KR20210025083A - 압타머 제제 - Google Patents

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KR20210025083A
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aqueous liquid
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liquid formulation
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요시카즈 나카무라
가즈마사 아키타
유서프 알리
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가부시키가이샤 리보믹
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Abstract

본 발명은, 압타머, 특히 FGF2에 대한 압타머의 활성을 장기간에 걸쳐 안정되게 유지할 수 있는 제제 처방을 제공하고, 이로써 압타머, 특히 FGF2 압타머를 유효 성분으로 하는 의약 제제를 제공한다.

Description

압타머 제제
본 발명은, 압타머 제제, 특히 염기성 섬유아세포 증식인자(FGF2)에 대한 압타머를 유효 성분으로 하는 압타머 제제에 관한 것이다.
최근, RNA 압타머의 치료약, 진단약, 시약에의 응용이 주목받고 있어, 몇 가지 RNA 압타머가 임상 단계 혹은 실용화 단계에 들어섰다. 2004년 12월에는, 세계 최초의 RNA 압타머 의약인 Macugen(등록상표)(일반명: 페갑타닙나트륨)이 가령(加齡)성 황반변성증의 치료약으로서 미국에서 승인되어, 일본에서도 2008년 7월에 승인되었다. Macugen(등록상표)은, VEGF에 대한 압타머를 활성 본체로 한다. 상기 압터머는 28개의 핵산 분자로 이루어진 합성 올리고뉴클레오티드로 구성되며, 그 5' 말단에 폴리에틸렌글리콜(PEG) 유도체가 결합되어 있다.
Macugen(등록상표)의 제형은 프리필드 시린지 주사제로, 유리체 내에 주사한다. 무색에서 약간 착색된 맑은 수성 주사액이며, 인산수소나트륨, 인산이수소나트륨, 등장화제 및 pH 조정제가 첨가되어 있다. 이 제제 처방으로 25±2℃의 가속 시험에서 6개월간, 5±3℃의 장기 보존 시험에서도 36개월간에 걸쳐 안정되게 존재하는 것이 기재되어 있다(비특허문헌 1).
한편, 본원의 출원 시점에서, Macugen(등록상표) 이외에 압타머를 유효 성분으로 하는 의약품은 존재하지 않아, 압타머 제제에 어떠한 제제 처방이 적절한지는 전혀 알려져 있지 않다.
출원인은, FGF2에 대한 압타머를 유효 성분으로 하고, 가령황반변성증이나 연골무형성증, 또한 암성동통을 적응증으로 하는 의약품을 개발중이다(특허문헌 1및 2). 본 발명자들은, FGF2 압타머 제제의 개발을 진행시키는 과정에서, Macugen(등록상표)과 대체로 동일하다고 생각되는 제제 처방이나, 인산완충생리식염수(PBS)를 매체로 한 제제 처방에서는, FGF2 압타머의 활성을 유지할 수 없다고 하는 결과를 얻었다.
[특허문헌 1] 국제 공개 제2011/099576호 [특허문헌 2] 국제 공개 제2015/147017호
[비특허문헌 1] 의약품인터뷰폼 가령황반변성증 치료 마쿠젠(등록상표) 유리체내 주사용 키트 0.3 mg 2015년 3월(개정 제5판)
따라서, 본 발명의 목적은, 압타머, 특히 FGF2에 대한 압타머의 활성을 장기간에 걸쳐 안정되게 유지할 수 있는 제제 처방을 제공하며, 이로써 압타머, 특히 FGF2 압타머를 유효 성분으로 하는 의약 제제를 제공하는 것이다.
본 발명자들은, 상기한 목적을 달성하기 위해 예의 검토를 거듭한 결과, FGF2 압타머에 있어서의 최적의 제제 조건을 발견하는 것에 성공하여, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
즉, 본 발명은 이하의 것을 제공한다.
[1] FGF2에 결합하는 압타머 또는 그 염과, 비전해질인 삼투압 조정제를 함유하여 이루어지는, 상기 압타머 또는 그 염이 장기간 안정된 수성 액제.
[2] 상기 압타머 또는 그 염 이외에, 실질적으로 전해질을 함유하지 않는 [1]에 기재된 수성 액제.
[3] 상기 압타머가, 하기 식 (1):
Figure pct00001
(여기서, N1 및 N6은 각각 독립적으로 임의의 0∼수개의 염기를 나타내고, N2, N3, N4 및 N5는 독립적으로 임의의 1개의 염기를 나타낸다)
로 표시되는 뉴클레오티드 서열(단, 우라실은 티민이어도 좋음)을 포함하는 압타머로서, 이하의 (a) 또는 (b) 중 어느 하나인 [1] 또는 [2]에 기재된 수성 액제:
(a) 상기 압타머에 포함되는 뉴클레오티드에 있어서,
(i) 각 피리미딘 뉴클레오티드의 리보오스의 2' 위치가 불소 원자이고
(ii) 각 퓨린 뉴클레오티드의 리보오스의 2' 위치가 히드록시기이다;
(b) 상기 (a)의 압타머에 있어서,
(i) 각 피리미딘 뉴클레오티드의 리보오스의 2' 위치의 불소 원자가, 각각 독립적으로 무치환이거나, 수소 원자, 히드록시기 및 메톡시기로 이루어진 군으로부터 선택되는 원자 또는 기로 치환되어 있고
(ii) 각 퓨린 뉴클레오티드의 리보오스의 2' 위치의 히드록시기가, 각각 독립적으로 무치환이거나, 수소 원자, 메톡시기 및 불소 원자로 이루어진 군으로부터 선택되는 원자 또는 기로 치환되어 있다.
[4] 상기 압타머가, 하기 식 (3):
Figure pct00002
(여기서, N1 및 N62는 각각 독립적으로 임의의 0∼수개의 염기를 나타낸다)
으로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 [1] 또는 [2]에 기재된 수성 액제.
[5] 상기 압타머가, 서열번호 3, 8, 9, 10 또는 12로 표시되는 어느 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 [1] 또는 [2]에 기재된 수성 액제.
[6] 압타머의 농도가 1∼60 mg/mL인 [1]∼[5] 중 어느 하나에 기재된 수성 액제.
[7] 삼투압 조정제의 배합 비율이, 수성 액제 전체의 2∼7.5%(w/v)인 [1]∼[6] 중 어느 하나에 기재된 수성 액제.
[8] 삼투압 조정제가 만니톨인 [1]∼[7] 중 어느 하나에 기재된 수성 액제.
[9] 압타머 1 mg에 대하여, 만니톨을 1∼50 mg의 비율로 함유하는 [8]에 기재된 수성 액제.
[10] 5℃ 이하로 보존되는 [1]∼[9] 중 어느 하나에 기재된 수성 액제.
[11] 4℃에서 3개월 보존 후의 단량체 압타머의 비율이 80% 이상인 [1]∼[10] 중 어느 하나에 기재된 수성 액제.
[12] 주사제인 [1]∼[11] 중 어느 하나에 기재된 수성 액제.
[13] 혈관신생을 수반하는 질환, 골·연골 질환 또는 동통의 예방 또는 치료용인 [1]∼[12] 중 어느 하나에 기재된 수성 액제.
[14] [1]∼[12] 중 어느 하나에 기재된 수성 액제를 대상으로 투여하는 것을 포함하는, 혈관신생을 수반하는 질환, 골·연골 질환 또는 동통의 예방 또는 치료 방법.
[15] 혈관신생을 수반하는 질환, 골·연골 질환 또는 동통의 예방 또는 치료에 있어서의 사용을 위한 [1]∼[12] 중 어느 하나에 기재된 수성 액제.
본 발명에 따르면, 유효 성분인 FGF2에 대한 압타머 또는 그 염을, 수성 액제의 형태로 장기간 안정되게 보존할 수 있기 때문에, 취급이 용이한 압타머 제제를 제공할 수 있다.
본 발명은, FGF2에 대한 압타머 또는 그 염을 유효 성분으로 하고, 상기 압타머 또는 그 염이 장기간 안정되게 유지되는 의약 제제(이하, 「본 발명의 압타머 제제」라고도 함)를 제공한다. 여기서 「장기간 안정」이라고 하는 것은, 유리병 안에 상기 제제를 봉입하여 4℃에서 3개월간 보존한 후의 단량체 압타머의 비율이 70% 이상인 것을 의미한다. 단량체 압타머의 비율은, 사이즈 배제 크로마토그래피를 이용하여, 이하의 조건에 의해 단량체와 다량체를 분리·검출하고, (단량체의 피크 면적)/(단량체 및 다량체의 피크 면적의 합)×100(%)을 산출한 값이다.
