KR20210047144A

KR20210047144A - Ift88 억제제를 유효성분으로 함유하는 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물

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Publication number: KR20210047144A
Application number: KR1020190130850A
Authority: KR
Inventors: 최승희; 장재명; 최유라; 김다솜; 이미숙; 정현진; 최영식
Original assignee: 재단법인대구경북과학기술원
Priority date: 2019-10-21
Filing date: 2019-10-21
Publication date: 2021-04-29
Also published as: KR102262663B1

Abstract

본 발명은 IFT88(Intraflagellar transport protein 88 homolog) 억제제의 신경퇴행성 질환의 치료 용도에 관한 것으로, 자세하게는 myh11 프로모터 특이적IFT88의 발현 또는 활성을 억제할 수 있는 억제제를 유효성분으로 포함하는 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명에서는 myh11 프로모터 특이적으로 ift88 유전자가 결손되도록 만들어진 알츠하이머 마우스 모델의 뇌에서 혈관의 끊어짐이 현저하게 사라지는 것을 확인하였으며, 또한, 뇌 혈관 끊어짐 감소 효과가 아밀로이드 베타 발현의 억제에 기인하는 것을 확인하였다. 구체적으로 본 발명에서는 알츠하이머 마우스 모델에서 myh11 프로모터 특이적으로 IFT88 유전자의 발현을 억제 또는 IFT88 유전자를 넉아웃 시킬 경우, 아밀로이드 베타 단백질의 발현을 억제하여 뇌신경세포의 손상을 효과적으로 감소시킬 수 있음을 확인하였는 바, myh11 프로모터 특이적 IFT88 유전자 조절이 알츠하이머와 같은 아밀로이드 단백질 관련 질환의 치료를 위한 새로운 치료 방법이 될 수 있음을 확인하였고, 궁극적으로 IFT88의 발현 또는 활성 억제제가 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료를 위한 치료제로 사용 가능함을 알 수 있었다.

Description

IFT88 억제제를 유효성분으로 함유하는 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물{Composition for preventing or treating neurodegenerative diseases comprising IFT88 inhibitor as an active ingredient}

본 발명은 IFT88(Intraflagellar transport protein 88 homolog) 억제제의 신경퇴행성 질환의 치료 용도에 관한 것으로, 자세하게는 myh11 프로모터 특이적IFT88의 발현 또는 활성을 억제할 수 있는 억제제를 유효성분으로 포함하는 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

뇌(brain)와 척수 (spinal cord)로 구성된 중추신경계는 생명현상을 운영하는 중심센터로서 감각과 (불)수의적인 운동에서부터 사고, 기억, 감정, 언어 등에 이르기까지 인체의 모든 기능을 총괄하는 아주 필수적인 기관이다. 따라서 뇌졸중, 외상 등으로 야기된 급행적인 신경세포의 사멸이나, 알츠하이머병으로 대표되는 노인성 치매, 파킨슨 질환 등과 같은 중추신경계 퇴행성 질환을 유발시키는 서행적인 신경세포의 사멸 등과 같은 모든 경우에서는 곧바로 신경회로망의 비가역적인 기능장애를 초래하게 되며 결국에는 해당 인체 기능의 영구적인 손실을 초래하게 된다. 알츠하이머병으로 대표되는 노인성 치매는 인간 평균수명의 연장과 의료복지시설의 현대화와 맞물려 비례적으로 증가하는 특성을 가지고 있다. 보건사회연구원 통계조사에 다르면 우리나라의 노인인구가 2000년에 7%를 넘어 고령사회에 진입한 이래 2003년 397만 명으로 노인인구의 비율이 8.3%에 이르렀고 2019년에는 14.4%에 이르러 완전고령사회에 진입할 것으로 예견된다. 65세 이상 노인인구 중 한 가지 이상 만성질환을 가지고 있는 노인은 에 이르며 특히 65세 이상 노인의 치매 유병율도 8.2%로 추정된다. 서구사회에서는 65세 이상인구의 약 10%, 80세 이상인구의 약 40 ~ 50%에서 알츠하이머병이 발생하고 있으며, 이미 미국에서는 이 질환 환자가 500만 명 이상으로 이로 인한 의료비 지출이 연간 1000억 달러로 추정되고 있다. 또한, 우리나라에서는 약 20만 명 이상이 치매 환자인 것으로 나타났다. 미국의 경우 2030년까지 현재의 2배 규모로 증가하고, 2050년까지는 350% 이상 늘어난 1,400만 명에 달할 것으로 추정되고 있다.

인지 기능 장애로 시작되는 알츠하이머병은 인간 본성이 파괴되며 장기간에 걸쳐 진행되는 퇴행성 질환이기 때문에 환자를 수용하는 수동적인 방법으로는 도저히 사회 경제적 부담을 감당할 수가 없으므로 예방제 및 원인 치료제를 개발하는 적극적인 시도를 해야 한다. 그러나 현재까지는 알츠하이머 질환의 근본적인 발병원인을 치료할 수 있는 치료제는 개발되어 있지 않으며, 일반적인 치료제로서 사용 가능한 것으로는 아세틸콜린 에스테라제 저해제인 화이자사의 아리셉트(Aricept), 노바티스사의 엑셀론(Exelon), 그리고 얀센사의 레미닐(Reminyl)과 최근에 미국 FDA로부터 허가를 받은 NMDA수용체의 길항제 기전의 룬드벡사의 에빅사(Ebixa; Memantine)가 있다. 그러나 아세틸콜린 에스테라제 저해제의 경우는 감퇴된 인지 능력을 개선해 줄 뿐 알츠하이머 질환의 근본적인 발병 원인을 치료하지는 못한다. 또한, 단지 일부 환자의 경우 (약 40-50%)에서 일시적인 증세 완화 효과를 보이며, 그 약효가 오래 지속되지 못하므로 근본적인 치료제라 하기 어렵다. 또한 질환의 특성상 장기 복용을 요하게 되는데, 상기 의약품들의 경우 간 독성, 구토, 식욕감퇴를 비롯한 여러 가지 부작용을 수반하는 등의 문제점을 안고 있다. 따라서 질환의 진행 과정을 막아 줄 수 있는 치료제의 개발이 시급한 과제가 되고 있다. 이를 위해서 많은 다국적 제약회사들이 이 분야에 대한 연구 개발에 막대한 투자를 하고 있으며 특히 알츠하이머 질환의 근본적인 발병 원인으로 추정되고 있는 40여개의 아미노산으로 구성된 베타-아밀로이드의 생성량을 감소시키는 베타 또는 감마 시크리테아제 저해제의 개발이 그 주종을 이루고 있다. 국내의 경우 알츠하이머 질환에 대한 기초 연구는 어느 정도 이루어지고 있으나 치매 치료제 개발 그 자체의 경우는 거의 전무한 실정이라고 사료된다. 감마 시크리테아제(secretase) 저해제의 경우 동물 실험 모델에서뿐만 아니라 최근의 임상 실험 결과에서도 상당한 독성을 수반함으로써 그 전망이 불투명하다. 비교적 연구 개발 기간은 상대적으로 짧으나 베타-시크리테아제의 경우에 유전자 결핍 형질 전환 동물모델의 결과에서도 나타난 것처럼 좀 더 안전하고도 효율적인 치매 치료제 개발을 위한 타겟으로써 유망하다고 할 수 있다. 또한 베타-아밀로이드의 응집에 관여하는 인자를 타겟으로 하는 것도 비교적 안전하게 효과를 보는 것으로 생각되고 있다.

한편, IFT88은 테트리코펩타이드반복(TPR) 계열의 구성원을 암호하며, 마우스에서 유사한 유전자의 돌연변이는 다낭성 신장 질환을 일으킬 수 있음이 알려져 있다. 그러나 IFT88과 알츠하이머 병과의 관련성에 관한 연구는 전무한 실정이다.

