KR20210055644A

KR20210055644A - 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2 검출용 등온 단일 반응 프로브 세트 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20210055644A
Application number: KR1020210055810A
Authority: KR
Inventors: 이정욱; 정규열; 우창하; 장성호; 신기영
Original assignee: 포항공과대학교 산학협력단
Priority date: 2019-04-22
Filing date: 2021-04-29
Publication date: 2021-05-17
Also published as: EP3943614A1; EP3943614A4; US20220213540A1; JP7477183B2; KR20200123753A; EP3943614B1; JP2022530041A; KR102249111B1; KR102287960B1; WO2020218831A1

Abstract

본 발명은 신규한 등온 단일 반응용 프로브 세트 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로, 등온 조건 하 단일 반응 조성물을 이용하여 핵산 서열-기반으로 현장 적용 가능한 형태의 쉽고 정확하며 신속하게 현장에서 분자, 특히, 감염성 질병의 진단하는 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 분자 진단 플랫폼을 이용하면 빠르고 정확하게 타겟 서열을 검출할 수 있다. 또한, 이를 이용한 진단 과정에서 필요한 요소들(반응 용액, 효소)이 기존의 항체기반의 진단보다 훨씬 간소하고 간편하여 숙련된 인력이 아니더라도 진행할 수 있으며, 일반적인 핵산 기반 분자 진단 기술에 사용되는 고가장비없이 등온에서 모든 반응이 일원화되고 반응이 일어나는 과정에서 증폭 과정이 자동적으로 실시되기 때문에 진단의 민감도와 신속성을 높일 수 있다.

Description

중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2 검출용 등온 단일 반응 프로브 세트 및 이의 용도{Probe Set of Isothermal One-pot Reaction for Detecting Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 and Uses Thereof}

본 발명은 신규한 등온 단일 반응용 프로브 세트 및 이의 용도에 관한 것이다. 구체적으로, 등온 조건 하 단일 반응 조성물을 이용하여 핵산 서열-기반으로 현장 적용 가능한 형태의 쉽고 정확하며 신속하게 현장에서 분자 진단하는 방법을 제공한다.

특정한 핵산(DNA 또는 RNA) 또는 단백질을 검출하는 방법은 과학연구 분야에서 기본적으로 중요한 기술이다. 특정한 핵산 또는 단백질을 검출하고 동정할 수 있게 됨으로써, 연구자들은 어떠한 유전적, 생물학적 표지가 인간의 건강상태를 나타내는 지표가 되는지를 판정할 수 있게 되었다.

이러한 핵산 또는 단백질을 검출하는 방법을 이용하면 시료에 존재하는 타겟 유전자, 예컨대, 병원체 유전자 및 이의 변형, 또는 특정 유전자의 발현 등을 발견할 수 있다.

그러나, 현대에 소득 수준이 높아지면서 건강 및 위생에 대하여 높은 관심을 나타내는 반면, 직접 눈에 보이지 않는 미생물을 검출하고 이를 정량적으로 평가하기는 쉽지 않은 상황이다.

인간이 사용하는 머리 빗, 휴대폰, 책상, 옷 등과 같은 일상적인 물건이나 화장실, 침실 등의 공간, 심지어 일반적인 공기 중에는 다양한 미생물이 서식하고 있으며, 이러한 미생물 중에는 기회감염균 및 병원성 세균 등이 포함되어 있을 가능성이 있다.

미생물의 양을 측정하는 전통적인 방법으로는 표준 평판법으로 미생물을 배양할 수 있는 배지에 환경으로부터 채취한 시료를 단계 희석하여 도말하고 2~3일 후에 배지로부터 생성되는 균락의 수를 계산하여 그 양을 추정하는 것이다. 이러한 전통적 방법은 전문적 실험 도구 및 숙련된 실험자가 필요할 뿐만 아니라 시간도 매우 오래 걸리는 단점을 지니고 있어 일반인이 신속하게 생존 미생물을 측정하기엔 힘든 점이 있다.

전통적 방법의 문제점을 해결하기 위하여 최근 여러 방법들이 개발되고 있다. 세포 내에 항시 존재하는 다양한 구성물질의 양을 측정함으로써 간접적으로 미생물의 양을 측정하는 것이다.

대표적인 방법으로 ATP의 양을 기반으로 측정하는 방법이 있다. ATP는 세포 내에서 주요 생체에너지원으로 사용되고 있으며, 모든 생물에 공통적으로 존재하는 구성물로 시료에서 세포 양을 측정하기에 유용한 물질이다. 이러한 장점으로 인하여 ATP 측정방법은 미생물 정량 측정에 현재 널리 사용되고 있으며, 이를 측정하기 위해서 일반적으로 루시퍼라아제(luciferase) 효소를 사용하여 발광반응을 유도하고 빛의 강도를 통하여 정량을 하게 된다. 이때, 기질로는 루시페린(luciferin)을 사용한다.

그러나, 상기 방법은 반응 시료 내 ATP가 빠르게 고갈되어 신호가 오래 지속되지 못하며, 첨가하는 효소 및 기질의 생산단가가 높은 단점이 존재한다.

또한, 측정하기 위한 구성물이 효소인 점으로 인하여 저장성에 한계점을 보유하고 있어 문제가 되고 있다. 이러한 ATP 측정을 통한 미생물 세포의 정량 방법에는 또 다른 문제점이 존재한다. 세포가 사멸하여도 ATP의 기능은 유지되어 사멸된 또는 생존력이 매우 낮은 미생물 역시 측정될 가능성이 높다는 것이다.

병원성 미생물을 진단하는 또다른 일반적인 방법은 ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) 또는 IRMA (Immunoradiometric assay)등과 같은 항체 기반 기술들이다. 그러나, 이 방법 역시 특정 항원에 반응하는 항체를 생성하는데 2~3개월이 소요되므로 변이가 빈번하고 단시간에 확산되므로 전염성 질병의 진단방법으로는 적합하지 않다.

따라서, 전염성 질병들을 진단하기 위해서는 항체 기반의 진단 기술 대신 극미량의 감염 물질의 정보를 담고 있는 DNA, RNA 같은 핵산을 검사하여 판단할 수 있는 분자 수준의 분자 진단 기술이 적합하다.

이러한 분자 진단 기술 중에 리가아제(ligase)를 이용하는 방법이 있다. 이는 특정 DNA 단편조각들을 시료에 넣어주게 되면 세포 내에 존재하는 리가아제가 이를 인지하고 중합반응을 통하여 두 개의 단편조각을 이어주게 된다. 이렇게 이어준 조각에 특정한 프라이머를 이용하여 real-time PCR 분석을 수행하는 경우, 미생물 양도 평가할 수 있는 것으로 알려져 있다.

그러나, 리가아제와 DNA 가닥과의 반응을 통해 만들어진 새로운 핵산 분자를 확인하기 위해서는 RT-PCR 및 PCR, 겔 전기영동 과정이 요구되기 때문에 고가의 장비 및 숙련된 실험자가 필요하며 분석 시간이 매우 오래 소요된다. 또한, 루시퍼라아제 측정법처럼 ATP 분자가 죽은 세포 상에도 존재하기 때문에 생존 미생물만의 측정이 불가능하다는 단점이 있다.

즉, 이러한 핵산을 이용한 분자 진단 기술은 기존의 진단 방법보다 감도가 뛰어나므로, 질환 예방을 목적으로 특정 유전자를 검출해내거나 감염 질환을 예방하기 위한 선별 검사, 조기 확인 및 빠른 대응이 가능하나, 대부분의 핵산을 이용한 분자 진단 기술은 온도순환형핵산증폭장치(thermocycler) 장비와 그 기계를 다룰 수 있는 전문 인력이 필요하다는 단점이 있다.

따라서, 상술한 종래 항체 기반의 진단 기술이 가지는 문제점인 특정 항원에 결합하여 항체가 생성되는 데 소요되는 시간적 소모를 줄이고, 고가의 장비 및 숙련된 인력의 확보 없이 매우 효과적으로 정확하게 단시간 내에 목적 DNA/RNA 서열의 검출 및/또는 진단할 수 있는 방법의 개발이 필요하다.

이러한 상황 하에서, 본 발명자들은 종래 기술의 문제점을 극복하면서 단일 또는 다수의 타겟 핵산서열의 검출을 보다 간편하면서도 위양성 및 위음성 결과없이 검출할 수 있는 기술을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 특정 프로모터 서열; 및 타겟 유전자와 혼성화하는 서열로 구성되는 프로모터 프로브(PP, promoter probe)인 제1 DNA 프로브, 및 타겟 유전자와 혼성화하는 서열; 및 형광-표지 RNA 압타머를 암호화하는 서열로 구성되는 리포터 프로브(RP, reporter probe)인 제2 DNA 프로브를 설계하였다. 또한, 타겟 유전자를 부목(splint)으로 사용한 상기 DNA 프로브들의 라이게이션 반응, 상기 라이게이션된 단일가닥 DNA로부터 RNA 중합효소에 의한 전사과정 및 상기 전사과정에서 생성된 전사산물 내의 압타머 구조가 특정 화학 분자와 결합하는 형광반응의 3 단계를 등온 조건 하에서 여러 단계, 특히, 증폭 단계 없이, 단일 반응으로 수행될 수 있도록 일원화하였고, 이에 의해 용이하고 간편하게 타겟 유전자를 검출할 뿐만 아니라, 실제로 고병원성 미생물을 단독 또는 다중 검출하여, 신속한 대응이 필요한 고병원성 질환을 진단하는 플랫폼이 될 수 있음을 규명함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 일 목적은 타겟 핵산서열 검출용 등온 단일 반응(isothermal one-pot reaction) 프로브 세트를 제공하는 데 있다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 프로브 세트를 포함하는 타겟 핵산서열 검출용 조성물을 제공하는 데 있다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 타겟 핵산서열 검출용 키트를 제공하는 데 있다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 별도의 증폭 반응 없이, 등온 단일 반응 조건하에서 타겟 핵산서열을 검출하는 방법을 제공하는 데 있다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 별도의 증폭 반응 없이, 등온 단일 반응 조건하에서의 현장용 분자 진단 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 첨부된 청구범위 및 도면으로부터 보다 명확하게 된다.

본 명세서에서 사용한 용어는 단지 설명을 목적으로 사용된 것으로, 한정하려는 의도로 해석되어서는 안된다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.

다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 실시예가 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 제1 프로브 및 제2 프로브로 구성되는, 타겟 핵산서열 검출용 등온 단일 반응(isothermal one-pot reaction) 프로브 세트를 제공하며,

상기 제1 프로브는, 하기 일반식 I의 구조를 갖는 프로모터 프로브(promoter probe, PP)이고;

3'-X- Y-5' (I)

상기 일반식(I)에서,

상기 X는 RNA 중합 효소가 인식할 수 있는 프로모터 서열을 포함하는 스템-루프 구조(Stem-loop structure) 부위이고; 상기 Y는 타겟 핵산서열과 상보적인 혼성화 서열을 갖는 UHS(Upstream Hybridization Sequence) 부위이며; 상기 타겟 핵산서열은 DNA 또는 RNA이고; 상기 X 및 Y는 디옥시리보뉴클레오타이드이며;

상기 제2 프로브는, 하기 일반식 II의 구조를 갖는 리포터 프로브(reporter probe, RP)이고;

3'-Y'-Z-5' (II)

상기 일반식(II)에서,

상기 Y'는 타겟 핵산서열과 상보적인 혼성화 서열을 갖는 DHS (Downstream Hybridization Sequence) 부위이고; 상기 Z는 검출가능한 시그널을 발생시키는 하나의 표지(label) 또는 다수의 표지를 포함하는 상호작용적 표지 시스템을 갖는 압타머 서열 부위이며; 상기 타겟 핵산서열은 DNA 또는 RNA이고; 상기 Y' 및 Z는 디옥시리보뉴클레오타이드이며;

상기 제1 프로브 및 제2 프로브는 타겟 핵산서열과 혼성화된 후 라이게이션(ligation)되고; 상기 라이게이션 산물은 RNA 중합효소에 의해 전사가 개시되어 시그널을 생성한다.

본 발명의 상기 프로브 세트를 이용하는 본 발명의 기술은 '등온 단일 반응 플랫폼'또는 '라이게이션 반응을 이용한 분자 진단 플랫폼'등으로 호칭된다.

본 발명의 프로브 세트의 제1 프로브는 각각 한 올리고뉴클레오타이드 분자 안에 2 개의 고유한 다른 부위(portion)를 포함하는 구조를 갖는다:

RNA 중합 효소가 인식할 수 있는 프로모터 서열을 포함하는 스템-루프 구조(Stem-loop structure) 부위인 X; 및 타겟 핵산서열과 상보적인 혼성화 서열을 갖는 UHS(Upstream Hybridization Sequence) 부위인 Y.