장치: Waters사 제조 ACQUITY UPLC H-Class Bio
검출기: Waters사 제조 TUV 검출기
칼럼: Waters사 제조 ACQUITY UPLC BEH200 SEC 칼럼
샘플 농도: 0.2 mg/mL
주입량: 5 μL
용리액: 10% 아세토니트릴/PBS
유속: 0.3 mL/분
칼럼 온도: 25℃
본 발명의 압타머 제제는, 유효 성분으로서의 FGF2에 대한 압타머 또는 그 염과, 비전해질인 삼투압 조정제를 함유한다.
압타머란, 소정의 표적 분자에 대한 결합 활성을 갖는 핵산 분자를 말한다. 압타머는, 소정의 표적 분자에 대하여 결합함으로써, 상기 표적 분자의 활성을 저해할 수 있다. 본 발명의 압타머 제제의 유효 성분인 압타머는, FGF2에 대하여 결합 활성을 갖는 압타머이다. 바람직한 실시양태에 있어서, 상기 압타머는, FGF2에 결합하여 FGF2와 FGF 수용체와의 결합을 저해할 수 있는 압타머이다. 즉, 상기 압타머는, FGF2에 대한 저해 활성을 갖는다.
본 발명에 이용되는 압타머는 FGF2에 결합하는 압타머이며, 더욱 바람직하게는 FGF2에 결합하여 FGF2와 FGF 수용체와의 결합을 저해할 수 있는 압타머이다. FGF2와 FGF 수용체와의 결합을 본 발명에 이용되는 압타머가 저해하는지 여부는, 예컨대 실시예 1 등의 표면 플라즈몬 공명법을 이용한 시험에 의해 평가할 수 있다.
FGF2에 대한 압타머는 특별히 제한되지 않지만, 예컨대, 국제 공개 제2015/147017호에 기재된 압타머, 구체적으로는, 하기 식 (1):
Figure pct00003
로 표시되는 뉴클레오티드 서열(단, 우라실은 티민이어도 좋음)을 포함하는 압타머로서, 이하의 (a) 또는 (b) 중 어느 하나인 압타머이다:
(a) 상기 압타머에 포함되는 뉴클레오티드에 있어서,
(i) 각 피리미딘 뉴클레오티드의 리보오스의 2' 위치가 불소 원자이고
(ii) 각 퓨린 뉴클레오티드의 리보오스의 2' 위치가 히드록시기이다;
(b) 상기 (a)의 압타머에 있어서,
(i) 각 피리미딘 뉴클레오티드의 리보오스의 2' 위치의 불소 원자가, 각각 독립적으로 무치환이거나 수소 원자, 히드록시기 및 메톡시기로 이루어진 군으로부터 선택되는 원자 또는 기로 치환되어 있고
(ii) 각 퓨린 뉴클레오티드의 리보오스의 2' 위치의 히드록시기가, 각각 독립적으로 무치환이거나 수소 원자, 메톡시기 및 불소 원자로 이루어진 군으로부터 선택되는 원자 또는 기로 치환되어 있다.
상기 식 (1) 중, N1 및 N6은 각각 독립적으로 임의의 0∼수개의 염기를 나타내고, N2, N3, N4 및 N5는 독립적으로 임의의 1개의 염기를 나타낸다. 본 명세서에 있어서 「염기」란, 핵산을 구성하는 아데닌(A), 구아닌(G), 시토신(C), 우라실(U) 또는 티민(T) 중 어느 하나를 의미한다.
N1의 염기수는, 식 (1)로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 압타머가 FGF2에 결합하는 한 특별히 한정되지 않지만, 예컨대, 0∼약 10개, 0∼9개, 0∼8개, 0∼7개, 0∼6개, 0∼5개, 0∼4개, 0∼3개, 0∼2개 등이어도 좋고, 바람직하게는 0∼2개일 수 있다.
N6의 염기수에 대해서도 N1과 마찬가지로 특별히 한정되지 않지만, 예컨대, 0∼약 10개, 0∼9개, 0∼8개, 0∼7개, 0∼6개, 0∼5개, 0∼4개, 0∼3개 등이어도 좋고, 바람직하게는 0∼10개, 3∼9개, 또는 5∼8개이다.
바람직한 실시양태에 있어서, 상기 식 (1) 중,
N1은 G, GG, AG, C 또는 갭이고,
N2는 A 또는 U이며,
N3은 G, C 또는 A이고,
N4는 G, C 또는 U이며,
N5는 G 또는 U이고,
N6은 UUCN61 또는 AGUCN62(식 중, N61 및 N62는 각각 독립적으로 임의의 0∼수개의 염기임)이다. 여기서, N1이 「갭」이라고 하는 것은, 식 (1) 중에 N1이 존재하지 않는 것, 즉 N1이 0개의 염기인 것을 의미한다.
N61의 염기수는 특별히 한정되지 않지만, 예컨대, 0∼약 10개, 0∼7개, 0∼6개, 0∼5개, 0∼4개 등이면 좋고, 바람직하게는 0∼5개, 1∼5개, 또는 2∼4개일 수 있다.
N62의 염기수에 대해서도 특별히 한정되지 않지만, 예컨대, 0∼약 10개, 0∼7개, 0∼5개, 0∼4개, 0∼3개 등이면 좋고, 바람직하게는 0∼5개, 0∼4개, 또는 0∼3개일 수 있다.
다른 바람직한 실시양태에 있어서, 상기 식 (1) 중,
N1은 G, GG, AG 또는 갭이고,
N2는 A 또는 U이며,
N3은 G 또는 A이고,
N4는 C 또는 U이며,
N5는 G 또는 U이고,
N6은 UUCN61 또는 AGUCN62(식 중, N61 및 N62는 상기와 동일함)이다.
바람직한 실시양태에 있어서, 본 발명에 이용되는 압타머는, 하기 식 (2) 또는 (3):
Figure pct00004
(식 중, N1, N61 및 N62는 상기와 동일함)
로 표시되는 뉴클레오티드 서열, 보다 바람직하게는, 식 (3)으로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
바람직한 실시양태에 있어서, 본 발명에 이용되는 압타머는, 서열번호 1∼12 중 어느 하나로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 이하에, 서열번호 1∼12로 표시되는 뉴클레오티드 서열(단, 우라실은 티민이어도 좋음)을 나타낸다(이하, A, G, C 및 U는 각각 뉴클레오티드의 염기가 아데닌, 구아닌, 시토신 및 우라실인 것을 나타냄).
서열번호 1:
Figure pct00005
서열번호 2:
Figure pct00006
서열번호 3:
Figure pct00007
서열번호 4:
Figure pct00008
서열번호 5:
Figure pct00009
서열번호 6:
Figure pct00010
서열번호 7:
Figure pct00011
서열번호 8:
Figure pct00012
서열번호 9:
Figure pct00013
서열번호 10:
Figure pct00014
서열번호 11:
Figure pct00015
서열번호 12:
Figure pct00016
바람직한 일 실시양태에 있어서, 본 발명에 이용되는 압타머는, 서열번호 1, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 또는 12, 보다 바람직하게는, 서열번호 3, 8, 9, 10 또는 12로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
다른 바람직한 실시양태에 있어서, 본 발명에 이용되는 압타머는, 서열번호 2 또는 7로 표시되는 뉴클레오티드 서열[상기 식 (2)에 포함됨]을 포함한다.
또 다른 바람직한 실시양태에 있어서, 본 발명에 이용되는 압타머는, 서열번호 1, 3, 4, 5, 6 또는 8로 표시되는 뉴클레오티드 서열[상기 식 (3)에 포함됨]을 포함한다.
일 실시양태에 있어서, 본 발명에 이용되는 압타머는, 상기한 어느 하나의 뉴클레오티드 서열에 있어서, 여전히 FGF2에 결합하는 한, 1 또는 수개의 뉴클레오티드가 치환, 결실, 삽입 또는 부가된 뉴클레오티드 서열을 포함하여도 좋고,
(a) 상기 압타머에 포함되는 뉴클레오티드에 있어서,
(i) 각 피리미딘 뉴클레오티드의 리보오스의 2' 위치가 불소 원자이고,
(ii) 각 퓨린 뉴클레오티드의 리보오스의 2' 위치가 히드록시기인 압타머;
(b) 상기 (a)의 압타머에 있어서,
(i) 각 피리미딘 뉴클레오티드의 리보오스의 2' 위치의 불소 원자가 각각 독립적으로 무치환이거나, 수소 원자, 히드록시기 및 메톡시기로 이루어진 군으로부터 선택되는 원자 또는 기로 치환되어 있고,
(ii) 각 퓨린 뉴클레오티드의 리보오스의 2' 위치의 히드록시기가, 각각 독립적으로 무치환이거나, 수소 원자, 메톡시기 및 불소 원자로 이루어진 군으로부터 선택되는 원자 또는 기로 치환되어 있는 압타머
여도 좋다.
