KR20210060567A - Tlr8 아고니스트 - Google Patents

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KR20210060567A
KR20210060567A KR1020217011377A KR20217011377A KR20210060567A KR 20210060567 A KR20210060567 A KR 20210060567A KR 1020217011377 A KR1020217011377 A KR 1020217011377A KR 20217011377 A KR20217011377 A KR 20217011377A KR 20210060567 A KR20210060567 A KR 20210060567A
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페이 쑨
찰스 제트. 딩
슈휘 첸
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치아타이 티안큉 파마수티컬 그룹 주식회사
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D471/00—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, at least one ring being a six-membered ring with one nitrogen atom, not provided for by groups C07D451/00 - C07D463/00
    • C07D471/02—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, at least one ring being a six-membered ring with one nitrogen atom, not provided for by groups C07D451/00 - C07D463/00 in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D471/04—Ortho-condensed systems
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    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
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    • A61K31/519—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim ortho- or peri-condensed with heterocyclic rings
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
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    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators

Abstract

구조가 식(I)로 표시되는 화합물인, TLR8(Toll 유사 수용체 8) 아고니스트, 그 이성질체, 또는 그 약학적으로 허용되는 염.

Description

TLR8 아고니스트
본 발명은 신규한 구조를 갖는 TLR8(Toll 유사 수용체 8) 아고니스트에 관한 것이다. 구체적으로는 식(I)로 표시되는 화합물, 그 이성질체 또는 그 약학적으로 허용되는 염, 및 제시되는 화합물 또는 그 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 의약용 조성물, 및 TLR8의 작동에 반응하는 질환의 치료 또는 예방에 있어서 식(I)로 표시되는 화합물 또는 그 약학적으로 허용되는 염 및 의약용 조성물의 사용에 관한 것이다.
Toll 유사 수용체(Toll-like receptors, TLR)는 비특이적 면역(자연 면역)에 관여하는 중요한 단백질 분자로 비특이적 면역과 특이적 면역을 잇는 가교이기도 하다. TLR은 주로 수상 세포, 대식 세포, 단핵구, T 세포, B 세포, NK 세포 등, 면역 세포에서 발현하는 단일 막관통형 비촉매 단백질이다. Toll 유사 수용체는 미생물에서 유래하는 보존된 구조를 갖는 분자를 인식할 수 있다. 미생물이 피부나 점막 등 생체의 물리적 장벽을 돌파하면 TLR은 그들을 인식하고 면역 세포로부터 반응을 생성하기 위해 생체를 활성화할 수 있다. 예를 들면 TLR1, TLR2, TLR4, TLR5 및 TLR6은 주로 세균의 리포 다당, 리포 펩타이드, 플라젤린(flagellin) 등의 세포외 자극을 인식하지만, TLR3, TLR7, TLR8 및 TLR9는 세포 엔도솜으로 역할을 하고, 식세포 작용 및 엔빌로프 용해 후 그들의 리간드에 결합하여 미생물의 핵산 등을 인식할 수 있다.
TLR의 다양한 서브타입 중에서 TLR8에는 고유한 기능이 있다. TLR8은 주로 단핵구, 대식 세포, 골수 수상 세포에서 발현한다. TLR8의 신호 전달 경로는 세균의 단일 가닥 RNA, 소분자 아고니스트 및 마이크로 RNAs에 의해 활성화된다. TLR8의 활성화로 인해 IL-12, IL-18, TNF-a 및 IFN-γ 등 Th1 극성 사이토카인, 및 CD80, CD86 등 다양한 공자극 인자의 생산으로 이어진다. 이러한 사이토카인은 자연 면역 반응과 획득 면역 반응을 활성화 및 증폭하여 항바이러스, 항감염, 자가 면역, 종양 등을 포함하는 질환에 유익한 치료를 제공할 수 있다. 예를 들면, B형 간염에 관해서는 간장 항원 제시 세포나 다른 면역 세포에서의 TLR8 활성화로 인해 IL-12 등의 사이토카인이 활성화되고, 바이러스에 의해 고갈된 특이적 T 세포나 NK 세포가 활성화됨으로써 간장의 항바이러스 면역을 재구축한다.
VentiRX Pharmaceuticals의 선택적 TLR8 아고니스트 VTX-2337은 다양한 종양 평가에 처음으로 임상적으로 사용되었으며 VTX-2337의 투여 방법은 피하 주사이다. 길리어드 사이언스는 현재 임상 제II상에 있는 만성 B형 간염 감염증 치료를 위한 경구 TLR8 아고니스트를 보고했지만 그 구조는 아직 공개되지 않았다.
Figure pct00001
일련의 TLR8 아고니스트는 Gilead Sciences가 보유한 특허출원 WO2016141092에 보고되어 있다. 예를 들면 식 1에 대해 TLR8을 작동시켜 특이적인 사이토카인 IL-12p40의 생산을 유도하는 AC50이 0.02μM(데이터는 WO2016141092의 표 1에서 인용)였다. AC50은 최대 아고니스트 효과의 절반에 대응하는 화합물의 농도를 나타낸다. 특허출원 WO2016141092에는 식 2 및 식 3 등 5원 질소 함유 복소환을 포함하는 화합물도 보고되어 있다. 단, 식 2 및 식 3은 TLR8을 작동시켜 특이적인 사이토카인 IL-12p40의 생성을 유도하는 활성이 불충분하였고, AC50이 각각 21.5μM 및 3.4μM였다(데이터는 WO2016141092의 표 1에서 인용). 식 1, 식 2 및 식 3은 각각 WO2016141092에 개시된 실시예 61, 55 및 56이다.
Figure pct00002
본 출원은 2018년 9월 19일에 중국 국가지식산권국에 제출된 중국특허출원 제201811094969.4호의 이익과 우선권을 주장하며 그 모든 내용은 참조에 의해 전체 본 명세서에 포함된다.
본 발명은 식(I)로 표시되는 화합물, 그 이성질체 또는 그 약학적으로 허용되는 염을 제공한다.
Figure pct00003
여기서,
"*"를 붙인 탄소 원자는 단독 (R) 또는 (S) 거울상 이성질체 형태로 존재하거나, 1개의 거울상 이성질체가 풍부한 형태로 존재하는 키랄 탄소 원자일 수 있다.
X는 N 및 CH에서 선택된다.
R1은 H, F, Cl, Br, I, CN, C1-6 알킬, C3-6 시클로알킬, -N(Ra)(Rb) 및 -O(Rc)에서 선택되고, 상기 C1-6 알킬 및 C3-6 시클로알킬은 임의로 1, 2 또는 3개의 Rd로 치환된다.
R2는 C1-6 알킬에서 선택되고, 상기 C1-6 알킬은 임의로 1, 2 또는 3개의 Re로 치환된다.
Ra, Rb, Rc, Rd 및 Re는 각각 독립적으로 H, F, Cl, Br, I, OH, CN, NH2, CH3,
Figure pct00004
,
Figure pct00005
,
Figure pct00006
,
Figure pct00007
,
Figure pct00008
,
Figure pct00009
,
Figure pct00010
,
Figure pct00011
및
Figure pct00012
에서 선택되고, 상기 CH3,
Figure pct00013
,
Figure pct00014
,
Figure pct00015
,
Figure pct00016
,
Figure pct00017
,
Figure pct00018
,
Figure pct00019
,
Figure pct00020
및
Figure pct00021
은 임의로 1, 2 또는 3개의 R로 치환된다.
