KR20200140882A - 항- pd-l1 항체 및 이의 용도 - Google Patents

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KR20200140882A
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오리진셀 테라퓨틱스 코포레이션, 엘티디.
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Abstract

본 발명은 PD-L1 단백질 또는 CD137 단백질에 결합하는 항체, 이의 항원-결합 단편 또는 변이체, 및 PD- L1 단백질 및 CD137 단백질 둘 다에 결합할 수 있는 이중특이적 항체를 제공한다. 이중특이적 항체는 PD-L1 단백질 및 CD137 단백질을 특이적으로 인식하는 강력한 능력을 가지며, T-세포 활성을 향상시킬 수 있다. 또한, 종양의 예방 및 치료에서의 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 변이체 및 이중특이적 항체의 용도를 제공한다.

Description

항- PD-L1 항체 및 이의 용도
본 출원은 생물의학 분야, 특히 항-PD-L1 항체에 관한 것이고, 또한 이러한 항체를 항-CD137 항체와 조합하여 사용함으로써 암을 치료하는 방법에 관한 것이며, 이러한 항체 및 항-CD137 항체에 의해 형성된 이중특이적 항체에 관한 것이다.
프로그램화된 사멸-1(Programmed death-1; PD-1, CD279로도 알려짐) 및 그의 리간드 PD-L1(B7-H1, CD274로도 알려짐) 및 PD-L2(B7-DC, CD273로도 알려짐)는 T세포의 활성화를 조절하기 위해 음성 공동-자극신호를 제공하도록 협동한다. 공동-자극신호의 부재 하에, T세포는 항원 자극을 느끼기 어렵고, 효과적인 면역반응을 제공할 수 없으며, 또한 이종 항원에 대한 고갈(exhaustion) 또는 내성을 야기할 수 있다. PD-1은 T세포, B세포, 자연살해 T세포(natural killer T cell), 활성화된 단핵세포(activated mononuclear cell) 및 수지상세포(DCs)에서 발현될 수 있다. PD-1은 활성화되지만 자극되지 않은 인간 CD4+ 및 CD8+ T세포, B세포 및 골수세포에 의해 발현될 수 있다. PD-L1 및 PD- L2는 그들의 발현 양식에서 서로 상이하다. PD-L1은 조혈세포뿐만 아니라 다양한 비-조혈세포에서도 발현될 수 있으며, 여기서 PD-L2의 발현은 주로 수지상세포 및 대식세포에서로 제한된다. B7.1(CD80)은 또한 활성화된 B세포, T세포, 대식세포 및 수지상세포에서 발현되는 PD-L1 수용체이다. PD-1 및 B7.1의 리간드로서, PD-L1은 또한 다양한 종양세포에서 선택적으로 발현된다. PD-L1 신호전달의 억제는 PD-L1과 PD-1 및 B7.1 중 하나 또는 둘 모두 사이의 상호작용을 차단하는 것을 포함하고, 이에 의해 PD-L1이 음성 공동-자극신호를 T세포 및 다른 항원-제시세포에 전달하는 것을 방지한다. 이는 감염(예: 급성 또는 만성)반응에 대한 면역 및 종양면역을 향상시킬 수 있다.
CD137(4-1BB, TNFRSF9 등으로도 알려짐)은 종양괴사인자 수퍼패밀리(tumor necrosis factor superfamily; TNFRS)의 막관통단백질이다. 연구는 CD137-활성화된 단일클론 항체가 많은 모델에서 공동-자극 분자의 발현을 증가시키고, 세포용해성 T 림프구의 반응을 유의하게 증진시키며, 항종양 역할을 한다는 것을 나타낸다. CD137-표적화 요법의 항종양 효과는 마우스에서 활성화된 항-마우스 CD137 단일클론 항체의 항종양 치료 효과를 수반하는 연구에 의해 입증된다.
현재, PD-L1 항체는 일부 암을 치료하는 데 사용하기 위해 승인되었고, 기존의 CD137 항체는 다양한 종양을 치료하는 가능성을 나타낸다. CD137 항체와 조합된 PD-1 항체의 항종양 치료 효과는 종양 함유 마우스 모델의 사용에 의해 연구되는 것으로 보고되었다. 그 결과, 조합하여 사용되는 2개의 항체는 단독으로 사용되는 것에 비해 종양-억제 활성이 현저하게 향상되지만, 순응도 및 통증의 관점에서 병용 요법은 환자에게 불편을 가져오고 치료 비용을 증가시킨다. 2개의 단일클론 항체의 이중특이적 항체(BsAb)의 개발은 이중특이적 항체에서 2개의 특이적 항원-결합 부위의 존재로 인해 상기 문제를 해결할 수 있다. 따라서, 보다 우수한 약학적 효능 및 보다 낮은 면역원성을 갖는 신규한 항-PD-L1 항체 및 보다 우수한 항종양 효과를 제공하는 PD-L1/CD137 이중특이적 항체를 개발하는 것이 시급히 필요하다.
본 발명은 하기 특성 중 하나 이상을 갖는 PD-L1 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체를 제공한다: 1) 높은 친화성 및 특이성으로 PD-L1 단백질에 결합할 수 있음; 2) PD-L1 단백질에 대한 PD-1 단백질의 결합을 억제할 수 있음; 및 3) 종양을 완화 또는 치료할 수 있음. 본 출원은 하기 특성 중 하나 이상을 갖는 이중특이적 항체를 제공한다: 1) 높은 친화성 및 특이성으로 PD-L1 단백질에 결합할 수 있음; 2) 높은 친화성 및 특이성으로 CD137 단백질에 결합할 수 있음; 3) T세포의 기능을 향상시킬 수 있음; 및 4) 종양을 완화 또는 치료할 수 있음. 본 출원은 PD-L1 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체, 이중특이적 항체의 제조방법 및 용도를 추가로 제공한다.
일 관점에서, 본 발명은 3x10-9M 이하의 KD로 PD-L1 단백질에 결합하는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체를 제공한다.
일부 실시예에서, 항체는 LCDR1을 포함하는 항체 경쇄 또는 이의 단편을 포함하고, 상기 LCDR1은 서열번호 53로 표시되는 아미노산 서열(TGTX1SX2VGGYX3X4VS)을 포함하며; 여기서 X1은 S, R 또는 V이고; X2는 D, E 또는 S이며; X3은 N 또는 R이고; X4는 Y 또는 E이며, 상기 LCDR1은 항체 카밧 수(Kabat number)의 지수에 따라 결정된다.
일부 실시예에서, 상기 LCDR1은 서열번호 54-58로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 항체 경쇄 또는 이의 단편은 LCDR2를 포함하고, 상기 LCDR2는 서열번호 59로 표시되는 아미노산 서열(X1NSX2RPS)을 포함하며, 여기서 X1은 G 또는 E이고; X2는 N 또는 I이며, 상기 LCDR2는 항체 카밧 수(Kabat number)의 지수에 따라 결정된다. 일부 실시예에서, 상기 LCDR2는 서열번호 60-61로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 항체 경쇄 또는 이의 단편은 LCDR3을 포함하고, 상기 LCDR3은 서열번호 62로 표시되는 아미노산 서열(QSYDSSLSGX1V)을 포함하며, 여기서 X1은 S 또는 T이고, 상기 LCDR3은 항체 카밧 수(Kabat number)의 지수에 따라 결정된다.
일부 실시예에서, 상기 항체 경쇄 또는 이의 단편은 프레임워크 영역 L-FR1, L-FR2, L-FR3 및 L-FR4를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 프레임워크 영역은 인간 컨센서스(consensus) 프레임워크 서열 및 인간 생식세포계열(germline) 서열로 구성된 군에서 선택된다. 일부 실시예에서, 상기 L-FR1의 C-말단은 상기 LCDR1의 N-말단에 직접 또는 간접적으로 연결되고, 상기 L-FR1은 서열번호 71로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 L-FR2는 상기 LCDR1및 상기 LCDR2 사이에 위치하고, 상기 L-FR2는 서열번호 72로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 L-FR3은 상기 LCDR2및 상기 LCDR3 사이에 위치하고, 상기 L-FR3은 서열번호 73-75로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 L-FR4의 N-말단은 상기 LCDR3의 C-말단에 직접 또는 간접적으로 연결되고, 상기 L-FR4는 서열번호 76으로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시예에서, 상기 항체 경쇄 또는 이의 단편은 경쇄 가변영역 VL을 포함하고, 상기 경쇄 가변영역 VL은 서열번호 4, 서열번호 11, 서열번호 33, 서열번호 37, 서열번호 39 및 서열번호 41로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 항체 경쇄 또는 이의 단편은 인간 불변영역을 추가로 포함하고, 상기 인간 불변영역은 인간 Igλ 불변영역을 포함한다.
일부 실시예에서, 상기 항체 경쇄 또는 이의 단편은 서열번호 8, 서열번호 15, 서열번호 34, 서열번호 38, 서열번호 40 및 서열번호 42로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시예에서, 상기 항체는 HCDR1을 포함하는 항체 중쇄 또는 이의 단편을 포함하고, 상기 HCDR1은 서열번호 45로 표시되는 아미노산 서열(X1YAIS)을 포함하며, 여기서 X1은 S 또는 T이고, 상기 HCDR1은 항체 카밧 수(Kabat number)의 지수에 따라 결정된다. 일부 실시예에서, 상기 항체 중쇄 또는 이의 단편은 HCDR2를 포함하고, 상기 HCDR2는 서열번호 48로 표시되는 아미노산 서열을 포함하며, 상기 HCDR2는 항체 카밧 수(Kabat number)의 지수에 따라 결정된다. 일부 실시예에서, 상기 항체 중쇄 또는 이의 단편은 HCDR3을 포함하고, 상기 HCDR3은 서열번호 49로 표시되는 아미노산 서열(TMX1X2YX3X4GNX5DY)을 포함하며; 여기서 X1은 D, E 또는 G고, X2는 G 또는 E이며, X3은 S 또는 G고, X4는 Y 또는 F이며, X5는 F 또는 Y이고, 상기 HCDR3은 항체 카밧 수(Kabat number)의 지수에 따라 결정된다. 일부 실시예에서, 상기 HCDR3은 서열번호 50-52로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시예에서, 상기 항체 중쇄 또는 이의 단편은 프레임워크 영역 H-FR1, H-FR2, H-FR3, 및 H-FR4를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 프레임워크 영역은 인간 컨센서스(consensus) 프레임워크 서열 및 인간 생식세포계열(germline) 서열로 구성된 군에서 선택된다. 일부 실시예에서, 상기 H-FR1의 C-말단은 상기 HCDR1의 N-말단에 직접 또는 간접적으로 연결되고, 상기 H-FR1은 서열번호 65-67로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 H-FR2는 상기 HCDR1및 상기 HCDR2 사이에 위치하고, 상기 H-FR2는 서열번호 68로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 H-FR3은 상기 HCDR2및 상기 HCDR3 사이에 위치하고, 상기 H-FR3은 서열번호 69로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 H-FR4의 N-말단은 상기 HCDR3의 C-말단에 직접 또는 간접적으로 연결되고, 상기 H-FR4는 서열번호 70으로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시예에서, 상기 항체 중쇄 또는 이의 단편은 중쇄 가변영역 VH를 포함하고, 상기 중쇄 가변영역 VH는 서열번호 2, 서열번호 9, 서열번호 31 및 서열번호 35로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시예에서, 상기 항체 중쇄 또는 이의 단편은 인간 불변영역을 추가로 포함하고, 상기 인간 불변영역은 인간 IgG1 불변영역을 포함한다.
일부 실시예에서, 상기 항체 중쇄 또는 이의 단편은 서열번호 6, 서열번호 13, 서열번호 32 및 서열번호 36으로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시예에서, 상기 PD-L1 단백질은 인간 PD-L1 단백질, 원숭이 PD-L1 단백질 및 뮤린(murine) PD-L1 단백질로 구성된 군에서 선택된다.
다른 관점에서, 본 발명은 5x10-9M 이하의 KD로 CD137 단백질에 결합하는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체를 제공한다.
일부 실시예에서, 상기 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체는 3x10-9M 이하의 KD로 CD137 단백질에 결합한다.
일부 실시예에서, 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체는 종양을 완화 또는 치료할 수 있다. 일부 실시예에서, 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체는 대장암(colon cancer)을 완화 또는 치료할 수 있다.
일부 실시예에서, 상기 항체는 항체 경쇄 또는 이의 단편을 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 경쇄 또는 이의 단편은 LCDR1-3을 포함하고, 상기 LCDR1-3의 아미노산 서열은 서열번호 80-82에 순차적으로 표시된다. 일부 실시예에서, 상기 항체 경쇄 또는 이의 단편은 프레임워크 영역 L-FR1, L-FR2, L-FR3 및 L-FR4를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 프레임워크 영역은 인간 컨센서스(consensus) 프레임워크 서열 및 인간 생식세포계열(germline) 서열로 구성된 군에서 선택된다. 일부 실시예에서, 상기 L-FR1의 C-말단은 상기 LCDR1의 N-말단에 직접 또는 간접적으로 연결되고, 상기 L-FR1은 서열번호 89로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 L-FR2는 상기 LCDR1및 상기 LCDR2 사이에 위치하고, 상기 L-FR2는 서열번호 90으로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 L-FR3은 상기 LCDR2및 상기 LCDR3 사이에 위치하고, 상기 L-FR3은 서열번호 91로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 L-FR4의 N-말단은 상기 LCDR3의 C-말단에 직접 또는 간접적으로 연결되고, 상기 L-FR4는 서열번호 92로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시예에서, 상기 항체 경쇄 또는 이의 단편은 경쇄 가변영역 VL을 포함하고, 상기 경쇄 가변영역 VL은 서열번호 20으로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시예에서, 상기 항체 경쇄 또는 이의 단편은 인간 불변영역을 추가로 포함하고, 상기 인간 불변영역은 인간 Igλ 불변영역을 포함한다.
일부 실시예에서, 상기 항체 경쇄 또는 이의 단편은 서열번호 23으로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시예에서, 상기 항체는 중쇄 또는 이의 단편을 포함하고, 상기 중쇄 또는 이의 단편은 HCDR1-3을 포함하며, 상기 HCDR1-3의 아미노산 서열은 서열번호 77-79에 순차적으로 표시된다. 일부 실시예에서, 상기 항체 중쇄 또는 이의 단편은 프레임워크 영역 H-FR1, H-FR2, H-FR3, 및 H-FR4를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 프레임워크 영역은 인간 컨센서스(consensus) 프레임워크 서열 및 인간 생식세포계열(germline) 서열로 구성된 군에서 선택된다. 일부 실시예에서, 상기 H-FR1의 C-말단은 상기 HCDR1의 N-말단에 직접 또는 간접적으로 연결되고, 상기 H-FR1은 서열번호 84-85로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 H-FR2는 상기 HCDR1및 상기 HCDR2 사이에 위치하고, 상기 H-FR2는 서열번호 86으로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 H-FR3은 상기 HCDR2및 상기 HCDR3 사이에 위치하고, 상기 H-FR3은 서열번호 87로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 H-FR4의 N-말단은 상기 HCDR3의 C-말단에 직접 또는 간접적으로 연결되고, 상기 H-FR4는 서열번호 88로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시예에서, 상기 항체 중쇄 또는 이의 단편은 중쇄 가변영역 VH를 포함하고, 상기 중쇄 가변영역 VH는 서열번호 18 및 서열번호 25로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시예에서, 상기 항체 중쇄 또는 이의 단편은 인간 불변영역을 추가로 포함하고, 상기 인간 불변영역은 인간 IgG 불변영역을 포함한다.
일부 실시예에서, 상기 항체 중쇄 또는 이의 단편은 서열번호 21 및 서열번호 27로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시예에서, 상기 CD137 단백질은 인간 CD137 단백질을 포함한다.
다른 관점에서, 본 발명은 2x10-9M 이하의 KD로 PD-L1 단백질에 결합하고, 8x10-9M 이하의 KD로 CD137 단백질에 결합하는 이중특이적 항체를 제공한다.
일부 실시예에서, 이중특이적 항체는 PD-L1 단백질에 특이적으로 결합하는 제1표적 모이어티(targeting moiety)를 포함하고, 상기 제1표적 모이어티는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체를 포함한다.
일부 실시예에서, 이중특이적 항체는 CD137 단백질에 특이적으로 결합하는 제2표적 모이어티(targeting moiety)를 포함하고, 상기 제2표적 모이어티는 CD137 단백질에 결합하는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체를 포함한다. 일부 실시예에서, CD137 단백질에 결합하는 상기 항체는 scFv를 포함하고, 상기 scFv는 서열번호 83으로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 이중특이적 항체는 제1폴리펩티드 사슬 및 제2폴리펩티드 사슬을 포함하고, 상기 제1폴리펩티드 사슬은 PD-L1 단백질에 결합하는 항체의 상기 중쇄 가변영역, CD137 단백질에 결합하는 항체의 상기 중쇄 가변영역, 및 CD137 단백질에 결합하는 항체의 상기 경쇄 가변영역을 포함하며; 상기 제2폴리펩티드 사슬은 PD-L1 단백질에 결합하는 항체의 상기 경쇄 가변영역을 포함한다.
일부 실시예에서, 상기 제1폴리펩티드 사슬에서, PD-L1 단백질에 결합하는 항체의 상기 중쇄 가변영역은 CD137 단백질에 결합하는 항체의 상기 중쇄 가변영역의 N-말단에 위치하고, CD137 단백질에 결합하는 항체의 상기 중쇄 가변영역은 CD137 단백질에 결합하는 항체의 상기 경쇄 가변영역의 N-말단에 위치하며; 대안적으로, PD-L1 단백질에 결합하는 항체의 상기 중쇄 가변영역은 CD137 단백질에 결합하는 항체의 상기 경쇄 가변영역의 N-말단에 위치하고, CD137 단백질에 결합하는 항체의 상기 경쇄 가변영역은 CD137 단백질에 결합하는 항체의 상기 중쇄 가변영역의 N-말단에 위치한다.
일부 실시예에서, 제1폴리펩티드 사슬에서 CD137 단백질에 결합하는 항체의 상기 경쇄 가변영역 및 CD137 단백질에 결합하는 항체의 상기 중쇄 가변영역은 scFv를 구성한다.
일부 실시예에서, 상기 제1폴리펩티드 사슬은 인간 IgG 불변영역을 추가로 포함하고, 상기 인간 IgG 불변영역은 PD-L1 단백질에 결합하는 항체의 상기 중쇄 가변영역의 C-말단에 위치하고 CD137 단백질에 결합하는 항체의 상기 경쇄 가변영역의 N-말단에 위치하며; 대안적으로, 상기 인간 IgG 불변영역은 PD-L1 단백질에 결합하는 항체의 상기 중쇄 가변영역의 C-말단에 위치하고 CD137 단백질에 결합하는 항체의 상기 중쇄 가변영역의 N-말단에 위치한다.
일부 실시예에서, 상기 제1폴리펩티드 사슬은 서열번호 30, 서열번호 43 및 서열번호 44로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 제2폴리펩티드 사슬은 서열번호 15 및 서열번호 34로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
다른 관점에서, 본 발명은 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체 또는 이중특이적 항체를 코딩하는 하나 이상의 핵산분자를 제공한다.
다른 관점에서, 본 발명은 상기 핵산분자를 포함하는 벡터를 제공한다.
다른 관점에서, 본 발명은 상기 핵산분자 또는 벡터를 포함하는 세포를 제공한다.
다른 관점에서, 본 발명은 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체, 또는 이중특이적 항체의 발현을 가능하게 하는 조건 하에서 세포를 배양하는 단계를 포함하는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체 또는 이중특이적 항체를 제조하는 방법을 제공한다.
다른 관점에서, 본 발명은 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체, 또는 이중특이적 항체, 핵산분자, 벡터 및/또는 세포, 및 임의의 약학적으로 허용 가능한 보조제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
다른 관점에서, 본 발명은 종양을 완화 또는 치료하기 위한 의약의 제조에서 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체, 또는 이중특이적 항체, 핵산분자, 벡터, 세포 및/또는 약학 조성물의 용도를 제공한다.
다른 관점에서, 본 발명은 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체, 또는 이중특이적 항체, 핵산분자, 벡터, 세포 및/또는 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 PD-1 단백질에 대한 PD-L1 단백질의 결합을 억제하는 방법을 제공한다.
본 발명에서 항체의 CDR 위치는 항체 Kabat 정의 방법에 따라 결정된다.
당업자는 하기의 상세한 설명으로부터 본 개시의 다른 관점 및 이점을 쉽게 인식할 수 있다. 하기의 상세한 설명은 본 개시의 예시적인 실시예들만을 도시하고 설명한다. 예를 들어, 당업자는 본 개시의 내용이 본 출원이 관련된 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않고 개시된 실시예를 당업자가 변형시킬 수 있다는 것을 인식할 것이다. 따라서, 첨부된 도면 및 본 출원의 명세서의 설명은 제한적이지 않고 예시적일 뿐이다.
본 출원과 관련된 본 발명의 구체적인 특징은 첨부된 청구범위에 기재되어 있다. 이하의 상세한 예시적인 실시예 및 첨부된 도면을 참조하면, 본 출원과 관련된 본 발명의 특징 및 이점이 더 잘 이해될 수 있다. 첨부된 도면에 대한 간략한 설명은 다음과 같다:
도 1은 본 출원의 PD-L1 항체 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역 및 관련된 생식세포계열 서열 사이의 아미노산 서열 정렬을 도시한다. 밑줄은 Kabat 정의 방법에 따라 결정된 CDR이다.
도 2는 인간 PD-1에 대한 인간 PD-L1의 결합을 억제하는 본 출원의 PD-L1 항체의 결과를 도시한다.
도 3은 Macaca fascicularis PD-1에 대한 Macaca fascicularis PD-L1의 결합을 억제하는 본 출원의 PD-L1 항체의 결과를 도시한다.
도 4는 마우스 PD-1에 대한 마우스 PD-L1의 결합을 억제하는 본 출원의 PD-L1 항체의 결과를 도시한다.
도 5는 C57BL/6 마우스에서 MC38 종양 성장에 대한 본 출원의 다양한 항체의 효과를 도시한다(*, P< 0.05; ***, P< 0.001; Unpaired t-test).
도 6은 본 출원의 CD137 항체 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역 및 관련된 생식세포계열 서열 사이의 아미노산 서열 정렬을 도시하고, 여기서 밑줄은 Kabat 정의 방법에 따라 결정된 CDR이다.
도 7은 인간 CD137 유전자가 녹-인된(knocked-in) C57BL/6 암컷 마우스에서 MC38 종양 성장에 대한 본 출원의 CD137 항체의 효과를 도시한다(*, P< 0.05; **, P< 0.01; Unpaired t-test).
도 8은 본 출원에서 PD-L1 항체 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역 및 관련된 생식세포계열 서열 사이의 아미노산 서열 정렬을 나타내고, 여기서 밑줄은 Kabat 정의 방법에 따라 결정된 CDR이며, 음영 부분은 IMGT 정의 방법에 따라서 결정된 CDR이다. 친화성 성숙을 수행할 때 무작위로 표적화되는 YN-003의 다양한 CDR 영역 내의 아미노산 잔기(CDR 영역 내의 일부 아미노산 잔기 및 CDR 영역에 인접한 FR 영역 내의 여러 아미노산 잔기를 포함함)는 이탤릭체로 표시된다.
도 9는 본 출원의 PD-L1 항체의 중쇄 가변영역의 아미노산 서열 및 관련된 생식세포계열 서열의 정렬을 나타낸다. 밑줄은 Kabat 정의 방법에 따라 결정된 CDR이고, 음영 부분은 IMGT 정의 방법에 따라서 결정된 CDR이다.
도 10은 본 출원의 PD-L1 항체의 경쇄 가변영역의 아미노산 서열 및 관련된 생식세포계열 서열의 정렬을 나타낸다. 밑줄은 Kabat 정의 방법에 따라 결정된 CDR이고, 음영 부분은 IMGT 정의 방법에 따라서 결정된 CDR이다.
도 11은 본 출원의 PD-L1 항체가 인간 PD-L1을 안정적으로 발현하는 CHO 세포에 결합하는 것을 도시한다.
도 12는 본 출원의 PD-L1 항체가 인간 PD-L1에 대한 인간 PD-1의 결합을 억제하는 상태를 도시한다.
도 13은 본 출원의 PD-L1 항체가 마우스 PD-L1을 안정적으로 발현하는 CHO 세포에 결합하는 상태를 도시한다.
도 14는 본 출원의 PD-L1 항체가 마우스 PD-L1에 대한 마우스 PD-1의 결합을 억제하는 상태를 도시한다.
도 15는 본 출원의 PD-L1 항체가 MDA-MB-231세포에 결합하는 상태를 도시한다.
도 16은 본 출원의 PD-L1 항체 및 PD-L1/CD137 이중특이적 항체가 인간 PD-L1을 안정적으로 발현하는 CHO 세포에 결합하는 상태를 도시한다.
도 17은 본 출원의 PD-L1 항체 및 PD-L1/CD137 이중특이적 항체가 인간 PD-L1에 대한 인간 PD-1의 결합을 억제하는 상태를 도시한다.
도 18은 본 출원의 PD-L1 항체 및 PD-L1/CD137 이중특이적 항체가 마우스 PD-L1을 안정적으로 발현하는 CHO 세포에 결합하는 상태를 도시한다.
도 19는 본 출원의 PD-L1 항체 및 PD-L1/CD137 이중특이적 항체가 마우스 PD-L1에 대한 마우스 PD-1의 결합을 억제하는 상태를 도시한다.
도 20은 본 출원의 CD137 항체 및 PD-L1/CD137 이중특이적 항체가 인간 CD137을 안정적으로 발현하는 293T세포에 결합하는 상태를 도시한다.
도 21은 본 출원의 항체의 분자량이 SDS-PAGE 분석에 의해 분석되는 상태를 도시한다. a, 비-환원; 및 b, 환원.
도 22는 인간 CD137을 발현하고 루시퍼레이즈(luciferase) 리포터 유전자를 안정적으로 통합시키는 293T세포의 루시퍼레이즈(luciferase) 활성을 자극하는 본 출원의 다양한 항체의 결과를 도시한다.
도 23은 인간 CD137 유전자를 갖는 C57BL/6 암컷 마우스에서 MC38 종양의 성장에 대한 본 출원의 항체의 효과를 도시한다(*, P<0.05; Unpaired t test).
이하, 본 출원에 포함된 본 발명의 구현예를 특정 실시예에 의해 예시한다. 당업자는 본 출원에 개시된 본 발명의 다른 이점들 및 효과들을 설명의 개시로부터 쉽게 이해할 수 있다.
본 출원에서, 용어 "항체(antibody)"는 일반적으로 특이적 항원을 특이적으로 인식하고 및/또는 중화시킬 수 있는 폴리펩티드 분자를 지칭한다. 예를 들어, 항체는 이황화 결합을 통해 연결된 적어도 2개의 중쇄(H) 및 2개의 경쇄(L)로 구성된 면역글로불린을 포함할 수 있고, 그의 항원 결합 부분을 포함하는 임의의 분자를 포함할 수 있다. 용어 "항체"는 단일클론 항체, 항체 단편 또는 항체 유도체를 포함하며, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 단일-가닥 항체(예: scFv), 및 항체의 항원-결합 단편(예: Fab, Fab' 및 (Fab)2 단편)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 용어 "항체"는 원핵 세포에서 발현된 항체, 글리코실화 되지 않은 항체 및 본원에 기재된 바와 같은 항체의 임의의 항원-결합 단편 및 그의 유도체와 같은 항체의 모든 재조합체(recombinants)를 추가로 포함한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변영역(VH) 및 중쇄 불변영역으로 구성될 수 있다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변영역(VLs) 및 경쇄 불변영역으로 구성될 수 있다. VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역(FR)으로 불리는 보다 보존된 영역에 분산되어 있는 상보성 결정영역(CDR)으로 지칭되는 고도로 가변적인 영역으로 추가로 분할될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 아미노 말단으로부터 카르복시 말단까지 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4의 순서로 배열될 수 있는 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성될 수 있다. 중쇄 및 경쇄의 가변영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 포함한다. 항체의 불변영역은 면역계의 다양한 세포(예: 이펙터 세포) 및 고전 보체계(classical complement system; Clq)의 제1성분을 포함하는 숙주 조직 또는 인자에 대한 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다.