여기서, 상기 치환, 결실, 삽입 또는 부가되는 뉴클레오티드수는, 치환, 결실, 삽입 또는 부가 후에도 여전히 FGF2에 결합하는 한 특별히 한정되지 않지만, 예컨대 1∼약 10개, 바람직하게는 1∼6개, 보다 바람직하게는 1∼5개, 더욱 바람직하게는 1∼4개, 더욱 바람직하게는 1∼3개, 가장 바람직하게는 1개 또는 2개일 수 있다. 뉴클레오티드가 치환, 결실, 삽입 또는 부가되는 부위도, 치환, 결실, 삽입 또는 부가 후에도 여전히 FGF2에 결합하는 한 특별히 한정되지 않지만, 상기 식 (1), (2) 및 (3) 중, 1종의 뉴클레오티드(즉, A, G, C 또는 U)로 특정되어 있는 부위에 있어서는, 1∼3 개소, 바람직하게는 1 또는 2 개소, 보다 바람직하게는 1개소에 있어서 뉴클레오티드가 치환, 결실, 삽입 또는 부가된다. 한편, 식 (1), (2) 및 (3) 중, 복수 종의 뉴클레오티드를 취할 수 있는 부위(즉, N1, N2, N3, N4, N5, N6, N61 또는 N62)에 있어서는, 보다 많은 뉴클레오티드(예컨대, 1∼약 10개, 바람직하게는 1∼6개, 보다 바람직하게는 1∼5개, 더욱 바람직하게는 1∼4개)의 치환, 결실, 삽입 또는 부가도 허용될 수 있다. 예컨대, 서열번호 3으로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 원래의 서열로 하면, 서열번호 1은 서열번호 3의 3' 말단의 CC가 UCGA로 치환된 것이고, 서열번호 4는 서열번호 3의 양 말단이 각각 1뉴클레오티드씩 결실된 것이며, 서열번호 5는 서열번호 3의 5' 말단에 G, 3' 말단에 C를 각각 부가한 것이고, 서열번호 6은 서열번호 3의 5' 말단에 A를 부가한 것이며, 서열번호 8은 서열번호 3의 5' 말단의 G를 C로, 3' 말단의 C를 G로 각각 치환한 것이고, 서열번호 9는 서열번호 3의 5' 말단의 GG를 CC로, 3' 말단의 CC를 GG로 각각 치환한 것이며, 서열번호 10은 서열번호 3의 14번째의 A가 G로, 19번째의 U가 C로 각각 치환된 것이고, 서열번호 12는 서열번호 3의 17번째의 A가 U로 치환된 것이다.
본 발명에 이용되는 압타머의 길이는 특별히 한정되지 않고, 통상, 약 10∼약 200 뉴클레오티드일 수 있지만, 예컨대, 약 20 뉴클레오티드 이상(예, 25 뉴클레오티드 이상, 30 뉴클레오티드 이상, 31 뉴클레오티드 이상, 32 뉴클레오티드 이상, 33 뉴클레오티드 이상)이며, 바람직하게는 25 뉴클레오티드 이상이고, 보다 바람직하게는 30 뉴클레오티드 이상이며, 더욱 바람직하게는 33 뉴클레오티드 이상일 수 있다. 또한, 예컨대, 약 100 뉴클레오티드 이하, 통상 약 80 뉴클레오티드 이하, 바람직하게는 약 70 뉴클레오티드 이하, 보다 바람직하게는 약 60 뉴클레오티드 이하, 더욱 바람직하게는 약 50 뉴클레오티드 이하, 더욱 바람직하게는 약 45 뉴클레오티드 이하(예, 44 뉴클레오티드 이하, 43 뉴클레오티드 이하, 42 뉴클레오티드 이하, 41 뉴클레오티드 이하, 40 뉴클레오티드 이하)일 수 있다. 총 뉴클레오티드수가 적으면, 화학 합성 및 대량 생산이 보다 용이하고, 또한 비용면에서의 메리트도 크다. 또한, 화학 수식도 용이하고, 생체내 안정성도 높으며, 독성도 낮다고 생각된다.
따라서 본 발명에 이용되는 압타머의 길이로는, 통상 약 10∼약 200 뉴클레오티드일 수 있고, 바람직하게는 20∼80 뉴클레오티드이며, 보다 바람직하게는 25∼60 뉴클레오티드이고, 더욱 바람직하게는 25∼50 뉴클레오티드이며, 가장 바람직하게는 30∼45 뉴클레오티드이다.
본 발명에 이용되는 압타머는 또한, 상기 식 (1)로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 압타머[압타머(A)]의 복수의 연결물, 상기 식 (1)로 표시되는 뉴클레오티드 서열에 있어서, 1 또는 수개의 뉴클레오티드가 치환, 결실, 삽입 또는 부가된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 압타머[압타머(B)]의 복수의 연결물, 및 1 또는 복수의 압타머(A)와 1 또는 복수의 압타머(B)와의 연결물로 이루어진 군으로부터 선택되는 연결물일 수 있다. 이들 연결물도 FGF2에 결합할 수 있다.
여기서 연결은 탠덤 결합으로 행해질 수 있다. 또한, 연결에 있어서, 링커를 이용하여도 좋다. 링커로는, 뉴클레오티드쇄(예, 1∼약 20 뉴클레오티드), 비뉴클레오티드쇄[예, -(CH2)n-링커, -(CH2CH2O)n-링커, 헥사에틸렌글리콜 링커, TEG 링커, 펩티드를 포함하는 링커, -S-S- 결합을 포함하는 링커, -CONH- 결합을 포함하는 링커, -OPO3- 결합을 포함하는 링커]를 들 수 있다. 상기 복수의 연결물에 있어서의 복수란, 2 이상이면 특별히 한정되지 않지만, 예컨대 2개, 3개 또는 4개일 수 있다.
본 발명에 이용되는 압타머에 포함되는 각 뉴클레오티드는 각각 동일하거나 또는 상이하고, 리보오스(예, 피리미딘 뉴클레오티드의 리보오스, 퓨린 뉴클레오티드의 리보오스)의 2' 위치에 있어서 히드록시기를 포함하는 뉴클레오티드(즉, 천연의 리보뉴클레오티드)이거나, 혹은 리보오스의 2' 위치에 있어서, 히드록시기가, 임의의 원자 또는 기로 치환(수식)되어 있는 뉴클레오티드(본 명세서에 있어서, 「수식 뉴클레오티드」라고 기재하는 경우가 있음)일 수 있다.
이러한 임의의 원자 또는 기로는, 예컨대, 수소 원자, 불소 원자 또는 -O-알킬기(예, -O-Me기), -O-아실기(예, -O-CHO기), 아미노기(예, -NH2기)로 치환되어 있는 뉴클레오티드를 들 수 있다. 본 발명에 이용되는 압타머는 또한, 적어도 1종(예, 1, 2, 3 또는 4종)의 뉴클레오티드가, 리보오스의 2' 위치에 있어서, 히드록시기, 또는 전술한 임의의 원자 또는 기, 예컨대, 수소 원자, 불소 원자, 히드록시기 및 -O-Me기로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 2종(예, 2, 3 또는 4종)의 기를 포함하는 수식 뉴클레오티드일 수 있다.
본 발명에 이용되는 압타머에 있어서는 또한, 모든 피리미딘 뉴클레오티드가, 리보오스의 2' 위치가 불소 원자인 뉴클레오티드이거나, 혹은 상기 불소 원자가, 동일하거나 또는 상이하고, 무치환이거나, 전술한 임의의 원자 또는 기, 바람직하게는, 수소 원자, 히드록시기 및 메톡시기로 이루어진 군으로부터 선택되는 원자 또는 기로 치환되어 있는 뉴클레오티드일 수 있다. 특히 본 발명에 이용되는 압타머의 제조 방법으로서, DuraScribeTM T7 Transcription Kit(Epicentre사 제조)를 이용한 제조 방법을 적용한 경우, 모든 피리미딘 뉴클레오티드의 리보오스 2' 위치가 플루오로화한 압타머를 얻을 수 있다. 불소 원자가 그 밖의 상기 원자 또는 기로 치환되어 있는 압타머는, 후술하는 방법으로 제조할 수 있다.
