KR20210031869A - 자가 포식 저분자 유도물질 - Google Patents

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제프 드 브라반더
키렌 리앙
베스 레빈
웨이-충 치앙
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Abstract

Beclin-1/Bcl-2 단백질-단백질 상호 작용의 저분자 방해자는 자가포식을 유도하므로 암, 감염(지카(Zika) 포함) 면역, 신경퇴화, 장수를 포함하여 치료적으로 유용한 다양한 적응증(indication)을 치료하는 데 유용하다.

Description

자가 포식 저분자 유도물질
자가포식은 세포 항상성, 발달, 면역, 종양 억제, 물질대사, 신경퇴화 예방 및 수명 연장에 중요한 역할을 한다. 따라서 자가포식의 약리학적 자극은 특정 인간 질병 및/또는 노화를 예방하거나 치료하기 위한 효과적인 접근 방식을 제공한다. 분할-루시페라아제(split-luciferase) 및 AlphaLISA 분석 및 SAR 개발을 사용하여 Beclin 1/Bcl-2 단백질-단백질 상호작용을 선택적으로 억제하는 저분자를 개발하였다(아포토시스를 유도하는 단백질-단백질 상호작용을 포함하는 다른 Bcl-2/BH3 영역을 억제하는 것과 비교). 이러한 Beclin-1/Bcl-2 단백질-단백질 상호작용의 저분자 방해자(disruptor)는 자가포식을 유도하므로 암, 감염(지카(Zika) 포함) 면역, 신경퇴화, 장수를 포함하여 자가포식의 자극(유도)이 치료적으로 유용한 다양한 적응증을 치료하는 데 유용하다.
본 발명은 국립 보건원(NIH)에서 수여한 허가 번호(Grant Number) U19-AI109725에 따라 정부의 지원을 받아 만들어졌다. 정부는 이 발명에 대한 특정 권리를 가지고 있다.
거대자가포식(macroautophagy, 이후 자가포식이라고 함)는 세포가 자가소화포(autophagosome)라고 하는 이중막 구조를 통해 원하지 않거나 손상된 세포 단백질 또는 세포소기관을 분리(sequester)하는 이화 작용 경로이다. 이 과정은 진화적으로 보존된 일련의 유전자인 자가포식 관련(autophagy-related, ATG) 유전자(참고문헌 1, 2)에 의해 매개되며, 이는 자가소화포 막의 핵 생성, 자가포식 막의 신장, 세포질 구성 요소의 분리, 이중막의 폐쇄, 리소좀과의 융합 및 분리된 내용물의 분해의 기능을 한다.
자가포식은 세포 생존 및 스트레스 적응(참고문헌 3), 대사(참고문헌 4), 발달(참고문헌 5, 6), 면역(참고문헌 7), 단백질 및 세포소기관 항상성(참고문헌 8) 및 노화에 대한 보호(참고문헌 9)에서 중요한 생리적 역할을 한다. 또한 여러 증거가 자가포식 및 당뇨병(diabetes), 감염(infection), 암(cancer), 신경퇴행성질환(neurodegenerative disease) 및 노화(aging)(참고문헌 3, 9, 10)를 포함한 포유류 질환 사이의 연관성을 나타낸다. 생쥐 내 자가포식의 전신 또는 조직 특이적인 유전적 방해(disruption)는 조직 이상, 비정상적인 염증, 면역 장애, 신경 퇴화 및 종양 형성에 대한 감수성을 포함한 여러 병리를 유발한다. 인간 내 자가포식 유전자의 돌연변이 또는 다형성은 감염(infection), 암(cancer), 염증성질환(inflammatory disease), 천식(asthma), 뇌성 마비(cerebral palsy), 이마관자엽 치매(frontotemporal dementia), 근위축성 측삭경화증(amyotrophic lateral sclerosis, ALS), 헌팅턴병(Huntington's disease) 및 파킨슨병(Parkinson's disease)에 대한 감수성과 관련이 있다(참고문헌 11 내지 14). 더욱이, 생쥐의 기능획득변이 또는 자가포식 유전자의 강제 발현은 대사 및 조직 기능 개선, 수명 연장, 신경 보호 및 종양 발생 감소를 포함하는 유익한 효과를 나타낸다(참고문헌 11, 15 내지 19). 따라서 자가포식 유도제의 개발은 임상 의학에서 특정 질병을 예방 및/또는 치료하는 치료적 접근 방식을 제공한다(참고문헌 11, 20 내지 22).
자가포식 개시를 조절하는 주요 메커니즘 중 하나는 Bcl-2가 Beclin 1-VPS34 클래스 III 포스파티딜이니시톨 3 키나아제 복합체의 활성의 필수적 결정 인자인 스캐폴드단백질인 Beclin 1에 결합하는 것이다(참고문헌 24, 25). 기저 조건 동안 자가포식 수준은 Bcl-2(또는 관련 계열 구성요소인, Bcl-xL)가 Beclin 1에 결합하여 제한된다. 스트레스 자극(예: 영양 결핍(참고문헌 24, 26), JNK 활성화(참고문헌 26), 세라마이드(참고문헌 27), 면역학적 신호(참고문헌 28))에 대한 반응으로, Beclin 1/Bcl-2 복합체의 방해(disruption)는 생체외에서 자가포식 상향조절을 유도한다. 이 방해는 Bcl-2의 비구조화 루프의 다중 부위 인산화(참고문헌 26), Bcl-2에 대한 친화도를 감소시키는 Beclin 1의 BH3 영역(양친매성 알파나선)의 조절 인산화(regulatory phosphorylation)(참고문헌 29, 30), 또는 Beclin 1/Bcl-2 결합을 경쟁적으로 방해하는 BH3-전용(only) 단백질(참고문헌 31)에 의해 매개될 수 있다. Beclin 1/Bcl-2 결합을 방해하는 데 필요한 Bcl-2 인산화 부위에 돌연변이가 있는 유전자 조작된 생쥐는 생체 내 기아 및 운동 유도 자가포식이 부족하다. 장기 운동 훈련의 유익한 대사 효과를 경험하지 못한다(참고문헌 32).
반대로, Bcl-2 및 Bcl-xL에 대한 생체외 결합 친화도를 감소시키는 Beclin 1(인간 단백질의 F123A, 생쥐 단백질의 F121A)에서 점 돌연변이를 갖는 녹-인 (knock-in) 생쥐는 뇌, 심장, 근육, 간, 유선 및 신장(비특헌문헌 17 내지 19)을 포함하는 다중 조직에서 증가된 구성적 자가포식을 초래한다. 이 생쥐는 수명이 증가하고 노화 관련 표현형, 특히 연령 관련 신장 및 심장 병리학적 변화 및 연령 관련 자발적 종양 발생이 감소함을 보여준다. Beclin 1 녹인(knock-in) 돌연변이는 또한 아밀로이드 올리고머의 축적을 감소시키고 알츠하이머 유사 질환의 생쥐 모델에서 인지 기능과 생존을 개선하며(참고문헌 18) HER2 기반 종양 발생 생쥐 모델에서 유방암 발생률을 감소시킨다(참고문헌 19).
따라서, Beclin 1/Bcl-2 상호작용이 생체내 자가포식 유도를 위한 중요한 체크 포인트로 작용한다는 강력한 유전적 증거가 있다. 중요한 것은 이 복합체의 장기적인 방해가 생쥐에서 안전할 뿐만 아니라 건강 수명을 개선하고 수명을 연장하며 신경퇴행성질환(neurodegenerative disease)과 암으로부터 보호한다는 것이다. 자가포식 조절에서 Beclin 1/Bcl-2의 역할에 대한 광범위한 생체외 데이터와 함께 취해진 이러한 생체내 연구 결과(참고문헌 25, 30)는 Beclin 1/Bcl-2 결합을 표적으로 하는 새로운 자가포식 유도 전략 개발에 대한 강력한 근거를 제공한다.
이 접근법의 중요한 도전은 자가포식 단백질 Beclin 1의 BH3 영역과 프로-아포토시스 단백질의 BH3 영역이 Bcl-2/Bcl-xL의 보존된 소수성 그루브(groove)에 결합하는 중첩 방식에 의해 제기된다(참고문헌 33, 34). BH3 모방체(예: ABT-737, ABT-263, ABT-199)가 개발되어 Beclin 1의 Bcl-2(및/또는 Bcl-xL) 결합을 방해하고(자가포식을 유도)(참고문헌 31, 35) 또한 항아포토시스 Bcl-2 계열 구성요소와 프로아포토시스 BH3 영역 사이의 결합을 방해한다(따라서 아포토시스 유도)(참고문헌 36). 이러한 화합물은 아포토시스 유도 활성에 최적화되어 잠재적인 암 화학요법제로 사용된다. 그러나 감염성 질환 및 신경퇴화를 치료하고 노화를 예방하는 관점에서(또한 자가포식의 상향 조절이 유익할 수 있는 다른 병리 생리학적 맥락), Bcl-2 계열 구성요소/프로아포토시스 계열 구성요소 결합이 아닌 Beclin 1/Bcl-2 결합을 선택적으로 방해하여 아포토시스를 유도하지 않고 선택적으로 자가포식을 유도하는 제제를 개발하는 것이 바람직할 것이다. 이것은 Beclin 1의 BH3 영역과 Bcl-xL의 결합 친화도가 프로아포토시스 BH3 계열 구성원의 결합 친화도 보다 상당히 낮기 때문에(참고문헌 34, 37, 38), 기술적으로 가능할 수 있으므로 Bcl-2/Bcl-xL에 결합한 Beclin 1의 선택적 방해를 위한 잠재적인 치료창(therapeutic window)을 제공한다. 또한 Bcl-2 계열 구성요소에 결합하는 BH3 펩티드에 대한 상세한 생화학적 및 생물물리학적 분석은 치료학적으로 이용될 수 있는 상이한 BH3 영역의 정확한 결합 방식의 차이가 존재함을 나타낸다(참고문헌 33, 34, 39). 따라서 본 발명자들은 Bcl-2의 프로아포토시스 BH3 영역 포함 분자에 대한 결합을 교란시키지 않고 Beclin 1/Bcl-2 상호작용을 표적으로 하는 새로운 자가포식 유도 약물을 식별하고자 하였다.
현재 임상 시험 또는 임상 사용중인 여러 약물이 자가포식을 유도하는 것으로 알려져 있다(참고문헌 11, 23). 그러나 이러한 약물의 효과는 다면발현성이며 그 작용은 자가포식 경로에 국한되지 않는다. 특히, 많은 약물은 상단부 신호 전달 경로(예: mTOR 억제, AMPK 활성화, 칼슘 채널 억제 및 cAMP 신호)의 조절을 통해 자가포식을 향상시키지만 다양한 하단부 생물학적 기능을 조절하여 임상적 유용성을 제한하는 자가포식과 관련되지 않은 효과를 초래한다(참고문헌 21). 따라서 이점을 극대화하고 독성을 최소화하기 위해 상단부 신호 전달보다는 자가포식 실행에서 속도 제한 단계를 선택적으로 목표로 하는 자가포식 유도제가 긴급히 필요하다.
여러 측면에서 본 발명은 하기의 내용을 제공한다:
-구조식 I의 화합물을 포함하는 약학적 조성물로 이를 필요로 하는 사람을 치료하는 단계를 포함하는 자가포식을 선택적으로 유도하는 방법;
-Beclin 1 BH 3 영역(domain)의 항아포토시스(anti-apoptotic) Bcl-2 BH3 영역에 대한 결합을 선택적으로 억제하지만, 프로(pro)-아포토시스 Bax BH3 영역 또는 프로-아포토시스 Bim BH3 단백질의 Bcl-2 BH3 영역에 대한 결합을 억제하지 않는, 구조식 I의 화합물을 포함하는 약학적 조성물로 이를 필요로 하는 사람을 치료하는 것을 포함하는 방법;
-구조식 I의 화합물을 포함하는, 이를 필요로 하는 사람에게 투여하기 위해 제형화된 약학적 조성물; 및
-라이브러리 화합물 SW076956을 제외한 구조식 I의 화합물, 또는 이의 염, 수화물 또는 입체 이성질체:
[구조식 I]
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여기서
R1은 임의적으로 치환된 C5 또는 C6 아릴 또는 헤테로아릴;
R1은 N, O 및 S로부터 선택된 1 내지 3개의 이종 원자(heteroatom)를 갖는 임의적으로 치환된 C5 또는 C6 아릴 또는 헤테로아릴;
R1은 임의적으로 치환된 피롤, 푸란, 티오펜, 이미다졸, 피라졸, 옥사졸, 이소옥사졸, 티아졸, 이소티아졸, 트리아졸, 푸라잔, 옥사디아졸, 티아디아졸, 디옥사졸, 디티아졸(dithiazole), 피리딘, 피란, 티오피란(thiopyran), 디아진, 옥사진, 티아진, 다이옥신, 디티인(dithiin) 및 트리아존; 또는
R1은 임의적으로 치환된 2- 또는 3-푸라닐(furanyl) 또는 페닐, 2, 3 또는 4-피리딘이고;
R2는 임의적으로 치환된 이종 원자 또는 임의적으로 치환된, 임의적으로 헤테로-, 임의적으로 사이클릭(cyclic) C1-C10 히드로카르빌(hydrocarbyl)로부터 독립적으로 선택된 0 내지 5개의 치환기;
R2는 할로겐, 아미드, 아민, 이민, 이미드, 니트로, 니트로소, 질산염, 아질산염, 시아노, 히드록실 또는 히드로카르빌옥시(hydrocarbyloxy), 또는 알데히드, 케톤, 카르복실, 에테르, 에스테르, 알킬, 알케닐(alkenyl), 알키닐(alkynyl), 술피닐, 술포닐로부터 독립적으로 선택된 0 내지 5개의 치환기;
R2는 각각 임의적으로 플루오르화된(fluorinated), 할로겐, NO2, N, C1-C4 알킬 (Me, Et, cPr, iPr, cBu, tBu), C1-C4 알콕시, C1-C4 카르보닐, C1-C4 카르복실, C1-C4 시아노, C1-C4 술피닐, C1-C4 술포닐로부터 선택된 0 내지 5개의 치환기; 또는
R2는 각각 임의적으로 플루오르화된, 할로겐, NO2, N, C1-C4 알킬, C1-C4 알콕시, C1-C4 카르보닐, C1-C4 카르복실, C1-C4 시아노, C1-C4 술피닐, C1-C4 술포닐로부터 선택된 1개의 파라 치환기(para substituent)이며;
R3은 임의적으로 치환된 이종 원자 또는 임의적으로 치환된, 임의적으로 헤테로-, 임의적으로 사이클릭 C1-C10 히드로카르빌로부터 독립적으로 선택된 0 내지 4개의 치환기;
R3은 할로겐, 아미드, 아민, 이민, 이미드, 니트로, 니트로소, 질산염, 아질산염, 시아노, 히드록실 또는 히드로카르빌옥시, 또는 알데히드, 케톤, 카르복실, 에테르, 에스테르, 알킬, 알케닐, 알키닐, 술피닐, 술포닐로부터 독립적으로 선택된 0 내지 4개의 치환기;
R3은 각각 임의적으로 플루오르화된, 할로겐, NO2, N, C1-C4 알킬 (Me, Et, cPr, iPr, cBu, tBu), C1-C4 알콕시, C1-C4 카르보닐, C1-C4 카르복실, C1-C4 시아노, C1-C4 술피닐, C1-C4 술포닐로부터 선택된 0 내지 4개의 치환기; 또는
R3은 0개의 치환기이고;
R4는 H, 임의적으로 치환된 이종 원자 또는 임의적으로 치환된, 임의적으로 헤테로-, 임의적으로 사이클릭 C1-C10 히드로카르빌; 또는
R4는 H, 히드록실 또는 히드로카르빌옥시, 또는 알데히드, 케톤, 카르복실, 에테르, 에스테르, 알킬, 알케닐, 알키닐, 술피닐, 술포닐;
R4는 각각 임의적으로 플루오르화된, H 또는 C1-C4 알킬 (Me, Et, cPr, iPr, cBu, tBu), C1-C4 알콕시, C1-C4 카르보닐, C1-C4 카르복실, C1-C4 시아노, C1-C4 술피닐, C1-C4 술포닐; 또는
R4는 H이고;
R5는 임의적으로 치환된 이종 원자 또는 임의적으로 치환된, 임의적으로 헤테로-, 임의적으로 사이클릭 C1-C10 히드로카르빌;
R5는 히드록실 또는 히드로카르빌옥시, 또는 알데히드, 케톤, 카르복실, 에테르, 에스테르, 알킬, 알케닐, 알키닐, 술피닐, 술포닐;
R5는 각각 임의적으로 플루오르화된, C1-C4 알킬 (Me, Et, cPr, iPr, cBu, tBu), C1-C4 알콕시, C1-C4 카르보닐, C1-C4 카르복실, C1-C4 시아노, C1-C4 술피닐, C1-C4 술포닐; 또는
R5는 술포닐 또는 에스테르, SO2R 또는 CO2R이고, 상기 R은 C1-C4 알킬이고, 임의적으로 플루오르화된 것이고;
상기 R4 및 R5는 헤테로사이클릭 고리(heterocylic ring)로 결합될 수 있다.
본 발명은 각각의 조합이 힘들게 인용된 것처럼 인용된 특정 실시예의 모든 조합을 포함한다.
본 발명자들은 새로운 Beclin 1/Bcl-2 결합 억제제를 식별하기 위해 세포 기반 분할-루시페라아제(split-luciferase) 또는 생체외 AlphaLISA 분석을 사용하여 고속대량스크리닝(high-throughput screening, HTS) 플랫폼을 사용하였다. UT Southwestern Medical Center와 Broad Institute of MIT 및 Harvard의 약 300,000개 화합물로 구성된 화학 라이브러리를 사용하여 세포 기반 분할-루시페라아제 분석에서 Beclin 1/Bcl-2 상호작용을 방해하고 마이크로몰(micromolar) IC50 값인 생체외 AlphaLISA 분석에서 Beclin 1/Bcl-2 상호작용을 직접적으로 억제하는 세 가지 저분자 화합물을 식별하였다. 이 세 가지 화합물은 세포 생존력을 감소시키지 않는 농도의 세포에서 자가포식 유동을 유도한다. 본 발명의 생화학적 데이터는 이러한 화합물이 프로아포토시스 단백질의 BH3 영역, Bax 및 Bcl-2 사이 또는 BH3 전용 단백질, Bim 및 Bcl-2 사이의 상호작용에 영향을 주지 않고 Beclin 1의 BH3 영역과 Bcl-2 사이의 상호작용을 억제함을 나타낸다. 이는 이들 화합물이 선택적 Beclin 1/Bcl-2 억제제임을 나타낸다. 전반적으로 이 스크리닝 프로그램은 Beclin 1/Bcl-2 상호작용을 선택적으로 방해하는 화합물을 식별하였다.
용어 "알킬"은 1 내지 18개, 또는 1 내지 12개, 또는 1 내지 6개의 탄소 원자의 선형 및 분지형 포화 탄화수소기(hydrocarbon group)로부터 선택된 탄화수소기를 의미한다. 알킬기의 예로는 메틸, 에틸, 1-프로필 또는 n-프로필("n-Pr"), 2-프로필 또는 이소프로필("i-Pr"), 1-부틸 또는 n-부틸("n-Bu"), 2-메틸-1-프로필 또는 이소부틸("i-Bu"), 1-메틸프로필 또는 s-부틸("s-Bu") 및 1,1-디메틸에틸 또는 t-부틸("t-Bu")을 포함한다. 알킬기의 다른 예는 1-펜틸, 2- 펜틸, 3-펜틸, 2-메틸-2-부틸, 3-메틸-2-부틸, 3-메틸-1-부틸, 2-메틸-1-부틸, 1-헥실, 2-헥실, 3-헥실, 2-메틸-2-펜틸, 3-메틸-2-펜틸, 4-메틸-2-펜틸, 3-메틸-3-펜틸, 2-메틸-3-펜틸, 2,3-디메틸-2-부틸 및 3,3-디메틸-2-부틸기를 포함한다.
