 결합 짝의 수와 한 가지 또는 그 이상의 결합 짝에 대한 이러한 결합 강도 모두를 지칭한다. 일부 구체예들에서, "응축물과 연합된 성분"은 단백질, 핵산, 또는 소 분자일 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 성분은 핵산 (예컨데, RNA, eRNA)이다. 한 구체예에서, 상기 핵산은 염색체 핵산이 아니다. 한 구체예에서, 상기 성분은 전사의 활성화 또는 규제에 관련된다. 일부 구체예들에서, 상기 성분은 RNA 중합효소 II, Mediator, 코헤신, Nipbl, p300, CBP, Chd7, Brd4, 및/또는 esBAF의 성분들 (Brg1) 또는 Lsd1-Nurd 복합체 (예컨데, RNA 중합효소 II)를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 성분은 Mediator 또는 Mediator 하위단위 (예컨데, Med1)다. 일부 구체예들에서, 상기 성분은 염색질 조절제 (예컨데, BET 브로모도메인 단백질, BRD4)다. 일부 구체예들에서, 상기 성분은 핵 수용체 리간드 (예컨데, 호르몬)이다. 일부 구체예들에서, 상기 성분은 신호전달 인자다. 일부 구체예들에서, 상기 성분은 메틸-DNA 결합 단백질이다. 일부 구체예들에서, 상기 성분은 유전자 침묵화 인자다. 일부 구체예들에서, 상기 성분은 스플라이싱 인자다. 일부 구체예들에서, 상기 성분은 mRNA 개시 또는 신장 복합체의 성분 (즉, 기구(apparatus))이다. 일부 구체예들에서, 상기 성분은 RNA 중합효소다. 일부 구체예들에서, 상기 성분은 염색질 성분, 예컨데, DNA 또는 히스톤으로부터 기능기, 예컨데, 메틸 또는 아세틸 그룹을 추가, 탐지, 또는 판독, 또는 제거하는 효소이거나, 또는 효소를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 성분은 히스톤 마크, 예컨데, H3K4me1 또는 H3K27Ac를 기록하고, 판독하고, 또는 지우는 염색질 성분의 구조, 예컨데, DNA 또는 히스톤, 예컨데, DNA 메틸라제 또는 탈메틸라제, 히스톤 메틸라제 또는 탈메틸라제, 또는 히스톤 아세틸라제 또는 탈-아세틸라제를 변경하거나, 판독하거나, 또는 탐지하는 효소이거나, 또는 효소를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 성분은 염색질 성분, 예컨데, DNA 또는 히스톤으로부터 기능기, 예컨데, 메틸 또는 아세틸 그룹을 추가, 탐지, 또는 판독, 또는 제거하는 효소이거나, 또는 효소를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 성분은 선별된 세포의 상태 또는 성질, 예컨데, 분화, 발생 또는 질환, 예컨데, 암성 상태의 상태, 또는 증식하는 경향 또는 경향 또는 아포팝토시스(apoptosis)를 겪게 되는 경향으로의 발달, 또는 이러한 것의 유지에 요구되는 단백질이거나, 또는 단백질을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 질환 상태는 증식성 질환, 염증성 질환, 심혈관 질환, 신경적 질환 또는 감염성 질환이다. 일부 구체예들에서, 상기 성분은 본원에서 기술된 바와 같은 효소는 아니다. 일부 구체예들에서, 상기 성분은 DNA 메틸라제 또는 탈메틸라제, 히스톤 메틸라제 또는 탈메틸라제, 및/또는 히스톤 아세틸라제 또는 탈-아세틸라제는 아니다.
일부 구체예들에서, 상기 성분은 전사 인자다. 일부 구체예들에서, 상기 전사 인자는 OCT4, p53, MYC, 또는 GCN4, NANOG, MyoD, KLF4, SOX 패밀리 전사 인자 (예컨데, SRY, SOX1, SOX2, SOX3, SOX14, SOX21, SOX4, SOX11, SOX12, SOX5, SOX6, SOX13, SOX8, SOX9, SOX10, SOX7, SOX17, SOX18, SOX15, SOX30), GATA 패밀리 전사 인자 (예컨데, GATA 1-6), 또는 핵 수용체 (예컨데, 핵 호르몬 수용체, 에스트로겐 수용체, 레티노산 수용체-알파)이다. 일부 구체예들에서, 상기 전사 인자는 IDR (예컨데, 상기 전사 인자의 활성화 도메인 안에 IDR)을 갖는다. 일부 구체예들에서, 상기 핵 수용체는 동족 리간드에 결합될 때, 전사를 활성화시킨다. 일부 구체예들에서, 상기 핵 수용체는 동족 리간드의 부재 하에서 전사를 활성화시키는 돌연변이 핵 수용체다. 일부 구체예들에서, 상기 TF는 신호전달 인자 (예컨데, TF와 신호전달 인자와의 상호작용에 의해 전사가 조정된다)에 의해 조정된다.
일부 구체예들에서, 상기 성분 (예컨데, 이질성염색질 성분)은 유전자 침묵화 인자 또는 이의 돌연변이체 형태다. 일부 구체예들에서, 상기 이질성염색질 인자는 ATRX, MECP2, WRN, DNMT1, DNMT3B, EZH2, HP1, D4Z4, ICR, 라민(lamin) A, WRN, 돌연변이체 ICR IGF2-H19, 또는 돌연변이체 ICR IGF2-H19이다.
일부 구체예들에서, 상기 성분은 표 S1에 열거된 단백질이다. 일부 구체예들에서, 상기 성분은 표 S3에서 열거된 매개체 성분이다. 일부 구체예들에서, 상기 성분은 표 S2에 열거된 모티프를 갖는 (예컨데, 모티프와 함께 IDR을 갖는) 단백질이다. 일부 구체예들에서, 상기 성분은 표 S2에 열거된 IDR과 상호작용하는 IDR을 보유한다. 일부 구체예들에서, 상기 성분은 IDR (예컨데, 표 S2에 열거된 모티프를 갖는 IDR)의 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 를 갖는다. 일부 구체예들에서, 상기 성분은 다중 IDRs (예컨데, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 그 이상의 IDR 영역)을 갖는다. 일부 구체예들에서, 상기 성분은 다중 개별적(discrete) 섹션으로 분리된 적어도 하나의 IDR을 갖는다. 일부 구체예들에서, 상기 성분은 전사 응축물의 스캐폴드(scaffold)의 일부분이다. 일부 구체예들에서, 상기 성분은 상기 응축물의 클라이언트다. 일부 구체예들에서, 상기 전사 응축물은 당해 전사 응축물과 연합된 성분과 한 가지 또는 그 이상의 본질적 무질서 도메인 또는 영역 (IDR)과 상호작용하는 제제를 당해 응축물에 접촉시킴으로써 조절된다. 일부 구체예들에서, 상기 성분은 Mediator, 매개체 성분, MED1, MED15, GCN4, 핵 수용체 리간드, 신호전달 인자, 또는 BRD4이다. 일부 구체예들에서, 상기 성분은 이질성염색질 응축물 또는 mRNA 개시 또는 신장 복합체와 연합된 응축물의 스캐폴드 일부분이다. 일부 구체예들에서, 상기 성분은 상기 이질성염색질 응축물 또는 mRNA 개시 또는 신장 복합체와 연합된 응축물의 클라이언트다. 일부 구체예들에서, 상기 이질성염색질 응축물 또는 mRNA 개시 또는 신장 복합체와 연합된 응축물은 당해 응축물과 연합된 성분의 한 가지 또는 그 이상의 본질적 무질서 도메인 또는 영역 (IDR)과 상호작용하는 제제를 당해 응축물에 접촉시킴으로써 조절된다. 일부 구체예들에서, 상기 성분은 Mediator, 매개체 성분, MED1, MED15, GCN4, 핵 수용체 리간드, 유전자 침묵화 인자, 스플라이싱 인자, 또는 BRD4이다.
일부 구체예들에서, 상기 IDR은 표 S2에 나타낸 모티프를 갖는다. 일부 구체예들에서, IDR을 갖는 상기 성분 표 S1에 열거되어 있다. 일부 구체예들에서, 상기 IDR은 핵 수용체 AD의 IDR이다. 일부 구체예들에서, 상기 성분은 본원에서 기술된 임의의 성분이다. 본원에서 개시된 방법들에서 유용한 상기 IDRs은 제한없다. IDRs는 당분야의 공지된 생물정보학 방법들에 의해 식별될 수 있다. 예컨데, Best RB (February 2017). "Computational and theoretical advances in studies of intrinsically disordered proteins". Current Opinion in Structural Biology. 42: 147-154 참고; http: address//d2p2.pro/about/predictors 또한 참고. 일부 구체예들에서, IDR을 갖는 상기 성분은 BRD4, Mediator, 또는 MED1이다. 일부 구체예들에서, 상기 IDR은 적어도 5개, 7개, 10개, 15개, 20개, 25개, 30개, 35개, 40개, 45개, 50개, 또는 100개 길이의 아미노산을 갖는다. 일부 구체예들에서, 상기 IDR는 별개의 개별적 영역을 갖는다. 일부 구체예들에서, 상기 IDR은 적어도 약 5개, 10개, 15개, 20개, 30개, 40개, 50개, 60개, 75개, 100개, 150개, 또는 그 이상의 무질서화된 아미노산 (예컨데, 인접 무질서화된 아미노산)이다. 일부 구체예들에서, D2P2 (Oates et al., 2013)를 이용한 알고리즘의 적어도 75%가 당해 잔기가 무질서화될 것으로 예상한다면, 이 아미노산은 무질서화된 아미노산으로 간주된다.
일부 구체예들에서, 상기 성분은 Mediator, 매개체 성분, MED1, MED15, p300, BRD4, TFIID, TCF7L2, TCF7, TCF7L1, LEF1, 베타-카테닌, SMAD2, SMAD3, SMAD4, STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5A, STAT5B, STAT6, NF-κB, MECP2, MBD1, MBD2, MBD3, MBD4, HP1α, TBL1R, HDAC3, SMRT, RNA 중합효소 II, SRSF2, SRRM1, SRSF1, 호르몬, 또는 이의 변이체, 이의 돌연변이체 형태, 또는 이의 단편 (예컨데, 기능성 단편)이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 단백질 또는 핵산의 "기능성 단편"은 당해 전장 단백질 또는 핵산의 적어도 하나의 생활성을 나타낸다. 일부 구체예들에서, 상기 생활성 수준은 당해 전장 단백질 또는 핵산의 생활성 수준의 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95% 수준일 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, "단편"이란 기능성 단편을 포함하는 것으로 이해된다. 일부 구체예들에서, 상기 기능성 단편의 길이는 당해 전장 단백질 또는 핵산 길이의 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95%, 또는 이 사이의 임의의 범위다. 일부 구체예들에서, 상기 기능성 단편은 적어도 하나의 기능성 도메인 또는 적어도 두 개의 기능성 도메인을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 기능성 단편은 리간드 결합 도메인 및 DNA-결합 도메인을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 기능성 단편은 활성화 도메인 및 DNA-결합 도메인을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 기능성 단편은 IDR을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 생활성은 결합 활성 (예컨데, 리간드-결합 활성, 호르몬 결합 활성, DNA-결합 활성, 전사 공동-인자 결합 활성, 유전자-침묵화 인자 결합 활성, mRNA-결합 활성)일 수 있다.
일부 구체예들에서, 기능성 단편은 이형성(heterotypic) 응축물 및/또는 상동형 응축물로 통합될 수 있다. 통합 (또는 통합되다)이란 관련 생리적 조건 (예컨데, 세포에서 조건과 동일하거나 또는 유사한 조건) 또는 관련 실험 조건 (예컨데, 시험관내 응축 물의 형성에 적합한 조건) 하에 있다는 것으로 이해된다. 일부 구체예들에서, 기능성 단편은 실시예 섹션에서 기술된 응축물 성분의 단편이다.
일부 구체예들에서, 신호전달 인자의 기능성 단편은 전사 인자에 결합할 수 있다. 일부 구체예들에서, 신호전달 인자의 기능성 단편은 응축물 (예컨데, 이형성(heterotypic) 응축물, 전사 응축물)로 통합되는 능력을 보유한다.
일부 구체예들에서, 저-포스포릴화된 RNA 중합효소 II C-말단 도메인의 기능성 단편은 RNA 합성 생활성을 갖는 단편, 및/또는 응축물 (예컨데, 이형성(heterotypic) 응축물들, 상동형 응축물들, 매개체를 포함하는 응축물들)로 통합되는 능력을 보유한 단편이다. 일부 구체예들에서, 스플라이싱 인자의 기능성 단편은 mRNA 스플라이싱을 갖는 단편 및/또는 응축물 (예컨데, 이형성(heterotypic) 응축물들, 상동형 응축물들, 또는 포스포릴화된 RNA 중합효소를 포함하는 응축물들)로 통합되는 능력을 보유한 단편이다.
일부 구체예들에서, 메틸-DNA 결합 단백질의 기능성 단편은 메틸화된 DNA에 결합할 수 있거나 및/또는 응축물 (예컨데, 이형성(heterotypic) 응축물들, 상동형 응축물들, 또는 억압제를 포함하는 응축물들)로 통합되는 능력을 보유한다. 일부 구체예들에서, 억압제의 기능성 단편은 유전자 침묵화 활성을 보유하거나 및/또는 응축물 (예컨데, 이형성(heterotypic) 응축물들, 상동형 응축물들, 또는 메틸-DNA 결합 단백질을 포함하는 응축물들)로 통합되는 능력을 보유한다.
일부 구체예들에서, 에스트로겐 수용체의 기능성 단편은 (a) 에스트로겐에 결합될 때, 전사를 활성화시키는 능력 (예컨데, 야생형 ER 단편), (b) 전사를 구성적으로 활성화시키는 능력 (예컨데, 돌연변이체 ER 단편), (c) 에스트로겐에 결합하는 능력, (d) 매개체에 결합하는 능력, (e) 이형성(heterotypic) 응축물들을 형성하는 능력, 및/또는 (f) 상동형 응축물들을 형성하는 능력을 갖는다. 일부 구체예들에서, 상기 에스트로겐 수용체 단편은 상기 생활성 (a)~(e)중 적어도 하나, 둘, 셋, 넷, 또는 다섯 가지 모두를 갖는다. 일부 구체예들에서, ER 리간드 결합 도메인의 기능성 단편은 에스트로겐 결합 활성을 갖는다.
본원에서 사용된 바와 같이, 그리고 일부 구체예들에서, 단백질의 변이체는 대상체 단백질 (예컨데, 야생형 단백질, 정의된 돌연변이체 단백질)의 아미노산 서열에 대하여 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 또는 99.5% 이상으로 동일한 아미노산 서열의 폴리펩티드를 포함하거나, 또는 이 폴리펩티드로 구성된다. 본원에서 사용된 바와 같이, 그리고 일부 구체예들에서, 핵산 서열의 변이체는 대상체 핵산의 핵산 서열에 대하여 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 또는 99.5% 이상으로 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 또는 이 핵산 서열로 구성된다.
"제제(agent)"는 본원에서 임의의 물질, 화합물 (예컨데, 분자), 초분자 복합체, 물질, 또는 이의 복합물 또는 이의 혼합물을 지칭하는데 이용된다. 일부 측면들에서, 제제는 화학식, 화학적 구조, 또는 서열로 대표될 수 있다. 제제의 예로는 예컨데, 소 분자, 폴리펩티드, 핵산 (예컨데, RNAi 제제, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 압타머(aptamers)), 지질, 폴리사카라이드, 펩티드 모방체, 등등이 포함된다. 일반적으로, 제제는 당분야의 공지된 임의의 적합한 방법을 이용하여 획득될 수 있다. 당업자는 예를 들어, 제제의 성질에 기초하여 적절한 방법을 선택할 것이다. 제제는 적어도 부분적으로 정제될 수 있다. 일부 구체예들에서, 제제는 조성물의 일부로서 제공될 수 있는데, 이 조성물은 다양한 구체예들에서 당해 제제에 추가하여, 예를 들어, 반대-이온, 수성 또는 비-수성 희석제 또는 담체, 완충제, 보존제 또는 기타 성분을 함유할 수 있다. 일부 구체예들에서, 제제는 염, 에스테르, 수화물, 또는 용매화합물로 제공될 수 있다. 일부 구체예들에서, 제제는 예컨데, 세포들이 취입하는 전형적 제제의 범위 안에서 세포-투과성이며, 예컨데, 포유류 세포들 안에서 세포내적으로 작용한다. 특정 화합물들은 특정 기하학적 또는 입체이성체적 형태로 존재할 수 있다. 시스(cis)- 및 트란스(trans)-이성질체, E- 및 Z-이성질체, R- 및 S-거울상이성질체, 부분입체이성질체, (D)-이성질체, (L)-이성질체, (-)- 및 (+)-이성질체, 이의 라셈체 혼합물들, 그리고 이의 기타 혼합물들이 포함된 이러한 혼합물은 다른 언급이 없는 한, 각종 구체예에서 본원에 포괄된다. 특정 화합물들은 변종(variety) 또는 양성자첨가(protonation) 상태로 존재하거나, 구성적 변종으로 존재하거나, 용매화합물 (예컨데, 물과 함께 (즉, 수화물) 또는 흔한 용매와 함께)로 존재하거나, 및/또는 상이한 결정 형태 (예컨데, 다형) 또는 상이한 호변체(tautomeric) 형태로 존재할 수 있다. 이러한 대체 양성자첨가 상태, 입체구성, 용매화합물, 그리고 형태를 나타내는 구체예들은 적용가능한 곳에서 본 명세서에 의해 포괄된다.
제 1 제제의 "유사체(analog)"는 당해 제1 제제와 구조적으로 및/또는 기능적으로 유사한 제 2 제제를 지칭한다. 제 1 제제의 "구조적 유사체"는 당해 제 1 제제와 구조적으로 유사한 유사체를 지칭한다. 다른 언급이 없는 한, 본원에서 사용된 용어 "유사체"는 구조적 유사체를 지칭한다. 제제의 구조적 유사체는 당해 제제와 실질적으로 유사한 물리적, 화학적, 생물학적, 및/또는 약물학적 성질을 보유하거나, 또는 적어도 하나의 물리적, 화학적, 생물학적, 또는 약물학적 성질이 상이할 수 있다. 일부 구체예들에서, 이러한 성질중 적어도 하나의 성질은 관심 목적, 예컨데, 응축물 조절에 더욱 적합한 유사체를 제공하는 방식으로 상이하다. 일부 구체예들에서, 제제의 구조적 유사체는 당해 제제의 적어도 하나의 원자, 기능기, 또는 하위구조를 유사체의 상이한 원자, 기능기, 또는 하위구조로 대체함으로써, 당해 제제와 상이하게 된다. 일부 구체예들에서, 제제의 구조적 유사체는 당해 제제에 존재하는 적어도 하나의 수소 또는 치환기가 당해 유사체에 있는 상이한 모이어티 (예컨데, 상이한 치환기)로 대체됨으로써, 당해 제제와 상이하게 된다.
일부 구체예들에서, 상기 제제는 핵산이다. 용어 "핵산"이란 폴리뉴클레오티드, 이를 테면, 데옥시리보핵산 (DNA) 및 리보핵산 (RNA)을 지칭한다. 용어 "핵산"과 "폴리뉴클레오티드"는 본원에서 호환이용되며, 이중-가닥의 폴리뉴클레오티드, 단일-가닥의 (이를 테면, 센스 또는 안티센스) 폴리뉴클레오티드, 그리고 부분적으로 이중-가닥의 폴리뉴클레오티드가 포함되는 것으로 이해되어야 한다. 핵산은 흔히 포스포디에스테르 결합에 의해 연결된, 자연 발생적 DNA 또는 RNA에서 전형적으로 볼 수 있는 표전 뉴클레오티드 (변형, 이를 테면, 메틸화된 핵염기 포함)를 포함한다. 일부 구체예들에서, 핵산은 한 가지 또는 그 이상의 비-표준 뉴클레오티드를 포함할 수 있는데, 이들은 각종 구체예들에서 자연 발생적 또는 비-자연 발생적 (즉, 인공적인, 자연계에서 볼 수 없는)이거나 및/또는 변형된 슈가 또는 변형된 백본(backbone) 링키지(linkage)를 내포할 수 있다. 핵산 변형 (예컨데, 염기, 슈가, 및/또는 백본 변형), 비-표준 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드, 등등, 이를 테면, 당분야에 공지된 것들은 연구 또는 치료 목적의 RNA 간섭 (RNAi), 압타머, CRISPR 기술, 폴리펩티드 생산, 재프로그래밍, 또는 안티센스-기반 분자들은 각종 구체예들에서 통합될 수 있다. 이러한 변형은 예를 들면, 안정성 (예컨데, 뉴클레아제에 의한 절단에 대한 민감성을 감축시킴으로써)을 증가시키고, 생체내 제거를 감소시키고, 세포 취입을 증가시키고, 또는 해독, 능력, 효과, 특이성을 개선시키거나 또는 의도된 용도에 당해 핵산이 더욱 적합하도록 하는 다른 성질들을 부여할 수 있다. 핵산 변형의 다양한 비-제한적인 예시들은 예컨데, Deleavey GF, et al., Chemical modification of siRNA. Curr. Protoc. Nucleic Acid Chem. 2009; 39:16.3.1-16.3.22; Crooke, ST (ed.) Antisense drug technology: principles, strategies, and applications, Boca Raton: CRC Press, 2008; Kurreck, J. (ed.) Therapeutic oligonucleotides, RSC biomolecular sciences. Cambridge: Royal Society of Chemistry, 2008; U.S. 특허 번호 4,469,863; 5,536,821; 5,541,306; 5,637,683; 5,637,684; 5,700,922; 5,717,083; 5,719,262; 5,739,308; 5,773,601; 5,886,165; 5,929, 226; 5,977,296; 6,140,482; 6,455,308 및/또는 PCT 출원 공개 WO 00/56746 및 WO 01/14398에서 기술된다. 이중-가닥의 핵산의 두 가닥에 상이한 변형이 이용될 수 있다. 핵산은 일관되게 변형되거나, 또는 이의 일부만 변형되거나, 및/또는 다수의 상이한 변형을 내포할 수 있다. 핵산 또는 핵산 영역의 길이가 뉴클레오티드 (nt)의 숫자로 제공되면, 다른 언급이 없는 한, 이 숫자는 단일-가닥의 핵산 또는 이중-가닥의 핵산의 각 가닥에 있는 뉴클레오티드의 수로 이해해야 한다. "올리고뉴클레오티드"는 상대적으로 짧은 핵산, 전형적으로 약 5개 내지 약 100 nt개 길이의 짧은 핵산이다.
"핵산 구조체(nucleic acid construct)"란 인간이 만든 핵산으로, 자연계에서 발생하는 핵산과는 동일하지 않으며, 즉, 자연 발생적 핵산 분자의 서열과는 상이하며, 및/또는 자연계에서 발현되는 핵산과 구별되는 변형을 포함한다. 핵산 구조체는 자연계에서 발견되는 핵산과 동일한 두 개 또는 그 이상의 핵산 또는 이의 일부분을 포함할 수 있지만, 자연계에서 볼 수 있는 단일 핵산의 일부분으로 발견되지는 않는다. 일부 구체예들에서, 전사 응축물을 조절하는 제제는 핵산 구조체에 의해 인코드된다. 일부 구체예들에서, 상기 핵산 구조체는 세포 안으로 도입되고, 전술한 세포에서 전사 응축물을 조절하기 위하여 그 안에서 발현된다. 일부 구체예들에서, 이질성염색질 응축물 또는 mRNA 개시 또는 신장 복합체와 물리적으로 연합된 응축물을 조절하는 제제는 핵산 구조체에 의해 인코드된다. 일부 구체예들에서, 상기 핵산 구조체는 세포 안으로 도입되고, 전술한 세포에서 이질성염색질 응축물 또는 mRNA 개시 또는 신장 복합체와 물리적으로 연합된 응축물을 조절하기 위하여, 그 안에서 발현된다.
일부 구체예들에서, 상기 제제는 소 분자다. 용어 "소 분자(small molecule)"란 이의 질량이 약 2 킬로달톤 (kDa) 미만의 유기 분자를 지칭한다. 일부 구체예들에서, 상기 소 분자는 약 1.5 kDa 미만, 또는 약 1 kDa 미만이다. 일부 구체예들에서, 상기 소 분자는 약 800 달톤 (Da), 600 Da, 500 Da, 400 Da, 300 Da, 200 Da, 또는 100 Da 미만이다. 대개, 소 분자의 질량은 적어도 50 Da이다. 일부 구체예들에서, 소 분자는 중합체가 아니다. 일부 구체예들에서, 소 분자는 아미노산이 아니다. 일부 구체예들에서, 소 분자는 뉴클레오티드가 아니다. 일부 구체예들에서, 소 분자는 사카라이드가 아니다. 일부 구체예들에서, 소 분자는 다중 탄소-탄소 결합을 함유하고, 한 가지 또는 그 이상의 이종(hetero)원자 및/ 또는 단백질들 (예컨데, 수소 결합)과 구조적 상호작용에 중요한 한 가지 또는 그 이상의 기능기, 예컨데, 아민, 카르보닐, 히드록실, 또는 카르복실 그룹, 그리고 일부 구체예들에서, 적어도 두 개의 기능기를 포함할 수 있다. 소 분자는 임의선택적으로 상기 기능기중 한 가지 또는 그 이상으로 치환된, 한 가지 또는 그 이상의 고리 탄소 또는 이종(hetero)고리 구조들 및/또는 방향족 또는 폴리-방향족 구조들를 대개 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 제제는 단백질 또는 폴리펩티드이다. 용어 "폴리펩티드"란 펩티드 결합에 의해 연결된 아미노산 중합체를 지칭한다. 단백질은 한 가지 또는 그 이상의 폴리펩티드를 포함하는 분자다. 펩티드는 상대적으로 짧은 폴리펩티드, 전형적으로 길이가 약 2개 내지 100개의 아미노산 (aa), 예컨데, 4개 내지 60개의 aa; 8개 내지 40개의 aa; 10개 내지 30개의 aa이다. 용어 "단백질", "폴리펩티드", 그리고 "펩티드"는 호환 이용될 수 있다. 일반적으로, 각종 구체예들에서 폴리펩티드는 오직 표준 아미노산만을 함유하거나, 또는 한 가지 또는 그 이상의 비-표준 아미노산 (자연 발생적 또는 비-자연 발생적 아미노산일 수 있음) 및/또는 아미노산 유사체일 수 있다. "표준 아미노산"은 포유류가 단백질 합성 시 흔히 이용되며, 유전자 코드에 의해 인코드되는 20개 L-아미노산중 임의의 것이다. "비-표준 아미노산"은 포유류가 단백질 합성 시 흔히 이용되지 않는 아미노산이다. 비-표준 아미노산에는 자연 발생적 아미노산 (20개 표준 아미노산이 아닌) 및 비-자연 발생적 아미노산이 내포된다. 아미노산, 예컨데, 폴리펩티드의 한 가지 또는 그 이상의 아미노산은 예를 들면, 모이어티의 공유 링키지, 이를 테면, 알킬기, 알카노일기, 탄화수소기, 포스페이트기, 지질, 폴리사카라이드, 할로겐, 콘쥬게이션용 링커, 보호기, 소 분자 (이를 테면, 형광단), 등등을 추가함으로써 변형될 수 있다.
일부 구체예들에서, 상기 제제는 펩티드 모방체다. 용어 "모방체(mimetic)", "펩티드 모방체" 및 "펩티도모방체(peptidomimetic)"는 본원에서 호환 사용되며, 일반적으로 선별된 고유(native) 펩티드 또는 단백질 기능성 도메인 (예컨데, 결합 모티프 또는 활성 부위)의 삼차 결합 구조 또는 활성을 모방하는 펩티드, 부분적인 펩티드 또는 비-펩티드 분자를 지칭한다. 이들 펩티드 모방체는 재조합적으로 또는 화학적으로 변형된 펩티드, 뿐만 아니라 비-펩티드 제제 이를 테면, 소 분자 약물 모방체를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 펩티드 모방체는 신호전달 인자 모방체다. 상기 신호전달 인자는 제한되지 않으며, 당분야의 공지 및/또는 본원에서 기술된 것들중 임의의 하나일 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 펩티드 모방체는 핵 수용체 리간드 모방체다.
일부 구체예들에서, 상기 제제는 응축물 (예컨데, 전사 응축물, 유전자 침묵화 응축물, mRNA 개시 또는 신장 복합체와 물리적으로 연합된 응축물)과 연합된 단백질, 폴리펩티드, 또는 핵산이다. 일부 구체예들에서, 상기 제제는 응축물과 연합된 단백질, 폴리펩티드, 또는 핵산의 변이체 또는 돌연변이체다. 일부 구체예들에서, 상기 제제는 핵 수용체 (예컨데, 핵 호르몬 수용체)의 길항제 또는 작용제다. 일부 구체예들에서, 상기 제제는 야생형 핵 응축물에 비교하여 돌연변이를 갖는 핵 수용체 (예컨데, 돌연변이를 갖는 핵 호르몬 수용체, 돌연변이를 갖는 리간드 의존적 핵 수용체)에 선호적으로 결합한다. 일부 구체예들에서, 상기 제제는 야생형 핵 수용체를 포함하는 응축물과 비교하여 돌연변이를 갖는 핵 수용체(예컨데, 돌연변이를 갖는 핵 호르몬 수용체, 리간드 의존적 돌연변이를 갖는 핵 수용체)를 포함하는 전사 응축물을 선호적으로 파괴한다.
일부 구체예들에서, 상기 제제는 신호전달 인자의 길항제 또는 작용제다. 상기 신호전달 인자는 제한되지 않으며, 본원에서 기술된 또는 당분야의 공지의 임의의 신호전달 인자일 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 신호전달 인자는 IDR을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 제제는 포스포릴화된 또는 저-포스포릴화된 RNA 중합효소 II C-말단 도메인 (Pol II CTD) 또는 이의 기능적 단편을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 제제는 포스포릴화된 또는 저-포스포릴화된 Pol II CTD에 선호적으로 결합한다. 일부 구체예들에서, 상기 제제는 스플라이싱 인자, 신장 복합체 성분, 또는 개시 복합체 성분에 결합한다. 일부 구체예들에서, 상기 제제는 메틸화된 DNA에 선호적으로 결합한다. 일부 구체예들에서, 상기 제제는 메틸-DNA 결합 단백질에 결합한다.
일부 구체예들에서, 상기 제제는 합성 RNA (예컨데, 변형된 mRNAs)에 의해 인코드된다. 상기 합성 RNA는 본원에서 기술된 임의의 적합한 제제를 인코드할 수 있다. 변형된 RNAs를 비롯한 합성 RNAs는 WO 2017075406에서 교시되며, 이는 본원의 참조에 편입된다. 예를 들면, 상기 합성 RNA는 응축물 구성, 유지, 해체, 형성, 또는 규제를 조절하는 제제를 인코드할 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 합성 RNA는 전사 응축물 성분, 이질성염색질 응축물 성분, 또는 mRNA 개시 또는 신장 복합체와 물리적으로 연합된 응축물의 성분에 결합하는 IDR (예컨데, IDR 표 S2에 열거된), 항체 (단일 쇄, 예컨데, 나노바디(nanobody)) 또는 공작된 친화력 단백질 (예컨데, 아피바디(affibody))를 인코드한다. 일부 구체예들에서, 상기 제제는 합성 RNA이다.
일부 구체예들에서, 상기 제제는 비-핵산 분자에 콘쥬게이트된 합성 RNA (예컨데, 변형된 mRNAs)이거나, 또는 이에 의해 인코드된다. 일부 구체예들에서, 상기 합성 RNAs는 세포의 취입, 핵 진입(entry), 및/또는 핵 잔류(retention) (예컨데, 펩티드 수송(transport) 모이어티 또는 핵산)를 촉진시키는 모이어티에 콘쥬게이트된다(또는 그렇지 않으면, 물리적으로 연합된다. 일부 구체예들에서, 상기 합성 RNA는 펩티드 수송체 모이어티, 예를 들면 세포-침투성 펩티드 수송 모이어티에 콘쥬게이트되며, 이는 세포 안으로 올리고머의 수송을 강화시키는데 효과적이다. 예를 들면, 일부 구체예들에서, 상기 펩티드 수송체 모이어티는 아르기닌-풍부한 펩티드이다. 추가 구체예들에서, 상기 수송 모이어티는 올리고머의 5' 또는 3' 말단중 하나에 부착된다. 이러한 펩티드가 말단중 하나에 콘쥬게이트될 때, 반대편 말단은 본원에서 기술된 변형된 말단 그룹으로 콘쥬게이션되는데 이용될 수 있다. 펩티드 수송 모이어티는 상기 핵산의 세포 침투를 강화시키는데 일반적으로 효과적이다. 일부 구체예들에서, 상기 펩티드 수송 모이어티 상기 콘쥬게이트의 독성을 축소하고, 한편으로 상기 펩티드 수송 모이어티와 핵산 사이에 상이한 링키지를 갖는 콘쥬게이트에 비교하여 효과를 유지 또는 개선시키기 위하여, 상기 핵산과 상기 펩티드 수송 모이어티의 나머지 사이 (예컨데, 상기 담체 펩티드의 카르복시 또는 아미노 말단)에 글리신 (G) 또는 프롤린 (P) 아미노산 하위단위가 내포된다.
일부 구체예들에서, 상기 제제는 상 파괴자 (phase disruptor) (예컨데, 응축물의 형성 파괴자)이다. 일부 구체예들에서, 상기 상 파괴자는 ATP 제거제 (예컨데, 아지드 나트륨 (NaN3) 및 디니트로페놀 (DNP)) 또는 1,6-헥산디올이다.
일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 제제는 예컨데, 유비퀴틴-프로테아좀 시스템 (UPS)에 의한 세포내 붕괴를 위한 전사 응축물 성분을 표적으로 한다. 일부 구체예들에서, 이러한 제제를 이용하여 전사 응축물 성분의 수준을 축소시키고, 이로 인하여 응축물 형성, 유지, 및/또는 활성이 저해된다. 일부 구체예들에서, 세포내 붕괴를 위한 전사 응축물 성분을 표적으로 하는 제제는 전사 응축물 성분에 결합하는 제 1 도메인과 붕괴와 연합된 엔터티, 예컨데, 프로테아좀을 표적으로 하는 제 2 도메인을 포함한다. 일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 제제는 응축물 (이질성염색질 응축물, 또는 mRNA 개시 또는 신장 복합체와 물리적으로 연합된 응축물) 세포내 붕괴를 위한 성분, 예컨데, 유비퀴틴-프로테아좀 시스템 (UPS)을 표적으로 한다. 일부 구체예들에서, 이러한 제제를 이용하여 응축물 성분의 수준을 축소시키고, 이로 인하여 응축물 형성, 유지, 및/또는 활성이 저해된다. 일부 구체예들에서, 응축물 (이질성염색질 응축물, 또는 mRNA 개시 또는 신장 복합체와 물리적으로 연합된 응축물) 세포내 붕괴를 위한 성분을 표적으로 하는 제제는 전사 응축물 성분에 결합하는 제 1 도메인과 붕괴와 연합된 엔터티, 예컨데, 프로테아좀을 표적으로 하는 제 2 도메인을 포함한다. 이러한 제제를 이용하여 당해 제제가 결합하게 되는 상기 응축물 성분의 수준을 축소시킬 수 있다. 일부 구체예들에서, 응축물 성분은 단백분해 표적화 키메라 (PROTAC) 개념에 기분을 둔 붕괴에 표적이 된다 (예컨데, Protacs: chimeric molecules that target proteins to the Skp1-Cullin-F box complex for ubiquitination and degradation Sakamoto, Kathleen M. et al. Proceedings of the National Academy of Sciences (2001), 98 (15), 8554-8559; Carmony, KC and Kim, K, PROTAC-Induced Proteolytic Targeting, Methods Mol Biol. 2012; 832: Ch. 44 참고). 이 접근법에서, 관심대상의 단백질(이 경우, 응축물 성분 (예컨데, 전사 응축물 성분))에 결합하는 제 1 도메인, E3 유비퀴틴 리게이즈(ligase) 복합체에 결합하는 제 2 도메인, 그리고 이들 도메인을 함께 테터링하는(tether) 전형적으로, 링커를 함유하도록 이종-이기능성 제제가 기획된다. 일부 구체예들에서, 상기 제 1 도메인, 상기 제 2 도메인, 또는 이 둘 모두는 펩티드를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 제 1 도메인, 상기 제 2 도메인, 또는 이 둘 모두는 소 분자를 포함한다. 예를 들면, 유비퀴틴 리게이즈 복합체에 결합하는 상기 분자는 Cullin4A 유비퀴틴 리게이즈 복합체의 성분인 세레브론(cereblon)에 대한 리간드인 소 분자일 수 있다. 세레브론에 결합하는 소 분자는 프탈리미드(phthalimide), 예컨데, 탈리도미드(thalidomide), 레날리도미드(lenalidomide), 또는 포말리도미드(pomalidomide)일 수 있다 (예컨데, Winter, GE, et al. Science 348 (6241), 1376-1381; 특허 공개 번호. 20160235731 및 20180009779 참고). 일부 구체예들에서, von Hippel-Lindau E3 유비퀴틴 리게이즈에 결합하는 분자, 이를 테면, Buckley DL, et al. Targeting the von Hippel-Lindau E3 ubiquitin ligase using small molecules to disrupt the VHL/HIF-1α interaction. J Am Chem Soc. 2012; 134(10):4465-4468에서 기술된 소 분자 (예컨데, 히드록시프롤린 유사체들), 또는 Galdeano, C. et al. Structure-guided design and optimization of small molecules targeting the protein-protein interaction between the von Hippel-Lindau (VHL) E3 ubiquitin ligase and the hypoxia inducible factor (HIF) alpha subunit with in vitro nanomolar affinities. J. Med. Chem. 57, 8657-8663 (2014)에서 기술된 소 분자들이 이용될 수 있다. 일부 구체예들에서, PROTAC는 브로모도메인-함유 단백질, 이를 테면, 붕괴용 BRD1, BRD2, BRD3, 및/또는 BRD4을 표적으로 할 수 있다. 일부 구체예들에서, PROTAC는 키나제(kinase), 이를 테면, 붕괴용 CDK7 또는 CDK9를 표적으로 할 수 있다. 예컨데, Robb, CM, et al., Chem Commun (Camb). 2017 Jul 4;53(54):7577-7580 참고.
일부 구체예들에서, 상기 제제는 유비퀴틴 리게이즈 복합체에 결합하는 소 분자에 연계될 수 있는 성분 (예컨데, 본원에서 기술된 성분)에 결합하는 소분자이며, 이렇게 생성된 복합체는 붕괴용 단백질을 표적으로 하는데 이용된다. 일부 구체예들에서, 상기 소 분자는 S1에 열거되어 있는 모티프를 갖는 IDR에 결합한다. 일부 구체예들에서, 방법은 표 S1에 열거된 성분 (또는 IDR)에 결합하는 소 분자를 식별해내고, 전술한 소 분자를 유비퀴틴 리게이즈 복합체의 성분에 결합하는 소분자에 연계시키는 것을 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 제제와 전사 응축물 (예컨데, 전사 응축물 성분) 간의 접촉으로 당해 응축물이 안정화되거나, 또는 해체되고, 이로 인하여 상기 한 가지 또는 그 이상의 유전자들의 전사, 스플라이싱, 또는 침묵화가 조절된다. 일부 구체예들에서, 상기 제제와 응축물 (예컨데, 이질성염색질 응축물, 또는 mRNA 개시 또는 신장 복합체와 물리적으로 연합된 응축물) 간의 접촉으로 당해 응축물이 안정화되거나, 또는 해체되고, 이로 인하여 상기 한 가지 또는 그 이상의 유전자들의 전사, 스플라이싱, 또는 침묵화가 조절된다. 일부 구체예들에서, 상기 제제는 상기 응축물의 반감기를 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 그 이상으로 증가 또는 감소시킨다. 일부 구체예들에서, 상기 제제는 접촉되지 않은 응축물의 반감기와 비교하여, 상기 응축물의 반감기를 적어도 약 1.1배, 적어도 1.2배, 1.3배, 적어도 1.4배, 적어도 1.5배, 적어도 1.6배, 적어도 1.7배, 적어도 1.8배, 적어도 1.9배, 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 30배, 적어도 40배, 적어도 50배, 또는 적어도 100배, 적어도 1,000배, 적어도 10,000배, 또는 그 이상으로 증가 또는 감소시킨다.
일부 구체예들에서, 상기 제제는 DNA, RNA, 또는 단백질들에 결합할 수 있고, 성분이 전사 응축물, 이질성염색질 응축물, 또는 mRNA 개시 또는 신장 복합체와 물리적으로 연합된 응축물로 통합되는 것을 방지할 수 있다. 다른 구체예들에서, 상기 제제는 기존의 전사 응축물들에 통합된다. 다른 구체예들에서, 상기 제제는 기존의 이질성염색질 응축물들, 또는 mRNA 개시 또는 신장 복합체와 물리적으로 연합된 응축물들에 통합된다. 다른 구체예들에서, 상기 제제는 기존의 전사 응축물들, 이질성염색질 응축물들, 또는 mRNA 개시 또는 신장 복합체와 물리적으로 연합된 응축물들로 또다른 성분의 통합을 강제한다. 다른 구체예들에서, 상기 제제는 전사 응축물, 이질성염색질 응축물, 또는 mRNA 개시 또는 신장 복합체와 물리적으로 연합된 응축물로 성분이 진입하는 것을 방지한다.
일부 구체예들에서, 상기 제제는 IDR (예컨데, 전사 인자의 활성화 도메인; 신호전달 인자, 핵 수용체, 메틸-DNA 결합 단백질, RNA 중합효소, 또는 억압제의 IDR) 안에 산성 잔기에 결합하고, 차단하고, 및/또는 중화시킨다. 일부 구체예들에서, 이로써 공동활성제, 예컨데, Mediator, 예컨데, Mediator 성분과 상기 TF의 상조작용이 저해될 수 있다. 일부 구체예들에서, 이로써 신호 인자 의존적 전사, 유전자 침묵화, 또는 mRNA 개시 및/또는 신장 (예컨데, 스플라이싱)이 조절될 수 있다. 일부 구체예들에서, 제제는 전사 인자의 활성화 도메인에 있는 비-산성 잔기에 결합하거나, 또는 이를 변형시킨다. 일부 구체예들에서, 이로써 상기 전사 인자와 공동활성제, 예컨데, Mediator, 예컨데, Mediator 성분과의 상호작용이 강화될 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 제제는 상기 전사 인자 (예컨데, 핵 수용체, 리간드 독립적 돌연변이 핵 수용체)와 유전자 침묵화 인자 또는 신호전달 인자와의 상호작용을 강화시킬 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 제제는 야생형 전사 인자보다는 돌연변이체 전사 인자 (예컨데, 리간드 독립적 돌연변이 핵 수용체)와 선호적으로 상호작용할 수 있다.
일부 구체예들에서, 상기 제제는 IDR (예컨데, 표 S2에 열거된 모티프를 갖는 IDR, 표 S3에서 열거된 전사 인자의 IDR)의 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%를 갖는 폴리펩티드 또는 단백질이다. 일부 구체예들에서, 상기 제제는 다중 IDRs (예컨데, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 그 이상의 IDR 영역)을 갖는다. 일부 구체예들에서, 상기 성분은 다중 개별적 섹션 (예컨데, 2, 3, 4, 5 또는 그 이상의 섹션)으로 분리된 적어도 하나의 IDR을 갖는다. 일부 구체예들에서, 상기 섹션은 링커 서열 또는 구조화된 아미노산에 의해 분리된다.
일부 구체예들에서, 상기 제제는 변형된 전사 응축물 성분 (예컨데, 전사 인자, 전사 공동-활성제, 핵 수용체 리간드)이다. 일부 구체예들에서, 상기 제제는 변형된 이질성염색질 응축물 성분 (예컨데, 메틸-DNA 결합 단백질, 유전자 침묵화 인자)이다. 일부 구체예들에서, 상기 제제는 변형된 mRNA 개시 또는 신장 복합체와 물리적으로 연합된 응축물 성분 (예컨데, 스플라이싱 인자, RNA 중합효소 II)이다. 일부 구체예들에서, 상기 성분은 변형된 IDR 영역을 갖는다. 일부 구체예들에서, 상기 IDR은 상기 전사 인자의 활성화 도메인에 위치하거나, 또는 이로부터 유래된다. 일부 구체예들에서, 상기 변형된 IDR에는 야생형 서열보다는 세린의 수가 증가되거나 또는 축소된다. 일부 구체예들에서, 상기 IDR은 야생형 서열과 비교하였을 때, 방향족 산의 수가 증가되거나 또는 축소된다. 일부 구체예들에서, 상기 IDR은 야생형 서열과 비교하였을 때, 산성 잔기의 수가 증가되거나 또는 축소된다. 일부 구체예들에서, 상기 IDR은 야생형 서열과 비교하였을 때, 양성 또는 음성 순-전하가 증가되거나 또는 축소된다.
일부 구체예들에서, 상기 IDR은 야생형 서열과 비교하였을 때, 프롤린 잔기의 수가 증가되거나 또는 축소된다. 일부 구체예들에서, 상기 IDR은 야생형 서열과 비교하였을 때, 세린 및/또는 트레오닌 잔기의 수가 증가되거나 또는 축소된다. 일부 구체예들에서, 상기 IDR은 야생형 서열과 비교하였을 때, 글루타민 잔기의 수가 증가되거나 또는 축소된다. 일부 구체예들에서, 상기 IDR의 잔기 또는 잔기들 ((예컨데, 세린, 트레오닌, 프롤린, 산성 잔기, 글루탐산, 방향족 잔기)은 야생형 서열과 비교하였을 때 1개, 2개, ,3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 31개, 32개, 33개, 34개, 35개, 40개, 45개, 50개, 75개, 100개, 또는 그 이상의 인자로 증가될 수 있거나, 또는 감소될 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 IDR의 잔기 또는 잔기들 ((예컨데, 세린, 트레오닌, 프롤린, 산성 잔기, 글루탐산, 방향족 잔기)은 야생형 서열과 비교하였을 때, 약 1.2, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5,, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 그 이상의 인자로 증가될 수 있거나, 또는 감소될 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 IDR의 잔기 또는 잔기들 ((예컨데, 세린, 트레오닌, 프롤린, 산성 잔기, 글루탐산, 방향족 잔기)은 야생형 서열과 비교하였을 때, 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 그 이상의 인자로 증가될 수 있거나, 또는 감소될 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 IDR의 모든 산성 잔기는 비-산성 잔기 (예컨데, 비-하전된 잔기, 염기성 잔기)로 대체될 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 IDR의 모든 프롤린 잔기는 비-프롤린 잔기 (예컨데, 친수성 잔기, 극성 잔기)로 대체될 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 IDR의 모든 세린 및/또는 트레오닌 잔기는 비-세린 및/또는 트레오닌 잔기 (예컨데, 소수성 잔기, 산성 잔기)로 대체될 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 변형된 성분은 응축물 (예컨데, 전사 응축물)의 다른 성분들에 대하여 축소된 또는 증가된 결합가를 갖는다. 일부 구체예들에서, 상기 변형된 전사 응축물 성분은 응축물 형성을 억압하거나, 또는 방지한다. 일부 구체예들에서, 상기 변형된 이질성염색질 응축물 성분 또는 mRNA 개시 또는 신장 복합체와 물리적으로 연합된 응축물의 변형된 성분은 응축물 형성 또는 응축물 활성을 억압하거나, 또는 방지한다.
전사 인자 활성
마스터 전사 인자들 (TFs)은 세포 유형 특이적 인헨서 (예컨데, 슈퍼-인헨서)를 확립함으로써, 주요 세포 정체성 유전자들을 조절하는 것으로 알려져 있다. 더욱이, 핵 수용체들은 암을 비롯한 수 많은 질환 및 병채와 연합된 TFs이다. TFs는 공동활성제들을 모집함으로써, 이들의 표적 유전자들의 전사를 활성화시킨다. TFs와 공동활성제들 간의 결합은 이들의 상호작용 경계면(interface)이 하나의 입체구조로는 설명될 수 없기 때문에, "퍼지(fuzzy)"로 묘사되어 왔다. 이러한 역동적 상호작용은 상-분리된 응축물들을 포함하는 IDR-IDR 상호작용의 전형이기도 하다. 다양한 유형의 낮은 복합성 활성화 도메인을 갖는 TFs는 Mediator, p300 및 일반적 전사 인자 II D (TFIID)를 포함하는 다중하위단위 공동활성제 복합체의 동일한 작은 세트와 상호작용하는 것으로 간주된다. TFs가 공동활성제들과 상호작용하고, 이로 인하여 전사를 활성화시키는 작용 기전은 공동활성제 응축물의 핵화(nucleating)에 의한 것으로 우리는 제안한다. 따라서, TF 활성화 도메인을 변경시키면 상기 공동활성제 복합체와의 상호작용이 파괴되며, 이로 인하여 상기 전사 결과량이 변경된다.
따라서, 일부 구체예들에서, 상기 전사 응축물의 성분에 대하여 전사 응축물과 연합된 전사 인자(TF)의 결합을 조절함으로써, 당해 전사 응축물이 조절된다. 일부 구체예들에서, 한 가지 또는 그 이상의 응축물 성분들에 대한 TF 활성화 도메인의 친화력이 조절된다. 일부 구체예들에서, TF에 대한 성분 (예컨데, TF 활성화 도메인)의 친화력이 조절된다. 일부 구체예들에서, 상기 전사 응축물의 성분에 대하여 전사 응축물과 연합된 전사 인자(TF)의 결합을 조절함으로써, 당해 전사 응축물의 형성이 조절된다. 일부 구체예들에서, 상기 TF의 수준 또는 성분의 조정에 의해, 전사 응축물에 연합된 성분에 상기 TF의 결합이 조절된다. 다른 구체예들에서, 상기 응축물의 성분에 대하여 당해 응축물에 연합된 전사 인자(TF)의 결합을 조절함으로써, 이질성염색질 응축물, 또는 mRNA 개시 또는 신장 복합체와 물리적으로 연합된 응축물이 조절된다. 일부 구체예들에서, 한 가지 또는 그 이상의 응축물 성분들 (예컨데, 이질성염색질 응축물 성분, 또는 mRNA 개시 또는 신장 복합체와 물리적으로 연합된 응축물의 성분)에 대한 TF 활성화 도메인의 친화력이 조절된다. 일부 구체예들에서, TF에 대한 성분 (예컨데, TF 활성화 도메인)의 친화력이 조절된다. 일부 구체예들에서, 상기 응축물의 성분에 대하여 당해 응축물에 연합된 전사 인자(TF)의 결합을 조절함으로써, 상기 이질성염색질 응축물, 또는 mRNA 개시 또는 신장 복합체와 물리적으로 연합된 응축물의 형성이 조절된다. 일부 구체예들에서, 상기 TF의 수준 또는 성분의 조절에 의해, 이질성염색질 응축물, 또는 mRNA 개시 또는 신장 복합체와 물리적으로 연합된 응축물과 연합된 성분과 연합된 성분에 대한 TF의 결합이 조절된다.
상기 성분은 제한되지 않으며, 본원에서 기술된 임의의 성분일 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 성분은 공동활성제, 공동인자, 또는 핵 수용체 리간드이다. 일부 구체예들에서, 상기 성분은 Mediator, 매개체 성분, MED1, MED15, GCN4, p300, BRD4, 호르몬 (예컨데 에스트로겐) 또는 TFIID이다. 일부 구체예들에서, 상기 성분은 전사 인자다. 일부 구체예들에서, 상기 전사 인자는 활성화 도메인 안에 IDR를 보유한다. 일부 구체예들에서, 상기 전사 인자는 OCT4, p53, MYC 또는 GCN4, NANOG, MyoD, KLF4, SOX 패밀리 전사 인자, GATA 패밀리 전사 인자, 또는 핵 수용체 (예컨데, 핵 호르몬 수용체, 에스트로겐 수용체, 레티노산 수용체-알파)이다. 일부 구체예들에서, 상기 핵 수용체는 동족 리간드에 결합될 때, 전사를 활성화시킨다. 일부 구체예들에서, 상기 핵 수용체는 동족 리간드의 부재 하에서 전사를 활성화시키는 돌연변이 핵 수용체다. 상기 돌연변이 핵 수용체는 본원에서 기술된 임의의 돌연변이 핵 수용체일 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 전사 인자는 슈퍼-인헨서와 연합된 전사 인자이다. 일부 구체예들에서, 상기 전사 인자는 표 S3에서 열거된 전사 인자의 활성화 도메인을 갖는다. 일부 구체예들에서, 상기 전사 인자는 표 S3에서 열거된 전사 인자의 IDR을 갖는다. 일부 구체예들에서, 상기 전사 인자는 표 S3에서 열거되어 있다. 일부 구체예들에서, 상기 전사 인자는 매개체 성분 (예컨데, 표 S3에 열거된 매개체 성분)과 상호작용하는 전사 인자다.
일부 구체예들에서, 상기 전사 인자 또는 전사 응축물에 본원에서 기술된 제제를 접촉시킴으로써, 상기 전사 응축물의 성분 (예컨데, 비-전사 인자 성분)에 대한 상기 전사 인자의 결합이 조절된다. 일부 구체예들에서, 상기 전사 인자 또는 이질성염색질 응축물, 또는 mRNA 개시 또는 신장 복합체와 물리적으로 연합된 응축물,에 본원에서 기술된 제제를 접촉시킴으로써,상기 이질성염색질 응축물, 또는 mRNA 개시 또는 신장 복합체와 물리적으로 연합된 응축물의 성분에 대한 상기 전사 인자의 결합이 조절된다. 일부 구체예들에서, 상기 제제는 펩티드, 핵산, 또는 소 분자이다. 일부 측면들에서, 음 전하를 갖는 펩티드는 양 전하를 갖는 IDR에 결합될 수 있다. 일부 측면들에서, 양 전하를 갖는 펩티드는 음 전하를 갖는 IDR에 결합될 수 있다.
일부 구체예들에서, 상기 제제는 본원에서 기술된 임의의 소 분자일 수 있다. 소 분자들은 상기 전사 인자 활성화 도메인 (예컨데, 상기 전사 인자 활성화 도메인에서 IDR)과 동족 공동활성제 상의 본질적으로 무질서화된 영역과의 연합을 방지하도록 기획될 수 있다. 이것은 IDRs와 연루된 종양형성적 융합 단백질들 (MLL-재배열, EWS-FLI, ETS 융합, BRD4-NUT, NUP98 융합, 종양형성적 전사 인자 융합, 등등.)을 품고 있는 암에 특히 관련될 수 있다. 이러한 상호작용의 교란을 이용하여 특이적 전사 인자 또는 특이적 좌와 연합된 전사 결과량을 강화시키거나, 줄이거나, 또는 그렇지 않으면 변경시킬 수 있다. 소 분자들은 야생형 전사 인자 보다는 돌연변이체 전사 인자 (예컨데, 돌연변이 핵 수용체)에 더 선호적으로 결합하도록 또한 기획될 수 있다.
스캐폴드와 클라이언트의 상호작용 변경
분자 응축물들은 "스캐폴드(scaffolds)"와 "클라이언트(clients)"로 나뉠 수 있는 다양한 형태의 성분을 갖는 것으로 기술되어 있다( Banani, S.F., Rice, A.M., Peeples, W.B., Lin, Y., Jain, S., Parker, R., and Rosen, M.K. (2016). Compositional Control of Phase-Separated Cellular Bodies. Cell 166, 651-663.). 스캐폴드 성분들은 상 분리시키고, 이들이 고도로 농축된 응축물들을 형성한다. 상 분리된 상태로, 이들 스캐폴드 성분들은 자체적으로는 상 분리되지 않는 클라이언트 성분들과 상호작용하지만, 그러나 클라이언트 스캐폴드 상호작용을 통하여 높은 국소 농도에 이를 수 있다 (Banani et al., 2016). 전사 응축물은 스캐폴드 성분과 클라이언트 성분으로 구성되며, 이들 클라이언트 성분들의 상호작용 도메인,즉 본질적으로 무질서화된 도메인 또는 영역을 표적으로 하는 펩티드 모방체 및 다른 생물 분자의 도입은 상기 전사 응축물로부터 이들 클라이언트를 배제시킬 것이라고 우리는 제안한다. 이들 클라이언트는 전사 공동-인자일 수 있고, 따라서 상기 전사 응축물로부터의 배제는 전사를 변경시킨다. 이들 클라이언트는 또한 신호전달 전사 인자일 수 있고, 따라서 상기 전사 응축물로부터의 배제는 특히 과다-활성화된 신호전달 경로를 전사 비활성시킨다. 일부 측면들에서, 상기 스캐폴드는 세포, 또는 시험관내에서 응축물을 형성하기 위하여 어셈블리될 수 있는 성분이며, 상기 성분은 스캐폴드 성분으로 간주될 수 있다.
일부 구체예들에서, 상기 전사 응축물과 연합된 성분 (예컨데, 클라이언트 성분) 의 양 또는 수준을 조절함으로써, 상기 전사 응축물이 조절된다. 상기 성분 (예컨데, 클라이언트 성분)은 제한되지 않으며, 본원에서 기술된 임의의 응축물 성분일 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 성분 (예컨데, 클라이언트 성분)은 한 가지 또는 그 이상의 전사 공동-인자들 및/또는 신호전달 전사 인자들 및/또는 핵 수용체 리간드들 (예컨데, 호르몬)이다. 일부 구체예들에서, 상기 성분 (예컨데, 클라이언트 성분)은 Mediator, MED1, MED15, GCN4, p300, BRD4, 호르몬, 또는 TFIID이다.
일부 구체예들에서, 상기 성분 (예컨데, 클라이언트 성분)과 상기 전사 응축물 간의 상호작용을 축소 또는 제거하는 제제에 접촉시킴으로써, 상기 전사 응축물과 연합된 성분 (예컨데, 클라이언트 성분)의 양 또는 수준이 조절된다. 상기 제제는 제한적이지 않으며, 본원에서 기술된 임의의 제제일 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 제제는 펩티드 모방체 또는 유사 생물분자이다.
일부 구체예들에서, 상기 제제는 상기 성분 (예컨데, 클라이언트 성분)의 상호작용 도메인을 표적으로 한다. 일부 구체예들에서, 상기 상호작용 도메인은 본질적으로 무질서한 도메인 또는 영역 (IDR)이다. 상기 IDR은 제한되지 않는다. 일부 구체예들에서, 상기 IDR은 표 S2에 열거된 모티프를 갖는 IDR이다.
신호전달(Signaling)
신호전달의 세포 유형-의존적 특이성은 슈퍼-인헨서에서 상 분리를 통하여 신호전달 인자들을 전사 응축물로 보냄으로써 적어도 부분적으로 획득될 수 있다는 것을 여기에서 기술된 실시예들에서 보여준다. 이와 같은 방식에서, 다중 신호전달 인자 분자들은 이러한 응축물들로 집중될 수 있고, 게놈 상의 적절한 부위를 점유할 수 있다.
따라서, 일부 구체예들에서, 응축물 (예컨데, 전사 응축물들)은 신호전달 인자에 대한 친화력이 증가 또는 감소되도록 조절될 수 있다 (예컨데, 제제에 의해). 일부 구체예들에서, 상기 응축물 (예컨데, 전사 응축물들)은 상기 신호전달 인자에 대한 친화력을 증가 또는 감소시키는 제제에 접촉될 수 있다. 예를 들면, 상기 제제는 상기 신호전달 인자 및 또다른 상기 응축물의 성분(예컨데, 전사 응축물들)과 연합될 수 있다. 대안으로, 상기 제제는 당해 제제와 상기 전사 인자의 성분과의 연합을 축소 또는 차단시킬 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 응축물 (예컨데, 전사 응축물들)에 대한 신호전달 인자의 친화력이 조절될 수 있다 (예컨데, 제제에 의해). 일부 구체예들에서, 상기 제제는 상기 신호전달 인자에 의한 활성화를 조절할 수 있다 (예컨데, 상기 신호전달 인자와 연합된 전사 응축물의 형성, 구성, 유지, 해체, 활성 및/또는 규제를 조절함으로써). 일부 구체예들에서, 상기 제제에 의한 응축물/신호전달 인자 친화력 또는 활성의 조절은 세포-유형 또는 인헨서 (예컨데 슈퍼-인헨서) 특이적이다. 일부 구체예들에서, 상기 제제는 상기 신호전달 인자와 공동-인자 (예컨데, 매개체 또는 매개체 성분) 간의 친화력을 조절한다.
일부 구체예들에서, 상기 응축물 (예컨데, 전사 응축물들)은 인헨서 (예컨데, 슈퍼-인헨서)와 연합된다. 상기 인헨서는 본원에서 기술된 또는 당분야의 공지된 한 가지 또는 그 이상의 유전자들과 연합될 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 인헨서는 세포 정체성과 관련된 한 가지 또는 그 이상의 유전자들과 연합된다. 일부 구체예들에서, 상기 인헨서는 본원에서 기술된 질환 또는 병태(예컨데, 암)와 연합된 유전자들과 연합된다. 상기 응축물은 본원에서 기술된 또는 당분야의 공지된 임의의 TF과 연합될 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 TF는 한 가지 또는 그 이상의 IDRs을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 응축물은 마스터 TF와 연합된다. 일부 구체예들에서, 상기 응축물과 연합된 TF는 MyoD, Oct4, Nanog, Klf4 또는 Myc이다.
상기 응축물들 (예컨데, 전사 응축물들)은 임의의 유전자 또는 유전자 그룹과 연합될 수 있다(예컨데 이의 전사를 조절). 일부 구체예들에서, 상기 유전자 또는 유전자들은 세포 정체성과 관련된다. 일부 구체예들에서, 상기 유전자들은 본원에서 기술된 질환 또는 병태(예컨데, 암)와 연합된다. 상기 응축물 (예컨데, 전사 응축물들)은 공동-인자를 포함할 수 있다. 상기 공동-인자는 제한되지 않는다. 일부 구체예들에서, 상기 공동-인자 및 신호전달 인자는 응축물에서 선호적으로 연합된다. 일부 구체예들에서, 상기 공동-인자는 Mediator, 매개체 성분, MED1, MED15, p300, BRD4, TFIID이다.
상기 응축물 (예컨데, 전사 응축물들)은 신호 응답 요소 (예컨데, 유전자 프로모터 영역 안에 있는 특이적 신호전달 인자들에 결합할 수 있고, 전사를 조정할 수 있는 짧은 서열의 DNA)와 연합될 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 신호 응답 요소는 슈퍼-인헨서와 연합된다. 일부 구체예들에서, 상기 신호 응답 요소는 슈퍼-인헨서와 연합된 게놈의 영역과 슈퍼-인헨서와 연합되지 않는 게놈 영역 모두에 존재한다.
상기 신호전달 인자는 제한되지 않으며, 본원에서 기술된 또는 당분야의 공지의 임의의 신호전달 인자일 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 신호전달 인자는 한 가지 또는 그 이상의 IDRs을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 신호전달 인자는 NF-kB, FOXO1, FOXO2, FOXO4, IKK알파, CREB, Mdm2, YAP, BAD, p65, p50, GLI1, GLI2, GLI3, YAP, TAZ, TEAD1, TEAD2, TEAD3, TEAD4, STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5A, STAT5B, STAT6, AP-1, C-FOS, CREB, MYC, JUN, CREB, ELK1, SRF, NOTCH1, NOTCH2, NOTCH3, NOTCH4, RBPJ, MAML1, SMAD2, SMAD3, SMAD4, IRF3, ERK1, ERK2, MYC, TCF7L2, TCF7, TCF7L1, LEF1, 또는 베타-카테닌으로 구성된 군에서 선별된다. 일부 구체예들에서, 상기 신호전달 인자는 상기 응축물과 연합된 하나 또는 그 이상의 신호 반응 요소들 또는 매개체에 선호적으로 결합한다. 일부 구체예들에서, 상기 응축물은 마스터 전사 인자를 포함한다.
신호전달 인자들 및 공동인자들은 전사 응축물들과 특이적으로 상호작용할 수 있고, 그리고 질환에서 일부 신호전달 경로는 변경된다. 상기 신호전달 경로는 제한되지 않는다. 일부 구체예들에서, 상기 신호전달 경로는 Akt/PKB 신호전달 경로, AMPK 신호전달 경로, cAMP-의존적 경로, EGF 수용체 신호전달 경로, Hedgehog 신호전달 경로, Hippo 신호전달 경로, 저산소증 유도성 인자 (HIF) 신호전달 경로, 인슐린 신호전달 경로, IGF 신호전달 경로, JAK-STAT 신호전달 경로, MAPK/ERK 신호전달 경로, mTOR 신호전달 경로, NF-kB 경로, Notch 신호전달 경로, PI3K/AKT 신호전달 경로, PDGF 수용체 경로, T 세포 수용체 신호전달 경로, TGF 베타 신호전달 경로, TLR 신호전달 경로, VEGF 수용체 신호전달 경로, 또는 Wnt 신호전달 경로다. 일부 구체예들에서, 상기 신호전달 경로는 핵 수용체 연합된 신호전달 경로다. 상기 핵 수용체는 제한되지 않으며, 본원에서 확인된 임의의 핵 수용체일 수 있다. 신호전달 경로가 질환 발병에 기여하는 경우, 응축물 형성, 구성, 유지, 해체, 형태 및/또는 규제의 변경은 치료적 잇점을 제공할 수 있다.
일부 구체예들에서, 조절 상기 전사 응축물은 한 가지 또는 그 이상의 신호전달 경로를 조절한다. 일부 구체예들에서, 상기 신호전달 경로는 질환 발병에 기여한다. 일부 구체예들에서, 상기 질환은 증식성 질환, 염증성 질환, 심혈관 질환, 신경적 질환 또는 감염성 질환이다. 일부 구체예들에서, 상기 질환은 암 (예컨데, 유방암)이다.
암의 유형은 제한되지 않는다. "암"이란 한 가지 또는 그 이상의 종양, 예컨데, 한 가지 또는 그 이상의 악성 또는 잠재적으로 악성 종양을 특징으로 하는 질환을 지칭할 때 일반적으로 이용된다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "종양"은 일탈적으로 증식하는 세포들을 포함하는 비정상적 성장을 포괄한다. 당분야에 공지된 바와 같이, 종양은 전형적으로 적절하게 제어되지 않는 과도한 세포 증식 (예컨데, 일반적으로 증식을 제한하는 생리적 영향 및 신호에 정상적으로 반응하지 않는)을 특징으로 하고, 다음 성질들중 한 가지 또는 그 이상을 나타낸다: 형성장애 (예컨데, 정상적인 세포 분화의 결어, 이로 인하여 미숙 세포의 수 또는 비율이 증가됨); 퇴화 (예컨데, 분화의 더 큰 손실, 구조적 조직의 더 많은 손실, 세포다형성, 비정상, 이를 테면, 큰, 과색성 핵, 세포질 대비 핵의 고-비율, 비정형 유사분열 등); 인접 조직의 침입 (예컨데, 기저막 파괴) 및/또는 전이. 악성 종양은 지속적으로 성장하는 경향이 있으며, 예를 들어 국소 침범 및/또는 국지적으로 및/또는 먼 위치로 전이하는 능력이 있는 반면, 양성 종양은 대개 원발성 부위로 국한되며, 대개 성장 측면에서 자가-제한적이다. 용어 "종양"은 악성 고형 종양, 예를 들어 암종 (상피 세포에서 발생하는 암), 육종 (간엽 기원의 세포에서 발생하는 암) 및 검출 가능한 고형 종양 덩어리가 없을 수 있는 악성 성장 (예컨데, 특정 혈액 학적)을 포함한다. 암은 다음을 포함하나, 이에 국한되지 않는다: 유방암; 담도암; 방광암; 뇌 암 (예컨데, 교모세포종, 수모세포종); 경부암; 융모막암종; 결장 암; 자궁내막 암; 식도 암; 위암; 급성 림프구성 백혈병 및 급성 골수성 백혈병을 비롯한 혈액 신생물(neoplasms); T-세포 급성 림프아구성 백혈병/림프종; 모(hairy) 세포 백혈병; 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 다발성 골수종; 성인 T-세포 백혈병/림프종; Bowen 질환 및 Paget 질환을 포함하는 상피내 신생물; 간 암; 폐암; Hodgkin 질환 및 림프구성 림프종을 포함하는 림프종; 신경아세포종; 흑색종, 편평 세포 암종을 포함한 구강암; 상피 세포, 간질 세포, 생식 세포 및 중간 엽 세포에서 발생하는 난소암을 포함한 난소암; 신경아세포종, 췌장암; 전립선암; 직장암; 혈관 육종, 위장관 간질 종양, 평활근 육종, 횡문근육종, 지방육종, 섬유육종 및 골육종을 포함한 육종; 신장 세포 암종 및 Wilms 종양을 포함한 신장암; 기저 세포 암종 및 편평 세포 암을 포함한 피부암; 정낭피종, 비-정낭피종 (기형종, 융모막암종), 간질 종양 및 생식 세포 종양과 같은 생식 종양을 포함한 고환암; 갑상선 선암 및 수질 암종을 포함한 갑상선암. 예를 들어, 임상적 및/또는 병리학적 특징 및/또는 분자 마커와 관련하여 상이할 수 있는 특정 장기에서 다양한 상이한 종양 유형이 발생할 수 있다는 것은 인지할 것이다. 다양한 장기에서 발생하는 종양에 대해 예컨데, WHO Classification of Tumours series, 4th ed, 또는 3rd ed (Pathology and Genetics of Tumours series)-International Agency for Research on Cancer (IARC), WHO Press, Geneva, Switzerland에서 논의되며, 모든 자료는 본원의 참고자료에 편입된다. 일부 구체예들에서, 상기 암은 폐암, 유방암, 경부암, 결장암, 위암, 신장암, 백혈병, 간암, 림프종, (예컨데, 비-Hodgkin 림프종, 예컨데, 미만성 거대 B-세포 림프종, Burkitts 림프종) 난소암, 췌장암, 전립선 암, 직장암, 육종, 피부 암, 고환암, 또는 자궁암이다. 암의 유형은 제한되지 않는다. 일부 구체예들에서, 상기 암은 일탈적인 유전자 발현을 나타낸다. 일부 구체예들에서, 상기 암은 일탈적인 유전자 산물 활성을 나타낸다. 일부 구체예들에서, 상기 암은 정상적인 수준에서 유전자 산물을 발현시키지만, 이의 활성을 변경시키는 돌연변이를 품고 있다. 일탈적으로 증가된 활성을 갖는 종양유전자의 경우에서, 본 발명의 방법들을 이용하여 당해 종양유전자의 발현을 감축시킬 수 있다. 일탈적으로 축소된 활성 (예컨데, 돌연변이로 인하여)을 갖는 종양 억압 유전자의 경우, 본 발명의 방법들을 이용하여 상기 조절 랜드스케이프를 조절함으로써, 당해 억압 유전자의 발현을 증가시킬 수 있다.
핵 구멍 연합(Nuclear pore association)
전사 응축물은 핵 구멍 단백질과 상호 작용하여 들어오는 신호에 우선적으로 접근하고, 새로 전사된 mRNA의 우선적으로 내보낼 수 있다. 상기 응축물과 상기 핵 구멍 사이의 상호작용의 안정화 또는 파괴로 인하여 당해 응축물의 전사 결과량이 변경될 수 있다. 이것은 또한 응축물과 연합된 유전자로부터 mRNA의 방출 및 해독을 유리하게 할 수 있다.
일부 구체예들에서, 조절 상기 전사 응축물의 조절은 당해 전사 응축물과 한 가지 또는 그 이상의 핵 구멍 단백질들 간의 상호작용을 조절한다. 일부 구체예들에서, 상기 전사 응축물과 상기 한 가지 또는 그 이상의 핵 구멍 단백질들 간의 상호작용의 조절은 신호전달, mRNA 방출, 및/또는 mRNA 해독을 조절한다. 일부 구체예들에서, 상기 핵 신호전달, mRNA 방출, 및/또는 mRNA 해독은 질환과 연합된다.
염증
박테리아 또는 바이러스 감염에 대한 염증 응답은 주요 사이토킨 및 케모킨의 활성화에 의존적이다. 이들 염증성 응답 유전자들의 전사 축소는 박테리아 또는 바이러스 감염의 유해한 효과를 축소시키는 것을 알려져 있다. 주요 염증성 유전자들의 강력한 발현은 응축물 형성에 의존적일 수 있는데, 펩티드, 핵산 또는 소 분자에 의해 표적화될 수 있는 특이적 단백질들, RNA 모티프 또는 DNA 모티프에 특히 의존적일 수 있다.
일부 구체예들에서, 조절 상기 전사 응축물 (또는, 일부 구체예들에서, 이질성염색질 응축물, 또는 mRNA 개시 또는 신장 복합체와 물리적으로 연합된 응축물)은 염증성 응답을 조절한다. 일부 구체예들에서, 상기 염증성 응답은 바이러스 또는 박테리아에 대한 염증성 응답이다. 일부 구체예들에서, 상기 염증성 응답은 부적절한, 잘못 제어된, 또는 과다활성 염증성 응답이다. 특정 구체예들에서, 본 명세서의 방법들을 이용하여 염증성 병태를 갖는 대상체에서 염증을 감소시키고, 한 가지 또는 그 이상의 염증성 사이토킨의 발현을 감소시키고, 및/또는 과다활성 염증성 응답을 감소시킨다. 일부 구체예들에서, 응축물을 조절하고, 이로 인하여 염증과 관련된 한 가지 또는 그 이상의 유전자들의 조절 전사, mRNA 개시 및/또는 신장, 또는 유전자 침묵화를 조절함으로써, 또는 염증 응답을 감축시킴으로써, 염증성 응답이 조절된다. 일부 구체예들에서, 염증과 관련된 신호전달 경로 활성 또는 염증 응답의 감축은 본원에서 개시된 방법 (예컨데, 응축물로 신호전달 인자의 친화력을 조절함으로써)을 통하여 조절된다.
DNA로 응축물 조절
DNA 메틸화/탈메틸화에 의한 DNA 서열의 변경 또는 변형 또는 기타 DNA 변형, 이를 테면, 아세틸화/데아세틸화는 응축물 형성, 구성, 유지, 해체, 형태 및/또는 규제에 영향을 줄 수 있다. 추가로, dCas9 (또는 기타 촉매적으로 비활성 부위-특이적 뉴클레아제)에 융합 및 특이적 가이드 RNAs를 이용함으로써, 부위-특이적 방식으로 게놈 DNA에 성분들 (DNA, RNA, 또는 단백질)을 테터링할 수 있다. 유사한 접근법을 이용하여 특이적 성분들을 기존의 응축물에 국소화시킬 수 있는데, 이로써 당해 응축물의 구성, 유지, 해체 또는 규제가 변경될 수 있다.
일부 구체예들에서, 상기 응축물 (예컨데, 전사 응축물)은 당해 응축물과 연합된 뉴클레오티드 서열 (예컨데, 게놈 DNA 서열)을 변경시킴으로써 조절된다. 예를 들자면, 전사 응축물과 연합된 인헨서 (예컨데, 슈퍼-인헨서)가 변경될 수 있다. 전사 인자 결합 부위 또한 변경될 수 있다. 일부 구체예들에서, 호르몬 응답 요소 또는 신호 응답 요소가 변경될 수 있다. 더욱이, 응축물과 연합된 성분을 인코딩하는 (예컨데, 전사 인자, 공동-인자, 공동-활성제, 억제 인자, 메틸-DNA 연합된 결합 단백질을 인코딩하는) 유전자가 변경될 수 있다. 상기 변경은 코딩 또는 넌코딩(noncoding) 영역에 있을 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 변경은 뉴클레오티드의 추가 또는 결손을 포함한다. 일부 구체예들에서, 응축물 형성을 촉발 또는 강화시키기 위하여, 또는 응축물 안정성을 조절하기 위하여 뉴클레오티드가 추가된다. 일부 구체예들에서, 응축물 형성 또는 응축물 안정성을 조절을 방지하기 위하여 뉴클레오티드가 결손된다. 일부 구체예들에서, 뉴클레오티드의 추가 또는 결손은 응축물 형성, 구성, 유지, 해체, 형태 및/또는 규제에 영향을 끼친다.
일부 구체예들에서, 상기 응축물과 연합된 DNA은 이질성염색질 (예컨데, 조건적(facultative) 이질성염색질)에 위치한다. 일부 구체예들에서, 상기 응축물과 연합된 DNA은 메틸화된다. 일부 구체예들에서, 게놈 DNA는 메틸화된 또는 탈메틸화되어 응축물 형성을 조절한다. 일부 구체예들에서, 상기 DNA는 메틸화된 또는 탈메틸화되어, 응축물 형성 또는 안정성을 조절하고, 이로 인하여 유전자 침묵화가 조절된다. 일부 구체예들에서, 부위-특이적 촉매적으로 비활성 엔도뉴클레아제를 이용하여 이질성염색질을 메틸화 또는 탈메틸화시켜, 응축물 형성 또는 안정성을 조절하고 및 이로 인하여 유전자 침묵화가 조절된다.
일부 구체예들에서, 상기 변경은 후생적(epigenetic) 변형을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 후생적 변형은 DNA 메틸화를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 뉴클레오티드 서열의 변경에는 당해 뉴클레오티드 서열에 DNA, RNA, 또는 단백질의 테터링(tethering)이 포함된다. 일부 구체예들에서, 상기 DNA, RNA, 또는 단백질은 본원에서 기술된 바와 같이, 전사 응축물 성분 또는 이의 단편 (예컨데, IDR 함유 단편)이다. 일부 구체예들에서, 상기 DNA, RNA, 또는 단백질은 본원에서 기술된 바와 같이, 이질성염색질 응축물 성분 또는 이의 단편 (예컨데, IDR 함유 단편)이다. 일부 구체예들에서, 상기 DNA, RNA, 또는 단백질은 본원에서 기술된 제제다. 일부 구체예들에서, 상기 DNA, RNA, 또는 단백질은 응축물의 형성을 촉진 또는 강화시킨다. 일부 구체예들에서, 상기 DNA, RNA, 또는 단백질은 응축물의 형성을 억압 또는 방지한다. 일부 구체예들에서, 공동인자 (예컨데, 매개체) 또는 이의 단편 (예컨데, IDR 함유 단편)은 상기 뉴클레오티드 서열에 테터링되어 있다. 일부 구체예들에서, 메틸-DNA 결합 단백질 또는 이의 단편 (예컨데, IDR 함유 단편)은 상기 뉴클레오티드 서열에 테터링되어 있다여 있다. 일부 구체예들에서, 사이클린 의존적 키나제 또는 이의 단편은 상기 뉴클레오티드 서열에 테터링되어 있다. 일부 구체예들에서, 스플라이싱 인자 또는 이의 단편 (예컨데, IDR 함유 단편)은 상기 뉴클레오티드 서열에 테터링되어 있다.
일부 구체예들에서, 상기 뉴클레오티드 서열에 DNA, RNA, 또는 단백질을 부착시킬 수 있는 촉매적으로 비활성 부위 특이적 뉴클레아제 및 작동체(effector) 도메인이 이용된다. 일부 구체예들에서, 상기 촉매적으로 비활성 부위 특이적 뉴클레아제 dCas (예컨데, dCas9 또는 Cpf1)가 이용된다.
당분야의 공지된 CRISPR 연합된 (Cas) 유전자들 또는 단백질들의 변종이 촉매적으로 비활성 부위 특이적 뉴클레아제가 만들어지도록 변형될 수 있으며, Cas 단백질의 선택은 상기 방법의 특정 조건에 따라 달라질 것이다 (예컨데, ncbi.nlm.nih.gov/gene/?term=cas9). Cas 단백질들의 특이적 예로는 Cas1, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9 및 Cas10을 포함한다. 특정 측면에서, 상기 방법에 이용된 Cas 핵산 또는 단백질은 Cas9이다. 일부 구체예들에서, Cas 단백질, 예컨데, Cas9 단백질은 원핵(prokaryotic) 종의 임의의 변종으로부터 유래될 수 있다. 일부 구체예들에서, 특정 프로토스페이스(protospacer)-이웃 모티프 (PAM) 서열을 인지하기 위하여 특정 Cas 단백질, 예컨데, 특정 Cas9 단백질이 선별될 수 있다. 특정 구체예들에서, Cas 단백질, 예컨데, Cas9 단백질은 박테리아 또는 고세균류(archaea)로부터 획득되거나, 또는 공지의 방법들을 이용하여 합성할 수 있다. 특정 구체예들에서, Cas 단백질은 그램 양성 박테리아 또는 그램 음성 박테리아로부터 유래될 수 있다. 특정 구체예들에서, Cas 단백질은 스트랩토코커스(Streptococcus), (예컨데, S. 피오게네스(pyogenes), S. 테르모필러스(thermophilus)) 크롭토코커스(Crptococcus), 코리네박테리움(Corynebacterium), 헤모필러스(Haemophilus), 유박테리움(Eubacterium), 파스테루레라(Pasteurella), 프레보테라(Prevotella), 베이우네라(VeiUonella), 또는 마리노박터(Marinobacter)로부터 유래될 수 있다. 일부 구체예들에서, 두 개 또는 그 이상의 상이한 Cas 단백질들, 또는 두 개 또는 그 이상의 Cas 단백질들을 인코딩하는 핵산을 세포, 접합체(zygote), 배(embryo), 또는 동물 안으로 도입시켜, 예컨데, 동일한, 유사한 또는 상이한 PAM 모티프를 포함하는 부위의 인지 및 변형이 허용될 수 있다.
일부 구체예들에서, 상기 Cas 단백질은 Cpf1 단백질 또는 이의 기능성 일부분이다. 일부 구체예들에서, 상기 Cas 단백질은 임의의 박테리아 종으로부터 유래된 Cpf1 또는 이의 기능성 일부분이다. 특정 구체예들에서, Cpf1 단백질은 프란시셀라 노비시다(Francisella novicida) U112 단백질 또는 이의 기능성 일부분, 악시드아미노코수스 종(Acidaminococcus sp). BV3L6 단백질 또는 이의 기능성 일부분, 또는 라취노스피라세 박테리움(Lachnospiraceae bacterium) ND2006 단백질 또는 이의 기능성 일부분이다. Cpf1 단백질은 유형 V CRISPR 시스템의 구성원이다. Cpf1 단백질은 약 1300개의 아미노산을 포함하는 폴리펩티드다. Cpf1은 RuvC-유사 엔도뉴클레아제 도메인을 내포한다.
일부 구체예들에서, Cas9 닉카제(nickase)는 상기 Cas9 뉴클레아제 도메인중 하나 또는 그 이상을 비활성화시킴으로써 생성될 수 있다. 일부 구체예들에서, Cas9의 RuvC I 도메인의 잔기 10에서 아미노산 치환은 당해 뉴클레아제를 DNA 닉카제로 전환시킨다. 예를 들면, 아미노산 잔기 10의 아스파르테이트는 알라닌을 대신하여 치환될 수 있다 (Cong et al, Science, 339:819-823). 촉매적으로 비활성 Cas9 단백질을 만들어내는 또다른 아미노산 돌연변이에는 잔기 10 및/또는 잔기 840에서의 돌연변이가 포함된다. 잔기 10과 잔기 840 모두에서 돌연변이는 촉매적으로 비활성 Cas9 단백질을 만들어낼 수 있는데, 본원에서 때때로, dCas9로 지칭된다. 예를 들면, D10A 및 H840A Cas9 돌연변이체는 촉매적으로 비활성이다.