본 발명에 이용되는 압타머에 있어서는 또한, 모든 퓨린 뉴클레오티드가, 리보오스의 2' 위치가 히드록시기인 뉴클레오티드이거나, 혹은 상기 히드록시기가, 동일하거나 또는 상이하고, 무치환이거나, 전술한 임의의 원자 또는 기, 바람직하게는, 수소 원자, 메톡시기 및 불소 원자로 이루어진 군으로부터 선택되는 원자 또는 기로 치환되는 뉴클레오티드일 수 있다. 히드록시기가 그 밖의 상기 원자 또는 기로 치환되어 있는 압타머는, 후술하는 방법으로 제조할 수 있다.
본 발명에 이용되는 압타머에 있어서는 또한, 모든 피리미딘 뉴클레오티드가, 리보오스의 2' 위치의 불소 원자가 전술한 임의의 원자 또는 기, 예컨대, 수소 원자, 히드록시기 및 -O-Me기로 이루어진 군으로부터 선택되는 동일 원자 또는 기로 치환되어 있는 뉴클레오티드일 수 있다.
본 발명에 이용되는 압타머에 있어서는 또한, 모든 퓨린 뉴클레오티드가, 리보오스의 2' 위치의 히드록시기가 전술한 임의의 원자 또는 기, 예컨대, 수소 원자, 불소 원자 및 -O-Me기로 이루어진 군으로부터 선택되는 동일 원자 또는 기로 치환되어 있는 뉴클레오티드일 수 있다.
바람직한 실시양태에 있어서, 본 발명에 이용되는 압타머에 포함되는 각 피리미딘 뉴클레오티드는 모두 리보오스의 2' 위치에 있어서 불소 원자를 포함하는 뉴클레오티드이고, 또한 각 퓨린 뉴클레오티드는 모두 리보오스의 2' 위치에 있어서 히드록시기를 포함하는 뉴클레오티드이다. 다른 실시양태에 있어서, 상기 각 피리미딘 뉴클레오티드의 리보오스의 2' 위치의 불소 원자는, 각각 독립적으로 수소 원자, 히드록시기 및 메톡시기로 이루어진 군으로부터 선택되는 원자 또는 기로 치환되어 있어도 좋고, 또한 상기 각 퓨린 뉴클레오티드의 리보오스의 2' 위치의 히드록시기는, 각각 독립적으로 수소 원자, 메톡시기 및 불소 원자로 이루어진 군으로부터 선택되는 원자 또는 기로 치환되어 있어도 좋다.
또한, 본 명세서에 있어서는, 압타머를 구성하는 뉴클레오티드를 RNA라고 가정하여(즉 당기를 리보오스라고 가정하여), 뉴클레오티드 중의 당기에 대한 수식의 양태를 설명하였으나, 이것은, 압타머를 구성하는 뉴클레오티드에서 DNA가 제외되는 것을 의미하는 것이 아니라, 적절하게 DNA에 대한 수식으로 바꿔 읽을 수 있다. 예컨대, 압타머를 구성하는 뉴클레오티드가 DNA인 경우, 리보오스의 2' 위치의 히드록실기의 X로의 치환은, 데옥시리보오스의 2' 위치의 수소 원자의 X로의 치환으로 바꿔 읽을 수 있다.
본 발명에 이용되는 압타머에 있어서, 우라실을 티민으로 치환함으로써, FGF2에 대한 결합성, FGF2와 FGF 수용체와의 결합 저해 활성, 압타머의 안정성, 약물 송달성, 혈액 중에서의 안정성 등을 높이는 것이 가능하다.
본 발명에 이용되는 압타머에 있어서는 또한, 뉴클레오티드에 있어서의 인산디에스테르 결합의 1 또는 수개, 예컨대, 1∼2개, 1∼3개, 1∼4개, 1∼5개의 뉴클레오티드가 임의의 치환기로 수식 혹은 치환되어 있어도 좋다. 예컨대, 인산디에스테르 결합이 포스포로티오에이트 결합, 포스포로디티오에이트 결합, 알킬포스포네이트 결합, 포스포로아미데이트 결합 등으로 치환되어 있어도 좋다. 여기서, 예컨대 「뉴클레오티드가 포스포로티오에이트 결합으로 치환되어 있다」라고 하는 것은, 인접한 뉴클레오티드간의 결합 부위에 있는 인산기가 황화되어 있는, 즉, 포스포디에스테르 결합이 포스포로티오에이트 결합으로 개변되어 있는 것을 나타낸다.
본 발명에 이용되는 압타머에 있어서는 또한, 압타머를 안정화하고, 그 활성을 향상시킬 목적으로, 1 또는 수개, 예컨대, 1∼2개, 1∼3개, 1∼4개, 1∼5개의 뉴클레오티드가 가교화 핵산 Bridged Nucleic Acid(BNA) 또는 Locked Nucleic Acid(LNA)로 치환되어 있어도 좋다. 여기서, 「가교화 핵산」이란, 핵산의 자유도를 분자내 가교로 구속함으로써, 상보 서열에 대한 결합 친화성을 높이고, 또한 뉴클레아제 내성을 획득하는 구조를 갖는 것을 말하며, 예컨대, 2',4'-BNA(LNA), 2'-O,4'-C-ethylene-bridged Nucleic Acid(ENA) 등을 들 수 있지만 이들에 한정되지 않는다.
본 발명에 이용되는 압타머는, FGF2에 대한 결합성, 안정성, 약물 송달성 등을 높이기 위해, 각 뉴클레오티드의 당잔기(예, 리보오스)가 수식된 것이어도 좋다. 당잔기에 있어서 수식되는 부위로는, 예컨대, 당잔기의 2' 위치, 3' 위치 및/또는 4' 위치의 산소 원자를 다른 원자로 치환한 것 등을 들 수 있다. 수식의 종류로는, 예컨대, 플루오로화, O-알킬화(예, O-메틸화, O-에틸화), O-알릴화, S-알킬화(예, S-메틸화, S-에틸화), S-알릴화, 아미노화(예, -NH2)를 들 수 있다. 그 외에도, 4' 위치의 산소를 황으로 치환한 4’-SRNA, 2' 위치와 4' 위치를 메틸렌을 통해 가교한 LNA(Locked Nucleic Acid), 3' 위치의 수산기를 아미노기로 치환한 3'-N-포스포로아미데이트핵산 등을 예로서 들 수 있다. 본 발명에 이용되는 압타머는, 그 제조 방법으로부터 피리미딘 뉴클레오티드의 리보오스 2' 위치의 산소 원자가 일정한 수식을 가지고 제조되는 경우가 있으며, 예컨대, DuraScribeTM T7 Transcription Kit(Epicentre사 제조)를 이용한 제조 방법을 적용한 경우, 바람직하게는 모든 피리미딘 뉴클레오티드의 리보오스 2' 위치가 플루오로화한 압타머가 제조된다. 따라서, 얻어진 압타머에 대하여 그 후 이러한 당잔기의 개변을 가함으로써, 염기서열은 동일하지만 활성을 높인 다양한 바리에이션의 압타머를 제조하는 것이 가능하다. 이상으로부터, 본 발명에 이용되는 압타머는, 바람직하게는 적어도 하나의 뉴클레오티드의 당잔기가 수식된 압타머일 수 있다. 이러한 당잔기의 개변은, 자체 공지된 방법에 의해 행할 수 있다[예컨대, Sproat et al., (1991), Nucl. Acid. Res. 19, 733-738; Cotton et al., (1991), Nucl. Acid. Res. 19, 2629-2635; Hobbs et al., (1973), Biochemistry 12, 5138-5145 참조]. 구체적으로는, 모든 피리미딘 뉴클레오티드의 리보오스 2' 위치의 수산기가 플루오로기로 치환된 압타머를 베이스로, 리보오스 2' 위치에 있어서의 수산기를, 수소 원자, 히드록실기 및 메톡시기로 이루어진 군으로부터 선택되는 원자 또는 기로 치환한 압타머를 제조할 수 있다.
