JP2024029228A - 凝縮体を調節することによって遺伝子の転写を調節するための方法及びアッセイ - Google Patents

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Abstract

【課題】凝縮体を調節することによって遺伝子の転写を調節するための方法及びアッセイを提供すること。【解決手段】１つ以上の遺伝子の転写を調節する方法であって、前記方法が、前記１つ以上の遺伝子と結び付く凝縮体の形成、組成、維持、崩壊、活性、及び／または制御を調節することを含み、前記凝縮体が、転写凝縮体、ヘテロクロマチン凝縮体、またはｍＲＮＡ開始複合体もしくはｍＲＮＡ伸長複合体と物理的に結び付く凝縮体である、前記方法。【選択図】なし

Description

関連出願
本出願は、２０１８年３月２３日出願の米国仮出願第６２／６４７，６１３号、２０１８年３月２６日出願の米国仮出願第６２／６４８，３７７号、２０１８年８月２４日出願の米国仮出願第６２／７２２，８２５号、２０１８年１０月２９日出願の米国仮出願第６２／７５２，３３２号、２０１９年３月１７日出願の米国仮出願第６２／８１９，６６２号、及び２０１９年３月１８日出願の米国仮出願第６２／８２０，２３７号の利益を主張し、これらすべての文献の内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
政府の支援
本発明は、米国国立衛生研究所によって交付された補助金第ＨＧ００２６６８号、同第ＣＡ０４２０６３号、同第Ｔ３２ＣＡ００９１７２号、同第ＧＭ１１７３７０号、同第ＧＭ００８７５９号、及び同第ＧＭ１２３５１１号、ならびに米国国立科学財団によって交付された補助金第１７４３９００号の下で政府の支援を受けてなされたものである。政府は、本発明に一定の権利を有する。
本発明は、凝縮体を調節することによって遺伝子の転写を調節するための方法及びアッセイに関する。
遺伝子発現の制御には、転写装置が特定のゲノム部位に効率的に動員されることが必要である。この特異性は、近位エンハンサーエレメント及び近位プロモーターエレメントに位置する特定のＤＮＡ配列をＤＮＡ結合転写因子（ＴＦ）が占有し、こうした部位に転写装置を動員することによって維持される。ＴＦは、典型的には、１つ以上のＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）と、１つ以上の別の活性化ドメイン（ＡＤ）と、からなる。ＴＦのＤＢＤの構造及び機能についての報告は多い一方で、ＡＤの構造、及びＡＤがコアクチベーターとどのように相互作用して遺伝子発現を誘導するかについては比較的不明な点が多い。
ＴＦのＤＢＤの構造、ならびにＴＦのＤＢＤと関連ＤＮＡ配列との間の相互作用は、多くのＴＦについて原子分解能で報告されており、ＴＦは、一般に、そのＤＢＤの構造的特徴によって分類される。例えば、ＤＢＤは、亜鉛が配位した塩基性ヘリックスループヘリックス、塩基性ロイシンジッパー、またはヘリックスターンヘリックスというＤＮＡ結合構造から構成され得る。こうしたＤＢＤは、およそ４～１２ｂｐの範囲の特定のＤＮＡ配列に選択的に結合し、こうしたＤＮＡ結合配列は、数百のＴＦに好適なものであることが報告されている。典型的には、任意の１つの近位エンハンサーエレメントまたは近位プロモーターエレメントに対して複数の異なるＴＦ分子が一緒に結合する。例えば、ＩＦＮ－βエンハンサーの５０ｂｐのコアコンポーネントには、少なくとも８つの異なるＴＦ分子が結合する（Ｐａｎｎｅ ｅｔ ａｌ．，２００７）。
ＡＤは、ＤＢＤによって適切な位置に固定されるとコアクチベーターと相互作用し、これらのコアクチベーターは、複数のＴＦに由来するシグナルを統合して転写量を制御する。ＤＢＤが構造化されていることとは対照的に、ほとんどのＴＦのＡＤが有するアミノ酸配は複雑性が低く、結晶構造解析に適さない。それ故に、こうした天然変性領域または天然変性ドメイン（ＩＤＲ）は、そのアミノ酸プロファイルによって、酸性、プロリン高含有、セリン／スレオニン高含有、もしくはグルタミン高含有として分類されているか、またはその仮説形状によって酸性ブロッブ（ａｃｉｄ ｂｌｏｂ）、ネガティブヌードル（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｎｏｏｄｌｅ）、もしくはペプチドの投げ縄（ｐｅｐｔｉｄｅ ｌａｓｓｏ）として分類されている（Ｈａｈｎ ａｎｄ Ｙｏｕｎｇ，２０１１、Ｍｉｔｃｈｅｌｌ ａｎｄ Ｔｊｉａｎ，１９８９、Ｒｏｂｅｒｔｓ，２０００、Ｓｉｇｌｅｒ，１９８８、Ｓｔａｂｙ ｅｔ ａｌ．，２０１７、Ｔｒｉｅｚｅｎｂｅｒｇ，１９９５）。注目すべきことに、数百のＴＦが、同じ少数のコアクチベーター複合体（とりわけ、メディエーター及びｐ３００を含むもの）と相互作用すると考えられている。配列相同性をほとんど共有しないＡＤが、ＴＦ間で機能的互換性を有しており、この互換性を、タンパク質間相互作用のモデルである従来の鍵と鍵穴モデルによって説明することは容易ではない。それ故に、数百の異なるＴＦの多様な活性化ドメインが、同様の少数のコアクチベーターとどのように相互作用するのかということは、答えを得ることが難しい問題として残ったままである。
エンハンサーは、転写因子と、細胞型特異的遺伝子の発現を制御する機能を有する転写装置の他のコンポーネントと、が結合する遺伝子制御エレメントである。スーパーエンハンサー（ＳＥ）は、転写装置が例外的に高密度に占有するエンハンサーのクラスターであり、細胞独自性において特に重要な役割を有する遺伝子を制御する。
発生の制御においては転写因子及びシグナル伝達因子が本質的に重要な役割を担うことがショウジョウバエの先駆的な遺伝学的研究によって示された。その後に多くの研究が行われていることで、各細胞の独自性を規定する遺伝子発現プログラムが、系譜及び細胞型に特異的なマスターＴＦ（細胞型特異的エンハンサーを確立する）及びシグナル伝達因子（こうしたエンハンサーに細胞外情報を伝える）によって制御されることが理解されてきている。
分化転換及び初期化の実験の結果は、少数のマスターＴＦが細胞型特異的な遺伝子発現の制御を支配することを立証するものである。各細胞型においては数百のＴＦが発現するものの、新たな独自性を細胞に獲得させる上で必要になるのは一握りのＴＦにすぎない。このことは、細胞を筋様細胞に分化転換させる能力をＴＦ ＭｙｏＤが有すること（Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，ｅｔ ａｌ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６，５４３４－５４３８）、ならびに線維芽細胞を人工多能性幹細胞に初期化する能力をＴＦ Ｏｃｔ４、ＴＦ Ｎａｎｏｇ、ＴＦ Ｋｌｆ４、及びＴＦ Ｍｙｃが有すること（Ｔａｋａｈａｓｈｉ，ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｃｅｌｌ １２６，６６３－６７６）によって実証された。こうしたマスターＴＦは、細胞独自性において顕著な役割を有する遺伝子の位置にエンハンサーを確立し、多くの場合、スーパーエンハンサーと呼ばれるエンハンサーのクラスターを確立することによって遺伝子発現プログラムの制御を支配する。
細胞は、その独自性を維持し、細胞外環境に応答する上でシグナル伝達経路に依存している。哺乳類の発生プロセスの制御において顕著な役割を担うシグナル伝達経路には、ＷＮＴ経路、ＴＧＦ－β経路、及びＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路が含まれる。こうした経路のそれぞれにおいて、特定の受容体によって細胞外リガンドが認識され、この受容体が、他のタンパク質を介して一連のシグナル伝達因子にシグナルを伝達し、こうしたシグナル伝達因子が核に入り、ゲノム中のシグナル応答エレメントに結合する。所与の細胞型では、こうしたシグナル伝達因子は、多数の推定シグナル応答エレメントのごく一部に結合し（その細胞型の活性エンハンサーに生じるものに優先的に結合する）、それによって、幅広いスペクトルの細胞型に発現するシグナル伝達因子に対して細胞型特異的な応答を生じさせることが可能になる。
ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ＰｏｌＩＩ）によるｐｒｅ－ｍＲＮＡの合成では、転写開始複合体の形成及び伸長複合体への移行が生じる。ＰｏｌＩＩの大サブユニットは、天然変性Ｃ末端ドメイン（ＣＴＤ）を含んでおり、このＣＴＤは、開始から伸長へと移行する間にサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）によってリン酸化され、それによって、ＣＴＤと転写開始複合体の異なるコンポーネントまたはＲＮＡスプライシング装置との間の相互作用に影響を及ぼす。最近の知見からは、このモデルから得られるＣＴＤリン酸化の作用像が、その全体像のごく一部でしかないことが示唆されている。
クロマチンは、一般に、ユークロマチン（凝縮度が低く、遺伝子含量が高い）及びヘテロクロマチン（凝縮度が高く、遺伝子含量が低い）というカテゴリーに分類される。構成的ヘテロクロマチンは、反復エレメント（サテライトＤＮＡ及びトランスポゾンなど）の位置に構築される。ヘテロクロマチンは、反復エレメント間の組換えの抑制、活性トランスポゾンの転写の制限、セントロメアＤＮＡの構造化、及び発生系譜にまたがる遺伝子発現の抑制において重要な役割を担う。
Ｔａｋａｈａｓｈｉ，ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｃｅｌｌ １２６，６６３－６７６
ＴＦ及びシグナル伝達因子の多様性と関連する遺伝子発現制御機構、ならびにヘテロクロマチンに対する遺伝子発現制御機構、ならびにｍＲＮＡの開始及び伸長の間の遺伝子発現制御機構を解明するには、さらなる研究が必要である。
さまざまなコンポーネントを有する凝縮体の存在及び有用性が、本明細書に記載の研究によって同定されており、こうした凝縮体には、天然起源の凝縮体も合成凝縮体または人工凝縮体も含まれる。本明細書には、凝縮体及びそのコンポーネント、凝縮体の構造及び機能を調節する薬剤を同定する方法、ならびに治療作用を得るために凝縮体機能／活性を調節する方法、ならびに他の関連する組成物及び方法が記載される。
一般に、本開示は、転写凝縮体、ヘテロクロマチン凝縮体、及びｍＲＮＡ開始複合体またはｍＲＮＡ伸長複合体と物理的に結び付く凝縮体、の調節、形成、及び使用に関する。本開示は、核内受容体、シグナル伝達因子、及びメチルＤＮＡ結合因子が凝縮体と相互作用し、それを修飾するという発見にも関する。以下の説明から明らかであろうが、凝縮体を調節することができ、こうした調節は、例えば、凝縮体のコンポーネントの型、量、もしくは属性を変えることによって行われるか、または薬剤を用いて行われる。スクリーニング方法に凝縮体を使用することで、治療剤の発見に有用であり、細胞内遺伝子発現制御をより正確に反映し得るツールが得られる。
転写凝縮体は、転写部位に生じる相分離多分子集合体であり、転写因子、補助因子、クロマチン制御因子、ＤＮＡ、非コードＲＮＡ、新生ＲＮＡ、及びＲＮＡポリメラーゼＩＩを含み得る複数のコンポーネントの高密度協同的集合体である（図１）。いくつかの実例では、転写凝縮体は、スーパーエンハンサー集合体によって形成される。多くの疾患は、こうした核酸コンポーネント及びタンパク質コンポーネントが変化することによって生じるか、またはこうした変化と結び付いており、凝縮体による転写量を変えることが治療的介入となり得る。本明細書で使用される「ヘテロクロマチン凝縮体」は、ヘテロクロマチンと物理的に結び付く（例えば、ヘテロクロマチン上に生じる）相分離多分子集合体である。本開示の態様のいくつかでは、ｍＲＮＡ開始複合体またはｍＲＮＡ伸長複合体と物理的に結び付く凝縮体について記載される。本明細書で使用されるこうした凝縮体（すなわち、ｍＲＮＡ開始複合体またはｍＲＮＡ伸長複合体と物理的に結び付く凝縮体）は、関連複合体に生じる相分離多分子集合体である。いくつかの実施形態では、伸長複合体と物理的に結び付く凝縮体は、スプライシング因子を含む。本明細書で使用される合成転写凝縮体は、転写凝縮体コンポーネントを含む非天然起源の凝縮体を指す。
本明細書に記載の結果は、転写因子がメディエーターと相互作用し、当該転写因子の活性化ドメインがこのコアクチベーターと共に相分離凝縮体を形成する能力によって遺伝子を活性化するというモデルを部分的に支持するものである。自己免疫、がん、及び神経変性を含めて、多くの疾患では、コアクチベーターと共に相分離凝縮体が形成されるこのプロセスが乱れている。例えば、悪性転化は、とりわけ、細胞の生存経路もしくは増殖経路を不適切に活性化する融合発がん性転写因子が生成されるプロセス、正常組織には発現しない転写因子が不適切に生じるプロセス、またはエンハンサー領域が変異することによってそれまではサイレントであったがん遺伝子に転写因子が動員されるプロセス、によって生じ得る。こうした活性化ドメインまたは凝縮体の他のコンポーネントの機能が乱れると、転写因子の活性を妨げる機構が生じる。
本明細書には、とりわけ、凝縮体が関与し得る疾患、ならびに転写凝縮体の形成、組成、維持、崩壊、及び制御を増進または低減することによって転写を調節するためのアッセイ及び方法が記載される。いくつかの態様では、転写凝縮体は、関連リガンドの非存在下で転写を活性化する核内受容体（例えば、核内ホルモン受容体または変異核内ホルモン受容体）を含む。いくつかの態様では、凝縮体（例えば、転写凝縮体、ヘテロクロマチン凝縮体、及び／またはｍＲＮＡ開始複合体もしくはｍＲＮＡ伸長複合体と物理的に結び付く凝縮体）は、シグナル伝達因子、メチルＤＮＡ結合タンパク質（例えば、メチルＣｐＧ結合タンパク質）、遺伝子サイレンシング因子（例えば、リプレッサー、抑制性ヘテロクロマチン因子）、ＲＮＡポリメラーゼ（例えば、ＰｏｌＩＩ、リン酸化されたＰｏｌＩＩ、脱リン酸化されたＰｏｌＩＩ）、またはスプライシング因子を含む。本開示の態様のいくつかは、凝縮体の形成、組成、維持、崩壊、活性、または制御を調節する薬剤を投与することによる疾患及び状態の治療に関する。本明細書に記載の方法の実施形態のいくつかでは、投与される薬剤は、標的疾患の治療に有用であることが知られていないものである。
本開示の態様のいくつかは、１つ以上の遺伝子（例えば、細胞における１つ以上の遺伝子）の転写を調節する方法を対象とし、この方法は、１つ以上の遺伝子と結び付く凝縮体（例えば、転写凝縮体）の形成、組成、維持、崩壊、活性、及び／または制御を調節することを含む。いくつかの実施形態では、凝縮体（例えば、転写凝縮体）は、凝縮体と結び付くコンポーネントの結合価を増加または減少させることによって調節される。
本明細書で使用される「凝縮体と結び付くコンポーネント」という語句または同様のもの、及び「凝縮体コンポーネント」という語句または同様のものは、凝縮体の一部であるか、または凝縮体（例えば、転写凝縮体）の一部となる能力を有するペプチド、タンパク質、核酸、シグナル伝達分子、脂質、または同様のものを指す。いくつかの実施形態では、コンポーネントは、凝縮体内に存在する。いくつかの実施形態では、コンポーネントは、凝縮体の表面上に存在する。いくつかの実施形態では、コンポーネントは、凝縮体の形成または安定性に必要である。いくつかの実施形態では、コンポーネントは、凝縮体の形成または安定性に不必要である。いくつかの実施形態では、コンポーネントは、タンパク質またはペプチドであり、天然変性ドメイン（例えば、転写因子の活性化ドメインのＩＤＲ、転写因子の活性化ドメインのＩＤＲと相互作用するＩＤＲ、シグナル伝達因子のＩＤＲ、メチルＤＮＡ結合タンパク質のＩＤＲ、遺伝子サイレンシング因子のＩＤＲ、ポリメラーゼのＩＤＲ、スプライシング因子のＩＤＲ）を１つ以上含む。いくつかの実施形態では、コンポーネントは、凝縮体の非構造メンバー（例えば、凝縮体の完全性に不必要なもの）であり、クライアントコンポーネントと称されることもある。いくつかの実施形態では、凝縮体は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個、またはそれを超える数のコンポーネントを含むか、当該コンポーネントからなるか、または当該コンポーネントから本質的になる。いくつかの実施形態では、凝縮体（例えば、合成転写凝縮体（合成転写凝縮体は、本明細書では「人工凝縮体」と称されることもある））は、核酸を含まない。いくつかの実施形態では、凝縮体（例えば、合成転写凝縮体）は、ＲＮＡを含まない。いくつかの実施形態では、コンポーネントは、タンパク質または核酸の断片である。
いくつかの実施形態では、コンポーネントは、ＤＮＡ配列（例えば、エンハンサーＤＮＡ配列、メチル化ＤＮＡ配列、スーパーエンハンサーＤＮＡ配列、転写される遺伝子の３’末端、シグナル応答エレメント、ホルモン応答エレメント）、転写因子、遺伝子サイレンシング因子、スプライシング因子、伸長因子、開始因子、ヒストン（例えば、修飾ヒストン）、補助因子、ＲＮＡ（例えば、ｎｃＲＮＡ）、メディエーター、及びＲＮＡポリメラーゼ（例えば、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、補助因子は、ＬＸＸＬＬモチーフを含む。いくつかの実施形態では、補助因子は、ＬＸＸＬＬモチーフを含み、リガンド（例えば、関連リガンド、天然起源のリガンド、合成リガンド）への結合時にＴＦ（例えば、核内受容体、マスター転写因子）に対する結合価が増加する。ＬＸＸＬＬモチーフを有する補助因子は、当該技術分野で知られている。いくつかの実施形態では、コンポーネントは、ＩＤＲ及びＬＸＸＬＬモチーフを含む補助因子の断片である。いくつかの実施形態では、コンポーネントは、核内受容体リガンドではない。いくつかの実施形態では、コンポーネントは、脂質ではない。いくつかの実施形態では、コンポーネントは、タンパク質または核酸である。
いくつかの実施形態では、凝縮体は、凝縮体を、凝縮体のコンポーネントの天然変性ドメインの１つ以上と相互作用する薬剤と接触させることによって調節される。いくつかの実施形態では、薬剤と接触する凝縮体のコンポーネントは、シグナル伝達因子、メチルＤＮＡ結合タンパク質、遺伝子サイレンシング因子、ＲＮＡポリメラーゼ、スプライシング因子、ＢＲＤ４、メディエーター、メディエーターコンポーネント、ＭＥＤ１、ＭＥＤ１５、転写因子、ＲＮＡポリメラーゼ、または核内受容体リガンド（例えば、ホルモン）である。いくつかの実施形態では、コンポーネントは、表Ｓ１に記載のタンパク質である。
いくつかの実施形態では、薬剤と接触する凝縮体のコンポーネントは、ＴＣＦ７Ｌ２、ＴＣＦ７、ＴＣＦ７Ｌ１、ＬＥＦ１、ベータ－カテニン、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ２、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ４、ＳＴＡＴ５Ａ、ＳＴＡＴ５Ｂ、ＳＴＡＴ６、及びＮＦ－κＢからなる群から選択されるシグナル伝達因子である。いくつかの実施形態では、シグナル伝達因子は、１つ以上の天然変性ドメインを含む。いくつかの実施形態では、シグナル伝達因子は、凝縮体と結び付く１つ以上のシグナル応答エレメントまたはメディエーターに優先的に結合する。いくつかの実施形態では、凝縮体は、マスター転写因子を含む。
いくつかの実施形態では、薬剤と接触する凝縮体のコンポーネントは、メチル化ＤＮＡに優先的に結合するメチルＤＮＡ結合タンパク質である。いくつかの実施形態では、メチルＤＮＡ結合タンパク質は、ＭＥＣＰ２、ＭＢＤ１、ＭＢＤ２、ＭＢＤ３、またはＭＢＤ４である。いくつかの実施形態では、メチルＤＮＡ結合タンパク質は、遺伝子サイレンシングと結び付く。いくつかの実施形態では、コンポーネントは、ヘテロクロマチンと結び付くサプレッサーである。いくつかの実施形態では、メチルＤＮＡ結合タンパク質は、ＨＰ１α、ＴＢＥ１Ｒ（トランスデューシンベータ様タンパク質）、ＨＤＡＣ３（ヒストンデアセチラーゼ３）、またはＳＭＲＴ（レチノイン酸受容体及び甲状腺受容体のサイレンシングメディエーター）である。
いくつかの実施形態では、薬剤と接触する凝縮体のコンポーネントは、ｍＲＮＡの開始及び伸長と結び付くＲＮＡポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩまたはＲＮＡポリメラーゼＩＩ Ｃ末端領域である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ Ｃ末端領域は、天然変性領域（ＩＤＲ）を含む。いくつかの実施形態では、ＩＤＲは、リン酸化部位を含む。いくつかの実施形態では、コンポーネントは、ＳＲＳＦ２、ＳＲＲＭ１、またはＳＲＳＦ１から選択されるスプライシング因子である。
いくつかの実施形態では、薬剤と接触する凝縮体のコンポーネントは、転写因子である。いくつかの実施形態では、転写因子は、ＯＣＴ４、ｐ５３、ＭＹＣもしくはＧＣＮ４、ＮＡＮＯＧ、ＭｙｏＤ、ＫＬＦ４、ＳＯＸファミリーの転写因子、ＧＡＴＡファミリーの転写因子、または核内受容体（例えば、核内ホルモン受容体、エストロゲン受容体、レチノイン酸受容体－アルファ）である。本明細書に開示の方法の実施形態のいくつかでは、転写因子は、Ｌａｍｂｅｒｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ．２０１８ Ｆｅｂ ８；１７２（４）：６５０－６６５において同定されたヒト転写因子である。いくつかの実施形態では、核内受容体は、関連リガンドに結合すると転写を活性化する。いくつかの実施形態では、核内受容体は、関連リガンドの非存在下で転写を活性化する変異核内受容体であるか、または天然のリガンド（例えば、関連リガンド）の存在下での野生型核内受容体と比較して関連リガンドの非存在下での転写活性レベルが上昇（例えば、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、もしくはそれを超える倍数）した変異核内受容体である。いくつかの実施形態では、核内受容体は、関連リガンドの存在下で転写の程度が野生型核内受容体と比較して異なるように調節する変異核内転写因子である。いくつかの実施形態では、転写因子は、融合発がん性転写因子または表Ｓ３に開示の転写因子である。いくつかの実施形態では、融合発がん性転写因子は、ＭＬＬ再構成体、ＥＷＳ－ＦＬＩ、ＥＴＳ融合体、ＢＲＤ４－ＮＵＴ、及びＮＵＰ９８融合体から選択される。発がん性転写因子は、当該技術分野で同定された任意の発がん性転写因子であり得る。
いくつかの実施形態では、凝縮体のコンポーネントの天然変性ドメインの１つ以上と相互作用する薬剤は、ペプチド、核酸、もしくは小分子であるか、またはペプチド、核酸、もしくは小分子を含む。いくつかの実施形態では、薬剤は、酸性アミノ酸の含量が高められたペプチド（例えば、正味の負電荷を有するペプチド、グルタミン酸及び／またはアスパラギン酸の含量が高められたペプチド）を含む。いくつかの実施形態では、薬剤は、シグナル伝達因子模倣物である。いくつかの実施形態では、薬剤は、シグナル伝達因子アンタゴニストである。いくつかの実施形態では、薬剤は、低リン酸化されたＲＮＡポリメラーゼＩＩ Ｃ末端ドメイン（ＰｏｌＩＩ ＣＴＤ）またはその機能性断片を含む。いくつかの実施形態では、薬剤は、低リン酸化されたＰｏｌＩＩ ＣＴＤに優先的に結合する。いくつかの実施形態では、薬剤は、メチル化ＤＮＡに結合する。いくつかの実施形態では、薬剤は、メチルＤＮＡ結合タンパク質に結合する。
いくつかの実施形態では、薬剤との接触によって凝縮体が安定化または崩壊し、それによって１つ以上の遺伝子の転写が調節される。いくつかの実施形態では、凝縮体は、凝縮体のコンポーネント（例えば、凝縮体と結び付くコンポーネントで転写因子ではないもの）への、凝縮体と結び付く転写因子の結合を調節することによって調節される。いくつかの実施形態では、凝縮体のコンポーネントは、コアクチベーター、シグナル伝達因子、メチルＤＮＡ結合タンパク質、スプライシング因子、遺伝子サイレンシング因子、ＲＮＡポリメラーゼ、または補助因子である。いくつかの実施形態では、凝縮体のコンポーネントは、核内受容体リガンドまたはシグナル伝達因子である。いくつかの実施形態では、コアクチベーター、シグナル伝達因子、メチルＤＮＡ結合タンパク質、スプライシング因子、遺伝子サイレンシング因子、ＲＮＡポリメラーゼ、または補助因子は、メディエーター、メディエーターコンポーネント、ＭＥＤ１、ＭＥＤ１５、ｐ３００、ＢＲＤ４、β－カテニン、ＳＴＡＴ３、ＳＭＡＤ３、ＮＦ－ｋＢ、ＭＥＣＰ２、ＭＢＤ１、ＭＢＤ２、ＭＢＤ３、ＭＢＤ４、ＨＰ１α、ＴＢＬ１Ｒ、ＨＤＡＣ３、ＳＭＲＴ、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ、ＳＲＳＦ２、ＳＲＲＭ１、ＳＲＳＦ１、またはＴＦＩＩＤである。いくつかの実施形態では、核内受容体リガンドは、ホルモンである。いくつかの実施形態では、転写因子は、ＯＣＴ４、ｐ５３、ＭＹＣ、ＧＣＮ４、ＮＡＮＯＧ、ＭｙｏＤ、ＫＬＦ４、ＳＯＸファミリーの転写因子、ＧＡＴＡファミリーの転写因子、核内受容体、または融合発がん性転写因子である。いくつかの実施形態では、凝縮体のコンポーネントへの転写因子の結合は、転写因子または凝縮体を薬剤（例えば、ペプチド、核酸、または小分子）と接触させることによって調節される。いくつかの実施形態では、凝縮体のコンポーネントへの転写因子の結合は、転写因子の活性化ドメイン（例えば、活性化ドメインのＩＤＲ）を薬剤（例えば、ペプチド、核酸、または小分子）と接触させることによって調節される。
いくつかの実施形態では、転写凝縮体は、転写凝縮体の一部である核内受容体、または転写凝縮体の一部となる能力を有する核内受容体、へのリガンドの結合を調節することによって調節される。いくつかの実施形態では、リガンドは、ホルモン（例えば、エストロゲン）である。いくつかの実施形態では、リガンドの結合は、薬剤（例えば、ペプチド、核酸、または小分子）を用いて調節される。いくつかの実施形態では、転写凝縮体は、核内受容体と転写凝縮体のコンポーネントとの結合を調節することによって調節される。いくつかの実施形態では、転写凝縮体のコンポーネントは、コアクチベーター、補助因子、または核内受容体リガンド（例えば、ホルモン）である。いくつかの実施形態では、コアクチベーター、補助因子、または核内受容体リガンドは、メディエーターコンポーネントまたはホルモンである。いくつかの実施形態では、核内受容体（例えば、変異核内受容体）は、関連リガンドに結合することなく転写を活性化する。いくつかの実施形態では、核内受容体とコンポーネントとの結び付きは、薬剤を用いて調節される。いくつかの実施形態では、凝縮体の転写活性は、核内受容体と別の凝縮体コンポーネント（例えば、メディエーターコンポーネント）との結合を調節することによって調節される。
いくつかの実施形態では、凝縮体（例えば、転写凝縮体）は、シグナル伝達因子と転写凝縮体のコンポーネントとの結合を調節することによって調節される。いくつかの実施形態では、コンポーネントは、メディエーター、メディエーターコンポーネント、または転写因子である。いくつかの実施形態では、凝縮体は、スーパーエンハンサーと結び付く。いくつかの実施形態では、凝縮体を調節することで、１つ以上のがん遺伝子の発現が調節される。いくつかの実施形態では、シグナル伝達因子は、発がん性のシグナル伝達経路と結び付く。いくつかの実施形態では、凝縮体は、レベルが異常なシグナル伝達因子（すなわち、健康な細胞または非抵抗性の細胞と比較してレベルが上昇または低下したシグナル伝達因子）を含む。
いくつかの実施形態では、凝縮体は、凝縮体のコンポーネントへのメチルＤＮＡ結合タンパク質の結合、またはメチル化ＤＮＡへのメチルＤＮＡ結合タンパク質の結合、を調節することによって調節される。いくつかの実施形態では、凝縮体は、凝縮体のコンポーネントへの遺伝子サイレンシング因子の結合を調節することによって調節される。いくつかの実施形態では、凝縮体は、転写因子のコンポーネントへのＲＮＡポリメラーゼの結合を調節することによって調節される。いくつかの実施形態では、凝縮体は、転写因子のコンポーネントへのスプライシング因子の結合を調節することによって調節される。
いくつかの実施形態では、凝縮体は、凝縮体と結び付くコンポーネント（例えば、クライアントコンポーネント、非構造コンポーネント）の量を調節することによって調節される。いくつかの実施形態では、コンポーネント（例えば、転写コンポーネント）は、１つ以上の転写補助因子及び／または転写因子（例えば、シグナル伝達因子）及び／または核内受容体リガンド（例えば、ホルモン）である。いくつかの実施形態では、コンポーネントは、メディエーター、メディエーターコンポーネント、ＭＥＤ１、ＭＥＤ１５、ｐ３００、ＢＲＤ４、ＴＦＩＩＤ、β－カテニン、ＳＴＡＴ３、ＳＭＡＤ３、ＮＦ－ＫＢ、ＭＥＣＰ２、ＭＢＤ１、ＭＢＤ２、ＭＢＤ３、ＭＢＤ４、ＨＰ１α、ＴＢＬ１Ｒ、ＨＤＡＣ３、ＳＭＲＴ、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ、ＳＲＳＦ２、ＳＲＲＭ１、ＳＲＳＦ１、またはホルモンである。いくつかの実施形態では、コンポーネントは、メディエーター、メディエーターコンポーネント、ＭＥＤ１、ＭＥＤ１５、ｐ３００、ＢＲＤ４、ＴＦＩＩＤ、または核内受容体リガンドであり得る。いくつかの実施形態では、コンポーネントは、転写因子（例えば、ＯＣＴ４、ｐ５３、ＭＹＣ、ＧＣＮ４、ＮＡＮＯＧ、ＭｙｏＤ、ＫＬＦ４、ＳＯＸファミリーの転写因子、ＧＡＴＡファミリーの転写因子、核内受容体、または融合発がん性転写因子）である。
いくつかの実施形態では、凝縮体と結び付くコンポーネントの量は、コンポーネントと凝縮体と結び付く他のコンポーネントとの間の相互作用を低減または除去する薬剤との接触によって調節される。いくつかの実施形態では、薬剤は、凝縮体と結び付くコンポーネントの相互作用ドメインを標的とする。いくつかの実施形態では、相互作用ドメインは、天然変性ドメインまたは天然変性領域（ＩＤＲ）である。いくつかの実施形態では、ＩＤＲは、転写因子の活性化ドメインに存在する。
いくつかの実施形態では、凝縮体（例えば、転写凝縮体）を調節することで、１つ以上のシグナル伝達経路が調節される。いくつかの実施形態では、シグナル伝達経路は、疾患発病（例えば、がん発病）に寄与する。いくつかの実施形態では、シグナル伝達経路は、ホルモンシグナル伝達に関与する。いくつかの実施形態では、シグナル伝達経路は、凝縮体のコンポーネントとしてシグナル伝達因子を含む。いくつかの実施形態では、シグナル伝達因子は、ＴＣＦ７Ｌ２、ＴＣＦ７、ＴＣＦ７Ｌ１、ＬＥＦ１、ベータ－カテニン、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ２、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ４、ＳＴＡＴ５Ａ、ＳＴＡＴ５Ｂ、ＳＴＡＴ６、及びＮＦ－κＢからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、シグナル伝達経路は、核内受容体（例えば、核内ホルモン受容体）を含む。いくつかの実施形態では、凝縮体を調節することで、凝縮体と１つ以上の核膜孔タンパク質との間の相互作用が調節される。いくつかの実施形態では、凝縮体と１つ以上の核膜孔タンパク質との間の相互作用を調節することで、核内シグナル伝達、ｍＲＮＡの搬出、及び／またはｍＲＮＡの翻訳が調節され得る。いくつかの実施形態では、凝縮体を調節することで、凝縮体とメチルＤＮＡ結合タンパク質との間の相互作用が調節される。いくつかの実施形態では、凝縮体を調節することで、凝縮体と遺伝子サイレンシング因子との間の相互作用が調節される。いくつかの実施形態では、凝縮体を調節することで、ヘテロクロマチンに位置する１つ以上の遺伝子の抑制または活性化が調節される。いくつかの実施形態では、凝縮体を調節することで、凝縮体とスプライシング因子、開始因子、または伸長因子との間の相互作用が調節される。いくつかの実施形態では、凝縮体を調節することで、凝縮体とＲＮＡポリメラーゼとの間の相互作用が調節される。いくつかの実施形態では、凝縮体を調節することで、ｍＲＮＡの開始または伸長が調節される。いくつかの実施形態では、凝縮体を調節することで、ｍＲＮＡスプライシングが調節される。いくつかの実施形態では、凝縮体を調節することで、炎症応答（例えば、ウイルスまたは細菌に対する炎症応答）が調節される。いくつかの実施形態では、凝縮体を調節することで、がんの生存能力または増殖が調節される（例えば、低減または除去）される。いくつかの実施形態では、凝縮体を調節することで、レット症候群またはＭｅＣＰ２過剰発現症候群が治療または予防される。いくつかの実施形態では、凝縮体を調節することで、ｍＲＮＡの開始異常、伸長異常、またはスプライシング異常と結び付く状態が治療または予防される。
いくつかの実施形態では、凝縮体は、凝縮体と結び付くヌクレオチド配列を改変することによって調節される。改変は、ヌクレオチドの追加もしくは欠失、またはエピジェネティック修飾（例えば、ＤＮＡメチル化の増加もしくは低減もしくは修飾）を含み得る。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列の改変は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質をヌクレオチド配列に繋留することを含む。いくつかの実施形態では、触媒的に不活性な部位特異的エンドヌクレアーゼ（例えば、ｄＣａｓ）を使用することで、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質がヌクレオチド配列に繋留される。いくつかの実施形態では、凝縮体は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質を凝縮体に繋留することによって調節される。いくつかの実施形態では、ホルモン応答エレメントまたはシグナル伝達応答エレメントが修飾される。いくつかの実施形態では、凝縮体は、凝縮体と結び付くＤＮＡをメチル化または脱メチル化することによって調節される。いくつかの実施形態では、凝縮体は、コンポーネントをリン酸化または脱リン酸化することによって調節される。いくつかの実施形態では、コンポーネントは、ＲＮＡポリメラーゼである。
いくつかの実施形態では、凝縮体は、凝縮体を外来性ＲＮＡと接触させることによって調節される。いくつかの実施形態では、凝縮体は、凝縮体と結び付く１つ以上のＲＮＡ（例えば、凝縮体コンポーネント）を安定化させることによって調節される。いくつかの実施形態では、凝縮体は、凝縮体と結び付くＲＮＡのレベルを調節することによって調節される。
いくつかの態様では、凝縮体を変化させることによって、細胞におけるＲＮＡプロセシングが変化する。いくつかの実施形態では、転写凝縮体が１つ以上のＲＮＡプロセシング装置凝縮体と融合することを抑制または増進することによってＲＮＡプロセシングが変化する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡプロセシングは、スプライシング、５’キャップの付加、及び／または３’ポリアデニル化を含む。いくつかの実施形態では、開始複合体または伸長複合体と結び付く凝縮体に対するＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ＰｏｌＩＩ）の親和性が調節される。いくつかの実施形態では、親和性は、ＰｏｌＩＩをリン酸化または脱リン酸化（例えば、ＰｏｌＩＩの天然変性Ｃ末端ドメインをリン酸化または脱リン酸化）することによって調節される。
いくつかの実施形態では、凝縮体は、凝縮体と結び付くスーパーエンハンサー（例えば、凝縮体内のスーパーエンハンサー、凝縮体依存的な転写活性を有するスーパーエンハンサー）の修飾因子／脱修飾因子の比を調節することによって調節される。いくつかの実施形態では、凝縮体は、コンポーネントの修飾／脱修飾を調節（例えば、タンパク質コンポーネント、ペプチドコンポーネント、ＤＮＡコンポーネント、またはＲＮＡコンポーネントのリン酸化またはアセチル化を調節）することによって調節される。いくつかの実施形態では、凝縮体は、修飾因子／脱修飾因子の発現または活性を阻害または増進することによって調節される（例えば、それによって、凝縮体コンポーネントの安定性、局在化、及び／または結合活性が調節される）。例えば、ある特定のタンパク質をリン酸化または脱リン酸化すると、当該タンパク質が他の分子実体（例えば、凝縮体コンポーネント）と相互作用する能力に影響が及び得る。いくつかの実施形態では、そのような修飾／脱修飾は、タンパク質から凝縮体コンポーネントを解離させ得るものであり、こうしたタンパク質は、そのような修飾／脱修飾を受けなければ凝縮体コンポーネントを細胞質に留まらせ、それが凝縮体に加わり得る場所である核へと凝縮体コンポーネントを移行させるものである。したがって、いくつかの実施形態では、凝縮体の形成、安定性、組成、維持、崩壊、または活性の修飾は、凝縮体コンポーネントの修飾因子／脱修飾因子の抑制または活性化を含む。いくつかの実施形態では、修飾因子は、キナーゼであり、修飾因子を阻害する薬剤は、キナーゼ阻害剤である。
いくつかの実施形態では、凝縮体は、凝縮体を、凝縮体と結び付くコンポーネントの天然変性ドメインに結合する薬剤と接触させることによって調節される。いくつかの実施形態では、コンポーネントは、メディエーター、メディエーターコンポーネント、ＭＥＤ１、ＭＥＤ１５、ｐ３００、ＢＲＤ４、ＴＦＩＩＤ、β－カテニン、ＳＴＡＴ３、ＳＭＡＤ３、ＮＦ－ＫＢ、ＭＥＣＰ２、ＭＢＤ１、ＭＢＤ２、ＭＢＤ３、ＭＢＤ４、ＨＰ１α、ＴＢＬ１Ｒ、ＨＤＡＣ３、ＳＭＲＴ、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ、ＳＲＳＦ２、ＳＲＲＭ１、またはＳＲＳＦ１である。いくつかの実施形態では、コンポーネントは、核内受容体リガンド（例えば、ホルモン）またはその断片である。いくつかの実施形態では、コンポーネントは、シグナル伝達因子またはその断片である。いくつかの実施形態では、コンポーネントは、メチル結合タンパク質もしくはサプレッサー、またはその断片である。いくつかの実施形態では、コンポーネントは、ＲＮＡポリメラーゼ、スプライシング因子、開始因子、伸長因子、またはその断片である。いくつかの実施形態では、コンポーネントは、表Ｓ１に記載のものである。いくつかの実施形態では、コンポーネントは、転写因子（例えば、ＯＣＴ４、ｐ５３、ＭＹＣ、ＧＣＮ４、ＮＡＮＯＧ、ＭｙｏＤ、ＫＬＦ４、ＳＯＸファミリーの転写因子、ＧＡＴＡファミリーの転写因子、核内受容体、または融合発がん性転写因子）である。いくつかの実施形態では、ＩＤＲは、転写因子の活性化ドメインに位置する。本明細書に開示の方法及び組成物の実施形態のいくつかでは、コンポーネントは、核内受容体であるか、または活性化ドメインもしくは活性化ドメインＩＤＲを含む核内受容体の断片である。いくつかの実施形態では、薬剤は、多価である。いくつかの実施形態では、薬剤は、二価である。いくつかの実施形態では、薬剤は、コンポーネントの非天然変性ドメインにさらに結合するか、または凝縮体と結び付く第２のコンポーネントにさらに結合する。いくつかの実施形態では、薬剤は、凝縮体のコンポーネントの間の相互作用を変化させるか、または破壊し得る。いくつかの実施形態では、薬剤は、凝縮体のコンポーネントの間の相互作用を安定化または増進し得る。いくつかの実施形態では、薬剤は、２つ以上のコンポーネントの非変性領域に結合する（その結果、例えば、それらのコンポーネントのＩＤＲ相互作用を増進する）。
いくつかの実施形態では、凝縮体の形成は、１つ以上の凝縮体コンポーネントをゲノムＤＮＡに繋留することによって誘発、増進、または安定化させることができる。いくつかの実施形態では、こうしたコンポーネントは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及び／またはタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、コンポーネントは、メディエーター、メディエーターコンポーネント、ＭＥＤ１、ＭＥＤ１５、ｐ３００、ＢＲＤ４、核内受容体リガンド、シグナル伝達因子、β－カテニン、ＳＴＡＴ３、ＳＭＡＤ３、ＮＦ－ＫＢ、ＭＥＣＰ２、ＭＢＤ１、ＭＢＤ２、ＭＢＤ３、ＭＢＤ４、ＨＰ１α、ＴＢＬ１Ｒ、ＨＤＡＣ３、ＳＭＲＴ、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ、ＳＲＳＦ２、ＳＲＲＭ１、ＳＲＳＦ１、またはＴＦＩＩＤを含む。いくつかの実施形態では、コンポーネントは、転写因子（例えば、ＯＣＴ４、ｐ５３、ＭＹＣ、ＧＣＮ４、ＮＡＮＯＧ、ＭｙｏＤ、ＫＬＦ４、ＳＯＸファミリーの転写因子、ＧＡＴＡファミリーの転写因子、核内受容体、または融合発がん性転写因子）である。いくつかの実施形態では、コンポーネントは、触媒的に不活性な部位特異的エンドヌクレアーゼ（例えば、ｄＣａｓ）を使用して繋留される。
いくつかの実施形態では、凝縮体は、凝縮体のコンポーネントの１つ以上を第２の凝縮体に隔離することによって調節される。いくつかの実施形態では、第２の凝縮体の形成は、細胞を外来性のペプチド、核酸、及び／またはタンパク質と接触させることによって誘導される。いくつかの実施形態では、隔離コンポーネントは、転写因子（例えば、ＯＣＴ４、ｐ５３、ＭＹＣ、ＧＣＮ４、ＮＡＮＯＧ、ＭｙｏＤ、ＫＬＦ４、ＳＯＸファミリーの転写因子、ＧＡＴＡファミリーの転写因子、核内受容体、または融合発がん性転写因子）である。いくつかの実施形態では、隔離コンポーネントは、Ｍｙｃである。いくつかの実施形態では、隔離コンポーネントは、野生型タンパク質の変異バージョンである。いくつかの実施形態では、隔離コンポーネントは、病状（例えば、がん）において過剰発現するコンポーネントである。いくつかの実施形態では、隔離コンポーネントは、核内受容体（例えば、変異バージョンの核内受容体、病状と結び付く変異バージョンの核内受容体）である。いくつかの実施形態では、隔離コンポーネントは、核内受容体リガンド、シグナル伝達因子、メチルＤＮＡ結合タンパク質、スプライシング因子、開始因子、伸長因子、遺伝子サイレンシング因子、またはＲＮＡポリメラーゼである。
いくつかの実施形態では、凝縮体は、凝縮体と結び付くｎｃＲＮＡ（例えば、凝縮体のコンポーネント）のレベルまたは活性を調節することによって調節される。いくつかの実施形態では、ｎｃＲＮＡのレベルまたは活性は、ｎｃＲＮＡを、ｎｃＲＮＡに結合するアンチセンスオリゴヌクレオチド、ＲＮａｓｅ、または化合物と接触させることによって調節される。いくつかの実施形態では、ｎｃＲＮＡは、エンハンサーＲＮＡ（ｅＲＮＡ）である。いくつかの実施形態では、ｎｃＲＮＡは、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｅｘＲＮＡ、ｓｃａＲＮＡ、Ｘｉｓｔ、またはＨＯＴＡＩＲである。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、凝縮体の形成、組成、維持、崩壊、または制御によって生じるか、またはそれに依存する疾患を治療するか、または当該疾患が生じる可能性を低減するものである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、がんを治療するか、またはがんが生じる可能性を低減するものである。いくつかの実施形態では、がんは、凝縮体コンポーネント（例えば、核内受容体）の変異と結び付くものである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、核内受容体（例えば、変異核内受容体）と結び付く疾患を治療するか、または当該疾患が生じる可能性を低減するものである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、タンパク質発現の異常と結び付く疾患（例えば、タンパク質を病的レベルで生じさせる疾患）を治療するか、または当該疾患が生じる可能性を低減するものである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、シグナル伝達の異常と結び付く疾患を治療するか、または当該疾患が生じる可能性を低減するものである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、炎症を低減するものである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、細胞状態を変化させるものである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、細胞の生存経路もしくは増殖経路を不適切に活性化する融合発がん性転写因子が生成されること、正常組織に発現しない転写因子産生が不適切に生じること、またはエンハンサー領域が変異することによってそれまではサイレントであったがん遺伝子に転写因子が動員されること、と結び付く疾患を治療するか、または当該疾患が生じる可能性を低減するものである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、細胞独自性を変化させるものである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、メチルＤＮＡ結合タンパク質の発現異常または活性異常（例えば、参照レベルまたは対照レベルと比較したときのレベルの上昇または低下）と結び付く疾患を治療するものである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、ｍＲＮＡの開始異常または伸長異常（例えば、参照レベルまたは対照レベルと比較したときのｍＲＮＡの開始または伸長の増加または減少）と結び付く疾患を治療するものである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、ｍＲＮＡスプライシングの異常（例えば、参照レベルまたは対照レベルと比較したときのｍＲＮＡスプライシング活性の上昇または低下）と結び付く疾患を治療するものである。
本開示の態様のいくつかは、凝縮体（例えば、転写凝縮体）の凝縮体形成、凝縮体安定性、凝縮体活性（例えば、ｍＲＮＡの開始活性もしくは伸長活性、遺伝子サイレンシング活性）、または凝縮体形態を調節する薬剤を同定する方法を対象とし、この方法は、凝縮体を有する細胞を提供すること、細胞を試験薬剤と接触させること、試験薬剤との接触によって凝縮体の形成、安定性、活性、または形態が調節されるかどうかを決定すること、を含む。いくつかの実施形態では、凝縮体は、検出可能なタグ（すなわち、検出可能な標識）を有し、検出可能なタグは、試験薬剤との接触によって凝縮体の形成、安定性、活性、または形態が調節されるかどうかを決定するために使用される。いくつかの実施形態では、検出可能なタグは、蛍光タグである。いくつかの実施形態では、検出可能なタグは、酵素タグ（例えば、ルシフェラーゼ）である。いくつかの実施形態では、検出可能なタグは、エピトープタグである。いくつかの実施形態では、試験薬剤との接触によって凝縮体の形成、安定性、活性、または形態が調節されるかどうかを決定するために、凝縮体に選択的に結合する抗体が使用される。いくつかの実施形態では、試験薬剤との接触によって凝縮体の形成、安定性、活性、または形態が調節されるかどうかを決定するステップは、顕微鏡法を使用して実施される。いくつかの実施形態では、凝縮体は、変異コンポーネント（例えば、変異バージョンの核内受容体またはその断片、野生型の受容体またはその断片と比較して関連リガンドに結合したときの活性または活性レベルが異なる変異バージョンの核内受容体、変異シグナル伝達因子またはその断片、変異メチルＤＮＡ結合タンパク質またはその断片）を含む。上記の実施形態のいくつかでは、細胞は、凝縮体を有しておらず、方法は、細胞において凝縮体を形成させる薬剤を同定することを含む。いくつかの実施形態では、凝縮体は、細胞において検出不可能であり、方法は、凝縮体を検出可能にする（例えば、凝縮体を検出に十分な大きさにする）薬剤を同定することを含む。いくつかの実施形態では、細胞は、凝縮体を有し、方法は、別の凝縮体を形成させる薬剤を同定することを含む。
いくつかの実施形態では、凝縮体（例えば、転写凝縮体）のコンポーネントは、シグナル伝達因子またはＩＤＲを含むその断片である。いくつかの実施形態では、凝縮体は、１つ以上のシグナル応答エレメントと結び付く。いくつかの実施形態では、シグナル伝達因子は、疾患と結び付くシグナル伝達経路と結び付く。いくつかの実施形態では、疾患は、がんである。いくつかの実施形態では、凝縮体は、がん遺伝子の転写を調節する。いくつかの実施形態では、凝縮体は、スーパーエンハンサーと結び付く。いくつかの実施形態では、凝縮体のコンポーネントは、メチルＤＮＡ結合タンパク質もしくはＣ末端ＩＤＲを含むその断片、またはサプレッサーもしくはＩＤＲを含むその断片である。いくつかの実施形態では、凝縮体は、メチル化ＤＮＡまたはヘテロクロマチンと結び付く。いくつかの実施形態では、凝縮体は、レベルまたは活性が異常なメチルＤＮＡ結合タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、本明細書で言及される任意の型の細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、神経細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、レット症候群またはＭｅＣＰ２過剰発現症候群を有する対象から（例えば、対象細胞に由来する人工多能性幹細胞を介して）得られるものである。
いくつかの実施形態では、凝縮体と結び付く遺伝子の発現の、薬剤による抑制が評価される。いくつかの実施形態では、凝縮体のコンポーネントは、スプライシング因子もしくはＩＤＲを含むその断片、またはＲＮＡポリメラーゼもしくはＩＤＲを含むその断片である。いくつかの実施形態では、凝縮体は、転写の開始複合体または伸長複合体と結び付く。いくつかの実施形態では、細胞は、サイクリン依存性キナーゼをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ＰｏｌＩＩ）である。いくつかの実施形態では、薬剤との接触によって生じる、凝縮体と結び付くＲＮＡ転写開始活性の変化が評価される。いくつかの実施形態では、薬剤との接触によって生じる、凝縮体と物理的に結び付くＲＮＡ伸長活性またはＲＮＡスプライシング活性の変化が評価される。
本開示の態様のいくつかは、凝縮体の形成、安定性、または形態を調節する薬剤を同定する方法を対象とし、この方法は、インビトロ凝縮体を提供し、インビトロ凝縮体の１つ以上の物理的特性を評価すること、インビトロ凝縮体を試験薬剤と接触させること、及びインビトロ凝縮体の１つ以上の物理的特性が試験薬剤によって変化するかどうかを評価すること、を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の物理的特性は、インビトロ凝縮体が細胞において遺伝子の発現を生じさせる、または増加させるか、または低減する能力と相関する。いくつかの実施形態では、１つ以上の物理的特性は、インビトロ凝縮体がＲＮＡスプライシングを生じさせるか、または増加させるか、または低減する能力と相関する。いくつかの実施形態では、１つ以上の物理的特性は、サイズ、濃度、透過性、形態、または粘性を含む。いくつかの実施形態では、試験薬剤は、小分子、ペプチド、ＲＮＡ、もしくはＤＮＡであるか、または小分子、ペプチド、ＲＮＡ、もしくはＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、インビトロ凝縮体は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及びタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、インビトロ凝縮体は、ＤＮＡ及びタンパク質を含むか、ＤＮＡ及びタンパク質からなるか、またはＤＮＡ及びタンパク質から本質的になる。いくつかの実施形態では、インビトロ凝縮体は、ＲＮＡ及びタンパク質を含むか、ＲＮＡ及びタンパク質からなるか、またはＲＮＡ及びタンパク質から本質的になる。いくつかの実施形態では、インビトロ凝縮体は、タンパク質を含むか、タンパク質からなるか、またはタンパク質から本質的になる。いくつかの実施形態では、インビトロ凝縮体は、天然変性領域または天然変性ドメイン（例えば、タンパク質、ペプチド、または１つ以上の天然変性領域もしくは天然変性ドメインを含むその断片もしくは誘導体）を含む。いくつかの実施形態では、インビトロ凝縮体は、弱いタンパク質間相互作用（例えば、容易に乱される相互作用、容易に乱され、かつ一過性の相互作用、マイクロモル濃度範囲のＫｄを有する相互作用、マイクロモル濃度範囲のＫｄを有し、かつ一過性の相互作用）によって形成される。いくつかの実施形態では、インビトロ凝縮体は、（天然変性ドメイン）－（誘導性オリゴマー化ドメイン）融合タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、インビトロ凝縮体は、細胞に見られる転写凝縮体を模倣する。いくつかの実施形態では、インビトロ凝縮体は、ヘテロクロマチン凝縮体（例えば、遺伝子発現をサイレンシングするヘテロクロマチン凝縮体）を模倣する。いくつかの実施形態では、インビトロ凝縮体は、メチル化ＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、インビトロ凝縮体は、ｍＲＮＡ開始複合体またはｍＲＮＡ伸長複合体を模倣する。いくつかの実施形態では、インビトロ凝縮体は、シグナル応答エレメントを含む。いくつかの実施形態では、凝縮体は、液滴中に存在する（例えば、インビトロの合成転写凝縮体）。
いくつかの実施形態では、凝縮体のコンポーネントは、シグナル伝達因子またはＩＤＲを含むその断片である。いくつかの実施形態では、凝縮体は、１つ以上のシグナル応答エレメントと結び付く。いくつかの実施形態では、シグナル伝達因子は、疾患と結び付くシグナル伝達経路と結び付く。いくつかの実施形態では、疾患は、がんである。いくつかの実施形態では、凝縮体は、がん遺伝子の転写を調節する。いくつかの実施形態では、凝縮体は、スーパーエンハンサーと結び付く。いくつかの実施形態では、凝縮体のコンポーネントは、メチルＤＮＡ結合タンパク質もしくはＣ末端ＩＤＲを含むその断片、またはサプレッサーもしくはＩＤＲを含むその断片である。いくつかの実施形態では、凝縮体は、メチル化ＤＮＡまたはヘテロクロマチンと結び付く。いくつかの実施形態では、凝縮体は、レベルまたは活性が異常なメチルＤＮＡ結合タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、本明細書で言及されるか、または当該技術分野で知られる任意の細胞型の細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、神経細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、レット症候群またはＭｅＣＰ２過剰発現症候群を有する対象から（例えば、対象細胞に由来する人工多能性幹細胞を介して）得られるものである。
いくつかの実施形態では、凝縮体と結び付く遺伝子の発現の、薬剤による抑制が評価される。いくつかの実施形態では、凝縮体のコンポーネントは、スプライシング因子もしくはＩＤＲを含むその断片、またはＲＮＡポリメラーゼもしくはＩＤＲを含むその断片である。いくつかの実施形態では、凝縮体は、転写の開始複合体または伸長複合体と結び付く。いくつかの実施形態では、細胞は、サイクリン依存性キナーゼをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ＰｏｌＩＩ）である。いくつかの実施形態では、薬剤との接触によって生じる、凝縮体と結び付くＲＮＡ転写開始活性の変化が評価される。いくつかの実施形態では、薬剤との接触によって生じる、凝縮体と結び付くＲＮＡ伸長活性またはＲＮＡスプライシング活性の変化が評価される。
本開示の態様のいくつかは、凝縮体の形成、安定性、機能、または形態を調節する薬剤を同定する方法を対象とし、この方法は、凝縮体依存的にレポーター遺伝子を発現する細胞を提供すること、細胞を試験薬剤と接触させること、及びレポーター遺伝子の発現を評価すること、を含む。
本明細書に開示の薬剤を同定する方法の実施形態のいくつかでは、凝縮体は、核内受容体（例えば、核内ホルモン受容体）または活性化ドメインＩＤＲを含むその断片を含む。いくつかの実施形態では、核内受容体は、関連リガンドに結合すると転写を活性化する。いくつかの実施形態では、核内受容体は、関連リガンドに結合することなく転写を活性化する。いくつかの実施形態では、核内受容体（例えば、変異核内受容体）によって活性化された転写のレベルは、野生型核内受容体、または疾患もしくは状態と結び付かないバージョンの核内受容体と比較して異なる（例えば、１．５倍異なる、２倍異なる、３倍異なる、４倍異なる、５倍異なる）。いくつかの実施形態では、核内受容体は、核内ホルモン受容体である。いくつかの実施形態では、核内受容体は、変異を有する。いくつかの実施形態では、変異は、疾患または状態と結び付く。いくつかの実施形態では、疾患または状態は、がん（例えば、乳癌または白血病）である。
いくつかの実施形態では、核内受容体を含む凝縮体と関連する本明細書に開示の方法では、さらにリガンドが存在する（例えば、凝縮体がリガンドを含む、アッセイ混合物がリガンドを含む）。いくつかの実施形態では、リガンドによって促進されると想定される凝縮体形成を阻害する薬剤、またはリガンドと付加的もしくは相乗的に作用することで凝縮体の形成／安定性、機能、または形態を促進する薬剤、を同定するために、リガンドを含むアッセイが使用される。リガンドは、天然起源の内在性リガンド（例えば、関連リガンド）、または天然起源の内在性リガンドとは構造が異なるリガンド（例えば、合成リガンド）であり得る。
本明細書に開示の薬剤を同定する方法の実施形態のいくつかでは、凝縮体は、１つ以上の異常な特性（例えば、凝縮体の異常な形成、安定性、機能、または形態）を示す変異凝縮体コンポーネント（例えば、変異ＴＦ、変異ＮＲ）を含み、アッセイは、そうした特性を少なくとも部分的に正常化させる薬剤を同定することを含む。本明細書に開示の薬剤を同定する方法の実施形態のいくつかでは、凝縮体は、１つ以上の異常な特性を示す変異ＮＲを含み、アッセイは、ＮＲと接触すると異常な特性を生じさせるリガンドの存在下で実施される。アッセイは、異常な特性を正常化する薬剤の同定に使用され得る。
本開示の態様のいくつかは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及びタンパク質を含む単離された合成転写凝縮体を対象とする。本開示の態様のいくつかは、ＤＮＡ及びタンパク質を含む単離された合成転写凝縮体を対象とする。いくつかの実施形態では、単離された合成転写凝縮体は、液滴に含まれる。本開示の態様のいくつかは、ヘテロクロマチン凝縮体に特有のタンパク質を含む単離された合成凝縮体、またはｍＲＮＡ開始複合体もしくはｍＲＮＡ伸長複合体と物理的に結び付く凝縮体に特有のタンパク質を含む単離された合成凝縮体を対象とする。本開示の態様のいくつかは、ヘテロクロマチン凝縮体に特有のＤＮＡ及びタンパク質を含む単離された合成凝縮体、またはｍＲＮＡ開始複合体もしくはｍＲＮＡ伸長複合体と物理的に結び付く凝縮体に特有のＤＮＡ及びタンパク質を含む単離された合成凝縮体を対象とする。いくつかの実施形態では、単離された合成凝縮体は、液滴に含まれる。
本開示の態様のいくつかは、転写凝縮体コンポーネント（例えば、転写因子またはその断片、活性化ドメインまたは活性化ドメインＩＤＲを含む転写因子の断片）と、オリゴマー化の誘導を可能にするドメインと、を含む融合タンパク質を対象とする。本開示の態様のいくつかは、ヘテロクロマチン凝縮体のコンポーネント、またはｍＲＮＡ開始複合体もしくはｍＲＮＡ伸長複合体と物理的に結び付く凝縮体のコンポーネント、を含む融合タンパク質を対象とする。融合タンパク質は、検出可能なタグ（例えば、蛍光タグ）をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、オリゴマー化の誘導を可能にするドメインは、小分子、タンパク質、または核酸を用いて誘導することが可能である。いくつかの実施形態では、小分子、タンパク質、核酸、または光を用いて凝縮体形成を誘導することが可能である。
本開示の態様のいくつかは、凝縮体（例えば、転写凝縮体、ヘテロクロマチン凝縮体、ｍＲＮＡ開始複合体またはｍＲＮＡ伸長複合体と結び付く凝縮体）を検出（例えば、可視化）する方法を対象とする。いくつかの態様では、転写凝縮体の形成、形態、または崩壊が可視化され得る。いくつかの実施形態では、転写凝縮体を可視化することは、当該凝縮体を調節する薬剤のスクリーニングにおいて有用であり得る。いくつかの態様では、凝縮体（例えば、ヘテロクロマチン凝縮体、またはｍＲＮＡ開始複合体もしくはｍＲＮＡ伸長複合体と物理的に結び付く凝縮体）の形成、形態、または崩壊が可視化され得る。いくつかの実施形態では、凝縮体（例えば、ヘテロクロマチン凝縮体、またはｍＲＮＡ開始複合体もしくはｍＲＮＡ伸長複合体と物理的に結び付く凝縮体）を可視化することは、当該凝縮体を調節する薬剤のスクリーニングにおいて有用であり得る。いくつかの実施形態では、方法は、凝縮体の形成率または崩壊率を監視することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、凝縮体の形成率または崩壊率を増加または減少させる薬剤を同定することを含む。
本開示の態様のいくつかは、ｍＲＮＡの開始を調節する方法を対象とし、この方法は、ｍＲＮＡの開始と物理的に結び付く凝縮体の形成、組成、維持、崩壊、及び／または制御を調節することを含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡの開始を調節することで、ｍＲＮＡの伸長、スプライシング、またはキャッピングも調節される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡの開始と物理的に結び付く凝縮体の形成、組成、維持、崩壊、及び／または制御を調節することで、ｍＲＮＡの転写速度が調節される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡの開始と物理的に結び付く凝縮体の形成、組成、維持、崩壊、及び／または制御を調節することで、遺伝子産物のレベルが調節される。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡの開始と物理的に結び付く凝縮体の形成、組成、維持、崩壊、及び／または制御は、薬剤を用いて調節される。薬剤は、限定されず、本明細書に記載の任意の薬剤であり得る。いくつかの実施形態では、薬剤は、低リン酸化されたＲＮＡポリメラーゼＩＩ Ｃ末端ドメイン（ＰｏｌＩＩ ＣＴＤ）またはその機能性断片を含む。いくつかの実施形態では、薬剤は、低リン酸化されたＰｏｌＩＩ ＣＴＤに優先的に結合する。
本開示の態様のいくつかは、ｍＲＮＡの伸長を調節する方法を対象とし、この方法は、ｍＲＮＡ伸長複合体と物理的に結び付く凝縮体の形成、組成、維持、崩壊、及び／または制御を調節することを含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡの伸長を調節することで、ｍＲＮＡの開始も調節される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡの伸長と物理的に結び付く凝縮体の形成、組成、維持、崩壊、及び／または制御を調節することで、転写と同時発生的なｍＲＮＡプロセシングが調節される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡの伸長と物理的に結び付く凝縮体の形成、組成、維持、崩壊、及び／または制御を調節することで、ｍＲＮＡスプライスバリアントの数または相対比率が調節される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡの伸長と物理的に結び付く凝縮体の形成、組成、維持、崩壊、及び／または制御は、薬剤を用いて調節される。薬剤は、限定されず、本明細書に開示の任意の薬剤であり得る。いくつかの実施形態では、薬剤は、リン酸化もしくは低リン酸化されたＲＮＡポリメラーゼＩＩ Ｃ末端ドメイン（ＰｏｌＩＩ ＣＴＤ）またはその機能性断片を含む。いくつかの実施形態では、薬剤は、リン酸化または低リン酸化されたＰｏｌＩＩ ＣＴＤに優先的に結合する。
本開示の態様のいくつかは、凝縮体の形成、組成、維持、崩壊、及び／または制御を調節する方法に関し、この方法は、凝縮体コンポーネントのリン酸化または脱リン酸化を調節することを含む。いくつかの実施形態では、コンポーネントは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩまたはＲＮＡポリメラーゼＩＩ Ｃ末端領域である。
本開示の態様のいくつかは、ｍＲＮＡプロセシングの異常と結び付く疾患もしくは状態を治療するか、または当該疾患もしくは状態が生じる可能性を低減する方法に関し、この方法は、ｍＲＮＡの伸長と物理的に結び付く凝縮体の形成、組成、維持、崩壊、及び／または制御を調節することを含む。
本開示の態様のいくつかは、凝縮体の形成、安定性、または形態を調節する薬剤を同定する方法に関し、この方法は、凝縮体を有する細胞を提供すること、細胞を試験薬剤と接触させること、及び試験薬剤との接触によって凝縮体の形成、安定性、または形態が調節されるかどうかを決定すること、を含み、凝縮体は、低リン酸化されたＲＮＡポリメラーゼＩＩ Ｃ末端ドメイン（ＰｏｌＩＩ ＣＴＤ）、リン酸化されたＲＮＡポリメラーゼＩＩ Ｃ末端ドメイン（ＰｏｌＩＩ ＣＴＤ）、スプライシング因子、またはその機能性断片を含む。疾患または状態と結び付く凝縮体（レベル、特性、または活性が異常なもの）の形成、組成、維持、崩壊、活性、及び／または制御を調節する薬剤を同定またはスクリーニングする本明細書に開示の方法の実施形態のいくつかでは、薬剤は、疾患または状態の治療に有用であることが知られていないものである。
本開示の態様のいくつかは、凝縮体の形成、安定性、または形態を調節する薬剤を同定する方法に関し、この方法は、インビトロ凝縮体を提供し、インビトロ凝縮体の１つ以上の物理的特性を評価すること、インビトロ凝縮体を試験薬剤と接触させること、及びインビトロ凝縮体の１つ以上の物理的特性が試験薬剤によって変化するかどうかを評価すること、を含み、凝縮体は、低リン酸化されたＲＮＡポリメラーゼＩＩ Ｃ末端ドメイン（ＰｏｌＩＩ ＣＴＤ）、リン酸化されたＲＮＡポリメラーゼＩＩ Ｃ末端ドメイン（ＰｏｌＩＩ ＣＴＤ）、スプライシング因子、またはその機能性断片を含む。
本開示の態様のいくつかは、低リン酸化されたＲＮＡポリメラーゼＩＩ Ｃ末端ドメイン（ＰｏｌＩＩ ＣＴＤ）またはその機能性断片を含む単離された合成凝縮体に関する。本開示の態様のいくつかは、リン酸化されたＲＮＡポリメラーゼＩＩ Ｃ末端ドメイン（ＰｏｌＩＩ ＣＴＤ）またはその機能性断片を含む単離された合成凝縮体に関する。本開示の態様のいくつかは、スプライシング因子またはその機能性断片を含む単離された合成凝縮体に関する。
本開示の態様のいくつかは、１つ以上の遺伝子の転写を調節する方法に関し、この方法は、ヘテロクロマチン凝縮体の形成、組成、維持、崩壊、及び／または制御を調節することを含む。いくつかの実施形態では、ヘテロクロマチン凝縮体を調節することで、１つ以上の遺伝子の転写の抑制が増強または安定化される。いくつかの実施形態では、ヘテロクロマチン凝縮体を調節することで、１つ以上の遺伝子の転写の抑制が低減される。いくつかの実施形態では、ヘテロクロマチンと結び付く複数の遺伝子の転写が調節される。いくつかの実施形態では、ヘテロクロマチン凝縮体の形成、組成、維持、崩壊、及び／または制御は、薬剤を用いて調節される。いくつかの実施形態では、薬剤は、ペプチド、核酸、もしくは小分子を含むか、またはペプチド、核酸、もしくは小分子からなる。いくつかの実施形態では、薬剤は、メチル化ＤＮＡ、メチルＤＮＡ結合タンパク質、または遺伝子サイレンシング因子に結合する。
本開示の態様のいくつかは、遺伝子サイレンシングを調節する方法に関し、この方法は、ヘテロクロマチン凝縮体の形成、組成、維持、崩壊、及び／または制御を調節することを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子サイレンシングは、安定化または増強される。いくつかの実施形態では、遺伝子サイレンシングは、低減される。いくつかの実施形態では、遺伝子サイレンシングは、薬剤を用いて調節される。
本開示の態様のいくつかは、遺伝子サイレンシングの異常（対照レベルまたは参照レベルと比較したときの遺伝子サイレンシングの増加または減少）と結び付く疾患もしくは状態を治療するか、または当該疾患もしくは状態が生じる可能性を低減する方法に関し、この方法は、ヘテロクロマチン凝縮体の形成、組成、維持、崩壊、及び／または制御を調節することを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子サイレンシングの異常と結び付く疾患または状態は、メチルＤＮＡ結合タンパク質の発現異常または活性異常と結び付く。いくつかの実施形態では、遺伝子サイレンシングの異常と結び付く疾患または状態は、レット症候群またはＭｅＣＰ２過剰発現症候群である。
本開示の態様のいくつかは、凝縮体の形成、安定性、または形態を調節する薬剤を同定する方法に関し、この方法は、凝縮体を有する細胞を提供すること、細胞を試験薬剤と接触させること、及び試験薬剤との接触によって凝縮体の形成、安定性、または形態が調節されるかどうかを決定すること、を含み、凝縮体は、ＭｅＣＰ２もしくはＭｅＣＰ２のＣ末端天然変性領域を含むその断片、またはサプレッサーを含む。いくつかの実施形態では、凝縮体は、ヘテロクロマチンと結び付く。いくつかの実施形態では、凝縮体は、メチル化ＤＮＡと結び付く。
本開示の態様のいくつかは、凝縮体の形成、安定性、または形態を調節する薬剤を同定する方法に関し、この方法は、インビトロ凝縮体を提供し、インビトロ凝縮体の１つ以上の物理的特性を評価すること、インビトロ凝縮体を試験薬剤と接触させること、及びインビトロ凝縮体の１つ以上の物理的特性が試験薬剤によって変化するかどうかを評価すること、を含み、凝縮体は、ＭｅＣＰ２もしくはＭｅＣＰ２のＣ末端天然変性領域を含むその断片、またはサプレッサーもしくはその機能性断片を含む。
本開示の態様のいくつかは、ＭｅＣＰ２またはＭｅＣＰ２のＣ末端天然変性領域を含むその断片を含む単離された合成凝縮体に関する。
本開示の態様のいくつかは、サプレッサー（本明細書では遺伝子サイレンシング因子と称されることもある）またはその機能性断片を含む単離された合成凝縮体に関する。
本開示の態様のいくつかは、細胞における１つ以上の遺伝子の転写を調節する方法に関し、この方法は、１つ以上の遺伝子と結び付く凝縮体の組成、維持、崩壊、及び／または制御を調節することを含み、凝縮体は、エストロゲン受容体（ＥＲ）またはその断片と、ＭＥＤ１またはその断片と、を凝縮体コンポーネントとして含む。いくつかの実施形態では、エストロゲン受容体は、変異エストロゲン受容体である。いくつかの実施形態では、変異エストロゲン受容体は、エストロゲンの結合に依存しない構成的活性を有する。いくつかの実施形態では、エストロゲン受容体断片は、リガンド結合ドメインまたはその機能性断片を含む。いくつかの実施形態では、ＭＥＤ１断片は、ＩＤＲ、ＬＸＸＬＬモチーフ、またはこれら両方を含む。いくつかの実施形態では、凝縮体は、エストロゲンまたはその機能性断片と接触される。いくつかの実施形態では、凝縮体は、選択的エストロゲン選択的調節剤（ＳＥＲＭ）と接触される。いくつかの実施形態では、ＳＥＲＭは、タモキシフェンである。いくつかの実施形態では、凝縮体を調節することで、ＭＹＣがん遺伝子の転写が低減または除去される。いくつかの実施形態では、細胞は、乳癌細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ＭＥＤ１を過剰発現する。いくつかの実施形態では、転写凝縮体は、転写凝縮体を薬剤と接触させることによって調節される。いくつかの実施形態では、薬剤は、ＥＲとＭＥＤ１との間の相互作用を低減または除去する。いくつかの実施形態では、薬剤は、ＥＲとエストロゲンとの間の相互作用を低減または除去する。いくつかの実施形態では、凝縮体は、変異ＥＲまたはその断片を含み、薬剤は、１つ以上の遺伝子の転写を低減する。
本開示の態様のいくつかは、凝縮体の形成、安定性、または形態を調節する薬剤を同定する方法に関し、この方法は、細胞を提供すること、細胞を試験薬剤と接触させること、及び試験薬剤との接触によって凝縮体の形成、安定性、または形態が調節されるかどうかを決定すること、を含み、凝縮体は、エストロゲン受容体（ＥＲ）またはその断片と、ＭＥＤ１またはその断片と、を凝縮体コンポーネントとして含む。いくつかの実施形態では、エストロゲン受容体は、変異エストロゲン受容体である。いくつかの実施形態では、変異エストロゲン受容体は、エストロゲンの結合に依存しない構成的活性を有する。いくつかの実施形態では、エストロゲン受容体断片は、リガンド結合ドメインまたはその機能性断片を含む。いくつかの実施形態では、ＭＥＤ１断片は、ＩＤＲ、ＬＸＸＬＬモチーフ、またはこれら両方を含む。いくつかの実施形態では、凝縮体は、エストロゲンまたはその機能性断片と接触される。いくつかの実施形態では、凝縮体は、選択的エストロゲン選択的調節剤（ＳＥＲＭ）と接触される。いくつかの実施形態では、ＳＥＲＭは、タモキシフェンまたはその活性代謝物である。いくつかの実施形態では、凝縮体を調節することで、ＭＹＣがん遺伝子の転写が低減または除去される。いくつかの実施形態では、細胞は、乳癌細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ＭＥＤ１を過剰発現する。いくつかの実施形態では、細胞は、ＥＲ＋乳癌細胞である。いくつかの実施形態では、ＥＲ＋乳癌細胞は、タモキシフェン処理に抵抗性である。いくつかの実施形態では、凝縮体は、検出可能な標識を含む。いくつかの実施形態では、凝縮体のコンポーネントは、検出可能な標識を含む。いくつかの実施形態では、ＥＲもしくはその断片、及び／またはＭＥＤ１もしくはその断片は、検出可能な標識を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の遺伝子は、レポーター遺伝子を含む。
本発明の態様のいくつかは、凝縮体の形成、安定性、または形態を調節する薬剤を同定する方法に関し、この方法は、インビトロ凝縮体を提供すること、凝縮体を試験薬剤と接触させること、及び試験薬剤との接触によって凝縮体の形成、安定性、または形態が調節されるかどうかを決定すること、を含み、凝縮体は、エストロゲン受容体（ＥＲ）またはその断片と、ＭＥＤ１またはその断片と、を凝縮体コンポーネントとして含む。いくつかの実施形態では、エストロゲン受容体は、変異エストロゲン受容体である。いくつかの実施形態では、変異エストロゲン受容体は、エストロゲンの結合に依存しない構成的活性を有する。いくつかの実施形態では、エストロゲン受容体断片は、リガンド結合ドメインまたはその機能性断片を含む。いくつかの実施形態では、ＭＥＤ１断片は、ＩＤＲ、ＬＸＸＬＬモチーフ、またはこれら両方を含む。いくつかの実施形態では、凝縮体は、エストロゲンまたはその機能性断片と接触される。いくつかの実施形態では、凝縮体は、選択的エストロゲン選択的調節剤（ＳＥＲＭ）と接触される。いくつかの実施形態では、ＳＥＲＭは、タモキシフェンである。いくつかの実施形態では、凝縮体は、細胞から単離される。いくつかの実施形態では、細胞は、乳癌細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ＭＥＤ１を過剰発現する。いくつかの実施形態では、細胞は、ＥＲ＋乳癌細胞である。いくつかの実施形態では、ＥＲ＋乳癌細胞は、タモキシフェン処理に抵抗性である。いくつかの実施形態では、凝縮体は、検出可能な標識を含む。いくつかの実施形態では、凝縮体のコンポーネントは、検出可能な標識を含む。いくつかの実施形態では、ＥＲもしくはその断片、及び／またはＭＥＤ１もしくはその断片は、検出可能な標識を含む。
本開示の態様のいくつかは、エストロゲン受容体（ＥＲ）またはその断片と、ＭＥＤ１またはその断片と、を凝縮体コンポーネントとして含む単離された合成転写凝縮体に関する。いくつかの実施形態では、エストロゲン受容体は、変異エストロゲン受容体である。いくつかの実施形態では、変異エストロゲン受容体は、エストロゲンの結合に依存しない構成的活性を有する。いくつかの実施形態では、エストロゲン受容体断片は、リガンド結合ドメインまたはその機能性断片を含む。いくつかの実施形態では、ＭＥＤ１断片は、ＩＤＲ、ＬＸＸＬＬモチーフ、またはこれら両方を含む。いくつかの実施形態では、凝縮体は、エストロゲンまたはその機能性断片を含む。いくつかの実施形態では、凝縮体は、選択的エストロゲン選択的調節剤（ＳＥＲＭ）を含む。
本発明のこうした特徴及び他の特徴については、添付の図面と併せて後述の詳細な説明を参照することによって理解がさらに深まるであろう。特許ファイルまたは出願ファイルは、カラーで描かれた図面を少なくとも１つ含む。カラーの図面を含むこの特許公開公報または特許出願公開公報のコピーは、要望及び必要経費の支払いに応じて特許庁から提供されることになる。
即ち、本発明の要旨は、以下のものに関する。
項１
１つ以上の遺伝子の転写を調節する方法であって、前記方法が、前記１つ以上の遺伝子と結び付く凝縮体の形成、組成、維持、崩壊、活性、及び／または制御を調節することを含み、前記凝縮体が、転写凝縮体、ヘテロクロマチン凝縮体、またはｍＲＮＡ開始複合体もしくはｍＲＮＡ伸長複合体と物理的に結び付く凝縮体である、前記方法。
本発明により、凝縮体を調節することによって遺伝子の転写を調節するための方法及びアッセイが提供され得る。
転写因子、補助因子、クロマチン制御因子、ＤＮＡ、非コードＲＮＡ、新生ＲＮＡ、及びＲＮＡポリメラーゼＩＩを含む複数のコンポーネントの高密度協同的集合体としての転写凝縮体を示す。 転写凝縮体の形成、維持、崩壊、または制御に対する天然変性ドメインまたは天然変性領域（ＩＤＲ）（配列番号１３）の影響を示す。Ａでは、ＩＤＲは、転写凝縮体を安定化している。Ｂでは、ＩＤＲと結合または相互作用する小分子が導入されたことで転写凝縮体が不安定化している。Ａ～Ｂに示されるＹＳＰＴＳＰＳというモチーフは、配列番号１３のものである。 スーパーエンハンサー及び典型的エンハンサーのモデル及び特徴を示す。Ａは、典型的エンハンサー及びスーパーエンハンサーの古典的な協同性モデルを示す模式図である。転写制御因子（「アクチベーター」と称される）がＤＮＡ結合部位に協同的に結合して高密度となることが、スーパーエンハンサーにおける転写量の上昇にも、アクチベーター濃度に対する感度上昇にも寄与する考えられている。画像は、Ｌｏｖｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０１３）から引用した。Ｂは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ＲＮＡ ＰｏｌＩＩ）のクロマチン免疫沈降シークエンシング（ＣｈＩＰ－ｓｅｑ）結合プロファイルを示し、マウス胚性幹細胞におけるＰＯＬＥ４遺伝子座及びｍｉＲ－２９０－２９５遺伝子座に対する表示の転写補助因子及びクロマチン制御因子のものが示される。転写因子結合プロファイルは、ＴＦであるＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、及びＮａｎｏｇのＣｈＩＰ－ｓｅｑ結合プロファイルをマージしたものである。ｒｐｍ／ｂｐは、リード数／百万／塩基対である。画像は、Ｈｎｉｓｚ ｅｔ ａｌ．（２０１３）から引用した。Ｃは、ヒトＴ細胞におけるＨ３Ｋ２７ＡｃのＣｈＩＰ－ｓｅｑプロファイル上に示されたＲＵＮＸ１遺伝子座におけるＣｈＩＡ－ＰＥＴ相互作用を示す。こうしたＣｈＩＡ－ＰＥＴ相互作用は、スーパーエンハンサー内のＨ３Ｋ２７Ａｃ占有領域とＲＵＮＸ１のプロモーターとの間で物理的接触が頻繁に生じていることを示す。 転写制御の単純な相分離モデルを示す。Ａは、スーパーエンハンサー－遺伝子座において転写制御因子の相分離多分子複合体を形成し得る生物学的な系の模式図である。Ｂは、生物学的な系の単純表記、及びこのモデルで相分離を引き起こし得るパラメーターである。「Ｍ」は、修飾されると架橋を形成することが可能な残基の修飾を示す。Ｃは、スーパーエンハンサー（Ｎ＝５０鎖からなる）及び典型的エンハンサー（Ｎ＝１０鎖からなる）の結合価パラメーターに転写活性（ＴＡ）が依存することを示す。架橋鎖の最大クラスターのサイズ（鎖の総数によって調製される）が、転写活性（ＴＡ）に代わるものとして定義される。結合価は、実際の結合価を参照数３で割って調整されている。５０回のシミュレーションにおける平均値（実線）及び標準偏差×２（破線）が示される。Ｋｅｑ値及び修飾因子／脱修飾因子比は一定に保った。ＨＣ（ヒル係数）は、協同的挙動を説明するための古典的指標である。挿入図は、この系においてヒル係数が鎖数またはコンポーネント数に依存することを示す。 スーパーエンハンサーの脆弱性を示す。Ａは、表示濃度のＢＲＤ４阻害剤ＪＱ１で処理した後のスーパーエンハンサー（ＩＧＬＬ５のもの）の断片のエンハンサー活性（赤色）及び典型的エンハンサー（ＰＤＨＸのもの）の断片のエンハンサー活性（灰色）を示す。エンハンサー活性は、ヒト多発性骨髄腫細胞におけるルシフェラーゼレポーターアッセイにおいて測定した。スーパーエンハンサーによって誘導されるルシフェラーゼ発現を約５０％阻害するＪＱ１濃度は、典型的エンハンサーによって誘導されるルシフェラーゼ発現のものと比較して１０倍低い（２５ｎＭ対２５０ｎＭ）ことに留意されたい。データ及び画像は、Ｌｏｖｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０１３）から引用した。Ｂは、転写活性（ＴＡ）がスーパーエンハンサー（Ｎ＝５０鎖からなる）及び典型的エンハンサー（Ｎ＝１０鎖からなる）の脱修飾因子／修飾因子比に依存することを示す。架橋鎖の最大クラスターのサイズ（鎖の総数によって調製される）が、転写活性（ＴＡ）に代わるものとして定義される。５０回のシミュレーションにおける平均値（実線）及び標準偏差×２（破線）が示される。Ｋｅｑ及びｆは、一定に保った。脱修飾因子レベルの上昇は、架橋の阻害（すなわち、結合価の減少）に相当することに留意されたい。ＴＡは、ｌｏｇ（脱修飾因子／修飾因子）＝－１．５の値に正規化されており、縦軸は、ｌｏｇ尺度で正規化されたＴＡを示す。 転写バーストを示す。Ａは、ショウジョウバエ胚の個々の核における転写活性の代表的な追跡結果である。転写活性は、蛍光プローブを使用して新生ＲＮＡを可視化することによって測定した。上のパネルは、弱いエンハンサーによって得られた代表的な追跡結果を示し、下のパネルは、強いエンハンサーによって得られた代表的な追跡結果を示す。データ及び画像は、Ｆｕｋａｙａ ｅｔ ａｌ．（２０１６）から引用した。Ｂは、スーパーエンハンサー（Ｎ＝５０鎖）及び典型的エンハンサー（Ｎ＝１０鎖）の転写活性（ＴＡ）をシミュレーションし、弱いエンハンサー及び強いエンハンサーのバースト挙動を経時的に再現したものである。Ｃは、１つの共有エンハンサーによって２つの遺伝子プロモーターが同期的に活性化されるモデルである。 インビボでの転写制御相分離（遺伝子制御エレメントの相分離複合体のモデル）を示す。複合体を形成する候補転写制御因子のいくつかが強調表示されている。Ｐ－ＣＴＤは、ＲＮＡ ＰｏｌＩＩのリン酸化Ｃ末端ドメインを示す。ヌクレオソームの化学修飾（アセチル化（Ａｃ）、メチル化（Ｍｅ））も強調表示されている。エンハンサー及びプロモーターにおいて異方向に転写が生じることで、ＲＮＡスプライシング因子が結合し得る新生ＲＮＡが生じる。コンポーネント間で生じ得る相互作用は破線として示される。 鎖の数（Ｎ）に転写活性（ＴＡ）が依存することを示す。架橋鎖の最大クラスターのサイズ（鎖の総数によって調製される）が、転写活性（ＴＡ）に代わるものとして定義される。５０回のシミュレーションにおける平均値（実線）及び標準偏差×２（破線）が示される。シミュレーションはすべて、修飾因子／脱修飾因子＝０．１、Ｋｅｑ＝ｌ、及びｆ＝５で実施されたものである。ＳＥと典型的エンハンサーとのＮ値（またはコンポーネントの濃度）の差異が十分である限り、ＴＡレベルは非常に異なる。 修飾因子／脱修飾因子バランスの急激な変化（シグナルの変化を模倣している）の後に生じるゲルの集合解離を試験するために実施したシミュレーションを示す。架橋鎖の最大クラスターのサイズ（鎖の総数によって調製される）が、転写活性（ＴＡ）に代わるものとして定義される。挿入図に示されるように、修飾因子／脱修飾因子のレベル比を（τ＝２５の時点で）０．１から０．０１６に急激に変化させており、ＴＡは、修飾因子／脱修飾因子バランスの変化からτ＝５０時間単位後に計算されている。シミュレーションはすべて、Ｎ＝５０（ＳＥのモデル）及びＫｅｑ＝１として実施されている。実線は、２５０回の反復シミュレーションにおいて計算されたＴＡの最大値が結合価（ｆ）の変化に伴って変動すること示す。クラスターが確実に形成される閾値結合価ｆｍｉｎ（図４Ｃを参照のこと）、及び修飾因子／脱修飾因子のレベル変化からτ＝５０時間単位後以内に着実な集合解離（ＴＡ＜０．５（点線）として定義される）が確実に生じる閾値結合価ｆｍａｘが同定されている。修飾因子／脱修飾因子の値を変化させてからの経過時間単位にτ＝５０という具体的な値を選んだ目的は例示であり、この具体的な値によってｆｍａｘ値が決定されている。それを超えると現実的な時間尺度ではゲルが集合解離しない最大結合価が存在するという定性的結果は、この時間尺度の選択値が変わっても揺るぎないものである。 スーパーエンハンサー及び典型的エンハンサーのノイズ特徴を示す。Ａは、転写活性（ＴＡ）の分散として測定される揺らぎ（または転写ノイズ）がＳＥ（Ｎ＝５０）の結合価及び典型的エンハンサー（Ｎ＝１０）の結合価に依存することを示す。架橋鎖の最大クラスターのサイズ（鎖の総数によって調製される）が、転写活性（ＴＡ）に代わるものとして定義される。縦軸を定義にある山括弧は、５０回の反復シミュレーションの平均値を示す。シミュレーションはすべて、修飾因子／脱修飾因子＝０．１、Ｋｅｑ＝ｌとして実施されている。正規化されたノイズ強度、そして重要なことには、ノイズが顕在化する結合価の範囲は、典型的エンハンサーと比較してＳＥでは小さかった。しかしながら、相分離点付近ではＮの値が大きくなるほどノイズの絶対強度が大きくなっていることに留意されたい。Ｂは、転写活性（ＴＡ）の分散として測定される揺らぎ（または転写ノイズ）がｆ＝５（Ｎ＝５０の場合のクラスター形成に必要な最小結合価）についてはＮに依存することを示す。シミュレーションはすべて、修飾因子／脱修飾因子＝０．１及びＫｅｑ＝ｌとして実施されている。架橋鎖の最大クラスターのサイズ（鎖の総数によって調製される）が、転写活性（ＴＡ）に代わるものとして定義される。縦軸を定義にある山括弧は、５０回の反復シミュレーションの平均値を示す。 ＢＲＤ４核内凝縮体及びＭＥＤ１核内凝縮体を可視化したものを示す。（Ａ）構造化照明顕微鏡法（ＳＩＭ）を使用して免疫蛍光法（ＩＦ）によってマウス胚性幹細胞（ｍＥＳＣ）におけるＢＲＤ４及びＭＥＤ１を画像化したものの代表的なものである。画像は、８つのスライス画像（各１２５ｎｍ）のｚ軸プロジェクションを示す。スケールバーは、５μｍを示す。ＩｇＧ対照は、図Ｓ１Ｃに示される。（Ｂ）異所性に発現したＢＲＤ４－ＧＦＰ（左パネル、緑色）とＭＥＤ１（ＭＥＤ１についてはＩＦ）（中央パネル、マゼンタ色）との共局在化を示す代表的な画像であり、これらの画像は、固定ｍＥＳＣにおいてＳＩＭによって画像化したものである。右のパネルには、２つのチャネルをマージしたものが示されており、オーバーラップは白色で示される。核の輪郭は、青線として示されており、ＤＡＰＩ染色（非掲載）によって決定した。画像は、単一のｚ軸スライス画像（１２５ｎｍ）を示す。スケールバーは、５μｍを示す。（Ｃ）ＢＲＤ４（左上のパネル、緑色）及びＨＰ１ａ（上中央パネル、マゼンタ色）の代表的な共ＩＦ画像、ならびにこれら２つのチャネルをマージしたもの（左上のパネル（オーバーラップは白色で示される））であり、これらの画像は、固定ｍＥＳＣにおいてＳＩＭによって画像化したものである。異所性に発現したＨＰ１ａ－ＧＦＰ（右下のパネル、緑色）とＭＥＤ１（ＭＥＤ１についてはＩＦ）（下中央パネル、マゼンタ色）との共局在化を示す代表的な画像、ならびにこれら２つのチャネルをマージしたもの（左下のパネル（オーバーラップは白色で示される））であり、これらの画像は、固定ｍＥＳＣにおいてＳＩＭによって画像化したものである。核の輪郭は、青線として示されており、ＤＡＰＩ染色（非掲載）によって決定した。画像は、単一のｚ軸スライス画像（１２５ｎｍ）を示す。スケールバーは、５μｍを示す。（Ｄ）既知の核内凝縮体、ＦＩＢ１（核小体）、ＮＰＡＴ（ヒストン遺伝子座構造体）、及びＨＰ１ａ（構成的ヘテロクロマチン）のマーカーに対する代表的なＩＦ画像であり、これらの画像は、デコンボリューション顕微鏡法によって画像化したものである。画像は、８つのスライス画像（各１２５ｎｍ）のｚ軸プロジェクションを示す。スケールバーは、５μｍを示す。（Ｅ）核内凝縮体の典型的な数及びサイズ（直径）である。本明細書で記載した値は黒色フォントで示されており、文献から収集した値は青色で示される（４８）。サイズ及び数の値は、ＦＩＪＩの３Ｄ ｏｂｊｅｃｔ ｃｏｕｎｔｅｒ ｐｌｕｇｉｎを使用して得た。スケールバーは、５μｍを示す。 同上。 同上。 スーパーエンハンサー関連の転写の部位にＢＲＤ４凝縮体及びＭＥＤ１凝縮体が生じることを示す。（Ａ）ｍｉｒ２９０、Ｅｓｒｒｂ、及びＫｌｆ４と結び付くスーパーエンハンサー（ＳＥ）に対するＢＲＤ４、ＭＥＤ１、及びＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ＲＮＡＰＩＩ）のＣｈＩＰ－ｓｅｑ結合プロファイルが示される（表示の通り）。各セットについて、ＳＥの位置（赤色）及び関連遺伝子（黒色）は、セットの下部に表示される。ｘ軸は、ゲノム位置を示し、リード数／百万／塩基対（ｒｐｍ／ｂｐ）をｙ軸にとってＣｈＩＰ－ｓｅｑシグナルの密集が示される。（Ｂ）ＢＲＤ４またはＭＥＤ１と、ＳＥ関連遺伝子であるｍｉｒ２９０、Ｅｓｒｒｂ、またはＫｌｆ４の新生ＲＮＡと、の共局在化を示す代表的な画像であり、これらの画像は、固定ｍＥＳＣにおいて免疫蛍光法（ＩＦ）及び蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）の蛍光によって画像化したものである（表示の通り）。試料は、スピニングディスク共焦点顕微鏡法を使用して画像化した。単一のｚ軸スライス画像（５００ｎｍ）が、表示のＩＦ及びＦＩＳＨごとに個別に示され、これらに加えて、これら２つのチャネルをマージしたもの（オーバーラップは白色で示される）が示される。ＤＡＰＩ染色（非掲載）によって決定した核の外縁が青線によって強調表示されている。「マージ」縦列において黄色のボックスによって強調表示されている領域は、ＩＦ及びＦＩＳＨから得られる共局在化領域であり、「マージ（拡大）」縦列では拡大されて詳細が示されている。スケールバーは、ＩＦ、ＦＩＳＨ、及びマージについては５μｍを示し、マージ（拡大）については０．５μｍを示す。 ＢＲＤ４凝縮体及びＭＥＤ１凝縮体が液体様ＦＲＡＰ動力学を示すことを示す。（Ａ）ＢＲＤ４－ＧＦＰ凝縮体の光退色の実施前、及び当該光退色実施から表示時間が経過した後のＢＲＤ４－ＧＦＰ発現ｍＥＳＣを示す代表的な画像である。黄色のボックスによって強調表示されている領域は、光退色の対象領域である。青色のボックスによって強調表示されている領域は、比較のための対照領域である。各画像の左下には光退色実施時点（０秒）に対する相対時間が表示されている。スケールバーは、５μｍを示す。（Ｂ）（Ａ）に示される領域をクローズアップしたタイムラプス画像である。上の横列には、パネルＡの光退色対象領域（パネルＡに示される黄色のボックス）が示される。各画像の上には、光退色実施時点に対する相対時間が示される。下の横列には、パネルＡの対照領域（パネルＡに示される青色のボックス）が示される。スケールバーは、１μｍを示す。（Ｃ）蛍光の回復を定量化し、平均化したものである。ｙ軸には、光退色実施前時点のものに対する相対シグナル強度が示される。ｘ軸には、光退色実施時点に対する相対時間が示される。非処理細胞（黒色）、及びオリゴマイシンで処理してＡＴＰを枯渇させた細胞（ＡＴＰ枯渇、赤色）についてのデータが示される。データは、非処理細胞（ｎ＝９）及びＡＴＰ枯渇細胞（ｎ＝３）の平均相対強度±ＳＥＭとして示される。（Ｄ）ＭＥＤ１－ＧＦＰを発現するｍＥＳＣを用いたこと以外は（Ａ）と同じである。スケールバーは、５μｍを示す。（Ｅ）ＭＥＤ１－ＧＦＰを発現するｍＥＳＣを用いたこと以外は（Ｂ）と同じである。スケールバーは、１μｍを示す。（Ｆ）ＭＥＤ１－ＧＦＰを発現するｍＥＳＣを用いたこと以外は（Ｃ）と同じである。データは、非処理細胞（ｎ＝５）及びＡＴＰ枯渇細胞（ｎ＝５）の平均相対強度±ＳＥＭとして示される。 ＢＲＤ４及びＭＥＤ１の天然変性領域（ＩＤＲ）がインビトロで相分離することを示す。（Ａ）ＢＲＤ４（上のグラフ）及びＭＥＤ１（下のグラフ）のアミノ酸区間について天然変性（ＰＯＮＤＲ ＶＳＬ２）スコアをプロットしたグラフである。ｙ軸にはＰＯＮＤＲ ＶＳＬ２スコアが示される。ｘ軸にはアミノ酸位置が示される。紫色のバーは、各タンパク質の天然変性Ｃ末端ドメインを示す。各天然変性ドメインの開始アミノ酸位置及び終了アミノ酸位置が表示されている。（Ｂ）この実験で使用した組換えＧＦＰ融合タンパク質の模式図である。紫色のボックスは、（Ａ）に示されるＢＲＤ４の天然変性ドメイン（ＢＲＤ４－ＩＤＲ）及びＭＥＤ１の天然変性ドメイン（ＭＥＤ１－ＩＤＲ）を示す。（Ｃ）液滴形成と結び付く濁度上昇を可視化したものである。ＢＲＤ４－ＩＤＲを含むチューブ（左のペア）、ＭＥＤ１－ＩＤＲを含むチューブ（中央のペア）、またはＧＦＰを含むチューブ（右のペア）が示される。各ペアについて、緩衝液におけるＰＥＧ－８０００（分子クラウディング剤）が存在するもの（＋）または存在しないもの（－）が示される。ペアの間には、対比用にブランクチューブが含められている。（Ｄ）異なるタンパク質濃度での液滴形成を示す代表的な画像である。ＢＲＤ４－ＩＤＲ（上の横列）、ＭＥＤ１－ＩＤＲ（中央の横列）、またはＧＦＰ（下の横列）を表示の最終濃度になるように液滴形成緩衝液に添加した。溶液を自作チャンバーにロードし、ガラスのカバースリップに焦点を合わせてスピニングディスク共焦点顕微鏡法によって画像化した。スケールバーは、５μｍを示す。（Ｅ）異なる塩濃度での液滴形成を示す代表的な画像である。ＢＲＤ４－ＩＤＲ（画像の上の横列）またはＭＥＤ１－ＩＤＲ（画像の下の横列）を１０μＭ濃度となるように液滴形成緩衝液に添加し、最終ＮａＣｌ濃度を、表示のように５０ｍＭ、１２５ｍＭ、２００ｍＭ、または３５０ｍＭとした。液滴は、（Ｄ）に記載のように可視化した。スケールバーは、５μｍを示す。（Ｆ）液滴の可逆性に関する実験を示す代表的な画像である。上の横列は、液滴形成緩衝液（タンパク質２０μＭ、ＮａＣｌ７５ｍＭ）において形成させたＢＲＤ４－ＩＤＲの液滴、及びその後にこの液滴含有緩衝液を希釈したもの、または希釈した上で塩濃度を変化させたものを示す。左の縦列は、元の量の３分の１量に分けた第１の分割液から得られた代表的な液滴を示す。中央の縦列は、元の量の３分の１量に分けた第２の分割液を等張液で１：１希釈したものを代表する液滴を示す。右の縦列は、元の量の３分の１量に分けた最後の分割液を高塩濃度溶液で１：１希釈して最終ＮａＣｌ濃度を４２５ｍＭとしたものを代表する液滴を示す。液滴は、（Ｄ）に記載のように可視化した。スケールバーは、５μｍを示す。 同上。 同上。 ＭＥＤ１のＩＤＲが細胞における相分離に関与することを示す。（Ａ）ｏｐｔｏＩＤＲアッセイの模式図であり、この模式図では、選択される天然変性ドメイン（紫色）、ｍＣｈｅｒｒｙ（赤色）、及びＣｒｙ２（オレンジ色）を含む組換えタンパク質を細胞において発現させた後、青色光に曝露することが示されている。（Ｂ）ｍＣｈｅｒｒｙ－Ｃｒｙ２組換えタンパク質を発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞に対して４８８ｎｍのレーザーによる２秒間隔の励起を行なった時間が０秒のもの（左パネル）または２００秒のもの（右パネル）を示す代表的な画像である。スケールバーは、１０μｍを示す。（Ｃ）ＭＥＤ１ ＩＤＲの一部（ＭＥＤ１のアミノ酸９４８～１１５７）がｍＣｈｅｒｒｙ－Ｃｒｙ２と融合したもの（ＭＥＤ１－ｏｐｔｏＩＤＲ）を発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞に対して４８８ｎｍのレーザーによる２秒間隔の励起を行なった時間が０秒のもの（左パネル）、６０秒のもの（中央パネル）、または２００秒のもの（右パネル）を示す代表的な画像である。１０μｍ。（Ｄ）ＭＥＤ１－ｏｐｔｏＩＤＲを発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞に対して４８８ｎｍのレーザーによる２秒間隔の励起を表示の時間行い、当該細胞の核に焦点を合わせたタイムラプス画像である。スケールバーは、５μｍを示す。黄色のボックスは、融合事象が生じたいくつかの領域のうちの１つを強調表示したものである。（Ｅ）液滴融合をクローズアップしたタイムラプス画像である。パネルＤにおいて黄色のボックスによって強調表示されている画像領域が時間枠を延長して示される。枠は、各枠の左下の隅に表示される時間に取られたものである。スケールバーは、１μｍを示す。（Ｆ）青色光による励起を行わずにｏｐｔｏＤｒｏｐｌｅｔの光退色を実施する前（左パネル）、実施している最中（中央パネル）、及び実施した後（右パネル）のＭＥＤ１－ｏｐｔｏＩＤＲのｏｐｔｏＤｒｏｐｌｅｔを示す代表的な画像である。黄色のボックスによって強調表示されている領域は、光退色の対象領域である。青色のボックスによって強調表示されている領域は、比較のための対照領域である。各画像の左下には光退色実施時点（０秒）に対する相対時間が表示されている。スケールバーは、５μｍを示す。（Ｇ）蛍光の回復を定量化し、平均化したものである。ｙ軸には、光退色実施前時点のものに対する相対シグナル強度が示される。ｘ軸には、光退色実施時点に対する相対時間が示される。データは、平均相対強度±ＳＤ（ｎ＝１５）として示される。（Ｈ）（Ｆ）において強調表示されている領域について液滴の回復がクローズアップして示されたタイムラプス画像である。図の上には光退色実施時点に対する相対時間が示される。スケールバーは、１μｍを示す。 同上。 ＢＲＤ４核内凝縮体及びＭＥＤ１核内凝縮体を可視化したものを示す。（Ａ）２つの遺伝子座に対するＢＲＤ４及びＭＥＤ１のＣｈＩＰ－ｓｅｑ結合プロファイルである（表示の通り）。各パネルについて、下部には染色体座標が示されており、左上にスケールバーが示される。ｘ軸は、ゲノム位置を示し、リード数／百万（ｒｐｍ）をｙ軸にとってＣｈＩＰ－ｓｅｑシグナルの密集が示される。（Ｂ）ｍＥＳＣにおけるＢＲＤ４結合部位またはＭＥＤ１結合部位に対するＢＲＤ４（左パネル）及びＭＥＤ１（右パネル）の占有を示すヒートマップである。各パネルは、それぞれのＢＲＤ４結合領域またはＭＥＤ１結合領域（横列）について、ＢＲＤ４結合領域またはＭＥＤ－１結合領域のピークを中心とする４ｋｂ幅の領域を示す。赤色は、ＣｈＩＰ－ｓｅｑシグナルが存在することを示す。黒色は、バックグラウンドを示す。（Ｃ）構造化照明顕微鏡法（ＳＩＭ）を使用して、二次ＩｇＧ抗体での免疫蛍光法による検出をマウス胚性幹細胞（ｍＥＳＣ）において行ったものである。ＩｇＧでの染色（左パネル）、ＤＡＰＩでの染色（中央パネル）、及びマージ画像（右パネル）が示される。スケールバーは、５μｍを示す。 スーパーエンハンサー関連の転写の部位にＢＲＤ４凝縮体及びＭＥＤ１凝縮体が生じることを示す。（Ａ）Ｎａｎｏｇ遺伝子座に対するＢＲＤ４、ＭＥＤ１、及びＲＮＡポリメラーゼＩＩのＣｈＩＰ－ｓｅｑ結合プロファイルが示される（表示の通り）。ｘ軸は、ゲノム位置を示し、リード数／百万／塩基対（ｒｐｍ／ｂｐ）をｙ軸にとってＣｈＩＰ－ｓｅｑシグナルの密集が示される。（Ｂ）ＢＲＤ４またはＭＥＤ１とＳＥ関連遺伝子Ｎａｎｏｇの新生ＲＮＡとの共局在化を示す代表的な画像であり、これらの画像は、固定ｍＥＳＣにおいて免疫蛍光法（ＩＦ）及び蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）の蛍光によって画像化したものである（表示の通り）。試料は、スピニングディスク共焦点顕微鏡法を使用して画像化した。上の横列は、ＢＲＤ４についての比較を示す。下の横列は、ＭＥＤ１についての比較を示す。各横列について、単一のｚ軸スライス画像（５００ｎｍ）が、ＩＦ（左パネル）及びＦＩＳＨ（中央パネル）ごとに個別に示され、これらに加えて、これら２つのチャネルをマージしたもの（右パネル）が示される。ＤＡＰＩ染色（非掲載）によって決定した核の外縁が青線によって強調表示されている。黄色のボックスによって強調表示されている領域は、ＩＦ及びＦＩＳＨから得られる共局在化領域であり、離れた右パネルには、この強調表示領域をクローズアップした画像が示される。スケールバーは、ＩＦ、ＦＩＳＨ、及びマージについては５μｍを示し、マージ（拡大）については０．５μｍを示す。（Ｃ）ＩＦフォーカスとＦＩＳＨフォーカスとの間の距離の定量化についての模式図である。最近傍フォーカス解析（上のパネル）については、ＦＩＳＨシグナルと最近傍ＩＦ像との間の距離を選択した。確率論的フォーカス解析（下のパネル）については、ＦＩＳＨシグナルと５μｍ半径以内に存在する無作為なＩＦ像との間の距離を選択した。（Ｄ）ＢＲＤ４のＩＦフォーカスとＦＩＳＨシグナルと間の距離（上の横列）、またはＭＥＤ１のＩＦフォーカスとＦＩＳＨシグナルと間の距離（下の横列）のボックスプロットであり、これらの距離は、ボックスプロットの各セットの上に表示される遺伝子について、（Ｃ）に定義される最近傍解析または確率論的解析を行って得たものである。各セットの左上には、最近傍解析のものと確率論的解析のものとを比較して得られたｐ値（ｔ検定）、解析したＲＮＡ－ＦＩＳＨフォーカスの数、ならびに独立した反復測定の回数が報告される。 同上。 ＢＲＤ４凝縮体及びＭＥＤ１凝縮体が液体様ＦＲＡＰ動力学を示すことを示す。（Ａ）光退色実施から回復に至るまでの時間の半分の時間（Ｔ＿ｈａｌｆ）、ならびに見かけの拡散速度（本明細書の試験で得たもの）をＢＲＤ４及びＭＥＤ１について示す表である。比較として、ＤＤＸ４及びＮＩＣＤに関する以前の公開情報が示される。（Ｂ）蛍光の回復を定量化し、平均化したものである。ｙ軸には、光退色実施前時点のものに対する相対シグナル強度が示される。ｘ軸には、光退色実施時点に対する相対時間が示される。細胞を固定化し、光退色実施後のタンパク質の拡散を制限するためにＰＦＡで処理したＢＲＤ－ＧＦＰ発現細胞（青色）及びＭＥＤ１－ＧＦＰ発現細胞（赤色）についてデータが示される。データは、平均相対強度±ＳＥＭとして示される。（Ｃ）グルコースの枯渇及びオリゴマイシンでの処理に応じたＡＴＰの枯渇を定量化したものである。 ＢＲＤ４及びＭＥＤ１の天然変性領域（ＩＤＲ）がインビトロで相分離することを示す。（Ａ）ＢＲＤ４－ＩＤＲの液滴及びＭＥＤ１－ＩＤＲの液滴についてのアスペクト比の分布を示すボックスプロットである。調べた液滴の数及び平均アスペクト比が示される。ボックスプロットは、１０～９０パーセンタイルを示す。（Ｂ）ＢＲＤ４－ＩＤＲ（左パネル）またはＭＥＤ１－ＩＤＲ（右パネル）についてタンパク質濃度と液滴サイズとの間の関係性を示すドットプロットである。ｘ軸にはタンパク質濃度（μＭ）が示され、ｙ軸には２次元画像の面積に応じた液滴サイズが示される。（Ｃ）低タンパク質濃度において小さな液滴が存在することを示す画像である。（Ｄ）ＢＲＤ４－ＩＤＲ（左パネル）またはＭＥＤ１－ＩＤＲ（右パネル）について塩濃度と液滴サイズとの間の関係性を示すドットプロットである。ｘ軸には塩濃度（ｍＭ）が示され、ｙ軸には２次元画像の面積に応じた液滴サイズが示される。 ＯＣＴ４及びメディエーターがインビボでスーパーエンハンサーを占有することを示す。ＥＳＣにおけるＳＥに対するＯＣＴ４及びＭＥＤ１のＣｈＩＰ－ｓｅｑトラック（左縦列）、ならびにＯＣＴ４ ＩＦとＲＮＡ－ＦＩＳＨとの併用によって、ＯＣＴ４がＥｓｒｒｂ、Ｎａｎｏｇ、Ｔｒｉｍ２８、及びＭｉｒ２９０を占有することが実証されている。Ｈｏｅｃｈｓｔ染色を使用して核の外縁（青線によって強調表示されている）を決定した。最も右側の２つの縦列は、少なくとも１１枚の画像から得られたＲＮＡ－ＦＩＳＨフォーカスに中心を置いた平均ＲＮＡ ＦＩＳＨシグナル及び平均ＯＣＴ４ ＩＦシグナルを示す。無作為に選択された核内位置における平均ＯＣＴ４ ＩＦシグナルは図２７に示される。 ＭＥＤ１凝縮体が、インビボでＯＣＴ４結合に依存することを示す。（Ａ）ＯＣＴ４の分解を示す模式図である。ＯＣＴ４のＣ末端は、両アレル共に内在性にＦＫＢＰタンパク質でタグ付けされている。このＯＣＴ４は、小分子ｄＴａｇに曝露されるとユビキチン化され、急速に分解される。（Ｂ）ＤＭＳＯまたはｄＴＡＧで２４時間処理したＦＫＢＰタグ付きＯＣＴ４保有ＥＳＣにおけるスーパーエンハンサー（ＳＥ）誘導性遺伝子または典型的エンハンサー（ＴＥ）誘導性遺伝子に対するＯＣＴ４及びＭＥＤ１のＣｈＩＰ－ｓｅｑのリード数ならびにＲＮＡ－ｓｅｑのリード数のｌｏｇ２倍率変化を示すボックスプロットである。（Ｃ）Ｎａｎｏｇ遺伝子座に対するＯＣＴ４（緑色）及びＭＥＤ１（黄色）のＣｈＩＰ－ｓｅｑデータを示すゲノムブラウザー図である。Ｎａｎｏｇ ＳＥ（赤色）では、ＯＣＴ４の分解後にＯＣＴ４及びＭＥＤ１の結合が９０％減少することが見て取れる。（Ｄ）ＯＣＴ４が分解されるとＮａｎｏｇ ｍＲＮＡのＲＮＡ－ｓｅｑの正規化リード数が６０％減少することが見て取れる。（Ｅ）ＤＭＳＯまたはｄＴＡＧで処理したＦＫＢＰタグ付きＯＣＴ４保有ＥＳＣにおけるＮａｎｏｇ遺伝子座に対するＤＮＡ ＦＩＳＨと共にＯＣＴ４及びＭＥＤ１のＩＦを示す共焦点顕微鏡画像である。挿入図は、拡大画像であり、黄色のボックスで示される。マージ画像は、３つのチャネル（ＯＣＴ４ ＩＦ、ＭＥＤ１ ＩＦ、及びＮａｎｏｇ ＤＮＡ ＦＩＳＨ）をすべて統合して示すものである。（Ｆ）ＥＳＣ及び分化細胞（Ｄｉｆｆ）におけるＭｉｒ２９０ ＳＥに対するＯＣＴ４ ＣｈＩＰ－ｑＰＣＲである。対照に対する濃縮度（ＥＳＣにおけるシグナルに対するもの）として示される。エラーバーは、２回の生物学的反復測定から得られた平均値の標準誤差を示す。（Ｇ）ＥＳＣ及び分化細胞（Ｄｉｆｆ）におけるＭｉｒ２９０ ＳＥに対するＭＥＤ１ ＣｈＩＰ－ｑＰＣＲである。対照に対する濃縮度（ＥＳＣにおけるシグナルに対するもの）として示される。エラーバーは、２回の生物学的反復測定から得られたＳＥＭを示す。（Ｈ）ＥＳＣまたは分化細胞（Ｄｉｆｆ）におけるＭｉｒ２９０ ｍｉＲＮＡのＲＮＡ－ｓｅｑの正規化リード数である。エラーバーは、２回の生物学的反復測定から得られたＳＥＭを示す。（Ｉ）ＥＳＣ及び分化細胞におけるＭＥＤ１ ＩＦ、及びＭｉｒ２９０ゲノム遺伝子座に対するＤＮＡ ＦＩＳＨを示す共焦点顕微鏡画像である。マージ（拡大）は、チャネルをマージして拡大した画像であり、黄色のボックスで示される。 ＯＣＴ４がインビトロでＭＥＤ１と共に液滴を形成することを示す。（Ａ）ＶＳＬ２アルゴリズム（ｗｗｗ．ｐｏｎｄｒ．ｃｏｍ）によって計算されたＯＣＴ４の天然変性を示すグラフである。変性スコアグラフ（Ｂｒｅｈｍ ｅｔ ａｌ．，１９９７）の上には、ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）及び活性化ドメイン（ＡＤ）が表示される。（Ｂ）１２５ｍＭのＮａＣｌ及び１０％のＰＥＧ－８０００を含む液滴形成緩衝液における表示濃度でのＯＣＴ４－ＧＦＰ（上の横列）及びＭＥＤ１－ＩＤＲ－ＧＦＰ（下の横列）の液滴形成を示す代表的な画像である。（Ｃ）１２５ｍＭのＮａＣｌ及び１０％のＰＥＧ－８０００を含む液滴形成緩衝液において各１０ｕＭのＧＦＰまたはＯＣＴ４－ＧＦＰと混合したＭＥＤ１－ＩＤＲ－ｍＣｈｅｒｒｙの液滴形成を示す代表的な画像である。（Ｄ）ＯＣＴ４－ＧＦＰ及びＭＥＤ１－ＩＤＲ－ｍＣｈｅｒｒｙの異型の液滴のＦＲＡＰである。共焦点画像は、光退色実施時点（０）に対する表示の相対時点に撮影した。（Ｅ）異なる濃度の塩及び１０％のＰＥＧ－８０００を含む液滴形成緩衝液における１０ｕＭのＭＥＤ１－ＩＤＲ－ｍＣｈｅｒｒｙ及びＯＣＴ４－ＧＦＰの液滴形成を示す代表的な画像である。 ＭＥＤ１を伴うＯＣＴ４の相分離が特定の相互作用に依存することを示す。（Ａ）ＡＤにおけるアミノ酸頻度によって順序付けされたアミノ酸富化解析（上のパネル）、ＯＣＴ４のアミノ酸残基当たりの正味荷電の解析（下のパネル）である。（Ｂ）液滴形成を示す代表的な画像であり、ポリ－ＥペプチドがＭＥＤ１－ＩＤＲ液滴に取り込まれることを示す。１２５ｍＭのＮａＣｌ及び１０％のＰＥＧ－８０００を含む液滴形成緩衝液に対して、ＭＥＤ１－ＧＦＰ、ならびにＴＭＲで標識されたプロリンデカペプチドまたはグルタミン酸デカペプチド（それぞれポリ－Ｐ及びポリ－Ｅ）を、それぞれ１０ｕＭで添加した。（Ｃ）（上のパネル）ＯＣＴ４タンパク質の模式図であり、ＡＤに位置する水平線では、酸性Ｄ残基（青色）及び酸性Ｅ残基（赤色）が印付けされている。Ｎ－ＡＤにおける１７個の酸性残基、及びＣ－ＡＤにおける６つの酸性残基をすべてアラニンに変異させてＯＣＴ４酸性変異体を生成させた。（下のパネル）液滴形成の代表的な共焦点画像であり、ＯＣＴ４酸性変異体がＭＥＤ１－ＩＤＲ液滴に密集する能力が弱まっていることを示す。１２５ｍＭのＮａＣｌ及び１０％のＰＥＧ－８０００を含む液滴形成緩衝液に対して、ＭＥＤ１－ＩＤＲ－ｍＣｈｅｒｒｙ及びＯＣＴ４－ＧＦＰまたはＯＣＴ４酸性変異体－ＧＦＰを１０ｕＭで添加した。（Ｄ）（上のパネル）液滴形成を示す代表的な画像であり、ＯＣＴ４はメディエーター複合体液滴に取り込まれるが、ＯＣＴ４酸性変異体はメディエーター複合体液滴に取り込まれないことを示す。１４０ｍＭのＮａＣｌ及び１０％のＰＥＧ－８０００を含む液滴形成緩衝液において精製メディエーター複合体を、１０ｕＭのＧＦＰ、ＯＣＴ４－ＧＦＰ、またはＯＣＴ４酸性変異体－ＧＦＰと混合した。（下のパネル）メディエーター複合体液滴におけるＧＦＰ、ＯＣＴ４－ＧＦＰ、またはＯＣＴ４酸性変異体－ＧＦＰの濃縮比である。エラーバーは、１０～９０パーセンタイルの分布（Ｎ＞２０）を示す。（Ｅ）（上のパネル）ＧＡＬ４活性化アッセイの模式図である。ＧＡＬ４－ＤＢＤ融合タンパク質用の発現ベクターと共にＧＡＬ４ルシフェラーゼレポータープラスミドがマウスＥＳ細胞にトランスフェクトされている。（下のパネル）ＧＡＬ４－ＤＢＤ、ＧＡＬ－ＯＣＴ４－ＣＡＤ、またはＧＡＬ－ＯＣＴ４－ＣＡＤ酸性変異体をトランスフェクトしたマウスＥＳ細胞のルシフェラーゼ活性によってＡＤ活性を測定した。 複数のＴＦがメディエーター液滴と共に相分離することを示す。（Ａ）（左のグラフ）さまざまなタンパク質クラスの変性パーセント（ｘ軸）を、そのクラスの変性タンパク質の累積的割合（ｙ軸）に対してプロットしたものである。（右のグラフ）転写因子（ＴＦ）ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）及び推定活性化ドメイン（ＡＤ）の変性率である。（Ｂ）液滴形成を示す代表的な画像であり、表示のＴＦによる同型の液滴の形成をアッセイしたものである。組換えのＭＹＣ－ＧＦＰ（１２ｕＭ）、ｐ５３－ＧＦＰ（４０ｕＭ）、ＮＡＮＯＧ－ＧＦＰ（１０ｕＭ）、ＳＯＸ２－ＧＦＰ（４０ｕＭ）、ＲＡＲａ－ＧＦＰ（４０ｕＭ）、ＧＡＴＡ－２－ＧＦＰ（４０ｕＭ）、及びＥＲ－ＧＦＰ（４０ｕＭ）を、１２５ｍＭのＮａＣｌ及び１０％のＰＥＧ－８０００を含む液滴形成緩衝液に添加した。（Ｃ）液滴形成を示す代表的な画像であり、試験したＴＦのすべてがＭＥＤ１－ＩＤＲ液滴に取り込まれたことを示す。ＭＥＤ１－ＩＤＲｍＣｈｅｒｒｙ（１０ｕＭ）と、ＭＹＣ－ＧＦＰ、ｐ５３－ＧＦＰ、ＮＡＮＯＧ－ＧＦＰ、ＳＯＸ２－ＧＦＰ、ＲＡＲａ－ＧＦＰ、ＧＡＴＡ－２－ＧＦＰ、またはＥＲ－ＧＦＰのいずれか（１０ｕＭ）とを、１２５ｍＭのＮａＣｌ及び１０％のＰＥＧ－８０００を含む液滴形成緩衝液に添加した。 ＭＥＤ１を伴うエストロゲン受容体の相分離をエストロゲンが刺激することを示す。（Ａ）エストロゲン刺激による遺伝子活性化を示す模式図である。エストロゲンは、ＥＲのリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）に結合する（この結合によって、ＭＥＤ１－ＩＤＲ内のＬＸＸＬＬモチーフに対する結合ポケットが露出する）ことによって、ＥＲとメディエーター及びＲＮＡＰＩＩとの相互作用を促進する。（Ｂ）組換えタンパク質の生成に使用したＭＥＤ１－ＩＤＲＸＬ及びＭＥＤ１－ＩＤＲの模式図である。（Ｃ）液滴形成を示す代表的な画像であり、ＥＲ－ＧＦＰ及びＭＥＤ１－ＩＤＲＸＬ－ｍＣｈｅｒｒｙの同型の液滴の形成をアッセイしたものである。このアッセイは、１２５ｍＭのＮａＣｌ及び１０％のＰＥＧ－８０００を含む液滴形成緩衝液において表示のタンパク質濃度で実施した。（Ｄ）液滴形成の代表的な共焦点画像であり、ＥＲがＭＥＤ１－ＩＤＲＸＬ液滴に取り込まれること、このことに加えて、エストロゲンを添加すると、異型の液滴の形成が大幅に増進したことを示す。ＥＲ－ＧＦＰ、エストロゲンを存在させたＥＲ－ＧＦＰ、またはＧＦＰがＭＥＤ１－ＩＤＲＸＬと混合されている。表示のタンパク質をそれぞれ、１２５ｍＭのＮａＣｌ及び１０％のＰＥＧ－８０００を含む液滴形成緩衝液に１０ｕＭで添加した。（Ｅ）ＭＥＤ１－ＩＤＲＸＬ液滴における、ＥＲ－ＧＦＰ、エストロゲンを存在させたＥＲ－ＧＦＰ、またはＧＦＰの濃縮比である。エラーバーは、１０～９０パーセンタイルの分布（Ｎ＞２０）を示す。 ＴＦ－コアクチベーター相分離が、トランス活性化に必要な残基に依存することを示す。（Ａ）１２５ｍＭのＮａＣｌ及び１０％のＰＥＧ－８０００を含む液滴形成緩衝液に対してＧＣＮ４－ＧＦＰまたはＭＥＤ１５－ｍＣｈｅｒｒｙを添加したときの液滴形成を示す代表的な共焦点画像である。（Ｂ）液滴形成を示す代表的な画像であり、ＧＣＮ４がＭＥＤ１５と共に液滴を形成することを示す。１２５ｍＭのＮａＣｌ及び１０％のＰＥＧ－８０００を含む液滴形成緩衝液に対して、ＧＣＮ４－ＧＦＰ及びｍＣｈｅｒｒｙ、またはＧＣＮ４－ＧＦＰ及びＭＥＤ１５－ｍＣｈｅｒｒｙを１０ｕＭで添加し、表示のフィルターを用いて蛍光顕微鏡で画像化した。（Ｃ）（上の横列）活性化ドメイン（ＡＤ）及びＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）から構成されるＧＣＮ４タンパク質の模式図である。ＡＤの疎水性パッチにおける芳香族残基には、青線で印が付けられている。これらの疎水性パッチにおける芳香族残基の１１個すべてをアラニン（Ａ）に変異させてＧＣＮ４芳香族変異体を生成させた。（下の横列）液滴形成を示す代表的な画像であり、ＧＣＮ４芳香族変異体がＭＥＤ１５と共に液滴を形成する能力が弱まっていることを示す。１２５ｍＭのＮａＣｌ及び１０％のＰＥＧ－８０００を含む液滴形成液に対して、ＧＣＮ４－ＧＦＰまたはＧＣＮ４芳香族変異体－ＧＦＰとＭＥＤ１５－ｍＣｈｅｒｒｙとを、それぞれ１０ｕＭで添加した。（Ｄ）（上のパネル）液滴形成を示す代表的な画像であり、ＧＣＮ４野生型はメディエーター複合体液滴に取り込まれるが、ＧＣＮ４芳香族変異体はメディエーター複合体液滴に取り込まれないことを示す。１２５ｍＭのＮａＣｌ及び１０％のＰＥＧ－８０００を含む液滴形成緩衝液においてＧＣＮ４－ＧＦＰまたはＧＣＮ４芳香族変異体－ＧＦＰを１０ｕＭとなるように精製メディエーター複合体と混合した。（Ｅ）（左のパネル）Ｌａｃアッセイの模式図である。Ｌａｃオペロンが反復して５０，０００個存在するＵ２ＯＳ細胞に対してＬａｃ結合ドメイン－ＣＦＰ－ＡＤ融合タンパク質がトランスフェクトされている。（右のパネル）表示のＬａｃ結合タンパク質コンストラクトをトランスフェクトしたＬａｃ－Ｕ２ＯＳ細胞におけるＭＥＤ１のＩＦである。（Ｆ）ＧＡＬ４活性化アッセイである。ＧＡＬ４ ＤＢＤと融合した表示の活性化ドメインの２９３Ｔ細胞におけるルシフェラーゼ活性によって転写量を測定した。（Ｇ）スーパーエンハンサーにおいて転写因子及びコアクチベーターが相分離凝縮体を形成して遺伝子活性化を誘導することを示すモデルである。このモデルでは、転写凝縮体では、動的相互作用及び構造化相互作用の両方が生じる。 無作為なフォーカス解析を示す。表示のＲＮＡ ＦＩＳＨフォーカスに中心を置いた平均蛍光強度（上のパネル）と、Ｘ及びＹの＋／－１．５ミクロンに無作為に分布したＩＦフォーカスの平均蛍光強度（下のパネル）と、が比較されている。カラースケールバーは、任意単位の蛍光強度を示す。 ＯＣＴ４の分解及びＥＳ細胞の分化を示す。（Ａ）Ｏｃｔ４－ＦＫＢＰ細胞操作方針の模式図である。修復ベクター及びＣａｓ９発現プラスミドをＶ６．５マウスＥＳ細胞にトランスフェクトして、選択のためのＢＦＰまたはＲＦＰのいずれかを含むノックイン遺伝子座を生成させた（左）。ＷＴ ＥＳ細胞または非処理ＯＣＴ４－ｄＴＡＧＥＳ細胞におけるＯＣＴ４、ＨＡ（ＦＫＢＰ上のもの）、及びアクチンに対して行ったブロットであり、ＯＣＴ４では予想通りにサイズシフトが生じている（右）。（Ｂ）ｄＴａｇ４７または媒体（ＤＭＳＯ）のいずれかで処理したＯＣＴ４デグロン株（ｄＴＡＧ）におけるＯＣＴ４（左のパネル）、ＭＥＤ１（右のパネル）、及びベータ－アクチンに対して行ったウエスタンブロットである。（Ｃ）Ｎａｎｏｇ ＤＮＡ ＦＩＳＨフォーカス内のＭＥＤ１の免疫蛍光シグナルの平均強度を、ＤＭＳＯで処理したＯＣＴ４－デグロン細胞と、ｄＴＡＧで処理したＯＣＴ４－デグロン細胞と、において比較したものである。Ｎ＝５の画像で作成したものであり、エラーバーは、１０～９０パーセンタイルの分布である。（Ｄ）分化細胞及びＥＳ細胞のＭｉＲ２９０遺伝子座に対するＯＣＴ４ ＣｈＩＰ－ｑＰＣＲ及びＭＥＤ１ ＣｈＩＰ－ｑＰＣＲに使用したプライマーの位置（それぞれＰ１及びＰ２）を示す模式図である。（Ｅ）ＥＳ細胞、またはＬＩＦの供給停止によって分化した細胞におけるＭＥＤ１及びベータ－アクチンに対するウエスタンブロットである。（Ｆ）ＭｉＲ２９０ ＤＮＡ ＦＩＳＨフォーカス内のＭＥＤ１の免疫蛍光シグナルの平均強度を、ＥＳ細胞と、ＬＩＦの供給停止によって分化した細胞と、において比較したものである。Ｎ＝５の画像で作成したものであり、エラーバーは、１０～９０パーセンタイルの分布である。 ＭＥＤ１及びＯＣＴ４による液滴形成を示す。（Ａ）ＮａＣｌ含有濃度が１２５ｍＭであり、ＰＥＧ－８０００含有率が１０％の液滴形成緩衝液に形成されるＭＥＤ１－ＩＤＲ－ｍＣｈｅｒｒｙ液滴における濃縮比をＯＣＴ４－ＧＦＰとＧＦＰとで比較したものである。エラーバーは、１０～９０パーセンタイルの分布（Ｎ＞２０）を示す。（Ｂ）塩濃度が１２５ｍＭであり、ＰＥＧ－８０００含有率が１０％の溶液（各タンパク質の含有濃度１０ｕＭ）に形成されたＭＥＤ１－ＩＤＲ－ＯＣＴ４液滴の面積（マイクロメーター四方中）ある。（Ｃ）塩濃度が１２５ｍＭであり、ＰＥＧ－８０００含有率が１０％の溶液（各タンパク質の含有濃度１０ｕＭ）に形成されたＭＥＤ１－ＩＤＲ－ＯＣＴ４液滴のアスペクト比である。エラーバーは、１０～９０パーセンタイルの分布（Ｎ＞２０）を示す。（Ｄ）塩濃度が１２５ｍＭ、２２５ｕＭ、または３００ｕＭであり、ＰＥＧ－８０００含有率が１０％の溶液（各タンパク質の含有濃度１０ｕＭ）に形成されたＭＥＤ１－ＩＤＲ－ＯＣＴ４液滴の面積（マイクロメーター四方中）ある。（Ｅ）クラウディング剤を用いないＮａＣｌ濃度５０ｍＭでの液滴形成を蛍光顕微鏡法によって画像化した結果であり、表示のタンパク質またはタンパク質の組み合わせ（各１０ｕＭ）についての結果を示し、パネルの上に表示されるチャネルで画像化したものである。（Ｆ）クラウディング剤を用いずにＮａＣｌ濃度５０ｍＭで液滴形成緩衝液に形成されたＭＥＤ１－ＩＤＲ－ｍＣｈｅｒｒｙ液滴における濃縮比をＯＣＴ４－ＧＦＰとＧＦＰとで比較したものである。エラーバーは、１０～９０パーセンタイルの分布（Ｎ＞２０）を示す。 変異ＯＣＴ４の相分離を示す。（Ａ）１０％のＰＥＧ－８０００及び１２５ｍＭのＮａＣｌを含む液滴形成緩衝液において表示濃度の表示のＴＭＲ標識ポリペプチドを蛍光顕微鏡法によって分析したものである。（Ｂ）ＭＥＤ１－ＩＤＲ－ｍＣｈｅｒｒｙ液滴内への表示のポリペプチドの濃縮比である。エラーバーは、１０～９０パーセンタイルの分布（Ｎ＞２０）を示す。（Ｃ）ＭＥＤ１－ＩＤＲ－ｍＣｈｅｒｒｙ液滴内への表示のタンパク質の濃縮比である。エラーバーは、１０～９０パーセンタイルの分布（Ｎ＞２０）を示す。（Ｄ）（上のパネル）ＯＣＴ４タンパク質の模式図であり、活性化ドメイン（ＡＤ）における芳香族残基には、青色の水平線で印が付けられている。Ｎ末端活性化ドメイン（Ｎ－ＡＤ）における９つの芳香族残基、及びＣ末端活性化ドメイン（Ｃ－ＡＤ）における１０個の芳香族残基をすべてアラニンに変異させてＯＣＴ４芳香族変異体を生成させた。（下のパネル）液滴形成の代表的な共焦点画像であり、ＯＣＴ４芳香族変異体が依然としてＭＥＤ１－ＩＤＲ液滴に取り込まれることを示す。１２５ｍＭのＮａＣｌ及び１０％のＰＥＧ－８０００を含む液滴形成緩衝液に対して、ＭＥＤ１－ＩＤＲ－ｍＣｈｅｒｒｙ及びＯＣＴ４－ＧＦＰ、またはＭＥＤ１－ＩＤＲ－ｍＣｈｅｒｒｙ及びＯＣＴ４芳香族変異体－ＧＦＰをそれぞれ１０ｕＭで添加し、表示のフィルターを用いて蛍光顕微鏡で可視化した。（Ｅ）インタクトなメディエーター複合体の液滴をペレット化させることによって収集し、インプット材料、上清、及びペレットを、ロード体積を揃えてＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルで泳動させ、ｓｙｐｒｏルビーで染色した。ペレットに存在したメディエーターサブユニットについては、最も右側の縦列に注釈が記載されている。 さまざまなＴＦがメディエーターと共に相分離することを示す。（Ａ）ＭＥＤ１－ＩＤＲ－ｍＣｈｅｒｒｙ液滴における表示のＧＦＰ融合型ＴＦの濃縮比である。エラーバーは、１０～９０パーセンタイルの分布（Ｎ＞２０）を示す。（Ｂ）１０％のＰＥＧ－８０００及び１２５ｍＭのＮａＣＬを含む液滴形成緩衝液に形成された異型のｐ５３－ＧＦＰ／ＭＥＤ１－ＩＤＲ－ｍＣｈｅｒｒｙ液滴のＦＲＡＰであり、３０秒にわたって１秒ごとに画像化したものである。 エストロゲン受容体がＭＥＤ１と共に相分離することを示す。１０ｕＭのエストロゲンの存在下または非存在下でのＭＥＤ１－ＩＤＲ－ｍＣｈｅｒｒｙ液滴におけるＥＲ－ＧＦＰの濃縮比である。液滴は、ＮａＣｌ含有濃度が１２５ｍＭであり、ＰＥＧ－８０００含有率が１０％の溶液において形成されたものである。エラーバーは、１０～９０パーセンタイルの分布（Ｎ＞２０）を示す。 ＧＣＮ４及びＭＥＤ１５が相分離液滴を形成することを示す。（Ａ）１０％のＰＥＧ－８０００及び１２５ｍＭのＮａＣｌを含む液滴形成緩衝液におけるＧＣＮ４－ＧＦＰ液滴におけるｍＣｈｅｒｒｙまたはＭＥＤ１５－ｍＣｈｅｒｒｙの濃縮比である。エラーバーは、１０～９０パーセンタイルの分布（Ｎ＞２０）を示す。