본원에서 사용된 바와 같이, "작동체 도메인"은 게놈 서열 (예컨데, 유전자)의 발현 및/또는 활성화를 조절하는 분자 (예컨데, 단백질)이다. 상기 작동체 도메인은 메틸화 활성 또는 탈메틸화 활성 (예컨데, DNA 메틸화 또는 DNA 탈메틸화 활성)을 보유할 수 있다. 일부 측면들에서, 상기 작동체 도메인은 유전자의 하나 또는 두 개 모두의 대립유전자를 표적으로 한다. 상기 작동체 도메인은 핵산 서열 및/또는 단백질로 도입될 수 있다. 일부 측면들에서, 상기 작동체 도메인은 구성적 또는 유도성 작동체 도메인일 수 있다. 일부 측면들에서, Cas (예컨데, dCas) 핵산 서열 또는 이의 변이체 및 작동체 도메인 핵산 서열은 응축물을 보유한 세포 안으로 키메라 서열로써 도입된다. 일부 측면들에서, 상기 작동체 도메인은 Cas 단백질과 연합된(예컨데, 이에 결합된) 분자와 연합된다 (예컨데, 상기 작동체 분자는 Cas 단백질에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 융합된다). 일부 측면들에서, Cas (예컨데, dCas) 단백질 또는 이의 변이체 및 작동체 도메인은 융합되거나 또는 서로 테터링되어 키메라 단백질을 만들어내고, 당해 키메라 단백질로써 상기 세포 안으로 도입된다. 일부 측면들에서, 상기 Cas (예컨데, dCas) 단백질과 작동체 도메인은 단백질-단백질 상호작용으로 결합된다. 일부 측면들에서, 상기 Cas (예컨데, dCas) 단백질과 작동체 도메인은 공유적으로 연계된다. 일부 측면들에서, 상기 작동체 도메인은 상기 Cas (예컨데, dCas) 단백질과 비-공유적으로 연합된다. 일부 측면들에서, Cas (예컨데, dCas) 핵산 서열과 작동체 도메인 핵산 서열은 별개의 서열 및/또는 단백질들로 도입된다. 일부 측면들에서, 상기 Cas (예컨데, dCas) 단백질과 작동체 도메인은 융합되지 않거나 또는 테터링되지 않는다.
일부 구체예들에서, 한 가지 또는 그 이상의 게놈 서열의 활성 및/또는 발현을 조절하기 위하여 (예컨데, 전사 또는 염색질 조직화에 특정 효과를 발휘하거나, 또는 특이적 DNA 좌로 특정 종류의 분자들을 가져오거나, 또는 국소 히스톤 또는 DNA 상태의 센서로 작용한다), 상기 촉매적으로 비활성 부위 특이적 뉴클레아제는 한 가지 또는 그 이상의 RNA 서열 (sgRNA)에 의해 특이적 DNA 부위로 유도될 수 있다. 특이적 측면들에서, 한 가지 또는 그 이상의 게놈 서열을 조절하거나, 또는 메틸화 또는 탈메틸화를 변형시키기 위하여, 작동체 도메인의 전부 또는 일부분에 테터링된 dCas9의 융합으로 한 가지 또는 그 이상의 RNA 서열에 의한 특정 DNA 부위로 유도될 수 있는 키메라 단백질을 만들어낸다. 본원에서 사용된 바와 같이, "작동체 도메인의 생물학적으로 활성 부분"이란 작동체 도메인(예컨데, "최소(minimal)" 또는 "핵심(core)" 도메인)의 기능을 유지하는 (예컨데, 완전하게, 부분적으로, 최소한으로) 일부분이다. 한 가지 또는 그 이상의 작동체 도메인의 전부 또는 일부분과 Cas9 (예컨데, dCas9)의 융합으로 키메라 단백질이 만들어졌다.
작동체 도메인의 예로는 염색질 조직체(organizer) 도메인, 리모델링 도메인, 히스톤 변형자 도메인, DNA 변형 도메인, RNA 결합 도메인, 단백질 상호작용 투입(input) 장치(devices) 도메인 (Grunberg and Serrano, Nucleic Acids Research, 3 '8 (8): '2663 -267 '5 (2010)), 그리고 단백질 상호작용 결과량 장치 도메인 (Grunberg and Serrano, Nucleic Acids Research, 3 '8 (8): '2663 -267 '5 (2010))이 포함된다. 일부 측면들에서, 상기 작동체 도메인은 DNA 변형자다. DNA 변형자의 특정 예로는 5mC로부터 5hmc 전환, 이를 테면, Tet1 (Tet1CD); Tet1, ACID A, MBD4, Apobecl, Apobec2, Apobec3, Tdg, Gadd45a, Gadd45b, ROS1에 의한 DNA 탈메틸화; Dnmt1, Dnmt3a, Dnmt3b, CpG 메틸트랜스퍼라제 M.SssI, 및/또는 M.EcoHK31I에 의한 DNA 메틸화를 포함한다. 특이적 측면들에서, 작동체 도메인은 Tet1이다. 다른 특이적 측면들에서, 작동체 도메인은 Dmnt3a이다. 일부 구체예들에서, dCas9는 Tet1에 융합된다. 다른 구체예들에서, dCas9는 Dnmt3a에 융합된다. 작동체 도메인의 기타 예들은 PCT 출원 번호 PCT/US2014/034387 및 U.S. 출원 번호 14/785031에 기술되며, 이의 전문이 본 명세서의 참고자료에 편입된다. 촉매적으로 비활성 부위 특이적 뉴클레아제를 이용하는 방법들, 뉴클레오티드 서열 (예컨데, 게놈 서열)을 변형시키기 위한 작동체 도메인, 그리고 sgRNA는 2017년 12월 12일에 제출된 PCT/US2017/065918에서 교시되며, 이는 본 명세서의 참고자료에 편입된다.
RNA로 응축물 조절
외인성 RNAs의 추가, RNAs의 안정화, 또는 특정 RNAs의 제거로 응축물들을 조절할 수 있다. 따라서, 일부 구체예들에서, 상기 응축물에 외인적으로 추가된 RNA를 접촉시킴으로써, 당해 전사 응축물이 조절된다. 일부 구체예들에서, 상기 응축물에 외인적으로 추가된 RNA를 접촉시킴으로써, 이질성염색질 응축물이 조절된다. 일부 구체예들에서, 상기 응축물에 외인적으로 추가된 RNA를 접촉시킴으로써, mRNA 개시 또는 신장 복합체와 연합된 응축물이 조절된다.
일부 구체예들에서, 상기 외인성 RNA는 자연 발생적 RNA 서열, 변형된 RNA 서열 (예컨데, 한 가지 또는 그 이상의 변형된 염기를 포함하는 RNA 서열), 합성 RNA 서열, 또는 이의 조합이다. 본원에서 사용된 바와 같이, "변형된 RNA"란 당해 RNA 서열에 한 가지 또는 그 이상의 변형 (예컨데, 백본 및 또는 슈가에 변형)을 포함하는 RNA (예컨데, 한 가지 또는 그 이상의 비-표준 및/또는 비-자연 발생적 염기를 포함하는 RNA)를 말한다. RNA의 염기를 변형시키는 방법들은 당분야의 잘 공지되어 있다. 이러한 변형된 염기의 예로는 뉴클레오시드 5-메틸시티딘 (5mC), 슈도우리딘 (Ψ), 5-메틸우리딘, 2'0-메틸우리딘, 2-티오우리딘, N-6 메틸아데노신, 하이포산틴, 디히드로우리딘 (D), 이노신 (I), 그리고 7- 메틸구아노신 (m7G)이 내포된 것들을 포함한다. RNA 서열의 임의의 수의 염기는 다양한 구체예들에서 치환될 수 있다는 점을 주지해야 한다. 상이한 변형의 조합이 사용될 수 있음도 추가로 이해해야 한다.
일부 측면들에서, 상기 외인성 RNA 서열은 몰포리노(morpholino)이다. 몰포리노는 전형적으로 길이가 약 25개의 염기의 합성 분자이며, 표준 핵산 염기-페어링에 의해 RNA의 상보적 서열에 결합한다. 몰포리노는 표준 핵산 염기를 보유하지만, 이들 염기는 데옥시리보스 고리 대신 몰포린 고리에 결합하고, 포스페이트 대신 포스포로디아미데이트 기를 통하여 연계된다. 몰포리노는 많은 다른 안티센스 구조 유형(예컨데, 포스포로티오에이트, siRNA)과 달리, 이들의 표적 RNA 분자를 분해하지 않는다. 대신, 몰포리노는 입체적 차단에 의해 작용하여, RNA 안의 표적 서열에 결합하고, 그렇지 않으면 당해 RNA와 상호작용할 수 있는 분자를 차단시킨다. 일부 구체예들에서, 상기 합성 RNA는 WO 2017075406에서 기술된다.
일부 구체예들에서, RNA 서열의 길이는 약 8개 염기쌍 (bp)에서부터 약 200개 bp, 약 500개 bp, 또는 약 1000개 bp까지 다양할 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 RNA 서열은 약 9개 내지 약 190개 bp; 약 10개 내지 약 150개 bp; 약 15개 내지 약 120개 bp; 약 20개 내지 약 100개 bp; 약 30개 내지 약 90개 bp; 약 40개 내지 약 80개 bp; 약 50개 내지 약 70개 bp의 길이일 수 있다.
일부 구체예들에서, 상기 외인성 RNA는 상기 응축물의 형성을 강화시키거나 또는 안정성을 강화시킨다. 일부 구체예들에서, 상기 외인성 RNA는 상기 응축물의 해체를 가속화시키거나, 또는 형성을 방지/억압시킨다.
일부 구체예들에서, 특정 (즉, 특이적) RNAs의 제거는 간섭 RNA (RNAi)를 이용하여 실행된다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "RNA 간섭" ("RNAi") (또한 당분야에서는 "유전자 침묵화" 및/또는 "표적 침묵화", 예컨데, "표적 mRNA 침묵화"로도 지칭됨)이란 RNA의 선택적 세포내 붕괴를 지칭한다. RNAi는 외부 RNAs (예컨데, 바이러스 RNAs)를 제거하기 위하여 자연적으로 세포 안에서 발생된다. 자연적 RNAi는 기타 유사한 RNA 서열에 대하여 분해 기전을 지시하는 자유 dsRNA로부터 절단된 단편을 통하여 나아간다. 일부 측면들에서, 특이적 RNA는 당해 특이적 RNA의 전사 억제를 통하여 제거된다.
일부 구체예들에서, RNA는 당분야의 공지된 방법에 의해 RNA의 한 쪽 단부 또는 양단을 보호함으로써(캡핑) 안정화된다. 일부 구체예들에서, 상기 RNA는 상기 응축물의 성분에 결합을 간섭하지 않는 분자 (즉, 안티센스 핵산 또는 소 분자)와의 연합에 의해, 당해 RNA가 안정화된다.
응축물들의 성분들의 표적화에 의해 RNA 프로세싱의 조절.
일부 질환은 RNA종의 비정상적 프로세싱과 연합된다. 일부 구체예들에서, 전사 응축물들은 RNA 프로세싱 기구에 의해 형성된 응축물들과 융합될 수 있다. 이들 응축물의 안정화 또는 파괴로 인하여 치료요법적으로 유익한 방식으로 RNA 프로세싱을 변경시킬 수 있다. 일부 구체예들에서, 전사 응축물과 상기 RNA 프로세싱 기구에 의해 형성딘 응축물의 융합을 강화 또는 안정화시키기 위하여, 본원에서 기술된 방법들을 이용하여 응축물을 조절할 수 있다. 일부 구체예들에서, 전사 응축물과 상기 RNA 프로세싱 기구에 의해 형성딘 응축물의 융합을 억압 또는 불안정화시키기 위하여, 본원에서 기술된 방법들을 이용하여 응축물을 조절할 수 있다. 일부 구체예들에서, mRNA 개시 또는 신장 복합체와 물리적으로 연합된 응축물은 본원에서 개시된 방법에 의해 조절될 수 있고, 이로 인하여 RNA 프로세싱이 조절된다. 일부 구체예들에서, mRNA 개시 또는 신장 복합체와 물리적으로 연합된 응축물은 치료요법적으로 유익한 방식으로 조절된다. 일부 구체예들에서, mRNA 신장과 연합된 응축물들이 조절되고, 이로 인하여 mRNA 스플라이싱은 치료요법적으로 유익한 방식으로 조절된다 (예컨데, 일탈적인 스플라이싱 변이체들의 축소, 유익한 스플라이싱 변이체들의 증가).
mRNA 방출 조절에 의해 해독 조절
전사 응축물은 핵 구멍 단백질과 상호 작용하여 새로 전사된 mRNA의 우선적으로 내보낼 수 있다. 상기 응축물과 핵 구멍 간의 상호작용의 안정화 또는 파괴로 인하여 당해 응축물과 연합된 당해 유전자들로부터 mRNAs의 해독이 변경될 수 있다. 이러한 변경은 특정 단백질들의 병리적 수준을 야기할 때, 치료요법적으로 유용할 수 있다. 일부 구체예들에서, 새로 전사된 mRNA의 선호적 방출을 강화시키기 위하여, 본원에서 기술된 방법들을 이용하여 응축물을 조절할 수 있다. 일부 구체예들에서, 새로 전사된 mRNA의 선호적 방출을 억압하기 위하여, 본원에서 기술된 방법들을 이용하여 응축물을 조절할 수 있다. 일부 구체예들에서, mRNA의 조절은 질환 치료에 치료효과적이다. 일부 구체예들에서, mRNA 조절로 단백질의 병인적 수준이 비-병인적 수준으로 복귀된다.
다가(multivalent) 분자를 이용한 응축물들을 표적화
응축물들 (예컨데, 전사 응축물들, 이질성염색질 응축물들, 또는 mRNA 개시 또는 신장 복합체와 연합된 응축물)은 IDRs을 갖는 단백질들 간에 다수의 약한 상호작용에 의해 형성될 수 있다. 이러한 무질서화된 영역이 임의의 정의된 2차 또는 3차 구조를 보유하지 않는다면, 이들 영역에 결합하는 소 분자 또는 펩티도모방체는 약한 친화력으로 그렇게 할 수 있다. 약한 IDR-IDR 상호작용을 교란시키기 위하여, 이러한 분자들을 응축물들 (예컨데, 전사 응축물들, 이질성염색질 응축물들, 또는 mRNA 개시 또는 신장 복합체와 연합된 응축물)에 집중시키기 위해, "고정자(anchor)"와 "파괴자(disruptor)"로 구성된 이가(bivalent) 분자가 이용될 수 있다. 상기 "파괴자"는 상호작용을 파괴하거나 또는 이의 성질을 변경시키기 위하여, 상기 응축물의 상호작용 분자에 약하게 결합하는 분자다. 상기 고정자 성분은 상기 응축물 안에 또는 부근에 있는 단백질의 구조화가 더 잘된 영역에 대하여 강한 친화력을 갖고, 따라서 당해 응축물 (예컨데, 전사 응축물들, 이질성염색질 응축물들, 또는 mRNA 개시 또는 신장 복합체와 연합된 응축물) 안에 또는 부근으로 당해 파괴자 분자를 집중시키는 역할을 하는 분자다.
일부 구체예들에서, 응축물 성분의 본질적으로 무질서화된 도메인에 결합하는 제제를 당해 응축물에 접촉시킴으로써, 상기 전사 응축물들은 조정된다. 일부 구체예들에서, 응축물 성분의 본질적으로 무질서화된 도메인에 결합하는 제제를 당해 응축물에 접촉시킴으로써, 이질성염색질 응축물은 조정된다. 일부 구체예들에서, 응축물 성분의 본질적으로 무질서화된 도메인에 결합하는 제제를 당해 응축물에 접촉시킴으로써, mRNA 개시 또는 신장 복합체와 연합된 응축물은 조정된다. 상기 성분은 제한되지 않으며, 본원에서 기술된 임의의 성분일 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 성분은 Mediator, MED1, MED15, GCN4, p300, BRD4, 핵 수용체 리간드, 또는 TFIID이다. 일부 구체예들에서, 상기 성분은 표 S3에서 열거된 매개체 성분이다. 일부 구체예들에서, 상기 성분은 전사 인자다. 일부 구체예들에서, 상기 전사 인자는 활성화 도메인 안에 IDR를 보유한다. 일부 구체예들에서, 상기 전사 인자는 OCT4, p53, MYC, GCN4, NANOG, MyoD, KLF4, SOX 패밀리 전사 인자, GATA 패밀리 전사 인자, 핵 수용체, 또는 융합 종양형성적 전사 인자다. 일부 구체예들에서, 상기 전사 인자는 표 S3에서 열거된 전사 인자의 활성화 도메인을 갖는다. 일부 구체예들에서, 상기 전사 인자는 표 S3에서 열거된 전사 인자의 IDR을 갖는다. 일부 구체예들에서, 상기 전사 인자는 표 S3에서 열거되어 있다. 일부 구체예들에서, 상기 전사 인자는 매개체 성분 (예컨데, 표 S3에 열거된 매개체 성분)과 상호작용하는 전사 인자다.
상기 제제는 또한 제한적이지 않으며, 본원에서 기술된 임의의 적합한 제제일 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 제제는 다가(multivalent) (예컨데, 이가(bivalent), 삼가(trivalent), 사가(tetravalent), 등등.)이다. 일부 구체예들에서, 상기 제제는 성분의 본질적으로 무질서화된 도메인에 결합하고, 동일한 성분의 비-본질적으로 무질서화된 도메인에도 더 결합한다. 일부 구체예들에서, 상기 제제는 성분의 본질적으로 무질서화된 도메인에결합하고, 전사 응축물과 연합된 제 2 성분에 더 결합한다. 일부 구체예들에서, 상기 제제는 다가(multivalent)이며, 활성화 도메인 (예컨데, 활성화 도메인의 IDR)에 결합하고, 전사 인자의 비-활성화 도메인 (예컨데, DNA 결합 도메인), 또는 비-본질적으로 무질서화된 영역에 더 결합한다. 일부 구체예들에서, 상기 제제는 돌연변이체 전사 인자 (예컨데, 돌연변이체 전사 인자 질환 또는 병태와 연합된다) 비-활성화 도메인 또는 전사 인자의 비-본질적으로 무질서화된 영역에 특이적으로 결합한다. 일부 구체예들에서, 상기 제제는 야생형 전사 인자 비-활성화 도메인 또는 당해 야생형 전사 인자의 비-본질적으로 무질서화된 영역에 결합하지 않는다. 일부 구체예들에서, 상기 다가(multivalent) 제제는 핵 수용체에 결합한다. 일부 구체예들에서, 상기 다가(multivalent) 제제는 핵 수용체의 돌연변이체 형태에 선호적으로 결합한다(예컨데 돌연변이체 형태 질환 또는 병태와 연합된다). 일부 구체예들에서, 상기 다가(multivalent) 제제는 신호전달 인자, 공동-인자, 메틸-DNA 결합 단백질, 스플라이싱 인자, 또는 RNA 중합효소에 결합한다.
일부 구체예들에서, 상기 제제는 상기 전사 응축물들의 성분들 간의 상호작용을 변경시키거나 또는 파괴시킨다. 일부 구체예들에서, 상기 제제는 상기 전사 응축물을 강화 또는 안정화시킨다. 일부 구체예들에서, 상기 제제는 상기 전사 응축물을 억압 또는 불안정하게 한다.
새로운 응축물의 형성 또는 기존 응축물의 변경을 개시하기 위하여 DNA에 성분들을 테터링
전사 응축물들 및 이질성염색질 응축물들은 DNA 상에 형성될 수 있다. 따라서, 새로운 응축물을 형성시키기 위하여, 본원에 개시된 방법으로 촉매적으로 비활성 부위 특이적 뉴클레아제 및 작동체 도메인을 이용하여 부위-특이적 방식으로, 게놈 DNA에 성분들 (DNA, RNA, 또는 단백질)을 테터링할 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 성분들은 본원에서 기술된 바와 같이, dCas (예컨데, dCas9)을 이용하여 DNA (예컨데, 게놈 DNA)에 테터링한다.
일부 구체예들에서, 한 가지 또는 그 이상의 전사 응축물 성분들을 게놈 DNA에 테터링함으로써, 상기 전사 응축물이 형성되거나, 강화되거나, 또는 안정화된다. 일부 구체예들에서, 한 가지 또는 그 이상의 이질성염색질 응축물 성분들을 게놈 DNA에 테터링함으로써, 상기 이질성염색질 응축물이 형성되거나, 강화되거나, 또는 안정화된다. 상기 성분들은 제한되지 않으며, 본원에서 기술된 임의의 성분을 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 성분들은 DNA, RNA, 및/또는 단백질을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 성분들은 Mediator, MED1, MED15, GCN4, p300, BRD4, β-카테닌, STAT3, SMAD3, NF-kB, MECP2, MBD1, MBD2, MBD3, MBD4, HP1α, TBL1R, HDAC3, SMRT, RNA 중합효소 II, SRSF2, SRRM1, SRSF1, 핵 수용체 리간드, 또는 TFIID를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 성분은 표 S3에서 열거된 매개체 성분이다. 일부 구체예들에서, 상기 성분은 본원에서 개시된 IDR을 갖는다. 일부 구체예들에서, 상기 성분은 전사 인자다. 일부 구체예들에서, 상기 전사 인자는 활성화 도메인 안에 IDR를 보유한다. 일부 구체예들에서, 상기 전사 인자는 OCT4, p53, MYC, GCN4, NANOG, MyoD, KLF4, SOX 패밀리 전사 인자, GATA 패밀리 전사 인자, 핵 수용체, 또는 융합 종양형성 전사 인자다. 일부 구체예들에서, 상기 전사 인자는 표 S3에서 열거된 전사 인자의 활성화 도메인을 갖는다. 일부 구체예들에서, 상기 전사 인자는 표 S3에서 열거된 전사 인자의 IDR을 갖는다. 일부 구체예들에서, 상기 전사 인자는 표 S3에서 열거되어 있다. 일부 구체예들에서, 상기 전사 인자는 매개체 성분 (예컨데, 표 S3에 열거된 매개체 성분)과 상호작용하는 전사 인자다.
질환 관련된 단백질들을 격리시키기 위하여 상 분리에서의 원리를 이용
암을 비롯한 많은 질환은 전사에 연루된 특이적 단백질들에 의존적일 수 있다. 예를 들면, Myc 전사 인자는 다수의 모든 암에서 과다발현되고, 이의 교란으로 암 세포 사멸 및 분화가 이어진다. Myc는 합성 MED1 응축물에 선호적으로 통합되는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 외인성 펩티드, 핵산, 또는 화학적 소 분자에 의해 유도된 응축물 형성을 이용하여 활성 유전자들의 프로모터에서 이의 정상적인 위치로부터 Myc를 격리시킬 수 있다. 응축물로 통합되는 능력을 보유한 임의의 질환 관련된 단백질에 대해서도 유사한 전략이 이용될 수 있다. 질환 관련된 단백질의 야생형 형태는 단독으로 남아있는 한편, 돌연변이된 형태는 상기 합성 응축물로 특이적으로 통합될 수 있다면, 돌연변이 또는 융합 사건을 겪는 질환 관련된 단백질들은 이러한 방식에 특히 취약할 수 있다.
일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 방법들을 이용하여 본원에서 기술된 바와 같이, 단백질, DNA, RNA 또는 기타 응축물 성분을 격리시키리 위하여, 응축물을 형성 또는 안정화시킬 수 있다. 예를 들면, DNA에 성분을 테터링하고, 응축물 형성을 핵화시킴으로써, 응축물이 형성되도록 유도할 수 있다. 본원에서 기술된 바와 같이, 적합한 제제 (예컨데, 외인적으로 추가된 단백질, DNA 또는 RNA) 또는 적합한 성분을 세포에 첨가함으로써, 응축물이 형성되도록 유도할 수 있다. 일부 구체예들에서, 응축물에서 성분 격리에 의해 당해 성분으로 접근이 제한됨으로써, 제 2 응축물이 조절된다. 일부 구체예들에서, 상기 격리된 성분은 Myc이다. 일부 구체예들에서, 상기 격리된 성분은 야생형-단백질의 돌연변이 형태다. 일부 구체예들에서, 상기 야생형 단백질은 격리되지 않는다. 일부 구체예들에서, 상기 격리된 성분은 질환 상태에서 과다-발현된 성분이다. 일부 구체예들에서, 상기 성분의 격리로 질환 상태가 치료된다. 상기 격리 성분은 제한되지 않으며, 본원에서 기술된 응축물의 임의의 성분 (예컨데, Mediator, MED1, MED15, GCN4, p300, BRD4, 핵 수용체 리간드, 그리고 TFIID)이다. 일부 구체예들에서, 상기 격리 성분은 전사 인자 또는 이의 일부분, 예컨데, 활성화 도메인이다. 일부 구체예들에서, 상기 전사 인자는 활성화 도메인 안에 IDR를 보유한다. 일부 구체예들에서, 상기 전사 인자는 OCT4, p53, MYC GCN4, NANOG, MyoD, KLF4, SOX 패밀리 전사 인자, GATA 패밀리 전사 인자, 핵 수용체, 또는 융합 종양형성적 전사 인자다. 일부 구체예들에서, 상기 전사 인자는 표 S3에서 열거된 전사 인자의 활성화 도메인을 갖는다. 일부 구체예들에서, 상기 전사 인자는 표 S3에서 열거된 전사 인자의 IDR을 갖는다. 일부 구체예들에서, 상기 전사 인자는 표 S3에서 열거되어 있다. 일부 구체예들에서, 상기 전사 인자는 매개체 성분 (예컨데, 표 S3에 열거된 매개체 성분)과 상호작용하는 전사 인자다.
넌-코딩 RNA는 적어도 일부 전사 응축물들의 중요 성분이다.
많은 응축물들은 RNA 성분들을 보유한다 (Banani, S.F., Lee, H.O., Hyman, A.A., and Rosen, M.K. (2017). Biomolecular condensates: organizers of cellular biochemistry. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 18, 285-298.). 유전자 조절 요소들은 예외적으로 높은 수준의 넌코딩 RNAs를 만든다 (Li, W., Notani, D., and Rosenfeld, M.G. (2016). Enhancers as non-coding RNA transcription units: recent insights and future perspectives. Nat. Rev. Genet. 17, 207-223.). 이들 RNAs의 생물학적 기능은 여전히 파악되지 않았다. 추가로, 많은 전사 인자들 및 공동-인자들은 RNA와 상호작용할 수 있다 (Li et al., 2016). 일부 전사 응축물들의 형성 및 유지는 넌코딩 RNAs에 의존적이라고 우리는 제안한다. 안티-센스 올리고뉴클레오티드, RNase (RNAs를 분해하는 효소), 또는 전사 응축물들 안에 이러한 넌코딩 RNA를 직접적으로 표적으로 하는 화학적 화합물은 건강한 세포와 질환 세포에서 전사 응축물들의 해체를 야기할 수 있다.
일부 구체예들에서, 상기 전사 응축물과 연합된 ncRNA의 수준 또는 활성을 조절함으로써, 당해 전사 응축물이 조절된다. ncRNA의 수준 또는 활성 조절은 임의의 적합한 방법에 의해 실행될 수 있다. 일부 구체예들에서, ncRNA의 수준 또는 활성 조절은 본원에서 기술된 (예컨데, RNAi)에 의해 실행될 수 있다. 일부 구체예들에서, 안티-센스 올리고뉴클레오티드, RNase, 또는 ncRNA에 결합하는 소 분자에 당해 ncRNA를 접촉시킴으로써, ncRNA의 수준 또는 활성이 조절된다.
스크리닝 방법들
본 명세서의 일부 측면들은 응축물들 (예컨데, 전사 응축물들, 이질성염색질 응축물들, mRNA 개시 또는 신장 복합체와 연합된 응축물)을 변형시킬 수 있는 본원에서 정의된 바의 제제를 스크리닝하는 방법에 관계한다.
응축물-변형시키는 치료요법을 스크리닝하기 위한 생체내 검정법
본 명세서의 일부 측면들은 응축물(예컨데, 전사 응축물)의 형성, 안정성, 또는 형태를 조정하는 제제를 식별해내는 방법에 관계하는데, 이 방법은 응축물을 보유한 세포를 제공하고, 상기 세포에 테스트 제제를 접촉시키고, 그리고 상기 테스트 제제와의 접촉으로 상기 응축물의 형성, 안정성, 또는 형태가 조정되는 지를 결정하는 것을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 응축물은 탐지가능한 테그를 보유하고, 당해 탐지가능한 테그를 이용하여 상기 테스트 제제와의 접촉으로 상기 응축물의 형성, 안정성, 또는 형태가 조정되는 지를 결정한다. 일부 구체예들에서, 상기 탐지가능한 테그를 발현시키기 위하여, 상기 세포는 유전공학적으로 공작된다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "탐지가능한 테그" 또는 "탐지가능한 라벨"에는 탐지가능한 라벨, 이를 테면, 형광단, 방사성동위원소, 발색성 물질, 또는 효소; 특이적 항체가 상업적으로 이용가능한 이종성 에피토프, 예컨데, FLAG-테그; 상업적으로 이용가능한 결합 단백질들의 리간드인 이종성 아미노산 서열, 예컨데, Strep-테그, 바이오틴; 다른 폴리펩티드 상에 있는 형광 테그와 협조적으로 일반적으로 이용되는 형광 해소제(quenchers); 및 상보적 생물발광 또는 형광 폴리펩티드 단편이 포함되나, 이에 국한되지 않는다. 탐지가능한 라벨 또는 상보적 생물발광 또는 형광 폴리펩티드 단편인 테그는 직접적으로 (예컨데, 연합안된 폴리펩티드와 비교하였을 때, 연합된 폴리펩티드의 분광광도측정에 의해 탐지가능한 색 변화를 만들기 위한 적절한 물질 또는 효소의 형광 또는 방사능활성을 측정하거나, 또는 이와 항온처리함으로써) 측정될 수 있다. 이종성 에피토프 또는 리간드인 테그는 예컨데, 항체 또는 결합 단백질에 결합하는 제 2 성분으로 전형적으로 탐지되며, 이때 상기 제 2 성분은 상기 탐지가능한 라벨과 연합된다.
일부 측면들에서, 상기 방법은 응축물 성분들을 보유한 세포, 당해 세포에 테스트 제제를 접촉시키고, 그리고 상기 테스트 제제와의 접촉으로 상기 성분들을 포함하는 응축물의 형성 (예컨데, 이형성(heterotypic) 응축물을 형성, 상동형 응축물 형성) 또는 활성이 조절되는 지를 결정하는 것을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 한 가지 또는 그 이상의 응축물 성분들은 탐지가능한 라벨을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 응축물 성분들은 응축물을 형성할 것이고, 응축물 형성의 조절 (예컨데, 응축물 형성의 증가 또는 감소, 응축물 형성 속도의 증가 또는 감소)에 있어서 상기 테스트 제제가 스크리닝될 것이다. 일부 구체예들에서, 상기 응축물 성분들은 응축물을 형성하지 않을 것이며, 상기 테스트 제제가 응축물의 형성을 야기시키는 지에 대하여, 당해 제제가 스크리닝될 것이다. 일부 구체예들에서, 상기 응축물 성분들은 MED1 (또는 이의 단편)과 ER 또는 이의 단편, 예컨데, 돌연변이체 ER (예컨데, 본원에서 기술된 바와 같이), 예컨데, 탐옥시펜 존재 하에서 MED1을 포함하는 응축물에 통합될 수 있는 돌연변이체 ER을 포함한다.
일부 구체예들에서, "결정하는(determining)"것에는 대조군 또는 참조와 비교하여, 물리적 성질을 측정하는 것을 포함한다. 예를 들면, 상기 응축물의 안정성이 조절되는 지의 결정은 테스트 조건 또는 제제를 겪지 않은 대조군 응축물과 비교하였을 때, 당해 응축물이 존재하는 기간을 측정하는 것을 포함할 수 있다. 응축물의 모양이 조절되는 지의 결정은 테스트 조건 또는 제제를 겪지 않은 대조군 응축물과 비교하였을 때, 당해 응축물의 모양을 비교하는 것을 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서, 응축물의 한 가지 또는 그 이상의 성질들은 이 성질이 통계학적으로 유의적인 양 (예컨데, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 50%, 적어도 75%, 또는 그 이상)으로 변화되면, 당해 성질은 조절된 것으로 "결정"될 수 있다.
일부 구체예들에서, 상기 탐지가능한 테그는 형광 테그 (예컨데, tdTomato)이다. 일부 구체예들에서, 상기 탐지가능한 테그는 본원에서 기술된 바와 같이, 응축물 성분에 부착된다. 일부 구체예들에서, 상기 성분은 OCT4, p53, MYC, GCN4, Mediator, 매개체 성분, MED1, MED15, p300, BRD4, NANOG, MyoD, KLF4, SOX 패밀리 전사 인자, GATA 패밀리 전사 인자, 핵 수용체, 핵 수용체 리간드, 융합 종양형성적 전사 인자, TFIID, 신호전달 인자, 메틸-DNA 결합 단백질, 스플라이싱 인자, 유전자 침묵화 인자, RNA 중합효소, β-카테닌, STAT3, SMAD3, NF-KB, MECP2, MBD1, MBD2, MBD3, MBD4, HP1α, TBL1R, HDAC3, SMRT, RNA 중합효소 II, SRSF2, SRRM1, SRSF1, 그리고 본질적으로 무질서화된 영역 (IDR)을 포함하는 이의 단편들로부터 선별된다.
일부 구체예들에서, 상기 응축물에 선택적으로 결합하는 항체를 이용하여 상기 테스트 제제와의 접촉으로 상기 응축물의 형성, 안정성, 또는 형태가 조정되는 지를 결정한다. 일부 구체예들에서, 상기 항체는 본원에서 기술된 바와 같은 응축물 성분에 결합한다. 일부 구체예들에서, 상기 성분은 Mediator, MED1, MED15, GCN4, p300, BRD4, 핵 수용체 리간드 및 TFIID, 또는 표 S3 또는 본원에서 기술된 매개체 성분 또는 전사 인자로부터 선별된다. 일부 구체예들에서, 상기 성분은 본원에서 기술된 핵 수용체 또는 이의 단편이다. 일부 구체예들에서, 상기 성분은 OCT4, p53, MYC, GCN4, Mediator, 매개체 성분, MED1, MED15, p300, BRD4, NANOG, MyoD, KLF4, SOX 패밀리 전사 인자, GATA 패밀리 전사 인자, 핵 수용체, 핵 수용체 리간드, 융합 종양형성적 전사 인자, TFIID, 신호전달 인자, 메틸-DNA 결합 단백질, 스플라이싱 인자, 유전자 침묵화 인자, RNA 중합효소, β-카테닌, STAT3, SMAD3, NF-KB, MECP2, MBD1, MBD2, MBD3, MBD4, HP1α, TBL1R, HDAC3, SMRT, RNA 중합효소 II, SRSF2, SRRM1, SRSF1, 그리고 본질적으로 무질서화된 영역 (IDR)을 포함하는 이의 단편들로부터 선별된다.
상기 테스트 제제에 의해 응축물 조정을 탐지하는 당분야에 공지된 그리고 본원에서 교시된 임의의 적합한 방법이 이용될 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 테스트 제제와의 접촉으로 상기 응축물의 형성, 안정성, 또는 형태가 조절되는 지를 결정하는 단계는 현미경을 이용하여 실행된다면, 현미경에는 제한이 없다. 일부 구체예들에서, 상기 현미경은 콘디볼루션 현미경, 구조 조명 현미경, 또는 간섭 현미경이다. 일부 구체예들에서, 상기 테스트 제제와의 접촉으로 상기 응축물의 형성, 안정성, 또는 형태가 조절되는 지를 결정하는 단계는 DNA-FISH, RNA-FISH, 또는 이의 조합을 이용하여 실행된다.
응축물을 보유한 세포의 유형에는 제한이 없으며, 본원에서 개시된 임의의 세포 유형일 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 세포는 질환 (예컨데, 암 세포)에 영향을 받는다. 일부 구체예들에서, 상기 응축물을 보유한 세포는 원발성 세포, 세포 계통의 구성원, 질환을 앓고 있는 대상체로부터 단리된 세포, 또는 질환을 앓고 있는 대상체로부터 단리된 세포에서 유래된 세포 (예컨데, 질환을 앓고 있는 대상체로부터 단리된 유도된 다능성 세포의 조상)이다.
일부 구체예들에서, 상기 세포는 에스트로겐 중재된 유전자 활성화에 반응적이다. 일부 구체예들에서, 상기 세포는 핵 수용체 리간드 중재된 유전자 에 반응적이다. 일부 구체예들에서, 상기 세포는 돌연변이 핵 수용체를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 세포는 핵 수용체 (예컨데, 돌연변이 핵 수용체)를 발현시키는 유전자삽입(transgenic) 세포다. 일부 구체예들에서, 상기 세포는 암 세포 (예컨데, 유방암 세포)다. 일부 구체예들에서, 상기 세포는 에스트로겐 존재 하에서 테스트 제제와 접촉되며, 에스트로겐 중재된 유전자 활성화가 평가된다. 일부 구체예들에서, 상기 세포는 라벨을 갖는 에스트로겐 수용체를 포함하고, 상기 테스트 제제 존재 하에서 에스트로겐 수용체의 응축물 통합이 평가된다.
일부 구체예들에서, 상기 세포는 탐옥시펜 존재 하에서 에스트로겐 중재된 유전자 활성화에 반응적이다. 일부 구체예들에서, 상기 세포는 암 세포 (예컨데, 유방암 세포)다. 일부 구체예들에서, 상기 세포는 에스트로겐 및 탐옥시펜 존재 하에서 테스트 제제와 접촉되며, 에스트로겐 중재된 유전자 활성화가 평가된다. 일부 구체예들에서, 상기 세포는 라벨을 갖는 에스트로겐 수용체를 포함하고, 상기 테스트 제제 존재 하에서 에스트로겐 수용체의 응축물 통합이 평가된다.
일부 구체예들에서, 상기 테스트 제제는 탐옥시펜 유사체다. 일부 구체예들에서, 상기 테스트 제제는 탐옥시펜 유사체가 아니다.
일부 구체예들에서, 상기 응축물은 신호전달 인자를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 시험관내 응축물은 유전자의 전사의 활성화에 필수적인 IDR을 포함하는 신호전달 인자 또는 이의 단편을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 신호전달 인자는 종양형성 신호전달 경로와 연합된다.
일부 구체예들에서, 상기 응축물은 메틸-DNA 결합 단백질 또는 C-말단 IDR을 포함하는 이의 단편, 또는 억압제 또는 IDR을 포함하는 이의 단편을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 응축물은 메틸화된 DNA 또는 이질성염색질과 연합된다. 일부 구체예들에서, 상기 응축물은 메틸-DNA 결합 단백질의 일탈적인 수준 또는 활성 (예컨데, 참조 수준과 비교하였을 때 증가 또는 감소된 수준)을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 제제에 의한 상기 응축물과 연합된 유전자들의 침묵화가 평가된다. 일부 구체예들에서, 상기 응축물은 스플라이싱 인자 또는 IDR을 포함하는 이의 단편, 또는 RNA 중합효소 또는 IDR을 포함하는 이의 단편을 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 응축물은 전사 개시 복합체 또는 신장 복합체와 연합된다. 일부 구체예들에서, 상기 응축물은 사이클린 의존적 키나제와 접촉된다. 일부 구체예들에서, 상기 RNA 중합효소는 RNA 중합효소 II (Pol II)다. 일부 구체예들에서, 상기 응축물과 연합된 RNA 전사 개시 활성에 있어서 상기 제제와의 접촉에 의해 야기된 당해 활성의 변화가 평가된다. 일부 구체예들에서, 상기 응축물과 연합된 RNA 신장 또는 스플라이싱 활성에 있어서 상기 제제와의 접촉에 의해 야기된 당해 활성의 변화가 평가된다.
응축물-변형시키는 제제, 예컨데, 치료요법을 스크리닝하기 위한 시험관내 검정법
응축물들은 RNA, DNA, 그리고 단백질로 구성된 시험관내 액체 소적을 형성할 수 있다. 전사 응축물 성분들은 한 가지 또는 그 이상의 단백질들, 예컨데, TF 및 한 가지 또는 그 이상의 공동활성제들 또는 공동인자들을 포함하는 시험관내 액체 소적을 또한 형성할 수 있다. 이러한 소적은 RNA 및/또는 DNA를 더 포함할 수 있다. 이러한 액체 소적은 시험관내 응축물들이며, 생체내 존재하는 응축물들 (예컨데, 전사 응축물들, 이질성염색질 응축물들, mRNA 개시 또는 신장 복합체와 연합된 응축물들, 스플라이싱 인자들을 포함하는 응축물들)에 상응하거나 및/또는 이의 모델로 작용한다. 이들 액체 소적은 측정가능한 물리적 성질들 (즉 크기, 농도, 투과성, 그리고 점성)을 보유한다. 이들 물리적 성질은 생체내 리포터 유전자를 활성화시키는 상기 응축물의 능력과 관련될 수 있다. 상기 액체 소적의 임의의 물리적 성질에 대하여 소 분자, 펩티드, RNA 또는 DNA 올리고(oligos) 라이브러리의 영향이 측정될 수 있다. 추가적으로, 세포-기반 리포터를 이용한 유전자 발현에 있어서 효과에 대하여 소적 성질들을 조절하는 분자이 검정될 수 있다. 이 응축물에서 개별 성분들이 부재할 경우, 이 성분은 비-기능성 (즉, 생산적 전사가 불가능)으로 간주될 수 있다. 추가적으로, 기존의 응축물들에 신규 성분의 통합으로 이들의 결과량이 변형, 감쇠, 또는 증폭될 수 있다. 이와 같이, 기존 응축물에 성분의 추가 또는 이로부터 성분을 제거하는 것이 바람직할 경우도 있다. 따라서, 일부 구체예들에서, DNA, RNA, 또는 단백질에 결합하고, 성분들을 전사 응축물, 이질성염색질 응축물, 또는 mRNA 개시 또는 신장 복합체와 물리적으로 연합된 응축물들로 구동시키는 소 분자를 단리시키기 위하여 스크리닝이 실행될 수 있다. 다른 구체예들에서, DNA, RNA, 또는 단백질에 결합하고, 성분이 응축물로 통합되는 것을 방지하기 위하여 스크리닝이 실행될 수 있다. 다른 구체예들에서, 기존의 응축물들로 통합되도록 기획된, 발현된, 또는 도입된 소 분자, 단백질들, RNA, 단백질들 또는 DNAs를 단리시키기 위하여 스크리닝이 실행될 수 있다. 다른 구체예들에서, 또다른 성분이 기존의 응축물들로의 통합을 강제하도록 기획된, 발현된, 또는 도입된 소 분자, 단백질들, RNA, 단백질들 또는 DNAs를 단리시키기 위하여 스크리닝이 실행될 수 있다. 다른 구체예들에서, 성분이 전사 응축물, 이질성염색질 응축물, 또는 mRNA 개시 또는 신장 복합체와 물리적으로 연합된 응축물로의 진입을 방지하도록 기획된, 발현된, 또는 도입된 소 분자, 단백질들, RNA, 단백질들 또는 DNAs를 단리시키기 위하여 스크리닝이 실행될 수 있다. 다른 구체예들에서, 한 가지 또는 그 이상의 성분들이 응축물의 형성 가능성을 방지 또는 감소시키도록 기획된, 발현된, 또는 도입된 소 분자, 단백질들, RNA, 단백질들 또는 DNAs를 단리시키기 위하여 스크리닝이 실행될 수 있다.
본 명세서의 일부 측면들은 응축물의 형성, 안정성, 또는 형태를 조정하는 제제를 식별해내는 방법에 관한 것이며, 이 방법은 시험관내 응축물을 제공하고, 그리고 이 시험관내 응축물의 하나 또는 그 이상의 물리적 성질을 평가하고, 이 시험관내 응축물에 테스트 제제를 접촉시키고, 그리고 당해 테스트 제제가 이 시험관내 응축물의 하나 또는 그 이상의 물리적 성질의 변화를 야기시키는 지를 평가하는 것을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 하나 또는 그 이상의 물리적 성질은 상기 시험관내 응축물이 세포 안 유전자의 발현을 야기시키는 능력과 관련된다. 일부 구체예들에서, 상기 한 가지 또는 그 이상의 물리적 성질으로는 시험관내 응축물의 크기, 농도, 투과성, 형태, 또는 점성을 포함한다. 당분야의 공지된 임의의 적합한 방법을 이용하여 상기 한 가지 또는 그 이상의 물리적 성질들을 측정할 수 있다.
본 명세서의 일부 측면들은 응축물 형성을 조절하는 제제를 식별해내는 방법들에 관계한다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 한 가지 또는 그 이상의 응축물 성분 또는 이의 단편 (예컨데, 본원에서 기술된 임의의 응축물 성분, IDR, 매개체 또는 이의 하위단위 (예컨데, MED1), 전사 인자를 갖는 임의의 응축물 성분)을 포함하는 주성을 제공하고, 이 구성에 테스트 제제를 접촉시키고, 그리고 당해 테스트 제제가 이러한 응축물 성분(들)을 포함하는 응축물의 형성을 조절하는지, 또는 이러한 응축물 성분(들)에 의해 형성된 당해 응축물의 한 가지 또는 그 이상의 성질들을 조절하는지 (예컨데, 안정성, 기능, 활성, 형태의 증가 또는 감소)를 결정하는 것을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 한 가지 또는 그 이상의 응축물 성분들은 탐지가능한 라벨을 포함한다. 상기 성분들을 제공하고, 이들을 용기 안에서 복합시키고, 그리고 응축물 형성이 일어나는 지를 관찰하거나 및/또는 생성된 응축물들의 성질(들) (예컨데, 안정성, 기능, 활성, 형태의 증가 또는 감소)을 측정할 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 제공된 구성은 응축물을 형성할 것이며, 조절 형성의 조절 (예컨데, 응축물 형성 또는 응축물 형성의 속도를 증가 또는 감소)에 있어서 상기 테스트 제제가 스크리닝될 것이다. 일부 구체예들에서, 상기 제공된 구성은 응축물을 형성하지 않을 것이며, 상기 테스트 제제가 응축물의 형성을 야기시키는 지에 대하여, 당해 제제가 스크리닝될 것이다. 일부 구체예들에서, 상기 응축물 성분들은 한 가지 또는 그 이상의 공동-인자들 (예컨데, MED1 또는 이의 기능적 단편) 및 핵 수용체 (예컨데, 야생형 핵 수용체, 돌연변이 핵 수용체, 돌연변이 핵 수용체 질환 또는 병태와 연합된다) 또는 이의 기능적 단편을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 응축물 성분들은 MED1 (또는 이의 단편)과 ER 또는 이의 단편, 예컨데, 돌연변이체 ER (예컨데, 본원에서 기술된 바와 같이), 예컨데, 탐옥시펜 존재 하에서 MED1을 포함하는 응축물에 통합될 수 있는 돌연변이체 ER을 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 시험관내 응축물은 핵 수용체 리간드 중재된 유전자 활성화에 반응적이다. 일부 구체예들에서, 상기 시험관내 응축물은 구성적 돌연변이 핵 수용체 중재된 유전자 활성화를 보유한다. 일부 구체예들에서, 상기 시험관내 응축물은 에스트로겐 중재된 유전자 활성화에 반응적이다. 일부 구체예들에서, 상기 시험관내 응축물은 에스트로겐 존재 하에서 테스트 제제와 접촉되며,및 에스트로겐 중재된 유전자 활성화가 평가된다. 일부 구체예들에서, 상기 테스트 제제 존재 하에서 에스트로겐 중재된 유전자 활성화가 감소되거나, 또는 제거되었다면, 당해 테스트 제제는 ER+ 암을 치료하기 위한 후보 항-암 제제로 확인된다. 일부 구체예들에서, 상기 시험관내 응축물은 라벨을 보유한 에스트로겐 수용체를 포함하며, 상기 테스트 제제 존재 하에서 에스트로겐 수용체의 응축물로의 통합이 평가된다. 일부 구체예들에서, 상기 테스트 제제 존재 하에서 ER 통합이 감소되거나 또는 제거된다면, 그 다음 당해 테스트 제제는 ER+ 암을 치료하기 위한 후보 항-암 제제로 확인된다.
일부 구체예들에서, 상기 시험관내 응축물은 탐옥시펜 존재 하에서 에스트로겐 중재된 유전자 활성화에 반응적이며(예컨데, 상기 시험관내 응축물은 탐옥시펜 저항성 유방암 세포로부터 단리되며, 상기 응축물은 구성적 활성을 갖는 돌연변이체 ER (예컨데, 본원에서 기술된 바와 같이)을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 시험관내 응축물은 에스트로겐 존재 하에서 테스트 제제와 접촉되며, 그리고 탐옥시펜 및 에스트로겐 중재된 유전자 활성화가 평가된다. 일부 구체예들에서, 상기 테스트 제제 존재 하에서 에스트로겐 중재된 유전자 활성화가 감소되거나 또는 제거된다면, 그 다음 상기 테스트 제제는 탐옥시펜 저항적 암을 치료하기 위한 후보 항-암 제제로 확인된다. 일부 구체예들에서, 상기 시험관내 응축물은 라벨을 보유한 에스트로겐 수용체를 포함하며, 상기 테스트 제제 존재 하에서 에스트로겐 수용체의 응축물로의 통합이 평가된다. 일부 구체예들에서, ER 통합이 감소되거나 또는 제거된다면 상기 테스트 제제 존재 하에서, 그 다음 상기 테스트 제제는 탐옥시펜 저항적 암을 치료하기 위한 후보 항-암 제제로 확인된다.
일부 구체예들에서, 상기 테스트 제제는 탐옥시펜 유사체다. 일부 구체예들에서, 상기 테스트 제제는 탐옥시펜 유사체가 아니다.
상기 테스트 제제는 제한되지 않으며, 그리고 본원에서 기재된 임의의 제제를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 테스트 제제는 소 분자, 펩티드, RNA 또는 DNA이다.
일부 구체예들에서, 상기 시험관내 응축물은 본원에서 기술된 바와 같이, 한 가지 또는 그 이상의 성분들을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 시험관내 응축물은 성분으로써 DNA, RNA 및/또는 단백질중 하나, 둘, 또는 세 가지 모두를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 시험관내 응축물은 성분으로써 DNA, RNA 그리고 단백질을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 시험관내 응축물은 Mediator, MED1, MED15, GCN4, p300, BRD4, 핵 수용체 리간드, 또는 TFIID를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 시험관내 응축물은 OCT4, p53, MYC, GCN4, Mediator, 매개체 성분, MED1, MED15, p300, BRD4, NANOG, MyoD, KLF4, SOX 패밀리 전사 인자, GATA 패밀리 전사 인자, 핵 수용체, 핵 수용체 리간드, 융합 종양형성적 전사 인자, TFIID, 신호전달 인자, 메틸-DNA 결합 단백질, 스플라이싱 인자, 유전자 침묵화 인자, RNA 중합효소, β-카테닌, STAT3, SMAD3, NF-KB, MECP2, MBD1, MBD2, MBD3, MBD4, HP1α, TBL1R, HDAC3, SMRT, RNA 중합효소 II, SRSF2, SRRM1, SRSF1, 그리고 본질적으로 무질서화된 영역 (IDR)을 포함하는 이의 단편들을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 응축물은 단일 성분 (즉, 상동형)을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 시험관내 응축물은 이형성(heterotypic)이며, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 그 이상의 클라이언트 또는 스캐폴드 성분들을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 시험관내 응축물은 MED15 및 GCN4을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 시험관내 응축물은 본원에서 기술된 바와 같이, 핵 수용체 또는 이의 단편을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 시험관내 응축물은 MED1 및 ER을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 ER은 돌연변이체 ER (예컨데, 돌연변이체 ER 본원에서 기술된, 구성적 활성을 보유한 돌연변이체 ER, 탐옥시펜 저항성을 부여하는 돌연변이를 보유한 돌연변이체 ER)이다. 일부 구체예들에서, 상기 응축물은 스플라이싱 인자 및 RNA 중합효소를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 응축물은 메틸-DNA 결합 단백질 (예컨데, MeCP2)을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 응축물은 신호전달 인자를 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 시험관내 응축물은 본원에서 기술된 바와 같이, 다수의 탐지가능한 테그를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 탐지가능한 테그는 상이한 성분들 상에 있는 상이한 형광 테그를 포함한다 (예컨데, 하나의 형광 테그로 라벨된 MED15, 그리고 상이한 형광 테그로 라벨된 GCN4 또는 핵 수용체 또는 이의 단편). 일부 구체예들에서, 상기 응축물의 한 가지 또는 그 이상의 성분은 해소제(quencher)를 갖는다.
상기 시험관내 응축물은 본질적으로 무질서화된 영역 또는 도메인, 또는 본질적으로 무질서화된 영역 또는 도메인을 보유한 단백질들을 또한 포함할 수 있다. 상기 IDR은 본원에서 기술된 임의의 것이거나, 또는 당분야(예컨데, 본원에서 언급된 문헌 및 웹사이트)의 방법들에 의해 획득될 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 IDR은 표 S2에 열거된 모티프 세트를 갖는 IDR이다. 일부 구체예들에서, 상기 성분은 표 S1에서 제시된다. 일부 구체예들에서, 상기 본질적으로 무질서화된 영역 또는 도메인들은 MED1, MED15, GCN4 또는 BRD4 본질적으로 무질서화된 영역 또는 도메인들이다. 일부 구체예들에서, 상기 IDR은 OCT4, p53, MYC, GCN4, Mediator, 매개체 성분, MED1, MED15, p300, BRD4, NANOG, MyoD, KLF4, SOX 패밀리 전사 인자, GATA 패밀리 전사 인자, 핵 수용체, 핵 수용체 리간드, 융합 종양형성적 전사 인자, TFIID, 신호전달 인자, 메틸-DNA 결합 단백질, 스플라이싱 인자, 유전자 침묵화 인자, RNA 중합효소, β-카테닌, STAT3, SMAD3, NF-KB, MECP2, MBD1, MBD2, MBD3, MBD4, HP1α, TBL1R, HDAC3, SMRT, RNA 중합효소 II, SRSF2, SRRM1, 또는 SRSF1 IDR으로부터 유래된 IDR, 또는 이의 일부분을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 시험관내 응축물은 IDR의 일부분을 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 응축물은 단백질 (예컨데, 생체내 전사 응축물과 연합된 단백질)의 IDR 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상을 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 시험관내 응축물은 IDR의 적어도 약 20개, 30개, 40개, 50개, 60개, 75개, 100개, 150개, 200개, 250개, 또는 300개의 아미노산 부분을 포함할 수 있다.
일부 구체예들에서, 상기 시험관내 응축물은 신호전달 인자 또는 이의 단편을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 시험관내 응축물은 유전자의 전사의 활성화에 필수적인 IDR을 포함하는 신호전달 인자 또는 이의 단편을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 신호전달 인자는 종양형성 신호전달 경로와 연합된다.
일부 구체예들에서, 상기 응축물은 메틸-DNA 결합 단백질 또는 C-말단 IDR을 포함하는 이의 단편, 또는 억압제 또는 IDR을 포함하는 이의 단편을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 응축물은 메틸화된 DNA 또는 이질성염색질과 연합된다. 일부 구체예들에서, 상기 응축물은 일탈 수준 또는 활성의 메틸-DNA 결합 단백질을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 제제에 의한 응축물과 연합된 유전자들의 침묵화가 평가된다. 일부 구체예들에서, 상기 응축물은 스플라이싱 인자 또는 IDR을 포함하는 이의 단편, 또는 RNA 중합효소 또는 IDR을 포함하는 이의 단편을 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 응축물은 전사 개시 복합체 또는 신장 복합체와 연합된다. 일부 구체예들에서, 상기 응축물은 사이클린 의존적 키나제와 접촉된다. 일부 구체예들에서, 상기 RNA 중합효소는 RNA 중합효소 II (Pol II)다. 일부 구체예들에서, 상기 응축물과 연합된 RNA 전사 개시 활성에 있어서 상기 제제와의 접촉에 의해 야기된 당해 활성의 변화가 평가된다. 일부 구체예들에서, 상기 응축물과 연합된 RNA 신장 또는 스플라이싱 활성에 있어서 상기 제제와의 접촉에 의해 야기된 당해 활성의 변화가 평가된다.
일부 구체예들에서, 상기 시험관내 응축물은 약한 단백질-단백질 상호작용에 의해 형성된다. 일부 구체예들에서, 상기 약한 단백질-단백질 상호작용은 IDRs 또는 IDRs의 일부분들 사이의 상호작용을 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 시험관내 응축물은 (본질적으로 무질서한 도메인)-(유도성 올리고머화 도메인) 융합 단백질들을 포함한다. 상기 유도성 올리고머화 도메인은 또한 제한되지 않는다. 일부 구체예들에서, 상기 유도성 올리고머화 도메인은 전자기 방사선 (예컨데, 가시 광선) 또는 제제 (예컨데, 소 분자)에 응답하여 올리고머화된다. 유도성 올리고머화 도메인의 예로는 FK506 및 FK506 결합 단백질들 및 사이클로필린의 사이클로스포린 결합 도메인, 그리고 FRAP의 라파마이신 결합 도메인이 내포된다. 일부 구체예들에서, 상기 유도성 올리고머화 도메인은 Cry 단백질 (예컨데, Cry2)이다. 일부 구체예들에서, 상기 융합 단백질은 본질적으로 무질서화된 도메인-Cry2 융합 단백질이다. 본 명세서에서 이용된 "CRY"은 크립토-크로미늄 (크립토크롬(chryptochrome)) 단백질을 지칭하며, 이것은 전형적으로 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)의 CRY2 (GenBank No.:NM_100320)이다. 광-유도된 올리고머화를 위한 Cry2를 이용하는 방법들은 "The Dual Characteristics of Light-Induced Cryptochrome 2, Homo-oligomerization and Heterodimerization, for Optogenetic Manipulation in Mammalian Cells," ACS Synth Biol. 2015 Oct 16; 4(10): 1124-1135 및 Duan, et al., "Understanding CRY2 interactions for optical control of intracellular signaling," Nature Communications, vol. 8:547(2017)에서 교시되며, 이들은 본원의 참조자료에 통합된다. 일부 구체예들에서, 상기 유도성 올리고머화 도메인은 소 분자, 단백질, 또는 핵산에 의해 유도된다. 일부 구체예들에서, 상기 유도성 올리고머화 도메인은 가시 광선 (예컨데, 청색광)에 의해 유도된다.
상기 IDR은 제한되지 않으며, 그리고 본원에서 기술된 또는 언급된 임의의 성분일 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 IDR은 표 S2에 나타낸 모티프 세트를 갖는다. 일부 구체예들에서, 상기 본질적으로 무질서화된 도메인은 MED1, MED15, GCN4, 또는 BRD4 본질적으로 무질서화된 도메인이다. 일부 구체예들에서, 상기 IDR은 표 S3에 열거된 전사 인자의 IDR이다. 일부 구체예들에서, 상기 IDR은 핵 수용체 활성화 도메인의 IDR이다. 일부 구체예들에서, 상기 IDR은 핵 수용체 활성화 도메인의 IDR이며, 이때 상기 핵 수용체는 질환과 연합된 돌연변이를 보유한다.
일부 구체예들에서, 상기 시험관내 응축물은 세포 안에서 발견되는 전사 응축물을 모방한다.
일부 구체예들에서, 시험관내 전사 응축물, 이질성염색질 응축물, 또는 mRNA 개시 또는 신장 복합체와 물리적으로 연합된 응축물이 단리된다. 단리를 위한 임의의 적합한 수단이 본원에 포괄된다. 일부 구체예들에서, 상기 시험관내 응축물은 화학적으로 또는 면역학적으로 침전된다. 일부 구체예들에서, 상기 시험관내 응축물은 원심분리 (예컨데, 약 5,000xg, 10,000xg, 15,000xg에서 약 5-15 분; 약 10.000xg에서 약 10 분)에 의해 단리된다.
일부 구체예들에서, 상기 시험관내 응축물은 전사 응축물, 이질성염색질 응축물, 또는 mRNA 개시 또는 신장 복합체와 물리적으로 연합된 응축물 세포로부터 단리된다. 상기 응축물을 단리하기 위해 당분야에 임의의 적합한 방법들을 이용할 수 있다. 예를 들자면, 상기 응축물은 적합한 완충제 조건 하에 세포의 핵을 균질기 (즉, 듄스(dounce) 균질기)를 이용해 용해시키고, 원심분리 및/또는 여과시켜, 당해 응축물을 분리시킴으로써, 단리될 수 있다.
본 명세서의 일부 측면들은 응축물 형성, 안정성, 기능, 또는 응축물의 형태를 조절하는 제제를 식별해내는 방법에 관한 것으로써, 이 방법은 리포터 유전자의 발현 의존적 전사 응축물을 갖는 세포를 제공하고, 상기 세포에 테스트 제제를 접촉시키고, 그리고 상기 리포터 유전자의 발현을 평가하는 것을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 세포는 유전자 테스트 제제와의 접촉 전, 상기 리포터를 발현시키지 않고, 응축물 형성, 안정성, 기능, 또는 형태를 강화시키는 제제와의 접촉 후, 당해 리포터 유전자를 발현시킨다. 일부 구체예들에서, 상기 세포 테스트 제제와의 접촉 전, 상기 리포터 유전자를 발현시키고, 응축물 형성, 안정성, 기능, 또는 형태를 억압, 분해 또는 방지하는 제제와의 접촉 후, 당해 리포터 유전자를 중단, 또는 축소시킨다.
일부 구체예들에서, 응축물 형성, 안정성, 기능, 또는 형태를 조정하는 제제를 식별해내는 방법은 전사 인자의 제어 하에서 리포터 유전자를 발현시키는 세포 또는 시험관내 전사 검정법을 제공하고 (또는 시험관내 검정법과 세포를 모두 제공하고), 이러한 세포 또는 검정법에 테스트 제제를 접촉시키고, 그리고 당해 리포터 유전자 발현의 평가를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 TF는 이종성 DNA-결합 도메인 (DBD) 및 활성화 도메인을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 TF는 포유류 TF의 활성화 도메인, 본원에서 기술된 TF, 또는 돌연변이체 포유류 TF, 또는 본원에서 기술된 TF의 돌연변이체 TF를 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 TF는 핵 수용체 (예컨데, 돌연변이 핵 수용체, 동족 리간드 결합과 독립적인 구성적 활성을 갖는 돌연변이 핵 수용체, 탐옥시펜 존재 하에서 에스트로겐 중재된 유전자 활성화를 야기하는 돌연변이체 에스트로겐 수용체, 에스트로겐 없이도 유전자 활성화를 야기하는 돌연변이체 에스트로겐 수용체)이다. 일부 구체예들에서, 상기 돌연변이체 TF 활성화 도메인은 질환 또는 병태(예컨데, 본원에서 기술된 질환 또는 병태)와 연합될 수 있다. 상기 DBD는 제한되지 않으며, 임의의 적합한 DBD일 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 DBD는 GAL4 DBD이다. 상기 시험관내 검정법 제한되지 않으며, 당분야에서 개시된 임의의 것일 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 시험관내 검정법은 Sabari et al. Science. 2018 Jul 27;361(6400)에서 개시된 시험관내 전사 검정법이다.
본원에 기술된 제제를 식별해내는 방법들의 일부 구체예들에서, 상기 응축물은 핵 수용체 (예컨데, 야생형 핵 수용체, 돌연변이 핵 수용체, 돌연변이 핵 수용체 질환 또는 병태와 연합된다, 핵 호르몬 수용체, 동족 리간드 결합에 의존적이지 않은 구성적 활성을 갖는 돌연변이체 핵 호르몬 수용체) 또는 활성화 도메인 IDR을 포함하는 이의 단편을 포함한다. 본원에서 기술된 임의의 핵 수용체 또는 단편이 이용될 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 핵 수용체는 동족 리간드에 결합될 때, 전사를 활성화시킨다. 일부 구체예들에서, 상기 핵 수용체는 리간드 결합과 독립적으로 전사를 활성화시킨다 (예컨데, 핵 수용체를 리간드 독립적으로 만드는 돌연변이를 갖는 핵 수용체, 탐옥시펜 존재 하에서 에스트로겐 중재된 유전자 활성화를 야기시키는 돌연변이체 에스트로겐 수용체, 에스트로겐 없이 유전자 활성화를 야기시키는 돌연변이체 에스트로겐 수용체). 일부 구체예들에서, 상기 핵 수용체는 핵 호르몬 수용체다. 일부 구체예들에서, 상기 핵 수용체는 돌연변이를 보유한다. 일부 구체예들에서, 상기 돌연변이는 질환 또는 병태와 연합된다. 일부 구체예들에서, 상기 질환 또는 병태는 암 (예컨데, 유방암)이다. 본원에 기술된 제제를 식별해내는 방법들의 일부 구체예들에서, 야생형 핵 수용체 및 질환과 연합된 돌연변이를 갖는 핵 수용체를 포함하는 두 응축물 모두에 대하여 제제가 스크리닝된다. 일부 구체예들에서, 상기 식별된 제제는 야생형 핵 응축물보다는 돌연변이를 갖는 핵 수용체 (예컨데, 돌연변이를 갖는 핵 호르몬 수용체, 리간드 의존적 돌연변이를 갖는 핵 수용체, 탐옥시펜 존재 하에서 에스트로겐 중재된 유전자 활성화를 야기시키는 돌연변이체 에스트로겐 수용체, 에스트로겐 없이 유전자 활성화를 야기시키는 돌연변이체 에스트로겐 수용체)에 선호적으로 결합한다. 일부 구체예들에서, 상기 식별된 제제는 야생형 핵 수용체를 포함하는 응축물보다는 돌연변이를 갖는 핵 수용체를 포함하는 전사 응축물 (예컨데, 돌연변이를 갖는 핵 호르몬 수용체, 리간드 의존적 돌연변이를 갖는 핵 수용체, 탐옥시펜 존재 하에서 에스트로겐 중재된 유전자 활성화를 야기시키는 돌연변이체 에스트로겐 수용체, 에스트로겐 없이 유전자 활성화를 야기시키는 돌연변이체 에스트로겐 수용체)를 선호적으로 파괴시킨다.
일부 구체예들에서, 본원에서 개시된 응축물 형성, 안정성, 기능, 또는 형태를 조절하는 방법에 의해 식별된 제제는 응축물의 한 가지 또는 그 이상의 기능성 성질들, 예컨데, 상기 응축물과 연합된 한 가지 또는 그 이상의 유전자들의 전사를 조절하는 능력에 당해 제제의 효과를 평가하기 위해 추가로, 또는 대안으로 테스트된다. 일부 구체예들에서, 본원에서 개시된 응축물 형성, 안정성, 기능, 또는 형태를 조절하는 방법에 의해 식별된 제제는 질환의 한 가지 또는 그 이상의 특징을 조절하는 당해 제제의 능력에 당해 제제의 효과를 평가하기 위해 더 테스트된다. 상기 질환은 제한되지 않으며, 그리고 본원에서 기재된 임의의 질환일 수 있다. 예를 들면, 상기 제제가 종양형성적 돌연변이체 TF에 의한 응축물 형성을 저해시킨다면, TF를 포함하는 암 세포 (예컨데, 지속된 생존력 및/또는 증식에 대하여 이러한 TF에 의존적인 암 세포들)를 저해시키는 당해 제제의 능력을 테스트할 수 있다.
일부 구체예들에서, 본원에서 개시된 방법들에 의해 응축물의 한 가지 또는 그 이상의 구조적 성질 (예컨데, 형성, 안정성, 또는 형태) 또는 응축물의 한 가지 또는 그 이상의 기능적 성질 (예컨데, 전사의 조절)을 조절하는 것으로 식별된 제제는 대상체, 예컨데, 질환 모델이 되는 비-인간 동물, 또는 이러한 질환 치료를 요하는 대상체에게 투여될 수 있다. 일부 구체예들에서, 응축물의 한 가지 또는 그 이상의 구조적 성질을 조절하는 것으로 식별된 제제를 이용한 치료를 요하는 대상체는 본원에서 개시된 방법에 의해 식별될 수 있다.
일부 구체예들에서, 본원에서 개시된 방법들에 의해 응축물의 한 가지 또는 그 이상의 구조적 성질(예컨데, 형성, 안정성, 기능, 또는 형태) 또는 응축물의 한 가지 또는 그 이상의 기능적 성질 (예컨데 전사의 조절)을 조절하는 것으로 식별된 제제의 유사체가 만들어질 수도 있다. 유사체를 만드는 방법은 당업계에 공지되어 있고, 본원에 기재되어 있는 방법도 내포된다. 일부 구체예들에서, 관심대상의 성질, 이를 테면, 안정성 (예컨데, 수성 매질에서, 인간 혈액에서, GI 기관에서, 등등.)의 증가, 생체이용성의 증가, 대상체에게 투여시 반감기의 증가, 증가된다 세포 취입, 응축물의 구조적 성질 (예컨데, 형성, 안정성, 기능, 또는 형태) 또는 응축물의 기능적 성질 (예컨데 전사의 조절)을 비롯한 응축물의 성질을 조절하는 활성의 증가, 야생형 또는 돌연변이체 성분 (예컨데, 돌연변이체 TF, 돌연변이체 NR)을 함유하는 응축물에 대한 특이성 증가, 본원에서 교시된 세포 유형에 대한 특이성의 증가에 대하여 생성된 유사체를 테스트할 수 있다.
일부 구체예들에서, 고속 대량 스크리닝 (high throughput screen: HTS)이 실행된다. 고속 대량 스크리닝은 무(free)-세포 또는 세포-기반 검정법 (예컨데, 본원에서 기술된 바와 같은 세포를 함유하는 응축물, 시험관내 응축물, 시험관내 단리된 응축물)을 이용할 수 있다. 고속 대량 스크리닝은 대개 고-효율의 다수의 화합물을 예컨데, 나란하게(in parallels) 테스트하는 것과 관련된다. 예를 들면, 수 만 또는 수십만개의 화합물이 단시간, 예컨데, 몇 시간 내지 몇 일 안에 일상적으로 스크리닝될 수 있다. 종종 이러한 스크리닝은 플레이트에 물리적으로 분리된 여러 공동(cavities) 또는 함몰부(depressions)가 존재하는 적어도 96 개의 웰 또는 기타 용기를 내포하는 멀티-웰 플레이트에서 수행된다. 고속 대량 스크린은 액체 취급, 이미징, 데이터 취득 및 프로세싱 등등과 같은 자동화 사용이 포함되는 경우가 많다. 본 발명의 HTS의 구체예들에 적용될 수 있는 특정 일반 원리 및 기술은 
R & Hertzberg RP. Design and implementation of high-throughput screening assays. Methods Mol Biol., 565:1-32, 2009 및/또는 An WF & Tolliday NJ., Introduction: cell-based assays for high-throughput screening. Methods Mol Biol. 486:1-12, 2009 및/또는 이 둘 중 어느 것에 언급된 참고문헌에 설명되어 있다. 유용한 방법들은 High Throughput Screening: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology) by William P. Janzen (2002) and High-Throughput Screening in Drug Discovery (Methods and Principles in Medicinal Chemistry) (2006), 
에서 또한 기술된다.
용어 "히트(hit)"는 스크린 또는 검정법에서 관심 효과를 획득한 제제, 예컨데, 세포 생존, 세포 증식, 유전자 발현, 단백질 활성, 또는 스크린 또는 검정법에서 측정될 수 있는 관심대상의 기타 매개변수에 있어서 적어도 예정된 수준의 조절 효과를 갖는 제제를 일반적으로 지칭한다. 스크린에서 히트로 식별된 테스트 제제는 추가 테스트, 발달, 또는 변형에 대하여 선별될 수 있다. 일부 구체예들에서, 테스트 제제는 동일한 검정법 또는 상이한 검정법을 이용하여 다시-테스트된다. 예를 들면, 후보인 항암 제제는 암 세포 생존 또는 증식, 종양 성장, 등등에서 이 제제의 효과를 결정하기 위해 상이한 다중 암 세포 계통 또는 생체내 종양 모델에서 테스트될 수 있다. 필요한 경우, 상기 테스트 제제의 추가 양이 합성될 수 있거나, 또는 그렇지 않으면 구할 수 있다. 물리적 테스트 또는 계산 접근법을 사용하여 스크린에서 식별된 화합물의 하나 또는 이상의 물리화학적, 약동학적 및/또는 약력학적 특성을 결정하거나 또는 예측할 수 있다. 예를 들면, 용해도, 흡수, 분포, 대사, 그리고 배설 (ADME) 매개변수들은 실험적으로 결정되거나 또는 예측될 수 있다. 이러한 정보를 이용하여, 예컨데, 추가 테스트, 발달, 또는 변형에 대하여 히트를 선별할 수 있다. 예를 들면, "약물-유사(drug-like)" 분자에 전형적 특징을 갖는 소분자가 선별될 수 있거나, 및/또는 한 가지 또는 그 이상의 적합하지 않은 특징을 갖는 소 분자를 회피하거나, 또는 변형시켜 이러한 적합하지 않은 특징(들)을 축소 또는 제거시킬 수 있다.
일부 구체예들에서, 히트 화합물들의 구조를 검사하여 약물작용발생단(pharmacophore)을 식별해내고, 이것은 추가적인 화합물을 기획하는데 이용될 수 있다. 추가적인 화합물은 예를 들면, 한 가지 또는 그 이상의 변경된 성질, 예컨데, 최초 히트와 비교하였을 때, 개선된 물리화학적, 약동학적 (예컨데, 흡수, 분포, 대사 및/또는 배설) 및/또는 약력학적 성질들을 갖거나, 또는 대략적으로 동일한 성질들을 보유하지만, 상이한 구조를 가질 수 있다. 개선된 성질이란 일반적으로 화합물을 더 용이하게 이용가능하게 하거나, 또는 한 가지 또는 그 이상의 의도된 용도에 유용하도록 만드는 성질이다. 상기 히트 구조의 경험적 변형 (예컨데, 관련된 구조들을 갖는 화합물을 합성하고, 이 화합물을 무-세포 또는 세포-기반 검정법 또는 비-인간 동물에서 테스트하고) 및/또는 자동화된 접근방법을 이용하여 개선이 이루어질 수 있다. 이러한 변형에 한 가지 또는 그 이상의 성질들을 예측 가능하게 변경시키기 위한 의약 화학의 확립된 원리를 이용할 수 있다. 일부 구체예들에서, 히트 화합물의 분자 표적이 식별되거나, 또는 공지되어 있다. 일부 구체예들에서, 동일한 분자 표적에 작용하는 추가적인 화합물들은 경험적으로 (예컨데, 화합물 라이브러리를 스크리닝함으로써) 식별되거나, 또는 기획될 수 있다.
테스트 제제로부터 얻은 데이터 또는 결과, 또는 스크리닝의 실행으로 얻은 데이터 또는 결과는 저장되거나, 또는 전자적으로 전송될 수 있다. 이러한 정보는 컴퓨터 판독가능 매체, 종이 등의 유형의 매체에 저장될 수 있다. 일부 구체예들에서, 제제를 식별해내거나 또는 테스트하는 방법은 테스트 제제가 한 가지 또는 그 이상의 관심대상의 성질(들)을 보유함을 나타내거나, 또는 테스트 제제가 특정 스크린에서 "히트"임을 나타내거나, 또는 테스트 제제를 이용하여 얻은 특정 결과를 나타내는 정보를 보관, 및/또는 전자적으로 전송하는 것을 포함한다. 스크린으로부터 히트 목록이 만들어지고, 보관되거나, 또는 전송될 수 있다. 활성, 구조적 유사성, 또는 기타 특징에 근거하여 히트들을 등급화시키거나, 또는 두 개 또는 그 이상의 군으로 분할시킬 수 있다.
일단 후보 제제가 식별되면, 이를 근거로 추가적인 제제, 예컨데, 유사체들이 생성될 수 있다. 추가적인 제제는 예를 들면, 암 세포 취입의 증가, 효능역가(potency) 증가, 안정성 증가, 더 큰 용해도, 또는 임의의 개선된 성질을 갖는다. 일부 구체예들에서, 라벨된 형태의 상기 제제가 생성된다. 상기 라벨된 제제를 이용하여, 예컨데, 세포 안 분자 표적에 당해 제제의 결합을 직접적으로 측정할 수 있다. 일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 바와 같이 식별된 제제의 분자 표적이 식별될 수 있다. 분자 표적을 단리시키기 위하여 친화력 시약으로 제제가 이용될 수 있다. 상기 분자 표적을 식별하기 위한 검정법, 예컨데, 상기 분자 표적을 식별해내는 검정법 이를 테면, 질량분석법이 실행될 수 있다. 일단 분자 표적이 식별되면, 한 가지 또는 그 이상의 추가적인 스크린을 실행하여, 이 표적에 특이적으로 작용하는 제제를 식별해낼 수 있다.
각종 구체예들에서 임의의 다양한 제제의 변종을 테스트 제제로 이용할 수 있다. 예를 들면, 테스트 제제는 소 분자, 폴리펩티드, 펩티드, 아미노산, 핵산, 올리고뉴클레오티드, 지질, 탄화수소, 또는 하이브리드 분자일 수 있다. 일부 구체예들에서, 테스트 제제로 이용된 핵산은 siRNA, shRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 압타머, 또는 랜덤 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예들에서, 테스트 제제는 세포 투과성이거나, 또는 세포 안으로 이 제제가 들어갈 수 있도록 하는 적절한 담체 또는 벡터의 형태, 또는 이들과 함께 제공된다. 상기 테스트 제제는 본원에서 기술된 바와 같이 임의의 제제일 수 있다.
제제는 천연 원천으로부터 얻거나, 또는 합성에 의해 만들어질 수 있다. 제제는 적어도 부분적으로 순수하거나, 또는 추출물 또는 다른 유형의 혼합물들에 존재할 수 있다. 추출물 또는 이의 분취는 예컨데, 식물, 동물, 미생물, 해양 유기체, 발효 브로스 (예컨데, 토양, 박테리아 또는 곰팡이 발효 브로스(broths)), 등등으로부터 만들어질 수 있다. 일부 구체예들에서, 화합물 콜렉션 ("라이브러리")이 테스트된다. 화합물 라이브러리는 천연 산물 및/또는 비-지시된(directed) 또는 지시된 합성 유기 화학을 이용하여 만들어진 화합물을 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서, 라이브러리는 소 분자 라이브러리, 펩티드 라이브러리, 펩토이드(peptoid) 라이브러리, cDNA 라이브러리, 올리고뉴클레오티드 라이브러리, 또는 디스플레이 라이브러리 (예컨데, 파아지 디스플레이 라이브러리)이다. 일부 구체예들에서, 라이브러리는 두 가지 또는 그 이상의 전술한 유형의 제제를 포함한다. 일부 구체예들에서, 올리고뉴클레오티드 라이브러리 안에 있는 올리고뉴클레오티드는 siRNAs, shRNAs, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 압타머, 또는 랜덤 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
라이브러리는 예컨데, 100개 내지 500,000개 또는 그 이상의 화합물을 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서, 라이브러리는 적어도 10,000개, 적어도 50,000개, 적어도 100,000개, 또는 적어도 250,000개의 화합물을 포함한다. 일부 구체예들에서, 화합물 라이브러리의 화합물은 다중웰 플레이트 상에 어레이된다. 이들 화합물은 용매 (예컨데, DMSO)에 용해되거나, 또는 예컨데, 분말 또는 고체와 같은 건조 형태로 제공될 수 있다. 합성 화합물, 반(semi)-합성 화합물, 및/또는 자연 발생적 화합물들의 콜렉션이 테스트될 수 있다. 화합물 라이브러리는 구조적으로 관련된 화합물, 구조적으로 다양한 화합물, 또는 구조적으로 무관한 화합물을 포함할 수 있다. 화합물들은 인공적 (자연계에서 볼 수 없는, 사람이 개발한 구조를 가짐) 또는 자연 발생적일 수 있다. 일부 구체예들에서, 약물 발견 프로그램에서 "히트(hits)" 또는 "리드(leads)"로 식별된 화합물 및/또는 이의 유사체. 일부 구체예들에서, 라이브러리는 집중될 수 있다 (예컨데, 동일한 코어 구조를 갖고, 동일한 전구체로부터 유래되거나, 또는 공통적으로 적어도 하나의 생화학적 활성을 갖는 화합물로 주로 구성됨). 화합물 라이브러리는 다수의 상업적 공급책, 이를 테면, Tocris BioScience, Nanosyn, BioFocus, 그리고 정부 기관, 이를 테면, U.S. National Institutes of Health (NIH)에서 이용가능한다. 일부 구체예들에서, 테스트 제제는 예컨데, 척추동물, 예컨데, 포유류 세포들을 배양하기 위한 당분야에 공지된 또는 이용되는 세포 배양 배지에서 볼 수 있는 제제, 예컨데, 상기 세포를 배양하는 목적으로 제공된 제제는 아니다. 일부 구체예들에서, 만일 상기 제제가 당분야에 공지된 또는 이용되는 세포 배양 배지에서 발견되는 것이라면, 본원에서 기술된 방법 또는 구성에서 테스트 제제가 이용될 때, 이 제제는 상이한 농도, 예컨데 더 높은 농도로 이용될 수 있다.
핵 수용체들이 관련된 스크리닝 검정법
본 명세서의 일부 측면들은 응축물의 형성, 안정성, 또는 형태를 조정하는 테스트 제제를 식별해내는 방법에 관계하는데, 이 방법은 세포를 제공하고, 이러한 세포에 테스트 제제를 접촉시키고, 그리고 당해 테스트 제제와의 접촉으로 응축물의 형성, 안정성, 또는 형태가 조절되는 지를 결정하는 것을 포함하고, 이때 당해 응축물은 응축물 성분으로써 핵 수용체 (NR), 또는 이의 단편을 포함한다. 상기 핵 수용체는 제한되지 않으며, 본원에서 기술된 임의의 핵 수용체일 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 핵 수용체는 돌연변이 핵 수용체 (예컨데, 질환과 연합된 돌연변이 핵 수용체, 동족 리간드 결합과 독립적인 구성적 활성 (예컨데, 전사 활성)을 갖는 돌연변이 핵 수용체)이다. 일부 구체예들에서, 상기 핵 수용체는 핵 호르몬 수용체, 에스트로겐 수용체, 또는 레티노산 수용체-알파이다. 일부 구체예들에서, 상기 응축물은 응축물 성분으로써 공동-인자 (예컨데, Mediator, MED1)를 더 포함한다. 상기 응축물의 성분들은 본원에서 기술된 임의의 적합한 응축물 성분일 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 세포는 상기 응축물을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 제제는 상기 세포에서 상기 응축물의 형성을 야기시킨다.
테스트 제제를 식별해내는 방법들의 일부 구체예들에서, 상기 응축물의 형성, 안정성, 또는 형태를 조절하는 제제 (예컨데, 이 제제가 당해 응축물의 형성 또는 안정성을 감소시킨다면)은 치료요법적 후보 제제 (예컨데, 돌연변이 핵 수용체를 특징으로 하는 질환에 대한 치료요법적 제제, 암, 또는 상기 핵 수용체를 포함하는 신호전달 경로를 특징으로 하는 질환에 대한 치료요법적 제제)로 식별된다. 일부 구체예들에서, 상기 식별된 제제는 본원에서 기술된 질환 또는 병태에 상응하는 임의의 치료에 대한 후보가 될 수 있다. 테스트 제제를 식별해내는 본원에서 기술된 방법들의 일부 구체예들에서, 돌연변이 핵 수용체를 포함하는 응축물의 형성 또는 안정성을 감소시키는 제제는 상기 돌연변이체 NR을 특징으로 하는 질환 또는 병태 치료용 후보 제제로 식별된다. 본원에서 기술된 테스트 제제를 식별해내는 방법들의 일부 구체예들에서, 핵 수용체 (예컨데, 돌연변이 핵 수용체) 또는 이의 단편을 포함하는 응축물의 형성 또는 안정성을 감소시키는 제제는 당해 핵 수용체의 조절자 후보로 식별된다.
테스트 제제를 식별해내는 방법들의 일부 구체예들에서, 상기 응축물의 조정으로 표적 유전자 (예컨데, MYC 종양유전자 또는 본원에서 기술된 기타 유전자 또는 암 성장 또는 생존력과 관련된 기타 유전자)의 전사가 감축 또는 제거된다. 일부 구체예들에서, 표적 유전자의 전사 (예컨데, MYC 종양유전자)은 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 그 이상으로 축소된다.
일부 구체예들에서, 상기 응축물은 탐지가능한 라벨을 포함한다. 상기 라벨은 제한되지 않으며, 본원에서 기술된 임의의 라벨일 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 응축물의 성분은 탐지가능한 라벨을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 핵 수용체 또는 이의 단편은 상기 탐지가능한 라벨을 포함한다.
