JP2022502084A - シャルコー・マリー・トゥース１ａ病の治療のための、ｐｍｐ２２を標的とするアンチセンスｒｎａ - Google Patents

シャルコー・マリー・トゥース１ａ病の治療のための、ｐｍｐ２２を標的とするアンチセンスｒｎａ Download PDF

Info

Publication number
JP2022502084A
JP2022502084A JP2021540927A JP2021540927A JP2022502084A JP 2022502084 A JP2022502084 A JP 2022502084A JP 2021540927 A JP2021540927 A JP 2021540927A JP 2021540927 A JP2021540927 A JP 2021540927A JP 2022502084 A JP2022502084 A JP 2022502084A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
seq
antisense rna
sequence
pmp22
sirna
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2021540927A
Other languages
English (en)
Inventor
リリアーヌ・マッサード
シャーベル・マッサード
スーザン・ブタリ
ジョルジア・マリア・ラウラ・ウルビナーティ
パトリック・クヴルール
ディディエ・デメーレ
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Publication of JP2022502084A publication Critical patent/JP2022502084A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/543—Lipids, e.g. triglycerides; Polyamines, e.g. spermine or spermidine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6921—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere
    • A61K47/6927—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores
    • A61K47/6929—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/5123—Organic compounds, e.g. fats, sugars
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/32—Special delivery means, e.g. tissue-specific

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

本発明は、PMP22を標的とし且つ細胞におけるPMP22の発現を40%〜60%阻害し得るアンチセンスRNA、及びそれを含む医薬組成物に関する。アンチセンスRNAは、好ましくはsiRNAであり、好ましくはナノ粒子の形態で提供される。本発明は、シャルコー・マリー・トゥース1A病の治療のための、PMP22を標的とするこれらアンチセンスRNAの使用にも関する。