각 R은 독립적으로 F, Cl, Br, I, OH, CN, NH2, CH3,
Figure pct00022
,
Figure pct00023
,
Figure pct00024
,
Figure pct00025
,
Figure pct00026
,
Figure pct00027
,
Figure pct00028
,
Figure pct00029
,
Figure pct00030
,
Figure pct00031
,
Figure pct00032
,
Figure pct00033
,
Figure pct00034
,
Figure pct00035
,
Figure pct00036
,
Figure pct00037
및
Figure pct00038
에서 선택된다.
본 발명은 식(I')로 표시되는 화합물, 그 이성질체 또는 그 약학적으로 허용되는 염을 제공한다.
Figure pct00039
여기서,
X는 N 및 CH에서 선택된다.
R1은 H, F, Cl, Br, I, CN, C1-6 알킬, C3-6 시클로알킬, -N(Ra)(Rb) 및 -O(Rc)에서 선택되고, 상기 C1-6 알킬 및 C3-6 시클로알킬은 임의로 1, 2 또는 3개의 Rd로 치환된다.
R2는 C1-6 알킬에서 선택되고, 상기 C1-6 알킬은 임의로 1, 2 또는 3개의 Re로 치환된다.
Ra, Rb, Rc, Rd 및 Re는 각각 독립적으로 H, F, Cl, Br, I, OH, CN, NH2, CH3,
Figure pct00040
,
Figure pct00041
,
Figure pct00042
,
Figure pct00043
,
Figure pct00044
,
Figure pct00045
,
Figure pct00046
,
Figure pct00047
및
Figure pct00048
에서 선택되고, 상기 CH3,
Figure pct00049
,
Figure pct00050
,
Figure pct00051
,
Figure pct00052
,
Figure pct00053
,
Figure pct00054
,
Figure pct00055
,
Figure pct00056
및
Figure pct00057
은 임의로 1, 2 또는 3개의 R로 치환된다.
각 R은 독립적으로 F, Cl, Br, I, OH, CN, NH2, CH3,
Figure pct00058
,
Figure pct00059
,
Figure pct00060
,
Figure pct00061
,
Figure pct00062
,
Figure pct00063
,
Figure pct00064
,
Figure pct00065
,
Figure pct00066
,
Figure pct00067
,
Figure pct00068
,
Figure pct00069
,
Figure pct00070
,
Figure pct00071
,
Figure pct00072
,
Figure pct00073
및
Figure pct00074
에서 선택된다.
본 발명의 일부 실시형태에서, 상기 Ra, Rb, Rc, Rd 및 Re는 각각 독립적으로 H, F, Cl, Br, I, OH, CN, NH2, CH3,
Figure pct00075
,
Figure pct00076
,
Figure pct00077
,
Figure pct00078
,
Figure pct00079
,
Figure pct00080
,
Figure pct00081
,
Figure pct00082
,
Figure pct00083
,
Figure pct00084
,
Figure pct00085
,
Figure pct00086
,
Figure pct00087
,
Figure pct00088
,
Figure pct00089
,
Figure pct00090
및
Figure pct00091
에서 선택된다.
본 발명의 일부 실시형태에서, 상기 R1은 H, F, Cl, Br, I, CN, CH3,
Figure pct00092
시클로펜틸, 시클로부틸,
Figure pct00093
NH2,
Figure pct00094
,
Figure pct00095
및
Figure pct00096
에서 선택된다. 상기 CH3,
Figure pct00097
시클로펜틸 및 시클로부틸은 임의로 1, 2 또는 3개의 Rd로 치환된다.
본 발명의 일부 실시형태에서, 상기 R1은 H, F, Cl, Br, I, CH3 및
Figure pct00098
에서 선택된다.
본 발명의 일부 실시형태에서, 상기 R2는
Figure pct00099
,
Figure pct00100
및
Figure pct00101
에서 선택된다. 상기
Figure pct00102
,
Figure pct00103
및
Figure pct00104
은 임의로 1, 2 또는 3개의 Re로 치환된다.
본 발명의 일부 실시형태에서, 상기 R2는
Figure pct00105
에서 선택된다.
본 발명은 또한 하기 식의 화합물, 그 이성질체 또는 그 약학적으로 허용되는 염을 제공한다.
Figure pct00106
본 발명의 일부 실시형태에서, 상기 화합물, 그 이성질체 또는 그 약학적으로 허용되는 염은
Figure pct00107
에서 선택된다.
본 발명의 일부 실시형태에서, 상기 Ra, Rb, Rc, Rd 및 Re는 각각 독립적으로 H, F, Cl, Br, I, OH, CN, NH2, CH3,
Figure pct00108
,
Figure pct00109
,
Figure pct00110
,
Figure pct00111
,
Figure pct00112
,
Figure pct00113
,
Figure pct00114
,
Figure pct00115
,
Figure pct00116
,
Figure pct00117
,
Figure pct00118
,
Figure pct00119
,
Figure pct00120
,
Figure pct00121
,
Figure pct00122
,
Figure pct00123
및
Figure pct00124
에서 선택된다. 다른 변수는 상기와 같이 정의된다.
본 발명의 일부 실시형태에서, 상기 R1은 H, F, Cl, Br, I, CN, CH3,
Figure pct00125
시클로펜틸, 시클로부틸,
Figure pct00126
NH2,
Figure pct00127
,
Figure pct00128
및
Figure pct00129
에서 선택된다. 상기 CH3,
Figure pct00130
시클로펜틸 및 시클로부틸은 임의로 1, 2 또는 3개의 Rd로 치환된다.
본 발명의 일부 실시형태에서, 상기 R1은 H, F, Cl, Br, I, CH3 및
Figure pct00131
에서 선택된다. 다른 변수는 상기와 같이 정의된다.
본 발명의 일부 실시형태에서, 상기 R2는
Figure pct00132
,
Figure pct00133
및
Figure pct00134
에서 선택된다. 상기
Figure pct00135
,
Figure pct00136
및
Figure pct00137
은 임의로 1, 2 또는 3개의 Re로 치환된다. 다른 변수는 상기와 같이 정의된다.
본 발명의 일부 실시형태에서, 상기 R2는
Figure pct00138
에서 선택된다. 다른 변수는 상기와 같이 정의된다.
본 발명의 다른 일부 실시형태는 상기 변수의 임의의 조합을 통해 얻을 수 있다.
한편, 본 발명은 본 발명의 화합물, 그 이성질체 또는 그 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 의약 조성물을 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 의약 조성물은 약학적으로 허용되는 첨가물을 더 포함한다.
한편, 본 발명은 필요로 하는 대상(바람직하게는 인간)에게 치료상 유효량의 본 발명의 화합물, 그 이성질체, 그 약학적으로 허용되는 염, 또는 그 의약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, TLR8을 작동시키는 방법을 제공한다.
한편, 본 발명은 TLR8 작동에 반응하는 질환을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 필요로 하는 대상(바람직하게는 인간)에게 치료상 유효량의 본 발명의 화합물, 그 이성질체, 그 약학적으로 허용되는 염, 또는 그 의약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 방법을 제공한다.
한편, 본 발명은 TLR8 작동에 반응하는 질환을 치료 또는 예방하기 위한 약물 제조에 있어서 본 발명의 화합물, 그 이성질체, 그 약학적으로 허용되는 염, 또는 그 의약 조성물의 사용을 제공한다.
한편, 본 발명은 TLR8 작동에 반응하는 질환의 치료 또는 예방에 있어서 본 발명의 화합물, 그 이성질체, 그 약학적으로 허용되는 염, 또는 그 의약 조성물의 사용을 제공한다.
한편, 본 발명은 TLR8 작동에 반응하는 질환을 치료 또는 예방하기 위한 본 발명의 화합물, 그 이성질체, 그 약학적으로 허용되는 염, 또는 그 의약 조성물을 제공한다.
본 발명의 일부 실시형태에서, 상기 TLR8의 작동에 반응하는 질환은 바이러스 감염에서 선택된다.
본 발명의 일부 실시형태에서, 상기 바이러스 감염은 B형 간염 바이러스(HBV) 감염에서 선택된다.
본 발명의 화합물은 TLR8에 대해 유의한 아고니스트 활성을 갖는다. 본 발명의 화합물은 TLR8에 대해 바람직한 아고니스트 활성 및 특이적 선택성을 나타낸다. 본 발명의 화합물은 바람직한 TLR8 경로에 특이적인 사이토카인(IL-12p40, IFN-γ) 유도 활성을 나타낸다. 마우스 약물 동태 연구에서는 본 발명의 화합물이 중등도의 경구 생체이용률(bioavailability) 및 약물 노출량을 가지며 경구 투여가 가능하다. TLR8 아고니스트는 면역 조절제이며, 그 과잉 노출은 신체의 면역 과잉 활성화를 일으켜 예측 불가능한 부작용을 야기할 수 있다.
[정의 및 설명]
본 명세서에서 사용되는 이하의 용어 및 어구는 특별히 언급이 없는 한 아래 의미를 갖는 것을 의도하였다. 하나의 특정 용어 또는 어구는 정의되지 않았다고 해서 불확실 또는 불명확하다고 간주되어서는 안 되며 그 일반적인 의미에 따라 해석되어야 한다. 본 명세서에 상품명이 기재된 경우에는 대응하는 상품 또는 유효 성분을 가리키는 것을 의미한다.
여기서 사용되는 "약학적으로 허용되는"이라는 용어는 그 화합물, 재료, 조성물 및/또는 제형에 대해 신뢰할 수 있는 의학적 판단 범위 내에서 과도한 독성, 자극, 알러지 반응 또는 기타 문제나 합병증 없이 인간 및 동물 조직과 접촉해서 사용하기에 적합하고, 합리적인 이익/리스크 비율에 걸맞은 것을 의미한다.
"약학적으로 허용되는 염"이라는 용어는 본 발명의 화합물의 염이라는 뜻으로, 본 발명에서 발견된 특정 치환기를 갖는 화합물과 비교적 독성이 없는 산 또는 염기로 제조된다. 본 발명의 화합물이 비교적 산성인 관능기를 포함하는 경우, 염기 부가염은 이러한 화합물의 중성 형태를 순수 용액 또는 적절한 비활성 용매에서 충분한 양의 염기와 접촉함으로써 얻을 수 있다. 본 발명의 화합물이 비교적 염기성인 관능기를 포함하는 경우, 산 부가염은 이러한 화합물의 중성 형태를 순수 용액 또는 적절한 비활성 용매에서 충분한 양의 산과 접촉함으로써 얻을 수 있다. 약학적으로 허용되는 산 부가염의 예에는 무기산염 또는 유기산염이 포함된다.
본 발명의 약학적으로 허용되는 염은 종래의 화학적 방법으로 산성 또는 염기성 기를 함유하는 모 화합물로부터 합성할 수 있다. 일반적으로 이러한 염은 물 또는 유기 용매 또는 그 2개의 혼합물에서, 유리된 산 형태 또는 염기 형태의 화합물을 화학양론적 양의 적절한 염기 또는 산과 반응시킴으로써 제조할 수 있다.
"임의" 또는 "임의로"라는 용어는 뒤에서 설명하는 이벤트 또는 상황이 발생할 가능성이 있다는 것을 의미하지만 반드시 그러한 것은 아니다. 예를 들면, 에틸은 "임의"로 할로겐으로 치환되는 것은 에틸이 비치환 (CH2CH3), 1치환 (예를 들면 CH2CH2F), 다치환 (예를 들면 CHFCH2F, CH2CHF2 등) 또는 완전히 치환된 (CF2CF3)일 수 있다. 1개 또는 복수개의 치환기를 포함하는 임의의 기에 대해 공간에 존재하는 것이 불가능하고 및/또는 합성 불가능한 임의의 치환 또는 치환 패턴이 도입되지 않는 것을 당업자는 이해할 것이다. 당업자는 어느 기가 복수개의 치환기로 치환되는 경우, 치환이 일어날 수 있는 모든 부위가 치환될 때까지 치환기의 수가 2, 3, 4, 5개 또는 그 이상일 수 있음을 이해할 것이다. 예를 들면 에틸이 복수개의 F 원자로 치환되어 있을 경우, 2, 3, 4 또는 5개의 F 원자로 치환될 수 있다.
본 명세서에서 "Cm-n"이란 그 부분이 소정 범위 내의 정수개의 탄소 원자를 갖는 것을 의미한다. 예를 들어 "C1-6"이란, 그 기가 1개의 탄소 원자, 2개의 탄소 원자, 3개의 탄소 원자, 4개의 탄소 원자, 5개의 탄소 원자 또는 6개의 탄소 원자를 가질 수 있음을 의미한다.
본 발명의 화합물은 특정 기하 이성질체 또는 입체 이성질체 형태로 존재할 수 있다. 본 발명에서는 이러한 모든 화합물, 시스체 및 트랜스체 이성질체, (-)- 및 (+)-거울상 이성질체, (R)- 및 (S)-거울상 이성질체, 부분입체 이성질체, (D)-이성질체, (L)-이성질체 및 그 라세미 혼합물을 포함하는 이러한 모든 화합물, 및 예를 들면 거울상 이성질체 또는 부분입체 이성질체가 풍부한 혼합물 등의 다른 혼합물의 모든 이 혼합물들은 본 발명 범위 내에 포함된다. 알킬 등의 치환기는 다른 비대칭 탄소 원자를 가져도 된다. 이러한 모든 이성질체 및 이들의 혼합물은 본 발명 범위 내에 포함된다.
특별히 언급이 없는 한, "거울상 이성질체" 또는 "광학 이성질체"라는 용어는 서로 거울상인 입체 이성질체를 가리킨다.
특별히 언급이 없는 한, "시스-트랜스 이성질체" 또는 "기하 이성질체"라는 용어는 환 탄소 원자의 단일 결합 또는 이중 결합이 자유롭게 회전 불가능한 것에 기인한다.
특별히 언급이 없는 한, "부분입체 이성질체"라는 용어는 분자가 각각 2개 이상의 키랄 중심을 가지며 서로 거울상이 아닌 입체 이성질체를 가리킨다.
특별히 언급이 없는 한, "(D)" 또는 "(+)"는 우선성을 나타내고, "(L)" 또는"(-)"는 좌선성을 나타내며, "(DL)" 또는 "(±)"는 라세미화를 나타낸다.
특별히 언급이 없는 한, 쐐기 형태의 실선 결합(
Figure pct00139
) 및 쐐기 형태의 점선 결합(
Figure pct00140
)으로 하나의 입체 중심의 절대 배치를 나타내고, 직선 실선 결합(
Figure pct00141
) 및 직선 점선 결합(
Figure pct00142
)으로 입체 중심의 상대 배치를 나타내며, 물결선(
Figure pct00143
)으로 쐐기 형태의 실선 결합(
Figure pct00144
) 또는 쐐기 형태의 점선 결합(
Figure pct00145
)을 나타내며, 또는 물결선(
Figure pct00146
)으로 직선 실선 결합(
Figure pct00147
)및 직선 점선 결합(
Figure pct00148
)을 나타낸다.
본 발명의 화합물은 특정 형태로 존재할 수 있다. 특별히 언급이 없는 한, "호변 이성질체" 또는 "호변 이성질체 형태"라는 용어는 다른 관능성 이성질체가 실온에서 동적 평형 상태에 있고, 서로 신속하게 변환할 수 있음을 의미한다. 호변 이성질체가 가능할 경우(예를 들면 용액중에서), 호변 이성질체의 화학 평형을 달성할 수 있다. 예를 들면 프로톤 호변 이성질체(proton tautomer)(프로토트로픽 호변 이성질체(prototropic tautomer)라고도 함)는 케토-에놀 이성화 및 이민-에나민 이성화 등 프로톤 이동에 따른 상호 변환을 포함한다. 원자가 이성질체(valence tautomer)는 여러 결합 전자의 재결합에 의한 상호 변환이 포함된다. 그 중 케토-에놀 호변 이성화의 구체적 예는 호변 이성질체 펜탄-2,4-디온과 4-히드록시펜트-3-엔-2-온 사이의 상호 변환이다.
본 발명에 기재된 "이성질체"라는 용어는 입체 이성질체, 시스-트랜스 이성질체, 및 호변 이성질체가 포함된다.
특별히 언급이 없는 한, "1개의 이성질체가 풍부하다", "이성질체가 풍부하다", "1개의 거울상 이성질체가 풍부하다" 또는 "거울상 이성질체가 풍부하다"라는 용어는 어느 1종류의 이성질체 또는 거울상 이성질체의 함유량이 100% 미만이면서, 당해 이성질체 또는 거울상 이성질체의 함유량이 60% 이상 또는 70% 이상 또는 80% 이상 또는 90% 이상 또는 95% 이상 또는 96% 이상 또는 97% 이상 또는 98% 이상 또는 99% 이상 또는 99.5% 이상 또는 99.6% 이상 또는 99.7% 이상 또는 99.8% 이상 또는 99.9% 이상인 것을 말한다.
특별히 언급이 없는 한, "이성질체 과잉률" 또는 "거울상 이성질체 과잉률"이라는 용어는 2개의 이성질체 또는 2개의 거울상 이성질체의 상대적 백분율 차를 의미한다. 예를 들어 한쪽 이성질체 또는 거울상 이성질체의 함유량이 90%이고, 다른 한쪽 이성질체 또는 거울상 이성질체의 함유량이 10%인 경우, 이성질체 또는 거울상체 과잉률(ee값)은 80%이다.
광학 활성체인 (R)-과 (S)-이성질체, 또는 D와 L 이성질체는 키랄 합성 또는 키랄 시약 또는 다른 종래기술을 통해 제조할 수 있다. 예를 들면 본 발명에 따른 어느 화합물의 어느 거울상 이성질체를 얻고자 할 경우에는 비대칭 합성 또는 키랄 보조제를 사용하는 유도체화를 통해 제조할 수 있다. 여기서, 얻어진 부분입체 이성질체 혼합물이 광학 분할되고 보조기가 절단되어 원하는 순수한 거울상 이성질체가 제공된다. 또는 분자가 염기성 관능기(아미노기 등) 또는 산성 관능기(카르복실기 등)를 포함할 경우, 적절한 광학 활성인 산 또는 염기와 부분입체 이성질체의 염을 형성한 후, 당기술분야에서 공지된 방법으로 부분입체 이성질체를 광학 분할하여 순수한 거울상 이성질체를 회수한다. 또한 거울상 이성질체와 부분입체 이성질체의 분리는 통상적으로 키랄 고정상을 사용하고 필요에 따라 화학적 유도체화(예를 들면, 아민으로부터 카바메이트를 형성)와 조합한 크로마토그래피를 사용해서 실시된다.
본 발명의 화합물은 화합물을 구성하는 하나 또는 복수의 원자에 비천연 비율의 원자 동위체를 포함할 수 있다. 예를 들면 화합물은 트리튬(3H), 요오드-125(125I) 또는 C-14(14C) 등의 방사성 동위체로 표지할 수 있다. 다른 예로서 수소를 중수소로 치환하여 중수소화 약물을 형성할 수 있고, 중수소와 탄소로 형성되는 결합은 일반적인 수소와 탄소로 형성되는 결합보다 견고하다. 비중수소화 약물에 비해 중수소화 약물은 독성 부작용 저감, 안정성 향상, 효력 증강, 생물학적 반감기 연장 등의 장점이 있다. 방사성 여부에 관계없이 본 명세서에 기재된 화합물의 모든 동위체 변환은 본 발명의 범위 내에 포함된다. "임의" 또는 "임의로"라는 용어는 나중에 설명하는 이벤트 또는 상황이 발생할 수 있음을 의미하지만 반드시 그러한 것은 아니다. 설명에는 이벤트 또는 상황이 발생하는 경우와 발생하지 않는 경우가 포함된다.
"치환된"이라는 용어는 특정 원자상의 임의의 하나 이상의 수소 원자가 치환기에 의해 치환되는 것을 의미하고, 특정 원자의 원자가가 정상이며 치환된 화합물이 안정적인 한, 중수소 및 수소 이성질체를 포함할 수 있다. 치환기가 산소(즉 =O)일 경우, 2개의 수소 원자가 치환된 것을 의미한다. 방향족 기에서는 산소 치환이 일어나지 않는다. "임의로 치환되는"이라는 용어는 그것이 치환 또는 비치환일 수 있음을 의미한다. 특별히 언급이 없는 한, 치환기의 종류 및 수는 화학적으로 실현 가능하다면 임의여도 된다.
화합물의 조성 또는 구조에 변수(R 등)가 여러 번 등장할 경우에는 각각의 경우 그 정의는 독립적이다. 따라서 예를 들면 1개의 기가 0~2개의 R로 치환될 경우, 상기 기는 옵션으로 최대 2개의 R로 치환될 수 있고, 각각의 경우 R의 정의는 독립적이다. 또한 치환기 및/또는 그 변이체의 조합은 그러한 조합을 통해 안정된 화합물이 생성되는 경우에만 허용된다.
특별히 언급이 없는 한, "C1-6 알킬"이라는 용어는 1 내지 6개의 탄소 원자를 포함하는 직쇄 또는 분기 포화 탄화수소기를 가리킨다. 상기 C1-6 알킬에는 C1-4, C1-3, C1-2, C2-6, C2-4, C6 및 C5 알킬 등이 포함된다. 그것은 1가(예를 들면 메틸), 2가(예를 들면 메틸렌) 또는 다가(예를 들면 메테닐)일 수 있다. C1-6 알킬의 예에는 메틸(Me), 에틸(Et), 프로필(n-프로필 및 이소프로필을 포함), 부틸(n-부틸, 이소부틸, s-부틸 및 t-부틸을 포함), 펜틸(n-펜틸, 이소펜틸 및 네오펜틸을 포함), 헥실 등이 포함되지만 이에 한정되지 않는다.
특별히 언급이 없는 한, "C3-6 시클로알킬"은 단환식 및 2환식인 3~6개의 탄소 원자로 구성된 포화 환상 탄화수소기를 의미한다. 상기 C3-6 시클로알킬은 C3-5, C4-5 및 C5-6 시클로알킬 등이 포함되며, 그것은 1가, 2가 또는 다가일 수 있다. C3-6 시클로알킬의 예에는 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 시클로헥실 등이 포함되지만 이에 한정되지 않는다.
"의약 조성물"이라는 용어는 본 출원의 1개 또는 복수의 화합물 또는 그들의 염과 약학적으로 허용되는 첨가물의 혼합물을 말한다. 의약 조성물의 목적은 본 출원의 화합물의 생물에 대한 투여를 용이하게 하는 것이다.
"약학적으로 허용되는 첨가물"이라는 용어는 생체에 대해 명확한 자극 효과를 갖지 않으며, 활성 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 해하지 않는 것을 가리킨다. 탄수화물, 왁스, 수용성 및/또는 수팽윤성 폴리머, 친수성 또는 소수성 재료, 젤라틴, 기름, 용매 및 물 등의 적절한 첨가물은 당업자에게 잘 알려진 것이다.
"치료"라는 용어는 질환 또는 질환과 관련된 하나 또는 여러 증상을 개선 또는 배제하기 위해 본 명세서에 기재된 화합물 또는 제제를 투여하는 것을 의미하며, 다음을 포함한다:
(i) 질환 또는 병증을 억제, 즉 그 진행을 억제한다,
(ii) 질환 또는 병증을 완화, 즉 그 관해를 도입한다.
"치료상 유효량"이라는 용어는 (i) 특정 질환, 상태 또는 장애를 치료하는 것, (ii) 특정 질환, 상태 또는 장애의 하나 또는 여러 증상을 경감, 개선 또는 배제할 수 있는 본 발명 화합물의 양을 의미한다. "치료상 유효량"을 구성하는 본 출원 화합물의 양은 화합물, 병증 및 그 중증도, 투여 방법, 그리고 치료되는 포유 동물의 연령에 따라 바뀌지만, 당업자라면 그 지식 및 본 발명의 내용에 따라 결정할 수 있다.
"예방"이라는 용어는 질환 또는 질환과 관련된 하나 또는 여러 증상을 예방하기 위해 본 출원에 기재된 화합물 또는 제제를 투여하는 것을 의미하며, 특히 포유 동물이 해당 병증에 걸리기 쉽지만 걸렸다고 진단되지 않은 경우에 포유 동물의 해당 질환 또는 병증의 발생을 예방하는 것을 포함한다.
본 발명에는 다음 약어가 사용된다:
Figure pct00149
본 발명에서 사용한 용매는 시판되고 있으며 더 정제할 필요는 없다. 반응은 일반적으로 질소 분위기하에 무수 용매중에서 실시된다. 프로톤 핵자기 공명 데이터는 Bruker Avance III 400(400MHz) 분광계로 기록되고, 화학 시프트는 테트라메틸실란의 고자기장에서 (ppm)으로 표시된다. 질량 스펙트럼은 Agilent 1200 시리즈와 6110(&1956A)으로 측정된다. LC/MS 또는 Shimadzu MS에는 하나의 DAD:SPD-M20A(LC)와 Shimadzu Micromass 2020 검출기가 포함된다. 질량 분석계에는 포지티브 모드 또는 네거티브 모드 중 어느 하나로 동작하는 일렉트로 스프레이 이온원(ESI)이 장착되어 있다.
Shimadzu SIL-20A 자동 샘플러와 Shimadzu DAD:SPD-M20A 검출기를 구비한 Shimadzu LC20AB 시스템을 사용해서 Xtimate C18(3m 필러, 규격: 2.1×300mm) 칼럼을 사용한 고속 액체 크로마토그래피 해석을 하였다.
이하, 실시예를 통해 본 발명에 대해 상세하게 설명하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 명세서에서 상세하게 설명되고 특정 예도 개시되어 있으나 본 발명의 정신 및 범위를 벗어나지 않고 특정 실시형태에 대해 다양한 변경 및 수정을 하는 것은 당업자에게 있어 자명하다.
실시예 1
Figure pct00150
중간체 화합물 1-10의 제조:
Figure pct00151
단계 A: 20-30℃에서 화합물 1-1(50g, 412.54mmol) 및 티탄산 테트라에틸(94.10g, 412.54mmol, 85.55mL)을 THF(500mL)에 용해하고, 2-헥사논(41.32g, 412.54mmol, 51.01mL)을 더 첨가하였다. 반응액을 65℃로 승온하여 48시간 교반하고 얻어진 반응액을 직접 다음 단계에 사용하였다.
단계 B: 단계 A의 반응액을 실온까지 냉각하여 THF(1000mL)를 추가하고, 브롬화 알릴(196.33g, 1.62mol)을 더 첨가하였다. 그 후 배치로 천천히 아연 분말(53.06g, 811.43mmol)을 첨가하고 반응액을 질소 분위기하에 20-30℃에서 12시간 교반하였다. 반응액을 규조토로 여과하고 여과액에 포화 식염수 100mL를 첨가하여 교반한 후 다시 규조토로 여과하고 여과액을 스핀 건조하였다. 잔존물을 아세트산에틸(100mL)로 용해하고, 분리된 유기상을 포화 식염수(300mL)로 1회 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조해서 여과하고 감압하에 농축하여 크루드(crude) 생성물을 얻었다. 크루드 생성물을 칼럼 크로마토그래피(SiO2, PE/EtOAc=15/1에서 5/1)로 정제하여 화합물 1-3을 얻었다. 1H NMR(400MHz, CDCl3) δ 5.96-5.75(m, 1H), 5.23-5.08(m, 2H), 3.20(s, 1H), 2.39-2.20(m, 2H), 1.74(br s, 1H), 1.56-1.42(m, 2H), 1.40-1.15(m, 14H), 0.96-0.86(m, 3H).
단계 C: 화합물 1-3(15g, 61.12mmol)을 메탄올(150mL)에 용해하여 0℃까지 냉각하고, 디옥산·염산 용액(4M, 91.68mL)을 0부터 20℃에서 천천히 첨가하여 반응액을 25℃에서 2시간 교반하였다. 반응액을 직접 감압하에 농축하여 화합물 1-4를 얻었다.
단계 D: 화합물 1-4(염산염, 13g, 73.15mmol) 및 탄산 수소 나트륨(55.31g, 658.36mmol)을 디옥산(90mL) 및 H2O(60mL)에 용해하고 0℃까지 냉각하였다. 그 후 CbzCl(74.87g, 438.91mmol, 62.40mL)을 천천히 적하하였다. 반응액을 20에서 30℃까지 승온하고 2시간 교반하여 아세트산에틸로 100ml/회, 총 2회 추출하고 유기상을 합쳐서 포화 식염수(150mL)로 1회 세척하고 무수 황산나트륨으로 건조하고, 여과해서 감압하에 농축하여 크루드 생성물을 얻었다. 크루드 생성물을 칼럼 크로마토그래피(SiO2, PE/EtOAc=1/0에서 100/1)로 정제하여 화합물 1-5를 얻었다. 1H NMR(400MHz, CDCl3) δ 7.30-7.26(m, 5H), 5.76-5.62(m, 1H), 5.08-4.91(m, 4H), 2.47-2.34(m, 1H), 2.32-2.20(m, 1H), 1.72-1.57(m, 1H), 1.50-1.42(m, 1H), 1.30-1.10(m, 7H), 0.76-0.76(m, 1H), 0.76-0.76(m, 1H), 0.82(t, J=7.0Hz, 2H).
단계 E: 화합물 1-5(20.8g, 75.53mmol)를 아세토니트릴(100mL), H2O(150mL)및 테트라클로로메탄(100mL)에 용해하여 0℃까지 냉각하고, 과요오드산 나트륨(64.62g, 302.12mmol)을 천천히 첨가하고, 삼염화 루테늄 3수화물(394.99mg, 1.51mmol)을 더 첨가하고 반응액을 25℃까지 승온하여 2시간 교반하였다. 반응액을 규조토로 여과한 후 DCM(200mL)으로 1회 추출하고 유기상을 포화 아황산나트륨 수용액(200mL)으로 1회 세척하고, 포화 식염수(200mL)로 1회 더 세척하여 무수 황산나트륨으로 건조하고, 여과해서 감압하에 농축하여 크루드 화합물 1-6을 얻어 직접 다음 단계에 사용하였다. 1H NMR(400MHz, CDCl3) δ 7.40-7.35(m, 5H), 5.19(s, 1H), 5.08(s, 2H), 2.89(br d, J=14.5Hz, 1H), 2.69(br d, J=14.4Hz, 1H), 1.90-1.77(m, 1H), 1.74-1.62(m, 1H), 1.43-1.20(m, 7H), 0.90(t, J=6.9Hz, 3H).
단계 F: 화합물 1-6(20g, 68.18mmol) 및 트리에틸아민(10.35g, 102.26mmol, 14.23mL)을 THF(250mL)에 용해하고, 질소 분위기하에 -10℃에서 클로로포름산 이소부틸(9.78g, 71.59mmol, 9.40mL)을 적하하고 -10부터 0℃에서 30분간 교반하였다. 이어서, 암모니아수(63.70g, 454.41mmol, 70mL, 25%)를 천천히 첨가하고 0부터 5℃하에 30분간 교반하여 반응시켰다. 반응액을 감압하에 농축한 다음, 아세트산에틸(200mL)로 1회 추출하고 유기상을 포화 식염수로 100mL/회, 총 2회 세척하여 무수 황산나트륨으로 건조하고, 여과해서 감압하에 농축하여 크루드 생성물을 얻었다. 크루드 생성물을 칼럼 크로마토그래피(SiO2, PE/EtOAc=10/1에서 1/1)로 정제하여 화합물 1-7을 얻었다. 1H NMR(400MHz, CDCl3) δ 7.41-7.28(m, 5H), 5.62(br s, 1H), 5.30-5.12(m, 2H), 5.11-5.01(m, 2H), 2.76(d, J=13.2Hz, 1H), 2.44(d, J=13.3Hz, 1H), 1.85-1.74(m, 1H), 1.73-1.62(m, 3H), 1.39-1.29(m, 5H), 0.90(t, J=7.0Hz, 3H). LCMS(ESI) m/z: 293.3 [M+H]+.
단계 G: 화합물 1-7(15.34g, 52.47mmol) 및 N,N-디메틸포름아미드디메틸아세탈(134.55g, 1.13mol, 150mL)을 120℃에서 2시간 교반하고 감압하에 농축한 후 아세트산(250mL)에 용해하고, 히드라진 수화물(25.75g, 504.09mmol, 25mL, 98%)을 천천히 첨가하여 질소 분위기하에 90℃에서 2시간 교반하였다. 반응액을 감압하에 농축하여 H2O(400mL)를 첨가한 후, DCM으로 200mL/회, 총 2회 추출하고 유기상을 합쳐서 포화 식염수로 200mL/회, 총 2회 세척하여 무수 황산나트륨으로 건조하고, 여과해서 감압하에 농축하여 크루드 화합물 1-8을 얻었다. 1H NMR(400MHz, CDCl3) δ 7.95(s, 1H), 7.43-7.29(m, 5H), 5.08(s, 2H), 4.90(br s, 1H), 3.42(br d, J=13.9Hz, 1H), 3.12(d, J=14.3Hz, 1H), 1.87-1.77(m, 1H), 1.68-1.58(m, 1H), 1.41-1.17(m, 7H), 0.90(br t, J=6.5Hz, 3H). LCMS(ESI) m/z: 317.2 [M+H]+.
단계 H: 화합물 1-8(15.20g, 48.04mmol) 및 DIPEA(12.42g, 96.08mmol, 16.74mL)를 DCM(160mL)에 용해하여 트리페닐클로로메탄(20.09g, 72.06mmol)을 천천히 첨가하고 반응액을 25℃에서 2시간 교반하였다. 반응액에 H2O(100mL)를 첨가하여 2N 희염산으로 pH 7~8로 조정하였다. 또한 100mL의 DCM으로 1회 추출하고 유기상을 포화 식염수로 100mL/회, 총 2회 세척하여 무수 황산나트륨으로 건조하고, 여과해서 감압하에 농축하여 크루드 생성물을 얻었다. 크루드 생성물을 칼럼 크로마토그래피(SiO2, PE/EtOAc=20/1에서 5/1)로 정제하여 화합물 1-9를 얻었다. 1H NMR(400MHz, CDCl3) δ 7.89(s, 1H), 7.37-7.27(m, 14H), 7.18-7.07(m, 6H), 5.72(br s, 1H), 5.16-4.93(m, 2H), 3.07(d, J=14.2Hz, 1H), 2.90(d, J=14.2Hz, 1H), 1.80-1.61(m, 4H), 1.33(s, 3H), 0.90-0.84(m, 3H). LCMS(ESI) m/z: 559.3 [M+H]+.
단계 I: 화합물 1-9(12.75g, 22.82mmol)를 이소프로판올(300mL)에 용해하고, 질소 분위기하에 Pd/C(6g)을 첨가하고, 현탁액을 진공 탈기하여 수소로 3회 치환하고 수소 분위기(15psi)하에 25℃에서 16시간 교반하였다. 반응액을 규조토로 여과하여 300mL의 DCM으로 세척하고 여과액을 감압하에 농축하여 화합물 1-10을 얻었다. 1H NMR(400MHz, CDCl3) δ 7.91(s, 1H), 7.37-7.28(m, 9H), 7.17-7.11(m, 6H), 2.87(s, 2H), 1.45-1.24(m, 6H), 1.12(s, 3H), 0.92-0.84(m, 3H). LCMS(ESI) m/z: 425.2 [M+H]+.
실시예 1의 합성:
Figure pct00152
단계 A: 화합물 1-10(1.91g, 4.50mmol) 및 화합물 1-11(900mg, 4.50mmol)을 THF(9mL)에 용해하고, DIPEA(9.00mmol, 1.57mL)를 더 첨가하였다. 혼합물을 질소 분위기하에 70℃에서 3시간 교반하여 반응시켰다. 반응액을 감압하에 농축하여 크루드 화합물 1-12를 얻었다. LCMS(ESI) m/z: 588.42 [M+H]+.
단계 B: 크루드 화합물 1-12(3.60g, 6.12mmol) 및 2,4-디메톡시벤질아민(3.01mg, 18.00mmol, 2.71mL)을 1,4-디옥산(30mL)에 용해하고 질소 분위기하에 DIPEA(8.99mmol, 1.57mL)를 더 첨가하였다. 혼합물을 100℃에서 12시간 교반하여 반응시켰다. 반응액에 물(20mL) 및 아세트산에틸(50mL)을 첨가하고, 액-액 분리하여 유기상을 포화 식염수(20mL)로 세척하고 무수 황산나트륨으로 건조하여 여과한 후 감압하에 농축하여 크루드 생성물을 얻었다. 크루드 생성물을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(SiO2, DCM/MeOH=100/1에서 15/1)로 정제하여 화합물 1-13을 얻었다. LCMS(ESI) m/z: 719.7 [M+H]+.
단계 C: 화합물 1-13(2.00g, 2.78mmol), 트리에틸실란(970.50mg, 8.35mmol, 1.33mL)을 TFA(41.81mL)에 용해한 후, 28℃에서 12시간 교반하여 반응시켰다. 반응액을 직접 감압하에 농축하고 p-HPLC(칼럼: Phenomenex luna C18 250*50mm*10μm; 이동상: [물(0.05% HCl)-아세토니트릴]; 아세토니트릴%: 10%-40%, 28min, 50% min)로 정제하여 실시예 1의 염산염을 얻었다. 1H NMR(400MHz, CD3OD) δ 9.15(s, 1H), 8.90(s, 1H), 8.59(d, J=5.6Hz, 1H), 8.26(d, J=5.5Hz, 1H), 4.11(d, J=14.8Hz, 1H), 3.53(d, J=14.9Hz, 1H), 2.60(dt, J=4.1, 12.8Hz, 1H), 1.79(dt, J=4.2, 12.8Hz, 1H), 1.58(s, 3H), 1.52-1.19(m, 4H), 0.92(t, J=7.2Hz, 3H). LCMS(ESI) m/z: 327.1 [M+H]+.
실험예 1: 인간 Toll 유사 수용체 7(TLR7) 및 인간 Toll 유사 수용체 8(TLR8)의 invitro에서의 수용체 결합 활성에 관한 스크리닝 실험
본 실험에서 사용한 HEK-Blue TM hTLR7(제품번호: hkb-htlr7) 및 HEK-Blue TM hTLR8(제품번호: hkb-htlr8) 세포주는 InvivoGen사에서 구입하였다. 이 2개의 세포주는 hTLR7 또는 hTLR8을 인간 배아 신장 293 세포주에 안정적으로 코트랜스펙션함과 아울러, 분비형 알칼리 포스파타아제(SEAP) 리포터 유전자의 발현을 유도함으로써 구축된 것으로, SEAP 리포터 유전자는 IFN-β 프로모터에 의해 제어되었다. 상기 프로모터는 NF-κB 및 AP-1 결합 부위와 융합되고, hTLR7 또는 hTLR8은 NF-κB 및 AP-1을 활성화시켜 분비형 염기성 포스파타아제(SEAP)의 발현과 분비를 유도한다. QUANTI-Blue TM 시약을 사용해서 SEAP의 발현 레벨을 측정함으로써 hTLR7 및 hTLR8 수용체에 대한 화합물의 아고니스트 활성을 식별하였다.
실험 단계:
1. 화합물을 3배의 구배로 세포판에 첨가하였고 최종 농도는 5000nM, 1667nM, 556nM, 185nM, 62nM, 21nM, 6.9nM, 2.3nM, 0.76nM, 0.25nM였다. 그리고 각 농도에 대해 2련으로 실시한다. 네거티브 컨트롤로서 DMSO를 각 웰에 1μL 첨가하였다.
2. T150 플라스크에서 배양한 세포를 CO2 인큐베이터에서 꺼내 세포 배양 상청을 폐기하고 얻어진 세포를 둘베코 인산 완충 생리 식염수(DPBS)로 1회 세척하였다. 플라스크에 약 10mL의 배지를 첨가하고 가볍게 두드려서 세포를 분리하고 얻어진 세포 덩어리를 부드럽고 균일하게 피펫팅하였다. 세포 수를 카운팅하고 세포 현탁액을 배지에서 500,000세포/mL로 조정하였다. 다음으로 100μL의 희석된 세포(50,000세포/웰)를 화합물을 포함하는 96웰 플레이트의 각 웰에 첨가하였다.
3. 화합물과 세포를 37℃의 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 인큐베이팅하였다.
4. 화합물 활성 검출: 유도 후 각 웰에서 20마이크로리터의 세포 상청을 채취하여 180μL의 QUANTI-Blue TM 시약을 포함하는 세포 배양 플레이트에 첨가하고 37℃에서 1시간 인큐베이팅하여 다기능 마이크로 플레이트 리더로 각 웰의 650나노 미터(OD650)에서의 광학 농도값(OD650)을 측정하였다.
5. 세포 생존율 검출: ATPlite 1Step의 지시에 따라 조작하여 다기능 마이크로 플레이트 리더로 루시페라아제 시그널(RLU)을 검출하였다.
6. 데이터 분석: 화합물 활성: GraphPad Prism 소프트웨어를 사용해서 OD650 값을 해석하고 화합물의 용량 효과 곡선을 적합시켜 화합물의 EC50 값(최대 효과 농도의 절반)을 계산하였다.
실험 결과: 표 1에 기재하였다.
Figure pct00153
결론: 본원 화합물은 이상적인 TLR8 아고니스트 활성을 나타내며, TLR8과 TLR7 사이에서 TLR8의 특이적인 선택성을 나타냈다.
실험예 2: 말초혈 단핵 세포의 실험 절차
TLR8은 외인성 병원체를 감지하는 자연 면역계 수용체로, 외인성 바이러스 단일 가닥 RNA를 인식하고 TNF-α, IL-12, IFN-γ 등 일련의 사이토카인 방출을 일으켜서 항바이러스 면역을 유발한다. TLR7은 자연 면역계가 외래 병원체를 감지하기 위한 다른 유형의 수용체이며, 활성화된 후 주로 IFN-α 등의 항바이러스성 사이토카인을 생산한다. 본 실험에서는 TLR8 아고니스트로서의 잠재적인 화합물을 사용해서 인간 말초혈 단핵 세포(hPBMC)를 자극하여 상기 TNF-α, IL-12p40, IFN-γ 및 IFN-α 레벨을 검출함으로써 TLR8 수용체에 대한 화합물의 활성화와 TLR8/TLR7 선택성을 반영하고 있다.
실험 단계:
1. 건강한 지원자의 신선한 혈액을 채취하여 EDTA-K2 항응고 튜브(제품번호: BD-8516542)에서 항응고 처리하였다.
2. 피콜 밀도 기울기 원심 분리하여 중앙의 구름형상 층의 hPBMC 세포를 분리하여 10% 혈청을 포함하는 RPMI1640(출처: Gibco, 제품번호: 224400-089)로 2회 세척하고 10mL가 되도록 배지로 재현탁하였다. Vi-cell cell counter로 세포 수를 카운팅한 후 세포 현탁액의 농도를 2×106/mL로 조정하였다.
3. 화합물을 100mM로 DMSO에 용해하고 DMSO로 50mM 및 2mM로 희석하여 이들을 초기 농도로 사용하였다. 다음으로 용액을 각각 3배의 그레디언트(직전 농도 샘플(5μL)+DMSO(10μL))로 순차적으로 희석하여 8개의 그레디언트를 얻었다. 얻어진 용액을 각각 배지에서 500배 희석하여 화합물의 작업 용액을 제조하였다.
4. U 바닥 96웰 플레이트에서 100μL의 hPBMC 현탁액과 100μL의 화합물의 작업 용액을 각 웰에 첨가하였고, 최종 농도는 2000nM, 666.7nM, 222.2nM, 74.1nM, 24.7nM, 8.2nM, 2.7nM, 0.9nM였다. 24시간 인큐베이팅한 후 상청을 수집하고 TNF-α, IFN-gamma, IL-12p40 사이토카인의 검출까지 -20℃ 동결하였다. 또 다른 그룹의 최종 농도는 50μM, 16.7μM, 5.6μM, 1.9μM, 0.6μM, 0.2μM, 0.1μM, 0.02μM였다. 24시간 인큐베이팅한 후 상청을 수집하고 IFN-alpha 사이토카인의 검출까지 -20℃ 동결하였다.
5. 플로우 사이토메트리 비즈 마이크로어레이(CBA)를 사용해서 상청액 중 IL-12p40, TNF-α, IFN-γ를 검출하였다. 효소 결합 면역 측정법(ELISA)으로 세포 상청액 중 IFN-α를 검출하였다.
6. 데이터 해석: 화합물 활성: EC50 값(최대 효과 농도의 절반)을 GraphPad Prism 소프트웨어로 해석하고 화합물의 용량 효과 곡선을 피팅시켜 화합물의 EC50 값을 계산하였다.
실험 결과: 표 2에 기재하였다.
Figure pct00154
결론: 본 발명의 화합물은 이상적인 TLR8 경로에 특이적인 사이토카인 IL-12p40, TNF-α 및 IFN-γ 유도 활성을 가지며, TLR7 경로에 특이적인 사이토카인 IFN-α에 대한 비교적 낮은 유도 활성을 가지며, TLR8 경로의 작동에 대한 이상적인 특이적 선택성을 나타냈다.
실험예 3: 마우스의 약물 동태에 관한 연구
이 실험은 마우스에 대한 단회 정맥내 주사 또는 위내 투여 후 화합물의 약물 동태학적 거동을 평가하는 것을 목적으로 하였다. 정맥 주사 투여: 시험 화합물은 0.5mg/ml의 투명한 용액으로 조제되었고, 용매는 5% DMSO/5% 폴리에틸렌글리콜-15 히드록시스테아레이트/90% 물이다. 위내 투여: 시험 화합물이 2mg/ml 현탁액으로 조제되었고, 용매는 0.5% 카르복시메틸셀룰로오스나트륨/0.2% Tween 80/99.3% 물이다.
시험 화합물의 혈중 농도는 고속 액체 크로마토그래피-질량 분석(LC-MS/MS)으로 측정하였다. 화합물과 내부 표준의 유지시간, 크로마토그램의 취득 및 크로마토그램의 적분은 소프트웨어 Analyst(Applied Biosystems)로 처리되었고, 데이터 통계 해석은 소프트웨어 Watson LIMS(Thermo Fisher Scientific) 또는 Analyst(Applied Biosystems)로 처리되었다.
혈장 농도는 WinNonlin TM 버전 6.3(Pharsight, Mountain View, CA)이라는 약물 동태 소프트웨어의 비구획 모델(non-compartmental model)을 사용해서 처리되었고, 약물 동태 파라미터는 선형 대수 사다리꼴법을 사용해서 계산되었다.
실시예 1의 염산염에 대해 1mg/Kg 정맥 내 주사 및 5mg/Kg 경구 위내 투여에서 마우스의 약물 동태 파라미터를 하기 표 3에 기재하였다.
Figure pct00155

Claims (13)

  1. 식(I)로 표시되는 화합물, 그 이성질체 또는 그 약학적으로 허용되는 염;
    Figure pct00156

    여기서 "*"를 붙인 탄소 원자는 단독 (R) 또는 (S)의 거울상 이성질체 형태로 존재하거나 1개의 거울상 이성질체가 풍부한 형태로 존재하는 키랄 탄소 원자일 수 있고,
    X는 N 및 CH에서 선택되고,
    R1은 H, F, Cl, Br, I, CN, C1-6 알킬, C3-6 시클로알킬, -N(Ra)(Rb) 및 -O(Rc)에서 선택되고, 상기 C1-6 알킬 및 C3-6 시클로알킬은 임의로 1, 2 또는 3개의 Rd로 치환되고,
    R2는 C1-6 알킬에서 선택되고, 상기 C1-6 알킬은 임의로 1, 2 또는 3개의 Re로 치환되고,
    Ra, Rb, Rc, Rd 및 Re는 각각 독립적으로 H, F, Cl, Br, I, OH, CN, NH2, CH3,
    Figure pct00157
    ,
    Figure pct00158
    ,
    Figure pct00159
    ,
    Figure pct00160
    ,
    Figure pct00161
    ,
    Figure pct00162
    ,
    Figure pct00163
    ,
    Figure pct00164
    및
    Figure pct00165
    에서 선택되고, 상기 CH3,
    Figure pct00166
    ,
    Figure pct00167
    ,
    Figure pct00168
    ,
    Figure pct00169
    ,
    Figure pct00170
    ,
    Figure pct00171
    ,
    Figure pct00172
    ,
    Figure pct00173
    및
    Figure pct00174
    은 임의로 1, 2 또는 3개의 R로 치환되고,
    각 R은 독립적으로 F, Cl, Br, I, OH, CN, NH2, CH3,
    Figure pct00175
    ,
    Figure pct00176
    ,
    Figure pct00177
    ,
    Figure pct00178
    ,
    Figure pct00179
    ,
    Figure pct00180
    ,
    Figure pct00181
    ,
    Figure pct00182
    ,
    Figure pct00183
    ,
    Figure pct00184
    ,
    Figure pct00185
    ,
    Figure pct00186
    ,
    Figure pct00187
    ,
    Figure pct00188
    ,
    Figure pct00189
    ,
    Figure pct00190
    및
    Figure pct00191
    에서 선택된다.
  2. 청구항 1에 있어서,
    Ra, Rb, Rc, Rd 및 Re는 각각 독립적으로 H, F, Cl, Br, I, OH, CN, NH2, CH3,
    Figure pct00192
    ,
    Figure pct00193
    ,
    Figure pct00194
    ,
    Figure pct00195
    ,
    Figure pct00196
    ,
    Figure pct00197
    ,
    Figure pct00198
    ,
    Figure pct00199
    ,
    Figure pct00200
    ,
    Figure pct00201
    ,
    Figure pct00202
    ,
    Figure pct00203
    ,
    Figure pct00204
    ,
    Figure pct00205
    ,
    Figure pct00206
    ,
    Figure pct00207
    및
    Figure pct00208
    에서 선택되는, 화합물, 그 이성질체 또는 그 약학적으로 허용되는 염.
  3. 청구항 1 또는 2에 있어서,
    R1은 H, F, Cl, Br, I, CN, CH3,
    Figure pct00209
    시클로펜틸, 시클로부틸,
    Figure pct00210
    NH2,
    Figure pct00211
    ,
    Figure pct00212
    및
    Figure pct00213
    에서 선택되고, 상기 CH3,
    Figure pct00214
    시클로펜틸 및 시클로부틸은 임의로 1, 2 또는 3개의 Rd로 치환되는, 화합물, 그 이성질체 또는 그 약학적으로 허용되는 염.
  4. 청구항 1 또는 2에 있어서,
    R1은 H, F, Cl, Br, I, CH3 및
    Figure pct00215
    에서 선택되는, 화합물, 그 이성질체 또는 그 약학적으로 허용되는 염.
  5. 청구항 1 또는 2에 있어서,
    R2는
    Figure pct00216
    ,
    Figure pct00217
    및
    Figure pct00218
    에서 선택되고, 상기
    Figure pct00219
    ,
    Figure pct00220
    및
    Figure pct00221
    은 임의로 1, 2 또는 3개의 Re로 치환되는, 화합물, 그 이성질체 또는 그 약학적으로 허용되는 염.
  6. 청구항 5에 있어서,
    R2는
    Figure pct00222
    에서 선택되는, 화합물, 그 이성질체 또는 그 약학적으로 허용되는 염.
  7. 하기 식의 화합물, 그 이성질체 또는 그 약학적으로 허용되는 염.
    Figure pct00223
  8. 청구항 7에 있어서,
    Figure pct00224
    에서 선택되는, 화합물, 그 이성질체 또는 그 약학적으로 허용되는 염.
  9. 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항에 기재된 화합물, 그 이성질체 또는 그 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 의약 조성물.
  10. 치료상 유효량의 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항에 기재된 화합물, 그 이성질체, 그 약학적으로 허용되는 염, 또는 그 의약 조성물을 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함하는, TLR8을 작동시키는 방법.
  11. TLR8의 작동에 반응하는 질환을 치료하는 방법으로서, 치료상 유효량의 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항에 기재된 화합물, 그 이성질체, 그 약학적으로 허용되는 염, 또는 그 의약 조성물을 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  12. 청구항 11에 있어서,
    상기 TLR8의 작동에 반응하는 질환이 바이러스 감염에서 선택되는, 방법.
  13. 청구항 12에 있어서,
    상기 바이러스 감염이 B형 간염 바이러스 감염에서 선택되는, 방법.
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