이에 본 발명자들은, myh11 프로모터 특이적으로 ift88 유전자가 결손되도록 만들어진 알츠하이머 마우스 모델의 뇌에서 혈관의 끊어짐이 현저하게 사라지는 것을 확인하였으며, 또한, 뇌혈관 끊어짐 감소 효과가 아밀로이드 베타 발현의 억제에 기인하는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

한국등록특허 제10-1823531호

따라서 본 발명의 목적은 IFT88의 발현 또는 활성 억제제를 이용하여 신경퇴행성 질환을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있는 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 IFT88의 발현 또는 활성 억제제를 이용하여 신경퇴행성 질환의 치료제로서 유용한 화합물, 추출물, 분획물, 기타 단백질 등과 같은 의약품 소재(후보물질)를 스크리닝/또는 선별할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 IFT88의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 IFT88는 서열번호 1 또는 서열번호 2로 기재되는 폴리뉴클레오티드로 이루어진 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 IFT88 발현 억제제는 IFT88 유전자 또는 IFT88의 발현을 촉진하는 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, siRNA, shRNA 및 리보자임으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 신경퇴행성 질환은 치매, 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 아밀로이드증(Amyloidosis), 파킨슨병(Parkinson's disease), 루게릭병(Lou Gehrig's disease), 헌팅턴병(Huntington's disease), HIV 연관 치매(HIV-associated dementia), 루이체 치매(Lewy body dementia), 다발성 경화증(multiple sclerosis), 프리온 질환(Prion disease), C형 니이먼-픽씨병(Niemann-Pick Type C, NPC) 및 간질(epilepsia)로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 IFT88은 주피세포(pericyte)에서 myh11 프로모터에 의해 특이적으로 발현이 조절되는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 IFT88의 발현 또는 활성 억제제는 주피세포(pericyte)에서 myh11 프로모터 특이적으로 IFT88의 발현 또는 활성을 억제시키는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은, a) 후보물질을 생물학적 시료에 처리하는 단계; 및 b) 상기 a)단계의 생물학적 시료에서 IFT88의 mRNA 또는 단백질의 발현양 변화를 측정하는 단계를 포함하는, 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료물질의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 생물학적 시료는 퇴행성 신경질환에 걸린 동물의 혈액, 소변, 타액, 조직으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 mRNA 발현양 변화는 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Realtime RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting) 및 DNA 칩으로 이루어진 군 중 선택된 1 종 이상의 방법을 이용하여 측정하는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 단백질 발현양 변화는 웨스턴 블롯팅, ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS) 및 단백질 칩(protein chip)로 이루어진 군 중 선택된 1종 이상의 방법을 이용하여 측정하는 것일 수 있다.

본 발명에서는 myh11 프로모터 특이적으로 ift88 유전자가 결손되도록 만들어진 알츠하이머 마우스 모델의 뇌에서 혈관의 끊어짐이 현저하게 사라지는 것을 확인하였으며, 또한, 뇌혈관 끊어짐 감소 효과가 아밀로이드 베타 발현의 억제에 기인하는 것을 확인하였다. 구체적으로 본 발명에서는 알츠하이머 마우스 모델에서 myh11 프로모터 특이적으로 IFT88 유전자의 발현을 억제 또는 IFT88 유전자를 넉아웃 시킬 경우, 아밀로이드 베타 단백질의 발현을 억제하여 뇌신경세포의 손상을 효과적으로 감소시킬 수 있음을 확인하였는 바, myh11 프로모터 특이적 IFT88 유전자 조절이 알츠하이머와 같은 아밀로이드 단백질 관련 질환의 치료를 위한 새로운 치료 방법이 될 수 있음을 확인하였고, 궁극적으로 IFT88의 발현 또는 활성 억제제가 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료를 위한 치료제로 사용 가능함을 알 수 있었다.

도 1은 대뇌 피질(Cortex) 조직에서 주피세포 마커로 잘 알려진 Pdgfr-b와 myh11-cre;Ai6의 발현되는 위치를 면역조직화학염색을 통해 확인한 결과이다.
도 2는 망막(Retina) 조직에서 내피세포 마커인 pecam과 myh11-cre;Ai6의 발현되는 위치를 면역조직화학염색을 통해 확인한 결과이다.
도 3은 Myh11-cre;Ai6, Myh11-cre;Tg6799;Ai6, Myh11-cre;ift88flx/flx;Tg6799;Ai6 및 Myh11-cre;ift88flx/+;Tg6799;Ai6 동물모델의 뇌 조직에서 혈관 형성 정도를 면역조직화학염색을 통해 확인한 결과이다.
도 4는 Myh11-cre;Ai6 및 Myh11-cre;Tg6799;Ai6 동물모델의 망막 조직에서 혈관 형성 정도를 면역조직화학염색을 통해 확인한 결과이다.
도 5는 마우스 뇌 조직에서 Myh11-cre;Ai6 및 아밀로이드 베타 펩티드의 발현 양상을 면역조직화학염색을 통해 확인한 결과이다.
도 6은 Myh11-cre;Ai6, Myh11-cre;Tg6799;Ai6 및 Myh11-cre;ift88flx/flx;Tg6799;Ai6 동물모델에서 Myh11-cre;Ai6 및 아밀로이드 베타 펩티드의 발현 양상을 면역조직화학염색을 통해 확인한 결과이다.
도 7은 Myh11-cre;Ai6, Myh11-cre;Tg6799;Ai6 및 Myh11-cre;ift88flx/flx;Tg6799;Ai6 동물모델에서 Myh11-cre;Ai6 및 아밀로이드 베타 펩티드의 발현 양상과 더불어 ICAM1 발현 양상을 면역조직화학염색을 통해 확인한 결과이다.
도 8은 Myh11-cre;Ai6, Myh11-cre;Tg6799;Ai6 및 Myh11-cre;ift88flx/flx;Tg6799;Ai6 동물모델에서 미세교세포(Microglial cell)의 발현 양상을 면역조직화학염색을 통해 확인한 결과이다.
도 9는 Myh11-cre;Tg6799;Ai6 및 Myh11-cre;ift88flx/flx;Tg6799;Ai6 동물모델에서 뇌에 축적된 아밀로이드-베타 단백질의 양을 웨스턴 블랏 분석을 통해 확인한 것이다(도 9a: soluble fraction, 도 9b: insoluble fraction).

본 발명은 IFT88(Intraflagellar transport protein 88 homolog)의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 신경퇴행성 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공한다.

상기 조성물은 약학적 조성물 또는 식품 조성물을 포함한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에서는 알츠하이머 마우스 모델에서 조직 특이적 프로모터인 myh11 프로모터 및 cre-loxP 삭제 시스템을 이용하여 IFT88 유전자를 넉아웃(Knock-ou) 시키는 경우 알츠하이머 마우스 모델의 뇌에서 혈관의 끊어짐이 현저하게 사라지는 것을 확인하였으며, 또한, 뇌 혈관 끊어짐 감소 효과가 아밀로이드 베타 발현의 억제에 기인하는 것을 확인함으로써, IFT88 유전자가 알츠하이머와 같은 아밀로이드 단백질 관련 질환의 치료를 위한 표적 유전자로 활용될 수 있음을 최초로 규명하였다.

상기 IFT88 유전자는 예를 들어, Gene ID: 21821[Mus musculus (house mouse)]; Gene ID: 8100[Homo sapiens (human)]; Gene ID: 305918[Rattus norvegicus (Norway rat)]; Gene ID: 321855[Danio rerio (zebrafish)]; Gene ID: 100519103transport 88 [Sus scrofa (pig)]; Gene ID: 514177[Bos taurus (cattle)]; Gene ID: 452461 [Pan troglodytes (chimpanzee)]; Gene ID: 703874[Macaca mulatta (Rhesus monkey)]; Gene ID: 100490149[Xenopus tropicalis (tropical clawed frog)]; Gene ID: 477345[Gallus gallus (chicken)]; Gene ID: 100054328[Equus caballus (horse)]; Gene ID: 101083054[Felis catus (domestic cat)] 등을 예시할 수 있다.

또한 본 발명의 IFT88 유전자는 상기 예시한 유전자 DNA를 바탕으로 하는 mRNA 및 이에 대한 cDNA일 수 있다.

본 발명의 일구체예에서, 상기 IFT88의 유전자는 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다.

본 발명의 상기 IFT88의 발현 억제제는 IFT88 유전자 또는 IFT88의 발현을 촉진하는 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, 짧은 헤어핀 RNA(small hairpin RNA; shRNA), 작은 간섭 RNA(small interfering RNA; siRNA) 및 리보자임(ribozyme)으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있다.

