CN112752573A - 治疗脊髓损伤的方法 - Google Patents

治疗脊髓损伤的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN112752573A
CN112752573A CN201980048789.9A CN201980048789A CN112752573A CN 112752573 A CN112752573 A CN 112752573A CN 201980048789 A CN201980048789 A CN 201980048789A CN 112752573 A CN112752573 A CN 112752573A
Authority
CN
China
Prior art keywords
injury
spinal cord
spinal
subject
kcc2
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201980048789.9A
Other languages
English (en)
Inventor
Z·何
B·陈
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Childrens Medical Center Corp
Original Assignee
Childrens Medical Center Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Childrens Medical Center Corp filed Critical Childrens Medical Center Corp
Publication of CN112752573A publication Critical patent/CN112752573A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/50—Pyridazines; Hydrogenated pyridazines
    • A61K31/501—Pyridazines; Hydrogenated pyridazines not condensed and containing further heterocyclic rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A61K31/195—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group
    • A61K31/196—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group the amino group being directly attached to a ring, e.g. anthranilic acid, mefenamic acid, diclofenac, chlorambucil
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/4409—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof only substituted in position 4, e.g. isoniazid, iproniazid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/55—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having seven-membered rings, e.g. azelastine, pentylenetetrazole
    • A61K31/551—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having seven-membered rings, e.g. azelastine, pentylenetetrazole having two nitrogen atoms, e.g. dilazep
    • A61K31/5513—1,4-Benzodiazepines, e.g. diazepam or clozapine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/191—Tumor necrosis factors [TNF], e.g. lymphotoxin [LT], i.e. TNF-beta
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A61K48/0058—Nucleic acids adapted for tissue specific expression, e.g. having tissue specific promoters as part of a contruct
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C12N2310/141—MicroRNAs, miRNAs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)

Abstract

本文描述用于治疗脊柱损伤的方法和组合物。本发明的多个方面涉及向受试者给药上调KCC2的药剂。本发明的另一个方面涉及向受试者给药降低抑制性中间神经元兴奋性的药剂。本文还描述包含这些药剂的组合物。