본 발명에 이용되는 압타머는 또한, FGF2에 대한 결합성, 다량체화의 방지, 안정성, 약물 송달성 등을 높이기 위해, 핵산염기(예, 퓨린, 피리미딘)가 개변(예, 화학적 치환)된 것이어도 좋다. 이러한 개변으로는, 예컨대, 5위 피리미딘 개변, 6 및/또는 8위 퓨린 개변, 환외(環外) 아민에 의한 개변, 4-티오우리딘에 의한 치환, 5-브로모 또는 5-요오드-우라실에 의한 치환을 들 수 있다. 또한, 뉴클레아제 및 가수 분해에 대하여 내성인 바와 같이, 본 발명에 이용되는 압타머에 포함되는 인산기가 개변되어 있어도 좋다. 예컨대, P(O)O기가, P(O)S(티오에이트), P(S)S(디티오에이트), P(O)N(R)R'(아미데이트, P(O)R, P(O)OR, CO 또는 CH2(포름아세탈) 또는 3'-아민(-NH-CH2-CH2-)으로 치환되어 있어도 좋다[여기서 각각의 R 또는 R'는 독립적으로 H이거나, 혹은 치환되어 있거나, 또는 치환되어 있지 않은 알킬(예, 메틸, 에틸)이다].
연결기로는, -O-, -N- 또는 -S-가 예시되며, 이들 연결기를 통해 인접한 뉴클레오티드에 결합할 수 있다.
개변은 또한, 캐핑과 같은 3' 및 5'의 개변을 포함하여도 좋다.
개변은 폴리에틸렌글리콜(PEG), 아미노산, 펩티드, 반전(inverted) dT, 핵산, 뉴클레오시드, 미리스토일(Myristoyl), 리토콜릭-올레일(Lithocolic-oleyl), 도코사닐(Docosanyl), 라우로일(Lauroyl), 스테아로일(Stearoyl), 팔미토일(Palmitoyl), 올레오일(Oleoyl), 리놀레오일(Linoleoyl), 기타 지질, 스테로이드, 콜레스테롤, 카페인, 비타민, 색소, 형광물질, 항암제, 독소, 효소, 방사성 물질, 비오틴 등을 말단에 더 부가함으로써 행해질 수 있다. 이러한 개변에 대해서는 예컨대 미국 특허 제5,660,985호, 동 제5,756,703호를 참조.
특히, 개변이 PEG의 말단 부가에 의해 행해지는 경우, PEG의 분자량은 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 1000∼100000, 보다 바람직하게는 30000∼90000이다. PEG는, 직쇄상이어도 좋고, 2개 이상의 쇄로 분기된 것(멀티 아암 PEG)이어도 좋다. PEG의 말단 부가는 후술하는 압타머의 다량체화의 방지에 유용하다.
이러한 PEG로서는 특별히 한정되지 않고, 당업자라면 시판 혹은 공지된 PEG를 적절하게 선택하여 이용할 수 있지만(예컨대, http://www.peg-drug.com/peg_product/branched.html을 참조), 본 발명에 이용되는 압타머에 적용하는 PEG의 적합예로서 구체적으로는, 분자량 40000의 2분기 GS형 PEG(SUNBRIGHT GL2-400GS 니치유 제조), 분자량 40000의 2분기 TS형 PEG(SUNBRIGHT GL2-400TS 니치유 제조), 분자량 40000의 4분기 TS형 PEG(SUNBRIGHT GL4-400TS 니치유 제조), 분자량 80000의 2분기 TS형 PEG(SUNBRIGHT GL2-800TS 니치유 제조), 또는 분자량 80000의 4분기 TS형 PEG(SUNBRIGHT GL4-800TS 니치유 제조) 등을 들 수 있다.
이 경우, 본 발명에 이용되는 압타머는, PEG가 말단에 직접 부가되어 있어도 좋지만, 그 말단에 PEG와 결합 가능한 기를 갖는 링커 등이 부가되며, 그것을 통해 PEG를 본 발명에 이용되는 압타머에 부가하는 것이 보다 바람직하다.
PEG와 본 발명에 이용되는 압타머의 링커로서는 특별히 한정되지 않고, 탄소쇄수나 작용기 등을 결합 부위나 PEG의 종류 등에 따라 적절하게 선택할 수 있다. 이러한 링커로는, 예컨대 아미노기를 갖는 링커를 들 수 있고, 구체적으로는, 5' 말단에 부가하는 경우는, ssH Linker(SAFC) 또는 DMS(O)MT-AMINO-MODIFIER(GLENRESEARCH)가, 3' 말단에 부가하는 경우는, TFA Amino C-6 lcaa CPG(ChemGenes) 등이 예시된다. 이 링커를 선택한 경우, PEG에는, 예컨대 N-히드록시숙신이미드의 활성기를 부가한 후에, 이것을 링커측의 아미노기와 반응시킴으로써, 본 발명에 이용되는 압타머와 PEG를 링커를 통해 결합할 수 있다.
또한 PEG나 링커로는, 시판되고 있는 것을 바람직하게 이용할 수 있다. 또한 PEG, 링커 및 본 발명에 이용되는 압타머의 결합에 관한 반응 조건 등은, 당업자라면 적절하게 설정하는 것이 가능하다.
본 발명에 이용되는 압타머의 보다 바람직한 실시양태로서, 서열번호 3으로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 압타머 ID1:
Figure pct00017
Figure pct00018
서열번호 8로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 압타머 ID2:
Figure pct00019
서열번호 9로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 압타머 ID3:
Figure pct00020
서열번호 10으로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 압타머 ID4:
Figure pct00021
서열번호 12로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 압타머 ID5:
Figure pct00022
서열번호 3으로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 압타머 ID6:
Figure pct00023
(상기 각 식 중, 각 뉴클레오티드에 있어서의 괄호는 리보오스의 2' 위치의 수식을 나타내고, F는 불소 원자, M은 메톡시기를 나타낸다.)
이들 압타머는, 어느 것을 이용했다고 해도 본 발명의 압타머 제제의 구성에 있어서 안정되게 존재할 수 있기 때문에, 본 발명의 압타머 제제의 유효 성분으로서 적절하다.
본 발명에 이용되는 압타머는, 프리체여도 좋고, 의약상 허용되는 그의 염이어도 좋다. 그러한 염으로는, 금속염, 암모늄염, 유기아민 부가염, 아미노산 부가염 등을 들 수 있다. 금속염으로는, 나트륨염, 칼륨염 등의 알칼리 금속염, 마그네슘염, 칼슘염 등의 알칼리 토류 금속염, 알루미늄염, 아연염 등을 들 수 있다. 암모늄염으로는, 암모늄, 테트라메틸암모늄 등의 염을 들 수 있다. 유기아민 부가염으로는, 트리스히드록시아미노메탄 등의 염을 들 수 있다. 아미노산 부가염으로는, 리신, 아르기닌, 히스티딘, 트립토판, 오르니틴 등의 염을 들 수 있다.
본 발명에 이용되는 FGF2에 대한 압타머의 농도는 특별히 한정되지 않고, 본 발명의 압타머 제제가 목적의 효능 효과를 발휘하는 한 어느 정도 포함되어 있어도 좋다. 본 명세서에 있어서 「압타머의 농도」란, 압타머 분자를 구성하는 5'→3' 인산 결합으로 연결되는 핵산 부분의 중량이 제제 전체의 체적에서 차지하는 비율(mg/mL)을 의미한다. 상기 압타머의 농도로서, 예컨대, 1∼60 mg/mL를 들 수 있다.
FGF2에 대한 압타머의 농도가 20 mg/mL를 초과하면, 통상의 보존 온도인 4∼5℃에서도 상기 압타머의 다량체가 생기기 쉬워지는 경향이 있다. FGF2에 대한 압타머는, 단량체로 존재하는 경우에 FGF2에 결합하고, FGF2의 기능을 저해함과 더불어 그 약효를 발휘하지만, 다량체화하고 있으면 비아 코어를 이용한 어세이에 있어서 FGF2에의 결합은 확인되지 않아, FGF2의 기능을 저해하지 않는다고 생각된다(실시예 4 참조). 압타머의 농도가 낮은 경우는 분자간 거리가 멀어 다량체화하는 경향은 낮지만, 압타머 농도가 20 mg/mL를 초과하면, 통상의 보존 온도인 4∼5℃에 있어서도 다량체화하여, 결과적으로 FGF2에의 결합 활성이 전체적으로 저하되는 경향이 있다(실시예 5 참조). 그 때문에, 본 발명의 압타머 제제에 있어서의 FGF2 압타머 농도의 상한은, 20 mg/mL를 초과하지 않는 농도인 것이 바람직하다. 또한, 본 발명의 압타머 제제의 압타머 농도가 낮은 경우, 주사제로서의 효과를 얻을 수 없는 경우가 있다. 그 때문에, 본 발명의 압타머 제제에 있어서의 FGF2 압타머 농도의 하한은, 주사제로서의 효과를 얻을 수 있는 농도라면 특별히 한정되지 않지만, 예컨대 1 mg/mL 이상의 농도인 것이 바람직하다.
