EA044684B1 - Антитело против pd-l1 и его применение - Google Patents
Антитело против pd-l1 и его применение Download PDFInfo
- Publication number
- EA044684B1 EA044684B1 EA202092420 EA044684B1 EA 044684 B1 EA044684 B1 EA 044684B1 EA 202092420 EA202092420 EA 202092420 EA 044684 B1 EA044684 B1 EA 044684B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- antibody
- seq
- amino acid
- acid sequence
- variant
- Prior art date
Links
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 610
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 404
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 384
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 288
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 288
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 285
- 101000851370 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 9 Proteins 0.000 claims description 145
- 102100036856 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 9 Human genes 0.000 claims description 127
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 115
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 113
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 113
- 102000008096 B7-H1 Antigen Human genes 0.000 claims description 95
- 108010074708 B7-H1 Antigen Proteins 0.000 claims description 95
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 71
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 47
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 44
- 230000008685 targeting Effects 0.000 claims description 21
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 20
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 15
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 15
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 11
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 9
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 5
- 229940126601 medicinal product Drugs 0.000 claims 1
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 168
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 113
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 51
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 46
- 101001117317 Homo sapiens Programmed cell death 1 ligand 1 Proteins 0.000 description 43
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 40
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 37
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 37
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 37
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 36
- NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 1-methylethyl 11-methoxy-3,7,11-trimethyl-2,4-dodecadienoate Chemical compound COC(C)(C)CCCC(C)CC=CC(C)=CC(=O)OC(C)C NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 35
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 35
- 238000000034 method Methods 0.000 description 34
- 102000048776 human CD274 Human genes 0.000 description 32
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 26
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 24
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 24
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 24
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 23
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 23
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 22
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 21
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 21
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 20
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 20
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 19
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 19
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 18
- 101001117316 Mus musculus Programmed cell death 1 ligand 1 Proteins 0.000 description 16
- 238000012575 bio-layer interferometry Methods 0.000 description 16
- 102000050327 human TNFRSF9 Human genes 0.000 description 16
- 230000004001 molecular interaction Effects 0.000 description 15
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 15
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 14
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 14
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 13
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 13
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 12
- 102100024216 Programmed cell death 1 ligand 1 Human genes 0.000 description 12
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 12
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 11
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 11
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 11
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 11
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 10
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 10
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 10
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 101000611936 Homo sapiens Programmed cell death protein 1 Proteins 0.000 description 9
- 230000006870 function Effects 0.000 description 9
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 9
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- 101000914484 Homo sapiens T-lymphocyte activation antigen CD80 Proteins 0.000 description 8
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 8
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 8
- 101100519207 Mus musculus Pdcd1 gene Proteins 0.000 description 8
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 8
- 102100027222 T-lymphocyte activation antigen CD80 Human genes 0.000 description 8
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 8
- 229960003852 atezolizumab Drugs 0.000 description 8
- 230000000139 costimulatory effect Effects 0.000 description 8
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 8
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 8
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 8
- 102000048362 human PDCD1 Human genes 0.000 description 8
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 8
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 8
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 8
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 8
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 8
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 8
- JJGWLCLUQNFDIS-GTSONSFRSA-M sodium;1-[6-[5-[(3as,4s,6ar)-2-oxo-1,3,3a,4,6,6a-hexahydrothieno[3,4-d]imidazol-4-yl]pentanoylamino]hexanoyloxy]-2,5-dioxopyrrolidine-3-sulfonate Chemical compound [Na+].O=C1C(S(=O)(=O)[O-])CC(=O)N1OC(=O)CCCCCNC(=O)CCCC[C@H]1[C@H]2NC(=O)N[C@H]2CS1 JJGWLCLUQNFDIS-GTSONSFRSA-M 0.000 description 8
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 8
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 7
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 7
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 7
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 7
- 238000011740 C57BL/6 mouse Methods 0.000 description 6
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 6
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 6
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 6
- 102100040678 Programmed cell death protein 1 Human genes 0.000 description 6
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 6
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 6
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 6
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 6
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 6
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 5
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 5
- 241000282567 Macaca fascicularis Species 0.000 description 5
- 101100407306 Mus musculus Cd274 gene Proteins 0.000 description 5
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 5
- 102100024213 Programmed cell death 1 ligand 2 Human genes 0.000 description 5
- 101710089372 Programmed cell death protein 1 Proteins 0.000 description 5
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 5
- 229950002916 avelumab Drugs 0.000 description 5
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 5
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 5
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 238000007857 nested PCR Methods 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 5
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 5
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 5
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 4
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 4
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 4
- 101100407308 Mus musculus Pdcd1lg2 gene Proteins 0.000 description 4
- 108700030875 Programmed Cell Death 1 Ligand 2 Proteins 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 4
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 4
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 4
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 4
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 4
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 4
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 4
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 4
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 4
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 4
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 4
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 4
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 4
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 4
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 4
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 241000894007 species Species 0.000 description 4
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000009020 BCA Protein Assay Kit Methods 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 102000013463 Immunoglobulin Light Chains Human genes 0.000 description 3
- 108010065825 Immunoglobulin Light Chains Proteins 0.000 description 3
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 3
- 108060008683 Tumor Necrosis Factor Receptor Proteins 0.000 description 3
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 3
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 3
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 3
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 3
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 3
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 3
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 3
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 3
- 102000003298 tumor necrosis factor receptor Human genes 0.000 description 3
- 238000011870 unpaired t-test Methods 0.000 description 3
- 229950003520 utomilumab Drugs 0.000 description 3
- 101100450694 Arabidopsis thaliana HFR1 gene Proteins 0.000 description 2
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 2
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 102000006496 Immunoglobulin Heavy Chains Human genes 0.000 description 2
- 108010019476 Immunoglobulin Heavy Chains Proteins 0.000 description 2
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 2
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 2
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 2
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 2
- 230000009824 affinity maturation Effects 0.000 description 2
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000005809 anti-tumor immunity Effects 0.000 description 2
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 2
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 2
- 230000001461 cytolytic effect Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 2
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 2
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 235000013861 fat-free Nutrition 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 210000004967 non-hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 235000008476 powdered milk Nutrition 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000002626 targeted therapy Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 102000035160 transmembrane proteins Human genes 0.000 description 2
- 108091005703 transmembrane proteins Proteins 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FVFVNNKYKYZTJU-UHFFFAOYSA-N 6-chloro-1,3,5-triazine-2,4-diamine Chemical group NC1=NC(N)=NC(Cl)=N1 FVFVNNKYKYZTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 229940116741 CD137 agonist Drugs 0.000 description 1
- 210000001266 CD8-positive T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 1
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 1
- 101100007328 Cocos nucifera COS-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 101001037140 Homo sapiens Immunoglobulin heavy variable 3-23 Proteins 0.000 description 1
- 101001134437 Homo sapiens Immunoglobulin lambda joining 1 Proteins 0.000 description 1
- 101001054838 Homo sapiens Immunoglobulin lambda variable 1-44 Proteins 0.000 description 1
- 101000956885 Homo sapiens Immunoglobulin lambda variable 2-14 Proteins 0.000 description 1
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 1
- 102100040220 Immunoglobulin heavy variable 3-23 Human genes 0.000 description 1
- 102100034172 Immunoglobulin lambda joining 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100026921 Immunoglobulin lambda variable 1-44 Human genes 0.000 description 1
- 102100038429 Immunoglobulin lambda variable 2-14 Human genes 0.000 description 1
- 101000668058 Infectious salmon anemia virus (isolate Atlantic salmon/Norway/810/9/99) RNA-directed RNA polymerase catalytic subunit Proteins 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- 240000000759 Lepidium meyenii Species 0.000 description 1
- 235000000421 Lepidium meyenii Nutrition 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 101710094000 Programmed cell death 1 ligand 1 Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 206010040070 Septic Shock Diseases 0.000 description 1
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 description 1
- 108010092262 T-Cell Antigen Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108700026226 TATA Box Proteins 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N [3-[hydroxy(2-hydroxyethoxy)phosphoryl]oxy-2-[(e)-octadec-9-enoyl]oxypropyl] (e)-octadec-9-enoate Chemical compound CCCCCCCC\C=C\CCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCCO)OC(=O)CCCCCCC\C=C\CCCCCCCC HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000006023 anti-tumor response Effects 0.000 description 1
- 230000009830 antibody antigen interaction Effects 0.000 description 1
- 230000007503 antigenic stimulation Effects 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- -1 apoptosis regulators Proteins 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 1
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000005889 cellular cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011284 combination treatment Methods 0.000 description 1
- 230000004154 complement system Effects 0.000 description 1
- 108091008034 costimulatory receptors Proteins 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001945 cysteines Chemical class 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000009795 derivation Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 150000002337 glycosamines Chemical group 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 229920001477 hydrophilic polymer Polymers 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 102000027596 immune receptors Human genes 0.000 description 1
- 108091008915 immune receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 102000028557 immunoglobulin binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091009323 immunoglobulin binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 229940027941 immunoglobulin g Drugs 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 235000012902 lepidium meyenii Nutrition 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 210000004216 mammary stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000000581 natural killer T-cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000010807 negative regulation of binding Effects 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 1
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004091 panning Methods 0.000 description 1
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 1
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 238000007634 remodeling Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000003938 response to stress Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000036303 septic shock Effects 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000003956 synaptic plasticity Effects 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 1
- 230000001875 tumorinhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
Description
Область техники
Изобретение относится к области биомедицины, в частности, к антителу против PD-L1, и дополнительно относится к способу лечения злокачественных новообразований посредством использования такого антитела в комбинации с антителом против CD137 и дополнительно относится к биспецифическому антителу, образованному таким антителом и антителом против CD137.
Уровень техники
Белок программируемой гибели клеток-1 (PD-1, также известный как CD279) и его лиганды PD-L1 (также известный как В7-Н1, CD274) и PD-L2 (также известный как B7-DC, CD273) взаимодействуют, что приводит к возникновению отрицательного костимуляторного сигнала для регуляции активации Тклеток. В отсутствие костимуляторного сигнала Т-клеткам трудно воспринимать антигенную стимуляцию, они не могут обеспечивать эффективный иммунный ответ, и это также может приводить к истощению или толерантности к гетерогенным антигенам. PD-1 может экспрессироваться в Т-клетках, Вклетках, естественных киллерных Т-клетках, активированных мононуклеарных клетках и дендритных клетках (DC). PD-1 может экспрессироваться активированными, но не стимулированными CD4+ и CD8+ Т-клетками, В-клетками и клетками костного мозга человека. PD-L1 и PD-L2 отличаются друг от друга профилями своей экспрессии. PD-L1 может экспрессироваться не только в гемопоэтических клетках, но также и в различных негемопоэтических клетках, где экспрессия PD-L2, главным образом, ограничена дендритными клетками и макрофагами. В7.1 (CD80) также является рецептором PD-L1, экспрессирующимся в активированных В-клетках, Т-клетках, макрофагах и дендритных клетках. Как лиганд PD-1 и В7.1, PD-L1 также селективно экспрессируется в различных опухолевых клетках. Ингибирование передачи сигнала PD-L1 включает блокирование взаимодействия между PD-L1 и PD-1 и В7.1 или и тем, и другим, и, таким образом, предотвращение отправки PD-L1 отрицательного костимуляторного сигнала в Т-клетки и другие антигенпрезентирующие клетки. Это может усиливать иммунный ответ на инфекцию (например, острую или хроническую) и противоопухолевый иммунитет.
CD137 (также известный как 4-1ВВ, TNFRSF9, и т.д.) является трансмембранным белком суперсемейства фактора некроза опухоли (TNFRS). Исследования показывают, что CD137-активирующее моноклональное антитело повышает экспрессию костимуляторных молекул во множестве моделей, что значительно повышает ответ цитолитических Т-лимфоцитов и играет противоопухолевую роль. Противоопухолевый ответ CD137-направленных способов терапии показан в исследованиях, включающих противоопухолевый терапевтический эффект активирующего моноклонального антитела против CD137 мыши у мышей.
В настоящее время антитела против PD-L1 одобрены для использования в лечении некоторых злокачественных новообразований, и существующие антитела против CD137 потенциально можно использовать в лечении различных опухолей. Сообщают, что исследовали противоопухолевый терапевтический эффект антитела против PD-1 в комбинации с антителом против CD137 посредством использования модели мышей, несущих опухоли. Результаты показали, что два антитела, используемые в комбинации, демонстрируют значительно усиленную ингибирующую опухоль активность по сравнению с их использованием по отдельности, но с точки зрения комплаентности и боли, комбинированное лечение доставляет неудобство пациентам и повышает затраты на лечение. Разработка биспецифического антитела (BsAb) из двух моноклональных антител может помочь решить указанную выше проблему благодаря наличию двух специфических антигенсвязывающих участков в биспецифическом антителе. Таким образом, существует острая необходимость в разработке нового антитела против PD-L1, имеющего лучшую фармацевтическую эффективность и более низкую иммуногенность, и биспецифического антитела PDL1/CD137 для достижения лучшего противоопухолевого эффекта.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение относится к антителу против PD-L1, его антигенсвязывающему фрагменту или варианту, имеющему одно или более из следующих свойств: 1) может связываться с белком PD-L1 с высокой аффинностью и специфичностью; 2) может ингибировать связывание белка PD-1 с белком PDL1; и 3) может приводить к облегчению симптомов или лечению опухолей. Настоящее изобретение также относится к биспецифическому антителу, имеющему одно или более из следующих свойств: 1) может связываться с белком PD-L1 с высокой аффинностью и специфичностью; 2) может связываться с белком CD137 с высокой аффинностью и специфичностью; 3) может усиливать функции Т-клеток; и 4) может приводить к облегчению симптомов или лечению опухолей. Настоящее изобретение также относится к способу получения и применению антитела против PD-L1, его антигенсвязывающего фрагмента или варианта, биспецифическому антителу.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к антителу, его антигенсвязывающему фрагменту или варианту, связывающемуся с белком PD-L1 с KD 3x10’9 М или менее.
В некоторых вариантах осуществления антитело включает легкую цепь антитела или ее фрагмент, включающую LCDR1, и LCDR1 включает аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 53: TGTX1SX2VGGYX3X4VS; где X1 является S, R или V; Х2 является D, Е или S; X3 является N или R; X4 является Y или Е, и где LCDR1 определяют в соответствии с индексом нумерации антител Kabat.
- 1 044684
В некоторых вариантах осуществления LCDR1 включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 54-58. В некоторых вариантах осуществления легкая цепь антитела или ее фрагмент включает LCDR2, включающую аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 59: X1NSX2RPS, где X1 является G или Е; Х2 является N или I, и где LCDR2 определяют в соответствии с индексом нумерации антител Kabat. В некоторых вариантах осуществления LCDR2 включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 60-61. В некоторых вариантах осуществления легкая цепь антитела или ее фрагмент включает LCDR3, включающую аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 62: QSYDSSLSGX1V, где X1 является S или Т, и где LCDR3 определяют в соответствии с индексом нумерации антител Kabat.
В некоторых вариантах осуществления легкая цепь антитела или ее фрагмент дополнительно включает каркасные области L-FR1, L-FR2, L-FR3 и L-FR4. В некоторых вариантах осуществления каркасные области выбраны из группы, состоящей из консенсусных каркасных последовательностей человека и последовательностей зародышевой линии человека. В некоторых вариантах осуществления С-конец LFR1 прямо или косвенно связан с N-концом LCDR1, и L-FR1 включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 71. В некоторых вариантах осуществления LFR2 находится между LCDR1 и LCDR2, и L-FR2 включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 72. В некоторых вариантах осуществления L-FR3 находится между LCDR2 и LCDR3, и L-FR3 включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 73-75. В некоторых вариантах осуществления N-конец L-FR4 прямо или косвенно связан с С-концом LCDR3, и L-FR4 включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 76.
В некоторых вариантах осуществления легкая цепь антитела или ее фрагмент включает вариабельную область легкой цепи VL, и вариабельная область легкой цепи VL включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39 и SEQ ID NO: 41.
В некоторых вариантах осуществления легкая цепь антитела или ее фрагмент дополнительно включает константную область человека, и константная область человека включает константную область Igλ человека.
В некоторых вариантах осуществления легкая цепь антитела или ее фрагмент включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40 и SEQ ID NO: 42.
В некоторых вариантах осуществления антитело включает тяжелую цепь антитела или ее фрагмент, включающую HCDR1, и HCDR1 включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей, приведенных в SEQ ID NO: 45: X1YAIS, где X1 является S или Т, и где HCDR1 определяют в соответствии с индексом нумерации антител Kabat. В некоторых вариантах осуществления тяжелая цепь антитела или ее фрагмент включает HCDR2, HCDR2 включает аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 48, и где HCDR2 определяют в соответствии с индексом нумерации антител Kabat. В некоторых вариантах осуществления тяжелая цепь антитела или ее фрагмент включает HCDR3, и HCDR3 включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из приведенных в SEQ ID NO: 49: TMX1X2YX3X4GNX5DY, где X1 является D, Е или G, Х2 является G или Е, X3 является S или G, X4 является Y или F, X5 является F или Y, и где HCDR3 определяют в соответствии с индексом нумерации антител Kabat. В некоторых вариантах осуществления HCDR3 включает аминокислотную последовательность, приведенную в группе SEQ ID NO: 5052.
В некоторых вариантах осуществления тяжелая цепь антитела или ее фрагмент дополнительно включает каркасные области H-FR1, H-FR2, H-FR3 и H-FR4. В некоторых вариантах осуществления каркасные области выбраны из группы, состоящей из консенсусных каркасных последовательностей человека и последовательностей зародышевой линии человека. В некоторых вариантах осуществления Сконец H-FR1 прямо или косвенно связан с N-концом HCDR1, и H-FR1 включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 65-67. В некоторых вариантах осуществления H-FR2 находится между HCDR1 и HCDR2, и H-FR2 включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 68. В некоторых вариантах осуществления HFR3 находится между HCDR2 и HCDR3, и H-FR3 включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 69. В некоторых вариантах осуществления N-конец HFR4 прямо или косвенно связан с С-концом HCDR3, и H-FR4 включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 70.
В некоторых вариантах осуществления тяжелая цепь антитела или ее фрагмент включает вариабельную область тяжелой цепи VH, и вариабельная область тяжелой цепи VH включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 31 и SEQ ID NO: 35.
В некоторых вариантах осуществления тяжелая цепь антитела или ее фрагмент дополнительно
- 2 044684 включает константную область человека, и константная область человека включает константную область IgG1 человека.
В некоторых вариантах осуществления тяжелая цепь антитела или ее фрагмент включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 32 и SEQ ID NO: 36.
В некоторых вариантах осуществления белок PD-L1 выбран из группы, состоящей из белка PD-L1 человека, белка PD-L1 обезьяны и белка PD-L1 мыши.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к антителу, его антигенсвязывающему фрагменту или варианту, связывающемуся с белком CD137 с KD 5х10-9 М или менее.
В некоторых вариантах осуществления антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант связывается с белком CD137 с KD 3х10-9 М или менее.
В некоторых вариантах осуществления антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант может приводить к облегчению или лечению опухолей. В некоторых вариантах осуществления антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант может приводить к облегчению или лечению рака толстого кишечника.
В некоторых вариантах осуществления антитело включает легкую цепь антитела или ее фрагмент. В некоторых вариантах осуществления легкая цепь или ее фрагмент включает LCDR1-3, и аминокислотные последовательности LCDR1-3 последовательно приведены в SEQ ID NO: 80-82. В некоторых вариантах осуществления легкая цепь антитела или ее фрагмент дополнительно включает каркасные области LFR1, L-FR2, L-FR3 и L-FR4. В некоторых вариантах осуществления каркасные области выбраны из группы, состоящей из консенсусных каркасных последовательностей человека и последовательностей зародышевой линии человека. В некоторых вариантах осуществления С-конец L-FR1 прямо или косвенно связан с N-концом LCDR1, и L-FR1 включает аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 89. В некоторых вариантах осуществления L-FR2 находится между LCDR1 и LCDR2, и LFR2 включает аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 90. В некоторых вариантах осуществления L-FR3 находится между LCDR2 и LCDR3, и L-FR3 включает аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 91. В некоторых вариантах осуществления N-конец L-FR4 прямо или косвенно связан с С-концом LCDR3, и L-FR4 включает аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 92.
В некоторых вариантах осуществления легкая цепь антитела или ее фрагмент включает вариабельную область легкой цепи VL, и вариабельная область легкой цепи VL включает аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 20.
В некоторых вариантах осуществления легкая цепь антитела или ее фрагмент дополнительно включает константную область человека, и константная область человека включает константную область Igλ человека.
В некоторых вариантах осуществления легкая цепь антитела или ее фрагмент включает аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 23.
В некоторых вариантах осуществления антитело включает тяжелую цепь антитела или ее фрагмент, где тяжелая цепь или ее фрагмент включает HCDR1-3, и аминокислотные последовательности HCDR1-3 последовательно приведены в SEQ ID NO: 77-79. В некоторых вариантах осуществления тяжелая цепь антитела или ее фрагмент дополнительно включает каркасные области H-FR1, H-FR2, HFR3 и H-FR4. В некоторых вариантах осуществления каркасные области выбраны из группы, состоящей из консенсусных каркасных последовательностей человека и последовательностей зародышевой линии человека. В некоторых вариантах осуществления С-конец H-FR1 прямо или косвенно связан с N-концом HCDR1, и H-FR1 включает аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 84-85. В некоторых вариантах осуществления H-FR2 находится между HCDR1 и HCDR2, и H-FR2 включает аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 86. В некоторых вариантах осуществления H-FR3 находится между HCDR2 и HCDR3, и H-FR3 включает аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 87. В некоторых вариантах осуществления N-конец H-FR4 прямо или косвенно связан с Сконцом HCDR3, и H-FR4 включает аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 88.
В некоторых вариантах осуществления тяжелая цепь антитела или ее фрагмент включает вариабельную область тяжелой цепи VH, и вариабельная область тяжелой цепи VH включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 18 и SEQ ID NO: 25.
В некоторых вариантах осуществления тяжелая цепь антитела или ее фрагмент дополнительно включает константную область человека, и константная область человека включает константную область IgG человека.
В некоторых вариантах осуществления тяжелая цепь антитела или ее фрагмент включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 21 и SEQ ID NO: 27.
В некоторых вариантах осуществления белок CD137 включает белок CD137 человека.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к биспецифическому антителу, связывающемуся с белком PD-L1 с KD 2х10-9 М или менее и связывающемуся с белком CD137 с KD 8х10’9 M или менее.
- 3 044684
В некоторых вариантах осуществления биспецифическое антитело включает первый нацеливающий фрагмент, специфически связывающийся с белком PD-L1, где первый нацеливающий фрагмент включает антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант.
В некоторых вариантах осуществления биспецифическое антитело включает второй нацеливающий фрагмент, специфически связывающийся с белком CD137, где второй нацеливающий фрагмент включает антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант, связывающийся с белком CD137. В некоторых вариантах осуществления антитело, связывающееся с белком CD137, включает scFv, и scFv включает аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 83. В некоторых вариантах осуществления биспецифическое антитело включает первую полипептидную цепь и вторую полипептидную цепь, где первая полипептидная цепь включает вариабельную область тяжелой цепи антитела, связывающуюся с белком PD-L1, вариабельную область тяжелой цепи антитела, связывающуюся с белком CD137, и вариабельную область легкой цепи антитела, связывающуюся с белком CD137; и вторая полипептидная цепь включает вариабельную область легкой цепи антитела, связывающуюся с белком PD-L1.
В некоторых вариантах осуществления в первой полипептидной цепи вариабельной области тяжелой цепи антитела, связывающегося с белком PD-L1, находится на N-конце вариабельной области тяжелой цепи антитела, связывающегося с белком CD137, и вариабельная область тяжелой цепи антитела, связывающегося с белком CD137, находится на N-конце вариабельной области легкой цепи антитела, связывающегося с белком CD137; альтернативно, вариабельная область тяжелой цепи антитела, связывающегося с белком PD-L1, находится на N-конце вариабельной области легкой цепи антитела, связывающегося с белком CD137, и вариабельная область легкой цепи антитела, связывающегося с белком CD137, находится на N-конце вариабельной области тяжелой цепи антитела, связывающегося с белком CD137.
В некоторых вариантах осуществления вариабельная область легкой цепи антитела, связывающегося с белком CD137, и вариабельная область тяжелой цепи антитела, связывающегося с белком CD137, в первой полипептидной цепи составляют scFv.
В некоторых вариантах осуществления первая полипептидная цепь дополнительно включает константную область IgG человека, и константная область IgG человека находится на С-конце вариабельной области тяжелой цепи антитела, связывающегося с белком PD-L1, и находится на N-конце вариабельной области легкой цепи антитела, связывающегося с белком CD137; альтернативно, константная область IgG человека находится на С-конце вариабельной области тяжелой цепи антитела, связывающегося с белком PD-L1, и находится на N-конце вариабельной области тяжелой цепи антитела, связывающегося с белком CD137.
В некоторых вариантах осуществления первая полипептидная цепь включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 43 и SEQ ID NO: 44. В некоторых вариантах осуществления вторая полипептидная цепь включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 15 и SEQ ID NO: 34.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к одной или более молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант или биспецифическое антитело.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к вектору, включающему молекулу нуклеиновой кислоты.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к клетке, включающей молекулу нуклеиновой кислоты или вектор.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу получения антитела, его антигенсвязывающего фрагмента или варианта, или биспецифического антитела, включающему культивирование клеток в условиях, делающих возможной экспрессию антитела, его антигенсвязывающего фрагмента или варианта или биспецифического антитела.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, включающей антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант, или биспецифическое антитело, молекулу нуклеиновой кислоты, вектор и/или клетку и, необязательно, фармацевтически приемлемое вспомогательное средство.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к применению антитела, его антигенсвязывающего фрагмента или варианта или биспецифического антитела, молекулы нуклеиновой кислоты, вектора, клетки и/или фармацевтической композиции в производстве лекарственного средства для облегчения или лечения опухолей.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу ингибирования связывания белка PDL1 с белком PD-1, включающему введение антитела, его антигенсвязывающего фрагмента или варианта, или биспецифического антитела, молекулы нуклеиновой кислоты, вектора, клетки и/или фармацевтической композиции.
В настоящем изобретении положение CDR в антителе определяют способом Kabat.
Специалистам в этой области будут понятны другие аспекты и преимущества настоящего изобретения из подробного описания ниже. В следующем подробном описании представлены исключительно
- 4 044684 примеры вариантов осуществления настоящего изобретения. Например, специалистам в этой области будет понятно, что содержание настоящего описания позволит специалистам в этой области делать изменения в описанных вариантах осуществления без отклонения от сущности и объема изобретения, к которому относится настоящее изобретение. Соответственно, сопутствующие чертежи и описание в настоящем изобретении являются исключительно примерами, а не ограничением.
Краткое описание чертежей
Конкретные признаки изобретения, описываемые в настоящем изобретении, приведены в формуле изобретения. Признаки и преимущества изобретения, описанные в настоящем изобретении, будут более понятными с учетом подробно описанных примеров вариантов осуществления и сопутствующих чертежей, представленных далее в настоящем описании. Краткое описание сопутствующих чертежей является следующим:
На фиг. 1 показано выравнивание аминокислотных последовательностей вариабельных областей тяжелой цепи и вариабельных областей легкой цепи антитела против PD-L1 по настоящему изобретению и соответствующих последовательностей зародышевой линии. Подчеркнуты CDR, определяемые способом Kabat.
На фиг. 2 показаны результаты, касающиеся ингибирования антителом против PD-L1 по настоящему изобретению связывания PD-L1 человека с PD-1 человека.
На фиг. 3 показаны результаты, касающиеся ингибирования антителом против PD-L1 по настоящему изобретению связывания PD-L1 Масаса fascicularis с PD-1 Масаса fascicularis.
На фиг. 4 показаны результаты, касающиеся ингибирования антителом против PD-L1 по настоящему изобретению связывания PD-L1 мыши с PD-1 мыши.
На фиг. 5 показан эффект различных антител по настоящему изобретению в отношении роста опухоли Мс38 у мыши C57BL/6 (*, Р<0,05; ***, Р<0,001; непарный t-критерий).
На фиг. 6 показано выравнивание аминокислотных последовательностей вариабельных областей тяжелой цепи и вариабельных областей легкой цепи антитела против CD137 по настоящему изобретению и соответствующих последовательностей зародышевой линии, где подчеркнуты CDR, определенные способом Kabat.
На фиг. 7 показан эффект антитела против CD137 по настоящему изобретению в отношении роста опухоли МС38 у самки мыши C57BL/6 с нокином гена CD137 человека (*, Р<0,05; **, Р<0,01; непарный t-критерий).
