KR20210043759A - 효율적인 유전자 전달 적용을 위한 비독성 hsv 벡터 및 이의 생산을 위한 보완 세포 - Google Patents

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유스튀스 코헨
요시타카 미야가와
데이비드 크리스키
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데런 울프
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유니버시티 오브 피츠버그-오브 더 커먼웰쓰 시스템 오브 하이어 에듀케이션
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Abstract

일 구체예에서, 본 발명은 비-보완 세포 내에서 독성 HSV 유전자를 발현하지 않는 단순 헤르페스 바이러스(HSV) 벡터를 제공하며, 상기 벡터는 비-보완 세포에서 적어도 28일 동안 도입 유전자를 발현할 수 있다. 본 발명은 또한 본 발명의 벡터의 스톡, 치료학적 사용 또는 인 비트로 적용에 적합한 이들의 조성물, 및 이들에 관한 방법에 관한 것이다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 벡터의 생산을 위해 세포가 HSV로 감염되면 ICP4 및 ICP27을 발현하도록 조작된 보완 세포를 제공한다.

Description

효율적인 유전자 전달 적용을 위한 비독성 HSV 벡터 및 이의 생산을 위한 보완 세포{Non-toxic HSV vectors for efficient gene delivery applications and complementing cells for their production}
관련 출원의 상호 참조
본 출원은, 그 모든 내용이 본 명세서에 완전히 통합된, 2013년 7월 17일 출원된 U.S.가출원 번호 61/847,405에 대한 우선권을 주장한다.
연방 정부가 후원하는 연구 및 개발에 관한 선언
본 발명은 미국 국립 보건원(National Institutes of Health)에 의해 수여된 수여번호(Grant Number) P01DK044935 및 5R01NS064988의 정부 지원과 함께 만들어진 것이다. 미국 정부는 본 발명에 대한 확정된 권리를 갖는다.
많은 바이러스성 및 비-바이러스성 벡터 시스템 중에서도, 단순 헤르페스 바이러스(Herpes Simplex Virus: HSV)-기반 벡터들이, 인간 환자에 대한 잠재적 치료학적 사용을 포함하여, 유전자 전달 벡터로 사용하기 위해 연구되고 있다. HSV는 매우 넓은 범위의 인간 및 동물 세포를 감염시킬 수 있는 복잡하고, 비-통합성(non-integrating)인 DNA 바이러스이다. 그 바이러스 게놈은 80개가 넘는 유전자를 포함하고, 중요한 이배체 유전자(diploid gene)를 코딩하는 역 반복 서열(inverted repeat)로 서로 측면에 배치된(flanked) UL 및 US 두 개의 고유 분절로 구성되어 있다. HSV 복제의 중요한 특징은 캐스케이드 조절(cascade regulation)로 언급되는 파동에서 그 유전자가 발현되는 것이다(Rajcani, Virus Genes, 28: 293-310 (2004)). 필수적인 전초기(immediate early: IE) 유전자 ICP27 및 ICP4의 제거는 바이러스를 완전히 결손형으로 바꾸어 버리고, 바이러스 게놈 복제 및 바이러스 게놈 복제에 관여하는 초기(early: E) 유전자 및 자손 비리온(progeny virion)의 조립에서 기능하는 후기(late: L) 유전자의 발현이 불가능해진다. 이러한 복제-결손 바이러스는 손실된 ICP4 및 ICP27 유전자 산물을 발현(보완)하는 보완 세포(complementing cell)에서 자랄 수 있고, 이후 바이러스 게놈이 안정적인 핵 에피솜으로서 거주하는 비-보완 세포를 감염시키는데 이용될 수 있다. 그러나, ICP0 및 ICP22 IE 유전자를 보존하는 벡터들은 세포 독성이 있고, 또한 이러한 유전자, 특히 ICP0 유전자의 불활성화 또는 결실(deletion)은 도입 유전자(trnasgene) 발현을 방해한다.
따라서, 인 비트로 또는 인 비보에서, 모든 조직 또는 세포에서 도입 유전자를 발현할 수 있고, 세포 또는 조직에 해롭지 않은 HSV 벡터 및 이러한 벡터를 증식시키는 시스템에 대한 요구가 있다.
본 발명은 인 비트로 또는 인 비보의 광범위한 조직 또는 세포(특히 포유류)에서, 어떠한 해로운 바이러스 유전자의 발현 없이, 도입 유전자를 발현할 기회를 제공하는 HSV 벡터 공학의 타개책(breakthrough)에 관한 것이다. 본 발명의 HSV 벡터는 비-보완 세포에서 모든 독성 바이러스 유전자를 발현하지 않으나, 활발하고, 지속적인(예를 들면, 적어도 14일간, 적어도 약 28일간, 및 바람직하게는 적어도 60일간) 도입 유전자 발현이 가능하다. 이와 같이, HSV는, 벡터의 통합(integration) 없이도 고효율의 감염 특성을 갖고, 일반적인 또는 세포 특이적인 프로모터에 의해 조절되는 큰(large) 단일- 또는 다중-도입 유전자 발현 카세트를 운반할 수 있는 능력을 겸비한 유일한 벡터이므로, 본 발명은 벡터 기술의 매우 중요한 틈새를 채운다. 본 발명의 벡터는, 현재 이용 가능한 효율적인 벡터가 없으므로, 간 등의 조직으로의 효율적인 유전자 운반을 가능하게 할 것이다.
일 구체예에서, 본 발명은 비-보완 세포에서 독성의 HSV 유전자를 발현하지 않고, 하나 이상의 도입 유전자를 포함하는 게놈을 포함하는 단순 헤르페스 바이러스(HSV) 벡터를 제공하고, 상기 벡터는 비-보완 세포에서 적어도 28일간 도입 유전자를 발현할 수 있다. 본 발명의 벡터는 게놈 내에서 하나 이상의 절연자(insulator) 서열과 작동 가능하게 연결되어 삽입된 도입 유전자를 포함할 수 있고, 상기 벡터는 ICP0, ICP4, ICP22, ICP27 및 ICP47과 같은 전초기 유전자들을 발현하지 않는다. 도입 유전자를 조절하는 프로모터의 활성에 의존하여, 본 발명의 벡터는 바이러스 유전자 발현과 연관된 세포 독성 없이도 감염시킬 수 있는 모든 유형의 포유류(특히 인간) 세포 내에서 도입 유전자를 발현할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 벡터의 생산을 위한 보완 세포를 제공한다. 본 발명의 세포주는, 세포가 HSV에 감염되었을 때 ICP4 및 ICP27을 발현하도록 조작된 U2OS 세포로부터 유래된 것이다.
다양한 HSV 벡터 기술과 관련이 있는 하기의 특허 및 공개문헌들은 본 명세서에 참조로서 통합된다. 미국 특허 번호 5,658,724는 ICP4 및 ICP27이 결손된 HSV 균주 및 이들의 생산, 성장 및 사용 방법에 관한 것이다. 미국 특허 번호 5,804,413은 ICP4, ICP27 및 ICP0을 코딩하는 DNA를 포함하는 세포주에 관한 것이다. 미국 특허 번호 5,849,571은 잠재(latency) 활성 헤르페스 바이러스 프로모터 및 이의 용도에 관한 것이다. 미국 특허 번호 5,849,572는 LAT 프로모터를 포함하는 HSV-1 벡터에 관한 것이다. 미국 특허 번호 5,879,934는 ICP4 및 ICP27 유전자 산물이 결손된 것 등의 ICP4 및 ICP27 유전자 내 유전적 돌연변이를 포함하는 재조합 HSV 벡터에 관한 것이다. 미국 특허 번호 5,998,174는 HSV 벡터를 제조하는 방법에 관한 것이다. 미국 특허 번호 6,261,552는 본래의 TAATGARAT 서열 내의 결실 또는 돌연변이를 갖는 HSV 게놈을 포함하는 HSV 벡터에 관한 것이고, 상기 결실 또는 돌연변이는 상기 게놈이 HSV ICP4 유전자 산물을 포함하는 세포 내에 있을 때 상기 게놈 내의 본래의 전초기 유전자의 발현 역학의 지연을 초래한다. 미국 특허 번호 7,078,029는, TAATGARAT 서열의 돌연변이가 있는 게놈을 가짐으로 인해 ICP4 유전자 산물의 존재하에서 본래의 전초기 유전자가 지연된 역학을 갖는 게놈으로부터 발현되는 HSV에 관한 것이다. 미국 특허 번호 7,531,167은 오로지 ICP4, ICP27 및 UL55 유전자가 결실된 HSV 벡터에 관한 것이다. 미국 특허 공개 번호 2013/0096186은 돌연변이 gB 및/또는 돌연변이 gH 글리코프로테인을 포함하는 HSV 벡터에 관한 것이다. 국제 특허 공개 번호 WO 1999/06583은 비-천연(non-native) 리간드를 포함하는 엔벨로프(envelope)를 포함하는 HSV에 관한 것이다.
일 구체예에서, 본 발명은 비-보완 세포 내에서 본래의 독성 HSV 유전자를 발현하지 않고 지속적으로 도입 유전자의 발현이 가능한 단순 헤르페스 바이러스(HSV) 벡터를 제공한다. 예를 들면, 본 발명의 HSV 벡터는 배양되는 인간 진피 섬유아세포(HDF) 내에서 도입 유전자를 적어도 14일, 적어도 28일 등, 바람직하게는 적어도 60일간 발현할 수 있다. 바람직하게는, 이러한 본 발명의 벡터로부터의 도입 유전자 발현은, 그러한 세포 내에 어떤 ICP0 유전자 산물도 없는 경우와 같이, 상기 세포 내의 측정 가능한 ICP0 유전자 산물의 부존재하에서 발생한다. 특정 구체예에서, 본 발명에 따른, LAT P2 요소 및 CTRL2 요소 사이의 LAT 영역에 삽입도입 유전자(예를 들면, 향상된 녹색 형광 단백질(EGFP) 또는 다른 마커를 코딩하는)를 갖고, CTRL1 및 CTRL2 모두를 포함하는 벡터는, 그 외 다른 동일한 유전자 돌연변이를 갖고 이러한 도입 유전자가 UL3 및 UL4 사이에 삽입된 벡터가 발현할 수 있는 것보다, 감염 후 7일의 정량적 RT-PCR로 결정된 바와 같이, 도입 유전자를 적어도 20배(또는 약 20배)로 발현할 수 있고, 감염 후 3일의 정량적 RT-PCR로 결정된 바와 같이 적어도 30배(또는 약 30배)로 발현할 수 있다. 도 13 및 32를 참조한다. 상기 벡터들은 바람직하게는 상기 도입 유전자들을 상기 수준에서 상기 기간 동안 발현하고, 상기 도입 유전자들은 CMV 인핸서(enhancer)/닭 베타-액틴 프로모터/키메릭 인트론의 작동 가능한 통제하에 있다. 본 발명의 HSV 벡터로 감염되어 있는 상기 세포들이 상기 기간 동안 배양될 수 있다는 것 또한 상기 벡터가 상기 세포들에 독성이 없다는(세포 내에서 본래의 독성 HSV 유전자를 발현하지 않음) 증거이다. 물론, 비-보완 세포는 치료학적 적용에 흥미 있는 다른 유형의 세포 또한 될 수 있고, 인 비보의 세포일 수 있다.
예를 들면, 본 발명의 HSV 벡터는 (a) 잠재-연관 전사체(LAT) 유전자 영역 내, (b) ICP4 유전자좌 내(및 바람직하게는, 상기한 바와 같이, 오직 조인트(joint)가 결실되는 부분) 및/또는 (c) 게놈 내 하나 이상의 절연자 서열과 작동 가능하게 연결된 벡터의 게놈 내에 삽입된 도입 유전자를 포함하는 게놈을 포함할 수 있다. 바람직하게는 상기 벡터는 ICP0, ICP4, ICP22, ICP27 및 ICP47을 전초기 유전자로서 발현하지 않는다(그러나 일부 구체예에서는 ICP47의 발현이 요구될 수 있다). 이론에 의한 제한 없이, 도입 유전자 내의 프로모터의 활성에 의존적으로, 본 발명의 벡터는 그가 바이러스 유전자 발현과 관련한 세포 독성 없이 감염시킬 수 있는 모든 유형의 포유류(특히 인간) 세포에서 도입 유전자를 발현할 수 있는 것으로 여겨진다. 본 발명의 벡터는 DNA, 세포 내 DNA, 또는 바이러스 엔벨로프(envelope) 내 포장된 것으로서 존재할 수 있다.
임의의 적절한 방법이 본 발명의 벡터가 비-보완 세포 내에서 ICP0, ICP4, ICP22, ICP27 및 ICP47을 전초기 유전자로서 발현할 수 없도록 바꾸는데 이용될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 벡터의 게놈은 상기의 모든 유전자 중 하나의 불활성화 돌연변이(예를 들면 결실)를 포함하도록 조작될 수 있다(예를 들면, ICP0, ICP4, ICP22, ICP27 및 ICP47 유전자 중 하나 이상의 서열 내 또는 코딩 서열 전체의 결실(바람직하게는 적어도 ICP0, ICP4, ICP27 및 ICP47 유전자의 불활성화 결실을 포함, 더욱 바람직하게는 ICP0, ICP4, ICP27 및 ICP47의 불활성화 결실을 포함), 또는, 대안적으로 또한 상기 유전자(들)의 프로모터 또는 다른 조절 서열의 결실을 포함). 대안적으로, 하나 이상의 HSV 유전자를 초기 또는 후기 유전자로서 발현하도록 조작할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 벡터의 특정 구체예의 게놈은 상기 유전자들 중 하나 이상의 코딩 서열을 얻도록 조작될 수 있고, 이와 함께 그 프로모터를 전초기(알파) 유전자가 아닌 초기(베타) 또는 후기(감마) 유전자를 만드는 것으로 교체한다. 예를 들면, 상기의 유전자는 ICP4에 반응하는 프로모터의 조절하에 있을 수 있다(전초기 유전자보다는 초기 유전자로서 ICP22를 발현하도록 하여, 적어도 ICP22에 관하여는 바람직한 접근). 초기(베타) 역학을 갖는 상기의 유전자를 발현하기 위한 적절한 일 프로모터는 HSV tk 프로모터이다. ICP22 프로모터는 절단, 즉 TAATGARAT를 포함하는 조절 서열의 결실로 인해 초기 역학으로 변환될 수 있다. 전체 ICP47 프로모터 및 개시 코돈이 결실될 수 있다. 대안적으로, 일부 구체예에서, ICP47 유전자는 전초기 유전자로서 발현되어 면역 인식에 대항하여 감염 세포를 보호할 수 있다(Hill er aI, Nature 1995,375(6530): 411-415; Goldsmith et aI, J Exp Med 1998; 187(3): 341-348).
ICP0, ICP4, ICP22, ICP27 및 ICP47 발현의 동요(perturbation) 외에도, 본 발명의 벡터는 바람직하게는 UL41(즉, 숙주 차단(host shut-off)(vhs) 유전자)도 발현하지 않는다. UL41은 많은 숙주 및 바이러스 mRNA를 분해하는 RNAse이고, 급속한 숙주 세포 단백질 합성 차단을 초래하며, 비리온 외피(tegument) 성분으로서 세포에 진입한다. 따라서, 예를 들면 UL41을 코딩하는 유전자는 본 발명의 벡터의 게놈으로부터 결실될 수 있다. 이론에 의한 제한 없이, 이러한 조작(manipulation)은 보완(complementing) ICP4 및 ICP27 mRNA를 보존(sparing)함으로써 본 발명의 벡터가 보완 세포 내에서 성장할 수 있는 능력을 추가적으로 향상시키고, 도입 유전자 mRNA를 보존하여 비-보완 세포 내의 도입 유전자 발현을 향상시킨다.
여러 HSV 균주의 게놈 서열이 당업자에게 알려진 것으로 인식해야 한다(e.g., MacDonald, J Viral., 86(11): 6371 (2012); McGeoch, J Gen. Viral., 69: 1531-1574 (1988); GenBank Accession No. JQ673480; NCBI Reference Sequence: NC_001806.l; MacDonald, J Viral. 86(17): 9540 (2012); GenBank Accession No. JX142173, 이들은 참조로서 본 명세서에 통합됨). 따라서, HSV 유전자 및 유전자좌의 서열의 조작은 당업자 수준 내에 있는 것이다. 또한 이러한 공개된 서열들은 단지 예시적인 것이고 다른 HSV 균주 또는 변종이 본 발명의 벡터를 조작하는데에 있어 게놈의 출처로서 이용될 수 있음을 알아두어야 한다.
추가적으로, 본 발명의 벡터의 게놈은 박테리아 인공 염색체(BAC) 카세트를 포함할 수 있다. 이러한 BAC 카세트의 포함은 박테리아 내부의 본 발명의 벡터의 게놈의 증식(propagation) 및 조작을 촉진시킨다. BAC 카세트는 박테리아 균주의 사용에 도움을 주는 박테리아성-발현 서열, 예를 들면 항생제 또는 독소(예를 들면, 바람직하게는 클로람페니콜이나, 다른 저항성 유전자(예를 들면, 테트라시클린, 암피실린, 제오신 등)들 또한 이용될 수 있다)에 대한 박테리아 저항성을 부여하는 유전자 등의 선별 가능한 유전자를 포함할 수 있다. 상기 BAC 카세트는 리포터 유전자(예를 들면 구성적 포유류(constitutive mammalian) 프로모터(예를 들면, SV40, RSV, CMV, 유비퀴틴 C(UbC), CAG, 또는 β-액틴 프로모터 등)와 같은 진핵 프로모터의 조절하의 lacZ(베타-칼락토시다제를 코딩), 또는 형광 단백질-코딩 유전자(예를 들면, gfp(녹색 형광 단백질 코딩), yfp(노란색 형광 단백질 코딩), rfp(적색 형광 단백질 코딩), 및 이들 유사체(예를 들면 iRFP, EGFP 등)))을 추가적으로 포함할 수 있다.
상기 BAC 카세트는, 벡터 게놈 내의 UL37-UL38 유전자간(intergenic) 영역과 같은, 본 발명의 벡터의 게놈 내의 임의의 적절한 위치에 있을 수 있다((예를 들면, Gierash, J Virol. Meth., 135: 197-206 (2006) and Morimoto, Microbiol. Immunol., 53: 155-161 (2009))). 또한, 바람직하게는 상기 BAC 카세트는, 부위-특이적 리콤비나제(recombinase) 인식 부위/공통 서열(consensus sequence)(예를 들면, cre, dre, flp, KD, B2, B3, R 등의 효소로 인식되는 것들)과 같은, 상기 BAC 카세트의 제거를 촉진하는 서열 옆에 위치한다. 이러한 부위의 포함은, BAC 서열이 배양되는 세포 내 바이러스 성장을 감소시키는 것이 알려졌으므로(예를 들면, Gierash, J Virol. Meth., 135: 197-206 (2006)), 만약 필요하다면, BAC 카세트의 절단을 촉진한다. 또한, BAC 카세트는 약 11kb 정도이므로, BAC 카세트의 절단은 하나 이상의 도입 유전자를 통합시키기 위한 벡터의 용량(capacity)을 증가시킬 수 있다. 본 발명의 벡터는 또한 리콤비나제(예를 들면 loxP)에 대한 공통 서열, 특히 HSV 게놈 고유의 것이 아닌 것을 가질 수 있고, 예를 들면 BAC 카세트를 절단하기 위한 적절한 부위-특이적 리콤비나제를 발현하는 세포주를 사용하여 BAC 카세트를 제거한 결과로, HSV 게놈 내 리콤비나제에 대한 단일 복제수의 공통 서열을 남길 수 있는 것으로 이해될 것이다(예를 들면, UL37-UL38 내 유전자간 영역 내에 BAC 카세트의 삽입 위치가 있는 경우).
상기한 바와 같이, 본 발명의 벡터는 HSV 벡터 게놈 내에 하나 이상의 절연자 서열과 작동 가능하게 연결된 적어도 하나의 도입 유전자를 포함할 수 있다. "작동 가능하게 연결된(operabley connected)"은, 하나 이상의 절연자 서열이 도입 유전자를 세포 내 환경에서 발현하도록 허용하는 것(그렇지 않으면 HSV 게놈 내 존재하는 유전적 요소(즉, "유전자")가 전사적으로 침묵일 것인)으로 이해된다. 임의의 특정 이론에 의해 제한됨 없이, 이러한 절연자 서열은 이러한 절연자 서열의 부위에서, 약 1kb 내지 약 5kb 길이 내의, 만약 형성된다면 유전자 발현을 침묵시키는, 헤테로크로마틴의 형성을 막는 것으로 여겨진다. 따라서, 본 발명의 벡터에서 이용되는 절연자 서열은 전형적으로 헤테로크로마틴의 결합 또는 형성을 방해하는 서열이고, 그렇지 않으면 도입 유전자의 발현을 침묵시킬 것이다. 적절한 절연자 서열의 예시는 비제한적으로 HSV 크로마틴 경계(boundary)(CTRL/CTCF-결합/절연자) 요소 CTRL1 및 CTRL2(이들은 본 명세서 기재된 바와 같이 LAT 유전자좌 본래의 것(native)일 수 있고, 게놈 내 이소성(ectopic) 위치로 옮겨간 것일 수 있다), 닭 초민감(hypersensitive) 부위 4 절연자(cHS4), 인간 HNRPA2B1--CBX3 유비쿼터스 크로마틴 개방 요소(ubiquitous chromatin opening element: UCOE) 및 인간 인터페론 베타 유전자(IFNB1)로부터의 스캐폴드/마트릭스 부착 부위(S/MAR)를 포함할 수 있다(Emery, Hum. Gene Ther. 22, 761-74 (2011); Antoniou et al., Hum. Gene Ther. 24, 363-74 (2013)).
