KR20210016427A

KR20210016427A - 발효 방법에서 재조합 단백질을 방출하기 위한 박테리아 균주

Info

Publication number: KR20210016427A
Application number: KR1020207037757A
Authority: KR
Inventors: 요한나 코치; 마르쿠스 브루너
Original assignee: 와커 헤미 아게
Priority date: 2018-07-06
Filing date: 2018-07-06
Publication date: 2021-02-15
Also published as: US20210269843A1; CN113631567A; WO2020007493A1; EP3818073A1; JP2021529542A; JP7185006B2

Abstract

본 발명은 기능적 프로모터의 제어 하에 재조합 단백질을 인코딩하는 개방형 리딩 프레임(open reading frame)을 함유하는 박테리아 균주에 관한 것이다. 본 발명은 박테리아 균주가 기능적 프로모터의 제어 하에 돌연변이화된 펩티도글리칸-관련 지질단백질(PAL 단백질)을 인코딩하는 개방형 리딩 프레임을 함유하고, 여기서, PAL 단백질은 이러한 PAL 단백질이 박테리아의 세포 외막에 대한 막 앵커(anchor)를 갖지 않도록 돌연변이화된다. 본 발명은 추가로, 재조합 단백질 및 돌연변이화된 PAL 단백질을 인코딩하는 플라스미드, 및 본 발명에 따른 박테리아 균주를 사용하여 재조합 단백질의 발효 생산하는 방법에 관한 것이다. 이러한 방식으로, 선행 기술과 비교하여 증가되는 배양 잔여물 중 생성물 수율은 박테리아 세포의 실질적인 다이-오프(die-off)를 야기하지 않으면서 달성될 수 있다.

Description

발효 방법에서 재조합 단백질을 방출하기 위한 박테리아 균주

본 발명은 기능적 프로모터의 제어 하에 재조합 단백질을 인코딩하는 개방형 리딩 프레임(open reading frame)을 함유하는 박테리아 균주에 관한 것이며, 상기 박테리아 균주는 기능적 프로모터의 제어 하에 돌연변이화된 펩티도글리칸-관련 지질단백질(Pal 단백질)을 인코딩하는 개방형 리딩 프레임을 함유하고, 여기서, Pal 단백질은 이것이 박테리아의 세포 외막에 대한 막 앵커(anchor)를 갖지 않도록 돌연변이화된 것이다. 본 발명은 추가로, 재조합 단백질 및 돌연변이화된 Pal 단백질을 인코딩하는 플라스미드, 및 본 발명에 따른 박테리아 균주를 사용하여 재조합 단백질의 발효 생산하는 방법에 관한 것이다.

재조합 단백질은 포유류 세포 배양물과 비교하여 짧은 세대 시간 및 단순한 취급때문에 박테리아에서 비용-효과적으로 생성될 수 있다. 이의 광범위하게 연구된 유전학 및 생리학 덕분에, 그람-음성 엔테로박테리움 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)는 현재, 재조합 단백질의 생성을 위해 가장 흔히 사용되는 유기체이다. 특히 관심을 끄는 것은 이. 콜라이(E. coli)에서 재조합 단백질의 생산 방법이며, 이는 복잡한 세포-분해 및 단백질-폴딩(folding)) 과정을 피하기 때문에 상기 방법에서 표적 단백질은 발효 배지 내로 고수율로 그리고 올바른 폴딩으로 직접 방출된다. 배양 배지 내로의 재조합 단백질의 방출을 달성하는 많은 이. 콜라이 균주 및 이. 콜라이 균주를 이용한 과정은 문헌에 개시되어 있다.

i) 우선, 소위 "리키(leaky)" 균주를 사용할 확률이 있다. 이는 외막에 결함을 가져서 주변세포질(periplasmic) 단백질을 배양 배지 내로 부분적으로 배출하는 이. 콜라이의 돌연변이체를 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 이는 비특이적인 기전이다. 이러한 "리키" 돌연변이체의 일례는 Tol-Pal 복합체에 결함을 갖는 균주, 예를 들어, tol-결실 및 pal-결실 돌연변이체이다. tol-결실 및 pal-결실 돌연변이체는 예를 들어 알칼리 포스파타제 PhoA 또는 RNase I와 같은 세포-내인성 주변세포질 단백질을 발효 배지 내로 배출하는 것으로 알려져 있다. 이러한 균주는 EDTA, 다양한 세제 및 항생제에 매우 민감하고, 성장 결함을 나타낸다(Lazzaroni and Portalier 1981, J. Bact. 145, 페이지 1351-1358; Lazzaroni and Portalier 1992, Mol. Microbiol. 6, 페이지 735-742; Chen et al. 2014, Microb. Biotechnol. 7, 페이지 360-370; Bernstein et al. 1972, J. Bacteriol. 112, 페이지 74-83). 따라서, 이들 균주는 높은-세포-밀도 발효 조건 하에 배양되기에는 단지 제한된 적합성을 가진다.

ii) 재조합 단백질의 방출을 달성하기 위한 추가 접근법은 이. 콜라이의 세포 외피를 투과하므로 배양 배지 내로의 단백질의 방출을 촉진하는 단백질의 발현이다. 외막의 분해 및 세포의 용해를 유발하는 작은 지질단백질인 박테리오신 방출 단백질(BRP)의 발현은 잘-설명되어 있다. ColE1 BRP(Kil 단백질) 또는 클로아신(cloacin) DF13 BRP의 과발현에 의해, 인터루킨-2, β-글루카나제, 알칼리 포스파타제 또는 β-락타마제를 배양 배지 내로 배출하는 것이 가능하였다(Beshay et al. 2007, Biotechnol. Lett. 29, 페이지 1893-1901; Robbens et al. 1995, Protein Expr. Purif. 6, 페이지 481-486; Sommer et al. 2010, J. Biotechnol. 145, 페이지 350-358).

iii) 세포 외피를 탈안정화시키는 또 다른 접근법은 Wan 및 Baneyx(1998, Protein Expr. Purif. 14, 페이지 13-22)에 기재되어 있다. 이는 TolA 단백질(TolAIII)의 가용성, C-말단 도메인을 과발현시킴으로써 막 온전성을 파괴하는 것을 수반하였다. 이는 주변세포질로부터 배지 내로의 단백질 RNase I 및 알칼리 포스파타제의 증가된 방출과 함께 tolA-결실 돌연변이체에서와 유사한 표현형 및 데옥시콜레이트에 대한 민감성을 유발하였다(Levengood-Freyermuth et al. 1993, J. Bacteriol. 175, 페이지 222-228). TolAIII 단백질의 과발현에 의해, OmpA-TEM-β-락타마제 단백질의 방출은 현저히 증가되었다. 그러나, β-락타마제의 발현은 대조군과 비교하여 1.5배 내지 2배만큼 감소하였다. 더욱이, 세포의 활력(vitality)은 tolA 돌연변이체에서와 같이 TolAIII의 발현에 의해 크게 손상되었다. 배양물의 활력의 척도로서 콜로니-형성 단위(CFU)의 수는 TolAIII 발현 시작 후 3시간째에 진탕 플라스크에서 1000배만큼 이미 감소하였다. 게다가, 세포는 명백한 막 결함의 지표인 저농도의 SDS(0.02%)에 민감하였다.

이러한 세포는 복잡한 진핵 단백질의 생성에 필요한 상대적으로 긴 기간에 걸쳐 높은 세포 밀도에서 배양하기에는 불안정하다. TolAIII의 공동발현의 추가 단점은, TolAIII 자체가 배양 상층액에서 다량으로 발견될 수 있으므로 외부로 이전되는 표적 단백질을 오염시킨다는 점이다.

본 발명의 목적은 강한 세포 용해가 발생하지 않으면서 재조합 단백질을 배양 배지 내로 증가된 수율로 방출하는 박테리아 균주를 제공하는 것이다.

이러한 목적은 기능적 프로모터의 제어 하에 재조합 단백질을 인코딩하는 개방형 리딩 프레임을 함유하는 박테리아 균주에 의해 달성되며, 상기 박테리아 균주는 기능적 프로모터의 제어 하에 돌연변이화된 펩티도글리칸-관련 지질단백질(Pal 단백질)을 인코딩하는 개방형 리딩 프레임을 함유하고, 상기 돌연변이화된 Pal 단백질은 이 단백질이 박테리아의 세포 외막에 대한 막 앵커를 갖지 않도록 돌연변이화된 것이다.

발효 방법에서 이러한 박테리아 균주의 사용은, 추가 단백질, 즉, 돌연변이화된 형태의 Pal 단백질이 재조합 단백질과 함께 발현되는 이점을 가진다. 돌연변이화된 Pal 단백질의 발현은 박테리아의 세포 외막의 제한된 투과를 유발하여, 재조합 단백질이 세포의 사멸 없이 상기 세포로부터 방출될 수 있다. 향상된 방출의 결과, 재조합 단백질은 증가된 수율로 단리될 수 있다. 본 발명은 상응하는 박테리아 균주, 상기 박테리아 균주를 사용하는 재조합 단백질의 발효 생산 방법, 및 상응하는 플라스미드를 제공한다. 이러한 방식으로, 박테리아 세포의 실질적인 사멸의 발생 없이, 선행 기술과 비교하여 배양 상층액에서 증가된 생성물 수율을 달성하는 것이 가능하다.

박테리아 균주는 바람직하게는 상기 박테리아 균주가 그람-음성 박테리아, 특히 바람직하게는 엔테로박테리아세애(Enterobacteriaceae) 속의 박테리아 균주, 특히 바람직하게는 에스케리키아 콜라이 종의 균주임을 특징으로 한다.

펩티도글리칸-관련 지질단백질(Pal, Pal 단백질)은 지질화된 N-말단을 통해 박테리아 세포의 외막에서 앵커링되고 C-말단을 통해 펩티도글리칸 층과 상호작용하는 박테리아, 주변세포질 단백질이다. 게다가, Pal은 Pal-Tol 시스템의 구성요소이고(Godlewska et al. 2009, FEMS Microbiol. Lett. 298, 페이지 1-11), 주변세포질의 다양한 추가 단백질, 예를 들어 lpp 및 ompA와 상호작용한다(Cascales et al., 2002, J. Bacteriol. 184, 페이지 754-759; Godlewska, 상기 참조). 기술적 적용에서, Pal 단백질은 예를 들어, 박테리아의 세포 표면 상에서 Pal 단백질과 항체 단편으로 이루어진 융합 단백질 형태로 항체 단편을 앵커링하는 데 사용된다(Fuchs et al. 1991, Biotechnology (N Y) 9, 페이지 1369-1372; Dhillon et al. 1999, Lett. Appl. Microbiol. 28, 페이지 350-354).

야생형 Pal 유전자는 진화에 의해 자연적으로 생겨났으며 야생형 박테리아 게놈에 존재하는 Pal 유전자의 형태를 지칭한다. 야생형 Pal 유전자는 야생형 Pal 전구체 단백질을 발현하며, 이 단백질은 신호 펩타이드 및 야생형 Pal 단백질의 아미노산 서열(SEQ ID No. 4)을 포함한다. 21개 아미노산의 신호 서열이 절단된 후, 이. 콜라이(균주 K-12)로부터의 성숙 야생형 Pal 단백질은 152개 아미노산의 서열(Genbank 엔트리 X05123, Uniprot P0A912 참조)을 포함하고, 아미노산 위치 1에 아미노산 시스테인을 갖고, 이는 박테리아 지질단백질에서 고도로 보존되고 막 앵커로 아실화된다(예를 들어, Zuckert et al. 2014, Biochimica et Biophysica Acta 1843, 페이지 1509-1516 또는 Konovalova and Silhavy 2015, Phil. Trans. R. Soc. B 370: 20150030 참조). 대조적으로, 돌연변이화된 Pal 단백질은 박테리아의 세포 외막에 대한 막 앵커를 갖지 않는다.

Pal 전구체 단백질(전구체 형태의 Pal 단백질)은 Pal 단백질 및 신호 서열의 아미노산 서열을 포함하고 번역-후 변형을 갖지 않는 Pal 단백질을 지칭한다.

성숙 야생형 Pal 단백질은 야생형 Pal 단백질의 아미노산 서열을 포함하고 신호 서열이 절단 제거되었기 때문에 상기 신호 서열을 더 이상 갖지 않으며, 번역-후 변형이 존재하는 Pal 단백질을 지칭한다. 이러한 번역-후 변형은 예를 들어, 막 앵커에 의한 Pal 단백질의 아실화이다.

