KR20210068573A

KR20210068573A - 통증 개선, 상처 치유 및 수술 후 회복을 위한 혈장 및 혈장 분획의 용도

Info

Publication number: KR20210068573A
Application number: KR1020217015177A
Authority: KR
Inventors: 마리안 카스트로; 이안 갤러거; 빅토리아 카이페츠; 벤슨 루
Original assignee: 알카헤스트 인코포레이티드
Priority date: 2018-10-26
Filing date: 2019-10-21
Publication date: 2021-06-09
Also published as: AU2019364271A1; EP3870190A1; US20210106616A1; CN113056275A; US20200129549A1; US20230111752A1; US20230285455A1; CN113056275B; US11547724B2; TW202408565A; CL2021001044A1; US11298377B2; US11103530B2; TW202029970A; TWI819129B; JP2024107305A; IL282227B2; CA3115308A1; MX2021004755A; JP2022505915A

Abstract

수술 후 회복을 개선하기 위한 방법 및 조성물이 설명된다. 방법에 사용된 조성물은 수술 후 회복과 관련된 상태를 치료 및/또는 예방하는데 효능이 있는 혈장 및 혈장 유래 혈장 분획을 포함한다.

Description

통증 개선, 상처 치유 및 수술 후 회복을 위한 혈장 및 혈장 분획의 용도

I. 관련 출원에 대한 상호 참조

35 U.S.C. §119(e)에 따라, 본 출원은 2018년 10월 26일에 출원된 미국 가특허 출원 번호 62/751,448 및 2019년 5월 2일에 출원된 미국 가특허 출원 번호 62/842,403의 출원에 기해 우선권을 주장하며, 그 개시 내용은 본원에 참조로 포함된다.

II. 기술 분야

본 발명은 질병 및 노화 관련 질병의 예방 및 치료에 관한 것이다. 본 발명은 수술과 관련된 상태 및 적응증을 포함하여 수술로부터 회복을 개선하고 가속화하기 위한 혈장 및 혈장 분획과 같은 혈액 제품의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 만성 통증 또는 신경 병증을 완화하고 상처 치유와 관련된 징후를 치료하기 위한 혈장 및 혈장 분획과 같은 혈액 제품의 용도에 관한 것이다.

III. 배경기술

다음은 배경 정보로만 제공되며 본 발명에 대한 선행 기술로 인정되지 않는다.

수술은 종종 통증, 심폐 문제, 감염, 혈전 색전 문제 및 수술 후 상처 치유로 인한 합병증과 관련이 있다. 또한 상처가 수술 자체(예: 절개)로 인해 발생하거나 사고, 힘 또는 질병으로 인해 발생한 후 수술 절차로 치료하는 데 시간이 걸린다. 이러한 합병증은 종종 나이가 들면서 더욱 악화된다. 외상으로 인한 분비 대사 변화와 캐스케이드(사이토카인, 보체, 아라키돈 산 대사 산물, 산화질소 및 자유 산소 라디칼)의 활성화에 의해 종종 매개되는 장기 기능에 대한 후속 요구와 함께 외과적 스트레스 반응에서 추가적인 합병증이 발생할 수 있다.(Kehlet H., et al., Br. J. Anaesthesia, 78: 606-17(1997)). 수술 스트레스 반응 동안 교감 신경계가 활성화된다.(Starkweather A, et al., Topics in Pain Management, 32(8): 1-11(2017)). 뇌하수체 호르몬 분비가 증가하여 이화 작용을 통해 에너지가 동원된다. 이것은 차례로 염분과 수분 보유를 초래한다. 부신피질 자극 호르몬(ACTH) 분비가 증가하여 노 에피네프린과 교감 신경 활동이 증가한다. 이것은 빈맥 및 고혈압과 같은 심혈관 반응을 일으키고 글루카곤이 방출되어 고혈당증을 유발한다. 성장 호르몬과 코르티솔의 증가는 또한 단핵구에서 대식세포로의 분화를 억제한다. 이것은 차례로 T-세포 신호/히스타민 생성을 방해하고 면역 세포 이동을 감소시킨다.

수술 후 회복을 위한 현재 치료법에는 수술 후 통증 감소와 복합적 개입이 포함된다. 통증 관리는 여러 유형의 외과적 회복에서 중요하며, 급성 통증이 예상된다.(Pinto PR, J Pain Res, 10: 1087-98(2017)). 수술 후 통증은 일반 수술을 받는 환자와 더 관련이 있다.(Couceiro TC, Rev Bras Anestesiol, 59(3): 314-20(2009)). 통증은 또한 치유와 회복을 저해하기 때문에 임상 결과에 부정적인 역할을 한다. 고관절 및 무릎 관절의 교체는 특히 만성(예: 골관절염) 및 급성 통증과 관련이 있다. 따라서 진통제는 입원 환자 시술과 집에서 회복하는 동안 수술 후 회복에 일반적으로 사용된다.

다중 모드 개입의 한 유형은 수술 후 개선된 회복(ERAS)이다.(상기 Starkweather A.). ERAS는 대장 수술, 정형외과, 부인과, 비뇨기과, 두경부암, 방광암, 간 질환, 직장 /골반 질환, 결장 병리학, 십이지장 절제술, 위 절제술, 비만 및 부인과 종양학 수술과 같은 광범위한 수술에 중점을 둔다. 복합적 전략으로서 다음을 강조한다: 수술 전 기술(상담, 체액 /탄수화물 로딩, 단식 기간 단축); 수술기 주위 기술(단시간 마취, 정상 체온, 항생제 예방, 혈전 색전 예방, 염분/수분 과부하 예방, 구토 예방) 및 수술 후 기술(초기 구강 식사, 운동, 비-오피오이드 진통제, 퇴원 후 지원).

그러나 현재의 치료법은 수술 후 이환율과 사망률을 제거하지 못했다. 다중모드 기술은 본질적으로 시간과 자원을 소모한다. 그리고 그러한 복합 요법과 일치할 수 있는 단일 기술이나 약제학적 치료는 없었다. 이러한 부족으로 인해 수술 후 회복을 개선하기 위한 새로운 치료법이 필요하다.

WO 2007-139291 US 2005-0142208 A1

IV. 요약

본 발명은 예를 들어 통증 및 상처 치유를 포함하는 외과적 회복에 영향을 미치는 증상 및 상태를 치료하기 위한 혈액 제품의 생산 및 사용에 기초한다. 본 발명은 무엇보다도 수술 후 회복과 관련된 원치 않는 상태를 치료하고 그러한 회복을 개선하기 위한 새로운 요법의 필요성을 인식한다. 혈액 및 혈장으로부터 유래된 본 발명의 본 발명의 조성물은 수술 후 회복과 관련된 원치 않는 상태의 치료에 효능을 나타내는 혈장 분획의 이용을 통한 현재 치료법의 실패 및 결점에 대한 해결책 및 그러한 회복을 개선하는 것에 관한 것이다.

본 발명은 또한 급성 및 만성 통증과 관련된 증상 및 상태를 치료하기 위한 혈액 제품의 생산 및 사용에 기초한다. 본 발명은 무엇보다도 통증 완화를 위한 새로운 요법의 필요성을 인식한다. 급성 및 만성 통증을 치료하기 위한 치료제가 존재하지만, 오피오이드 진통제와 같은 많은 치료법은 중독, 남용 및 관련 이환율 및 사망률이 높다.

V. 참고 문헌의 삽입

본 명세서에 언급된 모든 간행물 및 특허 출원은 각각의 개별 간행물 또는 특허 출원이 참조로 포함되는 것으로 구체적이고 개별적으로 표시된 것과 동일한 정도로 본원에 참조로 포함된다.

VI. 도면의 간단한 설명
도 1은 만성 수축 손상(CCI) 실험을 보여준다. 23개월 된 야생형 마우스는 PPF1, 가바펜틴, 재조합 인간 알부민(rhAlb) 또는 비히클 대조군의 7일 연속 펄스 투여 요법을 투여받기 24시간 전에 결찰을 통해 CCI 또는 가짜 수술을 받았다. 행동은 2주에서 5주까지 평가되었고 조직학을 위한 조직 수집은 5주 동안에 이루어졌다.
도 2는 22개월 된 야생형 마우스에 행해진 CCI의 위치를 나타내는 표현이다. 결찰은 도면에 표시된 바와 같이 좌골 신경에 투여되었다. 이 도면은 Suter MR, et al., Anesthesiology Res and Practice,(2011)에서 채택되었으며, 이는 전체가 여기에 참조로 포함된다.
도 3은 도 1에 설명된 CCI 또는 가짜 수술로 처리된 야생형 마우스에서 기계적 폰 프레이(von Frey) 이질통 검사 데이터를 나타낸다. 통증 행동 분석에 유용하며, 대상 좌골 신경에 의해 활성화된 뒷발을 두께를 달리한 폰 프레이 필라멘트로 자극하였다. 마우스가 뒷발을 뽑은 압력을 측정하고 도 3에 표시했다. 도면은 CCI 후 PPF1로 처리한 마우스가 CCI 후 비히클 대조군으로 처리한 마우스보다 훨씬 적은 통증(더 많은 압력을 견딜 수 있음)을 나타냄을 보여준다. 또한 비히클로 치료한 가짜 수술은 CCI 이후 비히클 대조군으로 치료한 경우보다 훨씬 적은 통증을 나타냈다. 이것은 PPF1이 기계적 통각 장애에 긍정적인 영향을 미친다는 것을 보여준다.
도 4는 도 1에 설명된 야생형 마우스에서 수행된 해마 조직학의 데이터를 나타낸다. 신경 생성은 더블코르틴(DCX) 마커를 사용하여 측정되었다. CCI 수술받고 PPF1로 치료받은 마우스는 비히클을 받은 마우스보다 해마에서 훨씬 더 많은 신경 생성을 가졌다. 가짜 수술과 비히클이 제공된 마우스는 CCI 수술 후 비히클이 제공된 마우스보다 더 큰 신경 생성 경향이 있다. 따라서 PPF1은 만성 신경 손상 후 신경 생성을 회복하는 능력을 나타냈다.
도 5는 도 1에 설명된 야생형 마우스에서 수행된 해마 조직학의 데이터를 나타낸다. CD68 발현은 정량화되었으며, CCI + 비히클이 제공된 마우스는 CCI + PPF1이 제공된 것보다 해마에서 훨씬 더 많은 수의 CD68 양성 세포를 발현했다. CCI + 비히클이 제공된 마우스와 가짜 수술 + 비히클이 제공된 마우스 간에 유사한 정도의 차이가 관찰되었다. 이것은 PPF1이 만성 신경 손상으로 인한 신경 염증을 차단하는 데 도움이될 수 있음을 보여준다.
도 6은 도 1에 설명된 대로 CCI 또는 가짜 수술을 받고 타임 라인에서 테스트 한 22개월 된 C57BL/6J 마우스를 대상으로 한 기계적 폰 프레이 이질통 테스트 데이터를 나타낸다. 마우스가 뒷발을 뽑은 압력이 CCI 또는 가짜 수술 후 주로 평가되고 도 6에 표시되었다. 이 도면은 CCI 수술 후 PPF1을 투여받은 마우스가 CCI 후 비히클로 치료한 마우스보다 모든 평가 시점에서 기계적 통각에 대한 내성이 상당히 증가했음을 보여준다. 반대로, 가바펜틴을 투여한 마우스는 CCI 수술 후 2주에만 기계적 통각의 현저한 개선을 보여주고 다른 모든 시점에서는 비히클 처리된 마우스와 유사하다. 가짜 수술 마우스는 수술 조작 후 3주와 5주에 기계적 통각에 대한 반응이 크게 증가했다. 함께, 이러한 데이터는 PPF1이 표준 치료(가바펜틴)보다 더 많은 시간 동안 말초 통증을 개선한다는 것을 보여준다.
도 7은 도 1에 설명된 대로 CCI 또는 가짜 수술을 받고 타임 라인에서 테스트 한 22개월 된 야생형 마우스에 대한 핫 플레이트 테스트의 데이터를 나타낸다. 이 분석은 Woolfe 및 Macdonald에 의해 설명된 대로 수행되었다.(Woolfe G. 및 Macdonald AD, J. Pharmacol. Exp. Ther. 80: 300-07(1944), 이는 전체가 본원에 참조로 포함됨). 핫 플레이트 온도는 55℃로 설정되어 있다. 마우스는 30분 동안 투명한 실린더 안에 놓이도록 적응된다. 실린더를 핫 플레이트 위에 놓고 타이머가 시작된다. 귀찮은 행동(예: 뒷발 핥기 또는 점프)이 처음 관찰되면 시간이 잠복기로 기록된다. 도 7은 CCI 또는 가짜 수술 5주 후 핫 플레이트 통각성 잠복기를 보여준다. PPF1 처리는 CCI와 비히클 대조군이 제공된 마우스에 비해 핫 플레이트 자극에 상당히 덜 민감하여 PPF1에 의한 구조 효과를 나타낸다. 반면, 표준 치료 효과(가바펜틴)는 비히클의 효과와 유사하다.
도 8은 도 1에 설명된 대로 CCI 또는 가짜 수술을 받고 타임 라인에서 테스트 한 야생형 마우스에 대한 핫 플레이트 테스트의 데이터를 나타낸다. 도 8은 CCI 또는 가짜 수술 5주 후 핫 플레이트 통각성 잠복기를 보여준다. PPF1 처리 및 rhALB는 CCI와 비히클 대조군이 제공된 마우스에 비해 핫 플레이트 자극에 훨씬 덜 민감한다.
도 9는 도 1에 설명된 대로 CCI 또는 가짜 수술을 받고 타임 라인에서 테스트 한 C57BL /6J 마우스의 기계적 폰 프레이 이질통 테스트 데이터를 나타낸다. 도 9는 CCI 수술 후 PPF1을 투여한 마우스가 CCI 후 비히클로 치료한 경우보다 모든 평가 시점에서 기계적 통각에 대한 내성을 크게 증가 시켰음을 보여준다. 반대로, rhALB를 투여한 마우스는 모든 시점에서 비히클 처리된 마우스에 대한 기계적 이질통과 유사한 반응을 보이다.
도 10은 도 1에 설명된 바와 같이 CCI 또는 가짜 수술을 받고 35일 후에 조직 수집 후 분석된, C57BL /6J 마우스에서 수초 염기성 단백질(MBP) 발현의 좌골 신경 조직학적 분석(마지막 결찰에서 약 1000㎛ 원위)의 데이터를 나타낸다. 도 10은 CCI 수술 후 PPF1을 투여받은 마우스가 비히클 처리된 동물과 비교하여, 증가된 미엘린 발현을 나타내는, 유의하게 증가된 MBP 강도를 가짐을 예시한다. 가짜 수술 마우스는 또한 CCI 손상된 비히클 마우스에 비해 증가된 MBP를 발현한다.
도 11은, 도 1에 설명된 바와 같이 CCI 또는 가짜 수술을 받고 35일 후에 조직 수집 후 분석된 C57BL /6J 마우스에서 S-100 단백질(슈반 세포에 의해 발현됨)의 좌골 신경 조직학적 분석(마지막 결찰서 약 1000㎛ 원위)의 데이터를 나타낸다. 도 11은 CCI 수술 후 PPF1을 투여한 마우스가 비히클 처리된 동물과 비교하여 증가된 슈반 세포(말초신경에서 수초를 생성하는 세포)를 나타내는 S-100 강도를 상당히 증가시켰음을 보여준다. 가짜 수술 마우스는 또한 CCI 손상된 비히클 마우스에 비해 증가된 S-100을 발현한다.
도 12는, 도 1에 설명된 대로 CCI 수술을 받고 비히클 또는 PPF1로 치료되고 35일 후 좌골 신경 조직의 정성 분석에 사용된 C57BL /6J 마우스에서, 도 10 및 11에서 정량화에 사용된 위치(마지막 합자에서 약 1000㎛ 원위)와 S-100 단백질(Schwann 세포에 의해 표현됨) 및 수초 염기성 단백질의 대표적인 강도를 확인하는 좌골 신경 조직학적 분석에서 선택한 이미지이다.
도 13은 도 1에 설명된 바와 같이 CCI 또는 가짜 수술을 받고 35일 후에 조직 수집 후 분석한 C57BL /6J 마우스의 척수 조직학적 분석(요추 섹션 L4-L6에서 수집된 척수 조직에서 수행됨) 데이터를 나타낸다. 도 13은 CCI 수술 후 PPF1을 투여받은 마우스가 척수의 등뿔 내에서 BDNF 강도를 상당히 감소시켰음을 보여 주며, 이는 척수 내 미세아교세포의 활성화 감소를 나타낸다. BDNF는 활성화된 미세아교세포에 의해 방출되는 전 염증성 사이토카인이기 때문에, 이러한 결과는 PPF1이 척수 내 통증 상태의 근본적인 조절자를 감소시켜 가짜 수술(비 CCI 손상) 마우스 수준으로 정상화하고 있음을 시사한다.
도 14는 도 1에 설명된 바와 같이 CCI 또는 가짜 수술을 받고 35일 후에 조직 수집 후 분석 한 C57BL /6J 마우스의 척수 조직학적 분석(요추 섹션 L4-L6에서 수집된 척수 조직에서 수행됨)의 데이터를 나타낸다. 도 14는 CCI 수술 후 PPF1을 투여받은 마우스가 척수의 등뿔 내에서 CD68 강도를 상당히 감소시켰음을 보여 주며, 이는 척수 내 미세아교세포의 활성화 감소를 나타낸다. CD68 단백질이 활성화된 미세아교세포에 의해 발현됨에 따라 이는 PPF1이 척수 내 통증 상태 유도를 담당하는 기본 세포 유형의 활성화를 감소시켜 가짜(비 CCI 손상) 마우스 수준으로 정상화하고 있음을 시사한다. 도 13 및 도 14에 제시된 데이터는 PPF1이 좌골 신경 손상으로 인한 통증 상태를 중앙에서 조절하고 중추 민감화라고도 하는 말초신경과 뇌 사이의 통증 신호 전달을 개선하거나 방지한다는 것을 나타낸다.
도 15는, 도 1에 설명된 대로 CCI 수술을 받고 비히클 또는 PPF1로 치료되고 35일 후 좌골 신경 조직의 정성 분석에 사용된 C57BL /6J 마우스에서, 도 14에서 정량화에 사용된 등뿔 위치 및 CD68 단백질(활성화된 미세아교세포에 의해 발현됨)의 대표적인 강도를 확인하는 척수 조직학적 분석(요추 섹션 L4-L6에서 수집한 척수 조직에서 수행됨)에서 선택한 이미지이다.
도 16은, 도 1에 설명된 대로 CCI 수술을 받고 비히클 또는 PPF1로 치료되고 35일 후 좌골 신경 조직의 정성 분석에 사용된 C57BL /6J 마우스에서, 도 13의 정량화에 사용된 등뿔의 위치 및 BDNF 단백질(활성화된 미세아교세포에 의해 방출되는 사이토카인)의 대표적인 강도를 확인하는 척수 조직학적 분석(요추 섹션 L4-L6에서 수집된 척수 조직에서 수행됨)에서 선택된 이미지이다.
도 17은 만성 수축 손상(CCI) 실험을 보여준다. 22개월 된 야생형 마우스는 PPF1, rhALB 또는 비히클 대조군의 7일 연속 펄스 투여 요법을 투여하기 2주 전에 결찰을 통해 CCI 또는 가짜 수술을 받았다. 행동은 2주에서 7주 사이에 매주 평가되었고 조직학적 분석을 위한 조직 수집은 7주에 이루어졌다.
도 18은 CCI 또는 가짜 수술을 받고 도 17에 설명된 바와 같이 타임 라인에서 테스트한 C57BL /6J 마우스에서 기계적 폰 프레이 이질통 테스트 데이터를 나타낸다. 도 18은 CCI 수술 후 2주에 PPF1을 투여한 마우스가 PPF1 치료 중단 후 1주일 시점에서 시작되어 연구 기간 동안 유지되는 기계적 통각에 내성을 상당히 증가시켰음을 보여준다. 도 18의 결과는 PPF1 치료가 치료 후 1주일 전까지는 개선된 내성이 입증되지 않기 때문에 종 방향 방식으로 기계적 이질통에 대한 민감성을 줄이는 과정을 시작하고(아편 유사 진통제와 같이 치료 중 독점적으로 혜택을 제공하는 치료와는 대조적으로) 최소 28일 동안 지속된다는 것을 시사한다. 반대로, rhALB를 투여한 마우스는 모든 시점에서 비히클 처리된 마우스에 대한 기계적 이질통에 유사한 반응을 보이다.
도 19는 CCI 또는 가짜 수술을 받고 도 17에 설명된 바와 같이 타임 라인에서 테스트한 야생형 마우스에 대한 핫 플레이트 테스트의 데이터를 나타낸다. 도 19는 CCI 또는 가짜 수술 5주 후 핫 플레이트 통각성 잠복기를 보여준다. PPF1 처리는 CCI에 비히클 대조군이 제공된 마우스에 비해 핫 플레이트 자극에 훨씬 덜 민감한다.
도 20은 CCI 또는 가짜 수술을 받고 도 17에 설명된 바와 같이 타임 라인에서 테스트한 야생형 마우스에 대한 핫 플레이트 테스트의 데이터를 나타낸다. 도 20은 CCI 또는 가짜 수술 7주 후 핫 플레이트 통각성 잠복기를 보여준다. PPF1 처리는 CCI와 비히클 대조군이 제공된 마우스에 비해 핫 플레이트 자극에 훨씬 덜 민감하다.
도 21A 및 21B는 치료되지 않은(21A) 또는 PPF1로 치료된(도 21B) 당뇨병 상처(B6.BKS(D)-Lepr^db/J 당뇨병 마우스 모델) 사이의 조직학적 비교를 제공한다. 검은색 막대는 상처 층 두께(표피 + 과립층)를 나타낸다. 화살표는 상처 경계를 나타낸다. 상처 층 두께에 의해 결정된 바와 같이 PPF1 처리된 마우스에서 상처 층 두께가 증가하였다. 따라서 PPF1은 향상된 상처 치유를 보여준다.
도 22A 및 22B는 치료되지 않은(22A) 또는 PPF1로 치료된(도 22B) 당뇨병 상처(B6.BKS(D)-Lepr^db/J 당뇨병 마우스 모델) 사이의 조직학적 비교를 제공한다. 검은색 막대는 과립층을 나타낸다. 파란색 막대는 표피층을 나타낸다. PPF1 처리된 상처는 처리되지 않은 상처보다 더 두꺼운 표피층을 보였지만, 과립층은 PPF1 처리된 상처와 처리되지 않은 상처 사이의 차이에서 훨씬 더 큰 경향을 나타냈다(즉, 과립층은 처리되지 않은 상처보다 PPF1 처리된 상처에서 더 두껍다).
도 23은 도 24 내지 28에서 사용된 당뇨병성 상처 치유 실험의 일반적인 설계를 묘사한다. 혈액 방울은 공복 혈당 수준을 측정하기 위해 혈액이 수집된 시기를 나타낸다. 2일째에 피부 상처를 만들고 1-7일째에 정맥 내(iv) 투여를 수행했다. 조직학(현미경으로 표시)은 희생 후 수행되었다.
도 24는 첫 번째 연구(연구 1)에서 상처 후 여러 시점에서 여전히 열린 상처의 비율을 나타낸다. 마우스는 7일 동안 PPF1(150㎕) 또는 식염수 대조군으로 처리되었다. 10일 후, PPF1 처리된 동물에서 열린 상처의 크기는 식염수 대조군에 비해 현저하게 감소했다.(** p <0.006, 독립표본 T-검정).
도 25는 두 번째 유사한 연구(연구 2)에서 상처 후 여러 시점에서 여전히 열린 상처의 비율을 나타낸다. 마우스는 7일 동안 PPF1(150㎕) 또는 식염수 대조군으로 처리되었다. 8일 후, PPF1 처리된 동물에서 열린 상처의 크기는 식염수 대조군에 비해 현저하게 감소했다.(** p <0.0018 독립표본 T- 검정).
도 26은 연구 1 및 2의 데이터를 결합하여 상처 내기 11일 후 여전히 열린 상처의 백분율을 나타낸다. PPF1 처리된 동물은 11일 후 열린 상처의 백분율에서 통계적으로 유의미한 감소를 나타낸다.(** p <0.006, 독립표본 T-검정). 10일째에 PPF1 처리된 동물과 비히클 처리된 동물 사이의 차이는 유사하게 유의했다(독립표본 T-검정에 의해 ** p <0.006).
도 27은 B6 ob /ob(B6.Cg-Lepob/J 마우스)에서 상처에 국소 투여된 PPF1 또는 비히클을 사용한 연구 결과를 나타낸다. 도 27은 상처에 투여된 30㎕의 국소 PPF1 또는 대조군 비히클의 매일 투여의 연구 패러다임을 보여준다. 상처는 도 23에 설명된 대로 수행되었다.
도 28은 10일 치료 후 남은 초기 상처 부위의 백분율과 함께 국소 연구의 결과를 나타낸다. 도 28은 PPF1이 대조군과 비교하여 10일 후 남은 상처의 비율을 현저히 감소시켰음을 나타낸다.