본 발명의 일부 측면들은 응축물의 형성, 안정성, 또는 형태를 조정하는 제제를 식별해내는 방법에 관한 것으로, 이 방법은 시험관내 응축물을 제공하고, 이 응축물에 테스트 제제를 접촉시키고, 그리고 당해 테스트 제제와의 접촉으로 상기 응축물의 형성, 안정성, 또는 형태가 조절되는 지를 결정하는 것을 포함하며, 이때 상기 응축물은 핵 수용체 (NR), 또는 이의 단편을 응축물 성분으로써 포함한다. 상기 핵 수용체는 제한되지 않으며, 본원에서 기술된 임의의 핵 수용체일 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 핵 수용체는 돌연변이 핵 수용체 (예컨데, 질환과 연합된 돌연변이 핵 수용체, 동족 리간드 결합과 독립적인 구성적 활성 (예컨데, 전사 활성)을 갖는 돌연변이 핵 수용체)이다. 일부 구체예들에서, 상기 핵 수용체는 핵 호르몬 수용체, 에스트로겐 수용체, 또는 레티노산 수용체-알파이다. 일부 구체예들에서, 상기 응축물은 응축물 성분으로써 공동-인자 (예컨데, Mediator, MED1)를 더 포함한다. 상기 응축물의 성분들은 본원에서 기술된 임의의 적합한 응축물 성분일 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 응축물은 세포로부터 단리된다. 상기 응축물이 단리되는 세포는 임의의 적합한 세포다. 일부 구체예들에서, 상기 제제는 시험관 내에서 상기 응축물의 형성을 야기시킨다.
테스트 제제를 식별해내는 방법들의 일부 구체예들에서, 상기 시험관내 응축물의 형성, 안정성, 또는 형태를 조절하는 제제 (예컨데, 이 제제가 당해 응축물의 형성 또는 안정성을 감소시킨다면)는 치료요법적 후보 제제 (예컨데, 돌연변이 핵 수용체를 특징으로 하는 질환에 대한 치료요법적 제제, 암, 또는 상기 핵 수용체를 포함하는 신호전달 경로를 특징으로 하는 질환에 대한 치료요법적 제제)로 식별된다. 일부 구체예들에서, 상기 식별된 제제는 본원에서 기술된 질환 또는 병태에 상응하는 임의의 치료에 대한 후보가 될 수 있다. 테스트 제제를 식별해내는 본원에서 기술된 방법들의 일부 구체예들에서, 돌연변이 핵 수용체를 포함하는 시험관내 응축물의 형성 또는 안정성을 감소시키는 제제는 상기 돌연변이체 NR을 특징으로 하는 질환 또는 병태 치료용 후보 제제로 식별된다. 본원에서 기술된 테스트 제제를 식별해내는 방법들의 일부 구체예들에서, 핵 수용체 (예컨데, 돌연변이 핵 수용체) 또는 이의 단편을 포함하는 시험관내 응축물의 형성 또는 안정성을 감소시키는 제제는 당해 핵 수용체의 조절자 후보로 식별된다.
일부 구체예들에서, 상기 시험관내 응축물은 탐지가능한 라벨을 포함한다. 상기 라벨은 제한되지 않으며, 본원에서 기술된 임의의 라벨일 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 응축물의 성분은 탐지가능한 라벨을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 핵 수용체 또는 이의 단편은 상기 탐지가능한 라벨을 포함한다.
질환 및 질환 의존성
암 세포들은 전사 탐닉(addiction)과 같이, 특정 유전자의 전사에 크게 의존적이 될 수 있고, 이러한 전사는 특정 응축물들에 의존적일 수 있다. 예를 들면, 전사 응축물은 종양이 의존하는 종양 유전자에서 형성될 수 있고, 당해 응축물은 본원에서 기술된 제제 (예컨데, 펩티드, 핵산 또는 소 분자)가 표적으로 할 수 있는 특이적 단백질, RNA 또는 DNA 모티프에 특별히 의존적일 수 있다. 본 명세서의 일부 구체예들은 암 세포들에서 전사 응축물의 억압, 제거, 또는 분해시키는 항-암 제제를 스크리닝하기 위한 본원에 기술된 방법에 관계한다. 본 명세서의 일부 구체예들은 암 세포들에서 이질성염색질 응축물들을 조절하는 항-암 제제를 스크리닝하기 위한 본원에 기술된 방법의 사용에 관계한다. 일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 방법들은 핵 수용체들 (예컨데, 돌연변이 핵 수용체들, 돌연변이 호르몬 수용체들)를 포함하는 전사 응축물들의 형성 또는 전사의 안정성을 감소시키는 제제를 식별하는데 이용된다.
예를 들면, 일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 방법들은 MED1 및 ER을 포함하는 전사 응축물의 형성 또는 전사의 안정성을 감소시키는 제제를 식별하는데 이용된다. 일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 방법들은 탐옥시펜에 저항성인 MED1 및 돌연변이체 ER을 포함하는 전사 응축물의 형성 또는 전사의 안정성을 감소시키는 제제를 식별하는데 이용된다. 일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 방법들은 MED1 및 ER을 포함하는 전사 응축물의 형성 또는 전사의 안정성을 감소시키는 제제 (예컨데, 본원에서 기술된 바와 같이 SERM 활성을 갖는 제제, 예컨데, ER+ 유방암에 대항하여 효과적인 후보 제제)를 식별하는데 이용된다. 일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 방법들은 증가된 수준의 MED1 (예컨데, 탐옥시펜 저항적이 않은 ER+ 유방암 세포로부터의 응축물보다 적어도 4-배 더 많은 MED1)를 포함하는 응축물의 형성 또는 전사의 안정성을 감소시키는 제제를 식별하는데 이용된다. 일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 방법들은 돌연변이체 ER (예컨데, 본원에서 기술된 바와 같이) 및 MED1을 포함하는 응축물의 형성 또는 전사의 안정성을 감소시키는 제제를 식별하는데 이용된다. 일부 구체예들에서, 상기 식별된 제제는 SERM (탐옥시펜) 저항적 암 (예컨데, 유방암)의 발달을 방지, 또는 극복하기 위한 후보 제제다.
질환을 야기하는 돌연변이 또는 후생적 변경을 품고 있는 세포들은 특이적 응축물들에 의존적인 변경된 전사를 겪는다. 예를 들면, 질환은 한 가지 또는 그 이상의 질환 유전자들에서 응축물 형성, 구성, 유지, 해체 또는 규제에 의해 야기되며, 이러한 것들에 의존적일 수 있다. 본 명세서의 일부 구체예들은 본원에서 기술된 방법들을 이용하여, 질환과 연합된 응축물의 조절에 관한 것이다. 본 명세서의 일부 구체예들은 본원에서 기술된 방법들에 의해 질환과 연합된 응축물들을 조절하는 제제를 스크리닝하는 것에 관한 것이다.
일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 상기 질환 또는 병태는 핵 수용체와 연합된다. 일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 상기 질환 또는 병태는 핵 수용체에서 돌연변이 또는 핵 수용체의 일탈적인 발현 (예컨데, 참조 수준과 비교하였을 때 증가 또는 감소된 수준)과 연합된다.
응축물 및 응축물 성분 구성
본 명세서의 일부 측면들은 DNA, RNA 그리고 단백질중 하나, 둘, 또는 세 가지 모두를 포함하는 단리된 합성 응축물들에 관한 것이다. 상기 합성 응축물들은 상기 성분들 본원에서 기술된 성분들중 임의의 성분을 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 합성 응축물들은 본원에서 기술된 바와 같이 IDR-유도성 올리고머화 도메인을 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 합성 응축물들은 Mediator, MED1, MED15, p300, BRD4, 핵 수용체 리간드, 또는 TFIID을 포함할 수 있다. 일부 측면들에서, 상기 합성 전사 응축물들은 전사 인자 (예컨데, OCT4, p53, MYC, NANOG, MyoD, KLF4, SOX 패밀리 전사 인자, GATA 패밀리 전사 인자, 핵 수용체, 융합 종양형성적 전사 인자, 또는 GCN4)를 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 합성 응축물은 OCT4, p53, MYC, GCN4, Mediator, 매개체 성분, MED1, MED15, p300, BRD4, NANOG, MyoD, KLF4, SOX 패밀리 전사 인자, GATA 패밀리 전사 인자, 핵 수용체, 신호전달 인자, 메틸-DNA 결합 단백질, 스플라이싱 인자, 유전자 침묵화 인자, RNA 중합효소, β-카테닌, STAT3, SMAD3, NF-KB, MECP2, MBD1, MBD2, MBD3, MBD4, HP1α, TBL1R, HDAC3, SMRT, RNA 중합효소 II, SRSF2, SRRM1, SRSF1, 또는 TFIID, 또는 이의 단편 또는 본질적으로 무질서화된 이의 도메인을 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 전사 인자는 표 S3에서 열거된 전사 인자의 활성화 도메인을 갖는다. 일부 구체예들에서, 상기 전사 인자는 표 S3에서 열거된 전사 인자의 IDR을 갖는다. 일부 구체예들에서, 상기 전사 인자는 표 S3에서 열거되어 있다. 일부 구체예들에서, 상기 전사 인자는 매개체 성분 (예컨데, 표 S3에 열거된 매개체 성분)과 상호작용하는 전사 인자다. 본 명세서의 일부 측면들은 한 가지 또는 그 이상의 합성 전사 응축물들을 포함하는 액체 소적에 관한 것이다. 본 명세서의 일부 측면들은 본원에서 기술된 바와 같은, 스크리닝 검정법에 필요한 성분들을 포함하는 구성에 관한 것이다.
본 명세서의 일부 측면들은 본원에서 기술된 바와 같은 전사 응축물 성분 및 본원에서 기술된 바와 같이 유도성 올리고머화를 부여하는 도메인을 포함하는 융합 단백질에 관한 것이다. 일부 구체예들에서, 상기 유도성 올리고머화를 부여하는 도메인은 Cry2이다. 일부 구체예들에서, 상기 융합 단백질은 본원에서 기술된 바와 같은 탐지가능한 테그를 더 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 탐지가능한 테그는 형광 테그이다. 일부 구체예들에서, 상기 유도성 올리고머화를 부여하는 도메인은 소 분자, 단백질, 또는 핵산으로 유도가능한다.
본 명세서의 일부 측면들은 합성 전사 응축물들, 이질성염색질 응축물들, 그리고 mRNA 개시 또는 신장 복합체와 물리적으로 연합된 응축물들을 만드는 방법들을 제공한다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 전사 응축물들, 이질성염색질 응축물들, 그리고 mRNA 개시 또는 신장 복합체와 물리적으로 연합된 응축물들의 형성에 적합한 조건 하에서 시험관 내에서 두 가지 또는 그 이상의 응축물 성분들을 복합시키는 것을 포함한다. 상기 조건에는 성분들의 적절한 농도, 염 농도, pH, 등등이 포함될 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 조건에는 약 25 mM, 40 mM, 50 mM, 125 mM, 200 mM, 350 mM, 또는 425 mM; 또는 약 10-250 mM, 25-150 mM, 또는 40-100 mM 범위의 염 농도 (예컨데, NaCl)가 내포된다. 일부 구체예들에서, 상기 조건에는 약 7-8, 7.2-7.8, 7.3-7.7, 7.4-7.6, 또는 약 7.5의 pH가 내포된다. 일부 구체예들에서, 상기 전사 응축물 성분들은 MED1, BRD4, BRD4의 상기 본질적으로 무질서화된 도메인 (BRD4-IDR), 및/또는 MED1의 상기 본질적으로 무질서화된 도메인 (MED1-IDR)을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 전사 응축물 성분들은 BRD4-IDR 및 MED1-IDR을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 전사 응축물 성분들은 전사 인자의 활성화 도메인 (예컨데, OCT4, p53, MYC, NANOG, MyoD, KLF4, SOX 패밀리 전사 인자, GATA 패밀리 전사 인자, 핵 수용체, 융합 종양형성적 전사 인자, 또는 GCN4)의 IDR을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 IDR은 표 S3에 열거된 전사 인자의 IDR이다. 일부 구체예들에서, 상기 전사 응축물 성분들은 핵 수용체 (예컨데, ER) 활성화 도메인을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 IDR은 OCT4, p53, MYC, GCN4, Mediator, 매개체 성분, MED1, MED15, p300, BRD4, NANOG, MyoD, KLF4, SOX 패밀리 전사 인자, GATA 패밀리 전사 인자, 핵 수용체, 신호전달 인자, 메틸-DNA 결합 단백질, 스플라이싱 인자, 유전자 침묵화 인자, RNA 중합효소, β-카테닌, STAT3, SMAD3, NF-KB, MECP2, MBD1, MBD2, MBD3, MBD4, HP1α, TBL1R, HDAC3, SMRT, RNA 중합효소 II, SRSF2, SRRM1, SRSF1, 또는 TFIID이거나, 이의 IDR이다.
mRNA 개시 또는 신장 복합체 연합된 응축물들
아래에서 나타낸 바와 같이, Pol II CTD 포스포릴화는 이의 응축물 분할 거동을 변경시키고, 따라서 전사 개시에 관련된 응축물로부터 Pol II를 RNA 스플라이싱에 관련된 것들로의 교환을 구동시킨다. 이 모델은 Pol II의 큰 클러스터가 세포 안에서 Mediator 응축물들과 융합할 수 있다는 기존 연구, 포스포릴화는 CTD-중재된 Pol II 클러스터를 용해시킬 수 있다는 기존 연구, CDK9/사이클린 T는 상 분리 기전을 통하여 CTD와 상호작용할 수 있다는 기존 연구, Pol II는 전사 신장 동안 Mediator와는 더 이상 연합되지 않는다는 기존 연구, 그리고 스플라이싱 인자들을 함유하는 핵 반점(speckles)이 높은 전사 활성을 갖는 좌에서 관찰될 수 있다는 기존 연구들의 증거와 일관된다.
본 명세서의 일부 측면들은 mRNA 개시를 조정하는 방법에 관한 것으로, 이 방법은 mRNA 개시와 물리적으로 연합된 응축물의 형성, 구성, 유지, 해체 및/또는 규제의 조정을 포함한다. 일부 구체예들에서, mRNA 개시의 조정으로 mRNA 신장, 스플라이싱 또는 캡핑(capping)이 또한 조정된다. 일부 구체예들에서, 상기 mRNA 개시와 물리적으로 연합된 응축물의 형성, 구성, 유지, 해체 및/또는 규제를 조정함으로써 mRNA 전사 속도가 조정된다. 일부 구체예들에서, 상기 mRNA 개시와 물리적으로 연합된 응축물의 형성, 구성, 유지, 해체 및/또는 규제를 조정함으로써 유전자 산물의 수준이 조정된다.
일부 구체예들에서, 상기 mRNA 개시와 물리적으로 연합된 응축물의 형성, 구성, 유지, 해체 및/또는 규제는 제제에 의해 조정된다. 상기 제제는 제한적이지 않으며, 본원에서 기술된 임의의 제제일 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 제제는 포스포릴화된 또는 저-포스포릴화된 RNA 중합효소 II C-말단 도메인 (Pol II CTD) 또는 이의 기능적 단편을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 제제는 포스포릴화된또는 저-포스포릴화된 Pol II CTD에 선호적으로 결합한다. 일부 구체예들에서, 상기 제제는 Pol CTD를 포스포릴화 또는 탈-포스포릴화시킨다. 일부 구체예들에서, 상기 제제는 사이클린 의존적 키나제 (CDK)의 포스포릴화 활성을 조절한다. 일부 구체예들에서, 상기 제제는 스플라이싱 인자들이 연합된 포스포릴화된 RNA 중합효소를 강화시키거나 또는 저해한다. 상기 스플라이싱 인자들은 본원에서 기술된 임의의 스플라이싱 인자일 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서의 일부 측면들은 mRNA 신장을 조정하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 mRNA 신장과 물리적으로 연합된 응축물의 형성, 구성, 유지, 해체 및/또는 규제의 조정을 포함한다. 일부 구체예들에서, mRNA 신장의 조정으로 mRNA 개시 또한 조정된다. 일부 구체예들에서, 상기 mRNA 신장 복합체와 물리적으로 연합된 응축물의 형성, 구성, 유지, 해체 및/또는 규제를 조정함으로써 mRNA의 공동-전사 프로세싱이 조정된다. 일부 구체예들에서, 상기 mRNA 신장 복합체와 물리적으로 연합된 응축물의 형성, 구성, 유지, 해체 및/또는 규제를 조정함으로써 mRNA 스플라이스 변이체들의 수 또는 상대적 비율이 조정된다. 일부 구체예들에서, 상기 mRNA 신장 복합체와 물리적으로 연합된 응축물의 형성, 구성, 유지, 해체 및/또는 규제는 제제에 의해 조정된다. 상기 제제는 제한적이지 않으며, 본원에서 기재된 임의의 제제일 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 제제는 포스포릴화된 또는 저-포스포릴화된 RNA 중합효소 II C-말단 도메인 (Pol II CTD) 또는 이의 기능적 단편을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 제제는 포스포릴화된 또는 저-포스포릴화된 Pol II CTD에 선호적으로 결합한다. 일부 구체예들에서, 상기 제제는 포스포릴화된 또는 저-포스포릴화된 Pol II CTD에 선호적으로 결합한다. 일부 구체예들에서, 상기 제제는 Pol CTD를 포스포릴화 또는 탈-포스포릴화시킨다. 일부 구체예들에서, 상기 제제는 사이클린 의존적 키나제 (CDK)의 포스포릴화 활성을 조절한다. 일부 구체예들에서, 상기 제제는 스플라이싱 인자들이 연합된 포스포릴화된 RNA 중합효소를 강화시키거나 또는 저해한다. 상기 스플라이싱 인자들은 본원에서 기술된 임의의 스플라이싱 인자일 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서의 일부 측면들은 응축물의 형성, 구성, 유지, 해체 및/또는 규제를 조정하는 방법에 관한 것으로, 이 방법은 당해 응축물 성분의 포스포릴화 또는 탈-포스포릴화의 조정을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 성분은 RNA 중합효소 II 또는 RNA 중합효소 II C-말단 영역이다. 일부 구체예들에서, 제제를 이용하여 응축물 성분의 포스포릴화 또는 탈-포스포릴화를 조절한다. 상기 제제는 제한적이지 않으며, 본원에서 기재된 임의의 제제일 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 제제는 사이클린 의존적 키나제 (CDK)의 포스포릴화 활성을 조절한다.
본 명세서의 일부 측면들은 일탈적인 mRNA 프로세싱과 연합된 질환 또는 병태의 가능성을 치료 또는 감소시키는 방법에 관한 것으로, 이 방법은 mRNA 신장 복합체와 물리적으로 연합된 응축물의 형성, 구성, 유지, 해체 및/또는 규제의 조정을 포함한다. 응축물 조절 방법은 제한되지 않으며, 본원에서 기술된 응축물 조절을 위한 임의의 방법일 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 응축물은 본원에서 기술된 제제에 의해 조절된다. 일부 구체예들에서, 일탈적인 mRNA 프로세싱과 연합된 질환 또는 병태는 일탈적인 스플라이싱 변이체들을 특징으로 한다. 일부 구체예들에서, 일탈적인 mRNA 프로세싱과 연합된 질환 또는 병태는 일탈적인 mRNA 개시를 특징으로 한다.
본 명세서의 일부 측면들은 mRNA 개시 또는 신장 복합체와 물리적으로 연합된 응축물의 형성, 안정성, 또는 형태를 조절하는 제제를 식별해내는 방법에 관계한다. 제제를 식별해내는 방법은 제제를 식별해내는 임의의 방법 또는 본원에서 기술된 제제를 스크리닝하는 임의의 방법일 수 있다.
일부 구체예들에서, 상기 방법은 응축물을 보유한 세포를 제공하고, 이 세포에 테스트 제제를 접촉시키고, 그리고 당해 테스트 제제와의 접촉으로 당해 응축물의 형성, 안정성, 또는 형태가 조절되는 지를 결정하는 것을 포함하고, 이때 상기 응축물은 저-포스포릴화된 RNA 중합효소 II C-말단 도메인 (Pol II CTD), 포스포릴화된 RNA 중합효소 II C-말단 도메인 (Pol II CTD), 스플라이싱 인자, 또는 이의 기능적 단편이다. 본 명세서의 일부 측면들은 응축물의 형성, 안정성, 또는 형태를 조정하는 제제를 식별해내는 방법에 관한 것으로, 이 방법은 시험관내 응축물을 제공하고, 이 시험관내 응축물의 한 가지 또는 그 이상의 물리적 성질들을 평가하고, 이 시험관내 응축물에 테스트 제제를 접촉시키고, 그리고 이 테스트 제제가 당해 시험관내 응축물의 한 가지 또는 그 이상의 물리적 성질들의 변화를 야기시키는 지를 평가하는 것을 포함하고, 이때 상기 응축물은 저-포스포릴화된 RNA 중합효소 II C-말단 도메인 (Pol II CTD), 포스포릴화된 RNA 중합효소 II C-말단 도메인 (Pol II CTD), 스플라이싱 인자, 또는 이의 기능적 단편을 포함한다.
본 명세서의 일부 측면들은 세포의 단백질들의 아미노산 잔기의 포스포릴화 상태가 응축물 형성, 안정성, 국소화, 분할, 활성, 또는 기타 성질들을 조절하는 아미노산 잔기를 식별해내는 방법에 관계한다. 식별된 잔기는 대상체 또는 시험관내에서 응축물 형성, 안정성, 국소화, 분할, 활성, 또는 기타 성질들을 조정하기 위한 변형의 표적이 될 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 응축물 성분에서 한 가지 또는 그 이상의 포스포릴화 부위들 또는 잠재적 포스포릴화 부위들 (예컨데, 세린, 트레오닌, 또는 티로신)를 물리적으로 또는 계산적으로 식별해내고, 한 가지 또는 그 이상의 이러한 잔기를 돌연변이시키고, 예컨데, 당해 잔기를 알라닌으로 바꾸고), 그리고 이러한 돌연변이가 이러한 돌연변이체 응축물 성분을 포함하는 당해 응축물의 성질 (예컨데, 형성, 안정성, 국소화, 분할, 활성)을 변경시키는지 (예컨데, 당해 돌연변이를 함유하지 않은 응축물 성분과 비교하였을 때)을 변경시키는 지를 결정하는 것을 수반한다. 만약 상기 돌연변이가 상기 응축물 성질을 변경시킨다면, 그러면 해당 포스포릴화 부위는 당해 응축물의 형성, 안정성, 국소화, 분할, 또는 활성을 조절하기 위한 변형의 표적으로 식별된다. 본 발명의 일부 구체예들에서, 상기 식별된 잔기의 포스포릴화를 담당하는 키나제 식별된다(예컨데, 상기 응축물이 기질이되는 시험관내 키나제 검정법을 이용하여, 개별 키나제의 발현을 축소시켰던 세포를 이용하여 (예컨데, 키노메-와이드(kinome-wide) siRNA 스크린을 실시함으로써), 특정 키나제를 저해시키는 것으로 알려진 공지의 키나제 저해제를 이용하여). 대안으로 또는 추가적으로, 일부 구체예들에서, 상기 식별된 잔기의 포스포릴화 상태에 영향을 주는 한 가지 또는 그 이상의 키나제를 식별해내기 위해 공지의 키나제 저해제의 라이브러리가 스크리닝된다. 본 발명의 일부 구체예들에서, 상기 식별된 잔기의 탈-포스포릴화를 담당하는 포스파타제가 식별된다 (예컨데, 상기 응축물이 기질이 되는 시험관내 포스파타제 검정법을 이용하여, 개별 포스파타제의 발현을 축소시킨 세포들을 이용하여 (예컨데, 공지의 포스파타제의 siRNA 스크린을 실시함으로써), 특정 포스파타제를 저해시키는 것으로 알려진 공지의 포스파타제 저해제를 이용하여). 대안으로 또는 추가적으로, 일부 구체예들에서, 상기 식별된 잔기의 포스포릴화 상태에 영향을 주는 한 가지 또는 그 이상의 포스파타제를 식별해내기 위해 공지의 포스파타제 저해제의 라이브러리가 스크리닝된다. 각종 구체예들에서 이러한 검정법은 시험관내, 무-세포 시스템, 또는 세포 안에서 실행될 수 있다.
본 명세서의 일부 측면들은 저-포스포릴화된 RNA 중합효소 II C-말단 도메인 (Pol II CTD) 또는 이의 기능적 단편을 포함하는 단리된 합성 응축물에 관한 것이다. 본 명세서의 일부 측면들은 포스포릴화된 RNA 중합효소 II C-말단 도메인 (Pol II CTD) 또는 이의 기능적 단편을 포함하는 단리된 합성 응축물에 관한 것이다. 본 명세서의 일부 측면들은 스플라이싱 인자 또는 이의 기능적 단편을 포함하는 단리된 합성 응축물에 관한 것이다.
이질성염색질 응축물들
이질성염색질은 염색체 유지 및 유전자 침묵화에 중요한 역할을 한다. 세포에서 산재적으로 발현되고, 정상적인 발달에 필수적인 MeCP2, 메틸-DNA 결합 단백질은 역동적 액체 이질성염색질 응축물들의 주요 성분임을 하기에서 보여준다. MeCP2 함유 응축물들은 유전자 침묵화에 기여하는 억제 이질성염색질 인자들을 구획화할 수 있다. 응축물들을 형성하고, 세포 안에서 이질성염색질로 통합되며, 그리고 유전자 침묵화 인자들을 구획화할 수 있는 MeCP2의 능력은 이의 C-말단 본질적으로 무질서화된 영역 (IDR)에 의존적이다.
본 명세서의 일부 측면들은 한 가지 또는 그 이상의 유전자 전사를 조절하는 방법에 관한 것으로, 이 방법은 이질성염색질과 연합된 응축물 (즉, 이질성염색질 응축물)의 형성, 구성, 유지, 해체 및/또는 규제를 조절하는 것을 포함한다. 상기 이질성염색질 응축물의 조절하는 방법은 제한되지 않으며, 본원에서 기술된 응축물 조절을 위한 임의의 방법일 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 이질성염색질 응축물의 조정으로 상기 한 가지 또는 그 이상의 유전자들의 전사 억제 (즉, 유전자 침묵화)가 증가되거나, 또는 안정화된다. 일부 구체예들에서, 상기 이질성염색질 응축물의 조정으로 상기 한 가지 또는 그 이상의 유전자들의 전사 억제 (즉, 유전자 침묵화)가 감소된다. 일부 구체예들에서, 이질성염색질과 연합된 다수의 응축물들이 조절된다. 일부 구체예들에서, 상기 이질성염색질 응축물의 형성, 구성, 유지, 해체 및/또는 규제는 제제에 의해 조정된다. 상기 제제는 제한적이지 않으며, 본원에서 기술된 임의의 제제일 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 제제는 펩티드, 핵산, 또는 소 분자를 포함하거나, 이로 구성된다. 일부 구체예들에서, 상기 제제는 메틸화된 DNA, 메틸-DNA 결합 단백질, 또는 유전자 침묵화 인자에 결합한다.
본 명세서의 일부 측면들은 유전자 침묵화를 조정하는 방법에 관한 것으로, 이 방법은 이질성염색질 응축물의 형성, 구성, 유지, 해체 및/또는 규제의 조정을 포함한다. 일부 구체예들에서, 유전자 침묵화는 안정화되거나 또는 증가된다. 일부 구체예들에서, 유전자 침묵화는 감소된다. 일부 구체예들에서, 유전자 침묵화는 제제에 의해 조정된다. 상기 제제는 제한적이지 않으며, 본원에서 기술된 임의의 제제일 수 있다.
본 명세서의 일부 측면들은 일탈적인 유전자 침묵화와 연합된 질환 또는 병태의 가능성을 치료 또는 감소시키는 (예컨데, 참조 또는 대조군 수준과 비교하였을 때, 증가된 또는 감소된 수준) 방법에 관한 것으로, 이 방법은 이질성염색질 응축물의 형성, 구성, 유지, 해체 및/또는 규제를 조절하는 것을 포함한다. 일부 구체예들에서, 일탈적인 유전자 침묵화와 연합된 질환 또는 병태는 메틸-DNA 결합 단백질의 일탈적인 발현 또는 활성과 연합된다. 일부 구체예들에서, 일탈적인 유전자 침묵화와 연합된 질환 또는 병태는 ATR-X 증후군, Juberg-Marsidi 증후군, Sutherland-Haan 증후군, Smith-Finemers 증후군, 유방암, MECP2 복제(duplication) 증후군, Rett 증후군, 자폐증, Down 증후군, ADHD/ADD, Alzheimer, Huntington, Parkinson, 간질, 양극성 기분 장애, 우울증, 태아 알코올 증후군, Werner 증후군, 결장 암, 림프종, 췌장암, ICF 증후군, 방광 암, 유방암, 결장 암, 간세포 암종, 폐 암, Barrett 식도, 방광 암, 유방암, 결장직장의 암, 흑색종, 골수종/림프종, 간세포 암종, 전립선 암, Wilms 종양, 유방암, 수모세포종, 유두 갑상샘 암종, 얼굴어깨위팔 근육 이영양증, Friedreich's 운동실조, 취약(fragile) X 증후군, Angelman 증후군, Prader-Willi 증후군, Hutchinson-Gilford progeria 증후군, Werner 증후군, Beckwith-Weidemann 증후군, Silver-Russel 증후군, 척수소뇌의 운동실조, 또는 코카인 물질 남용이다. 일부 구체예들에서, 일탈적인 유전자 침묵화와 연합된 질환 또는 병태는 Rett 증후군 또는 MeCP2 과다발현 증후군이다.
본 명세서의 일부 측면들은 이질성염색질 응축물의 응축물 형성, 안정성, 또는 형태를 조절하는 제제를 식별해내는 방법에 관계한다. 제제를 식별해내는 방법은 제제를 식별해내는 임의의 방법 또는 본원에서 기술된 제제를 스크리닝하는 임의의 방법일 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 응축물을 보유한 세포를 제공하고, 상기 세포에 테스트 제제를 접촉시키고, 그리고 당해 테스트 제제와의 접촉으로 상기 이질성염색질 응축물의 형성, 안정성, 또는 형태가 조절되는 지를 결정하는 것을 포함하고, 이때 상기 응축물은 메틸-DNA 결합 단백질 (예컨데, MeCP2) 또는 이의 단편 (예컨데, MeCP2의 C-말단 본질적으로 무질서화된 영역), 또는 억압제 또는 이의 기능적 단편을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 응축물은 메틸화된 DNA와 연합된다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 시험관내 응축물을 제공하고, 당해 시험관내 응축물의 한 가지 또는 그 이상의 물리적 성질들을 평가하고, 당해 시험관내 응축물에 테스트 제제를 접촉시키고, 그리고 당해 테스트 제제가 당해 시험관내 응축물의 한 가지 또는 그 이상의 물리적 성질들의 변화를 야기시키는 지를 평가하는 것을 포함하고, 이때 상기 응축물은 메틸-DNA 결합 단백질 (예컨데, MeCP2) 또는 이의 단편 (예컨데, MeCP2의 C-말단 본질적으로 무질서화된 영역), 또는 억압제 또는 이의 기능적 단편을 포함한다.
본 명세서의 일부 측면들은 메틸-DNA 결합 단백질 (예컨데, MeCP2) 또는 이의 단편 (예컨데, MeCP2의 C-말단 본질적으로 무질서화된 영역), 또는 억압제 또는 이의 기능적 단편을 포함하는 단리된 합성 응축물에 관한 것이다.
진단 방법들
본 명세서의 일부 측면들은 응축물-표적화된 치료요법적 제제를 이용한 치료의 후보가 되는 대상체를 식별해내는 방법들에 관한 것이다. 일부 구체예들에서, 응축물-표적화된 치료요법적 제제를 이용한 치료의 후보가 되는 대상체를 식별해내는 방법은 당해 대상체로부터 단리된 샘플을 얻고, 이 샘플 안에 있는 한 가지 또는 그 이상의 응축물들의 수준 (또는 안정성, 해체, 또는 유지에서 선택된 성질)을 결정하고, 그리고 당해 응축물의 안정성, 해체, 또는 유지의 일탈적인 수준 (예컨데, 참조 수준과 비교하였을 때 증가 또는 감소된 수준), 또는 상기 응축물의 안정성, 해체, 또는 유지중에서 선택된 일탈적인 성질이 탐지된다면, 이 대상체는 응축물-표적화된 치료요법적 제제를 이용한 치료의 후보로 식별되는 것을 포함한다. 상기 방법은 응축물-표적화된 치료요법적 제제를 당해 대상체에게 투여하는 것을 더 내포할 수 있는데, 이때 당해 제제는 당해 응축물의 일탈적인 수준 (또는 안정성, 해체, 또는 유지중에서 선택된 성질)의 적어도 일부분을 정상화시킨다. "응축물-표적화된 치료요법적 제제"란 응축물의 형성, 안정성, 구성, 유지, 해체, 또는 규제를 치료요법적으로 유익한 방식으로 조절하는, 예컨데, 응축물 성분과 물리적으로 연합시키고, 응축물 성분을 변형시키거나, 또는 응축물 성분의 변형자/탈변형자를 저해 또는 활성화시키는 제제로 본원에서 정의된다. 일부 구체예들에서, 상기 대상체는 암을 앓고 있다. 일부 구체예들에서, 상기 응축물은 종양유전자를 포함하거나, 또는 종양유전자의 전사를 구동시킨다. 일부 구체예들에서, 상기 응축물은 전사 응축물이다. 일부 구체예들에서, 상기 응축물은 이질성염색질-연합된 응축물이다.
일부 측면들에서, 방법은 대상체, 예컨데, 포유류 대상체, 예컨데, 인간 대상체로부터 획득된 샘플을 제공하고, 그리고 이 샘플 안에 전사 응축물을 탐지하는 것을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 샘플은 적어도 하나의 세포, 예컨데, 적어도 하나의 암 세포를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 대조군 세포 또는 샘플 (예컨데, 건강한 세포 또는 건강한 대상체의 샘플)과 비교하였을 때, 세포 또는 샘플 안에 일탈적인 수준 (예컨데, 참조 수준과 비교하였을 때, 증가 또는 감소된 수준), 일탈적인 구성, 또는 일탈적인 국소화를 탐지하는 것을 포함한다. 일부 구체예들에서, 전사 응축물의 일탈적인 수준, 구성, 또는 국소화의 탐지를 이용하여 질환을 진단할 수 있다.
일부 측면들에서, 방법은 대상체, 예컨데, 포유류 대상체, 예컨데, 인간 대상체로부터 얻은 샘플을 제공하고, 그리고 대조군 세포 또는 샘플 (예컨데, 건강한 세포 또는 건강한 대상체로부터 얻은 샘플)과 비교하였을 때, 당해 샘플에 있는 전사 응축물 성분의 돌연변이 또는 일탈적인 수준 또는 활성을 탐지하는 것을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 샘플은 적어도 하나의 세포, 예컨데, 적어도 하나의 암 세포를 포함한다. 일부 구체예들에서, 전사 응축물 성분의 돌연변이 또는 수준 또는 활성에서의 변경은 당해 전사 응축물의 형성, 안정성, 국소화, 활성, 또는 형태에 영향을 끼친다. 일부 구체예들에서, 당해 샘플에 있는 전사 응축물 성분의 돌연변이 또는 일탈적인 수준 또는 활성 탐지를 이용하여 질환을 진단할 수 있다.
이식유전자삽입된 비-인간 동물
본 명세서의 일부 측면들은 유전자삽입 비-인간 동물 (예컨데, 비-인간 포유류, 비-인간 영장류, 설치류 (예컨데, 마우스, 랫(rat), 토끼, 햄스터), 갯과(canine), 고양잇과(feline), 소, 또는 기타 포유류)에 관한 것으로, 이들 세포는 탐지가능한 라벨에 융합된 응축물 성분을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는 이식유전자(transgene)를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 테스트 제제를 이러한 동물에게 투여하고, 이 동물로부터 단리된 한 가지 또는 그 이상의 세포를 포함하는 샘플을 획득하고, 그리고 상기 폴리펩티드를 포함하는 응축물의 형성, 안정성, 또는 활성에 있어서 당해 테스트 제제의 효과를 결정하는 것을 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 샘플은 조직 샘플이다.
본 명세서의 일부 측면들은 질환 또는 병태에 대한 동물 모델로써 유전자삽입 동물에 관한 것이다. 상기 질환 또는 병태는 제한되지 않으며, 그리고 본원에서 기술된 임의의 질환 또는 병태일 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 유전자삽입 동물을 이용하여 당해 질환에 대한 후보 제제를 테스트한다. 일부 구체예들에서, 상기 유전자삽입 동물은 본원에 개시된 방법 (예컨데, 제제를 스크리닝 또는 식별해내는 방법)들을 실행하기 위한 원발성 세포의 원천이다.
유방암
유방암은 가장 흔한 암 중 하나이며, 암 사망률의 선두 원인이다. 인간 유방암의 대략적으로 70%는 호르몬-의존적 및 에스트로겐 수용체 양성 (ER+) (예컨데, 성장을 위하여 에스트로겐 의존적임)이다. ER+ 유방암을 치료하기 위해 선택적 에스트로겐 수용체 조절자 (SERM), 이를 테면, 탐옥시펜, 랄옥시펜(raloxifene), 또는 토레미펜(toremifene)이 흔히 이용된다. SERMs는 유방 조직에서 ER 저해제 (길항제)로 작용할 수 있지만, 그러나 상기 제제에 의존적이며, 특정 다른 조직(예컨데, 뼈)에서 당해 ER의 활성제들 (예컨데, 부분적인 작용제)로 작용할 수 있음을 인지할 것이다. 탐옥시펜 자체는 프로드럭으로써 당해 ER에 대하여 상대적으로 친화력이 거의 없지만, 활성 대사산물, 이를 테면, 4-히드록시탐옥시펜 (아핌옥시펜(afimoxifene)) 및 N-데스메틸-4-히드록시탐옥시펜 (엔독시펜(endoxifen))으로 대사된다는 것을 인지할 것이다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "탐옥시펜"은 내용에서 탐옥시펜 또는 이의 활성 대사산물을 의미하는 것으로 해석될 것이다. 예를 들면, 탐옥시펜은 통상적으로 환자들에게 투여되는 형태다. 그러나, 활성 대사산물, 이를 테면, 4-히드록시탐옥시펜 (아핌옥시펜) 및/또는 N-데스메틸-4-히드록시탐옥시펜 (엔독시펜)이 시험관내 사용에서는 더 적합할 수 있다.
탐옥시펜은 ER-양성 유방암 환자를 위한 가장 흔히 이용되는 치료 제제다. 탐옥시펜은 에스트로겐과 ER에 결합을 경쟁하고, 탐옥시펜 결합된 ER은 전사 인자 활성이 축소되거나 또는 없어진 것으로 본다. 그러나, 탐옥시펜을 복용한 많은 환자에서 종국에는 탐옥시펜 저항적 유방암이 발달된다. 에스트로겐 자극 시, ER은 슈퍼-인헨서 (Bojcsuk et al, Nucleic Acids Res 2017)를 확립한다. 더욱이, 아래에서 나타낸 바와 같이, MED1은 ER+ 유방암에서 과다-발현되고, ER 기능 및 ER+ 종양생성에 필요하다. 또한, 아래에서 나타낸 바와 같이, 에스트로겐은 MED1 응축물들로 ER 통합을 자극한다. 이러한 통합은 MED1에서 LXXL 모티프 존재에 의존적이다.
본원에서의 결과는 MED1-IDR 및 ER이 시험관내 그리고 세포 안에서 에스트로겐 의존적 응축물들을 형성한다는 것을 보여준다. 응축물 형성은 탐옥시펜에 의해 감쇠된다. 그러나, 일부 탐옥시펜 저항적 ER+ 유방암은 에스트로겐과 독립적으로 활성이 있는 돌연변이 ER (예컨데, Y537S 및 D538G 돌연변이체)을 포함한다. 기타 탐옥시펜 저항적 ER+ 유방암은 에스트로겐과 독립적으로 활성인 ER 융합 단백질 (예컨데, ER-YAP1, ER-PCDH11X)을 포함한다. 이들 ER은 에스트로겐 존재와 독립적으로 MED1과 함께 응축물을 형성한다. 본원에서 보여주는 추가 결과에서 MED1을 과다발현시키는 (예컨데, 비-탐옥시펜 저항적 ER+ 유방암 세포 보다 4-배 이상 더 많이) ER+ 유방암 세포는 상기 ER에 결합하는 에스트로겐 독립적인 MED1 함유 응축물로 통합됨이 실증된다.
본 명세서의 일부 측면들은 세포 안에 한 가지 또는 그 이상의 유전자 전사를 조정하는 방법에 관한 것으로, 이 방법은 한 가지 또는 그 이상의 유전자들과 연합된 응축물의 구성, 유지, 해체 및/또는 규제의 조정을 포함하며, 이때 상기 응축물은 에스트로겐 수용체 (ER) 또는 이의 단편, 그리고 MED1 또는 이의 단편을 응축물 성분으로 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 에스트로겐 수용체는 돌연변이체 에스트로겐 수용체다. 일부 구체예들에서, 상기 돌연변이체 에스트로겐 수용체(예컨데, Y537S 및 D538G 돌연변이체)는 에스트로겐 결합에 의존적이지 않은 구성적 활성을 보유한다. 일부 구체예들에서, 상기 돌연변이체 에스트로겐 수용체는 융합 단백질이다. 일부 구체예들에서, 상기 융합 단백질 (예컨데, ER-YAP1, ER-PCDH11X)은 에스트로겐 결합에 의존적이지 않은 구성적 활성을 보유한다. 일부 구체예들에서, 상기 에스트로겐 수용체 단편은 리간드 결합 도메인 또는 이의 기능적 단편을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 ER 단편은 2개의 리간드 결합 도메인 또는 기능성 이의 단편들을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 ER 단편은 DNA 결합 도메인을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 MED1 단편은 IDR, LXXLL 모티프, 또는 이 둘 모두를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 ER 또는 MED1은 인간 ER 또는 MED1이다. 본원에서 기술된 방법 및 구성의 일부 구체예들에서, 상기 ER 또는 MED1은 비-인간 포유류 (예컨데, 랫, 마우스, 토끼) ER 또는 MED1이다.
일부 구체예들에서, 상기 응축물은 에스트로겐 또는 이의 기능적 단편에 접촉된다 (예컨데, 상기 에스트로겐 또는 이의 단편은 상기 응축물과 물리적으로 연합되거나, 또는 상기 응축물을 포함하는 용액 안에 있다). 일부 구체예들에서, 상기 응축물은 선택적 에스트로겐 선택적 조절자 (SERM)과 접촉된다 (예컨데, 상기 SERM은 상기 응축물과 물리적으로 연합되거나, 또는 상기 응축물을 포함하는 용액 안에 있다). 일부 구체예들에서, 상기 SERM은 탐옥시펜 또는 이의 활성 대사산물 (4-히드록시탐옥시펜 및/또는 N-데스메틸-4-히드록시탐옥시펜)이다. 일부 구체예들에서, 상기 응축물의 조정으로 MYC 종양유전자의 전사가 감소되거나 또는 제거된다. 일부 구체예들에서, MYC 종양유전자의 전사는 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 그 이상으로 축소된다.
상기 세포는 임의의 적합한 세포일 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 세포는 유방암 세포 (예컨데, 환자로부터 단리된 유방암 세포, 세포 계통 (예컨데, 600MPE, AU565, BT-20, BT-474, BT483, BT-549, Evsa-T, Hs578T, MCF-7, MDA-MB-231, SkBr3, T-47D))으로 부터의 유방암 세포다. 일부 구체예들에서, 상기 세포는 MED1 및 에스트로겐 수용체 (예컨데 인간 MED1 및/또는 에스트로겐 수용체)를 발현시키는 유전자삽입 세포다. 일부 구체예들에서, 상기 세포는 MED1, 또는 이의 기능적 단편, 그리고 에스트로겐 수용체 (예컨데, 돌연변이체 에스트로겐 수용체) 또는 이의 기능적 단편 (예컨데 인간 MED1 및/또는 에스트로겐 수용체)를 발현시키는 유전자삽입 세포다. 일부 구체예들에서, 상기 세포는 MED1을 과다-발현시킨다. 본원에서 사용된 바와 같이, "MED1을 과다-발현시킨다"라는 의미는 상기 세포가 대조군 세포 또는 참조 수준과 비교하였을 때, MED1을 적어도 약 1.1배, 적어도 1.2배, 1.3배, 적어도 1.4배, 적어도 1.5배, 적어도 1.6배, 적어도 1.7배, 적어도 1.8배, 적어도 1.9배, 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 30배, 적어도 40배, 적어도 50배, 또는 적어도 100배, 적어도 1,000배, 적어도 10,000배, 또는 그 이상으로 발현시킨다는 의미다. 일부 구체예들에서, 상기 세포는 탐옥시펜 저항적 ER+ 유방암 세포이며, 상기 대조군 세포는 비-탐옥시펜 저항적 ER+ 유방암 세포이다. 일부 구체예들에서, 상기 세포 (예컨데, 탐옥시펜 저항적 ER+ 유방암 세포)는 대조군 세포 (예컨데, 비-탐옥시펜 저항적 ER+ 유방암 세포)와 비교하였을 때, 약 4-배 또는 그 이상의 (예컨데, 약 4-배 내지 4.5-배)의 수준으로 MED1을 과다발현시킨다.
일부 구체예들에서, 상기 전사 응축물은 당해 전사 응축물에 제제를 접촉시킴으로써, 조절된다. 일부 구체예들에서, 상기 제제는 ER과 MED1 간의 물리적 상호작용을 축소 또는 제거시킨다. 일부 구체예들에서, 상기 제제는 ER과 MED1 간의 물리적 상호작용 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 그 이상으로 축소시킨다. 일부 구체예들에서, 상기 제제는 ER과 에스트로겐 간의 상호작용을 축소 또는 시킨다. 일부 구체예들에서, 상기 제제는 상기 ER과 에스트로겐의 물리적 상호작용을 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 그 이상으로 축소시킨다. 일부 구체예들에서, 상기 응축물은 돌연변이체 ER 또는 이의 단편을 포함하고, 상기 제제는 한 가지 또는 그 이상의 유전자의 전사를 감소시킨다.
본 명세서의 일부 측면들은 응축물의 형성, 안정성, 또는 형태를 조정하는 제제를 식별해내는 방법에 관한 것으로, 이 방법은 세포를 제공하고, 이 세포에 테스트 제제를 접촉시키고, 그리고 이 테스트 제제와의 접촉으로 응축물의 형성, 안정성, 또는 형태가 조정되는 지를 결정하는 것을 포함하고, 이때 상기 응축물은 에스트로겐 수용체 (ER) 또는 이의 단편, 그리고 MED1 또는 이의 단편을 응축물 성분으로써 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 세포는 상기 응축물을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 제제는 상기 응축물의 형성을 야기한다.
본원에서 기술된 테스트 제제를 식별해내는 방법들의 일부 구체예들에서, 상기 응축물의 형성, 안정성, 또는 형태를 조절하는 제제, (예컨데, 이 제제가 당해 응축물의 형성 또는 안정성을 감소시킨다면)은 치료요법적 후보 제제 (예컨데, 항-암 제제)로 식별된다. 일부 구체예들에서, 상기 제제는 항-ER+ 암 제제 (예컨데, ER+ 유방암 제제, 항-탐옥시펜 저항적 유방암 제제)로 식별된다. 본원에서 기술된 테스트 제제를 식별해내는 방법들의 일부 구체예들에서, 돌연변이체 ER (또는 이의 단편) 및 MED1 (또는 이의 단편)을 포함하는 응축물의 형성 또는 안정성을 감소시키는 제제는 ER+ 암, (예컨데, 탐옥시펜-저항적 ER+ 암)을 치료하는 후보 제제로 식별된다. 본원에서 기술된 테스트 제제를 식별해내는 방법들의 일부 구체예들에서, ER (또는 이의 단편)을 포함하는 응축물의 형성 또는 안정성을 감소시키는 제제는 ER 활성 (예컨데, ER-중재된 전사)의 조절자 후보로 식별된다.
일부 구체예들에서, 상기 에스트로겐 수용체는 돌연변이체 에스트로겐 수용체다. 일부 구체예들에서, 상기 돌연변이체 에스트로겐 수용체(예컨데, Y537S 및 D538G 돌연변이체)는 에스트로겐 결합에 의존적이지 않은 구성적 활성을 보유한다. 일부 구체예들에서, 상기 돌연변이체 에스트로겐 수용체는 융합 단백질이다. 일부 구체예들에서, 상기 융합 단백질 (예컨데, ER-YAP1, ER-PCDH11X)은 에스트로겐 결합에 의존적이지 않은 구성적 활성을 보유한다. 일부 구체예들에서, 상기 에스트로겐 수용체 단편은 리간드 결합 도메인 또는 이의 기능적 단편을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 ER 단편은 2개의 리간드 결합 도메인 또는 기능성 이의 단편들을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 ER 단편은 DNA 결합 도메인을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 MED1 단편은 IDR, LXXLL 모티프, 또는 이 둘 모두를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 ER 또는 MED1은 인간 ER 또는 MED1이다. 일부 구체예들에서, 상기 ER 또는 MED1은 비-인간 포유류 (예컨데, 랫, 마우스, 토끼) ER 또는 MED1이다.
일부 구체예들에서, 상기 응축물은 에스트로겐 또는 이의 기능적 단편과 접촉된다. 일부 구체예들에서, 상기 응축물은 선택적 에스트로겐 선택적 조절자 (SERM)와 접촉된다. 상기 SERM 제한되지 않으며, 당분야의 공지된 또는 본원에서 기술된 임의의 것일 수 있다. 일부 구체예들에서, (예컨데, 본원에서 기술된 바와 같이) 상기 SERM은 탐옥시펜 또는 이의 활성 대사산물이다. 본원에서 기술된 방법들의 일부 구체예들에서, 상기 응축물의 조정으로 표적 유전자 (예컨데, MYC 종양유전자 또는 본원에서 기술된 또는 암 성장 또는 생존력에 관련된 다른 유전자)의 전사가 축소되거나, 또는 제거된다. 일부 구체예들에서, 표적 유전자의 전사 (예컨데, MYC 종양유전자)은 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 그 이상으로 축소된다.
일부 구체예들에서, 상기 세포는 유방암 세포 (예컨데, 본원에서 기술된 바와 같이)이다. 일부 구체예들에서, 상기 세포는 MED1을 과다-발현시킨다 (예컨데, 본원에서 기술된 바와 같이). 일부 구체예들에서, 상기 세포 (예컨데, 탐옥시펜 저항적 ER+ 유방암 세포)는 대조군 세포 (예컨데, 비-탐옥시펜 저항적 ER+ 유방암 세포)와 비교하였을 때, 약 4-배 또는 그 이상의 (예컨데, 약 4-배 내지 4.5-배)의 수준으로 MED1을 과다발현시킨다. 일부 구체예들에서, 상기 세포는 ER+ 유방암 세포다. 일부 구체예들에서, 상기 ER+ 유방암 세포는 탐옥시펜 치료에 저항성이다. 일부 구체예들에서, 상기 응축물은 탐지가능한 라벨을 포함한다. 상기 라벨은 제한되지 않으며, 본원에서 기술된 임의의 라벨일 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 응축물의 성분은 탐지가능한 라벨을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 ER 또는 이의 단편, 및/또는 상기 MED1 또는 이의 단편은 탐지가능한 라벨을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 한 가지 또는 그 이상의 유전자들은 리포터 유전자를 포함한다. 상기 리포터 유전자는 제한되지 않으며, 그리고 본원에서 기술된 임의의 리포터 유전자일 수 있다.
본 발명의 일부 측면들은 응축물의 형성, 안정성, 또는 형태를 조정하는 제제를 식별해내는 방법에 관한 것으로, 이 방법은 시험관내 응축물을 제공하고, 상기 응축물에 테스트 제제를 접촉시키고, 그리고 상기 테스트 제제와의 접촉으로 상기 응축물의 형성, 안정성, 또는 형태가 조정되는 지를 결정하는 것을 포함하고, 이때 상기 응축물은 에스트로겐 수용체 (ER) 또는 이의 단편, 그리고 MED1 또는 이의 단편을 응축물 성분으로 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 에스트로겐 수용체는 돌연변이체 에스트로겐 수용체 (예컨데, 본원에서 기술된 임의의 돌연변이체 에스트로겐 수용체)이다. 일부 구체예들에서, 상기 돌연변이체 에스트로겐 수용체(예컨데, Y537S 및 D538G 돌연변이체)는 에스트로겐 결합에 의존적이지 않은 구성적 활성을 보유한다. 일부 구체예들에서, 상기 돌연변이체 에스트로겐 수용체는 융합 단백질이다. 일부 구체예들에서, 상기 융합 단백질 (예컨데, ER-YAP1, ER-PCDH11X)은 에스트로겐 결합에 의존적이지 않은 구성적 활성을 보유한다. 일부 구체예들에서, 상기 에스트로겐 수용체 단편은 리간드 결합 도메인 또는 이의 기능적 단편을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 MED1 단편은 IDR, LXXLL 모티프, 또는 이 둘 모두를 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 응축물은 에스트로겐 또는 이의 기능적 단편에 접촉된다 (예컨데, 상기 에스트로겐 또는 이의 단편은 상기 응축물과 물리적으로 연합되거나, 또는 상기 응축물을 포함하는 용액 안에 있다). 일부 구체예들에서, 상기 응축물은 선택적 에스트로겐 선택적 조절자 (SERM)과 접촉된다 (예컨데, 상기 SERM은 상기 응축물과 물리적으로 연합되거나, 또는 상기 응축물을 포함하는 용액 안에 있다). 일부 구체예들에서, 상기 SERM은 탐옥시펜 또는 이의 활성 대사산물 (4-히드록시탐옥시펜 및/또는 N-데스메틸-4-히드록시탐옥시펜)이다.
일부 구체예들에서, 상기 응축물은 세포로부터 단리된다. 상기 응축물이 단리되는 세포는 임의의 적합한 세포다. 일부 구체예들에서, 상기 세포는 유방암 세포 (예컨데, 환자로부터 단리된 유방암 세포, 세포 계통 (예컨데, 600MPE, AU565, BT-20, BT-474, BT483, BT-549, Evsa-T, Hs578T, MCF-7, MDA-MB-231, SkBr3, T-47D))으로 부터의 유방암 세포다. 일부 구체예들에서, 상기 세포는 MED1 및 에스트로겐 수용체 (예컨데 인간 MED1 및/또는 에스트로겐 수용체)를 발현시키는 유전자삽입 세포다. 일부 구체예들에서, 상기 세포는 MED1, 또는 이의 기능적 단편, 그리고 에스트로겐 수용체 (예컨데, 돌연변이체 에스트로겐 수용체) 또는 이의 기능적 단편 (예컨데 인간 MED1 및/또는 에스트로겐 수용체)을 발현시키는 유전자삽입 세포다.
일부 구체예들에서, 상기 응축물은 탐지가능한 라벨을 포함한다. 상기 탐지가능한 라벨은 제한되지 않으며, 본원에서 기술된 또는 당분야의 공지된 임의의 라벨일 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 응축물의 성분은 탐지가능한 라벨을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 ER 또는 이의 단편, 및/또는 상기 MED1 또는 이의 단편은 탐지가능한 라벨을 포함한다.
본 명세서의 일부 측면들은 에스트로겐 수용체 (ER) 또는 이의 단편, 그리고 MED1 또는 이의 단편을 응축물 성분으로 포함하는 단리된 합성 전사 응축물에 관한 것이다. 일부 구체예들에서, 상기 에스트로겐 수용체는 돌연변이체 에스트로겐 수용체다. 일부 구체예들에서, 상기 돌연변이체 에스트로겐 수용체는 에스트로겐 결합에 의존적이지 않은 구성적 활성을 보유한다. 일부 구체예들에서, 상기 에스트로겐 수용체 단편은 리간드 결합 도메인 또는 이의 기능적 단편을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 MED1 단편은 IDR, LXXLL 모티프, 또는 이 둘 모두를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 응축물은 에스트로겐 또는 이의 기능적 단편을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 응축물은 선택적 에스트로겐 선택적 조절자 (SERM)를 포함한다.
조성물
본 발명의 일부 측면들은 본원에서 개시된 방법들에 의해 식별된 제제를 포함하는 조성물에 관계한다. 일부 구체예들에서, 상기 조성물은 약제학적 조성물이다.
상기 제제는 약제학적으로 수용가능한 용액으로 투여될 수 있으며, 이 용액은 일반적으로 약제학적으로 수용가능한 농도의 염, 완충제, 보존제, 양립가능한 담체, 어쥬번트(adjuvants), 그리고 임의선택적으로 기타 치료요법적 성분들을 함유할 수 있다.
상기 제제는 정제, 캡슐, 분말, 과립, 연고, 용액, 저장고(depositories), 흡입제 및 주사와 같은 고체, 반-고체, 액체 또는 기체 형태의 제제로 제형화될 수 있으며, 경구, 비-경구 또는 외과적 투여를 위한 일반적인 방법으로 제형화될 수 있다. 본 발명에는 또한 임플란트와 같은 국소 투여용으로 제형화된 약제학적 조성물 또한 포괄된다.
경구 투여에 적합한 조성물은 각각 미리-결정된 양의 활성제를 함유하는 캡슐, 정제, 로젠지(lozenges)와 같은 개별 단위로 제공될 수 있다. 다른 조성물은 수성 액체 또는 시럽, 엘릭시르(elixir) 또는 에멀젼과 같은 비-수성 액체의 현탁액을 포함한다.
일부 구체예들에서, 제제는 조직으로 직접 투여될 수 있다. 조직으로 직접 투여는 직접 주사에 의해 이루어질 수 있다. 상기 제제는 1 회 투여될 수 있거나, 또는 대안적으로 이들은 복수의 투여로 투여될 수 있다. 여러 번 투여되는 경우, 펩티드는 다른 경로를 통해 투여될 수 있다. 예를 들면, 첫 번째 (또는 처음 몇 번) 투여는 영향을 받은 조직에 직접적으로 이루어질 수 있는 반면, 이후 투여는 전신적으로 투여될 수 있다.
경구 투여를 위해, 조성물은 제제를 당업계에 잘 공지된 약제학적으로 수용되는 담체와 조합함으로써 용이하게 제형화될 수 있다. 이러한 담체는 치료 대상체가 치료제를 경구 섭취할 수 있도록 정제, 알약, 당의정, 캡슐, 액체, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁액 등으로 제형화될 수 있도록 한다. 융합 단백질을 고체 부형제와 혼합하고, 임의로 생성된 혼합물을 분쇄하고, 과립 혼합물을 가공하고, 필요한 경우 적합한 보조제를 첨가한 후, 정제 또는 당의정 코어를 수득함으로써, 고형 부형제로 수득될 수 있다. 적합한 부형제는 특히, 락토스, 슈크로스, 만니톨 또는 소르비톨을 비롯한 당과 같은 충전제; 셀룰로오스 조제물, 예를 들어, 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분, 감자 전분, 젤라틴, 검 트라가탄, 메틸 셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸셀룰로오스, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오스 및/또는 폴리비닐피롤리돈 (PVP)을 포함한다. 원하는 경우, 붕해제, 예컨대 가교-폴리비닐피롤리돈, 한천 또는 알긴산 또는 이의 염, 이를 테면, 알긴산 나트륨염이 첨가될 수 있다. 임의선택적으로, 경구 제형은 또한 내부 산(acid) 상태를 중화시키기 위해 식염수 또는 완충액으로 제형화될 수 있거나 또는 임의의 담체없이 투여될 수 있다.
당의정 코어에는 적절한 코팅이 제공된다. 이를 위해, 아라비아 검, 활석, 폴리비닐 피롤리돈, 카보폴 겔, 폴리에틸렌 글리콜 및/또는 이산화 티타늄, 래커 용액 및 적합한 유기 용매 또는 용매 혼합물을 임의로 함유할 수 있는 농축된 당 용액이 사용될 수 있다. 식별을 위해 또는 활성 화합물 용량의 다양한 조합을 특성화하기 위해 염료 또는 안료를 정제 또는 당의정 코팅에 첨가할 수 있다.
경구로 이용될 수 있는 약제학적 조제물(preparations)에는 젤라틴으로 만든 푸쉬-핏(push fit) 캡슐, 뿐만 아니라 젤라틴 및 가소제, 이를 테면, 글리세롤 또는 솔비톨로 만든 연질의 밀봉 캡슐이 내포된다. 푸시-핏 캡슐은 락토스와 같은 충전제, 전분과 같은 결합제 및/또는 활석 또는 스테아르산 마그네슘과 같은 윤활제 및 임의선택적으로로 안정화제와 혼합된 활성 성분을 함유할 수 있다. 연질 캡슐에서 상기 활성 화합물은 지방 오일, 액체 파라핀 또는 액체 폴리에틸렌 글리콜과 같은 적합한 액체에 용해되거나 현탁될 수 있다. 추가로, 안정화제가 추가될 수 있다. 경구 투여 용으로 제형화된 미세구(microspheres)도 사용할 수 있다. 이러한 미세구들은 당분야에서 잘 정의되어 있다. 경구 투여를 위한 모든 제형은 그러한 투여에 적합한 투여량(dosages)이어야 한다. 협측(buccal) 투여를 위해, 조성물은 통상적인 방식으로 제형화된 정제 또는 로젠지 형태를 취할 수 있다.
상기 화합물을 전신 전달하는 것이 바람직한 경우, 당해 화합물은 주사, 예를 들어 볼루스(bolus) 주사 또는 연속 주입에 의한 비-경구 투여용으로 제형화될 수 있다. 주사용 제형은 보존제를 첨가한 단위 투여 형태, 예를 들어 앰플 또는 다회-투여량 용기로 제공될 수 있다. 상기 조성물은 유성 또는 수성 비히클 안에 현탁액, 용액 또는 유제와 같은 형태를 취할 수 있으며, 현탁제, 안정화제 및/또는 분산제와 같은 제형화 제제를 함유할 수 있다.
비-경구 투여를 위한 조제물에는 멸균 수성 또는 비 수성 용액, 현탁액 및 에멀젼이 포함된다. 비-수성 용매의 예로는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름 및 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 유기 에스테르이다. 수성 담체에는 물, 알코올성/수성 용액, 에멀젼 또는 현탁액 (식염수 및 완충 매질 포함)이 포함된다. 비-경구 비히클에는 염화나트륨 용액, Ringer 덱스트로스, 덱스트로스 및 염화나트륨, 젖산화된 Ringer 또는 고정된(fixed) 오일 포함된다. 정맥내 비히클은 유체 및 영양 보충제, 전해질 보충제 (예를 들어, Ringer 덱스트로스에 기초한 것) 및 이와 유사한 것을 포함한다. 보존제 및 기타 첨가제, 예를 들어, 항균제, 항산화제, 킬레이트제 및 불활성 기체 그리고 이와 유사한 것과 같은 것들이 또한 존재할 수 있다. 정맥 투여와 같은 다른 형태의 투여 시에는 낮은 용량(doses)이 발생될 것이다. 적용되는 초기 용량에서 대상체의 반응이 불충분한 경우, 환자 내성이 허용하는 범위까지 더 높은 용량 (또는 상이한 더 국소화된 전달 경로에 의해 효과적으로 더 높은 용량)이 사용될 수 있다. 일부 구체예들에서, 화합물의 적절한 전신 수준을 달성하기 위해, 하루에 여러 차례 투여가 고려된다.
본 명세서에 개시된 본 발명의 특정 측면의 특이적 예시들은 하기 실시예들에서 설명된다.
본 발명이 목적을 수행하고, 언급된 목적 및 장점을 얻고, 뿐만 아니라 그에 내재된 목적을 달성하도록 잘 개작되었다는 것을 당업자는 바로 인지할 것이다. 본 명세서의 설명 및 실시예들의 세부 사항은 특정 구체예들을 대표하고, 예시적이며, 그리고 본 발명의 범위를 이에 국한시키는 것으로 의도하는 것은 아니다. 그 안에서의 변형 및 기타 용도는 당업자에게 존재할 수 있다. 이러한 변형들은 본 발명의 사상 내에 포괄된다. 본 발명의 범위 및 사상을 벗어나지 않고, 본 명세서에 개시된 본 발명에 대해 다양한 대안 및 변형이 이루어질 수 있다는 것은 당업자에게 명백할 것이다.
명세서 및 청구 범위에서 본원에 사용된 바와 같은 관사 "a" 및 "an"은 명확하게 반대로 표시되지 않는 한, 복수의 지시 대상을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 하나 이상의 그룹 구성원 사이에 "또는"을 내포하는 청구항 또는 설명은 달리 명시되지 않는 한, 또는 문맥에서 명백하지 않는 경우, 그룹 구성원 중 하나, 하나 이상 또는 모든 구성원이 주어진 산물 또는 프로세스에 존재하거나, 이용되는 것으로 간주된다. 본 발명은 그룹의 정확하게 하나의 구성원이 주어진 산물 또는 프로세스에 존재하거나, 이용되거나, 그렇지 않으면 관련되는 구체예들을 내포한다. 본 발명은 또한 하나 이상의 구성원, 또는 모든 그룹 구성원이 주어진 산물 또는 프로세스에 존재하거나, 이용되거나, 그렇지 않으면 관련된 구체예들을 내포한다. 더욱이, 본 발명은 다른 지시가 없는 한, 또는 모순 또는 불일치가 발생할 것이라는 것이 당업자에게 명백하지 않는 한, 모든 변형, 조합 및 순열을 제공하며, 이때 나열된 청구항 중 하나 또는 그 이상으로부터 동일한 청구항의 종속항인 또다른 항(또는 관련된 임의의 다른 청구항)으로 소개된다. 본 명세서에 설명된 모든 구체예는 적절한 경우 본 발명의 모든 상이한 측면에 적용될 수 있는 것으로 고려된다. 또한, 임의의 구체예 또는 측면들이 적절할 때 마다, 하나 또는 그 이상의 이러한 구체예 또는 측면과 자유롭게 조합 될 수 있다는 것도 고려된다. 요소가 예를 들어, Markush 그룹 또는 유사한 형식으로 목록으로 제시되는 경우, 당해 요소의 각 하위그룹도 또한 공개되고, 임의의 요소(들)이 그룹에서 제거될 수 있음을 이해해야 한다. 일반적으로, 본 발명 또는 본 발명의 측면이 특정 요소, 특징 등을 포함하는 것으로 언급되는 경우, 본 발명의 특정 구체예 또는 본 발명의 측면은 이러한 요소, 특징 등등으로 구성되거나, 본질적으로 구성된다는 것을 이해해야 한다. 단순화를 위해, 이러한 구체예들은 모든 경우에 있어서 본 명세서에서 그렇게 상세하게 구체적으로 설명되지 않았다. 본 발명의 임의의 구체예 또는 측면들은 특정 배제가 명세서에 언급되는지 여부에 관계없이, 청구범위로부터 명시적으로 배제될 수 있음을 또한 이해해야 한다. 예를 들면, 임의의 한 가지 또는 그 이상의 핵산, 폴리펩티드, 세포들, 종 또는 유기체의 유형, 장애, 대상체, 또는 이의 조합이 배제될 수 있다.
청구범위 또는 명세서가 물질의 조성, 예컨데, 핵산, 폴리펩티드, 세포, 또는 비-인간 유전자삽입 동물에 관련된 경우, 명시적으로 언급되지 않거나, 또는 모순 또는 불일치가 발생할 것이라는 것이 당업자에게 명백하지 않는 한, 본원에서 개시된 물질의 조성을 만들거나 또는 이용하는 방법들, 그리고 본원에 개시된 임의의 목적을 위한 물질의 조성을 이용하는 방법들이 본 발명의 측면이라는 것을 이해해야 한다. 청구범위 또는 명세서가 방법과 관련될 경우, 예컨데, 명시적으로 언급되지 않거나, 또는 모순 또는 불일치가 발생할 것이라는 것이 당업자에게 명백하지 않는 한, 상기 방법을 실행하는데 유용한 조성물을 만드는 방법들, 그리고 상기 방법에 따라 만들어진 산물은 본 발명의 측면이다.
본 명세서에서 범위가 주어진 경우, 본 발명에는 끝점이 포함된 구체예, 두 개 끝점이 모두 배제된 구체예 그리고 하나의 끝점은 포함되고 다른 끝점은 배제된 구체예들이 내포된다. 달리 표시되지 않는 한, 두 개 끝점 모두 포함되어 있다고 추정해야 한다. 더욱이, 당업자의 문맥 및 이해로부터 달리 지시되거나 달리 명백하지 않는 한, 범위로 표현되는 값은 본 발명의 상이한 구체예들에서 언급된 범위 내의 임의의 특정 값 또는 하위 범위를 언급된 범위의 하한 단위의 10 분의 1까지 추정할 수 있음을 이해해야 한다. 일련의 수치가 본 명세서에서 언급된 경우, 본 발명은 임의의 중간 값, 또는 일련의 임의의 두 값에 의해 특정된 범위와 유사하게 관련된 구체예들을 포함하고, 가장 낮은 값은 최소값으로 취해질 수 있고, 가장 큰 값은 최대 값으로 간주됨을 또한 이해해야 한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 수치는 백분율로 표현된 값을 포함한다. 숫자 값 앞에 "약(about)" 또는 "대략적으로"로 시작되는 본 발명의 임의의 구체예에 대해, 본 발명에는 정확한 값이 인용된 구체예들이 포함된다. 숫자 값 앞에 "약" 또는 "대략적으로"로 시작되지 않는 본 발명의 임의의 구체예에 대해, 본 발명에는 값 앞에 "약" 또는 "대략적으로"로 시작되는 구체예들이 포함된다. "대략적으로" 또는 "약"이란 달리 명시되지 않거나 또는 문맥상 명백하지 않은 경우, 일반적으로 1% 범위 내에 있는 숫자, 또는 일부 구체예들에서 5% 범위 내, 또는 일부 구체예들에서 당해 수의 10% 범위 내의 (어느 방향으로든, 이 수보다 더 크거나 또는 더 작은)을 포함한다 (해당 숫자가 가능한 값의 100%를 초과하는 것이 허용되지 않는 경우 제외). 반대로 명확하게 지시되지 않는 한, 하나 이상의 행위를 포함하는 본 명세서에서 청구된 임의의 방법에서, 이 방법에서 당해 행위의 순서는 반드시 방법에서 인용된 순서의 행위로 제한되는 것은 아니라는 것을 이해해야 하지만, 그러나 본 발명에서는 순서가 그렇게 국한된 구체예들이 포함된다. 문맥에서 달리 지시되거나 또는 명백하지 않는 한, 본원에 기술된 임의의 산물 또는 조성물은 "단리된" 것으로 간주될 수 있음을 또한 이해해야 한다.
실시예들
실시예 1
전사 제어의 기존 모델의 주요 특징은 기저 조절 상호작용이 사실상 확률적인 생화학적 규칙에 의해 단계적 방식으로 발생한다는 점이다. 이들 모델은 상이한 두 가지 유전자에서 동시발생적 전사 폭발을 야기시키는 슈퍼-인헨서 또는 인헨서의 능력과 관련된 최근 관찰을 설명하기 위하여 요청될 때 제약이 있다. 상-분리된 다중-분자 어셈블리 어셈블리는 세포 안에서 생화학적 반응을 구획화시킬 수 있는 필수적 조절 기전을 제공한다. 상 분리 모델은 슈퍼-인헨서의 형성, 교란에 대한 슈퍼-인헨서의 민감도, 이들의 전사 폭발(bursting) 패턴 그리고 다중 유전자들에서 동시 효과를 만드는 인헨서의 능력을 비롯한 전사 제어의 공지된 특징으로 더 잘 설명한다고 우리는 제안한다. 이 모델은 포유류에서 유전자 제어의 원리를 더 연구하기 위한 개념적 틀을 제공한다.
개요
전사 규제에 대한 최근 연구에 따르면, 지금까지는 정량적 설명이 부족했지만, 더 많은 이해를 통해 발달 및 질병 과정에서 유전자 제어에 대한 새로운 유익한 통찰력을 얻을 수 있을 것으로 보이는 몇 가지 난해한 것들이 관찰되었다. 예를 들면, 비록 수 천 개의 인헨서 요소들이 임의의 주어진 인간 세포 유형에서 수 천 개의 유전자들의 활성을 제어하지만, 수 백 개의 인헨서 클러스터, 소위 슈퍼-인헨서 (SEs)는 세포-유형-특이적 프로세스에서 특별히 눈에 띄게 중요한 역할을 갖는 유전자들을 제어한다 (ENCODE Project Consortium et al., 2012; Hnisz et al., 2013; Loven et al., 2013; Parker et al., 2013; Roadmap Epigenomics et al., 2015; Whyte et al., 2013). 암 세포들은 눈에 띄게 중요한 종양유전자들의 발현을 구동시키는 슈퍼-인헨서를 획득하고, 따라서 SEs는 발생 및 질환 모두에서 주요 역할을 한다 (Chapuy et al., 2013; Loven et al., 2013). 슈퍼-인헨서는 비정상적으로 고-밀도의 상호작용 인자들에 의해 점유되며, 전형적 인헨서 보다는 더 높은 수준의 전사를 구동시킬 수 있으며, 그리고 대부분의 인헨서와 공통적으로 연합된 성분들의 교란에 예외적으로 취약하다 (Chapuy et al., 2013; Hnisz et al., 2013; Loven et al., 2013; Whyte et al., 2013).
최근 연구로부터 부각된 또다른 난해한 관찰은 단일 인헨서가 다중 근위 유전자들을 동시에 활성화시킬 수 있다는 것이다 (Fukaya et al., 2016). 인헨서는 이들이 활성화시키는 유전자들에게 물리적으로 접촉하며, 염색질 접촉 맵핑 기술 (예컨데, β-글로빈 좌에서)을 이용한 초기 연구에서 임의의 주어진 시점에서 인헨서는 당해 좌 안에 몇 개의 글로빈 유전자들중에서 오직 하나만을 활성화시킨다는 것이 밝혀졌다 (Palstra et al., 2003; Tolhuis et al., 2002). 그러나, 높은 시간적(temporal) 해상도에서 정량적 이미징을 사용하는 보다 최근의 연구에서는 인핸서가 일반적으로 유전자 활성을 폭발적으로 활성화시키고, 두 유전자 프로모터는 동일한 인핸서에 의해 활성화될 때 동시발생적으로 폭발함하는 것으로 밝혔졌다(Fukaya et al., 2016).
전사 제어의 기존 모델들은 유전자 규제 원리에 중요한 식견을 제공하였다. 기존 대부분의 전사 제어 모델의 주요 특징은 기저 조절 상호작용이 사실상 확률적인 생화학적 규칙에 의해 단계적 방식으로 발생한다는 점이다(Chen and Larson, 2016; Elowitz et al., 2002; Levine et al., 2014; Orphanides and Reinberg, 2002; Raser 및 O'Shea, 2004; Spitz and Furlong, 2012; Suter et al., 2011; Zoller et al., 2015). 이러한 운동 모델은 단일 유전자 수준에서 유전자 활성화는 확률적, 노이지(noisy) 프로세스임을 예측하고, 다-단계 조절 프로세스가 어떻게 본질적 노이즈를 억합할 수 있는지, 그리고 폭발(bursting)로 이어지는 지에 대한 식견을 또한 제공한다. 이들 모델은 SEs의 형성, 기능, 그리고 성질들의 기저 기전을 밝히지 않거나, 또는 이를 테면, 두 유전자 프로모터가 동일한 인헨서에 의해 활성화될 때, 어떻게 동시발생적 폭발(bursting)을 나타내는 지에 대한 수수께기에 대해서는 답을 하지 못한다.
위에서 설명한 수수께끼를 설명할 수 있는 모델을 제안하고 탐색한다. 이 모델은 다중-분자 어셈블리의 상 분리와 관련된 원리를 기반으로 한다.
전사 제어에서 협력성(co-operativity)
30여년전, 인헨서가 발견된 이래로 인핸서의 기능적 특성을 정량적으로 설명하려는 연구가 진행되었으며, 이러한 노력은 대부분 인핸서 구성 요소 간의 협력적 상호 작용 개념에 매달려왔다. 전통적으로, 인헨서란 프로모터의 상류 또는 하류중 임의의 방향의 다양한 거리에서 삽입될 때, 표적 유전자 프로모터로부터 전사를 증가시킬 수 있는 요소로 정의되었다 (Banerji et al., 1981; Benoist and Chambon, 1981; Gruss et al., 1981). 인헨서는 전형적으로 DNA의 수 백개 염기-쌍으로 구성되며, 협력적 방식으로 다중 전사 인자 (TF) 분자들에 의해 결합된다 (Bulger 및 Groudine, 2011; Levine et al., 2014; Malik and Roeder, 2010; Ong and Corces, 2011; Spitz and Furlong, 2012). 전통적으로, 협력적 결합은 하나의 TF 분자가 DNA에 결합함으로써 또다른 TF 분자의 결합에 영향을 주는 현상을 말한다 (도 3A) (Carey, 1998; Kim and Maniatis, 1997; Thanos and Maniatis, 1995; Tjian and Maniatis, 1994). DNA 벤딩(bending) (Falvo et al., 1995), TFs 간의 상호작용 (Johnson et al., 1979) 그리고 TFs에 의한 큰 공동인자 복합체의 복합적 보충(Merika et al., 1998)에 있어서 TFs의 효과로 인하여 인헨서에서 전사 인자들의 협력적 결합이 제안되었었다.
슈퍼-인헨서는 매우 협력적 성질들을 나타낸다
수 백 개의 인헨서 클러스터, 소위 슈퍼-인헨서 (SEs)는 세포-유형-특이적 프로세스에서 특별히 눈에 띄게 중요한 역할을 갖는 유전자들을 제어한다(Hnisz et al., 2013; Whyte et al., 2013). SEs의 세 가지 주요 특징은 협력적 속성이 이들의 형성과 기능에 특히 중요하다는 것을 나타낸다: 1) SEs는 비정상적으로 고-밀도의 상호작용 인자들에 의해 점유되고; 2) SEs는 단일 핵형성(nucleation) 사건에 의해 형성될 수 있고; 그리고 3) SEs는 대부분의 인헨서와 공통적으로 연합된 일부 성분들 (즉, 슈퍼-인헨서 성분들)의 교란에 예외적으로 취약하다.
SEs는 전사 인자들, 공동-인자들, 염색질 조절제들, RNA 중합효소 II, 그리고 넌-코딩 RNA를 비롯한 비정상적으로 고-밀도의 상호작용 인자들에 의해 점유된다 (Hnisz et al., 2013). SEs 안에 전사 인자 결합 부위들에서 발산적 전사에 의해 만들어진 넌-코딩 RNA (인헨서 RNA 또는 eRNA)(Hah et al., 2015; Sigova et al., 2013)는 인헨서 활성에 기여하고, 주변 유전자를 시스(cis)로 발현시킬 수 있다(Dimitrova et al., 2014; Engreitz et al., 2016; Lai et al., 2013; Pefanis et al., 2015). SEs에서 단백질 인자들 및 eRNAs의 밀도는 게놈 상의 전형적 인헨서에서 동일한 성분들 세포의 밀도에 대략적으로 10-배의 밀도로 추정되었다 (도 3B) (Hnisz et al., 2013; Loven et al., 2013; Whyte et al., 2013). 염색질 접촉 맵핑 방법들에서 SEs 안의 인헨서 클러스터는 서로, 그리고 이들이 활성화시키는 유전자의 프로모터 영역과 근접하게 물리적으로 접해있다 (도 3C) (Dowen et al., 2014; Hnisz et al., 2016; Ji et al., 2016; Kieffer-Kwon et al., 2013).
추가적인 인자들에 결합하는 잠재력을 보유한 DNA 영역으로 단일 전사 인자 결합 부위를 도입시킨 결과로 SEs가 형성될 수 있다. T 세포 백혈병에서, 작은 (2-12bp) 단일-대립 유전자 삽입은 마스터 전사 인자 MYB에 대한 결합 부위를 생성함으로써 전체 SE의 형성을 핵화하고, 이는 인접한 결합 부위에 대한 추가 전사 조절제들을 동원시키고, 8kb 도메인에 걸쳐 펼쳐있는 다수의 인자들 어셈블리는 SE의 전형적인 특징이다(Mansour et al., 2014). 염증성 자극은에서 SEs의 신속한 형성을 또한 유도하고; 여기에서 다시 SE 형성은 염증성 자극에 대한 반응으로 전사 인자의 단일 결합 사건에 의해 분명하게 핵화된다 (Brown et al., 2014).
수만 개의 염기-쌍에 걸친 전체 슈퍼-인헨서는 이들의 공동-인자가 교란될 때, 하나의 단위로 붕괴될 수 있으며, SE 안에 구성적(constituent) 인헨서의 유전적 결손으로 다른 구성 요소의 기능이 제대로 발휘할 수 없게 될 수 있다. 예를 들면, 상기 공동-활성제 BRD4는 SEs에서 아세틸화된 염색질, 전형적 인헨서 및 프로모터에 결합하지만, SEs는 BRD4가 아세틸화된 염색질에 결합을 차단시키는 약물에 훨씬 더 민감하다(Chapuy et al., 2013; Loven et al., 2013). 사이클린-의존적 키나제 CDK7의 저해에 대한 SEs의 유사한 과민성이 다수의 연구에서도 관찰되었다 (Chipumuro et al., 2014; Kwiatkowski et al., 2014; Wang et al., 2015). 이 키나제는 RNA 중합효소 II (RNAPII)에 의한 전사 개시에 매우 중요하며, 이의 반복적 C-말단 도메인 (CTD)을 포스포릴화시킨다 (Larochelle et al., 2012). 더욱이, SEs 안에 구성적 인헨서의 유전적 결손으로 상기 슈퍼-인헨서 안의 기타 구성요소들의 활성이 제대로 기능을 못 할 수 있고 (Hnisz et al., 2015; Jiang et al., 2016; Proudhon et al., 2016; Shin et al., 2016), 그리고 이는 전체 슈퍼-인헨서의 붕괴로 이어질 수 있지만(Mansour et al., 2014), 일부 발생학적으로 규제된 수퍼-인핸서의 경우 구성적 인헨서의 상호-의존성이 덜 명확하다 ((Hay et al., 2016).
요약하면, 몇 가지 증거들로부터 SEs의 형성 및 기능이 많은 구성적 인헨서 및 이들의 결합된 인자들을 공간적으로 더 근접하게 가져오는 협력적 프로세스와 관련있다는 것을 나타낸다. 높은 밀도의 단백질과 핵산 - 그리고 이들 분자들 사이의 협력적 상호 작용 -은 진핵 세포에서 세포체(cellular bodies)라고 하는 막이 없는(membraneless) 소기관(organelles)의 형성과 연루되어 있었다(Banjade et al., 2015; Bergeron-Sandoval et al., 2016; Brangwynne et al., 2009). 아래에서, 먼저 세포체 형성의 특징을 우선 설명한 다음, 관련 개념을 활용하는 슈퍼 인헨서 형성 및 기능 모델을 개발한다.
상 분리에 의한 막-없는 소기관(organelles)의 형성
진핵 세포들은 세포 안에서 필수적인 생화학적 반응을 구획화하는데 필수적인 역할을 하는 막이 없는 소기관, 소위 세포체를 함유한다. 이들 세포체는 다가(multivalent) 분자 간의 협력적 상호작용에 의해 중개된 상 분리에 의해 형성된다(Banjade et al., 2015; Bergeron-Sandoval et al., 2016; Brangwynne et al., 2009). 핵 안에 이러한 소기관의 예로는 rRNA 생물발생 부위인 핵소체(nucleoli); 소핵 RNPs의 어셈블리 부위로 작용하는 Cajal 바디(bodies); 그리고 mRNA 스플라이싱 인자들의 저장 구획인 핵 반점이 포함된다 (Mao et al., 2011; Zhu and Brangwynne, 2015). 이들 소기관은 액체 소적의 특성을 나타내는데; 예를 들어, 그들은 분열과 융합을 겪을 수 있으며, 따라서 이들의 형성은 액체-액체 상 분리에 의해 중재되는 것으로 설명되었다. 정제된 RNA 및 RNA-결합 단백질들의 혼합물은 시험관내에서 이러한 유형의 상-분리된 바디(bodies)를 형성한다(Berry et al., 2015; Feric et al., 2016; Kato et al., 2012; Kwon et al., 2013; Li et al., 2012; Wheeler et al., 2016). 이러한 관찰과 일치하게, 과거의 이론적 연구에 따르면 겔 형성에는 일반적으로 상 분리가 수반된다 (Semenov and Rubinstein, 1998)). 따라서, 많은 연구에 따르면, 단백질과 핵산의 고밀도-그리고 이들 분자들 사이의 협력적 상호 작용-은 상 분리된 세포체의 형성과 연루되어 있다.