본 출원에서, 용어 "PD-L1 단백질(PD-L1 protein)"은 일반적으로 프로그램된 사멸-1(programmed death-1; PD-1) 단백질의 리간드를 지칭한다. PD-1은 T세포 항원 수용체의 신호전달을 음성적으로 조절하기 위해 특이적 리간드 (PD-L)와 상호작용하는 Ig 수퍼패밀리의 수용체이고, 자기관용(self tolerance)의 유지에 역할을 하는 것이 권장된다. 공동-자극신호의 부재시, T세포는 항원 자극을 느끼기 어렵고, 효과적인 면역반응을 생성할 수 없으며, 추가로 이종 항원의 고갈 또는 관용을 야기할 수 있다. PD-L1은 조혈 세포 또는 다양한 비-조혈 세포에서 발현될 수 있다. B7.1(CD80)은 또한 활성화된 B세포, T세포, 대식세포 및 수지상세포에서 발현되는 PD-L1 수용체이다. PD-1 및 B7.1의 리간드로서, PD-L1은 다양한 종양 세포에서 추가로 선택적으로 발현된다. PD-L1 신호전달을 억제하는 것은 PD-1 및 B7.1 중 하나 또는 둘 모두와 PD-L1의 상호작용을 차단하는 것을 포함하고, 이에 의해 PD-L1이 T세포 및 다른 항원-제시 세포에 음성 공동-자극신호를 전달하는 것을 방지한다. 이는 감염(예: 급성 및 만성) 반응에 대한 면역 및 종양 면역을 증진시킬 수 있다
본 출원에서, 4-1BB 또는 TNFRS9로도 알려진 용어 "CD137 단백질(CD137 protein)"은 일반적으로 활성화-유도된 공동-자극 분자 및 면역반응의 중요한 조절인자인 종양괴사인자수용체 수퍼패밀리(tumor necrosis factor receptor superfamily; TNFRS)의 막관통단백질을 지칭한다. 연구는 CD137-활성화된 단일클론 항체가 많은 모델에서 공동자극 분자의 발현을 증가시키고, 세포용해 T 림프구 반응을 유의하게 증진시키고 항종양 효과를 발휘하는 것을 보여주었다. CD137-표적화 요법의 항종양 효과는 활성화된 항-마우스 CD137 단일클론 항체를 사용하여 마우스에서 항종양 효능 연구에 의해 입증될 수 있다. CD137은 면역세포의 강력한 활성화제가 되고, 다양한 질환의 치료를 위한 중요한 후보 항원이 되었다.(Vinay, Dass S., and Byoung S. Kwon. "4-1BB (CD137), an inducible costimulatory receptor, as a specific target for cancer therapy." BMB reports 47.3 (2014): 122. 참조)
본 출원에서, 용어 "NFκB"는 활성화된 B세포의 핵인자 카파-경쇄-인핸서 (nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells; NFκB)를 지칭한다. 이는 DNA 전사를 조절하는 단백질 복합체이다. NFκB는 거의 모든 유형의 동물세포에 존재하고, 스트레스, 시토카인, 자유 라디칼, UV 방사선, LDL의 산화, 및 미생물 또는 바이러스 항원을 포함하는 많은 자극에 대한 세포의 반응에 관여한다. 감염에 대한 면역반응에서, NFκB는 중요한 조절 역할을 한다(κ경쇄는 면역글로불린의 중요한 부분이다). NFκB의 비정상적인 조절은 암, 염증 및 자가면역 질환, 패혈성 쇼크, 바이러스 감염 및 비정상적인 면역 발달과 관련된다. NFκB는 또한 시냅스 가소성 및 메모리 프로세스와 밀접하게 관련된다. NFκB의 주요 표적세포는 케모카인, 면역 수용체, 부착 분자, 스트레스 반응 유전자, 아폽토시스 조절제, 전사인자, 성장인자, 효소 및 세포 주기 조절제이다. 또한, NFκB는 여러 바이러스 프로모터/인핸서(예: HIV-1 및 CMV)의 전사에 중요한 영향을 갖는다(Tergaonkar, Vinay. "NFκB pathway: A good signaling paradigm and therapeutic target." The international journal of biochemistry & cell biology 38.10 (2006): 1647-1653. 참조).
본 출원에서, 용어 "K D "는 "KD"와 상호교환적으로 사용될 수 있고, 일반적으로 M(mol/L)의 단위의 특이적 항체-항원 상호작용의 해리 평형 상수를 지칭한다. KD는 AB의 해리에 의해 수득된 물질 AB 및 물질 A 및 B의 농도로부터 계산될 수 있다: KD = c(A)*c(B)/c(AB). 이 식으로부터, KD 값이 클수록 더 많이 해리되고, 물질 A와 B 사이의 친화성이 약해지며; 반대로 KD 값이 작을수록 더 적게 해리되고, 물질 A와 B 사이의 친화성이 강하다는 것을 알 수 있다.
본 출원에서, 용어 "단일클론 항체(monoclonal antibody)"는 일반적으로 실질적으로 상동성인 항체의 그룹을 지칭하며, 즉, 그룹에 포함된 각각의 항체는 미량의 가능한 자연발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 단일클론 항체는 고도로 특이적이고 단일 항원 부위를 향한다. 또한, 상이한 결정인자 (에피토프)를 향하는 상이한 항체를 포함하는 다클론 항체 제제와 대조적으로, 항원 상의 단일 결정인자를 향하는 각각의 단일클론 항체는 항체를 생산하기 위한 임의의 특별한 방법을 요구하는 것으로 해석되지 않는다. 예를 들어, 단일클론 항체는 하이브리도마 기술에 의해 제조되거나, 재조합 DNA 방법에 의해 박테리아, 진핵 동물 또는 식물 세포에서 제조될 수 있다. 대안적으로, 단일클론 항체는 또한, 예를 들어, Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) and Marks et al., Mol. Biol., 222:581-597 (1991)에 기재된 바와 같은 기술을 사용함으로써 파지 항체 라이브러리에서 수득될 수 있다.
본 출원에서, 용어 "단일쇄 항체(single chain antibody; scFv)"는 보통 항체의 중쇄의 가변영역을 짧은 펩티드 링커(링커)를 통해 경쇄의 가변영역에 연결함으로써 형성된 분자를 지칭한다.
본 출원에서, 용어 "키메라 항체(chimeric antibody)"는 일반적으로 각각의 중쇄 또는 경쇄의 아미노산 서열의 일부가 특정 종으로부터의 항체에서 상응하는 아미노산 서열에 상동성이거나, 또는 특정 부류에 속하고, 사슬의 나머지가 다른 종에서 상응하는 서열에 상동성인 항체를 지칭한다. 예를 들어, 경쇄 및 중쇄 모두의 가변영역은 하나의 동물 종(예: 마우스, 래트 등)으로부터의 항체의 가변영역으로부터 유래되는 반면, 불변 부분은 또 다른 종(예: 인간)으로부터의 항체 서열과 상동성이다. 예를 들어, 키메라 항체를 수득하기 위해, 비-인간 B세포 또는 하이브리도마 세포를 사용하여 가변영역을 생성시킬 수 있고, 이와 조합된 불변영역은 인간으로부터 유래된다. 가변영역은 제조하기 쉬운 이점을 가지며, 그의 특이성은 그와 조합된 불변영역의 공급원에 의해 영향을 받지 않는다. 동시에, 키메라 항체의 불변영역이 인간으로부터 유래될 수 있기 때문에, 주사 시 키메라 항체가 면역반응을 유도할 가능성은 불변영역이 비-인간 기원으로부터 유래된 항체의 가능성보다 낮다.
본 출원에서, 용어 "인간화된 항체(humanized antibody)"는 일반적으로, 원래의 항체의 항원-결합 특성을 여전히 유지하면서, 인간에 대한 비-인간 종(예: 마우스 또는 래트)으로부터 유래된 항체, 면역글로불린 결합 단백질 및 폴리펩티드의 면역원성을 감소시킴으로써 수득된 조작된 항체를 지칭한다. 예를 들어, 비-인간 결합 도메인을 인간화하기 위해 "재형성(reshaping)"(Verhoeyen, et al., 1988 Science 239:1534-1536; Riechmann, et al., 1988 Nature 332:323-337; Tempest, et al., Bio/Technol 1991 9:266-271), "과키머화(hyperchimerization)"(Queen, et al., 1989 Proc Natl Acad Sci USA 86:10029-10033; Co, et al., 1991 Proc Natl Acad Sci USA 88:2869-2873; Co, et al., 1992 J Immunol 148:1149-1154) 및 "베니어링(veneering)"(Mark, et al., "Derivation of therapeutically active humanized and veneered anti-CD18 antibodies." In: Metcalf BW, Dalton BJ, eds. Cellular adhesion: molecular definition to therapeutic potential. New York: Plenum Press, 1994: 291- 312)등을 포함하는 CDR 이식(Jones et al., Nature 321:522 (1986)) 및 그의 변이체를 포함하는 기술적 수단을 사용하는 것이 가능하다. 힌지영역 및 불변영역 도메인과 같은 다른 영역이 또한 비-인간 공급원으로부터 유래된다면, 이들 영역은 또한 인간화될 수 있다.
본 출원에서, 용어 "완전 인간항체(fully　human　antibody)"는 일반적으로 항체의 모든 부분 (항체의 불변영역, CH 및 CL 영역을 포함함)이 인간으로부터 유래된 유전자에 의해 코딩되는 것을 의미한다. 완전 인간항체는 인체 상의 이종 항체에 의해 야기되는 면역 부작용을 상당히 감소시킬 수 있다.
본 출원에서, 용어 "이중특이성 항체(bispecific antibody; BsAbs)"는 일반적으로 그의 결합 암(arm)에서 이중 특이성을 갖는 항체 또는 항체 작제물을 지칭한다. 자연 발생 항체는 단일특이성이며, 이들의 항원 결합 암에서 동일한 특이성을 갖는다. 이중특이적 항체는 2개의 상이한 공급원으로부터 수득되고 재조합 DNA 또는 세포 융합 기술에 의해 제작되어, 이들이 원래의 항체의 2개의 특이성을 보유한다. 이중특이적 항체는 2개의 상이한 항원 결합 부위를 갖는다. 이중특이적 항체의 Fc 부분은 임의의 모 단일특이적 항체의 Fc 부분과 상이하다. 이중특이적 항체는 약물 및 종양 세포 둘 다에 대해 이중 특이성을 갖기 때문에, 이들은 종양에서의 약물 축적이 신체의 비-종양 부위에서의 약물 축적보다 더 높도록 이론적으로 야기할 수 있다. 대부분의 이중특이적 신규 항체는 세포독성 이펙터 세포 (예: Tc 세포, NK 세포, 호중구)를 표적화된 세포 (예: 종양 세포)로 다시 향하도록(redirect) 할 수 있다. 이중특이적 항체는 병인에서 독특하거나 중복되는 역할을 하는 2개의 상이한 매개체/경로를 동시에 차단할 수 있고, 또한 1개 대신 2개의 상이한 세포 표면 항원과 상호작용함으로써 결합 특이성을 증가시킬 수 있다. (Fanger, Michael W., and Paul M. Guyre. "Bispecific antibodies for targeted cellular cytotoxicity." Trends in biotechnology, 1991: 375-380), (Fan, Gaowei, et al. "Bispecific antibodies and their applications." Journal of hematology & oncology, 2015: 130)
본 출원에서, 용어 "서열 상동성(sequence homology)"은 일반적으로 상동성 단백질의 아미노산 서열이 상당한 유사성을 갖는 것을 의미한다.
본 출원에서, 용어 "에피토프(epitope)"는 일반적으로 항원 결정기, 즉 면역계에 의해 인식되는(예를 들어, 항체에 의해 인지되는) 분자의 일부를 지칭한다. 예를 들어, 에피토프는 면역계에 의해 인식되는 항원 상의 별개의 3차원 부위이다. 에피토프는 일반적으로 분자의 화학적 활성 표면 기(예를 들어, 아미노산 또는 당 측쇄)로 구성되며, 일반적으로 특정 3차원 구조 특징 및 특정 전하 특징을 갖는다. 에피토프는 이들의 구조에 따라 입체형태(conformational) 에피토프 및 비입체형태(non-conformational) 에피토프(선형 에피토프)로 나뉠 수 있다. 입체형태 에피토프와 비입체형태 에피토프 사이의 차이는 전자는 변성 용매의 존재 하에 결합을 잃을 것이고, 후자는 잃지 않는다는 것이다. 항원 물질의 표면 상에만 있고 항원 인식 수용체 또는 항체에 쉽게 결합하는 에피토프는 기능적 에피토프(functional epitopes)로 지칭될 수 있고; 분자 내에 위치하고 면역원성이 아닌 에피토프는 숨겨진 에피토프(hidden epitopes)라고 지칭될 수 있다. 에피토프는 연속 잔기로 구성되거나, 항원 중합체의 접힘으로 인해 서로 근접한 불연속 잔기에 의해 형성될 수 있다. 단백질 내의 연속적인 아미노산에 의해 형성된 에피토프는 일반적으로 변성 용매에 노출될 때 유지되지만, 불연속적인 아미노산에 의해서 형성된 에피토프들은 일반적으로 노출 후에 손실된다.
본 출원에서, 용어 "항원-결합 단편(antigen-binding fragment)"은 일반적으로 온전한 항체의 일부, 예를 들어 온전한 항체의 항원-결합 영역 및/또는 가변영역을 지칭한다. 일부 실시예에서, 항원-결합 단편은 Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, 및 Fv 단편을 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 본 출원의 항체는 이중 가닥 항체, 선형 항체, 단일-스탠드(single-stand) 항체 분자, 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함할 수 있다. 온전한 구조를 갖는 항체를 파파인(papain)으로 소화시킴으로써(예를 들어, Fc 영역 및 힌지영역을 제거함으로써) 수득된 2개의 동일한 항원-결합 단편을 "Fab" 단편이라 칭한다. Fab 단편은 온전한 경쇄, 중쇄의 가변영역(VH) 및 중쇄의 제1 불변 도메인(CH1)으로 구성된다. 각각의 Fab 단편은 항원 결합에 대해 1가이며, 즉 단일 항원 결합 부위를 갖는다. F(ab)2 항체 단편을 초기에 시스테인을 통해 연결된 Fab 단편의 쌍으로서 제조하였다. 온전한 구조를 갖는 항체를 펩신으로 소화시킴으로써 수득되는 단일 및 대형 F(ab')2 단편은 이황화물을 통해 연결된 2개의 Fab 단편과 대략 동일하고, 상이한 항원 결합 활성을 가지며, 여전히 항원을 가교시킬 수 있다. Fab' 단편은, 항체의 힌지영역으로부터의 하나 이상의 시스테인을 포함하는, CH1 도메인의 카복시 말단에 여러 개의 추가의 잔기를 갖는다는 점에서 Fab 단편과 상이하다. Fv 단편은 항체의 하나의 암(arm)의 VL 및 VH 도메인으로 구성된다.
본 출원에서, 용어 "변이체(variant)"는 일반적으로 실질적으로 동일한 기능(예: PD-L1에 특이적으로 결합하는 능력) 및 적어도 85%(예: 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 100%) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 지칭한다. 일부 실시예에서, 아미노산 서열의 변이체는 실질적으로 동일한 기능(예: PD-L1에 특이적으로 결합할 수 있음)을 갖고, 하나 이상(예: 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7, 1-8, 1-9, 1-10 또는 그 이상)의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 포함하는 아미노산 서열이다.
본 출원에서, 용어 "동일성(identity)"은 일반적으로 후보 서열을 특정 펩티드 또는 폴리펩티드 서열과 비교할 때 모든 아미노산 잔기의 수에서 동일한 아미노산 잔기의 개수의 퍼센트를 지칭한다.
본 출원에서, 용어 "IgG"는 면역글로불린G를 일반적으로 지칭한다. IgG는 인간 면역글로불린 중 하나이고, 다른 것은 IgA, IgM, IgD 및 IgE를 포함한다. IgG는 혈청의 주요 항체 성분이며, 혈청 Ig의 약 75%를 차지한다. IgG 분자의 γ사슬에서의 항원성(antigenity) 차이에 따라, 인간 IgG는 4개의 하위유형: IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4을 갖는다. IgG는 면역에서 중요한 역할을 한다. 본 출원에서, 용어 "IgG1"은 일반적으로 Fc 수용체에 대해 더 높은 친화성을 갖는, 가장 높은 비율의 IgG를 갖는 하위유형을 지칭한다.
본 출원에서, 용어 "핵산분자(nucleic acid molecule)"는 일반적으로 뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드, 또는 이들의 자연 환경으로부터 단리되거나 인공적으로 합성된 임의의 길이의 이들의 유사체의 단리된 형태를 지칭한다.
본 출원에서, 용어 "벡터(vector)"는 일반적으로 삽입된 핵산분자를 숙주세포 내로 및/또는 숙주세포들 사이에서 전달하는, 적합한 숙주에서 자가-복제할 수 있는 핵산분자를 지칭한다. 벡터는 주로 세포에 DNA 또는 RNA를 삽입하기 위해 사용되는 벡터, 주로 DNA 또는 RNA를 복제하기 위해 사용되는 벡터, 및 주로 DNA 또는 RNA의 전사 및/또는 번역의 발현에 사용되는 벡터를 포함할 수 있다. 벡터는 또한 전술한 다수의 기능을 갖는 벡터를 포함한다. 벡터는 적합한 숙주세포 내로 도입될 때 폴리펩티드로 전사되고 번역될 수 있는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 일반적으로, 벡터를 함유하는 적합한 숙주세포를 배양함으로써, 벡터는 원하는 발현 생성물을 생성할 수 있다
본 출원에서, 용어 "숙주세포(host cell)"는 일반적으로 본 출원의 핵산분자, 또는 본 출원의 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 발현할 수 있는 개별 세포, 세포주 또는 세포 배양물을 포함하거나 또는 이를 포함할 수 있는 플라스미드 또는 벡터를 지칭한다. 숙주세포는 단일 숙주세포의 자손을 포함할 수 있다. 자연, 우발적 및 고의적 돌연변이로 인해, 자손 세포는 본 출원의 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 발현할 수 있는 한, 형태학 또는 게놈에서 원래의 모 세포와 정확하게 동일할 수 없다. 숙주세포는 본 출원의 벡터를 사용하여 시험관 내에서 세포를 형질감염시킴으로써 수득될 수 있다. 숙주세포는 원핵 세포(예: E. Coli)일 수 있고, 또한 진핵 세포(예: 효모 세포, COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, HeLa 세포, HEK293 세포, COS-1 세포, NS0 세포 또는 골수종 세포)일 수도 있다. 일부 실시예에서, 숙주세포는 포유동물세포다. 예를 들어, 포유동물세포는 CHO-K1 세포일 수 있다. 본 출원에서, 용어 "재조합 숙주세포(recombinant host cell)"는 일반적으로 재조합 발현 벡터가 도입되는 세포를 지칭한다. 재조합 숙주세포는 특정 세포를 포함할 뿐만 아니라, 이러한 세포의 자손도 포함한다.
본 출원에서, 용어 "암(cancer)"은 일반적으로 세포 증식 또는 생존의 장애를 전형적으로 특징으로 하는 포유동물의 생리학적 상태를 지칭하거나 기술한다. 암의 예는 암, 림프종, 모체 세포 종양, 육종 및 백혈병 및 림프성 악성 종양을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어, 림프종일 수 있다.
본 출원에서, 용어 "사이(between)"는 일반적으로 특정 아미노산 단편의 C-말단이 제1 아미노산 단편의 N-말단과 직접적으로 또는 간접적으로 연결되고, 그의 N-말단이 제2 아미노산 단편의 C-말단과 직접적으로 또는 간접적으로 연결되는 것을 의미한다. 경쇄에서, 예를 들어, L-FR2의 N-말단은 LCDR1의 C-말단에 직접 또는 간접적으로 연결되고, L-FR2의 C-말단은 LCDR2의 N-말단과 직접 또는 간접적으로 연결된다. 또 다른 예로서, L-FR3의 N-말단은 LCDR2의 C-말단에 직접 또는 간접적으로 연결되고, L-FR3의 C-말단은 LCDR3의 N-말단과 직접 또는 간접적으로 연결된다. 중쇄에서, 예를 들어, H-FR2의 N-말단은 HCDR1의 C-말단에 직접 또는 간접적으로 연결되고, H-FR2의 C-말단은 HCDR2의 N-말단과 직접 또는 간접적으로 연결된다. 또 다른 예에서, H-FR3의 N-말단은 HCDR2의 C-말단에 직접 또는 간접적으로 연결되고, H-FR3의 C-말단은 HCDR3의 N-말단과 직접 또는 간접적으로 연결된다.
본 출원에서, 용어 "약(about)"은 일반적으로 주어진 값 ±0.5% 내지 ±10%의 범위의 변화, 예컨대 주어진 값 ±0.5%, ±1%, ±1.5%, ±2%, ±2.5%, ±3%, ±3.5%, ±4%, ±4.5%, ±5%, ±5.5%, ±6%, ±6.5%, ±7%, ±7.5%, ±8%, ±8.5%, ±9%, ±9.5%, 또는 ±10%의 범위에서의 변화를 지칭한다.
본 출원에서, 용어 "포함한다(includes)"는 일반적으로 포함, 합계, 갖거나 함유하는 의미를 지칭한다. 일부 경우에, 이는 또한 "이거나(be)" 또는 "이루어지는(consist of)"의 의미로서 표현된다.
항체 또는 항체 결합 단편
일 관점에서, 본 발명은 3x10-9M 이하의 KD값(예: KD값은 약 3 x 10-9 M이하, 약 2 x 10-9 M이하, 약 1 x 10-9 M이하, 약 9 x 10-10 M이하, 약 8 x 10-10 M이하, 약 7 x 10-10 M이하, 약 6 x 10-10 M이하, 약 5 x 10-10 M이하, 약 4 x 10-10 M이하, 약 3 x 10-10 M이하, 약 2 x 10-10 M 이하, 1 x 10-10 M이하, 약 9 x 10-11 M이하, 약 8 x 10-11 M이하, 약 7 x 10-11 M이하, 약 6 x 10-11 M이하, 약 1 x 10-11M 또는 미만)으로 PD-L1 단백질에 결합하는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체를 제공한다.
본 출원의 항체 또는 그의 항원 결합 단편 또는 변이체는 PD-1에 대한 PD-L1의 결합을 억제할 수 있다.
본 출원의 항체 또는 그의 항원 결합 단편 또는 변이체는 종양-관련 질환을 완화 또는 치료할 수 있다. 종양은 대장암(colon cancer)을 포함한다.
본 출원에서, 항체는 단일클론 항체, 단일 가닥 항체, 키메라 항체, 인간화 항체 및 완전 인간 항체로 구성된 군에서 선택될 수 있다.
본 출원에서, 항원-결합 단편은 Fab, Fab', F(ab)2 및 Fv 단편으로 구성된 군에서 선택될 수 있다.
본 출원에서, 변이체는 실질적으로 동일한 기능(예: PD-L1에 특이적으로 결합할 수 있음)을 갖고, 적어도 85% 이상(예: 적어도 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 그 이상)의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열일 수 있다. 일부 실시예에서, 아미노산 서열의 변이체는 실질적으로 동일한 기능(예: PD-L1에 특이적으로 결합할 수 있음)을 가지며, 하나 이상(예: 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7, 1-8, 1-9, 1-10 또는 이상)의 아미노산의 첨가, 결실 또는 치환에 의해 수득된 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 예에서, 본 출원의 변이체는 하기 군에서 선택될 수 있다: 항체 또는 이의 항원 결합을 위한 단편에서 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가를 겪는 단백질 또는 폴리펩티드; 및 항체 또는 이의 항원 결합을 위한 단편에 대해 85 % 이상(예: 적어도 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 이상)의 서열 동일성을 갖는 단백질 또는 폴리펩티드.
일부 실시예에서, 본 발명의 항체는 LCDR1을 포함하는 항체 경쇄 또는 이의 단편을 포함하고, 상기 LCDR1은 서열번호 53로 표시되는 아미노산 서열(TGTX1SX2VGGYX3X4VS)을 포함하며; 여기서 X1은 S, R 또는 V이고; X2는 D, E 또는 S이며; X3은 N 또는 R이고; X4는 Y 또는 E이며, 상기 LCDR1은 항체 카밧 수(Kabat number)의 지수에 따라 결정된다. 예를 들어, 항체 경쇄 또는 이의 단편은 LCDR1을 포함하고, LCDR1은 다음의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함한다: 서열번호 54-58.
일부 실시예에서, 상기 항체 경쇄 또는 이의 단편은 서열번호 59로 표시되는 아미노산 서열(X1NSX2RPS)을 포함하는 LCDR2를 포함하고, 여기서 X1은 G 또는 E이고; X2는 N 또는 I이며, 상기 LCDR2는 항체 카밧 수(Kabat number)의 지수에 따라 결정된다. 예를 들어, 항체 경쇄 또는 이의 단편은 다음의 아미노산 서열: 서열번호 60-61 또는 이의 변이체를 포함하는 LCDR2를 포함할 수 있다.
일부 실시예에서, 상기 항체 경쇄 또는 이의 단편은 서열번호 62로 표시되는 아미노산 서열(QSYDSSLSGX1V)을 포함하는 LCDR3을 포함하고, 여기서 X1은 S 또는 T이고, 상기 LCDR3은 항체 카밧 수(Kabat number)의 지수에 따라 결정된다. 예를 들어, 항체 경쇄 또는 이의 단편은 서열번호 63 및 서열번호 64로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 LCDR3을 포함할 수 있다.
일부 실시예에서, 상기 항체 경쇄 또는 이의 단편은 프레임워크 영역 L-FR1, L-FR2, L-FR3 및 L-FR4를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 L-FR1의 C-말단은 상기 LCDR1의 N-말단에 직접 또는 간접적으로 연결될 수 있고, 상기 L-FR1은 서열번호 71로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다. 상기 L-FR2는 상기 LCDR1및 상기 LCDR2 사이에 위치하고, 상기 L-FR2는 서열번호 72로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다. 상기 L-FR3은 상기 LCDR2 및 상기 LCDR3 사이에 위치하고, 상기 L-FR3은 서열번호 73-75로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다. 상기 L-FR4의 N-말단은 상기 LCDR3의 C-말단에 직접 또는 간접적으로 연결되고, 상기 L-FR4는 서열번호 76으로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 프레임워크 영역은 인간 컨센서스(consensus) 프레임워크 서열 및 인간 생식세포계열(germline) 서열로 구성된 군에서 선택된다.
일부 실시예에서, 본 발명의 항체의 항체 경쇄 또는 이의 단편은 경쇄 가변영역 VL을 포함하고, 상기 경쇄 가변영역 VL은 서열번호 4, 서열번호 11, 서열번호 33, 서열번호 37, 서열번호 39 및 서열번호 41로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함한다.
본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 변이체에서, 상기 항체 경쇄 또는 이의 단편은 인간 불변영역을 추가로 포함할 수 있고, 상기 인간 불변영역은 인간 Igλ 불변영역을 포함한다.
본 출원에서, 상기 항체 경쇄 또는 이의 단편은 서열번호 8, 서열번호 15, 서열번호 34, 서열번호 38, 서열번호 40 및 서열번호 42로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 출원에서, 본 발명의 항체는 항체 중쇄 또는 이의 단편을 포함할 수 있고, 여기서 항체 중쇄 또는 이의 단편은 HCDR1을 포함할 수 있으며, 상기 HCDR1은 서열번호 45로 표시되는 아미노산 서열(X1YAIS)로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 여기서 X1은 S 또는 T이고, 상기 HCDR1은 항체 카밧 수(Kabat number)의 지수에 따라 결정된다. 예를 들어, 항체 중쇄 또는 이의 단편은 HCDR1을 포함할 수 있고, HCDR1은 서열번호 46 및 서열번호 47로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함한다.
본 출원에서, 상기 항체 중쇄 또는 이의 단편은 HCDR2를 포함할 수 있고, 상기 HCDR2는 다음의 아미노산 서열: 서열번호 48 또는 이의 변이체를 포함하며, 상기 HCDR2는 항체 카밧 수(Kabat number)의 지수에 따라 결정된다.
본 출원에서, 상기 항체 중쇄 또는 이의 단편은 HCDR3을 포함할 수 있고, 상기 HCDR3은 서열번호 49로 표시되는 아미노산 서열(TMX1X2YX3X4GNX5DY)로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하며; 여기서 X1은 D, E 또는 G고, X2는 G 또는 E이며, X3은 S 또는 G고, X4는 Y 또는 F이며, X5는 F 또는 Y이고, 상기 HCDR3은 항체 카밧 수(Kabat number)의 지수에 따라 결정된다. 예를 들어, 항체 중쇄 또는 이의 단편은 HCDR3을 포함할 수 있고, 상기 HCDR3은 다음의 아미노산 서열: 서열번호 50-52 또는 이의 변이체를 포함한다.
일부 실시예에서, 상기 항체 중쇄 또는 이의 단편은 프레임워크 영역 H-FR1, H-FR2, H-FR3, 및 H-FR4를 추가로 포함한다. 예를 들어, 상기 H-FR1의 C-말단은 상기 HCDR1의 N-말단에 직접 또는 간접적으로 연결되고, 상기 H-FR1은 서열번호 65, 서열번호 66 및 서열번호 67로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 상기 H-FR2는 상기 HCDR1및 상기 HCDR2 사이에 위치하고, 상기 H-FR2는 서열번호 68로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 상기 H-FR3은 상기 HCDR2및 상기 HCDR3 사이에 위치하고, 상기 H-FR3은 서열번호 69로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 상기 H-FR4의 N-말단은 상기 HCDR3의 C-말단에 직접 또는 간접적으로 연결되고, 상기 H-FR4는 서열번호 70으로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 상기 프레임워크 영역은 인간 컨센서스(consensus) 프레임워크 서열 및 인간 생식세포계열(germline) 서열로 구성된 군에서 선택된다.
본 발명의 항체 중쇄 또는 이의 단편은 중쇄 가변영역 VH를 포함할 수 있고, 상기 중쇄 가변영역 VH는 서열번호 2, 서열번호 9, 서열번호 31 및 서열번호 35로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함할 수 있다. 본 발명의 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체에서, 상기 항체 중쇄 또는 이의 단편은 인간 불변영역을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 인간 불변영역은 인간 IgG 불변영역을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 인간 IgG 불변영역은 인간 IgG1 불변영역을 포함할 수 있다.
일부 실시예에서, 상기 항체 중쇄 또는 이의 단편은 서열번호 6, 서열번호 13, 서열번호 32 및 서열번호 36으로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함할 수 있다.