Description

本発明は、シャルコー・マリー・トゥース1A(CMT-1A)病の治療に関する。
CMT-1Aニューロパチーは、末梢神経ミエリンの変更によるものであり、脱髄をもたらし、重度で且つ無効化する疾患を引き起こす。末梢神経軸索を取り囲む髄鞘は、シュワン細胞によって形成される。それらは、跳躍伝導による電気インパルスの迅速で且つ正確な伝送に必須である。シャルコー・マリー・トゥース病の支配的な亜型はCMT-1Aであり、全患者の50%を上回る割合を占める。それは、17p11.2の中間部染色体重複と関連しており、筋肉及び感覚機能の消失によって特徴付けられる疾患の原因となる22kDaの末梢ミエリンタンパク質(PMP22)をコードする遺伝子の過剰発現をもたらす。
CMT-1A病を治癒しようとする、又は少なくともその無効化症状を改善しようとするいくつかの試みがなされた。
有望な分子の1つはアスコルビン酸であった。PMP22を過剰発現するCMT-1Aの動物モデルにおいて、アスコルビン酸処理は、疾患表現型の実質的な改善をもたらし、PMP22の発現を低下させた。不運にも、CMT-1A患者におけるアスコルビン酸補充の効果を試験する臨床試験は、プラセボと比較した場合に有益な効果を有しなかった。故に、CMT-1Aを有する成人におけるアスコルビン酸治療を支持する臨床的証拠は今までのところない。
抗プロゲステロン療法は、PMP22トランスジェニックラットにおいて筋力を有意に増加させ且つ軸索消失を阻止し、とはいえ髄鞘の厚みは影響を受けないことが見出された。不運にも、現在利用可能なプロゲステロンアンタゴニストは、毒性がありすぎて患者に安全に投与できない。
軸索成長を促進することが知られる神経栄養因子であるニューロトロフィン-3(NT3)は、2つの動物モデルにおいて及び8人のCMT-1A患者を伴うパイロット調査において試験され、望ましい結果を有した。
しかしながら、CMT-1Aに対する有効な薬物は現在なく、支持的治療は、理学療法、装具学、骨格及び軟組織異常の外科治療、並びに対症薬物治療に限定される。
WO2006/090029
Needleman及びWunsch (1970) J. Mol Biol. 48:443〜453頁 Massaad-Massadeら、Bioconjugate Chem.、2018、29 (6)、1961〜1972頁、DOI:10.1021/acs.bioconjchem.8b00205 Reynolds及びTafer、Nature biotech.、2008、(26) 5、578〜83頁 Pereaら(Hum Mol Genet 10、1007〜1018頁、2001) Sawleら(Journal of lipid research 43、335〜343頁、2002)
それ故、CMT-1A病の治療の解決策を提供する必要性がある。
発明の説明
本発明者らは、特にRNA干渉(RNAi)を使用した、PMP22を標的とするアンチセンスRNAが、シャルコー・マリー・トゥース1Aの治療に非常に効率的であることを見出した。本発明者らは、実際に、PMP22を標的とする小分子干渉RNA(siRNA)を静脈内経路を介して投与することにより、PMP22がこれらのマウスにおいて1.5倍過剰発現されるシャルコー・マリー・トゥース1A病のマウスモデルにおいて、野生型マウスと同一の移動運動及び力の回復が可能となることを示した(実施例を参照されたい)。
重要なことに、本発明者らは、PMP22の発現を部分的にのみ、好ましくは40%〜60%阻害することが可能なアンチセンスRNA、特にsiRNAを選択して、染色体17p11.2上の1.5Mb重複に起因したPMP22の50%過剰発現に対抗した。PMP22タンパク質は、実際には、健常個体に見出されるものと同等の量で細胞にとどまらなければならない。
更には、siRNA PMP22がPMP22発現を厳密に調節することを実証するために、本発明者らは、野生型マウスへのPMP22遺伝子を標的とするsiRNAの投与がPMP22タンパク質レベルを減少させ、故に、これらのマウスにおいてニューロパチーを誘導することを示した(データ示さず)。
本発明によるアンチセンスRNA、特にsiRNA PMP22は、有利にはP0タンパク質の発現を妨げず、それは変化しないままである。P0タンパク質は、実際には、有髄化過程にPMP22とともに関与し、P0タンパク質をコードする遺伝子の脱調節は、CMT1B等の別のタイプのCMTの原因となる。
重要なことに、本発明によるアンチセンスRNA、特にsiRNA PMP22は、細胞の生存率に影響を及ぼさない。
PMP22を標的とするアンチセンスRNA、特にPMP22を標的とするsiRNAを保護し且つ安全に送達するために、それらはベクター化され得、例えばナノ粒子の形態で提供され得る。例えば、アンチセンスRNAはスクアレンにコンジュゲートされ得、それによって、アンチセンスRNAを含むナノ粒子を形成する。これらのナノ粒子(siRNA PMP22-SQ NPとも称される)は、パッセンジャーセンス鎖のみにおける修飾のおかげで、スクアレンとのバイオコンジュゲーション後に依然として活性である。有利には、これらのナノ粒子は、およそ180nmのサイズ及び0.14という低い多分散指数を有して30日間安定であり、それによって、静脈内注射されることを可能にする。
CMT-1Aの治療について査定されたほとんどの薬物は、PMP22発現に間接的に影響を及ぼすアデニリルシクラーゼ活性に焦点を合わせているのに対し、本発明によるアンチセンスRNA、特にsiRNAは、PMP22遺伝子自体を標的とし、運動活性、力、及び軸索再生等、疾患の種々の局面を向上させることを可能にする。
重要なことに、本発明によって提供されるアンチセンスRNA、特にsiRNAの治療効果は、特に低用量のアンチセンスRNAの静脈内投与(例えば、2,5mg/kg)を使用して、ヒトCMT-1Aに近い動物モデルで(特に、PMP22遺伝子の1つのみ又は2つの余分なコピーを有するマウスにおいて)及び人間に置き換え可能な条件において実証されている。高用量のsiRNAを投与することは、実際には、オフターゲット効果を誘導し得る。その上、本発明によるアンチセンスRNAは、長期の治療効果を提供する。
故に、本発明の第1の目的は、PMP22タンパク質をコードするmRNAを標的とするアンチセンスRNAである。
アンチセンスRNAは、好ましくは、細胞におけるPMP22タンパク質の量を40%〜60%、より好ましくは40%〜55%低下させる。
アンチセンスRNAは、siRNA、shRNA、miRNA、dsRNA、及びインビボで切断されてsiRNAを形成し得るRNA種からなる群から選択され得る。
アンチセンスRNAは、(i)配列番号9の配列、(ii)配列番号11、又は(iii)配列番号9若しくは11の配列の天然に存在するバリアント、の一部分に相補的であり得る。
例えば、アンチセンスRNAは、
(i)
- 配列番号11の配列のヌクレオチド989〜1007、
- 配列番号9の配列のヌクレオチド970〜988、
- 配列番号11の配列のヌクレオチド1721〜1739、
- 配列番号9の配列のヌクレオチド1726〜1744、
- 配列番号11の配列のヌクレオチド431〜449、
- 配列番号9の配列のヌクレオチド429〜447、
- 配列番号11の配列のヌクレオチド1805〜1823、
- 配列番号9の配列のヌクレオチド1809〜1827、
- 配列番号11の配列のヌクレオチド921〜939、若しくは
- 配列番号9の配列のヌクレオチド903〜921
からなる、その中に含まれる、若しくはそれと重複する一部分、又は
(ii)天然に存在するバリアントに存在する(i)の一部分と相同な一部分
に相補的な核酸であり得る。
アンチセンスRNAは、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、及び配列番号19の配列からなる群から選択される配列の少なくとも10個の連続ヌクレオチドを含み得る。
アンチセンスRNAは、1つ又は2つの一本鎖突出、例えば2つの一本鎖3'突出を含むsiRNAであり得る。
アンチセンスRNAは、(i)配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、及び配列番号19の配列からなる群から選択される配列、並びに(ii)任意で、1つ又は2つの一本鎖突出、特に1つ又は2つの一本鎖3'突出、を含む又はそれからなるsiRNAであり得る。
本発明の別の目的は、上で規定されるアンチセンスRNAを含むナノ粒子であり、アンチセンスRNAは、好ましくはスクアレン又はその誘導体に結合している。ナノ粒子は、例えばsiRNAを含み、siRNAのセンス鎖は、好ましくはスクアレン又はその誘導体に結合している。
本発明の別の目的は、上で規定される、PMP22タンパク質をコードするmRNAを標的とするアンチセンスRNA、及び薬学的に許容される担体を含む又はそれからなる医薬組成物である。
薬学的に許容される担体は、アンチセンスRNAと、例えばアンチセンスRNAのセンス鎖とコンジュゲートされ得る。そのような薬学的に許容される担体は、スクアレン、PEG、リン脂質、又は親油性部分等、コレステロールの前駆体であり得る。
本発明の更に別の目的は、シャルコー・マリー・トゥース1A(CMT-1A)の治療における使用のための、上で規定される、PMP22タンパク質をコードするmRNAを標的とするアンチセンスRNAである。故に、アンチセンスRNAは、シャルコー・マリー・トゥース病1Aに罹患している患者において正常レベルのPMP22発現を回復させることを可能にする。
アンチセンスRNAは、アンチセンスRNAを含むナノ粒子、例えば上で規定されるナノ粒子の形態で提供され得る。
アンチセンスRNAは、上で規定される医薬組成物の形態で提供され得る。
アンチセンスRNAは、静脈内に、腹腔内に、皮下に、又は神経内に(intranervously)、例えば座骨神経に投与され得る。
アンチセンスRNAは、シャルコー・マリー・トゥース1Aの治療において有用な少なくとも別の薬物と組み合わせて使用され得る。
PMP22タンパク質
末梢ミエリンタンパク質22とも呼ばれるPMP22タンパク質は、膜貫通糖タンパク質である。
ヒトPMP22タンパク質は、PMP22遺伝子によってコードされる。
PMP22タンパク質は、シュワン細胞において主に発現される。
PMP22タンパク質は、好ましくは哺乳動物起源のものである。
「哺乳動物」という用語は、ヒト及び非ヒト哺乳動物を含む。
「非ヒト哺乳動物」という表現は、例えばラット、マウス、ブタ、ネコ、イヌ、ウサギ、又は霊長類を含む。
シャルコー・マリー・トゥース1A(CMT1A)病は、PMP22コード遺伝子を含有する染色体17p11.2上の1.5Mb重複により生じ、CMT1Aを有する全個体においてPMP22の3つのコピーの存在をもたらす。
CMT1A病に関与するPMP22タンパク質は、機能的PMP22タンパク質である。
本明細書において、「機能的PMP22タンパク質」によって、mRNAレベル(例えば、RNA抽出、それに続く逆転写(RT-qPCR)の後に、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応によって試験される)及びタンパク質レベル(例えば、ウェスタンブロットによって及び免疫組織化学によって試験される)の両方でPMP22発現(重複がDNAレベルで生じる場合)を増加させ得、脱髄につながる遺伝子によってコードされるタンパク質を意味する。
当業者であれば、所与のPMP22タンパク質が機能的であるかどうかを周知の方法によって容易に判定し得る。例えば、非常に遅い神経伝導速度と組み合わせた家族歴の発端者、又はDNA診断、RT-qPCR、ウェスタンブロット、及び/若しくは電気生理学的試験が使用され得る。
ヒトPMP22に対する参照配列は、例えば配列番号10の配列である。
PMP22タンパク質は、配列番号10の配列と少なくとも80%同一の、配列番号10の配列と、好ましくは少なくとも85%同一の、より好ましくは少なくとも90%同一の、より好ましくは少なくとも95%同一の、例えば少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、又は少なくとも99%同一の配列を含み得る又はそれからなり得る。
ヒトPMP22をコードするmRNAに対する参照配列は、ヌクレオチド「T」が「U」で置き換えられている配列番号9の配列である。
ヒトPMP22タンパク質をコードするmRNAは、ヌクレオチド「T」が「U」で置き換えられている配列番号9の配列と少なくとも80%同一の、ヌクレオチド「T」が「U」で置き換えられている配列番号9の配列と、好ましくは少なくとも85%同一の、より好ましくは少なくとも90%同一の、より好ましくは少なくとも95%同一の、例えば少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、又は少なくとも99%同一の配列を含み得る又はそれからなり得る。
マウスPMP22をコードするmRNAに対する参照配列は、ヌクレオチド「T」が「U」で置き換えられている配列番号11の配列である。
マウスPMP22タンパク質をコードするmRNAは、ヌクレオチド「T」が「U」で置き換えられている配列番号11の配列と少なくとも80%同一の、ヌクレオチド「T」が「U」で置き換えられている配列番号11の配列と、好ましくは少なくとも85%同一の、より好ましくは少なくとも90%同一の、より好ましくは少なくとも95%同一の、例えば少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、又は少なくとも99%同一の配列を含み得る又はそれからなり得る。
本明細書において定義するとき、参照配列と「少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%同一の」アミノ酸配列は、参照配列と比較して、欠失、挿入、及び/又は置換等の変異を含み得る。
置換の場合、置換は、好ましくは、下記のTable 1(表1)に示される保存的置換に相当する。好ましい実施形態において、参照配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%同一の配列は、保存的置換だけ参照配列と異なるのみである。
Figure 2022502084
参照配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%同一のアミノ酸配列は、参照配列の天然に存在するバリアントに相当し得る。
参照配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%同一のアミノ酸配列は、参照配列とは別の哺乳動物種に由来する相同配列に相当し得る。
例えば、参照配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%同一のアミノ酸配列は、保存的置換だけ参照配列と異なり得、及び/又は参照配列の天然に存在するバリアントに相当し、及び/又は参照配列とは別の哺乳動物種に由来する相同配列に相当する。
「参照配列と少なくともx%同一の配列」によって、配列は参照配列と同一である、又は参照配列の各100個のアミノ酸あたり最高で100-x個のアミノ酸変更だけ参照配列と異なることが意図される。
アラインメント及び同一性のパーセンテージの判定は、例えばNeedleman及びWunsch (1970) J. Mol Biol. 48:443〜453頁に記載されるNeedleman及びWunschアルゴリズムに基づくニードルプログラムを使用して、手動で又は自動で実行され得、例えば、ポリペプチド配列比較のための以下のパラメーター:比較行列:BLOSUM62、ギャップオープンペナルティ:10及びギャップ伸長ペナルティ:0.5、エンドギャップペナルティ:誤り、エンドギャップオープンペナルティ=10、エンドギャップ伸長ペナルティ=0.5;並びに、ポリヌクレオチド配列比較のための以下のパラメーター:比較行列:DNAFULL;ギャップオープンペナルティ=10、ギャップ伸長ペナルティ=0.5、エンドギャップペナルティ:誤り、エンドギャップオープンペナルティ=10、エンドギャップ伸長ペナルティ=0.5を有する。
参照配列と「少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%同一の」核配列(nucleic sequence)は、参照配列と比較して、欠失、挿入、及び/又は置換等の変異を含み得る。
ヌクレオチド置換の場合、置換は、参照配列と比較すると、例えば上記のTable 1(表1)に示される、サイレント置換、又は翻訳されたアミノ酸配列における保存的置換につながる置換に相当し得る。
参照配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%同一の核配列は、参照配列の天然に存在するバリアントに相当し得る、及び/又は参照配列とは別の哺乳動物種に由来する相同配列に相当する。
参照配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%同一の核配列は、サイレント置換、及び/若しくは保存的アミノ酸置換につながる置換だけ参照配列と異なり得、並びに/又は参照配列の天然に存在するバリアントに相当し得、並びに/又は参照配列とは別の哺乳動物種に由来する相同配列に相当する。
PMP22タンパク質をコードするmRNAを標的とするアンチセンスRNA
本発明は、特に、PMP22タンパク質をコードするmRNAを標的とするアンチセンスRNAに関する。
PMP22タンパク質及びPMP22をコードするmRNAは、特に上で規定されるとおりである。
PMP22タンパク質をコードするmRNAを標的とするアンチセンスRNAは、以下で「アンチセンスRNA」と称される。
アンチセンスRNAは、細胞における、特にシュワン細胞におけるPMP22タンパク質の量を有利に低下させる。
アンチセンスRNAは、好ましくは、細胞における、好ましくはシュワン細胞におけるPMP22タンパク質の量を40%〜60%、好ましくは40%〜55%、より好ましくは40%〜50%、例えば40%〜45%若しくは45%〜50%低下させ、且つ/又は細胞における、好ましくはシュワン細胞におけるPMP22 mRNAの量を40%〜60%、好ましくは40%〜55%、好ましくは40%〜50%、例えば40%〜45%若しくは45%〜50%低下させる。