또한, 본 발명의 프로브 세트의 제2 프로브도 각각 한 올리고뉴클레오타이드 분자 안에 2 개의 고유한 다른 부위를 포함하는 구조를 갖는다:

타겟 핵산서열과 상보적인 혼성화 서열을 갖는 DHS(Downstream Hybridization Sequence) 부위인 Y'; 검출가능한 시그널을 발생시키는 하나의 표지(label) 또는 다수의 표지를 포함하는 상호작용적 표지 시스템을 갖는 압타머 서열 부위인 Z.

이러한 구조는 본 발명의 프로브 세트가 일원화된 단계로 등온 단일 반응 조건 하에서 단시간에 높은 검출 효과를 나타내는 프로브가 되도록 한다.

보다 구체적으로, 본 발명의 프로브 디자인은 두 개의 단일 가닥 DNA 프로브가 타겟 인식 서열이 노출되도록 설계되어 등온(예컨대, 효소가 작용할 수 있는 온도)에서 타겟 RNA/DNA와 프로브 세트의 혼성화를 가능하게 한다. 혼성화 서열은 타겟 RNA/DNA에 대한 혼성화를 최대화하면서 임의의 다른 구조 형성을 최소화하도록 디자인한다. 프로브와 타겟 RNA/DNA 사이의 효율적인 혼성화 과정은 등온 반응 동안 높은 민감도를 가지도록 한다.

제1 프로브인 프로모터 프로브는 줄기-루프 구조(Stem-loop structure)를 형성할 수 있도록 디자인되었고, 줄기 부분은 이중 가닥의 RNA 중합효소 프로모터 서열을 형성하여 RNA 중합효소를 이용한 전사 과정이 개시되도록 한다. 이중 가닥의 RNA 중합효소 프로모터 부분이 물리적으로 루프 서열에 의해 연결되어 있기 때문에 이중 가닥 프로모터가 기능할 수 있는 형태로 형성될 확률이 루프 서열에 의해 연결되지 않은 경우보다 높다. 따라서, 프로모터 프로브에서 헤어핀 구조가 형성된 자가 조립 프로모터 서열은 혼성화 과정 및 후속 전사 과정을 효과적으로 촉진할 수 있다.

제2 프로브인 리포터 프로브는 리포터로서 압타머 서열을 포함하도록 디자인되었고, 특정 물질에 반응하여 시그널을 생성하는 압타머에 의해 최종 생산물을 확인할 수 있다.

본 발명에 있어서, 리포터로서 사용되는 "압타머(Aptamer)"는 그 자체로 안정된 삼차구조를 가지면서 표적분자에 높은 친화성과 특이성으로 결합할 수 있는 특징을 가진 단일가닥 핵산 (DNA, RNA 또는 변형핵산)이다.

SELEX(Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment)라는 압타머 발굴 기술이 개발된 이후, 저분자 유기물, 펩타이드, 막 단백질까지 다양한 표적분자에 결합할 수 있는 압타머들이 계속해서 발굴되어 왔다. 압타머는 고유의 높은 친화성(보통 pM 수준)과 특이성으로 표적분자에 결합할 수 있다는 특성 때문에 자주 단일 항체와 비교가 되고, 특히 "화학 항체"라고 할 만큼 대체항체로서의 높은 가능성이 있다. 또한 결합하는 물질에 따라 흡수하는 파장대와 방출되는 파장대가 달라 형광을 발현하는 등의 방법으로 압타머와 특정 화학 분자의 결합을 확인할 수 있다.

본 발명의 압타머 및 상기 압타머와 상호 작용하는 반응 물질은 목적 효과로서 검출 가능한 시그널을 발생할 수 있는 한, 어떠한 종류의 압타머 및 반응 물질을 이용할 수 있다.

혼성화 후, 타겟 핵산서열에 혼성화된 제1 프로브 및 제2 프로브가 라이게이션된다.

즉, 본 발명의 제1 프로브 및 제2 프로브가 타겟 핵산서열과 혼성화된 이후 라이게이션 작용제를 이용하여 두 프로브 사이에 형성된 닉(nick)을 라이게이션시킨다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 제1 프로브 및 제2 프로브가 상기 타겟 핵산서열과 각각 혼성화 하는 경우, 제1 프로브 및 제2 프로브는 서로 바로 근접한(immediately adjacent) 위치에 위치한다.

근접한 위치에 위치하는 것이 두 개의 프로브 사이의 라이게이션 반응을 위해서 필요하다. 본 명세서에서 제1 프로브 및 제2 프로브의 혼성화 위치를 언급하면서 사용되는 용어"근접한(adjacent)"은 상기 두 프로브의 말단이 서로 연결될 수 있도록 상기 하나의 프로브의 3'-말단 및 나머지 하나의 프로브의 5'-말단이 서로 충분히 인접해 있는 것을 의미한다.

효소성 라이게이션은 제1 프로브 및 제2 프로브를 공유결합으로 연결시키는 바람직한 방법이므로, 용어 "라이게이션”은 본 명세서 전체적으로 이용된다.

그러나, 용어 "라이게이션"은 일반적인 용어이며 두 프로브를 공유결합으로 연결시키는 어떠한 방법도 포함한다는 것으로 이해된다.

본 발명의 라이게이션 반응은 매우 다양한 라이게이션 작용제를 이용하여 실시될 수 있으며, 효소성 라이게이션 작용제 및 비-효소성 라이게이션 작용제(예컨대, 화학적 작용제 및 포토라이게이션 작용제)를 포함한다.

화학적 라이게이션 작용제는 카보디이미드, BrCN(cyanogen bromide), N-시아노이미다졸, 이미다졸, 1-메틸이미다졸/카보디이미드/시스타민, DTT(dithiothreitol) 및 울트라바이올렛 라이트와 같은 활성제, 응축제 및 환원제를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 오토라이게이션, 즉, 라이게이션 작용제의 부존재 하에서의 자발적 라이게이션도 본 발명의 교시 범위에 포함된다. 화학적 라이게이션 방법의 상세한 프로토콜 및 적절한 작용기의 상세한 설명은 Xu 등, Nucl. Acids Res., 27:875-81(1999); Gryaznov and Letsinger, Nucl. Acids Res. 21:1403-08(1993); Gryaznov 등, Nucleic Acid Res. 22:2366-69(1994); Kanaya와 Yanagawa, Biochemistry 25:7423-30(1986); Luebke와 Dervan, Nucl. Acids Res. 20:3005-09(1992); Sievers와 von Kiedrowski, Nature 369:221-24(1994); Liu와 Taylor, Nucl. Acids Res. 26:3300-04(1999); Wang와 Kool, Nucl. Acids Res. 22:2326-33(1994)에서 찾을 수 있다.

라이게이션 작용제로서 적합한 파장의 광을 이용한 포토라이게이션 또한 본 발명의 교시 범위에 포함된다. 본 발명의 구현예에 따르면, 포토라이게이션은 뉴클레오타이드 아날로그를 포함하는 프로브를 포함하며, s4T(4-thiothymidine), 5-비닐우라실 및 그의 유사물 또는 이들의 조합물을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 라이게이션 반응은 효소성 라이게이션 작용제에 의한 것으로, 상기 라이게이션 작용제는 SplintR 리가아제, 박테리오파지 T4 리가아제, E.coli 리가아제, Afu 리가아제, Taq 리가아제, Tfl 리가아제, Mth 리가아제, Tth 리가아제, Tth HB8 리가아제, Thermus species AK16D 리가아제, Ape 리가아제, LigTk 리가아제, Aae 리가아제, Rm 리가아제, Pfu 리가아제, 리보자임(ribozyme) 및 이의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종을 이용하여 실시된다.

라이게이션에 의해 생성된 뉴클레오타이드간 연결(internucleotide linkage)은 포스포디에스테르 결합 및 다른 연결들을 포함한다. 예를 들어, 리가아제를 이용한 라이게이션은 일반적으로 포스포디에스테르 결합을 생성한다.

라이게이션을 위한 비-효소성 방법은 다른 뉴클레오타이드간 연결을 형성할 수 있다. 다른 뉴클레오타이드간 연결은 α-할로아실기 및 포스포티오에이트기 사이에 형성되는 티오포스포릴아세틸아미노기, 포스포티오에이트기 및 토실레이트기 또는 이오다이드기 사이에 형성되는 5'-포스포로티오에스테르, 및 피로포스페이트 연결과 같은 적합한 반응기들 사이의 공유결합의 형성을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

라이게이션 반응 후, 이의 결과물인 라이게이션 산물은 압타머 서열을 포함하고, 타겟 RNA/DNA를 증폭시키기 위한 주형으로서 단일 가닥 DNA가 된다.

이어서, RNA 중합효소에 의해 전사 과정이 개시되면, 상기 압타머 서열을 함유하는 타겟 RNA/DNA를 증폭시키기 위한 주형인 단일 가닥 DNA로부터 타겟 RNA/DNA이 연장되고, 특정 화학 분자와 결합함으로써 형광을 나타내도록 도입된 압타머에 의해 신속하고 간단하게 시그널이 생성된다.

또한, 종래 형광 단백질을 이용하는 형광 시그널과 비교하였을 때 RNA 압타머를 리포터로 사용한 경우 생성된 시그널을 관찰하는 데 걸리는 시간이 단축된다.

만약 제1 프로브 및 제2 프로브가 상기와 같이 실시되지 않는다면, 최종적으로 제1 프로브 및 제2 프로브의 전사 결과물 상의 표지로부터 나오는 시그널이 생성되지 않으므로, 타겟 핵산서열 검출은 달성되지 않는다.

본 발명의 상기 RNA 중합 효소는 목적 효과로서 전사를 개시할 수 있도록 프로모터 부위를 인식할 수 있는 한, 어떠한 종류의 RNA 중합 효소도 이용할 수 있다.

바람직하게는, 상기 RNA 중합 효소는 박테리오파지 T7 RNA 중합 효소, 박테리오파지 T3 중합 효소, 박테리오파지 RNA 중합 효소, 박테리오파지 ΦII 중합 효소, 살모넬라 박테리오파지 sp6 중합 효소, 슈도모나스 박테리오파지 gh-1 중합 효소, 대장균(E. coli) RNA 중합효소 홀로효소(holoenzyme), 대장균(E. coli) RNA 중합효소 코어 효소, 인간 RNA 중합효소 I, 인간 RNA 중합효소 II, 인간 RNA 중합효소 III, 인간 미토콘드리아 RNA 중합효소 및 이의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 일 실시예에서는 박테리오파지 T7 RNA 중합 효소를 이용하였다.

마찬가지로, RNA 중합 효소에 의해 전사가 개시될 수 있는 한, RNA 중합 효소가 인식하는 본 발명의 제1 프로브 내 프로모터 부위는 당업계에 공지된 임의의 프로모터 서열을 이용할 수 있다.

본 발명의 등온 단일 반응의 최적화를 위해서, 라이게이션 작용제 및 중합 효소는 적절하게 조절될 수 있으며, 바람직하게는, 단일 반응 용액 내 1:1 내지 1:5 unit, 보다 바람직하게는 1:4 unit, 가장 바람직하게는 1:1 unit으로 포함될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 표지는 화학적 표지, 효소 표지, 방사능 표지, 형광 표지, 발광 표지, 화학발광 표지 및 금속 표지로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

본 발명의 상기 등온 단일 반응은, 별도의 증폭 반응 없이, 15℃ 내지 50℃ 범위의 온도 중 어느 하나의 지정된 온도로 일원화하여 동시 수행된다.

상기 15℃ 내지 50℃ 범위의 온도는 당업계에 효소가 작용하는 것으로 알려진 온도로서, 본 발명의 목적 효과를 획득할 수 있는 한, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 실시예에서는 바람직하게는 상기 지정된 온도는 37℃이다.

또한, 상기 등온 단일 반응은 Tris-HCl, MgCl_2,NTPs, NaCl 및 ET-SSB(Extreme Thermostable Single-Stranded DNA Binding Protein)이 포함된 단일 반응 용액으로 일원화되어 동시 수행된다.

본 발명에서, 상기 단일 반응 용액은, 바람직하게는, 1 내지 100mM Tris-HCl; 1 내지 50mM MgCl₂; 0.1 내지 10mM NTPs 및 1 내지 50mM NaCl; 및 1 내지 800 ng ET-SSB를 포함하며, 보다 바람직하게는 10 내지 60mM Tris-HCl; 1 내지 30mM MgCl₂; 0.5 내지 5mM NTPs; 1 내지 30mM NaCl; 및 100 내지 600 ng ET-SSB를 포함하고, 가장 바람직하게는 50mM Tris-HCl; 10mM MgCl₂; 1mM NTPs; 10.5mM NaCl; 및 400 ng ET-SSB를 포함한다,

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는, 별도의 증폭반응 없이, 등온 단일 반응 조건하에서 타겟 핵산서열을 검출하는 방법을 제공한다:

(a) 샘플에, 상술한 제1 프로브 및 제2 프로브로 구성되는 타겟 핵산서열 검출용 등온 단일 반응(isothermal one-pot reaction) 프로브 세트를 처리하여 타겟 핵산서열과 혼성화시키는 단계;

(b) 상기 (a) 단계의 혼성화 산물에 라이게이션 작용제를 처리하여 상기 프로브 세트의 제1 프로브 및 제2 프로브를 라이게이션시키고 상기 라이게이션 산물에 중합효소를 처리하여 전사를 개시시키는 단계; 및

(c) 상기 (b) 단계의 전사 산물에 압타머-반응 물질을 처리하여 전사 산물 내 압타머의 시그널 생성을 검출하는 단계로서, 상기 시그널 생성은 샘플 중 타겟 핵산서열의 존재를 나타낸다.