Description

治疗脊髓损伤的方法
相关申请的交叉引用
本申请是国际申请，并基于35U.S.C.§119(e)而主张2018年5月25日提交的美国临时申请62/676,464的权益，该临时申请的内容通过引用而整体并入本文。
技术领域
本发明的技术领域涉及脊髓损伤的治疗。
背景技术
很多人的脊髓损伤在解剖学上是不完全的脊髓损伤，但表现为完全瘫痪。尚不清楚为什么在这些病例中，备用轴突不能介导功能恢复。目前用于此类损伤的疗法有限，并且往往不能使脊髓损伤的功能修复再生。因此，对于研发有效的治疗来说，需要更好地理解轴突再生。
发明内容
本文所述的发明部分地涉及以下发现：上调神经元特异性K+-Cl-协同转运蛋白(KCC2)活性和/或水平的药剂例如CLP290能够恢复具有交错双侧半横断术小鼠例如重度脊髓损伤模型的脚站立(stepping)功能。再者，KCC2过表达再现了脚站立的这一恢复。本文中还显示，对Na+/2Cl-/K+协同转运蛋白(NKCC)的抑制额外地恢复了脚站立能力
再者，本文所述的工作显示，将降低中间神经元兴奋性的药剂与氯氮平N-氧化物联合，额外地恢复了先前已经在交错双侧半横断术后失去脚站立能力的小鼠的这一能力。此类药剂包括上调Gi-DREADD(其已经被优化以用于在抑制性中间神经元中表达)和Kir2.1的药剂。
此外，本文描述了包含用于调节KCC2、NKCC、Gi-DREADD和Kir2.1的药剂的组合物，以待用于例如治疗脊髓损伤。
据此，本文所述发明的一个方面提供用于治疗脊柱损伤的方法，包括向具有脊柱损伤的受试者给药有效量的上调KCC2的药剂。
在任何方面的一个实施方案中，上调KCC2的药剂是选自由小分子、肽、基因标记系统和编码KCC2的表达载体所组成的群组。
在任何方面的一个实施方案中，小分子是CLP290。
在任何方面的一个实施方案中，载体是非整合型的或整合型的。在任何方面的一个实施方案中，载体是病毒载体或非病毒载体。
示例性的非整合型载体包括但不限于，附加型载体、EBNA1载体、微环载体、非整合型腺病毒、非整合型RNA和仙台病毒所组成的群组。
示例性的病毒载体包括但不限于，逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、疱疹病毒、痘病毒、α病毒、牛痘病毒和腺相关病毒。
示例性的非病毒载体包括但不限于，纳米颗粒、阳离子脂质、阳离子聚合物、金属纳米颗粒、纳米棒、脂质体、微泡、细胞渗透肽和脂质球所组成的群组。
在任何方面的一个实施方案中，载体跨越血脑屏障。
在任何方面的一个实施方案中，与适宜的对照物相比，KCC2被上调至少2倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍。
在任何方面的一个实施方案中，脊柱损伤是重度脊髓损伤。
在任何方面的一个实施方案中，受试者是人。在任何方面的一个实施方案中，受试者被诊断为具有脊柱损伤。在任何方面的一个实施方案中，受试者先前被诊断为具有脊柱损伤。在任何方面的一个实施方案中，受试者先前已经进行脊柱损伤治疗。
在任何方面的一个实施方案中，在给药之前，受试者被诊断为具有脊髓损伤。
在任何方面的一个实施方案中，受试者还被施予至少第二种脊柱损伤治疗。在任何方面的一个实施方案中，受试者还被给药至少第二种治疗性化合物。示例性的第二种治疗性化合物包括但不限于，骨桥蛋白、生长因子或4-胺基吡啶。
本文所述发明的另一个方面提供用于治疗脊柱损伤的方法，包括向具有脊柱损伤的受试者给药有效量的抑制Na+/2Cl-/K+协同转运蛋白(NKCC)的药剂。
在任何方面的一个实施方案中，抑制NKCC的药剂是选自由小分子、抗体、肽、反义寡核苷酸和RNAi所组成的群组。在任何方面的一个实施方案中，RNAi是microRNA、siRNA或shRNA。在任何方面的一个实施方案中，小分子是布美他尼(bumetanide)。
在任何方面的一个实施方案中，药剂包含在载体中。
本文所述发明的又一个方面提供用于治疗脊柱损伤的方法，包括向具有脊柱损伤的受试者给药有效量的降低抑制性中间神经元兴奋性的药剂。
在任何方面的一个实施方案中，药剂上调抑制性Gi偶联受体Gi-DREADD。
在任何方面的一个实施方案中，药剂是编码Gi-DREADD的表达载体。在任何方面的一个实施方案中，药剂是编码Kir2.1的表达载体。
在任何方面的一个实施方案中，该方法还包括在与所述药剂基本上相同的时间给药氯氮平N-氧化物。
在任何方面的一个实施方案中，与适宜的对照物相比，抑制性中间神经元的兴奋性被降低至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90、至少99％或更高。
本文所述发明的另一个方面提供用于治疗脊柱损伤的方法，包括向具有脊柱损伤的受试者给药有效量的降低抑制性中间神经元兴奋性的电刺激。在任何方面的一个实施方案中，该方法还包括给药氯氮平N-氧化物。
在任何方面的一个实施方案中，电刺激直接施加到脊髓。在任何方面的一个实施方案中，电刺激直接施加到脊髓的损伤位点。
在任何方面的一个实施方案中，与适宜的对照物相比，抑制性中间神经元的兴奋性被降低至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90、至少99％或更高。
本文所述发明的另一个方面提供一种药物组合物，其包含有效量的KCC2多肽或包含编码所述KCC2多肽的核酸序列的载体以及药学上可接受的载剂，用于治疗脊髓损伤。
在任何方面的一个实施方案中，KCC2多肽具有、包含以下氨基酸序列或由其组成或基本上由其组成，该氨基酸序列与SEQ ID NO:1具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更高的氨基酸序列一致性并且保留SEQ ID NO:1的KCC2生物学活性的至少80％。
在任何方面的一个实施方案中，组合物还包含至少第二种治疗性化合物。
本文所述发明的另一个方面提供一种药物组合物，其包含有效量的Gi-DREADD多肽或包含编码所述Gi-DREADD多肽的核酸序列的载体以及药学上可接受的载剂，用于治疗脊髓损伤。
在任何方面的一个实施方案中，Gi-DREADD多肽是优化的Gi-DREADD多肽。在任何方面的一个实施方案中，Gi-DREADD多肽包含SEQ ID NO:2的序列。
在任何方面的一个实施方案中，Gi-DREADD多肽具有、包含以下氨基酸序列或由其组成或基本上由其组成，该氨基酸序列与SEQ ID NO:2具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更高的氨基酸序列一致性并且保留SEQ ID NO:2的Gi-DREADD生物学活性的至少80％。
在任何方面的一个实施方案中，组合物还包含至少第二种治疗性化合物。在任何方面的一个实施方案中，组合物还包含氯氮平N-氧化物。
本文所述发明的另一个方面提供一种药物组合物，其包含有效量的Kir2.1多肽或包含编码所述Kir2.1多肽的核酸序列的载体以及药学上可接受的载剂，用于治疗脊髓损伤。
在任何方面的一个实施方案中，Kir2.1多肽包含SEQ ID NO:3的序列。
在任何方面的一个实施方案中，Kir2.1多肽具有、包含以下氨基酸序列或由其组成或基本上由其组成，该氨基酸序列与SEQ ID NO:3具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更高的氨基酸序列一致性并且保留SEQ ID NO:3的Kir2.1生物学活性的至少80％。
在任何方面的一个实施方案中，组合物还包含氯氮平N-氧化物。在任何方面的一个实施方案中，组合物还包含至少第二种治疗性化合物。
本文所述发明的另一个方面提供一种药物组合物，其包含有效量的如本文所述的抑制NKCC的任何药剂以及药学上可接受的载剂，用于治疗脊髓损伤。在任何方面的一个实施方案中，组合物还包含至少第二种治疗性化合物。
本文所述发明的另一个方面提供用于治疗脊柱损伤的方法，包括向具有脊柱损伤的受试者给药有效量的CLP290。
在任何方面的一个实施方案中，CLP290跨越血脑屏障。例如，将CLP290以允许其跨越血脑屏障的方式配制。
在任何方面的一个实施方案中，受试者还被施予至少第二种脊柱损伤治疗。在任何方面的一个实施方案中，受试者还被施予至少第二种治疗性化合物。在任何方面的一个实施方案中，第二种治疗性化合物是选自由骨桥蛋白、生长因子或4-胺基吡啶所组成的群组。
定义
方便起见，本说明书、实施例和所附权利要求书中使用的一些术语和短语的意义提供于下。除非另做指定或上下文矛盾，否则以下术语和短语包括提供于下的意义。提供该定义以辅助描述具体实施方案，而非试图限制所主张的技术，因为该技术的范畴仅为权利要求书所限制。除非另做定义，否则本文中使用的所有科技术语均具有与本技术所属领域技术人员所一般理解的相同的意义。如果本领域中术语的用法与本文所提供的定义之间存在明显不一致之处，则以本说明书中提供的定义为准。
如本文中所用，术语“治疗”、“处置”、“处理”或“缓解”是指治疗性治疗，其中目的为逆转、减轻、改善、抑制、减缓或终止与脊髓损伤相关的病症的进展或严重程度。术语“治疗”包括降低或减轻脊髓损伤的至少一种负面效果或症状，例如，局部或完全瘫痪。如果一种或多种症状或临床标记物减少，则治疗通常是“有效的”。另选地，如果疾病的进展减少或停止，则治疗是“有效的”。换言之，“治疗”不仅包括症状或标记物的改善，还包括症状进展或恶化的中断或至少减缓，与没有进行治疗时预期的相比。有益的或希望的临床结果包括但不限于，一种或多种症状的减轻、疾病程度的缩减、脊髓损伤的稳定(即，不恶化)状态、脊髓损伤进展的延迟或减缓、损伤状态的改善或缓和、减轻(无论部分或总体)和/或死亡率下降，无论可检测或不可检测。术语脊髓损伤的“治疗”也包括提供从该疾病的症状或副作用中解脱(包括姑息治疗)。
如本文中所用，术语“给药”是指将如本文所公开的治疗剂(例如，上调KCC2或降低抑制性中间神经元兴奋性的药剂)或药物组合物通过导致将该药剂至少部分地递送至受试者的方法或途径给药至该受试者体内。包含本文所公开药剂的药物组合物可通过在受试者体内导致有效治疗的任何适宜途径给药。
如本文中所用，“受试者”意为人或动物。通常，动物是脊椎动物诸如灵长动物、啮齿动物、家畜或狩猎动物。灵长动物包括，例如，大猩猩、食蟹猴、蜘蛛猴和猕猴，例如，恒河猴。啮齿动物包括，例如，小鼠、大鼠、土拨鼠、雪貂、兔和仓鼠。家畜和狩猎动物包括，例如，牛、马、猪、野牛、水牛、猫科动物(例如家猫)、犬科动物(例如狗、狐狸、狼)、鸟类(例如鸡、鸸鹋、鸵鸟)和鱼(例如鳟鱼、鲶鱼和鲑鱼)。在一些实施方案中，受试者是哺乳动物，例如灵长动物，例如人。术语“个体”、“患者”和“受试者”在本文中可互换地使用。
优选地，受试者是哺乳动物。哺乳动物可以是非人灵长动物、小鼠、大鼠、狗、猫、马或牛，但不限于这些示例。除人之外的哺乳动物可以有利地用作代表脊髓损伤动物模型的受试者。受试者可以是雄性或雌性。
受试者可以是先前已经被诊断具有或鉴定为正苦于或具有脊髓损伤或一种或多种与此损伤有关的并发症，并且任选地，已经进行了对脊髓损伤或一种或多种与该损伤有关的并发症的治疗。另选地，受试者也可以是先前并未被诊断为具有此类脊髓损伤或相关并发症。例如，受试者可以表现出脊髓损伤的一种或多种风险因素，例如，参与可能导致脊髓损伤的活动，例如，完全接触性体育运动例如美式足球，或可以表现出一种或多种与脊髓损伤有关的并发症，或受试者并未表现出风险因素。
本文所述的方法和组合物可用于治疗脊髓损伤。如本文中所用，“脊髓损伤”是指对脊髓的任何区域例如颈椎、胸椎、腰椎、骶椎、骶骨或尾骨的任何侵犯。“脊髓损伤”可导致各种水平的严重程度，从不影响活动性例如保留行走能力到瘫痪(例如，腿和身体下部的瘫痪)和四肢瘫痪(例如，四肢全部丧失肌肉力量)。“脊髓损伤”可以是完全的脊髓损伤，例如，导致损伤部位以下全部运动和感觉功能丧失的损伤。“脊髓损伤”可以是不完全的脊髓损伤，例如，其中损伤部位以下的一些运动功能得以保留。不完全脊髓损伤的非限制性示例包括但不限于，前索综合征、中央脊髓综合征和Brown-Sequard综合征。“脊髓损伤”可以是脊髓震荡或脊髓挫伤，例如，在例如一两天内自行痊愈的损伤。脊髓震荡或挫伤可以是完全的或不完全的。
如本文中所用，“药剂”是指例如分子、蛋白质、肽、抗体或核酸，其抑制多肽或多核苷酸的表达，或与多肽或多核苷酸结合，部分地或完全地阻断刺激，降低、阻止、延迟多肽或多核苷酸的激活，将多肽或多核苷酸灭活，令多肽或多核苷酸失去敏感性，或下调多肽或多核苷酸的活性。药剂抑制NKCC，例如，抑制多肽的表达，例如转译，例如转译后处理、稳定性、劣化、核定位或细胞质定位，或多核苷酸的转录、转录后处理、稳定性或劣化，或与多肽或多核苷酸结合，部分地或完全地阻断刺激、DNA结合、转录因子活性或酶促活性，降低、阻止、延迟多肽或多核苷酸的激活，将多肽或多核苷酸灭活，令多肽或多核苷酸失去敏感性，或下调多肽或多核苷酸的活性。药物可直接或间接作用。
如本文中所用，术语“药剂”意为任何化合物或物质诸如但不限于小分子、核酸、多肽、药物、离子等。“药剂”可以是任何化学品、实体或部分，包括而不限于，合成的和天然存在的蛋白性和非蛋白性实体。在一些实施方案中，药剂是核酸、核酸类似物、蛋白质、抗体、肽、适体、核酸寡聚物、氨基酸或碳水化合物，包括而不限于，蛋白质、寡核苷酸、核糖酶、DNAzyme、糖蛋白、RNAi(例如，microRNA、siRNA和shRNA)、脂蛋白、适体及其修饰和组合等。在某些实施方案中，药剂是具有化学实体的小分子。例如，化学部分包括未取代或取代的烷基、芳族或杂环基部分，包括大环内酯、莱普霉素(leptomycin)和相关的天然产物或其类似物。化合物可已知具有所希望的活性和/或特性，或可选自多种化合物的文库。
药剂可以是来自一个或多个化学类别的分子，例如，有机分子(其可包括有机金属分子)、无机分子、基因序列等。药剂也可以是来自一种或多种蛋白质的融合蛋白、嵌合蛋白(例如，相关或不同分子的功能显著区域的结构域切换或同源重组)、合成的蛋白质或包括替换、删除、插入和其他变体的其他蛋白质变异物。
如本文中所用，术语“小分子”是指化学剂，其可包括但不限于肽、拟肽、氨基酸、氨基酸类似物、多核苷酸、多核苷酸类似物、适体、核苷酸、核苷酸类似物、分子量小于约10,000克/摩尔的有机或无机极化合物(例如，包括杂有机化合物和有机金属化合物)、分子量小于约5,000克/摩尔的有机或无机化合物、分子量小于约1,000克/摩尔的有机或无机化合物、分子量小于约500克/摩尔的有机或无极化合物、及此类化合物的盐、酯和其他药学上可接受的形式。
本文所述的方法和组合物需要将KCC2的水平上调。如本文中所用，“K+-Cl-协同转运蛋白(KCC2)”是指其细胞内氯离子浓度低于电化学平衡电位的蛋白质。KCC2可以净流出或流入通路发挥作用，取决于钾和氯离子的化学浓度梯度。KCC2的序列，也称为溶质载剂家族12成员5，已知用于大量物种，例如人KCC2(NCBI基因ID：57468)多肽(例如，NCBI Ref SeqNP_001128243.1)和mRNA(例如，NCBI Ref Seq NM_001134771.1)。KCC2可以指人KCC2，包括其天然存在的变体、分子和等位基因。KCC2是指哺乳动物例如小鼠、大鼠、兔、狗、猫、牛、马、猪等的KCC2。SEQ ID NO:1的核酸序列包含编码大鼠KCC2的核酸序列。
本文所述的方法和组合物需要抑制NKCC的水平和/或活性。如本文中所用，“Na+/2Cl-/K+协同转运蛋白(NKCC)”是指通过介导钠和氯离子转运和再吸收而维持适宜平衡和细胞体积所需的蛋白质。NKCC的序列，也称为溶质载剂家族12成员2和NKCC1，已知用于大量物种，例如人NKCC(NCBI基因ID：6558)多肽(例如，NCBI Ref Seq NP_001037.1)和mRNA(例如，NCBI Ref Seq NM_001046.2)。NKCC可以指人NKCC，包括其天然存在的变体、分子和等位基因。NKCC是指哺乳动物例如小鼠、大鼠、兔、狗、猫、牛、马、猪等的NKCC。SEQ ID NO:4的核酸序列包含编码NKCC的核酸序列。
本文所述的方法和组合物需要增加Kir2.1的水平和/或活性。如本文中所用，“Kir2.1”是指钾电压门控通道亚族J成员2，其特征为更容易令钾流入而非流出细胞。Kir2.1可能参与神经元和肌肉组织的动作电位波形和兴奋性的建立。Kir2.1的序列已知用于大量物种，例如人Kir2.1(NCBI基因ID：3759)多肽(例如，NCBI Ref Seq NP_000882.1)和mRNA(例如，NCBI Ref Seq NM_000891.2)。Kir2.1可以指人Kir2.1，包括其天然存在的变体、分子和等位基因。Kir2.1是指哺乳动物例如小鼠、大鼠、兔、狗、猫、牛、马、猪等的Kir2.1。SEQ ID NO:3的核酸序列包含编码人Kir2.1的氨基酸序列。SEQ ID NO:5的核酸序列包含编码小鼠Kir2.1的氨基酸序列。
如本文中所用，术语“上调”和“上调了”是指导致(例如，KCC2、Gi-DREADD或Kir2.1的)生物学活性增加的变化或改变。上调包括但不限于，刺激或促进活性。上调可以是活性和/或水平的变化、结合特征的变化、或与蛋白质、通路、系统或其他该兴趣的生物学靶标的活性相关联的生物学、功能或免疫特性的变化，该变化导致其活性和/或水平增加。在一些实施方案中，术语“上调”可意为较之于参考水平增加至少10％，例如较之于参考水平增加至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％或高达且包括增加100％或介于10％与100％之间的任何增加，或较之于适宜对照物增加至少约2倍、或至少约3倍、或至少约4倍、或至少约5倍、或增加至少约10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、75倍、100倍等，或介于2倍和10被或更多之间的任何增加。
本文中使用的术语“降低”、“减少”、“减低”或“抑制”全部意为以统计学显著的量降低。在一些实施方案中，“降低”、“减少”、“减低”或“抑制”典型意为较之于适宜对照物(例如，在不存在给定治疗的情况下)降低至少10％，并且可包括例如降低至少约10％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或更多。如本文中所用，“减少”或“抑制”并不涵盖较之于参考水平的完全抑制或减少。“完全抑制”是较之于适宜对照物的100％抑制。
本文中使用的术语“增加”、“提升”或“激活”全部意为以可重现的统计学显著的量增加。在一些实施方案中，术语“增加”、“提升”或“激活”可意为较之于参考水平增加至少10％，例如较之于参考水平增加至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％或高达且包括增加100％或介于10％与100％之间的任何增加，或较之于适宜对照物增加至少约2倍、或至少约3倍、或至少约4倍、或至少约5倍、或增加至少约10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、6倍、75倍、100倍等，或介于2倍和10被或更多之间的任何增加。在标记物的语境中，“增加”是此水平的可重现的统计学显著的增加。
如本文中所用，“适宜对照物”是指未经处理但相同的细胞或群体(例如，与非对照患者相比，未给药本文所述药剂或仅给药本文所述药剂的子集的患者)。
如本文中所用，术语“药学上可接受的载剂”意为药学上可接受的材料、组合物或媒介物，诸如液体或固体填充物、稀释剂、赋形剂、溶剂或胶囊化材料，其牵涉入携带或运输活性成分(例如细胞)至受试者体内的靶向位置。就与配方中其他成分可相容且不对患者造成伤害而言，每种载剂必须是“可接受的”，并且於给药至受试者例如人相兼容。
术语“统计学上显著”或“显著地”是指统计学显著性，并且通常意为相差两个标准偏差(2SD)或更大。
如本文中所用，“包含”或“包括”是参照组合物、方法及对于该方法或组合物至关重要的对应组分而使用的，但对于包括未指定元件(无论其必要与否)是开放性的。
如本文中所用，术语“基本上由...组成”是指给定实施方案所需的那些元件。该术语允许存在在材料上不影响该实施方案的基本或新颖的功能特征的元件。术语“由...组成”是指如本文所述的组合物、方法和其相应组分不包括在该实施方案的描述中未引用的任何元件。
除非语境中明确排除，否则单数形式“一”和“该”包括复数个所指物。同样，除非语境中明确排除，否则词语“或”旨在包括“和”。尽管与本所述类似或等效的方法和材料可用于实践或测试本公开，但适当的方法和材料描述如下。缩写“e.g.”衍生自拉丁语“exempligratia”，本文中用来指示非限制性示例。因此，缩写“e.g”与术语“例如”同义。
附图说明
图1A至1K展示了数据，该数据显示将CLP290鉴定为导致具有交错损害的小鼠功能恢复的化合物。(图1A)在T7和T10行交错侧面半横断术的示意图。三角形指示损害，L为左，R为右。(图1B)在过度交错损害后10周，抗GFAP染色的脊髓断面的代表性图像。虚线表示中线。比例尺：500μm。(图1C)交错损害后2周，来自T5(损害头段)、T8(损害之间)和L2(损害尾段)小鼠)的抗5HT染色的横断面的代表性图像栈。比例尺：100μm。(图1D)实验方案。每一BMS测试在每天进行化合物治疗之前执行。(图1E)连续使用CLP290(35mg/kg)和媒介物溶液治疗的小鼠的BMS分数。进行双向重复测量ANOVA，之后进行事后Bonferroni校正。两个组均以n＝10开始；在第9周(终结时间点)，媒介物和CLP290组分别为n＝8和10。*P<0.05；****P<0.0001。误差条：SEM。(图1F)实现脚站立的小鼠的百分比。在交错损伤后9周，CLP290与媒介物对比(媒介物组，n＝8；CLP290组，n＝10)。(图1G)。用CLP290治疗10周，停药后，小鼠的行为持续改善。在停用化合物后第1、2、3、7和14天，测试BMS(n＝7)。进行双向重复测量ANOVA，之后进行事后Bonferroni校正。**p<0.01。误差条：SEM。(图1H)小鼠右后肢在摆动、站立(完整组)、拖曳(媒介物组)和脚站立(CLP290组)过程中移动的颜色编码棒试图分解。(图1I和图1J)。交错损害后9周，小鼠体重支持(图1I)和步幅(图1J)的定量(媒介物组，n＝8；CLP290组，n＝10)。学生t检验(双尾，无配对)。*p<0.05；**p<0.01。误差条：SEM。(图1K)代表性右后肢膝、踝关节角摆动轨迹及胫骨前(TA)和内侧腓肠肌(GS)同步肌电图记录。
图2A至2H展示了数据，该数据显示广泛的KCC2表达模拟CLP290促进功能恢复的效果。(图2A)实验方案。(图2B)取自交错损害后8周的小鼠，以抗HA染色(以检测HA-KCC2蛋白)的纵向(上图)和横向(下图)脊髓断面的代表性图像栈。比例尺：500μm(上图)和100μm(下图)。(图2C)实验组(AAV-PHP.B-HA-KCC2)和对照组(AAV-PHP.B-H2B-GFP)的BMS效能。进行双向重复测量ANOVA，之后进行事后Bonferroni校正。*p<0.05。(图2D)在损伤后8周实现脚站立的小鼠的百分比。(图2E和图2F)在第8周，小鼠体重支持(图2E)和步幅(图2F)的定量(n＝10/组)。应用学生t检验(双尾，无配对)。*p<0.05；**p<0.01。误差条：SEM。(图2G)小鼠右后肢在(AAV-PHP.B-H2B-GFP组)和脚站立(AAV-PHP.B-HA-KCC2组)过程中移动的颜色编码棒试图分解。(图2H)在损伤后8周，小鼠的代表性右后肢膝、踝关节角摆动轨迹及同步EMG记录。
图3A至3E展示了数据，该数据显示一致性神经元中的KCC2表达导致功能恢复。(图3A、图3B)代表性图像栈，显示尾静脉注射AAV-PHP.B-CAG-Flex-H2B-GFP(图3A)或AAV-PHP.B-Syn-Flex-HA-KCC2(图3B)的所指示转基因小鼠的T8脊髓中的GFP表达(图3A)或HA-KCC2表达(图3B)。比例尺：100μm。(图3C)所指示各组中的BMS效能。进行双向重复测量ANOVA，之后进行事后Bonferroni校正。*p<0.05；****p<0.0001。误差条：SEM。(图3D)在损伤后8周，所指示治疗组的)BMS分数明细。(图3E)在损伤后8周实现脚掌站立或脚背站立的小鼠的百分比。
图4A至4H展示了数据，该数据显示KCC2作用于位于损害之间和损害附近的脊髓段中的一致性神经元。(图4A)图4B至图4D的实验方案。(图4B)在第8周，抗HA染色的胸部和腰部脊髓横断面的代表性图像。比例尺：100μm。(图4C和图4D)左图，野生型小鼠(图4C)和Vgat-Cre小鼠(图4D)的不同治疗组中的BMS效能。右图，野生型小鼠(图4C)和Vgat-Cre小鼠(图4D)中实现脚站立的小鼠的百分比。ANOVA，之后进行事后Bonferroni校正。误差条：SEM。(图4E)图4F至图4H的实验方案。(图4F)在损伤后8周，抗HA染色的胸部和腰部脊髓横断面的代表性图像。比例尺：100μm。(图4G和图4H)左图，野生型小鼠(图4G)和Vgat-Cre小鼠(图4H)的实验组和对照组中的BMS效能。右图，野生型小鼠(图4G)和Vgat-Cre小鼠(图4H)中实现脚站立的小鼠的百分比。ANOVA，之后进行事后Bonferroni校正。*p<0.05。误差条：SEM。
图5A至5F展示了数据，该数据显示CLP290/KCC2促成的神经元激活模式和中继形成的改变。(图5A)脊髓横断面示意图，显示完整小鼠和使用媒介物、CLP290、AAV-PHP.B-syn-HA-KCC2或L838,417治疗的受损小鼠在连续运动1小时后，其T8/9段中的c-Fos表达模式。每个点表示使用c-Fos和NeuN两者阳性染色的细胞。代表性的原始图像显示在图11A中。(图5B)所有组中，背侧区域或中间及侧腹部区域中每个断面中的c-Fos+神经元的数目。单因素ANOVA，之后进行Bonferroni事后检验(将媒介物、CLP290、AAV-PHP.B-syn-HA-KCC2或L838,417治疗组中的背侧区域或中间/腹侧区域的c-Fos+NeuN+数目分别与完整组比较)。每只小鼠，n＝3个断面；每组中，n＝3只小鼠。*p<0.05；***P<0.001；****P<0.0001；n.s.：不显著。误差条：SEM。(图5C)所有组中，椎板1至5(背侧)或椎板6至10(中间-腹侧)中每个断面中的c-Fos+神经元的平均百分比。单因素ANOVA，之后进行Bonferroni事后检验(将媒介物、CLP290、AAV-PHP.B-syn-HA-KCC2或L838,417治疗组中的背侧区域或中间/腹侧区域的c-Fos+NeuN+百分比分别与完整组比较)。每只小鼠，n＝3个断面；每组中，n＝3只小鼠，*p<0.05；**P<0.01；***P<0.001；n.s.：不显著。误差条：SEM。(图5D)左图，皮层刺激和TA肌肉EMG实验的方案。右图，在对照组、AAV-PHP.B-syn-HA-KCC2组、CLP290治疗组、全横断组和完整组中，由一系列硬膜外运动皮层刺激引起的右TA肌肉的代表性应答。(图5E)来自所指示组的右TA肌肉EMG应答幅度。单因素ANOVA，之后进行Bonferroni事后检验。每只小鼠，n＝3次尝试，每一组，n＝3只小鼠，***p<0.001；n.s.：不显著；误差条：SEM。(图5F)来自所指示组的右TA肌肉EMG应答时延。单因素ANOVA，之后进行Bonferroni事后检验。每只小鼠，n＝3次尝试，每一组，n＝3只小鼠，***p<0.001；n.s.：不显著。误差条：SEM。
图6A至6F展示了数据，该数据显示位于损害之间或损害附近的一致性中间神经元中的Gi-DREADD表达模拟KCC2/CLP290的效果。(图6A)实验方案。(图6B)在SCI之后8周，用抗RFP进行免疫染色以指示hM4Di DREADD表达的胸椎脊髓和腰椎脊髓的横断面的代表性图像。比例尺：100μm。(图6C)在进行SCI以及病毒注射之后，Gi-DREADD组和GFP组的Vgat-Cre小鼠随时间推移的BMS效能。ANOVA，之后进行事后Bonferroni校正。**p<0.001，****p<0.0001，误差条，SEM。(图6D)。横向脊髓断面示意图，显示在连续运动1小时后，AAV-9-Syn-Gi-DREADD治疗的小鼠(脚背/脚掌站立)和AAV-9-Syn-GFP小鼠组(拖曳)的T8/9段中的c-Fos阳性神经元。(图6E)所指示组中每个断面的c-Fos+神经元(所有椎板)的平均数。学生t检验(双尾，无配对)。每只小鼠，n＝3个断面；每一组，n＝3只小鼠。n.s.：不显著。误差条：SEM。(图6F)所指示组中椎板1-5或椎板6-10中c-Fos+神经元的平均数。学生t检验(双尾，无配对)。每只小鼠，n＝9个样本片；每一组，n＝3只小鼠。**P<0.01；n.s.：不显著。误差条：SEM。
图7A至7F展示了数据，该数据显示小分子化合物在具有交错或完全脊髓损伤的小鼠体内的效果。(图7A)使用所指示化合物对交错损害的小鼠进行连续治疗，在给药该化合物24小时后的BMS分数。重复测量ANOVA，之后进行事后Bonferroni校正。所有组均以n＝10开始，并且在第9周(终止时间点)，盐水组、CP101606(10mg/Kg)组、布美他尼(0.3mg/Kg)组、巴氯芬(1mg/Kg)组、L838,417(1mg/Kg)组、8-OH-DPAT(0.1mg/Kg)组和喹哌嗪(0.2mg/Kg)组分别为n＝8、10、3、8、4、7和7。误差条，SEM。(图7B)在SCI后8周对交错损害的小鼠进行短期化合物治疗后(在给药化合物之后10、30、30、60和120分钟)测量的BMS分数。进行双向重复测量ANOVA，之后进行事后Bonferroni校正。所有组，n＝5；****P<0.0001；误差条，SEM。(图7C)在交错损害之后10周，对受损小鼠进行CLP290治疗，来自该小鼠的L2脊椎水平的使用5HT抗体染色的横断面代表性共焦图像。比例尺：100μm。(图7D)左图，在T8全横断面(FT)的示意图。三角形指示损害。右上图：在FT损害之后10周，用抗GFAP进行免疫染色的纵向脊髓断面(从T5到T12)的代表性共焦图像栈。虚线表示中线。比例尺：500μm。右下图：在交错损害之后8周，用抗5HT(羟色胺能轴突)进行免疫染色的胸椎和腰椎脊髓(T5，损害头段；T9；和T12，损害尾段)横断面的代表性共焦图像栈。比例尺：100μm。(图7E)在给药媒介物或CLP290后24小时，以具有全横断面小鼠测量的BMS分数。重复测量ANOVA，之后进行事后Bonferroni校正。两个组均以n＝10开始；在第9周(终结时间点)，媒介物和CLP290组分别为n＝8和10。误差条，SEM。(图7B)在全横断面而不进行长期治疗后8周，对小鼠进行短期化合物治疗后(在给药化合物之后10、30、30、60和120分钟)测量的BMS分数。重复测量ANOVA，之后进行事后Bonferroni校正。所有组，n＝5；****P<0.0001；误差条，SEM。
图8A至8F展示了数据，该数据显示CLP290对于轴突生长没有显著效果(逆行标记)。(图8A)左图：将HiRet-mCherry注射到逆行标记的脊髓固有神经元和脑神经元并向下投射到右侧腰椎脊髓(L2-4)的示意图。小鼠在损伤后1天(短期)8周(长期)接受HiRet-mCherry注射。在病毒注射后2周处死小鼠以进行组织学分析。中图：在短期和长期阶段标记的固有神经元的纵向表示。每个点代表5个神经元。右图：在交错损伤后10周，用抗RFP染色的T8(损害之间)和T13(损害以下)处横断面的代表性共焦图像栈。比例尺：100μm。下图：进行Ipsi追踪的PN：进行同侧追踪的脊髓固有神经元；跨中线的PN：跨越中线的脊髓固有神经元(相对于注射位点)。(图8B和图8C)来自图8A的脑和脊髓的标记神经元的定量。将在短期和长期阶段进行媒介物治疗的小鼠(图8B)或在长期阶段进行媒介物或CLP290治疗的小鼠(图8C)的不同脑部区域和脊髓段的逆行标记神经元的数目归一化至完整小鼠的那些逆行标记神经元。损害头段：高于T7；损害中段：T8至T10；损害尾段：T10至L1。L：左，R：右。学生t检验；完整组、短期SCI小鼠和长期SCI小鼠，各自n＝3。*p<0.05。n.s.，不显著。误差条：SEM。(图8D)左图：将HiRet-mCherry注射到逆行标记的脊髓固有神经元和脑神经元并向下投射到左侧腰椎脊髓(L2-4)的示意图。动物在交错损伤后1天(短期)8周(长期)接受HiRet-mCherry注射。在病毒注射后2周处死小鼠以进行组织学分析。中图：在短期和长期阶段标记的固有神经元的纵向表示。每个点代表5个神经元。右图：在交错损伤后10周，用抗RFP染色的T8(损害之间)和T13(损害以下)处横断面的代表性共焦图像栈。比例尺：100μm。下图：进行Ipsi追踪的PN：进行同侧追踪的脊髓固有神经元；跨中线的PN：跨越中线的脊髓固有神经元(相对于注射位点)。(图8E和图8F)来自图8D的脑和脊髓的标记神经元的定量。将在短期和长期阶段进行媒介物治疗的小鼠(图8E)或在长期阶段进行媒介物或CLP290治疗的小鼠(图8F)的不同脊髓段中mCherry标记的脑神经元和脊髓固有神经元的数目归一化至完整小鼠的那些逆行标记神经元。损害头段：高于T7；损害中段：T8至T10；损害尾段：T10至L1。L：左，R：右。学生t检验；完整组、短期SCI小鼠和长期SCI小鼠，各自n＝3。*P<0.05；n.s.：不显著。误差条：SEM。