일부 실시예에서, 본 발명의 항체는 LCDR1을 포함하는 항체 경쇄 또는 이의 단편을 포함하고, 상기 LCDR1은 서열번호 53로 표시되는 아미노산 서열(TGTX1SX2VGGYX3X4VS)을 포함하며; 여기서 X1은 S, R 또는 V이고; X2는 D, E 또는 S이며; X3은 N 또는 R이고; X4는 Y 또는 E이며, 상기 LCDR1은 항체 카밧 수(Kabat number)의 지수에 따라 결정된다. 예를 들어, 항체 경쇄 또는 이의 단편은 LCDR1을 포함할 수 있고, 상기 LCDR1은 서열번호 54-58로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 상기 항체 경쇄 또는 이의 단편은 서열번호 59로 표시되는 아미노산 서열(X1NSX2RPS)을 포함하는 LCDR2를 포함하고, 여기서 X1은 G 또는 E이고; X2는 N 또는 I이며, 상기 LCDR2는 항체 카밧 수(Kabat number)의 지수에 따라 결정된다. 예를 들어, 항체 경쇄 또는 이의 단편은 서열번호 60-61로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 LCDR2를 포함할 수 있다. 상기 항체 경쇄 또는 이의 단편은 서열번호 62로 표시되는 아미노산 서열(QSYDSSLSGX1V)을 포함하는 LCDR3을 포함하고, 여기서 X1은 S 또는 T이고, 상기 LCDR3은 항체 카밧 수(Kabat number)의 지수에 따라 결정된다. 예를 들어, 항체 경쇄 또는 이의 단편은 서열번호 63-64로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 LCDR3을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 항체는 HCDR1을 포함하는 항체 중쇄 또는 이의 단편을 포함하고, 상기 HCDR1은 서열번호 45로 표시되는 아미노산 서열(X1YAIS)로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 X1은 S 또는 T이고, 상기 HCDR1은 항체 카밧 수(Kabat number)의 지수에 따라 결정된다. 예를 들어, 항체 중쇄 또는 이의 단편은 HCDR1을 포함할 수 있고, HCDR1은 서열번호 46 및 서열번호 47로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함한다. 예를 들어, 상기 항체 중쇄 또는 이의 단편은 HCDR2를 포함할 수 있고, 상기 HCDR2는 다음의 아미노산 서열: 서열번호 48 또는 이의 변이체를 포함하며, 상기 HCDR2는 항체 카밧 수(Kabat number)의 지수에 따라 결정된다. 다른 실시예에서, 상기 항체 중쇄 또는 이의 단편은 HCDR3을 포함하고, 상기 HCDR3은 서열번호 49로 표시되는 아미노산 서열(TMX1X2YX3X4GNX5DY)에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하며; 여기서 X1은 D, E 또는 G고, X2는 G 또는 E이며, X3은 S 또는 G고, X4는 Y 또는 F이며, X5는 F 또는 Y이고, 상기 HCDR3은 항체 카밧 수(Kabat number)의 지수에 따라 결정된다. 항체 중쇄 또는 이의 단편은 HCDR3을 포함할 수 있고, 상기 HCDR3은 다음의 아미노산 서열: 서열번호 50-52 또는 이의 변이체를 포함한다.
본 발명의 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체의 LCDR1의 아미노산 서열은 서열번호 54 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; LCDR2의 아미노산 서열은 서열번호 60 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; LCDR3의 아미노산 서열은 서열번호 63 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; HCDR1의 아미노산 서열은 서열번호 46을 포함할 수 있고; HCDR2의 아미노산 서열은 서열번호 48 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; HCDR3의 아미노산 서열은 서열번호 50 또는 이의 변이체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체는 YN-002 항체 또는 동일한 LCDR1-3 및 HCDR1-3을 갖는 항체를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체의 L-FR1의 아미노산 서열은 서열번호 71 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; L-FR2의 아미노산 서열은 서열번호 72 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; L-FR3의 아미노산 서열은 서열번호 73 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; L-FR4의 아미노산 서열은 서열번호 76 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; H-FR1의 아미노산 서열은 서열번호 65 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; H-FR2의 아미노산 서열은 서열번호 68 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; H-FR3의 아미노산 서열은 서열번호 69 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; H-FR4의 아미노산 서열은 서열번호 70 또는 이의 변이체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체는 YN-002 항체와 동일한 LCDR1-3, HCDR1-3, L-FR1-4 및 H-FR1-4를 갖는 항체를 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 본 발명의 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체의 경쇄는 경쇄 가변영역을 포함할 수 있고, 경쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 4 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; 중쇄는 중쇄 가변영역을 포함할 수 있고, 중쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 2 또는 이의 변이체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체는 YN-002 항체 또는 동일한 경쇄 가변영역 및 중쇄 가변영역을 갖는 항체를 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 본 발명의 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체는 경쇄 및 중쇄를 포함할 수 있고, 경쇄의 아미노산 서열은 서열번호 8에 표시되고 중쇄의 아미노산 서열은 서열번호 6에 표시된다. 예를 들어, 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체는 YN-002 항체를 포함하거나 동일한 경쇄 및 중쇄를 가질 수 있다.
일부 실시예에서, 본 발명의 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체는 PD-L1 단백질(예: 인간 PD-L1 단백질)에 결합하기 위해 레퍼런스 항체와 경쟁한다. 레퍼런스 항체는 LCDR1-3 및 HCDR1-3을 포함할 수 있고, LCDR1의 아미노산 서열은 서열번호 54 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; LCDR2의 아미노산 서열은 서열번호 60 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; LCDR3의 아미노산 서열은 서열번호 63 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; HCDR1의 아미노산 서열은 서열번호 46 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; HCDR2의 아미노산 서열은 서열번호 48 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; HCDR3의 아미노산 서열은 서열번호 50 또는 이의 변이체를 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 레퍼런스 항체는 YN-002 항체 또는 동일한 LCDR1-3 및 HCDR1-3을 갖는 항체를 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 레퍼런스 항체는 L-FR1-4 및 H-FR1-4를 포함하고, L-FR1의 아미노산 서열은 서열번호 71 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; L-FR2의 아미노산 서열은 서열번호 72 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; L-FR3의 아미노산 서열은 서열번호 73 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; L-FR4의 아미노산 서열은 서열번호 76 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; H-FR1의 아미노산 서열은 서열번호 65 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; H-FR2의 아미노산 서열은 서열번호 68 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; H-FR3의 아미노산 서열은 서열번호 69 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; H-FR4의 아미노산 서열은 서열번호 70 또는 이의 변이체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 YN-002 항체 또는 동일한 LCDR1-3, HCDR1-3, L-FR1-4 및 H-FR1-4를 갖는 항체를 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 레퍼런스 항체는 경쇄 가변영역 및 중쇄 가변영역을 포함할 수 있고, 경쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 4 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; 중쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 2 또는 이의 변이체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 레퍼런스 항체는 YN-002 항체 또는 동일한 경쇄 가변영역 및 중쇄 가변영역을 갖는 항체를 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 레퍼런스 항체는 경쇄 및 중쇄를 포함할 수 있고, 경쇄의 아미노산 서열은 서열번호 8에 표시될 수 있고 중쇄의 아미노산 서열은 서열번호 6에 표시될 수 있다. 예를 들어, 레퍼런스 항체는 YN-002 항체를 포함하거나 동일한 경쇄 및 중쇄를 가질 수 있다.
일부 실시예에서, 본 발명의 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체의 LCDR1의 아미노산 서열은 서열번호 54 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; LCDR2의 아미노산 서열은 서열번호 60 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; LCDR3의 아미노산 서열은 서열번호 63 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; HCDR1의 아미노산 서열은 서열번호 46 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; HCDR2의 아미노산 서열은 서열번호 48 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; HCDR3의 아미노산 서열은 서열번호 50 또는 이의 변이체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체는 YN-003 항체 또는 동일한 LCDR1-3 및 HCDR1-3을 갖는 항체를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체의 L-FR1의 아미노산 서열은 서열번호 71 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; L-FR2의 아미노산 서열은 서열번호 72 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; L-FR3의 아미노산 서열은 서열번호 74 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; L-FR4의 아미노산 서열은 서열번호 76 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; H-FR1의 아미노산 서열은 서열번호 66 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; H-FR2의 아미노산 서열은 서열번호 68 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; H-FR3의 아미노산 서열은 서열번호 69 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; H-FR4의 아미노산 서열은 서열번호 70 또는 이의 변이체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체는 YN-003 항체 또는 동일한 LCDR1-3, HCDR1-3, L-FR1-4 및 H-FR1-4를 갖는 항체를 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 본 발명의 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체의 경쇄는 경쇄 가변영역을 포함할 수 있고, 경쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 11 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; 중쇄는 중쇄 가변영역을 포함할 수 있고, 중쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 9 또는 이의 변이체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체는 YN-003 항체 또는 동일한 경쇄 가변영역 및 중쇄 가변영역을 갖는 항체를 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 본 발명의 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체는 경쇄 및 중쇄를 포함할 수 있고, 경쇄의 아미노산 서열은 서열번호 15에 표시되고 중쇄의 아미노산 서열은 서열번호 13에 표시된다. 예를 들어, 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체는 YN-003 항체를 포함하거나 동일한 경쇄 및 중쇄를 가질 수 있다.
일부 실시예에서, 본 발명의 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체는 PD-L1 단백질(예: 인간 PD-L1 단백질)에 결합하기 위해 레퍼런스 항체와 경쟁한다. 레퍼런스 항체는 LCDR1-3 및 HCDR1-3을 포함할 수 있고, LCDR1의 아미노산 서열은 서열번호 54 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; LCDR2의 아미노산 서열은 서열번호 60 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; LCDR3의 아미노산 서열은 서열번호 63 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; HCDR1의 아미노산 서열은 서열번호 46 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; HCDR2의 아미노산 서열은 서열번호 48 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; HCDR3의 아미노산 서열은 서열번호 50 또는 이의 변이체를 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 레퍼런스 항체는 YN-003 항체 또는 동일한 LCDR1-3 및 HCDR1-3을 갖는 항체를 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 레퍼런스 항체는 L-FR1-4 및 H-FR1-4를 포함하고, L-FR1의 아미노산 서열은 서열번호 71 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; L-FR2의 아미노산 서열은 서열번호 72 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; L-FR3의 아미노산 서열은 서열번호 74 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; L-FR4의 아미노산 서열은 서열번호 76 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; H-FR1의 아미노산 서열은 서열번호 66 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; H-FR2의 아미노산 서열은 서열번호 68 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; H-FR3의 아미노산 서열은 서열번호 69 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; H-FR4의 아미노산 서열은 서열번호 70 또는 이의 변이체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 YN-003 항체 또는 동일한 LCDR1-3, HCDR1-3, L-FR1-4 및 H-FR1-4를 갖는 항체를 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 레퍼런스 항체는 경쇄 가변영역 및 중쇄 가변영역을 포함할 수 있고, 경쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 11 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; 중쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 9 또는 이의 변이체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 레퍼런스 항체는 YN-003 항체 또는 동일한 경쇄 가변영역 및 중쇄 가변영역을 갖는 항체를 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 레퍼런스 항체는 경쇄 및 중쇄를 포함할 수 있고, 경쇄의 아미노산 서열은 서열번호 15에 표시될 수 있고 중쇄의 아미노산 서열은 서열번호 13에 표시될 수 있다. 예를 들어, 레퍼런스 항체는 YN-003 항체를 포함하거나 동일한 경쇄 및 중쇄를 가질 수 있다.
일부 실시예에서, 본 발명의 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체의 LCDR1의 아미노산 서열은 서열번호 55 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; LCDR2의 아미노산 서열은 서열번호 60 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; LCDR3의 아미노산 서열은 서열번호 64 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; HCDR1의 아미노산 서열은 서열번호 47 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; HCDR2의 아미노산 서열은 서열번호 48 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; HCDR3의 아미노산 서열은 서열번호 51 또는 이의 변이체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체는 YN-035 항체 또는 동일한 LCDR1-3 및 HCDR1-3을 갖는 항체를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체의 L-FR1의 아미노산 서열은 서열번호 71 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; L-FR2의 아미노산 서열은 서열번호 72 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; L-FR3의 아미노산 서열은 서열번호 74 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; L-FR4의 아미노산 서열은 서열번호 76 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; H-FR1의 아미노산 서열은 서열번호 67 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; H-FR2의 아미노산 서열은 서열번호 68 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; H-FR3의 아미노산 서열은 서열번호 69 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; H-FR4의 아미노산 서열은 서열번호 70 또는 이의 변이체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체는 YN-035 항체 또는 동일한 LCDR1-3, HCDR1-3, L-FR1-4 및 H-FR1-4를 갖는 항체를 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 본 발명의 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체의 경쇄는 경쇄 가변영역을 포함할 수 있고, 경쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 33 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; 중쇄는 중쇄 가변영역을 포함할 수 있고, 중쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 31 또는 이의 변이체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체는 YN-035 항체 또는 동일한 경쇄 가변영역 및 중쇄 가변영역을 갖는 항체를 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 본 발명의 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체는 경쇄 및 중쇄를 포함할 수 있고, 경쇄의 아미노산 서열은 서열번호 34에 표시되고 중쇄의 아미노산 서열은 서열번호 32에 표시된다. 예를 들어, 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체는 YN-035 항체를 포함하거나 동일한 경쇄 및 중쇄를 가질 수 있다.
일부 실시예에서, 본 발명의 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체는 PD-L1 단백질(예: 인간 PD-L1 단백질)에 결합하기 위해 레퍼런스 항체와 경쟁한다. 레퍼런스 항체는 LCDR1-3 및 HCDR1-3을 포함할 수 있고, LCDR1의 아미노산 서열은 서열번호 55 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; LCDR2의 아미노산 서열은 서열번호 60 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; LCDR3의 아미노산 서열은 서열번호 64 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; HCDR1의 아미노산 서열은 서열번호 47 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; HCDR2의 아미노산 서열은 서열번호 48 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; HCDR3의 아미노산 서열은 서열번호 51 또는 이의 변이체를 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 레퍼런스 항체는 YN-035 항체 또는 동일한 LCDR1-3 및 HCDR1-3을 갖는 항체를 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 레퍼런스 항체는 L-FR1-4 및 H-FR1-4를 포함하고, L-FR1의 아미노산 서열은 서열번호 71 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; L-FR2의 아미노산 서열은 서열번호 72 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; L-FR3의 아미노산 서열은 서열번호 74 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; L-FR4의 아미노산 서열은 서열번호 76 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; H-FR1의 아미노산 서열은 서열번호 67 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; H-FR2의 아미노산 서열은 서열번호 68 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; H-FR3의 아미노산 서열은 서열번호 69 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; H-FR4의 아미노산 서열은 서열번호 70 또는 이의 변이체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 YN-035 항체 또는 동일한 LCDR1-3, HCDR1-3, L-FR1-4 및 H-FR1-4를 갖는 항체를 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 레퍼런스 항체는 경쇄 가변영역 및 중쇄 가변영역을 포함할 수 있고, 경쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 33 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; 중쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 31 또는 이의 변이체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 레퍼런스 항체는 YN-035 항체 또는 동일한 경쇄 가변영역 및 중쇄 가변영역을 갖는 항체를 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 레퍼런스 항체는 경쇄 및 중쇄를 포함할 수 있고, 경쇄의 아미노산 서열은 서열번호 34에 표시될 수 있고 중쇄의 아미노산 서열은 서열번호 32에 표시될 수 있다. 예를 들어, 레퍼런스 항체는 YN-035 항체를 포함하거나 동일한 경쇄 및 중쇄를 가질 수 있다.
일부 실시예에서, 본 발명의 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체의 LCDR1의 아미노산 서열은 서열번호 55 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; LCDR2의 아미노산 서열은 서열번호 60 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; LCDR3의 아미노산 서열은 서열번호 64 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; HCDR1의 아미노산 서열은 서열번호 47 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; HCDR2의 아미노산 서열은 서열번호 48 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; HCDR3의 아미노산 서열은 서열번호 52 또는 이의 변이체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체는 YN-036 항체 또는 동일한 LCDR1-3 및 HCDR1-3을 갖는 항체를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체의 L-FR1의 아미노산 서열은 서열번호 71 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; L-FR2의 아미노산 서열은 서열번호 72 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; L-FR3의 아미노산 서열은 서열번호 74 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; L-FR4의 아미노산 서열은 서열번호 76 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; H-FR1의 아미노산 서열은 서열번호 67 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; H-FR2의 아미노산 서열은 서열번호 68 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; H-FR3의 아미노산 서열은 서열번호 69 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; H-FR4의 아미노산 서열은 서열번호 70 또는 이의 변이체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체는 YN-036 항체 또는 동일한 LCDR1-3, HCDR1-3, L-FR1-4 및 H-FR1-4를 갖는 항체를 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 본 발명의 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체의 경쇄는 경쇄 가변영역을 포함할 수 있고, 경쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 33 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; 중쇄는 중쇄 가변영역을 포함할 수 있고, 중쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 35 또는 이의 변이체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체는 YN-036 항체 또는 동일한 경쇄 가변영역 및 중쇄 가변영역을 갖는 항체를 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 본 발명의 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체는 경쇄 및 중쇄를 포함할 수 있고, 경쇄의 아미노산 서열은 서열번호 34에 표시되고 중쇄의 아미노산 서열은 서열번호 36에 표시된다. 예를 들어, 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체는 YN-036 항체를 포함하거나 동일한 경쇄 및 중쇄를 가질 수 있다.
일부 실시예에서, 본 발명의 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체는 PD-L1 단백질(예: 인간 PD-L1 단백질)에 결합하기 위해 레퍼런스 항체와 경쟁한다. 레퍼런스 항체는 LCDR1-3 및 HCDR1-3을 포함할 수 있고, LCDR1의 아미노산 서열은 서열번호 55 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; LCDR2의 아미노산 서열은 서열번호 60 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; LCDR3의 아미노산 서열은 서열번호 64 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; HCDR1의 아미노산 서열은 서열번호 47 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; HCDR2의 아미노산 서열은 서열번호 48 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; HCDR3의 아미노산 서열은 서열번호 52 또는 이의 변이체를 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 레퍼런스 항체는 YN-036 항체 또는 동일한 LCDR1-3 및 HCDR1-3을 갖는 항체를 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 레퍼런스 항체는 L-FR1-4 및 H-FR1-4를 포함하고, L-FR1의 아미노산 서열은 서열번호 71 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; L-FR2의 아미노산 서열은 서열번호 72 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; L-FR3의 아미노산 서열은 서열번호 74 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; L-FR4의 아미노산 서열은 서열번호 76 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; H-FR1의 아미노산 서열은 서열번호 67 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; H-FR2의 아미노산 서열은 서열번호 68 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; H-FR3의 아미노산 서열은 서열번호 69 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; H-FR4의 아미노산 서열은 서열번호 70 또는 이의 변이체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 YN-036 항체 또는 동일한 LCDR1-3, HCDR1-3, L-FR1-4 및 H-FR1-4를 갖는 항체를 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 레퍼런스 항체는 경쇄 가변영역 및 중쇄 가변영역을 포함할 수 있고, 경쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 33 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; 중쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 35 또는 이의 변이체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 레퍼런스 항체는 YN-036 항체 또는 동일한 경쇄 가변영역 및 중쇄 가변영역을 갖는 항체를 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 레퍼런스 항체는 경쇄 및 중쇄를 포함할 수 있고, 경쇄의 아미노산 서열은 서열번호 34에 표시될 수 있고 중쇄의 아미노산 서열은 서열번호 36에 표시될 수 있다. 예를 들어, 레퍼런스 항체는 YN-036 항체를 포함하거나 동일한 경쇄 및 중쇄를 가질 수 있다.
일부 실시예에서, 본 발명의 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체의 LCDR1의 아미노산 서열은 서열번호 56 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; LCDR2의 아미노산 서열은 서열번호 61 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; LCDR3의 아미노산 서열은 서열번호 64 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; HCDR1의 아미노산 서열은 서열번호 47 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; HCDR2의 아미노산 서열은 서열번호 48 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; HCDR3의 아미노산 서열은 서열번호 52 또는 이의 변이체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체는 YN-037 항체 또는 동일한 LCDR1-3 및 HCDR1-3을 갖는 항체를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체의 L-FR1의 아미노산 서열은 서열번호 71 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; L-FR2의 아미노산 서열은 서열번호 72 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; L-FR3의 아미노산 서열은 서열번호 75 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; L-FR4의 아미노산 서열은 서열번호 76 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; H-FR1의 아미노산 서열은 서열번호 67 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; H-FR2의 아미노산 서열은 서열번호 68 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; H-FR3의 아미노산 서열은 서열번호 69 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; H-FR4의 아미노산 서열은 서열번호 70 또는 이의 변이체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체는 YN-037 항체 또는 동일한 LCDR1-3, HCDR1-3, L-FR1-4 및 H-FR1-4를 갖는 항체를 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 본 발명의 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체의 경쇄는 경쇄 가변영역을 포함할 수 있고, 경쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 37 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; 중쇄는 중쇄 가변영역을 포함할 수 있고, 중쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 35 또는 이의 변이체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체는 YN-037 항체 또는 동일한 경쇄 가변영역 및 중쇄 가변영역을 갖는 항체를 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 본 발명의 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체는 경쇄 및 중쇄를 포함할 수 있고, 경쇄의 아미노산 서열은 서열번호 38에 표시되고 중쇄의 아미노산 서열은 서열번호 36에 표시된다. 예를 들어, 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체는 YN-037 항체를 포함하거나 동일한 경쇄 및 중쇄를 가질 수 있다.
일부 실시예에서, 본 발명의 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체는 PD-L1 단백질(예: 인간 PD-L1 단백질)에 결합하기 위해 레퍼런스 항체와 경쟁한다. 레퍼런스 항체는 LCDR1-3 및 HCDR1-3을 포함할 수 있고, LCDR1의 아미노산 서열은 서열번호 56 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; LCDR2의 아미노산 서열은 서열번호 61 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; LCDR3의 아미노산 서열은 서열번호 64 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; HCDR1의 아미노산 서열은 서열번호 47 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; HCDR2의 아미노산 서열은 서열번호 48 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; HCDR3의 아미노산 서열은 서열번호 52 또는 이의 변이체를 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 레퍼런스 항체는 YN-037 항체 또는 동일한 LCDR1-3 및 HCDR1-3을 갖는 항체를 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 레퍼런스 항체는 L-FR1-4 및 H-FR1-4를 포함하고, L-FR1의 아미노산 서열은 서열번호 71 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; L-FR2의 아미노산 서열은 서열번호 72 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; L-FR3의 아미노산 서열은 서열번호 75 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; L-FR4의 아미노산 서열은 서열번호 76 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; H-FR1의 아미노산 서열은 서열번호 67 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; H-FR2의 아미노산 서열은 서열번호 68 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; H-FR3의 아미노산 서열은 서열번호 69 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; H-FR4의 아미노산 서열은 서열번호 70 또는 이의 변이체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 YN-037 항체 또는 동일한 LCDR1-3, HCDR1-3, L-FR1-4 및 H-FR1-4를 갖는 항체를 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 레퍼런스 항체는 경쇄 가변영역 및 중쇄 가변영역을 포함할 수 있고, 경쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 37 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; 중쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 35 또는 이의 변이체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 레퍼런스 항체는 YN-037 항체 또는 동일한 경쇄 가변영역 및 중쇄 가변영역을 갖는 항체를 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 레퍼런스 항체는 경쇄 및 중쇄를 포함할 수 있고, 경쇄의 아미노산 서열은 서열번호 38에 표시될 수 있고 중쇄의 아미노산 서열은 서열번호 36에 표시될 수 있다. 예를 들어, 레퍼런스 항체는 YN-037 항체를 포함하거나 동일한 경쇄 및 중쇄를 가질 수 있다.
일부 실시예에서, 본 발명의 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체의 LCDR1의 아미노산 서열은 서열번호 57 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; LCDR2의 아미노산 서열은 서열번호 61 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; LCDR3의 아미노산 서열은 서열번호 64 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; HCDR1의 아미노산 서열은 서열번호 47을 포함할 수 있고; HCDR2의 아미노산 서열은 서열번호 48 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; HCDR3의 아미노산 서열은 서열번호 52 또는 이의 변이체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체는 YN-038 항체 또는 동일한 LCDR1-3 및 HCDR1-3을 갖는 항체를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체의 L-FR1의 아미노산 서열은 서열번호 71 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; L-FR2의 아미노산 서열은 서열번호 72 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; L-FR3의 아미노산 서열은 서열번호 75 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; L-FR4의 아미노산 서열은 서열번호 76 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; H-FR1의 아미노산 서열은 서열번호 67 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; H-FR2의 아미노산 서열은 서열번호 68 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; H-FR3의 아미노산 서열은 서열번호 69 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; H-FR4의 아미노산 서열은 서열번호 70 또는 이의 변이체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체는 YN-038 항체 또는 동일한 LCDR1-3, HCDR1-3, L-FR1-4 및 H-FR1-4를 갖는 항체를 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 본 발명의 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체의 경쇄는 경쇄 가변영역을 포함할 수 있고, 경쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 39 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; 중쇄는 중쇄 가변영역을 포함할 수 있고, 중쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 35 또는 이의 변이체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체는 YN-038 항체 또는 동일한 경쇄 가변영역 및 중쇄 가변영역을 갖는 항체를 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 본 발명의 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체는 경쇄 및 중쇄를 포함할 수 있고, 경쇄의 아미노산 서열은 서열번호 40에 표시되고 중쇄의 아미노산 서열은 서열번호 36에 표시된다. 예를 들어, 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체는 YN-038 항체를 포함하거나 동일한 경쇄 및 중쇄를 가질 수 있다.
일부 실시예에서, 본 발명의 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체는 PD-L1 단백질(예: 인간 PD-L1 단백질)에 결합하기 위해 레퍼런스 항체와 경쟁한다. 레퍼런스 항체는 LCDR1-3 및 HCDR1-3을 포함할 수 있고, LCDR1의 아미노산 서열은 서열번호 57 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; LCDR2의 아미노산 서열은 서열번호 61 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; LCDR3의 아미노산 서열은 서열번호 64 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; HCDR1의 아미노산 서열은 서열번호 47 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; HCDR2의 아미노산 서열은 서열번호 48 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; HCDR3의 아미노산 서열은 서열번호 52 또는 이의 변이체를 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 레퍼런스 항체는 YN-038 항체 또는 동일한 LCDR1-3 및 HCDR1-3을 갖는 항체를 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 레퍼런스 항체는 L-FR1-4 및 H-FR1-4를 포함하고, L-FR1의 아미노산 서열은 서열번호 71 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; L-FR2의 아미노산 서열은 서열번호 72 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; L-FR3의 아미노산 서열은 서열번호 75 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; L-FR4의 아미노산 서열은 서열번호 76 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; H-FR1의 아미노산 서열은 서열번호 67 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; H-FR2의 아미노산 서열은 서열번호 68 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; H-FR3의 아미노산 서열은 서열번호 69 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; H-FR4의 아미노산 서열은 서열번호 70 또는 이의 변이체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 YN-038 항체 또는 동일한 LCDR1-3, HCDR1-3, L-FR1-4 및 H-FR1-4를 갖는 항체를 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 레퍼런스 항체는 경쇄 가변영역 및 중쇄 가변영역을 포함할 수 있고, 경쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 39 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; 중쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 35 또는 이의 변이체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 레퍼런스 항체는 YN-038 항체 또는 동일한 경쇄 가변영역 및 중쇄 가변영역을 갖는 항체를 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 레퍼런스 항체는 경쇄 및 중쇄를 포함할 수 있고, 경쇄의 아미노산 서열은 서열번호 40에 표시될 수 있고 중쇄의 아미노산 서열은 서열번호 36에 표시될 수 있다. 예를 들어, 레퍼런스 항체는 YN-038 항체를 포함하거나 동일한 경쇄 및 중쇄를 가질 수 있다.
일부 실시예에서, 본 발명의 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체의 LCDR1의 아미노산 서열은 서열번호 58 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; LCDR2의 아미노산 서열은 서열번호 61 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; LCDR3의 아미노산 서열은 서열번호 64 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; HCDR1의 아미노산 서열은 서열번호 47 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; HCDR2의 아미노산 서열은 서열번호 48 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; HCDR3의 아미노산 서열은 서열번호 52 또는 이의 변이체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체는 YN-039 항체 또는 동일한 LCDR1-3 및 HCDR1-3을 갖는 항체를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체의 L-FR1의 아미노산 서열은 서열번호 71 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; L-FR2의 아미노산 서열은 서열번호 72 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; L-FR3의 아미노산 서열은 서열번호 75 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; L-FR4의 아미노산 서열은 서열번호 76 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; H-FR1의 아미노산 서열은 서열번호 67 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; H-FR2의 아미노산 서열은 서열번호 68 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; H-FR3의 아미노산 서열은 서열번호 69 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; H-FR4의 아미노산 서열은 서열번호 70 또는 이의 변이체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체는 YN-039 항체 또는 동일한 LCDR1-3, HCDR1-3, L-FR1-4 및 H-FR1-4를 갖는 항체를 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 본 발명의 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체의 경쇄는 경쇄 가변영역을 포함할 수 있고, 경쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 41 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; 중쇄는 중쇄 가변영역을 포함할 수 있고, 중쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 35 또는 이의 변이체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체는 YN-039 항체 또는 동일한 경쇄 가변영역 및 중쇄 가변영역을 갖는 항체를 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 본 발명의 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체는 경쇄 및 중쇄를 포함할 수 있고, 경쇄의 아미노산 서열은 서열번호 42에 표시되고 중쇄의 아미노산 서열은 서열번호 36에 표시된다. 예를 들어, 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체는 YN-039 항체를 포함하거나 동일한 경쇄 및 중쇄를 가질 수 있다.