저급 알킬은 1 내지 8개, 바람직하게는 1 내지 6개, 더욱 바람직하게는 1 내지 4개의 탄소 원자를 의미하고; 저급 알케닐(alkenyl) 또는 알키닐(alkynyl)은 2 내지 8개, 2 내지 6개 또는 2 내지 4개의 탄소 원자를 의미한다.
용어 "알케닐"은 하나 이상의 C=C 이중 결합 및 2 내지 18개, 2 내지 12개, 또는 2 내지 6개의 탄소 원자를 포함하는 선형 및 분지형 탄화수소기로부터 선택된 탄화수소기를 의미한다. 알케닐기의 예는 에텐일(ethenyl) 또는 비닐, 프로프-1-에닐(prop-1-enyl), 프로프-2-에닐, 2-메틸프로프-1-에닐, 부트(but)-1-에닐, 부트-2-에닐, 부트-3-에닐, 부타-1,3-디에닐(dienyl), 2-메틸부타-1,3-디엔, 헥스-1-에닐, 헥스-2-에닐, 헥스-3-에닐, 헥스-4-에닐, 및 헥사-1,3-디에닐기로부터 선택될 수 있다.
용어 "알키닐"은 적어도 하나의 C≡C 삼중 결합 및 2 내지 18개, 2 내지 12개, 또는 2 내지 6개의 탄소 원자를 포함하는 선형 및 분지형 탄화수소기로부터 선택된 탄화수소기를 지칭한다. 알키닐기의 예에는 에틴일(ethynyl), 1-프로핀일(propynyl), 2-프로핀일(프로파르길), 1-부티닐(butynyl), 2-부티닐 및 3-부티닐기가 포함된다.
용어 "사이클로알킬(cycloalkyl)"은 단환 및 다환(예를 들어, 이환 및 삼환) 기를 포함하는 포화 및 부분 불포화 사이클릭 탄화수소기(cyclic hydrocarbon group)로부터 선택된 탄화수소기를 지칭한다. 예를 들어, 사이클로알킬기는 3 내지 12개, 3 내지 8개 또는 3 내지 6개의 탄소 원자일 수 있다. 더 나아가 예를 들어, 사이클로알킬기는 3 내지 12개, 또는 3 내지 8개, 또는 3 내지 6개의 탄소 원자의 단환기(monocyclic group)일 수 있다. 단환 사이클로알킬기의 예는 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 1-사이클로펜트-1-에닐, 1-사이클로펜트-2-에닐, 1-사이클로펜트-3-에닐, 사이클로헥실, 1-사이클로헥스-1-에닐, 1-사이클로헥스-2-에닐, 1-사이클로헥스-3-에닐, 사이클로헥사디에닐, 사이클로헵틸, 사이클로옥틸, 사이클로노닐, 사이클로데실, 사이클로운데실 및 사이클로도데실기를 포함한다. 이환 사이클로알킬기의 예는 [4,4], [4,5], [5,5], [5,6] 및 [6,6] 고리 시스템에서 선택되는 이환로서, 또는 바이사이클로[2.2.1]헵탄, 바이사이클로[2.2.2]옥탄 및 바이사이클로[3.2.2]노난에서 선택되는 가교된 이환(bridged bicyclic ring)로서 배열된 7 내지 12개의 고리 원자를 갖는 것들을 포함한다. 고리는 포화되거나 적어도 하나의 이중 결합(즉, 부분적으로 불포화됨)을 가질 수 있지만, 방향족이 본원에 정의된 바와 같이 완전히 접합(conjugated)되지 않고, 방향족이 아니다.
본원에서 용어 "아릴"은 예를 들어 페닐과 같은 5- 및 6-원(membered) 탄소환 방향족 고리(carbocyclic aromatic ring); 적어도 하나의 고리가 예를 들어 나프탈렌, 인단(indane) 및 1,2,3,4-테트라히드로퀴놀린(tetrahydroquinoline)으로부터 선택되는 탄소환 및 방향족인 7- 내지 12-원 이환 시스템(bicyclic ring system)과 같은 이환 시스템; 및 하나 이상의 고리가 예를 들어 플루오렌인 탄소환 및 방향족인 10- 내지 15-원 삼환 시스템(tricyclic ring system)과 같은 삼환 시스템으로부터 선택되는 기를 지칭한다.
예를 들어, 아릴기는 N, O 및 S로부터 선택된 하나 이상의 이종 원자를 임의적으로 포함하는 5- 내지 7-원 사이클로알킬 또는 헤테로사이클릭 고리(heterocyclic ring)에 융합된 5- 및 6-원 탄소환 방향족 고리(carbocyclic aromatic ring)로부터 선택되며, 제공되는 부착 지점은 탄소환 방향족 고리가 헤테로사이클릭 고리와 융합될 때 탄소환 방향족 고리에 있고, 부착 지점은 탄소환 방향족 고리가 사이클로알킬기와 융합될 때 탄소환 방향족 고리 또는 사이클로알킬기에 있을 수 있다. 치환된 벤젠 유도체로부터 형성되고 고리 원자에 자유 원자가를 갖는 2가 라디칼은 치환된 페닐렌 라디칼로 명명된다. 자유 원자가를 갖는 탄소 원자에서 하나의 수소 원자를 제거하여 이름이 "-일(-yl)"로 끝나는 1가 다환 탄화수소 라디칼에서 유도된 2가 라디칼은 해당 1가 라디칼의 이름에 "-이덴(-idene)"을 추가하여 명명된다. 예를 들어 두 개의 부착 지점을 가진 나프틸기는 나프틸리덴(naphthylidene)이라고 한다. 그러나 아릴은 하기에 별도로 정의된 헤테로아릴을 포함하거나 중첩하지 않는다. 따라서, 하나 이상의 탄소환 방향족 고리가 헤테로사이클릭 방향족 고리(heterocyclic aromatic ring)와 융합되는 경우, 생성된 고리 시스템은 본원에 정의된 바와 같이 아릴이 아닌 헤테로아릴이다.
용어 "할로겐" 또는 "할로"는 F, Cl, Br 또는 I를 지칭한다.
용어 "헤테로알킬(heteroalkyl)"은 하나 이상의 이종 원자를 포함하는 알킬을 지칭한다.
용어 "헤테로아릴(heteroaryl)"은 하기로부터 선택된 기를 의미한다:
N, O 및 S로부터 선택된 1, 2, 3 또는 4개의 이종 원자를 포함하고 나머지 고리 원자는 탄소인 5- 내지 7-원 방향족, 단환(monocyclic ring);
N, O 및 S로부터 선택된 1, 2, 3 또는 4개의 이종 원자를 포함하고 나머지 고리 원자는 탄소이고 적어도 하나의 고리는 방향족이고 방향족 고리 내 적어도 하나의 이종 원자를 포함하는 8- 내지 12-원 이환(bicyclic ring); 및
N, O 및 S로부터 선택된 1, 2, 3 또는 4개의 이종 원자를 포함하고 나머지 고리 원자는 탄소이고 적어도 하나의 고리는 방향족이고 방향족 고리 내 적어도 하나의 이종 원자를 포함하는 11- 내지 14-원 삼환(tricyclic ring).
예를 들어, 헤테로아릴기는 5- 내지 7-원 사이클로알킬 고리에 융합된 5 내지 7-원 헤테로사이클릭 방향족 고리를 포함한다. 고리 중 하나만이 적어도 하나의 이종 원자를 포함하는 이러한 융합된 이환 헤테로아릴 고리 시스템의 경우, 부착 지점은 헤테로방향족 고리 또는 사이클로알킬 고리에 있을 수 있다.
헤테로아릴기의 S 및 O 원자의 총 수가 1을 초과할 때, 이들 이종 원자는 서로 인접하지 않는다. 일부 실시예에서, 헤테로아릴기에서 S 및 O 원자의 총 수는 2 이하이다. 일부 실시예에서, 방향족 헤테로사이클에서 S 및 O 원자의 총수는 1 이하이다.
헤테로아릴기의 예에는(우선순위 1이 할당된 결합 위치로부터 번호가 매겨진 바와 같이) 피리딜(예: 2-피리딜, 3-피리딜 또는 4-피리딜), 신놀리닐(cinnolinyl), 피라진일, 2,4-피리미딘일, 3,5-피리미딘일, 2,4-이미다졸릴, 이미다조피리딘일(imidazopyridinyl), 이소옥사졸릴, 옥사졸릴, 티아졸일, 이소티아졸일, 티아디아졸릴(thiadiazolyl), 테트라졸일, 티에닐, 트리아진일, 벤조티에닐, 푸릴, 벤조푸릴, 벤조이미다졸릴, 인돌일, 이소인돌일, 인돌리닐, 프탈라진일(phthalazinyl), 피라진일, 피리다진일, 피롤일, 트리아졸일, 퀴놀린일(quinolinyl), 이소퀴놀린일(isoquinolinyl), 피라졸일, 피롤로피리딘일 (pyrrolopyridinyl)(예: 1H-피롤로[2,3-b]피리딘-5-일), 피라졸로피리딘일(pyrazolopyridinyl)(예: 1H-피라졸로[3,4-b]피리딘-5-일), 벤족사졸릴(benzoxazolyl)(예: 벤조[d]옥사졸-6-일), 프테리딘일(pteridinyl), 푸린일(purinyl), 1-옥사-2,3-디아졸릴, 1-옥사-2,4-디아졸릴, 1-옥사-2,5-디아졸릴, 1-옥사-3,4-디아졸릴, 1-티아-2,3-디아졸릴, 1-티아-2,4-디아졸릴, 1-티아-2,5-디아졸릴, 1-티아-3,4-디아졸릴, 푸라자닐(furazanyl), 벤조푸라자닐(benzofurazanyl), 벤조티오페닐(benzothiophenyl), 벤조티아졸일(bebzothiazolyl), 벤족사졸릴, 퀴나졸린일, 퀴녹살린일, 나프티리디닐(naphthyridinyl), 푸로피리디닐(furopyridinyl), 벤조티아졸릴(benzothiazolyl)(예: 벤조[d]티아졸-6-일), 인다졸일(예: 1H-인다졸-5-일) 및 5,6,7,8-테트라히드로이소퀴놀린(tetrahydroisoquinoline)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
용어 "헤테로사이클릭(heterocyclic)" 또는 "헤테로사이클(heterocycle)" 또는 "헤테로사이클릴(heterocyclyl)"은 산소, 황 및 질소에서 선택된 1, 2, 3 또는 4개의 이종 원자 이외에 적어도 하나의 탄소 원자를 포함하는 4- 내지 12-원 단환, 이환 및 삼환, 포화 및 부분 불포화 고리로부터 선택된 고리를 지칭한다. "헤테로사이클(heterocycle)"는 또한 5-, 6- 및/또는 7-원 사이클로알킬, 탄소환 방향족 또는 헤테로방향족(heteroaromatic) 고리와 융합된 N, O 및 S로부터 선택된 하나 이상의 이종 원자를 포함하는 5- 내지 7-원 헤테로사이클릭 고리를 지칭하고, 단, 부착 지점은 헤테로사이클릭 고리가 탄소환 방향족 또는 헤테로방향족 고리와 융합될 때 헤테로사이클릭 고리에 있고, 부착 지점은 헤테로사이클릭 고리가 사이클로알킬과 융합될 때 사이클로알킬 또는 헤테로사이클릭 고리에 있을 수 있음을 전제로 한다.
"헤테로사이클"은 또한 N, O 및 S로부터 선택된 하나 이상의 이종 원자를 포함하는 지방족 스피로사이클릭(spirocyclic) 고리를 지칭하며, 단 부착 지점은 헤테로사이클릭 고리에 있다. 고리는 포화되거나 하나 이상의 이중 결합을 가질 수 있다(즉, 부분적으로 불포화됨). 헤테로사이클은 옥소로 치환될 수 있다. 부착 지점은 헤테로사이클릭 고리에서 탄소 또는 이종 원자일 수 있다. 헤테로사이클은 본원에 정의된 헤테로아릴(heteroaryl)이 아니다.
헤테로사이클의 예는(우선순위 1이 할당된 결합 위치로부터 번호가 매겨진 바와 같이) 1-피롤리딘일, 2-피롤리딘일, 2,4-이미다졸리디닐(imidazolidinyl), 2,3-피라졸리디닐(pyrazolidinyl), 1-피페리디닐(piperidiny), 2-피페리디닐, 3-피페리디닐, 4-피페리디닐, 2,5-피페라지닐(piperazinyl), 피란일, 2-모르폴린일, 3-모르폴린일, 옥시라닐(oxiranyl), 아지리디닐, 티라닐(thiiranyl), 아제티디닐(azetidinyl), 옥세타닐(oxetanyl), 티에타닐(thietanyl), 1,2-디티에타닐(dithietanyl), 1,3-디티에타닐, 디히드로피리디닐(dihydropyridinyl), 테트라히드로피리디닐(tetrahydropyridinyl), 티오모르폴리닐(thiomorpholinyl), 티옥사닐(thioxanyl), 피페라지닐(piperazinyl), 호모피페라지닐(homopiperazinyl), 호모피페리디닐(homopiperidinyl), 아제파닐(azepanyl), 옥세파닐(oxepanyl), 티에파닐(thiepanyl), 1,4-옥사티아닐(oxathianyl), 1,4-디옥세파닐(dioxepanyl), 1,4-옥사티에파닐(oxathiepanyl), 1,4-옥사아제파닐(oxaazepanyl), 1,4-디티에파닐(dithiepanyl), 1,4-티아제파닐(thiazepanyl) 및 1,4-디아제판(diazepane) 1,4-디티아닐(dithianyl), 1,4-아자티아닐(azathianyl), 옥사제피닐(oxazepinyl), 디아제피닐(diazepinyl), 티아제피닐(thiazepinyl), 디히드로티에닐(dihydrothienyl), 디히드로피라닐(dihydropyranyl), 디히드로푸라닐(dihydrofuranyl), 테트라히드로푸라닐(tetrahydrofuranyl), 테트라히드로티에닐 (tetrahydrothienyl), 테트라히드로피라닐(tetrahydropyranyl), 테트라히드로티오피라닐(tetrahydrothiopyranyl), 1-피롤린일, 2-피롤린일, 3-피롤린일, 인돌리닐, 2H-피란일, 4H-피란일, 1,4-디옥사닐(dioxanyl), 1,3-디옥솔라닐(dioxolanyl), 피라졸린일, 피라졸리디닐(pyrazolidinyl), 디티아닐(dithianyl), 디티오라닐(dithiolanyl), 이미다졸리닐(imidazolinyl), 피리미디노닐(pyrimidinonyl), 1,1-디옥소(dioxo)-티오모르폴리닐(thiomorpholinyl), 3-아자바이사이클로(azabicyclo)[3.1.0]헥사닐(hexanyl), 3-아자바이사이클로[4.1.0]헵타닐(heptanyl) 및 아자바이사이클로[2.2.2]헥사닐을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 치환된 헤테로사이클은 또한 피페리디닐(piperidinyl) N-산화물, 모르폴린일-N-산화물, 1-옥소-1-티오모르폴린일(thiomorpholinyl) 및 1,1-디옥소-1-티오모르폴린일과 같은 하나 이상의 옥소 모이어티(moieties)로 치환된 고리 시스템을 포함한다.
치환기는 할로겐, -R', -OR', =O, =NR', =N-OR', -NR'R", -SR', -SiR'R"R'", -OC(O)R', -C(O)R', -CO2R', -CONR'R", -OC(O)NR'R", -NR"C(O)R', -NR'-C(O)NR"R'", -NR'-SO2NR'", -NR"CO2R', -NH-C(NH2)=NH, -NR'C(NH2)=NH, -NH-C(NH2)=NR', -S(O)R', -SO2R', -SO2NR'R", -NR"SO2R, -CN 및 -NO2, -N3, -CH(Ph)2, 퍼플루오로(perfluoro)(C1-C4)알콕시 및 퍼플루오로(C1-C4)알킬로부터 선택되고, 0 내지 3 범위의 수에서 0, 1 또는 2개의 치환기를 갖는 기가 특히 바람직하다. R', R" 및 R'"는 각각 독립적으로 수소, 비치환된 (C1-C8)알킬 및 헤테로알킬, 비치환된 아릴, 1 내지 3개의 할로겐으로 치환된 아릴, 비치환된 알킬, 알콕시 또는 티오알콕시기, 또는 아릴-(C1-C4)알킬기를 의미한다. R' 및 R"이 동일한 질소 원자에 부착되면 질소 원자와 조합하여 5-, 6- 또는 7-원 고리를 형성할 수 있다. 따라서 -NR'R"에는 1-피롤리딘일 및 4-모르폴린일이 포함되고, "알킬"은 트리할로알킬(trihaloalkyl)(예: -CF3 및 -CH2CF3)과 같은 기를 포함하며, 아릴기는 1,2,3,4-테트라히드로나프탈렌(tetrahydronaphthalene)인 경우 치환 또는 비치환된 (C3-C7)스피로사이클로알킬기(spirocycloalkyl)로 치환될 수 있다. (C3-C7)스피로사이클로알킬기는 "사이클로알킬"에 대해 본원에 정의된 것과 동일한 방식으로 치환될 수 있다.
바람직한 치환기는 할로겐, -R', -OR', =O, -NR'R", -SR', -SiR'R"R'", -OC(O)R', -C(O)R', -CO2R', -CONR'R", -OC(O)NR'R", -NR"C(O)R', -NR"CO2R', -NR'-SO2NR"R'", -S(O)R', -SO2R', -SO2NR'R", -NR"SO2R, -CN 및 -NO2, 퍼플루오로(C1-C4)알콕시 및 퍼플루오로(C1-C4)알킬로부터 선택되고, 여기서 R' 및 R"은 상기 정의한 바와 같다.
본원에서 용어 "융합된 고리"는 2개의 고리가 단지 2개의 고리 원자 및 1개의 결합을 공통으로 공유하는 다환 시스템, 예를 들어 이환 또는 삼환 시스템을 지칭한다. 융합된 고리의 예는 상기에서 언급된 바와 같은 [4,4], [4,5], [5,5], [5,6] 및 [6,6]에서 선택되는 이환 고리로 배열된 7 내지 12개의 고리 원자를 갖는 것과 같은 융합된 이환 사이클로알킬 고리; 상기 언급된 바와 같은 7- 내지 12-원 이환 아릴 고리 시스템과 같은 융합된 이환 아릴 고리; 상기 언급된 10- 내지 15-원 삼환 아릴 고리 시스템과 같은 융합된 삼환 아릴 고리; 상기 언급된 바와 같은 8- 내지 12-원 이환 헤테로아릴 고리와 같은 융합된 이환 헤테로아릴 고리; 상기 언급된 바와 같은 11- 내지 14-원 삼환 헤테로아릴 고리와 같은 융합된 삼환 헤테로아릴 고리; 및 상기 언급된 바와 같은 융합된 이환 또는 삼환 헤테로사이클릴 고리(heterocyclyl ring)를 포함할 수 있다.
