CN114796002B - 活性成分的纳米搭载、透皮递送系统及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及纳米技术领域，尤其涉及一种活性成分的纳米搭载、透皮递送系统及其制备方法和应用，所述纳米搭载系统包含由甘草蛋白自组装形成的纳米颗粒，所述纳米颗粒内部包埋有神经酰胺，所述透皮递送系统包含所述的纳米搭载系统以及吸附在纳米搭载系统上的护肤品活性成分。本发明通过甘草蛋白与神经酰胺之间的自组装作用，得到了一种具有良好生物相容性和透皮性的纳米搭载系统，还成功用其装载了亲水/疏水性活性成分如Vc、A醇。本发明有效提高了神经酰胺以及护肤活性成分生物利用率，且载体来源于食品原料，安全性高。

Description

活性成分的纳米搭载、透皮递送系统及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及纳米技术领域，尤其涉及一种活性成分的纳米搭载、透皮递送系统及其制备方法和应用。

背景技术

人体皮肤包含角质层，表皮层以及真皮层，共同形成人体的天然屏障，保护体内各种器官和组织免受外界有害因素的损害；同时，自然界中各种因子可经过皮肤进入体内，不同物质其被皮肤吸收的能力不同，水溶性物质或分子量大的物质不易被吸收，而一些脂溶性或小分子物质则较容易被吸收。皮肤的吸收功能主要涉及毛囊通道，细胞间隙，以及细胞内间隙途径，其中前两种途径为主要途径。因此在化妆品领域，提高活性物质的透皮吸收以及生物利用效率是当前研究与应用的热点。

神经酰胺是由神经鞘氨醇长链碱基与脂肪酸组成的一类磷脂，不仅具有保护皮肤屏障、修护皮肤屏障、保湿、抗衰老的作用，还能充当“弹头”带领活性成分深入表皮更深层。但是，未经处理的神经酰胺一般难溶于水且难溶于油，生物利用率低，故而化妆品中一般都是添加改性后的神经酰胺，使其易溶于水，而这会使得神经酰胺透皮效果降低，不易被皮肤所吸收；同时改性工艺复杂，配方繁琐，阻碍了神经酰胺在化妆品领域的应用。

近年来，纳米颗粒因其靶向性、穿透性等优点而被广泛应用于医药，食品，化妆品等领域。纳米载体能够有效改善难溶活性成分的水分散性，提高活性成分的稳定性，在皮肤疾病治疗和护肤美容等领域显示良好的应用前景。但是，纳米颗粒因其尺寸比常规分子更大，更难以跨越皮肤屏障。

甘草作为我国人民长期使用的食品与中药原料，被列为“药食同源”原料。目前一些技术方案中发现甘草汤剂中某些特性蛋白质可在加工过程中可自组装形成胶体纳米颗粒。这些纳米颗粒在人体内能够有效递送药物。

例如申请号为CN201310738014.9一种甘草蛋白及其纳米颗粒的制备方法，经过分离纯化获得了一个分子量为31.0kDa、等电点为4.5的甘草蛋白，该甘草蛋白的N-端一级结构序列为NPDGLIACYCGQYCW。该甘草蛋白的盐溶液在蛋白浓度为1mg/mL，pH7.9条件下，经过100℃加热60min后，制备得到甘草蛋白纳米颗粒，其平均粒径为74.09±0.69nm。甘草蛋白纳米颗粒冻干品流动性佳，复溶性好，易于稳定保存。该发明涉及的甘草蛋白来源于食品，安全性高。其纳米颗粒的制备方法不涉及任何交联剂，且其成品广泛存在于各类使用甘草的汤剂中，为广大人群服用多年，安全性高。

发明内容

本发明是为了进一步提高纳米颗粒负载有效成分的跨越皮肤屏障效率。现有技术中由于纳米颗粒尺寸较大，导致负载在其上的功能性化合物相对不易被皮肤吸收的问题，因此提供了一种活性成分的纳米搭载、透皮递送系统及其制备方法和应用以克服上述缺陷。