VII. 발명의 상세한 설명

A. 도입

본 발명은 수술 후 회복과 관련된 원치 않는 상태를 치료하고 그러한 회복을 개선하기 위한 방법 및 조성물의 확인 및 발견에 관한 것이다. "이러한 회복을 개선한다"는 것은 피험자의 수술 후 회복이 가속화될 수 있음을 의미한다. 즉, 피험자가, 본 발명의 실시 예의 개입 없이 소요되는 시간보다, 더 짧은 시간에 움직이거나 입원 치료에서 퇴원할 수 있음을 의미한다. "원치 않는 상태"는 예로서 통증, 심폐 문제, 감염, 혈전 색전 문제, 염증 및 지연된 상처 치유와 같은 상태 또는 증상을 의미한다. 본 발명의 측면인, 수술 후 회복과 관련된 원치 않는 상태를 앓고 있는 대상체를 치료하고 그러한 회복을 개선하기 위한 방법 및 조성물이 본원에 기술된다. 또한, 본원에서는 수술 후 회복과 관련된 원치 않는 상태를 겪고 있는 대상체에서 개선을 촉발하고 그러한 회복을 개선하는 투약 요법이 설명된다. 본 명세서에 기술된 방법 및 조성물은 다음에서 유용하다: 수술 후 회복으로 인한 합병증 예방; 수술 후 회복으로 인한 합병증을 예방하는 증상 개선; 수술 후 회복 가속화. 본 발명의 방법 및 조성물은 수술 전(수술 전); 수술 전후(수술 중); 또는 수술 후(수술 후)에 사용되거나 투여될 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면은 만성 통증 /신경 병증을 다 일반적으로 치료하는 것이며, 수술 후 회복과 관련된 만성 통증 /신경 병증만을 치료하는 것이 아니다. 본원에 기술된 본 발명의 방법 및 조성물은 만성 통증 및 신경 병증을 치료하는데 사용될 수 있다. "만성 통증 및 신경 병증을 치료하는 것"은 본 발명의 조성물이 투여되는 대상체가 경험하는 만성 통증의 정도가 주관적 또는 객관적 수단에 의해 평가될 때, 약간, 적당히 또는 상당히 감소됨을 의미한다. 이러한 수단에는 예를 들어 다음과 같은 자가 또는 의료 전문가가 관리하는 검사가 포함될 수 있다. X- 레이; MRI, CT 스캔; 통증에 대한 환자 평가 또는 설명; 운동 범위; 반사 신경, 근력; 민감도(예: 피험자가 압력이나 기타 자극을 받는 사지를 제거하는 데 걸리는 시간); 염증 마커에 대한 혈액 검사; 근전도 검사(EMG); 및 신경 전도 속도.

본 발명의 구현은 치료로서, 예를 들어, 후술되는 코온 분별법과 혈액 분별법으로부터 수득된 하나 이상의 분획 또는 유출물과 같은 혈장 분획을 사용하는 것을 포함한다. 본 발명의 한 실시 양태는 혈장 분획(정상 인간 알부민, 알파 및 베타 글로불린, 감마 글로불린 및 기타 단백질을 개별적으로 또는 복합체로서 포함하는 용액, 이하 "혈장 분획"이라고 함)의 사용을 포함한다. 본 발명의 또 다른 구체 예는 치료로서 혈장 단백질 분획(PPF)을 사용하는 것을 포함한다. 본 발명의 다른 구체 예는 치료로서 인간 알부민 용액(HAS) 분획을 사용하는 것을 포함한다. 또 다른 실시 예는 아래에 설명된 유출물 I 또는 유출물 II /III과 같은 혈액 분류 공정으로부터의 유출물을 사용하는 것을 포함한다. 추가 구체 예는 혈전증의 위험을 감소시키면서 효능을 유지하기 위해 실질적으로 모든 응고 인자가 제거된 혈장 분획을 포함한다(예를 들어, 미국 특허 출원 번호 62 /236,710 및 63 /376,529 참조, 여기에서 그 전체가 참조로 포함된다).

본 발명을 상세하게 설명하기 전에, 본 발명은 설명된 특정 방법 또는 구성에 제한되지 않고, 물론 다양할 수 있음을 이해해야 한다. 또한, 본 발명의 범위는 첨부된 청구 범위에 의해서만 제한될 것이기 때문에, 본 명세서에서 사용된 용어는 단지 특정 실시 예를 설명하기 위한 것이며 제한하려는 의도가 아님을 이해해야 한다.

본 명세서에서 논의된 간행물은 본 출원의 출원일 이전에 공개를 위해서만 제공된다. 본 명세서의 어떠한 것도 본 발명이 선행 발명에 의해 그러한 공보에 선행할 자격이 없다는 것을 인정하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 또한 제공되는 발행일은 개별 확인이 필요한 실제 발행일과 다를 수 있다.

값의 범위가 제공되는 경우, 문맥이 명확하게 달리 지시하지 않는 한, 그 범위의 상한과 하한 사이에 각각의 중간 값이 하한 단위의 10분의 1까지 구체적으로 개시되는 것으로 이해된다. 언급된 범위 내의 임의의 언급된 값 또는 중간 값과 그 언급된 범위 내의 임의의 다른 언급된 또는 중간 값 사이의 각각의 더 작은 범위가 본 발명에 포함된다. 이러한 더 작은 범위의 상한 및 하한은 범위에 독립적으로 포함되거나 제외될 수 있으며, 더 작은 범위에 어느 한도 또는 두 한도의 각 범위도 본 발명에 포함된다. 명시된 범위가 한계 중 하나 또는 둘 다를 포함하는 경우, 포함된 한계 중 하나 또는 둘 다를 제외한 범위도 본 발명에 포함된다.

청구 범위의 초안은 임의의 선택적 요소를 배제하기 위해서도 작성될 수 있다. 따라서, 이 설명은 청구범위 요소의 인용 또는 "부정적인" 제한의 사용과 관련하여 "단독", "만" 등과 같은 배타적인 용어 사용에 대한 선행 기반으로 사용되도록 의도되었다.

본 개시를 읽을 때 당업자에게 명백한 바와 같이, 본 명세서에 설명되고 예시된 각각의 개별 실시 예는 이탈하지 않고 다른 몇몇 실시 예의 특징으로부터 쉽게 분리되거나 결합될 수 있는 별개의 구성 요소 및 특징을 갖는다. 본 발명의 범위 또는 정신으로부터 언급된 모든 방법은 언급된 사건의 순서 또는 논리적으로 가능한 다른 순서로 수행될 수 있다.

B. 정의

달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 기재된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 일부 우선적이고 바람직한 방법 및 물질이 이제 설명된다. 본 명세서에 언급된 모든 간행물은 간행물이 인용하는 방법 및/또는 자료를 개시하고 설명하기 위해 본 명세서에 참고로 포함된다. 본 개시 내용은 모순이 있는 범위까지 통합된 간행물의 임의의 개시 내용을 대체하는 것으로 이해된다.

본 명세서 및 첨부된 청구 범위에서 사용된 바와 같이, 단수 형태 "하나", "한" 및 "그"는 문맥이 명백하게 달리 지시하지 않는 한 복수 지시 대상을 포함한다는 점에 유의해야 한다. 따라서, 예를 들어, "세포"에 대한 언급은 다수의 이러한 세포를 포함하고 "펩티드"에 대한 언급은 예를 들어 당업자에게 공지된 펩티드 등, 하나 이상의 펩티드 및 그의 등가물에 대한 언급을 포함한다.

본 발명의 방법을 설명함에 있어서, 용어 "숙주", "대상", "개체" 및 "환자"는 상호 교환적으로 사용되며 개시된 방법에 따른 이러한 치료를 필요로 하는 임의의 포유동물을 지칭한다. 이러한 포유동물은 예를 들어 인간, 양, 소, 말, 돼지, 개, 고양이, 비인간 영장류, 마우스 및 쥐를 포함한다. 특정 실시 양태에서, 대상체는 비인간 포유동물이다. 일부 실시 양태에서, 대상체는 농장 동물이다. 다른 구현 예에서, 대상체는 애완동물이다. 일부 구현 예에서, 대상체는 포유류이다. 특정 사례에서 대상은 인간이다. 다른 피험자는 애완동물(예: 개 및 고양이), 가축(예: 소, 돼지, 염소, 말 등), 설치류(예: 생쥐, 기니피그 및 쥐, 예를 들어 질병의 동물 모델로서) 및 비인간 영장류(예: 침팬지, 원숭이)를 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명의 대상체는 포유동물, 예를 들어 인간 및 침팬지 및 다른 유인원 및 원숭이 종과 같은 다른 영장류; 등이고, 특정 구체 예에서 대상은 인간이다. 대상이라는 용어는 또한 모든 연령, 체중 또는 기타 신체적 특성의 사람 또는 유기체를 포함하는 것을 의미하며, 여기서 대상은 성인, 어린이, 유아 또는 신생아 일 수 있다.

"젊은" 또는 "젊은 개인"은, 예를 들어 35세 이하, 30세 이하, 예를 들어 25세 이하, 22세 이하를 포함하여 40세 이하 연대기 연령의 개인을 의미한다. 일부 예에서, 젊은 혈장-포함 혈액 제제의 공급원으로 작용하는 개체는, 예를 들어 1세 이하, 5세 이하를 포함하여 10세 이하의 개체이다. 일부 예에서, 피험자는 신생아이고 혈장 제품의 공급원은 탯줄이며, 여기서 혈장 제품은 신생아의 탯줄로부터 수확된다. 따라서, "젊은" 및 "젊은 개인"은 0세에서 40세 사이의 대상을 지칭할 수 있다(예: 0, 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 또는 40세). 다른 예에서, "젊은" 및 "젊은 개인"은 비교적 나이가 많은 개인에서 나타나는 혈장에서 염증성 사이토카인의 수준을 나타내지 않은 개인과 같은 생물학적(연대기가 아닌) 연령을 지칭할 수 있다. 반대로, 이러한 "젊은" 및 "젊은 개인"은 비교적 나이가 많은 개인의 수준에 비해 혈장에서 더 높은 수준의 항염증성 사이토카인을 나타내는 개인과 같은 생물학적(연대기가 아닌) 연령을 지칭할 수 있다. 제한이 아닌 예로서, 염증성 사이토카인은 에오탁신이고, 젊은 개체 또는 젊은 개체와 노인 개체 사이의 배수 차이는 적어도 1.5 배이다. 유사하게, 다른 염증성 사이토카인에서 노인과 젊은 개인 간의 배 차이는 생물학적 연령을 나타내는 데 사용될 수 있다.(본원에 참고로 포함된 미국 특허 출원 번호 13 /575,437 참조). 일반적으로 개체는 건강하다. 예를 들어, 개체는 수확 시점에 혈액 악성 종양이나 자가 면역 질환이 없다.

