JP2021525707A - 脊髄損傷を処置するための方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2018年5月25日付で出願された米国仮特許出願第62/676,464号の米国特許法第119条(e)項の下での恩典を主張する国際出願であり、該米国仮特許出願の内容は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
本発明の分野は、脊髄損傷の処置に関する。
多くのヒト脊髄損傷は、解剖学的構造上では不完全であるが、完全麻痺を呈する。これらの場合、スペアの軸索が機能回復を媒介できない理由は不明である。そのような損傷に対する現行の治療法は限られており、脊髄損傷の機能回復を再生しない場合が多い。したがって、効果的な処置を開発するには、軸索再生をよりよく理解する必要がある。
本明細書において記載される本発明は、部分的に、ニューロン特異的K+-Cl-共輸送体(KCC2)活性および/またはレベルを上方調節する作用物質、例えばCLP290が、ジグザグ状の両側性半切断(staggered bilateral hemisection)を有するマウス、例えば、重症脊髄損傷モデルにおいてステッピング機能を回復することができたという発見に関する。さらに、KCC2の過剰発現は、このステッピングの回復を再現した。Na+/2Cl-/K+共輸送体(NKCC)の阻害がステッピング能力をさらに回復するということが本明細書においてさらに示される。
便宜上、本明細書、実施例、および添付の特許請求の範囲において用いられるいくつかの用語および語句の意味が、以下に提供される。特に明記しない限り、または文脈から暗に示されない限り、以下の用語および語句は以下に示す意味を含む。本技術の範囲は特許請求の範囲によってのみ限定されるため、定義は、特定の態様を説明するのを助けるために提供し、主張する本発明を限定する意図はない。特に定義されない限り、本明細書において用いられる全ての技術的および科学的用語は、本技術が属する分野の当業者によって一般に理解されているものと同じ意味を有する。当技術分野における用語の用法と、本明細書において提供されるその定義との間に明らかな矛盾がある場合、本明細書内に提供される定義が優先されるものとする。
本明細書において記載される本発明は部分的に、例えば、腰髄が全ての直接的な脳由来の神経支配を奪われているが、しかし休止状態の中継回路が残っている損傷など、ジグザグ状の両側性半切断を有するマウスにおいて、KCC2アゴニストがステッピング機能を回復したという発見に基づく。さらに、ステッピング能力のこの回復は、KCC2の選択的発現によって、またはジグザグ状の脊髄病変間およびジグザグ状の脊髄病変周囲の抑制性介在ニューロンにおいてDREADDを過分極させること(例えば、最適化されたGi-DREADD)によってさらに模倣されることができることがわかった。
本明細書において提供される方法は、脊髄損傷の処置を対象とする。1つの態様において、脊髄損傷は重度の脊髄損傷である。脊髄損傷は、脊椎の機能に対して悪影響を引き起こす、例えば、手足の感覚の可動性を低減する、脊髄の任意の領域、例えば、頸椎、胸椎、腰椎、仙椎、仙骨、または尾骨に対する任意の傷害をいう。脊髄損傷の重症度は、例えば、可動性に及ぼす影響なし、例えば、歩行能力の維持から、対麻痺(例えば、脚および下半身の麻痺)、および四肢麻痺(例えば、全4つの四肢の筋力低下)に及ぶ、損傷の結果のレベルで測定される。1つの態様において、本明細書において記載される方法および組成物は、重度の脊髄損傷を処置するために用いられる。本明細書において用いられる場合、「重度の脊髄損傷」は、損傷レベル下の全ての運動および感覚機能の完全な喪失をもたらす完全または不完全脊髄損傷をいう。
KCC2を上方調節する作用物質が本明細書において記載される。1つの態様において、KCC2を上方調節する作用物質は、小分子、ペプチド、遺伝子編集システム、または、KCC2をコードする発現ベクターである。1つの態様において、KCC2を上方調節する小分子は、CLP290、またはその誘導体である。作用物質は、例えば、投与時に、細胞内のKCC2の存在、量、活性、および/またはレベルを増加させる場合、KCC2を上方調節するのに有効であると見なされる。1つの態様において、KCC2は、参照レベルと比較して少なくとも10%、例えば参照レベルと比較して少なくとも約20%、もしくは少なくとも約30%、もしくは少なくとも約40%、もしくは少なくとも約50%、もしくは少なくとも約60%、もしくは少なくとも約70%、もしくは少なくとも約80%、もしくは少なくとも約90%の増加または100%を含むそれ以下の増加または10〜100%の任意の増加あるいは適切な対照と比較して少なくとも約2倍、もしくは少なくとも約3倍、もしくは少なくとも約4倍、もしくは少なくとも約5倍もしくは少なくとも約10倍の増加、20倍の増加、30倍の増加、40倍の増加、50倍の増加、60倍の増加、75倍の増加、100倍の増加など、または2倍〜10倍もしくはそれ以上の間の任意の増加、上方調節される。この文脈で本明細書において用いられる場合、適切な対照は、未処理細胞におけるKCC2のレベルをいう。当業者は、本明細書において記載される技法、例えば、KCC2タンパク質またはmRNAレベルを、それぞれ、評価するためのウエスタンブロッティング法またはPCRに基づくアッセイ法を用いてKCC2のレベルを測定することができる。
である構造を有する。