На фиг. 8 показано выравнивание аминокислотных последовательностей вариабельных областей тяжелой цепи и вариабельных областей легкой цепи антитела против PD-L1 по настоящему изобретению и соответствующих последовательностей зародышевой линии, где подчеркнуты CDR, определенные способом Kabat, и закрашены CDR, определенные способом IMGT. Аминокислотные остатки в различных областях CDR YN-003 (включающих некоторые аминокислотные остатки в областях CDR и несколько аминокислотных остатков в областях FR, смежные с областями CDR), на которые воздействуют случайным образом при осуществлении созревания аффинности, указаны курсивом.
На фиг. 9 показано выравнивание аминокислотных последовательностей вариабельных областей тяжелой цепи антитела против PD-L1 по настоящему изобретению с соответствующими последовательностями зародышевой линии. Подчеркнуты CDR, определенные способом Kabat, и закрашены CDR, определенные способом IMGT.
На фиг. 10 показано выравнивание аминокислотных последовательностей вариабельных областей легкой цепи антитела против PD-L1 по настоящему изобретению с соответствующими последовательностями зародышевой линии. Подчеркнуты CDR, определенные способом Kabat, и закрашены CDR, определенные способом IMGT.
На фиг. 11 показано связывание антитела против PD-L1 по настоящему изобретению с клетками СНО, стабильно экспрессирующими PD-L1 человека.
На фиг. 12 показано, что антитело против PD-L1 по настоящему изобретению ингибирует связывание PD-1 человека с PD-L1 человека.
На фиг. 13 показано, что антитело против PD-L1 по настоящему изобретению связывается с клетками СНО, стабильно экспрессирующими PD-L1 мыши.
На фиг. 14 показано, что антитело против PD-L1 по настоящему изобретению ингибирует связывание PD-1 мыши с PD-L1 мыши.
На фиг. 15 показано, что антитело против PD-L1 по настоящему изобретению связывается с клетками MDA-MB-231.
На фиг. 16 показано, что антитело против PD-L1 и биспецифическое антитело против PD-L1/CD137 по настоящему изобретению связываются с клетками СНО, стабильно экспрессирующими PD-L1 человека.
На фиг. 17 показано, что антитело против PD-L1 и биспецифическое антитело против PD-L1/CD137 по настоящему изобретению ингибирует связывание PD-1 человека с PD-L1 человека.
На фиг. 18 показано, что антитело против PD-L1 и биспецифическое антитело против PD-L1/CD137 по настоящему изобретению связываются с клетками СНО, стабильно экспрессирующими PD-L1 мыши.
- 5 044684
На фиг. 19 показано, что антитело против PD-L1 и биспецифическое антитело против PD-L1/CD137 по настоящему изобретению ингибируют связывание PD-1 мыши с PD-L1 мыши.
На фиг. 20 показано, что антитело CD137 и биспецифическое антитело против PD-L1/CD137 по настоящему изобретению связываются с клетками 293Т, стабильно экспрессирующими CD137 человека.
На фиг. 21 показано, что молекулярную массу антитела по настоящему изобретению анализируют посредством электрофореза в ПААГ с SDS. а, невосстановительные условия; и b, восстановительные условия.
На фиг. 22 показаны результаты, касающиеся стимуляции различными антителами по настоящему изобретению люциферазной активности клеток 293Т, экспрессирующих CD137 человека и имеющих стабильно интегрированный репортерный ген люциферазы.
На фиг. 23 показан эффект антител по настоящему изобретению в отношении роста опухолей МС38 у самок мышей C57BL/6 с геном CD137 человека (*, Р<0,05; непарный t-критерий).
Подробное описание вариантов осуществления
Далее в настоящем описании варианты осуществления изобретения, представленные в настоящем изобретении, проиллюстрированы с помощью конкретных примеров. Специалистам в этой области будут понятны другие преимущества и эффекты изобретения, представленного в настоящем изобретении, из следующего описания.
В настоящем изобретении термин антитело, в целом, относится к полипептидной молекуле, способной специфически распознавать и/или нейтрализовать специфический антиген. Например, антитело может включать иммуноглобулин, состоящий из по меньшей мере двух тяжелых (Н) цепей и двух легких (L) цепей, соединенных дисульфидной связью, и включает любую молекулу, включающую его антигенсвязывающую часть. Термин антитело включает моноклональные антитела, фрагмент антитела или производное антитела, включая, в качестве неограничивающих примеров, антитела человека, гуманизированные антитела, химерные антитела, одноцепочечные антитела (например, scFv) и антигенсвязывающие фрагменты антител (например, Fab-, Fab'- и (Fab)2-фрагменты). Термин антитело дополнительно включает все рекомбинантые антитела, такие как антитела, экспрессирующиеся в прокариотических клетках, негликозилированные антитела и любой антигенсвязывающий фрагмент антитела, как представлено в настоящем описании, и их производные. Каждая тяжелая цепь может состоять из вариабельной области тяжелой цепи (VH) и константной области тяжелой цепи. Каждая легкая цепь может состоять из вариабельных областей легкой цепи (VL) и константных областей легкой цепи. Области VH и VL можно дополнительно разделять на высоковариабельные области, названные определяющими комплементарность областями (CDR), распределенными по более консервативным областям, названным каркасными областями (FR). Каждая VH и VL может состоять из трех CDR и четырех FR, которые могут располагаться от амино-концу к карбокси-концу в порядке FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4. Вариабельные области в тяжелых цепях и легких цепях включают связывающие домены, взаимодействующие с антигеном. Константная область антитела может опосредовать связывание иммуноглобулина с тканью или фактором организма-хозяина, включая различные клетки иммунной системы (например, эффекторные клетки) и первый компонент классической системы комплемента (C1q).
В настоящем изобретении термин белок PD-L1, в целом, относится к лиганду белка программируемой гибели-1 (PD-1). PD-1 является рецептором суперсемейства Ig, взаимодействующим со специфическим лигандом (PD-L) и отрицательно регулирующим передачу сигнала Т-клеточного антигенного рецептора, и считают, что он играет роль в поддержании аутотолерантности. В отсутствие костимуляторного сигнала Т-клеткам трудно распознавать стимуляцию антигеном, они не могут эффективно продуцировать иммунный ответ, и это дополнительно может вызывать истощение или толерантность к гетерологичному антигену. PD-L1 может экспрессироваться в гемопоэтических клетках или различных негемопоэтических клетках. В7.1 (CD80) также является рецептором PD-L1, экспрессирующимся в активированных В-клетках, Т-клетках, макрофагах и дендритных клетках. Как лиганд PD-1 и В7.1, PD-L1 дополнительно селективно экспрессируется в различных опухолевых клетках. Ингибирование передачи сигнала PD-L1 включает блокирование взаимодействий PD-L1 с PD-1 и В7.1 или и тем, и другим, и, таким образом, предотвращение отправку PD-L1 отрицательного костимуляторного сигнала в Т-клетки и другие антигенпрезентирующие клетки. Это может усиливать иммунный ответ на инфекцию (например, острую и хроническую) и противоопухолевый иммунитет.
В настоящем изобретении термин белок CD137, также известный как 4-1ВВ или TNFRS9, как правило, относится к трансмембранному белку суперсемейства рецепторов фактора некроза опухоли (TNFRS), являющемуся индуцируемой активацией костимуляторной молекулой и важным регулятором иммунных ответов, исследования показали, что CD137-активирующие моноклональные антитела повышают экспрессию костимуляторных молекул во многих моделях, и значительно усиливают ответ цитолитических Т-лимфоцитов и имеют противоопухолевые эффекты. Противоопухолевый эффект CD137направленной терапии можно продемонстрировать в исследовании противоопухолевой эффективности на мышах с использованием активирующего моноклонального антитела против CD137 мыши. CD137 стал мощным активатором иммунных клеток и важным антигеном-кандидатом для лечения различных заболеваний (см. Vinay, Dass S., and Byoung S. Kwon. 4-1BB (CD137), an inducible costimulatory Receptor,
- 6 044684 as a specific target for cancer therapy. BMB reports 47,3 (2014): 122.).
В настоящем изобретении термин NFkB относится к ядерному фактору каппа-легкая цепьэнхансеру активированных В-клеток (NFkB). Он является белковым комплексом, контролирующим транскрипцию ДНК. NFkB существует почти во всех типах клеток животных и участвует в клеточных ответах на многие стимулы, включая стресс, цитокины, свободные радикалы, УФ-излучение, окисление LDL и микробные или вирусные антигены. При иммунном ответе на инфекцию NFkB играет важную регуляторную роль (κ-легкая цепь является важной частью иммуноглобулина). Аномальная регуляция NFkB ассоциирована со злокачественными новообразованиями, воспалением и аутоиммунными заболеваниями, септическим шоком, вирусными инфекциями и аномальным развитием иммунной системы. NFkB также тесно ассоциирован с синаптической пластичностью и процессами памяти. Основными клетками-мишенями NFkB являются хемокины, иммунные рецепторы, молекулы адгезии, гены ответа на стресс, регуляторы апоптоза, факторы транскрипции, факторы роста, ферменты и регуляторы клеточного цикла. Кроме того, NFkB оказывает влияние на транскрипцию нескольких вирусных промоторов/энхансеров (например, ВИЧ-1 и CMV) (см. Tergaonkar, Vinay. NFkB pathway: A good signaling paradigm and therapeutic target. The international journal of biochemistry & cell biology 38,10 (2006): 16471653.).
В настоящем изобретении термин KD можно использовать взаимозаменяемо с термином KD, и, в целом, он относится к равновесной константе диссоциации конкретного взаимодействия антителоантиген в единицах М (моль/л). KD можно вычислять из концентраций вещества АВ и веществ А и В, полученных посредством диссоциации АВ: KD=c(A)*c(B)/c(AB). Из этой формулы можно видеть, что чем больше значение KD, тем выше диссоциация и слабее аффинность между веществами А и В; и наоборот, чем меньше значение KD, тем меньше диссоциация, и тем выше аффинность между веществами А и В.
В настоящем изобретении термин моноклональное антитело, в целом, относится к группе антител, являющихся, по существу, гомологичными, т.е. каждое антитело, включенное в группу, является одинаковыми, за исключением возможных природных мутаций в незначительных количествах. Моноклональные антитела являются высокоспецифическими и направлены против одного участка антигена. Кроме того, в отличие от препаратов поликлональных антител, включающих разные антитела, направленные против разных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело, направленное против одной детерминанты на антигене, не интерпретируют как требующее какого-либо конкретного способа получения антител. Например, моноклональные антитела можно получать с помощью гибридомной технологии или продуцировать в бактериях, эукариотических животных или растительных клетках способами рекомбинантной ДНК. Альтернативно, моноклональные антитела также можно получать из фаговой библиотеки антител с использованием технологии, как описано, например, в Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) и Marks et al., Mol. Biol., 222:581-597 (1991).
В настоящем изобретении термин одноцепочечное антитело (scFv), как правило, относится к молекуле, образованной посредством связывания вариабельной области тяжелой цепи антитела с вариабельной областью легкой цепи с помощью короткого пептидного линкера (линкера).
В настоящем изобретении термин химерное антитело, в целом, относится к антителу, в котором часть аминокислотной последовательности каждой тяжелой или легкой цепи является гомологичной соответствующей аминокислотной последовательности в антителе конкретного биологического вида или принадлежит к конкретному классу, а остальная часть цепи является гомологичной соответствующей последовательности другого биологического вида. Например, вариабельные области легкой цепи и тяжелой цепи получают из вариабельной области антитела одного вида животных (например, мыши, крысы и т.д.), в то время как константная часть является гомологичной последовательности антитела другого биологического вида (например, человека). Например, в случае получения химерных антител, не принадлежащие человеку В-клетки или гибридомные клетки можно использовать для получения вариабельных областей, и константные области, комбинируемые с ними, получают из людей. Вариабельная область обладает преимуществом легкого получения, и на ее специфичность не влияет источник константной области, комбинируемой с ней. В то же время, т.к. константную область химерного антитела можно получать из людей, возможность индуцирования химерным антителом иммунного ответа при инъекции является более низкой, чем в случае антитела, константную область которого получают из не принадлежащего человеку источника.
В настоящем изобретении термин гуманизированное антитело, в целом, относится к сконструированному антителу, полученному посредством снижения иммуногенности антител, иммуноглобулиновым связывающим белкам и полипептидам, полученным из не являющихся человеком видов (например, мышей или крыс), для людей при одновременном сохранении антигенсвязывающих свойств исходного антитела. Например, можно использовать технические средства, включающие пересадку CDR (Jones et al., Nature 321:522 (1986)) и ее вариант, включающий реконструирование (Verhoeyen, et al., 1988 Science 239:1534-1536; Riechmann, et al., 1988 Nature 332:323-337; Tempest, et al., Bio/Technol 1991 9:266-271), гиперхимеризацию (Queen, et al., 1989 Proc Natl Acad Sci USA 86:10029-10033; Co, et al., 1991 Proc Natl
- 7 044684
Acad Sci USA 88:2869-2873; Co, et al., 1992 J Immunol 148:1149-1154) и венирование (Mark, et al., Derivation of therapeutically active humanized and veneered anti-CD18 antibodies. в: Metcalf BW, Dalton BJ, eds. Cellular adhesion: molecular definition to therapeutic potential. New York: Plenum Press, 1994: 291-312) или т.п., для гуманизации не принадлежащего человеку связывающего домена. Если другие области, такие как шарнирная область и домены константной области, также получают из не принадлежащих человеку источников, эти области также могут являться гуманизированными.
В настоящем изобретении термин полностью человеческое антитело, в целом, означает, что все части антитела (включая константные области, области СН и CL антитела) кодируются генами, полученными из человека. Полностью человеческое антитело может значительно снижать иммунные побочные эффекты, вызванные гетерогенными антителами, в отношении организма человека.
В настоящем изобретении термин биспецифическое антитело (BsAb), в целом, относится к антителу или конструкции антитела с двойной специфичностью в его связывающем плече. Природные антитела являются моноспецифическими и обладают одной и той же специфичностью в своих антигенсвязывающих плечах. Биспецифические антитела получают из двух разных источников и конструируют посредством технологии рекомбинантной ДНК или слияния клеток таким образом, что они сохраняют две специфичности исходного антитела. Биспецифические антитела несут два разных антигенсвязывающих участка. Fc-часть биспецифического антитела отличается от Fc-части любого родительского моноспецифического антитела. Т.к. биспецифические антитела имеют двойную специфичность к лекарственным средствам и опухолевым клеткам, теоретически они могут приводить к тому, что накопление лекарственного средства в опухолях будет более высоким, чем в неопухолевых частях организма. Большинство из новых биспецифических антител могут перенаправлять цитотоксические эффекторные клетки (например, Тс-клетки, NK-клетки, нейтрофилы) к целевым клеткам (например, опухолевым клеткам). Биспецифические антитела могут одновременно блокировать два разных медиатора/пути, играющих уникальную или перекрывающуюся роль в патогенезе, и также могут повышать специфичность связывания посредством взаимодействия с двумя, вместо одного, разными антигенами поверхности клетки (Fanger, Michael W., и Paul M. Guyre. Bispecific antibodies for targeted cellular cytotoxicity. Trends in biotechnology, 1991: 375-380), (Fan, Gaowei, et al. Bispecific antibodies and their applications. Journal of hematology & oncology, 2015: 130).
В настоящем изобретении термин гомология последовательности, в целом, означает, что аминокислотные последовательности гомологичных белков имеют значительное сходство.
В настоящем изобретении термин эпитоп, как правило, относится к антигенной детерминанте, т.е. части молекулы, распознаваемой иммунной системой (например, распознаваемой антителом). Например, эпитопы являются дискретными трехмерными участками на антигене, распознаваемыми иммунной системой. Эпитоп, как правило, состоит из химически активных поверхностных групп молекул (например, аминокислот или боковых цепей сахаров) и имеет специфические трехмерные структурные характеристики и специфические характеристики заряда. Эпитопы можно разделять на конформационные эпитопы и неконформационные эпитопы (линейные эпитопы) в зависимости от их структуры. Различие между конформационными эпитопами и неконформационными эпитопами состоит в том, что первые из них будут утрачивать свое связывание в присутствии денатурирующих растворителей, а последние из них не будут. Эпитопы, находящиеся только на поверхности антигенных веществ и легко связывающиеся с антигенраспознающими рецепторами или антителами, можно назвать функциональными эпитопами; и эпитопы, находящиеся внутри молекулы и не являющиеся иммуногенными, можно называть маскированными эпитопами. Эпитопы могут состоять из непрерывных остатков или могут быть образованы прерывающимися остатками, близкими друг к другу в результате фолдинга антигенного полимера. Эпитопы, образованные последовательными аминокислотами в белках, как правило, сохраняются при воздействии денатурирующих растворителей, но эпитопы, образованные прерывающимися аминокислотами, как правило, утрачиваются после такого воздействия.
В настоящем изобретении термин антигенсвязывающий фрагмент, в целом, относится к части интактного антитела, например, антигенсвязывающей области и/или вариабельной области интактного антитела. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий фрагмент может включать Fab-, Fab'-, F(ab)2-, F(ab')2- и Fv-фрагменты. В некоторых вариантах осуществления антитела по настоящему изобретению могут включают двухцепочечные антитела, линейные антитела, одноцепочечные молекулы антител и полиспецифические антитела, образованные фрагментами антител. Два идентичных антигенсвязывающих фрагмента, полученные посредством расщепления антитела, имеющего интактную структуру, папаином (например, посредством удаления Fc-области и шарнирной области), называют Fabфрагментами. Fab-фрагмент состоит из интактной легкой цепи, вариабельной области тяжелой цепи (VH) и первого константного домена (СН1) тяжелой цепи. Каждый Fab-фрагмент является моновалентным в отношении связывания антигена, т.е. он содержит один антигенсвязывающий участок. F(ab)2фрагменты антител исходно получали как пары Fab-фрагментов, соединенные через цистеин. Один крупный F(ab')2-фрагмент, полученный посредством расщепления антитела, имеющего интактную структуру, пепсином, приблизительно равен двум Fab-фрагментам, соединенным дисульфидной связью и имеющим разную антигенсвязывающую активность, и все равно способен перекрестно связывать анти
- 8 044684 ген. Fab'-фрагменты отличаются от Fab-фрагментов тем, что они имеют несколько дополнительных остатков на карбокси-конце домена СН1, включая один или более цистеинов из шарнирной области антитела. Fv-фрагмент состоит из доменов VL и VH одного плеча антитела.
В настоящем изобретении термин вариант, в целом, относится к аминокислотной последовательности, имеющей, по существу, ту же функцию (например, способность специфически связываться с PDL1) и по меньшей мере 85% (например, по меньшей мере 85, по меньшей мере 90, по меньшей мере 91, по меньшей мере 92, по меньшей мере 93, по меньшей мере 94, по меньшей мере 95, по меньшей мере 96, по меньшей мере 97, по меньшей мере 98, по меньшей мере 99% или по меньшей мере 100%) идентичности последовательности. В некоторых вариантах осуществления вариант аминокислотной последовательности является аминокислотной последовательностью, имеющей, по существу, ту же функцию (например, способность специфически связываться с PD-L1), и включает одну или более (например, 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7, 1-8, 1-9, 1-10 или более) замен, делеций или добавлений аминокислот.
В настоящем изобретении термин идентичность, в целом, относится к проценту количества одинаковых аминокислотных остатков среди всех аминокислотных остатков при сравнении последовательности-кандидата с конкретной пептидной или полипептидной последовательностью.
В настоящем изобретении термин IgG, в целом, относится к иммуноглобулину G. IgG является одним из иммуноглобулинов человека, и другие включают Igλ IgM, IgD и IgE. IgG является основным антительным компонентом сыворотки, на долю которого приходится приблизительно 75% Ig сыворотки. В соответствии с различиями антигенности у-цепи молекулы IgG, IgG человека имеет четыре подтипа: IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. IgG играет важную роль в иммунитете. В настоящем изобретении термин IgG1, в целом, относится к подтипу с наиболее высокой долей среди IgG, имеющему более высокую аффинность к Fc-рецепторам.
В настоящем изобретении термин молекула нуклеиновой кислоты, в целом, относится к выделенной форме нуклеотидов, дезоксирибонуклеотидов или рибонуклеотидов или их аналогов любой длины, выделенных из их природного окружения или синтезированной искусственно.
В настоящем изобретении термин вектор, в целом, относится к молекуле нуклеиновой кислоты, способной к саморепликации в подходящем организме-хозяине, с помощью которой переносят встроенную молекулу нуклеиновой кислоты в клетки-хозяева и/или между клетками-хозяевами. Вектор может включать вектор, в основном, используемый для встраивания ДНК или РНК в клетки, вектор, в основном, используемый для репликации ДНК или РНК, и вектор, в основном, используемый для экспрессии, транскрипции и/или трансляции ДНК или РНК. Вектор также включает вектор, имеющий множество описанных выше функций. Вектор может являться полинуклеотидом, который может транскрибироваться и транслироваться в полипептид при встраивании в подходящую клетку-хозяина. Как правило, при культивировании подходящей клетки-хозяина, содержащей вектор, вектор может приводить к образованию желаемого продукта экспрессии.
В настоящем изобретении термин клетка-хозяин, в целом, относится к плазмиде или вектору, которые могут включать или включают молекулу нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, или отдельной клетке, линии клеток или культуре клеток, которые могут экспрессировать антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению. Клетка-хозяин может включать потомство одной клетки-хозяина. Из-за природных, случайных и преднамеренных мутаций клетки-потомки могут не являться точно такими же, как исходные родительские клетки по морфологии или геному, при условии, что они могут экспрессировать антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению. Клетку-хозяина можно получать посредством трансфекции клеток in vitro с использованием вектора по настоящему изобретению. Клетка-хозяин может являться прокариотической клеткой (например, Е. coli), а также может являться эукариотической клеткой (например, такой как дрожжевые клетки, клетки COS, клетки яичника китайского хомяка (СНО), клетки HeLa, клетки HEK293, клетки COS-1, клетки NS0 или миеломные клетки). В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин является клеткой млекопитающего. Например, клетка млекопитающего может являться клеткой СНО-Ki. В настоящем изобретении термин рекомбинантная клетка-хозяин, как правило, относится к клетке, в которую встраивают рекомбинантный экспрессирующий вектор. Рекомбинантная клетка-хозяин не только включает конкретную клетку, но также включает и потомство таких клеток.
В настоящем изобретении термин злокачественное новообразование, в целом, относится к физиологическому статусу млекопитающего, как правило, отличающемуся нарушениями пролиферации или выживания клеток. Неограничивающие примеры злокачественных новообразований включают злокачественные новообразования, лимфому, опухоль материнских клеток, саркому, лейкоз и злокачественную лимфоидную опухоль. Например, оно может являться лимфомой.
В настоящем изобретении термин между, в целом, означает, что С-конец некоторого аминокислотного фрагмента прямо или косвенно связан с N-концом первого аминокислотного фрагмента, и его Nконец прямо или косвенно связан с С-концом второго аминокислотного фрагмента. В легкой цепи, например, N-конец L-FR2 прямо или косвенно связан с С-концом LCDR1, и С-конец L-FR2 прямо или косвенно связан с N-концом LCDR2. В качестве другого примера, N-конец L-FR3 прямо или косвенно связан с С-концом LCDR2, и С-конец L-FR3 прямо или косвенно связан с N-концом LCDR3. В тяжелой це
- 9 044684 пи, например, N-конец H-FR2 прямо или косвенно связан с С-концом HCDR1, и С-конец H-FR2 прямо или косвенно связан с N-концом HCDR2. В качестве другого примера, N-конец H-FR3 прямо или косвенно связан с С-концом HCDR2, и С-конец H-FR3 прямо или косвенно связан с N-концом HCDR3.
В настоящем изобретении термин приблизительно, в целом, относится к колебаниям в диапазоне указанного значения ±0,5% - ±10%, таким как колебания в диапазоне указанного значения ±0,5, ±1, ±1,5, ±2, ±2,5, ±3, ±3,5, ±4, ±4,5, ±5, ±5,5, ±6, ±6,5, ±7, ±7,5, ±8, ±8,5, ±9, ±9,5 или ±10%.
В настоящем изобретении термин включает, в целом, означает включают, суммируют, имеют или содержат. В некоторых случаях он также означает является или состоит из.
Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к антителу или его антигенсвязывающему фрагменту или варианту, связывающемуся с белком PD-L1 со значением KD 3x10’9 M или менее (например, значение KD составляет не более приблизительно 3x10’9, не более приблизительно 2x10’ , не более приблизительно 1x10’9, не более приблизительно 9x10’10 , не более приблизительно 8x10’10, не более приблизительно 7x10’10, не более приблизительно 6x10’10, не более приблизительно 5x10’10, не более приблизительно 4x10’10, не более приблизительно 3x10’10, не более приблизительно 2x10’10, не более
1x10’10, не более приблизительно 9x10’11, не более приблизительно 8x10’11, не более приблизительно 7x10’11, не более приблизительно 6x10’11, не более приблизительно 1x10’11 М или менее). Например, антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант может связываться с белком PD-L1 со значением KD менее 8x10’11 M.
Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент или вариант по настоящему изобретению может ингибировать связывание PD-L1 с PD-1.
Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент или вариант по настоящему изобретению может приводить к облегчению или лечению опухолеассоциированных заболеваний. Опухоль включает рак толстого кишечника.
В настоящем изобретении антитело может быть выбрано из группы, состоящей из моноклонального антитела, одноцепочечного антитела, химерного антитела, гуманизированного антитела и полностью человеческого антитела.
В настоящем изобретении антигенсвязывающий фрагмент может быть выбран из группы, состоящей из Fab-, Fab'-, F(ab)2- и Fv-фрагмента.
В настоящем изобретении вариант может являться аминокислотной последовательностью, имеющей, по существу, ту же функцию (например, может специфически связываться с PD-L1), и имеет по меньшей мере 85% или более (например, по меньшей мере приблизительно 85, приблизительно 90, приблизительно 91, приблизительно 92, приблизительно 93, приблизительно 94, приблизительно 95, приблизительно 96, приблизительно 97, приблизительно 98, приблизительно 99% или более) идентичности последовательности. В некоторых вариантах осуществления вариант аминокислотной последовательности имеет, по существу, ту же функцию (например, способность специфически связываться с PD-L1) и включает аминокислотную последовательность, полученную посредством добавления, делеции или замены одной или более (например, 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7, 1-8, 1-9, 1-10 или более) аминокислот. В качестве другого примера, вариант по настоящему изобретению может быть выбран из следующей группы: белок или полипептид, подвергнутый замене, делеции или добавлению одной или более аминокислот в антителе или его антигенсвязывающем фрагменте; и белок или полипептид, имеющий более 85% (например, по меньшей мере приблизительно 85, приблизительно 90, приблизительно 91, приблизительно 92, приблизительно 93, приблизительно 94, приблизительно 95, приблизительно 96, приблизительно 97, приблизительно 98, приблизительно 99% или более) идентичности последовательности по отношению к антителу или его антигенсвязывающему фрагменту.
В некоторых вариантах осуществления антитело по настоящему изобретению может включать легкую цепь антитела или ее фрагмент, включающий LCDR1, и LCDR1 включает аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 53: TGTX1SX2VGGYX3X4VS; где X1 является S, R или V; Х2 является D, Е или S; X3 является N или R; X4 является Y или Е, и где LCDR1 определяют в соответствии с индексом нумерации антител Kabat. Например, легкая цепь антитела или ее фрагмент может включать LCDR1, и LCDR1 включает следующую аминокислотную последовательность или ее вариант: SEQ ID NO: 54-58.
В некоторых вариантах осуществления легкая цепь антитела или ее фрагмент может включать LCDR2, включающую аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 59: X1NSX2RPS, где X1 является G или Е; Х2 является N или I, и где LCDR2 определяют в соответствии с индексом нумерации антител Kabat. Например, легкая цепь антитела или ее фрагмент может включать LCDR2, включающую следующую аминокислотную последовательность или ее вариант: SEQ ID NO: 6061.
В некоторых вариантах осуществления легкая цепь антитела или ее фрагмент может включать LCDR3, включающую аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 62: QSYDSSLSGX1V, где X1 является S или Т, и где LCDR3 определяют в соответствии с индексом нумера
- 10 044684 ции антител Kabat. Например, легкая цепь антитела или ее фрагмент может включать LCDR3, включающую аминокислотную последовательность или ее вариант, выбранные из группы, состоящей из SEQ ID NO: 63 и SEQ ID NO: 64.
В некоторых вариантах осуществления легкая цепь антитела или ее фрагмент может дополнительно включать каркасные области L-FR1, L-FR2, L-FR3 и L-FR4. Например, С-конец L-FR1 можно прямо или косвенно соединять с N-концом LCDR1, и L-FR1 включает аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 71. L-FR2 находится между LCDR1 и LCDR2, и L-FR2 включает аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 72. L-FR3 находится между LCDR2 и LCDR3, и L-FR3 включает аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 73-75. N-конец L-FR4 прямо или косвенно связан с С-концом LCDR3, и L-FR4 включает аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 76. В некоторых вариантах осуществления каркасные области выбраны из группы, состоящей из консенсусных каркасных последовательностей человека и последовательностей зародышевой линии человека.