상기 siRNA는 상기 표적서열에 상동인 독립적인 센스 RNA 가닥 및 이에 상보적인 안티센스 RNA 가닥을 포함하거나 상기 센스 RNA 가닥 및 안티센스 RNA 가닥이 루프에 의해 연결된 스템-루프 구조의 단일 RNA 가닥일 수 있다. 자세하게는, IFT88 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA의 염기서열 내에서 선택되는 15 내지 30머(mer)의 센스서열 및 상기 센스 서열에 상보적으로 결합하는 안티센스 서열로 구성될 수 있으며, 이때, 상기 센스 서열은 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 25개의 염기로 구성될 수 있다.

상기 siRNA는 RNA끼리 짝을 이루는 이중사슬 RNA 부분이 완전히 쌍을 이루는 것에 한정되지 않고, 스템-루프(stem-loop)의 구조를 이루는 헤어핀 구조를 가질 수 있는데, 이를 특히 shRNA(short hairpin RNA)라 지칭한다. 한편, 상기 이중사슬 또는 스템 부위는 미스매치(대응하는 염기가 상보적이지 않음), 벌지(일방의 사슬에 대응하는 염기가 없음) 등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분이 포함될 수도 있다. 전체 길이는 10 내지 80 염기, 바람직하게는 15 내지 60 염기, 더욱 바람직하게는 20 내지 40 염기이다. 또한, 상기 루프 영역은 서열에 특별한 의미가 없으며, 단지 센스서열과 안티센스서열을 적당한 간격으로 연결하기 위하여 3-10 정도의 염기를 가지고 있으면 족하다. 종래에 siRNA의 루프 영역으로 많이 사용되어온 예들은 다음과 같다: AUG(Sui et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99(8):5515-5520, 2002), CCC, CCACC 또는 CCACACC(Paul et al., Nature Biotechnology 20:505-508, 2002), UUCG(Lee et al., Nature Biotechnology 20:500-505), CTCGAG, AAGCUU(Editors of Nature Cell Biology Whither RNAi, Nat Cell Biol. 5:489-490, 2003), UUCAAGAGA(Yu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99(9):6047-6052, 2002) 및 TTGATATCCG(www.genscript.com의 default spacer). siRNA 말단 구조는 평활(blunt)말단 혹은 점착(cohesive) 말단 모두 가능하다. 점착 말단 구조는 3' 말단 돌출한 구조(protruding structure)와 5' 말단 쪽이 돌출한 구조가 모두 가능하고 돌출하는 염기 수는 한정되지 않는다. 예를 들어, 염기 수로는 1 내지 8 염기, 바람직하게는 2 내지 6 염기로 할 수 있다. 또한, siRNA는 표적유전자의 발현억제 효과를 유지할 수 있는 범위에서 예를 들어, 한쪽 말단의 돌출 부분에 저분자 RNA(예를 들어, tRNA, rRNA, 바이러스 RNA와 같은 천연의 RNA분자 또는 인공의 RNA분자)를 포함할 수 있다. siRNA 말단구조는 양측 모두 절단 구조를 가질 필요는 없고, 이중사슬 RNA의 일방의 말단 부위가 링커 RNA에 의하여 접속된 스템 루프형 구조일 수도 있다. 링커의 길이는 스템 부분의 쌍을 이루는 데 지장이 없는 길이면 특별히 한정되지 않는다.

상기 안티센스 뉴클레오티드는 왓슨-크릭(Watson-Crick) 염기쌍에 정의된 바에 따라, DNA, 미성숙-mRNA 또는 성숙된 mRNA의 상보적 염기서열에 결합(혼성화)하여 DNA에서 단백질로서 유전정보의 흐름을 방해하는 것이다. 표적 서열에 특이성이 있는 안티센스 뉴클레오티드의 성질은 그것들을 예외적으로 다기능이 되도록 한다. 안티센스 뉴클레오티드는 모노머 단위의 긴 사슬이기 때문에 이들은 표적 RNA 서열에 대해 쉽게 합성될 수 있다. 최근 많은 연구들은 표적 단백질을 연구하기 위한 생화학적 수단으로 안티센스 뉴클레오티드의 유용성을 증명하였다(Rothenberg et al., J. Natl. Cancer Inst., 81:1539-1544, 1999). 올리고뉴클레오티드 화학 및 향상된 세포흡착, 표적결합의 친화도 및 뉴클레아제(nuclease) 내성을 나타내는 뉴클레오티드 합성 분야에서 최근 많은 진보가 있었으므로 안티센스 뉴클레오티드의 사용은 새로운 형태의 억제제로 고려될 수 있다.

상기 siRNA는 센스 RNA 가닥과 상보적인 안티센스 RNA 가닥을 포함하고, 이들 두 가닥은 표준 왓슨-크릭 염기쌍 상호작용에 의해서 서로 결합(annealing)한다(이하 "염기쌍을 형성한(base-paired)"으로 표현함). 상기 센스가닥은 표적 mRNA 내의 표적서열에 동일한 핵산서열을 포함한다. siRNA의 표적서열을 선택할 수 있는 기술은 예를 들면 문헌 (Tuschl T 등, "The siRNA User Guide" revised Oct. 11, 2002)에 기술되어 있다.

더불어, 본 발명에 따른 siRNA에서, 센스 RNA 가닥 및/또는 안티센스 RNA가닥은 이의 당 부분, 뉴클레오베이스 부분 또는 인터뉴클레오타이드 구조 내에 최소한 1개의 화학적 변형을 포함하는 것이 가능하다. 이러한 변형은 생체 내에서 뉴클레아제에 의해 siRNA의 파괴를 저해하는 것을 가능하게 할 수 있다. 본 발명에 따른 siRNA의 안정성과 생적합성을 생체 내에서 향상시킬 수 있는 모든 화학적 변형이 본 발명의 범위에 포함된다. 당 부분에 대한 바람직한 변형 중에서, 언급될 수 있는 것은 2'-데옥시, 2'-플루오로, 2'-아미노, 2'-티오, 또는 2'-O-알킬과 같은 리보오스의 포지션 2', 그리고 바람직하게는 리보뉴클레오타이드 상의 정상 2'-OH 그룹을 대체하는 2'-O-메틸 또는 LNA의 포지션 2' 및 4' 사이에 있는 메틸렌 브릿지의 존재에서 일어나는 변형이다. 뉴클레오베이스의 경우, 5-브로모-유리딘, 5-이오도-유리딘, N3-메틸-유리딘, 2,6-디아미노퓨린(DAP, 5-메틸-2'-데옥시시티딘, 5-(1-프로피닐)-2'-데옥시-유리딘(pdU), 5-(1-프로피닐)-2'-데옥시시티딘(pdC)과 같은 변형된 염기 또는 콜레스테롤과 결합한 염기를 이용하는 것이 가능하다. 마지막으로, 인터뉴클레오타이드 골격의 바람직한 변형은 스포로티오에이트(phosphorothioate), 메틸포스포네이트, 포스포로디아미데이트 그룹에 의한 골격에 있는 포스포디에스터 그룹을 치환하는 것을 포함하거나, 펩타이드 결합에 의해 연결된 N-(2-아미노에틸)-글리신(PNA, 펩타이드 핵산)으로 구성되는 골격을 이용한다. 다양한 변형(염기, 당, 골격)은 몰포리노(morpholino) 타입의 변형된 핵산(몰포린 링에 고정되고 포스포로디아미데이트 그룹에 의해 연결된 염기) 또는 PNA(펩타이드 결합에 의해 연결된 N-(2-아미노에틸)-글리신 단위에 고정된 염기)에 결합될 수 있다.

상기 siRNA는 "분리된 것"이며, 이는 자연 상태에 있지 않은 것을 의미하지만 인간의 개입과 관련된 모든 수단에 의해 얻어질 수 있는 것을 의미한다. 특히, 본 발명에 따른 siRNA는 화학적 합성, 중합효소 연쇄반응(PCR)에 의한 요구되는 뉴클레오타이드 서열의 증폭, 또는 재조합 합성에 의해 이미 존재하는 siRNA를 정제함으로써 얻어질 수 있다.

본 발명의 일구체예에서, 상기 siRNA는 서열번호 3 내지 서열번호 6으로 표시되는 폴리뉴클레오타이드 중 선택되는 1종의 siRNA일 수 있으나, IFT88 유전자를 타겟팅할 수 있는 siRNA라면 특별히 그 종류를 제한하지 않는다.