본 발명의 상기 등온 단일 반응은, 별도의 증폭 반응 없이, 15℃ 내지 50℃ 범위의 온도 중 어느 하나의 지정된 온도로 일원화하여 동시 수행되며, 바람직하게는 상기 지정된 온도는 37℃이다.

상기 등온 단일 반응은 Tris-HCl, MgCl_2,NTPs, NaCl 및 ET-SSB(Extreme Thermostable Single-Stranded DNA Binding Protein)이 포함된 단일 반응 용액으로 일원화되어 동시 수행된다.

또한, 본 발명은 추가적인 별개의 증폭 과정(예컨대, PCR)이 요구되지 않고, 단일 등온 반응이 일어나는 과정에서 증폭 과정이 자동적으로 실시되는 것을 특징으로 한다.

이러한 증폭 과정이 포함되어 있는 단일 등온 반응이 가능한 이유는, (i) 헤어핀 구조를 지닌 이중가닥의 프로모터 서열을 포함한 제1 프로브와 라이게이션 반응이 일어나야 하류에 존재하는 압타머가 형성되도록 설계한 제2 프로브의 디자인 때문이며; (ii) 라이게이션된 산물이 전사 개시를 통한 전사되었을 때, 타겟 서열(즉, 부목)처럼 사용될 수 있는 것을 이용하여 별도의 증폭 과정이 없어도 반응 내에서 자연적으로 증폭과정이 일어나기 때문이다.

즉, 제1 프로브와 제2 프로브의 라이게이션 반응이 일어난 라이게이션 산물이 헤어핀 구조를 형성하는 제1 프로브의 RNA 중합효소 프로모터 서열로부터 전사 개시가 일어나 전사체가 만들어지면, 상기 전사체는 타겟 RNA 서열과 동일한 서열을 포함하고 있으므로 타겟 RNA처럼 사용될 수 있다. 또한, 전사된 라이게이션 산물은 타겟 핵산 서열과 같은 서열을 포함하고 있으므로 타겟 핵산 중에서도 타겟 RNA로써 작용될 수 있는 것이다.

따라서, 본 발명의 프로브 세트를 이용하는 플랫폼은 라이게이션, 전사 반응, 형광 반응까지 동시에 일어나도록 설계된 것이며, 더불어 라이게이션된 산물의 전사 반응이 일어난 전사체가 부목 RNA로써 사용되어 증폭과정이 포함되어 있는 단일 등온 반응인 것이다.

따라서, 본 발명의 (a) 내지 (c) 단계는 하나의 용기, 예컨대, 튜브 내에서 동시에 수행가능한다.

본 발명에 있어서, DNA 프로브의 서열은 목적 효과를 달성하는 한, 본 발명의 실시예에 기재된 서열에 제한되지 않으며, 모든 타겟 유전자 서열에 적용이 가능하다. 또한, 최종 신호 확인에 사용되는 압타머는 말라카이트 그린 압타머로 제한하지 않으며 어떠한 종류의 RNA 기반의 형광 압타머도 사용 가능하다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 1) 제작한 두 개의 DNA 프로브와 타겟 RNA, SplintR 리가아제를 사용한 라이게이션 단계 2) 상기 라이게이션된 프로브 어셈블리를 T7 RNA 중합효소를 통한 전사산물을 만들어내는 단계 3) 상기 생성된 전사산물의 하류에 존재하는 압타머가 특정 화학분자에 결합하여 형광의 세기로 검출여부를 확인하는 단계를 포함한 특정 질병 감염여부를 알아낼 수 있는 분자 진단법을 제공한다. 이에 대한 도식을 도 6에 나타내었다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 제1 프로브 및 제2 프로브로 구성되는 타겟 핵산서열 검출용 등온 단일 반응 프로브 세트; 라이게이션 작용제, 중합효소 및 등온 단일 반응 용액을 포함하는 타겟 핵산서열 검출용 조성물을 제공한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 조성물은 2 종 이상의 타겟 핵산서열 검출용 등온 단일 반응 프로브 세트를 포함할 수 있다.

상기 2 종 이상의 타겟 핵산서열 검출용 등온 단일 반응 프로브 세트는 각각 서로 상이한 상호작용적 표지 시스템을 포함하고; 상기 2 종 이상의 프로브 세트 각각은 각각 서로 상이한 타겟 핵산서열에 결합하여; 이로 인해 서로 상이한 타겟 핵산서열의 다중 검출이 가능하다.

즉, 상기 2 종 이상의 타겟은 상호작용적으로 상이한 분자 진단 대상, 예컨대, 감염성 유해 미생물일 수 있고, 이 경우, 서로 다른 병원체를 동시 검출 및 진단이 가능하다.

또한, 상기 2 종 이상의 타겟은 단일 병원체에 존재하는 서로 다른 타겟 부위일 수 있으며, 이 경우, 타겟의 다른 부위를 효과적으로 검출하여 더욱 정확하고 정밀한 진단이 가능하다.

본 발명의 조성물은 상기 서술된 본 발명의 프로브 세트에 의한 타겟 핵산서열 검출을 실시하기 위하여 제작되기 때문에, 중복되는 내용은 본 명세서의 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 타겟 핵산서열 검출용 조성물을 포함하는, 타겟 핵산서열 검출용 키트를 제공한다.

본 명세서에서 상술한 본 발명의 키트는 추가적으로, 다양한 폴리뉴클레오타이드 분자, 효소, 다양한 버퍼 및 시약을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 양성 대조군 및 음성 대조군 반응을 실시하는 데 필수한 시약을 포함할 수 있다. 어떤 하나의 특정 반응에서 사용되는 시약의 최적량은, 본 명세서에 개시사항을 습득한 당업자에 의해서 용이하게 결정될 수 있다.

전형적으로, 본 발명의 키트는 앞서 언급된 구성성분들을 포함하는 별도의 포장 또는 구분으로 제작된다.

본 발명의 키트는 상기 서술된 본 발명의 프로브 세트에 의한 타겟 핵산서열 검출을 실시하기 위하여 제작되기 때문에, 중복되는 내용은 본 명세서의 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는, 별도의 증폭 반응 없이, 등온 단일 반응 조건하에서의 현장용 분자 진단 방법을 제공한다:

본 발명의 방법에 의해 진단될 수 있는 한, 상기 타겟의 종류는 제한되지 않는다.

본 발명에서는 바람직하게는, 감염성 유해 미생물이다.

상기 감염성 유해 미생물은 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus Aureus), 비브리오 불니피쿠스(Vibrio vulnificus), 대장균(E. coli), 중동 호흡기 증후군 코로나바이러스(Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus), 인플루엔자 A 바이러스(Influenza A virus), 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus), 호흡기 세포 융합 바이러스(RSV), 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 헤르페스 심플렉스 바이러스(HSV), 인유두종 바이러스(HPV), 인간 파라인플루엔자 바이러스(HPIV), 뎅기열 바이러스, B형 간염 바이러스(Hepatitis B Virus (HBV)), 황열병 바이러스, 광견병 바이러스, 플라스모디움, 거대세포바이러스(CMV), 미코박테리움 튜버큘로시스, 클라미디아 트라코마티스, 로타바이러스, 인간 메타뉴모바이러스 (hMPV), 크리민 콩고 출혈열 바이러스 (Crimean-Congo hemorrhagic fever virus), 에볼라 바이러스, 지카바이러스, 헤니파바이러스, 노로바이러스, 라사바이러스, 리노바이러스, 플라비바이러스, 리프트 밸리 열 바이러스, 수족구병 바이러스, 살모넬라(Salmonella sp.), 쉬켈라(Shigella sp.), 엔테로박테리아세(Enterobacteriaceae sp.), 슈도모나스(Pseudomonas sp.), 모락셀라(Moraxella sp.), 헬리코박터(Helicobacter sp.) 및 스테노트로포모나스(Stenotrophomonas sp.)로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상일 수 있다.

본 발명의 방법은 2 종 이상의 타겟 핵산서열 검출용 등온 단일 반응 프로브 세트를 설계하고 이를 이용하여 2 종 이상의 타겟 핵산서열을 현장에서 신속 정확하게 검출할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 본 발명자들은 고도로 모듈화된 프로브 구조를 기반으로 최소한의 설계만을 이용하여 6개의 병원체에 적용하였고 성공적으로 다중-검출 및 진단하였다.

따라서, 본 발명의 프로브 세트는 타겟 핵산서열의 길이가 적절하다면 어떠한 RNA/DNA로부터 디자인될 수 있으므로, 이러한 특징에 의해 전염병 발생에 신속하게 대응할 수 있고, 항체 기반 진단에 비해 상당한 이점을 제공해 준다.

즉, 본 발명의 프로브 세트를 이용한 타겟 서열 검출 플랫폼은 목적 대상의 RNA/DNA 탐지를 위한 강력한 진단 플랫폼으로 작용하여 짧은 진단 시간, 높은 감도 및 특이도(specificity) 및 간단한 분석 절차를 제공할 뿐만 아니라, 비싼 기기 및 진단 전문가를 필요로 하지 않으므로, 신속한 대응이 필요한 신종 감염병에 적합한 진단 방법이 될 것이다.

또한, 이러한 고도로 모듈화된 구조를 갖는 본 발명의 제1 프로브 및 제2 프로브의 프로브 세트는 다중 타겟 검출에 있어서 위양성 및 위음성 결과로부터 완벽하게 자유로워진다.

본 발명의 방법은 상술한 본 발명의 프로브 세트를 포함하므로, 중복된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.

본 발명에 따른 분자 진단 플랫폼을 이용하면 타겟 유전자가 매우 낮은 농도로 존재하더라도 빠르고 정확하게 병원균을 검출할 수 있다. 또한 진단과정에서 필요한 요소들(반응용액, 효소)이 기존의 항체기반의 진단보다 훨씬 간소하며 간편하여 어느 누구라도 진행할 수 있으며, 일반적인 핵산 기반 분자 진단 기술에 사용되는 고가장비없이 등온에서 모든 반응이 동시에 진행되므로 진단의 민감도와 신속성을 높일 수 있다.

도 1a는 본 발명의 두 개의 DNA 프로브의 구조를 보여주고, 도 1b는 SplintR 리가아제를 이용한 라이게이션 반응을 나타내며, 도 1c는 본 발명의 라이게이션 기반의 분자 진단방법의 3 가지 핵심반응들을 나타내고, 도 1d는 본 발명의 라이게이션 반응을 이용한 핵산 검출법의 전체적인 개략도를 나타낸다.
도 2는 타겟 RNA가 존재할 때 두 프로브가 라이게이션 반응이 일어난 것을 모세관 전기영동 (Capillary Electrophoresis)로 확인한 결과를 보여준다
도 3은 본 발명의 라이게이션 반응이 일어난 산물이 전사 과정을 통해 전사되어 만들어진 전사산물을 확인하기 위한 아가로오스 젤 전기영동 결과를 보여준다.
도 4는 전사산물이 정확하게 말라카이트 그린 압타머 구조를 형성하였는지 확인하기 위하여 타겟 물질인 말라카이트 그린을 첨가하여 형광값을 측정한 결과를 보여준다.
도 5a는 본 발명의 등온 단일 반응으로 이루어진 핵산 검출 플랫폼의 개략도를 나타낸다.
도 5b은 20개의 단일 반응 용액 후보군 중에 단일반응을 위해 적합한 반응용액을 찾기 위해 형광값을 측정한 결과를 보여준다.
도 5c는 라이게이션의 효율을 높이기 위해 선별된 반응 용액(1번 반응 용액)에 추가적으로 단백질(ET-SSB)을 첨가함으로써 나타나는 형광값의 차이를 보여준다.
도 5d는 본 발명의 단일 반응 용액이 실제로 한 튜브 내에서 일련의 반응들(라이게이션, 전사반응, 형광반응)을 실시하는데 적합함을 보여준다.
도 6a는 단일반응의 최적화를 위해 필요한 효소들 (SplintR 리가아제, T7 RNA 중합효소)의 양을 조절하여 최적의 효소량을 찾아낸 결과를 보여준다.
도 6b는 단일반응에서 형광 반응을 매개하는 말라카이트 그린의 양을 최적화한 결과를 보여준다.
도 6c는 등온 단일 반응을 위해 37℃에서 타겟 RNA를 검출해낼 수 있는지 확인한 결과이다.
도 7a는 부목(Splint)으로 DNA를 이용하는 경우의 본 발명의 프로브 세트에 의한 검출 결과(젤 이미지)를 보여준다.
도 7b는 부목(Splint)으로 DNA를 이용하는 경우의 본 발명의 프로브 세트에 의한 검출 결과(Electropherogram)를 보여준다
도 7c는 부목(Splint)으로 DNA를 이용하는 경우의 본 발명의 프로브 세트에 의한 전사산물이 말라카이트 그린과 결합하여 형광 시그널을 나타내는 결과를 보여준다.
도 7d는 37℃ 등온 하에서, 단일 반응 용액으로 하나의 용기에서 부목(Splint)으로 DNA를 이용하는 경우의 본 발명의 프로브 세트에 의한 결과를 보여준다.
도 8a는 등온 단일 반응으로 진행되는 반응을 통해 타겟 RNA가 어느정도 시간이 지나야 검출될 수 있는지 진단의 신속성을 나타낸 결과를 보여준다.
도 8b는 등온 단일 반응으로 진행되는 반응을 통해 타겟 RNA 농도에 따른 형광값의 변화를 통해 검출한계를 나타낸 결과를 보여준다.
도 9(도 9a 내지 도 9f)는 등온 단일 반응으로 진행되는 반응을 통해 다양한 병원균의 타겟 RNA 농도에 따른 형광값의 세기를 나타낸 결과를 보여준다.
도 10(도 10a 내지 도 10d)은 등온 단일 반응으로 진행되는 반응을 통해 실제 병원균의 세포를 직접 검출되는 지에 대한 결과를 보여준다.
도 11(도 11a 내지 도 11c)은 등온 단일 반응으로 진행되는 반응을 통해 서로 다른 두 병원균을 독립적으로 각기 다른 형광 신호와 세기로 탐지해낼 수 있는 지에 대한 결과를 보여준다.
도 12(도 12a 내지 도 12c)는 등온 단일 반응으로 진행되는 반응을 통해 특정 병원체의 서로 다른 타겟 부위를 각기 다른 형광 신호와 세기로 탐지해낼 수 있는 지에 대한 결과를 보여준다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. 라이게이션 반응을 이용한 분자 진단 플랫폼 검증