일부 실시예에서, 본 발명의 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체는 PD-L1 단백질(예: 인간 PD-L1 단백질)에 결합하기 위해 레퍼런스 항체와 경쟁한다. 레퍼런스 항체는 LCDR1-3 및 HCDR1-3을 포함할 수 있고, LCDR1의 아미노산 서열은 서열번호 58 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; LCDR2의 아미노산 서열은 서열번호 61 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; LCDR3의 아미노산 서열은 서열번호 64 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; HCDR1의 아미노산 서열은 서열번호 47 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; HCDR2의 아미노산 서열은 서열번호 48 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; HCDR3의 아미노산 서열은 서열번호 52 또는 이의 변이체를 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 레퍼런스 항체는 YN-039 항체 또는 동일한 LCDR1-3 및 HCDR1-3을 갖는 항체를 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 레퍼런스 항체는 L-FR1-4 및 H-FR1-4를 포함하고, L-FR1의 아미노산 서열은 서열번호 71 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; L-FR2의 아미노산 서열은 서열번호 72 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; L-FR3의 아미노산 서열은 서열번호 75 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; L-FR4의 아미노산 서열은 서열번호 76 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; H-FR1의 아미노산 서열은 서열번호 67 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; H-FR2의 아미노산 서열은 서열번호 68 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; H-FR3의 아미노산 서열은 서열번호 69 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; H-FR4의 아미노산 서열은 서열번호 70 또는 이의 변이체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 YN-039 항체 또는 동일한 LCDR1-3, HCDR1-3, L-FR1-4 및 H-FR1-4를 갖는 항체를 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 레퍼런스 항체는 경쇄 가변영역 및 중쇄 가변영역을 포함할 수 있고, 경쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 41 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; 중쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 35 또는 이의 변이체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 레퍼런스 항체는 YN-039 항체 또는 동일한 경쇄 가변영역 및 중쇄 가변영역을 갖는 항체를 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 레퍼런스 항체는 경쇄 및 중쇄를 포함할 수 있고, 경쇄의 아미노산 서열은 서열번호 42에 표시될 수 있고 중쇄의 아미노산 서열은 서열번호 36에 표시될 수 있다. 예를 들어, 레퍼런스 항체는 YN-039 항체를 포함하거나 동일한 경쇄 및 중쇄를 가질 수 있다.
본 출원에서, 상기 PD-L1 단백질은 인간 PD-L1 단백질, 원숭이 PD-L1 단백질 및 뮤린(murine) PD-L1 단백질로 구성된 군에서 선택된다.
다른 관점에서, 본 발명은 5x10-9M 이하(예: 약 5 x 10-9 M이하, 약 4 x 10-9 M이하, 약 3 x 10-9 M이하, 약 2 x 10-9 M이하, 약 1 x 10-9 M 또는 약 1 x 10-10M 이하 또는 미만의 KD값)의 KD로 CD137 단백질에 결합하는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체를 제공한다.
본 발명의 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체는 종양을 완화 또는 치료할 수 있다. 예를 들어, 종양은 대장암(colon cancer)을 포함할 수 있다.
본 출원에서, 항체는 단일클론 항체, 단일 가닥 항체, 키메라 항체, 인간화 항체 및 완전 인간 항체로 구성된 군에서 선택될 수 있다.
본 출원에서, 항원-결합 단편은 Fab, Fab', F(ab)2 및 Fv 단편으로 구성된 군에서 선택될 수 있다.
본 출원에서, 변이체는 실질적으로 동일한 기능(예: CD137에 특이적으로 결합할 수 있음)을 갖고, 적어도 85% 이상(예: 적어도 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 그 이상)의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열일 수 있다. 일부 실시예에서, 아미노산 서열의 변이체는 실질적으로 동일한 기능(예: CD137에 특이적으로 결합할 수 있음)을 갖는 아미노산 서열이며, 기본적으로 하나 이상(예: 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7, 1-8, 1-9, 1-10 또는 이상)의 첨가, 결실 또는 치환을 추가로 포함한다.
일부 실시예에서, 상기 항체는 항체 경쇄 또는 이의 단편을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 경쇄 또는 이의 단편은 LCDR1을 포함할 수 있고, 상기 LCDR1은 다음의 아미노산 서열: 서열번호 80 또는 이의 변이체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 경쇄 또는 이의 단편은 다음의 아미노산 서열: 서열번호 81 또는 이의 변이체를 포함하는 LCDR2를 포함할 수 있다. 다른 예를 들어, 상기 경쇄 또는 이의 단편은 LCDR3 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고, 상기 LCDR3은 서열번호 82로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
일부 실시예에서, 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체와 관련하여, 상기 항체 경쇄 또는 이의 단편은 프레임워크 영역 L-FR1, L-FR2, L-FR3 및 L-FR4를 추가로 포함한다. 예를 들어, 상기 L-FR1의 C-말단은 상기 LCDR1의 N-말단에 직접 또는 간접적으로 연결되고, 상기 L-FR1은 서열번호 89로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 상기 L-FR2는 상기 LCDR1및 상기 LCDR2 사이에 위치하고, 상기 L-FR2는 서열번호 90으로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 상기 L-FR3은 상기 LCDR2및 상기 LCDR3 사이에 위치하고, 상기 L-FR3은 서열번호 91로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 상기 L-FR4의 N-말단은 상기 LCDR3의 C-말단에 직접 또는 간접적으로 연결되고, 상기 L-FR4는 서열번호 92로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
일부 실시예에서, 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체와 관련하여, 상기 항체 경쇄 또는 이의 단편은 경쇄 가변영역 VL을 포함하고, 상기 경쇄 가변영역 VL은 다음의 아미노산 서열: 서열번호 20 또는 이의 변이체를 포함할 수 있다.
본 출원에서, 상기 항체 경쇄 또는 이의 단편은 인간 불변영역을 추가로 포함할 수 있고, 상기 인간 불변영역은 인간 Igλ 불변영역을 포함한다.
본 출원에서, 상기 항체 경쇄 또는 이의 단편은 서열번호 23으로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
일부 실시예에서, 상기 항체는 항체 중쇄 또는 이의 단편을 포함할 수 있다. 상기 항체 중쇄 또는 이의 단편은 HCDR1을 포함하고, 상기 HCDR1은 다음의 아미노산 서열: 서열번호 77 또는 이의 변이체를 포함할 수 있다. 상기 항체 중쇄 또는 이의 단편은 HCDR2를 포함하고, 상기 HCDR2는 다음의 아미노산 서열: 서열번호 78 또는 이의 변이체를 포함할 수 있다. 상기 항체 중쇄 또는 이의 단편은 HCDR3을 포함하고, 상기 HCDR3은 다음의 아미노산 서열: 서열번호 79 또는 이의 변이체를 포함할 수 있다.
일부 실시예에서, 상기 항체 중쇄 또는 이의 단편은 프레임워크 영역 H-FR1, H-FR2, H-FR3, 및 H-FR4를 추가로 포함할 수 있다. 상기 H-FR1의 C-말단은 상기 HCDR1의 N-말단에 직접 또는 간접적으로 연결되고, 상기 H-FR1은 서열번호 84-85로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 상기 H-FR2는 상기 HCDR1및 상기 HCDR2 사이에 위치하고, 상기 H-FR2는 서열번호 86으로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 상기 H-FR3은 상기 HCDR2및 상기 HCDR3 사이에 위치하고, 상기 H-FR3은 서열번호 87로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 상기 H-FR4의 N-말단은 상기 HCDR3의 C-말단에 직접 또는 간접적으로 연결되고, 상기 H-FR4는 서열번호 88로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 항체 중쇄 또는 이의 단편은 중쇄 가변영역 VH를 포함하고, 상기 중쇄 가변영역 VH는 서열번호 18 또는 서열번호 25로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함할 수 있다.
본 발명의 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체에서, 상기 항체 중쇄 또는 이의 단편은 인간 불변영역을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 인간 불변영역은 인간 IgG 불변영역을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 인간 IgG 불변영역은 인간 IgG1 불변영역을 포함할 수 있다.
본 출원에서, 상기 항체 중쇄 또는 이의 단편은 서열번호 21 또는 서열번호 27로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함할 수 있다.
일부 실시예에서, 본 발명의 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체의 LCDR1의 아미노산 서열은 서열번호 80 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; LCDR2의 아미노산 서열은 서열번호 81 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; LCDR3의 아미노산 서열은 서열번호 82 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; HCDR1의 아미노산 서열은 서열번호 77 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; HCDR2의 아미노산 서열은 서열번호 78 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; HCDR3의 아미노산 서열은 서열번호 79 또는 이의 변이체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체는 YN-005 항체 또는 동일한 LCDR1-3 및 HCDR1-3을 갖는 항체를 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 본 발명의 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체의 경쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 20 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; 중쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 18 또는 이의 변이체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체는 YN-005 항체 또는 동일한 경쇄 가변영역 및 중쇄 가변영역을 갖는 항체를 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 본 발명의 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체는 경쇄 및 중쇄를 포함할 수 있고, 경쇄의 아미노산 서열은 서열번호 23에 표시될 수 있고 중쇄의 아미노산 서열은 서열번호 21에 표시될 수 있다. 예를 들어, 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체는 YN-005 항체를 포함하거나 동일한 경쇄 및 중쇄를 가질 수 있다.
일부 실시예에서, 본 발명의 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체는 CD137 단백질(예: 인간 CD137 단백질)에 결합하기 위해 레퍼런스 항체와 경쟁한다. 레퍼런스 항체는 LCDR1-3 및 HCDR1-3을 포함할 수 있고, LCDR1의 아미노산 서열은 서열번호 80 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; LCDR2의 아미노산 서열은 서열번호 81 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; LCDR3의 아미노산 서열은 서열번호 82 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; HCDR1의 아미노산 서열은 서열번호 77 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; HCDR2의 아미노산 서열은 서열번호 78 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; HCDR3의 아미노산 서열은 서열번호 79 또는 이의 변이체를 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 레퍼런스 항체는 YN-005 항체 또는 동일한 LCDR1-3 및 HCDR1-3을 갖는 항체를 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 레퍼런스 항체는 경쇄 가변영역 및 중쇄 가변영역을 포함할 수 있고, 경쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 20 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; 중쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 18 또는 이의 변이체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 레퍼런스 항체는 YN-005 항체 또는 동일한 경쇄 가변영역 및 중쇄 가변영역을 갖는 항체를 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 레퍼런스 항체는 경쇄 및 중쇄를 포함할 수 있고, 경쇄의 아미노산 서열은 서열번호 23에 표시될 수 있고 중쇄의 아미노산 서열은 서열번호 21에 표시될 수 있다. 예를 들어, 레퍼런스 항체는 YN-005 항체를 포함하거나 동일한 경쇄 및 중쇄를 가질 수 있다.
일부 실시예에서, 본 발명의 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체의 LCDR1의 아미노산 서열은 서열번호 80 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; LCDR2의 아미노산 서열은 서열번호 81 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; LCDR3의 아미노산 서열은 서열번호 82 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; HCDR1의 아미노산 서열은 서열번호 77 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; HCDR2의 아미노산 서열은 서열번호 78 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; HCDR3의 아미노산 서열은 서열번호 79 또는 이의 변이체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체는 YN-006 항체 또는 동일한 LCDR1-3 및 HCDR1-3을 갖는 항체를 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 본 발명의 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체의 경쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 20 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; 중쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 25 또는 이의 변이체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체는 YN-006 항체 또는 동일한 경쇄 가변영역 및 중쇄 가변영역을 갖는 항체를 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 본 발명의 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체는 경쇄 및 중쇄를 포함할 수 있고, 경쇄의 아미노산 서열은 서열번호 23에 표시될 수 있고 중쇄의 아미노산 서열은 서열번호 27에 표시될 수 있다. 예를 들어, 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체는 YN-006 항체를 포함하거나 동일한 경쇄 및 중쇄를 가질 수 있다.
일부 실시예에서, 본 발명의 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체는 CD137 단백질(예: 인간 CD137 단백질)에 결합하기 위해 레퍼런스 항체와 경쟁한다. 레퍼런스 항체는 LCDR1-3 및 HCDR1-3을 포함할 수 있고, LCDR1의 아미노산 서열은 서열번호 80 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; LCDR2의 아미노산 서열은 서열번호 81 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; LCDR3의 아미노산 서열은 서열번호 82 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; HCDR1의 아미노산 서열은 서열번호 77 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; HCDR2의 아미노산 서열은 서열번호 78 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; HCDR3의 아미노산 서열은 서열번호 79 또는 이의 변이체를 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 레퍼런스 항체는 YN-006 항체 또는 동일한 LCDR1-3 및 HCDR1-3을 갖는 항체를 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 레퍼런스 항체는 경쇄 가변영역 및 중쇄 가변영역을 포함할 수 있고, 경쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 20 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; 중쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 25 또는 이의 변이체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 레퍼런스 항체는 YN-006 항체 또는 동일한 경쇄 가변영역 및 중쇄 가변영역을 갖는 항체를 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 레퍼런스 항체는 경쇄 및 중쇄를 포함할 수 있고, 경쇄의 아미노산 서열은 서열번호 23에 표시될 수 있고 중쇄의 아미노산 서열은 서열번호 27에 표시될 수 있다. 예를 들어, 레퍼런스 항체는 YN-006 항체를 포함하거나 동일한 경쇄 및 중쇄를 가질 수 있다.
본 출원에서, CD137 단백질은 인간 CD137 단백질을 포함할 수 있다.
다른 관점에서, 본 발명은 2x10-9M 이하(예: 약 2 x 10-9 M 이하, 약 1 x 10-9 M 이하, 약 1 x 10-10M 이하 또는 약 8 x 10-11M 이하 또는 미만의 KD)의 KD로 PD-L1 단백질에 결합하고, 8x10-9M 이하(예: 약 8 x 10-9 M 이하, 약 7 x 10-9 M 이하, 약 6 x 10-9 M 이하, 약 5 x 10-9 M 이하, 약 4 x 10-9 M 이하, 약 3 x 10-9 M 이하, 약 2 x 10-9 M 이하, 약 1 x 10-9M 이하 또는 약 1 x 10-10M 이하 또는 미만의 KD)의 KD로 CD137 단백질에 결합하는 이중특이적 항체를 제공한다.
본 출원에서, 상기 PD-L1 단백질은 인간 PD-L1 단백질, 원숭이 PD-L1 단백질 및 뮤린(murine) PD-L1 단백질로 구성된 군에서 선택되고; 상기 CD137 단백질은 인간 CD137 단백질을 포함한다.
본 출원에서, 이중특이적 항체는 PD-L1 단백질에 특이적으로 결합하는 제1표적 모이어티(targeting moiety)를 포함하고, 상기 제1표적 모이어티는 PD-L1에 결합하는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체를 포함할 수 있다.
예를 들어, 제1표적 모이어티에서 항원 결합 단편은 Fab, Fab', F(ab)2 및 Fv 단편으로 구성된 군에서 선택될 수 있다. 다른 예를 들어, 제1표적 모이어티의 변이체는 항체 또는 이의 항원 결합 단편에서 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실 또는 첨가가 일어난 단백질 또는 폴리펩티드; 및 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 85 % 이상(예: 적어도 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 이상)의 서열 동일성을 갖는 단백질 또는 폴리펩티드로 구성된 군에서 선택될 수 있다. 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체는 PD-L1 단백질에 결합하는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체일 수 있다.
일부 실시예에서, 이중특이적 항체에서 PD-L1 단백질에 결합하는 항체는 경쇄 또는 이의 단편을 포함할 수 있다. 예를 들어, 경쇄 또는 이의 단편은 LCDR1-3을 포함하고, LCDR1의 아미노산 서열은 서열번호 54-58이고; LCDR2의 아미노산 서열은 서열번호 60-61이고; LCDR3의 아미노산 서열은 서열번호 63-64로 구성된 군에서 선택된다. 일부 실시예에서, 경쇄 또는 이의 단편은 경쇄 가변영역을 포함할 수 있고, 경쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 4, 서열번호 11, 서열번호 33, 서열번호 37, 서열번호 39 및 서열번호 41로 구성된 군에서 선택될 수 있다. 일부 실시예에서, 상기 항체의 경쇄 또는 이의 단편은 인간 불변영역을 포함할 수 있고, 상기 인간 불변영역은 인간 Igλ 불변영역을 포함한다.
일부 실시예에서, 상기 경쇄 또는 이의 단편은 서열번호 8, 서열번호 15, 서열번호 34, 서열번호 38, 서열번호 40 및 서열번호 42로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
일부 실시예에서, PD-L1 단백질에 결합하는 항체는 중쇄 또는 이의 단편을 포함할 수 있다. 예를 들어, 중쇄 또는 이의 단편은 HCDR1-3을 포함하고, HCDR1의 아미노산 서열은 서열번호 46-47로 구성된 군에서 선택되고; HCDR2의 아미노산 서열은 서열번호 48이고; HCDR3의 아미노산 서열은 서열번호 50-52이다.
일부 실시예에서, 중쇄 또는 이의 단편은 중쇄 가변영역을 포함할 수 있고, 중쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 2, 서열번호 9, 서열번호 31 및 서열번호 35로 구성된 군에서 선택될 수 있다.
일부 실시예에서, 상기 중쇄 또는 이의 단편은 인간 불변영역을 추가로 포함할 수 있고, 상기 인간 불변영역은 인간 IgG 불변영역을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 인간 IgG 불변영역은 인간 IgG1 불변영역이다.
일부 실시예에서, 상기 중쇄 또는 이의 단편은 서열번호 6, 서열번호 13, 서열번호 32 및 서열번호 36으로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
일부 실시예에서, 이중특이적 항체는 CD137 단백질에 특이적으로 결합하는 제2표적 모이어티(targeting moiety)를 포함하고, 상기 제2표적 모이어티는 CD137 단백질에 결합하는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체를 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 항원 결합 단편은 Fab, Fab', F(ab)2 및 Fv 단편으로 구성된 군에서 선택된다. 일부 실시예에서, 변이체는 항체 또는 이의 항원 결합 단편에서 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실 또는 첨가가 일어난 단백질 또는 폴리펩티드; 및 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 85 % 이상(예: 적어도 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 이상)의 서열 동일성을 갖는 단백질 또는 폴리펩티드로 구성된 군에서 선택된다.
일부 실시예에서, CD137 단백질에 결합하는 항체는 경쇄 또는 이의 단편을 포함할 수 있다. 예를 들어, 경쇄 또는 이의 단편은 LCDR1-3을 포함하고, LCDR1-3의 아미노산 서열은 순차적으로 서열번호 80, 서열번호 81 및 서열번호 82일 수 있다. 일부 실시예에서, 경쇄 또는 이의 단편은 경쇄 가변영역을 포함할 수 있고, 경쇄 가변영역은 서열번호 20으로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시예에서, CD137 단백질에 결합하는 항체는 중쇄 또는 이의 단편을 포함할 수 있다. 예를 들어, 중쇄 또는 이의 단편은 HCDR1-3을 포함할 수 있고, HCDR1-3의 아미노산 서열은 순차적으로 서열번호 77, 서열번호 78 및 서열번호 79일 수 있다. 일부 실시예에서, 중쇄 또는 이의 단편은 중쇄 가변영역을 포함할 수 있고, 중쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 18 및 서열번호 25로 구성된 군에서 선택될 수 있다.
일부 실시예에서, CD137 단백질에 결합하는 항체는 scFv를 포함할 수 있고, 상기 scFv는 서열번호 83으로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 출원에서, 이중특이적 항체는 제1폴리펩티드 사슬 및 제2폴리펩티드 사슬을 포함할 수 있고, 상기 제1폴리펩티드 사슬은 PD-L1 단백질에 결합하는 항체의 상기 중쇄 가변영역, CD137 단백질에 결합하는 항체의 상기 중쇄 가변영역, 및 CD137 단백질에 결합하는 항체의 상기 경쇄 가변영역을 포함할 수 있으며; 상기 제2폴리펩티드 사슬은 PD-L1 단백질에 결합하는 항체의 상기 경쇄 가변영역을 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 제1폴리펩티드 사슬에서, PD-L1 단백질에 결합하는 항체의 상기 중쇄 가변영역은 CD137 단백질에 결합하는 항체의 상기 중쇄 가변영역의 N-말단에 위치할 수 있고, CD137 단백질에 결합하는 항체의 상기 중쇄 가변영역은 CD137 단백질에 결합하는 항체의 상기 경쇄 가변영역의 N-말단에 위치할 수 있다. 다른 예를 들어, 상기 제1폴리펩티드 사슬에서, PD-L1 단백질에 결합하는 항체의 상기 중쇄 가변영역은 CD137 단백질에 결합하는 항체의 상기 경쇄 가변영역의 N-말단에 위치할 수 있고, CD137 단백질에 결합하는 항체의 상기 경쇄 가변영역은 CD137 단백질에 결합하는 항체의 상기 중쇄 가변영역의 N-말단에 위치할 수 있다.
예를 들어, 제1폴리펩티드 사슬에서, CD137 단백질에 결합하는 항체의 상기 경쇄 가변영역 및 CD137 단백질에 결합하는 항체의 상기 중쇄 가변영역은 scFv를 구성한다. 예를 들어, 상기 scFv는 서열번호 83으로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
제1폴리펩티드 사슬은 인간 IgG 불변영역을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 인간 IgG 불변영역은 인간 IgG1 불변영역일 수 있다.
일부 실시예에서, 인간 IgG 불변영역은 PD-L1 단백질에 결합하는 항체의 상기 중쇄 가변영역의 C-말단에 위치하고 CD137 단백질에 결합하는 항체의 상기 경쇄 가변영역의 N-말단에 위치하며; 대안적으로, 상기 인간 IgG 불변영역은 PD-L1 단백질에 결합하는 항체의 상기 중쇄 가변영역의 C-말단에 위치하고 CD137 단백질에 결합하는 항체의 상기 중쇄 가변영역의 N-말단에 위치한다.
일부 실시예에서, 상기 제1폴리펩티드 사슬은 서열번호 30, 서열번호 43 및 서열번호 44로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
일부 실시예에서, 상기 제2폴리펩티드 사슬은 인간 Igλ 불변영역을 추가로 포함할 수 있다.
본 출원에서, 상기 제2폴리펩티드 사슬은 다음의 아미노산 서열: 서열번호 15 및 서열번호 34을 포함할 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 이중특이적 항체의 제1표적 모이어티에서, LCDR1의 아미노산 서열은 서열번호 54, 서열번호 55, 서열번호 56, 서열번호 57 및 서열번호 58 또는 이의 변이체로 구성된 군에서 선택될 수 있고; LCDR2의 아미노산 서열은 서열번호 60 및 서열번호 61 또는 이의 변이체로 구성된 군에서 선택될 수 있고; LCDR3의 아미노산 서열은 서열번호 63 및 서열번호 64 또는 이의 변이체로 구성된 군에서 선택될 수 있고; HCDR1의 아미노산 서열은 서열번호 46 및 서열번호 47 또는 이의 변이체로 구성된 군에서 선택될 수 있고; HCDR2의 아미노산 서열은 서열번호 48 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; HCDR3의 아미노산 서열은 서열번호 50-52 또는 이의 변이체로 구성된 군에서 선택될 수 있다. 일부 실시예에서, 본 발명의 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체의 경쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 4, 서열번호 11, 서열번호 33, 서열번호 37, 서열번호 39 및 서열번호 41 또는 이의 변이체로 구성된 군에서 선택될 수 있고; 중쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 2, 서열번호 9, 서열번호 31 및 서열번호 35 또는 이의 변이체로 구성된 군에서 선택될 수 있다. 일부 실시예에서, 본 발명의 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체는 경쇄 및 중쇄를 포함할 수 있고, 경쇄의 아미노산 서열은 서열번호 8, 서열번호 15, 서열번호 34, 서열번호 38, 서열번호 40 및 서열번호 42로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열일 수 있고, 중쇄의 아미노산 서열은 서열번호 6, 서열번호 13, 서열번호 32 및 서열번호 36로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열일 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 이중특이적 항체의 제2표적 모이어티에서, LCDR1의 아미노산 서열은 서열번호 80 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; LCDR2의 아미노산 서열은 서열번호 81 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; LCDR3의 아미노산 서열은 서열번호 82 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; HCDR1의 아미노산 서열은 서열번호 77 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; HCDR2의 아미노산 서열은 서열번호 78 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; HCDR3의 아미노산 서열은 서열번호 79 또는 이의 변이체를 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 본 발명의 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체의 경쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 20 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고; 중쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 18 및 서열번호 25 또는 이의 변이체로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열일 수 있다. 일부 실시예에서, 본 발명의 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체는 경쇄 및 중쇄를 포함할 수 있고, 경쇄의 아미노산 서열은 서열번호 23에 표시될 수 있고 중쇄의 아미노산 서열은 서열번호 21 또는 서열번호 27에 표시될 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 이중특이적 항체에서, 제1폴리펩티드는 서열번호 30으로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 제2폴리펩티드는 서열번호 15로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 이중특이적 항체는 YN-007 항체 또는 동일한 제1폴리펩티드 및 제2폴리펩티드를 갖는 항체를 포함할 수 있다. 여기서, 제1폴리펩티드는 서열번호 25로 표시되는 아미노산 서열, 서열번호 20으로 표시되는 아미노산 서열 및 서열번호 13으로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 제2폴리펩티드는 서열번호 15로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 이중특이적 항체에서, 제1폴리펩티드는 서열번호 43으로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 제2폴리펩티드는 서열번호 34로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 이중특이적 항체는 YN-051 항체 또는 동일한 제1폴리펩티드 및 제2폴리펩티드를 갖는 항체를 포함할 수 있다. 여기서, 제1폴리펩티드는 서열번호 25로 표시되는 아미노산 서열, 서열번호 20으로 표시되는 아미노산 서열 및 서열번호 32로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 제2폴리펩티드는 서열번호 34로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 이중특이적 항체에서, 제1폴리펩티드는 서열번호 44로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 제2폴리펩티드는 서열번호 34로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 이중특이적 항체는 YN-052 항체 또는 동일한 제1폴리펩티드 및 제2폴리펩티드를 갖는 항체를 포함할 수 있다. 여기서, 제1폴리펩티드는 서열번호 25로 표시되는 아미노산 서열, 서열번호 20으로 표시되는 아미노산 서열 및 서열번호 36으로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 제2폴리펩티드는 서열번호 34로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 이중특이적 항체에서, 제1폴리펩티드는 서열번호 30으로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 제2폴리펩티드는 서열번호 15로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 이중특이적 항체는 YN-007 항체 또는 동일한 제1폴리펩티드 및 제2폴리펩티드를 갖는 항체를 포함할 수 있다. 여기서, 제1폴리펩티드는 서열번호 27로 표시되는 아미노산 서열, 서열번호 23으로 표시되는 아미노산 서열 및 서열번호 13으로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 제2폴리펩티드는 서열번호 15로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
다른 예를 들어, 본 발명의 이중특이적 항체에서, 제1폴리펩티드는 서열번호 43으로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 제2폴리펩티드는 서열번호 34로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 이중특이적 항체는 YN-051 항체 또는 동일한 제1폴리펩티드 및 제2폴리펩티드를 갖는 항체를 포함할 수 있다. 여기서, 제1폴리펩티드는 서열번호 32로 표시되는 아미노산 서열, 서열번호 27로 표시되는 아미노산 서열 및 서열번호 23으로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 제2폴리펩티드는 서열번호 34로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
다른 예를 들어, 본 발명의 이중특이적 항체에서, 제1폴리펩티드는 서열번호 44로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 제2폴리펩티드는 서열번호 34로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 이중특이적 항체는 YN-052 항체 또는 동일한 제1폴리펩티드 및 제2폴리펩티드를 갖는 항체를 포함할 수 있다. 여기서, 제1폴리펩티드는 서열번호 36으로 표시되는 아미노산 서열, 서열번호 27로 표시되는 아미노산 서열 및 서열번호 23으로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 제2폴리펩티드는 서열번호 34로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
핵산, 벡터, 숙주세포 및 제조방법
또 다른 관점에서, 본 발명은 본 발명의 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체, 또는 이중특이적 항체를 코딩할 수 있는 하나 이상의 단리된 핵산분자를 추가로 제공한다. 예를 들어, 하나 이상의 핵산분자의 각각의 핵산분자는 전체 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 코딩하거나, 또는 그 안의 일부(예: 하나 이상의 HCDR1-3, LCDR1-3, VL, VH, 경쇄 또는 중쇄)를 코딩할 수 있다.
본 출원의 핵산분자는 단리될 수 있다. 예를 들어, 이는 하기 방법에 의해 제조 또는 합성될 수 있다: (i) 시험관 내 증폭, 예컨대 중합효소연쇄반응(PCR)을 통한 증폭, (ii) 클론 재조합, (iii) 정제, 예컨대 제한 효소 분해 및 겔 전기영동에 의한 분획화, 또는 (iv) 합성, 예컨대 화학적 합성에 의한 합성. 일부 실시예에서, 단리된 핵산은 재조합 DNA 기술에 의해 제조된 핵산분자다.
본 출원에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 인코딩하는 핵산은 제한 단편 조작 또는 합성 올리고뉴클레오티드를 사용하는 중첩 연장 PCR(overlap extension PCR)을 포함하나 이에 제한되지 않는, 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 제조될 수 있다. 특정 조작(specific operations)의 경우, Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989; 및 Ausube, et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York N.Y., 1993을 참조.