상기에서 기술된 바와 같이, 슈퍼-인헨서는 전사 인자들, 전사 공동-인자들, 염색질 조절제들, 넌-코딩 RNA 및 RNA 중합효소 II (RNAPII)의 고-밀도 협력적 어셈블리로 기본적으로 간주될 수 있다. 더욱이, 낮은 복잡성 도메인을 가진 일부 전사 인자는 시험관 내에서 젤-유사 구조를 만드는 것으로 제안되었다 (Han et al., 2012; Kato et al., 2012; Kwon et al., 2013). 따라서, 상 분리된 다중-분자 어셈블리의 형성과 함께 상-분리가 SE의 형성 중에 발생할 가능성이 높고, 일반적인 인핸서에서는 발생 빈도가 적다고 우리는 가설을 세웠다(도 4A).
우리는 SE 어셈블리 및 기능에 있어서 상 분리의 역할을 탐구하기 위해, 상호 작용하는 구성요소들의 수와 결합가, 이러한 전사 조절제들과 핵산 간의 상호 작용 친화도의 맥락에서 협력성을 강조하는 간단한 모델을 제안한다. 이 모델의 컴퓨터 시뮬레이션에서 상 분리가 SEs의 형성, 기능 및 취약성의 측면을 비롯하여 이의 중요한 기능을 설명할 수 있음을 보여준다. 상기 시뮬레이션은 약한 인헨서와 강한 인헨서에 의해 구동되는 전사 폭발 패턴과 공유된 단일 인헨서에 의해 제어된 유전자들의 동시 폭발 간의 의 관찰된 차이와 또한 일치된다. 우리는 척추 동물에서 전사 제어의 이러한 개념에 대한 추가 탐색을 유도할 수 있는 상 분리 모델의 몇 가지 암시 및 예측에 주목하여 결론을 내린다.
인헨서 어셈블리 및 기능의 상 분리 모델
인헨서 및 SEs에 결합된 많은 분자, 이를 테면, 전사 인자들, 전사 공동-활성제들 (예컨데, BRD4), RNAPII 및 RNA는 다중 부위에서 가역적 화학적 변형 (예컨데, 아세틸화, 포스포릴화)을 겪을 수 있다. 이러한 변형 상에서, 이들 다가(multivalent) 분자들은 다중 기타 성분들과 상호작용할 수 있고, 따라서 "가교(cross-links)"를 형성한다(도 4A). 여기에서, 가교는 역동적 결합 및 결합안된 상호작용과 연루된 임의의 다른 특징을 비롯한, 임의의 가역적 특징으로 정의될 수 있다. 상 분리가 전사 제어의 특정 관찰된 기능의 기초가 될 수 있는지 여부를 고려할 때, 생물학자들이 측정하는 매개변수인 상호 작용하는 분자의 결합가 및 친화력 변화에 대한 상 분리의 의존성을 설명하기 위해 간단한 모델이 필요하다. 아래에서는 이러한 모델을 설명하고, 이 모델의 매개 변수가 일반적인 인헨서 및 수퍼-인헨서의 특성을 나타내는 방법을 기술한다.
이 모델에서 인헨서들의 단백질 및 핵산 구성 요소들은 쇄-모양의 분자로 표현되며, 각 분자에는 다른 쇄들과 잠재적으로 상호 작용으로 연결될 수 있는 일련의 잔기 세트가 함유되어 있다 (도 4B). 이들 잔기는 가역적 화학적 변형을 겪을 수 있는 부위로 제시되며, 그리고 당해 잔기들의 변형은 상기 쇄 간의 비-공유 가교 상호작용을 형성하는 이들의 능력과 연합된다 (도 4B). 전사 인자들, 공동-인자들, 그리고 RNA 중합효소 II의 C-말단 도메인(CTD)의 헵타펩티드 반복부를 비롯한 다수의 인헨서-성분들은 포스포릴화를 겪고, 그리고 이들의 포스포릴화 상태에 기반하여 다른 단백질들에 결합하는 것으로 알려져 있다 (Phatnani 및 Greenleaf, 2006). 우리 모델에는 결합 상호작용 결합이 이루어지고, 뿐만 아니라 인헨서 및 전사 조절제들에서 발현되는 아세틸화, 메틸화 또는 기타 유형의 화학적 변형에 의해 조절되는 히스톤과 다른 단백질들의 상호작용을 이루는 이러한 포스포릴화 또는 탈-포스포릴화가 포괄된다. 단순화를 위해, 모든 유형의 화학적 변형 및 탈-변형은 "변형자"와 "탈변형자"에 의해 차례로 중재되는 일반적으로 "변형"과 "탈변형"으로 지칭한다.
가장 단순한 형태의 모델에는 세 가지 매개변수가 있다: 1) "N" = 시스템에서 거대분자(또는 "쇄"라고도 함)의 수; 이 매개변수는 상호 작용하는 성분들의 농도를 설정한다- N 값이 클수록 농도는 커진다- SE는 N 값이 더 큰 것으로 간주되는 반면, 일반적인 인헨서는 더 적은 성분을 갖는 것으로 모델링된다. 2) "f" = 결합가, 각 분자에 있어서 잠재적으로 변형되어, 다른 쇄들과의 가교에 연결될 수 있는 잔기의 수에 대응한다. 단순화된 모델에서는 당해 잔기가 다른 쇄와의 가교를 생성할 수 있도록 잔기의 변형이 필요하다. 개념적으로, 상기 모델은 가교-형성을 허용하거나 또는 저해하는 효소 활동이 역전되는 것을 제외하고는 가교-형성에 잔기의 탈변형된 상태가 필요한 경우 유사한 방식으로 작동한다. 3) Keq = (kon/koff) 평형 상수, 상기 가교 반응 또는 상호작용을 설명하는 결합(on)-속도 또는 해리(off)-속도로 정의된다 (도 4B).
쇄 길이가 길고 분자 내 가교 또는 동일한 쇄 간의 다중 결합을 허용하지 않는 것과 같은 몇 가지 가정을 통해, 이 모델의 평형 특성을 분석적으로 얻을 수 있다(Cohen and Benedek, 1982; Semenov and Rubinstein, 1998). 상기 상호작용 쇄의 임계 농도(C*) 이상에서 상 분리가 일어나고, 다중-분자 어셈블리가 만들어진다. 이러한 조건 하에서, C*는 1/Keq f 2로 가변한다. 따라서, 상기 어셈블리 형성에 대한 임계(critical) 농도는 결합가에 민감하게 의존적이며, 상기 결합 상수에는 덜 의존적이다.
우리는 상기 모델의 컴퓨터 시뮬레이션 (위에서 언급한 평형 이론의 일부 가정을 완화)을 수행하여, 평형이 아닌, 이의 동적 속성을 탐구했다. 상기 모델의 동적 컴퓨터 시뮬레이션에서 결합가는 잔기가 변형 및 탈-변형에 따라, 0과 "f"사이에서 변화되고, 변형 및 탈-변형 반응 속도는 우리 연구에서 가변적이지 않다. 이 시스템에서 변형자 대비 탈변형자 비율 (예컨데, 키나아제 대비 포스파타제 비율)은 변형되고, 가교-연결될 수 있으며, 우리 연구에서 가변적일 수 있는 각 구성 요소의 부위(sites) 수를 결정한다.
이 모델은 고정된 용적에서 인헨서 또는 SE의 다양한 구성 요소가 집중되는 영역을 나타내는 N 쇄로 시뮬레이션되었다. 우리는 다양한 N 값을 고려했다. 시뮬레이션 동안, 쇄들은 운동 상수, 
를 사용하여 변형 및 탈변형을 수행할 수 있고, 이들 변형자 및 탈변형자 수준 (
)은 가변적이다. 가교 형성 및 해리는 운동 상수, 
및 
로 시뮬레이션된다. 상이한 쇄에서 오직 변형된 잔기만 가교가 허용되었으며, 쇄-내(intra-chain) 가교 반응은 허용되지 않지만, 두 쇄 간에 다중 결합이 형성될 수 있다. 상기 시뮬레이션은 모든 쇄의 모든 부위가 다른 쇄의 다른 모든 부위들과 가교 허용되는 한계에서 수행되었고 (Cohen and Benedek, 1982; Semenov and Rubinstein, 1998) - 즉, 상호 작용하는 부위들의 평균 농도가 있는 동안 (N과 변형된 부위들의 수로 결정됨) 시뮬레이션 용적 안에서 국소 농도의 변화는 고려되지 않는다.
상기 시뮬레이션은 Gillespie 알고리즘 (Gillespie, 1977)을 이용하여 실행되었으며, 이로써 고려된 동적 프로세스 (즉, 변형 및 가교 반응)의 시간적 변화에 대한 확률적 궤적(trajectories)을 만든다. 임의의 단일 궤적은 다양한 크기의 클러스터 사이에 분산되는 방식을 포함한, 상호작용하는 쇄들의 상태를 시간-변화(time-evolution)를 설명한다. 모든 궤적은 탈변형된, 비-가교 쇄로 초기화된다 - 즉, 각 쇄는 "별도의 클러스터(separate cluster)"로 있다. 시뮬레이션 은 시스템의 속성 (예컨데, 평균 클러스터 크기)이 시간-불변인 항정(steady) 상태에 도달할 때까지 실행된다. 원하는 경우, 통계적으로 평균화된 성질들을 얻기 위해 모든 계산에 대해 다중 궤적 (50회 반복)이 수행된다.
이 시뮬레이션에서 전사 활동 (TA)에 대한 프록시는 가교된 쇄의 최대 클러스터의 크기로 정의되며, 쇄의 총 수에 의해 등급화된다 [TA=(클러스터최대의 수) / N]. 시스템의 모든 쇄는 단일 가교된 클러스터 (TA
1)를 형성할 때, 상기 상-분리 어셈블리가 생성된다. 이 어셈블리는 상기 인헨서/SE에서 그리고 프로모터에서 인자들의 결합을 포괄하는 것으로 간주되는데, 이것은 유전자의 강화된 전사에 중요한 성분들의 농도로 이어진다. 시간에 대한 함수로써 상기 인헨서 및 SEs에 의해 생성된 전사 활성을 기록하였다.
결합가의 변화로 전사 규제
결합가의 함수로써 전사 활성을 모델링함으로써 SEs 형성은 전형적 인헨서의 형성보다 더 확연한 협력성이 관련된다는 것이 드러났다 (도 4C). 이들 시뮬레이션에서, SEs는 N=50개 분자로 구성된 시스템으로 모델화되었고, 그리고 전형적 인헨서는 N=10개 분자로 구성된 시스템으로 모델화되어, 이들 요소들에서 성분 밀도의 1 차이 크기와 일치한다 (Hnisz et al., 2013). 그런 다음, 다른 모든 매개변수가 일정하게 유지되는 동안, 다른 결합가에 대한 전사 활성 (TA)을 그래프로 표시나타냈다. SE는 정상화된 결합가 값 2 (즉, f = 3의 기준 값의 두 배)에서 최대 전사 활성의 ~ 90%에 도달한 반면, 전형적인 인핸서의 경우 최대 전사 활성의 90%는 정상화된 결합가 값 5에서 달성된다. 정상화된 결합가 2에서, 전형적 인헨서는 최대 전사 활성의 ~40%에 이른다(도 4C). 이러한 결과는 동일한 조건에서 더 많은 수의 구성 요소로 구성된 SEs가 더 적은 수의 구성 요소로 구성된 전형적인 인핸서보다 낮은 수준의 결합에서 더 크게 연결된 클러스터를 형성함(즉, 상 분리를 겪음)을 시사한다. 더욱이, 우리는 SEs에 대해 정상화된 결합가 값 ~ 1.5에서 전사 활성의 급격한 증가를 관찰한 반면, 결합가의 증가는 기존 고려 사항과 일관되게 (도 3A), 전형적인 인헨서 (도 4C)에 대한 전사 활성의 보다 더 적당하고, 완만한 증가로 이어진다(Loven et al., 2013).
강화된 협력성으로 인해 상호 작용하는 구성 요소들 (즉, 슈퍼-인헨서 구성 요소)의 결합가의 변화 시, SEs의 전사 활성의 더 급격한 변화는 Hill 계수로 정량화할 수 있다. SEs의 거동은 더 큰 값의 Hill 계수로 특징화되며, 이것은 결합가 변화에 대한 더 큰 협력성과 초-민감성을 나타낸다 (도 4C). 실제로, 도 4C의 삽입도에서 알 수 있듯이, Hill 계수는 더 넓은 범위의 N 값에 걸쳐 인헨서에 포함된 구성 요소의 수가 ~ N0.4로써 인헨서에 관련된 성분의 수로 증가된다. 또한, 예상된 바와 같이, 전형적인 인헨서와 SEs 간의 전사 활성의 차이는 이들의 모델링에 사용된 "N" 값의 차이와 상관 관계가 있고; N에서 충분히 큰 차이가 있는 경우, 도 4C에 보고된 거동으로 요약된다 (도 8).
슈퍼-인헨서 형성 및 취약성
상 분리 모델의 이러한 예측은 기존 발표된 실험 데이터와 질적으로 일치한다. 예를 들면, TNFα에 의한 내피 세포의 자극은 염증 유전자에서 SEs의 형성을 유도한다 (Brown et al., 2014). 이 명세서에서 SE 형성은 SEs와 전형적인 인헨서의 핵심 구성 요소인 전사 공동-인자 BRD4의 게놈 점유로 모니터링되었다. 이 세포의 염증 자극은 다른 유전자의 전형적인 인헨서와 비교하여, 염증 유전자의 SEs에서 BRD4의 더 확연한 동원을 초래했다(Brown et al., 2014). 우리의 상 분리 모델에서 TNFα에 의한 자극이 상호작용하는 구성 요소들의 결합가를 변화시키는 변형을 가져 왔고, SEs의 경우 상 분리가 전형적인 인헨서에 비해 낮은 결합가 값 이상에서 급격히 발생하고, 따라서 BRD4와 같은 상호작용하는 구성 요소의 동원이 향상되었기 때문임을 시사한다 (도 4C).
그 다음, 우리는 상 분리 모델이 공통적인 전사 공동-인자들의 저해제에 의한 섭동에 있어서 SEs의 비정상적인 취약성을 설명하는지 여부를 조사했다. BRD4 및 CDK7은 전형적 인헨서 및 SEs 모두의 성분이지만, SEs 및 이들의 연합된 유전자들은 BRD4 및 CDK7의 화학적 저해에 대하여 전형적 인헨서보다 훨씬 더 민감하다 (도 5A) (Chipumuro et al., 2014; Christensen et al., 2014; Kwiatkowski et al., 2014; Loven et al., 2013). 우리 시스템에서 탈변형자/변형자 활성 비율을 변화시킴으로써, 상호작용 분자 안에 변형 부위들의 균형을 변위시키는 결합가 감소에 있어서 BRD4 및 CDK7 저해제 효과를 모델링하였다. 이것은 CDK7는 변형자로써 작용하는 키나제이며, 그리고 BRD4는 많은 성분들과 상호작용할 수 있는 큰 결합가를 가지고 있고, 그래서 BRD4를 저해함으로써 상기 상호작용 성분들의 평균 결합가를 불균형적으로 감소시키기 때문이다. 도 5B에 나타낸 바와 같이, SEs (N=50)는 더 낮은 탈변형자/변형자 비율에서 이들의 활성을 전형적 인헨서 보다 더 많이 상실한다 (N=10). 이러한 결과는 상 분리가 주요 변수가 임계 값을 초과할 때, 갑자기 발생하는 협려적 현상이기 때문에, SE 활성이 결합가의 변화에 매우 민감하다는 개념과 일치한다.
전사 폭발(bursting)
진핵 생물의 유전자 발현은 일반적으로 전사 폭발로 구성된 단편적인 사건으로써, 우리는 상 분리 모델이 전사 폭발을 예측할 수 있는지 여부를 조사했다. 살아있는 세포들에서 전사 폭발의 정량적 이미징을 이용한 최근 연구에서 인헨서에 의해 구동된 유전자 발현 수준은 전사 폭발 빈도와 관련됨이 암시되었다 (Fukaya et al., 2016). 강력한 인헨서는 약한 인헨서보다 더 높은 빈도의 폭발을 유도하는 것으로 밝혀졌으며, 특정 수준 이상의 강도 이상에서는 이러한 폭발 더 이상 바뀌지 않고, 따라서 상대적으로 일정하게 높은 전사 활성을 나타냈다. (도 6A). SEs는 강한 인핸서에 의해 나타나는 낮은 변동 (비교적 일정하게 높은 전사 활성 주변) 폭발 패턴과 고-빈도로 정리되며, 한편으로 전형적인 인헨서는 더 낮은 빈도의, 더 다양한 폭발을 나타낸다는 것을 상 분리 모델에서 보여준다 (도 6B). 지속적인 상 분리가 발생하면 (TA 포화), 변동이 소멸되고, SEs에 대한 TA에서 변동은 더 낮아진다. 폭발 패턴의 이러한 차이는 우리가 얻은 결과를 파워 스펙트럼(power spectrum)으로 해독함으로써 정량화될 수 있다. SEs보다 성분 (N)이 더 적음에도 불구하고, 강력한 인핸서는 더 높은 결합가 가교로 인해 일반적인 인헨서보다 더 쉽게, 안정적으로 상 분리된 다중-분자 어셈블리를 형성할 것으로 우리는 예상한다. 따라서, 우리 모델의 예측은 SE와 같은 강한 인헨서는 약한 또는 전형적 인헨서와 비교하였을 때, 상이한 전사 폭발 패턴을 나타내어야 한다는 것이다.
상기 상 분리 모델은 두 개 프로모터가 동일한 인헨서에 의해 활성화될 때, 동시발생족 폭발을 나타낼 수 있다는 아주 흥미로운 관찰과 또한 일관되며 (Fukaya et al., 2016); 이 경우 상기 상-분리된 어셈블리는 이 인헨서와 양쪽 프로모터 모두에 통합된다(도 6C).
생체내 상-분리된 어셈블리를 형성하는 후보 전사 조절제
우리의 단순화된 모델에서, 상 분리는 상호작용하는 성분들 (즉, 슈퍼-인핸서 성분들)의 잔기가 변형되어 (또는 결합가), 분자-간 상호작용을 일으키는 정도의 변화에 의해 중재된다. 그러나, 실제로 인헨서는 이러한 상호작용을 설명할 수 있는 다양한 인자들로 구성되며, 이들 대부분은 화학적 가역적 변형을 겪는다 (도 7). 이들 성분에는 전사 인자들, 전사 공동-활성제들, 이를 테면, 상기 Mediator 복합체 및 BRD4, 염색질 조절제들 (예컨데, 히스톤 변형의 판독자(readers), 기록자(writers) 및 제거자(erasers)), 사이클린-의존적 키나제 (예컨데 CDK7, CDK8, CDK9, CDK12), RNA-결합 단백질들 및 RNA 중합효소 II와 함께 넌-코딩 RNAs가 내포된다 (Lai and Shiekhattar, 2014; Lee and Young, 2013; Levine et al., 2014; Malik and Roeder, 2010). 이들 분자중 많은 것들은 다가(multivalent)이며, 즉, 다중 모듈 도메인 또는 상호작용 모티프을 함유하고, 따라서 다중 다른 인헨서 성분들과 상호작용할 수 있다. 예를 들면, RNA 중합효소 II의 큰 하위 단위에는 인간 세포들에서 이의 C-말단 도메인(CTD)에 펩타펩티드의 52개 반복부가 함유되어 있고, 그리고 몇 가지 전사 인자들은 중합화되는 경향이 있는 동일한 아미노산 스트레취 반복부 또는 낮은-복합성 도메인 반복부를 함유한다(Gemayel et al., 2015; Kwon et al., 2013). 인헨서 및 많은 프로모터의 상기 DNA 부분은 다중 전사 인자들을 위한 결합 부위들을 함유하며, 이중 일부는 DNA와 RNA 모두에 동시 결합할 수 있다 (Sigova et al., 2015). 인헨서에서 히스톤 단백질들은 염색질 판독자에 의해 인지될 수 있는 변형을 위해 농축되며, 그리고 따라서 이웃 뉴클레오좀은 다중 염색질 판독자와 상호작용할 수 있는 플랫폼(platform)으로 간주될 수 있다. RNA 자체가 화학적으로 변형될 수 있고, 다중 RNA-결합 분자 및 스플라이싱 인자들과 물리적으로 상호작용할 수 있다. 이러한 상호작용에 연루된 잔기중 많은 것들이 "가교"를 만들어낸다 (도 7).
상기 상 분리 모델의 가능한 암시 및 예측
우리의 단순 상 분리 모델은 발생 및 질환에서 유전자 제거의 원칙을 더 조사하기 위한 개념적 틀을 제공한다. 아래에서는 전사 제어에서 상 분리된 다중-분자 복합체의 어셈블리와 이 모델의 일부 테스트 가능한 예측과 아마도 관련될 것 같은 현상의 몇 가지 예를 설명한다.
전사 조절제들의 상 분리된 다중-분자 어셈블리의 가시화
모델의 중요한 테스트는 전사 조절제의 다중-분자 어셈블리의 상 분리가 생체 내에서 직접 관찰될 수 있는지 여부이며, 이러한 복합체의 상 분리가 유전자 활성과 관련되어 있음을 입증한다. 최근 몇 가지 계통의 작업은 이러한 질문에 대한 초기 통찰력을 제공한다. 예를 들면, 고해상도 현미경을 사용한 최근 연구에 따르면 신호 자극은 살아있는 살아있는 포유류 세포에서 RNA 중합 효소 II의 큰 클러스터를 형성을 유도하고(Cisse et al., 2013), 유전자 하위집합에서 전사의 협화적(concordant) 활성화를 유도한다는 것을 보여주었다(Cho et al., 2016). 이러한 기술, 뿐만 아니라 기타 단일 분자 기술 (Chen and Larson, 2016; Shin et al., 2017)은 따라서 상 분리된 다중-분자 복합체가 SEs에 의해 조절되는 유전자 근처에서 형성되는지 여부, 여기에서 설명하는 단순 모델이 전사 제어의 특징을 예측하는지 여부를 가시화하고 테스트할 수 있다. 예로써, 52개 헵타펩티드 반복부로 구성된 RNAPII C-말단 도메인은 이 어셈블리 안에 결합가에 대한 주요 원인제공자이며, 절두된 CTD를 갖는 RNAPII를 발현시키는 세포들에서 상기 클러스터들은 유의적으로 더 낮은 반감기를 나타낼 것이라고 가설을 세웠다.
신호-의존적 유전자 대조군
세포는 유전자로 정보를 내보내는 신호 전달 경로를 통해 이들의 환경을 감지 및 이에 반응하지만, 특정 신호 경로에 반응하는 유전자는 동일한 신호에 대해 상이한 진폭의 활성화를 나타낼 수 있다. 일단 상 분리가 발생하면, 어셈블리가 탈-변형자인 구성 요소를 동원한다는 가설로 계산을 수행했다. 이러한 조건 하에서, 전형적 인헨서와 비교하여 SEs가 상 분리로의 전이 및 소실(resolution)이 더 명확하다. 흥미롭게도, 이러한 시뮬레이션은 SE 구성 요소의 최대 결합가와 최대 수가 있음을 시사하며, 초과하는 경우 현실적인 시간 척도에서 탈-어셈블리를 허용하지 않는다(도 9). 이것은 이들 분자가 너무 심하게 가교되어, 오랜 기간 동안 준-안정(metastable) 상태를 유지하기 때문이다. 이 모델은 세포의 신호 전달의 병적 과잉 활성화가 정상적인 생리적 조건 하에서 그들을 방해하는 신호에 반응하지 않게 되는(적어도 일시적으로) 발현 프로그램에서 세포를 잠그는 것을 통해 질병의 기저 상태가 될 수 있다는 것을 예측한다. 우리는 이러한 상태가 상호작용 성분의 결합가 또는 수를 증가시킴으로써 인위적으로 유도될 수 있다고 추측한다.
전사 제어의 충실도(fidelity)
동일한 환경 신호 (전사 노이즈라고 함)에 노출된 세포의 등질유전자형(isogenic) 집단 내 유전자 전사 수준의 가변성은 세포 표현형에 심각한 영향을 미칠 수 있다(Raj and van Oudenaarden, 2008). 상기 상 분리 모델은 SEs의 형성과 관련된 높은-협력성으로 인해 결합가 (상기 변형자/탈변형자 비율에 의해 조절됨, 실제로 활성화 캐스케이드를 통해 변환되는 발생적 신호와 유사함)가 명확하게 특정된 임계값을 초과할 때, 전사가 발생함을 나타낸다 (도 4C). 전형적 인헨서에서 더 적은 수의 구성 요소의 경우, 환경적 신호와 함께 전사의 변이는 더 연속적이어서, 잠재적으로 더 넓은 범위의 신호 강도에 걸쳐 "노이즈가 더 많거나" 또는 오류-유발성 전사로 이어진다. 상 분리 점 근처에서 두 개 상(우리 경우 낮은 TA와 강한 TA) 간의 변동이 있다. 우리의 모델은 이러한 변동 (또는 노이즈)이 전형적 인헨서에서 발생하는 광범위한 범위에 비해 SEs의 경우 좁은 범위의 환경 신호로 제한된다는 것을 보여준다 (도 10). 이러한 변동의 정상화된 진폭은 SEs의 경우에도 더 작다. 이러한 결과는 SEs가 진화한 한 가지 이유가 세포 정체성을 유지하는데 필요한 유전자의 상대적으로 오류가 없고, 강력한 전사를 가능하게 하는 것임을 시사한다. 그러나, 질병 상태 (예컨데, 암세포의 SEs)에서 일탈적인 유전자 발현을 유도하기 위해, 각 유전자 제어용으로 특정 분자의 진화를 통하여 중재되는 화학적 특이성이 아닌, 협력을 통한 이러한 형태의 전사 충실도가 선임될 수도 있다.
전사 저해에 대한 저항성
슈퍼-인헨서 성분들, 이를 테면, BRD4의 소 분자 저해제는 현재 클리닉에서 항암 치료제로 테스트되고 있으며, 이때 자주 있는 문제는 표적 치료제에 내성이 있는 종양 세포의 출현이다 (Stathis et al., 2016). 흥미롭게도, 최근 연구에서 BRD4를 저해하는 약물인 JQ1에 대한 저항성은 각종 종양 세포들에서 임의의 유전적 변화 없이 발생한다는 것이 드러났다 (Fong et al., 2015; Rathert et al., 2015; Shu et al., 2016). JQ1은 BRD4와 아세틸화된 히스톤과의 상호작용을 저해하지만, BRD4는 JQ1-저항적 세포에서 이의 과다-포스포릴화로 인하여 슈퍼-인헨서로 여전히 동원된다 (Shu et al., 2016). 이것은 BRD4가 SEs의 높은 결합가 성분이라는 우리 모델의 예측과 일치하며, 아세틸화된 히스톤과의 상호작용 억제 (즉, 결합가의 감소)는 BRD4 자체를 표적으로 하는 키나제 경로의 활성화를 통해 이의 결합가를 증가시킴으로써 보상될 수 있다. 우리 모델에서 슈퍼-인헨서는 높은 Hill 계수, 즉 높은 협력성 (도 4C)을 특징으로 하며, 이는 적절하게 선택된 여러 SE 성분둘의 저해가 종양 세포에서 SE-구동된 종양유전자들의 시너지 효과를 가질 수 있음을 시사한다. 이 예측이 맞다면, BRD4 억제제에 대한 내성은 전사 조절제의 추가 저해제와의 병용 치료를 통해 예방할 수 있다.
결론적 논평
전사 제어의 이러한 상 분리 모델의 본질적 특징은 성분들의 결합가와 수의 변화와 관련하여 상호 작용하는 성분들 간의 협력성을 고려한다는 것이다. 이 단일 개념적 틀은 인자들의 클러스터링, 동적 변화, SEs의 전사 억제제에 대한 과민성 및 동일한 인헨서에 의한 여러 유전자의 동시 활성화와 같은 전사 제어의 최근 관찰된 다양한 특징을 일관되게 설명한다. 세포의 신호전달 경로는 결합가의 변경에 의해 짧은 시간에 걸쳐 전사를 조절할 수 있다. 세포 성장 및 생존의 선택으로 더 긴 시간에 걸쳐 상기 인헨서의 상호작용의 횟수 또는 크기가 확장되거나 또는 축소될 것이다. 이 모델은 많은 세포 맥락에서 탐색될 수 는 많은 예측 (위에 언급된 일부)을 또한 만든다. 따라서, 매력적인 것은, 이 모델이 상-분리된 다중-분자 어셈블리 결과로써 막이 없는 세포-기관의 광범위한 패밀리, 이를 테면, 핵에서는 핵소체, Cajal 바디(bodies) 및 스플라이싱-반점, 그리고 세포질에서 스트레스 과립 및 P 바디(bodies)에 인헨서, 그리고 특별히 슈퍼-인헨서-유형 유전자 규제를 설정한다.
참조자료
실시예 2
여기에서, 우리는 슈퍼-인헨서가 액체-유사한 상-분리된 응축물들을 형성한다는 실험 증거를 제시한다. 이것은 이들 조절 요소에 대해 설명된 다양한 성질을 설명하는 새로운 틀을 확립하고, LLPS에 의해 규제된 생화학적 프로세스에 유전자 제어가 포함되도록 이 프로세스를 확장시킨다.
BRD4 및 MED1은 핵 응축물들의 성분들이다
SEs를 포함하는 인헨서 클러스터는 마스터 전사 인자들과 항상 고-밀도의 공동인자들, 이를 테면, BRD4 및 Mediator에 의해 점유되며, 이들의 존재를 이용하여 SEs를 특정할 수 있다 (1, 2, 13). SEs가 핵 응축물을 형성하면, 이러한 SE-풍부한 공동인자들이 세포의 핵에서 이산체(discrete bodies)로 가시화될 수 있다고 생각했다. BRD4 및 MED1 (Mediator의 하위단위)에 대한 항체와 함께 면역형광 (IF)의 구조 조명 현미경 (SIM)에서 뮤린 배아 줄기 세포 (mESCs)의 핵에서 개별 촛점이 드러났다 (도 11A). BRD4 및 MED1 촛점은 ChIP-seq 데이터 (도 16A 및 15B)와 일관된 유의적인 중첩 (도 11B)을 보였으며, 이로써 두 단백질은 이들 응축물을 전형적으로 공동-점유함을 암시한다. 상기 BRD4 및 MED1 촛점에서 핵의 HP1a(도 11C) 또는 기타 DAPI 치밀 영역 (도 11A)과는 저조한(poor) 중첩을 보여주는데, 이것은 BRD4 및 MED1 응축물은 핵의 이질염색질성 영역 외부에서 발생되는 경향이 있음을 나타낸다. 콘디볼루션 현미경 또는 SIM에 의해, 핵소체 (FIB1) (14), 히스톤 체 (NPAT) (15), 구성적 이질성염색질 (HP1a) (16, 17) (도 11D)를 비롯한 기존 설명된 핵 응축물들을 또한 가시화하였다. 핵 응축물들의 크기 및 숫자는 다양하지만, BRD4 및 MED1의 경우 기존 설명된 응축물들의 크기 범위 안에 있다 (도 11E). 이러한 결과는 BRD4 및 MED1이 핵 내에서 확산되지 않고, 별개 영역을 차지하고 있다는 것을 나타내며, 우리는 이것들을 BRD4 및 MED1 응축물이라고 한다.
BRD4 및 MED1 응축물들은 적극적으로 전사된 SEs에서 발생한다
인헨서에서 BRD4 및 MED1 결합에 관하여 ChIP-seq에 의한 글로벌 분석은 mESCs에서 상대적으로 높은 수준의 이러한 공동인자를 가진 수백 개의 SEs 및 추가적인 많은 인헨서가 있음을 시사한다 (1). BRD4 및 MED1 응축물들이 활성 SEs (SE-구동된 RNA 합성 부위들)와 일치하는 지 여부를 결정하기 위하여, BRD4 또는 MED1의 IF를 이용하여 응축물들을 식별해내고, SE-구동된 발생기 전사체의 RNA-FISH (인트론 RNAs 프로빙)를 이용하여 활성 SEs를 식별하였다 (도 12 및 도 17). 상이한 4개의 활성 SEs를 검사하였고, 각 경우에서 활성 SE-구동된 전사체의 부위들은 중첩되거나, 또는 BRD4 또는 MED1 응축물에 근접해서 있었다 (도 12B 및 도 17B). FISH 및 IF 신호가 중첩되거나 또는 근접한 빈도는 우연에 의한 예상보다는 훨씬 높았다(도 17C-17D, 재료 및 방법들 참고). 이러한 결과는 적극적으로 전사된 SE-구동된 유전자가 BRD4 또는 MED1을 포함하는 응축물과 관련이 있음을 나타낸다.
BRD4 및 MED1 응축물들은 광표백 동역학 후, 액체-유사 형광 복구를 나타낸다
BRD4 및 MED1 응축물들이 액체-유사 응축물들의 특정적 특징을 나타내는 지를 검사하였다. 액체-유사 응축물들의 각인적 특징은 내부 동적 재구성과 빠른 교환 역학인데 (10-12), 광표백(FRAP) 이후 형광 복구 속도를 측정함으로써, 정보를 얻을 수 있다. 살아있는 세포에서 BRD4 및 MED1 바디(bodies)의 역학을 연구하기 위해, mESCs에서 BRD4-GFP 또는 MED1-GFP를 이소성 발현시키고, FRAP 실험을 수행했다. 광표백 후 BRD4-GFP 및 MED1-GFP 응축물들은 초-단위 시간 등급에서 형광을 회수하였고 (도 13 및 18A), 겉보기 확산 계수는 차례로 0.54 ± 0.15 μm2/s 및 0.36 ± 0.13 μm2/s이다. 이 값은 액체-유사 응축물들의 기존 설명된 성분들의 것과 유사하다 (18, 19) (도 18A). 흥미로운 것으로, 동일한 경계내에서 형광 복구가 일어났으며, 이 형광 신호는 성분들을 희석-단계(phase)로 신속하게 교환하는 동적 조밀 단계(phase)를 나타낸다 (도 13B 및 13E). 파라포름알데히드 고정으로, BRD4-GFP 또는 MED1-GFP 응축물은 여전히 존재했지만, 광표백 후 회복되지 않았으며, 이것은 가교가 전체 응축물 구조를 유지하지만, 그러나 희석 단계로의 교환은 파괴시킴을 보여준다(도 18B). ATP는 에너지-의존적 공정을 유도하고 및/또는 이의 본질적 굴수성(hydrotrope) 활성을 통해 응축물 유동성을 촉진하는 것과 관련이 있다 (20, 21). 포도당 박탈(deprivation) 및 올리고마이신 치료에 의한 세포 ATP의 소진 (도 18C)으로 BRD4-GFP 바디 및 MED1-GFP 바디 모두에 대한 광표백 후, 형광 복구는 없어졌다 (도 13C 및 13F). 이러한 결과에서 BRD4 및 MED1을 함유하는 바디들은 세포 안에서 액체-유사 성질을 갖는다는 것을 나타내고, 이점은 기존 설명된 상-분리된 응축물과 일관된다.
BRD4 및 MED1의 본질적으로 무질서화된 영역은 시험관내에서 상 분리된다
본질적으로 무질서화된 영역 (IDRs)을 갖는 단백질들은 응축물 형성을 용이하게 하는데 연루되었다 (10, 12). BRD4 및 MED1은 큰 IDRs을 함유한다 (도 14A). 응축물 형성에 관련된 몇 가지 단백질들의 정제된 IDRs는 시험관내 상-분리된 소적을 형성한다 (18, 22, 23). 따라서, 우리는 BRD4 또는 MED1의 IDRs들이 시험관내에서 상-분리된 소적을 형성하는지 여부를 조사했다. 정제된 재조합 GFP-IDR 융합 단백질들 (BRD4-IDR 및 MED1-IDR) (도 14B)을 소적 형성 완충제 (재료 및 방법들 참고)에 추가하였고, 이 용액은 불투명하게 변하고, 반면 오로지 GFP 만을 담고 있는 등가 용액은 여전히 맑은 상태로 유지되었다 (도 14C). 형광 현미경에서 불투명한 MED1-IDR 및 BRD4-IDR 용액은 GFP-양성이었으며, 미크론-크기의 구형 소적은 용액에서 자유롭게 이동하며, 유리 커버 슬립 표면으로 떨어져 이를 적시고, 여기에서 당해 소적은 정지된 상태로 남아있다. 종횡 비율 분석에 의해 결정될 때, 상기 MED1-IDR 및 BRD4-IDR 소적은 상당히 구형 (도 19A)인데, 액체-유사 소적에 대하여 예측된 성질이다 (10-12).
상-분리된 소적은 이 시스템 안 성분들의 농도에 따라 전형적인 크기다(24). BRD4-IDR, MED1-IDR, 그리고 GFP의 농도를 0.6μM에서 20μM로 변화시키면서, 소적 형성 검정법을 실행하였다. BRD4-IDR 및 MED1-IDR은 농도-의존적 크기 분포를 갖는 소적을 형성한 반면, GFP는 테스트된 모든 조건에서 확산상태로 유지되었다 (도 14D 및 19B). 상기 소적은 더 낮은 농도에서는 더 작아지지만, 우리는 테스트된 최저 농도 (0.6μM)에서 BRD4-IDR 및 MED1-IDR 소적을 관찰하였다 (도 19C).
정제된 IDRs로 구성된 소적은 염 농도 증가에 민감할 수 있다 (25). BRD4-IDR 및 MED1-IDR 모두의 크기 분포는 NaCl 농도를 증가시킬 때 (50mM에서 350mM로) 더 작은 크기의 소적으로 변위하였고, 이것은 소적 형성이 약한 염-민감성 단백질-단백질 상호작용의 네트워크에 의해 구동된다는 사실과 일치한다 (도 14E 및 19D).
상기 소적이 비가역적 응집체(aggregates)인지 또는 가역적 상-분리된 응축물인지를 테스트하기 위하여, BRD4-IDR 및 MED1-IDR이 소적을 형성하도록 두고, 그 다음 이 단백질 농도는 등몰 염 또는 고-염 용액에서 절반으로 희석시켰다 (도 14F). BRD4-IDR 및 MED1-IDR의 사전-형성된 소적은 희석 및 상승된 염 농도에 의해 크기 및 숫자에서 축소되었다 (도 14F). 이러한 결과는 BRD4-IDR 및 MED1-IDR 소적이 시스템의 조건에 따라 크기 분포를 형성하고, 일단 형성되면 크기 분포를 빠르게 조정하여 시스템의 변화에 반응함을 보여준다. 이러한 특징은 약한 단백질-단백질 상호작용의 네트워크에 의해 형성된 상-분리된 응축물들의 특징이다.
MED1 IDR은 세포에서 액체-액체 상 분리에 참여한다
MED1의 IDR이 세포에서 분리를 용이하게 하는데 역할을 하는 지를 조사하기 위해, 생체내 소적 형성을 직접적으로 관찰할 수 있는 기존의 개발된 검정법을 이용하였다 (26). 간략하게 설명하자면, 광-활성화가능한, 자가-연합된 Cry2 단백질은 mCherry로 라벨되고, 관심대상의 IDR에 융합되어, 상기 당해 세포 안에서 선별된 IDRs의 국소 농도에서 청색광-유도가능한 증가가 허용된다 (도 15A)(26). 이 검정법에서, 상 분리를 촉진시키는 것으로 알려진 IDRs는 cry2의 광-반응성 클러스터링 성질을 강화시켜 (27, 28), 청색광 자극 시, 액체-유사 구형 소적 (optoDroplets)이 신속하게 형성되게 한다 (도 15A)(26). 상기 MED1 IDR의 일부분이 Cry2-mCherry로 융합되면 청색광 자극 시, 미크론-크기의 구형 optoDroplets의 신속한 형성이 용이하게 되었다 (도 15B 및 15C). 청색광 자극 동안, 근위 optoDroplets들은 함께 융합된다 (도 5D). 더욱이, 융합은 구형 모양으로 잘록하게 되고, 이완되는 특징적인 액체-유사 융합 성질들을 나타내었다 (도 5E).
그 다음, 상기 MED1-IDR optoDroplets가 액체-유사 FRAP 복구율을 나타내는 지를 테스트하였다 (도 15F-H). optoDroplets 형성은 청색광, 이어서 청색광 부재 하에서 광표백 및 복구에 의해 유도되었다. 형광은 몇 초 안에 복구되고, optoDroplets 경계를 유지하였다 (도 15F 및 15H). Cry2 상호작용의 청색광 활성화 부재 하에서 FRAP 신속 동역학은 청색광에 의해 확립된 MED1-IDR optoDroplets는 원래 신호가 없을 때 희석 단계로 교환되는 역동적 어셈블리임을 암시한다. 이들 데이터에서 MED1의 IDR은 살아있는 세포의 핵 안에 주요 국소 농도에서 액체-액체 상 분리에 참여할 수 있음을 보여준다.
논의
슈퍼-인헨서 (SEs)는 건강한 세포 상태와 병이 든 세포 상태에서 눈에 띄게 중요한 역할을 하는 유전자들을 규제하며, 따라서 이러한 요소에 대한 이해가 향상되면 이러한 세포 상태의 전사 제어와 관련된 규제 기전에 대한 새로운 식견을 제공할 수 있다(1, 2, 29). SEs 및 이들 성분은 상-분리된 응축물들을 형성하는 것으로 제안되었지만 (3), 그러나, 이 가설에 대한 실험적 증거는 거의 없었다. 여기에서, SEs의 두 가지 주요 성분, BRD4와 MED1은 SE-구동된 전사 부위에서 핵 응축물을 형성한다는 것을 우리가 실증했다. 이들 SE 응축물 안에, BRD4와 MED1은 생체내 상 분리를 구동시키는 다른 단백질들에 관하여 이미 보고된 것과 유사한 겉보기 확산 계수를 나타낸다 (18, 19). BRD4와 MED1 둘 모두의 IDRs는 시험관내 상 분리에 충분하며, 살아있는 세포 안에서 상기 MED1-IDR의 일부분이 액체-액체 상 분리를 용이하게 한다. 이러한 결과에서 SEs가 주요 유전자에서 전사 기구를 구획화하고, 집중시키며, 이러한 상 분리에 역할을 할 것 같은 SE 성분들을 식별해내는 상-분리된 응축물을 형성함을 나타낸다. 이 모델은 주요 세포 정체성 유전자들의 제어 및 핵의 상기 기능성 조직화에 연루된 기전에 영향을 준다.
SEs는 마스터 전사 인자들 (TFs)이 인헨서 클러스터에 결합함으로써 확립되며 (1, 2), 이들 마스터 TFs는 세포 정체성을 규정하는 유전자 발현 프로그램의 제어를 확립하는데 충분하다 (30-36). 이들 TFs는 전형적으로 DNA 결합 도메인(이 구조는 결정학적 방법들에 의해 결정될 수 있으며)과 IDRs로 구성된 전사 활성화 도메인으로 구성된다(이 구조는 이러한 방법에 의해 정의하지 못하였다) (37-39). TFs의 활성화 도메인은 고-밀도의 공동인자들, 이를 테면, Mediator 및 BRD4를 SEs로 동원시키고 (2), 상기 전사 기구의 이들 성분 및 다른 성분들의 농도는 액체 응축물의 형성에 충분한 것으로 보인다. 인간 게놈 안에 인코드된 대부분 단백질과 비교하여, 상기 TFs, 공동인자들 및 전사 기구는 IDRs에 풍부하며 (40), 이것은 약한 다가(multivalent) 상호작용을 중재하고, 이로 인하여 생체내 응축을 용이하게 할 수 있다. SEs에서 고-결합가 인자들의 응축으로 분리된 조밀한 상 안에 반응 도가니를 만들고, 여기에서 전사 기구의 높은 국소 농도는 강력한 유전자 발현을 확보한다고 우리는 제안한다.
염색체의 핵 조직화는 SE 응축물들에 의해 영향을 받을 것이다. DNA 상호작용 기술에서 SEs 안에 개별 인헨서는 서로 예외적으로 높은 상호작용 빈도를 갖고 (3, 41-43), 이점은 이들 응축물이 이들 요소들을 조밀한 상으로 근접하게 끌어들인다는 생각과 일관된다. 몇 가지 최근 연구에서 SEs는 서로간 상호작용할 수 있으며, 이러한 방식으로 염색체 조직화에도 기여할 수 있음이 암시된다 (44, 45). 구조적 유지 염색체 (SMC) 단백질 복합체인 코헤신은 SE-SE 상호작용을 억제하는데 연루되어 있는데, 그 이유는 이것의 상실로 핵 안에서 SEs의 방대한 융합이 야기되기 때문이다 (45). 이들 SE-SE 상호작용은 융합을 겪는 액체 상 응축물의 경향으로 인한 것일 수 있다 (10-12).
SEs가 주요 유전자에서 전사 기구를 구획화할 수 있는 상-분리된 응축물을 형성하는 모델은 많은 의문을 제기한다. 응축이 전사 결과량의 규제에 어떻게 기여할까? 상-분리된 응축물일 수도 있는 RNA 중합효소 II 클러스터의 초-고해상 연구는 응축물 수명과 전사 결과량 간에 긍정적 상관관계가 있음을 시사한다(46). 어떤 성분들이 전사 응축물의 형성 및 해체를 구동시키는가? BRD4와 MED1가 참여할 것 같지만, 그러나 DNA-결합 TFs, 공동인자들, RNA POL II 및 조절 RNAs의 역할에 대해 더 연구가 필요하다는 것이 우리 연구에서 나타났다. 종양 세포들은 이들 기원 세포에서는 발생되지 않은 구동자 종양 유전자에서 예외적으로 큰 SEs를 보유하며, 이들중 일부는 SE 풍부한 성분들을 표적으로 하는 약물에 예외적으로 민감하다 (29, 47).
재료 및 방법들
세포 배양
V6.5 뮤린 배아 줄기 세포 (mESCs)는 Jaenisch lab으로부터 기증받았다. 세포들을 2i 배지, DMEM-F12 (Life Technologies, 11320082), 0.5X B27 보충물 (Life Technologies, 17504044), 0.5X N2 보충물 (Life Technologies, 17502048), 여분의 0.5mM L-글루타민 (Gibco, 25030-081), 0.1mM b-멀캅토에탄올 (Sigma, M7522), 1% 페니실린 스트렙토마이신 (Life Technologies, 15140163), 0.5X 비필수 아미노산 (Gibco, 11140-050), 1000 U/ml LIF (Chemico, ESG1107), 1μM PD0325901 (Stemgent, 04-0006-10), 3μM CHIR99021 (Stemgent, 04-0004-10)의 0.2% 젤라틴화된 (Sigma, G1890) 조직 배양 플레이트에서 성장시켰다. 세포들은 가습화된 인큐베이터 안에서 37℃, 5% CO2에서 성장시켰다. 공촛점, 디콘볼루션 및 고-해상도 이미징을 위하여, 세포들은 5 μg/ml의 폴리-L-오르니틴(Sigma-Aldrich, P4957) 으로 피복된 유리 커버슬립 (Carolina Biological Supply, 633029), 유리 바닥 접시 (Thomas Scientific, 1217N79) 또는 8-쳄버 커버글라스 (Life Technologies, 155409PK 또는 VWR, 100489-104)에서 30분 동안 37C에서 성장시키고, 5μg/ml의 라미닌 (Corning, 354232)과 함께 2시간-16시간 동안 37C에서 성장시켰다. 계대를 위하여, 세포들은 PBS (Life Technologies, AM9625), 1000 U/ml LIF로 세척되었다. TrypLE Express 효소 (Life Technologies, 12604021)를 이용하여 플레이트로부터 세포를 떼내었다. TrypLE는 FBS/LIF-배지, DMEM K/O (Gibco, 10829-018), 1X 비필수 아미노산, 1% 페니실린 스트렙토마이신, 2mM L-글루타민, 0.1mM b-멀캅토에탄올 및 15% 태아 소 혈청, FBS, (Sigma Aldrich, F4135)으로 중단시켰다(quench). 세포들을 RT에서 1000rpm으로 3분 동안 회전시켰고, 2i 배지에서 재현탁시키고, 5x106 세포를 152 cm2에 도말시켰다.
HEK293T 세포 (ATCC, CRL-3216)를 optoDroplets 실험에 이용되는 바이러스 생성에 이용하였다. 가습화된 인큐베이터 안에 37℃, 5% CO2에서 HEK293T 세포는 10% FBS (Sigma Aldrich, F4135), 2mM L-글루타민 (Gibco, 25030) 및 100 U/mL 페니실린-스트렙토마이신 (Gibco, 15140)이 보충된 DMEM (GIBCO, 11995-073)으로 배양시켰다.
NIH 3T3 세포들 (ATCC, CRL-3216)을 optoDroplets 실험에 이용하였다. 가습화된 인큐베이터 안에 37℃, 5% CO2에서 NIH 3T3 세포들은 10% FBS (Sigma Aldrich, F4135), 2mM L-글루타민 (Gibco, 25030) 및 100 U/mL 페니실린-스트렙토마이신 (Gibco, 15140)이 보충된 DMEM (GIBCO, 11995-073)으로 배양시켰다.
구조체 생성
MED1-GFP 발현 구조체는 30 bp 세린-글리신 링커를 이용하여 mEGFP에 전장의 인간 MED1 cDNA를 융합시켜 만들었고, 이는 NEB Hi-Fi 클로닝 키트 (NEB E5520S)를 이용하여 렌티바이러스 발현 벡터에서 PGK 프로모터에 병치시켰다.
세포 처리 및 세포 계통 생성
형질감염: 세포들은 Lipofectamine 3000 (Life Technologies, L3000008)으로 형질감염 후, 다음의 변형을 제조업자의 지시에 따라 형질감염시켰다. 1ml의 FBS/LIF-배지에 있는 1x106 세포를 6-멀티웰 접시의 한 개 젤라틴-피복된 웰에 도말시키고, 도말하는 동안, 리포펙타민-DNA 믹스는 세포의 상단에 바로 추가시켰다. 12시간 후, FBS/LIF-배지는 2i 배지로 교체되었다. 세포들은 형질감염-후 24-48시간 시점에 이미지화되었다.
ATP 소진: 세포들은 0.5X B27 보충물 및 0.5X N2 보충물이 보충된 포도당-없는 DMEM (Gibco, 11966025) 에서 2시간 동안 배양시키고, 이어서 5mM 2-데옥시-포도당 (Sigma, D6134) 및 126nM 올리고마이신 (Sigma, 75351)으로 2 시간 동안 배양시켰다. 세포의 ATP 수준은 제조업자의 지침에 따라 생물발광 검정법 (Invitrogen, A22066)을 사용하여 측정되었다.
면역형광
면역형광은 이미 기술된 것에 약간의 변형을 더하여 실행되었다 (49). 간략하게 설명하자면, 피복된 유리에서 성장된 세포들은 PBS에서 4% 파라포름알데히드, PFA, (VWR, BT140770)로 RT에서 10 분간 고정되었다. PBS에서 5분 동안 3회 세척 후, 세포들을 4C에서 보관하거나, 또는 면역형광을 위해 처리하였다. 세포들은 RT에서 5분 동안 PBS 안에 0.5% 트리톤 X100 (Sigma Aldrich, X100)으로 투과화시켰다. PBS에서 5분 동안 3회 세척 후, 세포들은 4% IgG-없는 소 혈청 알부민, BSA, (VWR, 102643-516)로 적어도 15분 동안 RT에서 차단되었고, RT에서 4% IgG-없는 BSA O/N에서 원발성 항체 (항체 표 참고)와 함께 항온처리되었다. PBS에서 3회 세척 후, 원발성 항체는 어두운 상태에서 2차 항체 (항체 표 참고)에 의해 인지되었다. 세포들은 PBS에서 3회 세척되었고, 20μm/ml HOESCH (Life Technologies, H3569)을 이용하여 어두운 상태, RT에서 5분 동안 착색시켰다. 유리 슬라이드는 Vactashield (VWR, 101098-042)를 사용하여 슬라이드 상에 탑재되었다. 커버슬립은 투명 매니큐어 (Electron Microscopy Science Nm, 72180)로 밀봉하여, 4℃에 보관하였다. 도면의 범례에서 명시된 바와 같이, MetaMorph 촬영 소프트웨어 및 Hammamatsu ORCA-ER CCD 카메라 (W.M. Keck Microscopy Facility, MIT)를 이용하여 100x 대물렌즈를 이용한 RPI 스피닝 디스크 공촛점 현미경, 또는 60x 대물렌즈를 갖춘 Applied Precision DeltaVision-OMX 고-해상도 현미경 (Microscopy Core Facility, Koch Institute for Integrative Cancer Research)을 이용하여 이미지를 얻었다. 200nm 보다 더 작은 직경의 핵 바디(bodies)의 경우, 구조 조명 현미경을 이용하였고, 그렇지 않으면 도면 범례에서 기술된 바와 같이, 디콘볼루션 또는 공촛점 현미경을 이용하였다. //bitplane.com 에서 이용가능한 소프트웨어인 Fiji Is Just ImageJ (FIJI) (50) 또는 Imaris v9.0.0 Bitplane Inc (W.M. Keck Microscopy Facility, MIT), 또는 Softworx 프로세싱 소프트웨어 (Microscopy Core Facility, Koch Institute for Integrative Cancer Research)를 이용하여 이미지를 추후-프로세싱였다.
면역형광이 복합된 RNA-FISH
면역형광은 다음의 변형과 함께 이미 기술된 바와 같이 실행되었다. 면역형광은 RNase-없는 환경에서 실행되었으며, 피펫과 벤치는 RNaseZap (Life Technologies, AM9780)으로 처리되었다. RNase-없는 PBS를 이용하였으며, 모든 시점에서 항체들은 RNase-없는 PBS로 희석되었다. 면역형광 완료 후. 세포들은 RT에서 10분 동안 PBS에서 4% PFA로 후-고정되었다. 세포들은 RNase-없는 PBS로 2 회 세척하였다. 세포들은 RNase-없는 물 (Life Technologies, AM9932)에서 20% Stellaris RNA FISH 세척 완충제 A (Biosearch Technologies, Inc., SMF-WA1-60), 10% 탈이온화된 포름아미드(EMD Millipore, S4117)로 5분 동안 RT에서 한 번 세척하였다. 세포들은 90% Stellaris RNA FISH 하이브리드화 완충제 (Biosearch Technologies, SMF-HB1-10), 10% 탈이온화된 포름아미드, SE-연합된 유전자들의 전사체의 인트론을 혼성화시키기 위해 기획된 12.5 μM Stellaris RNA FISH 프로브를 이용하여 혼성화시켰다. 하이브리드화는 O/N, 37C에서 실행되었다. 그 다음 세포들은 세척 완충제 A를 이용하여 30분 동안 37℃에서 세척되었으며, 핵은 세척 완충제 A에서 20μm/ml HOESCH으로 5분 동안 RT에서 착색되었다. Stellaris RNA FISH 세척 완충제 B (Biosearch Technologies, SMF-WB1-20)로 RT에서 5-분간 한 번 세척 후. 커버슬립은 면역형광의 경우에서 설명된 바와 같이 탑재되었다. 이미지는 RPI 스피닝 디스크 공촛점 현미경으로 얻었다.
광표백-후 형광 복구 (FRAP)
세포들 발현시키는 형광으로 테그된 단백질들은 Andor Revolution 스피닝 디스크 공촛점, FRAPPA 시스템 및 Metamorph 촬영 소프트웨어 (W.M. Keck Microscopy Facility, MIT) 상에서 100x 대물렌즈를 이용하여 20s 동안 매 1s 마다 이미지화되었다. 하나 또는 두 개 이미지는 사전-표백되었고, 그 다음 대략적으로 0.5 μm2는 정량화가능한 레이져 모듈 (QLM)의 488nm 레이져로 표백되었다. FRAP는 각각 20 μs의 5회 펄스로 관심대상 영역의 선택에 수행되었다.
이미징 분석
구조화된 조명(illumination) 및 디콘볼루션 프로세싱, Softworx 프로세싱 소프트웨어 (Microscopy Core Facility, Koch Institute for Integrative Cancer Research)가 이용되었다.
도 11E에 도시된 데이터의 경우 FIJI 입자 분석 (51) 또는 FIJI Object Counter 3D 플러그인 (51)를 이용하여 핵 응축물들이 카운트되었다. 최저 복셀(voxel) 크기는 4이었으며, 강도 컷오프(cutoff)는 밝기 및 대비 분석에 의해 결정되었다.
IF/RNA-FISH의 분석을 위해, BRD4 및 MED1 응축물들의 크기 및 좌표, 그리고 RNA-FISH 촛점은 FIJI Object Counter 3D 플러그인 (51)를 이용하여 측정되었다. 이미지 촬영 매개변수에 따르면, 각 이미지의 픽셀(pixel) 폭과 길이는 FIJI 안에서 0.0572009 미크론으로 설정되었으며, 그리고 복셀 깊이는 0.5 미크론으로 설정되었다. 하나의 바디에는 최소 4 복셀이 필요하다. 각 발생기 RNA 전사체 (FISH)와 가장 가까운 단백질 바디(IF) 간의 3D 거리는 다음과 같이 측정되었다. FIJI Object Counter 3D 플러그인을 사용한 별도 촛점 호출 후, 각 FISH 촛점의 중심(centroids)과 동일한 이미지 세트의 모든 다른 IF 촛점 간의 3D 거리가 산출되었다. 단일 최접근 IF 촛점은 유지되었고, 가장 근접한 촛점까지의 거리 분포를 도시하는데 이용되었다. 확률적 대조군의 경우 각 FISH 촛점의 5 미크론 이내 랜덤 IF 촛점 또한 유지되었다.
FRAP 분석을 위해, 형광 복구는 표백안된 지역 또는 전체 핵 강도에 대하여 정상화된 광표백된 지역의 형광 강도로 측정되었다. 형광 강도는 FIJI FRAP 프로파일러 플러그인 (Tony Collins' Macbiophotonics plugins에서 개작된 Jeff Hardin에 의해 기록된 코드: //worms.zoology.wisc.edu/research/4d/4d.html에 의해 기록된 코드)로 측정되었다.
ChIP-Seq 분석
ChIP-Seq 데이터는 매개 변수 -k 1 -m 1 -베스트(best) 및 -l을 판독 길이로 설정한 bowtie를 사용하여 마우스 참조 게놈의 mm9 버전에 정렬되었다 (52). 매개변수 -w -S - 스페이스(space)=50 -노모델(nomodel)-변위크기=200와 함께 MACS를 이용하여 빈(bins) 안에서 판독 적용범위 디스플레이를 위한 Wiggle 파일이 만들어졌으며, 빈(bin) 하나의 판독 카운트는 wiggle 파일을 만들기 위해 이용된 맵핑된 판독 백만 개에 대하여 정상화되었다 (53). 백만개-당-판독-정상화된 wiggle 파일은 UCSC 게놈 브라우져 (54)에서 디스플레이되었다. 풍도(enrichment) 피크는 -p 1e-9 -keep-dup=1와 함께 MACS로, 그리고 BRD4, MED1, 그리고 RNA PolII의 투입(input) 대조군을 이용하여 식별되었다. 마우스 배아 줄기 세포에서 슈퍼-인헨서 위치는 기존 공개로부터 다운로드받았다 (55).
인자 공동-국소화 히트맵(heatmaps)은 베드툴(bedtools) 병합을 이용하여 생성된 BRD4 또는 MED1에서 피크로 불리는 영역의 붕괴된 유합(union)을 이용하여 만들었다 (56). 판독 밀도는 매개변수 -m 50 -r -f 1 -e 200와 함께, bamToGFF (https://github.com/BradnerLab/pipeline) 을 이용하여 각 붕괴된 영역에 대하여 50개의 균등한 크기 빈(bins)에서 산출되었다. 모든 컬럼에 걸쳐 주어진 열에 있는 BRD4/MED1/PolII 신호에서 판독 신호에 따라 정렬되었다. 추정된 PCR 복제물(duplicates)은 samtools rmdup을 사용하여 제거되었으며, 이러한 비-복제 판독의 밀도는 히트맵 구성에 사용되었다 (57).
데이터세트는 다음과 같다:
HP1a: GSM1375159 RNAPII: GSM1566094 MED1: GSM560348 BRD4: GSM1659409
투입(input) 대조군: GSM1082343
단백질 정제
박테리아에서 재조합 단백질 발현을 위해, BRD4- IDR (BRD4674-1351) 또는 MED1-IDR (MED1948-1574)의 6xHIS-mEGFP-링커-IDR 또는 6x-HIS-mEGFP-링커는 T7 pET 발현 벡터 (addgene: 29663) 안으로 클론되었다. 상기 링커 서열은 GAPGSAGSAAGGSG (서열 식별 번호: 14)이다. 플라스미드는 LOBSTR 세포 (Cheeseman Lab으로부터 선물로 제공받음)로 형질전환되었다. 새로운 박테리아 콜로니는 LB 배지 함유 카나마이신 및 클로람페니콜을 함유하는 LB 배지에 접종시키고, 37℃에서 하룻밤 동안 성장시켰다. 이들 박테리아는 새로 추가된 카나마이신 및 클로람페니콜과 함께 사전-데워진 LB 500ml에서 1:15로 희석되었고, 1.5 시간 동안 37℃에서 희석되었다. 1mM IPTG로 단백질 발현을 유도한 후, 또다른 5 시간 동안 세포를 성장시키고, 수거하고, 그리고 사용 준비될 때까지 -80℃에서 동결보관한다.
500ml 세포들로부터 펠렛은 10mM 이미다졸, 완전한 프로테아제 저해제 (Roche, 11873580001)를 함유하는 15ml의 완충제 A (50mM Tris pH7.5, 500mMNaCl)에서 재현탁시키고, 초음파분쇄시킨다 (15 초-작동, 60초-중단의 주기, 10회 주기). 상기 용해물은 4oC에서 12,000g에서 30분 동안 원심분리에 의해 맑게 만든 후, 10X 용적의 완충제 A로 사전-평형화된 1ml의 Ni-NTA 아가로스 (Invitrogen, R901-15)에 추가하였다. 이 아가로스 용해물 슬러리를 함유하는 튜브는 4C에서 1.5 시간 동안 회전시켰다. 상기 슬러리를 컬럼에 붓고, 패킹된 아가로스는 10mM 이미다졸을 함유하는 완충제 A의 15 용적으로 세척되었다. 50mM 이미다졸을 함유하는 완충제 A 2 X 2ml, 100mM 이미다졸을 갖는 완충재 A 2 X 2ml, 이어서 250mM 이미다졸을 갖는 완충재 A 4 X 2ml를 이용하여 단백질을 용리시켰다.
코마시(coomassie) 착색된 겔에 의해 판단된 단백질을 함유하는 용리액을 복합시키고, 완충제 D (50mM Tris-HCl pH 7.5, 500mM NaCl, 10% 글리세롤, 1mM DTT)에 대하여 투석되었다.
시험관내 소적 검정법
재조합 GFP 융합 단백질들을 농축시키고, Amicon Ultra 원심분리 필터 (30K MWCO, Millipore)를 이용하여 적절한 단백질 농도 및 125mM NaCl로 탈염시켰다. 재조합 단백질은 소적 형성 완충제 (50mM Trish-HCl pH 7.5, 10% 글리세롤, 10% PEG-8000 (Sigma 89510), 1mM DTT)에서 표시된 최종 염 농도를 갖도록 농도를 다양하게 하면서 용액에 추가되었다. 상기 단백질 용액은 두 개의 나란하게 있는 양-면 테이프 띠에 의해 부착된 커버슬립과 함께 유리 슬라이드를 포함하는 직접만든 챔버 상이 바로 적재하였다. 그 다음 슬라이드는 100x 대물렌즈와 함께 Andor Revolution 스피닝 디스크 공촛점을 이용하여 이미지화하였다. 다른 언급이 없는 한, 제공된 이미지는 유리 커버슬립 상에 자리잡은 소적의 이미지다.
OptoDroplet 검정법
OptoDroplet 검정법은 Shin, Y et al Cell 2017 (58)을 개작한 것이다. IDRs의 클로닝을 위해, 본질적으로 무질서화된 도메인을 인코딩하는 DNA 세그먼트는 Phusion Flash (ThermoFisher F548S)를 이용하여 증폭시켰다. 세그먼트들은 Hi-Fi NEBuilder (NEB E2621S)를 이용하여 mCherry-Cry2 융합 단백질 (Brangwynne laboratory에서 얻음)을 함유하는 세대 II 렌티바이러스 백본으로 클론되었다. 클론된 opto-droplet 플라스미드들은 PEI 형질감염 시약 (polysciences 23966-1)을 이용하여 psPAX (Addgene 12260), 그리고 pMD2.G (Addgene 12259) 바이러스 패키지 플라스미드로 공동-형질감염시켰다. HEK293T 세포에서 바이러스가 만들어졌고, 이를 바로 사용하거나, 또는 Takara Lenti-X 농축기 (631232)를 이용하여 농축시켰다. 형질도입을 위하여, 3T3 세포들은 형질도입 1일 전 도말되었는데, 35mm 조직 배양 웰당 400,000개 세포로 접종되었다. 바이러스 배지를 24 시간 동안 세포에 추가하였고, 이 시점에서 이미지 또는 증식을 위하여 정상 배지에서 세포들이 확장되었다. 이미징을 위해, 35mm MatTek 유리-바닥 슬라이드 (MatTek P35G-1.5-20-C)는 0.1mg/ml 피브로넥틴 (EMD-Millipore FC010)으로 20분 동안 37℃에서 피복되었고, 플레이팅 전 PBS로 두차례 세척되었다. 세포들은 이미징 하루 전, 35mm 접시당 400,000개 세포로 도말되었다. 이미징은 Zeiss LSM 710 포인트 스캐닝 현미경에서 실행되었다. 다른 언급이 없는 한, 소적 형성은 이미징 동안 매 2초마다 488nm 광 펄스로 유도되었고, 이미징 또한 매 2초 마다 얻었다. 표시된 이미징 기간 동안. mCherry 형광은 561nm 광으로 자극되었다. FRAP 실험을 위하여, 소적 형성은 488nm 광으로 40초 동안 유도되었고, 이 점 촛점은 561nm 광으로 표백되었고, 488nm 자극 부재 하에서 매 2초마다 복구가 이미지화되었다.
항체
구조체
참조자료
실시예 3
유전자 발현은 DNA-결합 도메인 (DBDs) 및 활성화 도메인 (ADs)으로 구성된 전사 인자들 (TFs)에 의해 제어된다. 상기 DBDs는 잘-특징화되었지만, 그러나 ADs가 유전자 활성화에 영향을 끼치는 기전에 대해서는 알려진 것이 거의 없다. 여기에서 우리는 다양한 ADs가 상기 Mediator 공동활성제와 함께 상-분리된 응축물을 형성한다고 보고한다. OCT4 및 GCN4 TFs의 경우, 시험관내에서 Mediator와 함께 상-분리된 소적을 형성하는 능력과 생체내에서 유전자들을 활성화시키는 능력은 동일한 아미노산 잔기에 의존적임을 우리가 보여준다. 리간드-의존적 활성제인에스트로겐 수용체 (ER)의 경우, 에스트로겐은 Mediator와의 상 분리를 강화시키고, 다시 상 분리는 유전자 활성화와 연계됨을 보여준다. 다양한 TFs가 이들 ADs의 상-분리 수용력을 통하여 Mediator과 상호작용할 수 있으며, Mediator과의 응축물 형성은 유전자 활성화와 관련됨을 이들 결과가 암시한다.
최근 연구에서 이스트 TF GCN4의 AD는 다수의 부위에서 Mediator 하위단위 MED15에 다수의 방향 및 입체 형태로 결합함을 보여주었다(Brzovic et al., 2011; Jedidi et al., 2010; Tuttle et al., 2018; Warfield et al., 2014). 이러한 유형의 단백질-단백질 상호작용 산물 (여기에서 상호작용 경계면은 단일 입체형태로 설명될 수 없음)은 "퍼지(fuzzy) 복합체"로 명명된다 (Tompa and Fuxreiter, 2008). 이들 역동적 상호작용은 상-분리된 생물분자 응축물 형성을 용이하게 하는 IDR-IDR 상호작용의 전형이다 (Alberti, 2017; Banani et al., 2017; Hyman et al., 2014; Shin and Brangwynne, 2017; Wheeler and Hyman, 2018).
여기에서, Mediator 공동활성제와 함께 다양한 TF ADs 상분리를 보고한다. 배아 줄기 세포 (ESC) 전분화능 TF OCT4, 상기 에스트로겐 수용체 (ER) 및 이스트 TF GCN4는 Mediator와 함께 상-분리된 응축물을 형성하고, 활성화 및 상 분리 모두를 위한 동일한 아미노산 또는 리간드들을 요구한다는 것을 보여준다. 공동활성제들을 이용한 IDR-중재된 상 분리는 TF ADs가 유전자들을 활성화시키는 기전이다.
결과
ESC 슈퍼-인헨서에서 Mediator 응축물은 OCT4에 의존적이다
OCT4는 ESCs의 다분화능 상태에 필수적인 마스터 TF이며, ESC SEs에서 규정적 TF다(Whyte et al., 2013). ESC SEs에서 응축물을 형성하는 상기 Mediator 공동활성제 (Sabari et al., 2018)는 상기 MED1 하위단위를 통하여 OCT4와 상호작용하는 것으로 간주된다 (표 S3) (Apostolou et al., 2013). 만약 OCT4가 Mediator 응축물 형성에 기여한다면, 그 다음 OCT4 푼차(puncta)는 MED1 푼차(puncta)가 관찰되었던 SEs에서 제시되어야 한다. 게다가, 동시 발생기 RNA FISH와 함께 면역형광 (IF) 현미경에서 주요 전분화능 유전자들 Esrrb, Nanog, Trim28 및 Mir290 의 SEs에서 개별적 OCT4 푼차(puncta)가 나타났다 (도 20). 평균 이미지 분석으로 OCT4 IF는 RNA FISH 촛점의 중앙에 풍부함이 확인되었다. 무작위로 선별된 핵 위치를 이용하면 이러한 풍도는 나타나지 않았다 (도 27). OCT4는 Mediator가 응축물을 형성하고 (Sabari et al., 2018) 그리고 ChIP-seq에서 OCT4 및 MED1의 공동-점유를 보여주었던 동일한 SEs의 푼차(puncta)에서 발생한다는 것을 이러한 결과가 확인시켜준다 (도 20).
우리는 SEs에 존재하는 Mediator 응축물이 OCT4 의존적인지를 붕괴 전략(degradation strategy)을 이용하여 조사하였다 (Nabet et al., 2018). OCT4에 융합된 FKBP 단백질을 인코딩하는 내생성 녹-인 DNA를 품고 있는 ESC 계통에서 OCT4의 붕괴는 24시간 동안 dTag를 도입시켜 유도하였다 (Weintraub et al., 2017) (도 21A 및 28A). OCT4 붕괴 유도로 OCT4 단백질 수준은 축소되었지만, 그러나 MED1 수준에는 영향을 주지 않았다 (도 28B). ChIP-seq 분석에서 인헨서에서 OCT4 및 MED1 점유 축소를 보여주었고, 전형적 인헨서 (TEs)와 비교하였을 때, SEs에서 가장 심각한 효과가 일어났다. (도 21B). RNA-seq에서 SE-구동된 유전자들의 발현은 동반적으로 감소된 것으로 드러났다 (도 21B). 예를 들면, OCT4 및 MED1 점유는 Nanog SE (도 21C)에서 대략적으로 90% 축소되었으며, Nanog mRNA 수준의 60% 축소와 연합된다 (도 21D). 동시 DNA FISH와 함께 면역형광 (IF) 현미경에서는 OCT4 붕괴가 Nanog 에서 MED1 응축물 축소를 야기시켰음을 보여주었다 (도 21E 및 28C). 이들 결과에서 ESC SE에서 Mediator 응축물 존재는 OCT4에 의존적임을 나타낸다.
ESC 분화는 특정 ESC SEs에서 OCT4 결합 상실을 야기시키며, 이것은 이들 OCT4-의존적 SEs의 상실로 이어지며, 따라서 이들 부위에서 Mediator 응축물 상실을 유발해야 한다. 이러한 발상을 테스트하기 위해, LIF 철회(withdrawal)를 통하여 ESCs를 분화시켰다. 분화된 세포 집단에서, MiR290 SE에서 OCT4 및 MED1 점유 축소가 관찰되었으며 (도 21F, 21G, 및 28D) 그리고 MED1 단백질의 지속적인 발현에도 불구하고 (도 28E), MiR290 miRNA 수준의 축소가 관찰되었다 (도 21H) 대응적으로, 분화된 세포 집단의 Mir290에서 MED1 응축물들이 축소되었다 (도 21I 및 28F). 이들 결과는 OCT4 degron 실험에서 얻은 것들과 일치하며, 이들 ESC SEs에서 Mediator 응축물들은 OCT4에 의한 인헨서 요소들의 점유에 의존적임을 뒷받침한다.
OCT4는 MED1 액체 소적으로 통합된다
OCT4s는 유전자 활성화를 담당하는 본질적으로 무질서화된 두 개의 ADs를 보유하며, 이것은 구조화된 DBD 측면에 있다 (도 22A) (Brehm et al., 1997). IDRs은 약한 상호작용의 역동적 네트워크를 형성할 수 있고, 응축물 형성에 관련된 정제된 IDRs은 상-분리된 소적을 형성할 수 있기 때문에 (Burke et al., 2015; Lin et al., 2015; Nott et al., 2015), 우리는 다음으로 Mediator의 MED1 하위단위의 IDR과 함께, 그리고 이것 없이, OCT4가 시험관내 소적을 형성할 수 있는 지를 조사하였다.
재조합 OCT4-GFP 융합 단백질을 정제하였고, 핵의 조밀하게 군집된 환경을 시뮬레이션하기 위하여, 군집제 (10% PEG-8000)를 함유하는 소적 형성 완충제에 추가하였다. 상기 소적 혼합물의 형광 현미경에서 OCT4 단독으로는 테스트된 농도 전체를 통하여 소적을 형성할 수 없음이 드러났다 (도 22B). 대조적으로, 정제된 재조합 MED1-IDR-GFP 융합 단백질은 기존에 설명된 바와 같이 (Sabari et al., 2018), 농도-의존적 액체-액체 상 분리 (도 22B)를 나타내었다.
그 다음 우리는 두 단백질을 혼합하였고, MED1-IDR의 소적은 통합되고, 정제된 OCT4-GFP를 농축시켜 이형성(heterotypic) 소적을 형성하기 위하여 정제된 OCT4-GFP를 농축시킨다는 것을 알았다 (도 22C). 대조적으로, 정제된 GFP는 MED1-IDR 소적으로 농축되지 않았다 (도 22C, 29A). OCT4-MED1-IDR 소적은 거의-미크론-크기이며 (도 29B), 광표백 후 신속한 복구를 나타내었으며 (도 22D), 구형 모양이며 (도 29C), 그리고 염 민감성이었다 (도 22E 및 29D). 따라서, 이들 소적은 상-분리된 액체 응축물과 연합된 특징을 나타내었다 (Banani et al 2017; Shin et al 2017). 더욱이, 우리는 OCT4-MED1-IDR 소적은 임의의 군집제 부재 하에서 형성될 수 있음을 알았다 (도 29E 및 29F).
OCT4-MED1-IDR 소적 형성 및 유전자 활성화에 요구되는 잔기
그 다음, 아미노산 상호작용의 다중 카테고리가 응축물 형성에 연루되어 있기 때문에, 우리는 OCT4-MED1-IDR 상-분리된 소적의 형성에 특이적 OCT4 아미노산 잔기가 필요한지 조사하였다. 예를 들면, MED1 상 분리를 위해서는 세린 잔기가 필요하다 (Sabari et al., 2018). OCT4 ADs의 아미노산 풍도가 상호작용을 위한 기전을 암시하는 지를 물었다. 아미노산 빈도 및 전하 편향 분석에서 OCT4 IDRs은 프롤린 및 글리신이 풍부하며, 그리고 전반적으로 산성 전하를 갖는다는 것이 나타났다 (도 23A). ADs는 산성 아미노산 및 프롤린이 풍부한 것으로 알려져 있고, 이러한 기준에 의해 역사적으로 분류되어 왔지만 (Frietze and Farnham, 2011), 그러나 이들 풍도가 유전자 활성화를 유발하는 기전은 알려지지 않고 있다. ADs에서 프롤린 또는 산성 아미노산이 상-분리된 MED1-IDR 소적과의 상호작용을 용이하게 할 수 있다고 가정하였다. 이점을 테스트하기 위해, 형광으로 라벨된 프롤린 및 글루탐산 데카펩티드를 기획하였고, 이들 펩티드가 MED1-IDR 소적으로 통합될 수 있는 지를 조사하였다. 소적 형성 완충제 단독에 추가될 경우, 이들 펩티드는 용액에 남아있다 (도 30A). 그러나, MED1-IDR-GFP와 혼합되면, 프롤린 펩티드는 MED1-IDR 소적에 통합되지 않았고, 한편 글루탐산 펩티드는 그 안에서 농축되었다 (도 23B 및 30B). 이들 결과에서 산성 잔기를 갖는 펩티드는 MED1 상-분리된 소적 안에서 통합이 잘 되는 것을 보여준다.
이들 결과를 근거로 하여, ADs에서 산성 아미노산이 결여된 OCT4 단백질은 MED1-IDR과 상 분리하는 능력에 결함이 있을 수 있다고 추론하였다. 이러한 산성 잔기 의존성은 OCT4-MED1-IDR 소적이 염 민감성이 매우 크다는 우리의 관찰과 일관될 것이다. 이러한 발상을 테스트하기 위해, 상기 ADs의 모든 산성 잔기가 알라닌으로 대체된 돌연변이체 OCT4를 만들었다 (따라서, N-말단 AD에서 17개 AAs 변화와 C-말단 AD에서 6개 변화됨) (도 23C). 이러한 GFP-융합된 OCT4 돌연변이체를 정제된 MED1-IDR과 혼합할 때, 소적으로의 진입이 상당히 감쇠되었다 (도 23C 및 30C). 이 효과가 산성 잔기에 특이적인지를 테스트하기 위해, 상기 ADs 안에 모든 방향족 잔기를 알라닌으로 교환시킨 OCT4 돌연변이체를 만들었다. 이 돌연변이체는 여전히 MED1-IDR 소적 안으로 통합됨을 알았다 (30C 및 30D). 이들 결과에서 MED1-IDR의 상 분리하는 OCT4의 능력은 OCT4 IDRs에서 산성 잔기에 의존적임을 나타낸다.
이러한 결과들이 MED1-IDR에 특이적이지 않음을 확인하기 위해, 정제된 Mediator 복합체들이 시험관내 소적을 형성할 수 있고, OCT4를 통합시키는 지를 조사하였다. 인간 Mediator 복합체는 기존에 설명된 바와 같이 정제되었으며 (Meyer et al., 2008) 그 다음 소적 형성 검정법에 사용을 위해 농축되었다 (도 30E). 정제된 내생성 Mediator는 형광 테그를 함유하지 않기 때문에, 차등 간섭 대비 (DIC) 현미경을 이용하여 소적 형성을 모니터하였고, ~200-400nM에서 단독으로 소적을 형성하는 것을 알았다 (도 23D). MED1-IDR 소적에 대한 결과와 일관되게, OCT4는 인간 Mediator 복합체 소적으로 통합되었지만, 그러나 OCT4 산성 돌연변이체의 통합은 감쇠되었다. 이들 결과에서 상기 MED1-IDR과 완전한 Mediator 복합체는 각각 상-분리 거동을 나타낸다는 것을 보여주며, 이들 모두는 산성 아미노산에 의해 제공되는 정전기적 상호작용에 의존적 방식으로 OCT4를 통합한다는 것을 암시한다.
OCT4 AD 산성 돌연변이가 생체내 전사를 활성화시키는 인자의 능력에 영향을 주는 지를 테스트하기 위해, GAL4 전사활성화 검정법을 이용하였다 (도 23E). 이 시스템에서 ADs 또는 이들 돌연변이체 대응부(counterparts)는 GAL4 DBD에 융합되며, 루시퍼라제 리포터 플라스미드를 휴대하는 세포에서 발현되었다. GAL4-DBD에 융합된 야생형 OCT4-AD는 전사를 활성화시킬 수 있는 반면, 상기 산성 돌연변이체는 이러한 기능을 상실하였음을 알았다 (도 23E). 이들 결과에서 OCT4 ADs의 산정 잔기는 시험관내에서 MED1 상-분리된 소적으로의 통합과 생체내 유전자 활성화 무도에 필수적인 것으로 나타났다.
Mediator 하위단위 소적에 의한 다중 TFs 상 분리
다양한 유형의 ADs를 갖는 TFs는 Mediator 하위단위와 상호작용하는 것을 보여주었으며, MED1은 TFs에 의해 대부분 표적화되는 하위단위중 하나이다 (표 S3). 기존의 분석(Liu et al., 2006; Staby et al., 2017b)에서 나타난 것과 같이, 포유류 TFs의 분석으로 TFs 및 이들의 추정 ADs는 IDRs에 풍부하다는 것이 확인되었다 (도 24A). 많은 상이한 TFs가 상기 MED1-IDR와 상호작용하여, 액체 소적을 만들고, 따라서 MED1 응축물들을 통합시킬 수 있다고 생각했다. 다양한 MED1-상호작용 전사 인자들이 MED1로 상 분리할 수 있는 지를 검사하기 위해, 정제된 재조합, mEGFP-테그된, 전장 MYC, p53, NANOG, SOX2, RARa, GATA2, 그리고 ER을 준비하였다 (표 S5). 소적 형성 완충제에 추가할 때, 대부분 TFs는 단독으로 소적을 형성하였다 (도 24B). MED1-IDR와 함께 소적 형성 완충제에 추가될 때, 이들 7가지 모든 TFs는 MED1-IDR 소적으로 농축되었다 (도 24C, 31A). FRAP 분석용으로 p53 소적을 선별하였고; 이들은 신속하고, 역동적인 내부 재조직화를 나타나었으며 (도 31B), 이는 이들이 액체 응축물이라는 개념을 뒷받침한다. 이들 결과에서 Mediator의 MED1 하위단위와 상호작용하는 것을 이미 보여준 TFs는 MED1과 함께 상-분리된 응축물을 형성함으로써 그렇게 할 수 있음을 나타낸다.
에스트로겐이 MED1와 함께 에스트로겐 수용체의 상 분리를 자극한다.
상기 에스트로겐 수용체 (ER)는 리간드-의존적 TF의 잘-연구된 예시다. ER은 N-말단 리간드-독립적 AD, 중앙 DBD, 그리고 C-말단 리간드-의존적 AD (리간드 결합 도메인 (LBD)이라고도 불림)로 구성된다 (도 25A). 에스트로겐은 ER의 LBD에 결함하고, 이로써 MED1-IDR 안에 LXXLL 모티프를 위한 결합 포켓이 노출되어, MED1과 ER의 상호작용을 촉진시킨다 (도 25A 및 25B) (Manavathi et al., 2014). LXXLL 모티프들이 결여되어, 이러한 연구에서 지금까지 이용된 MED1-IDR 재조합 단백질과 이형성(heterotypic) 소적을 형성할 수 있음에 주목하였다 (도 24C). 이로써 ER-MED1 소적 형성이 에스트로겐에 반응성인지 여부와 이것이 상기 MED1 LXXLL 모티프들과 관련되어 있는 지 여부를 조사하기에 이르렀다.