1-1. 리가아제를 이용한 라이게이션 반응

본 발명자들은 빠르고 저렴하며 정확하게 타겟(예컨대, 특정 질병)을 검출하고자 라이게이션 반응을 이용한 극미량의 타겟 RNA를 검출해 내는 분자 진단 플랫폼을 개발하고자 하였다.

이에, 본 실시예에서는 직접 제작한 특수한 DNA 프로브 구조 및 서열을 기반으로 리가아제의 라이게이션 반응을 이용하였다. 본 발명에 있어서, 특수한 DNA 프로브는 라이게이션, 그 이후의 전사, 압타머 구조 형성 및 형광 발현까지 3가지가 모두 가능하게 디자인하였다.

이를 위해서는 하기와 같은 3 가지의 조건들이 충족되어야 한다.

첫번째로, 먼저 등온(예컨대, 37℃)에서 모든 반응이 진행되어야 하므로, 이 온도에서 프로브와 타겟 RNA 서열사이의 중합반응이 충분히 잘 일어나야 하고, 그 과정에서 원하지 않는 구조가 형성되어서는 안된다.

두번째로, 타겟 RNA와 중합하는 DNA 프로브상의 구역이 불필요한 구조를 이루지 않고, 단일가닥으로 존재해야 한다. 또한, 라이게이션 반응이 일어난 후 RNA 중합효소에 의해 전사가 일어나야 하므로 DNA 프로브상에 이중가닥의 프로모터가 존재해야 한다.

세번째로, 하류에 존재하는 압타머가 상류의 혼성화(hybridization) 서열들과 상호작용하지 않고 독립적인 구조를 잘 형성해야 한다.

상술한 3 가지의 조건을 충족시킨 DNA 프로브 세트의 구조 및 반응은 도 1a 및 1b에 나타낸 바와 같다.

상술한 DNA 프로브 세트는 2개의 프로브로 구성되며, 상기 플랫폼은 하기와 같은 3 가지의 핵심 기술로 이루어져 있다(도 1c):

(1) 리가아제를 이용한 프로브들끼리의 라이게이션 반응

- DNA 프로브와 RNA가 존재할 때, 타겟 RNA를 부목(splint)으로 삼아 2 종의 DNA 프로브로 이루어진 프로브 세트를 연결시켜 준다. 즉, 타겟 RNA의 서열에 상보적인 DNA 프로브 2 종을 제작하고 리가아제(SplintR ligase)를 이용하여 서로 연결시켜줌으로써 라이게이션 반응을 수행한다.

(2) 라이게이션된 산물(Ligated product)의 In vitro 전사 반응

- 라이게이션된 산물의 5′ 부분에 위치한 T7 프로모터 서열에 T7 RNA 중합효소가 붙어 전사과정을 진행하여, 라이게이션된 산물로부터 전사산물인 RNA를 만들어낸다.

(3) RNA 압타머를 이용한 형광 발현

- RNA 3′말단 부분에 위치한 압타머가 특정 화학 물질과 결합하여 나타내는 형광을 이용해 목표 RNA 분자의 존재여부를 확인한다.

본 실시예에서는 상기 (1) - (3)의 핵심기술을 통해 일 구현예로서 MRSA 감염 여부를 진단하고자 한다.

이 과정들은 2시간 이내로 반응이 완료되므로 빠르게 결과가 도출될 수 있고, (1)의 반응이 일어나야 그 이후의 과정들이 차례대로 이루어지고 그렇게 (1) - (3)까지의 반응들이 모두 이루어질 때에만 원하는 결과를 얻을 수 있으므로, 진단의 정확성을 신뢰할 수 있다(도 1d).

상기 DNA 프로브 세트는 하기 2 종의 프로브로 구성되어 있다:

제1 DNA 프로브[프로모터 프로브(PP, promoter probe)로 명명]로서,

상기 PP는 프로모터 서열과 타겟 유전자와 혼성화(hybridization)하는 UHS(Upstream Hybridization Sequence) 서열의 두 부분으로 이루어져 있으며;

제2 DNA 프로브[리포터 프로브(RP, reporter probe)로 명명]로서,

상기 RP는 타겟 유전자와 혼성화하는 DHS(Downstream Hybridization Sequence) 서열과 최종 생산물을 확인할 수 있는 리포터로써 형광-반응 RNA 압타머를 암호화하는 서열의 두 부분으로 이루어져 있다.

본 실시예 1에서 타겟 RNA(부목 RNA)로 MRSA (Methicillin Resistant Staphylococcus Aureus)의 타겟 유전자인 mecA; 프로모터 서열로 T7 프로모터 서열; 및 형광-반응 RNA 압타머로서 말라카이트 그린 RNA 압타머를 이용하였고, 본 실시예 1에 이용된 상기 2 종의 DNA 프로브의 상세한 서열은 하기 표 1에 나타내었다.

PP (UHS + T7 프로모터 complementary + 루프 + T7 프로모터)	5'-TTCTCCTTGTTTCATTTTGAGTTCTGCAGccctatagtgagtcgtattaggatccacaacaggatcctaatacgactcactataggg-3'(서열번호 1)
RP(말라카이트 그린 압타머+ DHS)	5'-ggatccattcgttacctggctctcgccagtcgggatccaccACCCAATTTGTCTGCCAGT-3'(서열번호 2)

(대문자로 표시한 뉴클레오티드들은 타겟 핵산서열과 상보적인 혼성화 서열을 가르킨다.소문자로 표시한 뉴클레오티드들은 스템-루프 구조(Stem-loop structure)를 이루는 T7 프로모터 complementary 서열 + 루프 서열 + T7 프로모터 서열을 가르키며, 밑줄친 뉴클레오티드들은 스템-루프 구조(Stem-loop structure) 중 스템을 이루는 뉴클레오티드들을 가리킨다.

소문자 이탤릭체로 표시한 뉴클레오티드들은 압타머 서열을 가르킨다.)

간략하게, 앞서 제작한 두 개의 DNA 프로브와 타겟 RNA를 10x 어닐링(annealing) 반응 용액[100mM Tris-HCl (pH7.4), 500mM KCl]에서 95℃로 3분간 열로 변성시킨 후, 상온에서 천천히 식혔다. 타겟 RNA는 MRSA (Methicillin Resistant Staphylococcus Aureus)의 타겟 유전자인 mecA DNA 서열 상류에 T7 프로모터 서열을 삽입하여 클로닝한 후, T7 RNA 중합 효소(New England Biolabs., Ipswich, USA)를 사용하여 전사시켰다. 전사 반응에서 얻은 RNA는 DNaseI (Takara Bio Inc., Nojihigashi, Japan)로 처리한 후 RiboClear (㈜진올바이오테크놀러지, 서울, 대한민국)를 이용하여 정제하였다.

이렇게 어닐링된 올리고뉴클레오타이드를, 통상적으로 알려져 있는 방법으로, SplintR 리가아제 (New England Biolabs), 10x SplintR 리가아제 반응 반응 용액[50mM Tris-HCl (pH7.5), 10mM MgCl₂, 1mM ATP, 10mM DTT, 15mM NaCl]을 넣고 37℃에서 30분간 반응시켰다.

1-2. T7 중합효소를 이용한 전사반응

상기 실시예 1-1에서 라이게이션된 산물을, 통상적으로 알려져 있는 방법으로, 25mM NTPs, 10mM DTT, RNase Inhibitor (Takara Bio Inc)와 함께 10x T7 중합효소 반응용액 [40mM Tris-HCl (pH7.9), 6mM MgCl2, 1mM DTT, 10mM NaCl, 2mM Spermidine]를 넣고 37℃에서 16 시간동안 반응시켰다.

1-3. 하류의 압타머서열과 말라카이트 그린 결합을 통한 형광반응

상기 실시예 1-2에서 생성된 RNA(압타머 서열이 있는)을 1μM가 되도록 넣어 주고, 말라카이트 그린 압타머 반응 용액 [50mM Tris-HCl (pH7.5), 1mM ATP, 10mM NaCl, 140mM KCl]에 섞은 후, 통상적으로 알려져 있는 방법으로, 95℃에서 10 분 동안 열로 변성시켜 리폴딩시킨 후, 20 분 동안 실온으로 냉각시켰다. MgCl₂를 RNA 용액에 최종 농도 10 mM이 되도록 첨가하고, 용액을 실온에서 15분 동안 안정화시켰다. 그 이후 타겟 물질은 말라카이트 그린 수용액 (320μM)을 5 μL 첨가하였다. 말라카이트 그린 수용액은 말라카이트 그린 옥살산 염 (Sigma-Aldrich., St. Louis, USA)을 RNase-free water에 희석시켜 사용하였다. 그 이후, 96 well black polystyrene microplate clear flat bottom (Corning Inc., New York, USA)에 100 μL 의 용량으로 Hidex Sense Microplate Reader 에서 형광을 측정하였다(excitation: 616nm, emission: 665nm). 상술한 실시예 1에서의 일련의 반응들을 도 1c에 나타내었다.

1-4. 결과

본 실시예에서는 말라카이트 그린과 결합하여 형광을 발현하는 RNA 압타머를 이용하여 타겟 유전자를 감지하여 라이게이션된 프로브에서 생성된 전사산물을 검출하고자 하였다.

상기 설계한 프로브의 SplintR 리가아제를 통한 라이게이션 반응 수행 여부를 검증하기 위해, 반응 산물을 전기영동 방법으로 확인하였다. 이때 라이게이션된 프로브 어셈블리(Full-length 프로브)의 민감한 검출을 위해 모세관 전기영동(Capillary electrophoresis) [ABI 3130XL Genetic Analyzer (16-Capillary Array, 50cm ; Applied Biosystems Inc., Foster City, USA)]을 사용하여 분석하였다. 우선, RP의 5'에 6-FAM (6-Carboxyfluorescein)을 붙인 올리고뉴클레이오타이드를 제작하였다. 이 5'6-FAM RP는 라이게이션 반응 여부와 관계없이 특정한 위치의 피크를 나타내게 되고, 라이게이션이 일어난 시료에서는 이와 다른 위치에 피크가 나타나게 된다. SplintR 리가아제는 타겟 RNA가 존재할 경우에만 2개의 프로브를 연결시켜 주기 때문에, 타겟 RNA가 들어있는 시료에서만 라이게이션 반응이 일어나고, 그로 인해 5'6-FAM RP의 피크와 다른 위치에 2개의 프로브들이 연결된 라이게이션된 프로브 어셈블리 피크가 생성되었다(도 2).

이후 프로브 어셈블리가 올바르게 전사되는지 알아보기 위해 아가로오스 젤 전기영동으로 밴드의 위치를 확인하였다. 사용한 젤은 2.5% 아가로오스 젤 변성 젤이며, 타겟 RNA가 존재하지 않는 샘플을 음성 대조군으로, 합성한 프로브 어셈블리 [Integrated DNA Technoloiges, INC. (IDT)., Coralville, USA]를 양성 대조군으로 설정하였다. 이 때, 음성대조군에서는 라이게이션 반응이 일어나지 않았으므로 T7 프로모터 서열로부터 PP까지의 길이인 55nt의 전사산물이 만들어지고, 양성대조군과 실험군에서는 라이게이션 반응이 진행되었으므로 T7 프로모터 서열로부터 PP, RP를 모두 포함한 89nt의 전사산물이 만들어짐을 확인할 수 있다(도 3).