本明細書において記載される組成物は、脊髄損傷の処置に用いることを対象にしている。これらの組成物の投与方法は、本明細書において以下でさらに記載される。さまざまな態様において、本明細書において記載される任意の薬学的組成物は、少なくとも第2の治療用化合物をさらに含む。1つの態様において、第2の治療用化合物は、脊髄損傷の処置に有用である。
いくつかの態様において、本明細書において記載される方法は、本明細書において記載されるKCC2を上方調節する作用物質を投与する段階を含む、脊髄損傷を有するまたは有すると診断された対象の処置に関する。いくつかの態様において、本明細書において記載される方法は、本明細書において記載されるNKCCを阻害する作用物質を投与する段階を含む、脊髄損傷を有するまたは有すると診断された対象の処置に関する。いくつかの態様において、本明細書において記載される方法は、本明細書において記載されるGi-DREADDを上方調節する作用物質を投与する段階を含む、脊髄損傷を有するまたは有すると診断された対象の処置に関する。いくつかの態様において、本明細書において記載される方法は、本明細書において記載されるKir2.1を上方調節する作用物質を投与する段階を含む、脊髄損傷を有するまたは有すると診断された対象の処置に関する。脊髄損傷を有する対象は、医師により状態を診断する現行の方法を用いて同定することができる。脊髄損傷を特徴付け、かつ診断に役立つ、この損傷の症状および/または合併症は、当技術分野において周知であり、四肢の可動性の喪失または低減を含むが、これらに限定されることはない。例えば脊髄損傷の、診断に役立ちうる試験は、X線、MRIスキャン、またはCTスキャンを含むが、これらに限定されることはない。
「単位剤形」は、この用語が本明細書において用いられる場合、適切な1回の投与のための投薬量をいう。例として、単位剤形は、送達デバイス、例えば、シリンジまたは静脈内点滴バッグに配置された治療用物質の量であることができる。1つの態様において、単位剤形は、単回投与で投与される。別の態様において、2つ以上の単位剤形を同時に投与することができる。
1つの態様において、本明細書において記載される作用物質は、単剤療法として用いられる。1つの態様において、本明細書において記載される作用物質は、脊髄損傷のための他の公知の作用物質および治療法と組み合わせて用いることができる。本明細書において用いられる「組み合わせて」投与されるとは、損傷による対象の苦痛の経過中に2つ(またはそれ以上)の異なる処置が対象に送達される、例えば、対象が損傷と診断された後に、かつ損傷が治癒されもしくは取り除かれる前に、または他の理由で処置が打ち切られる前に、2つまたはそれ以上の処置が送達されることを意味する。いくつかの態様において、1つの処置の送達は、第2の処置の送達が始まる時に依然として行われているので、投与という点で重複している。これは本明細書において「同時」、「実質的に同時に」または「同時送達」といわれることもある。他の態様において、一方の処置の送達は、他方の処置の送達が始まる前に終了する。いずれかの場合のいくつかの態様において、処置は、併用投与のためにより効果的である。例えば、第2の処置はより効果的であり、例えば、第2の処置を少なくしても同等の効果が見られるか、または第2の処置が第1の処置の非存在下で実施された場合に見られるよりも大幅に、第2の処置が症状を低減するか、または第1の処置で同様の状況が見られる。いくつかの態様において、送達は、症状の低減、または損傷に関連する他のパラメータが、他方の非存在下で送達された一方の処置で観察されるものよりも大きいようなものである。2つの処理の効果は、部分的に相加的、完全に相加的、または相加的超であることができる。送達は、送達された第1の処置の効果が、第2の処置が送達される時に依然として検出可能であるようなものであることができる。本明細書において記載される作用物質および少なくとも1つのさらなる治療は同時に、同じもしくは別々の組成物中で、または連続的に与えることができる。連続投与の場合、本明細書において記載される作用物質を最初に投与することができ、さらなる作用物質を2番目に投与することができるか、または投与の順序を逆にすることができる。作用物質は、別の処置の前に、処置と同時に、処置後に、または障害の寛解中に投与することができる。
本明細書において記載される作用物質の非経口剤形は、硬膜外注射、皮下、静脈内(ボーラス注射を含む)、筋肉内、および動脈内を含むが、これらに限定されない、さまざまな経路によって対象に投与することができる。非経口剤形の投与は、通常、混入物に対する患者の自然防御を回避するので、非経口剤形は、好ましくは、無菌であるか、または患者への投与の前に滅菌することができる。非経口剤形の例としては、注射の準備ができている溶液、注射用の薬学的に許容されるビヒクルに溶解または懸濁される準備ができている乾燥製品、注射の準備ができている懸濁液、制御放出性の非経口剤形、および乳濁液が挙げられるが、これらに限定されることはない。