LXXLL 모티프를 함유하는 MED1-IDR 재조합 단백질(MED1-IDRXL-mCherry)을 이용한 소적 형성 검정법을 실행하였고, MED1-IDR 및 완전한 Mediator와 유사하게, 이것은 단독으로 소적을 형성하는 능력을 보유하였다 (도 25C). 그 다음, MED1-IDRXL-mCherry 및 MED1-IDR-mCherry 소적으로 상 분리되는 ER의 능력을 테스트하였다. 일부 재조합 ER은 MED1-IDRXL-mCherry 소적에 통합되고, 농축되었지만, 그러나 에스트로겐의 추가로 이형성(heterotypic) 소적 형성이 상당히 강화되었다 (도 25D 및 25E). 대조적으로, LXXLL 모티프가 결여된 MED1-IDR-mCherry으로 실험을 실시하였을 때, 소적 형성에 있어서 에스트로겐의 추가는 거의 효과가 없었다 (도 32). 이들 결과에서 생체내 ER-중재된 전사를 촉진시키는 에스트로겐은 시험관내에서 MED1-IDR 소적으로의 ER 통합을 또한 자극시킴을 보여준다. 따라서, OCT4 및 ER 둘 모두다 상 분리 및 활성화 모두를 위해 동일한 아미노산/리간드들을 요구한다. 더욱이, LBD는 MED1과 상호작용을 위해 에스트로겐 결합시 입체형태 변위를 겪는 구조화된 도메인이기 때문에, 구조화된 상호작용은 전사 응축물 형성에 기여하는 것으로 보인다.
GCN4 및 MED15 상 분리는 활성화에 필요한 잔기에 의존적이다
가장 잘 연구된 TF-공동활성제 시스템중에서 이스트 TF GCN4 및 Mediator의 MED15 하위단위와 이의 상호작용이 있다 (Brzovic et al., 2011; Herbig et al., 2010; Jedidi et al., 2010). GCN4 AD는 유전공학적으로 분석되어, 활성화에 기여하는 아미노산들이 식별되었고 (Drysdale et al., 1995; Staller et al., 2018), 그리고 최근 연구에서 GCN4 AD는 "퍼지 복합체"를 형성하기 위해 여러 방향 및 입체형태에서 MED15와 상호작용한다는 것이 드러났다(Tuttle et al., 2018). 퍼지 복합체를 형성하는 약한 상호작용은 상-분리된 응축물들을 만드는 것으로 보이는 IDR-IDR 상호작용의 특징을 갖는다.
GCN4 및 MED15가 상-분리된 소적을 형성할 수 있는지 여부를 테스트하기 위해, 재조합 이스트 GCN4-GFP, 그리고 GCN4와 상호작용을 담당하는 잔기 6-651를 함유하는 이스트 MED15-mCherry의 N-말단 부분 (이하 MED15로 불림)을 정제하였다. 소적 형성 완충제에 별도로 추가될 때, GCN4는 상당히 높은 농도 (40uM)에서만 미크론-크기의 소적을 형성하였고, 그리고 MED15는 이러한 고-농도에서 단지 작은 소적만을 형성하였다 (도 26A). 그러나 함께 혼합할 경우, GCN4 및 MED15 재조합 단백질들은 더 낮은 농도에서 이중-양성, 미크론-크기의, 구형 소적을 형성하였다 (도 26B, 33A). 아둘 GCN4-MED15 소적은 액체-유사 거동과 일관된 신속한 FRAP 동역학 (도 33B)을 나타내었다.이들 두 단백질의 상 다이어그램을 만들었고, 이들이 낮은 농도에서도 함께 소적을 형성한다는 것을 알았다 (도 33C 및 33D). 이것으로 저-농도에서 상 분리를 위해 이들 둘 사이의 상호작용이 필요함을 암시한다.
MED15와 상호작용하고, 유전자 발현을 활성화시키는 GCN4의 능력은 GCN4 AD의 특정 소수성 패치 및 방향족 잔기에 기인된 것이었다 (Drysdale et al., 1995; Staller et al., 2018; Tuttle et al., 2018). 이들 소수성 패치에 함유된 11개 방향족 잔기를 알라닌으로 변화시킨, GCN4의 돌연변이체를 만들었다 (도 26C). 소적 형성 완충제에 추가하였을 때, 단독으로 소적을 형성하는 상기 돌연변이체 단백질의 능력은 감쇠되었다 (도 33E). 그 다음, MED15와 함께 소적 형성에 영향을 미치는 지 여부를 테스트하였다; 게다가, 상기 돌연변이된 단백질은 MED15와의 소적 형성하는 능력이 훼손되어 있었다 (도 26C 및 33F). GCN4 및 GCN4의 방향족 돌연변이체가 완전한 Mediator 복합체를 갖는 소적 형성 완충제에 추가될 때 유사한 결과들을 얻었고; 한편 GCN4는 Mediator 소적으로 통합되었고, Mediator 소적에 GCN4 돌연변이체 통합은 감쇠되었다 (도 26D 및 33G). 이들 결과에서 GCN4의 AD와 MED15 사이의 다가(multivalent), 약한 상호작용은 액체-유사 소적으로의 상 분리를 촉진시킨다는 것이 실증된다.
이스트 TFs의 ADs는 포유류 세포에서 기능을 할 수 있고, 인간 Mediator와의 상호작용에 의해 그렇게 할 수 있다 (Oliviero et al., 1992). GCN4 AD의 방향족 돌연변이체는 생체내 Mediator를 동원시키는 능력이 손상되어 있는지 여부를 조사하기 위해, GCN4 AD와 GCN4 AD 돌연변이체를 U2OS 세포에서 Lac 어레이에 테터링하였다 (도 26E) (Janicki et al., 2004). 테터링된 GCN4 AD는 강력한 Mediator 동원을 야기한 반면, GCN4 방향족 돌연변이체는 그렇지 못하였다 (도 26E). GCN4 AD가 생체내 전사 활성화를 시킬 수 있으며, 한편 GCN4 방향족 돌연변이체는 이 성질을 상실하였음을 확인하기 위해 이미 설명된 GAL4 전사활성화 검정법을 이용하였다 (도 26F). 이들 결과는 Mediator와의 상 분리에 필수적인 TF AD 아미노산들이 유전자 활성화에도 필요하다는 발상을 더욱 뒷받침한다.
논의
여기에 설명된 결과들은 TFs가 Mediator와 상호작용하고, 이들의 ADs의 능력에 의해 유전자를 활성화하여 이 공동활성화제로 상 분리된 응축물들을 형성하는 모델을 뒷받침한다. 포유류 ESC 전분화능 TF OCT4 및 이스트 TF GCN4 두 경우 모두에서, Mediator 응축물들과의 상 분리에 요구되는 AD 아미노산들이 생체내 유전자 활성화에 또한 필요하다는 것을 알았다. 상기 에스트로겐 수용체의 경우, 에스트로겐은 상-분리된 ER-MED1 소적 형성을 자극한다는 것을 알았다. ADs 및 공동활성제들은 일반적으로 IDRs로 분류되었던 낮은-복합성 아미노산 서열로 구성되며, 그리고 IDR-IDR 상호작용은 상-분리된 응축물 형성을 용이하게 하는데 연루되어 있다. Mediator와 함께 IDR-중재된 상 분리는 TF ADs가 유전자 발현에 영향을 주는 일반적인 기전이며, 이것이 SEs에서 생체내에서 발생한다는 증거를 제공한다. 액체-액체 상-분리된 응축물의 높은 결합가, 낮은 친화력 특징을 이용하는, Mediator과의 상 분리 능력은 Mediator와의 높은 친화력 상호작용을 형성하는 일부 TFs의 능력과 함께 작용한다고 우리는 제안한다 (도 26G) (Taatjes, 2017).
TF ADs가 공동활성제들과 함께 상-분리된 응축물을 형성하여 기능하는 모델은 단백질-단백질 상호작용의 고전적 잠금-및-열쇠 모델과 조화되기 곤란한 몇 가지 관찰을 나타낸다. 포유류 게놈은 매우 작은 수의 공동활성제들과 상호작용해야만 하는 다양한 ADs를 갖는 수 백개의 TFs를 인코드하고(Allen and Taatjes, 2015; Arany et al., 1995; Avantaggiati et al., 1996; Dai and Markham, 2001; Eckner et al., 1996; Gelman et al., 1999; 녹색, 2005; Liu et al., 2009; Merika et al., 1998; Oliner et al., 1996; Yin and Wang, 2014; Yuan et al., 1996), 그리고 서열 상동성을 거의 공유하지 않는 ADs는 TFs 간의 기능적으로 호환된다(Godowski et al., 1988; Hope and Struhl, 1986; Jin et al., 2016; Lech et al., 1988; Ransone et al., 1990; Sadowski et al., 1988; Struhl, 1988; Tora et al., 1989). 복잡성이 낮은 IDR을 소유한-ADs의 공통 특징은 공동활성화제에서 두드러지는 특징이기도 하다. 상-분리된 응축물 형성에 의한 공동활성제 상호작용 및 유전자 활성화 모델은 따라서 수 백가지 포유류 TFs가 어떻게 이들 공동활성제와 상호작용하는 지를 더 잘 설명한다.
이전 연구는 TF ADs가 상-분리된 응축물을 형성하여 기능할 가능성을 우리가 조사하게 만든 중요한 식견을 제공했다. TF ADs는 이들의 아미노산 프로파일을 산성, 프롤린-풍부한, 세린/트레오닌-풍부한, 글루타민-풍부한, 또는 산 얼룩(acid blobs), 네가티브 누들(noodles), 또는 펩티드 라소(lassos)와 같은 이들의 가상 모량으로 분류되어 왔었다 (Sigler, 1988). 상-분리된 응축물들을 형성할 수 있는 IDRs에 대하여 많은 특징들이 기술되었다 (Babu, 2016; Darling et al., 2018; Das et al., 2015; Dunker et al., 2015; Habchi et al., 2014; van der Lee et al., 2014; Oldfield 및 Dunker, 2014; Uversky, 2017; Wright and Dyson, 2015). "퍼지 복합체"를 형성하기 위해 여러 방향 및 입체형태에서 GCN4 AD가 MED15와 상호작용한다는 증거 (Tuttle et al., 2018)는 상-분리된 응축물들의 역동적 저-친화력 상호작용의 개념과 일치한다. 유사하게, FET (FUS/EWS/TAF15) RNA-결합 단백질들의 낮은 복합성 도메인 (Andersson et al., 2008)은 상-분리된 하이드로겔을 형성하고, CTD 포스포릴화-의존적 방식으로 RNA 중합효소 II C-말단 도메인 (CTD)과 상호작용할 수 있으며(Kwon et al., 2013); 이것은 RNA 중합효소 II가 포스포릴화안된 상태에서 활성 유전자에 동원되고, CTD의 포스포릴화 연장을 위해 방출되는 기전을 설명할 수 있다.
TF AD 기능에 대하여 본원에서 기술하는 모델은 지금까지 잘 알 수 없었던 융합 종양단백질 클래스의 기능을 설명할 수 있다. 많은 종양은 TFs의 부분이 연루된 융합-단백질 전좌를 품고 있다 (Bradner et al., 2017; Kim et al., 2017; Latysheva et al., 2016). 이들 비정상적인 유전자 산물은 대개 DNA- 또는 염색질-결합 도메인을 다양한 짝 (대부분 IDRs) 어레이에 융합시킨다. 예를 들면, MLL은 AML에서 80가지 상이한 짝 유전자들에 융합될 수 있고 (Winters and Bernt, 2017), Ewing 육종에서 EWS-FLI 재배열은 무질서화된 도메인을 종양유전자들로 동원시킴으로써 악성 형질변환을 야기시키고 (Boulay et al., 2017; Chong et al., 2017), 그리고 무질서화된 상-분리 단백질 FUS는 특정 육종에서 DBD에 융합된 것을 발견하였다 (Crozat et al., 1993; Patel et al., 2015). 상 분리는 이러한 유전자 산물이 일탈적인 유전자 발현 프로그램을 초래하고; 무질서화된 단백질을 염색질로 동원시키고, 다양한 공동활성제들이 상-분리된 응축물들을 형성하여 종양유전자 발현을 구동시키는 기전을 제공한다. 이러한 일탈적 전사 응축물, 이들 구조 및 거동을 구성하는 상호 작용을 이해함으로써 새로운 치료 방법을 열 수 있다.
참고자료
표에 언급된 참고자료
STAR 방법
실험적 모델 및 대상체 상세
세포
V6.5 뮤린 배아 줄기는 Whitehead Institute의 R. Jaenisch으로부터 기증받았다. V6.5는 C57BL/6(F) x 129/sv(M) 교배로부터 유래된 수컷 세포다. HEK293T 세포는 ATCC (ATCC CRL-3216)로부터 구매하였다. 세포들은 미코플라스마(mycoplasma) 음성이었다.
세포 배양 조건
V6.5 뮤린 배아 줄기 (mES) 세포는 2i + LIF 조건에서 성장시켰다. mES 세포는 0.2% 젤라틴화된 (Sigma, G1890) 조직 배양 플레이트 상에서 항상 성장시켰다. 2i + LIF 배지 조건에 이용된 배지는 다음과 같다: 967.5 mL DMEM/F12 (GIBCO 11320), 5 mL N2 보충물 (GIBCO 17502048), 10 mL B27 보충물 (GIBCO 17504044), 0.5mML-글루타민 (GIBCO 25030), 0.5X 비-필수 아미노산 (GIBCO 11140), 100 U/mL 페니실린-스트렙토마이신 (GIBCO 15140), 0.1 mM b-멀캅토에탄올 (Sigma), 1 uM PD0325901 (Stemgent 04- 0006), 3 uM CHIR99021 (Stemgent 04-0004), 그리고 1000 U/mL 재조합 LIF (ESGRO ESG1107). 분화를 위해, mESCs는 다음과 같이 혈청 배지에서 배양되었다: 15% 태아 소 혈청 (Hyclone, SH3007103으로 특징지어짐), 100 mM 비필수 아미노산 (Invitrogen, 11140-050), 2 mM L-글루타민 (Invitrogen, 25030-081), 100 U/mL 페니실린, 100 mg/mL 스트렙토마이신 (Invitrogen, 15140-122), 그리고 0.1mM b-멀캅토에탄올 (Sigma Aldrich)이 보충된 DMEM (Invitrogen, 11965-092). HEK293T 세포는 ATCC (ATCC CRL-3216)에서 구입하였고, 10% 태아 소 혈청 (Hyclone, SH3007103으로 특징지어짐), 100 U/mL 페니실린-스트렙토마이신 (GIBCO 15140), 2 mM L-글루타민 (Invitrogen, 25030-081)와 함께, DMEM, 고-포도당, 피루베이트 (GIBCO 11995-073)에서 배양되었다. 세포들은 미코플라스마 음성이었다.
상세 방법
RNA FISH와 함께 면역형광
커버슬립은 37℃에서 5ug/mL 폴리-L-오르니틴 (Sigma-Aldrich, P4957)으로 30분 동안 피복되며, 5μg/ml의 라미닌 (Corning, 354232)으로 2 시간 동안 피복되었다. 세포는 사전-피복된 커버 슬립 상에 도말되었으며, 24 시간 동안 성장시키고, 이어서 4% 파라포름알데히드, PFA, (VWR, BT140770)/PBS를 이용하여 10분 동안 고정화되었다. 세포들을 PBS에서 3회 세척시킨 후, 상기 커버슬립을 가습 챔버 안에 넣거나 또는 4℃에서 PBS에 보관하였다. 세포들의 투과화는 0.5% 트리톤 X100 (Sigma Aldrich, X100)/PBS에서 10분 동안 실행한 후, PBS 세척을 3회 실시하였다. 세포들은 4% IgG-없는 소 혈청 알부민, BSA, (VWR, 102643-516)을 이용하여 30분 동안 차단시키고, 표시된 원발성 항체 (표 S4 참고)는 PBS에서 1:500의 농도로 4-16 시간 동안 추가되었다. 세포를 PBS로 3회 세척하였고, 이어서 PBS에서 1:5000의 농도로 2차 항체와 함께 1 시간 동안 항온처리하였다. PBS로 2회 세척 후, 세포들을 4% 파라포름알데히드, PFA, (VWR, BT140770)/PBS를 이용하여 10분 동안 고정시켰다. PBS로 2회 세척 후, RNase-없는 물 (Life Technologies, AM9932)에 세척 완충제 A (20% Stellaris RNA FISH 세척 완충제 A (Biosearch Technologies, Inc., SMF-WA1-60), 10% 탈이온화된 포름아미드(EMD Millipore, S4117)를 세포에 추가하였고, 5분 동안 항온처리하였다. 하이브리드화 완충제 (90% Stellaris RNA FISH 하이브리드화 완충제 (Biosearch Technologies, SMF-HB1-10) 및 10% 탈이온화된 포름아미드) 안에 12.5 μM RNA 프로브 (표 S6, Stellaris)를 세포에 추가하였고, 하룻밤 동안 37C에서 항온처리하였다. 세척 완충제 A로 30분 동안 37℃에서 세척 후, 상기 핵은 20μm/mL Hoechst 33258 (Life Technologies, H3569)에서 5분 동안 착색되었고, 이어서 세척 완충제 B (Biosearch Technologies, SMF-WB1-20)에서 5분간 세척되었다. 세포를 물로 한 번 세척 후, 커버슬립은 Vectashield (VWR, 101098-042)가 있는 유리 슬라이드에 탑재하고, 최종적으로 커버슬립은 메니큐어 (Electron Microscopy Science Nm, 72180)로 밀봉하였다. MetaMorph 촬영 소프트웨어 및 Hammamatsu ORCA-ER CCD 카메라 (W.M. Keck Microscopy Facility, MIT)를 이용하여, 100x 대물렌즈가 있는 RPI 스피닝 디스크 공촛점 현미경으로 이미지를 얻었다. 이미지는 Fiji Is Just ImageJ (FIJI)를 이용하여 추후-프로세스되었다.
DNA FISH과 함께 면역형광
면역형광은 상기 기술된 바와 같이 실행되었다. 상기 세포를 2차 항체와 함께 항온처리 후, 세포는 5분 동안 RT에서 PBS로 3회 세척하였고, 4% PFA/PBS에서 10분 동안 고정되었으며, PBS로 3회 세척하였다. 세포는 70% 에탄올, 85% 에탄올 및 그 다음 100% 에탄올로 1분 동안 RT에서 항온처리되었다. 7μL의 FISH 하이브리드화 완충제 (Agilent G9400A), 1μl의 FISH 프로브 (아래 영역 참고) 그리고 2μL의 물을 혼합함으로써 프로브 하이브리드화 혼합물이 만들어졌다. 5μL의 혼합물을 슬라이드 상에 추가하였고, 커버슬립을 상부에 배치시켰다 (세포-측면은 하이브리드화 혼합물 쪽으로 향하게). 커버슬립은 고무 시멘트를 이용하여 밀봉하였다. 고무 시멘트가 굳어지면, 게놈 DNA 및 프로브를 78℃에서 5분 동안 변성시키고, 슬라이드를 16℃, 어두운 O/N에서 항온처리하였다. 커버슬립을 슬라이드로부터 벗겨내었고, 사전-데워진 세척 완충제 1 (Agilent, G9401A)과 함께 73℃에서 2분 동안, 그리고 세척 완충제 2 (Agilent, G9402A)에서 1분 동안 RT에서 항온처리하였다 슬라이드를 대기 건조시키고, Hoechst/PBS로 핵을 5분 동안 RT에서 착색시켰다. 커버슬립은 PBS로 3회 세척하였고, Vectashield을 이용하여 슬라이드 상에 탑재하고, 메니큐어로 밀봉하였다. MetaMorph 촬영 소프트웨어 및 Hammamatsu ORCA-ER CCD 카메라 (W.M. Keck Microscopy Facility, MIT)를 이용하여, 100x 대물렌즈가 있는 RPI 스피닝 디스크 공촛점 현미경으로 이미지를 얻었다.
Nanog 및 MiR290 슈퍼 인헨서를 표적으로 하도록 Agilent 사에 의해 DNA FISH 프로브가 맞춤 기획 및 제작되었다.
Nanog
디자인 입력(input) 영역 - mm9
chr6 122605249 - 122705248
디자인 영역 - mm9
chr6: 122605985-122705394
Mir290
디자인 영역 - mm10
chr7: 3141151 - 3241381
조직 배양
V6.5 뮤린 배아 줄기 세포 (mESCs)는 Jaenisch lab으로부터 기증받았다. 세포들을 2i 배지, DMEM-F12 (Life Technologies, 11320082), 0.5X B27 보충물 (Life Technologies, 17504044), 0.5X N2 보충물 (Life Technologies, 17502048), 여분의 0.5mM L-글루타민 (Gibco, 25030-081), 0.1mM b-멀캅토에탄올 (Sigma, M7522), 1% 페니실린 스트렙토마이신 (Life Technologies, 15140163), 0.5X 비필수 아미노산 (Gibco, 11140-050), 1000 U/ml LIF (Chemico, ESG1107), 1μM PD0325901 (Stemgent, 04-0006-10), 3μM CHIR99021 (Stemgent, 04-0004-10)의 0.2% 젤라틴화된 (Sigma, G1890) 조직 배양 플레이트에서 성장시켰다. 세포들은 가습화된 인큐베이터 안에서 37℃, 5% CO2에서 성장시켰다. 공촛점 이미징을 위해, 5 μg/ml의 폴리-L-오르니틴 (Sigma Aldrich, P4957)으로 30분 동안 37℃에서 피복되고, 5μg/ml의 라미닌 (Corning, 354232)으로 2시간-16시간 동안 37℃에서 피복된 유리 커버슬립 (Carolina Biological Supply, 633029) 상에서 세포를 성장시켰다. 계대를 위해, PBS (Life Technologies, AM9625), 1000 U/mL LIF에서 세포를 세척하였다. TrypLE Express 효소 (Life Technologies, 12604021)를 이용하여 플레이트로부터 세포를 떼내었다. TrypLE는 FBS/LIF-배지, DMEM K/O (Gibco, 10829-018), 1X 비필수 아미노산, 1% 페니실린 스트렙토마이신, 2mM L-글루타민, 0.1mM b-멀캅토에탄올 및 15% 태아 소 혈청, FBS, (Sigma Aldrich, F4135)으로 중단시켰다. 세포들을 RT에서 1000rpm으로 3분 동안 회전시켰고, 2i 배지에서 재현탁시키고, 5x106 세포를 15 cm 접시에 도말시켰다. mESCs의 분화를 위해, 6-웰 조직 배양 접시 웰당 6000개 세포를 도말하였거나, 또는 라미닌 피복된 유리 커버슬립을 갖는 24-웰 플레이트의 웰당 1000개 세포를 도말하였다. 24 시간 후, 2i 배지를 LIF 없는 FBS 배지 (상기 참고)로 대체하였다. 5 일 동안 매일 배지를 교환하였으며, 그 다음 세포들을 수거하였다.
웨스턴 블랏
세포를 프로테아제 저해제 (Roche, 11697498001)와 함께 Cell Lytic M (Sigma-Aldrich C2978)에서 용해시켰다. 용해물을 3%-8% Tris-아세테이트 겔 또는 10% Bis-Tris 겔 또는 3-8% Bis-Tris 겔 상에서 80 V로 ~2 시간 동안 이동시킨 후, 염료의 전단이 겔의 끝에 도달할 때 까지 120 V로 이동시켰다. 그 다음 단백질을 얼음-냉각된 이동 완충제 (25 mM Tris, 192 mM 글리신, 10% 메탄올) 안에서 300 mA, 2 시간 동안 4℃에서 0.45 μm PVDF 막 (Millipore, IPVH00010)으로 이동시켰다. 이동 후, 5% 무지방-우유/TBS로 1 시간 동안 실온에서 교반시키면서, 당해 막을 차단시켰다. 그 다음 막은 5% 무지방-우유/TBST에서 희석된 표시된 항체(표 S4)와 1:1,000의 비율로 항온처리되었으며, 하룻밤 동안 4℃에서, 교반과 함께 항온처리되었다. 아침에, 상기 막을 TBST로 5분 동안 실온에서 3회 세척하였고, 매번 세척 때 마다 교반시킨다. 막은 1:5,000의 비율로 2차 항체와 함께 1시간 동안 RT에서 항온처리되었고, TBST로 5분 동안 3회 세척되었다. 막은 ECL 물질 (Thermo Scientific, 34080)로 현상하고, CCD 카메라를 이용하여 이미지화시키거나, 또는 필름 또는 고민감성 ECL을 이용하여 노출시켰다.
염색질 면역침전 (ChIP) qPCR 및 서열화
mES는 2i 배지에서 80% 합류(confluence)되도록 성장시켰다. 세포 가교를 위해 15분 동안 1% 포름알데히드/PBS를 이용하였고, 얼음 상에서 125mM의 최종 농도에서 글리신으로 중단시켰다. 세포를 차가운 PBS로 세척하였고, 차가운 PBS에서 세포를 긁어내어 수거하였다. 수거된 세포들은 1000g, 3분 동안 4℃에서 펠렛화시키고, 액체 질소에서 순간 냉동시켜, -80℃에서 보관하였다. 모든 완충제에는 새로 만든 완전 프로테아제 저해제가 함유되어 있었다 (Roche, 11873580001). 냉동된 가교 세포들을 얼음 위에서 해동시켰고, 그 다음 용해 완충제 I (50 mM HEPES-KOH, pH 7.5, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10% 글리세롤, 0.5% NP-40, 0.25% 트리톤 X-100, 1 3 프로테아제 저해제)에서 재현탁시키고, 10분 동안 4℃에서 회전(rotated)시킨 후, 그 다음 4℃, 1350 rcf에서 5분 동안 돌렸다(spun). 펠렛은 용해 완충제 II (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.5 mM EGTA, 1 3 프로테아제 저해제)에서 재현탁시킨 후, 4℃에서 10분 동안 회전시키고, 4℃, 1350 rcf.에서 5분 동안 돌렸다. 상기 펠렛은 음파파쇄(sonication) 완충제 (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA pH 8.0, 0.1% SDS, 그리고 1% 트리톤 X-100, 1 3 프로테아제 저해제)에 재현탁시키고, 그 다음 Misonix 3000 음파파쇄기 상에서 얼음 위에서 각 30s 씩 10 회 음파파쇄시켰고 (18-21 W), 각 주기 사이에 얼음 위에서 60s 두었다. 음파파쇄된 용해물은 16,000 rcf., 4℃에서 10 분간 한 차례 원심분리에 의해 맑아졌다. 입력(input) 물질은 따로 남겨 두었고, 나머지는 표시된 인자에 의해 결합된 DNA 단편들을 농축시키기 위하여 항체 (표 S4)가 결합된 자성 비드와 함께 하룻밤 동안 4℃에서 항온처리하였다. 다음의 각 완충제로 상기 비드를 2회씩 세척하였다: 세척 완충제 A (50 mM HEPES-KOH pH 7.5, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA pH 8.0, 0.1% Na-데옥시콜레이트, 1% 트리톤 X-100, 0.1% SDS), 세척 완충제 B (50 mM HEPES-KOH pH 7.9, 500 mM NaCl, 1 mM EDTA pH 8.0, 0.1% Na-데옥시콜레이트, 1% 트리톤 X-100, 0.1% SDS), 세척 완충제 C (20 mM Tris-HCl pH8.0, 250 mM LiCl, 1 mM EDTA pH 8.0, 0.5% Na-데옥시콜레이트, 0.5% IGEPAL C-630, 0.1% SDS), 세척 완충제 D (0.2% 트리톤 X-100와 함께 TE), 그리고 TE 완충제. DNA는 용리 완충액 (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 10 mM EDTA, 1% SDS)에서 간헐적으로 볼텍싱하면서 65℃에서 1 시간 동안 배양하여 비드에서 용리되었다. 가교는 65℃에서 하룻밤 동안에 역전되었다. 용리된 DNA를 정제하기 위하여, 200 μL TE가 추가되었고, 그 다음 RNA는 2.5 μL의 33 mg/mL RNase A (Sigma, R4642)를 추가하고, 37℃에서 2 시간 항온처리함으로써 분해되었다. 단백질은 10 μL의 20 mg/mL 단백질분해효소 K (Invitrogen, 25530049)를 추가하고, 55℃에서 2 시간 동안 항온처리함으로써 분해되었다. 페놀:클로로포름:이소아밀 알코올 추출은 에탄올 침전에 의해 수행되었다. 그 다음 DNA를 50 μL TE에 재현탁시키고, qPCR 또는 서열화에 이용하였다. ChIP-qPCR 실험을 위해, QuantStudio 5 또는 QuantStudio 6 System (Life Technologies) 상에서 Power SYBR Green mix (Life Technologies #4367659)를 이용하여 qPCR을 실행하였다.
RNA-Seq
RNA-Seq는 표시된 처리와 함께 표시된 세포 계통에서 실행하였으며, 그리고 발현된 유전자들을 결정하는데 이용하였다. RNA는 AllPrep Kit (Qiagen 80204)에 의해 단리되었고, 제조업자의 프로토콜에 따라 TruSeq Stranded mRNA Library Prep Kit (Illumina, RS-122-2101)를 이용하여 가닥으로된 polyA 선별된 라이브러리가 준비되었으며, Hi-seq 2500 기구 상에서 단일-단부(single-end) 서열화되었다.
단백질 정제
상기 관심대상의 유전자들 또는 이들의 IDRs를 인코딩하는 cDNA는 T7 pET 발현 벡터의 변형된 형태로 클론되었다. 상기 기본 벡터는 5' 6xHIS에 이어서 mEGFP 또는 mCherry 그리고 14개 아미노산의 링커 서열 "GAPGSAGSAAGGSG."(서열 식별 번호: 14)을 내포하도록 공작되었다. 상기 링커 아미노산과 동일-프레임(in-frame)에 이들 서열 (PCR에 의해 만듬)을 삽입시키는데 NEBuilder® HiFi DNA Assembly Master Mix (NEB E2621S)를 이용하였다. mEGFP 또는 mCherry 만을 발현시키는 벡터는 당해 링커 서열에 있어서, STOP 코돈을 내포한다. 돌연변이체 서열은 유전자블록 (IDT)으로 합성되었으며, 상기에서 기술된 바와 같이 동일한 기본 벡터 안으로 삽입되었다. 모든 발현 구조체를 서열화하여 서열 정체성을 확보하였다. 단백질 발현을 위해, 플라스미드를 LOBSTR 세포들 (Chessman Lab으로부터 선물로 받음) 안으로 형질전환시키고, 다음과 같이 성장시켰다. 새로운 박테리아 콜로니를 카나마이신 및 클로람페니콜을 함유하는 LB 배지에 접종시키고, 하룻밤 동안 37℃에서 성장시켰다. 세포들 함유 상기 MED1-IDR 구조체를 함유하는 세포들은 새로 추가된 카나마이신 및 클로람페니콜과 함께 500ml의 실온 LB에서 1:30으로 희석되었고, 16℃에서 1.5시간 동안 성장시켰다. IPTG를 1mM로 추가시키고, 18 시간 동안 성장을 지속시켰다. 세포들을 수거하여, -80℃에서 냉동 보관하였다. 모든 다른 구조체를 함유하는 세포들도 유사한 방식으로 처리하였는데, 단 IPTG 유도 후, 37℃에서 5시간 동안 성장시켰다는 것이 차이점이다.
500ml의 cMyc 및 Nanog 세포들의 펠렛은 완전한 프로테아제 저해제 (Roche,11873580001)를 함유하는 15ml의 변성 완충제 (50mM Tris 7.5, 300mM NaCl, 10mM 이미다졸, 8M 우레아)에 재현탁시키고, 음파파쇄시켰다 (15초-작동, 60초-중단의 주기, 10회). 상기 용해물은 12,000g에서 30분 동안 원심분리시킴으로써 맑게 만든 후, 동일한 완충제의 10배 용적으로 사전-평형화된 1ml의 Ni-NTA 아가로스 (Invitrogen, R901-15)에 추가하였다. 상기 아가로스 용해물 슬러리를 함유하는 튜브는 1.5 시간 동안 회전시켰다. 이 슬러리를 컬럼에 붓고, 15 용적의 용해 완충제로 세척한 후, 250mM 이미다졸을 함유하는 변성 완충제로 4X 용리시켰다. 각 분취는 12% 겔 상에서 이동시켰고, 정확한 크기의 단백질을 완충제 (50mM Tris pH 7.5, 125Mm NaCl, 1Mm DTT 및 4M 우레아)에 대하여 우선 투석시킨 후, 2M 우레아를 함유하는 동일한 완충제로 투석시키고, 끝으로 우레아가 없이 10% 글리세롤을 포함하는 완충제로 2 번 교환하여 투석시켰다. 투석 후 임의의 침전물은 3.000rpm에서 10분 동안 원심분리시켜 제거하였다. 모든 다른 단백질들도 유사한 방법으로 정제하였다. 500ml 세포 펠렛은 10mM 이미다졸 및 완전한 프로테아제 저해제을 함유하는 15ml의 완충제 A (50mM Tris pH7.5, 500 mM NaCl) 에 재현탁시키고, 음파파쇄되고, 12,000g, 30 분, 4℃에서 원심분리에 의해 맑아진 용해물은 1ml의 사전-평형화된 Ni-NTA 아가로스에 추가되고, 그리고 4℃에서 1.5 시간 동안 회전시켰다. 상기 슬러리를 컬럼에 붓고, 10mM 이미다졸을 함유하는 완충제 A 15 용적으로 세척하고, 그리고 단백질은 50mM 이미다졸을 함유하는 완충제 A로 2X, 100mM 이미다졸을 함유하는 완충제 A로 2X, 그리고 250mM 이미다졸을 함유하는 완충제 A로 3X 세척되었다. 대안으로, 상기 수지 슬러리는 3,000rpm에서 10분 동안 원심분리시키고, 15 용적의 완충제로 세척하고, 그리고 단백질들은 상기 각 완충제 (50mM, 100mM 및 250mM 이미다졸)와 함께 회전시키면서 10분 또는 그 이상의분 동안 항온처리하고, 이어서 원심분리하여 용리시키고, 겔 분석하였다. 정확한 크기의 단백질을 함유하는 분취물은 4℃에서 50mM Tris 7.5, 125mM NaCl, 10% 글리세롤 및 1mM DTT를 함유하는 완충제를 두 번 교환시키면서 투석하였다.
시험관내 소적 검정법
재조합 GFP 또는 mCherry 융합 단백질들을 농축시키고, Amicon Ultra 원심분리 필터 (30K MWCO, Millipore)를 이용하여 적절한 단백질 농도 및 125mM NaCl로 탈염시켰다. 재조합 단백질들은 소적 형성 완충제 (50mM Tris-HCl pH 7.5, 10% 글리세롤, 1mM DTT) 안에서 표시된 최종 염 및 10% PEG-8000 (군집제로써)와 함께 다양한 농도로 용액에 추가되었다. 상기 단백질 용액은 두 개의 나란하게 있는 양-면 테이프 띠에 의해 부착된 커버슬립과 함께 유리 슬라이드를 포함하는 직접만든 챔버 상이 바로 적재하였다. 그 다음 슬라이드를 150x 대물렌즈를 갖춘 Andor 공촛점 현미경으로 이미지화시켰다. 다른 언급이 없는 한, 제공된 이미지는 유리 커버슬립 상에 자리잡은 소적의 이미지다. 형광으로 라벨된 폴리펩티드를 이용한 실험을 위해, TMR 형광 테그와 함께 Koch Institute/MIT Biopolymers & Proteomics Core Facility를 이용하여 표시된 데카펩티드를 합성하였다. 관심대상의 단백질을 표시된 폴리펩티드와 함께 125mM NaCl 및 10% Peg-8000을 갖는 완충제 D에 추가하였고, 상기에서 기술된 바와 같이 이미지화시켰다. 시험관내 소적의 FRAP를 위해, 50us 거주 시간에서 5 펄스의 레이져를 당해 소적에 제공하였고, 그리고 복구는 표시된 기간 동안 매 1s 마다 Andor 현미경 상에서 이미지화시켰다. 에스트로겐 자극 실험을 위해, 새로운 B-에스트라디올 (E8875 Sigma)을 100% EtOH에서 10mM로 재구성시키고, 그 다음 125mM NaCl 소적 형성 완충제에서 100uM로 희석시켰다. 이렇게 농축된 원액(stock) 1 마이크로리터를 10uL 소적 형성 반응에 이용하여 최종 농도 10uM를 얻었다.
게놈 편집(Editing) 그리고 단백질 붕괴
CRISPR/Cas9 시스템을 이용하여 ESC 계통을 유전공학적으로 조작하였다. 표적-특이적 올리고뉴클레오티드를 GFP (R. Jaenisch로부터 선물로 받음)와 함께 코돈-최적화된 Cas9 형태를 휴대하는 플라스미드로 클론시켰다. 표적화된 DNA 서열 (프로토스페이스(protospacer) 이웃 모티프는 밑줄표시됨)은 동일한 표에 열거되어 있다. 내생성으로 테그된 계통의 생성을 위해, 1 백만개의 Med1-mEGFP 테그된 mES 세포들을 하기 가이드 서열 (pX330-GFP-Oct4) 및 1.25 mg 비-선형화된 복구 플라스미드 1 (pUC19-Oct4-FKBP-BFP) 및 1.25 mg 비-선형화된 복구 플라스미드 2 (pUC19-Oct4-FKBP-mcherry) (표 S5)을 함유하는 2.5 mg의 Cas9 플라스미드로 형질감염시켰다. GFP 존재에 대하여 48 시간 후에 세포들을 분류하였다. 세포들을 5일간 확장시키고, 그 다음 이중 양성 mCherry 및 BFP 세포들에 대하여 다시 분류하였다. mCherry+/BFP+ 분류된 사만개 세포를 연속 희석에 하여 6-웰 플레이트에 도말하였다. 2i 배지에 대략 1 주일 동안 세포를 성장시키고, 그 다음 개별 콜로니는 입체경(stereoscope)을 이용하여 96-웰 플레이트로 찍어내었다. 세포들을 확장시키고, PCR에 의해 유전자유형을 결정하였고, 웨스턴 블랏 및 IF를 통하여 붕괴를 확인하였다. 동형접합성(homozygous) 녹-인 테그를 갖는 클론을 추가 확장시키고, 실험에 이용하였다. 붕괴 실험용으로 FKBP 테그된 Oct4를 발현시키는 동형접합성 녹-인 계통 클론을 이용하였다. 2i에서 세포를 성장시키고, 그 다음 24 시간 동안 100 nM 농도의 dTAG-47로 처리한 다음, 수거하였다.
Oct4 가이드 서열
tgcattcaaactgaggcacc*NGG(PAM) (서열 식별 번호: 15)
GAL4 전사 검정법
GAL4 DNA-결합 도메인의 발현을 구동시키는 SV40 프로모터를 함유하는 포유류 발현 벡터에서 전사 인자 구조체를 어셈블리하였다. Oct4 및 Gcn4의 야생형 및 돌연변이체 활성화 도메인은 Gibson 클로닝 (NEB 2621S)에 의해 링커 GAPGSAGSAAGGSG (서열 식별 번호: 16)에 의해 연결되어, DNA-결합 도메인의 C-말단에 융합되었다. 이들 전사 인자 구조체는 Lipofectamine 3000 (Thermofisher L3000015)을 이용하여 HEK293T 세포 (ATCC CRL-3216) 또는 V6.5 마우스 배아 줄기 세포로 형질감염되었으며, 이 세포들은 백색의 평편한-바닥 96-웰 검정법 플레이트 (Costar 3917)에서 성장시켰다. 상기 전사 인자 구조체는 반딧불이 루시퍼라제 유전자의 상류 활성화 부위 상류에 5개 GAL4를 함유하는 변형된 형태의 PGL3-기본 (Promega) 벡터로 공동-형질감염되었다. SV40 프로모터에 의해 구동되는 Renilla 루시퍼라제 유전자를 함유하는 플라스미드인 pRL-SV40 (Promega) 또한 공동-형질감염되었다. 형질감염 후 24 시간 시점에, 각 루시퍼라제 단백질에 의해 생성되는 발광은 Dual-glo 루시퍼라제 검정법 시스템 (Promega E2920)을 이용하여 측정되었다. 제시된 데이터는 Renilla 루시퍼라제 발현에 대하여 조절된 것이다.
Lac 결합 검정법
CFP-LacI 융합 단백질의 발현을 구동시키는 SV40 프로모터를 함유하는 pSV2 포유류 발현 벡터에서 NEB HIFI 클로닝에 의해 구조체들을 어셈블리하였다. Gcn4 의 활성화 도메인 및 돌연변이체 활성화 도메인은 링커 서열 GAPGSAGSAAGGSG (서열 식별 번호: 17)에 의해 연결되어, 이 재조합 단백질의 c-말단에 융합되었다. ~51,000 Lac-억제인자 결합 부위들 (Spector laboratory로부터 선물로 받음)의 안정적으로 통합된 어레이를 함유하는 U2OS-268 세포들은 Lipofectamine 3000 (Thermofisher L3000015)을 이용하여 형질감염되었다. 형질감염 후 24 시간 시점에서, 피브로넥틴-피복된 유리 커버슬립 상에 세포들을 도말하였다. 유리 커버슬립 상에서 24 시간 후, 상기에서 기술된 바와 같이 MED1 항체 (표 S4)와 함께 면역형광을 위하여 세포를 고정시켰고, 회전 디스크 공-촛점 현미경을 이용하여 이미지화하였다.
CDK8-Mediator의 정제
상기 CDK8-Mediator 샘플들은 변형을 (Meyer et al., 2008)에서 기술된 것의 변형으로 정제되었다. 친화력 정제에 앞서, P0.5M/QFT 분취는 황산암모늄 침전 (35%)을 통하여12 mg/mL으로 농축시켰다. 펠렛은 20 mM KCl, 20mM HEPES, 0.1mM EDTA, 2mM MgCl2, 20% 글리세롤을 함유하는 pH 7.9 완충제에 재현탁시키고, 그 다음 친화력 정제 단계에 앞서, 0.15M KCl, 20mM HEPES, 0.1mM EDTA, 20% 글리세롤 및 0.02% NP-40을 함유하는 pH 7.9 완충제에 대하여 투석시켰다. 친화력 정제는 (Meyer et al., 2008)에서 기술된 바와 같이 실행되며, 2mL 0.15M KCl HEMG (20mM HEPES, 0.1mM EDTA, 2mM MgCl2, 10% 글리세롤)를 함유하는 2.2mL의 원심분리 튜브에 용리된 물질을 적하하였고, 4℃, 50K RPM에서 4h 동안 원심분리시켰다. 이는 과도한 자유 GST-SREBP를 제거하고, 최종 분취물에서 CDK8-Mediator를 농축시키는 역할을 했다. 소적 검정법에 앞서, 정제된 CDK8-Mediator는 Ultracel-30 막 (Millipore MRCF0R030)과 함께 Microcon-30kDa Centrifugal Filter Unit을 이용하여 ~300nM의 Mediator 복합체에 이르도록 농축되었다. 농축된 CDK8-Mediator는 10μM 표시된 GFP-테그된 단백질과 함께, 또는 이들 단백질 없이, ~200nM의 최종 농도로 소적 검정법에 추가되었다. 소적 반응에는 10% PEG-8000 및 140mM 염이 내포되어 있었다.
정량화 및 통계학적 분석
실험 기획
모든 실험은 복제되었다. 실행된 복제 특정 횟수에 대해서는 도면 범례 또는 하기 특정 섹션을 참고한다. 연구의 어떠한 측면도 블라인드(blind) 처리된 것은 없다. 샘플 크기는 사전결정되지 않았으며, 제외된 예외는 없었다.
평균 이미지 및 방사(radial) 분포 분석
면역형광과 함께 RNA FISH 분석을 위해, FISH (RNA/DNA) 및 IF 채널에서 수집된 3D 이미지 데이터를 처리하고, 분석하기 위해 맞춤형 사내 MATLAB™ 스크립터가 작성되었다. FISH 촛점은 강도(intensity) 역치값을 통해 개별 z-스택에서 수동으로 식별되었고, 
의 크기 상자를 따라 중앙배치되었고, 그리고 z-스택에서 3-D로 함께 스티치(stitched) 되었다. 소위 FISH 촛점은 여분의-핵 신호 또는 일시적인 상황 변화로 인하여 발생되는 위 양성(false positives)을 제거하기 위해 수작업으로 짜여진(curated) FISH 촛점 목록에 대하여 교차-참고되었다. 식별된 모든 RNA FISH 촛점의 경우, IF 채널에서 대응하는 위치로부터 얻은 신호는 모든 대응하는 z-슬라이스에서 RNA FISH 촛점에 집중된 
사각형에 담는다. 각 FISH 및 IF 짝에 대한 FISH 촛점에 집중된 IF 신호를 조합하고, 평균 강도 투영도를 산출하고, IF 신호 강도에 대한 평균 데이터를 FISH 촛점에 집중된 
사각형 안에 제공한다. 이것 자체 좌표 상에 집중된 FISH 신호 강도에 대하여 동일한 프로세스를 실시하였으며, FISH 신호 강도에 대한 평균 데이터는 FISH 촛점에 집중된 
사격형 안에 제공한다. 대조군으로써, 무작위로 선별된 핵 위치에 집중된 IF 신호에 대해서도 동일한 프로세스를 실시하였다. 우선 핵 용적을 식별해내고, 그 다음 이 용적 안에서 위치를 선택함으로써, 각 이미지 세트에 대하여 무작위로 선별된 핵 위치를 식별했다. z-스택 이미지를 통하여 DAPI 착색으로부터 핵 용적을 결정하였고, 이것은 맞춤형 CellProfiler 파이프라인(보조 화일로 포함됨)을 통하여 프로세스되었다. 간략하게 설명하자면, 이 파이프라인은 이미지 강도를 재설계하고, 프로세싱 속도를 위해 당해 이미지를 원본 크기의 20%로 압축시키고, 탐지된 반점을 강화시키고, 필터 정중 신호를 걸러내고, 임계 바디(bodies), 구멍(holes)을 제거하고, 정중 신호를 걸러내고, 당해 이미지를 다시 원본 크기로 확대시키고, 핵 분수령(watersheds), 그리고 생성된 객체를 흑백 이미지로 전환시킨다. 이 흑백 이미지는 readTIFF 및 im (spatstat에서)을 사용하여 이미지 세트당 40 개의 무작위 핵 복셀(voxels)을 선택하는 사용자지정 R 스크립트의 입력으로 사용된다. 이러한 평균 강도 투영은 신호 강도 또는 방사형 분포 플롯의 2D 등고선 맵을 생성하는데 사용되었다 . 등고선 플롯은 MATLAB™의 내장(in-built) 함수를 이용하여 생성된다. 상기 강도 방사 함수 ((
))는 평균 데이터에서 산출된다. 등고선 플롯의 경우, 표시된 강도-색상 범위는 선형 색상 범위에 걸쳐 사용자 지정되었다(
= 15). FISH 채널의 경우, 검정색에서 자홍색이 사용되었다. IF 채널의 경우, 우리는 chroma.js (온라인 색상 생성기)를 사용하여 15개 빈(bins) 전체에 색상을 생성했으며, 주요 전환 색상은 검정색, 청자색, 중간-파란색(mediumblue), 라임색이 선택되었다 . 이것은 판독자의 눈으로 신호의 대비를 더 쉽게 감지할 수 있도록 하기 위해 수행된 것이다. 생성된 컬러 맵은 모든 IF 플롯에 대해 균일한 간격의 강도 빈(bins) 15 개에 사용되었다. FISH 또는 무작위로 선별된 핵 위치에 집중된 평균 IF는 각 플롯의 최소 및 최대 신호를 포함하도록 설정된, 동일한 색상 척도를 사용하여 플롯된다. DNA FISH 분석을 위해, FISH 촛점은 FIJI의 강도 임계 값을 통해 개별 z-스택에서 수동으로 식별되었으며, 참조 지역으로 표시된다. 그런 다음 참조 영역을 이미지의 MED1 IF 채널로 전송하고, FISH 촛점 내의 평균 IF 신호를 결정했다. DNA FISH 촛점과 관련된 평균 MED1 IF 강도를 계산하기 위해, 이미지 당 10 개 이상의 세포를 포함하는 5 개의 이미지에 대한 평균 신호를 평균했다.
염색질 면역침전 PCR 및 서열화 (ChIP) 분석
도면에 표시된 값은 입력에 대해 정상화되었다. 평균 WT 표준 값과 표준 편차가 표시된다. 사용된 프라이머는 다음과 같다. 관심대상 영역 (ROI)의 ChIP 값은 입력 값 (배수(fold) 입력)으로 정상화되었으며, mir290 인헨서의 경우 추가 네가티브 영역 (네가티브 표준) 값이 분화 실험 실험에서 ES 상태로 정상화되고, OCT4 붕괴 실험 (대조군 정상화)에서 DMSO 대조군으로 정상화된 것으로 표시된다. qPCR 반응은 기술적으로 세 번 수행되었다.
ChIP qPCR 프라이머들
Mir290
mir290_Neg_F
GGACTCCATCCCTAGTATTTGC 서열 식별 번호: 16
mir290_Neg_R
GCTAATCACAAATTTGCTCTGC 서열 식별 번호: 17
mir290_OCT4_F
CCACCTAAACAAAGAACAGCAG 서열 식별 번호: 18
mir290_OCT4_R
TGTACCCTGCCACTCAGTTTAC 서열 식별 번호: 19
mir290_MED1_F
AAGCAGGGTGGTAGAGTAAGGA 서열 식별 번호: 20
mir290_MED1_R
ATTCCCGATGTGGAGTAGAAGT 서열 식별 번호: 21
ChIP-Seq 데이터는 매개 변수 -k 1 -m 1 -베스트(best) 및 -l을 판독 길이로 설정한 bowtie를 사용하여 마우스 참조 게놈의 mm9 버전에 정렬되었다. 매개변수 -w -S - 스페이스(space)=50 -노모델(nomodel)-변위크기=200와 함께 MACS를 이용하여 빈(bins) 안에서 판독 적용범위 디스플레이를 위한 Wiggle 파일이 만들어졌으며, 빈(bin) 하나의 판독 카운트는 wiggle 파일을 만들기 위해 이용된 맵핑된 판독 백만 개에 대하여 정상화되었다. 백만개-당-판독-정상화된 wiggle 파일은 UCSC 게놈 브라우져에서 디스플레이되었다. 도 1에 나타낸 ChIP-Seq 트랙은 Whyte et al., 2013.GSM1082340 (OCT4) 및 GSM560348 (MED1)로부터 유래된다. 2i 조건에서 성장된 세포의 슈퍼-인헨서와 전형적 인헨서 및 이들의 연합된 유전자들은 Sabari et al., 2018로부터 다운로드받았다. 2i 조건에서 성장된 세포의 슈퍼-인헨서 및 전형적 인헨서 범위를 정향화하기 위해, 점유 배수-변화 분포는 bamToGFF (github.com/BradnerLab/pipeline)을 이용하여 산출하였다. 각 전형적 및 슈퍼-인헨서 중첩 판독은 매개변수 -e 200 -f 1 -t TRUE와 함께 bamToGFF를 이용하여 결정되었으며, 후속적으로 이후 수백만 개의 맵핑된 판독 (RPM)으로 정상화되었다. 그런 다음, 각 조건의 RPM-정상화된 판독 카운트를 해당 조건의 RPM-정상화된 ChIP-Seq 판독 카운트에서 차감시킨다. 이러한 차감으로 음수가 생성된 지역의 값은 0으로 설정되었다. DMSO-처리된 경우(정상적인 OCT4 양)와 dTAG-처리된 경우 (고갈된 OCT4) 간에 Log2 배수-변화가 산출되었고; 각 조건에 하나의 슈도-카운트(pseudo-count)가 추가되었다.
슈퍼-인헨서 식별
슈퍼-인헨서는 Whyte et al에서 기술된 바와 같이 식별되었다. MED1에서 풍도(enrichment) 피크는 -p 1e-9 -keep-dup=1와 함께 MACS를 이용하여 식별되었다. 처리되지 않은 조건에서 MED1 정렬된 판독 값과 MED1의 해당 피크들은 매개 변수 -s 12500 -t 2000 -g mm9 및 입력 대조군과 함께 ROSE (bitbucket.org/young_computation/)에 대한 입력으로 사용되었다. 동일한 전사체의 일부인 이러한 인근 microRNA가 카운트되는 곱해지는 것을 방지하기 위해, D7Ertd143e를 추가하고, Mir290, Mir291a, Mir291b, Mir292, Mir293, Mir294 및 Mir295를 제거하여 사용자 지정 유전자 목록이 만들어졌다. 스티치된(stitched) 인핸서 (슈퍼 인핸서 및 전형적인 인핸서)는 프로모터가 스티치된 인핸서의 중심에 가장 가까운 단일 발현된 RefSeq 전사체에 할당되었다. 발현된 전사체는 상기에서 정의되었다.
RNA-Seq 분석
분석을 위해, 미가공(raw) 판독은 디폴트 매개변수와 함께 hisat2를 사용하여 마우스 참조 게놈의 mm9 수정(revision)에 정렬되었다. 유전자 이름-수준 판독 카운트 정량화는 매개변수 -I gene_id -stranded = reverse -f bam -m intersection-strict를 갖는 htseq-count와, 6/6/18에 다운로드된 Refseq의 전사 위치를 함유하는 GTF를 사용하여 수행되었다. 정상화된 카운트, 정상화된 배수-변경 및 차등 발현 p 값은 표준 워크플로우(workflow)와 각 조건의 두 복제를 사용하여 DEseq2에 의해 결정되었다.
OCT4의 풍도 및 전하 분석
아미노산 조성 플롯은 단백질의 아미노산 서열을 따라 각 잔기의 아미노산 정체성을 플롯함으로써 R을 사용하여 생성되었다. OCT4에 대한 잔기 당 순-전하(net charge)는 localCIDER 패키지(Holehouse et al., 2017)를 사용하여 5 개 아미노산 슬라이딩 윈도우에서 OCT4 아미노산 서열을 따라 평균 아미노산 전하를 계산하여 결정되었다.
무질서 풍도 분석
(Saint-
et al.)에서 정의된 바와 같이, TFs 상의 모든 분석에 인간 전사 인자들 단백질 서열이 이용된다. 참조 인간 프로테옴 (Uniprot UP000005640)을 이용하여 상기 목록을 정제하는데 이용하는데 (~1200개 단백질로 감소), 비-정본 동형(isoforms)들이 대부분 제거된다. 전사 공동활성제들 및 Pol II 연합된 단백질들은 GO 풍도(enrichments) IDS GO:0003713 및 GO:0045944를 이용하여 인간에서 식별되었다. 상기에서 정의된 참조 인간 프로테옴을 이용하여 인간 단백질 목록을 만들었고, 그리고 페록시좀 및 골지(golgi) 단백질은 Uniprot 검토 목록으로부터 식별되었다. 각 단백질의 경우, D2P2는 각 아미노산에 대한 무질서 경향을 검정하는데 이용되었다. D2P2 (Oates et al., 2013)에서 이용한 알고리점의 적어도 75%가 당해 잔기가 무질서화될 것으로 예상한다면, 이 단백질의 아미노산은 무질서화된 것으로 간주된다. 추가적으로, 전사 인자들의 경우, 주석이 달린(annotated) 모든 PFAM 도메인이 식별되었다 (총 5741개, 180개의 독특한 도메인). 공지의 DNA 결합 활성에 대한 교차-참조 PFAM 주석, 45 개의 독특한 고-신뢰성 DNA 결합-도메인의 하위 집합이 식별되었으며, 식별된 모든 도메인의 약 85%를 차지한다. 대다수의 TFs (>95%)는 적어도 하나의 식별된 DNA-결합 도메인을 보유하였다. 무질서 득점은 모든 TF의 모든 DNA-결합 영역 뿐만 아니라 대부분의 확인된 트랜스-활성화 도메인을 내포하는 서열의 나머지 부분에 대해 계산되었다.
시험관내 소적의 이미징 분석
시험관내 상 분리 이미징 실험을 분석하기 위하여, 소적을 식별하고, 이들의 크기 및 모양을 특징화하기 위하여 맞춤형 MATLABTM 스크립터가 기록되었다. 임의의 특정 실험 조건을 위해, 히스토그램의 피크와 크기 임계 값 (2 픽셀 반경)을 기반으로 한 강도 임계값을 사용하여 이미지를 세그먼트화했다. 소적 식별은 "스캐폴드" 채널 (MED1 + TFs의 경우 MED1, GCN4+MED15의 경우 GCN4)에서 실행했으며, 그리고 지역 및 종횡비가 결정되었다. 상기 시험관내 소적 검정법에 대한 풍도를 산출하기 위해, 소적은 상기 스캐폴드 채널에 의해 FIJI에서 관심 영역으로 정의되었으며, 그리고 당해 소적 안에 클라이언트의 최대 신호가 결정되었다. 선택된 스캐폴드는 MED1, Mediator 복합체, 또는 GCN4이었다. 이것은 Cin/out을 생성하기 위해 이미지의 백그라운드 클라이언트 신호로 나누었다. 풍도 득점는 실험 조건의 Cin/out을 대조군 형광 단백질 (GFP 또는 mCherry)의 Cin/out으로 나누어 계산했다.
데이터 및 소프트웨어 가용성
데이터세트
전체기탁:
GSE120476
주요 리소스(RESOURCES) 표
표 S4. 항체 표
표 S5. 구조체. 단백질들의 모든 서열은 다른 언급이 없는 한 인간 서열이다.
표 S6 RNA FISH 프로브 서열
실시예 4
포유류 이질성염색질은 뚜렷한 염색질 변형, 히스톤 H3 리신 9 삼중메틸화 (H3K9me3) 및 DNA 메틸화를 특징으로 하는 두 가지 주요 후생적 경로에 의해 제어된다. 이러한 변형은 억제 활성을 담당하는 판독자(reader) 단백질에 의해 특이적으로 인지되고, 결합된다. 가장 두드러진 것은, HP1α는 H3K9me3 변형의 판독자인 한편, MeCP2는 DNA 메틸화의 판독자다. HP1α 및 MeCP2는 포괄적(global) 유전자 제어에 연루된 일반적 염색질 조절제들이다. 이 두 단백질은 정상적인 발생에 필수적이며, 많은 조직에서 광범위하게 발현되며, 그리고 많은 상호작용 짝을 통하여 이들의 효과를 중재한다.
이질성염색질은 전통적으로 핵에서 정적이고, 접근하기 어려운 구조로 간주되어 왔다. 전사 침묵화의 지배적인 견해는 이질성염색질에서 염색질의 압축으로 기저 DNA로부터 RNA 중합효소와 같은 단백질들이 배제되고, 이로 인하여 전사가 억제된다는 것이다. 그러나, 일부 관찰에 따르면, 이질성염색질은 특정 단백질의 신속한 교환을 허용하는 더 역동적 어셈블리라는 것이 암시되었다. 염색질 변형자, 이를 테면, H3K9 메틸트랜스퍼라제 및 히스톤 데아세틸라제를 염색질로 소집하는 예를 들면, 이질성염색질 단백질 HP1α는 상이한 이질성염색질 도메인 사이에서, 뿐만 아니라 염색질-결합된 및 핵질 형태 사이에서 신속하게 교환된다.
액체-액체 상-분리된 (LLPS)은 이질적 농도를 갖는 별개의 액상으로 분자 탈-혼합(de-mixing)을 특징으로 하는 물리적 현상이다. 밀도가 높은 액체 상의 형성은 단백질의 낮은 복잡성 및 본질적으로 무질서한 도메인에 의해 발생하는 것과 같은 약한, 다가(multivalent) 분자간 상호 작용에 의해 주도된다. LLPS는 세포 조직화에서 기전으로 등장하여, 응축물이라고 하는 막-없는 소기관(organelles)의 형성을 주도하여, 생분자들을 구획하시키고, 막-없는 바디(bodies)로 농축시킨다.
MeCP2가 상-분리된 이질성염색질 구획화에 기여하는지 의문을 가졌다. 더욱이, 중증 신경적 증후군은 MeCP2 기능 상실 및 과다발현 모두에 의해 발생되며, 그리고 응축물 모델이 축소된 수준과 상승된 수준 모두가 관련된 증후군의 원인이 될 수 있는 지를 설명하는 가능성을 갖는다. 여기에서, MeCP2는 상 분리에 의한 역동적 액체 응축물을 형성하고, 이 성질이 이질성염색질 기능에 역할을 한다는 것을 보여준다. MeCP2는 이질성염색질에서 역동적 액체-유사 성질들을 갖는 핵 응축물을 형성한다. 이 단백질은 억제 인자들을 통합시킬 수 있는 시험관내 상-분리된 액체 소적을 형성할 수 있다. MeCP2의 C-말단 본질적으로 무질서화된 도메인은 시험관내 응축물 형성, 생체내 이질성염색질 연합, 그리고 이질성염색질 유전자 억제에 필수적이다. 이들 결과에서 MeCP2는 이질성염색질에서 억제 인자들을 구획화시키고, 농축시키는 기능을 한다는 것이 암시된다.
결과
액체-유사 이질성염색질 응축물들에서 MeCP2와 HP1α 잔기
MeCP2가 이질성염색질에서 이의 역동적 거동을 조사함으로써, 포유류 이질성염색질의 역동적 액체 응축물 성질에 기여할 수 있는 지 여부를 조사하기로 했다. 내생성 수준에서 생세포 안에서 MeCP2를 연구하기 위하여, CRISPR/Cas9 시스템을 이용하여 단량체 강화된 녹색 형광 단백질 (GFP)로 MeCP2를 테그하도록 뮤린 배아 줄기 세포 (mESCs)를 공작하였다. 동일한 세포 유형에서 MeCP2와 HP1α의 역동성을 비교하기 위해, 추가적으로 공작된 mESCs는 HP1α에 mCherry를 테그하도록 mESCs를 추가로 공작하였다. MeCP2-GFP 및 HP1α-mCherry 세포 모두의 생-세포 형광 현미경에서 DNA 조밀한 이질성염색질 촛점으로 중첩된 개별적 핵 바디(bodies)가 나타났다 (도 43A 및 도 43B). 동일한 핵에서 MeCP2-GFP와 HP1α-mCherry 신호 비교에서 이 둘은 모두 mESCs의 동일한 이질성염색질 응축물에서 발생됨을 보여준다 (도 43C). 생-세포 이미지의 분석에서 핵당 14.9 ± 2.7 MeCP2 응축물이 있고, 응축물당 1.04 ± 1.47 μm3 (평균 ± 표준 편차)의 용적을 갖는다는 것을 보여준다. 이들 결과는 mESCs에서 정상적으로 발현될 때, MeCP2와 HP1α는 이질성염색질 응축물의 공유 성분임을 나타낸다.
다음으로, MeCP2 응축물들이 상 분리에 의해 형성된 액체 응축물의 특질을 디스플레이하는 지의 여부를 조사하였다. 액체-액체 상 분리에 의해 형성된 응축물들의 주요 특징은 분자들의 역동적 내부 재배열 및 내부-외부 교환이며 (Hyman et al. 2014; Banani et al. 2017; Shin & Brangwynne 2017), 이것은 광표백 (FRAP) 실험 후, 형광 복구를 이용하여 측정할 수 있다. 생-세포에서 MeCP2 응축물들의 역동성을 조사하기 위해, 내생성으로 테그된 MeCP2-GFP mESCs 상에서 FRAP 실험을 실행하였다. MeCP2-GFP 응축물들은 초 단위로 광표백 후 형광을 복구하였다 (도 43D 및 도 43E). HP1α-mCherry mESCs의 FRAP는 유사한 복구 동역학을 보여주었다 (도 43F 및 도 43G). 정량적 분석에서 MeCP2-GFP의 경우 복구 하프-타임(half-time)은 ~10 s이며, 이동 분취는 ~80%이었다(도 43H 및 도 43I). 따라서, MeCP2와 HP1α는 모두 이질성염색질 응축물들에서 역동적 액체-유사 성질들을 보여준다.
MeCP2는 시험관내 상-분리된 액체 소적을 형성한다
MeCP2는 이의 구조화된 메틸-결합 도메인 (MBD)의 측면에 두 개의 보존된 본질적으로 무질서화된 영역 (IDRs)을 함유한다 (도 44A 및 도 50A)(Ghosh et al. 2010; Wakefield et al. 1999; Nan et al. 1993; Adams et al. 2007). 응축물 형성에 관여하는 단백질들은 대개 IDRs을 함유하며, 정제될 때 시험관내 상-분리된 액체 소적을 형성할 수 있다 (Burke et al. 2015; Nott et al. 2015; Lin et al. 2015; Kato et al. 2012; Sabari et al. 2018). MeCP2가 상-분리된 소적을 형성할 수 있는 지 여부를 결정하기 위해, 재조합 MeCP2-GFP 융합 단백질을 정제하고, 소적 형성 검정법으로 연구하였다. 핵 안의 고-농도를 모방하기 위해 군집제를 함유하는 완충제로 단백질의 추가로 MeCP2-GFP이 농축된 구형 소적 형성이 유도되었으며, 이는 형광 현미경 (도 44B)에 의해 탐지되었다. 상 분리된 소적은 이 시스템 안의 성분들의 농도에 의해 전형적으로 크기가 변경된다(Brangwynne 2013). MeCP2-GFP는 160 nM 내지 10 μM 범위 농도에서 소적을 형성하는 것으로 밝혀졌고, 이 소적은 단백질 농도 증가에 따라 크기가 증가된다 (도 44B-D 및 도 50B). 액체 소적은 융합할 수 있고, 소적 융합은 MeCP2-GFP로 관찰되었다 (도 44E). MeCP2-GFP 소적의 FRAP는 MeCP2-GFP 소적 안에 분자들의 역동적 재배열을 나타내는 복구를 보여주었다(도 44F). HP1α-mCherry는 상-분리된 소적을 형성한다는 것을 알았고 (도 50C), 이러한 사실은 기존 보고서에서 확인된다 (Strom et al. 2017; Larson et al. 2017). 이들 결과에서 MeCP2는 상 분리을 겪어 액체 소적을 형성할 수 있음이 실증되었으며, 이러한 사실로 MeCP2와 HP1α 모두 시험관내 상 분리를 겪는 능력을 갖춘 이질성염색질 성분이라는 결론에 이른다.
상 분리는 단백질 IDRs 안의 아미노산 잔기 사이의 다가(multivalent)의 약한 분자간 상호작용에 의해 구동될 수 있으며; 전하를 띈 잔기와 방향족 잔기는 모두 상 분리에 기여함을 보여주었다. MeCP2의 큰 두 개의 IDRs의 아미노산 함량 검사에서 전하를 띈 잔기의 풍도는 두드러진 반면, 방향족 잔기는 몇 개 뿐이었다 (도 44A 및 도 50A). 정전기적 상호작용이 MeCP2 상 분리에 기여한다면, 소적을 형성하는 MeCP2의 능력은 소적 형성 검정법에서 염 농도가 증가함에 따라 감소되어야 하고, 이는 이온 상호작용을 파괴할 것이다. 또한, MeCP2 소적은 염 농도 증가에 의해 줄어들었으며 (도 44G-도 44I), 이는 MeCP2의 상-분리된 소적을 형성함에 정전기적 상호작용이 기여함을 암시한다. 염 및 단백질 농도의 변화에서 MeCP2-GFP 소적 능력을 검사함으로써, MeCP2-GFP 소적 형성의 상 다이어그램이 생성되었다 (도 44J 및 도 50D).
응축물 형성, 이질성염색질 연합 및 유전자 억제는 MeCP2 C-말단 IDR에 의존적이다.
상-분리된 소적을 형성하는 MeCP2의 능력이 이의 IDRs의 하나 또는 둘 모두에 의존적인지를 결정하기 위해, N-말단 IDR (ΔIDR-1) 또는 C-말단 IDR (ΔIDR-2)이 결여된 재조합 MeCP2-GFP 결손 돌연변이체를 정제시키고 (도 45A), 시험관내 소적을 형성하는 이들의 능력을 검사하였다. 소적 검정법에서 N-말단 IDR (ΔIDR-1)이 결여된 돌연변이체는 소적을 형성하는 능력을 유지하지만, C-말단 IDR (ΔIDR-2)이 결여된 돌연변이체는 이 능력이 상실된다 (도 45B). 이들 결과는 시험관내 상-분리된 소적을 형성하는 MeCP2의 능력은 이의 C-말단 IDR에 의존적임을 나타낸다.
그 다음, N-말단 IDR (ΔIDR-1) 또는 C-말단 IDR (ΔIDR-2)이 결여된 MeCP2-GFP 돌연변이체가 내생성 Mecp2 좌로부터 이들 단백질을 발현시키도록 공작된 mESCs를 이용함으로써 세포 안에서 이질성염색질과 연합되는 능력을 조사하였다. 생-세포 형광 현미경에서 ΔIDR-1 MeCP2는 이질성염색질에 국소화되고, 전장의 MeCP2와 유사한 풍도를 나타내는 것으로 드러났다 (도 45C 및 도 45D). 대조적으로, ΔIDR-2 MeCP2는 이질성염색질에서 국소화 및 풍도가 축소됨을 나타내었다 (도 45C 및 도 45D). 이들 결과는 시험관내 응축물 형성 및 생체내 이질성염색질 연합은 모두 MeCP2의 C-말단 IDR에 의존적임을 나타낸다.
MeCP2가 이질성염색질 응축물들에서 국소화 및 농축을 통하여 유전자 억제를 촉진시키는 기능을 한다면, IDR-2의 상실은 반복성 요소 침묵화에 영향을 줄 것으로 기대한다. 또한, 전장 MeCP2 세포들과 비교하였을 때, ΔIDR-2 MeCP2 세포들에서 주요 새틀라이트 반복 발현의 유의적인 증가가 있었다(도 45E). 이와 함께, 이들 결과로부터 응축물 형성, 이질성염색질 국소화 및 유전자 침묵화는 MeCP2의 C-말단 IDR에 공통적으로 의존적임이 암시된다.
MeCP2 응축물들은 이질성염색질 인자들을 구획화할 수 있다
응축물들은 응축된 액체 상(phase) 내의 인자들을 구획화하고, 농축시키는 기능을 하는 것으로 간주된다. MeCP2가 이질성염색질과 연합되는 것으로 알려진 소적 각종 인자들로 구획화할 수 있는 지 여부를 조사하기 위해 핵 추출물과 함께 소적 형성 검정법을 이용하였다 (도 46A). 핵 추출물을 이용하였는데, 그 이유는 이들은 핵의 모든 성분들을 함유하고, 인위적인 군집제 추가 없이 응축물 형성이 일어날 수 있기 때문이다. 고-염 조건 하에서 MeCP2-mCherry 또는 MeCP2-ΔIDR-2-mCherry를 발현시키는 HEK293 세포로부터 핵 추출물을 준비하였고, 당해 핵 추출물의 염 농도를 감축시킴으로써 소적 형성이 유도되었다. MeCP2-mCherry를 발현시키지만, MeCP2-ΔIDR-2-mCherry를 발현시키지 않는 세포의 핵 추출물에서 소적이 형성된다는 것을 알았다 (도 46B). 응축물들은 단백질 성분들을 농축시키고, 따라서 주변 상보다 더 조밀하게 되며, 이러한 조밀한 물질을 가라앉히기 위해 당해 핵 추출물을 원심분리시키고, 웨스턴 블랏으로 이 물질을 분석하였다. 이들 결과에서 HP1α, TBL1R (트랜스듀신 베타-유사 단백질), HDAC3 (히스톤 데아세틸라제 3) 및 SMRT (레티노 및 갑상샘 수용체의 침묵화 매개체)를 비롯한, 이질성염색질과 연합되는 것으로 알려진 억제제들은 MeCP2-mCherry 추출물에는 풍부하였지만, MeCP2-ΔIDR-2-mCherry 추출물에는 그렇지 않았음이 드러났다 (도 46C 및 도 46D). 대조적으로, 진정염색질(euchromatin)의 성분들, 이를 테면, RNA 중합효소 II (RPB1)은 풍부하지 않았다 (도 46C 및 도 46D). 이들 결과는 MeCP2가 핵 추출물에서 이질성염색질과 함께 연합된 억제 인자들을 구획화시킬 수 있고, 농축시킬 수 있는 소적을 형성할 수 있음을 나타낸다.
MeCP2 IDR-2는 이질성염색질 응축물들로 분할할 수 있다
응축물 형성 단백질들의 IDRs는 단백질들을 특정 응축물들로 보내는 것으로 제안되었지만, 그러나 이러한 어드레싱(addressing) 기능에 대한 직접적인 증거는 거의 없다 (Banani et al. 2017). 따라서, MeCP2 IDR-2가 세포 안에서 mCherry 단백질을 이질성염색질로 보내는데 충분한 지 여부를 연구하였다 (도 47A). mCherry 에 융합된 MeCP2 IDR-2 (mCherry-MeCP2-IDR-2) 및 대조군 mCherry는 mESCs에서 이소성(ectopically) 발현되었고, 이들의 국소화는 현미경으로 검사하였다. mCherry-MeCP2-IDR-2는 DNA-조밀한 이질성염색질 및 핵소체 또는 상 분리에 의해 형성된 또다른 핵 바디에 선호적으로 국소화되었다 (도 47B-도 47D). 대조적으로, mCherry 단독은 이질성염색질 또는 핵소체에서 풍부하지 않았다 (도 47B-도 47C). 이들 결과에서 MeCP2-IDR-2는 세포에서 특이적 분할 거동 정도를 나타내며, 이는 선호적 분할이 특정 응축물들로 인자들을 적절하게 내는데 기여할 수 있다는 발상과 일치한다.
MeCP2는 마우스 뇌 뉴런의 이질성염색질에 농축된다
기능 돌연변이의 MECP2 상실은 Rett 증후군을 유발하고, 유전자 복제가 MECP2 복제 증후군을 유발하기 때문에 MeCP2를 집중적으로 연구하였으며; 이들 두 증후군은 모두 심각한 지적 장애를 특징으로 하는 신경적 장애와 관련된다. MeCP2는 모든 동물 조직에서 발현되지만, 뉴런에서 특히 높은 수준으로 발현된다
이러한 이유로(Skene et al.2010) MeCP2가 뮤린 뇌의 뉴런에서 액체-유사 응축물에 또한 농축되는 지 여부를 결정하기로 하였다. Rett 증후군의 마우스 모델은 인간 증후군에서 관찰되는 표현형을 충실히 재생한다. 리포터 ES 세포의 내성성 좌로 통합된 MECP2-GFP 및 MED1-GFP 구조체로부터 고-등급의 키메라 마우스가 만들어졌다. 생후 2개월 시점에, 포르말린 관류에 의한 고정화 후, 뮤린 뇌를 10 μm 슬라이스로 절단하였다. 형광 현미경에서 MeCP2는 Map2-발현시키는 뉴런 및 PU.1-발현시키는 미세아교세포에서 DNA-조밀한 이질성염색질 촛점에서 개별적 핵 바디(bodies)를 형성하는 것으로 드러났다 (도 48A-도 48C). 새로 준비된 살아있는 뇌 조직 섹션을 이용한 FRAP 실험에서 MeCP2-GFP는 이들 이질성염색질 응축물에서 상당히 역동적임을 보여주었다 (도 48D 및 도 48E). 예상된 바와 같이, MED1-GFP 푼차(puncta)는 더 작고, 더 많았으며, 그리고 이질성염색질과 연합되지 않았다 (도 48F). 이들 결과는 MeCP2가 살아있는 뮤린 뉴런의 이질성염색질에서 농축됨을 나타내고, 이들 조직에서 이질성염색질은 역동적 응축물로 거동함을 암시한다.
논의
여기에서 MeCP2는 ES 세포 및 뇌 조직 뉴런 모두에서 역동적 이질성염색질 응축물의 성분임을 보여준다. MeCP2의 C-말단 IDR은 이의 응축물 형성 성질들, 시험관내에서 억제 인자들을 구획화시키는 이의 능력, 그리고 생체내 이질성염색질 연합 및 유전자 침묵화에 필수적이다. 이 MeCP2 IDR은 당해 단백질의 나머지와 독립적으로 발현되고, 당해 도메인을 세포의 이질성염색질 응축물들로 보내고, 통합시키는데 충분하다. 따라서, 우리 결과에서 MeCP2는 다중 세포 유형에서 역동적 이질성염색질 응축물의 성분이라는 것을 보여주며, 이질성염색질과 MeCP2와 상호작용은 이의 메틸 DNA-결합 및 이의 응축물 연합 성질 모두에 의해 중재될 수 있음을 암시한다.
MeCP2와 HP1α는 모두 이질성염색질 응축물들의 성분이라는 관찰은 당해 두 단백질이 정상적인 발생에 필수적이며, 많은 조직에서 광범위하게 발현되고, 그리고 유전자 억제에 관여한다는 기존 증거와 일치한다 (Allshire & Madhani 2018; Ip et al. 2018; Ausiㆃ et al. 2014; Lyst & Bird 2015; Guy et al. 2011). 기존 연구들은 DNA 메틸화, H3K9 메틸화 및 결합 단백질들 MeCP2와 HP1α 간에 가교가 발생된다고 보고하였다. 예를 들면, 동원체주변(pericentromeric) 새틀라이트 반복부의 이질성염색질화 및 배 이식 후 POU5F1 유전자 침묵화에서, 히스톤 메틸트랜스퍼라제 G9a는 히스톤 H3K9를 트리메틸화시키고, 이는 HP1α 결합을 가능하게 하여, DNMT3에 결합하고, 이는 DNA를 메틸화시켜, MeCP2 결합을 유도한다. MeCP2와 HP1α는 모두 유전자 침묵화에 관여하는 추가 짝, 이를 테면, 히스톤 데아세틸라제를 동원시킬 수 있다. HP1α에 관하여 전술한 것들과 함께 우리 결과는 MeCP2와 HP1α는 모두 이질성염색질 구획의 침묵 상태를 유지시키기 위해 이들 억제 인자들을 구획화시키고, 농축시킬 수 있음을 암시한다.
이질성염색질 단백질들의 상 분리는 억제 인자들을 농축시키고 구획화시키는 기능을 한다는 관찰로 이들 단백질에 대하여 기술된 다양한 상호작용을 설명하는 단순화 모델이 제공된다. 이질성염색질은 수 백개의 단백질 인자와 연합된다. MeCP2와 HP1α는 모두 수 많은 다양한 상호작용 짝과 상호작용하는 것으로 관찰되었다. 이러한 상호작용 짝들이 어떻게 물리적으로 상호작용하고, 이질성염색질 바디(bodies)와 안정적으로 결합하는 지는 단백질-단백질 상호 작용의 고전적인 락-앤-키 모델에서 받아들이기 곤란하다. 역동적 상호작용 네트워크 안에서 억제 인자들을 농축시키고, 구획화시키는 상-분리된 이질성염색질 응축물을 형성하는 MeCP2와 HP1α의 능력이 이러한 관찰을 더 잘 설명한다. 특히, 억제 성분들을 특이적으로 농출시키고, 활성 전사 기구는 그렇게 하지 않는 이질성염색질 응축물의 능력은 활성 및 억제 인자들이 응축물의 상-분리 성질을 통하여 이들 별개의 응축물로 특이적으로 구획화되는 기전이 암시된다.
이 모델은 Rett 증후군의 원인이 되는 MeCP2 돌연변이가 DNA-결합 도메인 또는 C-말단 IDR에서 발생될 수 있는 지를 설명할 것이며, 이때 대부분 돌연변이는 상기 IDR의 상실 또는 절두를 여기한다 (도 48A).
이질성염색질 단백질들을 인코딩하는 유전자들을 파괴하는 돌연변이가 많은 질환에서 일어난다. 이러한 돌연변이들이 이질성염색질 상 분리의 파괴를 통하여 질환 표현형을 초래할 수 있는 지 여부를 추측하는 것은 흥미롭다. 특히, MECP2에서 미스센스 및 넌센스 돌연변이는 10,000명중 1명 꼴의 어린 소녀들에게 영향을 주는 신경발달 장애인 Rett 증후군을 야기한다 (Amir et al. 1999). 이들 돌연변이는 대개 MeCP2의 IDRs에 영향을 끼치며, 이질성염색질에서 상 분리를 겪거나, 또는 이질성염색질 응축물 안에 주요 인자들을 구획화시키는 MeCP2의 능력을 교란시킬 수 있다. 추가적으로, MECP2 유전자 용량(dosage)에서 병원성 증가는 젊은 남성의 관련된 신경발달 장애인 MECP2 복제 증후군을 야기한다 (Van Esch et al. 2005). 상 분리된 시스템은 성분 인자들의 농도에서 작은 변화에도 민감할 수 있고, 이는 유전자 용량의 일탈적인 증가 또는 감소가 응축물 거동에 실질적인 영향을 가질 수 있음을 암시한다. 이질성염색질 상 분리에서 질환 돌연변이의 영향을 이해는 분자 병리 이해 및 이들 질환을 치료하는 새로운 치료요법적 기회를 이해하는데 중요할 수 있다.
방법
세포 배양 조건
세포 배양
V6.5 뮤린 배아 줄기 세포 (ESCs)는 0.2% 젤라틴 (Sigma G1890)피복된 조직 배양 처리된 플레이트의 2i/LIF 배지에서 배양되었다. ESCs는 가습화된 인큐베이터에서 5% CO2, 37 ℃에서 성장시켰다. 세포들은 TrypLE Express (Gibco 12604)를 이용하여 매 2-3일마다 해리시킴으로써 계대되었다. 상기 해리 반응은 혈청/LIF 배지를 이용하여 중지되었다. 세포들은 MycoAlert Mycoplasma Detection Kit (Lonza LT07-218)를 이용하여 미코플라스마에 대해 정규적으로 테스트되었고, 음성으로 밝혀졌다.
HEK293T 세포는 ATCC에서 얻었고, 고-포도당, 10% 태아 소 혈청 (Hyclone, SH3007103으로 특징지어짐) 2mM L-글루타민 및 100U/mL 페니실린-스트렙토마이신 (GIBCO 15140)와 함께 DMEM (GIBCO)에서 배양되었다.
배지 조성
2i/LIF 배지의 조성은 다음과 같다: 0.5X N2 보충물 (Gibco 17502), 0.5X B27 보충물 (Gibco 17504), 2 mM L-글루타민 (Gibco 25030), 1X MEM 비-필수 아미노산 (Gibco 11140), 100 U/mL 페니실린-스트렙토마이신 (Gibco 15140), 0.1 mM 2-멀캅토에탄올 (Sigma M7522), 3 μM CHIR99021 (Stemgent 04-0004), 1 μM PD0325901 (Stemgent 04-0006), 그리고 1000 U/mL 백혈병 저해제 인자 (LIF) (ESGRO ESG1107)가 보충된 DMEM/F12 (Gibco 11320).
혈청/LIF 배지의 조성은 다음과 같다: 15% 태아 소 혈청 (Sigma F4135), 2 mM L-글루타민 (Gibco 25030), 1X MEM 비-필수 아미노산, 100 U/mL 페니실린-스트렙토마이신 (Gibco 15140), 0.1 mM 2-멀캅토에탄올 (Sigma M7522), 그리고 1000 U/mL 백혈병 저해제 인자 (LIF) (ESGRO ESG1107)가 보충된 KnockOut DMEM (Gibco 10829).
게놈 편집
CRISPR/Cas9 시스템을 이용하여 유전공학적으로 변형된 ESC 계통을 만들었다. 표적-특이적 서열들은 sgRNA 백본, 코돈-최적화된 Cas9 형태, 그리고 mCherry 또는 BFP (R. Jaenisch로부터 선물로 받음)를 함유하는 플라스미드로 클론시켰다. MeCP2-mEGFP 및 HP1a-mCherry 내생성으로 테그된 계통의 생성을 위해, 상동성 지향된(directed) 복구 주형은 NEBuilder HiFi DNA Master Mix (NEB E2621S)를 이용하여 pUC19로 클론되었다. mEGFP 또는 mCherry cDNA 서열로 구성된 상동성 복구 주형은 PCR을 이용하여 게놈 DNA로부터 증폭된 800 bp 상동성 아암(arms)의 어느 한 쪽에 측면으로 위치한다.
세포 계통을 만들기 위해, 750,000개 세포는 Lipofectamine 3000 (Invitrogen L3000)을 이용하여 833 ng Cas9 플라스미드와 1666 ng 비-선형화된 상동성 복구 주형과 함께 형질감염되었다. 형질감염 후 48 시간 시점에서 형질감염된 세포를 농축시키기 위해 Cas9 플라스미드에 인코드된 mCherry 또는 BFP 형광 단백질 존재에 대해 세포를 분류하였다. 이 집단은 GFP 또는 mCherry의 존재에 대하여 2차 분류 전, 1 주 동안 확장되도록 하였다. 40,000개의 GFP 양성 세포는 6-웰 플레이트에서 연속 희석으로 도말되며, 1 주일 간 확장시킨 후, 96-웰 플레이트로 수작업으로 개별 콜로니를 찍어넣었다. 삽입을 확인하기 위해 PCR 유전자형 확인을 이용하여 성공적인 표적화에 대해 24개 콜로니를 스크리닝하였다.