图9A至9I展示了数据，该数据显示CLP290对于备用轴突的轴突生长没有效果。(图9A)左图：对来自脑干网状结构的神经元进行顺行标记的AAV注射策略示意图。动物在损伤后1天(短期)或8周(长期)接受AAV-ChR2-mCherry注射(左侧)和AAV-ChR2-GFP注射(右侧)。在病毒注射后2周处死小鼠以进行组织学分析。黑线：从左侧网状结构下行的轴突；灰线：从右侧网状结构下行的轴突。右图：在损伤之后2周和10周，用抗RFP和抗GFP染色的胸椎脊髓和腰椎脊髓的横断面的代表性共焦图像栈。比例尺：100μm。(图9B)在交错损伤之后2周和10周，使用mCherry和GFP进行免疫染色的媒介物治疗组的荧光强度。所有图像均使用相同的成像参数和扫描设定获取。在每种情况下，将强度归一化至交错损伤之后2周的损害头段水平。学生t检验。每只小鼠，n＝3个断面；每一组，n＝3只小鼠。*p<0.05；n.s.：不显著。误差条：SEM。(图9C)在交错损伤之后10周，使用mCherry和GFP进行免疫染色的媒介物治疗组和CLP290治疗组的荧光强度。所有图像均使用相同的成像参数和扫描设定获取。在每种情况下，将强度归一化至交错损伤之后2周的损害头段水平。学生t检验。每只小鼠，n＝3个断面；每一组，n＝3只小鼠。*p<0.05；n.s.：不显著。误差条：SEM。(图9D)示意图和图像，其显示在损伤后2周或10周取自进行或不进行CLP290治疗小鼠的不同水平脊髓的羟色胺能轴突。(图9E、图9F)。比较媒介物治疗组的短期和长期阶段的5-HT免疫染色荧光强度(图9E)，也比较媒介物治疗组和CLP290治疗组的长期阶段的5-HT免疫染色荧光强度(图9F)。学生t检验。每只小鼠，n＝3个断面；每一组，n＝3只小鼠。*p<0.05；n.s.：不显著。误差条：SEM。(图9G至图9I)。(图9)在损伤并且进行或不进行CLP290治疗之后2周或10周，将AAV-ChR2-GFP注射到右侧皮层以追踪不同脊髓水平处的CST轴突终末。进行短期阶段和长期阶段的媒介物治疗小鼠之间的抗-GFP免疫染色荧光强度(图9H)，并且进行在损伤后10周进行媒介物治疗组或CLP290治疗组之间的抗GFP免疫染色荧光强度比较(图9I)。比例尺：100μm。学生t检验。每只小鼠，n＝3个断面；每一组，n＝3只小鼠。n.s.：不显著。误差条：SEM。
图10A至10E展示了数据，该数据显示脊髓神经元内的AAV介导的KCC2表达及其造成的行为后果。(图10A、图10B)代表性的免疫印迹图像和定量，显示在损伤后10周，完整小鼠或使用AAV-PHP.B-FLEX-GFP或AAV-PHP.B-HA-KCC2治疗的交错损害小鼠的损害中段区域(T8/9)(图10A)和腰椎脊髓(图10B)中的KCC2蛋白水平。肌动蛋白作为加载对照物。对于完整组、AAV-PHP.B-GFP组和AAV-PHP.B-HA-KCC2组，分别为n＝6、5和5只小鼠。学生t检验；*P<0.05；**P<0.01；误差条：SEM。(图10C)左图，实验设计方案。将AAV病毒经脊髓内注射到实验(AAV-1-Syn-HA-KCC2)小鼠和对照(AAV-1-Syn-GFP-H2B)小鼠的腰椎段(L2-4)。右图，在交错损害之后10周，用抗HA进行免疫染色以标记病毒表达的KCC2的纵向脊髓断面(从T5到S1)的代表性共焦图像栈。(图10D)左图，实验设计方案。将AAV病毒经尾静脉注射到实验(AAV-9-Syn-HA-KCC2)小鼠和对照(AAV-9-Syn-GFP-H2B)小鼠体内。右图，在交错损害之后10周，用抗HA进行免疫染色以标记病毒表达的KCC2的纵向脊髓断面(从T5到L3)的代表性共焦图像栈。比例尺：500μm。(图10E)在尾静脉注射AAV-9-Syn-HA-KCC2并使用媒介或CLP290治疗治疗24小时，以Vgat-Cre小鼠测量的BMS分数。两个组均以n＝8开始；在第9周(终结时间点)，媒介物和CLP290两组均为n＝6。重复测量ANOVA，之后进行事后Bonferroni校正。**P<0.01；误差条，SEM。
图11A至11D展示了数据，该数据显示进行不同治疗的交错损害小鼠的T8/9中的c-Fos表达模式改变。(图11A)在损伤后8周，使用抗c-Fos抗体、抗NeuN抗体或抗c-Fos和NeuN两者的抗体染色的来自T8/9脊髓的横断面的代表性共焦图像栈。比例尺：100μm。(图11B)完整小鼠或进行个体治疗(媒介物对照、CLP290、AAV-PHP.B-HA-KCC2和L838,417)的受损小鼠的c-fos+细胞中NeuN+细胞的百分比。单因素ANOVA，之后进行Bonferroni事后检验。每只小鼠，n＝3个断面，每一组，n＝3只小鼠。n.s.：不显著。误差条：SEM。(图11C)进行媒介物治疗(STA)、连续CLP290治疗(CLP290)和CLP290停药后2周(CLP290停药)的交错损害小鼠的背侧区域或中间及腹侧区域中每个断面的c-Fos+神经元的平均数。单因素ANOVA，之后进行Bonferroni事后检验(将CLP290组或CLP290停药组的背侧区域或中间/腹侧区域的c-Fos+NeuN+数目分别与媒介物组比较)。每只小鼠，n＝3个断面；每组中，n＝3只小鼠。*p<0.05；**P<0.01；n.s.：不显著。误差条：SEM。(图11D)进行媒介物治疗(STA)、连续CLP290治疗(CLP290)和CLP290停药后2周(CLP290停药)的交错损害小鼠的椎板1-5或椎板6-10中每个断面的c-Fos+神经元的平均百分比。单因素ANOVA，之后进行Bonferroni事后检验(将CLP290组或CLP290停药组的背侧区域或中间/腹侧区域的c-Fos+NeuN+的百分比分别与媒介物组比较)。每只小鼠，n＝3个断面；每组中，n＝3只小鼠。**P<0.01；n.s.：不显著。误差条：SEM。
图12A至12C展示了显示Gq-DREADD表达的数据。(图12A)在交错损害之后8周，用抗RFP进行染色以指示hM3D DREADD表达的胸椎脊髓和腰椎脊髓的横断面的代表性共焦图像。比例尺：100μm。(图12B)进行AAV9-Syn-FLEX-GFP或AAV9-FLEX-hM3Dq-mCherry病毒注射的受损Vglut2-Cre小鼠的BMS分数。重复测量ANOVA，之后进行事后Bonferroni校正。每一组，n＝5。误差条：SEM。(图12C)在SCI后8周对交错损害的vGlut2-Cre小鼠进行短期化合物治疗后(在给药CNO之后10、30、60,120和180分钟)测量的BMS分数。重复测量ANOVA，之后进行事后Bonferroni校正。n＝5，*P<0.05；***P<0.001；误差条，SEM。
图13A至13C展示了数据，该数据显示用AAV-PHP.B-HA-KCC2进行治疗在脊髓损伤模型中的效果。(图13A)进行KCC2治疗(AAV-PHP.B-HA-KCC2)的T10挫伤受损小鼠和对照小鼠的BMS分数。进行双向重复测量ANOVA，之后进行事后Bonferroni校正。*P<0.05，**P<0.01。误差条，SEM。(对照组，n＝11；KCC2族，n＝10)。(图13B)在挫伤后8周，对体重支持(上图)和脚站立高度(下图)的定量)(对照组，n＝11；KCC2族，n＝10)。应用学生t检验(双尾，无配对)。*p<0.05；**p<0.01。误差条，SEM。(图13C)在损伤后8周实现脚站立的小鼠的百分比(上图)。在损伤后8周具有痉挛状态的小鼠的百分比(下图)。如果受损小鼠在超过50％的BMS评分时间内显示痉挛，则将其归类为“强痉挛状态”(对照组，n＝11；KCC2族，n＝10)。
具体实施方式
本文所述的发明部分地基于以下发现：KCC2激动剂恢复进行交错双侧半横断术的小鼠的脚站立能力，该交错双侧半横断术是例如一种损伤，其中腰椎脊髓被剥夺了所有直接的脑源性神经支配但保留备用的中继回路。还发现，这一脚站立能力的恢复可通过位于交错脊髓损害之间和附近的抑制性中间神经元中的KCC2选择性表达或超极化DREADD(例如，优化的Gi-DREADD)来模拟。
此外，本文提供的证据显示，对NKCC的抑制或Kir2.1的表达导致先前由于例如交错双侧半横断术而失去脚站立能力的小鼠的脚站立能力增加。在机理上，这些治疗将这一损伤诱导的失能脊髓回路转化为功能性状态，促使脑源性指令向腰椎脊髓的中继。
因此，本文提供增加具有脊髓损伤的患者的KCC2、Gi-DREADD或Kir2.1表达或抑制NKCC的方法。此外，本文描述包含可用于增加KCC2、Gi-DREADD或Kir2.1表达或抑制NKCC的药剂的组合物。本文还提供包含调节KCC2、NKCC、Gi-DREAD或Kir2.1的药剂的组合物，用于治疗脊髓损伤。
治疗脊髓损伤
本文提供针对治疗脊髓损伤的方法。在一个实施方案中，脊柱损伤是重度脊柱损伤。脊髓损伤是指对脊髓任意区域例如颈椎、胸椎、腰椎、骶椎、骶骨或尾骨的任意侵犯，其对脊髓功能造成负面效果，例如，降低肢体感觉的活动性。脊髓损伤的严重程度以损伤造成结果的水平测量，例如，从不影响活动性例如保留行走能力到瘫痪(例如，腿和身体下部的瘫痪)和四肢瘫痪(例如，四肢全部丧失肌肉力量)。在一个实施方案中，本文所述的方法和组合物用于治疗重度脊髓损伤。如本文所用，“重度脊髓损伤”是指完全或不完全的脊髓损伤，其导致损伤水平以下全部运动和感觉功能丧失。
本发明的一个方面提供一种用于治疗脊柱损伤的方法，包括向具有脊柱损伤的受试者给药有效量的上调神经元特异性K+-Cl-协同转运蛋白(KCC2)的药剂。
本发明的第二方面提供用于治疗脊柱损伤的方法，包括向具有脊柱损伤的受试者给药有效量的抑制Na+/2Cl-/K+协同转运蛋白(NKCC)的药剂。
本发明的第三方面提供用于治疗脊柱损伤的方法，包括向具有脊柱损伤的受试者给药有效量的降低抑制性中间神经元兴奋性的药剂。在一个实施方案中，药剂上调抑制性Gi偶联受体Gi-DREADD。Gi偶联DREADD是指只能由人工设计药物激活的人工设计受体(DREADD)。Gi-DREADD可以表达在特定位置中，例如，表达在抑制性中间神经元上，并且可通过其激动剂或拮抗剂进行控制。DREADD还在例如Saloman,JL,et al.Journal ofneuroscience.19Oct 2016:36(42)；10769-10781中有所描述，该文献通过引用以其整体并入本文。
本文使用的是被优化用于在抑制性中间神经元中表达的Gi-DREADD。在一个实施方案中，Gi-DREADD被表达在脊髓中。在一个实施方案中，Gi-DREADD被表达在损伤位点处。在一个实施方案中，Gi-DREADD被表达在抑制性中间神经元上。在又一个实施方案中，该药剂在基本上与Gi-DREADD激动剂例如氯氮平N-氧化物相同的时间给药。在另一个实施方案中，该药剂上调Kir2.1。
本发明的第四方面提供用于治疗脊柱损伤的方法，包括向具有脊柱损伤的受试者施予有效量的降低抑制性中间神经元兴奋性的电刺激。电刺激，也称为硬膜外脊髓电刺激，是治疗苦于脊髓损伤所致慢性疼痛或重度中枢运动障碍的受试者的方法。电刺激是将连续电流施加至脊髓的下部，例如，通过植入到脊髓的硬膜(例如，保护性包膜)上的芯片施加。例如，通过远程控制芯片以改变电流的频率和强度。在一个实施方案中，将电刺激直接施加到脊髓但不施加在损伤位点处(例如，施加到脊髓的未受损部分上)。在另一个实施方案中，电刺激直接施加到脊髓的损伤位点。在一个实施方案中，该方法还包括给药Gi-DREADD激动剂，例如氯氮平N-氧化物。
在一个实施方案中，与适宜的对照物相比，本文所述的电刺激将抑制性中间神经元的兴奋性降低至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90、至少99％或更高。如本语境中所用，适宜的对照物是指未受刺激的抑制性中间神经元的兴奋性。
在多个方面的一个实施方案中，在给药之前，受试者被诊断为具有脊髓损伤。熟练的临床医师可通过例如身体检查或放射诊断途径诸如X射线、计算机断层(CT)扫描和/或磁共振成像(MRI)扫描将受试者诊断为具有脊髓损伤。
在多个实施方案中，受试者可能先前已经被诊断为具有脊髓损伤，并且可能先前已经进行脊髓损伤的治疗。
药剂
本文描述上调KCC2的药剂。在一个实施方案中，上调KCC2的药剂是小分子、肽、基因标记系统或编码KCC2的表达载体。在一个实施方案中，上调KCC2的小分子是CLP290或其衍生物。例如，如果药剂在给药时增加细胞中KCC2的存在、量、活性和/或水平，则认为该药剂对于上调KCC2是有效的。在一个实施方案中，与参考水平相比，KCC2被上调至少10％，例如参考水平相比，增加至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％或高达且包括增加100％或介于10％与100％之间的任何增加，或与适宜对照物相比，增加至少约2倍、或至少约3倍、或至少约4倍、或至少约5倍、或增加至少约10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、75倍、100倍等，或介于2倍和10被或更多之间的任何增加。如本文中所用，在本语境中中，适宜的对照物是指未处理的细胞中的KCC2水平。技术人员可使用本文所述的技术例如分别用以评估KCC2蛋白或mRNA水平的免疫印迹法或基于PCR的测定法来测量KCC2的水平。
CLP290是KCC2活性的小分子增强剂。CLP290在本领域中也称为[5-氟-2-[(Z)-(2-六氢哒嗪-1-基-4-氧代-噻唑l-5-亚基)甲基]苯基]吡咯烷-1-甲酸盐，并且具有以下结构：
Figure BDA0002909166630000221
再者，在一个实施方案中，小分子是本文所述的任何小分子例如CLP290的衍生物、变体或类似物。当一个分子含有正常情况下不是该分子一部分的额外化学部分时和/或其已经进行化学修饰时，则称其为另一个分子的“衍生物”。此类部分可改善该分子的表达水平、酶促活性、溶解度、吸收、生物半衰期等。该部分可另选地降低该分子的毒性，消除或衰减该分子的任何不希望的副作用等。能够介导此类效果的部分公开在《雷明顿药物科学(第十八版)》(Remington's Pharmaceutical Sciences,18th edition,A.R.Gennaro,Ed.,MackPubl.,Easton,PA(l990))中。分子的“变体”意指在结构和功能上与整个分子或其片段基本上类似的分子。如果两个分子具有基本上类似的结构和/或如果两个分子具备类似的生物学活性，则称一个分子“基本上类似于”另一个分子。因此，提供了具备类似活性的两个分子，就本文所用的术语层面而言，即使该分子之一的结构并未见于另一分子中或该结构并不相同，仍认为它们是变体。分子的“类似物”意指在功能上与整个分子或其片段基本上类似的分子。
本文也描述了抑制NKCC的药剂。在一个实施方案中，抑制NKCC的药剂是小分子、抗体、肽、反义寡核苷酸或RNAi。在一个实施方案中，上调KCC2的小分子是布美他尼或其衍生物。例如，如果药剂在给药时抑制细胞中KCC2的存在、量、活性和/或水平，则认为该药剂对于抑制KCC2是有效的。在一个实施方案中，与适宜的对照物相比，NKCC被抑制至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90、至少99％或更高。如本文中所用，在本语境中中，适宜的对照物是指未处理的细胞中的NKCC水平。技术人员可使用本文所述的技术例如分别用以评估NKCC蛋白或mRNA水平的免疫印迹法或基于PCR的测定法来测量NKCC的水平。
此外，本文描述了编码Gi-DREADD的表达载体，其用于在抑制性中间神经元中表达Gi-DREADD以降低抑制性中间神经元的兴奋性。例如，如果表达载体在给药时增加细胞中Gi-DREADD的存在、量、活性和/或水平，则认为该表达载体对于表达Gi-DREADD是有效的。在一个实施方案中，与适宜的对照物相比，Gi-DREADD的表达将抑制性中间神经元的兴奋性降低至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90、至少99％或更高。如本文中所用，在本语境中，适宜的对照物是指以其他方式与未经处理的抑制性中间神经元相同的群体。技术人员可使用本文所述的技术例如分别用以评估Gi-DREADD蛋白或mRNA水平的免疫印迹法或基于PCR的测定法来测量Gi-DREADD的水平。技术人员可例如通过测量表达在兴奋性中间神经元和抑制性中间神经元的细胞核中的c-fos水平来测量抑制剂中间神经元的兴奋性，例如，通过对生物样本进行免疫染色或电生理学记录(例如，直接测量神经元例如抑制性中间神经元的电活性)进行。c-Fos水平的下降将会指示，已经实现了抑制性中间神经元兴奋性的降低。用于执行例如神经元中的电生理学记录的方法在Du C.,et al.ASC Biomater.Sci.Eng.2017,3(10),pp 2235-2246中进一步回顾，该文献通过引用而以其整体并入本文。
此外，本文描述了编码Kir2.1D的表达载体，其用于在抑制性中间神经元中表达Kir2.1以降低抑制性中间神经元的兴奋性。例如，如果表达载体在给药时增加细胞中Kir2.1的存在、量、活性和/或水平，则认为该表达载体对于表达Kir2.1是有效的。在一个实施方案中，与适宜的对照物相比，Kir2.1的表达将抑制性中间神经元的兴奋性降低至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90、至少99％或更高。如本文中所用，在本语境中，适宜的对照物是指以其他方式与未经处理的抑制性中间神经元相同的群体。技术人员可使用本文所述的技术例如分别用以评估Kir2.1蛋白或mRNA水平的免疫印迹法或基于PCR的测定法来测量Kir2.1的水平。技术人员可如上文所述测量抑制剂中间神经元的兴奋性。
药剂可抑制例如细胞中NKCC的转录或转译。药剂可抑制或改变细胞中NKCC的活性(例如，NKCC的表达)(例如，使得该活性不在出现或出现率降低)。
药剂可增加例如细胞中KCC2、Gi-DREADD或Kir2.1的转录或转译。药剂可增加或改变例如细胞中KCC2、Gi-DREADD或Kir2.1的活性(例如，KCC2、Gi-DREADD或Kir2.1的表达)(例如，使得该活性更频繁地出现或出现率增加)。
药剂可以其被给药的形式直接发挥功能。另选地，药剂可经修饰或在细胞内使用以产生一些物质，该物质例如上调KCC2、Gi-DREADD或Kir2.1或者抑制NKCC，诸如将核酸序列引入细胞中，并且其转录导致例如在该细胞内产生NKCC的核酸和/或蛋白抑制剂或上调KCC2、Gi-DREADD或Kir2.1的核酸和/或蛋白质。在一些实施方案中，药剂是任何化学实体或部分，包括而不限于合成的和天然存在的非蛋白性实体。在某些实施方案中，药剂是具有化学部分的小分子。例如，化学部分包括未取代或取代的烷基、芳族或杂环基部分，包括大环内酯、莱普霉素(leptomycin)和相关的天然产物或其类似物。药剂可已知具有所希望的活性和/或特性，或可从多种化合物的文库中鉴定。
在多个实施方案中，药剂是上调KCC2或抑制NKCC的小分子。筛选小分子的方法是本领域中已知的，并且可用于鉴定小分子，该小分子对于例如在给定的所希望靶标(例如，KCC2或NKCC)下诱导致病性CD4细胞的细胞死亡是有效的。
在多个实施方案中，抑制NKCC的药剂是抗体或其抗原结合片段，或是对于NKCC为特异性的抗体试剂。如本文中所用，术语“抗体试剂”是指一种多肽，其包括至少一个免疫球蛋白可变结构域或免疫球蛋白可变结构域序列并且特异性地结合给定抗原。抗体试剂可包含具有抗体的抗原结合结构域的抗体或多肽。在任何方面的一些实施方案中，抗体试剂可包含具有单克隆抗体的抗原结合结构域的单克隆抗体或多肽。例如，抗体可包括重(H)链可变区(本文中简写为VH)和轻(L)链可变区(本文中简写为VL)。在另一个示例中，抗体包括两个重(H)链可变区和两个轻(L)链可变区。术语“抗体试剂”涵盖抗体的抗原结合片段(例如，单链抗体、Fab片段和sFab片段、F(ab')2、Fd片段、Fv片段、scFv、CDR和结构域抗体(dAb)片段(参见，例如，de Wildt et al.,Eur J.Immunol.1996；26(3):629-39，该文献通过引用而以其整体并入本文))以及完整抗体。抗体可具有IgA、IgG、IgE、IgD或IgM的结构特征(以及其亚型和组合)。抗体可来自任何来源，包括小鼠、兔、猪、大鼠和灵长动物(人类和非人灵长动物)以及人源化抗体。抗体也包括中间抗体、纳米抗体、人源化抗体、嵌合抗体等。
NKCC是反义寡核苷酸。如本文中所用，“反义寡核苷酸”是指合成的核苷酸序列，其与DNA或mRNA序列诸如microRNA的序列互补。反义寡核苷酸通常设计为通过结合至DNA或RNA靶标并将表达截止在转录、转译或剪接的水平上而阻断该靶标的表达。本发明的反义寡核苷酸与被设计成在细胞条件下与基因杂交的核酸例如NKCC互补。因此，选择与靶标足够互补(即，杂交足够充分)并且在细胞微环境情境下具有足够特异性的寡核苷酸，以给出所希望的效果。例如，抑制NKCC的反义寡核苷酸可包含至少5个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个或更多个与人NKCC基因编码序列(例如，SEQ ID NO:4)的一部分互补的碱基。
SEQ ID NO:4是编码NKCC的核酸序列。
Figure BDA0002909166630000251
Figure BDA0002909166630000261
在一个实施方案中，使用任何基因组编辑系统，将NKCC从细胞基因组中耗竭，或者将KCC2、本文所述的优化的Gi-DREAD或Kir2.1在细胞基因组中上调，该系统包括但不限于，锌指核酸酶、TALENS、归巢核酸内切酶(meganucleases)和CRISPR/Cas系统。在一个实施方案中，用来将编码一个或多个向导RNA的核酸并入细胞基因组中的基因组编辑系统不是CRISPR/Cas系统，这可能防止保留少量Cas酶/蛋白的细胞的不希望的细胞死亡。本文中还预期，Cas酶或sgRNA各自在不同诱导型启动子的控制下被表达，从而允许各自的瞬时表达以防止此类干扰。
当编码一种或多种sgRNA的核酸和编码RNA引导核酸内切酶的核酸各自需要体内给药时，特别考虑使用腺相关病毒(AAV)。用于将核酸同步递送至基因组编辑/片段化系统的两个组件(例如，sgRNA、RNA引导的核酸内切酶)的其他载体包括慢病毒载体，诸如EB病毒、人免疫缺陷病毒(HIV)和乙型肝炎病毒(HBV)。RNA引导的基因组编辑系统的每个组件(例如，sgRNA和核酸内切酶)可如本领域中已知的或如本文所述在独立的载体中递送。
在一个实施方案中，药剂通过RNA抑制(RNAi)来抑制NKCC。给定基因表达的抑制剂可以是抑制性核酸。在任何方面的一些实施方案中，抑制性核酸是抑制性RNA(iRNA)。RNAi可以是单链的或双链的。
iRNA可以是siRNA、shRNA、内源性microRNA(miRNA)或人工miRNA。在一个实施方案中，本文所述的iRNA影响对于靶标例如NKCC的表达和/或活性的抑制。在任何方面的一些实施方案中，药剂是抑制NKCC的siRNA。在任何方面的一些实施方案中，药剂是抑制NKCC的shRNA。
本领域技术人员将能够设计siRNA、shRNA或miRNA以靶向NKCC的核酸序列(例如，SEQ ID NO:4)，例如使用可公开获得的设计工具设计。siRNA、shRNA或miRNA一般由公司诸如Dharmacon(Layfayette,CO)或Sigma Aldrich(St.Louis,MO)生产。
在任何方面的一些实施方案中，iRNA可以是dsRNA。dsRNA包括两条RNA链，它们的互补性足以使得它们在dsRNA将要使用的条件下杂交以形成双链体结构。dsRNA的一条链(反义链)包括互补区域，该互补区域与靶标序列实质上互补并且通常完全互补。靶标序列可衍生自在靶标表达过程中形成的mRNA序列。另一条链(有义链)包括与反义链互补的区域，使得当两条链在合适条件下组合时杂交以形成双链体结构。
iRNA的RNA可经化学修饰以增强稳定性或其他有益特征。本发明提出的核酸可通过本领域中良好建立的方法诸如《核酸化学现代方法》(“Current protocols in nucleicacid chemistry,”Beaucage,S.L.et al.(Edrs.),John Wiley&Sons,Inc.,New York,NY,USA，该文献通过引用并入本文)中描述的那些来合成和/或修饰。
在一个实施方案中，药剂是抑制NKCC的miRNA。microRNA是平均长度为22个核苷酸的非编码小RNA。这些分子通过与mRNA分子内(通常在3′未转译(3′UTR)区域中)的互补序列结合而起作用，从而促进靶标mRNA降解或抑制mRNA转译。microRNA与mRNA之间的相互作用是由microRNA的被称为“种子序列”的6至8个核苷酸区域介导的，种子序列引导通过不完美Watson–Crick碱基配对进行的与mRNA的序列特异性结合。已知哺乳动物体内表达超过900种microRNA。这些microRNA中的许多被基于其种子序列归为不同家族，从而鉴别相似microRNA的“聚类”。miRNA可作为例如裸DNA表达在细胞中。miRNA可由例如作为裸DNA表达在细胞中的核酸编码，或可由包含在载体中的核酸编码。
药剂可导致靶标基因(例如，NKCC)的基因沉默，诸如使用RNAi分子(例如，siRNA或miRNA)进行。这意味着，相对于不存在药剂情况下见于细胞中的mRNA水平，靶标细胞中的mRNA水平降低至少约5％、约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％、约99％、约100％。在一个优选的实施方案中，mRNA水平被降低至少约70％、约80％、约90％、约95％、约99％、约100％。例如，通过将siRNA、shRNA或miRNA转染到细胞中并通过免疫印迹法检测见于该细胞内的基因(例如，NKCC)的水平，该领域技术人员将能够轻易地评估siRNA、shRNA或miRNA有效靶标(例如，NKCC)是否下调。
药剂可包含在载体中，并因此进一步包括载体。很多此类可用于将外源性基因转染到靶标哺乳动物细胞内的载体是可获得的。载体颗粒是附加型载体例如质粒，源自病毒的载体诸如巨细胞病毒、腺病毒等，或可通过同源重组或随机整合而整合至靶标细胞基因组中，例如源自逆转录病毒的载体诸如MMLV、HIV-1、ALV等。在一些实施方案中，也可使用逆转录病毒与适宜封装细胞系的组合，其中衣壳蛋白将发挥感染靶标细胞的功能。通常，将细胞和病毒在培养基中孵育至少约24小时。在一些应用中，然后领细胞在培养基中进行短时间的生长，例如24至73小时，或生长至少两周，并且可令其生长五周或更久，之后进行分析。常用的逆转录病毒载体是“缺陷性的”，即，不能产生生产性感染所需的病毒蛋白。载体的复制需要在封装细胞系中生长。
如本文中所用，术语“载体”是指被设计为用于递送至宿主细胞或在不同宿主细胞间转移的核酸构造体。如本文中所用，载体可以是病毒载体或非病毒载体。术语“载体”涵盖任何基因元件，该基因元件在与适宜控制元件缔合时能够进行复制，并且该基因元件可将基因序列转移到细胞。载体可包括但不限于，克隆载体、表达载体、质粒、噬菌体、转座子、粘粒、人工染色体、病毒、病毒粒子等。
如本文中所用，术语“表达载体”是指引导RNA或多肽(例如，KCC2、Gi-DREADD或Kir2.1)表达的载体，该RNA或多肽来自载体中包含的与载体上的转录调控序列链接的核酸序列。所表达的序列通常但不一定与细胞是异源的。表达载体可包含另外的元件，例如表达载体可具有两个复制系统，因此允许其被维持在两种生物体中，例如在人类细胞中用于表达以及在原核宿主中用于克隆和扩增。术语“表达”是指牵涉入产生RNA和蛋白质以及(若适宜)分泌蛋白质中的细胞过程，可用者包括但不限于，转录、转录本加工、转译以及蛋白质折叠、修饰和加工。“表达产物”包括从基因转录的RNA，以及通过转译从基因转录的mRNA获得的多肽。术语“基因”意为当与适宜的调控序列可操作地链接时在体外或体内被转录为RNA的核酸序列(DNA)。基因可包括或可不包括在编码区之前和之后的区域，例如，5’未转译(5’UTR)或“前导”序列和3’UTR或“尾随”序列，以及位于个体编码链段(外显子)之间的中间序列(内含子)。
整合型载体将其递送的RNA/DNA永久地并入宿主细胞染色体中。非整合型载体附加型，这意味着包含在其中的核酸永远不会被整合到宿主细胞染色体中。整合型载体的示例包括逆转录病毒载体、慢病毒载体、杂合腺病毒载体和单纯疱疹病毒载体。
非整合型载体的一个示例是非整合型病毒载体。非整合型病毒载体消除了整合型逆转录病毒所具备的风险，因为它们不将它们的基因组并入宿主DNA中。一个示例是EBoriP/核抗原-1(“EBNA1”)载体，其能够限制自我复制并且已知在哺乳动物细胞中发挥功能。由于含有来自EB病毒、oriP和EBNA1的两个元件，EBNA1蛋白与病毒复制子区域oriP的结合维持了质粒在哺乳动物细胞中的长期附加型存在。oriP/EBNA1自体的这一具体特征使得其成为用于生成无整合iPSC的理想选择。另一非整合型病毒载体是腺病毒载体和腺相关病毒(AAV)载体。
另一非整合型病毒载体是RNA仙台病毒载体，其可产生蛋白质而无需进入被感染细胞的细胞核。F基因缺失型仙台病毒载体在被感染细胞的细胞质中保留几代，但在数代(例如，10代)之后被迅速吸收并完全消失。
非整合型载体的另一示例是微环载体。微环载体是环状载体，其中质粒骨架已经被释放，仅留下了待表达的真核细胞启动子和cDNA。
在多个实施方案中，载体跨越了血脑屏障。在其他实施方案中，本文所述的任何药剂被配制为跨越血脑屏障。血脑屏障是高选择性半透膜屏障，其将循环血液与中枢神经系统(CNS)的脑细胞外流体分隔。对于需要递送至CNS的治疗剂，熟练的临床医师可直接将治疗剂递送至椎管。对于直接给药至椎管内，本文所述的化合物和组合物将由熟练的临床医师通过鞘内给药进行给药。鞘内给药是一种药物给药途径，使用该途径，药物被直接注射到椎管内或蛛网膜下腔内，使得其直接到达脑脊髓液(CSF)。其他经由鞘内给药进行给药的药物的非限制性示例是脊髓麻醉剂、化疗剂、疼痛管理药物和不能穿过血脑屏障的治疗剂。载体可与使得血脑屏障透化的至少一种第二药剂包封在一起。本领域技术人员可通过在给药之后确定是否在例如脊髓液中检测到载体而确定载体是否跨越了血脑屏障。
药物组合物
本文所述的组合物针对在治疗脊髓损伤中的用途。这些组合物的给药模式在下文中进一步描述。在多个实施方案中，本文所述的任何药物组合物还包含至少第二种治疗剂化合物。在一个实施方案中，第二种治疗剂化合物可用于治疗脊髓损伤。
本发明的一个方面提供一种药物组合物，其包含有效量的KCC2多肽或包含编码所述KCC2多肽的核酸序列的载体以及药学上可接受的载剂，用于治疗脊髓损伤。在一个实施方案中，KCC2多肽包含哺乳动物KCC2例如大鼠KCC2的核酸序列。
在一个实施方案中，KCC2多肽包含SEQ ID NO:1的序列。
SEQ ID NO:1是编码KCC2的核酸序列。