本明細書において記載される局面のいくつかの態様において、作用物質は、制御放出性または遅延放出性の手段によって対象に投与される。理想的には、医療処置での最適に設計された制御放出調製物の使用は、最少量の薬物を用いて最小限の時間で状態を治癒または制御することを特徴とする。制御放出製剤の利点には、(1) 薬物の活性延長; (2) 投薬頻度の低減; (3) 患者のコンプライアンス増大; (4) 合計薬物の使用減少; (5) 局所または全身副作用の低減; (6) 薬物蓄積の最小化; (7) 血中レベルの変動低減; (8) 処置の有効性の改善; (9) 薬物活性の増強または消失の低減; および(10) 疾患または状態の制御速度の改善が挙げられる。(Kim, Cherng-ju, Controlled Release Dosage Form Design, 2 (Technomic Publishing, Lancaster, Pa.: 2000))。制御放出製剤を用いて、式(I)の化合物の作用の発現、作用の持続期間、治療ウィンドウ内の血漿中レベル、およびピーク血中レベルを制御することができる。特に、制御放出性または延長放出性の剤形または製剤を用いて、作用物質の最大の有効性を達成する一方で、薬物の過少投与(すなわち、最低治療レベルを下回る)および薬物の毒性レベルの超過の両方から起こりうる、可能性のある有害作用および安全性の問題を最小限にすることを確実にできる。
例えば、脊髄損傷の処置のための、本明細書において記載される作用物質の有効性は、当業者によって決定されることができる。しかしながら、脊髄損傷の兆候もしくは症状の1つもしくは複数が有益な方法で変化するなら、他の臨床的に認められた症状が改善され、もしくはさらに好転されるなら、または所望の応答が、例えば、本明細書において記載される方法による処置後に少なくとも10%誘導されるなら、「有効な処置」という用語が本明細書において用いられるように、処置は「有効な処置」と見なされる。有効性は、例えば、マーカー、指標、症状、および/もしくは本明細書において記載される方法によって処置される損傷の発生率または適切な任意の他の測定可能なパラメータ、例えば、四肢の感覚および/もしくは可動性を測定することにより評価することができる。有効性は、入院によって評価されるように個体が悪化しないこと、または医学的介入の必要性(すなわち、四肢の感覚または可動性の喪失の進行)によって測定することもできる。これらの指標を測定する方法は、当業者に知られており、および/または本明細書において記載されている。
(1) 脊髄損傷を有する対象に、ニューロン特異的K+-Cl-共輸送体(KCC2)を上方調節する作用物質の有効量を投与する段階を含む、脊髄損傷を処置するための方法。
(2) KCC2を上方調節する前記作用物質が、小分子、ペプチド、遺伝子編集システム、および、KCC2をコードする発現ベクターからなる群より選択される、項目1の方法。
(3) 前記小分子がCLP290である、前記項目のいずれかの方法。
(4) 前記ベクターが非組み込み型または組み込み型である、前記項目のいずれかの方法。
(5) 前記ベクターがウイルスベクターまたは非ウイルスベクターである、前記項目のいずれかの方法。
(6) 前記非組み込み型ベクターが、エピソームベクター、EBNA1ベクター、ミニサークルベクター、非組み込み型アデノウイルス、非組み込み型RNA、およびセンダイウイルスからなる群より選択される、前記項目のいずれかの方法。
(7) 前記ウイルスベクターが、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、およびアデノ随伴ウイルスからなる群より選択される、前記項目のいずれかの方法。
(8) 前記非ウイルスベクターが、ナノ粒子、カチオン性脂質、カチオン性重合体、金属ナノ粒子、ナノロッド、リポソーム、マイクロバブル、細胞透過性ペプチド、およびリポスフィアからなる群より選択される、前記項目のいずれかの方法。
(9) 前記ベクターが血液脳関門を通過する、前記項目のいずれかの方法。
(10) KCC2が、適切な対照と比較して少なくとも2倍、少なくとも5倍、少なくとも6倍、少なくとも7倍、少なくとも8倍、少なくとも9倍、または少なくとも10倍上方調節される、前記項目のいずれかの方法。
(11) 前記脊髄損傷が重症脊髄損傷である、前記項目のいずれかの方法。
(12) 前記対象がヒトである、前記項目のいずれかの方法。
(13) 前記対象が脊髄損傷と診断されたことがある、前記項目のいずれかの方法。
(14) 前記対象が脊髄損傷の処置を以前に受けている、前記項目のいずれかの方法。
(15) 投与する段階の前に、前記対象が脊髄損傷を有すると診断されている、前記項目のいずれかの方法。
(16) 前記対象に少なくとも第2の脊髄損傷処置をさらに実施する、前記項目のいずれかの方法。
(17) 前記対象に少なくとも第2の治療用化合物をさらに投与する、前記項目のいずれかの方法。
(18) 前記第2の治療用化合物が、オステオポンチン、成長因子、または4-アミノプリジンからなる群より選択される、前記項目のいずれかの方法。
(19) 脊髄損傷を有する対象に、Na+/2Cl-/K+共輸送体(NKCC)を阻害する作用物質の有効量を投与する段階を含む、脊髄損傷を処置するための方法。
(20) NKCCを阻害する前記作用物質が、小分子、抗体、ペプチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、およびRNAiからなる群より選択される、項目19の方法。
(21) 前記RNAiがマイクロRNA、siRNA、またはshRNAである、前記項目のいずれかの方法。
(22) 前記小分子がブメタニドである、前記項目のいずれかの方法。
(23) 前記作用物質がベクター中に含まれる、前記項目のいずれかの方法。
(24) 脊髄損傷を有する対象に、抑制性介在ニューロンの興奮性を低減する作用物質の有効量を投与する段階を含む、脊髄損傷を処置するための方法。
(25) 前記作用物質が阻害性Gi共役受容体Gi-DREADDを上方調節する、前記項目のいずれかの方法。
