KR20210024795A

KR20210024795A - 감초추출물을 포함하는 지질나노입자 복합체 및 그의 제조방법

Info

Publication number: KR20210024795A
Application number: KR1020190104401A
Authority: KR
Inventors: 유동주
Original assignee: 주식회사 수암에치앤비
Priority date: 2019-08-26
Filing date: 2019-08-26
Publication date: 2021-03-08
Also published as: KR102291017B1

Abstract

본 발명은 감초추출물을 이용하여 안정성을 향상시킨 지질나노입자 복합체, 상기 지질나노입자 복합체의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에서 제공하는 지질나노입자 복합체는 감초추출물을 포함하여, 지질나노입자 자체의 안정성 뿐만 아니라, 내부에 포집된 물질의 안정성을 크게 향상시킬 수 있으며, 내부에 포집된 물질의 생체이용율을 향상시킬 수 있으므로, 항산화물질을 포함하는 다양한 제품의 개발에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

감초추출물을 포함하는 지질나노입자 복합체 및 그의 제조방법{Lipid nanoparticle complex containing extract of licorice and process for preparing the same}

본 발명은 감초추출물을 포함하는 지질나노입자 복합체 및 그의 제조방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 본 발명은 감초추출물을 이용하여 안정성을 향상시킨 지질나노입자 복합체, 상기 지질나노입자 복합체의 제조방법에 관한 것이다.

고분자는 조성이나 형태를 달리하여 직선, 가지화, 별 모양 등의 여러 가지 종류의 구조를 이룰 수 있기 때문에 많은 분야에서 활용도가 높다. 수용액에서 자기조립을 이룰 수 있는 양친매성 고분자의 경우, 소수성을 띠는 고분자와 친수성을 띠는 고분자가 다양한 형태로 연결되어 베시클 형태의 폴리머좀과 미셀 형태의 고분자 미셀을 형성할 수 있어 다양한 성질의 화학 약물 및 생물 약물을 효율적으로 봉입할 수 있다. 이 중 베시클 형태는 이중층 막을 포함하는 구형의 입자로, 친수성 및 소수성 약물 모두 봉입할 수 있는 장점을 가지고 있다. 그러나 이러한 고분자를 이용하는 방법은 생체 내 느린 분해 속도로 인해 세포 내 축적 가능성과 세포 내 주요 성분과의 원하지 않는 상호작용 등을 야기할 수 있어, 세포막을 구성하는 저분자량 양친매성 물질인 인지질 및 지질과 같은 생체 내 구성성분의 특성을 모사하는 방법이나, 생체적합성, 자극반응성을 가지는 물질을 사용하여 개선시킬 수 있다.

최근에는, 상기 고분자 이외의 다양한 물질을 이용하여 미세분자의 크기를 갖는 나노입자 운반체의 개발이 가속화되고 있다. 상기 나노입자 운반체는 약물 전달 시스템 분야에서 많은 관심을 얻고 이는데, 이는 나노 크기의 특성에 기인하며, 다양한 생물학적 경계를 통과하여 결과적으로 투과성과 유지력을 향상시킬 수 있다는 장점때문이다. 특히, 암치료 분야에서는 암조직 이외의 정상 조직에는 작용하지 않고, 암조직에만 작용하는 특성을 나타내는 약물 전달체를 개발하기 위한 연구가 활발히 진행되고 있는데, 이러한 약물 전달체로서 나노입자 운반체가 거론되고 있다. 그러나, 아직까지는 항암치료를 위한 나노입자 운반체의 개발이 답보상태에 있는데, 이는 나노입자 운반체는 크기를 작게 유지하기 위하여 매우 단순한 구조를 갖기 때문에, 약물 전달에 필수적인 방출량 조절이 불가능하기 때문이다.

약물전달 시스템에 사용되는 약물 전달체는 생체내에서 장기간 동안 소량의 약물을 서서히 방출하도록 설계되는데, 이러한 서방형 약물 전달체로는 지질 성분을 사용하여 제조되는 리포좀 기반의 전달체가 주로 사용되고 있다. 이에 따라, 리포좀 기반의 나노입자 전달체를 사용할 경우, 암의 치료에 효과적으로 사용될 수 있을 것으로 기대되었고, 이에 따라, 리포좀 기반의 나노입자 전달체를 개발하려는 연구가 활발히 진행되고 있다. 예를 들어, 한국등록특허 제10-1996713호에는 진세노사이드, 인지질, 글리세린지방산에스테르 및 포화지방산을 포함하는 지질나노입자의 제조방법이 개시되어 있다. 그러나, 상기 지질나노입자의 제조시 사용되는 진세노사이드는 다른 고분자화합물이나 지방물질에 비하여 매우 단가가 높기 때문에, 약물 전달체로서 사용하기에는 경제적이지 못하다는 단점이 있었다. 이에, 본 연구자들은 상기 지질나노입자의 제조시 진세노사이드를 대체하는 물질을 개발하고자 하였다.

이러한 배경하에서, 본 발명자들은 생리활성물질이 포집된 서방형 약물 전달체를 보다 경제적으로 제조할 수 있는 방법을 개발하고자 예의 연구노력한 결과, 진세노사이드 대신에 감초추출물을 사용하여도 서방형 약물 전달체의 일종인 지질나노입자를 제조할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 감초추출물을 포함하는 지질나노입자 복합체를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 지질나노입자 복합체의 제조방법을 제공하는 것이다.