본 발명의 압타머 제제의 제형은, 수성 액제인 한 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 주사제이다. 본 발명의 압타머 제제는 수성 액제이기 때문에, 유효 성분인 FGF2에 대한 압타머는, 용매 중에 용해되어 존재하고 있다.
통상, 압타머는 그 고차 구조의 유지에, 강전해질인 무기염을 필요로 하는 것이 잘 알려져 있다. 현재 출시되고 있는 유일한 압타머 의약품인 Macugen(등록상표)에 있어서도, 인산수소나트륨, 인산이수소나트륨, 등장화제 및 pH 조정제가 첨가되어 있다. 이 상태에서 Macugen은 25±2℃의 가속 시험에 있어서 6개월간, 5±3℃의 장기 보존 시험에 있어서도 36개월간에 걸쳐 안정되게 존재하는 것이 나타나 있다. 이들로부터, 당업자라면 압타머의 고차 구조를 유지한 상태에서 안정되게 주사제 내에서 존재시키기 위해서는 무기염(전해질)이 필요하다고 생각할 것이다.
그러나, 후술하는 실시예에서 나타낸 바와 같이, 본 발명에 있어서의 유효 성분인 상기 FGF2에 대한 압타머는, 용매로서 PBS나 생리식염수를 사용하면, 강전해질인 무기염의 영향으로 안정성을 잃고, 다량체를 형성하는 경향이 있어, 그 결과로서, FGF2에의 결합 활성을 잃는 것을 알 수 있었다. 그래서, 본 발명자들은, 용매로서 무기염(전해질)을 포함하지 않는 물을 이용한 결과, 예상외로 FGF2 압타머의 다량체화가 억제되어, FGF2 압타머가 단량체로 존재하는 비율이 증대되는 것을 발견하였다(실시예 3 참조).
어떠한 이론에 구속되기를 바라는 것은 아니지만, FGF2 압타머를 수중에 용해시킨 경우, 실시예 1에 나타낸 바와 같이 FGF2 압타머의 Tm값을 측정할 수 없고, 또한, 실시예 2에 나타낸 바와 같이 NMR에 있어서의 프로톤 시프트를 관측할 수 없기 때문에, 수중에 용해된 FGF2 압타머는, 단량체로 완전히 신장된 상태로 존재한다고 상정된다. 즉, 용매로서 무기염을 포함하지 않는 물을 이용함으로써, 활성 구축에 필요하다고 생각되는 압타머의 고차 구조가 파괴되어, 변성하여 단일쇄 상태로 존재하고, 그것에 의해 실활(다량체화)을 막을 수 있다고 생각된다. 게다가, 실시예 4 및 5에 나타낸 바와 같이, 전해질을 포함하는 용액 중에 용해하여 표면 플라즈몬 공명(SPR) 어세이를 실시하면, FGF2 압타머는 FGF2에 대한 결합 활성을 유지하였기 때문에, 수중에 용해된 FGF2 압타머를 체 내에 투여하면, 체액 중에 존재하는 전해질의 작용에 의해 압타머 활성에 필요한 고차 구조가 재구축되어, 활성을 발휘할 수 있는 것이 실증되었다.
이와 같이, 전해질을 포함하지 않는 용매 중에 용해됨으로써, 굳이 FGF2 압타머의 고차 구조를 붕괴시켜 완전히 신장된 상태로 함으로써, 장기 보존 중에도 다량체화를 방지하고, 투여 후에는 생리적인 염농도에 노출됨으로써 고차 구조가 재구축되어 약효를 발휘하는 제제 처방이, 결과적으로는 FGF2 압타머의 활성을 장기간 유지할 수 있는 것이 밝혀졌다. 본 발명은 이러한 용액 중에 있어서의 압타머의 존재 양식을 상세히 검증함으로써 완성된 것으로, 설령 당업자라 할지라도 용이하게 상도할 수 없는 것이다.
이상으로부터, 본 발명의 압타머 제제에 이용되는 용매로는, 무기염(전해질)을 포함하지 않는 수성 용매가 바람직하고, 특히 바람직하게는 물이다.
본 발명의 압타머 제제는, 상기한 바와 같이 무기염(전해질)을 포함하지 않는 용매를 이용하기 때문에 삼투압이 낮아, 그대로는 주사제로 사용할 수 없다. 그 때문에, 본 발명의 압타머 제제는, 혈장 삼투압에 대한 삼투압비를 1 이상, 바람직하게는 1∼3으로 조정할 목적으로, 비전해질인 삼투압 조정제(오스몰라이트)를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 압타머 제제에 이용되는 삼투압 조정제로는, 비전해질이라면 특별히 한정되지 않고, 무기 이온류(칼륨 이온, 염화물 이온 등)를 제외하고 일반적으로 이용되는 삼투압 조정제라면 어떤 것을 이용하여도 좋다. 이러한 삼투압 조정제로는, 다가 알코올(글리세롤, 만니톨, 트레할로오스, 글루코오스, 수크로오스, 소르비톨, 이노시톨 등), 아미노산류(알라닌, 글리신, 글루타민산, 프롤린, GABA, 타우린, 엑토인 등), 메틸암모늄류(TMAO, 콜린, 아세틸콜린, 글리신베타인, GPC, DMSP 등), 요소류 등을 들 수 있지만, 바람직하게는 다가 알코올이 이용되며, 보다 바람직하게는 만니톨이 이용된다.
삼투압 조정제의 양은 특별히 한정되지 않고, 제제 중에 포함되는 FGF2 압타머의 양, 사용하는 삼투압 조정제의 종류(분자량), 목적으로 하는 삼투압에 따라, 당업자라면 적절하게 변경할 수 있다. 예컨대 삼투압 조정제로서 만니톨을 사용하여, 생리식염수에 대한 삼투압비를 약 1로 하는 경우, 삼투압 조정제의 주사제 전체에 있어서의 배합 비율은 2∼7.5%(w/v)가 된다. 보다 구체적으로는, 생리식염수에 대한 삼투압비를 1로 하는 경우, 상기 FGF2 압타머의 농도가 2 mg/ml이면, 만니톨의 배합 비율은 4.9%가 되고, 상기 FGF2 압타머의 농도가 20 mg/ml이면, 만니톨의 배합 비율은 3.6%가 된다.
본 발명의 압타머 제제는, 유효 성분인 FGF2에 대한 압타머 또는 그 염 이외에, 실질적으로 전해질을 함유하지 않는 것이 바람직하다. 여기서 「실질적으로 함유하지 않는다」라고 하는 것은, 제제 중의 FGF2 압타머를 장기간 안정되게 보존할 수 있는 범위에서 소량의 전해질을 함유하여도 좋은 것을 의미한다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 압타머 제제는, 유효 성분인 FGF2에 대한 압타머 또는 그 염 이외에 전해질을 함유하지 않는다.
본 발명의 압타머 제제에는, 필요에 따라, 의약상 허용되는 첨가제를 더 함유시킬 수 있다. 그와 같은 첨가제로는, 예컨대, 안정화제, 보존제, 용해보조제, 완충제, pH 조정제, 무통화제 등을 들 수 있고, 종래부터 주사제용 첨가제로서 주지 관용의 비전해질인 의약 첨가물이 바람직하게 이용될 수 있다.
본 발명의 압타머 제제의 pH는 특별히 제한되지 않지만, 주사제로서 사용되는 경우, 중성 부근의 pH인 것이 바람직하고, 예컨대 pH5∼9, 바람직하게는 6∼8의 범위 내에서 적절하게 선택할 수 있다. 유효 성분인 FGF2에 대한 압타머 또는 그 염을 물에 용해시키면, 용액의 pH는 상기 범위 내가 되기 때문에, 본 발명의 압타머 제제에는, 전해질인 pH 조정제, 완충제를 굳이 첨가할 필요는 없다.
본 발명의 압타머 제제에는, FGF2 압타머의 활성이나 안정성에 악영향을 미치지 않는 한, 다른 활성 성분을 배합하여도 좋다. 그와 같은 활성 성분으로는, 혈관신생을 수반하는 질환 등의 치료약으로서의 마쿠젠(등록상표), 루센티스(등록상표), 아일리아(등록상표), 아바스틴(등록상표) 등의 VGEF 저해제, 스테로이드 등의 항염증제, 골질환 치료약 등으로서의 노르디트로핀(등록상표), 제노트로핀(등록상표) 등의 인간 성장 호르몬 제제, 모르핀 등의 진통·진정제가 포함되어 있어도 좋다. 가령황반변성증 등의 혈관신생을 수반하는 질환, 골다공증, 류마티스 관절염, 변형성 관절증, 골절 등의 골·연골 질환, 동통의 치료용 또는 예방용 의약 화합물을 들 수 있다.