화합물은 비대칭 중심을 포함할 수 있고 따라서 거울상 이성질체로 존재할 수 있다. 화합물이 둘 이상의 비대칭 중심을 갖는 경우, 이들은 추가로 부분입체 이성질체로 존재할 수 있다. 거울상 이성질체 및 부분입체 이성질체는 더 넓은 부류의 입체 이성질체에 속한다. 실질적으로 순수한 분해된 거울상 이성질체, 이들의 라세미 혼합물 및 부분입체 이성질체의 혼합물과 같은 모든 가능한 입체 이성질체가 포함되도록 의도된다. 화합물의 모든 입체 이성질체 및/또는 이의 약학적으로 허용되는 염이 포함되도록 의도된다. 달리 구체적으로 언급하지 않는 한, 하나의 이성질체에 대한 언급은 모든 가능한 이성질체에 적용된다. 이성질체 조성이 특정되지 않을 때마다 가능한 모든 이성체질가 포함된다.
본 발명의 화합물은 또한 이러한 화합물을 구성하는 하나 이상의 원자에서 예를 들어 메틸 대신 CD3, CD2H 또는 CDH2인 중수소(deuterium)와 같은 비자연적인 비율의 원자 동위원소를 포함할 수 있다. 예를 들어, 화합물은 삼중 수소(3H), 요오드-125(125I) 또는 탄소-14(14C)와 같은 방사성 동위원소로 방사성표지(radiolabeled)될 수 있다. 방사성 여부에 관계없이 본 발명의 화합물의 모든 동위원소 변형은 본 발명의 범위 내에 포함되는 것으로 의도된다.
용어 "실질적으로 순수한"은 표적 입체 이성질체가 다른 입체 이성질체의 중량 기준으로 35% 이하, 예를 들어 30% 이하, 추가로 예를 들어 25% 이하, 심지어 추가로 예를 들어 20% 이하를 함유함을 의미한다. 일부 실시예에서, 용어 "실질적으로 순수한"은 표적 입체 이성질체가 임의의 다른 입체 이성질체(들)의 중량을 기준으로 10% 이하, 예를 들어 5% 이하, 예컨대 1% 이하를 함유함을 의미한다.
화합물이 올레핀 이중 결합을 포함하는 경우, 달리 명시되지 않는 한, 이러한 이중 결합은 E 및 Z 기하 이성질체를 모두 포함하는 것을 의미한다.
일부 화합물은 호변 이성질체(tautomer)라고 하는 수소의 상이한 부착 지점으로 존재할 수 있다. 예를 들어, 카르보닐 -CH2C(O)-기(케토 형태)를 포함하는 화합물은 호변 이성질 현상을 거쳐 히드록실 -CH=C(OH)-기(에놀 형태)를 형성할 수 있다. 케토 및 에놀 형태, 개별적으로뿐만 아니라 이들의 혼합물도 적용 가능한 경우 포함되도록 의도된다.
반응 생성물을 서로 및/또는 출발 물질로부터 분리하는 것이 유리할 수 있다. 각 단계 또는 일련의 단계의 원하는 생성물은 당 업계에서 통상적인 기술에 의해 원하는 정도의 균질성으로 분리 및/또는 정제(이하 분리)된다. 일반적으로 이러한 분리에는 다상 추출, 용매 또는 용매 혼합물로부터의 결정화, 증류, 승화 또는 크로마토그래피가 포함된다. 크로마토그래피는 예를 들어 역상 및 순상; 크기 배제; 이온 교환; 고압, 중압 및 저압 액체 크로마토그래피 방법 및 장치; 소규모 분석; 모의 이동층(simulated moving bed, "SMB") 및 분취용 박층 또는 후층 크로마토그래피(preparative thin or thick layer chromatography)뿐만 아니라 소규모 박층 및 플래시(flash) 크로마토그래피 기술을 포함하는 많은 방법을 포함한다. 당업자는 원하는 분리를 달성할 가능성이 가장 높은 기술을 적용할 것이다.
부분입체 이성질체 혼합물은 크로마토그래피 및/또는 분별 결정과 같은 당업자에게 잘 알려진 방법에 의해 이들의 물리적 화학적 차이에 기초하여 개별 부분입체 이성질체로 분리될 수 있다. 거울상 이성질체는 적절한 광학 활성 화합물(예: z키랄(chiral) 알코올 또는 모셔의 산염화물(Mosher's acid chloride)과 같은 키랄 보조제)과의 반응에 의해 거울상 이성질체 혼합물을 부분입체 이성질체 혼합물로 전환하고, 부분입체 이성질체를 분리하고, 개별 부분입체 이성질체를 상응하는 순수한 거울상 이성질체로 전환(예: 가수분해)함으로써 분리될 수 있다. 거울상 이성질체는 또한 키랄 HPLC 칼럼(chiral HPLC column)을 사용하여 분리될 수 있다.
단일 입체 이성질체, 예를 들어 실질적으로 순수한 거울상 이성질체는 광학 활성 분해제(Eliel, E. and Wilen, S. Stereochemistry of Organic Compounds. New York: John Wiley & Sons, Inc., 1994; Lochmuller, C. H., et al. "Chromatographic resolution of enantiomers: Selective review." J. Chromatogr., 113(3) (1975): pp. 283-302)를 사용하여 부분입체 이성질체를 형성하는 것과 같은 방법을 사용하여 라세미 혼합물을 분해하여 수득할 수 있다. 본 발명의 키랄 화합물의 라세미 혼합물은 (1) 키랄 화합물과의 이온성, 부분입체 이성질체 염의 형성 및 분별 결정 또는 다른 방법에 의한 분리, (2) 키랄 유도체화 시약으로 부분입체 이성질체 화합물의 형성, 부분입체 이성질체의 분리 및 순수한 입체 이성질체로의 전환, 및 (3) 키랄 조건에서 직접적으로, 실질적으로 순수하거나 풍부한 입체 이성질체의 분리(참조: Wainer, Irving W., Ed. Drug Stereochemistry: Analytical Methods and Pharmacology. New York: Marcel Dekker, Inc., 1993)를 포함하는 임의의 적합한 방법에 의해 분리(separated) 및 분리(isolated)될 수 있다.
"약학적으로 허용되는 염"은 예를 들어 염산염(hydrochlorate), 인산염, 이인산염, 브롬산염(hydrobromate), 황산염, 술폰산염(sulfinate) 및 질산염으로부터 선택된 무기산과의 염; 뿐만 아니라, 예를 들어 말산염(malates), 말레산염(maleates), 푸마르산염(fumarates), 타르타르산염(tartrates), 숙신산염(succinates), 시트르염(citrates), 젖산염(lactates), 메탄술폰산염(methanesulfonates), p-톨루엔술폰산염(toluenesulfonates), 2-히드록시에틸술폰산염(hydroxyethylsulfonates), 벤조산염(benzoates), 살리실산염(salicylates), 스테아르산염(stearatse), 아세테이트와 같은 알카노에이트(alkanoates)로부터 선택된 유기산과의 염, 및 HOOC-(CH2)n-COOH와의 염(상기 n은 0 내지 4에서 선택됨)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 유사하게, 약학적으로 허용되는 양이온의 예는 나트륨, 칼륨, 칼슘, 알루미늄, 리튬 및 암모늄을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
또한, 산 부가 염으로서 화합물을 수득하는 경우, 산염 용액을 염기성화함으로써 유리 염기를 수득할 수 있다. 반대로, 염기 화합물로부터 산 부가 염을 제조하는 통상적인 절차에 따라 생성물이 유리 염기인 경우, 약학적으로 허용되는 부가 염과 같은 부가 염은 유리 염기를 적합한 유기 용매에 용해시키고 용액을 산으로 처리함으로써 생성될 수 있다. 당업자는 비독성 약학적으로 허용되는 부가 염을 제조하기 위해 과도한 실험없이 사용될 수 있는 다양한 합성 방법론을 인식할 것이다.
"치료하는(treating)", "치료하다(treat)" 또는 "치료(treatment)"는 적어도 하나의 화합물 및/또는 이의 적어도 하나의 입체 이성질체, 및/또는 이의 적어도 하나의 약학적으로 허용되는 염을 이를 필요로 하는 것으로 인식되는 대상체에게 투여하는 것을 지칭한다.
"유효량(effective amount)"은 대상체의 질환 또는 장애를 "치료(treat)"하는데 효과적인 적어도 하나의 화합물 및/또는 이의 적어도 하나의 입체 이성질체, 및/또는 이의 적어도 하나의 약학적으로 허용되는 염의 양을 지칭하고, 투여되는 경우와 같이 추구하는 조직, 시스템, 동물 또는 인간의 생물학적 또는 의학적 반응을 어느정도 이끌어내는 것은 치료할 상태 또는 장애의 하나 이상의 증상의 발생을 예방하거나 어느 정도 완화하기에 충분하다. 치료적 유효량은 화합물, 질병 및 그 중증도 및 치료할 포유 동물의 연령, 체중 등에 따라 달라질 수 있다.
용어 "적어도 하나의 치환기(at least one substituent)"는 예를 들어 1 내지 4개, 예컨대 1 내지 3개, 추가로 1 또는 2개의 치환기를 포함한다. 예를 들어, 본원에서 "적어도 하나의 치환기 R"은 본원에 기재된 바와 같은 R의 목록으로부터 선택된 1 내지 4개, 예컨대 1 내지 3개, 추가로 1 또는 2개의 치환기를 포함한다.
대상 화합물 및 이의 입체 이성질체, 및 이의 약학적으로 허용되는 염은 치료를 위해 단독으로 또는 적어도 하나의 다른 치료제와 조합하여 사용될 수 있다. 일부 실시예에서, 화합물, 이의 입체 이성질체, 및 이의 약학적으로 허용되는 염은 하나 이상의 추가적인 치료제와 조합하여 사용될 수 있다. 본원에 개시된 화합물 및/또는 하나의 약학적으로 허용되는 염은 하나 이상의 다른 치료제와 함께 단일 투여 형태로 또는 별도의(separate) 투여 형태로 투여될 수 있다. 별도의 투여 형태로 투여될 때, 적어도 하나의 다른 치료제는 본원에 개시된 화합물 및/또는 하나의 약학적으로 허용되는 염의 투여 전, 동시에, 또는 후에 투여될 수 있다.
또한, 대상 화합물 및 이의 입체 이성질체, 및 이의 약학적으로 허용되는 염, 및 적어도 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물이 제공된다.
대상 화합물 및 이의 입체 이성질체, 및 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 조성물은 경구, 국소, 직장, 비경구, 흡입 스프레이 또는 이식된 저장소와 같은 다양한 공지된 방식으로 투여될 수 있지만, 어떤 경우에도 가장 적합한 경로는 특정 숙주(host), 활성 성분이 투여되는 조건의 성격(nature) 및 중증도에 따라 달라진다. 본원에서 사용되는 용어 "비경구"는 피하, 피내, 정맥 내, 근육 내, 관절 내, 동맥 내, 활액 내(intrasynovial), 흉골 내(intrasternal), 척수강 내(intrathecal), 병변 내 및 두개 내(intracranial) 주사 또는 주입 기술을 포함한다. 본원에 개시된 조성물은 단위 투여 형태로 편리하게 제공될 수 있고 당 업계에 잘 알려진 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다.
대상 화합물 및 이의 입체 이성질체, 및 이의 약학적으로 허용되는 염은 캡슐, 정제, 트로키(troche), 드라제(Drag
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e), 과립 및 분말과 같은 고체 투여 형태로 또는 예컨대 엘릭시르, 시럽, 에멀션, 분산액 및 현탁액과 같은 액체 투여 형태로 경구 투여될 수 있다. 본원에 개시된 대상 화합물 및 이의 입체 이성질체, 및 이의 약학적으로 허용되는 염은 또한 분산액, 현탁액 또는 용액과 같은 멸균 액체 투여 형태로 비경구적으로 투여될 수 있다. 본 명세서에 개시된 대상 화합물 및 이의 입체 이성질체, 및 이의 약학적으로 허용되는 염을 국소 투여용 연고, 크림, 점적제(drops), 경피 패치 또는 분말로써, 안구 투여용, 즉 점안제와 같은 안과 용액 또는 현탁액 형태로써, 흡입 또는 비강내 투여용 에어로졸 스프레이 또는 분말 조성물로써, 또는 직장 또는 질 투여용 크림, 연고, 스프레이 또는 좌약으로써의 다른 형태로 대상체에 투여되는 데 사용될 수 있다.
본 명세서에 개시된 화합물 및/또는 이의 적어도 하나의 약학적으로 허용되는 염 및 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 스테아르산마그네슘, 스테아르산 등과 같은 분말 담체를 포함하는 젤라틴 캡슐이 또한 사용될 수 있다. 유사한 희석제를 사용하여 압축 정제를 만들 수 있다. 일정 기간 동안 약물의 지속적인 방출을 제공하기 위해 정제와 캡슐 모두 서방형 제품으로 제조될 수 있다. 압축 정제는 불쾌한 맛을 가리고 정제를 대기로부터 보호하기 위해 설탕 코팅되거나 필름 코팅되거나, 위장관에서 선택적 붕해를 위해 장용 코팅될 수 있다.
경구 투여용 액체 투여 형태는 환자 수용도를 높이기 위해 착색제 및 향미제로부터 선택된 하나 이상의 제제를 추가로 포함할 수 있다.
일반적으로, 물, 적합한 오일, 염수, 수성 덱스트로스(포도당), 및 관련 당 용액 및 프로필렌글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 글리콜이 비경구 용액에 적합한 담체의 예일 수 있다. 비경구 투여용 용액은 본원에 기재된 하나 이상의 화합물의 수용성 염, 하나 이상의 적합한 안정화제, 및 필요한 경우 하나 이상의 완충 물질을 포함할 수 있다. 중아황산 나트륨(sodium bisulfite), 아황산나트륨(sodium sulfite) 또는 아스코르브산과 같은 항산화제는 단독으로 또는 조합하여 적합한 안정화제의 예일 수 있다. 시트르산 및 그 염 및 나트륨 EDTA도 적합한 안정화제의 예로서 사용될 수 있다. 또한, 비경구 용액은 예를 들어 염화 벤잘코늄, 메틸- 및 프로필파라벤, 및 클로로부탄올로부터 선택된 적어도 하나의 방부제를 추가로 포함할 수 있다.
약학적으로 허용되는 담체는 예를 들어, 조성물의 활성 성분과 상용성이고(일부 실시예에서 활성 성분을 안정화할 수 있으며) 치료될 대상체에게 해롭지 않은 담체로부터 선택된다. 예를 들어, 가용화제, 예컨대 사이클로덱스트린(본 명세서에 개시된 하나 이상의 화합물 및/또는 하나 이상의 약학적으로 허용되는 염과 특이적이고 보다 가용성인 복합체를 형성할 수 있음)은 활성 성분의 전달을 위한 약학적 부형제로서 이용될 수 있다. 다른 담체의 예는 콜로이드성 이산화규소, 스테아르산 마그네슘, 셀룰로스, 라우릴황산나트륨 및 D&C Yellow #10과 같은 안료를 포함한다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체는 Remington's Pharmaceutical Sciences, A. Osol 및 당해 분야의 다른 참고 문헌에 기재되어 있다.
흡입 투여를 위해, 대상 화합물 및 이의 입체 이성질체, 및 이의 약학적으로 허용되는 염은 가압된 팩 또는 분무기로부터 에어로졸 스프레이 형태로 편리하게 전달될 수 있다. 대상 화합물 및 이의 입체 이성질체, 및 이의 약학적으로 허용되는 염은 또한 제형화될 수 있는 분말로서 전달될 수 있고, 분말 조성물은 흡입 분말 흡입기 장치의 도움으로 흡입될 수 있다. 흡입을 위한 하나의 예시적인 전달 시스템은 정량 흡입 (MDI) 에어로졸일 수 있으며, 이는 예를 들어, 플루오로카본 및 탄화수소에서 선택된 하나 이상의 적합한 분사제(propellant)에 본원에 개시된 대상 화합물 및 이의 입체 이성질체 및 이의 약학적으로 허용되는 염의 현탁액 또는 용액으로 제형화될 수 있다.
안구 투여를 위해, 안과용 제제는 적절한 안과용 운반체(vehicle)에서 대상 화합물 및 이의 입체 이성질체 및 이의 약학적으로 허용되는 염의 적절한 중량%의 용액 또는 현탁액으로 제제화될 수 있어서, 대상 화합물 및 이의 입체 이성질체, 및 이의 적어도 하나의 약학적으로 허용되는 염은 충분한 시간 동안 안구 표면과 접촉 상태를 유지하여 화합물이 눈의 각막 및 내부 영역을 침투할 수 있도록 한다.
본 명세서에 개시된 대상 화합물 및 이의 입체 이성질체, 및 이의 약학적으로 허용되는 염의 투여에 유용한 약학적 투여 형태는 경질 및 연질 젤라틴 캡슐, 정제, 비경구 주사제 및 경구 현탁액을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
투여되는 투여량은 수용자의 연령, 건강 및 체중, 질병의 정도, 동시 치료 유형(있는 경우), 치료 빈도 및 원하는 효과의 특성과 같은 요인에 따라 달라진다. 일반적으로, 활성 성분의 일일 복용량은 예를 들어 하루 0.1 내지 2000mg까지 다양할 수 있다. 예를 들어, 하루에 한 번 또는 여러 번 10 내지 500mg이 원하는 결과를 얻는 데 효과적일 수 있다.
일부 실시예에서, 표준 투피스(two-piece) 경질 젤라틴 캡슐 각각을 예를 들어 100mg의 분말 형태의 본원에 개시된 대상 화합물 및 이의 입체 이성질체, 및 이의 약학적으로 허용되는 염, 150mg의 락토스, 50mg의 셀룰로스 및 6mg의 스테아르산 마그네슘으로 충전함으로써 다수의 단위 캡슐이 제조될 수 있다.
일부 실시예에서, 화합물, 이의 입체 이성질체 및 이의 약학적으로 허용되는 염 및 대두유, 면실유 또는 올리브유와 같은 소화성 오일의 혼합물은 제조되고 양변위 펌프를 통해 젤라틴에 주입될 수 있으며 100mg의 활성 성분을 함유한 연질 젤라틴 캡슐을 형성한다. 상기 캡슐은 세척되고 건조된다.
일부 실시예에서, 투여 단위가 예를 들어 100mg의 화합물, 이의 입체 이성질체, 및 이의 약학적으로 허용되는 염, 0.2mg의 콜로이드성 이산화규소, 5mg의 스테아르산마그네슘, 275mg의 미정질 셀룰로스, 11mg의 전분 및 98.8mg의 락토스를 포함하도록 통상적인 절차에 의해 다수의 정제를 제조할 수 있다. 기호성을 높이거나 흡수를 지연시키기 위해 적절한 코팅이 적용될 수 있다.
일부 실시예에서, 주사 투여에 적합한 비경구 조성물은 본원에 개시된 화합물 및/또는 이의 적어도 하나의 거울상 이성질체, 부분입체 이성질체 또는 약학적으로 허용되는 염의 1.5 중량%를 10 부피%의 프로필렌 글리콜에 교반함으로써 제조될 수 있다. 용액은 주사용수로 예상되는 양으로 만들어지고 멸균된다.
일부 실시예에서, 수성 현탁액은 경구 투여를 위해 제조될 수 있다. 예를 들어, 100mg의 미분 화합물, 이의 입체 이성질체 및 이의 약학적으로 허용되는 염, 100mg의 카르복시메틸셀룰로스나트륨(sodium carboxymethyl cellulose), 5mg의 벤조산나트륨, 1.0g의 소르비톨 용액, U.S.P., 및 0.025ml의 바닐린을 포함하는 각 5ml의 수성 현탁액을 사용할 수 있다.
화합물, 이의 입체 이성질체 및 이의 약학적으로 허용되는 염이 단계적으로 또는 적어도 하나의 다른 치료제와 함께 투여될 때 동일한 투여 형태가 일반적으로 사용될 수 있다. 약물을 물리적 조합으로 투여하는 경우 조합된 약물의 적합성에 따라 제형과 투여 경로를 선택해야 한다. 따라서 용어 공동투여는 2개 이상의 제제를 부수적으로 또는 순차적으로, 또는 대안적으로 2개 이상의 활성 성분의 고정 용량 조합으로서 투여하는 것을 포함하는 것으로 이해된다.