또한, 전사산물이 말라카이트 그린과 결합하여 형광을 내는지를 Hidex Sense Microplate Reader (Hidex., Lemminkaisenkatu, Finland)를 이용해 확인하였다(도 4).

실시예 2. 라이게이션 반응을 이용한 단일반응 분자 진단 플랫폼 구축

상기 실시예 1에서 라이게이션 반응을 기반으로 한 분자 진단 플랫폼을 검증하는 과정에서 실시예 1-1, 1-2, 1-3 각각의 반응은 서로 다른 튜브에서 서로 다른 반응용액 조건에서 진행하였다. 또한, 각 단계 반응에 최적화된 온도를 사용하여 온도도 일정하게 유지시키지 않았다.

상기 공정들은 상당히 번거롭고 시간적 소모가 크다.

이에, 본 발명자들은 간편하고 신속하게 타겟 서열의 검출을 통한 진단을 수행하기 위해서, 도 5a에 나타낸 바와 같이, 단일 조성의 반응 용액을 이용하여 하나의 튜브로 일정한 온도 조건 하에서 모든 반응을 진행시킬 수 있도록 일원화된 '등온 단일 반응 분자 진단법'을 개발하고자 하였다.

이때, 사용되는 구성 성분이 적을수록, 온도 및 완충액 조성 측면에서 최적화하기가 더 용이하다.

이에, 본 발명자들은 검출 플랫폼을 설계할 때, 의도적으로 구성 성분의 종류를 줄이는 시도를 하였다.

이때, 본 실시예 2에서는 상기 실시예 1에서 설계된 프로브 세트(타겟 RNA로 MRSA의 타겟 유전자인 mecA에 혼성화되는 서열; 프로모터 서열로 T7 프로모터 서열; 및 말라카이트 그린 RNA 압타머 서열 부위를 포함하는 구성의 프로브 세트)와 SplintR 리가아제, T7 RNA 중합효소 및 말라카이트 그린을 이용하였다.

2-1. 반응용액의 일원화

라이게이션 반응을 이용한 분자 진단 플랫폼을 구성하는 반응들은 각각 최적의 반응용액이 있다. 당업계에 공지된 각각의 반응용액의 구성 성분 및 반응에 필요한 구성 요소들을 농도와 함께 하기 표 2에 나타내었다.

구성성분	SplintR 리가아제 반응용액	T7 RNA 중합효소 반응용액	말라카이트 그린 반응용액
Tris-HCl (mM)	50	40	50
MgCl₂(mM)	10	6	10
NTPs (mM)	0	1	0
ATP (mM)	1	0	1
DTT (mM)	10	1	0
NaCl (mM)	15	10	5
Spermidine (mM)	0	2	0

상술한 바와 같이, 반응용액의 일원화를 진행하기 위하여, SplintR 리가아제, T7 RNA 중합효소 각각의 반응 프로토콜에 나와있는 구성 성분 중 ATP, Spermidine 등을 제외한, Tris-HCl, MgCl₂, NTPs, NaCl, DTT를 기본 성분으로 하여 일원화된 반응용액의 후보군 20개를 제작하였다.

제작한 반응용액의 후보들은 하기 표 3에 나타내었다.

후보군	구성성분
1	50mM Tris-HCl, 10mM MgCl_2,1mM NTPs, 10.5mM NaCl
2	50mM Tris-HCl, 10mM MgCl_2,1mM NTPs, 13mM NaCl
3	50mM Tris-HCl, 10mM MgCl_2,1mM NTPs, 15.5mM NaCl
4	50mM Tris-HCl, 10mM MgCl_2,1mM NTPs, 18mM NaCl
5	50mM Tris-HCl, 10mM MgCl_2,1mM NTPs, 10.5mM NaCl, 1.25mM DTT
6	50mM Tris-HCl, 10mM MgCl_2,1mM NTPs, 13mM NaCl, 1.25mM DTT
7	50mM Tris-HCl, 10mM MgCl_2,1mM NTPs, 15.5mM NaCl, 1.25mM DTT
8	50mM Tris-HCl, 10mM MgCl_2,1mM NTPs, 18mM NaCl, 1.25mM DTT
9	50mM Tris-HCl, 10mM MgCl_2,1mM NTPs, 10.5mM NaCl, 2.5mM DTT
10	50mM Tris-HCl, 10mM MgCl_2,1mM NTPs, 13mM NaCl, 2.5mM DTT
11	50mM Tris-HCl, 10mM MgCl_2,1mM NTPs, 15.5mM NaCl, 2.5mM DTT
12	50mM Tris-HCl, 10mM MgCl_2,1mM NTPs, 18mM NaCl, 2.5mM DTT
13	50mM Tris-HCl, 10mM MgCl_2,1mM NTPs, 10.5mM NaCl, 6.25mM DTT
14	50mM Tris-HCl, 10mM MgCl_2,1mM NTPs, 13mM NaCl, 6.25mM DTT
15	50mM Tris-HCl, 10mM MgCl_2,1mM NTPs, 15.5mM NaCl, 6.25mM DTT
16	50mM Tris-HCl, 10mM MgCl_2,1mM NTPs, 18mM NaCl, 6.25mM DTT
17	50mM Tris-HCl, 10mM MgCl_2,1mM NTPs, 10.5mM NaCl, 12.5mM DTT
18	50mM Tris-HCl, 10mM MgCl_2,1mM NTPs, 13mM NaCl, 12.5mM DTT
19	50mM Tris-HCl, 10mM MgCl_2,1mM NTPs, 15.5mM NaCl, 12.5mM DTT
20	50mM Tris-HCl, 10mM MgCl_2,1mM NTPs, 18mM NaCl, 12.5mM DTT

상기한 20 종의 반응용액 후보를 이용해 라이게이션, 전사, 형광 반응을 순차적으로 진행한 뒤 형광의 세기를 측정하여, 각 반응용액이 3 단계의 반응에 모두 적합한지, 그리고 어떤 반응용액 후보에서 반응 효율이 가장 높은지 확인하였다.

그 결과, DTT가 제거된, 50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl_2,1 mM NTPs, 10.5 mM NaCl로 구성된 1번 후보를 이용해 반응시켰을 때 측정된 형광 세기가 가장 강했다(도 5b).

또한, 상술한 바와 같이 부목 RNA의 존재 여부에 의존해 PP와 RP의 라이게이션 반응이 일어나야 그 뒤의 과정들이 진행되므로, 라이게이션 반응은 진단 측면에서 정밀성과 정확성을 결정짓는 단계라고 할 수 있다. 또한 라이게이션 반응의 효율이 진단의 효율 및 민감도를 결정한다.

이에, 본 발명자들은 라이게이션 반응의 효율을 높이기 위해, 추가적으로 상기 1번 반응 용액에, ET-SSB(Extreme Thermostable Single-stranded DNA Binding Protein, New England Biolabs)을 첨가하였다. ET-SSB는 단일 가닥 DNA을 안정화시켜주며, 라이게이션 반응 시에 off-target 효과를 줄임으로써 라이게이션 효율을 높여주는 단백질로 알려져 있다. 이 단백질은 중합효소가 작용하는 반응용액 안에서는 모두 활성을 띈다. 이 점에 착안해 본 발명자는 ET-SSB를 100 μL 의 반응용량 기준으로 0.8 μL (50 μL 반응 용량에 400 ng의 ET-SSB) 첨가하여 형광을 측정하였다.

그 결과, 도 5c에 나타낸 바와 같이, ET-SSB가 첨가되지 않은 시료보다 첨가된 시료의 형광이 더 높게 나왔음을 확인할 수 있었다.

이처럼, 라이게이션 반응에 필요한 효소, 화학 물질, 단백질 등의 첨가량을 최적화함으로써 앞서 제작한 표 3의 '1번 반응용액 '상에서 타겟 RNA가 존재할 때 하류의 압타머서열과 말라카이트 그린이 특이적으로 결합하여 형광을 내는 반응의 효율을 극대화하였다.

또한, ET-SSB가 첨가된 1번 후보 반응용액으로 라이게이션, 전사, 형광 반응을 하나의 튜브에서 동시에 진행시켰을 때도 형광이 검출되는 것을 확인하였다(도 5d).

결과적으로, 단계별로 진행해오던 라이게이션, 전사, 형광반응까지 3 단계의 반응을, 본 발명의 ET-SSB가 첨가된 1번 반응 용액을 포함하는 하나의 튜브에서 동시에 진행해도 일련의 반응들이 문제없이 일어난다는 것을 확인하였다.

이하, 하기 실시예에서는 1번 반응용액(50mM Tris-HCl, 10mM MgCl_2,1mM NTPs, 10.5mM NaCl)에 ET-SSB를 첨가하여 제작한, 본 발명의 일련의 반응을 최적으로 달성할 수 있는 용액을 '단일 반응 용액'으로 명명하고 이용하였다.

2-2. 반응에 필요한 분자들의 양 최적화

라이게이션 반응을 이용한 분자 진단 플랫폼에 핵심적인 역할을 하는 단백질에는 리가아제, RNA 중합효소 등의 효소도 존재하고, 말라카이트 그린과 같은 화학물질도 있다. 이에, 본 발명자들은 단일 반응 용액상에서 형광의 세기를 극대화하기 위해서 상기한 분자들의 첨가량을 최적화하였다.

이때, 리가아제는 SplintR 리가아제를 이용하였고, RNA 중합효소는 T7 RNA 중합효소를 이용하였다.

먼저, 본 발명자들은 SplintR 리가아제와 T7 RNA 중합효소의 첨가량을 최적화하기 위하여,다양한 조합으로 실험하였다.

그 결과, 여러 번의 최적화 실험을 통해 100 μL 의 용량을 기준으로 Splint R 리가아제는 250 unit, T7 RNA 중합효소는 250 unit 일 때 형광 값이 가장 크게 측정되었다(도 6a).

또한, 본 발명자들은 형광 신호와 직접적인 관련이 있는 하류 압타머서열과 특이적으로 결합하는 화학분자인 말라카이트 그린의 농도를 최적화하였다.

말라카이트 그린 첨가량을 다양하게 조절해 본 결과, 16 μM을 첨가했을 때 가장 큰 형광 값을 나타냈다(도 6b).

2-3. 반응온도의 단일화 (등온반응화)

본 발명은 단일 반응 용액을 이용한 단일 단계 반응이므로 모든 반응이 한곳에서 일어나야만 한다. 단일 단계 반응이 성립하려면 반응 온도도 단일화되어야 한다. 실시예 1에서의 각 반응들이 이루어지는 온도가 서로 모두 다르다. 어닐링 과정과 라이게이션 과정과 말라카이트 그린 반응에서 각각 95℃라는 고온이 필요하다. 그러나, 이 온도에서 SplintR 리가아제와 T7 RNA 중합효소는 변성된다. 또한, 분자 진단을 구성하는 대부분의 반응들은 모두 37℃에서 진행된다.

이에, 본 발명자들은 반응 온도 역시 일원화하기 위하여, 앞서 확인된 단일 반응 용액을 이용하여 분자 진단을 구성하는 모든 반응들(라이게이션, 전사 및 형광반응)을 하나의 튜브에서 37℃ 조건으로 진행하였다.

그 결과, 타겟 RNA의 존재 여부에 따라 구별 가능한 수준의 형광이 발현됨을 확인할 수 있었다(도 6c).

상기 결과들을 통해 37℃의 등온 조건에서 단일 반응 용액을 이용하여 단일단계반응을 실시할 수 있음을 입증하였다.

이하, 본 발명에서 상기 반응을 '등온 단일 반응(isothermal one-pot reaction)'으로 명명하였고, 본 실시예상에서 이용된 상기 등온 단일 반응 용액의 조성 및 농도를 하기 표 4에 정리하였다.

구성성분	농도
PP	20　nM
RP	22　nM
타겟　RNA	Variable
단일 반응 용액	50mM Tris-HCl, 10mM MgCl_2, 1mM NTPs, 10.5mM NaCl,
말라카이트 그린	16 μM
ET-SSB	400 ng
RNase　Inhibitor	20 unit
Splint　R　리가아제	250 unit
T7　RNA　중합효소	250 unit

실시예 3. 부목(Splint)으로 DNA를 이용하는 경우의 본 발명의 프로브 세트에 의한 검출

상기 실시예 1-1 내지 1-3에서는 부목(Splint), 즉, 타겟 서열로서 RNA를 이용하였으나, 본 발명자들은 추가적으로 타겟 서열로 DNA를 이용하여, 상기 실시예 1-1 및 1-2에 개시된 것과 동일한 조건 및 방법으로 Splint R 리가아제를 이용한 프로브들끼리의 라이게이션 반응, T7 중합효소를 이용한 전사반응을 실시한 후 바이오아날라이저를 통하여 확인하였다.