상술한 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 감초추출물, 인지질 및 효소분해인지질을 포함하는 지질나노입자 복합체를 제공한다.

본 발명의 용어 "감초추출물"이란, 동양지역에서 오랫동안 한약재로 사용되어온 감초의 뿌리, 열매, 줄기 또는 감초전체를 추출하여 얻어지는 추출액, 상기 추출액의 희석액이나 농축액, 상기 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 상기 추출액의 조정제물이나 정제물, 또는 이들의 혼합물 등, 추출액 자체 및 추출액을 이용하여 형성 가능한 모든 제형의 추출물을 포함한다.

본 발명의 감초추출물을 수득하는 방법은 특별히 제한되지 않으며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방법에 따라 추출할 수 있다. 상기 추출 방법의 비제한적인 예로는, 열수 추출법, 초음파 추출법, 여과법, 환류 추출법 등을 들 수 있으며, 이들은 단독으로 수행되거나 2종 이상의 방법을 병용하여 수행될 수 있다.

본 발명에서 상기 추출에 사용되는 용매의 종류는 특별히 제한되지 않으며, 당해 기술 분야에서 공지된 임의의 용매를 사용할 수 있다. 상기 추출 용매의 비제한적인 예로는 물, 알코올 또는 이들의 혼합 용매 등을 들 수 있고, 이들은 단독으로 사용되거나 1종 이상 혼합하여 사용될 수 있으며, 구체적으로 물이 사용될 수 있다. 알코올을 용매로 사용하는 경우에는 구체적으로 탄소수 1 내지 4의 알코올을 사용할 수 있다.

일 예로서, 열수 추출법을 이용하여 감초추출물을 수득할 경우, 가열온도는 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서 90 내지 110℃가 될 수 있고, 추출시간 역시 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서 0.5 내지 5시간이 될 수 있다.

상기 감초추출물은 추출된 형태를 그대로 지질나노입자 복합체의 제조에 사용할 수도 있고, 수득한 감초추출물을 여과하여 불순물이 제거된 형태의 것을 지질나노입자 복합체의 제조에 사용할 수도 있으며, 상기 불순물이 제거된 형태의 것을 동결건조하여 수득한 건조물 또는 건조분말의 형태의 것을 지질나노입자 복합체의 제조에 사용할 수도 있다.

본 발명의 용어 "인지질(phospholipid)"이란, 복합지질의 일종으로, 인산에스테르 및 인산에스테르를 갖는 지질을 총칭하여 의미한다. 통상적으로, 글리세롤을 구성 성분으로 하는 글리세로인지질과, 스핑고신염기를 구성 성분으로 하는 스핑고인지질로 구분될 수 있는데, 특히 글리세로인지질은 생체조직내 인지질의 70% 이상을 차지한다고 알려져 있다. 상기 인지질은 미생물계, 식물계 및 동물계에 널리 분포하며, 단백질과 함께 각종 생체막을 구성하는 중요 성분의 하나이다.

본 발명에 있어서, 상기 인지질은 진세노사이드와 함께 지질나노입자를 형성하는데 사용될 수 있다.

본 발명의 용어 "효소분해인지질"이란, 인지질에 지방산 분해효소를 처리하여, 인지질에 포함된 2개의 지방산 사슬중에서 하나가 제거된 형태의 인지질을 의미한다. 상기 효소분해인지질은 통상적인 인지질에 비하여, 분자량이 감소되고, 수용성이 증진되는 특징을 나타낸다.

또한, 상기 효소분해인지질을 포함할 경우, 이의 함량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서 감초추출물의 함량대비 0.1 내지 10.0(중량비)이 될 수 있고, 다른 예로서, 0.5 내지 5.0(중량비)이 될 수 있으며, 또 다른 예로서, 2.0(중량비)이 될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 효소분해인지질은 지질나노입자의 수용성을 증가시키는 역할을 수행하므로, 상기 지질나노입자의 분산성을 향상시는데 기여할 수 있다.

본 발명의 용어 "지질나노입자(lipid nanoparticle)"란, 친유성(lipophilic) 약물의 체내 전달을 위한 약물전달체로서 응용 가능성을 갖는 물질을 의미하는데, 나노기술의 개발과 더불어 최근 새롭게 제시되고 있는 약물전달 시스템 또는 약학적 제제의 한 형태일 수 있다. 상기 지질나노입자는 고유한 크기 의존적 성질을 가지므로 새로운 치료제의 개발에 응용될 수 있다. 상기 지질나노입자는 유제, 리포좀 및 고분자성 나노 및 마이크로입자와 같은 종래의 콜로이드성 전달체(colloidal carriers)의 단점을 극복하기 위하여 제안된 대체 약물 전달체가 될 수 있다. 상기 지질나노입자는 구조적으로 볼 때, 유제, 리포좀 및 고분자성 나노 및 마이크로입자와 같은 종래의 콜로이드성 전달체와 유사한 구조를 나타내지만, 서브-마이크론 예컨대, 10 nm 내지 1000 nm의 직경을 갖는 것을 특징으로 하는 입자일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 지질나노입자는 그의 내부에 친유성 약물의 일종인 커큐민, 쿼세틴, 레스베라트롤 등을 비롯한 다양한 항산화물질을 포집하여, 항산화물질 함유 지질나노입자 복합체를 형성할 수 있다. 상기 항산화물질 함유 지질나노입자 복합체는 내부에 포집된 항산화물질의 안정성, 분산성 및 생체이용율을 향상시키는 효과를 나타낸다.