또 다른 관점에서, 본 발명은 하나 이상의 벡터를 제공하고, 본 발명의 하나 이상의 핵산분자를 포함한다. 각각의 벡터는 하나 이상의 핵산분자를 포함할 수 있다. 또한, 벡터는 적절한 숙주세포에서 그리고 적절한 조건 하에서 이 벡터를 선택할 수 있게 하는 마커 유전자와 같은 다른 유전자를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 벡터는 코딩 영역이 적절한 숙주세포에서 정확하게 발현되도록 하는 발현 제어 요소를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 제어 요소는 당업자에게 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 이들은 프로모터, 리보솜 결합 부위, 인핸서 및 유전자 전사 또는 mRNA 번역을 조절하기 위한 다른 제어 요소 등을 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 발현 제어 서열은 조절 요소다. 발현 제어 서열의 특정 구조는 종 또는 세포 유형의 기능에 따라 달라질 수 있지만, 일반적으로 TATA 박스, 캡핑된 서열, CAAT 서열 등과 같이 전사 및 번역 개시와 관련된 5'-비전사된 서열 및 5' 및 3'-비번역된 서열을 포함한다. 예를 들어, 5'-비전사된 발현 제어 서열은 기능적으로 연결된 핵산의 전사 조절을 위한 프로모터 서열을 포함할 수 있는 프로모터 영역을 포함할 수 있다. 본 출원에 기재된 하나 이상의 핵산분자는 발현 제어 요소에 작동가능하게 연결될 수 있다.
벡터는, 예를 들어 플라스미드, 코스미드, 바이러스, 파지, 또는 유전공학에서 일반적으로 사용되는 다른 벡터를 포함할 수 있으며, 예를 들면, 벡터는 발현 벡터이다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 본 발명의 핵산분자 및/또는 본 발명에 기재된 벡터를 포함할 수 있는 세포를 제공한다. 세포는 숙주세포일 수 있다. 일부 실시예에서, 각각의 숙주세포는 본 출원에 기재된 하나의 핵산분자 또는 벡터를 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 각각의 숙주세포는 본 출원에 기재된 다수의 (예를 들어, 2개 이상의) 핵산분자 또는 벡터를 포함할 수도 있다. 예를 들어, 본 출원의 벡터는 숙주세포, 예를 들어 진핵 세포, 예컨대 식물 유래 세포, 진균 또는 효모 세포 등에 도입될 수 있다. 본 출원의 벡터는 전기천공법, 리포펙틴 형질감염법 및 리포펙타민 형질감염법 등과 같은 당업계에 공지된 방법에 의해 숙주세포 내로 도입될 수 있다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 핵산분자 또는 벡터를 포함하는 하나 이상의 숙주세포를 제공한다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체, 또는 이중특이적 항체를 제조하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체, 또는 이중특이적 항체가 발현되도록 하는 조건 하에 본 출원의 숙주세포를 배양하는 단계, 및 임의로 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체를 수확하는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 적절한 배지, 적절한 온도, 배양 시간 등을 사용하는 것이 가능하고, 이들 방법은 당업자에 의해 이해된다.
약학 조성물, 용도
또 다른 관점에서, 본 발명은 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체, 또는 이중특이적 항체, 핵산분자, 벡터 및/또는 숙주세포, 및 임의의 약학적으로 허용 가능한 보조제를 포함할 수 있는 약학 조성물을 제공한다.
약학적으로 허용 가능한 보조제는 완충제, 항산화제, 보존제, 저분자량 폴리펩티드, 단백질, 친수성 중합체, 아미노산, 당, 킬레이트제, 반대이온, 금속 복합체 및/또는 비이온성 계면활성제 등을 포함할 수 있다.
본 출원에서, 약학 조성물은 경구 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 종양 부위에서의 인 시츄(in situ) 투여, 흡입, 직장 투여, 질 투여, 경피 투여 또는 피하 데포(subcutaneous depot)를 통한 투여를 위해 제형화될 수 있다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 종양을 완화 또는 치료하기 위한 의약의 제조에서 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체, 또는 이중특이적 항체, 핵산분자, 벡터, 숙주세포 및/또는 약학 조성물의 용도를 제공한다. 이들 중에서, 종양은 결장암을 포함한다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 PD-L1 단백질에 결합하는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체, CD137 단백질에 결합하는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체, 또는 이중특이적 항체, 핵산분자, 벡터, 숙주세포 및/또는 약학 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, T세포의 기능을 향상시키는 방법을 제공한다. 이들 중에서, T세포는 종양 관련 기능장애 T세포이다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체, 또는 이중특이적 항체, 핵산분자, 벡터, 숙주세포 및/또는 약학 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 PD-1 단백질에 대한 PD-L1 단백질의 결합을 억제하는 방법을 제공한다.
본 발명에서, 항체 CDR의 위치는 항체 Kabat 정의 방법에 따라 결정될 수 있다.
본 출원은 하기 구현예를 추가로 포함한다:
1. 3x10-9M 이하의 KD로 PD-L1 단백질에 결합하는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체.
2. 구현예 1에서, 8 x 10-11M 이하의 KD로 PD-L1 단백질에 결합하는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체.
3. 구현예 1-2에서, PD-1에 대한 PD-L1의 결합을 억제하는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체.
4. 구현예 1-3에서, 종양 관련 질환을 완화 또는 치료할 수 있는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체.
5. 구현예 4에서, 상기 종양은 대장암을 포함하는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체.
6. 구현예 1-5에서, 상기 항체는 단일클론 항체, 단일 가닥 항체, 키메라 항체, 인간화 항체 및 완전 인간 항체로 구성된 군에서 선택되는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체.
7. 구현예 1-6에서, 상기 항원-결합 단편은 Fab, Fab', F(ab)2 및 Fv 단편으로 구성된 군에서 선택되는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체.
8. 구현예 1-7에서, 상기 변이체는
1) 항체 또는 이의 항원 결합 단편에서 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실 또는 첨가에 의해 수득된 단백질 또는 폴리펩티드; 및
2) 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 단백질 또는 폴리펩티드로 구성된 군에서 선택되는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체.
9. 구현예 1-8에서, PD-L1 단백질에 결합하기 위해 레퍼런스 항체와 경쟁하고, 여기서 레퍼런스 항체는 경쇄 가변영역 및 중쇄 가변영역을 포함하고, 레퍼런스 항체의 경쇄 가변영역은 LCDR1-3을 포함하고, LCDR1은 서열번호 54-58로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하고; LCDR2는 서열번호 60-61로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하고; LCDR3은 서열번호 63-64로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하고; 레퍼런스 항체의 중쇄 가변영역은 HCDR1-3을 포함하고, HCDR1은 서열번호 46-47로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하고; HCDR2는 서열번호 48로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하고; HCDR3은 서열번호 50-52로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체.
10. 구현예 9에서, 상기 레퍼런스 항체의 경쇄 가변영역은 서열번호 4, 서열번호 11, 서열번호 33, 서열번호 37, 서열번호 39 및 서열번호 41로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 레퍼런스 항체의 중쇄 가변영역은 서열번호 2, 서열번호 9, 서열번호 31 및 서열번호 35로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체.
11. 구현예 9-10에서, 상기 레퍼런스 항체의 경쇄는 서열번호 8, 서열번호 15, 서열번호 34, 서열번호 38, 서열번호 40 및 서열번호 42로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하고; 레퍼런스 항체의 중쇄는 서열번호 6, 서열번호 13, 서열번호 32 및 서열번호 36으로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체.
12. 구현예 1-11에서, 상기 항체는 LCDR1을 포함하는 항체 경쇄 또는 이의 단편을 포함하고, 상기 LCDR1은 서열번호 53로 표시되는 아미노산 서열(TGTX1SX2VGGYX3X4VS)을 포함하며; 여기서 X1은 S, R 또는 V이고; X2는 D, E 또는 S이며; X3은 N 또는 R이고; X4는 Y 또는 E이며, 상기 LCDR1은 항체 카밧 수(Kabat number)의 지수에 따라 결정된 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체.
13. 구현예 12에서, 상기 LCDR1은 서열번호 54-58로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체.
14. 구현예 11-13에서, 상기 항체 경쇄 또는 이의 단편은 LCDR2를 포함하고, 상기 LCDR2는 서열번호 59로 표시되는 아미노산 서열(X1NSX2RPS)을 포함하며, 여기서 X1은 G 또는 E이고; X2는 N 또는 I이며, 상기 LCDR2는 항체 카밧 수(Kabat number)의 지수에 따라 결정된 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체.
15. 구현예 14에서, 상기 LCDR2는 서열번호 60-61로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체.
16. 구현예 11-15에서, 상기 항체 경쇄 또는 이의 단편은 LCDR3을 포함하고, 상기 LCDR3은 서열번호 62로 표시되는 아미노산 서열(QSYDSSLSGX1V)을 포함하며, 여기서 X1은 S 또는 T이고, 상기 LCDR3은 항체 카밧 수(Kabat number)의 지수에 따라 결정된 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체.
17. 구현예 11-16에서, 상기 항체 경쇄 또는 이의 단편은 프레임워크 영역 L-FR1, L-FR2, L-FR3 및 L-FR4를 추가로 포함하는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체.
18. 구현예 17에서, 상기 프레임워크 영역은 인간 컨센서스(consensus) 프레임워크 서열 및 인간 생식세포계열(germline) 서열로 구성된 군에서 선택되는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체.
19. 구현예 17-18에서, 상기 L-FR1의 C-말단은 상기 LCDR1의 N-말단에 직접 또는 간접적으로 연결되고, 상기 L-FR1은 서열번호 71로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체.
20. 구현예 17-19에서, 상기 L-FR2는 상기 LCDR1및 상기 LCDR2 사이에 위치하고, 상기 L-FR2는 서열번호 72로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체.
21. 구현예 17-20에서, 상기 L-FR3은 상기 LCDR2및 상기 LCDR3 사이에 위치하고, 상기 L-FR3은 서열번호 73-75로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체.
22. 구현예 17-21에서, 상기 L-FR4의 N-말단은 상기 LCDR3의 C-말단에 직접 또는 간접적으로 연결되고, 상기 L-FR4는 서열번호 76으로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체.
23. 구현예 12-22에서, 상기 항체 경쇄 또는 이의 단편은 경쇄 가변영역 VL을 포함하고, 상기 경쇄 가변영역 VL은 서열번호 4, 서열번호 11, 서열번호 33, 서열번호 37, 서열번호 39 및 서열번호 41로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체.
24. 구현예 12-23에서, 상기 항체 경쇄 또는 이의 단편은 인간 불변영역을 추가로 포함하고, 상기 인간 불변영역은 인간 Igλ 불변영역을 포함하는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체.
25. 구현예 12-24에서, 상기 항체 경쇄 또는 이의 단편은 서열번호 8, 서열번호 15, 서열번호 34, 서열번호 38, 서열번호 40 및 서열번호 42로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체.
26. 구현예 1-25에서, 상기 항체는 HCDR1을 포함하는 항체 중쇄 또는 이의 단편을 포함하고, 상기 HCDR1은 서열번호 45로 표시되는 아미노산 서열(X1YAIS)을 포함하며, 여기서 X1은 S 또는 T이고, 상기 HCDR1은 항체 카밧 수(Kabat number)의 지수에 따라 결정된 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체.
27. 구현예 26에서, 상기 항체 중쇄 또는 이의 단편은 HCDR2를 포함하고, 상기 HCDR2는 서열번호 48로 표시되는 아미노산 서열을 포함하며, 상기 HCDR2는 항체 카밧 수(Kabat number)의 지수에 따라 결정된 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체.
28. 구현예 26-27에서, 상기 항체 중쇄 또는 이의 단편은 HCDR3을 포함하고, 상기 HCDR3은 서열번호 49로 표시되는 아미노산 서열(TMX1X2YX3X4GNX5DY)을 포함하며; 여기서 X1은 D, E 또는 G고, X2는 G 또는 E이며, X3은 S 또는 G고, X4는 Y 또는 F이며, X5는 F 또는 Y이고, 상기 HCDR3은 항체 카밧 수(Kabat number)의 지수에 따라 결정된 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체.
29. 구현예 28에서, 상기 HCDR3은 서열번호 50-52로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체.
30. 구현예 26-29에서, 상기 항체 중쇄 또는 이의 단편은 프레임워크 영역 H-FR1, H-FR2, H-FR3, 및 H-FR4를 추가로 포함하는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체.
31. 구현예 30에서, 상기 프레임워크 영역은 인간 컨센서스(consensus) 프레임워크 서열 및 인간 생식세포계열(germline) 서열로 구성된 군에서 선택되는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체.
32. 구현예 30-31에서, 상기 H-FR1의 C-말단은 상기 HCDR1의 N-말단에 직접 또는 간접적으로 연결되고, 상기 H-FR1은 서열번호 65-67로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체.
33. 구현예 30-32에서, 상기 H-FR2는 상기 HCDR1및 상기 HCDR2 사이에 위치하고, 상기 H-FR2는 서열번호 68로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체.
34. 구현예 30-33에서, 상기 H-FR3은 상기 HCDR2및 상기 HCDR3 사이에 위치하고, 상기 H-FR3은 서열번호 69로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체.
35. 구현예 30-34에서, 상기 H-FR4의 N-말단은 상기 HCDR3의 C-말단에 직접 또는 간접적으로 연결되고, 상기 H-FR4는 서열번호 70으로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체.
36. 구현예 26-35에서, 상기 항체 중쇄 또는 이의 단편은 중쇄 가변영역 VH를 포함하고, 상기 중쇄 가변영역 VH는 서열번호 2, 서열번호 9, 서열번호 31 및 서열번호 35로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체.
37. 구현예 26-36에서, 상기 항체 중쇄 또는 이의 단편은 인간 불변영역을 추가로 포함하고, 상기 인간 불변영역은 인간 IgG1 불변영역을 포함하는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체.
38. 구현예 26-37에서, 상기 항체 중쇄 또는 이의 단편은 서열번호 6, 서열번호 13, 서열번호 32 및 서열번호 36으로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체.
39. 구현예 1-38에서, 상기 PD-L1 단백질은 인간 PD-L1 단백질, 원숭이PD-L1 단백질 및 뮤린(murine) PD-L1 단백질로 구성된 군에서 선택되는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체.
40. 5x10-9M 이하의 KD로 CD137 단백질에 결합하는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체.
41. 구현예 40에서, 3x10-9M 이하의 KD로 CD137 단백질에 결합하는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체.
42. 구현예 40-41에서, CD137 작용 활성(agonistic activity)을 갖는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체.
43. 구현예 40-42에서, 종양을 완화 또는 치료할 수 있는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체.
44. 구현예 43에서, 상기 종양은 대장암(colon cancer)을 포함하는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체.
45. 구현예 40-44에서, 상기 항체는 단일클론 항체, 단일 가닥 항체, 키메라 항체, 인간화 항체 및 완전 인간 항체로 구성된 군에서 선택되는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체.
46. 구현예 40-45에서, 상기 항원-결합 단편은 Fab, Fab', F(ab)2 및 Fv 단편으로 구성된 군에서 선택되는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체.
47. 구현예 40-46에서, 상기 변이체는
1) 항체 또는 이의 항원 결합 단편에서 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실 또는 첨가에 의해 수득된 단백질 또는 폴리펩티드; 및
2) 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 단백질 또는 폴리펩티드로 구성된 군에서 선택되는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체.
48. 구현예 40-47에서, CD137 단백질에 결합하기 위해 레퍼런스 항체와 경쟁하고, 여기서 레퍼런스 항체는 경쇄 가변영역 및 중쇄 가변영역을 포함하고, 레퍼런스 항체의 경쇄 가변영역은 LCDR1-3을 포함하고, LCDR1-3의 아미노산 서열은 순차적으로 서열번호 80-82에 표시되고, 레퍼런스 항체의 중쇄 가변영역은 HCDR1-3을 포함하고, HCDR1-3의 아미노산 서열은 순차적으로 서열번호 77-79에 표시되는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체.
49. 구현예 48에서, 상기 레퍼런스 항체의 경쇄 가변영역은 서열번호 20으로 표시된 것에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 레퍼런스 항체의 중쇄 가변영역은 서열번호 18 및 서열번호 25로 표시된 것에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체.
50. 구현예 48-49에서, 상기 레퍼런스 항체의 경쇄는 서열번호 23으로 표시된 것에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 레퍼런스 항체의 중쇄는 서열번호 21 및 서열번호 27로 표시된 것에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체.
51. 구현예 40-50에서, 상기 항체는 항체 경쇄 또는 이의 단편을 포함하는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체.
52. 구현예 51에서, 상기 경쇄 또는 이의 단편은 LCDR1을 포함하고, 상기 LCDR1은 서열번호 80으로 표시된 것에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체.
53. 구현예 51-52에서, 상기 경쇄 또는 이의 단편은 LCDR2를 포함하고, 상기 LCDR2는 서열번호 81로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체.
54. 구현예 51-53에서, 상기 경쇄 또는 이의 단편은 LCDR3을 포함하고, 상기 LCDR3은 서열번호 82로 표시된 것에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체.
55. 구현예 51-54에서, 상기 항체 경쇄 또는 이의 단편은 프레임워크 영역 L-FR1, L-FR2, L-FR3 및 L-FR4를 추가로 포함하는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체.
56. 구현예 55에서, 상기 프레임워크 영역은 인간 컨센서스(consensus) 프레임워크 서열 및 인간 생식세포계열(germline) 서열로 구성된 군에서 선택되는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체.
57. 구현예 55-56에서, 상기 L-FR1의 C-말단은 상기 LCDR1의 N-말단에 직접 또는 간접적으로 연결되고, 상기 L-FR1은 서열번호 89로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체.
58. 구현예 55-57에서, 상기 L-FR2는 상기 LCDR1및 상기 LCDR2 사이에 위치하고, 상기 L-FR2는 서열번호 90으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체.
59. 구현예 55-58에서, 상기 L-FR3은 상기 LCDR2및 상기 LCDR3 사이에 위치하고, 상기 L-FR3은 서열번호 91로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체.
60. 구현예 55-59에서, 상기 L-FR4의 N-말단은 상기 LCDR3의 C-말단에 직접 또는 간접적으로 연결되고, 상기 L-FR4는 서열번호 92로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체.
61. 구현예 51-60에서, 상기 항체 경쇄 또는 이의 단편은 경쇄 가변영역 VL을 포함하고, 상기 경쇄 가변영역 VL은 서열번호 20으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체.
62. 구현예 51-61에서, 상기 항체 경쇄 또는 이의 단편은 인간 불변영역을 추가로 포함하고, 상기 인간 불변영역은 인간 Igλ 불변영역을 포함하는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체.
63. 구현예 51-62에서, 상기 항체 경쇄 또는 이의 단편은 서열번호 23으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체.
64. 구현예 40-63에서, 상기 항체는 항체 중쇄 또는 이의 단편을 포함하는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체.
65. 구현예 64에서, 상기 항체 중쇄 또는 이의 단편은 HCDR1을 포함하고, 상기 HCDR1은 서열번호 77로 표시된 것에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체.
66. 구현예 64-65에서, 상기 항체 중쇄 또는 이의 단편은 HCDR2를 포함하고, 상기 HCDR2는 서열번호 78로 표시된 것에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체.
67. 구현예 64-66에서, 상기 항체 중쇄 또는 이의 단편은 HCDR3을 포함하고, 상기 HCDR3은 서열번호 79로 표시된 것에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체.
68. 구현예 64-67에서, 상기 항체 중쇄 또는 이의 단편은 프레임워크 영역 H-FR1, H-FR2, H-FR3, 및 H-FR4를 추가로 포함하는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체.
69. 구현예 68에서, 상기 프레임워크 영역은 인간 컨센서스(consensus) 프레임워크 서열 및 인간 생식세포계열(germline) 서열로 구성된 군에서 선택되는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체.
70. 구현예 68-69에서, 상기 H-FR1의 C-말단은 상기 HCDR1의 N-말단에 직접 또는 간접적으로 연결되고, 상기 H-FR1은 서열번호 84-85로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체.
71. 구현예 68-70에서, 상기 H-FR2는 상기 HCDR1및 상기 HCDR2 사이에 위치하고, 상기 H-FR2는 서열번호 86으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체.
72. 구현예 68-71에서, 상기 H-FR3은 상기 HCDR2및 상기 HCDR3 사이에 위치하고, 상기 H-FR3은 서열번호 87로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체.
73. 구현예 68-72에서, 상기 H-FR4의 N-말단은 상기 HCDR3의 C-말단에 직접 또는 간접적으로 연결되고, 상기 H-FR4는 서열번호 88로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체.
74. 구현예 68-73에서, 상기 항체 중쇄 또는 이의 단편은 중쇄 가변영역 VH를 포함하고, 상기 중쇄 가변영역 VH는 서열번호 18 또는 서열번호 25로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체.
75. 구현예 64-74에서, 상기 항체 중쇄 또는 이의 단편은 인간 불변영역을 추가로 포함하고, 상기 인간 불변영역은 인간 IgG 불변영역을 포함하는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체.
76. 구현예 75에서, 상기 IgG 불변영역은 인간 IgG1 불변영역을 포함하는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체.
77. 구현예 64-76에서, 상기 항체 중쇄 또는 이의 단편은 서열번호 21 또는 서열번호 27로 표시된 것에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체.
78. 구현예 40-77에서, 상기 CD137 단백질은 인간 CD137 단백질을 포함하는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체.
79. 2x10-9M 이하의 KD로 PD-L1 단백질에 결합하고, 8x10-9M 이하의 KD로 CD137 단백질에 결합하는 이중특이적 항체.
80. PD-L1 단백질에 특이적으로 결합하는 제1표적 모이어티(targeting moiety)를 포함하고, 상기 제1표적 모이어티는 구현예 1-39 중 어느 하나에 따른 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체를 포함하는 이중특이적 항체.
81. 구현예 30-31에서, CD137 단백질에 특이적으로 결합하는 제2표적 모이어티(targeting moiety)를 포함하고, 상기 제2표적 모이어티는 구현예 40-78 중 어느 하나에 따른 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체를 포함하는 이중특이적 항체.
82. 구현예 79-81에서, 제1폴리펩티드 사슬 및 제2폴리펩티드 사슬을 포함하고, 상기 제1폴리펩티드 사슬은 PD-L1 단백질에 결합하는 항체의 상기 중쇄 가변영역, CD137 단백질에 결합하는 항체의 상기 중쇄 가변영역, 및 CD137 단백질에 결합하는 항체의 상기 경쇄 가변영역을 포함하며; 상기 제2폴리펩티드 사슬은 PD-L1 단백질에 결합하는 항체의 상기 경쇄 가변영역을 포함하는 이중특이적 항체.
83. 구현예 82에서, 상기 제1폴리펩티드 사슬에서, PD-L1 단백질에 결합하는 항체의 상기 중쇄 가변영역은 CD137 단백질에 결합하는 항체의 상기 중쇄 가변영역의 N-말단에 위치하고, CD137 단백질에 결합하는 항체의 상기 중쇄 가변영역은 CD137 단백질에 결합하는 항체의 상기 경쇄 가변영역의 N-말단에 위치하며; 대안적으로,
PD-L1 단백질에 결합하는 항체의 상기 중쇄 가변영역은 CD137 단백질에 결합하는 항체의 상기 경쇄 가변영역의 N-말단에 위치하고, CD137 단백질에 결합하는 항체의 상기 경쇄 가변영역은 CD137 단백질에 결합하는 항체의 상기 중쇄 가변영역의 N-말단에 위치하는 이중특이적 항체.
84. 구현예 82-83에서, 제1폴리펩티드 사슬에서 CD137 단백질에 결합하는 항체의 상기 경쇄 가변영역 및 CD137 단백질에 결합하는 항체의 상기 중쇄 가변영역은 scFv를 구성하는 이중특이적 항체.
85. 구현예 82-84에서, 상기 제1폴리펩티드 사슬은 인간 IgG 불변영역을 추가로 포함하고, 상기 인간 IgG 불변영역은 PD-L1 단백질에 결합하는 항체의 상기 중쇄 가변영역의 C-말단에 위치하고 CD137 단백질에 결합하는 항체의 상기 경쇄 가변영역의 N-말단에 위치하며; 대안적으로, 상기 인간 IgG 불변영역은 PD-L1 단백질에 결합하는 항체의 상기 중쇄 가변영역의 C-말단에 위치하고 CD137 단백질에 결합하는 항체의 상기 중쇄 가변영역의 N-말단에 위치하는 이중특이적 항체.
86. 구현예 82-85에서, 상기 제1폴리펩티드 사슬은 서열번호 30, 서열번호 43 및 서열번호 44로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 이중특이적 항체.
87. 구현예 82-86에서, 상기 제2폴리펩티드 사슬은 서열번호 15 및 서열번호 34로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 이중특이적 항체.
88. 구현예 1-39 중 어느 하나에 따른 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체, 구현예 40-78 중 어느 하나에 따른 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체 또는 구현예 79-87 중 어느 하나에 따른 이중특이적 항체를 코딩하는 하나 이상의 단리된 핵산분자.
89. 구현예 88에 따른 핵산분자를 포함하는 벡터.
90. 구현예 88에 따른 핵산분자 또는 구현예 89에 따른 벡터를 포함하는 세포.
91. 구현예 1-39 중 어느 하나에 따른 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체, 구현예 40-78 중 어느 하나에 따른 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체 또는 구현예 79-87 중 어느 하나에 따른 이중특이적 항체의 발현을 가능하게 하는 조건 하에서 구현예 90에 따른 세포를 배양하는 단계를 포함하는 구현예 1-39 중 어느 하나에 따른 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체, 구현예 40-78 중 어느 하나에 따른 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체 또는 구현예 79-87 중 어느 하나에 따른 이중특이적 항체를 제조하는 방법.
92. 구현예 1-39 중 어느 하나에 따른 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체, 구현예 40-78 중 어느 하나에 따른 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체 또는 구현예 79-87 중 어느 하나에 따른 이중특이적 항체, 구현예 88에 따른 핵산분자, 구현예 89에 따른 벡터 및/또는 구현예 90에 따른 세포, 및 임의의 약학적으로 허용 가능한 보조제를 포함하는 약학 조성물.
93. 종양을 완화 또는 치료하기 위한 의약의 제조에서 구현예 1-39 중 어느 하나에 따른 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체, 구현예 40-78 중 어느 하나에 따른 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체 또는 구현예 79-87 중 어느 하나에 따른 이중특이적 항체, 구현예 88에 따른 핵산분자, 구현예 89에 따른 벡터, 구현예 90에 따른 세포 및/또는 구현예 92에 따른 약학 조성물의 용도.
94. 구현예 93에서 상기 종양은 대장암을 포함하는 용도.
95. 구현예 1-39 중 어느 하나에 따른 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체, 구현예 40-78 중 어느 하나에 따른 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체 또는 구현예 79-87 중 어느 하나에 따른 이중특이적 항체, 구현예 88에 따른 핵산분자, 구현예 89에 따른 벡터, 구현예 90에 따른 세포 및/또는 구현예 92에 따른 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 PD-1 단백질에 대한 PD-L1 단백질의 결합을 억제하는 방법.
96. 구현예 1-39 중 어느 하나에 따른 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체, 구현예 40-78 중 어느 하나에 따른 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체 또는 구현예 79-87 중 어느 하나에 따른 이중특이적 항체, 구현예 88에 따른 핵산분자, 구현예 89에 따른 벡터, 구현예 90에 따른 세포 및/또는 구현예 92에 따른 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 T세포의 기능을 향상시키는 방법.
하기 실시예는 임의의 이론에 의해 제한되지 않고, 본 출원의 장치, 방법 및 시스템의 작동 방법을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 출원 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.
실시예
실시예 1. 파지 항체 라이브러리의 사용에 의한 항-PD-L1 항체의 스크리닝
항원으로서 인간 PD-L1-Fc 단백질(Origincell Therapeutics Co., Ltd.)을 사용하여 파지 천연 인간 항체 라이브러리(Origincell Therapeutics Co., Ltd.)를 분류하였다. ELISA 튜브를 4℃에서 밤새 20 μg/ml (1차 및 2차) 또는 10 μg/ml(3차 및 4차)의 PD-L1 단백질을 함유하는 CBS 완충액으로 코팅하였다. 이어서, 튜브를 PBS 완충액으로 세척하였다. 10% 탈지 분유를 첨가하여 ELISA 튜브를 차단한 후, 차단된 파지 1ml를 첨가하여 실온(20±5℃)에서 1시간 동안 배양하였다. PBST로 완전히 세척한 후, pH 2.2의 Gly-HCl 완충액 800μl를 첨가하여 용출시키고, 이어서 pH 8.0의 Tris-HCl 완충 용액 400μl을 즉시 첨가하여 중화시켰다. 이어서, 이 혼합물을 20 ml의 E. coli SS320 에 OD 값이 약 0.8인 대수생장기(logarithmic growth phase)로 첨가하고, 잘 혼합하고, 37℃에서 1시간 동안 정치시켰다. 파지 역가를 측정하기 위해 500 μl의 미생물 용액을 취하고, 미생물을 보호하기 위해 글리세린을 사용하고, 나머지 미생물 용액을 사용하여 플레이트를 코팅하고, 37℃에서 밤새 배양하였다. 다음날, 플레이트 상의 박테리아를 80 ml의 2YT-Amp 배지에 비례적으로 접종하여, 미생물 용액이 0.2의 OD 값을 갖도록 하고, 몇 시간 동안 배양하였다. OD 값이 0.8에 도달하면, 헬퍼 파지 160μl를 첨가하고, 잘 혼합하고, 37℃에서 1시간 동안 정치시켰다. 이어서, IPTG 및 Kan 항생제를 첨가하고, 250 rpm에서 30℃에서 밤새 흔들면서 배양하였다. 이어서, 상등액을 수집하여 PEG/NaCl 용액에 의해 파지를 침전시키고, 농축 스크리닝을 위해 PBS 완충액 1.5 ml에 재현탁시켰다.