본원에 개시된 화합물, 이의 입체 이성질체 및 이의 약학적으로 허용되는 염은 단독 활성 성분으로서 또는 적어도 하나의 제2 활성 성분과 조합하여 투여될 수 있다.
대상 화합물은 약학적 조성물 또는 제형에 포함된다. 조성물은 약학적으로 허용되는 희석제 및/또는 담체, 즉 생리학적으로 적합하고 병원성 불순물이 실질적으로 없는 희석제 또는 담체를 포함한다. 투여 가능한 조성물을 제조하기 위한 적합한 부형제 또는 담체 및 방법은 당업자에게 공지되어 있거나 명백하며 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Co, NJ(1991)와 같은 간행물에 보다 상세하게 설명되어 있다. 조성물은 또한 당 업계에 공지된 방출조절(controlled release) 또는 서방형 조성물의 형태일 수 있다. 수많은 적용에 대해서, 대상 화합물은 아침/낮 투여를 위해 투여되고, 밤에는 투여되지 않는다.
대상 화합물은 그 자체로, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염의 형태, 예를 들어 염산염, 히드로브로마이드(hydrobromide), 아세테이트, 황산염, 시트르산염, 탄산염, 트리플루오로아세테이트(trifluoroacetate) 등으로 사용될 수 있다. 화합물이 상대적으로 산성 작용기를 함유하는 경우 염은 순수한 또는 적절한 불활성 용매에서 원하는 염기를 첨가하여 수득할 수 있다. 약학적으로 허용되는 염기 부가 염의 예는 나트륨, 칼륨, 칼슘, 암모늄, 유기 아미노, 또는 마그네슘 염 등을 포함한다. 화합물이 상대적으로 염기성 작용기를 포함할 때 염은 순수한 또는 적절한 불활성 용매에서 원하는 산을 첨가하여 수득할 수 있다. 약학적으로 허용되는 산 부가 염의 예는 염산(hydrochloric), 브롬화수소산, 질산, 탄산, 일수소탄산(monohydrogencarbonic acid), 인산, 일수소인산(monohydrogenphosphoric acid), 이수소인산(dihydrogenphosphoric acid), 황산, 일수소황산(monohydrogensulfuric acid), 요오드화수소산(hydriodic) 또는 아인산 등과 같은 무기산으로부터 유도된 것들뿐만 아니라, 아세트산, 프로피온산, 이소부티르산, 말레산, 말론산, 벤조산, 숙신산, 수베르산, 푸마르산, 젖산, 만델산, 프탈산, 벤젠술폰산, p-톨릴술폰산(p-tolylsulfonic acid), 시트르산, 타르타르산, 메탄술폰산 등과 같은 상대적으로 독성이 없는 유기산으로부터 유도된 것들을 포함한다. 또한 알긴산 등과 같은 아미노산의 염과 글루쿠론산 또는 갈락투론산 등과 같은 유기산의 염도 포함된다(예를 들어, Berge et al, "Pharmaceutical Salts", Journal of Pharmaceutical Science, 1977, 66, 1-19 참조).
중성 형태의 화합물은 염을 염기 또는 산과 접촉시키고 통상적인 방식으로 모 화합물(parent compound)을 분리함으로써 재생될 수 있다. 화합물의 모 형태(parent form)는 극성 용매에서의 용해도와 같은 특정 물리적 특성에서 다양한 염 형태와 다르지만, 그렇지 않으면 염은 본 발명의 목적상 화합물의 모 형태와 동등하다.
염 형태 이외에, 본 발명은 프로드러그(prodrug) 형태인 화합물을 제공한다. 본원에 기재된 화합물의 프로드러그는 본 발명의 화합물을 제공하기 위해 생리학적 조건하에서 화학적 변화를 쉽게 겪는 화합물이다. 추가로, 프로드러그는 생체외 환경에서 화학적 또는 생화학적 방법에 의해 본 발명의 화합물로 전환될 수 있다. 예를 들어, 프로드러그는 적절한 효소 또는 화학 시약과 함께 경피 패치 저장소에 배치될 때 본 발명의 화합물로 천천히 전환될 수 있다. 프로드러그는 경우에 따라 모약물보다 투여하기가 더 쉬울 수 있기 때문에 종종 유용하다. 예를 들어, 그들은 모약물보다 경구 투여에 의해 더 생체 이용가능할 수 있다. 프로드러그는 또한 모약물에 비해 약리학적 조성물에서 개선된 용해도를 가질 수 있다. 프로드러그의 가수분해 절단 또는 산화적 활성화에 의존하는 것과 같은 다양한 프로드러그 유도체가 당 업계에 공지되어있다. 제한없이, 프로드러그의 예는 에스테르("프로드러그")로 투여된 본 발명의 화합물일 수 있지만, 활성 물질인 카르복실산으로 대사적으로 가수분해된다.
본 발명의 특정 화합물은 수화된 형태를 포함하는 용매화된 형태뿐만 아니라 용매화되지 않은 형태로 존재할 수 있다. 일반적으로 용매화된 형태는 용매화되지 않은 형태와 동등하며 본 발명의 범위 내에 포함되는 것으로 의도된다. 본 발명의 특정 화합물은 다중 결정질 또는 무정형 형태로 존재할 수 있다. 일반적으로, 모든 물리적 형태는 본 발명에 의해 고려되는 용도에 대해 동등하며 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 의도된다.
일부 대상 화합물은 비대칭 탄소 원자(광학 중심) 또는 이중 결합을 보유하고; 라세미체(racemate), 부분입체 이성질체, 기하학적 이성질체 및 개별 이성질체는 모두 본 발명의 범위 내에 포함되는 것으로 의도된다.
화합물은 일반적으로 "치료적 유효량", 즉 연구자, 수의사, 의사 또는 다른 임상의가 추구하는 조직(tissue), 시스템, 동물 또는 인간의 생물학적 또는 의학적 반응을 유도할 대상 화합물의 양으로 투여된다. 용어 "치료적 유효량"은 투여될 때 치료되는 상태 또는 장애의 하나 이상의 증상의 발병을 예방하거나 어느 정도 완화하기에 충분한 화합물의 양을 포함한다. 치료적 유효량은 화합물, 질병 및 그 중증도 및 치료할 포유 동물의 연령, 체중 등에 따라 달라질 수 있다.
접촉은 일반적으로 상기 기재된 다양한 실시예를 포함하여 일반식 I(상기)을 갖는 하나 이상의 화합물의 유효량을 대상체에 투여함으로써 수행된다. 일반적으로 투여는 약 0.1 내지 50, 바람직하게는 0.5 내지 10, 더욱 바람직하게는 1 내지 10mg/kg의 치료적 투여량을 달성하도록 조정되지만, 최적 투여량은 화합물 특이적이고 일반적으로 각 화합물에 대해 경험적으로 결정된다.
용어 "단위 투여 형태"는 인간 대상체 및 다른 포유 동물에 대한 단위 투여량으로 적합한 물리적으로 분리된 단위를 지칭하며, 각 단위는 적합한 약학적 부형제와 함께 원하는 치료 효과를 생성하도록 계산된 미리 결정된 양의 활성 물질을 포함한다. 전형적인 단위 투여 형태는 액체 조성물의 미리 충전된, 미리 측정된 앰플 또는 주사기, 또는 고체 조성물의 경우 알약, 정제, 캡슐, 로젠지(lozenges) 등을 포함한다. 이러한 조성물에서, 모방체(mimetic)는 일반적으로 미량 성분(약 0.1 내지 약 50중량% 또는 바람직하게는 약 1 내지 약 40중량%)이고 나머지는 원하는 투여 형태를 형성하는 데 유용한 다양한 운반체 또는 담체 및 가공 보조제이다. 단위 투여 제형은 바람직하게는 단위 당 약 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500 또는 1,000mg이다. 특정 실시예에서, 단위 투여 형태는 적어도 6, 9 또는 12개의 단위 투여 형태의 시트를 포함하는 블리스터 팩과 같이 순차적 사용에 적합한 멀티팩으로 포장된다.
본 명세서에 설명된 예시 및 실시예는 제한이 아닌 단지 예시를 위한 것임을 이해해야 한다. 당업자는 본질적으로 유사한 결과를 산출하기 위해 변경되거나 수정될 수 있는 다양한 중요하지 않은 파라미터를 쉽게 인식할 것이며, 이러한 수정은 본 출원의 정신 및 범위 및 첨부된 청구항의 범위 내에 포함된다. 본 명세서에 인용된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 모든 목적을 위해 그 전체가 본 명세서에 참고로 포함된다.
실시예: 일반 실험
Figure pct00003
시약 및 조건: a) KOH, MeOH, H2O, 실온; b) H2NNH2, MeOH, 실온; c) 피리딘, CH2Cl2, 실온.
Figure pct00004
물 및 MeOH(물:MeOH=1:3)에 용해시킨 메틸 아릴 케톤(methyl aryl ketone) 화합물(1 eq) 및 KOH(3 eq)의 용액에 아릴 카르복스알데히드(aryl carboxaldehyde) 화합물(1.05 eq)을 실온에서 첨가하였다. 용액을 실온에서 10시간 동안 교반하고 물로 희석하고 아세트산에틸로 추출하였다. 조합된 유기 추출물을 염수로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조하고, 여과하고, 진공에서 농축시켰다. 잔류물을 칼럼크로마토그래피(실리카 겔, 구배 용리법, EtOAc:헥산=1:5)로 정제하여 원하는 생성물 알파 베타 불포화 케톤(alpha beta unsaturated ketone)을 수득하였다.
Figure pct00005
MeOH에 용해시킨 알파 베타 불포화 케톤 화합물(1 eq) 용액에 실온에서 히드라진(3 eq)을 첨가하였다. 용액을 실온에서 10시간 동안 교반하고 진공에서 농축시켰다. 잔류물을 물로 세척하고 건조하여 추가 정제없이 다음 단계에 사용되는 원하는 피라졸 생성물을 수득하였다.
Figure pct00006
디클로로메탄에 용해시킨 피라졸 화합물(1 eq) 용액에 상응하는 산염화물(1.1 eq) 및 피리딘(1.2 eq)을 실온에서 첨가하였다. 용액을 실온에서 6시간 동안 교반하고, 아세트산에틸로 희석하고, 염수로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조하고, 여과하고, 진공에서 농축시켰다. 잔류물을 칼럼크로마토그래피(실리카 겔, 경사 용리법, EtOAc:CH2Cl2=1:15)로 정제하여 생성물을 수득하였다.
활성은 하기 표에 제시된 대표적인 화합물에 예시된 바와 같이 R1, R2, R3, R4 및 R5의 범위를 포함하는 화학식의 실시예의 개시된 범위에 걸쳐 유지된다.
Beclin 1/Bcl-2 결합을 방해함으로써 기능하는 자가포식 유도제를 식별하기 위한 고속대량스크린
리소좀 분해 경로인 자가포식은 세포 항상성, 발달, 면역, 종양 억제, 대사, 신경퇴화 방지 및 수명 연장에 중요한 역할을 한다. 따라서, 자가포식의 약리학적 자극은 특정 인간 질병 및/또는 노화를 예방하거나 치료하기 위한 효과적인 접근법이 될 수 있다. 본 발명자들은 특별히 자가포식을 유도하는 새로운 화합물을 개발하는 방법을 모색하였다. 이를 위해 본 발명자들은 자가포식 유도의 주요 조절 노드를 표적으로 하는 화합물을 식별하는 두 가지 분석법을 개발하였다. 특히 Bcl-2(자가포식의 음성 조절자)와 Beclin 1(자가포식 개시에서 기능하는 Beclin 1/VPS34 지질 키나아제 복합체의 알로스테릭 조절제)의 결합이다. 이러한 분석은 분할-루시페라아제 분석을 사용하여 세포에서 Beclin 1/Bcl-2 결합을 측정하거나 AlphaLISA 분석을 사용하여 생체외에서 직접적인 Beclin 1/Bcl-2 결합을 직접 측정한다. 본 발명자들은 Beclin 1/Bcl-2 결합을 방해하고 자가포식을 유도하는 작은 분자를 식별하기 위해 ~300K 화합물을 포함하는 두 가지 다른 화합물 라이브러리를 스크린하였다. 마이크로몰(micromolar) 범위에서 IC50인 Beclin 1/Bcl-2 상호작용을 직접 억제하고 자가포식 플럭스를 증가시키는 세 가지 새로운 화합물이 식별되었다. 이들 화합물은 유의한 세포독성을 나타내지 않으며, 프로-아포토시스(pro-apoptotic) Bcl-2 계열 구성요소인 Bax 및 Bim의 BH3 영역과 비교하여 Beclin 1의 BH3 영역에 대한 Bcl-2 결합의 방해에 대한 선택성을 발휘한다.
Beclin 1/Bcl-2 분할-루시페라아제 분석의 개발
Beclin 1/Bcl-2 상호작용을 방해하는 새로운 화합물을 식별하기 위해, 본 발명자들은 (1) Beclin 1/Bcl-2 상호작용을 방해하는 세포 기반 분석에서 세포 침투 활성 및 기능을 갖는 화합물을 식별하는 것과; (2) 생체외에서 Beclin 1/Bcl-2 결합을 방해하는 화합물을 식별하고 따라서 세포 기반 분석에서 표적상 기능을 하는 것으로 검증할 수 있는 것이 동시에 설계된 두 가지 새로운 HTS 분석을 개발하였다.
첫 번째 HTS는 근접 기반 효소 상보성 리포터 시스템(proximity-based enzyme complementation reporter system)인 세포 기반 분할-루시페라아제 분석을 사용하였다. 분할-루시페라아제 접근법은 융합 파트너로서 관심있는 단백질로 발현된 NLuc(아미노산 2 내지 416) 및 CLuc(아미노산 398 내지 550)의 두 단편의 반딧불이 루시페라아제의 재구성에 의존한다. 상호작용하는 파트너의 결합에 따라 루시페라아제의 두 가지 비기능적 단편이 근접해져 활성 루시페라아제 단백질을 형성한다. 분할-루시페라아제 분석으로 Beclin 1/Bcl-2 상호작용을 측정하기 위해 분할-루시페라아제 리포터로써 N-말단 NLuc-태그(tagged) Beclin 1(NLuc-Beclin 1) 및 CLuc-태그(tagged) Bcl-2(CLuc-Bcl-2)를 발현하는 HeLa(HeLa) 세포주를 만들었다. 두 리포터 모두 Beclin 1 또는 Bcl-2의 구성적 과발현의 결과로 잠재적으로 발생할 수 있는 독성 또는 클론 적응(clonal adaptation)을 피하기 위해 테트라사이클린-유도성 프로모터의 통제하에 발현되었다. 레닐라 루시퍼레이즈는 내부 대조군으로 구성적으로 발현되었다. Beclin 1/Bcl-2의 상호작용은 상대 발광 단위(relative luminescence unit, RLU)로 측정되었고, 이는 분할-루시페라아제와 레닐라 루시페라아제 신호의 계산된 비율이다.
Figure pct00007
HeLa 세포에서 Beclin 1 및 Bcl-2 분할-루시페라아제 리포터의 발현은 강력한 BH3 모방체(참고문헌 40)인 양성 대조군 화합물 ABT-737에 의해 용량 의존적으로 억제된 측정 가능한 발광 활성을 산출하였다. 측정된 분할-루시페라아제 활성에 Beclin 1/Bcl-2 결합이 필요한지 확인하기 위해, 본 발명자들은 또한 Beclin 1의 Bcl-2-결합 영역 및 CLuc-Bcl-2의 결실을 운반하는 NLuc-Beclin 1 리포터를 발현하는 세포주를 만들었다(아미노산 81 내지 151 결핍; "Beclin 1ΔBcl-2BD"라고 함). Beclin 1ΔBcl-2BD/Bcl-2 분할-루시페라아제 리포터의 발현은 발광 활성을 10 내지 20배 감소시켰으며 Beclin 1ΔBcl-2BD/Bcl-2 분할-루시페라아제 리포터의 기준선 활성은 ABT-737에 영향을 받지 않았다. 따라서, 전장(full-length) Beclin 1/Bcl-2 분할-루시페라아제 활성은 루시페라아제 단편의 자발적인 재결합보다는 Beclin 1의 BH3 영역과 Bcl-2 사이의 특정 상호작용을 나타낼 가능성이 높다. 전반적으로 이러한 데이터는 HeLa 세포 Beclin 1/Bcl-2 분할-루시페라아제 분석이 강력하고 민감하여 Beclin 1/Bcl-2 상호작용을 측정하기 위한 넓은 동적 범위를 제공함을 보여준다.
본 발명자들은 Z'인자 테스트로 HTS에 대한 Beclin 1/Bcl-2 분할-루시페라아제 분석을 검증하였다. 384-웰 HTS 형식에서 Beclin 1/Bcl-2 분할-루시페라아제 분석의 균일성을 조사하였다. DMSO(240 웰) 및 ABT-737(16 웰)을 각각 중성 또는 양성 대조군으로 사용하였다. 계산된 Z'값은 0.7444로, 이는 Beclin 1/Bcl-2 분할-루시페라아제 분석이 HTS에 적합함을 나타낸다.
Beclin 1/Bcl-2 AlphaLISA 분석의 개발
본 발명자들은 또한 Beclin 1과 Bcl-2 사이의 생체외 상호작용을 직접 측정하기 위해 고속대량 Beclin 1/Bcl-2 AlphaLISA 분석을 개발하였다. AlphaLISA는 균질 용액에서 단백질-단백질 상호작용을 측정할 수 있는 비드 기반 근접 분석이다(참고문헌 41). 일중항 산소 분자(Oxygen singlet molecule)는 680nm에서 조사시 알파 공여체 비드에 의해 생성되고 근접한 수용체 비드로 이동한다. 일중항 산소(Oxygen singlet)는 공여체 비드를 들뜨게 하고 615nm에서 발광 방출을 발생시킨다. 산소 단일 분자의 반감기는 매우 짧아서 효율적인 에너지 전달이 반경 200nm 내에서만 발생한다. 따라서 측정 가능한 알파 발광 신호는 공여체와 수용체 비드 사이의 화학적 에너지 전달을 필요로 하며 비드에 고정된 한 쌍의 상호작용 분자는 측정 가능한 알파 신호를 생성하기 위해 비드 결합을 안정화시킨다.
AlphaLISA를 위해 정제된 재조합 Beclin 1 및 Bcl-2 단백질을 사용하였으며, 이는 향상된 용해도와 발현을 위해 최적화되었다. 인간 Beclin 1은 N-말단에서 StrepII-SUMO와의 융합 단백질로 발현되었으며, Beclin 1의 방향성 집게(aromatic finger)에 있는 3개의 잔기를 돌연변이(F359D/F360D/W361D)를 만들어 용해도와 단백질 안정성을 향상시켰다(참고문헌 42). 이러한 돌연변이는 BARA 영역에 존재하며, 이는 Bcl-2에 의해 인식되는 BH3 모티프와는 거리가 멀다. Beclin 1의 재조합 Bcl-2-결합 결핍 돌연변이(StrepII-SUMO-Beclin 1ΔBcl-2BD)를 음성 대조군으로 사용하였다. Bcl-2 구축물은 아미노산 1 내지 218로 구성되었고, C-말단 6xHis 태그의 추가를 위해 막횡단영역에서 잘렸다(Bcl-2-6xHis). 정규화 제어(normalization control)를 위해 정제된 SUMO 단백질(N-말단 StrepII 태그 및 C-말단 6xHis 태그 포함)과 함께 병렬 AlphaLISA 분석을 포함하였다. 정규화 제어의 목적은 Beclin 1/Bcl-2 상호작용과 관련이 없는 방식으로 AlphaLISA 분석을 방해하여 발광 신호를 감소시키는 내부 필터(위양성) 히트(hit)를 제거하는 것이다. 정규화 제어를 사용하여 Beclin 1과 Bcl-2의 상호작용을 하기와 같이 측정하였다.