본원에 사용된 "치료"는(i) 질환 또는 장애의 예방, 또는(ii) 질환 또는 장애의 증상의 감소 또는 제거 중 임의의 것을 지칭한다. 치료는 예방적으로(질병 발병 전) 또는 치료적으로(질병 발병 후) 시행될 수 있다. 효과는 질병 또는 이의 증상을 완전히 또는 부분적으로 예방하는 측면에서 예방적일 수 있고/있거나 질병에 대한 부분적 또는 완전한 치료 및/또는 질병에 기인하는 부작용 측면에서 치료적일 수 있다. 따라서, 본원에 사용된 용어 "치료"는 포유동물에서 수술 후 회복과 관련된 상태의 임의의 치료를 포함하고 다음을 포함한다: (a) 상태가 대상체에서 발생하는 것을 방지하는 것; (b) 상태 억제, 즉 발생 억제; 또는 (c) 상태 완화, 즉 상태 회귀를 유발한다. 치료는 예를 들어 유전자 발현의 조절, 조직 또는 기관의 회춘, 염증 감소 등과 같은 다양한 다른 물리적 징후를 초래할 수 있다. 치료제는 상태의 발병 전, 도중 또는 후에 투여될 수 있다. 대상 요법은 증상의 증후군 단계 동안 및 일부 경우 증상의 증후군 단계 후에 투여될 수 있다.

혈장 성분을 포함하는 혈액 제품. 본 방법을 실행함에 있어서, 혈장 성분을 포함하는 혈액 제제는 이를 필요로 하는 개체, 예를 들어 수술 후 증상을 앓고 있는 개체에게 투여된다. 이와 같이, 본 발명의 구체 예에 따른 방법은 개인("기증자 개인" 또는 "기증자")의 혈장 성분을 포함하는 혈액 제제를 수술 후 상태를 앓고 있는 개인("수용자" 또는 "수용자")에게 투여하는 것을 포함한다. "혈장 성분을 포함하는 혈액 제품"은 혈장(예: 전혈, 혈장 또는 이의 분획)을 포함하는 혈액으로부터 유래된 임의의 제품을 의미한다. 용어 "혈장"은 약 92%의 물, 7% 단백질, 예를 들어 알부민, 감마 글로불린, 항혈우병 인자 및 기타 응고 인자, 및 1% 미네랄 염, 설탕, 지방, 호르몬 및 비타민으로 구성된 혈액의 짚색 /담황색 액체 성분을 지칭하는 일반적인 의미로 사용된다. 대상 방법에 사용하기에 적합한 혈장 포함 혈액 제품의 비 제한적인 예에는 항응고제로 처리된 전혈(예: EDTA, 시트레이트, 옥살레이트, 헤파린 등)), 백혈구를 제거하기 위해 전혈을 여과하여 생산된 혈액 제제( "백혈구 감소"), 혈장 비 구형 유래 또는 비 구형 유래 혈장으로 구성된 혈액 제제, 신선 냉동 혈장, 본질적으로 정제된 혈장으로 구성된 혈액 제제, 및 본질적으로 혈장 분획으로 구성된 혈액 제품이 포함된다. 일부 경우에 사용되는 혈장 제품은 비-전혈 혈장 제품이며, 이는 제품이 전혈이 아니므로 예를 들어 적혈구, 백혈구 등과 같은 전혈에서 발견되는 성분이 하나 이상 이러한 성분이 전혈에 존재하는 정도까지 혈액에서 부족함을 의미한다. 일부 예에서, 혈장 생성물은 실질적으로 완전히는 아니지만 무 세포이며, 이러한 경우에 세포 함량은 5부피% 이하, 예를 들어 1% 이하, 0.5% 이하일 수 있으며, 일부 경우에는 무 세포 혈장 분획은 세포가 완전히 없는, 즉 세포를 포함하지 않는 조성물이다.

혈장 성분을 포함하는 혈액 제품 수집. 본원에 기재된 방법의 실시 양태는 인간 지원자를 포함하여 기증자로부터 유래될 수 있는 혈장 성분을 포함하는 혈액 제품의 투여를 포함한다. "인간 유래"라는 용어는 그러한 제품을 지칭할 수 있다. 공여자로부터의 혈액 제품을 포함하는 혈장 수집 방법은 당 업계에 잘 알려져 있다.(예를 들어, AABB TECHNICAL MANUAL,(Mark A. Fung, et al., eds., 18th ed. 2014), 여기에 참조로 포함됨).

한 실시 양태에서, 기부는 정맥 천자에 의해 획득된다. 다른 구체 예에서, 정맥 천자는 단지 단일 정맥 천자이다. 다른 구체 예에서, 식염수 부피 대체가 사용되지 않는다. 바람직한 구체 예에서, 혈장 채집 공정은 혈액 제제를 포함하는 혈장을 얻기 위해 사용된다. 혈장 채집은 세포 구성 요소를 기증자에게 되돌려 보내면서 체중 조정된 부피의 혈장을 제거하는 것을 포함할 수 있다. 바람직한 구체 예에서, 구연산 나트륨은 세포 응고를 방지하기 위해 혈장 분리 동안 사용된다. 공여자로부터 수집된 혈장의 부피는 바람직하게는 구연산염 투여 후 690 내지 880mL이고, 바람직하게는 공여자의 체중과 조정된다.

C. 혈장 분획

제2차 세계 대전 동안 병사들이 다량의 피를 잃었을 때 전장에서 사용할 수 있는 안정적인 플라즈마 확장기가 필요했다. 그 결과 동결 건조된 혈장을 제조하는 방법이 개발되었다. 그러나 동결 건조 혈장의 사용은 무균 수를 필요로 했기 때문에 전투 상황에서 어려웠다. 대안으로 E.J. Cohn은 알부민을 사용할 수 있다고 제안하고 쇼크 치료를 위해 즉시 도입할 수 있는 즉시 사용 가능한 안정된 용액을 준비했다.(Johan, Current Approaches to the Preparation of Plasma Fractions in(Biotechnology of Blood) 165(Jack Goldstein ed., 1st ed. 1991)). 코온 박사의 혈장 분획 정제 절차는 변성 효과를 위해 차가운 에탄올을 사용하고 분리를 달성하기 위해 pH 및 온도 변화를 사용한다.

본원에 기재된 방법의 실시 양태는 혈장 분획을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 분획화는 특정 단백질 하위 집합이 혈장에서 분리되는 과정이다. 분획화 기술은 당 업계에 알려져 있으며 1940년대 코온 등이 개발한 단계에 의존한다. (E. Cohn, Preparation and properties of serum and plasma proteins. IV. A system for the separation into fractions of the protein and lipoprotein components of biological tissues and fluids. 68 J Am Chem Soc 459 (1946), 본원에 참조로 포함됨) 이 공정에는 여러 단계가 포함되며, 각 단계는 특정 에탄올 농도와 pH, 온도 및 삼투압 변화를 포함하여 선택적 단백질 침전을 초래한다. 침전물은 원심 분리 또는 침전을 통해 분리된다. 원래의 "코온 분획화 공정"은 침전물을 통해 단백질을 5개의 분획, 지정된 분획 I, 분획 II + III, 분획 IV-1, 분획 IV-4 및 분획 V로 분리하는 것을 포함했다. 알부민은 이 과정의 원래 확인된 종점(분획 V) 생성물이었다. 본 발명의 구체 예에 따르면, 각각의 분획(또는 이전 분리 단계로부터의 유출물)은 치료적으로 유용한 단백질 분획을 포함하거나 잠재적으로 포함한다.(Thierry Burnouf, Modern Plasma Fractionation, 21(2) Transfusion Medicine Reviews 101(2007); Adil Denizli, Plasma fractionation: Conventional and chromatographic methods for albumin purification, 4 J. Biol. & Chem. 315,(2011); 및 T. Brodniewicz-Proba, Human Plasma Fractionation and the Impact of New Technologies on the Use and Quality of Plasma-dered Products, 5 Blood Reviews 245(1991), 및 미국 특허 번호 3869431, 5110907, 5219995, 7531513, 및 8772461, 본 명세서에 참고로 포함됨). 특정 단백질 분획을 얻기 위해 위의 실험 매개 변수를 조정할 수 있다.

더 최근에, 분획화는 더 복잡해졌고, 따라서 본 발명의 추가 실시 예를 포함한다. 이러한 복잡성의 최근 증가는 다음을 통해 발생했다. 크로마토그래피의 도입으로 저온 침전물, 저온-불량 혈장 및 코온 분획과 같은 기존 분획에서 새로운 단백질을 분리하고; 크로마토그래피와 에탄올 분별 과정을 통합하여 IgG 회수율을 높이고; 및 바이러스 감소/불활성화/제거한다. 생리적 pH 및 이온 강도에서 단백질을 포획하기 위해 음이온 교환 크로마토그래피를 사용할 수 있다. 이것은 단백질 및/또는 단백질 분획의 기능적 활성을 보존한다. 헤파린 및 단일 클론 항체는 친 화성 크로마토그래피에도 사용된다. 또한 겔 여과를 사용한 분별, 염에 의한 분별 및 폴리에틸렌 글리콜에 의한 분별이 사용된다.(Hosseini M Iran J Biotech, 14(4): 213-20(2016)). 당업자는 상술 한 파라미터 및 기술이 특별히 원하는 혈장 단백질 함유 분획을 얻기 위해 조정될 수 있음을 인식할 것이다.

혈장 분획은 황산 암모늄 기반일 수도 있다.(예를 들어, Odunuga OO, Biochem Compounds, 1: 3(2013); Wingfield PT, Curr Protoc Protein Sci, Appx. 3(2001), 본원에 참조로 포함됨). 특정 혈액 분획을 얻는 것 외에도 황산 암모늄 기반 분획을 사용하여 혈장에서 풍부한 단백질을 감소시킨다.(Saha S, et al., J. Proteomics Bioinform, 5(8)(2012), 본원에 참조로 포함됨).

본 발명의 일 실시 예에서, 혈장은 산업 환경에서 분류된다. 동결된 혈장은 1℃ ~ 4℃에서 해동된다. 해동된 혈장에 연속 냉장 원심 분리를 적용하고 냉동 침전물을 분리한다. 회수된 냉동 침전물은 -30℃ 이하에서 냉동 보관된다. 저온 침전물이 부족한( "저온 침전이 없는") 혈장은 인자 IX 복합체와 같은 불안정한 응고 인자와 그 성분뿐만 아니라 안티트롬빈 및 C1 에스테라제 억제제와 같은 프로테아제 억제제의 포획(예: 1차 크로마토그래피를 통해)을 위해 즉시 처리된다. 연속 원심 분리 및 침전물 분리는 후속 단계에서 적용할 수 있다. 이러한 기술은 당업자에게 공지되어 있으며, 예를 들어 미국 특허 No. 4624780, 5219995, 5288853 및 미국 특허 출원 번호. 20140343255 및 20150343025에 게시되어 있고, 이 개시 내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.

본 발명의 한 실시 양태에서, 혈장 분획은 상당한 농도의 알부민을 함유하는 혈장 분획을 포함할 수 있다. 본 발명의 또 다른 실시 양태에서, 혈장 분획은 상당한 농도의 IgG 또는 정맥 내 면역 글로불린(IGIV)(예: Gamunex-C®)을 함유하는 혈장 분획을 포함할 수 있다. 본 발명의 또 다른 구체 예에서, 혈장 분획은 예를 들어, 단백질 A 매개 고갈과 같은 당 업계의 숙련자에 의해 잘 알려진 방법에 의해 면역 글로불린(IgG)이 실질적으로 고갈된 Gamunex-C®와 같은 IGIV 혈장 분획을 포함할 수 있다. (Keshishian, H., et al., Multiplexed, Quantitative Workflow for Sensitive Biomarker Discovery in Plasma Yields Novel Candidates for Early Myocardial Injury, Molecular & Cellular Proteomics, 14 at 2375-93(2015)). 추가 실시 양태에서, 혈장 분획은 혈전증 위험이 감소된 분획의 효능을 유지하기 위해 실질적으로 모든 응고 인자가 제거된 것일 수 있다. 예를 들어, 혈장 분획은 2016년 8월 18일에 출원된 미국 특허 번호 62 /376,529에 기술된 바와 같은 혈장 분획 일 수 있으며; 그 개시 내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.

D. 알부민 제품

당업자에게 알부민 혈장 생성물( "APP")의 두 가지 일반적인 범주가 있다: 혈장 단백질 분획( "PPF") 및 인간 알부민 용액( "HAS"). PPF는 HAS보다 수율이 높은 공정에서 파생되지만 HAS보다 최소 알부민 순도가 낮다(PPF의 경우> 83%, HAS의 경우> 95%).(Production of human albumin solution: a continually developing colloid, P. Matejtschuk et al., British J. of Anesthesia 85(6): 887-95, at 888(2000)). 일부 경우에, PPF는 83%와 95% 사이의 알부민 순도 또는 대안적으로 83%와 96% 사이의 알부민 순도를 갖는다. 알부민 순도는 전기영동 또는 기타 정량 분석, 예를 들어 질량 분석법에 의해 결정될 수 있다. 또한, 일부는 PPF가 PKA와 같은 단백질 "오염 물질"의 존재로 인해 단점이 있다고 지적했다. 그 결과 PPF 제제는 알부민 혈장 제품으로 인기를 잃었고 특정 국가의 약전에서 목록이 삭제되기도했다. 이러한 우려와 달리, 본 발명은 이러한 "오염물"을 유익하게 사용한다. α, β 및 γ 글로불린과 앞서 언급한 PKA 외에, 본 발명의 방법은, 신경 발생, 신경 세포 생존, 개선된 인지 또는 운동 기능과 같은 과정을 촉진하고 신경 염증을 감소시키는, "오염물" 내의 추가 단백질 또는 기타 인자를 이용한다.

당업자는 PPF( "상업적 PPF 제제")의 여러 상업적 공급원이 존재했거나 존재했음을 인식할 것이다. 이들은 Plasma-Plex ™ PPF(Armour Pharmaceutical Co., Tarrytown, NY), Plasmanate ™, PPF(Grifols, Clayton, NC), Plasmatein ™(Alpha Therapeutics, Los Angeles, CA) 및 Protenate ™ PPF(Baxter Labs, Inc. Deerfield, IL)를 포함한다.

당업자는 또한 HAS( "상업적 HAS 제제")의 여러 상업적 공급원이 존재했거나 존재했음을 인식할 것이다. 이들은 Albuminar ™(CSL Behring), AlbuRx ™(CSL Behring), Albutein ™( Grifols, Clayton, NC), Buminate ™(Baxatla, Inc., Bannockburn, IL), Flexbumin ™(Baxalta, Inc., Bannockburn, IL) 및 Plasbumin ™(Grifols, Clayton, NC)를 포함한다.

1. 혈장 단백질 분획(인간)(PPF)

미국 식품의 약국( "FDA")에 따르면 "혈장 단백질 분획(인간)" 또는 PPF는 인간 혈장으로 유래된, 알부민과 글로불린으로 구성된 멸균 용액으로 정의된 제품의 고유 이름이다. (여기에 참조로 포함된 연방 규정 "CFR"21 CFR 640.90 코드). PPF의 원료 물질은 21 CFR 640.1 - 640.5(본원에 참조로 포함됨)에 규정된 대로 제조된 전혈에서 회수된 혈장 또는 21 CFR 640.60 - 640.76(본원에 참조로 포함됨)에 규정된대로 제조된 원료 혈장이다.

PPF는 21 CFR 640.92(여기에 참조로 포함됨)에 따라 다음 표준을 충족하는지 확인하기 위해 테스트되었다.

(a) 최종 제품은 5.0 +/- 0.30% 단백질 용액이어야 한다; 및

(b) 최종 제품의 총 단백질은 최소 83%의 알부민과 17% 이하의 글로불린으로 구성되어야 한다. 감마 글로불린은 총 단백질의 1%를 넘지 않아야 한다. 단백질 조성은 식품의 약국 생물 의약품 평가 연구 센터장에 의해 각 제조사별로 승인된 방법으로 결정된다.

본원에 사용된 "혈장 단백질 분획" 또는 "PPF"는 인간 혈장에서 유래된 알부민 및 글로불린으로 구성된 단백질의 멸균 용액을 의미하며, 알부민 함량은 적어도 83%이고 글로불린(α1, α2, β 및 γ 글로불린 포함)은 17% 이하이고 기타 혈장 단백질 및 전기영동으로 측정한 감마 글로불린은 1% 이하이다.(Hink, J.H., Jr., et al., Preparation and Properties of a Heat-Treated Human Plasma Protein Fraction, VOX SANGUINIS 2(174)(1957)). PPF는 또한 용매에 현탁되었을 때 유사한 조성을 갖는 고체 형태를 나타낼 수 있다. 총 글로불린 분획은 총 단백질에서 알부민을 빼서 결정할 수 있다.(Busher, J., Serum Albumin and Globulin, CLINICAL METHODS: THE HISTORY, PHYSICAL, AND LABORATORY EXAMINATIONS, Chapter 10, Walker HK, Hall WD, Hurst JD, eds.(1990)).

2. 알부민(인간)(HAS)

FDA에 따르면, "알부민(인간)"(본 명세서에서 "HAS"라고도 함)은 "인간 혈장에서 유래한 알부민의 멸균 용액"으로 정의된 제품의 고유 명칭이다.(본원에 참조로 포함된 연방 규정 "CFR"21 CFR 640.80의 코드이다.) 알부민(인간)의 소스 물질은 21 CFR 640.1-640.5(본원에 참조로 포함됨)에 규정된 대로 제조된 전혈에서 회수된 혈장이다 또는 21 CFR 640.60-640.76(본원에 참조로 포함됨)에 규정된 대로 제조된 소스 혈장이다. 알부민(인간)에 대한 기타 요구 사항은 21 CFR 640.80 - 640.84(여기에 참조로 포함됨)에 나열되어 있다.