ATGCTCAACAACCTGACGGACTGCGAGGACGGCGATGGGGGAGCCAACCCGGGTGACGGCAATCCCAAGGAGAGCAGCCCCTTCATCAACAGCACGGACACGGAGAAGGGGAGAGAGTATGATGGCAGGAACATGGCCCTGTTTGAGGAGGAGATGGACACCAGCCCCATGGTATCCTCCCTGCTCAGTGGGCTGGCCAACTACACCAACCTGCCTCAGGGAAGCAAAGAGCACGAAGAAGCAGAAAACAATGAGGGCGGAAAGAAGAAGCCGGTGCAGGCCCCACGCATGGGCACCTTCATGGGCGTGTACCTCCCGTGCCTGCAGAACATCTTTGGTGTTATCCTCTTTCTGCGGCTCACTTGGGTGGTGGGAATCGCAGGCATCATGGAGTCCTTCTGCATGGTCTTCATCTGCTGCTCCTGCACGATGCTCACAGCCATTTCCATGAGCGCAATTGCAACCAATGGTGTTGTGCCTGCTGGTGGCTCCTACTACATGATTTCCAGGTCTCTGGGCCCGGAGTTTGGGGGCGCCGTGGGCCTCTGCTTCTACCTGGGCACTACCTTTGCTGGGGCTATGTACATCCTGGGCACCATCGAGATCCTGCTGGCTTACCTCTTCCCAGCGATGGCCATCTTCAAGGCAGAAGATGCCAGTGGGGAGGCAGCCGCCATGTTGAATAACATGCGGGTGTATGGCACCTGTGTGCTCACCTGCATGGCCACCGTAGTCTTTGTGGGCGTCAAGTACGTGAACAAGTTTGCCCTGGTCTTCCTGGGTTGCGTGATCCTCTCCATCCTGGCCATCTACGCAGGGGTCATCAAGTCTGCCTTCGATCCACCCAATTTCCCGATTTGCCTCCTGGGGAACCGCACGCTGTCTCGCCATGGCTTTGATGTCTGTGCCAAGCTGGCTTGGGAAGGAAATGAGACAGTGACCACACGGCTCTGGGGCCTATTCTGTTCCTCCCGCCTCCTCAATGCCACCTGTGATGAGTACTTCACCCGAAACAATGTCACAGAGATCCAGGGCATTCCTGGTGCTGCAAGTGGCCTCATCAAAGAGAACCTGTGGAGTTCCTACCTGACCAAGGGGGTGATCGTGGAGAGGCGTGGGATGCCCTCTGTGGGCCTGGCAGATGGTACCCCCGTTGACATGGACCACCCCTATGTCTTCAGTGATATGACCTCCTACTTCACCCTGCTTGTTGGCATCTATTTCCCCTCAGTCACAGGGATCATGGCTGGCTCGAACCGGTCCGGAGACCTGCGGGATGCCCAGAAGTCTATCCCTACTGGAACTATCTTGGCCATTGCTACGACCTCTGCTGTCTACATCAGCTCTGTTGTTCTGTTCGGAGCCTGCATCGAAGGGGTCGTCCTACGGGACAAGTTTGGGGAAGCTGTGAATGGCAATCTGGTGGTGGGCACCCTGGCCTGGCCTTCTCCTTGGGTCATTGTCATAGGCTCTTTCTTCTCTACCTGCGGAGCTGGACTACAGAGCCTCACAGGGGCCCCACGCCTGCTGCAGGCCATCTCCCGGGATGGCATAGTGCCCTTCCTGCAGGTCTTTGGCCATGGCAAAGCCAACGGAGAGCCAACCTGGGCGCTGCTGCTGACTGCCTGCATCTGTGAGATCGGCATCCTCATCGCCTCCCTGGATGAGGTCGCCCCTATCCTTTCCATGTTCTTCCTGATGTGTTACATGTTTGTGAACTTGGCTTGCGCGGTGCAGACACTGCTGAGGACGCCCAACTGGAGGCCACGCTTCCGATATTACCACTGGACCCTCTCCTTCCTGGGCATGAGCCTCTGCCTGGCCCTGATGTTCATTTGCTCCTGGTATTATGCGCTGGTAGCTATGCTCATCGCTGGCCTCATCTATAAGTACATCGAGTACCGGGGGGCAGAGAAGGAGTGGGGGGATGGGATCCGAGGCCTGTCTCTCAGTGCAGCTCGCTATGCTCTCTTGCGTCTGGAGGAAGGACCCCCGCATACAAAGAACTGGAGGCCCCAGCTACTGGTGCTGGTGCGTGTGGACCAGGACCAGAACGTGGTGCACCCGCAGCTGCTGTCCTTGACCTCCCAGCTCAAGGCAGGGAAGGGCCTGACCATTGTGGGCTCTGTCCTTGAGGGCACCTTTCTGGACAACCACCCTCAGGCTCAGCGGGCAGAGGAGTCTATCCGGCGCCTGATGGAGGCTGAGAAGGTGAAGGGCTTCTGCCAGGTAGTGATCTCCTCCAACCTGCGTGACGGTGTGTCCCACCTGATCCAATCCGGGGGCCTCGGGGGCCTGCAACACAACACTGTGCTAGTGGGCTGGCCTCGCAACTGGCGACAGAAGGAGGATCATCAGACATGGAGGAACTTCATCGAACTCGTCCGGGAAACTACAGCTGGCCACCTCGCCCTGCTGGTCACCAAGAATGTTTCCATGTTCCCCGGGAACCCTGAGCGTTTCTCTGAGGGCAGCATTGACGTGTGGTGGATCGTGCACGACGGGGGCATGCTCATGCTGTTGCCCTTCCTCCTGCGTCACCACAAGGTCTGGAGGAAATGCAAAATGCGGATCTTCACCGTGGCGCAGATGGATGACAACAGCATTCAGATGAAGAAAGACCTGACCACGTTTCTGTACCACTTACGAATTACTGCAGAGGTGGAAGTCGTGGAGATGCACGAGAGCGACATCTCAGCATACACCTACGAGAAGACATTGGTAATGGAACAACGTTCTCAGATCCTCAAACAGATGCACCTCACCAAGAACGAGCGGGAACGGGAGATCCAGAGCATCACAGATGAATCTCGGGGCTCCATTCGGAGGAAGAATCCAGCCAACACTCGGCTCCGCCTCAATGTTCCCGAAGAGACAGCTTGTGACAACGAGGAGAAGCCAGAAGAGGAGGTGCAGCTGATCCATGACCAGAGTGCTCCCAGCTGCCCTAGCAGCTCGCCGTCTCCAGGGGAGGAGCCTGAGGGGGAGGGGGAGACAGACCCAGAGAAGGTGCATCTCACCTGGACCAAGGATAAGTCAGCGGCTCAGAAGAACAAAGGCCCCAGTCCCGTCTCCTCGGAGGGGATCAAGGACTTCTTCAGCATGAAGCCGGAGTGGGAAAACTTGAACCAGTCCAACGTGCGGCGCATGCACACAGCTGTGCGGCTGAACGAGGTCATCGTGAATAAATCCCGGGATGCCAAGTTGGTGTTGCTCAACATGCCCGGGCCTCCCCGCAACCGCAATGGAGATGAAAACTACATGGAGTTCCTGGAGGTCCTCACTGAGCAACTGGACCGGGTGATGCTGGTCCGCGGTGGTGGCCGAGAGGTCATCACCATCTACTCCTGA(SEQ ID NO:1)
在一个实施方案中，KCC2多肽具有、包含以下氨基酸序列或由其组成或基本上由其组成，该氨基酸序列与SEQ ID NO:1具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更高的氨基酸序列一致性并且保留SEQ ID NO:1的KCC2生物学活性的至少80％。如本文中所述，KCC2的生物学活性是指但不限于，其介导钾和氯离子梯度的功能。
本发明的另一个方面提供一种药物组合物，其包含有效量的Gi-DREADD多肽或包含编码所述Gi-DREADD多肽的核酸序列的载体以及药学上可接受的载剂，用于治疗脊髓损伤。在一个实施方案中，Gi-DREADD多肽被优化用于在抑制性中间神经元中表达。在一个实施方案中，组合物还包含氯氮平N-氧化物。
在一个实施方案中，Gi-DREADD多肽包含SEQ ID NO:2的序列。
SEQ ID NO:2是编码优化的Gi-DREADD的核酸序列。
Figure BDA0002909166630000321
Figure BDA0002909166630000331
在任何方面的一个实施方案中，Gi-DREADD多肽具有、包含以下氨基酸序列或由其组成或基本上由其组成，该氨基酸序列与SEQ ID NO:2具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更高的氨基酸序列一致性并且保留SEQ ID NO:2的Gi-DREADD生物学活性的至少80％。
本发明的又一个方面提供一种药物组合物，其包含有效量的Kir2.1多肽或包含编码所述Kir2.1多肽的氨基酸序列的载体以及药学上可接受的载剂，用于治疗脊髓损伤。
在一个实施方案中，Kir2.1多肽包含SEQ ID NO:3的序列。
SEQ ID NO:3是编码人类Kir2.1多肽的氨基酸序列。
MGSVRTNRYSIVSSEEDGMKLATMAVANGFGNGKSKVHTRQQCRSRFVKKDGHCNVQFINVGEKGQRYLADIFTTCVDIRWRWMLVIFCLAFVLSWLFFGCVFWLIALLHGDLDASKEGKACVSEVNSFTAAFLFSIETQTTIGYGFRCVTDECPIAVFMVVFQSIVGCIIDAFIIGAVMAKMAKPKKRNETLVFSHNAVIAMRDGKLCLMWRVGNLRKSHLVEAHVRAQLLKSRITSEGEYIPLDQIDINVGFDSGIDRIFLVSPITIVHEIDEDSPLYDLSKQDIDNADFEIVVILEGMVEATAMTTQCRSSYLANEILWGHRYEPVLFEEKHYYKVDYSRFHKTYEVPNTPLCSARDLAEKKYILSNANSFCYENEVALTSKEEDDSENGVPESTSTDTPPDIDLHNQASVPLEPRPLRRESEI(SEQ ID NO:3)
在一个实施方案中，Kir2.1多肽具有、包含以下氨基酸序列或由其组成或基本上由其组成，该氨基酸序列与SEQ ID NO:3具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更高的氨基酸序列一致性并且保留SEQ ID NO:3的KCC2生物学活性的至少80％。
在一个实施方案中，Kir2.1多肽包含SEQ ID NO:5的序列。
SEQ ID NO:5是编码小鼠Kir2.1多肽的氨基酸序列。
MGSVRTNRYSIVSSEEDGMKLATMAVANGFGNGKSKVHTRQQCRSRFVKKDGHCNVQFINVGEKGQRYLADIFTTCVDIRWRWMLVIFCLAFVLSWLFFGCVFWLIALLHGDLDTSKVSKACVSEVNSFTAAFLFSIETQTTIGYGFRCVTDECPIAVFMVVFQSIVGCIIDAFIIGAVMAKMAKPKKRNETLVFSHNAVIAMRDGKLCLMWRVGNLRKSHLVEAHVRAQLLKSRITSEGEYIPLDQIDINVGFDSGIDRIFLVSPITIVHEIDEDSPLYDLSKQDIDNADFEIVVILEGMVEATAMTTQCRSSYLANEILWGHRYEPVLFEEKHYYKVDYSRFHKTYEVPNTPLCSARDLAEKKYILSNANSFCYENEVALTSKEEEEDSENGVPESTSTDSPPGIDLHNQASVPLEPRPLRRESEI(SEQ ID NO:5)
在一个实施方案中，Kir2.1多肽具有、包含以下氨基酸序列或由其组成或基本上由其组成，该氨基酸序列与SEQ ID NO:5具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更高的氨基酸序列一致性并且保留SEQ ID NO:5的KCC2生物学活性的至少80％。
本发明的另一个方面提供一种药物组合物，其包含有效量的如本文所述的抑制NKCC的任何药剂以及药学上可接受的载剂，用于治疗脊髓损伤。在任何方面的一个实施方案中，组合物还包含至少第二种治疗性化合物。
在一个实施方案中，组合物包含调节KCC2、NKCC、本文所述的优化Gi-DREAD、或Kir2.1的本文所述的任何药剂。
如本文中所用，术语“药学上可接受的”是指在健全医疗判断范畴内适用于与人类和动物的组织接触而无高毒性、刺激、过敏反应或其他问题或并发症，并且与合理的效益/风险比相称的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。
如本文中所用，术语“药学上可接受的载剂”意为药学上可接受的材料、组合物或媒介物，诸如液体或固体填充物、稀释剂、赋形剂、制造助剂(例如，润滑剂、滑石、硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸锌或硬脂酸)或溶剂胶囊化材料，其牵涉入将受试化合物从一个器官或身体的一部分携带或运输至另一器官或身体的另一部分。就与配方中其他成分可相容且不对患者造成伤害而言，每种载剂必须是“可接受的”。可用作药学上可接受的载剂的材料的一些示例包括但不限于：(1)糖类，诸如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉类，诸如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3)纤维素及其衍生物，诸如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、乙基纤维素、微晶纤维素和醋酸纤维素；(4)黄蓍粉；(5)麦芽；(6)明胶；(7)润滑剂，诸如硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠和滑石；(8)赋形剂，诸如可可脂和栓蜡；(9)油类，诸如花生油、棉籽油、葵花籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；(10)二醇类，诸如丙二醇；(11)多元醇类，诸如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇(PEG)；(12)酯类，诸如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，诸如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)海藻酸；(16)无热原水；(17)等张盐水；(18)Ringer溶液；(19)乙醇；(20)pH缓冲溶液；(21)聚酯类、聚碳酸酯类和/或聚酐类；(22)填充剂，诸如多肽和氨基酸；(23)血清组分，诸如血清白蛋白、HDL和LDL；(22)C2-C12醇类，诸如乙醇；和(23)其他用于药物制剂中的无毒相容物质。润湿剂、粘合剂、填充物、润滑剂、着色剂、崩解剂、释放剂、包覆剂、甜味剂、调味剂、芳香剂、防腐剂、水、盐溶液、醇类、抗氧化剂、聚乙二醇、明胶、乳糖、直链淀粉、硬脂酸镁、滑石、硅酸、黏性石蜡、羟甲基纤维素、聚乙烯基吡咯烷酮等也可以存在于制剂中。术语诸如“赋形剂”、“载剂”、“药学上可接受的载剂”等在本文中可互换地使用。
在本文所述的一个方面，本文所述的组合物还包含促成穿过血脑屏障的药剂。在一个实施方案中，药学上可接受的载剂促成穿过血脑屏障或具有穿过血脑屏障的能力。
给药
在一些实施方案中，本文所述的方法涉及治疗具有或被诊断为具有脊髓损伤的受试者，包括给药如本文所述的上调KCC2的药剂。在一些实施方案中，本文所述的方法涉及治疗具有或被诊断为具有脊髓损伤的受试者，包括给药如本文所述的抑制NKCC的药剂。在一些实施方案中，本文所述的方法涉及治疗具有或被诊断为具有脊髓损伤的受试者，包括给药如本文所述的上调Gi-DREADD的药剂。在一些实施方案中，本文所述的方法涉及治疗具有或被诊断为具有脊髓损伤的受试者，包括给药如本文所述的上调Kir2.1的药剂。具有脊髓损伤的受试者可由医师使用现有诊断病症的方法进行鉴定。脊髓损伤的以这一损伤为特征并且有助于诊断的症状和/或并发症是本领域中周知的，并且包括但不限于肢体活动性的丧失或降低。可能有助于诊断例如脊髓损伤的测试包括但不限于，x射线、MRI扫描或CT扫描。
可将本文所述的药剂(例如，上调KCC2、Gi-DREADD(例如本文所述的优化Gi-DREADD)或Kir2.1的药剂)或抑制NKCC的药剂)给药至具有或被诊断为具有脊髓损伤的受试者。在一些实施方案中，本文所述的方法包括给药有效量的药剂至受试者，以便减轻脊髓损伤的至少一种症状。如本文所用，“减轻”脊髓损伤的至少一种症状是减轻与脊髓损伤有关的任何病症或症状(例如，感觉或肢体移动性的丧失)。与未治疗的等同对照物比较，如通过任何标准技术所测，这一下降为至少5％、10％、20％、40％、50％、60％、80％、90％、95％、99％或更多。各种将本文所述药剂给药至受试者的手段是本领域技术人员已知的。在一个实施方案中，该药剂经系统性给药或局部给药(例如，至脊髓或脊髓上损伤位点处)。在一个实施方案中，该药剂经静脉给药。在一个实施方案中，该药剂连续地、间隔地或零星地给药。该药剂的给药途径可关于被递送药剂的类型(例如，抗体、小分子、RNAi)进行优化，并且可由熟练的从业者决定。
如本文所用，术语“有效量”是指可给药至具有或被诊断具有脊髓损伤的需要减轻脊髓损伤的至少一种或多种症状的受试者的药剂(例如，上调KCC2、Gi-DREADD或Kir2.1的药剂，或抑制NKCC的药剂)的量。因此，术语“治疗有效量”是指当给药至典型受试者时足以提供特定抗脊髓损伤效果的药剂的量。如本文所用，在各种情境中，有效量也将包括足以迟滞脊髓损伤症状发展、改变脊髓损伤症状进程(例如，减缓肢体感觉或移动性丧失进展)或逆转脊髓损伤症状(例如，恢复先前减少或丧失的肢体感觉或移动性)的药剂的量。因此，具体指定确切的“有效量”通常是行不通的。但对于任何给定情形，该领域技术人员可仅使用常规实验确定适宜的“有效量”。
在一个实施方案中，在脊髓损伤出现之后至少1分钟、至少2分钟、至少3分钟、至少4分钟、至少5分钟、至少10分钟、至少15分钟、至少20分钟、至少25分钟、至少30分钟、至少35分钟、至少40分钟、至少45分钟、至少50分钟、至少55分钟、至少1小时、至少2小时、至少3小时、至少4小时、至少5小时、至少6小时、至少12小时、至少18小时、至少24小时、至少36小时、至少48小时、至少60小时、至少72小时、至少96小时、至少5天、至少6天、至少1周、至少2周、至少3周、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少7个月、至少8个月、至少9个月、至少10个月、至少11个月、至少12个月、至少2年、至少3年、至少4年、或至少5年或更长时间内，给药该药剂。
在一个实施方案中，该药剂可以约0.001至25mg/kg体重、或约0.005至8mg/kg体重、或约0.01至6mg/kg体重、或约0.1 to 0.2mg/kg体重、或约1至2mg/kg体重的量使用。在一些实施方案中，该药剂可以约0.1至1000μg/kg体重、或约1至100μg/kg体重、或约10至50μg/kg体重的量使用。在一个实施方案中，该药剂以0.01μg至15mg/kg体重每剂范围内的量使用，例如，10、1、0.1、0.01、0.001或0.00001mg/kg体重每剂。
可通过标准药学过程在细胞培养物或实验动物中评估有效量、毒性和疗效。剂量可依据所采用的剂型和所使用的给药途径而变。毒性与疗效之间的加量比率是治疗指数，其可表达为LD50/ED50比。表现出大治疗系数的组合物和方法是优选。最初，可以从细胞培养物测定中评估治疗有效剂量。而且，可在动物模型中制定实现循环血浆浓度范围的剂量，该范围包括如在细胞培养物或适宜的动物模型中测得的IC50(即，实现对症状的半最大抑制的药剂浓度)。举例而言，可通过高效液相色谱测量血浆中的水平。任何具体剂量的效果可通过合适的生物测定(例如，测量肢体活动性、测量条件反射等)来监控。医师可确定剂量并根据需要进行调节，以适应所观察到的治疗结果。
剂量
如本文所用，术语“单位剂型”是指适用于一次给药的剂量。举例而言，单位剂型可以是放置在递送装置例如注射器或静脉输液袋中的治疗剂的量。在一个实施方案中，单位剂型在一次给药中给药。在另一个实施方案中，可同步给药超过一个单位剂型。
医师可确定本文所述药剂的剂量并根据需要进行调节，以适应所观察到的治疗结果。关于治疗的持续时间和频率，熟练的临床医师通常监控受试者，以便确定治疗何时提供治疗有益效果，并且确定是否给药其他细胞、中断治疗、重新开始治疗或对治疗方案作出其他变动。剂量不应大到造成毒副作用，诸如细胞因子释放综合征。通常，剂量将根据患者的年龄、健康状况和性别而变，并且可由本领域技术人员决定。在存在任何并发症的事件中，剂量也可由医师个人进行调节。
联合疗法
在一个实施方案中，本文所述的药剂用作单一疗法。在一个实施方案中，本文所述药剂可与其他用于脊髓损伤的已知药剂和疗法联合。如本文所用，“联合”给药意为在受试者受到损伤折磨期间将两种(或更多种)不同的治疗递送至受试者，例如，在受试者已经被诊断为具有损伤之后或在损伤被治愈或消除之前或已经出于其他原因而终止治疗之前，递送两种或更多种治疗。在一些实施方案中，一种用于治疗在第二种治疗开始递送时仍在继续，使得就给药层面而言存在重叠。这在本文中有时称为“同步”、“基本上同时”或“并行递送”。在其他实施方案中，一种用于治疗在另一种用于治疗开始递送之前结束。在每种情况的一些实施方案中，治疗因为联合给药而更有效。例如，第二种治疗更有效，例如，使用较少的第二种治疗见到等同的效果，或第二种治疗以比在不存在第一种用于治疗的情况下进行第二种治疗所见者更大程度地减少症状，或使用第一种用于治疗见到了类似情况。在一些实施方案中，与在不存在一种用于治疗的情况下使用另一种用于治疗所观察者相比，递送使得症状或其他与损伤有关的因素减少得更多。两种治疗的效果可部分相加、完全相加或大于相加。递送可以使得当第二种治疗被递送时，仍可检测到第一种治疗的效果。本文所述的药剂和至少一种另外的疗法可同步给药、在相同或独立的组合物中给药或依次给药。对于依次给药，本文所述的药剂可首先给药，而另外的药剂可在第二顺位给药，或者给药次序可以相反。该药剂可在另一治疗之前给药，与病变的治疗并行给药，在治疗后给药，或在病变缓解过程中给药。
目前用来治疗脊髓损伤的治疗包括但不限于，物理疗法、电刺激、手术虚浮受损的脊髓、干细胞疗法、高压氧疗法。用来治疗脊髓损伤的药物治疗包括但不限于，皮质类固醇(例如，地塞米松和甲基泼尼松龙)、神经节苷脂、替拉扎特(Tirilazad)、纳洛酮。
可与本文所述药剂一起给药的另外的化合物包括但不限于轴突再生启动子(诸如骨桥蛋白和生长因子)和4-氨基吡啶。
骨桥蛋白，也称为骨涎蛋白I(BSP-1或BNSP)、早期T淋巴细胞活化因子(ETA-1)、分泌型焦磷酸蛋白1(SPP1)、2ar和立克次氏体抗性蛋白(Ric)，由分泌型焦磷酸蛋白1(SPP1)基因编码。骨桥蛋白在例如骨内被表达并且起到作为细胞外结构蛋白的作用。大量物种的骨桥蛋白序列(OPN)是本领域已知的，例如，人骨桥蛋白(NCBI基因ID：6696)多肽(例如，NCBI Ref Seq NP_000573.1)和mRNA(例如，NCBI Ref Seq NM_000582.2)。骨桥蛋白可以指人骨桥蛋白，包括其然存在的变体、分子和等位基因。骨桥蛋白是指哺乳动物例如小鼠、大鼠、兔、狗、猫、牛、马、猪等的骨桥蛋白。骨桥蛋白的给药在例如国际专利申请号WO/1999033415、US2004/0142865和WO/2003046135以及美国专利申请号US11/936,623或美国专利号6,686,444或5,695,761中有所描述，上述文献各自通过引用而以其整体并入本文。
4-氨基吡啶是一种处方肌肉强化剂，本领域中也称为C5H4N–NH2，并且具有以下结构：
Figure BDA0002909166630000391
当联合给药时，该药剂和另外的药剂(例如，第二药剂或第三药剂)或全部可以高于、低于每一药剂例如作为单一疗法而个体使用时的量或剂量或与其相同的量或剂量给药。在某些实施方案中，该药剂和另外的药剂(例如，第二药剂或第三药剂)的给药量或剂量比每种药剂个体使用的量或剂量低(例如，至少20％、至少30％、至少40％或至少50％)。在其他实施方案中，该药剂和另外的药剂(例如，第二药剂或第三药剂)的导致所希望效果(例如，治疗脊髓损伤)的给药量或剂量比个体使用每种药剂以实现相同疗效的量或剂量低(例如，低至少20％、至少30％、至少40％或至少50％)。
胃肠外剂型
本文所述药剂的胃肠外急性可通过各种途径给药至受试者，包括但不限于，硬膜外注射、皮下注射、静脉注射(包括快速注射)、肌肉注射和动脉注射。由于胃肠外剂型的给药通常绕过患者对污染物的天然防御，胃肠外剂型优选是无菌的或能够在给药至患者之前无菌化。胃肠外剂型的示例包括但不限于，即用型注射溶液、待溶解或悬浮于药学上可接受的注射用媒介物中的干燥产品、即用型注射悬浮液、控释型胃肠外型和乳液。
可用于提供本公开的胃肠外剂型的合适媒介物是本领域技术人员周知的。示例包括而不限于：无菌水；注射用水USP；盐水溶液；葡萄糖溶液；水性媒介物，诸如但不限于，氯化钠注射液、Ringer注射液、右旋葡萄糖注射液、右旋葡萄糖和氯化钠注射液、以及乳酸化Ringer注射液；可与水混溶的媒介物，诸如但不限于，乙醇、聚乙二醇和丙二醇；以及非水性媒介物，诸如但不限于，玉米油、棉籽油、花生油、芝麻油、油酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯和苯甲酸苄酯。
控制释放剂型和延迟释放剂型
在本文所述方面的一些实施方案中，通过控制释放或延迟释放手段将药剂给药至受试者。理想情况下，优化设计的控制释放制剂在医学治疗中的用途的特征在于，采用最少量的药物在最短时间内治愈或控制病症。控制释放制剂的优势包括：1)药物活性拓展；2)施药频率减少；3)患者依从性增加；4)使用的总药物量更少；5)局部或系统性副作用减少；6)药物蓄积程度最小；7)血液水平波动收窄；8)治疗功效改善；9)药物活性势差现象或损失减少；和10)对疾病或病症的控制速度改善。(Kim,Cherng-ju,Controlled Release DosageForm Design,2(Technomic Publishing,Lancaster,Pa.:2000))。控制释放制剂可用于控制式(I)化合物的作用启动、作用持续时间、治疗窗口内的血浆水平和峰值血液水平。具体地，控制释放或延迟释放剂型或制剂可用来确保实现药剂的最大有效性，同时最小化潜在的副作用和安全问题，这些副作用和安全问题可能是由于投药不足(即，低于最小治疗水平)或者是由于超过了药物的毒性水平。
多种已知的控制释放或延迟释放剂型、制剂和装置可适用于使用本文所述的药剂。示例包括但不限于，在通过引用而以其整体并入本文的美国专利3,845,770、3,916,899、3,536,809、3,598,123、4,008,719、5674,533、5,059,595、5,591,767、5,120,548、5,073,543、5,639,476、5,354,556、5,733,566和6,365,185中描述的那些。使用例如羟丙基甲基纤维素、其他聚合物基质、凝胶、渗透膜、渗透系统(诸如
Figure BDA0002909166630000411
(Alza Corporation,Mountain View,Calif.USA))、多层涂层、微粒、脂质体或微球或其组合，这些剂型可用于提供一种或多种活性成分的缓释或控释。此外，离子交换材料可用来制备固定化的吸附盐形式的所公开化合物，并因此影响药物的控制递送。特异性阴离子交换剂的示例包括但不限于，
Figure BDA0002909166630000412
A568和
Figure BDA0002909166630000413
AP143(Rohm&Haas,Spring House,Pa.USA)。
功效
本文所述药剂的例如用于治疗脊髓损伤的功效，可由熟练的从业人员确定。然而，如果在根据本文所述方法进行治疗之后，脊髓损伤的一种或多种征兆或症状被以有益的改变，其他临床上接受的症状得以改善甚至减轻，或诱导例如至少10％的所希望响应，则该治疗视为“有效治疗”，如该术语在本文中所用。例如，可通过测量根据本文所述方法治疗的损伤的标记物、指标、症状和/或发病率或者任何其他可测量的适宜参数例如肢体感觉和/或移动性来评估功效。也可通过住院评估为个体没有恶化，或需要进行医学干预(即，肢体失去感觉或移动性的进展)，从而测量功效。测量这些指标的方法是本领域技术人员已知的和/或如本文所述。
可在本文所述病症的动物模型例如小鼠模型中或适宜的脊髓损伤动物模型中评估功效，视情况而定。当使用实验动物模型时，当观察到统计学显著的变化例如肢体在移动性丧失后的移动性增加时，证明治疗的功效。
鉴定的全部专利、专利申请和出版物通过引用而出于描述和公开的目的明确并入本文，例如，此类出版物中描述的方法可与本发明关联使用。这些出版物仅提供其在本申请提交日期之前的公开内容。就这一点而言，任何内容都不应被解释为承认，由于先前的发明或任何其他原因，发明人无权提前进行此类披露。关于这些文件内容的日期或陈述的所有声明均基于申请人可获得的信息，并不构成对这些文件日期或内容正确性的任何承认。
本发明可由以下标号段落中的任一项界定：
1)一种用于治疗脊柱损伤的方法，包括向具有脊柱损伤的受试者给药有效量的上调神经元特异性K+-Cl-协同转运蛋白(KCC2)的药剂。
2)根据段落1所述的方法，其中上调KCC2的药剂是选自由小分子、肽、基因标记系统和编码KCC2的表达载体所组成的群组。
3)根据前述段落中任一者所述的方法，其中小分子是CLP290。
4)根据前述段落中任一者所述的方法，其中载体是非整合型的或整合型的。
5)根据前述段落中任一者所述的方法，其中载体是病毒载体或非病毒载体。
6)根据前述段落中任一者所述的方法，其中非整合型载体是选自由附加型载体、EBNA1载体、微环载体、非整合型腺病毒、非整合型RNA和仙台病毒所组成的群组。
7)根据前述段落中任一者所述的方法，其中病毒载体是选自由逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、疱疹病毒、痘病毒、α病毒、牛痘病毒和腺相关病毒所组成的群组。
8)根据前述段落中任一者所述的方法，其中非病毒载体是选自由纳米颗粒、阳离子脂质、阳离子聚合物、金属纳米颗粒、纳米棒、脂质体、微泡、细胞渗透肽和脂质球所组成的群组。
9)根据前述段落中任一者所述的方法，其中载体跨越血脑屏障。
10)根据前述段落中任一者所述的方法，其中，与适宜的对照物相比，KCC2被上调至少2倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍。
11)根据前述段落中任一者所述的方法，其中脊柱损伤是重度脊髓损伤。
12)根据前述段落中任一者所述的方法，其中受试者是人。
13)根据前述段落中任一项所述的方法，其中受试者被诊断为具有脊柱损伤。
14)根据前述段落中任一项所述的方法，其中受试者先前已经进行脊柱损伤治疗。
15)根据前述段落中任一项所述的方法，其中在给药之前，受试者被诊断为具有脊髓损伤。
16)根据前述段落中任一项所述的方法，其中受试者还被施予至少第二种脊柱损伤治疗。
17)根据前述段落中任一项所述的方法，其中受试者还被给药至少第二种治疗性化合物。
18)根据前述段落中任一项所述的方法，其中所述第二种治疗性化合物是选自由骨桥蛋白、生长因子或4-胺基吡啶所组成的群组。
19)一种用于治疗脊柱损伤的方法，包括向具有脊柱损伤的受试者给药有效量的抑制Na+/2Cl-/K+-协同转运蛋白(NKCC)的药剂。
20)根据段落19所述的方法，其中所述抑制NKCC的药剂是选自由小分子、抗体、肽、反义寡核苷酸和RNAi所组成的群组。
21)根据前述段落中任一项所述的方法，其中所述RNAi是microRNA、siRNA或shRNA。
22)根据前述段落中任一者所述的方法，其中所述小分子是布美他尼。
23)根据前述段落中任一项所述的方法，其中所述药剂包含在载体中。
24)一种用于治疗脊柱损伤的方法，包括向具有脊柱损伤的受试者给药有效量的降低抑制性中间神经元兴奋性的药剂。
25)根据前述段落中任一项所述的方法，其中所述药剂上调抑制性Gi偶联受体Gi-DREADD。
26)根据前述段落中任一项所述的方法，其中所述药剂是编码Gi-DREADD的载体。
27)根据前述段落中任一项所述的方法，其中所述药剂是编码Kir2.1的载体。
28)根据前述段落中任一项所述的方法，还包括在与所述药剂基本上相同的时间给药氯氮平N-氧化物。
29)根据前述段落中任一者所述的方法，其中所述载体跨越血脑屏障。
30)根据前述段落中任一项所述的方法，其中与适宜的对照物相比，所述抑制性中间神经元的兴奋性被降低至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90、至少99％或更高。
31)根据前述段落中任一项所述的方法，其中在给药之前，所述受试者被诊断为具有脊髓损伤。
32)根据前述段落中任一项所述的方法，其中所述受试者被施予至少第二种脊柱损伤治疗。
33)一种用于治疗脊柱损伤的方法，包括向具有脊柱损伤的受试者给药有效量的降低抑制性中间神经元兴奋性的电刺激。
34)根据前述段落中任一项所述的方法，还包括在与所述药剂基本上相同的时间给药氯氮平N-氧化物。
35)根据前述段落中任一项所述的方法，其中电刺激直接施加到脊髓。
36)根据前述段落中任一项所述的方法，其中电刺激直接施加到脊髓的损伤位点。
37)根据前述段落中任一项所述的方法，其中与适宜的对照物相比，所述抑制性中间神经元的兴奋性被降低至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90、至少99％或更高。
38)根据前述段落中任一项所述的方法，其中在给药之前，所述受试者被诊断为具有脊髓损伤。
39)根据前述段落中任一项所述的方法，其中所述受试者被施予至少第二种脊柱损伤治疗。
40)一种药物组合物，其包含有效量的KCC2多肽或包含编码所述KCC2多肽的核酸序列的载体以及药学上可接受的载剂，用于治疗脊髓损伤。
41)根据前述段落中任一项所述的药物组合物，其中所述KCC2多肽包含SEQ IDNO:1的序列。
42)根据前述段落中任一项所述的药物组合物，其中所述KCC2多肽与SEQ ID NO:1具有至少95％的氨基酸序列一致性并且保留SEQ ID NO:1的KCC2生物活性的至少80％。
43)根据前述段落中任一项所述的药物组合物，还包含至少第二种治疗性化合物。
44)一种药物组合物，其包含有效量的Gi-DREADD多肽或包含编码所述Gi-DREADD多肽的核酸序列的载体以及药学上可接受的载剂，用于治疗脊髓损伤。
45)根据前述段落中任一项所述的药物组合物，其中所述Gi-DREADD多肽是优化的Gi-DREADD多肽。
46)根据前述段落中任一项所述的药物组合物，其中所述Gi-DREADD多肽包含SEQID NO:2的序列。
47)根据前述段落中任一项所述的药物组合物，其中所述Gi-DREADD多肽与SEQ IDNO:2具有至少95％的氨基酸序列一致性并且保留SEQ ID NO:2的Gi-DREADD生物活性的至少80％。
48)根据前述段落中任一项所述的药物组合物，还包含氯氮平N-氧化物。
49)根据前述段落中任一项所述的药物组合物，还包含至少第二种治疗性化合物。
50)一种药物组合物，其包含有效量的Kir2.1多肽或包含编码所述Kir2.1多肽的核酸序列的载体以及药学上可接受的载剂，用于治疗脊髓损伤。