Figure pct00008
StrepII-SUMO-Beclin 1 및 Bcl-2-6xHis와 AlphaLISA 비드의 배양은 강한 알파 신호를 생성하였다. Beclin 1의 Bcl-2- 결합 영역의 삭제는 알파 신호를 거의 완전히 폐지하여 알파 신호가 Beclin 1/Bcl-2 상호작용에 특이적임을 나타낸다. 또한 약한 Beclin 1ΔBcl-2BD/Bcl-2 신호가 아닌 Beclin 1/Bcl-2의 강한 알파 신호는 BH3 모방체 ABT-737에 의해 용량 의존적으로 억제되었고, 이는 스크린에 대한 양성조절로 사용되었다.
이들 데이터는 이 분석이 생체외 Beclin 1/Bcl-2 결합의 약리학적 억제를 측정하는 데 적합하다는 것을 입증한다. Beclin 1/Bcl-2 AlphaLISA 분석을 HTS 플랫폼으로 추가 평가하기 위해 384-웰 플레이트 형식을 사용하여 Z'인자 테스트를 수행하였다. DMSO(240 웰) 및 ABT-737(16 웰)은 각각 중성 또는 양성 대조군으로 사용되었다. 결과 Z'값은 0.7237이었으며, 이는 Beclin 1/Bcl-2 AlphaLISA 분석이 강력한 HTS 분석임을 나타낸다.
Beclin 1/Bcl-2 결합 방해자에 대한 1차 및 2차 스크린
Beclin 1/Bcl-2 분할-루시페라아제 분석을 사용하여, 본 발명자들은 UT Southwestern Medical Center(UTSW)의 200,000개의 화합물과 Broad Institute of MIT and Harvard에서 다양성 지향 합성(diversity-oriented synthesis, DOS)으로부터 파생된 100,000개의 화합물을 포함하는 화학적 라이브러리로 1차 HTS를 수행하였다(참고문헌 43). UTSW 화학 라이브러리는 ChemBridge Corporation에서 구매한 75,000개의 화합물, Chemical Diversity Labs에서 구매한 100,000개의 화합물, ComGenex에서 22,000개의 화합물, TimTek에서 구매한 1,200개, Prestwick에서 구매한 1,100개, NIH 임상 컬렉션으로부터 450개의 의약품으로 구성되어 있다. TimTek에서 구입한 화합물은 "천연 제품과 유사한" 합성 화합물이며 Prestwick 화합물은 특허 기간이 끝난 의약품이다. NIH 임상 컬렉션은 I상(phase I) 임상 시험에서 테스트된 화합물로 구성된다. UTSW 화학 라이브러리에는 또한 Dr. John MacMillan(UC Santa Cruz)에 의해 고유한 해양 세균에서 분리된 약 30,000개의 천연 생성물이 포함되어 있다. 라이브러리의 화합물은 99%의 분자량이 550g/mol(평균 250 내지 300g/mol) 미만인 완화된 Lipinsky 규칙 집합을 충족한다. 모든 라이브러리 화합물은 384-웰 플레이트 HTS 형식에서 5μM 농도로 스크리닝되었다. 스크리닝 중에 본 발명자들은 다수의 라이브러리 화합물이 레닐라 루시페라아제 활성을 강력하게 증가시켰지만 분할-루시페라아제 활성에는 영향을 미치지 않음을 발견하였다. 따라서 이러한 위양성 히트를 제거하기 위해 분할-루시페라아제 활성과 정규화 활동(RLU) 모두에 대해 -3.0의 Z-점수 컷오프(Z-score cut-off)를 적용하였다. UTSW 라이브러리에서 식별된 1,027개 히트와 Broad 라이브러리의 193개 히트 중 233개와 55개 히트가 각각 반복 HTS 분석에서 확인되었다.
Beclin 1/Bcl-2 상호작용을 직접 억제하는 화합물을 식별하기 위해, 선별된 화합물(UTSW 라이브러리에서 1,027개 및 Broad 라이브러리에서 55개)을 Beclin 1/Bcl-2 AlphLISA 분석으로 2차 스크리닝하였다. 2차 HTS 스크린에서 본 발명자들은 -3.0이하의 Z 점수로 20% 초과(UTSW 라이브러리) 또는 40% 초과(Broad 라이브러리) 억제를 나타내는 35개(UTSW 라이브러리) 및 1개(Broad 라이브러리) 화합물을 식별하였다. 추가 용량-반응 AlphaLISA를 위해 19개의 화합물을 재공급하였다(사용할 수 없는 천연물 분획 및 화합물은 제외함). 재공급된 화합물 중 6개는 용량-의존 방식으로 생체외에서 Beclin 1/Bcl-2 상호작용을 억제하는 것으로 밝혀졌다. 팬-분석 간섭 화합물(pan-assay interference compounds, PAINS)(참고문헌 44)을 제거한 후 UTSW 라이브러리에서 2개의 화합물(SW063058 및 SW076956)과 추가 히트 검증 및 생물학적 조사를 위해 선택된 Broad 라이브러리에서 1개의 화합물(BRD1991)이 있었다.
히트(Hit) 검증 및 선택성 평가
이들 3가지 후보 화합물은 AlphaLISA를 이용하여 마이크로몰 범위의 IC50에서 Beclin 1/Bcl-2 결합을 용량-의존적으로 억제함을 확인하였다. 프로아포토시스(pro-apoptotic) Bcl-2 계열 구성요소의 것과 비교하여 Beclin 1의 BH3 영역과 Bcl-2의 결합 방해에 대한 선택성을 평가하기 위해, 본 발명자들은 Beclin 1의 BH3 영역(아미노산 105 내지 130) 또는 Bax의 BH3 영역(아미노산 49 내지 84)에 걸쳐 있는 정제된 재조합 Bcl-2 및 펩티드와 함께 AlphaLISA를 사용하였다. 본 발명의 결과는 3가지 후보 분자가 모두 Bax의 BH3 영역과 Bcl-2이 아닌 Beclin 1의 BH3 영역의 결합을 감소시켰음을 나타낸다. 대조적으로, ABT-737은 나노몰라 효율로 Bcl-2에 대한 Beclin 1 및 Bax의 BH3 영역의 결합을 억제하였다. SW063058, SW076956 및 BRD1991이 Bcl-2의 Bax 또는 기타 프로아포토시스 BH3 영역 함유 분자의 더 높은 농도(>20μM)에 대한 결합을 방해할 수 있지만 이러한 데이터는 Beclin 1/Bcl-2 상호작용의 선택적인 억제를 위한 창을 명확하게 보여준다.
대규모 조직 배양 실험(SW063058 및 SW076956)에 충분한 공급이 가능한 두 화합물에 대해 Bcl-2와의 Beclin 1, Bax 및 Bim 공동 면역침강반응에 미치는 영향을 조사하였다. Myc-태그 Bcl-2을 안정적으로 발현하는 이전에 기술된 HeLa 세포를 사용하여(참고문헌 26), 본 발명자들은 SW063058 또는 SW076956을 사용한 12시간 처리가 Beclin 1/Myc-Bcl-2 상호작용을 감소시켰지만 Bax/Myc-Bcl-2 또는 Bim/Myc-Bcl-2 상호작용은 감소시키지 않았다. 세포에서의 공동 면역침강반응 실험은 생체외 AlphaLISA 결합 실험과 동일한 경향을 보여주었다. SW076956은 Beclin 1/Bcl-2 상호작용(BH3 모방 ABT-737만큼 활성이 아님)과 SW063058 및 SW076956을 방해하는 데 SW063058보다 더 활동적이지만, ABT-737은 아니지만 Beclin 1/Bcl-2와 Bax/Bcl-2 결합을 선택적으로 방해한다. 또한 SW063058 또는 SW076956이 아닌 ABT-737은 Bcl-2와 BH3 전용 단백질인 Bim 사이의 공동-면역 면역침강반응을 방해한다.
Beclin 1/Bcl-2 결합 방해자의 기능적 분석
Beclin 1/Bcl-2 결합(Bax/Bcl-2 결합에 비해)을 방해하기 위한 SW063058, SW076956 및 BRD1991의 임의적 활성은 이들 화합물이 세포사 없이 자가포식을 유도할 수 있음을 나타냈다. 본 발명자들은 (i) 리소좀 억제제인 바필로마이신 A1(bafilomycin A1, Baf A1)의 존재 및 부재하에서 GFP-LC3 점(puncta)(자가소화포 표시)의 함량분석법(quantitation), 및 (ii) Baf A1의 존재 및 부재하에서 LC3-I의 지질화된 자가소화포 관련 단백질 LC3-II로의 전환에 대한 웨스턴 블롯 분석을 포함하여, 잘 확립된 분석을 사용하여 자가포식 활성을 평가하였다. SW063058, SW076956 또는 BRD1991로 처리된 GFP-LC3를 안정적으로 발현하는 HeLa 세포는 20μM 화합물로 처리한 후 24시간 후에 DMSO 대조군과 비교하여 GFP-LC3 점의 수가 증가하였다. 더 낮은 농도의 화합물(10μM)의 짧은 기간도 유사한 결과를 생성하였다. GFP-LC3 점의 수는 Baf A1의 존재하에 추가로 증가하였으며, 이는 이러한 화합물이 자가포식리소좀(autophagolysosomal) 성숙의 차단보다는 완전한 자가포식 플럭스를 유도한다는 것을 나타낸다. 이러한 발견을 뒷받침하기 위해, 본 발명자들은 또한 이러한 화합물이 Baf A1의 존재 하에서 추가로 증가하는 LC3-II의 증가를 유도함을 발견하였고, 자가포식 플럭스의 증가를 확인하였다. 따라서, 이러한 화합물은 HeLa 세포에서 자가포식 플럭스를 유도한다.
본 발명자들은 SW063058 및 SW076956에 의한 자가포식의 유도가 HeLa 세포에서 각각의 단백질을 녹다운(knockdown)시키기 위해 siRNA를 사용하는 Beclin 1 및 Bcl-2를 필요로 하는지 평가하였다. 필수 자가포식 단백질로서의 역할과 일치하여 Beclin 1 녹다운은 기준 조건에서 자가소화포 수를 감소시켰으며(GFP-LC3 점의 수로 입증된 바와 같이) 대조군 siRNA를 적용한 세포와 달리 SW063058, SW076956 또는 ABT-737로 처리시 GFP-LC3 점은 더 이상 증가하지 않았다. 자가포식 억제제로서의 역할과 일치하게, Bcl-2 녹다운은 기준 조건에서 GFP-LC3 점의 수를 증가시켰으며, 대조군 siRNA를 적용한 세포와 달리 SW063058, SW076956 또는 ABT-737로 처리하였을 때 GFP-LC3 점이 더 이상 증가하지 않았다. 본 발명자들은 Beclin 1 녹다운이 있는 세포에서 자가포식 기질 p62의 증가된 수준과 Bcl이 있는 세포에서 자가포식 기질 p62의 감소된 수준을 보여줌으로써, 각각 Beclin 1 녹다운이 자가포식 플럭스를 감소시키고 Bcl-2 녹다운이 자가포식 플럭스를 증가시키는 것을 확인하였다. 대조군 siRNA로 처리된 세포와 달리, SW063058, SW076956 또는 ABT-737은 Beclin 1 또는 Bcl-2 녹다운이 있는 세포에서 p62 수준을 변경하지 못하였다. 종합하면, 이 데이터는 Beclin 1과 Bcl-2가 SW063058, SW076956 및 ABT-737의 자가포식 유도 효과에 필요하다는 것을 보여준다.
GFP-LC3 분석에서 측정된 것과 같은 자가포식 플럭스(10 및 20μM)를 유도하는 동일한 농도에서, SW063058 및 SW076956은 HeLa 세포에서 세포독성을 나타내지 않은 반면, BRD1991 및 ABT-737은 CellTiter-Glo 분석에 의해 측정시 20μM에서 약한 세포독성을 나타냈다. Bcl-2의 과발현이 ABT-737에 의해 유도된 아포토시스 46, ABT-737로 처리하지만 SW063058, SW076956 또는 BRD1991로 처리하지 않으면 세포를 과발현한다는 이전 보고서와 일치하여 Bcl-2를 과발현하는 HeLa 세포에서 세포사의 용량 의존적 증가가 더욱 두드러졌다. 본 발명자들은 아포토시스 세포사, 카스파제 3 기질의 절단, PARP를 검출하기 위해 보다 구체적인 분석을 사용하여 CellTiter-Glo 결과를 확인하였다(참고문헌 47). ABT-737 처리에서 용량 의존적 PARP 절단 증가가 관찰되었으며, 절단된 PARP는 10 또는 20μM 화합물로 검출되었다. 이러한 동일한 농도에서 SW063058, SW076956 및 BRD1991은 PARP 절단을 유도하지 못하였다. 전체적으로 이러한 데이터는 새로 식별된 Beclin 1/Bcl-2 결합의 방해자가 아포토시스 또는 다른 형태의 세포사를 유발하지 않고 자가포식을 유도하는 창이 있음을 나타낸다.
약동학적 특성
특정 자가포식 유도제를 개발하기 위한 추가 SAR에 대한 시작점으로서 이러한 히트의 잠재적 유용성을 고려하여, 본 발명자들은 세포 침투를 분석 및 정량화하고 일부 대사 안정성 특성을 측정하였다. 질량 분석법을 사용하여 SW063058, SW076956 또는 BRD1991의 1μM과 함께 배양한 후 다른 시점에서 HeLa 세포의 세포내 약물 농도를 측정하였다. 세 가지 후보 화합물은 모두 1시간 이내에 세포에 들어 갔지만 SW076956과 BRD1991만이 시간이 지남에 따라 점진적인 세포내 축적을 나타냈다. 이러한 히트 화합물에 대한 생체외 ADME 특성을 측정할 때 마이크로 스케일 열역학적 용해도는 화합물이 PBS에서 0.72 내지 30μM, AlphaLISA 완충액에서 43.3 내지 202μM 범위의 용해도인 것을 보여주었다. 혈장 안정성은 쥣과(murine) 및 인간 혈장에서 90% 이상이었다. 쥣과 및 인간 마이크로솜(microsomal) 안정성은 모 화합물 SW063058의 36%가 인간 마이크로솜 추출물 노출 1시간 후에 대사되지 않은 반면 쥣과 또는 인간 마이크로솜에 노출된 다른 모든 화합물 조합은 1시간 후에 모 화합물의 2% 미만의 농도로 존재함을 보여주었다. 정교화하기 위해 선택한 스캐폴드(scaffold)에 따라 시리즈를 진행할 때 이러한 속성을 고려해야 한다.
NMR 화학 이동 섭동 분석
SW063058, SW076956 및 BRD1991이 Bcl-2의 소수성 포켓(hydrophobic pocket)을 차지하는지 여부를 알아보기 위해 화학 이동 섭동 분석(chemical shift perturbation analysis)을 수행하였다. 정제된 Bcl-2/-xL 키메라 단백질(Bcl-2의 구조화되지 않은 루프가 Bcl-xL의 짧은 루프로 대체됨)(참고문헌 48)을 후보 분자와 함께 배양하면 여러 잔기에 대한 화학 이동 변화가 발생하여 후보 분자는 Bcl-2에 결합한다. 특히, Bcl-2의 P2 소수성 결합 포켓(hydrophobic binding pocket) 내부에 위치한 F153에 대한 화학 이동 변화가 관찰되어 이러한 후보 화합물이 BH3 포켓내에서 결합할 수 있음을 나타낸다. P2 포켓(G141, V162 및 D171) 근처에 있지 않은 잔기의 다른 화학 이동 변화는 리간드 결합시 Bcl-2/-xL 키메라의 입체다른자리(allosteric) 형태 변화를 나타낸다. 전반적으로 SW063058, SW076956 및 BRD1991의 화학 이동 프로파일은 유사하지만, ABT-737 및 ABT-199 및 ABT-263을 포함한 알려진 BH3 모방체와 비교할 때 몇 가지 뚜렷한 특징을 보여준다. 예를 들어, SW063058, SW076956 및 BRD1991은 모두 소수성 그루브(groove) 내부의 F153에서 화학 이동을 초래했지만(BH3 모방체처럼) F104 및 E136과 같은 그루브의 다른 잔기에서 화학 이동을 일으키지 않았다. 또한 SW063058, SW076956 및 BRD1991은 Bcl-2가 Beclin 1에 결합하는 데 필수적인 잔기인 G155에서 화학 이동을 유도한 반면(참고문헌 49), ATB-737 및 기타 BH3 모방체는 그렇지 않았다. 이러한 데이터는 Bcl-2의 새로 식별된 Beclin 1/Bcl-2 결합 방해자에 대한 결합에 대한 구조적 결정인자가, 알려진 BH3 모방체와 다르다는 것을 나타낸다.
본 발명자들은 Beclin 1/Bcl-2 상호 작용을 방해하는 화합물을 식별하기 위한 두 가지 새로운 HTS 접근법을 개발하였다. 이러한 스크리닝 도구는 세 가지 검증된 히트인 SW063058, SW076956 및 BRD1991을 식별하였고, Bax/Bcl-2 및 Bim/Bcl-2 결합과 비교하여 Beclin 1/Bcl-2 결합을 임의적으로 방해하고, 최소 세포독성을 나타내는 농도에서 자가포식 플럭스를 유도한다. 또한, NMR 화학 이동 섭동 데이터는 이러한 새로 식별된 화합물이 현재 사용 가능한 BH3 모방체와 구별되는 양식을 통해 Bcl-2의 P2 포켓에 결합할 수 있음을 나타낸다.
최근에 Beclin 1 BH3 모방체로 기능하고 자가포식과 아포토시스를 모두 유도하는 저분자를 식별하기 위해 더 적은 수의 화합물로 이전 스크린이 보고되었다(참고문헌 50). 대조적으로, 본 발명의 목표는 Bcl-2에 대한 Bax의 BH3 영역이 아닌 Beclin 1의 BH3 영역의 결합을 방해하기 위해 선택성을 발휘하여 자가포식만 유도하는 화합물을 식별하는 것이었다. 본 발명자들은 이러한 기준을 충족하는 세 가지 초기 도구 화합물을 식별하였다. 비록 마이크로몰 범위에서 생물학적으로 활성이 있지만 본 발명에서 식별된 특성(특히 Bcl-2와 Beclin 1 BH3 모티프 간의 상호 작용을 방해하는 이들의 선택성, 세포독성 없이 자가포식을 유도하는 이들의 능력 및 고유한 NMR 화학 이동 섭동 프로필(알려진 BH3 모방체와 비교)이 효능이 증가하는 유사체 설계를 위한 강력한 히트 화합물을 렌더링하고 Beclin 1/Bcl-2 대 Beclin 1/Bax(또는 기타 프로-아포토시스 BH3 함유 단백질) 상호 작용을 방해하기 위한 선택성을 증가시키고 ADME 특성을 최적화시켰다. 세포 기반 및 생체외 기반 Beclin 1/Bcl-2 결합 분석은 이러한 유사체의 신속한 평가/최적화에 유용하다.
본 발명자들은 효과적인 Beclin 1/Bcl-2 선택적 억제제의 개발을 위한 출발점으로 이들 화합물을 사용하였고, 본 발명의 구조-활성 관계 연구는 본원에 추가로 설명된 자가포식 조절제를 생성하였다.