（Ｂ）１０％のＰＥＧ－８０００及び１２５ｍＭのＮａＣｌを含む液滴形成緩衝液に形成された異型のＧＣＮ４－ＧＦＰ／ＭＥＤ１５－ＩＤＲ－ｍＣｈｅｒｒｙ液滴のＦＲＡＰであり、３０秒にわたって１秒ごとに画像化したものである。（Ｃ）１０％のＰＥＧ－８０００及び１２５ｍＭの塩を含む液滴形成緩衝液に対して表示濃度で添加したＧＣＮ４－ＧＦＰ及びＭＥＤ１５－ｍＣｈｅｒｒｙの相図である。（Ｄ）Ｃから得られたＧＣＮ４液滴の濃縮比である。エラーバーは、１０～９０パーセンタイルの分布（Ｎ＞２０）を示す。（Ｅ）１０％のＰＥＧ－８０００及び１２５ｍＭのＮａＣｌに表示濃度で存在するＧＣＮ４－ＧＦＰまたはＧＣＮ４－ＧＦＰの芳香族変異体を蛍光画像化したものであり、ＧＦＰチャネルに由来する画像が示される。（Ｆ）１０％のＰＥＧ－８０００及び１２５ｍＭの塩を含む液滴形成緩衝液に形成されたＭＥＤ１５－ｍＣｈｅｒｒｙ液滴におけるＧＣＮ４－ＧＦＰまたはＧＣＮ４－ＧＦＰの芳香族変異体の濃縮比である。エラーバーは、１０～９０パーセンタイルの分布（Ｎ＞２０）を示す。（Ｇ）メディエーター複合体液滴におけるＧＦＰ、ＧＣＮ４－ＧＦＰ、またはＧＣＮ４芳香族変異体－ＧＦＰの濃縮比である。エラーバーは、１０～９０パーセンタイルの分布（Ｎ＞２０）を示す。 ＥＲ介在性の遺伝子活性化、ならびにＥＲ及びＭＥＤ１の相分離をタモキシフェンが阻害することを示す。左上部は、タモキシフェンがエストロゲン受容体（ＥＲ）のリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）に結合することを示す。右下部は、ＧＡＬ４トランス活性化アッセイにおいてＥＲ介在性の遺伝子活性化による転写量がエストロゲンに依存しており、タモキシフェンによって遮断されることを示す。左側は共焦点顕微鏡画像であり、ＧＦＰ標識ＥＲ、及びＬＸＸＬ結合ポケットを含むｍＣｈｅｒｒｙ標識ＭＥＤ１－ＩＤＲ（ＭＥＤ１－ＩＤＲＸＬ）がエストロゲン存在下では凝縮体を形成するが、このエストロゲン依存的な凝縮体形成がタモキシフェンによって遮断されることを示すものである。 エストロゲンに刺激されるとＥＲがスーパーエンハンサーを確立することが知られており、ＭＥＤ１がＥＲ＋乳癌に過剰発現する（右上のグラフ）ことを示す。ＭＥＤ１は、ＥＲ機能及びＥＲ＋乳癌の発がんに必要とされる。 リガンドが結合したＮＨＲ（核内ホルモン受容体（例えば、核内受容体））が誘導性スーパーエンハンサーに転写凝縮体（ＴＣ）を確立することを示す。こうしたＴＣが変化することが発がんの機構である。発がん性凝縮体を進化させることが、がんにおける薬物抵抗性を細胞が獲得する機構であり、現存する抗新生物薬物は、発がん性転写凝縮体を標的とし得る。こうしたことを踏まえると、ＴＣは、発がん性転写因子介在性疾患の合理的な標的である。 ＥＲ凝縮体（左縦列－緑色）、ＭＥＤ１－ＩＤＲＸＬ凝縮体（中央縦列－赤色）、及びＭＥＤ１－ＩＤＲＸＬ／ＥＲ凝縮体（右縦列－オレンジ色）の共焦点顕微鏡画像を示す。右下のパネルは、エストロゲン（１０ｕＭ）がＭＥＤ１－ＩＤＲＸＬ凝縮体へのＥＲの取り込みを刺激することを示す。この取り込みは、ＭＥＤ－ＩＤＲにおけるＬＸＸＬポケットの存在に依存している。 ＥＲ凝縮体（左縦列－緑色）、ＭＥＤ１－ＩＤＲＸＬ凝縮体（中央縦列－赤色）、及びＭＥＤ１－ＩＤＲＸＬ／ＥＲ凝縮体（右縦列－オレンジ色）の共焦点顕微鏡画像を示す。右中央のパネルは、エストロゲンがＭＥＤ１－ＩＤＲＸＬ凝縮体へのＥＲの取り込みを刺激することを示す。右下のパネルは、タモキシフェン（１００ｕＭ）がエストロゲン（１０ｕＭ）の存在下でＭＥＤ１－ＩＤＲＸＬ凝縮体へのＥＲの取り込みを弱めることを示す。 野生型エストロゲン受容体ＬＢＤ介在性のＭｅｄ１凝縮及び遺伝子活性化がエストロゲンによって刺激され、タモキシフェンによって弱まることを示す。Ｌａｃオペロンアレイを有するＵ２ＯＳ細胞にＬａｃ結合ドメイン－ＣＦＰ－ＥＲ活性化ドメイン融合タンパク質を導入した。上段の共焦点顕微鏡画像セットは、融合タンパク質の指標であるＣＦＰシグナルの画像を示し、下段のパネルセットは、メディエーターの免疫蛍光を示す。１０ｎＭのエストロゲンを４５分間導入（＋Ｅ）すると、ＬＢＤ介在性のＭｅｄ１凝縮が増加する一方で、１ｕＭのタモキシフェンを４５分間導入（＋Ｔ）すると、ＬＢＤ介在性のＭｅｄ１凝縮が弱まる。下の棒グラフは、ＧＡＬ４ ＤＢＤと融合した表示の活性化ドメインのルシフェラーゼ活性によって測定された転写量を示す。１０ｎＭのエストロゲンを導入（＋Ｅ）すると、レポーター転写量が増加する一方で、１０ｎＭのタモキシフェンを導入（＋Ｔ）してもレポーター転写量は増加しない。このアッセイでは、細胞のエストロゲンを２日間枯渇させた後、当該細胞をエストロゲンまたはタモキシフェンで２４時間処理した。 内分泌療法抵抗性患者の変異は、エストロゲン非依存的なＭｅｄ１凝縮及び遺伝子活性化の両方を可能にすることを示す。Ｌａｃ結合ドメイン－ＣＦＰ－ＥＲ活性化ドメイン（ＥＲ）融合タンパク質、Ｌａｃ結合ドメイン－ＣＦＰ－変異（Ｙ５３７Ｓ）ＥＲ活性化ドメイン融合タンパク質、またはＬａｃ結合ドメイン－ＣＦＰ－ＥＲ変異（Ｄ５３８Ｇ）活性化ドメイン融合タンパク質を、Ｌａｃオペロンアレイを有するＵ２ＯＳ細胞に導入した。上段の共焦点顕微鏡画像セットは、エストロゲンの存在下（Ｅ＋）または非存在下（Ｅ－）での、融合タンパク質の存在の指標であるＣＦＰシグナルを示す。エストロゲンは、野生型ＥＲの凝縮体形成を顕著に増加させたが、いずれの変異体の凝縮体形成にも顕著な影響を及ぼさなかった。下段の共焦点顕微鏡画像セットは、エストロゲンの存在下（Ｅ＋）または非存在下（Ｅ－）でのメディエーターの免疫蛍光を示す。エストロゲンは、野生型ＥＲの凝縮体形成を顕著に増加させたが、いずれの変異体の凝縮体形成にも顕著な影響を及ぼさなかった。下の棒グラフは、エストロゲンの存在下（Ｅ＋）または非存在下（Ｅ－）で、ＧＡＬ４ ＤＢＤと融合した表示の活性化ドメインのルシフェラーゼ活性によって測定された転写量を示す。ＷＴ ＥＲ活性化ドメインに対してエストロゲンが引き起こした転写量の増加は、いずれの変異体のものと比較してもはるかに大きいものであった。実験条件は、図３９のものと同じである。 内分泌療法抵抗性ＥＲ患者の変異は、リガンド非依存的な凝縮体形成を誘発することを示す。共焦点顕微鏡画像の上の２つの横列は、エストロゲン存在下でのＭＥＤ１／ＥＲ凝縮体形成を示す。この凝縮体形成は、タモキシフェンをさらに添加することによって弱まる。下の２つの横列は、ＭＥＤ１／変異ＥＲ（Ｙ５３７Ｓ）凝縮体形成がタモキシフェンを添加しても影響を受けないことを示す。 ＭＹＣがん遺伝子におけるＭＥＤ１凝縮体形成をエストロゲンが刺激することを示す。上の横列の共焦点顕微鏡画像は、エストロゲンの非存在下ではＭＥＤ１及びＭｙｃの存在位置が異なることを示す。下の横列の顕微鏡写真は、エストロゲンの存在下ではＭＥＤ１凝縮体がＭＹＣに形成されることを示す。 ＭｅＣＰ２及びＨＰ１αが液体様ヘテロクロマチン凝縮体に存在することを示す。（Ａ）マウスＥＳＣにおける、内在性にタグ付けされたＭｅＣＰ２－ＧＦＰの生細胞での共焦点顕微鏡法分析、及びＨｏｅｃｈｓｔによるＤＮＡ染色である。（Ｂ）マウスＥＳＣにおける、内在性にタグ付けされたＨＰ１α－ｍＣｈｅｒｒｙの生細胞での共焦点顕微鏡法分析、及びＨｏｅｃｈｓｔによるＤＮＡ染色である。（Ｃ）二重内在性にタグ付けされたＭｅＣＰ２－ＧＦＰ及びＨＰ１α－ｍＣｈｅｒｒｙをマウスＥＳＣにおいて生細胞画像化した結果である。（Ｄ）内在性にタグ付けされたＭｅＣＰ２－ＧＦＰマウスＥＳＣを用いたＦＲＡＰ実験の共焦点顕微鏡画像である。退色実施後画像は、光退色事象から１２秒後の回復を示す。（Ｅ）ＭｅＣＰ２－ＧＦＰヘテロクロマチン凝縮体についてのＦＲＡＰデータを定量化したものである。光退色事象は、ｔ＝０秒に生じている。７回の事象に対する平均値及び標準誤差が示される。（Ｆ）内在性にタグ付けされたＨＰ１α－ｍＣｈｅｒｒｙマウスＥＳＣを用いたＦＲＡＰ実験の共焦点顕微鏡画像である。退色実施後画像は、光退色事象から１２秒後の回復を示す。（Ｇ）ＨＰ１α－ｍＣｈｅｒｒｙヘテロクロマチン凝縮体についてのＦＲＡＰデータを定量化したものである。光退色事象は、ｔ＝０秒に生じている。７回の事象に対する平均値及び標準誤差が示される。（Ｈ）グラフは、ＭｅＣＰ２ヘテロクロマチン凝縮体及びＨＰ１αヘテロクロマチン凝縮体について、光退色実施から回復に至るまでの時間の半分の時間を示す。７回の事象に対する平均値及び標準誤差が示される。（Ｉ）グラフは、ヘテロクロマチン凝縮体内のＭｅＣＰ２及びＨＰ１αの流動率（ｍｏｂｉｌｅ ｆｒａｃｔｉｏｎ）を示す。７回の事象に対する平均値及び標準誤差が示される。 ＭｅＣＰ２がインビトロで相分離液滴を形成することを示す。（Ａ）ヒトＭｅＣＰ２タンパク質の模式図である。構造化メチル結合ドメイン（ＭＢＤ）ならびに天然変性領域（ＩＤＲ－１及びＩＤＲ－２）が示される。ＰＯＮＤＲ ＶＳＬ２アルゴリズムを使用して、タンパク質に沿って予測変性スコアを計算した。アミノ酸数５のスライド幅を使用して残基当たりの正味荷電を計算した。（Ｂ）ＭｅＣＰ２－ＧＦＰの濃度を上昇させる液滴形成アッセイを共焦点顕微鏡法によって行ったものである。（Ｃ）ＭｅＣＰ２－ＧＦＰの濃度上昇に対する液滴面積の分布を示すドットプロットである。各条件について、４００個の液滴を分析した。（Ｄ）液滴におけるＭｅＣＰ２－ＧＦＰタンパク質の凝縮部分割合をタンパク質濃度の上昇に対して示すバープロットである。１０枚の画像に対する平均値及び標準偏差が示される。（Ｅ）インビトロでのＭｅＣＰ２－ＧＦＰ液滴の融合をタイムラプス画像化したものである。（Ｆ）インビトロでのＭｅＣＰ２－ＧＦＰ液滴のＦＲＡＰを画像化したものである。（Ｇ）ＭｅＣＰ２－ＧＦＰを用いる液滴形成アッセイを共焦点顕微鏡法によって行ったものであり、液滴形成反応における塩濃度を上昇させて実施したものである。（Ｈ）液滴形成反応におけるＮａＣｌの濃度上昇に対する液滴面積の分布を示すドットプロットである。各条件について、４００個の液滴を分析した。（Ｉ）液滴におけるＭｅＣＰ２－ＧＦＰタンパク質の凝縮部分割合を塩濃度の上昇に対して示すバープロットである。１０枚の画像に対する平均値及び標準偏差が示される。（Ｊ）タンパク質濃度及び塩濃度に応じたＭｅＣＰ２－ＧＦＰ液滴形成を示す相図である。正の条件は、黒丸で示される。 ＭｅＣＰ２凝縮体形成がＣ末端ＩＤＲに依存することを示す。（Ａ）ＭＢＤ、ＩＤＲ－１、ＩＤＲ－２を示すＭｅＣＰ２タンパク質の模式図であり、インビトロでの液滴形成アッセイ及び生細胞画像化アッセイに使用した全長（ＦＬ）タンパク質及び２つの異なる短縮型タンパク質を表す。バーチャートは、ＲｅｔｔＢＡＳＥデータベースに見られる女性のレット症候群患者におけるＭＥＣＰ２がコードする変異の数を、ＭｅＣＰ２に沿って各アミノ酸位置について示す。その下には、ナンセンス変異、フレームシフト変異、及びミスセンス変異の位置が、ＭｅＣＰ２タンパク質ドメインの模式図と共に示される。（Ｂ）ＭｅＣＰ２－ＧＦＰ全長（ＦＬ）ならびにＩＤＲ短縮型変異体（ΔＩＤＲ－１及びΔＩＤＲ－２）を用いる液滴形成アッセイを共焦点顕微鏡法によって行ったものである。（Ｃ）内在性にタグ付けされた３つの異なるＭｅＣＰ２－ＧＦＰ株（マウスＥＳＣにおいて調製したもの）を生細胞で共焦点顕微鏡法によって分析したものである。ＦＬ：全長ＭｅＣＰ２－ＧＦＰ、ΔＩＤＲ－１：ＩＤＲ－１欠失体、及びΔＩＤＲ－２：ＩＤＲ－２欠失体。（Ｄ）内在性にタグ付けされた異なる株について、ヘテロクロマチン構造体に対するＭｅＣＰ２－ＧＦＰの分配係数を核質に対して定量化したものである。１０個の細胞に対する平均値及び標準偏差が示される。（Ｅ）全長（ＦＬ）を有するマウスＥＳＣ、ΔＩＤＲ－１を有するマウスＥＳＣ、及びΔＩＤＲ－２を有するマウスＥＳＣにおけるメジャーサテライト反復配列の発現をＲＴ－ｑＰＣＲによって分析したものである。発現は、ＦＬ及びＧａｐｄｈに正規化されている。３回の反復測定の平均値及び標準偏差が示される。 ＭｅＣＰ２凝縮体がヘテロクロマチン因子をコンパートメント化し得ることを示す。（Ａ）核抽出物での液滴形成アッセイの模式図である。（Ｂ）ＭｅＣＰ２－ｍＣｈｅｒｒｙを含む核抽出物及びＭｅＣＰ２－ΔＩＤＲ－２－ｍＣｈｅｒｒｙを含む核抽出物での液滴形成アッセイの共焦点顕微鏡画像である。当該抽出物のＮａＣｌ塩濃度を１５０ｍＭに低下させることによって液滴形成を開始させた。（Ｃ）表示のタンパク質に対する免疫ブロットであり、核抽出物での液滴形成アッセイのインプット材料のうちの１０％と、核抽出物での液滴形成アッセイの遠心分離（２７００×ｇ）後のペレット画分と、に見られた相対タンパク質量を示す。（Ｄ）Ｃに示される免疫ブロットを定量化したものである。バーチャートは、調べた各タンパク質について、それぞれの液滴形成反応にインプット材料に含まれていたものがペレット画分に見られたパーセントを示す。 ＭｅＣＰ２－ＩＤＲ－２がヘテロクロマチン凝縮体に優先的に分配されることを示す。（Ａ）ＭｅＣＰ２ ＩＤＲの分配実験の模式図である。ｍＣｈｅｒｒｙ－ＭｅＣＰ２－ＩＤＲ－２またはｍＣｈｅｒｒｙ単独のための発現コンストラクトを細胞にトランスフェクトした。核質と比較してヘテロクロマチン凝縮体に選択的に分配移入する能力によってヘテロクロマチン凝縮体への到達能力を評価した。（Ｂ）ＭｅＣＰ２－ＩＤＲ－２またはｍＣｈｅｒｒｙ対照を過剰発現させたマウスＥＳＣの生細胞での共焦点顕微鏡画像である。ボックスは、ヘテロクロマチン凝縮体を示す。（Ｃ）ＭｅＣＰ２－ＩＤＲ－２またはｍＣｈｅｒｒｙ対照を過剰発現させたマウスＥＳＣにおけるヘテロクロマチン凝縮体の追加の拡大例である。スケールバーは、１μｍを示す。（Ｄ）核質に対するヘテロクロマチン凝縮体の分配係数を定量化したものである。５回の反復測定の平均値及び標準偏差が示される。 マウスの脳のニューロンのヘテロクロマチンにＭｅＣＰ２が密集することを示す。（Ａ）高グレードのキメラＭｅＣＰ２－ＧＦＰマウスから得られた脳切片における内在性にタグ付けされたＭｅＣＰ２－ＧＦＰを固定細胞で共焦点顕微鏡法によって分析したものである。ＭＡＰ２及びＰＵ．１に対する免疫染色を行うことで、それぞれニューロン及びミクログリアを同定した。厚さ１０μｍの脳切片は、２ヶ月齢のマウスから採取した。（Ｂ）ニューロン及びミクログリアにおける細胞当たりのＭｅＣＰ２－ＧＦＰ凝縮体の数を定量化したものである。データは、３個の細胞の平均値±標準偏差として示される。（Ｃ）ニューロン及びミクログリアにおける細胞当たりのＭｅＣＰ２－ＧＦＰ凝縮体の数を定量化したものである。データは、ニューロンについては１８個の凝縮体の平均値±標準偏差として示され、ミクログリアについては２８個の凝縮体の平均値±標準偏差として示される。（Ｄ）内在性にタグ付けされたＭｅＣＰ２－ＧＦＰキメラマウスから２ヶ月齢の時点で採取した急性脳スライスで実施したＦＲＡＰ実験の生細胞での共焦点顕微鏡画像である。退色実施後画像は、光退色事象から１２秒後の回復を示す。（Ｅ）生存脳におけるＭｅＣＰ２－ＧＦＰヘテロクロマチン凝縮体についてのＦＲＡＰデータを定量化したものである。光退色事象は、ｔ＝０秒に生じている。３回の事象に対する平均値及び標準誤差が示される。（Ｆ）高グレードのキメラＭＥＤ１－ＧＦＰマウスから得られた脳切片における内在性にタグ付けされたＭＥＤ－ＧＦＰを固定細胞で共焦点顕微鏡法によって分析したものである。厚さ１０μｍの脳切片は、２ヶ月齢のマウスから採取した。 ＭｅＣＰ２－ＧＦＰ及びＨＰ１α－ｍＣｈｅｒｒｙの凝縮体数及び凝縮体体積を示す。（Ａ）ＭｅＣＰ２－ＧＦＰ及びＨＰ１α－ｍＣｈｅｒｒｙの凝縮体数／細胞を定量化したものである。ｎ＝５細胞。（Ｂ）ＭｅＣＰ２－ＧＦＰ及びＨＰ１α－ｍＣｈｅｒｒｙの凝縮体体積を定量化したものである。ｎ＝４５凝縮体（ＭｅＣＰ２）。 ＭｅＣＰ２がインビトロで相分離液滴を形成することを示す。（Ａ）ヒトＭｅＣＰ２タンパク質の拡張模式図であり、ラインプロットは、残基当たりのヒトＭｅＣＰ２タンパク質配列の進化的保存度を示し、チャートは、ＭｅＣＰ２のアミノ酸組成を示す。保存度は、Ｊｅｎｓｅｎ－Ｓｈａｎｎｏｎの発散として計算し、値が高いほど配列の保存度が高いことを示す。（Ｂ）１６０ｎＭのＭｅＣＰ２－ＧＦＰを用いた液滴形成アッセイの共焦点顕微鏡画像である。（Ｃ）１０μＭのＨＰ１α－ｍＣｈｅｒｒｙを用いた液滴形成アッセイの共焦点顕微鏡画像である。（Ｄ）タンパク質濃度及び塩濃度に応じたＭｅＣＰ２－ＧＦＰ液滴形成を示す相図のための画像である。 核におけるシグナル伝達因子及び転写凝縮体相互作用を示す。 シグナル伝達因子が、スーパーエンハンサーにおいてシグナル伝達依存性の凝縮体をインビボで形成することを示す。（Ａ）β－カテニン、ＳＴＡＴ３、ＳＭＡＤ３、及びＭＥＤ１に対する免疫蛍光であり、Ｎａｎｏｇ新生ＲＮＡに対して同時に行ったＲＮＡ－ＦＩＳＨと併せて、ｍＥＳ細胞においてこうしたシグナル伝達因子の凝縮核内フォーカスがＮａｎｏｇスーパーエンハンサーに存在することを実証するものである。固定化の２４時間前にＣＨＩＲ９９０２１、ＬＩＦ、及びアクチビンＡの存在下で細胞を２４時間増殖させることで、それぞれＷＮＴシグナル伝達経路、ＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル伝達経路、及びＴＧＦ－βシグナル伝達経路を活性化させた。核の外縁の決定にはＨｏｅｃｈｓｔ染色を使用し、核の外縁は点線によって強調表示されている。スピニングディスク型共焦点顕微鏡での画像化には、１００×対物レンズを使用した。各シグナル伝達因子について、少なくとも１０枚の画像から得られたＲＮＡ－ＦＩＳＨフォーカスに中心を置いた平均ＲＮＡ－ＦＩＳＨシグナル及び平均ＩＦシグナルが示される。最も右側のパネルには、無作為に選択された核内位置周辺のシグナル伝達因子の平均ＩＦシグナルが示される。スケールバーは、５μｍを示す。（Ｂ）ｍＥＳにおいて、Ｎａｎｏｇ遺伝子と結び付くスーパーエンハンサーをβ－カテニン、ＳＴＡＴ３、ＳＭＡＤ３、及びＭＥＤ１が占有することを示すＣｈＩＰ－ｓｅｑトラックである。リード密度は、リード数／百万／ビン（ｒｐｍ／ビン）で示され、スーパーエンハンサーは、赤色のバーで示される。（Ｃ）無刺激条件または刺激条件での、シグナル伝達因子であるβ－カテニン、ＳＴＡＴ３、及びＳＭＡＤ３に対するｍＥＳ細胞の免疫蛍光である。固定化の２４時間前にＣＨＩＲ９９０２１、ＬＩＦ、またはアクチビンＡのいずれかを用いて細胞を２４時間刺激することで、それぞれＷＮＴシグナル伝達経路、ＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル伝達経路、及びＴＧＦ－βシグナル伝達経路を活性化させた。核の外縁の決定にはＨｏｅｃｈｓｔ染色を使用し、核の外縁は点線によって強調表示されている。スピニングディスク型共焦点顕微鏡での画像化には、１００×対物レンズを使用した。スケールバーは、５μｍを示す。（Ｄ）左：ｍＥＧＦＰ－β－カテニンが操作導入されたＨＣＴ１１６細胞のＦＲＡＰ実験を示す代表的な画像である。退色の標的にした小斑点が黄色のボックスによって強調表示されている。右：ｍＥＧＦＰ－β－カテニンの小斑点に対するＦＲＡＰデータを定量化したものである。退色事象は、ｔ＝０秒に生じている。退色領域及び非退色対照のいずれについても、バックグラウンドを差し引いた蛍光強度が、退色前時点（ｔ＝－４秒）に対してプロットされている。データは、平均値＋／－ＳＥＭ（Ｎ＝９）としてプロットされている。画像は、Ａｉｒｙｓｃａｎ検出器を備えたＺｅｉｓｓ ＬＳＭ８８０共焦点顕微鏡（６３×対物レンズ使用）を使用して撮影した。スケールバーは、２μｍを示す。 同上。 精製シグナル伝達因子がインビトロで凝縮体を形成し得ることを示す。（Ａ）本明細書で使用したシグナル伝達因子のドメイン構造である。ＤＢＤ：ＤＮＡ結合ドメイン、ＰＩＤ：タンパク質相互作用ドメイン、ＣＣ：コイルドコイルドメイン、ＤＤ：二量体化ドメイン、ＳＨ２：Ｓｒｃ相同ドメイン２。推定天然変性領域（ＩＤＲ）は、赤色の括弧で示される。（Ｂ）ｍＥＧＦＰ－β－カテニン、ｍＥＧＦＰ－ＳＴＡＴ３、及びｍＥＧＦＰ－ＳＭＡＤ３の同型の液滴の形成を一連濃度で試験する液滴形成アッセイを示す代表的な共焦点画像である。対照としてｍＥＧＦＰ単独のものが含められている（左のパネル）。シグナル伝達因子の分配比を定量化したものである（右のパネル）。分配比は、液滴の外側の平均蛍光シグナルによって液滴の内側の平均蛍光シグナルを割ることによって計算し、すべての試験濃度で取得画像枚数が少なくとも１０となるようにした。アッセイはすべて、１２５ｍＭのＮａＣｌの存在下で実施し、１０％のＰＥＧ－８０００をクラウディング剤として使用した。スケールバーは、２μｍを示す。（Ｃ）シグナル伝達因子に対する希釈液滴アッセイである。最初の液滴は、１．２５μＭで形成させ、画像化した。次に、残りの反応混合物を、４ＭのＮａＣｌを含む反応緩衝液で２倍希釈して最終ＮａＣｌ塩濃度を２Ｍとした。液滴の希釈前後を示す代表的な画像が示される。 精製シグナル伝達因子がインビトロでメディエーター凝縮体に取り込まれることを示す。（Ａ）既存のＭＥＤ１－ＩＤＲ液滴へのシグナル伝達因子の添加を示す模式図である。ｍＣｈｅｒｒｙ－ＭＥＤ１－ＩＤＲ液滴を形成させ、ガラス皿に乗せ、ｍＥＧＦＰタグ付きシグナル伝達因子の添加前後に画像化した。（Ｂ）ＭＥＤ－ＩＤＲ液滴へのシグナル伝達因子の取り込みを示す代表的な画像である。ｍＥＧＦＰタグ付きシグナル伝達因子溶液の添加前後の合計１０分間、ｍＣｈｅｒｒｙ－ＭＥＤ１－ＩＤＲ事前形成液滴を画像化した。シグナル伝達因子は、画像の取得開始から３０秒後に添加した。最後に表示される画像は、画像化の終了時点に対応するものである。ＰＥＧ－８０００が存在する１０μＭのＭＥＤ１－ＩＤＲ－ｍＣｈｅｒｒｙを液滴形成に使用し、ｍＥＧＦＰ－β－カテニン、ｍＥＧＦＰ－ＳＭＡＤ３、またはｍＥＧＦＰ－ＳＴＡＴ３のいずれかを、ＰＥＧ－８０００を含めずに１０ｕＭで添加した。スケールバーは、２μｍを示す。（Ｃ）Ｂに記載のものと同じ条件を使用して、希薄なＧＦＰタグ付きシグナル伝達因子と混合したＭＥＤ１－ＩＤＲ－ｍＣｈｅｒｒｙ事前形成液滴に対する分配比を計算した。定量化には少なくとも１０枚の画像を使用した。液滴をマージチャネルで特定し、液滴内の領域におけるＧＦＰタグ付き因子のシグナル強度を、液滴の外側の領域のシグナル強度と比較した。星印は、ｔ検定によって得られたｐ値が＜０．０５であったことを示す。（Ｄ）β－カテニン、ＳＴＡＴ３、及びＳＭＡＤ３を生理学的濃度付近で用いた制限希釈液滴アッセイである。表示濃度のシグナル伝達因子を、単独で液滴形成緩衝液（１２５ｍＭのＮａＣＬ及び１０％のＰＥＧ－８０００）に添加するか、または１０μＭのＭＥＤ１－ＩＤＲと共に当該液滴形成緩衝液に添加した。スケールバーは、２μｍを示す。 同上。 β－カテニンの相分離が芳香族アミノ酸に依存することを示す。（Ａ）試験した異なるｍＥＧＦＰ－β－カテニン短縮型タンパク質の図である。（Ｂ）ｍＥＧＦＰ－β－カテニン、ｍＥＧＦＰ－Ｎ末端－ＩＤＲ、ｍＥＧＦＰ－アルマジロ、及びＧＦＰ－Ｃ末端－ＩＤＲの同型の液滴の形成を一連濃度で試験する液滴形成アッセイを示す代表的な共焦点画像である。液滴アッセイは、１２５ｍＭのＮａＣＬ及び１０％のＰＥＧ－８０００において実施した。（Ｃ）野生型ｍＥＧＦＰ－β－カテニン、芳香族変異ｍＥＧＦＰ－β－カテニン、及びｍＥＧＦＰが同型の液滴を形成する能力を一連濃度で試験する液滴形成アッセイを示す代表的な共焦点画像である。液滴アッセイは、１２５ｍＭのＮａＣｌ及び１０％のＰＥＧ－８０００において実施した。スケールバーは、１μｍを示す。上部には、記載の実験において使用した野生型ｍＥＧＦＰ－β－カテニン及び芳香族→アラニン変異体のドメイン構造を示す模式図が示される。（Ｄ）１０μＭのＭＥＤ１－ＩＤＲ－ｍＣｈｅｒｒｙと、１０μＭの野生型ｍＥＧＦＰ－β－カテニンまたは芳香族変異ｍＥＧＦＰ－β－カテニンと、を混合する異型の液滴の形成アッセイを示す代表的な共焦点画像である。スケールバーは、１μｍを示す。（Ｅ）因子の分配比をそれぞれ、少なくとも１０枚の画像について定量化した。液滴をマージチャネルで特定し、液滴内の領域における因子のシグナル強度を、液滴の外側の領域のシグナル強度と比較した。 同上。 β－カテニンの適切な到達及び標的遺伝子の活性化が芳香族アミノ酸に依存することを示す。（Ａ）ＣｈＩＰ実験の模式図である。ＴｄＴｏｍａｔｏタグ付きの野生型β－カテニンまたは芳香族変異β－カテニンをドキシサイクリン誘導性プロモーター下に配置してｍＥＳ細胞に安定的に組み込んだ。架橋の２４時間前にドキシサイクリンを培地に添加した。ＣｈＩＰは、ＴｄＴｏｍａｔｏに対する抗体を使用して実施した。ＴＲＥ＝テトラサイクリン応答エレメント。（Ｂ）（上）異所性に発現した野生型β－カテニンまたは芳香族変異β－カテニンのＣｈＩＰ－ｑＰＣＲを、Ｍｙｃエンハンサー、Ｓｐ５エンハンサー、及びＫｌｆ４エンハンサーに対して行ったものである。エラーバーは、３回の反復測定の標準偏差を示す。星印は、ｔ検定によって得られたｐ値が＜０．０５であったことを示す。（下）野生型β－カテニンまたは芳香族変異β－カテニンを異所発現させた後のＭｙｃ、Ｓｐ５、及びＫｌｆ４のｍＲＮＡレベルをＲＴ－ｑＰＣＲによって分析したものである。エラーバーは、３回の反復測定の標準偏差を示す。星印は、ｔ検定によって得られたｐ値が＜０．０５であったことを示す。（Ｃ）野生型β－カテニンまたは芳香族変異β－カテニンを過剰発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてコンセンサスＴＣＦ／ＬＥＦモチーフのコピーを１０個含む合成ＷＮＴ－レポーターを使用するルシフェラーゼアッセイである。３回の生物学的反復測定の平均が示される。エラーバーは、標準偏差を示す。星印は、ｔ検定によって得られたｐ値が＜０．０５であったことを示す。 β－カテニン－凝縮体相互作用がＴＣＦ因子に依存せずに生じ得ることを示す。（Ａ）Ｌａｃ結合ドメイン－ＣＦＰコンストラクトまたはＬａｃ結合ドメイン－ＣＦＰ－ＭＥＤ１－ＩＤＲコンストラクトをトランスフェクトしたＬａｃ－Ｕ２ＯＳ細胞におけるβ－カテニンの免疫蛍光であり、スピニングディスク型共焦点顕微鏡で１００×対物レンズを用いて画像化したものである。核の外縁の決定にはＨｏｅｃｈｓｔ染色を使用し、核の外縁は点線によって強調表示されている。ＣＦＰフォーカスにおけるβ－カテニンの相対強度を定量化したものが示される。スケールバーは、５μｍを示す。（Ｂ）Ｌａｃ結合ドメイン－ＣＦＰ－ＭＥＤ１－ＩＤＲコンストラクトをトランスフェクトしたＬａｃ－Ｕ２ＯＳ細胞におけるＴＣＦ４のＩＦである。画像は、スピニングディスク型共焦点顕微鏡で１００×対物レンズを使用して取得した。スケールバーは、５μｍを示す。（Ｃ）Ｌａｃ結合ドメイン－ＣＦＰコンストラクトまたはＬａｃ結合ドメイン－ＣＦＰ－ＭＥＤ１－ＩＤＲコンストラクトをコトランスフェクトしたＵ２ＯＳ２－６－３細胞において過剰発現するＴｄＴｏｍａｔｏタグ付きの野生型β－カテニンまたは芳香族変異β－カテニンの蛍光画像であり、スピニングディスク型共焦点顕微鏡で１００×対物レンズを用いて画像化したものである。核の外縁の決定にはＨｏｅｃｈｓｔ染色を使用し、核の外縁は点線によって強調表示されている。特定されたＣＦＰフォーカスにおける過剰発現β－カテニン形態の相対強度を定量化したものが示される。スケールバーは、５μｍを示す。（Ｄ）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＳＯＸ９、ＳＭＡＤ７、ＫＬＦ９、またはＧＡＴＡ３のエンハンサーに対するβ－カテニン－ＧＦＰ－キメラのＣｈＩＰ－ｑＰＣＲである。エラーバーは、平均値の標準偏差を示す。星印は、ｔ検定によって得られたｐ値が＜０．０５であったことを示す。（Ｅ）β－カテニン－ｍＥＧＦＰ－キメラを過剰発現する細胞において、コンセンサスＴＣＦ／ＬＥＦモチーフのコピーを１０個含む合成ＷＮＴ－レポーターと組み合わせて行うルシフェラーゼアッセイである。３回の生物学的反復測定の平均が示される。エラーバーは、標準偏差を示す。星印は、ｔ検定によって得られたｐ値が＜０．０５であったことを示す。 同上。 シグナル伝達因子が、スーパーエンハンサーにおいてシグナル伝達依存性の凝縮体をインビボで形成することを示す。（Ａ）ｍｉＲ２９０遺伝子のスーパーエンハンサーをβ－カテニン、ＳＴＡＴ３、ＳＭＡＤ３、及びＭＥＤ１が占有することを示すＣｈＩＰ－ｓｅｑトラックである。リード密度は、リード数／百万／ビン（ｒｐｍ／ビン）で示され、スーパーエンハンサーは、赤色のバーで示される。（Ｂ）β－カテニン、ＳＴＡＴ３、ＳＭＡＤ３、及びＭＥＤ１に対する免疫蛍光であり、ｍｉＲ２９０新生ＲＮＡに対して同時に行ったＲＮＡ－ＦＩＳＨと併せて、ｍＥＳ細胞においてこうしたシグナル伝達因子の凝縮核内フォーカスがｍｉＲ２９０スーパーエンハンサーに存在することを実証するものである。細胞は、固定化の前に、ＣＨＩＲ９９０２１、ＬＩＦ、またはアクチビンＡの存在下で２４時間増殖させた。核の外縁の決定にはＨｏｅｃｈｓｔ染色を使用し、核の外縁は点線によって強調表示されている。スピニングディスク型共焦点顕微鏡での画像化には、１００×対物レンズを使用した。各シグナル伝達因子について、少なくとも１０枚の画像から得られたＲＮＡ－ＦＩＳＨフォーカスに中心を置いた平均ＲＮＡ－ＦＩＳＨシグナル及び平均ＩＦシグナルが示される。最も右側のパネルには、無作為に選択された核内位置におけるシグナル伝達因子の平均ＩＦシグナルが示される。スケールバーは、５μｍを示す。（Ｃ）β－カテニンに対する免疫蛍光であり、Ｎａｎｏｇに対して同時に行ったＤＮＡ－ＦＩＳＨと併せて、Ｃ２Ｃ１２細胞においては、このシグナル伝達因子の核内フォーカスがＮａｎｏｇスーパーエンハンサーに存在しないことを実証するものである。細胞は、固定化する前に、ＣＨＩＲ９９０２１の存在下で２４時間増殖させた。核の外縁の決定にはＨｏｅｃｈｓｔ染色を使用し、核の外縁は点線によって強調表示されている。スピニングディスク型共焦点顕微鏡での画像化には、１００×対物レンズを使用した。各シグナル伝達因子について、少なくとも１０枚の画像から得られたＤＮＡ－ＦＩＳＨフォーカスに中心を置いた平均ＤＮＡ－ＦＩＳＨシグナル及び平均ＩＦシグナルが示される。最も右側のパネルには、無作為に選択された核内位置におけるシグナル伝達因子の平均ＩＦシグナルが示される。スケールバーは、５μｍを示す。（Ｄ）ＨＣＴ１１６細胞における、内在性にタグ付けされたｍＥＧＦＰ－β－カテニン及び内在性β－カテニンのレベルを比較して示すウエスタンブロットである。 同上。 β－カテニン、ＳＴＡＴ３、及びＳＭＡＤ３のドメイン構造を示す。ＤＢＤ：ＤＮＡ結合ドメイン、ＰＩＤ：タンパク質相互作用ドメイン、ＣＣ：コイルドコイルドメイン、ＤＤ：二量体化ドメイン、ＳＨ２：Ｓｒｃ相同ドメイン２。推定天然変性領域（ＩＤＲ）には、赤色で印が付けられている。アミノ酸当たりのＰＯＮＤＲ ＶＬ３スコアを変性の予測に使用し、下にプロットした。その下のバーコードプロットは、異なるアミノ酸の位置を示す。赤色のボックスは、タンパク質の推定ＩＤＲに最も多く出現した上位３つのアミノ酸を示す。最も下のパネルは、表示タンパク質の残基当たりの正味荷電（ＮＣＰＲ）を示す。 ドキシサイクリン誘導性プロモーターの下に配置されるようにｍＥＳ細胞に組み込んだ野生型β－カテニン及び変異β－カテニンの発現レベルを示すウエスタンブロットである。１μｇ／ｍｌのドキシサイクリンで細胞の誘導を２４時間行い、ＴｄＴｏｍａｔｏタグ付きβ－カテニンの発現についてＦＡＣＳ選別を行い、個々のコロニーをピックし、増殖させてクローン細胞株を得た。 β－カテニンの適切な到達及び標的遺伝子の活性化が芳香族アミノ酸に依存することを示す。（Ａ）Ｌａｃ結合ドメイン－ＣＦＰ－ＭＥＤ１－ＩＤＲコンストラクトをトランスフェクトしたＵ２ＯＳ２－６－３細胞におけるＨＰ１αのＩＦである。画像は、スピニングディスク型共焦点顕微鏡で１００×対物レンズを使用して取得した。スケールバーは、５μｍを示す。（Ｂ）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞における野生型β－カテニンまたはＩＤＲ－ｍＥＧＦＰ－ＩＤＲキメラタンパク質のレベルを示すウエスタンブロットである。ヒストンＨ３は、ロード対照として使用した。 ＰｏｌＩＩのＣＴＤがメディエーター凝縮体に取り込まれ、そこに密集することを示す。（Ａ）転写開始から伸長への移行、及びこの移行におけるＰｏｌＩＩ ＣＴＤのリン酸化の役割を示すモデルである。開始の間、低リン酸化ＣＴＤを有するＰｏｌＩＩはメディエーターと相互作用する。ＣＤＫ７がＣＴＤをリン酸化すると、開始部位のおよそ５０～１００ｂｐ下流に停止ＰｏｌＩＩが形成され、その後にＣＤＫ９によるリン酸化が行われると、停止が解除され、伸長が生じる。簡潔に述べれば、ＣＤＫ７及びＣＤＫ９がＣＴＤをリン酸化すると伸長への移行が見られるということである。伸長の間、リン酸化ＣＴＤを有するＰｏｌＩＩは、さまざまなＲＮＡプロセシング因子と相互作用する。（Ｂ）液滴実験を示す代表的な画像であり、ヘプタペプチド５２回反復配列を含む組換え全長ヒトＣＴＤにＧＦＰが融合したもの（ＧＦＰ－ＣＴＤ５２）がヒトメディエーター複合体液滴に取り込まれることを示す。精製ヒトメディエーター複合体（約２００～３００ｎＭ（方法を参照のこと））を、１３５ｍＭの一価塩と１０％のＰＥＧ－８０００または１６％のＦｉｃｏｌｌ－４００とを含む液滴形成緩衝液において１０ｕＭのＧＦＰまたはＧＦＰ－ＣＴＤ５２と混合し、表示のフィルターを備えた蛍光顕微鏡で可視化した。（Ｃ）液滴実験を示す代表的な画像であり、ＧＦＰ－ＣＴＤ５２がＭＥＤ１－ＩＤＲ液滴に取り込まれることを示す。１０ｕＭの精製ｍＣｈｅｒｒｙ融合ヒトＭＥＤ１－ＩＤＲ（ｍＣｈｅｒｒｙ－ＭＥＤ１－ＩＤＲ）を、１２５ｍＭのＮａＣｌと１０％のＰＥＧ－８０００または１６％のＦｉｃｏｌｌ－４００とを含む液滴形成緩衝液において３．３ｕＭのＧＦＰまたはＧＦＰ－ＣＴＤ５２と混合し、表示のフィルターを備えた蛍光顕微鏡で可視化した。（Ｄ）ＣＴＤの反復配列の長さに応じてＣＴＤがＭＥＤ１－ＩＤＲ液滴に密集する。ＧＦＰ、ＧＦＰ－ＣＴＤ５２、またはヘプタペプチド２６回反復配列を含むＣＴＤ短縮型変異体にＧＦＰが融合したもの（ＧＦＰ－ＣＴＤ２６）もしくはヘプタペプチド１０回反復配列を含むＣＴＤ短縮型変異体にＧＦＰが融合したもの（ＧＦＰ－ＣＴＤ１０）（各１０ｕＭ）を、１２５ｍＭのＮａＣｌ及び１６％のＦｉｃｏｌｌ－４００を含む液滴形成緩衝液において１０ｕＭのｍＣｈｅｒｒｙ－ＭＥＤ１－ＩＤＲと混合し、表示のフィルターを備えた蛍光顕微鏡で可視化した。（Ｅ）２つの全長ＣＴＤ／ＭＥＤ１－ＩＤＲ液滴の間の融合事象を示す画像である。液滴形成条件は、Ｄに記載のものと同じである。（Ｆ）ＧＦＰ－ＣＴＤ５２とＭＥＤ１－ＩＤＲ－ｍＣｈｅｒｒｙとの異型の液滴のＦＲＡＰである。液滴形成条件は、Ｄに記載のものと同じである。 同上。 ＣＴＤがリン酸化されると、インビトロでのＭＥＤ１－ＩＤＲ凝縮体へのＣＴＤの取り込みが減少することを示す。（Ａ）ＣＤＫ７介在性のＣＴＤのリン酸化（方法を参照のこと）が、ＣＴＤがＭＥＤ１－ＩＤＲ凝縮体に取り込まれる能力を低下させることを示す代表的な画像である。（左）１２５ｍＭのＮａＣｌ及び１６％のＦｉｃｏｌｌ－４００を含む液滴形成緩衝液において１０ｕＭのｍＣｈｅｒｒｙ－ＭＥＤ１－ＩＤＲを、３．３ｕＭのＧＦＰ、ＧＦＰ－ＣＴＤ５２、またはＧＦＰ－リン酸化ＣＴＤ５２と混合し、表示のフィルターを備えた蛍光顕微鏡で可視化した。（右）ＣＤＫ７介在性のリン酸化（方法を参照のこと）を伴う場合または伴わない場合のＭＥＤ１－ＩＤＲ液滴におけるＧＦＰ－ＣＴＤ５２の濃縮比である。ＧＦＰの濃縮比を１に設定した。ボックスプロット中のボックスの範囲は、２５～７５パーセンタイルである。ボックスの中央の線は、中央値にプロットされている。ひげの範囲は、最小値～最大値である。ｐ値は、両側スチューデントｔ検定によって決定されている。（Ｂ）ＣＤＫ７介在性のＣＴＤのリン酸化が、ＣＴＤがＭＥＤ１－ＩＤＲ凝縮体に取り込まれる能力を低下させることを示す代表的な画像である。（左）１２５ｍＭのＮａＣｌ及び１０％のＰＥＧ－８０００を含む液滴形成緩衝液において１０ｕＭのｍＣｈｅｒｒｙ－ＭＥＤ１－ＩＤＲを、３．３ｕＭのＧＦＰ、ＧＦＰ－ＣＴＤ５２、またはＧＦＰ－リン酸化ＣＴＤ５２と混合し、表示のフィルターを備えた蛍光顕微鏡で可視化した。（右）ＣＤＫ７介在性のリン酸化を伴う場合または伴わない場合のＭＥＤ１－ＩＤＲ液滴におけるＧＦＰ－ＣＴＤ５２の濃縮比である（２ａのものと同様に示される）。（Ｃ）ＣＤＫ９介在性のＣＴＤのリン酸化（方法を参照のこと）が、ＣＴＤがＭＥＤ１－ＩＤＲ凝縮体に取り込まれる能力を低下させることを示す代表的な画像である。（左）１２５ｍＭのＮａＣｌ及び１６％のＦｉｃｏｌｌ－４００を含む液滴形成緩衝液において１０ｕＭのｍＣｈｅｒｒｙ－ＭＥＤ１－ＩＤＲを、１０ｕＭのＧＦＰ、ＧＦＰ－ＣＴＤ５２、またはＧＦＰ－リン酸化ＣＴＤ５２と混合し、表示のフィルターを備えた蛍光顕微鏡で可視化した。（右）ＣＤＫ９介在性のリン酸化を伴う場合または伴わない場合のＭＥＤ１－ＩＤＲ液滴におけるＧＦＰ－ＣＴＤ５２の濃縮比である（Ａのものと同様に示される）。（Ｄ）ＣＤＫ９介在性のＣＴＤのリン酸化が、ＣＴＤがＭＥＤ１－ＩＤＲ凝縮体に取り込まれる能力を低下させることを示す代表的な画像である。（左）１２５ｍＭのＮａＣｌ及び１０％のＰＥＧ－８０００を含む液滴形成緩衝液において１０ｕＭのｍＣｈｅｒｒｙ－ＭＥＤ１－ＩＤＲを、１０ｕＭのＧＦＰ、ＧＦＰ－ＣＴＤ５２、またはＧＦＰ－リン酸化ＣＴＤ５２と混合し、表示のフィルターを備えた蛍光顕微鏡で可視化した。（右）ＣＤＫ９介在性のリン酸化を伴う場合または伴わない場合のＭＥＤ１－ＩＤＲ液滴におけるＧＦＰ－ＣＴＤ５２の濃縮比である（Ａのものと同様に示される）。 活性なスーパーエンハンサー誘導性遺伝子においてスプライシング凝縮体が生じることを示す。（Ａ）固定マウス胚性幹細胞（ｍＥＳＣ）においてＮａｎｏｇ及びＴｒｉｍ２８の新生ＲＮＡのＲＮＡ ＦＩＳＨと組み合わせてＳＲＳＦ２を画像化した代表的な免疫蛍光（ＩＦ）画像である。最初の２つの右側縦列は、ＲＮＡ ＦＩＳＨフォーカス（９７個のＮａｎｏｇフォーカス、１１５個のＴｒｉｍ２８フォーカスを使用した）に中心を置いた平均ＲＮＡ ＦＩＳＨシグナル及びスプライシング因子の平均ＩＦシグナルを示す。最も右の縦列は、無作為に選択された核内位置（方法を参照のこと）に中心を置いたスプライシング因子の平均ＩＦシグナルを示す。Ｎａｎｏｇ及びＴｒｉｍ２８に使用したＲＮＡ ＦＩＳＨプローブの対象位置は、それらのそれぞれの遺伝子モデルに示される。（Ｂ）固定ｍＥＳＣにおいてＮａｎｏｇ及びＴｒｉｍ２８の新生ＲＮＡのＲＮＡ ＦＩＳＨと組み合わせて、スプライシング因子であるＳＲＲＭ１及びＳＲＳＦ１を画像化した代表的なＩＦ画像である。最初の２つの右側縦列は、ＲＮＡ ＦＩＳＨフォーカス（ＳＲＲＭ１については、１３７個のＮａｎｏｇフォーカス、２０９個のＴｒｉｍ２８フォーカスを使用し、ＳＲＳＦ１については、１０９個のＮａｎｏｇフォーカス、２４８個のＴｒｉｍ２８フォーカスを使用した）に中心を置いた平均ＲＮＡ ＦＩＳＨシグナル及びスプライシング因子の平均ＩＦシグナルを示す。最も右の縦列は、無作為に選択された核内位置に中心を置いたスプライシング因子の平均ＩＦシグナルを示す． 同上。 リン酸化ＣＴＤが、ｍＥＳＣにおいてＳＲＳＦ２と共局在化し、インビトロでＳＲＳＦ２液滴に取り込まれ、そこに密集することを示す。（Ａ）ｍＥＳＣにおけるＭＥＤ１、ＳＲＳＦ２、及び２つの異なるリン酸化形態のＰｏｌＩＩ（非リン酸化形態またはセリン２がリン酸化された形態）の代表的なＣｈＩＰ－ｓｅｑトラック（Ｎａｎｏｇ遺伝子座及びＴｒｉｍ２８遺伝子座に対して行ったもの）である。ｙ軸は、リード数／百万を示す。（Ｂ）ＭＥＤ１、ＳＲＳＦ２、及び２つの異なるリン酸化形態のＰｏｌＩＩ（非リン酸化形態またはセリン２がリン酸化された形態）について、最も高度に発現する上位２０％の遺伝子に対して転写開始部位（ＴＳＳ）の上流２ｋｂ及び転写終了部位（ＴＥＳ）の下流２ｋｂを含めてＴＳＳからＴＥＳまでの遺伝子体にわたってＣｈＩＰ－ｓｅｑの平均リード数／百万（ＲＰＭ）のメタ遺伝子プロットを行ったものである。（Ｃ）液滴実験を示す代表的な画像であり、ＣＤＫ７によってＣＴＤがリン酸化されると、ＣＴＤが効率的にＳＲＳＦ２液滴に取り込まれることを示す。（左）１００ｍＭのＮａＣｌ及び１６％のＦｉｃｏｌｌ－４００を含む液滴形成緩衝液において２．４ｕＭの精製ｍＣｈｅｒｒｙ融合ヒトＳＲＳＦ２（ｍＣｈｅｒｒｙ－ＳＲＳＦ２）を、３．３ｕＭのＧＦＰ、ＧＦＰ－ＣＴＤ５２、またはＧＦＰ－リン酸化ＣＴＤ５２と混合し、表示のフィルターを備えた蛍光顕微鏡で可視化した。（右）ＣＤＫ７介在性のリン酸化（方法を参照のこと）を伴う場合または伴わない場合のＳＲＳＦ２液滴におけるＧＦＰ－ＣＴＤ５２の濃縮比である。ＧＦＰの濃縮比を１に設定した。ボックスプロット中のボックスの範囲は、２５～７５パーセンタイルである。ボックスの中央の線は、中央値にプロットされている。ひげの範囲は、最小値～最大値である。Ｐ値は、両側スチューデントｔ検定によって決定されている。（Ｄ）液滴実験を示す代表的な画像であり、ＣＤＫ７によってＣＴＤがリン酸化されると、ＣＴＤが効率的にＳＲＳＦ２液滴に取り込まれることを示す。（左）１００ｍＭのＮａＣｌ及び１０％のＰＥＧ－８０００を含む液滴形成緩衝液において２．４ｕＭのｍＣｈｅｒｒｙ－ＳＲＳＦ２を、３．３ｕＭのＧＦＰ、ＧＦＰ－ＣＴＤ５２、またはＧＦＰ－リン酸化ＣＴＤ５２と混合し、表示のフィルターを備えた蛍光顕微鏡で可視化した。（右）ＣＤＫ７介在性のリン酸化を伴う場合または伴わない場合のＳＲＳＦ２液滴におけるＧＦＰ－ＣＴＤ５２の濃縮比である（４ｃのものと同様に示される）。（Ｅ）液滴実験を示す代表的な画像であり、ＣＤＫ９によってＣＴＤがリン酸化されると、ＣＴＤが効率的にＳＲＳＦ２液滴に取り込まれることを示す。（左）１２０ｍＭのＮａＣｌ及び１６％のＦｉｃｏｌｌ－４００を含む液滴形成緩衝液において２．４ｕＭのｍＣｈｅｒｒｙ－ＳＲＳＦ２を、１０ｕＭのＧＦＰ、ＧＦＰ－ＣＴＤ５２、またはＧＦＰ－リン酸化ＣＴＤ５２と混合し、表示のフィルターを備えた蛍光顕微鏡で可視化した。（右）ＣＤＫ９介在性のリン酸化を伴う場合または伴わない場合のＳＲＳＦ２液滴におけるＧＦＰ－ＣＴＤ５２の濃縮比である（Ｃのものと同様に示される）。（Ｆ）液滴実験を示す代表的な画像であり、ＣＤＫ９によってＣＴＤがリン酸化されると、ＣＴＤが効率的にＳＲＳＦ２液滴に取り込まれることを示す。（左）１２０ｍＭのＮａＣｌ及び１０％のＰＥＧ－８０００を含む液滴形成緩衝液において２．４ｕＭのｍＣｈｅｒｒｙ－ＳＲＳＦ２を、１０ｕＭのＧＦＰ、ＧＦＰ－ＣＴＤ５２、またはＧＦＰ－リン酸化ＣＴＤ５２と混合し、表示のフィルターを備えた蛍光顕微鏡で可視化した。（右）ＣＤＫ９介在性のリン酸化を伴う場合または伴わない場合のＳＲＳＦ２液滴におけるＧＦＰ－ＣＴＤ５２の濃縮比である（Ｃのものと同様に示される）。 同上。 インビトロでのＣＤＫ７及びＣＤＫ９介在性のＣＴＤのリン酸化を示すと共に、ＣＤＫ７によって媒介されるＭＥＤ１－ＩＤＲ液滴へのＣＴＤの取り込みの減少がＡＴＰに依存することを示す。（Ａ）ＧＦＰ－ＣＴＤ５２のＳｅｒ５残基及びＳｅｒ２残基がＣＤＫ７によってリン酸化されることを示すウエスタンブロットである。等量のＧＦＰ－ＣＴＤ５２を各条件で使用しており、このことは、抗ＧＦＰ抗体によって示される。（Ｂ）ＧＦＰ－ＣＴＤ５２のＳｅｒ５残基及びＳｅｒ２残基がＣＤＫ９によってリン酸化されることを示すウエスタンブロットである。等量のＧＦＰ－ＣＴＤ５２を各条件で使用しており、このことは、抗ＧＦＰ抗体によって示される。（Ｃ）ＭＥＤ１－ＩＤＲ液滴へのＣＴＤの取り込みの減少にはＣＤＫ７及びＡＴＰが必要であることを示す代表的な画像である。組換えＣＤＫ７及び／またはＡＴＰと共にインキュベートしておいた１０ｕＭのＧＦＰ－ＣＴＤ５２（方法を参照のこと）を、１２５ｍＭのＮａＣｌ及び１６％のＦｉｃｏｌｌ－４００を含む液滴形成緩衝液において１０ｕＭのｍＣｈｅｒｒｙ－ＭＥＤ１－ＩＤＲと混合し、表示のフィルターを備えた蛍光顕微鏡で可視化した。 ＳＲＳＦ２がリン酸化ＣＴＤ相互作用因子であり、ＣＤＫ７によって媒介されるＳＲＳＦ２液滴へのＣＴＤの取り込みの増進がＡＴＰに依存することを示す。（Ａ）異なるリン酸化形態のＣＴＤを使用するプルダウンによって濃縮された異なるメディエーターサブユニット、ＳＲファミリースプライシング因子、及びスプライソソームコンポーネントについて質量分析から得られた平均ｉＢＡＱ（強度ベースの絶対的定量化）濃縮スコアを示すヒストグラムである。異なる分子に由来するメディエーターサブユニットが示される。スプライシング因子については、Ｅｂｍｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ ２０，１１７３－１１８６（２０１７））において検出された標準ＳＲタンパク質、及びＰｏｌＩＩと相互作用すると考えられるスプライソソームコンポーネントが示される。簡潔に記載すると、ｉＢＡＱスコアは、すべての試料にわたって、Ｅｂｍｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ（２０１７）からダウンロードしたものである。非リン酸化全長ＣＴＤ（非リン酸化）、ＴＦＩＩＨリン酸化全長ＣＴＤ（リン酸化ＣＤＫ７）、またはｐ－ＴＥＦｂリン酸化全長ＣＴＤ（リン酸化ＣＤＫ９）を使用するプルダウンについて複数回の反復測定から得られたスコアが平均化されている。ｙ軸には各タンパク質についての平均ｉＢＡＱスコアがプロットされている。（Ｂ）対照ｓｉＲＮＡ（左）または表示の因子に対するｓｉＲＮＡ（右）をトランスフェクトしたＣ２Ｃ１２細胞において、スプライシング因子であるＳＲＳＦ２、ＳＲＲＭ１、及びＳＲＳＦ１を画像化した代表的な免疫蛍光（ＩＦ）画像である。（Ｃ）ＳＲＳＦ２凝縮体へのＣＴＤの取り込みの増進にはＣＤＫ７及びＡＴＰが必要であることを示す代表的な画像である。組換えＣＤＫ７及び／またはＡＴＰと共にインキュベートしておいた３．３ｕＭのＧＦＰ－ＣＴＤ５２（方法を参照のこと）を、１００ｍＭのＮａＣｌ及び１０％のＰＥＧ－８０００を含む液滴形成緩衝液において１．２ｕＭのｍＣｈｅｒｒｙ－ＳＲＳＦ２と混合し、表示のフィルターを備えた蛍光顕微鏡で可視化した。 同上。 腫瘍組織及びがん細胞においてＭＹＣがん遺伝子がメディエーター凝縮体によって占有されることを示す。（Ａ）（左）ヘマトキシリン・エオシン染色されたＥＲ＋ヒト浸潤性乳管癌である。（右）ＥＲ＋ヒト乳癌組織においてＭＥＤ１ ＩＦまたはＥＲ ＩＦと、ＭＹＣ遺伝子座に対するＲＮＡ ＦＩＳＨと、を行った共焦点顕微鏡画像である。（Ｂ）（左）エストロゲンの存在下で増殖した乳癌細胞株ＭＣＦ７においてＭＹＣ遺伝子座に対するＲＮＡ ＦＩＳＨと併せてＥＲ ＩＦまたはＭＥＤ１ ＩＦを行った共焦点顕微鏡画像である。（右）ＭＣＦ７細胞におけるＭＹＣ ＲＮＡ ＦＩＳＨフォーカスにおいてＭＥＤ１（上（ｎ＝２３））ＩＦまたはＥＲ（下（ｎ＝１８））ＩＦの濃縮解析及び無作為なフォーカス解析を行ったものである。（Ｃ）ＭＣＦ７細胞におけるｍＥＧＦＰタグ付きＭＥＤ１のＦＲＡＰである。右側には定量化したものが示される（ｎ＝３、平均（緑色線）、最良適合線（黒の実線）、及び９５％信頼区間（黒の破線））。（Ｄ）表示のがん細胞株においてＭＥＤ１ ＩＦと、ＭＹＣ遺伝子座に対するｍＲＮＡ ＦＩＳＨと、を行った共焦点顕微鏡画像である。 同上。 ＥＲがエストロゲン依存性かつタモキシフェン感受性の凝縮体をメディエーターと共に形成することを示す。（Ａ）（左）刺激なし、エストロゲン刺激あり、またはタモキシフェン処理ありのＭＣＦ７細胞においてＭＹＣ遺伝子座に対するＤＮＡ ＦＩＳＨと併せてＭＥＤ１ ＩＦを行った共焦点顕微鏡画像である。（右）エストロゲン応答性がん遺伝子におけるメディエーター凝縮体に対するエストロゲン及びタモキシフェン処理の効果を示すモデルである。（Ｂ）ＭＣＦ７細胞における表示の条件でのＭＹＣ発現をＲＴ－ｑＰＣＲによって分析したものである。（Ｃ）（左）Ｕ２ＯＳ細胞におけるＬａｃアレイの模式図である。（右上）表示のリガンドと併せてＭＥＤ１ ＩＦと共に示されるＬａｃ－ＣＦＰ－ＥＲ－ＬＢＤ融合タンパク質の共焦点顕微鏡画像である。（右下）ＬａｃアレイにおけるＭＥＤ１の濃縮を定量化したものである（ｎ≧８）。（Ｄ）（上）ｍＥＧＦＰ－ＭＥＤ１（内在性にタグ付けされたもの）を含み、ＬＡＣ－ｍＣｈｅｒｒｙ－ＥＲ－ＬＢＤをトランスフェクトしたＵ２ＯＳ細胞において生細胞画像化を行ったものであり、当該Ｕ２ＯＳ細胞には、タモキシフェン処理を行い、０分及び３０分に画像化処理を行った。（下）表示のリガンドで３０分間処理したときのＬａｃアレイにおける濃縮比を定量化したものである（ｎ＝３）。（Ｅ）（左）インビトロの液滴アッセイの模式図である。（右上）表示のリガンドを用いてＥＲ－ＧＦＰ及びＭＥＤ１－ｍＣｈｅｒｒｙのインビトロの液滴アッセイを行ったものを示す共焦点画像である。（右下）液滴の挙動を示す模式図である。（Ｆ）ＥＲ－ＭＥＤ１液滴形成を示す相図である。 同上。 ホルモン療法抵抗性のＥＲ変異体がメディエーターと共に構成的に凝縮することを示す。（Ａ）ＥＲ－ＭＥＤ１液滴形成を示す相図である。（Ｂ）患者由来のＥＲの点変異及び転座を示す模式図である。（Ｃ～Ｄ）ＧＦＰと融合した表示のＥＲ変異体、及びＭＥＤ１－ｍＣｈｅｒｒｙを表示のリガンドと共に用いたインビトロの液滴アッセイである。（Ｅ）ＧＡＬ４トランス活性化アッセイを示す模式図である。（Ｆ～Ｇ）ＧＡＬ４－ＤＢＤ ＥＲ ＬＢＤの野生型タンパク質または変異タンパク質のトランス活性化活性であり、表示のリガンドを用いたときのものである（ｎ＝９）。アスタリスクは、エストロゲンなしのＥＲのものと比較してｐ＜０．０１であることを示す。 同上。 ＭＥＤ１が過剰発現するとメディエーター凝縮が促進されることを示す。（Ａ）ＥＲ－ＭＥＤ１液滴形成を示す相図である。（Ｂ）ＭＣＦ７細胞、または確立されたタモキシフェン抵抗性ＭＣＦ７細胞株におけるＭＥＤ１のウエスタンブロットである。（Ｃ）低ＭＥＤ１濃度（２００ｎＭ）または高ＭＥＤ１濃度（１６００ｎＭ）のＭＥＤ１－ｍＣｈｅｒｒｙとＥＲ－ＧＦＰとの液滴形成アッセイを表示のリガンドの存在下で行い、ＭＥＤ１チャネルで可視化したものである。下には、定量化したものが示される（ｎ＞２０）。（Ｄ）Ｌａｃ－ＥＲ－ＬＢＤ融合タンパク質（上の横列）をトランスフェクトした後、ＭＥＤ１ ＩＦ（下の横列）を行ったＵ２ＯＳ細胞の共焦点顕微鏡画像である。下には、定量化したものが示される（ｎ≧８）。（Ｅ）ＧＡＬ４－ＥＲ ＬＢＤを用いたトランス活性化アッセイを低レベルまたは高レベルのＭＥＤ１の存在下でタモキシフェンを存在させて実施したものである（ｎ＝９）。（Ｆ）ＭＥＤ１のレベルがＷＴレベルまたは高レベルのＭＣＦ７細胞をタモキシフェンで処理したときの当該ＭＣＦ７の生存率である。下には、定量化したものが示される（ｎ＝４）。（Ｇ）高レベルのＭＥＤ１の存在下では凝縮体形成及びがん遺伝子活性化がエストロゲン非依存的に生じることを示す模式図である。 同上。 腫瘍組織及びがん細胞においてＭＹＣがん遺伝子がメディエーター凝縮体によって占有されることを示す。（Ａ）生検乳癌検体から得られた臨床データである。（Ｂ）ＥＲ＋乳癌生検でのＭＥＤ１ ＩＦ及びＤＡＰＩ染色を示す共焦点顕微鏡画像であり、ＭＥＤ１小斑点を示す。（Ｃ）ＭＣＦ７ ＭＥＤ１－ｍＥＧＦＰ細胞株におけるＭＥＤ１レベルを示すウエスタンブロットである。 ＥＲがエストロゲン依存性かつタモキシフェン感受性の凝縮体をメディエーターと共に形成することを示す。（Ａ）ｍＥＧＦＰ－ＭＥＤ１ Ｕ２ＯＳ Ｌａｃ細胞を生成させるためのノックイン方針を示す模式図である。（Ｂ）Ｕ２ＯＳ－Ｌａｃ細胞におけるｍＥＧＦＰタグ付きＭＥＤ１が存在することを実証するウエスタンブロットである。（Ｃ）図２Ｅに示されるインビトロ液滴アッセイを定量化したものである（ｎ＞２０）。 ホルモン療法抵抗性のＥＲ変異体がメディエーターと共に構成的に凝縮することを示す。（Ａ）ホットスポット５３７及びホットスポット５３８を含めたＥＲ変異の頻度であり、ｃＢｉｏＰｏｒｔａｌデータベースにおける２２０人の患者から得られたデータである。（Ｂ）表示のリガンドを用いたときのＭＥＤ１液滴へのＥＲ変異タンパク質の取り込みを定量化したものである（ｎ＞２０）。（Ｃ）ＭＥＤ１ ＩＦを用いたＥＲ点変異体のＬａｃアッセイである。下には、濃縮を定量化したものが示される（ｎ≧８）。 ＭＥＤ１が過剰発現するとメディエーター凝縮が促進されることを示す。（Ａ）表示のリガンドの共存下でＭＥＤ１の濃度を上昇させるＥＲ－ＧＦＰ及びＭＥＤ１－ｍＣｈｅｒｒｙの液滴形成アッセイである。（Ｂ）低レベルまたは高レベルのＭＥＤ１の存在下でリガンドを存在させずに実施したＧＡＬ４－ＥＲ ＬＢＤを用いたトランス活性化アッセイである。
本発明を実施する際には、別段の指定がない限り、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換え核酸（例えば、ＤＮＡ）技術、免疫学、及びＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の従来技術が典型的には用いられることになるが、こうした従来技術は、当該技術分野の技能範囲内のものである。こうした技術のある特定のものについての説明は、限定されないが、下記の刊行物に見られる：Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，（ｅｄｓ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ、及びＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ（すべてＪｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．，ｅｄｉｔｉｏｎ（２００８年１２月時点））、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｒｕｓｓｅｌｌ，ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，２００１、Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ｄ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ－Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，１９８８、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．，“Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ，Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ”，５ｔｈ ｅｄ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ，２００５。治療剤及びヒト疾患に関する情報については、限定されないが、Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，１１ｔｈ Ｅｄ．，ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ，２００５、Ｋａｔｚｕｎｇ，Ｂ．（ｅｄ．）Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ／Ａｐｐｌｅｔｏｎ ＆ Ｌａｎｇｅ；１０ｔｈ ｅｄ．（２００６）または１１ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｊｕｌｙ ２００９）に見られる。遺伝子及び遺伝性障害に関する情報については、限定されないが、ＭｃＫｕｓｉｃｋ，Ｖ．Ａ．：Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｉｎ Ｍａｎ．Ａ Ｃａｔａｌｏｇ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ．Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ：Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９８（１２ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ）またはより最近のオンラインデータベース：Ｏｎｌｉｎｅ Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｉｎ Ｍａｎ，ＯＭＩＭ（商標）．ＭｃＫｕｓｉｃｋ－Ｎａｔｈａｎｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ）ａｎｄ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）（２０１０年５月１日時点）、ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｏｍｉｍ／、ならびにｏｍｉａ．ａｎｇｉｓ．ｏｒｇ．ａｕ／ｃｏｎｔａｃｔ．ｓｈｔｍｌにおけるＯｎｌｉｎｅ Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｉｎ Ａｎｉｍａｌｓ（ＯＭＩＡ）（動物種（ヒト及びマウス以外）における遺伝子、遺伝障害、及び遺伝形質のデータベース）に見られる。本明細書で言及される特許、特許出願、及び他の刊行物（例えば、科学論文、書籍、ウェブサイト、及びデータベース）はすべて、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。本明細書と、組み込まれる参考文献のいずれかとの間に矛盾が生じる場合、本明細書（その任意の補正物（組み込まれる参考文献に基づき得る）を含む）が優先されるものとする。本明細書では、用語は、別段の指定がない限り、それが当該技術分野で認められている標準的な意味で使用される。本明細書では、さまざまな用語に対して標準的な略語が使用される。
凝縮体のコンポーネントを標的とすることによる転写の調節
凝縮体タンパク質
転写凝縮体のタンパク質コンポーネントの多くは、天然変性の領域（天然（ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ）（もしくは天然（ｉｎｔｒｉｎｓｉｃａｌｌｙ））変性領域（ＩＤＲ）または天然（ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ）（もしくは天然（ｉｎｔｒｉｎｓｉｃａｌｌｙ））変性ドメインとも称される）を有する。こうした用語はそれぞれ、本開示を通じて互換的に使用される。ヘテロクロマチン凝縮体のコンポーネントの多く、及びｍＲＮＡ開始複合体またはｍＲＮＡ伸長複合体と物理的に結び付く凝縮体のコンポーネントの多くもまた、ＩＤＲを有する。ＩＤＲは、安定な二次構造及び三次構造を有さない。いくつかの実施形態では、ＩＤＲは、Ａｌｉ，Ｍ．，＆ Ｉｖａｒｓｓｏｎ，Ｙ．（２０１８）．Ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｄｉｓｏｒｄｅｒｅｄ ｒｅｇｉｏｎｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１４（５），ｅ８３７７に開示の方法によって同定され得る。
本明細書に記載の組成物及び方法の実施形態のいくつかでは、凝縮体コンポーネントは、転写因子である。本明細書で使用される「転写因子」（ＴＦ）は、特定のＤＮＡ配列に結合することによって転写を制御するタンパク質である。ＴＦは、一般に、ＤＮＡ結合ドメイン及び活性化ドメインを含む。いくつかの実施形態では、転写因子は、活性化ドメインにＩＤＲを有する。いくつかの実施形態では、転写因子（ＴＦ）は、ＯＣＴ４、ｐ５３、ＭＹＣもしくはＧＣＮ４、ＮＡＮＯＧ、ＭｙｏＤ、ＫＬＦ４、ＳＯＸファミリーの転写因子、またはＧＡＴＡファミリーの転写因子である。いくつかの実施形態では、ＴＦは、シグナル伝達因子によって制御される（例えば、ＴＦがシグナル伝達因子と相互作用することによって転写が調節される）。いくつかの実施形態では、ＴＦは、核内受容体（例えば、核内ホルモン受容体、エストロゲン受容体、レチノイン酸受容体－アルファ）である。核内受容体は、５～６つの相同ドメイン（Ｎ末端からＣ末端の順にＡ～Ｆと呼ばれる）からなる特徴的なモジュラー構造を示す進化的に関連するＤＮＡ結合転写因子の大きなスーパーファミリーのメンバーである。ＮＲの活性は、さまざまな小分子リガンドがリガンド結合ドメイン中のポケットに結合することによって少なくとも部分的に制御される。ヒトゲノムは、約５０種類のＮＲをコードする。ＮＲスーパーファミリーのメンバーには、糖質コルチコイド受容体、鉱質コルチコイド受容体、プロゲステロン受容体、アンドロゲン受容体、及びエストロゲン受容体、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（ＰＰＡＲ）、甲状腺ホルモン受容体、レチノイン酸受容体、レチノイドＸ受容体、ＮＲ１Ｈ受容体及びＮＲ１Ｉ受容体、ならびにオーファン核内受容体（すなわち、特定の日付時点でリガンドが同定されていない受容体）が含まれる。いくつかの実施形態では、核内受容体（ＮＲ）は、核内受容体サブファミリー０のメンバー、核内受容体サブファミリー１のメンバー、核内受容体サブファミリー２のメンバー、核内受容体サブファミリー３のメンバー、核内受容体サブファミリー４のメンバー、核内受容体サブファミリー５のメンバー、または核内受容体サブファミリー６のメンバーである。いくつかの実施形態では、核内受容体は、ＮＲ１Ｄ１（核内受容体サブファミリー１、Ｄ群、メンバー１）、ＮＲ１Ｄ２（核内受容体サブファミリー１、Ｄ群、メンバー２）、ＮＲ１Ｈ２（核内受容体サブファミリー１、Ｈ群、メンバー２；異名：肝臓Ｘ受容体ベータ）、ＮＲ１Ｈ３（核内受容体サブファミリー１、Ｈ群、メンバー３；異名：肝臓Ｘ受容体アルファ）、ＮＲ１Ｈ４（核内受容体サブファミリー１、Ｈ群、メンバー４）、ＮＲ１Ｉ２（核内受容体サブファミリー１、Ｉ群、メンバー２；異名：プレグナンＸ受容体）、ＮＲ１Ｉ３（核内受容体サブファミリー１、Ｉ群、メンバー３；異名：構成的アンドロスタン受容体）、ＮＲ１Ｉ４（核内受容体サブファミリー１、Ｉ群、メンバー４）、ＮＲ２Ｃ１（核内受容体サブファミリー２、Ｃ群、メンバー１）、ＮＲ２Ｃ２（核内受容体サブファミリー２、Ｃ群、メンバー２）、ＮＲ２Ｅ１（核内受容体サブファミリー２、Ｅ群、メンバー１）、ＮＲ２Ｅ３（核内受容体サブファミリー２、Ｅ群、メンバー３）、ＮＲ２Ｆ１（核内受容体サブファミリー２、Ｆ群、メンバー１）、ＮＲ２Ｆ２（核内受容体サブファミリー２、Ｆ群、メンバー２）、ＮＲ２Ｆ６（核内受容体サブファミリー２、Ｆ群、メンバー６）、ＮＲ３Ｃ１（核内受容体サブファミリー３、Ｃ群、メンバー１；異名：糖質コルチコイド受容体）、ＮＲ３Ｃ２（核内受容体サブファミリー３、Ｃ群、メンバー２；異名：アルドステロン受容体、鉱質コルチコイド受容体）、ＮＲ４Ａ１（核内受容体サブファミリー４、Ａ群、メンバー１）、ＮＲ４Ａ２（核内受容体サブファミリー４、Ａ群、メンバー２）、ＮＲ４Ａ３（核内受容体サブファミリー４、Ａ群、メンバー３）、ＮＲ５Ａ１（核内受容体サブファミリー５、Ａ群、メンバー１）、ＮＲ５Ａ２（核内受容体サブファミリー５、Ａ群、メンバー２）、ＮＲ６Ａ１（核内受容体サブファミリー６、Ａ群、メンバー１）、ＮＲ０Ｂ１（核内受容体サブファミリー０、Ｂ群、メンバー１）、ＮＲ０Ｂ２（核内受容体サブファミリー０、Ｂ群、メンバー２）、ＲＡＲＡ（レチノイン酸受容体、アルファ）、ＲＡＲＢ（レチノイン酸受容体、ベータ）、ＲＡＲＧ（レチノイン酸受容体、ガンマ）、ＲＸＲＡ（レチノイドＸ受容体、アルファ；異名：核内受容体サブファミリー２、Ｂ群、メンバー１）、ＲＸＲＢ（レチノイドＸ受容体、ベータ；異名：核内受容体サブファミリー２、Ｂ群、メンバー２）、ＲＸＲＧ（レチノイドＸ受容体、ガンマ；異名：核内受容体サブファミリー２、Ｂ群、メンバー３）、ＴＨＲＡ（甲状腺ホルモン受容体、アルファ）、ＴＨＲＢ（甲状腺ホルモン受容体、ベータ）、ＡＲ（アンドロゲン受容体）、ＥＳＲ１（エストロゲン受容体１）、ＥＳＲ２（エストロゲン受容体２；異名：ＥＲベータ）、ＥＳＲＲＡ（エストロゲン関連受容体アルファ）、ＥＳＲＲＢ（エストロゲン関連受容体ベータ）、ＥＳＲＲＧ（エストロゲン関連受容体ガンマ）、ＰＧＲ（プロゲステロン受容体）、ＰＰＡＲＡ（ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体アルファ）、ＰＰＡＲＤ（ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体デルタ）、ＰＰＡＲＧ（ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体ガンマ）、ＶＤＲ（ビタミンＤ（１，２５－ジヒドロキシビタミンＤ３）受容体）である。
いくつかの実施形態では、核内受容体は、タンパク質分解による切断によって生じる天然起源の短縮形態の核内受容体（短縮型ＲＸＲアルファまたは短縮型エストロゲン受容体など）である。いくつかの実施形態では、受容体（例えば、ＮＲ）は、ＨＳＰ７０クライアントである。例えば、アンドロゲン受容体（ＡＲ）及び糖質コルチコイド受容体（ＧＲ）は、ＨＳＰ７０クライアントである。ＮＲに関する詳細な情報は、Ｇｅｒｍａｉｎ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ，５８：６８５－７０４，２００６において見つけることができ、この文献では、核内受容体の命名法及び構造の総説、ならびにＮＲサブファミリーに関する総説として同じ号の薬理学的総説に掲載される他の文献が提供されている）。いくつかの実施形態では、ＨＳＰ９０Ａクライアントは、ステロイドホルモン受容体（例えば、エストロゲン、プロゲステロン、糖質コルチコイド、鉱質コルチコイド、またはアンドロゲン受容体）、ＰＰＡＲアルファ、またはＰＸＲである。いくつかの実施形態では、核内受容体（ＮＲ）は、リガンド依存性ＮＲである。リガンド依存性ＮＲは、ＮＲにリガンドが結合するとＮＲの活性が調節されることによって特徴付けられる。いくつかの実施形態では、リガンド依存性ＮＦにリガンドが結合すると、ＮＲに立体配座の変化が生じ、その結果、例えば、ＮＲの核内移行、ＮＲからの１つ以上のタンパク質の解離、ＮＲの活性化、またはＮＲの抑制が生じる。いくつかの実施形態では、ＮＲは、リガンド結合時に野生型ＮＲなら生じる１つ以上の活性（例えば、ＮＲの核内移行、ＮＲからの１つ以上のタンパク質の解離、ＮＲの活性化、またはＮＲの抑制）を有さない変異体である。いくつかの実施形態では、ＮＲは、野生型ＮＲではリガンド依存的な活性（例えば、ＮＲの核内移行、ＮＲからの１つ以上のタンパク質の解離、ＮＲの活性化、またはＮＲの抑制）がリガンド結合に依存せずに生じる変異体である。いくつかの実施形態では、核内受容体は、関連リガンドに結合すると転写を活性化する。いくつかの実施形態では、核内受容体は、関連リガンドの非存在下で転写を活性化する変異核内受容体である。
ＮＲは、幅広い範囲の生物学的プロセス（とりわけ、発生、分化、生殖、免疫応答、代謝制御、及び異物代謝など）、ならびにさまざまな病的状態において重要な役割を担う。ＮＲは、重要なクラスの薬物標的となっている。ＮＲを（例えば、ＮＲを含む転写凝縮体を調節することによって）薬理学的に調節することは、さまざまな障害（がん、自己免疫性、代謝性、及び炎症性／免疫系の障害（例えば、関節炎、喘息、アレルギー）を含む）、ならびに拒絶の可能性を低減するための移植後の免疫抑制において有用であり得る。内在性小分子リガンド及び／または外来性小分子リガンド（複数可）との相互作用に加えて、ＮＲは、さまざまな内在性タンパク質（二量体化パートナー、コアクチベーター、コリプレッサー、ユビキチンリガーゼ、キナーゼ、ホスファターゼなど）と相互作用し、こうした内在性タンパク質によってＮＲの活性が調節され得る。
核内受容体リガンドは、いくつかのＮＲの活性を調節する。いくつかのリガンドは、ＮＲの活性を刺激する。そのようなリガンドは、「アゴニスト」と称され得る。いくつかのリガンドは、アゴニストの非存在下ではＮＲまたは他のリガンド依存性ＴＦの活性に影響を与えない。一方で、「アンタゴニスト」と称され得るリガンドは、アゴニストの作用を阻害する能力を有し、こうした阻害は、例えば、タンパク質におけるアゴニストの結合部位と同じ結合部位に競合的に結合するか、またはタンパク質における異なる結合部位に結合することによって生じる。ある特定のＮＲは、アゴニストの非存在下で低レベルの遺伝子転写を促進する（基底活性または構成的活性とも称される）。核内受容体におけるこの基底レベルの活性を低減するリガンドは、インバースアゴニストと称され得る。
いくつかの実施形態では、転写因子は、表Ｓ３に記載の転写因子である。いくつかの実施形態では、転写因子は、メディエーターコンポーネント（例えば、表Ｓ３に記載のメディエーターコンポーネント）と相互作用する転写因子である。
いくつかの実施形態では、ＴＦは、シグナル伝達因子によって制御される活性を有するＴＦである。いくつかの実施形態では、シグナル伝達因子は、ＩＤＲを含む。いくつかの実施形態では、シグナル伝達因子は、ＴＣＦ７Ｌ２、ＴＣＦ７、ＴＣＦ７Ｌ１、ＬＥＦ１、ベータ－カテニン、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ２、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ４、ＳＴＡＴ５Ａ、ＳＴＡＴ５Ｂ、ＳＴＡＴ６、またはＮＦ－κＢである。本明細書に記載の組成物及び方法の実施形態のいくつかでは、シグナル伝達因子は、ＮＦ－ｋＢ、ＦＯＸＯ１、ＦＯＸＯ２、ＦＯＸＯ４、ＩＫＫアルファ、ＣＲＥＢ、Ｍｄｍ２、ＹＡＰ、ＢＡＤ、ｐ６５、ｐ５０、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２、ＧＬＩ３、ＹＡＰ、ＴＡＺ、ＴＥＡＤ１、ＴＥＡＤ２、ＴＥＡＤ３、ＴＥＡＤ４、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ２、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ４、ＳＴＡＴ５Ａ、ＳＴＡＴ５Ｂ、ＳＴＡＴ６、ＡＰ－１、Ｃ－ＦＯＳ、ＣＲＥＢ、ＭＹＣ、ＪＵＮ、ＣＲＥＢ、ＥＬＫ１、ＳＲＦ、ＮＯＴＣＨ１、ＮＯＴＣＨ２、ＮＯＴＣＨ３、ＮＯＴＣＨ４、ＲＢＰＪ、ＭＡＭＬ１、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４、ＩＲＦ３、ＥＲＫ１、ＥＲＫ２、ＭＹＣ、ＴＣＦ７Ｌ２、ＴＣＦ７、ＴＣＦ７Ｌ１、ＬＥＦ１、またはベータ－カテニンであり得る。
本明細書に記載の組成物及び方法の実施形態のいくつかでは、凝縮体コンポーネントは、表Ｓ１に記載のタンパク質である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物または方法のいずれかにおける凝縮体コンポーネントは、表Ｓ１に記載のタンパク質のＩＤＲを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物または方法のいずかにおける凝縮体コンポーネントは、表Ｓ１に記載のタンパク質と結び付く。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物または方法のいずれかにおける凝縮体コンポーネントは、表Ｓ１に記載のタンパク質のＩＤＲと結び付く。いくつかの実施形態では、凝縮体コンポーネントは、表Ｓ３に記載のメディエーターコンポーネントである。
表Ｓ１：タンパク質及び変性領域（ＩＤＲ）：
Figure 2024029228000001
Figure 2024029228000002
Figure 2024029228000003
表Ｓ１では、「ＩＤＲ長（ａａ）」は、変性％にタンパク質の全長を掛けることによって計算した。Ｐｏｔｅｎｚａ，ｅｔ ａｌ．，“ＭｏｂｉＤＢ ２．０：ａｎ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｄａｔａｂａｓｅ ｏｆ ｉｎｔｒｉｎｓｉｃａｌｌｙ ｄｉｓｏｒｄｅｒｅｄ ａｎｄ ｍｏｂｉｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ，”Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１５ Ｊａｎ；４３（Ｄａｔａｂａｓｅ ｉｓｓｕｅ）：Ｄ３１５－２０に示される方法を使用して所与のタンパク質の変性％を得ることができ、当該文献は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
こうした変性領域では、アミノ酸配列のモチーフまたは偏りがいくつか同定されている。表Ｓ２：モチーフのリスト
Figure 2024029228000004
こうしたモチーフは、凝縮体の形成、維持、崩壊、または制御に関与することが提唱されている（図２Ａ）。ペプチド、核酸、または小化学分子が任意の１つの型のタンパク質モチーフと特異的に相互作用するのであれば、そうしたペプチド、核酸、または小化学分子は、凝縮体の形成、組成物、維持、崩壊、または制御に影響を与え、それによって、そのようなモチーフを利用する凝縮体による転写量が変わるであろうと想定される（図２Ｂ）。したがって、転写凝縮体を調節することによって１つ以上の遺伝子の発現が影響を受け得る。
例えば、いくつかの実施形態では、転写凝縮体を調節することで、エンハンサーまたはスーパーエンハンサー（ＳＥ）によって制御される遺伝子の発現が調節され得る。本明細書で使用される「スーパーエンハンサー」は、例外的に高い密度の転写装置によって占有されるエンハンサーのクラスターであり、ある特定のＳＥは、細胞独自性（例えば、細胞増殖、細胞分化）において特に重要な役割を有する遺伝子を制御する。本開示は、任意のエンハンサーまたはスーパーエンハンサーを調節することを企図する。スーパーエンハンサーの例は、２０１３年１０月２５日出願のＰＣＴ国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０６６９５７号（代理人整理番号ＷＩＢＲ－１３７－ＷＯ１）に開示されており、当該文献は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
本明細書で使用される「スーパーエンハンサーコンポーネント」という語句は、通常のエンハンサー、またはスーパーエンハンサー以外のエンハンサーとは対照的に、スーパーエンハンサーにおける局所濃度または占有度が高く、いくつかの実施形態では、関連遺伝子の発現増加に寄与するコンポーネント（タンパク質など）を指す。ある実施形態では、スーパーエンハンサーコンポーネントは、核酸（例えば、ＲＮＡ（例えば、スーパーエンハンサーから転写されるｅＲＮＡ、すなわちｅＲＮＡ））である。ある実施形態では、核酸は、染色体核酸ではない。ある実施形態では、スーパーエンハンサーコンポーネントは、転写の活性化または制御に関与する。いくつかの実施形態では、スーパーエンハンサーコンポーネントは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ、メディエーター、コヒーシン、Ｎｉｐｂｌ、ｐ３００、ＣＢＰ、Ｃｈｄ７、Ｂｒｄ４、及びｅｓＢＡＦのコンポーネント（Ｂｒｇ１）またはＬｓｄ１－Ｎｕｒｄ複合体のコンポーネント（例えば、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ）を含む。
いくつかの実施形態では、スーパーエンハンサーコンポーネントは、転写因子である。いくつかの実施形態では、転写因子は、ＯＣＴ４、ｐ５３、ＭＹＣ、またはＧＣＮ４である。いくつかの実施形態では、転写因子は、ＩＤＲ（例えば、転写因子の活性化ドメインにおけるＩＤＲ）を有する。いくつかの実施形態では、転写因子は、表Ｓ３に記載の転写因子の活性化ドメインを有する。いくつかの実施形態では、転写因子は、表Ｓ３に記載の転写因子のＩＤＲを有する。いくつかの実施形態では、転写因子は、表Ｓ３に記載のものである。いくつかの実施形態では、転写因子は、メディエーターコンポーネント（例えば、表Ｓ３に記載のメディエーターコンポーネント）と相互作用する転写因子である。本明細書で使用される「転写因子」という用語は、ＤＮＡ結合ドメインを使用してＤＮＡの特定部分に結合し、ＤＮＡからＲＮＡへの遺伝情報の伝達（もしくは転写）を制御する系の一部となるタンパク質を指す。本明細書で使用される転写活性化ドメイン（ＡＤ）は、プロモーターからの転写を、ＤＮＡ結合ドメインと連動して活性化できる転写因子領域である。いくつかの実施形態では、ＡＤは、転写因子ＤＮＡ結合ドメインを含まない。いくつかの実施形態では、ＡＤは、Ｖｉｏｌａｉｎｅ Ｓａｉｎｔ－Ａｎｄｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎ Ｒｅｓ，２０１５において定義されるヒト転写因子に由来するものである。いくつかの実施形態では、ＡＤは、ＩＤＲを含む。いくつかの実施形態では、ＩＤＲは、少なくとも約５つ、少なくとも約１０個、少なくとも約１５個、少なくとも約２０個、少なくとも約３０個、少なくとも約４０個、少なくとも約５０個、少なくとも約６０個、少なくとも約７５個、少なくとも約１００個、少なくとも約１５０個、またはそれを超える数の変性アミノ酸（例えば、連続する変性アミノ酸）である。いくつかの実施形態では、アミノ酸は、Ｄ２Ｐ２（Ｏａｔｅｓ ｅｔ ａｌ．，２０１３）によって用いられるアルゴリズムのうちの少なくとも７５％が、当該残基が変性すると予測するのであれば、変性アミノ酸であると考えられる。いくつかの実施形態では、同定されるＡＤの断片を選択することができ、こうした断片は、例えば、全長ＡＤの活性化能力の少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、またはそれを超える％を保持する。
本明細書で使用される「エンハンサー」は、タンパク質（例えば、転写因子）が結合して遺伝子の転写を増進する短いＤＮＡ領域を指す。本明細書で使用される「転写コアクチベーター」は、転写因子と相互作用して遺伝子の転写を刺激するタンパク質またはタンパク質の複合体を指す。いくつかの実施形態では、転写コアクチベーターは、メディエーターである。いくつかの実施形態では、転写コアクチベーターは、Ｍｅｄ１（遺伝子識別子：５４６９）またはＭＥＤ１５である。いくつかの実施形態では、転写コアクチベーターは、メディエーターコンポーネントである。本明細書で使用される「メディエーターコンポーネント」は、天然起源のメディエーター複合体ポリペプチドのアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、または当該ポリペプチドからなる。天然起源のメディエーター複合体ポリペプチドは、例えば、細胞に生じるメディエーター複合体または細胞から精製されるメディエーター複合体に見られるおよそ３０種類のポリペプチドのいずれかであり得る（例えば、Ｃｏｎａｗａｙ ｅｔ ａｌ．，２００５、Ｋｏｒｎｂｅｒｇ，２００５、Ｍａｌｉｋ ａｎｄ Ｒｏｅｄｅｒ，２００５を参照のこと）。いくつかの実施形態では、天然起源のメディエーターコンポーネントは、Ｍｅｄ１～Ｍｅｄ３１のいずれかであるか、または当該技術分野で知られる任意の天然起源のメディエーターポリペプチドである。例えば、天然起源のメディエーター複合体ポリペプチドは、Ｍｅｄ６、Ｍｅｄ７、Ｍｅｄ１０、Ｍｅｄ１２、Ｍｅｄ１４、Ｍｅｄ１５、Ｍｅｄ１７、Ｍｅｄ２１、Ｍｅｄ２４、Ｍｅｄ２７、Ｍｅｄ２８、またはＭｅｄ３０であり得る。いくつかの実施形態では、メディエーターポリペプチドは、Ｍｅｄ１１複合体、Ｍｅｄ１７複合体、Ｍｅｄ２０複合体、Ｍｅｄ２２複合体、Ｍｅｄ８複合体、Ｍｅｄ１８複合体、Ｍｅｄ１９複合体、Ｍｅｄ６複合体、Ｍｅｄ３０複合体、Ｍｅｄ２１複合体、Ｍｅｄ４複合体、Ｍｅｄ７複合体、Ｍｅｄ３１複合体、Ｍｅｄ１０複合体、Ｍｅｄ１複合体、Ｍｅｄ２７複合体、Ｍｅｄ２６複合体、Ｍｅｄ１４複合体、Ｍｅｄ１５複合体に見られるサブユニットである。いくつかの実施形態では、メディエーターポリペプチドは、Ｍｅｄ１２／Ｍｅｄ１３／ＣＤＫ８／サイクリン複合体に見られるサブユニットである。メディエーターについては、ＰＣＴ国際出願第ＷＯ２０１１／１００３７４号においてさらに詳述されており、当該文献の教示内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
ペプチド、核酸、または小化学分子（例えば、本明細書に記載の化合物、小分子、薬剤）が、タンパク質において凝縮体形成に関与する任意の１つの型のモチーフと特異的に相互作用すると、そうした化合物が凝縮体に優先的に蓄積し得、こうして蓄積した化合物が作用することで、凝縮体関連機能の挙動に優先的に影響が及び得る。例えば、化合物は、凝縮体を安定化または崩壊させ、それによって転写を調節し得る。いくつかの実施形態では、化合物は、凝縮体を安定化または崩壊させ、それによって遺伝子サイレンシングを調節し得る。いくつかの実施形態では、化合物は、凝縮体を安定化または崩壊させ、それによってｍＲＮＡの開始または伸長（例えば、スプライシング）を調節し得る。いくつかの態様では、方法は、表Ｓ２に記載のモチーフと物理的に結び付く化合物を同定することを含む。いくつかの態様では、方法は、核内受容体ＡＤのＩＤＲと物理的に結び付く化合物を同定することを含む。いくつかの実施形態では、核内受容体は、疾患と結び付く変異核内受容体である。いくつかの実施形態では、変異核内受容体は、乳癌と結び付く。本明細書に開示の方法及び化合物の実施形態のいくつかでは、核内受容体は、変異エストロゲン受容体（例えば、エストロゲン受容体アルファ）（例えば、Ｙ５３７Ｓ ＥＳＲ１、Ｄ５３８Ｇ ＥＳＲ１）である。いくつかの実施形態では、方法は、ヘテロクロマチンまたは遺伝子サイレンシング凝縮体のコンポーネントと相互作用する化合物（例えば、メチル化ＤＮＡ、メチルＤＮＡ結合タンパク質、サプレッサー、またはスーパーエンハンサーにおけるメチル化ＤＮＡと相互作用する化合物）を同定することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、開始複合体または伸長複合体と物理的に結び付く凝縮体と優先的に相互作用する化合物を同定することを含む。
したがって、本発明の態様のいくつかは、細胞における１つ以上の遺伝子の転写を調節する方法を対象とし、この方法は、１つ以上の遺伝子と結び付く凝縮体（例えば、転写凝縮体）の形成、組成、維持、崩壊、及び／または制御を調節することを含む。本発明の態様のいくつかは、遺伝子サイレンシング（例えば、１つ以上の遺伝子の転写の抑制、ヘテロクロマチンにおける１つ以上の遺伝子の転写の抑制）を調節する方法を対象とし、この方法は、１つ以上の遺伝子と結び付く凝縮体の形成、組成、維持、崩壊、及び／または制御を調節することを含む。本開示の態様のいくつかは、ｍＲＮＡの開始または伸長を調節することを対象とし、この調節は、開始複合体または伸長複合体と物理的に結び付く凝縮体の形成、組成、維持、崩壊、及び／または制御を調節することを含む。
本明細書で使用される「調節すること」（及びその動詞形態（「調節する」など））は、定性的または定量的な変化、改変、または修飾を生じさせるか、または促進することを意味する。そのような変化は、定性的または定量的な側面での増加または減少であり得るが、こうしたものに、限定されない。
「増加した」、「増加する」、または「増進する」という用語は、例えば、統計的に有意な量での増加または増進であり得る。いくつかの実例では、例えば、要素の増加率または増進率は、参照レベル（例えば、対照）と比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約１００％であり得、こうした範囲は、そこに含まれる任意の整数量（例えば、２％、１４％、２８％など）（簡略化のために包括的には記載されていない）を含むことが理解されよう。他の実例では、要素の増加倍率または増進倍率は、参照レベルと比較して、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、またはそれを超える倍率であり得る。
「減少する」、「低減する」、「低減される」、「低減」、及び「阻害する」という用語は、例えば、参照（例えば、対照）と比較して統計的に有意な量での減少または低減であり得る。いくつかの実例では、例えば、要素の減少率または低減率は、参照レベルと比較して、少なくとも１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％（記載の最大値を含み、さらに、例えば、参照レベルと比較して要素が完全に存在しなくなることが含まれる）であり得る。こうした範囲は、そこに含まれる任意の整数量（例えば、６％、１８％、２６％など）（簡略化のために包括的には記載されていない）を含むことが理解されよう。
例えば、遺伝子の転写を調節することには、遺伝子の転写の速度または頻度を増加または減少させることが含まれる。凝縮体の形成を調節することには、形成率または形成成立有無を増加または減少させることが含まれる。凝縮体の組成を調節することには、凝縮体と結び付くコンポーネントのレベルを上昇または低下させることが含まれる。凝縮体の維持を調節することには、凝縮体の維持率を増加または減少させることが含まれる。凝縮体の崩壊を調節することには、凝縮体の崩壊率を増加または減少させること、及び凝縮体の崩壊を阻止または抑制することが含まれる。凝縮体の制御を調節することには、凝縮体の細胞制御を修飾することが含まれる。遺伝子サイレンシングを調節することには、遺伝子の転写阻害を増加または減少させることが含まれる。ｍＲＮＡの開始または転写を調節することには、ｍＲＮＡの転写開始、ｍＲＮＡの伸長、及びｍＲＮＡのスプライシング活性を増加または減少させることが含まれる。本明細書で使用されるように、凝縮体を調節することは、凝縮体の形成、組成、維持、崩壊、及び／または制御を調節することのうちの１つ、２つ、３つ、４つ、または５つすべてを含む。いくつかの実施形態では、凝縮体を調節することは、凝縮体の形態または形状を変化させることを含む。
本明細書で使用される「遺伝子サイレンシング」（遺伝子転写抑制と称されることもある）は、遺伝子の転写の低減または除去を指す。遺伝子の転写の低減率は、参照レベル（例えば、非処理の対照細胞または凝縮体）と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％、少なくとも約９９．９％、またはそれを超える％であり得る。いくつかの実施形態では、遺伝子サイレンシングは、ヘテロクロマチンまたはメチル化ゲノムＤＮＡと結び付く。いくつかの実施形態では、遺伝子サイレンシングは、メチル化ＤＮＡへのメチルＤＮＡ結合タンパク質の結合を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子サイレンシングは、クロマチンを修飾することを含む。本明細書で使用される「ヘテロクロマチン」は、密度が通常とは異なり（通常、密度が高まっている）、遺伝子の活性が修飾または抑制されている染色体物質を指す。本明細書の方法及び組成物の実施形態のいくつかでは、ヘテロクロマチンは、条件的ヘテロクロマチンを指し、条件的ヘテロクロマチンは、特定の発生的または環境的なシグナル伝達情報の下で、その凝縮構造を失い、転写的に活性となる。
いくつかの実施形態では、調節される１つ以上の遺伝子は、がん遺伝子を含む。がん遺伝子の例としては、ＭＹＣ、ＳＲＣ、ＦＯＳ、ＪＵＮ、ＭＹＢ、ＲＡＳ、ＡＢＬ、ＨＯＸＩ１、ＨＯＸＩ１ １Ｌ２、ＴＡＬ１／ＳＣＬ、ＬＭＯ１、ＬＭＯ２、ＥＧＦＲ、ＭＹＣＮ、ＭＤＭ２、ＣＤＫ４、ＧＬＩ１、ＩＧＦ２、活性化ＥＧＦＲ、変異遺伝子（ＦＬＴ３－ＩＴＤ、変異ＴＰ５３、変異ＰＡＸ３、変異ＰＡＸ７、変異ＢＣＲ／ＡＢＬ、変異ＨＥＲ２／ＮＥＵ、変異ＦＬＴ３Ｒ、変異ＦＬＴ６－ＩＴＤ、変異ＳＲＣ、変異ＡＢＬ、変異ＴＡＮ１、変異ＰＴＣ、変異Ｂ－ＲＡＦ、変異ＰＭＬ－ＲＡＲ－アルファ、変異Ｅ２Ａ－ＰＲＸ１、及び変異ＮＰＭ－ＡＬＫなど）、ならびにＰＡＸ遺伝子ファミリー及びＦＫＨＲ遺伝子ファミリーのメンバーが融合したものが挙げられる。がん遺伝子の例は、当該技術分野で他にもよく知られている。いくつかの実施形態では、がん遺伝子は、ｃ－ＭＹＣ及びＩＲＦ４からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、遺伝子は、発がん性融合タンパク質（例えば、ＭＬＬ再構成体、ＥＷＳ－ＦＬＩ、ＥＴＳ融合体、ＢＲＤ４－ＮＵＴ、ＮＵＰ９８融合体）をコードする。
いくつかの実施形態では、１つ以上の遺伝子は、疾患（がん（例えば、乳癌）など）の顕著な特徴と結び付くものである。いくつかの実施形態では、１つ以上の遺伝子は、疾患関連ＤＮＡ配列バリエーション（ＳＮＰなど）と結び付くものである。いくつかの実施形態では、疾患は、アルツハイマー病であり、遺伝子は、ＢＩＮ１（例えば、疾患関連ＤＮＡ配列バリエーション（ＳＮＰなど）を有するもの）を含む。いくつかの実施形態では、疾患は、１型糖尿病であり、１つ以上の遺伝子は、初代Ｔｈ細胞と結び付くもの（例えば、疾患関連ＤＮＡ配列バリエーション（ＳＮＰなど）を有するもの）である。いくつかの実施形態では、疾患は、全身性エリテマトーデスであり、１つ以上の遺伝子は、Ｂ細胞生物学において重要な役割を担うもの（例えば、疾患関連ＤＮＡ配列バリエーション（ＳＮＰなど）を有するもの）である。いくつかの実施形態では、１つ以上の遺伝子は、核内受容体（例えば、核内ホルモン受容体、リガンド依存性核内受容体）をコードする遺伝子における変異と結び付く疾患または状態と結び付くものである。いくつかの実施形態では、１つ以上の遺伝子は、細胞に特有の顕著な特徴と結び付くものである。いくつかの実施形態では、１つ以上の遺伝子は、異常に発現するものであるか、またはＤＮＡバリエーション（ＳＮＰなど）と結び付くものである。「異常に発現する」は、１種以上の目的細胞または目的インビトロ凝縮体における遺伝子発現が、試験処理または試験条件に供されない正常細胞（例えば、同じ細胞型の正常細胞、もしくは培養細胞については、同等の条件の下で培養された細胞）または凝縮体（例えば、細胞から単離された凝縮体については、同じ細胞型の正常細胞から単離された凝縮体、もしくは培養細胞については同等の条件の下で培養された細胞から単離された凝縮体）に見られる当該遺伝子発現に典型的な対照レベルと異なることが検出可能であることを示すために使用される。いくつかの実施形態では、１つ以上の遺伝子は、細胞におけるシグナル伝達の異常（例えば、ＷＮＴ経路、ＴＧＦ－β経路、またはＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路と結び付くシグナル伝達の異常）と結び付くものである。いくつかの実施形態では、１つ以上の遺伝子は、ｍＲＮＡの開始異常または伸長異常（例えば、スプライシング異常）を伴う遺伝子を含む。本明細書で使用される「ｍＲＮＡの開始異常または伸長異常」は、対照の細胞または対象におけるｍＲＮＡの開始または伸長との差異（例えば、健康な細胞もしくは対象、またはｍＲＮＡの開始もしくは伸長が普通ではないことによって特徴付けられる疾患もしくは状態を有さない細胞もしくは対象、と比較したときの上昇または低下（増加または減少））が検出可能または有意なことである。いくつかの実施形態では、１つ以上の遺伝子は、疾患または状態に特有のスプライシングバリアント（例えば、疾患または状態を有さない対照の対象におけるｍＲＮＡ配列と比較してｍＲＮＡ配列が長鎖化または短鎖化したスプライシングバリアント）と結び付くものである。いくつかの実施形態では、１つ以上の遺伝子は、遺伝子サイレンシングの異常（例えば、健康な細胞または健康な対象（例えば、対照の細胞または対象）における遺伝子サイレンシングと比較したときの遺伝子サイレンシング増加または減少）と結び付く疾患または障害と結び付くものである。いくつかの実施形態では、遺伝子サイレンシングの異常と結び付く疾患または障害は、レット症候群、ＭｅＣＰ２過剰発現症候群、またはＭｅＣＰ２の発現低下もしくは活性低下である。ＭｅＣＰ２は、メチルＣｐＧ結合タンパク質２（ヒトＵｎｉＰｒｏｔ識別子：Ｐ５１６０８）を指す。いくつかの実施形態では、１つ以上の遺伝子は、哺乳類細胞に見られるものであり、哺乳類細胞は、例えば、ヒトの細胞、胎児の細胞、胚性幹細胞または胚性幹細胞様細胞（例えば、臍帯静脈に由来する細胞（例えば、臍帯静脈に由来する内皮細胞））、筋肉（例えば、筋管、胎児の筋肉）、血液細胞（例えば、がん性血液細胞、胎児の血液細胞、単球）、Ｂ細胞（例えば、プロＢ細胞）、脳（例えば、星状膠細胞、脳の角回、脳の前部尾状核、脳の海馬、脳の下側頭葉、脳の中前頭葉、脳癌細胞）、Ｔ細胞（例えば、ナイーブＴ細胞、メモリーＴ細胞）、ＣＤ４陽性細胞、ＣＤ２５陽性細胞、ＣＤ４５ＲＡ陽性細胞、ＣＤ４５ＲＯ陽性細胞、ＩＬ－１７陽性細胞、ＰＭＡで刺激される細胞、Ｔｈ細胞、Ｔｈ１７細胞、ＣＤ２５５陽性細胞、ＣＤ１２７陽性細胞、ＣＤ８陽性細胞、ＣＤ３４陽性細胞、十二指腸（例えば、十二指腸の平滑筋組織）、骨格筋組織、筋芽細胞、胃（例えば、胃の平滑筋組織、例えば、胃細胞）、ＣＤ３陽性細胞、ＣＤ１４陽性細胞、ＣＤ１９陽性細胞、ＣＤ２０陽性細胞、ＣＤ３４陽性細胞、ＣＤ５６陽性細胞、前立腺（例えば、前立腺癌）、結腸（例えば、結腸直腸癌細胞）、陰窩細胞（例えば、結腸陰窩細胞）、腸（例えば、大腸、例えば、胎児の腸）、骨（例えば、骨芽細胞）、膵臓（例えば、膵癌）、脂肪組織、副腎、膀胱、食道、心臓（例えば、左心室、右心室、左心房、右心房、大動脈）、肺（例えば、肺癌細胞）、皮膚（例えば、線維芽細胞）、卵巣、腰筋、Ｓ状結腸、小腸、脾臓、胸腺（例えば、胎児の胸腺）、乳房（例えば、乳癌）、子宮頸部（例えば、子宮頸癌）、乳腺上皮、肝臓（例えば、肝癌）、ＤＮＤ４１細胞、ＧＭ１２８７８細胞、Ｈ１細胞、Ｈ２１７１細胞、ＨＣＣ１９５４細胞、ＨＣＴ－１１６細胞、ヒーラ細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＨＭＥＣ細胞、ＨＳＭＭ管細胞、ＨＵＶＥＣ細胞、ＩＭＲ９０細胞、ジャーカット細胞、Ｋ５６２細胞、ＬＮＣａＰ細胞、ＭＣＦ－７細胞、ＭＭ１Ｓ細胞、ＮＨＬＦ細胞、ＮＨＤＦ－Ａｄ細胞、ＲＰＭＩ－８４０２細胞、Ｕ８７細胞、ＶＡＣＯ９Ｍ細胞、ＶＡＣＯ４００細胞、またはＶＡＣＯ５０３細胞である。
いくつかの実施形態では、１つ以上の遺伝子は、関節リウマチ、多発性硬化症、全身性強皮症、原発性胆汁性肝硬変、クローン病、グレーブス病、白斑、及び心房細動と関連する疾患関連バリエーションである。いくつかの実施形態では、１つ以上の遺伝子は、発達障害と結び付くものである。いくつかの実施形態では、１つ以上の遺伝子は、神経障害または発達神経障害と結び付くものである。
いくつかの実施形態では、１つ以上の遺伝子は、細胞型特異的であると考えられるものである。細胞型特異的遺伝子は、単一の細胞型にのみ発現する必要はなく、一般に認識されるおよそ２００の細胞型（例えば、標準的な組織学の教科書に掲載されるもの）、及び／または成体脊椎動物（例えば、哺乳類（例えば、ヒト））に最も豊富に存在する細胞型、のうちの１つまたはいくつかの細胞型（例えば、最大で約５つの細胞型または約１０の異なる細胞型）で発現するものでもあり得る。いくつかの実施形態では、細胞型特異的遺伝子は、その発現レベルを調べれば、細胞（例えば、本明細書に開示の細胞（下記の型のうちの１つの細胞など））をその他の細胞型の細胞と区別できる遺伝子である：脂肪細胞（例えば、白色脂肪細胞または褐色脂肪細胞）、心筋細胞、軟骨細胞、内皮細胞、外分泌腺細胞、線維芽細胞、グリア細胞、肝細胞、ケラチノサイト、マクロファージ、単球、メラノサイト、ニューロン、好中球、骨芽細胞、破骨細胞、膵島細胞（例えば、ベータ細胞）、骨格筋細胞、平滑筋細胞、Ｂ細胞、形質細胞、Ｔ細胞（例えば、制御性Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞）、または樹状細胞。いくつかの実施形態では、細胞型特異的遺伝子は、系譜特異的なものであり、例えば、特定の系譜（例えば、造血、神経、筋肉など）に特異的なものである。いくつかの実施形態では、細胞型特異的遺伝子は、他の細胞型のほとんど（例えば、少なくとも８０％、少なくとも９０％）またはすべてと比較して所与の細胞型で高発現する遺伝子である。したがって、特異性は、発現レベルと関連し得、例えば、ある遺伝子が、広くは発現レベルが低いが、ある特定の細胞型でははるかに高発現するのであれば、そうした遺伝子は、それが高発現する細胞型に対して細胞型特異的であると考えることができる。いくつかの実施形態では、細胞型特異的遺伝子は、他の細胞型のほとんど（例えば、少なくとも８０％、少なくとも９０％）またはすべてと比較して所与の細胞型で低発現するか、または発現しない遺伝子である。したがって、特異性は、発現レベルと関連し得、例えば、ある遺伝子が、広く発現するが、ある特定の細胞型でははるかに低発現するのであれば、そうした遺伝子は、それが低発現するか、全く発現しない細胞型に対して細胞型特異的であると考えることができる。発現は、全ｍＲＮＡ発現（ｍｉＲＮＡ転写物、長鎖の非コードＲＮＡ転写物、及び／または他のＲＮＡ転写物を任意選択で含む）に基づいて正規化されるか、及び／または細胞におけるハウスキーピング遺伝子の発現に基づいて正規化され得ることが理解されよう。いくつかの実施形態では、遺伝子は、その種の成体の細胞型の少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％、もしくはそれを超える％における平均発現レベル、または代表的な細胞型セットにおける平均発現レベルと比較して、特定の細胞型の細胞における発現レベルの増減倍率が少なくとも２倍、少なくとも５倍、または少なくとも１０倍であるのであれば、その特定の細胞型に対して細胞型特異的であると考えられる。さまざまな細胞型の発現データを含むデータベースを当業者なら知っているであろうし、そうしたデータベースを使用することで細胞型特異的遺伝子を選択することができる。いくつかの実施形態では、細胞型特異的遺伝子は、転写因子である。いくつかの実施形態では、細胞型特異的遺伝子は、胚発生、胎児発達、または生後発達と結び付く。
いくつかの実施形態では、転写凝縮体は、凝縮体と結び付くコンポーネント（すなわち凝縮体コンポーネント）の結合価を増加または減少させることによって調節される。いくつかの実施形態では、ヘテロクロマチン凝縮体、またはｍＲＮＡ開始複合体もしくはｍＲＮＡ伸長複合体と物理的に結び付く凝縮体は、凝縮体と結び付くコンポーネント（すなわち凝縮体コンポーネント）の結合価を増加または減少させることによって調節される。本明細書で使用される「結合価」は、コンポーネント対する異なる結合パートナーの数と、１つ以上の結合パートナーへの結合強度と、の両方を指す。いくつかの実施形態では、「凝縮体と結び付くコンポーネント」は、タンパク質、核酸、または小分子であり得る。いくつかの実施形態では、コンポーネントは、核酸（例えば、ＲＮＡ、ｅＲＮＡ）である。ある実施形態では、核酸は、染色体核酸ではない。ある実施形態では、コンポーネントは、転写の活性化または制御に関与する。いくつかの実施形態では、コンポーネントは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ、メディエーター、コヒーシン、Ｎｉｐｂｌ、ｐ３００、ＣＢＰ、Ｃｈｄ７、Ｂｒｄ４、及び／またはｅｓＢＡＦのコンポーネント（Ｂｒｇ１）もしくはＬｓｄ１－Ｎｕｒｄ複合体のコンポーネント（例えば、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ）を含む。いくつかの実施形態では、コンポーネントは、メディエーターまたはメディエーターサブユニット（例えば、Ｍｅｄ１）である。いくつかの実施形態では、コンポーネントは、クロマチン制御因子（例えば、ＢＥＴブロモドメインタンパク質、ＢＲＤ４）である。いくつかの実施形態では、コンポーネントは、核内受容体リガンド（例えば、ホルモン）である。いくつかの実施形態では、コンポーネントは、シグナル伝達因子である。いくつかの実施形態では、コンポーネントは、メチルＤＮＡ結合タンパク質である。いくつかの実施形態では、コンポーネントは、遺伝子サイレンシング因子である。いくつかの実施形態では、コンポーネントは、スプライシング因子である。いくつかの実施形態では、コンポーネントは、ｍＲＮＡ開始複合体またはｍＲＮＡ伸長複合体（すなわち、装置）のコンポーネントである。いくつかの実施形態では、コンポーネントは、ＲＮＡポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、コンポーネントは、官能基（例えば、メチル基またはアセチル基）をクロマチンコンポーネント（例えば、ＤＮＡまたはヒストン）に付加、から検出、もしくはから解読、またはから除去する酵素であるか、あるいは当該酵素を含む。いくつかの実施形態では、コンポーネントは、クロマチンコンポーネント（例えば、ＤＮＡまたはヒストン）の構造を改変、解読、または検出する酵素（例えば、ヒストンマーク（例えば、Ｈ３Ｋ４ｍｅ１またはＨ３Ｋ２７Ａｃ）を付加、解読、または除去するＤＮＡメチル化酵素もしくはＤＮＡ脱メチル化酵素、ヒストンメチル化酵素もしくはヒストン脱メチル化酵素、またはヒストンアセチル化酵素もしくはヒストン脱アセチル化酵素）であるか、あるいは当該酵素を含む。いくつかの実施形態では、コンポーネントは、官能基（例えば、メチル基またはアセチル基）をクロマチンコンポーネント（例えば、ＤＮＡまたはヒストン）に付加、から検出、もしくはから解読、またはから除去する酵素であるか、あるいは当該酵素を含む。いくつかの実施形態では、コンポーネントは、選択される細胞状態または細胞特性（例えば、分化状態、発生状態、もしくは病状（例えば、がん性状態）、または分化性質もしくはアポトーシスが生じる性質）への発生またはその維持に必要なタンパク質であるか、または当該タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、病状は、増殖性疾患、炎症性疾患、循環器疾患、神経疾患、または感染性疾患である。いくつかの実施形態では、コンポーネントは、本明細書に記載の酵素ではない。いくつかの実施形態では、コンポーネントは、ＤＮＡメチル化酵素もしくはＤＮＡ脱メチル化酵素、ヒストンメチル化酵素もしくはヒストン脱メチル化酵素、及び／またはヒストンアセチル化酵素もしくはヒストン脱アセチル化酵素ではない。
いくつかの実施形態では、コンポーネントは、転写因子である。いくつかの実施形態では、転写因子は、ＯＣＴ４、ｐ５３、ＭＹＣ、もしくはＧＣＮ４、ＮＡＮＯＧ、ＭｙｏＤ、ＫＬＦ４、ＳＯＸファミリーの転写因子（例えば、ＳＲＹ、ＳＯＸ１、ＳＯＸ２、ＳＯＸ３、ＳＯＸ１４、ＳＯＸ２１、ＳＯＸ４、ＳＯＸ１１、ＳＯＸ１２、ＳＯＸ５、ＳＯＸ６、ＳＯＸ１３、ＳＯＸ８、ＳＯＸ９、ＳＯＸ１０、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１７、ＳＯＸ１８、ＳＯＸ１５、ＳＯＸ３０）、ＧＡＴＡファミリーの転写因子（例えば、ＧＡＴＡ１～６）、または核内受容体（例えば、核内ホルモン受容体、エストロゲン受容体、レチノイン酸受容体－アルファ）である。いくつかの実施形態では、転写因子は、ＩＤＲ（例えば、転写因子の活性化ドメインにおけるＩＤＲ）を有する。いくつかの実施形態では、核内受容体は、関連リガンドに結合すると転写を活性化する。いくつかの実施形態では、核内受容体は、関連リガンドの非存在下で転写を活性化する変異核内受容体である。いくつかの実施形態では、ＴＦは、シグナル伝達因子によって制御される（例えば、ＴＦがシグナル伝達因子と相互作用することによって転写が調節される）。
いくつかの実施形態では、コンポーネント（例えば、ヘテロクロマチンコンポーネント）は、遺伝子サイレンシング因子またはその変異形態である。いくつかの実施形態では、ヘテロクロマチン因子は、ＡＴＲＸ、ＭＥＣＰ２、ＷＲＮ、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＥＺＨ２、ＨＰ１、Ｄ４Ｚ４、ＩＣＲ、ラミンＡ、ＷＲＮ、変異ＩＣＲ ＩＧＦ２－Ｈ１９、または変異ＩＣＲ ＩＧＦ２－Ｈ１９である。
いくつかの実施形態では、コンポーネントは、表Ｓ１に記載のタンパク質である。いくつかの実施形態では、コンポーネントは、表Ｓ３に記載のメディエーターコンポーネントである。いくつかの実施形態では、コンポーネントは、表Ｓ２に記載のモチーフを有するタンパク質（例えば、モチーフを含むＩＤＲを有するもの）である。いくつかの実施形態では、コンポーネントは、表Ｓ２に記載のＩＤＲと相互作用するＩＤＲを有する。いくつかの実施形態では、コンポーネントは、ＩＤＲ（例えば、表Ｓ２に記載のモチーフを有するＩＤＲ）の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％を有する。いくつかの実施形態では、コンポーネントは、複数のＩＤＲ（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれを超える数のＩＤＲ領域）を有する。いくつかの実施形態では、コンポーネントは、複数の別々のセクションに分断されたＩＤＲを少なくとも１つ有する。いくつかの実施形態では、コンポーネントは、転写凝縮体の骨格の一部である。いくつかの実施形態では、コンポーネントは、凝縮体のクライアントである。いくつかの実施形態では、転写凝縮体は、凝縮体を、転写凝縮体と結び付くコンポーネントの天然変性ドメインまたは天然変性領域（ＩＤＲ）の１つ以上と相互作用する薬剤と接触させることによって調節される。いくつかの実施形態では、コンポーネントは、メディエーター、メディエーターコンポーネント、ＭＥＤ１、ＭＥＤ１５、ＧＣＮ４、核内受容体リガンド、シグナル伝達因子、またはＢＲＤ４である。いくつかの実施形態では、コンポーネントは、ヘテロクロマチン凝縮体の骨格の一部であるか、またはｍＲＮＡ開始複合体もしくはｍＲＮＡ伸長複合体と結び付く凝縮体の骨格の一部である。いくつかの実施形態では、コンポーネントは、ヘテロクロマチン凝縮体のクライアントであるか、またはｍＲＮＡ開始複合体もしくはｍＲＮＡ伸長複合体と結び付く凝縮体のクライアントである。いくつかの実施形態では、ヘテロクロマチン凝縮体、またはｍＲＮＡ開始複合体もしくはｍＲＮＡ伸長複合体と結び付く凝縮体は、凝縮体を、凝縮体と結び付くコンポーネントの天然変性ドメインまたは天然変性領域（ＩＤＲ）の１つ以上と相互作用する薬剤と接触させることによって調節される。いくつかの実施形態では、コンポーネントは、メディエーター、メディエーターコンポーネント、ＭＥＤ１、ＭＥＤ１５、ＧＣＮ４、核内受容体リガンド、遺伝子サイレンシング因子、スプライシング因子、またはＢＲＤ４である。
いくつかの実施形態では、ＩＤＲは、表Ｓ２に示されるモチーフを有する。いくつかの実施形態では、ＩＤＲを有するコンポーネントは、表Ｓ１に記載のものである。いくつかの実施形態では、ＩＤＲは、核内受容体ＡＤのＩＤＲである。いくつかの実施形態では、コンポーネントは、本明細書に記載の任意のコンポーネントである。本明細書に開示の方法に有用なＩＤＲは限定されない。ＩＤＲは、当該技術分野で知られるバイオインフォマティクス法によって同定することができる。例えば、Ｂｅｓｔ ＲＢ（Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２０１７）．“Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ ａｎｄ ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ｉｎｔｒｉｎｓｉｃａｌｌｙ ｄｉｓｏｒｄｅｒｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ”．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ．４２：１４７－１５４を参照のこと。ｈｔｔｐ：ａｄｄｒｅｓｓ／／ｄ２ｐ２．ｐｒｏ／ａｂｏｕｔ／ｐｒｅｄｉｃｔｏｒｓも併せて参照のこと。いくつかの実施形態では、ＩＤＲを有するコンポーネントは、ＢＲＤ４、メディエーター、またはＭＥＤ１である。いくつかの実施形態では、ＩＤＲは、少なくとも５つ、少なくとも７つ、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも３５個、少なくとも４０個、少なくとも４５個、少なくとも５０個、または少なくとも１００個のアミノ酸の長さを有する。いくつかの実施形態では、ＩＤＲは、別々に分かれた領域を有する。いくつかの実施形態では、ＩＤＲは、少なくとも約５つ、少なくとも約１０個、少なくとも約１５個、少なくとも約２０個、少なくとも約３０個、少なくとも約４０個、少なくとも約５０個、少なくとも約６０個、少なくとも約７５個、少なくとも約１００個、少なくとも約１５０個、またはそれを超える数の変性アミノ酸（例えば、連続する変性アミノ酸）である。いくつかの実施形態では、アミノ酸は、Ｄ２Ｐ２（Ｏａｔｅｓ ｅｔ ａｌ．，２０１３）によって用いられるアルゴリズムのうちの少なくとも７５％が、当該残基が変性すると予測するのであれば、変性アミノ酸であると考えられる。
いくつかの実施形態では、コンポーネントは、メディエーター、メディエーターコンポーネント、ＭＥＤ１、ＭＥＤ１５、ｐ３００、ＢＲＤ４、ＴＦＩＩＤ、ＴＣＦ７Ｌ２、ＴＣＦ７、ＴＣＦ７Ｌ１、ＬＥＦ１、ベータ－カテニン、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ２、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ４、ＳＴＡＴ５Ａ、ＳＴＡＴ５Ｂ、ＳＴＡＴ６、ＮＦ－κＢ、ＭＥＣＰ２、ＭＢＤ１、ＭＢＤ２、ＭＢＤ３、ＭＢＤ４、ＨＰ１α、ＴＢＬ１Ｒ、ＨＤＡＣ３、ＳＭＲＴ、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ、ＳＲＳＦ２、ＳＲＲＭ１、ＳＲＳＦ１、ホルモン、またはそのバリアント、変異形態、もしくは断片（例えば、機能性断片）である。
本明細書で使用される、タンパク質または核酸の「機能性断片」は、全長タンパク質または全長核酸の生物活性を少なくとも１つ示す。いくつかの実施形態では、生物活性のレベルは、全長タンパク質または全長核酸の生物活性のレベルの少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％であり得る。本明細書で使用される「断片」は、機能性断片を含むことが理解されよう。いくつかの実施形態では、機能性断片の長さは、全長タンパク質または全長核酸の長さの少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９５％であるか、またはそれらの間に存在する任意の範囲である。いくつかの実施形態では、機能性断片は、少なくとも１つの機能性ドメインまたは少なくとも２つの機能性ドメインを含む。いくつかの実施形態では、機能性断片は、リガンド結合ドメイン及びＤＮＡ結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、機能性断片は、活性化ドメイン及びＤＮＡ結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、機能性断片は、ＩＤＲを含む。いくつかの実施形態では、生物活性は、結合活性（例えば、リガンド結合活性、ホルモン結合活性、ＤＮＡ結合活性、転写補助因子結合活性、遺伝子サイレンシング因子結合活性、ｍＲＮＡ結合活性）であり得る。
いくつかの実施形態では、機能性断片は、異型の凝縮体及び／または同型の凝縮体に取り込まれ得る。取り込み（または取り込まれる）とは、適切な生理学的条件（例えば、細胞における条件と同じもしくは近い条件）または適切な実験条件（例えば、インビトロでの凝縮体の形成に適した条件）の下でのものを意味することが理解されよう。いくつかの実施形態では、機能性断片は、実施例セクションに後述される凝縮体コンポーネントの断片である。
いくつかの実施形態では、シグナル伝達因子の機能性断片は、転写因子に結合し得る。いくつかの実施形態では、シグナル伝達因子の機能性断片は、凝縮体（例えば、異型の凝縮体、転写凝縮体）に取り込まれる能力を有する。
いくつかの実施形態では、低リン酸化されたＲＮＡポリメラーゼＩＩ Ｃ末端ドメインの機能性断片は、ＲＮＡ合成生物活性を有し、及び／または凝縮体（例えば、異型の凝縮体、同型の凝縮体、メディエーターを含む凝縮体）に取り込まれる能力を有する断片である。いくつかの実施形態では、スプライシング因子の機能性断片は、ｍＲＮＡスプライシング活性を有し、及び／または凝縮体（例えば、異型の凝縮体、同型の凝縮体、もしくはリン酸化されたＲＮＡポリメラーゼを含む凝縮体）に取り込まれる能力を有する断片である。
いくつかの実施形態では、メチルＤＮＡ結合タンパク質の機能性断片は、メチル化ＤＮＡに結合することができ、及び／または凝縮体（例えば、異型の凝縮体、同型の凝縮体、もしくはサプレッサーを含む凝縮体）に取り込まれる能力を有する。いくつかの実施形態では、サプレッサーの機能性断片は、遺伝子サイレンシング活性を有し、及び／または凝縮体（例えば、異型の凝縮体、同型の凝縮体、もしくはメチルＤＮＡ結合タンパク質を含む凝縮体）に取り込まれる能力を有する。
いくつかの実施形態では、エストロゲン受容体の機能性断片は、（ａ）エストロゲンによる結合を受けると転写を活性化し（例えば、野生型ＥＲ断片）、（ｂ）構成的に転写を活性化し（例えば、変異ＥＲ断片）、（ｃ）エストロゲンに結合し、（ｄ）メディエーターに結合し、（ｅ）異型の凝縮体を形成し、及び／または（ｆ）同型の凝縮体を形成する能力を有する。いくつかの実施形態では、エストロゲン受容体断片は、生物活性（ａ）～（ｅ）のうちの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または５つすべてを有する。いくつかの実施形態では、ＥＲリガンド結合ドメインの機能性断片は、エストロゲン結合活性を有する。
本明細書で使用されるように、そしていくつかの実施形態では、タンパク質のバリアントは、対象タンパク質（例えば、野生型タンパク質、規定の変異タンパク質）のアミノ酸配列との同一性が少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、もしくは９９．５％超であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、または当該ポリペプチドからなる。本明細書で使用されるように、そしていくつかの実施形態では、核酸配列のバリアントは、対象核酸の核酸配列との配列同一性が少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、もしくは９９．５％超である核酸配列を含むか、または当該核酸配列からなる。
「薬剤」は、任意の物質、化合物（例えば、分子）、超分子複合体、材料、またはそれらの組み合わせもしくは混合物を指すために本明細書で使用される。いくつかの態様では、薬剤は、化学式、化学構造、または配列によって表現され得る。薬剤の例としては、例えば、小分子、ポリペプチド、核酸（例えば、ＲＮＡｉ剤、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アプタマー）、脂質、多糖、ペプチド模倣物などが挙げられる。一般に、薬剤は、当該技術分野で知られる任意の適切な方法を使用して得ることができる。当業者なら適切な方法を選択するであろう。こうした選択は、例えば、薬剤の性質に基づいて行われる。薬剤は、少なくとも部分的に精製されたものであり得る。いくつかの実施形態では、組成物の一部として薬剤を提供することができ、こうした組成物は、さまざまな実施形態において、当該薬剤に加えて、例えば、対イオン、水性もしくは非水性の希釈剤もしくは担体、緩衝剤、保存剤、または他の成分を含み得る。いくつかの実施形態では、薬剤は、塩、エステル、水和物、または溶媒和物として提供され得る。いくつかの実施形態では、薬剤は、細胞透過性（この透過性は、例えば、細胞によって取り込まれる典型的な薬剤の範囲内のものである）であり、細胞内（例えば、哺乳類細胞内）で作用する。ある特定の化合物は、特定の幾何学的形態または立体異性形態で存在し得る。別段の指定がない限り、本開示は、さまざまな実施形態において、そのような化合物（シス－異性体及びトランス－異性体、Ｅ－異性体及びＺ－異性体、Ｒ－エナンチオマー及びＳ－エナンチオマー、ジアステレオマー、（Ｄ）－異性体、（Ｌ）－異性体、（－）－異性体及び（＋）－異性体、それらのラセミ混合物、ならびにそれらの他の混合物を含む）を包含する。ある特定の化合物は、さまざまなプロトン化状態で存在し得、さまざまな立体配置を有し得、溶媒和物（例えば、水との溶媒和物（すなわち水和物）もしくは一般的な溶媒との溶媒和物）として存在し得、及び／または異なる結晶形態（例えば、多形）もしくは異なる互変異性形態を有し得る。適用可能な場合、本開示は、そのような別のプロトン化状態、立体配置、溶媒和物、及び形態をとる実施形態を包含する。
第１の薬剤の「類似体」は、第１の薬剤と構造的及び／または機能的に類似する第２の薬剤を指す。第１の薬剤の「構造類似体」は、第１の薬剤と構造的に類似する類似体である。別段の指定がない限り、本明細書で使用される「類似体」という用語は、構造類似体を指す。薬剤の構造類似体は、薬剤と実質的に類似する物理的特性、化学的特性、生物学的特性、及び／または薬理学的特性（複数可）を有し得るか、あるいは少なくとも１つの物理的特性、化学的特性、生物学的特性、または薬理学的特性が異なり得る。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのそのような特性が、意図される目的（例えば、凝縮体を調節すること）への類似体の適合性が向上する様式で異なる。いくつかの実施形態では、薬剤の構造類似体は、薬剤の原子、官能基、または部分構造の少なくとも１つが、類似体では、異なる原子、官能基、または部分構造によって置き換えられているという点において薬剤とは異なる。いくつかの実施形態では、薬剤の構造類似体は、薬剤に存在する水素または置換基の少なくとも１つが、類似体では、異なる部分（例えば、異なる置換基）によって置き換えられているという点において薬剤とは異なる。
いくつかの実施形態では、薬剤は、核酸である。「核酸」という用語は、ポリヌクレオチド（デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）及びリボ核酸（ＲＮＡ）など）を指す。「核酸」及び「ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書で互換的に使用され、二本鎖ポリヌクレオチド、一本鎖ポリヌクレオチド（センスポリヌクレオチドまたはアンチセンスポリヌクレオチドなど）、及び部分的に二本鎖のポリヌクレオチドを含むことを理解されたい。核酸は、ホスホジエステル結合によって連結された、天然起源のＤＮＡまたはＲＮＡに典型的に見られる標準的なヌクレオチド（修飾（メチル化核酸塩基など）を含み得る）を含むことが多い。いくつかの実施形態では、核酸は、１つ以上の非標準的なヌクレオチドを含み得、こうした非標準的なヌクレオチドは、さまざまな実施形態において天然起源もしくは非天然起源のもの（すなわち、人工的なもの、天然に見られないもの）であり得、及び／または修飾糖もしくは修飾骨格結合を含み得る。核酸修飾（例えば、塩基、糖、及び／または骨格の修飾）、非標準的なヌクレオチド、あるいは非標準的なヌクレオシドなど（研究目的または治療目的のためのＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）、アプタマー、ＣＲＩＳＰＲ技術、ポリペプチド生成、初期化、またはアンチセンスベースの分子との関連において有用であることが当該技術分野で知られるものなど）を、さまざまな実施形態に含めることができる。そのような修飾は、例えば、安定性を増加させるか（例えば、ヌクレアーゼによる切断に対する感受性を低減することによって安定性を増加させる）、インビボでのクリアランスを減少させるか、細胞への取り込みを増加させるか、または翻訳を改善する他の特性、効力を改善する他の特性、有効性を改善する他の特性、特異性を改善する他の特性、もしくは意図される用途への核酸の適合性をその他の様式で向上させる他の特性を付与し得る。核酸修飾の例は、さまざまなものが報告されており、限定されないが、例えば、Ｄｅｌｅａｖｅｙ ＧＦ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉＲＮＡ．Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔｏｃ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｈｅｍ．２００９；３９：１６．３．１－１６．３．２２、Ｃｒｏｏｋｅ，ＳＴ（ｅｄ．）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｄｒｕｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ：ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，２００８、Ｋｕｒｒｅｃｋ，Ｊ．（ｅｄ．）Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，ＲＳＣ ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｃｉｅｎｃｅｓ．Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ：Ｒｏｙａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００８、米国特許第４，４６９，８６３号、同第５，５３６，８２１号、同第５，５４１，３０６号、同第５，６３７，６８３号、同第５，６３７，６８４号、同第５，７００，９２２号、同第５，７１７，０８３号、同第５，７１９，２６２号、同第５，７３９，３０８号、同第５，７７３，６０１号、同第５，８８６，１６５号、同第５，９２９，２２６号、同第５，９７７，２９６号、同第６，１４０，４８２号、同第６，４５５，３０８号、及び／またはＰＣＴ出願公開公報ＷＯ００／５６７４６及び同ＷＯ０１／１４３９８に記載されている。二本鎖核酸の２つの鎖に異なる修飾が使用されることもあり得る。核酸は、均一に修飾されるか、もしくはその一部のみに修飾が施され得、及び／または複数の異なる修飾を含み得る。ヌクレオチド（ｎｔ）の数に関して核酸または核酸領域の長さが与えられる場合、そうした数は、別段の指定がない限り、一本鎖核酸におけるヌクレオチドの数を指すか、または二本鎖核酸の各鎖におけるヌクレオチドの数を指すことを理解されたい。「オリゴヌクレオチド」は、比較的短い核酸であり、典型的には、約５～約１００ｎｔの長さを有する。
「核酸コンストラクト」は、人工的に生成される核酸を指し、天然に生じる核酸と同一ではなく、すなわち、天然起源の核酸分子とは配列が異なり、及び／または天然に見られる核酸とそれが区別される修飾を含む。核酸コンストラクトは、天然に見られる核酸またはその一部と同一ではあるが、天然の単一の核酸の一部としては見られない２つ以上の核酸を含み得る。いくつかの実施形態では、転写凝縮体を調節する薬剤は、核酸コンストラクトによってコードされる。いくつかの実施形態では、核酸コンストラクトは、細胞に導入され、そこで発現することで、当該細胞における転写凝縮体を調節する。いくつかの実施形態では、ヘテロクロマチン凝縮体、またはｍＲＮＡ開始複合体もしくはｍＲＮＡ伸長複合体と物理的に結び付く凝縮体、を調節する薬剤は、核酸コンストラクトによってコードされる。いくつかの実施形態では、核酸コンストラクトは、細胞に導入され、そこで発現することで、当該細胞において、ヘテロクロマチン凝縮体、またはｍＲＮＡ開始複合体もしくはｍＲＮＡ伸長複合体と物理的に結び付く凝縮体を調節する。