HSV 게놈 본래의 절연자 서열(LAT 영역 내 CTRL1 및 CTRL 서열과 같은) 근처에 삽입된 도입 유전자와는 별도로, 절연자 서열은 벡터 게놈의 어느 적절한 부위에도 삽입될 수 있다. 이러한 절연자/경계 요소는 표준적 방법에 의해 본 발명의 벡터의 게놈으로 도입될 수 있고, 도입 유전자로서 동일한 카세트에 포함될 수 있고, 또는 게놈으로 개별적으로 도입되어 측면에 위치할 수 있고, 또는 그렇지 않으면 주어진 도입 유전자 카세트에 작동 가능하게 연결된 것일 수 있다. 따라서, 예를 들면 LAT 영역 부근에서 본래 발견되는 것과 기능적으로 유사한 하나 이상의 이소성 절연자 서열을 포함하는, 또는 그렇지 않으면 도입 유전자에 작동 가능하게 연결된 유전적 카세트를 삽입하는 것이 가능하다. 본 발명의 벡터는 LAT에 이소적인 부위를 포함하는 다중(multiple) 절연자 서열에 작동 가능하게 연결된, 다중 도입 유전자를 포함할 수 있다고 이해될 것이다. 일 구체예에서, 하나 이상의 도입 유전자가 LAT 외 다른 부위에 삽입되고, CTRL1 및/또는 CTRL2에 작동 가능하게 연결되는 경우, LAT 본래의 서열 및 본 발명의 벡터의 이소성(비-LAT) 부위 내 도입 유전자에 작동 가능하게 연결되도록 조작된 서열 사이의 재조합 확률을 최소화 또는 제거하기 위해서 LAT 내 CTRL 및/또는 CTRL2 서열을 LAT로부터 결실시키거나 변이시키는 것이 바람직하다. CTRL1 및 CTRL2이 LAT에 남아 있거나 또는 이소적으로 이동되는지와 관계없이, 도입 유전자가 본 발명의 벡터의 게놈으로 삽입되기에 바람직한 부위는 CTRL1 및 CTRL2 사이이다(예를 들면 각각의 CTRL1 및 CTRL2의 약 1-4 kb 이내이고, CTRL1 및 CTRL2는 상기 도입 유전자 부근에 위치함).
본 발명의 벡터 내에서, 이러한 절연자 서열 하나 이상이 도입 유전자에 작동 가능하게 되어 상기 도입 유전자는 유전자 침묵으로부터 절연되고(insulated), 발현된다. 일반적으로, 상기 도입 유전자 및 절연자 서열(들)은 게놈 내 근접해 있어야 하고, 약 5 kb 미만, 또는 약 4 kb 미만, 또는 약 3 kb 미만, 또는 약 2 kb 미만, 또는 약 1 kb 미만만큼 떨어져 있다. 또한 발현 카세트(도입 유전자를 포함하는)가 기능적으로 두 절연자 서열 사이에 있어 상기 절연자 서열들이 관심 있는 도입 유전자(들) 주변에 위치하는 것이 바람직 할 수 있다(See, e.g., Emery, Hum. Gene Ther. 22, 761-74 (2011); Antoniou et al., Hum. Gene Ther. 24, 363-74 (2013)).
본 발명의 벡터 내 도입 유전자(예를 들면, 첫 번째 도입 유전자)의 삽입을 위한 바람직한 일 부위는 벡터 게놈의 LAT 유전자 영역 내 절연자 서열들 사이이다-특히, 각각 LAT 프로모터 LAP(CTRL1)의 상류에 위치한 크로마틴 경계(CTRL/CTCF-결합/절연자) 요소 및 LAT 2-kb 인트론(CTRL2) 사이에 삽입(Amelio et al, J Virol 2006, 80(5): 2358-2368; Bloom, Biochim. Biophys. Acta, 1799: 246-256 (2010)). 상기 영역은 본 명세서에서 LAT(유전자) 영역 또는 유전자좌로 언급된다. 따라서, 바람직하게는, 본 발명의 벡터의 게놈은 CTRL1 및 CTRL2을 포함한다(예를 들면, 얻는다)(도 7 상단 참조). 이론에 의한 제한 없이, CTRL1 및 CTRL2의 존재는 영역의 헤테로크로마틴 형성을 막는 것으로 여겨지며, 따라서, LAT 유전자 영역의 도입 유전자의 발현에 대한 권한이 있는(privileged) 부위로 여겨진다. 따라서, 상기 벡터는 비-보완 세포 내 LAT 유전자 영역 내 삽입된 도입 유전자를 발현한다. 바람직한 구체예에서, 상기 벡터는 LAT 유전자 영역 내 다수의(plurality) 도입 유전자 카세트를 포함하고, 각각은 별개의 프로모터 및 코딩 영역을 포함하고 각각은 모노- 또는 폴리시스트론성(polycistronic)일 수 있다.
또한, 본 발명의 벡터의 LAT 영역(본 명세서에 기재된 바와 같이 하나 이상의 도입 유전자를 포함하는)은 또한 LATP2 또는 LAP2 인핸서 요소를 포함하는 것(예를 들면 얻는 것)이 바람직하다. 다시 이론에 의한 제한 없이, LATP2 또는 LAP2 인핸서 요소의 존재는 LAT 유전자 영역 내 도입 유전자의 코딩 서열(들)을 장기적으로 발현하는 능력에 공헌하는 것으로 여겨진다(Goins, J. Virol., 73: 519-532 (1999); Lilley, J. Virol., 75: 4343-4356 (2001)). 특히, 바람직한 구체예에서, LAT 유전자 영역 내 도입 유전자(들)은 LATP2 또는 LAP2 인핸서 요소의 하류에 삽입된다. 그러나, 본 발명은 상기 도입 유전자(들)이 LATP2 또는 LAP2 인핸서 요소의 상류(LAT 전사 방향에 대하여)에 삽입되어 있는 구체예들을 고려한다. 바람직하게는 상기 도입 유전자는 LAT 유전자 영역 내에서 LATP2 또는 LAP2 요소로부터 떨어진 곳을 향한다(예를 들면, 도 7 상단 참조).
본 발명의 벡터 내 도입 유전자(예를 들면, 두 번째 도입 유전자)의 삽입을 위한 또 다른 바람직한 부위는 ICP4 유전자 유전자좌 내이다. 예를 들면, 본 발명의 벡터 내 상기 유전자좌 내 삽입된 UbC 프로모터-조절 도입 유전자는 해마 신경 세포에서 장기의 신호를 만들어 낼 수 있고 DRG 내에서 적어도 단기적으로는 활성이다.
도입 유전자는 또한 본 발명의 벡터의 게놈 내 다른 절연자 서열과 작동 가능하게 연결되어(예를 들면, 부근(< 5 kb)) 삽입될 수 있다. HSV 게놈 본래의 절연자 서열 부근에 삽입된 것 외에도, 절연자 서열은 벡터 게놈 임의의 적절한 부위에 삽입될 수 있다. 그러므로, 예를 들면 도입 유전자 부근의 LAT 영역 내에서 본래 발견되는 것과 기능적으로 유사한 이소성 절연자 서열을 포함하는 유전적 카세트를 삽입하는 것이 가능하다. 본 발명의 벡터는 다중 도입 유전자를 포함할 수 있음이 이해될 것이다.
본 발명의 벡터로 삽입된 도입 유전자(들) 내에는, 적어도 프로모터 서열 및 전사 서열(transcribed sequence)이 있고, 따라서 상기 전사 서열은 상기 프로모터에 의해 조절된다. 도입 유전자 내 프로모터는 전사 서열(들)의 발현을 통제/조절 하기 위해 요구되는 임의의 프로모터일 수 있다. 예를 들면, 상기 프로모터는, 특이적 또는 선호적으로 특정한 세포 유형(예를 들면, 간 세포, 폐 세포, 상피 세포, 심근 세포, 신경 세포, 골격근 세포, 배아, 유도 다능(pluripotent), 또는 다른 줄기 세포, 암 세포 등) 내 유전자를 발현하는 프로모터 등의, 세포-특이적 또는 조직-특이적 프로모터(예를 들면, EOS, OCT4, Nanog(ESC/iPSC에 대한), SOX2 (신경 줄기 세포에 대한), αMHC, Brachyury, Tau, GFAP, NSE, Synapsin I(신경에 대한), Apo A-I, 알부민, ApoE(간에 대한), MCK, SMC α-액틴, 미오신 중쇄, 미오신 경쇄(근육에 대한) 등)일 수 있다. 감각 뉴런 내 사용을 위한 바람직한 프로모터는 TRPV1, CGRP, 및 NF200을 포함한다. 다른 구체예에서, 본 발명의 벡터 내 삽입된 도입 유전자 내의 프로모터는 유도적 프로모터일 수 있다(예를 들면, 당업계에 알려진 바와 같이, LAT 내 별개의 프로모터 또는 다른 유도적 프로모터부터의 rtTA3G 발현과 결합된 TRE3G). 물론, 본 발명의 벡터에 삽입된 도입 유전자 발현 카세트 내 프로모터는 당업계에 알려진 것과 같은 구성적 포유류 프로모터일 수 있다(예를 들면, SV40, CMV, CAG, EF1α, UbC, RSV, β-액틴, PGK 등).
프로모터(들) 및 코딩 서열(들) 이외에도, 본 발명의 벡터의 게놈에 삽입된 도입 유전자(들)은 또한 추가적인 조절 요소(들)를 포함할 수 있다. 예를 들면 도입 유전자(들)은 하나 이상의 마이크로 RNA의 결합 부위를 포함할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 도입 유전자(들)은 이러한 마이크로 RNA에 대한 2, 3, 4, 5, 또는 6 탠덤(tandem) 부위(4가 전형적)와 같은 탠덤 결합 부위를 포함한다. 이러한 부위의 존재, 특히 이러한 마이크로 RNA에 대한 탠덤 결합 부위의 존재는 특정 세포 유형 내의 도입 유전자 발현의 하향-조절(down-regulation)을 촉진한다. 그러므로, 예를 들면, 암 또는 종양 세포(많은 세포 유형에 대해 독성일 수 있는) 내에서 발현되기 원하는 도입 유전자를 포함하는 벡터는 "정상(normal)"(즉, 비-악성) 세포의 마이크로 RNA에 대한 결합 부위를 포함할 수 있고, 따라서 도입 유전자의 발현은 비-악성 세포에서 억제될 수 있다.
본 발명의 벡터 내 도입 유전자(들)은 모노시스트론성(즉, 하나의 단백질 또는 폴리펩티드를 코딩) 또는 폴리시스트론성(즉, 여러 단백질 또는 폴리펩티드를 코딩)일 수 있음을 알아두어야 한다. 더욱이 상기 도입 유전자의 전사되는 부분의 전부 또는 일부는, 예를 들면 siRNA 또는 miRNA와 같은, 비-번역 RNA를 코딩할 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 여러 별개의 모노시스트론성 또는 폴리시스트론성 도입 유전자 단위를 포함할 수 있고(바람직하게는 두 개의 별개의 도입 유전자 단위이나, 그 이상도 가능(예를 들면, 3, 4, 5, 또는 그 이상의 별개의 단위), 각각은 각각의 프로모터, 번역(translated) 서열(들) 또는 비-번역 RNA 서열(들) 및 다른 조절 요소들을 갖는다.
상기한 바와 같이, 도입 유전자(들)은 하나 이상의 전사 서열(들)을 포함하고, 이는 프로모터 및 선택적으로 도입 유전자 내의 다른 조절 요소(절연자 서열(들)에 대한 작동 가능한 연결 포함)의 조절하에서 발현된다. 전사 서열은 상기 벡터가 도입될 세포에서 발현되기 원하는 임의의 서열일 수 있다. 본 발명의 벡터 내의 도입 유전자에 존재하는 전사 서열의 비 제한적인 예시는 Oct4, Klf4, Sox2, c-Myc, L-myc, 지배적-음성(dominant-negative) p53, Nanog, Glis1, Lin28, TFIID, GATA4, Nkx2.5, Tbx5, Mef2C, Myocd, Hand2, SRF, Mesp1, SMARCD3, SERCA2a, Pax3, MyoD, Lhx2, FoxG1, FoxP2, Isl1, Ctip2, Tbr1, Ebf1, Gsx2, Srebp2, 인자 VIII, 인자 IX, 디스트로핀(Dystrophin), CFTR, GlyRα1, enkephalin, GAD67 (또는 다른 GAD 이소폼, 예를 들면, GAD 65), TNFα, IL-4, 신경 영양성(neurotrophic) 인자 (예를 들면, NGF, BDNF, GDNF, NT-3), Ascl1, Nurr1, Lmx1A, Brn2, Myt1l, NeuroD1, FoxA2, Hnf4α, Foxa1, Foxa2 or Foxa3, 임의의 마이크로 RNA or miRNA들의 조합(예를 들면, hsa-mir-302/367 유전자 클러스터; hsa-miR200c; hsa-miR369; hsa-mir-124) 및/또는 하나 이상의 다른 비-코딩 RNA들("ncRNA(들)") 또는 LacZ (베타-갈락토시다제 코딩), CAT (클로람페니콜 아세틸트렌스퍼라제 코딩), 또는 형광 단백질-코딩 유전자(예를 들면, gfp, yfp, rfp, 및 iRFP, EGFP 등과 같은 이들의 유사체)와 같은 포유류 세포 내 발현을 위한 리포터 유전자를 포함한다.
앞서 언급한 것 이외에도, 본 발명의 벡터는 또한 선택적으로 LAT 영역 또는 알려진 절연자 서열 부근이 아닌 다른 부위에 삽입된 발현 카세트를 포함할 수 있다. 이러한 발현 카세트를 위한 바람직한 부위는 ICP4이다. 예를 들면, 본 벡터가 ICP4 유전자의 완전한 또는 불활성화 결실을 포함하는 경우, 상기 발현 카세트는 ICP4 결실 부위로 삽입될 수 있다. 바람직하게는, LAT 영역이 아닌 다른 부위로 삽입된 발현 카세트의 코딩 서열은 구성적 포유류 프로모터(예를 들면, SV40, CMV, CAG, EF1α UbC, RSV, β-액틴, PGK 등)에 의해 조절되거나, 필요하다면 다른 프로모터들(본 명세서에 기재된 것 및 그렇지 않으면 당업계에 알려진 바와 같은)이 사용될 수 있다. 발현 카세트의 일 예시는 결실된 ICP4 유전자좌로 유전 조작된, mCherry의 발현을 주동하는(driving) UbCp를 포함한다. 물론, 이러한 도입 유전자는 또한 흥미있는 치료적 요소를 코딩할 수 있다.
앞서 언급한 것 이외에도, 본 발명의 HSV 벡터는 또한 바람직하게는 IRS 및 IRL을 포함하는 내부 반복(조인트) 영역의 결실을 포함한다. 이러한 영역의 결실은 벡터 게놈의 안정성에 공헌하고, 이러한 HSV DNA의 서열의 결실은 또한 상기 벡터가 큰 도입 유전자(적어도 15 kb)를 수용할 수 있도록 만들어 여전히 정확하게 성숙한 비리온에 포장될 수 있도록 한다. 상기 조인트의 결실은 IE 유전자 ICP0 및 ICP4 각각의 일 카피(copy)를 제거하여 남은 카피들이 쉽게 조작될 수 있다. 이는 또한 ICP22 또는 ICP47 전초기 유전자에 대한 프로모터가 결실된다. 필요하다면, ICP47 유전자는 전초기 프로모터, 바람직하게는 ICP0 프로모터 또는 HCMV 주요(major) IE 프로모터의 삽입으로 회복될 수 있고 감염된 세포의 면역 인식을 최소화할 수 있다(Hill er al, Nature 1995, 375(6530): 411-415; Goldsmith et al, J Exp Med. 1998; 187(3): 341-348).
HSV는 광범위한 포유류 세포를 감염시킬 수 있다; 따라서, 본 발명의 벡터는 넓은 응용성을 갖는다. 그러나, 감염성을 향상시키기 위하여, 바람직하게는 본 발명의 벡터의 엔벨로프는 야생형 당 단백질에 비하여 감염 및/또는 외측 확산(lateral spread)을 향상시키는 돌연변이 당단백질을 추가적으로 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 이에 더하여, 본 발명의 벡터의 엔벨로프는 HSV의 비-정규(non-canonical) 수용체를 통한 세포로의 진입을 지시하는 돌연변이 당단백질을 추가적으로 포함할 수 있다. 예를 들면, 이러한 돌연변이 당단백질(들)은 gB, gC, gD, gH, 또는 gK일 수 있다; 물론, 본 벡터는 이러한 돌연변이(향상된 침투성 또는 확산성) 당단백질을 하나 이상 가질 수 있다(예를 들면, 둘, 그 이상, 또는 이들 모두의 조합). 더욱이, 이러한 HSV 감염 및/또는 외측 확산을 향상시키기 위한 당단백질의 변이화를 위한 기술은 알려져 있으며, 이러한 기술 모두가 본 발명의 상황에서 이용될 수 있다(예를 들면, 미국 특허 공개 번호 2013-0096186 A1; 국제 특허 공개 번호 WO/1999/006583, Uchida, J. Virol., 84: 12200-12209 (2010), Uchida et al., J. Virol., 87(3). 1430-42 (2013), 및 Uchida, Mol. Ther., 21: 561-569 (2013)를 참조할 수 있고, 이들은 본 명세서에 참조로서 통합된다). 또한, 본 발명의 벡터의 게놈은 이러한 돌연변이 당단백질(들)을 코딩하는 돌연변이 유전자를 포함할 수 있다.
본 발명을 구체화하는 예시적인 벡터 "뼈대(backbone)"는 본 명세서에 "JΔNI5" 및 "JΔNI8"로서 언급되고, 이는 "뼈대"로서, 외부(extraneous) 조절 요소가 있거나 또는 없는 도입 유전자가 본 특이적 벡터의 LAT 영역으로 삽입될 수 있음이 고려되는 것으로 이해된다(예를 들면 도 7 상단 참조).
본 발명의 벡터의 일 응용은 다양한 유형의 세포를 리프로그래밍하여 만능 줄기 세포를 생산하는 것이다. 줄기 세포는 최근 의학 연구의 최전선에 있으며, 인간의 발생, 유전적 질병에 대한 이해 및 재생 의학의 새로운 치료법을 창조하는데 커다란 기대를 받고 있다. 2006년에는, Yamanaka 및 그의 동료들이 성체 섬유아세포를 리프로그래밍하여 배아-유사 줄기 세포를 만들어 내는 방법을 발견하였다(Takahashi and Yamanaka, Cell 126: 663-76, 2006). 이러한 신규한 세포는 유도 만능 줄기 세포로 고안되었고, 기능적으로 ES 세포와 유사하였으며(Wernig et al, Nature 448: 318-24, 2007), 인간 체세포로부터 유래된 때는((Takahashi et al, Cell 131: 861-72, 2007; Yu et al, Science 318: 1917-20, 2007) 인간 ES 세포의 사용을 포함하는 윤리적 문제를 회피하였다. 4개의 리프로그래밍 유전자가 본래의 iPS 세포 생산에 이용되었으나(Takahashi and Yamanaka, Cell 126: 663-76, 2006; Takahashi et al, Cell 131: 861-72, 2007), 이러한 유전자 또는 다른 유전자의 리프로그래밍 효율은 그 유전자 전달(transfer) 방법의 비효율로 인해 문제로 남아 있다. 본 발명의 벡터 시스템은 단일 벡터로부터 동시에 다중의 도입 유전자들을 발현할 수 있는 많은 세포 유형에 대한 높은 형질도입(transduction) 효율을 결합하여 이러한 문제를 해결한다. 예를 들면, 본 명세서에 기재된 JΔNI7 및 JΔNI8 벡터는 5개의 바이러스 IE 유전자의 결실 또는 변경된 발현 역학으로 인해 복제-결손 및 비-독성이다. 이들은 세포 게놈으로 통합되지 못하기 때문에, 이러한 벡터들은 세부 분열 동안 희석되고, 히트-앤-런(hit-and-run) 유전자 운반(delivery) 시스템을 만든다.
본 발명의 벡터의 성장, 생산, 및 증식과 이들의 스톡(stock) 생산을 촉진시키기 위해, 본 발명의 일 측면은 ICP0 및 ICP4, 바람직하게는 ICP0, ICP4 및 ICP27을 보완하는 보완 세포주를 제공한다. 바람직하게는 ICP0 보완은, 보완 세포 내의 독성을 감소시키기 위해 HSV ICP0의 발현 없이 달성된다. 따라서, 본 발명에 따르는 바람직한 보완 세포는 U2OS 세포와 같은, 자연적으로 HSV ICP0 기능을 보완하는 세포 유형으로부터 유래한다(Yao, J. Virol., 69: 6249-6258 (1995), 이는 본 명세서에 참조로서 통합된다). 이러한 세포들은 ICP4 또는 ICP4 및 ICP27을 발현하도록 당업계에 알려진 방법으로 조작될 수 있다(예를 들면 ICP4 또는 ICP4 및 ICP27 발현 카세트를 세포 내에 도입하여 이들이 HSV 게놈이 아닌 세포 염색체 등의 유전적 구조체로부터 ICP4 및 ICP27을 각각 발현하게 함). 바람직하게는, 세포주는 ICP4 및 ICP27을 인 트랜스(in trnas)에서 각각 발현한다. 바람직하게는, 도입된 ICP4 또는 ICP4/ICP27 코딩 서열은 이들의 같은 기원의(cognate) 바이러스 프로모터의 조절하에 있는다. 또한, 코딩 서열을 보완하는 ICP4 및 ICP27 중 하나 또는 둘 모두는 HSV 감염시 이러한 세포 내에서 유도적으로 발현될 수 있다.
상기한 바와 같이, 본 발명의 벡터의 구체예는 부위-특이적 리콤비나제 인식에 의한 BAC 카세트의 제거를 촉진하는 서열 부근에 위치한 BAC를 포함한다. 따라서, 본 발명의 보완 세포는 상기 벡터 내의 인식 서열에 적절한 부위-특이적 리콤비나제를 코딩하는 유전자를 추가적으로 발현하여 리콤비나제 단백질을 생산하도록 조작될 수 있다. 그러므로, 본 발명의 보완 세포는 cre, dre, flp, KD, 또는 B2, B3, R 등 또는 이들의 적절한 돌연변이 유도체를 발현 및 생산할 수 있다. 따라서, 상기의 세포주들을 통하여, 도입 유전자를 위한 공간(약 11 kb)을 회복하고, 바이러스 성장을 10 배 초과, 25배 초과 정도, 또는 50배 초과, 약 100배 정도 향상시킬 수 있다. 향상된 바이러스 성장은 리콤비나제가 없는 세포와의 비교를 통한 표준적 절차(성장 곡선을 만들기 위한)에 의해 분석될 수 있다. 이는 낮은 MOI에서의 세포의 복제 웰(replicate well)의 감염, 감염 후 여러 시간에서의 바이러스 수집 및 플라크 분석에 의한 통상적인 수율의 적정을 포함한다.