В некоторых вариантах осуществления легкая цепь или ее фрагмент из антитела по настоящему изобретению включает вариабельную область легкой цепи VL, и вариабельная область легкой цепи VL включает аминокислотную последовательность или ее вариант, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39 и SEQ ID NO: 41.
В антителе или его антигенсвязывающем фрагменте или варианте по настоящему изобретению легкая цепь антитела или ее фрагмент может дополнительно включать константную область человека, и константная область человека включает константную область Igλ человека.
В настоящем изобретении легкая цепь антитела или ее фрагмент может включать аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40 и SEQ ID NO: 42.
В настоящем изобретении антитело по настоящему изобретению может включать тяжелую цепь антитела или ее фрагмент, где тяжелая цепь антитела или ее фрагмент может включать HCDR1, и HCDR1 может включать аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей, приведенных в SEQ ID NO: 45: X1YAIS, где X1 является S или Т, и где HCDR1 определяют в соответствии с индексом нумерации антител Kabat. Например, тяжелая цепь антитела или ее фрагмент может включать HCDR1, и HCDR1 включает аминокислотную последовательность или ее вариант, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 46 и SEQ ID NO: 47.
В настоящем изобретении тяжелая цепь антитела или ее фрагмент может включать HCDR2, и HCDR2 включает следующую аминокислотную последовательность или ее вариант: SEQ ID NO: 48, и где HCDR2 определяют в соответствии с индексом нумерации антител Kabat.
В настоящем изобретении тяжелая цепь антитела или ее фрагмент может включать HCDR3, и HCDR3 включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей, приведенных в SEQ ID NO: 49: TMX1X2YX3X4GNX5DY, где X1 является D, Е или G, X2 является G или Е, X3 является S или G, X4 является Y или F, X5 является F или Y, и где HCDR3 определяют в соответствии с индексом нумерации антител Kabat. Например, тяжелая цепь антитела или ее фрагмент может включать HCDR3, и HCDR3 включает следующую аминокислотную последовательность или ее вариант: SEQ ID NO: 50-52.
В некоторых вариантах осуществления тяжелая цепь антитела или ее фрагмент дополнительно включает каркасные области H-FR1, H-FR2, H-FR3 и H-FR4. Например, С-конец H-FR1 прямо или косвенно связан с N-концом HCDR1, и H-FR1 может включать аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66 и SEQ ID NO: 67. H-FR2 находится между HCDR1 и HCDR2, и H-FR2 может включать аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 68. H-FR3 находится между HCDR2 и HCDR3, и H-FR3 может включать аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 69. N-конец H-FR4 прямо или косвенно связан с Сконцом HCDR3, и H-FR4 может включать аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 70. В некоторых вариантах осуществления каркасные области выбраны из группы, состоящей из консенсусных каркасных последовательностей человека и последовательностей зародышевой линии человека.
Тяжелая цепь антитела или ее фрагмент по настоящему изобретению может включать вариабельную область тяжелой цепи VH, и вариабельная область тяжелой цепи VH может включать аминокислотную последовательность или ее вариант, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 31, и SEQ ID NO: 35. В антителе, его антигенсвязывающем фрагменте или варианте по настоящему изобретению тяжелая цепь антитела или ее фрагмент может дополнительно включать константную область человека. Например, константная область человека может включать константную область IgG человека. Например, константная область IgG человека может включать константную область IgG1 человека.
В некоторых вариантах осуществления тяжелая цепь антитела или ее фрагмент может включать аминокислотную последовательность или ее вариант, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 32 и SEQ ID NO: 36.
- 11 044684
В некоторых вариантах осуществления антитело по настоящему изобретению включает легкую цепь антитела или ее фрагмент, включающую LCDR1, и LCDR1 включает аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 53: TGTX1SX2VGGYX3X4VS; где X1 является S, R или V; Х2 является D, Е или S; X3 является N или R; X4 является Y или Е, и где LCDR1 определяют в соответствии с индексом нумерации антител Kabat. Например, легкая цепь антитела или ее фрагмент может включать LCDR1, и LCDR1 включает аминокислотную последовательность или ее вариант, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 54-58. Легкая цепь антитела или ее фрагмент включает LCDR2, включающую аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 59: X1NSX2RPS, где X1 является G или Е; Х2 является N или I, и где LCDR2 определяют в соответствии с индексом нумерации антител Kabat. Например, легкая цепь антитела или ее фрагмент может включать LCDR2, включающую аминокислотную последовательность или ее вариант, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 60-61. Легкая цепь антитела или ее фрагмент включает LCDR3, включающую аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 62: QSYDSSLSGX1V, где X1 является S или Т, и где LCDR3 определяют в соответствии с индексом нумерации антител Kabat. Например, легкая цепь антитела или ее фрагмент может включать LCDR3, включающую аминокислотную последовательность или ее вариант, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 63-64. Кроме того, антитело по настоящему изобретению включает тяжелую цепь антитела или ее фрагмент, включающую HCDR1, и HCDR1 включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей, приведенных в SEQ ID NO: 45: X1YAIS, где X1 является S или Т, и где HCDR1 определяют в соответствии с индексом нумерации антител Kabat. Например, тяжелая цепь антитела или ее фрагмент может включать HCDR1, и HCDR1 включает аминокислотную последовательность или ее вариант, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 46 и SEQ ID NO: 47. Например, тяжелая цепь антитела или ее фрагмент может включать HCDR2, и HCDR2 включает следующую аминокислотную последовательность или ее вариант: SEQ ID NO: 48, и где HCDR2 определяют в соответствии с индексом нумерации антител Kabat. В качестве другого примера, тяжелая цепь антитела или ее фрагмент включает HCDR3, и HCDR3 включает аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 49: TMX1X2YX3X4GNX5DY, где X1 является D, Е или G, X2 является G или Е, X3 является S или G, X4 является Y или F, X5 является F или Y, и где HCDR3 определяют в соответствии с индексом нумерации антител Kabat. тяжелая цепь антитела или ее фрагмент может включать HCDR3, и HCDR3 включает следующую аминокислотную последовательность или ее вариант: SEQ ID NO: 50-52.
Аминокислотная последовательность LCDR1 антитела, его антигенсвязывающего фрагмента или варианта по настоящему изобретению может включать SEQ ID NO: 54 или ее вариант; аминокислотная последовательность LCDR2 может включать SEQ ID NO: 60 или ее вариант; аминокислотная последовательность LCDR3 может включать SEQ ID NO: 63 или ее вариант; и аминокислотная последовательность HCDR1 может включать SEQ ID NO: 46; аминокислотная последовательность HCDR2 может включать SEQ ID NO: 48 или ее вариант; аминокислотная последовательность HCDR3 может включать SEQ ID NO: 50 или ее вариант. Например, антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант может включать антитело YN-002 или антитело с теми же LCDR1-3 и HCDR1-3. В некоторых случаях, аминокислотная последовательность L-FR1 антитела, его антигенсвязывающего фрагмента или варианта может включать SEQ ID NO: 71 или ее вариант; аминокислотная последовательность L-FR2 может включать SEQ ID NO: 72 или ее вариант; аминокислотная последовательность L-FR3 может включать SEQ ID NO: 73 или ее вариант; аминокислотная последовательность L-FR4 может включать SEQ ID NO: 76 или ее вариант; и аминокислотная последовательность FIFR1 может включать SEQ ID NO: 65 или ее вариант; аминокислотная последовательность H-FR2 может включать SEQ ID NO: 68 или ее вариант; аминокислотная последовательность H-FR3 может включать SEQ ID NO: 69 или ее вариант; и аминокислотная последовательность H-FR4 может включать SEQ ID NO: 70 или ее вариант. Например, антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант может включать антитело, имеющее те же LCDR1-3, HCDR13, L-FR1-4 и H-FR1-4, что и антитело YN-002. В некоторых вариантах осуществления легкая цепь антитела, его антигенсвязывающего фрагмента или варианта по настоящему изобретению может включать вариабельную область легкой цепи, аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи может включать SEQ ID NO: 4 или ее вариант; и где тяжелая цепь может включать вариабельную область тяжелой цепи, и аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи может включать SEQ ID NO: 2 или ее вариант. Например, антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант может включать антитело YN-002 или антитело, имеющее ту же вариабельную область легкой цепи и вариабельную область тяжелой цепи. В некоторых вариантах осуществления антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант по настоящему изобретению может включать легкую цепь и тяжелую цепь, аминокислотная последовательность легкой цепи приведена в SEQ ID NO: 8, и аминокислотная последовательность тяжелой цепи приведена в SEQ ID NO: 6. Например, антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант может включать антитело YN-002 или иметь ту же легкую цепь и тяжелую цепь.
В некоторых вариантах осуществления антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант по настоящему изобретению конкурирует с референсным антителом за связывание с белком PD-L1 (на
- 12 044684 пример, белком PD-L1 человека). Референсное антитело может включать LCDR1-3 и HCDR1-3, и аминокислотная последовательность LCDR1 может включать SEQ ID NO: 54 или ее вариант; аминокислотная последовательность LCDR2 может включать SEQ ID NO: 60 или ее вариант; аминокислотная последовательность LCDR3 может включать SEQ ID NO: 63 или ее вариант; и аминокислотная последовательность HCDR1 может включать SEQ ID NO: 46 или ее вариант; аминокислотная последовательность HCDR2 может включать SEQ ID NO: 48 или ее вариант; аминокислотная последовательность HCDR3 может включать SEQ ID NO: 50 или ее вариант. В некоторых вариантах осуществления референсное антитело может включать антитело YN-002 или антитело с теми же LCDR1-3 и HCDR1-3. В некоторых вариантах осуществления референсное антитело включает L-FR1-4 и H-FR1-4, и аминокислотная последовательность L-FR1 может включать SEQ ID NO: 71 или ее вариант; аминокислотная последовательность L-FR2 может включать SEQ ID NO: 72 или ее вариант; аминокислотная последовательность L-FR3 может включать SEQ ID NO: 73 или ее вариант; аминокислотная последовательность L-FR4 может включать SEQ ID NO: 76 или ее вариант; и аминокислотная последовательность H-FR1 может включать SEQ ID NO: 65 или ее вариант; аминокислотная последовательность H-FR2 может включать SEQ ID NO: 68 или ее вариант; аминокислотная последовательность H-FR3 может включать SEQ ID NO: 69 или ее вариант; аминокислотная последовательность H-FR4 может включать SEQ ID NO: 70 или ее вариант. Например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент может включать антитело YN-002 или антитело с теми же LCDR1-3, HCDR1-3, L-FR1-4 и H-FR1-4. В некоторых вариантах осуществления референсное антитело может включать вариабельную область легкой цепи и вариабельную область тяжелой цепи, аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи может включать SEQ ID NO: 4 или ее вариант; и аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи может включать SEQ ID NO: 2 или ее вариант. Например, референсное антитело может включать антитело YN-002 или антитело, имеющее ту же вариабельную область легкой цепи и вариабельную область тяжелой цепи. В некоторых вариантах осуществления референсное антитело может включать легкую цепь и тяжелую цепь, аминокислотная последовательность легкой цепи может быть приведена в SEQ ID NO: 8, и аминокислотная последовательность тяжелой цепи может быть приведена в SEQ ID NO: 6. Например, референсное антитело может включать антитело YN-002 или иметь ту же легкую цепь и тяжелую цепь.
В некоторых вариантах осуществления аминокислотная последовательность LCDR1 антитела, его антигенсвязывающего фрагмента или варианта по настоящему изобретению может включать SEQ ID NO: 54 или ее вариант; аминокислотная последовательность LCDR2 может включать SEQ ID NO: 60 или ее вариант; аминокислотная последовательность LCDR3 может включать SEQ ID NO: 63 или ее вариант; и аминокислотная последовательность HCDR1 может включать SEQ ID NO: 46 или ее вариант; аминокислотная последовательность HCDR2 может включать SEQ ID NO: 48 или ее вариант; аминокислотная последовательность HCDR3 может включать SEQ ID NO: 50 или ее вариант. Например, антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант может включать антитело YN-003 или антитело с теми же LCDR1-3 и HCDR1-3. В некоторых случаях аминокислотная последовательность L-FR1 антитела, его антигенсвязывающего фрагмента или варианта может включать SEQ ID NO: 71 или ее вариант; аминокислотная последовательность L-FR2 может включать SEQ ID NO: 72 или ее вариант; аминокислотная последовательность L-FR3 может включать SEQ ID NO: 74 или ее вариант; аминокислотная последовательность L-FR4 может включать SEQ ID NO: 76 или ее вариант; и аминокислотная последовательность H-FR1 может включать SEQ ID NO: 66 или ее вариант; аминокислотная последовательность H-FR2 может включать SEQ ID NO: 68 или ее вариант; аминокислотная последовательность H-FR3 может включать SEQ ID NO: 69 или ее вариант; и аминокислотная последовательность H-FR4 может включать SEQ ID NO: 70 или ее вариант. Например, антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант может включать антитело YN-003 или антитело с теми же LCDR1-3, HCDR1-3, L-FR1-4 и H-FR1-4. В некоторых вариантах осуществления легкая цепь антитела, его антигенсвязывающего фрагмента или варианта по настоящему изобретению может включать вариабельную область легкой цепи, аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи может включать SEQ ID NO: 11 или ее вариант; и где тяжелая цепь может включать вариабельную область тяжелой цепи, и аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи может включать SEQ ID NO: 9 или ее вариант. Например, антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант может включать антитело YN-003 или антитело, имеющее ту же вариабельную область легкой цепи и вариабельную область тяжелой цепи. В некоторых вариантах осуществления антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант по настоящему изобретению может включать легкую цепь и тяжелую цепь, аминокислотная последовательность легкой цепи приведена в SEQ ID NO: 15 и аминокислотная последовательность тяжелой цепи приведена в SEQ ID NO: 13. Например, антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант может включать антитело YN-003 или иметь ту же легкую цепь и тяжелую цепь.
В некоторых вариантах осуществления антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант по настоящему изобретению конкурирует с референсным антителом за связывание с белком PD-L1 (например, белком PD-L1 человека). Референсное антитело может включать LCDR1-3 и HCDR1-3, и аминокислотная последовательность LCDR1 может включать SEQ ID NO: 54 или ее вариант; аминокислотная последовательность LCDR2 может включать SEQ ID NO: 60 или ее вариант; аминокислотная последова
- 13 044684 тельность LCDR3 может включать SEQ ID NO: 63 или ее вариант; и аминокислотная последовательность HCDR1 может включать SEQ ID NO: 46 или ее вариант; аминокислотная последовательность HCDR2 может включать SEQ ID NO: 48 или ее вариант; аминокислотная последовательность HCDR3 может включать SEQ ID NO: 50 или ее вариант. В некоторых вариантах осуществления референсное антитело может включать антитело YN-003 или антитело с теми же LCDR1-3 и HCDR1-3. В некоторых вариантах осуществления референсное антитело включает L-FR1-4 и H-FR1-4, и аминокислотная последовательность L-FR1 может включать SEQ ID NO: 71 или ее вариант; аминокислотная последовательность L-FR2 может включать SEQ ID NO: 72 или ее вариант; аминокислотная последовательность L-FR3 может включать SEQ ID NO: 74 или ее вариант; аминокислотная последовательность L-FR4 может включать SEQ ID NO: 76 или ее вариант; и аминокислотная последовательность H-FR1 может включать SEQ ID NO: 66 или ее вариант; аминокислотная последовательность H-FR2 может включать SEQ ID NO: 68 или ее вариант; аминокислотная последовательность H-FR3 может включать SEQ ID NO: 69 или ее вариант; аминокислотная последовательность H-FR4 может включать SEQ ID NO: 70 или ее вариант. Например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент может включать антитело YN-003 или антитело с теми же LCDR1-3, HCDR1-3, L-FR1-4 и H-FR1-4. В некоторых вариантах осуществления референсное антитело может включать вариабельную область легкой цепи и вариабельную область тяжелой цепи, аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи может включать SEQ ID NO: 11 или ее вариант; и аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи может включать SEQ ID NO: 9 или ее вариант. Например, референсное антитело может включать антитело YN-003 или антитело, имеющее ту же вариабельную область легкой цепи и вариабельную область тяжелой цепи. В некоторых вариантах осуществления референсное антитело может включать легкую цепь и тяжелую цепь, аминокислотная последовательность легкой цепи может быть приведена в SEQ ID NO: 15, и аминокислотная последовательность тяжелой цепи может быть приведена в SEQ ID NO: 13. Например, референсное антитело может включать антитело YN-003 или иметь ту же легкую цепь и тяжелую цепь.
В некоторых вариантах осуществления аминокислотная последовательность LCDR1 антитела, его антигенсвязывающего фрагмента или варианта по настоящему изобретению может включать SEQ ID NO: 55 или ее вариант; аминокислотная последовательность LCDR2 может включать SEQ ID NO: 60 или ее вариант; аминокислотная последовательность LCDR3 может включать SEQ ID NO: 64 или ее вариант; и аминокислотная последовательность HCDR1 может включать SEQ ID NO: 47 или ее вариант; аминокислотная последовательность HCDR2 может включать SEQ ID NO: 48 или ее вариант; аминокислотная последовательность HCDR3 может включать SEQ ID NO: 51 или ее вариант. Например, антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант может включать антитело YN-035 или антитело с теми же LCDR1-3 и HCDR1-3. В некоторых случаях, аминокислотная последовательность L-FR1 антитела, его антигенсвязывающего фрагмента или варианта может включать SEQ ID NO: 71 или ее вариант; аминокислотная последовательность L-FR2 может включать SEQ ID NO: 72 или ее вариант; аминокислотная последовательность L-FR3 может включать SEQ ID NO: 74 или ее вариант; аминокислотная последовательность L-FR4 может включать SEQ ID NO: 76 или ее вариант; и аминокислотная последовательность H-FR1 может включать SEQ ID NO: 67 или ее вариант; аминокислотная последовательность H-FR2 может включать SEQ ID NO: 68 или ее вариант; аминокислотная последовательность H-FR3 может включать SEQ ID NO: 69 или ее вариант; и аминокислотная последовательность H-FR4 может включать SEQ ID NO: 70 или ее вариант. Например, антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант может включать антитело YN-035 или антитело с теми же LCDR1-3, HCDR1-3, L-FR1-4 и H-FR1-4. В некоторых вариантах осуществления легкая цепь антитела, его антигенсвязывающего фрагмента или варианта по настоящему изобретению может включать вариабельную область легкой цепи, аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи может включать SEQ ID NO: 33 или ее вариант; и где тяжелая цепь может включать вариабельную область тяжелой цепи, и аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи может включать SEQ ID NO: 31 или ее вариант. Например, антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант может включать антитело YN-035 или антитело, имеющее ту же вариабельную область легкой цепи и вариабельную область тяжелой цепи. В некоторых вариантах осуществления антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант по настоящему изобретению может включать легкую цепь и тяжелую цепь, аминокислотная последовательность легкой цепи приведена в SEQ ID NO: 34, и аминокислотная последовательность тяжелой цепи приведена в SEQ ID NO: 32. Например, антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант может включать антитело YN-035 или иметь ту же легкую цепь и тяжелую цепь.
В некоторых вариантах осуществления антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант по настоящему изобретению конкурирует с референсным антителом за связывание с белком PD-L1 (например, белком PD-L1 человека). Референсное антитело может включать LCDR1-3 и HCDR1-3, и аминокислотная последовательность LCDR1 может включать SEQ ID NO: 55 или ее вариант; аминокислотная последовательность LCDR2 может включать SEQ ID NO: 60 или ее вариант; аминокислотная последовательность LCDR3 может включать SEQ ID NO: 64 или ее вариант; и аминокислотная последовательность HCDR1 может включать SEQ ID NO: 47 или ее вариант; аминокислотная последовательность HCDR2 может включать SEQ ID NO: 48 или ее вариант; аминокислотная последовательность HCDR3 может
- 14 044684 включать SEQ ID NO: 51 или ее вариант. В некоторых вариантах осуществления референсное антитело может включать антитело YN-035 или антитело с теми же LCDR1-3 и HCDR1-3. В некоторых вариантах осуществления референсное антитело включает L-FR1-4 и H-FR1-4, и аминокислотная последовательность L-FR1 может включать SEQ ID NO: 71 или ее вариант; аминокислотная последовательность L-FR2 может включать SEQ ID NO: 72 или ее вариант; аминокислотная последовательность L-FR3 может включать SEQ ID NO: 74 или ее вариант; аминокислотная последовательность L-FR4 может включать SEQ ID NO: 76 или ее вариант; и аминокислотная последовательность H-FR1 может включать SEQ ID NO: 67 или ее вариант; аминокислотная последовательность H-FR2 может включать SEQ ID NO: 68 или ее вариант; аминокислотная последовательность H-FR3 может включать SEQ ID NO: 69 или ее вариант; аминокислотная последовательность H-FR4 может включать SEQ ID NO: 70 или ее вариант. Например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент может включать антитело YN-035 или антитело с теми же LCDR1-3, HCDR1-3, L-FR1-4 и H-FR1-4. В некоторых вариантах осуществления референсное антитело может включать вариабельную область легкой цепи и вариабельную область тяжелой цепи, аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи может включать SEQ ID NO: 33 или ее вариант; и аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи может включать SEQ ID NO: 31 или ее вариант. Например, референсное антитело может включать антитело YN-035 или антитело, имеющее ту же вариабельную область легкой цепи и вариабельную область тяжелой цепи. В некоторых вариантах осуществления референсное антитело может включать легкую цепь и тяжелую цепь, аминокислотная последовательность легкой цепи может быть приведена в SEQ ID NO: 34, и аминокислотная последовательность тяжелой цепи может быть приведена в SEQ ID NO: 32. Например, референсное антитело может включать антитело YN-035 или иметь ту же легкую цепь и тяжелую цепь.
В некоторых вариантах осуществления аминокислотная последовательность LCDR1 антитела, его антигенсвязывающего фрагмента или варианта по настоящему изобретению может включать SEQ ID NO: 55 или ее вариант; аминокислотная последовательность LCDR2 может включать SEQ ID NO: 60 или ее вариант; аминокислотная последовательность LCDR3 может включать SEQ ID NO: 64 или ее вариант; и аминокислотная последовательность HCDR1 может включать SEQ ID NO: 47 или ее вариант; аминокислотная последовательность HCDR2 может включать SEQ ID NO: 48 или ее вариант; аминокислотная последовательность HCDR3 может включать SEQ ID NO: 52 или ее вариант. Например, антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант может включать антитело YN-036 или антитело с теми же LCDR1-3 и HCDR1-3. В некоторых случаях аминокислотная последовательность L-FR1 антитела, его антигенсвязывающего фрагмента или варианта может включать SEQ ID NO: 71 или ее вариант; аминокислотная последовательность L-FR2 может включать SEQ ID NO: 72 или ее вариант; аминокислотная последовательность L-FR3 может включать SEQ ID NO: 74 или ее вариант; аминокислотная последовательность L-FR4 может включать SEQ ID NO: 76 или ее вариант; и аминокислотная последовательность H-FR1 может включать SEQ ID NO: 67 или ее вариант; аминокислотная последовательность H-FR2 может включать SEQ ID NO: 68 или ее вариант; аминокислотная последовательность H-FR3 может включать SEQ ID NO: 69 или ее вариант; и аминокислотная последовательность H-FR4 может включать SEQ ID NO: 70 или ее вариант. Например, антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант может включать антитело YN-036 или антитело с теми же LCDR1-3, HCDR1-3, L-FR1-4 и H-FR1-4. В некоторых вариантах осуществления легкая цепь антитела, его антигенсвязывающего фрагмента или варианта по настоящему изобретению может включать вариабельную область легкой цепи, аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи может включать SEQ ID NO: 33 или ее вариант; и где тяжелая цепь может включать вариабельную область тяжелой цепи, и аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи может включать SEQ ID NO: 35 или ее вариант. Например, антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант может включать антитело YN-036 или антитело, имеющее ту же вариабельную область легкой цепи и вариабельную область тяжелой цепи. В некоторых вариантах осуществления антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант по настоящему изобретению может включать легкую цепь и тяжелую цепь, аминокислотная последовательность легкой цепи приведена в SEQ ID NO: 34 и аминокислотная последовательность тяжелой цепи приведена в SEQ ID NO: 36. Например, антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант может включать антитело YN-036 или иметь ту же легкую цепь и тяжелую цепь.
В некоторых вариантах осуществления антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант по настоящему изобретению конкурирует с референсным антителом за связывание с белком PD-L1 (например, белком PD-L1 человека). Референсное антитело может включать LCDR1-3 и HCDR1-3, и аминокислотная последовательность LCDR1 может включать SEQ ID NO: 55 или ее вариант; аминокислотная последовательность LCDR2 может включать SEQ ID NO: 60 или ее вариант; аминокислотная последовательность LCDR3 может включать SEQ ID NO: 64 или ее вариант; и аминокислотная последовательность HCDR1 может включать SEQ ID NO: 47 или ее вариант; аминокислотная последовательность HCDR2 может включать SEQ ID NO: 48 или ее вариант; и аминокислотная последовательность HCDR3 может включать SEQ ID NO: 52 или ее вариант. В некоторых вариантах осуществления референсное антитело может включать антитело YN-036 или антитело с теми же LCDR1-3 и HCDR1-3. В некоторых вариантах осуществления референсное антитело включает L-FR1-4 и H-FR1-4, и аминокислотная последователь
- 15 044684 ность L-FR1 может включать SEQ ID NO: 71 или ее вариант; аминокислотная последовательность LFR2 может включать SEQ ID NO: 72 или ее вариант; аминокислотная последовательность L-FR3 может включать SEQ ID NO: 74 или ее вариант; аминокислотная последовательность L-FR4 может включать SEQ ID NO: 76 или ее вариант; и аминокислотная последовательность H-FR1 может включать SEQ ID NO: 67 или ее вариант; аминокислотная последовательность H-FR2 может включать SEQ ID NO: 68 или ее вариант; аминокислотная последовательность H-FR3 может включать SEQ ID NO: 69 или ее вариант; аминокислотная последовательность H-FR4 может включать SEQ ID NO: 70 или ее вариант. Например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент может включать антитело YN-036 или антитело с теми же LCDR1-3, HCDR1-3, L-FR1-4 и H-FR1-4. В некоторых вариантах осуществления референсное антитело может включать вариабельную область легкой цепи и вариабельную область тяжелой цепи, аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи может включать SEQ ID NO: 33 или ее вариант; и аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи может включать SEQ ID NO: 35 или ее вариант. Например, референсное антитело может включать антитело YN-036 или антитело, имеющее ту же вариабельную область легкой цепи и вариабельную область тяжелой цепи. В некоторых вариантах осуществления референсное антитело может включать легкую цепь и тяжелую цепь, аминокислотная последовательность легкой цепи может быть приведена в SEQ ID NO: 34 и аминокислотная последовательность тяжелой цепи может быть приведена в SEQ ID NO: 36. Например, референсное антитело может включать антитело YN-036 или иметь ту же легкую цепь и тяжелую цепь.
В некоторых вариантах осуществления аминокислотная последовательность LCDR1 антитела, его антигенсвязывающего фрагмента или варианта по настоящему изобретению может включать SEQ ID NO: 56 или ее вариант; аминокислотная последовательность LCDR2 может включать SEQ ID NO: 61 или ее вариант; аминокислотная последовательность LCDR3 может включать SEQ ID NO: 64 или ее вариант; и аминокислотная последовательность HCDR1 может включать SEQ ID NO: 47 или ее вариант; аминокислотная последовательность HCDR2 может включать SEQ ID NO: 48 или ее вариант; и аминокислотная последовательность HCDR3 может включать SEQ ID NO: 52 или ее вариант. Например, антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант может включать антитело YN-037 или антитело с теми же LCDR1-3 и HCDR1-3. В некоторых случаях, аминокислотная последовательность L-FR1 антитела, его антигенсвязывающего фрагмента или варианта может включать SEQ ID NO: 71 или ее вариант; аминокислотная последовательность L-FR2 может включать SEQ ID NO: 72 или ее вариант; аминокислотная последовательность L-FR3 может включать SEQ ID NO: 75 или ее вариант; аминокислотная последовательность L-FR4 может включать SEQ ID NO: 76 или ее вариант; и аминокислотная последовательность H-FR1 может включать SEQ ID NO: 67 или ее вариант; аминокислотная последовательность H-FR2 может включать SEQ ID NO: 68 или ее вариант; аминокислотная последовательность H-FR3 может включать SEQ ID NO: 69 или ее вариант; и аминокислотная последовательность H-FR4 может включать SEQ ID NO: 70 или ее вариант. Например, антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант может включать антитело YN-037 или антитело с теми же LCDR1-3, HCDR1-3, L-FR1-4 и H-FR1-4. В некоторых вариантах осуществления легкая цепь антитела, его антигенсвязывающего фрагмента или варианта по настоящему изобретению может включать вариабельную область легкой цепи, аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи может включать SEQ ID NO: 37 или ее вариант; и где тяжелая цепь может включать вариабельную область тяжелой цепи, и аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи может включать SEQ ID NO: 35 или ее вариант. Например, антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант может включать антитело YN-037 или антитело, имеющее ту же вариабельную область легкой цепи и вариабельную область тяжелой цепи. В некоторых вариантах осуществления антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант по настоящему изобретению может включать легкую цепь и тяжелую цепь, аминокислотная последовательность легкой цепи приведена в SEQ ID NO: 38 и аминокислотная последовательность тяжелой цепи приведена в SEQ ID NO: 36. Например, антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант может включать антитело YN-037 или иметь ту же легкую цепь и тяжелую цепь.