細胞において発現されるPMP22タンパク質の分量は、ウェスタンブロット、Elisa(酵素結合免疫吸着アッセイ)又は免疫組織化学等、当業者によって周知の任意の方法によって判定され得る。
アンチセンスRNAが細胞におけるPMP22の量を低下させ得るかどうかを判定すること、及び任意で、低下のパーセンテージを定量することは、例えば、試験される対象となるアンチセンスRNAの存在下及び非存在下で細胞におけるPMP22タンパク質の量を査定することによって実施され得る(例えば、実施例の節を参照されたい)。
細胞に存在するPMP22をコードするmRNAの分量は、RT-PCR等、当業者によって周知の任意の方法によって判定され得る。
アンチセンスRNAが細胞におけるPMP22をコードするmRNAの量を低下させ得るかどうかを判定すること、及び任意で、低下のパーセンテージを定量することは、例えば、試験される対象となるアンチセンスRNAの存在及び非存在下で細胞におけるPMP22をコードするmRNAの量を例えばRT-PCRによって査定することによって実施され得る(例えば、実施例の節を参照されたい)。
故に、アンチセンスRNAは、PMP22をコードするmRNAを標的とする核酸である。
本明細書における「所与のmRNAを標的とする核酸」という表現は、mRNAに特異的に結合し得る核酸を意味する。故に、所与のmRNAを標的とする核酸は、mRNAの配列の一部分に完全に相補的である配列を含む又はそれからなる。相補性は、細胞内条件下におけるmRNAを標的とする核酸のmRNAへの特異的結合を可能にする。
本明細書において、「第2の配列に完全に相補的な配列」という表現によって、第2の配列の逆方向の相補的対応物を意味する。
PMP22をコードするmRNAを標的とするアンチセンスRNAは、例えばバイオインフォマティクスツールを使用して、mRNAの配列から設計され得る。例えば、配列番号9又は配列番号11の配列は、アンチセンスRNAを設計するための標的として使用され得る。配列番号9及び配列番号11の配列はcDNA配列であることから、mRNA配列を得るために、ヌクレオチド「T」をヌクレオチド「U」で置き換えなければならない。
上で規定されるアンチセンスRNAは、siRNA等、一本鎖又は二本鎖RNA(リボ核酸)であり得る。
アンチセンスRNAは、好ましくは、治療されるべき対象におけるPMP22をコードするmRNAの配列の一部分に完全に相補的である。
上で規定されるアンチセンスRNAは、天然に存在しないヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチド等、少なくとも1つの非標準ヌクレオチドを含み得る。
上で規定されるアンチセンスRNAは、RNA部分及び少なくとも1つの付加的な部分、例えばデオキシリボヌクレオチド部分を含み得る又はそれからなり得る。
上で規定されるアンチセンスRNAは、12〜50個のヌクレオチド、12〜35個のヌクレオチド、12〜30個、12〜25個、12〜22個、15〜35個、15〜30個、15〜25個、15〜22個、又は18〜22個、例えば19、20、又は21個のヌクレオチドの長さを有し得る。
上で規定されるアンチセンスRNAは、例えば、12〜50個の連続ヌクレオチド、12〜35個、12〜30個、12〜25個、12〜22個、15〜35個、15〜30個、15〜25個、15〜22個、又は18〜22個、例えば19、20、又は21個のヌクレオチドを含み得る又はそれからなり得る。
上で規定されるアンチセンスRNAは、PMP22タンパク質をコードするmRNAに相補的な配列の、12〜50個の連続ヌクレオチド、例えば12〜35個、12〜30個、12〜25個、12〜22個、15〜35個、15〜30個、15〜25個、15〜22個、又は18〜22個、例えば19、20、又は21個の連続ヌクレオチドを含み得る又はそれからなり得る。
アンチセンスRNAは、好ましくはRNA干渉剤である。
上で規定されるアンチセンスRNA、特にRNA干渉剤は、siRNA、shRNA、miRNA、dsRNA、及びインビボで切断されてsiRNAを形成し得るRNA種からなる群から選択され得る。
「短い干渉RNA」又は「siRNA」は、二本鎖RNA部分、及び任意で、1つ又は2つの一本鎖突出を含む。
一本鎖突出は、3'突出又は5'突出であり得る。
二本鎖RNA部分は、PMP22タンパク質をコードするmRNAに相補的なアンチセンス鎖、及びセンス鎖を含む。
上で規定されるsiRNAは、好ましくは、1つ又は2つの3'突出を含む。
上で規定されるsiRNAは、好ましくは、19、20、又は21個の塩基対を含む又はそれからなる。
上で規定されるsiRNAは、好ましくは、19、20、又は21個の塩基対及び2つの3'突出を含む又はそれからなる。
3'及び/又は5'突出は、少なくとも1つ、好ましくは少なくとも2つのデオキシリボヌクレオチドT(「dT」と称される)からなり得る。
例えば、3'及び/又は5'突出は、2つのデオキシリボヌクレオチドTからなり得る。
「短いヘアピンRNA(shRNA)」は、ステム-ループ(ヘアピン)構造を有する一本鎖RNAである。細胞におけるshRNAの発現は、ベクターを使用して獲得され得る。
「マイクロRNA」又は「miRNA」とは、およそ22ヌクレオチド長の短いノンコーディングRNAである。-miRNAは、標的遺伝子の転写後調節因子であり、一般的に、非常に組織特異的な又は発達段階特異的な形式で発現される。既存のmiRNA遺伝子の特質に基づいて、人工miRNAを設計し且つ発現させることが可能である。
「dsRNA」とは、DNAと同じ二本鎖を有するが、チミンの代わりにウラシルを有するRNAである。それは、多くのウイルスの遺伝物質を形成し、それは、インターフェロン系の主要な成分である。それは、ウイルス感染に対する免疫系を誘発する。
上で規定されるアンチセンスRNAは、配列番号9の配列、配列番号11の配列、又は天然に存在するそのバリアントの一部分を標的とし得、ヌクレオチド「T」は、これらの配列においてヌクレオチド「U」で置き換えられている。
言い換えれば、上で規定されるアンチセンスRNAは、(i)配列番号9の配列、(ii)配列番号11、又は(iii)配列番号9若しくは11の配列の天然に存在するバリアント、の一部分に相補的であり得る。
DNA配列である配列の一部分に相補的なアンチセンスRNAは、本明細書において、それが、DNA配列におけるヌクレオチド「T」がヌクレオチド「U」で置き換えられている対応するRNA配列に相補的であることを意味する。
上で規定されるアンチセンスRNAは、配列番号9の配列と少なくとも80%同一の、配列番号9の配列と、好ましくは少なくとも85%同一の、より好ましくは少なくとも90%同一の、より好ましくは少なくとも95%同一の、例えば少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、又は少なくとも99%同一の配列の一部分を標的とし得、配列同一性を判定するために、ヌクレオチド「T」はヌクレオチド「U」と同一と見なされる。
言い換えれば、上で規定されるアンチセンスRNAは、配列番号11の配列と少なくとも80%同一の、配列番号11の配列と、好ましくは少なくとも85%同一の、より好ましくは少なくとも90%同一の、より好ましくは少なくとも95%同一の、例えば少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、又は少なくとも99%同一の配列の一部分を標的とし得る。
上で規定されるアンチセンスRNAは、
(i)
- 配列番号11の配列のヌクレオチド989〜1007、
- 配列番号9の配列のヌクレオチド970〜988、
- 配列番号11の配列のヌクレオチド1721〜1739、
- 配列番号9の配列のヌクレオチド1726〜1744、
- 配列番号11の配列のヌクレオチド431〜449、
- 配列番号9の配列のヌクレオチド429〜447、
- 配列番号11の配列のヌクレオチド1805〜1823、
- 配列番号9の配列のヌクレオチド1809〜1827、
- 配列番号11の配列のヌクレオチド921〜939、若しくは
- 配列番号9の配列のヌクレオチド903〜921
からなる、その中に含まれる、若しくはそれと重複する一部分、又は
(ii)天然に存在するバリアントに存在する(i)の一部分と相同な一部分
に相補的であり得る。
上で規定されるアンチセンスRNAは、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、及び配列番号19の配列からなる群から選択される配列の、少なくとも10個の連続ヌクレオチド、好ましくは少なくとも12個のヌクレオチド、より好ましくは少なくとも15個のヌクレオチド、例えば16、17、18、又は19個のヌクレオチドを含み得る。
上で規定されるアンチセンスRNAは、(i)配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、及び配列番号19の配列からなる群から選択される配列の、少なくとも10個の連続ヌクレオチド、好ましくは少なくとも12個のヌクレオチド、より好ましくは少なくとも15個のヌクレオチド、例えば16、17、18、又は19個のヌクレオチド、並びに(ii)任意で、3'又は5'突出が例えば2つのdTからなる1つ又は2つの一本鎖突出、を含むsiRNAであり得る。
上で規定されるアンチセンスRNA、好ましくはsiRNAは、(i)配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、及び配列番号19の配列からなる群から選択される配列、並びに(ii)任意で、3'及び/若しくは5'突出が例えば2つのdTからなる1つ又は2つの一本鎖突出、を含み得る又はそれからなり得る。
上で規定されるアンチセンスRNAは、好ましくは、(i)配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、及び配列番号19の配列からなる群から選択される配列、並びに(ii)3'突出のそれぞれが好ましくは2つのdTからなる2つの3'突出、を含む又はそれからなるsiRNAである。
上で規定されるアンチセンスRNAは、インビボでのその安定性及び/又は治療効率を増加させる、修飾されたヌクレオチド、例えば化学修飾されたヌクレオチドを含み得る。
例えば、上で規定されるアンチセンスRNAは、ホスホロチオエート誘導体、2'-O-(2-メトキシエチル)オリゴリボヌクレオチド、及び/又は脂質修飾されたオリゴヌクレオチドを含み得る。アンチセンスRNAが二本鎖RNA部分を含む場合、センス鎖(パッセンジャー鎖とも呼ばれる)は、アンチセンス鎖と同じ修飾を含み得、それにより、修飾はアンチセンス鎖の阻害効果に影響を及ぼさないであろう。或いは、アンチセンスRNAが二本鎖RNA部分を含む場合、センス鎖のみが、特にN-(ヘキサメチレニル(hexamethylenyl))-6-オキソヘキサンアミドスペーサー(C6)等のスペーサーを介した、例えばセンス鎖の5'末端におけるジベンゾシクロオクチン(DBCO)反応基等の修飾を含み得る。
上で規定されるアンチセンスRNA、特にshRNAは、ベクター内にクローニングされ得、次いで細胞に送られ得る。
上で規定されるアンチセンスRNAは、医薬組成物で提供され得る。
少なくとも1つのアンチセンスRNAを含むナノ粒子
上で規定されるアンチセンスRNAは、アンチセンスRNAを含むナノ粒子の形態で提供され得る。
ナノ粒子に、アンチセンスRNAを担持させ得る。
ナノ粒子を使用することにより、特にsiRNAの場合には、アンチセンスRNAの半減期を増加させることが可能となる。
その上、ナノ粒子は、例えば標的細胞を本質的に標的にすることによって、又は標的細胞に特異的なリガンドに結合することによって、標的細胞への特異的送達を可能にし得る。
標的細胞は、例えばシュワン細胞である。
例えば、スクアレン等の天然トリテルペンは、siRNAに連結された場合、水中でナノ粒子のように自己会合する能力を有する。
スクアレン酸(squalenic acid)又はその誘導体を用いたベクター化は、例えば文献WO2006/090029に開示されている。
1つの有利な実施形態において、siRNAのセンス鎖は、アジドスクアレン又はその誘導体に共有結合で結合し、それは更にsiRNAのアンチセンス鎖にアニールし、それによって、特にナノ沈降の後に、ナノ粒子を形成する。
上で規定されるアンチセンスRNAの、特に上で規定されるsiRNAのセンス鎖は、例えば以前に記載されるように(Massaad-Massadeら、Bioconjugate Chem.、2018、29 (6)、1961〜1972頁、DOI:10.1021/acs.bioconjchem.8b00205)、銅不含のクリックケミストリーを使用することによって、スクアレンに結合し得る。
上で規定されるsiRNAを含むナノ粒子は、
- siRNAのセンス鎖の5'末端にジベンゾシクロオクチン残基を付加して、修飾されたセンス鎖を獲得する工程、
- 特にジベンゾシクロオクチン残基へのスクアレンのアジド官能基のバイオコンジュゲーションを介して、前記修飾されたセンス鎖にスクアレンを結合する工程、
- siRNAの両鎖をアニールさせるために、siRNAのアンチセンス鎖を添加する工程、
- 任意で、好ましくは撹拌下で、特に一方の相(水性又は有機)を他方にゆっくりと添加することによって、アセトン及び水を添加してナノ粒子を沈降させる工程、並びに
- 任意で、例えば窒素流動を使用してアセトンを蒸発させて、純粋なsiRNA-SQナノ粒子の水性懸濁液を獲得する工程
を含む方法によって獲得され得る。
ナノ粒子は、例えばHPLCによって精製され得る。
ナノ粒子は、好ましくは、300nmよりも低い、より好ましくは250nmよりも低いサイズ、及び/又は50nmよりも大きい、より好ましくは100nmよりも大きいサイズを有する。
例えば、ナノ粒子は、100〜200nm、より好ましくは170nm〜190nmに含まれるサイズ、例えば180nmを有する。
ナノ粒子は、好ましくは、低い多分散指数、特に0,3nmよりも低い、より好ましくは0,2nmよりも低い多分散性、例えば0,14という多分散指数を有する。
ナノ粒子は、好ましくは、少なくとも20日間、好ましくは少なくとも25日間、より好ましくは少なくとも30日間安定である。
ナノ粒子は、好ましくは静脈内注射に適している。
ナノ粒子は、特に、(i)配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、及び配列番号19の配列からなる群から選択される配列、並びに(ii)3'突出が好ましくは2つのdTからなる2つの3'突出、を含む又はそれからなるsiRNAを含み得る。
アンチセンスRNAを含むナノ粒子は、医薬組成物で提供され得る。
医薬組成物
本発明は、上で規定されるPMP22タンパク質をコードするmRNAを標的とするアンチセンスRNA、特に上で規定されるPMP22タンパク質をコードするmRNAを標的とするsiRNA、及び薬学的に許容される担体を含む又はそれからなる医薬組成物にも関する。
アンチセンスRNA等の核酸と、例えばsiRNAのセンス鎖とコンジュゲートされ得る薬学的に許容される担体の非限定的な例には、スクアレン、PEG、リン脂質、親油性部分、P-糖タンパク質阻害剤等、コレステロールの前駆体が含まれる。
故に、アンチセンスRNAは、核酸を含む若しくはそれとコンジュゲートされたエクソソーム、核酸を含む若しくはそれとコンジュゲートされたリポソーム、及び/又は核酸を含む若しくはそれとコンジュゲートされたナノ粒子、例えば上で規定されるナノ粒子の形態で提供され得る。
「薬学的に許容される」という表現は、活性成分の生物学的活性の有効性を妨げない、及び投与される宿主に好ましくは有害でない、任意の担体を包含することを意図される。
薬学的に許容される担体は、当業者によって公知の任意の方法によって調製され得る。
医薬組成物は、好ましくは無菌の溶液又は懸濁液である。
医薬組成物は、好ましくは、注射可能な投与に適している。
医薬組成物は、siRNAの場合にはアンチセンスRNAをコードする核酸、又は特にアンチセンスRNAがshRNAの一部である場合には前記核酸を含むベクターを含み得る。
医薬組成物は、少なくとも1つの薬学的に許容される賦形剤を更に含み得る。
適切な薬学的に許容される賦形剤は、当業者によって周知である。薬学的に許容される賦形剤は、投与の様式、RNAアンチセンスの溶解度及び安定性に従ってルーチン的に選択され得る。例えば、静脈内投与のための医薬組成物は、無菌の水溶液、緩衝剤、希釈剤、及び/又は他の適切な添加物を含み得る。
上で規定される医薬組成物は、0,1mgのRNAアンチセンス/kg対象〜20mgのRNAアンチセンス/kg対象、好ましくは0,2mg/kg〜15mg/kg、より好ましくは0,5mg/kg〜10mg/kgを投与するのに適したRNAアンチセンスの量を含み得る。
上で規定される医薬組成物は、例えば、5mg〜2gのRNAアンチセンス/kg対象、好ましくは15mg〜1g、より好ましくは30mg〜500mgを含み得る。
アンチセンスRNAがスクアレン又はその誘導体に結合し、それによってナノ粒子を形成する場合、上で規定される医薬組成物は、0,1mgのナノ粒子/kg対象〜20mgのナノ粒子/kg対象、好ましくは0,2mg/kg〜15mg/kg、より好ましくは0,5〜10mg/kgを投与するのに適したナノ粒子の量を含み得る。
アンチセンスRNAがスクアレン又はその誘導体に結合し、それによってナノ粒子を形成する場合、上で規定される医薬組成物は、5mg〜2gのナノ粒子、好ましくは15mg〜1g、より好ましくは30mg〜500mgを含み得る。
1つの実施形態において、医薬組成物は、正確な投薬を容易にする単位剤形で提示される。「単位剤形」という用語は、各単位が、適切な薬学的賦形剤と関連して、所望の治療効果をもたらすように算出された活性物質の所定の分量を含有する、ヒト対象及び他の非ヒト哺乳動物に対する単位投薬量として適した物理的に個別の単位を指す。典型的な単位剤形には、液体組成物のあらかじめ充填された、あらかじめ測定されたアンプル又は注射器が含まれる。
本発明は、上で規定される医薬品及び投与の様式に関する取扱説明書を含むキットにも関する。これらの取扱説明書は、例えば、医学的適応、投与の経路、投薬量、及び/又は治療されるべき患者の群を示し得る。