(26) 前記作用物質が、Gi-DREADDをコードする発現ベクターである、前記項目のいずれかの方法。
(27) 前記作用物質が、Kir2.1をコードする発現ベクターである、前記項目のいずれかの方法。
(28) 前記作用物質と実質的に同時にクロザピンN-オキシドを投与する段階をさらに含む、前記項目のいずれかの方法。
(29) 前記ベクターが血液脳関門を通過する、前記項目のいずれかの方法。
(30) 抑制性介在ニューロンの前記興奮性が、適切な対照と比較して少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90、少なくとも99%、またはそれ以上低減される、前記項目のいずれかの方法。
(31) 投与する段階の前に、前記対象が脊髄損傷を有すると診断されている、前記項目のいずれかの方法。
(32) 前記対象に少なくとも第2の脊髄損傷処置を実施する、前記項目のいずれかの方法。
(33) 脊髄損傷を有する対象に、抑制性介在ニューロンの興奮性を低減する電気刺激の有効量を与える段階を含む、脊髄損傷を処置するための方法。
(34) 前記作用物質と実質的に同時にクロザピンN-オキシドを投与する段階をさらに含む、前記項目のいずれかの方法。
(35) 前記電気刺激が脊髄に直接適用される、前記項目のいずれかの方法。
(36) 前記電気刺激が損傷部位において脊髄に直接適用される、前記項目のいずれかの方法。
(37) 抑制性介在ニューロンの前記興奮性が、適切な対照と比較して少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90、少なくとも99%、またはそれ以上低減される、前記項目のいずれかの方法。
(38) 投与する段階の前に、前記対象が脊髄損傷を有すると診断されている、前記項目のいずれかの方法。
(39) 前記対象に少なくとも第2の脊髄損傷処置を実施する、前記項目のいずれかの方法。
(40) 脊髄損傷の処置に用いるための、KCC2ポリペプチドのまたは該KCC2ポリペプチドをコードする核酸配列を含むベクターの有効量と薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物。
(41) 前記KCC2ポリペプチドがSEQ ID NO: 1の配列を含む、前記項目のいずれかの薬学的組成物。
(42) 前記KCC2ポリペプチドが、SEQ ID NO: 1との少なくとも95%のアミノ酸配列同一性を有し、かつSEQ ID NO: 1のKCC2の生物学的活性の少なくとも80%を保持している、前記項目のいずれかの薬学的組成物。
(43) 少なくとも第2の治療用化合物をさらに含む、前記項目のいずれかの薬学的組成物。
(44) 脊髄損傷の処置に用いるための、Gi-DREADDポリペプチドのまたは該Gi-DREADDポリペプチドをコードする核酸配列を含むベクターの有効量と薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物。
(45) 前記Gi-DREADDポリペプチドが、最適化されたGi-DREADDポリペプチドである、前記項目のいずれかの薬学的組成物。
(46) 前記Gi-DREADDポリペプチドがSEQ ID NO: 2の配列を含む、前記項目のいずれかの薬学的組成物。
(47) 前記Gi-DREADDポリペプチドが、SEQ ID NO: 2との少なくとも95%のアミノ酸配列同一性を有し、かつSEQ ID NO: 2のGi-DREADDの生物学的活性の少なくとも80%を保持している、前記項目のいずれかの薬学的組成物。
(48) クロザピンN-オキシドをさらに含む、前記項目のいずれかの薬学的組成物。
(49) 少なくとも第2の治療用化合物をさらに含む、前記項目のいずれかの薬学的組成物。
(50) 脊髄損傷の処置に用いるための、Kir2.1ポリペプチドのまたは該Kir2.1ポリペプチドをコードする核酸配列を含むベクターの有効量と薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物。
(51) 前記Kir2.1ポリペプチドがSEQ ID NO: 3の配列を含む、前記項目のいずれかの薬学的組成物。
(52) 前記Kir2.1ポリペプチドが、SEQ ID NO: 3との少なくとも95%のアミノ酸配列同一性を有し、かつSEQ ID NO: 3のKir2.1の生物学的活性の少なくとも80%を保持している、前記項目のいずれかの薬学的組成物。
(53) クロザピンN-オキシドをさらに含む、前記項目のいずれかの薬学的組成物。
(54) 少なくとも第2の治療用化合物をさらに含む、前記項目のいずれかの薬学的組成物。
(55) 脊髄損傷の処置に用いるための、項目19〜21のいずれかの作用物質の有効量と薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物。
(56) 少なくとも第2の治療用化合物をさらに含む、前記項目のいずれかの薬学的組成物。
(57) 脊髄損傷を有する対象にCLP290の有効量を投与する段階を含む、脊髄損傷を処置するための方法。
(58) CLP290が血液脳関門を通過する、前記項目のいずれかの方法。
(59) 前記脊髄損傷が重度の脊髄損傷である、前記項目のいずれかの方法。
(60) 前記対象がヒトである、前記項目のいずれかの方法。
(61) 前記対象が脊髄損傷と診断されたことがある、前記項目のいずれかの方法。
(62) 前記対象が脊髄損傷の処置を以前に受けている、前記項目のいずれかの方法。