추가적으로, 상기 보완 세포주는 포장 세포(packaging cell) 또는 임의의 다른 외래 유전자를 발현하는 세포의 유전 공학에서 전형적으로 이용되는 마커 등의 선별적 마커를 코딩하는 유전자를 발현하도록 조작될 수 있다. 적절한 선별적 유전자는 네오미신/G418, 히그로미신, 블라스티시딘, 푸로미신, 제오신 등에 저항성을 부여하는 것들을 포함한다.
HSV ICP4 및 ICP27 단백질과, 다른 단백질들(리콤비나제 및/또는 선별적 유전자 산물)을 코딩하는 발현 구조체를 얻기 위한 원본(source) 세포 유형(예를 들면, U2OS 세포)을 조작하는 방법은 당업자에게 알려져 있는 것으로 이해될 것이다. 예를 들면, 선별적 마커를 갖는 흥미있는 유전자가 렌티바이러스 벡터에 서브클로닝되고, 원본 세포가 렌티바이러스 벡터로 감염되고, 마커의 발현으로 선별하고(예를 들면, 블라스티시딘 저항성) 및 이후 관심 있는 도입 유전자(예를 들면 HSV ICP27)를 확인할 수 있다.
물론 본 발명의 보완 세포는 증식 및 클로닝할 수 있다. 그러므로 본 발명은 클론 집단(clonal population), 즉, 본 명세서에 기재된 바와 같은 보완 세포주를 포함하거나, 또는 보완 세포주로 구성된 또는 본질적으로 보완 세포주인 세포주를 제공한다.
본 발명의 보완 세포를 이용하여 본 발명의 HSV 벡터를 증식시킬 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 HSV 벡터를 증식시키는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법에 따라서, 상기 보완 세포주는 벡터 DNA로 형질주입되고 이후 플라크가 형성될 때까지 배양된다. 상기한 바이러스 DNA는 BAC를 포함할 수 있고, 포장된 벡터 내에 BAC가 포함될 필요가 없다면, 본 발명의 세포는 바이러스 게놈으로부터 BAC를 절단하기에 적절한 리콤비나제를 발현할 수 있다. 바이러스 집단은 반복된 감염성 입자의 전달로 증폭되어 점점 더 많고 새로운 보완 세포주 집단이 된다. 이러한 반복된 전달에 있어서, 감염다중도(multiplicity of infection: MOI)는 약 0.001 PFU/세포 내지 0.03 PFU/세포일 수 있다. 궁극적으로, 본 발명의 벡터(포장된 바이러스로서)는 90% 세포 병변(cytopathic) 효과의 세포로부터 정제된다.
일반적으로, 본 발명의 HSV 벡터는 충분한 바이러스가 세포 집단으로 운반되어 세포들이 적절한 수의 바이러스와 직면하는 것이 보장될 때 가장 유용하다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 HSV 벡터를 포함하는 스톡, 바람직하게는 균일한 스톡을 제공한다. HSV 스톡의 제조 및 분석은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들면, 바이러스 스톡은 HSV 벡터로 형질도입된 세포를 포함하는 롤러병 내에서 제조될 수 있다. 바이러스 스톡은 이후 연속적인 니코덴즈(nycodenze) 구배로 정제할 수 있고, 분취하여 필요할 때 까지 저장할 수 있다. 바이러스 스톡은 그 역가(titer)가 상당히 다양하며, 이를 제조하는데 사용된 바이러스 유전자형 및 프로토콜 및 세포주에 크게 의존적이다. 바람직하게는, 이러한 스톡은 약 106 PFU/ml 또는 더욱 바람직하게는 약 107 PFU/ml(또는 적어도 이러한 값)의 바이러스 역가를 갖는다. 더욱 바람직한 구체예에서는, 상기 역가는 약 108 PFU/ml 또는 약 109 PFU/ml(또는 적어도 이러한 수치)일 수 있고, 약 1010 PFU/ml 또는 1011 PFU/ml의 고 역가 스톡 또는 심지어 약 1012 PFU/ml(또는 적어도 이러한 수치)가 가장 바람직하다. 따라서, 본 발명에 따른 HSV 스톡의 역가는 약 106 PFU/ml 내지 1012 PFU/ml(바람직하게는 약 109 PFU/ml 내지 약 1011 PFU/ml)로 다양할 수 있다. 게놈 복제(gc) 수는 바이러스 입자 수의 세포주-독립적인 측정을 제공하지만, 결손적 입자를 포함한다. 일반적으로 야생형 HSV-1에 대한 gc 값은 20x 수준, 최대는 동일한 스톡의 PFU 값보다 높은 100x까지이다. 돌연변이 바이러스에 대하여, 특히 보완 세포에서 성장한 결손적 바이러스는 10,000x 초과 또는 심지어 그 이상까지 증가할 수 있다. gc 및 PFU 값은 그 스톡의 크기에 비례적으로 증가한다.
본 발명은 추가적으로 HSV 및 담체, 바람직하게는 생리학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물을 제공한다. 상기 조성물의 담체는 벡터에 적절한 모든 담체일 수 있다. 상기 담체는 일반적으로 액체일 것이나, 또한 고체, 또는 액체 및 고체 성분의 조합이 될 수 있다. 상기 담체는 바람직하게는 약학적으로 허용 가능한(예를 들면, 생리학적으로 또는 약리학적으로 허용 가능한) 담체(예를 들면, 부형제 또는 희석제)이다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 잘 알려져 있고 이미 사용 가능한 것이다. 담체의 선택은 적어도 부분적으로는 특정 벡터 및 상기 조성물을 투여하기 위해 사용되는 특정 방법에 의해 결정될 것이다. 상기 조성물은 임의의 다른 적절한 성분, 특히 상기 조성물 및/또는 이의 최종 사용의 안정성을 향상시키기 위한 성분을 추가적으로 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명의 조성물의 적절한 제형은 광범위하다. 하기의 제형 및 방법은 단지 예시적인 것이고 한정하는 것이 아니다.
비경구 투여를 위한 적절한 제형은 수성 및 비-수성의, 항-산화제, 버퍼, 정균제(bacteriostat) 및 제형을 의도한 수여자의 혈액과 등장으로 만들 수 있는 용질을 포함할 수 있는, 등장(isotonic) 멸균 주사액, 및 현탁제, 가용화제, 증점제, 안정화제 및 보존제를 포함할 수 있는 수성 및 비-수성의 멸균 현탁액을 포함한다. 상기 제형은 앰퓰 및 바이알 등의 단위-투여(unit-dose) 또는 복수-투여(multi-dose)의 밀봉된 용기로서 제공될 수 있고, 오직 멸균 액체 부형제, 예를 들면 사용 직전 주사를 위한 물의 추가만을 필요로 하는 동결 건조(lyophilized) 조건에서 저장될 수 있다. 즉석의(extemporaneous) 주사액 및 현탁액은 이전에 설명된 것들과 같은 멸균 분말, 과립 및 타블렛으로부터 제조될 수 있다.
게다가, 조성물은 추가적인 치료학적 또는 생물학적으로 활성인 작용제(agent)를 포함할 수 있다. 예를 들면, 특정 징후(indication)의 치료에 유용한 치료학적 인자가 존재할 수 있다. 이부프로펜 또는 스테로이드 등의 염증을 조절하는 인자는 조성물의 일부가 되어 인 비보에서의 벡터의 투여 및 생리적 고통과 관련한 붓기와 염증을 감소시킬 수 있다. 면역 시스템 억제자(suppressor)는 상기 조성물과 함께 투여되어 벡터 그 자체에 대한 또는 질병과 관련한 임의의 면역 반응을 감소시킬 수 있다. 대안적으로, 면역 인핸서가 조성물에 포함되어 질병에 대한 신체의 자연적 방어를 상향조절시킬 수 있다. 항생제, 즉 살미생물제 및 살진균제가 유전자 전달 절차 및 다른 질병과 관련한 감염의 위험을 줄이기 위해 존재할 수 있다.
본 발명의 벡터(및 상기 벡터를 포함하는 스톡 및 조성물)를 이용하여, 본 발명은 유핵 세포(nucleated cell), 특히 비-보완 세포 내에서 도입 유전자를 발현하는 방법을 제공한다. 상기 방법에 따르면, 본 발명의 벡터는 상기 벡터가 상기 세포를 감염시키기 적절한 조건하에서 세포에 노출된다. 한번 세포가 감염되면, 도입 유전자 내의 프로모터가 상기 세포 내에서 활성이며 도입 유전자가 또 다른 조절 메카니즘에 의해 억제되지 않는다면(예를 들면, 본 명세서에서 논한 마이크로 RNA), 벡터의 LAT 영역 내에 삽입된 도입 유전자는 그 세포 내에서 전사(발현)될 것이다. 다시 말하면, 본 발명의 벡터는 포유류 세포 내의 유전자 전달 및 발현 벡터의 역할을 한다.
본 발명의 방법은 상기한 바와 같이 인 비보 또는 인 비트로의 세포 내에서 도입 유전자를 발현시키는데 이용될 수 있다. 인 비보에서의 사용을 위해, 상기 세포는 외분비 세포(exocrine secretory cell)(예를 들면, 침샘 세포, 유선 세포, 땀샘 세포, 소화선 세포 등의 선세포), 호르몬 분비선 세포(예를 들면, 뇌하수체 세포, 갑상선 세포, 부갑상선 세포(parathyroid cell), 부신 세포 등), 외배엽-유래 세포(예를 들면, 케라틴 상피 세포(keratinizing epithelial cell)(예를 들면 피부와 모발을 구성하는), 습윤 층상 장벽(wet stratified barrier) 상피 세포(예를 들면, 각막, 혀, 구강, 위장관, 요도 질 등), 신경계 세포(예를 들면, 말초 및 중추 뉴런, 아교 등)), 중배엽-유래 세포, 많은 내부 장기 세포(신장, 간, 췌장, 심장, 폐 등), 골수 세포 및 종양 또는 다른 것 내의 암세포 등의 원하는 세포의 모든 유형일 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 벡터에 의한 감염에 적절한 세포의 비-제한적인 예시는 간세포, 폐세포, 상피 세포, 심장 세포, 근육 세포, 줄기 세포 및 암세포를 포함한다.
인 비보에서 사용되는 경우, 본 발명의 방법은, 벡터 내 도입 유전자가 하나 이상의 예방적- 또는 치료적-활성 단백질, 폴리펩티드 또는 다른 인자(예를 들면, siRNA 또는 miRNA와 같은 비-코딩 RNA(ncRNA))를 코딩할 때, 개체의 질병 또는 상태를 치료할 수 있다. 따라서, 본 발명은, 본 발명의 벡터를 개체의 세포를 감염시키기 충분한 양 및 위치에서 개체에 투여하여 도입 유전자가 개체의 세포 내에서 발현되게 하는 것을 포함하는 개체의 질병 또는 상태를 치료하는 방법을 제공하고, 여기서 상기 도입 유전자는 하나 이상의 예방적 또는 치료적 활성 단백질, 폴리펩티드 또는 ncRNA를 코딩한다. 예를 들면, 상기 질병 또는 상태는 일 유형의 암일 수 있고, 여기서 도입 유전자는 종양 살해 활성(TRAIL 또는 종양 괴사 인자(TNF) 등)을 향상시키는 작용제를 코딩할 수 있다. 추가적인 비-제한적 예시로서, 상기 도입 유전자는 근이영양증(muscular dystrophy)(적절한 도입 유전자는 디스트로핀을 코딩), 심혈관 질환(적절한 도입 유전자는, 예를 들면 SERCA2a, GATA4, Tbx5, Mef2C, Hand2, Myocd 등을 코딩), 신경퇴행성 질병(적절한 도입 유전자는 예를 들면 NGF, BDNF, GDNF, NT-3 등을 코딩), 만성적 통증(적절한 도입 유전자는 GlyRα1, 엔케팔린(enkephalin), 또는 글루타메이트 데카르복실라제(예를 들면, GAD65, GAD67, 또는 다른 이소폼), 폐질환(예를 들면, CFTR), 또는 혈우병(hemophilia) (적절한 도입 유전자는 예를 들면 Factor VIII 또는 Factor IX를 코딩)과 같은 상태의 치료에 적절한 작용제를 코딩할 수 있다.
다른 구체예에서, 본 발병의 방법은 인 비트로에서 사용되어 배양물 내 세포 내의 도입 유전자의 발현을 초래할 수 있다. 또한, 줄기 세포 및 섬유아세포, 인간 진피 섬유아세포(HDF) 또는 인간 폐 섬유아세포(HLF) 등의 모든 유형의 세포가 인 비트로에서 본 발명의 방법으로 감염될 수 있다. 인 비트로에서 이용하기 위한 다른 바람직한 세포 유형은 각질 세포(keratinocyte), 말초 혈액 단핵 세포(peripheral blood mononuclear cell), 조혈모 세포(hematopoietic stem cell) (CD34+), 또는 중간엽 줄기/전구 세포를 포함한다. 일 구체예에서, 상기 도입 유전자(들)은 세포의 분화에 영향을 미칠 수 있는 하나 이상의 인자를 코딩한다. 예를 들면, Oct4, Klf4, Sox2, c-Myc, L-Myc, 지배적-음성 p53, Nanog, Glis1, Lin28, TFIID, mir-302/367, 또는 다른 miRNA 중 하나 이상의 발현은 세포가 유도 만능 줄기(iPS)세포가 되는 것을 초래할 수 있다. 또한, Takahashi 및 Yamanaka, Cell, 126: 663-676 (2006); Takahashi, Cell, 131: 861-872 (2007); Wernig, Nature, 448: 318-324 (2007); 및 Yu, Science, 318: 1917-1920 (2007)를 참조하고, 상기 개시 내용은 본 명세서에 참조로서 통합된다. 대안적으로, 본 발명의 벡터 내 상기 도입 유전자(들)은 세포를 전환분화(transdifferentiating)시키기 위한 인자(예를 들면, GATA4, Tbx5, Mef2C, Myocd, Hand2, SRF, Mesp1, SMARCD3(심근 세포에 대해); Ascl1, Nurr1, Lmx1A, Brn2, Myt1l, NeuroD1, FoxA2(신경 세포에 대해), Hnf4α, Foxa1, Foxa2 or Foxa3 (간세포에 대해) 중 하나 이상)를 코딩할 수 있다.
인 비보 또는 인 비트로에서 본 발명의 벡터, 조성물 또는 스톡으로 세포를 감염시키는 것을 포함하는 본 발명의 방법을 수행할 때, 상기 세포는 도입 유전자를 발현시키기 원하는 임의의 포유류 유핵 세포일 수 있다. HSV는 넓은 감염성을 가지며, 본 명세서에 기재한 바와 같이, 본 발명의 벡터는 그의 자연적 향성(natural tropism)을 바꾸고 바이러스 엔벨로프 당단백질을 변형시켜 감염성을 향상시키도록 조작될 수 있다. 그러므로, 상기 벡터는 많은 포유 동물 종의 세포를 감염시키는데 이용될 수 있다. 본 발명의 방법은 소, 말, 양, 염소, 돼지 등과 같은 동물에서 외래 유전자를 발현시키거나 결손된 유전자를 공급하기 위한 것과 같이, 농업에 응용될 수 있는 것으로 여겨진다. 유사하게, 본 발명의 방법은 고양이, 개 등과 같은 반려 동물을 위한 수의학적 맥락에서 이용될 수 있다.
물론, 본 발명의 방법은 인간 내에서 인 비보로 이용되어, 의료적 환경하에서 예방학적- 또는 치료학적-활성 물질, 또는 인자의 발현을 제공할 수 있다. 상기 인자(본 발명의 벡터 내의 도입 유전자 하나 이상의 발현으로 공급된)는 외래성일 수 있고, 유전적 결손을 보완하는 것일 수 있다.
도 1a는 벡터의 리포터 유전자 발현을 도시적으로 나타내는 도이다. 상단 선은 전장의 야생형 HSV-1 균주 KOS BAC 클론(Gierash, J. Virol. Meth.,135: 197-206 (2006))을 나타내며, 본 발명의 JΔNI 벡터를 발생시키기 위해 사용된다. 두 번째 선은 JΔNI5, 즉 JΔNI7-GFP의 뼈대(backbone)을 나타낸다. 세 번째 선은 JΔNI5의 LAT부터 UL4 영역까지를 확대한 것이다. 네 번째 선의 좌측(LAT:CAG-GFP)은 JΔNI7-GFP 내 리포터 발현 카세트의 위치를 나타낸다. 네 번째 선의 우측(UL3/4:CAG-GFP)은 JΔNI5-유래 조절 벡터(JΔNI6-CAGGFP) 내 동일한 발현 벡터의 위치를 나타낸다. 도 1a 기호 설명: TR, 말단 반복; IR, 내부 반복; UL, 고유 장 영역(unique long region); US, 고유 단 영역(unique short); 여러 IE 유전자들의 위치를 확인하는 숫자들; Δ, 결손; β, 초기 프로모터; CTRL, 절연자; LAT P2, 장기 발현 요소(long-term expression element); CAG, CMV/액틴/글로빈 인핸서(enhancer)/프로모터/인트론 카세트. 도 1b는 리포터 유전자 발현을 나타내는 사진 세트이다. 도 1b 기호 설명: HDF, 인간 진피 섬유아세포(human dermal fibroblasts); hpi, 감염 후 경과시간; dpi, 감염 후 경과일; MOl, 감염 다중성(multiplicity).
도 2a-2b는 JΔNI6-CAGGFP- 및 JΔNI7-GFP-감염 세포의 도입 유전자 발현을 비교하는 사진의 세트이다. 도 2a는 표시된 MOI에서 감염된 HDF 및 U2OS 세포 내의 GFP("EGFP") 및 mCherry 발현을 나타낸다. 형광 현미경 이미지는 감염 3일 후 얻었다. 도 2b는 감염된 HDF(MOI=0.5) 내의 도입 유전자 발현 지속을 나타낸다. 이미지들은 감염 1-14일 후에 얻었다.
도 3은 보완 세포(U2OS-ICP4/ICP27) 세포 상의 JΔNI7-miR302GFP 바이러스의 발현(expansion)을 나타내는 사진 세트이다. 사진들은 감염 후 3일에 얻었다.
도 4는 테트라시클린-유도성 프로모터 및 게이트웨이(Gateway) 재조합 카세트의 HSV 벡터의 LAT 유전자좌(locus)로의 삽입(insertion)을 위한 표적 플라스미드(targeting plasmid)의 구조를 도시적으로 나타낸다. 도 4 기호 설명: Zeo, 제오미신-저항성 유전자(zeomycin-resistance gene); Cm, 클로람페니콜-저항성 유전자(chloramphenicol-resistance gene); ccdB, 음성적 선별을 위한 독성 유전자; LATP2, LAT 장기 발현 요소; CTRL2, LAT 유전자좌의 크로마틴 경계/절연자 요소 2.
도 5는 U2OS-ICP4 세포주 내의 ICP27 발현을 위한 렌티바이러스 플라스미드의 구조를 도시적으로 나타낸다. 도 5 기호 설명: p, 프로모터; bla, 블라스티시딘(blasticidin) 저항성 유전자.
도 6a는 QOZHG 바이러스(ICP4-결손; ICP27-결손)로 감염된 U2OS-ICP4 세포 및 여러 클론성 U2OS-ICP4/ICP27 세포의 ICP27 면역 형광 염색을 보여주는 사진 세트이다. 도 6b는 U2OS-ICP4 및 U2OS-ICP4/ICP27 세포 내 QOZHG 바이러스의 성장(바이러스 게놈 내 GFP 발현 HCMV 프로모터-GFP 카세트로부터의 GFP 발현)을 나타내는 사진 세트이다.
도 7은 본 발명의 HSV 벡터(JΔNI7-GFP, 중간), JΔNI7-GFP의 LAT 영역(상단), 및 야생형 HSV의 LAT 영역(하단)을 도시적으로 나타낸다.
도 8은 본 발명의 JΔNI7-GFP HSV 벡터의 LAT 영역의 서열을 나타낸다.
도 9a-9c. 바이러스 생산을 위한 벡터 게놈 구조 및 보완 세포. (도 9a) KOS-37 BAC(24) 내 야생형 HSV-1 KOS 게놈 및 IE 유전자-결실 파생물(derivative) JΔNI2, JΔNI3 및 JΔNI5의 게놈의 도시도. UL, 고유 장 분절; US, 고유 단 분절. 개방 박스: 말단 및 내부 반복. 클로람페니콜-저항성 유전자 및 β-갈락토시다제 발현 카세트를 포함하는 BAC 요소는 UL37-UL38 유전자간 영역 내의 loxP 부위(site)들 사이에 위치한다(Gierasch et aI., J Viral. Methods 135, 197-206 (2006)). 상기 KOS-37 BAC 및 이의 파생물 내의 US 영역은 HSV 게놈의 표준 표현(standard representation)과 비교하여 반전되어(inverted) 있다. JΔNI 구조체 내의 결실은 검은 박스와 Δ 부호로 표시된다; ICP47 프로모터 및 번역 개시 코돈은 조인트 결실의 일환으로서 제거된다. 프로모터 교체(ICP0, ICP27) 또는 TAATGARAT 결실(ICP22)에 의해 초기 발현 역학(kinetics)으로 변환되는 IE 유전자는 빗금 상자 및 ICP 번호 앞의 β 부호로 나타낸다. 모든 JΔNI 재조합체(recombinant)들은 gB 유전자 내에 초-활성(hyper activating) N/T 돌연변이(Uchida et aI., J Viral. 84, 12200-09 (2010)) 및 ICP4 유전자좌 내 유비퀴틴 C 프로모터(UbCp)-mCherry 카세트를 포함한다; mCherry 카세트의 SV40 폴리A 영역은 작은 패턴화 박스로 나타낸다. (도 9b) 보완 세포의 웨스턴 블롯 분석. MOI 1에서 비감염 세포 및 QOZHG(좌) 또는 JΔNI5 바이러스(우)로 감염된 세포를 24 hpi에서 수확하고 겔 전기영동을 위한 추출액을 제조하였다. 블롯들은 ICP4, ICP27, 또는 로딩 대조군인 α-투불린에 대한 항체로 검출(probe)하였다. (도 9c) U2OS, U2OS-ICP4, U2OS-ICP4/27 및 Vero-7b 세포 내 JΔNI2 및 JΔNI5 바이러스 성장. 0.001 MOI에서 세포들을 감염시켰고 3배수(triplicate) 웰로부터 세포 외 바이러스를 매일 수확하였고 U2OS-ICP4/27 세포 상에서 적정(titer)하였다.