상기 지질나노입자는 감초추출물, 인지질 및 효소분해인지질로 구성될 수 있는데, 상기 감초추출물와 인지질의 혼합비는 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서, 25:1 내지 1:20(중량비)이 될 수 있고, 다른 예로서, 1:1 내지 1:20(중량비)이 될 수 있으며, 또 다른 예로서, 1:5 내지 1:15(중량비)가 될 수 있고, 또 다른 예로서, 1:10(중량비)이 될 수 있다.

본 발명에서 제공하는 지질나노입자 복합체는 상기 감초추출물, 인지질 및 효소분해인지질 이외에도 포집되는 물질의 포집효율을 향상시키기 위한 성분을 추가로 포함할 수 있다.

일 예로서, 상기 지질나노입자 부위에 트리글리세라이드를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 용어 "트리글리세라이드(triglyceride)"란, 글리세롤에 3 분자의 지방산이 에스테르 결합으로 합한 것이다. 지방산은 1 개의 카복시기(-COOH)를 가지는 탄화수소 사슬의 카복실산으로 사슬 모양의 1가의 카복실산을 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 트리글리세라이드는 카프릴릭/카프릭 트리글리세라이드 또는 장쇄지방산 트리글리세라이드가 될 수 있는데, 이들 트리글리세라이드를 개별적으로 또는 모두 사용하여, 본 발명에서 제공하는 지질나노입자를 구성할 수 있다.

이때, 상기 장쇄지방산 트리글리세라이드는 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서 16 내지 20개의 탄소수를 가지는 직쇄형 지방산 트리글리세라이드가 될 수 있고, 다른 예로서 올레산, 리시놀레산, 12-하이드록시스테아린산, 리놀레인산, 팔미톨레인산 등을 단독으로 또는 혼합된 것이 될 수 있는데, 이들 장쇄지방산 트리글리세라이드는 순수하게 합성될 수도 있고, 천연물로부터 분리될 수도 있다.

또한, 상기 트리글리세라이드를 포함할 경우, 이의 함량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서 인지질의 함량대비 0.1 내지 5.0(중량비)이 될 수 있고, 다른 예로서, 0.5 내지 2.0(중량비)이 될 수 있으며, 또 다른 예로서, 1.0(중량비)이 될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 감초추출물, 인지질 및 효소분해인지질을 사용하여 지질나노입자 복합체를 제조하고, 이의 특성을 분석한 결과, 증류수에 분산시키고, 냉장고에서 6개월 동안 방치된 후에도, 층분리가 발생되지 않고(도 1); 분산액에 포함된 나노입자의 크기를 감소시킬 수 있음을 확인하였다(표 1).

본 발명의 다른 실시예에 의하면, 커큐민, 감초추출물, 인지질 및 효소분해인지질을 사용하여 커큐민이 봉입된 지질나노입자 복합체를 제조한 후 이의 특성을 분석한 결과, 증류수에 분산시키고, 냉장고에서 6개월 동안 방치된 후에도, 분산액에 포함된 나노입자는 방치시간이 경과되어도 원래의 나노입자 평균 입자직경이 일정수준으로 유지되고(도 4); 상기 지질나노입자 복합체를 증류수에 분산시키고, 냉장고에서 6개월 동안 방치된 후에도, 커큐민의 봉입효율이 98% 이상을 유지하였으며, 잔류량 역시 97% 이상을 유지하였고(도 5); 커큐민의 피부투과 수준을 감초추출물의 함량에 비례하여 증가시킬 수 있으며(도 7); 커큐민의 소장투과 수준을 높은 수준으로 유지할 수 있음을 확인하였다(도 8).

다른 양태로서, 본 발명은 상기 지질나노입자 복합체의 제조방법을 제공한다.

구체적으로, 본 발명의 지질나노입자 복합체의 제조방법은 감초추출물, 인지질 및 효소분해인지질을 혼합하고, 이를 용매에 용해시킨 다음, 용매를 제거하는 단계를 포함한다. 이때, 사용할 수 있는 감초추출물, 인지질 및 효소분해인지질은 앞서 설명한 바와 동일하고, 상기 용매로는 탄소수 1 내지 4의 알코올을 사용할 수 있다.

본 발명에서 제공하는 지질나노입자 복합체는 감초추출물을 포함하여, 지질나노입자 자체의 안정성 뿐만 아니라, 내부에 포집된 물질의 안정성을 크게 향상시킬 수 있으며, 내부에 포집된 물질의 생체이용율을 향상시킬 수 있으므로, 항산화물질을 포함하는 다양한 제품의 개발에 널리 활용될 수 있을 것이다.