개방형 리딩 프레임(ORF)은 시작 코돈과 정지 코돈 사이에 존재하고 단백질의 아미노산 서열을 인코딩하는 DNA 또는 RNA의 해당 영역을 지칭한다. ORF는 또한, 코딩 영역으로 지칭된다.

ORF는 비코딩 영역에 의해 둘러싸인다. 유전자는, 생물학적 활성 RNA를 생성하기 위한 모든 기본적인 정보를 함유하는 DNA 분절(segment)을 지칭한다. 유전자는, 단일-가닥 RNA 카피가 전사에 의해 생성되는 DNA 분절 및 이러한 카피 과정의 조절에 관여하는 발현 신호를 함유한다. 상기 발현 신호는 예를 들어, 적어도 하나의 프로모터, 전사 시작 부위, 번역 시작 부위 및 리보솜 결합 부위를 포함한다. 더욱이, 종결자 및 하나 이상의 작동자(operator)는 발현 신호로서 가능하다.

기능적 프로모터의 경우, 상기 프로모터의 조절 하에 있는 ORF는 RNA로 전사된다.

모노시스트론은 단지 하나의 개방형 리딩 프레임을 함유하는 메신저 RNA(mRNA)를 지칭한다.

오페론은 다수의 ORF, 프로모터 및 가능하게는 추가 발현 신호를 포함하는 DNA의 기능적 단위이다.

박테리아 균주는 (1) 재조합 단백질을 인코딩하는 하나의 ORF, (2) 동일한 재조합 단백질을 인코딩하는 다수의 ORF들 또는 (3) 다수의 재조합 단백질들을 인코딩하는 다수의 ORF들을 함유할 수 있다. 제2 가능성은 예를 들어, 재조합 단백질의 발현 및 수율을 증가시키는 데 사용되는 반면, 제3 가능성은 특히 다수의 폴리펩타이드들로 이루어진 단백질(서브단위)의 발현에 사용된다. 일례는 항체 단편의 발현이고, 상기 항체 단편은 후속해서 세포질 밖으로의 수송 후 조립된다.

이들 ORF는 각각 별개의 유전자에 존재할 수 있으며; 다수의 ORF들이 오페론에서 조직화되는 것, 즉, 공통 발현 신호에 의해 조절되는 것이 또한 가능하다.

더욱이, 각각의 오페론은 돌연변이화된 Pal 단백질을 인코딩하는 ORF를 함유할 수 있다. 하나 이상 재조합 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 ORF 및 돌연변이화된 Pal 단백질을 인코딩하는 ORF가 오페론에 존재하더라도, 돌연변이화된 Pal 단백질을 인코딩하는 ORF가 정의에 의하면 그 자체의 시작 코돈과 정지 코돈에 의해 구별되기 때문에 상기 돌연변이화된 Pal 단백질은 항상 별개의 단백질로서 발현되고 융합 단백질로서 발현되지 않는다.

재조합 단백질이 다수의 폴리펩타이드 사슬(서브단위)들로 이루어진 경우, 개별 펩타이드 사슬(서브단위)의 ORF가 오페론에서 조직화되는 것이 바람직하다.

돌연변이화된 Pal 단백질을 인코딩하는 ORF가 모노시스트론 메신저 RNA로서 전사되는 것이 바람직하다. 이는, 돌연변이화된 Pal 단백질이 그 자체의 별개의 유전자에 의해 발현됨을 의미한다. 상기 유전자는 돌연변이화된 Pal 유전자로 지칭된다.

재조합 단백질 및 돌연변이화된 Pal 단백질을 인코딩하는 ORF들은 염색체적으로 또는 플라스미드에 의해 발현될 수 있다. 별개의 유전자의 경우, 이들은 또한 복제 기원 및 선별 마커에 관하여 서로 융화성인 별개의 플라스미드들에 의해 발현될 수 있다. ORF는 바람직하게는 플라스미드-인코딩된다.

본 발명에 사용되고 돌연변이화된 Pal 단백질을 인코딩하는 ORF는 야생형 Pal 단백질과 비교하여 아미노산 서열의 변화, 예컨대 치환, 결실 및/또는 삽입을 함유한다.

본 발명에 따르면, 돌연변이화된 Pal 단백질을 인코딩하는 ORF의 서열은 바람직하게는, 돌연변이화된 Pal 단백질의 발현을 유발하며, DNA 서열이 재조합 단백질의 생성에 사용되는 것과 동일한 유기체로부터 기원하는 DNA 서열이다.

돌연변이화된 Pal 단백질을 인코딩하는 본 발명에 따른 ORF의 DNA 서열의 기원은, 비돌연변이화된 형태의 상응하는 Pal 단백질이 재조합 단백질의 생성에 사용되는 박테리아 균주에서 기능적인 한, 재조합 단백질의 생성에 사용되는 박테리아 균주로 한정되지 않는다. 이러한 측면에서, 기능적이란, 재조합 단백질의 생성에 사용되는 박테리아 균주의 Pal 단백질의 모든 생물학적 기능들이 상기 언급된 Pal 단백질에 의해 취해질 수 있음을 의미한다. 특히, 이는, Pal 유전자의 염색체 결실을 갖는 박테리아 균주의 표현형적 특징이 상기 언급된 Pal 유전자의 추가 도입된 카피에 의해 보완될 수 있음을 의미한다.

본 발명의 맥락에서 단수형으로 사용되는 용어 "재조합 단백질을 인코딩하는 ORF" 및 "재조합 단백질"은 또한 다수의 ORF들 및/또는 다수의 상이한 재조합 단백질들을 의미할 수 있다. 바람직하게는 1 내지 3개의 상이한 재조합 단백질, 특히 바람직하게는 1개의 재조합 단백질 또는 2개의 상이한 재조합 단백질이 관여한다. 박테리아에서 재조합 단백질의 클로닝 및 발현은 선행 기술에 기재된 바와 같이 달성된다. 재조합 단백질은 예를 들어, 주변세포질 내로의 수송을 위한 신호 서열을 갖는다.

재조합 단백질은, 야생형 박테리아 게놈이 천연적으로 전혀 발현되지 않거나 상이한 양으로 발현되는 단백질이다. 박테리아는 재조합 단백질의 생성에 역할을 하고, 상기 단백질은 본 발명에 따르면 배양 배지 내로 방출된다.

배양 배지 내로의 재조합 단백질의 방출을 달성하기 위해, 세포기질에서 단백질 생합성 후 재조합 단백질과 돌연변이화된 Pal 단백질 둘 다 주변세포질 내로 수송되는 것이 필요하다. 주변세포질 내로의 수송을 위해, 프레임내에서(in frame) 생성되는 단백질의 코딩 DNA 서열의 5' 단부를 단백질 외수송을 위해 신호 서열의 3' 단부와 연결하는 것이 필요하다. 원칙적으로 이 목적에 적합한 것은, 사용되는 박테리아 균주에서 Sec 또는 Tat 장치의 도움으로 표적 단백질의 전좌를 가능하게 하는 모든 신호 서열들이다. 다양한 신호 서열, 예를 들어 하기 유전자: phoA, ompA, pelB, ompF, ompT, lamB, malE, 스타필로콕칼(Staphylococcal) 단백질 A, StII 및 다른 것들(Choi and Lee 2004, Appl. Microbiol. Biotechnol. 64, 페이지 625-635)의 신호 서열은 선행 기술에 기재되어 있다. 본 발명에 따라 재조합 단백질에 바람직한 것은 이. 콜라이의 phoA 유전자 또는 ompA 유전자의 신호 서열 또는 클레브시엘라 뉴모니애(Klebsiella pneumoniae) M5a1로부터의 사이클로덱스트린 글리코실트랜스퍼라제(α-CGTase)에 대한 신호 서열 또는 US 2008/0076157에서 SEQ ID No. 1 및 3으로서 개시된 것들로부터 유래된 신호 서열이다. 바람직하게는, 돌연변이화된 Pal 단백질은 이의 전구체 형태에서, Chen 및 Henning(1987, Eur. J. Biochem. 163, 페이지 73-77)에 기재된 바와 같이 Pal 단백질의 네이티브(native) 신호 서열을 갖는다. 바람직하게는, 재조합 단백질 및 돌연변이화된 Pal 단백질은 이들의 전구체 형태에서, 상이한 신호 서열을 갖고 있으며, 2개의 신호 서열은 단백질 외수송을 유발한다.

돌연변이화된 Pal 단백질 및 재조합 단백질을 인코딩하는 ORF들의 발현은 하나의 프로모터 또는 상이한 프로모터들에 의해 제어될 수 있다. 돌연변이화된 Pal 단백질 및 재조합 단백질에 대한 ORF들은 상이한 프로모터들의 제어 하에 있는 것이 바람직하다.

돌연변이화된 Pal 단백질을 인코딩하는 DNA 분절은 우선, 프라이머로서 올리고뉴클레오타이드 및 Pal 단백질을 인코딩하는 DNA 주형, 예를 들어 이. 콜라이로부터 단리된 게놈 DNA를 사용하는 PCR에 의해 증폭된 다음, 각각의 경우 신호 펩타이드의 서열을 포함하는 DNA 분자와 연결되고 유사한 방식으로 생성되는 흔한 분자생물학 기법을 사용하여 증폭될 수 있으며, 따라서 프레임내 융합이 형성된다. 대안적으로, 전체 DNA 분자를 유전자 합성에 의해 생성하는 것이 또한 가능하다. 그 후에, 문제의 신호 서열 및 돌연변이화된 Pal 단백질의 코딩 서열로 구성된 상기 DNA 분자는 벡터, 예를 들어 플라스미드 내로 도입될 수 있거나, 박테리아 균주의 염색체 내로 기지의 방법에 의해 직접 통합될 수 있다. 바람직하게는, DNA 분자는 플라스미드, 예컨대, 기지의 발현 벡터의 유도체, 예컨대 pJF118EH, pKK223-3, pUC18, pBR322, pACYC184, pASK-IBA3 또는 pET 내로 도입된다. 플라스미드는 당업자에게 알려진 방법(형질전환)을 사용하여 박테리아 세포 내로 도입된다.

사용되는 플라스미드는 선별 마커를 가질 수 있다. 선별 마커로서 적합한 것은 예를 들어, 앰피실린, 테트라사이클린, 클로람페니콜, 칸나마이신 또는 다른 것들과 같은 항생제에 대한 내성을 인코딩하는 유전자이다. 바람직하게는, 플라스미드는, 유전자의 발현이 테트라사이클린 내성인 유전자를 함유한다. 더욱이, 선별 마커로서 적합한 것은 영양요구성 마커이며, 이러한 마커는 플라스미드를 함유하는 문제의 박테리아 균주에서 결실되었던 필수 유전자를 인코딩한다. 2개의 플라스미드가 세포 내로 형질전환되는 경우, 2개의 상이한 항생제 내성 또는 2개의 상이한 영양요구성 마커를 사용하여 플라스미드 둘 다의 존재에 대해 선별하는 것이 바람직하다.

프로모터로서 적합한 것은 당업자에게 알려진 모든 프로모터들, 예컨대 구성적 프로모터, 예를 들어, GAPDH 프로모터 또는 유도적 프로모터, 예컨대, 예를 들어, lac, tac, trc, lambda PL, ara, 쿠메이트 또는 tet 프로모터 또는 이로부터 유래된 서열이다. 재조합 단백질을 인코딩하는 ORF 및 돌연변이화된 Pal 단백질을 인코딩하는 ORF는 프로모터에 의해 오페론으로서 제어되거나 상이한 프로모터들의 제어 하에 있을 수 있다. 바람직하게는, 재조합 단백질을 인코딩하는 ORF 및 돌연변이화된 Pal 단백질을 인코딩하는 ORF는 상이한 유도적 프로모터들에 의해 제어된다. 특히 바람직하게는, 재조합 단백질은 tac 프로모터의 제어 하에서 발현되고, 돌연변이화된 Pal 단백질은 ara(아라비노스) 프로모터의 제어 하에서 발현된다.