対象
対象は、人間又は非ヒト哺乳動物であり得る。
非ヒト哺乳動物は、例えばマウス、ラット、ネコ、イヌ、ウサギ、又は霊長類である。
対象は、好ましくは、個体又は患者とも称される人間である。
対象は、任意の年齢のもの、例えば幼児、小児、青年、成人、高齢者、及び任意の性別のものであり得る。
シャルコー・マリー・トゥース1A病の治療
本明細書において、「シャルコー・マリー・トゥース1A病の治療」によって、該疾患の進展を少なくとも部分的に食い止めること、又は該疾患を逆転させることを意味する。
治療の望ましい効果には、例えば、
- 下肢の筋肉の衰弱及び/若しくは萎縮、手の衰弱、並びに/又は感覚消失を阻止し又は低下させ、それによって歩行を正常化すること並びに/又は下垂足を阻止すること若しくは低下させること、
- 下肢の筋肉の衰弱及び/若しくは萎縮、手の衰弱、並びに/又は感覚消失を食い止め、遅らせ、又は治癒し、それによって歩行を正常化すること並びに/又は下垂足を低下させること、並びに/或いは
- 神経伝導速度を正常化すること
が含まれる。
シャルコー・マリー・トゥース1A病の治療における使用のための、PMP22を標的とするアンチセンスRNA
本発明は、シャルコー・マリー・トゥース1A(CMT-1A)の治療における使用のための、PMP22タンパク質をコードするmRNAを標的とするアンチセンスRNAにも関する。
本発明は、PMP22タンパク質をコードするmRNAを標的とするアンチセンスRNAをそれを必要とする対象に投与する工程を含む、シャルコー・マリー・トゥース1A病を治療するための方法にも関する。
PMP22をコードするmRNAを標的とするアンチセンスRNAは、特に上で規定されるとおりである。
アンチセンスRNAは、医薬組成物の形態で提供され得る。
医薬組成物は、特に同じ名前の節において上で規定されるとおりである。
シャルコー・マリー・トゥース1A病の治療は、特に上で規定されるとおりである。
PMP22をコードするmRNAを標的とするアンチセンスRNA、特にsiRNAを投与する工程は、むき出しの投与及び/又はナノ粒子等の薬学的に許容される担体での投与を含めた、当技術分野において周知の様々な技法を使用して実行され得る。
本発明によるアンチセンスRNAを含むナノ粒子は、特に上で規定されるとおりである。
アンチセンスRNAは、シュワン細胞を標的とするように製剤化され得る。
アンチセンスRNAは、好ましくは、CMT-1Aに罹患している又は罹患しやすい対象に存在するPMP22をコードするmRNAに相補的である。
PMP22をコードするmRNAを標的とするアンチセンスRNAは、例えば、静脈内に又は腹腔内に又は皮下に又は神経内に、好ましくは座骨神経に投与され得る。
PMP22をコードするmRNAを標的とするアンチセンスRNAは、好ましくは「有効量」で、すなわちシャルコー・マリー・トゥース1A病を治療するのに十分な量で投与される。この量は、アンチセンスRNAの有効性及び使用される任意の担体の性質の両方によって変わるであろうことが解されるであろう。任意の所与の組成物に対する適当な量の決定は、適当な治療レベルを査定するように設計された標準的な一連の試験を通じて、当技術分野における技能の範囲内にある。
PMP22をコードするmRNAを標的とするアンチセンスRNAは、0,1〜20mg/kg対象、好ましくは0,2〜15mg/kg対象、より好ましくは0,5〜10mg/kg対象の用量で投与され得る。
PMP22をコードするmRNAを標的とするアンチセンスRNAがスクアレン又はその誘導体に結合している場合、0,1〜20mgのナノ粒子/kg対象、好ましくは0,2〜15mgのナノ粒子/kg対象、より好ましくは0,5〜10mgのナノ粒子/kg対象が投与され得る。
PMP22をコードするmRNAを標的とするアンチセンスRNAは、例えば少なくとも3週間且つ/又は最大3ヶ月の間、例えば1週間あたり1回又は2回、1回の注射又は数回の注射として投与され得る。
アンチセンスRNAは、アスコルビン酸、ニューロトロフィン3、及び/又はクルクミン等、シャルコー・マリー・トゥース1Aの治療において有用な少なくとも別の薬物と組み合わせて使用され得る。
本発明は、以下の実施例及び図に照らして更に例示されるであろう。
配列の簡単な説明
配列番号1は、配列番号12のアンチセンス鎖を含むsiRNAのセンス鎖配列である。
配列番号2は、配列番号13のアンチセンス鎖を含むsiRNAのセンス鎖配列である。
配列番号3は、配列番号14のアンチセンス鎖を含むsiRNAのセンス鎖配列である。
配列番号4は、配列番号15のアンチセンス鎖を含むsiRNAのセンス鎖配列である。
配列番号5は、配列番号16のアンチセンス鎖を含むsiRNAのセンス鎖配列である。
配列番号6は、配列番号17のアンチセンス鎖を含むsiRNAのセンス鎖配列である。
配列番号7は、配列番号18のアンチセンス鎖を含むsiRNAのセンス鎖配列である。
配列番号8は、配列番号19のアンチセンス鎖を含むsiRNAのセンス鎖配列である。
配列番号9は、2018年7月30日に入手可能な、参照配列NM_000304.3のヒトPMP22タンパク質をコードするcDNA配列である。
配列番号10は、配列番号9の配列によってコードされるヒトPMP22タンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号11は、センス鎖が、2018年7月30日に入手可能な、NCBIデータベースにおける参照NM_008885.3のマウスPMP22タンパク質をコードするcDNAであるcDNA配列である。
配列番号12は、配列番号11の配列のヌクレオチド474〜492に完全に相補的な、及び配列番号9の配列のヌクレオチド472〜489に部分的に相補的な(ヌクレオチド472に関して1つのミスマッチ)RNA配列である。
配列番号13は、配列番号11の配列のヌクレオチド923〜941に、及び配列番号9の配列のヌクレオチド905〜923に完全に相補的なRNA配列である。
配列番号14は、配列番号11の配列のヌクレオチド1562〜1580に完全に相補的な、及び配列番号9の配列のヌクレオチド1565〜1583に部分的に相補的な(5つのミスマッチ)RNA配列である。
配列番号15は、配列番号11の配列のヌクレオチド989〜1007に完全に相補的な、及び配列番号9の配列のヌクレオチド970〜988に部分的に相補的な(2つのミスマッチ)RNA配列である。
配列番号16は、配列番号11の配列のヌクレオチド1721〜1739に完全に相補的な、及び配列番号9の配列のヌクレオチド1726〜1744に完全に相補的なRNA配列である。
配列番号17は、配列番号11の配列のヌクレオチド431〜449に完全に相補的な、及び配列番号9の配列のヌクレオチド429〜447に完全に相補的なRNA配列である。
配列番号18は、配列番号11の配列のヌクレオチド1805〜1823に完全に相補的な、及び配列番号9の配列のヌクレオチド1809〜1827に完全に相補的なRNA配列である。
配列番号19は、配列番号11の配列のヌクレオチド921〜939に完全に相補的な、及び配列番号9の配列のヌクレオチド903〜921に完全に相補的なRNA配列である。
PMP22遺伝子発現に対するsiRNA PMP22の効果。クラスカル-ウォリス分析、それに続くダン検定を使用することによって、siRNA PMP22(1〜8)とsiRNA対照(CT)との間に統計的な差が見出された。siRNA PMP22(1〜8)と未処理の細胞(NT)との間の統計的な差も見出された。 PMP22タンパク質レベルに対するsiRNA PMP22の効果。タンパク質レベルを、siRNA5、6、7、及び8に対するウェスタンブロットによって査定した。GAPDHと比べた相対的PMP22タンパク質発現の定量が棒によって表されている。 PMP22及びP0 mRNA発現に対する種々の濃度のsiRNA PMP22の効果。siRNA対照(siCt)を25nM及び50nMで、並びにsiPMP22 #7(si7)を25nM、50nm、及び100nMで、MSC-80細胞に72時間及び96時間トランスフェクトした。PMP22及びP0発現をリアルタイムPCRによって査定し、GAPDH発現に対して正規化した。50nM濃度は、50%のPMP22 mRNA発現を減少させることが見出され、P0 mRNA発現に影響を及ぼすことなく、長期持続効果(96時間まで)を有した。 細胞生存率に対する種々の濃度のsiRNA PMP22の効果。細胞生存率を、図3にあるのと同じ濃度でのsiRNA対照及びsiRNA PMP22 #7の72時間及び96時間のトランスフェクション後にMTTアッセイを使用することによって査定した。50nM濃度は、MSC-80細胞生存率に有意な効果を有しない。 siRNAPMP22-SQナノ粒子のインビトロでの効力及び細胞生存率に対する効果。MSC-80細胞を、ベクター化されていないsiRNACtrl(siCtrl)、スクアレンとベクター化されたsiRNACtrl(siCtrlSQNP)、ベクター化されていないsiPMP22(siPMP22)、又はスクアレンとベクター化されたsiPMP22(siPMP22-SQ NP)によって、リポフェクタミンiMAX(登録商標)により48時間及び72時間トランスフェクトした。48時間及び72時間後、細胞を収穫し、次いでmRNAを抽出して、PMP22及びP0遺伝子発現(図5)並びに細胞生存率(図6)について分析した。ナノ製剤化されたPMP22-SQは、P0発現及び細胞生存率に影響を及ぼすことなく、ベクター化されていないsiRNA PMP22と同程度にPMP22産物を経時的に阻害した。 siRNAPMP22-SQナノ粒子のインビトロでの効力及び細胞生存率に対する効果。MSC-80細胞を、ベクター化されていないsiRNACtrl(siCtrl)、スクアレンとベクター化されたsiRNACtrl(siCtrlSQNP)、ベクター化されていないsiPMP22(siPMP22)、又はスクアレンとベクター化されたsiPMP22(siPMP22-SQ NP)によって、リポフェクタミンiMAX(登録商標)により48時間及び72時間トランスフェクトした。48時間及び72時間後、細胞を収穫し、次いでmRNAを抽出して、PMP22及びP0遺伝子発現(図5)並びに細胞生存率(図6)について分析した。ナノ製剤化されたPMP22-SQは、P0発現及び細胞生存率に影響を及ぼすことなく、ベクター化されていないsiRNA PMP22と同程度にPMP22産物を経時的に阻害した。 B6野生型及びトランスジェニックPMP22マウスでのPMP22遺伝子発現(A、B)及び行動試験(C、D、E)(n=5)。B6バックグラウンドでのトランスジェニックマウスJP18の座骨神経において、それらの対応する野生型マウスに対して査定された、PMP22(A)及びP0(B)mRNA発現。マウスに対して実施された行動試験:梁歩行試験(C)、ロコトロニック(locotronic)(D)、及び足引き込み試験(E)。 CBA野生型及びトランスジェニックPMP22マウスでのPMP22遺伝子発現(A及びB)及び行動試験(C、D)(n=3)。CBAバックグラウンドでのトランスジェニックマウスJP18の座骨神経において、それらの対応する野生型マウスに対して査定された、PMP22(A)及びP0(B)mRNA発現。マウスに対して実施された行動試験:ロコトロニック(C)及び足引き込み試験(D)。 JP18 B6バックグラウンドの行動に対するPMP22-SQナノ粒子の効果(n=5/群)。マウスを、ビヒクル(5%デキストロース、siRNA対照ナノ粒子、siRNA PMP22ナノ粒子)で処理した。次いで、握力試験(前肢の力(C)、並びに前肢及び後肢の力(D)に加えて、梁歩行(A)及びロコトロニック(B)試験を実施した。 CBAバックグラウンドでのマウスの行動に対するPMP22-SQナノ粒子の効果(n=3)。梁歩行試験を、siRNA PMP22ナノ粒子での処理の前後にマウスに対して実施した。 siRNA PMP22-SQバイオコンジュゲートの特徴付け。回収した産物を、MALDI-TOF MSによって7628の分子量を有すると特徴付けし(データ示さず)、次いでアンチセンス鎖とアニールさせた後、結果として生じたナノ粒子を、DLSによってそれらのサイズについて(下記のTable 4(表4)を参照されたい)、及びCryo-TEM(低温電子顕微鏡法)によってそれらの形態について調査した:画像は、siRNA PMP22-SQ NPが、DLSによって獲得された同じサイズを有することを示している。 ジベンゾシクロオクチンの歪み促進ヒュスゲン環化付加による、コンジュゲートしたsiRNA-スクアレンであるSQ-5'DBCO(NHC6)-siRNAの合成についての概略図。簡略化のために、1つの位置異性体トリアゾールのみが示されている。A.siRNA PMP22-SQバイオコンジュゲートの合成:siRNA:SQモル比1:50;溶媒:DMSO、アセトン、水;温度:室温;インキュベーション時間:撹拌下で一晩;B.アセトンの排除:窒素フロー下。C.HPLCによる精製。D.凍結乾燥による有機溶媒の排除;E.AS(アンチセンス)鎖とのバイオコンジュゲートアニーリング;F.水:アセトン(2:1)中へのバイオコンジュゲート可溶化。 ダブルトランスジェニックJP18/JY13 B6 CMT1Aマウスに関する行動試験分析。12週齢のダブルトランスジェニックマウスを、3つの群(それぞれn=6)に分けた。それらは以下の処理を受けた:それぞれ、5%デキストロース、siRNA Ct-SQ NP、及びsiPMP22-SQ NP。野生型B6群を対照として使用した。梁歩行試験を、処理を始める前及び処理後に実施した。各マウスによってかかった時間を、3つの通路にわたって記録した(平均±SD)。JP18/JY13 siPMP22-SQ NP群は、WT-B6群と比較した場合、処理後に正常化した時間を示し、5%デキストロース及びsiRNA ct-SQ NPを受けた群よりも有意に速かった。ロコトロニック試験を処理の終了後に実施し、それは、梁歩行試験のように有意な結果を示した。3つの通路が記録され、示されたデータは、9匹の独立したマウスの平均(平均±SD)である。(*)は、WT-B6と他の群との間の有意性を表す。(#)は、siRNA Ct NP群と他の群との間の有意性を表す。***、###:p<0.001(Anova、それに続くボンフェローニ検定)。 ダブルトランスジェニックCMT1Aマウスに関する握力試験分析。握力試験を、前肢のみ及び全肢の両方に対して、処理の終わりに実施した。siPMP22-SQ NP群を受けたJP18/JY13マウスは、未処理のマウス(ダブルトランスジェニック5%デキストロース)及びJP18/JY13 siRNA Ct-SQ NP群と比較して、それらの筋力の有意な向上を示した。それらのステングシー(stengthy)は、WT-B6群の筋力に匹敵するようになった。(*)は、WT-B6と他の群との間の有意性を表す。(#)は、JP18/JY13 5%デキストロースとJP18/JY13 siPMP22-SQ NPとの間の有意性を表す。***、###:p<0.001(Anova、それに続くボンフェローニ検定)。 シングルトランスジェニックJP18(A及びB)及びダブルトランスジェニックマウス(C及びD)JP18/JY13 CMT1Aマウスに関する電気生理学的分析:複合筋活動電位(A及びC)及び感覚神経速度(B及びD)。データは平均±SDを表す。(*)は、WT-B6と他の群との間の有意性を表す。(#)は、JP18又はJP18/JY13 5%デキストロースとJP18又はJP18/JY13 siPMP22-SQ NPとの間の有意性を表す。*#:p<0.05;**:p<0.01、***、###:p<0.001(Anova、それに続くボンフェローニ検定)。 シングルトランスジェニックJP18 CMT1Aマウスの座骨神経に関する、トルイジン染色した準超薄切片の小径及び大径線維についての線維密度及びg比分析。有髄化に対する有意な効果は、分析した種々の群の間で検出されなかった。 ダブルトランスジェニックJP18/JY13 B6 CMT1Aマウスの座骨神経に関する、トルイジン染色した準超薄切片の小径及び大径線維についての線維密度及びg比分析。有髄化に対する有意な効果は、分析した種々の群の間で検出されなかった。 シングルトランスジェニックJP18マウスに関する、転写因子SOX10(A)及びKROX20(B)のレベルについての定量分析。A.データは平均±SDを表し、各群は、3匹の異なるマウスからなる。*は、WT-B6群と他の群との間の有意性を表し、#は、JP18 5%デキストロースとJP18siPMP22-SQ NPとの間の有意性を表す。*:p<0.05;***:p<0.001、###:p<0.001(Anova、それに続くボンフェローニ検定)。B.データは平均±SDを表し、各群は、3匹の異なるマウスからなる。*は、WT-B6群と他の群との間の有意性を表し、#は、JP18 5%デキストロースとJP18siPMP22-SQ NPとの間の有意性を表す。**:p<0.01;***:p<0.001、#:p<0.05;###:p<0.001(Anova、それに続くボンフェローニ検定)。 シングルトランスジェニックJP18マウスに関する、軸索再生NFマーカーのレベルについての定量分析。データは平均±SDを表し、各群は、3匹の異なるマウスからなる。*は、WT-B6群と他の群との間の有意性を表し、#は、JP18 5%デキストロースとJP18siPMP22-SQ NPとの間の有意性を表す。***:p<0.001、###:p<0.001(Anova、それに続くボンフェローニ検定)。 ダブルトランスジェニックJP18/JY13 CMT1Aマウスに関する、シュワン細胞マーカーSOX10(A)及びKROX20(B)、並びに軸索再生NFマーカー(C)についての定量分析。データは平均±SDを表し、各群は、3匹の異なるマウスからなる。*は、WT-B6群と他の群との間の有意性を表し、#は、JP18/JY13 5%デキストロースとJP18/JY13 siPMP22-SQ NPとの間の有意性を表す。*:p<0.05;**:p<0.01;***:p<0.001、###:p<0.001(Anova、それに続くボンフェローニ検定)。 ダブルトランスジェニックJP18/JY13トランスジェニックマウスに対する、梁歩行及びロコトロニックについての長期持続効果分析。JP18/JY13 B6マウスはサイクルあたり2.5mg/Kgの2サイクルの処理を受けた。処理を2サイクルの間に21日間停止して、再発を調査した。梁歩行試験のデータ(左のパネル)は、棒を渡るのに費やされた時間を表す(平均±SD)。ロコトロニック試験のデータ(右のパネル)は、コンピューター化プログラムによって記録された時間を表す(平均±SD)。マウスを週1回追跡して、回復及び再発期間を分析した。(*)は、WT-B6と他の群との間の有意性を表す。(#)は、JP18/JY13 5%デキストロースとJP18/JY13 siPMP22-SQ NPとの間の有意性を表す。**、p<0.01、***p<0.001(Anova、それに続くボンフェローニ検定)。 ダブルトランスジェニックJP18/JY13トランスジェニックマウスに対する、握力試験についての長期持続効果分析。JP18/JY13 B6マウスはサイクルあたり2.5mg/Kgの2サイクルの処理を受けた。処理を2サイクルの間に21日間停止して、再発を調査した。握力試験のデータ(左のパネル)は、前肢でマウスによって発揮された力を表す(平均±SD)。握力試験のデータ(右のパネル)、全肢でマウスによって発揮された力(平均±SD)。マウスを週1回追跡して、回復及び再発期間を分析した。(*)は、WT-B6と他の群との間の有意性を表す。(#)は、JP18/JY13 5%デキストロースとJP18/JY13 siPMP22-SQ NPとの間の有意性を表す。**、p<0.01、***p<0.001(Anova、それに続くボンフェローニ検定)。