바이오아날라이저는 Agilent 2100을 사용하였고, 이 때 사용한 kit는 Agilent RNA 6000 nano kit 이다. 이는 전기영동 분리와 미체유체 기술의 특성을 가진 RNA의 단편과 크기 분석을 민감하게 해낼 수 있다.

그 결과, 도 7a(젤 이미지) 및 7b(Electropherogram)에 나타낸 바와 같이, 부목으로 DNA를 이용했을 경우에도, 타겟 DNA가 검출되는 것을 확인하였다.

즉, 상기 결과를 통해 프로모터 프로브 (PP), 리포터 프로브 (RP), 타겟 DNA, SplintR 리가아제가 모두 존재하여야 라이게이션 반응이 일어나서, 프로브 어셈블리가 되고 그 프로브 어셈블리가 올바르게 전사되는 것을 합성한 프로브 어셈블리를 양성 대조군으로 사용함으로써 확인하였다.

또한, 도 7c에 나타낸 바와 같이, 전사산물이 말라카이트 그린과 결합하여 형광을 내는지를 Hidex Sense Microplate Reader (Hidex., Lemminkδisenkatu, Finland)를 이용하여 확인하였다.

즉, 상기 결과를 통해 부목(splint)이 RNA가 아닌 DNA에서도 라이게이션 반응, In vitro 전사 반응, RNA 압타머를 이용한 형광 발현 반응 모두가 잘 일어남을 확인하였다.

또한, 추가적으로 상술한 세 가지 반응(라이게이션 반응, In vitro 전사 반응, RNA 압타머를 이용한 형광 발현 반응)들이, 상기 실시예 2에서 규명된 '등온 단일 반응'조건, 즉, 37℃ 등온 하에서, 50mM Tris-HCl, 10mM MgCl_2,1mM NTPs, 10.5mM NaCl 및 ET-SSB 400 ng를 포함하는 단일 반응 용액으로 하나의 용기에서 실시하는 경우에도 일어나는지 확인하였다.

부목 DNA로 SARS-CoV-2 (신종코로나바이러스)의 타겟 유전자인 RdRp(RNA dependent RNA polymerase)의 DNA를 이용하고, DFHBI-1T ((5Z)-5-[(3,5-Difluoro-4-hydroxyphenyl)methylene]-3,5-dihydro-2-methyl-3-(2,2,2-trifluoroethyl)-4H-imidazol-4-one)에 결합하는 브로콜리 압타머(DFHBI-1T/BRApt)를 이용하여 이들간의 형광반응으로 타겟 대상을 검출하고자 하였다.

그 결과, 도 7d에 나타낸 바와 같이, 타겟 DNA가 들어가지 않은 상태보다 타겟 DNA가 들어가 있는 샘플에서 형광의 세기가 더 높아짐을 확인할 수 있다.

따라서, 본 발명의 라이게이션 반응을 이용한 분자 진단 플랫폼은 부목으로서 DNA를 사용하여도 타겟 검출에 무리없이 적용할 수 있다는 것을 입증하였다.

실시예 4. 등온 단일 반응 플랫폼을 이용한 진단의 신속성, 민감성 및 특이성 확인

4-1. 등온 단일 반응 플랫폼을 이용한 신속성 확인

본 발명자들은, 상기 실시예 2의 표 4에서 확인한 본 발명의 최적 등온 단일 반응 조건인 37℃ 등온 및 단일 반응 용액 조건 하에서, 본 발명의 프로브 세트, 타겟 RNA(부목 RNA로 MRSA의 타겟 유전자인 mecA), 말라카이트 그린, 리가아제 및 중합효소가 포함된 하나의 용기에서 등온 단일 반응을 실시했을 때 소요되는 시간을 측정하였다.

이때, 96-well black polystyrene microplate clear flat bottom (Corning Inc)을 사용하였고, 반응 용량은 100 μL였다.

타겟 RNA의 분자수를 달리하여 첨가하고 0분, 30분, 60분, 90분, 120분 경과 후 Hidex Sense Microplate Reader를 이용해 형광을 측정하였다.

그 결과, 도 8a에 나타낸 바와 같이, 최종 결과를 단지 2 시간만에 신속하게 확보할 수 있었으며, 이는 종래 증폭 반응을 이용하는 PCR 방법보다 검출 시간을 현저하게 단축시켰다는 것을 나타낸다.

특히, 30분 이후부터 형광값의 차이를 보이기 시작하며, 60분의 반응시간이 지나면 타겟 RNA의 존재 유무에 따라 형광값의 차이를 명확하게 구분할 수 있는 것으로 나타났다.

4-2. 등온 단일 반응 플랫폼을 이용한 진단 민감성 (sensitivity) 확인

등온 단일 반응이 가능함을 밝힌 뒤, 이 반응을 통한 검출한계 (Limit of detection)를 측정하였다. 먼저, 타겟 RNA의 단계별 희석을 통해 220 nM - 0.1 aM 농도 범위의 시료를 제작하였다. 검출하고자 하는 타겟 RNA의 분자수로 나타내면 220 nM의 mecA RNA는 253 nt의 길이이고, 100 μL 반응에 포함된 RNA는 2.2 pmoles이므로 이는 1.32 x 10¹²개 RNA 분자에 해당한다.

본 실시예에서는 1.32 x 10¹²개 RNA (220 nM)부터 6 개 RNA (0.1 aM)까지 범위의 타겟 RNA를 첨가하고 등온 단일 반응을 진행한 뒤에 형광을 측정하여, 타겟 RNA가 존재하지 않는 음성대조군과의 형광 차이를 통해 타겟 RNA의 존재 여부를 판단하였다. 본 발명자들은 본 발명에서 개발한 등온 단일 반응으로 6 개 RNA 까지 검출할 수 있음을 확인하였다(도 8b).

실시예 5. 등온 단일 반응 플랫폼을 통한 다양한 병원균 RNA 검출 확인

다음으로 본 발명자들은 다양한 병원체로부터 RNA 마커의 검출을 위해 등온 단일 반응 플랫폼을 재구성하여 본 발명의 등온 단일 반응용 프로브를 이용하는 경우, 실제 목적하는 타겟을 신속 정확하고 용이하며 효과적으로 검출할 수 있을 뿐만 아니라, 높은 민감도로 검출할 수 있음을 규명하였다.

타겟 유전자에 따라 타겟 유전자와 혼성화 (hybridization)하는 프로브의 두 영역 (UHS 및 DHS)만 바꾸면 되므로, 많은 계산 단계없이 프로브 설계 프로세스를 빠르고 간단하게 수행할 수 있다. 이 등온 단일 반응은 뉴클레오타이드 서열만을 필요로 하므로 다양한 감염성 질환들에 대해 손쉽게 프로브를 디자인하고 구성할 수 있게 한다(도 9a). 타겟 유전자의 서열만 확보된다면, 본 발명자들이 원하는 서열을 상류, 하류에 추가함으로써 쉽게 프로브 세트를 제작할 수 있다.그렇게 제작된 프로브 서열들은 표 5에 나열하였다.

병원균(Pathogen)	유형	서열 (5'-3')	비고
Vibrio vulnificus	MG-PP	TTCTTGTGCGCCAACCTGTAccctatagtgagtcgtattaatttcgcgacaacacgcgaaattaatacgactcactataggg(서열번호 3)	5'-Ph
Vibrio vulnificus	MG-RP	ggatccattcgttacctggctctcgccagtcgggatccCTTCTCAACAATCGGCACATA(서열번호 4)
E. coli O157:H1	MG-PP	TCAACTCCCCAACGCCTTTTccctatagtgagtcgtattaatttcgcgacaacacgcgaaattaatacgactcactataggg(서열번호 5)	5'-Ph
E. coli O157:H1	MG-RP	ggatccattcgttacctggctctcgccagtcgggatccCGCACCGCTATTTGACTCCC(서열번호 6)
MERS-CoV	MG-PP	AAGAGGAACTGAATCGCGCGccctatagtgagtcgtattaatttcgcgacaacacgcgaaattaatacgactcactataggg(서열번호 7)	5'-Ph
MERS-CoV	MG-RP	ggatccattcgttacctggctctcgccagtcgggatccGAGCTCGGGGCGATTATGTG(서열번호 8)
Influenza A	MG-PP	TCCCCTGCTCATTGCTATGGccctatagtgagtcgtattaatttcgcgacaacacgcgaaattaatacgactcactataggg(서열번호 9)	5'-Ph
Influenza A	MG-RP	ggatccattcgttacctggctctcgccagtcgggatccTTTGTCTGCAGCGTATCCAC(서열번호 10)
Influenza A	BR-PP	TTCCACAACATACACCCCCTCccctatagtgagtcgtattaatttcgcgacaacacgcgaaattaatacgactcactataggg(서열번호 11)	5'-Ph
Influenza A	BR-RP	gtatgtgggagacggtcgggtccagatattcgtatctgtcgagtagagtgtgggctcccacatacGGGCGATAAACTCTAGTATGCCA(서열번호 12)
SARS- CoV-2 (SARS-CoV-MG1)	MG-PP1	GTTCCACCTGGTTTAACATATAGTccctatagtgagtcgtattaatttcgcgacaacacgcgaaattaatacgactcactataggg(서열번호 13)	5'-Ph
SARS- CoV-2 (SARS-CoV-MG1)	MG-RP1	ggatccattcgttacctggctctcgccagtcgggatccGTGGCATCTCCTGATGAG(서열번호 14)
SARS- CoV-2 (SARS-CoV-MG2)	MG-PP2	ACACTATTAGCATAAGCAGTTGTGGccctatagtgagtcgtattaatttcgcgacaacacgcgaaattaatacgactcactataggg(서열번호 15)	5'-Ph
SARS- CoV-2 (SARS-CoV-MG2)	MG-RP2	ggatccattcgttacctggctctcgccagtcgggatccTGACAGCTTGACAAATGTTAAAA(서열번호 16)
SARS- CoV-2 (SARS-CoV- BR1)	BR-PP1	AACACTATTAGCATAAGCAGTTGTGGccctatagtgagtcgtattaatttcgcgacaacacgcgaaattaatacgactcactataggg(서열번호 17)	5'-Ph
SARS- CoV-2 (SARS-CoV- BR1)	BR-RP1	gtatgtgggagacggtcgggtccagatattcgtatctgtcgagtagagtgtgggctcccacatacGTGACAGCTTGACAAATGTTAAA(서열번호 18)
SARS- CoV-2 (SARS-CoV- BR2)	BR-PP2	TTTCACTCAATACTTGAGCACACTCATTccctatagtgagtcgtattaatttcgcgacaacacgcgaaattaatacgactcactataggg(서열번호 19)	5'-Ph
SARS- CoV-2 (SARS-CoV- BR2)	BR-RP2	gtatgtgggagacggtcgggtccagatattcgtatctgtcgagtagagtgtgggctcccacatacTAACCGCCACACATGACCA(서열번호 20)

(MG-RP는 말라카이트 그린 압타머 서열을 포함하는 리포터 프로브 서열을 가르킨다.BR-RP는 브로콜리 압타머 서열을 포함하는 리포터 프로브 서열을 가르킨다.대문자로 표시한 뉴클레오티드들은 타겟 핵산서열과 상보적인 혼성화 서열을 가르킨다.

소문자로 표시한 뉴클레오티드들은 스템-루프 구조(Stem-loop structure)를 이루는 T7 프로모터 complementary 서열 + 루프 서열 + T7 프로모터 서열을 가르키며, 밑줄친 뉴클레오티드들은 스템-루프 구조(Stem-loop structure) 중 스템을 이루는 뉴클레오티드들을 가리킨다.

소문자 이탤릭체로 표시한 뉴클레오티드들은 압타머 서열을 가르킨다(말라카이트 그린 압타머;MG, 브로콜리 압타머 서열;BR).

5'-Ph는 5'-말단에 인산화시킨 것을 가르킨다.)

이에, 등온 단일 반응에 대한 다양한 병원체 검출을 입증하기 위해 먼저 V. vulnificus (Vibrio vulnificus)와 E. coli O157:H7 (Escherichia coli O157 : H7)의 두 병원성 미생물을 표적으로 삼았다 V. vulnificus는 인간의 위장염, 상처 감염 및 패혈증을 유발하는 것으로 알려져 있다. 이를 검출해내기 위해 본 발명자는 vvhA 유전자를 타겟으로 삼았다. vvhA는 세포 외에서 세포 독성 효과, 용혈 활성을 가지는 유전자이다.

그 결과, 본 발명의 등온 단일 반응을 통해 V. vulnificus가 효과적으로 검출되었다. 또한, In vitro 전사 반응을 통해 만들어진 vvhA을 검출해내기 위한 프로브 쌍을 이용한 등온 단일 반응의 민감도는 0.1 aM (10-18 mol/L)이며, 타겟 유전자 농도와 형광 세기 사이의 선형 상관 관계 R2 = 0.9566 로 관찰되었다(도 9b).