세포주
HeLa/GFP-LC3(참고문헌 51) 및 HeLa/Myc-Bcl-2(참고문헌 26) 세포는 이전에 본 발명자들의 실험실에서 설명하였다. Beclin 1/Bcl-2 분할-루시페라아제 세포는 NLuc-Beclin 1(또는 Beclin 1ΔBcl-2BD 돌연변이체)를 발현하는 테트라사이클린 유도성 플라스미드 pTRE2pur 벡터 및 CLuc-Bcl-2를 발현하는 pTRE2-RLuc-hyg3 벡터로 HeLa tet-on 세포(Clontech)의 안정적인 형질주입에 의해 생성되었다. 안정한 클론을 선별 배지에서 선택하였다(10% Tet 시스템 승인 FBS, 1mM 글루타민, 100μg/mL G418, 200μg/mL 히그로마이신 및 0.5μg/mL 퓨로마이신으로 보충된 DMEM). 이전에 설명한 Beclin 1ΔBcl-2BD 돌연변이(참고문헌 24, 49)는 Bcl-2에 대한 결합을 방해하는 아미노산 88 내지 150에 걸친 Beclin 1 BH3 영역의 결실을 포함한다.
재조합 단백질 및 펩티드
인간 beclin 1 유전자를 N-말단 StrepII 태그 및 SUMO 단백질과의 융합체로서 발현 벡터 ppSUMO-Strep에 클로닝하였다. 인간 Beclin 1의 "방향족 집게(aromatic finger)"에 위치한 3개의 방향족 잔기(참고문헌 42)는 단백질 용해도를 개선하기 위해 아스파르테이트(aspartate)(F359D/F360D/W361D)로 돌연변이를 만들었다. StrepII-SUMO-Beclin 1, StrepII-SUMO-Beclin 1ΔBcl-2BD 또는 StrepII-SUMO-6xHis 발현 플라스미드를 포함하는 E. coli BL21 Star (DE3) pLysS를 37℃에서 대수기까지 성장시키고 0.1mM IPTG에서 16℃에서 밤새 배양하였다. 가용성 StrepII-SUMO-Beclin 1 또는 StrepII-SUMO-Beclin 1ΔBcl-2BD 단백질을 StrepTactin 세파로오스(IBA Biosciences)로 친화도 정제하고, 변형된 완충액 W(Modified Buffer W)(100mM Tris-HCl, pH 8.0, 300mM NaCl, 5% 글리세롤, 0.1% CHAPS 및 1mM DTT)로 평형화된 HiLoad 16/60 Superdex 200 칼럼(GE Healthcare)을 사용하여 크기배제 크로마토그래피로 추가 정제하였다.
Bcl-2의 정제를 위해, C-말단 6xHis 태그를 갖는 막관통영역(transmembrane domain)이 결여된 인간 Bcl-2를 코딩하는 발현 플라스미드 pET21c-Bcl-2(스패닝(spanning) 아미노산 1 내지 218)를 사용하였다. 발현 플라스미드를 포함하는 BL21 Star (DE3) pLysS를 37℃에서 대수기(logarithmic phase)까지 성장시키고 IPTG를 최종 농도 0.1mM까지 첨가하고 16℃에서 밤새 배양하였다. 용해성 Bcl-2-6xHis 단백질은 용해 완충액(lysis buffer)(50mM 인산염, pH 8.0, 300mM NaCl, 0.1% CHAPS 및 5% 글리세롤)을 사용하여 Ni-NTA 아가로스(Qiagen)에 의해 친화도 정제되었다. 이미다졸은 결합에 10mM, 세척에 20mM, 용리에 250mM로 사용되었다. 친화도 정제된 Bcl-2-6xHis는 변형된 완충액 W(Modified Buffer W)로 평형화된 HiLoad 16/60 Superdex 200 칼럼을 사용하는 크기배제 크로마토그래피에 의해 추가로 정제되었다.
NMR 실험은 2D 스펙트럼을 개선하기 위해 Bcl-xL 루프를 대체하는 Bcl-2의 키메라 버전(Bcl-2/-xL)을 사용하였다(참고문헌 48). DNA는 E. coli(GeneArt, Life Technologies)에서 발현을 위해 최적화되었고, 과발현을 돕기 위해 N-말단 His6-MBP 태그를 갖는 pET28a 벡터로 클로닝된다. MBP-태그의 제거를 위해 MBP 태그와 Bcl-2/-xL 단백질 사이에 TEV 절단 부위를 조작하였다. 단백질은 설명된 바와 같이 발현되고 라벨링되었으며(참고문헌 52) 단백질 정제는 설명된 바와 같이 수행되었다(참고문헌 53). 단백질 순도는 ImageJ에 의한 이미지 분석을 통해 SDS-PAGE에 의해 ≥95%로 추정되고 43,430 M-1cm-1의 ε280을 사용하여 정량화되었다. 앨리쿼트는 ≥100μM로 농축되었고 필요할 때까지 -80℃에서 냉동되었다.
Beclin 1 BH3 펩티드는 N-말단 연결된 비오틴, YGGGGS 링커(linker) 및 인간 Beclin 1에서 파생된 16개의 아미노산(아미노산 105 내지 130)으로 이루어진다. Bax BH3 펩티드는 N-말단 연결된 비오틴, YGGGGS 링커 및 인간 Bax에서 파생된 36개의 아미노산(아미노산 49 내지 84)으로 이루어진다. 비오틴-6xHis 대조군 펩티드는 N-말단 연결된 비오틴, YGGGGS 링커, 및 C-말단의 6xHis 태그로 이루어진다.
Beclin 1/Bcl-2 분할-루시페라아제 스크린
Beclin 1/Bcl-2 분할-루시페라아제 세포를 유도 배지(Tet-승인 FBS, 1mM 글루타민, 100 units/mL의 페니실린/스트렙토마이신 및 1μg/mL 독시사이클린으로 보충된 DMEM)에 현탁하고, 1.2x104 세포/웰인 384-웰 플레이트(Corning #3570)에 넣고 37℃에서 밤새 배양하였다.
DMSO(중성 대조군), ABT-737(양성 대조군) 또는 라이브러리 화합물을 최종 농도 5μM까지 첨가하고 37℃에서 배양하였다. 화합물은 UTSW(200K) 또는 Broad Institute of MIT 및 Harvard 다양성-지향 합성(diversity-oriented synthesis)(100K) 컬렉션(Stuart Schreiber 제공)으로부터 나왔다. 5시간 배양 후, 원심분리로 배지를 제거하고 Dual-Glo® Luciferase Assay System(Promega)으로 Beclin 1/Bcl-2 분할-루시페라아제 리포터의 활성을 측정하였다. 20 마이크로리터의 1x FL 완충액(PBS로 루시페라아제 시약의 1:1 희석)을 먼저 웰에 첨가하고, 실온에서 10분 동안 배양하고, 반딧불이 발광 단위를 Envision 플레이트 판독기(Perkin Elmer)로 측정하였다. 10마이크로리터의 1x RL 완충액(Stop&Glo Reagent)를 샘플에 첨가하고, 샘플을 실온에서 10분 동안 배양한 후 레닐라 루시페라아제의 활성을 다시 측정하였다. Beclin 1/Bcl-2 상호 작용은 분할-루시페라아제 및 레닐라 루시페라아제 신호의 비율로 계산된 상대 발광 단위(relative luminescence unit, RLU)로 측정되었다.
스크린은 384-웰 방식으로 수행되었다. 각 분석 플레이트에는 칼럼 3 내지 22에 320개의 라이브러리 화합물이 포함되어있다. DMSO는 칼럼 2 및 23에 중립 대조군으로 포함되었으며 ABT-737은 칼럼 1에 양성 대조군으로 사용되었다. 1차 스크린 데이터 분석을 위해 수치 판독 EnVision 플레이트 판독기에서 얻은 수치 판독값은 Genedata Screener® Suite의 Assay Analyzer 모듈을 사용하여 품질 관리 및 처리되었다. 에지 효과 또는 플레이트 효과와 같은 전신적 변이 편향을 제거하기 위해 Assay Analyzer 소프트웨어의 독점 패턴 탐지 알고리즘으로 정규화된 값(RLU)을 수정하였다(참고문헌 54). Z-점수는 분할-루시페라아제 활성 및 각 화합물에 대한 수정된 정규화 활성(RLU)에서 계산되었다(참고문헌 54). 테스트된 농도에서 화합물의 활성 백분율은 하기와 같이 정의되었다.
Figure pct00009
분할-루시페라아제 활성에서 -3.0 미만의 Z-점수 및 수정된 정규화 활성(RLU)을 갖는 화합물은 확인 분석에서 연구를 위해 진행되었다.
UTSW 라이브러리로부터의 화합물에 대한 확인 분석은 5μM의 화합물 농도를 사용하여 3회 수행되었다. Broad Institute 라이브러리의 화합물에 대한 확인 분석은 2배 8포인트 연속 희석으로 5μM에서 수행되었다. 그런 다음 Genedata Screener®의 "Robust Condensing" 방법을 사용하여 각 화합물에 대한 삼중 활성도 백분율 값을 삼중 대표적인 단일 값인 "응축 활성"으로 단일 값으로 압축하였다. 일반적으로 삼중은 하기와 같이 한 쌍의 값 (X 및 Y)으로 미리 압축되었다.
Figure pct00010
분산 = 중앙값(|X1-m|,|X2-m|,|X3-m|)
낮은 |X-Y| 값은 더 나은 데이터 품질을 나타낸다. |X-Y|≤30%인 데이터 포인트의 경우, X 및 Y의 중앙값이 응축된 활동으로 사용되었으며, 이는 또한 3회 반복 측정의 중앙값이다. 그렇지 않으면 응축 함수 Max(X,Y)를 사용하여 응축 활성을 추정하였다. 그런 다음 하기 방정식을 사용하여 각 화합물에 대해 강력한 Z-점수를 계산하였다.
Figure pct00011
-3.0 미만의 Z-점수(UTSW 라이브러리) 또는 분할-루시페라아제 활성의 용량-반응 억제(Broad Institute 라이브러리)를 갖는 화합물이 확인된 것으로 간주되었다.
Beclin 1/Bcl-2 AlphaLISA 스크린
모든 AlphaLISA 분석은 BB 완충액(0.5% BSA 및 1mM DTT로 보충된 인산염 완충 식염수)을 사용하여 384-웰 형식으로 3회 수행되었다. Beclin 1/Bcl-2 AlphaLISA의 경우 정제된 StrepII-SUMO-Beclin 1을 각각 300nM 및 60nM에서 Bcl-2-6xHis 단백질과 함께 배양하였다. 내부 대조군 AlphaLISA 분석을 위해 StrepII-SUMO-6xHis 단백질(내부 대조군)을 20nM에서 사용하였다. Beclin 1/Bcl-2 또는 SUMO 단백질을 포함하는 샘플을 Multidrop으로 AlphaPlates-384(Perkin Elmer #6005350)에 첨가하고 DMSO(중성 대조군), ABT-737(양성 대조군) 또는 5μM(UTSW 라이브러리)의 라이브러리 화합물 또는 10μM(Broad 라이브러리)과 함께 실온에서 3시간 동안 배양하여 단백질-단백질 상호 작용을 허용한다. 초기 배양 후, Strep-Tactin Alpha donor(AS106D) 및 anti-6xHis AlphaLISA 수용체 비드(AL128M)를 각각 최종 농도가 40㎍/mL이 되도록 첨가하고 추가로 1시간 동안 어두운 곳에서 실온에서 배양하였다. 모든 샘플은 삼중으로 평가되었다. 알파 신호는 Envision 플레이트 판독기(Perkin Elmer)로 측정되었다. Beclin 1/Bcl-2 Alpha 신호는 내부 제어 Alpha 신호로 정규화되었다. 정규화된 값은 Beclin 1 및 Bcl-2의 결합 활성을 나타낸다. 화합물의 활성 백분율은 하기 공식으로 계산되었다.
Figure pct00012
3중의 각 화합물의 활성 백분율 값을 응축 활성으로 변환하고 강력한 Z-점수를 이전 섹션에서 설명한 바와 같이 계산하였다. Z-점수가 -3.0 미만이고 활성 백분율이 >20%(UTSW 라이브러리) 또는 >40%(Broad Institute 라이브러리)이고 용량-반응 실험으로 추가 확인을 위해 선택되었다.
용량-반응 AlphaLISA 실험을 위해, 화합물을 DMSO로 연속 희석(2배, 7포인트)하고 정제된 재조합 단백질 또는 비오틴화(biotinylated) 펩티드를 함유하는 BB 완충액에 최종 농도 범위 10μM 내지 156nM에 첨가하였다. 용량-반응 AlphaLISA 실험에 사용된 단백질 또는 펩티드 농도는 하기와 같다. Beclin1/Bcl-2 - 300nM/60nM; SUMO(Beclin 1/Bcl-2 AlphaLISA에 대한 내부 대조군) - 20 nM; Beclin 1 BH3/Bcl-2 - 1000nM/60nM; Bax BH3/Bcl-2 - 100nM/20nM; 비오틴-6xHis(BH3/Bcl-2 AlphaLISA의 내부 대조군) - 10nM
Analytical Assay
용해도는 Broad Institute의 Analytical Group에 의해 PBS 완충액에서 측정되거나 UT Southwestern Medical Center의 Preclinical Pharmacology Core Laboratory에 의해 AlphaLISA 반응 완충액에서 측정되었다. PBS 완충액에서 용해도를 측정하기 위해, 각 화합물은 100% DMSO와 1% DMSO가 있는 PBS에서 100μM에서 3중으로 제조되었다. 화합물은 18시간 동안 750rpm 볼텍스 진탕기(vortex shake)로 실온에서 평형이 되도록 하였다. 평형화 후, 샘플은 단일 사중극자 질량 분석기(single quadrupole mass spectrometer)에서 SIR 검출에 의해 검출된 화합물을 사용하여 UPLC-MS(Waters, Milford, MA)에 의해 분석되었다. DMSO 샘플을 사용하여 PBS의 반응이 맞는 2점 검량선을 생성하였다. AlphaLISA 반응 완충액에서 용해도를 측정하기 위해, 각 화합물은 유리병(glass vial)에 0.5% BSA 및 1mM DTT를 포함하는 PBS에서 1mM에서 3중으로 제조되었다. 유리병을 회전식 진탕기(orbital shaker)에서 18시간 동안 격렬하게 (250rpm) 흔들었다. 샘플을 테플론 에펜도르프 튜브(teflon eppendorf tube)에 넣고 16,100xg에서 10분 동안 원심 분리하였다. 상청액을 수집하고 Qtrap 3200 LC-MS/MS 시스템으로 분석하였다.
혈장 안정성은 인간 및 생쥐 혈장 모두에서 5시간에 37℃에서 측정되었다. 각 화합물은 PBS pH 7.4(0.95% 아세토니트릴, 0.05% DMSO)로 50/50(v/v) 희석된 혈장에서 5μM에서 중복으로 제조되었다. 화합물은 0시간 및 5시간에서 측정된 시점과 함께 350rpm 회전식 진탕기로 37℃에서 5시간 동안 배양되었다. 샘플은 단일 사중극자 질량 분석기에서 SIR 검출에 의해 검출된 화합물을 사용하여 UPLC-MS(Waters, Milford, MA)에 의해 분석되었다.
마이크로솜 안정성은 인간 및 생쥐 마이크로솜 모두에서 60분에 37℃에서 결정되었다. 각 화합물은 PBS pH 7.4(1% DMSO)에서 0.3mg/mL 마이크로솜을 사용하여 1μM에서 중복으로 제조되었다. 화합물은 0분 및 60분에서 측정한 시점과 함께 350rpm 회전식 진탕기로 37℃에서 60분 동안 배양되었다. 샘플은 단일 사중극자 질량 분석기에서 SIR 검출에 의해 검출된 화합물을 사용하여 UPLC-MS(Waters, Milford, MA)에 의해 분석되었다.
NMR 분광학 실험
NMR 데이터는 Broad Institute에서 극저온 QCI 저온탐침(cryogenic QCI cryoprobe)이 장착된 Bruker Avance III HD 600MHz 분광기를 사용하여 습득하였다. 2D 15N-1H HSQC 및 TROSY 스펙트럼은 화합물의 부재 또는 존재하에 25℃에서 수집되었다. NMR 샘플은 25mM HEPES (pH 7.5), 150mM NaCl 및 0.5mM TCEP 내 90% H2O/10% D2O로 구성되었다. ABT-737, ABT-199, ABT-263, SW063058, SW076956 및 BRD1991을 사용한 화학 이동 섭동 실험의 경우, 앨리쿼트를 15N 표지 Bcl-2/-xL로 적정(titrate)하였고, 2D 15N-1H HSQC 및 TROSY 스펙트럼은 25℃에서 수집되었다. Bcl-2/-xL에 대한 화학 이동 할당은 이전에 설명한 바와 같이 수행되었다(참고문헌 48). 모든 NMR 데이터는 SPARKY 소프트웨어를 사용하여 분석되었다.