도 10a-10b. 동일한 gc 또는 PFU로 감염 후의 상대적인 핵 바이러스 DNA 수준. HDF는 표시된 JΔNI 벡터로 5,000 gc/세포(도 10a) 또는 1 PFU/세포(도 10b)에서 감염되었다. 2 hpi에서, 핵 DNA를 분리하였고 세포성(cellular) 18S rRNA 유전자에 정규화된(normalized) gD 유전자를 위해, 상대적인 바이러스 gc 수를 qPCR로 결정하였다.
도 11a-11d. 비-보완 세포 내의 JΔNI 세포 독성 및 바이러스 유전자 발현. (도 11a) 인 비트로 세포 독성 분석. HDF 및 Vero 세포를 25,000 gc/세포에서 감염시켰고 5 dpi에서의 세포 생존능을 3배수 웰 내에서 MTT 분석법으로 측정하였다. 플롯 값(plotted value)는 바이러스-감염 내지 모조-감염(mock-infected) 세포의 평균 비율을 나타낸다. 별표가 있는 브라켓은 JΔNI2- 및 JΔNI3-감염 Vero 세포 사이 및 JΔNI3- 및 JΔNI5-감염 Vero 세포 사이의 통계적으로 유의한 차이(p<0.05)를 나타낸다. (도 11b) HDF 내 IE 유전자 산물의 면역블롯 분석. 세포들은 1 PFU/세포의 PFUKOS, QOZHG 또는 JΔNI 바이러스로 감염되었고 24 hpi에서 추출액을 제조하였다. 블롯들은 표시된 IE 유전자 산물 또는 로딩 대조군인 α-투불린에 대한 항체로 검출하였다. (도 11c) JΔNI IE 유전자 발현을 qRT-PCR로 측정하였다. HDF는 표시된 바이러스로 1,000 gc/세포에서 감염시켰다. mRNA는 12 hpi에서 분리하였고, 역 전사하여(reverse-transcribed) 상위에 위치한 유전자들의 cDNA 수준을 qPCR로 결정하였다. 발현은 18S rRNA 수준에 정규화되었고, JΔNI2-감염 세포에 상대적인 수준으로 나타낸 것이다. (도 11d) 초기(상단 패널) 및 후기(하단 패널) 유전자들의 발현에 대한 qRT-PCR 분석. HDF를 감염시키고 (도 11c)와 같이 처리하였다. ICP6은 지연된(delayed) IE 유전자로 여겨질 수 있으나, 이의 발현이 VP16 또는 ICP4보다는 ICP0에 의존적이라는 보고로 인해((Desai et aI., J. Viral. 67,6125-35 (1993); Sze et aI., Virus Res. 26,141-52 (1992); Harkness et aI., J. Viral. 88(12) 6847-61 (2014)), 본 명세서에서는 초기 유전자로 분류한다.
도 12a-12d. JΔNI-감염 HDF 내 리포터 유전자 발현. (도 12a) mCherry 형광. 세포들은 표시된 gc/세포로 감염되었고 24 hpi에서 촬영하였다. (도 12b) 상대적 mCherry mRNA 수준. HDF는 5,000 gc/세포로 감염시켰고 도 3c에서와 같은 mRNA 분리, 역 전사 및 qPCR을 위해 6 hpi에서 수확하였다. (도 12c) U2OS 세포 내 mCherry 형광. 세포는 1,000 gc/세포로 감염시켰고 24 hpi에서 촬영하였다. (도 12d) JΔNI5-감염 HDF 내 mCherry 발현의 유도. 세포들은 표시된 gc/세포로 감염시켰고, QOZHG를 5,000 gc/세포로 24시간에서 중복-감염(super-infected)시켰고, 24시간 후에 촬영하였다.
도 13a-13d. JΔNI6GFP 및 JΔNI7GFP 게놈 구조 및 리포터 유전자 발현. (도 13a) JΔNI7GFP는, LATP2 장기 발현/인핸서 영역 및 인트론 내 하류 CTCF-결합 모티프(CTRL2) 사이의, 2-kb LAT 인트론 영역 내에 CAG 프로모터-EGFP 발현 카세트를 포함한다. LATP2는 LAT 전사 개시 부위로부터 2-kb 인트론 내부까지 연장된다. JΔNI6GFP는 동일한 CAG 프로모터-EGFP 발현 카세트를 UL3 및 UL4 유전자 사이에 포함한다. CAGp-EGFP 카세트의 토끼 β-글로빈 폴리 A 영역은 작은 패턴화 박스로 나타낸다. (b-d) 감염된 HDF 내 EGFP 및 mCherry 발현. (도 13b) 세포는 JΔNI6GFP 또는 JΔNI7GFP 바이러스를 여러 gc/세포로 감염시켰고 형광은 3 dpi에서 영상화하였다. (도 13c) HDF는 JΔNI6GFP 또는 JΔNI7GFP 벡터를 12,500 gc/세포로 감염시켰고 3 또는 5일 후 2개의 리포터 유전자에 대한 mRNA 추출 및 qRT-PCR 분석을 위해 수확하였다. 18S rRNA에 대해 정규화된 발현을 3일차의 JΔNI6GFP-감염 세포에 대해 상대적으로 보여준다. (도 13d) HDF를 JΔNI6GFP 또는 JΔNI7GFP 바이러스를 25,000 gc/세포에서 감염시켰고 EGFP 형광을 7, 14 및 28 dpi에서 촬영하였다.
도 14a-14c. JΔNI7GFP로부터의 EGFP 발현에 대한 LAT 유전자좌 요소의 효과. (도 14a) JΔNI7GFP 및 CTRL1(ΔC1), CTRL2(ΔC2) 또는 LATP2(ΔLP2) 각각 또는 이들 조합이 결실된 파생물들. JQ673480 내 위치 8978-9161의 결실는 CTRL1을 포함하고, JQ673480 내 위치 5694-5857의 결실은 CTRL2를 포함한다. 이러한 결실은 CTCF 결합 모티프 이후(beyond) 일부 염기들을 포함한다. (도 14b) 감염된 HDF의 리포터 유전자 발현. 세포들을 표시된 바이러스로 12,500 gc/세포에서 감염시켰고 형광을 3 dpi에서 기록하였다. (도 14c) JΔNI7GFP, LAT 요소가 결실된 파생물, 또는 JΔNI6GFP로 감염된 HDF 내의 상대적 EGFP mRNA 수준; 바이러스는 약어 명칭으로 확인한다. 세포들을 12,500 gc/세포에서 감염시키고 qRT-PCR 분석을 위해 3 dpi에서 처리하였다. 발현 수준은 18S rRNA에 대해 정규화하였고, JΔNI7GFP-감염 세포 내의 수준에 대해 상대적으로 나타내었다.
도 15a-15d. 바이러스 게놈 내 다른 위치에 있는 LAT 서열의 항-침묵 활성. (도 15a) JΔNI9 및 JΔNI10 벡터의 구조. CTRL1, LATP2 및 CTRL2를 포함하는 XhoI 단편을 JΔNI5 게놈으로부터 제거하였고 GW 재조합 카세트를 UL45 및 UL46 사이에 도입하여 JΔNI9GW를 발생시키거나, 또는 UL50 및 UL51 사이에 도입하여 JΔNI10GW(상단)을 생산하였다. 동일한 XhoI 부위를 JΔNI7GFP로부터 CAGp-GFP-포함 LAT 단편을 분리하기 위해 사용하였다(하단 좌측). XhoI 단편을 pENTR1A로 클로닝(cloning)하여(하단 우측), 각각의 GW 카세트와의 attL/attR 재조합(LR 반응)으로 JΔNI9GW 또는 JΔNI9GW로 전달(transferred)하고 JΔNI9LAT-GFP 및 JΔNI10LAT-GFP를 각각 생산하였다. 대조군으로서 LAT 서열이 없는 CAGp-GFP 카세트를 pENTR1A 중간체를 경유하여 JΔNI9GW 또는 JΔNI10GW의 GW 유전자좌로 재조합하였고, JΔNI9GFP 및 JΔNI10GFP를 생산하였다. (도 15b) JΔNI9 또는 JΔNI10 바이러스로 감염된 HDF 내 리포터 유전자 발현. HDF는 12,500 gc/세포에서 표시된 바이러스로 감염되었다. EGFP 및 mCherry 형광은 3 dpi에서 기록되었다. (도 15c) 감염된 HDF 내 EGFP mRNA 수준을 앞선 도면들과 같이 qRT-PCR로 결정하였다. 그 수준은 JΔNI9GFP- 또는 JΔNI10GFP-감염 세포들에 상대적인 것으로 나타낸다. JΔNI10ΔC12LP2-GFP는 JΔNI17ΔC12LP2-GFP로부터, 상기 JΔNI10LAT-GFP의 구조와 유사한 JΔNI10GW의 GW 부위로 XhoI LAT 단편을 전달하여 구성하였다. (도 15d) 도입 유전자 발현에 대한 JΔNI10LAT-GFP로부터의 CTRL들 및 LATP2 모두의 결실의 효과. HDF를 12,500 gc/세포에서 감염시켰고 EGFP 및 mCherry 형광을 3 dpi에서 기록하였다.
도 16a-16d. 다른 비-보완 세포 내의 JΔNI 벡터들로부터의 리포터 유전자 발현. (도 16a) 상단에 나열된 세포들을 JΔNI6GFP 또는 JΔNI7GFP로 아래 패널에 표시된 gc/세포에서 감염시켰다. EGFP 및 mCherry 형광은 3 dpi에서 기록하였다. (도 16b) 도 16a와 같이 감염된 세포 내의 EGFP 유전자 발현을 3 dpi에서 qRT-PCR 분석으로 측정하였다. 18S rRNA에 대해 정규화된 결과는 JΔNI6GFP-감염 세포에 대해 상대적으로 나타낸다. (도 16c) hMDSC를 JΔNI6GFP 또는 JΔNI7GFP 바이러스로 50,000 gc/세포에서 감염시켰고, EGFP 형광을 14 및 28 dpi에서 촬영하였다. (도 16d) JΔNI10GFP 또는 JΔNI10:LAT-GFP로 12,500 gc/세포에서 감염된 hEK, hPAD 및 hHEP 세포 내에서의 감염 3일 후 EGFP mRNA 수준의 qRT-PCR 결정. 정규화된 발현은 JΔNI10GFP-감염 세포에 대해 상대적으로 나타낸다.
도 17은 JΔNI5로부터의 JΔNI8의 구조를 그래픽적으로 도시한다.
도 18은 1 게놈 복제수(gc)/세포에서 감염 후의 보완 세포(U2OS-ICP4/27) 내에서, JΔNI5와 비교한 JΔNI8의 성장에 관련한 데이터를 나타낸다. 상단 패널은 리포터 유전자 발현(mCherry)을 도시하고, 하단 좌측 패널은 플라크 형성 단위(PFU)의 바이러스 수율(yield)을 보고하고, 하단 우측 패널은 게놈 복제수(gc)의 바이러스 수율을 보고한다.
도 19는 바이러스 유전자가 보완 세포 내에서 JΔNI5보다 JΔNI8로부터 더 초기에 발현되는 것을 증명하는 데이터를 도시한다. 각각의 패널에서, 하단선은 JΔNI5에 대한 데이터를 나타내고, 상단 선은 JΔNI8에 대한 데이터를 나타낸다. 데이터들은 qRT-PCR로 수집하였고, 감염 후 6시간(hpi)에서의 JΔNI5 데이터 포인트에 상대적인 배수차로 표현된다.
도 20은 JDNI7GFP(또한 JΔNI7GFP로 언급) 및 JDNI8GFP(또한 JΔNI8GFP로 언급)의 게놈 구조를 그래픽적으로 도시한다.
도 21은 동일한 양의 JΔNI8 및 JΔNI5(gc로 표현)로 감염된 인간 진피 섬유아세포(HDF)가 핵 내에 동일한 양의 바이러스 DNA를 갖는다는 것을 증명하는 데이터를 나타낸다. 데이터는 감염 후 2시간(hpi)을 대표한다.
도 22는 다양한 HSV 벡터를 두 M.O.I에서 감염시킨 HDF의 세포 생존능(MTT)을 비교한 데이터를 나타낸다. 각각의 패널의 하단-X-선은 JΔNI5에 대한 결과를 나타내고, 각각의 그래프의 상단-X-선은 JΔNI8에 대한 결과를 나타낸다.
도 23은 다양한 HSV 벡터를 다양한 세포 당 바이러스 게놈 수에서 감염시킨 HDF의 세포 생존능(MTT)을 비교한 데이터를 나타낸다. 좌측 패널(12,500 gc/세포)에서, JΔNI5의 M.O.I는 5 PFU/세포이고, 반면 JΔNI8에 대한 M.O.I는 18 PFU/세포였다. 우측 패널(25,000 gc/세포)에서, JΔNI5의 M.O.I는 11이고, 반면 JΔNI8에 대한 M.O.I는 33이었다. 각각의 패널의 하단-X-선은 JΔNI5에 대한 결과를 나타내고, 각각의 그래프의 상단-X-선은 JΔNI8에 대한 결과를 나타낸다.
도 24는 KOS, JΔNI5 및 JΔNI8로 감염시킨 6개의 세포 타입(HDF, 인간 각질 세포(human neonatal keratinocytes), 인간 신경 줄기 세포, Vero, 인간 지방전구세포(human preadipocyte), 및 인간 간세포)의 세포의 생존능을 비교한 데이터를 나타낸다. MTT 분석은 25,000 gc/세포와 감염 후 5일(dpi)에서 보고된 데이터를 이용하여 수행하였다.
도 25는 표시된 gc/세포에서 JΔNI7GFP 및 JΔNI8GFP로 감염된 인간 진피 섬유아세포(HDF)들 사이의 리포터 유전자 발현(mCherry 또는 향상 녹색 형광 단백질(EGFP))을 비교하는, 감염 후 3일의 투여-반응(dose-response) 데이터를 나타낸다.
도 26은 25,000 gc/세포에서 JΔNI7GFP 및 JΔNI8GFP로 감염된 인간 진피 섬유아세포(HDF)들 사이의 리포터 유전자 발현(mCherry 또는 EGFP)을 비교하는 시간-코스(time-course) 데이터를 나타낸다.
도 27은 12,500 gc/세포 또는 25,000 gc/세포에서 JΔNI7GFP 또는 JΔNI8GFP로 감염된, 감염 후 3일의 인간 각질 세포에 대한 리포터 유전자 발현(mCherry 또는 EGFP)을 비교하는 실험 결과를 나타낸다.
도 28은 6,250 gc/세포에서 JΔNI7GFP 또는 JΔNI8GFP로 감염 3일 후의 래트 후근 신경절(dorsal root ganglion: DRG) 뉴런에 대한 리포터 유전자 발현(mCherry 또는 EGFP)을 비교하는 실험 결과를 나타낸다.
도 29는 JΔNI7GFP로 감염된 신경 세포에서 도입 유전자 발현(mCherry 또는 EGFP)을 조사하는 실험 결과를 나타낸다. 상단, 표시된 감염 후 일자(dpi)에서의 EGFP 및 mCherry 형광의 분리(좌측; 40x) 또는 통합(중간, 우측; 20x) 이미지; 하단, 15 dpi에서의 분리 및 통합 이미지(10x).
도 30은 pCX4Hyg-Cre의 도시적 다이어그램이다.
도 31은 pCX4Hyg-Cre의 발생을 도시적으로 나타낸다.
도 32는 정량적 역 전사(RT)-PCR에 의해 결정된 JΔNI7GFP- 및 JΔNI6GFP-감염 HDF 세포들의 EGFP mRNA 수준을 비교하는 데이터를 나타낸다.
하기의 실시예는 본 발명을 추가적으로 도시하지만, 물론 이는 그 범위를 제한하는 방식으로 구성된 것이 아니다.
실시예 1
본 실시예는 본 발명의 HSV 벡터를 복제 및 생산하기 위한 보완 세포주의 개발을 설명한다.
HSV의 수 개의 전초기(IE) 유전자는 바이러스 복제에 있어 필수적이지만, 이들 및 다른 IE 유전자는 다양한 세포 유형에 독성 효과를 갖는다. 반면 이들 유전자의 제거는 벡터 독성을 방지하고, 그 필수적인 산물은 감염성 바이러스 입자를 생산하기 위해 반드시 제공되어야 한다. U2OS 인간 골육종 세포에 기반한 신규한 세포주를 조작하여 조건적으로 필수적 IE 유전자 ICP4 및 ICP27을 발현하도록 만들었다. 이들 유전자들은 레트로바이러스-매개 삽입에 의해 같은 기원의 바이러스 프로모터의 조절하에서 도입되었다. 이러한 유전자들은, HSV 감염에 의해 HSV 외피 단백질 VP16이 핵(이들 프로모터의 활성에 의하여 통합된 ICP4 및 ICP27 유전자의 고-수준의 발현이 촉진되는)으로 운반되기 전까지는, 침묵으로 남아 있을 것이다. 그러므로, HSV 감염에 앞서, 이들 유전자들은 조작된 U2OS 세포 내에서 부적절한 독성 없이 안정적으로 유지될 수 있다. HSV 성장은 또한 ICP0의 발현에 의존적이지만, 이 단백질은 세포 복제를 저해하고, 세포 주기의 정지 및 프로그램된 세포 사멸을 초래한다. 놀랍게도, U2OS 세포는 자연적으로 ICP0 기능을 보완하고 따라서 ICP4 및 ICP27의 도입이 모든 3개의 IE 유전자들이 결실된 벡터의 효율적인 생산을 위한 세포 환경을 제공하기에 충분하다. 이러한 신규한 조작된 세포주는 안정하고, 배양물에서 잘 자라며, 비-독성 HSV 벡터의 임상적 생산에 이용될 수 있다.
U2OS-ICP4/27 세포 및 7b (Vero-ICP4/ICP27) 세포를 E1G6(ΔICP4::HCMVp-eGFP/ΔICP27/β22/β47) 또는 JDQOZEH1(ΔICP4/ΔICP27/ΔICP22/ΔICP0::HCMV-eGFP) 바이러스로 감염시켰다. 3일 후, 세포 상층액 내 바이러스를 U2OS-ICP4/27 세포 상에서 적정하였다.
Figure pat00001
상기 데이터는 E1G6(ICP4- 및 ICP27-결실; ICP22 및 ICP47의 발현 없음)이 둘 모두의 세포주에서 잘 성장하는 반면 JDQOZEH1(ICP0, ICP4, ICP27 및 ICP22 결실)은 오직 U2OS-ICP4/27 세포 상에서만 자랄 수 있는 것을 보여준다. 7b 상층액 내의 JDQOZEH1 역가는 7b 감염으로부터의 잔차 입력(residual input)을 유사하게 나타낸다.
실시예 2
본 실시예는 LAT 유전자 영역 내 삽입된 도입 유전자를 포함하는 게놈을 포함하는 HSV 벡터로서, 상기 벡터는 ICP0, ICP4, ICP22, ICP27 및 ICP47을 전초기 유전자로서 발현하지 않는 것인 벡터의 구체예를 설명한다.
벡터 게놈(도 1a)은 박테리아 내 증식 및 조작을 가능케 하는 UL37-UL38 유전자 간 영역 내에 Cre-제거 가능한 박테리아 인공 염색체(BAC) 카세트를 포함한다. UL 및 US 분절을 분리하는 비-필수적 내부 반복 영역(조인트, 14 kb)이 결실되어 도입 유전자 삽입을 위한 공간을 제공하고 벡터 안정성을 증가시킨다. 상기 벡터는 ICP4 및 ICP27 유전자의 결실로 인해 복제 결손이고, 추가적으로 독성 IE 유전자 ICP0와 그 프로모터, 및 ICP47 IE 유전자의 시작 코돈이 결실된 것이다; 남아있는 독성 IE 유전자인 ICP22는 ICP4-의존적(초기, β) 프로모터에 의해 조절되어 ICP40보안 세포 내에서 "전초기"가 아닌 "초기" HSV 유전자 발현 단계 동안 ICP22를 발현하게 된다. U2OS 세포는 자연적으로 ICP0을 보완하기 때문에, 상기 벡터는 U2OS-기반 바이러스 생산 세포주이고, 불필요한 ICP47 유전자를 제외한 모든 IE 유전자의 기능을 보완하는 U2OS-ICP4/ICP27에서 성장하였다. 상기 벡터 게놈은 또한 바이러스의 세포로의 진입을 증폭시키는 gB 유전자와 ICP4 결실 위치에서의 유비퀴틴(UbC) 프로모터-mCherry 리포터 유전자 발현 카세트의 돌연변이 쌍을 포함한다. 비-보완 세포에서, 헤테로크로마틴 형성을 막는 절연자(CTRL) 요소 사이에 위치한, 잠복-연관 전사체(LAT) 프로모터 영역은 활성으로 남는다. 본 영역은 인핸서 요소이며, 장기 유전자 발현을 촉진하는, LAT P2 또는 LAP2를 포함한다. CAG 프로모터-GFP 발현 카세트는 LATP2 및 CTRL2 사이에 삽입되었고, 강한 GFP 발현이 감염된 인간 진피 섬유아세포(HDF)에서 관찰되었고, 반면 게놈의 다른 위치에 삽입된 동일한 GFP 카세트 또는 mCherry 카세트로부터 최소의 발현이 관찰되었다(도 1b). 그러므로, IE 유전자 발현의 완전한 부존재하에서, LAT 유전자좌는 도입 유전자 발현에 대한 특권이 있는(privileged) 부위이다.