또한, 식중독을 일으키는 E. coli O157:H7을 검출해내는 프로브 쌍을 디자인하였고, 그 프로브 쌍으로 tir 유전자를 타겟 유전자로 이용하여 검출해냈다.

그 결과, 본 발명의 등온 단일 반응을 통해 E. coli O157:H7이 효과적으로 검출되었다. 또한, 유사하게, 0.1 aM의 낮은 RNA 농도가 등온 단일 반응에 의해 검출되었고, RNA의 농도와 형광 강도 사이의 높은 선형 상관관계 R2 = 0.9684 가 관찰되었다(도 9c).

또한, 타겟을 치명적인 질병을 일으키는 인간 감염성 RNA 바이러스로 확장하였다.

먼저, 중동 호흡기 증후군 관련 코로나 바이러스 (Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus, MERS-CoV)를 목표로 하였다. MERS-CoV의 사망률은 35 %로 보고되었으며 사람에서 사람으로 전염될 수 있어 빠르고 민감한 현장 진단 테스트의 필요성이 높다.

그 결과, 본 발명의 등온 단일 반응을 통해 MERS-CoV가 효과적으로 검출되었다. 또한, MERS-CoV 타겟 유전자 upE에 대한 프로브 쌍은 박테리아 사례와 유사한 민감도 및 선형성을 나타냈다(도 9d).

또한, 본 발명자들은 인플루엔자 A 바이러스 타겟유전자, HA (혈구 응집소) 유전자에 대한 프로브 쌍을 설계하였다.

그 결과, 본 발명의 등온 단일 반응을 통해 인플루엔자 A 바이러스가 효과적으로 검출되었다. 또한, 마찬가지로 높은 민감도와 높은 선형성을 나타냈다(도 9e).

또한, 최근에 출현한 바이러스인 SARS-CoV-2(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2) (신종 코로나바이러스)에 대한 프로브 쌍을 설계하였다. RNA-의존적 RNA 폴리머라제 (RdRp) 유전자를 타겟으로 SARS-CoV-2에 대한 표준 실시간 중합효소 연쇄반응 (Real time-PCR)에 기초하여 타겟 유전자 서열을 선택하였다.

그 결과, 본 발명의 등온 단일 반응을 통해 SARS-CoV-2가 효과적으로 검출되었다. 또한, 등온 단일 반응은 0.1 aM만큼 낮은 표적 RNA를 성공적으로 검출하였으며(도 9f), 이는 다양한 타겟 RNA 검출에 있어서 높은 범용성을 입증한다.

실시예 6. 등온 단일 반응 플랫폼을 통한 실제 병원균 검출 확인

다음으로, 본 발명자들은 병원체의 살아있는 세포로부터 타겟 RNA 검출을 위해 등온 단일 반응을 사용하였다. 이미 등온 단일 반응으로 검출된 바 있는 MRSA를 타겟 병원균으로 잡았다. 실험의 정확도를 높이기 위해 타겟 RNA를 가지고 있지 않은 MSSA (methicillin-sensitive Staphylococcus aureus)를 음성 대조군으로 사용하였다. MRSA와 MSSA 세포를 95℃로 가열하여 용해시킨 후 RNA를 방출시켰다. 이를 희석한 후 등온 단일 반응에 첨가하여 특이성 및 민감도를 조사 하였다.

그 결과, MRSA와 MSSA를 넣은 샘플의 형광 세기에 있어 유의미한 차이가 관찰되었다. 100 μL 반응 당 2 CFU(Cell forming unit) 부터 MRSA, MSSA를 넣은 샘플 간의 형광의 차이가 명확하게 나타나 살아있는 병원체 샘플을 이용한 등온 단일 반응에서도 높은 민감도와 특이성을 나타냄을 보여주었다(도 10a 및 10b).

마지막으로, 사람 혈청에 희석한 MRSA, MSSA 병원균 샘플을 주입하여 임상 샘플과 유사한 상태에서의 타겟 RNA 검출에 대한 등온 단일 반응의 성능을 추가로 검증하였다(도 10c).

그 결과, 도 10d에 나타낸 바와 같이, 2 CFU/μL부터 검출가능함을 확인하였다.

이를 통해, 본 발명의 등온 단일 반응이 실제 응용 분야 (유사 임상 샘플)에서도 높은 민감도 및 특이도로 적용 가능함을 확인하였다.

실시예 7. 등온 단일 반응의 직교성(orthogonal) 2개의 프로브 쌍을 이용한 이중 타겟 탐지

7-1. 등온 단일 반응을 이용한 서로 다른 종류의 병원체 동시 탐지

본 발명자들은 간단한 프로브 디자인을 활용하여 등온단일 반응으로 두 개의 타겟 RNA를 동시에 검출할 수 있도록 그 기능을 확장하였다.

위양성 및 위음성 결과를 줄임으로써 좀 더 정확한 타겟 검출 여부에 대한 판단을 내리려면 여러 바이오마커들을 탐지하는 것이 중요하다. 등온 단일 반응 프로브의 높은 특이성과 독특한 스펙트럼 특성을 가진 RNA 압타머의 가용성에 기초하여, 본 발명자들은 각각의 표적 RNA를 검출하기 위해 단일 반응에서 직교성을 가진 두 세트의 등온 단일 반응 프로브를 설계하였다. 먼저 인플루엔자A 바이러스에 대한 직교 리포터 프로브를 개발하였다. MRSA 감염은 독감과 유사한 증상을 유발하므로 일반적인 인플루엔자 A 바이러스와 이 병원체를 구별해야 할 필요성이 있다. 또한, 인플루엔자A 감염 환자는 MRSA 감염에 더 취약하다. 종합적으로, 두 병원체의 동시 탐지 및 식별은 진단과 후속 조치에 도움이 될 수 있다. 인플루엔자A 바이러스에 대한 직교 리포터 프로브는 그의 압타머 서열을 DFHBI-1T ((5Z)-5-[(3,5-Difluoro-4-hydroxyphenyl)methylene]-3,5-dihydro-2-methyl-3-(2,2,2-trifluoroethyl)-4H-imidazol-4-one)에 결합하는 브로콜리 압타머 서열로 대체하여 디자인하였다. 브로콜리 압타머는 말라카이트 그린 압타머와는 전혀 다른 스펙트럼 특성을 나타낸다. 말라카이트 그린의 스펙트럼 범위가 emission: 616 nm, excitation: 665 nm인 반면, 브로콜리 압타머는 스펙트럼의 범위가 emission: 460 nm, excitation: 520 nm이다. NUPACK을 사용하여 새로운 리포터 프로브 및 해당 full-length RNA 전사체의 2차 구조를 시뮬레이션하였으며, 이는 추가 최적화 없이도 본 발명자들의 프로브 설계 기준을 충족하였다. MRSA 및 인플루엔자A 바이러스의 이중 검출은 2 개의 프로브 쌍, 그들이 결합하는 형광 염료 및 다양한 농도의 타겟 RNA가 첨가된 상황에서 등온 단일 반응으로 진행되었다(도 11a). 프로브 쌍이 그들의 각각의 표적 RNA에 혼성화 (hybridization) 되고 성공적인 전사반응이 뒤따르게 되면, RNA 압타머는 그들이 결합하는 형광 염료에 결합하여 구별 가능한 형광을 방출한다. 각각의 타겟 RNA의 존재는 등온 단일 반응으로 부터의 형광 패턴에 의해 결정될 수 있다: MRSA에 대한 말라카이트 그린 압타머 형광 및 인플루엔자 A 바이러스에 대한 브로콜리 압타머 형광. 실제로, 타겟 RNA (1 nM)의 존재는 서로 다른 형광 패턴에 의해 쉽게 검출되었다(도 11b). 다양한 농도의 각 타겟 RNA에 걸쳐, 등온 단일 반응 프로브들은 각각의 표적에만 반응하는 형광이 특이적으로 생성됨을 확인하였고(도 11c), 본 발명자들은 등온 단일 반응을 이용한 2 개 병원체의 이중 탐지가 가능함을 검증하였다.

7-2. 등온 단일 반응을 이용한 특정 병원체의 다수 타겟 영역 동시 탐지

본 발명자들은 직교 이중 검출을 SARS-CoV-2에 적용하였다. 게놈을 따라 다수의 타겟 부위를 동시에 검출하면 이 병원체를 높은 서열 상동성을 가지는 많은 관련 바이러스들로부터 구별해 낼 수 있다. 이전에 입증된(도 9f 참조) 프로브 쌍 외에도 말라카이트 그린 압타머(MG) 또는 브로콜리 압타머(BR)를 사용하여 RdRp 유전자의 다른 영역에 대해 3 개의 추가 프로브 쌍을 디자인하였다. 각각의 프로브 쌍은 프로모터 프로브(PP, promoter probe)의 5'- 말단 또는 리포터 프로브(RP, reporter probe)의 3'- 말단에 mismatch된 염기를 포함하고 있으며, 이는 다른 유사한 바이러스에 비교하여 SARS-CoV-2에만 존재한다(도 12a). 프로브와 타겟이 아닌 RNA들 사이에서는 혼성화 (hybridization)가 되지 못하므로 그 이후의 과정인 라이게이션 및 전사반응, 형광반응을 포함한 반응들이 일어나지 않아 SARS-CoV-2의 특이적 검출을 가능하게 할 수 있다. 실제로, 이 4개의 프로브 쌍은 1 aM의 SARS-CoV-2 타겟 RNA를 검출해 낼 수 있으며, 관련 바이러스 RNA 서열에 비해 더 높은 형광 세기를 나타낸다(도 12b). 그런 다음 SARS-CoV-2-MG1 및 SARS-CoV-2-BR2 프로브 쌍을 사용하여 두 대상 영역의 직교 이중 탐지가 가능한 지를 실험하였다.

그 결과, 등온 단일 반응의 이중 탐지로 타겟 RNA의 다른 영역을 각각 효과적으로 검출해 냄을 확인하였다(도 12c).

따라서, 등온 단일 반응을 이용한 이중 탐지는 서로 보완할 수 있는 두 가지 검출 결과를 제공하여 더 정확한 진단을 위해 사용될 수 있다.

이상, 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다.

<110> POSTECH ACADEMY-INDUSTRY FOUNDATION <120> Novel Probe Set for Isothermal One-pot Reaction and Uses Thereof <130> POSTECH1-75P-1 <150> KR 10-2019-0046713 <151> 2019-04-22 <160> 20 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 87 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> promoter probe <400> 1 ttctccttgt ttcattttga gttctgcagc cctatagtga gtcgtattag gatccacaac 60 aggatcctaa tacgactcac tataggg 87 <210> 2 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reporter probe <400> 2 gggatccatt cgttacctgg ctctcgccag tcgggatcca ccacccaatt tgtctgccag 60 t 61 <210> 3 <211> 82 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> promoter probe <400> 3 ttcttgtgcg ccaacctgta ccctatagtg agtcgtatta atttcgcgac aacacgcgaa 60 attaatacga ctcactatag gg 82 <210> 4 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reporter probe <400> 4 ggatccattc gttacctggc tctcgccagt cgggatccct tctcaacaat cggcacata 59 <210> 5 <211> 82 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> promoter probe <400> 5 tcaactcccc aacgcctttt ccctatagtg agtcgtatta atttcgcgac aacacgcgaa 60 attaatacga ctcactatag gg 82 <210> 6 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reporter probe <400> 6 ggatccattc gttacctggc tctcgccagt cgggatcccg caccgctatt tgactccc 58 <210> 7 <211> 82 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> promoter probe <400> 7 aagaggaact gaatcgcgcg ccctatagtg agtcgtatta atttcgcgac aacacgcgaa 60 attaatacga ctcactatag gg 82 <210> 8 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reporter probe <400> 8 ggatccattc gttacctggc tctcgccagt cgggatccga gctcggggcg attatgtg 58 <210> 9 <211> 82 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> promoter probe <400> 9 tcccctgctc attgctatgg ccctatagtg agtcgtatta atttcgcgac aacacgcgaa 60 attaatacga ctcactatag gg 82 <210> 10 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reporter probe <400> 10 ggatccattc gttacctggc tctcgccagt cgggatcctt tgtctgcagc gtatccac 58 <210> 11 <211> 83 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> promoter probe <400> 11 ttccacaaca tacaccccct cccctatagt gagtcgtatt aatttcgcga caacacgcga 60 aattaatacg actcactata ggg 83 <210> 12 <211> 88 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reporter probe <400> 12 gtatgtggga gacggtcggg tccagatatt cgtatctgtc gagtagagtg tgggctccca 60 catacgggcg ataaactcta gtatgcca 88 <210> 13 <211> 86 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> promoter probe <400> 13 gttccacctg gtttaacata tagtccctat agtgagtcgt attaatttcg cgacaacacg 60 cgaaattaat acgactcact ataggg 86 <210> 14 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reporter probe <400> 14 ggatccattc gttacctggc tctcgccagt cgggatccgt ggcatctcct gatgag 56 <210> 15 <211> 87 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> promoter probe <400> 15 acactattag cataagcagt tgtggcccta tagtgagtcg tattaatttc gcgacaacac 60 gcgaaattaa tacgactcac tataggg 87 <210> 16 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reporter probe <400> 16 ggatccattc gttacctggc tctcgccagt cgggatcctg acagcttgac aaatgttaaa 60 a 61 <210> 17 <211> 88 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> promoter probe <400> 17 aacactatta gcataagcag ttgtggccct atagtgagtc gtattaattt cgcgacaaca 60 cgcgaaatta atacgactca ctataggg 88 <210> 18 <211> 88 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reporter probe <400> 18 gtatgtggga gacggtcggg tccagatatt cgtatctgtc gagtagagtg tgggctccca 60 catacgtgac agcttgacaa atgttaaa 88 <210> 19 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> promoter probe <400> 19 tttcactcaa tacttgagca cactcattcc ctatagtgag tcgtattaat ttcgcgacaa 60 cacgcgaaat taatacgact cactataggg 90 <210> 20 <211> 84 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reporter probe <400> 20 gtatgtggga gacggtcggg tccagatatt cgtatctgtc gagtagagtg tgggctccca 60 catactaacc gccacacatg acca 84