본 발명의 상기 IFT88의 활성 억제제는 IFT88 단백질에 특이적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 모방체, 기질유사체, 앱타머 및 항체로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상인 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 IFT88의 단백질은 GenBank 등록번호(Accession number) XP_011243310.1, XP_006518875.1, XP_006518874.1, XP_006518873.1, Q61371.2, NP_033402.2, EDL36171.1, AAH12250.1, AAG37228.1, NP_001305422.1, NP_001340499.1, NP_001340505.1, NP_001340507.1, NP_001340496.1, NP_001340506.1, NP_001340497.1, NP_001340502.1, NP_001340501.1, NP_001340504.1, NP_001340500.1, NP_001340503.1, NP_001340508.1, NP_001340498.1, NP_001340495.1, NP_001340494.1, NP_001305422.1, NP_001305420.1, NP_783195.2, NP_006522.2, Q13099.2. 등을 예시할 수 있다.

본 발명의 일구체예에서, 상기 IFT88의 단백질은 서열번호 7 또는 서열번호 8로 표시되는 폴리펩타이드로 이루어질 수 있다.

본 발명에서, IFT88의 단백질은 상기 서열번호 7 또는 서열번호 8로 표시되는 아미노산 서열 또는 이와 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 7 또는 서열번호 8로 표시되는 아미노산 서열과 실질적으로 동등한 기능을 나타내는 아미노산 서열로 이루어질 수 있다.

따라서, 본 발명에 따른 IFT88의 단백질의 범위는 서열번호 7 또는 서열번호 8로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. ‘기능적 동등물’이란 아미노산의 부가, 치환, 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 1로 표시된 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 7 또는 서열번호 8로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다.

또한, 상기 IFT88의 단백질은 IFT88의 단백질의 단편, 유도체 및 유사체(analogues)를 포함한다. 본원에 사용된, 용어 ‘단편’, ‘유도체’ 및 ‘유사체’는 본 발명의 IFT88의 단백질과 실질적으로 같은 생물학적 기능 또는 활성을 보유하는 폴리펩티드를 말한다. 본 발명의 단편, 유도체 및 유사체는 (i) 하나 이상의 보존적(conservative) 또는 비보존적 아미노산 잔기(바람직하게는 보존적 아미노산 잔기)가 치환된 폴리펩티드(상기 치환된 아미노산 잔기는 유전 암호에 의해 암호화될 수도, 되지 않을 수도 있다) 또는 (ⅱ) 하나 이상의 아미노산 잔기에서 치환기(들)를 가지는 폴리펩티드, 또는 (ⅲ) 또 다른 화합물(폴리펩티드의 반감기를 연장할 수 있는 화합물, 예를 들면 폴리에틸렌 글리콜)과 결합된 성숙 폴리펩티드로부터 유래된 폴리펩티드, 또는 (ⅳ) 부가적인 아미노산 서열(예를 들면, 선도 서열, 분비 서열, 상기 폴리펩티드를 정제하는데 사용된 서열, 프로테이노젠(proteinogen) 서열 또는 융합 단백질)과 결합된 상기 폴리펩티드로부터 유래된 폴리펩티드일 수 있다. 본 발명에 정의된 상기 단편, 유도체 및 유사체는 당업자에 잘 알려져 있다.

본 발명의 유효성분에 해당하는 IFT88 단백질에 특이적으로 결합하는 IFT88의 활성 억제제는 화합물, 펩티드, 펩티드 모방체, 기질유사체, 앱타머 및 항체로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있다.

상기 펩티드 모방체(Peptide mimetics)는 IFT88 단백질의 결합 도메인을 억제하여 IFT88 단백질의 활성을 억제하는 것이다. 펩티드 모방체는 펩티드 또는 비펩티드일 수 있고, psi 결합과 같은, 비펩티드 결합에 의해 결합된 아미노산으로 구성될 수 있다. 또한, "구조적으로 강제된(conformationally constrained)" 펩티드, 사이클릭 모방체(cyclic mimetics), 적어도 하나의 엑소사이클릭 도메인(exocyclic domain), 결합 부분(결합 아미노산) 및 활성 부위를 포함하는 사이클릭 모방체일 수 있다. 펩티드 모방체는 IFT88 단백질의 이차구조 특성과 유사하게 구조화되고 항체 또는 수용성 수용체와 같은 거대한 분자의 억제 특성을 모방할 수 있으며, 천연의 길항제와 동등한 효과로 작용할 수 있는 신규한 소분자일 수 있다.

상기 앱타머(aptamer)는 단일 사슬 DNA 또는 RNA 분자로서, SELEX(systematic evolution of ligands by exponential enrichment)라 불리는 올리고 뉴클레오티드 (oligonucleotide) 라이브러리를 이용한 진화적인 방법에 의해 특정 화학 분자나 생물학적 분자에 높은 친화력과 선별력을 갖고 결합하는 올리고머를 분리하여 수득할 수 있다. 앱타머는 표적에 특이적으로 결합하고 표적의 활성을 조정할 수 있는데, 예컨대, 결합을 통하여 표적의 기능을 차단할 수 있다.

상기 항체는 IFT88에 특이적이고 직접적으로 결합하여 IFT88의 활성을 효과적으로 억제할 수 있다. 상기 IFT88에 특이적으로 결합하는 항체로는 폴리클로날(polyclonal) 항체 또는 모노클로날(monoclonal) 항체를 사용하는 것이 바람직하다. 상기 IFT88에 특이적으로 결합하는 항체는 당업자에게 알려진 공지의 방법으로 제작하여도 무방하며, 상업적으로 알려진 IFT88 항체를 구입하여 사용할 수 있다. 상기 항체는 당업자에게 알려진 종래 방법에 따라 면역원인 IFT88 단백질을 외부 숙주에 주사함으로써 제조될 수 있다. 외부 숙주는 마우스, 랫트, 양, 토끼와 같은 포유동물을 포함한다. 면역원은 근육 내, 복강 내 또는 피하 주사방법으로 주사되며, 일반적으로 항원성을 증가시키기 위한 보조제(adjuvant)와 함께 투여할 수 있다. 외부 숙주로부터 정기적으로 혈액을 채취하여 형성된 역가 및 항원에 대한 특이성을 보이는 혈청을 수거하여 항체를 분리할 수 있다.

본 발명의 신경퇴행성 질환은 치매, 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 아밀로이드증(Amyloidosis), 파킨슨병(Parkinson's disease), 루게릭병(Lou Gehrig's disease), 헌팅턴병(Huntington's disease), HIV 연관 치매(HIV-associated dementia), 루이체 치매(Lewy body dementia), 다발성 경화증(multiple sclerosis), 프리온 질환(Prion disease), C형 니이먼-픽씨병(Niemann-Pick Type C, NPC) 및 간질(epilepsia)로 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 일구체예에서, 상기 IFT88은 주피세포(pericyte)에서 myh11 프로모터에 의해 특이적으로 발현이 조절될 수 있다.

본 발명의 다른 구체예에서, 상기 IFT88의 발현 또는 활성 억제제는 주피세포(pericyte)에서 myh11 프로모터 특이적으로 IFT88의 발현 또는 활성을 억제시킬 수 있다.

본 발명의 조성물은 상기 IFT88의 발현 억제제 또는 활성 억제제와 함께 IFT88의 발현 또는 활성 억제 효과를 갖는 공지의 유효성분을 1 종 이상 함유할 수 있다.

본 발명의 조성물이 약학적 조성물인 경우 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조될 수 있다.

경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 상기 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로오스(sucrose), 락토오스(lactose) 또는 젤라틴 등을 섞어 제조될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘스테아레이트(magnesium stearate), 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제 및 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라, 경구 또는 비경구로 투여될 수 있으며, 비경구 투여시 피부 외용 또는 복강내, 직장, 정맥, 근육, 피하, 흉부내 또는 뇌혈관내 주사 주입방식을 선택하는 것이 바람직하다.

본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도에 따라 그 범위가 다양하며, 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 개별 투약량은 구체적으로 유효 약물이 1회에 투여되는 양을 함유한다.

일일 투여량은 siRNA의 양을 기준으로 0.6 내지 1.2 ㎎/㎏이고, 바람직하게는 0.7 내지 1.1 ㎎/㎏이고, 더욱 바람직하게는 0.8 내지 1.1 ㎎/㎏이며, 하루 1회 투여되고 이때 여러 부위에 나누어 투여될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 IFT88의 발현 억제제 또는 활성 억제제는 신경퇴행성 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품에 첨가될 수 있다. 본 발명의 IFT88의 발현 억제제 또는 활성 억제제를 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 발현 억제제 또는 활성 억제제를 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.