いくつかの実施形態では、薬剤は、小分子である。「小分子」という用語は、質量が約２キロダルトン（ｋＤａ）未満の有機分子を指す。いくつかの実施形態では、小分子は、約１．５ｋＤａ未満または約１ｋＤａ未満である。いくつかの実施形態では、小分子は、約８００ダルトン（Ｄａ）未満、約６００Ｄａ未満、約５００Ｄａ未満、約４００Ｄａ未満、約３００Ｄａ未満、約２００Ｄａ未満、約または１００Ｄａ未満である。多くの場合、小分子は、少なくとも５０Ｄａの質量を有する。いくつかの実施形態では、小分子は、ポリマーではない。いくつかの実施形態では、小分子は、アミノ酸ではない。いくつかの実施形態では、小分子は、ヌクレオチドではない。いくつかの実施形態では、小分子は、糖ではない。いくつかの実施形態では、小分子は、複数の炭素間結合を含み、タンパク質との構造的相互作用（例えば、水素結合）に重要な１つ以上のヘテロ原子及び／または１つ以上の官能基（例えば、アミン基、カルボニル基、ヒドロキシル基、もしくはカルボキシル基）、ならびにいくつかの実施形態では、少なくとも２つの官能基を含み得る。小分子は、環式炭素構造もしくはヘテロ環式構造、及び／または芳香族構造もしくは多環芳香族構造を１つ以上含むことが多く、こうした構造は、上記の官能基のうちの１つ以上で、任意選択で置換される。
いくつかの実施形態では、薬剤は、タンパク質またはポリペプチドである。「ポリペプチド」という用語は、ペプチド結合によって連結されたアミノ酸のポリマーを指す。タンパク質は、１つ以上のポリペプチドを含む分子である。ペプチドは、比較的短いポリペプチドであり、その長さは、典型的には約２～１００アミノ酸（ａａ）であり、例えば、４～６０ａａ、８～４０ａａ、１０～３０ａａである。「タンパク質」、「ポリペプチド」、及び「ペプチド」という用語は、互換的に使用され得る。一般に、ポリペプチドは、さまざまな実施形態において、標準的なアミノ酸のみを含み得るか、あるいは非標準的なアミノ酸（天然起源もしくは非天然起源のアミノ酸であり得る）及び／またはアミノ酸類似体を１つ以上含み得る。「標準的なアミノ酸」は、哺乳類によるタンパク質の合成において一般に利用され、遺伝コードによってコードされる２０種類のＬ－アミノ酸のいずれかである。「非標準的なアミノ酸」は、哺乳類によるタンパク質の合成において一般に利用されないアミノ酸である。非標準的なアミノ酸には、天然起源のアミノ酸（２０種類の標準的なアミノ酸以外のもの）及び非天然起源のアミノ酸が含まれる。アミノ酸（例えば、ポリペプチドにおけるアミノ酸の１つ以上）は、修飾される可能性があり、こうした修飾は、例えば、ある部分（アルキル基、アルカノイル基、糖質基、リン酸基、脂質、多糖、ハロゲン、複合体化のためのリンカー、保護基、小分子（フルオロフォアなど）など）が付加される（例えば、共有結合で付加される）ことによって施される。
いくつかの実施形態では、薬剤は、ペプチド模倣物である。「模倣物（ｍｉｍｅｔｉｃ）」、「ペプチド模倣物（ｐｅｐｔｉｄｅ ｍｉｍｅｔｉｃ）」、及び「ペプチド模倣物（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ）」という用語は、本明細書で互換的に使用され、一般に、選択される天然のペプチドまたはタンパク質機能性ドメイン（例えば、結合モチーフもしくは活性部位）の三次結合構造または活性を模倣するペプチド分子、部分的ペプチド分子、または非ペプチド分子を指す。こうしたペプチド模倣物には、組換え的または化学的に修飾されたペプチド、ならびに非ペプチド剤（小分子薬物模倣物など）が含まれる。いくつかの実施形態では、ペプチド模倣物は、シグナル伝達因子模倣物である。シグナル伝達因子は、限定されず、当該技術分野で知られ、及び／または本明細書に記載の任意のものであり得る。いくつかの実施形態では、ペプチド模倣物は、核内受容体リガンド模倣物である。
いくつかの実施形態では、薬剤は、凝縮体（例えば、転写凝縮体、遺伝子サイレンシング凝縮体、ｍＲＮＡ開始複合体またはｍＲＮＡ伸長複合体と物理的に結び付く凝縮体）と結び付くタンパク質、ポリペプチド、または核酸である。いくつかの実施形態では、薬剤は、凝縮体と結び付くタンパク質、ポリペプチド、または核酸のバリアントまたは変異体である。いくつかの実施形態では、薬剤は、核内受容体（例えば、核内ホルモン受容体）のアンタゴニストまたはアゴニストである。いくつかの実施形態では、薬剤は、野生型核内凝縮体と比較して、変異を有する核内受容体（例えば、変異を有する核内ホルモン受容体、変異を有するリガンド依存性核内受容体）に優先的に結合する。いくつかの実施形態では、薬剤は、野生型核内受容体を含む凝縮体と比較して、変異を有する核内受容体（例えば、変異を有する核内ホルモン受容体、変異を有するリガンド依存性核内受容体）を含む転写凝縮体を優先的に破壊する。
いくつかの実施形態では、薬剤は、シグナル伝達因子のアンタゴニストまたはアゴニストである。シグナル伝達因子は、限定されず、本明細書に記載されるか、または当該技術分野で知られる任意のシグナル伝達因子であり得る。いくつかの実施形態では、シグナル伝達因子は、ＩＤＲを含む。いくつかの実施形態では、薬剤は、リン酸化もしくは低リン酸化されたＲＮＡポリメラーゼＩＩ Ｃ末端ドメイン（ＰｏｌＩＩ ＣＴＤ）またはその機能性断片を含む。いくつかの実施形態では、薬剤は、リン酸化または低リン酸化されたＰｏｌＩＩ ＣＴＤに優先的に結合する。いくつかの実施形態では、薬剤は、スプライシング因子、伸長複合体コンポーネント、または開始複合体コンポーネントに結合する。いくつかの実施形態では、薬剤は、メチル化ＤＮＡに優先的に結合する。いくつかの実施形態では、薬剤は、メチルＤＮＡ結合タンパク質に結合する。
いくつかの実施形態では、薬剤は、合成ＲＮＡ（例えば、修飾ｍＲＮＡ）によってコードされる。合成ＲＮＡは、本明細書に記載の任意の適切な薬剤をコードし得る。合成ＲＮＡについては、修飾ＲＮＡを含めて、ＷＯ２０１７０７５４０６に教示されており、当該文献は、参照によって本明細書に組み込まれる。例えば、合成ＲＮＡは、凝縮体の組成，維持，崩壊，形成，または制御を調節する薬剤をコードし得る。いくつかの実施形態では、合成ＲＮＡは、転写凝縮体コンポーネント、ヘテロクロマチン凝縮体コンポーネント、またはｍＲＮＡ開始複合体もしくはｍＲＮＡ伸長複合体と物理的に結び付く凝縮体のコンポーネント、に結合するＩＤＲ（例えば、表Ｓ２に記載のＩＤＲ）、抗体（一本鎖抗体（例えば、ナノボディ（ｎａｎｏｂｏｄｙ））、または操作された親和性タンパク質（例えば、アフィボディ（ａｆｆｉｂｏｄｙ））をコードする。いくつかの実施形態では、薬剤は、合成ＲＮＡである。
いくつかの実施形態では、薬剤は、非核酸分子と複合体化した合成ＲＮＡ（例えば、修飾ｍＲＮＡ）であるか、または当該合成ＲＮＡによってコードされる。いくつかの実施形態では、合成ＲＮＡは、細胞への取り込み、核内移行、及び／または核内保持を促進する部分（例えば、ペプチド輸送部分または核酸）と複合体化される（またはその他の様式で物理的に結び付けられる）。いくつかの実施形態では、合成ＲＮＡは、細胞への当該オリゴマーの輸送増進に有効なペプチド輸送部分（例えば、細胞透過性のペプチド輸送部分）と複合体化される。例えば、いくつかの実施形態では、ペプチド輸送部分は、アルギニン高含有ペプチドである。別の実施形態では、輸送部分は、オリゴマーの５’末端または３’末端のいずれかに付加される。そのようなペプチドが、いずれかの末端に複合体化されるとき、その後に、反対側の末端を、本明細書に記載の修飾末端基とのさらなる複合体化に利用することが可能である。ペプチド輸送部分は、一般に、細胞への核酸の浸透増進に有効である。いくつかの実施形態では、核酸と、ペプチド輸送部分の残部（例えば、当該担体ペプチドのカルボキシ末端またはアミノ末端）と、の間にグリシン（Ｇ）アミノ酸サブユニットまたはプロリン（Ｐ）アミノ酸サブユニットを含めることで、ペプチド輸送部分と核酸との間に異なる結合を有する複合体と比較して有効性を維持または改善しつつ、当該複合体の毒性が低減される。
いくつかの実施形態では、薬剤は、相破壊物質（例えば、凝縮体形成破壊物質）である。いくつかの実施形態では、相破壊物質は、ＡＴＰ枯渇物質（例えば、アジ化ナトリウム（ＮａＮ３）及びジニトロフェノール（ＤＮＰ））または１，６－ヘキサンジオールである。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の薬剤は、転写凝縮体コンポーネントを細胞内分解（例えば、ユビキチン－プロテアソーム系（ＵＰＳ）による分解）の標的とする。いくつかの実施形態では、そのような薬剤を使用することで転写凝縮体コンポーネントのレベルが低減され、それによって凝縮体の形成、維持、及び／または活性が阻害され得る。いくつかの実施形態では、転写凝縮体コンポーネントを細胞内分解の標的とする薬剤は、転写凝縮体コンポーネントに結合する第１のドメインと、分解（例えば、プロテアソームによる分解）を生じさせるために当該薬剤と結び付く実体を標的とする第２のドメインと、を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の薬剤は、凝縮体（ヘテロクロマチン凝縮体、またはｍＲＮＡ開始複合体もしくはｍＲＮＡ伸長複合体と物理的に結び付く凝縮体）コンポーネントを細胞内分解（例えば、ユビキチン－プロテアソーム系（ＵＰＳ）による分解）の標的とする。いくつかの実施形態では、そのような薬剤を使用することで凝縮体コンポーネントのレベルが低減され、それによって凝縮体の形成、維持、及び／または活性が阻害され得る。いくつかの実施形態では、凝縮体（ヘテロクロマチン凝縮体、またはｍＲＮＡ開始複合体もしくはｍＲＮＡ伸長複合体と物理的に結び付く凝縮体）コンポーネントを細胞内分解の標的とする薬剤は、凝縮体コンポーネントに結合する第１のドメインと、分解（例えば、プロテアソームによる分解）を生じさせるために当該薬剤と結び付く実体を標的とする第２のドメインと、を含む。そのような薬剤を使用することで、それが結合する凝縮体コンポーネントのレベルが低減され得る。いくつかの実施形態では、凝縮体コンポーネントは、タンパク質分解誘導キメラ分子（ＰＲＯＴＡＣ）の概念に基づく分解の標的とされる（ＰＲＯＴＡＣの概念については、例えば、Ｐｒｏｔａｃｓ：ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｔｈａｔ ｔａｒｇｅｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｔｏ ｔｈｅ Ｓｋｐ１－Ｃｕｌｌｉｎ－Ｆ ｂｏｘ ｃｏｍｐｌｅｘ ｆｏｒ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ Ｓａｋａｍｏｔｏ，Ｋａｔｈｌｅｅｎ Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（２００１），９８（１５），８５５４－８５５９、Ｃａｒｍｏｎｙ，ＫＣ ａｎｄ Ｋｉｍ，Ｋ，ＰＲＯＴＡＣ－Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２０１２；８３２：Ｃｈ．４４を参照のこと）。この手法では、目的タンパク質（この場合、凝縮体コンポーネント（例えば、転写凝縮体コンポーネント））に結合する第１のドメインと、Ｅ３ユビキチンリガーゼ複合体に結合する第２のドメインと、これらに加えて、典型的には、こうしたドメインを一緒に繋留するリンカーと、を含むようにヘテロ二官能性の薬剤が設計される。いくつかの実施形態では、第１のドメイン、第２のドメイン、またはそれらの両方は、ペプチドを含む。いくつかの実施形態では、第１のドメイン、第２のドメイン、またはそれらの両方は、小分子を含む。例えば、ユビキチンリガーゼ複合体に結合する分子は、セレブロン（Ｃｕｌｌｉｎ４Ａユビキチンリガーゼ複合体のコンポーネント）に対するリガンドである小分子であり得る。セレブロンに結合する小分子は、フタルイミド（例えば、サリドマイド、レナリドミド、またはポマリドミド）であり得る（例えば、Ｗｉｎｔｅｒ，ＧＥ，ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４８（６２４１），１３７６－１３８１、特許公開公報第２０１６０２３５７３１号、及び同第２０１８０００９７７９号を参照のこと）。いくつかの実施形態では、フォンヒッペル・リンドウＥ３ユビキチンリガーゼに結合する分子を使用することができ、こうした分子は、Ｂｕｃｋｌｅｙ ＤＬ，ｅｔ ａｌ．Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｔｈｅ ｖｏｎ Ｈｉｐｐｅｌ－Ｌｉｎｄａｕ Ｅ３ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ ｌｉｇａｓｅ ｕｓｉｎｇ ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｔｏ ｄｉｓｒｕｐｔ ｔｈｅ ＶＨＬ／ＨＩＦ－１α ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ．Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ．２０１２；１３４（１０）：４４６５－４４６８に記載の小分子（例えば、ヒドロキシプロリン類似体）、またはＧａｌｄｅａｎｏ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ｇｕｉｄｅｄ ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｖｏｎ Ｈｉｐｐｅｌ－Ｌｉｎｄａｕ（ＶＨＬ）Ｅ３ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ ｌｉｇａｓｅ ａｎｄ ｔｈｅ ｈｙｐｏｘｉａ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｆａｃｔｏｒ（ＨＩＦ）ａｌｐｈａ ｓｕｂｕｎｉｔ ｗｉｔｈ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｎａｎｏｍｏｌａｒ ａｆｆｉｎｉｔｉｅｓ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．５７，８６５７－８６６３（２０１４）に記載の小分子などである。いくつかの実施形態では、ＰＲＯＴＡＣは、ブロモドメイン含有タンパク質（ＢＲＤ１、ＢＲＤ２、ＢＲＤ３、及び／またはＢＲＤ４など）を分解の標的とし得る。いくつかの実施形態では、ＰＲＯＴＡＣは、キナーゼ（ＣＤＫ７またはＣＤＫ９など）を分解の標的とし得る。例えば、Ｒｏｂｂ，ＣＭ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ Ｃｏｍｍｕｎ（Ｃａｍｂ）．２０１７ Ｊｕｌ ４；５３（５４）：７５７７－７５８０を参照のこと。
いくつかの実施形態では、薬剤は、コンポーネント（例えば、本明細書に記載のコンポーネント）に結合する小分子であり、この小分子は、ユビキチンリガーゼ複合体に結合する小分子に連結することができ、この連結によって得られる複合体は、上記タンパク質を分解の標的にするために使用される。いくつかの実施形態では、小分子は、表Ｓ１に記載のモチーフを有するＩＤＲに結合する。いくつかの実施形態では、方法は、表Ｓ１に記載のコンポーネント（またはＩＤＲ）に結合する小分子を同定すること、及び当該小分子を、ユビキチンリガーゼ複合体のコンポーネントに結合する小分子に連結すること、を含む。
いくつかの実施形態では、薬剤と転写凝縮体（例えば、転写凝縮体コンポーネント）とを接触させることで凝縮体が安定化または崩壊し、それによって、１つ以上の遺伝子の転写、スプライシング、またはサイレンシングが調節される。いくつかの実施形態では、薬剤と凝縮体（例えば、ヘテロクロマチン凝縮体、またはｍＲＮＡ開始複合体もしくはｍＲＮＡ伸長複合体と物理的に結び付く凝縮体）とを接触させることで凝縮体が安定化または崩壊し、それによって、１つ以上の遺伝子の転写、スプライシング、またはサイレンシングが調節される。いくつかの実施形態では、薬剤は、凝縮体の半減期を増加または減少させ、その増減率は、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、またはそれを超える％である。いくつかの実施形態では、薬剤は、凝縮体の半減期を増加または減少させ、その増減倍率は、非接触凝縮体の半減期と比較して、少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．２倍、少なくとも約１．３倍、少なくとも約１．４倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約１．６倍、少なくとも約１．７倍、少なくとも約１．８倍、少なくとも約１．９倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、もしくは少なくとも約１００倍、少なくとも約１，０００倍、少なくとも約１０，０００倍、またはそれを超える倍率である。
いくつかの実施形態では、薬剤は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質に結合し、転写凝縮体、ヘテロクロマチン凝縮体、またはｍＲＮＡ開始複合体もしくはｍＲＮＡ伸長複合体と物理的に結び付く凝縮体、へのコンポーネントの取り込みを阻止し得る。他の実施形態では、薬剤は、現存転写凝縮体に取り込まれる。他の実施形態では、薬剤は、現存ヘテロクロマチン凝縮体に取り込まれるか、またはｍＲＮＡ開始複合体もしくはｍＲＮＡ伸長複合体と物理的に結び付く現存凝縮体に取り込まれる。他の実施形態では、薬剤は、現存転写凝縮体、現存ヘテロクロマチン凝縮体、またはｍＲＮＡ開始複合体もしくはｍＲＮＡ伸長複合体と物理的に結び付く現存凝縮体、へと別のコンポーネントを取り込ませる。他の実施形態では、薬剤は、転写凝縮体、ヘテロクロマチン凝縮体、またはｍＲＮＡ開始複合体もしくはｍＲＮＡ伸長複合体と物理的に結び付く凝縮体、へのコンポーネントの移行を阻止する。
いくつかの実施形態では、薬剤は、ＩＤＲ（例えば、転写因子の活性化ドメイン、シグナル伝達因子のＩＤＲ、核内受容体のＩＤＲ、メチルＤＮＡ結合タンパク質のＩＤＲ、ＲＮＡポリメラーゼのＩＤＲ、またはサプレッサーのＩＤＲ）における酸性残基に結合し、当該酸性残基を遮蔽し、及び／または当該酸性残基を中和する。これによって、いくつかの実施形態では、ＴＦとコアクチベーター（例えば、メディエーター（例えば、メディエーターコンポーネント））との間の相互作用が阻害され得る。これによって、いくつかの実施形態では、シグナル因子依存的な転写、遺伝子サイレンシング、あるいはｍＲＮＡの開始及び／または伸長（例えば、スプライシング）が調節され得る。いくつかの実施形態では、薬剤は、転写因子の活性化ドメインにおける非酸性残基に結合または当該非酸性残基を修飾する。これによって、いくつかの実施形態では、転写因子とコアクチベーター（例えば、メディエーター（例えば、メディエーターコンポーネント））との間の相互作用が増進し得る。いくつかの実施形態では、薬剤は、転写因子（例えば、核内受容体、リガンド非依存性変異核内受容体）と遺伝子サイレンシング因子またはシグナル伝達因子との間の相互作用を増進し得る。いくつかの実施形態では、薬剤は、野生型転写因子と比較して変異転写因子（例えば、リガンド非依存性変異核内受容体）と優先的に相互作用し得る。
いくつかの実施形態では、薬剤は、ＩＤＲ（例えば、表Ｓ２に記載のモチーフを有するＩＤＲ、表Ｓ３に記載の転写因子のＩＤＲ）の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％を有するポリペプチドまたはタンパク質である。いくつかの実施形態では、薬剤は、複数のＩＤＲ（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれを超える数のＩＤＲ領域）を有する。いくつかの実施形態では、コンポーネントは、複数の別々のセクション（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれを超える数のセクション）に分断されたＩＤＲを少なくとも１つ有する。いくつかの実施形態では、これらのセクションは、リンカー配列または構造化アミノ酸によって分断されている。
いくつかの実施形態では、薬剤は、修飾された転写凝縮体コンポーネント（例えば、転写因子、転写コアクチベーター、核内受容体リガンド）である。いくつかの実施形態では、薬剤は、修飾されたヘテロクロマチン凝縮体コンポーネント（例えば、メチルＤＮＡ結合タンパク質、遺伝子サイレンシング因子）である。いくつかの実施形態では、薬剤は、ｍＲＮＡ開始複合体またはｍＲＮＡ伸長複合体と物理的に結び付く凝縮体のコンポーネント（例えば、スプライシング因子、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ）が修飾されたものである。いくつかの実施形態では、コンポーネントは、修飾されたＩＤＲ領域を有する。いくつかの実施形態では、ＩＤＲは、転写因子の活性化ドメインに位置するか、または転写因子の活性化ドメインに由来する。いくつかの実施形態では、修飾ＩＤＲは、野生型配列と比較してセリンの数が増加または減少したものである。いくつかの実施形態では、ＩＤＲは、野生型配列と比較して芳香族酸の数が減少または増加したものである。いくつかの実施形態では、ＩＤＲは、野生型配列と比較して酸性残基の数が減少または増加したものである。いくつかの実施形態では、ＩＤＲは、野生型配列と比較して正または負の正味荷電が減少または増加したものである。
いくつかの実施形態では、ＩＤＲは、野生型配列と比較してプロリン残基の数が減少または増加したものである。いくつかの実施形態では、ＩＤＲは、野生型配列と比較してセリン残基及び／またはスレオニン残基の数が減少または増加したものである。いくつかの実施形態では、ＩＤＲは、野生型配列と比較してグルタミン残基の数が減少または増加したものである。いくつかの実施形態では、野生型配列と比較したときのＩＤＲの残基（複数可）（例えば、セリン、スレオニン、プロリン、酸性残基、グルタミン酸、芳香族残基）の増減数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、４０、４５、５０、７５、１００、またはそれを超える数であり得る。いくつかの実施形態では、野生型配列と比較したときのＩＤＲの残基（複数可）（例えば、セリン、スレオニン、プロリン、酸性残基、グルタミン酸、芳香族残基）の増減倍率は、約１．２、約１．５、約２、約２．５、約３、約３．５、約４、約４．５、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、またはそれを超える倍率であり得る。いくつかの実施形態では、野生型配列と比較したときのＩＤＲの残基（複数可）（例えば、セリン、スレオニン、プロリン、酸性残基、グルタミン酸、芳香族残基）の増減率は、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、またはそれを超える％であり得る。いくつかの実施形態では、ＩＤＲの酸性残基はすべて、非酸性残基（例えば、非荷電残基、塩基性残基）によって置き換えられ得る。いくつかの実施形態では、ＩＤＲのプロリン残基はすべて、非プロリン残基（例えば、親水性残基、極性残基）によって置き換えられ得る。いくつかの実施形態では、ＩＤＲのセリン残基及び／またはスレオニン残基はすべて、非セリン残基及び／または非スレオニン残基（例えば、疎水性残基、酸性残基）によって置き換えられ得る。いくつかの実施形態では、修飾されたコンポーネントは、凝縮体（例えば、転写凝縮体）の他のコンポーネントに対する結合価が減少または増加したものである。いくつかの実施形態では、修飾された転写凝縮体コンポーネントは、凝縮体形成を抑制または阻止する。いくつかの実施形態では、修飾されたヘテロクロマチン凝縮体コンポーネント、またはｍＲＮＡ開始複合体もしくはｍＲＮＡ伸長複合体と物理的に結び付く凝縮体のコンポーネントが修飾されたものは、凝縮体形成または凝縮体活性を抑制または阻止する。
転写因子の活性
マスター転写因子（ＴＦ）は、細胞型特異的エンハンサー（例えば、スーパーエンハンサー）を確立することによって主要な細胞独自性遺伝子を制御することが知られている。さらに、核内受容体は、がんを含めて、多数の疾患及び状態と結び付くＴＦである。ＴＦは、その標的遺伝子の転写を、コアクチベーターを動員することによって活性化する。ＴＦとコアクチベーターとの間の結合は、「ファジー」なものとして説明されており、これは、それらの相互作用界面を単一の立体配座によって説明できないことによるものである。こうした動的相互作用は、相分離凝縮体を構成するＩＤＲ間相互作用に特有のものでもある。さまざまな型の低複雑性活性化ドメインを有するＴＦは、同じ少数のマルチサブユニットコアクチベーター複合体（メディエーター、ｐ３００、及び一般的な転写因子ＩＩ
Ｄ（ＴＦＩＩＤ）を含む）と相互作用すると考えられている。本発明者らは、ＴＦがコアクチベーターと相互作用することによって転写を活性化する作用機構が、コアクチベーター凝縮体を核とすることによるものであることを提唱する。したがって、ＴＦ活性化ドメインを改変すれば、コアクチベーター複合体との相互作用が破壊され、それによって転写量が変化することになる。
したがって、いくつかの実施形態では、転写凝縮体は、転写凝縮体のコンポーネントへの、転写凝縮体と結び付く転写因子（ＴＦ）の結合を調節することによって調節される。いくつかの実施形態では、１つ以上の凝縮体コンポーネントに対するＴＦ活性化ドメインの親和性が調節される。いくつかの実施形態では、ＴＦ（例えば、ＴＦ活性化ドメイン）に対するコンポーネントの親和性が調節される。いくつかの実施形態では、転写凝縮体の形成は、転写凝縮体のコンポーネントへの、転写凝縮体と結び付く転写因子（ＴＦ）の結合を調節することによって調節される。いくつかの実施形態では、転写凝縮体と結び付くコンポーネントへのＴＦの結合は、ＴＦまたはコンポーネントのレベルを調節することによって調節される。他の実施形態では、ヘテロクロマチン凝縮体、またはｍＲＮＡ開始複合体もしくはｍＲＮＡ伸長複合体と物理的に結び付く凝縮体は、凝縮体のコンポーネントへの、凝縮体と結び付く転写因子（ＴＦ）の結合を調節することによって調節される。いくつかの実施形態では、１つ以上の凝縮体コンポーネント（例えば、ヘテロクロマチン凝縮体コンポーネント、またはｍＲＮＡ開始複合体もしくはｍＲＮＡ伸長複合体と物理的に結び付く凝縮体のコンポーネント）に対するＴＦ活性化ドメインの親和性が調節される。いくつかの実施形態では、ＴＦ（例えば、ＴＦ活性化ドメイン）に対するコンポーネントの親和性が調節される。いくつかの実施形態では、ヘテロクロマチン凝縮体の形成、またはｍＲＮＡ開始複合体もしくはｍＲＮＡ伸長複合体と物理的に結び付く凝縮体の形成は、凝縮体のコンポーネントへの、凝縮体と結び付く転写因子（ＴＦ）の結合を調節することによって調節される。いくつかの実施形態では、ヘテロクロマチン凝縮体と結び付くコンポーネントへのＴＦの結合、またはｍＲＮＡ開始複合体もしくはｍＲＮＡ伸長複合体と物理的に結び付く凝縮体と結び付くコンポーネントへのＴＦの結合は、ＴＦまたはコンポーネントのレベルを調節することによって調節される。
コンポーネントは、限定されず、本明細書に記載の任意のコンポーネントであり得る。いくつかの実施形態では、コンポーネントは、コアクチベーター、補助因子、または核内受容体リガンドである。いくつかの実施形態では、コンポーネントは、メディエーター、メディエーターコンポーネント、ＭＥＤ１、ＭＥＤ１５、ＧＣＮ４、ｐ３００、ＢＲＤ４、ホルモン（例えば、エストロゲン）、またはＴＦＩＩＤである。いくつかの実施形態では、コンポーネントは、転写因子である。いくつかの実施形態では、転写因子は、活性化ドメインにＩＤＲを有する。いくつかの実施形態では、転写因子は、ＯＣＴ４、ｐ５３、ＭＹＣもしくはＧＣＮ４、ＮＡＮＯＧ、ＭｙｏＤ、ＫＬＦ４、ＳＯＸファミリーの転写因子、ＧＡＴＡファミリーの転写因子、または核内受容体（例えば、核内ホルモン受容体、エストロゲン受容体、レチノイン酸受容体－アルファ）である。いくつかの実施形態では、核内受容体は、関連リガンドに結合すると転写を活性化する。いくつかの実施形態では、核内受容体は、関連リガンドの非存在下で転写を活性化する変異核内受容体である。変異核内受容体は、本明細書に記載の任意の変異核内受容体であり得る。いくつかの実施形態では、転写因子は、スーパーエンハンサーと結び付く転写因子である。いくつかの実施形態では、転写因子は、表Ｓ３に記載の転写因子の活性化ドメインを有する。いくつかの実施形態では、転写因子は、表Ｓ３に記載の転写因子のＩＤＲを有する。いくつかの実施形態では、転写因子は、表Ｓ３に記載のものである。いくつかの実施形態では、転写因子は、メディエーターコンポーネント（例えば、表Ｓ３に記載のメディエーターコンポーネント）と相互作用する転写因子である。
いくつかの実施形態では、転写凝縮体のコンポーネント（例えば、非転写因子コンポーネント）への転写因子の結合は、転写因子または転写凝縮体を本明細書に記載の薬剤と接触させることによって調節される。いくつかの実施形態では、ヘテロクロマチン凝縮体のコンポーネント、またはｍＲＮＡ開始複合体もしくはｍＲＮＡ伸長複合体と物理的に結び付く凝縮体のコンポーネント、への転写因子の結合は、転写因子、あるいはヘテロクロマチン凝縮体、またはｍＲＮＡ開始複合体もしくはｍＲＮＡ伸長複合体と物理的に結び付く凝縮体を本明細書に記載の薬剤と接触させることによって調節される。いくつかの実施形態では、薬剤は、ペプチド、核酸、または小分子である。いくつかの態様では、負電荷を有するペプチドは、正電荷を有するＩＤＲに結合し得る。いくつかの態様では、正電荷を有するペプチドは、負電荷を有するＩＤＲに結合し得る。
いくつかの実施形態では、薬剤は、本明細書に記載の任意の小分子であり得る。小分子は、転写因子活性化ドメイン（例えば、転写因子活性化ドメインにおけるＩＤＲ）と関連コアクチベーター上の天然変性領域との結び付きを阻止するように設計され得る。この設計は、ＩＤＲを含む発がん性融合タンパク質（ＭＬＬ再構成体、ＥＷＳ－ＦＬＩ、ＥＴＳ融合体、ＢＲＤ４－ＮＵＴ、ＮＵＰ９８融合体、発がん性転写因子融合体など）を保有するがんに特に適し得る。そのような相互作用を乱すことは、特定の転写因子または特定の遺伝子座のいずれかと結び付く転写量を増進させるか、減少させるか、またはその他の様式で変化させるために利用することができる。小分子は、野生型転写因子と比較して変異転写因子（例えば、変異核内受容体）に優先的に結合するようにも設計され得る。
クライアントと骨格との相互作用の改変
分子凝縮体は、「骨格（ｓｃａｆｆｏｌｄ）」及び「クライアント（ｃｌｉｅｎｔ）」に分類ことができる複数の型のコンポーネントを有することが報告されている（Ｂａｎａｎｉ，Ｓ．Ｆ．，Ｒｉｃｅ，Ａ．Ｍ．，Ｐｅｅｐｌｅｓ，Ｗ．Ｂ．，Ｌｉｎ，Ｙ．，Ｊａｉｎ，Ｓ．，Ｐａｒｋｅｒ，Ｒ．，ａｎｄ Ｒｏｓｅｎ，Ｍ．Ｋ．（２０１６）．Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｐｈａｓｅ－Ｓｅｐａｒａｔｅｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｏｄｉｅｓ．Ｃｅｌｌ １６６，６５１－６６３．）。骨格コンポーネントは、相分離し、それらが高度に密集する凝縮体を形成する。こうした骨格コンポーネントは、相分離する一方で、自体だけでは相分離しないが、クライアントと骨格との相互作用を介して高局所濃度を達成するクライアントコンポーネントと相互作用し得る（Ｂａｎａｎｉ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。本発明者らは、転写凝縮体が骨格コンポーネント及びクライアントコンポーネントからなり、こうしたクライアントコンポーネントの相互作用ドメイン（すなわち、天然変性ドメインまたは天然変性領域）を標的とするペプチド模倣物及び他の生体分子を導入することで、こうしたクライアントが転写凝縮体から除去されるということを提唱する。こうしたクライアントは、転写補助因子であり得、その結果、転写凝縮体から除去されると転写が変化する。こうしたクライアントは、シグナル伝達転写因子でもあり得、その結果、転写凝縮体から除去されると、過剰に活性化していたシグナル伝達経路が特異的に転写的に不活性となる。いくつかの態様では、骨格は、集合することで細胞内またはインビトロで凝縮体を形成し得るコンポーネントであり、それ故に、こうしたコンポーネントは、骨格コンポーネントであると考えることができる。
いくつかの実施形態では、転写凝縮体は、転写凝縮体と結び付くコンポーネント（例えば、クライアントコンポーネント）の量またはレベルを調節することによって調節される。コンポーネント（例えば、クライアントコンポーネント）は、限定されず、本明細書に記載の任意の凝縮体コンポーネントであり得る。いくつかの実施形態では、コンポーネント（例えば、クライアントコンポーネント）は、１つ以上の転写補助因子、及び／またはシグナル伝達転写因子、及び／または核内受容体リガンド（例えば、ホルモン）である。いくつかの実施形態では、コンポーネント（例えば、クライアントコンポーネント）は、メディエーター、ＭＥＤ１、ＭＥＤ１５、ＧＣＮ４、ｐ３００、ＢＲＤ４、ホルモン、またはＴＦＩＩＤである。
いくつかの実施形態では、転写凝縮体と結び付くコンポーネント（例えば、クライアントコンポーネント）の量またはレベルは、コンポーネント（例えば、クライアントコンポーネント）と転写凝縮体との間の相互作用を低減または除去する薬剤との接触によって調節される。薬剤は、限定されず、本明細書に記載の任意の薬剤であり得る。いくつかの実施形態では、薬剤は、ペプチド模倣物または類似生体分子である。
いくつかの実施形態では、薬剤は、コンポーネント（例えば、クライアントコンポーネント）の相互作用ドメインを標的とする。いくつかの実施形態では、相互作用ドメインは、天然変性ドメインまたは天然変性領域（ＩＤＲ）である。ＩＤＲは、限定されない。いくつかの実施形態では、ＩＤＲは、表Ｓ２に記載のモチーフを有するＩＤＲである。
シグナル伝達
本明細書に記載の例は、細胞型依存的なシグナル伝達特異性が、スーパーエンハンサーでの相分離を介してシグナル伝達因子が転写凝縮体に到達することによって少なくとも部分的には達成され得ることを示す。この様式では、そのような凝縮体に複数のシグナル伝達因子分子が密集し、ゲノム上の適切な位置を占有することが可能である。
したがって、いくつかの実施形態では、凝縮体（例えば、転写凝縮体）を（例えば、薬剤を用いて）調節することで、シグナル伝達因子に対する親和性を上昇または低下させることができる。いくつかの実施形態では、凝縮体（例えば、転写凝縮体）を、シグナル伝達因子に対する親和性を上昇または低下させる薬剤と接触させることができる。例えば、薬剤は、シグナル伝達因子、及び凝縮体（例えば、転写凝縮体）の別のコンポーネントと結び付き得る。あるいは、薬剤は、薬剤と転写因子のコンポーネントとの結び付きを低減または遮断し得る。いくつかの実施形態では、凝縮体（例えば、転写凝縮体）に対するシグナル伝達因子の親和性が（例えば、薬剤を用いて）調節され得る。いくつかの実施形態では、薬剤は、シグナル伝達因子による転写活性化を調節し得る（この調節は、例えば、シグナル伝達因子と結び付く転写凝縮体の形成、組成、維持、崩壊、活性、及び／または制御を調節することによって行われる）。いくつかの実施形態では、凝縮体／シグナル伝達因子の親和性または活性が薬剤によって調節されることは、細胞型またはエンハンサー（例えばスーパーエンハンサー）に特異的なことである。いくつかの実施形態では、薬剤は、シグナル伝達因子と補助因子（例えば、メディエーターまたはメディエーターコンポーネント）との間の親和性を調節する。
いくつかの実施形態では、凝縮体（例えば、転写凝縮体）は、エンハンサー（例えば、スーパーエンハンサー）と結び付く。エンハンサーは、本明細書に記載されるか、または当該技術分野で知られる遺伝子の１つ以上と結び付き得る。いくつかの実施形態では、エンハンサーは、細胞独自性に関与する遺伝子の１つ以上と結び付く。いくつかの実施形態では、エンハンサーは、本明細書に記載の疾患または状態（例えば、がん）と結び付く遺伝子と結び付く。凝縮体は、本明細書に記載されるか、または当該技術分野で知られる任意のＴＦと結び付き得る。いくつかの実施形態では、ＴＦは、１つ以上のＩＤＲを含む。いくつかの実施形態では、凝縮体は、マスターＴＦと結び付く。いくつかの実施形態では、凝縮体と結び付くＴＦは、ＭｙｏＤ、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、Ｋｌｆ４、またはＭｙｃである。
凝縮体（例えば、転写凝縮体）は、任意の遺伝子または遺伝子群と結び付き得る（例えば、任意の遺伝子または遺伝子群の転写を制御し得る）。いくつかの実施形態では、遺伝子（複数可）は、細胞独自性に関与する。いくつかの実施形態では、遺伝子は、本明細書に記載の疾患または状態（例えば、がん）と結び付く。凝縮体（例えば、転写凝縮体）は、補助因子を含み得る。補助因子は、限定されない。いくつかの実施形態では、補助因子及びシグナル伝達因子は、凝縮体において優先的に結び付く。いくつかの実施形態では、補助因子は、メディエーター、メディエーターコンポーネント、ＭＥＤ１、ＭＥＤ１５、ｐ３００、ＢＲＤ４、ＴＦＩＩＤである。
凝縮体（例えば、転写凝縮体）は、シグナル応答エレメント（例えば、特定のシグナル伝達因子に結合し、転写を制御することができる遺伝子プロモーター領域内の短いＤＮＡ配列）と結び付き得る。いくつかの実施形態では、シグナル応答エレメントは、スーパーエンハンサーと結び付く。いくつかの実施形態では、シグナル応答エレメントは、スーパーエンハンサーと結び付くゲノム領域にもスーパーエンハンサーと結び付かないゲノム領域にも存在する。
シグナル伝達因子は、限定されず、本明細書に記載されるか、または当該技術分野で知られる任意のシグナル伝達因子であり得る。いくつかの実施形態では、シグナル伝達因子は、１つ以上のＩＤＲを含む。いくつかの実施形態では、シグナル伝達因子は、ＮＦ－ｋＢ、ＦＯＸＯ１、ＦＯＸＯ２、ＦＯＸＯ４、ＩＫＫアルファ、ＣＲＥＢ、Ｍｄｍ２、ＹＡＰ、ＢＡＤ、ｐ６５、ｐ５０、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２、ＧＬＩ３、ＹＡＰ、ＴＡＺ、ＴＥＡＤ１、ＴＥＡＤ２、ＴＥＡＤ３、ＴＥＡＤ４、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ２、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ４、ＳＴＡＴ５Ａ、ＳＴＡＴ５Ｂ、ＳＴＡＴ６、ＡＰ－１、Ｃ－ＦＯＳ、ＣＲＥＢ、ＭＹＣ、ＪＵＮ、ＣＲＥＢ、ＥＬＫ１、ＳＲＦ、ＮＯＴＣＨ１、ＮＯＴＣＨ２、ＮＯＴＣＨ３、ＮＯＴＣＨ４、ＲＢＰＪ、ＭＡＭＬ１、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４、ＩＲＦ３、ＥＲＫ１、ＥＲＫ２、ＭＹＣ、ＴＣＦ７Ｌ２、ＴＣＦ７、ＴＣＦ７Ｌ１、ＬＥＦ１、またはベータ－カテニンからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、シグナル伝達因子は、凝縮体と結び付く１つ以上のシグナル応答エレメントまたはメディエーターに優先的に結合する。いくつかの実施形態では、凝縮体は、マスター転写因子を含む。
シグナル伝達因子及び補助因子は、転写凝縮体と特異的に相互作用し得るものであり、疾患においては、いくつかのシグナル伝達経路に変化が生じている。シグナル伝達経路は、限定されない。いくつかの実施形態では、シグナル伝達経路は、Ａｋｔ／ＰＫＢシグナル伝達経路、ＡＭＰＫシグナル伝達経路、ｃＡＭＰ依存性経路、ＥＧＦ受容体シグナル伝達経路、ヘッジホッグシグナル伝達経路、Ｈｉｐｐｏシグナル伝達経路、低酸素誘導因子（ＨＩＦ）シグナル伝達経路、インスリンシグナル伝達経路、ＩＧＦシグナル伝達経路、ＪＡＫ－ＳＴＡＴシグナル伝達経路、ＭＡＰＫ／ＥＲＫシグナル伝達経路、ｍＴＯＲシグナル伝達経路、ＮＦ－ｋＢ経路、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達経路、ＰＤＧＦ受容体経路、Ｔ細胞受容体シグナル伝達経路、ＴＧＦベータシグナル伝達経路、ＴＬＲシグナル伝達経路、ＶＥＧＦ受容体シグナル伝達経路、またはＷｎｔシグナル伝達経路である。いくつかの実施形態では、シグナル伝達経路は、核内受容体関連シグナル伝達経路である。核内受容体は、限定されず、本明細書に記載の任意の核内受容体であり得る。シグナル伝達経路が疾患発病に寄与する場合、凝縮体の形成、組成、維持、崩壊、形態、及び／または制御を変化させることで、治療効果を得ることができる。
いくつかの実施形態では、転写凝縮体を調節することで、１つ以上のシグナル伝達経路が調節される。いくつかの実施形態では、シグナル伝達経路は、疾患発病に寄与する。いくつかの実施形態では、疾患は、増殖性疾患、炎症性疾患、循環器疾患、神経疾患、または感染性疾患である。いくつかの実施形態では、疾患は、がん（例えば、乳癌）である。
がんの型は、限定されない。「がん」は、一般に、腫瘍（例えば、悪性または潜在的に悪性の腫瘍）が１つ以上生じることによって特徴付けられる疾患を指すために使用される。本明細書で使用される「腫瘍」という用語は、細胞の異常増殖を伴う増殖異常を包含する。当該技術分野で知られるように、腫瘍は、典型的には、適切に制御されることなく細胞が過剰に増殖すること（例えば、通常であれば増殖を抑圧すると想定される生理学的な影響及びシグナルに正常に応答せずに細胞が過剰に増殖すること）によって特徴付けられ、下記の特性のうちの１つ以上を示し得る：異形成（例えば、正常な細胞分化が失われる結果、未熟細胞の数または比率が増加する）、退形成（例えば、分化の大幅な喪失、組織構造の喪失進行、細胞多形性、奇形（大型の過染性核、細胞質に対する核の比の上昇、非定型有糸分裂など））、周囲組織への浸潤（例えば、基底膜を破壊して通過すること）、及び／または転移。悪性腫瘍は、増殖が持続する傾向があり、拡散能力を有することで、例えば、局所的に浸潤し、及び／または局部的に転移し、及び／または遠隔部位に転移する一方で、良性腫瘍は、原発部位に局所的に留まることが多く、増殖に関して自己制限的であることが多い。「腫瘍」という用語は、悪性固形腫瘍を含み、こうした悪性固形腫瘍は、例えば、癌腫（上皮細胞から生じるがん）、肉腫（間葉起源の細胞から生じるがん）、及び固形腫瘤が検出不可能であり得る悪性増殖物（例えば、ある特定の血液悪性腫瘍）である。がんには、限定されないが、乳癌、胆道癌、膀胱癌、脳癌（例えば、膠芽腫、髄芽腫）、子宮頸癌、絨毛癌、結腸癌、子宮内膜癌、食道癌、胃癌、血液学的新生物（急性リンパ性白血病及び急性骨髄性白血病を含む）、Ｔ細胞性急性リンパ芽球性白血病／リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、成人Ｔ細胞性白血病／リンパ腫、上皮内新生物（ボーエン病及びパジェット病を含む）、肝癌、肺癌、リンパ腫（ホジキン病及びリンパ球性リンパ腫を含む）、神経芽細胞腫、メラノーマ、口腔癌（扁平上皮癌を含む）、卵巣癌（上皮細胞、間質細胞、生殖細胞、及び間葉系細胞から生じる卵巣癌を含む）、神経芽細胞腫、膵癌、前立腺癌、直腸癌、肉腫（血管肉腫、消化管間質腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、脂肪肉腫、線維肉腫、及び骨肉腫を含む）、腎癌（腎細胞癌及びウイルムス腫瘍を含む）、皮膚癌（基底細胞癌及び扁平上皮癌を含む）、精巣癌（胚腫瘍（セミノーマ、非セミノーマ（奇形腫、絨毛癌）、間質性腫瘍、及び胚細胞性腫瘍など）を含む）、甲状腺癌（ｔｈｙｒｏｉｄ ｃａｎｃｅｒ）（甲状腺癌（ｔｈｙｒｏｉｄ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）及び髄様癌を含む）が含まれる。ある特定の臓器には、さまざまな異なる腫瘍型（例えば、臨床的特徴及び／または病的特徴及び／または分子マーカーに関して異なる得る）が生じ得ることが理解されよう。さまざまな異なる臓器に生じる腫瘍については、例えば、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ａｇｅｎｃｙ ｆｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｎ Ｃａｎｃｅｒ（ＩＡＲＣ）によるＷＨＯ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｕｍｏｕｒｓ ｓｅｒｉｅｓの４版または３版（Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｔｕｍｏｕｒｓ ｓｅｒｉｅｓ），ＷＨＯ Ｐｒｅｓｓ，Ｇｅｎｅｖａ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄにおいて論じられており、これらの文献の巻はすべて、参照によって本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、がんは、肺癌、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、胃癌、腎癌、白血病、肝癌、リンパ腫、（例えば、非ホジキンリンパ腫、例えば、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、バーキットリンパ腫）、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、直腸癌、肉腫、皮膚癌、精巣癌、または子宮癌である。がんの型は、限定されない。いくつかの実施形態では、がんは、異常な遺伝子発現を示す。いくつかの実施形態では、がんは、異常な遺伝子産物活性を示す。いくつかの実施形態では、がんは、遺伝子産物を正常レベルで発現するが、その遺伝子産物の活性を変える変異を保有する。がん遺伝子が、異常に上昇した活性を有する場合、本発明の方法を使用することで、がん遺伝子の発現を低減することができる。腫瘍抑制遺伝子が、（例えば、変異に起因して）異常に低下した活性を有する場合、本発明の方法を使用して制御状況を調節することによって腫瘍抑制遺伝子の発現を増加させることができる。
核膜孔との結び付き
転写凝縮体は、核膜孔タンパク質と相互作用することで、入ってくるシグナルに優先的にアクセスし、新たに転写されるｍＲＮＡを優先的に搬出することを可能にし得る。凝縮体と核膜孔との間の相互作用が安定化または破壊されると、凝縮体による転写量が変化し得る。このことは、凝縮体と結び付く遺伝子に由来するｍＲＮＡの搬出及び翻訳にも有利に働き得る。
いくつかの実施形態では、転写凝縮体を調節することで、転写凝縮体と１つ以上の核膜孔タンパク質との間の相互作用が調節される。いくつかの実施形態では、転写凝縮体と１つ以上の核膜孔タンパク質との間の相互作用を調節することで、核内シグナル伝達、ｍＲＮＡの搬出、及び／またはｍＲＮＡの翻訳が調節される。いくつかの実施形態では、核内シグナル伝達、ｍＲＮＡの搬出、及び／またはｍＲＮＡの翻訳は、疾患と結び付くものである。
炎症
細菌感染またはウイルス感染に対する炎症応答は、主要なサイトカイン及びケモカインの活性化に依存する。こうした炎症応答遺伝子の転写を低減すると、細菌感染またはウイルス感染の有害作用が低下することが知られている。主要な炎症性遺伝子の強固な発現は、凝縮体形成に依存する可能性があり、この凝縮体形成は、ペプチド、核酸、または小分子によって標的とすることができる特定のタンパク質、ＲＮＡモチーフ、またはＤＮＡモチーフに特に依存し得るものである。
いくつかの実施形態では、転写凝縮体（あるいはいくつかの実施形態では、ヘテロクロマチン凝縮体、またはｍＲＮＡ開始複合体もしくはｍＲＮＡ伸長複合体と物理的に結び付く凝縮体）を調節することで、炎症応答が調節される。いくつかの実施形態では、炎症応答は、ウイルスまたは細菌に対する炎症応答である。いくつかの実施形態では、炎症応答は、不適切な炎症応答、誤って制御される炎症応答、または過剰な炎症応答である。ある特定の実施形態では、本開示の方法は、炎症状態を有する対象において炎症を低減し、１つ以上の炎症性サイトカインの発現を低減し、及び／または過剰な炎症応答を低減するために使用される。いくつかの実施形態では、炎症応答は、凝縮体を調節することによって調節され、それによって、転写、ｍＲＮＡの開始、及び／またはｍＲＮＡの伸長が調節されるか、あるいは炎症に関与するか、または炎症応答を低減する１つ以上の遺伝子の遺伝子サイレンシングが調節される。いくつかの実施形態では、炎症に関与するか、または炎症応答を低減するシグナル伝達経路の活性が、本明細書に開示の方法を介して調節される（この調節は、例えば、シグナル伝達因子と凝縮体との親和性を調節することによって行われる）。
ＤＮＡを用いる凝縮体の調節
ＤＮＡ配列を改変するか、またはＤＮＡのメチル化／脱メチル化による修飾もしくは他のＤＮＡ修飾（アセチル化／脱アセチル化など）を行うと、凝縮体の形成、組成、維持、崩壊、形態、及び／または制御に影響を与えることができる。さらに、ｄＣａｓ９（または他の触媒的に不活性な部位特異的ヌクレアーゼ）との融合を利用し、特異的なガイドＲＮＡを使用することによって、部位特異的な様式でコンポーネント（ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質）をゲノムＤＮＡに繋留することができる。同様の手法を使用しても、特定のコンポーネントを現存凝縮体に局在化させることができ、これによって、当該現存凝縮体の組成、維持、崩壊、または制御を変えることができる。
いくつかの実施形態では、凝縮体（例えば、転写凝縮体）は、凝縮体と結び付くヌクレオチド配列（例えば、ゲノムＤＮＡ配列）を改変することによって調節される。例えば、転写凝縮体と結び付くエンハンサー（例えば、スーパーエンハンサー）が改変され得る。転写因子結合部位もまた、改変され得る。いくつかの実施形態では、ホルモン応答エレメントまたはシグナル応答エレメントが改変され得る。さらに、凝縮体と結び付くコンポーネントをコードする遺伝子（例えば、転写因子、補助因子、コアクチベーター、抑制因子、またはメチルＤＮＡ関連結合タンパク質をコードする遺伝子）が改変され得る。改変は、コード領域または非コード領域に対するものであり得る。いくつかの実施形態では、改変は、ヌクレオチドの付加または欠失を含む。いくつかの実施形態では、ヌクレオチドを付加することで、凝縮体の形成が誘発もしくは増進されるか、または凝縮体の安定性が調節される。いくつかの実施形態では、ヌクレオチドを欠失させることで、凝縮体の形成が阻止されるか、または凝縮体の安定性が調節される。いくつかの実施形態では、ヌクレオチドを付加または欠失させることで、凝縮体の形成、組成、維持、崩壊、形態、及び／または制御に影響が及ぶ。
いくつかの実施形態では、凝縮体と結び付くＤＮＡは、ヘテロクロマチン（例えば、条件的ヘテロクロマチン）に局在化するものである。いくつかの実施形態では、凝縮体と結び付くＤＮＡは、メチル化される。いくつかの実施形態では、ゲノムＤＮＡをメチル化または脱メチル化することで凝縮体の形成が調節される。いくつかの実施形態では、ＤＮＡをメチル化または脱メチル化することで、凝縮体の形成または安定性が調節され、それによって遺伝子サイレンシングが調節される。いくつかの実施形態では、触媒的に不活性な部位特異的エンドヌクレアーゼをヘテロクロマチンのメチル化または脱メチル化に使用することで、凝縮体の形成または安定性が調節され、それによって遺伝子サイレンシングが調節される。
いくつかの実施形態では、改変は、エピジェネティック修飾を含む。いくつかの実施形態では、エピジェネティック修飾は、ＤＮＡのメチル化を含む。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列の改変は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質をヌクレオチド配列に繋留することを含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質は、本明細書に記載の転写凝縮体コンポーネントまたはその断片（例えば、ＩＤＲ含有断片）である。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質は、本明細書に記載のヘテロクロマチン凝縮体コンポーネントまたはその断片（例えば、ＩＤＲ含有断片）である。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質は、本明細書に記載の薬剤である。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質は、凝縮体の形成を促進または増進するものである。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質は、凝縮体の形成を抑制または阻止するものである。いくつかの実施形態では、補助因子（例えば、メディエーター）またはその断片（例えば、ＩＤＲ含有断片）がヌクレオチド配列に繋留される。いくつかの実施形態では、メチルＤＮＡ結合タンパク質またはその断片（例えば、ＩＤＲ含有断片）がヌクレオチド配列に繋留される。いくつかの実施形態では、サイクリン依存性キナーゼまたはその断片がヌクレオチド配列に繋留される。いくつかの実施形態では、スプライシング因子またはその断片（例えば、ＩＤＲ含有断片）がヌクレオチド配列に繋留される。
いくつかの実施形態では、触媒的に不活性な部位特異的ヌクレアーゼと、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質をヌクレオチド配列に付加することが可能なエフェクタードメインと、が使用される。いくつかの実施形態では、触媒的に不活性な部位特異的ヌクレアーゼｄＣａｓ（例えば、ｄＣａｓ９またはＣｐｆ１）が使用される。
当該技術分野で知られるさまざまなＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）遺伝子またはＣａｓタンパク質を修飾することで、触媒的に不活性な部位特異的ヌクレアーゼの調製することができ、Ｃａｓタンパク質の選択は、方法の具体的条件に依存することになる（例えば、ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｅ／？ｔｅｒｍ＝ｃａｓ９）。Ｃａｓタンパク質の具体例としては、Ｃａｓ１、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９、及びＣａｓ１０が挙げられる。特定の態様では、方法において使用されるＣａｓ核酸またはＣａｓタンパク質は、Ｃａｓ９である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９タンパク質）は、さまざまな原核生物種のいずれかに由来し得る。いくつかの実施形態では、特定のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を認識させるために、特定のＣａｓタンパク質（例えば、特定のＣａｓ９タンパク質）が選択され得る。ある特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９タンパク質）を、細菌もしくは古細菌から得るか、または既知の方法を使用して合成することができる。ある特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、グラム陽性細菌またはグラム陰性細菌に由来し得る。ある特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｃｒｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ、ＶｅｉＵｏｎｅｌｌａ、またはＭａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒに由来し得る。いくつかの実施形態では、２つ以上の異なるＣａｓタンパク質をコードする核酸、または２つ以上のＣａｓタンパク質を細胞、接合体、胚、または動物に導入することで、例えば、同じ、同様、または異なるＰＡＭモチーフを含む部位を認識し、修飾することが可能になり得る。
いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃｐｆ１タンパク質またはその機能性部分である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、任意の細菌種に由来するＣｐｆ１またはその機能性部分である。ある特定の実施形態では、Ｃｐｆ１タンパク質は、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ Ｕ１１２のタンパク質もしくはその機能性部分、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓの１種ＢＶ３Ｌ６のタンパク質もしくはその機能性部分、またはＬａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＤ２００６のタンパク質もしくはその機能性部分である。Ｃｐｆ１タンパク質は、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ系のメンバーである。Ｃｐｆ１タンパク質は、約１３００個のアミノ酸を含むポリペプチドである。Ｃｐｆ１は、ＲｕｖＣ様エンドヌクレアーゼドメインを含む。
いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９ヌクレアーゼドメインの１つ以上を不活性化することによってＣａｓ９ニッカーゼが生成され得る。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９のＲｕｖＣ Ｉドメインにおける残基１０をアミノ酸置換することで、当該ヌクレアーゼがＤＮＡニッカーゼに変換される。例えば、１０番目に位置するアミノ酸残基であるアスパラギン酸がアラニンに置換され得る（Ｃｏｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３９：８１９－８２３）。触媒的に不活性なＣａｓ９タンパク質が創出される他のアミノ酸変異には、残基１０及び／または残基８４０の変異が含まれる。残基１０及び残基８４０の両方を変異させると触媒的に不活性なＣａｓ９タンパク質を創出することができ、この触媒的に不活性なＣａｓ９タンパク質は、本明細書ではｄＣａｓ９と称されることもある。例えば、Ｄ１０Ａ変異及びＨ８４０Ａ変異を有するＣａｓ９変異体は、触媒的に不活性である。
本明細書で使用される「エフェクタードメイン」は、ゲノム配列（例えば、遺伝子）の発現及び／または活性化を調節する分子（例えば、タンパク質）である。エフェクタードメインは、メチル化活性または脱メチル化活性（例えば、ＤＮＡメチル化活性またはＤＮＡ脱メチル化活性）を有し得る。いくつかの態様では、エフェクタードメインは、遺伝子の一方または両方のアレルを標的とする。エフェクタードメインは、核酸配列及び／またはタンパク質として導入され得る。いくつかの態様では、エフェクタードメインは、構成的エフェクタードメインまたは誘導性エフェクタードメインであり得る。いくつかの態様では、Ｃａｓ（例えば、ｄＣａｓ）核酸配列またはそのバリアントと、エフェクタードメイン核酸配列とが、凝縮体を有する細胞にキメラ配列として導入される。いくつかの態様では、エフェクタードメインは、Ｃａｓタンパク質と結び付く（例えば、結合する）分子と融合される（例えば、エフェクター分子は、Ｃａｓタンパク質に結合する抗体またはその抗原結合断片と融合される）。いくつかの態様では、Ｃａｓ（例えば、ｄＣａｓ）タンパク質またはそのバリアントとエフェクタードメインとが融合または繋留されてキメラタンパク質が創出され、当該キメラタンパク質として細胞に導入される。いくつかの態様では、Ｃａｓ（例えば、ｄＣａｓ）タンパク質とエフェクタードメインとは、タンパク質間相互作用で結合される。いくつかの態様では、Ｃａｓ（例えば、ｄＣａｓ）タンパク質とエフェクタードメインとは、共有結合で連結される。いくつかの態様では、エフェクタードメインは、非共有結合でＣａｓ（例えば、ｄＣａｓ）タンパク質と結び付く。いくつかの態様では、Ｃａｓ（例えば、ｄＣａｓ）核酸配列及びエフェクタードメイン核酸配列は、別々の配列及び／またはタンパク質として導入される。いくつかの態様では、Ｃａｓ（例えば、ｄＣａｓ）タンパク質とエフェクタードメインとは、融合または繋留されない。
いくつかの実施形態では、１つ以上のＲＮＡ配列（ｓｇＲＮＡ）によって、触媒的に不活性な部位特異的ヌクレアーゼを特定のＤＮＡ部位に導いて１つ以上のゲノム配列の活性及び／または発現を調節することができる（例えば、転写もしくはクロマチン高次構造化にある特定の作用を及ぼすか、または特定種の分子を特定のＤＮＡ遺伝子座に運ぶか、または局所的なヒストン状態もしくはＤＮＡ状態のセンサーとして働かせることができる）。特定の態様では、エフェクタードメインのすべてまたは一部にｄＣａｓ９を繋留して融合することで、１つ以上のＲＮＡ配列によって特定のＤＮＡ部位に導いて、１つ以上のゲノム配列のメチル化または脱メチル化を調節または修飾することが可能なキメラタンパク質が創出される。本明細書で使用される「エフェクタードメインの生物学的に活性な部分」は、エフェクタードメインの機能を（例えば、完全、部分的、最小限に）維持する部分（例えば、「最小」ドメインまたは「コア」ドメイン）である。１つ以上のエフェクタードメインのすべてまたは一部とＣａｓ９（例えば、ｄＣａｓ９）とを融合することで、キメラタンパク質が創出される。
エフェクタードメインの例としては、クロマチン高次構造化ドメイン、再構築ドメイン、ヒストン修飾ドメイン、ＤＮＡ修飾ドメイン、ＲＮＡ結合ドメイン、タンパク質相互作用入力装置ドメイン（Ｇｒｕｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｓｅｒｒａｎｏ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３’８（８）：‘２６６３－２６７’５（２０１０））、及びタンパク質相互作用出力装置ドメイン（Ｇｒｕｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｓｅｒｒａｎｏ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３’８（８）：‘２６６３－２６７’５（２０１０））が挙げられる。いくつかの態様では、エフェクタードメインは、ＤＮＡ修飾因子である。ＤＮＡ修飾因子の具体例としては、５ｍＣから５ｈｍｃへの変換を行うもの（Ｔｅｔｌ（ＴｅｔｌＣＤ）など）と、ＤＮＡの脱メチル化を行うＴｅｔｌ、ＡＣＩＤＡ、ＭＢＤ４、Ａｐｏｂｅｃｌ、Ａｐｏｂｅｃ２、Ａｐｏｂｅｃ３、Ｔｄｇ、Ｇａｄｄ４５ａ、Ｇａｄｄ４５ｂ、ＲＯＳ１と、ＤＮＡのメチル化を行うＤｎｍｔｌ、Ｄｎｍｔ３ａ、Ｄｎｍｔ３ｂ、ＣｐＧメチルトランスフェラーゼであるＭ．ＳｓｓＩ、及び／またはＭ．ＥｃｏＨＫ３１Ｉと、が挙げられる。特定の態様では、エフェクタードメインは、Ｔｅｔ１である。他の特定の態様では、エフェクタードメインは、Ｄｍｎｔ３ａである。いくつかの実施形態では、ｄＣａｓ９は、Ｔｅｔ１と融合される。他の実施形態では、ｄＣａｓ９は、Ｄｎｍｔ３ａと融合される。エフェクタードメインの他の例は、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０３４３８７号及び米国出願第１４／７８５０３１号に記載されており、これらの文献は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。触媒的に不活性な部位特異的ヌクレアーゼ、ヌクレオチド配列（例えば、ゲノム配列）を修飾するためのエフェクタードメイン、及びｓｇＲＮＡを使用する方法は、２０１７年１２月１２日出願のＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０６５９１８に教示されており、当該文献は、参照によって本明細書に組み込まれる。
ＲＮＡを用いる凝縮体の調節
外来性ＲＮＡを添加するか、ＲＮＡを安定化するか、またはある特定のＲＮＡを除去することで凝縮体を調節できることにさらに留意されたい。したがって、いくつかの実施形態では、転写凝縮体は、凝縮体を、外来性に添加されたＲＮＡと接触させることによって調節される。いくつかの実施形態では、ヘテロクロマチン凝縮体は、凝縮体を、外来性に添加されたＲＮＡと接触させることによって調節される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ開始複合体またはｍＲＮＡ伸長複合体と結び付く凝縮体は、凝縮体を、外来性に添加されたＲＮＡと接触させることによって調節される。
いくつかの実施形態では、外来性ＲＮＡは、天然起源のＲＮＡ配列、修飾ＲＮＡ配列（例えば、１つ以上の修飾塩基を含むＲＮＡ配列）、合成ＲＮＡ配列、またはそれらの組み合わせである。本明細書で使用される「修飾ＲＮＡ」は、ＲＮＡ配列に対する１つ以上の修飾（例えば、骨格及びまたは糖に対する修飾）を含むＲＮＡ（例えば、非標準的及び／または非天然起源の塩基を１つ以上含むＲＮＡ）である。ＲＮＡの塩基を修飾する方法は、当該技術分野でよく知られている。そのような修飾塩基の例としては、ヌクレオシドである５－メチルシチジン（５ｍＣ）、シュードウリジン（Ψ）、５－メチルウリジン、２’０－メチルウリジン、２－チオウリジン、Ｎ－６メチルアデノシン、ヒポキサンチン、ジヒドロウリジン（Ｄ）、イノシン（Ｉ）、及び７－メチルグアノシン（ｍ７Ｇ）に含まれる修飾塩基が挙げられる。さまざまな実施形態においてＲＮＡ配列における任意の数の塩基が置換され得ることに留意されたい。さらに、異なる修飾の組み合わせが使用され得ることが理解されよう。
いくつかの態様では、外来性ＲＮＡ配列は、モルホリノである。モルホリノは、典型的には、長さが約２５塩基の合成分子であり、標準的な核酸塩基対形成によってＲＮＡの相補的配列に結合する。モルホリノは、標準的な核酸塩基を有するが、そうした塩基は、デオキシリボース環の代わりにモルホリン環に結合しており、ホスフェートの代わりにホスホロジアミデート基を介して連結されている。モルホリノは、その標的ＲＮＡ分子を分解することはなく、このことは、多くのアンチセンス構造型（例えば、ホスホロチオエート、ｓｉＲＮＡ）とは異なる。代わりに、モルホリノは、立体的な遮断を行うことによって働くものであり、ＲＮＡ内の標的配列に結合し、遮断しなければ当該ＲＮＡと相互作用し得る分子を遮断する。いくつかの実施形態では、合成ＲＮＡは、ＷＯ２０１７０７５４０６に記載のものである。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ配列の長さは、約８塩基対（ｂｐ）～約２００ｂｐ、約５００ｂｐ、または約１０００ｂｐの間で異なり得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ配列の長さは、約９～約１９０ｂｐ、約１０～約１５０ｂｐ、約１５～約１２０ｂｐ、約２０～約１００ｂｐ、約３０～約９０ｂｐ、約４０～約８０ｂｐ、約５０～約７０ｂｐであり得る。
いくつかの実施形態では、外来性ＲＮＡは、凝縮体の形成または安定性を安定化または増進する。いくつかの実施形態では、外来性ＲＮＡは、凝縮体の崩壊を促進するか、または凝縮体の形成を阻止／抑制する。
いくつかの実施形態では、ある特定の（すなわち、特定の）ＲＮＡの除去は、干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）を使用して実施される。本明細書で使用される「ＲＮＡ干渉」（「ＲＮＡｉ」）という用語（当該技術分野では「遺伝子サイレンシング」及び／または「標的サイレンシング」（例えば、「標的ｍＲＮＡサイレンシング」）とも称される）は、細胞内での選択的なＲＮＡ分解を指す。天然では、ＲＮＡｉは、外来性ＲＮＡ（例えば、ウイルスＲＮＡ）を除去するために細胞内で生じる。天然のＲＮＡｉは、遊離のｄｓＲＮＡが切断されて断片が生じ、こうした断片が、他の類似ＲＮＡ配列に対して分解機構を誘導することで進行する。いくつかの態様では、特定のＲＮＡの除去は、当該特定のＲＮＡの転写を抑制することによるものである。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、当該技術分野で知られる方法によってＲＮＡの一方の末端または両方の末端を保護（キャッピング）することによって安定化される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、凝縮体のコンポーネントへの結合を妨害しない分子（すなわち、アンチセンス核酸または小分子）と当該ＲＮＡを結び付けることによって安定化される。
凝縮体のコンポーネントを標的とすることによるＲＮＡプロセシングの調節
いくつかの疾患は、ＲＮＡ種のプロセシングの異常と結び付く。いくつかの実施形態では、転写凝縮体は、ＲＮＡプロセシング装置によって形成される凝縮体と融合し得る。こうした凝縮体の安定化または破壊は、治療的に有益な様式でＲＮＡプロセシングを変化させ得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法を使用して凝縮体を調節することで、転写凝縮体とＲＮＡプロセシング装置によって形成される凝縮体との融合を増進または安定化させることができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法を使用して凝縮体を調節することで、転写凝縮体とＲＮＡプロセシング装置によって形成される凝縮体との融合を抑制または不安定化させることができる。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ開始複合体またはｍＲＮＡ伸長複合体と物理的に結び付く凝縮体を、本明細書に開示の方法によって調節し、それによってＲＮＡプロセシングを調節することができる。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ開始複合体またはｍＲＮＡ伸長複合体と物理的に結び付く凝縮体が、治療的に有益な様式で調節される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡの伸長と結び付く凝縮体が調節され、それによって、治療的に有益な様式でｍＲＮＡスプライシングが調節される（例えば、異常なスプライシングバリアントの低減、有益なスプライシングバリアントの増加）。
ｍＲＮＡの搬出を調節することによる翻訳の調節
転写凝縮体は、核膜孔タンパク質と相互作用することで、新たに転写されるｍＲＮＡを優先的に搬出することを可能にし得る。したがって、凝縮体と核膜孔との間の相互作用を安定化または破壊すると、凝縮体と結び付く遺伝子に由来するｍＲＮＡの翻訳が変化し得る。そのような変化は、疾患によって特定のタンパク質が病的レベルで生じる場合に治療的に有用であり得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法を使用して凝縮体を調節することで、新たに転写されるｍＲＮＡの優先的な搬出を増進することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法を使用して凝縮体を調節することで、新たに転写されるｍＲＮＡの優先的な搬出を抑制することができる。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡを調節することは、疾患治療のための治療となる。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡを調節することによって、タンパク質のレベルが病的レベルから非病的レベルに戻る。
多価分子を利用することによる凝縮体の標的化
凝縮体（例えば、転写凝縮体、ヘテロクロマチン凝縮体、またはｍＲＮＡ開始複合体もしくはｍＲＮＡ伸長複合体と結び付く凝縮体）は、ＩＤＲを有するタンパク質の間に複数の弱い相互作用が生じることによって形成され得る。そのような変性領域がいずれの規定の二次構造または三次構造を有し得ないことを考慮すると、こうした領域に結合する小分子またはペプチド模倣物は、そうした結合を弱い親和性で生じさせている可能性がある。そのような分子を凝縮体（例えば、転写凝縮体、ヘテロクロマチン凝縮体、またはｍＲＮＡ開始複合体もしくはｍＲＮＡ伸長複合体と結び付く凝縮体）に密集させて弱いＩＤＲ間相互作用を妨害するために、「アンカー」及び「破壊物質」から構成される二価分子を利用することができる。「破壊物質」は、凝縮体の相互作用コンポーネントに弱く結合して相互作用の性質を破壊するか、または変化させる分子である。アンカーコンポーネントは、凝縮体の中または付近に存在する構造化が進んだタンパク質領域に対して強い親和性を有し、それによって凝縮体（例えば、転写凝縮体、ヘテロクロマチン凝縮体、またはｍＲＮＡ開始複合体もしくはｍＲＮＡ伸長複合体と結び付く凝縮体）の中または付近に破壊物質分子が密集するように働く分子である。
いくつかの実施形態では、転写凝縮体は、凝縮体を、凝縮体コンポーネントの天然変性ドメインに結合する薬剤と接触させることによって調節される。いくつかの実施形態では、ヘテロクロマチン凝縮体は、凝縮体を、凝縮体コンポーネントの天然変性ドメインに結合する薬剤と接触させることによって調節される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ開始複合体またはｍＲＮＡ伸長複合体と結び付く凝縮体は、凝縮体を、凝縮体コンポーネントの天然変性ドメインに結合する薬剤と接触させることによって調節される。コンポーネントは、限定されず、本明細書に記載の任意のコンポーネントであり得る。いくつかの実施形態では、コンポーネントは、メディエーター、ＭＥＤ１、ＭＥＤ１５、ＧＣＮ４、ｐ３００、ＢＲＤ４、核内受容体リガンド、またはＴＦＩＩＤである。いくつかの実施形態では、コンポーネントは、表Ｓ３に記載のメディエーターコンポーネントである。いくつかの実施形態では、コンポーネントは、転写因子である。いくつかの実施形態では、転写因子は、活性化ドメインにＩＤＲを有する。いくつかの実施形態では、転写因子は、ＯＣＴ４、ｐ５３、ＭＹＣ、ＧＣＮ４、ＮＡＮＯＧ、ＭｙｏＤ、ＫＬＦ４、ＳＯＸファミリーの転写因子、ＧＡＴＡファミリーの転写因子、核内受容体、または融合発がん性転写因子である。いくつかの実施形態では、転写因子は、表Ｓ３に記載の転写因子の活性化ドメインを有する。いくつかの実施形態では、転写因子は、表Ｓ３に記載の転写因子のＩＤＲを有する。いくつかの実施形態では、転写因子は、表Ｓ３に記載のものである。いくつかの実施形態では、転写因子は、メディエーターコンポーネント（例えば、表Ｓ３に記載のメディエーターコンポーネント）と相互作用する転写因子である。
薬剤もまた、限定されず、本明細書に記載の任意の適切な薬剤であり得る。いくつかの実施形態では、薬剤は、多価（例えば、二価、三価、四価など）である。いくつかの実施形態では、薬剤は、コンポーネントの天然変性ドメインに結合すると共に、同じコンポーネントの非天然変性ドメインにさらに結合する。いくつかの実施形態では、薬剤は、コンポーネントの天然変性ドメインに結合すると共に、転写凝縮体と結び付く第２のコンポーネントにさらに結合する。いくつかの実施形態では、薬剤は、多価であり、活性化ドメイン（例えば、活性化ドメインのＩＤＲ）に結合すると共に、非活性化ドメイン（例えば、ＤＮＡ結合ドメイン）、または転写因子の非天然変性領域にさらに結合する。いくつかの実施形態では、薬剤は、変異転写因子（例えば、疾患もしくは状態と結び付く変異転写因子）の非活性化ドメイン、または転写因子の非天然変性領域に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、薬剤は、野生型転写因子の非活性化ドメイン、または野生型転写因子の非天然変性領域に結合しない。いくつかの実施形態では、多価薬剤は、核内受容体に結合する。いくつかの実施形態では、多価薬剤は、核内受容体の変異形態（例えば、疾患または状態と結び付く変異形態）に優先的に結合する。いくつかの実施形態では、多価薬剤は、シグナル伝達因子、補助因子、メチルＤＮＡ結合タンパク質、スプライシング因子、またはＲＮＡポリメラーゼに結合する。
いくつかの実施形態では、薬剤は、転写凝縮体のコンポーネントの間の相互作用を変化させるか、または破壊する。いくつかの実施形態では、薬剤は、転写凝縮体を増強または安定化させる。いくつかの実施形態では、薬剤は、転写凝縮体を抑制または不安定化させる。
コンポーネントをＤＮＡに繋留することによる新たな凝縮体の形成誘発または現存凝縮体の変化誘発
転写凝縮体及びヘテロクロマチン凝縮体は、ＤＮＡ上に形成され得る。したがって、新たな凝縮体を形成させるために、触媒的に不活性な部位特異的ヌクレアーゼ及びエフェクタードメインを本明細書に開示の方法によって利用することで、コンポーネント（ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質）を部位特異的な様式でゲノムＤＮＡに繋留することができる。いくつかの実施形態では、コンポーネントは、本明細書に記載のｄＣａｓ（例えば、ｄＣａｓ９）を使用してＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡ）に繋留される。
いくつかの実施形態では、転写凝縮体の形成は、１つ以上の転写凝縮体コンポーネントをゲノムＤＮＡに繋留することによって誘発、増進、または安定化される。いくつかの実施形態では、ヘテロクロマチン凝縮体の形成は、１つ以上のヘテロクロマチン凝縮体コンポーネントをゲノムＤＮＡに繋留することによって誘発、増進、または安定化される。コンポーネントは、限定されず、本明細書に記載の任意のコンポーネントを含み得る。いくつかの実施形態では、コンポーネントは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及び／またはタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、コンポーネントは、メディエーター、ＭＥＤ１、ＭＥＤ１５、ＧＣＮ４、ｐ３００、ＢＲＤ４、β－カテニン、ＳＴＡＴ３、ＳＭＡＤ３、ＮＦ－ｋＢ、ＭＥＣＰ２、ＭＢＤ１、ＭＢＤ２、ＭＢＤ３、ＭＢＤ４、ＨＰ１α、ＴＢＬ１Ｒ、ＨＤＡＣ３、ＳＭＲＴ、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ、ＳＲＳＦ２、ＳＲＲＭ１、ＳＲＳＦ１、核内受容体リガンド、またはＴＦＩＩＤを含む。いくつかの実施形態では、コンポーネントは、表Ｓ３に記載のメディエーターコンポーネントである。いくつかの実施形態では、コンポーネントは、本明細書に開示のＩＤＲを有する。いくつかの実施形態では、コンポーネントは、転写因子である。いくつかの実施形態では、転写因子は、活性化ドメインにＩＤＲを有する。いくつかの実施形態では、転写因子は、ＯＣＴ４、ｐ５３、ＭＹＣ、ＧＣＮ４、ＮＡＮＯＧ、ＭｙｏＤ、ＫＬＦ４、ＳＯＸファミリーの転写因子、ＧＡＴＡファミリーの転写因子、核内受容体、または融合発がん性転写因子である。いくつかの実施形態では、転写因子は、表Ｓ３に記載の転写因子の活性化ドメインを有する。いくつかの実施形態では、転写因子は、表Ｓ３に記載の転写因子のＩＤＲを有する。いくつかの実施形態では、転写因子は、表Ｓ３に記載のものである。いくつかの実施形態では、転写因子は、メディエーターコンポーネント（例えば、表Ｓ３に記載のメディエーターコンポーネント）と相互作用する転写因子である。
相分離における原理を使用することによる疾患関連タンパク質の隔離
がんを含めて、多くの疾患は、転写に関与する特定のタンパク質に依存し得る。例えば、Ｍｙｃ転写因子は、すべてのがんの大多数において過剰発現しており、それが乱れると、がん細胞の死及び分化が引き起こされる。Ｍｙｃは、合成ＭＥＤ１凝縮体に優先的に取り込まれることが示されている。したがって、外来性のペプチド、核酸、または小化学分子によって誘導される凝縮体形成を利用すれば、活性遺伝子のプロモーターにＭｙｃが通常位置する位置からＭｙｃを引き離して隔離することができる。凝縮体に取り込まれる能力を有する任意の疾患関連タンパク質に対しても、同様の方針を使用することができる。変異事象または融合事象が生じる疾患関連タンパク質は、変異バージョンを合成凝縮体に特異的に取り込まれせることができ、一方で野生型バージョンのみがそのまま残るのであれば、特に容易にこの手法の標的とすることが可能であろう。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のタンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、または他の凝縮体コンポーネントを隔離するために、本明細書に記載の方法を使用して凝縮体を形成または安定化させることができる。例えば、コンポーネントをＤＮＡに繋留し、凝縮体形成の核にすることによって、凝縮体を誘導して形成させることができる。適切な薬剤（例えば、外来性に添加されるタンパク質、ＤＮＡ、もしくはＲＮＡ）または適切なコンポーネントを本明細書に記載の細胞に添加することによっても、凝縮体を誘導して形成させることができる。いくつかの実施形態では、コンポーネントを凝縮体に隔離してコンポーネントへのアクセスを制限することによって第２の凝縮体が調節される。いくつかの実施形態では、隔離コンポーネントは、Ｍｙｃである。いくつかの実施形態では、隔離コンポーネントは、野生型タンパク質の変異バージョンである。いくつかの実施形態では、野生型タンパク質は、隔離されない。いくつかの実施形態では、隔離コンポーネントは、病状において過剰発現するコンポーネントである。いくつかの実施形態では、コンポーネントを隔離することによって病状が治療される。隔離コンポーネントは、限定されず、本明細書に記載の凝縮体の任意のコンポーネント（例えば、メディエーター、ＭＥＤ１、ＭＥＤ１５、ＧＣＮ４、ｐ３００、ＢＲＤ４、核内受容体リガンド、及びＴＦＩＩＤ）であり得る。いくつかの実施形態では、隔離コンポーネントは、転写因子またはその一部（例えば、活性化ドメイン）である。いくつかの実施形態では、転写因子は、活性化ドメインにＩＤＲを有する。いくつかの実施形態では、転写因子は、ＯＣＴ４、ｐ５３、ＭＹＣ、ＧＣＮ４、ＮＡＮＯＧ、ＭｙｏＤ、ＫＬＦ４、ＳＯＸファミリーの転写因子、ＧＡＴＡファミリーの転写因子、核内受容体、または融合発がん性転写因子である。いくつかの実施形態では、転写因子は、表Ｓ３に記載の転写因子の活性化ドメインを有する。いくつかの実施形態では、転写因子は、表Ｓ３に記載の転写因子のＩＤＲを有する。いくつかの実施形態では、転写因子は、表Ｓ３に記載のものである。いくつかの実施形態では、転写因子は、メディエーターコンポーネント（例えば、表Ｓ３に記載のメディエーターコンポーネント）と相互作用する転写因子である。
非コードＲＮＡは、少なくともいくつかの転写凝縮体の重要なコンポーネントである。
凝縮体の多くが、ＲＮＡコンポーネントを有する（Ｂａｎａｎｉ，Ｓ．Ｆ．，Ｌｅｅ，Ｈ．Ｏ．，Ｈｙｍａｎ，Ａ．Ａ．，ａｎｄ Ｒｏｓｅｎ，Ｍ．Ｋ．（２０１７）．Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｏｎｄｅｎｓａｔｅｓ：ｏｒｇａｎｉｚｅｒｓ ｏｆ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１８，２８５－２９８．）。遺伝子制御エレメントは、例外的に高いレベルの非コードＲＮＡを生じさせる（Ｌｉ，Ｗ．，Ｎｏｔａｎｉ，Ｄ．，ａｎｄ Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ，Ｍ．Ｇ．（２０１６）．Ｅｎｈａｎｃｅｒｓ ａｓ ｎｏｎ－ｃｏｄｉｎｇ ＲＮＡ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｕｎｉｔｓ：ｒｅｃｅｎｔ ｉｎｓｉｇｈｔｓ ａｎｄ ｆｕｔｕｒｅ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１７，２０７－２２３．）。しかしながら、こうしたＲＮＡの生物学的機能は理解されてない。さらには、転写因子及び補助因子の多くが、ＲＮＡと相互作用し得る（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。本発明者らは、いくつかの転写凝縮体の形成及び維持が非コードＲＮＡに依存することを提唱する。転写凝縮体内のこうした非コードＲＮＡコンポーネントを直接的に標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド、ＲＮａｓｅ（ＲＮＡを分解する酵素）、または化合物は、健康な細胞及び疾患細胞における転写凝縮体の崩壊を誘発し得る。
いくつかの実施形態では、転写凝縮体は、転写凝縮体と結び付くｎｃＲＮＡのレベルまたは活性を調節することによって調節される。ｎｃＲＮＡのレベルまたは活性を調節することは、任意の適切な方法によって実施され得る。いくつかの実施形態では、ｎｃＲＮＡのレベルまたは活性を調節することは、本明細書に記載の方法（例えば、ＲＮＡｉを使用するもの）によって実施され得る。いくつかの実施形態では、ｎｃＲＮＡのレベルまたは活性は、ｎｃＲＮＡを、ｎｃＲＮＡに結合するアンチセンスオリゴヌクレオチド、ＲＮａｓｅ、または小分子と接触させることによって調節される。
スクリーニングの方法
本開示の態様のいくつかは、凝縮体（例えば、転写凝縮体、ヘテロクロマチン凝縮体、ｍＲＮＡ開始複合体またはｍＲＮＡ伸長複合体と結び付く凝縮体）を修飾することが可能な本明細書で定義される薬剤をスクリーニングする方法を対象とする。
凝縮体を修飾する治療剤をスクリーニングするためのインビボアッセイ
本開示の態様のいくつかは、凝縮体（例えば、転写凝縮体）の形成、安定性、または形態を調節する薬剤を同定する方法を対象とし、この方法は、凝縮体を有する細胞を提供すること、細胞を試験薬剤と接触させること、及び試験薬剤との接触によって凝縮体の形成、安定性、または形態が調節されるかどうかを決定すること、を含む。いくつかの実施形態では、凝縮体は、検出可能なタグを有し、検出可能なタグは、試験薬剤との接触によって凝縮体の形成、安定性、または形態が調節されるかどうかを決定するために使用される。いくつかの実施形態では、細胞は、検出可能なタグを発現するように遺伝子操作される。本明細書で使用される「検出可能なタグ」または「検出可能な標識」という用語は、限定されないが、検出可能な標識（フルオロフォア、放射性同位体、発色基質、または酵素など）、それに対する特異的抗体が市販されている異種エピトープ（例えば、ＦＬＡＧタグ）、市販の結合タンパク質に対するリガンドである異種アミノ酸配列（例えば、Ｓｔｒｅｐタグ、ビオチン）、典型的には他のポリペプチドに対する蛍光タグと併用される蛍光消光剤、ならびに相補的な生物発光ポリペプチド断片または蛍光ポリペプチド断片を含む。検出可能な標識、または相補的な生物発光ポリペプチド断片もしくは蛍光ポリペプチド断片であるタグは、直接的に測定され得る（この測定は、例えば、適切な基質もしくは酵素の蛍光もしくは放射能を測定するか、または適切な基質もしくは酵素と共にインキュベートすることで、関連ポリペプチドと非関連ポリペプチドとで比較できるように、分光光度法で検出可能な色の変化を生じさせることによって行われる）。異種エピトープまたは異種リガンドであるタグは、典型的には、それに結合する第２のコンポーネント（例えば、抗体または結合タンパク質）を用いて検出され、第２のコンポーネントは、検出可能な標識と結び付く。
いくつかの態様では、方法は、凝縮体コンポーネントを有する細胞、細胞を試験薬剤と接触させること、及び試験薬剤との接触によって、コンポーネント（例えば、異型の凝縮体を形成するもの、同型の凝縮体を形成するもの）を含む凝縮体の形成または活性が調節されるかどうかを決定すること、を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の凝縮体コンポーネントは、検出可能な標識を含む。いくつかの実施形態では、凝縮体コンポーネントは、凝縮体を形成することになり、試験薬剤は、凝縮体形成の調節（例えば、凝縮体形成または凝縮体形成率の増加または減少）についてスクリーニングされることになる。いくつかの実施形態では、凝縮体コンポーネントは、凝縮体を形成することはなく、試験薬剤は、凝縮体の形成を誘発するかどうかが分かるようにスクリーニングされることになる。いくつかの実施形態では、凝縮体コンポーネントは、ＭＥＤ１（またはその断片）と、ＥＲまたはその断片（例えば、変異ＥＲ（例えば、本明細書に記載のもの））と、を含み、変異ＥＲは、例えば、ＭＥＤ１を含む凝縮体へとタモキシフェンの存在下で取り込まれることが可能な変異ＥＲである。
いくつかの実施形態では、「決定すること」は、対照または参照と比較して物理的特性を測定することを含む。例えば、凝縮体の安定性が調節されるかどうかを決定することは、試験条件または試験薬剤に供されない対照凝縮体と比較して凝縮体が存在する時間を測定することを含み得る。凝縮体の形状が調節されるかどうかを決定することは、試験条件または試験薬剤に供されない対照凝縮体と比較して凝縮体の形状を比較することを含み得る。いくつかの実施形態では、凝縮体が有する１つ以上の特性は、それが統計的に有意な変化量（例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、またはそれを超える％）を伴って調節されるかどうかが「決定」され得る。
いくつかの実施形態では、検出可能なタグは、蛍光タグ（例えば、ｔｄＴｏｍａｔｏ）である。いくつかの実施形態では、検出可能なタグは、本明細書に記載の凝縮体コンポーネントに付加される。いくつかの実施形態では、コンポーネントは、ＯＣＴ４、ｐ５３、ＭＹＣ、ＧＣＮ４、メディエーター、メディエーターコンポーネント、ＭＥＤ１、ＭＥＤ１５、ｐ３００、ＢＲＤ４、ＮＡＮＯＧ、ＭｙｏＤ、ＫＬＦ４、ＳＯＸファミリーの転写因子、ＧＡＴＡファミリーの転写因子、核内受容体、核内受容体リガンド、融合発がん性転写因子、ＴＦＩＩＤ、シグナル伝達因子、メチルＤＮＡ結合タンパク質、スプライシング因子、遺伝子サイレンシング因子、ＲＮＡポリメラーゼ、β－カテニン、ＳＴＡＴ３、ＳＭＡＤ３、ＮＦ－ＫＢ、ＭＥＣＰ２、ＭＢＤ１、ＭＢＤ２、ＭＢＤ３、ＭＢＤ４、ＨＰ１α、ＴＢＬ１Ｒ、ＨＤＡＣ３、ＳＭＲＴ、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ、ＳＲＳＦ２、ＳＲＲＭ１、ＳＲＳＦ１、及び天然変性領域（ＩＤＲ）を含むそれらの断片から選択される。
いくつかの実施形態では、試験薬剤との接触によって凝縮体の形成、安定性、または形態が調節されるかどうかを決定するために、凝縮体に選択的に結合する抗体が使用される。いくつかの実施形態では、抗体は、本明細書に記載の凝縮体コンポーネントに結合する。いくつかの実施形態では、コンポーネントは、メディエーター、ＭＥＤ１、ＭＥＤ１５、ＧＣＮ４、ｐ３００、ＢＲＤ４、核内受容体リガンド、及びＴＦＩＩＤ、または表Ｓ３に示されるか、もしくは本明細書に記載されるメディエーターコンポーネントもしくは転写因子から選択される。いくつかの実施形態では、コンポーネントは、本明細書に記載の核内受容体またはその断片である。いくつかの実施形態では、コンポーネントは、ＯＣＴ４、ｐ５３、ＭＹＣ、ＧＣＮ４、メディエーター、メディエーターコンポーネント、ＭＥＤ１、ＭＥＤ１５、ｐ３００、ＢＲＤ４、ＮＡＮＯＧ、ＭｙｏＤ、ＫＬＦ４、ＳＯＸファミリーの転写因子、ＧＡＴＡファミリーの転写因子、核内受容体、核内受容体リガンド、融合発がん性転写因子、ＴＦＩＩＤ、シグナル伝達因子、メチルＤＮＡ結合タンパク質、スプライシング因子、遺伝子サイレンシング因子、ＲＮＡポリメラーゼ、β－カテニン、ＳＴＡＴ３、ＳＭＡＤ３、ＮＦ－ＫＢ、ＭＥＣＰ２、ＭＢＤ１、ＭＢＤ２、ＭＢＤ３、ＭＢＤ４、ＨＰ１α、ＴＢＬ１Ｒ、ＨＤＡＣ３、ＳＭＲＴ、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ、ＳＲＳＦ２、ＳＲＲＭ１、ＳＲＳＦ１、及び天然変性領域（ＩＤＲ）を含むそれらの断片から選択される。
当該技術分野で知られる方法及び本明細書に教示される方法を含めて、試験薬剤による凝縮体の調節の検出する任意の適切な方法を使用することができる。いくつかの実施形態では、試験薬剤との接触によって凝縮体の形成、安定性、または形態が調節されるかどうかを決定するステップは、顕微鏡法を使用して実施され、こうした顕微鏡法は、限定されない。いくつかの実施形態では、顕微鏡法は、デコンボリューション顕微鏡法、構造化照明顕微鏡法、または干渉顕微鏡法である。いくつかの実施形態では、試験薬剤との接触によって凝縮体の形成、安定性、または形態が調節されるかどうかを決定するステップは、ＤＮＡ－ＦＩＳＨ、ＲＮＡ－ＦＩＳＨ、またはそれらの組み合わせを使用して実施される。
凝縮体を有する細胞の型は、限定されず、本明細書に開示の任意の細胞型であり得る。いくつかの実施形態では、細胞は、疾患を発症しているもの（例えば、がん細胞）である。いくつかの実施形態では、凝縮体を有する細胞は、初代細胞、細胞株のメンバー、疾患を患う対象から単離された細胞、または疾患を患う対象から単離された細胞に由来する細胞（例えば、疾患を患う対象から単離された、人工多能性細胞とする前の細胞）である。
いくつかの実施形態では、細胞は、エストロゲン介在性の遺伝子活性化に対して応答性である。いくつかの実施形態では、細胞は、核内受容体リガンド介在性の遺伝子活性化に対して応答性である。いくつかの実施形態では、細胞は、変異核内受容体を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、核内受容体（例えば、変異核内受容体）を発現するトランスジェニック細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、がん細胞（例えば、乳癌細胞）である。いくつかの実施形態では、細胞は、エストロゲンの存在下で試験薬剤と接触され、エストロゲン介在性の遺伝子活性化が評価される。いくつかの実施形態では、細胞は、標識を有するエストロゲン受容体を含み、凝縮体へのエストロゲン受容体の取り込みが試験薬剤の存在下で評価される。
いくつかの実施形態では、細胞は、エストロゲン介在性の遺伝子活性化に対してタモキシフェンの存在下で応答性である。いくつかの実施形態では、細胞は、がん細胞（例えば、乳癌細胞）である。いくつかの実施形態では、細胞は、エストロゲン及びタモキシフェンの存在下で試験薬剤と接触され、エストロゲン介在性の遺伝子活性化が評価される。いくつかの実施形態では、細胞は、標識を有するエストロゲン受容体を含み、凝縮体へのエストロゲン受容体の取り込みが試験薬剤の存在下で評価される。
いくつかの実施形態では、試験薬剤は、タモキシフェン類似体である。いくつかの実施形態では、試験薬剤は、タモキシフェン類似体ではない。
いくつかの実施形態では、凝縮体は、シグナル伝達因子を含む。いくつかの実施形態では、インビトロ凝縮体は、シグナル伝達因子、または遺伝子の転写の活性化に必要なＩＤＲを含むその断片を含む。いくつかの実施形態では、シグナル伝達因子は、発がん性のシグナル伝達経路と結び付く。
いくつかの実施形態では、凝縮体は、メチルＤＮＡ結合タンパク質もしくはＣ末端ＩＤＲを含むその断片、またはサプレッサーもしくはＩＤＲを含むその断片を含む。いくつかの実施形態では、凝縮体は、メチル化ＤＮＡまたはヘテロクロマチンと結び付く。いくつかの実施形態では、凝縮体は、レベルまたは活性が異常なメチルＤＮＡ結合タンパク質（例えば、参照レベルと比較してレベルが上昇または低下しているもの）を含む。いくつかの実施形態では、凝縮体と結び付く遺伝子の、薬剤によるサイレンシングが評価される。いくつかの実施形態では、凝縮体は、スプライシング因子もしくはＩＤＲを含むその断片、またはＲＮＡポリメラーゼもしくはＩＤＲを含むその断片を含む。
いくつかの実施形態では、凝縮体は、転写の開始複合体または伸長複合体と結び付く。いくつかの実施形態では、凝縮体は、サイクリン依存性キナーゼと接触される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ＰｏｌＩＩ）である。いくつかの実施形態では、薬剤との接触によって生じる、凝縮体と結び付くＲＮＡ転写開始活性の変化が評価される。いくつかの実施形態では、薬剤との接触によって生じる、凝縮体と結び付くＲＮＡ伸長活性またはＲＮＡスプライシング活性の変化が評価される。
凝縮体を修飾する薬剤（例えば、治療剤）をスクリーニングするためのインビトロアッセイ
凝縮体は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、及びタンパク質から構成される液滴をインビトロで形成し得る。転写凝縮体コンポーネントもまた、１つ以上のタンパク質（例えば、ＴＦ、及び１つ以上のコアクチベーターまたは補助因子）を含む液滴をインビトロで形成し得る。そのような液滴は、ＲＮＡ及び／またはＤＮＡをさらに含み得る。そのような液滴は、インビトロ凝縮体であり、インビボに存在する凝縮体（例えば、転写凝縮体、ヘテロクロマチン凝縮体、ｍＲＮＡ開始複合体またはｍＲＮＡ伸長複合体と結び付く凝縮体、スプライシング因子を含む凝縮体）のモデルに相当し、及び／または当該モデルとして働き得る。こうした液滴は、測定可能な物理的特性（すなわち、サイズ、濃度、透過性、及び粘性）を有する。こうした物理的特性は、凝縮体がレポーター遺伝子をインビボで活性化する能力と相関し得る。小分子、ペプチド、ＲＮＡオリゴ、またはＤＮＡオリゴのライブラリーが液滴の任意の物理的特性に与える作用を測定することができる。さらに、液滴特性を調節する分子が遺伝子発現に与える作用について、細胞ベースのレポーターを使用してアッセイすることができる。こうした凝縮体から個々のコンポーネントを取り払うと、当該凝縮体が非機能性（すなわち、生産的な転写を行う能力を有さない状態）となり得る。さらに、新規のコンポーネントを現存凝縮体に取り込ませると、現存凝縮体の出力が修飾されるか、弱まるか、または増幅され得る。したがって、既存凝縮体にコンポーネントを追加するか、または既存凝縮体からコンポーネントを除去することが望ましくあり得る。それ故に、いくつかの実施形態では、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質に結合し、転写凝縮体、ヘテロクロマチン凝縮体、またはｍＲＮＡ開始複合体もしくはｍＲＮＡ伸長複合体と物理的に結び付く凝縮体へとコンポーネントを誘導する小分子が単離されるようにスクリーニングが実施され得る。他の実施形態では、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質に結合し、凝縮体へのコンポーネントの取り込みを阻止する小分子が単離されるようにスクリーニングが実施され得る。他の実施形態では、設計、発現、または導入される小分子、タンパク質、ＲＮＡ、タンパク質、またはＤＮＡの中で、現存凝縮体に取り込まれるものが単離されるようにスクリーニングが実施され得る。他の実施形態では、設計、発現、または導入される小分子、タンパク質、ＲＮＡ、タンパク質、またはＤＮＡの中で、別のコンポーネントを現存凝縮体に取り込ませるものが単離されるようにスクリーニングが実施され得る。他の実施形態では、設計、発現、または導入される小分子、タンパク質、ＲＮＡ、またはＤＮＡの中で、転写凝縮体、ヘテロクロマチン凝縮体、またはｍＲＮＡ開始複合体もしくはｍＲＮＡ伸長複合体と物理的に結び付く凝縮体、へのコンポーネントの移行を阻止するものが単離されるようにスクリーニングが実施され得る。他の実施形態では、設計、発現、または導入される小分子、タンパク質、ＲＮＡ、またはＤＮＡの中で、１つ以上のコンポーネントが凝縮体を形成することを阻止するか、またはその可能性を低減するものが単離されるようにスクリーニングが実施され得る。
本開示の態様のいくつかは、凝縮体の形成、安定性、または形態を調節する薬剤を同定する方法を対象とし、この方法は、インビトロ凝縮体を提供し、インビトロ凝縮体の１つ以上の物理的特性を評価すること、インビトロ凝縮体を試験薬剤と接触させること、及びインビトロ凝縮体の１つ以上の物理的特性が試験薬剤によって変化するかどうかを評価すること、を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の物理的特性は、インビトロ凝縮体が細胞において遺伝子の発現を生じさせる能力と相関する。いくつかの実施形態では、１つ以上の物理的特性は、インビトロ凝縮体のサイズ、濃度、透過性、形態、または粘性を含む。１つ以上の物理的特性を測定するために、当該技術分野で知られる任意の適切な方法を使用することができる。
本開示の態様のいくつかは、凝縮体形成を調節する薬剤を同定する方法を対象とする。いくつかの実施形態では、方法は、１つ以上の凝縮体コンポーネントまたはその断片（例えば、本明細書に記載の任意の凝縮体コンポーネント、ＩＤＲを有する任意の凝縮体コンポーネント、メディエーターまたはそのサブユニット（例えば、ＭＥＤ１）、転写因子）を含む組成物を提供すること、組成物を試験薬剤と接触させること、及び凝縮体コンポーネント（複数可）を含む凝縮体の形成が試験薬剤によって調節されるかどうか、または凝縮体コンポーネント（複数可）によって形成される凝縮体の１つ以上の特性が試験薬剤によって調節されるかどうか（例えば、安定性、機能、活性、形態が増加もしくは減少するかどうか）を決定すること、を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の凝縮体コンポーネントは、検出可能な標識を含む。コンポーネントを提供し、それらのコンポーネントを容器において混合し、凝縮体形成に関して生じることを観測し、及び／または得られた凝縮体の特性（複数可）を測定（例えば、安定性、機能、活性、形態の増加もしくは減少の測定）することができる。いくつかの実施形態では、提供される組成物は、凝縮体を形成することになり、試験薬剤は、形成の調節（例えば、凝縮体形成または凝縮体形成率の増加または減少）についてスクリーニングされることになる。いくつかの実施形態では、提供される組成物は、凝縮体を形成することはなく、試験薬剤は、凝縮体の形成を誘発するかどうかが分かるようにスクリーニングされることになる。いくつかの実施形態では、凝縮体コンポーネントは、１つ以上の補助因子（例えば、ＭＥＤ１またはその機能性断片）と、核内受容体（例えば、野生型核内受容体、変異核内受容体、疾患もしくは状態と結び付く変異核内受容体）またはその機能性断片と、を含む。いくつかの実施形態では、凝縮体コンポーネントは、ＭＥＤ１（またはその断片）と、ＥＲまたはその断片（例えば、変異ＥＲ（例えば、本明細書に記載のもの））と、を含み、変異ＥＲは、例えば、ＭＥＤ１を含む凝縮体へとタモキシフェンの存在下で取り込まれることが可能な変異ＥＲである。
いくつかの実施形態では、インビトロ凝縮体は、核内受容体リガンド介在性の遺伝子活性化に対して応答性である。いくつかの実施形態では、インビトロ凝縮体では、変異核内受容体介在性の遺伝子活性化が構成的に生じる。いくつかの実施形態では、インビトロ凝縮体は、エストロゲン介在性の遺伝子活性化に対して応答性である。いくつかの実施形態では、インビトロ凝縮体は、エストロゲンの存在下で試験薬剤と接触され、エストロゲン介在性の遺伝子活性化が評価される。いくつかの実施形態では、エストロゲン介在性の遺伝子活性化が試験薬剤の存在下で低減または除去されるのであれば、ＥＲ＋癌の治療のための候補抗がん剤として試験薬剤が同定される。いくつかの実施形態では、インビトロ凝縮体は、標識を有するエストロゲン受容体を含み、凝縮体へのエストロゲン受容体の取り込みが試験薬剤の存在下で評価される。いくつかの実施形態では、ＥＲの取り込みが試験薬剤の存在下で低減または除去されるのであれば、ＥＲ＋癌の治療のための候補抗がん剤として試験薬剤が同定される。
いくつかの実施形態では、インビトロ凝縮体は、エストロゲン介在性の遺伝子活性化に対してタモキシフェンの存在下で応答性であり（例えば、インビトロ凝縮体は、タモキシフェン抵抗性乳癌細胞から単離される）、凝縮体は、構成的活性を有する変異ＥＲ（例えば、本明細書に記載のもの）を含む。いくつかの実施形態では、インビトロ凝縮体は、エストロゲン及びタモキシフェンの存在下で試験薬剤と接触され、エストロゲン介在性の遺伝子活性化が評価される。いくつかの実施形態では、エストロゲン介在性の遺伝子活性化が試験薬剤の存在下で低減または除去されるのであれば、タモキシフェン抵抗性癌の治療のための候補抗がん剤として試験薬剤が同定される。いくつかの実施形態では、インビトロ凝縮体は、標識を有するエストロゲン受容体を含み、凝縮体へのエストロゲン受容体の取り込みが試験薬剤の存在下で評価される。いくつかの実施形態では、ＥＲの取り込みが試験薬剤の存在下で低減または除去されるのであれば、タモキシフェン抵抗性癌の治療のための候補抗がん剤として試験薬剤が同定される。
いくつかの実施形態では、試験薬剤は、タモキシフェン類似体である。いくつかの実施形態では、試験薬剤は、タモキシフェン類似体ではない。
試験薬剤には、限定されず、本明細書に開示の任意の薬剤が含まれる。いくつかの実施形態では、試験薬剤は、小分子、ペプチド、ＲＮＡ、またはＤＮＡである。
いくつかの実施形態では、インビトロ凝縮体は、本明細書に記載のコンポーネントを１つ以上含む。いくつかの実施形態では、インビトロ凝縮体は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及び／またはタンパク質のうちの１つ、２つ、または３つすべてをコンポーネントとして含む。いくつかの実施形態では、インビトロ凝縮体は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及びタンパク質をコンポーネントとして含む。いくつかの実施形態では、インビトロ凝縮体は、メディエーター、ＭＥＤ１、ＭＥＤ１５、ＧＣＮ４、ｐ３００、ＢＲＤ４、核内受容体リガンド、またはＴＦＩＩＤを含む。いくつかの実施形態では、インビトロ凝縮体は、ＯＣＴ４、ｐ５３、ＭＹＣ、ＧＣＮ４、メディエーター、メディエーターコンポーネント、ＭＥＤ１、ＭＥＤ１５、ｐ３００、ＢＲＤ４、ＮＡＮＯＧ、ＭｙｏＤ、ＫＬＦ４、ＳＯＸファミリーの転写因子、ＧＡＴＡファミリーの転写因子、核内受容体、核内受容体リガンド、融合発がん性転写因子、ＴＦＩＩＤ、シグナル伝達因子、メチルＤＮＡ結合タンパク質、スプライシング因子、遺伝子サイレンシング因子、ＲＮＡポリメラーゼ、β－カテニン、ＳＴＡＴ３、ＳＭＡＤ３、ＮＦ－ＫＢ、ＭＥＣＰ２、ＭＢＤ１、ＭＢＤ２、ＭＢＤ３、ＭＢＤ４、ＨＰ１α、ＴＢＬ１Ｒ、ＨＤＡＣ３、ＳＭＲＴ、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ、ＳＲＳＦ２、ＳＲＲＭ１、ＳＲＳＦ１、及び天然変性領域（ＩＤＲ）を含むそれらの断片を含む。いくつかの実施形態では、凝縮体は、単一のコンポーネントを含む（すなわち、同型のものである）。いくつかの実施形態では、インビトロ凝縮体は、異型のものであり、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれを超える数のクライアントコンポーネントまたは骨格コンポーネントを含む。いくつかの実施形態では、インビトロ凝縮体は、ＭＥＤ１５及びＧＣＮ４を含む。いくつかの実施形態では、インビトロ凝縮体は、本明細書に記載の核内受容体またはその断片を含む。いくつかの実施形態では、インビトロ凝縮体は、ＭＥＤ１及びＥＲを含む。いくつかの実施形態では、ＥＲは、変異ＥＲ（例えば、本明細書に記載の変異ＥＲ、構成的活性を有する変異ＥＲ、タモキシフェン抵抗性を付与する変異を有する変異ＥＲ）である。いくつかの実施形態では、凝縮体は、スプライシング因子及びＲＮＡポリメラーゼを含む。いくつかの実施形態では、凝縮体は、メチルＤＮＡ結合タンパク質（例えば、ＭｅＣＰ２）を含む。いくつかの実施形態では、凝縮体は、シグナル伝達因子を含む。
いくつかの実施形態では、インビトロ凝縮体は、本明細書に記載の検出可能なタグを複数含む。いくつかの実施形態では、検出可能なタグは、異なるコンポーネントに対する異なる蛍光タグを含む（例えば、１つの蛍光タグでＭＥＤ１５が標識され、異なる蛍光タグでＧＣＮ４または核内受容体もしくはその断片が標識される）。いくつかの実施形態では、凝縮体のコンポーネントの１つ以上は、消光剤を有する。
インビトロ凝縮体は、天然変性領域もしくは天然変性ドメイン、または天然変性領域もしくは天然変性ドメインを有するタンパク質も含み得る。ＩＤＲは、本明細書に記載の任意のものであるか、または当該技術分野で知られる方法（例えば、本明細書で言及される文献及びウェブサイトに記載のもの）によって得られる任意のものであり得る。いくつかの実施形態では、ＩＤＲは、表Ｓ２に示されるモチーフを有するＩＤＲである。いくつかの実施形態では、コンポーネントは、表Ｓ１に示されるものである。いくつかの実施形態では、天然変性領域または天然変性ドメインは、ＭＥＤ１、ＭＥＤ１５、ＧＣＮ４、またはＢＲＤ４の天然変性領域または天然変性ドメインである。いくつかの実施形態では、ＩＤＲは、ＯＣＴ４、ｐ５３、ＭＹＣ、ＧＣＮ４、メディエーター、メディエーターコンポーネント、ＭＥＤ１、ＭＥＤ１５、ｐ３００、ＢＲＤ４、ＮＡＮＯＧ、ＭｙｏＤ、ＫＬＦ４、ＳＯＸファミリーの転写因子、ＧＡＴＡファミリーの転写因子、核内受容体、核内受容体リガンド、融合発がん性転写因子、ＴＦＩＩＤ、シグナル伝達因子、メチルＤＮＡ結合タンパク質、スプライシング因子、遺伝子サイレンシング因子、ＲＮＡポリメラーゼ、β－カテニン、ＳＴＡＴ３、ＳＭＡＤ３、ＮＦ－ＫＢ、ＭＥＣＰ２、ＭＢＤ１、ＭＢＤ２、ＭＢＤ３、ＭＢＤ４、ＨＰ１α、ＴＢＬ１Ｒ、ＨＤＡＣ３、ＳＭＲＴ、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ、ＳＲＳＦ２、ＳＲＲＭ１、またはＳＲＳＦ１のＩＤＲに由来するＩＤＲまたはその一部を含む。いくつかの実施形態では、インビトロ凝縮体は、ＩＤＲの一部を含み得る。例えば、凝縮体は、タンパク質（例えば、インビボ転写凝縮体と結び付くタンパク質）のＩＤＲの少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、またはそれを超える％を含み得る。いくつかの実施形態では、インビトロ凝縮体は、ＩＤＲの少なくとも約２０アミノ酸部分、少なくとも約３０アミノ酸部分、少なくとも約４０アミノ酸部分、少なくとも約５０アミノ酸部分、少なくとも約６０アミノ酸部分、少なくとも約７５アミノ酸部分、少なくとも約１００アミノ酸部分、少なくとも約１５０アミノ酸部分、少なくとも約２００アミノ酸部分、少なくとも約２５０アミノ酸部分、または少なくとも約３００アミノ酸部分を含み得る。
いくつかの実施形態では、インビトロ凝縮体は、シグナル伝達因子またはその断片を含む。いくつかの実施形態では、インビトロ凝縮体は、シグナル伝達因子、または遺伝子の転写の活性化に必要なＩＤＲを含むその断片を含む。いくつかの実施形態では、シグナル伝達因子は、発がん性のシグナル伝達経路と結び付く。
いくつかの実施形態では、凝縮体は、メチルＤＮＡ結合タンパク質もしくはＣ末端ＩＤＲを含むその断片、またはサプレッサーもしくはＩＤＲを含むその断片を含む。いくつかの実施形態では、凝縮体は、メチル化ＤＮＡまたはヘテロクロマチンと結び付く。いくつかの実施形態では、凝縮体は、レベルまたは活性が異常なメチルＤＮＡ結合タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、凝縮体と結び付く遺伝子の、薬剤によるサイレンシングが評価される。いくつかの実施形態では、凝縮体は、スプライシング因子もしくはＩＤＲを含むその断片、またはＲＮＡポリメラーゼもしくはＩＤＲを含むその断片を含む。
いくつかの実施形態では、凝縮体は、転写の開始複合体または伸長複合体と結び付く。いくつかの実施形態では、凝縮体は、サイクリン依存性キナーゼと接触される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ＰｏｌＩＩ）である。いくつかの実施形態では、薬剤との接触によって生じる、凝縮体と結び付くＲＮＡ転写開始活性の変化が評価される。いくつかの実施形態では、薬剤との接触によって生じる、凝縮体と結び付くＲＮＡ伸長活性またはＲＮＡスプライシング活性の変化が評価される。
いくつかの実施形態では、インビトロ凝縮体は、弱いタンパク質間相互作用によって形成される。いくつかの実施形態では、弱いタンパク質間相互作用は、ＩＤＲ間相互作用またはＩＤＲの一部分間相互作用を含む。
いくつかの実施形態では、インビトロ凝縮体は、（天然変性ドメイン）－（誘導性オリゴマー化ドメイン）融合タンパク質を含む。誘導性オリゴマー化ドメインもまた、限定されない。いくつかの実施形態では、誘導性オリゴマー化ドメインは、電磁波照射（例えば、可視光）または薬剤（例えば、小分子）に反応してオリゴマー化する。誘導性オリゴマー化ドメインの例としては、ＦＫ５０６結合タンパク質のＦＫ５０６結合ドメイン、及びシクロフィリンのシクロスポリン結合ドメイン、ならびにＦＲＡＰのラパマイシン結合ドメインが挙げられる。いくつかの実施形態では、誘導性オリゴマー化ドメインは、Ｃｒｙタンパク質（例えば、Ｃｒｙ２）である。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、天然変性ドメイン－Ｃｒｙ２融合タンパク質である。本明細書で使用される「ＣＲＹ」は、クリプト－クロム（クリプトクロム）タンパク質を指し、典型的には、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａのＣＲＹ２（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＭ＿１００３２０）である。光誘導性のオリゴマー化にＣｒｙ２を使用する方法については、Ｃｈｅ，ｅｔ ａｌ，“Ｔｈｅ Ｄｕａｌ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ Ｌｉｇｈｔ－Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｃｒｙｐｔｏｃｈｒｏｍｅ ２，Ｈｏｍｏ－ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ，ｆｏｒ Ｏｐｔｏｇｅｎｅｔｉｃ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ，”ＡＣＳ Ｓｙｎｔｈ Ｂｉｏｌ．２０１５ Ｏｃｔ １６；４（１０）：１１２４－１１３５、及びＤｕａｎ，ｅｔ ａｌ．，“Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ ＣＲＹ２ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｏｐｔｉｃａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，”Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，ｖｏｌ．８：５４７（２０１７）に教示されており、これらの文献は、参照によって本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、誘導性オリゴマー化ドメインは、小分子、タンパク質、または核酸によって誘導される。いくつかの実施形態では、誘導性オリゴマー化ドメインは、可視光（例えば、青色光）によって誘導される。
ＩＤＲは、限定されず、本明細書に記載または言及される任意のものであり得る。いくつかの実施形態では、ＩＤＲは、表Ｓ２に示されるモチーフを有する。いくつかの実施形態では、天然変性ドメインは、ＭＥＤ１、ＭＥＤ１５、ＧＣＮ４、またはＢＲＤ４の天然変性ドメインである。いくつかの実施形態では、ＩＤＲは、表Ｓ３に記載の転写因子のＩＤＲである。いくつかの実施形態では、ＩＤＲは、核内受容体活性化ドメインのＩＤＲである。いくつかの実施形態では、ＩＤＲは、核内受容体活性化ドメインのＩＤＲであり、核内受容体は、疾患と結び付く変異を有する。
いくつかの実施形態では、インビトロ凝縮体は、細胞に見られる転写凝縮体を模倣する。
いくつかの実施形態では、インビトロ転写凝縮体、インビトロヘテロクロマチン凝縮体、またはｍＲＮＡ開始複合体もしくはｍＲＮＡ伸長複合体と物理的に結び付くインビトロ凝縮体は、単離される。任意の適切な単離手段が本明細書に包含される。いくつかの実施形態では、インビトロ凝縮体は、化学的または免疫学的に沈降される。いくつかの実施形態では、インビトロ凝縮体は、遠心分離（例えば、約５，０００×ｇ、約１０，０００×ｇ、約１５，０００×ｇで約５～１５分間行うもの、約１０．０００×ｇで約１０分間行うもの）によって単離される。
いくつかの実施形態では、インビトロ凝縮体は、細胞から単離された、転写凝縮体、ヘテロクロマチン凝縮体、またはｍＲＮＡ開始複合体もしくはｍＲＮＡ伸長複合体と物理的に結び付く凝縮体である。凝縮体を単離するために、当該技術分野で知られる任意の適切な方法を使用することができる。例えば、凝縮体の単離は、適切な緩衝条件の下でホモジナイザー（すなわち、ダウンス型ホモジナイザー）を用いて細胞の核を溶解した後、遠心分離及び／またはろ過して凝縮体を分離することによって実施できる。
本開示の態様のいくつかは、凝縮体の凝縮体形成、凝縮体安定性、凝縮体機能、または凝縮体形態を調節する薬剤を同定する方法を対象とし、この方法は、転写凝縮体依存的にレポーター遺伝子を発現する細胞を提供すること、細胞を試験薬剤と接触させること、及びレポーター遺伝子の発現を評価すること、を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、試験薬剤との接触する前はレポーター遺伝子を発現せず、凝縮体の形成、安定性、機能、または形態を増進する薬剤と接触した後にレポーター遺伝子を発現する。いくつかの実施形態では、細胞は、試験薬剤と接触する前はレポーター遺伝子を発現し、凝縮体の形成、安定性、機能、または形態を抑制するか、劣化させるか、または阻止する薬剤と接触した後にレポーター遺伝子の発現を停止するか、または減少させる。
いくつかの実施形態では、凝縮体の形成、安定性、機能、または形態を調節する薬剤を同定する方法は、転写因子の制御下でレポーター遺伝子を発現する細胞もしくはインビトロ転写アッセイを提供すること（または当該インビトロアッセイ及び当該細胞の両方を提供すること）、細胞またはアッセイを試験薬剤と接触させること、ならびにレポーター遺伝子の発現を評価すること、を含む。いくつかの実施形態では、ＴＦは、異種のＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）及び活性化ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＴＦは、哺乳類ＴＦ、本明細書に記載のＴＦ、もしくは変異哺乳類ＴＦの活性化ドメイン、または本明細書に記載のＴＦの変異ＴＦの活性化ドメインを含み得る。いくつかの実施形態では、ＴＦは、核内受容体（例えば、変異核内受容体、関連リガンドの結合に依存しない構成的活性を有する変異核内受容体、エストロゲン介在性の遺伝子活性化をタモキシフェンの存在下で生じさせる変異エストロゲン受容体、エストロゲンの非存在下で遺伝子活性化を生じさせる変異エストロゲン受容体）である。いくつかの実施形態では、変異ＴＦ活性化ドメインは、疾患または状態（例えば、本明細書に記載の疾患または状態）と結び付き得る。ＤＢＤは、限定されず、任意の適切なＤＢＤであり得る。いくつかの実施形態では、ＤＢＤは、ＧＡＬ４ ＤＢＤである。インビトロアッセイは、限定されず、当該技術分野で開示される任意のものであり得る。いくつかの実施形態では、インビトロアッセイは、Ｓａｂａｒｉ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１８ Ｊｕｌ ２７；３６１（６４００）に開示のインビトロ転写アッセイである。
本明細書に開示の薬剤を同定する方法の実施形態のいくつかでは、凝縮体は、核内受容体（例えば、野生型核内受容体、変異核内受容体、疾患もしくは状態と結び付く変異核内受容体、核内ホルモン受容体、関連リガンドの結合に依存しない構成的活性を有する変異核内ホルモン受容体）または活性化ドメインＩＤＲを含むその断片を含む。本明細書に記載の任意の核内受容体または断片を使用することができる。いくつかの実施形態では、核内受容体は、関連リガンドに結合すると転写を活性化する。いくつかの実施形態では、核内受容体は、リガンド結合に依存せずに転写を活性化する（例えば、リガンド非依存的となる変異を有する核内受容体、エストロゲン介在性の遺伝子活性化をタモキシフェンの存在下で生じさせる変異エストロゲン受容体、エストロゲンの非存在下で遺伝子活性化を生じさせる変異エストロゲン受容体）。いくつかの実施形態では、核内受容体は、核内ホルモン受容体である。いくつかの実施形態では、核内受容体は、変異を有する。いくつかの実施形態では、変異は、疾患または状態と結び付く。いくつかの実施形態では、疾患または状態は、がん（例えば、乳癌）である。本明細書に開示の薬剤を同定する方法の実施形態のいくつかでは、薬剤は、野生型核内受容体を含む凝縮体に対しても、疾患と結び付く変異を有する核内受容体を含む凝縮体に対しても、スクリーニングされる。いくつかの実施形態では、同定される薬剤は、野生型核内凝縮体と比較して、変異を有する核内受容体（例えば、変異を有する核内ホルモン受容体、変異を有するリガンド依存性核内受容体、エストロゲン介在性の遺伝子活性化をタモキシフェンの存在下で生じさせる変異エストロゲン受容体、エストロゲンの非存在下で遺伝子活性化を生じさせる変異エストロゲン受容体）に優先的に結合する。いくつかの実施形態では、同定される薬剤は、野生型核内受容体を含む凝縮体と比較して、変異を有する核内受容体（例えば、変異を有する核内ホルモン受容体、変異を有するリガンド依存性核内受容体、エストロゲン介在性の遺伝子活性化をタモキシフェンの存在下で生じさせる変異エストロゲン受容体、エストロゲンの非存在下で遺伝子活性化を生じさせる変異エストロゲン受容体）を含む転写凝縮体を優先的に破壊する。