본 발명의 압타머 제제는, 상기한 구성을 취함으로써, 4℃에서도 3개월 이상 안정하다. 여기서 「안정하다」고 하는 것은, 전술한 바와 같이, 유리병 내에 상기 제제를 봉입하여 4℃에서 보관한 후의, 제제 내에 존재하는 단량체 압타머의 비율이 70% 이상인 것을 의미한다. 바람직하게는, 본 발명의 압타머 제제는, 4℃에서 3개월 보존 후 제제 중의 단량체 압타머의 비율이 80% 이상이다. 또한, 본 발명의 압타머 제제는, 백색 형광등이나 근자외 형광등에 노출된 상태에서도 안정하다.
따라서, 본 발명의 압타머 제제는, 그 상태의 수성 액제의 형태로, 바람직하게는, 프리필드 시린지제나 카트리지제 등의 주사제의 제형으로, 5℃ 이하에서의 냉장 보존에 의해 장기간 안정되게 보존할 수 있어, 취급이 매우 용이하다.
본 발명의 압타머 제제는, 예컨대, 가령황반변성증 등의 혈관신생을 수반하는 질환, 골다공증, 류마티스 관절염, 변형성 관절증, 골절 등의 골·연골 질환, 동통의 치료용 또는 예방용 의약으로서 바람직하게 이용할 수 있다.
본 발명의 압타머 제제는, 비경구적으로(예컨대, 정맥내 투여, 피하 투여, 근육내 투여, 국소 투여, 복강내 투여, 경비 투여, 경폐 투여, 점안 투여 등) 투여할 수 있다. 본 발명의 압타머 제제의 투여량은, FGF2 압타머의 종류·활성, 병의 중독도, 투여 대상이 되는 동물종, 투여 대상의 약물 수용성, 체중, 연령 등에 따라 상이하지만, 통상, 성인 1일당 유효 성분(압타머의 올리고뉴클레오티드 부분) 양으로서 약 0.0001∼약 100 mg/kg, 예컨대 약 0.0001∼약 10 mg/kg, 바람직하게는 약 0.005∼약 1 mg/kg일 수 있다.
실시예
이하에, 실시예를 나타내어 보다 상세히 설명하였으나, 본 발명은 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1(용매 중에서의 FGF2 압타머의 구조 해석: Tm값의 결정)
압타머 ID1로 표시되는 압타머의 구조를 이하에 나타낸다. 대문자는 RNA, 소문자는 DNA, idT는 반전 dT를 나타낸다. 또한, 각 뉴클레오티드에 있어서의 괄호는, 그 2' 위치의 수식을 나타내고, F는 불소 원자, M은 O-메틸기를 나타낸다. C6는 -(CH2)6-링커, PEG40TS2는 분자량 40000의 2분기 TS형 폴리에틸렌글리콜(SUNBRIGHT GL2-400TS 니치유 제조)이다.
압타머 ID1:
Figure pct00024
압타머 ID1로 표시되는 압타머를 0.1 mg/mL가 되도록 물로, 0.06 mg/mL가 되도록 PBS 또는 생리식염수로 용해시켰다. 얻어진 용액을 95℃에서 5분간 가열한 후 실온까지 냉각하여, 석영 유리제의 큐벳에 충전하였다. 온도를 20℃에서 90℃까지 변화시키면서 분광 광도계로 UV 흡수를 측정하여 Tm값을 결정하였다.
그 결과, PBS 중에서는 60.1℃, 생리식염수 중에서는 69.6℃였다. 한편 수중에서는 특정 Tm값은 관측되지 않았다. 이것으로부터 압타머 ID1로 표시되는 압타머는 통상 주사제의 용매가 될 수 있는 PBS나 생리식염수에서는 분자간 상호작용에 의해 고차 구조를 형성하는 것이 상정되었다. 또한 압타머 ID1로 표시되는 압타머는 전해질을 포함하지 않는 수중에서는 분자간, 분자 내에서 염기쌍을 형성하지 않아, 고차 구조를 만들지 않는 것이 상정되었다.
실시예 2(중수 중에서의 FGF2 압타머의 구조 해석: NMR 스펙트럼의 측정)
20 mg의 압타머 ID1로 표시되는 압타머를 유리제 바이알에 충전하고, 약 1 mL의 중수에 용해시켜 측정 샘플로 하였다. Bruker Avance 600 MHz NMR spectrometer를 이용하여 측정하였다. 그 결과, 8 ppm보다 저자장으로 관측되어야 할 염기쌍 형성에서 유래되는 이미노프로톤 시그널이 관측되지 않았다.
이것으로부터 압타머 ID1로 표시되는 압타머는 전해질을 포함하지 않는 수중에서는 분자간, 분자 내에서 염기쌍을 형성하지 않아, 고차 구조를 만들지 않는 것이 상정되었다.
실시예 3(전해질을 포함하는 용액 중에서의 FGF2 압타머의 구조 해석: SEC-MALS 측정)
압타머 ID1로 표시되는 압타머를 20 mg/mL가 되도록 생리식염수로 용해하고, 37℃에서 2주간 인큐베이트하여 인공적으로 고차 구조를 형성하는 FGF2 압타머 제제를 조제하였다. 이것과 조제 후 즉시 냉동 보존하여 고차 구조의 형성을 최소한으로 한 샘플을 0.2 mg/mL가 되도록 생리식염수로 각각 희석하여 분석에 제공하였다.
사이즈 배제 크로마토그래피에 의해 단량체와 다량체를 분리하여 각각의 분자량을 Wyatt Technology사의 MALS(Multi Angle Light Scattering) 검출기로써 측정하였다. 사이즈 배제 크로마토그래피는 Waters사 제조 ACQUITY UPLC로 BEH200 SEC 칼럼을 이용하여 실시하였다.
그 결과, 단량체라고 생각되는 피크의 분자량은 약 64000, 다량체로 이루어진 고차 구조라고 생각되는 피크의 분자량은 약 122000으로 측정되었다. 이 결과로부터 압타머 ID1로 표시되는 압타머가 전해질을 포함하는 수중에서 형성하는 고차 구조는 이량체라는 것을 알 수 있었다.
실시예 4(압타머의 단량체 함유율과 결합 활성과의 상관)
압타머 ID1로 표시되는 압타머를 20 mg/mL 또는 2 mg/mL가 되도록 PBS, 생리식염수 또는 3.3%의 만니톨 수용액으로 용해하고, 표 1에 나타낸 보존 조건 하에서 다양한 단량체 함유율을 나타내는 FGF2 압타머 제제를 조제하였다. 여기서, 조제한 각 FGF2 압타머 제제의 단량체 함유량은 사이즈 배제 크로마토그래피로써 결정하였다. 그 결과도 표 1에 나타낸다.
조제한 각 FGF2 압타머 제제의 FGF2 단백질에의 결합 활성은 GE사 제조의 Biacore T200을 이용하여 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의해 측정하였다. 센서칩은 아미노기와 반응하는 CM4를 이용하였다. 인간 FGF2는 고정화 용액(10 mM 아세트산나트륨, pH6)에 용해하여 10 μg/mL로 하였다. 단백질측의 아미노기와 칩측의 카르복실기의 반응에는 에틸-3-카보디이미드히드로클로라이드와 N-히드록시숙신이미드를 이용하였다. 반응 후, 에탄올아민에 의한 블로킹을 행하였다. FGF2의 고정화량은 약 1000RU로 하였다. 애널라이트용 압타머는 5 μM로 조제하였다. 러닝 버퍼에는 295 mM 염화나트륨, 5.4 mM 염화칼륨, 0.8 mM 염화마그네슘, 1.8 mM 염화칼슘, 20 mM Tris, 0.05% Tween20, pH7.6), 재생 용액으로서 2M 염화나트륨을 이용하였다. FGF2는 플로우셀 FC2, 또는 FC4로 고정화하여, FC1 또는 FC3의 결과를 이끌어냄으로써 최종적인 센서그램으로 하였다. 활성은 전해질을 포함하지 않는 용액으로 용사(用事) 조제한 다량체 함유량이 매우 낮은 FGF2 압타머 제제 스탠다드에 대한 상대값으로서 평가하였다.