돌연변이화된 Pal 단백질의 아미노산 서열은 기지의 방식으로, 예를 들어 보존된 시스테인 잔기를 제거하거나 막 앵커에 의한 변형을 방지하는 다른 돌연변이를 도입함으로써 생성될 수 있다. 당업자는, 도입된 돌연변이가 박테리아 균주에서 발현 후 막 앵커를 더 이상 함유하지 않는 돌연변이화된 Pal 단백질을 유발하는지의 여부를 체크하기 위한 방법을 문헌으로부터 알고 있다(Hayashi and Wu 1990, J. Bioenerg. Biomembr. 22, 페이지 451-471; Giam et al. 1984, Eur. J. Biochem. 141, 페이지 331-337; Lazzaroni and Portalier 1992, 상기 참조; Mizuno 1979, J. Biochem. 86, 페이지 991-1000).

바람직한 구현예에서, 박테리아 균주는, 상기 돌연변이화된 Pal 단백질을 인코딩하는 ORF가, 이것이 아미노산 위치 1 내지 6, 바람직하게는 1 내지 4, 특히 바람직하게는 1 내지 2 중 하나 이상에서 돌연변이화되었던 돌연변이화된 Pal 단백질을 인코딩하도록 돌연변이화된 것임을 특징으로 한다. 이러한 측면에서, 아미노산 위치는 신호 서열 다음의 아미노산을 지칭하며, 즉, 아미노산 위치 1은 신호 서열 이후의 첫번째 아미노산이다.

바람직하게는, 돌연변이는 결실(아미노산의 부재) 또는 치환(아미노산의 교환), 특히 바람직하게는 결실이다.

특히 바람직하게는, 박테리아 균주는, 상기 돌연변이화된 Pal 단백질을 인코딩하는 ORF가, 이것이 N-말단 시스테인 잔기가 치환되었던 돌연변이화된 Pal 단백질을 인코딩하도록 돌연변이화된 것임을 특징으로 한다.

추가로 바람직한 구현예에서, 박테리아 균주는, 상기 돌연변이화된 Pal 단백질을 인코딩하는 ORF가, 이것이 N-말단 시스테인 잔기가 부재하는 돌연변이화된 Pal 단백질을 인코딩하도록 돌연변이화된 것임을 특징으로 한다. 바람직하게는, 아미노산은 위치 1, 특히 바람직하게는 시스테인 잔기에서 결실된다.

N-말단 또는 아미노-말단은 유리(free) 아미노기(NH₂)를 갖는 Pal 단백질의 단부를 지칭한다. N-말단 시스테인 잔기는 신호 서열 이후의 아미노산 위치 1에서의 시스테인 잔기이다.

특히 바람직하게는, 돌연변이화된 Pal 단백질의 아미노산 서열은, SEQ ID No. 7(Pal22A)에서 명시되고 그 안의 N-말단 시스테인이 아미노산 알라닌으로 교환되어 있어서, 그 결과 알라닌이 신호 서열의 처음 21개 아미노산을 따르는 서열이다.

바람직한 구현예에서, 박테리아 균주는, 상기 돌연변이화된 Pal 단백질을 인코딩하는 ORF가, 이것이 아미노산 1 내지 6개, 바람직하게는 1 내지 4개, 특히 바람직하게는 1 내지 2개가 부재하는 돌연변이화된 Pal 단백질을 인코딩하도록 돌연변이화된 것임을 특징으로 한다. 특히 바람직하게는, 돌연변이화된 Pal 단백질의 아미노산 서열은, SEQ ID No. 5(Pal△_22-27)에 명시되어 있고 알라닌이 신호 서열의 처음 21개 아미노산을 따르는 서열이다. 돌연변이화된 Pal 단백질의 신호 펩타이드 이후의 서열은 이. 콜라이로부터의 성숙 야생형 Pal 단백질(야생형 단백질의 아미노산 서열에 대해 SEQ ID No. 4를 참조함)의 아미노산 7-152과 동일하다.

바람직하게는, 조합 단백질은 이종성 단백질이다. 이종성 단백질은 박테리아 균주, 바람직하게는 이. 콜라이 K12 균주의 프로테옴, 즉, 단백질의 전체 천연 세트에 속하지 않는 단백질을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 사용되는 박테리아 균주, 예를 들어 이. 콜라이 K12 균주에서 천연적으로 발생하는 모든 단백질들은 기지의 게놈 서열로부터(예를 들어 이. 콜라이 K12에 대해 수탁 번호 NC_000913 하에 Genbank 엔트리로부터) 유래될 수 있다.

이종성 단백질로서 특히 바람직한 것은, 하나 이상의 이황화 결합을 함유하는 진핵 단백질이다. 특히 바람직한 것은, 이의 기능적 형태에서 이량체 또는 다량체로서 존재하는 진핵 단백질이다.

가장 중요한 이종성 단백질 클래스는 항체 및 이의 단편, 사이토카인, 성장 인자, 단백질 키나제, 단백질 호르몬, 리포칼린, 안티칼린, 효소, 결합 단백질 및 분자 스캐폴드 및 이들로부터 유래된 단백질을 포함한다. 상기 단백질 클래스의 예는 특히, 중쇄 항체 및 이의 단편(예를 들어, 나노바디), 단쇄 항체, 인터페론, 인터루킨, 인터루킨 수용체, 인터루킨 수용체 길항제, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, 백혈병 저해제, 줄기세포 성장 인자, 종양 괴사 인자, 성장 호르몬, 인슐린-유사 성장 인자, 섬유모세포 성장 인자, 혈소판-유래 성장 인자, 형질전환 성장 인자, 간세포 성장 인자, 골 형태형성 인자, 신경 성장 인자, 뇌-유래 신경영양 인자(BDNF: brain-derived neurotrophic factor), 교질세포주-유래 신경영양 인자, 혈관신생 저해제, 조직 플라스미노겐 활성인자, 혈액 응고 인자, 트립신 저해제, 엘라스타제 저해제, 보체 구성원, 저산소증-유도 스트레스 단백질, 원발암유전자(proto-oncogenic) 생성물, 전사 인자, 바이러스-구성적 단백질, 프로인슐린, 프로유로키나제, 에리트로포이에틴, 트롬보포이에틴, 뉴트로핀, 단백질 C, 글루코세레브로시다제, 슈퍼옥사이드 디스뮤타제, 레닌, 리소자임, P450, 프로키모신, 리포코틴, 렙틴, 혈청 알부민, 스트렙토키나제, 테넥테플라제(tenecteplase), CNTF 및 사이클로덱스트린 글리코실트랜스퍼라제이다.

분자 스캐폴드로부터 유래된 단백질의 예는 특히, 에비바디(evibody)(CTLA-4로부터 유래됨), 아피바디(affibody)(에스. 아우레우스(S. aureus)의 단백질 A), 아비머(avimer)(인간 A 도메인 패밀리의), 트랜스바디(transbody)(트랜스페린의), DARPins(안키린 반복 단백질의), 아드넥틴(adnectin)(피브로넥틴 III의), 펩타이드 앱타머(티오레독신의), 마이크로바디(microbody)(마이크로단백질의), 아필린(affilin)(유비퀴틴의), α-크리스탈린, 샤리브도톡신(charybdotoxin), 테트라넥틴, RAS-결합 단백질 AF-6의 PDZ 도메인, 단백질 저해제의 쿠니츠-유형(Kunitz-type) 도메인이다.

바람직하게는, 박테리아 균주는, 이것이 펩티도글리칸-관련 지질단백질(Pal)을 인코딩하는 야생형 Pal 유전자를 추가로 함유하는 것을 특징으로 한다. 특히 바람직하게는, 야생형 Pal 유전자는 기능적 프로모터의 제어 하에 있다.

본 발명은 추가로, 기능적 프로모터의 제어 하에 재조합 단백질을 인코딩하는 개방형 리딩 프레임을 함유하는 플라스미드를 제공하며, 상기 플라스미드는 기능적 프로모터의 제어 하에 신호 펩타이드 및 돌연변이화된 Pal 단백질을 인코딩하는 개방형 리딩 프레임을 함유하고, 상기 Pal 단백질은 이 단백질이 박테리아의 세포 외막에 대한 막 앵커를 갖지 않도록 돌연변이화된 것임을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 박테리아 균주에 대해 언급된 바람직한, 특히 바람직한 특질은 또한, 본 발명에 따른 플라스미드에서 언급된 특질에 적용되며, 여기서 본 발명에 따른 박테리아 균주에 대해 언급된 바람직한, 특히 바람직한 구현예는 또한 플라스미드에서 각각 바람직하거나 특히 바람직하다.

유사하게는, 언급된 정의 및 바람직한 구현예는 신호 펩타이드 및 돌연변이화된 Pal 단백질을 인코딩하는 ORF 및 재조합 단백질을 인코딩하는 ORF에 적용된다.

예를 들어, 하나 이상 재조합 단백질을 인코딩하는 하나 이상 ORF는 하나의 오페론에 있을 수 있다. 바람직하게는, 돌연변이화된 Pal 단백질을 인코딩하는 ORF는 별개의 유전자에 있다. 이는, 돌연변이화된 Pal 단백질 및 재조합 단백질이 서로 독립적으로 발현될 수 있음을 의미한다. 돌연변이화된 Pal 단백질의 프로모터로부터 상이하고 상이하게 유도적인 재조합 단백질(들)의 프로모터(들)의 특히 바람직한 경우, 플라스미드는, 상기 플라스미드에 의한 박테리아의 형질전환 시, 단백질의 발현을 서로 독립적으로 나타내는 최적의 시간을 선택하는 것이 가능하다는 특정 이점을 가진다.

당업자에게 알려진 방법을 사용한 박테리아 균주 내로의 본 발명에 따른 플라스미드의 도입 및 상기 플라스미드에 의한 재조합 단백질 및 돌연변이화된 Pal 단백질의 발현은, 박테리아 균주의 세포로부터 재조합 단백질의 방출이 향상되고 이들 재조합 단백질이 증가된 수율로 단리될 수 있다는 이점을 갖는다.

재조합 단백질 및 돌연변이화된 Pal 단백질을 인코딩하는 ORF들의 염색체 통합과 비교하여, 플라스미드의 사용의 이점은, 박테리아 균주의 플라스미드-보유 세포가 선별 이점을 갖고 표준 방법에 의해 선별될 수 있다는 점이다.

각각의 플라스미드가 적어도 하나의 복제 기원(ORI)을 함유하기 때문에, 플라스미드가 자율적으로 복제하는 추가의 이점을 있다. 더욱이, 특히, 플라스미드가 박테리아 균주의 세포에서 높은 카피 수로 존재할 수 있고 유전된다는 것이 이점이 있다.

본 발명은 추가로, 재조합 단백질의 발효 생산 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 발명에 따른 박테리아 균주가 발효 배지에서 배양되며, 상기 발효 배지는 발효 후 세포로부터 제거되고, 상기 재조합 단백질은 상기 발효 배지로부터 단리되는 것을 특징으로 한다.

염색체 통합에 의해 또는 1 또는 2개의 발현 플라스미드로 형질전환된 박테리아 균주의 세포는 당업자에게 알려진 통상적인 방법에 의해 진탕 플라스크에서 또는 생물반응기(발효기)에서 배양된다.

발효 배지(성장 배지, 배양 배지)로서 가능한 것은 원칙적으로, 박테리아 배양을 위한 것으로 당업자에게 알려진 모든 보편적인 배지이다. 이러한 측면에서, 특정 비율의 복잡한 구성요소, 예컨대 펩톤, 트립톤, 효모 추출물, 당밀 또는 옥수수 침지액이 첨가되는 복잡한 배지 또는 최소 염 배지를 사용하는 것이 가능하다. 더욱이, 세포 성장을 향상시키는 추가 구성요소, 예컨대 비타민, 염, 아미노산 및 미량 원소를 배지에 첨가하는 것이 가능하다.

발효는 바람직하게는 통상적인 생물반응기, 예를 들어 교반된 탱크, 버블 컬럼 발효기 또는 에어리프트 발효기에서 수행된다. 교반된 탱크 발효기가 특히 바람직하다.

발효는 단백질 생성 균주의 세포를 성장 배지에서 다양한 매개변수, 예컨대 영양분 공급율, 산소 분압, 배양물의 pH 및 온도의 계속된 모니터링 및 정밀한 제어로 배양하는 단계를 수반한다. 배양 기간은 바람직하게는 24시간 내지 65시간이다.

발효에 사용되는 1차 탄소 공급원은 원칙적으로, 세포에 의해 이용 가능한 모든 당(sugar), 당 알코올 또는 유기 산 또는 이의 염일 수 있다. 이러한 측면에서, 글루코스, 락토스, 아라비노스 또는 글리세롤을 사용하는 것이 바람직하다. 글루코스 및 아라비노스가 특히 바람직하다. 또한, 다수의 상이한 탄소 공급원들의 조합된 공급이 가능하다. 이러한 경우, 탄소 공급원은 처음에 발효 시작 시 발효 배지에서 완전히 충전될 수 있거나, 탄소 공급원 중 어느 것도 처음에 시작 시 충전되지 않거나 탄소 공급원 중 일부만 충전되고, 탄소 공급원은 발효 과정에 걸쳐 공급된다. 이러한 측면에서, 탄소 공급원 중 일부가 처음에 충전되고 일부는 공급되는 하나의 구현예가 특히 바람직하다. 특히 바람직하게는, 탄소 공급원 글루코스는 처음에 10 - 30 g/l의 농도로 충전되고, 발효 과정에서 농도가 5 g/l 미만까지 하락하였고 농도가 5 g/l 미만에서 유지되도록 배치된 경우 공급이 시작된다.

재조합 단백질 및/또는 돌연변이화된 Pal 단백질의 발현이 유도적 프로모터에 의해 제어되는 경우, 발현은 발효 배치로의 프로모터-상응 유도제의 첨가에 의해 유도된다. 유도제로서 적합한 것은 예를 들어, 아라비노스, 락토스, IPTG, 테트라사이클린 또는 쿠메이트이다. 유도제는 발효 동안 임의의 요망된 시점에서 단일 용량 또는 다중 용량으로서 계량될 수 있다. 대안적으로, 유도제는 계속 첨가될 수 있다. 바람직하게는, 재조합 단백질의 발현은 IPTG의 첨가에 의해 유도되고, 돌연변이화된 Pal 단백질의 발현은 아라비노스의 첨가에 의해 유도된다. 특히 바람직하게는, IPTG는 단일 용량으로서 계량되고, 돌연변이화된 Pal 단백질의 발현 유도는, 글루코스 농도가 5 g/l 미만으로 하락한 후의 시점에서 글루코스와 아라비노스의 혼합물이 공급되도록 배치된다. 이러한 측면에서, 혼합물 중 아라비노스 비율은 바람직하게는 33 중량% 내지 66 중량%; 특히 바람직하게는, 상기 비율은 33 중량%이다.

돌연변이화된 Pal 단백질의 발현은 바람직하게는, 단지 소수의 세포 분열이 존재하거나 더 이상의 세포 분열이 존재하지 않는 경우, 즉, 성장 곡선의 정지기의 시작 직전에 또는 시작 시에 배양기에서 유도된다. 이 시점은 OD₆₀₀ 값 또는 CDW 값(하기 참조)으로 결정된 세포 밀도에서 단지 약간의 상승 내지 완전한 상승 부재에 의해 결정된다.

바람직하게는, 발효기 내의 배지는 접종 전에 교반되고, 멸균 압축 공기로 스파지(sparge)되며; 이러한 측면에서, 산소 함량은 100% 포화까지 보정되고 발효 동안 O₂ 포화에 대한 표적값은 이 값의 10% 내지 70%, 바람직하게는 20% 내지 60%, 특히 바람직하게는 30%에서 선택된다. O₂ 포화가 표적값 미만으로 하락한 후, 조절 캐스케이드가 시작되어 O₂ 포화 탱크를 표적값으로 되돌리고, 기체 공급 및 교반 속도를 조정하는 것이 가능하다.

배양물의 pH는 바람직하게는 pH 6 내지 pH 8이다. 바람직하게는, 6.5 내지 7.5의 pH가 설정되며; 특히 바람직하게는, 배양물의 pH는 6.8 내지 7.2에서 유지된다.

배양물의 온도는 바람직하게는 15℃ 내지 45℃이다. 20℃ 내지 40℃의 온도 범위가 바람직하며, 25℃ 내지 35℃의 온도 범위가 특히 바람직하고, 30℃의 온도가 매우 특히 바람직하다.

본 발명에 따르면, 발효 배지는 발효 후 세포로부터 제거되고, 재조합 단백질은 상기 발효 배지로부터 단리된다. 이는 당업계에 알려진 바와 같이 통상적인 방법에 의해 수행될 수 있다. 통상적으로, 세포는 제1 단계에서, 배양 배지 내로 방출된 재조합 단백질로부터 분리 방법, 예컨대 원심분리 또는 여과에 의해 제거된다. 그 후에, 재조합 단백질은 예를 들어, 초여과(ultrafiltration)에 의해 농축될 수 있다.

돌연변이화된 Pal 단백질은 배양 상층액 내로의 재조합 단백질의 방출을 향상시킨다. 향상된 방출의 결과, 재조합 단백질은 증가된 수율로 단리될 수 있다.

증가된 수율은, 배양 배지 내로 방출되는 것이, 재조합 단백질에 대한 유전자를 함유하는 야생형 박테리아 균주 또는 재조합 단백질에 대한 유전자를 함유하고 박테리아 세포 외피의 탈안정화를 위한 단백질을 추가로 발현하는 야생형 박테리아 균주를 사용하는 당업계의 현재 상태에 따라 생성될 수 있는 재조합 단백질의 양의 바람직하게는 적어도 110%, 특히 바람직하게는 적어도 150%, 특히 바람직하게는 적어도 200%임을 의미하는 것으로 이해된다. 이는, 배양 배지 내로 방출되는 재조합 단백질의 수율이, 선행 기술로부터의 상응하는 박테리아 균주로 달성될 수 있는 수율보다 바람직하게는 적어도 1.1배, 특히 바람직하게는 적어도 1.5배, 특히 바람직하게는 적어도 2배 높음을 의미한다.

예를 들어, 실시예 1은, 상응하는 야생형 박테리아 균주 또는 TolAIII-발현 박테리아 균주와 비교하여, Pal△_22-27 또는 Pal22A가 발현되는 경우 2배 내지 3배 초과의 CGTase가 동일한 배양 부피에서 세포 상층액에서 생성될 수 있음을 보여준다(표 1 참조). 마찬가지로 실시예 2에서, Pal△_22-27-발현 돌연변이체에 의한 CGTase의 생성은 상응하는 야생형 박테리아 균주 또는 TolAIII-발현 박테리아 균주와 비교되며, 2배 내지 3배만큼 증가된다(표 2 참조). 실시예 3(표 3 참조)은 유사하게, 명백한 증가를 확인시켜 준다.

기재된 Pal 돌연변이체의 추가 이점은, 동시에, 5시간 내지 24시간의 배양 기간의 경우 세포 용해가 상응하는 야생형 세포와 비교하여 단지 약간 증가된다는 것이다. Wan 및 Baneyx(1998, 상기 참조)는, TolAIII 과다생성이 단지 수시간 후에, 비유도된 세포와 비교하여 1400배 내지 3000배만큼 대략 더 낮은 CFU 카운트를 유발함을 보여주고, 박테리아 세포의 장기간 생존력(viability)이 외막에 미치는 영향으로 인해 명백히 하락하는 것으로 결론내린다. 대조적으로, 돌연변이화된 Pal△_22-27 단백질의 발현의 유도 후 24시간째에, CFU 카운트는 상응하는 야생형 박테리아 균주와 비교하여 단지 2배만큼 하락한다(실시예 3 참조).

박테리아 균주, 바람직하게는 이. 콜라이에서 돌연변이화된 Pal 단백질의 공동발현의 도움으로, Fab 항체 단편을 세포외로 생성하는 것이 또한 가능하다. 이러한 경우, 박테리아 세포는, 항체의 도메인 VL과 CL을 포함하는 경쇄 및 도메인 VH와 CH1을 포함하는 중쇄의 상응하는 단편들을 동시에 합성하고, 그 후에 주변세포질 내로 이들 단편들을 분비해야 한다. 그 후에, 2개의 사슬들은 세포질 밖에서 조립하여 기능적 Fab 단편을 형성한다. 상응하는 ORF는 상이한 유전자에 있을 수 있다. 경쇄 및 중쇄의 항체 단편을 인코딩하는 ORF들이 오페론에서 조직화되는 것이 바람직하다. 본 발명에 따라 돌연변이화된 Pal 단백질의 동시적인 생성의 결과, 항체의 중쇄 및 경쇄는 발효 배지 내로 증가된 농도로 방출된다.

본 방법은 긴 배양 기간 및 높은-세포-밀도 발효를 필요로 하는 재조합 단백질을 생성하는 데 적합하다는 주요 이점을 가진다. 그 결과, 복잡한 진핵 단백질을 재조합 단백질로서 생성하는 것이 가능하다.

바람직하게는, 상기 방법은 재조합 단백질이 발효 배지의 제거 후 상기 발효 배지로부터 정제되는 것을 특징으로 한다.

재조합 단백질은 표준 방법, 예컨대 침전 또는 크로마토그래피를 통해 추가로 정제될 수 있다. 본원에서, 단백질의 이미 올바르게 폴딩된 네이티브 입체형재(conformation)를 이용하는 친화성 크로마토그래피와 같은 방법이 특히 바람직하다.

바람직하게는, 상기 방법은 돌연변이화된 Pal 단백질의 발현이 유도되는 것을 특징으로 한다. 이는, 돌연변이화된 Pal 단백질의 발현 또는 재조합 단백질의 발현 및 돌연변이화된 Pal 단백질의 발현이 유도됨을 의미한다. 이는, 이러한 바람직한 구현예에서, 돌연변이화된 Pal 단백질의 발현이 임의의 경우 유도적 프로모터의 제어 하에 있음을 의미한다. 대조적으로, 재조합 단백질의 발현은 구성적 또는 유도적 프로모터의 제어 하에 있을 수 있다. 특히 바람직하게는, 재조합 단백질을 인코딩하는 ORF와 돌연변이화된 Pal 단백질을 인코딩하는 ORF 둘 다 유도적 프로모터, 특히 바람직하게는 상이하게 유도적 프로모터의 제어 하에 있다. 따라서, 돌연변이화된 Pal 단백질의 발현 및 재조합 단백질의 발현은 바람직하게는 유도적이다.

재조합 단백질 및 돌연변이화된 Pal 단백질을 인코딩하는 유전자들의 프로모터가 바람직하게는 서로 독립적으로 유도될 수 있기 때문에, 재조합 단백질의 발현 및 돌연변이화된 Pal 단백질의 발현에 대한 최적의 시점을 서로 독립적으로 선택하는 것이 가능하다.

유도적 프로모터를 사용함으로써, 상응하는 단백질의 발현을 발효의 임의의 요망되는 시점에서 유도하는 것이 가능하다. 바람직하게는, 돌연변이화된 Pal 단백질의 발현은 재조합 단백질의 발현의 유도 후 유도된다. 특히 바람직하게는, 돌연변이화된 Pal 단백질의 발현은 재조합 단백질의 유도 후 적어도 1시간째, 특히 바람직하게는 적어도 2시간째, 더욱 특히 바람직하게는 15시간 내지 24시간째, 구체적으로 바람직하게는 19시간째에 유도된다.

재조합 단백질 및 돌연변이화된 Pal 단백질의 발현의 유도는 배양 배지로의 유도제의 첨가에 의해 촉발되고, 유도제를 사용되는 유전자에 따라 선택하는 것이 필요하다. 돌연변이화된 Pal 유전자가 아라비노스(ara) 프로모터를 함유하는 바람직한 구현예에서, 돌연변이화된 Pal 단백질의 발현은 배양물 내로의 유도제 아라비노스의 첨가에 의해 유도된다. 재조합 유전자가 tac 프로모터를 함유하는 바람직한 구현예에서, 재조합 단백질의 발현은 배양물 내로의 유도제 락토스 또는 락토스 유사체 IPTG의 첨가에 의해 유도된다.

본 발명에 따르면, 심지어 돌연변이화된 Pal 단백질의 발현의 유도 및 세포의 추가 배양 후, 균주의 세포 밀도는 돌연변이화된 Pal 단백질을 발현하지 않는 박테리아 균주에 필적한다. 특히, 세포 용해로 인한 광학 밀도의 강한 저하는 발생하지 않고, 콜로니-형성 단위(CFU)로서 측정된 살아 있는 세포 카운트에서 단지 약간의 저하가 발생한다.

측정된 광학 밀도(OD)가 높을수록, 세포 밀도가 높다. 탈안정화된 세포 외피를 갖는 박테리아 균주는 일반적으로, 상대적으로 높은 세포 용해를 나타낸다. 상대적으로 높은 세포 용해의 경우, 세포 밀도는 하락하고 결과적으로 OD 값이 하락한다.

본 발명은, 박테리아 균주의 세포의 강한 용해의 발생 없이 재조합 단백질이 배양 배지 내로 방출되는 이점을 가진다. 따라서, 본 발명에 따른 방법은 상응하게 긴 배양 기간을 갖는 복잡한 진핵 단백질의 생성과 높은-세포-밀도 발현 둘 다에 적합함으로써 구별된다.

본 발명의 맥락에서, >50 g/l의 세포 건조 중량이 도달되는 발효는 높은-세포-밀도 발효인 것으로 간주된다. 이는 또한, 문헌에서 반영된다(Bruschi et al. 2014, Microb. Cell Fact. 13:99; Shokri and Larsson 2004, Microb. Cell Fact. 3:9; Knabben et al. 2010, J. Biotechnol. 150, 페이지 73-79).

긴 배양 기간은, 배양 시간이 적어도 24시간, 바람직하게는 적어도 48시간, 특히 바람직하게는 적어도 72시간임을 의미한다.

본 발명의 맥락에서, 상대적으로 낮은(또는 단지 약간 증가되거나 강하지 않은) 세포 용해는, OD₆₀₀ 값, CDW 값, 또는 돌연변이화된 Pal 단백질의 발현의 유도 후 바람직하게는 5시간 내지 24시간의 배양 기간의 경우 결정되는 박테리아 균주의 배양물의 살아 있는 세포 카운트에 대한 값에서, 상기 Pal 돌연변이를 갖지 않는 야생형 박테리아 균주와 비교하여 단지 약간의 감소가 있으며 감소가 전혀 없음을 의미한다. 돌연변이화된 Pal 단백질을 발현하는 박테리아 균주는 특히, 박테리아 균주의 세포 외피를 탈안정화시키기 위한 변형을 함유하는 상기 박테리아 균주의 배양물에 관하여, 이의 세포 용해가 TolAIII 단백질을 발현하는 세포에 대해 Wan 및 Baneyx(1998, 상기 참조)에 의해 제시된 바와 같이 명백히 증가되는 주요 이점을 갖는다.

따라서, 본 발명에 따른 발효 방법으로부터의 세포 배양물은 바람직하게는, 상기 세포 배양물이 돌연변이화된 Pal 단백질의 발현 유도 후 5시간 내지 24시간, 특히 바람직하게는 7시간째에, 돌연변이화된 Pal 단백질을 인코딩하는 ORF를 함유하지 않는다는 점에서 본 발명에 따른 박테리아 균주와 단지 상이한 박테리아 균주가 배양되는 본 발명에 따른 방법으로부터 단지 상이한 발효 방법으로부터 동일한 시점에서 세포 배양물의 OD₆₀₀ 값보다 20% 이하, 특히 바람직하게는 10% 이하, 특히 바람직하게는 5% 이하만큼 더 낮은, 600 nm에서 결정된 광학 밀도(OD₆₀₀)를 특징으로 한다. 600 nm에서의 세포 배양물의 광학 밀도는 분광광도법에 의해 결정된다.

600 nm에서 분광광도계의 도움으로 결정되는 세포 배양물의 광학 밀도는 부피 단위당 세포의 양(세포 농도, 세포 밀도)에 좌우되며, 이는 다시 말해 세포 분열 활성의 척도 및 세포 용해의 척도이고, 이때 세포 용해는 세포 밀도의 저하를 유발한다.

대안적으로, 세포 중량은 또한, 배양물의 정의된 양을 여과 또는 원심분리, 바람직하게는 원심분리, 및 후속적으로 상기 배양물의 건조 및 칭량에 의해 단리함으로써 세포 건조 중량(CDW)으로서 결정될 수 있다.

돌연변이화된 Pal 단백질을 발현하는 박테리아 균주의 활력과 돌연변이화된 Pal 단백질을 발현하지 않는 박테리아 균주의 비교를 가능하게 하는 추가의 대안은, 정의된 배양 부피에 기반하는 "콜로니-형성 단위"(CFU)로서의 살아 있는 세포 카운트의 결정이다. 실험 절차는 Wan 및 Baneyx(1998, 상기 참조)에 기재되어 있다. 단위 CFU는 배양물에서 증식 가능한 세포를 명시한다. 돌연변이화된 Pal 단백질 및 재조합 단백질을 발현하는 박테리아 균주의 경우 살아 있는 세포 카운트는 돌연변이화된 Pal 단백질을 발현하지 않는 박테리아 균주와 비교하여, 최대 100배만큼, 바람직하게는 최대 10배만큼, 특히 바람직하게는 최대 2배만큼 감소된다.

대조적으로, Wan 및 Baneyx(1998, 상기 참조)는 표 2에서, IPTG에 의한 TolAIII 발현의 유도 후 3시간째에, ml당 CFU의 수로서 결정된 살아 있는 세포 카운트가 야생형 박테리아 균주에서 추가로 증가되는 반면, TolAIII-발현 박테리아 균주에서 명백히 감소됨을 언급하고 있다. 저자들은, TolAIII 과발현이 박테리아 균주의 로그 성장기에서 박테리아 성장에 대해 상대적으로 작은 영향을 갖더라도, 박테리아 세포의 생존력이 세포 외막의 투과로 인해 더 장기간 내에 명백히 하락하는 것으로 결론을 내린다.

돌연변이화된 Pal 단백질의 발현에 의한 세포 온전성에 미치는 단지 무시할 만한 영향은 본 발명의 추가의 유의한 이점이다. 더욱이, 유도적 프로모터 하에 돌연변이화된 Pal 단백질을 인코딩하는 ORF의 바람직한 클로닝의 결과, 돌연변이화된 Pal 단백질의 발현을 제어하므로 요망되는 효과가 발생하는 배양 시간을 좁게 제한하는 것이 가능하고, 이는 다시 말해 박테리아 세포의 활력에 미치는 잠재적인 영향을 제한한다.

도 1은 플라스미드 pCGT-Pal의 플라스미드 맵을 도시한다.
도 2는 플라스미드 pCGT-TolAIII의 플라스미드 맵을 도시한다.
도 3은 플라스미드 pJF118ut-CD154의 플라스미드 맵을 도시한다.
도 4는 플라스미드 pJF118ut-CD154-Pal의 플라스미드 맵을 도시한다.
도 5는 플라스미드 pCGT-Pal22A의 플라스미드 맵을 도시한다.

도면에서 사용된 약어는 하기 기능을 인코딩하는 DNA 영역을 나타낸다:

tac p/o: tac 프로모터/작동자

pBAD p/o: 아라비노스 프로모터/작동자

bla: β-락타마제 유전자(앰피실린 내성)

TcR: 테트라사이클린 내성

lacIq: tac 프로모터의 억제인자

cgt-SP: CGTase의 신호 펩타이드

CGTase: 사이클로덱스트린 글리코실트랜스퍼라제

ColE1: 복제 기원

phoA-SP: phoA 신호 펩타이드

AFA-SP: CGTase의 신호 펩타이드의 유도체

rrnB 종결자: rrnB 유전자의 종결자 영역

trpA 종결자: trpA 유전자의 종결자 영역

Pal: 펩티도글리칸-관련 지질단백질

Pal-SP: Pal의 신호 펩타이드

TolAIII: TolA 단백질의 도메인

OmpA-SP: OmpA의 신호 펩타이드

HisTag: 히스티딘 태그

경쇄: 도메인 VL 및 CL을 포함하는 항체 단편

중쇄: 도메인 VH 및 CH1을 포함하는 항체 단편

ScaI/MauBI/EcoRI: 상응하는 제한 엔도뉴클레아제의 제한 부위

실시예

본 발명은 실시예 구현예를 참조로 하여 하기에서 더욱 상세히 설명되며, 이에 의해 제한되지 않는다.

사용된 모든 분자생물학 방법들, 예컨대 중합효소 연쇄 반응(PCR), 유전자 합성, DNA의 단리 및 정제, 제한 효소 및 리가제에 의한 DNA의 변형, 형질전환 등을 당업자에게 알려지고, 문헌에 기재되거나 각각의 제조업체에 의해 권장된 방식으로 수행하였다.

플라스미드의 설명:

pCGT:

플라스미드 pCGT의 생성은 US 2008/0254511 A1의 실시예 4에 기재되어 있고, 플라스미드 맵은 US 2008/0254511 A1의 도 4에 명시된다.

본질적으로, 상기 플라스미드는 테트라사이클린에 대한 내성을 위한 유전자를 함유할 뿐만 아니라, 특히 네이티브 CGTase 신호 서열을 포함하는 클레브시엘라 뉴모니애 M5a1로부터의 사이클로덱스트린 글리코실트랜스퍼라제(CGTase)의 구조 유전자를 함유한다. CGTase 유전자의 발현은 tac 프로모터의 제어 하에 있다.

pCGT-Pal:

pCGT-Pal(플라스미드 맵에 대해서는 도 1을 참조)을 수득하기 위해, 유로핀스(eurofin) 게놈에 의한 유전자 합성에 의해 DNA 단편을 생성하였다. 상기 DNA 단편 xI(SEQ ID No. 1에 명시됨)은

- 아라비노스 프로모터(pBAD 프로모터) 및 또한 작동자 O1과 I2+I1 및 CAP 결합 부위(SEQ ID No. 1의 뉴클레오타이드 10-178)를 함유하는 GenBank 엔트리 X81837.1로부터의 뉴클레오타이드 1136-1304,

- 샤인-달가노(Shine-Dalgarno) 서열(SEQ ID No. 1의 뉴클레오타이드 203-208) 및

- 하기의 융합을 인코딩하는 뉴클레오타이드 단편:

i 이. 콜라이 K12로부터의 펩티도글리칸-관련 지질단백질의 신호 서열(아미노산 -21 내지 -1을 인코딩하는 GenBank 엔트리 X05123.1로부터의 뉴클레오타이드 136-198, SEQ ID No. 1의 뉴클레오타이드 216-278),

ii 이. 콜라이 K12로부터의 펩티도글리칸-관련 지질단백질의 아미노산 7-152를 인코딩하는 GenBank 엔트리 X05123.1로부터의 뉴클레오타이드 217-654(SEQ ID No. 1의 뉴클레오타이드 279-716) 및

iii 이. 콜라이로부터의 trpA 유전자의 종결자(SEQ ID No. 1의 뉴클레오타이드 749-774)

를 포함하였다.

제한 효소 MauBI을 사용하여 상기 DNA 단편 xI을 절단하고, 동일한 제한 효소를 사용하여 절단되었던 발현 벡터 pCGT와 리게이션(ligate)하였다. 클로닝을 무정향성(undirected) 방식으로 수행하였으나; CGTase를 인코딩하는 유전자에 대해 반대되는 리딩 방향에서 DNA 단편을 삽입한 플라스미드를 이용하여 작업하는 것이 바람직하였고, 이때 검증은 제한 효소 ScaI의 제한 패턴 및 시퀀싱을 통해 수행되었다. 상기 플라스미드는 pCGT-Pal로 지칭되었고, 또한 PalD22-27(SEQ ID No. 5에 명시됨)로 동의적으로 지정된 단백질 Pal△_22-27을 인코딩한다.

pCGT-Pal22A:

pCGT-Pal22A(플라스미드 맵에 대해서는 도 5를 참조)을 수득하기 위해, 유로핀스 게놈에 의한 유전자 합성에 의해 DNA 단편을 생성하였다. 상기 DNA 단편 xIA(SEQ ID No. 6에 명시됨)은

- 아라비노스 프로모터(pBAD 프로모터) 및 또한 작동자 O1과 I2+I1 및 CAP 결합 부위(SEQ ID No. 6의 뉴클레오타이드 10-178)를 함유하는 GenBank 엔트리 X81837.1로부터의 뉴클레오타이드 1136-1304,

- 샤인-달가노 서열(SEQ ID No. 6의 뉴클레오타이드 203-208) 및

- 하기의 융합을 인코딩하는 뉴클레오타이드 단편:

i 이. 콜라이 K12로부터의 펩티도글리칸-관련 지질단백질의 신호 서열(아미노산 -21 내지 -1을 인코딩하는 GenBank 엔트리 X05123.1로부터의 뉴클레오타이드 136-198, SEQ ID No. 6의 뉴클레오타이드 216-278),

ii 이. 콜라이 K12로부터의 펩티도글리칸-관련 지질단백질의 아미노산 1-152(GenBank: X05123.1, SEQ ID No. 6의 뉴클레오타이드 279-734 참조), 여기서 위치 1에서의 아미노산 시스테인은 알라닌으로 교환되었음, 및

iii 이. 콜라이로부터의 trpA 유전자의 종결자(SEQ ID No. 6의 뉴클레오타이드 767-792)

를 포함하였다.

제한 효소 MauBI을 사용하여 상기 DNA 단편 xIA를 절단하고, 동일한 제한 효소를 사용하여 절단되었던 발현 벡터 pCGT와 리게이션하였다. 클로닝을 무정향성 방식으로 수행하였으나; CGTase를 인코딩하는 유전자에 대해 반대되는 리딩 방향에서 DNA 단편을 삽입한 플라스미드를 이용하여 작업하는 것이 바람직하였고, 이때 검증은 제한 효소 ScaI의 제한 패턴 및 시퀀싱을 통해 수행되었다. 상기 플라스미드는 pCGT-Pal22A로 지칭되었고, 단백질 Pal22A(SEQ ID No. 7로 명시됨)를 인코딩한다.

pCGT-TolAIII:

TolAIII의 과발현은 선행 기술에 상응하며(Wan 및 Baneyx 1998, 상기 참조); 따라서, pCGT-TolAIII은 선행 기술을 대표하는 비교예로서 선택되었고, 여기서 이 플라스미드를 함유하고 TolAIII을 발현하는 박테리아의 세포 외막 외피는 탈안정화되고 재조합 단백질의 방출은 그 결과로서 증가된다.

pCGT-TolAIII(플라스미드 맵에 대해서는 도 2를 참조)을 수득하기 위해, 유로핀스 게놈에 의한 유전자 합성에 의해 DNA 단편을 생성하였다. 상기 DNA 단편 xII(SEQ ID No. 2에 명시됨)은

- 아라비노스 프로모터(pBAD 프로모터) 및 또한 작동자 O1과 I2+I1 및 CAP 결합 부위(SEQ ID No. 2의 뉴클레오타이드 10-178)를 함유하는 GenBank 엔트리 X81837.1로부터의 뉴클레오타이드 1136-1304,

- 샤인-달가노 서열(SEQ ID No. 2의 뉴클레오타이드 203-208) 및

- 하기의 융합을 인코딩하는 뉴클레오타이드 단편:

i 이. 콜라이 K12로부터의 ompA의 신호 서열(SEQ ID No. 2의 뉴클레오타이드 216-278),

ii 이. 콜라이 K12로부터의 TolA 단백질의 아미노산 291-421(TolAIII을 인코딩함, SEQ ID Nr. 2의 뉴클레오타이드 279-671) 및

iii 이. 콜라이로부터의 trpA 유전자의 종결자(SEQ ID No. 2의 뉴클레오타이드 714-729)

를 포함하였다.

제한 효소 MauBI을 사용하여 상기 DNA 단편 xII를 절단하고, 동일한 제한 효소를 사용하여 절단되었던 발현 벡터 pCGT(상기 참조)와 리게이션하였다. 클로닝을 무정향성 방식으로 수행하였으나; CGTase를 인코딩하는 유전자에 대해 반대되는 리딩 방향에서 DNA 단편을 삽입한 플라스미드를 이용하여 작업하는 것이 바람직하였고, 이때 검증은 제한 효소 ScaI 및 EcoRI의 제한 패턴 및 시퀀싱을 통해 수행되었다. 상기 플라스미드는 pCGT-TolAIII로 지칭되었다.

pJF118ut-CD154:

인간화 모노클로날 항-CD154 항체 5c8의 Fab 단편의 유전자의 클로닝 및 발현을 위한 시작 벡터로서 US 2008/076157 A에 기재된 플라스미드 pJF118ut를 사용하였으며, 이의 서열은 Karpusas 등 2001(구조 9, 페이지 321-329)에 공개되어 있다. pJF118ut는 기지의 발현 벡터 pKK223-3(Amersham Pharmacia Biotech)의 유도체이고, 번호 DSM 18596 하에 DSMZ-독일 미생물 및 세포 배양물 수집 GmbH(Braunschweig)에 기탁되어 있다.

pJF118ut-CD154(플라스미드 맵에 대해서는 도 3을 참조)을 수득하기 위해, 유로핀스 게놈에 의한 유전자 합성에 의해 DNA 단편을 생성하였다. 상기 DNA 단편 xIII(SEQ ID No. 3에 명시됨)은

i US 2008/076157에서 SEQ ID No. 2 하에 개시되고 클레브시엘라 뉴모니애 M5a1로부터의 CGTase의 신호 서열로부터 유래된 신호 서열(SEQ ID No. 3의 뉴클레오타이드 25-114) 및

ii Karpusias 등 2001에서 도 3에 공개된 서열의 아미노산 1-221을 인코딩하는 인간화 모노클로날 항-CD154 항체 5c8의 Fab 단편의 중쇄(V_H-C_H1 도메인)에 대한 리딩 프레임(SEQ ID No. 3의 뉴클레오타이드 115-777),

iii phoA 신호 서열(SEQ ID No. 3의 뉴클레오타이드 800-862),

iv Karpusias 등 2001에서 도 3에 공개된 바와 같은 인간화 모노클로날 항-CD154 항체 5c8의 Fab 단편의 경쇄(V_L-C_L 도메인)에 대한 리딩 프레임(SEQ ID No. 3의 뉴클레오타이드 863-1516), 및

v 4개 아미노산 길이의 링커 및 헥사히스티딘 태그를 인코딩하는 SEQ ID No. 3의 뉴클레오타이드 1517-1546

으로 구성된 융합을 포함하였다.

제한 효소 EcoRI 및 PdmI를 사용하여 상기 DNA 단편 xIII을 절단하고, EcoRI 및 SmaI을 사용하여 절단되었던 발현 벡터 pJF118ut와 리게이션하였다. Fab 단편의 중쇄 및 경쇄에 대한 유전자의 발현이 tac 프로모터의 제어 하에 있는 생성된 플라스미드는 pJF118ut-CD154로 지정되었다.

pJF118ut-CD154-Pal:

pCGT-Pal에 대해 상기 기재된 바와 같이 아라비노스 프로모터의 제어 하에서 Pal 변이체를 인코딩하고 trpA 종결자의 측면에 있는 DNA 단편 xI을 MauBI 제한 부위를 통해 플라스미드 pJF118ut-CD154 내로 삽입하였다. 클로닝을 무정향성 방식으로 수행하였으나; CD154를 인코딩하는 DNA 단편 xIII에 대해 반대되는 리딩 방향에서 DNA 단편 xI을 삽입한 플라스미드를 이용하여 작업하는 것이 바람직하였고, 이때 검증은 제한 효소 ScaI의 제한 패턴 및 시퀀싱을 통해 수행되었다. 상기 플라스미드는 pJF118ut-CD154-Pal(플라스미드 맵에 대해서는 도 4 참조)로 지칭되었다.

실시예 1: 진탕 플라스크에서 사이클로덱스트린 글리코실트랜스퍼라제(CGTase)의 생성

클레브시엘라 뉴모니애 M5a1로부터의 CGTase의 생성을 위해, 이. 콜라이 균주 W3110(ATCC 27325)를 보편적인 방법(예를 들어, TSS 형질전환)에 의해 플라스미드 pCGT, pCGT-Pal, pCGT-Pal22A 또는 pCGT-TolAIII로 형질전환하였다. 플라스미드-함유 세포에 대한 선별을 테트라사이클린(20 mg/l)에 의해 수행하였다. 이. 콜라이 균주는 W3110/pCGT, W3110/pCGT-Pal, W3110/pCGT-Pal22A 및 W3110/pCGT-TolAIII로 지정되었다.

형질전환된 균주를 30℃에서, 1 ml/l 미량 원소 용액(0.15 g/l Na₂MoO₄ x 2 H₂O; 2.5 g/l Na₃BO₃; 0.7 g/l CoCl₂ x 6 H₂O; 0.25 g/l CuSO₄ x 5 H₂O; 1.6 g/l MnCl2 x 4 H₂O; 0.3 g/l ZnSO₄ x 7 H₂O), 3 g/l 글루코스, 10 g/l 락토스, 0.55 g/l CaCl₂ 및 20 mg/l 테트라사이클린을 추가로 함유하는 10 ml의 LB 배지(5 g/l 효모 추출물(Oxoid LP0021), 10 g/l 트립톤(Oxoid LP0042), 5 g/l NaCl)에서 성장시켰다. 사용된 배지는 자가유도 배지였으며, 즉, tac 프로모터에 대한 추가 유도제를 첨가할 필요가 없었다. 배지에 존재하는 글루코스의 대사 후, 락토스는 세포에 의해 흡수될 수 있었다. 이는 tac 프로모터로부터 기인하는 단백질 발현의 유도를 유발하였다. CGTase는 모든 4개의 플라스미드들에 의해 생성되었다.

48시간 후 0.2% (w/v) 아라비노스를 배양 배지에 첨가한 결과, 플라스미드 pCGT-Pal 및 pCGT-Pal22A에 의한, 마찬가지로 플라스미드 상에 존재하고 아라비노스 프로모터의 제어 하에 있는 Pal 변이체의 발현의 추가 유도가 존재하였으며, 대조적으로, 플라스미드 pCGT-TolAIII에 의한 TolAIII의 발현의 추가 유도가 존재하였다. 더 양호한 비교를 위해, 플라스미드 pCGT를 함유하는 대조군 배양물을 역시 아라비노스와 혼합하였다.

72시간의 배양 시간 후, 시료를 수집하고, 세포를 원심분리에 의해 배양 배지로부터 제거하고, 배양 상층액 내 CGTase 함량을, 하기 효소 검정법에 의해 전분으로부터 효소적으로 생성된 사이클로덱스트린(CD)의 양을 기준으로 결정하였다:

검정법 완충액: 5 mM Tris HCl 완충액, 5 mM CaCl₂ x 2 H₂O, pH 6.5

기질 용액: 검정법 완충액 중 10% 전분 용액(Merck No. 1.01252), pH 6.5

검정법 믹스: 0.2 ml의 기질 용액 + 0.2 ml의 원심분리된(5분, 12,000 rpm) 배양 상층액

반응 온도: 40℃

효소 검정법:

* 기질 용액의 온도를 예비조정하고, 배양 상층액을 원심분리하였다(40℃에서 대략 5분)

* 기질 용액과 원심분리된 배양 상층액의 신속한 혼합(월 믹서(whirl mixer))에 의해 검정법 믹스를 제조하고, 상기 원심분리된 배양 상층액을 필요하다면, 0.9-1.5 g/l CD의 값이 후속적인 HPLC 분석에서 결정되도록 검정법 완충액으로 희석시킨다

* 40℃에서 3분 동안 인큐베이션한다

* 0.6 ml의 메탄올의 첨가에 의해 효소 반응을 정지시키고 신속히 혼합한다(월 믹서)

* 상기 믹스를 얼음 상에서 냉각시킨다(대략 5분)

* 원심분리하고(5분, 12,000 rpm), 투명한 상층액을 피펫팅한다

* HPLC에 의해 생성된 CD의 양을 분석한다: 상기 분석을 Nucleodur 100-3 NH2-RP 컬럼(150 mm x 4.6 mm, Macherey-Nagel)이 구비된 Agilent HP 1100 HPLC 시스템 상에서 수중 64% 아세토니트릴(v/v)을 이동상으로서 사용하여 2.1 ml/분의 유속에서 수행하였다. RI 검출기(1260 Infinity RI, Agilent)를 통해 검출을 달성하고, 피크 면적 및 α-CD 표준(Cavamax W6-8 Pharma, Wacker Chemie AG)에 기반하여 정량화를 수행하였다.

효소 활성의 계산: A = G*V1*V2/(t*MG) [U/ml]

A = 활성,

G = CD 함량, mg/l

V1 = 검정법 믹스에서의 희석 인자

V2 = 검정법에 사용하기 전 배양 상층액의 희석 인자;

희석되지 않는 경우, V2 = 1

t = 반응 시간, 분

MG = 분자량, g/mol (MG_CD = 973 g/mol)

1 단위 (U)

1 μmol/l 생성물(CD) / 분

표 1은 각각 달성된 CGTase 수율을 보여준다.

표 1: 72시간의 배양 후 진탕 플라스크 상층액 중 CGTase 수율.

균주	진탕 플라스크: CGTase (U/ml)
W3110/pCGT	39
W3110/pCGT-Pal	134
W3110/pCGT-Pal22A	95
W3110/pCGT-TolAIII	42

실시예 2: 교반된 탱크 발효기에서 사이클로덱스트린 글리코실트랜스퍼라제(CGTase)의 발효 생산

W3110/pCGT, W3110/pCGT-Pal 및 W3110/pCGT-TolAIII의 실시예 1에 기재된 균주들을 클레브시엘라 뉴모니애 M5a1로부터의 사이클로덱스트린 글리코실트랜스퍼라제(CGTase)의 생성에 사용하였다.

CGTase 생성을 교반된 탱크 발효기에서 수행하였다.

1.2 l의 발효 배지(1.5 g/l KH₂PO₄; 5 g/l (NH₄)₂SO₄; 0.5 g/l MgSO₄ x 7 H₂O; 0.225 g/l CaCl₂ x 2 H₂O, 0.075 g/l FeSO₄ x 7 H₂O; 1 g/l Na₃시트레이트 x 2 H₂O; 0.5 g/l NaCl; 1 ml/l 미량 원소 용액(0.15 g/l Na₂MoO₄ x 2 H₂O; 2.5 g/l Na₃BO₃; 0.7 g/l CoCl₂ x 6 H₂O; 0.25 g/l CuSO₄ x 5 H₂O; 1.6 g/l MnCl₂ x 4 H₂O; 0.3 g/l ZnSO₄ x 7 H₂O); 5 mg/l 비타민 B1; 3 g/l 피톤 펩톤(BD 211906); 1.5 g/l 효모 추출물(Oxoid LP0021); 10 g/l 글루코스; 20 mg/l 테트라사이클린)로 충전된 발효기를, 진탕 플라스크에서 7시간 동안 실시예 1 하에 언급된 LB 배지에서 배양하였던 예비 배양물과 함께 0.1 OD₆₀₀까지 접종하였다. 이로써 발효가 시작되었다(시점 0(제로), 발효 시작). 발효 동안, 30℃의 온도를 설정하고, NH₄OH 또는 H₃PO₄를 계량함으로써 pH를 7.0의 값에서 일정하게 유지시켰다. 글루코스를 발효에 걸쳐 계량하였으며, 이때 < 5 g/l의 글루코스 농도를 얻고자 하였다. 22시간 후(로그 성장기의 종료 시) 이소프로필 β-D-티오갈락토피라노사이드(IPTG)를 0.15 mM까지 첨가함으로써 CGTase의 발현을 유도하였다. 발현 시작 후 24시간 또는 41시간째에 Pal 변이체의 발현을 유도하고, 발효 시작 후 41시간째에 순수한 글루코스 공급물(feed)을 2:1의 글루코스:아라비노스 비에서 3 g/l*h의 글루코스/아라비노스 믹스의 일정한 공급물로 전환시킴으로써 TolAIII의 발현을 유도하였다.

접종 전, 발효기 내의 배지를 400 rpm에서 교반하고, 멸균 필터를 통해 멸균된 압축 공기로 1.67 vvm(분당 배양 배지 부피당 공기의 부피)로 스파지하였다. 이들 시작 조건 하에, 접종 전에 광학적 산소 센서(VisiFerm DO225, Hamilton)를 100% 포화까지 보정하였다. 발효 동안 O₂ 포화에 대한 표적값을 이 값의 30%로 설정하였다. 발효 동안 산소 센서를 통해 O₂ 포화를 측정하고, 발효기 대조군 DCU(디지털 제어 유닛, Sartorius Stedim)에 의해 포착하였다. O₂ 포화가 표적값 미만으로 하락한 후, O₂ 포화가 표적값으로 되돌아가도록 하기 위해 소프트웨어 제어 하에 교반 속도를 최대 1500 rpm까지 계속 증가시켰다.

48시간의 발효 후, 시료를 수집하고, 세포를 원심분리에 의해 발효 배지로부터 제거하고, 발효 상층액 내 CGTase 함량을 실시예 1에 기재된 바와 같이 활성 검정법에 의해 결정하였다.

표 2는 각각 달성된 사이클로덱스트린 글리코실트랜스퍼라제 수율을 보여준다.

표 2: 48시간의 배양 후 발효 상층액 중 CGTase 수율.

균주	CGTase (상대 수율, %)
W3110/pCGT	100
W3110/pCGT-Pal, 24시간 후의 유도	430
W3110/pCGT-Pal, 41시간 후의 유도	690
W3110/pCGT-TolAIII	260

W3110/pCGT 및 W3110/pCGT-Pal(41시간 후 유도)에 대한 발효 과정에서, 분광광도계(Beckman Coulter DU 730) 상에서 600 nm에서의 광학 밀도(OD₆₀₀)의 측정을 통해 세포 성장을 결정함으로써, 세포 성장에 미치는 Pal 변이체의 발현의 영향을 조사하였다.

게다가, 배양물의 세포 건조 중량을 결정하였다. 세포 건조 중량을 결정하기 위해, 1 ml의 발효기 배양물을 함유하는 시료를 반응 용기로 옮겼으며, 상기 반응 용기의 빈 중량은 미리 결정해 두었었다. 원심분리(5분, 12,000 rpm) 후, 상층액을 제거하고, 세포 펠렛을 인큐베이터(60℃에서 48시간 이상)에서 건조하였다. 이후, 건조된 세포 펠렛을 함유하는 용기를 칭량하고, 건조된 세포 펠렛을 함유하는 용기의 중량과 빈 용기의 중량 사이의 차이로부터 세포 건조 중량(CDW)을 계산하였다. 그 결과를 표 3에서 조합한다.

표 3: 발효기에서 CGTase-생성 균주의 광학 밀도(OD₆₀₀) 및 세포 건조 중량(CDW).

균주	OD₆₀₀		CDW (g/l)
	배양 기간		배양 기간
	41 h	48 h	41 h	48 h
W3110/pCGT	142	153	51	55
W3110/pCGT-Pal, 41시간 후의 유도	146	150	52	52

실시예 3: 진탕 플라스크에서 Fab 항체 단편의 생성

이. 콜라이 균주 W3110/pJF118ut-CD154 및 W3110/pJF118ut-CD154-Pal을 사용하여 실시예 1에 기재된 방법과 유사하게 진탕 플라스크에서 CD154 Fab 단편의 생성을 수행하였다. 72시간 후, 시료를 수집하고, 세포를 원심분리에 의해 배양 배지로부터 제거하고, 상층액을 분석하여, 배양 배지 내로 방출된 CD154 Fab 단편을 결정하였다. 세포 펠렛을 PBS 완충액에서 수합하고, 세포를 FastPrep 균질화기(MP Biomedicals) 상에서 분해시켰다. 이렇게 해서 수득된 세포 용해물로부터 세포내 존재하는 CD154 Fab 단편을 결정하였다.

당업자에게 알려진 샌드위치 ELISA 검정법을 통해 CD154 Fab 단편을 정량화하였다. 이는 고정된 항-인간 IgG(Fd) 항체(The Binding Site, 제품 번호 PC075)를 캐처(catcher)로서 사용하고 퍼옥시다제-접합 염소 항-인간 카파 경쇄 항체(Sigma, 제품 번호 A 7164)를 검출 항체로서 사용하는 것을 수반하였다. 퍼옥시다제에 의한 발색성(chromogenic) 기질 Dako TMB+(Dako # S1599)의 전환 및 450 nm에서의 관련된 흡수 변화에 의해 정량화를 달성하였다. Fab 단편 "인간 Fab/카파"(Bethyl Laboratories, 제품 번호: P80-115)를 사용하여 ELISA를 보정하였다.

표 3: 배양 상층액 중 CD154 항체 단편의 수율.

	상층액 중 CD154 항체 단편 (mg/l)
균주	상층액 중 CD154 항체 단편 (mg/l)
W3110/pJF118ut-CD154	59
W3110/pJF118ut-CD154-Pal	87

생성물 수율 외에도, 배양물의 살아 있는 세포 카운트를 또한 72시간 후에 결정하였다. 이를 위해, 배양물의 시료를 LB 배지로 1 ml의 최종 부피에서 10⁵-배 희석시켰으며, 각각의 경우 20 mg/l 테트라사이클린을 함유하는 LB 한천 플레이트 상에 100 μl의 희석물을 평판배양하였다. 성장된 콜로니를 카운팅하고, 희석 인자를 고려하여 시작 배양물의 살아 있는 세포 카운트를 계산하였다. 이는 균주 W3110/pJF118ut-CD154에 대해 5.5·10⁸개 세포/ml이고 균주 W3110/pJF118ut-CD154-Pal에 대해 2.7·10⁸개 세포/ml이었다.

SEQUENCE LISTING <110> Wacker Chemie AG Koch, Dr. Johanna Brunner, Markus <120> Bacterial strain for releasing a recombinant protein in a fermentation method <130> CO11724 <160> 7 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 816 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA-Fragment xI <220> <221> misc_feature <222> (1)..(816) <400> 1 caattcgcgc gcgtaacaaa agtgtctata atcacggcag aaaagtccac attgattatt 60 tgcacggcgt cacactttgc tatgccatag catttttatc cataagatta gcggatccta 120 cctgacgctt tttatcgcaa ctctctactg tttctccata cccgtttttt tgggctagaa 180 ataattttgt ttaagaattc taaggaggaa attatatgca actgaacaaa gtgctgaaag 240 ggctgatgat tgctctgcct gttatggcaa ttgcggcagc cagcaatgac ggcagcgaag 300 gcatgctggg tgccggcact ggtatggatg cgaacggcgg caacggcaac atgtcttccg 360 aagagcaggc tcgtctgcaa atgcaacagc tgcagcagaa caacatcgtt tacttcgatc 420 tggacaagta cgatatccgt tctgacttcg ctcaaatgct ggatgcacat gcaaacttcc 480 tgcgtagcaa cccgtcttac aaagtcaccg tagaaggtca cgcggacgaa cgtggtactc 540 cggaatacaa catctccctg ggtgaacgtc gtgcgaacgc cgttaagatg tacctgcagg 600 gtaaaggcgt ttctgcagac cagatctcca tcgtttctta cggtaaagaa aaacctgcag 660 tactgggtca tgacgaagcg gcatactcca aaaaccgtcg tgcggtactg gtttactaag 720 aattgcaagc tggccgacgc gtcccacagc cgccagttcc gctggcggca ttttaacttt 780 ctttaatgaa gccggaaaaa tcccgcgcgc gaaggc 816 <210> 2 <211> 771 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA-Fragment xII <220> <221> misc_feature <222> (1)..(771) <400> 2 caattcgcgc gcgtaacaaa agtgtctata atcacggcag aaaagtccac attgattatt 60 tgcacggcgt cacactttgc tatgccatag catttttatc cataagatta gcggatccta 120 cctgacgctt tttatcgcaa ctctctactg tttctccata cccgtttttt tgggctagaa 180 ataattttgt ttaagaattc taaggaggaa attatatgaa aaagacagct atcgcgattg 240 cagtggcact ggctggtttc gctaccgtag cgcaggctgc cgcagaggca gatgatattt 300 tcggtgagct aagctctggt aagaatgcac cgaaaacggg gggaggggcg aaagggaaca 360 atgcttcgcc tgccgggagt ggtaatacta aaaacaatgg cgcatcaggg gccgatatca 420 ataactatgc cgggcagatt aaatctgcta tcgaaagtaa gttctatgac gcatcgtcct 480 atgcaggcaa aacctgtacg ctgcgcataa aactggcacc cgatggtatg ttactggata 540 tcaaacctga aggtggcgat cccgcacttt gtcaggctgc gttggcagca gctaaacttg 600 cgaagatccc gaaaccacca agccaggcag tatatgaagt gttcaaaaac gcaccattgg 660 acttcaaacc gtaagaattg caagctggcc gacgcgtccc acagccgcca gttccgctgg 720 cggcatttta actttcttta atgaagccgg aaaaatcccg cgcgcgaagg c 771 <210> 3 <211> 1599 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA-Fragment xIII <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1599) <400> 3 acagaattct aaggaggaaa ttatatgaaa agaaaccgtt tttttaatac ctcggctgct 60 attgccattt cgattgcatt acagatcttt tttccgtccg cttccgcttt cgctcaggtt 120 cagctggtgc agagcggtgc cgaagttgtt aaaccgggtg caagcgttaa actgagctgt 180 aaagcaagcg gctatatttt taccagctat tatatgtatt gggtgaaaca ggcaccgggt 240 cagggtctgg aatggattgg tgaaattaat ccgagcaatg gcgataccaa ttttaatgaa 300 aaatttaaaa gcaaagccac cctgaccgtt gataaaagcg caagcaccgc atatatggaa 360 ctgagcagcc tgcgtagcga agataccgca gtttattatt gtacccgtag tgatggtcgc 420 aatgatatgg atagctgggg tcagggcacc ctggtcaccg ttagcagcgc aagcaccaaa 480 ggtccgagcg tttttccgct ggcaccgagc agcaaaagca ccagcggtgg caccgcagca 540 ctgggttgtc tggttaaaga ttattttccg gaaccggtta cagttagctg gaatagcggt 600 gcactgacca gtggtgttca tacctttccg gcagttctgc aaagcagcgg tctgtatagc 660 ctgagcagcg ttgttaccgt tccgagcagt agcctgggca cccagaccta tatttgtaat 720 gttaatcata aaccgagcaa caccaaagtg gataaaaaag ttgaaccgaa aagctgctaa 780 taaccatgga gaaaataaag tgaaacaaag cactattgca ctggcactct taccgttact 840 cttcacccct gttaccaaag ccgatattgt gctcacccag agtccggcaa ccctgagcgt 900 tagtccgggt gaacgtgcaa ccattagctg tcgtgcaagc cagcgtgtta gcagcagcac 960 ctatagctat atgcattggt atcagcagaa accgggtcag cctccgaaac tgctgattaa 1020 atatgcaagc aatctggaaa gcggtgttcc ggcacgtttt agcggtagcg gtagtggcac 1080 cgattttacc ctgaccatta gcagcgttga accggaagat tttgccacct attattgtca 1140 gcatagctgg gaaattcctc cgacctttgg tggtggcacc aaactcgaga ttaaacgtac 1200 cgttgcagca ccgagcgtgt ttatctttcc gcctagtgat gaacagctga aaagcggcac 1260 cgcaagcgtt gtttgtctgc tgaataactt ttatccgcgt gaagcaaaag ttcagtggaa 1320 agttgataat gcactgcaaa gcggtaatag ccaagaaagc gttaccgaac aggatagcaa 1380 agatagcacc tatagcctgt caagcaccct gaccctgagc aaagcagatt atgaaaaaca 1440 caaagtgtat gcctgcgaag ttacccatca gggtctgagc agtccggtta caaaaagttt 1500 taatcgtggt gaatgtagct cttctgccca tcaccaccat caccattaat aagcttctag 1560 aagcttggct gttttggcgg atgagagaag attttcgac 1599 <210> 4 <211> 173 <212> PRT <213> Escherichia coli <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(173) <223> Wild-type Pal protein <400> 4 Met Gln Leu Asn Lys Val Leu Lys Gly Leu Met Ile Ala Leu Pro Val 1 5 10 15 Met Ala Ile Ala Ala Cys Ser Ser Asn Lys Asn Ala Ser Asn Asp Gly 20 25 30 Ser Glu Gly Met Leu Gly Ala Gly Thr Gly Met Asp Ala Asn Gly Gly 35 40 45 Asn Gly Asn Met Ser Ser Glu Glu Gln Ala Arg Leu Gln Met Gln Gln 50 55 60 Leu Gln Gln Asn Asn Ile Val Tyr Phe Asp Leu Asp Lys Tyr Asp Ile 65 70 75 80 Arg Ser Asp Phe Ala Gln Met Leu Asp Ala His Ala Asn Phe Leu Arg 85 90 95 Ser Asn Pro Ser Tyr Lys Val Thr Val Glu Gly His Ala Asp Glu Arg 100 105 110 Gly Thr Pro Glu Tyr Asn Ile Ser Leu Gly Glu Arg Arg Ala Asn Ala 115 120 125 Val Lys Met Tyr Leu Gln Gly Lys Gly Val Ser Ala Asp Gln Ile Ser 130 135 140 Ile Val Ser Tyr Gly Lys Glu Lys Pro Ala Val Leu Gly His Asp Glu 145 150 155 160 Ala Ala Tyr Ser Lys Asn Arg Arg Ala Val Leu Val Tyr 165 170 <210> 5 <211> 167 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PalD22-27 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(167) <400> 5 Met Gln Leu Asn Lys Val Leu Lys Gly Leu Met Ile Ala Leu Pro Val 1 5 10 15 Met Ala Ile Ala Ala Ala Ser Asn Asp Gly Ser Glu Gly Met Leu Gly 20 25 30 Ala Gly Thr Gly Met Asp Ala Asn Gly Gly Asn Gly Asn Met Ser Ser 35 40 45 Glu Glu Gln Ala Arg Leu Gln Met Gln Gln Leu Gln Gln Asn Asn Ile 50 55 60 Val Tyr Phe Asp Leu Asp Lys Tyr Asp Ile Arg Ser Asp Phe Ala Gln 65 70 75 80 Met Leu Asp Ala His Ala Asn Phe Leu Arg Ser Asn Pro Ser Tyr Lys 85 90 95 Val Thr Val Glu Gly His Ala Asp Glu Arg Gly Thr Pro Glu Tyr Asn 100 105 110 Ile Ser Leu Gly Glu Arg Arg Ala Asn Ala Val Lys Met Tyr Leu Gln 115 120 125 Gly Lys Gly Val Ser Ala Asp Gln Ile Ser Ile Val Ser Tyr Gly Lys 130 135 140 Glu Lys Pro Ala Val Leu Gly His Asp Glu Ala Ala Tyr Ser Lys Asn 145 150 155 160 Arg Arg Ala Val Leu Val Tyr 165 <210> 6 <211> 834 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA-Fragment xIA <220> <221> misc_feature <222> (1)..(834) <400> 6 caattcgcgc gcgtaacaaa agtgtctata atcacggcag aaaagtccac attgattatt 60 tgcacggcgt cacactttgc tatgccatag catttttatc cataagatta gcggatccta 120 cctgacgctt tttatcgcaa ctctctactg tttctccata cccgtttttt tgggctagaa 180 ataattttgt ttaagaattc taaggaggaa attatatgca actgaacaaa gtgctgaaag 240 ggctgatgat tgctctgcct gttatggcaa ttgcggcagc ttcttccaac aagaacgcca 300 gcaatgacgg cagcgaaggc atgctgggtg ccggcactgg tatggatgcg aacggcggca 360 acggcaacat gtcttccgaa gagcaggctc gtctgcaaat gcaacagctg cagcagaaca 420 acatcgttta cttcgatctg gacaagtacg atatccgttc tgacttcgct caaatgctgg 480 atgcacatgc aaacttcctg cgtagcaacc cgtcttacaa agtcaccgta gaaggtcacg 540 cggacgaacg tggtactccg gaatacaaca tctccctggg tgaacgtcgt gcgaacgccg 600 ttaagatgta cctgcagggt aaaggcgttt ctgcagacca gatctccatc gtttcttacg 660 gtaaagaaaa acctgcagta ctgggtcatg acgaagcggc atactccaaa aaccgtcgtg 720 cggtactggt ttactaagaa ttgcaagctg gccgacgcgt cccacagccg ccagttccgc 780 tggcggcatt ttaactttct ttaatgaagc cggaaaaatc ccgcgcgcga aggc 834 <210> 7 <211> 173 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Pal22A <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(173) <400> 7 Met Gln Leu Asn Lys Val Leu Lys Gly Leu Met Ile Ala Leu Pro Val 1 5 10 15 Met Ala Ile Ala Ala Ala Ser Ser Asn Lys Asn Ala Ser Asn Asp Gly 20 25 30 Ser Glu Gly Met Leu Gly Ala Gly Thr Gly Met Asp Ala Asn Gly Gly 35 40 45 Asn Gly Asn Met Ser Ser Glu Glu Gln Ala Arg Leu Gln Met Gln Gln 50 55 60 Leu Gln Gln Asn Asn Ile Val Tyr Phe Asp Leu Asp Lys Tyr Asp Ile 65 70 75 80 Arg Ser Asp Phe Ala Gln Met Leu Asp Ala His Ala Asn Phe Leu Arg 85 90 95 Ser Asn Pro Ser Tyr Lys Val Thr Val Glu Gly His Ala Asp Glu Arg 100 105 110 Gly Thr Pro Glu Tyr Asn Ile Ser Leu Gly Glu Arg Arg Ala Asn Ala 115 120 125 Val Lys Met Tyr Leu Gln Gly Lys Gly Val Ser Ala Asp Gln Ile Ser 130 135 140 Ile Val Ser Tyr Gly Lys Glu Lys Pro Ala Val Leu Gly His Asp Glu 145 150 155 160 Ala Ala Tyr Ser Lys Asn Arg Arg Ala Val Leu Val Tyr 165 170

Claims

기능적 프로모터의 제어 하에 재조합 단백질을 인코딩하는 개방형 리딩 프레임(open reading frame)을 함유하는 박테리아 균주로서,
상기 박테리아 균주는 기능적 프로모터의 제어 하에 돌연변이화된 펩티도글리칸-관련 지질단백질(Pal 단백질)을 인코딩하는 개방형 리딩 프레임을 함유하고, 상기 돌연변이화된 Pal 단백질은 이 단백질이 박테리아의 세포 외막에 대한 막 앵커(anchor)를 갖지 않도록 돌연변이화된 것임을 특징으로 하는, 박테리아 균주.
제1항에 있어서,
상기 박테리아 균주는 그람-음성 박테리아인 것을 특징으로 하는, 박테리아 균주.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 박테리아 균주는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 종의 균주인 것을 특징으로 하는, 박테리아 균주.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 돌연변이화된 Pal 단백질을 인코딩하는 개방형 리딩 프레임은, 상기 개방형 리딩 프레임이 아미노산 위치 1 내지 6 중 하나 이상에서 돌연변이화되었던 돌연변이화된 Pal 단백질을 인코딩하도록, 돌연변이화된 것임을 특징으로 하는, 박테리아 균주.
제4항에 있어서,
상기 돌연변이화된 Pal 단백질을 인코딩하는 개방형 리딩 프레임은, 상기 개방형 리딩 프레임이 N-말단 시스테인 잔기가 치환되었던 돌연변이화된 Pal 단백질을 인코딩하도록, 돌연변이화된 것임을 특징으로 하는, 박테리아 균주.
제4항에 있어서,
상기 돌연변이화된 Pal 단백질을 인코딩하는 개방형 리딩 프레임은, 상기 개방형 리딩 프레임이 N-말단 시스테인 잔기가 부재하는 돌연변이화된 Pal 단백질을 인코딩하도록, 돌연변이화된 것임을 특징으로 하는, 박테리아 균주.
제4항에 있어서,
상기 돌연변이화된 Pal 단백질을 인코딩하는 개방형 리딩 프레임은, 상기 개방형 리딩 프레임이 아미노산 1 내지 6이 부재하는 돌연변이화된 Pal 단백질을 인코딩하도록, 돌연변이화된 것임을 특징으로 하는, 박테리아 균주.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 재조합 단백질은 이종성(heterologous) 단백질인 것을 특징으로 하는, 박테리아 균주.
플라스미드로서,
- 기능적 프로모터의 제어 하에 재조합 단백질을 인코딩하는 개방형 리딩 프레임
을 포함하고,
상기 플라스미드는
- 기능적 프로모터의 제어 하에 신호 펩타이드 및 돌연변이화된 Pal 단백질을 인코딩하는 개방형 리딩 프레임을 함유하고, 상기 Pal 단백질은 이 단백질이 박테리아의 세포 외막에 대한 막 앵커를 갖지 않도록 돌연변이화된 것임을 특징으로 하는, 플라스미드.
재조합 단백질의 발효 생산 방법으로서,
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 박테리아 균주가 발효 배지에서 배양되며, 상기 발효 배지는 발효 후 세포로부터 제거되고, 상기 재조합 단백질은 상기 발효 배지로부터 단리되는 것을 특징으로 하는, 방법.
제10항에 있어서,
상기 재조합 단백질은 발효 배지의 제거 후 상기 발효 배지로부터 정제되는 것을 특징으로 하는, 방법.
제10항 또는 제11항에 있어서,
상기 돌연변이화된 Pal 단백질의 발현이 유도되는 것을 특징으로 하는, 방법.
제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 돌연변이화된 Pal 단백질의 발현이 상기 재조합 단백질의 발현의 유도 후 유도되는 것을 특징으로 하는, 방법.