도 1a는 UL(상단) 내에 BAC 서열을 갖는 완전한 HSV-1 게놈 및 기본 벡터 구조를 보여준다. LAT 및 UL3-UL4 영역은 아래 확대하여 나타내고 CAG-GFP 삽입의 다른 위치가 표시된다. 도1b는 감염된 HDF의 벡터 게놈 내 다른 위치로부터의 GFP 발현을 보여준다. 상기 벡터 내 GFP 유전자는 EGFP를 코딩한다.
실시예 3
본 실시예는 다양한 HSV 벡터 구조체들의 구조 및 특성을 나열한다.
Figure pat00002
†Δ = 결실; β = 초기 발현 역학으로 변환; Δp = 결실된 프로모터 및 시작 코돈
1 CAG 프로모터
2 EF1α 프로모터 후의 EF1α 최초 인트론을 포함한다
* 결실된 ICP4 유전자좌 내에 모두 동일한 mCherry 발현 구조체를 갖는다
** HDF (인간 진피 섬유아세포) 내 3 dpi
실시예 4
본 실시예는 JΔNI7-GFP- 및 JΔNI6-CAGGFP-감염 세포 내 도입 유전자의 발현을 증명한다. JΔNI7-GFP 내 CAG-GFP의 위치는 도 1에 LAT-CAG-GFP로 나타나 있다; 이의 JΔNI6-CAGGFP 내 위치는 도 1에 UL3/4:CAG-GFP로 나타나 있다. 더욱이, JΔNI7-GFP HSV의 LAT 영역의 서열은 도 8(서열번호 1)에 기재되어 있고, LAT 영역 내 다양한 유전적 요소들의 서열을 포함한다. 상기의 벡터들 내 GFP는 EGFP를 코딩하는 것에 주목해야 한다.
바이러스 스톡의 생물학적 역가는 U2OS-ICP4/ICP27 세포 상에서 결정하였고 게놈 복제수(gc) 역가는 바이러스 당단백질 D 유전자에 대한 정량적 실시간 PCR로 결정하였다. JΔNI6-CAGGFP 및 JΔNI7-GFP에 대한 입자(gc) 대 플라크 형성 단위(PFU)의 비율은 비슷하였다. 실시예 8, 표 2를 참조한다.
비-보완 인간 진피 섬유아세포(HDF) 및 ICP0-보완 U2OS 세포는 이들의 도입 유전자 발현을 비교하기 위해 각각의 바이러스로 감염되었다. LAT 유전자좌 내에 CAG-GFP 카세트를 포함하는 JΔNI7-GFP는, HDF 내에서 강하고, 바이러스 양-의존적인 GFP 발현을 나타내었고, 반면 JΔNI6-CAGGFP은 그 최고량이 오직 최소의 GFP 발현만을 나타내었다(도 2a, 좌측 패널, EGFP). JΔNI7-GFP-감염 HDF 내의 GFP 발현은 감염 후 2주간 검출 가능하게 남아있었다(도 2b, EGFP). 그러나, mCherry 발현은 HDF 내에서 둘 모두의 바이러스로부터 거의 또는 완전히 관찰되지 않았으며(도 2a, 2b, mCherry), 이는 HDF 내에서 LAT 유전자좌 바깥의 유전자는 침묵된다는 것을 시사한다. 대조적으로 U2OS 세포 내에서는 낮은 MOI에서 둘 모두의 바이러스에 대해 풍부한 GFP 및 mCherry 발현이 관찰되었고(도 2a, 우측 칼럼), 이는 상기 세포들의 ICP0-유사 활성이, HDF 내에서 일어나는 비-LAT 유전자좌의 침묵을 막는다는 해석과 일치한다. 이와 함께, 이러한 결과들은 LAT 유전자좌는, 복제-결손이고, ICP0-결손인 벡터의 도입 유전자 발현을 위한 바람직한 부위임을 강하게 나타낸다.
실시예 5
본 실시예는 U2OS-ICP4/ICP27 세포 내 JΔNI7-miR302GFP BAC의 두 개의 분리주(isolate)의 생산을 증명한다.
JΔNI7-miR302GFP BAC 구조체는 LAT 유전자좌 내에서, 일반적인 Yamanaka 체세포 리프로그래밍 유전자 칵테일(OKSM:Oct4, Klf4, Sox2, c-Myc)(Takahashi and Yamanaka, Cell, 126: 663-676 (2006); Takahashi, Cell, 131: 861-872 (2007)의 대안으로서 miR302s/367 클러스터(Anokye-Danso, Cell Stem Cell, 8: 376-388 (2011))에 대한 발현 카세트를 운반한다. 상기 miR302s/367 유전자 클러스터는 EF1α 프로모터와 GFP 코딩 서열을 연결하는 인트론 내에 위치한다. JΔNI7-miR302GFP BAC DNA의 두 분리주는 정제하여 U2OS-ICP4/ICP27 세포에 도입하였고, 바이러스 성장 및 도입 유전자 발현 실험을 위한 바이러스 입자를 생산하였다. 배양물 내 90% 세포 병변 효과가 관찰될 때, 세포 및 상층액으로부터 바이러스를 수집하고 이를 새로운 U2OS-ICP4/ICP27 세포를 감염시키는데 이용하였다. 이후 도입 유전자 발현 및 바이러스 확산을 매일 모니터링하였다. 도 3에서와 같이, 감염 후 3일차에 둘 모두의 BAC 분리주가 플라크-형성 바이러스를 생산하였고 둘 모두의 바이러스가 EGFP 및 mCherry를 발현하였다.
실시예 6
본 실시예는 테트라시클린-유도성 프로모터 및 Gateway 재조합 카세트의 HSV 벡터의 LAT 유전자좌로의 삽입을 위한 표적 플라스미드의 구조를 설명한다.
바이러스 확산(expansion) 중, JΔNI5 또는 JΔNI8의 LAT 유전자좌로 삽입된 OKSM 발현 카세트의 유전적 재배열 및 불활성화를 막기 위한 여러 전략이 이용될 수 있다. 이러한 전략 중 하나는 OKSM 카세트의 활성 CAG 프로모터를 테트라시클린-유도성 프로모터로 교체하는 것이다. 테트라시클린-유도성 프로모터는 오직 이의 전이활성자(transactivator)(rtTA)와 테트라시클린/독시시클린(doxyxycline) 모두의 존재하에서만 활성이므로, 도입 유전자 발현은 바이러스 확산 중 엄격하게 조절(억압)될 수 있다.
테트라시클린-유도성 프로모터의 LAT 유전자좌로의 삽입을 위한 표적 플라스미드가 개발되었다(도 4). 테트라시클린-유도성 TRE3G 프로모터를 운반하는 렌티바이러스 구조체(pLenti-CMVTRE3G-NeoDEST, Addgene)는 시작 구조체로 이용된다. TRE3G 프로모터는 DraI-SpeI 조각으로서 pLenti-CMVTRE3G-NeoDEST로부터 분리되어, 플라스미드 pCMV-GW의 NruI 및 SpeI 부위 사이에 삽입되고, 본래 있던 CMV 프로모터를 교체한다. 플라스미드 pCMV-GW는 렌티바이러스 플라스미드의 Gateway(GW) 내 클로람페니콜(Cm)-선별적 유전자 대신, GW 카세트 내 제오신(Zeo)-선별적 유전자를 포함하였다. TRE3G-GW(Zeo) 발현 카세트를 분리하고, LAT 유전자좌의 일부를 포함하는 플라스미드 내 LAT 서열 사이에 클로닝하여, TRE3G-GW(Zeo) 카세트로 BAC DNA로의 재조합을 위해 "상동 팔(homology arm)"을 추가하였다.
실시예 7
본 실시예는 ICP27에 대한 면역 형광 염색 및 상보성 분석(complementation assay)을 설명한다.
블라스티시딘에 대한 저항성 획득으로 선별된 U2OS-ICP4 세포 및 ICP27 렌티바이러스-감염 U2OS-ICP4 세포의 개별적 클론들을, QOZHG 바이러스(ICP4, ICP27::HCMV IEp-GFP, β-ICP22, β-ICP47, UL41::ICP0placZ; Chen, J. Virol., 74: 10132-10141 (2000))로, ICP27 면역 형광 염색을 위해서는 0.5 MOI에서, 및 상보성 분석을 위해서는 0.01 MOI에서 감염시켰다. ICP27 면역 형광 염색을 위해, 상기 세포들을 감염 24시간 후 고정시키고 염색하였다(도 6a). 클론 #1 및 #8은 ICP27-결손 HSV(QOZHG) 감염에 의한 강한 ICP27 발현 유도를 보여주었다. 상보성 분석을 위해, 바이러스 성장을 모니터링하였고, 감염 후 24, 48, 및 72시간에서 사진을 촬영하였다(도 6b). U2OS-ICP4/27 클론 #1 및 #8은 QOZHG 바이러스의 성장을 지원하는 가장 강한 능력을 나타냈다.
실시예 8
본 실시예는 여러 HSV 벡터의 구조 및 이에 대한 검사를 설명한다.
재료 및 방법
세포
인간 골육종 U2OS 세포(ATCC, Manassas, VA, USA)를 10% FBS 및 페니실린-스트렙토미신(P/S)을 갖는 DMEM에서 성장시켰다. 인간 신생(neonatal) 진피 섬유아세포(HDF)(ATCC, PCS-201-010) 및 BJ 인간 포피(foreskin) 섬유아세포(ATCC, CRL-2522)를 10% 배아줄기세포 인증 FBS(Embryonic Stem Cell Qualified FBS)(Invitrogen) 및 P/S를 갖는 DMEM에서 성장시켰다. Vero, Vero-7b (Krisky et al., Gene Ther. 5, 517-30 (1998)) 및 293T 세포를 5% FBS 및 P/S를 포함하는 DMEM에서 배양하였다. 인간 간세포(hHEP)는 분리하여 기재된 바와 같이 배양하였다(Ueki et al., Hepatology 54, 216-28 (2011); Yoshida et al., Hepatology 58, 163-75 (2013)). 인간 피하 지방 전구 세포(hPAD)(PT-5020, Lonza)는 PBM™-2 기초 배지(Lonza)에서 유지하였다. 인간 근육-유래 줄기/전구 세포(hMDSC)는 기재된 바와 같이 배양하였다(Gao et al., Cell Transplant 22, 2393-408 (2013)). 인간 신생 케라틴 세포(Human neonatal keratinocyte: hEK)(Invitrogen)는 인간 케라틴세포 성장 보충물로 보충된 EpiLife® 배지(모두 Invitrogen에서 얻음)에서 배양하였다. 후근 신경절(rDRGs)은 15일차 래트 배아로부터 미세 절단(micro-dissected)하였고, Leibovitz's L-15 배지 내에서 30분간 37℃에서 일정한 흔들기와 함께 3 mg/ml 제1형 콜라게나제(Sigma, St. Louis, MO)로 분해하였고, B27 보충물, Glutamax-I, Albumax-II, 및 P/S(Gibco/Invitrogen, Grand Island, NY)를 갖고, 100 ng/ml 7.0S NGF(Sigma)로 보충된, 500 μL의 규정된 신경기초 배지 내 24-웰 플레이트 내의 폴리-D-리신(Sigma)이 코팅된 커버슬립(coverslip) 상에, 약 105 세포/웰로 플레이팅하였다. 플레이팅 1-3일 후에, 상기 배지 내 배양물에 10 μM의 우리딘 및 10 μM의 플루오로데옥시우리딘(Sigma)을 처리하여 섬유아세포나 교질세포와 같은 분열하는 세포의 확장을 제한하였다. 세포는 이후 PBS로 세척하여, NGF로 보충된 상기 기재된 신경기초 배지에서 배양하였다. 바이러스 감염은 플레이팅 10-15일 후에 수행하였다.
U2OS-ICP4 세포는, U2OS 세포를 정제된 ICP4 렌티 바이러스로 감염, 푸로미신-저항성 클론을 분리(2 mg/ml), 및 0.5의 다중도(MOI)에서 ICP4-결손 바이러스(QOZHG)로 감염시킨 후 ICP4 발현을 면역 형광 스크리닝하여 만들었다(하기 참조). U2OS-ICP4/27 세포도 유사하게, U2OS-ICP4 세포를 정제된 ICP27 렌티 바이러스로 감염, 푸로미신 및 블라스티시딘에 대한 저항성으로 선별(10 mg/mL), 및 ICP27 면역 형광에 대한 QOZHG-감염 클론의 스크리닝과 바이러스 성장으로 만들어 내었다(도 6).
렌티 바이러스
렌티 바이러스 ICP4 발현 플라스미드 pCDH-ICP4-puro는 플라스미드 pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro(Systembio)의 전체 HCMV IE 프로모터를 ICP4 프로모터와, pUC19의 SphI 부위에 삽입된 pICP4-lox-pac(Rasty et al., J. Neurovirol. 3, 247-64 (1997))(GenBank JQ673480.1 HSV-1 KOS map positions 131,587-124,379; D. Krisky and J.C.G., 미출간)으로부터의 SphI 조각으로 구성된 플라스미드 S3으로부터의 코딩 영역으로 교체하여 구성하였다. 렌티바이러스 ICP27 발현 플라스미드 pCDH-ICP27-SV40-bla는 먼저 pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro의 푸로미신-저항성 카세트를 pcDNA6/BioEase™-DEST (Invitrogen)의 블라스티시딘-저항성 카세트로 교체하여 pCDH-CMV-MCS-SV40-bla를 만들어 구성하였다(도 5). ICP27 프로모터 및 코딩 영역은 이후, ICP27 유전자와, EcoRV 및 SacI 부위 사이의, BamHI(map position 113,244) 및 SacI를 갖는 측면 서열(flanking sequence)(GenBank JQ673480.1 map positions 110,580-115,666; D. Krisky and J.C.G., 미출간)을 포함하는 플라스미드 PD7의 소화(digestion)에 의해 분리되었고, 분리된 조각은 pCDH-CMV-MCS-SV40-bla의 CMV 프로모터를 교체하는데 이용되었다. 그 결과의 플라스미드 pCDH-ICP27-SV40-bla는 도 5에 도시되어 있다.
렌티바이러스는 제조사의 지시에 따라 ViraPower™ Lentiviral Packaging Mix(Invitrogen)를 이용하여 생산하였다. 요약하면, 293T 세포를 ViraPower™ mix 내의 pCDH-ICP4-puro 또는 pCDH-ICP27-SV40-bla로 형질주입시켰다. 상층액을 2일 후 수거하여 맑게하고, 0.45 μm필터를 통해 여과시키고, 및 원심분리로 농축하였다. pCDH-ICP4-puro로부터 생산된 렌티바이러스는 본 명세서에서 ICP4 렌티바이러스로 언급된다; pCDH-ICP27-SV40-bla로부터 생산된 렌티바이러스는 ICP27 렌티바이러스로 언급된다.
HSV-BAC 유전 조작
본 연구에서 발생한 모든 HSV-BAC 구조체와 바이러스 입자로 전환된 것들은 표 2에 나열되어 있으며, D. Leib(Dartmouth Medical School, NH)의 친절한 선물인 KOS-37 BAC(24)로부터 유래한 것이다. 모든 BAC 조작은 pRed/ET (Gene Bridges, Heidelberg, Germany)와, pBAD-I-sceI 플라스미드 (N. Osterrieder에 의해 제공됨, Free University of Berlin, Germany) 또는 E. coli 균주 GS1783(G. Smith, Northwestern University, Chicago, IL)와 함께, 흔적 없는(scarless) Red 재조합에 의해 수행되었고(Tischer et al., Methods Mol. Biol. 634, 421-30 (2010); Tischer et al., Biotechniques, 40, 191-97 (2006)에 기재된 바와 같이), 또는 Gateway Technology Manual (Invitrogen) (http:// tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/gatewayman.pdf)에 따른 인 비트로 Gateway(GW) 재조합으로 수행되었다. 모든 구조체는 PCR 분석, 제한 효소 소화의 FIGE 분석, 및 표적 DNA 시퀀싱으로 확인하였다. Red 재조합을 위한 표적 플라스미드는 (Tischer et al., Biotechniques, 40, 191-97 (2006))에 기재된 바와 같이 구성하였다. I-SceI 제한 부위 부근에 위치한 카나미신-저항성 유전자(I-SceI-aphAI 조각)을 pEPkan-S2 (from N. Osterrieder)(Tischer et al., Biotechniques, 40, 191-97 (2006))로부터 하기 특정되고 표 1에 나열된 여러 표적 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭하였다. 바이러스 게놈을 표적하는 프라이머 부분은 HSV-1 균주-17의 서열(GenBank JN555585.1)에 기반하여 고안하였다. Red 재조합을 위한 모든 표적 조각들은 Qiagen 겔 추출 키트(Qiagen) 또는 SpinSmart Nucleic Acid Prep & Purification Columns(Denville Scientific)으로 정제하였다. 하기 제공된 뉴클레오티드 위치는 HSV-1 균주 KOS의 GenBank JQ673480 서열을 의미한다.
JΔNI 벡터를 구성하기 위해, 상기 설명된 초활성 N/T 이중 돌연변이를 KOS-37 BAC의 gB 유전자(Uchida et al., J. Virol., 84, 12200-09 (2010))로 도입하였고 내부 반복(조인트) 영역을 결실시켰다. 상기 I-SceI-aphAI 조각을 플라스미드 pgB1:D285N/A549T(Uchida et al., J. Virol., 84, 12200-09 (2010))의 SnaBI 부위로 클로닝하였다. 그 결과의 플라스미드 pgB:N/T-kan은 프라이머 R21 및 R22(표 1)을 이용한 증폭을 위한 주형으로 이용하였고, 그 산물은 KOS-37 BAC의 음성 gB 유전자와 재조합하고, 이후 pBAD-I-sceI 플라스미드-형질전환 박테리아 내 aphAI 유전자를 I-SceI-증폭 결실시켰다. 다음, I-SceI-aphAI를 조인트 영역(GenBank JQ673480 positions 117,080-132,466)의 Red-매개 결실을 위한 내포된(nested) 정방향 프라이머 46, 48 및 역방향 프라이머 47로, 게놈의 인접 고유 단(US) 분절의 처음 14 뉴클레오티드(nts)와 함께 증폭하였고, 이후 aphAI 유전자를 제거하였다. KOS-37 BAC 내 US는 HSV 게놈의 일반적인 형태에 비하여 반전된 배향을 가지고 있으며, US12(ICP47) 유전자를 조인트에 바로 인접하도록 위치시키고, US1 유전자를 US 말단 반복에 인접하도록 위치시킨다. 상기 조인트(GenBank JQ673480 positions 145,377-145,390) 상부(beyond)의 14-nt 결실에 의해 ICP47 번역 개시 코돈이 제거되었다.
조인트-결실 gB:N/T BAC 내 ICP4 유전자좌의 mCherry 발현 카세트로의 교체는 하기와 같이 수행된다. 플라스미드 pUbC-mCherry-SV40pA는 pBluescriptUB-Flag-mArt(H. Nakai의 선물, Oregon Health & Science University, Portland, OR)로부터의 인간 유비퀴틴 C 프로모터(UbCp), pEP-miR (Cell Biolabs, San Diego, CA)로부터의 mCherry 유전자, 및 pEP4-EO2SCK2M-EN2L (Addgene plasmid 20924)(Yu et al., Science 324, 797-801 (2009))로부터의 SV40 폴리아데닐화(polyA 또는 pA) 영역을 pBluescript KS+(Stratagene)로 클로닝하여 구성하였다. I-SceI-aphAI 조각은 이후
UbCp 및 mCherry 사이의 경계에서 pUbC-mCherry-SV40pA의 BamHI 부위로 클로닝되어 pUbC-mCherry-SV40pA-KAN을 발생시킨다. 상기 삽입 부위는 프라이머 51 및 52(표 1)로 ICP4 표적 유전자좌와의 Red-매개 재조합을 위해 PCR 증폭된다. 그 결과의 구조체는 ICP22의 TAATGARAT 모티프를 포함하는, GenBank JQ673480 서열의 HSV-1 KOS 위치 146, 113-151, 581가 결실되었다.
JΔNI2를 발생시키기 위한 ICP0 및 ICP27 IE 프로모터의 초기(β) HSV-1 티미딘(thymidine) 키나제(TK) 프로모터로의 교체는, 조인트-결실 UbCp-mCherry gB:N/T BAC와의 Red 재조합을 위해, JΔββ 바이러스 게놈(Craft et al., Stem Cells 26, 3119-29 (2008))의 ICP0 및 ICP27 코딩 영역 모두의 앞에 위치한 TK 프로모터 각각의 내포된 프라이머 쌍 81/82 및 83/84을 이용한 PCR, 각각 pCRBlunt-β0 및 pCRBlunt-β27의 생산을 위한 각 반응 산물의 pCRBlunt(Invitrogen)로의 클로닝, I-SceI-aphAI의 pCRBlunt-β0-KAN 및 pCRBlunt-β27-KAN을 만들어 내기 위한 pCRBlunt-β0의 BglII 부위 및 pCRBlunt-β27의 HpaI 부위로의 삽입, 및 상기 삽입 부위의 각각 프라이머 쌍 85/86 및 87/88을 이용한 PCR 증폭으로 수행된다. JΔNI3은 이후 JΔNI2로부터, I-SceI-aphAI 증폭을 위한 ICP0 코딩 서열의 내포된 표적 정방향 프라이머 41, 42 및 역방향 프라이머 43을 이용한 Red-매개의 완전한 결실에 의해 유래되었다. JΔNI5 또한 마찬가지로 JΔNI3으로부터 표적 I-SceI-aphAI 조각을 생산하기 위한 프라이머 쌍 44/45를 이용한 ICP27 코딩 서열의 완전한 결실에 의해 유래되었다.