いくつかの実施形態では、凝縮体の形成、安定性、機能、または形態を調節する本明細書に開示の方法によって同定される薬剤は、凝縮体の機能特性の１つ以上に対するその作用（例えば、凝縮体と結び付く１つ以上の遺伝子の転写を調節する能力）を評価するために、付加的または代替的に試験される。いくつかの実施形態では、凝縮体の形成、安定性、機能、または形態を調節する本明細書に開示の方法によって同定される薬剤は、疾患の特徴の１つ以上を調節するその能力についてさらに試験される。疾患は、限定されず、本明細書に開示の任意の疾患であり得る。例えば、発がん性変異ＴＦによる凝縮体形成を薬剤が阻害するのであれば、そのＴＦを含むがん細胞（例えば、生存能力及び／または増殖を維持することをそのＴＦに依存するがん細胞）の増殖を薬剤が阻害する能力が試験されることになる。
いくつかの実施形態では、凝縮体の構造特性（例えば、形成、安定性、もしくは形態）、または凝縮体の機能特性（例えば、転写の調節）の１つ以上を調節するものとして、本明細書に開示の方法によって同定される薬剤は、対象（例えば、疾患のモデルとして働く非ヒト動物、または疾患の治療が必要な対象）に投与され得る。いくつかの実施形態では、凝縮体の構造特性の１つ以上を調節するものとして同定される薬剤での治療が必要な対象は、本明細書に開示の方法によって同定され得る。
いくつかの実施形態では、凝縮体の構造特性（例えば、形成、安定性、機能、もしくは形態）、または凝縮体の機能特性（例えば、転写の調節）の１つ以上を調節するものとして、本明細書に開示の方法によって同定される薬剤の類似体が生成され得る。類似体を生成する方法は、当該技術分野で知られており、そうした方法には、本明細書に記載の方法が含まれる。いくつかの実施形態では、生成される類似体の目的特性を試験することができ、こうした目的特性は、安定性（例えば、水性媒体、ヒト血液、胃腸管などにおける安定性）の向上、生物学的利用率の向上、対象への投与時の半減期の長期化、細胞への取り込みの増加、凝縮体特性（凝縮体の構造特性（例えば、形成、安定性、機能、もしくは形態）または凝縮体の機能特性（例えば、転写の調節）を含む）を調節する活性の上昇、野生型コンポーネントまたは変異コンポーネント（例えば、変異ＴＦ、変異ＮＲ）を含む凝縮体に対する特異性の向上、本明細書に開示の細胞型に対する特異性の向上などである。
いくつかの実施形態では、ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）が実施される。ハイスループットスクリーニングでは、無細胞アッセイまたは細胞ベースのアッセイ（例えば、本明細書に記載の凝縮体含有細胞、インビトロ凝縮体、単離されたインビトロ凝縮体）を利用することができる。ハイスループットスクリーニングは、多数の化合物を高効率で（例えば、並行して）試験するものであることが多い。例えば、数万または数十万もの化合物を短い時間（例えば、数時間～数日）で決められた通りにスクリーニングすることができる。多くの場合、そのようなスクリーニングは、少なくとも９６個のウェルを含むマルチウェルプレートにおいて実施されるか、または物理的に別々に分かれた複数の空洞もしくは窪みが基物に存在する他の容器において実施される。ハイスループットスクリーニングは、自動化して行うことが多く、例えば、液体の取り扱い、画像化、データの取得及び処理などが自動化される。本発明のＨＴＳの実施形態に適用され得るある特定の一般的な原理及び手法については、Ｍａｃａｒｒｏｎ Ｒ ＆ Ｈｅｒｔｚｂｅｒｇ ＲＰ．Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｉｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ａｓｓａｙｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．，５６５：１－３２，２００９ 、及び／またはＡｎ ＷＦ ＆ Ｔｏｌｌｉｄａｙ ＮＪ．，Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ：ｃｅｌｌ－ｂａｓｅｄ ａｓｓａｙｓ ｆｏｒ ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．４８６：１－１２，２００９、及び／またはこれらの文献のいずれかで引用される参考文献に記載されている。Ｗｉｌｌｉａｍ Ｐ．ＪａｎｚｅｎによるＨｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）（２００２）、及びＪｏｒｇ ＨｖｓｅｒによるＨｉｇｈ－Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｉｎ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）（２００６）にも有用な方法が開示されている。
「ヒット」という用語は、一般に、スクリーニングまたはアッセイにおいて目的作用を達成する薬剤を指し、例えば、細胞生存、細胞増殖、遺伝子発現、タンパク質活性、またはスクリーニングもしくはアッセイにおいて測定される他の目的パラメーターに対する少なくとも所定レベルの調節作用を有する薬剤を指す。スクリーニングにおいてヒットとして同定される試験薬剤は、さらなる試験、開発、または修飾に向けて選択され得る。いくつかの実施形態では、試験薬剤は、同じアッセイまたは異なるアッセイを使用して再試験される。例えば、候補抗がん剤は、がん細胞の生存または増殖、腫瘍増殖などに対するその作用を決定するために、複数の異なるがん細胞株に対して試験されるか、またはインビボ腫瘍モデルにおいて試験され得る。必要に応じて、追加量の試験薬剤を合成するか、またはその他の方法で入手することができる。スクリーニングにおいて同定される化合物の物理化学的特性、薬物動態学的特性、及び／または薬力学的特性を１つ以上決定または予測するために、物理的試験または計算的手法を使用することができる。例えば、溶解性、吸収、分布、代謝、及び排出（ＡＤＭＥ）パラメーターを実験的に決定または予測することができる。そのような情報を使用することで、例えば、さらなる試験、開発、または修飾に向けてヒットを選択することができる。例えば、「薬物様」分子に特有の特徴を有する小分子を選択することができ、及び／または望ましくない特徴を１つ以上有する小分子を回避するか、または修飾してそのような望ましくない特徴（複数可）を低減もしくは除去することができる。
いくつかの実施形態では、ヒット化合物の構造を調べてファーマコフォアを同定し、同定したファーマコフォアを使用して追加化合物を設計することができる。追加化合物は、例えば、最初のヒットと比較して物理化学的特性、薬物動態学的特性（例えば、吸収、分布、代謝、及び／または排出）及び／または薬力学的特性が１つ以上改変（例えば、改善）されたものであり得るか、あるいは特性はほぼ同じであるが、構造が異なるものであり得る。改善される特性は、一般に、化合物の利便性を向上させる特性、または意図される使用の１つ以上に対する化合物の有用性を向上させる特性である。ヒット構造を経験的に修飾すること（例えば、関連構造を有する化合物を合成し、合成した化合物を無細胞アッセイもしくは細胞ベースのアッセイ、または非ヒト動物において試験すること）、及び／または計算的手法を使用すること、によって改善を達成することができる。そのような修飾を行うにあたっては、１つ以上の特性を予想通りに改変するために確立された医薬品化学の原理を利用することができる。いくつかの実施形態では、ヒット化合物の分子標的は、同定されるか、または既知のものである。いくつかの実施形態では、同じ分子標的に作用する化合物が経験的に追加同定されるか（例えば、化合物ライブラリーのスクリーニングを介して行われる）、または追加設計され得る。
薬剤を試験するか、またはスクリーニングを実施して得られるデータまたは結果は、保存されるか、または電子的に伝送され得る。そのような情報は、有形媒体に保存することができ、そうした有形媒体は、コンピューターで読み取り可能な媒体、紙などであり得る。いくつかの実施形態では、薬剤を同定または試験する方法は、試験薬剤が１つ以上の目的特性（複数可）を有することを示す情報、または試験薬剤が特定のスクリーニングにおける「ヒット」であることを示す情報、または試験薬剤を使用して達成される特定の結果を示す情報、を保存及び／または電子的に伝送することを含む。スクリーニングから得られるヒットのリストが作成され、保存または伝送され得る。ヒットは、活性、構造類似性、または他の特徴に基づいて順位付けされるか、または２つ以上の群に分類され得る。
候補薬剤が同定されると、当該候補薬剤に基づいて追加薬剤（例えば、類似体）を生成させることができる。追加薬剤では、例えば、がん細胞への取り込みを増加させるか、効力を向上させるか、安定性を向上させるか、溶解性を上昇させるか、または任意の特性を改善することができる。いくつかの実施形態では、薬剤の標識形態が生成される。標識薬剤を使用することで、例えば、細胞における分子標的に対する薬剤の結合が直接的に測定され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のように同定される薬剤の分子標的が同定され得る。薬剤は、分子標的を単離するための親和性試薬として使用され得る。分子標的を同定するためのアッセイ（例えば、質量分析などの方法を使用するもの）が実施され得る。分子標的が同定されると、その標的に対して特異的に作用する薬剤を同定するために、１つ以上のスクリーニングが追加で実施され得る。
さまざまな実施形態において、さまざまな薬剤のいずれも、試験薬剤として使用することができる。例えば、試験薬剤は、小分子、ポリペプチド、ペプチド、アミノ酸、核酸、オリゴヌクレオチド、脂質、糖質、またはハイブリッド分子であり得る。いくつかの実施形態では、試験薬剤として使用される核酸は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アプタマー、またはランダムオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、試験薬剤は、細胞透過性であるか、あるいはそれが細胞に移行することを可能にする形態で提供されるか、またはそのことを可能にする担体もしくはベクターと共に提供される。試験薬剤は、本明細書に記載の任意の薬剤であり得る。
薬剤は、天然源から得るか、または合成的に生成させることができる。薬剤は、少なくとも部分的に純粋であり得るか、または抽出物もしくは他の型の混合物に存在し得る。抽出物またはその画分は、例えば、植物、動物、微生物、海洋生物、発酵ブロス（例えば、土壌、細菌または真菌の発酵ブロス）などから得ることができる。いくつかの実施形態では、化合物コレクション（「ライブラリー」）が試験される。化合物ライブラリーは、天然物、及び／または非指向化合成有機化学もしくは指向化合成有機化学を使用して生成される化合物を含み得る。いくつかの実施形態では、ライブラリーは、小分子ライブラリー、ペプチドライブラリー、ペプトイドライブラリー、ｃＤＮＡライブラリー、オリゴヌクレオチドライブラリー、またはディスプレイライブラリー（例えば、ファージディスプレイライブラリー）である。いくつかの実施形態では、ライブラリーは、上述の型のうちの２つ以上の型の薬剤を含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドライブラリーにおけるオリゴヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アプタマー、またはランダムオリゴヌクレオチドを含む。
ライブラリーは、例えば、１００～５００，０００個の化合物、またはそれを超える数の化合物を含み得る。いくつかの実施形態では、ライブラリーは、少なくとも１０，０００個、少なくとも５０，０００個、少なくとも１００，０００個、または少なくとも２５０，０００個の化合物を含む。いくつかの実施形態では、化合物ライブラリーの化合物は、マルチウェルプレートにおいてアレイ化される。そうした化合物は、溶媒（例えば、ＤＭＳＯ）に溶解されるか、または乾燥形態（例えば、粉末もしくは固体）で提供され得る。合成化合物、半合成化合物、及び／または天然起源の化合物のコレクションが試験され得る。化合物ライブラリーは、構造的に関連する化合物、構造的に多様な化合物、または構造的に関連しない化合物を含み得る。化合物は、人工のもの（ヒトによって発明された構造を有し、天然に見られないもの）または天然起源のものであり得る。いくつかの実施形態では、化合物は、創薬プログラムにおいて「ヒット」もしくは「リード」として同定されているもの、及び／またはその類似体である。いくつかの実施形態では、ライブラリーは、的を絞ったものであり得る（例えば、同じコア構造を有する化合物、同じ前駆物質に由来する化合物、または少なくとも１つの生物学的を共有する化合物、から主に構成される）。化合物ライブラリーは、いくつかの商業的供給業者（Ｔｏｃｒｉｓ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ、Ｎａｎｏｓｙｎ、ＢｉｏＦｏｃｕｓなど）、及び政府機関（米国国立衛生研究所（ＮＩＨ）など）から利用可能である。いくつかの実施形態では、試験薬剤は、当該技術分野で知られるか、または使用される細胞培養培地（例えば、脊椎動物細胞（例えば、哺乳類細胞）の培養のためのもの）に見られる薬剤（例えば、細胞を培養する目的のために提供される薬剤）ではない。いくつかの実施形態では、薬剤が、当該技術分野で知られるか、または使用される細胞培養培地に見られる薬剤であるならば、そうした薬剤は、本明細書に記載の方法または組成物において試験薬剤として使用される場合、濃度を変えて（例えば、濃度を高めて）使用され得る。
核内受容体が関わるスクリーニングアッセイ
本開示の態様のいくつかは、凝縮体の形成、安定性、または形態を調節する試験薬剤を同定する方法に関し、この方法は、細胞を提供すること、細胞を試験薬剤と接触させること、及び試験薬剤との接触によって凝縮体の形成、安定性、または形態が調節されるかどうかを決定すること、を含み、凝縮体は、核内受容体（ＮＲ）またはその断片を凝縮体コンポーネントとして含む。核内受容体は、限定されず、本明細書に記載の任意の核内受容体であり得る。いくつかの実施形態では、核内受容体は、変異核内受容体（例えば、疾患と結び付く変異核内受容体、関連リガンドの結合に依存しない構成的活性（例えば、転写活性）を有する変異核内受容体）である。いくつかの実施形態では、核内受容体は、核内ホルモン受容体、エストロゲン受容体、またはレチノイン酸受容体－アルファである。いくつかの実施形態では、凝縮体は、補助因子（例えば、メディエーター、ＭＥＤ１）を凝縮体コンポーネントとしてさらに含む。凝縮体のコンポーネントは、本明細書に記載の任意の適切な凝縮体コンポーネントであり得る。いくつかの実施形態では、細胞は、凝縮体を含む。いくつかの実施形態では、薬剤は、細胞において凝縮体の形成を誘発する。
試験薬剤を同定する方法の実施形態のいくつかでは、凝縮体の形成、安定性、または形態を調節する薬剤は、（例えば、凝縮体の形成または安定性を低減するのであれば）候補治療剤（例えば、変異核内受容体によって特徴付けられる疾患、がん、またはシグナル伝達経路がそうした核内受容体を含むことによって特徴付けられる疾患、に対する治療剤）として同定される。いくつかの実施形態では、同定される薬剤は、本明細書に記載の任意の対応疾患または対応状態の治療候補であり得る。本明細書に記載の試験薬剤を同定する方法の実施形態のいくつかでは、変異核内受容体を含む凝縮体の形成または安定性を低減する薬剤は、変異ＮＲによって特徴付けられる疾患または状態を治療するための候補薬剤として同定される。本明細書に記載の試験薬剤を同定する方法の実施形態のいくつかでは、核内受容体（例えば、変異核内受容体）またはその断片を含む凝縮体の形成または安定性を低減する薬剤は、核内受容体の活性の候補調節剤として同定される。
試験薬剤を同定する方法の実施形態のいくつかでは、凝縮体を調節することで、標的遺伝子（例えば、ＭＹＣがん遺伝子、あるいは本明細書に記載されるか、またはがんの増殖もしくは生存能力に関与する他の遺伝子）の転写が低減または除去される。いくつかの実施形態では、標的遺伝子（例えば、ＭＹＣがん遺伝子）の転写が低減され、その低減率は、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、またはそれを超える％である。
いくつかの実施形態では、凝縮体は、検出可能な標識を含む。標識は、限定されず、本明細書に記載の任意の標識であり得る。いくつかの実施形態では、凝縮体のコンポーネントは、検出可能な標識を含む。いくつかの実施形態では、核内受容体またはその断片は、検出可能な標識を含む。
本発明の態様のいくつかは、凝縮体の形成、安定性、または形態を調節する薬剤を同定する方法に関し、この方法は、インビトロ凝縮体を提供すること、凝縮体を試験薬剤と接触させること、及び試験薬剤との接触によって凝縮体の形成、安定性、または形態が調節されるかどうかを決定すること、を含み、凝縮体は、核内受容体（ＮＲ）またはその断片を凝縮体コンポーネントとして含む。核内受容体は、限定されず、本明細書に記載の任意の核内受容体であり得る。いくつかの実施形態では、核内受容体は、変異核内受容体（例えば、疾患と結び付く変異核内受容体、関連リガンドの結合に依存しない構成的活性（例えば、転写活性）を有する変異核内受容体）である。いくつかの実施形態では、核内受容体は、核内ホルモン受容体、エストロゲン受容体、またはレチノイン酸受容体－アルファである。いくつかの実施形態では、凝縮体は、補助因子（例えば、メディエーター、ＭＥＤ１）を凝縮体コンポーネントとしてさらに含む。凝縮体のコンポーネントは、本明細書に記載の任意の適切な凝縮体コンポーネントであり得る。いくつかの実施形態では、凝縮体は、細胞から単離される。凝縮体の単離元である細胞は、任意の適切な細胞であり得る。いくつかの実施形態では、薬剤は、インビトロで凝縮体の形成を誘発する。
試験薬剤を同定する方法の実施形態のいくつかでは、インビトロ凝縮体の形成、安定性、または形態を調節する薬剤は、（例えば、凝縮体の形成または安定性を低減するのであれば）候補治療剤（例えば、変異核内受容体によって特徴付けられる疾患、がん、またはシグナル伝達経路がそうした核内受容体を含むことによって特徴付けられる疾患、に対する治療剤）として同定される。いくつかの実施形態では、同定される薬剤は、本明細書に記載の任意の対応疾患または対応状態の治療候補であり得る。本明細書に記載の試験薬剤を同定する方法の実施形態のいくつかでは、変異核内受容体を含むインビトロ凝縮体の形成または安定性を低減する薬剤は、変異ＮＲによって特徴付けられる疾患または状態を治療するための候補薬剤として同定される。本明細書に記載の試験薬剤を同定する方法の実施形態のいくつかでは、核内受容体（例えば、変異核内受容体）またはその断片を含むインビトロ凝縮体の形成または安定性を低減する薬剤は、核内受容体の活性の候補調節剤として同定される。
いくつかの実施形態では、インビトロ凝縮体は、検出可能な標識を含む。標識は、限定されず、本明細書に記載の任意の標識であり得る。いくつかの実施形態では、凝縮体のコンポーネントは、検出可能な標識を含む。いくつかの実施形態では、核内受容体またはその断片は、検出可能な標識を含む。
疾患及び疾患の依存性
がん細胞は、転写依存に見られるように、ある特定の遺伝子の転写に高度に依存するようになり得、この転写は、特定の凝縮体に依存し得る。例えば、転写凝縮体は、腫瘍が依存するがん遺伝子に形成され得るものであり、この凝縮体は、本明細書に記載の薬剤（例えば、ペプチド、核酸、または小分子）によって標的とし得る特定のタンパク質モチーフ、ＲＮＡモチーフ、またはＤＮＡモチーフに特に依存し得る。本開示の実施形態のいくつかは、がん細胞における転写凝縮体を抑制、除去、または分解する抗がん剤を、本明細書に記載の方法を使用してスクリーニングすることを対象とする。本開示の実施形態のいくつかは、がん細胞におけるヘテロクロマチン凝縮体を調節する抗がん剤を、本明細書に記載の方法を使用してスクリーニングすることを対象とする。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法を使用することで、核内受容体（例えば、変異核内受容体、変異ホルモン受容体）を含む転写凝縮体の形成または安定性を低減する薬剤が同定される。
例えば、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法を使用することで、ＭＥＤ１及びＥＲを含む転写凝縮体の形成または安定性を低減する薬剤が同定される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法を使用することで、ＭＥＤ１と、タモキシフェンに抵抗性の変異ＥＲと、を含む転写凝縮体の形成または安定性を低減する薬剤が同定される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法を使用することで、ＭＥＤ１及びＥＲを含む転写凝縮体の形成または安定性を低減する薬剤（例えば、本明細書に記載のＳＥＲＭ活性を有する薬剤（例えば、ＥＲ＋乳癌に対して有効な候補薬剤））が同定される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法を使用することで、含有するＭＥＤ１のレベルが上昇している（例えば、タモキシフェン抵抗性ではないＥＲ＋乳癌細胞に由来する凝縮体と比較してＭＥＤ１のレベルが少なくとも４倍である）転写凝縮体の形成または安定性を低減する薬剤が同定される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法を使用することで、変異ＥＲ（例えば、本明細書に記載のもの）及びＭＥＤ１を含む転写凝縮体の形成または安定性を低減する薬剤が同定される。いくつかの実施形態では、同定される薬剤は、ＳＥＲＭ（タモキシフェン）抵抗性がん（例えば、乳癌）の発症を阻止するか、またはＳＥＲＭ（タモキシフェン）抵抗性がん（例えば、乳癌）を克服するための候補薬剤である。
疾患を生じさせ、転写を変化させてしまう変異またはエピジェネティック変化を保有する細胞は、特定の凝縮体に依存する。例えば、疾患は、１つ以上の疾患遺伝子における凝縮体の形成、組成、維持、崩壊、または制御によって生じ、それに依存し得る。本開示の実施形態のいくつかは、疾患と結び付く凝縮体を、本明細書に記載の方法を使用して調節することを対象とする。本開示の実施形態のいくつかは、疾患と結び付く凝縮体を調節し得る薬剤を、本明細書に記載の方法によってスクリーニングすることを対象とする。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の疾患または状態は、核内受容体と結び付く。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の疾患または状態は、核内受容体の変異または核内受容体の発現異常（例えば、参照レベルと比較したときのレベルの上昇もしくは低下）と結び付く。
凝縮体及び凝縮体コンポーネント組成物
本開示の態様のいくつかは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及びタンパク質のうちの１つ、２つ、または３つすべてを含む単離された合成凝縮体を対象とする。合成凝縮体は、本明細書に記載のコンポーネントのいずれも含み得る。いくつかの実施形態では、合成凝縮体は、本明細書に記載のＩＤＲ誘導性オリゴマー化ドメインを含み得る。いくつかの実施形態では、合成凝縮体は、メディエーター、ＭＥＤ１、ＭＥＤ１５、ｐ３００、ＢＲＤ４、核内受容体リガンド、またはＴＦＩＩＤを含み得る。いくつかの態様では、合成転写凝縮体は、転写因子（例えば、ＯＣＴ４、ｐ５３、ＭＹＣ、ＮＡＮＯＧ、ＭｙｏＤ、ＫＬＦ４、ＳＯＸファミリーの転写因子、ＧＡＴＡファミリーの転写因子、核内受容体、融合発がん性転写因子、またはＧＣＮ４）を含み得る。いくつかの実施形態では、合成凝縮体は、ＯＣＴ４、ｐ５３、ＭＹＣ、ＧＣＮ４、メディエーター、メディエーターコンポーネント、ＭＥＤ１、ＭＥＤ１５、ｐ３００、ＢＲＤ４、ＮＡＮＯＧ、ＭｙｏＤ、ＫＬＦ４、ＳＯＸファミリーの転写因子、ＧＡＴＡファミリーの転写因子、核内受容体、シグナル伝達因子、メチルＤＮＡ結合タンパク質、スプライシング因子、遺伝子サイレンシング因子、ＲＮＡポリメラーゼ、β－カテニン、ＳＴＡＴ３、ＳＭＡＤ３、ＮＦ－ＫＢ、ＭＥＣＰ２、ＭＢＤ１、ＭＢＤ２、ＭＢＤ３、ＭＢＤ４、ＨＰ１α、ＴＢＬ１Ｒ、ＨＤＡＣ３、ＳＭＲＴ、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ、ＳＲＳＦ２、ＳＲＲＭ１、ＳＲＳＦ１、もしくはＴＦＩＩＤ、またはその断片もしくは天然変性ドメインを含み得る。いくつかの実施形態では、転写因子は、表Ｓ３に記載の転写因子の活性化ドメインを有する。いくつかの実施形態では、転写因子は、表Ｓ３に記載の転写因子のＩＤＲを有する。いくつかの実施形態では、転写因子は、表Ｓ３に記載のものである。いくつかの実施形態では、転写因子は、メディエーターコンポーネント（例えば、表Ｓ３に記載のメディエーターコンポーネント）と相互作用する転写因子である。本開示の態様のいくつかは、１つ以上の合成転写凝縮体を含む液滴を対象とする。本開示の態様のいくつかは、本明細書に記載のスクリーニングアッセイに必要なコンポーネントを含む組成物を対象とする。
本開示の態様のいくつかは、本明細書に記載の転写凝縮体コンポーネントと、本明細書に記載のオリゴマー化の誘導を可能にするドメインと、を含む融合タンパク質を対象とする。いくつかの実施形態では、オリゴマー化の誘導を可能にするドメインは、Ｃｒｙ２である。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、本明細書に記載の検出可能なタグをさらに含む。いくつかの態様では、検出可能なタグは、蛍光タグである。いくつかの実施形態では、オリゴマー化の誘導を可能にするドメインは、小分子、タンパク質、または核酸を用いて誘導することが可能である。
本開示の態様のいくつかでは、合成転写凝縮体、ヘテロクロマチン凝縮体、及びｍＲＮＡ開始複合体またはｍＲＮＡ伸長複合体と物理的に結び付く凝縮体、を調製する方法が提供される。いくつかの実施形態では、方法は、転写凝縮体、ヘテロクロマチン凝縮体、及びｍＲＮＡ開始複合体またはｍＲＮＡ伸長複合体と物理的に結び付く凝縮体、を形成させる上で適した条件の下で、２つ以上の凝縮体コンポーネントをインビトロで混合することを含む。条件には、適切なコンポーネント濃度、塩濃度、ｐＨなどが含まれ得る。いくつかの実施形態では、条件には、約２５ｍＭ、約４０ｍＭ、約５０ｍＭ、約１２５ｍＭ、約２００ｍＭ、約３５０ｍＭ、もしくは約４２５ｍＭの塩（例えば、ＮａＣｌ）濃度、または約１０～２５０ｍＭ、約２５～１５０ｍＭ、もしくは約４０～１００ｍＭの範囲の塩（例えば、ＮａＣｌ）濃度が含まれる。いくつかの実施形態では、条件には、約７～８、約７．２～７．８、約７．３～７．７、約７．４～７．６、または約７．５のｐＨが含まれる。いくつかの実施形態では、転写凝縮体コンポーネントは、ＭＥＤ１、ＢＲＤ４、ＢＲＤ４の天然変性ドメイン（ＢＲＤ４－ＩＤＲ）、及び／またはＭＥＤ１の天然変性ドメイン（ＭＥＤ１－ＩＤＲ）を含む。いくつかの実施形態では、転写凝縮体コンポーネントは、ＢＲＤ４－ＩＤＲ及びＭＥＤ１－ＩＤＲを含む。いくつかの実施形態では、転写凝縮体コンポーネントは、転写因子（例えば、ＯＣＴ４、ｐ５３、ＭＹＣ、ＮＡＮＯＧ、ＭｙｏＤ、ＫＬＦ４、ＳＯＸファミリーの転写因子、ＧＡＴＡファミリーの転写因子、核内受容体、融合発がん性転写因子、またはＧＣＮ４）の活性化ドメインのＩＤＲを含む。いくつかの実施形態では、ＩＤＲは、表Ｓ３に記載の転写因子のＩＤＲである。いくつかの実施形態では、転写凝縮体コンポーネントは、核内受容体（例えば、ＥＲ）活性化ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＩＤＲは、ＯＣＴ４、ｐ５３、ＭＹＣ、ＧＣＮ４、メディエーター、メディエーターコンポーネント、ＭＥＤ１、ＭＥＤ１５、ｐ３００、ＢＲＤ４、ＮＡＮＯＧ、ＭｙｏＤ、ＫＬＦ４、ＳＯＸファミリーの転写因子、ＧＡＴＡファミリーの転写因子、核内受容体、シグナル伝達因子、メチルＤＮＡ結合タンパク質、スプライシング因子、遺伝子サイレンシング因子、ＲＮＡポリメラーゼ、β－カテニン、ＳＴＡＴ３、ＳＭＡＤ３、ＮＦ－ＫＢ、ＭＥＣＰ２、ＭＢＤ１、ＭＢＤ２、ＭＢＤ３、ＭＢＤ４、ＨＰ１α、ＴＢＬ１Ｒ、ＨＤＡＣ３、ＳＭＲＴ、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ、ＳＲＳＦ２、ＳＲＲＭ１、ＳＲＳＦ１、またはＴＦＩＩＤのＩＤＲである。
ｍＲＮＡ開始複合体またはｍＲＮＡ伸長複合体と結び付く凝縮体
以下に示されるように、ＰｏｌＩＩ ＣＴＤがリン酸化されると、その凝縮体分配挙動が変化し、それによって、転写開始に関与する凝縮体から、ＲＮＡスプライシングに関与する凝縮体へとＰｏｌＩＩが移動するように誘導され得る。このモデルは、大きなＰｏｌＩＩクラスターが細胞におけるメディエーター凝縮体と融合するという以前の研究、リン酸化が生じるとＣＴＤ介在性のＰｏｌＩＩクラスターが崩壊するという以前の研究、ＣＤＫ９／サイクリンＴが相分離機構を介してＣＴＤと相互作用し得るという以前の研究、転写伸長の間はＰｏｌＩＩがもはやメディエーターとは結び付かないという以前の研究、及びスプライシング因子を含む核スペックルが、転写活性が高い遺伝子座において観測され得るという以前の研究、から得られた証拠と一致するものである。
本開示の態様のいくつかは、ｍＲＮＡの開始を調節する方法を対象とし、この方法は、ｍＲＮＡの開始と物理的に結び付く凝縮体の形成、組成、維持、崩壊、及び／または制御を調節することを含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡの開始を調節することで、ｍＲＮＡの伸長、スプライシング、またはキャッピングも調節される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡの開始と物理的に結び付く凝縮体の形成、組成、維持、崩壊、及び／または制御を調節することで、ｍＲＮＡの転写速度が調節される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡの開始と物理的に結び付く凝縮体の形成、組成、維持、崩壊、及び／または制御を調節することで、遺伝子産物のレベルが調節される。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡの開始と物理的に結び付く凝縮体の形成、組成、維持、崩壊、及び／または制御は、薬剤を用いて調節される。薬剤は、限定されず、本明細書に記載の任意の薬剤であり得る。いくつかの実施形態では、薬剤は、リン酸化もしくは低リン酸化されたＲＮＡポリメラーゼＩＩ Ｃ末端ドメイン（ＰｏｌＩＩ ＣＴＤ）またはその機能性断片を含む。いくつかの実施形態では、薬剤は、リン酸化または低リン酸化されたＰｏｌＩＩ ＣＴＤに優先的に結合する。いくつかの実施形態では、薬剤は、Ｐｏｌ ＣＴＤをリン酸化または脱リン酸化する。いくつかの実施形態では、薬剤は、サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）のリン酸化活性を調節する。いくつかの実施形態では、薬剤は、スプライシング因子と結び付くリン酸化されたＲＮＡポリメラーゼを増進または阻害する。スプライシング因子は、本明細書に記載の任意のスプライシング因子であり得、限定されない。
本開示の態様のいくつかは、ｍＲＮＡの伸長を調節する方法を対象とし、この方法は、ｍＲＮＡの伸長と物理的に結び付く凝縮体の形成、組成、維持、崩壊、及び／または制御を調節することを含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡの伸長を調節することで、ｍＲＮＡの開始も調節される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡの伸長と物理的に結び付く凝縮体の形成、組成、維持、崩壊、及び／または制御を調節することで、転写と同時発生的なｍＲＮＡプロセシングが調節される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡの伸長と物理的に結び付く凝縮体の形成、組成、維持、崩壊、及び／または制御を調節することで、ｍＲＮＡスプライスバリアントの数または相対比率が調節される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡの伸長と物理的に結び付く凝縮体の形成、組成、維持、崩壊、及び／または制御は、薬剤を用いて調節される。薬剤は、限定されず、本明細書に開示の任意の薬剤であり得る。いくつかの実施形態では、薬剤は、リン酸化もしくは低リン酸化されたＲＮＡポリメラーゼＩＩ Ｃ末端ドメイン（ＰｏｌＩＩ ＣＴＤ）またはその機能性断片を含む。いくつかの実施形態では、薬剤は、リン酸化または低リン酸化されたＰｏｌＩＩ ＣＴＤに優先的に結合する。いくつかの実施形態では、薬剤は、リン酸化または低リン酸化されたＰｏｌＩＩ ＣＴＤに優先的に結合する。いくつかの実施形態では、薬剤は、Ｐｏｌ ＣＴＤをリン酸化または脱リン酸化する。いくつかの実施形態では、薬剤は、サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）のリン酸化活性を調節する。いくつかの実施形態では、薬剤は、スプライシング因子と結び付くリン酸化されたＲＮＡポリメラーゼを増進または阻害する。スプライシング因子は、本明細書に記載の任意のスプライシング因子であり得、限定されない。
本開示の態様のいくつかは、凝縮体の形成、組成、維持、崩壊、及び／または制御を調節する方法に関し、この方法は、凝縮体コンポーネントのリン酸化または脱リン酸化を調節することを含む。いくつかの実施形態では、コンポーネントは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩまたはＲＮＡポリメラーゼＩＩ Ｃ末端領域である。いくつかの実施形態では、薬剤を使用することで、凝縮体コンポーネントのリン酸化または脱リン酸化が調節される。薬剤は、限定されず、本明細書に開示の任意の薬剤であり得る。いくつかの実施形態では、薬剤は、サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）のリン酸化活性を調節する。
本開示の態様のいくつかは、ｍＲＮＡプロセシングの異常と結び付く疾患もしくは状態を治療するか、または当該疾患もしくは状態が生じる可能性を低減する方法に関し、この方法は、ｍＲＮＡの伸長と物理的に結び付く凝縮体の形成、組成、維持、崩壊、及び／または制御を調節することを含む。凝縮体を調節する方法は、限定されず、本明細書に記載の任意の凝縮体調節方法であり得る。いくつかの実施形態では、凝縮体は、本明細書に記載の薬剤を用いて調節される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡプロセシングの異常と結び付く疾患または状態は、異常なスプライシングバリアントによって特徴付けられる。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡプロセシングの異常と結び付く疾患または状態は、ｍＲＮＡの開始異常によって特徴付けられる。
本開示の態様のいくつかは、ｍＲＮＡ開始複合体またはｍＲＮＡ伸長複合体と物理的に結び付く凝縮体の形成、安定性、または形態を調節する薬剤を同定する方法に関する。薬剤を同定する方法は、本明細書に記載の任意の薬剤同定方法または薬剤スクリーニング方法であり得る。
いくつかの実施形態では、方法は、凝縮体を有する細胞を提供すること、細胞を試験薬剤と接触させること、及び試験薬剤との接触によって凝縮体の形成、安定性、または形態が調節されるかどうかを決定すること、を含み、凝縮体は、低リン酸化されたＲＮＡポリメラーゼＩＩ Ｃ末端ドメイン（ＰｏｌＩＩ ＣＴＤ）、リン酸化されたＲＮＡポリメラーゼＩＩ Ｃ末端ドメイン（ＰｏｌＩＩ ＣＴＤ）、スプライシング因子、またはその機能性断片を含む。本開示の態様のいくつかは、凝縮体の形成、安定性、または形態を調節する薬剤を同定する方法に関し、この方法は、インビトロ凝縮体を提供し、インビトロ凝縮体の１つ以上の物理的特性を評価すること、インビトロ凝縮体を試験薬剤と接触させること、及びインビトロ凝縮体の１つ以上の物理的特性が試験薬剤によって変化するかどうかを評価すること、を含み、凝縮体は、低リン酸化されたＲＮＡポリメラーゼＩＩ Ｃ末端ドメイン（ＰｏｌＩＩ ＣＴＤ）、リン酸化されたＲＮＡポリメラーゼＩＩ Ｃ末端ドメイン（ＰｏｌＩＩ ＣＴＤ）、スプライシング因子、またはその機能性断片を含む。
本開示の態様のいくつかは、細胞タンパク質のアミノ酸残基の中で、そのリン酸化状態が凝縮体の形成、安定性、局在化、分配、活性、または他の特性を制御するアミノ酸残基を同定する方法に関する。同定される残基は、対象またはインビトロにおける凝縮体の形成、安定性、局在化、分配、活性、または他の特性を調節するための修飾標的となり得る。いくつかの実施形態では、方法は、凝縮体コンポーネントにおけるリン酸化部位または潜在的リン酸化部位（例えば、セリン、スレオニン、またはチロシン）を物理的または計算的に１つ以上同定すること、そのような残基を１つ以上変異させること（例えば、そうした残基がアラニンに変更される）、及び変異によって、変異凝縮体コンポーネントを含む凝縮体の特性（例えば、形成、安定性、局在化、分配、活性）が変化するかどうかを決定すること（例えば、変異が導入されていない凝縮体コンポーネントと比較して決定される）、を含む。変異によって凝縮体特性が変わるのであれば、そのリン酸化部位が、凝縮体の形成、安定性、局在化、分配、または活性を調節するための修飾標的として同定される。本発明の実施形態のいくつかでは、同定される残基のリン酸化を担うキナーゼが同定される（この同定は、例えば、凝縮体を基質とするインビトロキナーゼアッセイを使用するか、個々のキナーゼの発現が低減された細胞を使用するか（例えば、キノーム全体にわたるｓｉＲＮＡスクリーニングが実施される）、特定のキナーゼを阻害することが知られる既知のキナーゼ阻害剤を使用して行われる）。代替的または付加的に、いくつかの実施形態では、既知のキナーゼ阻害剤のライブラリーをスクリーニングすることで、同定される残基のリン酸化状態に影響を与えるキナーゼが１つ以上同定される。本発明の実施形態のいくつかでは、同定される残基の脱リン酸化を担うホスファターゼが同定される（この同定は、例えば、凝縮体を基質とするインビトロホスファターゼアッセイを使用するか、個々のホスファターゼの発現が低減された細胞を使用するか（例えば、既知のホスファターゼのｓｉＲＮＡスクリーニングが実施される）、特定のホスファターゼを阻害することが知られる既知のホスファターゼ阻害剤を使用して行われる）。代替的または付加的に、いくつかの実施形態では、既知のホスファターゼ阻害剤のライブラリーをスクリーニングすることで、同定される残基のリン酸化状態に影響を与えるホスファターゼが１つ以上同定される。こうしたアッセイは、さまざまな実施形態において、インビトロ、無細胞系、または細胞において実施することができる。
本開示の態様のいくつかは、低リン酸化されたＲＮＡポリメラーゼＩＩ Ｃ末端ドメイン（ＰｏｌＩＩ ＣＴＤ）またはその機能性断片を含む単離された合成凝縮体に関する。本開示の態様のいくつかは、リン酸化されたＲＮＡポリメラーゼＩＩ Ｃ末端ドメイン（ＰｏｌＩＩ ＣＴＤ）またはその機能性断片を含む単離された合成凝縮体に関する。本開示の態様のいくつかは、スプライシング因子またはその機能性断片を含む単離された合成凝縮体に関する。
ヘテロクロマチン凝縮体
ヘテロクロマチンは、染色体の維持及び遺伝子サイレンシングにおいて重要な役割を担う。ＭｅＣＰ２は、細胞に遍在性に発現し、正常発生に必要不可欠なメチルＤＮＡ結合タンパク質であり、動的な液状ヘテロクロマチン凝縮体の主要コンポーネントであることが以下に示される。ＭｅＣＰ２を含む凝縮体は、遺伝子サイレンシングに寄与する抑制性のヘテロクロマチン因子をコンパートメント化し得る。ＭｅＣＰ２が、凝縮体を形成し、細胞におけるヘテロクロマチンに取り込まれ、遺伝子サイレンシング因子をコンパートメント化する能力は、そのＣ末端天然変性領域（ＩＤＲ）に依存する。
本開示の態様のいくつかは、１つ以上の遺伝子の転写を調節する方法に関し、この方法は、ヘテロクロマチンと結び付く凝縮体（すなわち、ヘテロクロマチン凝縮体）の形成、組成、維持、崩壊、及び／または制御を調節することを含む。ヘテロクロマチン凝縮体を調節する方法は、限定されず、本明細書に記載の任意の凝縮体調節方法であり得る。いくつかの実施形態では、ヘテロクロマチン凝縮体を調節することで、１つ以上の遺伝子の転写の抑制（すなわち、遺伝子サイレンシング）が増強または安定化される。いくつかの実施形態では、ヘテロクロマチン凝縮体を調節することで、１つ以上の遺伝子の転写の抑制（すなわち、遺伝子サイレンシング）が減少する。いくつかの実施形態では、ヘテロクロマチンと結び付く複数の凝縮体が調節される。いくつかの実施形態では、ヘテロクロマチン凝縮体の形成、組成、維持、崩壊、及び／または制御は、薬剤を用いて調節される。薬剤は、限定されず、本明細書に記載の任意の薬剤であり得る。いくつかの実施形態では、薬剤は、ペプチド、核酸、もしくは小分子を含むか、またはペプチド、核酸、もしくは小分子からなる。いくつかの実施形態では、薬剤は、メチル化ＤＮＡ、メチルＤＮＡ結合タンパク質、または遺伝子サイレンシング因子に結合する。
本開示の態様のいくつかは、遺伝子サイレンシングを調節する方法に関し、この方法は、ヘテロクロマチン凝縮体の形成、組成、維持、崩壊、及び／または制御を調節することを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子サイレンシングは、安定化または増強される。いくつかの実施形態では、遺伝子サイレンシングは、低減される。いくつかの実施形態では、遺伝子サイレンシングは、薬剤を用いて調節される。薬剤は、限定されず、本明細書に記載の任意の薬剤であり得る。
本開示の態様のいくつかは、遺伝子サイレンシングの異常（例えば、参照レベルまたは対照レベルと比較したときのレベルの上昇または低下）と結び付く疾患もしくは状態を治療するか、または当該疾患もしくは状態が生じる可能性を低減する方法に関し、この方法は、ヘテロクロマチン凝縮体の形成、組成、維持、崩壊、及び／または制御を調節することを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子サイレンシングの異常と結び付く疾患または状態は、メチルＤＮＡ結合タンパク質の発現異常または活性異常と結び付く。いくつかの実施形態では、遺伝子サイレンシングの異常と結び付く疾患または状態は、ＡＴＲ－Ｘ症候群、ジュバーグ・マルシディ（Ｊｕｂｅｒｇ－Ｍａｒｓｉｄｉ）症候群、サザーランド・ハーン（Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ－Ｈａａｎ）症候群、スミス・フィネマーズ（Ｓｍｉｔｈ－Ｆｉｎｅｍｅｒｓ）症候群、乳癌、ＭＥＣＰ２重複症候群、レット症候群、自閉症、ダウン症候群、ＡＤＨＤ／ＡＤＤ、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、てんかん、双極性気分障害、鬱病、胎児性アルコール症候群、ウェルナー症候群、結腸癌、リンパ腫、膵癌、ＩＣＦ症候群、膀胱癌、乳癌、結腸癌、肝細胞癌、肺癌、バレット食道、膀胱癌、乳癌、結腸直腸癌、メラノーマ、骨髄腫／リンパ腫、肝細胞癌、前立腺癌、ウイルムス腫瘍、乳癌、髄芽腫、甲状腺乳頭癌、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー、フリードライヒ運動失調症、脆弱Ｘ症候群、アンジェルマン症候群、プラダー・ウィリー症候群、ハッチンソン・ギルフォード早老症候群、ウェルナー症候群、ベックウィズ・ヴィーデマン症候群、シルバー・ラッセル症候群、脊髄小脳変性症、またはコカイン物質乱用である。いくつかの実施形態では、遺伝子サイレンシングの異常と結び付く疾患または状態は、レット症候群またはＭｅＣＰ２過剰発現症候群である。
本開示の態様のいくつかは、ヘテロクロマチン凝縮体の凝縮体形成、凝縮体安定性、または凝縮体形態を調節する薬剤を同定する方法に関する。薬剤を同定する方法は、本明細書に記載の任意の薬剤同定方法または薬剤スクリーニング方法であり得る。いくつかの実施形態では、方法は、凝縮体を有する細胞を提供すること、細胞を試験薬剤と接触させること、及び試験薬剤との接触によって、ヘテロクロマチン凝縮体の形成、安定性、または形態が調節されるかどうかを決定すること、を含み、凝縮体は、メチルＤＮＡ結合タンパク質（例えば、ＭｅＣＰ２）もしくはその断片（例えば、ＭｅＣＰ２のＣ末端天然変性領域）、またはサプレッサーもしくはその機能性断片を含む。いくつかの実施形態では、凝縮体は、メチル化ＤＮＡと結び付く。いくつかの実施形態では、方法は、インビトロ凝縮体を提供し、インビトロ凝縮体の１つ以上の物理的特性を評価すること、インビトロ凝縮体を試験薬剤と接触させること、及びインビトロ凝縮体の１つ以上の物理的特性が試験薬剤によって変化するかどうかを評価すること、を含み、凝縮体は、メチルＤＮＡ結合タンパク質（例えば、ＭｅＣＰ２）もしくはその断片（例えば、ＭｅＣＰ２のＣ末端天然変性領域）、またはサプレッサーもしくはその機能性断片を含む。
本開示の態様のいくつかは、メチルＤＮＡ結合タンパク質（例えば、ＭｅＣＰ２）もしくはその断片（例えば、ＭｅＣＰ２のＣ末端天然変性領域）、またはサプレッサーもしくはその機能性断片を含む単離された合成凝縮体に関する。
診断方法
本開示の態様のいくつかは、凝縮体標的化治療剤を用いる治療の候補となる対象を診断する方法及び同定する方法に関する。いくつかの実施形態では、凝縮体標的化治療剤を用いる治療の候補となる対象を同定する方法は、対象から単離される試料を得ること、試料における１つ以上の凝縮体のレベル（または安定性、崩壊、もしくは維持から選択される特性）を決定すること、及び凝縮体のレベルが異常であるか（例えば、参照レベルと比較してレベルが上昇もしくは低下している）、または安定性、崩壊、もしくは維持から選択される凝縮体の特性が異常であることが検出されるならば、凝縮体標的化治療剤を用いる治療の候補として対象を同定すること、を含む。方法は、凝縮体標的化治療剤を対象に投与することをさらに含み得、薬剤は、凝縮体のレベル（または安定性、崩壊、もしくは維持から選択される特性）の異常を少なくとも部分的に正常化する。「凝縮体標的化治療剤」は、治療的に有益な様式で凝縮体の形成、安定性、組成、維持、崩壊、または制御を調節する薬剤として本明細書で定義され、この調節は、例えば、当該薬剤が、凝縮体コンポーネントと物理的に結び付くか、凝縮体コンポーネントを修飾するか、または凝縮体コンポーネントの修飾因子／脱修飾因子を阻害もしくは活性化することによって行われる。いくつかの実施形態では、対象は、がんを患っている。いくつかの実施形態では、凝縮体は、がん遺伝子を含むか、またはがん遺伝子の転写を誘導する。いくつかの実施形態では、凝縮体は、転写凝縮体である。いくつかの実施形態では、凝縮体は、ヘテロクロマチン関連凝縮体である。
いくつかの態様では、方法は、対象（例えば、哺乳類対象（例えば、ヒト対象））から得られる試料を提供すること、及び試料における転写凝縮体を検出すること、を含む。いくつかの実施形態では、試料は、少なくとも１種類の細胞（例えば、少なくとも１種類のがん細胞）を含む。いくつかの実施形態では、方法は、対照細胞または対照試料（例えば、健康な細胞、または健康な対象から得られる試料）と比較して、細胞または試料における転写凝縮体のレベルの異常（例えば、参照レベルと比較したときのレベルの上昇もしくは低下）、組成の異常、または局在化の異常を検出すること、を含む。いくつかの実施形態では、転写凝縮体のレベル、組成物、または局在化の異常を検出して疾患が診断され得る。
いくつかの態様では、方法は、対象（例えば、哺乳類対象（例えば、ヒト対象））から得られる試料を提供すること、及び対照細胞または対照試料（例えば、健康な細胞、または健康な対象から得られる試料）と比較して、試料における転写凝縮体のコンポーネントの変異またはレベル異常もしくは活性異常を検出すること、を含む。いくつかの実施形態では、試料は、少なくとも１種類の細胞（例えば、少なくとも１種類のがん細胞）を含む。いくつかの実施形態では、転写凝縮体のコンポーネントの変異またはレベル変化もしくは活性変化によって、転写凝縮体の形成、安定性、局在化、活性、または形態が影響を受ける。いくつかの実施形態では、試料における転写凝縮体のコンポーネントの変異またはレベル異常もしくは活性異常を検出して疾患が診断され得る。
トランスジェニック非ヒト動物
本開示の態様のいくつかは、トランスジェニック非ヒト動物（例えば、非ヒト哺乳類、非ヒト霊長類、げっ歯類（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター）、イヌ、ネコ、ウシ、または他の哺乳類）に関し、当該トランスジェニック非ヒト動物の細胞は、検出可能な標識と融合した凝縮体コンポーネントを含むポリペプチドをコードする導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、方法は、そのような動物に試験薬剤を投与すること、動物から単離される１種以上の細胞を含む試料を得ること、及び上記ポリペプチドを含む凝縮体の形成、安定性、または活性に対する試験薬剤の作用を決定すること、を含み得る。いくつかの実施形態では、試料は、組織試料である。
本開示の態様のいくつかは、疾患または状態の動物モデルとしてのトランスジェニック動物に関する。疾患または状態は、限定されず、本明細書に開示の任意の疾患または状態であり得る。いくつかの実施形態では、トランスジェニック動物を使用することで、疾患に対する候補薬剤が試験される。いくつかの実施形態では、トランスジェニック動物は、本明細書に開示の方法（例えば、薬剤をスクリーニングする方法、または薬剤を同定する方法）を実施するための初代細胞の供給源である。
乳癌
乳癌は、最も一般的ながんの１つであり、がんによって死に至る主な原因である。ヒト乳癌のおよそ７０％がホルモン依存性であり、エストロゲン受容体陽性（ＥＲ＋）である（例えば、増殖をエストロゲンに依存する）。ＥＲ＋乳癌の治療には、選択的エストロゲン受容体調節剤（ＳＥＲＭ）（タモキシフェン、ラロキシフェン、またはトレミフェンなど）が使用されることが多い。ＳＥＲＭは、乳房組織ではＥＲ阻害剤（アンタゴニスト）として働き得るが、薬剤によっては、ある特定の他の組織（例えば、骨）ではＥＲのアクチベーター（例えば、部分アゴニスト）として働き得ることが理解されよう。タモキシフェン自体は、ＥＲに対する親和性が比較的低いプロドラッグであるが、代謝されて活性代謝物（４－ヒドロキシタモキシフェン（アフィモキシフェン）及びＮ－デスメチル－４－ヒドロキシタモキシフェン（エンドキシフェン）など）に変換されることも理解されよう。本明細書で使用される「タモキシフェン」という用語は、文脈に即して解釈されて、タモキシフェンまたはその活性代謝物を意味することになる。例えば、タモキシフェンは、通常、患者に投与される形態をとる。一方で、インビトロでの使用については、活性代謝物（４－ヒドロキシタモキシフェン（アフィモキシフェン）及び／またはＮ－デスメチル－４－ヒドロキシタモキシフェン（エンドキシフェン）など）がより適し得る。
タモキシフェンは、ＥＲ陽性乳癌患者に対して最も一般に使用される化学療法剤である。タモキシフェンは、ＥＲへの結合でエストロゲンと競合し、タモキシフェンがＥＲに結合すると、その転写因子活性が低減または除去されると考えられている。しかしながら、タモキシフェンを服用する患者の多くが、最終的には、タモキシフェン抵抗性乳癌を発症する。ＥＲは、エストロゲン刺激を受けると、スーパーエンハンサーを確立する（Ｂｏｊｃｓｕｋ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２０１７）。さらに、以下に示されるように、ＥＲ＋乳癌ではＭＥＤ１が過剰発現しており、ＥＲ機能及びＥＲ＋発がんにはＭＥＤ１が必要である。さらに以下に示されるように、エストロゲンは、ＭＥＤ１凝縮体へのＥＲの取り込みを刺激する。この取り込みは、ＭＥＤ１におけるＬＸＸＬモチーフの存在に依存している。
本明細書の結果は、インビトロ及び細胞においてＭＥＤ１－ＩＤＲ及びＥＲがエストロゲン依存性の凝縮体を形成することを示す。凝縮体形成は、タモキシフェンによって弱まる。しかしながら、いくつかのタモキシフェン抵抗性ＥＲ＋乳癌は、エストロゲンに依存せずに活性を有する変異ＥＲ（例えば、Ｙ５３７Ｓ変異体及びＤ５３８Ｇ変異体）を含む。他のタモキシフェン抵抗性ＥＲ＋乳癌は、エストロゲンに依存せずに活性を有するＥＲ融合タンパク質（例えば、ＥＲ－ＹＡＰ１、ＥＲ－ＰＣＤＨ１１Ｘ）を含む。こうしたＥＲは、エストロゲンの存在に依存せずにＭＥＤ１と凝縮体を形成する。本明細書に示される別の結果は、ＭＥＤ１を過剰発現するＥＲ＋乳癌細胞（発現量が、例えば、非タモキシフェン抵抗性ＥＲ＋乳癌細胞と比較して４倍を超えるもの）では、ＥＲへのエストロゲンの結合に依存せずにＥＲがＭＥＤ１含有凝縮体に取り込まれることを実証している。
本開示の態様のいくつかは、細胞における１つ以上の遺伝子の転写を調節する方法に関し、この方法は、１つ以上の遺伝子と結び付く凝縮体の組成、維持、崩壊、及び／または制御を調節することを含み、凝縮体は、エストロゲン受容体（ＥＲ）またはその断片と、ＭＥＤ１またはその断片と、を凝縮体コンポーネントとして含む。いくつかの実施形態では、エストロゲン受容体は、変異エストロゲン受容体である。いくつかの実施形態では、変異エストロゲン受容体は、エストロゲンの結合に依存しない構成的活性を有する（例えば、Ｙ５３７Ｓ変異体及びＤ５３８Ｇ変異体）。いくつかの実施形態では、変異エストロゲン受容体は、融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、エストロゲンの結合に依存しない構成的活性を有する（例えば、ＥＲ－ＹＡＰ１、ＥＲ－ＰＣＤＨ１１Ｘ）。いくつかの実施形態では、エストロゲン受容体断片は、リガンド結合ドメインまたはその機能性断片を含む。いくつかの実施形態では、ＥＲ断片は、リガンド結合ドメインまたはその機能性断片を２つ含む。いくつかの実施形態では、ＥＲ断片は、ＤＮＡ結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＭＥＤ１断片は、ＩＤＲ、ＬＸＸＬＬモチーフ、またはこれら両方を含む。いくつかの実施形態では、ＥＲまたはＭＥＤ１は、ヒトのＥＲまたはＭＥＤ１である。本明細書に記載の方法及び組成物の実施形態のいくつかでは、ＥＲまたはＭＥＤ１は、非ヒト哺乳類（例えば、ラット、マウス、ウサギ）のＥＲまたはＭＥＤ１である。
いくつかの実施形態では、凝縮体は、エストロゲンまたはその機能性断片と接触される（例えば、エストロゲンまたはその断片は、凝縮体と物理的に結び付くか、または凝縮体を含む溶液に含まれる）。いくつかの実施形態では、凝縮体は、選択的エストロゲン選択的調節剤（ＳＥＲＭ）と接触される（例えば、ＳＥＲＭは、凝縮体と物理的に結び付くか、または凝縮体を含む溶液に含まれる）。いくつかの実施形態では、ＳＥＲＭは、タモキシフェンまたはその活性代謝物（４－ヒドロキシタモキシフェン及び／またはＮ－デスメチル－４－ヒドロキシタモキシフェン）である。いくつかの実施形態では、凝縮体を調節することで、ＭＹＣがん遺伝子の転写が低減または除去される。いくつかの実施形態では、ＭＹＣがん遺伝子の転写が低減され、その低減率は、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、またはそれを超える％である。
細胞は、任意の適切な細胞であり得る。いくつかの実施形態では、細胞は、乳癌細胞（例えば、患者から単離された乳癌細胞、細胞株（例えば、６００ＭＰＥ、ＡＵ５６５、ＢＴ－２０、ＢＴ－４７４、ＢＴ４８３、ＢＴ－５４９、Ｅｖｓａ－Ｔ、Ｈｓ５７８Ｔ、ＭＣＦ－７、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＳｋＢｒ３、Ｔ－４７Ｄ）に由来する乳癌細胞）である。いくつかの実施形態では、細胞は、ＭＥＤ１及びエストロゲン受容体（例えばヒトのＭＥＤ１及び／またはエストロゲン受容体）を発現するトランスジェニック細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ＭＥＤ１またはその機能性断片と、エストロゲン受容体（例えば、変異エストロゲン受容体）またはその機能性断片と、を発現するトランスジェニック細胞（例えばヒトのＭＥＤ１及び／またはエストロゲン受容体を発現するもの）である。いくつかの実施形態では、細胞は、ＭＥＤ１を過剰発現する。本明細書で使用される「ＭＥＤ１を過剰発現する」は、細胞のＭＥＤ１発現レベルが、対照細胞または参照レベルと比較して、少なくとも約１．１倍、少なくとも１．２倍、１．３倍、少なくとも１．４倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．６倍、少なくとも１．７倍、少なくとも１．８倍、少なくとも１．９倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、もしくは少なくとも１００倍、少なくとも１，０００倍、少なくとも１０，０００倍、またはそれを超える倍率であることを意味する。いくつかの実施形態では、細胞は、タモキシフェン抵抗性ＥＲ＋乳癌細胞であり、対照細胞は、非タモキシフェン抵抗性ＥＲ＋乳癌細胞である。いくつかの実施形態では、細胞（例えば、タモキシフェン抵抗性ＥＲ＋乳癌細胞）は、対照細胞（例えば、非タモキシフェン抵抗性ＥＲ＋乳癌細胞）と比較して約４倍以上（例えば、約４倍～４．５倍）のレベルでＭＥＤ１を過剰発現する。
いくつかの実施形態では、転写凝縮体は、転写凝縮体を薬剤と接触させることによって調節される。いくつかの実施形態では、薬剤は、ＥＲとＭＥＤ１との間の物理的相互作用を低減または除去する。いくつかの実施形態では、薬剤は、ＥＲとＭＥＤ１との間の物理的相互作用を低減し、その低減率は、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、またはそれを超える％である。いくつかの実施形態では、薬剤は、ＥＲとエストロゲンとの間の相互作用を低減または除去する。いくつかの実施形態では、薬剤は、ＥＲとエストロゲンとの間の物理的相互作用を低減し、その低減率は、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、またはそれを超える％である。いくつかの実施形態では、凝縮体は、変異ＥＲまたはその断片を含み、薬剤は、１つ以上の遺伝子の転写を低減する。
本開示の態様のいくつかは、凝縮体の形成、安定性、または形態を調節する薬剤を同定する方法に関し、この方法は、細胞を提供すること、細胞を試験薬剤と接触させること、及び試験薬剤との接触によって凝縮体の形成、安定性、または形態が調節されるかどうかを決定すること、を含み、凝縮体は、エストロゲン受容体（ＥＲ）またはその断片と、ＭＥＤ１またはその断片と、を凝縮体コンポーネントとして含む。いくつかの実施形態では、細胞は、凝縮体を含む。いくつかの実施形態では、薬剤は、凝縮体の形成を誘発する。
本明細書に記載の試験薬剤を同定する方法の実施形態のいくつかでは、凝縮体の形成、安定性、または形態を調節する薬剤は、（例えば、凝縮体の形成または安定性を低減するのであれば）候補治療剤（例えば、抗がん剤）として同定される。いくつかの実施形態では、薬剤は、抗ＥＲ＋癌剤（例えば、ＥＲ＋乳癌剤、抗タモキシフェン抵抗性乳癌剤）として同定される。本明細書に記載の試験薬剤を同定する方法の実施形態のいくつかでは、変異ＥＲ（またはその断片）及びＭＥＤ１（またはその断片）を含む凝縮体の形成または安定性を低減する薬剤は、ＥＲ＋癌（例えば、タモキシフェン抵抗性ＥＲ＋癌）を治療するための候補薬剤として同定される。本明細書に記載の試験薬剤を同定する方法の実施形態のいくつかでは、ＥＲ（またはその断片）を含む凝縮体の形成または安定性を低減する薬剤は、ＥＲ活性（例えば、ＥＲ介在性の転写）の候補調節剤として同定される。
いくつかの実施形態では、エストロゲン受容体は、変異エストロゲン受容体である。いくつかの実施形態では、変異エストロゲン受容体は、エストロゲンの結合に依存しない構成的活性を有する（例えば、Ｙ５３７Ｓ変異体及びＤ５３８Ｇ変異体）。いくつかの実施形態では、変異エストロゲン受容体は、融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、エストロゲンの結合に依存しない構成的活性を有する（例えば、ＥＲ－ＹＡＰ１、ＥＲ－ＰＣＤＨ１１Ｘ）。いくつかの実施形態では、エストロゲン受容体断片は、リガンド結合ドメインまたはその機能性断片を含む。いくつかの実施形態では、ＥＲ断片は、リガンド結合ドメインまたはその機能性断片を２つ含む。いくつかの実施形態では、ＥＲ断片は、ＤＮＡ結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＭＥＤ１断片は、ＩＤＲ、ＬＸＸＬＬモチーフ、またはこれら両方を含む。いくつかの実施形態では、ＥＲまたはＭＥＤ１は、ヒトのＥＲまたはＭＥＤ１である。いくつかの実施形態では、ＥＲまたはＭＥＤ１は、非ヒト哺乳類（例えば、ラット、マウス、ウサギ）のＥＲまたはＭＥＤ１である。
いくつかの実施形態では、凝縮体は、エストロゲンまたはその機能性断片と接触される。いくつかの実施形態では、凝縮体は、選択的エストロゲン選択的調節剤（ＳＥＲＭ）と接触される。ＳＥＲＭは、限定されず、本明細書に記載されるか、または当該技術分野で知られる任意のものであり得る。いくつかの実施形態では、ＳＥＲＭは、タモキシフェンまたはその活性代謝物（例えば、本明細書に記載のもの）である。本明細書に記載の方法の実施形態のいくつかでは、凝縮体を調節することで、標的遺伝子（例えば、ＭＹＣがん遺伝子、あるいは本明細書に記載されるか、またはがんの増殖もしくは生存能力に関与する他の遺伝子）の転写が低減または除去される。いくつかの実施形態では、標的遺伝子（例えば、ＭＹＣがん遺伝子）の転写が低減され、その低減率は、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、またはそれを超える％である。
いくつかの実施形態では、細胞は、乳癌細胞（例えば、本明細書に記載のもの）である。いくつかの実施形態では、細胞は、ＭＥＤ１（例えば、本明細書に記載のもの）を過剰発現する。いくつかの実施形態では、細胞（例えば、タモキシフェン抵抗性ＥＲ＋乳癌細胞）は、対照細胞（例えば、非タモキシフェン抵抗性ＥＲ＋乳癌細胞）と比較して約４倍以上（例えば、約４倍～４．５倍）のレベルでＭＥＤ１を過剰発現する。いくつかの実施形態では、細胞は、ＥＲ＋乳癌細胞である。いくつかの実施形態では、ＥＲ＋乳癌細胞は、タモキシフェン処理に抵抗性である。いくつかの実施形態では、凝縮体は、検出可能な標識を含む。標識は、限定されず、本明細書に記載の任意の標識であり得る。いくつかの実施形態では、凝縮体のコンポーネントは、検出可能な標識を含む。いくつかの実施形態では、ＥＲもしくはその断片、及び／またはＭＥＤ１もしくはその断片は、検出可能な標識を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の遺伝子は、レポーター遺伝子を含む。レポーター遺伝子は、限定されず、本明細書に記載の任意のレポーター遺伝子であり得る。
本発明の態様のいくつかは、凝縮体の形成、安定性、または形態を調節する薬剤を同定する方法に関し、この方法は、インビトロ凝縮体を提供すること、凝縮体を試験薬剤と接触させること、及び試験薬剤との接触によって凝縮体の形成、安定性、または形態が調節されるかどうかを決定すること、を含み、凝縮体は、エストロゲン受容体（ＥＲ）またはその断片と、ＭＥＤ１またはその断片と、を凝縮体コンポーネントとして含む。いくつかの実施形態では、エストロゲン受容体は、変異エストロゲン受容体（例えば、本明細書に記載の任意の変異エストロゲン受容体）である。いくつかの実施形態では、変異エストロゲン受容体は、エストロゲンの結合に依存しない構成的活性を有する（例えば、Ｙ５３７Ｓ変異体及びＤ５３８Ｇ変異体）。いくつかの実施形態では、変異エストロゲン受容体は、融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、エストロゲンの結合に依存しない構成的活性を有する（例えば、ＥＲ－ＹＡＰ１、ＥＲ－ＰＣＤＨ１１Ｘ）。いくつかの実施形態では、エストロゲン受容体断片は、リガンド結合ドメインまたはその機能性断片を含む。いくつかの実施形態では、ＭＥＤ１断片は、ＩＤＲ、ＬＸＸＬＬモチーフ、またはこれら両方を含む。
いくつかの実施形態では、凝縮体は、エストロゲンまたはその機能性断片と接触される（例えば、エストロゲンまたはその断片は、凝縮体と物理的に結び付くか、または凝縮体を含む溶液に含まれる）。いくつかの実施形態では、凝縮体は、選択的エストロゲン選択的調節剤（ＳＥＲＭ）と接触される（例えば、ＳＥＲＭは、凝縮体と物理的に結び付くか、または凝縮体を含む溶液に含まれる）。いくつかの実施形態では、ＳＥＲＭは、タモキシフェンまたはその活性代謝物（４－ヒドロキシタモキシフェン及び／またはＮ－デスメチル－４－ヒドロキシタモキシフェン）である。
いくつかの実施形態では、凝縮体は、細胞から単離される。凝縮体の単離元である細胞は、任意の適切な細胞であり得る。いくつかの実施形態では、細胞は、乳癌細胞（例えば、患者から単離された乳癌細胞、細胞株（例えば、６００ＭＰＥ、ＡＵ５６５、ＢＴ－２０、ＢＴ－４７４、ＢＴ４８３、ＢＴ－５４９、Ｅｖｓａ－Ｔ、Ｈｓ５７８Ｔ、ＭＣＦ－７、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＳｋＢｒ３、Ｔ－４７Ｄ）に由来する乳癌細胞）である。いくつかの実施形態では、細胞は、ＭＥＤ１及びエストロゲン受容体（例えばヒトのＭＥＤ１及び／またはエストロゲン受容体）を発現するトランスジェニック細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ＭＥＤ１またはその機能性断片と、エストロゲン受容体（例えば、変異エストロゲン受容体）またはその機能性断片と、を発現するトランスジェニック細胞（例えばヒトのＭＥＤ１及び／またはエストロゲン受容体を発現するもの）である。
いくつかの実施形態では、凝縮体は、検出可能な標識を含む。検出可能な標識は、限定されず、本明細書に記載されるか、または当該技術分野で知られる任意の標識であり得る。いくつかの実施形態では、凝縮体のコンポーネントは、検出可能な標識を含む。いくつかの実施形態では、ＥＲもしくはその断片、及び／またはＭＥＤ１もしくはその断片は、検出可能な標識を含む。
本開示の態様のいくつかは、エストロゲン受容体（ＥＲ）またはその断片と、ＭＥＤ１またはその断片と、を凝縮体コンポーネントとして含む単離された合成転写凝縮体に関する。いくつかの実施形態では、エストロゲン受容体は、変異エストロゲン受容体である。いくつかの実施形態では、変異エストロゲン受容体は、エストロゲンの結合に依存しない構成的活性を有する。いくつかの実施形態では、エストロゲン受容体断片は、リガンド結合ドメインまたはその機能性断片を含む。いくつかの実施形態では、ＭＥＤ１断片は、ＩＤＲ、ＬＸＸＬＬモチーフ、またはこれら両方を含む。いくつかの実施形態では、凝縮体は、エストロゲンまたはその機能性断片を含む。いくつかの実施形態では、凝縮体は、選択的エストロゲン選択的調節剤（ＳＥＲＭ）を含む。
組成物
本発明の態様のいくつかは、本明細書に開示の方法によって同定される薬剤を含む組成物を対象とする。いくつかの実施形態では、組成物は、医薬組成物である。
薬剤は、医薬的に許容可能な溶液に含めて投与することができ、そうした医薬的に許容可能な溶液は、塩、緩衝剤、保存剤、適合担体、補助剤、及び任意選択の他の治療成分を医薬的に許容可能な濃度で規定通りに含み得る。
薬剤は、固形形態、半固形形態、液体形態、またはガス状形態（錠剤、カプセル、粉末、顆粒、軟膏、溶液、沈着物、吸入物、及び注射物など）において経口投与、非経口投与、または外科的投与に有用な方法で製剤化して調製物にすることができる。本発明は、局所投与（植込みによるものなど）向けに製剤化される医薬組成物も包含する。
経口投与に適した組成物は、別々の単位（カプセル、錠剤、トローチ剤など）として提供することができ、それぞれが所定量の活性薬剤を含む。他の組成物には、水性液体または非水性液体における懸濁液（シロップ、エリキシル剤、または乳濁液など）が含まれる。
いくつかの実施形態では、薬剤は、組織に直接的に投与され得る。直接的な組織投与は、直接的な注射によって達成され得る。薬剤は、単回投与され得るか、あるいは複数回の投与によって投与され得る。投与回数が複数回であるならば、異なる経路でペプチドが投与されることもあり得る。例えば、初回（または最初の数回）の投与を患部組織に直接的に行うことができ、その後の投与を全身性に行うことができる。
経口投与については、当該技術分野でよく知られる医薬的に許容可能な担体と薬剤を組み合わせることによって組成物を容易に製剤化することができる。そのような担体を用いることで、治療対象が経口摂取するための錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液などとして薬剤を製剤化することが可能になる。経口使用のための医薬調製物は、固形の医薬品添加物として得ることができ、その際、得られる混合物を任意選択で粉砕し、顆粒混合物を加工し、必要に応じて適切な補助剤を添加することで、錠剤または糖衣錠コアが得られる。適切な医薬品添加物は、具体的には、糖（ラクトース、スクロース、マンニトール、またはソルビトールを含む）などの賦形剤、セルロース調製物、例えば、トウモロコシデンプン、小麦デンプン、米デンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントガム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、及び／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などである。必要に応じて崩壊剤（架橋ポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸もしくはその塩（アルギン酸ナトリウムなど）など）が添加され得る。任意選択で、生理食塩水もしくは内部の酸性条件を中和するための緩衝液において経口製剤を製剤化することもでき、またはいずれの担体も用いずに経口製剤を投与することもできる。
糖衣錠コアは、適切なコーティングを施して提供される。この目的には、濃縮糖溶液を用いることができ、そうした濃縮糖溶液は、アラビアガム、タルク、ポリビニルピロリドン、ｃａｒｂｏｐｏｌゲル、ポリエチレングリコール、及び／または二酸化チタン、ラッカー溶液、ならびに適切な有機溶剤または溶剤混合物を任意選択で含み得る。異なる組み合わせの活性化合物を識別または特徴付けるために、錠剤または糖衣錠コーティングに染料または色素が添加され得る。
経口的に使用可能な医薬調製物には、ゼラチンでできた押し込み式カプセル、ならびにゼラチン及び可塑剤（グリセロールまたはソルビトールなど）でできたソフト密封カプセルが含まれる。押し込み式カプセルは、賦形剤（ラクトースなど）、結合剤（デンプンなど）、及び／または滑沢剤（タルクもしくはステアリン酸マグネシウムなど）ならびに任意選択の安定剤と混合された状態で活性成分を含み得る。ソフトカプセルでは、活性化合物は、適切な液体（脂肪油、流動パラフィン、または液体ポリエチレングリコールなど）に溶解または懸濁され得る。さらに、安定剤も添加され得る。経口投与向けに製剤化されたマイクロスフェアも使用され得る。そのようなマイクロスフェアは、当該技術分野でよく定義されている。経口投与用製剤はすべて、そのような投与に適した用量のものであるべきである。口腔投与については、組成物は、通常の様式で製剤化された錠剤またはトローチ剤の形態をとり得る。
化合物は、それを全身性に送達することが望ましい場合、注射による非経口投与（例えば、ボーラス投与または持続注入によるもの）向けに製剤化され得る。注射用製剤は、保存剤を添加した単位剤形（例えば、アンプルまたは多用量容器）において提供され得る。組成物は、油性媒体または水性媒体における懸濁液、溶液、または乳濁液などの形態をとり得、懸濁剤、安定剤、及び／または分散剤などの製剤化用薬剤を含み得る。
非経口投与用調製物には、滅菌された水性または非水性の溶液、懸濁液、及び乳濁液が含まれる。非水性溶剤の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油（オリーブ油など）、及び注射用有機エステル（オレイン酸エチルなど）である。水性担体には、水、アルコール性／水性の溶液、乳濁液、または懸濁液（生理食塩水及び緩衝媒体を含む）が含まれる。非経口媒体には、塩化ナトリウム溶液、ブドウ糖リンゲル液、ブドウ糖及び塩化ナトリウム、乳酸リンゲル液、または不揮発性油が含まれる。静脈内媒体には、水分及び栄養の補給液、電解質補給液（ブドウ糖リンゲル液に基づくものなど）、及び同様のものが含まれる。保存剤及び他の添加剤もまた存在し得、こうしたものは、例えば、抗微生物剤、抗酸化剤、キレート剤、及び不活性ガス、ならびに同様のものなどである。他の投与形態（静脈内投与など）の結果から、用量を減らすこともあろう。初回の適用用量では対象の応答が不十分な場合、患者の耐容能が許す程度に用量を増やすこと（または限局性が高まる異なる送達経路を用いることによって用量の効率を高めること）も行われ得る。１日に複数の用量を用いることが企図され、こうすることで、いくつかの実施形態では、化合物の適切な全身レベルが達成される。
後述の実施例では、本明細に開示の本発明のある特定の態様の具体例が示される。
本発明は、目的が達成され、言及される目標及び利点が、それらに内包されるものを含めて得られるように十分に適合化されたものであることを当業者なら容易に理解するであろう。本明細書における説明の詳細及び実施例は、ある特定の実施形態を代表するものであり、例示であり、本発明の範囲を限定することは意図されない。そうしたものの変更及び他の使用を当業者なら思い付くであろう。こうした変更は、本発明の趣旨に包含される。本発明の範囲及び趣旨から逸脱することなく、本明細書に開示の本発明に対してさまざまな置き換え及び変更を実施できることを当業者なら容易に理解するであろう。
本明細書及び特許請求の範囲において使用される「ａ」及び「ａｎ」という冠詞は、異なる定義が明確に示されない限り、複数の指示対象を含むと理解されたい。ある１つの群に属する１つ以上のメンバーの間に「または」を含む請求項または説明は、異なる定義が示されるか、またはその他の様式で文脈から明らかでない限り、当該群メンバーのうちの１つ、複数、またはすべてが、所与の生成物もしくはプロセスに存在するか、そこで用いられるか、またはその他の様式でそれと関連するのであれば、満たされたものと見なされる。本発明は、当該群に属する正確に１つのメンバーが、所与の生成物もしくはプロセスに存在するか、そこで用いられるか、またはその他の様式でそれと関連する実施形態を含む。本発明は、当該群メンバーの複数またはすべてが、所与の生成物もしくはプロセスに存在するか、そこで用いられるか、またはその他の様式でそれと関連する実施形態も含む。さらに、別段の指定がない限り、または矛盾もしくは不一致が生じるであろうことが当業者に明らかであると想定されない限り、１つ以上の限定、要素、項、説明用語などが、列挙される請求項の１つ以上から、同じ基礎請求項に依存する別の請求項（または同様に関連する任意の他の請求項）へと導入される変形、組み合わせ、及び順列はすべて、本発明によって提供されることが理解されよう。本明細書に記載の実施形態はすべて、適切な場合、本発明の異なる態様すべてに適用可能であることが企図される。実施形態または態様はいずれも、適切な場合はいつでも、他のそのような実施形態または態様の１つ以上と自由に組み合わせ可能であることも企図される。要素がリスト（例えば、マーカッシュ群または類似形式のもの）として提示される場合、そうした要素の各部分群も開示されると共に、当該群から任意の要素（複数可）を除外可能であることが理解されよう。一般に、本発明または本発明の態様が特定の要素、特徴などを含むと称される場合、本発明のある特定の実施形態、または本発明のある特定の態様は、そのような要素、特徴などからなるか、またはそれから本質的になると理解されたい。単純化の目的で、そうした実施形態は、そのような多くの言葉を用いて本明細書で場合ごとに具体的には示されていない。本発明の実施形態または態様はいずれも、具体的に除外されることが本明細書に記載されているか否かとは無関係に、請求項から明確に除外可能であることも理解されたい。例えば、１つ以上の核酸、ポリペプチド、細胞、生物種もしくは生物型、障害、対象、またはそれらの組み合わせはいずれも除外可能である。
請求項または説明が組成物（例えば、核酸、ポリペプチド、細胞、または非ヒトトランスジェニック動物）に関する場合、本明細書に開示の方法のいずれかに従って当該組成物を調製または使用する方法、及び本明細書に開示の目的のいずれかのために当該組成物を使用する方法は、別段の指定がない限り、または矛盾もしくは不一致が生じるであろうことが当業者に明らかであると想定されない限り、本発明の態様であることが理解されよう。請求項または説明が方法に関する場合、例えば、当該方法の実施に有用な組成物を調製する方法、及び当該方法に従って生成される生成物は、別段の指定がない限り、または矛盾もしくは不一致が生じるであろうことが当業者に明らかであると想定されない限り、本発明の態様であることが理解されよう。
本明細書で範囲が与えられる場合、本発明は、両方の終点が含まれる実施形態、両方の終点が除外される実施形態、及び一方の終点が含まれ、もう一方の終点が除外される実施形態を含む。別段の指定がない限り、両方の終点が含まれると想定されたい。さらに、別段の指定がない限り、またはその他の様式で文脈及び当業者の理解から明らかでない限り、範囲として示される値は、本発明の異なる実施形態に記載の範囲に含まれる任意の特定の値または部分範囲であり、こうした任意の特定の値または部分範囲は、別に文脈上明確に示されない限り、当該範囲の下限値の単位の１０分の１の桁までのものであると想定され得ることが理解されよう。一連の数値が本明細書に記載される場合、本発明は、当該一連の数値に介在する任意の値に同様に関する実施形態、または当該一連の数値に含まれる任意の２つの値によって定義される範囲に同様に関する実施形態を含み、最小値として下限値をとることができ、最大値として上限値をとることができることも理解されよう。数値には、本明細書で使用されるように、パーセントとして表される値が含まれる。数値の前に「約」または「およそ」が付く本発明の実施形態のいずれについても、本発明は、正確な値が挙がる実施形態を含む。数値の前に「約」または「およそ」が付かない本発明の実施形態のいずれについても、本発明は、当該値の前に「約」または「およそ」が付く実施形態を含む。「およそ」または「約」は、別段の記載がない限り、またはその他の様式で文脈から明らかでない限り、一般に、値からいずれかの向き（その値を上回る向きもしくはその値を下回る向き）に１％広げた範囲以内に含まれる数、またはいくつかの実施形態では値からいずれかの向き（その値を上回る向きもしくはその値を下回る向き）に５％広げた範囲以内に含まれる数、またはいくつかの実施形態では値からいずれかの向き（その値を上回る向きもしくはその値を下回る向き）に１０％広げた範囲以内に含まれる数を含む（但し、そのような値が、とり得る値の１００％を許容不可能なほどに超えると想定される場合を除く）。異なる定義が明確に示されない限り、本明細書で請求される方法の中で、複数の動作を含むもののいずれにおいても、そうした方法の動作の順序は、そうした方法の動作が記載される順序に必ずしも限定されないが、本発明は、順序がそのように限定される実施形態を含むことが理解されよう。別段の指定がない限り、または文脈から明らかでない限り、本明細書に記載の生成物または組成物はいずれも、「単離された」ものであると見なされ得ることも理解されよう。
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実施例１
現存する転写制御モデルの主要な特徴は、確率論的性質を有する生化学的法則によって決定される段階的様式で生じる制御相互作用が基礎をなすことにある。こうしたモデルでは、スーパーエンハンサーが関与するという知見が最近得られたこと、または２つの異なる遺伝子においてエンハンサーが同期的に転写バーストを生じさせる能力を有することを説明するとなると、限界が生じる。相分離多分子集合体からは、細胞内で生化学反応をコンパートメント化する上で必要不可欠な制御機構が得られる。本発明者らは、相分離モデルが、スーパーエンハンサーを形成、乱れに対するスーパーエンハンサーの感度、スーパーエンハンサーの転写バーストパターン、及び複数の遺伝子に対してエンハンサーが同時に作用する能力を含めて、既知の転写制御特徴の説明を容易化するものであることを提唱する。このモデルからは、哺乳類における遺伝子制御原理をさらに探求するための概念的枠組みが得られる。
序論
転写制御の最近の研究から明らかになっている知見のいくつかは、これまで定量的な説明に欠けており、不可解なものであるが、そうした知見に対する理解が深まれば、発生及び疾患の間に生じる遺伝子制御に対する新規かつ有用な洞察が得られる可能性がある。例えば、任意の所与のヒト細胞型においては、数千のエンハンサーエレメントが数千の遺伝子の活性を制御するが、細胞型特異的プロセスにおいて特に顕著な役割を有する遺伝子を制御するのは、スーパーエンハンサー（ＳＥ）と呼ばれる数百のエンハンサークラスターである（ＥＮＣＯＤＥ Ｐｒｏｊｅｃｔ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ ｅｔ ａｌ．，２０１２、Ｈｎｉｓｚ ｅｔ ａｌ．，２０１３、Ｌｏｖｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３、Ｐａｒｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１３、Ｒｏａｄｍａｐ Ｅｐｉｇｅｎｏｍｉｃｓ ｅｔ ａｌ．，２０１５、Ｗｈｙｔｅ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。がん細胞は、スーパーエンハンサーを獲得して顕著ながん遺伝子の発現を誘導することから、ＳＥは、発生及び疾患の両方において重要な役割を担う（Ｃｈａｐｕｙ ｅｔ ａｌ．，２０１３、Ｌｏｖｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。スーパーエンハンサーは、相互作用因子によって異常に高密度で占有され、典型的エンハンサーと比較して高いレベルで転写を誘導することができ、ほとんどのエンハンサーと共通して結び付くコンポーネントが乱れると例外的に影響を受ける（Ｃｈａｐｕｙ ｅｔ ａｌ．，２０１３、Ｈｎｉｓｚ ｅｔ ａｌ．，２０１３、Ｌｏｖｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３、Ｗｈｙｔｅ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。
最近の研究から新たに得られている別の不可解な知見は、単一のエンハンサーが複数の近位遺伝子を同時に活性化できるということである（Ｆｕｋａｙａ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。エンハンサーは、その活性化対象である遺伝子のプロモーターと物理的に接しており、クロマチン接触マッピング技術を使用した初期の研究（例えば、β－グロビン遺伝子座に対してこの技術を使用したもの）では、任意の所与の時点でエンハンサーが活性化させるのは、遺伝子座内にいくつかあるグロビン遺伝子のうちの１つのみであることが明らかとなった（Ｐａｌｓｔｒａ ｅｔ ａｌ．，２００３、Ｔｏｌｈｕｉｓ ｅｔ ａｌ．，２００２）。しかしながら、高い時間分解能で定量的な画像化を行ったより最近の研究からは、エンハンサーが、典型的には遺伝子を一気に活性化し、２つの遺伝子プロモーターが同じエンハンサーによって活性化されると、これらの遺伝子プロモーターが同期的バーストを示し得ることが明らかとなった（Ｆｕｋａｙａ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。
以前の転写制御モデルからは、遺伝子制御の原理に対する重要な洞察が得られている。以前の転写制御モデルのほとんどの主要な特徴は、確率論的性質を有する生化学的法則によって決定される段階的様式で生じる制御相互作用が基礎をなすことにある（Ｃｈｅｎ ａｎｄ Ｌａｒｓｏｎ，２０１６、Ｅｌｏｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，２００２、Ｌｅｖｉｎｅ ｅｔ ａｌ．，２０１４、Ｏｒｐｈａｎｉｄｅｓ ａｎｄ Ｒｅｉｎｂｅｒｇ，２００２、Ｒａｓｅｒ ａｎｄ Ｏ’Ｓｈｅａ，２００４、Ｓｐｉｔｚ ａｎｄ Ｆｕｒｌｏｎｇ，２０１２、Ｓｕｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１１、Ｚｏｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。そのような動力学的モデルは、単一遺伝子レベルでの遺伝子活性化が確率論的かつノイズのあるプロセスであることを予測するものであると共に、多段階制御プロセスがどのように固有ノイズを抑制し、結果的にバーストを生じさせ得るのかということに対する洞察を与えるものでもある。こうしたモデルでは、ＳＥの形成、機能、及び特性の基礎をなす機構には光が当たっていないか、または謎（同じエンハンサーによって活性化された場合に２つの遺伝子プロモーターがどのように同期的バーストを示すのかということなど）対する説明は得られない。
本発明者らは、本明細書において、上記の謎を説明し得るモデルを提唱及び探求する。このモデルは、多分子集合体の相分離に関する原理に基づく。
転写制御における協同性
エンハンサーが発見されてから３０年以上にわたって、エンハンサーの機能特性を定量的様式で説明しようと数々の研究が試みており、こうした試みのほとんどが、エンハンサーコンポーネント間に協同的な相互作用が生じるという概念に依存している。古典的には、エンハンサーは、標的遺伝子プロモーターの上流または下流にさまざまな距離をとっていずれかの向きで挿入されるとそうしたプロモーターからの転写を増加させ得るエレメントとして定義されている（Ｂａｎｅｒｊｉ ｅｔ ａｌ．，１９８１、Ｂｅｎｏｉｓｔ ａｎｄ Ｃｈａｍｂｏｎ，１９８１、Ｇｒｕｓｓ ｅｔ ａｌ．，１９８１）。エンハンサーは、典型的には、数百塩基対のＤＮＡからなり、エンハンサーには、複数の転写因子（ＴＦ）分子が協同的な様式で結合する（Ｂｕｌｇｅｒ ａｎｄ Ｇｒｏｕｄｉｎｅ，２０１１、Ｌｅｖｉｎｅ ｅｔ ａｌ．，２０１４、Ｍａｌｉｋ ａｎｄ Ｒｏｅｄｅｒ，２０１０、Ｏｎｇ ａｎｄ Ｃｏｒｃｅｓ，２０１１、Ｓｐｉｔｚ ａｎｄ Ｆｕｒｌｏｎｇ，２０１２）。古典的には、協同的結合は、ＤＮＡに１つのＴＦ分子が結合すると別のＴＦ分子の結合に影響が及ぶ現象を説明するものである（図３Ａ）（Ｃａｒｅｙ，１９９８、Ｋｉｍ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，１９９７、Ｔｈａｎｏｓ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，１９９５、Ｔｊｉａｎ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，１９９４）。エンハンサーに対する転写因子の協同的結合は、ＤＮＡの屈曲にＴＦが影響を与えること（Ｆａｌｖｏ ｅｔ ａｌ．，１９９５）、ＴＦ間に相互作用が生じること（Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９７９）、及びＴＦによって大きな補助因子複合体が組み合わさって動員されること（Ｍｅｒｉｋａ ｅｔ ａｌ．，１９９８）に起因することが提唱されている。
スーパーエンハンサーは、高度に協同的な特性を示す。
細胞型特異的プロセスにおいて特に顕著な役割を有する遺伝子を制御するのは、スーパーエンハンサー（ＳＥ）と呼ばれる数百のエンハンサークラスターである（Ｈｎｉｓｚ ｅｔ ａｌ．，２０１３、Ｗｈｙｔｅ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。ＳＥの形成及び機能には協同的特性が特に重要であることを示す主要なＳＥ特徴は３つある：１）ＳＥは、相互作用因子によって異常に高密度で占有される、２）ＳＥは、単一の核形成事象によって形成され得る、及び３）ＳＥは、ほとんどのエンハンサーと共通して結び付くいくつかのコンポーネント（すなわち、スーパーエンハンサーコンポーネント）が乱れると例外的に影響を受ける。
ＳＥは、エンハンサー関連因子によって異常に高密度で占有されるものであり、こうしたエンハンサー関連因子には、転写因子、補助因子、クロマチン制御因子、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ、及び非コードＲＮＡが含まれる（Ｈｎｉｓｚ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。非コードＲＮＡ（エンハンサーＲＮＡまたはｅＲＮＡ）は、ＳＥ内の転写因子結合部位における分岐転写によって生じるものであり（Ｈａｈ ｅｔ ａｌ．，２０１５、Ｓｉｇｏｖａ ｅｔ ａｌ．，２０１３）、エンハンサー活性及び近位遺伝子の発現にシスで寄与し得る（Ｄｉｍｉｔｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．，２０１４、Ｅｎｇｒｅｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，２０１６、Ｌａｉ ｅｔ ａｌ．，２０１３、Ｐｅｆａｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。ＳＥにおけるタンパク質因子及びｅＲＮＡの密度は、ゲノム中の典型的エンハンサーにおける同じコンポーネントセットの密度のおよそ１０倍であると推計されている（図３Ｂ）（Ｈｎｉｓｚ ｅｔ ａｌ．，２０１３、Ｌｏｖｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３、Ｗｈｙｔｅ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。ＳＥ内のエンハンサークラスターは、互いに物理的に密接に接触すると共に、その活性化対象である遺伝子のプロモーター領域とも物理的に密接に接触することが、クロマチン接触マッピング法によって示されている（図３Ｃ）（Ｄｏｗｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４、Ｈｎｉｓｚ ｅｔ ａｌ．，２０１６、Ｊｉ ｅｔ ａｌ．，２０１６、Ｋｉｅｆｆｅｒ－Ｋｗｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。
ＳＥは、単一の転写因子結合部位が、他にも因子が追加で結合する可能性のあるＤＮＡ領域に導入される結果として形成され得る。Ｔ細胞性白血病では、一方のアレルに小さな挿入（２～１２ｂｐ）が生じることが、マスター転写因子ＭＹＢの結合部位の創出よるＳＥ全体の形成の核となり、その結果、隣接する結合部位に転写制御因子が追加動員され、ＳＥに特有の特徴を有する因子集合領域が８ｋｂのドメインに広がって構築される（Ｍａｎｓｏｕｒ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。炎症性の刺激もまた、内皮細胞におけるＳＥの急速な形成に繋がり、ここでもまた、炎症性の刺激に応答して生じる単一の転写因子結合事象が核となってＳＥが形成されるものと思われる（Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。
何万もの塩基対にまたがるスーパーエンハンサー全体は、その補助因子が乱されると一単位として崩壊し得、ＳＥ内の構成エンハンサーを遺伝的に欠失させると、他の構成要素の機能が損なわれ得る。例えば、コアクチベーターＢＲＤ４は、ＳＥ、典型的エンハンサー、及びプロモーターにおけるアセチル化クロマチンに結合するが、アセチル化クロマチンへのＢＲＤ４の結合を遮断する薬剤に対する感受性がはるかに高いのはＳＥである（Ｃｈａｐｕｙ ｅｔ ａｌ．，２０１３、Ｌｏｖｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。サイクリン依存性キナーゼＣＤＫ７の阻害に対しても同様にＳＥの感受性が過剰に高いことも複数の研究において観測されている（Ｃｈｉｐｕｍｕｒｏ ｅｔ ａｌ．，２０１４、Ｋｗｉａｔｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，２０１４、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。このキナーゼは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ＲＮＡＰＩＩ）による転写の開始に必要不可欠なものであり、ＲＮＡＰＩＩの反復Ｃ末端ドメイン（ＣＴＤ）をリン酸化する（Ｌａｒｏｃｈｅｌｌｅ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。さらに、ＳＥ内の構成エンハンサーを遺伝的に欠失させると、スーパーエンハンサー内の他の構成要素の活性が損なわれ得（Ｈｎｉｓｚ ｅｔ ａｌ．，２０１５、Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１６、Ｐｒｏｕｄｈｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１６、Ｓｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１６）、スーパーエンハンサー全体の崩壊に繋がり得るが（Ｍａｎｓｏｕｒ ｅｔ ａｌ．，２０１４）、構成エンハンサーのこの相互依存は、発生的に制御されるいくつかのスーパーエンハンサーについては不明確である（Ｈａｙ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。
まとめると、いくつかの系統の証拠は、ＳＥの形成及び機能が、多くの構成エンハンサー及びそれらに結合する因子を空間的に近接するように導く協同的なプロセスを伴うものであることを示している。タンパク質及び核酸の高密度で存在すること、これに加えて、こうした分子の間に協同的相互作用が生じることは、細胞内構造体と呼ばれる無膜オルガネラが真核細胞に形成に関与している（Ｂａｎｊａｄｅ ｅｔ ａｌ．，２０１５、Ｂｅｒｇｅｒｏｎ－Ｓａｎｄｏｖａｌ ｅｔ ａｌ．，２０１６、Ｂｒａｎｇｗｙｎｎｅ ｅｔ ａｌ．，２００９）。以下では、本発明者らは、細胞内構造体の形成の特徴について初めて説明し、さらには、関連概念を活用したスーパーエンハンサーの形成及び機能のモデルを構築する。
相分離による無膜オルガネラの形成
真核細胞は、細胞内構造体と呼ばれる無膜オルガネラを含み、こうした無膜オルガネラは、細胞内で必要不可欠な生化学反応をコンパートメント化する上で必要不可欠な役割を担う。こうした構造体は、多価分子の間の協同的相互作用によって媒介される相分離によって形成される（Ｂａｎｊａｄｅ ｅｔ ａｌ．，２０１５、Ｂｅｒｇｅｒｏｎ－Ｓａｎｄｏｖａｌ ｅｔ ａｌ．，２０１６、Ｂｒａｎｇｗｙｎｎｅ ｅｔ ａｌ．，２００９）。核におけるそのようなオルガネラの例としては核小体（ｒＲＮＡ新生が生じる場所）、カハール体（核内低分子ＲＮＰの構築場所として働く）、及び核スペックル（ｍＲＮＡスプライシング因子の貯蔵コンパートメント）が挙げられる（Ｍａｏ ｅｔ ａｌ．，２０１１、Ｚｈｕ ａｎｄ Ｂｒａｎｇｗｙｎｎｅ，２０１５）。こうしたオルガネラは、液滴の特性を示し、例えば、こうしたオルガネラは、分裂及び融合を起こし得るため、その形成は、液－液相分離によって媒介されるものと説明されている。精製されたＲＮＡとＲＮＡ結合タンパク質との混合物は、こうした型の相分離構造体をインビトロで形成する（Ｂｅｒｒｙ ｅｔ ａｌ．，２０１５、Ｆｅｒｉｃ ｅｔ ａｌ．，２０１６、Ｋａｔｏ ｅｔ ａｌ．，２０１２、Ｋｗｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０１２、Ｗｈｅｅｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。こうした知見と一致して、過去の理論研究は、ゲルの形成が、通常、相分離によって達成されることを示している（Ｓｅｍｅｎｏｖ ａｎｄ Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ，１９９８）。したがって、いくつかの研究は、タンパク質及び核酸の高密度で存在すること、これに加えて、こうした分子の間に協同的相互作用が生じることが、相分離した細胞内構造体の形成に関与することを示している。
上記のように、スーパーエンハンサーは、本質的には、転写因子、転写補助因子、クロマチン制御因子、非コードＲＮＡ、及びＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ＲＮＡＰＩＩ）の高密度協同的集合体であると考えることができる。さらに、低複雑性ドメインを有するいくつかの転写因子は、ゲル様構造をインビトロで創出することが提唱されている（Ｈａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１２、Ｋａｔｏ ｅｔ ａｌ．，２０１２、Ｋｗｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。したがって、本発明者らは、相分離多分子集合体の形成に伴う相分離が、ＳＥ形成の間に生じる可能性があり、典型的エンハンサーでは生じる頻度が低いという仮説を立てている（図４Ａ）。
ＳＥの構築及び機能に対する相分離の役割を探求するために、本発明者らは、相互作用コンポーネントの数及び結合価、ならびにこうした転写制御因子及び核酸の間の相互作用の親和性と関連付けて協同性を強調する単純なモデルを提唱する。このモデルのコンピューターシミュレーションは、ＳＥの重要な特徴が、その形成、機能、及び脆弱性の側面を含めて、相分離によって説明され得ることを示す。このシミュレーションは、弱いエンハンサー及び強いエンハンサーによって誘導される転写バーストパターンの間に差異が観測されること、ならびに単一の共有エンハンサーによって制御される複数の遺伝子が同時バーストすることとも一致する。本発明者らは、この相分離モデルから得られるいくつかの意義及び予測に着目することによって、この相分離モデルが脊椎動物におけるこの転写制御概念をさらに探求するする上での指針となり得ると結論付ける。
エンハンサーの構築及び機能の相分離モデル
エンハンサー及びＳＥに結合する分子（転写因子、転写コアクチベーター（例えば、ＢＲＤ４）、ＲＮＡＰＩＩ、及びＲＮＡなど）の多くが、複数の部位に可逆的な化学修飾（例えば、アセチル化、リン酸化）を受け得る。こうした多価分子は、そのような修飾を受けると、複数の他のコンポーネントと相互作用できるようになり、それによって「架橋」を形成する（図４Ａ）。本明細書では、架橋は、可逆的な化学修飾を含む、任意の可逆的特徴、または動的な結合相互作用及び非結合相互作用に関与する任意の他の特徴を有するものとして定義され得る。相分離が、観測されるある特定の転写制御特徴の基礎をなし得るかどうかを考える上では、相互作用分子の結合価及び親和性（生物学者が測定するパラメーター）の変化に相分離が依存することを説明するために単純なモデルが必要である。以下では、本発明者らは、そのようなモデルについて記載し、このモデルのパラメーターがどのように典型的エンハンサー及びスーパーエンハンサーの特徴を示すのかについて説明する。
このモデルでは、エンハンサーのタンパク質コンポーネント及び核酸コンポーネントは、鎖様分子として表現され、こうした鎖様分子のそれぞれが、他の鎖との相互作用に関与する可能性があり得る一連の残基を含む（図４Ｂ）。こうした残基は、可逆的な化学修飾を受け得る部位として表現され、こうした残基の修飾は、それらの残基が鎖の間に非共有結合性の架橋相互作用を形成する能力と結び付く（図４Ｂ）。転写因子、補助因子、及びＲＮＡポリメラーゼＩＩのＣ末端ドメイン（ＣＴＤ）のヘプタペプチド反復配列を含めて、多数のエンハンサーコンポーネントがリン酸化を受け、こうしたエンハンサーコンポーネントは、そのリン酸化状態に基づいて他のタンパク質に結合することが知られている（Ｐｈａｔｎａｎｉ ａｎｄ Ｇｒｅｅｎｌｅａｆ，２００６）。本発明者らのモデルは、結合相互作用を生じさせ得るそのようなリン酸化または脱リン酸化、ならびにヒストン及びエンハンサーに見られる他のタンパク質及び転写制御因子の相互作用（アセチル化、メチル化、または他の型の化学修飾によって調節される）を含む。簡潔には、本発明者らは、すべての型の化学的な修飾及び脱修飾を、一般に、それぞれ「修飾因子」及び「脱修飾因子」によって媒介される「修飾」及び「脱修飾」と称する。
このモデルは、その最も単純な形態では、以下の３つのパラメーターを有する：１）「Ｎ」＝系における巨大分子（「鎖」とも称される）の数。このパラメーターによって相互作用コンポーネントの濃度が設定される（Ｎ値が大きくなるほど濃度が高くなる）。ＳＥは、より大きなＮ値を有すると考えられる一方で、典型的エンハンサーは、それが有するコンポーネントの数がより少ないものとしてモデル化される。２）「ｆ」＝結合価（各分子の残基の中で、修飾され、他の鎖との架橋に関与する可能性を有し得る残基の数に対応する）。本発明者らの単純モデルでは、残基が別の鎖と架橋を創出することが可能になるには、当該残基が修飾される必要があることに留意されたい。概念的には、残基の架橋形成に脱修飾状態が必要であるならば、架橋形成を可能化または阻害する酵素活性が逆転しない限り、このモデルは同様に機能する。３）Ｋｅｑ＝（ｋｏｎ／ｋｏｆｆ）（架橋反応または相互作用を説明する結合速度及び解離速度によって定義される平衡定数）（図４Ｂ）。
このモデルの平衡特性は、少数の前提事項（鎖長は長いものとする、及び分子内架橋または同じ２つの鎖の間に複数の結合を許容しないなど）を考慮して分析的に得ることができる（Ｃｏｈｅｎ ａｎｄ Ｂｅｎｅｄｅｋ，１９８２、Ｓｅｍｅｎｏｖ ａｎｄ Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ，１９９８）。相互作用鎖の限界濃度（Ｃ＊）を超えると、相分離が生じて多分子集合体が創出される。こうした条件の下では、Ｃ＊は、１／Ｋｅｑｆ２に従って変化する。したがって、集合体が形成されるための限界濃度は、結合価に敏感に依存し、結合定数にはそれほど依存しない。
本発明者らは、モデルのコンピューターシミュレーションを実施（上記の平衡理論における前提事項のいくつかを緩和した）することで、その平衡特性というよりは、むしろその動的特性を探求した。モデルの動的コンピューターシミュレーションでは、結合価は、残基の修飾及び脱修飾に伴って０～「ｆ」の間で変化し、本発明者らの試験では、修飾反応速度及び脱修飾反応速度は変動しない。系における修飾因子と脱修飾因子との比（例えば、キナーゼとホスファターゼとの比）によって、各コンポーネント上で修飾され、架橋し得る部位の数が決まり、本発明者らの試験では、この比は変動する。
エンハンサーまたはＳＥのさまざまなコンポーネントが密集する領域に相当する体積を固定し、鎖の数をＮとしてモデルのシミュレーションを実施した。本発明者らは、さまざまなＮ値を考慮した。シミュレーションの間は、修飾及び脱修飾が鎖に生じ得、その際、動力学的定数はｋ修飾＝０．０５、ｋ脱修飾＝０．０５とされる。修飾因子レベル及び脱修飾因子レベル（Ｎ修飾、Ｎ脱修飾）は変動する。架橋の形成及び解離は、動力学的定数をｋｏｎ＝０．５及びｋｏｆｆ＝０．５（Ｋｅｑ＝ｋｏｎ／ｋｏｆｆ＝１）としてシミュレーションされる。異なる鎖上の修飾残基のみに架橋形成を許容した。すなわち、鎖内架橋反応は許容されないが、２つの鎖の間には複数の結合が形成され得る。あらゆる鎖上のあらゆる部位が、他の鎖上のすべての他の部位と架橋することを許容するという限定条件でシミュレーションを実施した（Ｃｏｈｅｎ ａｎｄ Ｂｅｎｅｄｅｋ，１９８２、Ｓｅｍｅｎｏｖ ａｎｄ Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ，１９９８）。すなわち、相互作用部位の平均濃度（Ｎ及び修飾部位数によって決定される）が存在する一方で、シミュレーション体積内の局所濃度変動は考慮されない。
シミュレーションは、Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅアルゴリズム（Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅ，１９７７）を使用して実施し、このアルゴリズムでは、考慮される動的プロセス（すなわち、修飾反応及び架橋反応）を時間発展させた確率論的軌跡が生成される。任意の単一軌跡は、サイズが変動するクラスターに対して相互作用鎖がどのように分布するかを含めて、相互作用鎖の状態の時間発展を表すものである。すべての軌跡の初期化において、鎖は脱修飾され、架橋が存在しない状態とされ、すなわち、各鎖は、「個別クラスター」内にあるようにされる。シミュレーションは、安定状態に到達するまで実行され、安定状態に到達すると、系の特性（例えば、平均クラスターサイズ）が時間変動しなくなる。統計的に平均化された特性を得るために、必要に応じて、すべての計算について複数の軌跡（５０回反復実行して得られるもの）が取得される。
シミュレーションでは、架橋鎖の最大クラスターのサイズを、転写活性（ＴＡ）に代わるものとして定義した（鎖の総数によって調整される）［ＴＡ＝（クラスターｍａｘのサイズ）／Ｎ］。系におけるすべての鎖が単一の架橋クラスターを形成すると（ＴＡ＝約１）、相分離集合体の生成が終了する。この集合体は、エンハンサー／ＳＥに対する因子の結合、さらにはプロモーターに対する因子の結合も含むと考えられ、こうした結合が、遺伝子の転写増進に重要なコンポーネントの密集を引き起こす。本発明者らは、エンハンサー及びＳＥによって生じる転写活性を時間の関数として記録した。
結合価の変化を伴う転写制御
結合価の関数として転写活性をモデル化したところ、典型的エンハンサーの形成と比較してＳＥの形成にはより顕著な協同性が伴うことが明らかとなった（図４Ｃ）。こうしたシミュレーションでは、ＳＥは、Ｎ＝５０分子からなる系としてモデル化し、典型的エンハンサーは、Ｎ＝１０分子からなる系としてモデル化しており、こうしたエレメントにおけるコンポーネントの密度差異がおよそ１桁であることと一致させた（Ｈｎｉｓｚ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。次に、本発明者らは、結合価を変えて転写活性（ＴＡ）をグラフ化し、その間、他のパラメーターはすべて、一定に保った。ＳＥでは、正規化結合価値が２（すなわち、ｆ＝３の参照値の２倍）のときに転写活性が最大転写活性の約９０％に達した一方で、典型的エンハンサーでは、最大転写活性の９０％が達成されるのは、正規化結合価値が５のときである。正規化結合価が２のとき、典型的エンハンサーでは、転写活性が最大転写活性の約４０％に達した（図４Ｃ）。こうした結果は、同一条件の下では、多数のコンポーネントからなるＳＥが、少数のコンポーネントからなる典型的エンハンサーと比較して低い結合価レベルで、より大きな連結クラスター（すなわち、相分離を起こす）を形成することを示唆している。さらに、ＳＥでは、正規化結合価値が約１．５のときに転写活性が急上昇する一方で、典型的エンハンサーでは、結合価が上昇しても転写活性の上昇はより穏やかかつなだらかなものであることが観測され（図４Ｃ）、このことは、以前の考察と一致する（図３Ａ）（Ｌｏｖｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。
協同性の増進に起因して相互作用コンポーネント（すなわち、スーパーエンハンサーコンポーネント）の結合価の変化時にＳＥの転写活性変化が急速化することは、ヒル係数によって定量化することができる。ＳＥの挙動は、ヒル係数の値が大きくなることによって特徴付けられ、このことは、協同性が大きくなり、結合価の変化に対して過剰感受性であることを示している（図４Ｃ）。実際、図４Ｃの挿入図に示されるように、約Ｎ０．４として、エンハンサーに関与するコンポーネントの数に応じて、広いＮ値範囲にわたってヒル係数が上昇している。同様に、予測した通り、典型的エンハンサーの転写活性とＳＥの転写活性との間の差異は、それらのモデル化に使用する「Ｎ」値の差異と相関した。Ｎの差異が十分に大きい場合、図４Ｃに報告される挙動が再現される（図８）。
スーパーエンハンサーの形成及び脆弱性
相分離モデルのこうした予測は、以前に公開された実験データと定性的に一致している。例えば、ＴＮＦαによって内皮細胞を刺激すると、炎症性遺伝子にＳＥが形成される（Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。この文献では、転写補助因子ＢＲＤ４（ＳＥ及び典型的エンハンサーの主要コンポーネント）のゲノム占有によってＳＥ形成が監視された。こうした細胞において炎症性の刺激が生じると、他の遺伝子における典型的エンハンサーと比較して炎症性遺伝子のＳＥへとＢＲＤ４がより顕著に動員された（Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。このことが生じる理由は、相互作用コンポーネントの結合価を変化させる修飾がＴＮＦαによる刺激によって生じ、ＳＥについては、典型的エンハンサーと比較して低い結合価値を上回ると相分離が急激に生じ、それによって相互作用コンポーネント（ＢＲＤ４など）の動員が増進するためであることを、本発明者らの相分離モデルは示唆している（図４Ｃ）。
次に、本発明者らは、共通の転写補助因子が阻害剤によって乱れることに対してＳＥが異常に脆弱性であることが相分離モデルによって説明されるかどうかを調べた。ＢＲＤ４及びＣＤＫ７は、典型的エンハンサーのコンポーネントでもあり、ＳＥのコンポーネントでもあるが、ＳＥ及びその関連遺伝子は、典型的エンハンサーと比較してＢＲＤ４及びＣＤＫ７の化学的阻害に対する感受性がはるかに高い（図５Ａ）（Ｃｈｉｐｕｍｕｒｏ ｅｔ ａｌ．，２０１４、Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４、Ｋｗｉａｔｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，２０１４、Ｌｏｖｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。本発明者らは、本発明者らの系における脱修飾因子／修飾因子活性の比を変化させる（相互作用分子内の修飾部位のバランスが変化する）ことによって結合価を減少させたときのＢＲＤ４阻害剤及びＣＤＫ７阻害剤の作用をモデル化した。これを行った理由は、ＣＤＫ７が、修飾因子として働くキナーゼであり、ＢＲＤ４が、多くのコンポーネントと相互作用し得る大きな結合価を有しており、それ故にＢＲＤ４を阻害することによって相互作用コンポーネントの平均結合価が不相応に減少するものであることによるものである。図５Ｂに示されるように、ＳＥ（Ｎ＝５０）は、典型的エンハンサー（Ｎ＝１０）と比較して低い脱修飾因子／修飾因子比でその活性を急激かつ大幅に失う。こうした結果は、相分離が、主要な変数が閾値を超えると突然生じる協同的現象であるため、ＳＥ活性が結合価の変動に対して高い感受性を有するという概念と一致する。
転写バースト
真核生物における遺伝子発現は、一般に、突発性であり、転写バーストからなり立っている。本発明者らは、相分離モデルが転写バーストを予測し得るかどうかを調べた。生細胞において転写バーストを定量的に画像化した最近の研究からは、エンハンサーによって誘導される遺伝子発現のレベルが転写バーストの頻度と相関することが示唆されている（Ｆｕｋａｙａ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。弱いエンハンサーと比較して強いエンハンサーでは、バーストの誘導頻度が高く、ある特定の強度レベルを超えると、複数のバーストがもはや分離されず、その結果、比較的一定した高い転写活性が見られた（図６Ａ）。相分離モデルは、ＳＥが、強いエンハンサーによって示される低変動（比較的一定した高い転写活性を中心とするもの）バーストパターンを伴って高頻度でバーストを繰り返す一方で、典型的エンハンサーが示すバーストは、変動が大きく、頻度は低いことを示している（図６Ｂ）。ＳＥについては、相分離が持続的に生じると（ＴＡが飽和する）、揺らぎが静まり、その結果、ＴＡの変動が低下する。このバーストパターン差異は、本発明者らの結果をパワースペクトルに変換することによって定量化できる。強いエンハンサーは、ＳＥと比較してコンポーネント数（Ｎ）が少ないものの、典型的エンハンサーと比較して、結合価架橋数が大きいため、安定な相分離多分子集合体をより容易に形成することになると、本発明者らは予測する。それ故に、本発明者らのモデルからは、ＳＥのような強いエンハンサーが、弱いエンハンサーまたは典型的エンハンサーと比較して異なる転写バーストパターンを示すであろうことが予測される。
相分離モデルは、２つのプロモーターが、同じエンハンサーによって活性化されると同期的バーストを示し得る（Ｆｕｋａｙａ ｅｔ ａｌ．，２０１６）という興味深い知見とも一致しており、この場合、相分離集合体には、当該エンハンサー及び両方のプロモーターが取り込まれている（図６Ｃ）。
相分離集合体をインビボで形成する候補転写制御因子
本発明者らの単純モデルでは、相互作用コンポーネント（すなわち、スーパーエンハンサーコンポーネント）上の残基の修飾度（または結合価）が変化する結果、分子間相互作用が生じることによって相分離が媒介される。一方で、実際は、エンハンサーは、そのような相互作用を説明し得る多くの多様な因子から構成されており、こうした因子のほとんどが、可逆的な化学修飾を受ける（図７）。こうしたコンポーネントには、転写因子、転写コアクチベーター（メディエーター複合体及びＢＲＤ４など）、クロマチン制御因子（例えば、ヒストン修飾のリーダー、ライター、及びイレイサー）、サイクリン依存性キナーゼ（例えば、ＣＤＫ７、ＣＤＫ８、ＣＤＫ９、ＣＤＫ１２）、ＲＮＡ結合タンパク質を伴う非コードＲＮＡ、ならびにＲＮＡポリメラーゼＩＩが含まれる（Ｌａｉ ａｎｄ Ｓｈｉｅｋｈａｔｔａｒ，２０１４、Ｌｅｅ ａｎｄ Ｙｏｕｎｇ，２０１３、Ｌｅｖｉｎｅ ｅｔ ａｌ．，２０１４、Ｍａｌｉｋ ａｎｄ Ｒｏｅｄｅｒ、２０１０）。こうした分子の多くが多価であり、すなわち、複数のモジュラードメインまたは相互作用モチーフを含み、それ故に、複数の他のエンハンサーコンポーネントと相互作用することができる。例えば、ヒト細胞では、ＲＮＡポリメラーゼＩＩの大サブユニットは、そのＣ末端ドメイン（ＣＴＤ）にヘプタペプチド５２回反復配列を含んでおり、いくつかの転写因子は、低複雑性ドメインの反復配列、またはポリマー化易発性の同じアミノ酸区間の反復配列を含む（Ｇｅｍａｙｅｌ ｅｔ ａｌ．，２０１５、Ｋｗｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。エンハンサー及び多くのプロモーターのＤＮＡ部分は、複数の転写因子に対する結合部位を含んでおり、こうした転写因子のいくつかは、ＤＮＡ及びＲＮＡの両方に同時に結合し得る（Ｓｉｇｏｖａ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。エンハンサーにおけるヒストンタンパク質は、クロマチンリーダーによって認識され得る修飾の含量が高まっており、それ故に、隣接ヌクレオソームは、複数のクロマチンリーダーと相互作用できるプラットホームであると考えることができる。ＲＮＡは、それ自体が化学的に修飾され、複数のＲＮＡ結合分子及びスプライシング因子と物理的に相互作用し得る。こうした相互作用に関与する残基の多くが、「架橋」を形成し得る（図７）。
相分離モデルから考え得る意義及び予測
本発明者らの単純な相分離モデルからは、発生及び疾患における遺伝子制御の原理をさらに探求するための概念的枠組みが得られる。以下では、本発明者らは、転写制御における相分離多分子複合体の構築と関連する可能性のある少数の現象例、及びモデルから得られるいくつかの試験可能な予測について論じる。
転写制御因子の相分離多分子集合体の可視化
モデルに必要不可欠なことは、転写制御因子の多分子集合体の相分離がインビボで直接的に観測され得るかどうかを試験し、そうした複合体の相分離が遺伝子活性と結び付くことを実証することである。いくつかの系統の最近の研究からは、こうした問いに対する最初の洞察が得られる。例えば、高分解能顕微鏡法を使用した最近の研究は、シグナル刺激が生じると、哺乳類の生細胞においてＲＮＡポリメラーゼＩＩの大きなクラスターが形成されること（Ｃｉｓｓｅ ｅｔ ａｌ．，２０１３）、及び遺伝子のサブセットにおける転写が一致して活性化されること（Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ．，２０１６）を示している。したがって、この技術ならびに他の単分子技術（Ｃｈｅｎ ａｎｄ Ｌａｒｓｏｎ，２０１６、Ｓｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１７）を使用すれば、ＳＥによって制御される遺伝子の近傍に相分離多分子複合体が形成されるかどうか、及び本発明者らが本明細書に記載する単純モデルが転写制御の特徴を予測するかどうか、を可視化及び試験することが可能となり得る。一例として、本発明者らは、ＲＮＡＰＩＩ Ｃ末端ドメイン（ヘプタペプチド５２回反復配列からなる）が、この集合体内の結合価に寄与する主要因子であり、短縮型ＣＴＤを有するＲＮＡＰＩＩを発現する細胞では、クラスターの半減期が顕著に低下するであろうという仮説を立てている。
シグナル依存性の遺伝子制御
細胞は、情報を遺伝子に中継するシグナル伝達経路介して、自体の環境を感知し、それに応答するが、特定のシグナル伝達経路に応答する遺伝子は、同じシグナルに対する活性化の大きさが異なり得る。本発明者らは、相分離が生じると集合体が、脱修飾因子であるコンポーネントを動員するという仮説を用いて計算を実施した。こうした条件の下では、相分離（すなわち、転写活性）への移行及び相分離（すなわち、転写活性）の解消は、典型的エンハンサーと比較してＳＥではより明瞭である。興味深いことに、そのようなシミュレーションは、ＳＥコンポーネントの最大結合価及び最大数が存在し、この最大結合価及び最大数を超えると、現実的な時間尺度では集合解離することが不可能であることを示唆している（図９）。これは、こうした分子がそのように重度に架橋すると、準安定状態に長時間留まるためである。このモデルから予測されることは、細胞シグナル伝達が病的に過剰活性化されることが病状の基礎をなしており、この病的な過剰活性化が、正常な生理学的条件の下ではそうした病状を相殺することになるシグナルに対して少なくとも一時的に無応答性となる発現プログラムへと細胞をロックすることによって生じる得ということである。本発明者らは、相互作用コンポーネントの結合価または数を増加させることによってそのような状態を人工的に誘導し得ると推測する。
転写制御の忠実度
同じ環境シグナルに曝露された同系細胞集団内での遺伝子の転写物レベルの変動（転写ノイズと称される）は、細胞表現型に大きな影響を与え得る（Ｒａｊ ａｎｄ ｖａｎ Ｏｕｄｅｎａａｒｄｅｎ，２００８）。相分離モデルは、ＳＥの形成には高い協同性が伴うため、結合価（修飾因子／脱修飾因子比によって調節され、この調節は、実は、発生シグナルが活性化カスケードを介して伝達されることと類似している）が、厳格に規定された閾値を超えると転写が生じることを示している（図４Ｃ）。典型的エンハンサーでは、コンポーネントの数が少ないため、環境シグナルに伴う転写の変動は、幅広い範囲のシグナル強度にわたって連続化し、これによって「ノイズが多くなる」か、または転写エラーが生じやすくなる可能性がある。相分離点付近では、２つの相（本発明者らの場合では低いＴＡ及び強固なＴＡ）の間に揺らぎが存在する。本発明者らのモデルは、こうした揺らぎ（またはノイズ）が、ＳＥでは狭い範囲の環境シグナルに限局されるが、これに対して、典型的エンハンサーではこうした揺らぎが生じる範囲が広いことを示す（図１０）。こうした揺らぎの幅を正規化したものもまた、ＳＥの方が小さい。こうした結果は、細胞独自性の維持に必要な遺伝子を相対的にエラーなく、強固に転写すること可能にすることが、ＳＥが進化を遂げた唯一の理由であることを示唆している。各遺伝子を制御するために、特定の分子を進化させることによって媒介される化学的特異性ではなく、協同性を介して転写忠実度を得るこの形態は、一方では、病状における異常な遺伝子発現の誘導に利用される可能性もある（例えば、がん細胞におけるＳＥ）。
転写阻害に対する抵抗性
スーパーエンハンサーコンポーネント（ＢＲＤ４など）の小分子阻害剤は、医療機関において抗がん治療剤として現在試験されており、そこでは、標的化治療剤に対して抵抗性の腫瘍細胞が出現することが普遍的な課題となっている（Ｓｔａｔｈｉｓ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。興味深いことに、さまざまな腫瘍細胞においていずれの遺伝的変化も伴わずにＪＱ１（ＢＲＤ４を阻害する薬剤）に対する抵抗性が生じることが最近の研究から明らかになった（Ｆｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１５、Ｒａｔｈｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，２０１５、Ｓｈｕ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。ＪＱ１は、ＢＲＤ４とアセチル化ヒストンとの相互作用を阻害するが、ＪＱ１抵抗性細胞では、ＢＲＤ４が過剰にリン酸化されるため、ＢＲＤ４が依然としてスーパーエンハンサーに動員される（Ｓｈｕ ｅｔａｌ．、２０１６）。このことは、ＢＲＤ４が、ＳＥの高結合価コンポーネントであるという本発明者らのモデルの予測と一致しており、ＢＲＤ４とアセチル化ヒストンとの相互作用を阻害（すなわち、ＢＲＤ４の結合価を低減）しても、ＢＲＤ４自体を標的とするキナーゼ経路が活性化されてＢＲＤ４の結合価が増加することによって埋め合わせが生じる可能性がある。本発明者らのモデルでは、スーパーエンハンサーは、ヒル係数が大きいこと、すなわち、協同性が高いことによって特徴付けられ（図４Ｃ）、このことは、複数のＳＥコンポーネントを正しく選択して阻害すれば、腫瘍細胞におけるＳＥ誘導性がん遺伝子に相乗的な作用を与える得ることを示唆している。この予測が正しければ、転写制御因子の阻害剤を追加で用いる併用治療によってＢＲＤ４阻害剤に対する抵抗性を阻止し得るはずである。