51)根据前述段落中任一项所述的药物组合物，其中所述Kir2.1多肽包含SEQ IDNO:3的序列。
52)根据前述段落中任一项所述的药物组合物，其中所述Kir2.12多肽与SEQ IDNO:3具有至少95％的氨基酸序列一致性并且保留SEQ ID NO:3的Kir2.1生物活性的至少80％。
53)根据前述段落中任一项所述的药物组合物，还包含氯氮平N-氧化物。
54)根据前述段落中任一项所述的药物组合物，还包含至少第二种治疗性化合物。
55)一种药物组合物，其包含有效量的根据段落19至21所述的药剂以及药学上可接受的载剂，用于治疗脊髓损伤。
56)根据前述段落中任一项所述的药物组合物，还包含至少第二种治疗性化合物。
57)一种用于治疗脊柱损伤的方法，包括向具有脊柱损伤的受试者给药有效量的CLP290。
58)根据前述段落中任一者所述的方法，其中CLP290跨越血脑屏障。
59)根据前述段落中任一者所述的方法，其中所述脊柱损伤是重度脊髓损伤。
60)根据前述段落中任一者所述的方法，其中受试者是人。
61)根据前述段落中任一项所述的方法，其中受试者被诊断为具有脊柱损伤。
62)根据前述段落中任一项所述的方法，其中受试者先前已经进行脊柱损伤治疗。
63)根据前述段落中任一项所述的方法，其中在给药之前，受试者被诊断为具有脊髓损伤。
64)根据前述段落中任一项所述的方法，其中受试者还被施予至少第二种脊柱损伤治疗。
65)根据前述段落中任一项所述的方法，其中受试者还被给药至少第二种治疗性化合物。
66)根据前述段落中任一项所述的方法，其中第二种治疗性化合物是选自由骨桥蛋白、生长因子或4-胺基吡啶所组成的群组。
实施例
介绍
大多数的人脊髓损伤(SCI)在解剖学上是不完整的，在受损的脊髓段上有备用的轴突。但是，这些患者中有大约一半在损伤水平以下完全丧失了肌肉控制和感觉(Fawcettet al.,2007；Kakulas,1999)，表明备用连接在功能上处于休眠状态。值得注意的是，最近的研究已经证明，硬膜外刺激与康复训练结合使得一些具有SCI的长期瘫痪患者重获自主活动的能力(Angeli et al.,2014；Harkema et al.,2011)。一种假设的机制是，这些操控重新激活了此类休眠的脊髓回路，使得脑源性信号能够被中继至脊髓。但是，尚不清楚这一备用的脊髓回路为何在SCI后功能不全以及如何将其最好地重新激活。
在后肢功能的情况下，执行基本运动的脊髓中心，即中心模式发生器(CPG)，主要位于腰椎中(Frigon and Rossignol,2008；Gerasimenko et al.,2008；Grillner andWallen,1985；Kiehn,2016)。使用从新生动物分离的脊髓进行的经典研究显示，对神经元兴奋性的药物操纵可启动并调节传出模式(Cazalets et al.,1992；Cowley and Schmidt,1995；Kiehn,2006)。在完整动物中，腰椎运动中枢的输出部分地受控于俩字大脑的下行命令。通过SCI剥夺这些输入之后，即使感觉传入是完整的，但腰椎脊髓仍不能启动运动功能。为了在SCI之后恢复功能，重建下行输入与腰椎脊髓之间的联系至关重要。例如，SCI之后，代偿性轴突再生长和突触重组可提升不同脊柱水平处的此类联系(Ballermann andFouad,2006；Bareyre et al.,2004；Courtine et al.,2008；Filous and Schwab,2017；Heand Jin,2016；Jankowska and Edgley,2006；Rosenzweig et al.,2010；Takeoka et al.,2014；van den Brand et al.,2012；Zaporozhets et al.,2011)。在其中大多数下行脊髓投射通路受损的重度脊髓损伤中，由局限于单个脊椎节段内的局部中间神经元组成并且投射其轴突跨越多个脊椎节段的固有神经元的脊髓内神经网络的衔接，可作为间接中继通路以接受脑源性运动命令并将其中继到腰椎脊髓(O'Shea et al.,2017；Zaporozhets etal.,2011)。
已经提出不同的假说来解释为什么备用连接在SCI之后的代偿能力有限。例如，具有备用下行轴突的神经元的放电和传导性质可能被破坏(Edgerton et al.,2008；Arvanian et al.,2009；Sawada et al.,2015)。另选地，损伤可能造成具备脊髓回路功能丧失，使得它们可能不在能够中继或整合备用的下行输入(Courtine et al.,2008；Edgerton et al.,2008；Rossignol and Frigon,2011)。这些和其他因素的贡献仍待表征。此外，甚至尚不明确抑制或提升备用脊髓神经元的兴奋性是否将会有益于SCI之后的功能恢复。
在表征调节神经元兴奋性的细胞和分子机制方面已经取得了显著进展。因此，开发了大量小分子化合物以靶向关键调节因子，诸如铁通道和受体，并且它们的药理学性质已经得以良好表征。重要的是，这些化合物中很多可以有效地跨越血脑屏障(BBB)，这使得这些小分子可以进行系统性给药以分析其在SCI动物模型中的效果。因此，本文呈现了无偏化合物筛选方法，用以鉴定能够在SCI模型中重新激活休眠的脊髓回路并最终介导功能恢复的神经元活性调节剂。
结果
CLP290恢复了具有交错损害的瘫痪小鼠的持续脚站立能力。
优化了交错损害范例，其中在胸椎(T)7和T10水平同步执行两侧半横断术(图1A和1B)，与先前所述模型类似(Courtine 2008；van den Brand,2012)。T10损害是在脊髓中线截止的侧半横断术，而T7损害位于T10损害的相对侧，延伸略超过中线(图1A)。执行这一双重半横断术过程后，经过T10的所有下行轴突全被截断，仅留下T7与T10之间的跨越中线的下行轴突完好无损(图1C)。事实上，通过标记羟色胺能轴突的抗5-HT抗体进行的免疫组化，在位于损害之间的脊髓段中检测到了下行羟色胺能轴突，而在腰椎脊髓中则检测不到(图1C)。因此，损害(T7和T10)之间和附近保留了中继区域，在该处，下行轴突终止，但其中一部分神经元维持它们与腰椎脊髓神经元的连接(见下文)。
具有这种交错损害的小鼠表现出近乎完全且永久的后肢瘫痪(图1E和1F)。在损伤之后的10周内，受损小鼠罕有显示踝关节移动，并且从未展示任何类型的脚站立，后肢运动功能(Basso Mouse Scale(BMS)，一种已建立的开放场域运动测试)评分为0.5或1(Bassoet al.,2006)。因此，T7和T10之间的备用中继通路肯定保留在休眠状态。
通过在地上运动过程中监控后肢运动效能，使用这一双半横断SCI模型来寻找将会与备用但休眠的脊髓连接反应的小分子化合物。有鉴于此，在损伤之后1周开始每天进行化合物治疗，然后每周都监控在前一天进行化合物治疗之后大约24小时的BMS评分(图1D)。在这些时间段观察到的行为结局似乎反应了治疗的持续效果，这更具临床相关性。
基于备选化合物在进行全身递送时调节神经元兴奋性的能力而选择化合物。它们包括：巴氯芬，GABA受体激动剂；布美他尼，Na+/2Cl-/K+协同转运蛋白(NKCC)抑制剂；CLP290，神经元特异性K+-Cl-协同转运蛋白(KCC2)激动剂；，也称为SLC12A5；L838,417，GABAA阳性别构调节剂；CP101606，NMDAt受体拮抗剂；8-OHDPAT，5HT1A/7激动剂；和喹嗪，5HT2A/C激动剂(图1E、7A)。这些治疗中的一种在每天进行治疗之后的前2至3周内导致脚站立能力的显著改善。然而，在经CLP290治疗的小鼠中，功能恢复最早在治疗后4至5周出现，并且从第7周开始变明显(图1E)。布美他尼也显示了一些效果，但不具有统计学显著性(图7A)。因此，进一步的分析聚焦在CLP290治疗的SCI小鼠上。
与对照小鼠和经其他化合物治疗的主要表现为后置瘫痪的小鼠相比，经CLP290治疗的小鼠大多数(80％)都恢复了一致的后爪脚掌放置和负重脚站立(大多数脚背站立，一些脚掌站立；图1F)。这种程度的恢复在功能上有重大意义，因为脚站立已经被视为重度损伤模型中功能恢复的限制性步骤(Schucht et al.,2002)。在脚站立过程中，经CLP290治疗的小鼠将会部分地支持其体重，并表现出显著增加的后肢关节摆动(图1H至1K)。通过在对照受损小鼠中记录的肌电图(EMG)(图1K)，发现踝关节胫前屈肌(TA)很少活动，而从未观察到腓肠肌比目鱼肌伸肌(GS)的活动。相比之下，CLP290治疗的小鼠显示了TA活动和GS活动两者(图1K)。因此，经CLP290治疗的小鼠的后肢总步幅显著增加(图1J)。有趣的是，与在脚站立步态过程中TA(摆动阶段)和GS(站立阶段)交替激活的完整小鼠不同，经CLP290治疗的SCI小鼠显示TA和GS在摆动阶段期间的共同激活(图1K)，这是次优体重支持的标志。
再者，在停止治疗之后1至2周内，在具有CLP290诱导的恢复的小鼠中，BMS评分保留显著高于对照组(图1G)，表明了由CLP290治疗导致的持续功能恢复。在这些实验结束时，在腰椎区内没有观察到抗5-HT抗体的免疫染色，证实了这些小鼠中交错损害的成功(图7C)。总之，这些结果证明，CLP290治疗使得大多数瘫痪小鼠能够以持续的方式修复负重脚站立能力。
CLP290治疗不诱导具有完全损害小鼠的功能改善。
CLP290的效果将会由在SCI之后重新激活脊髓中的备用休眠下行连接而导致。然而，它也可独立于下行输入而直接作用于腰椎脊髓上。为了区分这些可能性，将相同的CLP290治疗应用于具有完全T8脊髓横切的小鼠，在该小鼠体内，没有轴突跨越损害位点(图7D)，并且发现CLP290无法促成任何限制的功能恢复(图7E)。相反，5-HT受体激动剂喹嗪在交错损害模型(图7B)和T8完全横切模型(图7F)两者中都造成快速但短暂的BMS改善(在第10分钟开始，持续时间短于2小时)。因此，不同于这一直接作用于腰椎脊髓上的短暂效应子，CLP290在功能改善上的效果取决于备用连接。
CLP290不影响轴突再生长。
由于具有交错损害或完全损害的小鼠展示相似的SCI相关行为缺陷(疼痛和瘫痪)，本文呈现的结果显示，CLP290诱导具有交错损害的小鼠的功能恢复仅表明，CLP290所致的功能改善似乎独立于此类镇痛和抗痉挛效果。因此，CLP290的可能作用机制似乎依赖于到腰椎脊髓的备用中继通路，例如，通过促进轴突出芽和/或通过增加中继通路信号保真度。
为了测试这些可能性，确定CLP290是否增加了备用的脊髓固有轴突的再生长和/或它们与来自脑部的轴突的再生。为了分析在每种情况下神经元向后肢运动控制中枢的投射，将表达mCherry的逆行追踪假型慢病毒载体(HiRet)(HiRet-mCherry)(Kato et al.,2011；Wang et al.,2017；Liu et al.,2017)注射到腰骶膨大(L2至L4)内。在损伤之后2周，发现逆行标记的神经元大多数位于损害之间和附近的脊髓段中，少量位于高于损害之处，而无一位于脑内(图82)。脊髓内逆行追踪神经元的数量在损伤后增加10周，与先前报告一致(Courtine et al.,2008)，但CLP290治疗不影响这些测量值(图8C和8F)。同样，使用AAV-ChR2-mCherry和AAV-ChR2-GFP从脑部顺行追踪，在损伤之后第2周和第10周的经CLP290治疗小鼠的脊髓中，未发现下行脑干网状脊髓轴突(图9A至9C)或皮质脊髓轴突(图9G至9I)出芽的增加。同样，通过5-HT免疫组化检测的羟色胺能轴突的出芽也未受到CLP290治疗的影响(图9D至9F)。因此，CLP290似乎通过促进脑源性下行轴突再生长至中继区域或脊髓固有轴突投射至腰椎脊髓而发挥作用。
KCC2表达模拟CLP290的促进功能恢复的效果。
CLP290被鉴别为K+-Cl-协同转运蛋白KCC2的活化剂，但它也作用于其他靶标上(Gagnon et al.,2013)。因此，确定KCC2在CNS神经元中的过表达在交错损害小鼠体内是否具有与CLP290类似的效果。利用AAV-PHP.B载体可以跨越成年小鼠BBB的特点(Deverman etal.,2016)，将在人突触蛋白启动子的控制下表达KCC2的AAV-PHP.B(AAV-PHP.B-syn-HA-KCC2)注射到尾静脉中。注射在损伤之后直接执行，因为KCC2需要1至2周时间以可检测地表达。然后每周执行行为监控(图2A)。如图2B中所示，AAV-PHP.B-KCC2治疗导致Ha标记的KCC2在所有脊髓段中的广泛表达，如在损伤之后8周所分析。与对照的AAV-PHP.B-H2B-GFP相反，AAV-PHP.B-KCC2治疗导致显著的功能恢复(图2C至2H)，其程度类似于或高于CLP290(图1E至1J)。事实上，在IAAV-KCC2治疗之后8周，80％的这些小鼠能够脚站立并且进行牵涉TA和GS的踝关节运动，大约一半的这些小鼠将会实现脚掌站立并且进行踝关节运动和膝关节运动(图2D和2H)。此外，经AAV-KCC2治疗的小鼠将会部分地支持它们的体重，并且在站立阶段期间具有频繁的GS放电(图2E和2H)。
在这一实验终止时(损伤之后9至10周)，通过蛋白质免疫印迹分析脊髓中KCC2的表达水平。在对照小鼠中，在损伤之后，腰椎和损害之间的脊髓段中的KCC2被显著减少(图10A和10B)，与先前报告一致(Boulenguez et al.,2010；Cote et al.,2014)。然而，相对于AAV-GFP对照小鼠，AAV-KCC2治疗将KCC2表达修复至与未受损小鼠明显接近的水平(图10A和10B)。因此，AAV-KCC2似乎通过抵消SCI诱导的KCC2下调而发挥作用。
抑制性中间神经元中的选择性KCC2表达导致功能恢复。
之后，评估特定类型神经元中的KCC2表达是否为所观察到的功能恢复的原因。为此，在损伤之后，直接将AAV-PHP.B-FLEX-KCC2(Cre依赖性KCC2表达)注射到Vglut2-Cre成年小鼠(对于兴奋性神经元(Tong et al.,2007))、Vgat-Cre成年小鼠(对于抑制性神经元(Vong et al.,2011))或Chat-Cre成年小鼠(对于运动神经元和中间神经元亚组(Rossi etal.,2011))的尾静脉中(图3A和3B)。与Chat-Cre小鼠和Vglut2-Cre小鼠相比，注射AAV-PHP.B-FLEX-KCC2的Vgat-Cre小鼠显示显著的功能恢复(图3C至3E)，其程度类似于CLP290治疗(图1)或非选择性KCC2表达(图2)。因此，这些结果表明，抑制性中间神经元的KCC2功能障碍或下调限制了交错损害小鼠的后肢功能恢复。
KCC2通过位于交错损害之间和附近的脊髓段中的抑制性中间神经元进行作用以诱导功能恢复。
如图7和8中所示，由位于交错损害之间和低于交错损害处的脊髓段组成的中继区域中的脊髓固有神经元，似乎将脑源性信号中继至腰椎脊髓。因此，交错损害小鼠中的KCC2介导的后肢功能恢复存在两种可能的机制：(1)KCC2作用于腰椎段(L2至L5)中的抑制性中间神经元上以促使脊髓固有输入的整合；和/或(2)KCC2作用于高于腰椎脊髓处的中继区域中的抑制性神经元上，以促使来自下行通路的脑源性输入的整合和/或将其中继至腰椎脊髓。
为了测试这些可能性，将AAV-KCC2或AAV-FLEX-KCC2局部注射至野生型小鼠或Vgat-Cre小鼠的腰椎段(L2至L5)(图4A、4B和10C)。这些治疗并未造成显著的功能恢复(图4C至4D)，表明腰椎脊髓中的抑制性神经元似乎不介导KCC2的功能恢复效果。
为了将KCC2引入位于交错损害之间和附近的脊髓段中，利用了损伤后损害位点附近急性损坏的血液-脊髓屏障。在过度交错损害之后3小鼠，将AAV-KCC2或AAV-FLEX-KCC2分别注射到野生型或Vgat-Cre小鼠的尾静脉中(图4E)。结果，KCC2表达跨过了T5和T12之间(图4F和10D)。在这些动物中，在两组小鼠中都观察到了显著和持续的功能恢复以及增加的BMS效能(图4G和4H)，其程度与AAV-PHP.B-KCC2治疗相当(图2)。在这些使用AAV-FLEX-KCC2的Vgat-Cre小鼠中，在大多数时间点，同时进行的CLP290治疗并未显著增强功能恢复(图10E)，与CLP290的效果主要通过在这些抑制性中间神经元中激活KCC2这一观念一致。因此，KCC2/CLP290主要通过位于胸椎脊髓水平中损害位点之间和相邻处的中继区域中的抑制性神经元发挥作用，以促使后肢功能恢复。
CLP290/KCC2改变兴奋性和中继形成。
在成熟神经元中，GABA和甘氨酸是抑制性的，因为它们打开氯离子通道，而这允许氯离子流入而造成超极化。相比之下，在发育过程中，细胞内氯离子水平的提升使得GABAA和甘氨酸介导的电流去极化并且通常是兴奋性的。在出生后早期，出生后神经元中的KCC2上调对于降低细胞内氯离子浓度、将兴奋转化为抑制来说至关重要(Ben-Ari et al.,2012；Kaila et al.,2014)。因此，损伤诱导的KCC2下调(Boulenguez et al.,2010；Coteet al.,2014)将会被预期修复不成熟的状态，在该状态下，GABA受体和甘氨酸受体可将神经元去极化。在这种情况下，脊髓抑制性神经元中的KCC2激活将会将中继区域中的局部回路朝着更接近生理学的状态转化，该状态对下行输入更为敏感。为了检查这一点，在损伤之后8周并在跑步机上行走1小时后，使用c-Fos免疫反应性作为位于T7和T10之间的脊髓段中的神经元活动的指标。在每一组中，这些脊髓段中的c-Fos阳性细胞大多数也是NeuN染色阳性的，NeuN是一种神经元标记物(图11A、11B)。c-Fos/NeuN双阳性细胞的代表性复合体显示在图5A中。在不进行治疗的受损小鼠中，c-Fos阳性神经元浓缩在脊髓的背角中(图5A至5C)，可能反应了在这些受损小鼠中对于外周感觉输入的超敏性。进行CLP290或AAV-KCC2治疗，c-Fos阳性神经元的分布变得大为不同，在背角中减少(椎板I至V)，而中间/腹侧脊髓中显著增加(图5A至5C)。这一KCC2转化的分布模式类似于在完整小鼠中检测到的响应于行走的模式(图5A至5C)。在停止CLP290治疗之后2周，c-Fos模式变回不进行治疗时所见(图11C和11D)，与行为结局一致(图1G)。总之，这些发现表明，增加KCC2活性将更接近生理学的神经元活动修复为局部脊髓回路。
作为对照，在使用L838,417(GABA激动剂，其已经显示减轻神经疼痛)进行长期治疗之后，检查了交错受损小鼠脊髓中的c-Fos免疫反应性(Knabl et al.,2008)。如图5A至5B中所示，L838,417减少了背角中的c-Fos阳性神经元，但并未增加中间区域和腹侧区域中的c-Fos阳性神经元，确证了L838,417治疗无法促成运动功能恢复的结果(图7A)。由于中间和腹侧脊髓是下行束缚的主要终止区域，这一区域中的神经元活动在CLP290/KCC2之后增加而在L838,417之后不增加，治疗似乎反映了对下行输入的响应改善。因此，这些结果表明，长期KCC2/CLP290治疗将中继区域的SCI诱导的、感觉集中化的活动模式转化为受控于感觉通路和下行通路两者的状态。
为了直接测试经治疗的脊髓是否将会更有效地将下行输入中继至腰椎脊髓，执行皮层刺激并记录TA肌肉中的EMG响应(图5D)。与完整小鼠相比，SCI小鼠中的皮层刺激响应的潜伏期显著延迟，并且KCC2相关治疗无法缩短刺激响应的潜伏期(图5D和5E)。这些结果与以下观念一致：KCC2激活的回路中存在多个突触连接，这将皮层刺激中继至受损小鼠腰椎脊髓中的运动神经元。另一方面，与对照组相比，进行AAV-PHP.B-syn-HA-KCC2或CLP290治疗的受损小鼠中的诱发EMG信号幅度显著增加(图5D和5F)，表明KCC2增强了这一脊髓回路的中继效率。因此，KCC2治疗促使来自脑的下行输入传播至腰椎脊髓。
对抑制性神经元的DREADD辅助调节模拟KCC2/CLP290的效果。
为了测试降低抑制性中间神经元的兴奋性是否将会模拟KCC2和CPL290的效果，通过在损伤之后3小时将AAV9载体(AAV9-FLEX-hM4Di-mCherry或AAV9-GFP)注射到Vgat-Cre小鼠的尾静脉中，在位于损害之间和附近的抑制性神经元内表达了hM4Di-mCherry(抑制性Gi偶联受体Gi-DREADD)(Krashes et al.,2011)(图6A)。每天给药氯氮平N-氧化物(CNO，其选择性地激活Gi-DREADD)(Roth,2017)，并每周监控行为。当在CNO给药(使用与CLP290相同的治疗时间表)之后24小时测试时，发现使用hM4Di的小鼠而非使用GFP的小鼠显示与进行LP290或KCC2治疗时观察到的类似程度的持续功能恢复(图6C)。此外，在连续行走之后，经hM4Di治疗的小鼠和经CNO治疗的小鼠表现出与进行KCC2相关治疗时观察到的类似的c-Fos表达模式(图6D至6F和图5A)。因此，这些结果证实了降低抑制性中间神经元兴奋的有益效果。
考虑到使用hM4Di对SCI小鼠的损害之间脊髓段中的整体去抑制，并且KCC2相关治疗将会增加兴奋性神经元的活动，有人质疑兴奋性中间神经元的直接活动是否将会模拟抑制抑制性中间神经元的效果。在交错损害之后，立即将AAV9-GFP或AAV9-FLEX-hM3Dq-mCherry注射到Vglut2-Cre小鼠的尾静脉中(图12A)。如图12B中所示，兴奋性激素神经元中的这一去极化hM3Dq的表达(将
AAV9-FLEX-hM3Dq-mCherry注射到Vglut2-Cre小鼠体内)与每天进行的CNO递送联合，无法在每天进行CNO治疗8周内引起功能恢复。有趣的是，在进行CNO给药之后立即存在短暂的功能改善但伴有后肢痉挛(图12C，数据未显示)，这与在进行哌嗪治疗后所见类似(图7B)。因此，直接降低抑制性中间神经元的兴奋性而非直接增加兴奋性中间神经元的兴奋性，在脊髓中是强有力的用以增强对于下行输入响应性的策略，并最终促成重度SCI之后持续的功能恢复。
讨论
使用去除所有脊髓上的与腰骶部脊髓的下行连接的双侧半横断术模型证明，长期的KCC2激活(或药理学地或通过AAV辅助基因递送)重新激活休眠的备用回路，并且导致持续的后肢脚站立。位于损害之间和高于腰椎脊髓处的脊髓段中的抑制性中间神经元主要介导这一效果。有人提出，通过抵消损伤诱导的KCC2下调，这些治疗调控中继区域中的神经元兴奋性，将已经通过损伤变成非功能性的脊髓回路复活。结果，这些局部回路能更好地将来自下行投射的指令中继至腰椎脊髓，导致改善的行为恢复。
与其他治疗的机理性差异和相关性。先前的研究显示，即使在完全的胸椎SCI中，药理学途径诸如羟色胺能和多巴胺能激动剂和GABA/甘氨酸受体拮抗剂也可以诱导立即但短暂的后肢运动(Courtine et al.,2009；de Leon et al.,1999；Edgerton et al.,2008；Robinson and Goldberger,1986；Rossignol and Barbeau,1993)。在这些“脊椎动物”中，因为腰椎脊髓完全中断与脑的连接，此类药理学治疗似乎通过改变脊髓回路的兴奋性，使得它能够响应仅感觉输入，从而发挥作用。一直以来，发现羟色胺能激动剂诱导急性但仅短暂的运动(在给药化合物之后最长2至3小时)，在完全和交错损害模型中均没有持续的改善。相比之下，CLP290在具有交错损害的小鼠中诱导持续的功能恢复，而在完全损害的小鼠中则不能。因此，尽管羟色胺能调节剂似乎作用于腰椎脊髓中的感觉驱动回路上，但CLP290在SCI后招募来自脑的休眠备用连接。
此外，在具有交错损害的大鼠中，硬膜外刺激与康复训练的联合治疗也已经显示诱导一定程度的自主运动(与羟色胺能和多巴胺能激动剂的药理学混合物一起)van denBrand et al.,2012)，甚至在一些长期SCI患者中(Angeli et al.,2014；Harkema et al.,2011)，尽管已经在这些大鼠中观察到了广泛的轴突出芽(van den Brand et al.,2012)，但轴突出芽是否与功能改善存在因果关系尚属未知。最近的研究表明，施加至腰椎段背侧的电神经调节主要参与本体感受回馈回路(Capogrosso et al.,2013；Hofstoetter etal.,2015；Wenger et al.,2014)。然而，这如何导致下行输入依赖性自主运动的功能修复仍未可知。鉴于这些结果显示，降低位于高于腰椎脊髓处的中继区域中的抑制性中间神经元的兴奋性足以使得这一脊髓回路能够将脑源性命令中继至腰椎脊髓，因此，测试硬膜外刺激和/或联合疗法是否也参与此类抑制性中间神经元介导它们的功能效果将会非常有趣。
KCC2和重新平衡脊髓运动回路。损伤触发了脊髓中的一连串改变，诸如局部KCC2下调。本文呈现的结果表明，抑制性中间神经元中KCC2的重新激活可以在SCI之后重建跨越脊髓网络的兴奋/抑制比率(E/I比)。这与以下观念一致：抑制性输入不仅对塑造神经网络内的特异性放电模式至关重要，而且对预防网络活性变成功能障碍性也至关重要(Mohleret al.,2004)。重要的是，并非所有增强抑制的操控都是有效的。与KCC2或Gi-DREADD相比，GABA受体激动剂似乎减少了跨越脊髓的整体激活模式，但无法重建更接近生理学的激活模式或促使功能改善。这可能是由于其直接且非选择性的抑制，由于L838,417治疗降低所有脊髓区域中的神经元激活水平(包括与椎板相关的腹侧运动)，它被表达以降低整体运动控制的质量。最后，脊髓兴奋性中间神经元的直接兴奋化无法诱导SCI后的持续功能恢复。因此，作为广泛靶向兴奋性或抑制性神经传播的替代，微调抑制性中间神经元的兴奋性似乎是更为有效的策略，它使得脊髓网络对下行输入和感觉输入更为敏感，从而成功地恢复运动功能。
转译视角。基于从高通量筛选中鉴定的选择性KCC2激活剂，已经将CLP290优化以用于系统性给药(Gagnon et al.,2013)，并且已经显示有效地治疗动物模型的神经性疼痛(Ferrini et al.,2017；Gagnon et al.,2013)。不同于本研究中测试的其他化合物，CLP290甚至在高剂量下仍表现出可忽略不计的副作用(数据未显示)。由于大多数SCI患者均具有一些备用的轴突，这些结果表明，这一可透过BBB的小分子，即CLP290，将会是这些情况的有前景的治疗手段。尽管如此，在这些实验中，并非后肢功能的所有方面都得以恢复。因此，未来的研究应探究将CLP290与其他治疗诸如额外的康复训练联合在SCI后的后肢恢复上的效果。
材料和方法
Figure BDA0002909166630000581
Figure BDA0002909166630000591
Figure BDA0002909166630000601
Figure BDA0002909166630000611
小鼠品系。所有实验过程均按照波士顿儿童医院动物护理和使用委员会批准的动物协议执行。本研究中采用的小鼠包括：C57BL/6野生型(WT)小鼠(Charles River,Straincode#027)；以及维持在C57BL/6基因背景上的Vgat-Cre(Jax#28862)、VGlut2-Cre(Jax#28863)和ChAT-Cre(Jax#28861)小鼠品系。对于行为学测量，所使用的所有实验动物均来自不同窝。在损伤之前，将19至21g的成年雌性小鼠随机分配到不同的治疗组，并且动物研究中不使用其他特异性随机化。行为学测试是盲测检查的。
化学品和抗体。对于系统性给药(i.p.)：将喹哌嗪(Sigma(Q1004)，0.2mg/kg)和8-OH-DPAT(Tocris(0529)，0.1mg/kg))悬浮在0.9％NaCl中；将巴氯芬(Tocris(0417)，1mg/kg)悬浮在100mM NaOH中，然后悬浮在0.9％NaCl中；将CP101606(Sigma(SML0053)，10mg/kg)悬浮在DMSO中，然后悬浮在0.9％NaCl中；将CLP290(由PharmaBlock合成，25mg/kg)悬浮在DMSO中，然后悬浮在20％2-羟丙基-β-环糊精中；将L838,417(由PharmaBlock合成，1mg/kg)悬浮在0.5％甲基纤维素和0.9％NaCl中；并且将布美他尼(Tocris(3108)，0.3mg/kg)悬浮在15％DMSO中。对于免疫染色和免疫印迹，所使用的一抗是：鸡抗GFP(Abcam(目录号：ab13970))、兔抗RFP(Abcam(目录号：ab34771))、兔抗GFAP(DAKO(Z0334))、兔抗5-HT(Immunostar(20080))、大鼠抗HA(Sigma(11867423001))、兔抗c-Fos(Cell signaling(2250s))、小鼠抗NeuN(Millipore(MAB377))和兔抗KCC2(Milipore(07-432))。
手术过程。T7和T10双侧半横断术的过程与本文中别处所述类似(Courtine etal.,2008；van den Brand et al.,2012)。简单地说，在胸椎上做中线开口，然后进行T7-10椎板切除术。对于T7右侧过半横断，小心地使用手术刀和微型剪刀在T7处切断双侧背侧脊柱，并且确保对侧上的腹侧通路没有备用(图1A)。对于T10左侧半横断，小心地使用手术刀和微型剪刀仅切断脊髓左侧，到中线为止。然后，缝合肌肉层，用伤口夹固定皮肤。所有动物均接受事后组织学分析，并且将在腰椎脊髓(L2-5)处备用5HT轴突的那些排除在行为学分析之外(图7)。
T8全横断过程与本文中别处所述类似(Courtine et al.,2009)。简单地说，在胸椎上做中线开口，然后进行T8椎板切除术。然后，使用手术刀和微型剪刀两者小心地执行完全的T8横断。然后，缝合肌肉层并用伤口夹固定皮肤。
EMG记录和皮层刺激。用于自由行动动物的EMG记录的过程类似于先前所述(Pearson et al.,2005)。简而言之，在术后9周，将定制双极电极植入每组5只小鼠(对照、CLP290和AAV-KCC2治疗的小鼠)的所选后肢肌肉内以记录EMG活动。电极(793200，A-MSystems)由30号针引导并插入右后肢的内侧腓肠肌(GS)和胫骨前肌(TA)肌肉的中间隆起部内。将功用接地线经皮下插入肩颈区域。将电线在皮下引导穿过背部，抵达牢固地固定在小鼠头骨上的透皮小连接器。使用具有10-1000Hz滤波的不同的交流放大器(1700,A-MSystems,WA)获取EMG信号，使用数字转换器(PowerLab 16/35,ADInstruments)以4kHz采样，并通过LabChart 8(ADInstruments)进行分析。
对于硬膜外刺激和EMG记录，将定制的头板固定在颅骨上，将单极刺激电极(SSM33A05,World Precision Instruments,Inc.)硬膜外地放置在左侧运动皮层的代表性后肢区域上。通过脉冲发生器和分离器(Master 9和Iso-Flex，A.M.P.I.)生成一系列电刺激(0.2ms双向脉冲，100ms脉冲串，20Hz，0.5-1.5mA)，并且在四足动物完全清醒状态下站立期间递送。在不进行和进行电化学刺激的情况下执行测试。从右侧TA肌肉的EMG记录计算所引起的响应的峰与峰振幅和时延。
病毒生产和注射。对于KCC2过表达病毒注射过程，将AAV2/PHP.B-Syn-HA-KCC2和AAV2/9-Syn-HA-KCC2注射到野生型小鼠的尾静脉内。将AAV2/PHP.B-Syn-FLEX-HA-KCC2注射到Vgat-Cre、Vglut2-Cre和ChAT-Cre小鼠尾静脉内。将AAV2/9-Syn-HA-KCC2和AAV2/9-Syn-FLEX-HA-KCC2、AAV2/9-Syn-FLEX-hM4Di-mCherry和AV2/9-Syn-FLEX-hM3Dq-mCherry注射到野生型、Vgat-Cre或Vglut2-cre小鼠尾静脉内。如先前所述(Deverman et al.,2016)，在SCI(AAV滴度调节至4-5x1013拷贝/ml进行注射，由波士顿儿童医院病毒中心生产)后3小时，实施尾静脉病毒注射。将AAV2/1-Syn-HA-KCC2和AAV2/1-Syn-FLEX-HA-KCC2分别经脊髓内注射到野生型和Vgat-Cre小鼠的腰椎水平(L2至4)处。在SCI过程前一天，实施腰椎水平的脊髓内病毒注射(AAV滴度调节至0.5-1x1013拷贝/ml进行注射，由波士顿儿童医院病毒中心生产)，以便消除任何可能的由腰椎水平脊髓内注射造成的行为缺陷。
对于网状脊髓追踪实验(过程如先前所述(Esposito et al.,2014))，将AAV2/8-ChR2-YFP和AAV2/8-ChR2-mCherry分别注射到小鼠脑干的右侧和左侧脑干结构内。对于CST追踪实验(过程如先前所述(Liu et al.,2010；Liu et al.,2017))，将AAV2/8-ChR2-mCherry注射到小鼠右侧感觉运动皮层(所有AAV滴度均调节至0.5-5x1013拷贝/ml进行注射，由波士顿儿童医院病毒中心生产)。对于腰椎水平逆行追踪，基于HiRet-lenti骨架来构造HiRet-mCherry的载体(慢病毒滴度调节至1.6-2x1012拷贝/ml进行注射)(Kinoshita etal.,2012)。注射过程如先前所述(Wang et al.,2017)，其中将HiRet-mCherry注射到来自段2至4的左侧和右侧腰脊髓内。