(63) 投与する段階の前に、前記対象が脊髄損傷を有すると診断されている、前記項目のいずれかの方法。
(64) 前記対象に少なくとも第2の脊髄損傷処置をさらに実施する、前記項目のいずれかの方法。
(65) 前記対象に少なくとも第2の治療用化合物をさらに投与する、前記項目のいずれかの方法。
(66) 前記第2の治療用化合物が、オステオポンチン、成長因子、または4-アミノプリジンからなる群より選択される、前記項目のいずれかの方法。
大部分のヒト脊髄損傷(SCI)は解剖学的に不完全であり、損傷した脊椎分節にスペアの軸索がまたがっている。しかしながら、これらの患者の約半数は、損傷レベル下の筋肉制御および感覚の完全な喪失を有し(Fawcett et al., 2007; Kakulas, 1999)、スペアの接続が機能的に休止していることを示唆している。注目すべきことに、最近の研究では、硬膜外刺激とリハビリトレーニングを組み合わせることで、慢性的に麻痺したSCI患者が自発的な動きを取り戻せることが実証されている(Angeli et al., 2014; Harkema et al., 2011)。想定される機構は、これらの操作がそのような休止状態の脊椎回路を再活性化し、脳由来のシグナルを脊髄に伝えられるようにすることである。しかしながら、このスペアの脊椎回路がSCI後に機能不全になる理由、およびそれを再活性化することができる最適な方法はほとんど不明である。
CLP290はジグザグ状病変を有する麻痺マウスにおいて一貫したステッピング能力を回復する
ジグザグ状病変のパラダイムを最適化し、既述のモデル(Courtine 2008; van den Brand, 2012)と同様に、胸部(T) 7およびT10レベルで同時に2つの外側性半切断を実施した(図1Aおよび1B)。T10病変は、脊髄正中線で終わる外側性半切断であり、T10病変の反対側にあるT7病変は、正中線をわずかに超えて延びている(図1A)。この二重半切断手技では、T10を通過する全ての下行性軸索が切断され、T7とT10の間の正中線を通過する軸索のみがそのまま残る(図1C)。実際、セロトニン作動性軸索を標識する抗5-HT抗体を用いた免疫組織化学により、下行性セロトニン作動性軸索を、病変間の脊髄分節において検出することができたが、腰髄では検出できなかった(図1C)。したがって、下行性軸索が終結し、一部の脊髄固有ニューロンが腰椎ニューロンとの接続を維持する病変(T7およびT10)の間および周辺に中継ゾーンが残る(本明細書において以下を参照のこと)。
CLP290の効果は、SCI後に脊髄内のスペアの休止中の下行性接続を再活性化することから生じる可能性がある。しかしながら、下行性入力とは関係なく、腰髄に直接作用することもありうる。これらの可能性を区別するために、同じCLP290処置を、軸索が病変部位を横切らない完全なT8脊髄切断を行ったマウスに適用し(図7D)、CLP290が有意な機能回復を促進できなかったことを見出した(図7E)。逆に、5-HT受容体アゴニストのキパジンは、ジグザグ状病変(図7B)とT8完全切断モデル(図7F)の両方で、急速ではあるが一過性のBMS改善(10分から始まり2時間未満続く)をもたらした。それゆえ、腰髄に直接作用するこの一過性のエフェクタとは異なり、機能改善に及ぼすCLP290の効果は、スペアの接続に依存する。
ジグザグ状病変または完全病変のいずれかを有するマウスは、同様のSCI関連行動障害(疼痛および痙縮)を呈するため、本明細書において提示される結果は、CLP290がジグザグ状病変を有するマウスにおいて機能回復を誘導することを示し、CLP290の機能改善はそのような鎮痛効果および抗痙攣効果とは無関係である可能性が高いことを示唆しているにすぎない。したがって、CLP290について可能な機構は、例えば軸索の発芽を促進することによって、および/または腰髄への中継経路シグナルの忠実度を高めることによって、スペアの中継経路に依存する可能性が高い。
CLP290は、K+-Cl-共輸送体KCC2の活性化因子として同定されたが、他の標的にも作用しうる(Gagnon et al., 2013)。したがって、CNSニューロンにおけるKCC2の過剰発現が、ジグザグ状病変マウスにおいてCLP290と同様の効果を有するかどうかを決定した。成体マウスにおいてBBBを通過できるAAV-PHP.Bベクター(Deverman et al., 2016)を用いて、ヒトシナプシンプロモーターの制御下でKCC2を発現するAAV-PHP.B (AAV-PHP.B-syn-HA-KCC2)を尾静脈に注射した。KCC2が検出可能に発現するまでに1〜2週間かかったため、注射は損傷の直後に実施した。次に、毎週の行動モニタリングを実施した(図2A)。図2Bに示されるように、AAV-PHP.B-KCC2処置は、損傷後8週間で分析したところ、全ての脊髄分節でHAタグ付きKCC2の広範な発現をもたらした。対照のAAV-PHP.B-H2B-GFPとは対照的に、AAV-PHP.B-KCC2処置は、CLP290 (図1E〜1J)と同程度か、それ以上の程度まで、有意な機能回復をもたらした(図2C〜2H)。実際、AAV-KCC2処置後8週間で、これらのマウスの80%は、TAおよびGSを伴う足首関節の動きでステップすることができ、これらのマウスの約半分は、足首と膝の両方の動きで足底ステッピングを達成することができた(図2Dおよび2H)。さらに、AAV-KCC2で処置したマウスは、立脚期に頻繁にGSを発火させることで、体重を部分的に支えることができた(図2EおよびH)。
次に、特定のタイプのニューロンにおけるKCC2発現が、観察された機能回復を説明するかどうかを評価した。これを行うために、AAV-PHP.B-FLEX-KCC2 (Cre依存性KCC2発現)を、損傷直後にVglut2-Cre (興奮性ニューロンの場合(Tong et al., 2007))、Vgat-Cre (抑制性ニューロンの場合(Vong et al., 2011))またはChat-Cre (運動ニューロンおよび一部の介在ニューロンの場合(Rossi et al., 2011))の成体マウスの尾静脈に注射した(図3Aおよび3B)。Chat-CreおよびVglut2-Creマウスとは対照的に、AAV-PHP.B-FLEX-KCC2を注射したVgat-Creマウスは、CLP290処置(図1)、または非選択的KCC2発現(図2)と同様の程度まで、有意な機能回復(図3C〜3E)を示した。したがって、これらの結果は、抑制性介在ニューロンにおけるKCC2の機能不全または下方制御が、ジグザグ状病変マウスにおける後肢の機能回復を制限することを示唆している。
図7および8に示されるように、ジグザグ状病変の間および下の脊髄分節からなる中継ゾーンにおける脊髄固有ニューロンは、脳由来のシグナルを腰椎に中継する可能性が高い。したがって、ジグザグ状病変マウスにおけるKCC2を介した後肢の機能回復には2つの可能性のある機構が存在する: (1) KCC2が、腰椎分節(L2〜5)における抑制性介在ニューロンに作用して、脊髄固有入力の統合を促進すること; ならびに/または(2) KCC2が、腰髄の上の中継ゾーンにおける抑制性ニューロンに作用して、下行性経路からの脳由来の入力の統合、および/もしくは腰髄へのその中継を促進すること。
成熟したニューロンにおいて、GABAおよびグリシンは、塩化物チャネルを開き、塩化物イオンの流入を可能にして過分極を引き起こすため、抑制性である。対照的に、発生中、細胞内塩化物レベルの上昇は、GABAAおよびグリシンを介した電流を脱分極させ、一般的に興奮性にさせる。出生後早期に、出生後のニューロンにおけるKCC2の上方制御は、細胞内の塩化物濃度を低減させ、興奮を抑制に変えるために重要である(Ben-Ari et al., 2012; Kaila et al., 2014)。したがって、損傷により誘導されるKCC2の下方制御(Boulenguez et al., 2010; Cote et al., 2014)は、GABAおよびグリシン受容体がニューロンを脱分極しうる未熟な状態を回復するものと予想される。このシナリオでは、脊髄抑制性ニューロンにおけるKCC2活性化は、中継ゾーンにおける局所回路をより生理学的な状態に変え、下行性入力を受け入れやすい。これを調べるために、c-Fos免疫反応性を損傷8週間後、および1時間のトレッドミル上の歩行後、T7とT10の間の脊髄分節におけるニューロン活動の代理として用いた。各群において、これらの脊髄分節におけるc-Fos陽性細胞の大部分も、ニューロンマーカーであるNeuNで陽性に染色された(図11A、11B)。c-Fos/NeuN二重陽性細胞の代表的な複合材料を図5Aに示す。処置なしの損傷マウスでは、c-Fos陽性ニューロンは脊髄の後角に集中しており(図5A〜5C)、おそらくこれらの損傷マウスでの末梢感覚入力に対する過敏症を反映している。CLP290またはAAV-KCC2処置では、c-Fos陽性ニューロンの分布が大きく異なっており、後角(ラミナI〜V)が低減し、中間/腹側脊髄が大幅に増加した(図5A〜5C)。このKCC2で変換された分布パターンは、歩行に応答して、無傷マウスで検出されたものと類似している(図5A〜5C)。CLP290処置の中止から2週間後、c-Fosパターンは処置なしで見られたものに戻り(図11Cおよび11D)、行動の結果と一致した(図1G)。まとめると、これらの所見は、KCC2活性を増加させることで、より生理学的なニューロン活動パターンが局所脊髄回路に回復されることを示唆している。
抑制性介在ニューロンの興奮性を低減させることでKCC2およびCPL290の効果を模倣することができるかどうかを試験するために、損傷の3時間後にVgat-Creマウスの尾静脈にAAV9ベクター(AAV9-FLEX-hM4Di-mCherryまたはAAV9-GFP)を注射することにより病変間および病変周辺の抑制性介在ニューロンにおいて、抑制性Gi共役受容体Gi-DREADD (Krashes et al., 2011)であるhM4Di-mCherryを発現させた(図6A)。Gi-DREADDを選択的に活性化するクロザピンN-オキシド(CNO) (Roth, 2017)を毎日投与し、毎週行動をモニターした。CNO投与の24時間後に(CLP290の場合と同じ処置スケジュールを用いて)試験した場合、GFPではなく、hM4Diで損傷したマウスは、CLP290またはKCC2処置で観察されたのと同程度の持続的な機能回復を示すことが分かった(図6C)。さらに、hM4DiおよびCNOで処置したマウスは、連続歩行後のKCC2関連処置で観察されたものと同様のc-Fos発現パターンを示した(図6D〜Fおよび図5A)。したがって、これらの結果は、抑制性介在ニューロンの興奮性を低減させることの有益な効果を検証するものであった。
腰仙髄への全ての脊柱上の下行性接続を取り除く両側性半切断モデルを用いて、薬理学的またはAAV支援遺伝子送達のいずれかによる長期KCC2活性化が、休止状態のスペア回路を再活性化し、持続的な後肢ステッピングをもたらすことが実証された。病変間および腰髄上の脊髄分節における抑制性介在ニューロンが、この効果を主に媒介する。損傷によって誘導されたKCC2の下方制御を打ち消すことにより、これらの処置は中継ゾーンにおけるニューロンの興奮性を調節し、損傷によって機能しなくされていた脊髄回路を蘇生させることが提唱されている。その結果、これらの局所回路は、より良好に下行性突起から腰髄へコマンドを中継することができ、行動回復の改善をもたらす。
Claims (66)
- 脊髄損傷を有する対象に、ニューロン特異的K+-Cl-共輸送体(KCC2)を上方調節する作用物質の有効量を投与する段階を含む、脊髄損傷を処置するための方法。
- KCC2を上方調節する前記作用物質が、小分子、ペプチド、遺伝子編集システム、および、KCC2をコードする発現ベクターからなる群より選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記小分子がCLP290である、請求項2に記載の方法。
- 前記ベクターが非組み込み型または組み込み型である、請求項2に記載の方法。
- 前記ベクターがウイルスベクターまたは非ウイルスベクターである、請求項2に記載の方法。
- 前記非組み込み型ベクターが、エピソームベクター、EBNA1ベクター、ミニサークルベクター、非組み込み型アデノウイルス、非組み込み型RNA、およびセンダイウイルスからなる群より選択される、請求項4に記載の方法。
- 前記ウイルスベクターが、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、およびアデノ随伴ウイルスからなる群より選択される、請求項5に記載の方法。
- 前記非ウイルスベクターが、ナノ粒子、カチオン性脂質、カチオン性重合体、金属ナノ粒子、ナノロッド、リポソーム、マイクロバブル、細胞透過性ペプチド、およびリポスフィア(liposphere)からなる群より選択される、請求項5に記載の方法。
- 前記ベクターが血液脳関門を通過する、請求項4〜8のいずれか一項に記載の方法。
- KCC2が、適切な対照と比較して少なくとも2倍、少なくとも5倍、少なくとも6倍、少なくとも7倍、少なくとも8倍、少なくとも9倍、または少なくとも10倍上方調節される、請求項1に記載の方法。
- 前記脊髄損傷が重症脊髄損傷である、請求項1に記載の方法。
- 前記対象がヒトである、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
- 前記対象が脊髄損傷と診断されたことがある、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
- 前記対象が脊髄損傷の処置を以前に受けている、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
- 投与する段階の前に、前記対象が脊髄損傷を有すると診断されている、請求項1に記載の方法。
- 前記対象に少なくとも第2の脊髄損傷処置をさらに実施する、請求項1〜14のいずれか一項に記載の方法。
- 前記対象に少なくとも第2の治療用化合物をさらに投与する、請求項1〜14のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第2の治療用化合物が、オステオポンチン、成長因子、または4-アミノプリジンからなる群より選択される、請求項17に記載の方法。
- 脊髄損傷を有する対象に、Na+/2Cl-/K+共輸送体(NKCC)を阻害する作用物質の有効量を投与する段階を含む、脊髄損傷を処置するための方法。
- NKCCを阻害する前記作用物質が、小分子、抗体、ペプチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、およびRNAiからなる群より選択される、請求項19に記載の方法。
- 前記RNAiがマイクロRNA、siRNA、またはshRNAである、請求項20に記載の方法。
- 前記小分子がブメタニドである、請求項20に記載の方法。
- 前記作用物質がベクター中に含まれる、請求項19〜21のいずれか一項に記載の方法。
- 脊髄損傷を有する対象に、抑制性介在ニューロンの興奮性を低減する作用物質の有効量を投与する段階を含む、脊髄損傷を処置するための方法。
- 前記作用物質が阻害性Gi共役受容体Gi-DREADDを上方調節する、請求項24に記載の方法。
- 前記作用物質が、Gi-DREADDをコードする発現ベクターである、請求項24または25に記載の方法。
- 前記作用物質が、Kir2.1をコードする発現ベクターである、請求項24に記載の方法。
- 前記作用物質と実質的に同時にクロザピンN-オキシドを投与する段階をさらに含む、請求項24に記載の方法。
- 前記ベクターが血液脳関門を通過する、請求項25〜27のいずれか一項に記載の方法。
- 抑制性介在ニューロンの前記興奮性が、適切な対照と比較して少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90、少なくとも99%、またはそれ以上低減される、請求項24〜29のいずれか一項に記載の方法。
- 投与する段階の前に、前記対象が脊髄損傷を有すると診断されている、請求項24に記載の方法。
- 前記対象に少なくとも第2の脊髄損傷処置を実施する、請求項24〜31のいずれか一項に記載の方法。
- 脊髄損傷を有する対象に、抑制性介在ニューロンの興奮性を低減する電気刺激の有効量を与える段階を含む、脊髄損傷を処置するための方法。
- 前記作用物質と実質的に同時にクロザピンN-オキシドを投与する段階をさらに含む、請求項33に記載の方法。