96-웰 ELISA 플레이트를 4℃에서 밤새 1 μg/ml의 인간 PD-L1-Fc 단백질 (Origincell Therapeutics Co., Ltd.) 및 마우스 PD-L1-Fc 단백질 (M5251, ACROBiosystems Inc.로부터 구입)을 함유하는 용액으로 코팅하였다. 이어서, 플레이트를 비특이적 결합 부위에서 10% 탈지 분유로 차단하였다. 철저한 세척 후, 모노클로날 파지 상등액을 취하여 96-웰 플레이트에 첨가하고, 37℃에서 2시간 동안 배양하였다. 철저한 세척 후, HRP-표지된 항-M13 항체 (227-9421-01, GE healtcare)를 각각의 웰에 첨가하고, 37℃에서 45분 동안 반응시켰다. 완전히 세척한 후, TMB를 각 웰에 첨가하여 발색시켰다. 실온(20±5℃)에서 5~10분간 반응시킨 후, 각 웰에 황산을 첨가하여 반응을 정지시켰다. 마이크로플레이트 판독기는 450 nm에서 각 웰의 OD 값을 측정하기 위해 사용된다.
인간 PD-L1 및 마우스 PD-L1 둘 다에 특이적으로 결합할 수 있는 파지 항체 클론 1B10을 ELISA에 의해 확인하였다. 시퀀싱 결과는 파지 항체 1B10의 중쇄 가변영역 VH를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 서열번호 1에 나타내고, 파지 항체 1B10의 중쇄 가변영역 VH의 아미노산 서열을 서열번호 2에 나타내고; 파지 항체 1B10의 경쇄 가변영역 VL을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 3에 나타내며, 파지 항체 1B10의 경쇄 가변영역 VL의 아미노산 서열은 서열번호 4에 나타내어 있음을 보여준다.
실시예 2. 항-PD-L1 완전 인간항체의 발현 및 정제
파지 항체 1B10의 VH의 PCR 증폭을 위해 프라이머를 설계하고, PCR 생성물을 재조합에 의해 pCMV-IgG1NDL 벡터 내로 클로닝하였으며, 이는 AgeI 및 SalI로 이중 분해되었다. 디자인 프라이머를 파지 항체 1B10의 VL의 PCR 증폭을 위해 디자인하고, PCR 생성물을 재조합에 의해 pCMV-λ 벡터로 클로닝하고, 이를 AgeI 및 BsiWI로 이중 분해하였다. 정확하게 시퀀싱한 후, 중쇄 및 경쇄 발현 벡터를 일시적 발현을 위해 293F 세포로 공동-형질감염시키고, ProteinA 컬럼에 의해 정제하여 파지 항체 1B10의 완전한 IgG1,λ 항체를 수득하였다. 이러한 항-PD-L1 완전 인간 항체는 YN-002로 명명되었다.
시퀀싱 결과는 항체 YN-002을 코딩하는 VH의 뉴클레오티드 서열이 서열번호 1에 표시되고, 항체 YN-002의 VH의 아미노산 서열은 서열번호 2에 표시됨을 보여준다. 항체 YN-002을 코딩하는 VL의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 3에 표시되고, 항체 YN-002의 VL의 아미노산 서열은 서열번호 4에 표시된다. 항체 YN-002을 코딩하는 중쇄의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 5에 표시되고, YN-002의 중쇄의 아미노산 서열은 서열번호 6에 표시된다. 항체 YN-002의 경쇄를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 7에 표시되고, 항체 YN-002에 있어서의 경쇄의 아미노산 서열은 서열번호 8에 표시된다.
실시예 3. 항-PD-L1 완전 인간 항체 YN-002의 생식세포계열(Germline) 버전
항체 YN-002 중쇄 면역글로불린 서열을 공지된 인간 생식세포계열 면역글로불린 중쇄 서열과 비교함으로써, 항체 YN-002 경쇄가 인간 생식세포계열 IGHV1-69*09로부터의 VH 세그먼트, 인간 생식세포계열 IGHD5-18*01로부터의 D 세그먼트, 및 인간 생식세포계열 IGHJ4*02로부터의 JH 세그먼트를 사용하였음을 확인하였다.
항체 YN-002의 경쇄 면역글로불린 서열을 공지된 인간 생식세포계열 면역글로불린 경쇄 서열과 비교함으로써, 항체 YN-002은 인간 생식세포계열 IGLV2-14*01로부터의 VL 단편 및 인간 생식세포계열 IGLJ2*01로부터 JL 단편을 사용한 것을 확인하였다.
항체 YN-002의 CDR 영역의 서열을 Kabat 시스템에 의해 분석하였다(도 1 참조).
시퀀싱 결과는 항체 YN-002의 LCDR1-3의 아미노산 서열이 각각 서열번호 54, 서열번호 60 및 서열번호 63에 표시되고; HCDR1-3의 아미노산 서열은 각각 서열번호 46, 서열번호 48 및 서열번호 50에 표시됨을 보여준다.
항체 YN-002의 면역원성을 최소화하기 위해, 일부 아미노산 잔기가 생식세포계열 서열로 다시 돌연변이될 수 있다. 항체 YN-003은 항체 YN-002의 생식세포계열 버전이며, 이는 YN-002 중쇄 가변영역의 FR1 영역 내의 하나의 아미노산을 생식세포계열의 서열로 다시 돌연변이시키고, YN-002 경쇄 가변영역 내의 FR2 영역 내의 1개의 아미노산 및 FR3 영역 내의 6개의 아미노산을 생식세포계열의 서열로 역으로 돌연변이시킴으로써 제조된다(도 1 참조). 항-PD-L1 완전 인간 항체 YN-003의 중쇄 발현 벡터는 상기-구성된 YN-002 중쇄 발현 플라스미드를 기초로 한 돌연변이 키트 (Tiangen Point Mutation Kit, KM101)를 사용한 부위-지정 돌연변이유발(mutagenesis)에 의해 수득된다. YN-003 경쇄 발현 벡터는 YN-002 경쇄 발현 플라스미드를 기초로 한 돌연변이 키트(Tiangen Point Mutation Kit, KM101)를 사용하여 부위-지정 돌연변이유발에 의해 수득된다.
항체 YN-003 VH의 아미노산 서열은 서열번호 9에 표시되며, 이는 항체 YN-002 VH의 서열에서 하나의 아미노산 잔기를 돌연변이시킴으로써 수득될 수 있다. YN-003 VH를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 10에 표시된다. 항체 YN-003 VL의 아미노산 서열은 서열번호 11에 표시되고, 이는 항체 YN-002 VL의 아미노산 서열에서 7개의 아미노산 잔기를 돌연변이시킴으로써 수득될 수 있고, YN-003VL에 상응하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 12에 표시된다. 항체 YN-003의 중쇄의 아미노산 서열은 서열번호 13에 표시되고; YN-003의 중쇄를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 14에 표시되고; 항체 YN-003의 경쇄의 아미노산 서열은 서열번호 15에 표시되고; 항체 YN-003의 경쇄를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 16에 표시된다.
YN-003 항체의 발현 및 정제를 위해, 실시예 2에서 YN-002 항체를 발현 및 정제하는 단계를 참조한다.
실시예 4. 항-PD-L1 항체의 결합 친화성 시험
재조합 인간, Macaca fascicularis, 마우스 및 개 PD-L1 단백질에 대한 항체 YN-002 및 항체 YN-003의 결합 친화성을 분자 상호작용 분석기 (Octet RED384, Pall ForteBio Analytics Co.,Ltd.로부터 구입)에 의해 측정하였다. 하기 단백질을 비오틴으로 표지하였다 (EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin, Pierce, 21327): 재조합 인간 PD-L1-Fc, 재조합 Macaca fascicularis PD-L1-Fc (90251-C02H, Sino Biological Inc.로부터 구입), 재조합 마우스 PD-L1-Fc (M5251, ACROBiosystems Inc.으로부터 구입) 및 재조합 개 PD-L1-Fc (70110-D02H, Sino Biological Inc.로부터 구입). 항원-항체 결합 동역학은 분자 상호작용 분석기(Octet RED384, Pall ForteBio Analytics Co.,Ltd.로부터 구입)를 사용하고, 0.1% BSA 및 0.02% Tween 20을 함유하는 PBS 완충액을 사용하여 바이오필름 간섭 (BLI) 기술로 분석되었다. 50 nM의 농도를 갖는 비오틴-결합된 항원 단백질을 SA 센서로 고정시키고(Pall ForteBio Analytics Co.,Ltd.), 이어서 1500rpm으로 10분간 이중-희석된 항체 용액과 결합시킨 후; 마지막으로 10분 동안 1500rpm에서 해리시켰다. 수득된 결과는 옥테트 데이터 분석(Octet Data Analysis) 9.0 소프트웨어(Pall ForteBio Analytics Co.,Ltd.)으로 분석되어 K D , K on (1/Ms) 및 K off (1/s)를 수득하였다.
항-PD-L1 항체 YN-002 내지 YN-003의 결합 친화성의 측정 결과는 표 1-4에 나타내었다.
인간 PD-L1-Fc에 대한 PD-L1 항체의 결합 친화성

항체		 인간 PD-L1-Fc-비오틴
kon (1/Ms) koff (1/s) K D (M)
YN-002 6.69 x 105 5.94 x 10-4 8.88 x 10-10
YN-003 1.50 x 106 6.11 x 10-4 4.08 x 10-10
마우스 PD-L1-Fc에 대한 PD-L1 항체의 결합 친화성

항체		 마우스 PD-L1-Fc-비오틴
kon (1/Ms) koff (1/s) K D (M)
YN-002 9.77 x 105 1.68 x 10-3 1.72 x 10-9
YN-003 1.03 x 106 9.97 x 10-4 9.96 x 10-10
Macaca Fascicularis PD-L1-Fc에 대한 PD-L1 항체의 결합 친화성

항체 		Macaca Fascicularis PD-L1-Fc-비오틴
kon (1/Ms) koff (1/s) K D (M)
YN-002 1.77 x 106 1.90 x 10-3 1.07 x 10-9
YN-003 2.08 x 106 1.36 x 10-3 6.54 x 10-10
개 PD-L1-Fc에 대한 PD-L1 항체의 결합 친화성

항체		 개 PD-L1-Fc-비오틴
kon (1/Ms) koff (1/s) K D (M)
YN-002 1.02 x 106 7.59 x 10-4 7.43 x 10-10
YN-003 8.64 x 105 5.14 x 10-4 5.94 x 10-10
실시예 5: PD-L1 항체는 인간 PD-L1 및 인간 PD-1의 결합을 억제함.
인간 PD-1-Fc 단백질 (ACROBiosystems Inc., H5257)을 비오틴 (EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin, Pierce, 21327)으로 표지하였다. 아포화된 농도의 비오틴으로 표지된 인간 PD-1-Fc를 인간 PD-L1을 안정적으로 발현하는 CHO 세포 1 x 106/ml 에 첨가한 후, 5배 비율로 희석된 각 항체를 첨가하고, 잘 혼합하고, 배양하였다(4℃, 1hr). 세포 세척 후, 스트렙타비딘 R-PE 접합체(life technology, SA10041)를 첨가하고, 배양하였다(4℃, 30분). 세포 세척 후, 형광 강도를 유세포 분석기(flow cytometer; Intellicyt iQue Screener)로 검출하였다. 결과는 도 2에 도시되어 있다: YN-002 및 YN-003 둘 다는 인간 PD-L1을 발현하는 CHO 세포에 대한 인간 PD-1의 결합을 효과적으로 억제할 수 있다.
실시예 6: PD-L1 항체는 Macaca Fascicularis PD-1에 대한 Macaca Fascicularis PD-L1의 결합을 억제함.
Macaca Fascicularis PD-1-Fc(Sino Biological Inc., 90311-C02H)에 대한 Macaca Fascicularis PD-L1-Fc(Sino Biological Inc., 90251-C02H)의 결합을 차단하기 위한 항-PD-L1 항체 YN-002 및 YN-003의 능력을 Octet RED384 기구(Pall ForteBio Analytics Co.,Ltd.)에 의해 평가하였다. 먼저, Macaca Fascicularis PD-1-Fc를 비오틴(EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin, Pierce, 21327)으로 표지하였다. Macaca Fascicularis PD-1에 대한 Macaca Fascicularis PD-L1의 결합을 억제하기 위한 PD-L1 항체의 결합 동역학 분석을, fortebio octet RED384 기구(PALL) 분자 상호작용 분석기를 사용하여, 바이오필름 간섭(BLI) 기술에 의해 수행하였다(항원 및 항체는 모두 PBS 완충액 중에서 0.1% BSA 및 0.02% Tween 20으로 희석됨). 100nM 비오틴-커플링된 재조합 인간 PD-1-Fc를 1500rpm/min으로 SA 센서로 고정시키고, 10분 동안 결합시켰다. 최종 농도 75nM의 Macaca Fascicularis PD-L1을 3배 희석된 항체 용액과 혼합하고, 60분 동안 배양한 후, 1500rpm/min에서 10분 동안 기계 상에서 조합하고, 최종적으로 1500rpm/min으로 10분간 해리시켰다. 얻어진 결과는 옥테트 데이터 분석 9.0 소프트웨어(Pall ForteBio Analytics Co.,Ltd.)에 의해 데이터 분석될 것이다. 결과는 도 3에 도시되어 있다: YN-002 및 YN-003 둘 모두는 Macaca fascicularis PD-1-Fc에 대한 Macaca fascicularis PD-L1-Fc의 결합을 효과적으로 억제할 수 있다.
실시예 7: PD-L1 항체는 마우스 PD-1에 대한 마우스 PD-L1의 결합을 억제함.
마우스 PD-1-Fc(ACROBiosystems Inc., M5259)를 비오틴(EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin, Pierce, 21327)으로 표지하고, 아포화된 농도의 비오틴으로 표지된 마우스 PD-1-Fc를 마우스 PD-L1을 안정적으로 발현하는 CHO 세포 1 x 106/ml에 첨가하고, 5배 비율로 희석한 항체를 첨가하고, 잘 혼합하고, 배양하였다(4℃, 1hr). 세포 세척 후, 스트렙타비딘 R-PE 접합체(life technology, SA10041)를 첨가하고, 배양하였다(4℃, 30분). 세포 세척 후, 형광 강도를 유세포 분석기(Intellicyt iQue Screener)로 검출하였다. 결과는 도 4에 도시되어 있다: YN-002 및 YN-003 둘 모두는 마우스 PD-L1을 발현하는 CHO 세포에 대한 마우스 PD-1의 결합을 효과적으로 억제할 수 있다.
실시예 8: 대장암-보유 마우스에서의 항-PD-L1 단일클론 항체의 항종양 효과의 연구
0일째에, 6-8주령의 C57BL/6 암컷 마우스에 3 x 106 MC38 마우스 결장직장암 세포 (Shanghai Linyuan Biological Technology Co., Ltd.)를 피하 접종하였다. 3일째에, 마우스를 7개의 군으로 균일하게 분할하고, 각 군에 8 내지 9개의 마우스를 첨가하였다. 각 군의 종양-보유 마우스에 인간 항체 IgG-Fc 단백질 (10mg/kg, 주 2회, 총 2주), YN-003 항체 (10mg/kg, 주 2회, 총 2주) 및 Atezolizumab (10mg/kg, 주 2회, 총 2주)을 각각 복강내 주사하였다. 각 군의 마우스는 체중 및 종양 크기의 변화에 대해 규칙적으로 관찰되었다. 실험 결과는 대조군 IgG1-Fc와 비교하여, YN-003 및 Atezolizumab 둘 다 종양 성장을 효과적으로 억제할 수 있고, 여기서 YN-003의 항종양 효과는 더 유의하다(도 5)는 것을 보여준다.
실시예 9: 파지 항체 라이브러리에 의한 항-CD137 항체의 스크리닝
CD137 단백질(Sino Biological Inc.로부터 구입)을 항원으로서 사용하여 파지 천연 인간 항체 라이브러리(Origincell Therapeutics Co., Ltd.)를 분류하였다. ELISA 튜브를 4℃에서 밤새 20 μg/ml (1차 및 2차) 또는 10 μg/ml (3차 및 4차)의 CD137 단백질을 함유하는 CBS 완충액으로 코팅하였다. 이어서, 튜브를 PBS 완충액으로 세척하였다. 10% 탈지 분유를 첨가하여 ELISA 튜브를 차단한 후, 차단된 파지 1ml를 첨가하여 실온(20±5℃)에서 1시간 동안 배양하였다. PBST로 완전히 세척한 후, pH 2.2의 Gly-HCl 완충액 800μl를 첨가하여 용출시키고, 이어서 pH 8.0의 Tris-HCl 완충 용액 400μl을 즉시 첨가하여 중화시켰다. 이어서, 이 혼합물을 20 ml의 E. coli SS320에 OD 값이 약 0.8인 대수생장기로 첨가하고, 잘 혼합하고, 37℃에서 1시간 동안 정치시켰다. 파지 역가를 측정하기 위해 500 μl의 미생물 용액을 취하고, 미생물을 보호하기 위해 글리세린을 사용하고, 나머지 미생물 용액을 사용하여 플레이트를 코팅하고, 37℃에서 밤새 배양하였다. 다음날, 플레이트 상의 박테리아를 80 ml의 2YT-Amp 배지에 비례적으로 접종하여, 미생물 용액이 0.2의 OD 값을 갖도록 하고, 몇 시간 동안 배양하였다. OD 값이 0.8에 도달하면, 헬퍼 파지 160μl를 첨가하고, 잘 혼합하고, 37℃에서 1시간 동안 정치시켰다. 이어서, IPTG 및 Kan 항생제를 첨가하고, 250 rpm에서 30℃에서 밤새 흔들면서 배양하였다. 이어서, 상등액을 수집하여 PEG/NaCl 용액에 의해 파지를 침전시키고, 농축 스크리닝을 위해 PBS 완충액 1.5 ml에 재현탁시켰다.
96-웰 ELISA 플레이트를 4℃에서 밤새 1 μg/ml의 인간 CD137 단백질을 함유하는 용액으로 코팅하였다. 이어서, 플레이트를 비특이적 결합 부위에서 10% 탈지 분유로 차단하였다. 철저한 세척 후, 모노클로날 파지 상등액을 취하여 96-웰 플레이트에 첨가하고, 37℃에서 2시간 동안 배양하였다. 철저한 세척 후, HRP-표지된 항-M13 항체 (27-9421-01, GE healtcare)를 각각의 웰에 첨가하고, 37℃에서 45 분 동안 반응시켰다. 완전히 세척한 후, TMB를 각 웰에 첨가하여 발색시켰다. 실온(20±5℃)에서 5~10분간 반응시킨 후, 각 웰에 황산을 첨가하여 반응을 정지시켰다. 마이크로플레이트 판독기는 450 nm에서 각 웰의 OD 값을 측정하기 위해 사용된다.
인간 CD137에 특이적으로 결합할 수 있는 파지 항체 클론 1A6을 ELISA에 의해 동정하고, 시퀀싱에 의해 VH 및 VL 유전자 서열을 수득하였다. 시퀀싱 결과는 파지 항체 1A6의 VH를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 17에 표시되고, 파지 항체 1A6의 VH의 아미노산 서열은 서열번호 18에 표시되며; 파지 항체 1A6의 VL을 코딩하는 뉴클레오시드 산(nucleoside acid) 서열은 서열번호 19에 표시되고, 파지 항체 1A6의 VL의 아미노산 서열은 서열번호가 20에 표시된 것을 나타냈다.
실시예 10: 항-CD137 완전 인간 항체(Fully Human Intact Antibody)의 발현 및 정제
파지 항체 1A6의 VH의 PCR 증폭을 위해 프라이머를 설계하였다. PCR 생성물을 재조합에 의해 AgeI 및 SalI로 이중 소화된 pCMV-IgG2 벡터 내로 클로닝하였다. 파지 항체 1A6의 VL의 PCR 증폭을 위해 프라이머를 설계하고, PCR 생성물을 AgeI 및 BsiWI로 소화된 pCMV-λ 벡터로 재조합에 의해 클로닝하였다. 정확한 시퀀싱 후, 중쇄 및 경쇄 발현 벡터를 일시적 발현을 위해 293F 세포로 공동-형질감염시키고, ProteinA 컬럼에 의해 정제하였다. 항-CD137 완전 인간 항체인 1A6의 온전한 IgG2,λ항체는 YN-005로 명명되었다.
시퀀싱 결과는 항체 YN-005 VH의 아미노산 서열은 서열번호 18에 표시되고, 항체 YN-005 VH을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 17에 표시되며; 항체 YN-005 VL의 아미노산 서열은 서열번호 20에 표시되고, 항체 YN-005 VL을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 19에 표시된다. 항체 YN-005의 중쇄의 아미노산 서열은 서열번호 21에 표시되고, 항체 YN-005의 중쇄를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 22에 표시되며; 항체 YN-005의 경쇄의 아미노산 서열은 서열번호 23에 표시되고, 또 항체 YN-005의 경쇄를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 24에 표시됨을 나타낸다.
실시예 11: 항- CD137 완전 인간 항체 YN-005의 생식세포계열 버전
항체 YN-005 중쇄 면역글로불린 서열을 공지된 인간 생식세포계열 면역글로불린 중쇄 서열과 비교함으로써, 항체 YN-005 중쇄가 인간 생식세포계열 IGHV3-23*04로부터의 VH 세그먼트, 인간 생식세포계열 IGHD7-27*01로부터의 D 세그먼트 및 인간 생식세포계열 IGHJ3*02로부터의 JH 세그먼트를 이용하였다는 것이 확인되었다.
YN-005 경쇄 면역글로불린 서열을 공지된 인간 생식세포계열 면역글로불린 경쇄 서열과 비교함으로써, 항체 YN-005 경쇄가 인간 생식세포계열 IGLV1-44*01 로부터의 VL 세그먼트 및 인간 생식세포계열 IGLJ1*01으로부터의 JL 세그먼트를 이용하였음을 확인하였다.
Kabat 시스템을 사용하여 항체 YN-005의 CDR 영역의 서열을 분석하였고 (도 6 참조), 시퀀싱 결과는 항체 YN-005 의 HCDR1-3의 아미노산 서열이 각각 서열번호 77, 서열번호 78 및 서열번호 79에 표시됨을 보여준다. 항체 YN-005의 LCDR1-3의 아미노산 서열은 각각 서열번호 80, 서열번호 81 및 서열번호 82에 표시된다.
항체 YN-005의 면역원성을 최소화하기 위해, 일부 아미노산 잔기를 생식세포계열 서열로 다시 돌연변이시킬 수 있다. 항체 YN-006은 항체 YN-005의 생식세포계열 버전이며, 이는 YN-005 중쇄 가변영역 내의 FR1 영역 내의 하나의 아미노산을 생식세포계의 서열로 다시 돌연변이시킴으로써 제조된다(도 6 참조). 항-CD137 완전 인간 항체 YN-006의 중쇄 발현 벡터는 상기-구성된 YN-005의 중쇄 발현 플라스미드를 기초로 한 돌연변이 키트(Tiangen Point Mutation Kit, KM101)를 사용하여 부위-지정 돌연변이유발에 의해 수득된다.
시퀀싱은 항체 YN-006 VH의 아미노산 서열은 서열번호 25에 표시되고, YN-006 VH를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 26에 표시됨을 보여준다. 항체 YN-006 VL의 아미노산 서열은 서열번호 20에 표시되고, YN-006 VL을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 19에 표시된다. 항체 YN-006 중쇄의 아미노산 서열은 서열번호 27에 표시되고; 항체 YN-006 중쇄를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 28에 표시되고; 항체 YN-006 경쇄의 아미노산 서열은 서열번호 23에 표시되고, YN-006 경쇄를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 24에 표시된다.
YN-006 항체의 발현 및 정제를 위해, 실시예 9에서 YN-005 항체를 발현 및 정제하는 특정 단계를 참조한다.
실시예 12: 항-CD137 항체의 결합 친화성의 측정
재조합 인간 CD137-His 단백질(Origincell Therapeutics Co.,Ltd.)에 대한 항체 YN-005 및 항체 YN-006의 결합 친화성은 분자 상호작용 분석기(Octet RED384, Pall ForteBio Analytics Co.,Ltd.로부터 구입)에 의해 측정하였다. 항원-항체 결합 동역학은 분자 상호작용 분석기(Octet RED384, Pall ForteBio Analytics Co.,Ltd.)를 사용하고 0.1% BSA 및 0.02% Tween 20을 함유하는 PBS 완충액을 사용하여, 바이오필름 간섭(BLI) 기술에 의해 분석되었다. 50 nM 농도의 항체를 AHC 센서로 고정하고, 1500 rpm에서 5분간 결합시킨 후, 이중-희석된 재조합 CD137-His 단백질 항원 용액(1100, 50, 25, 12.5, 6.25, 3.125, 1.56 nM)에 1500rpm에서 5분간 결합시키고, 최종적으로 1500rpm에서 10분간 해리시켰다. AHC 센서는 글리신 펄스에 의해 재생된 후 재사용된다. 얻어진 결과는 옥테트 데이터 분석 9.0 소프트웨어(Pall ForteBio Analytics Co.,Ltd.)에 의해 분석되어 K D , K on (1/Ms) 및 K off (1/s)를 수득한다. CD137 항체 YN-005 및 YN-006 의 결합 친화성의 측정 결과를 표 5에 나타낸다.
인간 CD137-His에 대한 CD137 항체의 친화성
항체 CD137-His
Kon (1/Ms) Koff (1/s) K D (M)
YN-005 9.38 x 104 4.55 x 10-5 4.85 x 10-10
YN-006 9.68 x 104 1.33 x 10-5 1.37 x 10-10
실시예 13: 대장암-보유마우스에서 CD137 단일클론 항체의 항종양 효과의 연구
0일째에, 인간 CD137 유전자를 갖는 6-8주령의 C57BL/6 암컷 마우스 (B-hTNFRSF9 (4-1BB) 마우스, Beijing BioCytogen Co., Ltd.로부터 구입)를 1.5 x 106 MC38 마우스 결장직장암으로 피하 접종하였다. 3일째, 마우스를 3개의 군으로 균일하게 분할하고, 각 군에 7마리의 마우스를 사용하였다. 각 군의 종양-보유 마우스에 인간 항체 IgG-Fc 단백질 (3 mg/kg, 주 2회, 총 2주), CD137 항체 YN-006 항체 (3 mg/kg, 주 2회, 총 2주), 및 CD137 항체 Utomilumab (3 mg/kg, 주 2회, 총 2주)을 복강내 주사하였다. 각 군의 마우스는 체중 및 종양 크기의 변화에 대해 규칙적으로 관찰되었다. 실험 결과는 대조군 IgG1-Fc와 비교하여, YN-006 및 Utomilumab 둘 다 종양 성장을 효과적으로 억제할 수 있음을 나타내고, YN-006의 항종양 효과는 Utomilumab 보다 더 유의하다는 것을 주목할 가치가 있다(예: 도 7에 나타냄).
실시예 14: 항-PD-L1/CD137 이중특이적 항체 YN-007의 구성
항-PD-L1/CD137 이중특이적 항체 YN-007의 제1 폴리펩티드 유전자는 항- PD-L1 항체 YN-003의 중쇄 유전자 및 항-인간 CD137 항체 YN-006의 중쇄 및 경쇄 유전자를 사용하여 분자 클로닝 방법, 예컨대 오버랩 PCR, 부위-특이적 돌연변이 등에 의해 구축되고, AgeI 및 BamHI로 이중 소화된 pCMV-IgG1AEM 벡터에 조합되어 클로닝되어 YN-007의 제1 폴리펩티드의 발현 벡터를 구축하였다.
YN-007의 제2 폴리펩티드 유전자는 YN-003의 경쇄 유전자의 것과 동일하다. YN-007의 제2 폴리펩티드의 발현 벡터는 YN-003의 경쇄의 상기-구축된 발현 벡터이다.
정확한 시퀀싱 후에, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드의 발현 벡터를 일시적 발현을 위해 293F 세포로 공동-형질감염시키고, Protein A 컬럼에 의해 정제하여 항-PD-L1/CD137 이중특이적 항체 YN-007을 수득하였다.
항체 YN-007의 제1 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 29에 표시되고, 항체 YN-007의 제1 폴리펩티드의 아미노산 서열은 서열번호 30에 표시되고; 항체 YN-007의 제2 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 16에 표시되고, 항체 YN-007의 제2 폴리펩티드의 아미노산 서열은 서열번호 15에 표시된다.
실시예 15: 항-PD-L1/CD137 이중특이적 항체 YN-007의 결합 친화성의 측정
항-PD-L1/CD137 이중특이적 항체 YN-007의 재조합 인간 PD-L1-Fc 단백질 및 재조합 마우스 PD-L1-Fc에 대한 결합 친화성을 분자 상호작용 분석기(Octet RED384, Pall ForteBio Analytics Co.,Ltd.로부터 구입) 에 의해 측정하였다. 재조합 인간 PD-L1-Fc 단백질 및 재조합 마우스 PD-L1-Fc를 비오틴으로 표지하였다(EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin, Pierce, 21327). 항원-항체 결합 동역학은 분자 상호작용 분석기(Octet RED384, Pall ForteBio Analytics Co.,Ltd.로부터 구입)를 사용하고 0.1% BSA 및 0.02% Tween 20을 함유하는 PBS 완충액을 사용하여 바이오필름 간섭(BLI) 기술에 의해 분석되었다. 50 nM의 농도를 갖는 비오틴-결합된 항원 단백질을 SA 센서로 고정시키고(Pall ForteBio Analytics Co.,Ltd.), 1500 rpm으로 10분간 결합시킨 후, 이중-희석된 YN-007 항체 용액과 1500rpm으로 10분간 결합시키고, 최종적으로 1500rpm으로 10분간 해리시켰다. 얻어진 결과는 옥테트 데이터 분석 9.0 소프트웨어(Pall ForteBio Analytics Co.,Ltd.)에 의해 분석되어 K D , K on (1/Ms) 및 K off (1/s)를 수득한다.