免疫组化和成像。将多聚甲醛(PFA)固定的组织用30％蔗糖进行抗冻保护，并使用低温恒温器(对于脊髓，切片厚度40μm)处理。在室温下，用含有10％常规驴血清和0.5％Triton-100的封闭溶液将切片处理2小时，之后染色。所使用的一抗(4C，过夜)是：兔抗GFAP(DAKO(Z0334)，1:600)；兔抗5-HT(Immunostar(20080)，1:5,000)；鸡抗GFP(Abcam(ab13970)，1:400)；兔抗RFP(Abcam(ab34771)，1:400)；兔抗PKCγ(Santa Cruz(sc211)，1:100)；大鼠抗HA(Sigma(11867423001)，1:200)；兔抗c-Fos(Cell signaling(2250s)，1:100)和小鼠抗NeuN(Millipore(MAB377)，1:400)。二抗(室温，2小时)包括：Alexa Fluor488偶联驴抗鸡和兔；以及Alexa Fluor 594偶联驴抗兔(全部来自Invitrogen)。如先前所述(Courtine et al.,2009)，在1小时的连续四足自由行走(完整)、脚站立(CLP290或AAV-KCC2治疗的小鼠)或拖曳(媒介物或AAV-GFP治疗的小鼠)后，测定脊髓神经元的c-Fos免疫反应性。将小鼠送回它们的笼子，然后麻醉并在2小时后通过心内灌注PFA在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的4％(wt/vol)溶液而将小鼠牺牲。
用共焦激光扫描显微镜(Zeiss 700或Zeiss 710)对脊髓横断面和纵断面成像。将以下项的荧光强度定量并比较：网状脊髓束投射(RFP+和GFP+)和皮层脊髓束(CST)投射(GFP+)，在不同的脊髓段横断面处(图10A和10C)；以及5HT轴突染色(图10B)。用于在多种条件下分析的所有图像均使用相同的光学参数取得，以避免色饱和。在对背景进行亚阈值化并通过面积进行归一化之后，使用FIJI软件进行显微密度测量。
为了对不同治疗组中的脊髓神经元的逆行HiRet-标记的细胞体进行定量和比较，将所有图像分解为个体通道和平面。使用定制开发的MATLAB代码对它们进行比对和定量。手动向HiRet标记的神经元分配坐标。
蛋白质印迹法。通过在异氟烷麻醉后斩首而杀死小鼠。迅速切出从T5到L1的脊髓并分为350μm切片。将样本在含有以下项的冷裂解缓冲液中匀浆：20mmol/L Tris(pH 7.4)、125mmol/L NaCl、10％甘油、1％Triton X-100,0.5％DCA、0.1％SDS、20mmol/L NaF、1mmol/L苯甲磺酰氟、4μg/mL抑肽酶、4μg/mL亮抑肽酶和1mmol/L Na3VO4。然后，将样本在4℃以13,000g离心10分钟。使用双软骨酸蛋白测定试剂盒(Bio-Rad,Hercules,CA)评估上清液中的蛋白质浓度。将等量的蛋白提取物通过4％至20％SDS-PAGE分离，并电转移到聚偏氟乙烯膜(Millipore,Bedford,MA)上。用Tris缓冲盐水加上3％BSA封闭之后，将膜暴露于稀释为1:500的多克隆兔KCC2特异性抗体(Millipore)或稀释为1:2000的多克隆兔β-肌动蛋白抗体(cell signaling)，在4℃于封闭溶液中过夜。使用ImmunoPure山羊辣根过氧化物酶偶联兔特异性抗体(1:500稀释于封闭溶液中，22℃，1小时)进行化学发光检测(Pierce Biotech)。
行为实验。使用开阔场地运动评定量表以后肢运动功能评分(Basso Mouse Scale(BMS))法评估运动功能。对于短暂的药物治疗，在行为检验(地面行走，其全部单独实施)之前十至十五分钟(van den Brand et al.,2012)，小鼠接受上述神经调节剂的系统性(i.p.)给药。值得注意的是，进行单次腹膜内注射，血浆CNO水平在15分钟达到峰值，并在注射后2小时变得非常低(Guettier et al.,2009)。对于长期的药物治疗，在行为检验之前24小时，小鼠接受上述化合物的系统性给药。所有行为检验都在1至3小时内完成。对于详细的后肢运动学分析，将来自不同组的小鼠放置在MotoRater(TSE系统，(Zorner et al.,2010))中，并且所有运动性分析都是基于通过MotoRater收集的数据实施的。
定量和统计分析。在应用任何因数检验之前，通过STATA(版本12，Collegestation,TX,USA)测量正态性和方差相似性。使用双尾学生t检验进行两个组间的单一比较。依据适宜的设计，使用单因素或双因素ANOVA来分析剩余的数据。仅当主要测量显示统计学显著性时才进行事后比较。使用Bonferroni校正来调节多个比较的P值。所有图中的误差条都代表均值±S.E.M。将来自不同窝的不同体重和性别的小鼠随机分配到不同的治疗组，并且动物研究中不使用其他特异性随机化。
参考文献
Angeli,C.A.,Edgerton,V.R.,Gerasimenko,Y.P.,and Harkema,S.J.(2014).Altering spinal cord excitability enables voluntary movements after chroniccomplete paralysis in humans.Brain137,1394-1409.
Arber,S.(2012).Motor circuits in action:specification,connectivity,and function.Neuron 74,975-989,2012.
Ballermann,M.,and Fouad,K.(2006).Spontaneous locomotor recovery inspinal cord injured rats is accompanied by anatomical plasticity ofreticulospinal fibers.Eur J Neurosci23,1988-1996.
Bareyre,F.M.,Kerschensteiner,M.,Raineteau,O.,Mettenleiter,T.C.,Weinmann,O.,and Schwab,M.E.(2004).The injured spinal cord spontaneously formsa new intraspinal circuit in adult rats.Nat Neurosci7,269-277.
Basso,D.M.,Fisher,L.C.,Anderson,A.J.,Jakeman,L.B.,McTigue,D.M.,andPopovich,P.G.(2006).Basso Mouse Scale for locomotion detects differences inrecovery after spinal cord injury in five common mouse strains.JNeurotrauma23,635-659.
Ben-Ari,Y.,Woodin,M.A.,Sernagor,E.,Cancedda,L.,Vinay,L.,Rivera,C.,Legendre,P.,Luhmann,H.J.,Bordey,A.,Wenner,P.,et al.(2012).Refuting thechallenges of the developmental shift of polarity of GABA actions:GABA moreexciting than ever！Front Cell Neurosci6,35.
Boulenguez,P.,Liabeuf,S.,Bos,R.,Bras,H.,Jean-Xavier,C.,Brocard,C.,Stil,A.,Darbon,P.,Cattaert,D.,Delpire,E.,et al.(2010).Down-regulation of thepotassium-chloride cotransporter KCC2 contributes to spasticity after spinalcord injury.Nat Med16,302-307.
Capogrosso,M.,Wenger,N.,Raspopovic,S.,Musienko,P.,Beauparlant,J.,Bassi Luciani,L.,Courtine,G.,and Micera,S.(2013).A computational model forepidural electrical stimulation of spinal sensorimotor circuits.J Neurosci33,19326-19340.
Cazalets,J.R.,Sqalli-Houssaini,Y.,and Clarac,F.(1992).Activation ofthe central pattern generators for locomotion by serotonin and excitatoryamino acids in neonatal rat.J Physiol455,187-204.
Cote,M.P.,Gandhi,S.,Zambrotta,M.,and Houle,J.D.(2014).Exercisemodulates chloride homeostasis after spinal cord injury.J Neurosci34,8976-8987.
Courtine,G.,Gerasimenko,Y.,van den Brand,R.,Yew,A.,Musienko,P.,Zhong,H.,Song,B.,Ao,Y.,Ichiyama,R.M.,Lavrov,I.,et al.(2009).Transformation ofnonfunctional spinal circuits into functional states after the loss of braininput.Nat Neurosci12,1333-1342.
Courtine,G.,Song,B.,Roy,R.R.,Zhong,H.,Herrmann,J.E.,Ao,Y.,Qi,J.,Edgerton,V.R.,and Sofroniew,M.V.(2008).Recovery of supraspinal control ofstepping via indirect propriospinal relay connections after spinal cordinjury.Nat Med14,69-74.
Cowley,K.C.,and Schmidt,B.J.(1995).Effects of inhibitory amino acidantagonists on reciprocal inhibitory interactions during rhythmic motoractivity in the in vitro neonatal rat spinal cord.J Neurophysiol74,1109-1117.
de Leon,R.D.,Tamaki,H.,Hodgson,J.A.,Roy,R.R.,and Edgerton,V.R.(1999).Hindlimb locomotor and postural training modulates glycinergic inhibition inthe spinal cord of the adult spinal cat.J Neurophysiol82,359-369.
Deverman,B.E.,Pravdo,P.L.,Simpson,B.P.,Kumar,S.R.,Chan,K.Y.,Banerjee,A.,Wu,W.L.,Yang,B.,Huber,N.,Pasca,S.P.,et al.(2016).Cre-dependent selectionyields AAV variants for widespread gene transfer to the adult brain.NatBiotechnol34,204-209.
Doyon,N.,Vinay,L.,Prescott,S.A.,and De Koninck,Y.(2016).ChlorideRegulation:A Dynamic Equilibrium Crucial for Synaptic Inhibition.Neuron89,1157-1172.
Edgerton,V.R.,Courtine,G.,Gerasimenko,Y.P.,Lavrov,I.,Ichiyama,R.M.,Fong,A.J.,Cai,L.L.,Otoshi,C.K.,Tillakaratne,N.J.,Burdick,J.W.,et al.(2008).Training locomotor networks.Brain Res Rev57,241-254.
Edgerton,V.R.,Tillakaratne,N.J.,Bigbee,A.J.,de Leon,R.D.,and Roy,R.R.(2004).Plasticity of the spinal neural circuitry after injury.Annu RevNeurosci27,145-167.
Esposito,M.S.,Capelli,P.,and Arber,S.(2014).Brainstem nucleus MdVmediates skilled forelimb motor tasks.Nature508,351-356.
Fawcett,J.W.,Curt,A.,Steeves,J.D.,Coleman,W.P.,Tuszynski,M.H.,Lammertse,D.,Bartlett,P.F.,Blight,A.R.,Dietz,V.,Ditunno,J.,et al.(2007).Guidelines for the conduct of clinical trials for spinal cord injury asdeveloped by the ICCP panel:spontaneous recovery after spinal cord injury andstatistical power needed for therapeutic clinical trials.Spinal Cord45,190-205.
Ferrini,F.,Lorenzo,L.E.,Godin,A.G.,Quang,M.L.,and De Koninck,Y.(2017).Enhancing KCC2 function counteracts morphine-induced hyperalgesia.SciRep7,3870.
Filous,A.R.,and Schwab,J.M.(2017).Determinants of Axon Growth,Plasticity,and Regeneration in the Context of Spinal Cord Injury.Am JPathol.188,53-62.
Frigon,A.,and Rossignol,S.(2008).Adaptive changes of the locomotorpattern and cutaneous reflexes during locomotion studied in the same catsbefore and after spinalization.J Physiol586,2927-2945.
Gackiere,F.,and Vinay,L.(2015).Contribution of the potassium-chloridecotransporter KCC2 to the strength of inhibition in the neonatal rodentspinal cord in vitro.J Neurosci35,5307-5316.
Gagnon,M.,Bergeron,M.J.,Lavertu,G.,Castonguay,A.,Tripathy,S.,Bonin,R.P.,Perez-Sanchez,J.,Boudreau,D.,Wang,B.,Dumas,L.,et al.(2013).Chlorideextrusion enhancers as novel therapeutics for neurological diseases.NatMed19,1524-1528.
Gerasimenko,Y.,Roy,R.R.,and Edgerton,V.R.(2008).Epidural stimulation:comparison of the spinal circuits that generate and control locomotion inrats,cats and humans.Exp Neurol209,417-425.
Grillner,S.,and Wallen,P.(1985).Central pattern generators forlocomotion,with special reference to vertebrates.Annu Rev Neurosci8,233-261.
Guettier,J.M.,Gautam,D.,Scarselli,M.,Ruiz de Azua,I.,Li,J.H.,Rosemond,E.,Ma,X.,Gonzalez,F.J.,Armbruster,B.N.,Lu,H.,et al.(2009).Achemical-genetic approach to study G protein regulation of beta cell functionin vivo.Proc Natl Acad Sci U S A106,19197-19202.
Harkema,S.,Gerasimenko,Y.,Hodes,J.,Burdick,J.,Angeli,C.,Chen,Y.,Ferreira,C.,Willhite,A.,Rejc,E.,Grossman,R.G.,et al.(2011).Effect of epiduralstimulation of the lumbosacral spinal cord on voluntary movement,standing,andassisted stepping after motor complete paraplegia:a case study.Lancet377,1938-1947.
He,Z.,and Jin,Y.(2016).Intrinsic control of axon regeneration.Neuron90,437-451.
Hofstoetter,U.S.,Danner,S.M.,Freundl,B.,Binder,H.,Mayr,W.,Rattay,F.,and Minassian,K.(2015).Periodic modulation of repetitively elicitedmonosynaptic reflexes of the human lumbosacral spinal cord.J Neurophysiol114,400-410.
Hubner,C.A.,Stein,V.,Hermans-Borgmeyer,I.,Meyer,T.,Ballanyi,K.,andJentsch,T.J.(2001).Disruption of KCC2 reveals an essential role of K-Clcotransport already in early synaptic inhibition.Neuron30,515-524.
Jankowska,E.,and Edgley,S.A.(2006).How can corticospinal tractneurons contribute to ipsilateral movements？A question with implications forrecovery of motor functions.Neuroscientist12,67-79.
Kaila,K.,Ruusuvuori,E.,Seja,P.,Voipio,J.,and Puskarjov,M.(2014).GABAactions and ionic plasticity in epilepsy.Curr Opin Neurobiol26,34-41.
Kakulas,B.A.(1999).A review of the neuropathology of human spinalcord injury with emphasis on special features.J Spinal Cord Med22,119-124.
Kato,S.,Kobayashi,K.,Inoue,K.,Kuramochi,M.,Okada,T.,Yaginuma,H.,Morimoto,K.,Shimada,T.,Takada,M.,and Kobayashi,K.(2011).A lentiviral strategyfor highly efficient retrograde gene transfer by pseudotyping with fusionenvelope glycoprotein.Hum Gene Ther22,197-206.
Kiehn,O.(2006).Locomotor circuits in the mammalian spinal cord.AnnuRev Neurosci29,279-306.
Kiehn,O.(2016).Decoding the organization of spinal circuits thatcontrol locomotion.Nat Rev Neurosci17,224-238.
Kinoshita,M.,Matsui,R.,Kato,S.,Hasegawa,T.,Kasahara,H.,Isa,K.,Watakabe,A.,Yamamori,T.,Nishimura,Y.,Alstermark,B.,et al.(2012).Geneticdissection of the circuit for hand dexterity in primates.Nature487,235-238.
Knabl,J.,Witschi,R.,Hosl,K.,Reinold,H.,Zeilhofer,U.B.,Ahmadi,S.,Brockhaus,J.,Sergejeva,M.,Hess,A.,Brune,K.,et al.(2008).Reversal ofpathological pain through specific spinal GABAA receptor subtypes.Nature451,330-334.
Krashes,M.J.,Koda,S.,Ye,C.,Rogan,S.C.,Adams,A.C.,Cusher,D.S.,Maratos-Flier,E.,Roth,B.L.,and Lowell,B.B.(2011).Rapid,reversible activation of AgRPneurons drives feeding behavior in mice.J Clin Invest121,1424-1428.
Liu,K.,Lu,Y.,Lee,J.K.,Samara,R.,Willenberg,R.,Sears-Kraxberger,I.,Tedeschi,A.,Park,K.K.,Jin,D.,Cai,B.,et al.(2010).PTEN deletion enhances theregenerative ability of adult corticospinal neurons.Nat Neurosci13,1075-1081.
Liu,Y.,Wang,X.,Li,W.,Zhang,Q.,Li,Y.,Zhang,Z.,Zhu,J.,Chen,B.,Williams,P.R.,Zhang,Y.,et al.(2017).A Sensitized IGF1 Treatment Restores CorticospinalAxon-Dependent Functions.Neuron95,817-833 e814.
Lu,Y.,Zheng,J.,Xiong,L.,Zimmermann,M.,and Yang,J.(2008).Spinal cordinjury-induced attenuation of GABAergic inhibition in spinal dorsal horncircuits is associated with down-regulation of the chloride transporter KCC2in rat.J Physiol586,5701-5715.
Mohler,H.,Fritschy,J.M.,Crestani,F.,Hensch,T.,and Rudolph,U.(2004).Specific GABA(A)circuits in brain development and therapy.BiochemPharmacol68,1685-1690.
Ni,Y.,Nawabi,H.,Liu,X.,Yang,L.,Miyamichi,K.,Tedeschi,A.,Xu,B.,Wall,N.R.,Callaway,E.M.,and He,Z.(2014).Characterization of long descendingpremotor propriospinal neurons in the spinal cord.J Neurosci34,9404-9417.
O'Shea,T.M.,Burda,J.E.,and Sofroniew,M.V.(2017).Cell biology ofspinal cord injury and repair.J Clin Invest127,3259-3270.
Pearson,K.G.,Acharya,H.,and Fouad,K.(2005).A new electrodeconfiguration for recording electromyographic activity in behaving mice.JNeurosci Methods148,36-42.
Robinson,G.A.,and Goldberger,M.E.(1986).The development and recoveryof motor function in spinal cats.II.Pharmacological enhancement ofrecovery.Exp Brain Res62,387-400.
Rosenzweig,E.S.,Courtine,G.,Jindrich,D.L.,Brock,J.H.,Ferguson,A.R.,Strand,S.C.,Nout,Y.S.,Roy,R.R.,Miller,D.M.,Beattie,M.S.,et al.(2010).Extensive spontaneous plasticity of corticospinal projections after primatespinal cord injury.Nat Neurosci13,1505-1510.
Rossi,J.,Balthasar,N.,Olson,D.,Scott,M.,Berglund,E.,Lee,C.E.,Choi,M.J.,Lauzon,D.,Lowell,B.B.,and Elmquist,J.K.(2011).Melanocortin-4 receptorsexpressed by cholinergic neurons regulate energy balance and glucosehomeostasis.Cell Metab13,195-204.
Rossignol,S.,and Barbeau,H.(1993).Pharmacology of locomotion:anaccount of studies in spinal cats and spinal cord injured subjects.J AmParaplegia Soc16,190-196.
Rossignol,S.,and Frigon,A.(2011).Recovery of locomotion after spinalcord injury:some facts and mechanisms.Annu Rev Neurosci34,413-440.
Ruder,L.,Takeoka,A.,and Arber,S.(2016).Long-Distance DescendingSpinal Neurons Ensure Quadrupedal Locomotor Stability.Neuron92,1063-1078.
Sawada,M.,Kato,K.,Kunieda,T.,Mikuni,N.,Miyamoto,S.,Onoe,H.,Isa,T.,andNishimura,Y.(2015).Function of the nucleus accumbens in motor control duringrecovery after spinal cord injury.Science350,98-101.
Schucht,P.,Raineteau,O.,Schwab,M.E.,and Fouad,K.(2002).Anatomicalcorrelates of locomotor recovery following dorsal and ventral lesions of therat spinal cord.Exp Neurol176,143-153.
Stepien,A.E.,Tripodi,M.,Arber,S.(2010).Monosynaptic rabies virusreveals premotor network organization and synaptic specificity of cholinergicpartition cells.Neuron 68,456-472.
Takeoka,A.,Vollenweider,I.,Courtine,G.,and Arber,S.(2014).Musclespindle feedback directs locomotor recovery and circuit reorganization afterspinal cord injury.Cell159,1626-1639.
Tong,Q.,Ye,C.,McCrimmon,R.J.,Dhillon,H.,Choi,B.,Kramer,M.D.,Yu,J.,Yang,Z.,Christiansen,L.M.,Lee,C.E.,et al.(2007).Synaptic glutamate release byventromedial hypothalamic neurons is part of the neurocircuitry that preventshypoglycemia.Cell Metab5,383-393.
van den Brand,R.,Heutschi,J.,Barraud,Q.,DiGiovanna,J.,Bartholdi,K.,etal.(2012).Restoring voluntary control of locomotion after paralyzing spinalcord injury.Science336,1182-1185.
Vong,L.,Ye,C.,Yang,Z.,Choi,B.,Chua,S.,Jr.,and Lowell,B.B.(2011).Leptin action on GABAergic neurons prevents obesity and reduces inhibitorytone to POMC neurons.Neuron71,142-154.
Wang,X.,Liu,Y.,Li,X.,Zhang,Z.,Yang,H.,Zhang,Y.,Williams,P.R.,Alwahab,N.S.A.,Kapur,K.,Yu,B.,et al.(2017).Deconstruction of Corticospinal Circuitsfor Goal-Directed Motor Skills.Cell171,440-455 e414.
Wenger,N.,Moraud,E.M.,Raspopovic,S.,Bonizzato,M.,DiGiovanna,J.,et al.(2014).Closed-loop neuromodulation of spinal sensorimotor circuits controlsrefined locomotion after complete spinal cord injury.Sci Transl Med6,255ra133.
Zaporozhets,E.,Cowley,K.C.,and Schmidt,B.J.(2011).Neurochemicalexcitation of propriospinal neurons facilitates locomotor commandsignaltransmission in the lesioned spinal cord.J Neurophysiol 105,2818-2829.
Zorner,B.,Filli,L.,Starkey,M.L.,Gonzenbach,R.,Kasper,H.,Rothlisberger,M.,Bolliger,M.,and Schwab,M.E.(2010).Profiling locomotorrecovery:comprehensive quantification of impairments after CNS damage inrodents.Nat Methods7,701-708.