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Claims (20)

  1. 구조식 I의 화합물, 또는 이의 염, 수화물 또는 입체 이성질체, 또는 본원에 개시된 화합물을 포함하는 약학적 조성물로 이를 필요로 하는 사람을 치료하는 것을 포함하는, 자가포식을 선택적으로 유도하는 방법:
    [구조식 I]
    Figure pct00039

    여기서
    R1은 임의적으로 치환된 C5 또는 C6 아릴 또는 헤테로아릴;
    R1은 N, O 및 S로부터 선택된 1 내지 3개의 이종 원자를 갖는 임의적으로 치환된 C5 또는 C6 아릴 또는 헤테로아릴;
    R1은 임의적으로 치환된 피롤, 푸란, 티오펜, 이미다졸, 피라졸, 옥사졸, 이소옥사졸, 티아졸, 이소티아졸, 트리아졸, 푸라잔, 옥사디아졸, 티아디아졸, 디옥사졸, 디티아졸, 피리딘, 피란, 티오피란, 디아진, 옥사진, 티아진, 다이옥신, 디티인 및 트리아존; 또는
    R1은 임의적으로 치환된 2- 또는 3- 푸라닐 또는 페닐, 2, 3 또는 4-피리딘이고;
    R2는 임의적으로 치환된 이종 원자 또는 임의적으로 치환된, 임의적으로 헤테로-, 임의적으로 사이클릭 C1-C10 히드로카르빌로부터 독립적으로 선택된 0 내지 5개의 치환기;
    R2는 할로겐, 아미드, 아민, 이민, 이미드, 니트로, 니트로소, 질산염, 아질산염, 시아노, 히드록실 또는 히드로카르빌옥시, 또는 알데히드, 케톤, 카르복실, 에테르, 에스테르, 알킬, 알케닐, 알키닐, 술피닐, 술포닐로부터 독립적으로 선택된 0 내지 5개의 치환기;
    R2는 각각 임의적으로 플루오르화된, 할로겐, NO2, N, C1-C4 알킬(Me, Et, cPr, iPr, cBu, tBu), C1-C4 알콕시, C1-C4 카르보닐, C1-C4 카르복실, C1-C4 시아노, C1-C4 술피닐, C1-C4 술포닐로부터 선택된 0 내지 5개의 치환기; 또는
    R2는 할로겐, NO2, N, C1-C4 알킬, C1-C4 알콕시, C1-C4 카르보닐, C1-C4 카르복실, C1-C4 시아노, C1-C4 술피닐, C1-C4 술포닐로부터 선택된 1개의 파라 치환기이며, 각각은 임의적으로 플루오르화된, 바람직하게는 메틸 또는 플루오르화된 메틸이고;
    R3은 임의적으로 치환된 이종 원자 또는 임의적으로 치환된, 임의적으로 헤테로-, 임의적으로 사이클릭 C1-C10 히드로카르빌로부터 독립적으로 선택된 0 내지 4개의 치환기;
    R3은 할로겐, 아미드, 아민, 이민, 이미드, 니트로, 니트로소, 질산염, 아질산염, 시아노, 히드록실 또는 히드로카르빌옥시, 또는 알데히드, 케톤, 카르복실, 에테르, 에스테르, 알킬, 알케닐, 알키닐, 술피닐, 술포닐로부터 독립적으로 선택된 0 내지 4개의 치환기;
    R3은 각각 임의적으로 플루오르화된, 할로겐, NO2, N, C1-C4 알킬(Me, Et, cPr, iPr, cBu, tBu), C1-C4 알콕시, C1-C4 카르보닐, C1-C4 카르복실, C1-C4 시아노, C1-C4 술피닐, C1-C4 술포닐로부터 선택된 0 내지 4개의 치환기; 또는
    R3은 0개의 치환기이고;
    R4는 H, 임의적으로 치환된 이종 원자 또는 임의적으로 치환된, 임의적으로 헤테로-, 임의적으로 사이클릭 C1-C10 히드로카르빌; 또는
    R4는 H, 히드록실 또는 히드로카르빌옥시, 또는 알데히드, 케톤, 카르복실, 에테르, 에스테르, 알킬, 알케닐, 알키닐, 술피닐, 술포닐;
    R4는 각각 임의적으로 플루오르화된, H 또는 C1-C4 알킬(Me, Et, cPr, iPr, cBu, tBu), C1-C4 알콕시, C1-C4 카르보닐, C1-C4 카르복실, C1-C4 시아노, C1-C4 술피닐, C1-C4 술포닐; 또는
    R4는 H이고;
    R5는 임의적으로 치환된 이종 원자 또는 임의적으로 치환된, 임의적으로 헤테로-, 임의적으로 사이클릭 C1-C10 히드로카르빌;
    R5는 히드록실 또는 히드로카르빌옥시, 또는 알데히드, 케톤, 카르복실, 에테르, 에스테르, 알킬, 알케닐, 알키닐, 술피닐, 술포닐;
    R5는 각각 임의적으로 플루오르화된, C1-C4 알킬(Me, Et, cPr, iPr, cBu, tBu), C1-C4 알콕시, C1-C4 카르보닐, C1-C4 카르복실, C1-C4 시아노, C1-C4 술피닐, C1-C4 술포닐; 또는
    R5는 술포닐 또는 에스테르, SO2R 또는 CO2R이고, 여기서 R은 C1-C4 알킬이고, 임의적으로 플루오르화된 것이고;
    상기 R4 및 R5는 헤테로사이클릭 고리로 결합될 수 있다.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 R1은 임의적으로 치환된 C5 또는 C6 아릴 또는 헤테로아릴;
    상기 R2는 임의적으로 치환된 이종 원자 또는 임의적으로 치환된, 임의적으로 헤테로-, 임의적으로 사이클릭 C1-C10 히드로카르빌로부터 독립적으로 선택된 0 내지 5개의 치환기;
    상기 R3은 임의적으로 치환된 이종 원자 또는 임의적으로 치환된, 임의적으로 헤테로-, 임의적으로 사이클릭 C1-C10 히드로카르빌로부터 독립적으로 선택된 0 내지 4개의 치환기;
    상기 R4는 H, 임의적으로 치환된 이종 원자 또는 임의적으로 치환된, 임의적으로 헤테로-, 임의적으로 사이클릭 C1-C10 히드로카르빌; 및
    상기 R5는 임의적으로 치환된 이종 원자 또는 임의적으로 치환된, 임의적으로 헤테로-, 임의적으로 사이클릭 C1-C10 히드로카르빌인 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 R1은 N, O 및 S로부터 선택된 1 내지 3개의 이종 원자를 갖는 임의적으로 치환된 C5 또는 C6 아릴 또는 헤테로아릴;
    상기 R2는 할로겐, 아미드, 아민, 이민, 이미드, 니트로, 니트로소, 질산염, 아질산염, 시아노, 히드록실 또는 히드로카르빌옥시, 또는 알데히드, 케톤, 카르복실, 에테르, 에스테르, 알킬, 알케닐, 알키닐, 술피닐, 술포닐로부터 독립적으로 선택된 0 내지 5개의 치환기;
    상기 R3은 할로겐, 아미드, 아민, 이민, 이미드, 니트로, 니트로소, 질산염, 아질산염, 시아노, 히드록실 또는 히드로카르빌옥시, 또는 알데히드, 케톤, 카르복실, 에테르, 에스테르, 알킬, 알케닐, 알키닐, 술피닐, 술포닐로부터 독립적으로 선택된 0 내지 4개의 치환기;
    상기 R4는 H, 히드록실 또는 히드로카르빌옥시, 또는 알데히드, 케톤, 카르복실, 에테르, 에스테르, 알킬, 알케닐, 알키닐, 술피닐, 술포닐; 또는
    상기 R5는 히드록실 또는 히드로카르빌옥시, 또는 알데히드, 케톤, 카르복실, 에테르, 에스테르, 알킬, 알케닐, 알키닐, 술피닐, 술포닐인 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 R1은 임의적으로 치환된 피롤, 푸란, 티오펜, 이미다졸, 피라졸, 옥사졸, 이소옥사졸, 티아졸, 이소티아졸, 트리아졸, 푸라잔, 옥사디아졸, 티아디아졸, 디옥사졸, 디티아졸, 피리딘, 피란, 티오피란, 디아진, 옥사진, 티아진, 다이옥신, 디티인 및 트리아존;
    상기 R2는 각각 임의적으로 플루오르화된, 할로겐, NO2, N, C1-C4 알킬(Me, Et, cPr, iPr, cBu, tBu), C1-C4 알콕시, C1-C4 카르보닐, C1-C4 카르복실, C1-C4 시아노, C1-C4 술피닐, C1-C4 술포닐로부터 선택된 0 내지 5개의 치환기;
    상기 R3은 각각 임의적으로 플루오르화된, 할로겐, NO2, N, C1-C4 알킬(Me, Et, cPr, iPr, cBu, tBu), C1-C4 알콕시, C1-C4 카르보닐, C1-C4 카르복실, C1-C4 시아노, C1-C4 술피닐, C1-C4 술포닐로부터 선택된 0 내지 4개의 치환기;
    상기 R4는 각각 임의적으로 플루오르화된, H 또는 C1-C4 알킬(Me, Et, cPr, iPr, cBu, tBu), C1-C4 알콕시, C1-C4 카르보닐, C1-C4 카르복실, C1-C4 시아노, C1-C4 술피닐, C1-C4 술포닐; 및
    상기 R5는 각각 임의적으로 플루오르화된, C1-C4 알킬(Me, Et, cPr, iPr, cBu, tBu), C1-C4 알콕시, C1-C4 카르보닐, C1-C4 카르복실, C1-C4 시아노, C1-C4 술피닐, C1-C4 술포닐인 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 R1은 임의적으로 치환된 2- 또는 3-푸라닐 또는 페닐, 2, 3 또는 4-피리딘;
    상기 R2는 할로겐, NO2, N, C1-C4 알킬, C1-C4 알콕시, C1-C4 카르보닐, C1-C4 카르복실, C1-C4 시아노, C1-C4 술피닐, C1-C4 술포닐로부터 선택된 1개의 파라 치환기이며, 각각은 임의적으로 플루오르화된, 바람직하게는 메틸 또는 플루오르화된 메틸;
    상기 R3은 0개의 치환기;
    상기 R4는 H; 및
    상기 R5는 술포닐 또는 에스테르, SO2R 또는 CO2R이며, 상기 R은 C1-C4 알킬이고, 임의적으로 플루오르화된 방법.
  6. 구조식 I의 화합물, 또는 이의 염, 수화물, 또는 입체 이성질체, 또는 본원에 개시된 화합물을 포함하는 약학적 조성물로 이를 필요로 하는 사람을 치료하는 것을 포함하는, Beclin 1 BH 3 영역의 항아포토시스 Bcl-2 BH3 영역에 대한 결합을 선택적으로 억제하지만, 프로아포토시스 Bax BH3 영역 또는 프로아포토시스 Bim BH3 단백질의 Bcl-2 BH3 영역에 대한 결합을 억제하지 않는 방법:
    [구조식 I]
    Figure pct00040

    여기서
    R1은 임의적으로 치환된 C5 또는 C6 아릴 또는 헤테로아릴;
    R1은 N, O 및 S로부터 선택된 1 내지 3개의 이종 원자를 갖는 임의적으로 치환된 C5 또는 C6 아릴 또는 헤테로아릴;
    R1은 임의적으로 치환된 피롤, 푸란, 티오펜, 이미다졸, 피라졸, 옥사졸, 이소옥사졸, 티아졸, 이소티아졸, 트리아졸, 푸라잔, 옥사디아졸, 티아디아졸, 디옥사졸, 디티아졸, 피리딘, 피란, 티오피란, 디아진, 옥사진 티아진, 다이옥신, 디티인 및 트리아존; 또는
    R1은 임의적으로 치환된 2- 또는 3-푸라닐 또는 페닐, 2, 3 또는 4-피리딘이고;
    R2는 임의적으로 치환된 이종 원자 또는 임의적으로 치환된, 임의적으로 헤테로-, 임의적으로 사이클릭 C1-C10 히드로카르빌로부터 독립적으로 선택된 0 내지 5개의 치환기;
    R2는 할로겐, 아미드, 아민, 이민, 이미드, 니트로, 니트로소, 질산염, 아질산염, 시아노, 히드록실 또는 히드로카르빌옥시, 또는 알데히드, 케톤, 카르복실, 에테르, 에스테르, 알킬, 알케닐, 알키닐, 술피닐, 술포닐로부터 독립적으로 선택된 0 내지 5개의 치환기;
    R2는 할로겐, NO2, N, C1-C4 알킬(Me, Et, cPr, iPr, cBu, tBu), C1-C4 알콕시, C1-C4 카르보닐, C1-C4 카르복실, C1-C4 시아노, C1-C4 술피닐, C1-C4 술포닐로부터 선택된 0 내지 5개의 치환기이며, 각각은 임의적으로 플루오르화된, 바람직하게는 메틸 또는 플루오르화된 메틸; 또는
    R2는 할로겐, NO2, N, C1-C4 알킬, C1-C4 알콕시, C1-C4 카르보닐, C1-C4 카르복실, C1-C4 시아노, C1-C4 술피닐, C1-C4 술포닐로부터 선택된 1개의 파라 치환기이며, 각각은 임의적으로 플루오르화된, 바람직하게는 메틸 또는 플루오르화된 메틸이고;
    R3은 임의적으로 치환된 이종 원자 또는 임의적으로 치환된, 임의적으로 헤테로-, 임의적으로 사이클릭 C1-C10 히드로카르빌로부터 독립적으로 선택된 0 내지 4개의 치환기;
    R3은 할로겐, 아미드, 아민, 이민, 이미드, 니트로, 니트로소, 질산염, 아질산염, 시아노, 히드록실 또는 히드로카르빌옥시, 또는 알데히드, 케톤, 카르복실, 에테르, 에스테르, 알킬, 알케닐, 알키닐, 술피닐, 술포닐로부터 독립적으로 선택된 0 내지 4개의 치환기;
    R3은 각각은 임의적으로 플루오르화된, 할로겐, NO2, N, C1-C4 알킬(Me, Et, cPr, iPr, cBu, tBu), C1-C4 알콕시, C1-C4 카르보닐, C1-C4 카르복실, C1-C4 시아노, C1-C4 술피닐, C1-C4 술포닐로부터 선택된 0 내지 4개의 치환기; 또는
    R3은 0개의 치환기이고;
    R4는 H, 임의적으로 치환된 이종 원자 또는 임의적으로 치환된, 임의적으로 헤테로-, 임의적으로 사이클릭 C1-C10 히드로카르빌, 또는
    R4는 H, 히드록실 또는 히드로카르빌옥시, 또는 알데히드, 케톤, 카르복실, 에테르, 에스테르, 알킬, 알케닐, 알키닐, 술피닐, 술포닐;
    R4는 각각 임의적으로 플루오르화된, H 또는 C1-C4 알킬(Me, Et, cPr, iPr, cBu, tBu), C1-C4 알콕시, C1-C4 카르보닐, C1-C4 카르복실, C1-C4 시아노, C1-C4 술피닐, C1-C4 술포닐; 또는
    R4는 H이고;
    R5는 임의적으로 치환된 이종 원자 또는 임의적으로 치환된, 임의적으로 헤테로-, 임의적으로 사이클릭 C1-C10 히드로카르빌;
    R5는 히드록실 또는 히드로카르빌옥시, 또는 알데히드, 케톤, 카르복실, 에테르, 에스테르, 알킬, 알케닐, 알키닐, 술피닐, 술포닐;
    R5는 각각 임의적으로 플루오르화된, C1-C4 알킬(Me, Et, cPr, iPr, cBu, tBu), C1-C4 알콕시, C1-C4 카르보닐, C1-C4 카르복실, C1-C4 시아노, C1-C4 술피닐, C1-C4 술포닐; 또는
    R5는 술포닐 또는 에스테르, SO2R 또는 CO2R이고, 상기 R은 C1-C4 알킬이고, 임의적으로 플루오르화된 것이고;
    상기 R4 및 R5는 헤테로사이클릭 고리로 결합될 수 있다.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 R1은 임의적으로 치환된 C5 또는 C6 아릴 또는 헤테로아릴;
    상기 R2는 임의적으로 치환된 이종 원자 또는 임의적으로 치환된, 임의적으로 헤테로-, 임의적으로 사이클릭 C1-C10 히드로카르빌로부터 독립적으로 선택된 0 내지 5개의 치환기;
    상기 R3은 임의적으로 치환된 이종 원자 또는 임의적으로 치환된, 임의적으로 헤테로-, 임의적으로 사이클릭 C1-C10 히드로카르빌로부터 독립적으로 선택된 0 내지 4개의 치환기;
    상기 R4는 H, 임의적으로 치환된 이종 원자 또는 임의적으로 치환된, 임의적으로 헤테로-, 임의적으로 사이클릭 C1-C10 히드로카르빌; 및
    상기 R5는 임의적으로 치환된 이종 원자 또는 임의적으로 치환된, 임의적으로 헤테로-, 임의적으로 사이클릭 C1-C10 히드로카르빌인 방법.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 R1은 N, O 및 S로부터 선택된 1 내지 3개의 이종 원자를 갖는 임의적으로 치환된 C5 또는 C6 아릴 또는 헤테로아릴;
    상기 R2는 할로겐, 아미드, 아민, 이민, 이미드, 니트로, 니트로소, 질산염, 아질산염, 시아노, 히드록실 또는 히드로카르빌옥시, 또는 알데히드, 케톤, 카르복실, 에테르, 에스테르, 알킬, 알케닐, 알키닐, 술피닐, 술포닐로부터 독립적으로 선택된 0 내지 5개의 치환기;
    상기 R3은 할로겐, 아미드, 아민, 이민, 이미드, 니트로, 니트로소, 질산염, 아질산염, 시아노, 히드록실 또는 히드로카르빌옥시, 또는 알데히드, 케톤, 카르복실, 에테르, 에스테르, 알킬, 알케닐, 알키닐, 술피닐, 술포닐로부터 독립적으로 선택된 0 내지 4개의 치환기;
    R4는 H, 히드록실 또는 히드로카르빌옥시, 또는 알데히드, 케톤, 카르복실, 에테르, 에스테르, 알킬, 알케닐, 알키닐, 술피닐, 술포닐; 또는
    R5는 히드록실 또는 히드로카르빌옥시, 또는 알데히드, 케톤, 카르복실, 에테르, 에스테르, 알킬, 알케닐, 알키닐, 술피닐, 술포닐인 방법.
  9. 제6항에 있어서,
    상기 R1은 임의적으로 치환된 피롤, 푸란, 티오펜, 이미다졸, 피라졸, 옥사졸, 이소옥사졸, 티아졸, 이소티아졸, 트리아졸, 푸라잔, 옥사디아졸, 티아디아졸, 디옥사졸, 디티아졸, 피리딘, 피란, 티오피란, 디아진, 옥사진, 티아진, 다이옥신, 디티인 및 트리아존;
    상기 R2는 각각 임의적으로 플루오르화된, 할로겐, NO2, N, C1-C4 알킬(Me, Et, cPr, iPr, cBu, tBu), C1-C4 알콕시, C1-C4 카르보닐, C1-C4 카르복실, C1-C4 시아노, C1-C4 술피닐, C1-C4 술포닐로부터 선택된 0 내지 5개의 치환기;
    상기 R3은 각각 임의적으로 플루오르화된, 할로겐, NO2, N, C1-C4 알킬(Me, Et, cPr, iPr, cBu, tBu), C1-C4 알콕시, C1-C4 카르보닐, C1-C4 카르복실, C1-C4 시아노, C1-C4 술피닐, C1-C4 술포닐로부터 선택된 0 내지 4개의 치환기;
    상기 R4는 각각 임의적으로 플루오르화된, H 또는 C1-C4 알킬(Me, Et, cPr, iPr, cBu, tBu), C1-C4 알콕시, C1-C4 카르보닐, C1-C4 카르복실, C1-C4 시아노, C1-C4 술피닐, C1-C4 술포닐; 및
    상기 R5는 각각 임의적으로 플루오르화된, C1-C4 알킬(Me, Et, cPr, iPr, cBu, tBu), C1-C4 알콕시, C1-C4 카르보닐, C1-C4 카르복실, C1-C4 시아노, C1-C4 술피닐, C1-C4 술포닐인 방법.
  10. 제6항에 있어서,
    상기 R1은 임의적으로 치환된 2- 또는 3-푸라닐 또는 페닐, 2, 3 또는 4-피리딘;
    상기 R2는 할로겐, NO2, N, C1-C4 알킬, C1-C4 알콕시, C1-C4 카르보닐, C1-C4 카르복실, C1-C4 시아노, C1-C4 술피닐, C1-C4 술포닐로부터 선택된 1개의 파라 치환기이고, 각각은 임의적으로 플루오르화된, 바람직하게는 메틸 또는 플루오르화 메틸;
    상기 R3은 0개의 치환기;
    상기 R4는 H; 및
    상기 R5는 술포닐 또는 에스테르, SO2R 또는 CO2R이고, 상기 R은 C1-C4 알킬이고, 임의적으로 플루오르화된 방법.
  11. 구조식 I의 화합물, 또는 이의 염, 수화물 또는 입체 이성질체, 또는 본원에 개시된 화합물을 포함하는, 이를 필요로 하는 사람에게 투여하기 위해 제형화된 약학적 조성물:
    [구조식 I]
    Figure pct00041

    여기서
    R1은 임의적으로 치환된 C5 또는 C6 아릴 또는 헤테로아릴;
    R1은 N, O 및 S로부터 선택된 1 내지 3개의 이종 원자를 갖는 임의적으로 치환된 C5 또는 C6 아릴 또는 헤테로아릴;
    R1은 임의적으로 치환된 피롤, 푸란, 티오펜, 이미다졸, 피라졸, 옥사졸, 이소옥사졸, 티아졸, 이소티아졸, 트리아졸, 푸라잔, 옥사디아졸, 티아디아졸, 디옥사졸, 디티아졸, 피리딘, 피란, 티오피란, 디아진, 옥사진, 티아진, 다이옥신, 디티인 및 트리아존; 또는
    R1은 임의적으로 치환된 2- 또는 3-푸라닐 또는 페닐, 2, 3 또는 4-피리딘이고;
    R2는 임의적으로 치환된 이종 원자 또는 임의적으로 치환된, 임의적으로 헤테로-, 임의적으로 사이클릭 C1-C10 히드로카르빌로부터 독립적으로 선택된 0 내지 5개의 치환기;
    R2는 할로겐, 아미드, 아민, 이민, 이미드, 니트로, 니트로소, 질산염, 아질산염, 시아노, 히드록실 또는 히드로카르빌옥시, 또는 알데히드, 케톤, 카르복실, 에테르, 에스테르, 알킬, 알케닐, 알키닐, 술피닐, 술포닐로부터 독립적으로 선택된 0 내지 5개의 치환기;
    R2는 각각 임의적으로 플루오르화된, 할로겐, NO2, N, C1-C4 알킬(Me, Et, cPr, iPr, cBu, tBu), C1-C4 알콕시, C1-C4 카르보닐, C1-C4 카르복실, C1-C4 시아노, C1-C4 술피닐, C1-C4 술포닐로부터 선택된 0 내지 5개의 치환기; 또는
    R2는 할로겐, NO2, N, C1-C4 알킬, C1-C4 알콕시, C1-C4 카르보닐, C1-C4 카르복실, C1-C4 시아노, C1-C4 술피닐, C1-C4 술포닐로부터 선택된 1개의 파라 치환기이며, 각각은 임의적으로 플루오르화된, 바람직하게는 메틸 또는 플루오르화된 메틸이고;
    R3은 임의적으로 치환된 이종 원자 또는 임의적으로 치환된, 임의적으로 헤테로-, 임의적으로 사이클릭 C1-C10 히드로카르빌로부터 독립적으로 선택된 0 내지 4개의 치환기;
    R3은 할로겐, 아미드, 아민, 이민, 이미드, 니트로, 니트로소, 질산염, 아질산염, 시아노, 히드록실 또는 히드로카르빌옥시, 또는 알데히드, 케톤, 카르복실, 에테르, 에스테르, 알킬, 알케닐, 알키닐, 술피닐, 술포닐로부터 독립적으로 선택된 0 내지 4개의 치환기;
    R3은 각각 임의적으로 플루오르화된, 할로겐, NO2, N, C1-C4 알킬(Me, Et, cPr, iPr, cBu, tBu), C1-C4 알콕시, C1-C4 카르보닐, C1-C4 카르복실, C1-C4 시아노, C1-C4 술피닐, C1-C4 술포닐로부터 선택된 0 내지 4개의 치환기; 또는
    R3은 0개의 치환기이고;
    R4는 H, 임의적으로 치환된 이종 원자 또는 임의적으로 치환된, 임의적으로 헤테로-, 임의적으로 사이클릭 C1-C10 히드로카르빌, 또는
    R4는 H, 히드록실 또는 히드로카르빌옥시, 또는 알데히드, 케톤, 카르복실, 에테르, 에스테르, 알킬, 알케닐, 알키닐, 술피닐, 술포닐;
    R4는 각각 임의적으로 플루오르화된, H 또는 C1-C4 알킬(Me, Et, cPr, iPr, cBu, tBu), C1-C4 알콕시, C1-C4 카르보닐, C1-C4 카르복실, C1-C4 시아노, C1-C4 술피닐, C1-C4 술포닐; 또는
    R4는 H이고;
    R5는 임의적으로 치환된 이종 원자 또는 임의적으로 치환된, 임의적으로 헤테로-, 임의적으로 사이클릭 C1-C10 히드로카르빌;
    R5는 히드록실 또는 히드로카르빌옥시, 또는 알데히드, 케톤, 카르복실, 에테르, 에스테르, 알킬, 알케닐, 알키닐, 술피닐, 술포닐;
    R5는 각각 임의적으로 플루오르화된, C1-C4 알킬(Me, Et, cPr, iPr, cBu, tBu), C1-C4 알콕시, C1-C4 카르보닐, C1-C4 카르복실, C1-C4 시아노, C1-C4 술피닐, C1-C4 술포닐; 또는
    R5는 술포닐 또는 에스테르, SO2R 또는 CO2R이고, 상기 R은 C1-C4 알킬이고, 임의적으로 플루오르화된 것이고;
    상기 R4 및 R5는 헤테로사이클릭 고리로 결합될 수 있다.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 R1은 임의적으로 치환된 C5 또는 C6 아릴 또는 헤테로아릴;
    상기 R2는 임의적으로 치환된 이종 원자 또는 임의적으로 치환된, 임의적으로 헤테로-, 임의적으로 사이클릭 C1-C10 히드로카르빌로부터 독립적으로 선택된 0 내지 5개의 치환기;
    상기 R3은 임의적으로 치환된 이종 원자 또는 임의적으로 치환된, 임의적으로 헤테로-, 임의적으로 사이클릭 C1-C10 히드로카르빌로부터 독립적으로 선택된 0 내지 4개의 치환기;
    상기 R4는 H, 임의적으로 치환된 이종 원자 또는 임의적으로 치환된, 임의적으로 헤테로-, 임의적으로 사이클릭 C1-C10 히드로카르빌; 및
    상기 R5는 임의적으로 치환된 이종 원자 또는 임의적으로 치환된, 임의적으로 헤테로-, 임의적으로 사이클릭 C1-C10 히드로카르빌인 조성물.
  13. 제11항에 있어서,
    상기 R1은 N, O 및 S로부터 선택된 1 내지 3개의 이종 원자를 갖는 임의적으로 치환된 C5 또는 C6 아릴 또는 헤테로아릴;
    상기 R2는 할로겐, 아미드, 아민, 이민, 이미드, 니트로, 니트로소, 질산염, 아질산염, 시아노, 히드록실 또는 히드로카르빌옥시, 또는 알데히드, 케톤, 카르복실, 에테르, 에스테르, 알킬, 알케닐, 알키닐, 술피닐, 술포닐로부터 독립적으로 선택된 0 내지 5개의 치환기;
    상기 R3은 할로겐, 아미드, 아민, 이민, 이미드, 니트로, 니트로소, 질산염, 아질산염, 시아노, 히드록실 또는 히드로카르빌옥시, 또는 알데히드, 케톤, 카르복실, 에테르, 에스테르, 알킬, 알케닐, 알키닐, 술피닐, 술포닐로부터 독립적으로 선택된 0 내지 4개의 치환기;
    상기 R4는 H, 히드록실 또는 히드로카르빌옥시, 또는 알데히드, 케톤, 카르복실, 에테르, 에스테르, 알킬, 알케닐, 알키닐, 술피닐, 술포닐; 또는
    상기 R5는 히드록실 또는 히드로카르빌옥시, 또는 알데히드, 케톤, 카르복실, 에테르, 에스테르, 알킬, 알케닐, 알키닐, 술피닐, 술포닐인 조성물.
  14. 제11항에 있어서,
    상기 R1은 임의적으로 치환된 피롤, 푸란, 티오펜, 이미다졸, 피라졸, 옥사졸, 이소옥사졸, 티아졸, 이소티아졸, 트리아졸, 푸라잔, 옥사디아졸, 티아디아졸, 디옥사졸, 디티아졸, 피리딘, 피란, 티오피란, 디아진, 옥사진, 티아진, 다이옥신, 디티인 및 트리아존;
    상기 R2는 각각 임의적으로 플루오르화된, 할로겐, NO2, N, C1-C4 알킬(Me, Et, cPr, iPr, cBu, tBu), C1-C4 알콕시, C1-C4 카르보닐, C1-C4 카르복실, C1-C4 시아노, C1-C4 술피닐, C1-C4 술포닐로부터 선택된 0 내지 5개의 치환기;
    상기 R3은 각각 임의적으로 플루오르화된, 할로겐, NO2, N, C1-C4 알킬(Me, Et, cPr, iPr, cBu, tBu), C1-C4 알콕시, C1-C4 카르보닐, C1-C4 카르복실, C1-C4 시아노, C1-C4 술피닐, C1-C4 술포닐로부터 선택된 0 내지 4개의 치환기;
    상기 R4는 각각 임의적으로 플루오르화된, H 또는 C1-C4 알킬(Me, Et, cPr, iPr, cBu, tBu), C1-C4 알콕시, C1-C4 카르보닐, C1-C4 카르복실, C1-C4 시아노, C1-C4 술피닐, C1-C4 술포닐; 및
    상기 R5는 각각 임의적으로 플루오르화된, C1-C4 알킬(Me, Et, cPr, iPr, cBu, tBu), C1-C4 알콕시, C1-C4 카르보닐, C1-C4 카르복실, C1-C4 시아노, C1-C4 술피닐, C1-C4 술포닐인 조성물.
  15. 제11항에 있어서,
    상기 R1은 임의적으로 치환된 2- 또는 3-푸라닐 또는 페닐, 2, 3 또는 4-피리딘;
    상기 R2는 할로겐, NO2, N, C1-C4 알킬, C1-C4 알콕시, C1-C4 카르보닐, C1-C4 카르복실, C1-C4 시아노, C1-C4 술피닐, C1-C4 술포닐로부터 선택된 1개의 파라 치환기이며, 각각은 임의적으로 플루오르화된, 바람직하게는 메틸 또는 플루오르화된 메틸;
    상기 R3은 0개의 치환기;
    상기 R4는 H; 및
    상기 R5는 술포닐 또는 에스테르, SO2R 또는 CO2R이고, 상기 R은 C1-C4 알킬이고, 임의적으로 플루오르화된 조성물.
  16. 라이브러리 화합물 SW076956을 제외한 구조식 I의 화합물, 또는 이의 염, 수화물 또는 입체 이성질체, 또는 본원에 개시된 화합물인 화합물:
    [구조식 I]
    Figure pct00042

    여기서,
    R1은 임의적으로 치환된 C5 또는 C6 아릴 또는 헤테로아릴;
    R1은 N, O 및 S로부터 선택된 1 내지 3개의 이종 원자를 갖는 임의적으로 치환된 C5 또는 C6 아릴 또는 헤테로아릴;
    R1은 임의적으로 치환된 피롤, 푸란, 티오펜, 이미다졸, 피라졸, 옥사졸, 이소옥사졸, 티아졸, 이소티아졸, 트리아졸, 푸라잔, 옥사디아졸, 티아디아졸, 디옥사졸, 디티아졸, 피리딘, 피란, 티오피란, 디아진, 옥사진, 티아진, 다이옥신, 디티인 및 트리아존; 또는
    R1은 임의적으로 치환된 2- 또는 3-푸라닐 또는 페닐, 2, 3 또는 4-피리딘이고;
    R2는 임의적으로 치환된 이종 원자 또는 임의적으로 치환된, 임의적으로 헤테로-, 임의적으로 사이클릭 C1-C10 히드로카르빌로부터 독립적으로 선택된 0 내지 5개의 치환기;
    R2는 할로겐, 아미드, 아민, 이민, 이미드, 니트로, 니트로소, 질산염, 아질산염, 시아노, 히드록실 또는 히드로카르빌옥시, 또는 알데히드, 케톤, 카르복실, 에테르, 에스테르, 알킬, 알케닐, 알키닐, 술피닐, 술포닐로부터 독립적으로 선택된 0 내지 5개의 치환기;
    R2는 각각 임의적으로 플루오르화된, 할로겐, NO2, N, C1-C4 알킬(Me, Et, cPr, iPr, cBu, tBu), C1-C4 알콕시, C1-C4 카르보닐, C1-C4 카르복실, C1-C4 시아노, C1-C4 술피닐, C1-C4 술포닐로부터 선택된 0 내지 5개의 치환기; 또는
    R2는 할로겐, NO2, N, C1-C4 알킬, C1-C4 알콕시, C1-C4 카르보닐, C1-C4 카르복실, C1-C4 시아노, C1-C4 술피닐, C1-C4 술포닐로부터 선택된 1개의 파라 치환기이며, 각각은 임의적으로 플루오르화된, 바람직하게는 메틸 또는 플루오르화 메틸이고;
    R3은 임의적으로 치환된 이종 원자 또는 임의적으로 치환된, 임의적으로 헤테로-, 임의적으로 사이클릭 C1-C10 히드로카르빌로부터 독립적으로 선택된 0 내지 4개의 치환기;
    R3은 할로겐, 아미드, 아민, 이민, 이미드, 니트로, 니트로소, 질산염, 아질산염, 시아노, 히드록실 또는 히드로카르빌옥시, 또는 알데히드, 케톤, 카르복실, 에테르, 에스테르, 알킬, 알케닐, 알키닐, 술피닐, 술포닐로부터 독립적으로 선택된 0 내지 4개의 치환기;
    R3은 각각 임의적으로 플루오르화된, 할로겐, NO2, N, C1-C4 알킬(Me, Et, cPr, iPr, cBu, tBu), C1-C4 알콕시, C1-C4 카르보닐, C1-C4 카르복실, C1-C4 시아노, C1-C4 술피닐, C1-C4 술포닐로부터 선택된 0 내지 4개의 치환기; 또는
    R3은 0개의 치환기이고;
    R4는 H, 임의적으로 치환된 이종 원자 또는 임의적으로 치환된, 임의적으로 헤테로-, 임의적으로 사이클릭 C1-C10 히드로카르빌, 또는
    R4는 H, 히드록실 또는 히드로카르빌옥시, 또는 알데히드, 케톤, 카르복실, 에테르, 에스테르, 알킬, 알케닐, 알키닐, 술피닐, 술포닐;
    R4는 각각 임의적으로 플루오르화된, H 또는 C1-C4 알킬(Me, Et, cPr, iPr, cBu, tBu), C1-C4 알콕시, C1-C4 카르보닐, C1-C4 카르복실, C1-C4 시아노, C1-C4 술피닐, C1-C4 술포닐; 또는
    R4는 H이고;
    R5는 임의적으로 치환된 이종 원자 또는 임의적으로 치환된, 임의적으로 헤테로-, 임의적으로 사이클릭 C1-C10 히드로카르빌;
    R5는 히드록실 또는 히드로카르빌옥시, 또는 알데히드, 케톤, 카르복실, 에테르, 에스테르, 알킬, 알케닐, 알키닐, 술피닐, 술포닐;
    R5는 각각 임의적으로 플루오르화된, C1-C4 알킬(Me, Et, cPr, iPr, cBu, tBu), C1-C4 알콕시, C1-C4 카르보닐, C1-C4 카르복실, C1-C4 시아노, C1-C4 술피닐, C1-C4 술포닐; 또는
    R5는 술포닐 또는 에스테르, SO2R 또는 CO2R이고, 상기 R은 C1-C4 알킬이고, 임의적으로 플루오르화된 것이고;
    상기 R4 및 R5는 헤테로사이클릭 고리로 결합될 수 있다.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 R1은 임의적으로 치환된 C5 또는 C6 아릴 또는 헤테로아릴;
    상기 R2는 임의적으로 치환된 이종 원자 또는 임의적으로 치환된, 임의적으로 헤테로-, 임의적으로 사이클릭 C1-C10 히드로카르빌로부터 독립적으로 선택된 0 내지 5개의 치환기;
    상기 R3은 임의적으로 치환된 이종 원자 또는 임의적으로 치환된, 임의적으로 헤테로-, 임의적으로 사이클릭 C1-C10 히드로카르빌로부터 독립적으로 선택된 0 내지 4개의 치환기;
    상기 R4는 H, 임의적으로 치환된 이종 원자 또는 임의적으로 치환된, 임의적으로 헤테로-, 임의적으로 사이클릭 C1-C10 히드로카르빌; 및
    상기 R5는 임의적으로 치환된 이종 원자 또는 임의적으로 치환된, 임의적으로 헤테로-, 임의적으로 사이클릭 C1-C10 히드로카르빌인 화합물.
  18. 제16항에 있어서,
    상기 R1은 N, O 및 S로부터 선택된 1 내지 3개의 이종 원자를 갖는 임의적으로 치환된 C5 또는 C6 아릴 또는 헤테로아릴;
    상기 R2는 할로겐, 아미드, 아민, 이민, 이미드, 니트로, 니트로소, 질산염, 아질산염, 시아노, 히드록실 또는 히드로카르빌옥시, 또는 알데히드, 케톤, 카르복실, 에테르, 에스테르, 알킬, 알케닐, 알키닐, 술피닐, 술포닐로부터 독립적으로 선택된 0 내지 5개의 치환기;
    상기 R3은 할로겐, 아미드, 아민, 이민, 이미드, 니트로, 니트로소, 질산염, 아질산염, 시아노, 히드록실 또는 히드로카르빌옥시, 또는 알데히드, 케톤, 카르복실, 에테르, 에스테르, 알킬, 알케닐, 알키닐, 술피닐, 술포닐로부터 독립적으로 선택된 0 내지 4개의 치환기;
    상기 R4는 H, 히드록실 또는 히드로카르빌옥시, 또는 알데히드, 케톤, 카르복실, 에테르, 에스테르, 알킬, 알케닐, 알키닐, 술피닐, 술포닐; 또는
    상기 R5는 히드록실 또는 히드로카르빌옥시, 또는 알데히드, 케톤, 카르복실, 에테르, 에스테르, 알킬, 알케닐, 알키닐, 술피닐, 술포닐인 화합물.
  19. 제16항에 있어서,
    상기 R1은 임의적으로 치환된 피롤, 푸란, 티오펜, 이미다졸, 피라졸, 옥사졸, 이소옥사졸, 티아졸, 이소티아졸, 트리아졸, 푸라잔, 옥사디아졸, 티아디아졸, 디옥사졸, 디티아졸, 피리딘, 피란, 티오피란, 디아진, 옥사진, 티아진, 다이옥신, 디티인 및 트리아존;
    상기 R2는 각각 임의적으로 플루오르화된, 할로겐, NO2, N, C1-C4 알킬(Me, Et, cPr, iPr, cBu, tBu), C1-C4 알콕시, C1-C4 카르보닐, C1-C4 카르복실, C1-C4 시아노, C1-C4 술피닐, C1-C4 술포닐로부터 선택된 0 내지 5개의 치환기;
    상기 R3은 각각 임의적으로 플루오르화된, 할로겐, NO2, N, C1-C4 알킬(Me, Et, cPr, iPr, cBu, tBu), C1-C4 알콕시, C1-C4 카르보닐, C1-C4 카르복실, C1-C4 시아노, C1-C4 술피닐, C1-C4 술포닐로부터 선택된 0 내지 4개의 치환기;
    상기 R4는 각각 임의적으로 플루오르화된, H 또는 C1-C4 알킬(Me, Et, cPr, iPr, cBu, tBu), C1-C4 알콕시, C1-C4 카르보닐, C1-C4 카르복실, C1-C4 시아노, C1-C4 술피닐, C1-C4 술포닐; 및
    상기 R5는 각각 임의적으로 플루오르화된, C1-C4 알킬(Me, Et, cPr, iPr, cBu, tBu), C1-C4 알콕시, C1-C4 카르보닐, C1-C4 카르복실, C1-C4 시아노, C1-C4 술피닐, C1-C4 술포닐인 화합물.
  20. 제16항에 있어서,
    상기 R1은 임의적으로 치환된 2- 또는 3-푸라닐 또는 페닐, 2, 3 또는 4-피리딘;
    상기 R2는 할로겐, NO2, N, C1-C4 알킬, C1-C4 알콕시, C1-C4 카르보닐, C1-C4 카르복실, C1-C4 시아노, C1-C4 술피닐, C1-C4 술포닐로부터 선택된 1개의 파라 치환기이며, 각각은 임의적으로 플루오르화된, 바람직하게는 메틸 또는 플루오르화된 메틸;
    상기 R3은 0개의 치환기;
    상기 R4는 H; 및
    상기 R5는 술포닐 또는 에스테르, SO2R 또는 CO2R이고, 상기 R은 C1-C4 알킬이고, 임의적으로 플루오르화된 화합물.
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