JΔNI6-CAGGFP는 JΔNI5의 UL3 및 UL4 유전자 사이의 EGFP 발현 카세트의 삽입으로 만들었다. 첫째로, 플라스미드 pCAG-GFP는 플라스미드 pPEP100(P. Spear로부터의 선물, Northwestern University)(Pertel et al., Virology 279(1), 313-24 (2001)) 내의 CAG 프로모터(CMV 인핸서/닭 베타-액틴 프로모터/키메릭 인트론) 및 토끼 β-글로빈 폴리A 영역 사이의 gH 유전자를 pEGFP-C1(Clontech)로부터의 EGFP 유전자로 교체하여 구성하였다. 이후 I-SceI-aphAI를 pCAG-GFP의 SnaBI 부위로 삽입하여 플라스미드 pCAG-GFPKAN을 만들었다. 별개로, KOS-37 BAC DNA를 시작 주형으로 이용하는 다단계의 PCR을, 하기와 같이, UL3 및 UL4 폴리A 영역 사이에 신규한 클로닝 부위(MCS)를 포함했던 조각을 만들기 위해 수행하였다. 첫째로, 각 3'UTR 조각에 중첩(overlapping) MCS 영역이 더해진 프라이머 쌍 57/58 및 59/60을 각각 이용하여 연장(extension) PCR을 수행하여 UL3 및 UL4의 3' UTR을 증폭시켰다. 그 2개의 PCR 산물을 겔-정제하고 각각의 100 ng을 프라이머 57 및 59를 이용한 중첩 PCR에 사용하여 연속된 조각을 만들었다. 이 산물은 pCRBlunt(Invitrogen)에 클로닝 되었고, 플라스미드 pCRBluntUL3-4linker를 만들어 내었다. pCAG-GFPKAN의 삽입 부분은 이후 pCRBluntUL3-4linker의 MCS 내 AccI 및 PsiI 부위 사이에 클로닝 되었다. 그 결과의 플라스미드를 MfeI 및 PpuMI로 소화시키고, UL3-CAG-GFPKAN-UL4 조각을 분리하여 JΔNI5의 UL3-UL4 유전자간 영역과 재조합하고, 이후 aphAI 유전자를 제거하였다.
JΔNI7GFP를 만들기 위해 HSV-1 유전자좌의 두 CTRL들, LAP1 및 LATP2를 포함하는 XhoI 조각(~6.2 kb)을 KOS-37 BAC DNA로부터 분리하고 pBluescript KS+로 클로닝하였다. LATP2의 끝 부근부터 CTRL2의 하류 ~250 bp까지 뻗은 내부 KpnI-SalI 조각을 본 재조합체로부터 분리하고 pSP72(Promega)의 KpnI 및 SalI 부위 사이에 클로닝하여 pSP72KOS-LAT를 생산하였다. 이후 다중 클로닝 부위를 KpnI 부위의 ~240 및 ~430 bp에 위치한 두 BstXI 부위 사이에 도입하여 pSP72KOS-LATlinker를 얻었다. 별개로, 플라스미드 pCAG-GW는 pPEP100(Pertel et al., Virology 279(1), 313-24 (2001))의 gH 유전자를 PCR-증폭 변형 GW 재조합 카세트[GW-Zeo; zeocin resistance instead of chloramphenicol resistance (Wolfe et al., J. Virol. 84, 7360-68 (2010))]와 교체하여 구성하였다. pCAG-GW의 삽입 부위는 이후 pSP72KOS-LATlinker의 MCS로 클로닝하여 pSP72KOS-LATlinker-GW를 생산하였다. 그 플라스미드는 KpnI 및 HpaI로 소화시켜, ccdB-저항성 HerpesHogs 박테리아(Wolfe et al., J. Virol. 84, 7360-68 (2010)) 내 JΔNI5의 LAT 유전자좌와의 Red-매개 재조합을 위한, 부근의 LAT 서열을 갖는 CAG-GW 영역을 분리하였다. 마지막으로, 그 결과의 JΔNI5 재조합체 BAC 내 GW 카세트는 플라스미드 pCAG-GFPKAN의, CAG 및 폴리A 서열을 포함하는, AatII-PsiI 조각과의 Red-매개 재조합에 의해 EGFP 유전자로 교체하였다. EGFP 카세트 외부의 특유의 LAT 영역 요소(CTRL1, CTRL2, LATP2)가 결실된 JΔNI7GFP 파생물들은 JΔNI7GFP DNA와 표 1에 나열된 F1, F2 및 R 프라이머(각각 63-65, 66-68, 및 69-71) 각각을 이용한 PCR로 생산한 표적 I-SceI-aphAI 카세트와의 Red-매개 재조합으로 만들었다.
여러 JΔNI9 및 JΔNI10 벡터의 구성을 위해, 상기 기재한 ~6.2 kb LAT XhoI 조각을, 프라이머 78, 79, 80을 이용한 PCR로 생성한 LAT-targeted I-SceI-aphAI과의 재조합으로, JΔNI 게놈으로부터 결실시켜 JΔNI5ΔL을 생성하였다. GW-Zeo는 이후 UL45 및 UL46(74/75) 또는 UL50 및 UL51(76/77) 사이의 유전자간 영역에 대한 표적 프라이머로 증폭하였고, 각 반응 산물을 JΔNI5ΔL BAC DNA와 재조합하여 JΔNI9GW 및 JΔNI10GW를 만들었다. JΔNI7GFP BAC DNA를 이후 XhoI로 소화시키고 LAT 유전자좌로부터의 ~7.2-kb CAG-GFP-함유 조각을 분리하고 pENTR1A(pENTR-LAT-XhoI)로 클로닝하였다. 그 상응하는 JΔNI7GFPΔC12LP2의 ~5.3-kb XhoI 조각도 마찬가지로 분리하고 pENTR1A(pENTR-LATΔ-XhoI)로 클로닝 하였으며, 마지막으로, pCAG-GFP(상기 참조)의 삽입 부분을 pENTR1A(pENTR-CAG-GFP)로 운반하였다. 이후 인 비트로 LR Clonase(Invitrogen) 반응을 수행하여 여러 pENTR 구조체들을 JΔNI10GW BAC DNA와 재조합시켰고, 각각 JΔNI10LAT-GFP, JΔNI10 C12LP2-GFP 및 JΔNI10GFP을 생산하였고, pENTR-LAT-XhoI 및 pENTR-CAG-GFP를 JΔNI9GW BAC DNA와 재조합하여 JΔNI9LAT-GFP 및 JΔNI9GFP를 만들었다.
KNTc는, gB:N/T 돌연변이를 상기 기재된 KOS-37 BAC로, UbCp-mCherry 카세트를 KOS-BAC의 UL3 및 UL4 유전자좌 사이의 유전자간 영역으로, 프라이머 53 및 54를 이용한 증폭의 표적이 되는 I-SceI-aphAI를 이용한 Red 재조합으로 도입하여, 구성하였다.
바이러스
JΔNI BAC DNA를 U2OS-기반 보완 세포의 형질주입으로 감염성 바이러스로 변환시켰다. 500 μL의 OptiMEM(Invitrogen) 내 DNA를 1 μL의 Lipofectamine Plus Reagent(Invitrogen)와 함께 상온에서 5분간 배양하고, 6.25 μL Lipofectamine LTX(Invitrogen)를 첨가하고, 그 혼합물을 상온에서 30분간 배양한 후 세포에 추가하였다. 37℃에서 6시간의 배양 후, 형질주입 혼합물을 제거하였고, 세포들을 무혈청 DMEM과 함께 37℃에서 밤새 배양하고, 33℃ 인큐베이터에 운반하고, 100% 세포병변 효과(CPE)를 관찰하였다. 상층액을 적정한 후, 0.001 PFU/세포의 다중도(MOI)에서 순차적으로 큰 배양물을 감염시켜 증폭하였다. KNTc 감염성 바이러스는 Vero 세포를 3 μL Lipofectamine Plus Reagent 및 9 μL Lipofectamine LTX를 이용하여 4시간 동안 37℃에서 형질주입하여 생산하였다; Vero 세포 상의 KNTc 바이러스 증폭에는 0.01 PFU/세포의 MOI가 이용되었다. 형질주입 및/또는 바이러스 성장을 위한 보완 세포는 하기와 같다: U2OS-ICP4 (JΔNI2, JΔNI3), U2OS-ICP4/27 (JΔNI5 및 파생물들), 및 Vero-7b [QOZHG 바이러스 (ICP4, ICP27::HCMV IEp-GFP β-ICP22, β-ICP47 및 UL41::ICP0p-lacZ)(Chen et al., J. Virol. 74, 10132-41 (2000))]. 모든 바이러스 스톡은 U2OS-ICP4/27 세포 상에 적정하였다(표 2). 물리적 역가 [게놈 수(gc)/ml]는 하기 기재된 정량적 실시간 PCR로 결정하였다. 감염된 세포의 형광 이미지를 Nikon Diaphot 형광 현미경(Nikon, Melville, PA)을 이용하여 40x 확대에서 얻었다.
바이러스 성장 곡선
24-웰 플레이트 내 Vero-7b, U2OS, U2OS-ICP4 및 U2OS-ICP4/27 세포를 0.001 다중도(MOI)에서 2시간동안 감염시킨 후, 0.1 M 글리신(pH 3.0)으로 1분간 처리하여 세포외 바이러스를 불활성화 시키고, 37℃ 및 5% CO2 에서 배양하였다. 배지는 매일 수거하여 U2OS-ICP4/27 세포 상의 표준 플라크 분석으로 적정하였다.
세포독성 분석
5 x 103 HDF 및 Vero 세포를 96-웰 플레이트에 분주하고 KOS, QOZHG 또는 JΔNI 바이러스로 25,000 gc/세포에서 감염시켰다. 세포 생존능은 기본적으로 (Uchida et al., J. Virol. 87, 1430-42 (2013))에 기재된 대로 5일 후 MTT 분석으로 결정하였다.
웨스턴 블롯팅 및 면역형광
세포 용해물 제조 및 웨스턴 블롯팅은 (Miyagawa et al., PLoS One 4, e4634 (2009))에 기재된 대로 수행하였다. 다클론성 토끼 항-ICP0 항체를 발명자들의 연구실에서 생산하고, 항-ICP27(10-H44)는 Fitzgerald Industries International (Concord, MA)로부터 얻고, 항-ICP22는 John Blaho(Mt Sinai School of Medicine, NY)로부터 받고, 항-ICP4(10F1)는 Santa Cruz Biotechnology로부터 얻고, 및 항-α-투불린(T6793)은 Sigma로부터 얻었다. 동일한 ICP4 및 ICP27 항체를 이용하는 면역 형광을 기본적으로 (Uchida et al., J. Virol. 83, 2951-61 (2009))에 기재된 대로 수행하였고 Nikon 형광 현미경으로 조사하였다.
정량적 역 전사-PCR(qRT-PCR) 및 게놈 PCR
qRT-PCR을 위한, 총 RNA는 일반적으로 RNeasy kit(Qiagen)로부터 추출하였다. cDNA는 RETROscript® Kit(Ambion)으로 합성하였다. 실시간 PCR은 StepOnePlus Real-Time PCR System(Applied Biosystems)으로 수행하였다. 작은 수의 세포들을 위해, a Cells-to-cDNA™ II Kit(Ambion)를 세포 용해 및 역 전사에 이용하였다. 18S 리보솜(r) RNA에 대한 결과가 데이터의 정규화에 이용되었다. 본 연구에 이용된 모든 qRT-PCR 프라이머는 표 1에 나열되어 있다.
바이러스 스톡의 물리적(게놈 수) 역가의 결정을 위해, 5 mL의 바이러스를 300 U/mL의 벤조나제 누클레아제(Benzonase nuclease)(Sigma)와 함께 1시간 동안 25℃에서 2 mM MgCl2의 존재하에서 배양하였고 바이러스 DNA를 DNeasy Blood & Tissue Kit(Qiagen)로 추출하였다. gc 역가는 표 1에 나열된 gD 프라이머(38/39) 및 프로브(40)를 이용한 당단백질 D(gD) 유전자에 대한 qPCR로 결정하였다. 핵 바이러스 DNA의 양은 세포를 2 hpi에서 세정하고, (Dignam et al., Nucleic Acids Res. 11, 1475-89 (1983); Suzuki et al., BMC Res. Notes 3, 294 (2010))에 기재된 대로 핵을 분리하고, DNeasy Blood & Tissue Kit로 DNA 추출하고, 상기와 같이 gD 유전자에 대한 qPCR을 하여 결정하였다. 세포 18S 리보솜 DNA 수준은 TaqMan® Ribosomal RNA Control Reagents(Invitrogen)를 사용하여 측정하였고, 이는 바이러스 DNA 양을 정규화하는데 이용하였다.
통계
모든 수치는 평균±SD로 나타낸다. 페어(pair)의 차이는 Microsoft Excel 14.4.1을 이용한 Student's t test로 분석하였다. 0.05 미만의 P 값(P<0.05)은 통계적으로 유의한 것으로 간주한다.
결과
벡터 조작 및 바이러스 성장
세포에 대한 검출 가능한 손상 없이, 결손형 HSV 벡터 JDββ의 마우스 배아 줄기 세포(mESC)로의 효율적인 형질도입이 보고되었다(Craft et al., Stem Cells 26, 3119-25 (2008)). JDββ는 HSV 게놈의 내부 반복 영역("조인트") 및 두 IE 유전자(ICP4 및 ICP22)가 결실된 것이다. 게다가, 두 다른 IE 유전자(ICP0 및 ICP27) 프로모터는 바이러스 티미딘 키나제(TK) 초기(E 또는 β) 유전자 프로모터로 교체되었다. JDββ-감염 비-보완 세포는 최소의 IE 유전자 발현을 나타내지만, 그 벡터는 mESC에서 배아체 형성 또는 발달 전사 프로그램과의 간섭 없이 효율적인 도입 유전자 발현이 가능하다. 이러한 벡터 뼈대의 이용을 다양한 유전자 전달 적용에서 촉진하기 위해, Red-매개 재조합을 박테리아에서 수행하여(Tischer et al., Biotechniques 40, 191-97 (2006)), KOS-37 BAC로부터 HSV-1 균주 KOS(Gierasch et al., Virol. Methods 135:197-206 (2006))의 완전한 게놈을 포함하는 박테리아 인공 염색체(BAC)이고, 그 뼈대인, JΔNI2(도 9a)를 얻어내었다. JΔNI2는 ICP47 프로모터를 포함하여, ICP4 및 조인트가 결실된 것이고, JDββ와 같은 ICP 및 ICP27 프로모터의 교체를 포함하였고, ICP22 조절 영역 내 공통 서열인 VP16-결합 (TAATGARAT) 모티프가 결실되어 초기 유전자의 역학에 대한 ICP22 발현 역학이 변하였다. 감염을 시각화하고 바이러스의 전사적 활성을 모니터링하기 위해, mCherry 리포터 유전자 발현 카세트를 결실된 ICP4 유전자좌의 위치에 도입하였다. 또한 당단백질 B 유전자를 초-활성 대립유전자인 gB:N/T(Uchida et al., J. Virol 84:12200-9 (2010))로 교체하여, 세포로의 바이러스 진입을 향상시켰다. 비-보완 세포 내의 독성 ICP0 및 ICP27 단백질의 저-수준 생산의 가능성을 제거하기 위해, ICP0(JΔNI3) 또는 ICP0 및 ICP27(JΔNI5)에 대한 완전한 코딩 서열을 결실시켜 JΔNI2의 두 파생물 또한 구성하였다(도 9a).
여러 JΔNI 벡터 구조체들을 감염성 바이러스 입자로 전환시키기 위해, ICP0, ICP4 및 ICP27 보완이 가능한 세포주들을 만들었다. 인간 골육종 U2OS 세포는 본래부터 ICP0을 보완하여(Yao et al., J. Virol. 69, 6249-58 (1995)), 이 독성 단백질을 발현할 필요를 제거한다. U2OS 세포는 그 자신의 조절 서열의 조절하의 ICP4 유전자를 운반하는 렌티 바이러스에 의해 형질도입되었고, 영구적으로 ICP4를 발현하는 클론 세포주(clonal line)을 분리하였다(U2OS-ICP4; 도 9b). ICP27 유전자 및 조절 영역을 운반하는 두 번째 렌티바이러스에 의한 상기 세포들의 형질도입(도 6)은 이후 ICP4/ICP27-결실 바이러스로 감염되면 ICP27을 추가로 발현하는 세포주 U2OS-ICP4/27을 선별하는데 이용되었다(도 9b 및 도 6). 반면 바이러스 VP16 단백질의 부존재하에서도 ICP4 프로모터를 활성화하고 지속적인 ICP4 발현을 허용할 수 있는 U2OS 세포의 능력은 예기치 못한 것이었고, 이러한 특징이 상기 세포의 본래의 ICP0-보완 활성과 관련이 있는지는 알려지지 않았다. BAC 구조체 JΔNI2 및 JΔNI3으로부터의 DNA는 U2OS-ICP4 세포의 형질주입에 의해 감염성 바이러스로 변환될 수 있고, 반면 JΔNI5 구조체로부터의 DNA는 오로지 U2OS-ICP4/27 세포로 형질주입 되었을 때만 감염성 입자를 만들어 낼 수 있다(데이터 표시되지 않음). 도 9c는 U2OS-ICP4 또는 U2OS-ICP4/27 세포를 각각 JΔNI2 또는 JΔNI5 BAC DNA로 형질주입하여 최초로 생산된 JΔNI2 및 JΔNI5 바이러스의 성장을 도시한다. 모든 바이러스는, 변형되지 않은 것이고, ICP4 및 ICP27을 보완하지만 ICP0은 보완하지 않는, U2OS 세포 또는 Vero-7b 세포 상에서 성장할 수 없었다. JΔNI2는 U2OS-ICP4 세포 상에서 ICP27 보완 없이 성장할 수 있었으나, 반면 JΔNI5의 성장은 상기의 추가적인 보완 활성을 요구하였다. U2OS-ICP4/27 세포의 JΔNI-보완 특성의 안정성을 여러 세포 계대(passage)에서 플라크 분석으로 시험하였고, 적어도 20계대에 걸쳐 플라크 형성 효율에서 유의한 감소가 관찰되지 않았다(표 3). 이러한 결과는 상기 바이러스들 내 조작된 IE 유전자 변형과 일치하고, 이들의 생물학적 특성의 비교를 감안하였다.
바이러스 투입량(input)의 표준화
감염되는 세포핵으로 동등한 양의 바이러스 DNA를 전달하기 위해 필요한 각각의 바이러스의 상대적인 양을 평가하였다. 다양한 바이러스 스톡의 생물학적 및 물리적인 역가를 각각 U2OS-ICP4/27 세포 상의 표준 플라크 분석과 바이러스 당단백질 D 유전자에 대한 qPCR로 결정하였다; JΔNI2, JΔNI3 및 JΔNI5 바이러스 스톡 사이에서 약 3배의 게놈 수(gc) 대 플라크-형성 단위(PFU) 비율의 차이가 관찰되었다(표 2). HDF를 3종의 바이러스로 동등한 PFU 또는 동등한 gc에서 감염시켰고, 감염 2시간 후(hpi) 세포핵 내 HSV 게놈의 수를 qPCR로 결정하였다. 감염에 동일한 gc가 이용되었을 때, JΔNI2-, JΔNI3- 및 JΔNI5-감염 세포 사이의 2 hpi에서의 핵 내 바이러스 게놈 수는 유사하였다(도 10a). 대조적으로, 동일한 PFU로 감염시키면 핵내 JΔNI5 게놈의 수가 JΔNI2 또는 JΔNI3 게놈보다 더 높았다(도 10b). 따라서, 본 연구의 나머지 부분에서, gc 수가 바이러스 투입량을 표준화하기 위해 사용되었다.
비-보완 세포 내 벡터 특성의 특징화(characterization)
비-보완 HDF 및 Vero 세포의 생존능에 대하여 JΔNI2, JΔNI3 및 JΔNI5 감염의 효과를 야생형 KOS 바이러스 및 이전의 IE 유전자-결실 벡터인 QOZHG(ICP4-/ICP27-/β-ICP22/β-ICP47; (Chen et al., J. Virol. 74, 10132-41 (2000))와 비교하여 처음 조사하였다. 25,000 gc/세포로 감염 후 5일차(dpi)에, KOS- 또는 QOZHG-감염 배양물보다 약 4-5배의 더 많은 생존 세포가 JΔNI-감염 HDF 배양물에 남아 있었고, 반면 JΔNI- 및 QOZHG-감염 Vero 세포 사이에서는 작은 차이만이 관찰되었다(도 11a). JΔNI 바이러스들 중, JΔNI2는 JΔNI3(p=0.0017) 및 JΔNI5(p=0.0430)보다 HDF에 다소 더 독성이 있는 반면, Vero 세포에 대한 독성은 JΔNI2보다 JΔNI3(p<0.001) 및 JΔNI5(p<0.001)에서 감소한다. 이러한 발견을 IE 유전자 발현과 연관시키기 위해, 감염된 HDF를 24 hpi에서 5종의 IE 단백질 중 4종에 대한 항체들로 표지하여 웨스턴 블롯을 수행하였다(도 11b). JΔNI2 및 JΔNI3 모두는 잔여 ICP27 발현을 보여주었고, 이는 둘 모두의 벡터 내 ICP27 유전자 앞의 TK 프로모터가 상기 세포들에서 침묵되지 않았음을 나타내며, 반면 JΔNI5-감염 세포 내에서는 2-3배 더 많은 gc/세포(동등한 PFU/세포, 표 2 참조)를 이용하였음에도 불구하고 IE 단백질이 검출되지 않았다. KOS 및 QOZHG 패턴은 ICP4에 의한 ICP0 발현의 하향 조절이 보고된 것과 일치하였다(Douville et al., Virology 207, 107-16 (1995); Resnick et al., J. Virol. 63, 2497-503 (1989)). 정량적 역 전사-PCR(qRT-PCR) 분석을 이용하여, ICP0 mRNA를 JΔNI2-감염 HDF 내에서 검출하였고, ICP22 및 ICP27 mRNA의 수준은 JΔNI2-, JΔNI3, JΔNI5-감염 세포들에서 동일한 gc/세포의 12 hpi에서 감소하였다(도 11c). 이러한 결과는 JΔNI2는 ICP22 및 ICP27 발현을 향상시키기에 충분한 수준의 ICP0을 생산하는 것을 시사하고, IE 유전자들의 점진적인 결실은 HSV 벡터의 세포 독성을 감소시키는 것을 확인하였다(Krisky et al., Gene Ther. 5, 1593-603 (1998); Samaniego et al., J. Virol. 72, 3307-20 (1998); Samaniego et al., J. Virol. 71, 4614-25 (1997)).
qRT-PCR을 이용하여 선별된 초기 및 후기 바이러스 유전자들의 발현을 조사하였다(도 11d). 12 hpi에서, IE 유전자들에 대해 관찰된 패턴과 유사하게, JΔNI2는 일반적으로 상기 유전자들을 최고 수준으로 발현하였고 JΔNI5는 최저였다. 이러한 결과는 본래의 ICP0 및 ICP27 프로모터를 초기 프로모터로 치환하는 것은 ICP4의 부존재하에서 바이러스 게놈을 침묵시키기에 충분하지 않은 반면, 둘 모두의 유전자의 결실은 잔여 유전자 발현을 급격하게 감소시킨다는 것을 보여주었다.