材料及び方法
siRNA及び化学修飾
センス及びアンチセンスsiRNA鎖の設計配列を、Eurogentec社、Franceから購入した。それらを合成し、次いでマトリックス支援レーザー脱離/イオン化飛行時間型質量分析(MALDI-TOF MS)によって特徴付けし、逆相高速液体クロマトグラフィー(RP-HPLC)によって精製した。ヌクレアーゼに対する安定化を提供する2つの3'突出2'デオキシヌクレオチド残基を有する19merとして、一本鎖RNAを合成した。機能性を保つために、ジベンゾシクロオクチン(DBCO)反応基を、N-(ヘキサメチレニル)-6-オキソヘキサンアミドスペーサー(C6)を介して各siRNA配列のセンス鎖の5'末端に導入した。RNA一本鎖からsiRNAを生成するために、等モル量のセンス及びアンチセンス鎖の両方を、アニーリングバッファー[30mM HEPES-KOH(pH7.4)、2mM酢酸Mg、100mM酢酸K]中で95℃で3分間アニールさせ、次いで、-20℃で保管する前に室温で45分間インキュベートした。
PMP22に対するsiRNAのスクリーニング
基礎レベルのPMP22遺伝子発現を回復させるために、PMP22に対する8つのsiRNA(Table 2(表2)及びTable 3(表3)を参照されたい)及びsiRNA対照(siRNA CTRL)スクランブル配列を、3つの異なる方法(Taferソフトウェア、Thermofisher社ソフトウェア、及びReynold法)を使用することによって設計した。siRNAを、リポフェクタミンiMAX(登録商標)を使用することによって、PMP22を内在的に発現するシュワン細胞モデル(MSC 80)にトランスフェクトした。PMP22発現を減少させるsiRNAの能力を、24時間、48時間、及び72時間の時点で試験した。PMP22及びP0遺伝子の両方の発現を、リアルタイムPCRによって査定した。次いで、P0レベルに影響を及ぼすことなく(P0脱調節はCMT-1病に関与すると記載されている)、長期持続効果を有して、約50%のPMP22発現を阻害し得る最良のsiRNA配列を、25nM、50nM、及び100nMの種々の濃度で試験して、PMP22及び細胞生存率(MTT試験)を減少させるその能力をチェックした。スクランブルsiRNAを対照として使用した。
Figure 2022502084
Figure 2022502084
スクアレン及びポリイソプレニル鎖へのsiRNAのコンジュゲーション:
スクアレンを、以前に記載されるように(Massaad-Massadeら、Bioconjugate Chem.、2018、29 (6)、1961〜1972頁、DOI:10.1021/acs.bioconjchem.8b00205)、ジベンゾシクロオクチンのヒュスゲン環化付加(銅不含のクリックケミストリー)によってsiRNAに結合した。簡潔には、オリゴヌクレオチドのセンス鎖を、siRNAに対する市販の修飾であるジベンゾシクロオクチン残基によって5'末端で修飾した。スクアレンは、アジド官能基を運んでいる。コンジュゲートをHPLCによって精製し、MALDI-TOFF質量分析によって特徴付けした。
siRNA PMP22及びsiRNA CTの両鎖のアニーリングを、SQへのセンス鎖のバイオコンジュゲーションの後に実施し、次いでアセトン/水中で沈降させた。撹拌下で、一方の相(水性又は有機)を他方にゆっくりと添加した。窒素流動を使用してアセトンを完全に蒸発させて、10μM濃度の純粋なsiRNA-SQナノ会合物の水性懸濁液を獲得した。対照siRNA-SQを、同じプロトコールを使用して調製した。ナノ会合物のサイズを動的光散乱によって、及びそれらのゼータ電位をそれらの電気泳動移動度によって判定した。低温透過型電子顕微鏡法を使用して、これらのスクアレンに基づくナノ会合物の形態を観察した。ナノ会合物安定性及び薬物放出を、リン酸バッファー(PBS)中及び細胞培養培地中で試験した。
siRNA PMP22-SQバイオコンジュゲートを獲得するための詳細なプロトコールが、下で記載される。
(i)siRNAのバイオコンジュゲーション
1nモルの、siRNA PMP22の5'末端修飾されたセンス鎖DBCO-C6(DNAse/RNAse不含水中1mg/mL)と、50nモルのSQ-N3(DMSO中1mg/mL)とを、DMSO(286μL)及びアセトン(65μL)を含有するガラスバイアル中で混合した。次いで、溶液を撹拌下で室温にて12時間インキュベートして、siRNA PMP22-SQバイオコンジュゲートを獲得した。翌日、過剰のアセトンを30分間の窒素フローの下で除去し、その後に凍結乾燥工程が続いた。
過剰のコンジュゲートされていないSQからのバイオコンジュゲートの精製を、下で記載されるポリマーカラムでのRP-HPLCによって実施した。siRNA PMP22-SQバイオコンジュゲートの素性をMALDI-TOF質量分析によって確認した。精製された産物を凍結乾燥し、次いでRNAse不含水に10μMの所望のモル濃度で可溶化した。同じプロトコールを実施して、siRNA Ct-SQバイオコンジュゲートを獲得した。
(ii)HPLCによるsiRNAPMP22-SQバイオコンジュゲートの精製
波長が190〜800nmに及ぶフォトダイオードアレイ検出器、ポンプ、及ぶ手動注入器を備えたthermoscientifc社高速液体クロマトグラフィーシステム(UltiMAte3000)でHPLC精製を実施した。固定相は、プレカラム(Hamilton社)で保護された、非多孔性アルキル化ポリスチレンジビニルベンゼンカラム(Hamilton社PRP-3 10μm、4.6×250mm、PEEK、Ref:79574)からなった。Thermofisher社Chromeleonソフトウェアを、1.2mL/分の流速及び100μLの注入容量を用いたデータ収集に使用した。移動相A及びBの勾配を適用した。移動相Aは、5%アセトニトリル、水90%とともに0.2M TEAA(5%)、pH7.0から構成され、一方で移動相Bは、5% TEAA、5%の水とともに95%アセトニトリルからなった。精製のために適用された勾配は以下のとおりであった:0〜8分、B相の0%〜24%の線形勾配;8〜16分、B相の24%〜90%の線形勾配;16〜18分、B相の90%〜100%の線形勾配;18〜30分、B相の100%;30〜32分、B相の100%からA相の100%への線形勾配;及び32〜42分、100%のA相での再平衡化。siRNA-SQバイオコンジュゲートを、手動のピーク回収によって精製した。2.4mLの画分容量に相当する画分を2分間回収し、次いで凍結乾燥した。すべての凍結乾燥siRNA画分を、DEPC処理水中で再構成した。
(iii)MALDI-TOF質量分析
MALDI-TOF/TOF UltrafleXtreme質量分析計(Bruker Daltonics社、Bremen)をすべての実験に使用した。マススペクトルを線形陽イオンモードで獲得した。レーザー強度をイオン生成閾値のすぐ上に設定して、著しいピークの広がりのない、考え得る最も高いシグナル対ノイズ(S/N)比を有するピークを獲得した。すべてのデータを、FlexAnalysisソフトウェアパッケージ(Bruker Daltonics社)を使用して処理した。
(iv)アンチセンスsiRNA鎖へのsiRNA-SQバイオコンジュゲートのアニーリング
メーカーのプロトコールに従って、及び1本のRNA鎖からのsiRNAの生成に関して前に言及されたのと同じように、siRNA PMP22及びsiRNA Ctの両鎖のアニーリングを、SQへのセンス鎖のバイオコンジュゲーションの後に実施した。正確には、等モル量のsiPMP22C6-SQバイオコンジュゲート及びアンチセンスsiPMP22の両方を、アニーリングバッファー[30mM HEPES-KOH(pH 7.4)、2mM酢酸Mg、100mM酢酸K]を用いて混合し、95℃で3分間インキュベートし、次いで、-80℃で保管する前又は直接沈降の前に室温で45分間インキュベートした。同じプロトコールを実施して、siRNA Ct-SQバイオコンジュゲートを獲得した。
(v)siRNAPMP22-SQナノ粒子の調製及び特徴付け
ナノ粒子(NP)のsiRNAPMP22-SQ及びsiRNA Ct-SQを、アセトン:水(1:2)中でのナノ沈降によって調製した。撹拌下で、一方の相を他方にゆっくりと添加し、すなわち10nモルのsiRNA-SQを1mlのDEPC処理水に溶解し、撹拌下で、500mlのアセトンの上に液滴を上手に添加した。次いで、2つの溶液を5分間撹拌下に保ち、その後、窒素流動を使用してアセトンを完全に蒸発させて、10μM濃度の純粋なsiRNA-SQナノ会合物の水性懸濁液を獲得した。
流体力学的直径(nm)を、動的光散乱(DLS)のMalven社Zeta Sizer NANOによって測定した。サンプルをH2O中10μM濃度で分析した。サンプルあたりそれぞれに対して5分間の3回の測定を実施し、3つの独立したサンプルの平均直径±S.D.を算出した。
低温透過型電子顕微鏡法(cryo-TEM)を、電子顕微鏡法プラットフォーム(IBPS/lnstitut de Biologie Paris-Seine、Universite P. et M. Curie、Paris、FRANCE)でJEOL社2100電子顕微鏡を用いて実施した。4μLのsiRNA PMP22-SQ NPの液滴(2.2mg/mLの濃度)を、炭素コーティングされた銅グリッド上に堆積させた。過剰の液体をブロッティング濾紙で除去し、サンプルを、ギロチン様骨組みを使用してエタン液体中にそれらを入れることによって急速にガラス状にした。次いで、サンプルを低温サンプル容器に移した。低い電子線量下にて200kVの加速電圧で観察を行った。Image Jソフトウェアを用いて分析を実施した。
条件付きCMT-1AトランスジェニックマウスモデルにおけるsiRNA PMP22-SQナノ粒子の効果
この調査は、Pereaら(Hum Mol Genet 10、1007〜1018頁、2001)によって確立されたCMT-1Aのマウスモデルにおいて、インビボで最初に実施された。このモデルでは、PMP22の過剰発現は、末梢神経のシュワン細胞で特異的に生じ、CMT-1A病の原因となる脱髄を引き起こす。トランスジェニックマウスを、B6及びCBAという2つの遺伝的バックグラウンドにおいて、卵母細胞の復活(reviviscence of oocyte)後に、TAAM CNRSから購入した。3ヶ月齢の時点で、分子及び行動調査をJP18 B6及びCBAで実施して、それぞれPMP22のそれらの遺伝子発現、運動機能及び感覚機能を調査した。このマウスモデルは、PMP22遺伝子の1つの余分なコピーを含む。すべてのデータを、B6又はCBAバックグラウンドにおけるCMT-1AマウスとWTマウスとの間で比較した。JP18マウスモデルに関しては、マウスpmp22 cDNAをPhCMV*-1プロモーターの制御下に導入し、それ故、マウスは一生を通じてpmp22を過剰発現した。
この調査を、ダブルトランスジェニックマウスモデル(JP18/JY13)でも実施した。このモデルは、JP18とJY13マウスとを交配することによって作出され、PMP22遺伝子の2つの余分なコピーを含む。テトラサイクリンの非存在下で、pmp22過剰発現は、マウス寿命を通して生じる。10日齢の時点で、PMP22及びtTA配列に対する特異的プライマーを使用することによって、Robertsonらによって以前に記載されるように、マウスを系統的に遺伝子型判定した。
CMT-1A病態の進行に対しての、PMP22に対するsiRNAの投与の影響
JP18B6マウスを、比較としての野生型群に加えて、それぞれ5匹の3群に分けた。1つの群に5%デキストロース溶液のビヒクルを与え、2番目をsiRNACTRL-SQ NPで処理し、3番目をsiRNAPMP22-SQ NPで処理した。すべての処理を、1週間あたり2回、注射あたり0.5mg/kgの間隔で、2.5mg/Kgの累積用量の眼下IV注射によって投与した(合計5回の処理)。処理の終わりに、マウスを屠殺し、座骨神経を更なる調査のために採取した。すべての動物実験は、French Ministry of Higher Education and Research(Ministere de I'Enseignement Superieur et de la Recherche;MESR、APAFIS#I 0131-2016112916404689 vl 6)に登録された施設内動物実験倫理委員会(CEEA)及び研究評議会によって承認され、欧州共同体によって確立された条件(2010/63/UE指示)下でのフランスの法律及び規制に従って実行された。検証は、倫理基準に従って及びヘルシンキ宣言に従って行われた。動物の苦痛を最小限に抑えるあらゆる努力がなされた:処理の投与は、イソフルラン麻酔の下で実施され、動物は頸椎脱臼によって屠殺された。すべての動物は、滅菌した層流ケージシステムで飼育された。食糧、水、及び寝床は、ケージ内に置かれる前に滅菌された。食糧及び水は、自由裁量で与えられた。
病態の進行又は退縮を、行動学的梁歩行試験及び握力試験によってモニターした。これらの試験は、本質的には、直立したままでいる及び上昇した且つ比較的狭い梁の上を歩く動物の能力、並びにそれらの筋力を検討する。
より影響を受けたCMT1Aマウスモデルに対してsiPMP22-SQ NPを試験する別の同様の実験では、PMP22遺伝子の2つの余分なコピーを持するダブルトランスジェニックモデル(JP18/JY13)を使用した。12週齢の時点で、JP18/JY13マウスを、J18マウスの群と同様の3つの群に分けた。処理の同じプロトコールを実施し、野生型B6群に加えて、群あたり6匹のマウスを使用した。行動試験を、JP18 B6マウスに関して言及されたように実施し、その後に座骨神経を採取した。
siPMP22-SQ NPの長期持続効果を調査するために、12週齢のJP18/JY13 B6マウスを使用した。マウスを、対照としての野生型B6群に加えて、それぞれ6匹の3つの群に再度分けた:JP18/JY13ビヒクル、JP18/JY13 siRNA Ct-SQ NP、及びJP18/JY13 siPMP22-SQ NP。2サイクルの処理を投与した。第1のサイクルの処理は、1週間あたり2回、注射あたり0.5mg/Kgの間隔で、2.5mg/kgのsiPMP22-SQ NP及びsiRNA Ct-SQ NPの累積用量である。次いで、処理を3週間停止して再発期間をチェックし、第1の処理サイクルの終わりに群あたり3匹のマウスを屠殺し、座骨神経を更なる分析のために採取した。4週目に、1週間あたり2回、注射あたり0.5mg/Kgの間隔で、2.5mg/kgのsiPMP22-SQ NP及びsiRNA Ct-SQ NPの別の累積用量に対して、新たなサイクルの処理を開始した。処理の前、1.5mg/kgの第1の処理サイクル時、2.5mg/kgの第1の処理サイクル時、第1のサイクルの処理を停止した2週間後、第1のサイクルの処理を停止した3週間後、1.5mg/kgの第2の処理サイクル、及び2.5mg/kgの第2の処理サイクルに、行動試験を実施した。座骨神経を、第2のサイクルの終わりに、更なる分析のために摘出した。
行動試験
梁歩行試験:3cmの直径、70cmの長さ、及び平面からおよそ30cm上方にある桿を有するプラットフォームにマウスを置いた。桿の一方の末端に、動物を収容する安全プラットフォームを設定した。まずマウスを順応させ、次いで梁を渡るために訓練し、その後、横断するのにかかる時間、速さ、停止の回数、及び左又は右ヒンダウ(hindaw)の誤り/スリップの回数を分析のために記録した。処理を始める前及び実験の終わりに、セッションあたり3回の試行に対して動物を記録した。動物あたり3回繰り返される行動課題を、高解像度デジタルカメラを使用して記録した。
ロコトロニック:ロコトロニック装置を使用して、歩行時の運動協調を試験した。マウスは、2cm離れて設定された棒(直径が7mm)を有する75×5×20cmの平らなはしごを渡った。棒の上下に位置した赤外線フォトセルセンサーが、足のエラーをモニターした。ロコトロニック装置は、経路を渡るのにマウスによってかかった時間並びに足のエラーを自動的に記録するソフトウェアに連結されている。時間及びエラーを、試行の間に15分間の休息を有して、3回の試行で査定した。処理の終わりに試験を実施した。獲得されたデータの統計分析を、各群に対して3日間にわたる1日あたり3回の試行の平均を算出することによって実施した。データを平均±SDとして提示した。