В некоторых вариантах осуществления антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант по настоящему изобретению конкурирует с референсным антителом за связывание с белком PD-L1 (например, белком PD-L1 человека). Референсное антитело может включать LCDR1-3 и HCDR1-3, и аминокислотная последовательность LCDR1 может включать SEQ ID NO: 56 или ее вариант; аминокислотная последовательность LCDR2 может включать SEQ ID NO: 61 или ее вариант; аминокислотная последовательность LCDR3 может включать SEQ ID NO: 64 или ее вариант; и аминокислотная последовательность HCDR1 может включать SEQ ID NO: 47 или ее вариант; аминокислотная последовательность HCDR2 может включать SEQ ID NO: 48 или ее вариант; и аминокислотная последовательность HCDR3 может включать SEQ ID NO: 52 или ее вариант. В некоторых вариантах осуществления референсное антитело может включать антитело YN-037 или антитело с теми же LCDR1-3 и HCDR1-3. В некоторых вариантах осуществления референсное антитело включает L-FR1-4 и H-FR1-4, и аминокислотная последовательность L-FR1 может включать SEQ ID NO: 71 или ее вариант; аминокислотная последовательность L-FR2 может включать SEQ ID NO: 72 или ее вариант; аминокислотная последовательность L-FR3 может включать SEQ ID NO: 75 или ее вариант; аминокислотная последовательность L-FR4 может включать
- 16 044684
SEQ ID NO: 76 или ее вариант; и аминокислотная последовательность H-FR1 может включать SEQ ID NO: 67 или ее вариант; аминокислотная последовательность H-FR2 может включать SEQ ID NO: 68 или ее вариант; аминокислотная последовательность H-FR3 может включать SEQ ID NO: 69 или ее вариант; и аминокислотная последовательность H-FR4 может включать SEQ ID NO: 70 или ее вариант. Например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент может включать антитело YN-037 или антитело с теми же LCDR1-3, HCDR1-3, L-FR1-4 и H-FR1-4. В некоторых вариантах осуществления референсное антитело может включать вариабельную область легкой цепи и вариабельную область тяжелой цепи, аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи может включать SEQ ID NO: 37 или ее вариант; и аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи может включать SEQ ID NO: 35 или ее вариант. Например, референсное антитело может включать антитело YN-037 или антитело, имеющее ту же вариабельную область легкой цепи и вариабельную область тяжелой цепи. В некоторых вариантах осуществления референсное антитело может включать легкую цепь и тяжелую цепь, аминокислотная последовательность легкой цепи может быть приведена в SEQ ID NO: 38 и аминокислотная последовательность тяжелой цепи может быть приведена в SEQ ID NO: 36. Например, референсное антитело может включать антитело YN-037 или иметь ту же легкую цепь и тяжелую цепь.
В некоторых вариантах осуществления аминокислотная последовательность LCDR1 антитела, его антигенсвязывающего фрагмента или варианта по настоящему изобретению может включать SEQ ID NO: 57 или ее вариант; аминокислотная последовательность LCDR2 может включать SEQ ID NO: 61 или ее вариант; аминокислотная последовательность LCDR3 может включать SEQ ID NO: 64 или ее вариант; и аминокислотная последовательность HCDR1 может включать SEQ ID NO: 47 или ее вариант; аминокислотная последовательность HCDR2 может включать SEQ ID NO: 48 или ее вариант; и аминокислотная последовательность HCDR3 может включать SEQ ID NO: 52 или ее вариант. Например, антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант может включать антитело YN-038 или антитело с теми же LCDR1-3 и HCDR1-3. В некоторых случаях, аминокислотная последовательность L-FR1 антитела, его антигенсвязывающего фрагмента или варианта может включать SEQ ID NO: 71 или ее вариант; аминокислотная последовательность L-FR2 может включать SEQ ID NO: 72 или ее вариант; аминокислотная последовательность L-FR3 может включать SEQ ID NO: 75 или ее вариант; аминокислотная последовательность L-FR4 может включать SEQ ID NO: 76 или ее вариант; и аминокислотная последовательность H-FR1 может включать SEQ ID NO: 67 или ее вариант; аминокислотная последовательность H-FR2 может включать SEQ ID NO: 68 или ее вариант; аминокислотная последовательность H-FR3 может включать SEQ ID NO: 69 или ее вариант; и аминокислотная последовательность H-FR4 может включать SEQ ID NO: 70 или ее вариант. Например, антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант может включать антитело YN-038 или антитело с теми же LCDR1-3, HCDR1-3, L-FR1-4 и H-FR1-4. В некоторых вариантах осуществления легкая цепь антитела, его антигенсвязывающего фрагмента или варианта по настоящему изобретению может включать вариабельную область легкой цепи, аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи может включать SEQ ID NO: 39 или ее вариант; и где тяжелая цепь может включать вариабельную область тяжелой цепи, и аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи может включать SEQ ID NO: 35 или ее вариант. Например, антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант может включать антитело YN-038 или антитело, имеющее ту же вариабельную область легкой цепи и вариабельную область тяжелой цепи. В некоторых вариантах осуществления антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант по настоящему изобретению может включать легкую цепь и тяжелую цепь, аминокислотная последовательность легкой цепи приведена в SEQ ID NO: 40 и аминокислотная последовательность тяжелой цепи приведена в SEQ ID NO: 36. Например, антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант может включать антитело YN-038 или иметь ту же легкую цепь и тяжелую цепь.
В некоторых вариантах осуществления антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант по настоящему изобретению конкурирует с референсным антителом за связывание с белком PD-L1 (например, белком PD-L1 человека). Референсное антитело может включать LCDR1-3 и HCDR1-3, и аминокислотная последовательность LCDR1 может включать SEQ ID NO: 57 или ее вариант; аминокислотная последовательность LCDR2 может включать SEQ ID NO: 61 или ее вариант; аминокислотная последовательность LCDR3 может включать SEQ ID NO: 64 или ее вариант; и аминокислотная последовательность HCDR1 может включать SEQ ID NO: 47 или ее вариант; аминокислотная последовательность HCDR2 может включать SEQ ID NO: 48 или ее вариант; и аминокислотная последовательность HCDR3 может включать SEQ ID NO: 52 или ее вариант. В некоторых вариантах осуществления референсное антитело может включать антитело YN-038 или антитело с теми же LCDR1-3 и HCDR1-3. В некоторых вариантах осуществления референсное антитело включает L-FR1-4 и H-FR1-4, и аминокислотная последовательность L-FR1 может включать SEQ ID NO: 71 или ее вариант; аминокислотная последовательность L-FR2 может включать SEQ ID NO: 72 или ее вариант; аминокислотная последовательность L-FR3 может включать SEQ ID NO: 75 или ее вариант; аминокислотная последовательность L-FR4 может включать SEQ ID NO: 76 или ее вариант; и аминокислотная последовательность H-FR1 может включать SEQ ID NO: 67 или ее вариант; аминокислотная последовательность H-FR2 может включать SEQ ID NO: 68 или ее вариант; аминокислотная последовательность H-FR3 может включать SEQ ID NO: 69 или ее вариант;
- 17 044684 и аминокислотная последовательность H-FR4 может включать SEQ ID NO: 70 или ее вариант. Например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент может включать антитело YN-038 или антитело с теми же LCDR1-3, HCDR1-3, L-FR1-4 и H-FR1-4. В некоторых вариантах осуществления референсное антитело может включать вариабельную область легкой цепи и вариабельную область тяжелой цепи, аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи может включать SEQ ID NO: 39 или ее вариант; и аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи может включать SEQ ID NO: 35 или ее вариант. Например, референсное антитело может включать антитело YN-038 или антитело, имеющее ту же вариабельную область легкой цепи и вариабельную область тяжелой цепи. В некоторых вариантах осуществления референсное антитело может включать легкую цепь и тяжелую цепь, аминокислотная последовательность легкой цепи может быть приведена в SEQ ID NO: 40 и аминокислотная последовательность тяжелой цепи может быть приведена в SEQ ID NO: 36. Например, референсное антитело может включать антитело YN-038 или иметь ту же легкую цепь и тяжелую цепь.
В некоторых вариантах осуществления аминокислотная последовательность LCDR1 антитела, его антигенсвязывающего фрагмента или варианта по настоящему изобретению может включать SEQ ID NO: 58 или ее вариант; аминокислотная последовательность LCDR2 может включать SEQ ID NO: 61 или ее вариант; аминокислотная последовательность LCDR3 может включать SEQ ID NO: 64 или ее вариант; и аминокислотная последовательность HCDR1 может включать SEQ ID NO: 47 или ее вариант; аминокислотная последовательность HCDR2 может включать SEQ ID NO: 48 или ее вариант; и аминокислотная последовательность HCDR3 может включать SEQ ID NO: 52 или ее вариант. Например, антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант может включать антитело YN-039 или антитело с теми же LCDR1-3 и HCDR1-3. В некоторых случаях, аминокислотная последовательность L-FR1 антитела, его антигенсвязывающего фрагмента или варианта может включать SEQ ID NO: 71 или ее вариант; аминокислотная последовательность L-FR2 может включать SEQ ID NO: 72 или ее вариант; аминокислотная последовательность L-FR3 может включать SEQ ID NO: 75 или ее вариант; аминокислотная последовательность L-FR4 может включать SEQ ID NO: 76 или ее вариант; и аминокислотная последовательность H-FR1 может включать SEQ ID NO: 67 или ее вариант; аминокислотная последовательность H-FR2 может включать SEQ ID NO: 68 или ее вариант; аминокислотная последовательность H-FR3 может включать SEQ ID NO: 69 или ее вариант; и аминокислотная последовательность H-FR4 может включать SEQ ID NO: 70 или ее вариант. Например, антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант может включать антитело YN-039 или антитело с теми же LCDR1-3, HCDR1-3, L-FR1-4 и H-FR1-4. В некоторых вариантах осуществления легкая цепь антитела, его антигенсвязывающего фрагмента или варианта по настоящему изобретению может включать вариабельную область легкой цепи, аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи может включать SEQ ID NO: 41 или ее вариант; и где тяжелая цепь может включать вариабельную область тяжелой цепи, и аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи может включать SEQ ID NO: 35 или ее вариант. Например, антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант может включать антитело YN-039 или антитело, имеющее ту же вариабельную область легкой цепи и вариабельную область тяжелой цепи. В некоторых вариантах осуществления антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант по настоящему изобретению может включать легкую цепь и тяжелую цепь, аминокислотная последовательность легкой цепи приведена в SEQ ID NO: 42 и аминокислотная последовательность тяжелой цепи приведена в SEQ ID NO: 36. Например, антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант может включать антитело YN-039 или иметь ту же легкую цепь и тяжелую цепь.
В некоторых вариантах осуществления антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант по настоящему изобретению конкурирует с референсным антителом за связывание с белком PD-L1 (например, белком PD-L1 человека). Референсное антитело может включать LCDR1-3 и HCDR1-3, и аминокислотная последовательность LCDR1 может включать SEQ ID NO: 58 или ее вариант; аминокислотная последовательность LCDR2 может включать SEQ ID NO: 61 или ее вариант; аминокислотная последовательность LCDR3 может включать SEQ ID NO: 64 или ее вариант; и аминокислотная последовательность HCDR1 может включать SEQ ID NO: 47 или ее вариант; аминокислотная последовательность HCDR2 может включать SEQ ID NO: 48 или ее вариант; и аминокислотная последовательность HCDR3 может включать SEQ ID NO: 52 или ее вариант. В некоторых вариантах осуществления референсное антитело может включать антитело YN-039 или антитело с теми же LCDR1-3 и HCDR1-3. В некоторых вариантах осуществления референсное антитело включает L-FR1-4 и H-FR1-4, и аминокислотная последовательность L-FR1 может включать SEQ ID NO: 71 или ее вариант; аминокислотная последовательность LFR2 может включать SEQ ID NO: 72 или ее вариант; аминокислотная последовательность L-FR3 может включать SEQ ID NO: 75 или ее вариант; аминокислотная последовательность L-FR4 может включать SEQ ID NO: 76 или ее вариант; и аминокислотная последовательность H-FR1 может включать SEQ ID NO: 67 или ее вариант; аминокислотная последовательность H-FR2 может включать SEQ ID NO: 68 или ее вариант; аминокислотная последовательность H-FR3 может включать SEQ ID NO: 69 или ее вариант; и аминокислотная последовательность H-FR4 может включать SEQ ID NO: 70 или ее вариант. Например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент может включать антитело YN-039 или антитело с теми же LCDR1-3, HCDR1-3, L-FR1-4 и H-FR1-4. В некоторых вариантах осуществления референсное антите- 18 044684 ло может включать вариабельную область легкой цепи и вариабельную область тяжелой цепи, аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи может включать SEQ ID NO: 41 или ее вариант; и аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи может включать SEQ ID NO: 35 или ее вариант. Например, референсное антитело может включать антитело YN-039 или антитело, имеющее ту же вариабельную область легкой цепи и вариабельную область тяжелой цепи. В некоторых вариантах осуществления референсное антитело может включать легкую цепь и тяжелую цепь, аминокислотная последовательность легкой цепи может быть приведена в SEQ ID NO: 42 и аминокислотная последовательность тяжелой цепи может быть приведена в SEQ ID NO: 36. Например, референсное антитело может включать антитело YN-039 или иметь ту же легкую цепь и тяжелую цепь.
В настоящем изобретении белок PD-L1 выбран из группы, состоящей из белка PD-L1 человека, белка PD-L1 обезьяны и белка PD-L1 мыши.
В другом аспекте настоящее изобретение также относится к антителу, его антигенсвязывающему фрагменту или варианту, связывающемуся с белком CD137 с KD ниже 5x10’9 М (например, KD не более приблизительно 5x10’9, не более приблизительно 4x10’9, не более приблизительно 3x10’9, не более приблизительно 2x10’9, не более приблизительно 1x10’9 или не более приблизительно 1x10’10 М или менее). Например, оно связывается с белком CD137 с KD ниже 3x10’9 М.
Антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант по настоящему изобретению может приводить к облегчению или лечению опухолей. Например, опухоль может включать рак толстого кишечника.
В настоящем изобретении антитело может быть выбрано из группы, состоящей из моноклонального антитела, одноцепочечного антитела, химерного антитела, гуманизированного антитела и полностью человеческого антитела.
В настоящем изобретении антигенсвязывающий фрагмент может быть выбран из группы, состоящей из Fab-, Fab'-, F(ab)2- и Fv-фрагмента.
В настоящем изобретении вариант может являться аминокислотной последовательностью, имеющей, по существу, ту же функцию (например, способность специфически связываться с CD137), и иметь по меньшей мере 85% или более (например, по меньшей мере приблизительно 85, приблизительно 90, приблизительно 91, приблизительно 92, приблизительно 93, приблизительно 94, приблизительно 95, приблизительно 96, приблизительно 97, приблизительно 98, приблизительно 99% или более) идентичности последовательности. В некоторых вариантах осуществления вариант аминокислотной последовательности является аминокислотной последовательностью, имеющей, по существу, ту же функцию (например, способность специфически связываться с CD137), и, по существу, дополнительно включает добавление, делецию или замену одной или более (например, 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7, 1-8, 1-9, 1-10 или более) аминокислот.
В некоторых вариантах осуществления антитело может включать легкую цепь антитела или ее фрагмент. Например, легкая цепь антитела или ее фрагмент может включать LCDR1, и LCDR1 может включать следующую аминокислотную последовательность или ее вариант: SEQ ID NO: 80. Например, легкая цепь антитела или ее фрагмент может включать LCDR2, включающую следующую аминокислотную последовательность или ее вариант: SEQ ID NO: 81. В качестве другого примера, легкая цепь антитела или ее фрагмент включает LCDR3 или ее вариант, и LCDR3 может включать аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 82.
В некоторых вариантах осуществления, что касается антитела, его антигенсвязывающего фрагмента или варианта, легкая цепь антитела или ее фрагмент дополнительно включает каркасные области L-FR1, L-FR2, L-FR3 и L-FR4. Например, С-конец L-FR1 прямо или косвенно связан с N-концом LCDR1, и LFR1 может включать аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 89. L-FR2 находится между LCDR1 и LCDR2, и L-FR2 может включать аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 90. L-FR3 находится между LCDR2 и LCDR3, и L-FR3 может включать аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 91. N-конец L-FR4 прямо или косвенно связан с С-концом LCDR3, и L-FR4 может включать аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 92.
В некоторых вариантах осуществления, что касается антитела, его антигенсвязывающего фрагмента или варианта, легкая цепь антитела или ее фрагмент включает вариабельную область легкой цепи VL, и вариабельная область легкой цепи VL может включать следующую аминокислотную последовательность или ее вариант: SEQ ID NO: 20.
В настоящем изобретении легкая цепь антитела или ее фрагмент может дополнительно включать константную область человека, и константная область человека включает константную область Igλ человека.
В настоящем изобретении легкая цепь или ее фрагмент из антитела может включать аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 23.
В некоторых вариантах осуществления антитело может включать тяжелую цепь антитела или ее фрагмент. Тяжелая цепь антитела или ее фрагмент включает HCDR1, и HCDR1 может включать сле- 19 044684 дующую аминокислотную последовательность или ее вариант: SEQ ID NO: 77. Тяжелая цепь антитела или ее фрагмент включает HCDR2, и HCDR2 может включать следующую аминокислотную последовательность или ее вариант: SEQ ID NO: 78. Тяжелая цепь антитела или ее фрагмент включает HCDR3, и
HCDR3 может включать следующую аминокислотную последовательность или ее вариант: SEQ ID NO:
79.
В некоторых вариантах осуществления тяжелая цепь антитела или ее фрагмент может дополнительно включать каркасные области H-FR1, H-FR2, H-FR3 и H-FR4. С-конец H-FR1 прямо или косвенно связан с N-концом HCDR1, и H-FR1 может включать аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 84-85. H-FR2 находится между HCDR1 и HCDR2, и H-FR2 может включать аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 86. H-FR3 находится между HCDR2 и HCDR3, и H-FR3 может включать аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 87. N-конец H-FR4 прямо или косвенно связан с С-концом HCDR3, и H-FR4 может включать аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 88.
Тяжелая цепь антитела или ее фрагмент по настоящему изобретению включает вариабельную область тяжелой цепи VH, и вариабельная область тяжелой цепи VH может включать аминокислотную последовательность или ее вариант, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 18 или SEQ ID NO: 25.
В антителе, его антигенсвязывающем фрагменте или варианте по настоящему изобретению тяжелая цепь антитела или ее фрагмент может дополнительно включать константную область человека. Например, константная область человека может включать константную область IgG человека. Например, константная область IgG человека может включать константную область IgG1 человека.
В настоящем изобретении тяжелая цепь антитела или ее фрагмент может включать аминокислотную последовательность или ее вариант, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 21 или SEQ ID NO: 27.
В некоторых вариантах осуществления аминокислотная последовательность LCDR1 антитела, его антигенсвязывающего фрагмента или варианта по настоящему изобретению может включать SEQ ID NO: 80 или ее вариант; аминокислотная последовательность LCDR2 может включать SEQ ID NO: 81 или ее вариант; аминокислотная последовательность LCDR3 может включать SEQ ID NO: 82 или ее вариант; и аминокислотная последовательность HCDR1 может включать SEQ ID NO: 77 или ее вариант; аминокислотная последовательность HCDR2 может включать SEQ ID NO: 78 или ее вариант; и аминокислотная последовательность HCDR3 может включать SEQ ID NO: 79 или ее вариант. Например, антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант может включать антитело YN-005 или антитело с теми же LCDR1-3 и HCDR1-3. В некоторых вариантах осуществления аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи антитела, его антигенсвязывающего фрагмента или варианта по настоящему изобретению может включать SEQ ID NO: 20 или ее вариант; и аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи может включать SEQ ID NO: 18 или ее вариант. Например, антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант может включать антитело YN-005 или антитело, имеющее ту же вариабельную область легкой цепи и вариабельную область тяжелой цепи. В некоторых вариантах осуществления антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант по настоящему изобретению может включать легкую цепь и тяжелую цепь, аминокислотная последовательность легкой цепи может быть приведена в SEQ ID NO: 23 и аминокислотная последовательность тяжелой цепи может быть приведена в SEQ ID NO: 21. Например, антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант может включать антитело YN-005 или иметь ту же легкую цепь и тяжелую цепь.
В некоторых вариантах осуществления антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант по настоящему изобретению конкурирует с референсным антителом за связывание с белком CD137 (например, белком CD137 человека). Референсное антитело может включать LCDR1-3 и HCDR1-3, и аминокислотная последовательность LCDR1 может включать SEQ ID NO: 80 или ее вариант; аминокислотная последовательность LCDR2 может включать SEQ ID NO: 81 или ее вариант; аминокислотная последовательность LCDR3 может включать SEQ ID NO: 82 или ее вариант; и аминокислотная последовательность HCDR1 может включать SEQ ID NO: 77 или ее вариант; аминокислотная последовательность HCDR2 может включать SEQ ID NO: 78 или ее вариант; и аминокислотная последовательность HCDR3 может включать SEQ ID NO: 79 или ее вариант. В некоторых вариантах осуществления референсное антитело может включать антитело YN-005 или антитело с теми же LCDR1-3 и HCDR1-3. В некоторых вариантах осуществления референсное антитело может включать вариабельную область легкой цепи и вариабельную область тяжелой цепи, аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи может включать SEQ ID NO: 20 или ее вариант; и аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи может включать SEQ ID NO: 18 или ее вариант. Например, референсное антитело может включать антитело YN-005 или антитело, имеющее ту же вариабельную область легкой цепи и вариабельную область тяжелой цепи. В некоторых вариантах осуществления референсное антитело может включать легкую цепь и тяжелую цепь, аминокислотная последовательность легкой цепи может быть приведена в SEQ ID NO: 23 и аминокислотная последовательность тяжелой цепи может быть приведена в SEQ ID NO: 21. Например, референсное антитело может включать антитело YN-005 или иметь
- 20 044684 ту же легкую цепь и тяжелую цепь.
В некоторых вариантах осуществления аминокислотная последовательность LCDR1 антитела, его антигенсвязывающего фрагмента или варианта по настоящему изобретению может включать SEQ ID NO: 80 или ее вариант; аминокислотная последовательность LCDR2 может включать SEQ ID NO: 81 или ее вариант; аминокислотная последовательность LCDR3 может включать SEQ ID NO: 82 или ее вариант; и аминокислотная последовательность HCDR1 может включать SEQ ID NO: 77 или ее вариант; аминокислотная последовательность HCDR2 может включать SEQ ID NO: 78 или ее вариант; и аминокислотная последовательность HCDR3 может включать SEQ ID NO: 79 или ее вариант. Например, антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант может включать антитело YN-006 или антитело с теми же LCDR1-3 и HCDR1-3. В некоторых вариантах осуществления аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи антитела, его антигенсвязывающего фрагмента или варианта по настоящему изобретению может включать SEQ ID NO: 20 или ее вариант; и аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи может включать SEQ ID NO: 25 или ее вариант. Например, антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант может включать антитело YN-006 или антитело, имеющее ту же вариабельную область легкой цепи и вариабельную область тяжелой цепи. В некоторых вариантах осуществления антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант по настоящему изобретению может включать легкую цепь и тяжелую цепь, аминокислотная последовательность легкой цепи может быть приведена в SEQ ID NO: 23 и аминокислотная последовательность тяжелой цепи может быть приведена в SEQ ID NO: 27. Например, антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант может включать антитело YN-006 или иметь ту же легкую цепь и тяжелую цепь.
В некоторых вариантах осуществления антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант по настоящему изобретению конкурирует с референсным антителом за связывание с белком CD137 (например, белком CD137 человека). Референсное антитело может включать LCDR1-3 и HCDR1-3, и аминокислотная последовательность LCDR1 может включать SEQ ID NO: 80 или ее вариант; аминокислотная последовательность LCDR2 может включать SEQ ID NO: 81 или ее вариант; аминокислотная последовательность LCDR3 может включать SEQ ID NO: 82 или ее вариант; и аминокислотная последовательность HCDR1 может включать SEQ ID NO: 77 или ее вариант; аминокислотная последовательность HCDR2 может включать SEQ ID NO: 78 или ее вариант; и аминокислотная последовательность HCDR3 может включать SEQ ID NO: 79 или ее вариант. В некоторых вариантах осуществления референсное антитело может включать антитело YN-006 или антитело с теми же LCDR1-3 и HCDR1-3. В некоторых вариантах осуществления референсное антитело может включать вариабельную область легкой цепи и вариабельную область тяжелой цепи, аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи может включать SEQ ID NO: 20 или ее вариант; и аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи может включать SEQ ID NO: 25 или ее вариант. Например, референсное антитело может включать антитело YN-006 или антитело, имеющее ту же вариабельную область легкой цепи и вариабельную область тяжелой цепи. В некоторых вариантах осуществления референсное антитело может включать легкую цепь и тяжелую цепь, аминокислотная последовательность легкой цепи может быть приведена в SEQ ID NO: 23 и аминокислотная последовательность тяжелой цепи может быть приведена в SEQ ID NO: 27. Например, референсное антитело может включать антитело YN-006 или иметь ту же легкую цепь и тяжелую цепь.
В настоящем изобретении белок CD137 может включать белок CD137 человека.
В другом аспекте настоящее изобретение также относится к биспецифическому антителу, связывающемуся с белком PD-L1 с KD ниже 2x10’9 М (например, KD не более приблизительно 2x10’9, не более приблизительно 1x10’9, не более приблизительно 1x10’10 или не более приблизительно 8x10’11 M или менее) и связывающемуся с белком CD137 с KD ниже 8x10’9 М (например, KD не более приблизительно 8x10’9, не более приблизительно 7x10’9, не более приблизительно 6x10’9, не более приблизительно 5x10’9, не более приблизительно 4x10’9, не более приблизительно 3x10’9, не более приблизительно 2x10’9, не более приблизительно 1x10’9 или не более приблизительно 1x10’10 М или менее).
В настоящем изобретении белок PD-L1 выбран из группы, состоящей из белка PD-L1 человека, белка PD-L1 обезьяны и белка PD-L1 мыши; и белок CD137 включает белок CD137 человека.
В настоящем изобретении биспецифическое антитело включает первый нацеливающий фрагмент, специфически связывающийся с белком PD-L1, где первый нацеливающий фрагмент может включать антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант, связывающееся с PD-L1.
Например, антигенсвязывающий фрагмент в первом нацеливающем фрагменте может быть выбран из группы, состоящей из Fab-, Fab'-, F(ab)2- и Fv-фрагмента. В качестве другого примера, вариант в первом нацеливающем фрагменте может быть выбран из группы, состоящей из белка или полипептида, подвергнутого замене, делеции или добавлению одной или более аминокислот в антителе или его антигенсвязывающем фрагменте; и белок или полипептид, имеющий 85% или более (например, по меньшей мере приблизительно 85, приблизительно 90, приблизительно 91, приблизительно 92, приблизительно 93, приблизительно 94, приблизительно 95, приблизительно 96, приблизительно 97, приблизительно 98, приблизительно 99% или более) идентичности последовательности по отношению к антителу или его
- 21 044684 антигенсвязывающему фрагменту. Антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант может являться антителом, его антигенсвязывающим фрагментом или вариантом, связывающимся с белком PDL1.
В некоторых вариантах осуществления антитело, связывающееся с белком PD-L1, в биспецифическом антителе может включать легкую цепь или ее фрагмент. Например, легкая цепь или ее фрагмент включает LCDR1-3, и аминокислотная последовательность LCDR1 представляет собой SEQ ID NO: 5458; аминокислотная последовательность LCDR2 представляет собой SEQ ID NO: 60-61; и аминокислотная последовательность LCDR3 выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 63-64. В некоторых вариантах осуществления легкая цепь или ее фрагмент может включать вариабельную область легкой цепи, и аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи может быть выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39 и SEQ ID NO: 41. В некоторых вариантах осуществления легкая цепь или ее фрагмент из антитела может включать константную область человека, и константная область человека включает константную область Igλ человека.
