KR20210050493A - 척수 손상의 치료 방법 - Google Patents

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KR20210050493A
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쯔강 허
보 첸
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더 칠드런스 메디칼 센터 코포레이션
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Abstract

척수 손상을 치료하기 위한 방법 및 조성물이 본원에 기재된다. 본 발명의 측면은 대상체에게 KCC2를 상향조절하는 작용제를 투여하는 것에 관한 것이다. 본 발명의 또 다른 측면은 대상체에게 억제성 인터뉴런의 흥분성을 감소시키는 작용제를 투여하는 것에 관한 것이다. 이들 작용제를 포함하는 조성물이 본원에 추가로 기재된다.

Description

척수 손상의 치료 방법
관련 출원의 상호 참고
본 출원은 35 U.S.C. § 119(e)하에 2018년 5월 25일에 출원된 미국 가출원 번호 62/676,464를 우선권으로 주장하는 국제 출원이며, 그의 내용은 전문이 본원에 참고로 포함된다.
기술분야
본 발명의 기술분야는 척수 손상의 치료에 관한 것이다.
여러 인간 척수 손상은 해부학적으로는 불완전하지만, 완전한 마비를 나타낸다. 이러한 경우에 남아 있는 축삭이 기능 회복을 매개하는데 실패하는 이유는 알려져 있지 않다. 이러한 손상에 대한 현재의 치료법은 제한적이며, 종종 척수 손상의 기능 회복을 재생하지 못한다. 따라서, 효과적인 치료를 개발하기 위해서는 축삭 재생에 대한 더 나은 이해가 필요하다.
본원에 기재된 발명은 부분적으로 뉴런-특이적인 K+-Cl- 공동-수송체 (KCC2) 활성 및/또는 수준을 상향조절하는 작용제, 예를 들어 CLP290이 엇갈린 양측 반절단을 가진 마우스, 예를 들어 중증 척수 손상 모델에서 보행(stepping) 기능을 복구할 수 있었다는 발견에 관한 것이다. 추가로, KCC2의 과발현은 이러한 보행 복구를 재현하였다. Na+/2Cl-/K+ 공동-수송체 (NKCC)의 억제가 보행 능력을 추가로 복구한다는 것이 본원에서 추가로 확인된다.
추가로, 본원에 기재된 연구는, 클로자핀 N-옥시드와 조합하여 인터뉴런에서 흥분성을 감소시키는 작용제가 이전에 엇갈린 양측 반절단 이후 보행 능력을 상실한 적이 있는 마우스에서 이 능력을 추가로 복구시킨다는 것을 보여준다. 이러한 작용제에는 억제성 인터뉴런에서의 발현을 위해 최적화된 Gi-DREADD, 및 Kir2.1을 상향조절하는 작용제가 포함된다.
추가로, 예를 들어 척수 손상의 치료에서 사용되는 KCC2, NKCC, Gi-DREADD, 및 Kir2.1을 조절하기 위한 작용제를 포함하는 조성물이 본원에 기재된다.
따라서, 본원에 기재된 발명의 한 측면은 척수 손상을 가진 대상체에게 KCC2를 상향조절하는 작용제의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 척수 손상을 치료하는 방법을 제공한다.
임의의 측면의 한 실시양태에서, KCC2를 상향조절하는 작용제는 소분자, 펩티드, 유전자 편집 시스템, 및 KCC2를 코딩하는 발현 벡터로 이루어진 군으로부터 선택된다.
임의의 측면의 한 실시양태에서, 소분자는 CLP290이다.
임의의 측면의 한 실시양태에서, 벡터는 비-통합적 또는 통합적이다. 임의의 측면의 또 다른 실시양태에서, 벡터는 바이러스 벡터 또는 비-바이러스 벡터이다.
예시적인 비-통합적 벡터에는 에피솜 벡터, EBNA1 벡터, 미니서클 벡터, 비-통합적 아데노바이러스, 비-통합적 RNA, 및 센다이 바이러스가 포함되나 이로 제한되지 않는다.
예시적인 바이러스 벡터에는 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 헤르페스바이러스, 수두 바이러스, 알파 바이러스, 우두 바이러스, 및 아데노-연관된 바이러스가 포함되나 이로 제한되지 않는다.
예시적인 비-바이러스 벡터에는 나노입자, 양이온성 지질, 양이온성 중합체, 금속성 나노입자, 나노막대, 리포솜, 미세기포, 세포 침투 펩티드 및 지방구가 포함되나 이로 제한되지 않는다.
임의의 측면의 한 실시양태에서, 벡터는 혈액 뇌 장벽을 가로지른다.
임의의 측면의 한 실시양태에서, KCC2는 적절한 대조군과 비교하여 적어도 2배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배만큼 상향조절된다.
임의의 측면의 한 실시양태에서, 척수 손상은 중증 척수 손상이다.
임의의 측면의 한 실시양태에서, 대상체는 인간이다. 임의의 측면의 한 실시양태에서, 대상체는 척수 손상을 가진 것으로 진단된 적이 있다. 임의의 측면의 한 실시양태에서, 대상체는 이전에 척수 손상을 가진 것으로 진단된 적이 있다. 임의의 측면의 한 실시양태에서, 대상체는 이전에 척수 손상에 대해 치료받은 적이 있다.
임의의 측면의 한 실시양태에서, 투여하기 전에, 대상체는 척수 손상을 가진 것으로 진단된다.
임의의 측면의 한 실시양태에서, 대상체는 적어도 제2 척수 손상 치료를 추가로 투여받는다. 임의의 측면의 한 실시양태에서, 대상체는 적어도 제2 치료 화합물을 추가로 투여받는다. 예시적인 제2 치료 화합물에는 오스테오폰틴, 성장 인자, 또는 4-아미노퓨리딘이 포함되나 이로 제한되지 않는다.
본원에 기재된 발명의 또 다른 측면은 척수 손상을 가진 대상체에게 Na+/2Cl-/K+ 공동-수송체 (NKCC)를 억제하는 작용제의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 척수 손상을 치료하는 방법을 제공한다.
임의의 측면의 한 실시양태에서, Na+/2Cl-/K+ 공동-수송체 (NKCC)를 억제하는 작용제는 소분자, 항체, 펩티드, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 및 RNAi로 이루어진 군으로부터 선택된다. 임의의 측면의 한 실시양태에서, RNAi는 마이크로RNA, siRNA, 또는 shRNA이다. 임의의 측면의 한 실시양태에서, 소분자는 부메타니드이다.
임의의 측면의 한 실시양태에서, 작용제는 벡터에 포함된다.
본원에 기재된 발명의 여전히 또 다른 측면은 척수 손상을 가진 대상체에게 억제성 인터뉴런의 흥분성을 감소시키는 작용제의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 척수 손상을 치료하는 방법을 제공한다.
임의의 측면의 한 실시양태에서, 작용제는 억제성 Gi-커플링된 수용체 Gi-DREADD를 상향조절한다.
임의의 측면의 한 실시양태에서, 작용제는 Gi-DREADD를 코딩하는 발현 벡터이다. 임의의 측면의 한 실시양태에서, 작용제는 Kir2.1을 코딩하는 발현 벡터이다.
임의의 측면의 한 실시양태에서, 상기 방법은 작용제와 실질적으로 동시에 클로자핀 N-옥시드를 투여하는 것을 추가로 포함한다.
임의의 측면의 한 실시양태에서, 억제성 인터뉴런의 흥분성은 적절한 대조군과 비교하여 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 99% 또는 그 초과만큼 감소된다.
본원에 기재된 발명의 또 다른 측면은 척수 손상을 가진 대상체에게 억제성 인터뉴런의 흥분성을 감소시키는 전기 자극의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 척수 손상을 치료하는 방법을 제공한다. 임의의 측면의 한 실시양태에서, 상기 방법은 클로자핀 N-옥시드를 투여하는 것을 추가로 포함한다.
임의의 측면의 한 실시양태에서, 전기 자극은 척수에 직접적으로 적용된다. 임의의 측면의 한 실시양태에서, 전기 자극은 손상 부위에서 척수에 직접적으로 적용된다.
임의의 측면의 한 실시양태에서, 억제성 인터뉴런의 흥분성은 적절한 대조군과 비교하여 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 99% 또는 그 초과만큼 감소된다.
본원에 기재된 발명의 또 다른 측면은 척수 손상의 치료에 사용하기 위한, KCC2 폴리펩티드, 또는 KCC2 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터의 유효량, 및 제약상 허용가능한 담체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
임의의 측면의 한 실시양태에서, KCC2 폴리펩티드는 서열식별번호(SEQ ID NO): 1과 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 그 초과의 아미노산 서열 동일성을 갖거나, 포함하거나 또는 그로 본질적으로 이루어지며, 서열식별번호: 1의 KCC2의 생물학적 활성의 적어도 80%를 보유한다.
임의의 측면의 한 실시양태에서, 조성물은 적어도 제2 치료 화합물을 추가로 포함한다.
본원에 기재된 발명의 또 다른 측면은 척수 손상의 치료에 사용하기 위한, Gi-DREADD 폴리펩티드, 또는 Gi-DREADD 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터의 유효량, 및 제약상 허용가능한 담체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
임의의 측면의 한 실시양태에서, Gi-DREADD 폴리펩티드는 최적화된 Gi-DREADD 폴리펩티드이다. 임의의 측면의 한 실시양태에서, Gi-DREADD 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 서열을 포함한다.
임의의 측면의 한 실시양태에서, Gi-DREADD 폴리펩티드는 서열식별번호: 2와 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 그 초과의 아미노산 서열 동일성을 갖거나, 포함하거나 또는 그로 본질적으로 이루어지고, 서열식별번호: 2의 Gi-DREADD의 생물학적 활성의 적어도 80%를 보유한다.
임의의 측면의 한 실시양태에서, 조성물은 적어도 제2 치료 화합물을 추가로 포함한다. 임의의 측면의 한 실시양태에서, 조성물은 클로자핀 N-옥시드를 추가로 포함한다.
본원에 기재된 발명의 또 다른 측면은 척수 손상의 치료에 사용하기 위한, Kir2.1 폴리펩티드, 또는 Kir2.1 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터의 유효량, 및 제약상 허용가능한 담체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
임의의 측면의 한 실시양태에서, Kir2.1 폴리펩티드는 서열식별번호: 3의 서열을 포함한다.
임의의 측면의 한 실시양태에서, Kir2.1 폴리펩티드는 서열식별번호: 3과 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 그 초과의 아미노산 서열 동일성을 갖거나, 포함하거나 또는 그로 본질적으로 이루어지며, 서열식별번호: 3의 Kir2.1의 생물학적 활성의 적어도 80%를 보유한다.
임의의 측면의 한 실시양태에서, 조성물은 클로자핀 N-옥시드를 추가로 포함한다. 임의의 측면의 한 실시양태에서, 조성물은 적어도 제2 치료 화합물을 추가로 포함한다.
본원에 기재된 발명의 또 다른 측면은 척수 손상의 치료에 사용하기 위한, 본원에 기재된 NKCC를 억제하는 임의의 작용제의 유효량, 및 제약상 허용가능한 담체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 임의의 측면의 한 실시양태에서, 조성물은 적어도 제2 치료 화합물을 추가로 포함한다.
본원에 기재된 발명의 또 다른 측면은 척수 손상을 가진 대상체에게 CLP290의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 척수 손상을 치료하는 방법을 제공한다.
임의의 측면의 한 실시양태에서, CLP290은 혈액 뇌 장벽을 가로지른다. 예를 들어, CLP290은 혈액 뇌 장벽을 가로지르도록 하는 방식으로 제형화된다.
임의의 측면의 한 실시양태에서, 대상체는 적어도 제2 척수 손상 치료를 추가로 투여받는다. 임의의 측면의 한 실시양태에서, 대상체는 적어도 제2 치료 화합물을 추가로 투여받는다. 임의의 측면의 한 실시양태에서, 제2 치료 화합물은 오스테오폰틴, 성장 인자, 또는 4-아미노퓨리딘으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
정의
편의를 위해, 명세서, 실시예 및 첨부된 청구범위에서 사용된 일부 용어 및 문구의 의미가 하기에 제공된다. 달리 명시되지 않거나 또는 문맥으로부터 암시되지 않는다면, 하기 용어 및 문구는 하기 제공된 의미를 포함한다. 정의는 특정한 실시양태를 기재하는데 도움이 되기 위해 제공되며, 기술의 범위가 청구범위에 의해서만 제한되기 때문에 청구된 기술을 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 달리 정의되지 않는다면, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명의 기술이 속하는 분야의 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 관련 기술분야에서의 용어의 용법과 본원에 제공된 그의 정의 사이에 명백한 불일치가 있는 경우에는, 본 명세서 내에 제공된 정의가 우세해야 한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "치료하다", "치료", "치료하는" 또는 "개선"은 치유적 치료를 지칭하며, 목적은 척수 손상과 연관된 상태의 진행 또는 중증도를 역전시키거나, 완화시키거나, 개선시키거나, 억제하거나, 늦추거나 또는 정지시키는 것을 지칭한다. 용어 "치료하는"은 척수 손상의 적어도 하나의 불리한 효과 또는 증상, 예를 들어 부분 또는 완전 마비를 감소시키거나 또는 완화시키는 것을 포함한다. 하나 이상의 증상 또는 임상적 마커가 감소되는 경우, 일반적으로 치료는 "효과적이다". 대안적으로, 질환의 진행이 감소되거나 또는 중단되는 경우, 치료는 "효과적이다". 즉, "치료"에는 치료의 부재시에 예상되는 것과 비교하여 증상 또는 마커의 개선, 뿐만 아니라 증상의 진행 또는 악화의 중단 또는 적어도 늦춤이 포함된다. 유익한 또는 원하는 임상적 결과에는 검출가능하건 또는 검출 불가능하건 간에 하나 이상의 증상(들)의 완화, 질환 정도의 감소, 척수 손상의 안정화된 (즉, 악화되지 않는) 상태, 척수 손상 진행의 지연 또는 늦춤, 손상 상태의 개선 또는 경감, 관해 (부분적이건 전체적이건 간에), 및/또는 감소된 사망률이 포함되나 이로 제한되지 않는다. 용어 척수 손상의 "치료"에는 또한 질환의 증상 또는 부작용으로부터의 완화 (경감적인 치료 포함)의 제공이 포함된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "투여하는"은 대상체에게 작용제를 적어도 부분적으로 전달하는 방법 또는 경로에 의해 본원에 개시된 치료제 (예를 들어, KCC2를 상향조절하거나 또는 억제성 인터뉴런의 흥분성을 감소시키는 작용제) 또는 제약 조성물을 대상체에게 배치시키는 것을 지칭한다. 본원에 개시된 작용제를 포함하는 제약 조성물은 대상체에서 효과적인 치료를 일으키는 임의의 적절한 경로에 의해 투여될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "대상체"는 인간 또는 동물을 의미한다. 일반적으로, 동물은 척추동물, 예컨대 영장류, 설치류, 가축 또는 게임 동물이다. 영장류에는 예를 들어 침팬지, 시노몰구스 원숭이, 거미 원숭이, 및 마카크, 예를 들어 레수스가 포함된다. 설치류에는 예를 들어 마우스, 래트, 마멋, 페렛, 토끼 및 햄스터가 포함된다. 가축 및 게임 동물에는 예를 들어 소, 말, 돼지, 사슴, 들소, 버팔로, 고양이과, 예를 들어 집 고양이, 개과, 예를 들어 개, 여우, 늑대, 조류, 예를 들어 닭, 에뮤, 타조, 및 물고기, 예를 들어 송어, 메기 및 연어가 포함된다. 일부 실시양태에서, 대상체는 포유동물, 예를 들어 영장류, 예를 들어 인간이다. 용어 "개체", "환자" 및 "대상체"는 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
바람직하게는, 대상체는 포유동물이다. 포유동물은 인간, 비-인간 영장류, 마우스, 래트, 개, 고양이, 말 또는 소일 수 있지만, 이들 예로 제한되지 않는다. 인간 이외의 포유동물이 척수 손상의 동물 모델을 나타내는 대상체로서 유리하게 사용될 수 있다. 대상체는 수컷 또는 암컷일 수 있다.
대상체는 척수 손상 또는 이러한 손상과 관련된 하나 이상의 합병증을 앓고 있거나 또는 가진 것으로 이전에 진단되거나 확인된 적이 있고, 임의적으로 척수 손상 또는 상기 손상과 관련된 하나 이상의 합병증에 대한 치료를 이미 받은 적이 있는 대상체일 수 있다. 대안적으로, 대상체는 또한 이러한 척수 손상 또는 관련된 합병증을 가진 것으로 이전에 진단된 적이 없는 대상체일 수 있다. 예를 들어, 대상체는 척수 손상의 하나 이상의 위험 인자를 나타내는, 예를 들어 척수 손상이 일어날 가능성이 있는 활동, 예를 들어 완전 접촉 스포츠, 예를 들어 미식 축구에 참여하거나, 또는 척수 손상과 관련된 하나 이상의 합병증을 나타내는 대상체, 또는 위험 인자를 나타내지 않는 대상체일 수 있다.
본원에 기재된 방법 및 조성물은 척수 손상의 치료를 위해 사용된다. 본원에서 사용된 바와 같이, "척수 손상"은 임의의 척수 영역, 예를 들어 경추, 흉추, 요추, 천추, 천골, 또는 미골에 대한 임의의 상해를 지칭한다. "척수 손상"은 움직임에 영향을 미치지 않는 것, 예를 들어 보행 능력 유지에서부터 대마비 (예를 들어, 다리 및 하체 마비) 및 사지마비 (예를 들어, 사지 모두에서 근육 강도 상실)에 이르는 다양한 수준의 중증도를 초래할 수 있다. "척수 손상"은 완전 척수 손상, 예를 들어 손상 부위 아래에서 모든 운동 및 감각 기능이 전부 상실되는 손상일 수 있다. "척수 손상"은 예를 들어 일차 손상 부위 아래에서 일부 운동 기능이 유지되는 불완전 척수 손상일 수 있다. 불완전 척수 손상의 비제한적인 예에는 척수 전삭 증후군, 중심삭 증후군, 및 브라운-세커드(Brown-Sequard) 증후군이 포함되나 이로 제한되지 않는다. "척수 손상"은 척수 진탕 또는 척수 타박상, 예를 들어 1 또는 2 일 내에 예를 들어 스스로 해결되는 손상일 수 있다. 척수 진탕 또는 타박상은 완전 또는 불완전일 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "작용제"는 예를 들어 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 발현을 억제하거나, 또는 결합하거나, 자극을 부분적으로 또는 완전히 차단하거나, 활성화를 감소시키거나, 예방하거나, 지연시키거나, 불활성화시키거나, 탈감작화시키거나, 또는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 활성을 하향조절하는 분자, 단백질, 펩티드, 항체 또는 핵산을 지칭한다. NKCC를 억제하는 작용제는 예를 들어 폴리펩티드의 발현, 예를 들어 번역, 번역후 가공, 안정성, 분해, 또는 핵 또는 세포질 국소화, 또는 폴리뉴클레오티드의 전사, 전사후 가공, 안정성 또는 분해를 억제하거나, 또는 결합하거나, 자극, DNA 결합, 전사 인자 활성 또는 효소 활성을 부분적으로 또는 완전히 차단하거나, 활성화를 감소시키거나, 예방하거나, 지연시키거나, 불활성화시키거나, 탈감작화시키거나, 또는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 활성을 하향조절한다. 작용제는 직접적으로 또는 간접적으로 작용할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "작용제"는 임의의 화합물 또는 물질, 예컨대 비제한적으로 소분자, 핵산, 폴리펩티드, 펩티드, 약물, 이온 등을 의미한다. "작용제"는 임의의 화학물질, 개체 또는 모이어티, 예컨대 비제한적으로 합성 및 천연 발생 단백질성 및 비-단백질성 개체일 수 있다. 일부 실시양태에서, 작용제는 핵산, 핵산 유사체, 단백질, 항체, 펩티드, 압타머, 핵산의 올리고머, 아미노산, 또는 탄수화물, 예컨대 비제한적으로 단백질, 올리고뉴클레오티드, 리보자임, DNAzyme, 당단백질, RNAi (예를 들어, 마이크로RNA, siRNA, 및 shRNA) 지단백질, 압타머, 및 이들의 변형물 및 조합물 등이다. 특정 실시양태에서, 작용제는 화학적 모이어티를 갖는 소분자이다. 예를 들어, 화학적 모이어티에는 비치환된 또는 치환된 알킬, 방향족 또는 헤테로시클릴 모이어티, 예컨대 마크롤리드, 렙토마이신 및 관련된 천연 생성물 또는 이들의 유사체가 포함된다. 화합물은 원하는 활성 및/또는 성질을 갖는 것으로 공지되어 있을 수 있거나, 또는 다양한 화합물의 라이브러리로부터 선택될 수 있다.
작용제는 1종 이상의 화학적 부류로부터의 분자, 예를 들어 유기 분자일 수 있으며, 유기금속성 분자, 무기 분자, 유전자 서열 등이 포함될 수 있다. 작용제는 또한 1종 이상의 단백질로부터의 융합 단백질, 키메라 단백질 (예를 들어, 관련된 또는 상이한 분자의 기능적으로 유의한 영역의 도메인 교체 또는 상동성 재조합), 합성 단백질 또는 다른 단백질 변형, 예컨대 치환, 결실, 삽입 및 다른 변이체일 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "소분자"는 화학적 작용제를 지칭하며, 펩티드, 펩티드 모방체, 아미노산, 아미노산 유사체, 폴리뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드 유사체, 압타머, 뉴클레오티드, 뉴클레오티드 유사체, 약 10,000 그램/몰 미만의 분자량을 갖는 유기 또는 무기 화합물 (예를 들어, 헤테로유기 및 유기금속성 화합물 포함), 약 5,000 그램/몰 미만의 분자량을 갖는 유기 또는 무기 화합물, 약 1,000 그램/몰 미만의 분자량을 갖는 유기 또는 무기 화합물, 약 500 그램/몰 미만의 분자량을 갖는 유기 또는 무기 화합물, 및 이러한 화합물의 염, 에스테르 및 다른 제약상 허용가능한 형태가 포함될 수 있으나 이로 제한되지 않는다.
본원에 기재된 방법 및 조성물은 KCC2의 수준이 상향조절되는 것을 필요로 한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "K+-Cl- 공동-수송체 (KCC2)"는 전기화학 평형 전위 아래에서 보다 낮은 세포내 클로라이드 농도를 갖는 단백질을 지칭한다. KCC2는 칼륨 및 클로라이드의 화학적 농도 구배에 따라 순 유출 또는 유입 경로에서 기능할 수 있다. 용질 담체 패밀리 12 구성원 5로도 공지된 KCC2에 대한 서열은 수많은 종, 예를 들어 인간 KCC2 (NCBI 유전자 ID: 57468) 폴리펩티드 (예를 들어, NCBI 참고 서열 NP_001128243.1) 및 mRNA (예를 들어, NCBI 참고 서열 NM_001134771.1)에 대해 공지되어 있다. KCC2는 인간 KCC2, 예컨대 그의 천연 발생 변이체, 분자 및 대립유전자를 지칭할 수 있다. KCC2는 예를 들어 마우스, 래트, 토끼, 개, 고양이, 소, 말, 돼지 등의 포유동물 KCC2를 지칭한다. 서열식별번호:1의 핵산 서열은 래트 KCC2를 코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
본원에 기재된 방법 및 조성물은 NKCC의 수준 및/또는 활성이 억제되는 것을 필요로 한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "Na+/2Cl-/K+ 공동-수송체 (NKCC)"는 예를 들어 나트륨 및 클로라이드 수송 및 재흡수를 매개함으로써 적절한 이온 균형 및 세포 부피를 유지하기 위해 필요한 단백질을 지칭한다. 용질 담체 패밀리 12 구성원 2 및 NKCC1로도 공지된 NKCC에 대한 서열은 수많은 종, 예를 들어 인간 NKCC (NCBI 유전자 ID: 6558) 폴리펩티드 (예를 들어, NCBI 참고 서열 NP_001037.1) 및 mRNA (예를 들어, NCBI 참고 서열 NM_001046.2)에 대해 공지되어 있다. NKCC는 인간 NKCC, 예컨대 그의 천연 발생 변이체, 분자 및 대립유전자를 지칭할 수 있다. NKCC는 예를 들어 마우스, 래트, 토끼, 개, 고양이, 소, 말, 돼지 등의 포유동물 NKCC를 지칭한다. 서열식별번호: 4의 핵산 서열은 NKCC를 코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
본원에 기재된 방법 및 조성물은 Kir2.1의 수준 및/또는 활성이 증가되는 것을 필요로 한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "Kir2.1"은 칼륨 전압-게이팅된 채널 서브패밀리 J 구성원 2로 지칭되며, 칼륨이 세포의 밖으로보다 안으로 유입되는 경향이 더 큰 것을 특징으로 한다. Kir2.1은 신경 및 근육 조직의 활동 전위 파형 및 흥분성을 확립하는데 참여할 수 있다. Kir2.1 서열은 수많은 종, 예를 들어 인간 Kir2.1 (NCBI 유전자 ID: 3759) 폴리펩티드 (예를 들어, NCBI 참고 서열 NP_000882.1) 및 mRNA (예를 들어, NCBI 참고 서열 NM_000891.2)에 대해 공지되어 있다. Kir2.1은 인간 Kir2.1, 예컨대 그의 천연 발생 변이체, 분자 및 대립유전자를 지칭할 수 있다. Kir2.1은 예를 들어 마우스, 래트, 토끼, 개, 고양이, 소, 말, 돼지 등의 포유동물 Kir2.1을 지칭한다. 서열식별번호: 3의 핵산 서열은 인간 Kir2.1을 코딩하는 아미노산 서열을 포함한다. 서열식별번호: 5의 핵산 서열은 마우스 Kir2.1을 코딩하는 아미노산 서열을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "상향조절" 및 "상향조절하다"는 (예를 들어, KCC2, Gi-DREADD 또는 Kir2.1의) 생물학적 활성을 증가시키는 변화 또는 변경을 지칭한다. 상향조절에는 활성을 자극하거나 또는 촉진시키는 것이 포함되나 이로 제한되지 않는다. 상향조절은 활성 및/또는 수준에서의 변화, 결합 특징에서의 변화, 또는 관심 단백질, 경로, 시스템 또는 다른 생물학적 표적의 활성과 연관된 생물학적, 기능적 또는 면역학적 성질에서의 임의의 다른 변화일 수 있으며, 이는 그의 활성 및/또는 수준을 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 용어 "상향조절하다"는 기준 수준과 비교하여 적어도 10% 증가, 예를 들어 기준 수준과 비교하여 적어도 약 20%, 또는 적어도 약 30%, 또는 적어도 약 40%, 또는 적어도 약 50%, 또는 적어도 약 60%, 또는 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 90% 증가, 또는 100% 이하의 증가, 또는 10-100%의 임의의 증가, 또는 적절한 대조군과 비교하여 적어도 약 2배, 또는 적어도 약 3배, 또는 적어도 약 4배, 또는 적어도 약 5배 또는 적어도 약 10배 증가, 20배 증가, 30배 증가, 40배 증가, 50배 증가, 60배 증가, 75배 증가, 100배 증가 등, 또는 2배 내지 10배의 임의의 증가 또는 그 초과를 의미할 수 있다.