알부민(인간)은 21 CFR 640.82에 따라 다음 표준을 충족하는지 확인하기 위해 테스트된다.

(a) 단백질 농도. 최종 제품은 다음 농도 중 하나를 준수해야 한다: 4.0 +/- 0.25%; 5.0 +/- 0.30%; 20.0 +/- 1.2%; 및 25.0 +/- 1.5% 단백질 용액.

(b) 단백질 조성. 최종 제품의 전체 단백질 중 최소 96%는 알부민이어야 하며, 이는 식품의 약국 생물 제제 평가 및 연구 센터장이 각 제조업체에 대해 승인한 방법에 따라 결정된다.

본원에 사용된 "알부민(인간)" 또는 "HAS"는 알부민 함량이 95% 이상, 글로불린(α1, α2, β 및 γ 글로불린 포함) 5% 이하인, 인간 혈장에서 유래된 알부민과 글로불린 그리고 기타 혈장 단백질로 구성된 단백질의 멸균 용액을 의미한다. HAS는 또한 용매에 현탁되었을 때 유사한 조성을 갖는 고체 형태를 나타낼 수 있다. 총 글로불린 분획은 총 단백질에서 알부민을 빼서 결정할 수 있다.

당업자에 의해 인식될 수 있는 바와 같이, PPF 및 HAS 분획은 또한 동결 건조되거나 다른 고체 형태일 수 있다. 적절한 첨가제와 함께 이러한 제제는 예를 들어 정제, 분말, 과립 또는 캡슐을 만드는 데 사용할 수 있다. 고체 형태는 식물성 또는 기타 유사한 오일, 합성 지방족 산 글리세리드, 고급 지방족 산의 에스테르 또는 프로필렌 글리콜과 같은 수성 또는 비 수성 용매에 용해, 현탁 또는 유화함으로써 주사용 제제로 제형화될 수 있다. 필요하다면, 가용화제, 등장제, 현탁제, 유화제, 안정제 및 방부제와 같은 통상적인 첨가제를 사용할 수 있다.

E. 응고 인자 감소 분획

본 발명의 다른 구체 예는 혈전증의 위험이 감소된 분획의 효능을 유지하기 위해 실질적으로 모든 응고 인자가 제거된 혈장 분획을 사용한다. 편리하게도, 혈액 제품은 젊은 기증자 또는 젊은 기증자 풀에서 파생될 수 있으며 ABO와 호환되는 젊은 혈액 제품을 제공하기 위해 IgM이 없는 상태로 만들 수 있다. 현재, A와 B 항원에 대한 자연 발생 항체의 존재는 수혈 반응을 일으킬 수 있기 때문에 수혈된 혈장은 ABO 혈액형과 일치한다. IgM은 환자에게 ABO가 일치하지 않는 혈장을 투여했을 때 수혈 반응을 일으키는 것으로 보인다. 혈액 제품 또는 분획에서 IgM을 제거하면 본 발명의 혈액 제품 및 혈장 분획을 투여받은 피험자의 수혈 반응을 제거하는 데 도움이된다.

따라서, 일 구현 예에서, 본 발명은 수술 후 회복과 관련된 원치 않는 상태를 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 다음을 포함한다: 개체 또는 개체 풀의 전혈로부터 유래된 혈액 제품 또는 혈액 분획을 피험자에게 투여하는 단계, 여기서 혈액 제품 또는 혈액 분획에는 (a) 적어도 하나의 응고 인자 및/또는( b) IgM가 실질적으로 없다. 일부 실시 양태에서, 혈액 제제 또는 혈액 분획이 유래된 개인(들)은 젊은 개인이다. 일부 실시 양태에서, 혈액 제제에는 적어도 하나의 응고 인자 및 IgM이 실질적으로 없다. 특정 실시 양태에서, 혈액 제제에는 피브리노겐(인자 I)이 실질적으로 없다. 추가 실시 양태에서, 혈액 제제는 적혈구 및/또는 백혈구가 실질적으로 부족하다. 추가 구체 예에서, 혈액 제품은 실질적으로 무 세포이다. 다른 구체 예에서, 혈액 제품은 혈장으로부터 유래된다. 본 발명의 이러한 실시 예는 2016년 8월 18일에 출원된 미국 특허 출원 번호 62 /376,529에 의해 추가로 지원되며, 이는 전체가 여기에 참조로 포함된다.

F. 단백질이 풍부한 혈장 단백질 제품 처리

본 발명의 추가 구체 예는 PPF에 비해 감소된 알부민 농도를 갖지만, 증가된 양의 글로불린 및 기타 혈장 단백질(일부는 "오염물"이라고 함)을 갖는 혈장 분획을 사용한다. PPF, HAS, 유출물 I 및 유출물 II /III에서와 같이 실시 양태는 모두 효과적으로 응고 인자가 없다. 이러한 혈장 분획은 이하 "단백질이 풍부한 혈장 단백질 제품"이라고 한다. 예를 들어, 본 발명의 실시 예는 82% 알부민 및 18% α, β 및 γ 글로불린 및 기타 혈장 단백질로 구성된 단백질이 풍부한 혈장 단백질 제품을 사용할 수 있다. 본 발명의 또 다른 구체 예는 81% 알부민 및 19%의 α, β 및 γ 글로불린 및/또는 다른 혈장 단백질로 구성된 단백질이 풍부한 혈장 단백질 제품을 사용할 수 있다. 본 발명의 또 다른 구체 예는 80% 알부민 및 20%의 α, β 및 γ 글로불린 및/또는 다른 혈장 단백질로 구성된 단백질이 풍부한 혈장 단백질 제품을 사용할 수 있다. 본 발명의 추가 구체 예는 70-79% 알부민 및 상응하는 21-30%의 α, β 및 γ 글로불린 및 기타 혈장 단백질로 구성된 단백질이 풍부한 혈장 단백질 제품을 사용할 수 있다. 본 발명의 추가 구체 예는 60-69% 알부민 및 상응하는 31-40%의 α, β 및 γ 글로불린 및 다른 혈장 단백질로 구성된 단백질이 풍부한 혈장 단백질 제품을 사용할 수 있다. 본 발명의 추가 구체 예는 50-59% 알부민 및 상응하는 41-50%의 α, β 및 γ 글로불린 및 기타 혈장 단백질로 구성된 단백질이 풍부한 혈장 단백질 제품을 사용할 수 있다. 본 발명의 추가 구체 예는 40-49% 알부민 및 상응하는 51-60%의 α, β 및 γ 글로불린 및 기타 혈장 단백질로 구성된 단백질이 풍부한 혈장 단백질 제품을 사용할 수 있다. 본 발명의 추가 구체 예는 30-39% 알부민 및 상응하는 61-70%의 α, β 및 γ 글로불린 및 기타 혈장 단백질로 구성된 단백질이 풍부한 혈장 단백질 제품을 사용할 수 있다. 본 발명의 추가 구체 예는 20-29% 알부민 및 이에 상응하는 71-80%의 α, β 및 γ 글로불린 및 기타 혈장 단백질로 구성된 단백질이 풍부한 혈장 단백질 제품을 사용할 수 있다. 본 발명의 추가 구체 예는 10-19% 알부민 및 상응하는 81-90%의 α, β 및 γ 글로불린 및 기타 혈장 단백질로 구성된 단백질이 풍부한 혈장 단백질 제품을 사용할 수 있다. 본 발명의 추가 구체 예는 1-9% 알부민 및 상응하는 91-99%의 α, β 및 γ 글로불린 및 기타 혈장 단백질로 구성된 단백질이 풍부한 혈장 단백질 제품을 사용할 수 있다. 본 발명의 추가 구체 예는 0% 알부민 및 100%의 α, β 및 γ 글로불린 및 기타 혈장 단백질로 구성된 단백질이 풍부한 혈장 단백질 제품을 사용할 수 있다.

전술한 본 발명의 구체 예는 또한 1-5%의 총 감마 글로불린 농도를 가질 수 있다.

혈장 분획에서 단백질의 특정 농도는 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 잘 알려진 기술을 사용하여 결정될 수 있다. 제한이 아닌 예로서, 이러한 기술에는 전기 영동, 질량 분석법, ELISA 분석 및 웨스턴 블롯 분석이 포함된다.

G. 혈장 분획의 준비

PPF 및 기타 혈장 분획을 제조하는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 본 발명의 일 실시 예는, Hink의 논문에 게시된 방법에 따라, 인간 혈장 단백질 분획의 제조에 사용되는 혈액을 응고 억제를 위해 시트레이트 또는 항응고제 시트레이트 덱스트로스 용액(또는 다른 항응고제)과 함께 플라스크에 수집하고, 분획 I, II + III, IV 및 PPF의 추가 분리를 할 수 있게 한다(Hink, JH, Jr., et al., Preparation and Properties of a Heat-Treated Human Plasma Protein Fraction, VOX SANGUINIS 2(174)(1957), 여기에 참조로 포함됨). 이 방법에 따르면, 혼합물은 2-8℃로 수집된다. 이어서 혈장을 7℃에서 원심 분리하여 제거하고 -20℃에서 보관할 수 있다. 그 후 혈장은 37℃에서 해동하고 분획화할 수 있으며, 바람직하게는 -20℃ 보관에서 제거한 후 8시간 이내에 분류할 수 있다.

혈장은 pH 7.2 및 -2 ~ -2.5℃의 온도에서 8% 에탄올을 사용하여 단백질 농도가 5.1 ~ 5.6%인 분획 I에서 분리할 수 있다. 아세트산염 완충액(200mL 4M 아세트산나트륨, 230mL 빙초산을 물로 1 L로 희석)이 포함된 차가운 53.3% 에탄올(176mL/L 혈장)을, 제트를 사용하여 예를 들어 플라즈마 온도를 -2℃로 낮추는 동안 450mL/분의 속도로 추가할 수 있다. 분획 I은 초 원심 분리를 통해 유출물(Effluent I)에서 분리 및 제거할 수 있다. 피브리노겐은 당업자에게 잘 알려진 방법에 따라 분획 I로부터 얻을 수 있다.

분획 II + III는 유출물을 pH 6.8, 온도 -6℃에서, 21% 에탄올로 단백질 농도 4.3%를 갖도록 조정하여, 유출물 I에서 분리할 수 있다. pH 조정에 사용되는 10M 아세트산과 함께 차가운 95% 에탄올(176mL /L의 유출물 I)은, 예를 들어 유출물 I의 온도를 -6℃로 낮추는 동안 분당 500mL의 속도로 제트를 사용하여 추가할 수 있다. 생성된 침전물(Fraction II + III)은 -6℃에서 원심 분리하여 제거할 수 있다. 감마 글로불린은 당업자에게 잘 알려진 방법을 사용하여 분획 II + III로부터 얻을 수 있다.

분획 IV-1은 유출물을 pH 5.2, -6℃의 온도에서 19% 에탄올로 3%의 단백질 농도로 조정하여 유출물 II + III("유출물 II /III")에서 분리할 수 있다. pH 조정에 사용되는 H₂0 및 10M 아세트산은 유출물 II /III를 -6℃에서 6시간 동안 유지하면서 제트를 사용하여 추가할 수 있다. 침전 분획 VI-1은 -6℃에서 6시간 동안 침전시킨 다음 동일한 온도에서 원심 분리하여 유출물과 분리할 수 있다. 안정적인 혈장 단백질 분획은 유출물 IV-1에서 에탄올 농도를 30%로 조정하여 pH 4.65, 온도 -7℃ 및 단백질 농도 2.5%에서 회수할 수 있다. 이것은 차가운 산-알코올(2M 아세트산 2부 및 95% 에탄올 1부)로 유출물 IV-1의 pH를 조정하여 달성할 수 있다. -7℃의 온도를 유지하면서 조정된 유출물 IV-1 1리터당 170mL의 차가운 에탄올(95%)을 추가한다. 침전된 단백질은 36시간 동안 침전시킨 다음 -7℃에서 원심 분리하여 제거할 수 있다.

회수된 단백질(안정한 혈장 단백질 분획)을 건조(예: 동결 건조)하여 알코올과 H₂0을 제거할 수 있다. 생성된 건조 분말은 예를 들어 15리터의 물 /kg 분말을 사용하여 멸균 증류수에 용해될 수 있으며 용액은 1M NaOH로 pH 7.0으로 조정된다. 5% 단백질의 최종 농도는 나트륨 아세틸 트립토파네이트, 나트륨 카프릴레이트 및 NaCl을 포함하는 멸균 증류수를 첨가하여 0.004M 아세틸 트립토파네이트, 0.004M 카프릴레이트 및 0.112M 나트륨의 최종 농도를 조정함으로써 얻을 수 있다. 마지막으로, 용액을 10℃에서 여과하여 투명한 용액을 얻은 다음 60℃에서 최소 10시간 동안 병원체의 불 활성화를 위해 열처리할 수 있다.

당업자는 전술한 상이한 분획 및 유출물 각각이 수술 후 회복과 관련된 상태를 처리하기 위해 본 발명의 방법과 함께 사용될 수 있음을 인식할 것이다. 예를 들어, 제한 없이, 유출물 I 또는 유출물 II /III는 수술 후 회복과 관련된 상태를 치료하거나 수술 후 회복을 가속화하기 위해 사용될 수 있으며 본 발명의 실시 예이다.

혈장 분획 및 혈장 단백질 분획(PPF)을 제조하는 선행 방법은 단지 예시일 뿐이며 본 발명의 구현 예로 포함된다. 당업자는 이러한 방법이 다양할 수 있음을 인식할 것이다. 예를 들어, pH, 온도 및 에탄올 농도는 무엇보다도 본 발명의 상이한 실시 양태 및 방법에서 혈장 분획 및 혈장 단백질 분획의 상이한 변형을 생성하도록 조정될 수 있다. 또 다른 예에서, 본 발명의 추가 실시 예는 혈장 분획 및 혈장 단백질 분획으로부터 병원균의 제거/불 활성화를 위한 나노 여과의 사용을 고려한다.

본 발명의 추가 실시 양태는 추가 혈장 분획을 사용 및/또는 포함하는 방법 및 조성물을 고려한다. 예를 들어, 본 발명은 특히 알부민의 특정 농도가 수술 후 회복과 관련된 상태를 치료하거나 수술 후 회복을 가속화하는 데 중요하지 않다는 것을 고려한다. 따라서, 83% 미만의 알부민을 갖는 분획과 같이 감소된 알부민 농도를 갖는 분획이 본 발명에 의해 고려된다.

H. 치료

본원에 기재된 본 발명의 방법의 측면은 예를 들어 상기 기재된 바와 같은 혈장 분획과 같은 혈액 제품을 포함하는 혈장으로 대상체를 치료하는 것을 포함한다. 한 실시 양태는 혈액 제제를 포함하는 혈장으로 인간 피험자를 치료하는 것을 포함한다. 당업자는 혈액 제제를 포함하는 혈장으로 대상체를 치료하는 방법이 당 업계에서 인식된다는 것을 알 것이다. 제한이 아닌 예로서, 본원에 기재된 본 발명의 방법의 한 실시 양태는 수술 후 회복과 관련된 상태의 치료를 위해 대상체에게 신선한 냉동 혈장을 투여하는 것을 포함한다. 한 실시 양태에서, 혈액 제제를 포함하는 혈장은 수술 후 회복과 관련된 상태를 앓고 있는 개체에게 즉시, 예를 들어 공여자로부터 수집한지 약 12-48시간 내에 투여된다. 이러한 경우 제품은 냉장 보관(예: 0-10℃)할 수 있다. 다른 구체 예에서, 신선 냉동 혈장은 -18℃ 이하에서 냉동(냉동 보존) 보관된 것이다. 투여 전, 신선한 냉동 혈장은 해동되고 해동되면 해동 과정이 시작된 후 60-75분 후에 대상에게 투여된다. 각 피험자는 바람직하게는 단일 단위의 신선한 냉동 혈장(200-250 mL)을 받고, 신선한 냉동 혈장은 바람직하게는 미리 결정된 연령 범위의 공여자로부터 유도된다. 본 발명의 한 실시 양태에서, 신선한 냉동 혈장은 젊은 개인(유래)에 의해 기증된다. 본 발명의 또 다른 구체 예에서, 신선한 냉동 혈장은 같은 성별의 기증자(유래)에 의해 기증된다. 본 발명의 또 다른 구체 예에서, 신선한 냉동 혈장은 18-22세 사이의 연령 범위의 공여자(유래)에 의해 기증된다.

본 발명의 한 실시 양태에서, 본 발명의 조성물(예를 들어, 혈장 분획과 같은 혈액 생성물을 포함하는 혈장)은 정맥 내로 투여된다. 본 발명의 조성물은 또한 복강 내로 전달될 수 있다. 본 발명의 또 다른 구체 예에서, 본 발명의 조성물은 경구, 피하 또는 국소로 전달될 수 있다. 상처를 치료하고 치유를 촉진하기 위한 국소 제형은 당 업계에 공지된 바와 같이 겔, 크림, 연고, 거즈, 패치 등이고, 본 발명의 조성물은 그와 같이 제형화될 수 있다.(예를 들어, Kahn AW, et al., Pharmacogn Mag, 9(Suppl 1): S6-S10(2013); 미국 특허 등록 5,641,483; 미국 특허 등록 4,885,163; 미국 특허 등록 8,313,764 참조. 그 전체가 여기에 통합됨).

본 발명의 한 실시 양태에서, 혈액 제품을 포함하는 혈장은 기증 후 혈액형에 의해 스크리닝된다. 본 발명의 또 다른 실시 양태에서, 혈액 제제를 포함하는 혈장은 21 CFR 640.33의 요건 및 FDA 지침에 포함된 권장 사항에 따라 HIV I & II, HBV, HCV, HTLV I & II, 항 -HBc와 같은 감염성 질환 인자에 대해 스크리닝된다.