JΔNI 리포터 유전자 발현
mCherry 리포터 유전자와 함께 JΔNI 벡터의 결실된 ICP4 유전자좌로 도입된 외래 인간 유비퀴틴 C(UbC) 프로모터(p)의 활성이 또한 JΔNI3- 및 JΔNI5-감염 세포 내에서 JΔNI2-감염 세포에 비교하여 하향 조절되는지 여부를 결정하기 위해, 감염된 HDF 내 mCherry 발현을 조사하였다. 5,000 gc/세포의 24 hpi에서, mCherry 형광은 JΔNI2-감염 세포 내에서 쉽게 검출되었으나, JΔNI3- 또는 JΔNI5-감염 세포에서는 그렇지 않았다(도 12a). qRT-PCR에 의한 6 hpi에서의 mCherry mRNA 수준 측정은 UbC 프로모터로부터의 전사적 활성이 JΔNI2- 및 JΔNI3-감염 세포들에서 일부 100배의 감소, 및 JΔNI5-감염 세포에서 약 5배의 추가적인 감소가 있음을 밝혀내었다(도 12b); 본 실험에서 이용된 KNTc 조절 바이러스는 복제 가능(replication-competent)하고, UL3 및 UL4 사이의 유전자간 영역에 UbCp-mCherry 카세트를 포함하였다. 이러한 데이터는 JΔNI2로부터의 잔여 ICP0 및 ICP27 발현(도 11c)이 바이러스 게놈의 전반적인(global) 전사적 침묵을 막는데 충분한 반면, 상기 두 유전자의 결실은 근본적으로 외래의(도 12a, 12b) 프로모터뿐만 아니라 모든 본래의(도 11d) 프로모터 활성을 제거한다는 해석과 일치한다. HDF와는 대조적으로, JΔNI3 또는 JΔNI5에 감염된 표준 U2OS 세포는 강한 mCherry 발현을 나타냈고(도 12c), 이는 U2OS 세포의 ICP0-보완 활성이 그렇지 않으면 침묵되었을 게놈들을 활성화하기에 충분하였음을 시사한다. 바이러스 ICP0 단백질이 동일한 활성을 갖는다는 것을 확인하기 위해, JΔNI5-감염 HDF를 ICP0+ QOZHG 바이러스로 중복감염(superinfected)시켰다(도 11b 참조). 도 12d에 도시된 바와 같이, 중복-감염은 mCherry 발현을 유도하였고, 반면 모의 중복 감염은 그렇지 못하였다. 종합적으로, 이러한 결과들은, 적어도 풍부한 ICP0 발현의 존재 또는 보완 활성하에서는, ICP27이 침묵된 JΔNI5 게놈의 발현을 활성화(derepress)하는데 필요하지 않음을 증명하였고, JΔNI2-감염 HDF 내에서 발현되는 최소량의 ICP0가 바이러스 게놈을 통틀어서 제한적인 전사적 활성을 유지하는데 충분함을 시사하였다.
침묵 JΔNI5 게놈으로부터의 고수준의 도입 유전자 발현
신경 세포의 감염시, HSV는 바이러스 게놈이 LAT 유전자좌를 제외하고 전사적으로 침묵인 잠복 상태(latent state)에 들어간다. 비-신경 세포에서, 활성이 아니면 침묵 바이러스 게놈인 상황에서, LAT 유전자좌가 신경 세포와 유사하게 활성으로 남는지 여부를 조사하였다. 이를 위해, CAG 인핸서/프로모터 및 EGFP 유전자(CAGp-GFP)로 구성된 발현 카세트를 JΔNI5의 LAT 2-kb 인트론 영역에 도입하였고, JΔNI7GFP로 언급되는 벡터 구조체를 만들었다(도 13a). 대조군으로서, 동일한 CAGp-GFP 카세트를 JΔNI5의 UL3-UL4 유전자간 영역에 도입하여 벡터 JΔNI6GFP를 생성하였다(도 13a); 상기 JΔNI5의 UL3-UL4 유전자간 영역은 도입 유전자 카세트의 비-파괴적(non-disruptive) 삽입에 이용되어 왔고(Baines et al., J. Virol. 65, 938-44 (1991); Menotti et al., J. Virol. 76, 5463-71 (2002)), LAT 유전자좌의 바깥쪽에 가까이 있다. 한편 본 명세서에서, "JΔNI6GFP"는 "JΔNI6-CAGGFP"로 언급될 수 있다(도 1a 또한 참조). 감염성 바이러스는 U2OS-ICP4/27 세포 상에서 생산되고, 새로운 바이러스 스톡의 gc:PFU 비율은 JΔNI5의 그것과 유사하였다(표 2). JΔNI6-CAGGFP 및 JΔNI7GFP 모두는 U2OS-ICP4/27 세포 내 증폭 도중 풍부한 녹색 및 적색 형광을 생산하였고, 이는 이들의 도입 유전자 발현 카세트의 무결점(integrity)을 확인시켜준다. 이러한 바이러스들의 비-보완 세포 내에서 EGFP 도입 유전자를 발현하는 능력을 조사하기 위해, HDF를 증가된 gc/세포에서 감염시켰고, EGFP 형광을 3 dpi에서 기록하였다(도 13b). JΔNI7GFP-감염 세포는 풍부하고, 바이러스 용량(dose)-의존적인 EGFP 발현을 나타냈고, 반면 JΔNI6-CAGGFP 감염은 최고 용량에서도 제한적인 발현을 만들어냈다. 비록 앞선 JΔNI5 감염보다 높은 바이러스 투여량이 여기서 사용되었을지라도, mCherry 발현은 최소로 남아있었다. 이러한 결과는 3 및 5 dpi에서 EGFP 및 mCherry mRNA의 qRT-PCR 측정으로 확인하였고(도 13c), 이는 JΔNI6-CAGGFP 및 JΔNI7GFP 바이러스 게놈이, JΔNI5 게놈과 유사하게, 감염된 HDF에서 침묵인 반면, LAT 유전자좌는 전사적으로 활성으로 남아있는다는 가정과 일치하였다. JΔNI7GFP-감염 세포 내의 EGFP mRNA 수준은 적어도 5 dpi에서 3 dpi에서의 수준만큼 높으므로(도 13c), 상기 세포가 완전히 접촉 저지(contact-inhibited)된 이후 시간에서 발현이 검출될 수 있는지 여부를 조사하였다. 그 결과는 발현이 적어도 4주 동안 지속될 수 있음을 나타냈다(도 13d). 종합하면, 이들 관찰은 LAT 유전자좌가, IE 유전자 발현의 기능적 결실로 인해 비-독성인 HSV 게놈으로부터의, 지속적인(durable) 도입 유전자 발현에 대한 권한이 있는 부위임을 나타낸다.
CTRL들 및 LATP2가 LAT 유전자좌로부터의 도입 유전자의 발현을 지원한다
잠복기(latency) 동안의 LAT 발현이 잠복-연관 프로모터(LAP) 1 및 2에 의해 조절된다는 것이 증명되었다(Goins et al., J. Virol. 68, 2239-52 (1994); Zwaagstra et al., Virology 182, 287-97 (1991)). LAP1은 ~8.7-kb 불안정 1차 LAT 전사물의 전사 개시 부위의 상류에 위치해 있고, 1차 전사물은 안정한 2-kb LAT 인트론으로 처리되고, 반면 LAP2는 첫 번째 엑손 내 LAP1의 하류에 위치하여 2-kb 인트론 영역까지 확장된다. 상기 인트론까지 다소 확장된 LAP2-포함 영역은 LATP2로 언급되어 왔다. 프로모터로서 작용하는 것 이외에도, LAP2/LATP2 영역이 뉴런 내에서 도입 유전자 발현을 위한 위치-독립적 장기 발현/인핸서 요소로서 기능할 수 있음이 알려져 왔다(Berthomme et al., J. Virol. 74, 3613-22 (2000); Palmer et al., J. Virol. 74, 5604-18 (2000)). 그러나, LAT 유전자좌가 잠복기 동안 바이러스 게놈의 전반적인 침묵으로부터 보호되고, 상기 보호는 CTCF 결합 부위가 풍부한 영역인, CTRL로 불리는 영역으로서, 하나는 LAP의 상류에 위치하고(CTRL1) 다른 하나는 LATP2의 바로 하류의 2-kb 인트론 내에 위치하는(CTRL2) 영역에 의한다는 것이 보고되어 왔다(Blooom et al., Biochim. Biophys. Acta 1799, 246-56 (2010)). 따라서 JΔNI7GFP-감염 HDF 내에서 관찰된 EGFP 발현의 활성화에서의 LATP2 및 CTRL 요소들의 잠재적인 역할을 탐구하였다. 상기 3개의 요소를 JΔNI7GFP 게놈으로부터 각각 결실시키거나, 조합하여 결실시켰고(도 14a) 감염된 HDF 내 리포터 유전자 발현을 조사하였다(도 14b, 14c). CTRL1(ΔC1) 또는 LATP2(ΔLP2)의 결실은 녹색 형광 및 EGFP mRNA 수준의 현저한 감소를 초래한 반면, CTRL2(ΔC2)의 결실은 오로지 작은 효과만을 가졌다. CTRL 둘 모두의 결실(ΔC12)은 CTRL1 단독의 결실과 동일한 효과를 가진 반면, 3개 모든 요소의 결실(ΔC12LP2)은 JΔNI6-CAGGFP-감염 세포에서 관찰된 수준까지 발현을 더 감소시켰다. 감염된 세포 모두에서 mCherry 형광은 검출 가능하지 않았으며(도 14b), 이는 다른 결실은 바이러스 게놈 내 다른 부위의 억제 해제(derepression)를 초래하지 않음을 시사한다. 이러한 결과들은 모든 IE 유전자가 기능적으로 결여된 바이러스 게놈의 상황에서, CTRL1 및 LATP2 영역 모두가 전사적 침묵으로부터 연결된(linked) 도입 유전자들을 보호하는데 주요한 역할을 하는 것을 나타낸다.
도입 유전자의 LAT 유전자좌 보호는 위치-독립적이다
IE 유전자 산물의 부재하에서, LAT 유전자좌와 관련된 서열들이 삽입된 도입 유전자 발현 카세트를 침묵으로부터 보호하기에 충분한지 여부를 결정하기 위해, 두 CTRL들, LAP1 및 LATP2를 포함하는 JΔNI7GFP의 LAT:CAGp-GFP 영역을, 본래의 부위 및 새로운 부위의 재조합을 회피하기 위해 동일한 LAT 영역을 결실시킨 JΔNI5 파생물 내의 두 개의 이소적 위치에 삽입하였다. 첫 째로, Gateway(GW) 재조합 카세트를 LAT-결실 JΔNI5 게놈의 UL45 및 46 사이(JΔNI9GW) 또는 UL50 및 UL51 사이(JΔNI10GW)의 유전자간 영역에 도입하였고, 그 후 LAT:CAGp-GFP 조각 또는 LAT 서열이 없는 단순 CAGp-GFP를 GW 카세트와 재조합하여 도입하였다(도 15a). U2OS-ICP4/27 세포 상의 바이러스 생산 후(표 2), 감염된 HDF 내 벡터들의 감 리포터 유전자 발현을 시험하였다. 3 dpi에서, 리포터 카세트 주변 LAT 서열이 없는 상기 벡터들(JΔNI9GFP 및 JΔNI10GFP)은 세포 내에서 JΔNI6-CAGGFP 대조군 벡터와 유사한 낮은 수준의 EGFP 형광(도 15b) 및 mRNA(도 15c)를 보였고, 이는 두 유전자간 삽입 부위가 UL3 및 UL4 사이의 유전자간 영역과 같이 전사적으로 억제되어 있음을 시사한다. 그러나, 리포터 카세트 양 측면에 LAT 서열이 위치하는 경우(벡터 JΔNI9LAT-GFP 및 JΔNI10LAT-GFP), EGFP 발현은 JΔNI7GFP-감염 세포에서 관찰된 수준까지 증가하고(도 15b), 이는 LAT-유래 영역의 항-침묵 활성이 위치-독립적인 방식임을 나타낸다. 이러한 LATP2 및 CTRL, 또는 두 CTRL 모두에 대한 활성의 독립성을 확인하기 위해, LAT:CAGp-GFP 조각의 LATP2- 및 CTRL-결실 버전을 GW 재조합으로 JΔNI10GW 게놈에 도입하였다; 상기 결실들은 앞선 JΔNI7GFPΔC12LP2 벡터의 LAT 영역 내에서의 결실과 동일하였다(도 14a). 상기 결실들은, 비록 LAT가 없는 JΔNI10GFP 벡터에서 관찰된 수준까지 완전히 내려가진 않았지만, 감염된 HDF 내 EGFP 발현을 감소시켰다(도 15c, 15d); 여기서 ΔC12LP2 결실의 효과(~3.5배)가 JΔNI7GFP보다(~50배) 더 작은 효과를 갖는 이유는 불명확하다(도 14c). 그러나, 이러한 결과는 IE 유전자 발현의 부존재 하에서, LAT 유전자좌의 2 CTRL들, LAP1 및 LATP2를 포함하는 일부가, 위치 독립적인 방식으로 전반적인 바이러스 게놈의 침묵에 대항하여 삽입된 도입 유전자 발현 카세트를 보호할 수 있음을 명확하게 증명하고, 적어도 CTRL1 및 LATP2는 이러한 활성에서 역할을 수행함을 나타낸다.
LAT 유전자좌 요소는 다른 세포 유형 내에서도 도입 유전자 발현을 보호한다
HDF를 넘어, 이러한 발견의 적용 가능성을 평가하기 위해, 선별된 벡터로부터의 EGFP 및 mCherry 발현을 다른 세포 유형에서 시험하였다. qRT-PCR에 의하여, 3 dpi에서, JΔNI6-CAGGFP-감염 인간 세포보다 JΔNI7GFP 감염 세포에서 높은 EGFP mRNA 수준이 관찰되었다(도 16b). BJ 인간 포피 섬유아세포에서, HDF에서와 유사한(~30배, 도 13c), 가장 큰 차이가 관찰되었고(~35배), 인간 간세포(hHEP)에서도 ~40배 차이가 관찰되었다. 인간 신생 각질 세포(hEK)는 가장 작은 차이를 보였고(~4.5배), 근육-유래 줄기 세포(hMDSC)는 ~10배, 지방 전구 세포(hPAD)는 ~7배의 중간 수치를 보였다. 태아 래트의 후근 신경절(rDRG) 뉴런 내의 두 벡터의 비교는 오직 2.5배의 차이만을 보였다. 도 16a는 동일한 감염 조건하에서 수행된 독립적인 실험에서의 3 dpi에서의 대표적 형광 이미지를 나타낸다. 여기서 도 16b와는 다른 도너(donor)로부터의 hHEP를 제외하면, 그 결과는 qRT-PCR 데이터와 매우 일치한다. 흥미롭게도, 인간 세포들은 유의미한 mCherry 형광을 나타내지 않았지만, 풍부한 mCherry 발현이 JΔNI6-CAGGFP- 및 JΔNI7GFP-감염 래트 DRG 배양물에서 관찰되었다. 이러한 관찰이 신경 세포에 고유한 것인지, 및 이것이 바이러스 게놈 내 발현 카세트의 위치의 mCherry 유전자의 앞쪽의 프로모터 및 또는 상기 세포의 래트 기원의 기능인지 여부는 아직 알려지지 않았다. hMDSC는 연장된 시간 동안 유지되었고, JΔNI7GFP-감염 세포 내에서 초과된 시간동안 EGFP 발현을 모니터링할 수 있었다. 도 16c에서 볼 수 있듯이, EGFP는, JΔNI7GFP-감염 HDF에서 관찰한 것과 유사하게(도 13d), 적어도 감염 후 4주간은 쉽게 검출 가능하였다.
마지막으로, 이들 세포 중 일부에 대하여, HDF에서와 같이, UL50/51 유전자간 영역 내 CAGp-GFP 활성이 부근 LAT 서열에 의하여 증폭되는지 여부를 결정하였다. 도 16d의 그 결과는 3종 모든 세포 유형에서 실질적인 증폭을 보여주며, 이는, 알려지지 않은 이유로 인해, 동일한 세포 내의 JΔNI6-CAGGFP 및 JΔNI7GFP 사이의 차이를 초과할 수도 있다. 전반적으로, 이러한 결과들은 LAT 유전자좌 내 유전적 요소들의 위치 독립적인 항-침묵 활성이 HDF에 제한되지 않고, 다양한 비-신경성 인간 세포 유형에서도 동작 가능함을 나타낸다.
실시예 8에 대한 표
표 1 - 프라이머 서열
qRT-PCR을 위한 PCR 프라이머
Figure pat00003
Figure pat00004
Red 매개 재조합
Figure pat00005
Figure pat00006
Figure pat00007
Figure pat00008
Figure pat00009
Figure pat00010
표 2 - 본 실시예에서 이용된 바이러스
Figure pat00011
표 2 (계속) - 본 실시예에서 이용된 바이러스
Figure pat00012
표 2 (계속) - 본 실시예에서 이용된 바이러스
* 모든 BAC-매개 ICP 바이러스들은 동일한 UbC 프로모터-주동 mCherry 발현 카세트를 결실된 ICP4 유전자좌 내에 갖는다
** 모든 BAC-매개 ICP22 바이러스에 대해서, ICP22 프로모터(TAATGARAT)의 조절 서열이 결실되어 IE로부터의 ICP22 유전자 발현을 초기 유전자로 변환시켰다.
*** gB:D285N/A549T는 여기서 gB:N/T로 언급된다
**** GW: Gateway 재조합 부위
표 3.
다른 계대 수의 U2OS-ICP4/27 세포 상에서의 JΔNI5 플라크 형성 효율
Figure pat00013
U2OS-ICP4/27 세포를 JΔNI5 바이러스로 0.1 gc/세포에서 감염시켰고, 상기 세포를 2 hpi에서 메틸셀룰로스에 위에 깔았다. 4 dpi에서 플라크를 세었다. 3회 결정의 평균 +/- SD.
실시예 9
본 실시예는 JΔNI8의 구성 및 특성을 증명한다.
JΔNI8은 상기 논의된 JΔNI5 벡터로부터 UL41을 결실시켜 구성하였다. 이는 그래픽적으로 도 17에 나타나 있다. JΔNI7GFP는 기본적으로 LATP2 및 CTRL2 사이의 LAT 유전자좌 내에 CAGp-EGFP-폴리A가 삽입된 JΔNI5이다. JΔNI8GFP는 UL41의 결실을 제외하면 JΔNI7GFP와 동일하다. 도 20을 또한 참조한다.
JΔNI8의 성장은, 상기 설명한 바와 같은, ICP4 및 ICP27을 발현하도록 조작된 U2OS 세포 보완 세포 내에서, JΔNI5에 상대적으로 평가하였다. 상기 보완 세포는 각각 세포 당 1 바이러스 게놈 수(gc)의 벡터로 감염시켰다. 도 18에 도시된 바와 같이, 플라크 형성 단위(PFU), 게놈 수(gc) 및 mCherry 도입 유전자의 발현으로 측정된 것으로서, JΔNI8은 JΔNI5보다 더욱 강력한 성장을 나타냈다. 더욱이, JΔNI8로부터의 본래의 HSV 유전자들은 보완 세포 내에서 감염 동안 초기에 발현되는 것으로 관찰되었으며, 이는 JΔNI5와는 대조적이었다(도 19, 6 hpi에서 임의로 1의 값이 할당된 각각의 JDNI5 유전자에 대해 상대적인 배수 발현을 나타냄).
표 9-1에서 나타나듯이, JΔNI8 및 JΔNI8GFP는 JΔNI5 및 JΔNI7GFP보다 게놈 수(gc) 당 더 많은 플라크(보완 세포 상의)를 각각 생산하였다. 이는 JΔNI8 및 JΔNI8GFP 제제의 결함 입자를 뛰어넘는 기능적 입자 비율(질의 측정)이 JΔNI5 및 JΔNI7GFP 제제보다 높음을 나타낸다.
