KR20200143975A - 쥐오줌풀 뿌리 추출물을 포함하는 지방간, 이상지질혈증 또는 대사증후군의 개선, 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 쥐오줌풀 뿌리 추출물을 포함하는 지방간, 이상지질혈증 또는 대사증후군의 개선, 예방 또는 치료용 조성물 및 자가포식 유도용 조성물을 제공한다. 본 발명의 쥐오줌풀 뿌리 추출물은 간세포 내 지방축적 및 지방전구세포의 분화를 억제하여 지방간을 개선시키고, 혈청 중성지방 및 총 콜레스테롤의 함량을 감소시켜 이상지질혈증을 개선시키며, 대사증후군에 대해서도 개선 효과를 나타낸다. 또한, 본 발명의 쥐오줌풀 뿌리 추출물은 우수한 자가포식 활성을 나타낸다.
Description
본 발명은 쥐오줌풀 뿌리 추출물을 포함하는 지방간, 이상지질혈증 또는 대사증후군의 개선, 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
최근 경제발전에 따른 생활수준의 향상으로 위생환경이 개선되고 인스턴트 음식물의 잦은 섭취와 육식 위주의 식생활 변화는 체내에 과다한 열량 에너지의 축적을 유발한다. 그러나 이러한 현대인의 식생활 변화는 운동부족으로 인한 열량 에너지 소모의 감소까지 더해져 비만 인구의 빠른 증가경향을 보이고 있다.
이처럼, 체내에 과다하게 축적된 열량 에너지는 비만 뿐 아니라 다양한 질병 형태로 나타나는 바, 지방간, 고지혈증, 고혈압 등을 포함한 대사증후군이 그것이다.
비만은 21세기 들어 단일 질환으로서는 가장 위험하고 치사율이 높은 병에 해당한다. 그 이유는 비만이 비만 그 자체로도 위험하지만 지방조직에 의한 복부의 압박으로 인하여 변비와 소화불량, 위장 장애 등을 일으키는 경우가 많고 다른 여러 가지 다양한 질병의 위험도를 유의적으로 높이기 때문이다. 비만으로 위험도가 증가하는 질환으로는 대표적으로 제2형 당뇨, 고혈압, 관상 동맥 질환, 뇌졸중 및 각종 암(cancer)이다.
지방간은 간 세포에 중성지방이 축적되는 질병으로, 비만, 대사증후군과 같은 에너지 과잉 상태나 과다한 알코올의 섭취에 의해 발생한다. 지방간이 지속되면 지방간염, 간경화 및 간암 까지도 이어지는 일련의 질환을 유발할 수 있다.
고지혈증이란 고콜레스테롤증과 고중성지방증을 모두 일컬으며, 혈액에서 콜레스테롤(240 mg/㎗ 이상)과 중성지방(200 mg/㎗ 이상)이 정상범위 이상으로 증가된 상태를 말하며 지단백과 지질대사 장애로 인해 발생한다. 고지혈증의 종류는 크게 유전적 이상에 의해 발생하는 일차성과 당뇨병 등의 다른 질병이나 약물에 의해 발생하는 이차성 고지혈증으로 나뉜다. 특별한 증상이 나타나는 것은 아니지만, 이런 혈중 콜레스테롤이나 중성지방의 증가가 동맥경화, 고혈압, 심혈관계 질환 등의 원인이 되기 때문에 문제가 된다.
따라서, 다양한 질환의 원인이 될 수 있는 대사증후군을 개선시키기 위한 필요성이 증대되고 있다. 대사증후군의 약물을 이용할 수 있으나, 시중에 유통되고 있는 약물은 그 부작용이 나타나는 문제점이 있다. 현재까지 비만, 지방간의 약물치료에 쓰이는 많은 제품들이 부작용을 나타내고 있으며 사회적으로도 많은 심각성을 나타내고 있음이 주지의 사실이다.
따라서, 이들 제제를 대신할 의약품 및 천연물이 함유된 기능성 식품 등의 개발에 대한 요구가 커지고 있다.
Anwar Shahzad and Taiba Saeed Hippocratic Journal of Unani Medicine 2015 10(1) 53-71.
Sudati JH et al. Neurochem Res. 2009 34(8) 1372-9
본 발명자들은 간 내 지방 축적을 억제하고, 혈중 지질 축적을 억제하는 효과를 갖는 천연물 소재를 찾고자 위해 노력한 결과, 쥐오줌풀 뿌리 추출물이 간에서 지방 축적을 억제하고, 지방 생성 관련 유전자의 발현을 억제하며, 혈중 지질 농도를 감소시킴으로써 지방간, 이상지질혈증 및 대사증후군에 대하여 개선 효과를 나타냄을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 지방간의 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 이상지질혈증 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 대사증후군 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 지방간의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 이상지질혈증의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 대사증후군의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 자가포식 유도용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 쥐오줌풀 뿌리 추출물을 유효성분으로 포함하는 지방간의 개선용 식품 조성물에 관한 것이다.
본 발명자들은 간 내 지방 축적을 억제하고, 혈중 지질 축적을 억제하는 효과를 갖는 천연물 소재를 찾고자 위해 노력한 결과, 쥐오줌풀 뿌리 추출물이 간에서 지방 축적을 억제하고, 지방 생성 관련 유전자의 발현을 억제하며, 혈중 지질 농도를 감소시킴으로써 지방간, 이상지질혈증 및 대사증후군에 대하여 개선 효과를 나타냄을 규명하였다.
쥐오줌풀(Valeriana fauriei)은 마타리과에 속하는 여러해살이풀로 우리나라와 중국 동북부, 일본, 사할린, 타이완 등지의 다소 습기가 많은 산속에 자생하며, 어린 순을 데쳐서 나물로 먹는다. 특이한 냄새가 나기 때문에 쥐오줌풀이라는 이름이 붙었다. 뿌리와 뿌리줄기를 약재로 사용한다.
상기 쥐오줌풀 뿌리 추출물은 쥐오줌풀 뿌리를 물, 및 탄소수 1 내지 5개의 직쇄 또는 분지형 알코올 또는 이들의 혼합물을 용매로 추출하여 얻어진 조추출물 일 수 있다.
쥐오줌풀 뿌리 조추출물 제조에 용매로 물과 알코올의 혼합물을 사용하는 경우에 상기 용매는 10%이상 내지 100%(v/v)미만, 20%이상 내지 100%(v/v)미만, 30%이상 내지 100%(v/v)미만, 40%이상 내지 100%(v/v)미만, 50%이상 내지 100%(v/v)미만, 60%이상 내지 100%(v/v)미만, 70%이상 내지 100%(v/v)미만, 10%이상 내지 90%(v/v)미만, 20%이상 내지 90%(v/v)미만, 30%이상 내지 90%(v/v)미만, 40%이상 내지 90%(v/v)미만, 50%이상 내지 90%(v/v)미만, 60%이상 내지 90%(v/v)미만 또는 60%이상 내지 80%(v/v)미만의 탄소수 1 내지 4개의 직쇄 또는 분지형 알코올 수용액, 예를 들어, 70%(v/v)의 탄소수 1 내지 4개의 직쇄 또는 분지형 알코올 수용액일 수 있다.
또한, 상기 알코올 수용액은 메탄올 수용액, 에탄올 수용액, 프로판올 수용액 및 부탄올 수용액으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으며, 예를 들어, 에탄올 수용액인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 쥐오줌풀 뿌리 추출물은 용매 조추출물을 추가의 용매로 분획한 용매 분획물일 수 있으며, 예를 들면 상기 용매 조추출물에 에틸에테르, 아세트산에틸 및 부탄올로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 용매를 사용한 용매 분획물일 수 있다.
예를 들면, 상기 쥐오줌풀 뿌리 추출물은 물 및 탄소수 1 내지 4개의 직쇄 또는 분지형 알코올로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 용매로 추출한 용매 조추출물을 에틸에테르, 아세트산에틸, 및 부탄올로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 용매를 사용한 용매 분획물일 수 있다.
본 발명에 사용된 추출 방법은 통상적으로 사용되는 모든 방법일 수 있으며, 예컨대, 냉침, 열수추출, 초음파 추출, 또는 환류 냉각 추출법일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서 용어, '추출물'은 용매 조추출물, 특정 용매 가용 추출물(용매 분획물) 및 용매 조추출물의 용매 분획물을 포함하며, 상기 쥐오줌풀 뿌리 추출물은 용액, 농축물 및/또는 분말 상태일 수 있다.
상기 방법에 의해 추출되어 본 발명의 조성물에 포함되는 쥐오줌풀 뿌리 추출물은 카바크롤(Cavacrol)을 함유하지 않는다.
본 발명에 따른 조성물 내의 유효성분으로서의 추출물의 함량은 사용 형태 및 목적, 사용자의 상태, 증상의 종류 및 경중 등에 의하여 적절하게 조절할 수 있으며, 고형분 중량 기준으로 0.001 내지 99.9 중량%, 또는 0.1 내지 99.9 중량%, 바람직하게는 0.1 내지 50 중량%, 또는 0.1 내지 40 중량%일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 쥐오줌풀 뿌리 추출물은 간세포 내 지방축적 및 지방전구세포의 지방세포로의 분화를 억제하고, 간 조직에서 지방 생성에 관여하는 유전자의 발현을 억제하여 지방간, 특히 비알콜성 지방간에 대하여 개선 효과를 나타낸다.
본 명세서에서 용어, "지방간(fatty liver)”은 정상 간에서 지방이 차지하는 비율(5%)보다 많은 양의 지방이 간에 축적된 증상을 의미한다. 상기 지방간은 크게 과음으로 인한 알코올성 지방간과 비만, 당뇨병, 고지혈증 또는 약물 등으로 인한 비알코올성 지방간으로 분류될 수 있다. 알코올성 지방간은 알코올을 많이 섭취하게 되면 간에서 지방 합성이 촉진되고 정상적인 에너지 대사가 이루어지지 않아 발생하고, 비알코올성 지방간은 알코올 이외의 원인으로 인하여 발생하며, 상기 비알코올성 지방간은 지방 대사의 이상을 초래하는 성인병에 동반되는 경우가 빈번한 것으로 알려져 있다.
본 발명에서 용어, "비알코올성 지방간"이란, 알코올 이외의 원인으로 인하여 발생하는 지방간을 의미한다. 이는 전체 지방간의 약 57%를 차지하고, 대체로 지방 대사의 이상을 초래하는 성인병에 동반되는 경우가 빈번한 것으로 알려져 있다. 이러한 성인병에 동반되는 원인 중 하나는 과도한 탄수화물의 섭취 및 이로 인하여 발생하는 비만인 것으로 알려져 있으며, 실제로 비알코올성 지방간이 발병된 환자의 약 75%가 비만환자라고 보고된 바 있다.
본 발명의 지방간 개선용 식품 조성물은 유효성분으로서 쥐오줌풀 뿌리 추출물 뿐만 아니라, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 [타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등]) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제로 제조되는 경우에는 본 발명의 쥐오줌풀 뿌리 추출물 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 두충 추출액, 대추 추출액, 감초 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 건강기능식품 조성물로 제조될 수 있다.
상기 건강기능식품은 식품 제조 시 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소 및 조미제를 포함한다. 예컨대, 드링크제로 제조되는 경우에는 유효성분으로서 쥐오줌풀 뿌리 추출물 이외에 향미제 또는 천연 탄수화물을 추가 성분으로 포함시킬 수 있다. 예를 들어, 천연 탄수화물은 모노사카라이드(예컨대, 글루코오스, 프럭토오스 등); 디사카라이드(예컨대, 말토스, 수크로오스 등); 올리고당; 폴리사카라이드(예컨대, 덱스트린, 시클로덱스트린 등); 및 당알코올(예컨대, 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등)을 포함한다. 향미제로서 천연 향미제(예컨대, 타우마린, 스테비아 추출물 등) 및 합성 향미제(예컨대, 사카린, 아스파탐 등)을 이용할 수 있다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 쥐오줌풀(Valeriana fauriei) 뿌리 추출물을 유효성분으로 포함하는 이상지질혈증의 개선용 식품 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 쥐오줌풀 뿌리 추출물은 혈청 중성지방 및 총 콜레스테롤의 함량을 효과적으로 감소시킴으로써 이상지질혈증에 대하여 개선 효과를 나타낸다.
본 명세서에서 용어, "이상지질혈증"은 지단백의 대사 이상에 의해 발생하는 질환으로 혈액 중에 지질 또는 지방성분이 과다하게 많이 함유되어 있는 상태를 의미한다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 쥐오줌풀 뿌리 추출물을 유효성분으로 포함하는 대사증후군의 개선용 식품 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 쥐오줌풀 뿌리 추출물은 체중 증가를 완화시키고, 혈청 중성지방 및 총 콜레스테롤의 함량을 감소시키며, 간세포 내 지방축적 및 지방전구세포의 지방세포로의 분화를 억제하므로 대사증후군에 대하여 개선 효과를 나타낸다.
본 명세서에서 용어, ‘대사증후군(또는 대사성 질환)’이란 비만, 지방간, 당뇨, 이상지질혈증과 같은 위험 인자가 함께 나타나는 질환을 의미한다. 일반적으로, ① 허리둘레가 남자 90 cm 이상, 여자 85 cm 이상인 복부 비만, ② 중성지방(triglycerides) 150 mg/dL 이상 또는 치료제복용, ③ HDL 콜레스테롤이 남자 40 mg/dL 미만 또는 치료제복용, 여자 50 mg/dL 미만 또는 치료제복용, ④ 혈압 130/85 mmHg 이상 또는 고혈압 치료제 복용, ⑤ 공복혈당(fasting glucose)이 100 mg/dL 이상 또는 제2형 당뇨병의 다섯 가지 위험인자 중 한 환자가 세 개 이상을 나타낼 경우 대사증후군으로 판정하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 쥐오줌풀 뿌리 추출물을 유효성분으로 포함하는 지방간의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 쥐오줌풀 뿌리 추출물을 유효성분으로 포함하는 이상지질혈증의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 쥐오줌풀 뿌리 추출물을 유효성분으로 포함하는 대사증후군의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 쥐오줌풀 뿌리 추출물의 약제학적 유효량 및/또는 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물로 이용될 수 있다.
본 명세서에서 용어, "약제학적 유효량"은 상술한 쥐오줌풀 뿌리 추출물의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.
본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 약제학적 조성물은 인간을 포함하는 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여 방식은 통상적으로 사용되는 모든 방식일 수 있으며, 예컨대, 경구, 피부, 정맥, 근육, 피하 등의 경로로 투여될 수 있으며, 바람직하게는 경구로 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 연고제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 또는 경피제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태의 비경구 제형 등으로 제형화하여 사용될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성별, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 0.001-1000 ㎎/㎏이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제, 캅셀제 또는 젤(예컨대, 하이드로젤) 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 명세서에서는 용어, "예방"은 본 발명의 조성물의 투여로 지방간, 이상지질혈증 또는 대사증후군을 억제시키거나 진행을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 명세서에서 용어, "치료"는 지방간, 이상지질혈증 또는 대사증후군 발전의 억제; 지방간, 이상지질혈증 또는 대사증후군의 경감; 및 지방간, 이상지질혈증 또는 대사증후군의 제거를 의미한다.
본 발명의 상기 약제학적 조성물은 상기 식품 조성물과 동일한 유효성분을 포함하므로, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 쥐오줌풀 뿌리 추출물을 포함하는 자가포식 유도용 조성물에 관한 것이다.
본 명세서에서 용어, "자가포식"은 리소좀을 사용하여 필요없거나 또는 이상기능을 나타내는 세포내 소기관의 분해에 관여하는 기본적인 이화작용기작을 의미한다. 영양결핍과 같은 특수한 상황에서는 세포내 소기관을 파괴하여 세포내 에너지 수준을 유지함으로써 세포 생존성을 향상시키는 효과를 나타낼 수 있다. 상기 자가포식은 진화적으로 보존적인 과정으로 모든 진핵세포에서 나타난다.
상기 자가포식은 크게 3단계로 진행된다. 1단계는 자가포식이 유도되는 단계로, 영양 또는 성장인자의 결핍, 또는 저산소 조건에서 mTOR(mechanistic target of rapamycin)이 불활성화되고 ATG1(autophage related 1)이 활성화되어 자가포식이 유도된다. 2단계는 자식포(autophagosome)가 형성되는 단계로, 세포질성 LC3(microtubule-associated protein 1 light chain 3 alpha)-I가 절단되고 지질화되어 LC3-II로 전환되게 되고 자식포 막에 존재하게 된다. 상기 LC3-II는 자식포 마커로 알려져 있다. 3단계는 상기 자식포와 라이소솜의 융합(fusion) 단계로, 상기 라이소솜에 의해 세포내 소기관이 분해된다(참조: www.abcam.com/pathways/autophagy-interactive-pathway).
본 명세서에서 용어, "자가포식 유도용"은 세포내 소기관의 분해를 유도하는 활성으로, (ⅰ) mTOR을 불활성화 시키거나; (ⅱ) ATG1을 활성화 시키거나; (ⅲ) 자식포 형성을 촉진하거나; (ⅳ) 자식포와 라이소솜의 융합을 촉진하는 활성을 나타낸다.
본 발명의 자가포식 유도용 조성물은 자식포의 형성을 촉진한다.
본 발명의 상기 자가포식 유도용 조성물은 상기 조성물과 동일한 유효성분을 포함하므로, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
상기 자가포식 유도용 조성물은 식품 조성물 또는 약제학적 조성물로 제조될 수 있다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 발레클로린(valechlorine), 발레리오트리에이트 B(valeriotriate B), 발트레이트(valtrate) 및 디드로발트레이트(didrovaltrate)로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상을 포함하는 자가포식(autophagy) 유도용 조성물에 관한 것이다.
상기 발레클로린, 발레리오트리에이트 B, 발트레이트 및 디드로발트레이트는 쥐오줌풀 뿌리 추출물로부터 분리된 화합물로서 자가포식 활성을 나타낸다.
본 발명은 쥐오줌풀 뿌리 추출물을 포함하는 지방간, 이상지질혈증 또는 대사증후군의 개선, 예방 또는 치료용 조성물 및 자가포식 유도용 조성물을 제공한다. 본 발명의 쥐오줌풀 뿌리 추출물은 간세포 내 지방축적 및 지방전구세포의 분화를 억제하여 지방간을 개선시키고, 혈청 중성지방 및 총 콜레스테롤의 함량을 감소시켜 이상지질혈증을 개선시키며, 대사증후군에 대해서도 개선 효과를 나타낸다. 또한, 본 발명의 쥐오줌풀 뿌리 추출물은 우수한 자가포식 활성을 나타낸다.
도 1a는 쥐오줌풀 뿌리 추출물에 대한 MTT 어세이 결과이다.
도 1b는 쥐오줌풀 뿌리 추출물 처리에 따른 자가포식 액포의 변화를 확인한 결과이다.
도 1c는 쥐오줌풀 뿌리 추출물 처리에 따른 LC3II 및 p62에 대한 단백질 발현 정도를 확인한 결과이다.
도 1d는 쥐오줌풀 뿌리 추출물 처리에 따른 LC3 반점의 변화를 확인한 결과이다.
도 1e는 리소좀 억제제 유무 조건 하에서 쥐오줌풀 뿌리 추출물 처리에 따른 자가포식 플럭스를 측정한 결과이다.
도 1f는 탠덤 태깅된 mCherry-GFP-LC3를 이용하여 쥐오줌풀 뿌리 추출물처리 세포에서 자가포식 플럭스를 측정한 결과이다.
도 1g는 도 1f의 결과를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 2a는 쥐오줌풀 뿌리 추출물의 지방 축적 억제 활성을 오일 레드 오 염색을 통해 확인한 결과이다.
도 2b는 도 2a의 결과를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 2c는 쥐오줌풀 뿌리 추출물 처리 세포에서 LC3와 지방 방울의 공존(co-localization)을 분석한 결과이다.
도 2d는 도 2c의 결과를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 2e는 쥐오줌풀 뿌리 추출물 처리 세포에서 mTORC1 의존적 자가포식 경로에 관여하는 단백질의 발현을 분석한 결과이다.
도 3a는 비만 동물모델에서 쥐오줌풀 뿌리 추출물의 투여에 따른 체중 변화를 측정한 결과이다.
도 3b는 8주 동안의 최종 체중 증가량을 나타낸다.
도 3c는 쥐오줌풀 뿌리 추출물의 투여에 따른 조직의 무게 변화를 측정한결과이다.
도 3d는 비만 동물모델에서 쥐오줌풀 뿌리 추출물의 투여에 따른 혈청 중성지방(TG), 총 콜레스테롤(TC) 및 고밀도지단백(HDL)의 농도를 측정한 결과이다.
도 3e는 비만 동물모델에서 쥐오줌풀 뿌리 추출물 투여 후 간 및 부고환 조직을 H&E 염색한 결과이다.
도 3f는 비만 동물모델에서 쥐오줌풀 뿌리 추출물 투여 후 간 조직내 지질양을 측정한 결과이다.
도 3g는 비만 동물모델에서 쥐오줌풀 뿌리 추출물 투여 후 지방 생성 관련 유전자의 mRNA 발현 정도를 측정한 결과이다.
도 4a는 비만 동물모델에서 쥐오줌풀 뿌리 추출물 투여 후 지방 생성 관련 유전자의 단백질 발현 정도를 측정한 결과이다.
도 4b는 비만 동물모델에서 쥐오줌풀 뿌리 추출물 투여 후 지방 생성 관련 유전자의 단백질 발현 정도를 측정한 결과이다.
도 4c는 비만 동물모델에서 쥐오줌풀 뿌리 추출물 투여 후 자가포식 마커의 단백질 발현 정도를 측정한 결과이다.
도 4d는 비만 동물모델에서 쥐오줌풀 뿌리 추출물 처리에 따른 LC3 반점의 변화를 확인한 결과이다.
도 4e는 비만 동물모델에서 쥐오줌풀 뿌리 추출물 처리에 따른 자가포식 액포의 변화를 확인한 결과이다.
도 4f는 비만 동물모델에서 쥐오줌풀 뿌리 추출물 처리에 따른 카텝신 B 활성 변화를 확인한 결과이다.
도 4g는 비만 동물모델에서 쥐오줌풀 뿌리 추출물 처리에 따른 자가포식 액포의 변화를 확인한 결과이다.
도 5는 쥐오줌풀 뿌리 추출물의 HPLC 분석 결과를 나타낸다.
도 6a는 쥐오줌풀 뿌리 추출물에서 분리한 이리도이드를 간세포에 처리하고 오일 레드 오 염색을 실시한 결과이다.
도 6b는 도 6a의 결과를 정량화하여 나타낸 것이다.
도 6c는 이리도이드 처리에 따른 LC3 단백질의 발현 정도를 측정한 결과이다.
도 6d는 리소좀 억제제 유무 조건 하에서 이리도이드 처리에 따른 LC3 단백질의 발현 정도를 측정한 결과이다.
도 6e는 이리도이드 처리 세포에서 LC3에 대하여 면역형광염색을 실시한 결과이다.
도 6f는 이리도이드 처리에 의한 mTOR 경로 조절 여부를 면역블롯팅으로확인한 결과이다.
도 6g는 Atg7 +/+ (WT) 또는 Atg7-/- (KO) MEF 세포에서 이리도이드를 처리하고 오일 레드 오 염색을 실시한 결과이다.
도 6h는 도 6g의 결과를 정량화하여 나타낸 것이다.
도 7a 및 7b는 쥐오줌풀 뿌리 추출물의 인 비트로 지방축적 억제 활성을 나타낸다. 도 7a는 오일 레드 오 염색 결과이고, 도 7b는 도 7a의 결과를 정량화하여 나타낸 것이다.
도 8a는 쥐오줌풀 70% 에탄올 추출물에 대한 MTT 어세이 결과이다.
도 8b는 설령쥐오줌풀 70% 에탄올 추출물에 대한 MTT 어세이 결과이다.
도 8c는 설령쥐오줌풀 45% 메탄올 추출물에 대한 MTT 어세이 결과이다.
도 9a는 쥐오줌풀 70% 에탄올 추출물의 지방세포 분화 억제 활성을 오일 레드 오 염색을 통해 확인한 결과이다.
도 9b는 도 9a의 결과를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 9c는 설령쥐오줌풀 70% 에탄올 추출물의 지방세포 분화 억제 활성을 오일 레드 오 염색을 통해 확인한 결과이다.
도 9d는 도 9c의 결과를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 9e는 설령쥐오줌풀 45% 메탄올 추출물의 지방세포 분화 억제 활성을 오일 레드 오 염색을 통해 확인한 결과이다.
도 9f는 도 9e의 결과를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 10a는 쥐오줌풀 추출물 처리에 따른 지방세포 분화 관련 유전자(C/EBPα, PPAR-γ, FAS 및 aP2)의 mRNA 발현 변화를 분석한 결과이다.
도 10b는 도 10a에서 C/EBPα에 대한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 10c는 도 10a에서 PPAR-γ에 대한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 10d는 도 10a에서 FAS에 대한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 10e는 도 10a에서 aP2에 대한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 11a는 설령쥐오줌풀 추출물 처리에 따른 지방세포 분화 관련 유전자(C/EBPα, PPAR-γ, FAS 및 aP2)의 mRNA 발현 변화를 분석한 결과이다.
도 11b는 도 11a에서 C/EBPα에 대한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 11c는 도 11a에서 PPAR-γ에 대한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 11d는 도 11a에서 FAS에 대한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 11e는 도 11a에서 aP2에 대한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 1b는 쥐오줌풀 뿌리 추출물 처리에 따른 자가포식 액포의 변화를 확인한 결과이다.
도 1c는 쥐오줌풀 뿌리 추출물 처리에 따른 LC3II 및 p62에 대한 단백질 발현 정도를 확인한 결과이다.
도 1d는 쥐오줌풀 뿌리 추출물 처리에 따른 LC3 반점의 변화를 확인한 결과이다.
도 1e는 리소좀 억제제 유무 조건 하에서 쥐오줌풀 뿌리 추출물 처리에 따른 자가포식 플럭스를 측정한 결과이다.
도 1f는 탠덤 태깅된 mCherry-GFP-LC3를 이용하여 쥐오줌풀 뿌리 추출물처리 세포에서 자가포식 플럭스를 측정한 결과이다.
도 1g는 도 1f의 결과를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 2a는 쥐오줌풀 뿌리 추출물의 지방 축적 억제 활성을 오일 레드 오 염색을 통해 확인한 결과이다.
도 2b는 도 2a의 결과를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 2c는 쥐오줌풀 뿌리 추출물 처리 세포에서 LC3와 지방 방울의 공존(co-localization)을 분석한 결과이다.
도 2d는 도 2c의 결과를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 2e는 쥐오줌풀 뿌리 추출물 처리 세포에서 mTORC1 의존적 자가포식 경로에 관여하는 단백질의 발현을 분석한 결과이다.
도 3a는 비만 동물모델에서 쥐오줌풀 뿌리 추출물의 투여에 따른 체중 변화를 측정한 결과이다.
도 3b는 8주 동안의 최종 체중 증가량을 나타낸다.
도 3c는 쥐오줌풀 뿌리 추출물의 투여에 따른 조직의 무게 변화를 측정한결과이다.
도 3d는 비만 동물모델에서 쥐오줌풀 뿌리 추출물의 투여에 따른 혈청 중성지방(TG), 총 콜레스테롤(TC) 및 고밀도지단백(HDL)의 농도를 측정한 결과이다.
도 3e는 비만 동물모델에서 쥐오줌풀 뿌리 추출물 투여 후 간 및 부고환 조직을 H&E 염색한 결과이다.
도 3f는 비만 동물모델에서 쥐오줌풀 뿌리 추출물 투여 후 간 조직내 지질양을 측정한 결과이다.
도 3g는 비만 동물모델에서 쥐오줌풀 뿌리 추출물 투여 후 지방 생성 관련 유전자의 mRNA 발현 정도를 측정한 결과이다.
도 4a는 비만 동물모델에서 쥐오줌풀 뿌리 추출물 투여 후 지방 생성 관련 유전자의 단백질 발현 정도를 측정한 결과이다.
도 4b는 비만 동물모델에서 쥐오줌풀 뿌리 추출물 투여 후 지방 생성 관련 유전자의 단백질 발현 정도를 측정한 결과이다.
도 4c는 비만 동물모델에서 쥐오줌풀 뿌리 추출물 투여 후 자가포식 마커의 단백질 발현 정도를 측정한 결과이다.
도 4d는 비만 동물모델에서 쥐오줌풀 뿌리 추출물 처리에 따른 LC3 반점의 변화를 확인한 결과이다.
도 4e는 비만 동물모델에서 쥐오줌풀 뿌리 추출물 처리에 따른 자가포식 액포의 변화를 확인한 결과이다.
도 4f는 비만 동물모델에서 쥐오줌풀 뿌리 추출물 처리에 따른 카텝신 B 활성 변화를 확인한 결과이다.
도 4g는 비만 동물모델에서 쥐오줌풀 뿌리 추출물 처리에 따른 자가포식 액포의 변화를 확인한 결과이다.
도 5는 쥐오줌풀 뿌리 추출물의 HPLC 분석 결과를 나타낸다.
도 6a는 쥐오줌풀 뿌리 추출물에서 분리한 이리도이드를 간세포에 처리하고 오일 레드 오 염색을 실시한 결과이다.
도 6b는 도 6a의 결과를 정량화하여 나타낸 것이다.
도 6c는 이리도이드 처리에 따른 LC3 단백질의 발현 정도를 측정한 결과이다.
도 6d는 리소좀 억제제 유무 조건 하에서 이리도이드 처리에 따른 LC3 단백질의 발현 정도를 측정한 결과이다.
도 6e는 이리도이드 처리 세포에서 LC3에 대하여 면역형광염색을 실시한 결과이다.
도 6f는 이리도이드 처리에 의한 mTOR 경로 조절 여부를 면역블롯팅으로확인한 결과이다.
도 6g는 Atg7 +/+ (WT) 또는 Atg7-/- (KO) MEF 세포에서 이리도이드를 처리하고 오일 레드 오 염색을 실시한 결과이다.
도 6h는 도 6g의 결과를 정량화하여 나타낸 것이다.
도 7a 및 7b는 쥐오줌풀 뿌리 추출물의 인 비트로 지방축적 억제 활성을 나타낸다. 도 7a는 오일 레드 오 염색 결과이고, 도 7b는 도 7a의 결과를 정량화하여 나타낸 것이다.
도 8a는 쥐오줌풀 70% 에탄올 추출물에 대한 MTT 어세이 결과이다.
도 8b는 설령쥐오줌풀 70% 에탄올 추출물에 대한 MTT 어세이 결과이다.
도 8c는 설령쥐오줌풀 45% 메탄올 추출물에 대한 MTT 어세이 결과이다.
도 9a는 쥐오줌풀 70% 에탄올 추출물의 지방세포 분화 억제 활성을 오일 레드 오 염색을 통해 확인한 결과이다.
도 9b는 도 9a의 결과를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 9c는 설령쥐오줌풀 70% 에탄올 추출물의 지방세포 분화 억제 활성을 오일 레드 오 염색을 통해 확인한 결과이다.
도 9d는 도 9c의 결과를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 9e는 설령쥐오줌풀 45% 메탄올 추출물의 지방세포 분화 억제 활성을 오일 레드 오 염색을 통해 확인한 결과이다.
도 9f는 도 9e의 결과를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 10a는 쥐오줌풀 추출물 처리에 따른 지방세포 분화 관련 유전자(C/EBPα, PPAR-γ, FAS 및 aP2)의 mRNA 발현 변화를 분석한 결과이다.
도 10b는 도 10a에서 C/EBPα에 대한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 10c는 도 10a에서 PPAR-γ에 대한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 10d는 도 10a에서 FAS에 대한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 10e는 도 10a에서 aP2에 대한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 11a는 설령쥐오줌풀 추출물 처리에 따른 지방세포 분화 관련 유전자(C/EBPα, PPAR-γ, FAS 및 aP2)의 mRNA 발현 변화를 분석한 결과이다.
도 11b는 도 11a에서 C/EBPα에 대한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 11c는 도 11a에서 PPAR-γ에 대한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 11d는 도 11a에서 FAS에 대한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 11e는 도 11a에서 aP2에 대한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 "%"는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량) %, 고체/액체는 (중량/부피) %, 그리고 액체/액체는 (부피/부피) %이다.
실시예 1. 쥐오줌풀(
V. fauriei
) 뿌리 추출물의 제조
쥐오줌풀(V. fauriei) 뿌리 부위(길초근)를 분쇄 후 70% 에탄올을 용매로 하여 열수 추출 방식으로 3회 반복 추출하였다. 분쇄한 쥐오줌풀 뿌리 부위 100 g에 70% 에탄올 1 L를 넣고 80℃에서 2시간 열수 추출하였으며, 추출 후에는 분쇄물은 필터링하여 제거하고 에탄올 용매는 감압농축기를 이용하여 제거하였다. 농축된 시료는 동결건조 후 실험에 사용하였다. 또한, 동속이종인 설령쥐오줌풀(V. officinalis)과의 효능을 비교하기 위해 동일한 방법으로 추출하였다.
실시예 2. 쥐오줌풀(
V. fauriei
) 뿌리 추출물 성분 분석
LC-MS/MS를 사용하여 항지방 형성(anti-lipogenesis) 및 지질포식(lipophagy)에 관여하는 쥐오줌풀 뿌리 추출물의 화합물을 확인하였다. UPLC-QTOF-MS를 통해 쥐오줌풀 뿌리 추출물로부터 플라보노이드 및 이리도이드를 포함하는 12개 화합물을 확인하였다(표 1). 분석 결과, 발트레이트(valtrate :VAL), 발레리오트리에이트 B(valeriotriate B: VAL B), 디드로발트레이트(didrovaltrate: DI), 발레클로린(valechlorine: VC) 및 발레리오테트레이트 C(valeriotetrate C: VAL C)가 검출되었으며, 카바크롤(Cavacrol)은 검출되지 않았다. 쥐오줌풀 뿌리 추출물에서 이들 화합물은 발레클로린(2.81 mg/g), 발레리오테트레이트 C(0.75 mg/g), 디드로발트레이트(0.44 mg/g), 발트레이트(0.28 mg/g) 및 발레리오트리에이트 B(0.09 mg/g)의 순으로 많이 포함되어 있었다(표 2). 이들 화합물이 지질포식 기능을 가지고 있는지를 이후 실험에서 분석하였다.
| Compounds | V. fauriei 70% 에탄올 추출물(mg/g) |
V. officinalis 70% 에탄올 추출물(mg/g) |
V. officinalis 45% 에탄올 추출물(mg/g) |
| Valtrate | 0.28 ± 0.01 | 0.09 ± 0.01 | N.D |
| Valeriotriate B | 0.09 ± 0.00 | 0.10 ± 0.02 | N.D |
| Didrovaltrate | 0.44 ± 0.03 | 0.14 ± 0.02 | 0.12 ± 0.01 |
| Valechlorine | 2.81 ± 0.09 | 0.15 ± 0.01 | 0.07 ± 0.01 |
| Valeriotriate C | 0.75 ± 0.03 | 0.45 ± 0.05 | 0.07 ± 0.01 |
실시예 3. 쥐오줌풀(
V. fauriei
) 뿌리 추출물의 자가포식 유도
3-1. 세포 배양
HepG2(HB-8065) 및 3T3-L1(CL-173) 세포는 ATCC(the American Type Culture Collection)에서 구매하였고, Huh7(KCLB No. 60104) 세포는 한국세포주 은행에서 구매하였다. Atg7 -/-와 일치하는 야생형 불멸화 MEF 세포주는 N. Mizushima 박사로부터 제공받았다. HepG2, Huh7, 및 MEF 세포는 10% 소태아혈청을, 3T3-L1 세포는 10% 소혈청을 추가로 포함하는 100 U/mL 페니실린 및 100 μg/mL 스트렙토마이신 포함 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium) 배지에서 37℃, 5% CO2 조건으로 배양하였다.
3-2. 오일 레드 오 염색
실험 물질 처리 후 세포를 PBS로 2회 세척하고 10% 포르말린으로 상온에서 1시간 동안 고정시켰다. 60% 이소프로파놀로 세포를 세척한 다음, 0.5% 오일 레드 오로 10분 동안 염색하였다. 염색한 세포는 증류수로 세척한 다음 광학현미경으로 관찰하였다. 100% 이스프로파놀을 이용하여 세포에서 오일 레드 오를 제거하고, 500 nm 파장에서 정량하였다.
3-3. 자가포식 플럭스(flux) 분석
탠덤 태깅된 mCherry-EGFP-LC3B 벡터를 이용하여 자가포식 플럭스를 측정하였다. FuGENE6® reagent(Roche Applied Science)를 이용하여 레트로바이러스 pBABE-puro mCherry-EGFP-LC3B 벡터(Addgene)를 pCMV-VSV-G(Addgene) 및 pUMVC(Addgene)와 함께 293T(CRL-3216, ATCC) 세포에 형질주입하였다. 안정된 세포주를 생성시키기 위해 레트로바이러스로 Huh7 세포를 감염시키고, 감염된 세포를 퓨로마이신으로 선별하였다. 자가포식 플럭스는 빨간색 및 노란색 반점의 백분율에 기초하여 결정되었다.
3-4. 면역블롯팅
세포 및 간 조직을 프로테아제 및 포스파타아제 억제제 칵테일(Thermo Scientific-Pierce)를 추가로 포함하는 RIPA 버퍼(Thermo Scientific-Pierce)로 용해하였다. SDS-PAGE에서 단백질을 분리하고, PVDF 멤브레인으로 트랜스퍼하였다. 멤브레인을 스킴 밀크로 블로킹한 다음, 1차 항체와 반응시키고 화학발광시약(Pierce ECL substrate)으로 가시화하였다.
3-5. 쥐오줌풀 뿌리 추출물의 자가포식 활성 분석
Cyto-ID 어세이 키트를 이용하여 세포 생존력에 영향을 미치지 않는 농도에서 쥐오줌풀 뿌리 추출물(100 μg/mL)의 자가포식 활성을 측정하였다. 상기 키트는 살아있는 세포에서 축적된 자가포식 액포(autophagic vacuoles)를 측정하는데 사용되었다. 쥐오줌풀 뿌리 추출물은 Huh7 세포에서 Cyto-ID 형광 강도를 증가시켰다(도 1b). 면역블롯팅 결과, 쥐오줌풀 뿌리 추출물의 장시간 처리로 자가포식 마커인 LC3II 및 SQSTM1/p62의 발현이 증가하였다(도 1c).
또한, 쥐오줌풀 뿌리 추출물은 LC3 반점을 증가시켰으며(도 1d), 이는 자가포식 액포 수의 증가를 의미한다. 자가포식이 일어날 때 SQSTM1/p62 레벨의 정량적 감소로 인해 자가용해소체(autolysome)가 형성될 것으로 예상된다. 따라서, 쥐오줌풀 뿌리 추출물을 처리한 세포에서 LC3II 및 SQSTM1/p62의 레벨이 증가하기 때문에 자가포식소체(autophagosome) 및 용해소체(lysome)의 융합이 억제된다고 결론 지을 수 있다.
다음으로 자가포식 플럭스를 측정하였다. 먼저, LC3II 레벨이 CQ(chloroquine)와 같은 용해소체 억제제의 존재 하에서 증가되는지 여부를 조사하였다. 도 1e에 나타낸 바와 같이, LC3II 레벨은 CQ에 의한 자가포식소체 분해 억제함으로써 쥐오줌풀 뿌리 추출물 및 라파마이신(RM)를 처리한 세포에서 증가되었다.
자가포식소체 및 자가용해소체 상태에 따라 노란색 또는 빨간색 형광을 나타내는 탠덤 태깅된 mCherry-GFP-LC3를 이용하여 자가포식 플럭스를 측정하였다. 쥐오줌풀 뿌리 추출물 처리 세포에서 GFP 반점의 수는 감소하였고, mCherry 반점의 수는 동일하게 유지되었다. 반대로 리소좀 양성자 펌프를 억제함으로써 자가포식 플럭스를 방해하는 BafA1으로 처리한 세포에서는 GFP 및 mCherry 레벨이 증가되었다(도 1f 및 도 1g). 이는 쥐오줌풀 뿌리 추출물이 간세포에서 자가포식을 증가시킨다는 것을 의미한다.
실시예 4. 쥐오줌풀(
V. fauriei
) 뿌리 추출물의 간세포 내 지방축적 억제 효과
4-2. 쥐오줌풀 뿌리 추출물의 간세포 내 지방축적 억제 활성 분석
지질포식(lipophagy)은 자가포식 활성을 통한 세포 내 지방 방울(lipid droplets)의 분해로 정의된다. 높은 수준의 혈장 유리지방산(free fatty acid: FFA)은 비알콜성 지방간의 발병 기전에 관여하며, in vitro에서는 올레산을 증가시킴으로써 재현될 수 있다. 자가포식을 유도하는 Torin1에 의한 mTOR 발현 억제는 세포 내 지질 축적을 억제하였고, 쥐오줌풀 뿌리 추출물 처리는 농도 의존적으로 올레산에 의해 유도된 지질 축적을 감소시켰다(도 2a 및 도 2b).
Huh7 세포에서 자가포식소체(LC3) 및 LD(BODIPY)의 위치를 분석하였다. 쥐오줌풀 뿌리 추출물을 처리한 세포에서 LC3 반점 및 부분적인 LC3 및 LD의 공존(colocalization)을 확인하였으며(도 2c 및 도 2d), 이는 자가포식소체가 LD 포획에 직접적으로 연관된다는 것을 의미한다. 자가포식 과정은 영양소에 대한 반응으로 mTORC1(mechanistic target of rapamycin complex 1)에 의해 조절된다. mTORC1은 자가포식의 음성 조절 인자이며, Ser757에서 ULK1을 인산화시켜 자가포식 활성을 억제한다. 쥐오줌풀 뿌리 추출물은 Thr389에서 S6K1 인산화를 억제하였다(도 2e). 또한, 쥐오줌풀 뿌리 추출물에 의한 mTORC1의 억제는 Ser757에서의 ULK1 인산화를 감소시키며, 이는 쥐오줌풀 뿌리 추출물이 mTORC1 발현을 억제시킴으로써 자가포식을 유도한다는 것을 의미한다.
실시예 5. 쥐오줌풀 뿌리 추출물의 지방간 개선 인비보 효과
5-1. 체중 및 조직 무게 변화
4주령 웅성 C57BL/6J를 오리엔트 바이오에서 구매하였다. 모든 동물 실험 과정은 한국식품연구원 동물관리 및 사용위원회의 승인을 받았다. 1주 동안 적응시킨 후 마우스에게 8주 동안 고지방식이(HFD)를 공급하고, 마우스 체중에 기초하여 그룹당 6마리씩 총 3그룹으로 나누었다: 고지방식이 그룹(HFD), 고지방식이 + 0.25% 쥐오줌풀 뿌리 추출물(HFD + VF 0.25), 및 고지방식이 + 0.5% 쥐오줌풀 뿌리 추출물(HFD + VF 0.5). 고지방식이는 45% kcal 지방 및 0.5% 콜레스테롤(W/W)를 포함한다.
콜레스테롤과 함께 고지방 식이는 비만 마우스에서 비알콜성 지방간의 진행을 유도한다. 마우스에 고지방식이를 8주간 제공하여 간 지방증(hepatic steatosis)를 유도한 다음, 쥐오줌풀 뿌리 추출물을 추가하여 8주간 고지방 식이를 제공하였다. 쥐오줌풀 뿌리 추출물을 추가하여 식이한 경우, 고지방 식이에 의한 체중 증가를 완화시키는데 효과적이었다(도 3a 및 도 3b). 쥐오줌풀 뿌리 추출물은 간 및 지방의 무게를 감소시켰다(도 3c).
5-2. 혈중 지질 농도 및 지질 축적
쥐오줌풀 뿌리 추출물은 혈청 중성지방(triglycerides: TG) 및 총 콜레스테롤(total cholesterol: TC) 레벨을 감소시켰다(도 3c 및 도 3d). H&E 염색 결과, 쥐오줌풀 뿌리 추출물을 투여한 경우 간 크기 및 지질 축적이 감소하였다(도 3e-3f).
5-3. 지방 생성 관련 유전자 발현
RNeasy mini kit(Qiagen)을 이용하여 세포 및 간 조직에서 총 RNA를 분리하고, ReverTra Ace® qPCR RT Kit(Toyobo)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 정량적 실시간 PCR에 사용된 프라이머 정보는 표 3과 같다.
| 구분 | 5'-3' | 서열번호 |
| CD36 정방향 | GATGACGTGGCAAAGAACAG | 1 |
| CD36 역방향 | AAAGGAGGCTGCGTCTGTG | 2 |
| SCD1 정방향 | TTCTTGCGATACACTCTGGTGC | 3 |
| SCD1 역방향 | CGGGATTGAATGTTCTTGTCGT | 4 |
| SREBP1c 정방향 | TGGATTGCACATTTGAAGACAT | 5 |
| SREBP1c 역방향 | GCCAGAGAAGCAGAAGAG | 6 |
| PPARⅴ 정방향 | TCGCTGATGCACTGCCTATG | 7 |
| PPARⅴ 역방향 | GAGAGGTCCACAGAGCTGATT | 8 |
| C/EBPα 정방향 | CAAGAACAGCAACGAGTACCG | 9 |
| C/EBPα 역방향 | GTCACTGGTCAACTCCAGCAC | 10 |
| FAS 정방향 | GGAGGTGGTGATAGCCGGTAT | 11 |
| FAS 역방향 | TGGGTAATCCATAGAGCCCAG | 12 |
| aP2 정방향 | CCGCAGACGACAGGA | 13 |
| aP2 역방향 | CTCATGCCCTTTCATAAACT | 14 |
비만 마우스에서 CD36(cluster of differentiation 36), SCD1(stearoyl-CoA desaturase-1), 및 SREBP1c(sterol regulatory element-binding protein 1c)와 같은 지방 생성 관련 유전자의 발현을 유의하게 감소시켰다(도 3g).
실시예 6. 쥐오줌풀 뿌리 추출물의 지방간에서 자가포식 활성
6-1. 면역화학염색
간 조직을 10% 포르말린으로 고정시키고, 내인성 퍼옥시다아제(endogenous peroxidase) 활성을 억제하기 위해 0.3% H2O2 용액을 처리하였다. 간 조직을 1% 말 혈청으로 블로킹한 다음 LC3B 항체(Cell Signaling Technology)와 반응시켰다. LC3 발현은 3,3'-디아미노벤지딘(diaminobenzidine)을 이용하여 확인하였다.
6-2. TEM(Transmission Electron Microscope)
간 조직을 2% 글루타르알데히드 및 2% 포름알데히드를 포함하는 0.1 M PBS로 고정시켰다. 고정시킨 조직을 PBS로 세척하고 1% 오스뮴 테트라옥사이드로 고정시킨 다음, 에탄올을 이용하여 탈수시킨 후 Epon 812 혼합물에 매립시켰다. 초박막 절편을 2% 우라닐 아세테이트 및 리드 시트레이트로 염색하여 가시화하였다.
6-3. 쥐오줌풀 뿌리 추출물의 지방간에서의 자가포식 활성 분석
쥐오줌풀 뿌리 추출물 투여가 지방간에서 자가포식 활성을 증가시키는지 조사하였다. 고지방 식이 섭취에 의한 FAS(fatty acid synthase), SCD1, 및 SREBP-1c와 같은 지방 생성 관련 유전자의 발현 증가는 쥐오줌풀 뿌리 추출물 투여에 의해 감소하였다(도 4a). 높은 mTORC1 활성은 Ser757에서 ULK1 인산화를 통해 자가포식을 억제한다. 쥐오줌풀 뿌리 추출물은 Ser757에서 ULK1 인산화를 감소시키며, 이는 쥐오줌풀 뿌리 추출물이 지방간에서 mTORC1 활성을 억제함을 나타낸다. 고지방 식이 그룹과 비교하여 고지방 식이 + 0.5% 쥐오줌풀 뿌리 추출물 그룹에서 자가포식 마커인 LC3-II 및 p62의 발현이 증가하였다(도 4b 및 도 4c). 쥐오줌풀 뿌리 추출물이 자가포식소체 형성을 증가시키는지 확인하기 위해 IHC(immunohistochemical) 및 TEM(transmission electron microscopy) 분석을 실시하였다. LC3B를 이용한 IHC 염색 결과, 쥐오줌풀 뿌리 추출물 투여시에만 농도의존적으로 지방간에서 LC3 반점 형성이 증가하는 것을 확인하였다(도 4d).
TEM 분석 결과, 고지방 식이 그룹과 비교하여 쥐오줌풀 뿌리 추출물 투여그룹에서 자가포식소체 형성이 현저히 증가하였다(도 4e). 이러한 결과는 쥐오줌풀 뿌리 추출물이 고지방 식이를 섭취한 마우스의 지방간에서 자가포식 활성을 증가시킨다는 것을 의미한다. 고지방 식이는 리소좀 기능장애를 유도하여 자가포식소체 분해를 억제한다고 알려져 있다. 주요 리소좀 프로테아제인 카텝신 B 및 L의 억제는 자가포식소체 및 리소좀의 융합을 저해한다. 쥐오줌풀 뿌리 추출물 투여 그룹에서 카텝신 B(cathepsin B: CTSB)의 활성은 농도 의존적으로 증가하는 경향이 있었지만 카텝신 L은 변하지 않았다(도 4f). 또한, CSTB의 발현도 증가하였다(도 4g). 이 결과는 쥐오줌풀 뿌리 추출물 투여군에서 복원된 CTSB 활성이 자가포식소체 분해를 증가시키고, 자가포식 플럭스를 회복시킬 수 있음을 의미한다.
실시예 7. 이리도이드(iridoid)의 지질 축적 억제 효과
이리도이드가 올레산 처리한 간세포에서 지질 축적을 억제하는지 확인하였다. 먼저, 이리도이드의 세포 독성 효과를 조사한 결과, valtrate는 1 μM 농도에서도 강력한 세포 독성 효과를 보였다. 세포 독성 효과를 나타내지 않는 농도로 각 화합물을 올레산을 처리한 간세포에 처리하였다. 이리노이드가 Huh7 세포에서 올레산에 의한 지방 방울 축적을 억제하였다(도 6a 및 도 6b). 특히, 발레클로린, 발레리오트리에이트 B 및 발트레이트는 양성대조군으로 사용된 torin1과 유사한 억제 효과를 보였다. 이리도이드를 간세포에 처리했을 때, 발레클로린, 발레리오트리에이트 B 및 발트레이트는 4시간 처리 후 LC3-II의 증가를 보였다(도 6c).
LC3-II의 증가가 자가포식 과정의 유도 또는 억제 중에 일어날 수 있으므로 BafA1(bafilomycin A1)과 같은 리소좀 억제제의 존재 또는 부재하에서 웨스턴 블롯으로 자가포식 플럭스(LC3-II 턴오버의 측정으로 정의됨)를 측정하였다. 발레리오테트레이트 C를 제외한 발레클로린, 발레리오트리에이트 B 및 발트레이트 및 디드로발트레이트는 BafA1 단독과 비교하여 BafA1의 존재하에서 LC3-II 단백질의 발현을 증가시켰으며, 이는 이들 화합물이 자가포식 유도체로 작용하는 것을 나타낸다(도 6d).
이들 화합물이 LC3 반점의 수를 증가시키는지 확인하였다. 발레리오테트레이트 C를 제외한 모든 화합물은 영양이 풍부한 상태에서 LC3 반점 형성을 증가시켰고 이는 자가포식 플럭스 결과와 일치하였다(도 6e). 이들 화합물의 자가포식 유도는 쥐오줌풀 뿌리 추출물과 달리 mTORC1 활성 억제에 의한 것으로 보이지 않았다(도 6f). 이들 화합물이 지질 포식 기능을 통해 지방 방울을 감소시키는지를 확인하기 위해 Atg7 결핍 세포에서 올레산에 의한 지질 축적을 측정하였다. ATG7 +/+ (WT) 또는 -/- (KO) MEF는 이리도이드의 존재 또는 부재하에 올레산을 처리하였다. ATG7 +/+ 세포에서의 이리도이드 처리에 의한 지방 방울이 감소는 ATG7 -/- 세포에서 관찰되지 않았다(도 6g 및 도 6h). 이 결과는 대부분의 이리도이드가 지질포식 또는 자가포식 활성을 통해 간세포에서 지질 축적을 감소시킨다는 것을 의미한다.
실시예 8. 동속이종과의 효과 비교
8-1. 간세포에서 지방 축적 정도 비교
Huh7 세포를 6 웰 플레이트에 3Х105 cells/well로 씨딩하여 하루 동안 부착 시킨 후, 200 μM 올레산(oleic acid, OA)과 함께 쥐오줌풀 뿌리 추출물을 처리하였다. 양성 대조군으로는 자가포식(autophagy) 활성제인 Torin1(250 nM)을 사용하여 쥐오줌풀 뿌리 추출물이 자가포식 조절을 통해 올레산으로 유도된 지방축적을 억제시키는지 확인하였다. 쥐오줌풀 뿌리 추출물은 50 및 100 μg/ml의 두 농도로 올레산과 함께 24시간 동안 처리하였다. 지방축적 억제 효능은 오일 레드 오 염색을 통해 시료를 처리하지 않은 대조군과 비교하여 확인하였다.
배양이 끝난 세포는 배지를 제거한 뒤 PBS로 세포를 세척한 후, 10% 포름알데하이드(in PBS)로 1시간 정치하여 세포를 고정하였다. 고정 후에는 포름알데하이드를 제거하고 60% 이소프로판올(isopropanol)로 세포를 세척하였으며, 세척한 60% 이소프로판올은 후드에서 건조시켜 제거하였다. 오일 레드 오(Oil red O) 용액(in isopropanol)을 증류수와 3:2로 혼합하고 필터링하여 건조된 플레이트에 처리 후 10분 동안 반응시켰다. 반응 후에는 오일 레드 오 용액을 제거하고 증류수로 세척하여 현미경으로 지방세포 분화 여부를 관찰하였다. 관찰이 끝난 뒤, 건조된 플레이트를 촬영하여 지방세포로의 분화 여부를 육안으로 확인하였으며, 확인 후에는 100% 이소프로판올로 염색을 녹여, 이를 96 웰 플레이트로 옮긴 후 500 nm에서 흡광도를 측정하였다.
쥐오줌풀 뿌리 70% 에탄올 추출물을 Huh7에 올레산과 함께 24시간 처리한 결과, 올레산만 처리한 세포와 비교하여 쥐오줌풀 뿌리 추출물을 함께 처리한 세포에서 지방축적이 유의적으로 감소한 것을 확인하였다. 자가포식 활성제인 Torin 1 도 유의적으로 지방 축적을 감소시키는 것으로 확인되었으며, 이를 통해 쥐오줌풀 뿌리 추출물이 자가포식 활성을 통해 올레산으로 유도한 지방축적을 억제함을 알 수 있다(도 7a 및 도 7b).
쥐오줌풀(V. fauriei)의 동속이종인 설령쥐오줌풀(V. officinalis)과 지방 축적 억제 효과를 비교하기 위해 각각의 뿌리 추출물을 처리하고 지방 축적 정도를 측정하였다. 그 결과, 설령쥐오줌풀 뿌리 70% 에탄올 추출물 및 설령쥐오줌풀 뿌리 45% 메탄올 추출물과 비교하여 쥐오줌풀 뿌리 70% 에탄올 추출물을 처리한 경우, 간세포에서 지방 축적 정도가 현저히 낮은 것을 확인하였다(도 7a 및 도 7b).
8-2. 지방세포 분화 억제 효과 비교
쥐오줌풀의 동속이종인 설령쥐오줌풀의 뿌리 추출물(VO)이 지방세포로의 분화를 억제하는지에 대한 평가를 위하여 먼저 3T3-L1 지방전구 세포에서 설령쥐오줌풀 뿌리 추출물의 세포 생존능을 MTT 분석으로 확인하였다. 그 결과 70% 에탄올 추출물을 10, 25, 50, 100 및 200 μg/ml 농도로 24시간 처리하였을 시 세포 생존능은 유의적인 감소를 보이지 않았다(도 8b). 설령쥐오줌풀의 뿌리 추출물을 쥐오줌풀 뿌리 추출물과 동일한 농도로 지방세포로 분화 과정에서 함께 처리하였을 때 50 및 100 μg/ml에서 유의적으로 지방세포 분화를 억제하는 것으로 확인하였으나, 그 억제능은 각각 9.5%, 22.5%(도 9d)로 50 및 100 μg/ml에서 각각 22.3%, 70%의 억제효능을 보였던 쥐오줌풀 뿌리 추출물(도 9b)과 대비하여 낮은 지방세포 분화 억제능을 나타냈다.
8-3. 지방 분화 관련 유전자의 발현 정도 비교
3T3-L1 지방전구세포를 지방세포로 분화 시 쥐오줌풀 뿌리 추출물을 함께 처리하여 지방 분화와 관련된 유전자인 PPAR-γ, C/EBPa, FAS 및 aP2의 mRNA 발현 정도를 확인한 결과, 오일 레드 오 결과와 동일하게 50 및 100 μg/ml 농도로 쥐오줌풀 뿌리 추출물을 처리한 세포에서 유의적으로 mRNA 발현이 감소되었다(도 10a-10e). 특히, 100 μg/ml 농도로 쥐오줌풀 뿌리 추출물을 처리한 경우, PPAR-γ, C/EBPa, FAS 및 aP2의 mRNA 발현의 약 90% 이상 감소되었다.
또한, 설령쥐오줌풀의 뿌리 추출물을 쥐오줌풀 뿌리 추출물과 동일한 농도로 지방세포로 분화 과정에서 함께 처리하였을 때 100 μg/ml에서 유의적으로 지방세포 분화를 억제하는 것으로 확인하였으나, 그 억제능은 쥐오줌풀 뿌리 추출물과 대비하여 낮게 나타났다(도 11a-11e).
<110> KOREA FOOD RESEARCH INSTITUTE
<120> Compositions for Improving, Preventing or Treating Fatty Liver,
Dyslipidemia or Metabolic Syndrome Comprising Valeriana fauriei
Root Extract
<130> PN180064
<160> 14
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD36 forward primer
<400> 1
gatgacgtgg caaagaacag 20
<210> 2
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD36 reverse primer
<400> 2
aaaggaggct gcgtctgtg 19
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SCD1 forward primer
<400> 3
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<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SCD1 reverse primer
<400> 4
cgggattgaa tgttcttgtc gt 22
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SREBP1c forward primer
<400> 5
tggattgcac atttgaagac at 22
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
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<220>
<223> SREBP1c reverse primer
<400> 6
gccagagaag cagaagag 18
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PPAR gamma forward primer
<400> 7
tcgctgatgc actgcctatg 20
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PPAR gamma reverse primer
<400> 8
gagaggtcca cagagctgat t 21
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> C/EBP alpha forward primer
<400> 9
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<223> C/EBP alpha reverse primer
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<210> 12
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FAS reverse primer
<400> 12
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<212> DNA
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<400> 13
ccgcagacga cagga 15
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> aP2 reverse primer
<400> 14
ctcatgccct ttcataaact 20
Claims (11)
- 쥐오줌풀(Valeriana fauriei) 뿌리 추출물을 포함하는 지방간의 개선용 식품 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 쥐오줌풀 뿌리 추출물은 물, 탄소수 1 내지 5개의 직쇄의 알코올, 분지형 알코올 또는 이들의 혼합물을 용매로 하여 추출한 것인, 지방간의 개선용 식품 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 쥐오줌풀 뿌리 추출물은 카바크롤(Cavacrol)을 함유하지 않는 것인, 지방간의 개선용 식품 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 지방간은 비알코올성 지방간인 것인, 지방간의 개선용 식품 조성물.
- 쥐오줌풀(Valeriana fauriei) 뿌리 추출물을 포함하는 이상지질혈증의 개선용 식품 조성물.
- 쥐오줌풀(Valeriana fauriei) 뿌리 추출물을 포함하는 대사증후군의 개선용 식품 조성물.
- 쥐오줌풀(Valeriana fauriei) 뿌리 추출물을 포함하는 지방간의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
- 쥐오줌풀(Valeriana fauriei) 뿌리 추출물을 포함하는 이상지질혈증의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
- 쥐오줌풀(Valeriana fauriei) 뿌리 추출물을 포함하는 대사증후군의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
- 쥐오줌풀(Valeriana fauriei) 뿌리 추출물을 포함하는 자가포식(autophagy) 유도용 조성물.
- 발레클로린(valechlorine), 발레리오트리에이트 B(valeriotriate B), 발트레이트(valtrate) 및 디드로발트레이트(didrovaltrate)로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상을 포함하는 자가포식(autophagy) 유도용 조성물.
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Citations (2)
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| KR100861473B1 (ko) | 2006-11-14 | 2008-10-06 | 전남대학교산학협력단 | 쥐오줌풀 뿌리의 생산방법, 그에 의해 생산되는 쥐오줌풀뿌리 및 그로부터 발레렌산 및 발레포트리에이트를생산하는 방법 |
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| KR20170053492A (ko) | 2015-11-06 | 2017-05-16 | 대한민국(농촌진흥청장) | 항우울 또는 항불안 활성을 갖는 쥐오줌풀 어린잎 추출물을 함유하는 조성물 |
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| Anwar Shahzad and Taiba Saeed Hippocratic Journal of Unani Medicine 2015 10(1) 53-71. |
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| AMND | Amendment | ||
| E601 | Decision to refuse application | ||
| X091 | Application refused [patent] | ||
| AMND | Amendment | ||
| X601 | Decision of rejection after re-examination |