용어 "감소하다", "감소된", "감소" 또는 "억제하다"는 모두 본원에서 통계적으로 유의한 양만큼의 감소를 의미하기 위해 사용된다. 일부 실시양태에서, "감소하다", "감소된", "감소" 또는 "억제하다"는 전형적으로 적절한 대조군 (예를 들어 주어진 치료의 부재)과 비교하여 적어도 10%만큼의 감소를 의미하고, 예를 들어 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 그 초과의 감소를 포함할 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, "감소" 또는 "억제"는 기준 수준과 비교하여 완전한 억제 또는 감소를 포함하지 않는다. "완전한 억제"는 적절한 대조군과 비교하여 100% 억제이다.
용어 "증가하다", "증강시키다" 또는 "활성화시키다"는 모두 본원에서 재현가능한 통계적으로 유의한 양만큼의 증가를 의미하기 위해 사용된다. 일부 실시양태에서, 용어 "증가하다", "증강시키다" 또는 "활성화시키다"는 기준 수준과 비교하여 적어도 10% 증가, 예를 들어 기준 수준과 비교하여 적어도 약 20%, 또는 적어도 약 30%, 또는 적어도 약 40%, 또는 적어도 약 50%, 또는 적어도 약 60%, 또는 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 90% 증가, 또는 100% 이하의 증가, 또는 10-100%의 임의의 증가, 또는 적절한 대조군과 비교하여 적어도 약 2배, 또는 적어도 약 3배, 또는 적어도 약 4배, 또는 적어도 약 5배 또는 적어도 약 10배 증가, 20배 증가, 30배 증가, 40배 증가, 50배 증가, 6배 증가, 75배 증가, 100배 증가 등, 또는 2배 내지 10배의 임의의 증가 또는 그 초과일 수 있다. 마커의 관점에서, "증가하다"는 이러한 수준에서 재현가능한 통계적으로 유의한 증가이다.
본원에서 사용된 바와 같이, "적절한 대조군"은 치료되지 않은 달리 동일한 세포 또는 집단 (예를 들어, 비대조군 환자와 비교하여 본원에 기재된 작용제를 투여하지 않았거나 또는 본원에 기재된 작용제의 하위 집합만을 투여한 환자)을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "제약상 허용가능한 담체"는 활성 성분 (예를 들어, 세포)을 대상체 신체의 표적 장소로 운반 또는 수송하는데 수반되는 제약상 허용가능한 물질, 조성물 또는 비히클, 예컨대 액체 또는 고체 충전제, 희석제, 부형제, 용매 또는 캡슐화 물질을 의미한다. 각각의 담체는 제형의 다른 성분과 상용성인 관점에서 "허용가능한" 것이어야 하고, 대상체, 예를 들어 인간에게 투여하는데 상용성이다.
용어 "통계적으로 유의한" 또는 "유의하게"는 통계적 유의성을 지칭하고, 일반적으로 2 표준 편차 (2SD) 또는 그 초과의 차이를 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "포함하는" 또는 "포함하다"는 조성물, 방법, 및 방법 또는 조성물에 필수적인 이들의 각각의 성분(들)과 관련하여 사용되며, 필수적이건 아니건 간에 명시되지 않은 요소의 포함에 대해 여전히 개방적이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "로 본질적으로 이루어진"은 주어진 실시양태에 필요한 이들 요소를 지칭한다. 상기 용어는 해당 실시양태의 기본적인 및 신규한 또는 기능적인 특징(들)에 실질적인 영향을 미치지 않는 요소의 존재를 허용한다. 용어 "로 이루어진"은 본원에 기재된 조성물, 방법, 및 이들의 각각의 성분을 지칭하며, 해당 실시양태의 기재에 인용되지 않은 임의의 요소는 배제한다.
단수 용어 "하나"는 문맥상 달리 명확하게 나타내지 않는다면 복수 형태를 포함한다. 유사하게, 단어 "또는"은 문맥상 달리 명확하게 나타내지 않는다면 "및"을 포함하는 것으로 의도된다. 본원에 기재된 것들과 유사하거나 동등한 방법 및 물질이 본 개시내용의 실시 또는 시험에서 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 물질이 하기에 기재된다. 약어 "예를 들어(e.g.)"는 라틴어 "exempli gratia"로부터 유래되며, 본원에서 비제한적인 예를 나타내기 위해 사용된다. 따라서, 약어 "예를 들어(e.g.)"는 용어 "예를 들어(for example)"와 동의어이다.
도 1a-1k는 엇갈린 병변을 가진 마우스에서 기능 회복을 유도하는 화합물로서 CLP290의 확인을 보여주는 데이터를 나타낸다. (도 1a) T7 및 T10에서 엇갈린 측면 반절단의 개략도. 화살촉은 병변, L은 좌측, R은 우측을 나타낸다. (도 1b) 과도하게 엇갈린 병변 이후 10 주째에 항-GFAP 염색된 척수 단면의 대표적인 영상. 점선은 중간선을 나타낸다. 축척 막대: 500 μm. (도 1c) 엇갈린 병변 이후 2 주째에 마우스의 T5 (병변에 대해 문측), T8 (병변 사이), 및 L2 (병변에 대해 미측)로부터 항-5HT-염색된 횡단면의 대표적인 영상 스택. 축척 막대: 100 μm. (도 1d) 실험 계획. 각각의 BMS 시험을 매일 화합물 처리 24 시간 전에 수행하였다. (도 1e) CLP290 (35mg/kg) 및 비히클 용액을 연속 처리한 손상된 마우스에서 BMS 점수. 이원 반복-측정 ANOVA, 이어서 사후 본페로니(Bonferroni) 보정. 두 그룹 모두 n = 10에서 시작하였고, 9 주째에 (종결 시점) 비히클 및 CLP290에 대해 각각 n = 8 및 10이었다. *P<0.05; ****P<0.0001. 오차 막대: SEM. (도 1f) 보행에 도달한 마우스의 백분율. 엇갈린 손상 이후 9 주째에 CLP290 대 비히클 (비히클 및 CLP290 그룹에 대해 각각 n = 8 및 10). (도 1g). 10 주 처리한 마우스에서 CLP290 중지 이후 지속된 거동 개선. BMS를 화합물 중지 이후 1, 2, 3, 7 및 14 일째에 시험하였다 (n = 7). 이원 반복-측정 ANOVA, 이어서 사후 본페로니 보정. **p < 0.01. 오차 막대: SEM. (도 1h) 유각기, 입각기 (무손상 그룹), 끌기(dragging) (비히클 그룹) 및 보행 (CLP290 그룹) 동안에 마우스 우측 뒷다리 움직임의 색상-표시된 스틱뷰 분해도. (도 1i 및 도 1j). 엇갈린 손상 이후 9 주째에 마우스의 체중 지탱 (도 1i) 및 보폭 (도 1j)의 정량화 (비히클 및 CLP290 그룹에 대해 각각 n = 8 및 10). 스튜던트 t-검사 (양측, 독립표본). *p < 0.05; **p < 0.01. 오차 막대: SEM. (도 1k) 대표적인 우측 뒷다리 무릎 및 발목 각도 진동 추적, 및 전경골근 (TA) 및 내측 비복근 (GS)으로부터 동시 EMG 기록.
도 2a-2h는 광범위한 KCC2 발현이 기능 회복을 촉진시키기 위해 CLP290의 효과를 모방함을 보여주는 데이터를 나타낸다. (도 2a) 실험 계획. (도 2b) 엇갈린 손상 이후 8 주째에 마우스로부터 취한, 항-HA로 염색된 (HA-KCC2 단백질을 검출하기 위해) 척수 종단면 (상단) 및 횡단면 (하단)의 대표적인 영상 스택. 축척 막대: 500 μm (상단) 및 100 μm (하단). (도 2c) 실험 (AAV-PHP.B-HA-KCC2) 및 대조군 (AAV-PHP.B-H2B-GFP) 그룹에서 BMS 성능. 이원 반복-측정 ANOVA, 이어서 사후 본페로니 보정. *p < 0.05. (도 2d) 손상 이후 8 주째에 보행에 도달한 마우스의 백분율. (도 2e 및 도 2f) 8 주째에 체중 지탱 (도 2e) 및 보폭 (도 2f)의 정량화 (그룹당 n = 10). 스튜던트 t-검사 (양측, 독립표본)를 적용하였다. *p < 0.05; **p < 0.01. 오차 막대: SEM. (도 2g) 끌기 (AAV-PHP.B-H2B-GFP 그룹) 및 보행 (AAV-PHP.B-HA-KCC2 그룹) 동안에 마우스 우측 뒷다리 움직임의 색상-표시된 스틱뷰 분해도. (도 2h) 손상 이후 8 주째에 마우스의 대표적인 우측 뒷다리 무릎 및 발목 각도 진동 추적 및 동시 EMG 기록.
도 3a-3e는 억제성 뉴런에서 KCC2 발현이 기능 회복을 유도함을 보여주는 데이터를 나타낸다. (도 3a, 3b) AAV-PHP.B-CAG-Flex-H2B-GFP (도 3a) 또는 AAV-PHP.B-Syn-Flex-HA-KCC2 (도 3b)를 꼬리 정맥 주사한 지정된 트랜스제닉 마우스의 T8 척수에서 GFP (도 3a) 또는 HA-KCC2 (도 3b)의 발현을 나타내는 대표적인 영상 스택. 축척 막대: 100 μm. (도 3c) 지정된 그룹에서 BMS 성능. 이원 반복-측정 ANOVA, 이어서 사후 본페로니 보정. *p < 0.05; ****p < 0.0001. 오차 막대: SEM. (도 3d) 손상 이후 8 주째에 지정된 처리 그룹에 대한 BMS 점수의 분석. (도 3e) 손상 이후 8 주째에 족저(plantar) 또는 배측(dorsal) 보행에 도달한 마우스의 백분율.
도 4a-4h는 KCC2가 병변 사이 및 주위의 척수 분절에서 억제성 뉴런에 대해 작용함을 보여주는 데이터를 나타낸다. (도 4a) 도 4b-도 4d에 대한 실험 계획. (도 4b) 8 주째에 흉추 및 요추 척수의 항-HA-염색된 횡단면의 대표적인 영상. 축척 막대: 100 μm. (도 4c 및 도 4d) 좌측, 야생형 마우스 (도 4c) 및 Vgat-Cre 마우스 (도 4d)에서 상이한 처리 그룹에서 BMS 성능. 우측, WT 마우스 (도 4c) 및 Vgat-Cre 마우스 (도 4d)에서 보행에 도달한 마우스의 백분율. ANOVA, 이어서 사후 본페로니 보정. 오차 막대: SEM. (도 4e) 도 4f-도 4h에 대한 실험 계획. (도 4f) 손상 이후 8 주째에 흉추 및 요추 척수의 항-HA-염색된 횡단면의 대표적인 영상. 축척 막대: 100 μm. (도 4g 및 도 4h) 좌측, WT 마우스 (도 4g) 및 Vgat-Cre 마우스 (도 4h)에서 실험 및 대조군 그룹에서 BMS 성능. 우측, WT 마우스 (도 4g) 및 Vgat-Cre 마우스 (도 4h)에서 보행에 도달한 마우스의 백분율. ANOVA, 이어서 사후 본페로니 보정. *p < 0.05. 오차 막대: SEM.
도 5a-5f는 변경된 신경 활성화 패턴 및 중계(relay) 형성이 CLP290/KCC2에 의해 용이해짐을 보여주는 데이터를 나타낸다. (도 5a) 무손상 마우스, 및 비히클, CLP290, AAV-PHP.B-syn-HA-KCC2 또는 L838,417로 처리된 손상된 마우스에서 연속 운동 1 시간 후에 T8/9 분절에서 c-Fos 발현 패턴을 보여주는 척수 횡단면의 개략도. 각각의 점은 c-Fos 및 NeuN 둘 다에 의해 양성으로 염색된 세포를 나타낸다. 대표적인 미가공 영상은 도 11a에 도시된다. (도 5b) 모든 그룹에서 배측 대역 또는 중간 및 복측(ventral) 대역에서 단면당 c-Fos+ 뉴런의 평균 개수. 일원 ANOVA, 이후에 본페로니 사후 시험 (비히클, CLP290, AAV-PHP.B-syn-HA-KCC2 또는 L838,417 처리된 그룹에서 배측 또는 중간/복측 대역의 c-Fos+ NeuN+ 개수를 각각 무손상 그룹과 비교하였다). 마우스당 n = 3개의 단면, 그룹당 n = 3 마리의 마우스. *p < 0.05; ***P<0.001; ****P < 0.0001; n.s. 유의하지 않음. 오차 막대: SEM. (도 5c) 모든 그룹에서 추궁판 1-5에서 (배측) 또는 추궁판 6-10에서 (중간-복측) 단면당 c-Fos+ 뉴런의 평균 백분율. 일원 ANOVA, 이후에 본페로니 사후 시험 (비히클, CLP290, AAV-PHP.B-syn-HA-KCC2 또는 L838,417 처리된 그룹에서 배측 또는 중간/복측 대역의 c-Fos+ NeuN+ 백분율을 각각 무손상 그룹과 비교하였다). 마우스당 n = 3개의 단면, 그룹당 n = 3 마리의 마우스, *p < 0.05; **P< 0.01; ***P<0.001; n.s. 유의하지 않음. 오차 막대: SEM. (도 5d) 좌측, 피질 자극 및 TA 근육 EMG 실험의 개략도. 우측, STA 대조군, AAV-PHP.B-syn-HA-KCC2, CLP290 처리된, 완전 횡절단, 및 무손상 그룹에서 경막외 운동 피질 자극의 트레인에 의해 유발된 우측 TA 근육에서의 대표적인 반응. (도 5e) 지정된 그룹으로부터 우측 TA 근육 EMG 반응 진폭. 일원 ANOVA, 이후에 본페로니 사후 시험. 마우스당 n = 3회 시도, 그룹당 n = 3 마리의 마우스, ***p < 0.001; n.s. 유의하지 않음; 오차 막대, SEM. (도 5f) 지정된 그룹으로부터 우측 TA 근육 EMG 반응 잠재시간. 일원 ANOVA, 이후에 본페로니 사후 시험. 마우스당 n = 3회 시도, 그룹당 n = 3 마리의 마우스, ***p < 0.001; n.s. 유의하지 않음. 오차 막대: SEM.
도 6a-6f는 병변 사이 및 주위의 억제성 인터뉴런에서 Gi-DREADD 발현이 KCC2/CLP290의 효과를 모방함을 보여주는 데이터를 도시한다. (도 6a) 실험 계획. (도 6b) SCI 이후 8 주째에 hM4Di DREADD 발현을 나타내기 위해 항-RFP로 면역염색된 흉추 및 요추 척수의 횡단면의 대표적인 영상. 축척 막대: 100 μm. (도 6c) Vgat-Cre 마우스에서 Gi-DREADD 및 GFP 그룹에서 SCI 및 바이러스 주사 이후 시간에 걸친 BMS 성능. ANOVA, 이어서 사후 본페로니 보정. **p < 0.001, ****p < 0.0001, 오차 막대, SEM. (도 6d). AAV-9-Syn-Gi-DREADD 처리된 마우스 (배측/족저 보행) 및 AAV-9-Syn-GFP 마우스 그룹 (끌기)에서 연속 운동 1 시간 후에 T8/9 분절에서 c-Fos 양성 뉴런을 보여주는 척수 횡단면의 개략도. (도 6e) 지정된 그룹에서 단면당 c-Fos+ 뉴런 (모든 추궁판)의 평균 개수. 스튜던트 t-검사 (양측, 독립표본). 마우스당 n = 3개의 단면, 그룹당 n = 3 마리의 마우스. n.s. 유의하지 않음. 오차 막대: SEM. (도 6f) 지정된 그룹에서 추궁판 1-5 또는 추궁판 6-10에서 c-Fos+ 뉴런의 백분율. 스튜던트 t-검사 (양측, 독립표본). 그룹당 n = 9개의 샘플 슬라이드, 그룹당 n = 3 마리의 마우스. **P < 0.01; n.s. 유의하지 않음. 오차 막대: SEM.
도 7a-7f는 엇갈린 또는 완전 척수 손상을 가진 마우스에서 소분자 화합물의 효과를 보여주는 데이터를 나타낸다. (도 7a) 지정된 화합물로 연속 처리한 엇갈린 병변을 가진 마우스에서 화합물 투여 이후 24 시간째에 측정한 BMS 점수. 반복-측정 ANOVA, 이어서 사후 본페로니 보정. 모든 그룹은 n = 10로 시작하였고, 9 주째에 (종결 시점) 식염수, CP101606 (10mg/Kg), 부메타니드 (0.3mg/Kg), 바클로펜 (1mg/Kg), L838,417 (1mg/Kg), 8-OH-DPAT (0.1mg/Kg) 및 퀴파진 (0.2mg/Kg)에 대해 각각 n = 8, 10, 3, 8, 4, 7 및 7이었다. 오차 막대, SEM. (도 7b) SCI 이후 8 주째에 엇갈린 병변을 가진 마우스에서 화합물 처리 직후에 (화합물 투여 이후 10, 30, 30, 60 및 120 분째에) 측정된 BMS 점수. 이원 반복-측정 ANOVA, 이어서 사후 본페로니 보정. 모든 그룹 n = 5, ****P < 0.0001; 오차 막대, SEM. (도 7c) 엇갈린 손상 이후 10 주째에 CLP290 처리한 손상된 마우스의 L2 척수 수준으로부터, 항-5HT 항체에 의해 염색된 횡단면의 대표적인 공초점 영상. 축척 막대: 100μm. (도 7d) 좌측, T8에서 완전 횡절단 (FT)의 개략도. 화살촉은 병변을 나타낸다. 우측 상단: FT 병변 이후 10 주째에 항-GFAP에 의해 면역염색된 척수 종단면 (T5에서 T12까지)의 대표적인 공초점 영상 스택. 점선은 중간선을 나타낸다. 축척 막대: 500 μm. 우측 하단: 과도하게 엇갈린 병변 (세로토닌성 축삭) 이후 8 주째에 항-5HT에 의해 면역염색된 흉추 및 요추 척수 (T5, 병변에 대해 문측, T9 및 L2, 병변에 대해 미측)로부터 횡단면의 대표적인 공초점 영상 스택. 축척 막대: 100μm. (도 7e) 완전 횡절단을 가진 마우스에서 비히클 또는 CLP290 투여 이후 24 시간째에 측정된 BMS 점수. 반복-측정 ANOVA, 이어서 사후 본페로니 보정. 두 그룹 모두 n = 10로 시작하였고, 9 주째에 (종결 시점) 비히클 및 CLP290에 대해 각각 n = 8 및 10이었다. 오차 막대, SEM. (도 7f) 만성 처리없이 완전 횡절단 이후 마우스에서 8 주째에 화합물 처리 직후에 (화합물 투여 이후 10, 30, 30, 60 및 120 분째에) 측정된 BMS 점수. 반복-측정 ANOVA, 이어서 사후 본페로니 보정. 모든 그룹 n = 5, ****P < 0.0001; 오차 막대, SEM.
도 8a-8f는 축삭 성장에 대해 CLP290의 유의한 효과가 없음을 보여주는 데이터를 나타낸다 (역행 표지). (도 8a) 좌측: 우측 요추 척수 (L2-4)로 하행 돌출을 갖는 역행 표지된 척수고유 및 뇌 뉴런에 대한 HiRet-mCherry 주사의 개략도. 마우스에게 손상 이후 1 일째에 (급성) 또는 8 주째에 (만성) HiRet-mCherry 주사를 제공하였다. 조직학적 분석을 위해 바이러스 주사 이후 2 주째에 마우스를 종료시켰다. 중간: 급성 및 만성 단계에 표지된 척수고유 뉴런의 종방향 표시. 각각의 점은 5가지 뉴런을 나타낸다. 우측: 엇갈린 손상 이후 10 주째에 항-RFP에 의해 염색된 T8 (병변 사이) 및 T13 (병변 아래)의 횡단면의 대표적인 공초점 영상 스택. 축척 막대: 100 μm. 하단: 동측-추적 PN: 동측-추적 척수고유 뉴런, 중간선-교차 PN: 중간선-교차 척수고유 뉴런 (주사 부위에 대해). (도 8b 및 도 8c) A로부터의 뇌 및 척수에서 표지된 뉴런의 정량화. 급성 및 만성 단계에서 비히클 처리한 마우스에서 (도 8b) 또는 만성 단계에서 비히클 또는 CLP290 처리된 마우스에서 (도 8c) 상이한 뇌 영역 및 척수 분절에서 역행 표지된 뉴런의 개수를 무손상 마우스에서 이들 역행 표지된 뉴런에 대해 정규화하였다. 문측: T7 위; 중간, T8-T10; 미측: T10-L1. L: 좌측, R: 우측. 스튜던트 t-검사; 무손상, 급성 및 만성 SCI 마우스에 대해 각각 n = 3. *P < 0.05, n.s. 유의하지 않음. 오차 막대: SEM. (도 8d) 좌측: 좌측 요추 척수 (L2-4)로 하행 돌출을 갖는 역행 표지된 척수고유 및 뇌 뉴런에 대한 HiRet-mCherry 주사의 개략도. 동물에게 엇갈린 손상 이후 1 일째에 (급성) 또는 8 주째에 (만성) HiRet-mCherry 주사를 제공하였다. 조직학적 분석을 위해 바이러스 주사 이후 2 주째에 마우스를 종료시켰다. 중간: 급성 및 만성 단계에 표지된 척수고유 뉴런의 종방향 표시. 각각의 점은 5가지 뉴런을 나타낸다. 우측: 엇갈린 손상 이후 10 주째에 항-RFP에 의해 염색된 T8 (병변 사이) 및 T13 (병변 아래)의 횡단면의 대표적인 공초점 영상 스택. 축척 막대: 100 μm. 하단: 동측-추적 PN: 동측-추적 척수고유 뉴런, 중간선-교차 PN: 중간선-교차 척수고유 뉴런 (주사 부위에 대해). (도 8e 및 도 8f) D로부터의 뇌 및 척수에서 표지된 뉴런의 정량화. 급성 및 만성 단계에서 비히클 처리된 마우스에서 (도 8e) 또는 만성 단계에서 비히클 또는 CLP290 처리된 마우스에서 (도 8f) 상이한 척수 분절에서 뇌 및 척수고유 뉴런의 mCherry-표시된 개수를 무손상 마우스에서 이들 역행 표지된 뉴런에 대해 정규화하였다. 문측: T7 위; 중간, T8-T10; 미측: T10-L1. L: 좌측, R: 우측. 스튜던트 t-검사; 무손상, 급성 및 만성 SCI 마우스에 대해 각각 n = 3. * P < 0.05, n.s. 유의하지 않음. 오차 막대: SEM.
도 9a-9i는 하행 축삭의 축삭 성장에 대해 CLP290의 효과가 없음을 보여주는 데이터를 나타낸다. (도 9a) 좌측: 뇌간 망상체로부터 뉴런의 순행 표지에 대한 AAV 주사 전략의 개략도. 동물에게 손상 이후 1 일째에 (급성) 또는 8 주째에 (만성) AAV-ChR2-mCherry (좌측) 및 AAV-ChR2-GFP (우측)의 주사를 제공하였다. 조직학적 분석을 위해 바이러스 주사 이후 2 주째에 마우스를 종료시켰다. 흑색 선: 좌측 망상체로부터 하행 축삭; 회색 선: 우측 망상체로부터 하행 축삭. 우측: 손상 이후 2 주 및 10 주째에 항-RFP 및 항-GFP에 의해 염색된 흉추 및 요추 척수의 횡단면의 대표적인 공초점 영상 스택. 축척 막대: 100 μm. (도 9b) 비히클 처리된 그룹에서 엇갈린 손상 이후 2 주 및 10 주째에 mCherry 및 GFP 면역염색의 형광 강도. 모든 영상은 동일한 영상화 파라미터 및 스캔 설정을 이용하여 획득하였다. 각각의 경우에, 강도를 문측 수준에서 엇갈린 손상 이후 2 주째에 대해 정규화하였다. 스튜던트 t-검사; 마우스당 n = 3개의 단면 및 그룹당 n = 3 마리의 마우스. *p < 0.05 및 ns, 유의하지 않음. 오차 막대: SEM. (도 9c) 비히클 처리된 및 CLP290 처리된 그룹에서 엇갈린 손상 이후 10 주째에 mCherry 및 GFP 면역염색의 형광 강도. 모든 영상을 동일한 영상화 파라미터 및 스캔 설정을 이용하여 획득하였다. 각각의 경우에, 강도를 문측 수준에서 엇갈린 손상 이후 2 주째에 대해 정규화하였다. 스튜던트 t-검사; 마우스당 n = 3개의 단면 및 그룹당 n = 3 마리의 마우스. *p < 0.05 및 ns, 유의하지 않음. 오차 막대: SEM. (도 9d) CLP290 처리하에 또는 처리없이 손상 이후 2 또는 10 주째로부터 취한 상이한 척수 수준에서 세로토닌성 축삭을 보여주기 위한 개략도 및 영상. (도 9e, 도 9f). 5-HT 면역염색의 형광 강도를 급성 및 만성 단계에서 비히클 처리된 그룹에 대해 비교하였고 (도 9e), 또한 만성 단계에서 비히클 및 CLP290 처리된 그룹 사이에서 (도 9f) 비교하였다. 스튜던트 t-검사; 마우스당 n = 3개의 단면 및 그룹당 n = 3 마리의 마우스. *p < 0.05 및 ns, 유의하지 않음. 오차 막대: SEM. (도 9g-도 9i). (도 9g) CLP290 처리하에 또는 처리없이 손상 이후 2 또는 10 주째에 상이한 척수 수준에서 CST 축삭 종결을 추적하기 위해 우측 피질에 주사된 AAV-ChR2-GFP. 항-GFP 면역염색의 형광 강도를 비히클 처리된 마우스에서 급성 및 만성 단계 사이에 (도 9h), 및 손상 이후 10 주째에 비히클 또는 CLP290 처리된 그룹 사이에 (도 9i) 비교하였다. 축척 막대: 100 μm. 스튜던트 t-검사; 마우스당 n = 3개의 단면 및 그룹당 n = 3 마리의 마우스. ns, 유의하지 않음. 오차 막대: SEM.