結論
転写制御のこの相分離モデルの本質的特徴は、この相分離モデルがコンポーネントの結合価及び数の変化と関連付けて相互作用コンポーネント間の協同性を考慮していることである。この単一の概念的枠組みは、最近観測されたさまざまな転写制御特徴（因子のクラスター化、動的変化、転写阻害剤に対するＳＥの過剰感受性、及び同じエンハンサーによる複数の遺伝子の同時活性化など）を一貫して説明するものである。細胞シグナル伝達経路は、結合価を変えることによって短時間で転写を調節し得る。細胞の増殖及び生存の選択となれば、より長い時間にわたってエンハンサーの相互作用数またはサイズの増減が生じることになる。このモデルからは、多くの細胞状況において探求可能ないくつかの予測（いくつかは上に記載される）も得られる。同様に、魅力的なことに、このモデルは、エンハンサー型の遺伝子制御、及び特にスーパーエンハンサー型の遺伝子制御を、相分離多分子集合の結果として、幅広いファミリーの無膜オルガネラ（核における核小体、カハール体、及びスプライシングスペックル、ならびに細胞質におけるストレス顆粒及びＰ体など）に当てはめるものである。
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Ｂｒｏｗｎ，Ｊ．Ｄ．，Ｌｉｎ，Ｃ．Ｙ．，Ｄｕａｎ，Ｑ．，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｇ．，Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ，Ａ．Ｊ．，Ｐａｒａｎａｌ，Ｒ．Ｍ．，Ｂａｉｒ，Ｓ．，Ｎｅｗｔｏｎ，Ｇ．，Ｌｉｃｈｔｍａｎ，Ａ．Ｈ．，Ｋｕｎｇ，Ａ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．（２０１４）．ＮＦ－ｋａｐｐａＢ Ｄｉｒｅｃｔｓ Ｄｙｎａｍｉｃ Ｓｕｐｅｒ Ｅｎｈａｎｃｅｒ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｔｈｅｒｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｅｌｌ．
Ｂｕｌｇｅｒ，Ｍ．，ａｎｄ Ｇｒｏｕｄｉｎｅ，Ｍ．（２０１１）．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎｄ ｍｅｃｈａｎｉｓｔｉｃ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ｄｉｓｔａｌ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｅｎｈａｎｃｅｒｓ．Ｃｅｌｌ １４４，３２７－３３９．
Ｃａｒｅｙ，Ｍ．（１９９８）．Ｔｈｅ ｅｎｈａｎｃｅｏｓｏｍｅ ａｎｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｓｙｎｅｒｇｙ．Ｃｅｌｌ ９２，５－８．
Ｃｈａｐｕｙ，Ｂ．，ＭｃＫｅｏｗｎ，Ｍ．Ｒ．，Ｌｉｎ，Ｃ．Ｙ．，Ｍｏｎｔｉ，Ｓ．，Ｒｏｅｍｅｒ，Ｍ．Ｇ．，Ｑｉ，Ｊ．，Ｒａｈｌ，Ｐ．Ｂ．，Ｓｕｎ，Ｈ．Ｈ．，Ｙｅｄａ，Ｋ．Ｔ．，Ｄｏｅｎｃｈ，Ｊ．Ｇ．，ｅｔ ａｌ．（２０１３）．Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｕｐｅｒ－ｅｎｈａｎｃｅｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｉｅｓ ｉｎ ｄｉｆｆｕｓｅ ｌａｒｇｅ Ｂ ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ．Ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ２４，７７７－７９０．
Ｃｈｅｎ，Ｈ．，ａｎｄ Ｌａｒｓｏｎ，Ｄ．Ｒ．（２０１６）．Ｗｈａｔ ｈａｖｅ ｓｉｎｇｌｅ－ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｓｔｕｄｉｅｓ ｔａｕｇｈｔ ｕｓ ａｂｏｕｔ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ？ Ｇｅｎｅｓ ＆ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ３０，１７９６－１８１０．
Ｃｈｉｐｕｍｕｒｏ，Ｅ．，Ｍａｒｃｏ，Ｅ．，Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，Ｃ．Ｌ．，Ｋｗｉａｔｋｏｗｓｋｉ，Ｎ．，Ｚｈａｎｇ，Ｔ．，Ｈａｔｈｅｗａｙ，Ｃ．Ｍ．，Ａｂｒａｈａｍ，Ｂ．Ｊ．，Ｓｈａｒｍａ，Ｂ．，Ｙｅｕｎｇ，Ｃ．，Ａｌｔａｂｅｆ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．（２０１４）．ＣＤＫ７ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ Ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ Ｓｕｐｅｒ－Ｅｎｈａｎｃｅｒ－Ｌｉｎｋｅｄ Ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｉｎ ＭＹＣＮ－Ｄｒｉｖｅｎ Ｃａｎｃｅｒ．Ｃｅｌｌ １５９，１１２６－１１３９．
Ｃｈｏ，Ｗ．Ｋ．，Ｊａｙａｎｔｈ，Ｎ．，Ｅｎｇｌｉｓｈ，Ｂ．Ｐ．，Ｉｎｏｕｅ，Ｔ．，Ａｎｄｒｅｗｓ，Ｊ．Ｏ．，Ｃｏｎｗａｙ，Ｗ．，Ｇｒｉｍｍ，Ｊ．Ｂ．，Ｓｐｉｌｌｅ，Ｊ．Ｈ．，Ｌａｖｉｓ，Ｌ．Ｄ．，Ｌｉｏｎｎｅｔ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．（２０１６）．ＲＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ＩＩ ｃｌｕｓｔｅｒ ｄｙｎａｍｉｃｓ ｐｒｅｄｉｃｔ ｍＲＮＡ ｏｕｔｐｕｔ ｉｎ ｌｉｖｉｎｇ ｃｅｌｌｓ．ｅＬｉｆｅ ５．
Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，Ｃ．Ｌ．，Ｋｗｉａｔｋｏｗｓｋｉ，Ｎ．，Ａｂｒａｈａｍ，Ｂ．Ｊ．，Ｃａｒｒｅｔｅｒｏ，Ｊ．，Ａｌ－Ｓｈａｈｒｏｕｒ，Ｆ．，Ｚｈａｎｇ，Ｔ．，Ｃｈｉｐｕｍｕｒｏ，Ｅ．，Ｈｅｒｔｅｒ－Ｓｐｒｉｅ，Ｇ．Ｓ．，Ａｋｂａｙ，Ｅ．Ａ．，Ａｌｔａｂｅｆ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．（２０１４）．Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ Ａｄｄｉｃｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｓｍａｌｌ Ｃｅｌｌ Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ ｗｉｔｈ ａ Ｃｏｖａｌｅｎｔ ＣＤＫ７ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ．Ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ２６，９０９－９２２．
Ｃｉｓｓｅ，ＩＩ，Ｉｚｅｄｄｉｎ，Ｉ．，Ｃａｕｓｓｅ，Ｓ．Ｚ．，Ｂｏｕｄａｒｅｎｅ，Ｌ．，Ｓｅｎｅｃａｌ，Ａ．，Ｍｕｒｅｓａｎ，Ｌ．，Ｄｕｇａｓｔ－Ｄａｒｚａｃｑ，Ｃ．，Ｈａｊｊ，Ｂ．，Ｄａｈａｎ，Ｍ．，ａｎｄ Ｄａｒｚａｃｑ，Ｘ．（２０１３）．Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｄｙｎａｍｉｃｓ ｏｆ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ＩＩ ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ ｉｎ ｌｉｖｅ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４１，６６４－６６７．
Ｃｏｈｅｎ，Ｒ．Ｊ．，ａｎｄ Ｂｅｎｅｄｅｋ，Ｇ．Ｂ．（１９８２）．Ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ ａｎｄ ｋｉｎｅｔｉｃ ｔｈｅｏｒｙ ｏｆ ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｏｌ－ｇｅｌ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ８６，３６９６－３７１４．
Ｄｉｍｉｔｒｏｖａ，Ｎ．，Ｚａｍｕｄｉｏ，Ｊ．Ｒ．，Ｊｏｎｇ，Ｒ．Ｍ．，Ｓｏｕｋｕｐ，Ｄ．，Ｒｅｓｎｉｃｋ，Ｒ．，Ｓａｒｍａ，Ｋ．，Ｗａｒｄ，Ａ．Ｊ．，Ｒａｊ，Ａ．，Ｌｅｅ，Ｊ．Ｔ．，Ｓｈａｒｐ，Ｐ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．（２０１４）．ＬｉｎｃＲＮＡ－ｐ２１ ａｃｔｉｖａｔｅｓ ｐ２１ ｉｎ ｃｉｓ ｔｏ ｐｒｏｍｏｔｅ Ｐｏｌｙｃｏｍｂ ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｔｏ ｅｎｆｏｒｃｅ ｔｈｅ Ｇ１／Ｓ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｅｌｌ ５４，７７７－７９０．
Ｄｏｗｅｎ，Ｊ．Ｍ．，Ｆａｎ，Ｚ．Ｐ．，Ｈｎｉｓｚ，Ｄ．，Ｒｅｎ，Ｇ．，Ａｂｒａｈａｍ，Ｂ．Ｊ．，Ｚｈａｎｇ，Ｌ．Ｎ．，Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，Ａ．Ｓ．，Ｓｃｈｕｉｊｅｒｓ，Ｊ．，Ｌｅｅ，Ｔ．Ｉ．，Ｚｈａｏ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．（２０１４）．Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｃｅｌｌ ｉｄｅｎｔｉｔｙ ｇｅｎｅｓ ｏｃｃｕｒｓ ｉｎ ｉｎｓｕｌａｔｅｄ ｎｅｉｇｈｂｏｒｈｏｏｄｓ ｉｎ Ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ．Ｃｅｌｌ １５９，３７４－３８７．
Ｅｌｏｗｉｔｚ，Ｍ．Ｂ．，Ｌｅｖｉｎｅ，Ａ．Ｊ．，Ｓｉｇｇｉａ，Ｅ．Ｄ．，ａｎｄ Ｓｗａｉｎ，Ｐ．Ｓ．（２００２）．Ｓｔｏｃｈａｓｔｉｃ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ａ ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９７，１１８３－１１８６．
ＥＮＣＯＤＥ Ｐｒｏｊｅｃｔ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ，Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，Ｂ．Ｅ．，Ｂｉｒｎｅｙ，Ｅ．，Ｄｕｎｈａｍ，Ｉ．，Ｇｒｅｅｎ，Ｅ．Ｄ．，Ｇｕｎｔｅｒ，Ｃ．，ａｎｄ Ｓｎｙｄｅｒ，Ｍ．（２０１２）．Ａｎ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ ＤＮＡ ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｉｎ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｅ．Ｎａｔｕｒｅ ４８９，５７－７４．
Ｅｎｇｒｅｉｔｚ，Ｊ．Ｍ．，Ｈａｉｎｅｓ，Ｊ．Ｅ．，Ｐｅｒｅｚ，Ｅ．Ｍ．，Ｍｕｎｓｏｎ，Ｇ．，Ｃｈｅｎ，Ｊ．，Ｋａｎｅ，Ｍ．，ＭｃＤｏｎｅｌ，Ｐ．Ｅ．，Ｇｕｔｔｍａｎ，Ｍ．，ａｎｄ Ｌａｎｄｅｒ，Ｅ．Ｓ．（２０１６）．Ｌｏｃａｌ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ ｌｎｃＲＮＡ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ，ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｐｌｉｃｉｎｇ．Ｎａｔｕｒｅ ５３９，４５２－４５５．
Ｆａｌｖｏ，Ｊ．Ｖ．，Ｔｈａｎｏｓ，Ｄ．，ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．（１９９５）．Ｒｅｖｅｒｓａｌ ｏｆ ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ ＤＮＡ ｂｅｎｄｓ ｉｎ ｔｈｅ ＩＦＮ ｂｅｔａ ｇｅｎｅ ｅｎｈａｎｃｅｒ ｂｙ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｔｈｅ ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ＨＭＧ Ｉ（Ｙ）．Ｃｅｌｌ ８３，１１０１－１１１１．
Ｆｅｒｉｃ，Ｍ．，Ｖａｉｄｙａ，Ｎ．，Ｈａｒｍｏｎ，Ｔ．Ｓ．，Ｍｉｔｒｅａ，Ｄ．Ｍ．，Ｚｈｕ，Ｌ．，Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，Ｔ．Ｍ．，Ｋｒｉｗａｃｋｉ，Ｒ．Ｗ．，Ｐａｐｐｕ，Ｒ．Ｖ．，ａｎｄ Ｂｒａｎｇｗｙｎｎｅ，Ｃ．Ｐ．（２０１６）．Ｃｏｅｘｉｓｔｉｎｇ Ｌｉｑｕｉｄ Ｐｈａｓｅｓ Ｕｎｄｅｒｌｉｅ Ｎｕｃｌｅｏｌａｒ Ｓｕｂｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔｓ．Ｃｅｌｌ １６５，１６８６－１６９７．
Ｆｏｎｇ，Ｃ．Ｙ．，Ｇｉｌａｎ，Ｏ．，Ｌａｍ，Ｅ．Ｙ．，Ｒｕｂｉｎ，Ａ．Ｆ．，Ｆｔｏｕｎｉ，Ｓ．，Ｔｙｌｅｒ，Ｄ．，Ｓｔａｎｌｅｙ，Ｋ．，Ｓｉｎｈａ，Ｄ．，Ｙｅｈ，Ｐ．，Ｍｏｒｉｓｏｎ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．（２０１５）．ＢＥＴ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｅｍｅｒｇｅｓ ｆｒｏｍ ｌｅｕｋａｅｍｉａ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ ５２５，５３８－５４２．
Ｆｕｋａｙａ，Ｔ．，Ｌｉｍ，Ｂ．，ａｎｄ Ｌｅｖｉｎｅ，Ｍ．（２０１６）．Ｅｎｈａｎｃｅｒ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ Ｂｕｒｓｔｉｎｇ．Ｃｅｌｌ １６６，３５８－３６８．
Ｇｅｍａｙｅｌ，Ｒ．，Ｃｈａｖａｌｉ，Ｓ．，Ｐｏｕｇａｃｈ，Ｋ．，Ｌｅｇｅｎｄｒｅ，Ｍ．，Ｚｈｕ，Ｂ．，Ｂｏｅｙｎａｅｍｓ，Ｓ．，ｖａｎ ｄｅｒ Ｚａｎｄｅ，Ｅ．，Ｇｅｖａｅｒｔ，Ｋ．，Ｒｏｕｓｓｅａｕ，Ｆ．，Ｓｃｈｙｍｋｏｗｉｔｚ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．（２０１５）．Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ－Ｒｉｃｈ Ｒｅｐｅａｔｓ Ｍｏｄｕｌａｔｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ Ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｅｌｌ ５９，６１５－６２７．
Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅ，Ｄ．Ｔ．（１９７７）．Ｅｘａｃｔ ｓｔｏｃｈａｓｔｉｃ ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｕｐｌｅｄ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ８１，２３４０－２３６１．
Ｇｒｕｓｓ，Ｐ．，Ｄｈａｒ，Ｒ．，ａｎｄ Ｋｈｏｕｒｙ，Ｇ．（１９８１）．Ｓｉｍｉａｎ ｖｉｒｕｓ ４０ ｔａｎｄｅｍ ｒｅｐｅａｔｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｓ ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｅａｒｌｙ ｐｒｏｍｏｔｅｒ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ ７８，９４３－９４７．
Ｈａｈ，Ｎ．，Ｂｅｎｎｅｒ，Ｃ．，Ｃｈｏｎｇ，Ｌ．Ｗ．，Ｙｕ，Ｒ．Ｔ．，Ｄｏｗｎｅｓ，Ｍ．，ａｎｄ Ｅｖａｎｓ，Ｒ．Ｍ．（２０１５）．Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ－ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｓｕｐｅｒ ｅｎｈａｎｃｅｒｓ ｆｏｒｍ ｄｏｍａｉｎｓ ｏｆ ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｌｙ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｅｎｈａｎｃｅｒ ＲＮＡｓ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ １１２，Ｅ２９７－３０２．
Ｈａｎ，Ｔ．Ｗ．，Ｋａｔｏ，Ｍ．，Ｘｉｅ，Ｓ．，Ｗｕ，Ｌ．Ｃ．，Ｍｉｒｚａｅｉ，Ｈ．，Ｐｅｉ，Ｊ．，Ｃｈｅｎ，Ｍ．，Ｘｉｅ，Ｙ．，Ａｌｌｅｎ，Ｊ．，Ｘｉａｏ，Ｇ．，ｅｔ ａｌ．（２０１２）．Ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ＲＮＡ ｇｒａｎｕｌｅｓ：ｂｏｕｎｄ ＲＮＡｓ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｆｅａｔｕｒｅｓ ａｎｄ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｏｆ ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｓｓｅｍｂｌｉｅｓ．Ｃｅｌｌ １４９，７６８－７７９．
Ｈａｙ，Ｄ．，Ｈｕｇｈｅｓ，Ｊ．Ｒ．，Ｂａｂｂｓ，Ｃ．，Ｄａｖｉｅｓ，Ｊ．Ｏ．，Ｇｒａｈａｍ，Ｂ．Ｊ．，Ｈａｎｓｓｅｎ，Ｌ．Ｌ．，Ｋａｓｓｏｕｆ，Ｍ．Ｔ．，Ｏｕｄｅｌａａｒ，Ａ．Ｍ．，Ｓｈａｒｐｅ，Ｊ．Ａ．，Ｓｕｃｉｕ，Ｍ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ．（２０１６）．Ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｌｐｈａ－ｇｌｏｂｉｎ ｓｕｐｅｒ－ｅｎｈａｎｃｅｒ ｉｎ ｖｉｖｏ．Ｎａｔｕｒｅ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ４８，８９５－９０３．
Ｈｎｉｓｚ，Ｄ．，Ａｂｒａｈａｍ，Ｂ．Ｊ．，Ｌｅｅ，Ｔ．Ｉ．，Ｌａｕ，Ａ．，Ｓａｉｎｔ－Ａｎｄｒｅ，Ｖ．，Ｓｉｇｏｖａ，Ａ．Ａ．，Ｈｏｋｅ，Ｈ．Ａ．，ａｎｄ Ｙｏｕｎｇ，Ｒ．Ａ．（２０１３）．Ｓｕｐｅｒ－ｅｎｈａｎｃｅｒｓ ｉｎ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｃｅｌｌ ｉｄｅｎｔｉｔｙ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｃｅｌｌ １５５，９３４－９４７．
Ｈｎｉｓｚ，Ｄ．，Ｓｃｈｕｉｊｅｒｓ，Ｊ．，Ｌｉｎ，Ｃ．Ｙ．，Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，Ａ．Ｓ．，Ａｂｒａｈａｍ，Ｂ．Ｊ．，Ｌｅｅ，Ｔ．Ｉ．，Ｂｒａｄｎｅｒ，Ｊ．Ｅ．，ａｎｄ Ｙｏｕｎｇ，Ｒ．Ａ．（２０１５）．Ｃｏｎｖｅｒｇｅｎｃｅ ｏｆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ａｎｄ Ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｐａｔｈｗａｙｓ ａｔ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ Ｓｕｐｅｒ－Ｅｎｈａｎｃｅｒｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｅｌｌ．
Ｈｎｉｓｚ，Ｄ．，Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，Ａ．Ｓ．，Ｄａｙ，Ｄ．Ｓ．，Ｖａｌｔｏｎ，Ａ．Ｌ．，Ｂａｋ，Ｒ．Ｏ．，Ｌｉ，Ｃ．Ｈ．，Ｇｏｌｄｍａｎｎ，Ｊ．，Ｌａｊｏｉｅ，Ｂ．Ｒ．，Ｆａｎ，Ｚ．Ｐ．，Ｓｉｇｏｖａ，Ａ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．（２０１６）．Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｏ－ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ ｂｙ ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｎｅｉｇｈｂｏｒｈｏｏｄｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５１，１４５４－１４５８．
Ｊｉ，Ｘ．，Ｄａｄｏｎ，Ｄ．Ｂ．，Ｐｏｗｅｌｌ，Ｂ．Ｅ．，Ｆａｎ，Ｚ．Ｐ．，Ｂｏｒｇｅｓ－Ｒｉｖｅｒａ，Ｄ．，Ｓｈａｃｈａｒ，Ｓ．，Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，Ａ．Ｓ．，Ｈｎｉｓｚ，Ｄ．，Ｐｅｇｏｒａｒｏ，Ｇ．，Ｌｅｅ，Ｔ．Ｉ．，ｅｔ ａｌ．（２０１６）．３Ｄ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｌａｎｄｓｃａｐｅ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｃｅｌｌｓ．Ｃｅｌｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ １８，２６２－２７５．
Ｊｉａｎｇ，Ｔ．，Ｒａｖｉｒａｍ，Ｒ．，Ｓｎｅｔｋｏｖａ，Ｖ．，Ｒｏｃｈａ，Ｐ．Ｐ．，Ｐｒｏｕｄｈｏｎ，Ｃ．，Ｂａｄｒｉ，Ｓ．，Ｂｏｎｎｅａｕ，Ｒ．，Ｓｋｏｋ，Ｊ．Ａ．，ａｎｄ Ｋｌｕｇｅｒ，Ｙ．（２０１６）．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｌｔｉ－ｌｏｃｉ ｈｕｂｓ ｆｒｏｍ ４Ｃ－ｓｅｑ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｓ ｔｈｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ ｏｆ ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ．
Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ａ．Ｄ．，Ｍｅｙｅｒ，Ｂ．Ｊ．，ａｎｄ Ｐｔａｓｈｎｅ，Ｍ．（１９７９）．Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ＤＮＡ－ｂｏｕｎｄ ｒｅｐｒｅｓｓｏｒｓ ｇｏｖｅｒｎ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｂｙ ｔｈｅ ｌａｍｂｄａ ｐｈａｇｅ ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ ７６，５０６１－５０６５．
Ｋａｔｏ，Ｍ．，Ｈａｎ，Ｔ．Ｗ．，Ｘｉｅ，Ｓ．，Ｓｈｉ，Ｋ．，Ｄｕ，Ｘ．，Ｗｕ，Ｌ．Ｃ．，Ｍｉｒｚａｅｉ，Ｈ．，Ｇｏｌｄｓｍｉｔｈ，Ｅ．Ｊ．，Ｌｏｎｇｇｏｏｄ，Ｊ．，Ｐｅｉ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．（２０１２）．Ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ＲＮＡ ｇｒａｎｕｌｅｓ：ｌｏｗ ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄｏｍａｉｎｓ ｆｏｒｍ ｄｙｎａｍｉｃ ｆｉｂｅｒｓ ｗｉｔｈｉｎ ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ．Ｃｅｌｌ １４９，７５３－７６７．
Ｋｉｅｆｆｅｒ－Ｋｗｏｎ，Ｋ．Ｒ．，Ｔａｎｇ，Ｚ．，Ｍａｔｈｅ，Ｅ．，Ｑｉａｎ，Ｊ．，Ｓｕｎｇ，Ｍ．Ｈ．，Ｌｉ，Ｇ．，Ｒｅｓｃｈ，Ｗ．，Ｂａｅｋ，Ｓ．，Ｐｒｕｅｔｔ，Ｎ．，Ｇｒｏｎｔｖｅｄ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．（２０１３）．Ｉｎｔｅｒａｃｔｏｍｅ ｍａｐｓ ｏｆ ｍｏｕｓｅ ｇｅｎｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｄｏｍａｉｎｓ ｒｅｖｅａｌ ｂａｓｉｃ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ １５５，１５０７－１５２０．
Ｋｉｍ，Ｔ．Ｋ．，ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．（１９９７）．Ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｓｙｎｅｒｇｙ ｏｆ ａｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｓｓｅｍｂｌｅｄ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－ｂｅｔａ ｅｎｈａｎｃｅｏｓｏｍｅ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｅｌｌ １，１１９－１２９．
Ｋｗｉａｔｋｏｗｓｋｉ，Ｎ．，Ｚｈａｎｇ，Ｔ．，Ｒａｈｌ，Ｐ．Ｂ．，Ａｂｒａｈａｍ，Ｂ．Ｊ．，Ｒｅｄｄｙ，Ｊ．，Ｆｉｃａｒｒｏ，Ｓ．Ｂ．，Ｄａｓｔｕｒ，Ａ．，Ａｍｚａｌｌａｇ，Ａ．，Ｒａｍａｓｗａｍｙ，Ｓ．，Ｔｅｓａｒ，Ｂ．，ｅｔ ａｌ．（２０１４）．Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｗｉｔｈ ａ ｃｏｖａｌｅｎｔ ＣＤＫ７ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ．Ｎａｔｕｒｅ ５１１，６１６－６２０．
Ｋｗｏｎ，Ｉ．，Ｋａｔｏ，Ｍ．，Ｘｉａｎｇ，Ｓ．，Ｗｕ，Ｌ．，Ｔｈｅｏｄｏｒｏｐｏｕｌｏｓ，Ｐ．，Ｍｉｒｚａｅｉ，Ｈ．，Ｈａｎ，Ｔ．，Ｘｉｅ，Ｓ．，Ｃｏｒｄｅｎ，Ｊ．Ｌ．，ａｎｄ ＭｃＫｎｉｇｈｔ，Ｓ．Ｌ．（２０１３）．Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ＩＩ ｔｏ ｆｉｂｒｏｕｓ ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｏｆ ｌｏｗ－ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ ｄｏｍａｉｎｓ．Ｃｅｌｌ １５５，１０４９－１０６０．
Ｌａｉ，Ｆ．，Ｏｒｏｍ，Ｕ．Ａ．，Ｃｅｓａｒｏｎｉ，Ｍ．，Ｂｅｒｉｎｇｅｒ，Ｍ．，Ｔａａｔｊｅｓ，Ｄ．Ｊ．，Ｂｌｏｂｅｌ，Ｇ．Ａ．，ａｎｄ Ｓｈｉｅｋｈａｔｔａｒ，Ｒ．（２０１３）．Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ＲＮＡｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅ ｗｉｔｈ Ｍｅｄｉａｔｏｒ ｔｏ ｅｎｈａｎｃｅ ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ ４９４，４９７－５０１．
Ｌａｉ，Ｆ．，ａｎｄ Ｓｈｉｅｋｈａｔｔａｒ，Ｒ．（２０１４）．Ｅｎｈａｎｃｅｒ ＲＮＡｓ：ｔｈｅ ｎｅｗ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｇｅｎｅｔ Ｄｅｖ ２５，３８－４２．
Ｌａｒｏｃｈｅｌｌｅ，Ｓ．，Ａｍａｔ，Ｒ．，Ｇｌｏｖｅｒ－Ｃｕｔｔｅｒ，Ｋ．，Ｓａｎｓｏ，Ｍ．，Ｚｈａｎｇ，Ｃ．，Ａｌｌｅｎ，Ｊ．Ｊ．，Ｓｈｏｋａｔ，Ｋ．Ｍ．，Ｂｅｎｔｌｅｙ，Ｄ．Ｌ．，ａｎｄ Ｆｉｓｈｅｒ，Ｒ．Ｐ．（２０１２）．Ｃｙｃｌｉｎ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｋｉｎａｓｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ－ｔｏ－ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｓｗｉｔｃｈ ｏｆ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ＩＩ．Ｎａｔｕｒｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ＆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ １９，１１０８－１１１５．
Ｌｅｅ，Ｔ．Ｉ．，ａｎｄ Ｙｏｕｎｇ，Ｒ．Ａ．（２０１３）．Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｔｓ ｍｉｓｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｃｅｌｌ １５２，１２３７－１２５１．
Ｌｅｖｉｎｅ，Ｍ．，Ｃａｔｔｏｇｌｉｏ，Ｃ．，ａｎｄ Ｔｊｉａｎ，Ｒ．（２０１４）．Ｌｏｏｐｉｎｇ ｂａｃｋ ｔｏ ｌｅａｐ ｆｏｒｗａｒｄ：ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｅｎｔｅｒｓ ａ ｎｅｗ ｅｒａ．Ｃｅｌｌ １５７，１３－２５．
Ｌｉ，Ｐ．，Ｂａｎｊａｄｅ，Ｓ．，Ｃｈｅｎｇ，Ｈ．Ｃ．，Ｋｉｍ，Ｓ．，Ｃｈｅｎ，Ｂ．，Ｇｕｏ，Ｌ．，Ｌｌａｇｕｎｏ，Ｍ．，Ｈｏｌｌｉｎｇｓｗｏｒｔｈ，Ｊ．Ｖ．，Ｋｉｎｇ，Ｄ．Ｓ．，Ｂａｎａｎｉ，Ｓ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．（２０１２）．Ｐｈａｓｅ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ ４８３，３３６－３４０．
Ｌｏｖｅｎ，Ｊ．，Ｈｏｋｅ，Ｈ．Ａ．，Ｌｉｎ，Ｃ．Ｙ．，Ｌａｕ，Ａ．，Ｏｒｌａｎｄｏ，Ｄ．Ａ．，Ｖａｋｏｃ，Ｃ．Ｒ．，Ｂｒａｄｎｅｒ，Ｊ．Ｅ．，Ｌｅｅ，Ｔ．Ｉ．，ａｎｄ Ｙｏｕｎｇ，Ｒ．Ａ．（２０１３）．Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ ｂｙ ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ ｏｆ ｓｕｐｅｒ－ｅｎｈａｎｃｅｒｓ．Ｃｅｌｌ １５３，３２０－３３４．
Ｍａｌｉｋ，Ｓ．，ａｎｄ Ｒｏｅｄｅｒ，Ｒ．Ｇ．（２０１０）．Ｔｈｅ ｍｅｔａｚｏａｎ Ｍｅｄｉａｔｏｒ ｃｏ－ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｃｏｍｐｌｅｘ ａｓ ａｎ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ ｈｕｂ ｆｏｒ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ ｒｅｖｉｅｗｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １１，７６１－７７２．
Ｍａｎｓｏｕｒ，Ｍ．Ｒ．，Ａｂｒａｈａｍ，Ｂ．Ｊ．，Ａｎｄｅｒｓ，Ｌ．，Ｂｅｒｅｚｏｖｓｋａｙａ，Ａ．，Ｇｕｔｉｅｒｒｅｚ，Ａ．，Ｄｕｒｂｉｎ，Ａ．Ｄ．，Ｅｔｃｈｉｎ，Ｊ．，Ｌａｗｔｏｎ，Ｌ．，Ｓａｌｌａｎ，Ｓ．Ｅ．，Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ，Ｌ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．（２０１４）．Ａｎ ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ ｓｕｐｅｒ－ｅｎｈａｎｃｅｒ ｆｏｒｍｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ｓｏｍａｔｉｃ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｎｃｏｄｉｎｇ ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃ ｅｌｅｍｅｎｔ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．
Ｍａｏ，Ｙ．Ｓ．，Ｚｈａｎｇ，Ｂ．，ａｎｄ Ｓｐｅｃｔｏｒ，Ｄ．Ｌ．（２０１１）．Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅａｒ ｂｏｄｉｅｓ．Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ ｇｅｎｅｔｉｃｓ：ＴＩＧ ２７，２９５－３０６．
Ｍｅｒｉｋａ，Ｍ．，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ａ．Ｊ．，Ｃｈｅｎ，Ｇ．，Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｔ．，ａｎｄ Ｔｈａｎｏｓ，Ｄ．（１９９８）．Ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ ｏｆ ＣＢＰ／ｐ３００ ｂｙ ｔｈｅ ＩＦＮ ｂｅｔａ ｅｎｈａｎｃｅｏｓｏｍｅ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｅｌｌ １，２７７－２８７．
Ｏｎｇ，Ｃ．Ｔ．，ａｎｄ Ｃｏｒｃｅｓ，Ｖ．Ｇ．（２０１１）．Ｅｎｈａｎｃｅｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ：ｎｅｗ ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｉｓｓｕｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ ｒｅｖｉｅｗｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １２，２８３－２９３．
Ｏｒｐｈａｎｉｄｅｓ，Ｇ．，ａｎｄ Ｒｅｉｎｂｅｒｇ，Ｄ．（２００２）．Ａ ｕｎｉｆｉｅｄ ｔｈｅｏｒｙ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｃｅｌｌ １０８，４３９－４５１．
Ｐａｌｓｔｒａ，Ｒ．Ｊ．，Ｔｏｌｈｕｉｓ，Ｂ．，Ｓｐｌｉｎｔｅｒ，Ｅ．，Ｎｉｊｍｅｉｊｅｒ，Ｒ．，Ｇｒｏｓｖｅｌｄ，Ｆ．，ａｎｄ ｄｅ Ｌａａｔ，Ｗ．（２００３）．Ｔｈｅ ｂｅｔａ－ｇｌｏｂｉｎ ｎｕｃｌｅａｒ ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ ｉｎ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ３５，１９０－１９４．
Ｐａｒｋｅｒ，Ｓ．Ｃ．，Ｓｔｉｔｚｅｌ，Ｍ．Ｌ．，Ｔａｙｌｏｒ，Ｄ．Ｌ．，Ｏｒｏｚｃｏ，Ｊ．Ｍ．，Ｅｒｄｏｓ，Ｍ．Ｒ．，Ａｋｉｙａｍａ，Ｊ．Ａ．，ｖａｎ Ｂｕｅｒｅｎ，Ｋ．Ｌ．，Ｃｈｉｎｅｓ，Ｐ．Ｓ．，Ｎａｒｉｓｕ，Ｎ．，Ｐｒｏｇｒａｍ，Ｎ．Ｃ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．（２０１３）．Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｓｔｒｅｔｃｈ ｅｎｈａｎｃｅｒ ｓｔａｔｅｓ ｄｒｉｖｅ ｃｅｌｌ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇｅｎｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｈａｒｂｏｒ ｈｕｍａｎ ｄｉｓｅａｓｅ ｒｉｓｋ ｖａｒｉａｎｔｓ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ １１０，１７９２１－１７９２６．
Ｐｅｆａｎｉｓ，Ｅ．，Ｗａｎｇ，Ｊ．，Ｒｏｔｈｓｃｈｉｌｄ，Ｇ．，Ｌｉｍ，Ｊ．，Ｋａｚａｄｉ，Ｄ．，Ｓｕｎ，Ｊ．，Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ，Ａ．，Ｃｈａｏ，Ｊ．，Ｅｌｌｉｏｔｔ，Ｏ．，Ｌｉｕ，Ｚ．Ｐ．，ｅｔ ａｌ．（２０１５）．ＲＮＡ ｅｘｏｓｏｍｅ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｌｏｎｇ ｎｏｎ－ｃｏｄｉｎｇ ＲＮＡ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｃｏｎｔｒｏｌｓ ｓｕｐｅｒ－ｅｎｈａｎｃｅｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｃｅｌｌ １６１，７７４－７８９．
Ｐｈａｔｎａｎｉ，Ｈ．Ｐ．，ａｎｄ Ｇｒｅｅｎｌｅａｆ，Ａ．Ｌ．（２００６）．Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ＩＩ ＣＴＤ．Ｇｅｎｅｓ ＆ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ２０，２９２２－２９３６．
Ｐｒｏｕｄｈｏｎ，Ｃ．，Ｓｎｅｔｋｏｖａ，Ｖ．，Ｒａｖｉｒａｍ，Ｒ．，Ｌｏｂｒｙ，Ｃ．，Ｂａｄｒｉ，Ｓ．，Ｊｉａｎｇ，Ｔ．，Ｈａｏ，Ｂ．，Ｔｒｉｍａｒｃｈｉ，Ｔ．，Ｋｌｕｇｅｒ，Ｙ．，Ａｉｆａｎｔｉｓ，Ｉ．，ｅｔ ａｌ．（２０１６）．Ａｃｔｉｖｅ ａｎｄ Ｉｎａｃｔｉｖｅ Ｅｎｈａｎｃｅｒｓ Ｃｏｏｐｅｒａｔｅ ｔｏ Ｅｘｅｒｔ Ｌｏｃａｌｉｚｅｄ ａｎｄ Ｌｏｎｇ－Ｒａｎｇｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ ｒｅｐｏｒｔｓ １５，２１５９－２１６９．
Ｒａｊ，Ａ．，ａｎｄ ｖａｎ Ｏｕｄｅｎａａｒｄｅｎ，Ａ．（２００８）．Ｎａｔｕｒｅ，ｎｕｒｔｕｒｅ，ｏｒ ｃｈａｎｃｅ：ｓｔｏｃｈａｓｔｉｃ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｉｔｓ ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．Ｃｅｌｌ １３５，２１６－２２６．
Ｒａｓｅｒ，Ｊ．Ｍ．，ａｎｄ Ｏ’Ｓｈｅａ，Ｅ．Ｋ．（２００４）．Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｓｔｏｃｈａｓｔｉｃｉｔｙ ｉｎ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０４，１８１１－１８１４．
Ｒａｔｈｅｒｔ，Ｐ．，Ｒｏｔｈ，Ｍ．，Ｎｅｕｍａｎｎ，Ｔ．，Ｍｕｅｒｄｔｅｒ，Ｆ．，Ｒｏｅ，Ｊ．Ｓ．，Ｍｕｈａｒ，Ｍ．，Ｄｅｓｗａｌ，Ｓ．，Ｃｅｒｎｙ－Ｒｅｉｔｅｒｅｒ，Ｓ．，Ｐｅｔｅｒ，Ｂ．，Ｊｕｄｅ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．（２０１５）．Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｐｒｉｍａｒｙ ａｎｄ ａｃｑｕｉｒｅｄ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ＢＥＴ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ ５２５，５４３－５４７．
Ｒｏａｄｍａｐ Ｅｐｉｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｃ．，Ｋｕｎｄａｊｅ，Ａ．，Ｍｅｕｌｅｍａｎ，Ｗ．，Ｅｒｎｓｔ，Ｊ．，Ｂｉｌｅｎｋｙ，Ｍ．，Ｙｅｎ，Ａ．，Ｈｅｒａｖｉ－Ｍｏｕｓｓａｖｉ，Ａ．，Ｋｈｅｒａｄｐｏｕｒ，Ｐ．，Ｚｈａｎｇ，Ｚ．，Ｗａｎｇ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．（２０１５）．Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ １１１ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｈｕｍａｎ ｅｐｉｇｅｎｏｍｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ ５１８，３１７－３３０．
Ｓｅｍｅｎｏｖ，Ａ．Ｎ．，ａｎｄ Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ，Ｍ．（１９９８）．Ｔｈｅｒｍｏｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ ｇｅｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ ｏｆ ａｓｓｏｃｉａｔｉｖｅ ｐｏｌｙｍｅｒｓ．Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ３１，１３７３－１３８５．
Ｓｈｉｎ，Ｈ．Ｙ．，Ｗｉｌｌｉ，Ｍ．，Ｙｏｏ，Ｋ．Ｈ．，Ｚｅｎｇ，Ｘ．，Ｗａｎｇ，Ｃ．，Ｍｅｔｓｅｒ，Ｇ．，ａｎｄ Ｈｅｎｎｉｇｈａｕｓｅｎ，Ｌ．（２０１６）．Ｈｉｅｒａｒｃｈｙ ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅ ｍａｍｍａｒｙ ＳＴＡＴ５－ｄｒｉｖｅｎ Ｗａｐ ｓｕｐｅｒ－ｅｎｈａｎｃｅｒ．Ｎａｔｕｒｅ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ４８，９０４－９１１．
Ｓｈｉｎ，Ｙ．，Ｂｅｒｒｙ，Ｊ．，Ｐａｎｎｕｃｃｉ，Ｎ．，Ｈａａｔａｊａ，Ｍ．Ｐ．，Ｔｏｅｔｔｃｈｅｒ，Ｊ．Ｅ．，ａｎｄ Ｂｒａｎｇｗｙｎｎｅ，Ｃ．Ｐ．（２０１７）．Ｓｐａｔｉｏｔｅｍｐｏｒａｌ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｈａｓｅ Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎｓ Ｕｓｉｎｇ Ｌｉｇｈｔ－Ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｏｐｔｏＤｒｏｐｌｅｔｓ．Ｃｅｌｌ １６８，１５９－１７１ ｅ１１４．
Ｓｈｕ，Ｓ．，Ｌｉｎ，Ｃ．Ｙ．，Ｈｅ，Ｈ．Ｈ．，Ｗｉｔｗｉｃｋｉ，Ｒ．Ｍ．，Ｔａｂａｓｓｕｍ，Ｄ．Ｐ．，Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｊ．Ｍ．，Ｊａｎｉｓｚｅｗｓｋａ，Ｍ．，Ｈｕｈ，Ｓ．Ｊ．，Ｌｉａｎｇ，Ｙ．，Ｒｙａｎ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．（２０１６）．Ｒｅｓｐｏｎｓｅ ａｎｄ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ＢＥＴ ｂｒｏｍｏｄｏｍａｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｉｎ ｔｒｉｐｌｅ－ｎｅｇａｔｉｖｅ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ．Ｎａｔｕｒｅ ５２９，４１３－４１７．
Ｓｉｇｏｖａ，Ａ．Ａ．，Ａｂｒａｈａｍ，Ｂ．Ｊ．，Ｊｉ，Ｘ．，Ｍｏｌｉｎｉｅ，Ｂ．，Ｈａｎｎｅｔｔ，Ｎ．Ｍ．，Ｇｕｏ，Ｙ．Ｅ．，Ｊａｎｇｉ，Ｍ．，Ｇｉａｌｌｏｕｒａｋｉｓ，Ｃ．Ｃ．，Ｓｈａｒｐ，Ｐ．Ａ．，ａｎｄ Ｙｏｕｎｇ，Ｒ．Ａ．（２０１５）．Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ｔｒａｐｐｉｎｇ ｂｙ ＲＮＡ ｉｎ ｇｅｎｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｅｌｅｍｅｎｔｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５０，９７８－９８１．
Ｓｉｇｏｖａ，Ａ．Ａ．，Ｍｕｌｌｅｎ，Ａ．Ｃ．，Ｍｏｌｉｎｉｅ，Ｂ．，Ｇｕｐｔａ，Ｓ．，Ｏｒｌａｎｄｏ，Ｄ．Ａ．，Ｇｕｅｎｔｈｅｒ，Ｍ．Ｇ．，Ａｌｍａｄａ，Ａ．Ｅ．，Ｌｉｎ，Ｃ．，Ｓｈａｒｐ，Ｐ．Ａ．，Ｇｉａｌｌｏｕｒａｋｉｓ，Ｃ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ．（２０１３）．Ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｏｆ ｌｏｎｇ ｎｏｎｃｏｄｉｎｇ ＲＮＡ／ｍＲＮＡ ｇｅｎｅ ｐａｉｒｓ ｉｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ １１０，２８７６－２８８１．
Ｓｐｉｔｚ，Ｆ．，ａｎｄ Ｆｕｒｌｏｎｇ，Ｅ．Ｅ．（２０１２）．Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ：ｆｒｏｍ ｅｎｈａｎｃｅｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｎａｔｕｒｅ ｒｅｖｉｅｗｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １３，６１３－６２６．
Ｓｔａｔｈｉｓ，Ａ．，Ｚｕｃｃａ，Ｅ．，Ｂｅｋｒａｄｄａ，Ｍ．，Ｇｏｍｅｚ－Ｒｏｃａ，Ｃ．，Ｄｅｌｏｒｄ，Ｊ．Ｐ．，ｄｅ Ｌａ Ｍｏｔｔｅ Ｒｏｕｇｅ，Ｔ．，Ｕｒｏ－Ｃｏｓｔｅ，Ｅ．，ｄｅ Ｂｒａｕｄ，Ｆ．，Ｐｅｌｏｓｉ，Ｇ．，ａｎｄ Ｆｒｅｎｃｈ，Ｃ．Ａ．（２０１６）．Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｏｆ Ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ Ｈａｒｂｏｒｉｎｇ ｔｈｅ ＢＲＤ４－ＮＵＴ Ｏｎｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｔｏ ｔｈｅ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｂｒｏｍｏｄｏｍａｉｎ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ＯＴＸ０１５／ＭＫ－８６２８．Ｃａｎｃｅｒ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ６，４９２－５００．
Ｓｕｔｅｒ，Ｄ．Ｍ．，Ｍｏｌｉｎａ，Ｎ．，Ｇａｔｆｉｅｌｄ，Ｄ．，Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｋ．，Ｓｃｈｉｂｌｅｒ，Ｕ．，ａｎｄ Ｎａｅｆ，Ｆ．（２０１１）．Ｍａｍｍａｌｉａｎ ｇｅｎｅｓ ａｒｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ ｗｉｔｈ ｗｉｄｅｌｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｂｕｒｓｔｉｎｇ ｋｉｎｅｔｉｃｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３２，４７２－４７４．
Ｔｈａｎｏｓ，Ｄ．，ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．（１９９５）．Ｖｉｒｕｓ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ＩＦＮ ｂｅｔａ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｒｅｑｕｉｒｅｓ ｔｈｅ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ａｎ ｅｎｈａｎｃｅｏｓｏｍｅ．Ｃｅｌｌ ８３，１０９１－１１００．
Ｔｊｉａｎ，Ｒ．，ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．（１９９４）．Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ：ａ ｃｏｍｐｌｅｘ ｐｕｚｚｌｅ ｗｉｔｈ ｆｅｗ ｅａｓｙ ｐｉｅｃｅｓ．Ｃｅｌｌ ７７，５－８．
Ｔｏｌｈｕｉｓ，Ｂ．，Ｐａｌｓｔｒａ，Ｒ．Ｊ．，Ｓｐｌｉｎｔｅｒ，Ｅ．，Ｇｒｏｓｖｅｌｄ，Ｆ．，ａｎｄ ｄｅ Ｌａａｔ，Ｗ．（２００２）．Ｌｏｏｐｉｎｇ ａｎｄ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｓｉｔｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｅ ｂｅｔａ－ｇｌｏｂｉｎ ｌｏｃｕｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｅｌｌ １０，１４５３－１４６５．
Ｗａｎｇ，Ｙ．，Ｚｈａｎｇ，Ｔ．，Ｋｗｉａｔｋｏｗｓｋｉ，Ｎ．，Ａｂｒａｈａｍ，Ｂ．Ｊ．，Ｌｅｅ，Ｔ．Ｉ．，Ｘｉｅ，Ｓ．，Ｙｕｚｕｇｕｌｌｕ，Ｈ．，Ｖｏｎ，Ｔ．，Ｌｉ，Ｈ．，Ｌｉｎ，Ｚ．，ｅｔ ａｌ．（２０１５）．ＣＤＫ７－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ａｄｄｉｃｔｉｏｎ ｉｎ ｔｒｉｐｌｅ－ｎｅｇａｔｉｖｅ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ．Ｃｅｌｌ １６３，１７４－１８６．
Ｗｈｅｅｌｅｒ，Ｊ．Ｒ．，Ｍａｔｈｅｎｙ，Ｔ．，Ｊａｉｎ，Ｓ．，Ａｂｒｉｓｃｈ，Ｒ．，ａｎｄ Ｐａｒｋｅｒ，Ｒ．（２０１６）．Ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｓｔａｇｅｓ ｉｎ ｓｔｒｅｓｓ ｇｒａｎｕｌｅ ａｓｓｅｍｂｌｙ ａｎｄ ｄｉｓａｓｓｅｍｂｌｙ．ｅＬｉｆｅ ５．
Ｗｈｙｔｅ，Ｗ．Ａ．，Ｏｒｌａｎｄｏ，Ｄ．Ａ．，Ｈｎｉｓｚ，Ｄ．，Ａｂｒａｈａｍ，Ｂ．Ｊ．，Ｌｉｎ，Ｃ．Ｙ．，Ｋａｇｅｙ，Ｍ．Ｈ．，Ｒａｈｌ，Ｐ．Ｂ．，Ｌｅｅ，Ｔ．Ｉ．，ａｎｄ Ｙｏｕｎｇ，Ｒ．Ａ．（２０１３）．Ｍａｓｔｅｒ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｍｅｄｉａｔｏｒ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ｓｕｐｅｒ－ｅｎｈａｎｃｅｒｓ ａｔ ｋｅｙ ｃｅｌｌ ｉｄｅｎｔｉｔｙ ｇｅｎｅｓ．Ｃｅｌｌ １５３，３０７－３１９．
Ｚｈｕ，Ｌ．，ａｎｄ Ｂｒａｎｇｗｙｎｎｅ，Ｃ．Ｐ．（２０１５）．Ｎｕｃｌｅａｒ ｂｏｄｉｅｓ：ｔｈｅ ｅｍｅｒｇｉｎｇ ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ ｏｆ ｎｕｃｌｅｏｐｌａｓｍｉｃ ｐｈａｓｅｓ．Ｃｕｒｒｅｎｔ ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ ｃｅｌｌ ｂｉｏｌｏｇｙ ３４，２３－３０．
Ｚｏｌｌｅｒ，Ｂ．，Ｎｉｃｏｌａｓ，Ｄ．，Ｍｏｌｉｎａ，Ｎ．，ａｎｄ Ｎａｅｆ，Ｆ．（２０１５）．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｓｉｌｅｎｔ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｉｎｔｅｒｖａｌｓ ａｎｄ ｎｏｉｓｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｇｅｎｅｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｙｓｔｅｍｓ ｂｉｏｌｏｇｙ １１，８２３．
実施例２
本明細書において、本発明者らは、スーパーエンハンサーが液体様相分離凝縮体を形成するという実験的証拠を提供する。これによって、こうした制御エレメントについて述べられる多様な特性を説明するための新たな枠組みが確立され、ＬＬＰＳによって制御される生化学的プロセスが遺伝子制御を含むように拡大される。
ＢＲＤ４及びＭＥＤ１は、核内凝縮体のコンポーネントである
ＳＥを構成するエンハンサークラスターは、マスター転写因子及び通常は高密度の補助因子（ＢＲＤ４及びメディエーターなど）によって占有され、こうしたものの存在が、ＳＥの定義に使用され得る（１、２、１３）。本発明者らは、ＳＥが核内凝縮体を形成するのであれば、こうしたＳＥ濃縮補助因子を細胞の核において個別の構造体として可視化できるであろうと推論した。実際、ＢＲＤ４及びＭＥＤ１（メディエーターのサブユニット）に対する抗体を用いる免疫蛍光（ＩＦ）の構造化照明顕微鏡法（ＳＩＭ）で分析したところ、マウス胚性幹細胞（ｍＥＳＣ）の核に個別のフォーカスが存在することが明らかとなった（図１１Ａ）。ＢＲＤ４フォーカス及びＭＥＤ１フォーカスは、顕著にオーバーラップしており（図１１Ｂ）（ＣｈＩＰ－ｓｅｑデータ（図１６Ａ及び図１５Ｂ）とも一致する）、このことは、これら２つのタンパク質が、典型的には、こうした凝縮体を共占有することを示唆している。ＢＲＤ４フォーカス及びＭＥＤ１フォーカスは、ＨＰ１ａ（図１１Ｃ）または核の他のＤＡＰＩ濃染色領域（図１１Ａ）とはあまりオーバーラップしておらず、このことは、ＢＲＤ４凝縮体及びＭＥＤ１凝縮体が、核のヘテロクロマチン領域の外側に生じる傾向を有することを示している。本発明者らは、以前に報告された核内凝縮体についても、デコンボリューション顕微鏡法またはＳＩＭによって可視化した。可視化した核内凝縮体には、核小体（ＦＩＢ１）（１４）、ヒストン構造体（ＮＰＡＴ）（１５）、構成的ヘテロクロマチン（ＨＰ１ａ）（１６、１７）（図１１Ｄ）が含まれる。核内凝縮体のサイズ及び数は多様であった一方で、ＢＲＤ４及びＭＥＤ１のものは、以前に報告された凝縮体のサイズ範囲内であった（図１１Ｅ）。こうした結果は、ＢＲＤ４及びＭＥＤ１が、核内で拡散するのではなく、個別領域を占有することを示しており、本発明者らは、こうした個別領域をＢＲＤ４凝縮体及びＭＥＤ１凝縮体と称する。
ＢＲＤ４凝縮体及びＭＥＤ１凝縮体は、転写が活発なＳＥに生じる
エンハンサーに対するＢＲＤ４及びＭＥＤ１の結合のＣｈＩＰ－ｓｅｑによる網羅的な解析からは、ｍＥＳＣには、数百のＳＥが存在し、こうした補助因子のレベルが相対的に高いエンハンサーが追加で多く存在することが示唆されている（１）。ＢＲＤ４凝縮体及びＭＥＤ１凝縮体が、活性ＳＥ（ＳＥ誘導性のＲＮＡ合成が生じている部位）と同時に生じるかどうかを決定するために、本発明者らは、ＢＲＤ４またはＭＥＤ１のＩＦを使用して凝縮体を同定すると共に、ＳＥ誘導性の新生転写物のＲＮＡ－ＦＩＳＨ（イントロンＲＮＡのプロービング）を使用することによって活性ＳＥを同定した（図１２及び図１７）。４つの異なる活性ＳＥを調べたところ、各場合において、活性ＳＥ誘導性の転写物の存在部位は、ＢＲＤ４凝縮体またはＭＥＤ１凝縮体とオーバーラップするか、またはその近傍に位置していた（図１２Ｂ及び図１７Ｂ）。ＦＩＳＨシグナル及びＩＦシグナルがオーバーラップするか、または近傍に位置する頻度は、偶然起こり得る頻度と比較してはるかに高いものであった（図１７Ｃ～１７Ｄ、材料及び方法を参照のこと）。こうした結果は、転写が活発なＳＥに誘導される遺伝子が、ＢＲＤ４またはＭＥＤ１を含む凝縮体と結び付くことを示している。
ＢＲＤ４凝縮体及びＭＥＤ１凝縮体は、液体様の光退色後蛍光回復動力学を示す
本発明者らは、ＢＲＤ４凝縮体及びＭＥＤ１凝縮体が、液体様凝縮体に特有の特徴を示すかどうかを探求して調べた。液体様凝縮体の顕著な特徴は、内部的な動的再組織化及び急速交換動力学であり（１０～１２）、これらの特徴は、光退色後蛍光回復（ＦＲＡＰ）速度を測定することによって調べることができる。生細胞におけるＢＲＤ４体及びＭＥＤ１体の動態を試験するために、本発明者らは、ｍＥＳＣにおいてＢＲＤ４－ＧＦＰまたはＭＥＤ１－ＧＦＰのいずれかを異所性に発現させ、ＦＲＡＰ実験を実施した。光退色実施後、ＢＲＤ４－ＧＦＰ凝縮体及びＭＥＤ１－ＧＦＰ凝縮体では、数秒の時間尺度で蛍光の回復が生じ（図１３及び図１８Ａ）、見かけの拡散係数は、それぞれ０．５４±０．１５μｍ２／秒及び０．３６±０．１３μｍ２／秒であった。こうした値は、以前に報告された液体様凝縮体コンポーネントと類似している（１８、１９）（図１８Ａ）。興味深いことに、蛍光の回復は同じ境界内で生じており、このことは、この蛍光シグナルが、コンポーネントと希薄相との交換が急速に生じる動的濃密相を示すことを実証している（図１３Ｂ及び図１３Ｅ）。パラホルムアルデヒドでの固定化を行うと、ＢＲＤ４－ＧＦＰ凝縮体またはＭＥＤ１－ＧＦＰ凝縮体は、依然として存在したが、光退色実施後の回復を示さなくなっており、このことは、架橋によって凝縮体の全体構造は維持されるが、希薄相との交換は生じなくなることを実証している（図１８Ｂ）。ＡＴＰは、エネルギー依存性プロセスを誘導し、及び／またはそれに固有のヒドロトロープ活性を介して凝縮体の流動性を促進することに関与している（２０、２１）。グルコース除去及びオリゴマイシン処理によって細胞ＡＴＰを枯渇させると（図１８Ｃ）、ＢＲＤ４－ＧＦＰ体及びＭＥＤ１－ＧＦＰ体の両方で光退色後蛍光回復が抑止された（図１３Ｃ及び図１３Ｆ）。こうした結果は、ＢＲＤ４を含む構造体及びＭＥＤ１を含む構造体が、細胞において液体様特性を有することを示しており、このことは、以前に報告された相分離凝縮体と一致する。
ＢＲＤ４及びＭＥＤ１の天然変性領域は、インビトロで相分離する
天然変性領域（ＩＤＲ）を有するタンパク質は、凝縮体形成の促進に関与している（１０、１２）。ＢＲＤ４及びＭＥＤ１は、大きなＩＤＲを含む（図１４Ａ）。凝縮体形成に関与するいくつかのタンパク質の精製ＩＤＲは、インビトロで相分離液滴を形成する（１８、２２、２３）。それ故に、本発明者らは、ＢＲＤ４またはＭＥＤ１のＩＤＲがインビトロで相分離液滴を形成するかどうかを調べた。精製組換えＧＦＰ－ＩＤＲ融合タンパク質（ＢＲＤ４－ＩＤＲ及びＭＥＤ１－ＩＤＲ）（図１４Ｂ）を液滴形成緩衝液（材料及び方法を参照のこと）に添加すると溶液が不透明化したが、ＧＦＰのみを含む対応溶液は透明のままであった（図１４Ｃ）。不透明なＭＥＤ１－ＩＤＲ溶液及びＢＲＤ４－ＩＤＲ溶液を蛍光顕微鏡法で分析したところ、ＧＦＰ陽性のミクロンサイズの球状液滴が存在し、こうした球状液滴は、溶液中を自由に移動し、ガラスのカバースリップの表面に落ちると表面を濡らし、そこに安定して留まるものであることが明らかとなった。ＭＥＤ１－ＩＤＲ液滴及びＢＲＤ４－ＩＤＲ液滴は、高度に球状であることがアスペクト比分析から決定され（図１９Ａ）、こうして高度に球状であることは、液体様液滴で予測される特性である（１０～１２）。
相分離液滴は、典型的には、系におけるコンポーネントの濃度に応じてサイズが増減する（２４）。本発明者らは、０．６μＭ～２０μＭの範囲の異なる濃度でＢＲＤ４－ＩＤＲ、ＭＥＤ１－ＩＤＲ、及びＧＦＰを用いて液滴形成アッセイを実施した。ＢＲＤ４－ＩＤＲ及びＭＥＤ１－ＩＤＲは、濃度依存性のサイズ分布を有する液滴を形成した一方で、ＧＦＰは、試験したすべての条件で拡散したままであった（図１４Ｄ及び図１９Ｂ）。濃度が下がると液滴は小さくなったが、最小試験濃度（０．６μＭ）でもＢＲＤ４－ＩＤＲ液滴及びＭＥＤ１－ＩＤＲ液滴が観測された（図１９Ｃ）。
精製ＩＤＲからなる液滴は、塩濃度の上昇に感受性であり得る（２５）。ＮａＣｌ濃度の上昇（５０ｍＭ→３５０ｍＭ）に伴ってＢＲＤ４－ＩＤＲ及びＭＥＤ１－ＩＤＲの両方のサイズ分布が、液滴が小さくなる方向に向かって変化し、このことは、弱い塩感受性タンパク質間相互作用のネットワークによって液滴形成が誘導されることと一致する（図１４Ｅ及び図１９Ｄ）。
液滴が、不可逆的に凝集するのか、または可逆的に相分離凝縮するのかどうかを試験するために、ＢＲＤ４－ＩＤＲ及びＭＥＤ１－ＩＤＲの液滴を形成させ、等モル濃度の塩溶液または高濃度の塩溶液で希釈してタンパク質濃度を１／２にした（図１４Ｆ）。事前に形成させたＢＲＤ４－ＩＤＲ液滴及びＭＥＤ１－ＩＤＲ液滴は共に、希釈及び塩濃度上昇に伴ってサイズ及び数が減少した（図１４Ｆ）。こうした結果は、ＢＲＤ４－ＩＤＲ液滴及びＭＥＤ１－ＩＤＲ液滴が系の条件に依存してサイズ分布を形成し、一度形成されても、系の変化に応答性であり、その際、サイズ分布が急速に調整されることを示している。こうした特徴は、弱いタンパク質間相互作用のネットワークによって形成される相分離凝縮体に特有のものである。
ＭＥＤ１ ＩＤＲは、細胞における液－液相分離に関与する
細胞における相分離の促進においてＭＥＤ１のＩＤＲが役割を担うかどうかを調べるために、本発明者らは、インビボでの液滴形成を直接的に観測することを可能にする以前に開発されたアッセイを使用した（２６）。簡潔に記載すると、光活性化可能な自己会合Ｃｒｙ２タンパク質がｍＣｈｅｒｒｙで標識され、目的ＩＤＲと融合しており、これによって、選択ＩＤＲの局所濃度を青色光誘導性に細胞内で上昇させることが可能である（図１５Ａ）（２６）。このアッセイでは、相分離を促進することが知られるＩＤＲは、ｃｒｙ２の光反応性のクラスター特性を増進することで（２７、２８）、青色光刺激に応じて液体様の球状液滴（ｏｐｔｏＤｒｏｐｌｅｔ）を急速に形成させる（図１５Ａ）（２６）。ＭＥＤ１ ＩＤＲの一部をＣｒｙ２－ｍＣｈｅｒｒｙと融合させると、青色光刺激に応じたミクロンサイズの球状ｏｐｔｏＤｒｏｐｌｅｔの急速形成が促進された（図１５Ｂ及び図１５Ｃ）。青色光刺激の間、近位に存在するｏｐｔｏＤｒｏｐｌｅｔが共に融合している（図５Ｄ）。さらに、融合においては、くびれ形成及び球形への弛緩という特徴的な液体様融合特性が示された（図５Ｅ）。
次に、本発明者らは、ＭＥＤ１－ＩＤＲ ｏｐｔｏＤｒｏｐｌｅｔが、液体様のＦＲＡＰ回復速度を示すかどうかを試験した（図１５Ｆ～Ｈ）。青色光を用いてＯｐｔｏＤｒｏｐｌｅｔ形成を誘導した後、青色光の非存在下で光退色を実施し、回復を観測した。蛍光は、数秒以内に回復し、ｏｐｔｏＤｒｏｐｌｅｔの境界を保持した（図１５Ｆ及び図１５Ｈ）。青色光によるＣｒｙ２相互作用の活性化の非存在下で急速なＦＲＡＰ動力学が得られたことは、青色光によって確立されたＭＥＤ１－ＩＤＲ ｏｐｔｏＤｒｏｐｌｅｔが、元のシグナルの非存在下で希薄相との交換が生じる動的な集合体であることを示唆している。こうしたデータは、生細胞の核内の臨界局所濃度での液－液相分離にＭＥＤ１のＩＤＲが関与し得ることを示す。
考察
スーパーエンハンサー（ＳＥ）は、健康な細胞状態及び病的な細胞状態において顕著な役割を有する遺伝子を制御することから、こうしたエレメントの理解が進めば、こうした細胞状態の転写制御に関与する制御機構への新たな洞察を得ることができる（１、２、２９）。ＳＥ及びそのコンポーネントは、相分離凝縮体を形成することが提唱されているが（３）、この仮説に対する実験的証拠はほとんど存在しない。本明細書において、本発明者らは、２つの主要なＳＥコンポーネントであるＢＲＤ４及びＭＥＤ１が、ＳＥ誘導性の転写が生じる部位に核内凝縮体を形成することを実証する。こうしたＳＥ凝縮体内では、ＢＲＤ４及びＭＥＤ１は、インビボでの相分離を誘導する他のタンパク質について以前に報告されたものと同様の見かけの拡散係数を示す（１８、１９）。ＢＲＤ４のＩＤＲ及びＭＥＤ１のＩＤＲの両方が、インビトロでの相分離に十分なものであり、ＭＥＤ１－ＩＤＲの一部分は、生細胞において液－液相分離を促進する。こうした結果は、転写装置を主要遺伝子にコンパートメント化し、そこに密集させる相分離凝縮体をＳＥが形成することを示すと共に、相分離において役割を担う可能性のあるＳＥコンポーネントを同定するものである。このモデルは、主要な細胞独自性遺伝子の制御及び核の機能的組織化に関わる機構に対する意義を有する。
ＳＥは、マスター転写因子（ＴＦ）がエンハンサークラスターに結合することによって確立され（１、２）、こうしたマスターＴＦは、細胞独自性を規定する遺伝子発現プログラムの制御を確立する上で十分なものである（３０～３６）。こうしたＴＦは、典型的には、結晶学的な方法によって決定可能な構造を有するＤＮＡ結合ドメインと、そのような方法によって規定できていない構造を有するＩＤＲからなる転写活性化ドメインと、からなる（３７～３９）。こうしたＴＦの活性化ドメインは、補助因子（メディエーター及びＢＲＤ４など）をＳＥに高密度で動員するものであり（２）、転写装置のこうしたコンポーネント及び他のコンポーネントの濃度は、液状凝縮体の形成に十分なものであると思われる。ヒトゲノムにコードされるほとんどのタンパク質と比較して、ＴＦ、補助因子、及び転写装置は、ＩＤＲ含量が高く（４０）、こうしたＩＤＲは、弱い多価相互作用を媒介し、それによってインビボでの凝縮を促進し得る。本発明者らは、高結合価因子がＳＥに凝縮すると、分離濃密相内に反応るつぼが創出され、そこでは、転写装置の局所濃度が高いことで、強固な遺伝子発現が維持されることを提唱する。
染色体の核内高次構造化は、ＳＥ凝縮体によって影響を受ける可能性がある。ＳＥ内の個々のエンハンサーが互いに相互作用する頻度は例外的に高いことがＤＮＡ相互作用技術によって示されており（３、４１～４３）、このことは、凝縮体がこうしたエレメントを濃密相中で近接するように導くいう考えと一致する。いくつかの最近の研究は、ＳＥが互いに相互作用し得、この様式で染色体高次構造化にも寄与し得ることを示唆している（４４、４５）。コヒーシンは、染色体構造維持（ＳＭＣ）タンパク質複合体であり、それが失われると核内でＳＥが広範に融合することから、ＳＥ間相互作用の抑制に関与している（４５）。こうしたＳＥ間相互作用は、液相凝縮体が融合を起こす傾向を有すること起因し得る（１０～１２）。
重要な遺伝子において転写装置をコンパートメント化する相分離凝縮体をＳＥが形成するというモデルは、多くの疑問を生じさせる。凝縮がどのように転写量の制御に寄与するのか？ＲＮＡポリメラーゼＩＩクラスター（相分離凝縮体であり得る）の超分解能試験は、凝縮体の寿命と転写量との間に正の相関があることを示唆している（４６）。どのコンポーネントが転写凝縮体の形成及び崩壊を誘導するのか？本発明者らの試験は、ＢＲＤ４及びＭＥＤ１が関与する可能性があることを示しているが、ＤＮＡ結合ＴＦ、補助因子、ＲＮＡ ＰＯＬＩＩ、及び制御性ＲＮＡの役割については、さらなる研究が必要である。腫瘍細胞は、ドライバーがん遺伝子に例外的に大きなＳＥを有しており、こうした例外的に大きなＳＥは、その起源細胞には生じないものであり、そのいくつかは、ＳＥでの濃度が高いコンポーネントを標的とする薬物に例外的に感受性である（２９、４７）。
材料及び方法
細胞培養
Ｖ６．５マウス胚性幹細胞（ｍＥＳＣ）は、Ｊａｅｎｉｓｃｈ ｌａｂからの供与物である。０．２％のゼラチン（Ｓｉｇｍａ、Ｇ１８９０）でコートされた組織培養プレート上で２ｉ培地において細胞を増殖させた。この２ｉ培地の組成は、ＤＭＥＭ－Ｆ１２（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１１３２００８２）、０．５×Ｂ２７サプリメント（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１７５０４０４４）、０．５×Ｎ２サプリメント（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１７５０２０４８）、追加の０．５ｍＭのＬ－グルタミン（Ｇｉｂｃｏ、２５０３０－０８１）、０．１ｍＭのｂ－メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ、Ｍ７５２２）、１％のペニシリンストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１５１４０１６３）、０．５×非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ、１１１４０－０５０）、１０００Ｕ／ｍｌのＬＩＦ（Ｃｈｅｍｉｃｏ、ＥＳＧ１１０７）、１μＭのＰＤ０３２５９０１（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ、０４－０００６－１０）、３μＭのＣＨＩＲ９９０２１（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ、０４－０００４－１０）である。細胞は、加湿インキュベーターにおいて、５％のＣＯ２雰囲気下、３７℃で増殖させた。共焦点画像化、デコンボリューション画像化、及び超分解能画像化については、ガラスのカバースリップ（Ｃａｒｏｌｉｎａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｕｐｐｌｙ、６３３０２９）、ガラス底ディッシュ（Ｔｈｏｍａｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１２１７Ｎ７９）、または８つのチャンバーを備えたカバーガラス（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１５５４０９ＰＫ、またはＶＷＲ、１００４８９－１０４）の上で細胞を増殖させ、これらのものは、５μｇ／ｍｌのポリ－Ｌ－オルニチン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｐ４９５７）及び５μｇ／ｍｌのラミニン（Ｃｏｒｎｉｎｇ、３５４２３２）を用いて、それぞれ３７Ｃで３０分間、及び３７Ｃで２時間～１６時間コートしてから使用した。継代培養については、１０００Ｕ／ｍｌのＬＩＦを含むＰＢＳ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＡＭ９６２５）で細胞を洗浄した。プレートからの細胞の剥離には、ＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｅｎｚｙｍｅ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１２６０４０２１）を使用した。ＴｒｙｐＬＥの反応停止は、ＦＢＳ／ＬＩＦ－培地を用いて行い、このＦＢＳ／ＬＩＦ－培地の組成は、ＤＭＥＭ Ｋ／Ｏ（Ｇｉｂｃｏ、１０８２９－０１８）、１×非必須アミノ酸、１％のペニシリンストレプトマイシン、２ｍＭのＬ－グルタミン、０．１ｍＭのｂ－メルカプトエタノール、及び１５％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｆ４１３５）である。１０００ｒｐｍ、室温で細胞を３分間スピンダウンしてから、２ｉ培地に再浮遊させ、５×１０６個の細胞を１５２ｃｍ２に蒔いた。
ｏｐｔｏＤｒｏｐｌｅｔ実験に使用するウイルスの生成には、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ－３２１６）を使用した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の培養は、１０％のＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｆ４１３５）、２ｍＭのＬ－グルタミン（Ｇｉｂｃｏ、２５０３０）、及び１００Ｕ／ｍＬのペニシリン－ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ、１５１４０）が添加されたＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ、１１９９５－０７３）において、加湿インキュベーター中、５％のＣＯ２雰囲気下、３７℃で行った。
ｏｐｔｏＤｒｏｐｌｅｔ実験では、ＮＩＨ３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ－３２１６）を使用した。ＮＩＨ３Ｔ３細胞の培養は、１０％のＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｆ４１３５）、２ｍＭのＬ－グルタミン（Ｇｉｂｃｏ、２５０３０）、及び１００Ｕ／ｍＬのペニシリン－ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ、１５１４０）が添加されたＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ、１１９９５－０７３）において、加湿インキュベーター中、５％のＣＯ２雰囲気下、３７℃で行った。
コンストラクトの生成
３０ｂｐのセリン－グリシンリンカーを利用して全長ヒトＭＥＤ１ ｃＤＮＡをｍＥＧＦＰと融合させることによってＭＥＤ１－ＧＦＰ発現コンストラクトを生成させ、これを、ＮＥＢ Ｈｉ－Ｆｉクローニングキット（ＮＥＢ Ｅ５５２０Ｓ）を使用してレンチウイルス発現ベクター中のＰＧＫプロモーターの隣に配置した。
細胞の処理及び細胞株の生成
トランスフェクト：細胞のトランスフェクトは、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｌ３０００００８）を用いて製造者の説明に従って行い、その際、下記の改変を加えた。１ｍｌのＦＢＳ／ＬＩＦ－培地に含めた１×１０６個の細胞を、６マルチウェルディッシュのうちの１つのゼラチンコートウェルに蒔いた。細胞を蒔く間、細胞上にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ－ＤＮＡ混合物を直ちに添加した。１２時間後、ＦＢＳ／ＬＩＦ－培地を２ｉ培地で置き換えた。トランスフェクトから２４～４８時間後に細胞を画像化した。
ＡＴＰの枯渇：０．５×Ｂ２７サプリメント及び０．５×Ｎ２サプリメントが添加されたグルコース非含有ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ、１１９６６０２５）において細胞を２時間培養した後、５ｍＭの２－デオキシ－グルコース（Ｓｉｇｍａ、Ｄ６１３４）及び１２６ｎＭのオリゴマイシン（Ｓｉｇｍａ、７５３５１）と共に細胞を２時間インキュベートした。製造者の説明に従って生物発光アッセイ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａ２２０６６）を使用して細胞のＡＴＰレベルを測定した。
免疫蛍光法
免疫蛍光法は、以前の報告のように実施し、その際、幾分かの改変を加えた（４９）。簡潔に記載すると、コートガラス上で増殖した細胞を、４％のパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）（ＶＷＲ、ＢＴ１４０７７０）を含むＰＢＳにおいて室温で１０分間固定化した。ＰＢＳでの５分間の洗浄を３回行った後、細胞を４Ｃで保管するか、または免疫蛍光法を行うために処理した。０．５％のｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｘ１００）を含むＰＢＳを用いて細胞の透過処理を室温で５分間行った。ＰＢＳでの５分間の洗浄を３回行った後、４％のＩｇＧ非含有ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（ＶＷＲ、１０２６４３－５１６）を用いて室温で少なくとも１５分間、細胞をブロッキングし、４％のＩｇＧ非含有ＢＳＡにおいて一次抗体（抗体表を参照のこと）と共に室温で一晩インキュベートした。ＰＢＳでの洗浄を３回行った後、暗所で二次抗体（抗体表を参照のこと）によって一次抗体を認識させた。ＰＢＳを用いて細胞を３回洗浄し、２０μｍ／ｍｌのＨＯＥＳＣＨ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｈ３５６９）を使用して暗所で核を室温で５分間染色した。Ｖａｃｔａｓｈｉｅｌｄ（ＶＷＲ、１０１０９８－０４２）を用いてスライドガラスをスライド上にマウントした。透明マニキュア液（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ 番号７２１８０）を用いてカバースリップをシールし、４℃で保管した。画像の取得は、ＭｅｔａＭｏｒｐｈ取得ソフトウェア及びＨａｍｍａｍａｔｓｕ ＯＲＣＡ－ＥＲ ＣＣＤカメラ（Ｗ．Ｍ．Ｋｅｃｋ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｆａｃｉｌｉｔｙ，ＭＩＴ）を使用して、１００×対物レンズを備えたＲＰＩスピニングディスク型共焦点顕微鏡で行うか、または６０×対物レンズを備えたＡｐｐｌｉｅｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＤｅｌｔａＶｉｓｉｏｎ－ＯＭＸ Ｓｕｐｅｒ－Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ顕微鏡（Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｃｏｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙ，Ｋｏｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）で行い、図の説明に記載されるように行った。構造化照明顕微鏡法は、直径が２００ｎｍ未満の核内構造体に使用し、その他の場合は、図の説明に記載したようにデコンボリューション顕微鏡法または共焦点顕微鏡法を使用した。画像の後処理は、Ｆｉｊｉ Ｉｓ Ｊｕｓｔ ＩｍａｇｅＪ（ＦＩＪＩ）（５０）もしくはＩｍａｒｉｓ ｖ９．０．０ Ｂｉｔｐｌａｎｅ Ｉｎｃ（Ｗ．Ｍ．Ｋｅｃｋ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｆａｃｉｌｉｔｙ，ＭＩＴ）（／／ｂｉｔｐｌａｎｅ．ｃｏｍで利用可能なソフトウェア）、またはＳｏｆｔｗｏｒｘ処理ソフトウェア（Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｃｏｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙ，Ｋｏｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して行った。
ＲＮＡ－ＦＩＳＨと免疫蛍光法との併用
免疫蛍光法は、以前の報告のように実施し、その際、下記の改変を加えた。免疫蛍光法は、ＲＮａｓｅが存在しない環境で実施し、ピペット及びベンチは、ＲＮａｓｅＺａｐ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＡＭ９７８０）で処理した。ＲＮａｓｅ非含有ＰＢＳを使用し、抗体の希釈は、常にＲＮａｓｅ非含有ＰＢＳで行った。免疫蛍光法の完了後、４％のＰＦＡを含むＰＢＳを用いて細胞を室温で１０分間、ポスト固定化した。ＲＮａｓｅ非含有ＰＢＳで細胞を２回洗浄した。２０％のＳｔｅｌｌａｒｉｓ ＲＮＡ ＦＩＳＨ緩衝液Ａ（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＳＭＦ－ＷＡ１－６０）、及び１０％の脱イオン化ホルムアミド（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｓ４１１７）を含むＲＮａｓｅ非含有水（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＡＭ９９３２）を用いて細胞を室温で５分間、１回洗浄した。９０％のＳｔｅｌｌａｒｉｓ ＲＮＡ ＦＩＳＨハイブリダイゼーション緩衝液（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＳＭＦ－ＨＢ１－１０）、１０％の脱イオン化ホルムアミド、ＳＥ関連遺伝子の転写物のイントロンへのハイブリダイゼーションが生じるように設計された１２．５μＭのＳｔｅｌｌａｒｉｓ ＲＮＡ ＦＩＳＨプローブを用いて細胞のハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーションは、３７Ｃで一晩実施した。次に、洗浄緩衝液Ａを用いて細胞を３７℃で３０分間洗浄し、２０μｍ／ｍｌのＨＯＥＳＣＨを含む洗浄緩衝液Ａを用いて核を室温で５分間染色した。Ｓｔｅｌｌａｒｉｓ ＲＮＡ ＦＩＳＨ洗浄緩衝液Ｂ（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＳＭＦ－ＷＢ１－２０）を用いて５分間の洗浄を室温で１回実施した後、免疫蛍光法について記載したようにカバースリップをマウントした。画像の取得は、ＲＰＩスピニングディスク型共焦点顕微鏡で行った。
光退色後蛍光回復（ＦＲＡＰ）
蛍光タグを有するタンパク質を発現する細胞の画像化は、１００×対物レンズを備えたＡｎｄｏｒ Ｒｅｖｏｌｕｔｉｏｎ Ｓｐｉｎｎｉｎｇ Ｄｉｓｋ Ｃｏｎｆｏｃａｌ，ＦＲＡＰＰＡシステム、及びＭｅｔａｍｏｒｐｈ取得ソフトウェア（Ｗ．Ｍ．Ｋｅｃｋ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｆａｃｉｌｉｔｙ，ＭＩＴ）を用いて２０秒間にわたって１秒ごとに行った。退色実施前に１枚または２枚の画像を取得してから、定量可能なレーザーモジュール（ＱＬＭ）のレーザー（４８８ｎｍ）を用いておよそ０．５μｍ２を退色させた。目的の選択領域に対して各２０μ秒のパルスを５回照射してＦＲＡＰを実施した。
画像化解析
構造化照明及びデコンボリューションの処理については、Ｓｏｆｔｗｏｒｘ処理ソフトウェア（Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｃｏｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙ，Ｋｏｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用した。
図１１Ｅに示されるデータについては、ＦＩＪＩ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ（５１）またはＦＩＪＩ Ｏｂｊｅｃｔ Ｃｏｕｎｔｅｒ ３Ｄ Ｐｌｕｇｉｎ（５１）を使用して核内凝縮体の数を数えた。最小ボクセルサイズを４とし、強度のカットオフは、明暗対比解析に基づいて決定した。
ＩＦ／ＲＮＡ－ＦＩＳＨの解析については、ＢＲＤ４凝縮体及びＭＥＤ１凝縮体ならびにＲＮＡ－ＦＩＳＨフォーカスのサイズ及び座標をＦＩＪＩ Ｏｂｊｅｃｔ Ｃｏｕｎｔｅｒ ３Ｄ Ｐｌｕｇｉｎを用いて測定した（５１）。画像取得パラメーターに従って、画像のピクセルの幅及び長さをＦＩＪＩ内で０．０５７２００９ミクロンに設定し、ボクセル幅を０．５ミクロンに設定した。構造体については、最小値を４ボクセルとする必要があった。それぞれの新生ＲＮＡ転写物構造体（ＦＩＳＨ）と最も近いタンパク質構造体（ＩＦ）との間の３次元距離は、以下のように測定した。ＦＩＪＩ Ｏｂｊｅｃｔ Ｃｏｕｎｔｅｒ ３Ｄ ｐｌｕｇｉｎを用いて個別フォーカスを特定した後、同じセットの画像におけるそれぞれのＦＩＳＨフォーカスの中心とすべての他のＩＦフォーカスの中心との間の３次元距離を計算した。最も近い１つのＩＦフォーカスを確保し、最近傍フォーカスまでの距離の分布の表示に使用した。それぞれのＦＩＳＨフォーカスの５ミクロン以内に存在する無作為なＩＦフォーカスもまた、確率論的対照として確保した。
ＦＲＡＰ解析については、非退色領域の強度または核全体の強度に対して光退色領域の蛍光強度を正規化したものとして蛍光回復を測定した。蛍光強度は、ＦＩＪＩ ＦＲＡＰプロファイラープラグイン（コードは、Ｊｅｆｆ Ｈａｒｄｉｎによって記述されたものであり（Ｔｏｎｙ ＣｏｌｌｉｎｓのＭａｃｂｉｏｐｈｏｔｏｎｉｃｓプラグインの改良物）、以下で入手可能である：／／ｗｏｒｍｓ．ｚｏｏｌｏｇｙ．ｗｉｓｃ．ｅｄｕ／ｒｅｓｅａｒｃｈ／４ｄ／４ｄ．ｈｔｍｌ）を用いて測定した
ＣｈＩＰ－Ｓｅｑ解析
リード長に対するパラメーターを－ｋ １ －ｍ １ －ｂｅｓｔ及び－ｌに設定してｂｏｗｔｉｅを使用してｍｍ９バージョンのマウス参照ゲノムへのＣｈＩＰ－Ｓｅｑデータのアライメントを行った（５２）。ビンにおけるリードカバレッジを表示するためのＷｉｇｇｌｅファイルは、ＭＡＣＳ（パラメーターを－ｗ －Ｓ －ｓｐａｃｅ＝５０ －ｎｏｍｏｄｅｌ －ｓｈｉｆｔｓｉｚｅ＝２００とした）を使用して作成し、ビン当たりのリード数は、ｗｉｇｇｌｅファイルの作成に使用した数百万のマッピングリードに正規化した（５３）。リード数／百万に正規化されたｗｉｇｇｌｅファイルをＵＣＳＣゲノムブラウザーに表示した（５４）。ＢＲＤ４、ＭＥＤ１、及びＲＮＡ ＰｏｌＩＩについて、ＭＡＣＳ（－ｐ １ｅ－９－ｋｅｅｐ－ｄｕｐ＝１を使用）及びインプット対照を使用して濃縮のピークを同定した。マウス胚性幹細胞におけるスーパーエンハンサーの位置は、以前の刊行物からダウンロードした（５５）。
因子の共局在化ヒートマップは、ＢＲＤ４またはＭＥＤ１のピークが特定されたコラプス領域単位を使用して作成し、コラプス領域単位は、ｂｅｄｔｏｏｌｓ ｍｅｒｇｅを使用して生成させた（５６）。ｂａｍＴｏＧＦＦ（ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ＢｒａｄｎｅｒＬａｂ／ｐｉｐｅｌｉｎｅ）（パラメーターを－ｍ ５０－ｒ－ｆ １－ｅ ２００とした）を使用することで、コラプス領域ごとに、等しいサイズの５０のビンにおいてリード密度を計算した。ヒートマップでは、所与の横列におけるＢＲＤ４／ＭＥＤ１／ＰｏｌＩＩシグナルのリードシグナルによる順序付けを、すべての縦列にわたって行った。ｓａｍｔｏｏｌｓ ｒｍｄｕｐを使用して、想定されるＰＣＲ重複を除去し、こうした非重複リードの密度をヒートマップの構築に使用した（５７）。
データセットは、以下の通りである：
ＨＰ１ａ：ＧＳＭ１３７５１５９ ＲＮＡＰＩＩ：ＧＳＭ１５６６０９４ ＭＥＤ１：ＧＳＭ５６０３４８ ＢＲＤ４：ＧＳＭ１６５９４０９
インプット対照：ＧＳＭ１０８２３４３
タンパク質精製
細菌における組換えタンパク質発現については、６×ＨＩＳ－ｍＥＧＦＰ－リンカー－ＩＤＲ（ＢＲＤ４－ＩＤＲ（ＢＲＤ４６７４－１３５１）もしくはＭＥＤ１－ＩＤＲ（ＭＥＤ１９４８－１５７４）のためのもの）または６×－ＨＩＳ－ｍＥＧＦＰ－リンカーをＴ７ ｐＥＴ発現ベクター（ａｄｄｇｅｎｅ：２９６６３）にクローニングした。リンカー配列は、ＧＡＰＧＳＡＧＳＡＡＧＧＳＧ（配列番号１４）である。プラスミドを用いた形質転換は、ＬＯＢＳＴＲ細胞（Ｃｈｅｅｓｅｍａｎ Ｌａｂからの供与物）に対して行った。カナマイシン及びクロラムフェニコールを含むＬＢ培地に新鮮な細菌コロニーを播種し、３７℃で一晩増殖させた。カナマイシン及びクロラムフェニコールを新たに添加した５００ｍｌの予熱ＬＢでこうした細菌を１：１５希釈し、３７℃で１．５時間増殖させた。１ｍＭのＩＰＴＧを用いてタンパク質発現を誘導した後、細胞をさらに５時間増殖させ、収集し、使用するまで－８０℃で凍結保管した。
５００ｍｌの細胞から得られたペレットを、１０ｍＭのイミダゾール及びｃＯｍｐｌｅｔｅプロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ、１１８７３５８０００１）を含む１５ｍｌの緩衝液Ａ（５０ｍＭのトリス（ｐＨ７．５）、５００ｍＭのＮａＣｌ）に再浮遊させ、超音波処理（１５秒間オン、６０秒間オフのサイクルを１０回実施）に供した。可溶化液を１２，０００ｇ、４℃で３０分間遠心分離することによって清澄化し、１０倍体積の緩衝液Ａで事前に平衡化した１ｍｌのＮｉ－ＮＴＡアガロース（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｒ９０１－１５）を添加した。このアガロース可溶化液スラリーを含むチューブを４Ｃで１．５時間旋回振とうした。このスラリーをカラムに流し込み、このパッキングしたアガロースを１５倍体積のイミダゾール（１０ｍＭ）含有緩衝液Ａで洗浄した。タンパク質の溶出を、２ｍｌのイミダゾール（５０ｍＭ）含有２×緩衝液Ａ、２ｍｌのイミダゾール（１００ｍＭ）含有２×緩衝液Ａ、及び最後に２ｍｌのイミダゾール（２５０ｍＭ）含有４×緩衝液Ａで行った。
タンパク質を含むことをクマシー染色ゲルによって判断した溶出液を統合し、緩衝液Ｄ（５０ｍＭのトリス－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５００ｍＭのＮａＣｌ、１０％のグリセロール、１ｍＭのＤＴＴ）に対して透析した。
インビトロの液滴アッセイ
Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ遠心分離フィルター（３０Ｋ ＭＷＣＯ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して組換えＧＦＰ融合タンパク質を濃縮及び脱塩することで、タンパク質を適切な濃度とし、ＮａＣｌ濃度を１２５ｍＭとした。液滴形成緩衝液（５０ｍＭのトリス－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０％のグリセロール、１０％のＰＥＧ－８０００（Ｓｉｇｍａ ８９５１０）、１ｍＭのＤＴＴ）中に異なる濃度（記載の最終塩濃度）で塩を含む溶液に組換えタンパク質を添加した。このタンパク質溶液を、並行に配置された２つの両面テープ片によってカバースリップが取り付けられたスライドガラスから構成される自作チャンバーに直ちにロードした。次に、１００×対物レンズを使用してＡｎｄｏｒ Ｒｅｖｏｌｕｔｉｏｎ Ｓｐｉｎｎｉｎｇ Ｄｉｓｋ Ｃｏｎｆｏｃａｌでスライドを画像化した。別段の指定がない限り、示される画像は、ガラスのカバースリップ上で安定した状態の液滴のものである。
ＯｐｔｏＤｒｏｐｌｅｔアッセイ
ｏｐｔｏＤｒｏｐｌｅｔアッセイは、Ｓｈｉｎ，Ｙ ｅｔ ａｌ Ｃｅｌｌ ２０１７のものを当てはめた（５８）。ＩＤＲのクローニングについては、天然変性ドメインをコードするＤＮＡセグメントを、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｆｌａｓｈ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｆ５４８Ｓ）を使用して増幅した。ｍＣｈｅｒｒｙ－Ｃｒｙ２融合タンパク質を含む第ＩＩ世代のレンチウイルス骨格（Ｂｒａｎｇｗｙｎｎｅ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから入手した）へと、Ｈｉ－Ｆｉ ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ（ＮＥＢ Ｅ２６２１Ｓ）を使用してセグメントをクローニングした。クローニングしたｏｐｔｏ－ｄｒｏｐｌｅｔプラスミドを、ｐｓＰＡＸ（Ａｄｄｇｅｎｅ １２２６０）ウイルスパッケージングプラスミド及びｐＭＤ２．Ｇ（Ａｄｄｇｅｎｅ １２２５９）ウイルスパッケージングプラスミドと共に、ＰＥＩトランスフェクト試薬（ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ ２３９６６－１）を使用してコトランスフェクトした。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてウイルスを生成させ、直接的に使用するか、またはＴａｋａｒａ Ｌｅｎｔｉ－Ｘ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（６３１２３２）を使用して濃縮した。形質導入については、形質導入の１日前に３Ｔ３細胞を蒔いた（３５ｍｍの組織培養ウェル当たり４００，０００個細胞で播種した）。細胞にウイルス培地を添加し、２４時間の時点で、画像化または増殖のために細胞を通常培地で増殖させた。画像化については、０．１ｍｇ／ｍｌのフィブロネクチン（ＥＭＤ－Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＦＣ０１０）を用いて３５ｍｍのＭａｔＴｅｋガラス底ディッシュ（ＭａｔＴｅｋ Ｐ３５Ｇ－１．５－２０－Ｃ）を３７℃で２０分間コートし、細胞を蒔く前にＰＢＳで２回洗浄した。画像化の１日前に、３５ｍｍのディッシュ当たり４００，０００個細胞で細胞を蒔いた。画像化は、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ７１０ポイントスキャン顕微鏡で実施した。別段の指定がない限り、画像化の間、２秒ごとに４８８ｎｍの光パルスを用いて液滴形成を誘導し、画像もまた、２秒ごとに取得した。画像化時間は、示される通りである。ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光は、５６１ｎｍの光で刺激した。ＦＲＡＰ実験については、４８８ｎｍの光を用いて液滴形成を４０秒間誘導し、４０秒の時点で、５６１ｎｍの光でフォーカスの退色を実施し、４８８ｎｍの刺激の非存在下で回復を２秒ごとに画像化した。
抗体
Figure 2024029228000005
コンストラクト
Figure 2024029228000006
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実施例３
遺伝子発現は、ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）及び活性化ドメイン（ＡＤ）からなる転写因子（ＴＦ）によって制御される。ＤＢＤについてはよく特徴付けられているが、ＡＤが遺伝子活性化に影響を与える機構についてはほとんど知られていない。本明細書において、本発明者らは、多様なＡＤが、メディエーターコアクチベーターと共に相分離凝縮体を形成することを報告する。ＯＣＴ４ ＴＦ及びＧＣＮ４ ＴＦについて、本発明者らは、メディエーターと共に相分離液滴をインビトロで形成する能力と、インビボで遺伝子を活性化する能力とが、同じアミノ酸残基に依存することを示す。エストロゲン受容体（ＥＲ）（リガンド依存性アクチベーター）について、本発明者らは、エストロゲンがメディエーターと共に相分離を増進することで、先と同様に、相分離が遺伝子活性化と結び付くことを示す。こうした結果は、多様なＴＦが、そのＡＤの相分離能力によってメディエーターと相互作用することができ、メディエーターとの凝縮体の形成が、遺伝子活性化に関与することを示唆している。
酵母ＴＦ ＧＣＮ４のＡＤは、メディエーターサブユニットＭＥＤ１５の複数部位に対して複数の配向及び立体配座で結合することが最近の研究によって示されている（Ｂｒｚｏｖｉｃ ｅｔ ａｌ．，２０１１、Ｊｅｄｉｄｉ ｅｔ ａｌ．，２０１０、Ｔｕｔｔｌｅ ｅｔ ａｌ．，２０１８、Ｗａｒｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。この型のタンパク質間相互作用は、その相互作用界面を単一の立体配座によって説明できないものであり、こうした相互作用の産物は、「ファジー複合体」と呼ばれている（Ｔｏｍｐａ ａｎｄ Ｆｕｘｒｅｉｔｅｒ，２００８）。こうした動的相互作用は、相分離生体分子凝縮体の形成を促進するＩＤＲ間相互作用に典型的なものでもある（Ａｌｂｅｒｔｉ，２０１７、Ｂａｎａｎｉ ｅｔ ａｌ．，２０１７、Ｈｙｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４、Ｓｈｉｎ ａｎｄ Ｂｒａｎｇｗｙｎｎｅ，２０１７、Ｗｈｅｅｌｅｒ ａｎｄ Ｈｙｍａｎ，２０１８）。
本明細書において、本発明者らは、多様なＴＦ ＡＤがメディエーターコアクチベーターと共に相分離することを報告する。本発明者らは、胚性幹細胞（ＥＳＣ）多能性ＴＦ ＯＣＴ４、エストロゲン受容体（ＥＲ）、及び酵母ＴＦ ＧＣＮ４が、メディエーターと共に相分離凝縮体を形成し、活性化及び相分離の両方に同じアミノ酸またはリガンドを必要とすることを示す。本発明者らは、コアクチベーターとのＩＤＲ介在性の相分離が、ＴＦ ＡＤが遺伝子を活性化する機構であることを示す。
結果
ＥＳＣスーパーエンハンサーにおけるメディエーター凝縮体は、ＯＣＴ４に依存する
ＯＣＴ４は、ＥＳＣの多能性状態に必要不可欠なマスターＴＦであり、ＥＳＣ ＳＥにおける決定的なＴＦである（Ｗｈｙｔｅ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。メディエーターコアクチベーターは、ＥＳＣ ＳＥにおいて凝縮体を形成するものであり（Ｓａｂａｒｉ ｅｔ ａｌ．，２０１８）、ＭＥＤ１サブユニット（表Ｓ３）を介してＯＣＴ４と相互作用すると考えられている（Ａｐｏｓｔｏｌｏｕ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。メディエーター凝縮体の形成にＯＣＴ４が寄与するのであれば、ＭＥＤ１小斑点が観測されているＳＥにＯＣＴ４小斑点が存在するはずである。実際、免疫蛍光（ＩＦ）顕微鏡法を新生ＲＮＡ ＦＩＳＨと同時に行うと、主要な多能性遺伝子であるＥｓｒｒｂ、Ｎａｎｏｇ、Ｔｒｉｍ２８、及びＭｉｒ２９０のＳＥに個別のＯＣＴ４小斑点が認められた（図２０）。平均画像解析からは、ＯＣＴ４ ＩＦがＲＮＡ ＦＩＳＨフォーカスの中心に濃縮されることが確認された。この濃縮は、無作為に選択された核内位置を使用すると観測されなかった（図２７）。こうした結果から、メディエーターが凝縮体を形成するＳＥと同じＳＥに存在する小斑点にＯＣＴ４が生じることが確認され（Ｓａｂａｒｉ ｅｔ ａｌ．，２０１８）、こうしたＳＥを、ＯＣＴ４とＭＥＤ１とが共に占有するすることをＣｈＩＰ－ｓｅｑは示している（図２０）。
本発明者らは、ＳＥに存在するメディエーター凝縮体がＯＣＴ４に依存するかどうかを、分解方針を使用して調べた（Ｎａｂｅｔ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。ＯＣＴ４と融合したＦＫＢＰタンパク質をコードするＤＮＡの内在性ノックインを有するＥＳＣ株におけるＯＣＴ４の分解を、ｄＴａｇを添加することによって２４時間誘導した（Ｗｅｉｎｔｒａｕｂｅｔａｌ．，２０１７）（図２１Ａ及び図２８Ａ）。ＯＣＴ４の分解を誘導すると、ＯＣＴ４タンパク質のレベルは減少したが、ＭＥＤ１のレベルは影響を受けなかった（図２８Ｂ）。ＣｈＩＰ－ｓｅｑで分析したところ、エンハンサーに対するＯＣＴ４及びＭＥＤ１の占有が減少し、典型的エンハンサー（ＴＥ）と比較して、ＳＥが受ける影響が最も大きいことが示された（図２１Ｂ）。ＲＮＡ－ｓｅｑからは、ＳＥ誘導性遺伝子の発現が同時に減少することが明らかとなった（図２１Ｂ）。例えば、ＯＣＴ４及びＭＥＤ１による占有は、Ｎａｎｏｇ ＳＥでは、およそ９０％減少し（図２１Ｃ）、この占有減少は、Ｎａｎｏｇ ｍＲＮＡのレベルが６０％減少することと関連していた（図２１Ｄ）。免疫蛍光（ＩＦ）顕微鏡法をＤＮＡ ＦＩＳＨと同時に行ったところ、ＯＣＴ４が分解されると、ＮａｎｏｇにおけるＭＥＤ１凝縮体が減少することが示された（図２１Ｅ及び図２８Ｃ）。こうした結果は、ＥＳＣ ＳＥにおけるメディエーター凝縮体の存在がＯＣＴ４に依存することを示す。
ある特定のＥＳＣ ＳＥでは、ＥＳＣが分化するとＯＣＴ４の結合が減少し、それによってこうしたＯＣＴ４依存性ＳＥが減少することで、こうした部位におけるメディエーター凝縮体が減少することになる。この考えを試験するために、本発明者らは、ＬＩＦの供給停止によってＥＳＣを分化させた。分化細胞集団では、ＭＥＤ１タンパク質が継続的に発現している（図２８Ｅ）にもかかわらず、ＭｉＲ２９０ ＳＥに対するＯＣＴ４及びＭＥＤ１の占有が減少し（図２１Ｆ、図２１Ｇ、及び図２８Ｄ）、ＭｉＲ２９０ ｍｉＲＮＡのレベルが減少する（図２１Ｈ）ことが観測された。このことに対応して、分化細胞集団では、ＭＥＤ１凝縮体がＭｉｒ２９０において減少した（図２１Ｉ及び図２８Ｆ）。こうした結果は、ＯＣＴ４デグロン実験から得られたものと一致しており、こうしたＥＳＣ
ＳＥにおけるメディエーター凝縮体が、ＯＣＴ４によるエンハンサーエレメントの占有に依存するという考えを支持するものである。
ＯＣＴ４は、ＭＥＤ１液滴に取り込まれる
ＯＣＴ４は、遺伝子活性化を担う天然変性ＡＤを２つ有しており、これらの天然変性ＡＤは、構造化ＤＢＤに隣接する（図２２Ａ）（Ｂｒｅｈｍ ｅｔ ａｌ．，１９９７）。ＩＤＲは、弱い相互作用の動的ネットワークを形成することが可能であり、凝縮体形成に関与するタンパク質の精製ＩＤＲは、相分離液滴を形成できることから（Ｂｕｒｋｅ ｅｔ ａｌ．，２０１５、Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５、Ｎｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，２０１５）、本発明者らは、次に、メディエーターのＭＥＤ１サブユニットのＩＤＲの存在下及び非存在下で、ＯＣＴ４が、インビトロで液滴を形成することが可能かどうかを調べた。
組換えＯＣＴ４－ＧＦＰ融合タンパク質を精製し、クラウディング剤（１０％のＰＥＧ－８０００）を含む液滴形成緩衝液に添加して、核の密に込み合った環境を模倣した。液滴混合物を蛍光顕微鏡法で分析したところ、ＯＣＴ４は、試験した濃度範囲を通じて、単独では液滴を形成しないことが明らかとなった（図２２Ｂ）。対照的に、精製された組換えＭＥＤ１－ＩＤＲ－ＧＦＰ融合タンパク質では、濃度依存性の液－液相分離が生じ（図２２Ｂ）、このことは、以前の報告（Ｓａｂａｒｉ ｅｔ ａｌ．，２０１８）と一致した。
次に、本発明者らは、これら２つのタンパク質を混合し、ＭＥＤ１－ＩＤＲの液滴が精製ＯＣＴ４－ＧＦＰを取り込み、密集させて異型の液滴を形成することを見出した（図２２Ｃ）。対照的に、精製ＧＦＰは、ＭＥＤ１－ＩＤＲ液滴に密集しなかった（図２２Ｃ、図２９Ａ）。ＯＣＴ４－ＭＥＤ１－ＩＤＲ液滴は、ほぼミクロンサイズの大きさを有し（図２９Ｂ）、光退色後の回復が早く（図２２Ｄ）、球形を有し（図２９Ｃ）、塩に感受性であった（図２２Ｅ及び図２９Ｄ）。このように、ＯＣＴ４－ＭＥＤ１－ＩＤＲ液滴が示した特徴は、相分離液状凝縮体と結び付くものであった（Ｂａｎａｎｉ ｅｔ ａｌ ２０１７、Ｓｈｉｎ ｅｔ ａｌ ２０１７）。さらに、本発明者らは、クラウディング剤が全く存在しなくてもＯＣＴ４－ＭＥＤ１－ＩＤＲ液滴が形成され得ることを見出した（図２９Ｅ及び図２９Ｆ）。
ＯＣＴ４－ＭＥＤ１－ＩＤＲの液滴形成及び遺伝子活性化に必要な残基
凝縮体の形成には、複数のカテゴリーのアミノ酸相互作用が関与しているため、本発明者らは、次に、ＯＣＴ４－ＭＥＤ１－ＩＤＲ相分離液滴が形成される上で特定のＯＣＴ４アミノ酸残基が必要であるかどうかを調べた。例えば、ＭＥＤ１相分離にはセリン残基が必要である（Ｓａｂａｒｉ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。本発明者らは、ＯＣＴ４ ＡＤにおけるアミノ酸含量の高まりが相互作用のための機構を示唆し得るかどうかを調べた。アミノ酸頻度及び電荷の偏りを分析したところ、ＯＣＴ４ ＩＤＲは、プロリン及びグリシンの含量が高く、全体として酸性の電荷を有していることが明らかとなった（図２３Ａ）。ＡＤは、酸性アミノ酸及びプロリンの含量が高いことが知られており、このことを基礎として歴史的に分類されているが（Ｆｒｉｅｔｚｅ ａｎｄ Ｆａｒｎｈａｍ，２０１１）、こうして高含有であることによって遺伝子活性化が生じ得る機構は知られていない。本発明者らは、ＡＤにおけるプロリンまたは酸性アミノ酸が、相分離ＭＥＤ１－ＩＤＲ液滴との相互作用を促進し得るという仮説を立てた。このことを試験するために、本発明者らは、蛍光標識されたプロリンデカペプチド及びグルタミン酸デカペプチドを設計し、これらのペプチドがＭＥＤ１－ＩＤＲ液滴に密集し得るかどうかを調べた。これらのペプチドを単独で液滴形成緩衝液に添加すると、これらのペプチドは、溶液に留まった（図３０Ａ）。一方で、ＭＥＤ１－ＩＤＲ－ＧＦＰとの混合時には、プロリンペプチドはＭＥＤ１－ＩＤＲ液滴に取り込まれなかった一方で、グルタミン酸ペプチドは、その中に密集した（図２３Ｂ及び図３０Ｂ）。こうした結果は、酸性残基を有するペプチドがＭＥＤ１相分離液滴に取り込まれやすいことを示している。
こうした結果に基づき、本発明者らは、ＯＣＴ４タンパク質がそのＡＤに酸性アミノ酸を有さなければ、それがＭＥＤ１－ＩＤＲと共に相分離する能力が失われ得ると推定した。そのように酸性残基に依存するのであれば、ＯＣＴ４－ＭＥＤ１－ＩＤＲ液滴が塩に対して高度に感受性であるという本発明者らの知見と一致することになる。この考えを試験するために、本発明者らは、ＡＤにおける酸性残基をすべてアラニンで置き換えた変異ＯＣＴ４（したがって、Ｎ末端ＡＤにおける１７個のＡＡ、及びＣ末端ＡＤにおける６つのＡＡが変更されている）を生成させた（図２３Ｃ）。このＧＦＰ融合型ＯＣＴ４変異体を精製ＭＥＤ１－ＩＤＲと混合すると、液滴への移行が大幅に弱まった（図２３Ｃ及び図３０Ｃ）。この効果が酸性残基に特異的なものであるかどうかを試験するために、本発明者らは、ＡＤ内のすべての芳香族アミノ酸をアラニンに変更したＯＣＴ４変異体を生成させた。本発明者らは、この変異体がＭＥＤ１－ＩＤＲ液滴に依然として取り込まれることを見出した（３０Ｃ及び３０Ｄ）。こうした結果は、ＯＣＴ４がＭＥＤ１－ＩＤＲと共に相分離する能力がＯＣＴ４ ＩＤＲの酸性残基に依存することを示している。
こうした結果がＭＥＤ１－ＩＤＲに限ったものではないことを確かめるために、本発明者らは、精製メディエーター複合体がインビトロで液滴を形成し、ＯＣＴ４を取り込み得るかどうかを探求した。以前の報告（Ｍｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００８）のようにヒトメディエーター複合体を精製した後、液滴形成アッセイに使用するために濃縮した（図３０Ｅ）。精製した内在性メディエーターは蛍光タグを含まないため、本発明者らは、微分干渉（ＤＩＣ）顕微鏡法によって液滴形成を監視し、この精製内在性メディエーターが約２００～４００ｎＭで液滴を単独で形成することを見出した（図２３Ｄ）。ＭＥＤ１－ＩＤＲ液滴についての結果と一致して、ＯＣＴ４は、ヒトメディエーター複合体液滴内に取り込まれたが、ＯＣＴ４酸性変異体の取り込みは弱まった。こうした結果は、ＭＥＤ１－ＩＤＲ及び完全なメディエーター複合体がそれぞれ、相分離挙動をとることを示すと共に、それら両方が、酸性アミノ酸によって生じる静電的相互作用に依存する様式でＯＣＴ４を取り込むことを示唆している。
ＯＣＴ４ ＡＤの酸性変異が、この因子がインビボで転写を活性化する能力に影響を与えるかどうかを試験するために、本発明者らは、ＧＡＬ４トランス活性化アッセイを利用した（図２３Ｅ）。この系では、ＡＤまたはその変異体対応物をＧＡＬ４ ＤＢＤと融合させ、ルシフェラーゼレポータープラスミドを保有する細胞において発現させた。本発明者らは、ＧＡＬ４－ＤＢＤと融合した野生型ＯＣＴ４－ＡＤが転写を活性化することができる一方で、酸性変異体はこの機能を失っていることを見出した（図２３Ｅ）。こうした結果は、インビトロでのＭＥＤ１相分離液滴に取り込まれるためにも、インビボで遺伝子を活性化するためにも、ＯＣＴ４ ＡＤの酸性残基が必要であることを示している。
複数のＴＦがメディエーターサブユニット液滴と共に相分離する
さまざまな型のＡＤを有するＴＦがメディエーターサブユニットと相互作用することが示されており、そうしたサブユニットの中で、ＭＥＤ１は、ＴＦが最も標的とするサブユニットである（表Ｓ３）。以前の分析によって示されているように、ＴＦ及びその推定ＡＤは、ＩＤＲの含有率が高いことが、哺乳類ＴＦの分析から確認されている（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，２００６、Ｓｔａｂｙ ｅｔ ａｌ．，２０１７ｂ）（図２４Ａ）。本発明者らは、多くの異なるＴＦが、ＭＥＤ１－ＩＤＲと相互作用して液滴を形成し、それ故に、ＭＥＤ１凝縮体に取り込まれ得ると推論した。多様なＭＥＤ１相互作用転写因子がＭＥＤ１と共に相分離し得るかどうかを評価するために、本発明者らは、全長のＭＹＣ、ｐ５３、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＲＡＲａ、ＧＡＴＡ２、及びＥＲをｍＥＧＦＰタグ付きの組換え体として精製して調製した（表Ｓ５）。液滴形成緩衝液に添加すると、ほとんどのＴＦが単独で液滴を形成した（図２４Ｂ）。ＭＥＤ１－ＩＤＲと共に液滴形成緩衝液に添加すると、こうしたＴＦの７つすべてが、ＭＥＤ１－ＩＤＲ液滴に密集した（図２４Ｃ、図３１Ａ）。本発明者らは、ＦＲＡＰ分析にｐ５３液滴を選択した。ｐ５３液滴では、急速かつ動的な内部組織化が生じ（図３１Ｂ）、このことは、ｐ５３液滴が液状凝縮体であるという考えを支持するものである。こうした結果は、メディエーターのＭＥＤ１サブユニットと相互作用することが以前に示されたＴＦがそのような能力を有することが、ＭＥＤ１と共に相分離凝縮体を形成することによるものであることを示している。
エストロゲンは、ＭＥＤ１と共に生じるエストロゲン受容体の相分離を刺激する
エストロゲン受容体（ＥＲ）は、リガンド依存性ＴＦの研究がよく進んでいる例である。ＥＲは、Ｎ末端に位置するリガンド非依存性ＡＤと、中央に位置するＤＢＤと、Ｃ末端に位置するリガンド依存性ＡＤ（リガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）とも呼ばれる）と、からなる（図２５Ａ）。エストロゲンは、ＥＲのＬＢＤに結合する（この結合によって、ＭＥＤ１－ＩＤＲ内のＬＸＸＬＬモチーフに対する結合ポケットが露出する）ことによって、ＥＲとＭＥＤ１との相互作用を促進する（図２５Ａ及び図２５Ｂ）（Ｍａｎａｖａｔｈｉ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。本発明者らは、ＥＲが、これまでこうした試験に使用してきたＭＥＤ１－ＩＤＲ組換えタンパク質（ＬＸＸＬＬモチーフを有さない）と共に異型の液滴を形成し得ることを見出した（図２４Ｃ）。このことがきっかけとなり、本発明者らは、ＥＲ－ＭＥＤ１液滴形成がエストロゲンに対して応答性であるかどうか、及びこのことにＭＥＤ１ ＬＸＸＬＬモチーフが関与するかどうかを調べた。
本発明者らは、ＬＸＸＬＬモチーフを含むＭＥＤ１－ＩＤＲ組換えタンパク質（ＭＥＤ１－ＩＤＲＸＬ－ｍＣｈｅｒｒｙ）を使用して液滴形成アッセイを実施し、ＭＥＤ１－ＩＤＲ及び完全なメディエーターと同様に、ＭＥＤ１－ＩＤＲＸＬ－ｍＣｈｅｒｒｙが単独で液滴を形成する能力を有していることを見出した（図２５Ｃ）。次に、本発明者らは、ＥＲがＭＥＤ１－ＩＤＲＸＬ－ｍＣｈｅｒｒｙ液滴及びＭＥＤ１－ＩＤＲ－ｍＣｈｅｒｒｙ液滴と共に相分離する能力を試験した。いくつかの組換えＥＲは、ＭＥＤ１－ＩＤＲＸＬ－ｍＣｈｅｒｒｙ液滴に取り込まれ、そこに密集したが、エストロゲンを添加すると異型の液滴の形成がかなり増進した（図２５Ｄ及び図２５Ｅ）。対照的に、この実験をＭＥＤ１－ＩＤＲ－ｍＣｈｅｒｒｙ（ＬＸＸＬＬモチーフを有さない）を用いて実施すると、エストロゲンを添加しても液滴形成に対する影響をほとんどなかった（図３２）。こうした結果は、エストロゲン（インビボでＥＲ介在性の転写を刺激する）が、インビトロでのＭＥＤ１－ＩＤＲ液滴へのＥＲの取り込みも刺激することを示している。したがって、ＯＣＴ４及びＥＲは共に、相分離にも活性化にも同じアミノ酸／リガンドを必要とする。さらに、ＬＢＤは、エストロゲンが結合するとＭＥＤ１と相互作用するように立体配座が変化する構造化ドメインであるため、構造化相互作用は、転写凝縮体形成に寄与し得ると思われる。
ＧＣＮ４及びＭＥＤ１５の相分離は、活性化に必要な残基に依存する
ＴＦ－コアクチベーター系の中で、最も研究されたものは、酵母ＴＦ ＧＣＮ４と、メディエーターのＭＥＤ１５サブユニットと、の相互作用である（Ｂｒｚｏｖｉｃ ｅｔ ａｌ．，２０１１、Ｈｅｒｂｉｇ ｅｔ ａｌ．，２０１０、Ｊｅｄｉｄｉ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。ＧＣＮ４ ＡＤは、遺伝子学的に解明されており、活性化に寄与するアミノ酸が同定されており（Ｄｒｙｓｄａｌｅ ｅｔ ａｌ．，１９９５、Ｓｔａｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１８）、最近の研究から、ＧＣＮ４ ＡＤが複数の配向及び立体配座でＭＥＤ１５と相互作用して「ファジー複合体」を形成することが示されている（Ｔｕｔｔｌｅ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。ファジー複合体を形成する弱い相互作用は、相分離凝縮体を生じさせると考えられるＩＤＲ間相互作用の特徴を有する。
ＧＣＮ４及びＭＥＤ１５が相分離液滴を形成し得るかどうかを試験するために、本発明者らは、組換え酵母ＧＣＮ４－ＧＦＰと、残基６～６５１（ＧＣＮ４との相互作用を担う）を含む酵母ＭＥＤ１５－ｍＣｈｅｒｒｙのＮ末端部分（本明細書ではこれ以後はＭＥＤ１５と呼ばれる）と、を精製した。別々に液滴形成緩衝液に添加すると、ＧＣＮ４は、非常に高い濃度（４０ｕＭ）でのみミクロンサイズの液滴を形成し、この高濃度でＭＥＤ１５が形成した液滴は小さなもののみであった（図２６Ａ）。一方で、ＧＣＮ４組換えタンパク質及びＭＥＤ１５組換えタンパク質は、一緒に混合すると、二重に陽性のミクロンサイズの球状液滴を、より低い濃度で形成した（図２６Ｂ、図３３Ａ）。こうしたＧＣＮ４－ＭＥＤ１５液滴は、急速なＦＲＡＰ動力学を示し（図３３Ｂ）、このことは、液体様挙動と一致するものである。本発明者らは、これら２つのタンパク質の相図を作成し、これら２つのタンパク質が、低い濃度で一緒に液滴を形成することを見出した（図３３Ｃ及び図３３Ｄ）。このことは、低濃度での相分離には、これら２つの間の相互作用が必要であることを示唆している。
ＧＣＮ４がＭＥＤ１５と相互作用し、遺伝子発現を活性化する能力は、ＧＣＮ４ ＡＤにおける特定の疎水性パッチ及び芳香族残基に起因している（Ｄｒｙｓｄａｌｅ ｅｔ ａｌ．，１９９５、Ｓｔａｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１８、Ｔｕｔｔｌｅ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。本発明者らは、こうした疎水性パッチに含まれる１１個の芳香族残基をアラニンに変更したＧＣＮ４変異体を創出した（図２６Ｃ）。この変異タンパク質を、液滴形成緩衝液に添加すると、それが単独で液滴を形成する能力が弱まっていた（図３３Ｅ）。次に、本発明者らは、ＭＥＤ１５との液滴形成が影響を受けるかを試験したところ、実際に、変異タンパク質がＭＥＤ１５と液滴を形成する能力が損なわれていた（図２６Ｃ及び図３３Ｆ）。ＧＣＮ４及びＧＣＮ４の芳香族変異体を、完全なメディエーター複合体と共に液滴形成緩衝液に添加しても同様の結果が得られ、ＧＣＮ４は、メディエーター液滴に取り込まれた一方で、メディエーター液滴へのＧＣＮ４変異体の取り込みは弱まっていた（図２６Ｄ及び図３３Ｇ）。こうした結果は、ＧＣＮ４のＡＤとＭＥＤ１５との間の多価の弱い相互作用が、液体様液滴への相分離を促進することを実証するものである。
酵母ＴＦのＡＤは、哺乳類細胞において機能し得ると共に、ヒトメディエーターと相互作用することによって機能し得る（Ｏｌｉｖｉｅｒｏ ｅｔ ａｌ．，１９９２）。ＧＣＮ４ ＡＤの芳香族変異体が、そのインビボでのメディエーター動員能力を失っているかどうかを調べるために、ＧＣＮ４ ＡＤ及びＧＣＮ４変異ＡＤをＵ２ＯＳ細胞においてＬａｃアレイに繋留した（図２６Ｅ）（Ｊａｎｉｃｋｉ ｅｔ ａｌ．，２００４）。繋留されたＧＣＮ４ ＡＤは、メディエーターを強固に動員した一方で、ＧＣＮ４芳香族変異体ではこの動員は生じなかった（図２６Ｅ）。本発明者らは、以前に報告されたＧＡＬ４トランス活性化アッセイを使用することで、ＧＣＮ４ ＡＤが、インビボで転写を活性化する能力を有する一方で、ＧＣＮ４芳香族変異体がその特性を失っていることを確認した（図２６Ｆ）。こうした結果は、メディエーターと共に生じる相分離に必要不可欠なＴＦ ＡＤアミノ酸が遺伝子活性化に必要であるという考えをさらに支持するものである。
考察
本明細書に記載の結果は、ＴＦがメディエーターと相互作用し、ＴＦのＡＤがこのコアクチベーターと共に相分離凝縮体を形成する能力によって遺伝子を活性化するというモデルを支持するものである。哺乳類のＥＳＣ多能性ＴＦ ＯＣＴ４及び酵母ＴＦ ＧＣＮ４の両方について、本発明者らは、メディエーター凝縮体と共に生じる相分離に必要なＡＤアミノ酸が、インビボでの遺伝子活性化にも必要であることを見出した。エストロゲン受容体について、本発明者らは、エストロゲンが相分離ＥＲ－ＭＥＤ１液滴の形成を刺激することを見出した。ＡＤ及びコアクチベーターは、一般に、ＩＤＲとして分類されている低複雑性アミノ酸配列からなり、ＩＤＲ間相互作用は、相分離凝縮体の形成促進に関与している。本発明者らは、メディエーターと共に生じるＩＤＲ介在性の相分離が、ＴＦ ＡＤが遺伝子発現に影響を与える一般的な機構であることを提唱すると共に、このことが、インビボでＳＥにおいて生じるという証拠を提供する。本発明者らは、メディエーターと共に相分離する能力（高結合価かつ低親和性であるという、液体－液相分離凝縮体に特有の特徴を利用すると想定される）が、いくつかのＴＦがメディエーターと共に高親和性相互作用を形成する能力と並行して機能することを提唱する（図２６Ｇ）（Ｔａａｔｊｅｓ，２０１７）。
ＴＦ ＡＤがコアクチベーターと共に相分離凝縮体を形成することによって機能するというモデルは、タンパク質間相互作用の古典的な鍵と鍵穴モデルとの両立が困難ないくつかの知見を説明するものである。哺乳類ゲノムは、非常に少数のコアクチベーターと相互作用することになる多様なＡＤを有する数百ものＴＦをコードし（Ａｌｌｅｎ ａｎｄ Ｔａａｔｊｅｓ，２０１５、Ａｒａｎｙ ｅｔ ａｌ．，１９９５、Ａｖａｎｔａｇｇｉａｔｉ ｅｔ ａｌ．，１９９６、Ｄａｉ ａｎｄ Ｍａｒｋｈａｍ，２００１、Ｅｃｋｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９６、Ｇｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９、Ｇｒｅｅｎ，２００５、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，２００９、Ｍｅｒｉｋａ ｅｔ ａｌ．，１９９８、Ｏｌｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９６、Ｙｉｎ ａｎｄ Ｗａｎｇ，２０１４、Ｙｕａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６）、配列相同性をほとんど共有しないＡＤがＴＦ間で機能的互換性を有する（Ｇｏｄｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９８８、Ｈｏｐｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｈｌ，１９８６、Ｊｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１６、Ｌｅｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９８８、Ｒａｎｓｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，１９９０、Ｓａｄｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９８８、Ｓｔｒｕｈｌ，１９８８、Ｔｏｒａ ｅｔ ａｌ．，１９８９）。ＡＤに共通する特徴は、低複雑性ＩＤＲを有することであり、この特徴は、コアクチベーターに顕著な特徴でもある。したがって、コアクチベーターが相分離凝縮体を形成することによって相互作用し、遺伝子を活性化するというモデルは、数百もの哺乳類ＴＦがこうしたコアクチベーターとどのように相互作用するかを、より容易に説明するものである。
以前の研究からは、相分離凝縮体を形成することによってＴＦ ＡＤが機能する可能性を調べるきっかけを本発明者らに与えた重要な洞察が得られている。ＴＦ ＡＤは、そのアミノ酸プロファイルによって、酸性、プロリン高含有、セリン／スレオニン高含有、グルタミン高含有として分類されているか、またはその仮説形状によって酸性ブロッブ、ネガティブヌードル、もしくはペプチドの投げ縄として分類されている（Ｓｉｇｌｅｒ，１９８８）。こうした特徴の多くは、相分離凝縮体を形成することが可能なＩＤＲについて報告されているものである（Ｂａｂｕ，２０１６、Ｄａｒｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１８、Ｄａｓ ｅｔ ａｌ．，２０１５、Ｄｕｎｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１５、Ｈａｂｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，２０１４、ｖａｎ ｄｅｒ Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，２０１４、Ｏｌｄｆｉｅｌｄ ａｎｄ Ｄｕｎｋｅｒ，２０１４、Ｕｖｅｒｓｋｙ，２０１７、Ｗｒｉｇｈｔ ａｎｄ Ｄｙｓｏｎ，２０１５）。ＧＣＮ４ ＡＤが複数の配向及び立体配座でＭＥＤ１５と相互作用して「ファジー複合体」を形成する（Ｔｕｔｔｌｅ ｅｔ ａｌ．，２０１８）という証拠は、相分離凝縮体に特有の動的な低親和性相互作用が生じるという考えと一致する。同様に、ＦＥＴ（
Figure 2024029228000007
 ）ＲＮＡ結合タンパク質の低複雑性ドメイン（Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００８）は、相分離ハイドロゲルを形成し、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ Ｃ末端ドメイン（ＣＴＤ）とＣＴＤリン酸化依存性様式で相互作用し得る（Ｋｗｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。このことは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩが、それがリン酸化されていない状態では活性遺伝子に動員され、ＣＴＤがリン酸された後は伸長に向けて放出される機構を説明し得るものである。