본 발명의 또 다른 구체 예에서, 대상체는 혈장 분획으로 치료된다. 본 발명의 일 실시 예에서, 혈장 분획은 PPF 또는 HAS이다. 본 발명의 추가 실시 양태에서, 혈장 분획은 상업적 HAS 제제의 상업적 PPF 제제 중 하나이다. 본 발명의 또 다른 구체 예에서, 혈장 분획은 특정 연령 범위의 개인, 예를 들어 젊은 개인의 풀로부터 유래된 PPF 또는 HAS이거나, 추가 분획 또는 처리를 거친 변형된 PPF 또는 HAS 분획이다(예: 하나 이상의 특정 단백질이 부분적으로 또는 실질적으로 제거된 PPF 또는 HAS). 본 발명의 또 다른 실시 양태에서, 혈장 분획은 면역 글로불린(IgG)이 실질적으로 고갈된 IGIV 혈장 분획이다. IgG와 같이 특정 단백질이 "실질적으로 고갈된" 또는 "실질적으로 제거된" 혈액 분획은 참조 제품 또는 전 혈장에서 발생하는 양의 약 50% 미만, 예를 들어 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.25%, 0.1%, 감지 불가능 수준, 또는 당 업계에 잘 알려진 표준 분석을 사용하여 측정된 이들 값 사이의 임의의 정수를 함유하는 혈액 분획을 의미한다.

I. 투여

본원에 기재된 본 발명의 방법의 측면은 예를 들어 상기 기재된 바와 같은 혈장 또는 혈장 분획과 같은 혈액 제제를 포함하는 혈장으로 대상체를 치료하는 것을 포함한다. 한 실시 양태는 혈액 제제를 포함하는 혈장으로 인간 피험자를 치료하는 것을 포함한다. 당업자는 혈액 제제를 포함하는 혈장으로 대상체를 치료하는 방법이 당 업계에서 인식된다는 것을 알 것이다. 제한이 아닌 예로서, 본원에 기재된 본 발명의 방법의 한 실시 양태는 수술 후 회복과 관련된 상태의 치료를 위해 대상체에게 신선한 냉동 혈장을 투여하는 것을 포함한다. 한 실시 양태에서, 혈액 제제를 포함하는 혈장은 수술 후 회복과 관련된 원치 않는 상태를 앓고 있는 개체에게 즉시, 예를 들어, 기증자로부터 수집 한 지 약 12-48시간 내에 투여된다. 이러한 경우 제품은 냉장 보관(예: 0-10℃)할 수 있다. 다른 구체 예에서, 신선 냉동 혈장은 -18℃ 이하에서 냉동(냉동 보존) 보관된 것이다. 투여 전, 신선한 냉동 혈장은 해동되고 해동되면 해동 과정이 시작된 후 60-75분 후에 대상에게 투여된다. 각 피험자는 바람직하게는 단일 단위의 신선한 냉동 혈장(200-250 mL)을 받고, 신선한 냉동 혈장은 바람직하게는 미리 결정된 연령 범위의 공여자로부터 유도된다. 본 발명의 한 실시 양태에서, 신선한 냉동 혈장은 젊은 개인(유래)에 의해 기증된다. 본 발명의 또 다른 구체 예에서, 신선한 냉동 혈장은 같은 성별의 기증자(유래)에 의해 기증된다. 본 발명의 또 다른 구체 예에서, 신선한 냉동 혈장은 18-22 세 사이의 연령 범위의 공여자(유래)에 의해 기증된다.

본 발명의 또 다른 구체 예에서, 대상체는 혈장 분획으로 치료된다. 본 발명의 일 실시 예에서, 혈장 분획은 PPF 또는 HAS이다. 본 발명의 추가 실시 양태에서, 혈장 분획은 상업적 PPF 제제 또는 상업적 HAS 제제 중 하나이다. 본 발명의 또 다른 구체 예에서, 혈장 분획은 특정 연령 범위의 개인, 예를 들어 젊은 개인의 풀로부터 유래된 PPF 또는 HAS이거나, 추가 분획 또는 처리를 거친 변형된 PPF 또는 HAS 분획이다(예: 하나 이상의 특정 단백질이 부분적으로 또는 실질적으로 제거된 PPF 또는 HAS). 본 발명의 또 다른 실시 양태에서, 혈장 분획은 면역 글로불린(IgG)이 실질적으로 고갈된 IGIV 혈장 분획이다. IgG와 같이 특정 단백질이 "실질적으로 고갈된" 또는 "실질적으로 제거된" 혈액 분획은 참조 제품 또는 전 혈장에서 발생하는 양의 약 50% 미만, 예를 들어 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.25%, 0.1%, 감지 불가능 수준, 또는 당 업계에 잘 알려진 표준 분석을 사용하여 측정된 이들 값 사이의 임의의 정수를 함유하는 혈액 분획을 의미한다.

본 발명의 한 실시 양태는 유효량의 혈장 또는 혈장 분획을 대상체에게 투여함으로써 수술 후 회복과 관련된 상태를 앓고 있는 대상체를 치료하는 것을 포함한다. 본 발명의 또 다른 실시 양태는 유효량의 혈장 또는 혈장 분획을 투여하고 후속적으로 대상체의 기능 개선, 상처 치유, 마커 존재, 통증 감소 또는 염증 감소를 모니터링하는 것을 포함한다. 본 발명의 또 다른 실시 양태는 유효량의 혈장 또는 혈장 분획을 대상체에게 투여함으로써 수술 후 회복과 관련된 상태를 앓고 있는 대상체를 치료하는 것을 포함하며, 여기서 혈장 또는 혈장 분획은, 혈장 단백질 또는 혈장 분획 단백질의 평균 또는 중간 반감기에 도달한 후, 가장 최근 투여에 비해 개선된 기능, 상처 치유, 마커의 존재, 통증 감소 또는 염증 감소를 나타내는 방식으로 투여된다( "펄스 투여" 또는 "맥박 투여"라고 함) ”)(미국 특허 등록 10,357,513 및 미국 특허 출원 번호 15 /961,618 및 62 /701,411 참조, 이는 전체가 본원에 참조로 포함됨). 본 발명의 또 다른 실시 양태는 연속 2일 이상의 투약 요법을 통해 혈장 또는 혈장 분획을 투여하고, 최종 투여일로부터 3일 이상 지난 후에 개선된 기능 또는 HSC 마커 수준에 대해 대상체를 모니터링하는 것을 포함한다. 본 발명의 추가 구체 예는 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14일 연속 투여 요법을 통해 혈장 또는 혈장 분획을 투여하고 마지막 투여일로부터 적어도 3일 후에 기능 개선, 상처 치유, 마커 존재, 통증 감소 또는 염증 감소에 대해 대상체를 모니터링하는 것을 포함한다. 본 발명의 또 다른 구체 예는 적어도 연속 2일의 투여 요법을 통해 혈장 또는 혈장 분획을 투여하고 마지막 투여일 이후에, 혈장 또는 혈장 분획에서 단백질의 평균 반감기에 도달했을 때 기능적 개선, 상처 치유, 마커의 존재, 통증 감소 또는 염증 감소를 모니터링하는 것을 포함한다. 본 발명의 또 다른 실시 양태는 2 내지 14일의 비 연속적 투여 요법을 통해 혈장 또는 혈장 분획을 투여하는 것을 포함하며, 여기서 투여 간의 각 갭은 각각 0 내지 3일일 수 있다.

일부 예에서, 본 발명에 따른 펄스 투약은 예를 들어 상기 기재된 바와 같은 제1세트의 용량의 투여를 포함하고, 이어서 비 투여 기간, 예를 들어 "무 투여 기간"이 뒤따르고, 다시 다른 용량 또는 용량 세트의 투여가 뒤따른다. 이 "무 투여" 기간의 기간은 다양할 수 있지만, 일부 실시 양태에서, 7일 이상, 예를 들어, 10일 이상, 또는 14일 이상이고, 일부 경우에 비 투여 기간은 15 내지 365일, 예를 들어, 30 ~ 90일, 30 ~ 60일 등이다. 이와 같이, 본 발명의 방법의 실시 양태는 비-만성(즉, 비 연속적) 투여, 예를 들어 혈장 생성물의 비-만성 투여를 포함한다. 일부 실시 양태에서, 펄스 투여 패턴에서 무 투여 기간은 필요한 경우 여러 번 반복되며, 일부 경우에 이 패턴은 1년 이상, 예컨대 2년 이상, 최대 대상체의 생애를 포함한다. 본 발명의 또 다른 구체 예는 연속 5일의 투약 요법을 통해 2-3일의 무 투여 기간으로 혈장 또는 혈장 분획을 투여한 후 연속 2-14일 동안 투여하는 것을 포함한다.

생화학적으로, 활성제의 "유효량" 또는 "유효 용량"은 약 20% 이상, 예를 들어 30% 이상, 40% 이상, 또는 50% 이상, 일부 경우에는 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 또는 90% 이상, 일부 경우에는 약 100%, 까지 즉, 무시할 수 있는 수준으로, 억제, 길항, 감소, 감소 또는 억제하고, 경우에 따라 수술 후 회복과 관련된 원치 않는 상태를 되리는 활성제의 양을 의미한다.

J. 혈장 단백질 분획

본 발명의 실시 방법에서, 혈장 분획이 대상체에게 투여된다. 일 구체 예에서, 혈장 분획은 혈장 단백질 분획(PPF)이다. 추가 실시 양태에서, PPF는 상업적 PPF 제제로부터 선택된다.

다른 구체 예에서, PPF는 전기영동에 의해 결정된 바와 같이 88% 정상 인간 알부민, 12% 알파 및 베타 글로불린 및 1% 이하 감마 글로불린으로 구성된다. 본 발명의 방법을 실행하는데 사용되는 이 구체 예의 추가 구체 예는, 예를 들어 탄산나트륨으로 완충되고 0.004M 카프릴산 나트륨 및 0.004M 아세틸 트립토판으로 안정화된 PPF의 5% 용액으로서의 구체 예를 포함한다. 용액에서 PPF의 백분율(예: 약 1% 내지 약 10%, 약 10% 내지 약 20%, 약 20% 내지 25%, 약 25% 내지 30%) 및 농도를 변경하는 것들을 포함하는 추가 제형의 본 발명의 방법을 실행하는데 용매 및 안정화제가 사용될 수 있다

K. 특정 기증자 연령의 혈장 분획

본 발명의 추가 구체 예는 특정 연령 범위의 개체의 혈장으로부터 유래된 혈장 단백질 분획을 투여하는 것을 포함한다. 한 실시 양태는 젊은 개체의 혈장으로부터 유래된 PPF 또는 HAS를 투여하는 것을 포함한다. 본 발명의 다른 구체 예에서, 젊은 개체는 단일 특정 연령 또는 특정 연령 범위를 갖는다. 또 다른 구체 예에서, 공여자의 평균 연령은 피험자의 연령보다 적거나 치료되는 피험자의 평균 연령보다 적다.

본 발명의 특정 구체 예는 PPF 또는 HAS와 같은 혈장 단백질 분획 생성물을 얻기 위해 특정 연령 범위의 개인으로부터 혈액 또는 혈장을 모으고 상기 기재된 바와 같이 혈장을 분획화하는 것을 포함한다. 본 발명의 다른 구체 예에서, 혈장 단백질 분획 또는 특정 혈장 단백질 분획은 특정 연령 범위에 맞는 특정 개인으로부터 획득된다.

L. 징후

대상 방법 및 혈장 포함 혈액 제제 및 분획은 수술 후 회복과 관련된 원치 않는 상태를 치료하고 심지어 수술 후 회복을 가속화하는 데 사용된다. 이러한 상태 및 징후에는 예로서 통증 및 상처 치유가 포함되며 이에 국한되지는 않는다. 본 발명의 대상 방법 및 조성물은 또한 수술 후 회복과 필수적으로 관련되지는 않는 질환 또는 증상에서 급성 및 만성 통증을 치료하는 데 사용된다. 본 발명의 방법 및 조성물은 또한 수술 후 회복과 필수적으로 관련되지는 않는 상처 치유를 치료하는 데도 사용된다. 본 발명의 방법 및 조성물은 또한 미엘린초의 재생을 촉진 또는 자극하고 다발성 경화증과 같은 수초화와 관련된 질병을 치료하는데도 사용된다.

대상 방법 및 혈장을 포함하는 혈액 제품 및 분획은 또한 신경계와 관련된 적응증을 치료하는 데 사용된다. 이러한 상태는 제한이 아닌 예로서 중추 신경 병증 통증, 척수 손상, 골수 병증 및 수술 후 회복과 관련된 중추 신경병성 통증과 같은 중추 신경계 증상을 포함한다. 매년 17,000건의 새로운 척추 손상 사례가 약 300,000의 유병률로 발생하며, 이 중 40-75%의 척추 손상 환자가 중추 신경병성 통증을 앓고 있다.(Jadad A et al., AHRQ Evidence Report Summaries, Agency for Healthcare Research and Quality;(1998-2005); https://www.nscisc.uab.edu/Public/Facts%202016.pdf; 및 https: // www.nscisc.uab.edu/PublicDocuments/fact_figures_docs/Facts%202012%20Feb%20Final.pdf). 환자의 3분의 1은 극심한 통증을 경험하며 1/3만이 치료를 통해 통증이 50% 이상 감소한다.(Charbonneau R, CMAJ, 189(2): E48-E49(2017); 및 Hadjipavlou G, et al., BJA Education, 16(8): 264-68(2016)). 골수 병증은 수술 옵션으로 1,000,000 명당 605의 발생률을 보였지만 약리학적 치료는 없기 때문에 현장에서 충족되지 않은 필요를 나타낸다.(Nouri A, et al., Spine, 40(12): E675-93(2015); The Lancet Neurology, editorial 18(7): P615(2019)).

이러한 중상은 또한 제한이 아닌 예로서 신경총 병증, 경추 신경근 병증 및 좌골 신경통(요추 신경근 병증)과 같은 신경총/신경근 증상을 포함한다. 신경총 병증은 100,000건당 2-3 건 발생한다. 현재 옵션에는 항간질제 및 항우울제를 사용한 신경병성 통증 관리가 포함되며, 이는 충족되지 않은 필요를 나타낸다. 경추 신경근 병증의 발병률은 남성 100,000명당 100명, 여성 100,000명당 60명이다.(McCartney S, et al., Br. J. Gen. Pract., 68(666): 44-46(2018)). 좌골 신경통은 연간 1-5%의 발생률을 가지며 많은 경우가 자발적으로 해결되지만 좌골 신경통은 장기간의 에피소드 치료에 덜 반응한다. 치료 옵션에는 수술, 표준 진통제 및 스테로이드가 포함되며 새로운 치료법이 필요함을 나타낸다.(Lewis R, et al., Health Technology Assessment-The Clinical Effectiveness and Cost-Effectiveness of Management Strategies for Sciatica: Systematic Review and Economic Model, No. 15.39 NIHR Journals Library(2011)).

추가 징후로는 말초신경계 장애가 있다. 여기에는 예를 들어 제한이 아닌 다음이 포함된다. 말초신경 병증; 수술 후 회복과 관련된 말초신경 병증; 손목 터널 증후군; 화학 요법으로 유발된 말초신경 병증; 압박과 외상; 당뇨병성 신경 병증; 대상 포진과 관련된 말초신경 병증(포진 후 신경통); 복합 부위 통증 증후군; 및 삼차 신경통. 말초신경 병증은 말초신경의 장애이며 미국에서 적어도 2 천만 명에게 영향을 미친다. 당뇨병 환자의 거의 60%가 말초신경 병증의 일종인 당뇨병성 신경 병증을 경험한다.(http://www.healthcommunities.com/neuropathy/overview-of-neuropathy.shtml). 손목 터널 증후군은 성인의 3 ~ 6%에 영향을 미치며 치료에는 부목, 스테로이드 및 수술이 포함된다.(LeBlanc KE, et al., Am Fam Physician, 83(8): 952-58(2011)). 화학 요법으로 유발된 말초신경 병증은 화학 요법을 받은 후 최대 3개월 동안 환자의 40 ~ 60%에서 발생하며 연간 650,000명의 환자가 화학 요법을 받는 것으로 보고되었다. 말초신경 병증은 화학 요법의 용량 감소 또는 심지어 중단으로 이어져 삶의 질에 영향을 미치며 장애를 예방하는 약물이나 보충제가 없는 것으로 나타났다.(JAMA Oncology, 5(5): 750,(2019)). 압박 및 외상과 관련된 말초신경 병증은 외상 환자의 2 ~ 3%에서 발생하며, 미국에서 300만 건의 외상이 발생한다. 수술은 종종 효과적이지만 새로운 약리학적 제제가 필요하다.(American Association for the Surgery of Trauma-Trauma Facts, http://www.aast.org/trauma-facts에서 입수 가능, Novak CB, Medscape-Peripheral Nerve Injuries,(2018년 10월 5일), https: // emedicine.medscape.com/article/1270360-overview에서 입수 가능).

대상 방법 및 혈장을 포함하는 혈액 제품 및 분획이 또한 치료에 사용된다는 추가 말초신경계 징후는 당뇨병성 신경 병증을 포함한다. 미국에서 당뇨병 환자의 인구는 약 3천만 명이며, 이들 환자의 8-26%가 신경 병증을 앓고 있다.(Risson V, et al., Incidence and prevalence of painful diabetic neuropathy and postherpetic neuralgia in major 5 European countries, the United States and Japan, Value in Health (20):A339-A811 PSY18 (2017), https://www.valueinhealthjournal.com/article/S1098-3015(17)31179-8/pdf에서 입수 가능) 미국과 일본의 주요 5개 유럽 국가에서 통증 성 당뇨병성 신경 병증 및 포진 후 신경통의 발생 및 유병률, Value in Health(20): A339-A811 PSY18(2017), https: /에서 제공) 당뇨병성 신경병성 통증에 대해 FDA가 승인한 옵션에는 프레가발린, 둘록세틴, 플루옥세틴 및 타펜타돌이 포함되며, 이들은 모두 많은 환자가 반응하지 않고 신경 손상을 직접 해결하지 않는다.

대상 포진과 관련된 말초신경 병증(포진 후 신경통)은 또한 본 발명의 방법 및 제품에 의해 치료될 수 있다. 대상 포진 환자의 20%가 대상 포진 후 신경통을 경험하며 미국에서 매년 백만 건이 발생한다.(https://emedicine.medscape.com/article/1143066-overview#a6 https://www.cdc.gov/shingles/hcp/clinical-overview.html.참조) 가바펜틴과 프레가발린은 증상에 대한 승인된 치료법이지만 통증은 종종 치료에 불응한다.(Sacks GM, Am J Manag Care 19(1 Suppl): S207-13(2013)).

복합 국소 통증 증후군 및 삼차 신경통과 같은 추가적인 말초신경 병증 증상은 본 발명의 방법 및 조성물로 치료할 수 있다. 인구 10만 명당 5 ~ 26건의 사례가 발생한다. 심각한 통증 및 장애와 관련이 있으며 치료에 대한 반응이 다양하여 충족되지 않은 요구가 높다는 것을 나타낸다.(National Institutes of Health- National Institute of Neurological Disorders and Stroke, Complex Region Pain Syndrome Fact Sheet, https://www.ninds.nih.gov/Disorders/Patient-Caregiver-Education/Fact-Sheets/Complex-Regional -Pain-Syndrome-Fact-Sheet). 삼차 신경통은 인구 100,000명당 4.2-28.9에서 발생한다. 그것은 삶의 질에 중대한 영향을 미치고 시간이 지남에 따라 치료에 저항할 수 있어 환자가 다양한 치료를 시도해야 한다.(Wu N, et al., J Pain, 18(Suppl 4): S69,(2017)). 승인된 유일한 치료법은 카르바마제핀이다. 따라서 이러한 환자들이 경험한 통증을 치료해야 할 충족되지 않은 욕구가 있다.

본 발명의 방법 및 조성물로 치료될 수 있는 추가 징후는 다음의 예를 포함한다: 뇌졸중 후 중추 통증; 다발성 경화증의 중심 통증; 외상 후 두통; 데제린-루시 증후군; 시신경염; 미토콘드리아 시신경 병증; 허혈성 시신경 병증; 시신경 척수염; 유전성 시신경 병증; 알코올성 신경 병증; 길랭-바레 증후군; 만성 염증성 탈수 초성 다발 신경 병증(CIDP); 다초점 운동 신경 병증(MNN); 비정상 자율 신경 병증; 유육종증과 관련된 말초신경 병증; 류마티스 관절염과 관련된 말초신경 병증; 전신성 홍반성 루푸스와 관련된 말초신경 병증; 쇼그렌 증후군과 관련된 말초신경 병증; 체강 질병과 관련된 말초신경 병증; 벨 마비; 라임병과 관련된 말초신경 병증; 나병과 관련된 말초신경 병증; B형 간염과 관련된 말초신경 병증; C형 간염과 관련된 말초신경 병증; HIV/AIDS와 관련된 말초신경 병증; 아밀로이드증과 관련된 말초신경 병증; 항-MAG와 관련된 말초신경 병증; 한냉글로불린혈증과 관련된 말초신경 병증; POEMS와 관련된 말초신경 병증; 독소 유발성 말초신경 병증; 신장 질환과 관련된 말초신경 병증; 혈관염과 관련된 말초신경 병증; 비타민 및 영양 결핍과 관련된 말초신경 병증; 샤르코-마리치아 병(CMT); 특발성 말초신경 병증; 섬유근통; 및 부종 양성 말초신경 병증.

대상 방법 및 혈장 포함 혈액 제품 및 분획은 또한 상처 치유와 관련된 적응증을 치료하는 데 사용된다. 예를 들어, 상처는 찰과상, 찰과상, 절개, 열상 및 천공일 수 있지만 이에 국한되지 않다. 이러한 징후에는 만성 상처와 급성 상처가 모두 포함될 수 있다. 제한이 아닌 예로서, 상처 징후는 다음을 포함한다: 당뇨병성 궤양과 같은 만성 상처; 욕창; 정맥 궤양; 동맥 궤양; 뿐만 아니라 외과적 상처와 같은 급성 상처; 외상성 상처; 화상. 그러나 임의의 유형의 만성 또는 급성 상처는 본 발명의 대상 방법 및 조성물에 의해 치료될 수 있다.

당뇨병성 궤양은 전 세계적으로 6.4%의 발병률로 미국에서 220만 명 이상의 사람들에게 영향을 미친다.(Chun D, et al., J Clin Med, 8: 748(2019)). 변연절제술 및 의료용 드레싱과 같은 여러 치료 옵션에도 불구하고 많은 환자가 감염을 경험하고 결국 절단이 필요하므로 새로운 치료, 특히 약리 치료의 필요성이 강조된다.

욕창은 입원 환자의 전체 비율이 1.8%이며 연간 총 사례 수가 수십만 건에 이른다.(Bauer K, et al., Ostomy Wound Manage, 62(11): 30-38(2016)). 당뇨병성 궤양과 마찬가지로 변연절제술 및 의료 드레싱과 같은 치료 옵션이 있지만 많은 환자가 감염을 경험하고 궤양으로 인해 사망할 수 있다.

정맥 궤양은 주로 다리에서 발생하며 노인에게 상당한 부담을 주며 전 세계 인구의 약 1%에서 발생한다.(Nelzen O, Phlebolymphology, 15(4)(2008)). 정맥 궤양은 치유가 어렵고 다른 만성 궤양보다 재발하는 경향이 현저하다. 당뇨병 및 욕창과 마찬가지로 변연절제술 및 의료 드레싱과 같은 치료 옵션이 있지만 재발은 특히 약리학 기반 치료에서 새로운 치료의 필요성을 강조한다. 동맥 궤양은 정맥 궤양 비율의 약 1/4 비율로 발생한다.(Gabriel A, Vascular Ulcers,(2018), https://emedicine.medscape.com/article/1298345-overview#a6에서 입수 가능). 치료 옵션에는 변연절제술 및 의료 드레싱도 포함되지만 승인된 약리학적 제제가 부족하다.

외과적 상처는 연간 약 130만 명의 환자에게서 발생한다.(참조: MediWound - Innovating Solutions for Wound & Burn Care (2019) http://ir.mediwound.com/static-files/cd547017-d1ed-460e-8cb2-0550b1e18a29에서 입수 가능). 외과적 상처는 일반적으로 수술 중 메스로 피부를 절개하거나 자른 것이지만 수술 중 드레인으로 인해 발생할 수도 있다. 수술 상처의 치유는 수술의 중요한 결과이다. 수술 후 상처 파열 또는 근막 파열로 상처 층 분리는 심각한 합병증이 될 수 있다.(참조: Hospital Harm Improvement Resource - Wound Disruption (2016), https://www.patientsafetyinstitute.ca/en/toolsResources/Hospital-Harm-Measure/Documents/Resource-Library/HHIR%20Wound%20Disruption.pdf에서 입수 가능). 또한, 외과적 상처의 치유는 젊은 개인에 비해 노인 환자에서 훨씬 더 많은 시간이 걸린다. (Gerstein AD, Dermatol Clin, 11 (4) : 749-57 (1993)).

외상성 상처는 주로 피부와 기저 조직에 손상이 발생한 베인 상처, 열상, 천자 또는 찰과상이다. 외상성 상처는 일반적으로 급성 상처; 베인 상처, 관통하는 상처의 세 그룹으로 나누어진다. 급성 상처는 피부가 까지거나 찢어지고 상처의 모양이 들쭉날쭉하며 일반적으로 유리, 금속, 자갈, 모래 또는 흙과 같은 이물질이 포함되어 있다. 절단 상처는 날카로운 물체가 피부와 밑에 있는 피하 조직을 관통할 때 발생한다. 관통상은 세 가지 유형 중 가장 깊고 가장 심한 상처이다. 자상과 총상이 대표적인 예이다.(https://www.woundcarecenters.org/article/wound-types/traumatic-wounds에서 입수 가능한 Traumatic Wounds 및 Leaper DJ, BMJ, 332(7540): 532-35(2006) 참조). 여러 가지 물리 치료 옵션(예: 봉합사)이 있지만 약리학적 개입이 여전히 필요한다.

세계 보건기구(WHO)는 화상으로 인해 매년 180,000명이 사망하는 것으로 추정한다. 치명적이지 않은 화상 부상은 장기 입원을 포함하여 이환율의 주요 원인이다.(https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/burns). 일반적인 치료에는 외과적 관리와 드레싱이 포함된다. 약리학적 치료는 진통, 감염 조절, 진정, 순환 혈액량 대체, 항응고 및 영양에 중점을 둔다.(Green A, et al., Clinical Pharmacist, 2: 249-54(2010)). 본 발명의 방법 및 조성물은 피부 및 기저 조직에 대한 손상의 치유를 촉진하는 약리학적 개입에 대한 충족되지 않은 요구를 채울 수 있다.

대상 방법 및 혈장 포함 혈액 제품 및 분획은 다른 시점에서 수술 후 회복과 관련된 상태 및 적응증을 치료하는 데 사용될 수 있다. 제한이 아닌 예로, 피험자에게 투여는 수술 전, 수술 전후(시술 중) 또는 수술 후 수행될 수 있다.

본 발명의 한 구체 예는 본 발명의 방법 및 혈장-포함 혈액 제품 및 분획이 통증 치료에 사용될 수 있다는 것이다. 이러한 통증은 제한이 아닌 예로서 급성 또는 만성 통증을 포함할 수 있다. 본 발명의 또 다른 구체 예는 본 발명의 방법 및 혈장-포함 혈액 제품 및 분획이 또한 중추 통증 또는 중추 신경 병증을 치료하는데 사용될 수 있다는 것이다. 중추 통증에는 뇌, 뇌간 및 척수를 포함한 중추 신경계(CNS)의 손상 또는 기능 장애로 인한 신경학적 상태가 포함된다. 신체의 많은 부분에 영향을 미치거나 특정 부위로 제한될 수 있다. 통증은 지속적이거나 간헐적 일 수 있다. 통증은 강도가 중등도에서 중증일 수 있다. 이러한 통증은 촉각, 움직임, 감정 및 온도 변화의 영향을 받을 수도 있다. 통증은 원인이 된 사건 이후에 즉시 발병하거나 몇 개월 또는 몇 년까지 지연될 수도 있다.(Central Pain Information Page - National Institute of Neurological Disorders and Stroke, Central Pain Syndrome Information Page, https://www.ninds.nih.gov/disorders/all-disorders/central-pain-syndrome-information-page에서 입수 가능; 및 Colloca L, et al., Nat Rev Dis Primers, 3:17002 (2017) 참조). 본 발명의 추가 실시 양태는 다음을 치료하기 위해 대상 방법 및 혈장-포함 혈액 제품 및 분획을 사용하는 것을 포함한다: 척수 손상(SCI); 골수 병증; 신경총 병증; 경추 신경근 병증; 좌골 신경통(요추 신경근 병증); 뇌졸중 후 중앙 통증; 다발성 경화증의 중심 통증; 외상 후 두통; 데제린-루시 증후군; 시신경염; 미토콘드리아 시신경 병증; 허혈성 시신경 병증; 시신경 척수염; 및 유전성 시신경 병증.

본 발명의 또 다른 구체 예는 대상 방법 및 혈장-포함 혈액 제품 및 분획이 또한 말초 통증 또는 말초신경 병증을 치료하는데 사용될 수 있다는 것이다. 말초신경 병증은 말초신경계 손상과 관련된 여러 상태를 의미할 수 있다. 100개가 넘는 말초신경 병증이 확인되었으며 운동 신경, 감각 신경 및 자율 신경을 포함하여 어떤 유형의 신경이 손상되었는지에 따라 달라진다.(참조: Central Page Information Page - National Institute of Neurological Disorders and Stroke, Peripheral Neuropathy Fact Sheet, https://www.ninds.nih.gov/Disorders/Patient-Caregiver-Education/Fact-Sheets/Peripheral-Neuropathy-Fact-Sheet에서 입수 가능; 및 Colloca L, et al., Nat Rev Dis Primers, 3:17002 (2017)). 본 발명의 추가 실시 양태는 다음을 치료하기 위해 대상 방법 및 혈장-포함 혈액 생산 및 분획을 사용하는 것을 포함한다: 손목 터널 증후군; 화학 유발성 말초신경 병증; 압박과 외상; 당뇨병성 신경 병증; 대상 포진과 관련된 말초신경 병증(포진 후 신경통); 복합 부위 통증 증후군; 삼차 신경통; 알코올성 신경 병증; 길랭-바레 증후군; 만성 염증성 탈수초성 다발 신경 병증(CIDP); 다초점 운동 신경 병증(MNN); 비정상 자율 신경 병증; 유육종증과 관련된 말초신경 병증; 류마티스 관절염과 관련된 말초신경 병증; 전신성 홍 반성 루푸스와 관련된 말초신경 병증; 쇼그렌 증후군과 관련된 말초신경 병증; 체강 질병과 관련된 말초신경 병증; 벨 마비; 라임 병과 관련된 말초신경 병증; 나병과 관련된 말초신경 병증; B형 간염과 관련된 말초신경 병증; C형 간염과 관련된 말초신경 병증; HIV /AIDS와 관련된 말초신경 병증; 아밀로이드증과 관련된 말초신경 병증; 항-MAG와 관련된 말초신경 병증; 한냉글로불린혈증과 관련된 말초신경 병증; POEMS와 관련된 말초신경 병증; 독소 유발성 말초신경 병증; 신장 질환과 관련된 말초신경 병증; 혈관염과 관련된 말초신경 병증; 비타민 및 영양 결핍과 관련된 말초신경 병증; 샤르코-마리치아 병(CMT); 특발성 말초신경 병증; 섬유근통; 및 부종 양성 말초신경 병증.

본 발명의 한 실시 양태는 대상 방법 및 혈장-포함 혈액 제품 및 분획이 상처 치유를 촉진함으로써 상처를 치료하는데 사용될 수 있다는 것이다. 본 발명의 추가 실시 양태는 만성 또는 급성 상처를 치료하기 위해 대상 방법 및 혈장-포함 혈액 생산 및 분획을 사용하는 것을 포함한다. 본 발명의 추가 구현 예는 당뇨병성 궤양; 욕창; 정맥 궤양; 동맥 궤양; 외과적 상처; 외상성 상처; 및 화상을 치료하는 것을 포함한다.

M. 시약, 장치 및 키트

또한, 상기 기재된 방법 중 하나 이상을 실행하기 위한 시약, 장치 및 키트가 제공된다. 대상 시약, 장치 및 키트는 크게 다를 수 있다.

관심 있는 시약 및 장치는 예를 들어 항응고제, 동결 보존제, 완충제, 등장 성 용액 등과 같이 이를 필요로 하는 피험자에게 수혈하기 위한 혈장-포함 혈액 제품을 제조하는 방법과 관련하여 위에서 언급한 것들을 포함한다.

키트는 또한 혈액 수집 백, 튜브, 바늘, 원심 분리 튜브 등을 포함할 수 있다. 또 다른 실시 양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 키트는 혈장 단백질 분획과 같은 혈장 제품의 2개 이상의 용기, 예를 들어 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상의 혈장 제품의 용기를 포함한다. 일부 예에서, 키트에 포함된 혈장 제품의 개별 용기의 수는 9개 이상, 12개 이상, 15개 이상, 18개 이상, 21개 이상, 24개 이상 30개 이상, 36개 이상, 예를 들어 48개 이상일 수 있다. 각 용기는 그 안에 포함된 혈장 제품에 대한 다양한 데이터를 포함하는 식별 정보와 연관될 수 있으며, 식별 정보에는 혈장 제품 기증자의 연령, 혈장 제품에 관한 처리 세부 사항, 예를 들어 혈장 제품이 평균 분자량을 초과하는 단백질을 제거하도록 처리되었는지 여부(예: 위에서 설명한), 혈액형 세부 정보 등 중 하나 이상이 포함될 수 있다. 일부 경우 키트의 각 용기에는 그 안에 포함된 혈장에 대한 식별 정보와 혈장 제품 공여자의 연령 관련 데이터를 확인하는 식별 정보(이러한 식별 정보는 수확 당시 공여자의 나이 일 수 있음)가 포함된다. 일부 경우에, 키트의 각 용기는 실질적으로 동일한 연령의 기증자로부터의 혈장 제품을 포함한다. 즉, 모든 용기에는 연령이 동일하지는 않더라도 실질적으로 동일한 기증자의 제품이 포함된다. 실질적으로 동일한 연령은 키트의 혈장 제품이 얻어지는 다양한 공여자가 각각에서, 일부 경우에, 5년 이하, 예를 들어 4년 이하, 3년 이하, 2년 이하, 예컨대 1년 이하, 예를 들어 9개월 이하, 6개월 이하, 3개월 이하, 1개월 이하의 연령 차이를 갖는 것을 의미한다. 식별 정보는 라벨, RFID 칩 등과 같은 컨테이너의 임의의 편리한 구성 요소에 존재할 수 있다. 식별 정보는 원하는 대로 사람이 읽을 수 있고 컴퓨터가 읽을 수도 있다. 용기는 편리한 구성을 가질 수 있다. 용기의 부피는 다양할 수 있지만, 일부 경우 부피는 10ml에서 5000mL, 예를 들어 25mL ~ 2500mL, 예를 들어 100mL ~ 500mL를 포함하여 50 ~ 1000mL이다. 용기는 단단하거나 유연할 수 있으며, 의료용 플라스틱 재료를 포함하는 폴리머 재료와 같은 편리한 재료로 제작될 수 있다. 일부 사례에서 용기는 백 또는 파우치 구성을 갖는다. 용기에 추가하여, 이러한 키트는 예를 들어 상기 기재된 바와 같은 투여 장치를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 키트의 구성 요소는 용기 및 기타 키트 구성 요소를 보관하도록 구성된 상자 또는 유사한 구조와 같은 임의의 적합한 포장으로 제공될 수 있다.

상기 구성 요소에 추가하여, 대상 키트는 대상 방법을 실행하기 위한 지침을 추가로 포함할 것이다. 이러한 지침은 다양한 형태로 대상 키트에 존재할 수 있으며, 그중 하나 이상이 키트에 존재할 수 있다. 이러한 지침이 존재할 수 있는 한 가지 형태는 적절한 매체 또는 기판에 인쇄된 정보, 예를 들어 정보가 인쇄된 종이 조각, 키트 포장, 패키지 삽입물 등이다. 또 다른 수단은 정보가 기록된 컴퓨터 판독 가능 매체, 예를 들어 디스켓, CD, 휴대용 플래시 드라이브 등이다. 존재할 수 있는 또 다른 수단은 제거된 사이트에서 정보에 액세스하기 위해 인터넷을 통해 사용할 수 있는 웹 사이트 주소이다. 편리한 수단이 키트에 있을 수 있다.

N. 실험 예

1. 통증 모델

a) 통증-부상 전 치료

(1) 신경병성 신경 손상의 변화

만성 수축 손상(CCI)을 사용하는 만성 통증 모델을 사용하여 다음으로 치료한 22개월령 C57BL /6J 마우스가 경험한 통증 수준을 결정했다.(1) CCI 후 PPF1; (2) CCI 후 비히클; 또는 (3) 가짜 수술 후 비히클. 이러한 모델을 사용하면 신경계가 지속적으로 높은 반응성 상태로 조절되어 초기 부상이 발생한 후에도 통증 임계 값을 낮춘다.(예를 들어, Safakhah, H.A. et.al., Journal of Pain, 10: 1457-66 및 Suter MR, et al., Anesthesiology Res and Practice(2011) 참조).

PPF1은, 전기영동으로 측정한, 약 88%의 정상 인간 알부민(총 단백질 대비), 12% 알파 및 베타 글로불린, 감마 글로불린 1% 이하를 포함하는 PPF이다. 언급된 경우를 제외하고, PPF1은 5% 용액(w /v, 50g /L)을 사용하여 생체 내에서 본원의 실시 예에서 투여된다. PPF2도 PPF이지만 PPF1과는 다르다. PPF2는 PPF1과 동일한 단백질 함량 및 농도 사양을 충족한다.

도 1은 CCI 실험의 타임 라인을 보여준다. 23개월 된 야생형 마우스는 PPF1 또는 비히클 대조군의 150㎕/일(정맥 내 꼬리 정맥)의 7일 연속 펄스 투여 요법을 투여하기 24시간 전에 결찰을 통해 CCI 또는 가짜 수술을 받았다. 행동은 4주 동안 평가되었고 조직학을 위한 조직 수집은 5주차에 이루어졌다.

도 2는 22개월 된 야생형 마우스에 행해진 CCI의 위치를 나타내는 표현이다. 결찰은 도면에 표시된 바와 같이 좌골 신경에 투여되었다. 이 도면은 Suter MR, et al., Anesthesiology Res and Practice,(2011)에서 채택되었으며, 이는 전체가 여기에 참조로 포함된다.

도 3은 도 1에 설명된 CCI 또는 가짜 수술로 처리된 야생형 마우스에서 기계적 폰 프레이(von Frey) 이질통 검사 데이터를 나타낸다. 동물의 기계적 압력에 대한 내성을 결정하기 위해 대상 좌골 신경에 의해 활성화된 뒷발이 자극되었다. 폰 프레이 필라멘트의 두께를 다르게 하여 마우스가 뒷발을 뽑은 압력을 측정하고 도 3에 표시했다. 도면은 CCI 후 PPF1로 처리한 마우스가 CCI 후 비히클 대조군으로 처리한 마우스보다 훨씬 적은 통증(더 많은 압력을 견딜 수 있음)을 나타냄을 보여준다. 또한, 비히클로 치료한 가짜 수술은 CCI 이후 비히클 대조군으로 치료한 경우보다 훨씬 적은 통증을 나타냈다. 이것은 PPF1이 기계적 통각 장애에 긍정적인 영향을 미친다는 것을 보여준다. *** P <0.001 PPF1 대 CCI 비히클 처리로 처리된 CCI, * P <0.05 가짜 수술 비히클 대 CCI 비히클; 튜키(Tukey) 사후 분석을 사용한 일원 분산 분석.

도 4는 도 1에 설명된 야생형 마우스에서 수행된 해마 조직학의 데이터를 나타낸다. 신경 생성은 더블코르틴(DCX) 마커를 사용하여 측정되었다. CCI 수술을 받고 PPF1로 치료받은 생쥐는 비히클을 받은 생쥐보다 해마의 치아 이랑에서 신경 발생이 유의하게 증가했다. 가짜 수술을 받은 마우스는 CCI 수술을 받은 마우스보다 신경 발생이 더 큰 경향이 있었으며, 두 그룹 모두 수술 후 비히클 치료를 받았다. 따라서 PPF1은 만성 신경 손상 후 신경 발생을 회복하는 능력을 나타냈다. * P <0.05 PPF1로 처리된 CCI 대 CCI 비히클 처리; 독립표본 T- 테스트.

도 5는 도 1에 설명된 야생형 마우스에서 수행된 해마 조직학의 데이터를 나타낸다. CD68 발현에 의해 측정된 염증 마커를 정량화했다. 우리의 연구 결과는 CCI 수술 및 비히클 치료를 받은 마우스가 CCI 수술 후 PPF1로 처리된 쥐보다 해마에서 훨씬 더 많은 수의 CD68 양성 세포를 발현했음을 보여준다. PPF1 처리된 동물은 가짜 수술 그룹과 유사한 염증 수준을 가졌다. 이것은 PPF1이 만성 신경 손상으로 인한 신경 염증을 개선하는 데 도움이 될 수 있음을 보여준다. * P <0.05 PPF1로 처리된 CCI 대 CCI 비히클 처리, 가짜 수술 비히클 대 CCI 비히클; 튜키 사후 분석을 사용한 일원 분산 분석.

도 6은 CCI 또는 가짜 수술을 받고 도 1에 설명된 대로 타임 라인에서 테스트 한 C57BL/6J 마우스의 기계적 폰 프레이 이질통 테스트 데이터를 나타낸다. 22개월 된 마우스에 PPF1 또는 비히클 대조군의 150㎕/일(정맥 꼬리 정맥)을 7일 연속 펄스 투여 요법으로 투여했다. 또 다른 그룹은 7일 동안 매일 75mg/kg(복강 내 투여)의 가바펜틴을 투여받았다. 모든 치료는 CCI 또는 가짜 수술 후 24시간에 시작되었다. 동물의 기계적 압력에 대한 내성을 결정하기 위해, 대상 좌골 신경에 의해 활성화된 뒷발을 폰 프레이 필라멘트의 두께를 다르게 하여 자극했다. 마우스가 뒷발을 빼낸 압력을 평가하고 CCI 또는 가짜 수술 후 주로 도 6에 표시했다. 이 도면은 CCI 수술 후 PPF1을 투여받은 마우스가 CCI 후 비히클로 치료한 마우스보다 모든 평가 시점에서 기계적 통각에 대한 내성이 상당히 증가했음을 보여준다. 반대로, 가바펜틴을 투여한 마우스는 CCI 수술 후 2주에 기계적 통각의 현저한 개선을 보여주고 다른 모든 시점에서 비히클 처리된 마우스와 유사하다. 가짜 수술 마우스는 수술 조작 후 3주와 5주에 기계적 통각에 대한 반응이 크게 증가했다. 함께, 이러한 데이터는 PPF1이 표준 치료 치료(가바펜틴)보다 더 많은 시간 동안 말초 통증을 개선한다는 것을 보여준다. ***, **** P <0.001, P <0.0001 PPF1 대 비히클 대조군; 튜키 사후 분석을 사용한 ANOVA. * P <0.05 가바펜틴 대 비히클 대조군; 튜키 사후 분석을 사용한 ANOVA. *, ** P <0.05, P <0.01 가짜 수술 대 비히클 대조군; 튜키 사후 분석을 사용한 ANOVA.

도 7은 도 1에 설명된 대로 처리되고 Woolfe 및 Macdonald에 의해 설명된 대로 처리된 야생형 마우스에 대한 핫 플레이트 테스트 데이터를 나타낸다.(Woolfe G. 및 Macdonald AD, J. Pharmacol. Exp. Ther. 80: 300-07(1944), 이는 전체가 본원에 참조로 포함됨). 핫 플레이트 온도는 55℃로 설정되어 있다. 마우스는 30분 동안 투명한 실린더 안에 놓이도록 적응된다. 실린더를 핫 플레이트 위에 놓고 타이머가 시작된다. 귀찮은 행동(예: 뒷발 핥기 또는 점프)이 처음 관찰되면 시간이 잠복기로 기록된다. 주의를 기울이는 행동이 관찰되지 않으면 조직 손상을 방지하기 위해 30초와 같이 미리 결정된 컷오프 시간에 동물을 제거한다. 마우스는 CCI 수술 후 2주 및 5주 후에만 테스트된다. 테스트에 대한 반복적인 노출은 민감도를 변경하는 것으로 나타났다. 도 7은 CCI 또는 가짜 수술 5주 후 핫 플레이트 통 각성 잠복기를 보여준다. PPF1 처리는 CCI와 비히클 대조군이 제공된 마우스에 비해 핫 플레이트 자극에 상당히 덜 민감하여 PPF1에 의한 구조 효과를 나타낸다. ** P <0.01 가짜 수술 대 CCI 수술, **** P <0.0001 PPF1 대 비히클 처리된 CCI 수술 마우스. 튜키 사후 분석을 사용한 ANOVA.

(2) 척수 신경염 예방

이전 연구(위)와 유사한 별도의 연구가 22개월 된 C57BL /6J 마우스에 대해 수행되었다. 마우스 코호트는 다음과 같이 처리되었다: (1) CCI 후 PPF(PPF2); (2) CCI 후 비히클; (3) CCI 후 재조합 인간 알부민(rhAlb); 또는 (4) 가짜 수술 후 비히클. 마우스에게 PPF2, 재조합 인간 알부민 또는 비히클 대조군의 150㎕/일(정맥 내 꼬리 정맥)의 7일 연속 펄스 투여 요법을 투여하였다. 모든 치료는 CCI 또는 가짜 수술 후 24시간에 시작되었다.

도 8은 도 1의 타임 라인에서 처리된 CCI 후 35일 후 핫 플레이트 테스트(위에서 설명한 대로) 데이터를 나타낸다. PPF2 처리된 마우스는 CCI와 비히클 대조군이 제공된 마우스에 비해 핫 플레이트 자극에 상당히 덜 민감했다. 재조합 인간 알부민으로 처리된 마우스는 또한 CCI와 비히클 대조군이 주어졌을 때 마우스에 비해 상당히 덜 민감했지만 PPF2로 처리된 마우스 정도는 아니었다. * P <0.05 rhAlb 대 비히클 처리된 CCI 마우스, *** P <0.001 PPF2 대 비히클 처리된 CCI 수술 마우스. 튜키 사후 분석을 사용한 ANOVA.

도 9는 동일한 마우스에서 CCI 이전(기준선)과 이후의 서로 다른 시간 간격에서 기계적 폰 프레이 이질통 테스트 데이터를 나타낸다. 마우스가 뒷발을 뽑은 압력을 평가하고 CCI 또는 가짜 수술 후 주로 도 9에 표시한다. 도면은 CCI 수술 후 PPF2를 투여한 마우스가 CCI 후 비히클 또는 재조합 인간 알부민(rhAlb)으로 처리된 마우스보다 모든 평가 시점에서 기계적 통각에 대한 내성이 상당히 증가했음을 보여준다. 이것은 PPF(PPF2)가 대조군 비히클 또는 알부민(알부민이 PPF의 주요 단백질 성분임)보다 더 많은 시간 동안 통증을 개선했음을 보여준다. 따라서 이러한 효과는 알부민을 통해 매개되는 것이 아니라 PPF에 존재하는 다른 단백질에 매개되는 것으로 보이다. * P <0.05; ** P <0.01; *** P <0.001; **** P <0.0001 PPF대 비히클 대조군; 튜키 사후 분석을 사용한 ANOVA.

도 10은 위에서 설명한 대로 22개월령 마우스에 수행된 또 다른 유사한 실험에서 PPF(PPF1)의 마지막 투여 5주 후 원위 좌골 신경에서 미엘린 염기성 단백질(MBP, Abcam에 의해 검출됨, ab40390 항 토끼 항체)의 상대적 수준을 나타낸다. * P <0.05; *** P <0.001 PPF 대 비히클 대조군; 튜키 사후 분석을 사용한 ANOVA.

도 11은 S-100 슈반 세포 마커의 이러한 마우스의 상대적 수준을 나타낸다. 두 경우 모두, CCI가 있는 마우스의 PPF는 CCI가 있는 비히클 대조군 마우스에 비해 이러한 마커의 상대적 수준을 증가시켰다. 이것은 PPF가 미엘린 단백질과 S-100 단백질 발현을 증가시켜 좌골 신경 복구 메커니즘을 촉진한다는 것을 보여준다. 또한 PPF가 수초형성 복구 메커니즘을 유도한다는 것을 보여준다. ** P <0.01; *** P <0.001 PPF 대 비히클 대조군; 튜키 사후 분석을 사용한 ANOVA.

도 12는 도 10과 11에 보고된 데이터의 형광 현미경 정성적 표현이다.

도 13 및 도 14는 각각 CCI 손상 후 24시간 처리된 마우스의 척수의 등뿔에서 BDNF 및 CD68의 검출을 보여준다. 뇌 유래 신경 영양 인자(BDNF, Abcam에 의해 검출됨, ab108319 항 토끼 항체)는 활성화된 미세아교세포에 의해 분비되며, 시냅스 촉진 및 중앙 민감화와 유사한 메커니즘의 개입을 통해 척추 통각(통증성 자극의 검출)을 향상시키는 것으로 나타났다. 말초 손상으로 인한 신경병성 통증은 종종 BDNF의 척추 발현 증가를 동반한다(Garraway SM, et al. Neural Plast. Article ID 9857201(2016)). CD68 수준(Biorad MCA1957 GA 항-래트 항체에 의해 검출됨)도 결정되었다. CD68은 활성화된 미세아교세포에 대한 마커이다. 도 13 및 14는 CCI 손상 24시간 후 PPF 치료가 척수의 등뿔에서 BDNF 및 CD68 마커 모두의 현저한 감소를 가져옴을 보여 주며, 이는 미세아교세포 활성화의 예방과 신경병성 통증의 발생과 관련된 유해한 하류 이벤트의 차단을 나타낸다. ** P <0.01; *** P <0.001 PPF 대 비히클 대조군; 튜키 사후 분석을 사용한 ANOVA.

도 15 및 16은 각각도 13 및 14에 제시된 데이터의 형광 현미경 이미지이다. 직사각형은 L4-L6 요추 분절에서 분석된 척수의 등뿔을 강조 표시한다. 도면의 오른쪽에 있는 이미지는 각 도면의 왼쪽에 있는 직사각형 영역의 초점이 더 높은 이미지이다.

b) 통증-부상 14일 후 치료

도 17은 22개월 된 C57BL /6J 마우스에 사용된 프로토콜을 보여준다. 기계적 이질통을 측정하기 위한 기준선 폰 프레이 뒷발 철수 역치는 CCI 또는 가짜 수술 3-4일 전에 취했다. 마우스 코호트는 다음과 같이 처리되었다:(1) CCI 14일 후PPF(PPF1); (2) CCI 14일 후 비히클; (3) CCI 14일 후 재조합 인간 알부민(rhAlb); 또는 (4) 가짜 수술 14일 후 비히클. 마우스에게 PPF1, 재조합 인간 알부민 또는 비히클 대조군의 150㎕/일(정맥 내 꼬리 정맥)의 7일 연속 펄스 투여 요법을 투여했다. 모든 치료는 CCI 또는 가짜 수술 후 14일에 시작되었다.

도 18은 CCI 후 기준선, 14, 21, 28, 35, 42 및 49일에서 폰 프레이 발 철수 임계 값을 보고한다. 14일째에 가짜 그룹을 제외한 모든 그룹에서 심각한 결손이 나타났으며, 이는 손상 2주 후 모든 CCI 그룹에서 중추적 민감화가 있음을 나타낸다. 이는 PPF로 치료를 중단한 후 7일(28일)까지 되돌려지지 않으며, 이는 이 모델에서 PPF로 단순 진통이 일어나지 않음을 나타낸다. 대신, 비히클 또는 재조합 인간 알부민(rh 알부민)에서는 관찰되지 않는 기계적 효과가 PPF 처리로 발생한다. 이것은 PPF 치료 전에 완전히 확립된 통증(필연적으로 중앙 구성 요소를 포함함)이 비히클 대조군에 비해 PPF에 의해 상당히 완화된다는 것을 보여준다. ** P <0.01; *** P <0.001; **** P <0.0001 PPF 대 비히클 대조군; 튜키 사후 분석을 사용한 ANOVA.

도 19 및 20은 CCI 후 35일(도 19) 및 CCI 후 49일(도 20)에서 핫 플레이트 잠복기 값을 나타낸다. 두 세트의 결과는 PPF 처리된 마우스가 핫 플레이트 통증 민감도의 오래 지속되는 감소를 가짐을 보여준다. 이것은 또한 PPF가 단순히 진통 효과를 제공하는 것이 아니라 기계적 효과를 통해 작동한다는 관찰을 뒷받침한다. ** P <0.01; 튜키 사후 분석을 사용한 ANOVA.

2. 상처 치유 모델

당뇨병의 마우스 모델(B6.BKS(D) -Leprdb /J)을 사용하여 상처 치유에 대한 PPF1의 효능을 평가했다. 6주령 수컷 B6.BKS(D) -Leprdb /J 마우스를 -1일에 등을 면도했다. 마우스는 0일에 등의 두 위치에 상처를 입었다. 마우스는 0일(피부 상처 직후)부터 6일까지 비히클(150 ㎕) 또는 PPF1(150 ㎕)의 일일 치료(IV)를 받았다.

피부 상처는 다음과 같이 수행되었다: 피부 상처 전날 동물을 제모 크림을 사용하여 제모한 다음 따뜻한 물로 피부를 부드럽게 씻었다. 동물을 흡입 이소 플루란을 사용하여 마취하고, 수술 부위를 면도하고 포비돈-요오드("베타딘") 또는 클로르헥시딘 살균 제품(또는 유사한 수술 스크럽) 및 70% 에탄올로 준비했다. 온수 가열 패드(또는 유사한 수술용 제품)를 마우스 아래에 두었다. 영구 마커를 사용하여 5mm 지름의 원으로 등 쪽 피부에 두 개의 상처 부위를 표시했다. 등 쪽 피부를 깨끗한 집게를 사용하여 들어올리고 표시된 원과 함께 미세한 외과용 가위를 사용하여 절단했다. Vetbond 및 나일론 봉합사를 사용하여 중앙에 6mm 지름으로 절단된 15mm 지름의 실리콘 부목을 상처 주변에 적용했다. 피부에 상처를 입힌 후, 생쥐의 무게를 측정하고(초기 체중), 가열 패드가 있는 깨끗한 케이지에 넣고 음식을 부드럽게 했다. 마우스는 패드에 머물렀고 마우스가 밝고, 기민하고, 활동적이 될 때까지 모니터링되었다.

수술 후, 봉합사가 제거될 때까지 매일 상처 치유를 평가했다. 부페노르핀은 수술 직후와 ~12시간마다 총 3회 주사한다. 멜록시캄은 수술 전과 수술 후 24시간에 주사한다. 연화 식품과 투명 H₂O 회수 젤은 수술 후 케이지 바닥에 놓인다. 마우스 체중은 수술 후 매일 측정되었다. 마우스가 수술 후 체중으로 1g 이상 체중이 감소한 경우, 500㎕ 식염수/일을 투여했다.

마우스는 캘리퍼를 사용하여 상처 크기를 측정하여 상처 봉합량에 대해 매일 평가되었다. 마우스를 10일 및 14일에 희생시켰다. 마우스를 아베르틴(250mg /kg IP)으로 깊이 마취한 다음 심장 천자를 하고 EDTA로 미리 채워진 주사기로 혈액 샘플을 수집하였다. 혈액/EDTA를 마이크로 원심 분리기 튜브에 주입했다. 튜브는 얼음에 보관하고 혈장은 가능한 한 빨리 15분 동안 1000g(+ 4℃)에서 원심 분리되었다. 각 마우스의 혈장은 바이알 당 100㎕로 분취하고 나머지는 두 번째 바이알에 넣고 -80℃에 보관한다.

각 마우스로부터 피부를 수집하고, 고정하고 4% 파라 포름알데히드에 이어 PBS에서 2회 세척하고 이어서 파라핀에 담갔다. 조직은 절편화되거나 용해되고 qRT-PCR, 웨스턴 블롯, ELISA 및 면역 조직 화학을 포함한 표준 조직학적 및 생화학적 방법에 의해 염증 마커에 대해 분석된다.

도 21A 및 21B는 치료되지 않은(21A) 또는 PPF1로 치료된(도 21B) 당뇨병 상처(B6.BKS(D)-Lepr^db/J 당뇨병 마우스 모델) 사이의 조직학적 비교를 제공한다. 검은색 막대는 상처 층 두께(표피 + 과립층)를 나타낸다. 화살표는 상처 경계를 나타낸다. 상처 층 두께에 의해 결정된 바와 같이 PPF1 처리된 마우스에서 상처 층 두께가 증가하였다. 따라서 PPF1은 향상된 상처 치유를 보여준다.

도 22A 및 22B는 치료되지 않은(22A) 또는 PPF1로 치료된(도 22B) 당뇨병 상처(B6.BKS(D)-Lepr^db/J 당뇨병 마우스 모델) 사이의 조직학적 비교를 제공한다. 검은색 막대는 과립층을 나타낸다. 파란색 막대는 표피층을 나타낸다. PPF1 처리된 상처는 처리되지 않은 상처보다 더 두꺼운 표피층을 보였지만, 과립층은 PPF1 처리된 상처와 처리되지 않은 상처 사이의 차이에서 훨씬 더 큰 경향을 나타냈다(즉, 과립층은 처리되지 않은 상처보다 PPF1 처리된 상처에서 더 두껍다).

도 23 내지 도 26은 당뇨병성 상처 치유에 대한 비히클 대 PPF1의 효능을 평가하는 B6 ob/ob(B6.Cg-Lepob /J 마우스) 당뇨병 마우스 모델의 결과를 나타낸다. 9주령 수컷 B6 OB/OB 마우스를 사용했다. 상처를 입기 전날, 마우스의 체중을 측정하고 5시간 동안 금식하여 꼬리 혈액에서 공복 포도당을 측정했다. 마우스는 체중과 포도당 수준에 따라 2개의 다른 처리 군으로 동등하게 나뉘었다. 상처를 위해, 마우스를 면도하고 제모 크림(Nair ™)을 바르고 등 두 곳(지름 5mm 절제)에 상처를 입힌 다음 70% 알코올에 담근 실리콘 링(외주 12mm, 내주 6mm)을 부착한다. 링은 Vectabond ™로 열린 상처에 부착되었다. 4개의 봉합사를 각 링에 적용하여 실리콘 링이 실험의 전체 과정을 통해 상처에 부착된 상태를 유지하도록 했다. 30㎕의 PPF1 및 대조군을 상처 위에 직접 적용하고 두 개의 상처를 Tegaderm ™ 조각으로 밀봉했다. 상처를 덮은 Tegaderm ™ 내부에 PPF1과 대조군을 주사하여 매일 치료를 했다. 상처를 이미지화하기 위해, 상처를 단지 덮고 있던 Tegaderm ™을 잘라 내고 새로운 Tegaderm ™ 조각으로 상처를 다시 봉했다. 희생 때 링을 제거하고 조직학적 분석을 위해 등에서 상처를 잘라 냈다.

상처 봉합량을 측정하여 매일 상처 치유를 평가했다. 상처 크기는 카메라와 눈금을 위한 정밀 자를 사용하여 측정되었다. 10일 및 14일에 최종 조직 수집을 수행했다. 조직을 절편화하거나 용해하고, 면역 조직 화학, qRT-PCR, H & E 및 기타 특수 염색을 포함한 표준 조직학적 방법으로 염증 마커에 대해 분석했다.

도 23은 실험의 일반적인 설계를 보여준다. 혈액 방울은 공복 혈당 수치를 측정하기 위해 혈액이 수집된 시기를 나타낸다. 2일째에 피부 상처를 만들고 1-7 일째에 정맥 내(iv) 투여를 수행했다. 도 24는 첫 번째 연구에서 상처 후 여러 시점에서 여전히 열린 상처의 비율을 나타낸다(연구 1). 마우스는 7일 동안 PPF1(150㎕) 또는 식염수 대조군으로 처리되었다. 10일 후, PPF1 처리된 동물에서 열린 상처의 크기는 식염수 대조군에 비해 현저하게 감소했다.(** p <0.006, 독립표본 T- 검정).

도 25는 두 번째 유사한 연구(연구 2)에서 상처 후 여러 시점에서 여전히 열린 상처의 비율을 나타낸다. 마우스는 7일 동안 PPF1(150㎕) 또는 식염수 대조군으로 처리되었다. 8일 후, PPF1 처리된 동물에서 열린 상처의 크기는 식염수 대조군에 비해 현저하게 감소했다.(** p <0.0018 독립표본 T- 검정).

도 26은 연구 1 및 2의 데이터를 결합하여 상처 11일 후 여전히 열린 상처의 백분율을 나타낸다. PPF1 처리된 동물은 11일 후 열린 상처의 백분율에서 통계적으로 유의미한 감소를 나타낸다.(** p <0.006, 독립표본 T- 검정). 10일째에 PPF1 처리된 동물과 비히클 처리된 동물 사이의 차이는 유사하게 유의했다(독립표본 T-검정에 의해 ** p <0.006).

도 27 및 도 28은 B6 ob/ob(B6.Cg-Lepob /J 마우스)의 상처에 국소 투여된 PPF1 또는 비히클을 사용한 연구 결과를 나타낸다. 도 27은 상처에 투여된 30㎕의 국소 PPF1 또는 대조군 비히클의 매일 투여의 연구 패러다임을 보여준다. 상처는 도 23에 설명된 대로 수행되었다. 도 28은 치료 10일 후 남은 초기 상처 면적의 백분율과 함께 국소 연구의 결과를 나타낸다. 도 28은 PPF1이 대조군과 비교하여 10일 후 남은 상처의 비율을 크게 감소시켰음을 나타낸다.

전술 한 실시 예 중 적어도 일부에서, 실시 예에서 사용된 하나 이상의 요소는, 그러한 대체가 기술적으로 불가능하지 않은 한, 다른 실시 예에서 상호 교환적으로 사용될 수 있다. 당업자라면 청구된 주제의 범위를 벗어나지 않고 전술한 방법 및 구조에 대해 다양한 다른 생략, 추가 및 수정이 이루어질 수 있다는 것을 이해할 것이다. 이러한 모든 수정 및 변경은 첨부된 청구 범위에 의해 정의된 바와 같이 주제의 범위 내에 포함되도록 의도된다.

일반적으로 본 명세서에서, 특히 첨부된 청구 범위(예를 들어, 첨부된 청구 범위의 본문)에서 사용된 용어는 일반적으로 "개방된" 용어이다(예를 들어, "포함하는"이라는 용어는 "포함하지만 이에 제한되지 않는"으로 해석될 수 있고, 용어 "갖는"은 "적어도 갖는"으로 해석되어야 하며, "포함한다"라는 용어는 "포함하지만 이에 제한되지 않는다" 등으로 해석되어야 한다.). 특정 수의 도입된 청구 인용이 의도된 경우, 그러한 의도가 청구에서 명시적으로 인용될 것이며, 그러한 인용이 없는 경우 그러한 의도가 존재하지 않는다는 것이 당업자에 의해 추가로 이해될 것이다. 예를 들어, 이해를 돕기 위해, 다음의 첨부된 청구항은 청구항 인용을 소개하기 위해 소개 문구 "적어도 하나" 및 "하나 이상"의 사용을 포함할 수 있다. 그러나 그러한 문구의 사용은 부정 관사 "a" 또는 "an"에 의한 청구 인용의 도입이 그러한 도입된 청구 인용을 포함하는 특정 청구를 그러한 인용을 하나만 포함하는 구체 예로 제한한다는 것을 의미하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 마찬가지로 청구범위가 "하나 이상" 또는 "적어도 하나"라는 소개 문구와 "하나" 또는 "한"과 같은 비 한정 관사를 포함하는 경우도 같다(예: "하나" 및/또는 "한"은 "적어도 하나" 또는 "하나 이상"을 의미하는 것으로 해석되어야 한다. ); 청구범위의 인용을 도입하는 데 사용되는 정관사의 사용도 마찬가지이다. 또한, 도입된 청구범위에 특정 개수가 명시적으로 인용되더라도, 당업자는 그러한 인용이 적어도 인용된 숫자를 의미하는 것으로 해석되어야 함을 인식할 것이다(예를 들어, 다른 변형이 없는 단순한 "2개의 인용"에 대한 수식어는 두 개 이상의 인용 또는 적어도 두 개의 인용을 의미한다.) 또한 "A, B, C 등 중 하나 이상"과 유사한 규칙이 있는 경우 일반적으로 그러한 구성은 당업자가 관례를 이해할 것이라는 의미에서 의도된다(예를 들어, "A, B 및 C 중 적어도 하나를 갖는 시스템"은 다음과 같은 시스템을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. A 단독, B 단독, C 단독, A와 B 함께, A와 C 함께, B와 C 함께, 및/또는 A, B 및 C 함께 등). "A, B 또는 C 등 중 하나 이상"과 유사한 규칙이 있는 경우 일반적으로 그러한 구성은 당업자가 관례를 이해할 것이라는 의미에서 의도된다(예를 들어, "A, B 또는 C 중 적어도 하나를 갖는 시스템"은 다음과 같은 시스템을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. A 단독, B 단독, C 단독, A와 B 함께, A와 C 함께, B와 C 함께, 및/또는 A, B 및 C 함께 등). 설명, 청구 범위 또는 도면에 있든 간에 둘 이상의 대체 용어를 제시하는 사실상 임의의 분리 단어 및/또는 구는 용어 중 하나를 포함할 가능성을 고려하기 위해 이해되어야 한다는 것을 당업자는 더 잘 이해할 것이다. 용어 중 하나 또는 두 용어 모두. 예를 들어, "A 또는 B"라는 문구는 "A" 또는 "B" 또는 "A 및 B"의 가능성을 포함하는 것으로 이해된다.

또한, 본 개시의 특징 또는 측면이 Markush 그룹의 관점에서 설명되는 경우, 당업자는 개시가 또한 Markush 그룹의 구성원의 임의의 개별 구성원 또는 하위 그룹의 관점에서 설명된다는 것을 인식할 것이다.

당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 임의의 및 모든 목적을 위해, 예를 들어 서면 설명을 제공하는 것과 관련하여, 본 명세서에 개시된 모든 범위는 또한 임의의 및 모든 가능한 하위 범위 및 그의 하위 범위의 조합을 포함한다. 나열된 모든 범위는 동일한 범위를 적어도 동일한 절반, 3분의 1, 4분의 1, 5분의 1, 10분의 1 등으로 쉽게 나누어질 수 있는 것으로 충분히 설명되고 인식될 수 있다. 비 제한적인 예로서, 여기에서 논의된 각 범위는 더 낮은 3번째, 중간 3번째, 및 더 높은 3번째로 쉽게 나누어질 수 있다. 또한, 당업자에 의해 이해되는 바와 같이 "최대", "적어도", "더욱 큼", "더욱 작음" 및 인용된 숫자를 포함하고 위에서 논의한 바와 같이 이후에 하위 범위로 나눌 수 있는 범위를 의미한다. 마지막으로, 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 범위는 각각의 개별 구성원을 포함한다. 따라서, 예를 들어 1-3 개의 물품을 갖는 그룹은 1, 2 또는 3개의 물품을 갖는 그룹을 의미한다. 유사하게, 1-5 개의 물품을 갖는 그룹은 1, 2, 3, 4 또는 5개의 물품 등을 갖는 그룹을 의미한다.

전술한 발명이 이해의 명료 함을 위해 예시 및 예를 통해 일부 상세하게 설명되었지만, 본 발명의 교시에 비추어 본 기술 분야의 통상의 기술자에게는 특정 변경 및 수정이 가능하다는 것이 명백하다. 첨부된 특허 청구 범위의 사상 또는 범위를 벗어나지 않는 범위 내에서 만들어졌다.

따라서, 전술한 내용은 단지 본 발명의 원리를 예시한 것이다. 당업자는 본 명세서에 명시적으로 설명되거나 도시되지 않았지만, 본 발명의 원리를 구현하고 그 정신 및 범위 내에 포함되는 다양한 변형을 고안할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 또한, 본 명세서에 인용된 모든 예 및 조건부 언어는 주로 독자가 본 발명의 원리 및 본 발명자들이 기술을 발전시키는 데 기여한 개념을 이해하는 데 도움을 주기 위한 것이며, 이러한 구체적으로 인용된 예는 이에 제한되지 않는 것으로 해석되어야 한다. 더욱이, 본 발명의 원리, 측면 및 실시 예뿐만 아니라 그 특정 예를 인용하는 모든 진술은 구조적 및 기능적 등가물을 모두 포함하도록 의도된다. 또한, 이러한 등가물에는 현재 알려진 등가물과 향후 개발될 등가물, 즉 구조에 관계없이 동일한 기능을 수행하는 모든 요소가 모두 포함된다. 더욱이, 여기에 개시된 어떤 것도 그러한 공개가 청구 범위에 명시적으로 언급되는지에 관계없이 대중에게 기부하려는 의도는 없다.

따라서, 본 발명의 범위는 여기에 도시되고 설명된 예시적인 실시 예로 제한되도록 의도되지 않는다. 오히려, 본 발명의 범위 및 사상은 첨부된 청구 범위에 의해 구체화된다. 특허청구범위에서 35 U.S.C. §112(f) 또는 35 U.S.C. §112(6)은 정확한 문구 "수단" 또는 정확한 문구 "단계"가 청구에서 그러한 제한의 시작 부분에 언급된 경우에만 청구의 제한을 위해 적용되는 것으로 명시적으로 정의된다. 이러한 정확한 문구가 청구의 제한에 사용되지 않으면 35 U.S.C. § 112(f) 또는 35 U.S.C. §112(6)이 적용되지 않는다.

Claims

유효량의 혈장 분획을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 수술 후 회복에서 대상체를 치료하는 방법.
제1항에 있어서, 혈장 분획이 혈장 단백질 분획인 방법.
제2항에 있어서, 혈장 단백질 분획이 83% 내지 95% 알부민을 포함하는 방법.
제3항에 있어서, 혈장 단백질 분획이 상업적으로 입수 가능한 혈장 단백질 분획인 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 투여가 펄스 용량 투여 요법을 사용하여 수행되는 방법.
유효량의 혈장 분획을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 통증을 갖는 것으로 진단된 대상체를 치료하는 방법.
제6항에 있어서, 통증이 만성 통증인 방법.
제6항에 있어서, 통증이 말초 통증인 방법.
제6항에 있어서, 통증이 중추 통증인 방법.
제6항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 혈장 분획이 혈장 단백질 분획인 방법.
제6항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 혈장 단백질 분획이 83% 내지 95% 알부민을 포함하는 방법.
제11항에 있어서, 혈장 단백질 분획이 상업적으로 입수 가능한 혈장 단백질 분획인 방법.
제6항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 투여가 펄스 용량 투여 요법을 사용하여 수행되는 방법.