생-세포 이미징
생-세포 이미징 조건
세포들을 35 mm 유리 플레이트 (Mattek Corporation P35G-1.5-20-C) 상에서 성장시키고, Airyscan 검출기 (Zeiss, Thornwood, NY)와 함께 LSM880 공촛점 현미경을 이용하여 2i/LIF 배지에서 이미지화하였다. 세포는 37 ℃ 가습화된 대기가 보충된 37 ℃ 가열 단계에서 이미지화되었다. 추가적으로, 상기 현미경은 37 ℃로 가열된 항온 챔버로 감싸두었다. 촬영에는 ZEN 블랙 에디션 버젼 2.3 (Zeiss, Thornwood NY)이 이용되었다. Plan-Apochromat 63x/1.4 오일 대물렌즈와 함께 초-해상(SR) 모드의 Airyscan 검출기로 이미지를 얻었다. Airyscan 미-가공 이미지는 ZEN 2.3 (Zeiss, Thornwood NY)로 처리하였다.
광표백 후 형광 복구 (FRAP)
LSM880 Airyscan 현미경에서 488nm 및 561nm 레이져로 FRAP가 실행되었다. 100% 레이져 파워에서 표백화가 실행되었고, 매 2초마다 이미지가 수집되었다. 각 이미지는 LSM880 Airyscan 평균 수용력을 이용하며, 두 개 이미지의 평균 결과다. 복합 이미지는 ZEN2.3을 이용하여 가공하였다.
광표백 후 복구는 우선 배경 값을 차감시키고, 그 다음 광표백을 카운트하기 위해 별도의 주변 세포 안의 응축물 안에 신호로 정상화된 표백된 응축물 내 상실된 형광 강도를 정량화시킴으로써 산출되었다. 비록 정상화는 맞춤 분석을 이용하여 실행하였지만, MATLAB script FRAPPA Profiler를 이용하여 이미지에서 강도 값을 산출하였다.
MeCP2 응축물 용적 계산
ZEN 2.3 소프트웨어를 이용하여 Z-스택 이미지를 얻었다. 단순화된 촛점 과정을 위해 DNA를 착색시키는 SiR-DNA 염료 (Spirochrome SC007)로 세포를 처리하였다. 원-적외선 (SiR-DNA) 신호를 이용하여 핵의 상단- 및 하단-z 경계를 결정하였다. 그 다음, 핵질을 통하여 488 채널 또는 561 채널 그리고 643 채널 모두에서 0.19 미크론 단계로 이미지를 촬영하였다. 이미지는 단일 Airyscan 이미지 결과이며, ZEN 2.3 소프트웨어를 이용하여 가공하였다.
MeCP2 응축물의 용적을 정량화시키기 위해, SiR-DNA 신호를 이용하여 주어진 세포의 핵-경계를 특정하였다. 이 경계를 이용하여 488 이미지 또는 561 이미지에서 비-핵 신호를 차단시켰다. 일단 비-핵 신호가 차단되었으면, 488 이미지 및 561 이미지는 7.0 픽셀의 정중 필터를 거치고, 개체는 FIJI 3D Object 카운트를 이용하여 카운트하고, 정량화되며, 임계값은 154이다.
분할 계수의 계산
생-세포 이미징에서 분할-계수는 Fiji를 이용하여 산출되었다. 세포 당 단일 촛점 평면을 이용하여, 응축물 안의 평균 신호 강도가 정량화되었으며, 상기 핵 경계 안의 8-12개의 비-이질성염색질 영역으로 부터의 평균 신호 강호와 비교하였다. 이질성염색질 영역과 핵 경계의 한계는 Hoechst 채널에서 정의되었다. 선별된 평면에서 >3 이질성염색질 촛점을 갖는 세포는 산출된 분할 계수를 보유하였다. 이 개별 계수는 실험에서 단일 n을 나타낸다.
단백질 정제
단백질 발현 벡터 클로닝
인간 cDNA는 T7 pET 발현 벡터의 변형된 형태로 클론되었다. 상기 기본 벡터는 N-말단 6xHis에 이어서 mEGFP 또는 mCherry 그리고 14개 아미노산 링커 서열 "GAPGSAGSAAGGSG." (서열 식별 번호: 14)을 인코드하는 서열을 내포하도록 공작되었고, NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix (NEB E2621S)를 이용하여 링커 서열 다음에 cDNA 서열(PCR에 의해 생성)을 삽입시켰다. 벡터 발현시키는 mEGFP 만을 발현시키는 벡터는 상기 링커 서열에 이어서 STOP 코돈을 내포한다. 돌연변이체 cDNA 서열은 PCR에 의해 만들어지고, 상기에서 기술된 바와 같이 동일한 기본 벡터 안으로 삽입되었다. 모든 발현 구조체를 서열화하여 서열 정체성을 확보하였다.
단백질 정제
단백질 발현을 위해, 플라스미드를 LOBSTR 세포 안으로 형질전환시키고, 다음과 같이 성장시켰다. 새로운 박테리아 콜로니를 카나마이신 및 클로람페니콜을 함유하는 LB 배지에 접종시키고, 하룻밤 동안 37 ℃에서 성장시켰다. 세포들은 새로 추가된 카나마이신 및 클로람페니콜과 함께 사전-데워진 LB 500mL에서 1:30으로 희석되었고, 1.5 시간 동안 37 ℃에서 성장시켰다. 발현을 유도하기 위해, IPTG는 상기 박테리아 배양물에 1 mM 최종 농도로 추가되었고, 4 시간 동안 성장을 지속시켰다. 그 다음 유도된 박테리아는 원심분리에 의해 펠렛화시키고, 박테리아 펠렛은 사용할 때까지 -80 ℃에 보관시켰다.
500 mL 세포 펠렛은 15ml의 용해 완충제 (50mM Tris-HCl pH 7.5, 500 mM NaCl, 그리고 1X 완전한 프로테아제 저해제)에서 재현탁된 후, 15초-작동, 60초-중간 주기를 10회하여 음파파쇄되었다. 12,000g, 30 분, 4℃에서 원심분리에 의해 맑아진 용해물은 1mL의 사전-평형화된 Ni-NTA 아가로스에 추가되고, 그리고 4℃에서 1.5 시간 동안 회전시켰다. 슬러리는 3,000rpm에서 10분 동안 원심분리시키고, 10 용적의 용해 완충제로 세척하고, 그리고 단백질들은 50 mM 이미다졸, 100 mM 이미다졸, 또는 3 X 250 mM 이미다졸을 함유하는 용해 완충제로 와 함께 회전시키면서 10분 또는 그 이상의분 동안 항온처리하고, 이어서 원심분리하여 용리시키고, 겔 분석하였다. 정확한 크기의 단백질을 함유하는 분취물은 4 ℃에서 50 mM Tris-HCl pH 7.5, 125 mM NaCl, 10% 글리세롤 및 1 mM DTT를 함유하는 완충제를 두 번 교환시키면서 투석하였다. 정제된 단백질들의 단백질 농도는 Pierce BCA Protein Assay Kit(Thermo Scientific 23225)를 이용하여 결정하였다.
시험관내 소적 검정법
시험관내 소적 검정법
단백질들은 10% 글리세롤, 50 mM Tris-HCl pH 7.5, 500 mM NaCl, 1 mM DTT에 보관되었다. Amicon 초-원심분리 필터 (30K 또는 50K MWCO, Millipore)를 이용하여 원하는 농도로 단백질들을 농축시켰다. 원고를 통하여 개별 반응에 대해 특정 소적 검정법의 반응 조건이 표시된다. 소적 검정법은 8-튜브 PCR 스트립(strip)에서 실행되었다. 10% PEG-8000, 10% 글리세롤, 50 mM Tris-HCl pH 7.5, 1 mM DTT를 포함하는 소적 형성 완충제에서 0mM에서부터 500mM까지의 NaCl 염을 가변시키면서, 재조합 단백질 상 분리가 유도되었다. 그 다음, 원하는 양의 단백질을 추가시켜 상 전이를 유도하였고, 이 용액은 피펫팅(pipetting)을 통하여 혼합되었다. 그 다음 반응물은 유리 현미경 슬라이드 또는 유리-바닥의 384개 웰-플레이트 상에 탑재된 이중-측면 테이프의 2개 다란한 스크립 상에 탑재된 유리 커버슬립에 의해 만들어진 맞춤 슬라이드 챔버에 적하되었다. 그 다음 이 반응물은 100x 대물렌즈를 갖춘 Andor 공촛점 현미경으로 이미지화시켰다. 다른 언급이 없는 한, 제시된 이미지는 유리 커버슬립 또는 384개 웰-플레이트의 유리 바닥에 자리잡은 소적의 이미지다.
데이터 분석
시험관내 상 분리 이미징 실험을 분석하기 위해, 소적을 식별하고, 이들의 크기, 종횡비, 응축된 분취 및 분할 인자를 특징화하기 위하여 맞춤형 MATLAB 스크립터가 기록되었다. 임의의 특정 실험 조건을 위해, 히스토그램의 피크와 크기 임계 값 (2-픽셀 반경)을 기반으로 한 강도 임계값을 사용하여 이미지를 세그먼트화했고, 이 지점에서 관심대상 영역이 정의되고, 신호 강도가 소적 안팎에서 정량화될 수 있다.
핵 추출물에서 소적 검정법
핵 추출물의 준비
핵 추출물은 HEK293T세포에서 준비되었다. 세포를 격렬하게 피펫팅하여 배양 플레이트에서 제거하고, 1,000Xg에서 펠릿화했다. 상기 펠렛은 추가된 신선한 프로테아제 저해제와 함께 TMSD50 완충제 (20mM HEPES, 5mM MgCl2 250mM 수크로스, 1mM DTT, 50mM NaCl)에서 재현탁되었다. 세포들을 30분 동안 4 도씨에서 TMSD50 완충제 안에서 교반시켜, 핵을 추출하였다. 그 다음 이 용액을 3,500Xg에서 10분 동안 회전시켰다. 핵은 Mnase 완충제 (20mM HEPES, 100mM NaCl, 5mM MgCl2, 5mM CaCl2, 프로테아제 저해제)에서 세척되었으며, 3,500Xg에서 다시 회전시켰다. 그 다음 핵을 Mnase 완충제의 한 개 펠렛 용적(one pellet volume)에 재현탁시키고, 1U Mnase를 이용하여 15분 동안 37도씨에서 처리하였다. 반응은 한 개 펠렛 용적의 중단 완충제 (20mM HEPES, 500mM NaCl, 5mM MgCl2, 20% 글리세롤, 15mM EGTA, 프로테아제 저해제)를 이용하여 중단시켰다. 그런 다음, 분해된 핵을 팁 음파파쇄기(tip sonicator)에서 진폭 20에서 20 회 음파파쇄처리하고, 2,700Xg에서 두 번 회전시켜 찌꺼기를 가라앉혀 제거하였다.
핵 추출물 소적 형성
핵 추출물의 소적 형성 검정법은 원액 핵 추출물을 완충제 B (10% 글리세롤, 20mM HEPES)로 1:2로 희석시켜, 전체 염을 150mM NaCl로 축소시켜 실행하였다. 검정법은 8-웰 PCR 스트립에서 수행되었으며, 여기서 반응물은 유리-바닥 384개 웰-플레이트에 로딩되기 전, 15분 동안 배양되었다. 150X에서 Andor 공촛점 현미경으로 이미징하기 전, 15분 동안 플레이트의 유리 바닥위에 소적이 자라잡을 수 있도록 하였다.
핵 추출물 펠렛화
1.5mL Eppendorf 튜브에서 위와 같이 소적을 형성하고, 10분 동안 배양했다. 이 시점에서, 반응물은 2,700Xg에서 10분 동안 원심 분리되었다. 모든 상청액이 제거되었다. 그 다음 상기 튜브를 1mL 소적 형성 완충제 (20mM HEPES, 15% 글리세롤, 150mM NaCl, 6.6mM MgCl2, 5mM EGTA, 1.7mM CaCl2)를 이용하여 부드럽게 세척하였다. 세척 용액을 제거한 후, 25% βME, 25% XT 완충제 (Bio-rad), 50% 물을 당해 튜브에 추가하여, 웨스턴 블랏팅을 위한 펠렛 분취을 준비하였다. 소적 형성에 이용된 물질의 10%는 또한 웨스턴 블랏팅을 위하여 βME, XT 완충제 및 물과 복합시켰다.
웨스턴 블랏 분석
상기에서 기술된 단백질 용액은 10% Bis-Tris 겔 (Bio-Rad) 상에서, 80V에서 15분 동안, 이어서 150V에서 ~1.5 시간 동안 이동시켰다. 그 다음 단백질을 4도씨, 전이 완충제(25mM Tris, 192mM 글리신, 10% 메탄올)에서 0.45μm PVDF 막 (Millipore, IPVH00010)으로 2 시간 동안 260mA에서 전이시켰다. 그 다음 막을 실온에서 1시간 동안 5% 무지방-우유/TBST에서 차단시켰다. 그 다음, 표시된 단백질에 대한 항체와 함께 5% 우유/TBST에서 4도씨, 하룻밤 동안 교반시키면서 막을 항온처리하였다. 그 다음, 막은 TBST로 3회 세척하였는데, 각 세척은 10분 동안 실시되며, 1hr 동안 실온에서 2차 항체와 함께 항온처리되며, TBST로 다시 3회 세척하였고, 그리고 ECL 또는 fempto-ECL 물질 (Thermo Scientific)를 이용하여 Bio-Rad chemidoc 상에서 이미지화하였다.
qPCR 분석
RNA는 RNeasy 키트 (Qiagen)를 이용하여 수거하였다. 그 다음 역 전사효소 반응은 Superscript3 (Invitrogen)을 이용하여 실행하였다. 다음의 TaqMan 프로브를 이용하여 qPCRs를 실행하였다:
mL1-Orf2a_1f- cctccattgttggtgggatt (서열 식별 번호: 221); mL1-Orf2a_2r- ggaaccgccagactgatttc (서열 식별 번호: 222); mGapdh_1f- ccatgtagttgaggtcaatgaagg (서열 식별 번호: 223); mGapdh_2r- tggtgaaggtcggtgtgaa (서열 식별 번호: 224).
면역형광
뮤린 ESCs는 폴리-L-오르니틴 및 라미닌이 피복된 유리 커버슬립 상에 도말되었다. 24 시간 후, 세포들은 4% 파라포름알데히드/PBS에서 고정되었다. 그 다음, 세포를 PBS로 3회 세척하고, 0.5% 트리톤-X100/PBS로 투과하시켰다. 그 다음, 세포를 PBS로 3회 세척하였다. 세포는 1시간 동안 4% IgG-없는 BSA/PBS에서 차단시키고, 그리고 실온의 가습화된 챔버에서 4% IgG-없는 BSA에서 표시된 항체와 함께 하룻밤 동안 착색시켰다. 그 다음, 세포를 PBS로 3회 세척하였다. 2차 항체는 4% IgG-없는 BSA에서 세포에 추가하였다, 1시간 동안 실온에서 항온처리되었다. 그 다음, 세포를 PBS로 2회 세척하였다. 세포들은 Hoecsht 염료/milliQ 물에서 5분 동안 착색되었고, 그리고 Vectashield 탑재 배지에 탑재되었다. RPI 스피닝 디스크 공촛점에서 100x 확대로 이미징이 실행되었다.
IDR 발현 벡터의 형질감염
세포들은 Lipofectamine 3000 (Life Technologies)을 이용하여 형질감염되었다. 750,000개 뮤린 ESCs를 카운트하였고, 젤라틴화된 6-웰 접시 상에 도말하였다. 도말 직후, Lipofectamine 3000 키트 지침에 따라 준비된 DNA 믹스를 세포에 추가하였다. 24 시간 후, 세포들을 트립신화시키고(trypsonized), 이미징화를 위해 폴리-L-오르니틴 및 라미닌-피복된 35mm 유리-바닥 접시 (Matek)에 나눠 두었다.
참조자료
실시예 5
각 세포의 정체성을 규정하는 유전자 발현 프로그램은 마스터 전사 인자들 (TFs)에 의해 제어되며, 이것은 세포-유형 특이적 인헨서, 그리고 신호전달 인자들을 확립시키고, 여분의 세포 자극을 이러한 인헨서로 가져온다. 신호전달 인자들은 다양한 세포 유형에서 발현되며, DNA 결합 서열 특이성은 거의 없지만, 그러나 세포-유형 특이적 인헨서로 보충되지만, 이 기전에 대해서는 아는 바가 거의 없다. 최근 연구에서 마스터 TFs는 인헨서에서 공동활성제들과 함께 상-분리된 응축물을 형성한다는 것이 밝혀졌다. 여기에서 우리는 WNT, TGF-β 및 JAK/STAT 경로의 신호전달 인자들은 이들의 본질적으로 무질서화된 영역 (IDRs)을 이용하여 슈퍼-인헨서 구동된 유전자들에서 Mediator 응축물로 유입되고, 농축된다는 증거를 제시한다. 신호전달에 대한 응답의 세포-유형 특이성은 상기 신호전달 인자들의 IDRs에 의해 일부 중재되는데, 이것은 이들 인자가 세포 정체성에 있어서 상당히 중요한 역할을 하는 유전자들에서 마스터 TFs 및 Mediator에 의해 확립된 응축물로의 분할을 야기시킨다고 우리는 제안한다.
주어진 세포 유형의 활성 인헨서 및 슈퍼-인헨서에 선호적으로 결합하는 신호전달 인자들의 능력을 설명하는 몇몇 기전이 기술되었다. 신호전달 인자들은 포유류 게놈에 고-빈도로 존재하는 상대적으로 작은 서열 모티프에 약한 친화력으로 결합하고 (Farley et al., 2015), 그리고 활성 인헨서에서 서열에 대한 선호적인 결합은 활성 인헨서와 연합된 "개방(open) 염색질"에 접근을 부분적으로 반영할 수 있다 (Mullen et al., 2011). 상기 신호전달 인자들은 이들 인헨서에서 다른 TFs의 결합에 의해 중재된 DNA에서의 구조적 변화로 인하여 이러한 부위에 또한 결합을 선호하거나 (Hallikas et al., 2006; Zhu et al., 2018) 또는 마스터 TFs와 직접적인 단백질-단백질 상호작용을 통하여 공조적으로 결합하는 것을 선호할 수 있다 (Kelly et al., 2011).
최근 연구에서 마스터 TFs 및 상기 Mediator 공동활성제는 슈퍼-인헨서에서 상-분리된 응축물들을 형성하고, 이것은 주요 세포 정체성 유전자들에서 전사 기구를 구획화시키고, 농축시킨다는 것이 드러났다(Boija et al., 2018; Cho et al., 2018; Sabari et al., 2018). 신호전달 인자들은 세포 유형-특이적 슈퍼-인헨서에 대하여 특별한 선호를 갖는 것으로 나타났으며(Hnisz et al., 2015), 이로 인하여 우리는 세포 유형-특이적 인헨서 연합에 대하여 이전에 특징화되지 않은 기전인 슈퍼-인헨서에서 전사 응축물로의 분할을 유도하는 성질을 가질 수 있다고 추정한다. 여기에서, 세포 유형-특이적 방식으로 슈퍼-인헨서 구동된 유전자에서 신호 자극에 대한 반응으로 신호전달인자들은 공동활성화제와 함께 상분리된다고 보고한다. 상 분리는 신호전달 인자들을 마스터 TF-구동된 전사 응축물들로 보냄으로써, 신호전달의 상황-의존적 특이성을 달성하는데 도움이 된다고 우리는 제안한다.
결과
슈퍼-인헨서에서 응축물로 신호전달 인자들의 신호-의존적 통합
최근 연구에서 TFs 및 Mediator는 슈퍼-인헨서에서 상-분리된 응축물들을 형성할 수 있고 (Boija et al., 2018; Cho et al., 2018; Sabari et al., 2018), 그리고 WNT, JAK/STAT 및 TGF-β 경로의 말단 신호전달 인자들 (차례로 β-카테닌, STAT3 및 SMAD3)은 선호적으로 슈퍼-인헨서를 점유한다 (Hnisz et al., 2015) 것을 보여주었다. 이들 신호전달 인자가 슈퍼-인헨서 연합된 유전자들에서 응축몰로 통합되는 지 여부를 테스트하기 위해, 상기 3가지 신호전달 인자 각각에 대하여 면역형광과 함께 Nanog에 대한 RNA FISH를 실행하였다 (도 52A). 전분화능에 중요한 유전자인 Nanog는 ChIP-서열화에 의해 나타난 바와 같이, 마우스 배아 줄기 세포 (mESCs)에서 이들 3가지 신호전달 인자와 Mediator에 의해 점유된 슈퍼-인헨서와 연합된다 (도 52B). 응축된 촛점은 개별 세포의 Nanog 좌에서 이들 3개 인자 모두에서 관찰될 수 있다는 것을 알았고 (도 52A), 이로써 이들 3개 인자들은 슈퍼-인헨서 연합된 응축물로 통합됨을 암시한다. 전사 응축물들이 mESCs에서 발생한다는 것이 증명된 추가적인 슈퍼-인헨서 좌 에서도 유사한 결과를 얻었다 (Boija et al, 2018; Sabari et al., 2018) (도 58A, B). 신호전달 인자들과 이 좌와의 연합이 세포 유형-특이적임을 확인하기 위해, 면역형광 및 DNA FISH의 조합을 이용하여 β-카테닌 응축된 촛점이 C2C12 근모세포에서 Nanog와 중첩되는 지 여부를 조사하였고; β-카테닌 신호는 C2C12 세포의 이 좌에서 탐지되지 않았다(도 58C). 이들 결과는 신호전달 인자들이 세포 유형-특이적 슈퍼-인헨서 응축물로 통합된다는 발상과 일치한다. β-카테닌, STAT3 및 SMAD3 신호전달 인자가 경로 자극 시 핵 응축물로 통합되는 지를 확인하기 위해, 각 신호전달 경로에 대한 자극 존재 하에, 또는 부재 하에서 mESCs에서 이들 인자에 대한 면역형광을 실시하였다. 이들 3 가지 신호전달 인자는 이들의 각 신호전달 경로가 활성화될 때 면역형광에 의해 응축된 핵 촛점으로 탐지되었다 (도 52C). 이러한 결과들은 경호 활성화 시에 β-카테닌, SMAD3 및 STAT3이 핵 응축물들로 통합됨을 나타낸다.
슈퍼-인헨서에서 전사 인자들 및 Mediator에 의해 형성된 응축물은 액체-유사 거동을 나타낸다 (Boija et al., 2018; Cho et al., 2018; Sabari et al., 2018). 액체-액체 상-분리된 응축물들의 각인적 특징은 역동적 내부 재-구성 및 신속한 교환 동역학이며 (Banani et al., 2017; Hyman et al., 2014; Shin 및 Brangwynne, 2017), 형광 광표백(FRAP) 이후 형광 복구 속도를 측정함으로써, 정보를 얻을 수 있다. 신호전달 인자들이 이러한 유형의 거동을 나타내는지 여부를 테스트하기 위해, 구성적 WNT-활성화된 HCT116 세포의 β-카테닌 유전자의 내성성 좌에서 mEGFP-테그를 도입시켜, 이들 세포에서 발현된 mEGFP-테그된 β-카테닌 수준이 이들 세포에서 정상적으로 발현된 것과 유사하다는 것을 확인하였고 (도 58D), 그리고 FRAP에 의해 이들 응축물의 거동을 검사하였다. β-카테닌 핵 푼차(puncta)는 초-단위 시간 등급으로 최수되었으며 (도 52D), 대략적인 겉보기 확산 계수는 0.004 ± 0.003 μm2/s이다. 이들 값은 액체-유사 응축물들의 기존 설명된 성분과 유사하며 (Nott et al., 2015; Pak et al., 2016, Sabari et al., 2018), 이것은 β-카테닌 함유 응축물이 액체-유사 성질들을 나타낸다는 것을 말한다.
정제된 신호전달 인자들은 시험관내 응축물들을 형성할 수 있다
β-카테닌, STAT3 및 SMAD3의 아미노산 서열 분석에서 이들은 본질적으로 무질서화된 영역 (IDRs)을 함유하는 것으로 드러났다 (도 53A, 도 59). IDRs은 약한 상호작용의 역동적 네트워크를 형성할 수 있고, 응축물 형성에 연루되어 있기 때문에 (Burke et al., 2015; Lin et al., 2015; Nott et al., 2015), 우리는 이들 신호전달 단백질이 시험관내 상-분리된 소적을 형성할 수 있는 지 여부를 조사하였다. 또한, 정제된 재조합 mEGFP-β-카테닌, mEGFP-STAT3 및 mEGFP-SMAD3은 농도-의존적 소적을 형성하였다 (도 53B). 상기 소적은 구형의, 미크론-크기이며, 용액 안에서 자유로이 움직인다. 이들 단백질의 소적 형성 거동은 마이크로몰 농도에서 조밀한 상과 희석된 상 사이의 분할 비율에서 전환을 나타내며, 이러한 점은 상 분리를 겪는 단백질의 거동과 일치된다 (도 53B). 이들 소적의 추가 특징화에서 이들은 희석에 의해 가역적이었으며, 염 농도의 증가에 민감한 것으로 나타났으며 (도 53C), 이는 액체-액체 상-분리된 소적의 거동 특징이다.
정제된 신호전달 인자들은 시험관내 Mediator 응축물들로 통합된다
슈퍼-인헨서에서 형성된 전사 응축물은 고-농도의 Mediator 공동활성제를 함유하며, 그리고 전사 인자들은 이들 활성화 도메인의 상 분리에 중요한 동일한 잔기를 통하여 Mediator와 상호작용한다 (Sabari et al., 2018; Boija et al., 2018). β-카테닌, SMAD3 및 STAT3의 소적 형성 성질 및 이들의 생체내 국소화를 감안할 때, 이들 신호전달 단백질은 Mediator 응축물들과 또한 상호작용하고, 이 응축물로 농축될 수 있다고 추론했다. 이러한 발상을 테스트하기 위해, PEG-8000에서 소적을 형성하도록 Mediator 복합체 (Boija et al., 2018)의 대리물로써 MED1-IDR를 이용하였고, 당해 용액으로 희석된 신호전달 물질을 추가하였고, 그리고 MED1-IDR 소적으로의 신호전달 인자들의 통합을 모니터링하였다 (도 54A). 우리는 β-카테닌, SMAD3 및 STAT3가 MED1-IDR 소적으로 통합 및 농축되었다는 것을 알았다 (도 54B, C).
β-카테닌, SMAD3 및 STAT3는 포유류 세포들에서 나노몰 농도로 발견되지만 (Beck et al., 2017), 그러나, 상기 재조합 신호전달 단백질들이 시험관내 소적을 형성하는 농도는 마이크로몰 범위다 (도 53B). 이러한 사실로 우리로 하여금 신호전달 인자들이 Mediator 존재 하에서 나노몰 농도(이 농도에서는 이들 자체가 탐지가능한 소적 형성을 할 수 없다)에서 소적을 형성할 수 있는 지 여부를 조사하게 하였다. 이들 검정법에서, 상기 신호전달 인자들은 또한 MED1-IDR 소적으로 효과적으로 분할되었다 (도 54D). 이들 결과는 Mediator 응축물로의 신호전달 인자들의 분할이 슈퍼-인헨서에서 전사 응축물로 신호전달 인자들의 국소화에 기여한다는 가능성과 일치한다.
표적 유전자들의 β-카테닌 및 활성화의 상 분리는 방향족 아미노산에 의존적이다
슈퍼-인헨서에서 신호전달 인자들의 풍도가 이들의 IDRs의 상 분리 성질 및 Mediator 응축물들의 통합을 통하여 발생된다면, 시험관내 상-분리된 소적을 형성하는 이들의 능력에 영향을 주는 IDRs에서의 돌연변이는 생체내 유전자를 표적으로 하고, 이들 유전자를 활성화시키는 이들의 능력에 영향을 주는 것으로 예상할 수 있다. 이러한 가설을 테스트하기 위해, β-카테닌에 대한 추가 연구에 촛점을 맞추고, 이의 상 분리 성질을 담당하는 단백질의 부분을 확인하려고 했다. β-카테닌은 N-말단 IDR 및 C-말단 IDR에 의해 둘러싸인 Armadillo 반복부와 함께 중앙의 구조화된 도메인으로 구성된다(도 55A). 소적 검정법에서 상기 Armadillo 반복부 또는 N-말단 또는 C-말단 IDRs만을 함유하는 재조합 단백질들은 테스트된 임의의 농도에서 상 분리를 할 수 없는 것으로 나타났고 (도 55B), 이로써 이들 성분 만으로는 무손상 단백질의 상 분리 성질에 기여하지 못하며, 이러한 거동을 위해서 두 IDRs 모두가 필요함을 암시한다.
그 다음, 우리는 응축에 기여할 수 있는 두 개 IDRs 안에 있는 아미노산 잔기에 집중하였고, 방향족 잔기의 풍부함에 주목했다 (도 59). 두 개 IDRs 모두에서 방향족 잔기가 알라닌으로 대체된, β-카테닌의 돌연변이체 형태를 만들었다 (도 55C). 이들 유형의 돌연변이는 pi-양이온 상호작용을 교란시키는데, 이때 이러한 상호작용은 다중 단백질들의 상 분리 수용력에 중요한 역할을 한다 (Frey et al., 2018; Wang et al., 2018). 소적 형성 검정법으로 테스트하였을 때, 상기 β-카테닌의 돌연변이체 형태는 매우 높은 농도(매우 작은 소적이 관찰되었던 농도)를 제외하고, 소적을 형성할 수 없었다 (도 55C). MED1-IDR을 이용한 이형성(heterotypic) 소적 형성 검정법에서 테스트하였을 때, 상기 돌연변이체 β-카테닌 단백질은 MED1-IDR 소적으로의 통합 및 농축화에 실패하였다 (도 55D, E). 이들 결과는 β-카테닌의 IDRs에 있는 방향족 잔기가 이의 상 분리 거동에 기여함을 암시한다.
상기 IDRs에서의 방향족 잔기가 생체내 β-카테닌 기능에 기여하는 지 여부를 테스트하기 위해, TdTomato-테그된 야생형 및 β-카테닌의 돌연변이체 형태를 인코드하는 구조체를 독시사이클린-유도성 프로모터의 제어 하에서 mESCs의 게놈에 통합시키고 (도 56A) 및 독시사이클린에 의한 활성화 후, β-카테닌의 ChIP-qPCR을 실행하였다 야생형 β-카테닌은 예상과 같이, WNT-반응성 유전자인 Myc, Sp5 및 Klf4를 점유하는 것으로 드러났으며, 한편 이들 인헨서에서 낮은 수준의 방향족 돌연변이체들이 발견되었다 (도 56B). 이러한 차등 점유는 이들 유전자로부터 낮은 수준의 발현을 반영하는 것이었다 (도 56B). 이들 결과는 β-카테닌 IDRs의 방향족 아미노산들이 생체내 인헨서에서 응축물 형성 및 β-카테닌의 적절한 연합 및 기능에 모두 필수적임을 암시하는 것이다.
우리는 β-카테닌의 야생형 및 돌연변이체 형태를 이용한 루시퍼라제 검정법에서 WNT-반응성 리포터 유전자의 트랜스활성화에 대한 β-카테닌 방향족 돌연변이체의 능력을 독립적으로 테스트하였다 (도 56C). 야생형 β-카테닌의 발현으로 루시퍼라제 활성 증가가 8-배 자극되었지만, 한편, 상기 방향족 돌연변이체는 루시퍼라제 리포터에 거의 효과가 없었다 (도 56C). 이들 결과는 시험관내 Mediator과의 응축물 형성에 필수적인 β-카테닌 아미노산은 생체내 유전자 활성화에 또한 중요하다는 사실을 뒷받침한다.
본원에서 이용된 베타-카테닌 서열:
베타-카테닌 N-말단 IDR 서열:
Gctactcaagctgatttgatggagttggacatggccatggaaccagacagaaaagcggctgttagtcactggcagcaacagtcttacctggactctggaatccattctggtgccactaccacagctccttctctgagtggtaaaggcaatcctgaggaagaggatgtggatacctcccaagtcctgtatgagtgggaacagggattttctcagtccttcactcaagaacaagtagctgatattgatggacagtatgcaatgactcgagctcagagggtacgagctgctatgttccctgagacattagatgagggcatgcagatcccatctacacagtttgatgctgctcatcccactaatgtccagcgtttggctgaaccatcacagatgctg (서열 식별 번호: 249)
>베타-카테닌_C-말단 IDR 서열:
Ccacaagattacaagaaacggctttcagttgagctgaccagctctctcttcagaacagagccaatggcttggaatgagactgctgatcttggacttgatattggtgcccagggagaaccccttggatatcgccaggatgatcctagctatcgttcttttcactctggtggatatggccaggatgccttgggtatggaccccatgatggaacatgagatgggtggccaccaccctggtgctgactatccagttgatgggctgccagatctggggcatgcccaggacctcatggatgggctgcctccaggtgacagcaatcagctggcctggtttgatactgacctg (서열 식별 번호: 250)
>방향족 잔기들이 알라닌으로 전환된 베타-카테닌 N-말단 IDR:
Gctactcaagctgatttgatggagttggacatggccatggaaccagacagaaaagcggctgttagtcacgcgcagcaacagtctgccctggactctggaatccattctggtgccactaccacagctccttctctgagtggtaaaggcaatcctgaggaagaggatgtggatacctcccaagtcctggctgaggcggaacagggagcttctcagtccgccactcaagaacaagtagctgatattgatggacaggctgcaatgactcgagctcagagggtacgagctgctatggcccctgagacattagatgagggcatgcagatcccatctacacaggctgatgctgctcatcccactaatgtccagcgtttggctgaaccatcacagatgctg (서열 식별 번호: 251)
> 방향족 잔기들이 알라닌으로 전환된 베타-카테닌_C--말단 IDR:
Ccacaagatgccaagaaacggctttcagttgagctgaccagctctctcgccagaacagagccaatggctgcgaatgagactgctgatcttggacttgatattggtgcccagggagaaccccttggagctcgccaggatgatcctagcgctcgttctgctcactctggtggagctggccaggatgccttgggtatggaccccatgatggaacatgagatgggtggccaccaccctggtgctgacgctccagttgatgggctgccagatctggggcatgcccaggacctcatggatgggctgcctccaggtgacagcaatcagctggccgcggctgatactgacctg (서열 식별 번호: 252)
β-카테닌-응축물 상호작용은 TCF 인자들과는 독립적으로 발생된다
β-카테닌은 DNA-결합 활성을 보유하지 않고, 유전자들로 β-카테닌 동원에 대한 통상적인 모델은 이의 Armadillo 반복부와 TCF/LEF 패밀리 DNA-결합 전사 인자 간의 구조화된 상호작용과 관련된다. 만약 β-카테닌이 생체내에서 응축되는 것을 허용하는 역동적 상호작용을 통하여 Mediator 응축물로 β-카테닌이 동원된다면, 이는 TCF/LEF 인자들의 부재 상황에서 일어나야 한다. 우리는 이러한 발상을 테스트하기 위해 일련의 검정법을 개발하였다.
우선, 핵 반점을 연구하기 위한 목적으로 원래 개발된 응축물 검정법을 이용하여 생체내 MED1 응축물로 β-카테닌이 통합될 수 있는 지 여부를 우선 조사하였다 (Janicki et al., 2004) (도 57A). 상기 MED1-IDR은 구성적으로 활성화된 WNT 신호전달 경로를 보유한 U2OS 세포 안 LacI 결합 부위에 테터링하였고, 따라서 핵 안에서 탐지가능한 수준의 β-카테닌을 보유한다(Chen et al.2015). 세포들을 LacI-MED1-IDR 또는 대조군 LacI으로 일시적으로 형질감염시켰다. LacI-MED1-IDR은 내생성 β-카테닌을 lac 어레이로 동원시킨다는 것을 알았지만, LacI 단독으로는 그렇지 못하였다 (도 57A). lac 어레이가 TCF 모티프를 함유하지 않았고, IF를 통하여 LacI-MED1-IDR 촛점에서 TCF4가 탐지되지 않았기 때문에, 이러한 효과는 TCF/LEF 및 DNA와의 직접적인 상호작용을 통하여 중재되지 않을 가능성이 있었다 (도 57B). 상기 이질성염색질 결합 단백질 HP1α는 대조군으로 사용되었으며, 상기 어레이로 동원되지도 않았다 (도 61A). TdTomato-라벨된 야생형 및 방향족 돌연변이체 β-카테닌이 이소성(ectopically) 발현될 때, 당해 TdTomato-라벨된 야생형 β-카테닌은 상기 MED1-IDR 점유된 lac 어레이에서 축적되었고, 한편 당해 TdTomato-라벨된 방향족 돌연변이체의 축적은 유의적으로 축소되었다 (도 57C). 이들 결과는 β-카테닌은 시험관내 MED1 응축물들로 β-카테닌이 통합되고, 농축되는데 필요한 동일한 아미노산에 의존적인 방식으로, TCF4의 부재하 에서 생체내 MED1-IDR 응축물들로 통합됨을 암시한다.
Mediator와의 상 분리를 허용하는 β-카테닌의 영역이 TCF/LEF 인자들과의 상호작용 부재 하에서 특이적 게놈 좌로 β-카테닌를 보내는데 충분한지 여부를 추가 테스트하기 위해, TCF 상호작용 도메인을 비롯한 armadillo 반복부를 mEGFP으로 대체시킨 β-카테닌-키메라 단백질을 만들었다. 상기 β-카테닌-키메라는 독시사이클린 유도성 프로모터의 제어 하에서 HEK293T 세포로 통합되었다. GFP에 대한 ChIP-qPCR에서 WNT-구동된 유전자 SOX9, SMAD7, KLF9 및 GATA3에서 β-카테닌-키메라에 대한 풍도를 보여주는데, 상기 β-카테닌의 IDRs은 mEGFP를 특이적 게놈 좌로 보내는데 충분함을 나타낸다 (도 57D). 이 효과는 상기 야생형 형태의 β-카테닌과 필적되는 수준에서 발현된 키메라에서 이들 인자의 발현 수준에 차이로 인한 것은 아니다 (도 61B). β-카테닌의 C-말단 IDR은 이의 전사활성화 도메인을 함유하고, 따라서 우리는 β-카테닌-키메라가 전사를 또한 활성화시키고, 뿐만 아니라 정확한 게놈 위치로 국소화될 수 있는 지를 조사했다. 상기 β-카테닌-키메라가 루시퍼라제 리포터 검정법에서 과다-발현되었을 때, 이러한 활성화는 야생형 형태의 β-카테닌의 수준보다는 비록 낮지만, WNT-리포터를 활성화시킬 수 있었다(도 57E). 이들 데이터는 β-카테닌이 Mediator 축물과 상호작용하는 이의 능력을 통하여 동원될 수 있으며, TCF/LEF 인자들과의 이의 고유한 상호작용과 독립적이라는 발상과 일치된다.
논의
다양한 세포 유형은 유전자 발현 프로그램을 적절하게 조정하기 위해 세포외 정보를 전송하는 공유의, 발생적으로 중요한 신호전달 경로의 작은 세트를 이용한다 (Perrimon et al., 2012). 임의의 하나의 세포 유형에서, WNT, TGF-β 및 JAK/STAT 경로의 작동체 성분들은 다수의 잠재적 신호 응답 요소들의 작은 하위집단에만 연결되고, 이 세포 유형의 마스터 전사 인자들에 의해 형성된 활성 인헨스 안에 이들과의 결합을 선호하고, 따라서 세포 유형-특이적 반응이 생성된다 (David and 
, 2018; Hnisz et al., 2015; Mullen et al., 2011; Trompouki et al., 2011). 이러한 편향을 설명하기 위한 기전에는 "개방 염색질"에 선호적 접근 (Mullen et al, 2011), 다른 TFs 결합에 의해 야기되는 변경된 DNA 구조, 그리고 마스터 TFs와의 공조적 단백질-단백질 상호작용을 포함한다 (Hallikas et al., 2006; Kelly et al., 2011). TFs와 Mediator가 슈퍼-인헨서에서 상-분리된 응축물들을 형성한다는 발견 (Boija et al., 2018; Cho et al., 2018; Sabari et al., 2018)과 함께, 신호전달 인자들이 세포 유형-특이적 슈퍼-인헨서에 대한 특별한 선호를 갖는다(Hnisz et al., 2015)는 관찰에 의해 우리는 신호전달 인자들이 슈퍼-인헨서에서 전사 응축물로의 분할을 촉진시키는 성질을 보유하는 지 여부를 조사하게끔 하였다. 신호전달의 세포 유형-의존적 특이성은 슈퍼-인헨서에서 상 분리를 통하여 신호전달 인자들을 전사 응축물로 보냄으로써 적어도 부분적으로 획득될 수 있다는 것을 여기에서 기술된 증거에서 보여준다. 이와 같은 방식에서, 다중 신호전달 인자 분자들은 이러한 응축물들로 집중될 수 있고, 게놈 상의 적절한 부위를 점유할 수 있다.
상기 신호전달 인자 β-카테닌, STAT3 및 SMAD3은 ESCs의 신호-반응성 슈퍼-인헨서에서 응축된 푼차(puncta)에서 발생한다는 것을 알았고, 여기에서 전사 응축물들은 수백개의 Mediator 및 RNA 중합효소 II 분자들을 함유하는 것으로 보고되었다 (Boija et al., 2018; Cho et al., 2018; Sabari et al., 2018). 이들 신호전달 인자는 시험관내 Mediator 하위단위 응축물으로 통합 및 농축될 수 있으며, 이것은 Mediator 응축물들 안으로 진입하는 이들의 능력이 생체내 슈퍼-인헨서에서 발견되는 Mediator 응축물과 선호적으로 연합하는 것에 기여할 수 있다는 것을 암시한다. 또한, 게놈 부위들의 어레이에 Mediator 하위단위를 테터링하면 이들 신호전달 인자중 적어도 하나, β-카테닌을 상기 응축물로 동원시킬 수 있는 응축물을 형성하게 되고, 이의 고유한 짝인 DNA-결합 인자 TCF4와의 구조화된 상호작용 부재 하에서도 형성할 수 있다. 중요한 것은, 시험관내에서 β-카테닌-Mediator 응축물 통합을 축소시키는 잔기의 돌연변이는 생체내에서 Mediator 하위단위 응축물들로 진입하고, 전사를 활성화시키는 β-카테닌의 능력을 유사하게 축소시킨다.
β-카테닌이 슈퍼-인헨서 응축물들로 진입을 설명하는 우리의 모델이 상기 신호전달 문헌에서 추가적인 난제를 도와줄 수 있을지도 모른다. 예를 들면, β-카테닌은 수많은 상이한 단백질들과 상호작용한다고 보고되었으며 (Schuijers et al., 2014), 이러한 상호작용 난혼성(promiscuity)은 수 많은 DNA-결합 전사 인자들이 TCF/LEF 패밀리의 정식 동원자(recruiters)에 추가하여 β-카테닌을 동원시키는 능력을 보유한다는 제안에 이르게 되었다 (Nateri et al., 2005; Kouzmenko et al, 2004; Essers et al., 2005; Kaidi et al., 2007; Botrugno et al., 2004; Kelly et al., 2011; Sinner et al., 2004). 그러나, 이렇게 보고된 상호작용의 대부분은 기능성 데이터에 의해 뒷받침되지 않았고, TCF에 결합 만이 공동-결정화에 의해 뒷받침되었다 (Poy et al., 2001; Sampietro et al., 2006). 우리 모델은 β-카테닌이 전사 응축물에서 많은 수의 TFs와 기능적으로 상호작용할 수 있는 지를 설명할 수 있을 지라도, 이러한 응축물이 어셈블리되지 않을 수도 있는 인공 시스템에서는 여전히 전사를 활성화시키는데 실패했다.
본원에서 기술된 응축물 모델은 질환, 이를 테면, 암에서 병리적 신호전달의 추가 이해를 촉진시킬 수 있다. 암의 두 가지 각인적 특징은 실제 제어안된 전사 및 신호전달이다 (Bradner et al., 2017). 암 세포들은 구동자 종양유전자들에서 슈퍼-인헨서를 만드는 게놈 변경을 발달시키고 (Chapuy et al., 2013; Hnisz et al., 2013; Lin et al., 2016; Mansour et al., 2014; Zhang et al., 2016), 그리고 이들 종양유전자는 종양형성적 신호전달에 특이적으로 반응성이 있다 (Hnisz et al., 2015). 종양형성적 신호전달에 기여하는 신호전달 인자들은 상 분리를 또한 촉진시키는 성질들을 통하여 일반적으로 슈퍼-인헨서 응축물들과 상호작용할 수 있다. 이와 같은 방식으로, 특정 신호전달 경로에 의존적인 종양 세포는 대체 신호전달 경로를 이용함으로써 치료에 대한 저항성을 습득할 수 있고, 이의 신호전달 인자들은 전사 응축물로 통합될 수 있다. 종양형성적 신호전달 경로 및 슈퍼-인헨서 성분들을 모두 표적으로 하는 치료는 신호전달 및 전사 의존성을 갖는 종양 세포에서 특히 효과적이라는 것을 입증할 것이다.
STAR 방법들
주요 리소스(RESOURCES) 표
실험 모델 및 대상체 상세
세포 계통
V6.5 뮤린 배아 줄기 세포는 Jaenisch lab으로부터 기증받았다. HEK293T 세포 및 HCT116 세포는 ATCC에서 구하였다. U2OS 세포는 Spector lab에서 구하였다. 미코플라스마에 대하여 세포들을 일상적으로 테스트하였다.
세포 배양 조건
V6.5 뮤린 배아 줄기 세포는 0.2% 젤라틴화된 (Sigma, G1890) 조직 배양 플레이트에서 2i + LIF 조건에서 성장시켰다. 2i + LIF 배지 조건에 이용된 배지는 다음과 같다: 967.5 mL DMEM/F12 (GIBCO 11320), 5 mL N2 보충물 (GIBCO 17502048), 10 mL B27 보충물 (GIBCO 17504044), 0.5 mM L-글루타민 (GIBCO 25030), 0.5X 비-필수 아미노산 (GIBCO 11140), 100 U/mL 페니실린-스트렙토마이신 (GIBCO 15140), 0.1 mM β-멀캅토에탄올 (Sigma), 1 uM PD0325901 (Stemgent 04-0006), 3 uM CHIR99021 (Stemgent 04-0004), 그리고 1000 U/mL 재조합 LIF (ESGRO ESG1107). HEK293T, U2OS 및 HCT116 세포들은 10% 태아 소 혈청 (Hyclone, SH3007103으로 특징지어짐), 100 U/mL 페니실린-스트렙토마이신 (GIBCO 15140), 2 mM L-글루타민 (Invitrogen, 25030-081)와 함께, DMEM, 고-포도당, 피루베이트 (GIBCO 11995-073)에서 배양되었다.
세포 계통 자극
WNT의 경우: 세포들을 CHIR (mES) 없이, 또는 10% FBS DMEM 배지에서 (HEK293) CHIR와 함께, 2i + LIF 배지에서 24시간 동안 CHIR99021 또는 IWP2 (Sigma Aldrich I0536)로 처리하였다.
SMAD3의 경우: 세포들을 2i + LIF 배지에서 24 시간 동안 액티빈A (R&D systems 338-AC-010) 또는 SB431542 (Tocis Bioscience 16-141)로 처리하였다. STAT3의 경우: 세포들을 24 시간 동안 2i + LIF 또는 2i - LIF 배지로 처리하였다.
세포 계통 생성
V6.5 뮤린 배아 줄기 세포, HCT116 결장직장의 암 세포 또는 HEK293T 배아 신장 세포를 CRISPR-Cas9 시스템을 이용하여 유전공학적으로 변형시켰다. 베타 카테닌의 N-말단을 표적화시키는 가이드는 mCherry 선택성 마커 및 다음 서열을 갖는 px330 벡터로 클론되었다: CTGCGTGGACAATGGCTACT (서열 식별 번호: 248). mEGFP-테그 측면에 있는 내생성 좌에 상동성인 800bp의 복구 주형은 pUC19 벡터로 클로닝되었다. 세포들을 2.5 μg의 양쪽 구조체로 형질감염시키고, 형질감염-후 2일 차에 mCherry에 대해 분류하고, 그리고 형질감염-후 일 주일 시점에 다시 mEGFP에 대해 분류하였다. 세포들을 연속적으로 희석시키고, 콜리니를 찍어내어 클론 세포 계통을 얻었다.
FRAP
LSM880 Airyscan 현미경에서 488nm 레이져로 FRAP가 실행되었다. 
100% 레이져 파워를 이용하여 표백화가 실행되었고, 매 2초마다 이미지가 수집되었다. 형광 강도는 FIJI를 이용하여 측정하였다. 배경 강도를 차감하였고, 값은 사전-표백화된 시점과 비교하여 보고되었다.
배경 광표백 및 표백-전 강도에 대한 정상화를 고려하여 강도 데이터를 프로세스하기 위해 맞춤형 MATLAB™ 원고가 작성되었다. 표백 후 FRAP 복구 데이터는 각 세포-주 및 조건에 대해 9 회 복제에 걸쳐 평균화되었다. FRAP 복구 곡선을 다음에 피팅하였다:
면역형광
Sabari et al. 2018에서 기술된 바와 같이, RT에서 10분 동안 4% 파라포름알데히드에서 세포를 고정시켰다. 그 다음 세포를 3회 세척하였고, 0.5 TritonX 100/PBS에서 5분 동안 RT에서 투과화시켰다. PBS에서 3회 세척 후, 세포들은 4% 소 혈청 알부민에서 15분 동안 RT에서 차단시키고, 원발성 항체/4% BSA에서 하룻밤 동안 실온에서 항온처리하였다. PBS에서 3회 세척 후, 세포들은 2차 항체/4% BSA에서 암 상태에서 1 시간 동안 항온처리하였다. 세포들을 PBS에서 3회 세척되었고, 이어서 Hoechst에서 5분 동안, 암 상태, RT에서 항온처리하였다. 슬라이드는 Vectashield H-1000상에 탑재하고, 커버슬립은 투명한 메니큐어로 밀봉하고, 4C에 보관하였다. Metamorph 소프트웨어 및 CCD 카메라를 이용하여 100x 대물렌즈가 있는 RPI 스피닝 디스크 공촛점 현미경으로 이미지를 얻었다.
DNA FISH와 함께 공동-면역형광
면역형광은 2차 항체와 함께 항온처리 후, 변형 프로토콜에 따라 앞서 설명된 바와 같이 실행되었다. 2차 항체 세포는 RT에서 PBS로 3회 세척시킨 후, 그 다음 4% PFA/PBS로 20분 동안 고정되었으며, PBS로 3회 세척하였다. 세포는 70% 에탄올, 85% 에탄올 및 그 다음 100% 에탄올로 1분 동안 RT에서 항온처리되었다. 7μl의 FISH 하이브리드화 완충제 (Agilent G9400A), 1μl의 FISH 프로브와 2μl의 물을 혼합함으로써 프로브 하이브리드화 혼합물이 만들어졌다. 5μl의 혼합물을 슬라이드 상에 추가하였고, 커버슬립을 상부에 배치시켰다. 커버슬립은 고무 시멘트를 이용하여 밀봉하였다. 일단 고무 시멘트가 고형화되면, 게놈 DNA와 프로브를 78C에서 5분 동안 변성시키고, 슬라이드는 16C, 암 상태에서 하룻밤 동안 항온처리하였다. 커버슬립을 당해 슬라이드로부터 제거하고, 사전-데워진 세척 완충제 1에서 73C에서 3 분간 항온처리하고, 세척 완충제 2에서 RT에서 1분 동안 항온처리하였다. 슬라이드를 공기-건조시키고, 핵은 Hoechst/PBS에서 5분 동안 RT에서 책색되었다. 커버슬립은 PBS로 3회 세척하였고, Vectashield H-1000을 이용하여 슬라이드 상에 탑재하고, 메니큐어로 밀봉하였다. MetaMorph 촬영 소프트웨어 및 Hammamatsu ORCA-ER CCD 카메라를 이용하여 100x 대물렌즈가 있는 RPI 스피닝 디스크 공촛점 현미경으로 이미지를 얻었다. Nanog 좌를 표적화하도록 Agilent 사에 의해 DNA FISH 프로브가 맞춤 기획 및 제작되었다.
RNA FISH와 함께 공동-면역형광
이미 기술된 부분에서(Sabari et al., 2018) 약간의 변형을 포함하여, 면역형광이 실행되었다. 면역형광은 RNase-없는 환경에서 실행되었으며, 피펫과 벤치는 RNaseZap (Life Technologies, AM9780)으로 처리되었다. RNase-없는 PBS를 이용하였으며, 모든 시점에서 항체들은 RNase-없는 PBS로 희석되었다. 면역형광을 완료한 후, 세포들은 RT에서 10분 동안 PBS에서 4% PFA로 후-고정되었다. 세포들은 RNase-없는 PBS로 2 회 세척하였다. 세포들은 RNase-없는 물 (Life Technologies, AM9932)에서 20% Stellaris RNA FISH 세척 완충제 A (Biosearch Technologies, Inc., SMF-WA1-60), 10% 탈이온화된 포름아미드(EMD Millipore, S4117)로 5분 동안 RT에서 한 번 세척하였다. 세포들은 90% Stellaris RNA FISH 하이브리드화 완충제 (Biosearch Technologies, SMF-HB1-10), 10% 탈이온화된 포름아미드, SE-연합된 유전자들의 전사체의 인트론을 혼성화시키기 위해 기획된 12.5 μM Stellaris RNA FISH 프로브를 이용하여 혼성화시켰다. 하이브리드화는 하룻밤 동안 37℃에서 실행되었다. 그 다음 세포들은 세척 완충제 A를 이용하여 30분 동안 37℃에서 세척되었으며, 핵은 세척 완충제 A에서 20μm/ml HOESCHT로 5분 동안 RT에서 착색되었다. Stellaris RNA FISH 세척 완충제 B (Biosearch Technologies, SMF-WB1-20)로 실온에서 5-분간 한 번 세척 후. 커버슬립은 면역형광의 경우에서 설명된 바와 같이 탑재되었다. MetaMorph 촬영 소프트웨어 및 Hammamatsu ORCA-ER CCD 카메라를 이용하여, 100x 대물렌즈가 있는 RPI 스피닝 디스크 공촛점 현미경으로 이미지를 얻었다. 이용된 원발성 항체는 항-MED1 Abcam ab64965 1:500 희석, 항-b 카테닌 Abcam ab22656 1:500 희석, 항-pSTAT3 Santa Cruz 1:20 희석, 항-SMAD2/3 Santa Cruz 1:20 희석)이다. 이용된 2차 항체는 항-토끼 IgG, 항-염소 IgG 및 항-마우스 IgG이다.
평균 이미지 분석
면역형광과 함께 RNA FISH 분석을 위해, RNA FISH 및 IF 채널에서 수집된 3D 이미지 데이터를 처리하고, 분석하기 위해 맞춤형 MATLAB™ 스크립터가 작성되었다. FISH 촛점은 강도(intensity) 및 크기 역치값을 통해 개별 z-스택에서 식별되었고, 
의 크기 상자를 따라 중앙배치되었고, 그리고 z-스택에서 3-D로 함께 스티치(stitched) 되었다. 식별된 모든 FISH 촛점의 경우, IF 채널에서 대응하는 위치로부터 얻은 신호는 모든 대응하는 z-슬라이스에서 RNA FISH 촛점에 집중된 
사각형에 담는다. 각 FISH 및 IF 짝에 대한 FISH 촛점에 집중된 IF 신호를 조합하고, 평균 강도 투영도를 산출하고, IF 신호 강도에 대한 평균 데이터를 FISH 촛점에 집중된 
사각형 안에 제공한다. 이것 자체 좌표 상에 집중된 FISH 신호 강도에 대하여 동일한 프로세스를 실시하였으며, FISH 신호 강도에 대한 평균 데이터는 FISH 촛점에 집중된 
사격형 안에 제공한다. 대조군으로써, 무작위로 선별된 핵 위치에 집중된 IF 신호에 대해서도 동일한 프로세스를 실시하였다. 각 복제의 경우, 40개의 랜덤 핵 포인트(points)는 상기 핵 외피의 내부에서 생성되었고, 큰 크기 (200 voxels) 및 강도 (DNA 밀도) 임계치의 조합에 의해 DAPI 채널로부터 식별되었다. 그 다음, 이러한 평균 강도 투영은 신호 강도의 2D 등고선 맵을 생성하는데 사용되었다 . 등고선 플롯은 MATLAB™의 내장(built-in) 함수를 이용하여 생성된다. 등고선 플롯의 경우, 표시된 강도-색상 범위는 선형 색상 범위에 걸쳐 사용자 지정되었다(
= 15). FISH 채널의 경우, 검정색에서 자홍색이 사용되었다. IF 채널의 경우, 우리는 chroma.js (온라인 색상 생성기)를 사용하여 15개 빈(bins) 전체에 색상을 생성했으며, 주요 전환 색상은 검정색, 청자색, 중간-파란색, 라임색이 선택되었다. 이것은 판독자의 눈으로 신호의 대비를 더 쉽게 감지할 수 있도록 하기 위해 수행된 것이다. 생성된 컬러 맵은 모든 IF 플롯에 대해 균일한 간격의 강도 빈(bins) 15 개에 사용되었다. FISH 또는 무작위로 선별된 핵 위치에 집중된 평균 IF는 각 플롯의 최소 및 최대 신호를 포함하도록 설정된, 동일한 색상 척도를 사용하여 플롯된다.
단백질 정제
상기 관심대상의 유전자들 또는 이들의 IDRs를 인코딩하는 cDNA는 T7 pET 발현 벡터의 변형된 형태로 클론되었다. 상기 기본 벡터는 5' 6xHIS에 이어서 mEGFP 또는 mCherry 그리고 14개 아미노산 링커 서열 "GAPGSAGSAAGGSG." (서열 식별 번호: 14)을 포함하도록 공작되었으며, NEBuilder® HiFi DNA Assembly Master Mix (NEB E2621S)는 링커 아미노산과 동일한 틀(in-frame)에 이들 서열(PCR을 이용하여 생성됨)을 삽입시키기 위해 이용하였다. mEGFP 또는 mCherry 만을 발현시키는 벡터는 당해 링커 서열에 있어서, STOP 코돈을 내포한다. 돌연변이체 서열은 유전자블록 (IDT)으로 합성되었으며, 상기에서 기술된 바와 같이 동일한 기본 벡터 안으로 삽입되었다. 모든 발현 구조체를 서열화하여 서열 정체성을 확보하였다.
단백질 발현을 위해, 플라스미드를 LOBSTR 세포들 (Chessman Lab으로부터 선물로 받음) 안으로 형질전환시키고, 다음과 같이 성장시켰다. 새로운 박테리아 콜로니는 카나마이신 및 클로람페니콜을 함유하는 LB 배지에 접종시키고, 하룻밤 동안 37oC에서 성장시켰다. 상기 MED1-IDR 구조체를 함유하는 세포를 새로 추가된 카나마이신 및 클로람페니콜이 새로 추가된 500ml의 실온 LB에서 1:30으로 희석시키고, 1.5 시간 동안 16oC에서 성장시켰다. IPTG를 1mM로 추가하였고, 18 시간 동안 성장을 지속시켰다. 세포들을 수거하고, -80oC에서 냉동 보관하였다. 다른 모든 구조체를 함유하는 세포들도 유사한 방식으로 처리하였는데, 단 IPTG 유도 후, 37oC에서 5시간 동안 성장시켰다는 것이 차이점이다.
500ml의 베타 카테닌 돌연변이체 세포는 완전한 프로테아제 저해제 (Roche, 11873580001)를 함유하는 15ml의 변성 완충제 (50mM Tris 7.5, 300mM NaCl, 10mM 이미다졸, 8M 우레아)에 재현탁시키고, 음파파쇄시켰다 (15초-작동, 60초-중단의 주기, 10회). 상기 용해물은 12,000g에서 30분 동안 원심분리시킴으로써 맑게 만든 후, 1ml의 사전-평형화된 Ni-NTA 아가로스 (Invitrogen, R901-15)에 추가하였다. 상기 아가로스 용해물 슬러리를 함유하는 튜브는 실온에서 1.5 시간 동안 회전시켰다. 상기 슬러리는 Thermo Legend XTR 스윙 버켓 로터(swinging bucket rotor)에서 3,000 rpm로 10분 동안 원심분리되었다. 상기 펠렛은 5ml의 용해 완충제로 2 X 세척한 후, 상기와 같이, 3,000 rpm로 10분 동안 원심분리되었다. 단백질은 250mM 이미다졸과 함께, 2ml의 용해 완충제로 3X 용리되었다. 각 주기에서, 상기 용리 완충제가 추가되었고, 상기에서 언급된 바와 같이 적어도 10분 동안 회전 및 원심분리되었다. 용출물은 Coomassie 착색된 12% 아크릴아미드 겔에서 분석되었다. 예상 크기의 단백질을 함유하는 분뭐 취물을 모으고(pooled), 250mM 이미다졸 완충제로 1:1로 희석시키고, 50mM Tris pH 7.5, 125Mm NaCl, 1mM DTT 및 4M 우레아를 함유하는 완충제에 대하여 우선 투석시키고, 이어서 2M 우레아를 함유하는 동일한 완충제로 투석시키고, 끝으로 우레아 없이 10% 글리세롤을 포함하는 완충제로 2 번 교환하여 투석시켰다. 투석 후 임의의 침전물은 3.000rpm에서 10분 동안 원심분리시켜 제거하였다. MED1-IDR 및 WT 베타 카테닌은 유사한 방식으로 정제되었는데, 단 상기 용해 완충제는 우레아를 함유하지 않으며, 항온처리는 4C에서 실행되며, 투석은 50mM Tris pH7.5, 125mM NaCl, 10% 글리세롤 및 1mM DTT의 2회 변화로 실시되었다.
시험관내
소적 형성 검정법
재조합 GFP 또는 mCherry 융합 단백질들을 농축시키고, Amicon Ultra 원심분리 필터 (30K MWCO, Millipore)를 이용하여 적절한 단백질 농도 및 125mM NaCl로 탈염시켰다. 재조합 단백질들은 소적 형성 완충제 (50mM Tris-HCl pH 7.5, 10% 글리세롤, 1mM DTT) 안에서 표시된 최종 염 및 10% PEG-8000 (군집제로써)와 함께 다양한 농도로 용액에 추가되었다. 상기 단백질 용액은 두 개의 나란하게 있는 양-면 테이프 띠에 의해 부착된 커버슬립과 함께 유리 슬라이드를 포함하는 직접만든 챔버 상이 바로 적재하였다. 그 다음 슬라이드를 150x 대물렌즈를 갖춘 Andor 공촛점 현미경으로 이미지화시켰다. 다른 언급이 없는 한, 제공된 이미지는 유리 커버슬립 상에 자리잡은 소적의 이미지다.
커버슬립은 전하를 중화시키기 위해 PEG-실란으로 피복되었다. 간략하게 설명하자면, 커버슬립은 2% Helmanex III로 2 시간 동안 세척되었으며, H2O로 3회 세척되었고, 에탄올로 한 번 세척한 후, 0.5% PEG-실란/에탄올과 1% 아세트산으로 하룻밤 동안 항온처리되었다. 그 다음, 이들은 에탄올로 한 번 세척된 후, 수조 음파파쇄기에서 15분 동안 에탄올에서 음파파쇄되었고, H2O로 3회 세척된 후, 에탄올로 헹궈내고, 대기-건조되었다.
이형성(heterotypic) 소적 분석
시험관내 소적 실험을 분석하기 위해, 소적을 식별해내고, 이들의 크기, 모양, 그리고 강도를 특징화하기 위해 scikit-이미지 패키지를 이용하여 맞춤 Python 스크럽터가 기록되었다. 소적은 다양한 기준에 따라 캡처된 채널의 평균 이미지에서 분할되었다: (1) 이미지의 평균보다 3 표준 편차 위의 강도 임계 값, (2) 크기 임계값 (9 픽셀 최소 소적 크기), (3) 그리고 0.8의 최소 순환도 (
)(1은 완벽한 순환이다). 분할(segmentation) 후, 각 소적에 대한 평균 강도를 계산하고, 상 경계면 근처의 픽셀은 제외되었다 (Banani et al., 2016). 일반적으로 5-10 개의 독립적인 시야에서 확인된 수백 개의 소적이 정량화되었다. 각 채널에서 소적 (C-인) 안에, 그리고 벌크 (C-아웃)에서의 평균 강도가 산출되었다. 분할 비율은 (C-인)/(C-아웃)로 계산되었다. 박스 플롯은 모든 소적의 분포를 보여준다. 도 2b의 단백질 농도 대비 분할 비율에 대한 측정된 데이터 세트는 로지스틱(logistic) 방정식으로 적용시켰다 (Wang et al., 2018):
여기에서 f 는 분할 비율이며, x 는 대응하는 단백질 농도임.
RT-qPCR
RNA는 제조업자의 지침에 따라 Rneasy Plus Mini Kit (QIAGEN, 74136)를 이용하여 단리되었다. 제조업자의 지침에 따라 oligo-dT 프라이머들 (Promega, C1101)와 함께 SuperScript II 역 전사효소 (Invitrogen, 18080093)를 이용하여 cDNA가 생성되었다. 정량적 실-시간 PCR은 SE 유전자들에 대한 TaqMan 프로브를 이용하여 Applied Biosystems 7000, QuantStudio5 및 QuantStudio6 기구에서 실행되었다.
ChIP
세포는 플레이트 당 4-5 백만개 세포 밀도로 도말되었고, 24-48 시간 후에 수거되었다. 세포 가교를 위해 15분 동안 1% 포름알데히드/PBS를 이용하였고, 얼음 상에서 125mM의 최종 농도에서 글리신으로 중단시켰다. 세포를 차가운 PBS로 세척하였고, 차가운 PBS에서 세포를 긁어내어 수거하였다. 수거된 세포들은 1500 g로 5분 동안 4℃에서 펠렛화되었고, LB1 (50mM Hepes- KOH, pH7.9, 140mM NaCl, 1mM EDTA 0.5mL 0.5M, 10% 글리세롤, 0.5% NP40, 1% TritonX-100, 1x 프로테아제 저해제)에서 재현탁되고, 20분 동안 회전시키면서 4℃에서 항온처리되었다. 세포는 5분 동안 1350 g에서 펠렛화되고, LB2 (10 mM Tris pH 8.0, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.5 mM EGTA, 1x 프로테아제 저해제)에서 재현탁되고, 5분 동안 회전시키면서 4℃에서 항온처리되었다. 펠렛은 LB3 (10 mM Tris pH 8.0, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.5 mM EGTA, 0.1% 데옥시콜레이트-나트륨, 0.5% 라우릴 사르코시네이트 나트륨, 1% TritonX-100, 1x 프로테아제 저해제)에서 ml당 3천-5천만개 세포의 밀도로 재현탁되었다. 세포는 Covaris S220에서 12분 동안 제조업자의 지침에 따라 음파파쇄되고, 이어서 20 000g로 30분 동안 4℃에서 회전시켰다. 0.5% BSA로 사전-차단된 Dynabeads는 GFP 항체 (Abcam, ab290), Med1 항체 (Abcam, ab64965) 또는 dsRed (Takara, 632496) 항체와 함께 6 시간 동안 항온처리되었다. 염색질을 항체-비드 복합체에 추가시키고, 하룻밤 동안 4℃에서 회전시키면서 항온처리하였다. 비드를 각 세척 완충제 1 (50mM Hepes pH7.5, 500mM NaCl, 1mM EDTA, 1mM EGTA,1% 트리톤, 0.1% NaDoc, 0.1% SDS) 및 세척 완충제 2 (20mM Tris pH 8, 1mM EDTA, 250mM LiCl, 0.5% NP40, 0.5% NaDoc)을 이용하여 4℃에서 3회 세척한 후, TE로 실온에서 한 번 세척하였다. 염색질은 용리 완충제 (50 mM, Tris pH 8.0, 10 mM EDTA, 1% 도데실 술페이트 나트륨, 20ug/ml RNaseA)를 이용하여 비드로 용리시키고, 60℃에서 30분 동안 회전시키면서 항온처리하였다. 가교의 역전은 4 시간 동안 58℃에서 실행되었다. 단백질분해효소 K가 추가되었고, 단백질 제거를 위해 1-2 시간 동안 37℃에서 항온처리하였다. DNA는 Qiagen PCR 정제 키트를 이용하여 정제하였고, 10mM Tris-HCL에서 재현탁되었다. ChIP 라이브러리는 제조업자의 지침에 따라 PippinHT 시스템(Sage Science 사의)에서 추가 크기 선별 단계와 함께, Swift Biosciences Accel-NGS® 2S Plus DNA Library Kit로 준비되었다. 라이브러리 준비 후, ChIP 라이브러리는 PippinHT 상에서 2% 겔 상에 이동되었으며, 크기 콜렉션 창은 200-600개 염기다. 최종 라이브러리는 KAPA 라이브러리 정량화 키트(Roche 사의)와 함께 qPCR을 이용하여 정량화되었으며, Illumina HiSeq 2500 상에서 40개 염기에 대한 단일-판독 모드에서 서열화되었다.
ChIP-seq 분석
ChIP-Seq 데이터는 매개 변수 -k 1 -m 1 -베스트(best) 및 -l을 판독 길이로 설정한 bowtie를 사용하여 마우스 참조 게놈의 mm9 버전에 정렬되었다. 매개변수 -w -S - 스페이스(space)=50 -노모델(nomodel) -변위크기=200와 함께 MACS를 이용하여 빈(bins) 안에서 판독 적용범위 디스플레이를 위한 Wiggle 파일이 만들어졌으며, 빈(bin) 하나의 판독 카운트는 wiggle 파일을 만들기 위해 이용된 맵핑된 판독 백만 개에 대하여 정상화되었다 (Zhang et al., 2008). 백만개-당-판독-정상화된 wiggle 파일은 UCSC 게놈 브라우져(Kent et al., 2002)에서 디스플레이되었다.
참고자료
실시예 6
전사 개시 기전과 스플라이싱 기전은 모두 많은 수의 성분 분자들을 함유하는 상-분리된 응축물을 형성할 수 있고; 수백개의 Pol II 및 Mediator 복합체들은 슈퍼-인헨서에서 응축물 안에 농축되며8,9, 그리고 많은 수의 스플라이싱 인자들은 핵 반점에서 농축되며, 이들중 일부는 상당한 활성 전사 부위들에서 발생된다10-17. 여기에서, 우리는 상기 CTD의 포스포릴화가 전사 개시 및 스플라이싱과 연합된 상-분리된 응축물로의 통합을 규제하는지 여부를 조사하였다. 우리는 저-포스포릴화된Pol II CTD는 Mediator 응축물들에 통합되고, 조절 CDKs에 의한 포스포릴화는 이의 축출을 야기시킴을 알았다. 우리는 포스포릴화된 CTD가 스플라이싱 인자들에 의해 형성된 응축물 안으로 선호적으로 통합된다는 것을 또한 알았다. 이들 결과에서 Pol II CTD 포스포릴화는 전사 개시에 연루된 응축물을 RNA 프로세싱에 연루된 것들로 교환하게끔 만든다는 것을 암시하고, 포스포릴화는 응축물 선호도를 조절하기 위한 기전임을 나타낸다.
연구에서 저-포스포릴화된 Pol II CTD는 Mediator와 상호작용할 수 있고5-7, 그리고 Pol II 및 Mediator는 슈퍼-인헨서에서 응축물 안에서 발생된다는 것을 보여주었다8,9. Pol II CTD가 Mediator 응축물들로 통합되는 지 여부를 조사하기 위해, 인간 Mediator 복합체를 정제하였고, 응축물 형성을 시험관내 소적 검정법으로 측정하였다. Mediator 소적은 GFP (GFP-CTD)에 융합된 인간 전장의 CTD를 통합 및 농축시키지만, 대조군 GFP의 경우는 아니다 (도 62B). 이 검정법은 세포에서 군집된 단백질 환경을 모방하기 위해 군집제가 이용되었으며, 이러한 관찰이 이용된 제제에 특이적인 것이 아님을 확인하기 위해, 우리는 동일한 실험을 실행하여, 화학적으로 별개의 두 군집제 존재 하에서도 동일한 결과를 얻었다(도 62B). 이들 결과는 Pol II CTD가 Mediator 응축물로 이의 통합에 기여한다는 발상과 일치한다.
Mediator 복합체18의 최대 하위단위인 MED1 상에서 우리의 실험에 촛점을 맞추어 Mediator과 CTD의 상호작용을 추가로 조사하였다. 추가 연구로는 MED1을 선택하였는데, 그 이유는 MED1은 기존 연구에서 상기 Mediator 응축물의 유용한 대리물인 것이 증명되었기 때문이다9. 추가로, MED1은 응축물 형성에 기여하는 예외적으로 큰 본질적으로 무질서화된 영역 (IDR)을 보유하며9, 인간 세포에서 MED1은 Pol II와 선호적으로 연합되는 것을 보여주었다19. 상기 Mediator 복합체 (도 62B)에서 관찰된 바와 같이, 소적 검정법에서 MED1-IDR 응축물들은 GFP-CTD를 통합시키고, 농축시키는 것으로 드러났다 (도 62C). 높은 결합가 성분이 연루된 상호작용의 경우에서 예상되는 바와 같이, 상기 MED1-IDR 응축물로 진입하는 CTD의 능력은 CTD 헵타펩티드 반복부의 수를 축소시킬 때손상되었고 (도 62D), 이것은 응축물-형성 생물분자의 특징이다20,21. Pol II CTD/MED1-IDR 응축물들은 액체-유사 융합 거동을 나타내었고 (도 62E), 형광 광표백 후 복구(FRAP; 도 62F)에 의해 역동적 내부 재배열 및 분자의 내부-외부 교환 증거를 보여주었으며, 액체-액체 상-분리된 응축물들과 일치된다.
개시에서 신장으로의 Pol II 전이는 CDK7 및 CDK9에 의한 CTD의 포스포릴화 헵타펩티드 반복부가 수반된다22-25. 상기 CTD의 포스포릴화는 FET 단백질들의 낮은 복합성 도메인 (FUS/EWS/TAF15) 에 의해 형성된 하이드로겔과의 상호작용에 영향을 주는 것으로 나타났으며26, 이것은 포스포릴화가 상기 CTD의 응축물 상호작용 성질에 영향을 줄 수 있음을 암시한다.
우리는 CDK7 또는 CDK9에 의한 CTD의 포스포릴화가 MED1-IDR 응축물로의 이의 통합에 영향을 줄 수 있는 지 여부를 조사하였다. CTD 포스포릴화 검정법에서 CDK7 및 CDK9 조제물은 시험관내에서 재조합 CTD의 세린 2와 세린 5 모두를 포스포릴화시킬 수 있으며, 공개된 결과와 일치되고22-25, CDK7은 세린 5 포스포릴화를 더 선호하는 것으로 나타났다 (도 66A,B). CDK7에 의한 CTD 포스포릴화는 CTD가 MED1-IDR 소적으로의 통합의 유의적인 축소를 야기하였으며 (도 63A,B; 도 66C), 그리고 이 효과는 이용된 군집제와는 독립적임을 알았다 (도 63A,B). 유사하게, CDK9에 의한 CTD 포스포릴화는 CTD가 MED1-IDR 소적으로의 통합의 유의적인 축소를 야기하였으며, 그리고 이것은 반응에 이용된 군집제와는 독립적임을 알았다 (도 63A,B). 이들 결과는 Pol II CTD 포스포릴화가 Mediator 응축물로부터 축출을 야기한다는 모델과 일치한다.
포스포릴화된 Pol II CTD는 상기 스플라이싱 기전의 많은 성분들과 상호작용한다고 보고되었으며27-30, 그리고 세린/아르기닌-풍부한 (SR) 단백질 SRSF2는 그중에서도 이들 스플라이싱 인자들에서 풍부한 것들이다 (도 66A)7. SRSF2는 상기 스플라이스좀을 스플라이스 부위로 동원을 용이하게 하고31, 핵 반점에서 pre-mRNA 스플라이싱 기전과 연합된다는 것도 알 수 있다10. 상기 스플라이싱 기전에 대한 대리물로써 SRSF2를 이용하여, 스플라이싱-연합된 응축물들이 마우스 배아 줄기 세포 (mESCs)의 활성 슈퍼-인헨서 연합된 유전자들에서도 발견되는 지 여부를 조사하였다 (도 64). 동시 발생기 RNA FISH와 함께, SRSF2에 특이적인 항체를 이용한 면역형광 현미경(도 67B)에서 Nanog 및 Trim28 유전자에서 SRSF2의 개별적 푼차(puncta)가 드러났고, 이는 주요 ESC 전분화능 전사 인자들을 인코드하는 슈퍼-인헨서 연합된 유전자들이다 (도 64A). Nanog 및 Trim28 FISH 촛점 (방법 참고)의 다중 이미지 분석에서 SRSF2는 두 유전자들에서 발생기 RNA FISH 촛점에서 풍부한 것으로 나타났다 (도 64A). 스플라이싱에 요구되는 2개 추가 SR 단백질인 SRRM1 및 SRSF132,33은 Nanog 및 Trim28 유전자 모두에서 발생기 RNA FISH 촛점에서 또한 풍부하다는 것이 증명되었다 (도 64B). 이들 결과에서 스플라이싱 기전과 연합된 SRSF2 및 기타 단백질들은 활발하게 전사된 유전자에 위치한 응축물들의 성분들임을 나타낸다.
그 다음, 포스포릴화된 Pol II가 염색질 상의 SRSF2와 연합되는 지 여부를 조사하였다. 각종 좌 게놈-폭(wide)에서 이들 성분들의 상대적 점유에 대한 단서를 얻기 위해 MED1에 대한 항체, SRSF2, 포스포릴화안된 Pol II CTD 그리고 세린 2에서 포스포릴화된(S2P) Pol II CTD로 ChIP-seq를 실행하였다 (도 4a, b). 예상과 같이, MED1은 포스포릴화안된 CTD를 함유하는 Pol II와 함께, 슈퍼-인헨서 및 프로모터를 점유하였다 도 65A,B). Pol II 함유 세린 2 포스포릴화된 CTD를 함유하는 Pol II는 전사된 유전자들의 3' 단부에서 가장 많이 관찰되었으며, SRSF2와 강한 중첩을 나타내었다 (도 65A,B). 이들 결과는 SRSF2에 의해 점유된 게놈의 일부분은 포스포릴화된 CTD를 갖는 Pol II에 의해 공동-점유되는 경향이 있음을 암시한다.
CTD의 포스포릴화가 스플라이싱 인자 응축물들로의 이의 통합에 영향을 주는 지 여부를 직접적으로 테스트하기 위해, 재조합 SRSF2를 이용하여 시험관내에서 이들 응축물의 모델을 찾아 구하였다. mCherry에 융합된 전장-길이 인간 SRSF2를 정제하였고, 상-분리된 소적을 형성한다는 것을 알았다 (도 65C,D). 포스포릴화안된 CTD는 SRSF2 소적으로 효과적으로 통합되지 않는 반면, CDK7- 또는 CDK9-포스포릴화된 CTD는 SRSF2 소적으로 통합되고, 농축되었다 (도 65C,D,E,F 및 도 67C). SRSF2 소적에 의한 포스포릴화된Pol II CTD의 통합에 대한 이러한 선택성은 실험에 이용된 군집제와는 독립적이었다 (도 65C,D,E,F). 이들 결과는 Pol II CTD의 포스포릴화가 SRSF2 응축물들과의 상호작용하는 능력을 활성화시킨다는 것을 보여준다.
우리 결과에서 Pol II CTD 포스포릴화는 이의 응축물 분할 거동을 변경시키고, 따라서 전사 개시에 관련된 응축물로부터 Pol II를 RNA 스플라이싱에 관련된 것들로의 교환을 구동시킨다는 것이 나타난다. 이 모델은 Pol II의 큰 클러스터가 세포 안에서 Mediator 응축물들과 융합할 수 있다는 기존 연구8, 포스포릴화는 CTD-중재된 Pol II 클러스터를 용해시킬 수 있다는 기존 연구34, CDK9/사이클린 T는 상 분리 기전을 통하여 CTD와 상호작용할 수 있다는 기존 연구35, Pol II는 전사 신장 동안 Mediator와는 더 이상 연합되지 않는다는 기존 연구18, 그리고 스플라이싱 인자들을 함유하는 핵 반점(speckles)이 높은 전사 활성을 갖는 좌에서 관찰될 수 있다는 기존 연구들의 증거10-17와 일관된다. 기존 연구에서 CTD는 포스포형태-특이적 방식으로 전사 개시 기구 및 RNA 프로세싱 기전의 성분들과 상호작용할 수 있음을 보여주었지만5-7, 그러나 이들 성분들이 응축물들에서 발생되거나 또는 Pol II CTD의 포스포릴화가 이들 응축물 간의 이의 분할 거동을 변경시킬 수 있다는 가능성을 분석하지는 않았다. 우리 결과에서 Mediator 및 스플라이싱 인자 응축물들은 동일한 슈퍼-인헨서 구동된 유전자들에서 발생하는 것으로 드러났고, 개시에 관련된 성분들과의 상호작용으로부터 스플라이싱에 관련된 성분들로의 Pol II 전환은 CTD 포스포릴화 규제된 응축물 분할 전환을 통하여 중재될 수 있음이 암시된다. 이들 결과에서 포스포릴화는 단백질 기능이 하나의 응축물로부터 축축되어 또다른 응축물로 이전되는 것과 관련된 프로세스에서 단백질의 응축물 분할을 규제하는 기전 중에 하나일 수 있음을 또한 암시한다.
방법
세포 배양
V6.5 뮤린 배아 줄기 세포 (mESCs)는 Jaenisch lab으로부터 기증받았다. 세포들을 2i 배지, DMEM-F12 (Life Technologies, 11320082), 0.5X B27 보충물 (Life Technologies, 17504044), 0.5X N2 보충물 (Life Technologies, 17502048), 여분의 0.5mM L-글루타민 (Gibco, 25030-081), 0.1mM 베타-멀캅토에탄올 (Sigma, M7522), 1% 페니실린 스트렙토마이신 (Life Technologies, 15140163), 1X 비필수 아미노산 (Gibco, 11140-050), 1000 U/ml LIF (Chemico, ESG1107), 1μM PD0325901 (Stemgent, 04-0006-10), 3μM CHIR99021 (Stemgent, 04-0004-10)의 0.2% 젤라틴화된 (Sigma, G1890) 조직 배양 플레이트에서 성장시켰다. 세포들은 가습화된 인큐베이터 안에서 37℃, 5% CO2에서 성장시켰다. 공촛점 이미징을 위해, 5 μg/mL의 폴리-L-오르니틴 (Sigma Aldrich, P4957)으로 적어도 30분 동안 37℃에서 피복되고, 5μg/ml의 라미닌 (Corning, 354232)으로 2시간-16시간 동안 37℃에서 피복된 유리 커버슬립 (Carolina Biological Supply, 633029) 상에서 세포를 성장시켰다. 계대를 위해, PBS (Life Technologies, AM9625), 1000 U/mL LIF에서 세포를 세척하였다. TrypLE Express 효소 (Life Technologies, 12604021)를 이용하여 플레이트로부터 세포를 떼내었다. TrypLE는 FBS/LIF-배지, DMEM K/O (Gibco, 10829-018), 1X 비필수 아미노산, 1% 페니실린 스트렙토마이신, 2mM L-글루타민, 0.1mM 베타-멀캅토에탄올 및 15% 태아 소 혈청, FBS, (Sigma Aldrich, F4135)으로 중단시켰다.