도 1의 A는 감초추출물을 사용하여 제조된 인지질나노입자 복합체를 나타내는 사진이고, B는 감초추출물을 사용하여 제조된 본 발명의 인지질나노입자 복합체를 정제수에 분산시켜서 나노입자를 형성한 후 냉장고에서 6개월 동안 방치한 상태를 나타내는 사진이며, C는 대조군의 인지질나노입자 복합체를 정제수에 분산시켜서 나노입자를 형성한 후 냉장고에서 일주일 동안 방치한 상태를 나타내는 사진이다.
도 2는 감초추출물을 함유하는 인지질나노입자 복합체를 사용하여 제조된 분산액의 현미경 사진으로서, (A)는 광학현미경으로 촬영한 사진이고, (B)는 전자투과현미경으로 촬영한 사진이다.
도 3은 커큐민이 봉입된 인지질나노입자의 분산액을 6개월 동안 냉장고에서 방치한 결과물을 나타내는 사진이다.
도 4는 커큐민이 봉입된 인지질나노입자 복합체의 분산액에 포함된 각 나노입자의 평균입자 크기를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5는 커큐민이 봉입된 인지질나노입자의 분산액을 6개월 동안 냉장고에서 방치한 후, 커큐민의 잔류량을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6은 쿼세틴이 봉입된 인지질나노입자의 분산액을 6개월 동안 냉장고에서 방치한 후, 쿼세틴의 잔류량을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 7은 커큐민이 봉입된 감초추출물 함유 인지질나노입자 복합체 분산액 중 커큐민의 돼지 피부투과 수준을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 8은 커큐민이 봉입된 감초추출물 함유 인지질나노입자 복합체 분산액 중 커큐민의 돼지 소장투과 수준을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 9는 천연항산화물질이 봉입된 감초추출물 함유 인지질나노입자의 과립제의 제조과정에 따른 중간산물을 나타내는 사진으로서, A는 열풍으로 건조된 건식과립을 나타내고, B는 정립된 건식과립을 나타내며, C는 최종제조된 감초추출물 함유 인지질나노입자의 과립제를 나타낸다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 감초추출물을 함유하는 인지질나노입자 복합체의 제조 및 특성분석

실시예 1-1: 감초추출물을 함유하는 인지질나노입자 복합체의 제조

우선, 감초추출물 0.5 g, 인지질 1.0 g, 효소분해인지질 0.2 g 및 주정(94% 에탄올) 1.5 g을 60℃에서 혼합하여 용해시킨 다음, 감압증발기로 에탄올을 증발시킴으로써 인지질나노입자 복합체를 제조하였다. 또한, 대조군으로서, 상기 감초추출물 대신에 진세노사이드를 사용하여 인지질나노입자 복합체를 제조하였다.

실시예 1-2: 감초추출물을 함유하는 인지질나노입자 복합체의 분산특성 분석

상기 실시예 1-1에서 제조된 각각의 인지질나노입자 복합체(도 1)를 적당량의 물에 넣고 와류진탕기 또는 호모믹서로 분산시켜서, 나노입자를 형성시키고, 이들을 냉장고에서 방치한 후, 이들의 물성을 비교하였다. 이때, 대조군의 분산액은 일주일 동안 방치하였고, 감초추출물을 사용하여 제조된 인지질나노입자 복합체를 사용한 분산액은 6개월 동안 방치하였다.

도 1의 A는 감초추출물을 사용하여 제조된 인지질나노입자 복합체를 나타내는 사진이고, B는 감초추출물을 사용하여 제조된 본 발명의 인지질나노입자 복합체를 정제수에 분산시켜서 나노입자를 형성한 후 냉장고에서 6개월 동안 방치한 상태를 나타내는 사진이며, C는 대조군의 인지질나노입자 복합체를 정제수에 분산시켜서 나노입자를 형성한 후 냉장고에서 일주일 동안 방치한 상태를 나타내는 사진이다.

도 1에서 보듯이, 진세노사이드를 사용하여 제조된 인지질나노입자 복합체(대조군)는 분산후 냉장고에서 일주일 동안 방치된 후에, 층분리됨을 확인하였으나, 감초추출물을 사용하여 제조된 인지질나노입자 복합체(대조군)는 분산후 냉장고에서 6개월 동안 방치된 후에도, 층분리가 발생되지 않음을 확인하였다.

따라서, 감초추출물을 사용하여 제조된 인지질나노입자 복합체는 종래의 방법으로 제조된 인지질나노입자 복합체 보다도 우수한 분산안정성을 나타냄을 알 수 있었다.

실시예 1-3: 감초추출물을 함유하는 인지질나노입자 복합체의 입자크기 분석

상기 실시예 1-2에서 제조된 감초추출물을 함유하는 인지질나노입자 복합체를 사용하여 제조된 분산액을 광학현미경 및 전자투과현미경으로 관찰하였다(도 2).

도 2는 감초추출물을 함유하는 인지질나노입자 복합체를 사용하여 제조된 분산액의 현미경 사진으로서, (A)는 광학현미경으로 촬영한 사진이고, (B)는 전자투과현미경으로 촬영한 사진이다.

도 2에서 보듯이, 감초추출물을 함유하는 인지질나노입자 복합체를 사용하여 제조된 분산액에 포함된 나노입자는 약 500nm 보다 작은 크기의 직경을 갖고, 각 나노입자가 응집되지 않은 상태로 존재함을 알 수 있었다. 특히, 전자투과현미경 사진에서 보듯이, 나노입자의 중심부는 진한 검정색이고 외곽은 옅은 회색인 것을 알 수 있는데, 이는 나노입자의 중심부는 고체상태의 지질이고 외곽은 감초추출물로부터 유래된 양친매성 성분으로 구성되어 있는 것으로 분석되었다.

실시예 1-2에서 제조된 각각의 분산액에 포함된 나노입자의 평균 입자직경과 다분산지수(polydispersity index)를 Malvern nanosizer를 이용하여 측정한 후, 비교하였다(표 1).

인지질나노입자 복합체를 사용한 분산액에 포함된 나노입자의 평균 입자직경(nm) 및 다분산지수

	평균 입자직경	다분산지수
대조군	864.45±215.4	0.687±0.616
감초추출물 나노입자	324.6±40.5	0.134±0.002

상기 표 1에서 보듯이, 감초추출물을 사용하여 제조된 인지질나노입자 복합체를 사용한 분산액에 포함된 나노입자는 대조군의 것에 비하여, 현저히 감소된 수준의 평균 입자직경 및 다분산지수를 나타냄을 확인하였다.

실시예 2: 감초추출물을 함유하는 인지질나노입자 복합체의 제조조건 분석

상기 실시예 1-1 내지 1-3의 결과로부터, 종래의 방법으로 제조된 인지질나노입자 복합체 보다도 감초추출물을 사용하여 제조된 인지질나노입자 복합체가 우수한 분산안정성을 나타냄을 확인하였으므로, 상기 감초추출물을 사용하여 인지질나노입자 복합체를 제조하는 조건을 분석하고자 하였다.

이에 따라, 감초추출물, 인지질, 효소분해 인지질 및 주정의 함량을 다양하게 변화시켜서 각각의 인지질나노입자 복합체를 제조하였다(표 2).

인지질나노입자 복합체의 원료비율

	감초추출물	인지질	효소분해 인지질	주정	감초추출물/ 인지질 비율
조성물-1 조성물-2 조성물-3 조성물-4 조성물-5 조성물-6 조성물-7	0.04 g 0.05 g 0.1 g 1.0 g 1.0 g 1.0 g 1.0 g	1.0 g 1.0 g 1.0 g 1.0 g 0.1 g 0.05 g 0.04 g	0.1 g 0.1 g 0.1 g 0.1 g 0.01 g 0.005 g 0.004 g	1.5 g 1.5 g 1.5 g 2.0 g 2.0 g 2.0 g 2.0 g	1/25 1/20 1/10 1/1 10/1 20/1 25/1

이어, 상기 제조된 각각의 인지질나노입자 복합체를 분산시켜서 분산액을 제조하고, 상기 분산액에 포함된 나노입자의 평균 입자직경 및 다분산지수를 비교하였다(표 3).

다양한 인지질나노입자 복합체를 사용한 분산액에 포함된 나노입자의 평균 입자직경(nm) 및 다분산지수

	평균 입자직경	다분산지수
조성물-1 조성물-2 조성물-3 조성물-4 조성물-5 조성물-6 조성물-7	1526.2±254.6 912.6±120.6 654.5±59.6 327.6±47.6 367.5±26.7 218.1±56.7 267.6±82.1	0.597±0.346 0.267±0.024 0.205±0.004 0.132±0.002 0.162±0.003 0.246±0.003 0.126±0.002

통상적인 나노입자로 인정받기 위하여는, 평균입자크기가 1000 nm 이하이어야만 하므로, 나노입자로 인정받을 수 있는 것은 조성물-2 내지 조성물-7이며, 대체로 인지질 대비 감초추출물의 비율이 증가할 수록 평균 입자직경과 다분산지수가 감소되는 경향을 나타내었다. 다만, 인지질 대비 감초추출물의 비율이 1:1을 초과하면 더 이상 의미있는 경향을 나타내지 않음을 확인하였다.

실시예 3: 커큐민이 봉입된 인지질나노입자 복합체의 제조 및 분산특성 분석

실시예 3-1: 커큐민이 봉입된 인지질나노입자 복합체의 제조

커큐민이 봉입된 인지질나노입자 복합체를 다양한 조성비로 제조하였다(표 4).

대략적으로, 커큐민, 감초추출물, 인지질, 효소분해인지질 및 주정을 60℃에서 혼합하여 용해시키고 감압증발기로 에탄올을 증발시킴으로써 인지질나노입자 복합체를 제조하였다. 또한, 대조군으로서 감초추출물이 포함되지 않고, 커큐민이 봉입된 인지질나노입자 복합체를 제조하였다.

커큐민이 봉입된 인지질나노입자 복합체의 원료비율

	커큐민	감초추출물	인지질	효소분해 인지질	주정
조성물-13 조성물-14 조성물-15 조성물-16 조성물-17 조성물-18 조성물-19	0.05 g 0.05 g 0.05 g 0.05 g 0.05 g 0.05 g 0.05 g	0.04 g 0.05 g 0.1 g 1.0 g 1.0 g 1.0 g 1.0 g	1.0 g 1.0 g 1.0 g 1.0 g 0.1 g 0.05 g 0.04 g	0.1 g 0.1 g 0.1 g 0.1 g 0.01 g 0.005 g 0.004 g	1.5 g 1.5 g 1.5 g 1.5 g 2.0 g 2.0 g 2.0 g

실시예 3-2: 커큐민이 봉입된 인지질나노입자 복합체의 분산특성 분석

상기 실시예 3-1에서 제조된 각각의 인지질나노입자 복합체를 분산시켜서 각각의 분산액을 수득하고, 수득한 각 분산액을 6개월 동안 냉장고에서 방치한 다음, 분산안정성을 비교하였다(도 3).

도 3은 커큐민이 봉입된 인지질나노입자의 분산액을 6개월 동안 냉장고에서 방치한 결과물을 나타내는 사진이다.

도 3에서 보듯이, 조성물-13을 제외한, 모든 분산액이 동등한 수준의 분산안정성을 나타냄을 확인하였다.

또한, 상기 도 13에서 확인된 분산액 중에서 조성물-16을 6개월 동안 방치하고, 제조직후, 1주일 경과시점, 1개월 경과시점 및 6개월 경과시점에서, 분산액에 포함된 나노입자의 평균 입자직경을 비교하였다(도 4). 이를 위하여, 대조군으로는 감초추출물을 사용하지 않는 것을 제외하고는, 실시예 3-1의 방법으로 제조된 커큐민이 봉입된 인지질나노입자 복합체를 사용하였다.

도 4는 커큐민이 봉입되고, 감초추출물이 포함되거나 또는 포함되지 않은 인지질나노입자 복합체의 분산액을 장기간 동안 방치하면서, 시간의 경과에 따른 각 나노입자의 평균입자 크기변화를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.

도 4에서 보듯이, 감초추출물이 포함되지 않은 인지질나노입자 복합체(대조군)의 분산액에 포함된 나노입자는 방치시간이 경과될 수록 이의 평균 입자직경이 증가하여 6개월이 경과된 시점에서 약 11배 크기로 급격히 증가되었으나, 감초추출물을 포함하는 인지질나노입자 복합체(조성물-16)의 분산액에 포함된 나노입자는 6개월이 경과되어도 원래의 나노입자 평균 입자직경 대비 약 1.4배 크기로 약간만 증가됨을 확인하였다.

실시예 3-3: 커큐민이 봉입된 인지질나노입자 복합체의 봉입효율

상기 실시예 3-1에서 제조된 인지질나노입자 복합체(조성물-16)에 봉입된 커큐민의 봉입효율을 분석하였다.

구체적으로, 조성물-16의 분산액 1 mL를 Amikon Ultra-4 Filter (MWCO 10,000 g/mol)에 넣고 4℃에서 30 분 동안 원심분리(4,000 g)하였다. 나노입자에 봉입되지 않은 커큐민은 필터를 통과하게 되고 봉입된 커큐민은 필터를 통과하지 못하고 남게 되는데, 필터를 통과한 여액 50 ㎕를 취하여 acetonitrile과 2% acetic acid in water 혼합액(70:30 v/v) 350 ㎕와 내부표준물질 시액 20 ㎕를 첨가한 다음 HPLC vial에 넣고 오토인젝터로 분석하였다. 컬럼은 C18 Inertsil ODS (150 mm×4.6 mm, 5㎛)로 하고 425 nm에서 diode array detector로 나타나는 커큐민 피크와 내부표준물질(quercetin)의 면적비율로 정량분석을 실시하였다 (컬럼 온도: 25℃). 이동상은 아세토니트릴과 2% acetic acid in water 혼액 (70:30 v/v)으로 하였다. HPLC 분석조건은 아래에 자세히 표시하였다.

커큐민의 HPLC 분석조건

- 시료 100 ㎕를 취하여 Eppendorf tube에 넣고 메탄올 900 ㎕로 희석하여(×10배 희석) 3분간 vortex mixer로 인지질나노입자 구조를 파쇄한 다음 Eppendorf centrifuge로 14,000 rpm에서 5분간 원심분리함

- 상등액 100 ㎕를 취하여 Eppendorf tube에 넣고 아세토니트릴 900 ㎕를 가한 다음 (×10배 희석) 30초 동안 vortex mixer로 희석함

- 상등액 500 ㎕를 취하여 Eppendorf tube에 넣고 이동상 500 ㎕를 가한 다음 (×2배 희석) 30초 동안 vortex mixer로 희석하여 HPLC vial에 넣고 HPLC를 실시함 (n=3)

- 컬럼: C18 Phenomenex ODS (150 mm×4.6 mm, 5㎛)

- 검출기: 자외부흡광도계 (425 nm)

- 이동상: mixture of acetonitrile and 2% acetic acid (70:30 v/v)

- 내부표준물질: quercetin

- 유속: 0.4 mL/min

- 주입량: 20 ㎕

커큐민의 봉입효율 계산식

봉입효율(%) = 100×(Dtotal-Dunentrapped)/Dtotal

Dtotal: 감초추출물 함유 인지질나노입자 복합체 분산액 중 커큐민의 중량 (mg)

Dunentrapped: 감초추출물 함유 인지질나노입자 복합체에 봉입되지 않은 커큐민의 중량 (mg)

그 결과, 분산액 중 커큐민 중량(100ng)에 대하여 봉입되지 않은 커큐민의 중량은 1.188mg으로 측정되었으므로, 봉입효율은 98.812±0.252%인 것으로 확인되었다.

실시예 3-4: 감초추출물 함유 인지질나노입자 복합체 중 커큐민의 화학적 안정성 평가

실시예 3-1에서 제조된 커큐민이 봉입된 감초추출물 함유 인지질나노입자 복합체(조성물-16)를 냉장고에 보관하면서 측정한 커큐민의 화학적 안정성을 평가하고자 하였다.

대략적으로, 상기 실시예 3-3의 방법을 이용하여, 커큐민 함유 인지질나노입자 복합체 중 커큐민의 잔류량을 HPLC로 측정하였는데, 조성물-16의 분산액을 10 배 중량의 증류수에 희석하고 1분간 vortex mixer로 분산시킨 다음 용기 바닥에 가라앉지 않고 균질하게 분산된 부분을 취하여 시료로 사용하였다(도 5).

도 5는 커큐민이 봉입된 인지질나노입자의 분산액을 6개월 동안 냉장고에서 방치한 후, 커큐민의 잔류량을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.

도 5에서 보듯이, 커큐민을 감초추출물 함유 인지질나노입자 복합체에 봉입하면 6개월이 지나도 커큐민 잔류량이 제조직후에 비하여 97.8±1.06%로 유지된 반면, 감초추출물을 함유하지 않은 인지질나노입자 복합체에 봉입하면 6개월 후 커큐민의 잔류량이 제조직후에 비하여 12.3±8.25%로 저하됨을 확인하였다.

상기 결과는 감초추출물 함유 인지질나노입자 복합체의 경우 나노입자를 감싸고 있는 피막이 나노입자에 봉입되어 있는 커큐민이 외부 환경에 노출되지 않도록 보호하여 주기 때문인 것으로 분석되었다.

실시예 3-5: 쿼세틴이 봉입된 인지질나노입자 복합체 중 쿼세틴의 화학적 안정성 평가

실시예 3-1에서 제조된 조성물-16에서 커큐민 대신에 쿼세틴이 봉입된 감초추출물 함유 인지질나노입자 복합체를 제조하고, 이를 사용하는 것을 제외하고는, 실시예 3-4의 방법을 수행하여, 쿼세틴의 화학적 안정성을 평가하였다(도 6).

도 6은 쿼세틴이 봉입된 인지질나노입자의 분산액을 6개월 동안 냉장고에서 방치한 후, 쿼세틴의 잔류량을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.

도 6에서 보듯이, 쿼세틴을 감초추출물 함유 인지질나노입자 복합체에 봉입하면 6개월이 지나도 쿼세틴 함량이 제조직후에 비하여 95.2±1.25%로 유지된 반면, 감초추출물을 함유하지 않은 인지질나노입자 복합체에 봉입하면 6개월 후 쿼세틴 함량이 제조직후에 비하여 28.4±8.6%로 저하되었다.

상기 결과 역시, 감초추출물 함유 인지질나노입자 복합체의 경우 나노입자를 감싸고 있는 피막이 나노입자에 봉입되어 있는 쿼세틴이 외부 환경에 노출되지 않도록 보호하여 주기 때문인 것으로 분석되었다.

실시예 3-6: 커큐민이 봉입된 감초추출물 함유 인지질나노입자 복합체 분산액 중 커큐민의 피부투과 시험

실시예 3-1에서 제조된 커큐민이 봉입된 감초추출물 함유 인지질나노입자 복합체(조성물-14, 조성물-15 또는 조성물-16)의 분산액을 사용하여 커큐민의 피부투과 수준을 평가하였다.

대략적으로, 도축한지 4시간이 지나지 않은 돼지 피부를 4℃의 차가운 생리식염수로 세척하고 피하지방을 제거한 다음 Franz diffusion cell에 표피가 donor compartment로 향하고 진피가 receptor compartment로 향하도록 장착하였다(유효확산면적: 2.27 cm2). 그런 다음, Franz diffusion cell의 Donor compartment에 조성물-14, 조성물-15 또는 조성물-16의 분산액 0.5 mL를 담고, Franz diffusion cell의 receptor compartment에는 인산완충액(pH 7.0)을 담은 다음, 전체 온도를 37℃로 유지하면서, 상기 분산액에 포함된 커큐민이 피부를 투과하는 정도를 평가하였다. 이때, 대조군으로는, 감초추출물을 포함하지 않고, 커큐민이 봉입된 인지질나노입자 복합체를 사용하였고, 상기 피부투과 수준의 평가는 정해진 시간 간격(1, 2, 3, 4, 6 시간)으로 receptor compartment에서 수득한 500 ㎕의 시료를 실시예 3-3의 조건으로 HPLC 로 분석하여 수행하였다(도 7).

도 7은 커큐민이 봉입된 감초추출물 함유 인지질나노입자 복합체 분산액 중 커큐민의 돼지 피부투과 수준을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.

도 7에서 보듯이, 6시간이 경과된 시점에서, 대조군의 경우 돼지 피부를 투과한 커큐민의 양이 피부에 도포된 양의 11.6%에 불과하였으나, 조성물-14는 20.5%이고, 조성물-15는 39.1%이며, 조성물-16은 70.7%임을 확인하였다. 특히, 조성물-16의 경우 3시간이 경과된 시점에서, 이미 투입된 커큐민의 64.53%가 투과됨을 확인하였다.

상기 결과로부터, 상기 커큐민의 피부투과 수준은 인지질나노입자 복합체에 포함된 감초추출물의 함량에 비례함을 알 수 있었는데, 이는 감초추출물에 포함된 성분이 인지질나노입자의 나노입자의 표면 특성을 개질함으로써 피부장벽을 이루는 세라마이드 및 콜레스테롤과의 친화성을 증대시키기 때문인 것으로 분석되었다.

따라서, 커큐민 등 천연항산화물질이 봉입된 감초추출물 함유 인지질나노입자 복합체 분산액이 화장품 소재로 응용될 경우 항산화작용에 힘입어 피부의 노화 및 주름을 억제하는 소재로 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.

실시예 3-7: 커큐민이 봉입된 감초추출물 함유 인지질나노입자 복합체 분산액 중 커큐민의 소장투과 시험

실시예 3-1에서 제조된 커큐민이 봉입된 감초추출물 함유 인지질나노입자 복합체(조성물-14, 조성물-15 또는 조성물-16)의 분산액을 사용하여 커큐민의 소장투과 수준을 평가하였다.

대략적으로, 도축한지 4시간이 지나지 않은 돼지의 상부소화관을 4℃의 차가운 생리식염수로 소화관 내부를 세척하여 내용물을 제거하고, longitudinal section한 다음 Franz diffusion cell에 점액질 부분이 donor compartment로 향하고 근육층 부분이 receptor compartment로 향하도록 장착하였다(유효확산면적: 2.27 cm2). 그런 다음, Franz diffusion cell의 Donor compartment에 조성물-14, 조성물-15 또는 조성물-16의 분산액 0.5 mL과 인공장액 0.5 mL의 혼합액를 담고, Franz diffusion cell의 receptor compartment에는 인산완충액(pH 7.0)을 담은 다음, 전체 온도를 37℃로 유지하면서, 상기 분산액에 포함된 커큐민이 소장을 투과하는 정도를 평가하였다. 이때, 대조군으로는, 감초추출물을 포함하지 않고, 커큐민이 봉입된 인지질나노입자 복합체를 사용하였고, 상기 소장투과 수준의 평가는 정해진 시간 간격(1, 2, 4, 6 시간)으로 receptor compartment에서 수득한 500 ㎕의 시료를 실시예 3-3의 조건으로 HPLC 로 분석하여 수행하였다(도 8).

도 8은 커큐민이 봉입된 감초추출물 함유 인지질나노입자 복합체 분산액 중 커큐민의 돼지 소장투과 수준을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.

도 8에서 보듯이, 6시간이 경과된 시점에서, 대조군의 경우 돼지 소장을 투과한 커큐민의 양이 투입된 양의 9.46%에 불과하였으나, 조성물-14는 19.65%이고, 조성물-15는 28.47%이며, 조성물-16은 39.87%임을 확인하였다. 특히, 조성물-16의 경우 4시간이 경과된 시점에서, 이미 투입된 커큐민의 36.72%가 투과됨을 확인하였다.

상기 결과는 감초추출물 함유 인지질나노입자 분산액의 입자도가 균질하고 안정하여 소화관에서 잘 흡수되기 때문인 것으로 분석되었다.

따라서, 천연항산화물질 등 감초추출물 함유 인지질나노입자 복합체 분산액에 봉입된 물질은 의약품, 건강기능식품 및 동물용 배합사료에 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.

실시예 4: 천연항산화물질이 봉입된 감초추출물 함유인지질나노입자 복합체 과립의 제조

실시예 3-1에서 제조된 커큐민이 봉입된 감초추출물 함유 인지질나노입자 복합체 또는 그의 분산액은 기본적으로 액상의 물성을 나타내므로, 산업현장에서 취급성을 용이하게 하기 위해 이들을 고체상태로 제조하고자 하였다.

고체상태의 제조예시로서, 과립제 형태로 제조하였는데, 대략적인 제조방법은 다음과 같다:

천연항산화물질로 알려진 커큐민 10mg, 쿼세틴 10mg 및 레스베라트롤 10mg과, 인지질 200mg, 효소분해인지질 20mg 및 감초추출물 200mg을 혼합하고 이에 주정 150mg을 가한 다음, 60℃에서 용해시킴으로써 액상의 인지질나노입자 복합체를 제조하였다. 상기 제조된 액상의 인지질나노입자 복합체를 증류수에 희석한 후, 하이드록시메틸셀룰로스(HPMC2910) 15mg, 자일리톨 2,445mg 및 이산화규소 60mg을 가하고, 유동층 과립제조기를 사용한 습식연합법을 수행하여 습식과립을 제조하였다. 상기 제조된 습식과립에 2시간 동안 40℃ 열풍을 가하여 건조시켜서 건식과립을 수득하였다. 상기 수득한 건식과립을 정립하고, 이에 활택제인 스테아린산마그네슘 30mg을 가하여, 유동성이 향상되고 취급성이 매우 우수한 과립제를 최종적으로 제조하였다(도 9).

도 9는 천연항산화물질이 봉입된 감초추출물 함유 인지질나노입자의 과립제의 제조과정에 따른 중간산물을 나타내는 사진으로서, A는 열풍으로 건조된 건식과립을 나타내고, B는 정립된 건식과립을 나타내며, C는 최종제조된 감초추출물 함유 인지질나노입자의 과립제를 나타낸다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims

감초추출물, 인지질 및 효소분해인지질을 포함하는 지질나노입자 복합체.
제1항에 있어서,
상기 감초추출물은 감초의 뿌리, 열매, 줄기 또는 감초전체를 대상으로, 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 용매를 사용하여 추출된 것인, 복합체.
제1항에 있어서,
상기 감초추출물과 인지질의 혼합비는 25:1 내지 1:20(중량비)인 것인, 복합체.
제1항에 있어서,
상기 지질나노입자에 트리글리세라이드를 추가로 포함하는 것인, 복합체.
제4항에 있어서,
상기 트리글리세라이드는 카프릴릭/카프릭 트리글리세라이드, 장쇄지방산 트리글리세라이드 또는 이들의 조합인 것인, 복합체.
감초추출물, 인지질 및 효소분해인지질을 혼합하고, 이를 용매에 용해시킨 다음, 용매를 제거하는 단계를 포함하는 제1항의 지질나노입자 복합체의 제조방법.
제6항에 있어서,
상기 용매는 탄소수 1 내지 4의 알코올인 것인, 방법.
제6항에 있어서,
상기 용매에 트리글리세라이드를 용해시키는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법.