握力試験:握力試験を使用することによって、神経筋の力を査定した。コンピューター化された握力計測器を使用して、この試験を実施した。装置は、力変換器に接続されたT型の金属棒及び長方形の金属棒からなった。マウスの前足における力を測定するために、各マウスを尾の付け根でそっと支え、動物にT型金属棒をその前足で握らせた。マウスが変換器金属棒をそれらの前足で握り次第、マウスを、握りが解放されるまで尾で後方へそっと引き寄せた。この工程を3回繰り返し、最も高い力が機器によってグラム(g)で自動的に記録された。両肢に関する力を測定するために、各マウスに前及び後肢で長方形の金属を握らせた。その後、マウスが握りを解放するまで、それを装置の軸と垂直のその尾でそっと引き寄せた。最も高い力が、機器によって自動的に記録された。
ホットプレート試験:後足引き込み試験を使用して、熱に対する感度を査定した。動物を置いたプラットフォームを52℃に設定し、熱を感知しそれらの足を引き込むまでの時間を分析のために記録した。
電気生理学的調査
アメリカ神経筋電気診断医学協会(American Association Of Neuromuscular And Electrodiagnostic Medicine)のガイドラインに従って、標準的EMG装置(Natus/EMG)を用いて試験を行った。イソフルラン吸入によって麻酔を実施し、マウスを純酸素中1.5〜2%イソフルランを含有する誘導チャンバーに置いた。全手順の間、フェイスマスクにより麻酔を同じレベルで維持した。マウスを加熱パッド上のそれらの正面側に置いて、それらの体温を34〜36℃に維持した。複合筋活動電位を記録するために、刺激針電極を座骨神経ノッチレベルに挿入し、陽極電極を尾の上側基部に挿入し、一方でレセプター針又は記録針を腓腹筋の内側部に挿入した。8mAの最大上矩形波パルスを刺激針を通じて送達し、筋肉を通じて大きさとして記録した。感覚神経伝導速度の測定のために、レセプター針から2〜2.5cmの距離を有して尾の長さの2/3に配置された刺激針を通じて、尾神経の複数回刺激を送達した。刺激電極とレセプター電極の中間に接地電極を挿入した。感覚神経伝導速度を、刺激の待ち時間、及び刺激電極とレセプター電極の間の距離から算出した。
生物学的試験
CMT-1A動物(siRNAで処理された又は処理されていない)の座骨神経組織構造を、有髄又は無髄軸索の数及び髄鞘の厚みがg比を判定することによって査定される電子顕微鏡法によって調査した。次いで、軸索あたりのミトコンドリアの数を算出して、軸索罹患を査定した。RT-qPCR及びウェスタンブロット実験を実施して、CMT-1Aマウスの座骨神経におけるPMP22発現に対するsiRNAの効果を評価した。PMP22発現を対照レベル(siRNA PMP22で処理されたWT動物又はCMT-1Aマウス)に対して正規化した。siRNA PMP22で処理された又は処理されていないCMT-1Aマウスの神経筋接合部(NMJ)を免疫組織化学によって分析する。CMT-1Aにおける筋肉の衰弱は軸索変性症に起因しており、筋肉の除神経及び萎縮をもたらす。
CMT-1Aでは、神経筋接合部消失が観察される。NMJを調査して、siRNA療法の有効性を判定することが重要である。共焦点及び電子顕微鏡法を使用して、NJMの構造についての包括的調査(神経支配、除神経、神経再支配等)を実施する。
薬物動態及び生体内分布調査
放射性標識された遊離した又はSQコンジュゲートしたsiRNA PMP22(siRNA PMP22-SQ 32P NP)を、CMT-1Aを持つトランスジェニックマウスに静脈内注射する。種々の時点で臓器及び血液を採取し、遊離対siRNA PMP22-SQ NPの濃度を、gカウンターによって放射能をカウントすることによって判定した。また、siRNA PMP22は所望の組織内にいったん蓄積されると分解されないことが「Radio-HPLC」分析によって立証される。薬物動態パラメーターを算出する(例えば、血漿中半減期及びクリアランス)。特筆すべきは、スクアレンの50%を上回る割合がLDL及びHDLリポタンパク質によって輸送され、それ故、siRNA PMP22-SQ NPと血液構成成分(すなわち、LDL、HDL、VLDL、血球等)との考え得る相互作用を、Sawleら(Journal of lipid research 43、335〜343頁、2002)によって以前に記載されるように評価する。
統計分析
すべてのデータを平均±標準偏差(SD)として提示した。ノンパラメトリックなクラスカル-ウォリス分析、それに続くダン検定、又はAnova、それに続くボンフェローニ検定を使用し、GraphPad Prismを使用して複数の処理を比較した。p<0.05を統計的に有意なレベルと見なした。
結果
MSC-80細胞におけるPMP22 mRNA発現に対するsiRNA PMP22の効果
まず、mRNA PMP22発現に対するsiRNA PMP22(1〜8)の効果を調査した。それを、未処理の細胞へのsiRNA対照であるスクランブル配列に対する効果と比較した。クラスカル-ウォリス、それに続くダン検定を使用することによって、siPMP6を除いて、すべてのsiRNAが、PMP22発現を24時間及び48時間有意に下方調節することが見出された。トランスフェクションの72時間後、siPMP4、5、7、及び8は、対照と比較した場合に、PMP22遺伝子発現を50%減少させ得た(図1を参照されたい)。加えて、トランスフェクションの72時間後、siPMP7は、PMP22の遺伝子発現を減少させ得るだけでなく、そのタンパク質発現も減少させ得ることが見出された(図2を参照されたい)。
mRNA PMP22及びP0に対する並びに細胞生存率に対する、種々の濃度のsiPMP22の効果
その後、72時間及び96時間のMSC80細胞のトランスフェクションによるPMP22及びP0の遺伝子発現に対する、種々の濃度(25nM、50nM、及び100nM)のsiPMP7の効果を調査して、ミエリン圧縮及び細胞生存率にPMP22とともに関与するタンパク質であるP0発現に影響を及ぼすことなくPMP22発現を正常化し得る最適な濃度を判定した。本発明者らの結果は、最適な濃度は50nMであることを示している。siPMP7(50nM)は、72及び96時間の間、PMP22の遺伝子発現をそれぞれ50%減少させ、一方でそれはP0遺伝子発現に影響を及ぼさなかった(図3を参照されたい)。また、MTTアッセイによる細胞生存率試験は、siPMP7 50nMが、MSC80生存率に有意な効果を有しないことを示している(図4を参照されたい)。siRNA対照(siCt)は、調査した2つの遺伝子の発現及び細胞生存率を改変しない。
その後siPMP22と名付けられたsiPMP7は、それがPMP22レベルを50%減少させる能力を有し、それはP0レベルに影響を及ぼさず且つインビトロで細胞の生存率に効果を有しなかったことから、調査を続ける最良の候補であった。
siRNA PMP22の配列は、
センス鎖:5'-AUACCAACUGUGUGGACUA-3'(配列番号7)
アンチセンス鎖:5'-UAGUCCACACAGUUGGUAU-3'(配列番号18)
である。
スクアレン(SQ)へのsiRNAPMP22及びsiRNA CTRLの結合、並びにsiRNA PMP22-SQナノ粒子の特徴付け
バイオコンジュゲートsiRNA PMP22-SQ及びsiRNA CTRLを、図12に詳述される反応の最適化条件のおかげで90%を上回る割合の産出量を有して、Cu不含クリックケミストリーによって獲得した。siRNA PMP22-SQに関しては、HPLCによって同定され且つMALDI-TOF MSによって分析された回収副産物(bi-product)は、バイオコンジュゲートが7628の予想分子量を有することを示した(データ示さず)。結果として生じたバイオコンジュゲートをアンチセンス鎖とアニールさせ、RNAse不含水中でナノ沈降させた。溶液はチンダル効果を生み出し、ナノ粒子の形成を示唆した。動的光散乱分析(DLS)及びcryoTEM画像は、良好な多分散指数(0.14〜0.2)を有する約180nmの安定なナノ粒子の形成を30日間示し、IV注射に適した均質な溶液を反映した(図4を参照されたい)。siRNA CTRLに関しては、バイオコンジュゲーション及び産物の回収の後にMALDI-TOF MSによって同定された分子量は7621ダルトンであった。DLS測定は、siRNA CTRL-SQ NPのサイズが、1ヶ月の期間にわたって安定であること(サイズ:0日目に255±2及び30日目に238±4)、及び多分散指数(0及び30日目にそれぞれ0.15±0.02及び0.1±0.01)を示した。
Figure 2022502084
次いで、これらのナノ粒子siRNA PMP22-SQ及びsiRNA CTRLを、それらの効率及び細胞生存率に対する効果についてインビトロで経時的に(48時間及び72時間)試験した。以前に、本発明者らは、スクアレンに基づくsiRNAナノ粒子が、いかなるカチオン性化合物もなしでは、細胞内に自然発生的に入り得ないことを示した。故に、SQに基づくsiRNA PMP22ナノ粒子並びにベクター化されていないsiRNA PMP22を、リポフェクタミンiMAX(登録商標)を使用することによってMSC-80細胞にトランスフェクトした。48及び72時間後、ベクター化されたsiRNA PMP22は、細胞生存率に影響を及ぼすことなく(図6を参照されたい)、遊離siRNA PMP22と同程度にmRNA PMP22を阻害し得た(図5を参照されたい)。更には、ナノ製剤化された又はベクター化されていないsiRNA対照は、細胞がトランスフェクトされた場合、PMP22 mRNAレベル又は細胞生存率に影響を及ぼさなかった(図5及び図6を参照されたい)。
まとめると、調査のこの部分は、
i)siRNA PMP22のスクアレノイル化(squalenoylation)が、SQへのバイオコンジュゲーション後に約100%の産出量、及びHPLC精製後に約85%の産出量を生み出したこと;
ii)結果として生じたNPが再現性があり且つ1ヶ月にわたって安定であること;並びに
iii)NPがインビトロで効率的であり:リポフェクタミンを用いてトランスフェクトした場合に、それらは、むき出しのsiRNA PMP22と同程度にPMP22を阻害し、且つ細胞生存率に効果を有しなかったこと
を示した。
インビボ実験:B6及びCBA野生型及びトランスジェニックPMP22マウスでのPMP22遺伝子発現及び行動試験
まず、B6及びCBAバックグラウンドにおけるトランスジェニックPMP22マウスをそれらの対応する野生型マウスと比較することによって、座骨神経でのPMP22の発現を試験した。B6及びCBAバックグラウンドにおける両PMP22マウスに関して、本発明者らは、野生型と比較してPMP22 mRNA発現の増加を見出した。P0発現は、両鎖において同じレベルで見出された(図7A及び図7B、並びに図8A及び図8Bを参照されたい)。
微細な運動協調及び平衡を、梁歩行及びロコトロニックアッセイによって査定した。これらの試験の目標は、マウスが、直立した状態を保つこと、及び上昇した狭い梁を安全プラットフォームまで歩いて渡ることである。興味深いことに、梁歩行及びロコトロニックアッセイは、野生型と比較して、B6及びCBAバックグラウンドにおける両PMP22マウスに関して時間及び誤りの回数の増加を示し、CMT-1A病の発症を示唆した。実のところ、図7C、図7D、及び図8Cに見られるように、CMT-1Aマウスにおいて、梁上での速さの有意な減少が観察される。実際に、CMT-1Aマウスは、対照マウスよりも2倍遅く距離を歩き、CMT-1A動物の脚スリップ(誤り)の回数は増加する。侵害受容器(感覚ニューロン)の刺激によって引き起こされる、痛みを感じる等の不快な刺激を検出する足引き込み試験は、トランスジェニック及び野生型マウスに対して同一であることが見出され、これらのトランスジェニックマウスの感覚ニューロンは影響を受けないことを示唆した。それ故、本発明者らの調査において有用なモデルは、i)染色体17p11.2上の1.5Mb重複に起因したPMP22発現の2倍未満の増加、ii)運動ニューロン活性の減少、及びiii)感覚ニューロンは影響を受けなかった、によって特徴付けられるCMT-1A病態を表す。末梢神経損傷は欠陥を誘導する傾向があり、それは、齧歯類を一方の側にスリップさせ得る。
JP18 B6及びCBAバックグラウンドの行動に対するPMP22-SQナノ粒子の効果
非常に興味深いことに、B6バックグラウンドでのJP18で行われた梁歩行試験は、siRNA PMP22-SQナノ粒子により処理されたマウスによって道を渡るのに費やされた時間が、未処理の野生型マウスのものに匹敵することを示した(図8C;図8Dを参照されたい)。ビヒクル(5%デキストロース)で又はsiRNA対照-SQナノ粒子で処理されたマウスは、時間の差を示さなかった。CBAマウスでの予備的結果は、siRNA PMP22-SQナノ粒子で処理された群に対して同じ結果を示した(図10を参照されたい)。
まとめると、これらの結果は、siRNAPMP22-SQナノ粒子が、CMT-1Aトランスジェニックマウスの運動活性を回復させ得ることを示している。
siRNA PMP22-SQナノ粒子は、シングル及びダブルトランスジェニックマウスにおいて運動活性を回復させる
マウスの歩行運動活性を、処理の前及び終了後に、2つの補完的試験:梁歩行及びロコトロニック試験によって試験した。また、握力を同じ条件下で調査した。本発明者らは、siRNA PMP22-SQナノ粒子で処理されたJP18(シングルトランスジェニック)及びJP18/JY13(ダブルトランスジェニック)マウスが、野生型マウスと同様の歩行運動能力、並びに未処理のマウス(5%デキストロース)及びCt-SQナノ粒子で処理されたマウスよりも有意により優れた歩行運動能力を有することを見出した(図13及び図14)。
電気生理学結果
siPMP22-SQ NPは、単一及びダブルトランスジェニックマウスの両方において、処理の3週間後に、複合筋活動電位(CMAP)(図15A及び図15Cを参照されたい)及び感覚神経速度(図15B及び図15Dを参照されたい)を回復させる。
有髄化及び軸索再生
siPMP22-SQ NPは、単一及びダブルトランスジェニックマウスの両方において、g比を改変しなかった(図16及び図17を参照されたい)。
座骨神経の超薄切片のTEM顕微鏡写真は、siPMP22-SQ NPで処理された単一及びダブルトランスジェニックマウスにおいて、髄鞘の調節を示した(データ示さず)。ナノ粒子は、シュワン細胞の細胞質に局在し、それらはランヴィエ絞輪を通って神経に入り得ることも示された(データ示さず)。
次いで、有髄化及び軸索再生に関与するタンパク質の発現を、単一トランスジェニックマウスモデルにおいて分析した。転写因子SOX10、有髄化因子KROX20、及び軸索再生NFマーカーのレベルは、JP18 5%デキストロース及びsiRNA Ct群において低減し;顕著には、siPMP22-SQ NP処理は、JP18 5%デキストロース群と比較して、それらのレベルを有意に増加させた(図18A及び図18B及び図19を参照されたい)。同様の結果がダブルトランスジェニックマウスモデルにおいて得られ:siPMP22-SQ NP処理は、JP18/JY13 5%デキストロース群と比較して、有髄化転写因子(SOX10及びKROX20)を増加させ、軸索再生を増強した(図20を参照されたい)。
ダブルトランスジェニックマウスの行動に対するsiRNA PMP22-SQ NPの長期効果
次いで、梁歩行、ロコトロニック、及び握力試験に対するsiPMP22-SQ NPの長期持続効果を分析した。ダブルトランスジェニックJP18/JY13 B6マウスはサイクルあたり2.5mg/Kgの2サイクルの処理を受けた。処理を2サイクルの間に21日間停止して、再発を調査した。マウスを週1回追跡して、回復及び再発期間を分析した。
JP18/JY13マウスの運動活性は、1,5mg/kgの投薬から回復し(1回目の注射の11日後)、この効果は、最後の処理(1回目の注射のおよそ30日後)の後15日間続いた。しかしながら、1回目の注射の37日後に再発があった。第2のサイクルの処理における同じ用量(1,5mg/kg、第2のサイクルの1回目の注射の11日後)から、マウスは野生型マウスのように歩行した。第2のサイクルの処理の終わりに、寛解は完全であった(図21を参照されたい)。同じ結果プロファイルが握力に関して観察された(図22を参照されたい)。
結論
CMT-1A病は、シャルコー・マリー・トゥース(CMT)病態の最もよく見られるタイプであり、CMTの症例の40〜50%を占める。この独創的な手法は、特にsiRNAによって、末梢ミエリンタンパク質22(PMP22)の過剰発現を標的とすることによる、CMT-1A病に対する新たな療法を開発することを目指す。
染色体17p11.2上の1.5Mb重複に起因したPMP22の50%過剰発現に対抗し得る、PMP22に対するsiRNAの開発に成功し、故に正常レベルのPMP22発現を回復させた。重要なことに、PMP22のノックダウンは、有髄化過程にPMP22とともに関与するMPZ(P0)に影響を及ぼさなかった(MPZの異常調節は、別のタイプのCMTであるCMT1Bにつながり得る)。更には、言及されたsiRNAは、細胞の生存率に影響を及ぼさなかった。
次いで、PMP22を標的とするsiRNAを保護し且つ安全に送達するために、「クリックケミストリースクアレノイル化手法」を開発した。スクアレンへのsiRNA PMP22のバイオコンジュゲーションは準完全であり、95%の反応物産出量を与えた。siRNA PMP22-SQ NPは、パッセンジャーセンス鎖のみにおける修飾のおかげで、スクアレンとのバイオコンジュゲーション後に依然として活性であった。ナノ沈降の後、結果として生じたナノ粒子は、約180nmのサイズ及び0.14という低い多分散指数を有して30日間安定であり、これらのナノ粒子が静脈内注射され得ることを表した。
興味深いことに、PMP22が1.5倍過剰発現するCMT-1Aのトランスジェニックマウスモデルにおいて、静脈内経路を介して注射されたこれらのsiRNA PMP22-SQナノ粒子は、CMT-1Aマウスの運動活性を回復させ得、それは野生型マウスと同一になったことが実証された。この実証は、B6及びCBAマウスという2つの遺伝的バックグラウンドで行われ、同様の結果を与えた。同様の結果が、ダブルトランスジェニックJP18/JY13 B6マウスを使用して得られた。
CMT病態の主要な形態であるCMT-1Aにおいて、PMP22発現を微調整することにおける調節のおかげで、siRNAによって遺伝子の発現を50%ノックダウンすることによるマウスにおける運動活性の回復を記載している利用可能な同等の調査は、欧州にも世界の他の地域にもない。