- 前記電気刺激が脊髄に直接適用される、請求項33に記載の方法。
- 前記電気刺激が損傷部位において脊髄に直接適用される、請求項33に記載の方法。
- 抑制性介在ニューロンの前記興奮性が、適切な対照と比較して少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90、少なくとも99%、またはそれ以上低減される、請求項33〜36のいずれか一項に記載の方法。
- 投与する段階の前に、前記対象が脊髄損傷を有すると診断されている、請求項33に記載の方法。
- 前記対象に少なくとも第2の脊髄損傷処置を実施する、請求項33〜38のいずれか一項に記載の方法。
- 脊髄損傷の処置に用いるための、KCC2ポリペプチドのまたは該KCC2ポリペプチドをコードする核酸配列を含むベクターの有効量と薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物。
- 前記KCC2ポリペプチドがSEQ ID NO: 1の配列を含む、請求項40に記載の薬学的組成物。
- 前記KCC2ポリペプチドが、SEQ ID NO: 1との少なくとも95%のアミノ酸配列同一性を有し、かつSEQ ID NO: 1のKCC2の生物学的活性の少なくとも80%を保持している、請求項40または41に記載の薬学的組成物。
- 少なくとも第2の治療用化合物をさらに含む、請求項40〜42のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
- 脊髄損傷の処置に用いるための、Gi-DREADDポリペプチドのまたは該Gi-DREADDポリペプチドをコードする核酸配列を含むベクターの有効量と薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物。
- 前記Gi-DREADDポリペプチドが、最適化されたGi-DREADDポリペプチドである、請求項44に記載の薬学的組成物。
- 前記Gi-DREADDポリペプチドがSEQ ID NO: 2の配列を含む、請求項44または45に記載の薬学的組成物。
- 前記Gi-DREADDポリペプチドが、SEQ ID NO: 2との少なくとも95%のアミノ酸配列同一性を有し、かつSEQ ID NO: 2のGi-DREADDの生物学的活性の少なくとも80%を保持している、請求項44〜46のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
- クロザピンN-オキシドをさらに含む、請求項44〜47のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
- 少なくとも第2の治療用化合物をさらに含む、請求項44〜47のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
- 脊髄損傷の処置に用いるための、Kir2.1ポリペプチドのまたは該Kir2.1ポリペプチドをコードする核酸配列を含むベクターの有効量と薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物。
- 前記Kir2.1ポリペプチドがSEQ ID NO: 3の配列を含む、請求項50に記載の薬学的組成物。
- 前記Kir2.1ポリペプチドが、SEQ ID NO: 3との少なくとも95%のアミノ酸配列同一性を有し、かつSEQ ID NO: 3のKir2.1の生物学的活性の少なくとも80%を保持している、請求項50または51に記載の薬学的組成物。
- クロザピンN-オキシドをさらに含む、請求項50〜52のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
- 少なくとも第2の治療用化合物をさらに含む、請求項50〜52のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
- 脊髄損傷の処置に用いるための、請求項19〜21のいずれか一項に記載の作用物質の有効量と薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物。
- 少なくとも第2の治療用化合物をさらに含む、請求項55に記載の薬学的組成物。
- 脊髄損傷を有する対象にCLP290の有効量を投与する段階を含む、脊髄損傷を処置するための方法。
- CLP290が血液脳関門を通過する、請求項1に記載の方法。
- 前記脊髄損傷が重度の脊髄損傷である、請求項1に記載の方法。
- 前記対象がヒトである、請求項57〜59のいずれか一項に記載の方法。
- 前記対象が脊髄損傷と診断されたことがある、請求項57〜60のいずれか一項に記載の方法。
- 前記対象が脊髄損傷の処置を以前に受けている、請求項57〜61のいずれか一項に記載の方法。
- 投与する段階の前に、前記対象が脊髄損傷を有すると診断されている、請求項1に記載の方法。
- 前記対象に少なくとも第2の脊髄損傷処置をさらに実施する、請求項57〜63のいずれか一項に記載の方法。
- 前記対象に少なくとも第2の治療用化合物をさらに投与する、請求項57〜63のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第2の治療用化合物が、オステオポンチン、成長因子、または4-アミノプリジンからなる群より選択される、請求項65に記載の方法。
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