本発明者らがＴＦ ＡＤ機能について本明細書に記載するモデルは、これまではほとんど理解されていなかった融合がんタンパク質のクラスの機能を説明し得る。悪性腫瘍の多くが、ＴＦの一部分が関与する融合タンパク質転座を有する（Ｂｒａｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１７、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，２０１７、Ｌａｔｙｓｈｅｖａ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。こうした異常な遺伝子産物では、ＤＮＡ結合ドメインまたはクロマチン結合ドメインが幅広いパートナーと融合していることが多く、こうしたパートナーの多くはＩＤＲである。例えば、ＭＬＬは、ＡＭＬでは８０の異なるパートナー遺伝子と融合し得（Ｗｉｎｔｅｒｓ ａｎｄ Ｂｅｒｎｔ，２０１７）、ユーイング肉腫におけるＥＷＳ－ＦＬＩ再構成体は、変性ドメインをがん遺伝子に動員することによって悪性形質転換を生じさせ（Ｂｏｕｌａｙ ｅｔ ａｌ．，２０１７、Ｃｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１７）、変性相分離タンパク質ＦＵＳは、ある特定の肉腫ではＤＢＤと融合することが明らかとなっている（Ｃｒｏｚａｔ ｅｔ ａｌ．，１９９３、Ｐａｔｅｌ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。相分離は、そのような遺伝子産物が、異常な遺伝子発現プログラムを生じさせる機構となり、変性タンパク質がクロマチンに動員されることによって、多様なコアクチベーターが相分離凝縮体を形成してがん遺伝子発現を誘導し得る。こうした異常な転写凝縮体を構成する相互作用、その構造、及び挙動を理解することで、新たな治療への道が開かれる可能性がある。
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Ｈｅｒｂｉｇ，Ｅ．，Ｗａｒｆｉｅｌｄ，Ｌ．，Ｆｉｓｈ，Ｌ．，Ｆｉｓｈｂｕｒｎ，Ｊ．，Ｋｎｕｔｓｏｎ，Ｂ．Ａ．，Ｍｏｏｒｅｆｉｅｌｄ，Ｂ．，Ｐａｃｈｅｃｏ，Ｄ．，ａｎｄ Ｈａｈｎ，Ｓ．（２０１０）．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ Ｍｅｄｉａｔｏｒ Ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ ｂｙ Ｔａｎｄｅｍ Ｇｃｎ４ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ｄｏｍａｉｎｓ ａｎｄ Ｔｈｒｅｅ Ｇａｌ１１ Ａｃｔｉｖａｔｏｒ－Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｄｏｍａｉｎｓ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３０，２３７６－２３９０．
Ｈｎｉｓｚ，Ｄ．，Ｓｈｒｉｎｉｖａｓ，Ｋ．，Ｙｏｕｎｇ，Ｒ．Ａ．，Ｃｈａｋｒａｂｏｒｔｙ，Ａ．Ｋ．，ａｎｄ Ｓｈａｒｐ，Ｐ．Ａ．（２０１７）．Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ Ａ Ｐｈａｓｅ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｃｅｌｌ １６９，１３－２３．
Ｈｏｌｅｈｏｕｓｅ，Ａ．Ｓ．，Ｄａｓ，Ｒ．Ｋ．，Ａｈａｄ，Ｊ．Ｎ．，Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，Ｍ．Ｏ．Ｇ．，ａｎｄ Ｐａｐｐｕ，Ｒ．Ｖ（２０１７）．ＣＩＤＥＲ：Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ ｔｏ Ａｎａｌｙｚｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ－Ｅｎｓｅｍｂｌｅ Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ｏｆ Ｉｎｔｒｉｎｓｉｃａｌｌｙ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．１１２，１６－２１．
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Ｊａｎｉｃｋｉ，Ｓ．Ｍ．，Ｔｓｕｋａｍｏｔｏ，Ｔ．，Ｓａｌｇｈｅｔｔｉ，Ｓ．Ｅ．，Ｔａｎｓｅｙ，Ｗ．Ｐ．，Ｓａｃｈｉｄａｎａｎｄａｍ，Ｒ．，Ｐｒａｓａｎｔｈ，Ｋ．Ｖ，Ｒｉｅｄ，Ｔ．，Ｓｈａｖ－Ｔａｌ，Ｙ．，Ｂｅｒｔｒａｎｄ，Ｅ．，Ｓｉｎｇｅｒ，Ｒ．Ｈ．，ｅｔ ａｌ．（２００４）．Ｆｒｏｍ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｔｏ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌｓ．Ｃｅｌｌ １１６，６８３－６９８．
Ｊｅｄｉｄｉ，Ｉ．，Ｚｈａｎｇ，Ｆ．，Ｑｉｕ，Ｈ．，Ｓｔａｈｌ，Ｓ．Ｊ．，Ｐａｌｍｅｒ，Ｉ．，Ｋａｕｆｍａｎ，Ｊ．Ｄ．，Ｎａｄａｕｄ，Ｐ．Ｓ．，Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅ，Ｓ．，Ｗｉｎｇｆｉｅｌｄ，Ｐ．Ｔ．，Ｊａｒｏｎｉｅｃ，Ｃ．Ｐ．，ｅｔ ａｌ．（２０１０）．Ａｃｔｉｖａｔｏｒ Ｇｃｎ４ ｅｍｐｌｏｙｓ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｅｇｍｅｎｔｓ ｏｆ Ｍｅｄ１５／Ｇａｌ１１，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｔｈｅ ＫＩＸ ｄｏｍａｉｎ，ｔｏ ｒｅｃｒｕｉｔ ｍｅｄｉａｔｏｒ ｔｏ ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｖｉｖｏ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８５，２４３８－２４５５．
Ｊｉｎ，Ｗ．，Ｗａｎｇ，Ｌ．，Ｚｈｕ，Ｆ．，Ｔａｎ，Ｗ．，Ｌｉｎ，Ｗ．，Ｃｈｅｎ，Ｄ．，Ｓｕｎ，Ｑ．，ａｎｄ Ｘｉａ，Ｚ．（２０１６）．Ｃｒｉｔｉｃａｌ ＰＯＵ ｄｏｍａｉｎ ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｃｏｎｆｅｒ Ｏｃｔ４ ｕｎｉｑｕｅｎｅｓｓ ｉｎ ｓｏｍａｔｉｃ ｃｅｌｌ ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ．Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．６，２０８１８．
Ｊｏｌｍａ，Ａ．，Ｙａｎ，Ｊ．，Ｗｈｉｔｉｎｇｔｏｎ，Ｔ．，Ｔｏｉｖｏｎｅｎ，Ｊ．，Ｎｉｔｔａ，Ｋ．Ｒ．，Ｒａｓｔａｓ，Ｐ．，Ｍｏｒｇｕｎｏｖａ，Ｅ．，Ｅｎｇｅ，Ｍ．，Ｔａｉｐａｌｅ，Ｍ．，Ｗｅｉ，Ｇ．，ｅｔ ａｌ．（２０１３）．ＤＮＡ－Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒｓ．Ｃｅｌｌ １５２，３２７－３３９．
Ｊｕｖｅｎ－Ｇｅｒｓｈｏｎ，Ｔ．，ａｎｄ Ｋａｄｏｎａｇａ，Ｊ．Ｔ．（２０１０）．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｉａ ｔｈｅ ｃｏｒｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ａｎｄ ｔｈｅ ｂａｓａｌ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｍａｃｈｉｎｅｒｙ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．３３９，２２５－２２９．
Ｋｅｅｇａｎ，Ｌ．，Ｇｉｌｌ，Ｇ．，ａｎｄ Ｐｔａｓｈｎｅ，Ｍ．（１９８６）．Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｂｉｎｄｉｎｇ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ－ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３１，６９９－７０４．
Ｋｈａｎ，Ａ．，Ｆｏｒｎｅｓ，Ｏ．，Ｓｔｉｇｌｉａｎｉ，Ａ．，Ｇｈｅｏｒｇｈｅ，Ｍ．，Ｃａｓｔｒｏ－Ｍｏｎｄｒａｇｏｎ，Ｊ．Ａ．，ｖａｎ ｄｅｒ Ｌｅｅ，Ｒ．，Ｂｅｓｓｙ，Ａ．，Ｃｈｅｎｅｂｙ，Ｊ．，Ｋｕｌｋａｒｎｉ，Ｓ．Ｒ．，Ｔａｎ，Ｇ．，ｅｔ ａｌ．（２０１８）．ＪＡＳＰＡＲ ２０１８：ｕｐｄａｔｅ ｏｆ ｔｈｅ ｏｐｅｎ－ａｃｃｅｓｓ ｄａｔａｂａｓｅ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｆｉｌｅｓ ａｎｄ ｉｔｓ ｗｅｂ ｆｒａｍｅｗｏｒｋ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．４６，Ｄ２６０－Ｄ２６６．
Ｋｉｍ，Ｐ．，Ｂａｌｌｅｓｔｅｒ，Ｌ．Ｙ．，ａｎｄ Ｚｈａｏ，Ｚ．（２０１７）．Ｄｏｍａｉｎ ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｉｎ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ｆｕｓｉｏｎ ｇｅｎｅｓ ａｎｄ ｉｔｓ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：ａ ｐａｎ－ｃａｎｃｅｒ ｓｔｕｄｙ．Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ ８，１１０１０３－１１０１１７．
Ｌａｔｙｓｈｅｖａ，Ｎ．Ｓ．，Ｏａｔｅｓ，Ｍ．Ｅ．，Ｍａｄｄｏｘ，Ｌ．，Ｂｕｌｊａｎ，Ｍ．，Ｗｅａｔｈｅｒｉｔｔ，Ｒ．Ｊ．，Ｍａｄａｎ Ｂａｂｕ，Ｍ．，Ｆｌｏｃｋ，Ｔ．，ａｎｄ Ｇｏｕｇｈ，Ｊ．（２０１６）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎ Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｒｅｗｉｒｉｎｇ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ Ｎｅｔｗｏｒｋｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ ６３，５７９－５９２．
Ｌｅｃｈ，Ｋ．，Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｋ．，ａｎｄ Ｂｒｅｎｔ，Ｒ．（１９８８）．ＤＮＡ－ｂｏｕｎｄ Ｆｏｓ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｃｔｉｖａｔｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｉｎ ｙｅａｓｔ．Ｃｅｌｌ ５２，１７９－１８４．
ｖａｎ ｄｅｒ Ｌｅｅ，Ｒ．，Ｂｕｌｊａｎ，Ｍ．，Ｌａｎｇ，Ｂ．，Ｗｅａｔｈｅｒｉｔｔ，Ｒ．Ｊ．，Ｄａｕｇｈｄｒｉｌｌ，Ｇ．Ｗ．，Ｄｕｎｋｅｒ，Ａ．Ｋ．，Ｆｕｘｒｅｉｔｅｒ，Ｍ．，Ｇｏｕｇｈ，Ｊ．，Ｇｓｐｏｎｅｒ，Ｊ．，Ｊｏｎｅｓ，Ｄ．Ｔ．，ｅｔ ａｌ．（２０１４）．Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｒｉｎｓｉｃａｌｌｙ ｄｉｓｏｒｄｅｒｅｄ ｒｅｇｉｏｎｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１１４，６５８９－６６３１．
Ｌｉｎ，Ｙ．，Ｐｒｏｔｔｅｒ，Ｄ．Ｓ．Ｗ．，Ｒｏｓｅｎ，Ｍ．Ｋ．，ａｎｄ Ｐａｒｋｅｒ，Ｒ．（２０１５）．Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｈａｓｅ－Ｓｅｐａｒａｔｅｄ Ｌｉｑｕｉｄ Ｄｒｏｐｌｅｔｓ ｂｙ ＲＮＡ－Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ ６０，２０８－２１９．
Ｌｉｕ，Ｊ．，Ｐｅｒｕｍａｌ，Ｎ．Ｂ．，Ｏｌｄｆｉｅｌｄ，Ｃ．Ｊ．，Ｓｕ，Ｅ．Ｗ．，Ｕｖｅｒｓｋｙ，Ｖ．Ｎ．，ａｎｄ Ｄｕｎｋｅｒ，Ａ．Ｋ．（２００６）．Ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ Ｄｉｓｏｒｄｅｒ ｉｎ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒｓ†．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４５，６８７３－６８８８．
Ｌｉｕ，Ｗ．－Ｌ．，Ｃｏｌｅｍａｎ，Ｒ．Ａ．，Ｍａ，Ｅ．，Ｇｒｏｂ，Ｐ．，Ｙａｎｇ，Ｊ．Ｌ．，Ｚｈａｎｇ，Ｙ．，Ｄａｉｌｅｙ，Ｇ．，Ｎｏｇａｌｅｓ，Ｅ．，ａｎｄ Ｔｊｉａｎ，Ｒ．（２００９）．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｏｆ ｔｈｒｅｅ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ａｃｔｉｖａｔｏｒ－ＴＦＩＩＤ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．２３，１５１０－１５２１．
Ｍａｌｉｋ，Ｓ．，ａｎｄ Ｒｏｅｄｅｒ，Ｒ．Ｇ．（２０１０）．Ｔｈｅ ｍｅｔａｚｏａｎ Ｍｅｄｉａｔｏｒ ｃｏ－ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｃｏｍｐｌｅｘ ａｓ ａｎ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ ｈｕｂ ｆｏｒ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１１，７６１－７７２．
Ｍａｎａｖａｔｈｉ，Ｂ．，Ｓａｍａｎｔｈａｐｕｄｉ，Ｖ．Ｓ．Ｋ．，ａｎｄ Ｇａｊｕｌａｐａｌｌｉ，Ｖ．Ｎ．Ｒ．（２０１４）．Ｅｓｔｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｃｏｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ ａｎｄ ｐｉｏｎｅｅｒ ｆａｃｔｏｒｓ：ｔｈｅ ｏｒｃｈｅｓｔｒａｔｏｒｓ ｏｆ ｍａｍｍａｒｙ ｇｌａｎｄ ｃｅｌｌ ｆａｔｅ ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｆｒｏｎｔ．Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２，３４．
Ｍｅｒｉｋａ，Ｍ．，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ａ．Ｊ．，Ｃｈｅｎ，Ｇ．，Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｔ．，ａｎｄ Ｔｈａｎｏｓ，Ｄ．（１９９８）．Ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ ｏｆ ＣＢＰ／ｐ３００ ｂｙ ｔｈｅ ＩＦＮ ｂｅｔａ ｅｎｈａｎｃｅｏｓｏｍｅ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ １，２７７－２８７．
Ｍｅｙｅｒ，Ｋ．Ｄ．，Ｄｏｎｎｅｒ，Ａ．Ｊ．，Ｋｎｕｅｓｅｌ，Ｍ．Ｔ．，Ｙｏｒｋ，Ａ．Ｇ．，Ｅｓｐｉｎｏｓａ，Ｊ．Ｍ．，ａｎｄ Ｔａａｔｊｅｓ，ａｎｄ Ｄ．Ｊ．（２００８）．Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｃｄｋ８ ａｎｄ ＧＣＮ５Ｌ ｗｉｔｈｉｎ Ｍｅｄｉａｔｏｒ ｄｉｒｅｃｔｓ ｔａｎｄｅｍ ｐｈｏｓｐｈｏａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｓｔｏｎｅ Ｈ３．ＥＭＢＯ Ｊ．２７，１４４７－１４５７．
Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，Ｐ．Ｊ．，ａｎｄ Ｔｊｉａｎ，Ｒ．（１９８９）．Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＤＮＡ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４５，３７１－３７８．
Ｎａｂｅｔ，Ｂ．，Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｊ．Ｍ．，Ｂｕｃｋｌｅｙ，Ｄ．Ｌ．，Ｐａｕｌｋ，Ｊ．，Ｄａｓｔｊｅｒｄｉ，Ｓ．，Ｙａｎｇ，Ａ．，Ｌｅｇｇｅｔｔ，Ａ．Ｌ．，Ｅｒｂ，Ｍ．Ａ．，Ｌａｗｌｏｒ，Ｍ．Ａ．，Ｓｏｕｚａ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．（２０１８）．Ｔｈｅ ｄＴＡＧ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ａｎｄ ｔａｒｇｅｔ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ．Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１４，４３１－４４１．
Ｎｏｔｔ，Ｔ．Ｊ．，Ｐｅｔｓａｌａｋｉ，Ｅ．，Ｆａｒｂｅｒ，Ｐ．，Ｊｅｒｖｉｓ，Ｄ．，Ｆｕｓｓｎｅｒ，Ｅ．，Ｐｌｏｃｈｏｗｉｅｔｚ，Ａ．，Ｃｒａｇｇｓ，Ｔ．Ｄ．，Ｂａｚｅｔｔ－Ｊｏｎｅｓ，Ｄ．Ｐ．，Ｐａｗｓｏｎ，Ｔ．，Ｆｏｒｍａｎ－Ｋａｙ，Ｊ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．（２０１５）．Ｐｈａｓｅ Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｅｄ Ｎｕａｇｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇｅｎｅｒａｔｅｓ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｌｙ Ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ Ｍｅｍｂｒａｎｅｌｅｓｓ Ｏｒｇａｎｅｌｌｅｓ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ ５７，９３６－９４７．
Ｏａｔｅｓ，Ｍ．Ｅ．，Ｒｏｍｅｒｏ，Ｐ．，Ｉｓｈｉｄａ，Ｔ．，Ｇｈａｌｗａｓｈ，Ｍ．，Ｍｉｚｉａｎｔｙ，Ｍ．Ｊ．，Ｘｕｅ，Ｂ．，Ｄｏｓｚｔａｎｙｉ，Ｚ．，Ｕｖｅｒｓｋｙ，Ｖ．Ｎ．，Ｏｂｒａｄｏｖｉｃ，Ｚ．，Ｋｕｒｇａｎ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．（２０１３）．Ｄ２Ｐ２：ｄａｔａｂａｓｅ ｏｆ ｄｉｓｏｒｄｅｒｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．４１，Ｄ５０８－１６．
Ｏｌｄｆｉｅｌｄ，Ｃ．Ｊ．，ａｎｄ Ｄｕｎｋｅｒ，Ａ．Ｋ．（２０１４）．Ｉｎｔｒｉｎｓｉｃａｌｌｙ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ Ｉｎｔｒｉｎｓｉｃａｌｌｙ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｇｉｏｎｓ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８３，５５３－５８４．
Ｏｌｉｎｅｒ，Ｊ．Ｄ．，Ａｎｄｒｅｓｅｎ，Ｊ．Ｍ．，Ｈａｎｓｅｎ，Ｓ．Ｋ．，Ｚｈｏｕ，Ｓ．，ａｎｄ Ｔｊｉａｎ，Ｒ．（１９９６）．ＳＲＥＢＰ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ａｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ＣＲＥＢ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１０，２９０３－２９１１．
Ｏｌｉｖｉｅｒｏ，Ｓ．，Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｇ．Ｓ．，Ｓｔｒｕｈｌ，Ｋ．，ａｎｄ Ｓｐｉｅｇｅｌｍａｎ，Ｂ．Ｍ．Ｙｅａｓｔ ＧＣＮ４ ａｓ ａ ｐｒｏｂｅ ｆｏｒ ｏｎｃｏｇｅｎｅｓｉｓ ｂｙ ＡＰ－１．ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ：ｔｒａｎｓｃｎｐｕｏｎａｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ＡＰ－１ ｓｉｔｅｓ ｉｓ ｎｏｔ ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ ｆｏｒ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ．
Ｐａｎｎｅ，Ｄ．，Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，ａｎｄ Ｈａｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｃ．（２００７）．Ａｎ Ａｔｏｍｉｃ Ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－β Ｅｎｈａｎｃｅｏｓｏｍｅ．Ｃｅｌｌ １２９，１１１１－１１２３．
Ｐａｔｅｌ，Ａ．，Ｌｅｅ，Ｈ．Ｏ．，Ｊａｗｅｒｔｈ，Ｌ．，Ｍａｈａｒａｎａ，Ｓ．，Ｊａｈｎｅｌ，Ｍ．，Ｈｅｉｎ，Ｍ．Ｙ．，Ｓｔｏｙｎｏｖ，Ｓ．，Ｍａｈａｍｉｄ，Ｊ．，Ｓａｈａ，Ｓ．，Ｆｒａｎｚｍａｎｎ，Ｔ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（２０１５）．Ａ Ｌｉｑｕｉｄ－ｔｏ－Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＡＬＳ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＦＵＳ Ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ ｂｙ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｍｕｔａｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ １６２，１０６６－１０７７．
Ｐｌａｓｃｈｋａ，Ｃ．，Ｎｏｚａｗａ，Ｋ．，ａｎｄ Ｃｒａｍｅｒ，Ｐ．（２０１６）．Ｍｅｄｉａｔｏｒ Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ ａｎｄ ＲＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ＩＩ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４２８，２５６９－２５７４．
Ｒａｎｓｏｎｅ，Ｌ．Ｊ．，Ｗａｍｓｌｅｙ，Ｐ．，Ｍｏｒｌｅｙ，Ｋ．Ｌ．，ａｎｄ Ｖｅｒｍａ，Ｉ．Ｍ．（１９９０）．Ｄｏｍａｉｎ ｓｗａｐｐｉｎｇ ｒｅｖｅａｌｓ ｔｈｅ ｍｏｄｕｌａｒ ｎａｔｕｒｅ ｏｆ Ｆｏｓ，Ｊｕｎ，ａｎｄ ＣＲＥＢ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０，４５６５－４５７３．
Ｒｅｉｔｅｒ，Ｆ．，Ｗｉｅｎｅｒｒｏｉｔｈｅｒ，Ｓ．，ａｎｄ Ｓｔａｒｋ，Ａ．（２０１７）．Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｃｏｆａｃｔｏｒｓ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．４３，７３－８１．
Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｓ．Ｇ．（２０００）．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ ｄｏｍａｉｎｓ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．５７，１１４９－１１６０．
Ｓａｂａｒｉ，Ｂ．，Ｄａｌｌ’Ａｇｎｅｓｅ，Ａ．，Ｂｏｉｊａ，Ａ．，Ｋｌｅｉｎ，Ｉ．Ａ．，Ｃｏｆｆｅｙ，Ｅ．Ｌ．，Ｓｈｒｉｎｉｖａｓ，Ｋ．，Ａｂｒａｈａｍ，Ｂ．Ｊ．，Ｈａｎｎｅｔｔ，Ｎ．Ｍ．，Ｚａｍｕｄｉｏ，Ａ．Ｖ．，Ｍａｎｔｅｉｇａ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．（２０１８）．Ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ ｃｏｎｄｅｎｓａｔｉｏｎ ａｔ ｓｕｐｅｒ－ｅｎｈａｎｃｅｒｓ ｌｉｎｋｓ ｐｈａｓｅ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（８０－．）．
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Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，Ａ．Ｓ．，Ｌｉ，Ｃ．Ｈ．，Ｚａｍｕｄｉｏ，Ａ．Ｖ．，Ｓｉｇｏｖａ，Ａ．Ａ．，Ｈａｎｎｅｔｔ，Ｎ．Ｍ．，Ｄａｙ，Ｄ．Ｓ．，Ａｂｒａｈａｍ，Ｂ．Ｊ．，Ｃｏｈｅｎ，Ｍ．Ａ．，Ｎａｂｅｔ，Ｂ．，Ｂｕｃｋｌｅｙ，Ｄ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．（２０１７）．ＹＹ１ Ｉｓ ａ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｏｆ Ｅｎｈａｎｃｅｒ－Ｐｒｏｍｏｔｅｒ Ｌｏｏｐｓ．Ｃｅｌｌ １７１，１５７３－１５８８．ｅ２８．
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Ｗｈｙｔｅ，Ｗ．Ａ．，Ｏｒｌａｎｄｏ，Ｄ．Ａ．，Ｈｎｉｓｚ，Ｄ．，Ａｂｒａｈａｍ，Ｂ．Ｊ．，Ｌｉｎ，Ｃ．Ｙ．，Ｋａｇｅｙ，Ｍ．Ｈ．，Ｒａｈｌ，Ｐ．Ｂ．，Ｌｅｅ，Ｔ．Ｉ．，ａｎｄ Ｙｏｕｎｇ，Ｒ．Ａ．（２０１３）．Ｍａｓｔｅｒ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｍｅｄｉａｔｏｒ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ｓｕｐｅｒ－ｅｎｈａｎｃｅｒｓ ａｔ ｋｅｙ ｃｅｌｌ ｉｄｅｎｔｉｔｙ ｇｅｎｅｓ．Ｃｅｌｌ １５３，３０７－３１９．
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表Ｓ３．報告されている転写因子－メディエーターサブユニット相互作用の表
Figure 2024029228000008
表中の引用参考文献
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４．Ｍｅｙｅｒ，Ｋ．Ｄ．，Ｌｉｎ，Ｓ．，Ｂｅｒｎｅｃｋｙ，Ｃ．，Ｇａｏ，Ｙ．＆ Ｔａａｔｊｅｓ，Ｄ．Ｊ．ｐ５３ ａｃｔｉｖａｔｅｓ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｂｙ ｄｉｒｅｃｔｉｎｇ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｓｈｉｆｔｓ ｉｎ Ｍｅｄｉａｔｏｒ．Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７，７５３－７６０（２０１０）．５．Ｄｒａｎｅ，Ｐ．，Ｂａｒｅｌ，Ｍ．，Ｂａｌｂｏ，Ｍ．＆ Ｆｒａｄｅ，Ｒ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＲＢ１８Ａ，ａ ２０５ ｋＤａ ｎｅｗ ｐ５３ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｈｉｃｈ ｓｈａｒｅｓ ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｗｉｔｈ ｐ５３．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １５，３０１３－３０２４（１９９７）．
６．Ｆｒａｄｅ，Ｒ．，Ｂａｌｂｏ，Ｍ．＆ Ｂａｒｅｌ，Ｍ．ＲＢ１８Ａ，ｗｈｏｓｅ ｇｅｎｅ ｉｓ ｌｏｃａｌｉｚｅｄ ｏｎ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ １７ｑ１２－ｑ２１．１，ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｉｎ ｖｉｖｏ ｐ５３ ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６０，６５８５－９（２０００）．
７．Ｇｅ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ ＴＲＡＰ２２０ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ＰＰＡＲγ２－ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ａｄｉｐｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｎａｔｕｒｅ ４１７，５６３－５６７（２００２）．
８．Ｙｕａｎ，Ｃ．Ｘ．，Ｉｔｏ，Ｍ．，Ｆｏｎｄｅｌｌ，Ｊ．Ｄ．，Ｆｕ，Ｚ．Ｙ．＆ Ｒｏｅｄｅｒ，Ｒ．Ｇ．Ｔｈｅ ＴＲＡＰ２２０ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｏｆ ａ ｔｈｙｒｏｉｄ ｈｏｒｍｏｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＴＲＡＰ）ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ ｃｏｍｐｌｅｘ ｉｎｔｅｒａｃｔｓ ｄｉｒｅｃｔｌｙ ｗｉｔｈ ｎｕｃｌｅａｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｉｎ ａ ｌｉｇａｎｄ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｆａｓｈｉｏｎ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９５，７９３９－４４（１９９８）．
９．Ｚｈｕ，Ｘ．Ｇ．，ＭｃＰｈｉｅ，Ｐ．，Ｌｉｎ，Ｋ．Ｈ．＆ Ｃｈｅｎｇ，Ｓ．Ｙ．Ｔｈｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｈｏｒｍｏｎｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｙｒｏｉｄ ｈｏｒｍｏｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｉｓｏｆｏｒｍｓ ｉｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ｉｎｔｅｒｐｌａｙ ｏｆ ｔｈｅｉｒ ｄｏｍａｉｎｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２，９０４８－５４（１９９７）．
１０．Ｋａｎｇ，Ｙ．Ｋ．，Ｇｕｅｒｍａｈ，Ｍ．，Ｙｕａｎ，Ｃ．－Ｘ．＆ Ｒｏｅｄｅｒ，Ｒ．Ｇ．Ｔｈｅ ＴＲＡＰ／Ｍｅｄｉａｔｏｒ ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ ｃｏｍｐｌｅｘ ｉｎｔｅｒａｃｔｓ ｄｉｒｅｃｔｌｙ ｗｉｔｈ ｅｓｔｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ａｎｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ ＴＲＡＰ２２０ ｓｕｂｕｎｉｔ ａｎｄ ｄｉｒｅｃｔｌｙ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｅｓｔｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９９，２６４２－２６４７（２００２）．
１１．Ｊｉａｎｇ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．Ｋｅｙ ｒｏｌｅｓ ｆｏｒ ＭＥＤ１ ＬｘｘＬＬ ｍｏｔｉｆｓ ｉｎ ｐｕｂｅｒｔａｌ ｍａｍｍａｒｙ ｇｌａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｌｕｍｉｎａｌ－ｃｅｌｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０７，６７６５－７０（２０１０）．
１２．Ｂｕｒａｋｏｖ，Ｄ．，Ｗｏｎｇ，Ｃ．Ｗ．，Ｒａｃｈｅｚ，Ｃ．，Ｃｈｅｓｋｉｓ，Ｂ．Ｊ．＆ Ｆｒｅｅｄｍａｎ，Ｌ．Ｐ．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｅｓｔｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｎｄ ＤＲＩＰ２０５，ａ ｓｕｂｕｎｉｔ ｏｆ ｔｈｅ ｈｅｔｅｒｏｍｅｒｉｃ ＤＲＩＰ ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ ｃｏｍｐｌｅｘ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５，２０９２８－３４（２０００）．
１３．Ｌｉ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ Ｍｅｄ１ Ｓｕｂｕｎｉｔ ｏｆ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉａｔｏｒ Ｐｌａｙｓ ａ Ｃｅｎｔｒａｌ Ｒｏｌｅ ｉｎ Ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ ＣＣＡＡＴ／Ｅｎｈａｎｃｅｒ－ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ－β－ｄｒｉｖｅｎ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｉｎ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－γ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８３，１３０７７－１３０８６（２００８）．
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１５．Ｓｔｕｍｐｆ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｍｅｄｉａｔｏｒ ｃｏｍｐｌｅｘ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ａｓ ａ ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ ｆｏｒ ＧＡＴＡ－１ ｉｎ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｓｉｓ ｖｉａ ｓｕｂｕｎｉｔ Ｍｅｄ１／ＴＲＡＰ２２０．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０３，１８５０４－１８５０９（２００６）．
１６．Ｃｒａｗｆｏｒｄ，Ｓ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ｄｅｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｅａｒｔ，Ｅｙｅ，ａｎｄ Ｍｅｇａｋａｒｙｏｃｙｔｅｓ ｉｎ Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ Ａｃｔｉｖａｔｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＰＢＰ）Ｎｕｌｌ Ｅｍｂｒｙｏｓ Ｉｍｐｌｉｃａｔｅ ＧＡＴＡ Ｆａｍｉｌｙ ｏｆ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７，３５８５－３５９２（２００２）．
１７．Ｍａｌｉｋ，Ｓ．，Ｗａｌｌｂｅｒｇ，Ａ．Ｅ．，Ｋａｎｇ，Ｙ．Ｋ．＆ Ｒｏｅｄｅｒ，Ｒ．Ｇ．ＴＲＡＰ／ＳＭＣＣ／ｍｅｄｉａｔｏｒ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ＤＮＡ ａｎｄ ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｔｅｍｐｌａｔｅｓ ｂｙ ｏｒｐｈａｎ ｎｕｃｌｅａｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ ４．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２２，５６２６－３７（２００２）．
１８．Ｗａｎｇ，Ｓ．，Ｇｅ，Ｋ．，Ｒｏｅｄｅｒ，Ｒ．Ｇ．＆ Ｈａｎｋｉｎｓｏｎ，Ｏ．Ｒｏｌｅ ｏｆ ｍｅｄｉａｔｏｒ ｉｎ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｂｙ ｔｈｅ ａｒｙｌ ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９，１３５９３－６００（２００４）．
１９．Ｗａｎｇ，Ｑ．，Ｓｈａｒｍａ，Ｄ．，Ｒｅｎ，Ｙ．＆ Ｆｏｎｄｅｌｌ，Ｊ．Ｄ．Ａ Ｃｏｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｒｏｌｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ＴＲＡＰ－Ｍｅｄｉａｔｏｒ Ｃｏｍｐｌｅｘ ｉｎ Ａｎｄｒｏｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７，４２８５２－４２８５８（２００２）．
２０．Ｎａａｒ，Ａ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ ｃｏ－ａｃｔｉｖａｔｏｒ ＡＲＣ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｃｈｒｏｍａｔｉｎ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ ３９８，８２８－３２（１９９９）．
２１．Ｈｉｔｔｅｌｍａｎ，Ａ．Ｂ．，Ｂｕｒａｋｏｖ，Ｄ．，Ｉｎｉｇｕｅｚ－Ｌｌｕｈｉ，Ｊ．Ａ．，Ｆｒｅｅｄｍａｎ，Ｌ．Ｐ．＆ Ｇａｒａｂｅｄｉａｎ，Ｍ．Ｊ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｖｉａ ＡＦ－１－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．ＥＭＢＯ Ｊ．１８，５３８０－５３８８（１９９９）．
２２．Ａｔｋｉｎｓ，Ｇ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．Ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｏｒｐｈａｎ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＲＯＲα．Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１３，１５５０－１５５７（１９９９）．
２３．Ｃｈｅｎ，Ｗ．＆ Ｒｏｅｄｅｒ，Ｒ．Ｇ．Ｔｈｅ Ｍｅｄｉａｔｏｒ ｓｕｂｕｎｉｔ ＭＥＤ１／ＴＲＡＰ２２０ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｏｐｔｉｍａｌ ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３５，６１６１－９（２００７）．
２４．Ｐｉｎｅｄａ Ｔｏｒｒａ，Ｉ．，Ｆｒｅｅｄｍａｎ，Ｌ．Ｐ．＆ Ｇａｒａｂｅｄｉａｎ，Ｍ．Ｊ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＲＩＰ２０５ ａｓ ａ Ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｆａｒｎｅｓｏｉｄ Ｘ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９，３６１８４－３６１９１（２００４）．
２５．Ｚｈｏｕ，Ｔ．＆ Ｃｈｉａｎｇ，Ｃ．－Ｍ．Ｓｐ１ ａｎｄ ＡＰ２ ｒｅｇｕｌａｔｅ ｂｕｔ ｄｏ ｎｏｔ ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅ ＴＡＴＡ－ｌｅｓｓ ｈｕｍａｎ ＴＡＦ（ＩＩ）５５ ｃｏｒｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３０，４１４５－５７（２００２）．
２６．Ｉｔｏ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｉｄｅｎｔｉｔｙ ｂｅｔｗｅｅｎ ＴＲＡＰ ａｎｄ ＳＭＣＣ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｓ ｎｏｖｅｌ ｐａｔｈｗａｙｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅａｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ａｎｄ ｄｉｖｅｒｓｅ ｍａｍｍａｌｉａｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ ３，３６１－７０（１９９９）．
２７．Ｚｈｏｕ，Ｈ．，Ｋｉｍ，Ｓ．，Ｉｓｈｉｉ，Ｓ．＆ Ｂｏｙｅｒ，Ｔ．Ｇ．Ｍｅｄｉａｔｏｒ Ｍｏｄｕｌａｔｅｓ Ｇｌｉ３－Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｓｏｎｉｃ Ｈｅｄｇｅｈｏｇ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２６，８６６７－８６８２（２００６）．
２８．Ｔｕｔｔｅｒ，Ａ．Ｖ ｅｔ ａｌ．Ｒｏｌｅ ｆｏｒ Ｍｅｄ１２ ｉｎ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎａｎｏｇ ａｎｄ Ｎａｎｏｇ ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８４，３７０９－１８（２００９）．
２９．Ｈｅｉｎ，Ｍ．Ｙ．ｅｔ ａｌ．Ａ ｈｕｍａｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｏｍｅ ｉｎ ｔｈｒｅｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｄｉｍｅｎｓｉｏｎｓ ｏｒｇａｎｉｚｅｄ ｂｙ ｓｔｏｉｃｈｉｏｍｅｔｒｉｅｓ ａｎｄ ａｂｕｎｄａｎｃｅｓ．Ｃｅｌｌ １６３，７１２－２３（２０１５）．
３０．Ｇｗａｃｋ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｉｎｃｉｐａｌ ｒｏｌｅ ｏｆ ＴＲＡＰ／ｍｅｄｉａｔｏｒ ａｎｄ ＳＷＩ／ＳＮＦ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｉｎ Ｋａｐｏｓｉ’ｓ ｓａｒｃｏｍａ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ ＲＴＡ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｌｙｔｉｃ ｒｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２３，２０５５－６７（２００３）．
３１．Ｋｉｍ，Ｓ．，Ｘｕ，Ｘ．，Ｈｅｃｈｔ，Ａ．＆ Ｂｏｙｅｒ，Ｔ．Ｇ．Ｍｅｄｉａｔｏｒ ｉｓ ａ ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ ｏｆ Ｗｎｔ／ｂｅｔａ－ｃａｔｅｎｉｎ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８１，１４０６６－７５（２００６）．
３２．Ｘｕ，Ｘ．，Ｚｈｏｕ，Ｈ．＆ Ｂｏｙｅｒ，Ｔ．Ｇ．Ｍｅｄｉａｔｏｒ ｉｓ ａ ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ ｏｆ ａｍｙｌｏｉｄ－ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ－ｐｒｏｔｅｉｎ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｎｕｃｌｅａｒ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ．ＥＭＢＯ Ｒｅｐ．１２，２１６－２２２（２０１１）．
３３．Ｇｒｏｎｔｖｅｄ，Ｌ．，Ｍａｄｓｅｎ，Ｍ．Ｓ．，Ｂｏｅｒｇｅｓｅｎ，Ｍ．，Ｒｏｅｄｅｒ，Ｒ．Ｇ．＆ Ｍａｎｄｒｕｐ，Ｓ．ＭＥＤ１４ ｔｅｔｈｅｒｓ ｍｅｄｉａｔｏｒ ｔｏ ｔｈｅ Ｎ－ｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｇａｍｍａ ａｎｄ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｆｕｌｌ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ａｄｉｐｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３０，２１５５－６９（２０１０）．
３４．Ｈｕｔｔｌｉｎ，Ｅ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ＢｉｏＰｌｅｘ Ｎｅｔｗｏｒｋ：Ａ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｅｘｐｌｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔｏｍｅ．Ｃｅｌｌ １６２，４２５－４４０（２０１５）．
３５．Ｙａｎｇ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．Ａｎ ＡＲＣ／Ｍｅｄｉａｔｏｒ ｓｕｂｕｎｉｔ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ＳＲＥＢＰ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ａｎｄ ｌｉｐｉｄ ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ．Ｎａｔｕｒｅ ４４２，７００－７０４（２００６）．
３６．Ｋｉｍ，Ｔ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．ＭＥＤ１６ ａｎｄ ＭＥＤ２３ ｏｆ Ｍｅｄｉａｔｏｒ ａｒｅ ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒｓ ｏｆ ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ－ａｎｄ ｈｅａｔ－ｓｈｏｃｋ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０１，１２１５３－８（２００４）．
３７．Ｔａａｔｊｅｓ，Ｄ．Ｊ．，Ｎａａｒ，Ａ．Ｍ．，Ａｎｄｅｌ，Ｆ．，Ｎｏｇａｌｅｓ，Ｅ．＆ Ｔｊｉａｎ，Ｒ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｏｒ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ＣＲＳＰ ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９５，１０５８－６２（２００２）．３８．ｖａｎ Ｅｓｓｅｎ，Ｄ．，Ｅｎｇｉｓｔ，Ｂ．，Ｎａｔｏｌｉ，Ｇ．＆ Ｓａｃｃａｎｉ，Ｓ．Ｔｗｏ Ｍｏｄｅｓ ｏｆ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｔ Ｎａｔｉｖｅ Ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ ｂｙ ＮＦ－κＢ ｐ６５．ＰＬｏＳ Ｂｉｏｌ．７，ｅ１００００７３（２００９）．
３９．Ｐａｒｋ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｓｉｇｎａｌ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｂｙ Ｄｉｆ ｒｅｑｕｉｒｅｓ ｔｈｅ ｄＴＲＡＰ８０ ｍｅｄｉａｔｏｒ ｍｏｄｕｌｅ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２３，１３５８－６７（２００３）．
４０．Ｐａｒｋ，Ｊ．Ｍ．，Ｗｅｒｎｅｒ，Ｊ．，Ｋｉｍ，Ｊ．Ｍ．，Ｌｉｓ，Ｊ．Ｔ．＆ Ｋｉｍ，Ｙ．Ｊ．Ｍｅｄｉａｔｏｒ，ｎｏｔ ｈｏｌｏｅｎｚｙｍｅ，ｉｓ ｄｉｒｅｃｔｌｙ ｒｅｃｒｕｉｔｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｂｙ ＨＳＦ ｕｐｏｎ ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ ８，９－１９（２００１）．
４１．Ｄｉｎｇ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．ＭＥＤ１９ ａｎｄ ＭＥＤ２６ ａｒｅ ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｔａｒｇｅｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ＲＥ１ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ｉｎ ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｏｆ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８４，２６４８－５６（２００９）．
４２．Ｇｕ，Ｗ．ｅｔ ａｌ．Ａ ｎｏｖｅｌ ｈｕｍａｎ ＳＲＢ／ＭＥＤ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｃｏｆａｃｔｏｒ ｃｏｍｐｌｅｘ，ＳＭＣＣ，ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ ３，９７－１０８（１９９９）．
４３．Ｎｅｖａｄｏ，Ｊ．，Ｔｅｎｂａｕｍ，Ｓ．Ｐ．＆ Ａｒａｎｄａ，Ａ．ｈＳｒｂ７，ａｎ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｈｕｍａｎ Ｍｅｄｉａｔｏｒ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ，ａｃｔｓ ａｓ ａ ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｈｙｒｏｉｄ ｈｏｒｍｏｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２２２，４１－５１（２００４）．
４４．Ａｓａｄａ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｅｘｔｅｒｎａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｈｅｒ２ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ ｂｙ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ａ Ｒａｓ－ｌｉｎｋｅｄ ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９９，１２７４７－５２（２００２）．
４５．Ｌａｍｂｅｒｔ，Ｊ．－Ｐ．，Ｔｕｃｈｏｌｓｋａ，Ｍ．，Ｇｏ，Ｃ．，Ｋｎｉｇｈｔ，Ｊ．Ｄ．Ｒ．＆ Ｇｉｎｇｒａｓ，Ａ．－Ｃ．Ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｒｅ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｏｍｅ ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ｃｈｒｏｍａｔｉｎ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ．Ｊ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ １１８，８１－９４（２０１５）．
４６．Ｇａｌｂｒａｉｔｈ，Ｍ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．ＨＩＦ１Ａ ｅｍｐｌｏｙｓ ＣＤＫ８－ｍｅｄｉａｔｏｒ ｔｏ ｓｔｉｍｕｌａｔｅ ＲＮＡＰＩＩ ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｈｙｐｏｘｉａ．Ｃｅｌｌ １５３，１３２７－３９（２０１３）．
４７．Ｍｏ，Ｘ．，Ｋｏｗｅｎｚ－Ｌｅｕｔｚ，Ｅ．，Ｘｕ，Ｈ．＆ Ｌｅｕｔｚ，Ａ．Ｒａｓ ｉｎｄｕｃｅｓ ｍｅｄｉａｔｏｒ ｃｏｍｐｌｅｘ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｏｎ Ｃ／ＥＢＰ ｂｅｔａ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ １３，２４１－５０（２００４）．
４８．Ｃａｎｔｉｎ，Ｇ．Ｔ．，Ｓｔｅｖｅｎｓ，Ｊ．Ｌ．＆ Ｂｅｒｋ，Ａ．Ｊ．Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ－ｍｅｄｉａｔｏｒ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｐｒｏｍｏｔｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｐｒｅｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｎ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ＤＮＡ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１００，１２００３－８（２００３）．
４９．Ｓｔｅｖｅｎｓ，Ｊ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｂｙ Ｅ１Ａ ａｎｄ ＭＡＰ Ｋｉｎａｓｅ Ｐａｔｈｗａｙ ｖｉａ Ｓｕｒ２ Ｍｅｄｉａｔｏｒ Ｓｕｂｕｎｉｔ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（８０－．）．２９６，７５５－７５８（２００２）．
５０．Ｍｉｔｔｌｅｒ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．Ａ ｎｏｖｅｌ ｄｏｃｋｉｎｇ ｓｉｔｅ ｏｎ Ｍｅｄｉａｔｏｒ ｉｓ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｆｏｒ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｂｙ ＶＰ１６ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ．ＥＭＢＯ Ｊ．２２，６４９４－５０４（２００３）．
５１．Ｙａｎｇ，Ｆ．，ＤｅＢｅａｕｍｏｎｔ，Ｒ．，Ｚｈｏｕ，Ｓ．＆ Ｎａａｒ，Ａ．Ｍ．Ｔｈｅ ａｃｔｉｖａｔｏｒ－ｒｅｃｒｕｉｔｅｄ ｃｏｆａｃｔｏｒ／Ｍｅｄｉａｔｏｒ ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ ｓｕｂｕｎｉｔ ＡＲＣ９２ ｉｓ ａ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｔａｒｇｅｔ ｏｆ ｔｈｅ ＶＰ１６ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ａｃｔｉｖａｔｏｒ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０１，２３３９－４４（２００４）．
５２．Ｌｅｅ，Ｈ．－Ｋ．，Ｐａｒｋ，Ｕ．－Ｈ．，Ｋｉｍ，Ｅ．－Ｊ．＆ Ｕｍ，Ｓ．－Ｊ．ＭＥＤ２５ ｉｓ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｆｒｏｍ ＴＲＡＰ２２０／ＭＥＤ１ ｉｎ ｃｏｏｐｅｒａｔｉｎｇ ｗｉｔｈ ＣＢＰ ｆｏｒ ｒｅｔｉｎｏｉｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．ＥＭＢＯ Ｊ．２６，３５４５－３５５７（２００７）．
５３．Ｒａｎａ，Ｒ．，Ｓｕｒａｐｕｒｅｄｄｉ，Ｓ．，Ｋａｍ，Ｗ．，Ｆｅｒｇｕｓｏｎ，Ｓ．＆ Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ，Ｊ．Ａ．Ｍｅｄ２５ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ＲＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ＩＩ ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ ｔｏ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ，ｔｈｕｓ ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃ ａｎｄ ｌｉｐｉｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｌｉｖｅｒ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３１，４６６－８１（２０１１）．
５４．Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．Ｗｗｐ２ ｉｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ ｐａｌａｔｏｇｅｎｅｓｉｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｓｏｘ９ ａｎｄ ｍｅｄｉａｔｏｒ ｓｕｂｕｎｉｔ ２５．Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．２，２５１（２０１１）．
５５．Ｇａｒｒｅｔｔ－Ｅｎｇｅｌｅ，Ｃ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．ｉｎｔｅｒｓｅｘ，ａ ｇｅｎｅ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｆｅｍａｌｅ ｓｅｘｕａｌ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｉｎ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ，ｉｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｂｏｔｈ ｓｅｘｅｓ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｔｏｇｅｔｈｅｒ ｗｉｔｈ ｄｏｕｂｌｅｓｅｘ ｔｏ ｒｅｇｕｌａｔｅ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２９，４６６１－７５（２００２）．
５６．Ｅｂｅｒｈａｒｄｙ，Ｓ．Ｒ．＆ Ｆａｒｎｈａｍ，Ｐ．Ｊ．Ｍｙｃ Ｒｅｃｒｕｉｔｓ Ｐ－ＴＥＦｂ ｔｏ Ｍｅｄｉａｔｅ ｔｈｅ Ｆｉｎａｌ Ｓｔｅｐ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｃａｄ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７，４０１５６－４０１６２（２００２）．
５７．Ｂｏｒｇｇｒｅｆｅ，Ｔ．＆ Ｙｕｅ，Ｘ．Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｓｕｂｕｎｉｔｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｍｅｄｉａｔｏｒ ｃｏｍｐｌｅｘ ｗｉｔｈ ｇｅｎｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ．Ｓｅｍｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２２，７５９－７６８（２０１１）．
ＳＴＡＲ法
実験モデル及び主題詳細
細胞
Ｖ６．５マウス胚性幹細胞は、Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＲ．Ｊａｅｎｉｓｃｈからの供与物である。Ｖ６．５は、Ｃ５７ＢＬ／６（Ｆ）×１２９／ｓｖ（Ｍ）交雑種から得られた雄性細胞である。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、ＡＴＣＣ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－３２１６）から購入した。細胞は、マイコプラズマ陰性であった。
細胞培養条件
Ｖ６．５マウス胚性幹（ｍＥＳ）細胞は、２ｉ＋ＬＩＦ条件で増殖させた。ｍＥＳ細胞は、常に、０．２％のゼラチン（Ｓｉｇｍａ、Ｇ１８９０）でコートされた組織培養プレートで増殖させた。２ｉ＋ＬＩＦ培地条件に使用した培地は、以下の通りである：９６７．５ｍＬのＤＭＥＭ／Ｆ１２（ＧＩＢＣＯ １１３２０）、５ｍＬのＮ２サプリメント（ＧＩＢＣＯ １７５０２０４８）、１０ｍＬのＢ２７サプリメント（ＧＩＢＣＯ １７５０４０４４）、０．５ｍＭのＬ－グルタミン（ＧＩＢＣＯ ２５０３０）、０．５×非必須アミノ酸（ＧＩＢＣＯ １１１４０）、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン－ストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ １５１４０）、０．１ｍＭのｂ－メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ）、１ｕＭのＰＤ０３２５９０１（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ ０４－０００６）、３ｕＭのＣＨＩＲ９９０２１（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ ０４－０００４）、及び１０００Ｕ／ｍＬの組換えＬＩＦ（ＥＳＧＲＯ ＥＳＧ１１０７）。分化については、下記の血清培地においてｍＥＳＣを培養した：１５％のウシ胎仔血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ、キャラクタライズドＳＨ３００７１０３）、１００ｍＭの非必須アミノ酸（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１１１４０－０５０）、２ｍＭのＬ－グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、２５０３０－０８１）、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００ｍｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１５１４０－１２２）、及び０．１ｍＭのｂ－メルカプトエタノール（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）が添加されたＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１１９６５－０９２）。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、ＡＴＣＣ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－３２１６）から購入し、ＤＭＥＭ、高濃度グルコース、ピルビン酸（ＧＩＢＣＯ １１９９５－０７３）（１０％ウシ胎仔血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ、キャラクタライズドＳＨ３００７１０３）、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン－ストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ１５１４０）、２ｍＭのＬ－グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、２５０３０－０８１）を含む）において培養した。細胞は、マイコプラズマ陰性であった。
方法詳細
免疫蛍光法とＲＮＡ ＦＩＳＨとの併用
５ｕｇ／ｍＬのポリ－Ｌ－オルニチン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｐ４９５７）及び５μｇ／ｍＬのラミニン（Ｃｏｒｎｉｎｇ、３５４２３２）を用いて、それぞれ３０分間及び２時間、カバースリップを３７℃でコートした。事前にコートしたカバースリップ上に細胞を蒔き、２４時間増殖させた後、４％のパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）（ＶＷＲ、ＢＴ１４０７７０）を含むＰＢＳを使用して１０分間固定化した。細胞をＰＢＳで３回洗浄した後、カバースリップを加湿チャンバーに入れるか、またはＰＢＳにおいて４℃で保管した。０．５％のｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｘ１００）を含むＰＢＳを使用して細胞の透過処理を１０分間行った後、ＰＢＳでの洗浄を３回行った。４％のＩｇＧ非含有ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（ＶＷＲ、１０２６４３－５１６）を用いて細胞を３０分間ブロッキングし、記載の一次抗体（表Ｓ４を参照のこと）を、ＰＢＳで１：５００希釈した濃度で添加し、４～１６時間インキュベートした。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、ＰＢＳで１：５０００希釈した濃度の二次抗体と共に１時間インキュベートした。ＰＢＳでの洗浄を２回行った後、４％のパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）（ＶＷＲ、ＢＴ１４０７７０）を含むＰＢＳを使用して細胞を１０分間固定化した。ＰＢＳでの洗浄を２回行った後、洗浄緩衝液Ａ（２０％のＳｔｅｌｌａｒｉｓ ＲＮＡ ＦＩＳＨ緩衝液Ａ（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、ＳＭＦ－ＷＡ１－６０）、１０％の脱イオン化ホルムアミド（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｓ４１１７）を含むＲＮａｓｅ非含有水（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＡＭ９９３２））を細胞に添加し、５分間インキュベートした。１２．５μＭのＲＮＡプローブ（表Ｓ６、Ｓｔｅｌｌａｒｉｓ）を含むハイブリダイゼーション緩衝液（９０％のＳｔｅｌｌａｒｉｓ ＲＮＡ ＦＩＳＨハイブリダイゼーション緩衝液（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＳＭＦ－ＨＢ１－１０）及び１０％の脱イオン化ホルムアミド）を細胞に添加し、３７Ｃで一晩インキュベートした。洗浄緩衝液Ａでの洗浄を３７℃で３０分間行った後、２０μｍ／ｍＬのＨｏｅｃｈｓｔ ３３２５８（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｈ３５６９）において核を５分間染色してから、洗浄緩衝液Ｂ（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＳＭＦ－ＷＢ１－２０）での洗浄を５分間行った。細胞を水で１回洗浄した後、Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（ＶＷＲ、１０１０９８－０４２）を用いてカバースリップをスライドガラス上にマウントし、最終的に、マニキュア液（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ 番号７２１８０）を用いてカバースリップをシールした。画像の取得は、ＭｅｔａＭｏｒｐｈ取得ソフトウェア及びＨａｍｍａｍａｔｓｕ ＯＲＣＡ－ＥＲ ＣＣＤカメラ（Ｗ．Ｍ．Ｋｅｃｋ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｆａｃｉｌｉｔｙ，ＭＩＴ）を使用して、１００×対物レンズを備えたＲＰＩスピニングディスク型共焦点顕微鏡で行った。画像の後処理は、Ｆｉｊｉ Ｉｓ Ｊｕｓｔ ＩｍａｇｅＪ（ＦＩＪＩ）を使用して行った。
免疫蛍光法とＤＮＡ ＦＩＳＨとの併用
免疫蛍光法は、上記のように実施した。細胞を二次抗体と共にインキュベートした後、ＰＢＳで細胞を室温で５分間、３回洗浄し、４％のＰＦＡを含むＰＢＳを用いて１０分間固定化し、ＰＢＳで３回洗浄した。７０％のエタノール、８５％のエタノール、次いで１００％のエタノールにおいて細胞を室温で１分間インキュベートした。７μＬのＦＩＳＨハイブリダイゼーション緩衝液（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｇ９４００Ａ）、１μｌのＦＩＳＨプローブ（対象領域については後述部を参照のこと）、及び２μＬの水を混合してプローブハイブリダイゼーション混合物を調製した。５μＬの混合物をスライド上に添加し、カバースリップを上に被せた（細胞側の面がハイブリダイゼーション混合物と接するようにした）。ゴムのりを使用してカバースリップをシールした。ゴムのりが固化した時点で、ゲノムＤＮＡ及びプローブを７８℃で５分間変性させ、スライドを暗所、１６℃で一晩インキュベートした。スライドからカバースリップを剥がし、予熱した洗浄緩衝液１（Ａｇｉｌｅｎｔ、Ｇ９４０１Ａ）において７３℃で２分間インキュベートし、洗浄緩衝液２（Ａｇｉｌｅｎｔ、Ｇ９４０２Ａ）において室温で１分間インキュベートした。スライドを風乾し、Ｈｏｅｃｈｓｔを含むＰＢＳを用いて核を室温で５分間染色した。ＰＢＳでカバースリップを３回洗浄し、Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄを使用してスライド上にマウントし、マニキュア液を用いてシールした。画像の取得は、ＭｅｔａＭｏｒｐｈ取得ソフトウェア及びＨａｍｍａｍａｔｓｕ ＯＲＣＡ－ＥＲ ＣＣＤカメラ（Ｗ．Ｍ．Ｋｅｃｋ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｆａｃｉｌｉｔｙ，ＭＩＴ）を使用して、１００×対物レンズを備えたＲＰＩスピニングディスク型共焦点顕微鏡で行った。
Ｎａｎｏｇスーパーエンハンサー及びＭｉＲ２９０スーパーエンハンサーを標的とするために、ＤＮＡ ＦＩＳＨプローブは、Ａｇｉｌｅｎｔによってカスタム設計及び生成されたものを使用した。
Ｎａｎｏｇ
設計インプット領域－ｍｍ９
ｃｈｒ６ １２２６０５２４９－１２２７０５２４８
設計領域－ｍｍ９
ｃｈｒ６：１２２６０５９８５－１２２７０５３９４
Ｍｉｒ２９０
設計領域－ｍｍ１０
ｃｈｒ７：３１４１１５１－３２４１３８１
組織培養
Ｖ６．５マウス胚性幹細胞（ｍＥＳＣ）は、Ｊａｅｎｉｓｃｈ ｌａｂからの供与物である。０．２％のゼラチン（Ｓｉｇｍａ、Ｇ１８９０）でコートされた組織培養プレート上で２ｉ培地において細胞を増殖させた。この２ｉ培地の組成は、ＤＭＥＭ－Ｆ１２（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１１３２００８２）、０．５×Ｂ２７サプリメント（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１７５０４０４４）、０．５×Ｎ２サプリメント（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１７５０２０４８）、追加の０．５ｍＭのＬ－グルタミン（Ｇｉｂｃｏ、２５０３０－０８１）、０．１ｍＭのｂ－メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ、Ｍ７５２２）、１％のペニシリンストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１５１４０１６３）、０．５×非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ、１１１４０－０５０）、１０００Ｕ／ｍｌのＬＩＦ（Ｃｈｅｍｉｃｏ、ＥＳＧ１１０７）、１μＭのＰＤ０３２５９０１（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ、０４－０００６－１０）、３μＭのＣＨＩＲ９９０２１（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ、０４－０００４－１０）である。細胞は、加湿インキュベーターにおいて、５％のＣＯ２雰囲気下、３７℃で増殖させた。共焦点画像化については、５μｇ／ｍＬのポリ－Ｌ－オルニチン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｐ４９５７）及び５μｇ／ｍｌのラミニン（Ｃｏｒｎｉｎｇ、３５４２３２）を用いて、それぞれ３７℃で３０分間、及び３７℃で２時間～１６時間コートしたガラスのカバースリップ（Ｃａｒｏｌｉｎａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｕｐｐｌｙ、６３３０２９）上で細胞を増殖させた。継代培養については、１０００Ｕ／ｍｌのＬＩＦを含むＰＢＳ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＡＭ９６２５）で細胞を洗浄した。プレートからの細胞の剥離には、ＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｅｎｚｙｍｅ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１２６０４０２１）を使用した。ＴｒｙｐＬＥの反応停止は、ＦＢＳ／ＬＩＦ－培地（ＤＭＥＭ Ｋ／Ｏ（Ｇｉｂｃｏ、１０８２９－０１８）、１×非必須アミノ酸、１％のペニシリンストレプトマイシン、２ｍＭのＬ－グルタミン、０．１ｍＭのｂ－メルカプトエタノール、及び１５％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｆ４１３５））を用いて行った。１０００ｒｐｍ、室温で細胞を３分間スピンダウンしてから、２ｉ培地に再浮遊させ、５×１０６個の細胞を１５ｃｍディッシュに蒔いた。ｍＥＳＣの分化については、６ウェル組織培養ディッシュのウェルごとに６０００個の細胞を蒔くか、またはラミニンでコートされたガラスのカバースリップを含む２４ウェルプレートのウェルごとに１０００個の細胞を蒔いた。２４時間後、２ｉ培地をＬＩＦ非含有ＦＢＳ培地（上記のもの）と交換した。５日間、培地を毎日交換した後、細胞を収集した。
ウエスタンブロット
プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ、１１６９７４９８００１）を含むＣｅｌｌ Ｌｙｔｉｃ Ｍ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃ２９７８）において細胞を溶解させた。３％～８％のトリス酢酸ゲルまたは１０％のビス－トリスゲルまたは３～８％のビス－トリスゲルにおいて８０Ｖで可溶化液を約２時間泳動させた後、色素の最前部がゲルの末端に達するまで１２０Ｖで泳動させた。次に、氷冷転写緩衝液（２５ｍＭのトリス、１９２ｍＭのグリシン、１０％のメタノール）において、孔径０．４５μｍのＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＩＰＶＨ０００１０）へと３００ｍＡ、４℃でタンパク質を湿潤状態で２時間転写した。転写後、５％の無脂肪乳を含むＴＢＳにおいて膜を振とうしながら室温で１時間ブロッキングした。次に、５％の無脂肪乳を含むＴＢＳＴで１：１，０００希釈した記載の抗体（表Ｓ４）と共に膜をインキュベートし、振とうしながらインキュベートを４℃で一晩継続した。朝に、ＴＢＳＴを用いて膜の洗浄を３回行い、その際、洗浄ごとに、室温で振とうしながら膜の洗浄を５分間行った。１：５，０００希釈した二次抗体と共に膜を室温で１時間インキュベートし、ＴＢＳＴを用いる５分間の膜の洗浄を３回行った。ＥＣＬ基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、３４０８０）を用いて膜を発色させ、ＣＣＤカメラを使用して画像化するか、もしくはフィルムを使用して感光させるか、または高感度ＥＣＬを用いて膜を発色させた。
クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）ｑＰＣＲ及びシークエンシング
２ｉ培地において８０％コンフルエンスになるまでｍＥＳを増殖させた。１％のホルムアルデヒドを含むＰＢＳを使用して細胞における架橋反応を１５分間行った後、最終濃度１２５ｍＭのグリシンを用いて氷上でこの架橋反応を停止した。冷却ＰＢＳで細胞を洗浄し、冷却ＰＢＳにおいて細胞を剥がし取ることによって細胞を収集した。収集した細胞を、１０００ｇ、４℃で３分間ペレット化し、液体窒素中で急速凍結させ、－８０℃で保管した。新たに調製したｃＯｍｐｌｅｔｅプロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ、１１８７３５８０００１）をすべての緩衝液に含めた。凍結架橋細胞を氷上で解凍した後、溶解緩衝液Ｉ（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ７．５）、１４０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１０％のグリセロール、０．５％のＮＰ－４０、０．２５％のＴｒｉｔｏｎＸ－１００、１３種類のプロテアーゼ阻害剤）に再浮遊させ、４℃で１０分間、旋回振とうした後、１３５０ｒｃｆ、４℃で５分間スピンダウンした。ペレットを溶解緩衝液ＩＩ（１０ｍＭのトリス－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．５ｍＭのＥＧＴＡ、１３種類のプロテアーゼ阻害剤）に再浮遊させ、４℃で１０分間、旋回振とうし、１３５０ｒｃｆ、４℃で５分間スピンダウンした。ペレットを超音波処理緩衝液（２０ｍＭのトリス－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、０．１％のＳＤＳ、及び１％のＴｒｉｔｏｎＸ－１００、１３種類のプロテアーゼ阻害剤）に再浮遊させた後、Ｍｉｓｏｎｉｘ３０００超音波処理器での各３０秒の超音波処理（１８～２１Ｗ）を氷上で１０サイクル行い、サイクル間には氷上での６０秒の保持を挟んだ。超音波処理した可溶化液を、１６，０００ｒｃｆ、４℃での１０分間の遠心分離に１回供して清澄化した。インプット材料を取り分け、残りを、抗体（表Ｓ４）が結合した磁気ビーズと共に４℃で一晩インキュベートして、記載の因子が結合したＤＮＡ断片を濃縮した。下記の緩衝液のそれぞれを用いてビーズを２回洗浄した：洗浄緩衝液Ａ（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ７．５）、１４０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、０．１％のデオキシコール酸Ｎａ、１％のＴｒｉｔｏｎＸ－１００、０．１％のＳＤＳ）、洗浄緩衝液Ｂ（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ７．９）、５００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、０．１％のデオキシコール酸Ｎａ、１％のＴｒｉｔｏｎＸ－１００、０．１％のＳＤＳ）、洗浄緩衝液Ｃ（２０ｍＭのトリス－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２５０ｍＭのＬｉＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、０．５％のデオキシコール酸Ｎａ、０．５％のＩＧＥＰＡＬＣ－６３０、０．１％のＳＤＳ）、洗浄緩衝液Ｄ（０．２％のＴｒｉｔｏｎＸ－１００を含むＴＥ）、及びＴＥ緩衝液。溶出緩衝液（５０ｍＭのトリス－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭのＥＤＴＡ、１％のＳＤＳ）において６５℃で間欠的に１時間ボルテックスしながらインキュベートすることによってビーズからＤＮＡを溶出させた。６５℃で一晩架橋を外した。ＤＮＡを精製するために、ＴＥを２００μＬ添加した後、３３ｍｇ／ｍＬのＲＮａｓｅＡ（Ｓｉｇｍａ、Ｒ４６４２）を２．５μＬ添加し、３７℃で２時間インキュベートすることによってＲＮＡを分解した。２０ｍｇ／ｍＬのプロテイナーゼＫ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、２５５３００４９）を１０μＬ添加し、５５℃で２時間インキュベートすることによってタンパク質を分解した。フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール抽出を実施した後、エタノール沈殿を実施した。次に、ＤＮＡを５０μＬのＴＥに再懸濁し、ｑＰＣＲまたはシークエンシングのいずれかに使用した。ＣｈＩＰ－ｑＰＣＲ実験については、Ｐｏｗｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ｍｉｘ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ 番号４３６７６５９）を使用してＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ５ Ｓｙｓｔｅｍ またはＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ６ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）でｑＰＣＲを実施した。
ＲＮＡ－Ｓｅｑ
記載の処理を行った記載の細胞株においてＲＮＡ－Ｓｅｑを実施し、発現遺伝子の決定に使用した。ＡｌｌＰｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ ８０２０４）によってＲＮＡを単離し、ＴｒｕＳｅｑ Ｓｔｒａｎｄｅｄ ｍＲＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、ＲＳ－１２２－２１０１）を製造者のプロトコールに従って使用してストランド特異的ポリＡ選択ライブラリーを調製し、Ｈｉ－ｓｅｑ ２５００装置でシングルエンドシークエンシングに供した。
タンパク質精製
目的遺伝子またはそのＩＤＲをコードするｃＤＮＡを改変バージョンのＴ７ ｐＥＴ発現ベクターにクローニングした。このベースベクターは、５’に６×ＨＩＳ、その下流にｍＥＧＦＰまたはｍＣｈｅｒｒｙのいずれか、及び「ＧＡＰＧＳＡＧＳＡＡＧＧＳＧ」（配列番号１４）という１４個のアミノ酸のリンカー配列を含むように操作した。こうした配列（ＰＣＲによって生成させた）をリンカーアミノ酸と共にフレーム内に挿入するために、ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ（登録商標）ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＮＥＢ Ｅ２６２１Ｓ）を使用した。ｍＥＧＦＰまたはｍＣｈｅｒｒｙを単独で発現するベクターは、リンカー配列の下流に終始コドンを含む。変異配列は、ｇｅｎｅｂｌｏｃｋｓ（ＩＤＴ）として合成し、上記のものと同じベースベクターに挿入した。発現コンストラクトはすべて、シークエンシングして配列が変化していないことを確認した。タンパク質発現については、プラスミドを用いた形質転換をＬＯＢＳＴＲ細胞（Ｃｈｅｓｓｍａｎ Ｌａｂからの供与物）に対して行い、下記のように増殖させた。カナマイシン及びクロラムフェニコールを含むＬＢ培地に新鮮な細菌コロニーを播種し、３７℃で一晩増殖させた。ＭＥＤ１－ＩＤＲコンストラクトを含む細胞を、カナマイシン及びクロラムフェニコールを新たに添加した５００ｍｌの室温のＬＢで１：３０希釈し、１６℃で１．５時間増殖させた。ＩＰＴＧを添加して１ｍＭとし、増殖を１８時間継続した。細胞を収集し、－８０℃で凍結保管した。いずれの他のコンストラクトを含む細胞もまた、ＩＰＴＧによる誘導後に３７℃で５時間増殖させたことを除いて、同様の様式で処理した。
ｃＯｍｐｌｅｔｅプロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ、１１８７３５８０００１）を含む１５ｍｌの変性緩衝液（５０ｍＭのトリス（７．５）、３００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのイミダゾール、８Ｍの尿素）に５００ｍｌのｃＭｙｃ細胞及びＮａｎｏｇ細胞のペレットを再浮遊させ、超音波処理（１５秒間オン、６０秒間オフのサイクルを１０回実施）した。１２，０００ｇで３０分間遠心分離することによって可溶化液を清澄化し、１０倍体積の同じ緩衝液で事前に平衡化しておいた１ｍｌのＮｉ－ＮＴＡアガロース（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｒ９０１－１５）に添加した。このアガロース可溶化液スラリーを含むチューブを１．５時間旋回振とうした。スラリーをカラムに流し込み、１５倍体積の溶解緩衝液で洗浄し、２５０ｍＭのイミダゾールを含む変性緩衝液を用いて溶出処理を４回行った。各画分を１２％ゲルで泳動させ、正しいサイズのタンパク質の透析を行った。この透析は、最初は緩衝液（５０ｍＭのトリス（ｐＨ７．５）、１２５ＭｍのＮａＣｌ、１ＭｍのＤＴＴ、及び４Ｍの尿素）に対して行い、次に、２Ｍの尿素を含む同じ緩衝液に対して行い、最終的に、１０％のグリセロールを含む尿素非含有緩衝液（この緩衝液による外液交換を２回実施）に対して行った。透析後に生じた沈殿物はいずれも、３，０００ｒｐｍでの１０分間の遠心分離によって除去した。他のタンパク質もすべて、同様の様式で精製した。１０ｍＭのイミダゾール及びｃＯｍｐｌｅｔｅプロテアーゼ阻害剤を含む１５ｍｌの緩衝液Ａ（５０ｍＭのトリス（ｐＨ７．５）、５００ｍＭのＮａＣｌ）に５００ｍｌの細胞のペレットを再浮遊させ、超音波処理を行い、可溶化液を、１２，０００ｇ、４℃で３０分間遠心分離することによって清澄化し、事前に平衡化した１ｍｌのＮｉ－ＮＴＡアガロースに添加し、４℃で１．５時間旋回振とうした。スラリーをカラムに流し込み、１０ｍＭのイミダゾールを含む１５倍体積の緩衝液Ａで洗浄し、タンパク質の溶出処理を、５０ｍＭのイミダゾールを含む緩衝液Ａで２回、１００ｍＭのイミダゾールを含む緩衝液Ａで２回、及び２５０ｍＭのイミダゾールを含む緩衝液Ａで３回行った。代替法として、樹脂スラリーを３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、１５倍体積の緩衝液で洗浄し、上記の緩衝液（５０ｍＭのイミダゾール、１００ｍＭのイミダゾール、及び２５０ｍＭのイミダゾール）のそれぞれと共に１０分間以上旋回振とうしながらインキュベートすることによってタンパク質を溶出させた後、遠心分離及びゲルでの分析を行った。５０ｍＭのトリス（７．５）、１２５ｍＭのＮａＣｌ、１０％のグリセロール、及び１ｍＭのＤＴＴを含む緩衝液（この緩衝液による外液交換を２回実施）に対して、正しいサイズのタンパク質を含む画分を４℃で透析した。
インビトロの液滴アッセイ
Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ遠心分離フィルター（３０Ｋ ＭＷＣＯ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して組換えＧＦＰ融合タンパク質または組換えｍＣｈｅｒｒｙ融合タンパク質を濃縮及び脱塩することで、タンパク質を適切な濃度とし、ＮａＣｌ濃度を１２５ｍＭとした。液滴形成緩衝液（５０ｍＭのトリス－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０％のグリセロール、１ｍＭのＤＴＴ）中に異なる濃度（記載の最終塩濃度）の塩及び１０％のＰＥＧ－８０００（クラウディング剤）を含む溶液に組換えタンパク質を添加した。このタンパク質溶液を、並行に配置された２つの両面テープ片によってカバースリップが取り付けられたスライドガラスから構成される自作チャンバーに直ちにロードした。次に、１５０×対物レンズを備えたＡｎｄｏｒ共焦点顕微鏡を用いてスライドを画像化した。指定がない限り、示される画像は、ガラスのカバースリップ上で安定した状態の液滴のものである。蛍光標識ポリペプチドを用いる実験については、ＴＭＲ蛍光タグを用いてＫｏｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ／ＭＩＴ Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ＆ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ Ｃｏｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙによって合成された記載のデカペプチドを使用した。記載のポリペプチドを含む緩衝液Ｄ（１２５ｍＭのＮａＣｌ及び１０％のＰｅｇ－８０００を含む）に目的タンパク質を添加し、上記のように画像化した。インビトロ液滴のＦＲＡＰについては、５０ｕ秒の画素滞在時間でレーザーパルスを液滴に５回照射し、回復の画像化をＡｎｄｏｒ顕微鏡で１秒ごとに記載の時間実施した。エストロゲンによる刺激実験については、Ｂ－エストラジオール（Ｅ８８７５Ｓｉｇｍａ）を１００％のＥｔＯＨで新たに再構成して１０ｍＭとした後、１２５ｍＭのＮａＣｌを含む液滴形成緩衝液で希釈して１００ｕＭとした。１０ｕＬの液滴形成反応液においてこの高濃度貯蔵液を１マイクロリットル使用して最終濃度を１０ｕＭとした。
ゲノム編集及びタンパク質分解
ＥＳＣ株の遺伝子操作にはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を使用した。ＧＦＰと共にコドン最適化バージョンのＣａｓ９を保有するプラスミド（Ｒ．Ｊａｅｎｉｓｃｈからの供与物）に標的特異的オリゴヌクレオチドをクローニングした。標的ＤＮＡの配列（プロトスペーサー隣接モチーフには下線が付けられている）は、同じ表に記載されている。内在性にタグ付けされた株の生成には、以下のガイド配列を含む２．５ｍｇのＣａｓ９プラスミド（ｐＸ３３０－ＧＦＰ－Ｏｃｔ４）、１．２５ｍｇの非直鎖化修復プラスミド１（ｐＵＣ１９－Ｏｃｔ４－ＦＫＢＰ－ＢＦＰ）、及び１．２５ｍｇの非直鎖化修復プラスミド２（ｐＵＣ１９－Ｏｃｔ４－ＦＫＢＰ－ｍｃｈｅｒｒｙ）（表Ｓ５）を、Ｍｅｄ１－ｍＥＧＦＰタグを有する１００万個のｍＥＳ細胞にトランスフェクトした。４８時間後、ＧＦＰが存在する細胞を選別した。細胞を５日間増殖させた後、ｍＣｈｅｒｒｙ及びＢＦＰについて二重に陽性の細胞を再び選別した。４０，０００個のｍＣｈｅｒｒｙ＋／ＢＦＰ＋選別細胞を段階希釈して６ウェルプレートに蒔いた。２ｉ培地において細胞をおよそ１週間増殖させた後、立体鏡を使用して個々のコロニーをピッキングし、９６ウェルプレートに移した。細胞を増殖させ、ＰＣＲによって遺伝子型を同定し、分解が生じることをウエスタンブロット及びＩＦによって確認した。ホモ接合型ノックインタグを有するクローンをさらに増殖させ、実験に使用した。ＦＫＢＰタグ付きＯｃｔ４を発現するホモ接合型ノックインクローン株を分解実験に使用した。２ｉにおいて細胞を増殖させた後、１００ｎＭ濃度のｄＴＡＧ－４７で２４時間処理してから収集した。
Ｏｃｔ４ガイド配列
ｔｇｃａｔｔｃａａａｃｔｇａｇｇｃａｃｃ＊ＮＧＧ（ＰＡＭ）（配列番号１５）
ＧＡＬ４転写アッセイ
ＧＡＬ４ ＤＮＡ結合ドメインの発現を誘導するＳＶ４０プロモーターを含む哺乳類発現ベクターにおいて転写因子コンストラクトを構築した。このＤＮＡ結合ドメインのＣ末端に対してＯｃｔ４及びＧｃｎ４の野生型活性化ドメイン及び変異活性化ドメインを、Ｇｉｂｓｏｎクローニング（ＮＥＢ ２６２１Ｓ）によって融合し、この融合では、ＧＡＰＧＳＡＧＳＡＡＧＧＳＧ（配列番号１６）という配列のリンカーを連結に使用した。こうした転写因子コンストラクトを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｌ３００００１５）を使用してＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－３２１６）またはＶ６．５マウス胚性幹細胞にトランスフェクトし、トランスフェクトした細胞を白色の平底９６ウェルアッセイプレート（Ｃｏｓｔａｒ ３９１７）において増殖させた。こうした転写因子コンストラクトは、ホタルルシフェラーゼ遺伝子の上流に５つのＧＡＬ４上流活性化部位を含む改変バージョンのＰＧＬ３－Ｂａｓｉｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ）ベクターと共にコトランスフェクトした。ｐＲＬ－ＳＶ４０（Ｐｒｏｍｅｇａ）もまた、コトランスフェクトした。ｐＲＬ－ＳＶ４０は、ＳＶ４０プロモーターによって誘導されるウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子を含むプラスミドである。トランスフェクトから２４時間後、各ルシフェラーゼタンパク質によって生じる発光を、Ｄｕａｌ－ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｅ２９２０）を使用して測定した。データは、ウミシイタケルシフェラーゼの発現量として示されている。
Ｌａｃ結合アッセイ
ＣＦＰ－ＬａｃＩ融合タンパク質の発現を誘導するＳＶ４０プロモーターを含むｐＳＶ２哺乳類発現ベクターにおいて、ＮＥＢ ＨＩＦＩクローニングによってコンストラクトを構築した。この組換えタンパク質のＣ末端に対してＧｃｎ４の活性化ドメイン及び変異活性化ドメインを融合し、この融合では、ＧＡＰＧＳＡＧＳＡＡＧＧＳＧ（配列番号１７）という配列のリンカーを連結に使用した。約５１，０００個のＬａｃリプレッサー結合部位のアレイが安定的に組み込まれたＵ２ＯＳ－２６８細胞（Ｓｐｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙからの供与物）へのトランスフェクトを、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｌ３００００１５）を使用して行った。トランスフェクトから２４時間後、フィブロネクチンでコートされたガラスのカバースリップ上に細胞を蒔いた。ガラスのカバースリップ上に蒔いてから２４時間後、上記のようにＭＥＤ１抗体（表Ｓ４）での免疫蛍光を行うために細胞を固定化し、スピニングディスク型共焦点顕微鏡法によって画像化した。
ＣＤＫ８－メディエーターの精製
ＣＤＫ８－メディエーター試料は、報告（Ｍｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００８）に改変を加えて精製した。親和性精製を行う前に、硫酸アンモニウム沈殿法（３５％）によってＰ０．５Ｍ／ＱＦＴ画分を濃縮して１２ｍｇ／ｍＬとした。２０ｍＭのＫＣｌ、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、２ｍＭのＭｇＣｌ２、２０％のグリセロールを含むｐＨ７．９の緩衝液にペレットを再懸濁した後、０．１５ＭのＫＣｌ、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、２０％のグリセロール、及び０．０２％のＮＰ－４０を含むｐＨ７．９の緩衝液に対して透析してから、親和性精製ステップに供した。報告（Ｍｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００８）のように親和性精製を実施し、溶出した材料を、０．１５ＭのＫＣｌ ＨＥＭＧ（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、２ｍＭのＭｇＣｌ２、１０％のグリセロール）を２ｍＬ入れた２．２ｍＬの遠心分離チューブにロードし、５０Ｋ ＲＰＭ、４℃で４時間遠心分離した。この操作を行うことで、過剰な遊離ＧＳＴ－ＳＲＥＢＰが除去され、ＣＤＫ８－メディエーターが最終画分に濃縮された。液滴アッセイを行う前に、Ｕｌｔｒａｃｅｌ－３０膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＭＲＣＦ０Ｒ０３０）を備えたＭｉｃｒｏｃｏｎ－３０ｋＤａ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｉｌｔｅｒ Ｕｎｉｔを使用して精製ＣＤＫ８－メディエーターを濃縮して、メディエーター複合体の濃度を約３００ｎＭとした。濃縮したＣＤＫ８－メディエーターを、最終濃度が約２００ｎＭとなるようにして液滴アッセイに使用し、その際、１０μＭの記載のＧＦＰタグ付きタンパク質の存在下または非存在下で液滴アッセイを行った。液滴反応には、１０％のＰＥＧ－８０００及び１４０ｍＭの塩を含めた。
定量化及び統計解析
実験設計
実験はすべて、反復測定した。具体的な反復測定実施回数については、図の説明または以下の具体的なセクションを参照のこと。試験は盲検の状況で行ったものではない。試料のサイズは所定のものではなく、異常値の除去は行わなかった。
平均画像及び動径分布解析
免疫蛍光法を併用するＲＮＡ ＦＩＳＨの解析については、社内カスタムＭＡＴＬＡＢ（登録商標）スクリプトを記述することで、ＦＩＳＨ（ＲＮＡ／ＤＮＡ）チャネル及びＩＦチャネルに集積した３次元画像データを処理及び解析した。強度閾値によって個々のｚ軸スタック画像においてＦＩＳＨフォーカスを手動で同定し、サイズｌ＝２．９μｍのボックスの中心に置き、ｚ軸スタック画像にまたがって３次元で繋ぎ合わせた。特定されたＦＩＳＨフォーカスは、ＦＩＳＨフォーカスの手動精選リストに対する相互参照を行うことで偽陽性を除去してあり、こうした偽陽性は、過剰な核内シグナルまたは誤差に起因して生じるものである。同定したＲＮＡ ＦＩＳＨフォーカスごとに、ＩＦチャネルにおける対応位置に由来するシグナルが、あらゆるｚ軸スライス画像においてＲＮＡ ＦＩＳＨフォーカスを中心とするｌ×ｌ四方に集積される。次に、ＦＩＳＨとＩＦとのペアごとに、ＦＩＳＨフォーカスを中心とするＩＦシグナルが統合され、平均強度プロジェクションが計算されることで、ＦＩＳＨフォーカスを中心とするｌ×ｌ四方内のＩＦシグナル強度の平均データが得られる。自体の座標に中心を置いたＦＩＳＨシグナル強度について同じ処理を実施することで、ＦＩＳＨフォーカスを中心とするｌ×ｌ四方内のＦＩＳＨシグナル強度の平均データを得た。対照として、これと同じ処理を、無作為に選択された核内位置を中心とするＩＦシグナルにも実施した。無作為に選択された核内位置は、核体積を最初に同定し、次に、その体積内の位置を選択することによって画像セットごとに同定した。核体積は、ｚ軸スタック画像を取得した後、カスタムＣｅｌｌＰｒｏｆｉｌｅｒパイプライン（補助ファイルとして含めた）を介して処理することでＤＡＰＩ染色から決定した。簡潔に記載すると、このパイプラインでは、画像強度の再調整、処理速度を得るために行われる元サイズの２０％への画像の縮小、検出されたスペックルの強調、シグナルのメジアンフィルター処理、構造体の閾値判定、穴の除去、シグナルのメジアンフィルター処理、元のサイズへの画像の拡大、核の境界決定、及び得られる物体の白黒画像への変換が行われる。この白黒画像は、カスタムＲスクリプトのインプットとして使用され、このカスタムＲスクリプトでは、ｒｅａｄＴＩＦＦ及びｉｍ（ｓｐａｔｓｔａｔ由来）を使用することで、画像セット当たり４０の無作為な核ボクセルが選択される。次に、こうした平均強度プロジェクションを使用して、シグナル強度の２次元等高線図または動径分布プロットが作成される。等高線図は、ＭＡＴＬＡＢ（登録商標）のイン・ビルト（ｉｎ－ｂｕｉｌｔ）関数を使用して作成される。強度動径関数（（ｒ））は、平均データから計算される。等高線図については、示される強度－色範囲は、直線色範囲（ｎ！＝１５）にわたってカスタマイズしたものである。ＦＩＳＨチャネルについては、黒色～マゼンタ色を使用した。ＩＦチャネルについては、本発明者らは、ｃｈｒｏｍａ．ｊｓ（オンラインカラージェネレーター）を使用して１５のビンわたって色を生成させ、主要な変遷色として、黒色、青紫色、ミディアムブルー色、ライム色を選択した。これを行った目的は、読み手が一目でシグナル強度差をより容易に判別し得るようにすることにある。作成したカラーマップを、すべてのＩＦプロットについて、等間隔の１５の強度ビンに用いた。ＦＩＳＨ位置または無作為に選択された核内位置を中心とする平均ＩＦは、同じ色尺度を使用してプロットされ、この色尺度は、各プロットに由来する最小シグナル及び最大シグナルを含むように設定されている。ＤＮＡ ＦＩＳＨ解析については、ＦＩＪＩにおける強度閾値によって個々のｚ軸スタック画像においてＦＩＳＨフォーカスを手動で同定し、参照領域として選択した。次に、この参照領域を、画像のＭＥＤ１ ＩＦチャネルに当てはめ、当該ＦＩＳＨフォーカス内の平均ＩＦシグナルを決定した。画像当たり１１個以上の細胞を含む５枚の画像の平均シグナルを平均化することで、ＤＮＡ ＦＩＳＨフォーカスと結び付く平均ＭＥＤ１ ＩＦ強度を計算した。
クロマチン免疫沈降ＰＣＲ及びシークエンシング（ＣｈＩＰ）解析
図に示される値は、インプットに正規化したものである。平均ＷＴ正規化値及び標準偏差が示される。使用プライマーは、以下に示される。目的領域（ＲＯＩ）に対するＣｈＩＰをインプット値に正規化し（インプット倍率）、ｍｉｒ２９０エンハンサーについては、追加で負の領域に正規化した（負の正規化値）。値は、分化実験ではＥＳ状態に正規化したものが示され、ＯＣＴ４分解実験ではＤＭＳＯ対照に正規化したもの（対照正規化値）が示される。ｑＰＣＲ反応は、同じ試料を３回反復測定して実施した。
インプット倍率＝２（Ｃｔ＿インプット－Ｃｔ＿ＣＨＩＰ）
負の正規化値＝インプット倍率ＲＯＩ／インプット倍率ｎｅｇ
対照正規化値（分化）＝負の正規化値分化／負の正規化値ＥＳ
ＣｈＩＰ ｑＰＣＲプライマー
Ｍｉｒ２９０
Figure 2024029228000009
リード長に対するパラメーターを－ｋ １ －ｍ １ －ｂｅｓｔ及び－ｌに設定してｂｏｗｔｉｅを使用してｍｍ９バージョンのマウス参照ゲノムへのＣｈＩＰ－Ｓｅｑデータのアライメントを行った。ビンにおけるリードカバレッジを表示するためのＷｉｇｇｌｅファイルは、ＭＡＣＳ（パラメーターを－ｗ －Ｓ －ｓｐａｃｅ＝５０ －ｎｏｍｏｄｅｌ －ｓｈｉｆｔｓｉｚｅ＝２００とした）を使用して作成し、ビン当たりのリード数は、ｗｉｇｇｌｅファイルの作成に使用した数百万のマッピングリードに正規化した。リード数／百万に正規化されたｗｉｇｇｌｅファイルをＵＣＳＣゲノムブラウザーに表示した。図１に示されるＣｈＩＰ－Ｓｅｑトラックは、Ｗｈｙｔｅ ｅｔ ａｌ．，２０１３のＧＳＭ１０８２３４０（ＯＣＴ４）及びＧＳＭ５６０３４８（ＭＥＤ１）から得られたものである。２ｉ条件で増殖した細胞におけるスーパーエンハンサー及び典型的エンハンサーならびにその関連遺伝子は、Ｓａｂａｒｉ ｅｔ ａｌ．，２０１８からダウンロードした。ｂａｍＴｏＧＦＦ（ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ＢｒａｄｎｅｒＬａｂ／ｐｉｐｅｌｉｎｅ）を使用して占有倍率変化の分布を計算することで、２ｉ条件で増殖した細胞に由来するスーパーエンハンサー及び典型的エンハンサーのカバレッジを定量化した。それぞれの典型的エンハンサー及びスーパーエンハンサーのリードオーバーラップは、ｂａｍＴｏＧＦＦ（パラメーターを－ｅ ２００－ｆ １－ｔ ＴＲＵＥとした）を使用して決定し、その後、数百万のマッピングリードに正規化した（ＲＰＭ）。次に、各条件から得られたＲＰＭ正規化インプットリード数を、対応条件から得られたＲＰＭ正規化ＣｈＩＰ－Ｓｅｑリード数から差し引いた。この差し引きの結果が負の数となる領域に由来する値を０に設定した。ＤＭＳＯ処理（通常のＯＣＴ４量）とｄＴＡＧ処理（ＯＣＴ４の枯渇）との間のＬｏｇ２倍率変化を計算した。各条件には、擬頻度（ｐｓｅｕｄｏｃｏｕｎｔ）として１を追加した。
スーパーエンハンサーの同定
スーパーエンハンサーは、Ｗｈｙｔｅ ｅｔ ａｌ．に記載のように同定した。ＭＡＣＳ（－ｐ １ｅ－９－ｋｅｅｐ－ｄｕｐ＝１）及びインプット対照を使用してＭＥＤ１における濃縮のピークを同定した。非処理細胞に由来するＭＥＤ１アライメントリード及びＭＥＤ１の対応ピークを、ＲＯＳＥ（ｂｉｔｂｕｃｋｅｔ．ｏｒｇ／ｙｏｕｎｇ＿ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎ／）（パラメーターを－ｓ １２５００ －ｔ ２０００ －ｇ ｍｍ９とした）のインプット、及びインプット対照として使用した。Ｄ７Ｅｒｔｄ１４３ｅを追加する共に、Ｍｉｒ２９０、Ｍｉｒ２９１ａ、Ｍｉｒ２９１ｂ、Ｍｉｒ２９２、Ｍｉｒ２９３、Ｍｉｒ２９４、及びＭｉｒ２９５を除外することによってカスタム遺伝子リストを作成することで、同じ転写物の一部であるこうした近隣マイクロＲＮＡが重複カウントされないようにした。繋ぎ合わせたエンハンサー（スーパーエンハンサー及び典型的エンハンサー）を、そうした繋ぎ合わせたエンハンサーの中央に最も近い位置にプロモーターを有する単一の発現ＲｅｆＳｅｑ転写物に割り当てた。発現転写物は、上記のように定義した。
ＲＮＡ－Ｓｅｑ解析
解析については、デフォルトパラメーターでｈｉｓａｔ２を使用してｍｍ９版のマウス参照ゲノムに生のリードをアライメントした。遺伝子名－レベルリード数定量化は、ｈｔｓｅｑ－ｃｏｕｎｔ（パラメーターを－Ｉ ｇｅｎｅ＿ｉｄ －ｓｔｒａｎｄｅｄ＝ｒｅｖｅｒｓｅ －ｆ ｂａｍ －ｍ ｉｎｔｅｒｓｅｃｔｉｏｎ－ｓｔｒｉｃｔとした）と、Ｒｅｆｓｅｑ（６／６／１８にダウンロード）由来の転写物位置を含むＧＴＦと、を用いて実施した。正規化数、正規化倍率変化、及び発現差ｐ値は、ＤＥｓｅｑ２（標準的なワークフロー及び各条件の両方の反復測定結果を使用）を使用して決定した。
ＯＣＴ４の濃縮及び電荷解析
アミノ酸組成プロットは、タンパク質のアミノ酸配列に沿って各残基のアミノ酸独自性をプロットすることによってＲを使用して作成した。ＯＣＴ４の残基当たりの正味荷電は、ｌｏｃａｌＣＩＤＥＲパッケージ（Ｈｏｌｅｈｏｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，２０１７）を使用してアミノ酸数５のスライド幅でＯＣＴ４アミノ酸配列に沿って平均アミノ酸電荷を計算することによって決定した。
変性濃縮解析
（Ｓａｉｎｔ－ａｎｄｒｅ ｅｔ ａｌ．）に定義されるＴＦに対する解析のすべてについて、ヒト転写因子タンパク質配列のリストが使用される。参照ヒトプロテオーム（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＵＰ０００００５６４０）を使用してリストの抽出が行われ（約１２００のタンパク質に数が絞られる）、その際、非標準的アイソフォームの大部分が除去される。ＧＯ：０００３７１３及びＧＯ：００４５９４４のＧＯ濃縮ＩＤを使用してヒトにおいて転写コアクチベーター及びＰｏｌＩＩ関連タンパク質を同定した。上に定義した参照ヒトプロテオームを使用してすべてのヒトタンパク質のリストを作成し、Ｕｎｉｐｒｏｔのレビューリストからペルオキシソームタンパク質及びゴルジタンパク質を同定した。タンパク質ごとに、Ｄ２Ｐ２を使用して各アミノ酸の変性傾向を調べた。タンパク質におけるアミノ酸は、Ｄ２Ｐ２（Ｏａｔｅｓ ｅｔ ａｌ．，２０１３）によって用いられるアルゴリズムうちの少なくとも７５％が、当該残基が変性すると予測するのであれば、変性するものと考えられる。さらに、転写因子については、アノテーションされているＰＦＡＭドメインをすべて同定した（総数５７４１、特有ドメイン数１８０）。既知のＤＮＡ結合活性に対するＰＦＡＭアノテーションの相互参照を行うことで、４５の特有の高信頼性ＤＮＡ結合ドメインのサブセットを同定した。これは、すべての同定ドメインの約８５％に相当する。ＴＦの圧倒的多数（＞９５％）が、同定結合ドメインを少なくとも１つ有していた。あらゆるＴＦのＤＮＡ結合領域のすべて、ならびに配列の残りの部分（ほとんどの同定トランス活性化ドメインを含む）について、変性スコアを計算した。
インビトロ液滴の画像化解析
インビトロでの相分離画像化実験を解析するために、カスタムＭＡＴＬＡＢ（登録商標）スクリプトを記述して液滴を同定し、そのサイズ及び形状を特徴付けた。いずれの具体的な実験条件についても、ヒストグラムのピークに基づく強度閾値、及びサイズ閾値（半径２ピクセル）を用いて画像をセグメント化した。液滴の同定は、「骨格」チャネル（ＭＥＤ１＋ＴＦの場合はＭＥＤ１、ＧＣＮ４＋ＭＥＤ１５についてはＧＣＮ４）で実施し、面積及びアスペクト比を決定した。インビトロの液滴アッセイのための濃縮を計算するために、骨格チャネルによって液滴をＦＩＪＩの目的領域として定義し、その液滴内のクライアントの最大シグナルを決定した。ＭＥＤ１、メディエーター複合体、またはＧＣＮ４を骨格として選択した。これを、画像中のバックグラウンドクライアントシグナルで割ることで、Ｃイン／アウトを得た。濃縮スコアの計算は、実験条件のＣイン／アウトを、対照蛍光タンパク質（ＧＦＰまたはｍＣｈｅｒｒｙのいずれか）のＣイン／アウトで割ることによって計算した。
データ及びソフトウェアの入手
データセット
Figure 2024029228000010
Figure 2024029228000011
全体的な受け入れ番号：
ＧＳＥ１２０４７６
主要資源の表
Figure 2024029228000012
Figure 2024029228000013
Figure 2024029228000014
Figure 2024029228000015
表Ｓ４．抗体の表
Figure 2024029228000016
Figure 2024029228000017
表Ｓ５．コンストラクト。別段の指定がない限り、タンパク質の配列はすべて、ヒトのものである。
Figure 2024029228000018
Figure 2024029228000019
表Ｓ６ ＲＮＡ ＦＩＳＨプローブの配列
Figure 2024029228000020
Figure 2024029228000021
Figure 2024029228000022
実施例４
哺乳類ヘテロクロマチンは、特徴的なクロマチン修飾（ヒストンＨ３リジン９トリメチル化（Ｈ３Ｋ９ｍｅ３）及びＤＮＡメチル化）によって特徴付けられる２つの主要なエピジェネティック経路によって制御される。こうした修飾は、特異的に認識され、抑制活性を有するリーダータンパク質による結合を受ける。最も注目すべきは、ＨＰ１αがＨ３Ｋ９ｍｅ３修飾のリーダーである一方で、ＭｅＣＰ２がＤＮＡメチル化のリーダーであるということである。ＨＰ１α及びＭｅＣＰ２は、全体的な遺伝子制御に関与する一般的なクロマチン制御因子である。両タンパク質は、正常発生に必要不可欠なものであり、多くの組織に広く発現し、多数の相互作用パートナーを介してその作用を媒介する。
ヘテロクロマチンは、核における静的かつ隔絶された構造であると伝統的に見なされている。転写サイレンシングは、ヘテロクロマチンにおいてクロマチン凝縮が生じることで、内包ＤＮＡからタンパク質（ＲＮＡポリメラーゼなど）が排除され、それによって転写が抑制されるものであるという見方が一般的である。しかしながら、いくつかの知見からは、ヘテロクロマチンが、ある特定のタンパク質の急速交換を許容するより動的な集合体であることが示唆されている。例えば、ヘテロクロマチンタンパク質ＨＰ１αは、クロマチン修飾因子（Ｈ３Ｋ９メチルトランスフェラーゼ及びヒストン脱アセチル化酵素など）をクロマチンに動員するものであり、クロマチン結合形態と核質形態との間だけでなく、異なるヘテロクロマチンドメインの間でも急速に交換される。
液－液相分離（ＬＬＰＳ）は、分子の混合が解かれ、異なる濃度を有する別々の液相へと別れることによって特徴付けられる物理的現象である。高密度液相の形成は、弱い多価分子間相互作用（タンパク質の低複雑性ドメイン及び天然変性ドメインによって生じるものなど）によって誘導される。ＬＬＰＳは、凝縮体と呼ばれる無膜オルガネラの形成を誘導する細胞組織化の機構として浮上してきており、こうした凝縮体によって生体分子が無膜構造体にコンパートメント化され、そこに密集する。
本発明者らは、ＭｅＣＰ２が相分離ヘテロクロマチンコンパートメントに寄与するのではないかと疑った。さらに、重度の神経症候群は、ＭｅＣＰ２の機能が失われてもＭｅＣＰ２が過剰に発現しても引き起こされるものであり、凝縮体モデルは、何故レベルが低下しても上昇しても関連症候群が引き起こされ得るかを説明できる可能性を有するものである。本明細書において、本発明者らは、ＭｅＣＰ２が相分離によって動的な液状凝縮体を形成し、この特性がヘテロクロマチン機能に寄与することを示す。ＭｅＣＰ２は、ヘテロクロマチンにおいて動的な液体様特性を有する核内凝縮体を形成する。このタンパク質は、抑制因子を取り込む得る相分離液滴をインビトロで形成し得る。ＭｅＣＰ２のＣ末端天然変性ドメインは、インビトロでの凝縮体形成、インビボでのヘテロクロマチンとの結び付き、及びヘテロクロマチンの遺伝子抑制に必要不可欠なものである。こうした結果は、ＭｅＣＰ２が、ヘテロクロマチンに抑制因子をコンパートメント化し、そこに密集させるように機能することを示唆している。
結果
ＭｅＣＰ２及びＨＰ１αは、液体様ヘテロクロマチン凝縮体に存在する
本発明者らは、ヘテロクロマチンにおけるＭｅＣＰ２の動的挙動を調べることによって、哺乳類ヘテロクロマチンの動的な液状凝縮体特性にＭｅＣＰ２が寄与し得るかどうかを決定することを目指した。生細胞においてＭｅＣＰ２を内在レベルで試験するために、本発明者らは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を使用して、マウス胚性幹細胞（ｍＥＳＣ）のＭｅＣＰ２が高感度緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）単量体タグを有するように操作導入した。同じ細胞型においてＭｅＣＰ２及びＨＰ１αの動態を比較するために、本発明者らは、ｍＥＳＣのＨＰ１αがｍＣｈｅｒｒｙタグを有するように追加操作を行った。ＭｅＣＰ２－ＧＦＰを含む細胞及びＨＰ１α－ｍＣｈｅｒｒｙを含む細胞の両方を生細胞での蛍光顕微鏡法によって分析したところ、個別の核内構造体がＤＮＡ高密度ヘテロクロマチンフォーカスとオーバーラップすることが明らかとなった（図４３Ａ及び図４３Ｂ）。同じ核においてＭｅＣＰ２－ＧＦＰとＨＰ１α－ｍＣｈｅｒｒｙとのシグナル比較を行ったところ、これら両方のシグナルが、ｍＥＳＣにおいて同じヘテロクロマチン凝縮体に生じることが示された（図４３Ｃ）。生細胞画像の解析から、ＭｅＣＰ２凝縮体が核当たり１４．９±２．７個存在し、凝縮体当たりの体積は１．０４±１．４７μｍ３であることが示された（平均値±標準偏差）。こうした結果は、ＭｅＣＰ２及びＨＰ１αが、ｍＥＳＣにおいて正常レベルで発現する場合、それらがヘテロクロマチン凝縮体の共有コンポーネントであることを示している。
次に、本発明者らは、相分離によって形成される液状凝縮体に特有の特徴をＭｅＣＰ２凝縮体が示すかどうかを決定することを目指した。液－液相分離によって形成される凝縮体の主な特徴は、分子の内部再構成及び内外交換が動的に生じることであり（Ｈｙｍａｎ ｅｔ ａｌ．２０１４、Ｂａｎａｎｉ ｅｔ ａｌ．２０１７、Ｓｈｉｎ ＆ Ｂｒａｎｇｗｙｎｎｅ ２０１７）、こうしたことは、光退色後蛍光回復（ＦＲＡＰ）実験を使用して測定することができる。生細胞におけるＭｅＣＰ２凝縮体の動態を調べるために、本発明者らは、内在性にタグ付けされたＭｅＣＰ２－ＧＦＰを含むｍＥＳＣでのＦＲＡＰ実験を実施した。ＭｅＣＰ２－ＧＦＰ凝縮体では、光退色実施後に数秒の時間尺度で蛍光の回復が生じた（図４３Ｄ及び図４３Ｅ）。ＨＰ１α－ｍＣｈｅｒｒｙを含むｍＥＳＣのＦＲＡＰでも、同様の回復動力学が示された（図４３Ｆ及び図４３Ｇ）。定量的解析からは、ＭｅＣＰ２－ＧＦＰが回復に至るまでの時間の半分の時間は約１０秒であり、流動率は約８０％であることが示された（図４３Ｈ及び図４３Ｉ）。したがって、ＭｅＣＰ２及びＨＰ１αの両方が、ヘテロクロマチン凝縮体において動的な液体様特性を示す。
ＭｅＣＰ２は、インビトロで相分離液滴を形成する
ＭｅＣＰ２は、その構造化メチル結合ドメイン（ＭＢＤ）に隣接する２つの保存された天然変性領域（ＩＤＲ）を含む（図４４Ａ及び図５０Ａ）（Ｇｈｏｓｈ ｅｔ ａｌ．２０１０、Ｗａｋｅｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．１９９９、Ｎａｎ ｅｔ ａｌ．１９９３、Ａｄａｍｓ ｅｔ ａｌ．２００７）。凝縮体形成に関与するタンパク質は、ＩＤＲを含むことが多く、精製されると、インビトロで相分離液滴を形成し得る（Ｂｕｒｋｅ ｅｔ ａｌ．２０１５、Ｎｏｔｔ ｅｔ ａｌ．２０１５、Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．２０１５、Ｋａｔｏ ｅｔ ａｌ．２０１２；Ｓａｂａｒｉ ｅｔ ａｌ．２０１８）。ＭｅＣＰ２が相分離液滴を形成する能力を有するかどうかを決定するために、組換えＭｅＣＰ２－ＧＦＰ融合タンパク質を精製し、液滴形成アッセイにおいて試験した。クラウディング剤を含む緩衝液にタンパク質を添加することで、因子が核に高濃度で存在する状態を模倣したところ、ＭｅＣＰ２－ＧＦＰが濃縮された球状液滴（蛍光顕微鏡法を使用して検出した）の形成が誘導された（図４４Ｂ）。相分離液滴は、典型的には、系におけるコンポーネントの濃度に応じてサイズが増減する（Ｂｒａｎｇｗｙｎｎｅ ２０１３）。ＭｅＣＰ２－ＧＦＰは、１６０ｎＭ～１０μＭの濃度範囲で液滴を形成することが明らかとなり、タンパク質濃度の上昇に伴って液滴のサイズが増加した（図４４Ｂ～Ｄ及び図５０Ｂ）。液滴は、融合する能力を有しており、ＭｅＣＰ２－ＧＦＰで液滴融合が観測された（図４４Ｅ）。ＭｅＣＰ２－ＧＦＰ液滴のＦＲＡＰからは、ＭｅＣＰ２－ＧＦＰ液滴内で分子が動的に再構成されることを示す回復が生じることが示された（図４４Ｆ）。ＨＰ１α－ｍＣｈｅｒｒｙもまた、相分離液滴を形成することが明らかとなり（図５０Ｃ）、以前の報告（Ｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．２０１７、Ｌａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．２０１７）が追認された。こうした結果は、ＭｅＣＰ２が相分離を起こして液滴を形成できることを実証するものであり、このことから、本発明者らは、ＭｅＣＰ２及びＨＰ１αの両方が、インビトロで相分離を起こす能力を有するヘテロクロマチンコンポーネントであるという結論を下す。
相分離は、タンパク質ＩＤＲ内のアミノ酸残基の間の多価の弱い分子間相互作用によって誘導され得るものであり、荷電残基及び芳香族残基の両方が相分離に寄与することが示されている。ＭｅＣＰ２の２つの大きなＩＤＲのアミノ酸含量を調べたところ、荷電残基が顕著に豊富であるが、芳香族残基は少数にすぎないことが明らかとなった（図４４Ａ及び図５０Ａ）。静電的相互作用がＭｅＣＰ２相分離に寄与するのであれば、液滴形成アッセイにおいて塩濃度を上昇させることによって（イオン性相互作用が破壊されることになる）、ＭｅＣＰ２が液滴を形成する能力が低下するはずである。実際、塩濃度を上昇させることによってＭｅＣＰ２液滴が減少し（図４４Ｇ～図４４Ｉ）、このことは、ＭｅＣＰ２が相分離液滴を形成する能力に静電的相互作用が寄与することを示唆している。ＭｅＣＰ２－ＧＦＰがさまざまな塩濃度及びタンパク質濃度で液滴を形成する能力を調べることによって、ＭｅＣＰ２－ＧＦＰ液滴形成の相図を作成した（図４４Ｊ及び図５０Ｄ）。
凝縮体形成、ヘテロクロマチンとの結び付き、及び遺伝子抑制は、ＭｅＣＰ２のＣ末端ＩＤＲに依存する。