인간 PD-L1-Fc에 대한 YN-007의 결합 친화성의 측정된 결과를 표 6에 나타내었다.
마우스 PD-L1-Fc에 대한 YN-007의 결합 친화성의 측정 결과를 표 7에 나타내었다.
인간 PD-Ll-Fc에 대한 항-PD-L1/CD137 이중특이적 항체 YN-007의 결합 친화성

항체		 인간 PD-L1-Fc-비오틴
kon (1/Ms) koff (1/s) K D (M)
YN-007 1.13 x 106 5.92 x 10-4 5.25 x 10-10
마우스 PD-Ll-Fc에 대한 항-PD-L1/CD137 이중특이적 항체 YN-007의 결합 친화성

항체		 마우스 PD-L1-Fc-비오틴
kon (1/Ms) koff (1/s) K D (M)
YN-007 8.1 x 105 1.09 x 10-3 1.34 x 10-9
재조합 인간 CD137-His 단백질에 대한 항-PD-L1/CD137 이중특이적 항체 YN-007의 결합 친화성을 분자 상호작용 분석기 (Octet RED384, Pall ForteBio Analytics Co.,Ltd.로부터 구입)에 의해 측정하였다. 항원-항체 결합 동역학은 분자 상호작용 분석기(Octet RED384, Pall ForteBio Analytics Co.,Ltd.로부터 구입)를 사용하고 0.1% BSA 및 0.02% Tween 20을 함유하는 PBS 완충액을 사용하여 바이오필름 간섭(BLI) 기술에 의해 분석되었다. 50 nM 농도의 항체를 AHC 센서로 고정하고, 1500 rpm에서 5분간 결합시킨 후, 이중-희석된 재조합 인간 CD137-His 단백질 항원 용액(100, 50, 25, 12.5, 6.25, 3.125, 1.56 nM)에 1500rpm에서 5분간 결합시키고, 최종적으로 1500회전에서 10분간 해리시켰다. AHC 센서를 글리신 펄스로 재생한 후 재사용하였다. 얻어진 결과는 옥테트 데이터 분석 9.0 소프트웨어(Pall ForteBio Analytics Co.,Ltd.)에 의해 분석하여 항원과 항체 사이의 결합 강도를 계산하고, K D , K on (1/Ms) 및 K off (1/s)를 수득한다.
인간 CD137에 대한 항-PD-L1/CD137 이중특이적 항체 YN-007의 결합 친화성의 측정된 결과를 표 8에 나타내었다.
인간 CD137-His에 대한 항-PD-L1/CD137 이중특이적 항체 YN-007의 결합 친화성
항체 인간 CD137-His
Kon (1/Ms) Koff (1/s) K D (M)
YN-007 8.96 x 104 9.83 x 10-5 1.1 x 10-9
실시예 16: PD-L1 항체 YN-003의 친화성 성숙
프라이머를 중첩 PCR에 의해 PD-L1 항체 YN-003의 단일-쇄 항체(ScFv) 유전자를 구축하도록 디자인하고, pDF 파지미드 벡터 내로 클로닝하고, 이는 pDF-YN-003 ScFv로 표시하였다. pDF-YN-003 ScFv를 주형으로서 사용하여, 각각 중첩 PCR에 의해 항체 YN-003의 6개의 CDR 영역(CDR 영역 내의 일부 아미노산 잔기 및 CDR 영역에 인접한 FR 영역 내의 개별 아미노산 잔기를 포함함)을 랜덤화하는 퇴화 프라이머(degenerate primer)를 설계하였다(도 8에 나타낸 바와 같음).
중첩 PCR에 의해 얻어진 CDR 영역-무작위 scFv 유전자 단편을 BssHII 및 NheI로 이중 소화하고, 이어서 Bss HII 및NheI에 의해 이중 소화된 pDF 파지미드 벡터로 결찰시켰다. 1 μg의 결찰(ligation) 생성물을 TG1 전기-수용성세포(electro-competent cells) 내로 전기천공하고, 다중 희석 후 2YT+AG 플레이트 상에 코팅하였다. 다음날, 론(lawn)을 플레이트로부터 긁어내고, 300 ml의 2YT+Amp 배지로 팽창시켰다. 이를 37℃에서 약 0.8의 OD로 배양하였다. 헬퍼 파지를 첨가하고 잘 혼합하고, 1시간 동안 정치시키고, 최종 농도 1mM 및 50μg/ml의 카나를 갖는 IPTG를 첨가하고, 밤새 30℃에서 흔들었다. 다음날, 상등액을 원심분리에 의해 수집하고, 0.45 필터로 여과하였다. 1/5 부피의 PEG-NaCl을 첨가하여 파지를 침전시키고, 원심분리하여 침전물을 수집하였다. 1/10 부피의 PBS를 사용하여 침전물을 재현탁시키고, OD260을 측정하여 파지 pfu를 측정하였다. 생성물을 4℃에서 저장하였다. 파지 항체 라이브러리는 추후 패닝(panning)에 직접적으로 사용될 수 있다.
항원으로서의 인간 PD-L1-His 단백질(Origincell Therapeutics Co., Ltd.)을 사용하여 상기 파지 항체 라이브러리를 분류하였다. ELISA 튜브에서, CBS 완충액을 사용하여 4℃에서 밤새 100 nM (1차 및 2차) 또는 5 nM (3차)의 농도로 항원 PD-L1 (1 ml)을 코팅하였다. 다음날, 10% 탈지 분유를 함유하는 PBS 완충액 2ml를 사용하여 튜브를 차단하였다. 1 ml의 차단된 파지를 튜브에 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 배양하고; PBST로 20회(1차), 50회(2차) 또는 100회(3차) 세척하였다. Gly-HCl 완충액(pH 2.2) 800μl를 첨가하여 용출시키고, Tris-HCl 완충용액(pH 8.0) 400μl를 즉시 첨가하여 중화시켰다. 약 0.8의 대수생장기 OD를 갖는 E. coli TG1 20ml에 첨가하고, 잘 혼합하고, 37℃에서 1시간 동안 정치시켰다. 파지 역가를 측정하기 위해 500 μl를 취하고, 미생물을 보호하기 위해 글리세롤을 사용하였다. 나머지 미생물 액체를 플레이트 상에 살포하고, 인큐베이터에서 37℃에서 밤새 배양하였다. 다음날, 플레이트 상의 미생물을 긁어내고, OD가 0.2이 되도록 특정 비율로 80 ml의 2YT-Amp 배지에 접종하였다. 혼합물을 OD가 0.8에 도달할 때까지 몇 시간 동안 배양하였다. 헬퍼 파지 160μl를 첨가하고, 잘 혼합하고, 37℃에서 1시간 동안 정치시켰다. IPTG 및 Kan 항생제를 첨가하고, 250 rpm에서 30℃에서 밤새 흔들면서 배양하였다. 상등액을 수집하고 파지를 침전시키기 위해 PEG/NaCl 용액으로 처리하고, 이를 PBS 완충액 1.5ml에 재현탁시켰다. 재현탁된 파지를 농축 스크리닝의 다음 차수에 사용하였다. 3차 분류 후, 상당한 농축이 관찰되었다. 분류된 파지 항체 클론을 ELISA에 의해 확인하였다: 인간 PD-L1-His 단백질을 4℃에서 밤새 1 μg/ml 농도로 96-웰 ELISA 플레이트 상에 코팅하였다. 이어서, 비특이적 결합 부위를 10% 탈지 분유로 차단하였다. 충분한 세척 후, 모노클로날 파지 상등액을 96-웰 플레이트에 첨가하고, 37℃에서 2시간 동안 배양하였다. 철저한 세척 후, HRP-표지된 항-M13 항체 (GE healtcare, 27-9421-01)를 첨가하고, 45분 동안 37℃에서 반응시켰다. 철저한 세척 후, TMB를 첨가하여 발색시키고, 실온에서 5 내지 10분 동안 반응시켰다. 마지막으로, 황산으로 반응을 정지시켰다. 각 웰의 OD 값을 450 nm에서 측정하고, OD450 값이 더 높은 파지 항체 클론을 시퀀싱을 위해 선택하였다. 각 파지 항체 클론의 중쇄 및 경쇄 가변영역 유전자 서열을 수득한 후, 각 파지 항체를 전장 IgG1,λ 항체로서 재설계하였다: 프라이머를 각 파지 항원 클론의 VH의 PCR 증폭을 수행하도록 설계하고, PCR 생성물을 AgeI 및 SalI로 이중 소화된 pCMV-IgG1NDL 항체 중쇄 발현 벡터로의 재조합에 의해 클로닝하였다. 프라이머를 각 파지 항체 클론의 VL의 PCR 증폭을 위해 설계하였고, PCR 생성물을 AgeI 및 BsiWI로 2배 소화된 pCMV-λ 항체 경쇄 발현 벡터 내로 클로닝하였다. 정확한 시퀀싱 후에, 각각의 항체의 중쇄 및 경쇄 발현 벡터를 일시적 발현을 위해 293F 세포로 공동-형질감염시켰다. 무혈청 배지에서 7일 배양한 후, 세포 배양 상등액을 수집하고, ProteinA 컬럼으로 정제하여 항체 단백질을 얻었다. 정제된 항체를 PBS로 투석하고, 최종적으로 BCA 단백질 분석 키트(Pierce, 23225)로 정량화하였다. 재조합 인간 PD-L1-His 단백질(Origincell Therapeutics Co., Ltd.)에 대한 상기 전장 항체의 결합 친화성은 분자 상호작용 분석기(Octet RED384, Pall ForteBio Analytics Co.,Ltd.로부터 구입)를 사용하여 분석되었다. 항원-항체 결합 동역학은 분자 상호작용 분석기(Octet RED384, Pall ForteBio Analytics Co.,Ltd.로부터 구입)를 사용하고 0.1% BSA 및 0.02% Tween 20을 함유하는 PBS 완충액을 사용하여 바이오필름 간섭(BLI) 기술에 의해 분석되었다. 50nM의 농도를 갖는 항체를 AHC 센서로 고정시키고, 1500rpm에서 5분 동안 결합시킨 후, 이중-희석된 항원 용액(50, 25, 12.5, 6.25, 3.125, 1.56nM)으로 1500 rpm에서 7 농도 구배로 5분간 결합시키고, 최종적으로 1500회전에서 10분 동안 해리시켰다. AHC 센서를 글리신 펄스로 재생한 후 재사용하였다. 얻어진 결과는 옥테트 데이터 분석 9.0 소프트웨어(Pall ForteBio Analytics Co.,Ltd.)에 의해 분석되어 K D , K on (1/Ms) 및 K off (1/s)를 수득한다. 친화성이 증가된 수득된 돌연변이 클론을 스크리닝한 후, 상이한 CDR 영역에서 친화성이 증가한 아미노산 변이점을 중첩 PCR과 같은 방법을 사용하여 조합하고, 이어서 상기 방법에 따라 항체 단백질을 발현 및 정제하고 친화성을 측정하였다. 다수의 스크리닝 및 조합 후, 높은 친화성을 갖는 상부 5개의 YN-003 항체 돌연변이 클론을 각각 YN-035 항체, YN-036 항체, YN-037 항체, YN-038 항체, 및 YN-039 항체로 명명하였다. 상기 방법에 의해 얻어진 5개의 항체의 친화성 값은 표 9에 나타난다. 그 결과는 YN-035 항체, YN-036 항체, YN-037 항체, YN-038 항체, 및 YN-039 항체의 친화성이 모두 항-PD-L1 항체 Atezolizumab 및 Avelumab 보다 더 높음을 보여준다.
인간 PD-L1-His 에 대한 PD-L1 항체의 결합 친화성
항체 인간 PD-L1-His
K D (M) K D Error Kon (1/Ms) Kon Error Koff (1/s) Koff Error Full R^2
Atezolizumab 9.16 x 10-10 8.79 x 10-12 3.78 x 105 1.95 x 103 3.46 x 10-4 2.80 x 10-6 0.9984
Avelumab 1.03 x 10-9 9.20 x 10-12 2.96 x 105 1.31 x 103 3.05 x 10-4 2.37 x 10-6 0.9991
YN-035 4.52 x 10-10 3.54 x 10-12 4.27 x 105 1.16 x 103 1.93 x 10-4 1.42 x 10-6 0.9995
YN-036 4.74 x 10-10 4.95 x 10-12 3.69 x 105 1.22 x 103 1.75 x 10-4 1.73 x 10-6 0.9994
YN-037 3.82 x 10-10 5.66 x 10-12 3.55 x 105 1.36 x 103 1.36 x 10-4 1.94 x 10-6 0.9991
YN-038 4.47 x 10-10 4.61 x 10-12 3.50 x 105 1.05 x 103 1.56 x 10-4 1.54 x 10-6 0.9995
YN-039 4.85 x 10-10 4.41 x 10-12 3.56 x 105 1.02 x 103 1.73 x 10-4 1.49 x 10-6 0.9995
YN-035 항체 중쇄 가변영역(YN-035 VH)의 아미노산 서열은 서열번호 31에 표시되고, YN-035 항체 중쇄의 아미노산 서열은 서열번호 32에 표시되고, YN-035 항체 경쇄 가변영역(YN-035 VL)의 아미노산 서열은 서열번호 33에 표시되고, YN-035 항체 경쇄의 아미노산 서열은 서열번호 34에 표시된다.
YN-036 항체 중쇄 가변영역(YN-036 VH)의 아미노산 서열은 서열번호 35에 표시되고, YN-036 항체 중쇄의 아미노산 서열은 서열번호 36에 표시되고, YN-036 항체 경쇄 가변영역(YN-036 VL)의 아미노산 서열은 서열번호 33에 표시되고, YN-036 항체 경쇄의 아미노산 서열은 서열번호 34에 표시된다.
YN-037 항체 중쇄 가변영역(YN-037 VH)의 아미노산 서열은 서열번호 35에 표시되고, YN-037 항체 중쇄의 아미노산 서열은 서열번호 36에 표시되고, YN-037 항체 경쇄 가변영역(YN-037 VL)의 아미노산 서열은 서열번호 37에 표시되고, YN-037 항체 경쇄의 아미노산 서열은 서열번호 38에 표시된다.
YN-038 항체 중쇄 가변영역(YN-038 VH)의 아미노산 서열은 서열번호 35에 표시되고, YN-038 항체 중쇄의 아미노산 서열은 서열번호 36에 표시되고, YN-038 항체 경쇄 가변영역(YN-038 VL)의 아미노산 서열은 서열번호 39에 표시되고, YN-038 항체 경쇄의 아미노산 서열은 서열번호 40에 표시된다.
YN-039 항체 중쇄 가변영역(YN-039 VH)의 아미노산 서열은 서열번호 35에 표시되고, YN-039 항체 중쇄의 아미노산 서열은 서열번호 36에 표시되고, YN-039 항체 경쇄 가변영역(YN-039 VL)의 아미노산 서열은 서열번호 41에 표시되고, YN-039 항체 경쇄의 아미노산 서열은 서열번호 42에 표시된다.
도 9는 항체 YN-003, 및 YN-035 내지 YN-039의 중쇄 가변영역 및 관련된 생식세포계열 서열의 아미노산 서열 정렬을 나타내고, 여기서 밑줄은 카밧 정의 방법에 따라 결정된 CDR이다. 도 10는 항체 YN-003, 및 YN-035 내지 YN-039의 경쇄 가변영역 및 관련된 생식세포계열 서열의 아미노산 서열 정렬을 나타내고, 여기서 밑줄은 카밧 정의에 따라 결정된 CDR이다. 이들 중, 항체 YN-003의 HCDR1의 아미노산 서열은 서열번호 46에 표시되고, YN-003의 HCDR1의 아미노산 서열은 서열번호 46에 표시되고, YN-035 내지 YN-039의 HCDR1의 아미노산 서열은 서열번호 47에 표시되고; 항체 YN-003의 HCDR2의 아미노산 서열 및 항체 YN-035 내지 YN-039의 HCDR2의 아미노산 서열은 서열번호 48에 표시되고; YN-003의 HCDR3의 아미노산 서열은 서열번호 50에 표시되고; YN-035의 HCDR3의 아미노산 서열은 서열번호 51에 표시되고; YN-036 내지 YN-039의 HCDR3의 아미노산 서열은 서열번호 52에 표시된다.
항체 YN-003의 LCDR1의 아미노산 서열은 서열번호 54에 표시되고, 항체 YN-035 및 YN-036의 LCDR1의 아미노산 서열은 서열번호 55에 표시되고, 항체 YN-037의 LCDR1의 아미노산 서열은 서열번호 56에 표시되고, 항체 YN-038의 LCDR1의 아미노산 서열은 서열번호 57에 표시되고, 항체 YN-039의 LCDR1의 아미노산 서열은 서열번호 58에 표시되고; 항체 YN-003의 LCDR2의 아미노산 서열 및 항체 YN-035 내지 YN-036의 LCDR2의 아미노산 서열은 서열번호 60에 표시되고, 항체 YN-037 내지 YN-039의 LCDR2의 아미노산 서열은 서열번호 61에 표시되고; 항체 YN-003의 LCDR3의 아미노산 서열은 서열번호 63에 표시되고; 항체 YN-035 내지 YN-039의 LCDR3의 아미노산 서열은 서열번호 64에 표시된다.
인간 PD-L1에 대한 PD-L1 항체 YN-035, YN-036, YN-037, YN-038, YN-039의 결합 활성을 유세포 분석법에 의해 검출하였다: 인간 PD-L1을 안정적으로 발현하는 CHO 세포 1 x 106/ml에 개별 이중-희석된 PD-L1 항체를 첨가하였다. 혼합물을 잘 혼합하고 4℃에서 1시간 동안 배양하였다. 세포 세척 후, Goat F(ab')2 항-인간 IgG-Fc (DyLight 650) (ab98593, Abcam)를 첨가하고 4℃에서 30분 동안 배양하였다. 세포 세척 후, 형광 강도를 유세포 분석기(Intellicyt iQue Screener)로 검출하였다. 실험 결과는 도 11에 도시되어 있다: YN-035, YN-036, YN-037, YN-038, YN-039 모두는 인간 PD-L1을 발현하는 CHO 세포에 효과적으로 결합할 수 있다.
인간 PD-L1/인간 PD-1에 대한 PD-L1 항체 YN-035, YN-036, YN-037, YN-038, YN-039의 억제 능력을 유세포측정법에 의해 검출하였다: 인간 PD-1-Fc 단백질(Origincell Therapeutics Co., Ltd.)을 비오틴 (EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin, Pierce, 21327)으로 표지하였다. 아포화된 농도의 비오틴으로 표지된 인간 PD-1-Fc를 인간 PD-L1을 안정적으로 발현하는 CHO 세포 1 x 106/ml에 첨가한 후, 개별 이중-희석된 항체를 즉시 첨가하고, 잘 혼합하고, 배양하였다(4℃, 1hr). 세포 세척 후, 스트렙타비딘 R-PE 접합체(life technology, SA10041)를 첨가하고, 배양하였다(4℃, 30분). 세포 세척 후, 형광 강도를 유세포 분석기(Intellicyt iQue Screener)로 검출하였다. 실험 결과는 도 12에 도시되어 있다: PD-L1 항체 YN-035, YN-036, YN-037, YN-038, YN-039 모두는 인간 PD-L1을 발현하는 CHO 세포에 대한 인간 PD-1의 결합을 효과적으로 억제할 수 있다.
마우스 PD-L1에 대한 PD-L1 항체 YN-035, YN-036, YN-037, YN-038, YN-039의 결합 활성을 유세포 분석법에 의해 검출하였다: 마우스 PD-L1을 안정적으로 발현하는 CHO 세포 1 x 106/ml에 개별 이중-희석된 PD-L1 항체를 첨가하였다. 혼합물을 잘 혼합하고 4℃에서 1시간 동안 배양하였다. 세포 세척 후, Goat F(ab')2 항-인간 IgG-Fc (DyLight 650) (ab98593)를 첨가하고 4℃에서 30분 동안 배양하였다. 세포 세척 후, 형광 강도를 유세포 분석기(Intellicyt iQue Screener)로 검출하였다. 실험 결과는 도 13에 도시되어 있다: YN-035, YN-036, YN-037, YN-038, YN-039 모두는 마우스 PD-L1을 발현하는 CHO 세포에 효과적으로 결합할 수 있다.
마우스 PD-L1/마우스 PD-1에 대한 PD-L1 항체 YN-035, YN-036, YN-037, YN-038, YN-039의 억제 능력을 유세포측정법에 의해 검출하였다: 마우스 PD-1-Fc 단백질(Origincell Therapeutics Co., Ltd.)을 비오틴 (EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin, Pierce, 21327)으로 표지하였다. 아포화된 농도의 비오틴으로 표지된 마우스 PD-1-Fc를 마우스 PD-L1을 안정적으로 발현하는 CHO 세포 1 x 106/ml에 첨가한 후, 개별 이중-희석된 항체를 즉시 첨가하고, 잘 혼합하고, 배양하였다(4℃, 1hr). 세포 세척 후, 스트렙타비딘 R-PE 접합체(life technology, SA10041)를 첨가하고, 배양하였다(4℃, 30분). 세포 세척 후, 형광 강도를 유세포 분석기(Intellicyt iQue Screener)로 검출하였다. 실험 결과는 도 14에 도시되어 있다: PD-L1 항체 YN-035, YN-036, YN-037, YN-038, YN-039 모두는 마우스 PD-L1을 안정적으로 발현하는 CHO 세포에 대한 마우스 PD-1의 결합을 효과적으로 억제할 수 있다.
실시예 17: 항-PD-L1/CD137 이중특이적 항체 YN-051 및 YN-052의 구성 및 동정
항-PD-L1/CD137 이중특이적 항체 YN-051의 제1 폴리펩티드 유전자를, 항- PD-L1 항체 YN-035의 중쇄 유전자 및 항-인간 CD137 항체 YN-006의 중쇄 및 경쇄 유전자를 사용하여 분자 클로닝 방법, 예컨대 중첩 PCR, 부위-특이적 돌연변이 등에 의해 구축하고, 재조합에 의해, AgeI 및 BamHI로 이중 소화된 pCMV-IgG1AEM 벡터 내로 클로닝하여, YN-051의 제1 폴리펩티드 발현 벡터를 구축하였다. YN-051의 제2 폴리펩티드 유전자는 YN-035의 경쇄 유전자와 동일하다. YN-035의 제2 폴리펩티드 발현 벡터는 YN-035의 경쇄 발현 벡터이다.
정확한 시퀀싱 후에, 항-PD-L1/CD137 이중특이적 항체 YN-051의 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드 발현 벡터를 일시적 발현을 위해 293F 세포로 공동-형질감염시켰다. 무혈청 배지에서 7일간 배양한 후, 세포 배양 상등액을 회수하고, Protein A 컬럼으로 정제하여 항체 단백질을 얻었다. 정제된 항체를 PBS로 투석하고, 최종적으로 BCA 단백질 분석 키트(Pierce, 23225)로 정량하였다.
YN-051의 제1 폴리펩티드의 아미노산 서열은 서열번호 43에 표시되고, YN-051의 제2 폴리펩티드의 아미노산 서열은 서열번호 34에 표시된다.
항-PD-L1/CD137 이중특이적 항체 YN-052의 제1 폴리펩티드 유전자를, 항- PD-L1 항체 YN-036의 중쇄 유전자 및 항-인간 CD137 항체 YN-006의 중쇄 및 경쇄 유전자를 사용하여 분자 클로닝 방법, 예컨대 중첩 PCR, 부위-특이적 돌연변이 등에 의해 구축하고, 재조합에 의해, AgeI 및 BamHI로 이중 소화된 pCMV-IgG1AEM 벡터 내로 클로닝하여, YN-052의 제1 폴리펩티드 발현 벡터를 구축하였다. YN-052의 제2 폴리펩티드 유전자는 YN-036의 경쇄 유전자와 동일하다. YN-052의 제2 폴리펩티드 발현 벡터는 YN-036의 경쇄 발현 벡터이다.
정확한 시퀀싱 후에, 항-PD-L1/CD137 이중특이적 항체 YN-052의 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드 발현 벡터를 일시적 발현을 위해 293F 세포로 공동-형질감염시켰다. 무혈청 배지에서 7일간 배양한 후, 세포 배양 상등액을 회수하고, Protein A 컬럼으로 정제하여 항체 단백질을 얻었다. 정제된 항체를 PBS로 투석하고, 최종적으로 BCA 단백질 분석 키트(Pierce, 23225)로 정량하였다.
YN-052의 제1 폴리펩티드의 아미노산 서열은 서열번호 44에 표시되고, YN-052의 제2 폴리펩티드의 아미노산 서열은 서열번호 34에 표시된다.
재조합 인간 PD-L1-His 단백질 (Origincell Therapeutics Co., Ltd.)에 대한 항-PD-L1/CD137 이중특이적 항체 YN-051 및 YN-052의 결합 친화성을 분자 상호작용 분석기(Octet RED384, Pall ForteBio Analytics Co.,Ltd.로부터 구입)에 의해 측정하였다. 항원-항체 결합 동역학은 분자 상호작용 분석기(Octet RED384, Pall ForteBio Analytics Co.,Ltd.로부터 구입)를 사용하고 0.1% BSA 및 0.02% Tween 20을 함유하는 PBS 완충액을 사용하여 바이오필름 간섭(BLI) 기술에 의해 분석되었다. 50 nM 농도의 항체를 AHC 센서로 고정시키고, 1500 rpm에서 5분간 결합시킨 후, 이중-희석된 항원 용액(50, 25, 12.5, 6.25, 3.125, 1.56nM)과 1500rpm에서 7 농도 구배로 5분 동안 결합시키고, 최종적으로 1500회전에서 10분 동안 해리시켰다. AHC 센서를 글리신 펄스로 재생한 후 재사용하였다. 얻어진 결과는 옥테트 데이터 분석 9.0 소프트웨어(Pall ForteBio Analytics Co.,Ltd.)에 의해 분석되어 K D , K on (1/Ms) 및 K off (1/s)를 수득하였다. 인간 PD-L1-Fc에 대한 YN-007의 결합 친화성의 측정된 결과는 표 10에 도시되어 있다.
인간 PD-L1-His에 대한 항-PD-L1/CD137 이중특이적 항체의 결합 친화성
항체 인간 PD-L1-His
K D (M) K D Error Kon (1/Ms) Kon Error Koff (1/s) Koff Error Full R^2
YN-051 5.17 x 10-10 4.97 x 10-12 5.32 x 105 2.54 x 103 2.75 x 10-4 2.29 x 10-6 0.9981
YN-052 5.72 x 10-10 5.69 x 10-12 4.48 x 105 2.06 x 103 2.57 x 10-4 2.26 x 10-6 0.9984
재조합 인간 CD137-His 단백질 (Origincell Therapeutics Co., Ltd.)에 대한 항-PD-L1/CD137 이중특이적 항체 YN-051 및 YN-052의 결합 친화성을 분자 상호작용 분석기(Octet RED384, Pall ForteBio Analytics Co.,Ltd.로부터 구입)에 의해 측정하였다. 항원-항체 결합 동역학은 분자 상호작용 분석기(Octet RED384, Pall ForteBio Analytics Co.,Ltd.로부터 구입)를 사용하고 0.1% BSA 및 0.02% Tween 20을 함유하는 PBS 완충액을 사용하여 바이오필름 간섭(BLI) 기술에 의해 분석되었다. 50 nM 농도의 항체를 AHC 센서로 고정시키고, 1500 rpm에서 5분간 결합시킨 후, 이중-희석된 재조합 인간 CD137-His 단백질 항원 용액(100, 50, 25, 12.5, 6.25, 3.125, 1.56nM)과 1500rpm에서 5분 동안 결합시키고, 최종적으로 1500회전에서 10분 동안 해리시켰다. AHC 센서를 글리신 펄스로 재생한 후 재사용하였다. 얻어진 결과는 옥테트 데이터 분석 9.0 소프트웨어(Pall ForteBio Analytics Co.,Ltd.)에 의해 분석되어 K D , K on (1/Ms) 및 K off (1/s)를 수득하였다.
인간 CD137에 대한 항-PD-L1/CD137 이중특이적 항체 YN-051 및 YN-052의 결합 친화성의 측정된 결과는 표 11에 도시되어 있다.
인간 CD137에 대한 항-PD-L1/CD137 이중특이적 항체의 결합 친화성
항체 인간 4-1BB-His
K D (M) K D Error kon (1/Ms) kon Error kdis (1/s) kdis Error Full R^2
YN-051 1.64 x 10-9 3.93 x 10-11 8.99 x 104 7.25 x 102 1.47 x 10-4 3.33 x 10-6 0.9981
YN-052 2.08 x 10-9 4.36 x 10-11 8.37 x 104 6.93 x 102 1.74 x 10-4 3.35 x 10-6 0.9982
인간 유방 세포 균주 MDA-MB-231 (Shanghai Chinese Academy of Sciences Cell Library)은 인간 PD-L1 분자를 고도로 발현한다. MDA-MB-231 세포에 대한 PD-1 항체 YN-035, YN-036 및 항-PD-L1/CD137 이중특이적 항체 YN-051 및 YN-052 의 결합은 유세포측정법에 의해 검출되었다: 1 x 106/ml의 MDA-MB-231 세포에 각각 개별 이중-희석된 항체를 첨가하고, 잘 혼합하고, 4℃에서 1시간 동안 배양하였다. 세포 세척 후, Goat F(ab')2 항-인간 IgG-Fc (DyLight 650) (ab98593, abcam) 를 첨가하고 4℃에서 30분 동안 배양하였다. 세포 세척 후, 형광 강도를 유세포 분석기(Intellicyt iQue Screener)로 검출하였다. 실험 결과는 도 15에 도시되어 있다: YN-035, YN-036, YN-051 및 YN-052 모두는 MDA-MB-231 세포에 효과적으로 결합할 수 있다.