为实现上述发明目的，本发明通过以下技术方案实现：

本发明的第一个目的在于提供了一种纳米搭载系统，

包含由甘草蛋白自组装形成的纳米颗粒，所述纳米颗粒内部包埋有神经酰胺。

本发明的研发人员在先前的研发过程中发现，部分纳米颗粒可以通过皮肤表面的毛囊通道以及细胞间隙进入体内，但随机性比较高，跨膜作用存在不稳定性，因此这类纳米颗粒难以作为跨膜传递介质。

而本发明团队在先前的研发过程中还发现，甘草中的甘草蛋白在特定条件下能够自组装形成纳米颗粒，这些甘草蛋白纳米颗粒能够作为活性成分的装载系统。但是发明人发现纯甘草蛋白纳米颗粒虽然有着较强的装载能力，但是由于其亲水性较强，难溶于皮肤中的脂质，导致其通过皮肤表面的毛囊通道以及细胞间隙进入体内的难度较大，最终表现出皮肤透过率较低的问题。因此其在应用过程中，只能通过汤剂口服的方式进行利用，因此限制了其应用领域。对于某些需要外用的活性成分而言，这些纯甘草蛋白纳米颗粒便无法发挥其作用，并且现有的技术中也没有相应解决这一技术问题的启示。

此外，现有技术中为了提升神经酰胺以及其他护肤活性成分的透皮效果，通常可采用乙醇以及表面活性剂进行溶解分散，但是乙醇以及表面活性剂对于皮肤有一定的刺激性，因而无法大剂量应用于护肤品中，导致现有的一些化妆品中虽然存在这类活性护肤成分，但是由于其透过率较低，导致其无法发挥其原本应有的作用。

因此本发明的产生思路在于，如何通过筛选得到皮肤透过效果较好的纳米颗粒，并且通过这类纳米颗粒作为搭载系统负载活性成分以及护肤成分，使得其能够顺利进入到人体皮肤内部，从而发挥其原本作用。

本发明的发明人在研发过程中偶然发现，当甘草蛋白与神经酰胺一起自组装形成纳米颗粒后，可以在很大程度上增强整体递送系统的透皮和跨膜能力。其原因在于，神经酰胺本身就是皮肤的疏水性组成成分之一，在与甘草蛋白自组装成纳米颗粒后，会使得整体的纳米颗粒具有一定的疏水效果，使得其脂溶性大幅增加，从而能够更加容易地沿着皮肤表面的毛囊通道以及细胞间隙进入到皮肤的内部，提高跨膜作用的选择性，使得跨膜作用更加稳定。因此这些由甘草蛋白与神经酰胺自组装形成的纳米颗粒能够作为纳米搭载系统应用于皮肤外用传递介质中。

此外，本发明由于纳米搭载系统内部包埋神经酰胺，能够使得整体纳米搭载系统在进入到皮肤内部后，神经酰胺也能够随着纳米颗粒进入到人体皮肤内部，从而能够在皮肤内部释放神经酰胺。因此，相较于现有技术中通过对神经酰胺采用亲水改性，从而提高生物利用率的方案而言，本发明能够有效提升了神经酰胺对于皮肤的渗透效率，使得对于神经酰胺对于保护皮肤屏障、修护皮肤屏障、保湿、抗衰老的作用更加有效。

作为优选，于所述纳米搭载系统中神经酰胺的装载量小于90 mg/g，所述装载量为每1g纳米搭载系统中包埋神经酰胺的含量。

本发明中纳米搭载系统中的神经酰胺的含量相对较高，将其应用到化妆品领域后能够有效提升神经酰胺的利用率，同时提升神经酰胺对皮肤的改善效果。

作为优选，神经酰胺的结合率为40~90%，所述结合率的计算方法为纳米搭载系统中神经酰胺含量与初始神经酰胺溶液中神经酰胺含量之间的比值。

作为优选，所述纳米搭载系统的粒径为20~600nm。

本发明中的纳米搭载系统粒径范围在20~600nm，在此范围内甘草蛋白-神经酰胺纳米颗粒能够渗透进入到皮肤中的效率最高，而当纳米颗粒的粒径小于20nm后所能够结合的神经酰胺的浓度较低，而当粒径大于600nm后，则会导致颗粒直径较大，无法渗透进入到皮肤组织中。