본 발명의 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당 및 과당과 같은 모노사카라이드, 말토오스 및 수크로오스와 같은 디사카라이드, 덱스트린 및 시클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 및 자일리톨, 소르비톨 및 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다.

상기 외에 본 발명의 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 식품 조성물은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.

또한, 본 발명은 myh11 프로모터 염기서열; Cre 재조합 효소를 코딩하는 염기서열; Cre 재조합 효소가 특이적으로 인식하는 첫 번째 loxP 염기서열; IFT88 염기서열; 및 Cre 재조합 효소가 특이적으로 인식하는 두 번째 loxP 염기서열을 포함하는, IFT88 유전자 적중 재조합 벡터를 유효성분으로 포함하는 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 벡터는 추가적으로 리포터 유전자의 염기서열을 더 포함할 수 있다.

상기 벡터는 cre-loxP 시스템을 이용하여 IFT88 유전자 적중시킬 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 조성물의 치료적 유효량을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다.

본 발명의 치료방법은 본 발명의 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 치료적 유효량으로 투여하는 것을 포함한다. 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치에 의해 결정될 수 있다는 것은 당업자에게 자명한 일이다. 특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다. 따라서 본 발명의 목적에 적합한 조성물의 유효량은 전술한 사항을 고려하여 결정하는 것이 바람직하다.

또한, 경우에 따라, 본 발명의 조성물과 함께 공지의 신경퇴행성 질환 치료제를 병용 투여하여 퇴행성 신경질환 치료의 효과를 증대시킬 수 있다.

본 발명은 신경퇴행성 질환을 갖는 임의의 포유동물에 적용가능하고, 상기 포유동물은 인간 및 영장류뿐만 아니라, 소, 돼지, 양, 말, 개 및 고양이 등의 가축을 포함한다.

또한, 본 발명은 a) 후보물질을 생물학적 시료에 처리하는 단계; 및 b) 상기 a)단계의 생물학적 시료에서 IFT88의 mRNA 또는 단백질의 발현양 변화를 측정하는 단계를 포함하는, 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료물질의 스크리닝 방법을 제공한다.

상기 시료는 퇴행성 신경질환에 걸린 동물의 혈액, 소변, 타액, 조직을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

상기 mRNA 발현양 변화를 측정하는 방법은 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Realtime RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting) 및 DNA 칩을 포함한다.

상기 단백질 발현양 변화를 측정하는 방법은 웨스턴 블롯팅, ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS) 및 단백질 칩(protein chip)을 포함한다.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예들은 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예>

1. 실험방법

<1-1> 모델 준비

Myh11 cre 마우스와 ift88 flox/flox 마우스는 각각 중앙실험동물을 통하여 미국에서 수입하였으며, Tg6799는 생명공학연구원, Ai6 마우스는 한국뇌연구원 오원종박사로부터 분양 받아 사용하였다. 한편, 하기 실험에서 사용한 Myh11-cre;Ai6, Myh11-cre;Tg6799;Ai6, Myh11-cre;ift88flx/flx;Tg6799;Ai6 및 Myh11-cre;ift88flx/+;Tg6799;Ai6는 마우스의 교배를 통해 얻었다. 이 모든 유전형 발현 마우스들을 몇 대에 거쳐 교차 교배하여 각각의 유전형을 동시에 발현하는 개체들을 얻어서 genotyping을 통해 유전형을 확인하였고, 본 발명에 사용하였다.

가. Myh11 cre 마우스

수입처: The Jackson Laboratory

Stock Number: 019079

Strain Name: B6.FVB-Tg(Myh11-cre/ERT2)1Soff/J

사용에 자세한 정보: https://www2.jax.org/protocolsdb/f?p=116:1:0::NO:::

나. ift88 마우스

수입처: The Jackson Laboratory

Stock Number: 022409

Strain Name: B6.129P2-Ift88tm1Bky/J

사용에 자세한 정보: https://www2.jax.org/protocolsdb/f?p=116:1:0::NO:::

다. Tg6799(PSEN1) 마우스

수입처: The Jackson Laboratory

Stock Number: 006554

Strain Name: B6SJL-Tg(APPSwFlLon,PSEN1*M146L*L286V)6799Vas/Mmjax

사용에 자세한 정보: https://www2.jax.org/protocolsdb/f?p=116:1:0::NO:::

상기 마우스 모델은 B6SJL-Tg(APPSwFlLon,PSEN1*M146L*L286V)6799Vas/Mmjax 유전자가 발현되도록 만든 마우스로서, Tg6799+/-는 APP KM670/671NL (Swedish), APP I716V (Florida), APP V717I (London), PSEN1 M146L (A>C), PSEN1 L286V의 5개의 돌연변이 유전자를 발현하며 일반적으로 알츠하이머 질환 연구에 사용되는 마우스이다. 상기 마우스 모델은 하기 실험에서 알츠하이머 유도 모델로 사용하였다.

라. Ai6(ZsGreen1) 마우스

수입처: The Jackson Laboratory

Stock Number: 007906

Strain Name: B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm6(CAG-ZsGreen1)Hze/J

사용에 자세한 정보: https://www2.jax.org/protocolsdb/f?p=116:1:0::NO:::

마. Myh11-cre;Ai6 마우스

Myh11-cre(The Jackson Laboratory, Stock Number: 019079) 및 Ai6(The Jackson Laboratory, Stock Number: 007906) 두가지 마우스의 교배를 통해 두가지 형질을 가진 마우스를 얻었다.

상기 마우스 모델은 myh11 프로모터 특이적으로 cre가 발현되고 Ai6 flox/flox가 발현되므로, 결과적으로 myh11가 발현되는 특이적 부분(pericyte)에서만 cre가 발현되어 Ai6의 flox/flox site를 인지하여 cre-loxP system의 원리로 Ai6(green fluorescence)를 발현하게 된다. 상기 마우스 모델은 하기 실험에서 대조군(정상적인 모델)로 사용하였다.

바. Myh11-cre;Tg6799;Ai6 마우스

Myh11-cre(The Jackson Laboratory, Stock Number: 019079), Ai6(The Jackson Laboratory, Stock Number: 007906) 및 Tg6799(The Jackson Laboratory, Stock Number: 006554) 세 가지 마우스의 교배를 통하여 세 개의 형질을 모두 가진 마우스를 얻었다.

상기 마우스 모델은 myh11 프로모터 특이적으로 Ai6를 발현하도록 만든 유전형질을 가지며, Tg6799의 유전형도 함께 발현하므로 알츠하이머 질환을 가지는 마우스이다. 상기 마우스 모델은 하기 실험에서 알츠하이머 유도 모델이며 myh11 프로모터에 대한 control 모델로 사용하였다. 즉, myh11 프로모터 특이적으로 어떠한 유전자 변이 작용도 일어나지 않으나 변이 유발 유전자는 지니고 있는 모델이다.

사. Myh11-cre;ift88flx/flx;Tg6799;Ai6 마우스

Myh11-cre(The Jackson Laboratory, Stock Number: 019079), ift88(The Jackson Laboratory, Stock Number: 022409), Tg6799(The Jackson Laboratory, Stock Number: 006554) 및 Ai6(The Jackson Laboratory, Stock Number: 007906) 네 가지 마우스의 교배를 통하여 네 개의 형질을 모두 가진 마우스를 얻었다. 상기에서 언급된 ift88flx/flx 마우스는 두 개의 유전체에서 모두 ift88flox 유전형을 발현하는 호모타입(homo type)을 의미한다.

상기 마우스 모델은 Myh11 프로모터 특이적으로 발현한 cre가 ift88 flox/flox와 반응하여 ift88을 넉아웃(knockout) 시키도록 만든 모델이다. 동시에 Tg6799와 Ai6도 함께 발현하므로 알츠하이머를 가지고 myh11 프로모터에 반응하는 타겟은 Ai6(green fluorescence)를 함께 발현한다. 상기 마우스 모델은 하기 실험에서 myh11 프로모터 특이적으로 ift88 유전자가 결손되도록 만들어진 알츠하이머 모델로 사용하였다.