Claims

다음을 포함하며, 부목(splint) RNA 또는 DNA를 생성하는, SARS-CoV-2 (Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2) 검출용 등온 단일 반응(isothermal one-pot reaction) 프로브 세트:
(1) 제1 프로브로서, 상기 제1 프로브는, 하기 일반식 I의 구조를 갖는 프로모터 프로브(promoter probe, PP)이고;
3'-X- Y-5' (I)
상기 일반식(I)에서,
상기 X는 RNA 중합 효소가 인식할 수 있는 프로모터 서열을 포함하는 스템-루프 구조(Stem-loop structure) 부위이고; 상기 Y는 SARS-CoV-2 핵산서열과 상보적인 혼성화 서열을 갖는 UHS(Upstream Hybridization Sequence) 부위이며; 상기 SARS-CoV-2 핵산서열은 DNA 또는 RNA이고; 상기 X 및 Y는 디옥시리보뉴클레오타이드이며; 및
(2) 제2 프로브로서, 상기 제2 프로브는, 하기 일반식 II의 구조를 갖는 리포터 프로브(reporter probe, RP)이고;
3'-Y'-Z-5' (II)
상기 일반식(II)에서,
상기 Y'는 SARS-CoV-2 핵산서열과 상보적인 혼성화 서열을 갖는 DHS(Downstream Hybridization Sequence) 부위이고; 상기 Z는 검출가능한 시그널을 발생시키는 하나의 표지(label) 또는 다수의 표지를 포함하는 상호작용적 표지 시스템을 갖는 압타머 서열 부위이며; 상기 SARS-CoV-2 핵산서열은 DNA 또는 RNA이고; 상기 Y' 및 Z는 디옥시리보뉴클레오타이드이며;
상기 제1 프로브 및 제2 프로브는 SARS-CoV-2 핵산서열과 혼성화된 후 라이게이션(ligation)되고; 상기 라이게이션 산물은 RNA 중합효소에 의해 전사가 개시되어 시그널을 생성하고;
상기 라이게이션된 산물의 전사체는 부목 RNA 또는 DNA로 생성되어 SARS-CoV-2 핵산서열로 작용하고;
상기 등온 단일 반응은, 별도의 증폭 반응 없이, 15℃내지 50℃범위 온도 중 어느 하나의 지정된 온도로 일원화되어 동시 수행되는 것을 특징으로 하는,
SARS-CoV-2 검출용 등온 단일 반응 프로브 세트.
제1항에 있어서,
상기 라이게이션은 SplintR 리가아제, 박테리오파지 T4 리가아제, E.coli 리가아제, Afu 리가아제, Taq 리가아제, Tfl 리가아제, Mth 리가아제, Tth 리가아제, Tth HB8 리가아제, Thermus species AK16D 리가아제, Ape 리가아제, LigTk 리가아제, Aae 리가아제, Rm 리가아제, Pfu 리가아제, 리보자임(ribozyme) 및 이의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종의 라이게이션 작용제에 의해 실시되는 것을 특징으로 하는,
SARS-CoV-2 검출용 등온 단일 반응 프로브 세트.
제1항에 있어서,
상기 RNA 중합 효소는 박테리오파지 T7 RNA 중합 효소, 박테리오파지 T3 중합 효소, 박테리오파지 RNA 중합 효소, 박테리오파지 Φ중합 효소, 살모넬라 박테리오파지 sp6 중합 효소, 슈도모나스 박테리오파지 gh-1 중합 효소, 대장균(E. coli) RNA 중합효소 홀로효소(holoenzyme), 대장균(E. coli) RNA 중합효소 코어 효소, 인간 RNA 중합효소 I, 인간 RNA 중합효소 II, 인간 RNA 중합효소 III, 인간 미토콘드리아 RNA 중합효소 및 이의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는,
SARS-CoV-2 검출용 등온 단일 반응 프로브 세트.
제1항에 있어서,
상기 표지는 화학적 표지, 효소 표지, 방사능 표지, 형광 표지, 발광 표지, 화학발광 표지 및 금속 표지로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는,
SARS-CoV-2 검출용 등온 단일 반응 프로브 세트.
제1항에 있어서,
상기 SARS-CoV-2의 타겟 유전자는 RdRp(RNA dependent RNA polymerase)인 것을 특징으로 하는,
SARS-CoV-2 검출용 등온 단일 반응 프로브 세트.
제1항에 있어서,
상기 등온 단일 반응은 Tris-HCl, MgCl₂, NTPs, NaCl 및 ET-SSB(Extreme Thermostable Single-Stranded DNA Binding Protein)가 포함된 단일 반응 용액으로 일원화되어 동시 수행되는 것을 특징으로 하는,
SARS-CoV-2 검출용 등온 단일 반응 프로브 세트.
제1항의 부목(splint) RNA 또는 DNA를 생성하는, SARS-CoV-2 검출용 등온 단일 반응 프로브 세트; 라이게이션 작용제; 중합효소; 및 등온 단일 반응 용액을 포함하는, SARS-CoV-2 검출용 조성물로서,
상기 등온 단일 반응은, 별도의 증폭 반응 없이, 15℃내지 50℃범위 온도 중 어느 하나의 지정된 온도로 일원화되어 동시 수행되는 것을 특징으로 하는, SARS-CoV-2 검출용 조성물.
제7항에 있어서,
상기 조성물은 추가적으로 2 종 이상의 SARS-CoV-2 검출용 등온 단일 반응 프로브 세트를 포함할 수 있는 것을 특징으로 하는,
SARS-CoV-2 검출용 조성물.
제8항에 있어서,
상기 2 종 이상의 SARS-CoV-2 검출용 등온 단일 반응 프로브 세트는 각각 서로 상이한 상호작용적 표지 시스템을 포함하고; 상기 2 종 이상의 프로브 세트 각각은 각각 서로 상이한 SARS-CoV-2 핵산서열 영역에 결합하여; 이로 인해 서로 상이한 SARS-CoV-2 핵산서열의 다중 탐지가 정확도를 높이는 것을 특징으로 하는,
SARS-CoV-2 검출용 조성물.
제7항에 있어서,
상기 SARS-CoV-2의 타겟 유전자는 RdRp(RNA dependent RNA polymerase)인 것을 특징으로 하는,
SARS-CoV-2 검출용 조성물.
제7항에 있어서,
상기 등온 단일 반응 용액은 Tris-HCl, MgCl₂, NTPs, NaCl 및 ET-SSB(Extreme Thermostable Single-Stranded DNA Binding Protein)가 포함된 것이고, 상기 등온 단일 반응은 상기 단일 반응 용액으로 일원화되어 동시 수행되는 것을 특징으로 하는,
SARS-CoV-2 검출용 조성물.
제8항 내지 제11항 중 어느 한 항의 부목(splint) RNA 또는 DNA를 생성하는, SARS-CoV-2 검출용 조성물을 포함하는, SARS-CoV-2 검출용 키트.
다음 단계를 포함하는, 별도의 증폭반응 없이, 등온 단일 반응 조건하에서 SARS-CoV-2를 검출하는 방법:
(a) 샘플에, 제1항의 부목(splint) RNA 또는 DNA를 생성하는 SARS-CoV-2 검출용 등온 단일 반응(isothermal one-pot reaction) 프로브 세트를 처리하여 SARS-CoV-2 핵산서열과 혼성화시키는 단계;
(b) 상기 (a) 단계의 혼성화 산물에 라이게이션 작용제를 처리하여 상기 프로브 세트의 제1 프로브 및 제2 프로브를 라이게이션시키고 상기 라이게이션 산물에 중합효소를 처리하여 전사를 개시시키는 단계로서,
상기 라이게이션된 산물의 전사체는 부목 RNA 또는 DNA로 생성되어 SARS-CoV-2 핵산서열로 작용하고; 및
(c) 상기 (b) 단계의 전사 산물에 압타머-반응 물질을 처리하여 전사 산물 내 압타머의 시그널 생성을 검출하는 단계로서, 상기 시그널 생성은 샘플 중 SARS-CoV-2의 존재를 나타내고;
상기 등온 단일 반응은, 15℃내지 50℃범위 온도 중 어느 하나의 지정된 온도로 일원화되어 동시 수행되는 것을 특징으로 하는,
별도의 증폭반응 없이, 등온 단일 반응 조건하에서 SARS-CoV-2를 검출하는 방법.
제13항에 있어서,
상기 SARS-CoV-2의 타겟 유전자는 RdRp(RNA dependent RNA polymerase)인 것을 특징으로 하는,
별도의 증폭 반응 없이, 등온 단일 반응 조건하에서 SARS-CoV-2를 검출하는 방법.
제13항에 있어서,
상기 등온 단일 반응은 Tris-HCl, MgCl₂, NTPs, NaCl 및 ET-SSB(Extreme Thermostable Single-Stranded DNA Binding Protein)가 포함된 단일 반응 용액으로 일원화되어 동시 수행되는 것을 특징으로 하는,
별도의 증폭 반응 없이, 등온 단일 반응 조건하에서 SARS-CoV-2를 검출하는 방법.
다음 단계를 포함하는, 별도의 증폭 반응 없이, 등온 단일 반응 조건하에서의 현장용 SARS-CoV-2 분자 진단 방법:
(a) 샘플에, 부목(splint) RNA 또는 DNA를 생성하는 SARS-CoV-2 검출용 등온 단일 반응(isothermal one-pot reaction) 프로브 세트를 처리하여 SARS-CoV-2 핵산서열과 혼성화시키는 단계;
(b) 상기 (a) 단계의 혼성화 산물에 라이게이션 작용제를 처리하여 상기 프로브 세트의 제1 프로브 및 제2 프로브를 라이게이션시키고 상기 라이게이션 산물에 중합효소를 처리하여 전사를 개시시키는 단계로서,
상기 라이게이션된 산물의 전사체는 부목 RNA 또는 DNA로 생성되어 SARS-CoV-2 핵산서열로 작용하고; 및
(c) 상기 (b) 단계의 전사 산물에 압타머-반응 물질을 처리하여 전사 산물 내 압타머의 시그널 생성을 검출하는 단계로서, 상기 시그널 생성은 샘플 중 SARS-CoV-2의 존재를 나타내고;
상기 등온 단일 반응은, 15℃내지 50℃범위 온도 중 어느 하나의 지정된 온도로 일원화되어 동시 수행되는 것을 특징으로 하는,
별도의 증폭 반응 없이, 등온 단일 반응 조건하에서의 현장용 SARS-CoV-2 분자 진단 방법.
제16항에 있어서,
상기 SARS-CoV-2의 타겟 유전자는 RdRp(RNA dependent RNA polymerase)인 것을 특징으로 하는,
별도의 증폭 반응 없이, 등온 단일 반응 조건하에서의 현장용 SARS-CoV-2 분자 진단 방법.
제16항에 있어서,
상기 등온 단일 반응은 Tris-HCl, MgCl₂, NTPs, NaCl 및 ET-SSB(Extreme Thermostable Single-Stranded DNA Binding Protein)가 포함된 단일 반응 용액으로 일원화되어 동시 수행되는 것을 특징으로 하는,
별도의 증폭 반응 없이, 등온 단일 반응 조건하에서의 현장용 SARS-CoV-2 분자 진단 방법.
제1항에 있어서,
상기 제1 프로브는 서열번호 13, 서열번호 15, 서열번호 17 및 서열번호 19로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상인 것을 특징으로 하는,
SARS-CoV-2 검출용 등온 단일 반응 프로브 세트.
제1항에 있어서,
상기 제2 프로브는 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 18 및 서열번호 20으로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상인 것을 특징으로 하는,
SARS-CoV-2 검출용 등온 단일 반응 프로브 세트.