도 10a-10e는 척수 뉴런 및 그의 거동 결과에서 AAV-매개된 KCC2 발현을 보여주는 데이터를 나타낸다. (도 10a, 도 10b) 무손상 마우스, 또는 손상 이후 10 주째에 AAV-PHP.B-FLEX-GFP 또는 AAV-PHP.B-HA-KCC2로 처리된 엇갈린 병변이 있는 마우스의 병변간 영역 (T8/9)에서 (도 10a) 및 요추 척수 (L2-4)에서 (도 10b) KCC2 단백질 수준을 보여주는 대표적인 웨스턴 블롯팅 영상 및 정량화. 로딩 대조군으로서 액틴. 무손상, AAV-PHP.B-GFP 및 AAV-PHP.B-HA-KCC2 그룹에 대해 각각 n =6, 5 및 5 마리의 마우스. 스튜던트 t-검사; *P<0.05; **P < 0.01; 오차 막대: SEM. (도 10c) 좌측, 실험 설계의 개략도. AAV 바이러스를 실험 (AAV-1-Syn-HA-KCC2) 및 대조군 마우스 (AAV-1-Syn-GFP-H2B)의 요추 분절 (L2-4)로 척수내 주사하였다. 우측, 엇갈린 손상 이후 10 주째에 바이러스 발현된 KCC2를 표지하기 위해 항-HA에 의해 면역염색된 척수 종단면 (T5에서 S1까지)의 대표적인 공초점 영상 스택. (도 10d) 좌측, 실험 설계의 개략도. AAV 바이러스를 실험 (AAV-9-Syn-HA-KCC2) 및 대조군 (AAV-9-Syn-GFP-H2B) 마우스의 꼬리 정맥에 주사하였다. 우측, 엇갈린 손상 이후 10 주째에 바이러스 발현된 KCC2를 표지하기 위해 항-HA에 의해 면역염색된 척수 종단면 (T5에서 L3까지)의 대표적인 공초점 영상 스택. 축척 막대: 500 μm. (도 10e) AAV-9-Syn-HA-KCC2를 꼬리 정맥 주사하고 비히클 또는 CLP290으로 처리한 Vgat-Cre 마우스에서 24 시간에 측정한 BMS 점수. 두 그룹 모두 n = 8로 시작하였고, 9 주째에 (종결 시점) 비히클 및 CLP290 둘 다에 대해 n = 6이었다. 반복-측정 ANOVA, 이어서 사후 본페로니 보정. **P < 0.01; 오차 막대, SEM.
도 11a-11d는 상이한 처리를 한 엇갈린 병변을 가진 마우스의 T8/9에서 변경된 c-Fos 발현 패턴을 보여주는 데이터를 나타낸다. (도 11a) 손상 이후 8 주째에 c-Fos, NeuN, 또는 c-Fos 및 NeuN 둘 다에 대한 항체에 의해 염색된 T8/9 척수로부터의 횡단면의 대표적인 공초점 영상 스택. 축척 막대: 100μm. (도 11b) 무손상 마우스, 또는 개별 처리 (비히클 대조군, CLP290, AAV-PHP.B-HA-KCC2 및 L838,417)를 한 손상된 마우스에서 c-fos+ 세포 중에서 NeuN+ 세포의 백분율. 일원 ANOVA, 이후에 본페로니 사후 시험. 마우스당 n = 3개의 단면, 그룹당 n = 3 마리의 마우스. n.s. 유의하지 않음. 오차 막대: SEM. (도 11c) 비히클 처리 (STA), 연속 CLP290 처리 (CLP290), 및 CLP290 중지 이후 2 주 (CLP290 중지)인 엇갈린 병변을 가진 마우스의 배측 대역에서 또는 중간 및 복측 대역에서 단면당 c-Fos+ 뉴런의 평균 개수. 일원 ANOVA, 이후에 본페로니 사후 시험 (CLP290, 또는 CLP290 중지 그룹에서 배측 또는 중간/복측 대역의 c-Fos+ NeuN+ 개수를 각각 비히클 그룹과 비교하였다). 마우스당 n = 3개의 단면, 그룹당 n = 3 마리의 마우스. *p < 0.05; **P< 0.01; n.s. 유의하지 않음. 오차 막대: SEM. (도 11d) 비히클 처리 (STA), 연속 CLP290 처리 (CLP290), 및 CLP290 중지 이후 2 주 (CLP290 중지)인 엇갈린 병변을 가진 마우스에서 추궁판 1-5에서 또는 추궁판 6-10에서 단면당 c-Fos+ 뉴런의 평균 백분율. 일원 ANOVA, 이후에 본페로니 사후 시험 (CLP290, 또는 CLP290 중지 그룹에서 배측 또는 중간/복측 대역의 c-Fos+ NeuN+ 백분율을 각각 비히클 그룹과 비교하였다). 마우스당 n = 3개의 단면, 그룹당 n = 3 마리의 마우스, **P< 0.01; n.s. 유의하지 않음. 오차 막대: SEM.
도 12a-12c는 Gq-DREADD 발현을 보여주는 데이터를 나타낸다. (도 12a) 엇갈린 손상 이후 8 주째에 hM3D DREADD 발현을 나타내기 위해 항-RFP에 의해 염색된 흉추 및 요추 척수의 횡단면의 대표적인 공초점 영상. 축척 막대: 100 μm. (도 12b) AAV9-Syn-FLEX-GFP 또는 AAV9-FLEX-hM3Dq-mCherry의 바이러스 주사에 의한 엇갈린 손상된 Vglut2-Cre 마우스의 BMS 점수. 반복-측정 ANOVA, 이어서 사후 본페로니 보정. 각각의 그룹에 대해 n = 5. 오차 막대: SEM. (도 12c) SCI 이후 8 주째에 엇갈린 병변을 가진 vGlut2-Cre 마우스에서 화합물 처리 직후에 (CNO 투여 이후 10, 30, 60,120 및 180 분째에) 측정된 BMS 점수. 반복-측정 ANOVA, 이어서 사후 본페로니 보정. n = 5, *P<0.05; ***P < 0.001; 오차 막대, SEM.
도 13a-13c는 척수 손상 모델에서 AAV-PHP.B-HA-KCC2에 의한 처리의 효능을 보여주는 데이터를 나타낸다. (도 13a) KCC2 처리 (AAV-PHP.B-HA-KCC2) 및 대조군에 의한 T10 타박상 손상된 마우스에서 BMS 점수. 이원 반복-측정 ANOVA, 이어서 사후 본페로니 보정. * P<0.05, **P<0.01. 오차 막대, SEM. (대조군 그룹에서 n=11, KCC2 그룹에서 n=10). (도 13b) 타박상 손상 이후 8 주째에 체중 지탱 (상단) 및 보행 높이 (하단)의 정량화 (대조군 그룹에서 n=11, KCC2 그룹에서 n=10). 스튜던트 t-검사 (양측, 독립표본)를 적용하였다. *p < 0.05; **p < 0.01. 오차 막대, SEM. (도 13c) 손상 이후 8 주째에 보행에 도달한 마우스의 백분율 (상단). 손상 이후 8 주째에 경직을 가졌던 마우스의 백분율 (하단). 손상된 마우스가 50% BMS 평점 시간에 걸쳐 경련을 나타낸 경우에, 이들은 "경직-강성"으로 분류되었다 (대조군 그룹에서 n=11, KCC2 그룹에서 n=10).
본원에 기재된 발명은 부분적으로 KCC2 효능제가 엇갈린 양측 반절단, 예를 들어 요추 척수에서 모든 직접적인 뇌-유래된 신경분포가 상실되었지만 휴면 상태의 중계 회로는 남아 있는 것인 손상을 가진 마우스에서 보행 능력을 복구시킨다는 발견을 기반으로 한다. 추가로, 이러한 보행 능력의 복구가 엇갈린 척수 병변 사이 및 주위의 억제성 인터뉴런에서 KCC2의 선택적 발현 또는 DREADD 과분극화 (예를 들어, 최적화된 Gi-DREADD)에 의해 추가로 모방될 수 있다는 것이 발견되었다.
추가로, 억제 또는 NKCC, 또는 Kir2.1의 발현이 예를 들어 엇갈린 양측 반절단으로 인해 이전에 보행 능력이 상실된 적이 있는 마우스에서 이러한 능력을 증가시킴을 보여주는 증거가 본원에 제공된다. 기계적으로, 이들 치료는 이러한 손상-유도된 기능장애 척수 회로를 기능적 상태로 전환시켜, 요추 척수로 뇌-유래된 명령의 중계를 용이하게 한다.
따라서, 척수 손상을 가진 환자에서 KCC2, Gi-DREADD 또는 Kir2.1의 발현을 증가시키거나 또는 NKCC를 억제하는 방법이 본원에 제공된다. 추가로, KCC2, Gi-DREADD 또는 Kir2.1의 발현을 증가시키거나 또는 NKCC를 억제하는데 유용한 작용제를 포함하는 조성물이 본원에 기재된다. 추가로, 척수 손상의 치료에 사용하기 위한, KCC2, NKCC, Gi-DREAD 또는 Kir2.1을 조절하는 작용제를 포함하는 조성물이 본원에 제공된다.
척수 손상의 치료
본원에 제공된 방법은 척수 손상의 치료에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 척수 손상은 중증 척수 손상이다. 척수 손상은 척수 기능에 부정적인 영향을 미치는, 예를 들어 사지에서 감각의 이동을 감소시키는, 임의의 척수 영역, 예를 들어 경추, 흉추, 요추, 천추, 천골 또는 미골에 대한 임의의 상해를 지칭한다. 척수 손상의 중증도는 예를 들어 움직임에 영향을 미치지 않는 것, 예를 들어 보행 능력 유지에서부터 대마비 (예를 들어, 다리 및 하체 마비) 및 사지마비 (예를 들어, 사지 모두에서 근육 강도 상실)에 이르는 손상 결과의 수준으로 측정된다. 한 실시양태에서, 본원에 기재된 방법 및 조성물을 이용하여 중증 척수 손상을 치료한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "중증 척수 손상"은 손상 수준 아래에서 모든 운동 및 감각 기능이 전부 상실되는 완전 또는 불완전 척수 손상을 지칭한다.
본 발명의 한 측면은 척수 손상을 가진 대상체에게 뉴런-특이적인 K+-Cl- 공동-수송체 (KCC2)를 상향조절하는 작용제의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 척수 손상을 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명의 제2 측면은 척수 손상을 가진 대상체에게 Na+/2Cl-/K+ 공동-수송체 (NKCC)를 억제하는 작용제의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 척수 손상을 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명의 제3 측면은 척수 손상을 가진 대상체에게 억제성 인터뉴런의 흥분성을 감소시키는 작용제의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 척수 손상을 치료하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 작용제는 억제성 Gi-커플링된 수용체 Gi-DREADD를 상향조절한다. Gi-커플링된 DREADD는 설계자 약물에 의해서만 활성화되는 설계자 수용체 (designer receptor exclusively activated by designer drugs; DREADD)를 지칭한다. Gi-DREADD는 특이적인 국소 영역에서, 예를 들어 억제성 인터뉴런 상에서 발현될 수 있으며, 예를 들어 그의 효능제 또는 길항제에 의해 제어될 수 있다. DREADD는 예를 들어 [Saloman, JL, et al. Journal of neuroscience. 19 Oct 2016: 36 (42); 10769-10781]에 추가로 기재되어 있으며, 이는 그의 전문이 본원에 참고로 포함된다.
억제성 인터뉴런에서의 발현을 위해 최적화된 Gi-DREADD가 본원에서 사용된다. 한 실시양태에서, Gi-DREADD는 척수에서 발현된다. 한 실시양태에서, Gi-DREADD는 손상 부위에서 발현된다. 한 실시양태에서, Gi-DREADD는 억제성 인터뉴런 상에서 발현된다. 여전히 또 다른 실시양태에서, 작용제는 Gi-DREADD의 효능제, 예를 들어 클로자핀 N-옥시드와 실질적으로 동시에 투여된다. 또 다른 실시양태에서, 작용제는 Kir2.1을 상향조절한다.
본 발명의 제4 측면은 척수 손상을 가진 대상체에게 억제성 인터뉴런의 흥분성을 감소시키는 전기 자극의 유효량을 투여하는 것을 포함하는 척수 손상을 치료하는 방법을 제공한다. 경막외 척수 전기자극으로도 공지된 전기자극은 예를 들어 척수 손상으로 인해 만성 통증 또는 중증 중추 운동 장애를 앓고 있는 대상체를 위한 치료 방법이다. 전기자극은 예를 들어 척수의 경막 (예를 들어, 보호 코팅)을 거쳐 이식된 칩을 통해 척수의 하부로 연속적인 전류를 적용하는 것이다. 칩은 예를 들어 전류의 빈도 및 강도를 변화시키기 위해 원격으로 제어된다. 한 실시양태에서, 전기자극은 손상 부위가 아닌 척수에 직접적으로 (예를 들어, 척수의 손상되지 않은 부분 상에) 적용된다. 또 다른 실시양태에서, 전기자극은 손상 부위에서 척수에 직접적으로 적용된다. 한 실시양태에서, 상기 방법은 Gi-DREADD의 효능제, 예를 들어, 클로자핀 N-옥시드를 투여하는 것을 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, 본원에 기재된 전기자극은 적절한 대조군과 비교하여 억제성 인터뉴런의 흥분성을 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 99% 또는 그 초과만큼 감소시킨다. 이 문맥에서 사용된 바와 같이, 적절한 대조군은 자극되지 않은 억제성 인터뉴런의 흥분성을 지칭한다.
다양한 측면의 한 실시양태에서, 투여하기 전에, 대상체는 척수 손상을 가진 것으로 진단된다. 숙련된 임상의는 예를 들어 신체 검사 또는 방사선 진단 접근법, 예컨대 X-선, 컴퓨터 단층촬영 (CT) 스캔 및/또는 자기 공명 영상화 (MRI) 스캔을 통해 대상체가 척수 손상을 가진 것으로 진단할 수 있다.
다양한 실시양태에서, 대상체는 이전에 척수 손상을 가진 것으로 진단된 적이 있을 수 있고, 이전에 척수 손상에 대한 치료를 받은 적이 있을 수 있다.
작용제
KCC2를 상향조절하는 작용제가 본원에 기재된다. 한 실시양태에서, KCC2를 상향조절하는 작용제는 소분자, 펩티드, 유전자 편집 시스템, 또는 KCC2를 코딩하는 발현 벡터이다. 한 실시양태에서, KCC2를 상향조절하는 소분자는 CLP290 또는 그의 유도체이다. 작용제가 예를 들어 투여시 세포에서 KCC2의 존재, 양, 활성 및/또는 수준을 증가시키는 경우에, 이는 KCC2를 상향조절하는데 효과적인 것으로 고려된다. 한 실시양태에서, KCC2는 기준 수준과 비교하여 적어도 10% 상향조절되고, 예를 들어 기준 수준과 비교하여 적어도 약 20%, 또는 적어도 약 30%, 또는 적어도 약 40%, 또는 적어도 약 50%, 또는 적어도 약 60%, 또는 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 90% 증가, 또는 100% 이하의 증가, 또는 10-100%의 임의의 증가, 또는 적절한 대조군과 비교하여 적어도 약 2배, 또는 적어도 약 3배, 또는 적어도 약 4배, 또는 적어도 약 5배 또는 적어도 약 10배 증가, 20배 증가, 30배 증가, 40배 증가, 50배 증가, 60배 증가, 75배 증가, 100배 증가 등, 또는 2배 내지 10배의 임의의 또는 그 초과이다. 이 문맥에서 본원에서 사용된 바와 같이, 적절한 대조군은 비처리 세포에서 KCC2의 수준을 지칭한다. 숙련가는 본원에 기재된 기술, 예를 들어 KCC2 단백질 또는 mRNA 수준을 평가하기 위해 각각 웨스턴 블롯팅 또는 PCR-기반 검정을 이용하여 KCC2의 수준을 측정할 수 있다.
CLP290은 KCC2 활성의 소분자 인핸서이다. CLP290은 또한 [5-플루오로-2-[(Z)-(2-헥사히드로피리다진-1-일-4-옥소-티아졸-5-일리덴)메틸]페닐]피롤리딘-1-카르복실레이트로 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00001
추가로, 한 실시양태에서, 소분자는 본원에서 기재된 임의의 소분자, 예를 들어 CLP290의 유도체, 변이체 또는 유사체이다. 분자는 일반적으로 분자의 일부분이 아닌 추가의 화학적 모이어티를 함유할 때 및/또는 화학적으로 변형되었을 때 또 다른 분자의 "유도체"인 것으로 지칭된다. 이러한 모이어티는 분자의 발현 수준, 효소 활성, 가용성, 흡수, 생물학적 반감기 등을 개선시킬 수 있다. 모이어티는 대안적으로 분자의 독성을 감소시킬 수 있고, 분자의 임의의 바람직하지 않은 부작용 등을 제거하거나 약화시킬 수 있다. 이러한 효과를 매개할 수 있는 모이어티는 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A. R. Gennaro, Ed., MackPubl., Easton, PA (l990)]에 개시되어 있다. 분자의 "변이체"는 전체 분자 또는 그의 단편과 구조 및 기능에서 실질적으로 유사한 분자를 지칭하는 것으로 의도된다. 분자와 또 다른 분자 둘 다 실질적으로 유사한 구조를 갖는 경우 및/또는 분자와 또 다른 분자 둘 다 유사한 생물학적 활성을 갖는 경우, 분자는 또 다른 분자와 "실질적으로 유사한" 것이다. 따라서, 2가지 분자가 유사한 활성을 갖는다면, 분자 중 하나의 구조가 다른 분자에서 발견되지 않는 경우에도 또는 구조가 동일하지 않은 경우에도 해당 용어가 본원에서 사용되기 때문에 이들은 변이체로 고려된다. 분자의 "유사체"는 전체 분자 또는 그의 단편과 기능에서 실질적으로 유사한 분자를 지칭하기 위해 의도된다.
NKCC를 억제하는 작용제 또한 본원에 기재된다. 한 실시양태에서, NKCC를 억제하는 작용제는 소분자, 항체, 펩티드, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 또는 RNAi이다. 한 실시양태에서, KCC2를 상향조절하는 소분자는 부메타니드 또는 그의 유도체이다. 작용제는 예를 들어 투여시 세포에서 NKCC의 존재, 양, 활성 및/또는 수준을 억제하는 경우 NKCC를 억제하는데 효과적인 것으로 고려된다. 한 실시양태에서, NKCC는 적절한 대조군과 비교하여 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 99% 또는 그 초과만큼 억제된다. 이 문맥에서 본원에서 사용된 바와 같이, 적절한 대조군은 비처리 세포에서 NKCC의 수준을 지칭한다. 숙련가는 본원에 기재된 기술, 예를 들어 NKCC 단백질 또는 mRNA 수준을 평가하기 위해 각각 웨스턴 블롯팅 또는 PCR-기반 검정을 이용하여 NKCC의 수준을 측정할 수 있다.
추가로, 억제성 인터뉴런의 흥분성을 감소시키기 위해 억제성 인터뉴런에서 Gi-DREADD의 발현을 위해 Gi-DREADD를 코딩하는 발현 벡터가 본원에 기재된다. 발현 벡터가 예를 들어 투여시 세포에서 Gi-DREADD의 존재, 양, 활성 및/또는 수준을 증가시키는 경우, 이는 Gi-DREADD를 발현하는데 효과적인 것으로 고려된다. 한 실시양태에서, Gi-DREADD의 발현은 적절한 대조군과 비교하여 억제성 인터뉴런의 흥분성을 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 99% 또는 그 초과만큼 감소시킨다. 이 문맥에서 본원에서 사용된 바와 같이, 적절한 대조군은 비처리 억제성 인터뉴런의 달리 동일한 집단을 지칭한다. 숙련가는 본원에 기재된 기술, 예를 들어 Gi-DREADD 단백질 또는 mRNA 수준을 평가하기 위해 각각 웨스턴 블롯팅 또는 PCR-기반 검정을 이용하여 Gi-DREADD의 수준을 측정할 수 있다. 숙련가는 예를 들어 생물학적 샘플의 면역염색 또는 전기생리학적 기록을 통해 예를 들어 흥분성 및 억제성 인터뉴런의 핵에서 발현되는 c-fos 수준을 측정함으로써 (예를 들어, 뉴런, 예를 들어 억제성 인터뉴런의 전기 활성의 직접적인 측정) 억제제 인터뉴런의 흥분성을 측정할 수 있다. c-Fos 수준에서의 감소는 억제성 인터뉴런의 감소된 흥분성이 달성되었음을 나타낸다. 예를 들어 뉴런에서 전기생리학적 기록을 수행하는 방법은 예를 들어 [Du C., et al. ASC Biomater. Sci. Eng. 2017, 3(10), pp 2235-2246]에 추가로 검토되어 있으며, 이는 그의 전문이 본원에 참고로 포함된다.
추가로, 억제성 인터뉴런의 흥분성을 감소시키기 위해 억제성 인터뉴런에서 Kir2.1의 발현을 위해 Kir2.1을 코딩하는 발현 벡터가 본원에 기재된다. 발현 벡터가 예를 들어 투여시 세포에서 Kir2.1의 존재, 양, 활성 및/또는 수준을 증가시키는 경우, 이는 Kir2.1의 발현에 효과적인 것으로 고려된다. 한 실시양태에서, Kir2.1의 발현은 적절한 대조군과 비교하여 억제성 인터뉴런의 흥분성을 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 99% 또는 그 초과만큼 감소시킨다. 이 문맥에서 본원에서 사용된 바와 같이, 적절한 대조군은 비처리 억제성 인터뉴런의 달리 동일한 집단을 지칭한다. 숙련가는 본원에 기재된 기술, 예를 들어 Kir2.1 단백질 또는 mRNA 수준을 평가하기 위해 각각 웨스턴 블롯팅 또는 PCR-기반 검정을 이용하여 Kir2.1의 수준을 측정할 수 있다. 숙련가는 본원에서 상기 기재된 바와 같이 억제제 인터뉴런의 흥분성을 측정할 수 있다.
작용제는 예를 들어 세포에서 NKCC의 전사 또는 번역을 억제할 수 있다. 작용제는 세포에서 NKCC (예를 들어, NKCC의 발현)의 활성을 억제할 수 있거나 또는 활성을 변경시킬 수 있다 (예를 들어 이에 따라 활성이 더 이상 발생하지 않거나 또는 감소된 비율로 발생한다).
작용제는 예를 들어 세포에서 예를 들어 KCC2, Gi-DREADD 또는 Kir2.1의 전사 또는 번역을 증가시킬 수 있다. 작용제는 예를 들어 세포에서 KCC2, Gi-DREADD 또는 Kir2.1 (예를 들어, KCC2, Gi-DREADD 또는 Kir2.1의 발현)의 활성을 증가시킬 수 있거나 또는 활성을 변경시킬 수 있다 (예를 들어, 이에 따라 활성이 더욱 빈번하게 발생하거나 또는 증가된 비율로 발생한다).
작용제는 투여된 형태로 직접적으로 기능할 수 있다. 대안적으로, 작용제는 예를 들어 KCC2, Gi-DREADD 또는 Kir2.1을 상향조절하거나 또는 NKCC을 억제하는 것을 생성하도록 세포 내에서 변형되거나 또는 이용될 수 있으며, 예컨대 세포로 핵산 서열의 도입 및 그의 전사는 예를 들어 NKCC의 핵산 및/또는 단백질 억제제, 또는 세포 내에서 KCC2, Gi-DREADD 또는 Kir2.1을 상향조절하는 핵산 및/또는 단백질을 생성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 작용제는 임의의 화학물질, 개체 또는 모이어티, 예컨대 비제한적으로 합성 및 천연 발생 비-단백질성 개체이다. 특정 실시양태에서, 작용제는 화학적 모이어티를 갖는 소분자이다. 예를 들어, 화학적 모이어티에는 비치환된 또는 치환된 알킬, 방향족, 또는 헤테로시클릴 모이어티, 예컨대 마크롤리드, 렙토마이신 및 이들의 관련된 천연 생성물 또는 유사체가 포함된다. 작용제는 원하는 활성 및/또는 성질을 갖는 것으로 공지되어 있을 수 있거나 또는 다양한 화합물의 라이브러리로부터 확인될 수 있다.
다양한 실시양태에서, 작용제는 KCC2를 상향조절하거나 또는 NKCC를 억제하는 소분자이다. 소분자를 스크리닝하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 예를 들어 원하는 표적에서 (예를 들어, KCC2, 또는 NKCC) 병원성 CD4 세포의 세포 사멸을 유도하는데 효율적인 소분자를 확인하기 위해 이용될 수 있다.
다양한 실시양태에서, NKCC를 억제하는 작용제는 NKCC에 특이적인 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 또는 항체 시약이다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "항체 시약"은 적어도 1개의 면역글로불린 가변 도메인 또는 면역글로불린 가변 도메인 서열을 포함하고, 주어진 항원에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드를 지칭한다. 항체 시약은 항체, 또는 항체의 항원-결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 임의의 측면의 일부 실시양태에서, 항체 시약은 모노클로날 항체, 또는 모노클로날 항체의 항원-결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 항체는 중쇄 (H) 가변 영역 (본원에서 VH로 약칭됨) 및 경쇄 (L) 가변 영역 (본원에서 VL로 약칭됨)을 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, 항체는 2개의 중쇄 (H) 가변 영역 및 2개의 경쇄 (L) 가변 영역을 포함한다. 용어 "항체 시약"은 항체의 항원-결합 단편 (예를 들어, 단일 쇄 항체, Fab 및 sFab 단편, F(ab')2, Fd 단편, Fv 단편, scFv, CDRs, 및 도메인 항체 (dAb) 단편 (예를 들어, [de Wildt et al., Eur J. Immunol. 1996; 26(3):629-39] 참고; 이는 그의 전문이 본원에 참고로 포함됨)) 뿐만 아니라 완전 항체를 포함한다. 항체는 IgA, IgG, IgE, IgD 또는 IgM의 구조적 특징 (뿐만 아니라 이들의 아형 및 조합)을 가질 수 있다. 항체는 마우스, 토끼, 돼지, 래트, 및 영장류 (인간 및 비-인간 영장류) 및 영장류화 항체를 비롯한 임의의 공급원으로부터의 것일 수 있다. 항체에는 또한 미니바디, 나노바디, 인간화 항체, 키메라 항체 등이 포함된다.
NKCC는 안티센스 올리고뉴클레오티드이다. 본원에서 사용된 바와 같이, "안티센스 올리고뉴클레오티드"는 DNA 또는 mRNA 서열, 예컨대 마이크로RNA에 대해 상보성인 합성된 핵산 서열을 지칭한다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 전형적으로 표적에 결합하고, 전사, 번역 또는 스플라이싱의 수준에서 발현을 중단시킴으로써 DNA 또는 RNA 표적의 발현을 차단하도록 설계된다. 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 세포 조건하에 유전자, 예를 들어 NKCC에 혼성화하도록 설계된 상보성 핵산 서열이다. 따라서, 원하는 효과를 제공하기 위해 표적에 대해 충분히 상보성인, 즉, 세포 환경의 맥락에서 충분히 양호하게 및 충분한 특이적으로 혼성화하는 올리고뉴클레오티드가 선택된다. 예를 들어, NKCC를 억제하는 안티센스 올리고뉴클레오티드는 각각 인간 NKCC 유전자의 코딩 서열 (예를 들어, 서열식별번호: 4)의 일부분에 대해 상보성인 적어도 5, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30개 또는 그 초과의 염기를 포함할 수 있다.
서열식별번호: 4는 NKCC를 코딩하는 핵산 서열이다.
Figure pct00002
Figure pct00003
한 실시양태에서, 임의의 게놈 편집 시스템, 예컨대 비제한적으로, 아연 핑거 뉴클레아제, TALENS, 메가뉴클레아제, 및 CRISPR/Cas 시스템을 이용하여, NKCC가 세포의 게놈으로부터 고갈되거나, 또는 KCC2, 본원에 기재된 최적화된 Gi-DREAD, 또는 Kir2.1가 세포의 게놈에서 상향조절된다. 한 실시양태에서, 1개 이상의 가이드 RNA를 코딩하는 핵산을 세포의 게놈에 도입시키기 위해 사용되는 게놈 편집 시스템은 CRISPR/Cas 시스템이 아니며; 이는 소량의 Cas 효소/단백질을 보유하는 세포에서 바람직하지 않은 세포 사멸을 방지할 수 있다. Cas 효소 또는 sgRNA가 각각 상이한 유도성 프로모터의 제어하에 발현되어, 각각의 시간적 발현이 이러한 간섭을 방지하도록 하는 것 또한 본원에서 고려된다
1개 이상의 sgRNA를 코딩하는 핵산 및 RNA-유도된 엔도뉴클레아제를 코딩하는 핵산 각각이 생체내로 투여될 필요가 있을 때, 아데노바이러스 연관된 벡터 (AAV)의 사용이 구체적으로 고려된다. 게놈 편집/단편화 시스템의 두 성분 모두 (예를 들어, sgRNA, RNA-유도된 엔도뉴클레아제)에 핵산을 동시에 전달하는 다른 벡터에는 렌티바이러스 벡터, 예컨대 엡스타인 바르, 인간 면역결핍 바이러스 (HIV), 및 B형 간염 바이러스 (HBV)가 포함된다. RNA-유도된 게놈 편집 시스템의 각각의 성분 (예를 들어, sgRNA 및 엔도뉴클레아제)은 관련 기술분야에 공지된 바와 같이 또는 본원에 기재된 바와 같이 별도의 벡터에서 전달될 수 있다.
한 실시양태에서, 작용제는 RNA 억제 (RNAi)에 의해 NKCC를 억제한다. 주어진 유전자의 발현의 억제제는 억제성 핵산일 수 있다. 임의의 측면의 일부 실시양태에서, 억제성 핵산은 억제성 RNA (iRNA)이다. RNAi는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다.
iRNA는 siRNA, shRNA, 내인성 마이크로RNA (miRNA), 또는 인공 miRNA일 수 있다. 한 실시양태에서, 본원에 기재된 iRNA는 표적, 예를 들어 NKCC의 발현 및/또는 활성을 억제시킨다. 임의의 측면의 일부 실시양태에서, 작용제는 NKCC를 억제하는 siRNA이다. 임의의 측면의 일부 실시양태에서, 작용제는 NKCC를 억제하는 shRNA이다.
관련 기술분야의 기술자는 예를 들어 공개적으로 입수가능한 설계 도구를 이용하여 NKCC의 핵산 서열 (예를 들어, 서열식별번호: 4)을 표적화하도록 siRNA, shRNA 또는 miRNA를 설계할 수 있다. siRNA, shRNA 또는 miRNA는 일반적으로 다마콘(Dharmacon) (콜로라도주 라파예트) 또는 시그마 알드리치 (Sigma Aldrich, 미주리주 세인트 루이스)와 같은 회사를 이용하여 제조된다.
임의의 측면의 일부 실시양태에서, iRNA는 dsRNA일 수 있다. dsRNA는 dsRNA가 사용될 조건하에 듀플렉스 구조를 형성하도록 혼성화하기에 충분히 상보성인 2개의 RNA 가닥을 포함한다. dsRNA의 1개의 가닥 (안티센스 가닥)은 표적 서열에 대해 실질적으로 상보성인 및 일반적으로 완전히 상보성인 상보성 영역을 포함한다. 표적 서열은 표적의 발현 동안에 형성된 mRNA의 서열로부터 유래될 수 있다. 다른 가닥 (센스 가닥)은 안티센스 가닥에 대해 상보성인 영역을 포함하여, 적합한 조건하에 조합될 때 두 가닥이 혼성화하여 듀플렉스 구조를 형성한다.
iRNA의 RNA는 안정성 또는 다른 유익한 특징을 증강시키도록 화학적으로 변형될 수 있다. 본 발명에서 특징화된 핵산은 관련 기술분야에 널리 확립된 방법, 예컨대 ["Current protocols in nucleic acid chemistry," Beaucage, S.L. et al. (Edrs.), John Wiley & Sons, Inc., New York, NY, USA] (이는 본원에 참고로 포함됨)에 기재된 방법에 의해 합성되고/거나 변형될 수 있다.
한 실시양태에서, 작용제는 NKCC를 억제하는 miRNA이다. 마이크로RNA는 평균 22개 뉴클레오티드 길이를 갖는 소형 비코딩 RNA이다. 이들 분자는 일반적으로 3' 비번역 (3'UTR) 영역에서 mRNA 분자 내의 상보성 서열에 결합하여, 표적 mRNA 분해를 촉진시키거나 또는 mRNA 번역을 억제함으로써 작용한다. 마이크로RNA와 mRNA 사이의 상호작용은 불완전한 왓슨-크릭 염기쌍 형성을 통해 mRNA와의 서열-특이적인 결합을 지시하는 마이크로RNA의 6-8-뉴클레오티드 영역인 "시드 서열"로 공지된 것에 의해 매개된다. 900개 초과의 마이크로RNA가 포유동물에서 발현되는 것으로 공지되어 있다. 이들 중 다수는 그들의 시드 서열을 기반으로 하여 패밀리로 분류될 수 있으며, 이에 따라 유사한 마이크로RNA의 "클러스터"를 확인할 수 있다. miRNA는 세포에서 예를 들어 네이키드 DNA로서 발현될 수 있다. miRNA는 세포에서 예를 들어 네이키드 DNA로 발현된 핵산에 의해 코딩될 수 있거나 또는 벡터 내에 함유된 핵산에 의해 코딩될 수 있다.
작용제는 예컨대 RNAi 분자 (예를 들어 siRNA 또는 miRNA)에 의해 표적 유전자 (예를 들어, NKCC)의 유전자 침묵을 일으킬 수 있다. 이는 표적에 대한 세포에서 mRNA 수준을 작용제의 부재하에 세포에서 발견되는 mRNA 수준의 적어도 약 5%, 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 99%, 약 100%만큼 감소시킨다. 한 바람직한 실시양태에서, mRNA 수준은 적어도 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 99%, 약 100%만큼 감소된다. 관련 기술분야의 기술자는 예를 들어 siRNA, shRNA 또는 miRNA를 세포에 형질감염시키고, 웨스턴 블롯팅을 통해 세포 내에서 발견되는 유전자 (예를 들어, NKCC)의 수준을 검출함으로써, siRNA, shRNA 또는 miRNA가 표적, 예를 들어 NKCC에 대해 그의 하향조절을 위해 효과적인지 여부를 용이하게 평가할 수 있다.
작용제는 벡터에 함유될 수 있고, 따라서 벡터를 추가로 포함할 수 있다. 표적 포유동물 세포에 외인성 유전자를 전달하는데 유용한 이러한 여러 벡터가 이용가능하다. 벡터는 에피솜, 예를 들어 플라스미드, 바이러스-유래된 벡터, 예컨대 시토메갈로바이러스, 아데노바이러스 등일 수 있거나, 또는 상동성 재조합 또는 무작위 통합을 통해 표적 세포 게놈에 통합될 수 있으며, 예를 들어 레트로바이러스-유래된 벡터, 예컨대 MMLV, HIV-1, ALV 등일 수 있다. 일부 실시양태에서, 레트로바이러스 및 적절한 팩키징 세포주의 조합 또한 이용될 수 있으며, 여기서 캡시드 단백질은 표적 세포를 감염시키는 기능을 할 것이다. 일반적으로, 세포 및 바이러스를 배양 배지에서 적어도 약 24 시간 동안 인큐베이션할 것이다. 이어서, 세포를 일부 적용에서는 짧은 간격 동안, 예를 들어 24-73 시간 동안 또는 적어도 2 주 동안 배양 배지에서 성장시킬 수 있고, 분석하기 전에 5 주 이상 성장시킬 수 있다. 일반적으로 사용되는 레트로바이러스 벡터는 "결함성"이며, 즉, 생산적인 감염을 위해 필요한 바이러스 단백질을 생성하지 않는다. 벡터의 복제는 팩키징 세포주에서 성장을 필요로 한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "벡터"는 숙주 세포로 전달을 위해 또는 상이한 숙주 세포 사이에서 전달을 위해 설계된 핵산 구축물을 지칭한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 벡터는 바이러스 또는 비-바이러스일 수 있다. 용어 "벡터"는 적절한 대조군 요소와 회합될 때 복제할 수 있고, 유전자 서열을 세포에 전달할 수 있는 임의의 유전자 요소를 포함한다. 벡터에는 클로닝 벡터, 발현 벡터, 플라스미드, 파지, 트랜스포손, 코스미드, 인공 염색체, 바이러스, 비리온 등이 포함되나 이로 제한되지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "발현 벡터"는 벡터 상의 전사 조절 서열에 연결되어 있는 벡터에 함유된 핵산 서열로부터 RNA 또는 폴리펩티드 (예를 들어, KCC2, Gi-DREADD 또는 Kir2.1)의 발현을 지시하는 벡터를 지칭한다. 발현된 서열은 반드시 그런 것은 아니지만 종종 세포에 대해 이종성일 것이다. 발현 벡터는 추가의 요소를 포함할 수 있고, 예를 들어 발현 벡터는 2가지 복제 시스템을 포함할 수 있으며, 이에 따라 2가지 유기체에서, 예를 들어 발현을 위해 인간 세포에서 및 클로닝 및 증폭을 위해 원핵생물 숙주에서 유지될 수 있다. 용어 "발현"은 RNA 및 단백질을 생성하는데 및 적절한 경우 단백질을 분비하는데 수반되는 세포 과정, 예컨대 적절한 경우 비제한적으로 예를 들어 전사, 전사 프로세싱, 번역 및 단백질 폴딩, 변형 및 프로세싱을 지칭한다. "발현 생성물"에는 유전자로부터 전사된 RNA, 및 유전자로부터 전사된 mRNA의 번역에 의해 수득된 폴리펩티드가 포함된다. 용어 "유전자"는 적절한 조절 서열에 작동가능하게 연결될 때 시험관내 또는 생체내에서 (DNA에서) RNA로 전사된 핵산 서열을 의미한다. 유전자는 코딩 영역 이전 및 이후의 영역, 예를 들어 5' 비번역 (5'UTR) 또는 "리더" 서열 및 3' UTR 또는 "트레일러" 서열, 뿐만 아니라 개별 코딩 세그먼트 (엑손) 사이의 개재 서열 (인트론)을 포함할 수 있거나 또는 포함하지 않을 수 있다.
통합 벡터는 그들의 전달된 RNA/DNA가 숙주 세포 염색체에 영구적으로 통합되게 한다. 비-통합 벡터는 에피솜으로 남아 있으며, 이는 그에 함유된 핵산이 숙주 세포 염색체에 절대 통합되지 않음을 의미한다. 통합 벡터의 예에는 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 하이브리드 아데노바이러스 벡터, 및 단순 포진 바이러스 벡터가 포함된다.
비-통합적 벡터의 한 예는 비-통합적 바이러스 벡터이다. 비-통합적 바이러스 벡터는 숙주 DNA에 그들의 게놈을 통합시키지 않기 때문에 통합적 레트로바이러스가 안고 있는 위험을 제거한다. 한 예는 엡스타인 바르 oriP/핵 항원-1 ("EBNA1") 벡터이며, 이는 제한된 자가-복제가 가능하고, 포유동물 세포에서 기능하는 것으로 공지되어 있다. 엡스타인-바르 바이러스로부터의 2가지 요소, oriP 및 EBNA1을 함유하기 때문에, EBNA1 단백질과 바이러스 레플리콘 영역 oriP의 결합은 포유동물 세포에서 플라스미드의 비교적 장기간 에피솜 존재를 유지한다. oriP/EBNA1 벡터의 이러한 특별한 특징은 통합이 없는 iPSC의 생성에 이상적이게 만든다. 또 다른 비-통합적 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터 및 아데노-연관된 바이러스 (AAV) 벡터이다.
또 다른 비-통합적 바이러스 벡터는 RNA 센다이 바이러스 벡터이며, 이는 감염된 세포의 핵에 들어가지 않고 단백질을 생성할 수 있다. F-결핍성 센다이 바이러스 벡터는 수회의 계대 동안 감염된 세포의 세포질에 남아 있지만, 몇회의 계대 (예를 들어, 10회 계대) 이후에 신속히 희석되고 완전히 사라진다.
비-통합적 벡터의 또 다른 예는 미니서클 벡터이다. 미니서클 벡터는 플라스미드 백본이 방출되어 진핵생물 프로모터 및 발현되어야 하는 cDNA(들)만을 남기는 원형화된 벡터이다.
다양한 실시양태에서, 벡터는 혈액 뇌 장벽을 가로지른다. 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 임의의 작용제는 혈액 뇌 장벽을 가로지르도록 제형화된다. 혈액 뇌 장벽은 중추 신경계 (CNS)에서 뇌세포 외액으로부터 순환 혈액을 분리하는 매우 선택적인 반투과성 막 장벽이다. CNS로 전달될 필요가 있는 치료제의 경우에는, 숙련된 임상의가 치료제를 척수관에 직접적으로 전달한다. 척수관으로 직접적인 투여의 경우, 본원에 기재된 화합물 및 조성물은 숙련된 임상의에 의해 경막내 투여를 통해 투여될 것이다. 경막내 투여는 약물이 척수관에 또는 지주막하 공간에 직접적으로 주사되어, 뇌척수액 (CSF)으로 직접적으로 도달하게 하는 약물 투여 경로이다. 경막내 투여를 통해 투여되는 다른 약물의 비제한적인 예는 혈액 뇌 장벽을 통과할 수 없는 척추 마취제, 화학요법, 통증 관리 약물, 및 치료제이다. 벡터는 혈액 뇌 장벽을 투과하는 적어도 제2 작용제에 의해 팩키징될 수 있다. 관련 기술분야의 기술자는 예를 들어 투여후 벡터가 예를 들어 척수액에서 검출되는지를 측정함으로써 벡터가 혈액 뇌 장벽을 가로질렀는지 여부를 결정할 수 있다.
제약 조성물
척수 손상의 치료에 사용하기 위한 조성물이 본원에 기재된다. 이들 조성물의 투여 방식은 하기에서 본원에 추가로 기재된다. 다양한 실시양태에서, 본원에 기재된 임의의 제약 조성물은 적어도 제2 치료 화합물을 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 제2 치료 화합물은 척수 손상의 치료에 유용하다.
본 발명의 한 측면은 척수 손상의 치료에 사용하기 위한, KCC2 폴리펩티드, 또는 KCC2 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터의 유효량, 및 제약상 허용가능한 담체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 한 실시양태에서, KCC2 폴리펩티드는 포유동물 KCC2, 예를 들어 래트 KCC2의 핵산 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, KCC2 폴리펩티드는 서열식별번호: 1의 서열을 포함한다.
서열식별번호:1은 래트 KCC2를 코딩하는 핵산 서열이다.
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Figure pct00005
한 실시양태에서, KCC2 폴리펩티드는 서열식별번호: 1과 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 그 초과의 아미노산 서열 동일성을 갖거나, 포함하거나, 그로 이루어지거나 또는 그로 본질적으로 이루어지고, 서열식별번호: 1의 KCC2의 생물학적 활성의 적어도 80%를 보유한다. 본원에서 사용된 바와 같이, KCC2의 생물학적 활성은 칼륨 및 클로라이드 구배를 매개하는 그의 능력을 지칭하지만 이로 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 측면은 척수 손상의 치료에 사용하기 위한, Gi-DREADD 폴리펩티드, 또는 Gi-DREADD 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터의 유효량, 및 제약상 허용가능한 담체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 한 실시양태에서, Gi-DREADD 폴리펩티드는 억제성 인터뉴런에서의 발현을 위해 최적화된다. 한 실시양태에서, 조성물은 클로자핀 N-옥시드를 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, Gi-DREADD 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 서열을 포함한다.
서열식별번호: 2는 최적화된 Gi-DREADD를 코딩하는 핵산 서열이다.
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임의의 측면의 한 실시양태에서, Gi-DREADD 폴리펩티드는 서열식별번호: 2와 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 그 초과의 아미노산 서열 동일성을 갖거나, 포함하거나, 그로 이루어지거나 또는 그로 본질적으로 이루어지고, 서열식별번호: 2의 Gi-DREADD의 생물학적 활성의 적어도 80%를 보유한다.
본 발명의 여전히 또 다른 측면은 척수 손상의 치료에 사용하기 위한, Kir2.1 폴리펩티드, 또는 Kir2.1 폴리펩티드를 코딩하는 아미노산 서열을 포함하는 벡터의 유효량, 및 제약상 허용가능한 담체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
한 실시양태에서, Kir2.1 폴리펩티드는 서열식별번호: 3의 서열을 포함한다.
서열식별번호: 3은 인간 Kir2.1 폴리펩티드를 코딩하는 아미노산 서열이다.
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한 실시양태에서, Kir2.1 폴리펩티드는 서열식별번호: 3과 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 그 초과의 아미노산 서열 동일성을 갖거나, 포함하거나, 그로 이루어지거나 또는 그로 본질적으로 이루어지고, 서열식별번호: 3의 Kir2.1의 생물학적 활성의 적어도 80%를 보유한다.
한 실시양태에서, Kir2.1 폴리펩티드는 서열식별번호: 5의 서열을 포함한다.
서열식별번호: 5는 마우스 Kir2.1 폴리펩티드를 코딩하는 아미노산 서열이다.
Figure pct00008
한 실시양태에서, Kir2.1 폴리펩티드는 서열식별번호: 5와 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 그 초과의 아미노산 서열 동일성을 갖거나, 포함하거나, 그로 이루어지거나 또는 그로 본질적으로 이루어지고, 서열식별번호: 5의 Kir2.1의 생물학적 활성의 적어도 80%를 보유한다.
본 발명의 또 다른 측면은 척수 손상의 치료에 사용하기 위한, 본원에 기재된 NKCC를 억제하는 임의의 작용제의 유효량, 및 제약상 허용가능한 담체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 임의의 측면의 한 실시양태에서, 조성물은 적어도 제2 치료 화합물을 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, 조성물은 KCC2, NKCC, 본원에 기재된 최적화된 Gi-DREAD, 또는 Kir2.1을 조절하는 본원에 기재된 임의의 작용제를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "제약상 허용가능한"은 합리적인 이익/위험 비에 상응하게, 과도한 독성, 자극, 알러지 반응, 또는 다른 문제 또는 합병증이 없이, 인간 및 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합한, 건전한 의학적 판단 범위 내에 있는 이들 화합물, 물질, 조성물 및/또는 투여 형태를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "제약상 허용가능한 담체"는 하나의 장기 또는 신체의 일부분으로부터 또 다른 장기 또는 신체의 일부분으로 대상 화합물을 운반하거나 수송하는데 관여하는 제약상 허용가능한 물질, 조성물 또는 비히클, 예컨대 액체 또는 고체 충전제, 희석제, 부형제, 제조 보조제 (예를 들어, 윤활제, 활석 스테아르산마그네슘, 스테아르산칼슘 또는 스테아르산아연, 또는 스테아르산), 또는 용매 캡슐화 물질을 의미한다. 각각의 담체는 제형의 다른 성분들과 상용성이고 환자에게 무해하다는 관점에서 "허용가능한" 것이어야 한다. 제약상 허용가능한 담체로서 작용할 수 있는 물질의 일부 예에는 (1) 당, 예컨대 락토스, 글루코스 및 수크로스; (2) 전분, 예컨대 옥수수 전분 및 감자 전분; (3) 셀룰로스, 및 그의 유도체, 예컨대 나트륨 카르복시메틸 셀룰로스, 메틸셀룰로스, 에틸 셀룰로스, 미세결정질 셀룰로스 및 셀룰로스 아세테이트; (4) 분말상 트래거캔쓰; (5) 맥아; (6) 젤라틴; (7) 윤활제, 예컨대 스테아르산마그네슘, 나트륨 라우릴 술페이트 및 활석; (8) 부형제, 예컨대 코코아 버터 및 좌약 왁스; (9) 오일, 예컨대 땅콩유, 면실유, 홍화유, 참깨유, 올리브유, 옥수수유 및 대두유; (10) 글리콜, 예컨대 프로필렌 글리콜; (11) 폴리올, 예컨대 글리세린, 소르비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌 글리콜 (PEG); (12) 에스테르, 예컨대 에틸 올레에이트 및 에틸 라우레이트; (13) 한천; (14) 완충화제, 예컨대 수산화마그네슘 및 수산화알루미늄; (15) 알긴산; (16) 발열원-무함유 물; (17) 등장성 식염수; (18) 링거 용액; (19) 에틸 알콜; (20) pH 완충된 용액; (21) 폴리에스테르, 폴리카르보네이트 및/또는 폴리무수물; (22) 벌크화제, 예컨대 폴리펩티드 및 아미노산, (23) 혈청 성분, 예컨대 혈청 알부민, HDL 및 LDL; (22) C2-C12 알콜, 예컨대 에탄올; 및 (23) 제약 제형에서 사용되는 다른 무독성 상용성 물질이 포함되나 이로 제한되지 않는다. 습윤제, 결합제, 충전제, 윤활제, 착색제, 붕해제, 방출제, 코팅제, 감미제, 향미제, 향료, 보존제, 물, 염 용액, 알콜, 항산화제, 폴리에틸렌 글리콜, 젤라틴, 락토스, 아밀로스, 스테아르산마그네슘, 활석, 규산, 점성 파라핀, 히드록시메틸셀룰로스, 폴리피롤리돈 등 또한 제형에 존재할 수 있다. "부형제", "담체", "제약상 허용가능한 담체" 등과 같은 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
본원에 기재된 한 측면에서, 본원에 기재된 조성물은 혈액 뇌 장벽을 통한 통과를 용이하게 하는 작용제를 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 제약상 허용가능한 것은 혈액 뇌 장벽을 통한 통과를 용이하게 하거나 또는 그를 통과하는 능력을 갖는다.
투여
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 본원에 기재된 바와 같이 KCC2를 상향조절하는 작용제를 투여하는 것을 포함하는, 척수 손상을 갖고 있거나 또는 가진 것으로 진단된 대상체를 치료하는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 본원에 기재된 바와 같이 NKCC를 억제하는 작용제를 투여하는 것을 포함하는, 척수 손상을 갖고 있거나 또는 가진 것으로 진단된 대상체를 치료하는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 본원에 기재된 바와 같이 Gi-DREADD를 상향조절하는 작용제를 투여하는 것을 포함하는, 척수 손상을 갖고 있거나 또는 가진 것으로 진단된 대상체를 치료하는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 본원에 기재된 바와 같이 Kir2.1을 상향조절하는 작용제를 투여하는 것을 포함하는, 척수 손상을 갖고 있거나 또는 가진 것으로 진단된 대상체를 치료하는 것에 관한 것이다. 척수 손상을 가진 대상체는 상태를 진단하는 현재의 방법을 이용하여 의사에 의해 확인될 수 있다. 척수 손상을 특징화하고 진단에 도움이 되는 이러한 손상의 증상 및/또는 합병증은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 사지에서 움직임의 상실 또는 감소가 포함되나 이로 제한되지 않는다. 예를 들어 척수 손상의 진단에 도움이 될 수 있는 시험에는 x-선, MRI 스캔, 또는 CT 스캔 등이 포함되나 이로 제한되지 않는다.
본원에 기재된 작용제 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이 KCC2, Gi-DREADD, 예를 들어 최적화된 Gi-DREADD), 또는 Kir2.1을 상향조절하는 작용제, 또는 NKCC를 억제하는 작용제)는 척수 손상을 갖고 있거나 또는 가진 것으로 진단된 대상체에 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 척수 손상의 적어도 하나의 증상을 완화시키기 위해 작용제의 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "척수 손상의 적어도 하나의 증상을 완화시키는 것"은 척수 손상과 연관된 임의의 상태 또는 증상 (예를 들어, 사지에서 감각 또는 움직임의 상실)을 개선시키는 것이다. 동등한 비처리 대조군과 비교하여, 이러한 감소는 임의의 표준 기술에 의해 측정시 적어도 5%, 10%, 20%, 40%, 50%, 60%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 그 초과만큼이다. 본원에 기재된 작용제를 대상체에게 투여하기 위한 다양한 수단이 관련 기술분야의 기술자에게 공지되어 있다. 한 실시양태에서, 작용제는 전신으로 또는 국소적으로 (예를 들어, 척수로, 또는 척수 상의 손상 부위로) 투여된다. 한 실시양태에서, 작용제는 정맥내로 투여된다. 한 실시양태에서, 작용제는 연속적으로, 간격을 두고, 또는 산발적으로 투여된다. 작용제의 투여 경로는 전달될 작용제 (예를 들어, 항체, 소분자, RNAi)의 유형에 대해 최적화될 것이고, 숙련가에 의해 결정될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "유효량"은 척수 손상의 적어도 하나 이상의 증상을 완화시키기 위해 척수 손상을 갖고 있거나 또는 가진 것으로 진단된 대상체에게 투여될 수 있는 작용제 (예를 들어, KCC2, Gi-DREADD 또는 Kir2.1을 상향조절하는 작용제, 또는 NKCC를 억제하는 작용제)의 양을 지칭한다.
따라서, 용어 "치료 유효량"은 전형적인 대상체에게 투여될 때 특정한 항-척수 손상 효과를 제공하는데 충분한 작용제의 양을 지칭한다. 다양한 문맥에서 본원에 사용된 유효량은 척수 손상의 증상의 발달을 지연시키거나, 척수 손상의 증상의 과정을 변경시키거나 (예를 들어, 사지에서 감각 또는 움직임의 상실의 진행을 늦춤), 또는 척수 손상의 증상을 역전시키는데 (예를 들어, 이전에 감소되거나 상실된 사지에서의 감각 또는 움직임을 복구시킴) 충분한 작용제의 양을 또한 포함할 것이다. 따라서, 정확한 "유효량"을 명시하는 것이 일반적으로 실행가능하지 않다. 그러나, 임의의 주어진 경우에 대해, 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 일상적인 실험만을 이용하여 적절한 "유효량"을 결정할 수 있다.
한 실시양태에서, 작용제는 척수 손상 발생 이후 적어도 1 분, 적어도 2 분, 적어도 3 분, 적어도 4 분, 적어도 5 분, 적어도 10 분, 적어도 15 분, 적어도 20 분, 적어도 25 분, 적어도 30 분, 적어도 35 분, 적어도 40 분, 적어도 45 분, 적어도 50 분, 적어도 55 분, 적어도 1 시간, 적어도 2 시간, 적어도 3 시간, 적어도 4 시간, 적어도 5 시간, 적어도 6 시간, 적어도 12 시간, 적어도 18 시간, 적어도 24 시간, 적어도 36 시간, 적어도 48 시간, 적어도 60 시간, 적어도 72 시간, 적어도 96 시간, 적어도 5 일, 적어도 6 일, 적어도 1 주, 적어도 2 주, 적어도 3 주, 적어도 1 개월, 적어도 2 개월, 적어도 3 개월, 적어도 4 개월, 적어도 5 개월, 적어도 6 개월, 적어도 7 개월, 적어도 8 개월, 적어도 9 개월, 적어도 10 개월, 적어도 11 개월, 적어도 12 개월, 적어도 2 년, 적어도 3 년, 적어도 4 년, 또는 적어도 5 년 또는 그 초과 이내에 투여된다.
한 실시양태에서, 작용제는 약 0.001 내지 25 mg/kg 체중 또는 약 0.005 내지 8 mg/kg 체중 또는 약 0.01 내지 6 mg/kg 체중 또는 약 0.1 내지 0.2 mg/kg 체중 또는 약 1 내지 2 mg/kg 체중의 양으로 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 작용제는 약 0.1 내지 1000 μg/kg 체중 또는 약 1 내지 100 μg/kg 체중 또는 약 10 내지 50 μg/kg 체중의 양으로 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 작용제는 0.01 μg 내지 15 mg/kg 체중/용량, 예를 들어 10, 1, 0.1, 0.01, 0.001 또는 0.00001 mg/kg 체중/용량 범위의 양으로 사용된다. [발명자 - 어떤 범위를 사용할 것으로 예상되는가?]
유효량, 독성, 및 치료 효능은 세포 배양 또는 실험 동물에서 표준 제약 절차에 의해 평가될 수 있다. 용량은 사용되는 투여 형태 및 이용되는 투여 경로에 따라 달라질 수 있다. 독성 및 치료 효과 사이의 용량 비는 치료 지수이며, LD50/ED50 비로 표현될 수 있다. 큰 치료 지수를 나타내는 조성물 및 방법이 바람직하다. 치료 유효 용량은 세포 배양 검정으로부터 초기에 추정될 수 있다. 또한, 용량은 세포 배양에서 또는 적절한 동물 모델에서 결정되는 바와 같이 IC50 (즉, 증상의 최대 억제의 절반을 달성하는 작용제의 농도)을 포함하는 순환 혈장 농도 범위를 달성하기 위해 동물 모델에서 제형화될 수 있다. 혈장에서의 수준은 예를 들어 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 측정될 수 있다. 임의의 특정한 용량의 효과는 예를 들어 사지의 움직임을 측정하고, 반사 등을 측정하여 적합한 생물검정에 의해 모니터링될 수 있다. 용량은 의사에 의해 결정될 수 있고, 필요한 경우 관찰된 치료 효과에 맞게 조정될 수 있다.
용량
본원에서 사용된 용어 "단위 투여 형태"는 적합한 하나의 투여를 위한 용량을 지칭한다. 예를 들어, 단위 투여 형태는 전달 기기, 예를 들어 시린지 또는 정맥내 드립 백에 배치된 치료제의 양일 수 있다. 한 실시양태에서, 단위 투여 형태는 단일 투여로 투여된다. 또 다른 실시양태에서, 1개 초과의 단위 투여 형태는 동시에 투여될 수 있다.
본원에 기재된 작용제의 용량은 의사에 의해 결정될 수 있고, 필요한 경우 관찰된 치료 효과에 맞게 조정될 수 있다. 치료의 지속시간 및 빈도와 관련하여, 치료가 치료 이익을 제공하고 있는 때를 결정하기 위해, 세포를 추가로 투여할지, 치료를 중단할지, 치료를 재개할지 또는 치료 요법에 대해 다른 변경을 수행할지 여부를 결정하기 위해, 숙련된 임상의가 대상체를 모니터링하는 것이 전형적이다. 용량은 불리한 부작용, 예컨대 시토카인 방출 증후군을 일으킬 정도로 커서는 안된다. 일반적으로, 용량은 환자의 연령, 상태 및 성별에 따라 달라질 것이고, 관련 기술분야의 기술자에 의해 결정될 수 있다. 임의의 합병증이 발생할 경우에 개별 의사에 의해 용량이 또한 조정될 수 있다.
조합 요법
한 실시양태에서, 본원에 기재된 작용제는 단일요법으로 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 본원에 기재된 작용제는 척수 손상에 대한 다른 공지된 작용제 및 치료제와 조합하여 사용될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, "조합하여" 투여하는 것은, 대상체가 손상을 앓고 있는 동안에 대상체에게 2가지 (또는 그 초과) 상이한 치료를 전달하는 것, 예를 들어 대상체가 손상을 가진 것으로 진단된 후에 및 손상이 치유되거나 제거되거나 또는 다른 이유로 치료가 중단되기 전에 2가지 이상의 치료를 전달하는 것을 의미한다. 일부 실시양태에서, 투여의 관점에서 중복이 있도록, 한 치료의 전달은 제2 치료의 전달이 시작될 때 여전히 일어나고 있다. 이는 때때로 본원에서 "동시에", "실질적으로 동시에" 또는 "공동 전달"로 지칭된다. 다른 실시양태에서, 한 치료의 전달은 다른 치료의 전달이 시작되기 전에 종료된다. 이들 경우의 일부 실시양태에서, 상기 치료는 조합된 투여이기 때문에 더욱 효과적이다. 예를 들어, 제2 치료가 더욱 효과적이며, 예를 들어 제2 치료가 더 적어도 동등한 효과가 나타나거나, 또는 제2 치료가 제1 치료의 부재시에 투여된 경우에 나타나는 것에 비해 제2 치료가 증상을 더 큰 정도로 감소시키거나, 또는 유사한 상황이 제1 치료에 의해서도 나타난다. 일부 실시양태에서, 전달은 손상과 관련된 증상 또는 다른 파라미터에서의 감소가 다른 치료없이 한 치료의 전달시에 관찰되는 것보다 더 크도록 한다. 두 치료의 효과는 부분 상가적이거나, 전체 상가적이거나, 또는 상가적인 것을 초과한다. 전달은 전달된 제1 치료의 효과가 제2 치료의 전달시에 여전이 검출가능하도록 할 수 있다. 본원에 기재된 작용제 및 적어도 1종의 추가의 치료제는 동시에, 동일한 또는 별도의 조성물에서, 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 순차적 투여의 경우, 본원에 기재된 작용제가 먼저 투여될 수 있고, 추가의 작용제가 두번째로 투여될 수 있거나, 또는 투여 순서를 반대로 할 수 있다. 작용제는 또 다른 치료 이전에, 상기 치료와 동시에, 치료 후에, 또는 장애의 관해 동안에 투여될 수 있다.
척수 손상을 치료하기 위해 현재 사용되는 치료에는 물리 치료, 전기자극, 손상된 척수를 복구시키기 위한 수술, 줄기 세포 요법, 고압 산소 요법이 포함되나 이로 제한되지 않는다. 척수 손상을 치료하기 위해 사용되는 약리 치료에는 코르티코스테로이드 (예를 들어, 덱사메타손 및 메틸프레드니솔론), 간글리오시드, 티릴라자드, 날록손이 포함되나 이로 제한되지 않는다.
본원에 기재된 작용제와 함께 투여될 수 있는 추가의 화합물에는 축삭 재생 프로모터 (예컨대 오스테오폰틴, 및 성장 인자), 및 4-아미노퓨리딘이 포함되나 이로 제한되지 않는다.
골격 시알로단백질 I (BSP-1 또는 BNSP), 초기 T-림프구 활성화 (ETA-1), 분비된 인단백질 1 (SPP1), 2ar, 및 리케차(Rickettsia) 내성 (Ric)으로도 공지된 오스테오폰틴은 분비된 인단백질 1 (SPP1) 유전자에 의해 코딩된다. 오스테오폰틴은 예를 들어 골에서 발현되고, 세포외 구조 단백질로서 기능한다. 오스테오폰틴 (OPN)에 대한 서열은 수많은 종, 예를 들어 인간 오스테오폰틴 (NCBI 유전자 ID: 6696) 폴리펩티드 (예를 들어, NCBI 참고 서열 NP_000573.1) 및 mRNA (예를 들어, NCBI 참고 서열 NM_000582.2)에 대해 관련 기술분야에 공지되어 있다. 오스테오폰틴은 인간 오스테오폰틴, 예컨대 그의 천연 발생 변이체, 분자 및 대립유전자를 지칭할 수 있다. 오스테오폰틴은 예를 들어 마우스, 래트, 토끼, 개, 고양이, 소, 말, 돼지 등의 포유동물 오스테오폰틴을 지칭한다. 오스테오폰틴의 투여는 예를 들어 국제 출원 번호 WO/1999033415, US2004/0142865, 및 WO/2003046135; 또는 미국 출원 번호 US11/936,623; 또는 미국 특허 번호 6,686,444 또는 5,695,761에 기재되어 있고, 이들 각각의 내용은 그들의 전문이 본원에 참고로 포함된다.
처방 근육 강화제인 4-아미노퓨리딘 또한 C5H4N-NH2로 관련 기술분야에 공지되어 있고, 하기 구조를 갖는다.
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조합하여 투여될 때, 작용제 및 추가의 작용제 (예를 들어, 제2 또는 제3 작용제), 또는 모두는 예를 들어 단일요법으로서 개별적으로 사용되는 각각의 작용제의 양 또는 용량보다 높거나, 낮거나 또는 그와 동일한 양 또는 용량으로 투여될 수 있다. 특정 실시양태에서, 작용제 및 추가의 작용제 (예를 들어, 제2 또는 제3 작용제), 또는 모두의 투여된 양 또는 용량은 개별적으로 사용되는 각각의 작용제의 양 또는 용량보다 (예를 들어, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 또는 적어도 50%) 낮다. 다른 실시양태에서, 원하는 치료 효과 (예를 들어, 척수 손상의 치료)를 생성하는 작용제 및 추가의 작용제 (예를 들어, 제2 또는 제3 작용제), 또는 모두의 투여된 양 또는 용량은 동일한 치료 효과를 달성하기 위해 필요한 개별적인 각각의 작용제의 양 또는 용량보다 (예를 들어, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 또는 적어도 50%) 낮다.
비경구 투여 형태
본원에 기재된 작용제의 비경구 투여 형태는 다양한 경로에 의해, 예컨대 비제한적으로, 경막외 주사, 피하, 정맥내 (예컨대 볼루스 주사), 근육내, 및 동맥내로 대상체에게 투여될 수 있다. 비경구 투여 형태의 투여가 전형적으로 오염물에 대한 환자의 자연적인 방어를 우회하기 때문에, 비경구 투여 형태는 바람직하게는 멸균성이거나 또는 환자에게 투여하기 전에 멸균될 수 있다. 비경구 투여 형태의 예에는 주사를 위해 준비된 용액, 주사를 위해 제약상 허용가능한 비히클에 용해되거나 현탁될 준비된 건식 제품, 주사를 위해 준비된 현탁액, 제어 방출 비경구 투여 형태, 및 에멀젼이 포함되나 이로 제한되지 않는다.
본 개시내용의 비경구 투여 형태를 제공하기 위해 사용될 수 있는 적합한 비히클은 관련 기술분야의 기술자에게 널리 공지되어 있다. 그 예로는 비제한적으로 멸균수; 주사용수 USP; 식염수 용액; 글루코스 용액; 수성 비히클, 예컨대 비제한적으로 염화나트륨 주사, 링거 주사, 덱스트로스 주사, 덱스트로스 및 염화나트륨 주사, 및 젖산 링거 주사; 수혼화성 비히클, 예컨대 비제한적으로 에틸 알콜, 폴리에틸렌 글리콜, 및 프로필렌 글리콜; 및 비수성 비히클, 예컨대 비제한적으로 옥수수유, 면실유, 땅콩유, 참깨유, 에틸 올레에이트, 이소프로필 미리스테이트, 및 벤질 벤조에이트가 포함된다.
제어 및 지연 방출 투여 형태
본원에 기재된 측면의 일부 실시양태에서, 작용제는 제어 또는 지연 방출 수단에 의해 대상체에게 투여된다. 이상적으로, 의학적 치료에서 최적으로 설계된 제어 방출 제제의 사용은 최소 시간 내에 상태를 치유하거나 제어하기 위해 사용되는 최소의 약물 물질을 특징으로 한다. 제어 방출 제형의 이점에는 다음이 포함된다: 1) 약물의 연장된 활성; 2) 감소된 투여 빈도; 3) 증가된 환자 순응도; 4) 더 적은 총 약물의 사용; 5) 국소 또는 전신 부작용에서의 감소; 6) 약물 축적의 최소화; 7) 혈액 수준 변동에서의 감소; 8) 치료 효능에서의 개선; 9) 약물 활성의 강화 또는 손실의 감소; 및 10) 질환 또는 상태의 제어 속도에서의 개선. (Kim, Cherng-ju, Controlled Release Dosage Form Design, 2 (Technomic Publishing, Lancaster, Pa.: 2000)). 제어 방출 제형을 이용하여, 화학식 (I)의 화합물의 작용 개시, 작용의 지속시간, 치료 범위 내에서 혈장 수준, 및 피크 혈액 수준을 제어할 수 있다. 특히, 제어 또는 연장 방출 투여 형태 또는 제형을 이용하여, 약물의 과소 투여 (즉, 최소 치료 수준 아래) 뿐만 아니라 약물에 대한 독성 수준 초과 둘 다로부터 발생할 수 있는 잠재적인 부작용 및 안전성 우려를 최소화하면서 작용제의 최대 효과가 달성되는 것을 보장할 수 있다.
다양한 공지된 제어 또는 연장 방출 투여 형태, 제형 및 기기는 본원에 기재된 임의의 작용제와 함께 사용하기 위해 적합화될 수 있다. 그 예에는 미국 특허 번호: 3,845,770; 3,916,899; 3,536,809; 3,598,123; 4,008,719; 5674,533; 5,059,595; 5,591,767; 5,120,548; 5,073,543; 5,639,476; 5,354,556; 5,733,566; 및 6,365,185에 기재된 것들이 포함되나 이로 제한되지 않고, 이들 각각은 그들의 전문이 본원에 참고로 포함된다. 이들 투여 형태를 이용하여, 다양한 비율로 원하는 방출 프로파일을 제공하기 위해 예를 들어 히드록시프로필메틸 셀룰로스, 다른 중합체 매트릭스, 겔, 투과성 막, 삼투성 시스템 (예컨대, 오로스(OROS)® (알자 코퍼레이션(Alza Corporation), 미국 캘리포니아주 마운틴뷰)), 다층 코팅, 미세입자, 리포솜, 또는 미세구 또는 이들의 조합물을 사용하여 1종 이상의 활성 성분의 느린 또는 제어 방출을 제공할 수 있다. 추가로, 이온 교환 물질을 사용하여 개시된 화합물의 고정된 흡착된 염 형태를 제조하고, 이에 따라 약물의 제어 전달을 달성한다. 구체적인 음이온 교환의 예에는 듀오라이트(DUOLITE)® A568 및 듀오라이트® AP143 (롬앤하스(Rohm&Haas), 미국 펜실베니아주 스프링 하우스)이 포함되나 이로 제한되지 않는다.
효능
예를 들어 척수 손상을 치료하기 위해 본원에 기재된 작용제의 효능은 숙련된 의사에 의해 결정될 수 있다. 그러나, 척수 손상의 징후 또는 증상 중 하나 이상이 유익한 방식으로 변경되거나, 다른 임상적으로 허용되는 증상이 개선되거나 또는 심지어 향상되거나, 또는 본원에 기재된 방법에 따른 치료 이후에 원하는 반응이 예를 들어 적어도 10% 유도되는 경우에, 치료는 본원에서 사용된 용어로서 "효과적인 치료"로 고려된다. 효능은 예를 들어 본원에 기재된 방법에 따라 치료된 손상의 마커, 지표, 증상 및/또는 지수, 또는 적절한 임의의 다른 측정가능한 적절한 파라미터, 예를 들어 사지에서의 감각 및/또는 움직임을 측정함으로써 평가될 수 있다. 효능은 또한 입원 또는 의학적 개입의 필요 (즉, 사지에서 감각 또는 움직임의 상질의 진행)에 의해 평가되는 바와 같이 개체의 악화 실패에 의해 측정될 수 있다. 이들 지표를 측정하는 방법은 관련 기술분야의 기술자에게 공지되어 있고/거나 본원에 기재되어 있다.
효능은 본원에 기재된 상태를 갖는 동물 모델, 예를 들어 경우에 따라 척수 손상의 마우스 모델 또는 적절한 동물 모델에서 평가될 수 있다. 실험 동물 모델을 사용할 때, 치료 효능은 마커에서 통계적으로 유의한 변화, 예를 들어 움직임 상실 이후에 사지 움직임 증가가 관찰될 때 입증된다.
확인된 모든 특허, 특허 출원 및 공보는 예를 들어 본 발명과 관련하여 사용될 수 있는 이러한 공보에 기재된 방법을 기재하고 개시하기 위한 목적으로 본원에서 명백히 참고로 포함된다. 이들 공보는 본 출원의 출원일 이전에 그들의 개시를 위해서만 제공된다. 이와 관련하여, 어떠한 것도 본 발명자들이 선행 발명에 의해 또는 임의의 다른 이유로 이러한 개시를 앞설 자격이 없음을 인정하는 것으로 해석되어서는 안된다. 이들 문헌의 내용에 대한 날짜 또는 제시에 대한 모든 진술은 출원인이 이용가능한 정보를 기반으로 하며, 이들 문헌의 날짜 또는 내용의 정확도에 대한 어떠한 인정도 구성하지 않는다.
본 발명은 하기 넘버링된 임의의 문단에서 정의될 수 있다:
1) 척수 손상을 가진 대상체에게 뉴런-특이적인 K+-Cl- 공동-수송체 (KCC2)를 상향조절하는 작용제의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 척수 손상을 치료하는 방법.
2) 문단 1에 있어서, KCC2를 상향조절하는 작용제가 소분자, 펩티드, 유전자 편집 시스템, 및 KCC2를 코딩하는 발현 벡터로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
3) 상기 임의의 문단에 있어서, 소분자가 CLP290인 방법.
4) 상기 임의의 문단에 있어서, 벡터가 비-통합적 또는 통합적인 방법.
5) 상기 임의의 문단에 있어서, 벡터가 바이러스 벡터 또는 비-바이러스 벡터인 방법.
6) 상기 임의의 문단에 있어서, 비-통합적 벡터가 에피솜 벡터, EBNA1 벡터, 미니서클 벡터, 비-통합적 아데노바이러스, 비-통합적 RNA, 및 센다이 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
7) 상기 임의의 문단에 있어서, 바이러스 벡터가 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 헤르페스바이러스, 수두 바이러스, 알파 바이러스, 우두 바이러스, 및 아데노-연관된 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
8) 상기 임의의 문단에 있어서, 비-바이러스 벡터가 나노입자, 양이온성 지질, 양이온성 중합체, 금속성 나노입자, 나노막대, 리포솜, 미세기포, 세포 침투 펩티드 및 지방구로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
9) 상기 임의의 문단에 있어서, 벡터가 혈액 뇌 장벽을 가로지르는 것인 방법.
10) 상기 임의의 문단에 있어서, KCC2가 적절한 대조군과 비교하여 적어도 2배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배 또는 10배만큼 상향조절되는 것인 방법.
11) 상기 임의의 문단에 있어서, 척수 손상이 중증 척수 손상인 방법.
12) 상기 임의의 문단에 있어서, 대상체가 인간인 방법.
13) 상기 임의의 문단에 있어서, 대상체가 척수 손상을 가진 것으로 진단된 적이 있는 것인 방법.
14) 상기 임의의 문단에 있어서, 대상체가 이전에 척수 손상에 대해 치료받은 적이 있는 것인 방법.
15) 상기 임의의 문단에 있어서, 투여하기 전에, 대상체가 척수 손상을 가진 것으로 진단된 것인 방법.
16) 상기 임의의 문단에 있어서, 대상체가 적어도 제2 척수 손상 치료를 추가로 투여받는 것인 방법.
17) 상기 임의의 문단에 있어서, 대상체가 적어도 제2 치료 화합물을 추가로 투여받는 것인 방법.
18) 상기 임의의 문단에 있어서, 제2 치료 화합물이 오스테오폰틴, 성장 인자, 또는 4-아미노퓨리딘으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
19) 척수 손상을 가진 대상체에게 Na+/2Cl-/K+ 공동-수송체 (NKCC)를 억제하는 작용제의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 척수 손상을 치료하는 방법.
20) 문단 19에 있어서, NKCC를 억제하는 작용제가 소분자, 항체, 펩티드, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 및 RNAi로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
21) 상기 임의의 문단에 있어서, RNAi가 마이크로RNA, siRNA, 또는 shRNA인 방법.
22) 상기 임의의 문단에 있어서, 소분자가 부메타니드인 방법.
23) 상기 임의의 문단에 있어서, 작용제가 벡터에 포함되는 것인 방법.
24) 척수 손상을 가진 대상체에게 억제성 인터뉴런의 흥분성을 감소시키는 작용제의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 척수 손상을 치료하는 방법.
25) 상기 임의의 문단에 있어서, 작용제가 억제성 Gi-커플링된 수용체 Gi-DREADD를 상향조절하는 것인 방법.
26) 상기 임의의 문단에 있어서, 작용제가 Gi-DREADD를 코딩하는 발현 벡터인 방법.
27) 상기 임의의 문단에 있어서, 작용제가 Kir2.1을 코딩하는 발현 벡터인 방법.
28) 상기 임의의 문단에 있어서, 작용제와 실질적으로 동시에 클로자핀 N-옥시드를 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
29) 상기 임의의 문단에 있어서, 벡터가 혈액 뇌 장벽을 가로지르는 것인 방법.
30) 상기 임의의 문단에 있어서, 억제성 인터뉴런의 흥분성이 적절한 대조군과 비교하여 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 99% 또는 그 초과만큼 감소되는 것인 방법.
31) 상기 임의의 문단에 있어서, 투여하기 전에, 대상체가 척수 손상을 가진 것으로 진단된 것인 방법.
32) 상기 임의의 문단에 있어서, 대상체가 적어도 제2 척수 손상 치료를 투여받는 것인 방법.
33) 척수 손상을 가진 대상체에게 억제성 인터뉴런의 흥분성을 감소시키는 전기 자극의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 척수 손상을 치료하는 방법.
34) 상기 임의의 문단에 있어서, 작용제와 실질적으로 동시에 클로자핀 N-옥시드를 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
35) 상기 임의의 문단에 있어서, 전기 자극이 척수에 직접적으로 적용되는 것인 방법.
36) 상기 임의의 문단에 있어서, 전기 자극이 손상 부위에서 척수에 직접적으로 적용되는 것인 방법.
37) 상기 임의의 문단에 있어서, 억제성 인터뉴런의 흥분성이 적절한 대조군과 비교하여 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 99% 또는 그 초과만큼 감소되는 것인 방법.
38) 상기 임의의 문단에 있어서, 투여하기 전에, 대상체가 척수 손상을 가진 것으로 진단된 것인 방법.
39) 상기 임의의 문단에 있어서, 대상체가 적어도 제2 척수 손상 치료를 투여받는 것인 방법.
40) 척수 손상의 치료에 사용하기 위한, KCC2 폴리펩티드, 또는 KCC2 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터의 유효량, 및 제약상 허용가능한 담체를 포함하는 제약 조성물.
41) 상기 임의의 문단에 있어서, KCC2 폴리펩티드가 서열식별번호: 1의 서열을 포함하는 것인 제약 조성물.
42) 상기 임의의 문단에 있어서, KCC2 폴리펩티드가 서열식별번호: 1과 적어도 95% 아미노산 서열 동일성을 갖고, 서열식별번호: 1의 KCC2의 생물학적 활성의 적어도 80%를 보유하는 것인 제약 조성물.
43) 상기 임의의 문단에 있어서, 적어도 제2 치료 화합물을 추가로 포함하는 제약 조성물.
44) 척수 손상의 치료에 사용하기 위한, Gi-DREADD 폴리펩티드, 또는 Gi-DREADD 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터의 유효량, 및 제약상 허용가능한 담체를 포함하는 제약 조성물.
45) 상기 임의의 문단에 있어서, Gi-DREADD 폴리펩티드가 최적화된 Gi-DREADD 폴리펩티드인 제약 조성물.
46) 상기 임의의 문단에 있어서, Gi-DREADD 폴리펩티드가 서열식별번호: 2의 서열을 포함하는 것인 제약 조성물.
47) 상기 임의의 문단에 있어서, Gi-DREADD 폴리펩티드가 서열식별번호: 2와 적어도 95% 아미노산 서열 동일성을 갖고, 서열식별번호: 2의 Gi-DREADD의 생물학적 활성의 적어도 80%를 보유하는 것인 제약 조성물.
48) 상기 임의의 문단에 있어서, 클로자핀 N-옥시드를 추가로 포함하는 제약 조성물.
49) 상기 임의의 문단에 있어서, 적어도 제2 치료 화합물을 추가로 포함하는 제약 조성물.
50) 척수 손상의 치료에 사용하기 위한, Kir2.1 폴리펩티드, 또는 Kir2.1 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터의 유효량, 및 제약상 허용가능한 담체를 포함하는 제약 조성물.
51) 상기 임의의 문단에 있어서, Kir2.1 폴리펩티드가 서열식별번호: 3의 서열을 포함하는 것인 제약 조성물.
52) 상기 임의의 문단에 있어서, Kir2.1 폴리펩티드가 서열식별번호: 3과 적어도 95% 아미노산 서열 동일성을 갖고, 서열식별번호: 3의 Kir2.1의 생물학적 활성의 적어도 80%를 보유하는 것인 제약 조성물.
53) 상기 임의의 문단에 있어서, 클로자핀 N-옥시드를 추가로 포함하는 제약 조성물.
54) 상기 임의의 문단에 있어서, 적어도 제2 치료 화합물을 추가로 포함하는 제약 조성물.
55) 척수 손상의 치료에 사용하기 위한, 문단 19-21의 작용제의 유효량 및 제약상 허용가능한 담체를 포함하는 제약 조성물.
56) 상기 임의의 문단에 있어서, 적어도 제2 치료 화합물을 추가로 포함하는 제약 조성물.
57) 척수 손상을 가진 대상체에게 CLP290의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 척수 손상을 치료하는 방법.
58) 상기 임의의 문단에 있어서, CLP290가 혈액 뇌 장벽을 가로지르는 것인 방법.
59) 상기 임의의 문단에 있어서, 척수 손상이 중증 척수 손상인 방법.
60) 상기 임의의 문단에 있어서, 대상체가 인간인 방법.
61) 상기 임의의 문단에 있어서, 대상체가 척수 손상을 가진 것으로 진단된 적이 있는 것인 방법.
62) 상기 임의의 문단에 있어서, 대상체가 이전에 척수 손상에 대해 치료받은 적이 있는 것인 방법.
63) 상기 임의의 문단에 있어서, 투여하기 전에, 대상체가 척수 손상을 가진 것으로 진단된 것인 방법.
64) 상기 임의의 문단에 있어서, 대상체가 적어도 제2 척수 손상 치료를 추가로 투여받는 것인 방법.
65) 상기 임의의 문단에 있어서, 대상체가 적어도 제2 치료 화합물을 추가로 투여받는 것인 방법.
66) 상기 임의의 문단에 있어서, 제2 치료 화합물이 오스테오폰틴, 성장 인자, 또는 4-아미노퓨리딘으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
실시예
서론
대부분의 인간 척수 손상 (SCI)은 해부학적으로 불완전하며, 손상된 척수 분절에 걸쳐 축삭이 남아 있다. 그러나, 이들 환자 중 대략 절반은 손상 수준 아래에서 근육 조절 및 감각의 완전 상실을 가지며 (Fawcett et al., 2007; Kakulas, 1999), 이는 남아 있는 연결이 기능적으로 휴면 상태임을 시사한다. 놀랍게도, 최근의 연구는 재활 훈련과 함께 경막외 자극이 SCI를 가진 일부 만성 마비 환자가 자발적인 움직임을 회복할 수 있게 한다는 것이 입증되었다 (Angeli et al., 2014; Harkema et al., 2011). 가정되는 메카니즘은, 이들 조직이 이러한 휴면 상태의 척수 회로를 재활성화시켜, 뇌-유래된 신호가 척수로 중계될 수 있게 한다는 것이다. 그러나, 이러한 남아 있는 척수 회로가 SCI 이후에 왜 기능장애가 되는지와, 어떻게 하면 최상으로 재활성화될 수 있는지는 거의 알려져 있지 않다.
뒷다리 기능의 경우, 기본적인 운동을 수행하기 위한 척수 중심인 중추 패턴 발생기 (CPG)가 주로 요추 척수에 위치한다 (Frigon and Rossignol, 2008; Gerasimenko et al., 2008; Grillner and Wallen, 1985; Kiehn, 2016). 신생아 동물로부터 단리된 척수를 사용하는 고전적인 연구는, 신경 흥분성의 약리학적 조작이 원심성 패턴을 개시하고 조절할 수 있음을 보여주었다 (Cazalets et al., 1992; Cowley and Schmidt, 1995; Kiehn, 2006). 무손상 동물에서, 요추 운동 중심의 출력은 뇌로부터의 하행 명령에 의해 부분적으로 제어된다. SCI에 의해 이들 입력이 상실된 후에, 심지어 감각 구심성이 무손상인 경우에도 요추 척수는 운동 기능을 시작하는데 실패한다. SCI 이후 기능을 복구시키기 위해서는, 하행 입력과 요추 척수 사이의 연결을 재확립하는 것이 중요하다. 예를 들어, 보상성 축삭 재성장 및 시냅스 재조직화는 SCI 이후에 상이한 척수 수준에서 이러한 연결을 증강시킬 수 있다 (Ballermann and Fouad, 2006; Bareyre et al., 2004; Courtine et al., 2008; Filous and Schwab, 2017; He and Jin, 2016; Jankowska and Edgley, 2006; Rosenzweig et al., 2010; Takeoka et al., 2014; van den Brand et al., 2012; Zaporozhets et al., 2011). 대부분의 하행 척수-돌출 경로가 손상된 중증 척수 손상에서, 단일 척수 분절에 제한된 국소 인터뉴런, 및 축삭이 여러 척수 분절을 가로지르는 돌출 척수고유 뉴런으로 이루어지는 척수내 네트워크의 연계성은 요추 척수로 뇌-유래된 운동 명령을 수신하고 전송하는 간접적인 중계 경로로서 기능할 수 있다 (O'Shea et al., 2017; Zaporozhets et al., 2011).
남아 있는 연결이 SCI 이후 보상하는데 제한된 능력을 갖는 이유를 설명하기 위해 상이한 가설이 제안되었다. 예를 들어, 남아 있는 하행 축삭을 갖는 뉴런의 발화 및 전도 성질이 손상될 수 있다 (Edgerton et al., 2008; Arvanian et al., 2009; Sawada et al., 2015). 대안적으로, 국소 척수 회로가 손상에 의해 기능을 상실하여, 남아 있는 하행 입력을 더이상 중계하거나 통합시킬 수 없을 수 있다 (Courtine et al., 2008; Edgerton et al., 2008; Rossignol and Frigon, 2011). 이들 및 다른 인자의 기여는 특징분석되어야 한다. 더우기, 남아 있는 척수 뉴런의 흥분성을 억제하거나 또는 증강시키는 것이 SCI 이후에 기능 회복을 위해 유익한지 여부도 명확하지 않다.
신경 흥분성을 조절하는 세포 및 분자 메카니즘을 특징분석하는데 있어서 현저한 진전이 이루어졌다. 그 결과, 핵심 조절인자, 예컨대 이온 채널 및 수용체를 표적화하기 위한 수많은 소분자 화합물이 개발되었고, 그들의 약리학적 성질이 잘 특성분석되었다. 중요하게는, 이들 여러 화합물은 혈액-뇌-장벽 (BBB)을 효율적으로 가로지를 수 있고, 이는 이들 소분자의 전신 투여가 SCI 동물 모델에서 그들의 효과를 분석하는 것을 가능하게 한다. 따라서, SCI 모델에서 휴면 상태의 척수 회로를 재활성화시킬 수 있고 궁극적으로 기능 회복을 매개할 수 있는 신경 활성 조절인자를 확인하기 위한 편향되지 않은 화합물 스크리닝 접근법이 본원에서 제시된다.
결과
CLP290는 엇갈린 병변을 가진 마비된 마우스에서 일관된 보행 능력을 복구시킨다.
이전에 기재된 모델과 유사하게 2개의 측면 반절단이 흉추 (T) 7 및 T10 수준에서 동시에 수행된 엇갈린 병변 패러다임이 최적화되었다 (도 1a 및 1b) (Courtine 2008; van den Brand, 2012). T10 병변은 척수 중간선에서 종결되는 측면 반절단인 반면에, T10 병변에 대해 반대쪽에 있는 T7 병변은 중간선을 넘어서 약간 연장되어 있다 (도 1a). 이러한 이중 반절단 절차에 의해, T10을 통과하는 모든 하행 축삭이 절단되어, T7과 T10 사이의 중간선을 가로지르는 축삭만이 무손상으로 남는다 (도 1c). 실제로, 세로토닌성 축삭을 표지하는 항-5-HT 항체에 의한 면역조직화학에 의해, 하행 세로토닌성 축삭이 요추 척수에서가 아니라 병변들 사이의 척수 분절에서 검출될 수 있었다 (도 1c). 따라서, 중계 대역은 하행 축삭이 종결되는 병변 (T7 및 T10) 사이 및 주위에 남아 있고, 일부 척수고유 뉴런은 요추 척수 뉴런과 그들의 연결을 유지한다 (하기 참고).
이러한 엇갈린 병변을 가진 마우스는 거의 완전하고 영구적인 뒷다리 마비를 나타내었다 (도 1e 및 1f). 손상 이후 10 주 동안에, 손상된 마우스는 발목 움직임을 거의 나타내지 않았고, 어떠한 유형의 보행도 전혀 나타내지 않았으며, 바쏘 마우스 스케일 (Basso Mouse Scale, BMS; 확립된 개방 필드 운동 시험 (Basso et al., 2006))에서 0.5 또는 1의 점수를 가졌다. 따라서, T7과 T10 사이에 남아 있는 중계 경로는 휴면 상태로 유지되어야 한다.
이러한 이중 반절단 SCI 모델을 이용하여, 지상 운동 동안에 뒷다리 운동 성능을 모니터링함으로써 남아 있지만 휴면 상태인 척수 연결을 재활성화시킬 수 있는 소분자 화합물을 찾았다. 이를 위해, 매일 화합물 처리를 손상 이후 1 주째에 시작한 다음, 전날의 화합물 처리 대략 24 시간 후에 매주 BMS 점수를 모니터링하였다 (도 1d). 이들 시점에서 관찰된 거동 결과는 지속된 처리 효과를 반영하며, 이는 임상적으로 더욱 관련이 있다.
후보 화합물은 전신 전달시 신경 흥분성을 조절하는 그들의 능력을 기반으로 하여 선택하였다. 그들에는 다음이 포함된다: 바클로펜, GABA 수용체 효능제; 부메타니드, Na+/2Cl-/K+ 공동-수송체 (NKCC)의 억제제; CLP290, 뉴런-특이적인 K+-Cl- 공동-수송체 (KCC2)의 효능제, SLC12A5로도 지칭됨; L838,417, GABAA 양성 알로스테릭 조절인자; CP101606, NMDA 수용체 길항제; 8-OHDPAT, 5HT1A/7 효능제; 및 퀴파진, 5HT2A/C 효능제 (도 1e, 7a). 이들 처리 중 하나는 매일 처리 이후 처음 2-3 주 내에 보행 능력에서 유의한 개선을 나타내었다. 그러나, CLP290-처리된 마우스에서, 기능 회복은 4-5 주째에 처음 나타났고, 처리 이후 7 주째부터 유의해지기 시작했다 (도 1e). 부메타니드 또한 다소 효과를 나타내었지만, 통계적 유의성이 없었다 (도 7a). 따라서, 추가의 분석은 CLP290-처리된 SCI 마우스에 집중하였다.
주로 마비된 뒷다리를 입증한 대조군 마우스 및 다른 화합물로 처리된 마우스와는 대조적으로, CLP290-처리된 마우스의 대부분 (80%)은 일관된 뒷발 족저 배치, 및 체중-지탱 보행을 회복하였다 (대부분은 배측 보행이고, 일부는 족저 보행임; 도 1f). 중증 손상 모델에서는 보행 능력이 기능 회복에 대한 제한 단계로서 관련되었기 때문에, 이러한 회복 정도는 기능적으로 유의한 것이다 (Schucht et al., 2002). 보행 동안에, CLP290-처리된 마우스는 부분적으로 그들의 체중을 지탱할 수 있었고, 뒷다리 관절의 유의하게 증가된 진동을 나타내었다 (도 1h-1k). 대조군 손상된 마우스의 근전도 (EMG) 기록에 의해 (도 1k), 발목 전경골 굴근 (TA)은 거의 활동하지 않은 반면에, 신근 비복근 가자미근 (GS)의 활동은 전혀 관찰되지 않은 것으로 확인되었다. 대조적으로, CLP290-처리된 마우스는 TA 및 GS 활동을 둘 다 나타내었다 (도 1k). 결과적으로, CLP290 처리된 마우스에서 총 뒷다리 보폭은 유의하게 증가되었다 (도 1j). 흥미롭게도, 보행 동안에 TA (유각기) 및 GS (입각기)의 활성화가 변경된 무손상 마우스와는 상이하게, CLP290-처리된 SCI 마우스는 유각기 동안에 TA 및 GS의 공동-활성화를 나타내었고 (도 1k), 이는 차선적인 체중 지탱의 지표이다.
추가로, CLP290-유도된 회복을 가진 마우스에서, 처리 중단 이후 1-2 주 동안 BMS 점수가 대조군에 비해 유의하게 높게 유지되었고 (도 1g), 이는 지속된 기능 회복이 CLP290 처리로 인한 것임을 시사한다. 이들 실험 마지막에, 요추 영역에서는 항-5-HT 항체에 의한 면역염색이 관찰되지 않았고, 이는 이들 마우스에서 엇갈린 병변의 성공을 입증하였다 (도 7c). 이와 함께, 이들 결과는 CLP290 처리가 대부분의 마비된 마우스가 지속된 방식으로 체중-지탱 보행 능력을 복구할 수 있게 한다는 것을 입증한다.
CLP290 처리는 완전 병변을 가진 마우스에서 기능적 개선을 유도하지 않는다.
CLP290의 효과는 SCI 이후 척수에서 남아 있는 휴면 상태의 하행 연결을 재활성화시킴으로써 발생할 수 있다. 그러나, 이는 하행 입력과는 무관하게 요추 척수에도 직접적으로 작용할 수 있다. 이들 가능성을 구별하기 위해, 축삭이 병변 부위를 가로지르지 않는 완전 T8 척수 횡절단을 가진 마우스에게 동일한 CLP290 처리를 적용하였고 (도 7d), CLP290이 임의의 유의한 기능 회복을 촉진시키는데 실패하였음을 확인하였다 (도 7e). 반대로, 5-HT 수용체 효능제 퀴파진은 엇갈린 병변 (도 7b) 및 T8 완전 횡절단 모델 (도 7f) 둘 다에서 신속하지만 일시적인 BMS 개선 (10 분째에 시작하여, 2 시간 미만 동안 지속됨)을 유도하였다. 따라서, 요추 척수에 직접적으로 작용하는 이러한 일시적인 이펙터와는 상이하게, 기능 개선에 대한 CLP290의 효과는 남아 있는 연결에 따라 좌우된다.
CLP290은 축삭 재성장에 영향을 미치지 않는다.
엇갈린 병변 또는 완전 병변을 가진 마우스가 유사한 SCI-연관된 거동 결함 (통증 및 경직)을 나타내기 때문에, 본원에 제시된 결과는 CLP290이 엇갈린 병변을 가진 마우스에서 기능 회복을 유도한다는 것을 보여주며, 이는 단지 CLP290의 기능 개선이 이러한 진통 및 진경 효과와는 독립적일 가능성이 있음을 시사한다. 따라서, CLP290에 대해 가능한 메카니즘은 예를 들어 요추 척수로 축삭 발아를 촉진시킴으로써 및/또는 중계 경로 신호의 충실도를 증가시킴으로써 남아 있는 중계 경로에 의존할 가능성이 있다.
이들 가능성을 시험하기 위해, CLP290이 남아 있는 척수고유 축삭 및/또는 뇌로부터 그들의 연결 축삭의 재성장을 증가시켰는지 여부를 결정하였다. 각각의 조건에서 뒷다리 운동 조절 중심으로의 신경 돌출을 분석하기 위해, mCherry를 발현하는 역행 추적 위형 렌티바이러스 벡터 (HiRet) (HiRet-mCherry) (Kato et al., 2011; Wang et al., 2017; Liu et al., 2017)를 요추 확장부 (L2-L4)에 주사하였다. 손상 이후 2 주째에, 대부분의 역행 표지된 뉴런이 병변 사이 및 주위의 척수 분절에서 발견되었고, 병변 위에서 약간 발견되었으며, 뇌에서는 전혀 발견되지 않았다 (도 82). 척수에서 역행 추적된 뉴런의 개수는 손상 이후 10 주째에 증가하였고, 이는 이전의 보고와 일치하였지만 (Courtine et al., 2008), CLP290 처리는 이들 측정에 영향을 미치지 않았다 (도 8c 및 8f). 유사하게, AAV-ChR2-mCherry 및 AAV-ChR2-GFP에 의한 뇌로부터 순행 추적은 손상 이후 2 및 10 주째에 CLP290-처리된 마우스의 척수에서 하행 뇌간 망상척수 축삭 (도 9a-9c) 또는 피질척수 축삭 (도 9g-9i)의 증가된 발아를 나타내는데 실패하였다. 유사하게, 5-HT 면역조직화학에 의해 검출된 세로토닌성 축삭의 발아 또한 CLP290 처리에 의해 영향을 받지 않았다 (도 9d-9f). 따라서, CLP290이 중계 대역으로 뇌-유래된 하행 축삭의 재성장 또는 요추 척수로 척수고유 축삭 돌출을 촉진시킴으로써 작용할 가능성은 낮다.
KCC2 발현은 기능 회복을 촉진시키기 위해 CLP290의 효과를 모방한다.
CLP290은 K+-Cl- 공동-수송체 KCC2의 활성화제인 것으로 확인되었지만, 다른 표적에 대해서도 작용할 수 있다 (Gagnon et al., 2013). 따라서, CNS 뉴런에서 KCC2의 과발현이 엇갈린 병변을 가진 마우스에서 CLP290과 유사한 효과를 갖는지 여부를 결정하였다. 성체 마우스에서 BBB를 가로지를 수 있는 AAV-PHP.B 벡터의 이점을 활용하여 (Deverman et al., 2016), 인간 시냅신 프로모터의 제어하에 KCC2를 발현하는 AAV-PHP.B (AAV-PHP.B-syn-HA-KCC2)를 꼬리 정맥에 주사하였다. KCC2가 검출가능하게 발현되는데 1-2 주 걸리기 때문에, 손상 직후에 주사하였다. 이어서, 매주 거동 모니터링을 수행하였다 (도 2a). 도 2b에 도시된 바와 같이, AAV-PHP.B-KCC2 처리는 손상 이후 8 주째에 분석시 모든 척수 분절에서 HA-태그 부착된 KCC2의 광범위한 발현을 나타내었다. 대조군 AAV-PHP.B-H2B-GFP와는 대조적으로, AAV-PHP.B-KCC2 처리는 CLP290 (도 1e-1j)과 유사한 정도로 또는 그보다 더 높은 정도로 유의한 기능 회복을 유도하였다 (도 2c-2h). 실제로, AAV-KCC2 처리 이후 8 주째에, 이들 마우스 중 80%가 TA 및 GS와 관련된 발목 관절 움직임으로 보행할 수 있었고, 이들 마우스 중 대략 절반이 발목 및 무릎 움직임 둘 다에 의한 족저 보행을 달성할 수 있었다 (도 2d 및 2h). 추가로, AAV-KCC2 처리된 마우스는 입각기 동안에 빈번한 GS 발화를 가지면서 부분적으로 그들의 체중을 지탱할 수 있었다 (도 2e 및 h).
이 실험의 종료시에 (손상 이후 9-10 주째), 척수에서 KCC2의 발현 수준을 웨스턴 블롯팅에 의해 분석하였다. 대조군 마우스에서, 손상 이후 요추 및 병변간 척수 분절에서 KCC2가 유의하게 감소되고 (도 10a 및 10b), 이는 이전의 보고와 일치한다 (Boulenguez et al., 2010; Cote et al., 2014). 그러나, AAV-KCC2 처리는 AAV-GFP 대조군에 비해 비손상 마우스와 유의하게 더 근접한 수준으로 KCC2 발현을 복구하였다 (도 10a 및 10b). 따라서, AAV-KCC2는 SCI-유도된 KCC2 하향조절을 방해함으로써 작용할 가능성이 있다.
억제성 인터뉴런에서 선택적 KCC2 발현은 기능 회복을 유도한다.
다음으로, 특이적인 유형의 뉴런에서 KCC2 발현이 관찰된 기능 회복을 설명하는지 여부를 평가하였다. 이를 위해, AAV-PHP.B-FLEX-KCC2 (Cre-의존성 KCC2 발현)를 손상 직후에 Vglut2-Cre (흥분성 뉴런의 경우 (Tong et al., 2007)), Vgat-Cre (억제성 뉴런의 경우 (Vong et al., 2011)) 또는 Chat-Cre (운동 뉴런 및 인터뉴런 하위집합의 경우 (Rossi et al., 2011))의 성체 마우스의 꼬리 정맥에 주사하였다 (도 3a 및 3b). Chat-Cre 및 Vglut2-Cre 마우스와는 대조적으로, AAV-PHP.B-FLEX-KCC2를 주사한 Vgat-Cre 마우스는 CLP290 처리 (도 1) 또는 비-선택적 KCC2 발현 (도 2)과 유사한 정도로 유의한 기능 회복 (도 3c-3e)을 나타내었다. 따라서, 이들 결과는 억제성 인터뉴런에서 KCC2 기능장애 또는 하향조절이 엇갈린 병변을 가진 마우스에서 뒷다리 기능 회복을 제한함을 시사한다.
KCC2는 기능 회복을 유도하기 위해 엇갈린 병변 사이 및 주위의 척수 분절에서 억제성 인터뉴런을 통해 작용한다.
도 7 및 8에 도시된 바와 같이, 엇갈린 병변 사이 및 주위의 척수 분절로 이루어지는 중계 대역에서 척수고유 뉴런은 뇌-유래된 신호를 요추 척수로 중계할 가능성이 있다. 따라서, 엇갈린 병변을 가진 마우스에서 KCC2-매개된 뒷다리 기능 회복에 대한 2가지 가능한 메카니즘이 있다: (1) KCC2는 요추 분절 (L2-5)에서 억제성 인터뉴런에 대해 작용하여, 척수고유 입력의 통합을 용이하게 하고/거나, (2) KCC2는 요추 척수 위의 중계 대역에서 억제성 뉴런에 대해 작용하여, 하행 경로로부터 뇌-유래된 입력의 통합 및/또는 요추 척수로 그의 중계를 용이하게 한다.
이들 가능성을 시험하기 위해, AAV-KCC2 또는 AAV-FLEX-KCC2를 야생형 마우스 또는 Vgat-Cre 마우스의 요추 분절 (L2-5)에 국소 주사하였다 (도 4a-b 및 10c). 이들 처리는 유의한 기능 회복을 유도하지 않았으며 (도 4c-d), 이는 요추 척수에서 억제성 뉴런이 KCC2의 기능 회복 효과를 매개할 가능성이 없음을 시사한다.
엇갈린 병변 사이 및 주위의 척수 분절에 KCC2를 도입하기 위해, 손상 직후 병변 부위 주위의 손상된 혈액-척수-장벽을 이용하였다. AAV-KCC2 또는 AAV-FLEX-KCC2를 과도하게 엇갈린 병변 이후 3 시간째에 야생형 또는 Vgat-Cre 마우스 각각의 꼬리 정맥에 주사하였다 (도 4e). 그 결과, KCC2 발현이 T5와 T12 사이에 걸쳐 일어났다 (도 4f 및 10d). 이들 동물에서, 증가된 BMS 성능과 함께 유의한 및 지속적인 기능 회복이 AAV-PHP.B-KCC2 처리 (도 2)와 비교가능한 정도로 두 마우스 그룹 모두에서 관찰되었다 (도 4g 및 4h). AAV-FLEX-KCC2를 갖는 이들 Vgat-Cre 마우스에서, CLP290 처리의 병행은 대부분의 시점에서 기능 회복을 유의하게 증강시키지 않았으며 (도 10e), 이는 CLP290의 효과가 주로 이들 억제성 인터뉴런에서 KCC2를 활성화시킴으로써 매개된다는 개념과 일치한다. 따라서, KCC2/CLP290은 주로 흉추 척수 수준에서 병변 부위 사이 및 그와 인접한 중계 대역에서 억제성 뉴런을 통해 작용하여, 뒷다리 기능 회복을 용이하게 한다.
CLP290/KCC2는 흥분성 및 중계 형성을 변경시킨다.
성숙한 뉴런에서, GABA 및 글리신은 클로라이드 채널을 개방하여 클로라이드 이온 유입을 가능하게 하여 과분극화를 초래할 수 있기 때문에 이는 억제성이다. 대조적으로, 발달 동안에, 상승된 세포내 클로라이드 수준은 GABAA- 및 글리신-매개된 전류를 탈분극시키고 일반적으로 흥분시킨다. 출생후 초기 생애 동안에, 출생후 뉴런에서 KCC2 상향조절은 세포내 클로라이드 농도를 감소시켜, 여기를 억제로 변환시키는데 중요하다 (Ben-Ari et al., 2012; Kaila et al., 2014). 따라서, 손상-유도된 KCC2 하향조절 (Boulenguez et al., 2010; Cote et al., 2014)은 GABA 및 글리신 수용체가 뉴런을 탈분극시킬 수 있는 미성숙 상태를 복구시킬 것으로 예상된다. 이 시나리오에서, 척수 억제성 뉴런에서 KCC2 활성화는 중계 대역의 국소 회로를 하행 입력에 대해 더욱 수용적인 더욱 생리학적인 상태로 변환시킬 것이다. 이를 실험하기 위해, 손상 이후 8 주째에 및 1 시간 동안 쳇바퀴에서 걷게 한 후에 c-Fos 면역반응을 T7과 T10 사이의 척수 분절에서 신경 활성의 대용으로 사용하였다. 각각의 그룹에서, 이들 척수 분절에서 대부분의 c-Fos-양성 세포를 신경 마커인 NeuN으로 양성으로 염색하였다 (도 11a, 11b). c-Fos/NeuN 이중-양성 세포의 대표적인 합성물이 도 5a에 도시된다. 처리하지 않은 손상된 마우스에서, c-Fos-양성 뉴런은 척수의 배각에 집중되었고 (도 5a-5c), 이는 아마도 이들 손상된 마우스에서 말초 감각 입력에 대한 과민성을 반영하는 것이다. CLP290 또는 AAV-KCC2 처리에 의해, c-Fos-양성 뉴런의 분포는 매우 상이해 졌고, 배각 (추궁판 I-V)에서는 감소되고, 중간/복측 척수에서는 유의하게 증가하였다 (도 5a-5c). 이 KCC2-전환된 분포 패턴은 걷기에 대한 반응으로 무손상 마우스에서 검출된 것과 유사하였다 (도 5a-5c). CLP290 처리의 중지 이후 2 주째에, c-Fos 패턴이 처리가 없을 때 보인 것으로 되돌아 왔고 (도 11c 및 11d), 이는 거동 결과와 일치한다 (도 1g). 종합하면, 이들 발견은 KCC2 활성의 증가가 더욱 생리학적인 신경 활성 패턴을 국소 척수 회로로 복구시킨다는 것을 시사한다.
대조군으로서, 신경병성 통증을 감소시키는 것으로 확인된 GABA 효능제인 L838,417로의 만성 처리 이후에 엇갈린 손상을 가진 마우스의 척수에서 c-Fos 면역반응을 실험하였다 (Knabl et al., 2008). 도 5a-5b에 도시된 바와 같이, L838,417은 배각에서 c-Fos-양성 뉴런을 감소시켰지만, 중간 대역 및 복측 영역에서는 상기 뉴런을 증가시키지 않았고, 이는 L838,417 처리가 기능적 운동 회복을 촉진시키는데 실패했다는 결과를 확증시킨다 (도 7a). 중간 및 복측 척수가 하행 입력의 주요 종결 대역이기 때문에, 이 영역에서 증가된 신경 활성은 L838,417 처리가 아니라 CLP290/KCC2 처리 이후에 하행 입력에 대한 개선된 반응을 반영할 가능성이 있다. 따라서, 이들 결과는 만성 KCC2/CLP290 처리가 중계 대역의 SCI-유도된, 감각-중심 활성화 패턴을 감각 및 하행 경로 둘 다의 조절하에 있는 상태로 변환시킴을 시사한다.
처리된 척수가 요추 척수로의 하행 입력을 더욱 효율적으로 중계하는지를 직접적으로 시험하기 위해, TA 근육에서 피질 자극을 수행하여 EMG 반응을 기록하였다 (도 5d). 피질-자극 반응의 잠재시간은 무손상 마우스에 비해 SCI 마우스에서 유의하게 지연되었고, KCC2-관련 처리는 자극 반응의 잠재시간을 단축시키는데 실패하였다 (도 5d 및 5e). 이들 결과는 다중 시냅스 연결이 손상된 마우스의 요추에서 피질 자극을 운동 뉴런으로 중계하는 KCC2-활성화된 회로에 존재한다는 개념과 일치한다. 한편, 유발된 EMG 신호의 진폭은 대조군과 비교하여 AAV-PHP.B-syn-HA-KCC2 또는 CLP290에 의해 처리된 손상된 마우스에서 유의하게 증가하였고 (도 5d 및 5f), 이는 KCC2가 이 척수 회로의 중계 효율을 유의하게 증강시켰음을 시사한다. 따라서, KCC2 처리는 뇌로부터 요추 척수로 하행 입력의 전달을 용이하게 한다.
억제성 뉴런 흥분성의 DREADD-보조된 조절은 KCC2/CLP290의 효과를 모방한다.
억제성 인터뉴런의 흥분성을 감소시키는 것이 KCC2 및 CPL290의 효과를 모방할 수 있는지를 시험하기 위해, 손상 이후 3 시간째에 Vgat-Cre 마우스의 꼬리 정맥에 AAV9 벡터 (AAV9-FLEX-hM4Di-mCherry 또는 AAV9-GFP)를 주사함으로써, 억제성 Gi-커플링된 수용체 Gi-DREADD인 (Krashes et al., 2011) hM4Di-mCherry가 병변 사이 및 주위의 억제성 인터뉴런에서 발현되었다 (도 6a). Gi-DREADD를 선택적으로 활성화시키는 클로자핀 N-옥시드 (CNO) (Roth, 2017)를 매일 투여하였고, 매주 거동을 모니터링하였다. CNO 투여 이후 24 시간째에 시험하였을 때 (CLP290과 동일한 처리 스케쥴을 이용함), 손상된 마우스가 GFP가 아니라 hM4Di에 의해 CLP290 또는 KCC2 처리에서 관찰된 것과 유사한 정도의 지속된 기능 회복을 나타내는 것으로 확인되었다 (도 6c). 추가로, hM4Di- 및 CNO-처리된 마우스는 연속 걷기 이후에 KCC2-관련 처리에 의해 관찰된 것과 유사한 c-Fos 발현 패턴을 나타내었다 (도 6d-f 및 도 5a). 따라서, 이들 결과는 억제성 인터뉴런의 흥분성을 감소시키는 유익한 효과를 입증하였다.
hM4Di를 통한 SCI 마우스의 병변간 분절 내의 전반적인 탈억제, 및 KCC2-관련 처리가 흥분성 뉴런의 활성을 증가시킬 수 있음을 고려할 때, 흥분성 인터뉴런의 직접적인 활성화가 억제성 인터뉴런을 억제하는 효과를 모방할 수 있는지가 의문이었다. AAV9-GFP 또는 AAV9-FLEX-hM3Dq-mCherry를 엇갈린 병변 직후에 Vglut2-Cre 마우스의 꼬리 정맥에 주사하였다 (도 12a). 도 12b에 도시된 바와 같이, 매일 CNO 전달과 함께, 흥분성 척수 뉴런에서 이러한 탈분극 hM3Dq의 발현 (AAV9-FLEX-hM3Dq-mCherry에서 Vglut2-Cre로)은 매일 CNO 처리 8 주 이내에 기능 회복을 유도하는데 실패하였다. 흥미롭게도, CNO 투여 직후에, 일시적인 기능 개선이 있었지만, 뒷다리 경직이 있었고 (도 12c, 데이터는 도시되지 않음), 이는 퀴파진 처리 이후에 보인 것과 유사하였다 (도 7b). 따라서, 척수에서 억제성 인터뉴런의 흥분성을 직접적으로 감소시키지만, 흥분성 인터뉴런의 흥분성을 직접적으로 증가시키지 않는 것이, 하행 입력에 대한 반응을 증강시키고, 궁극적으로 중증 SCI 이후 지속적인 기능 회복을 촉진시키기 위한 강력한 전략이다.
논의
요천추 척수로의 모든 척수위 하행 연결을 제거하는 양측 반절단 모델을 이용하여, 약리학적으로 또는 AAV-보조된 유전자 전달을 통해 만성 KCC2 활성화가 휴면 상태의 남아 있는 회로를 재활성화시키고, 지속적인 뒷다리 보행을 일으킨다는 것이 입증되었다. 병변 사이 및 요추 척수 위에서 척수 분절의 억제성 인터뉴런이 주로 이 효과를 매개한다. 손상-유도된 KCC2 하향조절을 방해함으로써, 이들 처리가 중계 대역에서 신경 흥분성을 조절하여, 손상에 의해 기능이 상실된 척수 회로를 되살리는 것이 제안된다. 그 결과, 이들 국소 회로가 하행 돌출로부터 요추 척수로 명령을 더 잘 중계할 수 있고, 따라서 거동 회복을 개선시킨다.
상이한 처리에 대한 기계적 차이 및 관련성. 이전의 연구는, 심지어 완전 흉추 SCI에서도, 약리학적 접근법, 예컨대 GABA/글리신 수용체의 세로토닌성 및 도파민성 효능제 및 길항제가 즉각적이지만 일시적인 뒷다리 운동을 유도할 수 있음을 나타내었다 (Courtine et al., 2009; de Leon et al., 1999; Edgerton et al., 2008; Robinson and Goldberger, 1986; Rossignol and Barbeau, 1993). 요추 척수가 이들 "척추 동물"에서 뇌로부터 완전히 분리되었기 때문에, 이러한 약리학적 처리는 척수 회로의 흥분성을 변경시킴으로써 작용하여, 감각 입력에만 반응할 수 있도록 한다. 일관되게, 세로토닌성 효능제는 완전 및 엇갈린 병변 모델 둘 다에서 급성이지만 단지 일시적인 운동 (화합물 투여후 2-3 시간 이하 동안)을 유도하였고, 지속된 개선이 없었음이 확인되었다. 대조적으로, CLP290은 엇갈린 병변이지만 완전 병변이 아닌 마우스에서 지속된 기능 회복을 유도하였다. 따라서, 세로토닌성 조절인자가 요추 척수에서 국소 감각-유도된 회로에 대해 작용할 가능성이 있지만, CLP290은 SCI 이후에 뇌로부터 휴면 상태의 남아 있는 연결을 동원한다.
추가로, 경막외 자극 및 재활의 조합 치료가 또한 엇갈린 병변을 가진 래트에서 (세로토닌성 및 도파민성 효능제의 약리학적 칵테일과 함께) (van den Brand et al., 2012), 및 심지어 일부 만성 SCI 환자에서 (Angeli et al., 2014; Harkema et al., 2011) 어느 정도의 자발적인 움직임을 유도하는 것으로 확인되었고, 광범위한 축삭 발아가 이들 래트에서 관찰되었지만 (van den Brand et al., 2012), 축삭 발아가 기능 개선과 인과 관계가 있는지 여부는 알려지지 않았다. 최근의 연구는, 요추 분절의 배측 측면에 적용된 전기 신경조절이 주로 고유수용성 피드백 회로와 관련이 있음을 시사한다 (Capogrosso et al., 2013; Hofstoetter et al., 2015; Wenger et al., 2014). 그러나, 이것이 하행 입력-의존성의 자발적인 움직임의 기능 복구를 어떻게 유도하는지는 알려지지 않고 있다. 요추 척수 위의 중계 대역에서 억제성 인터뉴런의 흥분성을 감소시키는 것이 이 척수 회로가 요추 척수로 뇌-유래된 명령을 중계하게 하는데 충분하다는 것을 보여주는 이들 결과에 비추어 볼 때, 경막외 자극 및/또는 조합된 치료가 또한 그들의 기능적 효과를 매개하는데 이러한 억제성 인터뉴런과 관련이 있는지 여부를 시험하는 것이 흥미로울 것이다.
KCC2 및 재균형 척수 운동 회로. 손상은 국소 KCC2 하향조절과 같이 척수에서 수많은 변경을 촉발시킨다. 본원에 제시된 결과는, 억제성 인터뉴런에서 KCC2의 재활성화가 SCI 이후 척수 네트워크를 가로질러 여기/억제 비 (E/I 비)를 재확립시킬 수 있음을 시사한다. 이는 억제성 입력이 신경 네트워크 내에서 특정한 발화 패턴을 조각하는데 있어서 뿐만 아니라, 네트워크 활성이 기능장애되는 것을 방지하는데 있어서 중요하다는 개념과 일치한다 (Mohler et al., 2004). 중요하게는, 모든 억제-강화 조작이 효과적인 것은 아니다. KCC2 또는 Gi-DREADD와는 대조적으로, GABA 수용체 효능제는 척수를 가로질러 전반적인 활성화 패턴을 감소시키는 것으로 보이지만, 더욱 생리학적인 활성화 패턴을 재확립하거나 또는 기능 개선을 촉진시키는데는 실패하였다. 이는 그의 직접적이고 비-선택적 억제 때문일 수 있는데, L838,417 처리가 중요한 복부 운동 연관된 추궁판을 비롯하여 모든 척수 영역에서 신경 활성화 수준을 감소시켰기 때문이고, 이는 운동 조절의 품질을 전반적으로 감소시킬 것으로 예상된다. 최종적으로, 척수 흥분성 인터뉴런의 직접적인 여기는 SCI 이후에 지속적인 기능 회복을 유도하는데 실패하였다. 따라서, 흥분성 또는 억제성 신경전달을 광범위하게 표적화하는 대신에, 억제성 인터뉴런의 흥분성을 미세하게 조정하는 것이 척수 네트워크가 운동 기능의 성공적인 회복에 대한 하행 및 감각 입력 둘 다에 대해 수용적이게 만드는데 더욱 효과적인 전략인 것으로 보인다.
번역적 관점. 고처리량 스크리닝으로부터 확인된 선택적 KCC2 활성화제를 기반으로 하여, CLP290은 전신 투여를 위해 최적화되었고 (Gagnon et al., 2013), 동물 모델에서 신경병성 통증을 효과적으로 치료하는 것으로 확인되었다 (Ferrini et al., 2017; Gagnon et al., 2013). 이 연구에서 시험한 다른 화합물과는 달리, CLP290은 고용량에서도 무시할만한 부작용을 나타내었다 (데이터는 도시되지 않음). 대부분의 SCI 환자가 일부 남아 있는 축삭을 갖기 때문에, 이들 결과는 이 BBB-투과성 소분자인 CLP290이 이들 경우에 유망한 치료일 수 있음을 시사한다. 그럼에도 불구하고, 뒷다리 기능의 모든 측면이 이들 실험에서 복구되지는 않았다. 따라서, 추가의 연구는 SCI 이후 뒷다리 회복에 대해 CLP290과 다른 치료, 예컨대 추가의 재활 훈련을 조합한 치료 효과를 연구해야 한다.
물질 및 방법
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
마우스 계통. 모든 실험 절차를 보스턴 어린이 병원(Boston Children's Hospital)에서 기관 동물 관리 및 이용 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)에 의해 승인된 동물 프로토콜을 준수하여 수행하였다. 이 연구에서 사용된 마우스에는 다음이 포함되었다: C57BL/6 야생형 (WT) 마우스 (챨스 리버(Charles River), 계통 코드#027); 및 C57BL/6 유전적 백그라운드에서 유지된 Vgat-Cre (Jax#28862), VGlut2-Cre (Jax#28863) 및 ChAT-Cre (Jax#28861) 마우스 계통. 거동 특징을 위해, 사용된 모든 실험 동물은 상이한 한배 새끼로부터의 것이었다. 19~21g 성체 암컷 마우스를 무작위화하고, 손상 이전에 상이한 처리 그룹으로 배정하였고, 동물 연구에 대해 다른 특정한 무작위화는 이용하지 않았다. 거동 시험은 맹검으로 실험하였다.
화학물질 및 항체. 전신 투여의 경우 (i.p.): 퀴파진 [시그마 (Q1004), 0.2 mg/kg)] 및 8-OH-DPAT [토크리스(Tocris) (0529), 0.1 mg/kg)]를 0.9% NaCl에 현탁시켰고; 바클로펜 [토크리스 (0417), 1 mg/kg)]을 100mM NaOH에 이어서 0.9% NaCl에 현탁시켰고; CP101606 [시그마 (SML0053), 10 mg/kg)]을 DMSO에 이어서 0.9% NaCl에 현탁시켰고; CLP290 [파마블록(PharmaBlock)에 의해 합성됨, 25mg/kg]을 DMSO에 이어서 20% 2-히드록시프로필-β-시클로덱스트린에 현탁시켰고; L838,417 [파마블록에 의해 합성됨, 1mg/kg]을 0.5% 메틸셀룰로스 및 0.9% NaCl에 현탁시켰고; 부메타니드 [토크리스, (3108), 0.3 mg/kg)]를 15% DMSO에 현탁시켰다. 면역염색 및 웨스턴 블롯팅의 경우, 일차 항체를 사용하였다: 닭 항-GFP [압캡(Abcam) (Cat: ab13970)], 토끼 항-RFP [압캡 (Cat: ab34771)], 토끼 항-GFAP [DAKO (Z0334)], 토끼 항-5-HT [이뮤노스타(Immunostar) (20080)], 래트 항-HA [시그마 (11867423001)], 토끼 항-c-Fos [셀 시그널링(Cell signaling) (2250s)], 마우스 항-NeuN [밀리포어(Milipore) (MAB377)]; 및 토끼 항-KCC2 [밀리포어 (07-432)].
수술 절차. T7 및 T10 이중 측면 반절단의 절차는 다른 것에 기재된 것과 유사하였다 (Courtine et al., 2008; van den Brand et al., 2012). 간략히, 흉추에 걸쳐 중간선을 절개한 후, T7-10 추궁절제술을 수행하였다. T7 우측 과다-반절단의 경우, 메스 및 미세-가위를 주의해서 사용하여 T7에서 양측 배측 컬럼을 중단시켰고, 반대측 상의 복측 경로가 남지 않도록 하였다 (도 1a). T10 좌측 반절단의 경우, 메스 및 미세-가위를 주의해서 사용하여 중간선까지 척수의 좌측만을 중단시켰다. 이어서, 근육 층을 봉합하고, 피부를 창상 클립으로 고정하였다. 모든 동물은 사후 조직학적 분석을 받았으며, 요추 척수 (L2-5)에서 남아 있는 5HT 축삭을 가진 것들은 거동 분석을 위해 제외되었다 (도 7).
T8 완전 횡절단의 절차는 다른 것에 기재된 것과 유사하였다 (Courtine et al., 2009). 간략히, 흉추에 걸쳐 중간선을 절개한 후, T8 추궁절제술을 수행하였다. 이어서, 완전 T8 횡절단을 메스 및 미세-가위 둘 다를 사용하여 주의해서 수행하였다. 이어서, 근육 층을 봉합하고, 피부를 창상 클립으로 고정하였다.
EMG 기록 및 피질 자극. 자유롭게 움직이는 동물에서 EMG 기록 절차는 이전에 기재된 것과 유사하였다 (Pearson et al., 2005). 간략히, 수술 이후 9 주째에, 각각의 그룹 (대조군, CLP290 및 AAV-KCC2 처리된 마우스)으로부터 5 마리의 마우스의 선택된 뒷다리 근육에 맞춤식 양극성 전극을 이식하여, EMG 활성을 기록하였다. 전극 (793200, 에이-엠 시스템즈(A-M Systems))을 30 게이지 니들에 의해 연결하고, 우측 뒷다리의 내측 비복근 (GS) 및 전경골근 (TA)의 중간에 삽입하였다. 일반적인 접지선을 목-어깨 영역에 피하로 삽입하였다. 와이어는 피하로 등을 통해 마우스의 두개에 단단히 접합된 소형 경피 커넥터로 이어졌다. EMG 신호는 10-1000 Hz 여과에 의한 시차 AC 증폭기 (1700, 에이-엠 시스템즈, 워싱턴주)를 이용하여 획득하였고, 디지타이저 (파워랩(PowerLab) 16/35, 에이디인스트루먼츠(ADInstruments)))를 사용하여 4 kHz에서 샘플링하고, 랩차트(LabChart) 8 (에이디인스트루먼츠)에 의해 분석하였다.
경막외 자극 및 EMG 기록을 위해, 맞춤식 헤드 플레이트를 두개 위에 고정하고, 단극 자극 전극 (SSM33A05, 월드 프리시젼 인스트루먼츠, 인크.(World Precision Instruments, Inc.))을 좌측 운동 피질의 대표적인 뒷다리 영역에 걸쳐 경막외로 위치시켰다. 전기 자극의 트레인 (0.2ms 2상 펄스, 100ms 펄스 트레인, 20 Hz, 0.5-1.5 mA)을 펄스 발생기 및 절연기 (마스터(Master) 9 및 이소-플렉스(Iso-Flex), A.M.P.I.)에 의해 생성하였고, 완전히 깨어있는 상태에서 네 발로 서 있는 동안에 전달하였다. 시험은 전기화학 자극의 부재 및 존재하에 수행되었다. 유발된 반응의 피크-대-피크 진폭 및 잠재시간을 우측 TA 근육의 EMG 기록으로부터 계산하였다.
바이러스 생성 및 주사. KCC2 과발현 바이러스 주사 절차를 위해, AAV2/PHP.B-Syn-HA-KCC2 및 AAV2/9-Syn-HA-KCC2를 WT 마우스의 꼬리 정맥에 주사하였다. AAV2/PHP.B-Syn-FLEX-HA-KCC2를 Vgat-Cre, Vglut2-Cre 및 ChAT-Cre 마우스 꼬리 정맥에 주사하였다. AAV2/9-Syn-HA-KCC2 및 AAV2/9-Syn-FLEX-HA-KCC2, AAV2/9-Syn-FLEX-hM4Di-mCherry 및 AV2/9-Syn-FLEX-hM3Dq-mCherry를 WT, Vgat-Cre 또는 Vglut2-cre 마우스 꼬리 정맥에 주사하였다. 꼬리 정맥 바이러스 주사는 SCI 이후 3 시간째에 이전에 기재된 것과 같이 수행하였다 (Deverman et al., 2016) (AAV 역가는 4-5x1013 카피/ml 주사로 조정되었고, 더 바이러스 코어, 보스턴 어린이 병원 (The Viral Core, Boston Children's Hospital)에 의해 생성되었음). AAV2/1-Syn-HA-KCC2 및 AAV2/1-Syn-FLEX-HA-KCC2를 WT 및 Vgat-Cre 마우스 각각의 요추 수준 (L2-4)에서 척수내로 주사하였다. 요추 수준 척수내 바이러스 주사를 SCI 절차 하루 전에 수행하여, 요추 수준 척수내 주사에 의해 초래되는 임의의 가능한 거동 결함을 제거하였다 (AAV 역가는 0.5-1x1013 카피/ml 주사로 조정되었고, 더 바이러스 코어, 보스턴 어린이 병원에 의해 생성되었음).
망상척수 추적 실험을 위해 (절차는 이전에 기재되었음 (Esposito et al., 2014)), AAV2/8-ChR2-YFP 및 AAV2/8-ChR2-mCherry를 각각 뇌 줄기에서 마우스 우측 및 좌측 망상체에 주사하였다. CST 추적 실험을 위해 (절차는 이전에 기재되었음 (Liu et al., 2010; Liu et al., 2017)), AAV2/8-ChR2-mCherry를 마우스 우측 감각운동 피질에 주사하였다 (모든 AAV 역가는 0.5-5x1013 카피/ml 주사로 조정되었고, 더 바이러스 코어, 보스턴 어린이 병원에 의해 생성되었음). 요추 수준 역행 추적의 경우, HiRet-mCherry의 벡터 (렌티-바이러스 역가는 1.6-2x1012 카피/ml 주사로 조정되었음)를 HiRet-렌티 백본을 기반으로 하여 구축하였다 (Kinoshita et al., 2012). 주사 절차는 이전에 기재되었고 (Wang et al., 2017), HiRet-mCherry를 분절 2-4로부터의 좌측 또는 우측 요추 척수에 주사하였다.
면역조직화학 및 영상화. 파라포름알데히드 (PFA) 고정된 조직을 30% 수크로스에 의해 동결보호하고, 저온 유지 장치를 사용하여 가공하였다 (척수에 대한 단면 두께 40 μm). 염색하기 전에 0.5% 트리톤-100을 갖는 10% 정상 당나귀 혈청을 함유하는 차단 용액으로 실온에서 2 시간 동안 단면을 처리하였다. 일차 항체 (4□, 밤새)를 사용하였다: 토끼 항-GFAP [DAKO (Z0334), 1:600]; 토끼 항-5-HT [이뮤노스타 (20080), 1: 5,000]; 닭 항-GFP [압캡 (ab13970), 1:400]; 토끼 항-RFP [압캡 (ab34771), 1:400]; 토끼 항-PKCγ [산타 크루즈(Santa Cruz) (sc211),1:100]; 래트 항-HA [시그마 (11867423001), 1:200]; 토끼 항-c-Fos [셀 시그널링 (2250s), 1:100]; 및 마우스 항-NeuN [밀리포어 (MAB377), 1:400]. 이차 항체 (실온, 2h)를 사용하였다: 알렉사 플루오르 488-접합된 당나귀 항 닭 및 토끼; 및 알렉사 플루오르 594-접합된 당나귀 항 토끼 (모두 인비트로겐(Invitrogen)으로부터). 네 다리로 자유롭게 연속 걷기 (무손상), 보행 (CLP290 또는 AAV-KCC2 처리된 마우스) 또는 끌기 (비히클 또는 AAV-GFP 처리된 마우스)의 1 시간 후에 척수 뉴런의 c-Fos 면역반응을 이전에 기재된 바와 같이 결정하였다 (Courtine et al., 2009). 마우스를 그들의 우리에 되돌려 놓은 다음, 약 2 시간 후에 마취시키고 포스페이트 완충된 식염수 (PBS) 중 4% PFA (wt/vol)를 심장내로 관류하여 희생시켰다.
척수 횡단면 및 종단면을 공초점 레이저-스캐닝 현미경 (자이쓰(Zeiss) 700 또는 자이쓰 710)을 사용하여 영상화하였다. 상이한 척수 분절 횡단면 (도 10a 및 10c) 뿐만 아니라 5HT 축삭 염색 (도 10b)에서 망상척수로 돌출 (RFP+ 및 GFP+) 및 피질척수로 (CST) 돌출 (GFP+)의 형광 강도를 정량화하고 비교하기 위해. 여러 조건하에 분석을 위해 사용된 모든 영상은 동일한 광학 파라미터를 이용하여 취하여 포화를 피하였다. 밀도계측 측정은 FIJI 소프트웨어를 사용하여 백그라운드에 대해 준역치화(sub-thresholded)하고 면적에 의해 정규화한 후에 구하였다.
상이한 처리에서 척수 뉴런의 역행 HiRet-표시된 세포체를 정량화하고 비교하기 위해, 모든 영상을 개별 채널 및 평면으로 분해하였다. 맞춤-개발된 MATLAB 코드를 사용하여 이들을 정렬하고 정량화하였다. HiRet-표시된 뉴런을 수동으로 좌표를 배정하였다.
웨스턴 블롯팅. 동물을 이소플루란 마취 후에 참수에 의해 사망시켰다. 척수를 T5에서 L1까지 신속히 절단하고, 350 μm 슬라이스로 나누었다. 20 mmol/L 트리스 (pH 7.4), 125 mmol/L NaCl, 10% 글리세롤, 1% 트리톤 X-100,0.5% DCA, 0.1% SDS, 20 mmol/L NaF, 1 mmol/L 페닐메틸술포닐 플루오라이드, 4 μg/mL 아프로티닌, 4 μg/mL 류펩틴, 및 1 mmol/L Na3VO4를 함유하는 저온 용해 완충제 중에서 샘플을 균질화시켰다. 이어서, 샘플을 13,000 g에서 4℃에서 10 분 동안 원심분리하였다. 상청액에서 단백질 농도를 비신코닌산 단백질 검정 키트 (바이오-라드, 캘리포니아주 허큘레스)를 사용하여 평가하였다. 동일한 양의 단백질 추출물을 4-20% SDS-PAGE에 의해 분해하고, 폴리비닐리덴 디플루오라이드 막 (밀리포어, 메사추세츠주 베드포드) 상에 전기 전달하였다. 트리스-완충된 식염수 및 3% BSA 중에서 차단시킨 후, 막을 1/500으로 희석된 폴리클로날 토끼 KCC2-특이적인 항체 (밀리포어) 또는 1/2000으로 희석된 폴리클로날 토끼 베타-액틴 항체 (셀 시그널링)에 차단 용액 중에서 4℃에서 밤새 노츨시켰다. 화학발광 검출 (피어스 바이오텍(Pierce Biotech))을 위해 이뮤노퓨어(ImmunoPure) 염소 서양고추냉이 퍼옥시다제-접합된 토끼-특이적인 항체를 사용하였다 (차단 용액 중에서 1/500, 22℃에서 1 시간).
거동 실험. 운동 기능을 바쏘 마우스 스케일 (BMS) 상에서 운동 개방 필드 등급 스케일로 평가하였다. 일시적인 약리학적 처리의 경우, 거동 시험하기 10 내지 15 분 전에 (van den Brand et al., 2012) (지상 걷기, 모두 개별적으로 수행됨), 마우스에게 상기 나열된 신경 조절인자를 전신 투여하였다 (i.p.). 단일 복막내 주사에 의해 혈장 CNO 수준이 15 분째에 피크였고, 주사 2 시간 후에 매우 낮아지기 시작했다 (Guettier et al., 2009). 만성 약리학적 처리를 위해, 거동 시험하기 24 시간 전에, 마우스에게 상기 나열된 화합물을 전신 투여하였다. 모든 거동 시험은 1-3 시간 내에 완료되었다. 상세한 뒷다리 운동학적 분석을 위해, 상이한 그룹으로부터의 마우스를 모터레이터(MotoRater) (티에스이 시스템즈(TSE Systems)에 두었고 (Zorner et al., 2010)), 모든 운동학적 분석을 모터레이터에 의해 수집된 데이터를 기반으로 하여 수행하였다.
정량화 및 통계적 분석. 임의의 파라미터 시험을 적용하기 전에, 정규성 및 분산 유사성을 STATA (버전 12, 컬리지 스테이션(College station), 미국 텍사스주)에 의해 측정하였다. 양측 스튜던트 t-검사를 두 그룹 사이의 단일 비교를 위해 이용하였다. 나머지 데이터는 적절한 설계에 따라 일원 또는 이원 ANOVA를 이용하여 분석하였다. 사후 비교는 일차 측정이 통계적 유의성을 나타낸 경우에만 수행하였다. 다중 비교의 P-값은 본페로니 보정에 의해 조정되었다. 모든 도면에서 오차 막대는 평균 ± S.E.M을 나타낸다. 상이한 한배 새끼, 체중 및 성별을 갖는 마우스를 무작위화하고, 상이한 처리 그룹으로 배정하였고, 동물 연구에 대해 다른 특정한 무작위화는 이용하지 않았다.
참고문헌
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ctctgtgcaa cgccaccttt 1380 aaaaagacct tccggcacct gctgctgtgc cagtatcgga acatcggcac tgccaggcg 1439 <210> 3 <211> 427 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Met Gly Ser Val Arg Thr Asn Arg Tyr Ser Ile Val Ser Ser Glu Glu 1 5 10 15 Asp Gly Met Lys Leu Ala Thr Met Ala Val Ala Asn Gly Phe Gly Asn 20 25 30 Gly Lys Ser Lys Val His Thr Arg Gln Gln Cys Arg Ser Arg Phe Val 35 40 45 Lys Lys Asp Gly His Cys Asn Val Gln Phe Ile Asn Val Gly Glu Lys 50 55 60 Gly Gln Arg Tyr Leu Ala Asp Ile Phe Thr Thr Cys Val Asp Ile Arg 65 70 75 80 Trp Arg Trp Met Leu Val Ile Phe Cys Leu Ala Phe Val Leu Ser Trp 85 90 95 Leu Phe Phe Gly Cys Val Phe Trp Leu Ile Ala Leu Leu His Gly Asp 100 105 110 Leu Asp Ala Ser Lys Glu Gly Lys Ala Cys Val Ser Glu Val Asn Ser 115 120 125 Phe Thr Ala Ala Phe Leu Phe Ser Ile Glu Thr Gln Thr Thr Ile Gly 130 135 140 Tyr Gly Phe Arg Cys Val Thr Asp Glu Cys Pro Ile Ala Val Phe Met 145 150 155 160 Val Val Phe Gln Ser Ile Val Gly Cys Ile Ile Asp Ala Phe Ile Ile 165 170 175 Gly Ala Val Met Ala 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catggacgct 660 gtgcccagga tcgatcacta ccggcacaca gccgcgcagc tgggcgagaa gctgctccgg 720 cctagcctgg cggagctcca cgacgagctg gaaaaggaac cttttgagga tggctttgca 780 aatggggaag aaagtactcc aaccagagat gctgtggtca cgtatactgc agaaagtaaa 840 ggagtcgtga agtttggctg gatcaagggt gtattagtac gttgtatgtt aaacatttgg 900 ggtgtgatgc ttttcattag attgtcatgg attgtgggtc aagctggaat aggtctatca 960 gtccttgtaa taatgatggc cactgttgtg acaactatca caggattgtc tacttcagca 1020 atagcaacta atggatttgt aagaggagga ggagcatatt atttaatatc tagaagtcta 1080 gggccagaat ttggtggtgc aattggtcta atcttcgcct ttgccaacgc tgttgcagtt 1140 gctatgtatg tggttggatt tgcagaaacc gtggtggagt tgcttaagga acattccata 1200 cttatgatag atgaaatcaa tgatatccga attattggag ccattacagt cgtgattctt 1260 ttaggtatct cagtagctgg aatggagtgg gaagcaaaag ctcagattgt tcttttggtg 1320 atcctacttc ttgctattgg tgatttcgtc ataggaacat ttatcccact ggagagcaag 1380 aagccaaaag ggttttttgg ttataaatct gaaatattta atgagaactt tgggcccgat 1440 tttcgagagg aagagacttt cttttctgta tttgccatct tttttcctgc tgcaactggt 1500 attctggctg gagcaaatat ctcaggtgat cttgcagatc ctcagtcagc catacccaaa 1560 ggaacactcc tagccatttt aattactaca ttggtttacg taggaattgc agtatctgta 1620 ggttcttgtg ttgttcgaga tgccactgga aacgttaatg acactatcgt aacagagcta 1680 acaaactgta cttctgcagc ctgcaaatta aactttgatt tttcatcttg tgaaagcagt 1740 ccttgttcct atggcctaat gaacaacttc caggtaatga gtatggtgtc aggatttaca 1800 ccactaattt ctgcaggtat attttcagcc actctttctt cagcattagc atccctagtg 1860 agtgctccca aaatatttca ggctctatgt aaggacaaca tctacccagc tttccagatg 1920 tttgctaaag gttatgggaa aaataatgaa cctcttcgtg gctacatctt aacattctta 1980 attgcacttg gattcatctt aattgctgaa ctgaatgtta ttgcaccaat tatctcaaac 2040 ttcttccttg catcatatgc attgatcaat ttttcagtat tccatgcatc acttgcaaaa 2100 tctccaggat ggcgtcctgc attcaaatac tacaacatgt ggatatcact tcttggagca 2160 attctttgtt gcatagtaat gttcgtcatt aactggtggg ctgcattgct aacatatgtg 2220 atagtccttg ggctgtatat ttatgttacc tacaaaaaac cagatgtgaa ttggggatcc 2280 tctacacaag ccctgactta cctgaatgca ctgcagcatt caattcgtct ttctggagtg 2340 gaagaccacg tgaaaaactt taggccacag tgtcttgtta tgacaggtgc tccaaactca 2400 cgtccagctt tacttcatct tgttcatgat ttcacaaaaa atgttggttt gatgatctgt 2460 ggccatgtac atatgggtcc tcgaagacaa gccatgaaag agatgtccat cgatcaagcc 2520 aaatatcagc gatggcttat taagaacaaa atgaaggcat tttatgctcc agtacatgca 2580 gatgacttga gagaaggtgc acagtatttg atgcaggctg ctggtcttgg tcgtatgaag 2640 ccaaacacac ttgtccttgg atttaagaaa gattggttgc aagcagatat gagggatgtg 2700 gatatgtata taaacttatt tcatgatgct tttgacatac aatatggagt agtggttatt 2760 cgcctaaaag aaggtctgga tatatctcat cttcaaggac aagaagaatt attgtcatca 2820 caagagaaat ctcctggcac caaggatgtg gtagtaagtg tggaatatag taaaaagtcc 2880 gatttagata cttccaaacc actcagtgaa aaaccaatta cacacaaagt tgaggaagag 2940 gatggcaaga ctgcaactca accactgttg aaaaaagaat ccaaaggccc tattgtgcct 3000 ttaaatgtag ctgaccaaaa gcttcttgaa gctagtacac agtttcagaa aaaacaagga 3060 aagaatacta ttgatgtctg gtggcttttt gatgatggag gtttgacctt attgatacct 3120 taccttctga cgaccaagaa aaaatggaaa gactgtaaga tcagagtatt cattggtgga 3180 aagataaaca gaatagacca tgaccggaga gcgatggcta ctttgcttag caagttccgg 3240 atagactttt ctgatatcat ggttctagga gatatcaata ccaaaccaaa gaaagaaaat 3300 attatagctt ttgaggaaat cattgagcca tacagacttc atgaagatga taaagagcaa 3360 gatattgcag ataaaatgaa agaagatgaa ccatggcgaa taacagataa tgagcttgaa 3420 ctttataaga ccaagacata ccggcagatc aggttaaatg agttattaaa ggaacattca 3480 agcacagcta atattattgt catgagtctc ccagttgcac gaaaaggtgc tgtgtctagt 3540 gctctctaca tggcatggtt agaagctcta tctaaggacc taccaccaat cctcctagtt 3600 cgtgggaatc atcagagtgt ccttaccttc tattcataa 3639 <210> 5 <211> 428 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 5 Met Gly Ser Val Arg Thr Asn Arg Tyr Ser Ile Val Ser Ser Glu Glu 1 5 10 15 Asp Gly Met Lys Leu Ala Thr Met Ala Val Ala Asn Gly Phe Gly Asn 20 25 30 Gly Lys Ser Lys Val His Thr Arg Gln Gln Cys Arg Ser Arg Phe Val 35 40 45 Lys Lys Asp Gly His Cys Asn Val Gln Phe Ile Asn Val Gly Glu Lys 50 55 60 Gly Gln Arg Tyr Leu Ala Asp Ile Phe Thr Thr Cys Val Asp Ile Arg 65 70 75 80 Trp Arg Trp Met Leu Val Ile Phe Cys Leu Ala Phe Val Leu Ser Trp 85 90 95 Leu Phe Phe Gly Cys Val Phe Trp Leu Ile Ala Leu Leu His Gly Asp 100 105 110 Leu Asp Thr Ser Lys Val Ser Lys Ala Cys Val Ser Glu Val Asn Ser 115 120 125 Phe Thr Ala Ala Phe Leu Phe Ser Ile Glu Thr Gln Thr Thr Ile Gly 130 135 140 Tyr Gly Phe Arg Cys Val Thr Asp Glu Cys Pro Ile Ala Val Phe Met 145 150 155 160 Val Val Phe Gln Ser Ile Val Gly Cys Ile Ile Asp Ala Phe Ile Ile 165 170 175 Gly Ala Val Met Ala Lys Met Ala Lys Pro Lys Lys Arg Asn Glu Thr 180 185 190 Leu Val Phe Ser His Asn Ala Val Ile Ala Met Arg Asp Gly Lys Leu 195 200 205 Cys Leu Met Trp Arg Val Gly Asn Leu Arg Lys Ser His Leu Val Glu 210 215 220 Ala His Val Arg Ala Gln Leu Leu Lys Ser Arg Ile Thr Ser Glu Gly 225 230 235 240 Glu Tyr Ile Pro Leu Asp Gln Ile Asp Ile Asn Val Gly Phe Asp Ser 245 250 255 Gly Ile Asp Arg Ile Phe Leu Val Ser Pro Ile Thr Ile Val His Glu 260 265 270 Ile Asp Glu Asp Ser Pro Leu Tyr Asp Leu Ser Lys Gln Asp Ile Asp 275 280 285 Asn Ala Asp Phe Glu Ile Val Val Ile Leu Glu Gly Met Val Glu Ala 290 295 300 Thr Ala Met Thr Thr Gln Cys Arg Ser Ser Tyr Leu Ala Asn Glu Ile 305 310 315 320 Leu Trp Gly His Arg Tyr Glu Pro Val Leu Phe Glu Glu Lys His Tyr 325 330 335 Tyr Lys Val Asp Tyr Ser Arg Phe His Lys Thr Tyr Glu Val Pro Asn 340 345 350 Thr Pro Leu Cys Ser Ala Arg Asp Leu Ala Glu Lys Lys Tyr Ile Leu 355 360 365 Ser Asn Ala Asn Ser Phe Cys Tyr Glu Asn Glu Val Ala Leu Thr Ser 370 375 380 Lys Glu Glu Glu Glu Asp Ser Glu Asn Gly Val Pro Glu Ser Thr Ser 385 390 395 400 Thr Asp Ser Pro Pro Gly Ile Asp Leu His Asn Gln Ala Ser Val Pro 405 410 415 Leu Glu Pro Arg Pro Leu Arg Arg Glu Ser Glu Ile 420 425

Claims (66)

  1. 척수 손상을 가진 대상체에게 뉴런-특이적인 K+-Cl- 공동-수송체 (KCC2)를 상향조절하는 작용제의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 척수 손상을 치료하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, KCC2를 상향조절하는 작용제가 소분자, 펩티드, 유전자 편집 시스템, 및 KCC2를 코딩하는 발현 벡터로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  3. 제2항에 있어서, 소분자가 CLP290인 방법.
  4. 제2항에 있어서, 벡터가 비-통합적 또는 통합적인 방법.
  5. 제2항에 있어서, 벡터가 바이러스 벡터 또는 비-바이러스 벡터인 방법.
  6. 제4항에 있어서, 비-통합적 벡터가 에피솜 벡터, EBNA1 벡터, 미니서클 벡터, 비-통합적 아데노바이러스, 비-통합적 RNA, 및 센다이 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  7. 제5항에 있어서, 바이러스 벡터가 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 헤르페스바이러스, 수두 바이러스, 알파 바이러스, 우두 바이러스, 및 아데노-연관된 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  8. 제5항에 있어서, 비-바이러스 벡터가 나노입자, 양이온성 지질, 양이온성 중합체, 금속성 나노입자, 나노막대, 리포솜, 미세기포, 세포 침투 펩티드 및 지방구로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  9. 제4항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 벡터가 혈액 뇌 장벽을 가로지르는 것인 방법.
  10. 제1항에 있어서, KCC2가 적절한 대조군과 비교하여 적어도 2배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배 또는 10배만큼 상향조절되는 것인 방법.
  11. 제1항에 있어서, 척수 손상이 중증 척수 손상인 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 인간인 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 척수 손상을 가진 것으로 진단된 것인 방법.
  14. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 이전에 척수 손상에 대해 치료받은 적이 있는 것인 방법.
  15. 제1항에 있어서, 투여하기 전에, 대상체가 척수 손상을 가진 것으로 진단된 것인 방법.
  16. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 적어도 제2 척수 손상 치료를 추가로 투여받는 것인 방법.
  17. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 적어도 제2 치료 화합물을 추가로 투여받는 것인 방법.
  18. 제17항에 있어서, 제2 치료 화합물이 오스테오폰틴, 성장 인자, 또는 4-아미노퓨리딘으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  19. 척수 손상을 가진 대상체에게 Na+/2Cl-/K+ 공동-수송체 (NKCC)를 억제하는 작용제의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 척수 손상을 치료하는 방법.
  20. 제19항에 있어서, NKCC를 억제하는 작용제가 소분자, 항체, 펩티드, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 및 RNAi로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  21. 제20항에 있어서, RNAi가 마이크로RNA, siRNA, 또는 shRNA인 방법.
  22. 제20항에 있어서, 소분자가 부메타니드인 방법.
  23. 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 작용제가 벡터에 포함되는 것인 방법.
  24. 척수 손상을 가진 대상체에게 억제성 인터뉴런의 흥분성을 감소시키는 작용제의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 척수 손상을 치료하는 방법.
  25. 제24항에 있어서, 작용제가 억제성 Gi-커플링된 수용체 Gi-DREADD를 상향조절하는 것인 방법.
  26. 제24항 또는 제25항에 있어서, 작용제가 Gi-DREADD를 코딩하는 발현 벡터인 방법.
  27. 제24항에 있어서, 작용제가 Kir2.1을 코딩하는 발현 벡터인 방법.
  28. 제24항에 있어서, 작용제와 실질적으로 동시에 클로자핀 N-옥시드를 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  29. 제25항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 벡터가 혈액 뇌 장벽을 가로지르는 것인 방법.
  30. 제24항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 억제성 인터뉴런의 흥분성이 적절한 대조군과 비교하여 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 99% 또는 그 초과만큼 감소되는 것인 방법.
  31. 제24항에 있어서, 투여하기 전에, 대상체가 척수 손상을 가진 것으로 진단된 것인 방법.
  32. 제24항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 적어도 제2 척수 손상 치료를 투여받는 것인 방법.
  33. 척수 손상을 가진 대상체에게 억제성 인터뉴런의 흥분성을 감소시키는 전기 자극의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 척수 손상을 치료하는 방법.
  34. 제33항에 있어서, 작용제와 실질적으로 동시에 클로자핀 N-옥시드를 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  35. 제33항에 있어서, 전기 자극이 척수에 직접적으로 적용되는 것인 방법.
  36. 제33항에 있어서, 전기 자극이 손상 부위에서 척수에 직접적으로 적용되는 것인 방법.
  37. 제33항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 억제성 인터뉴런의 흥분성이 적절한 대조군과 비교하여 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 99% 또는 그 초과만큼 감소되는 것인 방법.
  38. 제33항에 있어서, 투여하기 전에, 대상체가 척수 손상을 가진 것으로 진단된 것인 방법.
  39. 제33항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 적어도 제2 척수 손상 치료를 투여받는 것인 방법.
  40. 척수 손상의 치료에 사용하기 위한, KCC2 폴리펩티드, 또는 KCC2 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터의 유효량, 및 제약상 허용가능한 담체를 포함하는 제약 조성물.
  41. 제40항에 있어서, KCC2 폴리펩티드가 서열식별번호: 1의 서열을 포함하는 것인 제약 조성물.
  42. 제40항 또는 제41항에 있어서, KCC2 폴리펩티드가 서열식별번호: 1과 적어도 95% 아미노산 서열 동일성을 갖고, 서열식별번호: 1의 KCC2의 생물학적 활성의 적어도 80%를 보유하는 것인 제약 조성물.
  43. 제40항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 제2 치료 화합물을 추가로 포함하는 제약 조성물.
  44. 척수 손상의 치료에 사용하기 위한, Gi-DREADD 폴리펩티드, 또는 Gi-DREADD 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터의 유효량, 및 제약상 허용가능한 담체를 포함하는 제약 조성물.
  45. 제44항에 있어서, Gi-DREADD 폴리펩티드가 최적화된 Gi-DREADD 폴리펩티드인 제약 조성물.
  46. 제44항 또는 제45항에 있어서, Gi-DREADD 폴리펩티드가 서열식별번호: 2의 서열을 포함하는 것인 제약 조성물.
  47. 제44항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, Gi-DREADD 폴리펩티드가 서열식별번호: 2와 적어도 95% 아미노산 서열 동일성을 갖고, 서열식별번호: 2의 Gi-DREADD의 생물학적 활성의 적어도 80%를 보유하는 것인 제약 조성물.
  48. 제44항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 클로자핀 N-옥시드를 추가로 포함하는 제약 조성물.
  49. 제44항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 제2 치료 화합물을 추가로 포함하는 제약 조성물.
  50. 척수 손상의 치료에 사용하기 위한, Kir2.1 폴리펩티드, 또는 Kir2.1 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터의 유효량, 및 제약상 허용가능한 담체를 포함하는 제약 조성물.
  51. 제50항에 있어서, Kir2.1 폴리펩티드가 서열식별번호: 3의 서열을 포함하는 것인 제약 조성물.
  52. 제50항 또는 제51항에 있어서, Kir2.1 폴리펩티드가 서열식별번호: 3과 적어도 95% 아미노산 서열 동일성을 갖고, 서열식별번호: 3의 Kir2.1의 생물학적 활성의 적어도 80%를 보유하는 것인 제약 조성물.
  53. 제50항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 클로자핀 N-옥시드를 추가로 포함하는 제약 조성물.
  54. 제50항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 제2 치료 화합물을 추가로 포함하는 제약 조성물.
  55. 척수 손상의 치료에 사용하기 위한, 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항의 작용제의 유효량 및 제약상 허용가능한 담체를 포함하는 제약 조성물.
  56. 제55항에 있어서, 적어도 제2 치료 화합물을 추가로 포함하는 제약 조성물.
  57. 척수 손상을 가진 대상체에게 CLP290의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 척수 손상을 치료하는 방법.
  58. 제1항에 있어서, CLP290이 혈액 뇌 장벽을 가로지르는 것인 방법.
  59. 제1항에 있어서, 척수 손상이 중증 척수 손상인 방법.
  60. 제57항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 인간인 방법.
  61. 제57항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 척수 손상을 가진 것으로 진단된 적이 있는 것인 방법.
  62. 제57항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 이전에 척수 손상에 대해 치료받은 적이 있는 것인 방법.
  63. 제1항에 있어서, 투여하기 전에, 대상체가 척수 손상을 가진 것으로 진단된 것인 방법.
  64. 제57항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 적어도 제2 척수 손상 치료를 추가로 투여받는 것인 방법.
  65. 제57항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 적어도 제2 치료 화합물을 추가로 투여받는 것인 방법.
  66. 제65항에 있어서, 제2 치료 화합물이 오스테오폰틴, 성장 인자, 또는 4-아미노퓨리딘으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
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