本发明的第二个目的在于提供了所述纳米搭载系统的制备方法，

包括以下步骤：将神经酰胺溶液滴加至甘草蛋白溶液中，搅拌，使得甘草蛋白完成自组装，从而得到纳米搭载系统。

本发明中的纳米搭载系统的制备方法较为简单，只需要将神经酰胺溶液滴加至甘草蛋白溶液搅拌即可诱导甘草蛋白进行自组装，从而将神经酰胺包覆在甘草蛋白纳米颗粒内部。其原因在于，甘草蛋白与神经酰胺之间能够形成稳定的氢键作用，从而使得甘草蛋白之间发生团聚，从而形成纳米颗粒，并且由于神经酰胺的疏水性作用，从而形成了外部为甘草蛋白内部为神经酰胺的稳定结构。

作为优选，所述甘草蛋白的制备方法如下：将粉碎过筛的甘草粉加入到缓冲液中，搅拌浸提后得到样品蛋白粗提液，向样品蛋白粗提液中加入无水乙醇，醇沉提纯后得到沉淀，将其冷冻干燥即为甘草蛋白冻干粉。

本发明中的原料蛋白在制备过程中制备方法简单，不需添加任何交联剂且无须色谱分离，从而容易放大生产。

作为优选，搅拌反应结束后还需要对反应液经过过滤，过滤后，得到含有甘草蛋白-神经酰胺纳米颗粒的水溶液。

作为优选，过滤时选用0.45 μm或0.22μm水系膜过滤，滤过液即为纳米搭载系统的溶液。

本发明的第三个目的在于提供了一种透皮递送系统，

包含所述的纳米搭载系统；以及

吸附在纳米搭载系统上的护肤品活性成分。

本发明中的纳米搭载系统由于其皮肤穿透效果优异，因此通过护肤品活性成分进行吸附表面改性后形成透皮递送系统，透皮递送系统上负载的这些护肤品活性成分便也能够同时沿着纳米搭载系统渗透到人体皮肤中，从而提高了人体皮肤对于这类护肤品活性成分的吸收效率。

作为优选，所述护肤品活性成分包括Vc、A醇、积雪草苷、水杨酸、烟酰胺中的一种或多种的组合物。

本发明第四个目的在于提供了上述透皮递送系统的制备方法，

将护肤品活性成分配制成溶液后，加入到含有纳米搭载系统的溶液中，搅拌使得纳米搭载系统吸附护肤品活性成分，过滤得到所述透皮药物递送系统。

本发明第五个目的在于，提供了如上所述的甘纳米搭载系统或者透皮递送系统在护肤品中的应用。

因此，本发明具有以下有益效果：

（1）本发明通过甘草蛋白与神经酰胺之间的自组装作用，得到了一种具有良好生物相容性和透皮性的纳米搭载系统，还成功用其装载了亲水/疏水性活性成分如Vc、A醇。；

（2）提高了神经酰胺生物利用率，且载体来源于食品原料，安全性高；

（3）被载物神经酰胺反馈增强整体纳米颗粒的透皮能力以及深度，建立了高效透皮性能的甘草蛋白-神经酰胺纳米颗粒载药系统；

（4）本发明的制备技术简单安全，不需添加任何交联剂，原料蛋白提取无需色谱分离，易实现放大生产；

（5）本发明包埋率高，装载、负载量大，可极大提高被装载物的生物利用率。

附图说明

图1 为冻干粉复溶的甘草蛋白提纯液电泳条带。

图2 为甘草蛋白-神经酰胺纳米颗粒电泳条带。

图3 为在不同初始神经酰胺浓度下，神经酰胺结合率与结合量图。

图4 为在最优装载比例下所形成纳米颗粒的粒径分布图。

图5 为Vc以及复合纳米颗粒的透皮试验结果图。

图6 为A醇以及复合纳米颗粒的透皮试验结果图。

具体实施方式

下面结合说明书附图以及具体实施例对本发明做进一步描述。本领域普通技术人员在基于这些说明的情况下将能够实现本发明。此外，下述说明中涉及到的本发明的实施例通常仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。因此，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

实施例1

【甘草蛋白的提取】

向经粉碎机粉碎并过筛的甘草粉末中加入含0.1 mol/L NaCl的磷酸缓冲液（0.02mol/L、pH 7.2），使甘草质量与缓冲液比例为1:5。将其置于4 ℃搅拌浸提12 h，而后在4 ℃下、12000 g离心15 min，收集上清液，得到样品蛋白粗提液。

使用氨水将粗提液pH调至10，在磁力搅拌条件下向置于4℃的甘草样品粗提液中缓慢滴加预冷的无水乙醇（-20℃）使溶液饱和度达到40%。静置4 h，以12000 g离心15 min，收集上清液。继续向上清液缓慢加入预冷的无水乙醇至终饱和度为50%，静置12 h，12000 g离心15 min，收集沉淀物。

进一步的，沉淀用Tris-盐酸缓冲液（0.02 mol/L、pH 7.9）充分溶解，并用HCl将沉淀复溶液PH调至1~2，4℃静置0~20min后于4 ℃下、12000 g离心10~15 min，收集上清液。向收集的上清液中缓慢滴加预冷的无水乙醇使溶液饱和度达到60%，静置4h后12000g离心15min，收集沉淀，沉淀冷冻干燥即为甘草蛋白冻干粉。

冻干粉复溶的甘草蛋白提纯液电泳条带如图1所示，经上述步骤提纯的甘草蛋白（分子量为31 KDa）中还含有少量其他分子量的蛋白质（分子量为20 KDa、66 KDa），且在甘草蛋白-神经酰胺纳米颗粒形成过程中也参与了自组装过程，其电泳条带如图2所示。

实施例2

【甘草蛋白-神经酰胺纳米颗粒的制备】

取10mg甘草蛋白冻干粉用10mL Tris-盐酸缓冲液（0.02 mol/L、pH 7.9）充分溶解，制成1mg/mL甘草蛋白溶液。分别取不同浓度神经酰胺-乙醇溶液（分别为1、2.5、5、10mg/mL）200μL缓慢逐滴加入10mL甘草蛋白溶液，并在100℃水浴条件下磁力搅拌60min，转速为350r/min，经室温冷却后于0.45或0.22μm水系微滤膜过滤，滤液即为甘草蛋白-神经酰胺纳米颗粒（纳米搭载系统）。

神经酰胺检测方法建立：采用反相高效液相色谱法（RP-HPLC）检测神经酰胺的含量。色谱柱为Thermo C18柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm)，流动相为甲醇：异丙醇=7:3，流速1.0mL/min，进样量20 μL，检测波长205 nm。标准品神经酰胺进样浓度在0.2~200 μg/mL范围内，其峰面积与浓度呈良好的线性关系(R²=0.9991)。

甘草蛋白-神经酰胺纳米颗粒中神经酰胺含量的测定：甘草蛋白-神经酰胺纳米颗粒经乙醇沉淀（纳米颗粒溶液：乙醇=1:9）并静置30min，待颗粒中神经酰全部释放后离心去掉蛋白沉淀，取上清液，随后检测步骤同标品神经酰胺测定。

结合率=（纳米颗粒中神经酰胺含量/初始溶液中神经酰胺含量）×100%

结合量=（纳米颗粒中神经酰胺含量/甘草蛋白含量）×100%

在不同初始神经酰胺浓度下，神经酰胺结合率与结合量如图3所示。当初始神经酰胺浓度为100μg时其装载率高达76%（纳米颗粒中神经酰胺含量/初始溶液中神经酰胺含量），此时结合量为76 mg/g（纳米颗粒中神经酰胺含量/甘草蛋白含量），即每克甘草蛋白-神经酰胺纳米颗粒中含有神经酰胺大约76mg；在此最优装载比例下所形成纳米颗粒平均粒径为130.07±0.46nm，其粒径分布图如图4所示。

实施例3

【甘草蛋白-神经酰胺纳米颗粒吸附装载水溶性成分Vc测试】

将40μL Vc水溶液（2.5mg/mL）缓慢加入2mL甘草蛋白-神经酰胺纳米颗粒水溶液（1mg/mL，此处所用神经酰胺为最佳装载比例下形成的纳米颗粒）中，漩涡震荡5-10min。

而后用100KDa超滤管超滤截留复合纳米颗粒并反复冲洗复合纳米颗粒2次，收集三次超滤滤过液测量滤过液中Vc含量，差减法得Vc吸附装载量。计算可得Vc吸附装载率可达40%以上。

Vc检测方法建立。采用紫外分光光度法测量Vc含量。检测波长为260nm，线性范围为0~10μg/mL。其吸光值与浓度呈良好的线性关系(R²=0.9999)。

吸附装载率=（复合纳米颗粒吸附Vc含量/初始溶液中Vc含量）×100%

实施例4

【甘草蛋白-神经酰胺纳米颗粒吸附装载疏水性成分A醇测试】

将200μL A醇-乙醇溶液（5 mg/mL）缓慢加入10mL甘草蛋白-神经酰胺纳米颗粒水溶液（1mg/mL，此处所用神经酰胺最大包埋量的纳米颗粒）中，磁力搅拌混匀后静置10~30min，全程需避光处理。而后用0.22或0.45μm水系微滤膜过滤，去掉未吸附的A醇，滤过液经乙醇沉淀（滤过液：乙醇=1:9）并静置30min，待颗粒中A醇全部释放后12000g转速离心去掉蛋白沉淀，取上清液，随后检测上清液中A醇含量。计算可得A醇吸附装载率可达60%以上。

A醇检测方法建立。采用反相高效液相色谱法（RP-HPLC）检测神经酰胺的含量。色谱柱为Thermo C18柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm)，流动相为体积比98:2的正己烷-异丙醇，流速为1.0 mL/min，于25 ℃下等度洗脱，紫外检测波长为325 nm，进样量为20 μL。标准品A醇进样浓度在2~200 μg/mL范围内，其峰面积与浓度呈良好的线性关系(R²=0.9997)。

吸附装载率=（复合纳米颗粒吸附A醇含量/初始溶液中A醇含量）×100%

实施例5

【Vc、A醇以及复合纳米颗粒提高活性成分透过皮肤屏障能力】

分别将装载活性成分Vc、A醇的复合纳米颗粒溶液以及纯品Vc、A醇溶液置于Start-M人工皮肤膜上（其中纯品A醇用10%乙醇-30% Tween水溶液溶解，其他均为水溶液），装在供给池与接受池之间，加入接收液至刻度线，排除气泡。A醇接受池中接受液为10%乙醇-30% Tween生理盐水溶液、Vc接受池中接受液为生理盐水，接受液均为15mL。磁力搅拌速度为600 r.min^-1，水浴温度为37摄氏度，分别于1，2，3，4 ，6，8h取样，每次取样1 mL，同时补加1 mL接受液。样品溶液用0.22微米滤膜过滤，测定其中活性成分的含量。

不含神经酰胺的甘草蛋白纳米颗粒装载活性成分Vc、A醇的透皮能力对照：

①取10mg甘草蛋白冻干粉用10mL Tris-盐酸缓冲液（0.02 mol/L、pH 7.9）充分溶解，制成1mg/mL甘草蛋白溶液，并在100℃水浴条件下磁力搅拌60min，转速为350r/min，经室温冷却后于0.45或0.22μm水系微滤膜过滤，滤液即为甘草蛋白纳米颗粒（无神经酰胺）。将40μL Vc水溶液（2.5mg/mL）缓慢加入2mL甘草蛋白纳米颗粒水溶液（1mg/mL）中，漩涡震荡5-10min后即为装载Vc的甘草蛋白纳米颗粒（无神经酰胺）。

②取10mg甘草蛋白冻干粉用10mL Tris-盐酸缓冲液（0.02 mol/L、pH 7.9）充分溶解，制成1mg/mL甘草蛋白溶液，并在100℃水浴条件下磁力搅拌60min，转速为350r/min，经室温冷却后于0.45或0.22μm水系微滤膜过滤，滤液即为甘草蛋白纳米颗粒（无神经酰胺）。将200μL A醇-乙醇溶液（5 mg/mL）缓慢加入10mL甘草蛋白纳米颗粒水溶液（1mg/mL）中，磁力搅拌混匀后静置10~30min，全程需避光处理。而后用0.22或0.45μm水系微滤膜过滤后滤液即为装载A醇的甘草蛋白纳米颗粒（无神经酰胺）。透皮能力检测方法如上。

透皮试验结果如图5、6所示，在第8小时时纯品Vc透过百分比仅仅只有5.11 %，经甘草蛋白纳米颗粒吸附后的Vc在第8小时透皮率为36.73%，而经甘草蛋白-神经酰胺纳米颗粒吸附后的Vc在第8小时透皮率可达52.36%，较纯品Vc透过率增加了近11倍，较无神经酰胺的甘草蛋白纳米颗粒增了近1.5倍。

同时，即使经过乙醇和表面活性剂溶解助分散的纯品A醇，在8小时时透过率也仅能达30.27%（实际化妆品中不可能添加10%乙醇以及30%Tween助溶），经甘草蛋白纳米颗粒吸附后的A醇在第8小时透皮率为59.39%，但经甘草蛋白-神经酰胺纳米颗粒吸附后的A醇在第8小时时透过率能达71.96%。

Claims (8)

1.纳米搭载系统，其特征在于，

包含由甘草蛋白自组装形成的纳米颗粒，所述纳米颗粒内部包埋结合有神经酰胺；

所述纳米搭载系统的制备方法包括以下步骤：将神经酰胺溶液滴加至甘草蛋白溶液中，搅拌使得甘草蛋白完成自组装，从而得到所述纳米搭载系统；

所述甘草蛋白的制备方法如下：将粉碎过筛的甘草粉加入到缓冲液中，搅拌浸提后得到样品蛋白粗提液，向样品蛋白粗提液中加入无水乙醇，醇沉提纯后得到沉淀，将其冷冻干燥即为甘草蛋白冻干粉。

2.根据权利要求1所述的纳米搭载系统，其特征在于，

所述神经酰胺的装载量小于90 mg/g；

神经酰胺的结合率为40~90%。

3.根据权利要求1或2所述的纳米搭载系统，其特征在于，

纳米搭载系统的粒径为20~600nm。

4.根据权利要求1所述纳米搭载系统，其特征在于，

搅拌反应结束后还需要对反应液经过过滤，过滤后，得到含有纳米搭载系统的溶液。

5.透皮递送系统，其特征在于，

包含如权利要求1~4中任意一项所述的纳米搭载系统；以及，

吸附在纳米搭载系统上的护肤品活性成分。

6.根据权利要求5所述的透皮递送系统，其特征在于，

所述护肤品活性成分包括Vc、A醇、积雪草苷、水杨酸、烟酰胺中的一种或多种的组合物。

7.如权利要求5或6所述的透皮递送系统的制备方法，其特征在于，

将护肤品活性成分配制成溶液后，加入到含有纳米搭载系统的溶液中，搅拌使得纳米搭载系统吸附护肤品活性成分，过滤得到透皮递送系统。

8.如权利要求1~4任意一项所述的纳米搭载系统或者权利要求5或6所述的透皮递送系统在制备护肤品中的应用。