ＭｅＣＰ２が相分離液滴を形成する能力が、そのＩＤＲの一方または両方に依存するかどうかを決定するために、本発明者らは、Ｎ末端ＩＤＲを欠失させた組換えＭｅＣＰ２－ＧＦＰ変異体（ΔＩＤＲ－１）またはＣ末端ＩＤＲを欠失させた組換えＭｅＣＰ２－ＧＦＰ変異体（ΔＩＤＲ－２）を精製し（図４５Ａ）、それらがインビトロで液滴を形成する能力を調べた。液滴アッセイを行ったところ、Ｎ末端ＩＤＲを有さない変異体（ΔＩＤＲ－１）は、液滴形成能力を依然として有していたが、Ｃ末端ＩＤＲを有さない変異体（ΔＩＤＲ－２）は、この能力を失っていることが明らかとなった（図４５Ｂ）。こうした結果は、ＭｅＣＰ２がインビトロで相分離液滴を形成する能力が、そのＣ末端ＩＤＲに依存することを示している。
次に、本発明者らは、Ｎ末端ＩＤＲを有さないＭｅＣＰ２－ＧＦＰ変異体（ΔＩＤＲ－１）またはＣ末端ＩＤＲを有さないＭｅＣＰ２－ＧＦＰ変異体（ΔＩＤＲ－２）が細胞においてヘテロクロマチンと結び付く能力を、こうしたタンパク質を内在性のＭｅｃｐ２遺伝子座から発現するように操作したｍＥＳＣを使用することによって調べた。生細胞での蛍光顕微鏡法で分析したところ、ΔＩＤＲ－１ ＭｅＣＰ２が、ヘテロクロマチンに局在化し、そこに全長ＭｅＣＰ２と同様に濃縮されることが明らかとなった（図４５Ｃ及び図４５Ｄ）。対照的に、ΔＩＤＲ－２ ＭｅＣＰ２では、ヘテロクロマチンにおける局在化及び濃縮が減少した（図４５Ｃ及び図４５Ｄ）。こうした結果は、インビトロでの凝縮体形成と、インビボでのヘテロクロマチンとの結び付きと、の両方が、ＭｅＣＰ２のＣ末端ＩＤＲに依存することを示している。
ＭｅＣＰ２が、ヘテロクロマチン凝縮体に局在及び密集することによって遺伝子抑制を促進するように機能するのであれば、ＩＤＲ－２が失われると、反復エレメントサイレンシングに影響が及ぶであろうと本発明者らは想定した。実際、ΔＩＤＲ－２ ＭｅＣＰ２細胞では、メジャーサテライト反復配列の発現が、全長ＭｅＣＰ２細胞と比較して有意に増加した（図４５Ｅ）。まとめると、こうした結果は、凝縮体形成、ヘテロクロマチン局在化、及び遺伝子サイレンシングが、ＭｅＣＰ２のＣ末端ＩＤＲに相互依存することを示唆している。
ＭｅＣＰ２凝縮体は、ヘテロクロマチン因子をコンパートメント化し得る
凝縮体は、凝縮液相内に因子をコンパートメント化し、そこに密集させるように機能すると考えられる。本発明者らは、核抽出物を用いる液滴形成アッセイを使用することで、ヘテロクロマチンと結び付くことが知られるさまざまな因子をＭｅＣＰ２が液滴にコンパートメントし得るかどうかを調べた（図４６Ａ）。核抽出物を使用した理由は、こうしたものが、核のコンポーネントをすべて含み、人工的なクラウディング剤を添加せずとも凝縮体形成が生じ得ることよるものである。核抽出物は、ＭｅＣＰ２－ｍＣｈｅｒｒｙまたはＭｅＣＰ２－ΔＩＤＲ－２－ｍＣｈｅｒｒｙのいずれかを発現するＨＥＫ２９３細胞から高塩濃度下で調製し、核抽出物の塩濃度を低下させることによって液滴形成を誘導した。本発明者らは、ＭｅＣＰ２－ｍＣｈｅｒｒｙを発現する細胞に由来する核抽出物では液滴が形成されるが、ＭｅＣＰ２－ΔＩＤＲ－２－ｍＣｈｅｒｒｙを発現する細胞に由来する核抽出物では液滴が形成されないことを見出した（図４６Ｂ）。凝縮体にはタンパク質コンポーネントが密集しており、それ故に、こうした凝縮体は、周囲の相と比較して密度が高いため、核抽出物を遠心分離して高密度材料をスピンダウンし、この材料をウエスタンブロットによって分析した。この結果から、ＨＰ１α、ＴＢＬ１Ｒ（トランスデューシンベータ様タンパク質）、ＨＤＡＣ３（ヒストン脱アセチル化酵素３）、及びＳＭＲＴ（レチノイン酸受容体及び甲状腺受容体のサイレンシングメディエーター）を含めて、ヘテロクロマチンと結び付くことが知られる抑制因子が、ＭｅＣＰ２－ｍＣｈｅｒｒｙ抽出物には濃縮されるが、ＭｅＣＰ２－ΔＩＤＲ－２－ｍＣｈｅｒｒｙ抽出物には濃縮されないことが明らかとなった（図４６Ｃ及び図４６Ｄ）。対照的に、ユークロマチンのコンポーネント（ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ＲＰＢ１）など）は濃縮されなかった（図４６Ｃ及び図４６Ｄ）。こうした結果は、ヘテロクロマチンと結び付く抑制因子をコンパートメント化し、密集させ得る液滴をＭｅＣＰ２が核抽出物において形成し得ることを示している。
ＭｅＣＰ２ ＩＤＲ－２は、ヘテロクロマチン凝縮体へと分配され得る
凝縮体を形成するタンパク質のＩＤＲは、タンパク質を特定の凝縮体に到達させることが提唱されているが、そのような到達先決定機能に対する直接的な証拠はほとんど存在しない（Ｂａｎａｎｉ ｅｔ ａｌ．２０１７）。それ故に、本発明者らは、細胞においてｍＣｈｅｒｒｙタンパク質がヘテロクロマチンに到達する上でＭｅＣＰ２ ＩＤＲ－２が十分なものであるかどうかを試験した（図４７Ａ）。ｍＣｈｅｒｒｙと融合したＭｅＣＰ２ ＩＤＲ－２（ｍＣｈｅｒｒｙ－ＭｅＣＰ２－ＩＤＲ－２）、及び対照ｍＣｈｅｒｒｙをｍＥＳＣにおいて異所性に発現させ、それらの局在化を顕微鏡法によって調べた。ｍＣｈｅｒｒｙ－ＭｅＣＰ２－ＩＤＲ－２は、ＤＮＡ高密度ヘテロクロマチン及び核小体（相分離によって形成される別の核内構造体）に優先的に局在化した（図４７Ｂ～図４７Ｄ）。対照的に、単独のｍＣｈｅｒｒｙは、ヘテロクロマチンまたは核小体に濃縮されなかった（図４７Ｂ～図４７Ｃ）。こうした結果は、ＭｅＣＰ２－ＩＤＲ－２が細胞において特異的な分配挙動をある程度示すことを示唆しており、このことは、優先的な分配が生じることが一因となって特定の凝縮体に因子が適切に到達し得るという考えと一致する。
ＭｅＣＰ２は、マウスの脳のニューロンのヘテロクロマチンに密集する
ＭｅＣＰ２は集中的に研究されており、この理由は、ＭＥＣＰ２に機能喪失変異が生じるとレット症候群が引き起こされ、遺伝子重複が生じるとＭＥＣＰ２重複症候群が引き起こされることによるものであり、こうした症候群は両方共、重度の知的障害によって特徴付けられる神経障害を伴う。ＭｅＣＰ２は、すべての動物組織に発現するが、ニューロンでは特に高いレベルで発現する（Ｓｋｅｎｅ ｅｔ ａｌ．２０１０）。こうした理由から、本発明者らは、ＭｅＣＰ２が、マウスの脳のニューロンにおいても液体様凝縮体に密集するかどうかを決定することを目指した。レット症候群のマウスモデルでは、ヒト症候群において観測される表現型が忠実に再現される。ＭＥＣＰ２－ＧＦＰコンストラクト及びＭＥＤ１－ＧＦＰコンストラクトをレポーターＥＳ細胞の内在性遺伝子座に組み込むことで、高度キメラマウスを生成させた。２ヶ月齢の時点で、ホルマリン灌流による固定化を行った後、マウスの脳の１０μｍ切片を作成した。蛍光顕微鏡法によって分析したところ、Ｍａｐ２発現ニューロン及びＰＵ．１発現ミクログリアにおいてＤＮＡ高密度ヘテロクロマチンフォーカスの位置にＭｅＣＰ２が個別の核内構造体を形成することが明らかとなった（図４８Ａ～図４８Ｃ）。新たに調製した生存脳組織切片を用いたＦＲＡＰ実験からは、こうしたヘテロクロマチン凝縮体においてＭｅＣＰ２－ＧＦＰが高度に動的であることが示された（図４８Ｄ及び図４８Ｅ）。予測通り、ＭＥＤ１－ＧＦＰ小斑点は、サイズが小さくかつ数が多く、ヘテロクロマチンと結び付いていなかった（図４８Ｆ）。こうした結果は、生存マウスニューロンのヘテロクロマチンにＭｅＣＰ２が密集することを示すと共に、こうした組織におけるヘテロクロマチンが動的凝縮体として挙動することを示唆している。
考察
本明細書において、本発明者らは、ＥＳ細胞においても、脳組織のニューロンにおいても、ＭｅＣＰ２が、動的なヘテロクロマチン凝縮体のコンポーネントであることを示す。ＭｅＣＰ２のＣ末端ＩＤＲは、それがインビトロで凝縮体を形成する特性、及びそれがインビトロで抑制因子をコンパートメント化する能力、ならびにインビボでのヘテロクロマチンとの結び付き及び遺伝子サイレンシングに必要不可欠なものである。このＭｅＣＰ２ ＩＤＲは、ＭｅＣＰ２タンパク質の残りの部分から独立させて発現させると、このドメインが細胞のヘテロクロマチン凝縮体に到達し、それに取り込まれる上で十分なものである。したがって、本発明者らの結果は、ＭｅＣＰ２が複数の細胞型において動的なヘテロクロマチン凝縮体のコンポーネントであることを示すと共に、ＭｅＣＰ２とヘテロクロマチンとの相互作用が、それがメチルＤＮＡと結合する特性と、それが凝縮体と結び付く特性と、の両方によって媒介され得ることを示唆している。
ＭｅＣＰ２及びＨＰ１αの両方がヘテロクロマチン凝縮体のコンポーネントであるという知見は、これら２つのタンパク質が正常発生に必要不可欠なものであり、多くの組織において広く発現し、遺伝子抑制に関与するという以前の証拠と一致する（Ａｌｌｓｈｉｒｅ ＆ Ｍａｄｈａｎｉ ２０１８、Ｉｐ ｅｔ ａｌ．２０１８、Ａｕｓｉｏ ｅｔ ａｌ．２０１４、Ｌｙｓｔ ＆ Ｂｉｒｄ ２０１５、Ｇｕｙ ｅｔ ａｌ．２０１１）。ＤＮＡメチル化、Ｈ３Ｋ９メチル化、ならびに結合タンパク質であるＭｅＣＰ２及びＨｐ１αの間でクロストークが生じることが以前の研究によって報告されている。例えば、動原体周囲のサテライト反復配列のヘテロクロマチン形成、及び胚着床後のＰＯＵ５Ｆ１遺伝子サイレンシングでは、ヒストンメチルトランスフェラーゼＧ９ａが、ヒストンＨ３Ｋ９をトリメチル化し（これによってＨＰ１αの結合が可能になる）、ＤＮＭＴ３（ＤＮＡをメチル化する）を結合させることで、ＭｅＣＰ２の結合を生じさせる。ＭｅＣＰ２及びＨＰ１αの両方が、遺伝子サイレンシングに関与する追加パートナー（ヒストン脱アセチル化酵素など）を動員し得る。本発明者らの結果は、ＨＰ１αについて以前に報告されたものと合わせると、ＭｅＣＰ２及びＨＰ１αの両方が、こうした抑制因子をコンパートメント化し、密集させることで、ヘテロクロマチンコンパートメントの静的状態を維持することを示唆している。
ヘテロクロマチンタンパク質の相分離が、抑制因子を密集させ、コンパートメント化するように機能し得るという知見からは、こうしたタンパク質に起因する多様な相互作用を説明する単純化モデルが得られる。ヘテロクロマチンは、数百のタンパク質因子と結び付く。ＭｅＣＰ２及びＨＰ１αの両方が、多数の多様な相互作用パートナーと相互作用することが観測されている。こうした相互作用パートナーが、どのようにヘテロクロマチン構造体と物理的に相互作用し、それと安定的に結び付くのかということは、タンパク質間相互作用の古典的な鍵と鍵穴モデルの下ではうまく説明することが困難である。こうした知見を説明する上では、相互作用の動的網目構造内に抑制因子を密集させ、そこにコンパートメント化する相分離ヘテロクロマチン凝縮体を形成する能力をＭｅＣＰ２及びＨＰ１αが有するとした方が適切である。注目すべきことに、ヘテロクロマチン凝縮体が、抑制コンポーネントを特異的に密集させ、活性転写装置は密集させない能力を有することは、異なる凝縮体の相分離特性を介して活性因子及び抑制因子がこうした凝縮体に特異的にコンパートメント化される機構が存在することを示唆している。
このモデルを用いれば、何故、ＤＮＡ結合ドメインまたはＣ末端ＩＤＲのいずれにＭｅＣＰ２変異（ほとんどの変異が、ＩＤＲの消失または短縮に繋がる）が生じてもレット症候群が引き起こされ得るのかが説明されることになる（図４８Ａ）。
いくつかの疾患では、ヘテロクロマチンタンパク質をコードする遺伝子を破壊する変異が生じている。こうした変異がヘテロクロマチン相分離を破壊することによって疾患表現型を生じさせ得るかどうかを推測することは興味深いことである。注目すべきことに、ＭＥＣＰ２にミスセンス変異及びナンセンス変異が生じるとレット症候群が引き起こされる。レット症候群は、若年女性の１０、０００人に１人が発症する神経発達障害である（Ａｍｉｒ ｅｔ ａｌ．１９９９）。こうした変異は、多くの場合、ＭｅＣＰ２のＩＤＲに影響を与え、ＭｅＣＰ２がヘテロクロマチンにおいて相分離を起こす能力、またはＭｅＣＰ２がヘテロクロマチン凝縮体内に主要因子をコンパートメント化する能力を乱し得る。さらに、ＭＥＣＰ２遺伝子量が病原性に増加すると、ＭＥＣＰ２重複症候群（若年男性における関連神経発達障害）が引き起こされる（Ｖａｎ Ｅｓｃｈ ｅｔ ａｌ．２００５）。相分離系は、コンポーネント因子の軽微な濃度変化に感受性であり得、このことは、遺伝子量が異常に増減すれば、凝縮体挙動に相当な影響が及ぶことになることを示唆している。ヘテロクロマチン相分離に対する疾患変異の意義を理解することは、分子病態を理解し、こうした疾患を治療する新たな治療機会を得る上で重要なことであり得る。
方法
細胞培養条件
細胞培養
Ｖ６．５マウス胚性幹細胞（ＥＳＣ）は、０．２％のゼラチン（Ｓｉｇｍａ Ｇ１８９０）でコートされた組織培養処理プレート上で２ｉ／ＬＩＦ培地において培養した。５％のＣＯ２雰囲気の加湿インキュベーターにおいてＥＳＣを３７℃で増殖させた。ＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｇｉｂｃｏ １２６０４）を使用して解離させることによって細胞を２～３日ごとに継代培養した。解離反応の反応停止は、血清／ＬＩＦ培地を使用して行った。ＭｙｃｏＡｌｅｒｔ Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｌｏｎｚａ ＬＴ０７－２１８）を使用して細胞のマイコプラズマ試験を定期的に行い、陰性であることを確認した。
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、ＡＴＣＣから入手し、高濃度グルコース、１０％のウシ胎仔血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ、キャラクタライズドＳＨ３００７１０３）、２ｍＭのＬ－グルタミン、及び１００Ｕ／ｍＬのペニシリン－ストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ １５１４０）を含むＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ）において培養した。
培地組成
２ｉ／ＬＩＦ培地の組成は、以下の通りである：０．５×Ｎ２サプリメント（Ｇｉｂｃｏ １７５０２）、０．５×Ｂ２７サプリメント（Ｇｉｂｃｏ １７５０４）、２ｍＭのＬ－グルタミン（Ｇｉｂｃｏ ２５０３０）、１×ＭＥＭ非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ １１１４０）、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン－ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ １５１４０）、０．１ｍＭの２－メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ Ｍ７５２２）、３μＭのＣＨＩＲ９９０２１（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ ０４－０００４）、１μＭのＰＤ０３２５９０１（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ ０４－０００６）、及び１０００Ｕ／ｍＬの白血病抑制因子（ＬＩＦ）（ＥＳＧＲＯ ＥＳＧ１１０７）が添加されたＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ １１３２０）。
血清／ＬＩＦ培地の組成は、以下の通りである：１５％のウシ胎仔血清（Ｓｉｇｍａ Ｆ４１３５）、２ｍＭのＬ－グルタミン（Ｇｉｂｃｏ ２５０３０）、１×ＭＥＭ非必須アミノ酸、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン－ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ １５１４０）、０．１ｍＭの２－メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ Ｍ７５２２）、及び１０００Ｕ／ｍＬの白血病抑制因子（ＬＩＦ）（ＥＳＧＲＯ ＥＳＧ１１０７）が添加されたＫｎｏｃｋＯｕｔ ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ １０８２９）。
ゲノム編集
遺伝子改変ＥＳＣ株の生成にはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を使用した。ｓｇＲＮＡ骨格、コドン最適化バージョンのＣａｓ９、及びｍＣｈｅｒｒｙまたはＢＦＰを含むプラスミド（Ｒ．Ｊａｅｎｉｓｃｈからの供与物）に標的特異的配列をクローニングした。内在性にタグ付けされたＭｅＣＰ２－ｍＥＧＦＰ株及びＨＰ１ａ－ｍＣｈｅｒｒｙ株の生成には、ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＮＥＢ Ｅ２６２１Ｓ）を使用して相同組換え修復鋳型をｐＵＣ１９にクローニングした。この相同組換え修復鋳型は、ＰＣＲを使用してゲノムＤＮＡから増幅した８００ｂｐのホモロジーアームが両側に隣接するｍＥＧＦＰ ｃＤＮＡ配列またはｍＣｈｅｒｒｙ ｃＤＮＡ配列からなるものを使用した。
細胞株の生成には、８３３ｎｇのＣａｓ９プラスミド及び１６６６ｎｇの非直鎖化相同組換え修復鋳型を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌ３０００）を使用して７５０，０００個の細胞にトランスフェクトした。トランスフェクトから４８時間後に、Ｃａｓ９プラスミド上にコードされるｍＣｈｅｒｒｙ蛍光タンパク質またはＢＦＰ蛍光タンパク質が存在する細胞を選別してトランスフェクト細胞を濃縮した。この集団を１週間増殖させてから、ＧＦＰまたはｍＣｈｅｒｒｙの存在を対象とする選別を再度行った。４０，０００個のＧＦＰ陽性細胞を段階希釈して６ウェルプレートに蒔き、１週間増殖させてから個々のコロニーを手動でピッキングして９６ウェルプレートに移した。標的化が成功したかについて、ＰＣＲによる遺伝子型判定を行って２４個のコロニーをスクリーニングすることで挿入を確認した。
生細胞画像化
生細胞画像化条件
３５ｍｍのガラスプレート（Ｍａｔｔｅｋ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ Ｐ３５Ｇ－１．５－２０－Ｃ）上で細胞を増殖させ、Ａｉｒｙｓｃａｎ検出器を備えたＬＳＭ８８０共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ，Ｔｈｏｒｎｗｏｏｄ，ＮＹ）を使用して２ｉ／ＬＩＦ培地において画像化した。細胞の画像化は、３７℃の加湿空気が供給される３７℃加温ステージ上で行った。さらに、顕微鏡は、３７℃に加温されたインキュベートチャンバー内に入れた。画像の取得には、ＺＥＮブラックエディションバージョン２．３（Ｚｅｉｓｓ，Ｔｈｏｒｎｗｏｏｄ ＮＹ）を使用した。画像の取得は、Ｐｌａｎ－Ａｐｏｃｈｒｏｍａｔ ６３ｘ／１．４油浸対物レンズと共にＡｉｒｙｓｃａｎ検出器を高分解能（ＳＲ）モードで使用して行った。生のＡｉｒｙｓｃａｎ画像の処理は、ＺＥＮ２．３（Ｚｅｉｓｓ，Ｔｈｏｒｎｗｏｏｄ ＮＹ）を使用して行った。
光退色後蛍光回復（ＦＲＡＰ）
ＦＲＡＰは、４８８ｎｍ及び５６１ｎｍのレーザーを用いてＬＳＭ８８０ Ａｉｒｙｓｃａｎ顕微鏡で実施した。退色は、１００％のレーザー出力で実施し、２秒ごとに画像を収集した。各画像は、ＬＳＭ８８０ Ａｉｒｙｓｃａｎの平均化機能を利用したものであり、２枚の画像が平均化された結果である。次に、この統合画像を、ＺＥＮ２．３を使用して処理した。
光退色からの回復は、最初にバックグラウンド値を差し引き、次に、光退色を説明するために、退色凝縮体内の蛍光強度の減少を、別の近隣細胞における凝縮体内のシグナルに正規化して定量化することによって計算した。カスタム解析を行って正規化を実施することによる画像中の強度値の計算には、ＭＡＴＬＡＢ（登録商標）スクリプトＦＲＡＰＰＡ Ｐｒｏｆｉｌｅｒを使用した。
ＭｅＣＰ２凝縮体体積の計算
ｚ軸スタック画像の取得は、ＺＥＮ２．３ソフトウェアを使用して行った。焦点調節手順を簡略化するために、ＳｉＲ－ＤＮＡ色素（Ｓｐｉｒｏｃｈｒｏｍｅ ＳＣ００７）を用いて細胞を処理してＤＮＡを染色した。核の上側ｚ軸境界及び下側ｚ軸境界の決定には、Ｆａｒ－ｒｅｄ（ＳｉＲ－ＤＮＡ）シグナルを使用した。次に、４８８チャネルまたは５６１チャネルのいずれかと６４３チャネルとの両方において核質を上方向に通過させて０．１９ミクロン刻みで画像を取得した。画像は、ＺＥＮ２．３ソフトウェアを使用して処理した１枚のＡｉｒｙｓｃａｎ画像の結果である。
ＭｅＣＰ２凝縮体の体積を定量化するために、ＳｉＲ－ＤＮＡを使用して所与の細胞の核境界を定義した。この境界を使用して、４８８画像または５６１画像における非核シグナルをマスクした。非核シグナルをマスクした時点で、４８８画像及び５６１画像を７．０ピクセルのメジアンフィルターに供し、閾値を１５４としてＦＩＪＩ ３Ｄ Ｏｂｊｅｃｔ ｃｏｕｎｔｅｒを使用して物体の計数及び定量化を行った。
分配係数の計算
生細胞画像化における分配係数は、Ｆｉｊｉを使用して計算した。細胞当たり単一の焦点面を使用して、凝縮体内の平均シグナル強度を定量化し、核の境界内の８～１２ヶ所の非ヘテロクロマチン領域に由来する平均シグナル強度と比較した。ヘテロクロマチン領域の限界及び核の境界は、Ｈｏｅｃｈｓｔチャネルにおいて定義した。選択した面におけるヘテロクロマチンフォーカスの数が＞３である細胞を分配係数の計算に使用した。この個々の係数が、実験における１つのｎに相当する。
タンパク質精製
タンパク質発現ベクターのクローニング
ヒトｃＤＮＡを改変バージョンのＴ７ ｐＥＴ発現ベクターにクローニングした。このベースベクターは、Ｎ末端の６×Ｈｉｓをコードする配列、その下流にｍＥＧＦＰまたはｍＣｈｅｒｒｙのいずれかをコードする配列、及び「ＧＡＰＧＳＡＧＳＡＡＧＧＳＧ」（配列番号１４）という１４個のアミノ酸のリンカー配列をコードする配列を含むように操作した。ｃＤＮＡ配列は、ＰＣＲによって生成させ、ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＮＥＢ Ｅ２６２１Ｓ）使用してリンカー配列の下流に位置するようにフレーム内に挿入した。ｍＥＧＦＰを単独で発現するベクターは、リンカー配列の下流に終始コドンを含む。変異ｃＤＮＡ配列は、ＰＣＲによって生成させ、上記のものと同じベースベクターに挿入した。発現コンストラクトはすべて、シークエンシングして配列が変化していないことを確認した。
タンパク質精製
タンパク質発現については、プラスミドを用いた形質転換をＬＯＢＳＴＲ細胞に対して行い、下記のように増殖させた。カナマイシン及びクロラムフェニコールを含むＬＢ培地に新鮮な細菌コロニーを播種し、３７℃で一晩増殖させた。カナマイシン及びクロラムフェニコールを新たに添加した５００ｍＬの予熱ＬＢで細胞を１：３０希釈し、３７℃で１．５時間増殖させた。発現を誘導するために、ＩＰＴＧを細菌培地に添加して最終濃度を１ｍＭとし、増殖を４時間継続した。次に、誘導をかけた細菌を遠心分離によってペレット化し、使用するまでの間、細菌ペレットを－８０℃で保管した。
５００ｍｌの細胞のペレットを１５ｍｌの溶解緩衝液（５０ｍＭのトリス－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５００ｍＭのＮａＣｌ、及び１×ｃＯｍｐｌｅｔｅプロテアーゼ阻害剤）に再浮遊させた後、超音波処理（１５秒間オン、６０秒間オフのサイクルを１０回実施）に供した。１２，０００×ｇ、４℃で３０分間遠心分離することによって可溶化液を清澄化し、事前に平衡化した１ｍＬのＮｉ－ＮＴＡアガロースに添加し、４℃で１．５時間旋回振とうした。スラリーを３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、１０倍体積の溶解緩衝液で洗浄し、５０ｍＭのイミダゾールを含む溶解緩衝液、１００ｍＭのイミダゾールを含む溶解緩衝液、または２５０ｍＭのイミダゾールを含む溶解緩衝液（３回）と共に１０分間以上旋回振とうしながらインキュベートすることによってタンパク質を溶出させた後、遠心分離及びゲルでの分析を行った。５０ｍＭのトリス－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１２５ｍＭのＮａＣｌ、１０％のグリセロール、及び１ｍＭのＤＴＴを含む緩衝液（この緩衝液による外液交換を２回実施）に対して、正しいサイズのタンパク質を含む画分を４℃で透析した。精製タンパク質のタンパク質濃度は、Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ２３２２５）を使用して決定した。
インビトロの液滴アッセイ
インビトロの液滴アッセイ
タンパク質は、１０％のグリセロール、５０ｍＭのトリス－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＤＴＴにおいて保管した。Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ ｆｉｌｔｅｒ（３０Ｋ ＭＷＣＯまたは５０Ｋ ＭＷＣＯ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用してタンパク質を所望の濃度に濃縮した。具体的な液滴アッセイの反応条件は、本明細書を通じて個々の反応ごとに示される。液滴アッセイは、８チューブＰＣＲストリップにおいて実施した。１０％のＰＥＧ－８０００、１０％のグリセロール、５０ｍＭのトリス－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭのＤＴＴ、及び塩濃度が異なる（０ｍＭ～５００ｍＭの範囲）のＮａＣｌから構成される液滴形成緩衝液において組換えタンパク質相分離を誘導した。次に、所望量のタンパク質を添加して相転移を誘導し、ピぺッティングによって溶液を混合した。次に、顕微鏡スライドガラス上にマウントした２つの並行な両面テープ片上にガラスのカバースリップをマウントして作成したカスタムスライドチャンバー、またはガラス底の３８４ウェルプレートのいずれかに上記の反応液をロードした。次に、１００×対物レンズを備えたＡｎｄｏｒ共焦点顕微鏡で反応液を画像化した。示される画像は、別段の記載がない限り、ガラスのカバースリップまたはガラス底の３８４ウェルプレートの上で安定した状態の液滴のものである。
データ解析
インビトロでの相分離画像化実験を解析するために、カスタムＭＡＴＬＡＢ（登録商標）スクリプトを記述して液滴を同定し、そのサイズ、アスペクト比、凝縮部分割合、及び分配係数を特徴付けた。いずれの具体的な実験条件についても、ヒストグラムのピークに基づく強度閾値、及びサイズ閾値（半径２ピクセル）を用いて画像をセグメント化し、こうすることで、目的領域を定義し、液滴の内外においてシグナル強度を定量化することが可能であった。
核抽出物における液滴アッセイ
核抽出物の調製
核抽出物は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞から調製した。激しくピぺッティングして培養プレートから細胞を回収した後、１，０００×ｇで細胞をペレット化した。このペレットを、プロテアーゼ阻害剤を新たに添加したＴＭＳＤ５０緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、２５０ｍＭのスクロース、１ｍＭのＤＴＴ、５０ｍＭのＮａＣｌ）に再浮遊させた。ＴＭＳＤ５０緩衝液において細胞を４℃で３０分間攪拌して核を抽出した。次に、３，５００×ｇで１０分間、溶液のスピンダウンを行った。核をＭｎａｓｅ緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、５ｍＭのＣａＣｌ２、プロテアーゼ阻害剤）で洗浄し、３，５００×ｇで再びスピンダウンした。次に、ペレットと同体積のＭｎａｓｅ緩衝液に核を再浮遊させ、１ＵのＭｎａｓｅを用いて３７℃で１５分間処理した。ペレットと同体積の停止緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、５００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、２０％のグリセロール、１５ｍＭのＥＧＴＡ、プロテアーゼ阻害剤）を用いて反応を停止させた。次に、消化した核を、チップ付き超音波処理器での超音波処理（振幅値を２０）に２０回供し、２，７００×ｇで２回スピンダウンしてデブリを除去した。
核抽出物での液滴形成
核抽出物を用いる液滴形成アッセイは、貯蔵核抽出物を緩衝液Ｂ（１０％のグリセロール、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ）で１：２希釈して総ＮａＣｌ塩濃度を１５０ｍＭに下げることによって実施した。アッセイは、８ウェルＰＣＲストリップにおいて実施し、反応液を１５分間インキュベートしてからガラス底の３８４ウェルプレートにロードした。液滴がプレートのガラス底で安定した状態となるまで１５分間保持してからＡｎｄｏｒ共焦点顕微鏡（１５０×）で画像化した。
核抽出物のペレット化
１．５ｍＬのＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブにおいて上記のように液滴を形成させ、１０分間インキュベートした。この時点で、反応液を２，７００×ｇで１０分間遠心分離した。上清をすべて除去した。次に、１ｍＬの液滴形成緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５％のグリセロール、１５０ｍＭのＮａＣｌ、６．６ｍＭのＭｇＣｌ２、５ｍＭのＥＧＴＡ、１．７ｍＭのＣａＣｌ２）を用いてチューブを穏やかに洗浄した。洗浄溶液を除去した後、βＭＥを２５％、ＸＴ緩衝液（Ｂｉｏ－ｒａｄ）を２５％、水を５０％含む溶液をチューブに添加してウエスタンブロットのためのペレット画分を調製した。液滴形成に使用した材料のうちの１０％にも、βＭＥ、ＸＴ緩衝液、及び水を混合してウエスタンブロット用とした。
ウエスタンブロット分析
１０％のビス－トリスゲル（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）において上記のタンパク質溶液を８０Ｖで１５分間泳動させてから、１５０Ｖで約１．５時間泳動させた。次に、転写緩衝液（２５ｍＭのトリス、１９２ｍＭのグリシン、１０％のメタノール）において孔径０．４５μｍのＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＩＰＶＨ０００１０）へとタンパク質を２６０ｍＡ、４℃で２時間転写した。次に、５％の無脂肪乳を含むＴＢＳＴにおいて膜を室温で１時間ブロッキングした。次に、５％の乳を含むＴＢＳＴにおいて、記載のタンパク質に対する抗体と共に膜を振とうしながら４℃で一晩インキュベートした。次に、ＴＢＳＴで膜を３回洗浄（各１０分間）し、二次抗体と共に室温で１時間インキュベートし、ＴＢＳＴでさらに３回洗浄し、ＥＣＬ基質またはｆｅｍｐｔｏ－ＥＣＬ基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してＢｉｏ－Ｒａｄ ｃｈｅｍｉｄｏｃで画像化した。
ｑＰＣＲ分析
ＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して収集した。次に、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して逆転写酵素反応を実施した。ｑＰＣＲは、下記のＴａｑＭａｎプローブを使用して実施した：
ｍＬ１－Ｏｒｆ２ａ＿１ｆ－ ｃｃｔｃｃａｔｔｇｔｔｇｇｔｇｇｇａｔｔ（配列番号２２１）、ｍＬ１－Ｏｒｆ２ａ＿２ｒ－ ｇｇａａｃｃｇｃｃａｇａｃｔｇａｔｔｔｃ（配列番号２２２）、ｍＧａｐｄｈ＿１ｆ－ ｃｃａｔｇｔａｇｔｔｇａｇｇｔｃａａｔｇａａｇｇ（配列番号２２３）、ｍＧａｐｄｈ＿２ｒ－ ｔｇｇｔｇａａｇｇｔｃｇｇｔｇｔｇａａ（配列番号２２４）。
免疫蛍光法
ポリ－Ｌ－オルニチン及びラミニンでコートされたガラスのカバースリップ上にマウスＥＳＣを蒔いた。２４時間後、４％のパラホルムアルデヒドを含むＰＢＳを用いて細胞を固定化した。次に、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、０．５％のＴｒｉｔｏｎ－Ｘ１００を含むＰＢＳを用いて細胞の透過処理を行った。次に、細胞をＰＢＳで３回洗浄した。４％のＩｇＧ非含有ＢＳＡを含むＰＢＳにおいて細胞を１時間ブロッキングした後、加湿チャンバー内で、４％のＩｇＧ非含有ＢＳＡ溶液において記載の抗体を用いて室温で一晩染色した。次に、細胞をＰＢＳで３回洗浄した。細胞を含む４％のＩｇＧ非含有ＢＳＡ溶液に二次抗体を添加し、室温で１時間インキュベートした。次に、細胞をＰＢＳで２回洗浄した。Ｈｏｅｃｓｈｔ色素を含むｍｉｌｌｉＱ水を用いて細胞を５分間染色した後、Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄマウント媒体にマウントした。ＲＰＩスピニングディスク型共焦点顕微鏡（拡大率１００×）で画像化を実施した。
ＩＤＲ発現ベクターのトランスフェクト
細胞へのトランスフェクトは、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して行った。マウスＥＳＣの個数を数えて７５０，０００個とし、この７５０，０００個のマウスＥＳＣを、ゼラチンでコートされた６ウェルディッシュに蒔いた。蒔き終えてからすぐに、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００キットの説明に従って調製したＤＮＡ混合液を細胞に添加した。２４時間後、細胞をトリプシンで処理し、ポリ－Ｌ－オルニチン及びラミニンでコートされた３５ｍｍガラス底ディッシュ（Ｍａｔｅｋ）に分割して蒔き、画像化用とした。
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実施例５
各細胞の独自性を規定する遺伝子発現プログラムは、マスター転写因子（ＴＦ）（細胞型特異的エンハンサーを確立する）及びシグナル伝達因子（そのようなエンハンサーに細胞外刺激を伝える）によって制御される。シグナル伝達因子は、多様な細胞型において発現しており、ＤＮＡ結合配列特異性をほとんど有さないにもかかわらず、細胞型特異的エンハンサーに動員されるが、この動員機構については、ほとんど理解されていない。最近の研究からは、エンハンサーにおいてマスターＴＦがコアクチベーターと共に相分離凝縮体を形成することが明らかとなっている。本明細書において、本発明者らは、ＷＮＴ経路、ＴＧＦ－β経路、及びＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路のシグナル伝達因子が、その天然変性領域（ＩＤＲ）を利用してスーパーエンハンサー誘導性遺伝子におけるメディエーター凝縮体に移行し、そこに密集するという証拠を提示する。本発明者らは、シグナル伝達に対する応答の細胞型特異性の一部が、シグナル伝達因子のＩＤＲによって媒介され、こうしたＩＤＲは、こうした因子を、細胞独自性において顕著な役割を有する遺伝子においてマスターＴＦ及びメディエーターによって確立される凝縮体へと分配させることを提唱する。
シグナル伝達因子が、所与の細胞型の活性エンハンサー及びスーパーエンハンサーに優先的に結合する能力を説明するものとして、いくつかの機構が報告されている。シグナル伝達因子は、哺乳類ゲノムに高頻度で存在する比較的短い配列モチーフに対して弱い親和性で結合する（Ｆａｒｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。活性エンハンサーにおける配列への結合優先性が存在することは、活性エンハンサーと結び付く「オープンクロマチン」へのアクセスを部分的に反映するものである可能性がある（Ｍｕｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。シグナル伝達因子は、こうしたエンハンサーに他のＴＦが結合することによって媒介されるＤＮＡの構造変化に起因してそのような部位に優先的に結合するか（Ｈａｌｌｉｋａｓ ｅｔ ａｌ．，２００６、Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．，２０１８）、またはマスターＴＦとの直接的なタンパク質間相互作用を介して協同的に結合する可能性もある（Ｋｅｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。
スーパーエンハンサーにおいてマスターＴＦ及びメディエーターコアクチベーターが相分離凝縮体を形成し、こうした相分離凝縮体が転写装置を主要な細胞独自性遺伝子にコンパートメント化し、そこに密集させることが最近の研究によって明らかになっている（Ｂｏｉｊａ ｅｔ ａｌ．，２０１８、Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ．，２０１８、Ｓａｂａｒｉ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。シグナル伝達因子は、細胞型特異的スーパーエンハンサーに特殊な優先性を有していることが示されており（Ｈｎｉｓｚ ｅｔ ａｌ．，２０１５）、このことがきっかけとなり、本発明者らは、スーパーエンハンサーにおける転写凝縮体へとシグナル伝達因子自体を導いてそこに分配移入させる特性をシグナル伝達因子が有し得るのではないかという仮説を立てるに至った。これは、細胞型特異的エンハンサーとの結び付きに対してこれまで特徴付けられたことのない機構である。本明細書において、本発明者らは、細胞型特異的な様式でシグナル伝達刺激に応じてスーパーエンハンサー誘導性遺伝子においてシグナル伝達因子がコアクチベーターと共に相分離することを報告する。本発明者らは、シグナル伝達因子がマスターＴＦ誘導性転写凝縮体に到達するように導くことによって相分離がシグナル伝達の状況依存的特異性の達成を支援することを提唱する。
結果
スーパーエンハンサーにおける凝縮体へのシグナル伝達因子のシグナル依存的取り込み
スーパーエンハンサーにおいてＴＦ及びメディエーターが相分離凝縮体を形成することが最近の研究によって示されており（Ｂｏｉｊａ ｅｔ ａｌ．，２０１８、Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ．，２０１８、Ｓａｂａｒｉ ｅｔ ａｌ．，２０１８）、さらに、ＷＮＴ経路、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路、及びＴＧＦ－β経路の最終シグナル伝達因子（それぞれβ－カテニン、ＳＴＡＴ３、及びＳＭＡＤ３）がスーパーエンハンサーを優先的に占有することが示されている（Ｈｎｉｓｚ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。こうしたシグナル伝達因子がスーパーエンハンサー関連遺伝子における凝縮体に取り込まれるかどうかを試験するために、本発明者らは、これら３つのシグナル伝達因子のそれぞれの対する免疫蛍光法と組み合わせてＮａｎｏｇに対するＲＮＡ ＦＩＳＨを実施した（図５２Ａ）。Ｎａｎｏｇは、多能性に重要な遺伝子であり、マウス胚性幹細胞（ｍＥＳＣ）においてこれら３つのシグナル伝達因子及びメディエーターによって占有されるスーパーエンハンサーと結び付くことが、ＣｈＩＰ－シークエンシングによって示される（図５２Ｂ）。本発明者らは、３つすべての因子について、個々の細胞のＮａｎｏｇ遺伝子座に凝縮フォーカスが観測され得ることを見出し（図５２Ａ）、このことは、３つすべての因子が、凝縮体と結び付くスーパーエンハンサーに取り込まれることを示唆している。ｍＥＳＣにおいて転写凝縮体が生じることが実証されている追加のスーパーエンハンサー遺伝子座においても同様の結果が得られた（Ｂｏｉｊａ ｅｔ ａｌ，２０１８、Ｓａｂａｒｉ ｅｔ ａｌ．，２０１８）（図５８Ａ、図５８Ｂ）。この遺伝子座とシグナル伝達因子との結び付きが細胞型特異的なものであるかを確認するために、本発明者らは、β－カテニン凝縮フォーカスがＣ２Ｃ１２筋芽細胞におけるＮａｎｏｇとオーバーラップするかどうかを、免疫蛍光法とＤＮＡ ＦＩＳＨとを組み合わせて使用して調べ、その結果、Ｃ２Ｃ１２細胞におけるこの遺伝子座ではβ－カテニンシグナルは検出されなかった（図５８Ｃ）。こうした結果は、シグナル伝達因子が細胞型特異的スーパーエンハンサー凝縮体に取り込まれるという考えと一致する。シグナル伝達因子（β－カテニン、ＳＴＡＴ３、及びＳＭＡＤ３）が経路刺激に応じて核内凝縮体に取り込まれるかどうかを確認するために、本発明者らは、それぞれのシグナル伝達経路に対する刺激の存在下または非存在下でｍＥＳＣにおいてそうした因子に対して免疫蛍光法を実施した。本発明者らは、３つすべてのシグナル伝達因子が、それらのそれぞれのシグナル伝達経路が活性化されると、免疫蛍光による凝縮核内フォーカスとして検出されることを見出した（図５２Ｃ）。こうした結果は、経路活性化に応じてβ－カテニン、ＳＭＡＤ３、及びＳＴＡＴ３が核内凝縮体に取り込まれることを示している。
スーパーエンハンサーにおいて転写因子及びメディエーターによって形成される凝縮体は、液体様挙動を示す（Ｂｏｉｊａ ｅｔ ａｌ．，２０１８、Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ．，２０１８、Ｓａｂａｒｉ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。液－液相分離凝縮体の顕著な特徴は、動的な内部再組織化及び急速な交換動力学であり（Ｂａｎａｎｉ ｅｔ ａｌ．，２０１７、Ｈｙｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４、Ｓｈｉｎ ａｎｄ Ｂｒａｎｇｗｙｎｎｅ，２０１７）、こうした特徴は、光退色後蛍光回復（ＦＲＡＰ）の速度を測定することによって調べることができる。シグナル伝達因子がこの型の挙動を示すかどうかを試験するために、本発明者らは、構成的にＷＮＴが活性化しているＨＣＴ１１６細胞におけるβ－カテニン遺伝子の内在性遺伝子座にｍＥＧＦＰタグを導入し、こうした細胞におけるｍＥＧＦＰタグ付きβ－カテニンの発現レベルが、こうした細胞において通常発現するものと同様であることを確認し（図５８Ｄ）、こうした凝縮体の挙動をＦＲＡＰによって調べた。β－カテニン核内小斑点では、数秒の時間尺度で回復が生じ（図５２Ｄ）、およその見かけの拡散係数は、０．００４±０．００３μｍ２／秒であった。こうした値は、以前に報告された液体様凝縮体コンポーネントのものと同様であり（Ｎｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，２０１５、Ｐａｋ ｅｔ ａｌ．，２０１６、Ｓａｂａｒｉ ｅｔ ａｌ．，２０１８）、β－カテニンを含む凝縮体が液体様特性を示すことを示している。
精製シグナル伝達因子は、インビトロで凝縮体を形成し得る
β－カテニン、ＳＴＡＴ３、及びＳＭＡＤ３のアミノ酸配列を分析したところ、それらが天然変性領域（ＩＤＲ）を含むことが明らかとなった（図５３Ａ、図５９）。ＩＤＲは、弱い相互作用の動的ネットワークを形成する能力を有し、凝縮体形成に関与しているため（Ｂｕｒｋｅ ｅｔ ａｌ．，２０１５、Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５、Ｎｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，２０１５）、本発明者らは、こうしたシグナル伝達タンパク質がインビトロで相分離液滴を形成し得るかどうかを調べた。実際に、精製された組換えｍＥＧＦＰ－β－カテニン、ｍＥＧＦＰ－ＳＴＡＴ３、及びｍＥＧＦＰ－ＳＭＡＤ３は、濃度依存性の液滴を形成した（図５３Ｂ）。こうした液滴は、球状であり、ミクロンサイズを有し、溶液中を自由に移動するものであった。こうしたタンパク質の液滴形成挙動は、マイクロモル濃度で濃密相と希薄相と間で分配比が切り替わり、このことは、相分離を起こすタンパク質の挙動と一致する（図５３Ｂ）。こうした液滴をさらに特徴付けたところ、それらが希釈による可逆性を有しており、塩濃度の上昇に対して感受性であることが明らかとなり（図５３Ｃ）、こうした挙動は、液－液相分離液滴に特有の挙動である。
精製シグナル伝達因子は、インビトロでメディエーター凝縮体に取り込まれる
スーパーエンハンサーに形成される転写凝縮体は、メディエーターコアクチベーターを高濃度で含み、転写因子は、その活性化ドメインの相分離に重要な残基と同じ残基を介してメディエーターと相互作用する（Ｓａｂａｒｉ ｅｔ ａｌ．，２０１８、Ｂｏｉｊａ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。β－カテニン、ＳＭＡＤ３、及びＳＴＡＴ３の液滴形成特性、及びインビボでのその局在化を踏まえ、本発明者らは、こうしたシグナル伝達タンパク質もまた、メディエーター凝縮体と相互作用し、そこに密集し得ると推論した。この考えを試験するために、本発明者らは、ＭＥＤ１－ＩＤＲ（メディエーター複合体の代替物（Ｂｏｉｊａ ｅｔ ａｌ．，２０１８））を使用してＰＥＧ－８０００において液滴を形成させ、この溶液に希薄なシグナル伝達因子を添加し、ＭＥＤ１－ＩＤＲ液滴へのシグナル伝達因子の取り込みを監視した（図５４Ａ）。本発明者らは、β－カテニン、ＳＭＡＤ３、及びＳＴＡＴ３が、ＭＥＤ１－ＩＤＲ液滴に取り込まれ、そこに密集することを見出した（図５４Ｂ、図５４Ｃ）。
β－カテニン、ＳＭＡＤ３、及びＳＴＡＴ３は、哺乳類細胞ではナノモル濃度で見られるが（Ｂｅｃｋ ｅｔ ａｌ．，２０１７）、組換えシグナル伝達タンパク質がインビトロで液滴を形成する濃度は、マイクロモル濃度範囲内である（図５３Ｂ）。このことがきっかけとなり、本発明者らは、メディエーターが存在すればシグナル伝達因子がナノモル濃度（シグナル伝達因子が、それ自体だけでは検出可能な液滴を形成することが不可能な濃度）で液滴を形成し得るかどうかを調べた。こうしたアッセイでは、先と同様に、シグナル伝達因子はＭＥＤ１－ＩＤＲ液滴へと効率的に分配された（図５４Ｄ）。こうした結果は、メディエーター凝縮体にシグナル伝達因子が分配されることが、スーパーエンハンサーにおける転写凝縮体へのシグナル伝達因子の局在化に寄与するという可能性と一致するものである。
β－カテニンの相分離及び標的遺伝子の活性化は、芳香族アミノ酸に依存する
スーパーエンハンサーにおけるシグナル伝達因子の濃縮が、そのＩＤＲの相分離特性、及びメディエーター凝縮体への取り込みを介して生じるのであれば、ＩＤＲが相分離液滴をインビトロで形成する能力に影響を与える変異をＩＤＲに導入すれば、ＩＤＲがインビボで遺伝子を標的とし、活性化する能力に影響が及ぶであろうと予測される。この仮説を試験するために、本発明者らは、β－カテニンに関する追加試験に重点を置き、その相分離特性を担うタンパク質部分を同定することを目指した。β－カテニンは、アルマジロ反復配列を有する中央の構造化ドメイン、ならびにそれを囲むＮ末端ＩＤＲ及びＣ末端ＩＤＲからなる（図５５Ａ）。液滴アッセイを行ったところ、アルマジロ反復配列またはＮ末端ＩＤＲもしくはＣ末端ＩＤＲのみを含む組換えタンパク質は、いずれの試験濃度でも相分離能力を有さないことが示され（図５５Ｂ）、このことは、こうしたコンポーネントが、インタクトなタンパク質の相分離特性に単独では寄与せず、この挙動には、両方のＩＤＲが必要であることを示唆している。
次に、本発明者らは、これら２つのＩＤＲ内で凝縮に寄与し得るアミノ酸残基に注意を払い、芳香族残基の存在量に着目した（図５９）。本発明者らは、β－カテニンの変異形態を生成し、この変異形態では、両方のＩＤＲにおける芳香族残基をアラニンで置き換えた（図５５Ｃ）。こうした型の変異は、π－陽イオン相互作用を乱すものであり、この相互作用は、複数のタンパク質の相分離能力において重要な役割を担う（Ｆｒｅｙ ｅｔ ａｌ．，２０１８、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。液滴形成アッセイにおいて試験すると、β－カテニンの変異形態は、非常に高濃度では非常に小さな液滴が観測されたことを除けば、液滴を形成することができなかった（図５５Ｃ）。ＭＥＤ１－ＩＤＲを用いる異型液滴形成アッセイにおいて試験すると、ＭＥＤ１－ＩＤＲ液滴への変異β－カテニンタンパク質の取り込み及び密集は生じなかった（図５５Ｄ、図５５Ｅ）。こうした結果は、β－カテニンのＩＤＲにおける芳香族残基が、その相分離挙動に寄与することを示唆している。
ＩＤＲにおける芳香族残基が、インビボでのβ－カテニン機能に寄与するかどうかを試験するために、ＴｄＴｏｍａｔｏタグ付きの野生型β－カテニンをドキシサイクリン誘導性プロモーターの制御下にコードするコンストラクト、及びＴｄＴｏｍａｔｏタグ付きのβ－カテニン変異形態をドキシサイクリン誘導性プロモーターの制御下にコードするコンストラクトをｍＥＳＣのゲノムに組み込み（図５６Ａ）、ドキシサイクリンによる活性化後にβ－カテニンに対するＣｈＩＰ－ｑＰＣＲを実施した。野生型β－カテニンは、ＷＮＴ応答性遺伝子であるＭｙｃ、Ｓｐ５、及びＫｌｆ４を占有することが明らかとなった一方で、予測通り、こうしたエンハンサーでは芳香族変異体のレベルが下がっていることが明らかとなった（図５６Ｂ）。この占有差異は、こうした遺伝子の発現レベルの低下に反映された（図５６Ｂ）。こうした結果は、β－カテニンＩＤＲにおける芳香族アミノ酸が、凝縮体を形成するにも、β－カテニンがインビボでエンハンサーと適切に結び付いてそこで機能するにも必要であることを示唆している。
本発明者らは、ルシフェラーゼアッセイにおいてβ－カテニン芳香族変異体がＷＮＴ応答性レポーター遺伝子をトランス活性化する能力を、野生型及び変異形態のβ－カテニンを用いて独立して試験した（図５６Ｃ）。野生型β－カテニンを発現させるとルシフェラーゼ活性が刺激されて８倍に増加した一方で、芳香族変異体を発現させてもルシフェラーゼレポーターに対する作用はほとんどなかった（図５６Ｃ）。こうした結果は、インビトロでメディエーターと共に凝縮体を形成するために必要なβ－カテニンアミノ酸が、インビボでの遺伝子活性化にも重要であるという考えをさらに支持するものである。
本明細書で使用したベータ－カテニンの配列：
ベータ－カテニンＮ末端ＩＤＲの配列：
Ｇｃｔａｃｔｃａａｇｃｔｇａｔｔｔｇａｔｇｇａｇｔｔｇｇａｃａｔｇｇｃｃａｔｇｇａａｃｃａｇａｃａｇａａａａｇｃｇｇｃｔｇｔｔａｇｔｃａｃｔｇｇｃａｇｃａａｃａｇｔｃｔｔａｃｃｔｇｇａｃｔｃｔｇｇａａｔｃｃａｔｔｃｔｇｇｔｇｃｃａｃｔａｃｃａｃａｇｃｔｃｃｔｔｃｔｃｔｇａｇｔｇｇｔａａａｇｇｃａａｔｃｃｔｇａｇｇａａｇａｇｇａｔｇｔｇｇａｔａｃｃｔｃｃｃａａｇｔｃｃｔｇｔａｔｇａｇｔｇｇｇａａｃａｇｇｇａｔｔｔｔｃｔｃａｇｔｃｃｔｔｃａｃｔｃａａｇａａｃａａｇｔａｇｃｔｇａｔａｔｔｇａｔｇｇａｃａｇｔａｔｇｃａａｔｇａｃｔｃｇａｇｃｔｃａｇａｇｇｇｔａｃｇａｇｃｔｇｃｔａｔｇｔｔｃｃｃｔｇａｇａｃａｔｔａｇａｔｇａｇｇｇｃａｔｇｃａｇａｔｃｃｃａｔｃｔａｃａｃａｇｔｔｔｇａｔｇｃｔｇｃｔｃａｔｃｃｃａｃｔａａｔｇｔｃｃａｇｃｇｔｔｔｇｇｃｔｇａａｃｃａｔｃａｃａｇａｔｇｃｔｇ（配列番号２４９）
＞ベータ－カテニン＿Ｃ末端ＩＤＲの配列：
Ｃｃａｃａａｇａｔｔａｃａａｇａａａｃｇｇｃｔｔｔｃａｇｔｔｇａｇｃｔｇａｃｃａｇｃｔｃｔｃｔｃｔｔｃａｇａａｃａｇａｇｃｃａａｔｇｇｃｔｔｇｇａａｔｇａｇａｃｔｇｃｔｇａｔｃｔｔｇｇａｃｔｔｇａｔａｔｔｇｇｔｇｃｃｃａｇｇｇａｇａａｃｃｃｃｔｔｇｇａｔａｔｃｇｃｃａｇｇａｔｇａｔｃｃｔａｇｃｔａｔｃｇｔｔｃｔｔｔｔｃａｃｔｃｔｇｇｔｇｇａｔａｔｇｇｃｃａｇｇａｔｇｃｃｔｔｇｇｇｔａｔｇｇａｃｃｃｃａｔｇａｔｇｇａａｃａｔｇａｇａｔｇｇｇｔｇｇｃｃａｃｃａｃｃｃｔｇｇｔｇｃｔｇａｃｔａｔｃｃａｇｔｔｇａｔｇｇｇｃｔｇｃｃａｇａｔｃｔｇｇｇｇｃａｔｇｃｃｃａｇｇａｃｃｔｃａｔｇｇａｔｇｇｇｃｔｇｃｃｔｃｃａｇｇｔｇａｃａｇｃａａｔｃａｇｃｔｇｇｃｃｔｇｇｔｔｔｇａｔａｃｔｇａｃｃｔｇ（配列番号２５０）
＞芳香族残基をアラニンに変換したベータ－カテニンＮ末端ＩＤＲ：
Ｇｃｔａｃｔｃａａｇｃｔｇａｔｔｔｇａｔｇｇａｇｔｔｇｇａｃａｔｇｇｃｃａｔｇｇａａｃｃａｇａｃａｇａａａａｇｃｇｇｃｔｇｔｔａｇｔｃａｃｇｃｇｃａｇｃａａｃａｇｔｃｔｇｃｃｃｔｇｇａｃｔｃｔｇｇａａｔｃｃａｔｔｃｔｇｇｔｇｃｃａｃｔａｃｃａｃａｇｃｔｃｃｔｔｃｔｃｔｇａｇｔｇｇｔａａａｇｇｃａａｔｃｃｔｇａｇｇａａｇａｇｇａｔｇｔｇｇａｔａｃｃｔｃｃｃａａｇｔｃｃｔｇｇｃｔｇａｇｇｃｇｇａａｃａｇｇｇａｇｃｔｔｃｔｃａｇｔｃｃｇｃｃａｃｔｃａａｇａａｃａａｇｔａｇｃｔｇａｔａｔｔｇａｔｇｇａｃａｇｇｃｔｇｃａａｔｇａｃｔｃｇａｇｃｔｃａｇａｇｇｇｔａｃｇａｇｃｔｇｃｔａｔｇｇｃｃｃｃｔｇａｇａｃａｔｔａｇａｔｇａｇｇｇｃａｔｇｃａｇａｔｃｃｃａｔｃｔａｃａｃａｇｇｃｔｇａｔｇｃｔｇｃｔｃａｔｃｃｃａｃｔａａｔｇｔｃｃａｇｃｇｔｔｔｇｇｃｔｇａａｃｃａｔｃａｃａｇａｔｇｃｔｇ（配列番号２５１）
芳香族残基をアラニンに変換したベータ－カテニン＿Ｃ末端ＩＤＲ：
Ｃｃａｃａａｇａｔｇｃｃａａｇａａａｃｇｇｃｔｔｔｃａｇｔｔｇａｇｃｔｇａｃｃａｇｃｔｃｔｃｔｃｇｃｃａｇａａｃａｇａｇｃｃａａｔｇｇｃｔｇｃｇａａｔｇａｇａｃｔｇｃｔｇａｔｃｔｔｇｇａｃｔｔｇａｔａｔｔｇｇｔｇｃｃｃａｇｇｇａｇａａｃｃｃｃｔｔｇｇａｇｃｔｃｇｃｃａｇｇａｔｇａｔｃｃｔａｇｃｇｃｔｃｇｔｔｃｔｇｃｔｃａｃｔｃｔｇｇｔｇｇａｇｃｔｇｇｃｃａｇｇａｔｇｃｃｔｔｇｇｇｔａｔｇｇａｃｃｃｃａｔｇａｔｇｇａａｃａｔｇａｇａｔｇｇｇｔｇｇｃｃａｃｃａｃｃｃｔｇｇｔｇｃｔｇａｃｇｃｔｃｃａｇｔｔｇａｔｇｇｇｃｔｇｃｃａｇａｔｃｔｇｇｇｇｃａｔｇｃｃｃａｇｇａｃｃｔｃａｔｇｇａｔｇｇｇｃｔｇｃｃｔｃｃａｇｇｔｇａｃａｇｃａａｔｃａｇｃｔｇｇｃｃｇｃｇｇｃｔｇａｔａｃｔｇａｃｃｔｇ（配列番号２５２）
β－カテニン－凝縮体相互作用は、ＴＣＦ因子に依存せずに生じ得る
β－カテニンは、ＤＮＡ結合活性を有しておらず、β－カテニンが遺伝子に動員される従来のモデルは、そのアルマジロ反復配列とＴＣＦ／ＬＥＦファミリーのＤＮＡ結合転写因子との間に構造化相互作用が生じるというものである。インビボでのβ－カテニンの凝縮を可能にする動的相互作用を介してβ－カテニンがメディエーター凝縮体に動員されるのであれば、この動員は、ＴＣＦ／ＬＥＦ因子が存在しなくても生じるはずである。本発明者らは、この考えを試験するために一連のアッセイを開発した。
本発明者らは、元々は核スペックルを試験するために開発された凝縮体アッセイ（Ｊａｎｉｃｋｉ ｅｔ ａｌ．，２００４）を使用することによってインビボでβ－カテニンがＭＥＤ１凝縮体に取り込まれ得るかどうかを最初に調べた（図５７Ａ）。Ｕ２ＯＳ細胞におけるＬａｃＩ結合部位のアレイにＭＥＤ１－ＩＤＲを繋留した。このＵ２ＯＳ細胞では、ＷＮＴシグナル伝達経路が構成的に活性化されており（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５）、それ故に、検出可能なレベルのβ－カテニンが核に存在する。ＬａｃＩ－ＭＥＤ１－ＩＤＲまたは対照ＬａｃＩのいずれかを細胞に一過性にトランスフェクトした。ＬａｃＩ－ＭＥＤ１－ＩＤＲは、内在性β－カテニンをｌａｃアレイに動員することが明らかとなったが、ＬａｃＩ単独ではこの動員は生じなかった（図５７Ａ）。この作用は、ＴＣＦ／ＬＥＦとの相互作用、及びＤＮＡとの直接的な相互作用を介して媒介されるものではなかった可能性があり、この理由は、このｌａｃアレイは、ＴＣＦモチーフを含んでおらず、ＩＦによってＬａｃＩ－ＭＥＤ１－ＩＤＲフォーカスにＴＣＦ４が検出されなかったことによるものである（図５７Ｂ）。ヘテロクロマチン結合タンパク質ＨＰ１αを対照としたが、ＨＰ１αもアレイに動員されることはなかった（図６１Ａ）。ＴｄＴｏｍａｔｏで標識された野生型β－カテニン及び芳香族変異β－カテニンを異所性に発現させると、ＴｄＴｏｍａｔｏで標識された野生型β－カテニンは、ＭＥＤ１－ＩＤＲが占有するｌａｃアレイに蓄積したが、ＴｄＴｏｍａｔｏで標識された芳香族変異体の蓄積は有意に少なかった（図５７Ｃ）。こうした結果は、インビボでのＭＥＤ１－ＩＤＲ凝縮体へのβ－カテニンの取り込みが、ＴＣＦ４が存在しなくても生じ、インビトロでのＭＥＤ１凝縮体へのβ－カテニンの取り込み及び密集に必要なアミノ酸と同じアミノ酸に依存する様式で生じること示唆している。
自体がメディエーターと共に相分離することを可能にするβ－カテニンの領域が、ＴＣＦ／ＬＥＦ因子との相互作用の非存在下でβ－カテニンが特定のゲノム遺伝子座に到達する上で十分なものであるかどうかをさらに試験するために、本発明者らは、ＴＣＦ相互作用ドメインを含むアルマジロ反復配列をｍＥＧＦＰで置き換える操作を行ってβ－カテニン－キメラタンパク質を得た。このβ－カテニン－キメラを、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に組み込んでドキシサイクリン誘導性プロモーターの制御下に置いた。ＧＦＰに対するＣｈＩＰ－ｑＰＣＲを行ったところ、ＷＮＴ－誘導性遺伝子であるＳＯＸ９、ＳＭＡＤ７、ＫＬＦ９、及びＧＡＴＡ３にβ－カテニン－キメラが濃縮されることが示され、このことは、β－カテニンのＩＤＲが、ｍＥＧＦＰを特定のゲノム遺伝子座に到達させる上で十分なものであることを示している（図５７Ｄ）。この作用は、このキメラの発現レベルが野生型形態のβ－カテニンの発現レベルと同等であったことから、こうした因子の発現差異に起因するものではなかった（図６１Ｂ）。β－カテニンのＣ末端ＩＤＲは、そのトランス活性化ドメインを含むため、本発明者らは、β－カテニン－キメラが、正しいゲノム位置に局在化するだけでなく、転写を活性化することも可能であり得るかどうかを探求して調べた。ルシフェラーゼレポーターアッセイにおいてβ－カテニン－キメラを過剰発現させると、β－カテニン－キメラは、β－カテニンの野生型と比較すると活性化レベルは低かったものの、ＷＮＴ－レポーターを活性化することが可能であった（図５７Ｅ）。こうしたデータは、β－カテニンがメディエーター凝縮体に動員され、この動員が、β－カテニンがこの凝縮体と相互作用する能力を介して生じるものであり、β－カテニンとＴＣＦ／ＬＥＦ因子との古典的相互作用に依存することなく生じ得るものであるという考えと一致している。
考察
細胞外情報を伝達して遺伝子発現プログラムを適切に調節する上で、発生的に重要な少数の共有シグナル伝達経路が多様な細胞型によって利用される（Ｐｅｒｒｉｍｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。いずれの１つの細胞型においても、その細胞型のマスター転写因子によって形成される活性エンハンサーにおけるエフェクターコンポーネントに優先的に結合することで、ＷＮＴ経路、ＴＧＦ－β経路、及びＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路のエフェクターコンポーネントは、多数の潜在的シグナル応答エレメントのうちのごく少数のみと繋がっており、これによって細胞型特異的な応答を生じさせている（Ｄａｖｉｄ ａｎｄ Ｍａｓｓａｇｕｅ，２０１８、Ｈｎｉｓｚ ｅｔ ａｌ．，２０１５、Ｍｕｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１１、Ｔｒｏｍｐｏｕｋｉ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。この偏りを説明するために報告されている機構には、「オープンクロマチン」への優先的アクセス（Ｍｕｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ，２０１１）、他のＴＦの結合によって変化が生じたＤＮＡ構造への優先的アクセス、及びマスターＴＦとの協同的タンパク質間相互作用（Ｈａｌｌｉｋａｓ ｅｔ ａｌ．，２００６、Ｋｅｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，２０１１）が含まれる。シグナル伝達因子が細胞型特異的スーパーエンハンサーに対する空間的優先性を有するという知見（Ｈｎｉｓｚ ｅｔ ａｌ．，２０１５）に加えて、スーパーエンハンサーにおいてＴＦ及びメディエーターが相分離凝縮体を形成することが見出されており（Ｂｏｉｊａ ｅｔ ａｌ．，２０１８、Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ．，２０１８、Ｓａｂａｒｉ ｅｔ ａｌ．，２０１８）、このことがきっかけとなり、本発明者らは、スーパーエンハンサーにおける転写凝縮体への分配を促進する特性をシグナル伝達因子が有するかどうかを調べるに至った。本明細書に記載の証拠は、シグナル伝達の細胞型依存的特異性が、スーパーエンハンサーにおける相分離を介してシグナル伝達因子を転写凝縮体に到達させることによって少なくとも部分的には達成され得るということを立証するものである。この様式では、そのような凝縮体に複数のシグナル伝達因子分子が密集し、ゲノム上の適切な位置を占有することが可能である。
本発明者らは、シグナル伝達因子であるβ－カテニン、ＳＴＡＴ３、及びＳＭＡＤ３が、ＥＳＣのシグナル応答性スーパーエンハンサーにおける凝縮小斑点に生じることを見出しており、こうしたシグナル応答性スーパーエンハンサーでは、転写凝縮体が、数百のメディエーター分子及びＲＮＡポリメラーゼＩＩ分子を含むことが報告されている（Ｂｏｉｊａ ｅｔ ａｌ．，２０１８、Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ．，２０１８、Ｓａｂａｒｉ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。こうしたシグナル伝達因子は、インビトロでメディエーターサブユニット凝縮体に取り込まれ、そこに密集することができ、このことは、こうしたシグナル伝達因子がメディエーター凝縮体に移入する能力が、こうしたシグナル伝達因子がスーパーエンハンサーに見られるメディエーター凝縮体とインビボで優先的に結び付くことに寄与し得ることを示唆している。実際、ゲノム部位のアレイにメディエーターサブユニットを繋留すると、こうしたシグナル伝達因子のうちの少なくとも１つ（β－カテニン）を自体に動員し得る凝縮体が形成され、この動員は、その古典的パートナーであるＤＮＡ結合因子ＴＣＦ４との構造化相互作用の非存在下で生じる。重要なことに、インビトロでのβ－カテニン－メディエーター凝縮体取り込みを低減する残基変異は、同様に、β－カテニンがインビボでメディエーターサブユニット凝縮体に移入し、転写を活性化する能力も低減する。
スーパーエンハンサー凝縮体へのβ－カテニンの移入について本発明者らが説明するモデルは、シグナル伝達に関する文献におけるさらなる難問を説明する上で役立ち得るものである。例えば、β－カテニンは、多数の異なるタンパク質と相互作用することが報告されており（Ｓｃｈｕｉｊｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，２０１４）、この相互作用乱雑性の結果として、ＴＣＦ／ＬＥＦファミリーの標準的な動員因子に加えて、多数のＤＮＡ結合転写因がβ－カテニンを動員する能力を有するという提唱がなされている（Ｎａｔｅｒｉ ｅｔ ａｌ．，２００５、Ｋｏｕｚｍｅｎｋｏ ｅｔ ａｌ，２００４、Ｅｓｓｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，２００５、Ｋａｉｄｉ ｅｔ ａｌ．，２００７、Ｂｏｔｒｕｇｎｏ ｅｔ ａｌ．，２００４、Ｋｅｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，２０１１、Ｓｉｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００４）。しかしながら、報告されたこうした相互作用の大多数は、機能性データによって裏付けされておらず、ＴＣＦへの結合のみが、共結晶化によって裏付けられている（Ｐｏｙ ｅｔ ａｌ．，２００１、Ｓａｍｐｉｅｔｒｏ ｅｔ ａｌ．，２００６）。本発明者らのモデルは、どのようにβ－カテニンが転写凝縮体における多数のＴＦと機能的に相互作用し、さらには、人工的な系では転写を活性化し得ない（この場合、そのような凝縮体が構築されていない可能性がある）のかを説明し得るものである。
本明細書に記載の凝縮体モデルは、疾患（がんなど）における病的シグナル伝達のさらなる理解を促進し得るものである。実際、転写及びシグナル伝達の制御不全は、がんの２つの顕著な特徴である（Ｂｒａｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。がん細胞では、ドライバーがん遺伝子にスーパーエンハンサーを創出するゲノム変化が生じており（Ｃｈａｐｕｙ ｅｔ ａｌ．，２０１３、Ｈｎｉｓｚ ｅｔ ａｌ．，２０１３、Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１６、Ｍａｎｓｏｕｒ ｅｔ ａｌ．，２０１４、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１６）、こうしたがん遺伝子は、発がん性シグナル伝達に特に応答性である（Ｈｎｉｓｚ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。発がん性シグナル伝達に寄与するシグナル伝達因子は、一般に、相分離も促進する特性を介してスーパーエンハンサー凝縮体と相互作用し得る。このようにして、特定のシグナル伝達経路に依存する腫瘍細胞は、代替のシグナル伝達経路を利用することによって治療に対する抵抗性を獲得し得、こうした代替のシグナル伝達経路のシグナル伝達因子は、転写凝縮体に取り込まれ得る。おそらく、発がん性のシグナル伝達経路及びスーパーエンハンサーコンポーネントの両方を標的とする治療は、シグナル伝達依存性及び転写依存性を有する腫瘍細胞に特に有用であることが判明するであろう。
ＳＴＡＲ法
主要資源の表
Figure 2024029228000023
Figure 2024029228000024
Figure 2024029228000025
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実験モデル及び主題詳細
細胞株
Ｖ６．５マウス胚性幹細胞は、Ｊａｅｎｉｓｃｈ ｌａｂからの供与物である。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞及びＨＣＴ１１６細胞は、ＡＴＣＣから入手した。Ｕ２ＯＳ細胞は、Ｓｐｅｃｔｏｒ ｌａｂから入手した。細胞のマイコプラズマ試験を定期的に行った。
細胞培養条件
Ｖ６．５マウス胚性幹細胞は、０．２％のゼラチン（Ｓｉｇｍａ、Ｇ１８９０）でコートされた組織培養プレート上で２ｉ＋ＬＩＦ条件で増殖させた。２ｉ＋ＬＩＦ培地条件に使用した培地は、以下の通りである：９６７．５ｍＬのＤＭＥＭ／Ｆ１２（ＧＩＢＣＯ １１３２０）、５ｍＬのＮ２サプリメント（ＧＩＢＣＯ １７５０２０４８）、１０ｍＬのＢ２７サプリメント（ＧＩＢＣＯ １７５０４０４４）、０．５ｍＭのＬ－グルタミン（ＧＩＢＣＯ ２５０３０）、０．５×非必須アミノ酸（ＧＩＢＣＯ １１１４０）、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン－ストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ １５１４０）、０．１ｍＭのβ－メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ）、１ｕＭのＰＤ０３２５９０１（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ ０４－０００６）、３ｕＭのＣＨＩＲ９９０２１（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ ０４－０００４）、及び１０００Ｕ／ｍＬの組換えＬＩＦ（ＥＳＧＲＯ ＥＳＧ１１０７）。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、Ｕ２ＯＳ細胞、及びＨＣＴ１１６細胞は、ＤＭＥＭ、高濃度グルコース、ピルビン酸（ＧＩＢＣＯ１１９９５－０７３）（１０％ウシ胎仔血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ、キャラクタライズドＳＨ３００７１０３）、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン－ストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ１５１４０）、２ｍＭのＬ－グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、２５０３０－０８１）が添加されたもの）において培養した。
細胞株の刺激
ＷＮＴについては、ＣＨＩＲを含まない２ｉ＋ＬＩＦ培地（ｍＥＳ）またはＣＨＩＲを含む１０％のＦＢＳ ＤＭＥＭ培地（ＨＥＫ２９３）においてＣＨＩＲ９９０２１またはＩＷＰ２（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ Ｉ０５３６）のいずれかで細胞を２４時間処理した。
ＳＭＡＤ３については、２ｉ＋ＬＩＦ培地においてアクチビンＡ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ ３３８－ＡＣ－０１０）またはＳＢ４３１５４２（Ｔｏｃｉｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ １６－１４１）で細胞を２４時間処理した。ＳＴＡＴ３については、２ｉ＋ＬＩＦ培地または２ｉ－ＬＩＦ培地で細胞を２４時間処理した。
細胞株の生成
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系を使用してＶ６．５マウス胚性幹細胞、ＨＣＴ１１６結腸直腸癌細胞、またはＨＥＫ２９３Ｔ胚性腎細胞を遺伝子改変した。ベータカテニンのＮ末端を標的とするガイドを、ｍＣｈｅｒｒｙ選択可能マーカーを含むｐｘ３３０ベクターにクローニングした。このガイドは、次の配列を有する：ＣＴＧＣＧＴＧＧＡＣＡＡＴＧＧＣＴＡＣＴ（配列番号２４８）。内在性遺伝子座に相同性を有する８００ｂｐをｍＥＧＦＰタグと隣接して含む修復鋳型をｐＵＣ１９ベクターにクローニングした。両方のコンストラクト（２．５μｇ）を細胞にトランスフェクトし、トランスフェクトから２日後にｍＣｈｅｒｒｙを対象として選別し、トランスフェクトから１週間後にｍＥＧＦＰを対象として再び選別した。細胞を段階希釈し、コロニーをピッキングしてクローン細胞株を得た。
ＦＲＡＰ
ＦＲＡＰは、４８８ｎｍレーザーを用いてＬＳＭ８８０ Ａｉｒｙｓｃａｎ顕微鏡で実施した。退色は、１００％のレーザー出力を使用してｒ退色≒１ｕｍで実施し、２秒ごとに画像を収集した。蛍光強度は、ＦＩＪＩを使用して測定した。バックグラウンド強度の差し引きを行い、退色実施前時点に対する値が報告される。
カスタムＭＡＴＬＡＢ（登録商標）スクリプトを記述することで、バックグラウンドの光退色及び退色実施前強度に対する正規化を考慮して強度データを処理した。退色実施後のＦＲＡＰ回復データを、細胞株及び条件ごとに９回の反復測定にわたって平均化した。ＦＲＡＰの回復曲線は、下記の式にフィッティングさせた：
ＦＲＡＰ（ｔ）＝Ｍ（１－ｅｘｐ（－ｔ／τ））
免疫蛍光法
Ｓａｂａｒｉ ｅｔ ａｌ．２０１８に記載のように４％のパラホルムアルデヒドにおいて細胞を室温で１０分間固定化した。次に、細胞を３回洗浄し、０．５のＴｒｉｔｏｎＸ １００を含むＰＢＳを用いて細胞の透過処理を室温で５分間行った。ＰＢＳでの洗浄を３回行った後、４％のウシ血清アルブミンにおいて細胞を室温で１５分間ブロッキングし、４％のＢＳＡにおいて一次抗体と共に室温で一晩インキュベートした。ＰＢＳでの洗浄を３回行った後、４％のＢＳＡにおいて二次抗体と共に細胞を暗所で１時間インキュベートした。細胞をＰＢＳで３回洗浄した後、Ｈｏｅｃｈｓｔと共に細胞を暗所、室温で５分間インキュベートした。スライドにＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ Ｈ－１０００をマウントし、透明マニキュア液を用いてカバースリップをシールし、４Ｃで保管した。画像の取得は、Ｍｅｔａｍｏｒｐｈソフトウェア及びＣＣＤカメラを使用して、１００×対物レンズを備えたＲＰＩスピニングディスク型共焦点顕微鏡を使用して実施した。
免疫蛍光法とＤＮＡ ＦＩＳＨとの併用
免疫蛍光法は、先に記載したように実施し、その際、二次抗体とのインキュベート後のプロトコールに改変を加えた。二次抗体とのインキュベート後、ＰＢＳにおいて細胞を室温で３回洗浄した後、４％のＰＦＡを含むＰＢＳで細胞を２０分間固定化し、ＰＢＳで３回洗浄した。７０％のエタノール、８５％のエタノール、次いで１００％のエタノールにおいて細胞を室温で１分間インキュベートした。７μｌのＦＩＳＨハイブリダイゼーション緩衝液（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｇ９４００Ａ）、１μｌのＦＩＳＨプローブ、及び２μｌの水を用いてプローブハイブリダイゼーション混合物を調製した。５μｌの混合物をスライド上に添加し、カバースリップを上に被せた。ゴムのりを使用してカバースリップをシールした。ゴムのりが固化した時点で、ゲノムＤＮＡ及びプローブを７８Ｃで５分間変性させ、スライドを暗所、１６Ｃで一晩インキュベートした。スライドからカバースリップを剥がし、予熱した洗浄緩衝液１において７３Ｃで３分間インキュベートし、洗浄緩衝液２において室温で１分間インキュベートした。スライドを風乾し、Ｈｏｅｃｈｓｔを含むＰＢＳを用いて核を室温で５分間染色した。ＰＢＳでカバースリップを３回洗浄し、Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ Ｈ－１０００を使用してスライド上にマウントし、マニキュア液を用いてシールした。画像の取得は、ＭｅｔａＭｏｒｐｈ取得ソフトウェア及びＨａｍｍａｍａｔｓｕ ＯＲＣＡ－ＥＲ ＣＣＤカメラを使用して、１００×対物レンズを備えたＲＰＩスピニングディスク型共焦点顕微鏡を使用して行った。ＤＮＡ ＦＩＳＨプローブは、Ｎａｎｏｇ遺伝子座が標的となるようにＡｇｉｌｅｎｔによってカスタム設計及び生成されたものを使用した。
免疫蛍光法とＲＮＡ ＦＩＳＨとの併用
免疫蛍光法は、以前の報告のように実施し（Ｓａｂａｒｉ ｅｔ ａｌ．，２０１８）、その際、軽微な改変を加えた。免疫蛍光法は、ＲＮａｓｅが存在しない環境で実施し、ピペット及びベンチは、ＲＮａｓｅＺａｐ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＡＭ９７８０）で処理した。ＲＮａｓｅ非含有ＰＢＳを使用し、抗体の希釈は、常にＲＮａｓｅ非含有ＰＢＳで行った。免疫蛍光法の完了後、４％のＰＦＡを含むＰＢＳを用いて細胞を室温で１０分間、ポスト固定化した。ＲＮａｓｅ非含有ＰＢＳで細胞を２回洗浄した。２０％のＳｔｅｌｌａｒｉｓ ＲＮＡ ＦＩＳＨ緩衝液Ａ（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＳＭＦ－ＷＡ１－６０）、及び１０％の脱イオン化ホルムアミド（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｓ４１１７）を含むＲＮａｓｅ非含有水（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＡＭ９９３２）を用いて細胞を室温で５分間、１回洗浄した。９０％のＳｔｅｌｌａｒｉｓ ＲＮＡ ＦＩＳＨハイブリダイゼーション緩衝液（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＳＭＦ－ＨＢ１－１０）、１０％の脱イオン化ホルムアミド、ＳＥ関連遺伝子の転写物のイントロンへのハイブリダイゼーションが生じるように設計された１２．５μＭのＳｔｅｌｌａｒｉｓ ＲＮＡ ＦＩＳＨプローブを用いて細胞のハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーションは、３７℃で一晩実施した。次に、洗浄緩衝液Ａを用いて細胞を３７℃で３０分間洗浄し、２０μｍ／ｍｌのＨＯＥＳＣＨＴを含む洗浄緩衝液Ａを用いて核を室温で５分間染色した。Ｓｔｅｌｌａｒｉｓ ＲＮＡ ＦＩＳＨ洗浄緩衝液Ｂ（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＳＭＦ－ＷＢ１－２０）を用いて５分間の洗浄を室温で１回実施した。免疫蛍光法について記載したようにカバースリップをマウントした。画像の取得は、ＭｅｔａＭｏｒｐｈ取得ソフトウェア及びＨａｍｍａｍａｔｓｕ ＯＲＣＡ－ＥＲ ＣＣＤカメラを使用して、１００×対物レンズを備えたＲＰＩスピニングディスク型共焦点顕微鏡で行った。使用した一次抗体は、抗ＭＥＤ１ Ａｂｃａｍ ａｂ６４９６５ １：５００希釈、抗ｂカテニンＡｂｃａｍ ａｂ２２６５６ １：５００希釈、抗ｐＳＴＡＴ３ Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ １：２０希釈、抗ＳＭＡＤ２／３ Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ １：２０希釈である。使用した二次抗体は、抗ウサギＩｇＧ、抗ヤギＩｇＧ、及び抗マウスＩｇＧである。
平均画像解析
免疫蛍光法を併用するＲＮＡ ＦＩＳＨの解析については、カスタムＭＡＴＬＡＢ（登録商標）スクリプトを記述することで、ＲＮＡ ＦＩＳＨチャネル及びＩＦチャネルに集積した３次元画像データを処理及び解析した。強度及びサイズの閾値によって個々のｚ軸スタック画像においてＦＩＳＨフォーカスを同定し、サイズｌ＝２．９μｍのボックスの中心に置き、ｚ軸スタック画像にまたがって３次元で繋ぎ合わせた。同定したＦＩＳＨフォーカスごとに、ＩＦチャネルにおける対応位置に由来するシグナルが、あらゆるｚ軸スライス画像においてＲＮＡ ＦＩＳＨフォーカスを中心とするｌ×ｌ四方に集積される。次に、ＦＩＳＨとＩＦとのペアごとに、ＦＩＳＨフォーカスを中心とするＩＦシグナルが統合され、平均強度プロジェクションが計算されることで、ＦＩＳＨフォーカスを中心とするｌ×ｌ四方内のＩＦシグナル強度の平均データが得られる。自体の座標に中心を置いたＦＩＳＨシグナル強度について同じ処理を実施することで、ＦＩＳＨフォーカスを中心とするｌ×ｌ四方内のＦＩＳＨシグナル強度の平均データを得た。対照として、これと同じ処理を、無作為に選択された核内位置を中心とするＩＦシグナルにも実施した。反復測定ごとに、サイズ上限（２００ボクセル）閾値及び強度（ＤＮＡ密度）閾値を組み合わせることによって、ＤＡＰＩチャネルから同定した核膜の内部から４０ヶ所の無作為な核内地点を選択した。次に、こうした平均強度プロジェクションを使用してシグナル強度の２次元等高線図を作成した。等高線図は、ＭＡＴＬＡＢ（登録商標）の組み込み関数を使用して作成されている。等高線図については、示される強度－色範囲は、直線色範囲（ｎ！＝１５）にわたってカスタマイズしたものである。ＦＩＳＨチャネルについては、黒色～マゼンタ色を使用した。ＩＦチャネルについては、本発明者らは、ｃｈｒｏｍａ．ｊｓ（オンラインカラージェネレーター）を使用して１５のビンわたって色を生成させ、主要な変遷色として、黒色、青紫色、ミディアムブルー色、ライム色を選択した。これを行った目的は、読み手が一目でシグナル強度差をより容易に判別し得るようにすることにある。作成したカラーマップを、すべてのＩＦプロットについて、等間隔の１５の強度ビンに用いた。ＦＩＳＨ位置または無作為に選択された核内位置を中心とする平均ＩＦは、同じ色尺度を使用してプロットされ、この色尺度は、各プロットに由来する最小シグナル及び最大シグナルを含むように設定されている。
タンパク質精製
目的遺伝子またはそのＩＤＲをコードするｃＤＮＡを改変バージョンのＴ７ ｐＥＴ発現ベクターにクローニングした。このベースベクターは、５’に６×ＨＩＳ、その下流にｍＥＧＦＰまたはｍＣｈｅｒｒｙのいずれか、及び「ＧＡＰＧＳＡＧＳＡＡＧＧＳＧ」（配列番号１４）という１４個のアミノ酸のリンカー配列を含むように操作した。こうした配列（ＰＣＲによって生成させた）をリンカーアミノ酸と共にフレーム内に挿入するために、ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ（登録商標）ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＮＥＢ Ｅ２６２１Ｓ）を使用した。ｍＥＧＦＰまたはｍＣｈｅｒｒｙを単独で発現するベクターは、リンカー配列の下流に終始コドンを含む。変異配列は、ｇｅｎｅｂｌｏｃｋｓ（ＩＤＴ）として合成し、上記のものと同じベースベクターに挿入した。発現コンストラクトはすべて、シークエンシングして配列が変化していないことを確認した。
タンパク質発現については、プラスミドを用いた形質転換をＬＯＢＳＴＲ細胞（Ｃｈｅｓｓｍａｎ Ｌａｂからの供与物）に対して行い、下記のように増殖させた。カナマイシン及びクロラムフェニコールを含むＬＢ培地に新鮮な細菌コロニーを播種し、３７℃で一晩増殖させた。ＭＥＤ１－ＩＤＲコンストラクトを含む細胞を、カナマイシン及びクロラムフェニコールを新たに添加した５００ｍｌの室温のＬＢで１：３０希釈し、１６℃で１．５時間増殖させた。ＩＰＴＧを添加して１ｍＭとし、増殖を１８時間継続した。細胞を収集し、－８０℃で凍結保管した。いずれの他のコンストラクトを含む細胞もまた、ＩＰＴＧによる誘導後に３７℃で５時間増殖させたことを除いて、同様の様式で処理した。
ｃＯｍｐｌｅｔｅプロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ、１１８７３５８０００１）を含む１５ｍｌの変性緩衝液（５０ｍＭのトリス（７．５）、３００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのイミダゾール、８Ｍの尿素）に５００ｍｌのベータカテニン変異体細胞のペレットを再浮遊させ、超音波処理（１５秒間オン、６０秒間オフのサイクルを１０回実施）した。１２，０００ｇで３０分間遠心分離することによって可溶化液を清澄化し、事前に平衡化した１ｍｌのＮｉ－ＮＴＡアガロース（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｒ９０１－１５）に添加した。このアガロース可溶化液スラリーを含むチューブを室温で１．５時間旋回振とうした。このスラリーを、Ｔｈｅｒｍｏ Ｌｅｇｅｎｄ ＸＴＲスイングバケットローターにおいて３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。５ｍｌの溶解緩衝液でペレットを２回洗浄した後、上記のように３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。２５０ｍＭのイミダゾールを含む２ｍｌの溶解緩衝液でタンパク質を３回溶出させた。サイクルごとに溶出緩衝液を添加し、少なくとも１０分間旋回振とうし、上記のように遠心分離した。溶出液を１２％のアクリルアミドゲルで分析し、クマシーで染色した。予測サイズのタンパク質を含む画分をプールし、２５０ｍＭのイミダゾール緩衝液で１：１希釈し、透析を行った。この透析は、５０ｍＭのトリス（ｐＨ７．５）、１２５ＭｍのＮａＣｌ、１ｍＭのＤＴＴ、及び４Ｍの尿素を含む緩衝液に対して最初に行い、次に、２Ｍの尿素を含む同じ緩衝液に対して行い、最終的に、１０％のグリセロールを含む尿素非含有緩衝液（この緩衝液による外液交換を２回実施）に対して行った。透析後に生じた沈殿物はいずれも、３，０００ｒｐｍでの１０分間の遠心分離によって除去した。ＭＥＤ１－ＩＤＲ及びＷＴベータカテニンも同様の様式で精製し、その際の例外として、尿素を含まない溶解緩衝液を使用し、インキュベートは４Ｃで行い、透析では、外液（５０ｍＭのトリス（ｐＨ７．５）、１２５ｍＭのＮａＣｌ、１０％のグリセロール、及び１ｍＭのＤＴＴ）の交換を２回行った。
インビトロの液滴形成アッセイ
Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ遠心分離フィルター（３０Ｋ ＭＷＣＯ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して組換えＧＦＰ融合タンパク質または組換えｍＣｈｅｒｒｙ融合タンパク質を濃縮及び脱塩することで、タンパク質を適切な濃度とし、ＮａＣｌ濃度を１２５ｍＭとした。液滴形成緩衝液（５０ｍＭのトリス－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０％のグリセロール、１ｍＭのＤＴＴ）中に異なる濃度（記載の最終塩濃度）の塩及び１０％のＰＥＧ－８０００（クラウディング剤）を含む溶液に組換えタンパク質を添加した。このタンパク質溶液を、並行に配置された２つの両面テープ片によってカバースリップが取り付けられたスライドガラスから構成される自作チャンバーに直ちにロードした。次に、１５０×対物レンズを備えたＡｎｄｏｒ共焦点顕微鏡を用いてスライドを画像化した。指定がない限り、示される画像は、ガラスのカバースリップ上で安定した状態の液滴のものである。
電荷を中和するためにＰＥＧ－シランを用いてカバースリップをコートした。簡潔に記載すると、カバースリップを、２％のＨｅｌｍａｎｅｘＩＩＩで２時間洗浄し、Ｈ２Ｏで３回洗浄し、エタノールで１回洗浄した後、０．５％のＰＥＧ－シランを含むエタノール（酢酸を１％含有）において一晩インキュベートした。次に、カバースリップをエタノールで１回洗浄し、水浴超音波処理器においてエタノール中で１５分間超音波処理し、Ｈ２Ｏで３回洗浄した後、エタノールですすぎ、風乾した。
異型の液滴の分析
インビトロの液滴実験を分析するために、ｓｃｉｋｉｔ－ｉｍａｇｅパッケージを使用してカスタムＰｙｔｈｏｎスクリプトを記述して液滴を同定し、そのサイズ、形状、及び強度を特徴付けた。取り込みチャネルの平均画像からさまざまな基準（以下のもの）で液滴をセグメント化した：（１）強度閾値（画像の平均値＋標準偏差の３倍超）（２）サイズ閾値（最小液滴サイズが９ピクセル）、及び（３）最小円形度（（円形度＝４π＊面積／周囲長２）が０．８（真円の場合は１））。セグメント化後、液滴ごとの平均強度を計算し、その際、相の境界面付近のピクセルは除外した（Ｂａｎａｎｉ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。典型的には５～１０個の独立画像領域において同定した数百の液滴を定量化した。液滴内の平均強度（Ｃ－イン）及び広域内の平均強度（Ｃ－アウト）をチャネルごとに計算した。分配比は、（Ｃ－イン）／（Ｃ－アウト）として計算した。ボックスプロットは、すべての液滴の分布を示す。図２ｂにおける分配比対タンパク質濃度の測定データセットは、下記のロジスティック方程式（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１８）によってフィッティングを行った：
Figure 2024029228000029
式中、ｆは分配比であり、ｘは対応タンパク質濃度である。
ＲＴ－ｑＰＣＲ
ＲＮＡは、製造者の説明に従ってＲｎｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ、７４１３６）を使用して単離した。ｃＤＮＡは、製造者の説明に従ってオリゴｄＴプライマー（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｃ１１０１）と共にＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１８０８００９３）を使用して生成させた。定量的リアルタイムＰＣＲは、ＳＥ遺伝子に対するＴａｑＭａｎプローブを使用してＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ７０００装置、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ５装置、及びＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ６装置で実施した。
ＣｈＩＰ
プレート当たり４～５万個の細胞密度で細胞をプレートに蒔き、２４～４８時間後に収集した。１％のホルムアルデヒドを含むＰＢＳを使用して細胞における架橋反応を１５分間行った後、最終濃度１２５ｍＭのグリシンを用いて氷上でこの架橋反応を停止した。冷却ＰＢＳで細胞を洗浄し、冷却ＰＢＳにおいて細胞を剥がし取ることによって細胞を収集した。収集した細胞を、１５００ｇ、４℃で５分間ペレット化し、ＬＢ１（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ－ＫＯＨ（ｐＨ７．９）、１４０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ ０．５ｍＬ（０．５Ｍ）、１０％のグリセロール、０．５％のＮＰ４０、１％のＴｒｉｔｏｎＸ－１００、１×プロテアーゼ阻害剤）に再浮遊させ、４℃で２０分間旋回振とうしながらインキュベートした。細胞を１３５０ｇで５分間ペレット化し、ＬＢ２（１０ｍＭのトリス（ｐＨ８．０）、２００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．５ｍＭのＥＧＴＡ、１×プロテアーゼ阻害剤）に再浮遊させ、４℃で５分間旋回振とうしながらインキュベートした。ペレットを３０～５０百万個細胞／ｍｌの濃度でＬＢ３（１０ｍＭのトリス（ｐＨ８．０）、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．５ｍＭのＥＧＴＡ、０．１％のデオキシコール酸ナトリウム、０．５％のラウロイルサルコシンナトリウム、１％のＴｒｉｔｏｎＸ－１００、１×プロテアーゼ阻害剤）に再浮遊させた。製造者の説明に従ってＣｏｖａｒｉｓ Ｓ２２０を使用して細胞を１２分間超音波処理した後、２００００ｇ、４℃で３０分間スピンダウンした。０．５％のＢＳＡを用いて事前にブロッキングしたＤｙｎａｂｅａｄｓを、ＧＦＰ抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ２９０）、Ｍｅｄ１抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ６４９６５）、またはｄｓＲｅｄ抗体（Ｔａｋａｒａ、６３２４９６）と共に６時間インキュベートした。クロマチンを抗体－ビーズ複合体に添加し、４℃で一晩旋回振とうしながらインキュベートした。洗浄緩衝液１（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）、５００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＥＧＴＡ、１％のＴｒｉｔｏｎ、０．１％のＮａＤｏｃ、０．１％のＳＤＳ）及び洗浄緩衝液２（２０ｍＭのトリス（ｐＨ８）、１ｍＭのＥＤＴＡ、２５０ｍＭのＬｉＣｌ、０．５％のＮＰ４０、０．５％のＮａＤｏｃ）のそれぞれでビーズを４℃で３回洗浄した後、ＴＥを用いて室温で１回洗浄した。溶出緩衝液（５０ｍＭのトリス（ｐＨ８．０）、１０ｍＭのＥＤＴＡ、１％のドデシル硫酸ナトリウム、２０ｕｇ／ｍｌのＲＮａｓｅＡ）をビーズに添加することによってクロマチンを溶出し、６０℃で３０分間振とうしながらインキュベートした。架橋の解除を５８℃で４時間実施した。タンパク質を除去するために、プロテイナーゼＫを添加し、３７℃で１～２時間インキュベートした。Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲ精製キットを使用してＤＮＡを精製し、１０ｍＭのトリス－ＨＣＬに再懸濁した。キットの説明に従ってＳｗｉｆｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ａｃｃｅｌ－ＮＧＳ（登録商標）２Ｓ Ｐｌｕｓ ＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｋｉｔを用いてＣｈＩＰライブラリーを調製し、Ｓａｇｅ Ｓｃｉｅｎｃｅから入手したＰｉｐｐｉｎＨＴシステムでサイズ選択ステップを追加で行った。ライブラリーの調製後、ＰｉｐｐｉｎＨＴを使用して２％のゲルでＣｈＩＰライブラリーを泳動させ、２００～６００塩基のサイズ幅での収集を行った。最終的なライブラリーを、Ｒｏｃｈｅから入手したＫＡＰＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎキットを用いるｑＰＣＲによって定量化し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ ２５００で４０塩基のシングルリードモードでシークエンシングした。
ＣｈＩＰ－ｓｅｑ解析
リード長に対するパラメーターを－ｋ １ －ｍ １ －ｂｅｓｔ及び－ｌに設定してｂｏｗｔｉｅを使用してｍｍ９バージョンのマウス参照ゲノムへのＣｈＩＰ－Ｓｅｑデータのアライメントを行った。ビンにおけるリードカバレッジを表示するためのＷｉｇｇｌｅファイルは、パラメーターを－ｗ －Ｓ ｓｐａｃｅ＝５０ －ｎｏｍｏｄｅｌ －ｓｈｉｆｔｓｉｚｅ＝２００としてＭＡＣＳを使用して作成し、ビン当たりのリード数は、ｗｉｇｇｌｅファイルの作成に使用した数百万のマッピングリードに正規化した（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００８）。リード数／百万に正規化されたｗｉｇｇｌｅファイルをＵＣＳＣゲノムブラウザーに表示した（Ｋｅｎｔ ｅｔ ａｌ．，２００２）。
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実施例６
転写開始装置及びスプライシング装置の両方が、多数のコンポーネント分子を含む相分離凝縮体を形成し得、スーパーエンハンサーにおける凝縮体には数百のＰｏｌＩＩ複合体及びメディエーター複合体が密集し８、９、核スペックルには多数のスプライシング因子が密集し、こうした核スペックルのいくつかは、高度に活性な転写部位に生じる１０～１７。本明細書において、本発明者らは、転写開始及びスプライシングと結び付く相分離凝縮体へのＣＴＤの取り込みがそのリン酸化によって制御されるかどうかを調べている。本発明者らは、低リン酸化されたＰｏｌＩＩ ＣＴＤがメディエーター凝縮体に取り込まれ、制御性ＣＤＫによってリン酸化されると、その排除が生じることを見出している。本発明者らは、リン酸化ＣＴＤが、スプライシング因子によって形成される凝縮体に優先的に取り込まれることも見出している。こうした結果は、ＰｏｌＩＩ ＣＴＤのリン酸化が、転写開始に関与する凝縮体からＲＮＡプロセシングに関与する凝縮体への交換を誘導し、凝縮体優先性を制御する機構としてリン酸化を関連付けるものであることを示唆している。
低リン酸化されたＰｏｌＩＩ ＣＴＤがメディエーターと相互作用し得５～７、スーパーエンハンサーにおける凝縮体にＰｏｌＩＩ及びメディエーターが生じる８、９ことが研究によって示されている。ＰｏｌＩＩ ＣＴＤがメディエーター凝縮体取り込まれるかどうかを調べるために、本発明者らは、ヒトメディエーター複合体を精製し、インビトロの液滴アッセイにおける凝縮体形成を測定した。ＧＦＰと融合したヒト全長ＣＴＤ（ＧＦＰ－ＣＴＤ）はメディエーター液滴に取り込まれ、そこに密集したが、対照ＧＦＰではこの取り込み及び密集は生じなかった（図６２Ｂ）。こうしたアッセイでは、クラウディング剤を使用することで、細胞における込み合ったタンパク質環境を模倣すると共に、こうした知見が使用薬剤に限ったものではないことを確認するために、本発明者らは、化学的に異なる２つのクラウディング剤の存在下で同じ実験を実施し、同一の結果を得た（図６２Ｂ）。こうした結果は、ＰｏｌＩＩ ＣＴＤが、メディエーター凝縮体へのその取り込みに寄与するという考えと一致する。
本発明者らは、本発明者らの実験をＭＥＤ１（メディエーター複合体の最大サブユニット１８）に重点を置いたものとすることによってＣＴＤとメディエーターとの相互作用をさらに調べた。本発明者らが、さらなる試験のためにＭＥＤ１を選択した理由は、以前の研究９においてＭＥＤ１がメディエーター凝縮体の有用な代替物であることが判明していることによるものである。さらに、ＭＥＤ１は、凝縮体形成に寄与する例外的に大きな天然変性領域（ＩＤＲ）を有しており９、ＭＥＤ１は、ヒト細胞においてＰｏｌＩＩと優先的に結び付くことが示されている１９。液滴アッセイを行ったところ、ＧＦＰ－ＣＴＤがＭＥＤ１－ＩＤＲ凝縮体に取り込まれ、そこに密集することが明らかとなり（図６２Ｃ）、このことは、メディエーター複合体についての観測と同様であった（図６２Ｂ）。ＣＴＤヘプタペプチドの反復回数を減らすと、ＣＴＤがＭＥＤ１－ＩＤＲ凝縮体に移入する能力が損なわれ（図６２Ｄ）、このことは、高結合価コンポーネントが関与する相互作用では予測されることであり、これは、凝縮体形成生体分子の特徴である２０、２１。ＰｏｌＩＩ ＣＴＤ／ＭＥＤ１－ＩＤＲ凝縮体は、液体様融合挙動を示すと共に（図６２Ｅ）、光退色後蛍光回復（ＦＲＡＰ；図６２Ｆ）によって分子の内部再構成及び内外交換が動的に生じる証拠を示し、こうしたことは、液－液相分離凝縮体と一致するものである。
開始から伸長へのＰｏｌＩＩの移行は、ＣＴＤヘプタペプチド反復配列がＣＤＫ７及びＣＤＫ９によってリン酸化されることによって達成される２２～２５。ＣＴＤがリン酸化されると、ＦＥＴ（ＦＵＳ／ＥＷＳ／ＴＡＦ１５）タンパク質の低複雑性ドメインによって形成されるハイドロゲルとのＣＴＤの相互作用が影響を受けることが示されており２６、このことは、ＣＴＤの凝縮体相互作用特性にリン酸化が影響し得ることを示唆している。
本発明者らは、ＣＤＫ７またはＣＤＫ９によってＣＴＤがリン酸化されると、ＭＥＤ１－ＩＤＲ凝縮体へのＣＴＤの取り込みが影響を受けることになるかどうかを調べた。ＣＴＤリン酸化アッセイを行ったところ、組換えＣＴＤのセリン２及びセリン５の両方をＣＤＫ７調製物及びＣＤＫ９調製物がインビトロでリン酸化することが可能であり、ＣＤＫ７によるリン酸化には、セリン５に対する優先的が存在することが示され（図６６Ａ、図６６Ｂ）、このことは、公開結果２２～２５と一致する。本発明者らは、ＣＤＫ７によってＣＴＤがリン酸化されると、ＭＥＤ１－ＩＤＲ液滴へのＣＴＤの取り込みが有意に減少することを見出した（図６３Ａ、図６３Ｂ；図６６Ｃ）。この作用は、使用したクラウディング剤に非依存的であった（図６３Ａ、図６３Ｂ）。同様に、ＣＤＫ９によるリン酸化が生じると、ＭＥＤ１－ＩＤＲ液滴へのＣＴＤの取り込みが有意に減少し、このことは、反応において使用したクラウディング剤に非依存的であった（図６３Ａ、図６３Ｂ）。こうした結果は、ＰｏｌＩＩ ＣＴＤがリン酸化されるとメディエーター凝縮体から排除されるというモデルと一致する。
リン酸化されたＰｏｌＩＩ ＣＴＤは、多くのスプライシング装置コンポーネントと相互作用することが報告されており２７～３０、こうしたスプライシング因子の中で、セリン／アルギニン高含有（ＳＲ）タンパク質ＳＲＳＦ２が最も豊富に存在する（図６６Ａ）７。ＳＲＳＦ２は、スプライス部位へのスプライソソームの動員を促進し３１、核スペックルにおけるｐｒｅ－ｍＲＮＡスプライシング装置と結び付いた状態で見られ得る１０。本発明者らは、ＳＲＳＦ２をスプライシング装置の代替物として使用することで、マウス胚性幹細胞（ｍＥＳＣ）における活性なスーパーエンハンサー関連遺伝子にスプライシング関連凝縮体が見られ得るかどうかを調べた（図６４）。ＳＲＳＦ２に特異的な抗体を使用する免疫蛍光顕微鏡法（図６７Ｂ）を新生ＲＮＡ ＦＩＳＨと併用すると、個別のＳＲＳＦ２小斑点がＮａｎｏｇ遺伝子及びＴｒｉｍ２８遺伝子（主要なＥＳＣ多能性転写因子をコードするスーパーエンハンサー関連遺伝子である）に存在することが明らかとなった（図６４Ａ）。Ｎａｎｏｇ ＦＩＳＨフォーカス及びＴｒｉｍ２８ ＦＩＳＨフォーカスの複数の画像を解析したところ（方法を参照のこと）、両方の遺伝子における新生ＲＮＡ ＦＩＳＨフォーカスにＳＲＳＦ２が濃縮されることが示された（図６４Ａ）。本発明者らは、スプライシングに必要な２つの追加ＳＲタンパク質（ＳＲＲＭ１及びＳＲＳＦ１３２、３３）もまた、Ｎａｎｏｇ遺伝子及びＴｒｉｍ２８遺伝子の両方における新生ＲＮＡ ＦＩＳＨフォーカスに濃縮されることを確認した（図６４Ｂ）。こうした結果は、ＳＲＳＦ２、及びスプライシング装置と結び付く他のタンパク質が、こうした活発に転写される遺伝子に位置する凝縮体のコンポーネントであることを示している。
次に、本発明者らは、リン酸化されたＰｏｌＩＩが、クロマチン上のＳＲＳＦ２と結び付くかどうかを調べた。ＭＥＤ１、ＳＲＳＦ２、非リン酸化ＰｏｌＩＩ ＣＴＤ、及びセリン２がリン酸化されたＰｏｌＩＩ ＣＴＤ（Ｓ２Ｐ）に対する抗体を用いてＣｈＩＰ－ｓｅｑを実施することで、さまざまな遺伝子座に対するこうしたコンポーネントの相対占有度に対する手がかりをゲノム規模で得た（図４ａ、図４ｂ）。予測通り、ＭＥＤ１は、非リン酸化ＣＴＤを含むＰｏｌＩＩと一緒にスーパーエンハンサー及びプロモーターを占有した（図６５Ａ、図６５Ｂ）。セリン２がリン酸化されたＣＴＤを含むＰｏｌＩＩは、転写される遺伝子の３’末端に最も顕著に観測され、ＳＲＳＦ２との強いオーバーラップを示した（図６５Ａ、図６５Ｂ）。こうした結果は、ＳＲＳＦ２によって占有されるゲノム部分が、リン酸化ＣＴＤを有するＰｏｌＩＩによって共占有される傾向を有することを示唆している。
ＣＴＤのリン酸化が、スプライシング因子凝縮体へのＣＴＤの取り込みに影響を与えるかどうかを直接的に試験するために、本発明者らは、組換えＳＲＳＦ２を使用してこうした凝縮体をインビトロでモデル化することを目指した。ｍＣｈｅｒｒｙと融合した全長ヒトＳＲＳＦ２を精製し、これが相分離液滴を形成することが明らかとなった（図６５Ｃ、図６５Ｄ）。非リン酸化ＣＴＤは、ＳＲＳＦ２液滴に効率的に取り込まれなかった一方で、ＣＤＫ７またはＣＤＫ９によってリン酸化されたＣＴＤは、ＳＲＳＦ２液滴に取り込まれ、そこに密集した（図６５Ｃ、図６５Ｄ、図６５Ｅ、図６５Ｆ、及び図６７Ｃ）。リン酸化されたＰｏｌＩＩ ＣＴＤがＳＲＳＦ２液滴によって取り込まれることに対するこの選択性は、実験で使用したクラウディング剤に非依存的であった（図６５Ｃ、図６５Ｄ、図６５Ｅ、図６５Ｆ）。こうした結果は、ＰｏｌＩＩ ＣＴＤがリン酸化されると、ＰｏｌＩＩ ＣＴＤがＳＲＳＦ２凝縮体と相互作用する能力が切り替わることを示している。
本発明者らの結果は、ＰｏｌＩＩ ＣＴＤがリン酸化されると、その凝縮体分配挙動が変化し、それによって、転写開始に関与する凝縮体から、ＲＮＡスプライシングに関与する凝縮体へとＰｏｌＩＩが移動するように誘導され得ることを示している。このモデルは、大きなＰｏｌＩＩクラスターが細胞におけるメディエーター凝縮体と融合し得るという以前の研究８、リン酸化が生じるとＣＴＤ介在性のＰｏｌＩＩクラスターが崩壊するという以前の研究３４、ＣＤＫ９／サイクリンＴが相分離機構を介してＣＴＤと相互作用し得るという以前の研究３５、転写伸長の間はＰｏｌＩＩがもはやメディエーターとは結び付かないという以前の研究１８、及びスプライシング因子を含む核スペックルが、転写活性が高い遺伝子座において観測され得るという以前の研究１０～１７、から得られた証拠と一致するものである。転写開始装置のコンポーネント及びＲＮＡプロセシング装置のコンポーネントとＣＴＤがリン酸化形態特異的様式で相互作用し得ることが以前の研究によって示されているが５～７、そうした研究では、こうしたコンポーネントが凝縮体に生じる可能性、またはＰｏｌＩＩ ＣＴＤがリン酸化されると、こうした凝縮体の間でのＰｏｌＩＩ ＣＴＤの分配挙動が変化する可能性については探求されなかった。本発明者らの結果は、メディエーター凝縮体及びスプライシング因子凝縮体が、同じスーパーエンハンサー誘導性遺伝子に生じることを明らかにするものであると共に、開始に関与するコンポーネントとの相互作用から、スプライシングに関与するコンポーネントとの相互作用へとＰｏｌＩＩが移行することが、ＣＴＤのリン酸化によって制御される凝縮体分配切り替えを介して媒介され得ることを示唆するものである。こうした結果は、リン酸化が、ある凝縮体からの排除及び別の凝縮体への移行をタンパク質機能が伴うプロセスにおいてタンパク質の凝縮体分配を制御する機構の１つであり得ることも示唆している。
方法
細胞培養
Ｖ６．５マウス胚性幹細胞（ｍＥＳＣ）は、Ｊａｅｎｉｓｃｈ ｌａｂからの供与物である。０．２％のゼラチン（Ｓｉｇｍａ、Ｇ１８９０）でコートされた組織培養プレート上で２ｉ培地において細胞を増殖させた。この２ｉ培地の組成は、ＤＭＥＭ－Ｆ１２（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１１３２００８２）、０．５×Ｂ２７サプリメント（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１７５０４０４４）、０．５×Ｎ２サプリメント（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１７５０２０４８）、追加の０．５ｍＭのＬ－グルタミン（Ｇｉｂｃｏ、２５０３０－０８１）、０．１ｍＭのベータ－メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ、Ｍ７５２２）、１％のペニシリンストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１５１４０１６３）、１×非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ、１１１４０－０５０）、１０００Ｕ／ｍｌのＬＩＦ（Ｃｈｅｍｉｃｏ、ＥＳＧ１１０７）、１μＭのＰＤ０３２５９０１（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ、０４－０００６－１０）、３μＭのＣＨＩＲ９９０２１（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ、０４－０００４－１０）である。細胞は、加湿インキュベーターにおいて、５％のＣＯ２雰囲気下、３７℃で増殖させた。共焦点画像化については、５μｇ／ｍＬのポリ－Ｌ－オルニチン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｐ４９５７）及び５μｇ／ｍｌのラミニン（Ｃｏｒｎｉｎｇ、３５４２３２）を用いて、それぞれ３７℃で少なくとも３０分間、及び３７℃で２時間～１６時間コートしたガラスのカバースリップ（Ｃａｒｏｌｉｎａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｕｐｐｌｙ、６３３０２９）上で細胞を増殖させた。継代培養については、１０００Ｕ／ｍｌのＬＩＦを含むＰＢＳ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＡＭ９６２５）で細胞を洗浄した。プレートからの細胞の剥離には、ＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｅｎｚｙｍｅ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１２６０４０２１）を使用した。ＴｒｙｐＬＥの反応停止は、ＦＢＳ／ＬＩＦ－培地（ＤＭＥＭ Ｋ／Ｏ（Ｇｉｂｃｏ、１０８２９－０１８）、１×非必須アミノ酸、１％のペニシリンストレプトマイシン、２ｍＭのＬ－グルタミン、０．１ｍＭのベータ－メルカプトエタノール、及び１５％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｆ４１３５））を用いて行った。
ウエスタンブロット
精製されたリン酸化ＣＴＤを１×ＸＴ緩衝液（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）に含め、１０％のＣｒｉｔｅｒｉｏｎ（商標）ＸＴ Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ Ｐｒｅｃａｓｔ Ｇｅｌ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）において色素の最前部がゲルの末端に達するまで１００Ｖで泳動させた。次に、氷冷転写緩衝液（２５のｍＭトリス、１９２のｍＭグリシン、１０％のメタノール）において孔径０．４５μｍのＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＩＰＶＨ０００１０）へとタンパク質を湿潤状態、２５０ｍＡ、４℃で２時間転写した。転写後、５％の無脂肪乳を含むＴＢＳにおいて膜を振とうしながら室温で１時間ブロッキングした。次に、抗ＧＦＰ抗体（Ａｂｃａｍ 番号ａｂ２９０）、抗Ｓｅｒ５リン酸化Ｐｏｌ ＩＩ抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ 番号０４－１５７２）、または抗Ｓｅｒ２リン酸化Ｐｏｌ ＩＩ抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ 番号０４－１５７１）を無脂肪乳５％含有ＴＢＳＴで１：２，０００希釈した溶液と共に膜を振とうしながら４℃で一晩インキュベートした。振とうしながら室温で１０分間、膜をＴＢＳＴで３回洗浄した。１：１０，０００希釈した二次抗体（ＧＥ ｈｅａｌｔｈ）と共に膜を室温で１時間インキュベートし、ＴＢＳＴで膜を５分間洗浄（３回）した。Ｆｅｍｔｏ ＥＣＬ基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、３４０９５）を用いて膜を発色させ、ＣＣＤカメラを使用して画像化した。
免疫蛍光法とＲＮＡ ＦＩＳＨとの併用
５ｕｇ／ｍＬのポリ－Ｌ－オルニチン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｐ４９５７）及び５μｇ／ｍＬのラミニン（Ｃｏｒｎｉｎｇ、３５４２３２）を用いて、それぞれ３０分間及び２時間、カバースリップを３７℃でコートした。事前にコートしたカバースリップ上に細胞を蒔き、２４時間増殖させた後、４％のパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）（ＶＷＲ、ＢＴ１４０７７０）を含むＰＢＳを使用して１０分間固定化した。細胞をＰＢＳで３回洗浄した後、カバースリップを加湿チャンバーに入れるか、またはＰＢＳにおいて４℃で保管した。０．５％のｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｘ１００）を含むＰＢＳを使用して細胞の透過処理を１０分間行った後、ＰＢＳでの洗浄を３回行った。４％のＩｇＧ非含有ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（ＶＷＲ、１０２６４３－５１６）を用いて細胞を３０分間ブロッキングした。その後、ＰＢＳで１：５００希釈した濃度の記載一次抗体と共に細胞を４～１６時間インキュベートした。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、ＰＢＳで１：５０００希釈した濃度の二次抗体と共に１時間インキュベートした。ＰＢＳでの洗浄を２回行った後、４％のパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）（ＶＷＲ、ＢＴ１４０７７０）を含むＰＢＳを使用して細胞を１０分間固定化した。洗浄緩衝液Ａ（２０％のＳｔｅｌｌａｒｉｓ ＲＮＡ ＦＩＳＨ緩衝液Ａ（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、ＳＭＦ－ＷＡ１－６０）、１０％の脱イオン化ホルムアミド（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｓ４１１７）を含むＲＮａｓｅ非含有水（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＡＭ９９３２））を細胞に添加し、５分間インキュベートした。１２．５μＭのＲＮＡプローブを含むハイブリダイゼーション緩衝液（９０％のＳｔｅｌｌａｒｉｓ ＲＮＡ ＦＩＳＨハイブリダイゼーション緩衝液（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＳＭＦ ＨＢ１－１０）及び１０％の脱イオン化ホルムアミド）を細胞に添加し、３７℃で一晩インキュベートした。洗浄緩衝液Ａでの洗浄を３７℃で３０分間行った後、２０μｍ／ｍＬのＨｏｅｃｈｓｔ ３３２５８（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｈ３５６９）において核を５分間染色してから、洗浄緩衝液Ｂ（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＳＭＦＷＢ１－２０）での洗浄を５分間行った。細胞を水で１回洗浄した後、Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（ＶＷＲ、１０１０９８－０４２）を用いてカバースリップをスライドガラス上にマウントし、最終的に、マニキュア液（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ 番号７２１８０）を用いてカバースリップをシールした。画像の取得は、ＭｅｔａＭｏｒｐｈ取得ソフトウェア及びＨａｍｍａｍａｔｓｕ ＯＲＣＡ－ＥＲ ＣＣＤカメラ（Ｗ．Ｍ．Ｋｅｃｋ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｆａｃｉｌｉｔｙ，ＭＩＴ）を使用して、１００×対物レンズを備えたＲＰＩスピニングディスク型共焦点顕微鏡で行った。画像の後処理は、Ｆｉｊｉ Ｉｓ Ｊｕｓｔ ＩｍａｇｅＪ（ＦＩＪＩ）を使用して行った。ＲＮＡ ＦＩＳＨプローブは、Ｎａｎｏｇ及びＴｒｉｍ２８のイントロン領域が標的となって新生ＲＮＡが可視化されようにＡｇｉｌｅｎｔによってカスタム設計及び生成されたものを使用した。
タンパク質精製
ヒトｃＤＮＡを改変バージョンのＴ７ ｐＥＴ発現ベクターにクローニングした。このベースベクターは、５’に６×ＨＩＳ、その下流にｍＥＧＦＰまたはｍＣｈｅｒｒｙのいずれか、及び「ＧＡＰＧＳＡＧＳＡＡＧＧＳＧ」（配列番号１４）という１４個のアミノ酸のリンカー配列を含むように操作した。こうした配列（ＰＣＲによって生成させた）をリンカーアミノ酸と共にフレーム内に挿入するために、ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ（登録商標）ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＮＥＢ Ｅ２６２１Ｓ）を使用した。ｍＥＧＦＰを単独で発現するベクターは、リンカー配列の下流に終始コドンを含む。変異配列は、ＰＣＲによって生成させ、上記のものと同じベースベクターに挿入した。発現コンストラクトはすべて、シークエンシングして配列が変化していないことを確認した。
タンパク質発現については、プラスミドを用いた形質転換をＬＯＢＳＴＲ細胞（Ｃｈｅｓｓｍａｎ Ｌａｂからの供与物）に対して行い、下記のように増殖させた。カナマイシン及びクロラムフェニコールを含むＬＢ培地に新鮮な細菌コロニーを播種し、３７℃で一晩増殖させた。カナマイシン及びクロラムフェニコールを新たに添加した５００ｍｌの室温のＬＢで細胞を１：３０希釈し、１６℃で１．５時間増殖させた。ＩＰＴＧを添加して１ｍＭとし、増殖を２０時間継続した。細胞を収集し、－８０℃で凍結保管した。ＧＦＰを単独で含む細胞、及びＧＦＰ－ＳＲＳＦ２を含む細胞を、ＩＰＴＧによる誘導後に３７℃で５時間増殖させたことを除いて、同様の様式で処理した。
５００ｍｌのｍＣｈｅｒｒｙ－ＳＲＳＦ２発現細胞のペレットを、ｃＯｍｐｌｅｔｅプロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ、１１８７３５８０００１）を含む１５ｍｌの変性緩衝液（５０ｍＭのトリス（７．５）、３００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのイミダゾール、８Ｍの尿素）に再浮遊させ、超音波処理（１５秒間オン、６０秒間オフのサイクルを１０回実施）した。１２，０００ｇで３０分間遠心分離することによって可溶化液を清澄化し、１０倍体積の同じ緩衝液で事前に平衡化しておいた１ｍｌのＮｉ－ＮＴＡアガロース（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｒ９０１－１５）に添加した。このアガロース可溶化液スラリーを含むチューブを室温で１．５時間旋回振とうした。スラリーをカラムに流し込み、１５倍体積の溶解緩衝液で洗浄し、２５０ｍＭのイミダゾールを含む２ｍｌの変性緩衝液で４回溶出処理を行った。各画分を１２％ゲルで泳動させ、正しいサイズのタンパク質の透析を行った。この透析は、最初は緩衝液（５０ｍＭのトリス（ｐＨ７．５）、１２５ＭｍのＮａＣｌ、１ＭｍのＤＴＴ、及び４Ｍの尿素）に対して行い、次に、２Ｍの尿素を含む同じ緩衝液に対して行い、最終的に、１０％のグリセロールを含む尿素非含有緩衝液（この緩衝液による外液交換を２回実施）に対して行った。透析後に生じた沈殿物はいずれも、３，０００ｒｐｍでの１０分間の遠心分離によって除去した。
他のタンパク質もすべて、同様の様式で精製した。１０ｍＭのイミダゾール及びｃＯｍｐｌｅｔｅプロテアーゼ阻害剤を含む１５ｍｌの緩衝液Ａ（５０ｍＭのトリス（ｐＨ７．５）、５００ｍＭのＮａＣｌ）に約５００ｍｌの細胞のペレットを再浮遊させ、超音波処理によって可溶化させ、１２，０００×ｇ、４℃で３０分間遠心分離することによって清澄化し、事前に平衡化した１ｍＬのＮｉ－ＮＴＡアガロースに添加し、４℃で１．５時間旋回振とうした。スラリーをカラムに流し込み、１０ｍＭのイミダゾールを含む１５倍体積の溶解緩衝液で洗浄し、タンパク質の溶出処理を、５０ｍＭのイミダゾールを含む緩衝液で２回、１００ｍＭのイミダゾールを含む緩衝液で２回、２５０ｍＭのイミダゾールを含む緩衝液で３回行った。代替法として、樹脂スラリーを３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、１０ｍＭのイミダゾールを含む緩衝液（１０倍体積）で洗浄し、上記の緩衝液のそれぞれと共に１０分間以上旋回振とうしながらインキュベートすることによってタンパク質を溶出させた後、遠心分離及びゲルでの分析を行った。５０ｍＭのトリス（７．５）、１２５ｍＭのＮａＣｌ、１０％のグリセロール、及び１ｍＭのＤＴＴを含む緩衝液（この緩衝液による外液交換を２回実施）に対して、正しいサイズのタンパク質を含む画分を４℃で透析した。
メディエーターの精製
メディエーター試料の精製は、以前の報告３６に改変を加えて行った。親和性精製を行う前に、硫酸アンモニウム沈殿法（３５％）によってＰ０．５Ｍ／ＱＦＴ画分を濃縮して１２ｍｇ／ｍＬとした。２０ｍＭのＫＣｌ、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、２ｍＭのＭｇＣｌ２、２０％のグリセロールを含むｐＨ７．９の緩衝液にペレットを再懸濁した後、０．１５ＭのＫＣｌ、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、２０％のグリセロール、及び０．０２％のＮＰ－４０を含むｐＨ７．９の緩衝液に対して透析してから、親和性精製ステップに供した。報告３６のように親和性精製を実施し、溶出した材料を、０．１５ＭのＫＣｌ ＨＥＭＧ（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、２ｍＭのＭｇＣｌ２、１０％のグリセロール）を２ｍＬ入れた２．２ｍＬの遠心分離チューブにロードし、５０Ｋ ＲＰＭ、４℃で４時間遠心分離した。この操作を行うことで、過剰な遊離ＧＳＴ－ＳＲＥＢＰが除去され、メディエーターが最終画分に濃縮された。液滴アッセイを行う前に、Ｕｌｔｒａｃｅｌ－３０膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＭＲＣＦ０Ｒ０３０）を備えたＭｉｃｒｏｃｏｎ－３０ｋＤａ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｉｌｔｅｒ Ｕｎｉｔを使用して精製メディエーターをさらに濃縮して、メディエーター複合体の濃度を約３００ｎＭとした。濃縮したメディエーターを、最終濃度が約２００ｎＭとなるようにして液滴アッセイに使用し、その際、１０μＭの記載のＧＦＰタグ付きタンパク質の存在下または非存在下で液滴アッセイを行った。液滴反応には、１０％のＰＥＧ－８０００または１６％のＦｉｃｏｌｌ－４００と１４０ｍＭの塩とを含めた。
クロマチン免疫沈降シークエンシング（ＣｈＩＰ－ｓｅｑ）