아. Myh11-cre;ift88flx/+;Tg6799;Ai6 마우스

Myh11-cre(The Jackson Laboratory, Stock Number: 019079), ift88(The Jackson Laboratory, Stock Number: 022409), Tg6799(The Jackson Laboratory, Stock Number: 006554) 및 Ai6(The Jackson Laboratory, Stock Number: 007906) 네 가지 마우스의 교배를 통하여 네 개의 형질을 모두 가진 마우스를 얻었다.

상기에서 언급된 ift88flx/+ 마우스는 한 개의 유전체에서 ift88flox 유전형을 발현하는 헤테로 타입(hetero type)을 의미한다. 상기 마우스 모델은 하기 실험에서 myh11 프로모터 특이적으로 상동염색체 중 한 개만 ift88 유전자 결손이 유도되도록 만들어진 알츠하이머 모델로 사용하였다.

상기 각 마우스의 유전형은 아래와 같은 방법으로 확인하여 사용하였다.

모든 유전형 확인용 PCR 프로토콜은 jackson laboratory 홈페이지에서 정보를 얻어사용하였다.

- material : Maxime PCR Pre/Mix (i-Tag) (iNtRON, #25026)

- machine : Eppendorf Vapo Protect Mastercycler (Eppendorf, #ST014)

- gDNA sample : 마우스 꼬리 일부를 얻어 15ul의 lysis solution(58mM KCl, 15mM Tri-HCl(pH8.3), 2.5mM MgCl2, 0.5% Tween20, proteinase K 20mg/ml)에 넣고 55’C에서 1시간, 95‘C에서 15분 반응시킨 후 PCR에 이용

- DNA ladder : SMOBIO (#DM2100) 사용

<1-2> 조직 샘플링

조직 샘플링을 위하여 먼저, Avertin(2,2,2-Tribromoethanol [sigma, T48402] 0.5g + 2-Methyl-2-butanol [sigma, 152463] 1ml + final 1X PBS 40ml)으로 복강마취된 마우스를 개복하고 혈액을 제거한 뒤 차가운 1X PBS를 이용하여 관류하였다. 이후, 차가운 4% 파라포름알데하이드(Paraformaldehyde, PFA)로 추가적으로 관류하여 조직을 고정화시켰다. 보고자 하는 조직(망막, 뇌)을 적출한 후, 추가적으로 4% PFA가 담긴 튜브에 넣어 4℃에서 천천히 흔들어 O/N 반응시켰다. 다음날 차가운 1X PBS로 버퍼를 교체한 후 보관하였다.

<1-3> 면역조직화학(Immunohistochemistry)

50um 두께의 조직 절편을 1시간 동안 실온에서 건조하였으며, 동결용 포매제(Optimal cutting temperature compound)를 제거하기 위해 0.2% PBS-T (containing Triton X-100)로 RT에서 10분 동안 세척하였다. 이후, 항원 복구(Antigen retrieval)를 위해 4% detergent C(based on 1X PBS)로 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 1차 항체 1ul를 0.2% PBS-T 100ul에 넣고 RT에서 O/N 반응시키고 0.2% PBS-T로 3번 세척하였으며, 이후, 2차 항체 1ul를 0.2% PBS-T 500ul에 넣고 RT에서 O/N 반응시킨 다음 0.2% PBS-T로 3번 세척하였다. 마운트하여 이미징(imaging)을 진행하였다. 실험에 사용한 1차 항체 및 2차 항체의 정보는 하기와 같다.

1차 항체: 정식명칭 [제조사, 카탈로그 번호]

1) Pdgfr-β: CD140b (PDGFRB) Monoclonal Antibody (APB5)[invitrogen, 14-1402-82]

2)Pecam: Purified Rat Anti-Mouse CD31 [BD Pharmingen, 550274]

mouse 594

3) amyloid-β: β-Amyloid (D54D2) XP® Rabbit mAb [cell signaling, 8243S]

4) ICAM1: Anti-ICAM1 antibody (YN1/1.7.4) [abcam, ab25375]

5) CD11b: Anti-CD11b antibody (M1/70) (Alexa Fluor® 647)[abcam, ab197702]

2차 항체: 정식명칭 [제조사, 카탈로그 번호]

1) Pdgfr-β: Alexa Fluor® 647 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L)[Jackson immuno research, 712-605-153]

2)Pecam: Goat anti-Mouse IgM Heavy Chain Secondary Antibody, Alexa Fluor® 594 conjugate [life technologies, A21044]

3) amyloid-β: Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 [life technologies, A21207]

4) ICAM1: Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 [life technologies, A21247]

5) CD11b: conjugate Ab

<1-4> 3D 이미징

4% 파라포름알데하이드에 넣어 4℃에서 O/N 반응된 조직(망막, 뇌)을 멸균된 1X PBS로 세척하였다. 이후, A1P0(1% acrylamide, 2.5% Azo-bis based in 1X PBS) 용액에 조직을 담그고 4℃에서 O/N으로 반응시킨 다음, 1X PBS에 세척한 후 1X PBS에 조직을 담그고 X-CLARITY™ polymerization system [logos biosystem, XC-POL1]에 조직을 넣어 37℃, -90kPa 조건에서 3시간 동안 반응시켰다. ETC clearing을 위해 X-CLARITY™ Tissue Clearing System [logos biosystem, C10001]을 사용하여 2-8% SDS 버퍼를 관류시키며 42℃에서 18시간 동안 반응시킨 후, 멸균된 1X PBS-T로 detergent를 제거하였다. 거대시료이미징 평면레이저 현미경(Macro laser light-sheet illumination imaging system: [Lavision BioTec, UltraMicroscope II]) 또는 가변평면레이저현미경(Selective Plane Illumination MicroscopyLightsheet Z.1: [Carl Zeiss, Lightsheet Z.1])을 이용하여 이미지화하였다.

<1-5> 웨스턴 블랏 분석

해당 마우스의 뇌를 적출하고 타겟 부위별로 나눴다. phosphate-buffered saline(PBS)로 깨끗이 잘 씻은 후 ice에서 1X의 Halt™ Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail(100X)와 5mM EDTA를 넣은 RIPA(Thermo, #89901. 25mM Tris-HCl pH 7.6, 150mM NaCl, 1% NP-40, 1% sodium deoxycholate, 0.1% SDS) 버퍼를 사용하여 조직을 lysis 시킨 후 13000rpm, 10분의 조건으로 원심분리하여 soluble fraction을 얻고 남은 pellet에 2% SDS를 넣어 lysis 시킨 후 insoluble fraction을 얻었다. 각각의 lysate를 BCA Protein Assay Kit(thermo, #23225)을 이용하여 정량하고 동량을 덜어 실험을 진행하였다. 다음 과정을 진행하기 전에 10% β-mercaptoethanol을 포함한 4x sample buffer(Biorad, #1016747)를 1x가 되도록 넣고 100‘C에서 5분 반응 시킨 후 충분히 식혀서 분석 대상 샘플을 준비하였다.

4-20% Mini-PROTEAN® TGX™ Precast Protein Gels(biorad, #4561096)을 이용하여 준비된 샘플과 스탠다드를 로딩하고 로딩이 끝나면 Polyvinylidene difluoride(PVDF) membrane(millipore, #IPVH00010)에 transfer하였다. 1x Tris-buffered saline/Tween 20 (TBST)로 washing한 후 5% skim milk에 30분간 반응시켰다. 다시 1x Tris-buffered saline/Tween 20 (TBST)로 washing하고 1차 항체(1:1000)를 넣고 4‘C에서 overnight으로 반응시킨다. 다음날 1x TBST로 washing하고 실온에서 1시간동안 2차 항체(1:5000)를 반응시켰다. 반응이 끝나면 1x TBST로 washing 후 chemiluminescence(GE, LAS4000)를 이미징화하였다. 상기 실험에서 사용한 1차 및 2차 항체는 다음에서 자세히 나타내었다.

[1차 항체]

amyloid-β(6E10): Purified anti-β-Amyloid, 1-16 Antibody[covance, SIG-39320]

amyloid-β(D54D2): β-Amyloid (D54D2) XP® Rabbit mAb [cell signaling, 8243S]

[2차 항체]

amyloid-β(6E10):Mouse IgG HRP Linked Whole Ab [GE, NA931]

amyloid-β(D54D2):Rabbit IgG HRP Linked Whole Ab [GE,LNA934V/AH]

2. 결과

<2-1> Myh11-cre;Ai6 동물모델에서 주피세포(pericyte) 마커와의 위치 확인

Myh11는 “smooth muscle myosin heavy chain 11 protein”을 지칭하며, 근섬유를 구성하고 근육 긴장(contraction)에 중요한 단백질이다. 이는 혈관 세포의 구성 요소 중 하나인 민무늬근(smooth muscle)에서 많이 발견되며 혈관을 둘러싸고 있는 주피세포(pericyte)에서 발현되기도 한다.