각 FGF2 압타머 제제의 조제 방법, 단량체 함유율 및 FGF2 단백질에의 결합 활성의 측정 결과를 표 1에 나타낸다. 이 결과로부터 FGF2 압타머 제제의 단량체의 함유량과 FGF2 단백질에의 결합 활성은 상관되어 있는 것이 분명해졌다.
Figure pct00025
실시예 5(FGF2 압타머 제제의 안정성 시험)
압타머 ID1로 표시되는 압타머를 20 mg/mL 또는 2 mg/mL가 되도록 3.3% 또는 3.6% 또는 4.9%의 만니톨 용액에 용해하여 표 2에 나타내는 다양한 온도 조건으로 3개월간 보존한 후 사이즈 배제 크로마토그래피 및 SPR법에 의해 단량체 함유율과 결합 활성을 측정하였다. 결과를 표 2에 나타낸다.
이 결과로부터 전해질을 포함하지 않는 만니톨 수용액에 의해 조제된 FGF2 압타머 제제는 안정한 것이 밝혀졌다.
Figure pct00026
실시예 6(다른 FGF2 압타머 제제에 있어서의 결과)
압타머 ID2∼6으로 표시되는 압타머를, 물(만니톨 수용액), 생리식염수 또는 PBS로 적절한 농도로 용해하여 FGF2 압타머 제제를 조제한다. 얻어지는 각 FGF2 압타머 제제를 다양한 온도 조건이나 보존 온도에서 수개월간 보존한 후, 사이즈 배제 크로마토그래피 및 SPR법에 의해 단량체 함유율과 결합 활성을 측정한다.
압타머 ID2:
Figure pct00027
압타머 ID3:
Figure pct00028
압타머 ID4:
Figure pct00029
Figure pct00030
압타머 ID5:
Figure pct00031
압타머 ID6:
Figure pct00032
이들 결과로부터, 그 밖의 FGF2 압타머에 있어서도 전해질을 포함하지 않는 만니톨 수용액에 의해 조제된 FGF2 압타머 제제는 안정하다는 것이 밝혀졌다.
비교예 1(FGF2 압타머 제제의 안정성 시험)
압타머 ID1로 표시되는 압타머를 생리식염수 또는 PBS로 20 mg/mL가 되도록 용해하여 FGF2 압타머 제제를 조제하였다. 얻어진 각 FGF2 압타머 제제를 표 3에 나타낸 다양한 온도 조건으로 3개월간 보존한 후 사이즈 배제 크로마토그래피에 의해 단량체 함유율을 측정하였다. 결과를 표 3에 나타낸다. 이 결과로부터 전해질을 포함하는 생리식염수나 PBS에 의해 조제된 FGF2 압타머 제제는 불안정하다는 것이 밝혀졌다.
Figure pct00033
산업상 이용가능성
본 발명의 압타머 제제는, FGF2에 대한 압타머 또는 그 염을, 주사제 등의 수성 액제의 형태로, 냉장 보존에 의해서도 장기간 안정되게 보존할 수 있기 때문에, FGF2를 저해함으로써 약효를 발휘할 수 있는 질환(예, 가령황반변성증 등의 혈관신생을 수반하는 질환, 골다공증, 류마티스 관절염, 변형성 관절증, 골절 등의 골·연골 질환, 동통)에 대한 치료 또는 예방제로서, 취급이 우수한 제제를 제공할 수 있는 점에서 매우 유용하다.
본 출원은, 일본에서 출원된 특허 출원 2018-124390(출원일: 평성 30년 6월 29일)을 기초로 하고 있고, 그 내용은 전부 본 명세서에 포함되는 것으로 한다.
SEQUENCE LISTING <110> RIBOMIC INC. <120> Aptamer Preparation <130> 092922 <150> JP 2018-124390 <151> 2018-06-29 <160> 12 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 38 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FGF2 Aptamer <400> 1 gggauacuag ggcauuaaug uuaccagugu agucucga 38 <210> 2 <211> 37 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FGF2 Aptamer <400> 2 gggaaacuag ggcguuaacg ugaccagugu uucucga 37 <210> 3 <211> 36 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FGF2 Aptamer <400> 3 gggauacuag ggcauuaaug uuaccagugu aguccc 36 <210> 4 <211> 34 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FGF2 Aptamer <400> 4 ggauacuagg gcauuaaugu uaccagugua gucc 34 <210> 5 <211> 38 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FGF2 Aptamer <400> 5 ggggauacua gggcauuaau guuaccagug uagucccc 38 <210> 6 <211> 37 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FGF2 Aptamer <400> 6 agggauacua gggcauuaau guuaccagug uaguccc 37 <210> 7 <211> 35 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FGF2 Aptamer <400> 7 gggaaacuag ggcguuaacg ugaccagugu uuccc 35 <210> 8 <211> 36 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FGF2 Aptamer <400> 8 cggauacuag ggcauuaaug uuaccagugu aguccg 36 <210> 9 <211> 36 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FGF2 Aptamer <400> 9 ccgauacuag ggcauuaaug uuaccagugu agucgg 36 <210> 10 <211> 36 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FGF2 Aptamer <400> 10 gggauacuag ggcguuaacg uuaccagugu aguccc 36 <210> 11 <211> 36 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FGF2 Aptamer <400> 11 gggauacuag ggccuuaagg uuaccagugu aguccc 36 <210> 12 <211> 36 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FGF2 Aptamer <400> 12 gggauacuag ggcauuuaug uuaccagugu aguccc 36

Claims (15)

  1. FGF2에 결합하는 압타머 또는 그 염과, 비전해질인 삼투압 조정제를 함유하여 이루어지는, 상기 압타머 또는 그 염이 장기간 안정된 수성 액제.
  2. 제1항에 있어서, 상기 압타머 또는 그 염 이외에, 실질적으로 전해질을 함유하지 않는 수성 액제.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 압타머가, 하기 식 (1):
    Figure pct00034

    (여기서, N1 및 N6은 각각 독립적으로 임의의 0∼수개의 염기를 나타내고, N2, N3, N4 및 N5는 독립적으로 임의의 1개의 염기를 나타낸다)
    로 표시되는 뉴클레오티드 서열(단, 우라실은 티민이어도 좋음)을 포함하는 압타머로서, 이하의 (a) 또는 (b) 중 어느 하나인 수성 액제:
    (a) 상기 압타머에 포함되는 뉴클레오티드에 있어서,
    (i) 각 피리미딘 뉴클레오티드의 리보오스의 2' 위치가 불소 원자이고
    (ii) 각 퓨린 뉴클레오티드의 리보오스의 2' 위치가 히드록시기이다;
    (b) 상기 (a)의 압타머에 있어서,
    (i) 각 피리미딘 뉴클레오티드의 리보오스의 2' 위치의 불소 원자가, 각각 독립적으로 무치환이거나, 수소 원자, 히드록시기 및 메톡시기로 이루어진 군으로부터 선택되는 원자 또는 기로 치환되어 있고
    (ii) 각 퓨린 뉴클레오티드의 리보오스의 2' 위치의 히드록시기가, 각각 독립적으로 무치환이거나, 수소 원자, 메톡시기 및 불소 원자로 이루어진 군으로부터 선택되는 원자 또는 기로 치환되어 있다.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 압타머가, 하기 식 (3):
    Figure pct00035

    (여기서, N1 및 N62는 각각 독립적으로 임의의 0∼수개의 염기를 나타낸다)
    으로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 수성 액제.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 압타머가, 서열번호 3, 8, 9, 10 또는 12로 표시되는 어느 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 수성 액제.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 압타머의 농도가 1∼60 mg/mL인 수성 액제.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 삼투압 조정제의 배합 비율이, 수성 액제 전체의 2∼7.5%(w/v)인 수성 액제.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 삼투압 조정제가 만니톨인 수성 액제.
  9. 제8항에 있어서, 압타머 1 mg에 대하여, 만니톨을 1∼50 mg의 비율로 함유하는 수성 액제.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 5℃ 이하에서 보존되는 수성 액제.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 4℃에서 3개월 보존 후의 단량체 압타머의 비율이 80% 이상인 수성 액제.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 주사제인 수성 액제.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 혈관신생을 수반하는 질환, 골·연골 질환 또는 동통의 예방 또는 치료용인 수성 액제.
  14. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 기재된 수성 액제를 대상으로 투여하는 것을 포함하는, 혈관신생을 수반하는 질환, 골·연골 질환 또는 동통의 예방 또는 치료 방법.
  15. 혈관신생을 수반하는 질환, 골·연골 질환 또는 동통의 예방 또는 치료에 있어서의 사용을 위한 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 기재된 수성 액제.
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