인간 PD-L1에 대한 PD-1 항체 YN-035, YN-036 및 항-PD-L1/CD137 이중특이적 항체 YN-051 및 YN-052의 결합 활성을 유세포측정법에 의해 검출하였다: 인간 PD-L1을 안정적으로 발현하는 CHO 세포 1 x 106/ml에 개별적으로 이중-희석된 항체를 각각 첨가하고, 잘 혼합하고, 4℃에서 1시간 동안 배양하였다. 세포 세척 후, Goat F(ab')2 항-인간 IgG-Fc (DyLight 650) (ab98593, abcam)를 첨가하고 4℃에서 30분 동안 배양하였다. 세포 세척 후, 형광 강도를 유세포 분석기(Intellicyt iQue Screener)로 검출하였다. 실험 결과는 도 16에 도시되어 있다: YN-035, YN-036, YN-051, YN-052, YN-007 모두는 인간 PD-L1을 발현하는 CHO 세포에 효과적으로 결합할 수 있다.
인간 PD-L1/인간 PD-1에 대한 PD-1 항체 YN-035, YN-036 및 항-PD-L1/CD137 이중특이적 항체 YN-051, YN-052, YN-007의 억제 능력을 유세포측정법에 의해 검출하였다: 인간 PD-l-Fc 단백질을 비오틴(EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin, Pierce, 21327)으로 표지하였다. 아포화된 농도의 비오틴으로 표지된 인간 PD-1-Fc를 인간 PD-L1을 안정적으로 발현하는 CHO 세포 1 x 106/ml에 첨가한 후, 개별 이중-희석된 항체를 즉시 첨가하고, 잘 혼합하고, 배양하였다(4℃, 1hr). 세포 세척 후, 스트렙타비딘 R-PE 접합체(life technology, SA10041)를 첨가하고, 배양하였다(4℃, 30분). 세포 세척 후, 형광 강도를 유세포 분석기(Intellicyt iQue Screener)로 검출하였다. 실험 결과는 도 17에 도시되어 있다: PD-L1 항체 YN-035, YN-036, YN-051, YN-052, YN-007 모두는 인간 PD-1이 인간 PD-L1을 발현하는 CHO 세포에 결합하는 것을 효과적으로 억제할 수 있다.
마우스 PD-L1에 대한 PD-1 항체 YN-035, YN-036 및 항-PD-L1/CD137 이중특이적 항체 YN-007, YN-051 및 YN-052의 결합 활성을 유세포측정법에 의해 검출하였다: 마우스 PD-L1을 안정적으로 발현하는 CHO 세포 1 x 106/ml에 개별적으로 이중-희석된 항체를 각각 첨가하고, 잘 혼합하고, 4℃에서 1시간 동안 배양하였다. 세포 세척 후, Goat F(ab')2 항-인간 IgG-Fc (DyLight 650) (ab98593, abcam)를 첨가하고 4℃에서 30분 동안 배양하였다. 세포 세척 후, 형광 강도를 유세포 분석기(Intellicyt iQue Screener)로 검출하였다. 실험 결과는 도 18에 도시되어 있다: YN-035, YN-036, YN-051, YN-052, YN-007 모두는 마우스 PD-L1을 발현하는 CHO 세포에 효과적으로 결합할 수 있다.
마우스 PD-L1/ 마우스 PD-1에 대한 PD-1 항체 YN-035, YN-036 및 항-PD-L1/CD137 이중특이적 항체 YN-007, YN-051 및 YN-052의 억제 능력을 유세포측정법에 의해 검출하였다: 마우스 PD-l-Fc 단백질을 비오틴(EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin, Pierce, 21327)으로 표지하였다. 아포화된 농도의 비오틴으로 표지된 마우스 PD-1-Fc를 마우스 PD-L1을 안정적으로 발현하는 CHO 세포 1 x 106/ml에 첨가한 후, 개별 이중-희석된 항체를 즉시 첨가하고, 잘 혼합하고, 배양하였다(4℃, 1hr). 세포 세척 후, 스트렙타비딘 R-PE 접합체(life technology, SA10041)를 첨가하고, 배양하였다(4℃, 30분). 세포 세척 후, 형광 강도를 유세포 분석기(Intellicyt iQue Screener)로 검출하였다. 실험 결과는 도 19에 도시되어 있다: PD-L1 항체 YN-035, YN-036, YN-051, YN-052, YN-007 모두는 마우스 PD-1이 마우스 PD-L1을 발현하는 CHO 세포에 결합하는 것을 효과적으로 억제할 수 있다.
인간 CD137에 대한 CD137 항체 YN-006 및 항-PD-L1/CD137 이중특이적 항체 YN-007, YN-051 및 YN-052의 결합 활성을 유세포측정법에 의해 검출하였다: 인간 CD137을 안정적으로 발현하는 293T 세포 1 x 106/ml에 개별적으로 이중-희석된 항체를 각각 첨가하고, 잘 혼합하고, 4℃에서 1시간 동안 배양하였다. 세포 세척 후, Goat F(ab')2 항-인간 IgG-Fc (DyLight 650) (ab98593, abcam)를 첨가하고 4℃에서 30분 동안 배양하였다. 세포 세척 후, 형광 강도를 유세포 분석기(Intellicyt iQue Screener)로 검출하였다. 실험 결과는 도 20에 도시되어 있다: YN-006, YN-007, YN-051 및 YN-052 모두는 인간 CD137을 발현하는 293T 세포에 효과적으로 결합할 수 있다.
실시예 18: SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE) 분석
상기와 같이 정제한 후, 항체 YN-003, YN-006, YN-007, YN-035, YN-036, YN-051, YN-052는 SDS-PAGE에 의해 그들의 분자량에 대한 환원 및 비환원 조건 하에서 측정되었다. 결과는 도 21에 도시되어 있다: 비환원 조건 하에서(도 21a에 도시된 바와 같음), 단일클론 항체 YN-003, YN006, YN-035, 및 YN-036는 모두 약 150kDa의 분자량을 갖는 밴드로서 제시되고, 반면에 이중특이적 항체 YN-007, YN-051, YN-052는 모두 약 200kDa의 분자량을 가지는 밴드로서 제시된다. 환원 조건 하에서(도 21b에 도시된 바와 같음), 단일클론 항체 YN-003, YN006, YN-035, 및 YN-036은 모두 약 55kDa 및 25kDa의 분자량을 갖는 2개의 밴드로서 제시되고, 반면에 이중특이적 항체 YN-007, YN-051, YN-052는 모두 약 75kDa 및 25kDa의 분자량을 갖는 2개의 밴드로서 제시된다.
실시예 19: 항-PD-L1/CD137 이중특이적 항체의 작용 활성(루시퍼레이즈 활성 검정)
인간 CD137을 발현하는 293T 세포 및 안정적으로 통합된 NFκB 루시퍼레이즈 리포터 유전자를 제조하였다. 세포를 수확하고, 세척하고, 페놀 레드가 없는 완전한 배지 (10% 소 태아 혈청, HEPES 완충액, 비필수 아미노산 및 L-글루타민을 함유하는 DMEM 배지)에 6 x 105 cells/mL의 밀도로 재현탁시켰다. 96-웰 플레이트(PerkinElmer로부터 구입)를 플레이팅하고, 50 μl의 세포 현탁액을 각 웰에 첨가하였다. 가교(cross-linked) 항체(goat 항-인간 IgG Fc)를 2.5:1의 비율로 첨가한 후, YN-006 (10 μg/ml), YN-035 (10 μg/ml), YN-035+YN-006 (10 μg/ml+10μg/ml), YN-051 (10 μg/ml), YN-003+YN006 (10 μg/ml+10μg/ml), YN-007 (10 μg/ml), 및 대조군 항체 IgG Fc (10 μg/ml)를 각각 첨가하고, 37℃에서 5시간 동안 배양하였다. 이어서, Bright-Glo 루시퍼레이즈 시약(Promega로부터 구입) 75μL를 첨가하고, 마이크로플레이트 리더(Tecan으로부터 구입)를 사용하여 루시퍼레이즈 활성을 측정하였다. 각 항체 처리 세포군과 비항체 처리군의 세포 형광값의 비율을 비교하였다(도 22 참조). 결과는 대조군 IgG Fc와 비교하여 YN-006, YN035+YN006, YN003+YN006, YN-007, YN-051 모두가 명백한 작용 활성(agonistic activity)을 갖는 반면, 항-PD-L1 항체 YN-035는 그렇지 않음을 보여준다(도 22 참조).
실시예 20: 대장암-보유 마우스에서의 항-PD-L1/CD137 이중특이적 항체의 항종양 효과의 연구
0일째에, 인간 4-1BB를 갖는 6-8주령의 C57BL/6 암컷 마우스 (B-hTNFRSF9 (4-1BB) 마우스, Beijing Biocytogen Co., Ltd.로부터 구입)를 3 x 106 MC38 마우스 결장직장암 세포 (Shanghai Linyuan Biotechnology Co., Ltd.)로 피하 접종하였다. 6일째에, 마우스를 8개의 그룹으로 균일하게 분할하였다. 각 군의 종양-보유 마우스에 각각 PBS (주2회, 총2주), 대조군 항체 인간 IgG-Fc 단백질 (7.5 mg/kg, 주2회, 총2주), CD137 항체 YN-006 항체 (3 mg/kg, 주2회, 총2주), PD-L1 항체 YN-035 (7.5 mg/kg, 주2회, 총2주), CD137 항체 YN-006 항체 (3 mg/kg, 주2회, 총2주)+PD-L1 항체 YN-035 (7.5 mg/kg, 주2회, 총2주), 항-PD-L1/CD137 이중특이적 항체 YN-051 (7.5 mg/kg, 주2회, 총2주), 항-PD-L1 항체 Atezolizumab (7.5 mg/kg, 주2회, 총2주), 및 항-PD-L1 항체 Avelumab (7.5 mg/kg, 주2회, 총2주)을 복강내 주사하였다. 5마리의 마우스를 포함하는 PBS 그룹을 제외하고, 나머지 7개의 그룹 각각은 6마리의 마우스를 포함한다. 각 그룹의 마우스는 체중 및 종양 크기의 변화에 대해 규칙적으로 관찰되었다. 실험 결과를 도 23 및 표 12에 나타내었다. 도 23은 YN006, YN035, YN006+YN035, YN051, Atezolizumab, 및 Avelumab 모두 PBS 그룹 또는 대조군 항체 인간 IgG-Fc 그룹과 비교하여 유의한 항종양 활성을 갖는다는 것을 보여준다. 이들 중에서, YN006+YN035 및 YN051의 항종양 활성은 YN006, YN035, Atezolizumab, 및 Avelumab 보다 상당히 강하다. 표 12는 동물 실험의 마지막에, YN051 그룹 내에서 5마리의 마우스가 종양이 완전히 퇴행된 반면, YN006+YN035 그룹 내에서는 단지 1마리의 마우스만이 종양이 완전 퇴출되었고, 이는 YN051의 치료 효과가 YN006+YN035의 치료 효과보다 좋음을 나타내는 것을 보여준다.
종양이 완전히 제거된 각 그룹의 마우스의 수
항체 종양이 완전히 제거된 마우스의 수/ 각 그룹의 총 실험 동물 수
PBS 0/5
인간 IgG1 Fc 0/6
Atezolizumab 0/6
Avelumab 0/6
YN-006 0/6
YN-035 1/6
YN-006+YN-035 1/6
YN-051 5/6
전술한 상세한 설명은 설명 및 실시예로서 제공되며, 첨부된 청구범위의 범위를 제한하려는 것이 아니다. 현재, 본 명세서에 열거된 구현예의 다양한 변화는 당업자에게 명백하며 첨부된 청구범위 및 이들의 등가의 해결책의 범위 내에 있다.
SEQUENCE LISTING <110> SHANGHAI ORIGINCELL MEDICAL TECHNOLOGY CO., LTD LI Bohua <120> ANTI-PD-L1 ANTIBODY AND USE THEREOF <130> 0065-PA-015 <160> 92 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence encoding PD-L1 antibody YN-002 VH <400> 1 caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaggaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc agctatgcta tcagctgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggaagg atcatcccta tccttggtat agcaaactac 180 gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggaca aatccacgag cacagcctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagaacgatg 300 gacggataca gctatggcaa ctttgactac tggggccagg gaaccctggt cactgtctcc 360 tca 363 <210> 2 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH of PD-L1 antibody YN-002 <400> 2 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Arg Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Ile Ser Trp Val 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actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag 600 acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaagttgag 660 cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg 720 ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 780 cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 840 tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac 900 aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 960 aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc 1020 tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggat 1080 gagctgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac 1140 atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc 1200 gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 1260 tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 1320 acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt aaa 1353 <210> 15 <211> 217 <212> PRT <213> Artificial 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Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys 20 <210> 90 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 4-1BB antibody YN-005/006 L-FR2 <400> 90 Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 91 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 4-1BB antibody YN-005/006 L-FR3 <400> 91 Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser 1 5 10 15 Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 92 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 4-1BB antibody YN-005/006 L-FR4 <400> 92 Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 1 5 10

Claims (72)

  1. 3x10-9M 이하의 KD로 PD-L1 단백질에 결합하는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항체는 LCDR1을 포함하는 항체 경쇄 또는 이의 단편을 포함하고, 상기 LCDR1은 서열번호 53로 표시되는 아미노산 서열(TGTX1SX2VGGYX3X4VS)을 포함하며; 여기서 X1은 S, R 또는 V이고; X2는 D, E 또는 S이며; X3은 N 또는 R이고; X4는 Y 또는 E이며, 상기 LCDR1은 항체 카밧 수(Kabat number)의 지수에 따라 결정된 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체.
  3. 제2항에 있어서, 상기 LCDR1은 서열번호 54-58로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 경쇄 또는 이의 단편은 LCDR2를 포함하고, 상기 LCDR2는 서열번호 59로 표시되는 아미노산 서열(X1NSX2RPS)을 포함하며, 여기서 X1은 G 또는 E이고; X2는 N 또는 I이며, 상기 LCDR2는 항체 카밧 수(Kabat number)의 지수에 따라 결정된 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체.
  5. 제4항에 있어서, 상기 LCDR2는 서열번호 60-61로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 경쇄 또는 이의 단편은 LCDR3을 포함하고, 상기 LCDR3은 서열번호 62로 표시되는 아미노산 서열(QSYDSSLSGX1V)을 포함하며, 여기서 X1은 S 또는 T이고, 상기 LCDR3은 항체 카밧 수(Kabat number)의 지수에 따라 결정된 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 경쇄 또는 이의 단편은 프레임워크 영역 L-FR1, L-FR2, L-FR3 및 L-FR4를 추가로 포함하는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체.
  8. 제7항에 있어서, 상기 프레임워크 영역은 인간 컨센서스(consensus) 프레임워크 서열 및 인간 생식세포계열(germline) 서열로 구성된 군에서 선택되는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체.
  9. 제7항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 L-FR1의 C-말단은 상기 LCDR1의 N-말단에 직접 또는 간접적으로 연결되고, 상기 L-FR1은 서열번호 71로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체.
  10. 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 L-FR2는 상기 LCDR1및 상기 LCDR2 사이에 위치하고, 상기 L-FR2는 서열번호 72로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체.
  11. 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 L-FR3은 상기 LCDR2및 상기 LCDR3 사이에 위치하고, 상기 L-FR3은 서열번호 73-75로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체.
  12. 제7항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 L-FR4의 N-말단은 상기 LCDR3의 C-말단에 직접 또는 간접적으로 연결되고, 상기 L-FR4는 서열번호 76으로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체.
  13. 제2항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 경쇄 또는 이의 단편은 경쇄 가변영역 VL을 포함하고, 상기 경쇄 가변영역 VL은 서열번호 4, 서열번호 11, 서열번호 33, 서열번호 37, 서열번호 39 및 서열번호 41로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체.
  14. 제2항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 경쇄 또는 이의 단편은 인간 불변영역을 추가로 포함하고, 상기 인간 불변영역은 인간 Igλ 불변영역을 포함하는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체.
  15. 제2항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 경쇄 또는 이의 단편은 서열번호 8, 서열번호 15, 서열번호 34, 서열번호 38, 서열번호 40 및 서열번호 42로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 HCDR1을 포함하는 항체 중쇄 또는 이의 단편을 포함하고, 상기 HCDR1은 서열번호 45로 표시되는 아미노산 서열(X1YAIS)을 포함하며, 여기서 X1은 S 또는 T이고, 상기 HCDR1은 항체 카밧 수(Kabat number)의 지수에 따라 결정된 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체.
  17. 제16항에 있어서, 상기 항체 중쇄 또는 이의 단편은 HCDR2를 포함하고, 상기 HCDR2는 서열번호 48로 표시되는 아미노산 서열을 포함하며, 상기 HCDR2는 항체 카밧 수(Kabat number)의 지수에 따라 결정된 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체.
  18. 제16항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 중쇄 또는 이의 단편은 HCDR3을 포함하고, 상기 HCDR3은 서열번호 49로 표시되는 아미노산 서열(TMX1X2YX3X4GNX5DY)을 포함하며; 여기서 X1은 D, E 또는 G고, X2는 G 또는 E이며, X3은 S 또는 G고, X4는 Y 또는 F이며, X5는 F 또는 Y이고, 상기 HCDR3은 항체 카밧 수(Kabat number)의 지수에 따라 결정된 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체.
  19. 제18항에 있어서, 상기 HCDR3은 서열번호 50-52로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체.
  20. 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 중쇄 또는 이의 단편은 프레임워크 영역 H-FR1, H-FR2, H-FR3, 및 H-FR4를 추가로 포함하는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체.
  21. 제20항에 있어서, 상기 프레임워크 영역은 인간 컨센서스(consensus) 프레임워크 서열 및 인간 생식세포계열(germline) 서열로 구성된 군에서 선택되는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체.
  22. 제20항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 H-FR1의 C-말단은 상기 HCDR1의 N-말단에 직접 또는 간접적으로 연결되고, 상기 H-FR1은 서열번호 65-67로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체.
  23. 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 H-FR2는 상기 HCDR1및 상기 HCDR2 사이에 위치하고, 상기 H-FR2는 서열번호 68로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체.
  24. 제20항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 H-FR3은 상기 HCDR2및 상기 HCDR3 사이에 위치하고, 상기 H-FR3은 서열번호 69로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체.
  25. 제20항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 H-FR4의 N-말단은 상기 HCDR3의 C-말단에 직접 또는 간접적으로 연결되고, 상기 H-FR4는 서열번호 70으로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체.
  26. 제16항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 중쇄 또는 이의 단편은 중쇄 가변영역 VH를 포함하고, 상기 중쇄 가변영역 VH는 서열번호 2, 서열번호 9, 서열번호 31 및 서열번호 35로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체.
  27. 제16항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 중쇄 또는 이의 단편은 인간 불변영역을 추가로 포함하고, 상기 인간 불변영역은 인간 IgG1 불변영역을 포함하는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체.
  28. 제16항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 중쇄 또는 이의 단편은 서열번호 6, 서열번호 13, 서열번호 32 및 서열번호 36으로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PD-L1 단백질은 인간 PD-L1 단백질 및 뮤린(murine) PD-L1 단백질로 구성된 군에서 선택되는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체.
  30. 5x10-9M 이하의 KD로 CD137 단백질에 결합하는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체.
  31. 제30항에 있어서, 3x10-9M 이하의 KD로 CD137 단백질에 결합하는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체.
  32. 제30항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 종양을 완화 또는 치료할 수 있는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체.
  33. 제32항에 있어서, 상기 종양은 대장암(colon cancer)을 포함하는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체.
  34. 제30항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 항체 경쇄 또는 이의 단편을 포함하는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체.
  35. 제34항에 있어서, 상기 경쇄 또는 이의 단편은 LCDR1-3을 포함하고, 상기 LCDR1-3의 아미노산 서열은 서열번호 80-82에 순차적으로 표시된 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체.
  36. 제34항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 경쇄 또는 이의 단편은 프레임워크 영역 L-FR1, L-FR2, L-FR3 및 L-FR4를 추가로 포함하는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체.
  37. 제36항에 있어서, 상기 프레임워크 영역은 인간 컨센서스(consensus) 프레임워크 서열 및 인간 생식세포계열(germline) 서열로 구성된 군에서 선택되는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체.
  38. 제36항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 L-FR1의 C-말단은 상기 LCDR1의 N-말단에 직접 또는 간접적으로 연결되고, 상기 L-FR1은 서열번호 89로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체.
  39. 제36항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 L-FR2는 상기 LCDR1및 상기 LCDR2 사이에 위치하고, 상기 L-FR2는 서열번호 90으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체.
  40. 제38항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 L-FR3은 상기 LCDR2및 상기 LCDR3 사이에 위치하고, 상기 L-FR3은 서열번호 91로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체.
  41. 제38항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 L-FR4의 N-말단은 상기 LCDR3의 C-말단에 직접 또는 간접적으로 연결되고, 상기 L-FR4는 서열번호 92로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체.
  42. 제34항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 경쇄 또는 이의 단편은 경쇄 가변영역 VL을 포함하고, 상기 경쇄 가변영역 VL은 서열번호 20으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체.
  43. 제34항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 경쇄 또는 이의 단편은 인간 불변영역을 추가로 포함하고, 상기 인간 불변영역은 인간 Igλ 불변영역을 포함하는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체.
  44. 제34항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 경쇄 또는 이의 단편은 서열번호 23으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체.
  45. 제30항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 중쇄 또는 이의 단편을 포함하고, 상기 중쇄 또는 이의 단편은 HCDR1-3을 포함하며, 상기 HCDR1-3의 아미노산 서열은 서열번호 77-79에 순차적으로 표시된 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체.
  46. 제45항에 있어서, 상기 항체 중쇄 또는 이의 단편은 프레임워크 영역 H-FR1, H-FR2, H-FR3, 및 H-FR4를 추가로 포함하는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체.
  47. 제46항에 있어서, 상기 프레임워크 영역은 인간 컨센서스(consensus) 프레임워크 서열 및 인간 생식세포계열(germline) 서열로 구성된 군에서 선택되는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체.
  48. 제46항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 H-FR1의 C-말단은 상기 HCDR1의 N-말단에 직접 또는 간접적으로 연결되고, 상기 H-FR1은 서열번호 84-85로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체.
  49. 제46항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 H-FR2는 상기 HCDR1및 상기 HCDR2 사이에 위치하고, 상기 H-FR2는 서열번호 86으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체.
  50. 제46항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 H-FR3은 상기 HCDR2및 상기 HCDR3 사이에 위치하고, 상기 H-FR3은 서열번호 87로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체.
  51. 제46항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 H-FR4의 N-말단은 상기 HCDR3의 C-말단에 직접 또는 간접적으로 연결되고, 상기 H-FR4는 서열번호 88로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체.
  52. 제46항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 중쇄 또는 이의 단편은 중쇄 가변영역 VH를 포함하고, 상기 중쇄 가변영역 VH는 서열번호 18 및 서열번호 25로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체.
  53. 제45항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 중쇄 또는 이의 단편은 인간 불변영역을 추가로 포함하고, 상기 인간 불변영역은 인간 IgG 불변영역을 포함하는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체.
  54. 제45항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 중쇄 또는 이의 단편은 서열번호 21 및 서열번호 27로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체.
  55. 제30항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CD137 단백질은 인간 CD137 단백질을 포함하는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체.
  56. 2x10-9M 이하의 KD로 PD-L1 단백질에 결합하고, 8x10-9M 이하의 KD로 CD137 단백질에 결합하는 이중특이적 항체.
  57. 제56항에 있어서, 상기 PD-L1 단백질에 특이적으로 결합하는 제1표적 모이어티(targeting moiety)를 포함하고, 상기 제1표적 모이어티는 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 따른 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체를 포함하는 이중특이적 항체.
  58. 제56항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CD137 단백질에 특이적으로 결합하는 제2표적 모이어티(targeting moiety)를 포함하고, 상기 제2표적 모이어티는 제30항 내지 제55항 중 어느 한 항에 따른 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체를 포함하는 이중특이적 항체.
  59. 제57항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, CD137 단백질에 결합하는 상기 항체는 scFv를 포함하고, 상기 scFv는 서열번호 83으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 이중특이적 항체.
  60. 제56항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 제1폴리펩티드 사슬 및 제2폴리펩티드 사슬을 포함하고, 상기 제1폴리펩티드 사슬은 PD-L1 단백질에 결합하는 항체의 상기 중쇄 가변영역, CD137 단백질에 결합하는 항체의 상기 중쇄 가변영역, 및 CD137 단백질에 결합하는 항체의 상기 경쇄 가변영역을 포함하며; 상기 제2폴리펩티드 사슬은 PD-L1 단백질에 결합하는 항체의 상기 경쇄 가변영역을 포함하는 이중특이적 항체.
  61. 제60항에 있어서, 상기 제1폴리펩티드 사슬에서, PD-L1 단백질에 결합하는 항체의 상기 중쇄 가변영역은 CD137 단백질에 결합하는 항체의 상기 중쇄 가변영역의 N-말단에 위치하고, CD137 단백질에 결합하는 항체의 상기 중쇄 가변영역은 CD137 단백질에 결합하는 항체의 상기 경쇄 가변영역의 N-말단에 위치하며;
    대안적으로, PD-L1 단백질에 결합하는 항체의 상기 중쇄 가변영역은 CD137 단백질에 결합하는 항체의 상기 경쇄 가변영역의 N-말단에 위치하고, CD137 단백질에 결합하는 항체의 상기 경쇄 가변영역은 CD137 단백질에 결합하는 항체의 상기 중쇄 가변영역의 N-말단에 위치하는 이중특이적 항체.
  62. 제60항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 제1폴리펩티드 사슬에서 CD137 단백질에 결합하는 항체의 상기 경쇄 가변영역 및 CD137 단백질에 결합하는 항체의 상기 중쇄 가변영역은 scFv를 구성하는 이중특이적 항체.
  63. 제60항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1폴리펩티드 사슬은 인간 IgG 불변영역을 추가로 포함하고, 상기 인간 IgG 불변영역은 PD-L1 단백질에 결합하는 항체의 상기 중쇄 가변영역의 C-말단에 위치하고 CD137 단백질에 결합하는 항체의 상기 경쇄 가변영역의 N-말단에 위치하며; 대안적으로, 상기 인간 IgG 불변영역은 PD-L1 단백질에 결합하는 항체의 상기 중쇄 가변영역의 C-말단에 위치하고 CD137 단백질에 결합하는 항체의 상기 중쇄 가변영역의 N-말단에 위치하는 이중특이적 항체.
  64. 제60항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1폴리펩티드 사슬은 서열번호 30, 서열번호 43 및 서열번호 44로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 이중특이적 항체.
  65. 제60항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2폴리펩티드 사슬은 서열번호 15 및 서열번호 34로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 이중특이적 항체.
  66. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 따른 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체, 제30항 내지 제55항 중 어느 한 항에 따른 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체 또는 제56항 내지 제65항 중 어느 한 항에 따른 이중특이적 항체를 코딩하는 하나 이상의 단리된 핵산분자.
  67. 제66항에 따른 핵산분자를 포함하는 벡터.
  68. 제66항에 따른 핵산분자 또는 제67항에 따른 벡터를 포함하는 세포.
  69. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 따른 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체, 제30항 내지 제55항 중 어느 한 항에 따른 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체 또는 제56항 내지 제65항 중 어느 한 항에 따른 이중특이적 항체의 발현을 가능하게 하는 조건 하에서 제68항에 따른 세포를 배양하는 단계를 포함하는 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 따른 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체, 제30항 내지 제55항 중 어느 한 항에 따른 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체 또는 제56항 내지 제65항 중 어느 한 항에 따른 이중특이적 항체를 제조하는 방법.
  70. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 따른 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체, 제30항 내지 제55항 중 어느 한 항에 따른 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체 또는 제56항 내지 제65항 중 어느 한 항에 따른 이중특이적 항체, 제66항에 따른 핵산분자, 제67항에 따른 벡터 및/또는 제68항에 따른 세포, 및 임의의 약학적으로 허용 가능한 보조제를 포함하는 약학 조성물.
  71. 종양을 완화 또는 치료하기 위한 의약의 제조에서 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 따른 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체, 제30항 내지 제55항 중 어느 한 항에 따른 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체 또는 제56항 내지 제65항 중 어느 한 항에 따른 이중특이적 항체, 제66항에 따른 핵산분자, 제67항에 따른 벡터, 제68항에 따른 세포 및/또는 제70항에 따른 약학 조성물의 용도.
  72. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 따른 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 변이체 또는 제56항 내지 제65항 중 어느 한 항에 따른 이중특이적 항체, 제66항에 따른 핵산분자, 제67항에 따른 벡터, 제68항에 따른 세포 및/또는 제70항에 따른 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 PD-1 단백질에 대한 PD-L1 단백질의 결합을 억제하는 방법.
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