본 실험에서는 Myh11-cre;Ai6 마우스 모델의 주피세포에서 Myh11 단백질이 잘 발현되고 있는지를 확인하기 위하여, 대뇌 피질(Cortex) 조직에서 주피세포 마커로 잘 알려진 Pdgfr-b와 myh11-cre;Ai6의 발현되는 위치를 면역조직화학염색을 통해 확인하였다.

그 결과 도 1에서 나타낸 바와 같이, Pdgfr-b와 myh11-cre;Ai6의 발현이 같은 위치에서 나타나는 양상을 확인하였다. 이러한 결과를 통해, Myh11가 주피세포에서 잘 발현되고 있음을 확인할 수 있었고, 혈관의 주위를 둘러싸고 있는 것을 확인할 수 있었다.

또한, Myh11-cre;Ai6 동물모델의 망막(Retina) 조직에서 Myh11 단백질이 잘 발현되고 있는지를 확인하기 위하여, 망막 내피세포 마커인 pecam과 myh11-cre;Ai6의 발현되는 위치를 면역조직화학염색을 통해 확인하였다.

그 결과 도 2에서 나타낸 바와 같이, 망막 조직에서도 내피세포 마커인 pecam과 myh11-cre;Ai6의 발현의 위치가 겹치는 것을 확인하였다.

<2-2> 알츠하이머 모델인 Tg6799 마우스에서의 Myh11-cre 프로모터 유무에 따른 혈관 형성 비교

본 실험에서는 IFT88 유전자의 역할을 규명하기 위하여, 알츠하이머 모델인 Tg6799 마우스 뇌 조직에서 Myh11-cre 프로모터를 이용하여 주피세포에 특이적으로 IFT88 유전자를 넉아웃(Knock-ou)시키는 경우 뇌 혈관 형성에 미치는 영향을 조사하였다.

그 결과 도 3 및 도 4에서 나타난 바와 같이, Myh11-cre;Ai6 마우스에 비해 Tg6799 마우스에서는 혈관의 정상적인 연결이 많이 끊어져 있는 반면(도 3: brain, 도 4: retina), Ift88 유전자가 억제된 Tg6799 마우스의 뇌에서는 이러한 혈관의 끊어짐이 현저하게 사라짐이 확인할 수 있었다(도 3 참조).

상기와 같은 결과를 통해, IFT88 유전자가 알츠하이머와 같은 질환의 치료를 위한 표적 유전자로 활용될 있을 것이라 판단되었다.

<2-3> 아밀로이드 베타 펩티드가 혈관의 연결을 끊어 놓음을 확인

본 실험에서는 아밀로이드 베타 펩티드의 뇌 혈관 미치는 영향을 확인하기 위하여, 마우스 뇌 조직에서 혈관 및 아밀로이드 베타 펩티드의 발현 양상을 면역조직화학염색을 통해 확인하였다.

그 결과 도 5에서 나타낸 바와 같이, 아밀로이드 베타가 뇌 혈관의 주위에 얽혀 혈관의 연결을 끊어 놓는 것을 확인할 수 있었다.

<2-4> 주피세포 특이적 IFT88 유전자 억제를 통한 아밀로이드 베타 감소 효과

본 실험에서는 Myh11-cre 프로모터를 이용하여 주피세포에 특이적으로 IFT88 유전자를 넉아웃(Knock-ou)시키는 경우, 알츠하이머 마우스 모델의 뇌 조직에서 증가되는 아밀로이드 베타의 발현을 억제시킬 수 있는지를 확인하기 위하여, Myh11-cre;Ai6 및 아밀로이드 베타 펩티드의 발현 양상을 면역조직화학염색을 통해 확인하였다.

그 결과 도 6에서 나타낸 바와 같이, 알츠하이머 모델인 Tg6799 마우스 대비 뇌 조직에서 Myh11-cre 프로모터를 이용하여 IFT88 유전자를 넉아웃(Knock-ou)시킨 마우스 모델(Myh11-cre;ift88flx/flx;Tg6799;Ai6)에서 아밀로이드 베타 단백질의 발현이 두드러지게 억제(감소)되는 것을 확인할 수 있었다.

상기와 같은 결과를 통해, 주피세포 특이적인 IFT88 유전자 억제가 알츠하이머 병증으로 인해 증대되는 아밀로이드 베타 발현을 효과적으로 감소시킴으로써 뇌 혈관 끊김을 방지할 수 있음을 알 수 있었다.

<2-5> 주피세포 특이적 IFT88 유전자 억제에 의한 아밀로이드 베타 감소 효과의 기전

상기 실험에서는 주피세포 특이적 IFT88 유전자 억제가 뇌 조직에서 아밀로이드 베타 단백질을 효과적으로 감소시킬 수 있음을 확인하였는바, 본 실험에서는 이러한 아밀로이드 베타 감소 효과가 어떠한 기전으로 발생되는지를 조사하였다.

먼저, Myh11-cre;Ai6, 아밀로이드 베타 및 ICAM1의 발현 양상을 면역조직화학염색을 통해 확인하였다.

ICAM1은 염증반응에 의하여 증가하는 대표적인 세포부착분자로, 혈관내피세포에서 발현이 증가되면 백혈구의 부착 및 이동을 유도한다. 알츠하이머 치매과 관련하여 알츠하이머 치매 환자의 혈장에서 ICAM1의 농도가 정상인에 비해 1.9배 높으며(Rentzos 등, 2004, J Geriatr Psychiatry Neurol), 알츠하이머 치매 생쥐 동물모델의 뇌에서 아밀로이드 베타가 축적된 병변 부위에 ICAM1이 관찰되었고(Apelt등, 2002 , Neurosci Lett), 아밀로이드 베타가 축적된 부위 근처의 미세혈관에서 ICAM1의 발현이 증가된 것이 보고되었다(Zenaro 등, 2015, Nat Med.). 또한, ICAM1의 발현을 억제시키는 경우 아밀로이드 베타의 분해가 증대된다는 것이 보고되었다(한국등록특허 제10-1779491호).

따라서, 본 실험에서는 Myh11-cre;Ai6 및 아밀로이드 베타 펩티드의 발현 양상과 더불어 ICAM1 발현 양상을 살펴봄으로써, 주피세포 특이적 IFT88 유전자 억제에 의한 아밀로이드 베타 감소 효과가 ICAM1 발현 억제 기전에 의한 것인지 확인하였다.

그 결과 도 7에서 나타낸 바와 같이, 정상적인 조건에서는 icam1의 발현이 혈관을 따라 나타난 반면, 알츠하이머 모델인 Tg6799 마우스의 경우 혈관 유지(vessel integrity)가 나빠져 icam1의 발현 정도가 현저하게 증가되어 있는 현상이 나타났다. 한편, 주피세포 특이적 IFT88 유전자를 억제했을 때에는 이러한 현상이 다시 사라짐을 확인하였다.

상기와 같은 결과를 통해, 주피세포 특이적 IFT88 유전자가 icam1의 발현을 억제하고, 이에 기인하여 아밀로이드 베타 감소함으로써 혈관의 유지(integrity)를 증가시켜서 상태를 호전시켰을 가능성이 있다고 판단되었다.

또한, 주피세포 특이적 IFT88 유전자 억제가 미세교세포(Microglial cell)의 발현에 어떠한 영향을 미치는지를 살펴보았다.