웨스턴 블랏
정제된 포스포릴화된 CTD는 1X XT 완충제 (Bio-Rad)에서 혼합되며, 10% Criterion™ XT Bis-Tris Precast Gels (Bio-Rad) 상에서 염료의 앞부분의 당해 겔의 끝에 도달할 때까지 100 V에서 이용시킨다. 그 다음 단백질을 얼음-냉각된 이동 완충제 (25 mM Tris, 192 mM 글리신, 10% 메탄올) 안에서 250 mA, 2 시간 동안 4℃에서 0.45 μm PVDF 막 (Millipore, IPVH00010)으로 이동시켰다. 이동 후, 5% 무지방-우유/TBS로 1 시간 동안 실온에서 교반시키면서, 당해 막을 차단시켰다. 그 다음, 당해 막은 5% 무지방-우유/TBST에서 1:2,000 희석 비율로 항- GFP (Abcam #ab290), 항-Pol II 포스포-Ser5 (Millipore #04-1572) 또는 항-Pol II 포스포- Ser2 (Millipore #04-1571) 항체와 함께 하룻밤 동안 4℃에서 교반과 함께 항온처리되었다. 상기 막은 TBST로 10분 동안 실온에서 교반시키면서 3회 세척되었다. 상기 막은 1:10,000의 비율로 2차 항체(GE health)와 함께 1시간 동안 RT에서 항온처리되었고, TBST로 5분 동안 3회 세척되었다. 막은 Femto ECL 물질(Thermo Scientific, 34095) 로 현상하고, CCD 카메라를 이용하여 이미지화시시켰다.
RNA FISH와 함께 면역형광
커버슬립은 37℃에서 5ug/mL 폴리-L-오르니틴 (Sigma-Aldrich, P4957)으로 30분 동안 피복되며, 5μg/ml의 라미닌 (Corning, 354232)으로 2 시간 동안 피복되었다. 세포는 사전-피복된 커버 슬립 상에 도말되었으며, 24 시간 동안 성장시키고, 이어서 4% 파라포름알데히드, PFA, (VWR, BT140770)/PBS를 이용하여 10분 동안 고정화되었다. 세포들을 PBS에서 3회 세척시킨 후, 상기 커버슬립을 가습 챔버 안에 넣거나 또는 4℃에서 PBS에 보관하였다. 세포들의 투과화는 0.5% 트리톤 X100 (Sigma Aldrich, X100)/PBS에서 10분 동안 실행한 후, PBS 세척을 3회 실시하였다. 세포들은 4% IgG-없는 소 혈청 알부민, BSA, (VWR, 102643-516)을 이용하여 30분 동안 차단시켰다. 그 다음 세포를 표시된 원발성 항체와 함께 1:500의 농도 비율로 PBS에서 4-16 시간 동안 항온처리하였다. 세포를 PBS로 3회 세척하였고, 이어서 PBS에서 1:5000의 농도로 2차 항체와 함께 1 시간 동안 항온처리하였다. PBS로 2회 세척 후, 세포들을 4% 파라포름알데히드, PFA, (VWR, BT140770)/PBS를 이용하여 10분 동안 고정시켰다. PBS로 2회 세척 후, RNase-없는 물 (Life Technologies, AM9932)에 세척 완충제 A (20% Stellaris RNA FISH 세척 완충제 A (Biosearch Technologies, Inc., SMF-WA1-60), 10% 탈이온화된 포름아미드(EMD Millipore, S4117)를 세포에 추가하였고, 5분 동안 항온처리하였다. 하이브리드화 완충제 (90% Stellaris RNA FISH 하이브리드화 완충제 (Biosearch Technologies, SMF HB1-10) 및 10% 탈이온화된 포름아미드)에서 12.5 μM의 RNA 프로브를 세포에 추가하였고, 하룻밤 동안 37℃에서 항온처리하였다. 세척 완충제 A로 30분 동안 37℃에서 세척 후, 상기 핵은 20μm/mL Hoechst 33258 (Life Technologies, H3569)에서 5분 동안 착색되었고, 이어서 세척 완충제 B (Biosearch Technologies, SMFWB1-20)에서 5분간 세척되었다. 세포를 물로 한 번 세척 후, 커버슬립은 Vectashield (VWR, 101098-042)가 있는 유리 슬라이드에 탑재하고, 최종적으로 커버슬립은 메니큐어 (Electron Microscopy Science Nm, 72180)로 밀봉하였다. MetaMorph 촬영 소프트웨어 및 Hammamatsu ORCA-ER CCD 카메라 (W.M. Keck Microscopy Facility, MIT)를 이용하여, 100x 대물렌즈가 있는 RPI 스피닝 디스크 공촛점 현미경으로 이미지를 얻었다. 이미지는 Fiji Is Just ImageJ (FIJI)를 이용하여 추후-프로세스되었다. RNA FISH 프로브는 발생기 RNA를 가시화시키기 위해, Nanog 및 Trim28 인트론 영역을 표적으로 하도록 Agilent 사에 의해 맞춤 기획 및 제작되었다.
단백질 정제
인간 cDNA는 T7 pET 발현 벡터의 변형된 형태로 클론되었다. 상기 기본 벡터는 5' 6xHIS에 이어서 mEGFP 또는 mCherry 그리고 14개 아미노산의 링커 서열 "GAPGSAGSAAGGSG."(서열 식별 번호: 14)을 내포하도록 공작되었다. 상기 링커 아미노산과 동일-프레임(in-frame)에 이들 서열 (PCR에 의해 만듬)을 삽입시키는데 NEBuilder® HiFi DNA Assembly Master Mix (NEB E2621S)를 이용하였다. 벡터 발현시키는 mEGFP 만을 발현시키는 벡터는 상기 링커 서열에 이어서 STOP 코돈을 내포한다. 돌연변이체 서열은 PCR에 의해 만들어지고, 상기에서 기술된 바와 같이 동일한 기본 벡터 안으로 삽입되었다. 모든 발현 구조체를 서열화하여 서열 정체성을 확보하였다.
단백질 발현을 위해, 플라스미드를 LOBSTR 세포들 (Chessman Lab으로부터 선물로 받음) 안으로 형질전환시키고, 다음과 같이 성장시켰다. 새로운 박테리아 콜로니는 카나마이신 및 클로람페니콜을 함유하는 LB 배지에 접종시키고, 하룻밤 동안 37도에서 성장시켰다. 세포를 새로 추가된 카나마이신 및 클로람페니콜이 새로 추가된 500ml의 실온 LB에서 1:30으로 희석시키고, 1.5 시간 동안 16도에서 성장시켰다. IPTG를 1mM로 추가하였고, 20 시간 동안 성장을 지속시켰다. 세포들을 수거하고, -80도에서 냉동 보관하였다. 오로지 GFP만을 함유하는 세포와 GFP-SRSF2를 함유하는 세포들도 유사한 방식으로 처리하였는데, 단 IPTG 유도 후, 37도에서 5시간 동안 성장시켰다는 것이 차이점이다.
500ml의 mCherry-SRSF2 발현시키는 세포의 펠렛을 완전한 프로테아제 저해제 (Roche,11873580001)와 함께, 15 ml의 변성 완충제 (50 mM Tris 7.5, 300 mM NaCl, 10 mM 이미다졸, 8 M 우레아)에 재현탁시키고, 음파파쇄시켰다 (15초-작동, 60초-중단의 주기, 10회). 상기 용해물은 12,000g에서 30분 동안 원심분리시킴으로써 맑게 만든 후, 동일한 완충제의 10배 용적으로 사전-평형화된 1ml의 Ni-NTA 아가로스 (Invitrogen, R901-15)에 추가하였다. 상기 아가로스 용해물 슬러리를 함유하는 튜브는 실온에서 1.5 시간 동안 회전시켰다. 이 슬러리를 컬럼에 붓고, 15 용적의 용해 완충제로 세척한 후, 250mM 이미다졸을 함유하는 변성 완충제로 2ml로 4X 용리시켰다. 각 분취는 12% 겔 상에서 이동시켰고, 정확한 크기의 단백질을 완충제 (50mM Tris pH 7.5, 125 mM NaCl, 1 mM DTT 및 4M 우레아)에 대하여 우선 투석시킨 후, 동일한 완충제 함유 2M 우레아를 함유하는 동일한 완충제로 투석시키고, 끝으로 우레아가 없이 10% 글리세롤을 포함하는 완충제로 2 번 교환하여 투석시켰다. 투석 후 임의의 침전물은 3,000rpm에서 10분 동안 원심분리시켜 제거하였다.
모든 다른 단백질들도 유사한 방법으로 정제하였다. 약 500ml 세포 펠렛은 10mM 이미다졸 및 완전한 프로테아제 저해제을 함유하는 15ml의 완충제 A (50mM Tris pH7.5, 500 mM NaCl) 에 재현탁시키고, 음파파쇄에 의해 용해되고, 12,000 xg, 30 분, 4도에서 원심분리에 의해 맑아진 용해물은 1ml의 사전-평형화된 Ni-NTA 아가로스에 추가되고, 그리고 4도에서 1.5 시간 동안 회전시켰다. 상기 슬러리를 컬럼에 붓고, 10mM 이미다졸을 함유하는 용해 완충제 15 용적으로 세척하고, 그리고 단백질은 50mM 이미다졸을 함유하는 완충제로 2X, 100mM 이미다졸을 함유하는 완충제로 2X, 그리고 250mM 이미다졸을 함유하는 완충제로 3X 세척되었다. 대안으로, 상기 수지 슬러리는 3,000rpm에서 10분 동안 원심분리시키고, 10mM 이미다졸 완충제를 10 용적으로 세척하고, 그리고 단백질들은 상기 각 완충제와 함께 회전시키면서 10분 또는 그 이상의분 동안 항온처리하고, 이어서 원심분리하여 용리시키고, 겔 분석하였다. 정확한 크기의를 이용하여 결정하였다. 정확한 크기의 단백질을 함유하는 분취물은 4도에서 50 mM Tris 7.5, 125 mM NaCl, 10% 글리세롤 및 1 mM DTT를 함유하는 완충제를 두 번 교환시키면서 투석하였다.
Mediator의 정제
상기 Mediator 샘플들은 기존에 기술된 것에 변형을 가하여 정제되었다36. 친화력 정제에 앞서, P0.5M/QFT 분취는 황산암모늄 침전 (35%)을 통하여 12 mg/mL으로 농축시켰다. 펠렛은 20 mM KCl, 20 mM HEPES, 0.1 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 20% 글리세롤을 함유하는 pH 7.9 완충제에 재현탁시키고, 그 다음 친화력 정제 단계에 앞서, 0.15 M KCl, 20 mM HEPES, 0.1 mM EDTA, 20% 글리세롤 및 0.02% NP-40을 함유하는 pH 7.9 완충제에 대하여 투석시켰다. 친화력 정제는 기술된36 바와 같이 실행되며, 2mL 0.15M KCl HEMG (20 mM HEPES, 0.1 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 10% 글리세롤)를 함유하는 2.2 mL의 원심분리 튜브에 용리된 물질을 적하하였고, 4℃, 50K RPM에서 4h 동안 원심분리시켰다. 이는 과도한 자유 GST-SREBP를 제거하고, 최종 분취물에서 Mediator를 농축시키는 역할을 했다. 소적 검정법에 앞서, 정제된 Mediator는 Ultracel-30 막 (Millipore MRCF0R030)과 함께 Microcon-30kDa Centrifugal Filter Unit을 이용하여 ~300nM의 Mediator 복합체에 이르도록 농축되었다. 농축된 Mediator는 10 μM 표시된 GFP-테그된 단백질과 함께, 또는 이들 단백질 없이, ~200 nM의 최종 농도로 소적 검정법에 추가되었다. 소적 반응물에는 10% PEG-8000 또는 16% Ficoll-400 및 140 mM 염이 내포되어 있었다.
염색질 면역침전 서열화 (ChIP-seq)
mES는 2i 배지에서 80% 합류되도록 성장시켰다. 세포 가교를 위해 15분 동안 1% 포름알데히드/PBS를 이용하였고, 얼음 상에서 125mM의 최종 농도에서 글리신으로 중단시켰다. 세포를 차가운 PBS로 세척하였고, 차가운 PBS에서 세포를 긁어내어 수거하였다. 수거된 세포들은 1000g, 3분 동안 4℃에서 펠렛화시키고, 액체 질소에서 순간 냉동시켜, -80℃에서 보관하였다. 모든 완충제에는 새로 만든 완전 프로테아제 저해제가 함유되어 있었다 (Roche, 11873580001). 포스포-특이적 항체를 이용하는 ChIPs의 경우, 모든 완충제는 새로 만들어진 PhosSTOP 포스파타제 저해제 칵테일 (Roche, 4906837001)을 함유하고 있었다. 냉동된 가교된 세포들은 얼음 위에서 해동시키고, 그 다음 LB1 (50mM Hepes- KOH, pH7.9, 140mM NaCl, 1mM EDTA 0.5mL 0.5M, 10% 글리세롤, 0.5% NP-40, 1% TritonX-100, 1x 프로테아제 저해제)에서 재현탁되고, 20분 동안 회전시키면서 4℃에서 항온처리되었다. 세포는 5분 동안 1350 g에서 펠렛화되고, LB2 (10 mM Tris pH 8.0, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.5 mM EGTA, 1x 프로테아제 저해제)에서 재현탁되고, 5분 동안 회전시키면서 4℃에서 항온처리되었다. 펠렛은 LB3 (10 mM Tris pH 8.0, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.5 mM EGTA, 0.1% 데옥시콜레이트-나트륨, 0.5% 라우릴 사르코시네이트 나트륨, 1% TritonX-100, 1x 프로테아제 저해제)에서 ml당 3천-5천만개 세포의 밀도로 재현탁되었다. 세포는 Covaris S220를 이용하여 12분 동안 음파파쇄되었다 (의무 주기: 5%, 강도: 4, 폭발당 주기(cycles per burst): 200). 음파파쇄된 물질은 20000 xg로 30분 동안 4℃에서 맑게 만들었다. 이 상청액은 ChIP를 위해 이용되는 가용성 염색질이다. 0.5% BSA로 사전-차단된 표시된 항체와 함께 2 시간 동안 항온처리되었다. 염색질을 항체-비드 복합체에 추가시키고, 하룻밤 동안 4℃에서 회전시키면서 항온처리하였다. 비드를 각 세척 완충제 1 (50 mM Hepes pH7.5, 500 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA,1% 트리톤, 0.1% NaDoc, 0.1% SDS) 및 세척 완충제 2 (20 mM Tris pH 8, 1 mM EDTA, 250 mM LiCl, 0.5% NP-40, 0.5% NaDoc)을 이용하여 4℃에서 3회 세척한 후, TE로 실온에서 한 번 세척하였다. 염색질은 용리 완충제 (50 mM, Tris pH 8.0, 10 mM EDTA, 1% 도데실 술페이트 나트륨)를 이용하여 비드로 용리시키고, 60℃에서 30분 동안 회전시키면서 항온처리하였다. 가교의 역전은 하룻밤 동안 58℃에서 실행되었다. RNaseA가 추가되었고, RNA 제거를 위해 50℃에서 1 시간 동안 항온처리하였다. 단백질분해효소 K가 추가되었고, 단백질 제거를 위해 1 시간 동안 60℃에서 항온처리하였다. Qiagen PCR 정제 키트를 이용하여 제작자의 지침에 따라 DNA를 정제하였고, 그리고 50 μL 10 mM Tris-HCl, pH 8.5에서 용리시켜, 정량화 및 ChIP 라이브러리 준비에 이용하였다. ChIP 라이브러리는 제조업자의 지침에 따라 PippinHT 시스템(Sage Science 사의)에서 추가 크기 선별 단계와 함께, Swift Biosciences Accel-NGS® 2S Plus DNA Library Kit로 준비되었다. 라이브러리 준비 후, ChIP 라이브러리는 PippinHT 상에서 2% 겔 상에 이동되었으며, 크기 콜렉션 창은 200-600개 염기다. 최종 라이브러리는 KAPA 라이브러리 정량화 키트(Roche 사의)와 함께 qPCR을 이용하여 정량화되었으며, Illumina HiSeq 2500 상에서 40개 염기에 대한 단일-판독 모드에서 서열화되었다.
ChIP-Seq 데이터는 매개 변수 -k 1 -m 1 -베스트(best) 및 -l을 판독 길이로 설정한 bowtie를 사용하여 마우스 참조 게놈의 mm9 버전에 정렬되었다. 매개변수 -w -S - 스페이스(space)=50 -노모델(nomodel) -변위크기=200와 함께 MACS를 이용하여 빈(bins) 안에서 판독 적용범위 디스플레이를 위한 Wiggle 파일이 만들어졌으며, 빈(bin) 하나의 판독 카운트는 wiggle 파일을 만들기 위해 이용된 맵핑된 판독 백만 개에 대하여 정상화되었다. 백만개-당-판독-정상화된 wiggle 파일은 UCSC 게놈 브라우져에서 디스플레이되었다. Metagene 플롯은 디폴트 매개변수를 이용하여 ngs.plot37 (v2.61)에서 만들었다. 발현된 유전자들의 상위 20%는 공개된 RNA-seq 데이터세트 (GSE112807)9로부터 산출되었다. SRSF2 및 Ser2-P Pol II ChIP-seqs는 SRSF2 (Abcam ab11826) 및 Pol II Ser2 포스포 CTD (Millipore 04-1571)에 대항하는 항체를 이용하여 본 연구에서 만들었고, 한편 MED1 및 전체 Pol II ChIP-seqs는 기존에 공개된 것이다 (GSE112808)9.
평균 이미지 분석
면역형광과 함께 RNA FISH 분석을 위해, RNA FISH 및 IF 채널에서 수집된 3D 이미지 데이터를 처리하고, 분석하기 위해 맞춤형 사내 (in-house) MATLAB™ 스크립터가 작성되었다. FISH 촛점은 강도(intensity) 및 크기 역치값을 통해 개별 z-스택에서 식별되었고, 
의 크기 상자를 따라 중앙배치되었고, 그리고 z-스택에서 3-D로 함께 스티치(stitched) 되었다. 식별된 모든 FISH 촛점의 경우, IF 채널에서 대응하는 위치로부터 얻은 신호는 모든 대응하는 z-슬라이스에서 RNA FISH 촛점에 집중된 
사각형에 담는다. 각 FISH 및 IF 짝에 대한 FISH 촛점에 집중된 IF 신호를 조합하고, 평균 강도 투영도를 산출하고, IF 신호 강도에 대한 평균 데이터를 FISH 촛점에 집중된 
사각형 안에 제공한다. 이것 자체 좌표 상에 집중된 FISH 신호 강도에 대하여 동일한 프로세스를 실시하였으며, FISH 신호 강도에 대한 평균 데이터는 FISH 촛점에 집중된 
사격형 안에 제공한다. 각 이미지 세트에 대해 평균 강도 투영도 당 복제 수는 도면의 범례 안에 제공된다. 대조군으로써, 무작위로 선별된 핵 위치에 집중된 IF 신호에 대해서도 동일한 프로세스를 실시하였다. 각 복제의 경우, 40개의 랜덤 핵 포인트(points)는 상기 핵 외피의 내부에서 생성되었고, 큰 크기 (200 voxels) 및 강도 (DNA 밀도) 임계치의 조합에 의해 DAPI 채널로부터 식별되었다.
그 다음, 이러한 평균 강도 투영은 신호 강도의 2D 등고선 맵을 생성하는데 사용되었다. 등고선 플롯은 MATLAB™의 내장(built-in) 함수를 이용하여 생성된다. 등고선 플롯의 경우, 표시된 강도-색상 범위는 선형 색상 범위에 걸쳐 사용자 지정되었다(
= 15). FISH 채널의 경우, 검정색에서 자홍색이 사용되었다. IF 채널의 경우, 우리는 chroma.js (온라인 색상 생성기)를 사용하여 15개 빈(bins) 전체에 색상을 생성했으며, 주요 전환 색상은 검정색, 청자색, 중간-파란색, 라임색이 선택되었다. 이것은 판독자의 눈으로 신호의 대비를 더 쉽게 감지할 수 있도록 하기 위해 수행된 것이다. 생성된 컬러 맵은 모든 IF 플롯에 대해 균일한 간격의 강도 빈(bins) 15 개에 사용되었다. FISH 또는 무작위로 선별된 핵 위치에 집중된 평균 IF는 각 플롯의 최소 및 최대 신호를 포함하도록 설정된, 동일한 색상 척도를 사용하여 플롯된다.
시험관내 소적 검정법
재조합 GFP 또는 mCherry 융합 단백질들을 농축시키고, Amicon Ultra 원심분리 필터 (30K MWCO, Millipore)를 이용하여 적절한 단백질 농도 및 125 mM NaCl로 탈염시켰다. 도면의 범례에서 기술된 바와 같이, 재조합 단백질들은 소적 형성 완충제 (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 10% 글리세롤, 1 mM DTT)에서 군집제로 100- 125 mM 최종 염 및 16% Ficoll-400 또는 10% PEG-8000와 함께 농도를 변화시키면서 용액에 추가되었다. 상기 단백질 용액은 두 개의 나란하게 있는 양-면 테이프 띠에 의해 부착된 커버슬립과 함께 유리 슬라이드를 포함하는 직접 만든 챔버 상이 바로 적재하였다. 그 다음 슬라이드를 150x 대물렌즈를 갖춘 Andor 공촛점 현미경으로 이미지화시켰다. 다른 언급이 없는 한, 제공된 이미지는 유리 커버슬립 상에 자리잡은 소적의 이미지다. 시험관내 소적의 FRAP를 위해, 20us 거주 시간에서 2 펄스의 레이져(20% 파워)를 당해 소적에 제공하였고, 그리고 복구는 표시된 기간 동안 매 1s 마다 Andor 현미경 상에서 이미지화시켰다. CDK7 또는 CDK9 중재된 CTD 포스포릴화의 경우, 상업적으로 이용가능한 활성 CDK7/MAT1/CCNH (CAK 복합체; Millipore 14-476) 또는 CDK9/사이클린 T1(Millipore 14-685)를 이용하여 키나제 반응 완충제 (20 mM MOPs-NaOH pH 7.0, 1 mM EDTA, 0.001% NP-40, 2.5% 글리세롤, 0.05% 베타-멀캅토에탄올, 10 mM MgAc, 10 uM ATP)에서 GFP- CTD52를 실온에서 2-3 시간 동안 포스포릴화시켰다. 효소에 대한 CTD 비율은 ~1 uM CTD 내지 ~4.8 ng/ul CDK7 또는 CDK9이다.
시험관내 소적의 이미징 분석
시험관내 상 분리 이미징 실험을 분석하기 위하여, 소적을 식별하고, 이들의 크기 및 모양을 특징화하기 위하여 맞춤형 MATLABTM 스크립터가 기록되었다. 임의의 특정 실험 조건을 위해, 히스토그램의 피크와 크기 임계 값 (z-슬라이스 당 9 픽셀 반경)을 기반으로 한 강도 임계값을 사용하여 이미지를 세그먼트화했다. 소적 식별은 "스캐폴드" 채널 (MED1-IDR + CTD의 경우 MED1-IDR, SRSF2+CTD의 경우 SRSF2)에서 실행했으며, 그리고 지역 및 종횡비가 결정되었다. 일반적으로 5-10 개의 독립적인 시야에서 확인된 수백 개의 소적이 정량화되었다. GFP 채널 (즉 GFP-CTD)의 경우 소적 (C-인) 및 벌크 (C-아웃)에서의 평균 강도가 산출되었다. GFP-CTD에 대한 분할 계수/풍도 비율은 (C-인)/(C-아웃)으로 계산되었다. 풍도 득점는 실험 조건의 C인/아웃을 대조군 GFP 형광 단백질 의 C인/아웃으로 나누어 계산했다.
데이터 가용성
본 연구에서 생성된 데이터세트는 Gene Expression Omnibus에 기탁번호 GSE120656로 기탁되었다.
참고자료
실시예 7
상 분리란 생물분자가 희석된 상 및 농축된 상으로 분리되고, 이로 인하여 형성 "막이 없는 세포-기관"을 형성하는 물리화학적 프로세스다 (1-5). 최근 연구에 따르면, TFs 및 Mediator 공동활성제는 정상적인 세포 정체성에서 눈에 띄게 중요한 역할을 하는 유전자들에서 전사 기구를 구획화시키고, 농축시키는 상-분리된 응축물을 형성할 수 있는 것으로 드러났다 (6-10). 전사 조절 장애는 악성 종양의 잘 설명된 특징이지만, 응축 물이 암에서 수행하는 역할에 대한 이해수준은 지극히 제한적이다.(11-16). 따라서, 우리는 전사 응축물이 암 치료에 의해 교란되는지, 약물-내성 상태에서 변경되는지 여부를 확인하기 위해, 전사응축물이 종양형성적 전사 프로그램을 유도하는지 확인했다.
유방암은 가장 흔한 종양으로, 대부분의 경우 종양형성적 TF인 ER에 의해 구동된다 (17). ER은 전사 기구와 상호작용하여 MYC 종양유전자를 비롯한 에스트로겐 반응성 유전자들의 발현을 구동시킨다 (18-20). 전사 응축물들이 인간 종양 조직의 MYC에서 발생하는 지 여부를 결정하기 위해, Mediator의 MED1 하위단위 및 ER에 대한 면역형광 (IF) 및 RNA FISH를 ER+ 침습성 관내 암종 생검체에서 실행하였다 (도 68A, 도 72A). ER 및 MED1은 인간 종양 조직의 활성 MYC 좌에서 발행되는 핵 푼차(puncta) 의 성분들이라는 것을 알았고, 이것은 전사 응축물들에 대한 우리의 예상과 일치된다 (도 68A, 도 72B). 우리는 우리의 연구를 실험적으로 더 다루기 쉬운 ER+ 유방암 세포 계통 MCF7로 확장하였으며, MED1 및 ER 푼차(puncta)는 에스트로겐 존재 하에서 활성 MYC 전사 부위에서 형성된다는 것을 확인했다 (도 68B). mEGFP-테그된 MED1을 만들기 위해 만들어진 MCF7 세포에서 MED1 푼차(puncta)는 신속한 형광 광표백 후 복구 (FRAP)를 실증하였으며 (도 68C, 도 72C), 이것은 액체-유사 응축물들에 대하여 예측된 성질과 일치한다. 이러한 결과에서 ER 및 Mediator는 유방암 세포의 MYC 종양유전자에서 전사 응축물을 형성한다는 것이 암시된다.
MYC 종양유전자의 발현은 이상조절되어, 다양한 변종 암에서 종양발생을 유도한다 (21). Mediator는 몇 가지 TFs의 공동활성제이며, 따라서 Mediator 응축물들이 많은 세포 유형의 MYC 에 존재할 것으로 예측할 수 있다 (22). 또한, MED1 푼차(puncta)는 전립선 암, 다발성 골수종, Burkitt's 림프종, 그리고 결장 암 세포 계통의 전자 활성 MYC 좌에서 발견되었다 (도 68D). 이와 함께, 이러한 결과들로부터 MYC (이 유전자는 종양형성 구동자임)는 종양 조직 및 암 세포의 Mediator 응축물에 의해 점유된다는 것을 암시한다.
ER+ 유방암 세포에서, ER에 에스트로겐의 결합은 ER 표적 유전자의 활성 강화로 이어진다 (23). 에스트로겐이 ER 표적 유전자에서 Mediator 응축물 형성을 강화시키는 지 여부를 평가하기 위해, MCF7 세포의 MYC 좌에서 DNA FISH와 함께 MED1에 대하여 IF를 실시하였다. MED1 신호는 에스트로겐 자극 시에 MYC 에서 강화되었고 (도 69A) 그리고 이것은 MYC RNA 발현의 증가에 수반되었다 (도 69B). 탐옥시펜은 ER 리간드-결합 도메인 (LBD)에 결합하고, ER의 활성화 잠재력 및 MED1에 대한 친화력을 감소시키는 형태학적 변위를 초래하는 항-에스트로겐 치료요법제이다, (24). 탐옥시펜 치료는 MYC 에서 MED1 신호를 축소시키는데 (도 69A), MYC RNA 발현 축소가 동시에 일어난다 (도 69B). 이러한 결과는 에스트로겐이 종양유전자에서 공동활성제 응축물 형성 및 전사를 자극하고, 그리고 탐옥시펜은 응축물 형성 및 전사 모두의 에스트로겐-의존적 자극을 억압시킨다는 모델과 일치한다 (도 69A).
에스트로겐 및 탐옥시펜의 효과가 공동활성제 응축물들의 ER LBD-의존적 형성 및 해체로 인한 것인지 여부를 더 조사하기 위해, 상기 ER LBD를 세포에서 Lac 어레이에 테터링할 때, 상-분리된 응축물들의 형성을 모니터하는 공작된 시스템을 이용하였다 (도 69C) (25, 26). 이렇게 테터링된 ER LBD은 세포가 에스트로겐에 노출될 때 MED1-함유 응축물을 만들었고, 그리고 이러한 응축물 형성은 탐옥시펜에 의해 방해된다는 것을 알았다 (도 69C). 내생성으로 테그된 MED1-mEGFP를 함유하는 세포들의 생 세포 이미징(도 73A, 도 73B)에서 탐옥시펜은 ER LBD-MED1 응축물을 용해시키는 것이 밝혀졌고, 이는 이 어셈블리에 대하여 예상된 역동적 성질을 확인시킨다(도 69D). 이들 결과에서 상기 ER LBD의 에스트로겐-의존적, 탐옥시펜-민감성 전사활성화 기능은 세포에서 에스트로겐-의존적, 탐옥시펜-민감성 MED1-함유 응축물의 형성과 관련된다.
ER-MED1 응축물들에서 에스트로겐 및 탐옥시펜의 효과를 더 연구하기 위해, 정제된 재조합 ER-GFP 및 절두된 MED1-mCherry 융합 단백질들과 함께 시험관내 소적 형성 검정법을 이용하였다. 이미 보고된 바와 같이, MED1-mCherry는 상-분리된 소적을 형성하였고, 이때 ER 통합은 에스트로겐에 의해 강화되었다 (도 69E, 도 73C) (6). ER의 에스트로겐 자극에 의한 MED1 응축물로의 통합은 탐옥시펜에 의해 방해되었다 (도 69E, 도 73C). 이들 결과는 에스트로겐-반응성 종양유전자들의 활성화는 강화된 Mediator 응축을 통하여 발생한다는 모델과 일치하며, 그리고 유방암 치료 효과가 있는 약물은 이들 응축물 형성을 방해할 수 있다 (도 69F).
항에스트로겐, 이를 테면, 탐옥시펜은 유방암 치료에 매우 효과적인 반면, 저항성은 여전히 극복해야 하는 주요 과제로 남아있다 (17). 저항성은 다중 기전에 의해 발생할 수 있지만, 이들중 많은 것들은 ER과 공동활성제 간의 호르몬-독립적 상호작용을 유발하고, 결과적으로 유전자 활성화 및 종양 성장을 초래할 수 있다 (27). 종양 성장 및 생존에 ER이 공동활성제와 응축하는 능력이 필수적이라면, 희석된 상과 응축된 상 간의 경계를 가로질러 전이하는 전사 인자와 공동인자의 능력을 변경시킴으로써 항에스트로겐 저항성이 달성될 수 있다고 생각했다. 도 70A에서 도시된 바와 같이, TF-Mediator 응축물에 대한 상 분리 경계에 걸친 변위는 당해 응축물을 구성하는 성분들의 친화력을 변경시킴으로써 발생될 수 있을 것이다(28).
ER의 다양한 유전적 변경은 공동활성제 상호작용에 적합한 구조적 입체형태를 안정화시키는 LBD의 돌연변이 (Y537S 및 D538G) (29) 및 공동활성제 YAP1 및 상기 세포 표면 단백질 PCDH11X를 비롯한 다양한 유전자로의 전좌를 포함하는 항에스트로겐-저항적 유방암 환자에서 발견된다 (도 70B, 도 74A) (30). 이들 ER 돌연변이체의 응축물 형성 성질을 검사하기 위해, 재조합 ER Y537S, ER D538G, ER-YAP1, 그리고 ER-PCDH11X GFP 융합 단백질들을 만들었다. 야생형 ER에 대한 결과(MED1 소적으로의 통합은 에스트로겐에 의해 강화되며, 탐옥시펜에 의해 방해됨)와 대조적으로, 4개 돌연변이체 ER 단백질은 모두 MED1와 함께 에스트로겐-독립적, 탐옥시펜-둔감성 응축물을 형성하였다 (도 70C-D, 도 74B). 이들 돌연변이체 ER 단백질들의 변경된 상 분리 수용력은 이들의 에스트로겐-독립적 전사활성화 잠재력과 관련있다 (도 70E-G) (29, 30). 세포에서 이들 응축물 형성 성질을 검사하기 위해, 세포에서 ER LBD 점 돌연변이체를 Lac 어레이에 테터링하고 (도 69C); 정상적인 ER은 오직 에스트로겐 존재 하에서만 당해 게놈 좌에 대해 MED1 응축물을 만들었지만, 한편 ER 돌연변이체는 에스트로겐 존재 및 부재 모두의 경우에서 MED1 응축물을 형성하였다 (도 74C). 이와 함꼐, 이들 데이터는 항에스트로겐-저항적 환자에서 발견된 습득된 유전적 변형으로 ER 및 MED1의 에스트로겐-독립적 응축을 허용하고, 결과적으로 유전자 활성화 및 종양 성장이 결과된다는 것을 실증한다.
TF-Mediator 응축물의 경우 상 분리 경계에 걸친 변위는 또한 응축물 성분, 이를 테면, MED1의 농도를 변경시켜 발생될 수 있다 (도 71A) (8, 28). 탐옥시펜-결합된 ER은 에스트로겐-결합된 ER과 비교하여 공동활성제에 대한 친화력이 축소된다 (31). 그러나, MED1 과다발현은 이러한 축소된 친화력을 보상하기 위한 것으로 보이며; MED1-과다발현시키는 종양을 갖는 환자는 탐옥시펜 치료에도 불구하고 재발을 경험할 가능성이 있다 (32). 이 사실과 일관되게, 탐옥시펜 저항성으로 선별된 MCF7 세포는 MED1를 4-배 이상 더 많이 과다발현시킨다 (도 71B). 이로써 MED1 고-농도 존재 하에서, 공동활성제들에 대한 낮은 친화력에도 불구하고, 탐옥시펜-결합된 ER은 ER-MED1 응축물을 형성할 수 있고, 유전자들을 활성화시킬 수 있으며, 그리고 암 세포 생존에 영향을 줄 수 있다는 가설을 우리로 하여금 세우게 하였다. 상승된 농도의 MED1이 탐옥시펜-결합된 ER과의 응축물 형성을 용이하게 할 수 있다는 발상을 테스트하기 위해, 상이한 농도의 MED1로 시험관내 소적 실험을 실시했다. 낮은 MED1 농도에서, 에스트로겐-결합된 ER은 MED1 응축물 형성을 촉진시키지만, 탐옥시펜-결합된 ER은 그렇지 않았다 (도 71C, 도 75A). 그러나, 더 높은 MED1 농도에서, 에스트로겐-결합된 및 탐옥시펜-결합된 ER은 모두 MED1 응축을 허용하였다 (도 71C, 도 75A). 이것이 세포에서 또한 일어나는 지 여부를 테스트하기 위해, Lac 어레이에 테터링된 ER LBD를 갖는 세포에서 MED1 수준을 변경시켰다. 상기 ER LBD는 탐옥시펜 존재 하에서 정상적인 MED1 수준으로는 MED1 응축물을 만들지 않았고 (도 71D); 대조적으로, 탐옥시펜-결합된 ER LBD은 MED1이 과다발현될 때 MED1 응축물을 만들었다(도 71D). MED1 과다발현의 기능적 결과를 검사하기 위해, 탐옥시펜-결합된 ER과 함께 GAL4 전사활성화 검정법을 이용하였으며, 여기에서 상승된 MED1 수준 하에서 활성화된다는 것을 보여주었다 (도 71E 및 도 75B). MED1 과다발현이 유방암 세포에서 약물 저항성에 기여할 수 있는 지를 확인하기 위해, 생성된 MCF7 세포들 MED1을 과다발현시키는 MCF7 세포를 만들었는데, 이는 탐옥시펜에 대한 축소된 민감성을 나타내었다 (도 71F). 이들 데이터에서 MED1의 과다발현은 응축물 형성을 강화시킴으로써 항에스트로겐 저항성을 중재할 수 있으며, 이로 인하여 암에서 약물 저항성의 기전으로써 단백질 발현 및 농도-의존적 상 분리 조절에 연루되어 있음을 암시한다(도 71G).
우리 결과에서 전사 응축물들은 암에서 종양유전자 발현을 구동시키는 전가 기구를 구획화시키고, 농축시킬 수 있으며, 이들 종양형성적 응축물들은 임상적으로 효과적인 약물에 의해 교란될 수 있고, 그리고 다양한 약물 저항성 기전의 진화는 전사 응축물 거농의 조절로 수렴될 수 있음이 암시된다. 이러한 발상은 종양 세포들이 구동자 종양 유전자에서 슈퍼-인헨서 (SEs)를 획득하고 (33), 종양형성적 SEs는 TF-DNA 상호작용에서 단지 작은 변화에 의해 획득될 수 있으며(34), 그리고 일부 종양유전자 SEs는 특정 약물에 의해 비정상적으로 중단되는 경향이 있다(11)는 기존 증거와 일치한다. 형성 및 해체의 급격한 전이, 성분의 고-농도, 그리고 특정 화학물의 차등 분할 가능성을 비롯한 응축물들의 특징적 특징이 이러한 관찰을 설명할 수 있다. 응축물 거동 및 소 분자 화학물질에 의한 이의 조절에 대한 우리의 이해가 더 진전되면 암 환경에 유익할 수 있을 것이다.
재료 및 방법
세포 배양
MCF7 세포들 (Weinberg laboratory의 선물), HCT116 세포들 (ATCC CCL-247), ~50,000 Lac-억제인자 결합 부위들의 안정적으로 통합된 어레이(이하 "U2OS-Lac 세포들"로 지칭됨 (Spector laboratory의 선물)를 함유하는 U2OS-268 세포, 그리고 HEK293T 세포 (ATCC CRL-3216)는 DMEM 완전 배지 (DMEM (Life Technologies 11995073), 10% 태아 소 혈청, FBS, (Sigma Aldrich, F4135), 1% L-글루타민 (GIBCO, 25030-081), 1% 페니실린 스트렙토마이신 (Life Technologies, 15140163))에서 성장시켰다. 에스트로겐 박탈에 대하여, 세포들을 표시된 시간 동안 에스트로겐-없는 DMEM ((페놀-레트 없는 DMEM (Life Technologies, 31053028), 목탄-박리된 태아 소 혈청, FBS, (Sigma-Aldrich F6765), 1% L-글루타민 (GIBCO, 25030-081), 1% 페니실린 스트렙토마이신 (Life Technologies, 15140163))에서 성장시켰다.
LN-CAP (ATCC CRL-1740), MM1S (ATCC CRL-2974), 그리고 Ramos (ATCC CRL-1596) 세포들은 RPMI 완전 배지 (RPMI-1640 (Life Technologies, 61870127), 1% 페니실린 스트렙토마이신 (Life Technologies, 15140163), 10% 태아 소 혈청, FBS, (Sigma Aldrich, F4135))에서 성장시켰다.
TamR7 (ECACC 16022509) 세포들은 TAMR7 배지 (페놀 레드-없는 DMEM/F12 (Life Technologies 21041025, 1% L-글루타민 (GIBCO, 25030-081)1% 페니실린 스트렙토마이신 (Life Technologies, 15140163), 1% 태아 소 혈청, FBS, (Sigma Aldrich, F4135), 6ng/mL 인슐린 (Santa Cruz Biotechnology, sc-360248))에서 성장시켰다.
계대를 위해, 세포들은 PBS (Life Technologies, AM9625)로 세척되었다. TrypLE Express 효소 (Life Technologies, 12604021)를 이용하여 플레이트로부터 세포를 떼내었다. TrypLE는 완전 DMEM으로 중단되었다.
조직 샘플
10uM 섹션의 새로 냉동된 미처리 에스트로겐 수용체 양성, 프로게스테론 수용체 양성, HER2/neu 음성, 침윤성 관내 암종은 BioIVT에서 제공하였다. H&E 착색은 샘플을 얻은 회사에서 실시되었다.
세포 계통 생성
CRISPR/Cas9는 U2OS-Lac 세포에서 내생성으로-mEGFP-테그된 MED1을 만드는데 이용되었다. 이 단백질의 N-말단 부근 게놈 서열을 표적으로 하는 2개의 가이드 RNAs를 코딩하는 올리고뉴클레티드는 Cas9 및 mCherry을 발현시키는 px330 벡터 (R. Jaenisch로부터 선물로 받음)로 클론시켰다. MED1을 표적으로 하는 서열은 5'CCTTCAGGATGAAAGCTCAG 3' (서열 식별 번호: 253) 및 5'CCCCTGAGCTTTCATCCTGA 3' (서열 식별 번호: 254)이었다. 복구 주형은 mEGFP, 10개 아미노산 GS 링커 및 상기 삽입물 측면의 800 bp 상동성 암(arms)을 함유하는 pUC19 벡터 (NEB)로 클론시켰다. 500k 세포는 Lipofectamine 3000을 이용하여 1.25 μg px330 벡터 및 1.25 μg 복구 주형으로 형질감염시켰다. 형질감염 후 2일 시점에 mCherry에 대하여 세포를 분류하였다. 일차 분류 후 1 주일 시점에서, 96-웰 플레이트의 웰당 단일 세포와 함께, mEGFP로 세포를 분류하였다. 세포를 확장시키고, PCR을 통하여 유전자형을 확정하였고, 동형접합성 녹-인 테그를 갖는 클론을 실험에 이용하였다.
MCF7 mEGFP-MED1 세포들를 만들기 위해, 10개의 아미노산 GS 링커에 의해 연결된 N-말단 mEGFP 융합을 갖는 전장 MED1을 함유하는 렌티바이러스 구조체가 클론되었는데, 퓨로마이신 선별 마커를 함유한다. 렌티바이러스 입자들이 HEK293T 세포에서 생성되었다. 250,000개 MCF7 세포를 6-웰 플레이트의 한 개 웰에 도말시키고, 바이러스 상청액을 추가하였다. 48 시간 후 선별을 위해 5일 동안 1ug/mL의 퓨로마이신이 추가되었다.
단백질 생산
상기 관심대상의 유전자들 또는 이들의 IDRs를 인코딩하는 cDNA는 T7 pET 발현 벡터의 변형된 형태로 클론되었다. ER 및 이의 변이체들의 경우, 모든 경우에서 전장의 단백질이 이용되었다. MED1의 경우, ER과 상호작용하는 것으로 알려진 LXXLL 도메인을 함유하고, 아미노산 600-1582을 포함하는 연장된 IDR이 만들어졌다. 상기 기본 벡터는 5' 6xHIS에 이어서 mEGFP 또는 mCherry 그리고 14 아미노산 링커 서열 "GAPGSAGSAAGGSG." (서열 식별 번호: 14)을 포함하도록 공작되었으며, NEBuilder® HiFi DNA Assembly Master Mix (NEB E2621S)는 링커 아미노산과 동일한 틀(in-frame)에 이들 서열(PCR을 이용하여 생성됨)을 삽입시키기 위해 이용하였다. mEGFP 또는 mCherry 만을 발현시키는 벡터는 당해 링커 서열에 있어서, STOP 코돈을 내포한다. 돌연변이체 서열은 유전자블록 (IDT)으로 합성되었으며, 상기에서 기술된 바와 같이 동일한 기본 벡터 안으로 삽입되었다. 모든 발현 구조체를 서열화하여 서열 정체성을 확보하였다.
단백질 발현 플라스미드는 LOBSTR 세포들 (Chessman laboratory로부터 선물로 받음)로 형질전환되었다. 새로운 박테리아 콜로니는 카나마이신 및 클로람페니콜을 함유하는 LB 배지에 접종시키고, 하룻밤 동안 37oC에서 성장시켰다. 상기 MED1-IDR 구조체를 함유하는 세포를 새로 추가된 카나마이신 및 클로람페니콜이 새로 추가된 500ml의 실온 LB에서 1:30으로 희석시키고, 1.5 시간 동안 16oC에서 성장시켰다. IPTG를 1mM로 추가하였고, 20 시간 동안 성장을 지속시켰다. 세포들을 수거하고, -80oC에서 냉동 보관하였다. 다른 모든 구조체를 함유하는 세포들도 유사한 방식으로 처리하였는데, 단 IPTG 유도 후, 37C에서 5시간 동안 성장시켰다는 것이 차이점이다.
500ml 세포 펠렛은 15ml의 완충제 A (50mM Tris pH7.5, 500 mM NaCl, 10mM 이미다졸, 완전한 프로테아제 저해제, Roche 11872580001)에서 재현탁되었고, 15 초-작동, 60초-중단의 주기, 10회 주기에 의해 음파파쇄시켰다. 상기 용해물은 4oC, 12,000g에서 30분 동안 원심분리시킴으로써 맑게 만든 후, 1ml의 사전-평형화된 Ni-NTA 아가로스 (Invitrogen, R901-15)에 추가하였고, 4oC에서 1.5 시간 동안 회전시켰다. 상기 슬러리는 Thermo Legend XTR 스윙 버켓 로터(swinging bucket rotor)에서 3,000 rpm로 10분 동안 원심분리되었다. 상기 수지 펠렛은 5ml의 용해 완충제 A로 2 X 세척한 후, 상기와 같이, 원심분리되었다. 단백질은 2ml의 완충제 A + 250mM 이미다졸을 이용하여 3X 용리되었다. 각 주기에서, 상기 용리 완충제가 추가되었고, 상기에서 언급된 바와 같이 4C에서 적어도 10분 동안 회전 및 원심분리되었다. 용출물은 Coomassie 착색된 12% 아크릴아미드 겔에서 분석되었다. 예상된 크기의 단백질을 함유하는 분취물을 모으고, 250mM 이미다졸 완충제로 1:1로 희석시키고, 4C에서 50mM Tris 7.5, 125mM NaCl, 10% 글리세롤 및 1mM DTT를 함유하는 완충제를 두 번 교환시키면서 투석하였다. 단백질 농도는 BCA Protein Assay Kit - 필적가능한 환원제에 의해 측정되었다.
면역형광
10μm 두께로 슬라이스된 인간 종양 조직 또는 폴리-L-오르니틴 피복된 유리 상에서 성장된 세포는 PBS로 한 번 세척한 후, 4% 파라포름알데히드, PFA, (VWR, BT140770)에서 10 분간 고정되었다. PBS에서 5분 동안 3회 세척 후, 세포들은 4℃에 보관하거나 또는 가습 챔버로 옮기고, 면역형광을 위해 처리하였다. 세포들의 투과화는 0.5% 트리톤 X100 (Sigma Aldrich, X100)/PBS에서 10분 동안 실행한 후, PBS 세척을 3회 실시하였다. 세포들은 4% IgG-없는 소 혈청 알부민, BSA, (VWR, 102643-516)을 이용하여 30분 동안 차단시키고, 표시된 원발성 항체(ER ab32063, MED1 ab64965)는 4% IgG-없는 소 혈청 알부민에서 1:500의 농도로 4-16 시간 동안 추가되었다. RNA FISH 또는 DNA FISH 이후, 원발성 항체는 PBS에서 희석되었다. 세포를 PBS로 3회 세척하였고, PBS에서 1:500의 농도로 2차 항체 (염소 항-토끼 IgG Alexa Fluor 488, Life Technologies A11008)와 함께 1 시간 동안 항온처리하였다.
PBS로 2회 세척 후, 핵은 20μm/mL Hoechst 33258 (Life Technologies, H3569)에서 5분 동안 착색되었다. 그 다음, 세포를 물로 한 번 세척 후, 커버슬립은 Vectashield (VWR, 101098-042)가 있는 유리 슬라이드에 탑재하고, 최종적으로 커버슬립은 메니큐어 (Electron Microscopy Science Nm, 72180)로 밀봉하였다. MetaMorph 촬영 소프트웨어 및 Hammamatsu ORCA-ER CCD 카메라 (W.M. Keck Microscopy Facility, MIT)를 이용하여, 100x 대물렌즈가 있는 RPI 스피닝 디스크 공촛점 현미경으로 이미지를 얻었다. 이미지는 Fiji Is Just ImageJ (The worldwide web at //fiji.sc/)를 이용하여 추후-프로세스되었다.
RNA FISH와 함께 면역형광
면역형광은 상기 기술된 바와 같이 실행되었다. 상기 세포를 2차 항체와 함께 항온처리 후, 세포는 5분 동안 RT에서 PBS로 3회 세척하였고, 4% PFA/PBS에서 10분 동안 고정되었다. PBS로 2회 세척 후, RNase-없는 물 (Life Technologies, AM9932)에 세척 완충제 A (20% Stellaris RNA FISH 세척 완충제 A (Biosearch Technologies, Inc., SMF-WA1-60), 10% 탈이온화된 포름아미드(EMD Millipore, S4117)를 세포에 추가하였고, 5분 동안 항온처리하였다. 하이브리드화 완충제 (90% Stellaris RNA FISH 하이브리드화 완충제 (Biosearch Technologies, SMF-HB1-10) 및 10% 탈이온화된 포름아미드)에서 12.5 μM의 RNA 프로브 (Custom Stellaris MYC 프로브 Ref# SS4687950104)를 세포에 추가하였고, 하룻밤 동안 37℃에서 항온처리하였다. 세척 완충제 A로 30분 동안 37℃에서 세척한 후, 핵은 20μm/mL Hoechst 33258 (Life Technologies, H3569)/PBS에서 5분 동안 착색시키고, 이어서 5분 동안 세척 완충제 B (Biosearch Technologies, SMF-WB1-20)으로 세척하였다. 그 다음 세포는 물로 한번 세척한 후, 유리 슬라이드 상의 커버슬립에 탑재시킨 후, 밀봉하고, 이미징촬영하고, 그리고 전술한 바와 같이 추후-프로세싱하였다.
DNA FISH과 함께 면역형광
MCF7 세포들은 24-웰 플레이트에서 폴리-L-오르니틴 피복된 커버슬립 상에서 3일 동안 에스트로겐-없는 DMEM에서 성장시켰고, 웰당 최초 씨딩 밀도는 50,000개 세포다. 그 다음, 세포는 비히클, 10uM 에스트라디올, 또는 10uM 에스트라디올 및 5uM 4-히드록시탐옥시펜으로 45분 동안 처리되었다. 커버 슬립 상의 세포는 4% 파라포름알데히드에서 고정되었다. 면역형광은 상기 기술된 바와 같이 실행되었다. 상기 세포를 2차 항체와 함께 항온처리 후, 세포는 5분 동안 RT에서 PBS로 3회 세척하였고, 4% PFA/PBS에서 10분 동안 고정되었으며, PBS로 3회 세척하였다. 세포는 70% 에탄올, 85% 에탄올 및 그 다음 100% 에탄올로 1분 동안 RT에서 항온처리되었다. 프로브 하이브리드화 혼합물은 7μL의 FISH 하이브리드화 완충제 (Agilent G9400A), 1μl의 FISH 프로브 (SureFISH 8q24.21 MYC 294kb G101211R-8) 및 2μL의 물을 혼합하여 만들었다. 5μL의 혼합물을 슬라이드 상에 추가하였고, 커버슬립을 상부에 배치시켰다 (세포-측면은 하이브리드화 혼합물 쪽으로 향하게). 커버슬립은 고무 시멘트를 이용하여 밀봉하였다. 고무 시멘트가 굳어지면, 게놈 DNA 및 프로브를 78℃에서 5분 동안 변성시키고, 슬라이드를 16℃, 어두운 O/N에서 항온처리하였다. 커버슬립을 슬라이드로부터 벗겨내었고, 사전-데워진 세척 완충제 1 (Agilent, G9401A)과 함께 73℃에서 2분 동안, 그리고 세척 완충제 2 (Agilent, G9402A)에서 1분 동안 RT에서 항온처리하였다 슬라이드는 대기-건조시키고, 핵은 20μm/mL Hoechst 33258 (Life Technologies, H3569)/PBS에서 5분 동안 RT에서 착색되었다. 커버슬립은 PBS로 3회 세척하였고, 유리 슬라이드 상의 커버슬립에 탑재시킨 후, 밀봉하고, 이미징촬영하고, 그리고 전술한 바와 같이 추후-프로세싱하였다.
RT-qPCR
MCF7 세포에서 3일 동안 에스트로겐을 탈취하고, 그 다음 10nM 에스트로겐 또는 10nM 에스트로겐 및 5uM 4-히드록시탐옥시펜으로 24 시간 동안 자극하였다. RNA는 AllPrep Kit (Qiagen 80204)로 단리시키고, 고-수용력 cDNA 역 전사 키트 (Applies Biosystems 4368814)를 이용하여 cDNA 합성하였다. QuantStudio 6 System (Life Technologies) 상에서 Power SYBR Green mix (Life Technologies #4367659)를 이용하여 생물학적 그리고 기술적 삼중(triplicate)으로 qPCR을 실행하였다. 다음의 올리고(oligos)가 qPCR에 이용되었다; Myc fwd AACCTCACAACCTTGGCTGA (서열 식별 번호: 255), MYC rev TTCTTTTATGCCCAAAGTCCAA (서열 식별 번호: 256), GAPDH fwd TGCACCACCAACTGCTTAGC (서열 식별 번호: 257), GAPDH rev GGCATGGACTGTGGTCATGAG (서열 식별 번호: 258). 배수 변화가 산출되었고, MYC 발현 값은 GAPDH 발현에 대해 정상화되었다.
LAC 결합 검정법
CFP-LacI 융합 단백질의 발현을 구동시키는 SV40 프로모터를 함유하는 pSV2 포유류 발현 벡터에서 NEB HIFI 클로닝에 의해 구조체들을 어셈블리하였다. ESR1 의 활성화 도메인 및 돌연변이체 활성화 도메인은 링커 서열 GAPGSAGSAAGGSG (서열 식별 번호: 14)에 의해 연결되어, 이 재조합 단백질의 c-말단에 융합되었다. 일부 실험의 경우, CFP 대신 mCherry를 갖는 변이체 플라스미드가 이용되었다. U2OS-Lac 세포로부터 24시간 동안 에스트로겐을 탈취하였다. 그 다음 세포를 피브로넥틴-피복된 유리 커버슬립 상에 도말하고, Lipofectamine 3000 (Thermofisher L3000015)를 이용하여 형질감염시켰다. 높은 MED1 조건의 경우, GFP에 융합된 MED1의 발현을 구동시키는 PGK 프로모터를 함유하는 포유류 발현 벡터로 구조체를 공동-형질감염시켰다. 형질감염 후 24 시간 시점에, DMSO, DMSO에서 재구성된 10nM의 B-에스트라디올 (Sigma-Aldrich E8875) 또는 DMSO에서 재구성된 1uM의 4-히드록시탐옥시펜 (Sigma-Aldrich H7904)으로 45분 동안 세포를 처리하였다. 처리 후, 상기에서 설명된 바와 같이, 세포들을 고정시키고, MED1 항체로 면역형광을 실시하였다.
Lac 어레이 이미지 분석
Lac 어레이 데이터의 분석을 위해, Lac 및 테그된-단백질 채널에서 수집된 이미지 데이터를 프로세스하고, 분석하기 위해 맞춤 Python 스크립트가 작성되었다. 핵 착색은 Gaussian 필터 (시그마 = 2.0)로 흐릿하게 만들었고, K-means에 의해 2개 클러스터(핵과 배경)로 무리를 만들었다. 그 다음 핵은 measure.label 기능을 이용하여 python scikit-이미지 패키지로 라벨하였다. Lac 스팟을 세그먼트화시키기 위해, Lac 이미지 채널은 Gaussian 필터 (시그마 = 2.0)로 흐릿하게 만들었고, 그리고 강도 임계값(평균 + 1.5*std)을 당해 이미지에 적용하였다. 세그먼트화된 영역 (measure.label에 의해 또한 결정됨)은 최소 영역 (150 픽셀), 최대 영역 (2000 픽셀), 순환도 (c = 4pi*영역/둘레(perimeter)^2; 0.8), 그리고 상기에서 기술된 마스크에 의해 정의된 바와 같이 핵에서의 존재에 근거하여 필터되었다. 표준 농축 비율은 세그먼트화된 Lac 스팟에서 테그-단백질의 평균 강도를 결정하고, 동일한 전체 핵에 존재하는 테그-단백질의 평균 강도로 나누어 계산되었다.
생 세포 이미징
U2OS-Lac 세포들의 생-세포 처리를 위해, 내생성으로 테그된 GFP-MED1을 갖는 세포는 24 시간 동안 에스트로겐-차단시키고, 그 다음 폴리-L-오르니틴-피복된 (Sigma-Aldrich A-004) 접시에 도말시키고, mCherry-LacI-ESR1 융합을 갖는 플라스미드로 형질감염시켰다. 24 시간 후, 세포는 10nM B-에스트라디올로 45분 동안 처리하였다. 세포들은 에스트로겐-없는 DMEM에서 DMSO 또는 10uM 4-히드록시탐옥시펜의 1:1000 희석으로 처리 전, 그리고 처리 후 30분 시점에 이미지화했다. 정량화는 FIJI에서 실행하였고; 기기 배경은 어레이의 평균 신호 강도에서 차감하고, 평균 핵 신호에서 차감된 기기 배경으로 나누어 정상화된 신호 강도를 산출한다. 탐옥시펜 또는 비히클 처리된 표본에서 상대적 강도를 산출하기 위해, 30분 시점의 정상화된 신호 강도를 0 시간 시점의 강도로 나누었다.
생-세포 FRAP 실험을 위해, 내생성으로 테그된 U2OS-Lac 세포들 또는 MED1-mEGFP MCF7 세포들을 폴리-L-오르니틴 피복된 유리-바닥 조직 배양 플레이트 상에 도말하였다. U2OS-Lac 세포들은 상기에서 기술된 바와 같이, B-에스트라디올 처리를 받았다. 50us 거주 시간에서 20 펄스의 레이져를 당해 어레이에 제공하였고, 그리고 복구는 표시된 기간 동안 매 1s 마다 Andor 현미경 상에서 이미지화시켰다. 정량화는 FIJI에서 실행하였다.
MCF7 MED1-mEGFP FRAP의 경우, 기기 배경은 표백된 푼차(puncta)의 평균 신호 강도에서 차감하고, 그 다음 대조군 푼차(puncta)로부터 차감된 기기 배경으로 나누었다. U2OS-Lac MED1-mEGFP FRAP의 경우, 기기 배경은 lac 어레이에서 MED1 신호의 표백된 부분에서 평균 신호 강도부터 차감시키고, 그 다음 핵의 대조군 영역으로부터 차감된 기기 배경으로 나누었다. 이 값들을 매 초마다 플롯시켰고, 95% 신뢰 구간의 최적 피팅 선을 산출하였다.
시험관내 소적 검정법 및 정량화
재조합 GFP 또는 mCherry 융합 단백질들을 농축시키고, Amicon Ultra 원심분리 필터 (30K MWCO, Millipore)를 이용하여 적절한 단백질 농도 및 125mM NaCl로 탈염시켰다. 재조합 단백질들은 소적 형성 완충제 (50mM Tris-HCl pH 7.5, 10% 글리세롤, 1mM DTT) 안에서 표시된 최종 염 및 10% PEG-8000 (군집제로써)와 함께 다양한 농도로 용액에 추가되었다. 상기 단백질 용액은 두 개의 나란하게 있는 양-면 테이프 띠에 의해 부착된 커버슬립과 함께 유리 슬라이드를 포함하는 직접 만든 챔버 상이 바로 적재하였다. 그 다음 슬라이드를 150x 대물렌즈를 갖춘 Andor 공촛점 현미경으로 이미지화시켰다. 다른 언급이 없는 한, 제공된 이미지는 유리 커버슬립 상에 자리잡은 소적의 이미지다. B-에스트라디올 (E8875 Sigma) 또는 4-히드록시탐옥시펜 (Sigma-Aldrich H7904)을 100% EtOH에서 10mM로 재구성시키고, 그 다음 125mM NaCl 소적 형성 완충제에서 1mM로 희석시켰다. 이렇게 농축된 원액(stock) 1 마이크로리터를 10uL 소적 형성 반응에 이용하여 최종 농도 100uM를 얻었다. 상기 시험관내 소적 검정법에 대한 풍도를 산출하기 위해, 소적은 상기 MED1 스캐폴드 채널에 의해 FIJI에서 관심 영역으로 정의되었으며, 그리고 당해 소적 안에 ER 클라이언트의 최대 신호가 결정되었다. 대안으로, MED1의 최대 신호를 측정하였다. 모든 경우에서, 최대 신호는 C인/아웃을 생성하기 위해 이미지의 백그라운드 클라이언트 신호로 나누었다.
Gal4 전사 검정법
GAL4 DNA-결합 도메인의 발현을 구동시키는 SV40 프로모터를 함유하는 포유류 발현 벡터에서 전사 인자 구조체를 어셈블리하였다. ESR1의 야생형 및 돌연변이체 활성화 도메인은 Gibson 클로닝 (NEB 2621S)에 의해 링커 GAPGSAGSAAGGSG (서열 식별 번호: 14)에 의해 연결되어, DNA-결합 도메인의 C-말단에 융합되었다. HEK293T 세포 (ATCC CRL-3216)에서 24 시간 동안 에스트로겐을 박탈시키고, 그 다음 백색의 편형한-바닥의 96-웰 검정법 플레이트 (Costar 3917) 상에 도말하였다. 상기 전사 인자 구조체는 Lipofectamine 3000 (Thermofisher L3000015)을 이용하여 24시간 후 형질감염되었다. 이들 구조체는 반딧불이 루시퍼라제 유전자의 상류 활성화 부위 상류에 5개 GAL4를 함유하는 변형된 형태의 PGL3-기본 (Promega) 벡터로 공동-형질감염되었다. SV40 프로모터에 의해 구동되는 Renilla 루시퍼라제 유전자를 함유하는 플라스미드인 pRL-SV40 (Promega) 또한 공동-형질감염되었다. 높은 MED1 조건의 경우, GFP에 융합된 MED1의 발현을 구동시키는 PGK 프로모터를 함유하는 포유류 발현 벡터로 구조체를 공동-형질감염시켰다. 형질감염 시, 세포들은 표시된 바와 같이, 1:1000 희석된 DMSO, 10nM B-에스트라디올, 또는 1uM 탐옥시펜으로 처리되었다. MED1 과다발현 실험을 위해, 세포들을 10nM 탐옥시펜으로 처리하였다. 형질감염 후 24 시간 시점에, 각 루시퍼라제 단백질에 의해 생성되는 발광은 Dual-glo 루시퍼라제 검정법 시스템 (Promega E2920)을 이용하여 측정되었다. 제시된 데이터는 Renilla 루시퍼라제 발현에 대하여 조절된 것이며, 상기 ER-LBD 에스트로겐 탈취된 조건에 대해 표준화되었다.
고-처리량 서열화 데이터 세트 및 가시화
에스트로겐 자극 MCF 세포들 (GEO 기탁 번호 GSE60270) 및 MCF7 CTCF ChIA-PET (GEO 기탁 번호 GSE92881)에서 MED1 및 ESR1 ChIP-Seq는 공적 출처로부터 얻었고, UCSC 브라우져 (https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway)에서 가시화되었다.
Cbioportal 데이터 획득
환자 돌연변이의 빈도의 경우, cbioportal (http://www.cbioportal.org/)는 임의의 유방암 서열화 데이터 세트에 존재하는 ESR1의 돌연변이에 대해 조회되었다.
웨스턴 블랏
세포를 프로테아제 저해제 (Roche, 11697498001)와 함께 Cell Lytic M (Sigma-Aldrich C2978)에서 용해시켰다. 용해물을 3%-8% Tris-아세테이트 겔 또는 10% Bis-Tris 겔 또는 3-8% Bis-Tris 겔 상에서 80 V로 ~2 시간 동안 이동시킨 후, 염료의 전단이 겔의 끝에 도달할 때 까지 120 V로 이동시켰다. 그 다음 단백질을 얼음-냉각된 이동 완충제 (25 mM Tris, 192 mM 글리신, 10% 메탄올) 안에서 300 mA, 2 시간 동안 4℃에서 0.45 μm PVDF 막 (Millipore, IPVH00010)으로 이동시켰다. 이동 후, 5% 무지방-우유/TBS로 1 시간 동안 실온에서 교반시키면서, 당해 막을 차단시켰다. 그 다음 막은 5% 무지방-우유/TBST에서 희석된 ER ab32063, MED1 ab64965)와 1:1,000의 비율로 항온처리되었으며, 하룻밤 동안 4℃에서, 교반과 함께 항온처리되었다. 아침에, 상기 막을 TBST로 5분 동안 실온에서 3회 세척하였고, 매번 세척 때 마다 교반시킨다. 막은 1:5,000의 비율로 2차 항체와 함께 1시간 동안 RT에서 항온처리되었고, TBST로 5분 동안 3회 세척되었다. 막은 ECL 물질 (Thermo Scientific, 34080)로 현상하고, CCD 카메라를 이용하여 이미지화시키거나, 또는 필름 또는 고민감성 ECL을 이용하여 노출시켰다. 웨스턴 블랏 정량화는 BioRad image lab을 이용하여 실행되었다.
MCF7 생존 검정법
MCF7 세포들은 PiggyBac 유전자전위효소(transposase) 및 MED1-mApple을 함유하는 PiggyBac 통합 벡터로 형질감염시키고, 2ug/ml의 독시사이클린 존재 하에서 성장되었다. 5일 후, 높은 수준의 mApple을 발현시키는 것에 대해 세포를 분류하였다. 그 다음, 부모 MCF7 또는 MED1-mApple를 발현시키는 MCF7 세포를 완전 DMEM에서 24 웰 플레이트의 웰당 50,000 세포로 씨딩하였다. 1 일 후, 배지는 비히클 (DMSO) 또는 25uM 4-히드록시탐옥시펜을 함유하는 것으로 교환하였다. 48 시간 후, Tecan 플레이트 판독기에서 백색-바닥 96 웰 플레이트에서 ATP 양을 정량화시키기 위해 웰을 Cell Titer-Glo로 검정하였다. 생존 백분율은 이렇게 처리된 웰에 있는 루시퍼라제 신호를 비히클 처리된 웰의 신호로 나누어 산출하였고, 상대적 생존을 얻기 위해 처리된 경우의 생존 백분율을 비히클에서의 생존 백분율로 나눈 데이터를 제공한다.
FISH-IF 평균 이미지 분석
면역형광과 함께 RNA/DNA FISH 분석을 위해, FISH 및 IF 채널에서 수집된 3D 이미지 데이터를 처리하고, 분석하기 위해 맞춤형 Python 스크립터가 작성되었다. 핵 착색은 Gaussian 필터 (시그마 = 2.0)로 흐릿하게 만들었고, z 평면에서 최대로 투영시키고, 그리고 K-means에 의해 2개 클러스터(핵과 배경)로 무리를 만들었다. FISH 촛점은 ImageJ로 수동적으로 호출되거나, 또는 scipy ndimage 패키지를 이용하여 자동적으로 호출되었다. 자동 탐지를 위해, 강도 임계치 (평균 + 3*표준 편차)를 FISH 채널에 적용시켰다. 그 다음 ndimage find_objects 기능을 이용하여 3D에서 인접 FISH 촛점을 호출하였다. 이들 FISH 촛점은 크기 (최소 100 복셀), 최대 z-투영도의 순환도 (순환도 = 4pi*지역/외주^2; 0.7) 그리고 핵에 존재한다는 것 (상기에서 기술된 핵 마스크에 의해 결정됨)을 비롯한 각종 기준에 의해 필터되었다. 수동 호출의 경우, FISH 채널의 최대 z-투영에서 FISH 촛점이 식별되었으며, x 및 y 좌표는 상기에서 설명한 자동 감지를 안내하는 기준점으로 사용되었다. 그 다음 FISH 촛점은 3D-상자 (길이 크기 
= 3.0 μm)에 집중되었다. 각 FISH 및 IF 짝에 대한 FISH 촛점에 집중된 IF 신호를 조합하고, 평균 강도 투영도를 산출하고, IF 신호 강도에 대한 평균 데이터를 FISH 촛점에 집중된 
사각형 안에 제공한다. 대조군으로써, 무작위로 선별된 대등한 수의 핵 위치에 집중된 IF 신호에 대해서도 동일한 프로세스를 실시하였다. 그 다음, 이러한 평균 강도 투영은 신호 강도의 2D 등고선 맵을 생성하는데 사용되었다. 등고선 플롯은 matplotlib python 패키지를 이용하여 생성된다. 등고선 플롯의 경우, 표시된 강도-색상 범위는 선형 색상 범위에 걸쳐 사용자 지정되었다(
= 15). FISH 채널의 경우, 검정색에서 자홍색이 사용되었다. IF 채널의 경우, 우리는 chroma.js (온라인 색상 생성기)를 사용하여 15개 빈(bins) 전체에 색상을 생성했으며, 주요 전환 색상은 검정색, 청자색, 중간-파란색, 라임색이 선택되었다. 이것은 판독자의 눈으로 신호의 대비를 더 쉽게 감지할 수 있도록 하기 위해 수행된 것이다. 생성된 컬러 맵은 모든 IF 플롯에 대해 균일한 간격의 강도 빈(bins) 15 개에 사용되었다. FISH 또는 무작위로 선별된 핵 위치에 집중된 평균 IF는 각 플롯의 최소 및 최대 신호를 포함하도록 설정된, 동일한 색상 척도를 사용하여 플롯된다.
참조자료
SEQUENCE LISTING
<110> Whitehead Institute for Biomedical Research
<120> METHODS AND ASSAYS FOR MODULATING GENE TRANSCRIPTION BY
MODULATING CONDENSATES
<130> WIBR-165-WO1
<140> PCT/US2019/023694
<141> 2019-03-22
<150> 62/647,613
<151> 2018-03-23
<150> 62/648,377
<151> 2018-03-26
<150> 62/722,825
<151> 2018-08-24
<150> 62/752,332
<151> 2018-08-29
<150> 62/819,662
<151> 2019-03-17
<150> 62/820,237
<151> 2019-03-18
<160> 258
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Ser Tyr Ser Pro Thr Ser Pro
1 5
<210> 2
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Gln Gln Gln Gln Gln
1 5
<210> 3
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 3
Pro Cys Glu Thr His Glu Thr Gly Thr Thr His Thr Ala Thr Thr
1 5 10 15
<210> 4
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4
Glu Glu Glu Gly Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu
1 5 10
<210> 5
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 5
Met Glu Pro Ala Gln Met Glu Val Ala Gln Ile Glu Pro Ala Pro
1 5 10 15
<210> 6
<211> 15
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(15)
<223> N is isoleucine
<400> 6
dkrnsncasd krnac 15
<210> 7
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 7
His His His His His
1 5
<210> 8
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 8
Gly Arg Pro Glu Thr Pro Lys Gln Lys
1 5
<210> 9
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 9
Phe Phe Pro Gln Arg Gln Phe
1 5
<210> 10
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 10
Gln His Arg Leu Gln Gln Ala Gln Leu Leu Arg Arg Arg Met Ala
1 5 10 15
<210> 11
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 11
Arg Lys Lys Glu Lys Lys Glu Lys Lys Lys Lys Arg Lys Lys Glu
1 5 10 15
<210> 12
<211> 13
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 12
Arg Thr Pro Met Tyr Gly Ser Gln Thr Pro Leu His Asp
1 5 10
<210> 13
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic IDS
<400> 13
Tyr Ser Pro Thr Ser Pro Ser
1 5
<210> 14
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct, linker sequence
<400> 14
Gly Ala Pro Gly Ser Ala Gly Ser Ala Ala Gly Gly Ser Gly
1 5 10
<210> 15
<211> 23
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Guide Sequence
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(24)
<223> N is any amino acid
<400> 15
Thr Gly Cys Ala Thr Thr Cys Ala Ala Ala Cys Thr Gly Ala Gly Gly
1 5 10 15
Cys Ala Cys Cys Asn Gly Gly
20
<210> 16
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 16
ggactccatc cctagtattt gc 22
<210> 17
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 17
gctaatcaca aatttgctct gc 22
<210> 18
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 18
ccacctaaac aaagaacagc ag 22
<210> 19
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 19
tgtaccctgc cactcagttt ac 22
<210> 20
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 20
aagcagggtg gtagagtaag ga 22
<210> 21
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 21
attcccgatg tggagtagaa gt 22
<210> 22
<400> 22
000
<210> 23
<400> 23
000
<210> 24
<400> 24
000
<210> 25
<400> 25
000
<210> 26
<400> 26
000
<210> 27
<400> 27
000
<210> 28
<400> 28
000
<210> 29
<400> 29
000
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 30
tcaggagact tctagagcac 20
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 31
gaaatccttg tctaggatcc 20
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 32
aatagtagca cctattcctc 20
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 33
cctttctaca ggtgtgatta 20
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 34
actcccaaac acattcatgg 20
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 35
gactggatcc accattatta 20
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 36
ccagaaagaa tatcgcccag 20
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 37
gaagcattag gagtctcgtt 20
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 38
tcagttaagt gttcaccact 20
<210> 39
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 39
acagaatcac cctagggaag 20
<210> 40
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 40
gcctccaaat ggttaagtag 20
<210> 41
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 41
aagagctggt tcaagtgtca 20
<210> 42
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 42
gtaaagacgg cgatcggaga 20
<210> 43
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 43
taggtgtggt ggtgatagac 20
<210> 44
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 44
ggtatagagc agcaaaagcc 20
<210> 45
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 45
attcatttca ccttgaggtc 20
<210> 46
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 46
aagagacaca actgtctgcc 20
<210> 47
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 47
ctcaatgtaa gctctaggca 20
<210> 48
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 48
caaggtcact tcccaattta 20
<210> 49
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 49
tgtttacaga tcttccctag 20
<210> 50
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 50
cttttcacgg tagcacgtaa 20
<210> 51
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 51
tcagccaact tctaggaaga 20
<210> 52
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 52
cgagtcctgt aatgagttca 20
<210> 53
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 53
tacagggcga tagcaatctt 20
<210> 54
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 54
aaaccatccc agagaattgc 20
<210> 55
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 55
ggaatgtcta ggtgattgct 20
<210> 56
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 56
gaagtttagg ttccagtctg 20
<210> 57
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 57
gttccataga actctagctt 20
<210> 58
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 58
actggaaggg atagcagagt 20
<210> 59
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 59
ttctgtaaac ttccttcctt 20
<210> 60
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 60
caaagtctgt catcacgtgc 20
<210> 61
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 61
cagacagctg tttcaactca 20
<210> 62
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 62
aactgatctg tctacctagc 20
<210> 63
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 63
tagtgtggtc aaggttgact 20
<210> 64
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 64
ggtaaagact tagaggctcc 20
<210> 65
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 65
gttatcctaa gggctggaaa 20
<210> 66
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 66
tcaggaaatc agaccagtgc 20
<210> 67
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 67
aaagtggaag gaagccagcg 20
<210> 68
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 68
cgataaagtc taccccacaa 20
<210> 69
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 69
tagctcgaaa ggctggcaaa 20
<210> 70
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 70
agttgaagtg ttgggagtca 20
<210> 71
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 71
attttagtac cctcaggatt 20
<210> 72
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 72
gtgcaatgat tggcactcaa 20
<210> 73
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 73
aacttaccct gagagctatt 20
<210> 74
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 74
cagaacaacc catcagtcat 20
<210> 75
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 75
gctccatttt aacagactct 20
<210> 76
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 76
gactctcacc aagtcaaagc 20
<210> 77
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 77
atggctcagt ttcagcaata 20
<210> 78
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 78
gttcttcggg gactgaattc 20
<210> 79
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 79
ttttttctac tcttacccta 20
<210> 80
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 80
agaagcaata acccttcagc 20
<210> 81
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 81
cccgcttatg ttaatgacta 20
<210> 82
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 82
gggtttccag aagagtgata 20
<210> 83
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 83
cagactagaa ggccaacgta 20
<210> 84
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 84
ttatattgct ccgtcctgtg 20
<210> 85
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 85
taggatgtta ggtctccctg 20
<210> 86
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 86
aaatggggtg ctcattccaa 20
<210> 87
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 87
ctaactgtat aacctcacca 20
<210> 88
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 88
aaacggccat ttgggcaaat 20
<210> 89
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 89
aatgctaact gcttctgctg 20
<210> 90
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 90
taagtgacat ccatattccc 20
<210> 91
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 91
tgagctcaca aacccagaac 20
<210> 92
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 92
ctccagatgc tagctataag 20
<210> 93
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 93
agacaatgag cttcagacct 20
<210> 94
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 94
tgagtactgg gctgactctg 20
<210> 95
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 95
ctcttggttc taccatttac 20
<210> 96
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 96
catcacaaca cgcacctgag 20
<210> 97
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 97
tcacttacaa aggctatccc 20
<210> 98
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 98
aaattatgcc atctgctggc 20
<210> 99
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 99
ccctgaaagc agcttctaaa 20
<210> 100
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 100
ctgcagtcta gcaaataagt 20
<210> 101
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 101
tgatggcaat gctgaggtta 20
<210> 102
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 102
tgaagacatc tgtgctccac 20
<210> 103
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 103
aggtagaaga cacctcctac 20
<210> 104
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 104
caacatttcc tagatccagc 20
<210> 105
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 105
tcagcaagag acaagtgctc 20
<210> 106
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 106
tcttatcctt gaccctctag 20
<210> 107
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 107
tttcggttaa ccaaattcgt 20
<210> 108
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 108
cagagggtcc agttaattat 20
<210> 109
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 109
taggaatgca cagtcctgag 20
<210> 110
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 110
tccagggtta aatcacttgt 20
<210> 111
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 111
tactctacta ccactgagtc 20
<210> 112
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 112
aatagaatcc tgttgggacc 20
<210> 113
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 113
ctagattttt gcatggtgct 20
<210> 114
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 114
tttgggggga cttttatctc 20
<210> 115
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 115
gaggtttatc caaagactca 20
<210> 116
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 116
cagcagagga tctagtctat 20
<210> 117
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 117
agaatttgag atcagcccgt 20
<210> 118
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 118
ctgctccagt agctgagatg 20
<210> 119
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 119
acagtgggta gcacaaatct 20
<210> 120
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 120
acactgtaaa cctctgatcc 20
<210> 121
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 121
tcttcattag aaccgtgacc 20
<210> 122
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 122
tgtagtctgc tctttccaat 20
<210> 123
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 123
tatacaatta gaccctggga 20
<210> 124
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 124
ccggctatat ttactttcaa 20
<210> 125
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 125
gctagcctgc cttttaaaaa 20
<210> 126
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 126
gagcgaggaa ggctgagttc 20
<210> 127
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 127
aatgtcttct ttggagacca 20
<210> 128
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 128
actctttttc cacacacatt 20
<210> 129
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 129
ttcctccctt gaaattatgt 20
<210> 130
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 130
tactcacttt ccccacatag 20
<210> 131
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 131
taactcctag ctttggtttc 20
<210> 132
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 132
aatgtactgc atagactccc 20
<210> 133
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 133
cttaaaattc actccaacct 20
<210> 134
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 134
ccaggaggaa agaacgtgga 20
<210> 135
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 135
gcggtccaga cgttaaaaca 20
<210> 136
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 136
gctggtaaat gtgccagata 20
<210> 137
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 137
cagttaaccc ggaacacgtg 20
<210> 138
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 138
tttcttcgaa tccgtactca 20
<210> 139
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 139
tcgctatact cagtctcatt 20
<210> 140
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 140
tacaacgacc acctcagtta 20
<210> 141
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 141
taacagctcc aagcagcgac 20
<210> 142
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 142
gcgtcagatg caaagctatg 20
<210> 143
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 143
taaactccaa gcctaaaccc 20
<210> 144
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 144
aactgaaccg ccctctttag 20
<210> 145
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 145
acgactgcct tacatccatc 20
<210> 146
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 146
caatctacaa tgcacctgga 20
<210> 147
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 147
ttagttctta gccgttttga 20
<210> 148
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 148
agaaatgcaa ccccagtgaa 20
<210> 149
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 149
gactcaaacc cacatgtgac 20
<210> 150
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 150
aacgcggaaa gcctttagta 20
<210> 151
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 151
tccaacttcc aagacctgag 20
<210> 152
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 152
aggtaagcga ttccaggttg 20
<210> 153
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 153
agcacacata cctgtttcaa 20
<210> 154
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 154
tagccagtgg caacgaattc 20
<210> 155
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 155
taatatggcg gccacgtgag 20
<210> 156
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 156
gcaactacag tagtcaagca 20
<210> 157
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 157
ccaactacag tagtcaagca 20
<210> 158
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 158
ttaaagtcag ctacagccag 20
<210> 159
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 159
aagcttgttt gtgctaggag 20
<210> 160
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 160
ttatgggtat tatctacccg 20
<210> 161
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 161
ctgggctatt gtaaagccaa 20
<210> 162
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 162
agattatgct tagggcacac 20
<210> 163
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 163
gctaggcagg attacattca 20
<210> 164
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 164
ttgaaggcaa gtaagtaccc 20
<210> 165
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 165
ccacagatga cacccaaatg 20
<210> 166
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 166
cacctcagct tttacttttg 20
<210> 167
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 167
ctgtcaaatc tgggtcactt 20
<210> 168
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 168
gccaaaagga taaatgcagc 20
<210> 169
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 169
ttcgctagat ccaaacatgc 20
<210> 170
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 170
gttgattgaa gttccgatgc 20
<210> 171
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 171
gatgagcaag caaggagtct 20
<210> 172
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 172
aaagcagccg acctgtgaat 20
<210> 173
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 173
aaaccagcag gcctacttaa 20
<210> 174
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 174
agacctggta acgggcattg 20
<210> 175
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 175
tctgatttct tgacatctcc 20
<210> 176
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 176
agatttccca caggacatac 20
<210> 177
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 177
cagacactga gaccgcataa 20
<210> 178
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 178
aatgcactca aatctgtgcc 20
<210> 179
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 179
cttgccagta aacacaagct 20
<210> 180
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 180
tagaacaggc agacctaacc 20
<210> 181
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 181
gagtgataga aaggtggggg 20
<210> 182
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 182
ccaacagcct acaaatccaa 20
<210> 183
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 183
tgtcaggttc ctgaaaatcc 20
<210> 184
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 184
caaagtctgc tcctgaaacc 20
<210> 185
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 185
agacttccta gtaccaatgg 20
<210> 186
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 186
ttatgctaag tgacccacta 20
<210> 187
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 187
ttcgttctag cctttactag 20
<210> 188
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 188
accaccaact gcaaagatgg 20
<210> 189
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 189
caactacctt ccactatctt 20
<210> 190
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 190
catctatcct gtaagtgcag 20
<210> 191
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 191
actaaaagag cagtcctgca 20
<210> 192
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 192
aaccaagccc aaactatgga 20
<210> 193
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 193
ctacccaatg ctaatccaat 20
<210> 194
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 194
agactaacaa atcagtcccc 20
<210> 195
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 195
gcgccaccaa aatagaaagt 20
<210> 196
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 196
accagcactc actgtcaaaa 20
<210> 197
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 197
ttcccaaata aacaaggccc 20
<210> 198
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 198
cccactcacc aatgaacaac 20
<210> 199
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 199
aagtccttac tatttcctgg 20
<210> 200
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 200
tctaggtctg gaagcttttt 20
<210> 201
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 201
cttggcccat ttattgataa 20
<210> 202
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 202
ggaaacagga attatgccct 20
<210> 203
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 203
ataatggttt ccaactaccc 20
<210> 204
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 204
cacaaaagag tgagcctgca 20
<210> 205
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 205
caagcaagga taaccttgcc 20
<210> 206
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 206
acagtctcgt tagggaaagc 20
<210> 207
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 207
tgaatgaagc ccaccactac 20
<210> 208
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 208
aaggtcttaa ggtgctgagg 20
<210> 209
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 209
aatgggggag agggtgcaaa 20
<210> 210
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 210
ataaatactg cctcacctca 20
<210> 211
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 211
taagagaatt cccattgggc 20
<210> 212
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 212
tttccaaggc acaactactt 20
<210> 213
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 213
aagacagaga cggggtactc 20
<210> 214
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 214
tattcctacc acaccaatac 20
<210> 215
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 215
tgtatcttgt catgagctca 20
<210> 216
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 216
taaggaccat cctgtacatc 20
<210> 217
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 217
atcttagggt gacaggtttc 20
<210> 218
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 218
tggaaagctt cagctactgg 20
<210> 219
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 219
aacatagaca ttgagggggg 20
<210> 220
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 220
gaatacacac gtgagtgggt 20
<210> 221
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 221
cctccattgt tggtgggatt 20
<210> 222
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 222
ggaaccgcca gactgatttc 20
<210> 223
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 223
ccatgtagtt gaggtcaatg aagg 24
<210> 224
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 224
tggtgaaggt cggtgtgaa 19
<210> 225
<400> 225
000
<210> 226
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 226
acacaacatc tgcccaaaca 20
<210> 227
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 227
tgagatcctg gtgtgaccaa 20
<210> 228
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 228
agggtgatga atggatcagg 20
<210> 229
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 229
ctctccccac gaattaacga 20
<210> 230
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 230
ccagtgaaca aaagtgcaa 19
<210> 231
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 231
tccaggcaca tctcagtttg 20
<210> 232
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 232
ggagctcgct ttagtcctca 20
<210> 233
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 233
cccccacttg caattaaaga 20
<210> 234
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 234
ctcccttcca tcttcccttc 20
<210> 235
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 235
tgctttcttg gggcattaac 20
<210> 236
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 236
ctgttgggaa ttcagccaat 20
<210> 237
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 237
aatgaaggga gtgcaggatg 20
<210> 238
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 238
aaatccatcg ggtatctgga 20
<210> 239
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 239
aggcggcctc ttttgtttat 20
<210> 240
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 240
gctctgaaac ctggctcatc 20
<210> 241
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 241
attctcttgt cgggttgcag 20
<210> 242
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 242
ggctgacatc acccagagat 20
<210> 243
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 243
acagaaaaga agccgggaat 20
<210> 244
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 244
ccatgtagtt gaggtcaatg aagg 24
<210> 245
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 245
tggtgaaggt cggtgtgaac 20
<210> 246
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 246
ctcccgtcct tctccacgtt 20
<210> 247
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 247
ttcctcacgc caacggtta 19
<210> 248
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> guide sequence
<400> 248
ctgcgtggac aatggctact 20
<210> 249
<211> 393
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 249
gctactcaag ctgatttgat ggagttggac atggccatgg aaccagacag aaaagcggct 60
gttagtcact ggcagcaaca gtcttacctg gactctggaa tccattctgg tgccactacc 120
acagctcctt ctctgagtgg taaaggcaat cctgaggaag aggatgtgga tacctcccaa 180
gtcctgtatg agtgggaaca gggattttct cagtccttca ctcaagaaca agtagctgat 240
attgatggac agtatgcaat gactcgagct cagagggtac gagctgctat gttccctgag 300
acattagatg agggcatgca gatcccatct acacagtttg atgctgctca tcccactaat 360
gtccagcgtt tggctgaacc atcacagatg ctg 393
<210> 250
<211> 345
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 250
ccacaagatt acaagaaacg gctttcagtt gagctgacca gctctctctt cagaacagag 60
ccaatggctt ggaatgagac tgctgatctt ggacttgata ttggtgccca gggagaaccc 120
cttggatatc gccaggatga tcctagctat cgttcttttc actctggtgg atatggccag 180
gatgccttgg gtatggaccc catgatggaa catgagatgg gtggccacca ccctggtgct 240
gactatccag ttgatgggct gccagatctg gggcatgccc aggacctcat ggatgggctg 300
cctccaggtg acagcaatca gctggcctgg tttgatactg acctg 345
<210> 251
<211> 393
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Modified beta-catenin IDR sequence
<400> 251
gctactcaag ctgatttgat ggagttggac atggccatgg aaccagacag aaaagcggct 60
gttagtcacg cgcagcaaca gtctgccctg gactctggaa tccattctgg tgccactacc 120
acagctcctt ctctgagtgg taaaggcaat cctgaggaag aggatgtgga tacctcccaa 180
gtcctggctg aggcggaaca gggagcttct cagtccgcca ctcaagaaca agtagctgat 240
attgatggac aggctgcaat gactcgagct cagagggtac gagctgctat ggcccctgag 300
acattagatg agggcatgca gatcccatct acacaggctg atgctgctca tcccactaat 360
gtccagcgtt tggctgaacc atcacagatg ctg 393
<210> 252
<211> 345
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Modified beta-catenin IDR sequence
<400> 252
ccacaagatg ccaagaaacg gctttcagtt gagctgacca gctctctcgc cagaacagag 60
ccaatggctg cgaatgagac tgctgatctt ggacttgata ttggtgccca gggagaaccc 120
cttggagctc gccaggatga tcctagcgct cgttctgctc actctggtgg agctggccag 180
gatgccttgg gtatggaccc catgatggaa catgagatgg gtggccacca ccctggtgct 240
gacgctccag ttgatgggct gccagatctg gggcatgccc aggacctcat ggatgggctg 300
cctccaggtg acagcaatca gctggccgcg gctgatactg acctg 345
<210> 253
<211> 20
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 253
ccttcaggat gaaagctcag 20
<210> 254
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 254
cccctgagct ttcatcctga 20
<210> 255
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 255
aacctcacaa ccttggctga 20
<210> 256
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 256
ttcttttatg cccaaagtcc aa 22
<210> 257
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 257
tgcaccacca actgcttagc 20
<210> 258
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 258
ggcatggact gtggtcatga g 21
Claims (352)
- 한 가지 또는 그 이상의 유전자 전사를 조정하는 방법에 있어서, 이 방법은 한 가지 또는 그 이상의 유전자들과 연합된 응축물의 조절 형성, 구성, 유지, 해체, 활성, 및/또는 규제를 포함하며, 이때 상기 응축물은 전사 응축물, 이질성염색질 응축물, 또는 mRNA 개시 또는 신장 복합체와 물리적으로 연합된 응축물인, 방법.
- 청구항 1에 있어서, 이때 상기 응축물은 당해 응축물과 연합된 성분의 결합가(valency)를 증가 또는 감소시킴으로써 조정되는, 방법.
- 청구항 1-2에 있어서, 이때 상기 응축물은 상기 응축물의 성분의 하나 또는 그 이상의 본질적 무질서 도메인들과 상호작용하는 제제를 당해 응축물에 접촉시킴으로써 조정되는, 방법.
- 청구항 2-3에 있어서, 이때 상기 성분은 신호전달 인자, 메틸-DNA 결합 단백질, 유전자 침묵화 인자, RNA 중합효소, 스플라이싱 인자, BRD4, Mediator, 매개체 성분, MED1, MED15, 전사 인자, 또는 핵 수용체 리간드인, 방법.
- 청구항 4에 있어서, 이때 상기 신호전달 인자는 TCF7L2, TCF7, TCF7L1, LEF1, 베타-카테닌, SMAD2, SMAD3, SMAD4, STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5A, STAT5B, STAT6, 그리고 NF-κB로 구성된 군에서 선별되는, 방법.
- 청구항 4 또는 5에 있어서, 이때 상기 신호전달 인자는 한 가지 또는 그 이상의 본질적 무질서 도메인을 포함하는, 방법.
- 청구항 4-6에 있어서, 이때 상기 신호전달 인자는 상기 응축물과 연합된 하나 또는 그 이상의 신호 반응 요소들 또는 매개체에 선호적으로 결합하는, 방법.
- 청구항 4-7에 있어서, 이때 상기 전사 응축물은 마스터 전사 인자인, 방법.
- 청구항 4에 있어서, 이때 상기 메틸-DNA 결합 단백질은 메틸화된 DNA에 선호적으로 결합하는, 방법.
- 청구항 4 또는 9에 있어서, 이때 상기 메틸-DNA 결합 단백질은 MECP2, MBD1, MBD2, MBD3, 또는 MBD4인, 방법.
- 청구항 4, 9, 또는 10에 있어서, 이때 상기 메틸-DNA 결합 단백질은 유전자 침묵화와 연합된, 방법.
- 청구항 4에 있어서, 이때 상기 유전자 침묵화 인자는 이질성염색질과 연합된, 방법.
- 청구항 4 또는 12에 있어서, 이때 상기 유전자 침묵화 인자는 HP1α, TBL1R (트랜스듀신 베타-유사 단백질), HDAC3 (히스톤 데아세틸라제 3) 또는 SMRT (레티노 및 갑상샘 수용체의 침묵화 매개체)인, 방법.
- 청구항 4에 있어서, 이때 상기 RNA 중합효소는 mRNA 개시 또는 신장 복합체와 물리적으로 연합된, 방법.
- 청구항 4 또는 14에 있어서, 이때 상기 RNA 중합효소는 RNA 중합효소 II 또는 RNA 중합효소 II C-말단 영역인, 방법.
- 청구항 15에 있어서, 이때 상기 RNA 중합효소 II C-말단 영역은 본질적으로 무질서화된 영역 (IDR)을 포함하는, 방법.
- 청구항 16에 있어서, 이때 상기 IDR은 포스포릴화 부위를 포함하는, 방법.
- 청구항 4에 있어서, 이때 상기 스플라이싱 인자는 SRSF2, SRRM1, 또는 SRSF1인, 방법.
- 청구항 4에 있어서, 이때 상기 전사 인자는 OCT4, p53, MYC, GCN4, NANOG, MyoD, KLF4, SOX 패밀리 전사 인자, GATA 패밀리 전사 인자, 핵 수용체, 유전자 침묵화 인자, 또는 융합 종양형성적 전사 인자인, 방법.
- 청구항 19에 있어서, 이때 상기 핵 수용체는 핵 호르몬 수용체 (NHR)인, 방법.
- 청구항 19-20에 있어서, 이때 상기 핵 수용체는 동족 리간드에 결합될 때, 전사를 활성화시키는, 방법.
- 청구항 21에 있어서, 이때 상기 동족 리간드는 호르몬인, 방법.
- 청구항 19-21에 있어서, 이때 상기 핵 수용체는 동족 리간드에 결합없이, 전사를 활성화시키는 돌연변이 핵 수용체인, 방법.
- 청구항 19-23에 있어서, 이때 상기 핵 수용체는 에스트로겐 수용체 (ER), 구성적 활성 또는 레티노산 수용체-알파 (RARa)를 갖는 돌연변이체 ER인, 방법.
- 청구항 19에 있어서, 이때 상기 SOX 패밀리 전사 인자는 SOX2인, 방법.
- 청구항 19에 있어서, 이때 GATA 패밀리 전사 인자는 GATA2인, 방법.
- 청구항 19에 있어서, 이때 상기 유전자 침묵화 인자는 이질성염색질과 연합된, 방법.
- 청구항 3-27에 있어서, 이때 상기 제제는 펩티드, 핵산, 또는 소 분자를 포함하는, 방법.
- 청구항 28에 있어서, 이때 상기 펩티드는 산성 아미노산이 풍부한, 방법.
- 청구항 3-29에 있어서, 이때 상기 제제는 신호전달 인자 모방체인, 방법.
- 청구항 3-29에 있어서, 이때 상기 제제는 신호전달 인자 길항제인, 방법.
- 청구항 3-29에 있어서, 이때 상기 제제는 포스포릴화된 또는 저-포스포릴화된 RNA 중합효소 II C-말단 도메인 (Pol II CTD), 또는 이의 기능적 단편을 포함하는, 방법.
- 청구항 32에 있어서, 이때 상기 제제는 저-포스포릴화된 Pol II CTD에 선호적으로 결합하는, 방법.
- 청구항 3-29에 있어서, 이때 상기 제제는 메틸화된 DNA에 결합하는, 방법.
- 청구항 3-29에 있어서, 이때 상기 제제는 메틸-DNA 결합 단백질에 결합하는, 방법.
- 청구항 3-35에 있어서, 이때 상기 제제와의 접촉은 상기 응축물을 안정화시키거나 또는 용해시키고, 이로 인하여 상기 하나 또는 그 이상의 유전자들의 전사를 조정하는, 방법.
- 청구항 1-36에 있어서, 이때 상기 응축물의 성분에 응축물과 연합된 전사 인자의 결합을 조절함으로써, 당해 응축물이 조절되는, 방법.
- 청구항 37에 있어서, 이때 상기 응축물의 성분에 전사 인자의 활성화 도메인의 결합이 조절되는, 방법.
- 청구항 37-38에 있어서, 이때 상기 상기 응축물의 성분은 공동활성제, 공동인자, 신호전달 인자, 메틸-DNA 결합 단백질, 스플라이싱 인자, 유전자 침묵화 인자, RNA 중합효소, 또는 핵 수용체 리간드인, 방법.
- 청구항 39에 있어서, 이때 상기 공동활성제, 공동인자, 신호전달 인자, 메틸-DNA 결합 단백질, 스플라이싱 인자, 유전자 침묵화 인자, RNA 중합효소, 또는 핵 수용체 리간드는 Mediator, 매개체 성분, MED1, MED15, p300, BRD4, TFIID, β-카테닌, STAT3, SMAD3, NF-kB, MECP2, MBD1, MBD2, MBD3, MBD4, HP1α, TBL1R, HDAC3, SMRT, RNA 중합효소 II, SRSF2, SRRM1, SRSF1, 또는 호르몬인, 방법.
- 청구항 38-40에 있어서, 이때 상기 전사 인자는 OCT4, p53, MYC, GCN4, NANOG, MyoD, KLF4, SOX 패밀리 전사 인자, GATA 패밀리 전사 인자, 핵 수용체, 또는 융합 종양형성적 전사 인자인, 방법.
- 청구항 38-41에 있어서, 이때 상기 응축물의 성분에 전사 인자의 결합은 상기 전사 인자 또는 응축물에 펩티드, 핵산, 또는 소 분자를 접촉시킴으로써 조정되는, 방법.
- 청구항 42에 있어서, 이때 상기 펩티드는 산성 아미노산이 풍부한, 방법.
- 청구항 1에 있어서, 이때 상기 상기 응축물과 연합된 핵 수용체에 리간드의 결합을 조정함으로써, 당해 전사 응축물이 조절되는, 방법.
- 청구항 44에 있어서, 이때 상기 리간드는 호르몬인, 방법.
- 청구항 44-45에 있어서, 이때 상기 리간드의 결합은 제제에 의해 조정되는, 방법.
- 청구항 1에 있어서, 이때 상기 응축물과 연합된 핵 수용체가 상기 응축물의 성분에 결합하는 것을 조정함으로써, 당해 전사 응축물이 조절되는, 방법.
- 청구항 47에 있어서, 이때 상기 상기 응축물의 성분은 공동활성제, 공동인자, 또는 핵 수용체 리간드인, 방법.
- 청구항 48에 있어서, 이때 상기 공동활성제, 공동인자, 또는 핵 수용체 리간드는 매개체 성분 또는 호르몬인, 방법.
- 청구항 47-49에 있어서, 이때 상기 핵 수용체는 동족 리간드에 결합없이, 전사를 활성화시키는 돌연변이 핵 수용체인, 방법.
- 청구항 47-50에 있어서, 이때 상기 성분에 핵 수용체의 결합은 제제에 의해 조정되는, 방법.
- 청구항 1-2에 있어서, 이때 상기 전사 응축물의 성분에 신호전달 인자가 결합하는 것을 조정함으로써, 상기 응축물이 조정되는, 방법.
- 청구항 52에 있어서, 이때 상기 성분은 매개체, 매개체 성분, 또는 전사 인자인, 방법.
- 청구항 52-53에 있어서, 이때 상기 전사 응축물은 슈퍼-인헨서와 연합된, 방법.
- 청구항 52-54에 있어서, 이때 상기 전사 응축물의 조정으로 한 가지 또는 그 이상의 종양유전자들의 발현이 조정되는 방법.
- 청구항 52-55에 있어서, 이때 상기 신호전달 인자는 종양형성적 신호전달 경로와 연합된, 방법.
- 청구항 52-56에 있어서, 이때 상기 응축물은 신호전달 인자의 일탈적 수준을 포함하는, 방법.
- 청구항 1-2에 있어서, 이때 상기 응축물의 성분으로 또는 메틸화된 DNA로 메틸-DNA 결합 단백질의 결합을 조정함으로써, 상기 이질성염색질 응축물이 조정되는, 방법.
- 청구항 1-2에 있어서, 이때 상기 응축물의 성분에 유전자 침묵화 인자의 결합을 조정함으로써, 상기 이질성염색질 응축물이 조정되는, 방법.
- 청구항 1-2에 있어서, 이때 상기 전사 인자의 성분에 RNA 중합효소의 결합을 조절함으로써, 상기 mRNA 개시 또는 신장 복합체와 연합된 응축물이 조절되는, 방법.
- 청구항 1-2에 있어서, 이때 상기 전사 인자의 성분에 스플라이싱 인자의 결합을 조절함으로써, 상기 mRNA 개시 또는 신장 복합체와 연합된 응축물이 조절되는, 방법.
- 청구항 1-2에 있어서, 이때 상기 응축물 안에 성분의 양을 조절함으로써 상기 응축물이 조절되는, 방법.
- 청구항 62에 있어서, 이때 상기 성분은 한 가지 또는 그 이상의 전사 공동-인자들, 핵 수용체 리간드들, 신호전달 인자, 메틸-DNA 결합 단백질, 유전자 침묵화 인자, RNA 중합효소, 스플라이싱 인자, 및/또는 신호전달 전사 인자들인, 방법.
- 청구항 63에 있어서, 이때 상기 성분은 Mediator, 매개체 성분, MED1, MED15, p300, BRD4, TFIID, β-카테닌, STAT3, SMAD3, NF-kB, MECP2, MBD1, MBD2, MBD3, MBD4, HP1α, TBL1R, HDAC3, SMRT, RNA 중합효소 II, SRSF2, SRRM1, SRSF1, 또는 호르몬인, 방법.
- 청구항 62-64에 있어서, 이때 상기 응축물 성분은 OCT4, p53, MYC, GCN4, NANOG, MyoD, KLF4, SOX 패밀리 전사 인자, GATA 패밀리 전사 인자, 핵 수용체, 그리고 융합 종양형성적 전사 인자로부터 선택된 전사 인자인, 방법.
- 청구항 62-65에 있어서, 이때 상기 응축물과 연합된 성분의 양은 이 성분과 응축물 간의 상호작용을 축소시키거나, 또는 제거하는 제제에 접촉됨으로써 조정되는, 방법.
- 청구항 66에 있어서, 이때 상기 제제는 상기 성분의 상호작용 도메인을 표적으로 하는, 방법.
- 청구항 67에 있어서, 이때 상기 상호작용 도메인은 한 가지 또는 그 이상의 본질적으로 무질서화된 도메인인, 방법.
- 청구항 66에 있어서, 이때 상기 제제는 전사 인자 활성화 도메인을 표적으로 하는, 방법.
- 청구항 69에 있어서, 이때 상기 제제는 상기 활성화 도메인의 본질적으로 무질서화된 도메인을 표적으로 하는, 방법.
- 청구항 1-2에 있어서, 이때 상기 전사 응축물의 조절로 한 가지 또는 그 이상의 신호전달 경로가 조절되는, 방법.
- 청구항 71에 있어서, 이때 상기 신호전달 경로는 질환 발병에 기여하는, 방법.
- 청구항 71-72에 있어서, 이때 상기 신호전달 경로는 암 발병에 기여하는, 방법.
- 청구항 71-73에 있어서, 이때 상기 신호전달 경로는 호르몬 신호전달과 관련된, 방법.
- 청구항 71-74에 있어서, 이때 상기 신호전달 경로는 전사 응축물의 성분으로써 신호전달 인자를 포함하는, 방법.
- 청구항 75에 있어서, 이때 상기 신호전달 인자는 TCF7L2, TCF7, TCF7L1, LEF1, 베타-카테닌, SMAD2, SMAD3, SMAD4, STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5A, STAT5B, STAT6, 그리고 NF-κB로 구성된 군에서 선별되는, 방법.
- 청구항 1-2에 있어서, 이때 상기 전사 응축물의 조정으로 상기 응축물과 한 가지 또는 그 이상의 핵 구멍 단백질들 간의 상호작용이 조절되는, 방법.
- 청구항 77에 있어서, 이때 상기 전사 응축물과 상기 한 가지 또는 그 이상의 핵 구멍 단백질들 간의 상호작용의 조절로 신호전달, mRNA 방출, 및/또는 mRNA 해독이 조절되는, 방법.
- 청구항 1-2에 있어서, 이때 상기 이질성염색질 응축물의 조정으로 상기 응축물과 메틸-DNA 결합 단백질들 간의 상호작용이 조절되는, 방법.
- 청구항 1-2 또는 79에 있어서, 이때 상기 이질성염색질 응축물의 조정으로 상기 응축물과 유전자 침묵화 인자들 간의 상호작용이 조절되는, 방법.
- 청구항 79-80에 있어서, 이때 상기 이질성염색질 응축물의 조정으로 이질성염색질 안에 위치하는 하나 또는 그 이상의 유전자들의 억제 또는 활성화가 조절되는, 방법.
- 청구항 1-2에 있어서, 이때 상기 mRNA 개시 또는 신장 복합체와 연합된 응축물의 조절로 상기 응축물과 스플라이싱 인자들 간의 상호작용이 조절되는, 방법.
- 청구항 1-2 또는 82에 있어서, 이때 상기 mRNA 개시 또는 신장 복합체와 연합된 응축물의 조절로 상기 응축물과 RNA 중합효소 간의 상호작용이 조절되는, 방법.
- 청구항 82-83에 있어서, 이때 상기 mRNA 개시 또는 신장 복합체와 연합된 응축물의 조절로 mRNA 개시 또는 신장이 조절되는, 방법.
- 청구항 82-84에 있어서, 이때 상기 mRNA 개시 또는 신장 복합체와 연합된 응축물의 조절로 mRNA 스플라이싱이 조절되는, 방법.
- 청구항 1-2에 있어서, 이때 상기 응축물의 조절로 염증성 응답이 조절되는, 방법.
- 청구항 86에 있어서, 이때 상기 염증성 응답은 바이러스 또는 박테리아에 대한 염증성 응답인, 방법.
- 청구항 1-2에 있어서, 이때 상기 전사 응축물 또는 이질성염색질 응축물의 조절로 암 세포의 성장 또는 생존력이 축소 또는 제거되는, 방법.
- 청구항 1-2에 있어서, 이때 상기 응축물과 연합된 뉴클레오티드 서열의 변경에 의해 상기 응축물이 조절되는, 방법.
- 청구항 89에 있어서 이때 상기 변경은 뉴클레오티드의 추가 또는 삭제를 포함하는, 방법.
- 청구항 90에 있어서, 이때 상기 추가된 또는 삭제된 뉴클레오티드는 산성 뉴클레오티드 또는 방향족 아미노산을 코드하는, 방법.
- 청구항 89에 있어서, 이때 상기 변경은 후생적 변형을 포함하는, 방법.
- 청구항 92에 있어서, 이때 상기 후생적 변형은 DNA 메틸화를 포함하는, 방법.
- 청구항 89에 있어서, 이때 상기 뉴클레오티드 서열의 변경에는 당해 뉴클레오티드 서열에 DNA, RNA, 또는 단백질의 테터링이 포함된, 방법.
- 청구항 94에 있어서, 이때 dCas 부위-특이적 엔도뉴클레아제는 상기 DNA, RNA, 또는 단백질을 당해 뉴클레오티드 서열에 테터링하는데 이용되는, 방법.
- 청구항 1-2에 있어서, 이때 DNA, RNA, 또는 단백질을 상기 응축물에 테터링함으로써, 당해 응축물이 조절되는, 방법.
- 청구항 1-2에 있어서, 이때 상기 응축물에 외인성 RNA를 접촉시킴으로써, 당해 응축물이 조절되는, 방법.
- 청구항 1-2에 있어서, 이때 상기 응축물과 연합된 DNA를 메틸화 또는 탈메틸화시킴으로써 당해 응축물이 조절되는, 방법.
- 청구항 1-2에 있어서, 이때 상기 성분을 포스포릴화 또는 탈-포스포릴화시킴으로써, mRNA 개시 또는 신장 복합체와 연합된 응축물이 조절되는, 방법
- 청구항 99에 있어서, 이때 상기 성분은 RNA 중합효소인, 방법.
- 청구항 1-2에 있어서, 이때 상기 응축물과 연합된 한 가지 또는 그 이상의 RNAs를 안정화시킴으로써, 당해 응축물이 조절되는, 방법.
- 청구항 1-2에 있어서, 이때 상기 응축물과 연합된 RNA 수준을 조정함으로써, 당해 응축물이 조절되는, 방법.
- 청구항 1-102에 있어서, 이때 상기 세포 안에서 RNA 프로세싱이 변경되는, 방법.
- 청구항 103에 있어서, 하나 또는 그 이상의 RNA 프로세싱 도구 응축물들로 상기 응축물 융합을 억압 또는 강화시킴으로써, RNA 프로세싱이 변경되는, 방법.
- 청구항 1-2에 있어서, 이때 상기 응축물의 성분의 본질적으로 무질서화된 도메인에 결합하는 제제를 상기 응축물에 접촉시킴으로써 당해 응축물이 조절되는, 방법.
- 청구항 105에 있어서, 이때 상기 성분은 Mediator, 매개체 성분, MED1, MED15, p300, BRD4, TFIID, β-카테닌, STAT3, SMAD3, NF-KB, MECP2, MBD1, MBD2, MBD3, MBD4, HP1α, TBL1R, HDAC3, SMRT RNA 중합효소 II, SRSF2, SRRM1, SRSF1, 또는 핵 수용체 리간드인, 방법.
- 청구항 105에 있어서, 이때 상기 성분은 전사 인자인, 방법.
- 청구항 107에 있어서, 이때 상기 전사 인자는 OCT4, p53, MYC, GCN4, NANOG, MyoD, KLF4, SOX 패밀리 전사 인자, GATA 패밀리 전사 인자, 핵 수용체, 또는 융합 종양형성적 전사 인자인, 방법.
- 청구항 105-108에 있어서, 이때 상기 제제는 다가(multivalent)인, 방법.
- 청구항 109에 있어서, 이때 상기 제제는 이가(bivalent)인, 방법.
- 청구항 109-110에 있어서, 이때 상기 제제는 이 성분의 비-본질적으로 무질서화된 도메인 또는 제 2 상기 응축물의 성분에 추가 결합하는, 방법.
- 청구항 104-111에 있어서, 이때 상기 제제는 상기 응축물들의 성분들 간의 상호작용을 변경시키거나 또는 파괴시키는, 방법.
- 청구항 1-2에 있어서, 이때 하나 또는 그 이상의 응축물 성분들을 게놈 DNA에 테터링시킴으로써, 응축물 형성이 야기되거나, 강화되거나, 또는 안정화되는, 방법.
- 청구항 113에 있어서, 이때 상기 성분들은 DNA, RNA, 펩티드, 및/또는 단백질을 포함하는, 방법.
- 청구항 113-114에 있어서, 이때 상기 성분들은 Mediator, Mediator 성분, MED1, MED14, p300, BRD4, TFIID, 신호전달 인자, β-카테닌, STAT3, SMAD3, NF-KB, MECP2, MBD1, MBD2, MBD3, MBD4, HP1α, TBL1R, HDAC3, SMRT RNA 중합효소 II, SRSF2, SRRM1, SRSF1, 또는 핵 수용체 리간드를 포함하는, 방법.
- 청구항 113-114에 있어서, 이때 상기 성분은 전사 인자인, 방법.
- 청구항 116에 있어서, 이때 상기 전사 인자는 OCT4, p53, MYC, GCN4, NANOG, MyoD, KLF4, SOX 패밀리 전사 인자, GATA 패밀리 전사 인자, 핵 수용체, 또는 융합 종양형성적 전사 인자인, 방법.
- 청구항 113-117에 있어서, 이때 상기 한 가지 또는 그 이상의 성분들은 dCas 부위-특이적 엔도뉴클레아제를 이용하여 테터링되는, 방법.
- 청구항 1-2에 있어서, 이때 제 2의 응축물 안에 상기 응축물의 하나 또는 그 이상의 성분들을 격리시킴으로써, 상기 응축물이 조정되는, 방법.
- 청구항 119에 있어서, 제 2의 응축물의 형성은 상기 세포에 외인성 펩티드, 핵산 및/또는 단백질을 접촉시킴으로써 유도되는, 방법.
- 청구항 119-120에 있어서, 이때 상기 격리된 성분은 전사 인자, 공동-활성제, 신호전달 인자, 메틸-DNA 결합 단백질, 스플라이싱 인자, 유전자 침묵화 인자, RNA 중합효소, 또는 핵 수용체 리간드인, 방법.
- 청구항 121에 있어서, 이때 상기 격리된 성분은 Mediator, MED1, MED14, p300, BRD4, TFIID, OCT4, p53, MYC, GCN4, NANOG, MyoD, KLF4, SOX 패밀리 전사 인자, GATA 패밀리 전사 인자, 핵 수용체, 또는 융합 종양형성적 전사 인자인, 방법.
- 청구항 119-122에 있어서, 이때 상기 격리된 성분은 야생형-단백질의 돌연변이 형태인, 방법.
- 청구항 123에 있어서, 이때 상기 야생형 단백질은 격리되지 않는, 방법.
- 청구항 119-124에 있어서, 이때 상기 격리된 성분은 포스포릴화된 성분인, 방법.
- 청구항 119-124에 있어서, 이때 상기 격리된 성분은 탈-포스포릴화된 성분인, 방법.
- 청구항 119-126에 있어서, 이때 상기 격리된 성분은 질환 상태에서 과다-발현된 성분인, 방법.
- 청구항 119-127에 있어서, 이때 상기 격리된 성분은 핵 수용체인, 방법.
- 청구항 128에 있어서, 이때 상기 핵 수용체는 핵 수용체의 돌연변이 형태인, 방법.
- 청구항 119에 있어서, 이때 상기 격리된 성분은 신호전달 인자인, 방법.
- 청구항 119에 있어서, 이때 상기 격리된 성분은 메틸-DNA 결합 단백질인, 방법.
- 청구항 119에 있어서, 이때 상기 격리된 성분은 스플라이싱 인자인, 방법.
- 청구항 119에 있어서, 이때 상기 격리된 성분은 유전자 침묵화 인자인, 방법.
- 청구항 1-2에 있어서, 이때 상기 응축물과 연합된 ncRNA 수준 또는 활성을 조정함으로써, 당해 응축물이 조절되는, 방법.
- 청구항 134에 있어서, 이때 상기 ncRNA에 안티-센스 올리고뉴클레오티드, RNase, 또는 ncRNA에 결합하는 화학적 화합물을 접촉시킴으로써, 당해 ncRNA의 수준 또는 활성이 조정되는, 방법.
- 청구항 1-135에 있어서, 이때 상기 방법은 응축물 형성, 구성, 유지, 해체 또는 규제로 인하여 발생되거나, 또는 이에 의존적인 질환 가능성을 치료하거나 또는 감소시키는, 방법.
- 청구항 1-136에 있어서, 이때 상기 방법은 암 가능성을 치료 또는 축소시키는, 방법.
- 청구항 1-137에 있어서, 이때 상기 방법은 일탈적인 단백질 발현과 연합된 질환을 치료하는, 방법.
- 청구항 138에 있어서, 이때 상기 질환은 단백질의 발병적 수준을 초래하는, 방법.
- 청구항 1-139에 있어서, 이때 상기 방법은 유전자 발현시키는 핵 수용체에서 돌연변이와 연합된 질환을 치료하는, 방법.
- 청구항 1-140에 있어서, 이때 상기 방법은 메틸-DNA 결합 단백질의 일탈적인 발현 또는 활성과 연합된 질환을 치료하는, 방법.
- 청구항 1-141에 있어서, 이때 상기 방법은 일탈적인 mRNA 개시 또는 신장과 연합된 질환을 치료하는, 방법.
- 청구항 1-141에 있어서, 이때 상기 방법은 일탈적인 mRNA 스플라이싱과 연합된 질환을 치료하는, 방법.
- mRNA 개시를 조절하는 방법에 있어서, 이 방법은 mRNA 개시와 물리적으로 연합된 응축물의 형성, 구성, 유지, 해체 및/또는 규제의 조정을 포함하는, 방법.
- 청구항 144에 있어서, 이때 mRNA 개시의 조정으로 mRNA 신장, 스플라이싱 또는 캡핑이 또한 조절되는, 방법.
- 청구항 144 또는 145에 있어서, 이때 mRNA 개시 복합체와 물리적으로 연합된 응축물의 형성, 구성, 유지, 해체 및/또는 규제를 조정함으로써 mRNA 전사 속도가 조정되는, 방법.
- 청구항 144-146에 있어서, 이때 mRNA 개시 복합체와 물리적으로 연합된 응축물의 형성, 구성, 유지, 해체 및/또는 규제를 조정함으로써 유전자 산물의 수준이 조절되는, 방법.
- 청구항 144-147에 있어서, 이때 mRNA 개시 복합체와 물리적으로 연합된 응축물의 형성, 구성, 유지, 해체 및/또는 규제는 제제에 의해 조절되는, 방법.
- 청구항 148에 있어서, 이때 상기 제제는 저-포스포릴화된 RNA 중합효소 II C-말단 도메인 (Pol II CTD) 또는 이의 기능적 단편을 포함하는, 방법.
- 청구항 148에 있어서, 이때 상기 제제는 저-포스포릴화된 Pol II CTD에 선호적으로 결합하는, 방법.
- mRNA 신장을 조정하는 방법에 있어서, 이 방법은 mRNA 신장 복합체와 물리적으로 연합된 응축물의 형성, 구성, 유지, 해체 및/또는 규제의 조정을 포함하는, 방법.
- 청구항 151에 있어서, 이때 mRNA 신장의 조정으로 mRNA 개시가 또한 조절되는, 방법.
- 청구항 151 또는 152에 있어서, 이때 상기 mRNA 신장 복합체와 물리적으로 연합된 응축물의 형성, 구성, 유지, 해체 및/또는 규제를 조정함으로써 mRNA의 공동-전사 프로세싱이 조절되는, 방법.
- 청구항 151-153에 있어서, 이때 상기 mRNA 신장 복합체와 물리적으로 연합된 응축물의 형성, 구성, 유지, 해체 및/또는 규제를 조절함으로써 mRNA 스플라이스 변이체들의 수 또는 상대적 비율이 조절되는, 방법.
- 청구항 151-154에 있어서, 이때 상기 mRNA 신장 복합체와 물리적으로 연합된 응축물의 형성, 구성, 유지, 해체 및/또는 규제는 제제에 의해 조절되는, 방법.
- 청구항 155에 있어서, 이때 상기 제제는 포스포릴화된 RNA 중합효소 II C-말단 도메인 (Pol II CTD) 또는 이의 기능적 단편을 포함하는, 방법.
- 청구항 155에 있어서, 이때 상기 제제는 포스포릴화된 Pol II CTD에 선호적으로 결합하는, 방법.
- 응축물의 형성, 구성, 유지, 해체 및/또는 규제를 조정하는 방법에 있어서, 이 방법은 당해 응축물 성분의 포스포릴화 또는 탈-포스포릴화의 조절을 포함하는, 방법.
- 청구항 158에 있어서, 이때 상기 성분은 RNA 중합효소 II 또는 RNA 중합효소 II C-말단 영역인, 방법.
- 일탈적인 mRNA 프로세싱과 연합된 질환 또는 병태의 가능성을 치료 또는 감축시키는 방법에 있어서, 이 방법은 mRNA 신장 복합체와 물리적으로 연합된 응축물의 형성, 구성, 유지, 해체 및/또는 규제의 조정을 포함하는, 방법.
- 응축물 형성, 안정성, 또는 형태를 조절하는 제제를 식별하는 방법에 있어서, 다음을 포함하는 방법:
a. mRNA 개시 또는 신장 복합체와 물리적으로 연합된 응축물을 보유한 세포를 제공하고,
b. 상기 세포에 테스트 제제를 접촉시키고, 그리고
c. 상기 테스트 제제와의 접촉으로 상기 응축물의 형성, 안정성, 또는 형태가 조절되는 지를 결정하고,
이때 상기 응축물은 저-포스포릴화된 RNA 중합효소 II C-말단 도메인 (Pol II CTD), 포스포릴화된 RNA 중합효소 II C-말단 도메인 (Pol II CTD), 스플라이싱 인자, 또는 이의 기능적 단편을 포함한다. - 응축물 형성, 안정성, 또는 형태를 조절하는 제제를 식별하는 방법에 있어서, 다음을 포함하는 방법:
a. 시험관내 응축물을 제공하고, 시험관내 당해 응축물의 한 가지 또는 그 이상의 물리적 성질들을 평가하고,
b. 당해 시험관내 응축물에 테스트 제제를 접촉시키고, 그리고
c. 당해 태스트 제제가 당해 시험관내 응축물의 한 가지 또는 그 이상의 물리적 성질들의 변화를 야기시키는 지 여부를 평가하고,
이때 상기 응축물은 저-포스포릴화된 RNA 중합효소 II C-말단 도메인 (Pol II CTD), 포스포릴화된 RNA 중합효소 II C-말단 도메인 (Pol II CTD), 스플라이싱 인자, 또는 이의 기능적 단편을 포함한다. - 저-포스포릴화된 RNA 중합효소 II C-말단 도메인 (Pol II CTD) 또는 이의 기능적 단편을 포함하는 단리된 합성 응축물.
- 포스포릴화된 RNA 중합효소 II C-말단 도메인 (Pol II CTD) 또는 이의 기능적 단편을 포함하는 단리된 합성 응축물.
- 스플라이싱 인자 또는 이의 기능적 단편을 포함하는 단리된 합성 응축물.
- 한 가지 또는 그 이상의 유전자 전사를 조정하는 방법에 있어서, 이 방법은 이질성염색질 응축물의 형성, 구성, 유지, 해체 및/또는 규제의 조절을 포함하는, 방법.
- 청구항 166에 있어서, 이때 상기 이질성염색질 응축물의 조정으로 상기 한 가지 또는 그 이상의 유전자의 전사의 억제가 증가되거나, 또는 안정화되는, 방법.
- 청구항 166에 있어서, 이때 상기 이질성염색질 응축물의 조정으로 상기 한 가지 또는 그 이상의 유전자의 전사 억제가 감소되는, 방법.
- 청구항 166-168에 있어서, 이때 다수의 이질성염색질 응축물들이 조절되는, 방법.
- 청구항 166-169에 있어서, 이때 상기 이질성염색질 응축물의 형성, 구성, 유지, 해체 및/또는 규제는 제제에 의해 조절되는, 방법.
- 청구항 170에 있어서, 이때 상기 제제는 펩티드, 핵산, 또는 소 분자를 포함하는, 방법.
- 청구항 170-171에 있어서, 이때 상기 제제는 메틸화된 DNA, 메틸-DNA 결합 단백질, 또는 유전자 침묵화 인자에 결합하는, 방법.
- 유전자 침묵화를 조정하는 방법에 있어서, 이 방법은 이질성염색질 응축물의 형성, 구성, 유지, 해체 및/또는 규제의 조절을 포함하는, 방법.
- 청구항 173에 있어서, 이때 유전자 침묵화는 안정화되거나 또는 증가되는, 방법.
- 청구항 173에 있어서, 이때 유전자 침묵화는 감소되는, 방법.
- 청구항 173-175에 있어서, 이때 유전자 침묵화는 제제에 의해 조절되는, 방법.
- 일탈적인 유전자 침묵화와 연합된 질환 또는 병태의 가능성을 치료 또는 감소시키는 방법에 있어서, 이 방법은 이질성염색질 응축물의 형성, 구성, 유지, 해체 및/또는 규제의 조절을 포함하는, 방법.
- 청구항 177에 있어서, 이때 일탈적인 유전자 침묵화와 연합된 질환 또는 병태는 메틸-DNA 결합 단백질의 일탈적인 발현 또는 활성과 연합된, 방법.
- 청구항 177-178에 있어서, 이때 일탈적인 유전자 침묵화와 연합된 질환 또는 병태는 Rett 증후군 또는 MeCP2 과다발현 증후군인, 방법.
- 응축물 형성, 안정성, 또는 형태를 조절하는 제제를 식별하는 방법에 있어서, 다음을 포함하는 방법:
a. 응축물을 보유한 세포를 제공하고,
b. 당해 세포에 테스트 제제를 접촉시키고, 그리고
c. 당해 테스트 제제와의 접촉으로 상기 응축물의 형성, 안정성, 또는 형태가 조절되는 지를 결정하고,
이때 당해 응축물은 MeCP2 또는 MeCP2의 C-말단 본질적으로 무질서화된 영역을 포함하는 이의 단편, 또는 억압제를 포함한다. - 청구항 180에 있어서, 이때 상기 응축물은 이질성염색질 응축물인, 방법.
- 청구항 180-181에 있어서, 이때 상기 응축물은 메틸화된 DNA와 연합된, 방법.
- 응축물 형성, 안정성, 또는 형태를 조절하는 제제를 식별하는 방법에 있어서, 다음을 포함하는 방법:
a. 시험관내 응축물을 제공하고, 시험관내 당해 응축물의 한 가지 또는 그 이상의 물리적 성질들을 평가하고,
b. 당해 시험관내 응축물에 테스트 제제를 접촉시키고, 그리고
c. 당해 테스트 제제가 당해 시험관내 응축물의 한 가지 또는 그 이상의 물리적 성질들의 변화를 야기시키는 지 여부를 평가하고,
이때 상기 응축물은 MeCP2 또는 MeCP2의 C-말단 본질적으로 무질서화된 영역을 포함하는 이의 단편, 또는 억압제 또는 이의 기능적 단편을 포함한다. - MeCP2 또는 MeCP2의 C-말단 본질적으로 무질서화된 영역을 포함하는 이의 단편을 포함하는 단리된 합성 응축물.
- 억압제 또는 이의 기능적 단편을 포함하는 단리된 합성 응축물.
- 응축물 형성, 안정성, 활성, 또는 형태를 조절하는 제제를 식별하는 방법에 있어서, 다음을 포함하는 방법:
a.응축물을 보유한 세포를 제공하고,
b.당해 세포에 테스트 제제를 접촉시키고, 그리고
c.상기 테스트 제제와의 접촉으로 상기 응축물의 형성, 안정성, 활성, 또는 형태가 조절되는 지 여부를 결정하고, 이때 상기 응축물은 전사 응축물, 이질성염색질 응축물, 또는 mRNA 개시 또는 신장 복합체와 물리적으로 연합된 응축물이다. - 청구항 186에 있어서, 이때 상기 응축물은 탐지가능한 테그를 보유하고, 당해 탐지가능한 테그를 이용하여 상기 테스트 제제와의 접촉으로 상기 응축물의 형성, 안정성, 활성, 또는 형태가 조정되는 지를 결정하는, 방법.
- 청구항 187에 있어서, 이때 상기 세포는 상기 탐지가능한 테그를 발현시키도록 유전공학적으로 공작된, 방법.
- 청구항 187-188에 있어서, 이때 상기 탐지가능한 테그는 형광 테그인, 방법.
- 청구항 187-189에 있어서, 이때 상기 탐지가능한 테그는 OCT4, p53, MYC, GCN4, Mediator, 매개체 성분, MED1, MED15, p300, BRD4, NANOG, MyoD, KLF4, SOX 패밀리 전사 인자, GATA 패밀리 전사 인자, 핵 수용체, 핵 수용체 리간드, 융합 종양형성적 전사 인자, TFIID, 신호전달 인자, 메틸-DNA 결합 단백질, 스플라이싱 인자, 유전자 침묵화 인자, RNA 중합효소, β-카테닌, STAT3, SMAD3, NF-KB, MECP2, MBD1, MBD2, MBD3, MBD4, HP1α, TBL1R, HDAC3, SMRT, RNA 중합효소 II, SRSF2, SRRM1, SRSF1, 그리고 본질적으로 무질서화된 영역 (IDR)을 포함하는 이의 단편들로 구성된 군에서 선별된 응축물 성분에 부착되는, 방법.
- 청구항 190에 있어서, 이때 상기 응축물 또는 이의 성분에 선택적으로 결합하는 항체를 이용하여 상기 테스트 제제와 접촉에 의해 당해 응축물의 형성, 안정성, 활성, 또는 형태가 조정되는 지를 결정하는, 방법.
- 청구항 191에 있어서, 이때 상기 항체는 OCT4, p53, MYC, GCN4, Mediator, 매개체 성분, MED1, MED15, p300, BRD4, NANOG, MyoD, KLF4, SOX 패밀리 전사 인자, GATA 패밀리 전사 인자, 핵 수용체, 핵 수용체 리간드, 융합 종양형성적 전사 인자, TFIID, 신호전달 인자, 메틸-DNA 결합 단백질, 스플라이싱 인자, 유전자 침묵화 인자, RNA 중합효소, β-카테닌, STAT3, SMAD3, NF-KB, MECP2, MBD1, MBD2, MBD3, MBD4, HP1α, TBL1R, HDAC3, SMRT, RNA 중합효소 II, SRSF2, SRRM1, SRSF1, 그리고 본질적으로 무질서화된 영역 (IDR)을 포함하는 이의 단편들로 구성된 군에서 선별된 응축물 성분에 선택적으로 결합하는, 방법.
- 청구항 186-192에 있어서, 이때 상기 테스트 제제와 접촉에 의해 당해 응축물의 형성, 안정성, 활성, 또는 형태가 조정되는 지를 결정하는 단계는 현미경을 이용하여 실행되는, 방법.
- 청구항 193에 있어서, 이때 상기 현미경은 콘디볼루션 현미경 또는 구조 조명 현미경인, 방법.
- 청구항 186-194에 있어서, 이때 상기 테스트 제제와 접촉에 의해 당해 응축물의 형성, 안정성, 활성, 또는 형태가 조정되는 지를 결정하는 단계는 DNA-FISH, RNA-FISH, 또는 이의 조합을 이용하여 실행되는, 방법.
- 청구항 186-195에 있어서, 이때 상기 응축물의 성분은 핵 수용체 또는 IDR을 포함하는 이의 단편인, 방법.
- 청구항 196에 있어서, 이때 상기 핵 수용체는 동족 리간드에 결합될 때, 전사를 활성화시키는, 방법.
- 청구항 196에 있어서, 이때 상기 핵 수용체는 동족 리간드에 결합없이, 전사를 활성화시키는 돌연변이 핵 수용체인, 방법.
- 청구항 196-198에 있어서, 이때 상기 핵 수용체는 핵 호르몬 수용체인, 방법.
- 청구항 196-199에 있어서, 이때 상기 핵 수용체는 돌연변이를 갖는, 방법.
- 청구항 199-200에 있어서, 이때 상기 핵 수용체는 에스트로겐 수용체 또는 돌연변이체 에스트로겐 수용체인, 방법.
- 청구항 201에 있어서, 이때 상기 돌연변이체 에스트로겐 수용체는 전사 활성화를 위한 에스트로겐에 의존적이지 않는, 방법.
- 청구항 201-202에 있어서, 이때 상기 돌연변이체 에스트로겐 수용체에 의한 전사 활성화는 탐옥시펜 또는 이의 활성 대사산물에 의해 저해되지 않는, 방법.
- 청구항 201-203에 있어서, 이때 상기 세포는 에스트로겐에 접촉되는, 방법.
- 청구항 201-204에 있어서, 이때 상기 세포는 탐옥시펜 또는 이의 활성 대사산물에 접촉되는, 방법.
- 청구항 204-205에 있어서, 에스트로겐 및/또는 탐옥시펜 또는 이의 활성 대사산물의 존재 하에서 돌연변이체 에스트로겐 수용체의 전사 활성을 저해시키는 지를 더 포함하는, 방법.
- 청구항 200에 있어서, 이때 상기 돌연변이는 질환 또는 병태와 연합되거나, 이를 특징화시키는, 방법.
- 청구항 207에 있어서, 이때 상기 질환 또는 병태는 암인, 방법.
- 청구항 186-208에 있어서, 이때 상기 상기 전사 응축물의 성분은 IDR을 포함하는 신호전달 인자 또는 이의 단편인, 방법.
- 청구항 209에 있어서, 이때 상기 전사 응축물은 한 가지 또는 그 이상의 신호 응답 요소들과 물리적으로 연합된 방법.
- 청구항 209-210에 있어서, 이때 상기 신호전달 인자는 질환과 연합된 신호전달 경로와 연합된, 방법.
- 청구항 211에 있어서, 이때 상기 질환은 암인, 방법.
- 청구항 186-212에 있어서, 이때 상기 응축물은 종양유전자의 전사를 조절하는 방법.
- 청구항 186-213에 있어서, 이때 상기 응축물은 슈퍼-인헨서와 연합된, 방법.
- 청구항 186-195에 있어서, 이때 상기 mRNA 개시 또는 신장 복합체와 물리적으로 연합된 응축물의 성분은 C-말단 IDR을 포함하는 메틸-DNA 결합 단백질 또는 이의 단편, 또는 IDR을 포함하는 억압제 또는 이의 단편인, 방법.
- 청구항 215에 있어서, 이때 상기 이질성염색질 응축물은 메틸화된 DNA 또는 이질성염색질과 연합된, 방법.
- 청구항 215-216에 있어서, 이때 상기 이질성염색질 응축물은 일탈 수준 또는 활성의 메틸-DNA 결합 단백질을 포함하는, 방법.
- 청구항 215-217에서, 이때 상기 세포는 신경 세포인, 방법.
- 청구항 218에 있어서 이때 상기 세포는 Rett 증후군 또는 MeCP2 과다발현 증후군을 갖는 대상체로부터 유도된, 방법.
- 청구항 215-219에 있어서, 이때 상기 mRNA 개시 또는 신장 복합체와 물리적으로 연합된 응축물과 연합된 유전자들의 발현이 상기 제제에 의해 억제되는 지를 평가하는, 방법.
- 청구항 186-220에 있어서, 이때 mRNA 개시 또는 신장 복합체와 물리적으로 연합된 응축물의 성분은 스플라이싱 인자 또는 IDR을 포함하는 이의 단편, 또는 RNA 중합효소 또는 IDR을 포함하는 이의 단편인, 방법.
- 청구항 221에 있어서, 이때 상기 세포는 사이클린 의존적 키나제를 더 포함하는, 방법.
- 청구항 221-222에 있어서, 이때 상기 RNA 중합효소는 RNA 중합효소 II (Pol II)인, 방법.
- 청구항 221-223에 있어서, 이때 상기 제제와의 접촉에 의한 상기 응축물과 연합된 RNA 전사 개시 활성에서의 변화가 평가되는, 방법.
- 청구항 221-224에 있어서, 이때 상기 제제와의 접촉에 의한 상기 응축물과 연합된 RNA 신장 또는 스플라이싱 활성에서의 변화가 평가되는, 방법.
- 응축물 형성, 안정성, 활성, 또는 형태를 조절하는 제제를 식별하는 방법에 있어서, 다음을 포함하는 방법:
a. 시험관내 응축물을 제공하고, 시험관내 당해 응축물의 한 가지 또는 그 이상의 물리적 성질들을 평가하고,
b. 당해 시험관내 응축물에 테스트 제제를 접촉시키고, 그리고
c. 당해 테스트 제제가 당해 시험관내 응축물의 한 가지 또는 그 이상의 물리적 성질들의 변화를 야기시키는 지 여부를 평가한다. - 청구항 226에 있어서, 이때 상기 하나 또는 그 이상의 물리적 성질은 상기 시험관내 응축물이 세포 안 유전자의 발현을 야기 또는 억제시키는 능력과 관련된, 방법.
- 청구항 226-227에 있어서, 이때 상기 한 가지 또는 그 이상의 물리적 성질은 크기, 농도, 투과성, 형태, 또는 점성을 포함하는, 방법.
- 청구항 226-228에 있어서, 이때 상기 테스트 제제는 소 분자, 펩티드, RNA 또는 DNA를 포함하는, 방법.
- 청구항 226-229에 있어서, 이때 상기 시험관내 응축물은 DNA, RNA 그리고 단백질을 포함하는, 방법.
- 청구항 226-230에 있어서, 이때 상기 시험관내 응축물은 OCT4, p53, MYC, GCN4, Mediator, 매개체 성분, MED1, MED15, p300, BRD4, NANOG, MyoD, KLF4, SOX 패밀리 전사 인자, GATA 패밀리 전사 인자, 핵 수용체, 핵 수용체 리간드, 융합 종양형성적 전사 인자, TFIID, 신호전달 인자, 메틸-DNA 결합 단백질, 스플라이싱 인자, 유전자 침묵화 인자, RNA 중합효소, β-카테닌, STAT3, SMAD3, NF-KB, MECP2, MBD1, MBD2, MBD3, MBD4, HP1α, TBL1R, HDAC3, SMRT, RNA 중합효소 II, SRSF2, SRRM1, SRSF1, 그리고 본질적으로 무질서화된 영역 (IDR)을 포함하는 이의 단편들로 구성된 군에서 선별된 응축물 성분을 포함하는, 방법.
- 청구항 226-231에 있어서, 이때 상기 시험관내 응축물은 본질적으로 무질서화된 영역 또는 도메인을 포함하는, 방법.
- 청구항 232에 있어서, 이때 상기 본질적으로 무질서화된 영역 또는 도메인은 MED1 또는 BRD4 본질적으로 무질서화된 영역 또는 도메인을 포함하는, 방법.
- 청구항 232에 있어서, 이때 상기 본질적으로 무질서화된 영역 또는 도메인은 한 가지 또는 그 이상의 전사 인자 본질적으로 무질서화된 영역 또는 도메인을 포함하는, 방법.
- 청구항 234에 있어서, 이때 상기 본질적으로 무질서화된 영역 또는 도메인은 활성화 인자 본질적으로 무질서화된 영역 또는 도메인을 포함하는, 방법.
- 청구항 233-235에 있어서, 이때 상기 핵 수용체는 동족 리간드에 결합될 때, 전사를 활성화시키는, 방법.
- 청구항 231-235에 있어서, 이때 상기 핵 수용체는 동족 리간드에 결합없이, 전사를 활성화시키는 돌연변이 전사 인자인, 방법.
- 청구항 231-237에 있어서, 이때 상기 핵 수용체는 핵 호르몬 수용체인, 방법.
- 청구항 231-238에 있어서, 이때 상기 핵 수용체는 돌연변이를 갖는, 방법.
- 청구항 238-239에 있어서, 이때 상기 핵 수용체는 에스트로겐 수용체 또는 돌연변이체 에스트로겐 수용체인, 방법.
- 청구항 240에 있어서, 이때 상기 돌연변이체 에스트로겐 수용체는 전사 활성화를 위한 에스트로겐에 의존적이지 않는, 방법.
- 청구항 240-241에 있어서, 이때 상기 돌연변이체 에스트로겐 수용체에 의한 전사 활성화는 탐옥시펜 또는 이의 활성 대사산물에 의해 저해되지 않는, 방법.
- 청구항 240-242에 있어서, 이때 상기 세포는 에스트로겐에 접촉되는, 방법.
- 청구항 240-243에 있어서, 이때 상기 세포는 탐옥시펜 또는 이의 활성 대사산물에 접촉되는, 방법.
- 청구항 243-244에 있어서, 에스트로겐 및/또는 탐옥시펜 또는 이의 활성 대사산물의 존재 하에서 돌연변이체 에스트로겐 수용체의 전사 활성을 저해시키는 지를 더 포함하는, 방법.
- 청구항 239-245에 있어서, 이때 상기 돌연변이는 질환 또는 병태와 연합된, 방법.
- 청구항 246에 있어서, 이때 상기 질환 또는 병태는 암인, 방법.
- 청구항 226-247에 있어서, 이때 상기 시험관내 응축물은 약한 단백질-단백질 상호작용에 의해 형성되는, 방법.
- 청구항 226-248에 있어서, 이때 상기 시험관내 응축물은 돌연변이 핵 수용체, 또는 IDR을 포함하는 이의 단편을 포함하는데, 이는 상기 핵 수용체 리간드의 부재 하에 유전자의 전사를 활성화시키는, 방법.
- 청구항 226-250에 있어서, 이때 상기 시험관내 응축물은 돌연변이 핵 수용체, 또는 IDR을 포함하는 이의 단편을 포함하는데, 이는 상기 핵 수용체 리간드의 부재 하에 유전자의 전사를 억제시키는, 방법.
- 청구항 226-250에 있어서, 이때 상기 시험관내 응축물은 유전자의 전사의 활성화에 필수적인 IDR을 포함하는 신호전달 인자 또는 이의 단편을 포함하는, 방법.
- 청구항 226-251에 있어서, 이때 상기 신호전달 인자는 종양형성적 신호전달 경로와 연합된, 방법.
- 청구항 226-235에 있어서, 이때 상기 응축물은 메틸-DNA 결합 단백질 또는 C-말단 IDR을 포함하는 이의 단편, 또는 억압제 또는 IDR을 포함하는 이의 단편을 포함하는, 방법.
- 청구항 253에 있어서, 이때 상기 응축물은 메틸화된 DNA 또는 이질성염색질과 연합된, 방법.
- 청구항 253-254에 있어서, 이때 상기 응축물은 메틸-DNA 결합 단백질의 일탈적인 수준 또는 활성을 포함하는, 방법.
- 청구항 253-255에 있어서, 이때 상기 제제에 의한 응축물과 연합된 유전자들의 발현의 억제가 평가되는, 방법.
- 청구항 226-235에 있어서, 이때 상기 응축물은 스플라이싱 인자 또는 IDR을 포함하는 이의 단편, 또는 RNA 중합효소 또는 IDR을 포함하는 이의 단편을 포함하는, 방법.
- 청구항 257에 있어서, 이때 상기 응축물은 전사 개시 복합체 또는 신장 복합체와 연합된, 방법.
- 청구항 257-258에 있어서, 이때 상기 응축물은 사이클린 의존적 키나제와 접촉되는, 방법.
- 청구항 257-259에 있어서, 이때 상기 RNA 중합효소는 RNA 중합효소 II (Pol II)인, 방법.
- 청구항 257-260에 있어서, 이때 상기 제제와의 접촉에 의한 상기 응축물과 연합된 RNA 전사 개시 활성에서의 변화가 평가되는, 방법.
- 청구항 257-261에 있어서, 이때 상기 제제와의 접촉에 의한 상기 응축물과 연합된 RNA 신장 또는 스플라이싱 활성에서의 변화가 평가되는, 방법.
- 청구항 226-262에 있어서, 이때 상기 시험관내 응축물은 (본질적으로 무질서화된 도메인)-(유도성 올리고머화 도메인) 융합 단백질들을 포함하는, 방법.
- 청구항 263에 있어서, 이때 상기 융합 단백질은 본질적으로 무질서화된 도메인-Cry2 융합 단백질인, 방법.
- 청구항 263-264에 있어서, 이때 상기 유도성 올리고머화 도메인은 소 분자, 단백질, 또는 핵산에 의해 유도되는, 방법.
- 청구항 263-265에 있어서, 이때 상기 본질적으로 무질서화된 도메인은 OCT4, p53, MYC, GCN4, Mediator, 매개체 성분, MED1, MED15, p300, BRD4, NANOG, MyoD, KLF4, SOX 패밀리 전사 인자, GATA 패밀리 전사 인자, 핵 수용체, 신호전달 인자, 메틸-DNA 결합 단백질, 스플라이싱 인자, 유전자 침묵화 인자, RNA 중합효소, β-카테닌, STAT3, SMAD3, NF-KB, MECP2, MBD1, MBD2, MBD3, MBD4, HP1α, TBL1R, HDAC3, SMRT, RNA 중합효소 II, SRSF2, SRRM1, SRSF1, 또는 TFIID 본질적으로 무질서화된 도메인인, 방법.
- 청구항 263-266에 있어서, 이때 상기 시험관내 응축물은 청색광 자극에 대한 반응으로 형성되는 방법.
- 청구항 263-267에 있어서, 이때 상기 시험관내 응축물은 세포 안에서 발견된 응축물을 자극시키는, 방법.
- 청구항 268에 있어서, 이때 상기 세포는 암 세포 또는 신경 세포인, 방법.
- 응축물 형성, 안정성, 기능, 또는 형태를 조정하는 제제를 식별해내는 방법에 있어서, 다음을 포함하는 방법:
a. 리포터 유전자의 응축물 의존적 발현을 하는 세포 또는 시험관내 전사 검정법을 제공하고,
b. 당해 세포 또는 시험관내 전사 검정법에 테스트 제제를 접촉시키고, 그리고
c. 당해 리포터 유전자의 발현을 평가한다. - 청구항 270에 있어서, 이때 단계 (a)의 세포 또는 시험관내 전사 검정법은 상기 리포터 유전자를 발현시키지 않는, 방법.
- 청구항 270에 있어서, 이때 단계 (a)의 세포 또는 시험관내 전사 검정법은 상기 리포터 유전자를 발현시키는, 방법.
- 청구항 270-272에 있어서, 이때 상기 리포터 유전자의 발현은 이종성 DNA-결합 도메인 및 활성화 도메인을 갖는 전사 인자에 의존적인, 방법.
- 청구항 270-273에 있어서, 이때 상기 리포터 유전자의 발현은 돌연변이체 전사 인자 활성화 도메인을 갖는 전사 인자에 의존적인, 방법.
- 청구항 274에 있어서, 이때 상기 돌연변이체 전사 인자 활성화 도메인은 질환 또는 병태와 연합된, 방법.
- 청구항 270-275에 있어서, 이때 상기 응축물은 핵 수용체 또는 IDR을 포함하는 이의 단편을 포함하는, 방법.
- 청구항 276에 있어서, 이때 상기 핵 수용체는 동족 리간드에 결합될 때, 전사를 활성화시키는, 방법.
- 청구항 276에 있어서, 이때 상기 핵 수용체는 동족 리간드에 결합없이, 전사를 활성화시키는 돌연변이 핵 수용체인, 방법.
- 청구항 276-278에 있어서, 이때 상기 핵 수용체는 핵 호르몬 수용체인, 방법.
- 청구항 270-275에 있어서, 이때 상기 응축물은 신호전달 인자 또는 IDR을 포함하는 이의 단편을 포함하는, 방법.
- 청구항 280에 있어서, 이때 상기 신호전달 인자는 종양형성적 신호전달 경로와 연합된, 방법.
- 청구항 270-275에 있어서, 이때 상기 응축물은 메틸-DNA 결합 단백질 또는 C-말단 IDR을 포함하는 이의 단편, 또는 억압제 또는 IDR을 포함하는 이의 단편을 포함하는, 방법.
- 청구항 282에 있어서, 이때 상기 응축물은 메틸화된 DNA 또는 이질성염색질과 연합된, 방법.
- 청구항 281-282에 있어서, 이때 상기 응축물은 메틸-DNA 결합 단백질의 일탈적인 수준 또는 활성을 포함하는, 방법.
- 청구항 281-283에 있어서, 이때 상기 제제에 의한 응축물과 연합된 유전자들의 발현의 억제가 평가되는, 방법.
- 청구항 270-275에 있어서, 이때 상기 응축물은 스플라이싱 인자 또는 IDR을 포함하는 이의 단편, 또는 RNA 중합효소 또는 IDR을 포함하는 이의 단편을 포함하는, 방법.
- 청구항 286에 있어서, 이때 상기 응축물은 전사 개시 복합체 또는 신장 복합체와 연합된, 방법.
- 청구항 286-287에 있어서, 이때 상기 응축물은 사이클린 의존적 키나제와 접촉되는, 방법.
- 청구항 286-288에 있어서, 이때 상기 RNA 중합효소는 RNA 중합효소 II (Pol II)인, 방법.
- 청구항 286-289에 있어서, 이때 상기 제제와의 접촉에 의한 상기 응축물과 연합된 RNA 전사 개시 활성에서의 변화가 평가되는, 방법.
- 청구항 286-290에 있어서, 이때 상기 제제와의 접촉에 의한 상기 응축물과 연합된 RNA 신장 또는 스플라이싱 활성에서의 변화가 평가되는, 방법.
- DNA, RNA 그리고 단백질중 하나, 둘, 또는 세 가지 모두를 포함하는 단리된 합성 응축물.
- 청구항 292에 있어서, 이때 상기 응축물은 OCT4, p53, MYC, GCN4, Mediator, 매개체 성분, MED1, MED15, p300, BRD4, NANOG, MyoD, KLF4, SOX 패밀리 전사 인자, GATA 패밀리 전사 인자, 핵 수용체, 핵 수용체 리간드, 융합 종양형성적 전사 인자, TFIID, 신호전달 인자, 메틸-DNA 결합 단백질, 스플라이싱 인자, 유전자 침묵화 인자, RNA 중합효소, β-카테닌, STAT3, SMAD3, NF-KB, MECP2, MBD1, MBD2, MBD3, MBD4, HP1α, TBL1R, HDAC3, SMRT, RNA 중합효소 II, SRSF2, SRRM1, SRSF1, 또는 본질적으로 무질서화된 영역 (IDR)을 포함하는 이의 단편을 포함하는, 단리된 합성 응축물.
- 청구항 292 또는 293의 단리된 합성 응축물을 포함하는 액체 소적.
- 응축물 성분 및 유도성 올리고머화를 부여하는 도메인을 포함하는 융합 단백질.
- 청구항 295에 있어서, 이때 상기 융합 단백질은 탐지가능한 테그를 더 포함하는, 융합 단백질.
- 청구항 296에 있어서, 이때 상기 탐지가능한 테그는 형광 테그인, 융합 단백질.
- 세포 안에 한 가지 또는 그 이상의 유전자 전사를 조정하는 방법에 있어서, 이 방법은 한 가지 또는 그 이상의 유전자들과 연합된 응축물의 구성, 유지, 해체 및/또는 규제의 조정을 포함하며, 이때 상기 응축물은 에스트로겐 수용체 (ER) 또는 이의 단편, 그리고 MED1 또는 이의 단편을 응축물 성분으로 포함하는, 방법.
- 청구항 298에 있어서, 이때 상기 에스트로겐 수용체는 돌연변이체 에스트로겐 수용체인, 방법.
- 청구항 299에 있어서, 이때 상기 돌연변이체 에스트로겐 수용체는 에스트로겐 결합에 의존적이지 않은 구성적 활성을 갖는, 방법.
- 청구항 298-300에 있어서, 이때 상기 에스트로겐 수용체 단편은 리간드 결합 도메인 또는 이의 기능적 단편을 포함하는, 방법.
- 청구항 298-301에 있어서, 이때 상기 MED1 단편은 IDR, LXXLL 모티프, 또는 이 둘 모두를 포함하는, 방법.
- 청구항 298-302에 있어서, 이때 상기 응축물은 에스트로겐 또는 이의 기능적 단편과 접촉되는, 방법.
- 청구항 298-303에 있어서, 이때 상기 응축물은 선택적 에스트로겐 선택적 조절자 (SERM)와 접촉되는, 방법.
- 청구항 304에 있어서, 이때 상기 SERM은 탐옥시펜 또는 이의 활성 대사산물인, 방법.
- 청구항 298-305에 있어서, 이때 상기 응축물의 조정으로 MYC 종양유전자의 전사가 축소되거나 또는 제거되는, 방법.
- 청구항 298-306에 있어서, 이때 상기 세포는 유방암 세포인, 방법.
- 청구항 298-307에 있어서, 이때 상기 세포는 MED1을 과다-발현시키는, 방법.
- 청구항 298-308에 있어서, 이때 상기 전사 응축물은 당해 전사 응축물에 제제를 접촉시킴으로써, 조절되는, 방법.
- 청구항 309에 있어서, 이때 상기 제제는 ER과 MED1 간의 상호작용을 축소 또는 제거하는, 방법.
- 청구항 309-310에 있어서, 이때 상기 제제는 ER과 에스트로겐 간의 상호작용을 축소 또는 제거하는, 방법.
- 청구항 309-311에 있어서, 이때 상기 응축물은 돌연변이체 ER 또는 이의 단편을 포함하며, 당해 제제는 상기 한 가지 또는 그 이상의 유전자의 전사를 축소 또는 제거하는, 방법.
- 응축물의 형성, 안정성, 또는 형태를 조정하는 제제를 식별해내는 방법에 있어서, 다음을 포함하는 방법:
a. 세포를 제공하고,
b. 당해 세포에 테스트 제제를 접촉시키고, 그리고
c. 당해 테스트 제제와의 접촉으로 상기 응축물의 형성, 안정성, 또는 형태가 조절되는 지를 결정하고,
이때 상기 응축물은 응축물 성분으로써 에스트로겐 수용체 (ER) 또는 이의 단편, 그리고 MED1 또는 이의 단편을 포함한다. - 청구항 313에 있어서, 이때 상기 에스트로겐 수용체는 돌연변이체 에스트로겐 수용체인, 방법.
- 청구항 314에 있어서, 이때 상기 돌연변이체 에스트로겐 수용체는 에스트로겐 결합에 의존적이지 않은 구성적 활성을 갖는, 방법.
- 청구항 313-315에 있어서, 이때 상기 에스트로겐 수용체 단편은 리간드 결합 도메인 또는 이의 기능적 단편을 포함하는, 방법.
- 청구항 313-316에 있어서, 이때 상기 MED1 단편은 IDR, LXXLL 모티프, 또는 이 둘 모두를 포함하는, 방법.
- 청구항 313-317에 있어서, 이때 상기 응축물은 에스트로겐 또는 이의 기능적 단편과 접촉되는, 방법.
- 청구항 313-318에 있어서, 이때 상기 응축물은 선택적 에스트로겐 선택적 (SERM)와 접촉되는, 방법.
- 청구항 319에 있어서, 이때 상기 SERM은 탐옥시펜 또는 이의 활성 대사산물인, 방법.
- 청구항 313-320에 있어서, 이때 상기 응축물의 조정으로 MYC 종양유전자의 전사가 축소되거나 또는 제거되는, 방법.
- 청구항 313-321에 있어서, 이때 상기 세포는 유방암 세포인, 방법.
- 청구항 313-322에 있어서, 이때 상기 세포는 MED1을 과다-발현시키는, 방법.
- 청구항 313-323에 있어서, 이때 상기 세포는 ER+ 유방암 세포인, 방법.
- 청구항 313-324에 있어서, 이때 상기 ER+ 유방암 세포는 탐옥시펜 치료에 저항적인, 방법.
- 청구항 313-325에 있어서, 이때 상기 응축물은 탐지가능한 라벨을 포함하는, 방법.
- 청구항 326에 있어서, 이때 상기 응축물의 성분은 탐지가능한 라벨을 포함하는, 방법.
- 청구항 327에 있어서, 이때 상기 ER 또는 이의 단편, 및/또는 상기 MED1 또는 이의 단편은 탐지가능한 라벨을 포함하는, 방법.
- 청구항 313-328에 있어서, 이때 상기 한 가지 또는 그 이상의 유전자는 리포터 유전자를 포함하는, 방법.
- 응축물의 형성, 안정성, 또는 형태를 조정하는 제제를 식별해내는 방법에 있어서, 다음을 포함하는 방법:
a. 시험관내 응축물을 제공하고,
b. 상기 응축물에 테스트 제제를 접촉시키고, 그리고
c. 당해 테스트 제제와의 접촉으로 상기 응축물의 형성, 안정성, 또는 형태가 조절되는 지를 결정하고,
이때 상기 응축물은 응축물 성분으로써 에스트로겐 수용체 (ER) 또는 이의 단편, 그리고 MED1 또는 이의 단편을 포함한다. - 청구항 330에 있어서, 이때 상기 에스트로겐 수용체는 돌연변이체 에스트로겐 수용체인, 방법.
- 청구항 331에 있어서, 이때 상기 돌연변이체 에스트로겐 수용체는 에스트로겐 결합에 의존적이지 않은 구성적 활성을 갖는, 방법.
- 청구항 330-332에 있어서, 이때 상기 에스트로겐 수용체 단편은 리간드 결합 도메인 또는 이의 기능적 단편을 포함하는, 방법.
- 청구항 330-333에 있어서, 이때 상기 MED1 단편은 IDR, LXXLL 모티프, 또는 이 둘 모두를 포함하는, 방법.
- 청구항 330-334에 있어서, 이때 상기 응축물은 에스트로겐 또는 이의 기능적 단편과 접촉되는, 방법.
- 청구항 330-334에 있어서, 이때 상기 응축물은 선택적 에스트로겐 선택적 (SERM)와 접촉되는, 방법.
- 청구항 336에 있어서, 이때 상기 SERM은 4-히드록시탐옥시펜 및/또는 N-데스메틸-4-히드록시탐옥시펜인, 방법.
- 청구항 330-337에 있어서, 이때 상기 응축물은 세포로부터 단리된, 방법.
- 청구항 338에 있어서, 이때 상기 세포는 유방암 세포인, 방법.
- 청구항 330-339에 있어서, 이때 상기 세포 MED1을 과다-발현시키는, 방법.
- 청구항 330-340에 있어서, 이때 상기 세포는 ER+ 유방암 세포인, 방법.
- 청구항 341에 있어서, 이때 상기 ER+ 유방암 세포는 탐옥시펜 치료에 저항적인, 방법.
- 청구항 330-342에 있어서, 이때 상기 응축물은 탐지가능한 라벨을 포함하는, 방법.
- 청구항 343에 있어서, 이때 상기 응축물의 성분은 탐지가능한 라벨을 포함하는, 방법.
- 청구항 344에 있어서, 이때 상기 ER 또는 이의 단편, 및/또는 상기 MED1 또는 이의 단편은 탐지가능한 라벨을 포함하는, 방법.
- 응축물 성분으로써 에스트로겐 수용체 (ER) 또는 이의 단편, 그리고 MED1 또는 이의 단편을 포함하는 단리된 합성 전사 응축물.
- 청구항 346에 있어서, 이때 상기 에스트로겐 수용체는 돌연변이체 에스트로겐 수용체인, 단리된 합성 전사 응축물.
- 청구항 347에 있어서, 이때 상기 돌연변이체 에스트로겐 수용체는 에스트로겐 결합에 의존적이지 않은 구성적 활성을 갖는, 단리된 합성 전사 응축물.
- 청구항 346-348에 있어서, 이때 상기 에스트로겐 수용체 단편은 리간드 결합 도메인 또는 이의 기능적 단편을 포함하는, 단리된 합성 전사 응축물.
- 청구항 346-349에 있어서, 이때 상기 MED1 단편은 IDR, LXXLL 모티프, 또는 이 둘 모두를 포함하는, 단리된 합성 전사 응축물.
- 청구항 346-350에 있어서, 이때 상기 응축물은 에스트로겐 또는 이의 기능적 단편을 포함하는, 단리된 합성 전사 응축물.
- 청구항 346-351에 있어서, 이때 상기 응축물은 선택적 에스트로겐 선택적 조절자 (SERM)을 포함하는, 단리된 합성 전사 응축물.
Applications Claiming Priority (13)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201862647613P | 2018-03-23 | 2018-03-23 | |
| US62/647,613 | 2018-03-23 | ||
| US201862648377P | 2018-03-26 | 2018-03-26 | |
| US62/648,377 | 2018-03-26 | ||
| US201862722825P | 2018-08-24 | 2018-08-24 | |
| US62/722,825 | 2018-08-24 | ||
| US201862752332P | 2018-10-29 | 2018-10-29 | |
| US62/752,332 | 2018-10-29 | ||
| US201962819662P | 2019-03-17 | 2019-03-17 | |
| US62/819,662 | 2019-03-17 | ||
| US201962820237P | 2019-03-18 | 2019-03-18 | |
| US62/820,237 | 2019-03-18 | ||
| PCT/US2019/023694 WO2019183552A2 (en) | 2018-03-23 | 2019-03-22 | Methods and assays for modulating gene transcription by modulating condensates |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20210070233A true KR20210070233A (ko) | 2021-06-14 |
Family
ID=67987575
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020207029166A KR20210070233A (ko) | 2018-03-23 | 2019-03-22 | 응축물을 조절하여 유전자 전사를 조절하기 위한 방법 및 분석 |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20220120736A1 (ko) |
| EP (1) | EP3768329A4 (ko) |
| JP (2) | JP2021535737A (ko) |
| KR (1) | KR20210070233A (ko) |
| CN (1) | CN113164622A (ko) |
| AU (1) | AU2019239084A1 (ko) |
| CA (1) | CA3094974A1 (ko) |
| IL (1) | IL277533A (ko) |
| SG (1) | SG11202009359WA (ko) |
| TW (1) | TW202003051A (ko) |
| WO (1) | WO2019183552A2 (ko) |
Families Citing this family (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP3921650A1 (en) | 2019-02-08 | 2021-12-15 | Dewpoint Therapeutics, Inc. | Methods of characterizing condensate-associated characteristics of compounds and uses thereof |
| AU2020274530A1 (en) * | 2019-05-15 | 2021-12-16 | Whitehead Institute For Biomedical Research | Methods of characterizing and utilizing agent-condensate interactions |
| KR20220084047A (ko) | 2019-09-18 | 2022-06-21 | 듀포인트 테라퓨틱스, 인크. | 응축물 관련 특이성에 대한 스크리닝 방법 및 이의 용도 |
| US20230061804A1 (en) * | 2020-01-23 | 2023-03-02 | The Rockefeller University | Phase separation sensors and uses thereof |
| CN111269976A (zh) * | 2020-02-03 | 2020-06-12 | 清华大学 | 检测MeCP2突变的物质在检测MeCP2突变是否为致病突变以及筛选药物中的应用 |
| CN111487399B (zh) * | 2020-03-26 | 2021-09-17 | 湖南师范大学 | 一种蛋白分子标记在鱼类生殖细胞发育研究中的应用 |
| CN111471713A (zh) * | 2020-04-23 | 2020-07-31 | 北京大学 | 基于可控相分离液滴控制细胞内mRNA定位和翻译过程的方法 |
| WO2021258075A2 (en) * | 2020-06-18 | 2021-12-23 | Whitehead Institute For Biomedical Research | Viral condensates and methods of use thereof |
| WO2022115539A2 (en) * | 2020-11-25 | 2022-06-02 | Whitehead Institute For Biomedical Research | Modulating transcriptional condensates |
| WO2022171163A1 (en) * | 2021-02-10 | 2022-08-18 | Etern Biopharma (Shanghai) Co., Ltd. | Methods of modulating androgen receptor condensates |
| AU2022229784A1 (en) * | 2021-03-02 | 2023-09-14 | Dewpoint Therapeutics, Inc. | Methods of identifying a condensate phenotype and uses thereof |
| WO2022187202A1 (en) * | 2021-03-02 | 2022-09-09 | Dewpoint Therapeutics, Inc. | New condensate paradigms |
| US20240167030A1 (en) * | 2021-04-02 | 2024-05-23 | Case Western Reserve University | Methods and compositions for accelerating oligodendrocyte maturation |
| CN113254499B (zh) * | 2021-05-21 | 2023-09-29 | 国家卫星气象中心(国家空间天气监测预警中心) | 基于长序列历史资料再定标的气候数据集生产方法 |
| WO2023014989A1 (en) * | 2021-08-05 | 2023-02-09 | Whitehead Institute For Biomedical Research | Methods and agents for decreasing insulin resistance |
| WO2024001989A1 (en) * | 2022-06-27 | 2024-01-04 | Etern Biopharma (Shanghai) Co., Ltd. | Compositions and methods for modulating molecules |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002038734A2 (en) * | 2000-11-13 | 2002-05-16 | Cistem Molecular Corporation | Methods for determining the biological effects of compounds on gene expression |
| WO2006063356A1 (en) * | 2004-12-10 | 2006-06-15 | Isis Phamaceuticals, Inc. | Regulation of epigenetic control of gene expression |
| WO2016054106A1 (en) * | 2014-09-29 | 2016-04-07 | The Regents Of The University Of California | SCAFFOLD RNAs |
| US20190194150A1 (en) * | 2016-07-01 | 2019-06-27 | Arrakis Therapeutics, Inc. | Compounds and methods for modulating rna function |
-
2019
- 2019-03-22 KR KR1020207029166A patent/KR20210070233A/ko not_active Application Discontinuation
- 2019-03-22 WO PCT/US2019/023694 patent/WO2019183552A2/en unknown
- 2019-03-22 SG SG11202009359WA patent/SG11202009359WA/en unknown
- 2019-03-22 JP JP2021500505A patent/JP2021535737A/ja active Pending
- 2019-03-22 CA CA3094974A patent/CA3094974A1/en active Pending
- 2019-03-22 US US17/040,967 patent/US20220120736A1/en active Pending
- 2019-03-22 AU AU2019239084A patent/AU2019239084A1/en active Pending
- 2019-03-22 CN CN201980034629.9A patent/CN113164622A/zh active Pending
- 2019-03-22 EP EP19772171.5A patent/EP3768329A4/en active Pending
- 2019-03-22 TW TW108110178A patent/TW202003051A/zh unknown
-
2020
- 2020-09-23 IL IL277533A patent/IL277533A/en unknown
-
2024
- 2024-01-11 JP JP2024002727A patent/JP2024029228A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN113164622A (zh) | 2021-07-23 |
| TW202003051A (zh) | 2020-01-16 |
| EP3768329A4 (en) | 2022-01-05 |
| US20220120736A1 (en) | 2022-04-21 |
| WO2019183552A3 (en) | 2019-10-31 |
| JP2024029228A (ja) | 2024-03-05 |
| CA3094974A1 (en) | 2019-09-26 |
| EP3768329A2 (en) | 2021-01-27 |
| AU2019239084A1 (en) | 2020-11-05 |
| WO2019183552A2 (en) | 2019-09-26 |
| IL277533A (en) | 2020-11-30 |
| JP2021535737A (ja) | 2021-12-23 |
| SG11202009359WA (en) | 2020-10-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR20210070233A (ko) | 응축물을 조절하여 유전자 전사를 조절하기 위한 방법 및 분석 | |
| Zhang et al. | A peptide encoded by circular form of LINC-PINT suppresses oncogenic transcriptional elongation in glioblastoma | |
| Yang et al. | Determination of a comprehensive alternative splicing regulatory network and combinatorial regulation by key factors during the epithelial-to-mesenchymal transition | |
| Yi et al. | A PRC2-independent function for EZH2 in regulating rRNA 2′-O methylation and IRES-dependent translation | |
| Li et al. | Excess PLAC8 promotes an unconventional ERK2-dependent EMT in colon cancer | |
| Bonasio et al. | Interactions with RNA direct the Polycomb group protein SCML2 to chromatin where it represses target genes | |
| Wang et al. | Mutual dependency between lncRNA LETN and protein NPM1 in controlling the nucleolar structure and functions sustaining cell proliferation | |
| KR20220027845A (ko) | 제제-축합물 상호작용을 특성화하고 이용하는 방법 | |
| Jin et al. | MEN1 is a regulator of alternative splicing and prevents R-loop-induced genome instability through suppression of RNA polymerase II elongation | |
| Cui et al. | Cooperation between IRTKS and deubiquitinase OTUD4 enhances the SETDB1-mediated H3K9 trimethylation that promotes tumor metastasis via suppressing E-cadherin expression | |
| Biancon et al. | Multi-omics profiling of U2AF1 mutants dissects pathogenic mechanisms affecting RNA granules in myeloid malignancies | |
| Wu | RNA and Cancer | |
| Hysenaj | Investigating the regulation of alternative splicing by Tra2 proteins and RBMX in triple negative breast cancer cells | |
| Nachar | Decreased replication potency and extended S phase, due to shortened G1 and replication origin under-licensing, are a common feature of cancer cells | |
| Ozenberger | Mouse Modeling and Epigenomic Profiling of Clear Cell Sarcoma | |
| Yuan | G-quadruplexes in Gene Regulation and Telomere Maintenance | |
| Röschert | Aurora-A prevents transcription-replication conflicts in MYCN-amplified neuroblastoma | |
| Corujo Garcia | The role of the histone variant macroH2A in the regulation of chromatin architecture | |
| Agupitan | Exploring the effects of symmetric arginine methylation readers on E2F1-dependent transcriptional output in vitro | |
| Siachisumo | Identification of RNA binding and processing targets of RBMX protein and their role in maintaining genome stability | |
| de Vivo Diaz | New Mechanisms that Control FACT Histone Chaperone and Transcription-Mediated Genome Stability | |
| Deraze | Epigenetic control of ribosome biogenesis homeostasis | |
| Chan et al. | Transcriptional elongation machinery controls vulnerability of breast cancer cells to PRC2 inhibitors | |
| Martin | Translation Control Tunes Drosophila Oogenesis | |
| Kupp | Molecular Mechanisms of C11orf95 translocations in cancer. |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| E902 | Notification of reason for refusal |