Claims (66)

1.一种用于治疗脊柱损伤的方法，包括向具有脊柱损伤的受试者给药有效量的上调神经元特异性K+-Cl-协同转运蛋白(KCC2)的药剂。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述上调KCC2的药剂是选自由小分子、肽、基因标记系统和编码KCC2的表达载体所组成的群组。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述小分子是CLP290。
4.根据权利要求2所述的方法，其中所述载体是非整合型的或整合型的。
5.根据权利要求2所述的方法，其中所述载体是病毒载体或非病毒载体。
6.根据权利要求4所述的方法，其中所述非整合型载体是选自由附加型载体、EBNA1载体、微环载体、非整合型腺病毒、非整合型RNA和仙台病毒所组成的群组。
7.根据权利要求5所述的方法，其中所述病毒载体是选自由逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、疱疹病毒、痘病毒、α病毒、牛痘病毒和腺相关病毒所组成的群组。
8.根据权利要求5所述的方法，其中所述非病毒载体是选自由纳米颗粒、阳离子脂质、阳离子聚合物、金属纳米颗粒、纳米棒、脂质体、微泡、细胞渗透肽和脂质球所组成的群组。
9.根据权利要求4至8所述的方法，其中所述载体跨越血脑屏障。
10.根据权利要求1所述的方法，其中，与适宜的对照物相比，KCC2被上调至少2倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述脊柱损伤是重度脊髓损伤。
12.根据权利要求1至11所述的方法，其中所述受试者是人。
13.根据权利要求1至12所述的方法，其中所述受试者被诊断为具有脊柱损伤。
14.根据权利要求1至12所述的方法，其中所述受试者先前已经被进行脊柱损伤治疗。
15.根据权利要求1所述的方法，其中在给药之前，所述受试者被诊断为具有脊髓损伤。
16.根据权利要求1至14所述的方法，其中所述受试者还被施予至少第二种脊柱损伤治疗。
17.根据权利要求1至14所述的方法，其中所述受试者还被给药至少第二种治疗性化合物。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述第二种治疗性化合物是选自由骨桥蛋白、生长因子或4-胺基吡啶所组成的群组。
19.一种用于治疗脊柱损伤的方法，包括向具有脊柱损伤的受试者给药有效量的抑制Na+/2Cl-/K+-协同转运蛋白(NKCC)的药剂。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述抑制NKCC的药剂是选自由小分子、抗体、肽、反义寡核苷酸和RNAi所组成的群组。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述RNAi是microRNA、siRNA或shRNA。
22.根据权利要求20所述的方法，其中所述小分子是布美他尼。
23.根据权利要求19至21所述的方法，其中所述药剂包含在载体中。
24.一种用于治疗脊柱损伤的方法，包括向具有脊柱损伤的受试者给药有效量的降低抑制性中间神经元兴奋性的药剂。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述药剂上调抑制性Gi偶联受体Gi-DREADD。
26.根据权利要求24至25所述的方法，其中所述药剂是编码Gi-DREADD的表达载体。
27.根据权利要求24所述的方法，其中所述药剂是编码Kir2.1的表达载体。
28.根据权利要求24上所述的方法，还包括在与所述药剂基本上相同的时间给药氯氮平N-氧化物。
29.根据权利要求25至27所述的方法，其中所述载体跨越血脑屏障。
30.根据权利要求24至29所述的方法，其中与适宜的对照物相比，所述抑制性中间神经元的兴奋性被降低至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90、至少99％或更多。
31.根据权利要求24所述的方法，其中在给药之前，所述受试者被诊断为具有脊髓损伤。
32.根据权利要求24至31所述的方法，其中所述受试者被施予至少第二种脊柱损伤治疗。
33.一种用于治疗脊柱损伤的方法，包括向具有脊柱损伤的受试者给药有效量的降低抑制性中间神经元兴奋性的电刺激。
34.根据权利要求33上所述的方法，还包括在与所述药剂基本上相同的时间给药氯氮平N-氧化物。
35.根据权利要求33所述的方法，其中所述电刺激直接施加到所述脊髓。
36.根据权利要求33所述的方法，其中所述电刺激直接施加到所述脊髓的损伤位点处。
37.根据权利要求33至36所述的方法，其中与适宜的对照物相比，所述抑制性中间神经元的兴奋性被降低至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90、至少99％或更高。
38.根据权利要求33所述的方法，其中在给药之前，所述受试者被诊断为具有脊髓损伤。
39.根据权利要求33至38所述的方法，其中所述受试者被施予至少第二种脊柱损伤治疗。
40.一种药物组合物，其包含有效量的KCC2多肽或包含编码所述KCC2多肽的核酸序列的载体以及药学上可接受的载剂，用于治疗脊髓损伤。
41.根据权利要求40所述的药物组合物，其中所述KCC2多肽包含SEQ ID NO:1的序列。
42.根据权利要求40至41中任一项所述的药物组合物，其中所述KCC2多肽与SEQ IDNO:1具有至少95％的氨基酸序列一致性并且保留SEQ ID NO:1的KCC2生物活性的至少80％。
43.根据权利要求40至42中任一项所述的药物组合物，还包含至少第二种治疗性化合物。
44.一种药物组合物，其包含有效量的Gi-DREADD多肽或包含编码所述Gi-DREADD多肽的核酸序列的载体以及药学上可接受的载剂，用于治疗脊髓损伤。
45.根据权利要求44所述的药物组合物，其中所述Gi-DREADD多肽是优化的Gi-DREADD多肽。
46.根据权利要求44至45中任一项所述的药物组合物，其中所述Gi-DREADD多肽包含SEQ ID NO:2的序列。
47.根据权利要求44至46中任一项所述的药物组合物，其中所述Gi-DREADD多肽与SEQID NO:2具有至少95％的氨基酸序列一致性并且保留SEQ ID NO:2的Gi-DREADD生物活性的至少80％。
48.根据权利要求44至47中任一项所述的药物组合物，还包含氯氮平N-氧化物。
49.根据权利要求44至47中任一项所述的药物组合物，还包含至少第二种治疗性化合物。
50.一种药物组合物，其包含有效量的Kir2.1多肽或包含编码所述Kir2.1多肽的核酸序列的载体以及药学上可接受的载剂，用于治疗脊髓损伤。
51.根据权利要求50所述的药物组合物，其中所述Kir2.1多肽包含SEQ ID NO:3的序列。
52.根据权利要求50至51中任一项所述的药物组合物，其中所述Kir2.1多肽与SEQ IDNO:3具有至少95％的氨基酸序列一致性并且保留SEQ ID NO:3的Kir2.1生物活性的至少80％。
53.根据权利要求50至52中任一项所述的药物组合物，还包含氯氮平N-氧化物。
54.根据权利要求50至52中任一项所述的药物组合物，还包含至少第二种治疗性化合物。
55.一种药物组合物，其包含有效量的根据权利要求19至21所述的药剂以及药学上可接受的载剂，用于治疗脊髓损伤。
56.根据权利要求55所述的药物组合物，还包含至少第二种治疗性化合物。
57.一种用于治疗脊柱损伤的方法，包括向具有脊柱损伤的受试者给药有效量的CLP290。
58.根据权利要求1所述的方法，其中CLP290跨越血脑屏障。
59.根据权利要求1所述的方法，其中所述脊柱损伤是重度脊髓损伤。
60.根据权利要求57至59所述的方法，其中所述受试者是人。
61.根据权利要求57至60所述的方法，其中所述受试者被诊断为具有脊柱损伤。
62.根据权利要求57至61所述的方法，其中所述受试者先前已经被进行脊柱损伤治疗。
63.根据权利要求1所述的方法，其中在给药之前，所述受试者被诊断为具有脊髓损伤。
64.根据权利要求57至63所述的方法，其中所述受试者还被施予至少第二种脊柱损伤治疗。
65.根据权利要求57至63所述的方法，其中所述受试者还被给药至少第二种治疗性化合物。
66.根据权利要求65所述的方法，其中所述第二种治疗性化合物是选自由骨桥蛋白、生长因子或4-胺基吡啶所组成的群组。
CN201980048789.9A 2018-05-25 2019-05-21 治疗脊髓损伤的方法 Pending CN112752573A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201862676464P 2018-05-25 2018-05-25
US62/676,464 2018-05-25
PCT/US2019/033303 WO2019226643A1 (en) 2018-05-25 2019-05-21 Methods for treating spinal cord injury