미세교세포(microglia)는 미세아교세포, 또는 소교세포로도 불리며 중추신경계(central nervous system, CNS)에 상재하는 면역세포로서(Stoll and Jander, Prog Neurobiol 58:233-247, 1999; Kim and de Vellis, J Neurosci Res 81:302-313, 2005) 전체 뇌 세포의 5-10%를 차지한다. 상기 미세교세포는 CNS에서 일차 방어라인으로서 기능한다. 미세교세포는 CNS에서 염증 매개자의 주요 세포 내 공급원이다. 미세교세포는 일산화질소(NO), 반응성 산소종(reactiveoxygen species, ROS), 전염증성 사이토카인 및 프로스타글란딘을 생산함으로써 신경염증에 관여한다. 활성화된 미세교세포는 손상된 신경 조직 영역으로 이동하여 미생물 및 세포 파편(cell debris)을 포식하고 파괴하는 것으로 알려져 있다. 그러나 염증세포로서의 미세교세포의 역할은 항상 유익한 것만은 아니다. 현재, 조절되지 않은 미세교세포의 활성화와 지속적인 과도한 신경염증은 퇴행성 신경질환(neurodegenerative diseases)을 포함하는 다양한 CNS 병리의 원인으로 여겨지고 있다. 즉, 기능적으로 활성화된 미세교세포는 염증매개물질을 생성 및 분비하여 신경세포 사멸을 초래하는 것으로 알려져 있다.

따라서, 본 실험에서는 알츠하이머 모델인 Tg6799 마우스 뇌 조직에서 Myh11-cre 프로모터를 이용하여 주피세포에 특이적으로 IFT88 유전자를 넉아웃(Knock-ou)시키는 경우 미세교세포(Microglial cell)의 발현에 어떠한 영향을 미치는지를 확인하였다.

그 결과 도 8에서 나타낸 바와 같이, 알츠하이머 모델인 Tg6799에서 증가된 미세교세포의 발현이 Myh11 특이적 ift88 억제에 의해 현저하게 줄어듦을 확인하였으다. 즉, 알츠하이머 모델인 Tg6799에서 증가되는 아밀로이드 베타 펩티드의 제거를 위해 증가되고 과도하게 활성화되는 미세아교세포(microglia)가 줄어듦으로써, 미세아교세포의 과도한 활성화로 유도되는 신경 손상 또한 막을 수 있을 것으로 생각되었다.

<2-6> Tg6799 마우스 및 Myh11 - cre;ift88flx / flx;Tg6799 마우스의 뇌(cortex, hippocampus ) 조직에 축적된 아밀로이드-베타의 단백질 양 측정

본 실험에서는 Myh11-cre 프로모터를 이용하여 주피세포에 특이적으로 IFT88 유전자를 넉아웃(Knock-ou)시키는 경우, 알츠하이머 마우스 모델의 뇌 조직에서 증가되는 아밀로이드 베타의 발현을 억제시킬 수 있는지를 확인하기 위하여, 아밀로이드 베타 펩티드의 단백질 양을 웨스턴 블랏 분석을 통해 확인하였다.

그 결과 도 9에서 나타낸 바와 같이, 알츠하이머 모델인 Tg6799 마우스 뇌 조직에서 Myh11-cre 프로모터를 이용하여 IFT88 유전자를 넉아웃(Knock-ou)시킨 Myh11-cre;ift88flx/flx;Tg6799 마우스의 뇌에서 아밀로이드 베타의 단백질 발현양이 감소되는 것을 확인할 수 있었다.

상기와 같은 결과를 통해, 주피세포 특이적인 IFT88 유전자 억제가 알츠하이머 병증으로 인해 증대되는 아밀로이드 베타 단백질의 발현을 효과적으로 감소시킬 수 있음을 확인할 수 있었으며, 이러한 결과는 상기 실시예 <2-4>의 실험 결과와 일치한다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

<110> Daegu Gyeongbuk Institute of Science and Technology <120> Composition for preventing or treating neurodegenerative diseases comprising IFT88 inhibitor as an active ingredient <130> NPDC-77153 <160> 8 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 2478 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide sequence of mouse IFT88 gene <400> 1 atgatggaaa atgttcatct ggcaccagaa acagatgagg acgaccttta ctctggtttc 60 aacgactaca acccagccta tgatactgag gagttggaga atgacacggg ttttcagcaa 120 gcagtgagaa ccagtcatgg cagaagacct cccgtaactg ctaaaatacc aagcacagca 180 gtcagcagac ccatagctac tggatatggg tccaagacat ccctgacatc atcaatggga 240 agaccgatga cagggacaat tcaggatgga gttgctcgac cgatgacagc agtgagagca 300 gctggctttt ccaaggcagc tttgcgaggc tctgcatttg acccccttgg tcagtccagg 360 ggccctgctc ctcctttgga agccaaaaat gaagacagtc cagaagaaaa aattagacag 420 ttggagaaga aagtaaatga gttggtggaa gaaagctgta ttgccaacag ttgtggagac 480 ttaaaactgg ccttagagaa ggcaaaagat gcaggaagaa aagagagagt cctggtgaga 540 caacgagagc aagtcacaag 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<220> <223> polypeptide sequence of mouse IFT88 protein <400> 7 Met Met Glu Asn Val His Leu Ala Pro Glu Thr Asp Glu Asp Asp Leu 1 5 10 15 Tyr Ser Gly Phe Asn Asp Tyr Asn Pro Ala Tyr Asp Thr Glu Glu Leu 20 25 30 Glu Asn Asp Thr Gly Phe Gln Gln Ala Val Arg Thr Ser His Gly Arg 35 40 45 Arg Pro Pro Val Thr Ala Lys Ile Pro Ser Thr Ala Val Ser Arg Pro 50 55 60 Ile Ala Thr Gly Tyr Gly Ser Lys Thr Ser Leu Thr Ser Ser Met Gly 65 70 75 80 Arg Pro Met Thr Gly Thr Ile Gln Asp Gly Val Ala Arg Pro Met Thr 85 90 95 Ala Val Arg Ala Ala Gly Phe Ser Lys Ala Ala Leu Arg Gly Ser Ala 100 105 110 Phe Asp Pro Leu Gly Gln Ser Arg Gly Pro Ala Pro Pro Leu Glu Ala 115 120 125 Lys Asn Glu Asp Ser Pro Glu Glu Lys Ile Arg Gln Leu Glu Lys Lys 130 135 140 Val Asn Glu Leu Val Glu Glu Ser Cys Ile Ala Asn Ser Cys Gly Asp 145 150 155 160 Leu Lys Leu Ala Leu Glu Lys Ala Lys Asp Ala Gly Arg Lys Glu Arg 165 170 175 Val Leu Val Arg Gln Arg Glu Gln Val Thr Ser Pro Glu Asn Ile Asn 180 185 190 Leu Asp Leu Thr Tyr Ser Val Leu 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Claims

IFT88의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 IFT88은 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 폴리뉴클레오티드로 이루어진 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서,
상기 IFT88 발현 억제제는 IFT88 유전자 또는 IFT88의 발현을 촉진하는 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, siRNA, shRNA 및 리보자임으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서,
상기 신경퇴행성 질환은 치매, 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 아밀로이드증(Amyloidosis), 파킨슨병(Parkinson's disease), 루게릭병(Lou Gehrig's disease), 헌팅턴병(Huntington's disease), HIV 연관 치매(HIV-associated dementia), 루이체 치매(Lewy body dementia), 다발성 경화증(multiple sclerosis), 프리온 질환(Prion disease), C형 니이먼-픽씨병(Niemann-Pick Type C, NPC) 및 간질(epilepsia)로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서,
상기 IFT88은 주피세포(pericyte)에서 myh11 프로모터에 의해 특이적으로 발현이 조절되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서,
상기 IFT88의 발현 또는 활성 억제제는 주피세포(pericyte)에서 myh11 프로모터 특이적으로 IFT88의 발현 또는 활성을 억제시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
a) 후보물질을 생물학적 시료에 처리하는 단계; 및
b) 상기 a)단계의 생물학적 시료에서 IFT88의 mRNA 또는 단백질의 발현양 변화를 측정하는 단계를 포함하는, 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료물질의 스크리닝 방법.
제7항에 있어서,
상기 생물학적 시료는 퇴행성 신경질환에 걸린 동물의 혈액, 소변, 타액, 조직으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
제7항에 있어서,
상기 mRNA 발현양 변화는 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Realtime RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting) 및 DNA 칩으로 이루어진 군 중 선택된 1 종 이상의 방법을 이용하여 측정하는 것을 특징으로 하는 방법.
제7항에 있어서,
상기 단백질 발현양 변화는 웨스턴 블롯팅, ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS) 및 단백질 칩(protein chip)로 이루어진 군 중 선택된 1종 이상의 방법을 이용하여 측정하는 것을 특징으로 하는 방법.