Claims (17)

  1. シャルコー・マリー・トゥース1A(CMT-1A)の治療における使用のための、PMP22タンパク質をコードするmRNAを標的とするアンチセンスRNA。
  2. 前記アンチセンスRNAが、細胞におけるPMP22タンパク質の量を40%〜60%低下させる、請求項1に記載の使用のためのアンチセンスRNA。
  3. 前記アンチセンスRNAが、siRNA、shRNA、miRNA、dsRNA、及びインビボで切断されてsiRNAを形成し得るRNA種からなる群から選択される、請求項1又は2に記載の使用のためのアンチセンスRNA。
  4. 前記アンチセンスRNAが、(i)配列番号9の配列、(ii)配列番号11、又は(iii)配列番号9若しくは11の配列の天然に存在するバリアント、の一部分に相補的である、請求項1から3のいずれか一項に記載の使用のためのアンチセンスRNA。
  5. 前記アンチセンスRNAが、
    (i)
    - 配列番号11の配列のヌクレオチド989〜1007、
    - 配列番号9の配列のヌクレオチド970〜988、
    - 配列番号11の配列のヌクレオチド1721〜1739、
    - 配列番号9の配列のヌクレオチド1726〜1744、
    - 配列番号11の配列のヌクレオチド431〜449、
    - 配列番号9の配列のヌクレオチド429〜447、
    - 配列番号11の配列のヌクレオチド1805〜1823、
    - 配列番号9の配列のヌクレオチド1809〜1827、
    - 配列番号11の配列のヌクレオチド921〜939、若しくは
    - 配列番号9の配列のヌクレオチド903〜921
    からなる、その中に含まれる、若しくはそれと重複する一部分、又は
    (ii)天然に存在するバリアントに存在する(i)の一部分と相同な一部分
    に相補的である、請求項4に記載の使用のためのアンチセンスRNA。
  6. 前記アンチセンスRNAが、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、及び配列番号19の配列からなる群から選択される配列の少なくとも10個の連続ヌクレオチドを含む、請求項1から5のいずれか一項に記載の使用のためのアンチセンスRNA。
  7. 前記アンチセンスRNAが、1つ又は2つの一本鎖突出を含むsiRNAである、請求項1から6のいずれか一項に記載の使用のためのアンチセンスRNA。
  8. 前記アンチセンスRNAが、(i)配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、及び配列番号19の配列からなる群から選択される配列、並びに(ii)任意で、1つ又は2つの一本鎖突出、を含む又はそれからなるsiRNAである、請求項1から7のいずれか一項に記載の使用のためのアンチセンスRNA。
  9. 前記アンチセンスRNAが、前記アンチセンスRNAを含むナノ粒子の形態で提供される、請求項1から8のいずれか一項に記載の使用のためのアンチセンスRNA。
  10. 前記アンチセンスRNAが、静脈内に、腹腔内に、皮下に、又は神経内に、好ましくは座骨神経に投与される、請求項1から9のいずれか一項に記載の使用のためのアンチセンスRNA。
  11. 前記アンチセンスRNAが、シャルコー・マリー・トゥース1Aの治療において有用な少なくとも別の薬物と組み合わせて使用される、請求項1から10のいずれか一項に記載の使用のためのアンチセンスRNA。
  12. PMP22タンパク質をコードするmRNAを標的とするアンチセンスRNAであって、前記アンチセンスRNAが、
    (i)
    - 配列番号9の配列のヌクレオチド970〜988、
    - 配列番号11の配列のヌクレオチド431〜449、
    - 配列番号9の配列のヌクレオチド429〜447
    からなる、その中に含まれる、又はそれと重複する一部分、
    (ii)
    - 配列番号11の配列のヌクレオチド1721〜1739、
    - 配列番号9の配列のヌクレオチド1726〜1744、
    - 配列番号11の配列のヌクレオチド1805〜1823、
    - 配列番号9の配列のヌクレオチド1809〜1827
    からなる又はそれと重複する一部分、
    (iii)天然に存在するバリアントに存在する(i)又は(ii)の一部分と相同な一部分
    に相補的な核酸である、アンチセンスRNA。
  13. 前記アンチセンスRNAが、siRNA、shRNA、miRNA、dsRNA、及びインビボで切断されてsiRNAを形成し得るRNA種からなる群から選択される、請求項12に記載のPMP22を標的とするアンチセンスRNA。
  14. 前記アンチセンスRNAが、1つ又は2つの一本鎖突出を含むsiRNAである、請求項12又は13に記載のPMP22を標的とするアンチセンスRNA。
  15. 前記アンチセンスRNAが、(i)配列番号16、配列番号17、及び配列番号18の配列からなる群から選択される配列、並びに(ii)任意で、1つ又は2つの一本鎖突出、を含む又はそれからなるsiRNAである、請求項12から14のいずれか一項に記載のPMP22を標的とするアンチセンスRNA。
  16. 請求項12から15のいずれか一項に記載のアンチセンスRNAを含むナノ粒子。
  17. 前記アンチセンスRNAが、スクアレン又はその誘導体に結合している、請求項16に記載のナノ粒子。
JP2021540927A 2018-09-25 2019-09-24 シャルコー・マリー・トゥース１ａ病の治療のための、ｐｍｐ２２を標的とするアンチセンスｒｎａ Pending JP2022502084A (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP18306241.3A EP3628735A1 (en) 2018-09-25 2018-09-25 Antisense rna targeting pmp22 for the treatment of charcot-marie-tooth 1a disease
EP18306241.3 2018-09-25
PCT/EP2019/075736 WO2020064749A1 (en) 2018-09-25 2019-09-24 Antisense rna targeting pmp22 for the treatment of charcot-marie-tooth 1a disease

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2022502084A true JP2022502084A (ja) 2022-01-11

Family

ID=63762431

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2021540927A Pending JP2022502084A (ja) 2018-09-25 2019-09-24 シャルコー・マリー・トゥース１ａ病の治療のための、ｐｍｐ２２を標的とするアンチセンスｒｎａ

Country Status (6)

Country Link
US (1) US11939577B2 (ja)
EP (2) EP3628735A1 (ja)
JP (1) JP2022502084A (ja)
AU (1) AU2019350357A1 (ja)
CA (1) CA3112870A1 (ja)
WO (1) WO2020064749A1 (ja)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021184021A1 (en) * 2020-03-13 2021-09-16 Codiak Biosciences, Inc. Extracellular vesicle-aso constructs targeting pmp22
WO2023012165A1 (en) 2021-08-02 2023-02-09 Universite De Montpellier Compositions and methods for treating cmt1a or cmt1e diseases with rnai molecules targeting pmp22
WO2023070086A1 (en) * 2021-10-22 2023-04-27 Sarepta Therapeutics, Inc. Morpholino oligomers for treatment of peripheral myelin protein 22 related diseases
CA3235392A1 (en) * 2021-11-18 2023-05-25 Novartis Ag Compounds targeting pmp22 for the treatment of charcot-marie-tooth disease

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2601497T3 (es) 2004-06-10 2017-02-15 Omeros Corporation Métodos para tratar afecciones asociadas con la activación del complemento dependiente de MASP-2
FR2874016B1 (fr) 2004-06-30 2006-11-24 Centre Nat Rech Scient Cnrse Nanoparticules de derives de la gemcitabine
CA2767225A1 (en) * 2009-07-06 2011-01-13 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for enhancing production of a biological product
WO2012139081A2 (en) 2011-04-08 2012-10-11 University Of Leicester Methods for treating conditions associated with masp-2 dependent complement activation
US9970001B2 (en) * 2014-06-05 2018-05-15 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for nuclease design
WO2016011080A2 (en) * 2014-07-14 2016-01-21 The Regents Of The University Of California Crispr/cas transcriptional modulation
US20170196954A1 (en) 2014-07-15 2017-07-13 Immune Design Corp. Prime-boost regimens with a tlr4 agonist adjuvant and a lentiviral vector
AU2017229778A1 (en) * 2016-03-09 2018-08-16 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for inhibiting PMP22 expression
KR101872105B1 (ko) * 2016-09-05 2018-06-27 사회복지법인 삼성생명공익재단 샤르코 마리 투스병 치료용 약학 조성물
AU2017358122B2 (en) * 2016-11-14 2022-12-22 Toolgen Incorporated Artificially engineered SC function control system

Also Published As

Publication number Publication date
EP3628735A1 (en) 2020-04-01
EP3856906A1 (en) 2021-08-04
WO2020064749A1 (en) 2020-04-02
CA3112870A1 (en) 2020-04-02
US20220002721A1 (en) 2022-01-06
AU2019350357A1 (en) 2021-04-22
US11939577B2 (en) 2024-03-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11939577B2 (en) Antisense RNA targeting PMP22 for the treatment of Charcot-Marie-Tooth 1A disease
Kordower et al. Delivery of neurturin by AAV2 (CERE‐120)‐mediated gene transfer provides structural and functional neuroprotection and neurorestoration in MPTP‐treated monkeys
Kostich et al. Inhibition of AAK1 kinase as a novel therapeutic approach to treat neuropathic pain
Wu et al. The promotion of functional recovery and nerve regeneration after spinal cord injury by lentiviral vectors encoding Lingo-1 shRNA delivered by Pluronic F-127
Jablonka et al. Therapy development for spinal muscular atrophy: perspectives for muscular dystrophies and neurodegenerative disorders
Elsherbiny et al. ABT-702, an adenosine kinase inhibitor, attenuates inflammation in diabetic retinopathy
US20210077520A1 (en) Vesicles comprising a pten inhibitor and uses of same
Boutary et al. Treating PMP22 gene duplication-related Charcot-Marie-Tooth disease: the past, the present and the future
EP3942049A1 (en) Antisense oligonucleotide-based progranulin augmentation therapy in neurodegenerative diseases
JP2016521556A (ja) Ｆｏｘｐ３発現を調節するための組成物及び方法
JP2015518711A (ja) Ｂｄｎｆ発現を調節するための組成物及び方法
Almutiri et al. Non-viral-mediated suppression of AMIGO3 promotes disinhibited NT3-mediated regeneration of spinal cord dorsal column axons
JP2021525707A (ja) 脊髄損傷を処置するための方法
Uniyal et al. Unlocking the potential of TRPV1 based siRNA therapeutics for the treatment of chemotherapy-induced neuropathic pain
KR20210044771A (ko) 인간 지방세포에 대한 치료제의 표적화 전달
Rauck et al. Biocompatibility of a coacervate-based controlled release system for protein delivery to the injured spinal cord
Longaretti et al. LSD1 is an environmental stress-sensitive negative modulator of the glutamatergic synapse
TW201919655A (zh) 治療肌肉萎縮症的方法
US10220077B2 (en) Combination treatment for amyotrophic lateral sclerosis (ALS)
Kawakami et al. Atelocollagen‐mediated systemic administration of myostatin‐targeting siRNA improves muscular atrophy in caveolin‐3‐deficient mice
Quinn et al. Effects of dantrolene therapy on disease phenotype in dystrophin deficient mdx mice
WO2016181011A1 (es) Método para promover la regeneración muscular
AU2019293687A1 (en) Composition comprising antisense oligonucleotide and use thereof for treatment of Duchenne muscular dystrophy
Leiguarda et al. Intrathecal administration of an anti‐nociceptive non-CpG oligodeoxynucleotide reduces glial activation and central sensitization
Jørgensen et al. Meteorin reverses hypersensitivity in rat models of neuropathic pain

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20220824

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20230724

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20231024

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20240124

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20240318