２ｉ培地において８０％コンフルエンスになるまでｍＥＳを増殖させた。１％のホルムアルデヒドを含むＰＢＳを使用して細胞における架橋反応を１５分間行った後、最終濃度１２５ｍＭのグリシンを用いて氷上でこの架橋反応を停止した。冷却ＰＢＳで細胞を洗浄し、冷却ＰＢＳにおいて細胞を剥がし取ることによって細胞を収集した。収集した細胞を、１０００ｇ、４℃で３分間ペレット化し、液体窒素中で急速凍結させ、－８０℃で保管した。新たに調製したｃＯｍｐｌｅｔｅプロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ、１１８７３５８０００１）をすべての緩衝液に含めた。リン酸特異的抗体抗体を使用するＣｈＩＰについては、新たに調製したＰｈｏｓＳＴＯＰホスファターゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ、４９０６８３７００１）をすべての緩衝液に含めた。凍結架橋細胞を氷上で解凍した後、ＬＢ１（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ－ＫＯＨ（ｐＨ７．９）、１４０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ ０．５ｍＬ（０．５Ｍ）、１０％のグリセロール、０．５％のＮＰ－４０、１％のＴｒｉｔｏｎＸ－１００、１×プロテアーゼ阻害剤）に再浮遊させ、４℃で２０分間旋回振とうしながらインキュベートした。細胞を１３５０ｇで５分間ペレット化し、ＬＢ２（１０ｍＭのトリス（ｐＨ８．０）、２００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．５ｍＭのＥＧＴＡ、１×プロテアーゼ阻害剤）に再浮遊させ、４℃で５分間旋回振とうしながらインキュベートした。ペレットを３０～５０百万個細胞／ｍｌの濃度でＬＢ３（１０ｍＭのトリス（ｐＨ８．０）、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．５ｍＭのＥＧＴＡ、０．１％のデオキシコール酸ナトリウム、０．５％のラウロイルサルコシンナトリウム、１％のＴｒｉｔｏｎＸ－１００、１×プロテアーゼ阻害剤）に再浮遊させた。Ｃｏｖａｒｉｓ Ｓ２２０を使用して細胞を１２分間超音波処理（デューティサイクル：５％、強度：４、バースト当たりのサイクル数：２００）した。超音波処理した材料を、２００００×ｇ、４℃で３０分間スピンダウンすることによって清澄化した。上清を、可溶性クロマチンとしてＣｈＩＰに使用した。０．５％のＢＳＡを用いて事前にブロッキングしたＤｙｎａｂｅａｄｓを記載の抗体と共に２時間インキュベートした。クロマチンを抗体－ビーズ複合体に添加し、４℃で一晩旋回振とうしながらインキュベートした。洗浄緩衝液１（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）、５００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＥＧＴＡ、１％のＴｒｉｔｏｎ、０．１％のＮａＤｏｃ、０．１％のＳＤＳ）及び洗浄緩衝液２（２０ｍＭのトリス（ｐＨ８）、１ｍＭのＥＤＴＡ、２５０ｍＭのＬｉＣｌ、０．５％のＮＰ－４０、０．５％のＮａＤｏｃ）を用いてビーズを４℃でそれぞれ３回洗浄した後、ＴＥを用いて室温で１回洗浄した。溶出緩衝液（５０ｍＭのトリス（ｐＨ８．０）、１０ｍＭのＥＤＴＡ、１％のドデシル硫酸ナトリウム）をビーズに添加することによってクロマチンを溶出し、６０℃で３０分間振とうしながらインキュベートした。架橋の解除を５８℃で一晩実施した。ＲＮＡを除去するために、ＲＮａｓｅＡを添加し、５０℃で１時間インキュベートした。タンパク質を除去するために、プロテイナーゼＫを添加し、６０℃で１時間インキュベートした。製造者の説明に従ってＱｉａｇｅｎ ＰＣＲ精製キットを使用してＤＮＡを精製し、５０μＬのトリス－ＨＣｌ（１０ｍＭ、ｐＨ８．５）において溶出し、これを定量化及びＣｈＩＰライブラリー調製に使用した。キットの説明に従ってＳｗｉｆｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ａｃｃｅｌ－ＮＧＳ（登録商標）２Ｓ Ｐｌｕｓ ＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｋｉｔを用いてＣｈＩＰライブラリーを調製し、Ｓａｇｅ Ｓｃｉｅｎｃｅから入手したＰｉｐｐｉｎＨＴシステムでサイズ選択ステップを追加で行った。ライブラリーの調製後、ＰｉｐｐｉｎＨＴを使用して２％のゲルでＣｈＩＰライブラリーを泳動させ、２００～６００塩基のサイズ幅での収集を行った。最終的なライブラリーを、Ｒｏｃｈｅから入手したＫＡＰＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎキットを用いるｑＰＣＲによって定量化し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ ２５００で４０塩基のシングルリードモードでシークエンシングした。
リード長に対するパラメーターを－ｋ １ －ｍ １ －ｂｅｓｔ及び－ｌに設定してｂｏｗｔｉｅを使用してｍｍ９バージョンのマウス参照ゲノムへのＣｈＩＰ－Ｓｅｑデータのアライメントを行った。ビンにおけるリードカバレッジを表示するためのＷｉｇｇｌｅファイルは、ＭＡＣＳ（パラメーターを－ｗ －Ｓ －ｓｐａｃｅ＝５０ －ｎｏｍｏｄｅｌ －ｓｈｉｆｔｓｉｚｅ＝２００とした）を使用して作成し、ビン当たりのリード数は、ｗｉｇｇｌｅファイルの作成に使用した数百万のマッピングリードに正規化した。リード数／百万に正規化されたｗｉｇｇｌｅファイルをＵＣＳＣゲノムブラウザーに表示した。メタ遺伝子プロットは、ｎｇｓ．ｐｌｏｔ３７（ｖ２．６１）（デフォルトパラメーターを使用）を使用して作成した。発現遺伝子の上位２０％の計算は、公開ＲＮＡ－ｓｅｑデータセット（ＧＳＥ１１２８０７）９から行った。ＳＲＳＦ２及びＳｅｒ２－Ｐ ＰｏｌＩＩのＣｈＩＰ－ｓｅｑは、ＳＲＳＦ２に対する抗体（Ａｂｃａｍ ａｂ１１８２６）及びＳｅｒ２リン酸化Ｐｏｌ ＩＩ ＣＴＤに対する抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ０４－１５７１）を使用して本試験において得たものであり、ＭＥＤ１及び全Ｐｏｌ ＩＩのＣｈＩＰ－ｓｅｑは、以前に公開されたもの（ＧＳＥ１１２８０８）９である。
平均画像解析
免疫蛍光法を併用するＲＮＡ ＦＩＳＨの解析については、社内カスタムＭＡＴＬＡＢ（登録商標）スクリプトを記述することで、ＲＮＡ ＦＩＳＨチャネル及びＩＦチャネルに集積した３次元画像データを処理及び解析した。強度及びサイズの閾値によって個々のｚ軸スタック画像においてＦＩＳＨフォーカスを同定し、サイズｌ＝２．９μｍのボックスの中心に置き、ｚ軸スタック画像にまたがって３次元で繋ぎ合わせた。同定したＦＩＳＨフォーカスごとに、ＩＦチャネルにおける対応位置に由来するシグナルが、あらゆるｚ軸スライス画像においてＲＮＡ ＦＩＳＨフォーカスを中心とするｌ×ｌ四方に集積される。次に、ＦＩＳＨとＩＦとのペアごとに、ＦＩＳＨフォーカスを中心とするＩＦシグナルが統合され、平均強度プロジェクションが計算されることで、ＦＩＳＨフォーカスを中心とするｌ×ｌ四方内のＩＦシグナル強度の平均データが得られる。自体の座標に中心を置いたＦＩＳＨシグナル強度について同じ処理を実施することで、ＦＩＳＨフォーカスを中心とするｌ×ｌ四方内のＦＩＳＨシグナル強度の平均データを得た。図の説明内には、平均強度プロジェクション当たりの反復測定数が、画像ごとに示される。対照として、これと同じ処理を、無作為に選択された核内位置を中心とするＩＦシグナルにも実施した。反復測定ごとに、サイズ上限（２００ボクセル）閾値及び強度（ＤＮＡ密度）閾値を組み合わせることによって、ＤＡＰＩチャネルから同定した核膜の内部から４０ヶ所の無作為な核内地点を選択した。
次に、こうした平均強度プロジェクションを使用してシグナル強度の２次元等高線図を作成した。等高線図は、ＭＡＴＬＡＢ（登録商標）の組み込み関数を使用して作成されている。等高線図については、示される強度－色範囲は、直線色範囲（ｎ！＝１５）にわたってカスタマイズしたものである。ＦＩＳＨチャネルについては、黒色～マゼンタ色を使用した。ＩＦチャネルについては、本発明者らは、ｃｈｒｏｍａ．ｊｓ（オンラインカラージェネレーター）を使用して１５のビンわたって色を生成させ、主要な変遷色として、黒色、青紫色、ミディアムブルー色、ライム色を選択した。これを行った目的は、読み手が一目でシグナル強度差をより容易に判別し得るようにすることにある。作成したカラーマップを、すべてのＩＦプロットについて、等間隔の１５の強度ビンに用いた。ＦＩＳＨ位置または無作為に選択された核内位置を中心とする平均ＩＦは、同じ色尺度を使用してプロットされ、この色尺度は、各プロットに由来する最小シグナル及び最大シグナルを含むように設定されている。
インビトロの液滴アッセイ
Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ遠心分離フィルター（３０Ｋ ＭＷＣＯ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、組換えＧＦＰ融合タンパク質または組換えｍＣｈｅｒｒｙ融合タンパク質を濃縮及び脱塩することで、タンパク質を適切な濃度とし、ＮａＣｌ濃度を１２５ｍＭとした。図の説明に記載のように液滴形成緩衝液（５０ｍＭのトリス－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０％のグリセロール、１ｍＭのＤＴＴ）中に異なる最終塩濃度（１００～１２５ｍＭ）の塩と、１６％のＦｉｃｏｌｌ－４００または１０％のＰＥＧ－８０００（クラウディング剤）と、を含む溶液に組換えタンパク質を添加した。このタンパク質溶液を、並行に配置された２つの両面テープ片によってカバースリップが取り付けられたスライドガラスから構成される自作チャンバーに直ちにロードした。次に、１５０×対物レンズを備えたＡｎｄｏｒ共焦点顕微鏡を用いてスライドを画像化した。指定がない限り、示される画像は、ガラスのカバースリップ上で安定した状態の液滴のものである。インビトロの液滴のＦＲＡＰについては、２０ｕ秒の画素滞在時間でレーザー（出力２０％）パルスを液滴に２回適用し、回復の画像化をＡｎｄｏｒ顕微鏡で１秒ごとに記載の時間実施した。ＣＤＫ７介在性またはＣＤＫ９介在性のＣＴＤのリン酸化については、市販の活性なＣＤＫ７／ＭＡＴ１／ＣＣＮＨ（ＣＡＫ複合体、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ １４－４７６）またはＣＤＫ９／サイクリンＴ１（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ １４－６８５）を使用することで、キナーゼ反応緩衝液（２０ｍＭのＭＯＰｓ－ＮａＯＨ（ｐＨ７．０）、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．００１％のＮＰ－４０、２．５％のグリセロール、０．０５％のベータ－メルカプトエタノール、１０ｍＭのＭｇＡｃ、１０ｕＭのＡＴＰ）においてＧＦＰ－ＣＴＤ５２を室温で２～３時間リン酸化した。ＣＴＤ：酵素比は、ＣＴＤ約１ｕＭ：ＣＤＫ７またはＣＤＫ９約４．８ｎｇ／ｕｌである。
インビトロ液滴の画像化解析
インビトロでの相分離画像化実験を解析するために、カスタムＭＡＴＬＡＢ（登録商標）スクリプトを記述して液滴を同定し、そのサイズ及び形状を特徴付けた。いずれの具体的な実験条件についても、ヒストグラムのピークに基づく強度閾値、及びサイズ閾値（ｚ軸スライス画像当たり９ピクセル）を用いて画像をセグメント化した。液滴の同定は、「骨格」チャネル（ＭＥＤ１－ＩＤＲ＋ＣＴＤの場合はＭＥＤ１－ＩＤＲ、ＳＲＳＦ２＋ＣＴＤについてはＳＲＳＦ２）で実施し、面積及びアスペクト比を決定した。典型的には画像における５～１０ヶ所の独立領域において同定した数百の液滴を定量化した。ＧＦＰチャネル（すなわちＧＦＰ－ＣＴＤ）を対象として、液滴内の平均強度（Ｃ－イン）及び広域内の平均強度（Ｃ－アウト）を計算した。ＧＦＰ－ＣＴＤの分配係数／濃縮比を、（Ｃ－イン）／（Ｃ－アウト）として計算した。濃縮スコアは、対照ＧＦＰ蛍光タンパク質のＣイン／アウトによって実験条件のＣイン／アウトを割ることによって計算した。
データの入手
本試験において得られたデータセットは、受入番号ＧＳＥ１２０６５６の下でＧｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｍｎｉｂｕｓに登録されている。
参考文献
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実施例７
相分離は、生体分子が希薄相及び濃密相へと別れ、それによって「無膜オルガネラ」を形成する物理化学的プロセスである（１～５）。ＴＦ及びメディエーターコアクチベーターが相分離凝縮体を形成することで、正常な細胞独自性において顕著な役割を有する遺伝子に転写装置をコンパートメント化し、そこに密集させ得ることが最近の研究によって示されている（６～１０）。転写制御不全は、悪性腫瘍をうまく言い表す特徴であるが、がんにおいて凝縮体が担う役割についての我々の理解は限られている（１１～１６）。それ故に、本発明者らは、転写凝縮体が発がん性転写プログラムを誘導するかどうか、がん治療によって転写凝縮体が乱されるかどうか、及び薬物抵抗性状態では転写凝縮体が変化しているかどうかを明らかにすることを試みた。
乳癌は、最も一般的な悪性腫瘍であり、症例の大多数がＥＲ（発がん性ＴＦ）によって誘導される（１７）。ＥＲは、転写装置と相互作用することで、ＭＹＣがん遺伝子を含む、エストロゲン応答性遺伝子の発現を誘導する（１８～２０）。ヒト腫瘍組織におけるＭＹＣに転写凝縮体が生じるかどうかを決定するために、本発明者らは、ＥＲ＋浸潤性乳管癌生検試料に対して、メディエーターのＭＥＤ１サブユニット及びＥＲに対する免疫蛍光法（ＩＦ）をＲＮＡ ＦＩＳＨと併せて実施した（図６８Ａ、図７２Ａ）。本発明者らは、ＥＲ及びＭＥＤ１が、ヒト腫瘍組織における活性なＭＹＣ遺伝子座に生じる核内小斑点のコンポーネントであることを見出し、このことは、本発明者らが転写凝縮体について予測したことと一致する（図６８Ａ、図７２Ｂ）。本発明者らは、実験的により扱いやすいＥＲ＋乳癌細胞株ＭＣＦ７に本発明者らの試験を広げ、エストロゲンの存在下でＭＹＣの転写が活性な部位にＭＥＤ１小斑点及びＥＲ小斑点が形成されることを確認した（図６８Ｂ）。ｍＥＧＦＰタグ付きＭＥＤ１を産生するように操作したＭＣＦ７細胞におけるＭＥＤ１小斑点では、光退色後蛍光回復（ＦＲＡＰ）が急速に生じることが実証され（図６８Ｃ、図７２Ｃ）、このことは、液体様凝縮体について予測される特性と一致する。こうした結果は、ＥＲ及びメディエーターが、乳癌細胞におけるＭＹＣがん遺伝子に転写凝縮体を形成することを示唆するものである。
多種多様ながんにおいて、ＭＹＣがん遺伝子の発現は制御されておらず、腫瘍形成を誘導する（２１）。メディエーターは、いくつかのＴＦのコアクチベーターであり、したがって、多くのがん細胞型では、メディエーター凝縮体がＭＹＣに存在すると予測され得る（２２）。実際、前立腺癌細胞株、多発性骨髄腫細胞株、バーキットリンパ腫細胞株、及び結腸癌細胞株では、転写が活発なＭＹＣ遺伝子座にＭＥＤ１小斑点が見られた（図６８Ｄ）。まとめると、こうした結果は、ＭＹＣ遺伝子が発がん性ドライバーである腫瘍組織及びがん細胞では、メディエーター凝縮体がＭＹＣを占有することを示唆している。
ＥＲ＋乳癌細胞では、ＥＲにエストロゲンが結合すると、ＥＲ標的遺伝子の活性化が増進する（２３）。ＥＲ標的遺伝子でのメディエーター凝縮体の形成をエストロゲンが増進するかどうかを評価するために、本発明者らは、ＭＣＦ７細胞においてＭＹＣ遺伝子座に対するＤＮＡ ＦＩＳＨと併せてＭＥＤ１に対するＩＦを実施した。エストロゲン刺激を受けるとＭＥＤ１シグナルがＭＹＣにおいて増進し（図６９Ａ）、このことは、ＭＹＣ ＲＮＡ発現が増加することによって達成された（図６９Ｂ）。タモキシフェンは、ＥＲのリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）に結合し、ＥＲの活性化潜在力及びＭＥＤ１に対する親和性を低減する立体配座変化を引き起こす抗エストロゲン治療剤である（２４）。タモキシフェン処理を行うと、ＭＹＣにおけるＭＥＤ１シグナルが減少し（図６９Ａ）、これと同時に、ＭＹＣのＲＮＡ発現も減少した（図６９Ｂ）。こうした結果は、がん遺伝子におけるコアクチベーター凝縮体形成及び転写をエストロゲンが刺激し、凝縮体形成及び転写の両方のエストロゲン依存性刺激をタモキシフェンが抑制するというモデルと一致する（図６９Ａ）。
エストロゲン及びタモキシフェンの作用が、コアクチベーター凝縮体のＥＲ ＬＢＤ依存性の形成及び崩壊に起因するものであるかどうかをさらに調べるために、本発明者らは、細胞におけるＬａｃアレイにＥＲ ＬＢＤが繋留されると相分離凝縮体の形成を監視することが可能となる操作系を使用した（図６９Ｃ）（２５、２６）。本発明者らは、細胞がエストロゲンに曝露されると、繋留ＥＲ ＬＢＤがＭＥＤ１含有凝縮体を生じさせ、この凝縮体形成が、タモキシフェンによって阻止されることを見出した（図６９Ｃ）。内在性にタグ付けされたＭＥＤ１－ｍＥＧＦＰ（図７３Ａ、図７３Ｂ）を含むこうした細胞を生細胞画像化すると、タモキシフェンがＥＲ ＬＢＤ－ＭＥＤ１凝縮体を崩壊させることが明らかとなり、これによって、この集合体について予測された動的性質が確認された（図６９Ｄ）。こうした結果は、ＥＲ ＬＢＤのエストロゲン依存性かつタモキシフェン感受性のトランス活性化機能が、細胞におけるエストロゲン依存性かつタモキシフェン感受性のＭＥＤ１含有凝縮体の形成と相関することを示している。
ＥＲ－ＭＥＤ１凝縮体に対するエストロゲン及びタモキシフェンの作用をさらに試験するために、本発明者らは、精製された組換えＥＲ－ＧＦＰ融合タンパク質及び切断型ＭＥＤ１－ｍＣｈｅｒｒｙ融合タンパク質を用いるインビトロの液滴形成アッセイを使用した。以前の報告のように、ＭＥＤ１－ｍＣｈｅｒｒｙは相分離液滴を形成し、この相分離液滴へのＥＲの取り込みは、エストロゲンによって増進した（図６９Ｅ、図７３Ｃ）（６）。ＭＥＤ１凝縮体へのＥＲのエストロゲン刺激性の取り込みは、タモキシフェンによって相殺された（図６９Ｅ、図７３Ｃ）。こうした結果は、エストロゲン応答性がん遺伝子の活性化が、メディエーター凝縮の増進を介して生じ、乳癌において治療効果を有する薬物が、こうした凝縮体の形成を相殺し得るというモデルと一致する（図６９Ｆ）。
抗エストロゲン剤（タモキシフェンなど）は、極めて有効な乳癌治療であるが、抵抗性が生じることが大きな課題として残っている（１７）。抵抗性は複数の機構によって生じ得、こうした機構の多くが、ＥＲとコアクチベーターとの間にホルモン非依存性の相互作用を引き起こし、その結果、遺伝子活性化及び腫瘍増殖を招く（２７）。本発明者らは、ＥＲがコアクチベーターと共に凝縮する能力が腫瘍の増殖及び生存に必要不可欠であるならば、当該転写因子及び当該補助因子が希薄相と凝縮相との間の境界をまたいで移行する能力が変化することによって抗エストロゲン剤抵抗性が達成され得ると推論した。図７０Ａに示されるように、ＴＦ－メディエーター凝縮体の相分離境界をまたぐシフトが、凝縮体を構成するコンポーネントの間の親和性が変化することによって生じ得る（２８）。
抗エストロゲン剤抵抗性乳癌患者では、ＥＲに多様な遺伝子変化が見られ、こうした遺伝子変化には、コアクチベーター相互作用に適した構造立体配座を安定化させるＬＢＤ変異（Ｙ５３７Ｓ及びＤ５３８Ｇ）（２９）、ならびに多様な遺伝子（コアクチベーターＹＡＰ１及び細胞表面タンパク質ＰＣＤＨ１１Ｘを含む）への転座（図７０Ｂ、図７４Ａ）（３０）が含まれる。こうしたＥＲ変異体の凝縮体形成特性を調べるために、本発明者らは、ＥＲ Ｙ５３７Ｓ ＧＦＰ融合タンパク質、ＥＲ Ｄ５３８Ｇ ＧＦＰ 融合タンパク質、ＥＲ－ＹＡＰ１ ＧＦＰ融合タンパク質、及びＥＲ－ＰＣＤＨ１１Ｘ ＧＦＰ融合タンパク質を組換えで生じさせた。野生型ＥＲでは、ＭＥＤ１液滴への取り込みがエストロゲンによって増進し、タモキシフェンによって相殺されるという結果が得られたこととは対照的に、４つすべての変異ＥＲタンパク質が、エストロゲン非依存かつタモキシフェン非感受性の凝縮体をＭＥＤ１と共に形成した（図７０Ｃ～Ｄ、図７４Ｂ）。これらの変異ＥＲタンパク質の相分離能力の変化は、それらのエストロゲン非依存性のトランス活性化潜在力と相関した（図７０Ｅ～Ｇ）（２９、３０）。細胞におけるそれらの凝縮体形成特性を調べるために、細胞におけるＬａｃアレイにそうしたＥＲ ＬＢＤ点変異体を繋留した（図６９Ｃ）。正常なＥＲは、エストロゲンの存在下でのみゲノム遺伝子座にＭＥＤ１凝縮体を生成させた一方で、ＥＲ変異体は、エストロゲンが存在してもしなくてもＭＥＤ１凝縮体を形成させた（図７４Ｃ）。まとめると、こうしたデータは、抗エストロゲン剤抵抗性患者に見られる遺伝子変化が獲得されると、ＥＲ及びＭＥＤ１がエストロゲン非依存的に凝縮することが可能となり、その結果、遺伝子活性化及び腫瘍増殖を招くことを実証するものである。
ＴＦ－メディエーター凝縮体の相分離境界にまたがるシフトは、凝縮体コンポーネント（ＭＥＤ１など）の濃度が変化することによっても生じ得る（図７１Ａ）（８、２８）。タモキシフェンが結合したＥＲは、エストロゲンが結合したＥＲと比較してコアクチベーターに対する親和性が低下した状態となる（３１）。しかしながら、ＭＥＤ１が過剰発現すると、この親和性低下が補われると思われ、ＭＥＤ１過剰発現腫瘍を有する患者では、タモキシフェン治療を行っても再発が生じる可能性がある（３２）。このことと一致して、タモキシフェン抵抗性として選択したＭＣＦ７細胞は、ＭＥＤ１を４倍超過剰発現する（図７１Ｂ）。このことがきっかけとなり、本発明者らは、ＭＥＤ１が高濃度で存在すると、タモキシフェンが結合したＥＲは、コアクチベーターに対する親和性が低下しているにもかかわらず、ＥＲ－ＭＥＤ１凝縮体を形成し、遺伝子を活性化し、がん細胞の生存に影響を及ぼし得るという仮説を立てるに至った。ＭＥＤ１の濃度が上昇すると、タモキシフェンが結合したＥＲとの凝縮体形成が促進され得るという考えを試験するために、本発明者らは、異なるＭＥＤ１濃度でインビトロの液滴実験を実施した。低ＭＥＤ１濃度では、エストロゲンがＥＲに結合すると、ＭＥＤ１凝縮体の形成が促進されたが、ＥＲにタモキシフェンが結合するとこの促進は生じなかった（図７１Ｃ、図７５Ａ）。一方で、ＭＥＤ１濃度が高まると、ＥＲにエストロゲンが結合してもタモキシフェンが結合してもＭＥＤ１凝縮が可能であった（図７１Ｃ、図７５Ａ）。このことが細胞においても生じるかどうかを試験するために、本発明者らは、Ｌａｃアレイに繋留されたＥＲ ＬＢＤを含む細胞におけるＭＥＤ１レベルを変化させた。正常なＭＥＤ１レベルでは、タモキシフェンが存在するとＥＲ ＬＢＤはＭＥＤ１凝縮体を生じさせなかったが（図７１Ｄ）、対照的に、ＭＥＤ１が過剰発現すると、タモキシフェンがＥＲ ＬＢＤに結合しても、ＭＥＤ１凝縮体が生じた（図７１Ｄ）。ＭＥＤ１が過剰に発現することの機能的な結果を調べるために、タモキシフェンが結合したＥＲを用いてＧＡＬ４トランス活性化アッセイを行い、タモキシフェンが結合したＥＲは、ＭＥＤ１の存在レベルが上昇していると、活性化を生じさせた（図７１Ｅ及び図７５Ｂ）。ＭＥＤ１の過剰発現が乳癌細胞における薬物抵抗性に寄与し得るかを確認するために、本発明者らは、ＭＥＤ１を過剰発現するＭＣＦ７細胞を生成させたところ、このＭＣＦ７細胞では、タモキシフェンに対する感受性が低下していた（図７１Ｆ）。こうしたデータは、ＭＥＤ１の過剰発現が、凝縮体形成を増進することによって抗エストロゲン剤抵抗性を媒介し、それによって、がんにおける薬物抵抗性機構としてタンパク質発現及び濃度依存性相分離の調節に関与し得ることを示唆している（図７１Ｇ）。
本発明者らの結果は、転写凝縮体が転写装置をコンパートメント化し、密集させることで、がんにおけるがん遺伝子発現を誘導し、こうした発がん性凝縮体が、臨床的に有効な薬物によって乱し得るものであり、多様な薬物抵抗性機構の進化が、転写凝縮体挙動の調節に収束し得るものであることを示唆している。こうした考えは、腫瘍細胞がドライバーがん遺伝子においてスーパーエンハンサー（ＳＥ）を獲得するという以前の証拠（３３）、発がん性ＳＥが、ＴＦ－ＤＮＡ相互作用がわずかに変化しただけでも獲得され得るものであるという以前の証拠（３４）、及びいくつかのがん遺伝子ＳＥが、ある特定の薬剤によって異常に破壊されやすいという以前の証拠（１１）と一致する。形成と崩壊との移行が急激に生じること、コンポーネント濃度が高いこと、及び特定の化学によって差次的な分配を生じさせる潜在力を有することを含めて、凝縮体に特有の特徴は、こうした知見を説明し得るものである。したがって、凝縮体挙動及び小分子化学によるその調節についての理解を深めることが、がんの状況において有益なこととなる可能性がある。
材料及び方法
細胞培養
ＭＣＦ７細胞（Ｗｅｉｎｂｅｒｇ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙからの供与物）、ＨＣＴ１１６細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－２４７）、約５０，０００個のＬａｃ－リプレッサー結合部位が安定的に組み込まれたアレイを含むＵ２ＯＳ－２６８細胞（これ以後は、「Ｕ２ＯＳ－Ｌａｃ細胞」と称される）（Ｓｐｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙからの供与物）、及びＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－３２１６）は、完全ＤＭＥＭ培地（ＤＭＥＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ １１９９５０７３）、１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｆ４１３５）、１％のＬ－グルタミン（ＧＩＢＣＯ，２５０３０－０８１）、１％のペニシリンストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，１５１４０１６３））において増殖させた。エストロゲンの枯渇については、エストロゲン非含有ＤＭＥＭ（（フェノールレッド非含有ＤＭＥＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、３１０５３０２８）、活性炭処理済ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｆ６７６５）、１％のＬ－グルタミン（ＧＩＢＣＯ、２５０３０－０８１）、１％のペニシリンストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１５１４０１６３））において記載の時間、細胞を増殖させた。
ＬＮ－ＣＡＰ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１７４０）、ＭＭ１Ｓ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－２９７４）、及びＲａｍｏｓ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１５９６）は、完全ＲＰＭＩ培地（ＲＰＭＩ－１６４０（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、６１８７０１２７）、１％のペニシリンストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１５１４０１６３）、１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｆ４１３５））において増殖させた。
ＴａｍＲ７細胞（ＥＣＡＣＣ １６０２２５０９）は、ＴＡＭＲ７培地（フェノールレッド非含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ２１０４１０２５）、１％のＬ－グルタミン（ＧＩＢＣＯ、２５０３０－０８１）、１％のペニシリンストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１５１４０１６３）、１％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｆ４１３５）、６ｎｇ／ｍＬのインスリン（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｓｃ－３６０２４８））において増殖させた。
継代培養については、細胞をＰＢＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＡＭ９６２５）で洗浄した。プレートからの細胞の剥離には、ＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｅｎｚｙｍｅ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１２６０４０２１）を使用した。ＴｒｙｐＬＥの反応停止は、完全ＤＭＥＭを用いて行った。
組織試料
エストロゲン受容体陽性、プロゲステロン受容体陽性、ＨＥＲ２／ｎｅｕ陰性の新鮮凍結非処理浸潤性乳管癌の１０ｕＭ切片は、ＢｉｏＩＶＴから入手した。Ｈ＆Ｅ染色は、試料の入手元の会社によって実施された。
細胞株の生成
Ｕ２ＯＳ－Ｌａｃ細胞において内在性にｍＥＧＦＰタグが付加されるＭＥＤ１の生成には、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を使用した。タンパク質のＮ末端付近のゲノム配列を標的とする２つのガイドＲＮＡをコードするオリゴヌクレオチドを、Ｃａｓ９及びｍＣｈｅｒｒｙを発現するｐｘ３３０ベクター（Ｒ．Ｊａｅｎｉｓｃｈからの供与物）にクローニングした。ＭＥＤ１を標的とするために使用した配列は、５’ＣＣＴＴＣＡＧＧＡＴＧＡＡＡＧＣＴＣＡＧ３’（配列番号２５３）及び５’ＣＣＣＣＴＧＡＧＣＴＴＴＣＡＴＣＣＴＧＡ３’（配列番号２５４）である。ｍＥＧＦＰ、１０個のアミノ酸のＧＳリンカー、及び当該挿入断片に隣接する８００ｂｐのホモロジーアームを含むｐＵＣ１９ベクター（ＮＥＢ）に修復鋳型をクローニングした。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００を使用して１．２５μｇのｐｘ３３０ベクター及び１．２５μｇの修復鋳型を５００ｋ個の細胞にトランスフェクトした。トランスフェクトから２日後に、ｍＣｈｅｒｒｙを含む細胞を選別した。最初の選別から１週間後に、９６ウェルプレートのウェル当たり単一の細胞を用いてｍＥＧＦＰを含む細胞を選別した。細胞を増殖させ、ＰＣＲによって遺伝子型を同定し、ホモ接合型ノックインタグを含むクローンを実験に使用した。
ＭＣＦ７ ｍＥＧＦＰ－ＭＥＤ１細胞を生成させるために、１０個のアミノ酸のＧＳリンカーによって連結されたＮ末端ｍＥＧＦＰ融合部を有する全長ＭＥＤ１を含むピューロマイシン選択マーカー含有レンチウイルスコンストラクトをクローニングした。レンチウイルス粒子の生成は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において行った。６ウェルプレートの１つのウェルに２５０，０００個のＭＣＦ７細胞を蒔き、ウイルス上清を添加した。４８時間後にピューロマイシンを１ｕｇ／ｍＬで添加し、５日間の選択を行った。
タンパク質の産生
目的遺伝子またはそのＩＤＲをコードするｃＤＮＡを改変バージョンのＴ７ ｐＥＴ発現ベクターにクローニングした。ＥＲ及びそのバリアントについては、すべての場合において全長タンパク質を使用した。ＭＥＤ１については、ＥＲと相互作用することが知られるＬＸＸＬＬドメインを含む延長型ＩＤＲ（アミノ酸６００～１５８２を含む）を産生させた。上記のベースベクターは、５’に６×ＨＩＳ、その下流にｍＥＧＦＰまたはｍＣｈｅｒｒｙのいずれか、及び「ＧＡＰＧＳＡＧＳＡＡＧＧＳＧ」（配列番号１４）という１４個のアミノ酸のリンカー配列を含むように操作した。こうした配列（ＰＣＲによって生成させた）をリンカーアミノ酸と共にフレーム内に挿入するために、ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ（登録商標）ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＮＥＢ Ｅ２６２１Ｓ）を使用した。ｍＥＧＦＰまたはｍＣｈｅｒｒｙを単独で発現するベクターは、リンカー配列の下流に終始コドンを含む。変異配列は、ｇｅｎｅｂｌｏｃｋｓ（ＩＤＴ）として合成し、上記のものと同じベースベクターに挿入した。発現コンストラクトはすべて、シークエンシングして配列が変化していないことを確認した。
タンパク質発現プラスミドを用いた形質転換は、ＬＯＢＳＴＲ細胞（Ｃｈｅｓｓｍａｎ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙからの供与物）に対して行った。カナマイシン及びクロラムフェニコールを含むＬＢ培地に新鮮な細菌コロニーを播種し、３７℃で一晩増殖させた。ＭＥＤ１－ＩＤＲコンストラクトを含む細胞を、カナマイシン及びクロラムフェニコールを新たに添加した５００ｍｌの室温のＬＢで１：３０希釈し、１６℃で１．５時間増殖させた。ＩＰＴＧを添加して１ｍＭとし、増殖を２０時間継続した。細胞を収集し、－８０℃で凍結保管した。いずれの他のコンストラクトを含む細胞もまた、ＩＰＴＧによる誘導後に３７Ｃで５時間増殖させたことを除いて、同様の様式で処理した。
５００ｍｌの細胞のペレットを１５ｍｌの緩衝液Ａ（５０ｍＭのトリス（ｐＨ７．５）、５００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのイミダゾール、ｃＯｍｐｌｅｔｅプロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ １１８７２５８０００１））に再浮遊させ、超音波処理（１５秒間オン、６０秒間オフのサイクルを１０回実施）に供した。１２，０００ｇ、４℃で３０分間遠心分離することによって可溶化液を清澄化し、事前に平衡化した１ｍｌのＮｉ－ＮＴＡアガロース（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｒ９０１－１５）に添加し、４℃で１．５時間旋回振とうした。このスラリーを、Ｔｈｅｒｍｏ Ｌｅｇｅｎｄ ＸＴＲスイングバケットローターにおいて３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。５ｍｌの緩衝液Ａで樹脂ペレットを２回洗浄した後、上記のように遠心分離した。２５０ｍＭのイミダゾールを含む２ｍｌの緩衝液Ａでタンパク質を３回溶出させた。サイクルごとに溶出緩衝液を添加し、４Ｃで少なくとも１０分間旋回振とうし、上記のように遠心分離した。溶出液を１２％のアクリルアミドゲルで分析し、クマシーで染色した。予測サイズのタンパク質を含む画分をプールし、２５０ｍＭのイミダゾール緩衝液で１：１希釈し、５０ｍＭのトリス（７．５）、１２５ｍＭのＮａＣｌ、１０％のグリセロール、及び１ｍＭのＤＴＴを含む緩衝液（この緩衝液による外液交換を２回実施）に対して４Ｃで透析した。タンパク質濃度の測定は、Ｔｈｅｒｍｏ ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ－Ｒｅｄｕｃｉｎｇ Ａｇｅｎｔ Ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅによって行った。
免疫蛍光法
ヒト腫瘍組織を１０μｍの厚さにスライスするか、またはポリ－Ｌ－オルニチンでコートされたガラス上で増殖させた細胞をＰＢＳで１回洗浄し、４％のパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）（ＶＷＲ、ＢＴ１４０７７０）において１０分間固定化した。５分間のＰＢＳでの洗浄を３回行った後、細胞を４℃で保管するか、または加湿チャンバーに移し、免疫蛍光法のための処理を行った。０．５％のｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｘ１００）を含むＰＢＳを使用して細胞の透過処理を１０分間行った後、ＰＢＳでの洗浄を３回行った。４％のＩｇＧ非含有ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（ＶＷＲ、１０２６４３－５１６）を用いて細胞を３０分間ブロッキングし、４％のＩｇＧ非含有ウシ血清アルブミンで１：５００希釈した濃度で記載の一次抗体（ＥＲ ａｂ３２０６３、ＭＥＤ１ ａｂ６４９６５）を添加し、４～１６時間インキュベートした。その後にＲＮＡ ＦＩＳＨまたはＤＮＡ ＦＩＳＨを行う場合は、一次抗体の希釈はＰＢＳで行った。細胞をＰＢＳで３回希釈した後、ＰＢＳで１：５００希釈した濃度の二次抗体（ヤギ抗ウサギＩｇＧ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ａ１１００８）と共に１時間インキュベートした。
ＰＢＳでの洗浄を２回行った後、２０μｍ／ｍＬのＨｏｅｃｈｓｔ ３３２５８（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｈ３５６９）において核を５分間洗浄した。次に、細胞を水で１回洗浄した後、Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（ＶＷＲ、１０１０９８－０４２）を用いてカバースリップをスライドガラス上にマウントし、最終的に、マニキュア液（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ 番号７２１８０）を用いてカバースリップをシールした。画像の取得は、ＭｅｔａＭｏｒｐｈ取得ソフトウェア及びＨａｍｍａｍａｔｓｕ ＯＲＣＡ－ＥＲ ＣＣＤカメラ（Ｗ．Ｍ．Ｋｅｃｋ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｆａｃｉｌｉｔｙ，ＭＩＴ）を使用して、１００×対物レンズを備えたＲＰＩスピニングディスク型共焦点顕微鏡で行った。画像の後処理は、Ｆｉｊｉ Ｉｓ Ｊｕｓｔ ＩｍａｇｅＪ（／／ｆｉｊｉ．ｓｃ／のワールドワイドウェブ）を使用して行った。
免疫蛍光法とＲＮＡ ＦＩＳＨとの併用
免疫蛍光法は、上記のように実施した。二次抗体と共に細胞をインキュベートした後、ＰＢＳでの細胞の洗浄を室温で５分間、３回行い、４％のＰＦＡを含むＰＢＳを用いて細胞を１０分間固定化した。ＰＢＳでの洗浄を２回行った後、洗浄緩衝液Ａ（２０％のＳｔｅｌｌａｒｉｓ ＲＮＡ ＦＩＳＨ緩衝液Ａ（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、ＳＭＦ－ＷＡ１－６０）、１０％の脱イオン化ホルムアミド（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｓ４１１７）を含むＲＮａｓｅ非含有水（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＡＭ９９３２））を細胞に添加し、５分間インキュベートした。１２．５μＭのＲＮＡプローブ（Ｃｕｓｔｏｍ Ｓｔｅｌｌａｒｉｓ ＭＹＣプローブ参照番号ＳＳ４６８７９５０１０４）を含むハイブリダイゼーション緩衝液（９０％のＳｔｅｌｌａｒｉｓ ＲＮＡ ＦＩＳＨハイブリダイゼーション緩衝液（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＳＭＦ－ＨＢ１－１０）及び１０％の脱イオン化ホルムアミド）を細胞に添加し、３７℃で一晩インキュベートした。洗浄緩衝液Ａでの洗浄を３７℃で３０分間行った後、２０μｍ／ｍＬのＨｏｅｃｈｓｔ３３２５８（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｈ３５６９）を含むＰＢＳにおいて核を５分間染色してから、洗浄緩衝液Ｂ（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＳＭＦ－ＷＢ１－２０）での洗浄を５分間行った。次に、細胞を水で１回洗浄した後、スライドガラス上へのカバースリップのマウント、シール、画像化、及び後処理を上記のように行った。
免疫蛍光法とＤＮＡ ＦＩＳＨとの併用
２４ウェルプレートにおいてポリ－Ｌ－オルニチンでコートされたカバースリップ上で、エストロゲン非含有ＤＭＥＭにおいてＭＣＦ７細胞を３日間増殖させ、その際、初期の細胞播種密度をウェル当たり５０，０００個とした。次に、媒体、１０ｕＭのエストラジオール、または１０ｕＭのエストラジオール及び５ｕＭの４－ヒドロキシタモキシフェンで細胞を４５分間処理した。次に、カバースリップ上の細胞を４％のパラホルムアルデヒドにおいて固定化した。免疫蛍光法は、上記のように実施した。細胞を二次抗体と共にインキュベートした後、ＰＢＳで細胞を室温で５分間、３回洗浄し、４％のＰＦＡを含むＰＢＳを用いて１０分間固定化し、ＰＢＳで３回洗浄した。７０％のエタノール、８５％のエタノール、次いで１００％のエタノールにおいて細胞を室温で１分間インキュベートした。７μＬのＦＩＳＨハイブリダイゼーション緩衝液（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｇ９４００Ａ）、１μｌのＦＩＳＨプローブ（ＳｕｒｅＦＩＳＨ ８ｑ２４．２１ ＭＹＣ ２９４ｋｂ Ｇ１０１２１１Ｒ－８）、及び２μＬの水を混合してプローブハイブリダイゼーション混合物を調製した。５μＬの混合物をスライド上に添加し、カバースリップを上に被せた（細胞側の面がハイブリダイゼーション混合物と接するようにした）。ゴムのりを使用してカバースリップをシールした。ゴムのりが固化した時点で、ゲノムＤＮＡ及びプローブを７８℃で５分間変性させ、スライドを暗所、１６℃で一晩インキュベートした。スライドからカバースリップを剥がし、予熱した洗浄緩衝液１（Ａｇｉｌｅｎｔ、Ｇ９４０１Ａ）において７３℃で２分間インキュベートし、洗浄緩衝液２（Ａｇｉｌｅｎｔ、Ｇ９４０２Ａ）において室温で１分間インキュベートした。スライドを風乾し、２０μｍ／ｍＬのＨｏｅｃｈｓｔ ３３２５８（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｈ３５６９）を含むＰＢＳにおいて核を室温で５分間染色した。ＰＢＳでカバースリップを３回洗浄した後、スライドガラス上へのカバースリップのマウント、シール、画像化、及び後処理を上記のように行った。
ＲＴ－ｑＰＣＲ
ＭＣＦ７細胞のエストロゲンを３日間枯渇させた後、１０ｎＭのエストロゲン、または１０ｎＭのエストロゲン及び５ｕＭの４－ヒドロキシタモキシフェンのいずれかを用いてＭＣＦ７細胞を２４時間刺激した。ＡｌｌＰｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ ８０２０４）によってＲＮＡを単離した後、Ｈｉｇｈ－Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｓ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４３６８８１４）を使用してｃＤＮＡを合成した。ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ６ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）でＰｏｗｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ｍｉｘ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ 番号４３６７６５９）を使用して生物学的かつ技術的に３回反復測定してｑＰＣＲを実施した。ｑＰＣＲでは、下記のオリゴを使用した；Ｍｙｃ ｆｗｄ ＡＡＣＣＴＣＡＣＡＡＣＣＴＴＧＧＣＴＧＡ（配列番号２５５）、ＭＹＣ ｒｅｖ ＴＴＣＴＴＴＴＡＴＧＣＣＣＡＡＡＧＴＣＣＡＡ（配列番号２５６）、ＧＡＰＤＨ ｆｗｄ ＴＧＣＡＣＣＡＣＣＡＡＣＴＧＣＴＴＡＧＣ（配列番号２５７）、ＧＡＰＤＨ ｒｅｖ ＧＧＣＡＴＧＧＡＣＴＧＴＧＧＴＣＡＴＧＡＧ（配列番号２５８）。倍率変化を計算し、ＭＹＣの発現値は、ＧＡＰＤＨの発現量に正規化した。
Ｌａｃ結合アッセイ
ＣＦＰ－ＬａｃＩ融合タンパク質の発現を誘導するＳＶ４０プロモーターを含むｐＳＶ２哺乳類発現ベクターにおいて、ＮＥＢ ＨＩＦＩクローニングによってコンストラクトを構築した。この組換えタンパク質のＣ末端に対してＥＳＲ１の活性化ドメイン及び変異活性化ドメインを融合し、この融合では、ＧＡＰＧＳＡＧＳＡＡＧＧＳＧ（配列番号１４）という配列のリンカーを連結に使用した。いくつかの実験については、ＣＦＰの代わりにｍＣｈｅｒｒｙを含むバリアントプラスミドを使用した。Ｕ２ＯＳ－Ｌａｃ細胞のエストロゲンを２４時間枯渇させた。次に、フィブロネクチンでコートされたガラスのカバースリップ上に細胞を蒔き、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｌ３００００１５）を使用して細胞へのトランスフェクトを行った。ＭＥＤ１高濃度条件については、ＧＦＰと融合したＭＥＤ１の発現を誘導するＰＧＫプロモーターを含む哺乳類発現ベクターを用いたコンストラクトをコトランスフェクトした。トランスフェクトから２４時間後、ＤＭＳＯ、ＤＭＳＯにおいて再構成した１０ｎＭのＢ－エストラジオール（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｅ８８７５）、またはＤＭＳＯにおいて再構成した１ｕＭの４－ヒドロキシタモキシフェン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｈ７９０４）のいずれかを用いて細胞を４５分間処理した。処理後、細胞を固定化し、上記のようにＭＥＤ１抗体を用いて免疫蛍光法を実施した。
Ｌａｃアレイ画像解析
Ｌａｃアレイデータの解析については、カスタムＰｙｔｈｏｎスクリプトを記述することで、Ｌａｃチャネル及びタグ付きタンパク質チャネルに集積した画像データを処理及び解析した。ガウシアンフィルター（シグマ＝２．０）を用いて核染色をぼかし、Ｋ平均法によって２つのクラスター（核及びバックグラウンド）にクラスター化した。次に、ｍｅａｓｕｒｅ．ｌａｂｅｌ関数を使用してｐｙｔｈｏｎ ｓｃｉｋｉｔ－ｉｍａｇｅパッケージで核を標識した。Ｌａｃスポットをセグメント化するために、Ｌａｃ画像チャネルを、ガウシアンフィルター（シグマ＝２．０）を用いてぼかし、画像に強度閾値（平均値＋１．５＊標準偏差）を適用した。次に、セグメント化した領域（ｍｅａｓｕｒｅ．ｌａｂｅｌによっても決定される）を、最小面積（１５０ピクセル）、最大面積（２０００ピクセル）、円形度（ｃ＝４π＊面積／周囲長＾２；０．８）、及び核内存在判定（上記のマスクによって定義される）に基づいてフィルタリングした。正規化濃縮比は、セグメント化Ｌａｃスポットにおけるタグ付きタンパク質の平均強度を決定し、この平均強度を、同じ全体核に存在するタグ付きタンパク質の平均強度で割ることによって計算した。
生細胞画像化
Ｕ２ＯＳ－Ｌａｃ細胞の生細胞での処理については、内在性にタグ付けされたＧＦＰ－ＭＥＤ１を含むＵ２ＯＳ－Ｌａｃ細胞のエストロゲンを２４時間欠乏させた後、このＵ２ＯＳ－Ｌａｃ細胞をポリ－Ｌ－オルニチンでコートされた（Ｓｉｇｍａ－ＡｌｄｒｉｃｈＡ－００４）ディッシュ上に蒔き、ｍＣｈｅｒｒｙ－ＬａｃＩ－ＥＳＲ１融合体を含むプラスミドを当該Ｕ２ＯＳ－Ｌａｃ細胞にトランスフェクトした。２４時間後、１０ｎＭのＢ－エストラジオールを用いて細胞を４５分間処理した。ＤＭＳＯまたは１０ｕＭの４－ヒドロキシタモキシフェンをエストロゲン非含有ＤＭＥＭで１：１０００希釈した溶液を用いる処理の前及び３０分後に細胞を画像化した。定量化は、ＦＩＪＩにおいて実施した。アレイにおける平均シグナル強度から機器バックグラウンドを差し引いた後、このシグナル強度差を、平均核シグナルから機器バックグラウンドを差し引いたもので割ることで、正規化シグナル強度を得た。３０分時点の正規化シグナル強度を、０分時点のものによって割ることで、タモキシフェン処理検体または媒体処理検体の相対強度を得た。
生細胞でのＦＲＡＰ実験については、内在性にタグ付けされたＵ２ＯＳ－Ｌａｃ細胞またはＭＥＤ１－ｍＥＧＦＰ ＭＣＦ７細胞を、ポリ－Ｌ－オルニチンでコートされたガラス底の組織培養プレートに蒔いた。上記のようにＢ－エストラジオールでＵ２ＯＳ－Ｌａｃ細胞を処理した。５０ｕ秒の画素滞在時間でレーザーのパルスをアレイに２０回適用し、回復の画像化をＡｎｄｏｒ顕微鏡で１秒ごとに記載の時間実施した。定量化は、ＦＩＪＩにおいて実施した。
ＭＣＦ７ ＭＥＤ１－ｍＥＧＦＰのＦＲＡＰについては、退色を行った小斑点における平均シグナル強度から機器バックグラウンドを差し引いた後、このシグナル強度差を、対照小斑点から機器バックグラウンドを差し引いたもので割った。Ｕ２ＯＳ－Ｌａｃ ＭＥＤ１－ｍＥＧＦＰのＦＲＡＰについては、ｌａｃアレイにおけるＭＥＤ１シグナルの退色実施部分における平均シグナル強度から機器バックグラウンドを差し引いた後、このシグナル強度差を、核内の対照領域から機器バックグラウンドを差し引いたもので割った。こうした値を秒ごとにプロットし、９５％信頼区間を有する最良適合線を計算した。
インビトロの液滴アッセイ及び定量化
Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ遠心分離フィルター（３０Ｋ ＭＷＣＯ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して組換えＧＦＰ融合タンパク質または組換えｍＣｈｅｒｒｙ融合タンパク質を濃縮及び脱塩することで、タンパク質を適切な濃度とし、ＮａＣｌ濃度を１２５ｍＭとした。液滴形成緩衝液（５０ｍＭのトリス－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０％のグリセロール、１ｍＭのＤＴＴ）中に異なる濃度（記載の最終塩濃度）の塩及び１０％のＰＥＧ－８０００（クラウディング剤）を含む溶液に組換えタンパク質を添加した。このタンパク質溶液を、並行に配置された２つの両面テープ片によってカバースリップが取り付けられたスライドガラスから構成される自作チャンバーに直ちにロードした。次に、１５０×対物レンズを備えたＡｎｄｏｒ共焦点顕微鏡を用いてスライドを画像化した。指定がない限り、示される画像は、ガラスのカバースリップ上で安定した状態の液滴のものである。Ｂ－エストラジオール（Ｅ８８７５ Ｓｉｇｍａ）または４－ヒドロキシタモキシフェン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｈ７９０４）を１００％のＥｔＯＨで再構成して１０ｍＭとした後、１２５ｍＭのＮａＣｌを含む液滴形成緩衝液で希釈して１ｍＭとした。１０ｕＬの液滴形成反応液においてこの高濃度貯蔵液を１マイクロリットル使用して最終濃度を１００ｕＭとした。インビトロの液滴アッセイのための濃縮を計算するために、ＭＥＤ１骨格チャネルによって液滴をＦＩＪＩの目的領域として定義し、その液滴内のＥＲクライアントの最大シグナルを決定した。あるいは、ＭＥＤ１の最大シグナルを測定した。すべての場合において、画像における最大シグナルをバックグラウンドクライアントシグナルで割ることでＣイン／アウトを得た。
Ｇａｌ４転写アッセイ
ＧＡＬ４ ＤＮＡ結合ドメインの発現を誘導するＳＶ４０プロモーターを含む哺乳類発現ベクターにおいて転写因子コンストラクトを構築した。このＤＮＡ結合ドメインのＣ末端に対してＥＳＲ１の野生型活性化ドメイン及び変異活性化ドメインを、Ｇｉｂｓｏｎクローニング（ＮＥＢ ２６２１Ｓ）によって融合し、この融合では、ＧＡＰＧＳＡＧＳＡＡＧＧＳＧ（配列番号１４）という配列のリンカーを連結に使用した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－３２１６）のエストロゲンを２４時間枯渇させた後、このＨＥＫ２９３Ｔ細胞を白色の平底９６ウェルアッセイプレート（Ｃｏｓｔａｒ ３９１７）に蒔いた。２４時間後に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｌ３００００１５）を使用して転写因子コンストラクトのトランスフェクトを行った。こうしたコンストラクトを、ホタルルシフェラーゼ遺伝子の上流に５つのＧＡＬ４上流活性化部位を含む改変バージョンのＰＧＬ３－Ｂａｓｉｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ）ベクターと共にコトランスフェクトした。ｐＲＬ－ＳＶ４０（Ｐｒｏｍｅｇａ）もまた、コトランスフェクトした。ｐＲＬ－ＳＶ４０は、ＳＶ４０プロモーターによって誘導されるウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子を含むプラスミドである。ＭＥＤ１の高濃度条件については、ＧＦＰと融合したＭＥＤ１の発現を誘導するＰＧＫプロモーターを含む哺乳類発現ベクターを用いたコンストラクトをコトランスフェクトした。トランスフェクトした時点で、記載のようにＤＭＳＯ、１０ｎＭのＢ－エストラジオール、または１ｕＭのタモキシフェンの１：１０００希釈液で細胞を処理した。ＭＥＤ１の過剰発現実験については、１０ｎＭのタモキシフェンを用いて細胞を処理した。トランスフェクトから２４時間後、各ルシフェラーゼタンパク質によって生じる発光を、Ｄｕａｌ－ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｅ２９２０）を使用して測定した。示されるデータは、ウミシイタケルシフェラーゼの発現量として示されており、ＥＲ－ＬＢＤエストロゲン枯渇条件のものに正規化されている。
ハイスループットシークエンシングデータセット及び視覚化
エストロゲンで刺激したＭＣＦ細胞から得られたＭＥＤ１及びＥＳＲ１のＣｈＩＰ－Ｓｅｑ（ＧＥＯ受入番号ＧＳＥ６０２７０）ならびにＭＣＦ７ ＣＴＣＦ ＣｈＩＡ－ＰＥＴ（ＧＥＯ受入番号ＧＳＥ９２８８１）は、公的な入手元から入手し、ＵＣＳＣ ブラウザーで視覚化した（ｈｔｔｐｓ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／ｃｇｉ－ｂｉｎ／ｈｇＧａｔｅｗａｙ）。
Ｃｂｉｏｐｏｒｔａｌデータの取得
患者変異の頻度については、任意の乳癌シークエンシングデータセットに存在するＥＳＲ１変異についてｃｂｉｏｐｏｒｔａｌ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｉｏｐｏｒｔａｌ．ｏｒｇ／）を検索した。
ウエスタンブロット
プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ、１１６９７４９８００１）を含むＣｅｌｌ Ｌｙｔｉｃ Ｍ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃ２９７８）において細胞を溶解させた。３％～８％のトリス酢酸ゲルまたは１０％のビス－トリスゲルまたは３～８％のビス－トリスゲルにおいて８０Ｖで可溶化液を約２時間泳動させた後、色素の最前部がゲルの末端に達するまで１２０Ｖで泳動を行った。次に、氷冷転写緩衝液（２５ｍＭのトリス、１９２ｍＭのグリシン、１０％のメタノール）において、孔径０．４５μｍのＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＩＰＶＨ０００１０）へと３００ｍＡ、４℃でタンパク質を湿潤状態で２時間転写した。転写後、５％の無脂肪乳を含むＴＢＳにおいて膜を振とうしながら室温で１時間ブロッキングした。次に、５％の無脂肪乳を含むＴＢＳＴで１：１，０００希釈した記載の抗体（ＥＲ ａｂ３２０６３、ＭＥＤ１ ａｂ６４９６５）と共に膜をインキュベートし、振とうしながらインキュベートを４℃で一晩継続した。朝に、ＴＢＳＴを用いて膜の洗浄を３回行い、その際、洗浄ごとに、室温で振とうしながら膜の洗浄を５分間行った。１：５，０００希釈した二次抗体と共に膜を室温で１時間インキュベートし、ＴＢＳＴを用いる５分間の膜の洗浄を３回行った。ＥＣＬ基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、３４０８０）を用いて膜を発色させ、ＣＣＤカメラを使用して画像化するか、もしくはフィルムを使用して感光させるか、または高感度ＥＣＬを用いて膜を発色させた。ウエスタンブロットの定量化は、ＢｉｏＲａｄ ｉｍａｇｅ ｌａｂを使用して実施した。
ＭＣＦ７生存アッセイ
ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポゼース、及びＭＥＤ１－ｍＡｐｐｌｅを含むＰｉｇｇｙＢａｃ組み込みベクターをＭＣＦ７細胞にトランスフェクトし、２ｕｇ／ｍｌのドキシサイクリンの存在下で増殖させた。５日後、ｍＡｐｐｌｅを高レベルで発現する細胞を選別した。次に、親ＭＣＦ７細胞、またはＭＥＤ１－ｍＡｐｐｌｅを発現するＭＣＦ７細胞を、ウェル当たり５０，０００個として、完全ＤＭＥＭを含む２４ウェルプレートに播種した。１日後、媒体（ＤＭＳＯ）または２５ｕＭの４－ヒドロキシタモキシフェンのいずれかを含む培地への培地交換を行った。４８時間後、Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ－Ｇｌｏによってウェルをアッセイすることで、白色底の９６ウェルプレートにおけるＡＴＰの量をＴｅｃａｎプレートリーダーで定量化した。処理ウェルにおけるルシフェラーゼシグナルを、媒体処理ウェルにおけるシグナルで割ったものとしてとして、生存パーセントを計算し、データは、相対生存率を得るために、処理行った場合の生存パーセントを、媒体で処理した場合の生存パーセントで割ったものとして示される。
ＦＩＳＨ－ＩＦ平均画像解析
免疫蛍光法を併用するＲＮＡ／ＤＮＡ ＦＩＳＨの解析については、カスタムＰｙｔｈｏｎスクリプトを記述することで、ＦＩＳＨチャネル及びＩＦチャネルに集積した三次元画像データを処理及び解析した。ガウシアンフィルター（シグマ＝２．０）を用いて核染色をぼかし、ｚ軸平面に最大限プロジェクションし、Ｋ平均法によって２つのクラスター（核及びバックグラウンド）にクラスター化した。ＦＩＳＨフォーカスを、ＩｍａｇｅＪを用いて手動で特定するか、またはｓｃｉｐｙ ｎｄｉｍａｇｅパッケージを使用して自動で特定した。自動検出については、ＦＩＳＨチャネルに強度閾値（平均値＋３＊標準偏差）を適用した。次に、ｎｄｉｍａｇｅ ｆｉｎｄ＿ｏｂｊｅｃｔｓ関数を使用して近接ＦＩＳＨフォーカスを三次元で特定した。こうしたＦＩＳＨフォーカスをさまざまな判定基準（サイズ（最小ボクセル１００）、最大ｚ軸プロジェクションの円形度（円形度＝４π＊面積／周囲長＾２；０．７）、及び核内存在判定（上記の核マスクによって決定される）を含む）によってフィルタリングした。手動特定については、ＦＩＳＨチャネルの最大ｚ軸プロジェクションにおいてＦＩＳＨフォーカスを同定し、そのｘ座標及びｙ座標を参照点として使用することで、上記の自動検出をガイドした。次に、当該ＦＩＳＨフォーカスを三次元ボックス（サイズ長ｌ＝３．０μｍ）の中心に置いた。次に、ＦＩＳＨとＩＦとのペアごとに、ＦＩＳＨフォーカスを中心とするＩＦシグナルが統合され、平均強度プロジェクションが計算されることで、ＦＩＳＨフォーカスを中心とするｌ×ｌ四方内のＩＦシグナル強度の平均データが得られる。対照として、これと同じ処理を、同数の無作為に選択された核内位置に中心を置いたＩＦシグナルにも実行した。次に、こうした平均強度プロジェクションを使用してシグナル強度の２次元等高線図を作成した。等高線図の作成は、ｍａｔｐｌｏｔｌｉｂ ｐｙｔｈｏｎパッケージを使用して行った。等高線図については、示される強度－色範囲は、直線色範囲（ｎ！＝１５）にわたってカスタマイズしたものである。ＦＩＳＨチャネルについては、黒色～マゼンタ色を使用した。ＩＦチャネルについては、本発明者らは、ｃｈｒｏｍａ．ｊｓ（オンラインカラージェネレーター）を使用して１５のビンわたって色を生成させ、主要な変遷色として、黒色、青紫色、ミディアムブルー色、ライム色を選択した。これを行った目的は、読み手が一目でシグナル強度差をより容易に判別し得るようにすることにある。作成したカラーマップを、すべてのＩＦプロットについて、等間隔の１５の強度ビンに用いた。ＦＩＳＨ位置または無作為に選択された核内位置を中心とする平均ＩＦは、同じ色尺度を使用してプロットされ、この色尺度は、各プロットに由来する最小シグナル及び最大シグナルを含むように設定されている。
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２８．Ｓ．Ｆ．Ｂａｎａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｐｈａｓｅ－Ｓｅｐａｒａｔｅｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｏｄｉｅｓ．Ｃｅｌｌ １６６，６５１－６６３（２０１６）．
２９．Ｓ．Ｗ．Ｆａｎｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｅｓｔｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｌｐｈａ ｓｏｍａｔｉｃ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ Ｙ５３７Ｓ ａｎｄ Ｄ５３８Ｇ ｃｏｎｆｅｒ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｂｙ ｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ ｔｈｅ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｆｕｎｃｔｉｏｎ－２ ｂｉｎｄｉｎｇ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｅｌｉｆｅ ５，（２０１６）．
３０．Ｊ．Ｔ．Ｌｅｉ ｅｔ ａｌ．，Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ ｏｆ ＥＳＲ１ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎｓ ｉｎ Ｅｓｔｒｏｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ－Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ ２４，１４３４－１４４４ ｅ１４３７（２０１８）．
３１．Ｍ．Ｓ．Ｏｚｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｌｉｇａｎｄ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ ｏｆ ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｔｏ ｅｓｔｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｕｓｉｎｇ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ．Ｍｏｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ １９，２５－３４（２００５）．
３２．Ａ．Ｎａｇａｌｉｎｇａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｄ１ ｐｌａｙｓ ａ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｒｏｌｅ ｉｎ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｔａｍｏｘｉｆｅｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ ３３，９１８－９３０（２０１２）．
３３．Ｄ．Ｈｎｉｓｚ ｅｔ ａｌ．，Ｓｕｐｅｒ－ｅｎｈａｎｃｅｒｓ ｉｎ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｃｅｌｌ ｉｄｅｎｔｉｔｙ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｃｅｌｌ １５５，９３４－９４７（２０１３）．
３４．Ｍ．Ｒ．Ｍａｎｓｏｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ．Ａｎ ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ ｓｕｐｅｒ－ｅｎｈａｎｃｅｒ ｆｏｒｍｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ｓｏｍａｔｉｃ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｎｃｏｄｉｎｇ ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃ ｅｌｅｍｅｎｔ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４６，１３７３－１３７７（２０１４）．
本発明の態様として以下のものが挙げられる。
項１
１つ以上の遺伝子の転写を調節する方法であって、前記方法が、前記１つ以上の遺伝子と結び付く凝縮体の形成、組成、維持、崩壊、活性、及び／または制御を調節することを含み、前記凝縮体が、転写凝縮体、ヘテロクロマチン凝縮体、またはｍＲＮＡ開始複合体もしくはｍＲＮＡ伸長複合体と物理的に結び付く凝縮体である、前記方法。
項２
前記凝縮体が、前記凝縮体と結び付くコンポーネントの結合価を増加または減少させることによって調節される、項１記載の方法。
項３
前記凝縮体が、前記凝縮体を、前記凝縮体のコンポーネントの天然変性ドメインの１つ以上と相互作用する薬剤と接触させることによって調節される、項１～２に記載の方法。
項４
前記コンポーネントが、シグナル伝達因子、メチルＤＮＡ結合タンパク質、遺伝子サイレンシング因子、ＲＮＡポリメラーゼ、スプライシング因子、ＢＲＤ４、メディエーター、メディエーターコンポーネント、ＭＥＤ１、ＭＥＤ１５、転写因子、または核内受容体リガンドである、項２～３に記載の方法。
項５
前記シグナル伝達因子が、ＴＣＦ７Ｌ２、ＴＣＦ７、ＴＣＦ７Ｌ１、ＬＥＦ１、ベータ－カテニン、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ２、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ４、ＳＴＡＴ５Ａ、ＳＴＡＴ５Ｂ、ＳＴＡＴ６、及びＮＦ－κＢからなる群から選択される、項４に記載の方法。
項６
前記シグナル伝達因子が、１つ以上の天然変性ドメインを含む、項４または項５に記載の方法。
項７
前記シグナル伝達因子が、前記転写凝縮体と結び付く１つ以上のシグナル応答エレメントまたはメディエーターに優先的に結合する、項４～６に記載の方法。
項８
前記転写凝縮体が、マスター転写因子を含む、項４～７に記載の方法。
項９
前記メチルＤＮＡ結合タンパク質が、メチル化ＤＮＡに優先的に結合する、項４に記載の方法。
項１０
前記メチルＤＮＡ結合タンパク質が、ＭＥＣＰ２、ＭＢＤ１、ＭＢＤ２、ＭＢＤ３、またはＭＢＤ４である、項４または項９に記載の方法。
項１１
前記メチルＤＮＡ結合タンパク質が、遺伝子サイレンシングと結び付く、項４、項９、または項１０に記載の方法。
項１２
前記遺伝子サイレンシング因子が、ヘテロクロマチンと結び付く、項４に記載の方法。
項１３
前記遺伝子サイレンシング因子が、ＨＰ１α、ＴＢＬ１Ｒ（トランスデューシンベータ様タンパク質）、ＨＤＡＣ３（ヒストン脱アセチル化酵素３）、またはＳＭＲＴ（レチノイン酸受容体及び甲状腺受容体のサイレンシングメディエーター）である、項４または項１２に記載の方法。
項１４
前記ＲＮＡポリメラーゼが、ｍＲＮＡ開始複合体またはｍＲＮＡ伸長複合体と物理的に結び付く、項４に記載の方法。
項１５
前記ＲＮＡポリメラーゼが、ＲＮＡポリメラーゼＩＩまたはＲＮＡポリメラーゼＩＩ Ｃ末端領域である、項４または項１４に記載の方法。
項１６
前記ＲＮＡポリメラーゼＩＩ Ｃ末端領域が、天然変性領域（ＩＤＲ）を含む、項１５に記載の方法。
項１７
前記ＩＤＲが、リン酸化部位を含む、項１６に記載の方法。
項１８
前記スプライシング因子が、ＳＲＳＦ２、ＳＲＲＭ１、またはＳＲＳＦ１である、項４に記載の方法。
項１９
前記転写因子が、ＯＣＴ４、ｐ５３、ＭＹＣ、ＧＣＮ４、ＮＡＮＯＧ、ＭｙｏＤ、ＫＬＦ４、ＳＯＸファミリーの転写因子、ＧＡＴＡファミリーの転写因子、核内受容体、遺伝子サイレンシング因子、または融合発がん性転写因子である、項４に記載の方法。
項２０
前記核内受容体が、核内ホルモン受容体（ＮＨＲ）である、項１９に記載の方法。
項２１
前記核内受容体が、関連リガンドに結合すると転写を活性化する、項１９～２０に記載の方法。
項２２
前記関連リガンドが、ホルモンである、項２１に記載の方法。
項２３
前記核内受容体が、関連リガンドに結合することなく転写を活性化する変異核内受容体である、項１９～２１に記載の方法。
項２４
前記核内受容体が、エストロゲン受容体（ＥＲ）、構成的活性を有する変異ＥＲ、またはレチノイン酸受容体－アルファ（ＲＡＲａ）である、項１９～２３に記載の方法。
項２５
前記ＳＯＸファミリーの転写因子が、ＳＯＸ２である、項１９に記載の方法。
項２６
ＧＡＴＡファミリーの転写因子が、ＧＡＴＡ２である、項１９に記載の方法。
項２７
前記遺伝子サイレンシング因子が、ヘテロクロマチンと結び付く、項１９に記載の方法。
項２８
前記薬剤が、ペプチド、核酸、または小分子を含む、項３～２７に記載の方法。
項２９
前記ペプチドが、酸性アミノ酸の含量が高められたものである、項２８に記載の方法。
項３０
前記薬剤が、シグナル伝達因子模倣物である、項３～２９に記載の方法。
項３１
前記薬剤が、シグナル伝達因子アンタゴニストである、項３～２９に記載の方法。
項３２
前記薬剤が、リン酸化もしくは低リン酸化されたＲＮＡポリメラーゼＩＩ Ｃ末端ドメイン（ＰｏｌＩＩ ＣＴＤ）またはその機能性断片を含む、項３～２９に記載の方法。
項３３
前記薬剤が、低リン酸化されたＰｏｌＩＩ ＣＴＤに優先的に結合する、項３２に記載の方法。
項３４
前記薬剤が、メチル化ＤＮＡに結合する、項３～２９に記載の方法。
項３５
前記薬剤が、メチルＤＮＡ結合タンパク質に結合する、項３～２９に記載の方法。
項３６
前記薬剤との接触によって前記凝縮体が安定化または崩壊し、それによって前記１つ以上の遺伝子の転写が調節される、項３～３５に記載の方法。
項３７
前記凝縮体が、前記凝縮体のコンポーネントへの、前記凝縮体と結び付く転写因子の結合を調節することによって調節される、項１～３６に記載の方法。
項３８
前記凝縮体のコンポーネントへの前記転写因子の活性化ドメインの結合が調節される、項３７に記載の方法。
項３９
前記凝縮体の前記コンポーネントが、コアクチベーター、補助因子、シグナル伝達因子、メチルＤＮＡ結合タンパク質、スプライシング因子、遺伝子サイレンシング因子、ＲＮＡポリメラーゼ、または核内受容体リガンドである、項３７～３８に記載の方法。
項４０
前記コアクチベーター、補助因子、シグナル伝達因子、メチルＤＮＡ結合タンパク質、スプライシング因子、遺伝子サイレンシング因子、ＲＮＡポリメラーゼ、または核内受容体リガンドが、メディエーター、メディエーターコンポーネント、ＭＥＤ１、ＭＥＤ１５、ｐ３００、ＢＲＤ４、ＴＦＩＩＤ、β－カテニン、ＳＴＡＴ３、ＳＭＡＤ３、ＮＦ－ｋＢ、ＭＥＣＰ２、ＭＢＤ１、ＭＢＤ２、ＭＢＤ３、ＭＢＤ４、ＨＰ１α、ＴＢＬ１Ｒ、ＨＤＡＣ３、ＳＭＲＴ、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ、ＳＲＳＦ２、ＳＲＲＭ１、ＳＲＳＦ１、またはホルモンである、項３９に記載の方法。
項４１
前記転写因子が、ＯＣＴ４、ｐ５３、ＭＹＣ、ＧＣＮ４、ＮＡＮＯＧ、ＭｙｏＤ、ＫＬＦ４、ＳＯＸファミリーの転写因子、ＧＡＴＡファミリーの転写因子、核内受容体、または融合発がん性転写因子である、項３８～４０に記載の方法。
項４２
前記凝縮体のコンポーネントへの前記転写因子の結合が、前記転写因子または凝縮体をペプチド、核酸、または小分子と接触させることによって調節される、項３８～４１に記載の方法。
項４３
前記ペプチドが、酸性アミノ酸の含量が高められたものである、項４２に記載の方法。
項４４
前記転写凝縮体が、前記凝縮体と結び付く核内受容体へのリガンドの結合を調節することによって調節される、項１に記載の方法。
項４５
前記リガンドが、ホルモンである、項４４に記載の方法。
項４６
前記リガンドの結合が、薬剤を用いて調節される、項４４～４５に記載の方法。
項４７
前記転写凝縮体が、前記凝縮体と結び付く核内受容体と前記凝縮体のコンポーネントとの結合を調節することによって調節される、項１に記載の方法。
項４８
前記凝縮体の前記コンポーネントが、コアクチベーター、補助因子、または核内受容体リガンドである、項４７に記載の方法。
項４９
前記コアクチベーター、補助因子、または核内受容体リガンドが、メディエーターコンポーネントまたはホルモンである、項４８に記載の方法。
項５０
前記核内受容体が、関連リガンドに結合することなく転写を活性化する変異核内受容体である、項４７～４９に記載の方法。
項５１
前記核内受容体と前記コンポーネントとの結合が、薬剤を用いて調節される、項４７～５０に記載の方法。
項５２
前記凝縮体が、シグナル伝達因子と前記転写凝縮体のコンポーネントとの結合を調節することによって調節される、項１～２に記載の方法。
項５３
前記コンポーネントが、メディエーター、メディエーターコンポーネント、または転写因子である、項５２に記載の方法。
項５４
前記転写凝縮体が、スーパーエンハンサーと結び付く、項５２～５３に記載の方法。
項５５
前記転写凝縮体を調節することで、１つ以上のがん遺伝子の発現が調節される、項５２～５４に記載の方法。
項５６
前記シグナル伝達因子が、発がん性のシグナル伝達経路と結び付く、項５２～５５に記載の方法。
項５７
前記凝縮体が、レベルが異常なシグナル伝達因子を含む、項５２～５６に記載の方法。
項５８
前記ヘテロクロマチン凝縮体が、前記凝縮体のコンポーネントへのメチルＤＮＡ結合タンパク質の結合、またはメチル化ＤＮＡへのメチルＤＮＡ結合タンパク質の結合、を調節することによって調節される、項１～２に記載の方法。
項５９
前記ヘテロクロマチン凝縮体が、前記凝縮体のコンポーネントへの遺伝子サイレンシング因子の結合を調節することによって調節される、項１～２に記載の方法。
項６０
ｍＲＮＡ開始複合体またはｍＲＮＡ伸長複合体と結び付く前記凝縮体が、前記転写因子のコンポーネントへのＲＮＡポリメラーゼの結合を調節することによって調節される、項１～２に記載の方法。
項６１
ｍＲＮＡ開始複合体またはｍＲＮＡ伸長複合体と結び付く前記凝縮体が、前記転写因子のコンポーネントへのスプライシング因子の結合を調節することによって調節される、項１～２に記載の方法。
項６２
前記凝縮体が、前記凝縮体におけるコンポーネントの量を調節することによって調節される、項１～２に記載の方法。
項６３
前記コンポーネントが、１つ以上の転写補助因子、核内受容体リガンド、シグナル伝達因子、メチルＤＮＡ結合タンパク質、遺伝子サイレンシング因子、ＲＮＡポリメラーゼ、スプライシング因子、及び／またはシグナル伝達転写因子である、項６２に記載の方法。
項６４
前記コンポーネントが、メディエーター、メディエーターコンポーネント、ＭＥＤ１、ＭＥＤ１５、ｐ３００、ＢＲＤ４、ＴＦＩＩＤ、β－カテニン、ＳＴＡＴ３、ＳＭＡＤ３、ＮＦ－ｋＢ、ＭＥＣＰ２、ＭＢＤ１、ＭＢＤ２、ＭＢＤ３、ＭＢＤ４、ＨＰ１α、ＴＢＬ１Ｒ、ＨＤＡＣ３、ＳＭＲＴ、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ、ＳＲＳＦ２、ＳＲＲＭ１、ＳＲＳＦ１、またはホルモンである、項６３に記載の方法。
項６５
前記凝縮体コンポーネントが、ＯＣＴ４、ｐ５３、ＭＹＣ、ＧＣＮ４、ＮＡＮＯＧ、ＭｙｏＤ、ＫＬＦ４、ＳＯＸファミリーの転写因子、ＧＡＴＡファミリーの転写因子、核内受容体、及び融合発がん性転写因子から選択される転写因子である、項６２～６４に記載の方法。
項６６
前記凝縮体と結び付く前記コンポーネントの量が、前記コンポーネントと前記凝縮体との間の相互作用を低減または除去する薬剤との接触によって調節される、項６２～６５に記載の方法。
項６７
前記薬剤が、前記コンポーネントの相互作用ドメインを標的とする、項６６に記載の方法。
項６８
前記相互作用ドメインが、１つ以上の天然変性ドメインである、項６７に記載の方法。
項６９
前記薬剤が、転写因子活性化ドメインを標的とする、項６６に記載の方法。
項７０
前記薬剤が、前記活性化ドメインの天然変性ドメインを標的とする、項６９に記載の方法。
項７１
前記転写凝縮体を調節することで、１つ以上のシグナル伝達経路が調節される、項１～２に記載の方法。
項７２
前記シグナル伝達経路が、疾患発病に寄与する、項７１に記載の方法。
項７３
前記シグナル伝達経路が、がんに寄与する、項７１～７２に記載の方法。
項７４
前記シグナル伝達経路が、ホルモンシグナル伝達に関与する、項７１～７３に記載の方法。
項７５
前記シグナル伝達経路が、前記転写凝縮体のコンポーネントとしてシグナル伝達因子を含む、項７１～７４に記載の方法。
項７６
前記シグナル伝達因子が、ＴＣＦ７Ｌ２、ＴＣＦ７、ＴＣＦ７Ｌ１、ＬＥＦ１、ベータ－カテニン、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ２、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ４、ＳＴＡＴ５Ａ、ＳＴＡＴ５Ｂ、ＳＴＡＴ６、及びＮＦ－κＢからなる群から選択される、項７５に記載の方法。
項７７
前記転写凝縮体を調節することで、前記凝縮体と１つ以上の核膜孔タンパク質との間の相互作用が調節される、項１～２に記載の方法。
項７８
前記転写凝縮体と前記１つ以上の核膜孔タンパク質との間の前記相互作用を調節することで、核内シグナル伝達、ｍＲＮＡの搬出、及び／またはｍＲＮＡの翻訳が調節される、項７７に記載の方法。
項７９
前記ヘテロクロマチン凝縮体を調節することで、前記凝縮体とメチルＤＮＡ結合タンパク質との間の相互作用が調節される、項１～２に記載の方法。
項８０
前記ヘテロクロマチン凝縮体を調節することで、前記凝縮体と遺伝子サイレンシング因子との間の相互作用が調節される、項１～２または項７９に記載の方法。
項８１
前記ヘテロクロマチン凝縮体を調節することで、ヘテロクロマチンに位置する１つ以上の遺伝子の抑制または活性化が調節される、項７９～８０に記載の方法。
項８２
ｍＲＮＡ開始複合体またはｍＲＮＡ伸長複合体と結び付く前記凝縮体を調節することで、前記凝縮体とスプライシング因子との間の相互作用が調節される、項１～２に記載の方法。
項８３
ｍＲＮＡ開始複合体またはｍＲＮＡ伸長複合体と結び付く前記凝縮体を調節することで、前記凝縮体とＲＮＡポリメラーゼとの間の相互作用が調節される、項１～２または項８２に記載の方法。
項８４
ｍＲＮＡ開始複合体またはｍＲＮＡ伸長複合体と結び付く前記凝縮体を調節することで、ｍＲＮＡの開始または伸長が調節される、項８２～８３に記載の方法。
項８５
ｍＲＮＡ開始複合体またはｍＲＮＡ伸長複合体と結び付く前記凝縮体を調節することで、ｍＲＮＡスプライシングが調節される、項８２～８４に記載の方法。
項８６
前記凝縮体を調節することで、炎症応答が調節される、項１～２に記載の方法。
項８７
前記炎症応答が、ウイルスまたは細菌に対する炎症応答である、項８６に記載の方法。
項８８
前記転写凝縮体またはヘテロクロマチン凝縮体を調節することで、がん細胞の増殖または生存能力が低減または除去される、項１～２に記載の方法。
項８９
前記凝縮体が、前記凝縮体と結び付くヌクレオチド配列を改変することによって調節される、項１～２に記載の方法。
項９０
前記改変が、ヌクレオチドの付加または欠失を含む、項８９に記載の方法。
項９１
前記付加または欠失されるヌクレオチドが、酸性ヌクレオチドまたは芳香族アミノ酸をコードする、項９０に記載の方法。
項９２
前記改変が、エピジェネティック修飾を含む、項８９に記載の方法。
項９３
前記エピジェネティック修飾が、ＤＮＡのメチル化を含む、項９２に記載の方法。
項９４
前記ヌクレオチド配列の前記改変が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質を前記ヌクレオチド配列に繋留することを含む、項８９に記載の方法。
項９５
ｄＣａｓ部位特異的エンドヌクレアーゼが使用することで、前記ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質が前記ヌクレオチド配列に繋留される、項９４に記載の方法。
項９６
前記凝縮体が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質を前記凝縮体に繋留することによって調節される、項１～２に記載の方法。
項９７
前記凝縮体が、前記凝縮体を外来性ＲＮＡと接触させることによって調節される、項１～２に記載の方法。
項９８
前記凝縮体が、前記凝縮体と結び付くＤＮＡをメチル化または脱メチル化することによって調節される、項１～２に記載の方法。
項９９
ｍＲＮＡ開始複合体またはｍＲＮＡ伸長複合体と結び付く前記凝縮体が、コンポーネントをリン酸化または脱リン酸化することによって調節される、項１～２に記載の方法。
項１００
前記コンポーネントが、ＲＮＡポリメラーゼである、項９９に記載の方法。
項１０１
前記凝縮体が、前記凝縮体と結び付く１つ以上のＲＮＡを安定化することによって調節される、項１～２に記載の方法。
項１０２
前記凝縮体が、前記凝縮体と結び付くＲＮＡのレベルを調節することによって調節される、項１～２に記載の方法。
項１０３
前記細胞におけるＲＮＡプロセシングが変化する、項１～１０２に記載の方法。
項１０４
前記凝縮体が１つ以上のＲＮＡプロセシング装置凝縮体と融合することを抑制または増進することによってＲＮＡプロセシングが変化する、項１０３に記載の方法。
項１０５
前記凝縮体が、前記凝縮体を、前記凝縮体のコンポーネントの天然変性ドメインに結合する薬剤と接触させることによって調節される、項１～２に記載の方法。
項１０６
前記コンポーネントが、メディエーター、メディエーターコンポーネント、ＭＥＤ１、ＭＥＤ１５、ｐ３００、ＢＲＤ４、ＴＦＩＩＤ、β－カテニン、ＳＴＡＴ３、ＳＭＡＤ３、ＮＦ－ＫＢ、ＭＥＣＰ２、ＭＢＤ１、ＭＢＤ２、ＭＢＤ３、ＭＢＤ４、ＨＰ１α、ＴＢＬ１Ｒ、ＨＤＡＣ３、ＳＭＲＴ、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ、ＳＲＳＦ２、ＳＲＲＭ１、ＳＲＳＦ１、または核内受容体リガンドである、項１０５に記載の方法。
項１０７
前記コンポーネントが、転写因子である、項１０５に記載の方法。
項１０８
前記転写因子が、ＯＣＴ４、ｐ５３、ＭＹＣ、ＧＣＮ４、ＮＡＮＯＧ、ＭｙｏＤ、ＫＬＦ４、ＳＯＸファミリーの転写因子、ＧＡＴＡファミリーの転写因子、核内受容体、または融合発がん性転写因子である、項１０７に記載の方法。
項１０９
前記薬剤が、多価である、項１０５～１０８に記載の方法。
項１１０
前記薬剤が、二価である、項１０９に記載の方法。
項１１１
前記薬剤が、前記コンポーネントの非天然変性ドメインにさらに結合するか、または前記凝縮体の第２のコンポーネントにさらに結合する、項１０９～１１０に記載の方法。
項１１２
前記薬剤が、前記凝縮体のコンポーネントの間の相互作用を変化させるか、または破壊する、項１０４～１１１に記載の方法。
項１１３
前記凝縮体の形成が、１つ以上の凝縮体コンポーネントをゲノムＤＮＡに繋留することによって誘発、増進、または安定化される、項１～２に記載の方法。
項１１４
前記コンポーネントが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド、及び／またはタンパク質を含む、項１１３に記載の方法。
項１１５
前記コンポーネントが、メディエーター、メディエーターコンポーネント、ＭＥＤ１、ＭＥＤ１４、ｐ３００、ＢＲＤ４、ＴＦＩＩＤ、シグナル伝達因子、β－カテニン、ＳＴＡＴ３、ＳＭＡＤ３、ＮＦ－ＫＢ、ＭＥＣＰ２、ＭＢＤ１、ＭＢＤ２、ＭＢＤ３、ＭＢＤ４、ＨＰ１α、ＴＢＬ１Ｒ、ＨＤＡＣ３、ＳＭＲＴ、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ、ＳＲＳＦ２、ＳＲＲＭ１、ＳＲＳＦ１、または核内受容体リガンドを含む、項１１３～１１４に記載の方法。
項１１６
前記コンポーネントが、転写因子である、項１１３～１１４に記載の方法。
項１１７
前記転写因子が、ＯＣＴ４、ｐ５３、ＭＹＣ、ＧＣＮ４、ＮＡＮＯＧ、ＭｙｏＤ、ＫＬＦ４、ＳＯＸファミリーの転写因子、ＧＡＴＡファミリーの転写因子、核内受容体、または融合発がん性転写因子である、項１１６に記載の方法。
項１１８
前記１つ以上のコンポーネントが、ｄＣａｓ部位特異的エンドヌクレアーゼを使用して繋留される、項１１３～１１７に記載の方法。
項１１９
前記凝縮体が、前記凝縮体のコンポーネントの１つ以上を第２の凝縮体に隔離することによって調節される、項１～２に記載の方法。
項１２０
前記第２の凝縮体の形成が、前記細胞を外来性のペプチド、核酸、ペプチド及び／またはタンパク質と接触させることによって誘導される、項１１９に記載の方法。
項１２１
前記隔離コンポーネントが、転写因子、コアクチベーター、シグナル伝達因子、メチルＤＮＡ結合タンパク質、スプライシング因子、遺伝子サイレンシング因子、ＲＮＡポリメラーゼ、または核内受容体リガンドである、項１１９～１２０に記載の方法。
項１２２
前記隔離コンポーネントが、メディエーター、ＭＥＤ１、ＭＥＤ１４、ｐ３００、ＢＲＤ４、ＴＦＩＩＤ、ＯＣＴ４、ｐ５３、ＭＹＣ、ＧＣＮ４、ＮＡＮＯＧ、ＭｙｏＤ、ＫＬＦ４、ＳＯＸファミリーの転写因子、ＧＡＴＡファミリーの転写因子、核内受容体、または融合発がん性転写因子である、項１２１に記載の方法。
項１２３
前記隔離コンポーネントが、野生型タンパク質の変異バージョンである、項１１９～１２２に記載の方法。
項１２４
前記野生型タンパク質が、隔離されない、項１２３に記載の方法。
項１２５
前記隔離コンポーネントが、リン酸化されたコンポーネントである、項１１９～１２４に記載の方法。
項１２６
前記隔離コンポーネントが、脱リン酸化されたコンポーネントである、項１１９～１２４に記載の方法。
項１２７
前記隔離コンポーネントが、病状において過剰発現するコンポーネントである、項１１９～１２６に記載の方法。
項１２８
前記隔離コンポーネントが、核内受容体である、項１１９～１２７に記載の方法。
項１２９
前記核内受容体が、核内受容体の変異バージョンである、項１２８に記載の方法。
項１３０
前記隔離コンポーネントが、シグナル伝達因子である、項１１９に記載の方法。
項１３１
前記隔離コンポーネントが、メチルＤＮＡ結合タンパク質である、項１１９に記載の方法。
項１３２
前記隔離コンポーネントが、スプライシング因子である、項１１９に記載の方法。
項１３３
前記隔離コンポーネントが、遺伝子サイレンシング因子である、項１１９に記載の方法。
項１３４
前記凝縮体が、前記凝縮体と結び付くｎｃＲＮＡのレベルまたは活性を調節することによって調節される、項１～２に記載の方法。
項１３５
前記ｎｃＲＮＡの前記レベルまたは活性が、前記ｎｃＲＮＡを、前記ｎｃＲＮＡに結合するアンチセンスオリゴヌクレオチド、ＲＮａｓｅ、または化合物と接触させることによって調節される、項１３４に記載の方法。
項１３６
前記方法が、凝縮体の形成、組成、維持、崩壊、または制御によって生じるか、またはそれに依存する疾患を治療するか、または前記疾患が生じる可能性を低減するものである、項１～１３５に記載の方法。
項１３７
前記方法が、がんを治療するか、またはがんが生じる可能性を低減するものである、項１～１３６に記載の方法。
項１３８
前記方法が、タンパク質発現の異常と結び付く疾患を治療するものである、項１～１３７に記載の方法。
項１３９
前記疾患が、タンパク質を病的レベルで生じさせる、項１３８に記載の方法。
項１４０
前記方法が、核内受容体を発現する遺伝子の変異と結び付く疾患を治療するものである、項１～１３９に記載の方法。
項１４１
前記方法が、メチルＤＮＡ結合タンパク質の発現異常または活性異常と結び付く疾患を治療するものである、項１～１４０に記載の方法。
項１４２
前記方法が、ｍＲＮＡの開始異常または伸長異常と結び付く疾患を治療するものである、項１～１４１に記載の方法。
項１４３
前記方法が、ｍＲＮＡスプライシングの異常と結び付く疾患を治療するものである、項１～１４１に記載の方法。
項１４４
ｍＲＮＡの開始を調節する方法であって、前記方法が、ｍＲＮＡ開始複合体と物理的に結び付く凝縮体の形成、組成、維持、崩壊、及び／または制御を調節することを含む、前記方法。
項１４５
ｍＲＮＡの開始を調節することで、ｍＲＮＡの伸長、スプライシング、またはキャッピングも調節される、項１４４に記載の方法。
項１４６
ｍＲＮＡ開始複合体と物理的に結び付く前記凝縮体の形成、組成、維持、崩壊、及び／または制御を調節することで、ｍＲＮＡの転写速度が調節される、項１４４または項１４５に記載の方法。
項１４７
ｍＲＮＡ開始複合体と物理的に結び付く前記凝縮体の形成、組成、維持、崩壊、及び／または制御を調節することで、遺伝子産物のレベルが調節される、項１４４～１４６に記載の方法。
項１４８
ｍＲＮＡ開始複合体と物理的に結び付く前記凝縮体の形成、組成、維持、崩壊、及び／または制御が、薬剤を用いて調節される、項１４４～１４７に記載の方法。
項１４９
前記薬剤が、低リン酸化されたＲＮＡポリメラーゼＩＩ Ｃ末端ドメイン（ＰｏｌＩＩ ＣＴＤ）またはその機能性断片を含む、項１４８に記載の方法。
項１５０
前記薬剤が、低リン酸化されたＰｏｌＩＩ ＣＴＤに優先的に結合する、項１４８に記載の方法。
項１５１
ｍＲＮＡの伸長を調節する方法であって、前記方法が、ｍＲＮＡ伸長複合体と物理的に結び付く凝縮体の形成、組成、維持、崩壊、及び／または制御を調節することを含む、前記方法。
項１５２
ｍＲＮＡの伸長を調節することで、ｍＲＮＡの開始も調節される、項１５１に記載の方法。
項１５３
ｍＲＮＡ伸長複合体と物理的に結び付く前記凝縮体の形成、組成、維持、崩壊、及び／または制御を調節することで、転写と同時発生的なｍＲＮＡプロセシングが調節される、項１５１または項１５２に記載の方法。
項１５４
ｍＲＮＡ伸長複合体と物理的に結び付く前記凝縮体の形成、組成、維持、崩壊、及び／または制御を調節することで、ｍＲＮＡスプライスバリアントの数または相対比率が調節される、項１５１～１５３に記載の方法。
項１５５
ｍＲＮＡ伸長複合体と物理的に結び付く前記凝縮体の形成、組成、維持、崩壊、及び／または制御が、薬剤を用いて調節される、項１５１～１５４に記載の方法。
項１５６
前記薬剤が、リン酸化されたＲＮＡポリメラーゼＩＩ Ｃ末端ドメイン（ＰｏｌＩＩ ＣＴＤ）またはその機能性断片を含む、項１５５に記載の方法。
項１５７
前記薬剤が、リン酸化されたＰｏｌＩＩ ＣＴＤに優先的に結合する、項１５５に記載の方法。
項１５８
凝縮体の形成、組成、維持、崩壊、及び／または制御を調節する方法であって、前記方法が、凝縮体コンポーネントのリン酸化または脱リン酸化を調節することを含む、前記方法。
項１５９
前記コンポーネントが、ＲＮＡポリメラーゼＩＩまたはＲＮＡポリメラーゼＩＩ Ｃ末端領域である、項１５８に記載の方法。
項１６０
ｍＲＮＡプロセシングの異常と結び付く疾患もしくは状態を治療するか、または前記疾患もしくは状態が生じる可能性を低減する方法であって、前記方法が、ｍＲＮＡ伸長複合体と物理的に結び付く凝縮体の形成、組成、維持、崩壊、及び／または制御を調節することを含む、前記方法。
項１６１
凝縮体の形成、安定性、または形態を調節する薬剤を同定する方法であって、前記方法が、
ａ．ｍＲＮＡ開始複合体またはｍＲＮＡ伸長複合体と物理的に結び付く凝縮体を有する細胞を提供すること、
ｂ．前記細胞を試験薬剤と接触させること、及び
ｃ．前記試験薬剤との接触によって前記凝縮体の形成、安定性、または形態が調節されるかどうかを決定すること、
を含み、
前記凝縮体が、低リン酸化されたＲＮＡポリメラーゼＩＩ Ｃ末端ドメイン（ＰｏｌＩＩ ＣＴＤ）、リン酸化されたＲＮＡポリメラーゼＩＩ Ｃ末端ドメイン（ＰｏｌＩＩ ＣＴＤ）、スプライシング因子、またはその機能性断片を含む、前記方法。
項１６２
凝縮体の形成、安定性、または形態を調節する薬剤を同定する方法であって、前記方法が、
ａ．インビトロ凝縮体を提供し、前記インビトロ凝縮体の１つ以上の物理的特性を評価すること、
ｂ．前記インビトロ凝縮体を試験薬剤と接触させること、及び
ｃ．前記インビトロ凝縮体の前記１つ以上の物理的特性が前記試験薬剤によって変化するかどうかを評価すること、
を含み、
前記凝縮体が、低リン酸化されたＲＮＡポリメラーゼＩＩ Ｃ末端ドメイン（ＰｏｌＩＩ ＣＴＤ）、リン酸化されたＲＮＡポリメラーゼＩＩ Ｃ末端ドメイン（ＰｏｌＩＩ ＣＴＤ）、スプライシング因子、またはその機能性断片を含む、前記方法。
項１６３
低リン酸化されたＲＮＡポリメラーゼＩＩ Ｃ末端ドメイン（ＰｏｌＩＩ ＣＴＤ）またはその機能性断片を含む単離された合成凝縮体。
項１６４
リン酸化されたＲＮＡポリメラーゼＩＩ Ｃ末端ドメイン（ＰｏｌＩＩ ＣＴＤ）またはその機能性断片を含む単離された合成凝縮体。
項１６５
スプライシング因子またはその機能性断片を含む単離された合成凝縮体。
項１６６
１つ以上の遺伝子の転写を調節する方法であって、前記方法が、ヘテロクロマチン凝縮体の形成、組成、維持、崩壊、及び／または制御を調節することを含む、前記方法。
項１６７
前記ヘテロクロマチン凝縮体を調節することで、前記１つ以上の遺伝子の転写の抑制が増強または安定化される、項１６６に記載の方法。
項１６８
前記ヘテロクロマチン凝縮体を調節することで、前記１つ以上の遺伝子の転写の抑制が低減される、項１６６に記載の方法。
項１６９
複数のヘテロクロマチン凝縮体が調節される、項１６６～１６８に記載の方法。
項１７０
前記ヘテロクロマチン凝縮体の形成、組成、維持、崩壊、及び／または制御が、薬剤を用いて調節される、項１６６～１６９に記載の方法。
項１７１
前記薬剤が、ペプチド、核酸、または小分子を含む、項１７０に記載の方法。
項１７２
前記薬剤が、メチル化ＤＮＡ、メチルＤＮＡ結合タンパク質、または遺伝子サイレンシング因子に結合する、項１７０～１７１に記載の方法。
項１７３
遺伝子サイレンシングを調節する方法であって、前記方法が、ヘテロクロマチン凝縮体の形成、組成、維持、崩壊、及び／または制御を調節することを含む、前記方法。
項１７４
遺伝子サイレンシングが安定化または増強される、項１７３に記載の方法。
項１７５
遺伝子サイレンシングが低減される、項１７３に記載の方法。
項１７６
遺伝子サイレンシングが、薬剤を用いて調節される、項１７３～１７５に記載の方法。
項１７７
遺伝子サイレンシングの異常と結び付く疾患もしくは状態を治療するか、または前記疾患もしくは状態が生じる可能性を低減する方法であって、前記方法が、ヘテロクロマチン凝縮体の形成、組成、維持、崩壊、及び／または制御を調節することを含む、前記方法。
項１７８
遺伝子サイレンシングの異常と結び付く前記疾患または状態が、メチルＤＮＡ結合タンパク質の発現異常または活性異常と結び付く、項１７７に記載の方法。
項１７９
遺伝子サイレンシングの異常と結び付く前記疾患または状態が、レット症候群またはＭｅＣＰ２過剰発現症候群である、項１７７～１７８に記載の方法。
項１８０
凝縮体の形成、安定性、または形態を調節する薬剤を同定する方法であって、前記方法が、
ａ．凝縮体を有する細胞を提供すること、
ｂ．前記細胞を試験薬剤と接触させること、及び
ｃ．前記試験薬剤との接触によって前記凝縮体の形成、安定性、または形態が調節されるかどうかを決定すること、
を含み、
前記凝縮体が、ＭｅＣＰ２もしくはＭｅＣＰ２のＣ末端天然変性領域を含むその断片、またはサプレッサーを含む、前記方法。
項１８１
前記凝縮体が、ヘテロクロマチン凝縮体である、項１８０に記載の方法。
項１８２
前記凝縮体が、メチル化ＤＮＡと結び付く、項１８０～１８１に記載の方法。
項１８３
凝縮体の形成、安定性、または形態を調節する薬剤を同定する方法であって、前記方法が、
ａ．インビトロ凝縮体を提供し、前記インビトロ凝縮体の１つ以上の物理的特性を評価すること、
ｂ．前記インビトロ凝縮体を試験薬剤と接触させること、及び
ｃ．前記インビトロ凝縮体の前記１つ以上の物理的特性が前記試験薬剤によって変化するかどうかを評価すること、
を含み、
前記凝縮体が、ＭｅＣＰ２もしくはＭｅＣＰ２のＣ末端天然変性領域を含むその断片、またはサプレッサーもしくはその機能性断片を含む、前記方法。
項１８４
ＭｅＣＰ２またはＭｅＣＰ２のＣ末端天然変性領域を含むその断片を含む単離された合成凝縮体。
項１８５
サプレッサーまたはその機能性断片を含む単離された合成凝縮体。
項１８６
凝縮体の形成、安定性、活性、または形態を調節する薬剤を同定する方法であって、前記方法が、
ａ．凝縮体を有する細胞を提供すること、
ｂ．前記細胞を試験薬剤と接触させること、及び
ｃ．前記試験薬剤との接触によって前記凝縮体の形成、安定性、活性、または形態が調節されるかどうかを決定すること、
を含み、
前記凝縮体が、転写凝縮体、ヘテロクロマチン凝縮体、またはｍＲＮＡ開始複合体もしくはｍＲＮＡ伸長複合体と物理的に結び付く凝縮体である、前記方法。
項１８７
前記凝縮体が、検出可能なタグを有し、前記検出可能なタグが、前記試験薬剤との接触によって前記凝縮体の形成、安定性、活性、または形態が調節されるかどうかを決定するために使用される、項１８６に記載の方法。
項１８８
前記細胞が、前記検出可能なタグを発現するように遺伝子操作される、項１８７に記載の方法。
項１８９
前記検出可能なタグが、蛍光タグである、項１８７～１８８に記載の方法。
項１９０
ＯＣＴ４、ｐ５３、ＭＹＣ、ＧＣＮ４、メディエーター、メディエーターコンポーネント、ＭＥＤ１、ＭＥＤ１５、ｐ３００、ＢＲＤ４、ＮＡＮＯＧ、ＭｙｏＤ、ＫＬＦ４、ＳＯＸファミリーの転写因子、ＧＡＴＡファミリーの転写因子、核内受容体、核内受容体リガンド、融合発がん性転写因子、ＴＦＩＩＤ、シグナル伝達因子、メチルＤＮＡ結合タンパク質、スプライシング因子、遺伝子サイレンシング因子、ＲＮＡポリメラーゼ、β－カテニン、ＳＴＡＴ３、ＳＭＡＤ３、ＮＦ－ＫＢ、ＭＥＣＰ２、ＭＢＤ１、ＭＢＤ２、ＭＢＤ３、ＭＢＤ４、ＨＰ１α、ＴＢＬ１Ｒ、ＨＤＡＣ３、ＳＭＲＴ、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ、ＳＲＳＦ２、ＳＲＲＭ１、ＳＲＳＦ１、及び天然変性領域（ＩＤＲ）を含むそれらの断片からなる群から選択される凝縮体コンポーネントに前記検出可能なタグが付加される、項１８７～１８９に記載の方法。
項１９１
前記凝縮体またはそのコンポーネントに選択的に結合する抗体が、前記試験薬剤との接触によって前記凝縮体の形成、安定性、活性、または形態が調節されるかどうかを決定するために使用される、項１９０に記載の方法。
項１９２
ＯＣＴ４、ｐ５３、ＭＹＣ、ＧＣＮ４、メディエーター、メディエーターコンポーネント、ＭＥＤ１、ＭＥＤ１５、ｐ３００、ＢＲＤ４、ＮＡＮＯＧ、ＭｙｏＤ、ＫＬＦ４、ＳＯＸファミリーの転写因子、ＧＡＴＡファミリーの転写因子、核内受容体、核内受容体リガンド、融合発がん性転写因子、ＴＦＩＩＤ、シグナル伝達因子、メチルＤＮＡ結合タンパク質、スプライシング因子、遺伝子サイレンシング因子、ＲＮＡポリメラーゼ、β－カテニン、ＳＴＡＴ３、ＳＭＡＤ３、ＮＦ－ＫＢ、ＭＥＣＰ２、ＭＢＤ１、ＭＢＤ２、ＭＢＤ３、ＭＢＤ４、ＨＰ１α、ＴＢＬ１Ｒ、ＨＤＡＣ３、ＳＭＲＴ、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ、ＳＲＳＦ２、ＳＲＲＭ１、ＳＲＳＦ１、及び天然変性領域（ＩＤＲ）を含むそれらの断片からなる群から選択される凝縮体コンポーネントに対して前記抗体が選択的に結合する、項１９１に記載の方法。
項１９３
前記試験薬剤との接触によって前記凝縮体の形成、安定性、活性、または形態が調節されるかどうかを決定する前記ステップが、顕微鏡法を使用して実施される、項１８６～１９２に記載の方法。
項１９４
前記顕微鏡法が、デコンボリューション顕微鏡法または構造化照明顕微鏡法である、項１９３に記載の方法。
項１９５
前記試験薬剤との接触によって前記凝縮体の形成、安定性、活性、または形態が調節されるかどうかを決定する前記ステップが、ＤＮＡ－ＦＩＳＨ、ＲＮＡ－ＦＩＳＨ、またはそれらの組み合わせを使用して実施される、項１８６～１９４に記載の方法。
項１９６
前記凝縮体のコンポーネントが、核内受容体またはＩＤＲを含むその断片である、項１８６～１９５に記載の方法。
項１９７
前記核内受容体が、関連リガンドに結合すると転写を活性化する、項１９６に記載の方法。
項１９８
前記核内受容体が、関連リガンドに結合することなく転写を活性化する変異核内受容体である、項１９６に記載の方法。
項１９９
前記核内受容体が、核内ホルモン受容体である、項１９６～１９８に記載の方法。
項２００
前記核内受容体が、変異を有する、項１９６～１９９に記載の方法。
項２０１
前記核内受容体が、エストロゲン受容体または変異エストロゲン受容体である、項１９９～２００に記載の方法。
項２０２
前記変異エストロゲン受容体が、転写を活性化する上でエストロゲンに依存しない、項２０１に記載の方法。
項２０３
前記変異エストロゲン受容体による転写の活性化が、タモキシフェンまたはその活性代謝物によって阻害されない、項２０１～２０２に記載の方法。
項２０４
前記細胞が、エストロゲンと接触される、項２０１～２０３に記載の方法。
項２０５
前記細胞が、タモキシフェンまたはその活性代謝物と接触される、項２０１～２０４に記載の方法。
項２０６
エストロゲン及び／またはタモキシフェンあるいはその活性代謝物の存在下で前記薬剤が変異エストロゲン受容体の転写活性を阻害するかどうかを決定することをさらに含む、項２０４～２０５に記載の方法。
項２０７
前記変異が、疾患もしくは状態と結び付くか、または疾患もしくは状態を特徴付ける、項２００に記載の方法。
項２０８
前記疾患または状態が、がんである、項２０７に記載の方法。
項２０９
前記転写凝縮体の前記コンポーネントが、シグナル伝達因子またはＩＤＲを含むその断片である、項１８６～２０８に記載の方法。
項２１０
前記転写凝縮体が、１つ以上のシグナル応答エレメントと物理的に結び付く、項２０９に記載の方法。
項２１１
前記シグナル伝達因子が、疾患と結び付くシグナル伝達経路と結び付く、項２０９～２１０に記載の方法。
項２１２
前記疾患が、がんである、項２１１に記載の方法。
項２１３
前記凝縮体が、がん遺伝子の転写を調節する、項１８６～２１２に記載の方法。
項２１４
前記凝縮体が、スーパーエンハンサーと結び付く、項１８６～２１３に記載の方法。
項２１５
ｍＲＮＡ開始複合体またはｍＲＮＡ伸長複合体と物理的に結び付く前記凝縮体の前記コンポーネントが、メチルＤＮＡ結合タンパク質もしくはＣ末端ＩＤＲを含むその断片、またはサプレッサーもしくはＩＤＲを含むその断片である、項１８６～１９５に記載の方法。
項２１６
前記ヘテロクロマチン凝縮体が、メチル化ＤＮＡまたはヘテロクロマチンと結び付く、項２１５に記載の方法。
項２１７
前記ヘテロクロマチン凝縮体が、レベルまたは活性が異常なメチルＤＮＡ結合タンパク質を含む、項２１５～２１６に記載の方法。
項２１８
前記細胞が、神経細胞である、項２１５～２１７に記載の方法。
項２１９
前記細胞が、レット症候群またはＭｅＣＰ２過剰発現症候群を有する対象に由来する、項２１８に記載の方法。
項２２０
ｍＲＮＡ開始複合体またはｍＲＮＡ伸長複合体と物理的に結び付く前記凝縮体と結び付く遺伝子の発現の、前記薬剤による抑制が評価される、項２１５～２１９に記載の方法。
項２２１
ｍＲＮＡ開始複合体またはｍＲＮＡ伸長複合体と物理的に結び付く前記凝縮体の前記コンポーネントが、スプライシング因子もしくはＩＤＲを含むその断片、またはＲＮＡポリメラーゼもしくはＩＤＲを含むその断片である、項１８６～２２０に記載の方法。
項２２２
前記細胞が、サイクリン依存性キナーゼをさらに含む、項２２１に記載の方法。
項２２３
前記ＲＮＡポリメラーゼが、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ＰｏｌＩＩ）である、項２２１～２２２に記載の方法。
項２２４
前記薬剤との接触によって生じる、前記凝縮体と結び付くＲＮＡ転写開始活性の変化が評価される、項２２１～２２３に記載の方法。
項２２５
前記薬剤との接触によって生じる、前記凝縮体と結び付くＲＮＡ伸長活性またはＲＮＡスプライシング活性の変化が評価される、項２２１～２２４に記載の方法。
項２２６
凝縮体の形成、安定性、活性、または形態を調節する薬剤を同定する方法であって、前記方法が、
ａ．インビトロ凝縮体を提供し、前記インビトロ凝縮体の１つ以上の物理的特性を評価すること、
ｂ．前記インビトロ凝縮体を試験薬剤と接触させること、及び
ｃ．前記インビトロ凝縮体の前記１つ以上の物理的特性が前記試験薬剤によって変化するかどうかを評価すること、
を含む、前記方法。
項２２７
前記１つ以上の物理的特性が、前記インビトロ凝縮体が細胞における遺伝子の発現を誘発または抑制する能力と相関する、項２２６に記載の方法。
項２２８
前記１つ以上の物理的特性が、サイズ、濃度、透過性、形態、または粘性を含む、項２２６～２２７に記載の方法。
項２２９
前記試験薬剤が、小分子、ペプチド、ＲＮＡ、またはＤＮＡを含む、項２２６～２２８に記載の方法。
項２３０
前記インビトロ凝縮体が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及びタンパク質を含む、項２２６～２２９に記載の方法。
項２３１
前記インビトロ凝縮体が、ＯＣＴ４、ｐ５３、ＭＹＣ、ＧＣＮ４、メディエーター、メディエーターコンポーネント、ＭＥＤ１、ＭＥＤ１５、ｐ３００、ＢＲＤ４、ＮＡＮＯＧ、ＭｙｏＤ、ＫＬＦ４、ＳＯＸファミリーの転写因子、ＧＡＴＡファミリーの転写因子、核内受容体、核内受容体リガンド、融合発がん性転写因子、ＴＦＩＩＤ、シグナル伝達因子、メチルＤＮＡ結合タンパク質、スプライシング因子、遺伝子サイレンシング因子、ＲＮＡポリメラーゼ、β－カテニン、ＳＴＡＴ３、ＳＭＡＤ３、ＮＦ－ＫＢ、ＭＥＣＰ２、ＭＢＤ１、ＭＢＤ２、ＭＢＤ３、ＭＢＤ４、ＨＰ１α、ＴＢＬ１Ｒ、ＨＤＡＣ３、ＳＭＲＴ、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ、ＳＲＳＦ２、ＳＲＲＭ１、ＳＲＳＦ１、及び天然変性領域（ＩＤＲ）を含むそれらの断片からなる群から選択される凝縮体コンポーネントを含む、項２２６～２３０に記載の方法。
項２３２
前記インビトロ凝縮体が、天然変性領域または天然変性ドメインを含む、項２２６～２３１に記載の方法。
項２３３
前記天然変性領域または天然変性ドメインが、ＭＥＤ１またはＢＲＤ４の天然変性領域または天然変性ドメインを含む、項２３２に記載の方法。
項２３４
前記天然変性領域または天然変性ドメインが、転写因子の天然変性領域または天然変性ドメインを１つ以上含む、項２３２に記載の方法。
項２３５
前記天然変性領域または天然変性ドメインが、活性化因子の天然変性領域または天然変性ドメインを含む、項２３４に記載の方法。
項２３６
前記核内受容体が、関連リガンドに結合すると転写を活性化する、項２３３～２３５に記載の方法。
項２３７
前記核内受容体が、関連リガンドに結合することなく転写を活性化する変異転写因子である、項２３１～２３５に記載の方法。
項２３８
前記核内受容体が、核内ホルモン受容体である、項２３１～２３７に記載の方法。
項２３９
前記核内受容体が、変異を有する、項２３１～２３８に記載の方法。
項２４０
前記核内受容体が、エストロゲン受容体または変異エストロゲン受容体である、項２３８～２３９に記載の方法。
項２４１
前記変異エストロゲン受容体が、転写を活性化する上でエストロゲンに依存しない、項２４０に記載の方法。
項２４２
前記変異エストロゲン受容体による転写の活性化が、タモキシフェンまたはその活性代謝物によって阻害されない、項２４０～２４１に記載の方法。
項２４３
前記細胞が、エストロゲンと接触される、項２４０～２４２に記載の方法。
項２４４
前記細胞が、タモキシフェンまたはその活性代謝物と接触される、項２４０～２４３に記載の方法。
項２４５
エストロゲン及び／またはタモキシフェンあるいはその活性代謝物の存在下で前記薬剤が変異エストロゲン受容体の転写活性を阻害するかどうかを決定することをさらに含む、項２４３～２４４に記載の方法。
項２４６
前記変異が、疾患または状態と結び付く、項２３９～２４５に記載の方法。
項２４７
前記疾患または状態が、がんである、項２４６に記載の方法。
項２４８
前記インビトロ凝縮体が、弱いタンパク質間相互作用によって形成される、項２２６～２４７に記載の方法。
項２４９
前記インビトロ凝縮体が、前記核内受容体リガンドの非存在下で遺伝子の転写を活性化する変異核内受容体またはＩＤＲを含むその断片を含む、項２２６～２４８に記載の方法。
項２５０
前記インビトロ凝縮体が、前記核内受容体リガンドの非存在下で遺伝子の転写を抑制する変異核内受容体またはＩＤＲを含むその断片を含む、項２２６～２５０に記載の方法。
項２５１
前記インビトロ凝縮体が、シグナル伝達因子、または遺伝子の転写の活性化に必要なＩＤＲを含むその断片を含む、項２２６～２５０に記載の方法。
項２５２
前記シグナル伝達因子が、発がん性のシグナル伝達経路と結び付く、項２２６～２５１に記載の方法。
項２５３
前記凝縮体が、メチルＤＮＡ結合タンパク質もしくはＣ末端ＩＤＲを含むその断片、またはサプレッサーもしくはＩＤＲを含むその断片を含む、項２２６～２３５に記載の方法。
項２５４
前記凝縮体が、メチル化ＤＮＡまたはヘテロクロマチンと結び付く、項２５３に記載の方法。
項２５５
前記凝縮体が、レベルまたは活性が異常なメチルＤＮＡ結合タンパク質を含む、項２５３～２５４に記載の方法。
項２５６
前記凝縮体と結び付く遺伝子の発現の、前記薬剤による抑制が評価される、項２５３～２５５に記載の方法。
項２５７
前記凝縮体が、スプライシング因子もしくはＩＤＲを含むその断片、またはＲＮＡポリメラーゼもしくはＩＤＲを含むその断片を含む、項２２６～２３５に記載の方法。
項２５８
前記凝縮体が、転写の開始複合体または伸長複合体と結び付く、項２５７に記載の方法。
項２５９
前記凝縮体が、サイクリン依存性キナーゼと接触される、項２５７～２５８に記載の方法。
項２６０
前記ＲＮＡポリメラーゼが、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ＰｏｌＩＩ）である、項２５７～２５９に記載の方法。
項２６１
前記薬剤との接触によって生じる、前記凝縮体と結び付くＲＮＡ転写開始活性の変化が評価される、項２５７～２６０に記載の方法。
項２６２
前記薬剤との接触によって生じる、前記凝縮体と結び付くＲＮＡ伸長活性またはＲＮＡスプライシング活性の変化が評価される、項２５７～２６１に記載の方法。
項２６３
前記インビトロ凝縮体が、（天然変性ドメイン）－（誘導性オリゴマー化ドメイン）融合タンパク質を含む、項２２６～２６２に記載の方法。
項２６４
前記融合タンパク質が、天然変性ドメイン－Ｃｒｙ２融合タンパク質である、項２６３に記載の方法。
項２６５
前記誘導性オリゴマー化ドメインが、小分子、タンパク質、または核酸によって誘導される、項２６３～２６４に記載の方法。
項２６６
前記天然変性ドメインが、ＯＣＴ４、ｐ５３、ＭＹＣ、ＧＣＮ４、メディエーター、メディエーターコンポーネント、ＭＥＤ１、ＭＥＤ１５、ｐ３００、ＢＲＤ４、ＮＡＮＯＧ、ＭｙｏＤ、ＫＬＦ４、ＳＯＸファミリーの転写因子、ＧＡＴＡファミリーの転写因子、核内受容体、シグナル伝達因子、メチルＤＮＡ結合タンパク質、スプライシング因子、遺伝子サイレンシング因子、ＲＮＡポリメラーゼ、β－カテニン、ＳＴＡＴ３、ＳＭＡＤ３、ＮＦ－ＫＢ、ＭＥＣＰ２、ＭＢＤ１、ＭＢＤ２、ＭＢＤ３、ＭＢＤ４、ＨＰ１α、ＴＢＬ１Ｒ、ＨＤＡＣ３、ＳＭＲＴ、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ、ＳＲＳＦ２、ＳＲＲＭ１、ＳＲＳＦ１、またはＴＦＩＩＤの天然変性ドメインである、項２６３～２６５に記載の方法。
項２６７
前記インビトロ凝縮体が、青色光刺激に反応して形成される、項２６３～２６６に記載の方法。
項２６８
前記インビトロ凝縮体が、細胞に見られる凝縮体を模倣する、項２６３～２６７に記載の方法。
項２６９
前記細胞が、がん細胞または神経細胞である、項２６８に記載の方法。
項２７０
凝縮体の形成、安定性、機能、または形態を調節する薬剤を同定する方法であって、前記方法が、
ａ．凝縮体依存的にレポーター遺伝子を発現する細胞またはインビトロ転写アッセイを提供すること、
ｂ．前記細胞またはインビトロ転写アッセイを試験薬剤と接触させること、及び
ｃ．前記レポーター遺伝子の発現を評価すること、
を含む、前記方法。
項２７１
ステップ（ａ）における前記細胞またはインビトロ転写アッセイが、前記レポーター遺伝子を発現しない、項２７０に記載の方法。
項２７２
ステップ（ａ）における前記細胞またはインビトロ転写アッセイが、前記レポーター遺伝子を発現する、項２７０に記載の方法。
項２７３
前記レポーター遺伝子の発現が、異種ＤＮＡ結合ドメイン及び活性化ドメインを有する転写因子に依存する、項２７０～２７２に記載の方法。
項２７４
前記レポーター遺伝子の発現が、変異転写因子活性化ドメインを有する転写因子に依存する、項２７０～２７３に記載の方法。
項２７５
前記変異転写因子活性化ドメインが、疾患または状態と結び付く、項２７４に記載の方法。
項２７６
前記凝縮体が、核内受容体またはＩＤＲを含むその断片を含む、項２７０～２７５に記載の方法。
項２７７
前記核内受容体が、関連リガンドに結合すると転写を活性化する、項２７６に記載の方法。
項２７８
前記核内受容体が、関連リガンドに結合することなく転写を活性化する変異核内受容体である、項２７６に記載の方法。
項２７９
核内受容体が、核内ホルモン受容体である、項２７６～２７８に記載の方法。
項２８０
前記凝縮体が、シグナル伝達因子またはＩＤＲを含むその断片を含む、項２７０～２７５に記載の方法。
項２８１
前記シグナル伝達因子が、発がん性のシグナル伝達経路と結び付く、項２８０に記載の方法。
項２８２
前記凝縮体が、メチルＤＮＡ結合タンパク質もしくはＣ末端ＩＤＲを含むその断片、またはサプレッサーもしくはＩＤＲを含むその断片を含む、項２７０～２７５に記載の方法。
項２８３
前記凝縮体が、メチル化ＤＮＡまたはヘテロクロマチンと結び付く、項２８２に記載の方法。
項２８４
前記凝縮体が、レベルまたは活性が異常なメチルＤＮＡ結合タンパク質を含む、項２８１～２８２に記載の方法。
項２８５
前記凝縮体と結び付く遺伝子の発現の、前記薬剤による抑制が評価される、項２８１～２８３に記載の方法。
項２８６
前記凝縮体が、スプライシング因子もしくはＩＤＲを含むその断片、またはＲＮＡポリメラーゼもしくはＩＤＲを含むその断片を含む、項２７０～２７５に記載の方法。
項２８７
前記凝縮体が、転写の開始複合体または伸長複合体と結び付く、項２８６に記載の方法。
項２８８
前記凝縮体が、サイクリン依存性キナーゼと接触される、項２８６～２８７に記載の方法。
項２８９
前記ＲＮＡポリメラーゼが、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ＰｏｌＩＩ）である、項２８６～２８８に記載の方法。
項２９０
前記薬剤との接触によって生じる、前記凝縮体と結び付くＲＮＡ転写開始活性の変化が評価される、項２８６～２８９に記載の方法。
項２９１
前記薬剤との接触によって生じる、前記凝縮体と結び付くＲＮＡ伸長活性またはＲＮＡスプライシング活性の変化が評価される、項２８６～２９０に記載の方法。
項２９２
ＤＮＡ、ＲＮＡ、及びタンパク質のうちの１つ、２つ、または３つを含む単離された合成凝縮体。
項２９３
前記凝縮体が、ＯＣＴ４、ｐ５３、ＭＹＣ、ＧＣＮ４、メディエーター、メディエーターコンポーネント、ＭＥＤ１、ＭＥＤ１５、ｐ３００、ＢＲＤ４、ＮＡＮＯＧ、ＭｙｏＤ、ＫＬＦ４、ＳＯＸファミリーの転写因子、ＧＡＴＡファミリーの転写因子、核内受容体、核内受容体リガンド、融合発がん性転写因子、ＴＦＩＩＤ、シグナル伝達因子、メチルＤＮＡ結合タンパク質、スプライシング因子、遺伝子サイレンシング因子、ＲＮＡポリメラーゼ、β－カテニン、ＳＴＡＴ３、ＳＭＡＤ３、ＮＦ－ＫＢ、ＭＥＣＰ２、ＭＢＤ１、ＭＢＤ２、ＭＢＤ３、ＭＢＤ４、ＨＰ１α、ＴＢＬ１Ｒ、ＨＤＡＣ３、ＳＭＲＴ、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ、ＳＲＳＦ２、ＳＲＲＭ１、ＳＲＳＦ１、または天然変性領域（ＩＤＲ）を含むその断片を含む、項２９２に記載の単離された合成凝縮体。
項２９４
項２９２または項２９３に記載の単離された合成凝縮体を含む液滴。
項２９５
凝縮体コンポーネントと、オリゴマー化の誘導を可能にするドメインと、を含む融合タンパク質。
項２９６
前記融合タンパク質が、検出可能なタグをさらに含む、項２９５に記載の融合タンパク質。
項２９７
前記検出可能なタグが、蛍光タグである、項２９６に記載の融合タンパク質。
項２９８
細胞における１つ以上の遺伝子の転写を調節する方法であって、前記方法が、前記１つ以上の遺伝子と結び付く凝縮体の組成、維持、崩壊、及び／または制御を調節することを含み、前記凝縮体が、エストロゲン受容体（ＥＲ）またはその断片と、ＭＥＤ１またはその断片と、を凝縮体コンポーネントとして含む、前記方法。
項２９９
前記エストロゲン受容体が、変異エストロゲン受容体である、項２９８に記載の方法。
項３００
前記変異エストロゲン受容体が、エストロゲンの結合に依存しない構成的活性を有する、項２９９に記載の方法。
項３０１
前記エストロゲン受容体断片が、リガンド結合ドメインまたはその機能性断片を含む、項２９８～３００に記載の方法。
項３０２
前記ＭＥＤ１断片が、ＩＤＲ、ＬＸＸＬＬモチーフ、またはこれら両方を含む、項２９８～３０１に記載の方法。
項３０３
前記凝縮体が、エストロゲンまたはその機能性断片と接触される、項２９８～３０２に記載の方法。
項３０４
前記凝縮体が、選択的エストロゲン選択的調節剤（ＳＥＲＭ）と接触される、項２９８～３０３に記載の方法。
項３０５
前記ＳＥＲＭが、タモキシフェンまたはその活性代謝物である、項３０４に記載の方法。
項３０６
前記凝縮体を調節することで、ＭＹＣがん遺伝子の転写が低減または除去される、項２９８～３０５に記載の方法。
項３０７
前記細胞が、乳癌細胞である、項２９８～３０６に記載の方法。
項３０８
前記細胞が、ＭＥＤ１を過剰発現する、項２９８～３０７に記載の方法。
項３０９
前記転写凝縮体が、前記転写凝縮体を薬剤と接触させることによって調節される、項２９８～３０８に記載の方法。
項３１０
前記薬剤が、前記ＥＲと前記ＭＥＤ１との間の相互作用を低減または除去する、項３０９に記載の方法。
項３１１
前記薬剤が、ＥＲとエストロゲンとの間の相互作用を低減または除去する、項３０９～３１０に記載の方法。
項３１２
前記凝縮体が、変異ＥＲまたはその断片を含み、前記薬剤が、前記１つ以上の遺伝子の転写を低減する、項３０９～３１１に記載の方法。
項３１３
凝縮体の形成、安定性、または形態を調節する薬剤を同定する方法であって、前記方法が、
ａ．細胞を提供すること、
ｂ．前記細胞を試験薬剤と接触させること、及び
ｃ．前記試験薬剤との接触によって凝縮体の形成、安定性、または形態が調節されるかどうかを決定すること、
を含み、
前記凝縮体が、エストロゲン受容体（ＥＲ）またはその断片と、ＭＥＤ１またはその断片と、を凝縮体コンポーネントとして含む、前記方法。
項３１４
前記エストロゲン受容体が、変異エストロゲン受容体である、項３１３に記載の方法。
項３１５
前記変異エストロゲン受容体が、エストロゲンの結合に依存しない構成的活性を有する、項３１４に記載の方法。
項３１６
前記エストロゲン受容体断片が、リガンド結合ドメインまたはその機能性断片を含む、項３１３～３１５に記載の方法。
項３１７
前記ＭＥＤ１断片が、ＩＤＲ、ＬＸＸＬＬモチーフ、またはこれら両方を含む、項３１３～３１６に記載の方法。
項３１８
前記凝縮体が、エストロゲンまたはその機能性断片と接触される、項３１３～３１７に記載の方法。
項３１９
前記凝縮体が、選択的エストロゲン選択的調節剤（ＳＥＲＭ）と接触される、項３１３～３１８に記載の方法。
項３２０
前記ＳＥＲＭが、タモキシフェンまたはその活性代謝物である、項３１９に記載の方法。
項３２１
前記凝縮体を調節することで、ＭＹＣがん遺伝子の転写が低減または除去される、項３１３～３２０に記載の方法。
項３２２
前記細胞が、乳癌細胞である、項３１３～３２１に記載の方法。
項３２３
前記細胞が、ＭＥＤ１を過剰発現する、項３１３～３２２に記載の方法。
項３２４
前記細胞が、ＥＲ＋乳癌細胞である、項３１３～３２３に記載の方法。
項３２５
前記ＥＲ＋乳癌細胞が、タモキシフェン処理に抵抗性である、項３１３～３２４に記載の方法。
項３２６
前記凝縮体が、検出可能な標識を含む、項３１３～３２５に記載の方法。
項３２７
前記凝縮体のコンポーネントが、前記検出可能な標識を含む、項３２６に記載の方法。
項３２８
前記ＥＲもしくはその断片、及び／または前記ＭＥＤ１もしくはその断片が、前記検出可能な標識を含む、項３２７に記載の方法。
項３２９
前記１つ以上の遺伝子が、レポーター遺伝子を含む、項３１３～３２８に記載の方法。
項３３０
凝縮体の形成、安定性、または形態を調節する薬剤を同定する方法であって、前記方法が、
ａ．インビトロ凝縮体を提供すること、
ｂ．前記凝縮体を試験薬剤と接触させること、及び
ｃ．前記試験薬剤との接触によって前記凝縮体の形成、安定性、または形態が調節されるかどうかを決定すること、
を含み、
前記凝縮体が、エストロゲン受容体（ＥＲ）またはその断片と、ＭＥＤ１またはその断片と、を凝縮体コンポーネントとして含む、前記方法。
項３３１
前記エストロゲン受容体が、変異エストロゲン受容体である、項３３０に記載の方法。
項３３２
前記変異エストロゲン受容体が、エストロゲンの結合に依存しない構成的活性を有する、項３３１に記載の方法。
項３３３
前記エストロゲン受容体断片が、リガンド結合ドメインまたはその機能性断片を含む、項３３０～３３２に記載の方法。
項３３４
前記ＭＥＤ１断片が、ＩＤＲ、ＬＸＸＬＬモチーフ、またはこれら両方を含む、項３３０～３３３に記載の方法。
項３３５
前記凝縮体が、エストロゲンまたはその機能性断片と接触される、項３３０～３３４に記載の方法。
項３３６
前記凝縮体が、選択的エストロゲン選択的調節剤（ＳＥＲＭ）と接触される、項３３０～３３４に記載の方法。
項３３７
前記ＳＥＲＭが、４－ヒドロキシタモキシフェン及び／またはＮ－デスメチル－４－ヒドロキシタモキシフェンである、項３３６に記載の方法。
項３３８
前記凝縮体が、細胞から単離される、項３３０～３３７に記載の方法。
項３３９
前記細胞が、乳癌細胞である、項３３８に記載の方法。
項３４０
前記細胞が、ＭＥＤ１を過剰発現する、項３３０～３３９に記載の方法。
項３４１
前記細胞が、ＥＲ＋乳癌細胞である、項３３０～３４０に記載の方法。
項３４２
前記ＥＲ＋乳癌細胞が、タモキシフェン処理に抵抗性である、項３４１に記載の方法。
項３４３
前記凝縮体が、検出可能な標識を含む、項３３０～３４２に記載の方法。
項３４４
前記凝縮体のコンポーネントが、前記検出可能な標識を含む、項３４３に記載の方法。
項３４５
前記ＥＲもしくはその断片、及び／または前記ＭＥＤ１もしくはその断片が、前記検出可能な標識を含む、項３４４に記載の方法。
項３４６
エストロゲン受容体（ＥＲ）またはその断片と、ＭＥＤ１またはその断片と、を凝縮体コンポーネントとして含む単離された合成転写凝縮体。
項３４７
前記エストロゲン受容体が、変異エストロゲン受容体である、項３４６に記載の単離された合成転写凝縮体。
項３４８
前記変異エストロゲン受容体が、エストロゲンの結合に依存しない構成的活性を有する、項３４７に記載の単離された合成転写凝縮体。
項３４９
前記エストロゲン受容体断片が、リガンド結合ドメインまたはその機能性断片を含む、項３４６～３４８に記載の単離された合成転写凝縮体。
項３５０
前記ＭＥＤ１断片が、ＩＤＲ、ＬＸＸＬＬモチーフ、またはこれら両方を含む、項３４６～３４９に記載の単離された合成転写凝縮体。
項３５１
前記凝縮体が、エストロゲンまたはその機能性断片を含む、項３４６～３５０に記載の単離された合成転写凝縮体。
項３５２
前記凝縮体が、選択的エストロゲン選択的調節剤（ＳＥＲＭ）を含む、項３４６～３５１に記載の単離された合成転写凝縮体。

Claims (1)

  1. １つ以上の遺伝子の転写を調節する方法であって、前記方法が、前記１つ以上の遺伝子と結び付く凝縮体の形成、組成、維持、崩壊、活性、及び／または制御を調節することを含み、前記凝縮体が、転写凝縮体、ヘテロクロマチン凝縮体、またはｍＲＮＡ開始複合体もしくはｍＲＮＡ伸長複合体と物理的に結び付く凝縮体である、前記方法。
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