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN112752573A true CN112752573A (zh) 2021-05-04

Family

ID=68616947

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201980048789.9A Pending CN112752573A (zh) 2018-05-25 2019-05-21 治疗脊髓损伤的方法

Country Status (8)

Country Link
US (1) US20210254101A1 (zh)
EP (1) EP3801482A4 (zh)
JP (1) JP2021525707A (zh)
KR (1) KR20210050493A (zh)
CN (1) CN112752573A (zh)
AU (1) AU2019274481A1 (zh)
CA (1) CA3100902A1 (zh)
WO (1) WO2019226643A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023108405A1 (zh) * 2021-12-14 2023-06-22 中国科学院深圳先进技术研究院 重组载体及其构建方法和应用

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
LT4103566T (lt) * 2020-03-13 2023-11-10 Astrazeneca Ab Kondensuoti pirimidino junginiai, kaip kcc2 moduliatoriai
CN111388654A (zh) * 2020-05-22 2020-07-10 南通大学 治疗脊髓损伤的药物、药物试剂盒及方法
RU2758760C1 (ru) * 2021-01-22 2021-11-01 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Казанский Государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации Способ лечения травматического повреждения спинного мозга
CN114107231B (zh) * 2021-12-13 2023-08-18 重庆大学 实现全脑突触后神经元胞体标记的重组腺相关病毒及其应用
WO2024006905A1 (en) * 2022-07-01 2024-01-04 Nevro Corp. Neurostimulation for treating sensory deficits, and associated systems and methods
CN115317614B (zh) * 2022-10-14 2022-12-27 暨南大学 Adk抑制剂在制备治疗脊髓损伤的药物中的应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1805769A (zh) * 2003-05-16 2006-07-19 拉瓦勒大学 Cns氯化物调节及其用途
CN102341380A (zh) * 2009-01-22 2012-02-01 神经病治疗药物股份有限公司 布美他尼、呋塞米、吡咯他尼、佐塞米和托拉塞米类似物、组合物和使用方法

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100519693B1 (ko) * 2003-12-12 2005-10-13 한국과학기술연구원 α1Ｇ Ｔ-형 칼슘 채널 활성 연구 및 고효율 억제제 검색용 ＨＥＫ２９３ 세포주
AU2006335153B2 (en) * 2006-01-05 2012-03-15 Essentialis, Inc. Salts of potassium ATP channel openers and uses thereof
US8812115B2 (en) * 2009-07-10 2014-08-19 Boston Scientific Neuromodulation Corporation System and method for reducing excitability of dorsal root fiber by introducing stochastic background noise
WO2011086126A1 (en) * 2010-01-15 2011-07-21 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Compounds for the treatment of autism
EP2732815A1 (en) * 2012-11-16 2014-05-21 Neurochlore Modulators of intracellular chloride concentration for treating fragile X syndrome
EP3116495B1 (en) * 2014-03-10 2019-11-06 Université d'Aix-Marseille Piperazine phenothiazine derivatives for treating spasticity
ES2968042T3 (es) * 2016-03-09 2024-05-06 Fadi Assaf Uso de DREADD para la modulación neuronal en el tratamiento de enfermedades neuronales
US20190046662A1 (en) * 2016-03-24 2019-02-14 Rutgers, The State University Of New Jersey Compositions and Methods for Treating Neuropathic Pain
EP3507371A4 (en) * 2016-08-31 2020-08-05 Rutgers, The State University of New Jersey METHODS AND COMPOSITIONS FOR TREATING DISEASES AND DISORDERS OF THE NERVOUS SYSTEM

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1805769A (zh) * 2003-05-16 2006-07-19 拉瓦勒大学 Cns氯化物调节及其用途
CN102341380A (zh) * 2009-01-22 2012-02-01 神经病治疗药物股份有限公司 布美他尼、呋塞米、吡咯他尼、佐塞米和托拉塞米类似物、组合物和使用方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GAGNON 等: ""Chloride Extrusion Enhancers as Novel Therapeutics forNeurological Diseases"", 《 NATURE MEDICINE 》, vol. 19, pages 1 - 4 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023108405A1 (zh) * 2021-12-14 2023-06-22 中国科学院深圳先进技术研究院 重组载体及其构建方法和应用

Also Published As

Publication number Publication date
US20210254101A1 (en) 2021-08-19
JP2021525707A (ja) 2021-09-27
EP3801482A4 (en) 2022-06-29
AU2019274481A1 (en) 2020-12-03
WO2019226643A1 (en) 2019-11-28
CA3100902A1 (en) 2019-11-28
KR20210050493A (ko) 2021-05-07
EP3801482A1 (en) 2021-04-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112752573A (zh) 治疗脊髓损伤的方法
Chen et al. Reactivation of dormant relay pathways in injured spinal cord by KCC2 manipulations
Trakhtenberg et al. Zinc chelation and Klf9 knockdown cooperatively promote axon regeneration after optic nerve injury
Lovett-Barr et al. Repetitive intermittent hypoxia induces respiratory and somatic motor recovery after chronic cervical spinal injury
Luoni et al. Whole brain delivery of an instability-prone Mecp2 transgene improves behavioral and molecular pathological defects in mouse models of Rett syndrome
Kami et al. Histone acetylation in microglia contributes to exercise-induced hypoalgesia in neuropathic pain model mice
Bączyk et al. Synaptic restoration by cAMP/PKA drives activity-dependent neuroprotection to motoneurons in ALS
Xu et al. Hippocampal mTOR signaling is required for the antidepressant effects of paroxetine
Wu et al. Expressing constitutively active rheb in adult neurons after a complete spinal cord injury enhances axonal regeneration beyond a chondroitinase-treated glial scar
WO2012016081A2 (en) Method and therapeutic for the treatment and regulation of memory formation
US20110224278A1 (en) Methods and compositions for treating a subject for central nervous system (cns) injury
Peng et al. Inhibition of Notch1 signaling promotes neuronal differentiation and improves functional recovery in spinal cord injury through suppressing the activation of Ras homolog family member A
Urban et al. Cell-type specific expression of constitutively-active Rheb promotes regeneration of bulbospinal respiratory axons following cervical SCI
US10047377B2 (en) Methods for modulating KLHL1 levels, methods for modulating current activity in T-type calcium channels, molecules therefor, and methods for identifying molecules therefor
Kaya et al. Vagus nerve stimulation inhibits seizure activity and protects blood–brain barrier integrity in kindled rats with cortical dysplasia
Meng et al. Intrathecal injection of lentivirus‐mediated glial cell line‐derived neurotrophic factor RNA interference relieves bone cancer‐induced pain in rats
Stewart et al. PTEN knockout using retrogradely transported AAVs transiently restores locomotor abilities in both acute and chronic spinal cord injury
Leibinger et al. Inhibition of microtubule detyrosination by parthenolide facilitates functional CNS axon regeneration
Steward et al. A re-assessment of the effects of intracortical delivery of inosine on transmidline growth of corticospinal tract axons after unilateral lesions of the medullary pyramid
Copp et al. Effects of peripheral and spinal κ-opioid receptor stimulation on the exercise pressor reflex in decerebrate rats
Baertsch et al. Inactivity-induced phrenic motor facilitation requires PKCζ activity within phrenic motor neurons
US10597655B2 (en) Methods for modulating KLHL1 levels, methods for modulating current activity in T-type calcium channels, molecules therefor, and methods for identifying molecules therefor
Pomrenze Genetic dissection of an amygdala CRF circuit for fear and anxiety
Sydney-Smith Improving sensorimotor deficits after spinal cord injury with peripheral Neurotrophin-3
Zhuo Targeting injury-related synaptic plasticity for the treatment of chronic pain

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20210504

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication