CN113631567A - 在发酵方法中释放重组蛋白的细菌菌株 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种细菌菌株，其含有编码重组蛋白的开放阅读框，从而控制功能性启动子。本发明的特征在于该细菌菌株含有编码突变的肽聚糖相关的脂蛋白(PAL蛋白)的开放阅读框，从而控制功能性启动子，其中所述PAL蛋白被突变，使得PAL蛋白不含细菌外细胞膜的膜锚。本发明还涉及编码重组蛋白和突变的PAL蛋白的质粒，并且涉及一种使用根据本发明的细菌菌株发酵生产重组蛋白的方法。以这种方式，与现有技术相比，可以在不导致细菌细胞大量死亡的情况下实现增加的培养残余物中的产物产量。
Description
技术领域
本发明涉及一种含有在功能性启动子的控制下编码重组蛋白的开放阅读框的细菌菌株，其特征在于该细菌菌株含有在功能性启动子的控制下编码突变的肽聚糖相关的脂蛋白(Pal蛋白)的开放阅读框，Pal蛋白已经突变使得其不具有细菌外细胞膜的膜锚。本发明还涉及一种编码重组蛋白和突变的Pal蛋白的质粒，并且涉及一种使用根据本发明的细菌菌株发酵生产重组蛋白的方法。
背景技术
与哺乳动物细胞培养相比，重组蛋白在细菌中的生成时间短且操作简单，因此可以在细菌中经济高效地生产重组蛋白。由于其广泛研究的遗传学和生理学，革兰氏阴性肠杆菌大肠杆菌(Escherichia coli)是目前生产重组蛋白最常用的生物。特别有吸引力的是在大肠杆菌中生产重组蛋白的方法，其中目标蛋白以高产量和正确折叠方式直接释放到发酵培养基中，因为这避免了复杂的细胞破碎和蛋白质折叠过程。文献中公开了一系列大肠杆菌菌株以及使用大肠杆菌菌株实现重组蛋白向培养基中释放的方法。
i)首先，有可能使用所谓的“泄漏(leaky)”菌株。这些应理解为是指在外膜上有缺陷并因此将周质蛋白部分地排放到培养基中的大肠杆菌突变体。这是一种非特异性机制。此类“泄漏”突变体的一个例子是在Tol-Pal复合体中具有缺陷的菌株，例如tol-和pal-缺失突变体。已知tol-和pal-缺失突变体将细胞内源性周质蛋白释放到发酵培养基中，诸如例如碱性磷酸酶PhoA或RNase I。这种菌株对EDTA、各种洗涤剂和抗生素极为敏感，并表现出生长缺陷(Lazzaroni和Portalier 1981,J.Bact.145,第1351-1358页；Lazzaroni和Portalier 1992,Mol.Microbiol.6,第735-742；Chen et al.2014,Microb.Biotechnol.7,第360-370页；Bernstein et al.1972,J.Bacteriol.112,第74-83页)。因此，它们仅有限适合于在高细胞密度发酵条件下培养。
ii)实现重组蛋白释放的另一方法是表达可渗透大肠杆菌的细胞被膜的蛋白，从而促进蛋白向培养基中的释放。细菌素释放蛋白(BRP)(一种导致外膜降解和细胞裂解的小脂蛋白)的表达已被充分地描述。通过过表达ColE1 BRP(Kil蛋白)或阴沟肠道菌素DF13BRP，可以将白介素-2、β-葡聚糖酶、碱性磷酸酶或β-内酰胺酶排放到培养基中(Beshay etal.2007,Biotechnol.Lett.29,第1893-1901页；Robbens et al.1995,ProteinExpr.Purif.6,第481-486页；Sommer et al.2010,J.Biotechnol.145,第350-358页)。
iii)Wan和Baneyx描述了另一种使细胞被膜不稳定的方法(1998,ProteinExpr.Purif.14,第13-22页)。这涉及通过过表达TolA蛋白(TolAIII)的可溶性C-末端结构域来破坏膜完整性。这导致了与tolA-缺失突变体类似的表型，蛋白RNase I和碱性磷酸酶从周质向培养基的释放增加，并且导致对脱氧胆酸盐敏感(Levengood-Freyermuth etal.1993,J.Bacteriol.175,第222-228页)。通过TolAIII蛋白的过表达，OmpA-TEM-β-内酰胺酶蛋白的释放明显增加。然而，与对照相比，β-内酰胺酶的表达降低了1.5-2倍。此外，正如在tolA突变体中一样，TolAIII的表达大大损害了细胞的活力。TolAIII表达开始后3小时，摇瓶中作为培养物活力量度的菌落形成单位(CFU)数降低了1000倍。此外，细胞对低浓度的SDS(0.02％)敏感，表明存在明显的膜缺陷。
这种细胞不适合在生产复杂的真核蛋白所需的相对较长时间内在高细胞密度下培养。TolAIII共表达的另一个缺点是，可以在培养上清液中大量发现TolAIII本身，因此污染了向外转移的靶蛋白。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种细菌菌株，其以增加的产量将重组蛋白释放到培养基中而不会发生强烈的细胞裂解。
该目的是通过一种含有在功能性启动子的控制下编码重组蛋白的开放阅读框(open reading frame)的细菌菌株来实现的，其特征在于细菌菌株含有在功能性启动子的控制下编码突变的肽聚糖相关的脂蛋白(peptidoglycan-associated lipoprotein，Pal蛋白)的开放阅读框，突变的Pal蛋白已经突变，使得其不具有细菌外细胞膜的膜锚。
在发酵方法中使用这种细菌菌株的优点在于，另外的蛋白质(即突变形式的Pal蛋白质)与重组蛋白一起表达。突变的Pal蛋白的表达导致细菌的外细胞膜有限透化，因此重组蛋白可以从细胞中释放出来而不会导致细胞死亡。由于改善了释放，可以以提高的收率分离重组蛋白。本发明提供了相应的细菌菌株、使用细菌菌株发酵生产重组蛋白的方法以及相应的质粒。这样，与现有技术相比，有可能在培养上清液中获得增加的产物产量，而不会发生细菌细胞的大量死亡。
细菌菌株优选特征在于该细菌菌株是革兰氏阴性细菌，特别优选肠杆菌科的细菌菌株，特别优选大肠杆菌(Escherichia coli)种的菌株。
肽聚糖相关的脂蛋白(Pal，Pal蛋白)是一种细菌的周质蛋白，通过其脂化的N-末端锚定在细菌细胞的外膜中，并通过C-末端与肽聚糖层相互作用。此外，Pal是Pal-Tol系统的组件(Godlewska et al.2009,FEMS Microbiol.Lett.298,第1-11页)并且与周质的各种其它蛋白质相互作用，例如Lpp和ompA(Cascales et al.,2002,J.Bacteriol.184,第754-759页；Godlewska，见上文)。在技术应用中，Pal蛋白例如用于以由Pal蛋白和抗体片段组成的融合蛋白的形式将抗体片段锚定在细菌的细胞表面上(Fuchs et al.1991,Biotechnology(N Y)9,第1369-1372页；Dhillon et al.1999,Lett.Appl.Microbiol.28,第350-354页)。
野生型Pal基因(wild-type Pal gene)是指通过进化自然产生并存在于野生型细菌基因组中的Pal基因的形式。野生型Pal基因表达野生型Pal前体蛋白，其包含信号肽和野生型Pal蛋白的氨基酸序列(SEQ ID No.4)。切掉21个氨基酸的信号序列后，来自大肠杆菌(菌株K-12)的成熟野生型Pal蛋白包含152个氨基酸的序列(参见Genbank条目X05123，Uniprot P0A912)并且在1位氨基酸处带有氨基酸半胱氨酸，该半胱氨酸在细菌脂蛋白中高度保守并被膜锚酰化(参见例如Zückert et al.2014,Biochimica et Biophysica Acta1843,第1509-1516页或者Konovalova和Silhavy 2015,Phil.Trans.R.Soc.B 370:20150030)。相反，突变的Pal蛋白没有细菌外细胞膜的膜锚。
Pal前体蛋白(Pal蛋白的前体形式)是指包含Pal蛋白的氨基酸序列和信号序列并且不携带翻译后修饰的Pal蛋白。
成熟的野生型Pal蛋白是指包含野生型Pal蛋白的氨基酸序列并且而不再携带信号序列(由于已被切除)的Pal蛋白，并且其中存在可能的翻译后修饰。这样的翻译后修饰是例如Pal蛋白与膜锚的酰化。
开放阅读框(ORF)是指DNA或RNA的起始密码子和终止密码子之间并且编码蛋白质的氨基酸序列的区域。ORF也被称为编码区域。
ORF被非编码区域包围。基因是指含有产生生物活性RNA的所有基本信息的DNA片段。一个基因包含通过转录产生单链RNA拷贝的DNA片段和参与调控该拷贝过程的表达信号。该表达信号包括例如至少一个启动子、转录起始位点、翻译起始位点和核糖体结合位点。此外，终止子和一个或多个操纵子(operator)可以作为表达信号。
在功能性启动子的情况下，在启动子的调控下的ORF被转录成RNA。
单顺反子是指仅含有一个开放阅读框的信使RNA(mRNA)。
操纵子是DNA的功能单元，包含多个ORF、启动子和可能的其它表达信号。
细菌菌株可以含有(1)编码重组蛋白的一个ORF，(2)编码相同重组蛋白的多个ORF或(3)编码不同重组蛋白的多个ORF。例如，第二种可能性用于增加重组蛋白的表达和产量，而第三种可能性尤其用于表达由多种多肽(亚基)组成的蛋白质。一个例子是表达抗体片段，该抗体片段在转运出细胞质后进行后续组装。
这些ORF中的每一个都可以位于单独的基因中；也可以将多个ORF组织在一个操纵子中，即由共同表达信号调节。
此外，每个操纵子可以含有编码突变的Pal蛋白的ORF。即使编码一种或多种重组蛋白的一个或多个ORF和编码突变的Pal蛋白的ORF位于一个操纵子中，但突变的Pal蛋白始终表达为单独的蛋白而不是融合蛋白，因为按照定义，编码突变的Pal蛋白的ORF的特点在于其自身的翻译起始密码子和终止密码子。
如果重组蛋白由多个多肽链(亚基)组成，则优选将各个肽链(亚基)的ORF组织在一个操纵子中。
优选将编码突变的Pal蛋白的ORF转录为单顺反信使RNA。这意味着突变的Pal蛋白由其自身的单独基因表达。基因被称为突变的Pal基因。
编码重组蛋白和突变的Pal蛋白的ORF可以通过染色体或质粒表达。在单独基因的情况下，它们也可以由在复制起点和选择标志物方面彼此兼容的单独质粒表达。ORF优选地是质粒编码的。
与野生型Pal蛋白相比，用于本发明并编码突变的Pal蛋白的ORF含有氨基酸序列的变化，例如取代、缺失和/或插入。
根据本发明，编码突变的Pal蛋白的ORF的序列优选是导致突变的Pal蛋白表达的DNA序列，该DNA序列源自也用于生产重组蛋白的同一生物。
编码突变的Pal蛋白的根据本发明的ORF的DNA序列的来源不限于用于生产重组蛋白的细菌菌株，只要非突变形式的相应Pal蛋白在用于生产重组蛋白的细菌菌株中是功能性的即可。就此而言，功能性是指上述Pal蛋白可以承担用于生产重组蛋白的细菌菌株的Pal蛋白的所有生物学功能。特别地，这意味着具有Pal基因的染色体缺失的细菌菌株的表型特征可以通过额外引入上述Pal基因的拷贝来补充。
在本发明的上下文中以单数形式使用的术语“编码重组蛋白的一个/或该ORF”和“一种/重组蛋白”也可以表示多个ORF和/或多种不同的重组蛋白。优选涉及1至3种不同的重组蛋白，特别优选1种重组蛋白或2种不同的重组蛋白。如现有技术中，实现重组蛋白在细菌中的克隆和表达。重组蛋白具有例如转运至周质的信号序列。
重组蛋白是野生型细菌基因组天然完全不表达或以不同的量表达的蛋白。细菌供用于产生重组蛋白，根据本发明，蛋白被释放到培养基中。
为了实现重组蛋白向培养基中的释放，在胞质溶胶中进行蛋白质生物合成后，重组蛋白和突变的Pal蛋白都需要转运到周质中。为了转运到周质中，有必要将待生产蛋白质的编码DNA序列的5'末端在框中与蛋白输出的信号序列的3'末端连接起来。原则上，适用于此目的的是所有信号序列，这些信号序列允许借助Sec或Tat装置在所使用细菌菌株中对目标蛋白进行易位。现有技术中描述了各种信号序列，例如以下基因的信号序列：phoA、ompA、pelB、ompF、ompT、lamB、malE、葡萄球菌蛋白A、StII等(Choi和Lee 2004,Appl.Microbiol.Biotechnol.64,第625-635页)。根据本发明优选的重组蛋白是大肠杆菌的phoA基因或ompA基因的信号序列，或US 2008/0076157中以SEQ ID No.1和3公开的肺炎克雷伯菌M5a1的环糊精糖基转移酶(α-CGTase)的信号序列或由其衍生的信号序列。优选地，突变的Pal蛋白以其前体形式带有Pal蛋白的天然信号序列，如Chen和Henning(1987,Eur.J.Biochem.163,第73-77页)。优选地，重组蛋白和突变的Pal蛋白以其前体形式带有不同的信号序列，这两个信号序列导致蛋白输出。
编码突变的Pal蛋白和重组蛋白的ORF的表达可以由一个启动子或多个不同启动子控制。优选的是，突变的Pal蛋白和重组蛋白的ORF受不同启动子的控制。
可以首先通过PCR使用寡核苷酸作为引物和编码Pal蛋白的DNA模板(例如从大肠杆菌中分离的基因组DNA)扩增编码突变的Pal蛋白的DNA片段，然后使用常见的分子生物学技术，在每种情况下均与包含信号肽序列并以类似方式产生的DNA分子连接，从而形成框内融合。或者，也可以通过基因合成产生整个DNA分子。然后可以将由所讨论的信号序列和突变的Pal蛋白的编码序列组成的DNA分子引入载体(例如质粒)中，或者通过已知方法直接整合到细菌菌株的染色体中。优选地，将DNA分子引入质粒，诸如例如已知表达载体的衍生物，诸如pJF118EH、pKK223-3、pUC18、pBR322、pACYC184、pASK-IBA3或pET。使用本领域技术人员已知的方法将质粒引入细菌细胞(转化)。
使用的质粒可以带有选择标志物。适于作为选择标志物的是编码对抗生素例如氨苄青霉素、四环素、氯霉素、卡那霉素等抗药性的基因。优选地，质粒包含基因，该基因的表达介导四环素抗性。此外，适合作为选择标志物的是营养缺陷型标志物，其编码已在含有质粒的所讨论的细菌菌株中缺失的必需基因。如果将两种质粒转化到细胞中，则优先使用两种不同的抗生素抗性或两种不同的营养缺陷型标志物来选择两种质粒的存在。
适合作为启动子的是本领域技术人员已知的所有启动子，诸如组成型启动子，例如GAPDH启动子，或诱导型启动子，例如Lac、tac、trc、λPL、ara、cumate或tet启动子或由其衍生的序列。编码重组蛋白的ORF和编码突变的Pal蛋白的ORF可以被启动子控制为操纵子，也可以受不同启动子的控制。优选地，编码重组蛋白的ORF和编码突变的Pal蛋白的ORF受不同诱导型启动子的控制。特别优选地，重组蛋白在tac启动子的控制下表达，而突变的Pal蛋白在ara(阿拉伯糖)启动子的控制下表达。
可以通过已知的方式产生突变的Pal蛋白的氨基酸序列，例如通过去除保守的半胱氨酸残基或引入阻止膜锚修饰的其它突变。本领域技术人员知道文献中用于检查在细菌菌株中表达后引入的突变是否导致突变的Pal蛋白不再含有膜锚的方法(Hayashi和Wu1990,J.Bioenerg.Biomembr.22,第451-471页；Giam et al.1984,Eur.J.Biochem.141,第331-337页；Lazzaroni和Portalier 1992，见上文；Mizuno 1979,J.Biochem.86,第991-1000页)。
在优选的实施方式中，细菌菌株的特征在于，编码突变的Pal蛋白的ORF已经突变，使得其编码一种突变的Pal蛋白，该蛋白在氨基酸位置1至6、优选1至4且特别优选1至2中的一个或多个处被突变。就此而言，氨基酸位置是指追随信号序列的氨基酸，即氨基酸位置1是信号序列之后的第一个氨基酸。
优选地，突变是缺失(缺少氨基酸)或取代(氨基酸交换)，特别优选缺失。
特别优选地，细菌菌株的特征在于，编码突变的Pal蛋白的ORF已经突变，使得其编码其中N-末端半胱氨酸残基已被取代的突变的Pal蛋白。
在另一个优选的实施方式中，细菌菌株的特征在于，编码突变的Pal蛋白的ORF已经被突变，使得其编码其中不存在N-末端半胱氨酸残基的突变的Pal蛋白。优选地，氨基酸在位置1处缺失，特别优选缺失半胱氨酸残基。
N-末端或氨基末端是指具有游离氨基(NH2)的Pal蛋白端部。N-末端半胱氨酸残基是信号序列后氨基酸位置1处的半胱氨酸残基。
特别优选地，突变的Pal蛋白的氨基酸序列是SEQ ID No.7(Pal22A)中指定的序列，并且其中N-末端半胱氨酸已交换为氨基酸丙氨酸，结果是丙氨酸跟随信号序列的前21个氨基酸。
在一个优选的实施方式中，细菌菌株的特征在于，编码突变的Pal蛋白的ORF已经被突变，使得其编码其中缺少氨基酸1至6、优选1至4且特别优选1至2的突变的Pal蛋白。特别优选地，突变的Pal蛋白的氨基酸序列是SEQ ID No.5(PalΔ22-27)中指定的序列，并且其中丙氨酸跟随信号序列的前21个氨基酸。突变的Pal蛋白的信号肽后的序列与大肠杆菌成熟野生型Pal蛋白的氨基酸7-152相同(野生型蛋白的氨基酸序列见SEQ ID No.4)。
优选地，重组蛋白是异源蛋白。异源蛋白应理解为是指不属于蛋白质组的蛋白质，蛋白质组即为细菌菌株(优选大肠杆菌K12菌株)的整个天然蛋白质集合。在所用细菌菌株(例如在大肠杆菌K12菌株)中自然存在的所有蛋白质都可以从已知的基因组序列导出(例如从大肠杆菌K12的登录号为NC_000913的Genbank条目)。
特别优选作为异源蛋白的是含有一个或多个二硫键的真核蛋白。特别优选的是功能形式为二聚体或多聚体的真核蛋白。
最重要的异源蛋白类别包括抗体及其片段、细胞因子、生长因子、蛋白激酶、蛋白激素、脂质运载蛋白、抗运载蛋白(anticalins)、酶、结合蛋白和分子支架以及由其衍生的蛋白。蛋白质类别的实例尤其是重链抗体及其片段(例如纳米抗体)、单链抗体、干扰素、白介素、白介素受体、白介素受体拮抗剂、G-CSF、GM-CSF、M-CSF、白血病抑制剂、干细胞生长因子、肿瘤坏死因子、生长激素、胰岛素样生长因子、成纤维细胞生长因子、血小板源性生长因子、转化生长因子、肝细胞生长因子、骨形态发生因子、神经生长因子、脑源性神经营养因子(BDNF)、胶质细胞源性神经营养因子、血管生成抑制剂、组织纤溶酶原激活剂、凝血因子、胰蛋白酶抑制剂、弹性蛋白酶抑制剂、补体成分、缺氧诱导的应激蛋白、原癌产物、转录因子、病毒组成蛋白、胰岛素原、尿激酶、促红细胞生成素、血小板生成素、神经营养蛋白、蛋白C、葡萄糖脑苷脂酶、超氧化物歧化酶、肾素、溶菌酶、P450、胰凝乳蛋白酶、脂皮质蛋白、reptin、血清白蛋白、链激酶、替奈普酶、CNTF和环糊精糖基转移酶。
衍生自分子支架的蛋白质的实例尤其是evibodies(衍生自CTLA-4)、亲和体(金黄色葡萄球菌的蛋白A)、高亲和性多聚体(人类A结构域家族的)、转体(转铁蛋白的)、DARPins(锚蛋白重复蛋白的)、adnectin(纤连蛋白III的)、肽适体(硫氧还蛋白的)、微体(微蛋白的)、affilins(泛素的)、α-晶状体蛋白、卡律蝎毒素、四连接素、RAS结合蛋白AF-6的PDZ结构域、蛋白抑制剂的Kunitz型结构域。
优选地，细菌菌株的特征在于它还含有编码肽聚糖相关的脂蛋白(Pal)的野生型Pal基因。特别优选地，野生型Pal基因受功能性启动子的控制。
本发明进一步提供了一种含有在功能性启动子的控制下编码重组蛋白的开放阅读框的质粒，其特征在于含有在功能性启动子的控制下编码信号肽和突变的Pal蛋白的开放阅读框，Pal蛋白已经突变使得其没有细菌外细胞膜的膜锚。
对于根据本发明的细菌菌株提及的优选和特别优选的特征也适用于在根据本发明的质粒中提及的特征，其中对于根据本发明的细菌菌株提及的优选和特别优选的实施方式在质粒中也分别是优选或特别优选的。
类似地，提及的定义和优选实施方式适用于编码信号肽和突变的Pal蛋白的ORF以及编码重组蛋白的ORF。
例如，编码一种或多种重组蛋白的一个或多个ORF可以在一个操纵子中。优选地，编码突变的Pal蛋白的ORF位于单独的基因中。这意味着突变的Pal蛋白和重组蛋白可以彼此独立表达。在重组蛋白的启动子与突变的Pal蛋白的启动子不同并且可不同地诱导的特别优选的情况下，质粒具有特别的优势，即用质粒转化细菌后，可以选择彼此独立表达蛋白质的最佳时间点。
使用本领域技术人员已知的方法将根据本发明的质粒引入细菌菌株中，并且通过质粒表达重组蛋白和突变的Pal蛋白具有以下优点：重组蛋白从细菌菌株细胞中的释放得到改善，并且它们可以提高的产量分离。
与编码重组蛋白和突变的Pal蛋白的ORF的染色体整合相比，使用质粒的优点在于细菌菌株的带有质粒的细胞具有选择优势，并且可以通过标准方法进行选择。由于每个质粒都含有至少一个复制起点(ORI)，因此另一个优点是质粒可以自主复制。此外，特别的优点是，质粒可以高拷贝数存在于细菌菌株的细胞中并被遗传。
本发明进一步提供了一种发酵生产重组蛋白的方法，其特征在于在发酵培养基中培养根据本发明的细菌菌株，发酵后从细胞中去除发酵培养基，和从发酵培养基中分离出重组蛋白。
通过本领域技术人员已知的常规方法在摇瓶或生物反应器(发酵罐)中培养通过染色体整合或用一种或两种表达质粒转化的细菌菌株的细胞。
原则上，可以作为发酵培养基(生长培养基、培养基)是本领域技术人员已知用于培养细菌的所有常用培养基。在这一点上，可以使用添加了特定比例的复杂组分(例如蛋白胨、胰蛋白胨、酵母提取物、糖蜜或玉米浆)的复杂培养基或最小盐培养基。此外，可以向培养基中添加其这组分，例如维生素、盐、氨基酸和微量元素，它们可改善细胞生长。
发酵优选在常规生物反应器中进行，例如搅拌罐、气泡塔型发酵罐或气举式发酵罐。特别优选搅拌罐发酵罐。
发酵涉及在持续监测和精确控制各种参数(例如营养物进料、氧气分压、培养物的pH和温度)的生长培养基中培养蛋白质生产菌株的细胞。培养时间优选为24-65h。
发酵中使用的主要碳源原则上可以是所有可被细胞利用的糖、糖醇或有机酸或其盐。在这一点上，优选使用葡萄糖、乳糖、阿拉伯糖或甘油。特别优选葡萄糖和阿拉伯糖。也可以将多种不同的碳源联合供料。在这种情况下，可以在发酵开始时将碳源最初完全装入到发酵培养基中，或一开始不装入任何碳源或只装入一部分碳源，然后在发酵过程中进料碳源。在这方面特别优选的是一个实施方式，其中最初装入一部分碳源并且进料一部分碳源。特别优选地，最初以10-30g/l的浓度装入碳源葡萄糖，并且在发酵过程中当浓度降至低于5g/l时开始进料，并配置为保持该浓度低于5g/l。
如果重组蛋白和/或突变的Pal蛋白的表达由诱导型启动子控制，则通过将对应于启动子的诱导剂添加到发酵批次中来诱导表达。适合作为诱导剂的是例如阿拉伯糖、乳糖、IPTG、四环素或cumate。诱导剂可以在发酵过程中的任何所需时间点以单剂量或多剂量计量加入。或者，可以连续添加诱导剂。优选地，通过添加IPTG诱导重组蛋白的表达，并且通过添加阿拉伯糖诱导突变的Pal蛋白的表达。特别优选地，IPTG作为单剂量计量加入，并且配置突变的Pal蛋白表达的诱导，使得在葡萄糖浓度降至低于5g/l的某个时间点进料葡萄糖和阿拉伯糖的混合物。在这一点上，混合物中阿拉伯糖的比例优选为33重量％至66重量％；特别优选为33重量％。
优选在细胞分裂很少至细胞不再分裂的培养阶段中(即在生长曲线平稳阶段的开始之前或开始时)诱导突变的Pal蛋白的表达。通过细胞密度的升高很少至完全没有来确定该时间点，细胞密度测定为OD600值或CDW值(见下文)。
优选地，接种前搅拌发酵罐中的培养基，并用无菌压缩空气鼓泡；在这一点上，将氧气含量校准至100％饱和度，并选择发酵过程中O2饱和度的目标值，该目标值介于该值的10％至70％之间，优选为20％至60％之间，特别优选为30％。在O2饱和度降至目标值以下之后，开始调节级联，以使O2饱和度回到目标值，可以调节气体供应和搅拌速度。
培养物的pH优选为pH 6至pH 8。优选地，设定pH 6.5至7.5；特别优选地，培养物的pH保持在6.8至7.2。
培养物的温度优选为15℃至45℃。优选20℃至40℃的温度范围，特别优选25℃至35℃的温度范围，并且非常特别优选温度30℃。
根据本发明，发酵后从细胞中去除发酵培养基，并从发酵培养基中分离出重组蛋白。如现有技术中已知的，这可以通过常规方法来完成。通常，在第一步中，通过分离方法(例如离心或过滤)从释放到培养基中的重组蛋白中除去细胞。然后可以例如通过超滤浓缩重组蛋白。
突变的Pal蛋白的表达改善了重组蛋白向培养上清液中的释放。由于改善了释放，可以以增加的产量分离重组蛋白。
增加的产量应理解为是指：相比于根据现有技术使用含有重组蛋白基因的野生型细菌菌株或含有重组蛋白基因并附加表达使细菌细胞被膜失稳的蛋白质的野生型细菌菌株可以生产的重组蛋白的量，释放到培养基中的量优选为至少110％，特别优选为至少150％，且尤其优选为至少200％。这意味着释放到培养基中的重组蛋白的产量优选是现有技术的相应细菌菌株所能达到的产量的至少1.1倍，特别优选至少1.5倍且尤其优选至少2倍。
例如，实施例1显示，与相应的野生型细菌菌株或表达TolAIII的细菌菌株相比，当表达PalΔ22-27或Pal22A时，在相同培养体积下，可以在细胞上清液中产生超过2-3倍量的CGTase(见表1)。同样在实施例2中，与相应的野生型细菌菌株或表达TolAIII的细菌菌株相比，表达PalΔ22-27的突变体产生的CGTase增加了2-3倍(见表2)。实施例3(参见表3)类似地证实了明显增加。
的Pal突变体的另一个优点是，同时，与相应的野生型细胞相比，培养时间为5-24h的细胞裂解仅略微增加。Wan和Baneyx(1998，见上文)证明，几个小时之后，与非诱导细胞相比，TolAIII生产过剩导致CFU计数降低了约1400-3000倍，并得出结论，由于对外膜的影响，细菌细胞的长期生存能力明显下降。相比之下，在诱导突变的PalΔ22-27蛋白表达后24h，CFU计数与相应的野生型细菌菌株相比仅下降了2倍(见实施例3)。
借助于突变的Pal蛋白在细菌菌株(优选在大肠杆菌)中的共表达，还可以在细胞外产生Fab抗体片段。在这种情况下，细菌细胞必须同时合成抗体的轻链(包含结构域VL和CL)和重链(包含结构域VH和CH1)的相应片段，然后将其分泌到周质中。在细胞质外，将两条链组装形成功能性Fab片段。相应的ORF可以位于不同的基因中。优选将编码轻链和重链的抗体片段的ORF组织在操纵子中。作为同时产生根据本发明突变的Pal蛋白的结果，抗体的重链和轻链以增加的浓度释放到发酵培养基中。
方法的主要优点是其适合于生产需要较长培养时间的重组蛋白并且适合于高细胞密度发酵。因此，可以生产复杂的真核蛋白作为重组蛋白。
优选地，方法的特征在于，去除发酵培养基后，从发酵培养基中纯化重组蛋白。
可以通过标准方法(例如沉淀或色谱法)进一步纯化重组蛋白。在此特别优选诸如亲和色谱等方法，其利用已经正确折叠的蛋白质的天然构象。
优选地，方法的特征在于诱导了突变的Pal蛋白的表达。这意味着诱导了突变的Pal蛋白的表达或者重组蛋白的表达以及突变的Pal蛋白的表达。这意味着，在该优选实施方式中，突变的Pal蛋白的表达在任何情况下都受诱导型启动子的控制。相比之下，重组蛋白的表达可以受组成型或诱导型启动子的控制。特别优选地，编码重组蛋白的ORF和编码突变的Pal蛋白的ORF均受诱导型启动子的控制，特别优选受不同诱导型启动子的控制。因此，优选可诱导突变的Pal蛋白和重组蛋白的表达。
由于编码重组蛋白和突变的Pal蛋白的基因的启动子可以优选被彼此独立地诱导，因此可以彼此独立地选择表达重组蛋白和表达突变的Pal蛋白的最佳时间点。
通过使用诱导型启动子，可以在发酵的任何所需时间点诱导相应蛋白质的表达。优选地，在诱导重组蛋白的表达之后诱导突变的Pal蛋白的表达。特别优选地，在诱导重组蛋白的表达后至少1小时，特别优选至少2小时，进一步特别优选15至24小时且特别优选19小时，诱导突变的Pal蛋白的表达。
通过向培养基中添加诱导剂来触发重组蛋白和突变的Pal蛋白表达的诱导，有必要根据所用基因选择诱导剂。在突变的Pal基因含有阿拉伯糖(ara)启动子的优选实施方式中，通过将诱导剂阿拉伯糖添加到培养物中来诱导突变的Pal蛋白的表达。在重组基因含有tac启动子的优选实施方式中，通过向培养物中添加诱导剂乳糖或乳糖类似物IPTG来诱导重组蛋白的表达。
根据本发明，即使在诱导表达突变的Pal蛋白并进一步培养细胞之后，该菌株的细胞密度也可与不表达突变的Pal蛋白的细菌菌株相比。特别地，不会发生由于细胞裂解引起的光密度的强烈下降，并且仅发生以集落形成单位(CFU)衡量的活细胞计数的轻微下降。
测量的光密度(OD)越高，细胞密度越高。具有不稳定的细胞被膜的细菌菌株通常表现出相对较高的细胞裂解。在细胞裂解相对较高的情况下，细胞密度下降并由此OD值也会下降。
本发明的优点是重组蛋白被释放到培养基中而不会发生细菌菌株细胞的强烈裂解。因此，根据本发明的方法的特点在于，其既适合于生产具有相应较长培养时间的复杂的真核蛋白质，又适合于高细胞密度发酵。
在本发明的上下文中，达到细胞干重＞50g/l的发酵被认为是高细胞密度发酵。文献中也反映了这一点(Bruschi et al.2014,Microb.Cell Fact.13:99；Shokri和Larsson2004,Microb.Cell Fact.3:9；Knabben et al.2010,J.Biotechnol.150,第73-79页)。
长培养时间意味着培养时间为至少24h，优选至少48h，且特别优选至少72h。
在本发明的上下文中，相对较低(或仅略微增加的或不强烈的)细胞裂解意味着与未携带Pal突变的野生型细菌菌株相比，在诱导突变的Pal蛋白表达后优选5-24小时的培养时间的情况下，测定的细菌菌株培养物的OD600值、CDW值或活细胞计数值几乎没有或绝对没有下降。表达突变的Pal蛋白的细菌菌株具有一个主要优势，特别是在培养含有破坏其细胞被膜稳定性的修饰的细菌菌株方面，其细胞裂解明显增加，如Wan和Baneyx(1998，见上文)为表达TolAIII蛋白的细胞所显示的。
因此，根据本发明的发酵方法的细胞培养物优选特征在于：与如下发酵方法在相同时间点的细菌培养物的OD600值相比，该发酵方法与本发明方法的差异仅在于所培养的细菌菌株只是不含根据本发明的细菌菌株所含的编码突变的Pal蛋白的ORF，在诱导突变的Pal蛋白表达后5至24小时，特别优选7小时，本发明的发酵方法在600nm下测定的光密度(OD600)降低不超过20％，特别优选不超过10％，且特别优选不超过5％。用分光光度法测定600nm下细胞培养物的光密度。
借助于分光光度计在600nm下确定的细胞培养物的光密度取决于每单位体积的细胞数量(细胞浓度、细胞密度)，而细胞数量又是细胞分裂活性的量度和细胞裂解的量度，细胞裂解会导致细胞密度降低。
或者，也可以通过过滤或离心(优选离心)分离出一定量的培养物，然后干燥并称重，将细胞重量确定为细胞干重(CDW)。
可以比较表达突变的Pal蛋白的细菌菌株的活力与不表达突变的Pal蛋白的细菌菌株的活力的另一种方法是基于确定的培养物体积确定作为“菌落有成单位(CFU)”的活细胞计数。Wan和Baneyx(1998，见上文)中描述了实验程序。CFU单位指定培养物中可繁殖的细胞。与不表达突变的Pal蛋白的细菌菌株相比，在表达突变的Pal蛋白和重组蛋白的细菌菌株的情况下，活细胞计数最多减少100倍，优选最多减少10倍，特别优选最多减少2倍。
相比之下，Wan和Baneyx(1998，见上文)在表2中指出，用IPTG诱导TolAIII表达后3小时，在野生型细菌菌株中确定为每毫升CFU数的活细胞计数进一步增加，而在表达TolAIII的细菌菌株中则明显减少。作者得出结论，尽管TolAIII过表达在细菌菌株的对数生长期对细菌生长的影响相对较小，但由于外层细胞膜的透化，细菌细胞的活力从长远来看会明显下降。
表达的突变的Pal蛋白对细胞完整性的只有可忽略的影响是本发明的另一个显着优点。另外，由于优选克隆在诱导型启动子下编码突变的Pal蛋白的ORF，可以控制突变的Pal蛋白的表达，并且从而狭窄地限制发生所需作用的培养时间，进而限制了对细菌细胞活力的潜在影响。
附图说明
图1示出了质粒pCGT-Pal的质粒图。
图2示出了质粒pCGT-TolAIII的质粒图。
图3示出了质粒pJF118ut-CD154的质粒图。
图4示出了质粒pJF118ut-CD154-Pal的质粒图。
图5示出了质粒pCGT-Pal22A的质粒图。
附图中的缩写表示编码以下功能的DNA区域：
tac p/o： tac启动子/操纵子
pBAD p/o： 阿拉伯糖启动子/操纵子
bla： β-内酰胺酶基因(氨苄青霉素抗性)
TcR： 四环素抗性
lacIq： tac启动子的阻遏物
cgt-SP： CGTase的信号肽
CGTase： 环糊精糖基转移酶
ColE1： 复制起点
phoA-SP： phoA信号肽
AFA-SP： CGTase信号肽的衍生物
rrnB终止子： rrnB基因的终止子区域
trpA终止子： trpA基因的终止子区域
Pal： 肽聚糖相关的脂蛋白
Pal-SP： Pal的信号肽
TolAIII： TolA蛋白的结构域
OmpA-SP： OmpA的信号肽
HisTag： 组氨酸标签
轻链： 包含结构域VL和CL的抗体片段
重链： 包含域VH和CH1的抗体片段
ScaI/MauBI/EcoRI： 相应限制性核酸内切酶的限制位点
具体实施方式
实施例
以下参考示例实施方式更详细地描述本发明，但本发明不限于此。
所有使用的分子生物学方法，例如聚合酶链反应(PCR)、基因合成、DNA的分离和纯化、通过限制酶和连接酶对DNA的修饰、转化等均以本领域技术人员已知的、文献中描述的或各制造商推荐的方式进行。
质粒描述：
pCGT：
US 2008/0254511 A1的实施例4中描述了质粒pCGT的产生，并且US 2008/0254511A1的图4中详细说明了质粒图。
本质上，该质粒不仅含有对四环素具有抗性的基因，而且尤其还含有包括天然CGTase信号序列的肺炎克雷伯菌M5a1的环糊精糖基转移酶(CGTase)的结构基因。CGTase基因的表达受tac启动子控制。
pCGT-Pal：
为了获得pCGT-Pal(见图1的质粒图)，由Eurofins Genomics通过基因合成产生DNA片段。DNA片段xI(详细说明于SEQ ID No.1)含有：
-来自GenBank条目X81837.1的核苷酸1136-1304，含有阿拉伯糖启动子(pBAD启动子)和操纵子O1和I2+I1以及CAP结合位点(SEQ ID No.1的核苷酸10-178)，
-Shine-Dalgarno序列(SEQ ID No.1的核苷酸203-208)和
-编码以下i、ii和iii的融合物的核苷酸片段：
i大肠杆菌K12的肽聚糖相关的脂蛋白的信号序列(来自GenBank条目X05123.1的核苷酸136-198，编码氨基酸-21至-1，SEQ ID No.1的核苷酸216-278)，
ii来自GenBank条目X05123.1的核苷酸217-654，编码来自大肠杆菌K12的肽聚糖相关的脂蛋白的氨基酸7-152(SEQ ID No.1的核苷酸279-716)和
iii大肠杆菌trpA基因的终止子(SEQ ID No.1的核苷酸749-774)。
用限制酶MauBI切割DNA片段xI，并与用相同限制酶切割的表达载体pCGT连接。克隆以非定向方式进行；但是，优先使用其中DNA片段的插入方向与编码CGTase的基因的读取方向相反的质粒，并通过限制酶ScaI的限制模式和测序进行验证。质粒被称为pCGT-Pal，并且编码蛋白质PalΔ22-27，其也被同义命名为PalD22-27(详细说明于SEQ ID No.5)。
pCGT-Pal22A：
为了获得pCGT-Pal22A(见图5的质粒图)，由Eurofins Genomic通过基因合成产生DNA片段。DNA片段xIA(详细说明于SEQ ID No.6)含有：
-来自GenBank条目X81837.1的核苷酸1136-1304，含有阿拉伯糖启动子(pBAD启动子)和操纵子O1和I2+I1以及CAP结合位点(SEQ ID No.6的核苷酸10-178)，
-Shine-Dalgarno序列(SEQ ID No.6的核苷酸203-208)和
-编码以下i、ii和iii的融合物的核苷酸片段：
i大肠杆菌K12的肽聚糖相关的脂蛋白的信号序列(来自GenBank条目X05123.1的核苷酸136-198，编码氨基酸-21至-1，SEQ ID No.6的核苷酸216-278)，
ii大肠杆菌K12的肽聚糖相关的脂蛋白的氨基酸1-152(参照GenBank：X05123.1，SEQ ID No.6的核苷酸279-734)，其中位置1的氨基酸半胱氨酸已被交换为丙氨酸，和
iii大肠杆菌trpA基因的终止子(SEQ ID No.6的核苷酸767-792)。
使用限制酶MauBI切割DNA片段xIA，并与已使用相同限制酶切割的表达载体pCGT连接。克隆以非定向方式进行；但是，优先使用其中DNA片段的插入方向与编码CGTase的基因的读取方向相反的质粒，并通过限制酶ScaI的限制模式和测序进行验证。质粒称为pCGT-Pal22A，编码蛋白Pal22A(详细说明于SEQ ID No.7)。
pCGT-TolAIII：
TolAIII的过表达对应于现有技术(Wan和Baneyx 1998，见上文)；因此，选择pCGT-TolAIII作为代表现有技术的比较例，其中破坏了含有该质粒并且表达TolAIII的细菌的外细胞被膜，并因此增加了重组蛋白的释放。
为了获得pCGT-TolAIII(见图2的质粒图)，由Eurofins Genomics通过基因合成产生DNA片段。
DNA片段xII(详细说明于SEQ ID No.2)含有：
-来自GenBank条目X81837.1的核苷酸1136-1304，含有阿拉伯糖启动子(pBAD启动子)和操纵子O1和I2+I1以及CAP结合位点(SEQ ID No.2的核苷酸10-178)，
-Shine-Dalgarno序列(SEQ ID No.2的核苷酸203-208)和
-编码以下i、ii和iii的融合物的核苷酸片段：
i大肠杆菌K12的ompA的信号序列(SEQ ID No.2的核苷酸216-278)，
ii大肠杆菌K12的TolA蛋白的氨基酸291-421(编码TolAIII，SEQ ID No.2的核苷酸279-671)和
iii大肠杆菌trpA基因的终止子(SEQ ID No.2的核苷酸714-729)。
使用限制酶MauBI切割DNA片段xII，并与已使用相同限制酶切割的表达载体pCGT(参见上文)连接。克隆以非定向方式进行；但是，优先使用其中DNA片段的插入方向与编码CGTase的基因的读取方向相反的质粒，并通过限制酶ScaI和EcoRI的限制模式或测序进行验证。质粒称为pCGT-TolAIII。
pJF118ut-CD154：
将US 2008/076157 A中描述的质粒pJF118ut用作克隆和表达人源化单克隆抗-CD154抗体5c8的Fab片段基因的起始载体，其序列公布于Karpusas et al.2001(结构9，第321-329页)。pJF118ut是已知表达载体pKK223-3(Amersham Pharmacia Biotech)的衍生物，保藏在DSMZ-德国微生物和细胞培养有限公司保藏中心(DSMZ-德国微生物保藏中心)(Braunschweig)，编号为DSM 18596。
为了获得pJF118ut-CD154(见图3的质粒图)，由Eurofins Genomics通过基因合成产生DNA片段。DNA片段xIII(详细说明于SEQ ID No.3)包含由以下i、ii、iii、iv和v组成的融合物：
i US 2008/076157以SEQ ID No.2公开并且由肺炎克雷伯菌M5a1的CGTase信号序列衍生的信号序列(SEQ ID No.3的核苷酸25-114)，和
ii人源化单克隆抗-CD154抗体5c8的Fab片段重链(VH-CH1结构域)的阅读框，编码Karpusias et al.2001在图3中公布序列的氨基酸1-221(SEQ ID No.3的核苷酸115-777)，
iii phoA信号序列(SEQ ID No.3的核苷酸800-862)，
iv人源化单克隆抗-CD154抗体5c8的Fab片段的轻链(VL-CL结构域)的阅读框，如Karpusias et al.2001在图3中公布的(SEQ ID No.3的核苷酸863-1516)，和
v SEQ ID No.3的核苷酸1517-1546，编码长度为4个氨基酸的接头和六组氨酸标签。
使用限制酶EcoRI和PdmI切割DNA片段xIII，并与使用EcoRI和SmaI切割的表达载体pJF118ut连接。将所得的质粒命名为pJF118ut-CD154，其中Fab片段重链和轻链的基因表达受tac启动子的控制。
pJF118ut-CD154-Pal：
通过MauBI限制位点，如上文针对pCGT-Pal，将在阿拉伯糖启动子的控制下编码Pal变体并由trpA终止子侧翼的DNA片段xI插入质粒pJF118ut-CD154。克隆以非定向方式进行；然而，优选使用其中DNA片段xI以与编码CD154的DNA片段xIII相反的读取方向插入的质粒，通过限制酶ScaI的限制模式和测序进行验证。质粒称为pJF118ut-CD154-Pal(见图4的质粒图)。
实施例1：在摇瓶中生产环糊精糖基转移酶(CGTase)
为了生产来自肺炎克雷伯菌M5a1的CGTase，通过常用方法(例如TSS转化)用质粒pCGT、pCGT-Pal、pCGT-Pal22A或pCGT-TolAIII转化大肠杆菌菌株W3110(ATCC 27325)。通过四环素(20mg/l)选择含质粒的细胞。将大肠杆菌菌株分别命名为W3110/pCGT、W3110/pCGT-Pal、W3110/pCGT-Pal22A和W3110/pCGT-TolAIII。
使转化的菌株在30℃下生长于10ml LB培养基(5g/l酵母提取物(Oxoid LP0021)、10g/l胰蛋白胨(Oxoid LP0042)、5g/l NaCl)，附加含有1ml/l微量元素溶液(0.15g/lNa2MoO4×2H2O；2.5g/l Na3BO3；0.7g/l CoCl2×6H2O；0.25g/l CuSO4×5H2O；1.6g/l MnCl2×4H2O；0.3g/l ZnSO4×7H2O)，3g/l葡萄糖，10g/l乳糖，0.55g/l CaCl2和20mg/l四环素)中。使用的培养基是自动诱导培养基，即不必为tac启动子添加额外的诱导剂。培养基中存在的葡萄糖代谢后，乳糖可以被细胞吸收。这导致从tac启动子开始诱导蛋白质表达。由所有四种质粒产生CGTase。
由于在48h后向培养基中添加0.2％(w/v)阿拉伯糖，质粒pCGT-Pal和pCGT-Pal22A附加诱导了Pal变体的表达，这些变体也存在于质粒上并且受阿拉伯糖启动子的控制，相比之下，质粒pCGT-TolAIII附加诱导表达TolAIII。也将含有质粒pCGT的对照培养物与阿拉伯糖适当混合，以实现更好的可比性。
培养72小时后，收集样品，通过离心从培养基中除去细胞，并且通过以下酶测定法，基于淀粉酶促产生的环糊精(CD)的量来确定培养上清液中的CGTase含量：
测定缓冲液：5mM Tris HCl缓冲液，5mM CaCl2×2H2O，pH 6.5
底物溶液：10％淀粉溶液(Merck No.1.01252)在测定缓冲液中，pH 6.5
测定混合物：0.2ml底物溶液+0.2ml离心的(5min，12 000rpm)培养上清液
反应温度：40℃
酶测定：
*预先调节底物溶液和离心培养上清液的温度(在40℃下约5分钟)
*通过快速混合(涡旋混合器)底物溶液和离心的培养上清液来制备测定混合物，如有必要，将用测定缓冲液稀释离心的培养上清液，以便在后续的HPLC分析中测定CD值为0.9-1.5g/l；
*在40℃下温育3分钟
*通过添加0.6ml甲醇并快速混合(涡旋混合器)来终止酶反应
*在冰上冷却混合物(约5分钟)
*离心(5分钟，12 000rpm)并移出澄清的上清液
*通过HPLC分析产生的CD量：在Agilent HP 1100 HPLC系统上上使用Nucleodur100-3 NH2-RP柱(150mm×4.6mm，Macherey-Nagel)并且使用64％乙腈水溶液(v/v)作为流动相在2.1ml/min的流动速率下进行分析。通过RI检测器(1260 Infinity RI,Agilent)进行检测并且根据峰面积和α-CD标准进行定量(Cavamax W6-8 Pharma,Wacker Chemie AG)。
酶活性的计算：A＝G*V1*V2/(t*MG)[U/ml]
A＝活性，
G＝CD含量，单位：mg/l
V1＝在测定混合物中的稀释因子
V2＝用于测定之前的培养上清液的稀释因子；
如果未稀释，则：V2＝1
t＝反应时间，单位：分钟
MG＝分子量，单位：g/mol(MGCD＝973g/mol)
1单位(U)
1μmol/l产物(CD)/min
表1示出了分别实现的CGTase产量。
表1：培养72小时后，摇瓶上清液中的CGTase产量。
| 菌株 | 摇瓶：CGTase(U/ml) |
| W3110/pCGT | 39 |
| W3110/pCGT-Pal | 134 |
| W3110/pCGT-Pal22A | 95 |
| W3110/pCGT-TolAIII | 42 |
实施例2：在搅拌罐发酵罐中发酵生产环糊精糖基转移酶(CGTase)
将实施例1中描述的菌株W3110/pCGT、W3110/pCGT-Pal和W3110/pCGT-TolAIII用于生产来自肺炎克雷伯菌M5a1的环糊精糖基转移酶(CGTase)。CGTase的生产在搅拌罐发酵罐中进行。
使用在摇瓶中在实施例1的LB培养基中培养7小时的初步培养物，将装有1.2l发酵培养基(1.5g/l KH2PO4；5g/l(NH4)2SO4；0.5g/l MgSO4×7H2O；0.225g/l CaCl2×2H2O,0.075g/l FeSO4×7H2O；1g/l Na3柠檬酸盐×2H2O；0.5g/l NaCl；1ml/l微量元素溶液(0.15g/l Na2MoO4×2H2O；2.5g/l Na3BO3；0.7g/l CoCl2×6H2O；0.25g/l CuSO4×5H2O；1.6g/l MnCl2×4H2O；0.3g/l ZnSO4×7H2O)；5mg/l维生素B1；3g/l植物蛋白胨(BD211906)；1.5g/l酵母提取物(Oxoid LP0021)；10g/l葡萄糖；20mg/l四环素)的发酵罐接种至0.1OD600。由此开始发酵(时间点0，开始发酵)。在发酵过程中，将温度设定为30℃，并通过计量加入NH4OH或H3PO4将pH值恒定保持在7.0。在发酵过程中计量加入葡萄糖，力争葡萄糖浓度<5g/l。22小时后(在对数增长阶段结束时)，通过向0.15mM中添加异丙基β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)诱导CGTase的表达。通过将纯葡萄糖进料切换成3g/l*h恒定进料葡萄糖:阿拉伯糖比例为2:1的葡萄糖/阿拉伯糖混合物，在发酵开始后24h或41h诱导Pal变体的表达，并且在发酵开始后41h诱导TolAIII的表达。
接种前，将发酵罐中的培养基以400rpm的速度搅拌，并用无菌过滤器用1.67vvm(空气体积/培养基体积/分钟)压缩空气鼓泡。在这些起始条件下，在接种前将光学氧气传感器(VisiFerm DO225,Hamilton)校准为100％饱和度。将发酵过程中O2饱和度的目标值设置为该值的30％。在发酵过程中通过氧气传感器测量O2饱和度，并由发酵罐控制DCU(数字控制单元,Sartorius Stedim)捕获。在O2饱和度降至目标值以下之后，在软件控制下将搅拌速度连续提高至最大1500rpm，以使O2饱和度回到目标值。
发酵48h后，收集样品，通过离心从发酵培养基中去除细胞，并通过如实施例1的活性测定法测定发酵上清液中的CGTase含量。
表2示出了分别获得的环糊精糖基转移酶的产量。
表2：培养48h后，发酵上清液中的CGTase产量。
| 菌株 | CGTase(相对产量，单位：％) |
| W3110/pCGT | 100 |
| W3110/pCGT-Pal，24h后诱导 | 430 |
| W3110/pCGT-Pal，41h后诱导 | 690 |
| W3110/pCGT-TolAIII | 260 |
在W3110/pCGT和W3110/pCGT-Pal的发酵过程中(41h后诱导)，通过在分光光度计(Beckman Coulter DU 730)上测量在600nm下的光密度(OD600)来确定细胞的生长，研究Pal变体表达对细胞生长的影响。
此外，确定了培养物的细胞干重。为了确定细胞干重，将含有1ml发酵罐培养物的样品转移到预先确定了空重的反应容器中。离心后(5分钟，12 000rpm)，去除上清液，并在培养箱中干燥细胞团粒(在60℃下，≥48h)。之后，称出含有干燥细胞团粒的容器的重量，并且由含有干燥细胞团粒的容器的重量与空容器的重量之差计算细胞干重(CDW)。结果汇总于表3中。
表3：发酵罐中生产CGTase菌侏的光密度(OD600)和细胞干重(CDW)。
实施例3：在摇瓶中生产Fab抗体片段
使用大肠杆菌菌株W3110/pJF118ut-CD154和W3110/pJF118ut-CD154-Pal，使用类似于实施例1中描述的方法在摇瓶中进行CD154 Fab片段的生产。72h后，收集样品，通过离心从培养基中去除细胞，并分析上清液以确定释放到培养基中的CD154 Fab片段。将细胞团粒收集在PBS缓冲液中，并在FastPrep匀浆器(MP Biomedicals)中破碎细胞。从如此获得的细胞裂解物中确定细胞内存在的CD154 Fab片段。
通过本领域技术人员已知的夹心ELISA测定法定量CD154 Fab片段。这涉及使用作为捕集器的固定化抗人IgG(Fd)抗体(The Binding Site，产品No.PC075)和作为检测抗体的过氧化物酶缀合的山羊抗人κ轻链抗体(Sigma,产品no.A 7164)。通过过氧化物酶转换生色底物Dako TMB+(Dako#S1599)以及在450nm处的相关吸收变化来实现定量。使用Fab片段“人类Fab/κ”(Bethyl Laboratories，产品号：P80-115)对ELISA进行校准。
表3：培养上清液中CD154抗体片段的产量。
| 菌株 | 上清液中CD154抗体片段(mg/l) |
| W3110/pJF118ut-CD154 | 59 |
| W3110/pJF118ut-CD154-Pal | 87 |
除了产物产量，还在72h后确定了培养物的活细胞计数。为此，在1ml最终体积中用LB培养基将培养物样品稀释105倍，然后将100μl稀释液分别铺板在含有20mg/l四环素的LB琼脂平板上。计算生长的菌落，并考虑稀释因子计算起始培养物的活细胞计数。对于菌株W3110/pJF118ut-CD154为5.5·108个细胞/ml，并且对于菌株W3110/pJF118ut-CD154-Pal为2.7·108个细胞/ml。
PCT
输出(原始电子形式)
(本页不作为国际申请的一部分且不计作国际申请的页数)
SEQUENCE LISTING
<110> 瓦克化学股份公司
约翰娜·科赫
马库斯·布伦纳
<120> 在发酵方法中释放重组蛋白的细菌菌株
<130> CO11724
<160> 7
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 816
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNS-片段 xI
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(816)
<400> 1
caattcgcgc gcgtaacaaa agtgtctata atcacggcag aaaagtccac attgattatt 60
tgcacggcgt cacactttgc tatgccatag catttttatc cataagatta gcggatccta 120
cctgacgctt tttatcgcaa ctctctactg tttctccata cccgtttttt tgggctagaa 180
ataattttgt ttaagaattc taaggaggaa attatatgca actgaacaaa gtgctgaaag 240
ggctgatgat tgctctgcct gttatggcaa ttgcggcagc cagcaatgac ggcagcgaag 300
gcatgctggg tgccggcact ggtatggatg cgaacggcgg caacggcaac atgtcttccg 360
aagagcaggc tcgtctgcaa atgcaacagc tgcagcagaa caacatcgtt tacttcgatc 420
tggacaagta cgatatccgt tctgacttcg ctcaaatgct ggatgcacat gcaaacttcc 480
tgcgtagcaa cccgtcttac aaagtcaccg tagaaggtca cgcggacgaa cgtggtactc 540
cggaatacaa catctccctg ggtgaacgtc gtgcgaacgc cgttaagatg tacctgcagg 600
gtaaaggcgt ttctgcagac cagatctcca tcgtttctta cggtaaagaa aaacctgcag 660
tactgggtca tgacgaagcg gcatactcca aaaaccgtcg tgcggtactg gtttactaag 720
aattgcaagc tggccgacgc gtcccacagc cgccagttcc gctggcggca ttttaacttt 780
ctttaatgaa gccggaaaaa tcccgcgcgc gaaggc 816
<210> 2
<211> 771
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNS-片段 xII
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(771)
<400> 2
caattcgcgc gcgtaacaaa agtgtctata atcacggcag aaaagtccac attgattatt 60
tgcacggcgt cacactttgc tatgccatag catttttatc cataagatta gcggatccta 120
cctgacgctt tttatcgcaa ctctctactg tttctccata cccgtttttt tgggctagaa 180
ataattttgt ttaagaattc taaggaggaa attatatgaa aaagacagct atcgcgattg 240
cagtggcact ggctggtttc gctaccgtag cgcaggctgc cgcagaggca gatgatattt 300
tcggtgagct aagctctggt aagaatgcac cgaaaacggg gggaggggcg aaagggaaca 360
atgcttcgcc tgccgggagt ggtaatacta aaaacaatgg cgcatcaggg gccgatatca 420
ataactatgc cgggcagatt aaatctgcta tcgaaagtaa gttctatgac gcatcgtcct 480
atgcaggcaa aacctgtacg ctgcgcataa aactggcacc cgatggtatg ttactggata 540
tcaaacctga aggtggcgat cccgcacttt gtcaggctgc gttggcagca gctaaacttg 600
cgaagatccc gaaaccacca agccaggcag tatatgaagt gttcaaaaac gcaccattgg 660
acttcaaacc gtaagaattg caagctggcc gacgcgtccc acagccgcca gttccgctgg 720
cggcatttta actttcttta atgaagccgg aaaaatcccg cgcgcgaagg c 771
<210> 3
<211> 1599
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNS-片段 xIII
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1599)
<400> 3
acagaattct aaggaggaaa ttatatgaaa agaaaccgtt tttttaatac ctcggctgct 60
attgccattt cgattgcatt acagatcttt tttccgtccg cttccgcttt cgctcaggtt 120
cagctggtgc agagcggtgc cgaagttgtt aaaccgggtg caagcgttaa actgagctgt 180
aaagcaagcg gctatatttt taccagctat tatatgtatt gggtgaaaca ggcaccgggt 240
cagggtctgg aatggattgg tgaaattaat ccgagcaatg gcgataccaa ttttaatgaa 300
aaatttaaaa gcaaagccac cctgaccgtt gataaaagcg caagcaccgc atatatggaa 360
ctgagcagcc tgcgtagcga agataccgca gtttattatt gtacccgtag tgatggtcgc 420
aatgatatgg atagctgggg tcagggcacc ctggtcaccg ttagcagcgc aagcaccaaa 480
ggtccgagcg tttttccgct ggcaccgagc agcaaaagca ccagcggtgg caccgcagca 540
ctgggttgtc tggttaaaga ttattttccg gaaccggtta cagttagctg gaatagcggt 600
gcactgacca gtggtgttca tacctttccg gcagttctgc aaagcagcgg tctgtatagc 660
ctgagcagcg ttgttaccgt tccgagcagt agcctgggca cccagaccta tatttgtaat 720
gttaatcata aaccgagcaa caccaaagtg gataaaaaag ttgaaccgaa aagctgctaa 780
taaccatgga gaaaataaag tgaaacaaag cactattgca ctggcactct taccgttact 840
cttcacccct gttaccaaag ccgatattgt gctcacccag agtccggcaa ccctgagcgt 900
tagtccgggt gaacgtgcaa ccattagctg tcgtgcaagc cagcgtgtta gcagcagcac 960
ctatagctat atgcattggt atcagcagaa accgggtcag cctccgaaac tgctgattaa 1020
atatgcaagc aatctggaaa gcggtgttcc ggcacgtttt agcggtagcg gtagtggcac 1080
cgattttacc ctgaccatta gcagcgttga accggaagat tttgccacct attattgtca 1140
gcatagctgg gaaattcctc cgacctttgg tggtggcacc aaactcgaga ttaaacgtac 1200
cgttgcagca ccgagcgtgt ttatctttcc gcctagtgat gaacagctga aaagcggcac 1260
cgcaagcgtt gtttgtctgc tgaataactt ttatccgcgt gaagcaaaag ttcagtggaa 1320
agttgataat gcactgcaaa gcggtaatag ccaagaaagc gttaccgaac aggatagcaa 1380
agatagcacc tatagcctgt caagcaccct gaccctgagc aaagcagatt atgaaaaaca 1440
caaagtgtat gcctgcgaag ttacccatca gggtctgagc agtccggtta caaaaagttt 1500
taatcgtggt gaatgtagct cttctgccca tcaccaccat caccattaat aagcttctag 1560
aagcttggct gttttggcgg atgagagaag attttcgac 1599
<210> 4
<211> 173
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<220>
<221> 肽
<222> (1)..(173)
<223> 野生型-Pal-蛋白
<400> 4
Met Gln Leu Asn Lys Val Leu Lys Gly Leu Met Ile Ala Leu Pro Val
1 5 10 15
Met Ala Ile Ala Ala Cys Ser Ser Asn Lys Asn Ala Ser Asn Asp Gly
20 25 30
Ser Glu Gly Met Leu Gly Ala Gly Thr Gly Met Asp Ala Asn Gly Gly
35 40 45
Asn Gly Asn Met Ser Ser Glu Glu Gln Ala Arg Leu Gln Met Gln Gln
50 55 60
Leu Gln Gln Asn Asn Ile Val Tyr Phe Asp Leu Asp Lys Tyr Asp Ile
65 70 75 80
Arg Ser Asp Phe Ala Gln Met Leu Asp Ala His Ala Asn Phe Leu Arg
85 90 95
Ser Asn Pro Ser Tyr Lys Val Thr Val Glu Gly His Ala Asp Glu Arg
100 105 110
Gly Thr Pro Glu Tyr Asn Ile Ser Leu Gly Glu Arg Arg Ala Asn Ala
115 120 125
Val Lys Met Tyr Leu Gln Gly Lys Gly Val Ser Ala Asp Gln Ile Ser
130 135 140
Ile Val Ser Tyr Gly Lys Glu Lys Pro Ala Val Leu Gly His Asp Glu
145 150 155 160
Ala Ala Tyr Ser Lys Asn Arg Arg Ala Val Leu Val Tyr
165 170
<210> 5
<211> 167
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PalD22-27
<220>
<221> 肽
<222> (1)..(167)
<400> 5
Met Gln Leu Asn Lys Val Leu Lys Gly Leu Met Ile Ala Leu Pro Val
1 5 10 15
Met Ala Ile Ala Ala Ala Ser Asn Asp Gly Ser Glu Gly Met Leu Gly
20 25 30
Ala Gly Thr Gly Met Asp Ala Asn Gly Gly Asn Gly Asn Met Ser Ser
35 40 45
Glu Glu Gln Ala Arg Leu Gln Met Gln Gln Leu Gln Gln Asn Asn Ile
50 55 60
Val Tyr Phe Asp Leu Asp Lys Tyr Asp Ile Arg Ser Asp Phe Ala Gln
65 70 75 80
Met Leu Asp Ala His Ala Asn Phe Leu Arg Ser Asn Pro Ser Tyr Lys
85 90 95
Val Thr Val Glu Gly His Ala Asp Glu Arg Gly Thr Pro Glu Tyr Asn
100 105 110
Ile Ser Leu Gly Glu Arg Arg Ala Asn Ala Val Lys Met Tyr Leu Gln
115 120 125
Gly Lys Gly Val Ser Ala Asp Gln Ile Ser Ile Val Ser Tyr Gly Lys
130 135 140
Glu Lys Pro Ala Val Leu Gly His Asp Glu Ala Ala Tyr Ser Lys Asn
145 150 155 160
Arg Arg Ala Val Leu Val Tyr
165
<210> 6
<211> 834
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNS-片段 xIA
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(834)
<400> 6
caattcgcgc gcgtaacaaa agtgtctata atcacggcag aaaagtccac attgattatt 60
tgcacggcgt cacactttgc tatgccatag catttttatc cataagatta gcggatccta 120
cctgacgctt tttatcgcaa ctctctactg tttctccata cccgtttttt tgggctagaa 180
ataattttgt ttaagaattc taaggaggaa attatatgca actgaacaaa gtgctgaaag 240
ggctgatgat tgctctgcct gttatggcaa ttgcggcagc ttcttccaac aagaacgcca 300
gcaatgacgg cagcgaaggc atgctgggtg ccggcactgg tatggatgcg aacggcggca 360
acggcaacat gtcttccgaa gagcaggctc gtctgcaaat gcaacagctg cagcagaaca 420
acatcgttta cttcgatctg gacaagtacg atatccgttc tgacttcgct caaatgctgg 480
atgcacatgc aaacttcctg cgtagcaacc cgtcttacaa agtcaccgta gaaggtcacg 540
cggacgaacg tggtactccg gaatacaaca tctccctggg tgaacgtcgt gcgaacgccg 600
ttaagatgta cctgcagggt aaaggcgttt ctgcagacca gatctccatc gtttcttacg 660
gtaaagaaaa acctgcagta ctgggtcatg acgaagcggc atactccaaa aaccgtcgtg 720
cggtactggt ttactaagaa ttgcaagctg gccgacgcgt cccacagccg ccagttccgc 780
tggcggcatt ttaactttct ttaatgaagc cggaaaaatc ccgcgcgcga aggc 834
<210> 7
<211> 173
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Pal22A
<220>
<221> 肽
<222> (1)..(173)
<400> 7
Met Gln Leu Asn Lys Val Leu Lys Gly Leu Met Ile Ala Leu Pro Val
1 5 10 15
Met Ala Ile Ala Ala Ala Ser Ser Asn Lys Asn Ala Ser Asn Asp Gly
20 25 30
Ser Glu Gly Met Leu Gly Ala Gly Thr Gly Met Asp Ala Asn Gly Gly
35 40 45
Asn Gly Asn Met Ser Ser Glu Glu Gln Ala Arg Leu Gln Met Gln Gln
50 55 60
Leu Gln Gln Asn Asn Ile Val Tyr Phe Asp Leu Asp Lys Tyr Asp Ile
65 70 75 80
Arg Ser Asp Phe Ala Gln Met Leu Asp Ala His Ala Asn Phe Leu Arg
85 90 95
Ser Asn Pro Ser Tyr Lys Val Thr Val Glu Gly His Ala Asp Glu Arg
100 105 110
Gly Thr Pro Glu Tyr Asn Ile Ser Leu Gly Glu Arg Arg Ala Asn Ala
115 120 125
Val Lys Met Tyr Leu Gln Gly Lys Gly Val Ser Ala Asp Gln Ile Ser
130 135 140
Ile Val Ser Tyr Gly Lys Glu Lys Pro Ala Val Leu Gly His Asp Glu
145 150 155 160
Ala Ala Tyr Ser Lys Asn Arg Arg Ala Val Leu Val Tyr
165 170
Claims (13)
1.一种含有在功能性启动子的控制下编码重组蛋白的开放阅读框的细菌菌株，其特征在于
所述细菌菌株含有在功能性启动子控制下编码突变肽聚糖相关的脂蛋白(Pal蛋白)的开放阅读框，所述突变Pal蛋白已经突变，使得其不具有用于所述细菌的外细胞膜的膜锚。
2.根据权利要求1所述的细菌菌株，其特征在于所述细菌菌株是革兰氏阴性细菌。
3.根据权利要求1或2中任一项或多项所述的细菌菌株，其特征在于所述细菌菌株是大肠杆菌(Escherichia coli)种的菌株。
4.根据权利要求1至3中任一项或多项所述的细菌菌株，其特征在于编码所述突变Pal蛋白的所述开放阅读框已经突变，使得所述开放阅读框编码在氨基酸位置1至6中一个或多个处的已经突变的突变Pal蛋白。
5.根据权利要求4所述的细菌菌株，其特征在于编码所述突变Pal蛋白的所述开放阅读框已经突变，使得所述开放阅读框编码N-末端半胱氨酸残基已被取代的突变Pal蛋白。
6.根据权利要求4所述的细菌菌株，其特征在于编码所述突变Pal蛋白的所述开放阅读框已经突变，使所述开放阅读框编码不包含N-末端半胱氨酸残基的突变Pal蛋白。
7.根据权利要求4所述的细菌菌株，其特征在于编码所述突变Pal蛋白的所述开放阅读框已经突变，使得所述开放阅读框编码不存在氨基酸1至6的突变Pal蛋白。
8.根据权利要求1至7中任一项或多项所述的细菌菌株，其特征在于所述重组蛋白是异源蛋白。
9.一种质粒，包含
-在功能性启动子的控制下编码重组蛋白的开放阅读框，
其特征在于
-含有在功能性启动子的控制下编码信号肽和突变Pal蛋白的开放阅读框，所述Pal蛋白已经突变使得其不具有用于所述细菌的外细胞膜的膜锚。
10.一种用于发酵生产重组蛋白的方法，其特征在于在发酵培养基中培养权利要求1至8中任一项所述的细菌菌株，发酵后从细胞中去除所述发酵培养基，并从所述发酵培养基中分离出重组蛋白。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于在去除所述发酵培养基之后，从所述发酵培养基中纯化所述重组蛋白。
12.根据权利要求10和11中任一项或多项所述的方法，其特征在于诱导所述突变Pal蛋白的表达。
13.根据权利要求10至12中任一项或多项所述的方法，其特征在于在诱导所述重组蛋白的表达后，诱导所述突变Pal蛋白的表达。
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Patent Citations (2)
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| CN102827904A (zh) * | 2012-08-13 | 2012-12-19 | 安徽大学 | 一种大肠杆菌胞外生产外源蛋白的集成化方法 |
| CN102827860A (zh) * | 2012-08-13 | 2012-12-19 | 安徽大学 | 一种用于重组蛋白分泌型表达的双基因突变大肠杆菌的构建方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
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Also Published As
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