표 9-1
Figure pat00014
또한, 인간 진피 섬유아세포의 핵 내에서, 동등한 수준의 gc에서의 감염은 동등한 양의 바이러스 DNA를 만들어 낸다는 것이 관찰되었다. 그러나, 도 10과 관련하여 논의한 프로토콜을 사용하였을 때, JΔNI8에 대하여는, JΔNI5에 비해 훨씬 낮은 PFU에서 수행되었다(도 21). 이러한 데이터는 동등한 gc에서의 감염이 JΔNI8과 JΔNI5(또는 JΔNI7GFP와 JΔNI8GFP)를 비교하는 연구에 사용될 수 있음을 나타낸다. MTT 세포 생존능 분석(도 22 참조)에서, 5 또는 10 PFU/세포(M.O.I.=5 또는 10)에서 JΔNI8(각 그래프의 상단 -X- 선)의 독성이 다른 모든 벡터들보다 분명히 낮은 것을 증명되었다(비 감염 대조군 세포의 생존능에 대등 또는 초과). 이러한 데이터는 또한, 손상되지 않은 ICP0 유전자를 갖는 벡터가, 심지어 β 프로모터(JΔBBB3(또한 JDBBB3 또는 JΔβββ3 또는 JDβββ3으로 불림))하 또는 UL41(QOZHG) 없이도, JΔNI5 또는 JΔNI8보다 더 독성이 있음을 나타낸다. 예측한대로, 복제 가능한 바이러스(KOS)는 세포를 죽인다. HDF를 이용한 추가적인 MTT 실험에서, 비록 JΔNI8이 높은 MOI에서 약간의 독성을 보였지만, 이는 3배 낮은 MOI(동등한 gc/세포)에서 JΔNI5보다 훨씬 낮음을 밝혀내었다(도 23). 다른 MTT 데이터는 JΔNI8이 일부 세포 유형(HDF, 인간 신생 각질 세포, 및 인간 신경 줄기 세포)에서 JΔNI5보다 낮은 독성이 있지만, 모든 세포 유형에서 그렇지는 않은 것(Vero, 인간 지방 전구 세포, 및 인간 간세포)을 나타내었다(도 24 참조).
JΔNI7GFP 및 JΔNI8GFP 내에 존재하는 두 도입 유전자로부터의 각각의 리포터 유전자 발현(즉, EGFP 및 mCherry)을 HDF 세포 내에서 3 dpi에서 비교하였다. 그 결과는 도 25 및 26에 나타나 있다. JΔNI8GFP에 의한 GFP 발현은 그 용량과 함께 증가하였고(5,000 내지 50,000 gc/세포, 도 25), 그러나 JΔNI7GFP에 대해서는 변동이 없음이 관찰되었다. 이론에 의한 제한 없이, JΔNI7GFP로부터의 발현에서 관찰되는 이러한 수평화(leveling-off)는 HDF 세포 내 벡터의 고용량(high-dose) 독성에 기인하는 것일 수 있다고 여겨지고, 이는 상기와 같은 독성이 JΔNI8GFP에서는 낮음을 암시한다. 또한, JΔNI8GFP로 감염된 HDF 세포로부터 주목할만한 mCherry가 관찰되었으나, JΔNI7GFP로 감염된 HDF 세포에서는 그렇지 않았다. 유사한 실험을 일정한 용량의 JΔNI7GFP 또는 JΔNI8GFP(25,000 gc/세포)로 수행하였고, EGFP 또는 mCherry 형광의 수준을 시간에 따라 분석하였다(감염 후 2, 4, 및 6일(도 26)). JΔNI8GFP-감염 배양물 내의 리포터 신호는 4 내지 6 dpi에서 감소하였고, 이는 손상되지 않은 세포 분열에 의한 바이러스 게놈 희석의 결과일 가능성이 있다. JΔNI7GFP-감염 배양물에서의 신호는 더욱 안정하였고, 이는 세포 분열이 감소한 것 때문일 가능성이 있다.
JΔNI7GFP 또는 JΔNI8GFP로 감염된 다른 세포로부터의 도입 유전자(EGFP 또는 mCherry) 발현 또한 조사하였다. 도 27에 도시된 바와 같이, 두 개의 측정된 용량에서(12,500 gc/세포 및 25,000 gc/세포), JΔNI8GFP는 JΔNI7GFP보다 더 많은 GFP를 인간 신생 각질 세포에서 발현하였다.
또한, JΔNI7GFP 또는 JΔNI8GFP(6,250 gc/세포)로 감염된 래트 후근 신경절(DRG) 세포로부터의 도입 유전자 발현을 분석하였다. 도 28에 도시된 바와 같이, JΔNI7GFP로부터의 mCherry(둘 모두의 벡터의 ICP4 결실 유전자좌로 삽입됨) 발현이 GFP에 상대적으로, 비-신경세포에 비하여 래트 DRG 뉴런에서 향상되었고, 상대적으로 JΔNI7GFP-감염 세포보다 JΔNI8GFP-감염 세포에서 더욱 그러하였다. 이러한 결과는 JΔNI8이 독성이 없고, LAT 및 ICP4 유전자좌 모두로부터의 뉴런 내 도입 유전자 발현을 가능하게 함을 나타낸다.
실시예 10
본 실시예는 장기(long-term) 실험에서 JΔNI7-GFP 벡터로부터의 인 비보 발현을 증명한다.
JDNI7-GFP(8.0 x 108 게놈 수/2 mL; 3.7 x 105 PFU)는 정위적으로(sterotactically) 래트(AP: -1.8; ML: -1.7; P: +3.5)의 해마에 0.1 μL/분의 속도로 주입하였다. 벡터 주입 후 6, 15 또는 30일(dpi)에 동물을 안락사시킨 후 관류하였고, 뇌 동결 절편(cryosection)을 형광 현미경으로 이미징하였다. 도 29는 해마 내의 동일한 세포 내에 함께 국부화(co-localized)한 EGFP 및 mCherry 모두의 강력한 발현을 나타낸다. 도 29에서는, 상단, 감염 후 표시된 날(dpi)에서의 EGFP 및 mCherry의 분리(좌측; 40x) 또는 병합(merge)(중간, 우측; 20x) 이미지; 하단, 15 dpi에서의 분리 및 합병 이미지 (10x)를 나타낸다.
실시예 11
본 실시예는 감염된 1차 성상세포(primary astrocyte) 내 JΔNI7-GFP 벡터로부터의 mCherry의 발현을 증명한다.
마우스 성상세포를 감염시키고(M.O.I.=5), 배양하였다. 감염 후 25일에 상기 세포들을 고정시키고, 신경교 섬유질 산성 단백질(glial fibrillary acidic protein: GFAP)에 특이적인 항체에 노출시켰으며, 이의 양성 결합은 성상 세포를 식별한다. 면역 형광 이미징으로 JΔNI7-GFP가 독성이 없고, 성상세포 내에서의 지속적인 발현을 가능하게 하는 것임을 밝혀내었다.
실시예 12
본 실시예는 본 발명의 HSV 벡터를 보완하고, 또한 바이러스 증식시에 loxP-측면(flanked) BAC 카세트의 절단을 촉진하는 위한 세포주의 발생을 증명한다.
상기 논의된 U2OS-ICP4/27 세포주를 Cre 리콤비나제를 발현하도록 조작하였다. 그 결과의 세포주인 U2OS-ICP4/27/Cre은 벡터 JDNI5, 7, 8 및 이들의 파생물 내의, 필요 없는 ICP47 유전자의 기능을 제외한, 결손된 HSV IE 유전자 모두의 기능을 보완하고, 바이러스 성장 중에 BAC 카세트를 제거한다.
U2OS-ICP4/27/Cre 세포는 Cre-발현 레트로 바이러스 벡터를 U2OS-ICP4/27 세포에 감염시켜 생성하였다. 상기 레트로 바이러스 벡터의 구성을 위해, 플라스미드 pCX4Hyg(PNAS 2003, 100: 13567-13572; GenBank accession number AB086387)를, Gateway 재조합 카세트를 다중 클로닝 부위로 삽입하는 것으로 변형시켰고, pCX4Hyg-GW를 만들었다. 플라스미드 pTurbo-Cre(GenBank accession number AF334827.1)로부터의 완전한 NLS-Cre 코딩 서열을 pENTR1A(Invitrogen)의 attL1 및 attL2 사이로 삽입하였고, 이후 LR Clonase-매개 Gateway 재조합으로 pCX4Hyg-GW로 운반시켜, pCX4Hyg-Cre를 만들었다. 이 플라스미드 및 이의 구조는 도 30 및 31에 개략적으로 도시하였다. 레트로바이러스 입자는 Makino et al. (Exp Cell Res 2009, 315: 2727-2740)에 기재된 대로 생산하였다. 요약하면, pCX4Hyg-Cre를, Gag-Pol 및 VSV-G expression 플라스미드와 함께, 293T 세포로 공동 형질주입(co-transfected)하였고, 48시간 후에 상층액을 수집하고, 0.45 미크론 필터로 여과시키고, 원심분리로 농축하였다. 적절한 Gag-Pol & VSV-G 플라스미드는 상업적으로 구매 가능하다(예를 들면, Cell Biolabs의 pCMV-Gag-Pol(Cat. No. RV-111) 및 Addgene의 pCMV-VSV-G).
U2OS-ICP4/27 세포는 정제된 Cre 레트로 바이러스로 감염시키고, 세포를 푸로미신, 블라스티시딘 및 히그로미신에 대한 저항성으로 선별하였다. 저항성 콜로니들을 분리하고, 증폭하고, 0.001-1 PFU/세포에서 JΔNI7-GFP로 감염시켰고, 감염 후 2일(dpi)에 β-갈락토시다제 활성에 대해 염색하였다. 청색 세포를 거의 보이지 않는 클론은 급격한 세포 병변 효과를 겪는 것이 발견되었고(MOI=0.01에서 감염 후 4 dpi에서 100% CPE), 반면 부모 U2OS-ICP4/27 세포는 청색 세포의 플라크-형성 클러스터와 9 dpi에서 약 25% CPE를 나타냈다. 이러한 결과는 JΔNI7-GFP 내에서 BAC 요소 및 연결된 LacZ 발현 카세트를 함께 Cre-매개 제거하는 것이 바이러스 성장을 촉진했던 것을 나타내었다. JΔNI7-GFP의 loxP 부위들 사이의 BAC 및 LacZ 서열의 정확한 제거는 선별된 U2OS-ICP4+/27+/Cre+ 클론 상의 각각의 JΔNI7-GFP 플라크로부터의 바이러스 DNA에 대한 PCR로 확인하였다.
따라서, 이들을 통해, 본 U2OS-ICP4/27 Cre 세포주에서 약 11kb BAC 서열을 제거하여 도입 유전자를 위한 공간을 회복하고, 바이러스 성장을 현저하게 가속시키는 것을 관찰하였다.
본 명세서에서 인용된 공개 문헌, 특허 출원, 및 특허를 포함하는 모든 참조 문헌들은, 각각의 참조 문헌이 개별적으로 및 특이적으로 참조로서 통합된다고 표시된 것과 같이, 그리고 완전하게 본 명세서에 기술된 것과 같이, 동일한 범위를 참조하는 것으로서 본 명세서에 통합된다
본 발명을 설명하는 맥락에서(특히 하기의 청구항의 맥락에서), 용어 "하나 및 일(a 및 an)" 및 "그(the)" 및 "적어도 하나(하나 이상)(at least one)" 및 유사한 지시체(referent)의 사용은, 다르게 표시되거나 문맥상 분명하게 모순되지 않는 한, 단수 및 복수 모두를 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 하나 또는 더 많은 항목의 목록이 따르는(예를 들면 "A 및 B 중 적어도 하나"), 용어 "적어도 하나(하나 이상)"는, 다르게 표시되거나 문맥상 명백하게 모순되지 않는 한, 나열된 항목(A 또는 B)으로부터 선택된 한 항목 또는 나열된 항목(A 및 B)의 하나 이상의 모든 조합을 의미하는 것으로 해석되어야 한다. 용어 "포함", "함유" 및 "갖는"("comprising", "having", "including", 및 "containing")은, 다르게 표시되지 않는 한, 개방된 끝을 갖는 용어로 해석되어야 한다(즉, "포함하지만 이에 한정되지는 않는"). 본 명세서에서 수치의 범위의 인용은, 다르게 표시되지 않는 한, 단순히 그 범위 내의 각각의 별도의 값을 개별적으로 언급하는 축약적 방법으로서 역할 하도록 의도하는 것이고, 각각의 별도의 값은 그들 각각이 본 명세서에 언급된 것과 같이 본 명세서에 통합된다. 본 명세서에 설명된 모든 방법은 다르게 표시되거나 문맥상 명백하게 모순되지 않는 한 임의의 적절한 순서로 수행될 수 있다. 본 명세서에서 제공된 임의 및 모든 예시, 또는 예시적 언어(예를 들면, "등"("such as")의 사용은 단지 본 발명을 더 잘 밝히기 위한 것으로 의도하는 것이고, 달리 언급되지 않으면 본 발명의 범위를 제한하는 것이 아니다. 본 명세서 내에는 본 발명의 실시에 필수적인 것으로서 임의의 미-청구적 요소를 표시하는 것으로 해석되는 언어는 없다.
본 발명의 바람직한 구체예는, 본 발명을 수행하기 위해 본 발명자들에게 알려진 최상의 형태를 포함하여, 본 명세서에 설명되어 있다. 이러한 바람직한 구체예의 변형들은 전술된 설명을 읽으면 당업자에게 명백할 것이다. 본 발명자들은 숙련된 기술자들이 적절한 변형 등을 이용하기를 기대하며, 본 발명자들은 특히 본 명세서에 설명되지 않은 경우보다 본 발명이 실행되기를 바란다. 따라서 본 발명은 해당 법률이 허용하는 것으로서, 본 명세서에 첨부된 청구항의 모든 변형 및 청구항 내 인용된 구성의 균등물을 포함한다. 더욱이, 이들의 모든 가능한 변형 내 상기 기재된 요소들의 모든 조합이, 다르게 표시되거나 문맥상 명백하게 모순되지 않는 한, 본 발명에 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> University of Pittsburgh - Of the Commonwealth System of Higher Education Glorioso, Joseph C. III Cohen, Justus Yoshitaka, Miyagawa Wolfe, Darren Paul Krisky, David M. Wechuck, James B. <120> NON-TOXIC HSV VECTORS FOR EFFICIENT GENE DELIVERY APPLICATIONS AND COMPLEMENTING CELLS FOR THEIR PRODUCTION <130> 716777 <150> US 61/847,405 <151> 2013-07-17 <160> 88 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5730 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LAT-derived sequence <400> 1 cacggcggcc accgccgccg ccgccgccga caccgcagag ccggcgcgcg cacacacaag 60 cggcagaggc agaaaggccc cgagtcattg tttatgtggc cgcgggccag cagacggccc 120 gcgacacccc cccccgcccg tgtgggtatc cggccccccg ccccgcgccg gtccattaag 180 ggcgcgcgtg cccgcgagat atcaatccgt taagtgctct gcagacaggg gcaccgcgcc 240 cggaaatcca ttaggccgca gacgaggaaa ataaaattac atcacctacc catgtggtgc 300 tgtggcctgt ttttgctgcg tcatctgagc ctttataaaa gcgggggcgc ggccgtgccg 360 atcgccggtg gtgcgaaaga ctttccgggc gcgtccgggt gccgcggctc tccgggcccc 420 cctgcagccg gggcggccaa ggggcgtcgg cgacatcctc cccctaagcg ccggccggcc 480 gctggtctgt tttttcgttt tccccgtttc gggggtggtg ggggttgcgg tttctgtttc 540 tttaacccgt ctggggtgtt tttcgttccg tcgccggaat gtttcgttcg 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primer <400> 81 cccggccaac cagcgtccgc cgagtcttcg g 31 <210> 82 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 82 gccggttcca gtgtaagggt cgggggtccc 30 <210> 83 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 83 cctgacagag ctgtattgta 20 <210> 84 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 84 agatcgctgt cggagaggtc c 21 <210> 85 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 85 tatagatctc gagctcaagc ttcgaattct gcagtcgacg gtaccgcggg cccaggatga 60 cgacgataag taggg 75 <210> 86 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 86 aatctgcaga gatctctaca accaattaac caattctgat tag 43 <210> 87 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 87 tatgttaaca acaacaattg cattcatttt atgtttcagg ttcaggggga ggtaggatga 60 cgacgataag taggg 75 <210> 88 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 88 aatctgcagg ttaacctaca accaattaac caattctgat tag 43

Claims (25)

  1. 하나 이상의 도입 유전자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단순 헤르페스 바이러스(HSV) 벡터로서,
    상기 HSV 벡터는 전초기(immediate early) 유전자로서 ICP0, ICP4, ICP22, 및 ICP27을 발현하지 않고, 상기 HSV 벡터는 그 HSV 벡터로 비-보완 세포를 감염시킨 후 적어도 28일 동안 하나 이상의 도입 유전자를 발현할 수 있는 것인, HSV 벡터.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 HSV 벡터는 추가로 전초기 유전자로서 ICP47을 추가로 발현하지 않는 것인 HSV 벡터.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 비-보완 세포가 배양된 인간 진피 섬유아세포(HDF)인 HSV 벡터.
  4. 청구항 1에 있어서, ICP0, ICP4, ICP22, 및 ICP27 유전자좌 중 하나 이상에서 불활성화 결실을 포함하는 것인 HSV 벡터.
  5. 청구항 4에 있어서, 상기 ICP0, ICP4, ICP22, 및 ICP27 유전자좌 중 하나 이상에서의 불활성화 결실이 상기 유전자좌 내의 코딩 서열의 완전한 결실인 것인 HSV 벡터.
  6. 청구항 1에 있어서, ICP0, ICP4, ICP22, 및 ICP27 유전자좌 각각에서 불활성화 결실을 포함하는 것인 HSV 벡터.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 ICP0, ICP4, ICP22, 및 ICP27 유전자좌 중 하나 이상은 초기 또는 후기 유전자로서 발현되는 것인 HSV 벡터.
  8. 청구항 7에 있어서, 상기 ICP22는 초기 유전자로서 발현되는 것인 HSV 벡터.
  9. 청구항 8에 있어서, 상기 게놈 내 ICP22는 초기 프로모터의 조절하에 있는 것인 HSV 벡터.
  10. 청구항 1에 있어서, 하나 이상의 비필수적(nonessential) 유전자의 결실을 더 포함하는 것인 HSV 벡터.
  11. 청구항 10에 있어서, 상기 하나 이상의 비필수적 유전자는 UL41을 포함하는 것인 HSV 벡터.
  12. 청구항 1에 있어서, 내부 반복(조인트) 영역의 결실을 추가로 포함하는 것인 HSV 벡터.
  13. 청구항 1에 있어서, 야생형 당단백질을 포함하는 HSV 벡터에 비해 HSV 벡터의 감염성을 증진시키거나 또는 비-정규(non-canonical) 수용체를 통한 세포로의 HSV 벡터의 진입을 지시하는 돌연변이 당단백질을 코딩하는 유전자를 추가로 포함하는 것인 HSV 벡터.
  14. 청구항 13에 있어서, 상기 당단백질은 gB, gC, gD, gH, 및 gK 로부터 선택되는 것인 HSV 벡터.
  15. 청구항 1에 있어서, 상기 하나 이상의 도입 유전자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 구성적 포유류(constitutive mammalian) 프로모터에 작동적으로 연결되어 있는 것인 HSV 벡터.
  16. 청구항 15에 있어서, 상기 프로모터는 세포 또는 조직 특이적 프로모터인 것인 HSV 벡터.
  17. 청구항 1에 있어서, 상기 하나 이상의 도입 유전자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 폴리시스트론성인 것인 HSV 벡터.
  18. 청구항 1에 있어서, 상기 하나 이상의 도입 유전자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 마이크로 RNA에 대한 하나 이상의 결합 부위를 포함하는 것인 HSV 벡터.
  19. 청구항 1에 있어서, 상기 하나 이상의 도입 유전자는 Oct4, Klf4, Sox2, c-Myc, L-myc, 지배적-음성 p53, Nanog, Glis1, Lin28, TFIID, GATA4, Nkx2.5, Tbx5, Mef2C, Myocd, Hand2, SRF, Mesp1, SMARCD3, SERCA2a, Pax3, MyoD, Lhx2, FoxG1, FoxP2, Isl1, Ctip2, Tbr1, Ebf1, Gsx2, Srebp2, 인자 VIII, 인자 IX, 디스트로핀(Dystrophin), CFTR, GlyRα1, 엔케팔린(enkephalin), GAD 이소폼, 신경 영양성 인자, Ascl1, Nurr1, Lmx1A, Brn2, Myt1l, NeuroD1, FoxA2, Hnf4α, Foxa1, Foxa2 Foxa3, 마이크로 RNA, miRNA들의 조합, 및 하나 이상의 비-코딩 RNA(ncRNA)로부터 선택되는 것인 HSV 벡터.
  20. 청구항 1에 있어서, 상기 HSV 게놈은 리콤비나제(recombinase) 효소에 대한 하나 또는 둘의 공통 서열(consensus sequence)을 포함하는 것인 HSV 벡터.
  21. 청구항 20에 있어서, 상기 리콤비나제 효소에 대한 공통 서열이 유전자간(intergenic) 영역에 삽입된 것인 HSV 벡터.
  22. 청구항 1 내지 21 중 어느 한 항의 HSV 벡터를 포함하는 바이러스 스톡.
  23. 의약으로서 사용하기 위한, 청구항 1 내지 21 중 어느 한 항의 HSV 벡터, 또는 청구항 1 내지 21 중 어느 한 항의 HSV 벡터를 포함하는 바이러스 스톡으로서,
    상기 의약은 상기 도입 유전자 중 하나 이상이 개체의 세포 내에서 발현되도록 개체의 세포를 감염시키기 충분한 양 및 위치로 개체에 투여되고,
    상기 발현되는 도입 유전자는 하나 이상의 예방학적 또는 치료학적 활성 단백질, 폴리펩티드 또는 ncRNA를 코딩하는 것인 HSV 벡터 또는 바이러스 스톡.
  24. 청구항 1 내지 21 중 어느 한 항의 HSV 벡터 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물.
  25. 인 비트로(in vitro)에서 도입 유전자를 세포에서 발현시키는 방법으로서, 비-보완 세포를 청구항 1 내지 21 중 어느 한 항의 HSV 벡터로 감염시켜 상기 도입 유전자의 하나 이상이 세포 내에서 발현되도록 하는 것인 방법.
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