В некоторых вариантах осуществления легкая цепь или ее фрагмент может включать аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40 и SEQ ID NO: 42.
В некоторых вариантах осуществления антитело, связывающееся с белком PD-L1, может включать тяжелую цепь или ее фрагмент. Например, тяжелая цепь или ее фрагмент включает HCDR1-3, и аминокислотная последовательность HCDR1 выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 46-47; аминокислотная последовательность HCDR2 представляет собой SEQ ID NO: 48; и аминокислотная последовательность HCDR3 представляет собой SEQ ID NO: 50-52.
В некоторых вариантах осуществления тяжелая цепь или ее фрагмент может включать вариабельную область тяжелой цепи, и аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи может быть выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 31 и SEQ ID NO: 35.
В некоторых вариантах осуществления тяжелая цепь или ее фрагмент может дополнительно включать константную область человека, и константная область человека может включать константную область IgG человека. Например, константная область IgG человека является константной областью IgG1 человека.
В некоторых вариантах осуществления тяжелая цепь или ее фрагмент может включать аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO: 32 и SEQ ID NO: 36.
В некоторых вариантах осуществления биспецифическое антитело включает второй нацеливающий фрагмент, специфически связывающийся с белком CD137, где второй нацеливающий фрагмент может включать антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант, связывающееся с белком CD137. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий фрагмент выбран из группы, состоящей из Fab-, Fab'-, F(ab)2- и Fv-фрагмента. В некоторых вариантах осуществления вариант выбран из группы, состоящей из белка или полипептида, подвергнутого замене, делеции или добавлению одной или более аминокислот в антителе или его антигенсвязывающем фрагменте; и белок или полипептид, имеющий 85% или более (например, по меньшей мере приблизительно 85, приблизительно 90, приблизительно 91, приблизительно 92, приблизительно 93, приблизительно 94, приблизительно 95, приблизительно 96, приблизительно 97, приблизительно 98, приблизительно 99% или более) идентичности последовательности по отношению к антителу или его антигенсвязывающему фрагменту.
В некоторых вариантах осуществления антитело, связывающееся с белком CD137, может включать легкую цепь или ее фрагмент. Например, легкая цепь или ее фрагмент включает LCDR1-3, и аминокислотные последовательности LCDR1-3 последовательно могут являться SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81 и SEQ ID NO: 82. В некоторых вариантах осуществления легкая цепь или ее фрагмент может включать вариабельную область легкой цепи, и вариабельная область легкой цепи включает аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 20.
В некоторых вариантах осуществления антитело, связывающееся с белком CD137, может включать тяжелую цепь или ее фрагмент. В некоторых вариантах осуществления тяжелая цепь или ее фрагмент из антитела может включать HCDR1-3, и аминокислотные последовательности HCDR1-3 последовательно могут являться SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78 и SEQ ID NO: 79. В некоторых вариантах осуществления тяжелая цепь или ее фрагмент из антитела может включать вариабельную область тяжелой цепи, и аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи может быть выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 18 и SEQ ID NO: 25.
В некоторых вариантах осуществления антитело, связывающееся с белком CD137, может включать scFv, и scFv может включать аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 83.
В настоящем изобретении биспецифическое антитело может включать первую полипептидную цепь и вторую полипептидную цепь, где первая полипептидная цепь может включать вариабельную область тяжелой цепи антитела, связывающегося с белком PD-L1, вариабельную область тяжелой цепи ан- 22 044684 титела, связывающегося с белком CD137, и вариабельную область легкой цепи антитела, связывающегося с белком CD137; и вторая полипептидная цепь может включать вариабельную область легкой цепи антитела, связывающегося с белком PD-L1.
Например, в первой полипептидной цепи вариабельная область тяжелой цепи антитела, связывающегося с белком PD-L1, может находиться на N-конце вариабельной области тяжелой цепи антитела, связывающегося с белком CD137, и вариабельная область тяжелой цепи антитела, связывающегося с белком CD137, может находиться на N-конце вариабельной области легкой цепи антитела, связывающегося с белком CD137. В качестве другого примера, в первой полипептидной цепи вариабельная область тяжелой цепи антитела, связывающегося с белком PD-L1, может находиться на N-конце вариабельной области легкой цепи антитела, связывающегося с белком CD137, и вариабельная область легкой цепи антитела, связывающегося с белком CD137, может находиться на N-конце вариабельной области тяжелой цепи антитела, связывающегося с белком CD137.
Например, в первой полипептидной цепи вариабельная область легкой цепи антитела, связывающегося с белком CD137, и вариабельная область тяжелой цепи антитела, связывающегося с белком CD137, составляют scFv. Например, scFv может включать аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 83.
Первая полипептидная цепь может дополнительно включать константную область IgG человека. Например, константная область IgG человека может являться константной областью IgG1 человека.
В некоторых вариантах осуществления константная область IgG человека может находиться на Сконце вариабельной области тяжелой цепи антитела, связывающегося с белком PD-L1, и может находиться на N-конце вариабельной области легкой цепи антитела, связывающегося с белком CD137; альтернативно, константная область IgG человека может находиться на С-конце вариабельной области тяжелой цепи антитела, связывающегося с белком PD-L1, и может находиться на N-конце вариабельной области тяжелой цепи антитела, связывающегося с белком CD137.
В некоторых вариантах осуществления первая полипептидная цепь может включать аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 43 и SEQ ID NO: 44.
В некоторых вариантах осуществления вторая полипептидная цепь может дополнительно включать константную область Igλ человека.
В настоящем изобретении вторая полипептидная цепь может включать следующие аминокислотные последовательности: SEQ ID NO: 15 и SEQ ID NO: 34.
Например, в первом нацеливающем фрагменте биспецифического антитела по настоящему изобретению аминокислотная последовательность LCDR1 может быть выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57 и SEQ ID NO: 58 или ее варианта; аминокислотная последовательность LCDR2 может быть выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 60 и SEQ ID NO: 61 или ее варианта; аминокислотная последовательность LCDR3 может быть выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 63 и SEQ ID NO: 64 или ее варианта; и аминокислотная последовательность HCDR1 может быть выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 46 и SEQ ID NO: 47 или ее варианта; аминокислотная последовательность HCDR2 может включать SEQ ID NO: 48 или ее варианта; и аминокислотная последовательность HCDR3 может быть выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 50-52 или ее варианта. В некоторых вариантах осуществления аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи антитела, его антигенсвязывающего фрагмента или варианта по настоящему изобретению может быть выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39 и SEQ ID NO: 41 или ее варианта; и аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи может быть выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 31 и SEQ ID NO: 35 или ее варианта. В некоторых вариантах осуществления антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант по настоящему изобретению может включать легкую цепь и тяжелую цепь, аминокислотная последовательность легкой цепи может являться аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40 и SEQ ID NO: 42, и аминокислотная последовательность тяжелой цепи может являться аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 32 и SEQ ID NO: 36.
Например, во втором нацеливающем фрагменте биспецифического антитела по настоящему изобретению, аминокислотная последовательность LCDR1 может включать SEQ ID NO: 80 или ее вариант; аминокислотная последовательность LCDR2 может включать SEQ ID NO: 81 или ее вариант; аминокислотная последовательность LCDR3 может включать SEQ ID NO: 82 или ее вариант; и аминокислотная последовательность HCDR1 может включать SEQ ГО NO: 77 или ее вариант; аминокислотная последовательность HCDR2 может включать SEQ ID NO: 78 или ее вариант; и аминокислотная последовательность HCDR3 может включать SEQ ID NO: 79 или ее вариант. В некоторых вариантах осуществления аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи антитела, его антигенсвязывающего фрагмента или варианта по настоящему изобретению может включать SEQ ID NO: 20 или ее вариант; и аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи может являться последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 18 и SEQ ID NO: 25 или их вариантов.
- 23 044684
В некоторых вариантах осуществления антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант по настоящему изобретению может включать легкую цепь и тяжелую цепь, аминокислотная последовательность легкой цепи может быть приведена в SEQ ID NO: 23, и аминокислотная последовательность тяжелой цепи может быть приведена в SEQ ID NO: 21 или SEQ ID NO: 27.
Например, в биспецифическом антителе по настоящему изобретению первый полипептид может включать аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 30, и второй полипептид может включать аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 15. Биспецифическое антитело может включать антитело YN-007 или антитело с теми же первым полипептидом и вторым полипептидом, где первый полипептид может включать аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 25, аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 20, и аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 13; и второй полипептид может включать аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 15.
В качестве другого примера, в биспецифическом антителе по настоящему изобретению первый полипептид может включать аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 43, и второй полипептид может включать аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 34. Биспецифическое антитело может включать антитело YN-051 или антитело с теми же первым полипептидом и вторым полипептидом. Где первый полипептид может включать аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 25, аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 20, и аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 32; и второй полипептид может включать аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 34.
В качестве другого примера в биспецифическом антителе по настоящему изобретению первый полипептид может включать аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 44, и второй полипептид может включать аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 34. Биспецифическое антитело может включать антитело YN-052 или антитело с теми же первым полипептидом и вторым полипептидом. Где первый полипептид может включать аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 25, аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 20, и аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 36; и второй полипептид может включать аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 34.
Например, в биспецифическом антителе по настоящему изобретению первый полипептид может включать аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 30, и второй полипептид может включать аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 15. Биспецифическое антитело может включать антитело YN-007 или антитело с теми же первым полипептидом и вторым полипептидом. Где первый полипептид может включать аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 27, аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 23, и аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 13; и второй полипептид может включать аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 15.
В качестве другого примера, в биспецифическом антителе по настоящему изобретению первый полипептид может включать аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 43, и второй полипептид может включать аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 34. Биспецифическое антитело может включать антитело YN-051 или антитело с теми же первым полипептидом и вторым полипептидом. Где первый полипептид может включать аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 32, аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 27, аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 23; и второй полипептид может включать аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 34.
В качестве другого примера, в биспецифическом антителе по настоящему изобретению первый полипептид может включать аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 44, и второй полипептид может включать аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 34. Биспецифическое антитело может включать антитело YN-052 или антитело с теми же первым полипептидом и вторым полипептидом. Где первый полипептид может включать аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 36, аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 27, аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 23; и второй полипептид может включать аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 34.
Нуклеиновая кислота, вектор, клетка-хозяин и способ получения.
В другом аспекте настоящее изобретение также относится к одной или более выделенным молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант или биспецифическое антитело по настоящему изобретению. Например, каждая молекула нуклеиновой кислоты из одной или более молекул нуклеиновой кислоты может кодировать целое антитело или его антигенсвязывающий фрагмент или кодировать его часть (например, одну или более из HCDR1-3, LCDR1-3, VL, VH, легкой цепи или тяжелой цепи).
Молекула нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению может являться выделенной. Например, ее можно получать или синтезировать следующими способами: (i) амплификация in vitro, такая как, амплификация посредством полимеразной цепной реакции (ПЦР), (ii) клональная рекомбинация, (iii)
- 24 044684 очистка, такая как фракционирование посредством расщепления ферментами рестрикции и электрофореза в геле, или (iv) синтез, такой как химический синтез. В некоторых вариантах осуществления выделенная нуклеиновая кислота является молекулой нуклеиновой кислоты, полученной с помощью технологии рекомбинантных ДНК.
В настоящем изобретении нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, можно получать множеством известных в этой области способов, включая, в качестве неограничивающих примеров, ПЦР с достройкой перекрывающихся участков с использованием рестрикционных фрагментов или синтетических олигонуклеотидов. Конкретные действия см. в Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989; и Ausube, et al., Current Protocols in Molecular biology, Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York N.Y., 1993.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к одному или более векторам и включает одну или более молекул нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению. Каждый вектор может включать одну или более молекул нуклеиновой кислоты. Кроме того, вектор может дополнительно включать другие гены, такие как маркерные гены, делающие возможной селекцию этого вектора в подходящей клетке-хозяине и в подходящих условиях. Кроме того, вектор может дополнительно включать элемент контроля экспрессии, позволяющий правильно экспрессировать кодирующую область в подходящей клеткехозяине. Такие контрольные элементы хорошо известны специалистам в этой области, например, они могут включать промоторы, участки связывания рибосомы, энхансеры и другие контрольные элементы для регуляции транскрипции генов или трансляции мРНК и т.д. В некоторых вариантах осуществления последовательность контроля экспрессии является регуляторным элементом. Конкретная структура последовательности контроля экспрессии может варьироваться в зависимости от функции видов или типов клеток, но, как правило, включает 5'-нетранскрибируемую последовательность и 5'- и 3'нетранслируемую последовательность, участвующие в инициации транскрипции и трансляции, такие как ТАТА-бокс, последовательность кэпа, последовательность СААТ и т.д. Например, 5'нетранскрибируемая последовательность контроля экспрессии может включать промоторную область, которая может включать промоторную последовательность для транскрипционного контроля функционально связанной нуклеиновой кислоты. Одну или более молекул нуклеиновой кислоты, описанных в настоящем изобретении, можно функционально связывать с элементом контроля экспрессии.
Вектор может включать, например, плазмиду, космиду, вирус, фаг или другие векторы, общеупотребительные в генной инженерии, например, вектор является экспрессирующим вектором.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к клетке, которая может включать молекулу нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению и/или вектор, описанный в настоящем изобретении. Клетка может являться клеткой-хозяином. В некоторых вариантах осуществления каждая клетка-хозяин может включать одну молекулу нуклеиновой кислоты или вектор, описанный в настоящем изобретении. В некоторых вариантах осуществления каждая клетка-хозяин может включать множество (например, две или более) молекул нуклеиновой кислоты или векторов, описанных в настоящем изобретении. Например, вектор по настоящему изобретению можно встраивать в клетку-хозяина, например, эукариотическую клетку, например, клетку растительного происхождения, клетку гриба или дрожжевые клетки и т.д. Вектор по настоящему изобретению можно встраивать в клетку-хозяина известными в этой области способами, такими как электропорация, трансфекция с липофектином, трансфекция с липофектамином и т.п.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к одной или более клеткам-хозяевам, включающим молекулу нуклеиновой кислоты или вектор.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу получения антитела, его антигенсвязывающего фрагмента или варианта или биспецифического антитела. Способ может включать культивирование клетки-хозяина по настоящему изобретению в условиях, делающих возможной экспрессию антитела, его антигенсвязывающего фрагмента или варианта или биспецифического антитела, и, необязательно, сбор антитела, его антигенсвязывающего фрагмента или варианта. Например, можно использовать подходящую среду, подходящую температуру, время культивирования и т.д., и эти способы будут понятны специалистам в этой области.
Фармацевтическая композиция и применение.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, которая может включать антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант или биспецифическое антитело, молекулу нуклеиновой кислоты, вектор и/или клетку-хозяина и, необязательно, фармацевтически приемлемое вспомогательное средство.
Фармацевтически приемлемое вспомогательное средство может включать буферы, антиоксиданты, консерванты, низкомолекулярные полипептиды, белки, гидрофильные полимеры, аминокислоты, сахара, хелаторы, противоионы, комплексные соединения с металлами и/или неионное поверхностно-активное вещество и т.п.
В настоящем изобретении фармацевтическую композицию можно составлять для перорального введения, внутривенного введения, внутримышечного введения, введения in situ в очаг опухоли, ингаляции, ректального введения, вагинального введения, трансдермального введения или введения с помощью
- 25 044684 подкожного депо.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к применению антитела, его антигенсвязывающего фрагмента или варианта или биспецифического антитела, молекулы нуклеиновой кислоты, вектора, клетки-хозяина и/или фармацевтической композиции в производстве лекарственного средства для облегчения или лечения опухолей. Помимо прочего, опухоли включают рак толстого кишечника.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу повышения функции Т-клеток, включающему введение нуждающемуся в этом индивидууму антитела, связывающегося с белком PD-L1, его антигенсвязывающего фрагмента или варианта, антитела, связывающегося с белком CD137, его антигенсвязывающего фрагмента или варианта или биспецифического антитела, молекулы нуклеиновой кислоты, вектора, клетки-хозяина и/или фармацевтической композиции. Среди них, Т-клетки являются опухолеассоциированными дисфункциональными Т-клетками.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу ингибирования связывания белка PDL1 с белком PD-1, включающему введение нуждающемуся в этом индивидууму антитела, его антигенсвязывающего фрагмента или варианта или биспецифического антитела, молекулы нуклеиновой кислоты, вектора, клетки-хозяина и/или фармацевтической композиции.
В настоящем изобретении положение CDR антитела можно определять способом Kabat.
Настоящее изобретение дополнительно включает следующие варианты осуществления.
1. Антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант, связывающееся с белком PD-L1 с KD 3x10’9 М или менее.
2. Антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант по варианту осуществления 1, связывающееся с белком PD-L1 с KD 8x10’11 М или менее.
3. Антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант по любому из вариантов осуществления 1-2, ингибирующее связывание PD-L1 с PD-1.
4. Антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант по любому из вариантов осуществления 1-3, способное приводить к облегчению или лечению опухолеассоциированных заболеваний.
5. Антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант по варианту осуществления 4, где опухоль включает рак толстого кишечника.
6. Антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант по любому из вариантов осуществления 1-5, где антитело выбрано из группы, состоящей из моноклонального антитела, одноцепочечного антитела, химерного антитела, гуманизированного антитела и полностью человеческого антитела.
7. Антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант по любому из вариантов осуществления 1-6, где антигенсвязывающий фрагмент выбран из группы, состоящей из Fab-, Fab'-, F(ab)2- и Fvфрагмента.
8. Антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант по любому из вариантов осуществления 1-7, где вариант выбран из группы, состоящей из:
1) белка или полипептида, полученного посредством замены, делеции или добавления одной или более аминокислот в антителе или его антигенсвязывающем фрагменте; и
2) белка или полипептида, имеющего 90% или более идентичности последовательности по отношению к антителу или его антигенсвязывающему фрагменту.
9. Антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант по любому из вариантов осуществления 1-8, конкурирующее с референсным антителом, связывающимся с белком PD-L1, где референсное антитело включает вариабельную область легкой цепи и вариабельную область тяжелой цепи, вариабельная область легкой цепи референсного антитела включает LCDR1-3, вариабельная область легкой цепи референсного антитела включает LCDR1-3, и LCDR1 включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 54-58; LCDR2 включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 60-61; и LCDR3 включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 63-64; и вариабельная область тяжелой цепи референсного антитела включает HCDR1-3, HCDR1 включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 46-47; HCDR2 включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 48; и HCDR3 включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 50-52.
10. Антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант по варианту осуществления 9, где вариабельная область легкой цепи референсного антитела включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39 и SEQ ID NO: 41, и вариабельная область тяжелой цепи референсного антитела включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 31 и SEQ ID NO: 35.
11. Антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант по любому из вариантов осуществления 9-10, где легкая цепь референсного антитела включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40 и SEQ ID NO: 42; и тяжелая цепь референсного антитела включает аминокислотную последова-
- 26 044684 тельность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 32 и SEQ ID
NO: 36.
12. Антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант по вариантам осуществления 1-11, где антитело включает легкую цепь антитела или ее фрагмент, включающую LCDR1, и LCDR1 включает аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 53: TGTX1SX2VGGYX3X4VS; где X1 является S, R или V; Х2 является D, Е или S; X3 является N или R; X4 является Y или Е, и где LCDR1 определяют в соответствии с индексом нумерации антител Kabat.
13. Антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант по варианту осуществления 12, где LCDR1 включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 54-58.
14. Антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант по любому из вариантов осуществления 11-13, где легкая цепь антитела или ее фрагмент включает LCDR2, включающую аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 59: X1NSX2RPS, где X1 является G или Е; Х2 является N или I, и где LCDR2 определяют в соответствии с индексом нумерации антител Kabat.
15. Антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант по варианту осуществления 14, где LCDR2 включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 60-61.
16. Антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант по любому из вариантов осуществления 11-15, где легкая цепь антитела или ее фрагмент включает LCDR3, включающую аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 62: QSYDSSLSGX1V, где X1 является S или Т, и где LCDR3 определяют в соответствии с индексом нумерации антител Kabat.
17. Антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант по любому из вариантов осуществления 11-16, где легкая цепь антитела или ее фрагмент дополнительно включает каркасные области LFR1, L-FR2, L-FR3 и L-FR4.
18. Антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант по варианту осуществления 17, где каркасные области выбраны из группы, состоящей из консенсусных каркасных последовательностей человека и последовательностей зародышевой линии человека.
19. Антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант по любому из вариантов осуществления 17-18, где С-конец L-FR1 прямо или косвенно связан с N-концом LCDR1, и L-FR1 включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 71.
20. Антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант по любому из вариантов осуществления 17-19, где L-FR2 находится между LCDR1 и LCDR2, и LFR2 включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 72.
21. Антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант по любому из вариантов осуществления 17-20, где L-FR3 находится между LCDR2 и LCDR3, и LFR3 включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 73-75.
22. Антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант по любому из вариантов осуществления 17-21, где N-конец L-FR4 прямо или косвенно связан с С-концом LCDR3, и L-FR4 включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 76.
23. Антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант по любому из вариантов осуществления 12-22, где легкая цепь антитела или ее фрагмент включает вариабельную область легкой цепи VL, и вариабельная область легкой цепи VL включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39 и SEQ ID NO: 41.
24. Антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант по любому из вариантов осуществления 12-23, где легкая цепь антитела или ее фрагмент дополнительно включает константную область человека, и константная область человека включает константную область Igλ человека.
25. Антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант по любому из вариантов осуществления 12-24, где легкая цепь антитела или ее фрагмент включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID nO: 8, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40 и SEQ ID NO: 42.
26. Антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант по любому из вариантов осуществления 1-25, где антитело включает тяжелую цепь антитела или ее фрагмент, включающую HCDR1, и HCDR1 включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей, приведенных в SEQ ID NO: 45: X1YAIS, где X1 является S или Т, и где HCDR1 определяют в соответствии с индексом нумерации антител Kabat.
27. Антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант по варианту осуществления 26, где тяжелая цепь антитела или ее фрагмент включает HCDR2, HCDR2 включает аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 48, и где HCDR2 определяют в соответствии с индексом нумерации антител Kabat.
28. Антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант по любому из вариантов осуществления 26-27, где тяжелая цепь антитела или ее фрагмент включает HCDR3, и HCDR3 включает амино-
- 27 044684 кислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 49: TMX1X2YX3X4GNX5DY, где X1 является D, Е или G, X2 является G или Е, X3 является S или G, X4 является Y или F, X5 является F или Y, и где HCDR3 определяют в соответствии с индексом нумерации антител Kabat.
29. Антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант по варианту осуществления 28, где HCDR3 включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 50-52.
30. Антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант по любому из вариантов осуществления 26-29, где тяжелая цепь антитела или ее фрагмент дополнительно включает каркасные области HFR1, H-FR2, H-FR3, и H-FR4.
31. Антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант по вариантам осуществления 30, где каркасные области выбраны из группы, состоящей из консенсусных каркасных последовательностей человека и последовательностей зародышевой линии человека.
32. Антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант по любому из вариантов осуществления 30-31, где С-конец H-FR1 прямо или косвенно связан с N-концом HCDR1, и H-FR1 включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 65-67.
33. Антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант по любому из вариантов осуществления 30-32, где H-FR2 находится между HCDR1 и HCDR2, и HFR2 включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 68.
34. Антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант по любому из вариантов осуществления 30-33, где H-FR3 находится между HCDR2 и HCDR3, и HFR3 включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 69.
35. Антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант по любому из вариантов осуществления 30-34, где N-конец H-FR4 прямо или косвенно связан с С-концом HCDR3, и H-FR4 включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 70.
36. Антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант по любому из вариантов осуществления 26-35, где тяжелая цепь антитела или ее фрагмент включает вариабельную область тяжелой цепи VH, и вариабельная область тяжелой цепи VH включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 31 и SEQ ID NO: 35.
37. Антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант по любому из вариантов осуществления 26-36, где тяжелая цепь антитела или ее фрагмент дополнительно включает константную область человека, и константная область человека включает константную область IgG1 человека.
38. Антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант по любому из вариантов осуществления 26-37, где тяжелая цепь антитела или ее фрагмент включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 32 и SEQ ID NO: 36.
39. Антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант по любому из вариантов осуществления 1-38, где белок PD-L1 выбран из группы, состоящей из белка PDL1 человека, белка PD-L1 обезьяны и белка PD-L1 мыши.
40. Антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант, связывающееся с белком CD137 с KD 5x10’9 М или менее.
41. Антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант по варианту осуществления 40, связывающееся с белком CD137 с KD 3x10’9 M или менее.
42. Антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант по любому из вариантов осуществления 40-41, имеющее CD137-агонистическую активность.
43. Антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант по любому из вариантов осуществления 40-42, способное приводить к облегчению или лечению опухолей.
44. Антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант по варианту осуществления 43, где опухоль включает рак толстого кишечника.
45. Антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант по любому из вариантов осуществления 40-44, где антитело выбрано из группы, состоящей из моноклонального антитела, одноцепочечного антитела, химерного антитела, гуманизированного антитела и полностью человеческого антитела.
46. Антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант по любому из вариантов осуществления 40-45, где антигенсвязывающий фрагмент выбран из группы, состоящей из Fab-, Fab'-, F(ab)2- и Fvфрагмента.
47. Антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант по любому из вариантов осуществления 40-46, где вариант выбран из группы, состоящей из:
1) белка или полипептида, полученного посредством замены, делеции или добавления одной или более аминокислот в антителе или его антигенсвязывающем фрагменте; и
2) белка или полипептида, имеющего 90% или более идентичности последовательности по отношению к антителу или его антигенсвязывающему фрагменту.
48. Антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант по любому из вариантов осуществления 40-47, конкурирующее с референсным антителом за связывание с белком CD137, где референсное
- 28 044684 антитело включает вариабельную область легкой цепи и вариабельную область тяжелой цепи, вариабельная область легкой цепи референсного антитела включает LCDR1-3, и аминокислотные последовательности LCDR1-3 последовательно приведены в SEQ ID NO: 80-82, и вариабельная область тяжелой цепи референсного антитела включает HCDR1-3, и аминокислотные последовательности HCDR1-3 последовательно приведены в SEQ ID NO: 77-79.
49. Антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант по варианту осуществления 48, где вариабельная область легкой цепи референсного антитела включает аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 20, и вариабельная область тяжелой цепи референсного антитела включает аминокислотную последовательность, выбранную из последовательностей, приведенных в SEQ ID NO: 18 и SEQ ID NO: 25.
50. Антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант по любому из вариантов осуществления 48-49, где легкая цепь референсного антитела включает аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 23; и тяжелая цепь референсного антитела включает аминокислотную последовательность, выбранную из последовательностей, приведенных в SEQ ID NO: 21 и SEQ ID NO: 27.
51. Антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант по любому из вариантов осуществления 40-50, где антитело включает легкую цепь антитела или ее фрагмент.
52. Антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант по варианту осуществления 51, где легкая цепь антитела или ее фрагмент включает LCDR1, и LCDR1 включает аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 80.
53. Антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант по любому из вариантов осуществления 51-52, где легкая цепь антитела или ее фрагмент включает LCDR2, и LCDR2 включает аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 81.
54. Антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант по любому из вариантов осуществления 51-53, где легкая цепь антитела или ее фрагмент включает LCDR3, и LCDR3 включает аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 82.
55. Антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант по любому из вариантов осуществления 51-54, где легкая цепь антитела или ее фрагмент дополнительно включает каркасные области LFR1, L-FR2, L-FR3 и L-FR4.
56. Антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант по варианту осуществления 55, где каркасные области выбраны из группы, состоящей из консенсусных каркасных последовательностей человека и последовательностей зародышевой линии человека.
57. Антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант по любому из вариантов осуществления 55-56, где С-конец L-FR1 прямо или косвенно связан с N-концом LCDR1, и L-FR1 включает аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 89.
58. Антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант по любому из вариантов осуществления 55-57, где L-FR2 находится между LCDR1 и LCDR2, и LFR2 включает аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 90.
59. Антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант по любому из вариантов осуществления 55-58, где L-FR3 находится между LCDR2 и LCDR3, и LFR3 включает аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 91.
60. Антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант по любому из вариантов осуществления 55-59, где N-конец L-FR4 прямо или косвенно связан с С-концом LCDR3, и L-FR4 включает аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 92.
61. Антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант по любому из вариантов осуществления 51-60, где легкая цепь антитела или ее фрагмент включает вариабельную область легкой цепи VL, и вариабельная область легкой цепи VL включает аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 20.
62. Антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант по любому из вариантов осуществления 51-61, где легкая цепь антитела или ее фрагмент дополнительно включает константную область человека, и константная область человека включает константную область Igλ человека.
63. Антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант по любому из вариантов осуществления 51-62, где легкая цепь антитела или ее фрагмент включает аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 23.
64. Антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант по любому из вариантов осуществления 40-63, где антитело включает тяжелую цепь антитела или ее фрагмент.
65. Антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант по варианту осуществления 64, где тяжелая цепь антитела или ее фрагмент включает HCDR1, и HCDR1 включает аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 77.
66. Антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант по любому из вариантов осуществления 64-65, где тяжелая цепь антитела или ее фрагмент включает HCDR2, и HCDR2 включает аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 78.
67. Антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант по любому из вариантов осуществ-
- 29 044684 ления 64-66, где тяжелая цепь антитела или ее фрагмент включает HCDR3, и HCDR3 включает аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 79.
68. Антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант по любому из вариантов осуществления 64-67, где тяжелая цепь антитела или ее фрагмент дополнительно включает каркасные области HFR1, H-FR2, H-FR3 и H-FR4.
69. Антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант по варианту осуществления 68, где каркасные области выбраны из группы, состоящей из консенсусных каркасных последовательностей человека и последовательностей зародышевой линии человека.
70. Антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант по любому из вариантов осуществления 68-69, где С-конец H-FR1 прямо или косвенно связан с N-концом HCDR1, и H-FR1 включает аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 84-85.
71. Антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант по любому из вариантов осуществления 68-70, где H-FR2 находится между HCDR1 и HCDR2, и HFR2 включает аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 86.
72. Антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант по любому из вариантов осуществления 68-71, где H-FR3 находится между HCDR2 и HCDR3, и HFR3 включает аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 87.
73. Антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант по любому из вариантов осуществления 68-72, где N-конец H-FR4 прямо или косвенно связан с С-концом HCDR3, и H-FR4 включает аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 88.
74. Антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант по любому из вариантов осуществления 68-73, где тяжелая цепь антитела или ее фрагмент включает вариабельную область тяжелой цепи VH, и вариабельная область тяжелой цепи VH включает аминокислотную последовательность, выбранную из последовательностей, приведенных в SEQ ID NO: 18 или SEQ ID NO: 25.
75. Антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант по любому из вариантов осуществления 64-74, где тяжелая цепь антитела или ее фрагмент дополнительно включает константную область человека, и константная область человека включает константную область IgG человека.
76. Антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант по варианту осуществления 75, где константная область IgG включает константную область IgG1 человека.
77. Антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант по любому из вариантов осуществления 64-76, где тяжелая цепь антитела или ее фрагмент включает аминокислотную последовательность, выбранную из последовательностей, приведенных в SEQ ID NO: 21 или SEQ ID NO: 27.
78. Антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант по любому из вариантов осуществления 40-77, где белок CD137 включает белок CD137 человека.
79. Биспецифическое антитело, связывающееся с белком PD-L1 с KD 2x10’9 М или менее и связывающееся с белком CD137 с KD 8x10’9 M или менее.
80. Биспецифическое антитело по варианту осуществления 30, включающее первый нацеливающий фрагмент, специфически связывающийся с белком PD-L1, где первый нацеливающий фрагмент включает антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант по любому из вариантов осуществления 1-39.
81. Биспецифическое антитело по любому из вариантов осуществления 30-31, включающее второй нацеливающий фрагмент, специфически связывающийся с белком CD137, где второй нацеливающий фрагмент включает антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант по любому из вариантов осуществления 40-78.
82. Биспецифическое антитело по любому из вариантов осуществления 79-81, включающее первую полипептидную цепь и вторую полипептидную цепь, где первая полипептидная цепь включает вариабельную область тяжелой цепи антитела, связывающегося с белком PD-L1, вариабельную область тяжелой цепи антитела, связывающегося с белком CD137, и вариабельную область легкой цепи антитела, связывающегося с белком CD137; и вторую полипептидную цепь включает вариабельную область легкой цепи антитела, связывающегося с белком PD-L1.
83. Биспецифическое антитело по варианту осуществления 82, где в первой полипептидной цепи вариабельная область тяжелой цепи антитела, связывающегося с белком PD-L1, находится на N-конце вариабельной области тяжелой цепи антитела, связывающегося с белком CD137, и вариабельная область тяжелой цепи антитела, связывающегося с белком CD137, находится на N-конце вариабельной области легкой цепи антитела, связывающегося с белком CD137; альтернативно, вариабельная область тяжелой цепи антитела, связывающегося с белком PD-L1, находится на N-конце вариабельной области легкой цепи антитела, связывающегося с белком CD137, и вариабельная область легкой цепи антитела, связывающегося с белком CD137, находится на N-конце вариабельной области тяжелой цепи антитела, связывающегося с белком CD137.
84. Биспецифическое антитело по любому из вариантов осуществления 82-83, где вариабельная область легкой цепи антитела, связывающегося с белком CD137, и вариабельная область тяжелой цепи антитела, связывающегося с белком CD137, в первой полипептидной цепи составляют scFv.
- 30 044684
85. Биспецифическое антитело по любому из вариантов осуществления 82-84, где первая полипептидная цепь дополнительно включает константную область IgG человека, и константная область IgG человека находится на С-конце вариабельной области тяжелой цепи антитела, связывающегося с белком PDL1, и находится на N-конце вариабельной области легкой цепи антитела, связывающегося с белком CD137; альтернативно, константная область IgG человека находится на С-конце вариабельной области тяжелой цепи антитела, связывающегося с белком PD-L1, и находится на N-конце вариабельной области тяжелой цепи антитела, связывающегося с белком CD137.
86. Биспецифическое антитело по любому из вариантов осуществления 82-85, где первая полипептидная цепь включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 43 и SEQ ID NO: 44.
87. Биспецифическое антитело по любому из вариантов осуществления 82-86, где вторая полипептидная цепь включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 15 и SEQ ID NO: 34.
88. Одна или более выделенных молекул нуклеиновой кислоты, кодирующих антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант по любому из вариантов осуществления 1-39, антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант по любому из вариантов осуществления 40-78 или биспецифическое антитело по любому из вариантов осуществления 79-87.
89. Вектор, включающий молекулу нуклеиновой кислоты по варианту осуществления 88.
90. Клетка, включающая молекулу нуклеиновой кислоты по варианту осуществления 88 или вектор по варианту осуществления 89.
91. Способ получения антитела, его антигенсвязывающего фрагмента или варианта по любому из вариантов осуществления 1-39, антитела, его антигенсвязывающего фрагмента или варианта по любому из вариантов осуществления 40-78 или биспецифического антитела по любому из вариантов осуществления 79-87, включающий культивирование клетки по варианту осуществления 90 в условиях, делающих возможной экспрессию антитела, его антигенсвязывающего фрагмента или варианта по любому из вариантов осуществления 1-39, антитела, его антигенсвязывающего фрагмента или варианта по любому из вариантов осуществления 40-78 или биспецифического антитела по любому из вариантов осуществления 79-87.
92. Фармацевтическая композиция, включающая антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант по любому из вариантов осуществления 1-39, антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или вариант по любому из вариантов осуществления 40-78 или биспецифическое антитело по любому из вариантов осуществления 79-87, молекулу нуклеиновой кислоты по варианту осуществления 88, вектор по варианту осуществления 89 и/или клетку по варианту осуществления 90 и, необязательно, фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.
93. Применение антитела, его антигенсвязывающего фрагмента или варианта по любому из вариантов осуществления 1-39, антитела, его антигенсвязывающего фрагмента или варианта по любому из вариантов осуществления 40-78 или биспецифического антитела по любому из вариантов осуществления 79-87, молекулы нуклеиновой кислоты по варианту осуществления 88, вектора по варианту осуществления 89, клетки по варианту осуществления 90 и/или фармацевтической композиции по варианту осуществления 92 в производстве лекарственного средства для облегчения или лечения опухолей.
94. Применение по варианту осуществления 93, где опухоль включает рак толстого кишечника.
95. Способ ингибирования связывания белка PD-L1 с белком PD-1, включающий введение антитела, его антигенсвязывающего фрагмента или варианта по любому из вариантов осуществления 1-39, антитела, его антигенсвязывающего фрагмента или варианта по любому из вариантов осуществления 40-78 или биспецифического антитела по любому из вариантов осуществления 79-87, молекулы нуклеиновой кислоты по варианту осуществления 88, вектора по варианту осуществления 89, клетки по варианту осуществления 90 и/или фармацевтической композиции по варианту осуществления 92.
96. Способ повышения функции Т-клеток, включающий введение антитела, его антигенсвязывающего фрагмента или варианта по любому из вариантов осуществления 1 -39, антитела, его антигенсвязывающего фрагмента или варианта по любому из вариантов осуществления 40-78 или биспецифического антитела по любому из вариантов осуществления 79-87, молекулы нуклеиновой кислоты по варианту осуществления 88, вектора по варианту осуществления 89, клетки по варианту осуществления 90 и/или фармацевтической композиции по варианту осуществления 92.
Не ограничиваемые какой-либо теорией, следующие примеры представлены исключительно для иллюстрирования рабочих способов в случае устройства, способа и системы по настоящему изобретению, но не ограничивают объем настоящего изобретения.
Примеры
Пример 1. Скрининг антитела против PD-L1 с использованием фаговой библиотеки антител.
Белок PD-L1-Fc человека (Origincell Therapeutics Co., Ltd.) использовали в качестве антигена для сортировки фаговой библиотеки природных антител человека (Origincell Therapeutics Co., Ltd.). Пробирку для ELISA покрывали буфером CBS, содержащим 20 мкг/мл (первый и второй раунды) или 10 мкг/мл (третий и четвертый раунды) белка PD-L1, при 4°C в течение ночи. Затем пробирку промывали буфером
- 31 044684
PBS. Добавляли 10% обезжиренного порошкового молока для блокирования пробирки для ELISA, а затем добавляли 1 мл блокированного фага и инкубировали при комнатной температуре (20±5°C) в течение 1 ч. После тщательной промывки PBS добавляли 800 мкл буферного раствора Gly-HCl, pH 2,2, для элюции, а затем незамедлительно добавляли 400 мкл буферного раствора Трис-HCl, рН 8,0, для нейтрализации. Затем смесь добавляли к 20 мл Е. coli SS320 в логарифмической фазе роста со значением OD приблизительно 0,8, тщательно смешивали и отстаивали при 37°C в течение 1 ч. Отбирали 500 мкл микробного раствора для измерения титра фага и использовали глицерин для защиты микроорганизмов, оставшийся микробный раствор использовали для покрывания планшета и культивировали при 37°C в течение ночи. На следующий день бактерии на планшете пропорционально инокулировали в 80 мл среды 2YT-Amp таким образом, что микробный раствор имел значение OD 0,2, и культивировали в течение нескольких часов. Когда значение OD достигало 0,8, добавляли 160 мкл хелперного фага, тщательно смешивали и отстаивали при 37°C в течение 1 ч. Затем добавляли IPTG и антибиотик канамицин и культивировали при встряхивании при 250 об./мин при 30°C в течение ночи. Затем супернатант собирали для осаждения фага раствором PEG/NaCl, который ресуспендировали в 1,5 мл буфера PBS для скрининга с обогащением.
96-луночные планшеты для ELISA покрывали растворами, содержащими 1 мкг/мл белка PD-L1-Fc человека (Origincell Therapeutics Co., Ltd.) и белка PD-L1-Fc мыши (М5251, приобретенного в ACROBiosystems Inc.) при 4°C в течение ночи. Затем планшет блокировали 10% обезжиренным порошковым молоком по неспецифическим участкам связывания. После тщательной промывки отбирали супернатант моноклонального фага, и добавляли в 96-луночные планшеты и инкубировали при 37°C в течение 2 ч. После тщательной промывки в каждую лунку добавляли HRP-меченое антитело против М13 (27-9421-01, GE Healtcare) и проводили реакцию при 37°C в течение 45 мин. После тщательной промывки в каждую лунку добавляли ТМВ для проявления цвета. После реакции при комнатной температуре (20±5°C) в течение 5-10 мин в каждую лунку добавляли серную кислоту для остановки реакции. Для измерения значения OD в каждой лунке при 450 нм использовали спектрофотометр для чтения микропланшетов.
Фаг с клоном антитела 1В10, которое может специфически связываться с PD-L1 человека и PD-L1 мыши, идентифицировали посредством ELISA. В соответствии с результатами секвенирования, нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи VH фагового антитела 1В10, приведена в SEQ ID NO: 1, и аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи VH фагового антитела 1В10 приведена в SEQ ID NO: 2; нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную область легкой цепи VL фагового антитела 1В10, приведена в SEQ ID NO: 3, и аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи VL фагового антитела 1В10 приведена в SEQ ID NO: 4.
Пример 2. Экспрессия и очистка полностью человеческого интактного антитела против PD-L1. Конструировали праймер для ПЦР-амплификации VH фагового антитела.
1B10 и продукт ПЦР клонировали посредством рекомбинации в вектор pCMV-IgG1NDL, дважды расщепленный с помощью AgeI и SalI. Конструировали праймер для ПЦР-амплификации VL фагового антитела 1В10 и продукт ПЦР клонировали посредством рекомбинации в вектор pCMV-λ, дважды расщепленный с помощью AgeI и BsiWI. После секвенирования клетки 293F котрансфицировали с помощью экспрессирующих векторов для тяжелой цепи и легкой цепи для транзиторной экспрессии и очищали с помощью колонки с протеином А для получения интактного антитела IgG1,λ, из фагового антитела 1В10. Это полностью человеческое антитело против PD-L1 обозначали YN-002.
В соответствии с результатами секвенирования, нуклеотидная последовательность VH, кодирующая антитело YN-002, приведена в SEQ ID NO: 1, и аминокислотная последовательность VH антитела YN-002 приведена в SEQ ID NO: 2. Нуклеотидная последовательность VL, кодирующая антитело YN002, приведена в SEQ ID NO: 3, и аминокислотная последовательность VL антитела YN-002 приведена в SEQ ID NO: 4. Нуклеотидная последовательность тяжелой цепи, кодирующая антитело YN-002, приведена в SEQ ID NO: 5, и аминокислотная последовательность тяжелой цепи YN-002 приведена в SEQ ID NO: 6. Нуклеотидная последовательность, кодирующая легкую цепь антитела YN-002, приведена в SEQ ID NO: 7, и аминокислотная последовательность легкой цепи антитела YN-002 приведена в SEQ ID NO: 8.
Пример 3. Версия зародышевой линии полностью человеческого антитела против PD-L1 YN-002.
Сравнивая последовательность тяжелой цепи антитела YN-002 с известной последовательностью тяжелой цепи иммуноглобулина зародышевой линии человека, подтверждали, что в тяжелой цепи антитела YN-002 использовали сегмент VH из IGHV1 -69*09 зародышевой линии человека, сегмент D из IGHD5-18*01 зародышевой линии человека и сегмент JH из IGHJ4*02 зародышевой линии человека.
Сравнивая последовательность легкой цепи антитела YN-002 с известной последовательностью легкой цепи иммуноглобулина зародышевой линии человека, подтверждали, что в легкой цепи антитела YN-002 использовали сегмент VL из IGLV2-14*01 зародышевой линии человека и сегмент JL из IGLJ2 *01 зародышевой линии человека.
Последовательность области CDR антитела YN-002 анализировали по системе Kabat (см. фиг. 1).
- 32 044684
В соответствии с результатами секвенирования, аминокислотные последовательности LCDR1-3 антитела YN-002 приведены в SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 60 и SEQ ID NO: 63, соответственно; и аминокислотные последовательности HCDR1-3 приведены в SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48 и SEQ ID NO: 50, соответственно.
Для минимизации иммуногенности антитела YN-002 некоторые аминокислотные остатки можно подвергать обратной мутации в последовательность зародышевой линии. Антитело YN-003 является версией зародышевой линии антитела YN-002, полученной посредством мутации одной аминокислоты в области FR1 вариабельной области тяжелой цепи YN-002 обратно в последовательность зародышевой линии и мутации 1 аминокислоты в области FR2 и 6 аминокислот в области FR3 в вариабельной области легкой цепи YN-002 обратно в последовательность зародышевой линии (см. фиг. 1). Экспрессирующий вектор тяжелой цепи полностью человеческого антитела против PD-L1 YN-003 получают посредством сайт-специфического мутагенеза с использованием набора для мутагенеза (набора для точечной мутации Tiangen, KM101) на основе сконструированной экспрессирующей плазмиды тяжелой цепи YN-002. Экспрессирующий вектор легкой цепи YN-003 получают посредством сайт-специфического мутагенеза с использованием набора для мутагенеза (набора для точечной мутации Tiangen, KM101) на основе экспрессирующей плазмиды легкой цепи YN-002.
Аминокислотная последовательность VH антитела YN-003 приведена в SEQ ID NO: 9, которую можно получать посредством мутации одного аминокислотного остатка в аминокислотной последовательности VH антитела YN-002. Нуклеотидная последовательность, кодирующая VH YN-003, приведена в SEQ ID NO: 10. Аминокислотная последовательность VL антитела YN-003 приведена в SEQ ID NO: 11, которую можно получать посредством мутации 7 аминокислотных остатков в аминокислотной последовательности VL антитела YN-002, и нуклеотидная последовательность, соответствующая VL YN-003, приведена в SEQ ID NO: 12. Аминокислотная последовательность тяжелой цепи антитела YN-003 приведена в SEQ ID NO: 13; нуклеотидная последовательность, кодирующая тяжелую цепь YN-003, приведена в SEQ ID NO: 14; аминокислотная последовательность легкой цепи антитела YN-003 приведена в SEQ ID NO: 15; и нуклеотидная последовательность, кодирующая легкую цепь антитела YN-003, приведена в SEQ ID NO: 16.
В случае экспрессии и очистки антитела YN-003 см. стадии экспрессии и очистки антитела YN-002 в примере 2.
Пример 4. Тестирование аффинности связывания антитела против PD-L1.
Аффинность связывания антитела YN-002 и антитела YN-003 с рекомбинантными белками PD-L1 человека, Масаса fascicularis, мыши и собаки измеряли с помощью анализатора молекулярных взаимодействий (Octet RED384, приобретенного в Pall ForteBio Analytics Co., Ltd.). Следующие белки метили биотином (сульфо-NHS-LC-биотином EZ-Link, Pierce, 21327): рекомбинантный PD-L1-Fc человека, рекомбинантный PD-L1-Fc Масаса fascicularis (90251-C02H, приобретенный в Sino Biological Inc.), рекомбинантный PD-L1-Fc мыши (М5251, приобретенный в ACROBiosystems Inc.), рекомбинантный PD-L1-Fc собаки (70110-D02H, приобретенный в Sino Biological Inc.). Кинетику связывания антигена-антитела анализировали с помощью технологии биослойной интерферометрии (BLI) с использованием анализатора молекулярных взаимодействий (Octet RED384, приобретенного в Pall ForteBio Analytics Co., Ltd.) и буфера PBS, содержащего 0,1% BSA и 0,02% Tween 20. Биотин-связанный антигенный белок в концентрации 50 нМ фиксировали на сенсоре SA (Pall ForteBio Analytics Co., Ltd.) и связывали при 1500 об./мин в течение 10 мин; затем его связывали с дважды разведенным раствором антитела при 1500 об./мин в течение 10 мин; и наконец подвергали диссоциации при 1500 об./мин в течение 10 мин. Полученные результаты анализировали с помощью программного обеспечения Octet Data Analysis 9.0 (Pall ForteBio Analytics Co., Ltd.) для получения KD, Kon (1/Мс) и Kof (1/с).
Результаты измерения аффинности связывания антител против PD-L1 YN-002 и YN-003 приведены в табл. 1-4.
Таблица 1
Аффинность связывания антитела против PD-L1 с PD-L1-Fc человека
| Антитело | iO-Ll-Fc человека-биотин | ||
| Con (1/Мс) | Coff (1/c) | Kd(M) | |
| YN-002 | 5,69x10 | 5,94xl0·4 | 1,88x10’w |
| YN-003 | l,50x 106 | 5,11x10’4 | 1,08xl0’w |
- 33 044684
Таблица 2
Аффинность связывания антитела против PD-L1 с PD-L1-Fc мыши
| Антитело | PD-Ll-Fc мыши-биотин | ||
| коп (1/Мс) | kOff (1/с) | KD (М) | |
| YN-002 | 9,77x10 | 1,68x10'3 | 1,72x10-9 |
| YN-003 | 1,03х106 | 9,97x10-4 | 9,96χ10'ιυ |
Таблица 3
Аффинность связывания антитела против PD-L1 с PD-L1-Fc Macaca Fascicularis
| Антитело | PD-Ll-Fc Масаса Fascicularis-биотин | ||
| коп (1/Мс) | kOff (1/с) | KD (М) | |
| YN-002 | 1,77х106 | 1,90x10-3 | 1,07x10-9 |
| YN-003 | 2,08х106 | 1,36х10'3 | 6,54χ10'ιυ |
Таблица 4
Аффинность связывания антитела против PD-L1 с PD-L1-Fc собаки_______
| Антитело | PD-Ll-Fc собаки-биотин | ||
| коп (1/Мс) | kOff (1/с) | Kd(M) | |
| YN-002 | 1,02х106 | 7,59х10’4 | 7,43χ10'ιυ |
| YN-003 | 8,64x10 | 5,14х10’4 | 5,94χ10'ιυ |
Пример 5. Антитело против PD-L1 ингибирует связывание PD-L1 человека и PD-1 человека.
Белок PD-1-Fc человека (ACROBiosystems Inc., H5257) метили биотином (сульфо-NHS-LCбиотином EZ-Link, Pierce, 21327). PD-1-Fc человека, меченный субнасыщенной концентрацией биотина, добавляли к 1х106/мл клеток СНО, стабильно экспрессирующих PD-L1 человека, а затем добавляли каждое антитело, разведенное в пять раз, тщательно смешивали и инкубировали (4°C, 1 ч). После промывки клеток добавляли конъюгат стрептавидин R-PE (Life Technology, SA10041) и инкубировали (4°C, 30 мин). После промывки клеток определяли интенсивность флуоресценции с помощью проточного цитометра (Intellicyt iQue Screener). Результаты показаны на фиг. 2: YN-002 и YN-003 могут эффективно ингибировать связывание PD-1 человека с клетками СНО, экспрессирующими PD-L1 человека.
Пример 6. Антитело против PD-L1 ингибирует связывание PD-L1 Масаса Fascicularis с PD-1 Масаса fascicularis.
Способность антител против PD-L1 YN-002 и YN-003 блокировать связывание PD-L1-Fc Масаса fascicularis (Sino Biological Inc., 90251-C02H) с PD-1-Fc Масаса fascicularis (Sino Biological Inc., 90311C02H) оценивали с помощью устройства Octet RED384 ((Pall ForteBio Analytics Co., Ltd.). Сначала PD-1Fc Масаса fascicularis метили биотином (сульфо-NHS-LC-биотином EZ-Link, Pierce, 21327). Анализ кинетики связывания антитела против PD-L1 в случае ингибирования связывания PD-L1 Масаса fascicularis с PD-1 Масаса fascicularis осуществляли с помощью технологии биослойной интерферометрии (BLI) с использованием устройства Fortebio Octet RED384 (PALL) для анализа молекулярных взаимодействий (антиген и антитело разводили 0,1% BSA и 0,02% Tween 20 в буфере PBS). 100 нМ биотин-связанный рекомбинантный PD-1-Fc человека фиксировали на сенсоре SA при 1500 об./мин и связывали в течение 10 мин. PD-L1 Масаса fascicularis в конечной концентрации 75 нМ смешивали с разведенным в три раза раствором антитела, инкубировали в течение 60 мин, а затем объединяли в устройстве в течение 10 мин при 1500 об./мин, и наконец подвергали диссоциации в течение 10 мин при 1500 об./мин. Полученные результаты подвергали анализу с помощью программного обеспечения Octet Data Analysis 9.0 (Pall ForteBio Analytics Co., Ltd.). Результаты показаны на фиг. 3: YN-002 и YN-003 могут эффективно ингибировать связывание PD-L1-Fc Масаса fascicularis с PD-1-Fc Масаса fascicularis.
Пример 7. Антитело против PD-L1 ингибирует связывание PD-L1 мыши с PD-1 мыши.
PD-1-Fc мыши (ACROBiosystems Inc., M5259) метили биотином (сульфо-NHS-LC-биотином EZLink, Pierce, 21327), PD-1-Fc мыши, меченый субнасыщенной концентрацией биотина, добавляли к 1х106/мл клеток СНО, стабильно экспрессирующих PD-L1 мыши, а затем добавляли каждое антитело, разведенное в пять раз, тщательно смешивали и инкубировали (4°C, 1 ч). После промывки клеток добавляли конъюгат стрептавидин R-PE (Life Technology, SA10041) и инкубировали (4°C, 30 мин). После промывки клеток определяли интенсивность флуоресценции с помощью проточного цитометра (Intellicyt iQue Screener). Результаты показаны на фиг. 4: YN-002 и YN-003 могут эффективно ингибировать связывание PD-1 мыши с клетками СНО, экспрессирующими PD-L1 мыши.
Пример 8. Исследования противоопухолевого эффекта моноклонального антитела против PD-L1 на мышах, несущих рак толстого кишечника.
В день 0 самкам мышей C57BL/6 возрастом 6-8 недель подкожно инокулировали 3х106 клеток ко
- 34 044684 лоректального рака мыши МС38 (Shanghai Linyuan Biological Technology Co., Ltd.). В день 3 мышей равномерно распределяли по 7 группам с 8-9 мышами в каждой группе. Несущим опухоли мышам в каждой группе интраперитонеально инъецировали белок антитела IgG-Fc человека (10 мг/кг, дважды в неделю, всего две недели), антитело YN-003 (10 мг/кг, дважды в неделю, всего две недели), атезолизумаб (10 мг/кг, дважды в неделю, всего две недели), соответственно. Мышей в каждой группе регулярно обследовали на предмет изменения массы тела и размера опухоли. Результаты эксперимента свидетельствуют о том, что, по сравнению с контрольным IgG1-Fc, YN-003 и атезолизумаб могут эффективно ингибировать рост опухоли, где противоопухолевый эффект YN-003 является более значимым (фиг. 5).
Пример 9. Скрининг антитела против CD137 с помощью фаговой библиотеки антител.
Белок CD137 (приобретенный в Sino Biological Inc.) использовали в качестве антигена для сортировки фаговой библиотеки природных антител человека (Origincell Therapeutics Co., Ltd.). Пробирку для ELISA покрывали буфером CBS, содержащим 20 мкг/мл (первый и второй раунды) или 10 мкг/мл (третий и четвертый раунды) белка CD137 при 4°C в течение ночи. Затем пробирку промывали буфером PBS. Добавляли 10% обезжиренное порошковое молоко для блокирования пробирки для ELISA, а затем добавляли 1 мл блокированного фага и инкубировали при комнатной температуре (20±5°C) в течение 1 ч. После тщательной промывки PBST добавляли 800 мкл буферного раствора Gly-HCl, pH 2,2, для элюции, а затем незамедлительно добавляли 400 мкл буферного раствора Трис-HCl, рН 8,0, для нейтрализации. Затем смесь добавляли к 20 мл Е. coli SS320 в логарифмической фазе роста со значением OD приблизительно 0,8, тщательно смешивали и отстаивали при 37°C в течение 1 ч. Отбирали 500 мкл микробного раствора для измерения титра фага и использовали глицерин для защиты микроорганизмов, оставшийся раствор микроорганизмов использовали для покрывания планшета и культивировали при 37°C в течение ночи. На следующий день бактерии на планшете пропорционально инокулировали в 80 мл среды 2YT-Amp таким образом, что раствор микроорганизмов имел значение OD 0,2, и культивировали в течение нескольких часов. Когда значение OD достигало 0,8, добавляли 160 мкл хелперного фага, тщательно смешивали и отстаивали при 37°C в течение 1 ч. Затем добавляли IPTG и антибиотик канамицин и культивировали со встряхиванием при 250 об./мин при 30°C в течение ночи. Затем супернатант собирали для осаждения фага раствором PEG/NaCl, который ресуспендировали в 1,5 мл буфера PBS для скрининга с обогащением.
96-луночные планшеты для ELISA покрывали растворами, содержащими 1 мкг/мл белка CD137 человека, при 4°C в течение ночи. Затем планшет блокировали 10% обезжиренным порошковым молоком по неспецифическим участкам связывания. После тщательной промывки отбирали супернатант моноклонального фага, добавляли в 96-луночные планшеты и инкубировали при 37°C в течение 2 ч. После тщательной промывки в каждую лунку добавляли HRP-меченое антитело против М13 (27-9421-01, GE Healtcare) и проводили реакцию при 37°C в течение 45 мин. После тщательной промывки в каждую лунку добавляли ТМВ для проявления цвета. После реакции при комнатной температуре (20±5°C) в течение 5-10 мин в каждую лунку добавляли серную кислоту для остановки реакции. Для измерения значения OD в каждой лунке при 450 нм используют спектрофотометр для чтения микропланшетов.
Клон фагового антитела 1А6, который может специфически связываться с CD137 человека, идентифицировали с помощью ELISA, и последовательности генов VH и VL получали посредством секвенирования. В соответствии с результатами секвенирования, нуклеотидная последовательность, кодирующая VH фагового антитела 1А6, приведена в SEQ ID NO: 17, аминокислотная последовательность VH фагового антитела 1А6 приведена в SEQ ID NO: 18; нуклеотидная последовательность, кодирующая VL фагового антитела 1А6, приведена в SEQ ID NO: 19, и аминокислотная последовательность VL фагового антитела 1А6 приведена в SEQ ID NO: 20.
Пример 10. Экспрессия и очистка полностью человеческого интактного антитела против CD137.
Конструировали праймер для ПЦР-амплификации VH фагового антитела 1А6. Продукт ПЦР клонировали посредством рекомбинации в вектор pCMV-IgG2, дважды расщепленный с помощью AgeI и SalI. Конструировали праймер для ПЦР-амплификации VL фагового антитела 1А6, и продукт ПЦР клонировали посредством рекомбинации в вектор pCMV-λ, расщепленный AgeI и BsiWI. После правильного секвенирования клетки 293F котрансфицировали с помощью экспрессирующих векторов для тяжелой цепи и легкой цепи для транзиторной экспрессии и очищали с помощью колонки с протеином А. Интактное антитело IgG2,λ, 1A6, полностью человеческое антитело против CD137, обозначали как YN-005.
В соответствии с результатами секвенирования аминокислотная последовательность VH антитела YN-005 приведена в SEQ ID NO: 18, нуклеотидная последовательность, кодирующая VH антитела YN005, приведена в SEQ ID NO: 17; и аминокислотная последовательность VL антитела YN-005 приведена в SEQ ID NO: 20, и нуклеотидная последовательность, кодирующая VL антитела YN-005, приведена в SEQ ID NO: 19. Аминокислотная последовательность тяжелой цепи антитела YN-005 приведена в SEQ ID NO: 21, нуклеотидная последовательность, кодирующая тяжелую цепь антитела YN-005, приведена в SEQ ID NO: 22; аминокислотная последовательность легкой цепи антитела YN-005 приведена в SEQ ID NO: 23, и нуклеотидная последовательность, кодирующая легкую цепь антитела YN-005, приведена в SEQ ID NO: 24.
- 35 044684
Пример 11. Версия зародышевой линии полностью человеческого антитела против CD137 YN-005.
Сравнивая последовательность тяжелой цепи антитела YN-005 с известной последовательностью тяжелой цепи иммуноглобулина зародышевой линии человека, подтверждали, что в тяжелой цепи антитела YN-005 использовали сегмент VH из IGHV3-23*04 зародышевой линии человека, сегмент D из
IGHD7-27*01 зародышевой линии человека и сегмент JH из IGHJ3*02 зародышевой линии человека.
Сравнивая последовательность легкой цепи иммуноглобулина YN-005 с известной последовательностью легкой цепи иммуноглобулина зародышевой линии человека, подтверждали, что в легкой цепи антитела YN-005 использовали сегмент VL из IGLV1-44*01 зародышевой линии человека и сегмент JL из IGLJ1*01 зародышевой линии человека.
Для анализа последовательности области CDR антитела YN-005 использовали систему Kabat (см. фиг. 6), и в соответствии с результатами секвенирования, аминокислотная последовательность HCDR1-3 антитела YN-005 приведена в SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78 и SEQ ID NO: 79, соответственно. Аминокислотная последовательность LCDR1-3 антитела YN-005 приведена в SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81 и SEQ ID NO: 82, соответственно.
Для минимизации иммуногенности антитела YN-005 некоторые аминокислотные остатки можно подвергать обратной мутации в последовательность зародышевой линии. Антитело YN-006 является версией зародышевой линии антитела YN-005, полученной посредством мутации одной аминокислоты в области FR1 в вариабельной области тяжелой цепи YN-005 обратно в последовательность зародышевой линии (см. фиг. 6). Экспрессирующий вектор для тяжелой цепи полностью человеческого антитела против CD137 YN-006 получают посредством сайт-специфического мутагенеза с использованием набора для мутации (набора для точечной мутации Tiangen, KM101) на основе сконструированной экспрессирующей плазмиды тяжелой цепи YN-005.
В соответствии с результатами секвенирования, аминокислотная последовательность VH антитела YN-006 приведена в SEQ ID NO: 25, и нуклеотидная последовательность, кодирующая VH YN-006, приведена в SEQ ID NO: 26. Аминокислотная последовательность VL антитела YN-006 приведена в SEQ ID NO: 20, и нуклеотидная последовательность, кодирующая VL YN-006, приведена в SEQ ID NO: 19. Аминокислотная последовательность тяжелой цепи антитела YN-006 приведена в SEQ ID NO: 27; нуклеотидная последовательность, кодирующая тяжелую цепь антитела YN-006, приведена в SEQ ID NO: 28; и аминокислотная последовательность легкой цепи антитела YN-006 приведена в SEQ ID NO: 23, и нуклеотидная последовательность, кодирующая легкую цепь YN-006, приведена в SEQ ID NO: 24.
В случае экспрессии и очистки антитела YN-006, см. конкретные стадии экспрессии и очистки антитела YN-005 в примере 9.
Пример 12. Определение аффинности связывания антитела против CD137.
Аффинность связывания антитела YN-005 и антитела YN-006 с рекомбинантным белком CD137-His человека (Origincell Therapeutics Co., Ltd.) измеряли с помощью анализатора молекулярных взаимодействий (Octet RED384, приобретенного в Pall ForteBio Analytics Co., Ltd.). Кинетику связывания антигенаантитела анализировали с помощью технологии биослойной интерферометрии (BLI) с использованием анализатора молекулярных взаимодействий (Octet RED384, приобретенного в Pall ForteBio Analytics Co., Ltd.) и буфера PBS, содержащего 0,1% BSA и 0,02% Tween 20. Антитело в концентрации 50 нМ фиксировали на сенсоре АНС и связывали при 1500 об./мин. В течение 5 мин; затем его связывали с разведенным в два раза раствором рекомбинантного антигенного белка CD137-His (100, 50, 25, 12,5, 6,25, 3,125, 1,56 нМ) при 1500 об./мин в течение 5 мин; и наконец подвергали диссоциации при 1500 об./мин в течение 10 мин. Сенсор АНС регенерировали импульсным введением глицина, а затем использовали повторно. Полученные результаты анализировали с помощью программного обеспечения Octet Data Analysis 9.0 (Pall ForteBio Analytics Co., Ltd.) для получения KD, Kon (1/Mc) и Koff (1/c). Результаты измерения аффинности связывания антитела против CD137 YN-005 и YN-006 показаны в табл. 5.
Таблица 5
Аффинность антитела против CD137 к CD137-His человека
| Антитело | CD137-His | ||
| Kon (1/Mc) | KOff (1/c) | KD(M) | |
| YN-005 | 9,38χ104 | 4,55x10’ | 4,85xl0’w |
| YN-006 | 9,68χ104 | 1,33x10’ | 1,37χ10’ιυ |
Пример 13. Исследования противоопухолевого эффекта моноклонального антитела против CD137 у мышей, несущих рак толстого кишечника.
В день 0 самкам мышей C57BL/6 возрастом 6-8 недель с геном CD137 человека (мышам BhTNFRSF9 (4-1BB), приобретенным в Beijing BioCytogen Co., Ltd.) подкожно инокулировали 1,5х106 клеток колоректального рака мыши МС38. В день 3 мышей равномерно разделяли по 3 группам с 7 мышами в каждой группе. Несущим опухоли мышам в каждой группе интраперитонеально инъецировали белок антитела IgG-Fc человека (3 мг/кг, дважды в неделю, всего две недели), антитело против CD137 YN-006 (3 мг/кг, дважды в неделю, всего две недели) и антитело против CD137 утомилумаб (3 мг/кг,
- 36 044684 дважды в неделю, всего две недели), соответственно. Мышей в каждой группе регулярно обследовали на предмет изменения массы тела и размера опухоли. Результаты эксперимента показали, что, по сравнению с контрольным IgG1-Fc, YN-006 и утомилумаб могут эффективно ингибировать рост опухоли, и стоит отметить, что противоопухолевый эффект YN-006 является более значимым, чем у утомилумаба (например, как показано на фиг. 7).
Пример 14. Конструирование биспецифического антитела против PD-L1/CD137 YN-007.
Ген первого полипептида биспецифического антитела против PD-L1/CD137 YN-007 конструировали способом молекулярного клонирования, таким как ПЦР с достройкой перекрывающихся участков, сайт-специфический мутагенез или т.п. с использованием гена тяжелой цепи антитела против PD-L1 YN003 и генов тяжелой цепи и легкой цепи антитела против CD137 человека YN-006, и клонировали посредством комбинации в векторе pCMVIgG1 AEM, дважды расщепленном с помощью AgeI и BamHI, для конструирования экспрессирующего вектора первого полипептида YN-007.
Ген второго полипептида YN-007 является тем же, что и ген легкой цепи YN-003. Экспрессирующий вектор второго полипептида YN-007 является описанным выше сконструированным экспрессирующим вектором легкой цепи YN-003.
После правильного секвенирования клетки 293F котрансфицировали с помощью экспрессирующих векторов первого полипептида и второго полипептида для транзиторной экспрессии и очищали с помощью колонки с протеином А для получения биспецифического антитела против PD-L1/CD137 YN-007.
Нуклеотидная последовательность, кодирующая первый полипептид антитела YN-007, приведена в SEQ ID NO: 29, и аминокислотная последовательность первого полипептида антитела YN-007 приведена в SEQ ID NO: 30; нуклеотидная последовательность, кодирующая второй полипептид антитела YN-007, приведена в SEQ ID NO: 16, и аминокислотная последовательность второго полипептида антитела YN007 приведена в SEQ ID NO: 15.
Пример 15. Определение аффинности связывания биспецифического антитела против PD-L1/CD137 YN-007.
Аффинность связывания биспецифического антитела против PD-L1/CD137 YN-007 с рекомбинантным белком PD-L1-Fc человека и рекомбинантным PD-L1-Fc мыши измеряли с помощью анализатора молекулярных взаимодействий (Octet RED384, приобретенного в Pall ForteBio Analytics Co., Ltd.). Рекомбинантный белок PD-L1-Fc человека и рекомбинантный PD-L1-Fc мыши метили биотином (сульфоNHS-LC-биотином EZ-Link, Pierce, 21327). Кинетику связывания антигена-антитела анализировали с помощью технологии биослойной интерферометрии (BLI) с использованием анализатора молекулярных взаимодействий (Octet RED384, приобретенного в Pall ForteBio Analytics Co., Ltd.) и буфера PBS, содержащего 0,1% BSA и 0,02% Tween 20. Биотин-связанный антигенный белок в концентрации 50 нМ фиксировали на сенсоре SA (Pall ForteBio Analytics Co., Ltd.) и связывали при 1500 об./мин в течение 10 мин; затем его связывали с разведенным в два раза раствором антитела YN-007 при 1500 об./мин в течение 10 мин; и наконец подвергали диссоциации при 1500 об./мин в течение 10 мин. Полученные результаты будут анализировать с помощью программного обеспечения Octet Data Analysis 9.0 (Pall ForteBio Analytics Co., Ltd.) для получения KD, Kon (1/Mc) и Koff (1/c).
Результаты измерения аффинности связывания YN-007 с PD-L1-Fc человека приведены в табл. 6.
Результаты измерения аффинности связывания YN-007 с PD-L1-Fc мыши приведены в табл. 7.
Таблица 6 Аффинность связывания биспецифического антитела против PD-L1/CD137 YN-007 с PD-L1-Fc человека
| Антитело | PD-Ll-Fc человека-биотин | ||
| kon (1/Mc) | kOff (1/c) | Kd(M) | |
| YN-007 | 1,13х106 | 5,92χ10’4 | 5,25χ10'ιυ |
Таблица 7
Аффинность связывания биспецифического антитела против PD-L1/CD137 YN-007 с PDL1-Fc мыши
| Антитело | PD-Ll-Fc мыши-биотин | ||
| kon (1/Mc) | kOff (1/c) | KD (M) | |
| YN-007 | 8,lxl06 | l,09xl0'3 | l,34xl0’y |
Аффинность связывания биспецифического антитела против PD-L1/CD137 YN-007 с рекомбинантным белком CD137-His человека измеряли с помощью анализатора молекулярных взаимодействий (Octet RED384, приобретенного в Pall ForteBio Analytics Co., Ltd.). Кинетику связывания антигена-антитела анализировали с помощью технологии биослойной интерферометрии (BLI) с использованием анализатора молекулярных взаимодействий (Octet RED384, приобретенного в Pall ForteBio Analytics Co., Ltd.) и буфера PBS, содержащего 0,1% BSA и 0,02% Tween 20. Антитело в концентрации 50 нМ фиксировали на сенсоре АНС и связывали при 1500 об./мин в течение 5 мин; затем его связывали с разведенным в два
- 37 044684 раза раствором рекомбинантного антигенного белка CD137-His человека (100, 50, 25, 12,5, 6,25, 3,125, 1,56 нМ) при 1500 об./мин. в течение 5 мин; и наконец подвергали диссоциации 1500 об./мин в течение 10 мин. Сенсор АНС регенерировали посредством импульсного введения глицина, а затем использовали повторно. Полученные результаты будут анализировать с помощью программного обеспечения Octet Data Analysis 9.0 (Pall ForteBio Analytics Co., Ltd.) для вычисления силы связывания между антигеном и антителом для получения KD, Kon (1/Мс) и Koff (1/с).
Результаты измерения аффинности связывания биспецифического антитела против PD-L1/CD137 YN-007 с CD137 человека приведены в табл. 8.
Таблица 8
Аффинность связывания биспецифического антитела против PD-L1/CD137 YN-007 с CD137-His человека
| Антитело | CD137-His человека | ||
| kon (1/Мс) | kOff (1/с) | KD (Μ) | |
| YN-007 | 8,96^104 | 9,83 χ ΙΟ'5 | 1,1х10'у |
Пример 16. Созревание аффинности антитела против PD-L1 YN-003.
Конструировали праймер для конструирования гена одноцепочечного антитела (ScFv) из антитела против PD-L1 YN-003 посредством ПЦР с достройкой перекрывающихся фрагментов, клонировали в фагмидный вектор pDF и обозначали как ScFv pDF-YN-003. ScFv pDF-YN-003 использовали в качестве матрицы для конструирования вырожденного праймера для рандомизации 6 областей CDR (включая некоторые аминокислотные остатки в областях CDR и отдельные аминокислотные остатки в областях FR, смежных с областями CDR) антитела YN-003 посредством ПЦР с достройкой перекрывающихся фрагментов, соответственно (как показано на фиг. 8).
Рандомизированные по области CDR фрагменты гена scFv, полученные посредством ПЦР с достройкой перекрывающихся фрагментов, дважды расщепляли с помощью BssHII и NheI, а затем лигировали с фагмидным вектором pDF, дважды расщепленным с помощью BssHII и NheI. 1 мкг продукта лигирования подвергали электропорации в электрокомпетентные клетки TG1 и покрывали им чашку 2YT+AG после множественных разведений. На следующий день с чашки соскребали газон и переносили в 300 мл среды 2YT+Amp. Клетки культивировали при 37°C до OD приблизительно 0,8. Добавляли хелперный фаг и тщательно смешивали, отстаивали в течение 1 ч и добавляли IPTG в конечной концентрации 1 мМ и 50 мкг/мл канамицина и встряхивали при 30°C в течение ночи. На следующий день супернатант собирали посредством центрифугирования и фильтровали через фильтр 0,45. К осажденному фагу добавляли 1/5 объема PEG-NaCl и центрифугировали для сбора осадка. Использовали 1/10 объема PBS для ресуспендирования осадка и измеряли OD260 для вычисления БОЕ фага. Продукт хранили при 4°C. Фаговую библиотеку антител можно использовать напрямую для последующего пэннинга.
Белок PD-L1-His человека (Origincell Therapeutics Co., Ltd.) использовали в качестве антигена для сортировки указанной выше фаговой библиотеки антител. В пробирках для ELISA буфер CBS использовали для покрывания антигеном PD-L1 (1 мл) в концентрации 100 нМ (первый и второй раунд) или 5 нМ (третий раунд) при 4°C в течение ночи. На следующий день 2 мл буфера PBS, содержащего 10% обезжиренное порошковое молоко, использовали для блокирования пробирки. Добавляли 1 мл блокированного фага в пробирку и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре; промывали PBST 20 раз (первый раунд), 50 раз (второй раунд) или 100 раз (третий раунд). Добавляли 800 мкл буфера Gly-HCl (pH 2,2) для элюции и незамедлительно добавляли 400 мкл буфера Трис-HCl (рН 8,0) для нейтрализации. Его добавляли к 20 мл Е. coli TGI в фазе логарифмического роста с OD приблизительно 0,8, тщательно смешивали и отстаивали при 37°C в течение 1 ч. Отбирали 500 мкл для определения титра фага и использовали глицерин для защиты микроорганизмов. Оставшуюся микробную жидкость распределяли по чашке и инкубировали при 37°C в инкубаторе в течение ночи. На следующий день микроорганизмы на планшете и инокулировали в 80 мл среды 2YTAmp в некоторой пропорции для достижения OD 0,2. Смесь инкубировали в течение нескольких часов до достижения OD 0,8. Добавляли 160 мкл хелперного фага, тщательно смешивали и отстаивали при 37°C в течение 1 ч. Добавляли IPTG и антибиотик канамицин и инкубировали при встряхивании при 250 об./мин и 30°C в течение ночи. Супернатант собирали и обрабатывали раствором PEG/NaCl для осаждения фага, который ресуспендировали в 1,5 мл буфера PBS. Ресуспендированного фага использовали для следующего раунда скрининга с обогащением. После 3 раундов сортировки наблюдали значительное обогащение. Сортированных фаговых клонов антитела идентифицировали посредством ELISA: белком PD-L1-His человека покрывали 96-луночный планшет для ELISA в концентрации 1 мкг/мл при 4°C в течение ночи. Затем неспецифические участки связывания блокировали 10% обезжиренным порошковым молоком. После достаточной промывки супернатант моноклонального фага добавляли в 96-луночный планшет и инкубировали при 37°C в течение 2 ч. После тщательной промывки добавляли HRP-меченое антитело против М13 (GE Healtcare, 27-9421-01) и проводили реакцию при 37°C в течение 45 мин. После тщательной промывки добавляли ТМВ для проявления цвета и проводили реакцию при комнатной температуре в течение 5-10 мин. И наконец, реакцию оста
- 38 044684 навливали серной кислотой. Значение OD в каждой лунке измеряли при 450 нм и для секвенирования выбирали фаговый клон антитела с более высоким значением OD450. После получения последовательностей генов вариабельной области тяжелой цепи и легкой цепи каждого клона фагового антитела, каждое фаговое антитело реконструировали в виде полноразмерного антитела IgG1,λ: конструировали праймер для осуществления ПЦР-амплификации VH каждого клона фагового антитела и продукт ПЦР клонировали посредством рекомбинации в экспрессирующий вектор тяжелой цепи антитела pCMVIgG1NDL, дважды расщепленный с помощью AgeI и SalI. Конструировали праймер для ПЦРамплификации VL каждого клона фагового антитела, и продукт ПЦР клонировали в экспрессирующий вектор легкой цепи антитела pCMV-λ, дважды расщепленный с помощью AgeI и BsiWI. После правильного секвенирования клетки 293F котрансфицировали с помощью экспрессирующих векторов для тяжелой цепи и легкой цепи каждого антитела для транзиторной экспрессии. Через 7 дней культивирования в бессывороточной среде, собирали супернатант культуры клеток и очищали с помощью колонки с протеином А для получения белка антитела. Очищенное антитело диализовали с помощью PBS и в конечном итоге количественно анализировали с помощью набора для анализа белка ВСА (Pierce, 23225). Аффинность связывания указанного полноразмерного антитела с рекомбинантным белком PDL1-His человека (Origincell Therapeutics Co., Ltd.) с использованием анализатора молекулярных взаимодействий (Octet RED384, приобретенного в Pall ForteBio Analytics Co., Ltd.). Кинетику связывания антигена-антитела анализировали с помощью технологии биослойной интерферометрии (BLI) с использованием анализатора молекулярных взаимодействий (Octet RED384, приобретенного в Pall ForteBio Analytics Co., Ltd.) и буфера PBS, содержащего 0,1% BSA и 0,02% Tween 20. Антитело в концентрации 50 нМ фиксировали на сенсоре АНС и связывали при 1500 об./мин в течение 5 мин; затем связывали с разведенным в два раза раствором антигена (50, 25, 12,5, 6,25, 3,125, 1,56 нМ) с 7 градиентами концентрации при 1500 об./мин в течение 5 мин, и наконец подвергали диссоциации 1500 об./мин в течение 10 мин. Сенсор АНС регенерировали посредством импульсного введения глицина, а затем использовали повторно. Полученные результаты будут анализировать с помощью программного обеспечения Octet Data Analysis 9.0 (Pall ForteBio Analytics Co., Ltd.) для получения KD, Kon (1/Мс) и Koff (1/c). После скрининга полученные мутантные клоны с повышенной аффинностью точечные мутации аминокислот с повышенной аффинностью в разных областях CDR комбинировали способами, такими как ПЦР с достройкой перекрывающихся фрагментов, а затем белок антитела экспрессировали и очищали указанным выше способом и определяли аффинность. После множества раундов скрининга и комбинации лучшие 5 мутантных клонов антитела YN-003 с высокой аффинностью обозначали как антитело YN-035, антитело YN-036, антитело YN-037, антитело YN-038 и антитело YN-039, соответственно.
Значения аффинности 5 антител, полученных указанным выше способом, приведены в табл. 9. Результаты показали, что аффинность антитела YN-035, антитела YN-036, антитела YN-037, антитела YN038 и антитела YN-039 была выше, чем у антител против PD-L1 атезолизумаба и авелумаба.
- 39 044684
Таблица 9
Аффинность связывания антитела против PD-L1 с PD-L1-His человека
| Антите ло | PD-Ll-His человека | ||||||
| KD(M) | Ошибка KD | Kon (1/Mc) | Ошибка Kon | Koff(l/c) | Ошибка K0ff | Пол ный RA2 | |
| Атезол изумаб | 9,16xlO'10 | 8,79xl0'12 | 3,78x10 | 1,95x10 | 3,46x10'4 | 2,80xl0'6 | 0,9984 |
| Авелу маб | l,03xl0-y | 9,20* 10’12 | 2,96x10 | 1,31x10 | 3,05 x 10-4 | 2,37xl0’6 | 0,9991 |
| YN- 035 | 4,52^10-10 | 3,54xl0'12 | 4,27x10 | 1,16x10 | 1,93 x 10-4 | 1,42x1 O'6 | 0,9995 |
| YN- 036 | 4,74xlO'10 | 4,95xl0'12 | 3,69x10 | 1,22x10 | 1,75x10'4 | 1,73x1 O'6 | 0,9994 |
| YN- 037 | 3,82xlO'10 | 5,66xl0'12 | 3,55x10 | 1,36x10 | l,36xl0-4 | 1,94x1 O'6 | 0,9991 |
| YN- 038 | 4,47 x 10-10 | 4,61xl0'12 | 3,50x10 | 1,05x10 | l,56xl0-4 | l,54xl0’6 | 0,9995 |
| YN- 039 | 4,85xl0'lu | 4,41 x 10-12 | 3,56x10 | 1,02x10 | 1,73 x 10-4 | 1,49x1 O’6 | 0,9995 |
Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела YN-035 (VH YN-035) приведена в SEQ ID NO: 31, аминокислотная последовательность тяжелой цепи антитела YN035 приведена в SEQ ID NO: 32, аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи антитела YN-035 (YN-035 VL) приведена в SEQ ID NO: 33, и аминокислотная последовательность легкой цепи антитела YN-035 приведена в SEQ ID NO: 34.
Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела YN-036 (YN036 VH) приведена в SEQ ID NO: 35, аминокислотная последовательность тяжелой цепи антитела YN036 приведена в SEQ ID NO: 36, аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи антитела YN-036 (YN-036VL) приведена в SEQ ID NO: 33, и аминокислотная последовательность легкой цепи антитела YN-036 приведена в SEQ ID NO: 34.
Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела YN-037 (YN037 VH) приведена в SEQ ID NO: 35, аминокислотная последовательность тяжелой цепи антитела YN037 приведена в SEQ ID NO: 36, аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи антитела YN-037 (YN-037VL) приведена в SEQ ID NO: 37, и аминокислотная последовательность легкой цепи антитела YN-037 приведена в SEQ ID NO: 38.
Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелая цепь антитела YN-038 (YN038 VH) приведена в SEQ ID NO: 35, аминокислотная последовательность тяжелой цепи антитела YN038 приведена в SEQ ID NO: 36, аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи антитела YN-038 (YN-038VL) приведена в SEQ ID NO: 39, и аминокислотная последовательность легкой цепи антитела YN-038 приведена в SEQ ID NO: 40.
Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелая цепь антитела YN-039 (YN039VH) приведена в SEQ ID NO: 35, аминокислотная последовательность тяжелой цепи антитела YN-039 приведена в SEQ ID NO: 36, аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи антитела YN-039 (YN-039 VL) приведена в SEQ ID NO: 41, и аминокислотная последовательность легкой цепи антитела YN-039 приведена в SEQ ID NO: 42.
На фиг. 9 показано выравнивание аминокислотных последовательностей вариабельных областей тяжелой цепи и соответствующих последовательностей зародышевой линии антител YN-003 и YN-035YN-039, где подчеркнуты CDR, определенные способом Kabat. На фиг. 10 показано выравнивание аминокислотных последовательностей вариабельных областей легкой цепи и соответствующих последовательностей зародышевой линии антител YN-003 и YN-035-YN-039, где подчеркнуты CDR, определенные способом Kabat. Из них, аминокислотная последовательность HCDR1 антитела YN-003 приведена в SEQ ID NO: 46, аминокислотная последовательность HCDR1 YN-035-YN-039 приведена в SEQ ID NO: 47; аминокислотная последовательность HCDR2 антитела YN-003 и аминокислотная последовательность HCDR2 антител YN-035-YN-039 приведена в SEQ ID NO: 48; аминокислотная последовательность
- 40 044684
HCDR3 YN-003 приведена в SEQ ID NO: 50; аминокислотная последовательность HCDR3 YN-035 приведена в SEQ ID NO: 51; и аминокислотная последовательность HCDR3 антител YN-036-YN-039 приведена в SEQ ID NO: 52.
Аминокислотная последовательность LCDR1 антитела YN-003 приведена в SEQ ID NO: 54, аминокислотная последовательность LCDR1 антител YN-035-YN-036 приведена в SEQ ID NO: 55, аминокислотная последовательность LCDR1 антитела YN-037 приведена в SEQ ID NO: 56, аминокислотная последовательность LCDR1 антитела YN-038 приведена в SEQ ID NO: 57, аминокислотная последовательность LCDR1 антитела YN-039 приведена в SEQ ID NO: 58; аминокислотная последовательность LCDR2 антитела YN-003 и антител YN-035-YN-036 приведена в SEQ ID NO: 60, аминокислотная последовательность LCDR2 антител YN-037-YN-039 приведена в SEQ ID NO: 61; аминокислотная последовательность LCDR3 антитела YN-003 приведена в SEQ ID NO: 63; и аминокислотная последовательность LCDR3 антител YN-035-YN-039 приведена в SEQ ID NO: 64.
Связывающая активность антител против PD-L1 YN-035, YN-036, YN-037, YN-038, YN-039 с PDL1 человека определяли посредством проточной цитометрии: к 1х106/мл клеток СНО, стабильно экспрессирующих PD-L1 человека, добавляли отдельные разведенные в два раза антитела против PD-L1. Смесь тщательно смешивали и инкубировали при 4°C в течение 1 ч. После промывки клеток добавляли F(ab')2 козы против IgG-Fc человека (DyLight 650) (ab98593, Abcam) и инкубировали при 4°C в течение 30 мин. После промывки клеток определяли интенсивность флуоресценции с помощью проточного цитометра (Intellicyt iQue Screener). Результаты эксперимента показаны на фиг. 11: все из YN-035, YN-036, YN-037, YN-038, YN-039 могут эффективно связываться с клетками СНО, экспрессирующими PD-L1 человека.
Ингибиторную способность антител против PD-L1 YN-035, YN-036, YN-037, YN-038, YN-039 в отношении PD-L1 человека/PD-1 человека определяли посредством проточной цитометрии: белок PD-1-Fc человека (Origincell Therapeutics Co., Ltd.) метили биотином (сульфо-NHS-LC-биотином EZ-Link, Pierce, 21327). PD-1-Fc человека, меченый субнасыщенной концентрацией биотина, добавляли к 1х106/мл клеток СНО, стабильно экспрессирующих PD-L1 человека, а затем незамедлительно добавляли отдельные разведенные в два раза антитела, тщательно смешивали и инкубировали (4°C, 1 ч). После промывки клеток добавляли конъюгат стрептавидин R-PE (Life Technology, SA10041) и инкубировали (4°C, 30 мин). После промывки клеток определяли интенсивность флуоресценции с помощью проточного цитометра (Intellicyt iQue Screener). Результаты эксперимента показаны на фиг. 12: все из антител против PD-L1 YN-035, YN-036, YN-037, YN-038, YN-039 могут эффективно ингибировать связывание PD-1 человека с клетками СНО, экспрессирующими человек PD-L1.
Связывающую активность антител против PD-L1 YN-035, YN-036, YN-037, YN-038, YN-039 с PDL1 мыши определяли посредством проточной цитометрии: к 1х106/мл клеток СНО, стабильно экспрессирующих PD-L1 мыши, добавляли отдельные разведенные в два раза антитела против PD-L1. Смесь тщательно смешивали и инкубировали при 4°C в течение 1 ч. После промывки клеток добавляли F(ab')2 козы против IgG-Fc человека (DyLight 650) (ab98593) и инкубировали при 4°C в течение 30 мин. После промывки клеток определяли интенсивность флуоресценции с помощью проточного цитометра (Intellicyt iQue Screener). Результаты эксперимента показаны на фиг. 13: все из YN-035, YN-036, YN-037, YN-038, YN-039 могут эффективно связываться с клетками СНО, экспрессирующими мышь PD-L1.
Ингибиторную способность антител против PD-L1 YN-035, YN-036, YN-037, YN-038, YN-039 в отношении PD-L1 мыши/PD-I мыши определяли посредством проточной цитометрии: PD-1-Fc мыши (Origincell Therapeutics Co., Ltd.) метили биотином (сульфо-NHS-LC-биотином EZ-Link, Pierce, 21327). PD-1-Fc мыши, меченый субнасыщенной концентрацией биотина, добавляли к 1х106/мл клеток СНО, стабильно экспрессирующих PD-L1 мыши, а затем незамедлительно добавляли отдельные разведенные в два раза антитела, тщательно смешивали и инкубировали (4°C, 1 ч). После промывки клеток добавляли конъюгат стрептавидин R-PE (Life Technology, SA10041) и инкубировали (4°C, 30 мин). После промывки клеток определяли интенсивность флуоресценции с помощью проточного цитометра (Intellicyt iQue Screener). Результаты показаны на фиг. 14: все из антител против PD-L1 YN-035, YN-036, YN-037, YN038, YN-039 могут эффективно ингибировать связывание PD-1 мыши с клетками СНО, стабильно экспрессирующими PD-L1 мыши.
Пример 17. Конструирование и идентификация биспецифических антител против PD-L1/CD137 YN-051 и YN-052.
Ген первого полипептида биспецифического антитела против PD-L1/CD137 YN-051 конструировали способом молекулярного клонирования, таким как ПЦР с достройкой перекрывающихся участков, сайт-специфический мутагенез или т.п., с использованием гена тяжелой цепи антитела против PD-L1 YN-035 и генов тяжелой цепи и легкой цепи антитела против CD137 человека YN-006 и клонировали посредством рекомбинации в вектор pCMV-IgG1AEM, дважды расщепленный с помощью AgeI и BamHI, для конструирования экспрессирующего вектора первого полипептида YN-051. Ген второго полипептида YN-051 является тем же, что и ген легкой цепи YN-035. Экспрессирующий вектор второго полипептида YN-035 является экспрессирующим вектором легкой цепи YN-035.
- 41 044684
После правильного секвенирования клетки 293F котрансфецировали с помощью экспрессирующих векторов первого полипептида и второго полипептида биспецифического антитела против PD-L1/CD137 YN-051 для транзиторной экспрессии. После культивирования в бессывороточной среде в течение 7 дней собирали супернатант культуры клеток и очищали с помощью колонки с протеином А для получения белка антитела. Очищенное антитело диализовали с помощью PBS и в конечном итоге количественно анализировали с помощью набора для анализа белка ВСА (Pierce, 23225).
Аминокислотная последовательность первого полипептида YN-051 приведена в SEQ ID NO: 43, и аминокислотная последовательность второго полипептида YN-051 приведена в SEQ ID NO: 34.
Ген первого полипептида биспецифического антитела против PD-L1/CD137 YN-052 конструировали способом молекулярного клонирования, таким как ПЦР с достройкой перекрывающихся участков, сайт-специфический мутагенез или т.п., с использованием гена тяжелой цепи антитела против PD-L1 YN-036 и генов тяжелой цепи и легкой цепи антитела против CD137 человека YN-006 и клонировали посредством рекомбинации в вектор pCMV-IgG1AEM, дважды расщепленный с помощью AgeI и BamHI, для конструирования экспрессирующего вектора первого полипептида YN-052. Ген второго полипептида YN-052 является тем же, что и ген легкой цепи YN-036. Экспрессирующий вектор второго полипептида YN-052 является экспрессирующим вектором легкой цепи YN-036.
После правильного секвенирования клетки 293F котрансфицировали с помощью экспрессирующих векторов первого полипептида и второго полипептида биспецифического антитела против PD-L1/CD137 YN-052 для транзиторной экспрессии. После культивирования в бессывороточной среде в течение 7 дней собирали супернатант культуры клеток и очищали с помощью колонки с протеином А для получения белка антитела. Очищенное антитело диализовали с помощью PBS и в конечном итоге количественно анализировали с помощью набора для анализа белка ВСА (Pierce, 23225).
Аминокислотная последовательность первого полипептида YN-052 приведена в SEQ ID NO: 44, и аминокислотная последовательность второго полипептида YN-052 приведена в SEQ ID NO: 34.
Аффинность связывания биспецифических антител против PD-L1/CD137 YN-051 и YN-051 с рекомбинантным белком PD-L1-His человека (Origincell Therapeutics Co., Ltd.) измеряли с помощью анализатора молекулярных взаимодействий (Octet RED384, приобретенного в Pall ForteBio Analytics Co., Ltd.). Кинетику связывания антигена-антитела анализировали с помощью технологии биослойной интерферометрии (BLI) с использованием анализатора молекулярных взаимодействий (Octet RED384, приобретенного в Pall ForteBio Analytics Co., Ltd.) и буфера PBS, содержащего 0,1% BSA и 0,02% Tween 20. Антитело в концентрации 50 нМ фиксировали на сенсоре АНС и связывали при 1500 об./мин в течение 5 мин; затем его связывали с разведенным в два раза раствором антигена (50, 25, 12,5, 6,25, 3,125, 1,56 нМ) с 7 градиентами концентрации при 1500 об./мин в течение 5 мин; и наконец подвергали диссоциации 1500 об./мин. в течение 10 мин.
Сенсор АНС регенерировали посредством импульсного введения глицина, а затем использовали повторно. Полученные результаты будут анализировать с помощью программного обеспечения Octet Data Analysis 9.0 (Pall ForteBio Analytics Co., Ltd.) для получения KD, Kon (1/Мс) и Koff (1/c). Результаты измерения аффинности связывания YN-007 с PD-L1-Fc человека приведены в табл. 10.
Таблица 10
Аффинность связывания биспецифического антитела против PD-L1/CD137 с PD-L1-His человека
| Антитело | PD-Ll-His человека | ||||||
| KD (М) | Ошибка KD | Коп (1/Мс) | Ошибка Коп | Koff(l/c) | Ошибка K0ff | Полный RA2 | |
| YN-051 | 5,17χ1Ο’10 | 4,97хЮ’12 | 5,32x10^ | 2,54х103 | 2,75x10’4 | 2,29x10’6 | 0,9981 |
| YN-052 | 5,72* 10’10 | 5,69х10'12 | 4,48 хЮ5 | 2,06х103 | 2,57х10'4 | 2,26x10-6 | 0,9984 |
Аффинность связывания биспецифических антител против PD-L1/CD137 YN-051 и YN-052 с рекомбинантным белком CD137-His человека (Origincell Therapeutics Co., Ltd.) измеряли с помощью анализатора молекулярных взаимодействий (Octet RED384, приобретенного в Pall ForteBio Analytics Co., Ltd.). Кинетику связывания антигена-антитела анализировали с помощью технологии биослойной интерферометрии (BLI) с использованием анализатора молекулярных взаимодействий (Octet RED384, приобретенного в Pall ForteBio Analytics Co., Ltd.) и буфера PBS, содержащего 0,1% BSA и 0,02% Tween 20. Антитело в концентрации 50 нМ фиксировали на сенсоре АНС и связывали при 1500 об./мин в течение 5 мин; затем его связывали с разведенным в два раза растворе антигена рекомбинантного белка CD137-His человека (100, 50, 25, 12,5, 6,25, 3,125, 1,56 нМ) при 1500 об./мин. в течение 5 мин; и наконец подвергали диссоциации 1500 об./мин в течение 10 мин. Сенсор АНС регенерировали посредством импульсного
- 42 044684 введения глицина, а затем использовали повторно. Полученные результаты будут анализировать с помощью программного обеспечения Octet Data Analysis 9.0 (Pall ForteBio Analytics Co., Ltd.) для получения KD, Kon (1/Мс) и Koff (1/с).
Результаты измерения аффинности связывания биспецифических антител против PD-L1/CD137
YN-051 и YN-052 с CD137 человека приведены в табл. 11.
Таблица 11
Аффинность связывания биспецифического антитела против PD-L1/CD137 с CD137-His человека
| Антитело | 4-lBB-His человека | ||||||
| KD (Μ) | Ошибка KD | Коп (1/Мс) | Ошибка Коп | kdis (ΙΑ) | Ошибка kdis | Полный RA2 | |
| YN-051 | 1,64х10’у | 3,93χ10-11 | 8,99χ104 | 7,25х102 | 1,47 xlO-4 | 3,33χ10’6 | 0,9981 |
| YN-052 | 2,08 xlO-9 | 4,36χ10-11 | 8,37χ104 | 6,93 хЮ2 | 1,74χ10-4 | 3,35χ10-6 | 0,9982 |
Линия клеток молочной железы человека MDA-MB-231 (Библиотека клеток Китайской академии наук в Шанхае) высоко экспрессирует молекулу PD-L1 человека. Связывание антител против PD-1 YN035, YN-036 и биспецифических антител против PD-L1/CD137 YN-051 и YN-052 с клетками MDA-MB231 определяли посредством проточной цитометрии: к 1х106/мл клеток MDA-MB-231 добавляли отдельные разведенные в два раза антитела, соответственно, тщательно смешивали и инкубировали при 4°C в течение 1 ч. После промывки клеток добавляли F(ab')2 козы против IgG-Fc человека (DyLight 650) (ab98593, Abcam) и инкубировали при 4°C в течение 30 мин. После промывки клеток, определяли интенсивность флуоресценции с помощью проточного цитометра (Intellicyt iQue Screener). Результаты эксперимента показаны на фиг. 15: все из YN-035, YN-036, YN-051 и YN-052 могут эффективно связываться с клетками MDA-MB-231.
Связывающую активность антител против PD-1 YN-035, YN-036 и биспецифических антител против PDL1/CD137 YN-051 и YN-052 с PD-L1 человека определяли посредством проточной цитометрии: к 1х106/мл клеток СНО, стабильно экспрессирующих PD-L1 человека, добавляли отдельные разведенные в два раза антитела, соответственно, тщательно смешивали и инкубировали при 4°C в течение 1 ч. После промывки клеток добавляли F(ab')2 козы против IgG-Fc человека (DyLight 650) (ab98593, Abcam) и инкубировали при 4°C в течение 30 мин. После промывки клеток, определяли интенсивность флуоресценции с помощью проточного цитометра (Intellicyt iQue Screener). Результаты эксперимента показаны на фиг. 16: все из YN-035, YN-036, YN-051, YN-052, YN-007 могут эффективно связываться с клетками СНО, экспрессирующими PD-L1 человека.
Ингибиторную способность антител против PD-1 YN-035, YN-036 и биспецифических антител против PDL1/CD137 YN-051, YN-052, YN-007 с PD-L1 человека/PD-t человека определяли посредством проточной цитометрии: белок PD-1-Fc человека метили биотином (сульфо-NHS-LC-биотином EZ-Link, Pierce, 21327). PD-1-Fc человека, меченый субнасыщенной концентрацией биотина, добавляли к 1х106/мл клеток СНО, стабильно экспрессирующих PD-L1 человека, а затем незамедлительно добавляли отдельные разведенные в два раза антитела, тщательно смешивали и инкубировали (4°C, 1 ч). После промывки клеток добавляли конъюгат стрептавидин R-PE (Life Technology, SA10041) и инкубировали (4°C, 30 мин). После промывки клеток определяли интенсивность флуоресценции с помощью проточного цитометра (Intellicyt iQue Screener). Результаты эксперимента показаны на фиг. 17: все антитела против PD-L1 YN-035, YN-036, YN-051, YN-052, YN-007 могут эффективно ингибировать связывание PD-1 человека с клетками СНО, экспрессирующими PD-L1 человека.
Связывающую активность антител против PD-1 YN-035, YN-036 и биспецифических антител против PDL1/CD137 YN-007, YN-051 и YN-052 с PD-L1 мыши определяли посредством проточной цитометрии: к 1х106/мл клеток СНО, стабильно экспрессирующих PD-L1 мыши, добавляли отдельные разведенные в два раза антитела, соответственно, тщательно смешивали и инкубировали при 4°C в течение 1 ч. После промывки клеток добавляли F(ab')2 козы против IgG-Fc человека (DyLight 650) (ab98593, Abcam) и инкубировали при 4°C в течение 30 мин. После промывки клеток определяли интенсивность флуоресценции с помощью проточного цитометра (Intellicyt iQue Screener). Результаты эксперимента показаны на фиг. 18: все из YN-035, YN-036, YN-051, YN-052, YN007 могут эффективно связываться с клетками СНО, экспрессирующими PD-L1 мыши.
Ингибиторную способность антител против PD-1 YN-035, YN-036 и биспецифических антител против PDL1/CD137 YN-007, YN-051 и YN-052 в отношении PD-L1 мыши/PD-1 мыши определяли посредством проточной цитометрии: PD-1-Fc мыши, меченый биотином (сульфо-NHS-LC-биотином EZ-Link, Pierce, 21327). PD-1-Fc мыши, меченый субнасыщенной концентрацией биотина, добавляли к 1х106/мл
- 43 044684 клеток СНО, стабильно экспрессирующих PD-L1 мыши, а затем незамедлительно добавляли отдельные разведенные в два раза антитела, тщательно смешивали и инкубировали (4°C, 1 ч). После промывки клеток добавляли конъюгат стрептавидин R-PE (Life Technology, SA10041) и инкубировали (4°C, 30 мин). После промывки клеток определяли интенсивность флуоресценции с помощью проточного цитометра (Intellicyt iQue Screener). Результаты показаны на фиг. 19: все антитела против PD-L1 YN-035, YN-036, YN-051, YN052, YN-007 могут эффективно ингибировать связывание PD-1 мыши с клетками СНО, экспрессирующими PD-L1 мыши.
Связывающую активность антитела против CD137 YN-006 и биспецифических антител против PDL1/CD137 YN-007, YN-051 и YN-052 в отношении CD137 человека определяли посредством проточной цитометрии: к 1х106/мл клеток 293Т, стабильно экспрессирующих CD137 человека, добавляли отдельные разведенные в два раза антитела, соответственно, тщательно смешивали и инкубировали при 4хС в течение 1 ч. После промывки клеток добавляли F(ab')2 козы против IgG-Fc человека (DyLight 650) (ab98593, Abcam) и инкубировали при 4°C в течение 30 мин. После промывки клеток определяли интенсивность флуоресценции с помощью проточного цитометра (Intellicyt iQue Screener). Результаты эксперимента показаны на фиг. 20: все из YN-006, YN-007, YN-051 и YN-052 могут эффективно связываться с клетками 293Т, экспрессирующими CD137 человека.
Пример 18. Анализ электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) в присутствии SDS.
После очистки, как описано выше, измеряли молекулярные массы антител YN-003, YN-006, YN007, YN-035, YN-036, YN-051, YN-052 посредством электрофореза в ПААГ с SDS в восстановительных и невосстановительных условиях. Результаты показаны на фиг. 21: в невосстановительных условия (как показано на фиг. 21а) все из моноклональных антител YN-003, YN006, YN-035 и YN-036 выглядели как полоса с молекулярной массой приблизительно 150 кДа, в то время как все из биспецифических антител YN-007, YN -051, YN-052 выглядели как полоса с молекулярной массой приблизительно 200 кДа. В восстановительных условиях (как показано на фиг. 21b) все из моноклональных антител YN-003, YN006, YN-035 и YN-036 выглядели как две полосы с молекулярной массой приблизительно 55кДа и 25кДа, в то время как все из биспецифических антител YN-007, YN-051, YN-052 выглядели как две полосы с молекулярной массой приблизительно 75 и 25 кДа.
Пример 19. Агонистическая активность биспецифического антитела против PD-L1/CD137 (анализ активности люциферазы).
Получали клетки 293Т, экспрессирующие CD137 человека, и в которые стабильно встроен репортерный ген NFKB-люциферазы. Клетки собирали, промывали и ресуспендировали в полной среде без фенолового красного (среде DMEM, содержащей 10% эмбриональную телячью сыворотку, буфер HEPES, заменимые аминокислоты и L-глутамин) при плотности 6х105 клеток/мл. Использовали 96луночные планшеты (приобретенные в PerkinElmer) и в каждую лунку добавляли 50 мкл суспензии клеток. Добавляли перекрестно-сшитое антитело (антитело козы против IgG Fc человека) в соотношении 2,5:1, затем добавляли YN-006 (10 мкг/мл), YN-035 (10 мкг/мл), YN-035+YN-006 (10 мкг/мл+10 мкг/мл), YN-051 (10 мкг/мл), YN-003+YN006 (10 мкг/мл+10 мкг/мл), YN-007 (10 мкг/мл) и контрольное антитело IgG Fc (10 мкг/мл), соответственно, и инкубировали при 37°C в течение 5 ч. Затем добавляли 75 мкл реагента люциферазы Bright-Glo (приобретенного в Promega) и измеряли активность люциферазы с использованием спектрофотометра для чтения микропланшетов (приобретенного в Тесап). Сравнивали соотношения значений флуоресценции из каждой группы обработанных антителом клеток с группой необработанных антителом клеток (см. фиг. 22). Результаты показали, что по сравнению с контрольным IgG Fc, все из YN-006, YN035+YN006, YN003+YN006, YN-007, YN-051 имели очевидную агонистическую активность, в то время как антитело против PD-L1 YN-035 не имело ее (см. фиг. 22).
Пример 20. Исследования противоопухолевого эффекта биспецифического антитела против PDL1/CD137 у мышей, несущих рак толстого кишечника.
В день 0 самкам мышей C57BL/6 возрастом 6-8 недель с 4-1ВВ человека (мышей B-hTNFRSF9 (41BB), приобретенных в Beijing Biocytogen Co., Ltd.) подкожно инокулировали 3х106 клеток колоректального рака мыши МС38 (Shanghai Linyuan Biotechnology Co., Ltd.). В день 6 мышей равномерно разделяли на 8 групп. Несущим опухоли мышам в каждой группе интраперитонеально инъецировали PBS (дважды в неделю, всего две недели), контрольное антитело IgG-Fc человека (7,5 мг/кг, дважды в неделю, всего две недели), антитело против CD137 YN-006 (3 мг/кг, дважды в неделю, всего две недели), антитело против PD-L1 YN-035 (7,5 мг/кг, дважды в неделю, всего две недели), антитело против CD137 YN-006 (3 мг/кг, дважды в неделю, всего две недели) + антитело против PD-L1 YN-035 (7,5 мг/кг, дважды в неделю, всего две недели), биспецифическое антитело против PDL1/CD137 YN-051 (7,5 мг/кг, дважды в неделю, всего две недели), антитело против PD-L1 атезолизумаб (7,5 мг/кг, дважды в неделю, всего две недели) и антитело против PD-L1 авелумаб (7,5 мг/кг, дважды в неделю, всего две недели), соответственно. За исключением группы PBS, включавшей 5 мышей, каждая из остальных 7 групп включала 6 мышей. Мышей в каждой группе регулярно обследовали на предмет изменения массы тела и размера опухоли. Результаты эксперимента показаны на фиг. 23 и в табл. 12. На фиг. 23 показано, что все из YN006, YN035, YN006+YN035, YN051, атезолизумаба и авелумаба имели значительную противоопухолевую активность
- 44 044684 по сравнению с группой PBS или группой контрольного антитела IgG-Fc человека. Среди них, противоопухолевая активность YN006+YN035 и YN051 была значительно выше, чем у YN006, YN035, атезолизумаба и авелумаба. В табл. 12 показано, что к концу эксперимента на животных у 5 мышей в группе YN051 опухоли полностью регрессировали, в то время как только у 1 мыши в группе YN006+YN035 опухоли полностью регрессировали, что свидетельствует о том, что терапевтический эффект YN051 был лучше, чем у YN006+YN035.
Таблица 12 Количество мышей в каждой группе, у которых опухоли полностью исчезли
| Антитело | Количество мышей, у которых опухоли полностью исчезли/общее количество экспериментальных животных в |
| каждой группе | |
| PBS | 0/5 |
| IgGl-Fc человека | 0/6 |
| Атезолизумаб | 0/6 |
| Авелумаб | 0/6 |
| YN-006 | 0/6 |
| YN-035 | 1/6 |
| YN-006+YN-035 | 1/6 |
| YN-051 | 5/6 |
Изложенное выше подробное описание представлено в виде объяснения и примеров и не предназначено для ограничения объема формулы изобретения. В настоящее время различные изменения вариантов осуществления, приведенных в настоящем описании, очевидны специалистам в этой области и входят в объем формулы изобретения и ее эквивалентов.
Claims (11)
- (1) LCDR1: SEQ ID NO: 54, LCDR2: SEQ ID NO: 60, LCDR3: SEQ ID NO: 63, HCDR1: SEQ ID NO: 46, HCDR2: SEQ ID NO: 48 и HCDR3: SEQ ID NO: 50;1. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, способный связываться с белком PD-L1, содержащее вариабельную область легкой цепи VL, которая содержит LCDR1-3, и вариабельную область тяжелой цепи VH, которая содержит HCDR1-3, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит аминокислотные последовательности, выбранные из любой из следующих групп:
- 2. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1, где указанная вариабельная область тяжелой цепи VH содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 31 и SEQ ID NO: 35, и указанная вариабельная область легкой цепи VL содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39 и SEQ ID NO: 41.(2) LCDR1: SEQ ID NO: 55, LCDR2: SEQ ID NO: 60, LCDR3: SEQ ID NO: 64, HCDR1: SEQ ID NO: 47, HCDR2: SEQ ID NO: 48 и HCDR3: SEQ ID NO: 51;
- 3. Биспецифическое антитело, содержащее первый нацеливающий фрагмент, который специфически связывается с белком PD-L1, и второй нацеливающий фрагмент, который специфически связывается с белком CD137, где указанный первый нацеливающий фрагмент содержит антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1, 2.(3) LCDR1: SEQ ID NO: 55, LCDR2: SEQ ID NO: 60, LCDR3: SEQ ID NO: 64, HCDR1: SEQ ID NO: 47, HCDR2: SEQ ID NO: 48 и HCDR3: SEQ ID NO: 52;
- 4. Биспецифическое антитело по п.3, где указанный второй нацеливающий фрагмент содержит антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который содержит вариабельную область легкой цепи VL, которая содержит LCDR1-3, где аминокислотные последовательности указанных LCDR1-3 последовательно приведены в SEQ ID NO: 80-82.(4) LCDR1: SEQ ID NO: 56, LCDR2: SEQ ID NO: 61, LCDR3: SEQ ID NO: 64, HCDR1: SEQ ID NO: 47, HCDR2: SEQ ID NO: 48 и HCDR3: SEQ ID NO: 52;
- 5. Биспецифическое антитело по п.4, где указанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент из второго нацеливающего фрагмента содержит вариабельную область тяжелой цепи VH, содер-- 45 044684 жащую HCDR1-3, где аминокислотные последовательности указанных HCDR1-3 последовательно приведены в SEQ ID NO: 77-79.(5) LCDR1: SEQ ID NO: 57, LCDR2: SEQ ID NO: 61, LCDR3: SEQ ID NO: 64, HCDR1: SEQ ID NO: 47, HCDR2: SEQ ID NO: 48 и HCDR3: SEQ ID NO: 52; и (6) LCDR1: SEQ ID NO: 58, LCDR2: SEQ ID NO: 61, LCDR3: SEQ ID NO: 64, HCDR1: SEQ ID NO: 47, HCDR2: SEQ ID NO: 48 и HCDR3: SEQ ID NO: 52.
- 6. Биспецифическое антитело по любому из пп.4, 5, где указанное антитело, связывающееся с белком CD137, содержит scFv, и указанный scFv содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 83.
- 7. Биспецифическое антитело по любому из пп.5, 6, содержащее первую полипептидную цепь и вторую полипептидную цепь, где указанная первая полипептидная цепь содержит указанную вариабельную область тяжелой цепи антитела, связывающегося с белком PD-L1, указанную вариабельную область тяжелой цепи антитела, связывающегося с белком CD137, и указанную вариабельную область легкой цепи антитела, связывающегося с белком CD137; и указанная вторая полипептидная цепь содержит указанную вариабельную область легкой цепи антитела, связывающегося с белком PD-L1.
- 8. Биспецифическое антитело по п.7, где в указанной первой полипептидной цепи указанная вариабельная область тяжелой цепи антитела, связывающегося с белком PD-L1, находится на N-конце указанной вариабельной области тяжелой цепи антитела, связывающегося с белком CD137, и указанная вариабельная область тяжелой цепи антитела, связывающегося с белком CD137, находится на N-конце указанной вариабельной области легкой цепи антитела, связывающегося с белком CD137; альтернативно, указанная вариабельная область тяжелой цепи антитела, связывающегося с белком PD-L1, находится на Nконце указанной вариабельной области легкой цепи антитела, связывающегося с белком CD 137, и указанная вариабельная область легкой цепи антитела, связывающегося с белком CD137, находится на Nконце указанной вариабельной области тяжелой цепи антитела, связывающегося с белком CD137.
- 9. Биспецифическое антитело по любому из пп.3-8, где указанная первая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 43, и указанная вторая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 34.
- 10. Фармацевтическая композиция, содержащая антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1, 2 или биспецифическое антитело по любому из пп.3-9 и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.
- 11. Применение антитела, или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1, 2 или биспецифического антитела по любому из пп.3-9, или указанной фармацевтической композиции по п.10 в производстве лекарственного средства для лечения опухолей.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201810309302.5 | 2018-04-09 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA044684B1 true EA044684B1 (ru) | 2023-09-22 |
Family
ID=
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP7488323B2 (ja) | 抗ｌａｇ－３抗体および組成物 | |
| JP6875385B2 (ja) | 抗ｐｄ−１抗体および組成物 | |
| US11993655B2 (en) | Anti-PD-L1 antibody and use thereof | |
| WO2016197497A1 (zh) | 一种抗pd-1的单克隆抗体及其获得方法 | |
| JP2020504627A (ja) | 抗ｐｄ−１抗体及びその使用 | |
| KR20190029641A (ko) | 항-pd-1 항체, 이의 생산 방법 및 사용 방법 | |
| RU2755150C2 (ru) | Гуманизированные антитела против базигина и их применение | |
| US20210284734A1 (en) | Anti-pd-1 antibodies and compositions | |
| KR20220167331A (ko) | 항-flt3 항체 및 조성물 | |
| US20210261677A1 (en) | Anti-pd-l1 antibody and use thereof | |
| EA044684B1 (ru) | Антитело против pd-l1 и его применение | |
| WO2023001025A1 (zh) | Pd-l1抗体及其用途 | |
| WO2023284741A1 (zh) | Pd-1抗体及其用途 | |
| CN113004416B (zh) | 靶向her2-cd137双特异性抗体的构建及其应用 | |
| WO2023174396A1 (zh) | 一种新型免疫调节剂的开发和应用 |