JP2024503393A - 抗ｐｄ－ｌ１／抗４－１ｂｂ天然抗体構造様ヘテロダイマー二重特異性抗体及びその製造方法 - Google Patents

抗ｐｄ－ｌ１／抗４－１ｂｂ天然抗体構造様ヘテロダイマー二重特異性抗体及びその製造方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、抗ＰＤ－Ｌ１／抗４－１ＢＢ天然抗体構造様ヘテロダイマー二重特異性抗体及びその製造方法を提供する。具体的に、天然ＩｇＧの構造特徴を有し、且つ重鎖－軽鎖のミスマッチがない、非常に安定な抗ＰＤ－Ｌ１／抗４－１ＢＢヘテロダイマー二重特異性抗体及びその製造方法を提供し、この二重特異性抗体は、２種類のターゲット分子と同時に結合することができ、複雑な疾患を治療する面で、より優れた効果を有し、且つ副作用がより小さい。

Description

本発明は、抗ＰＤ－Ｌ１／抗４－１ＢＢ天然抗体構造様ヘテロダイマー二重特異性抗体及びその製造方法に関する。具体的には、本発明は、天然ＩｇＧの特徴を有し、且つ重鎖－軽鎖のミスマッチがない、非常に安定なヘテロダイマー抗ＰＤ－Ｌ１／抗４－１ＢＢ二重特異性抗体及びその製造方法を提供する。
プログラム細胞死リガンド－１（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｄｅａｔｈ ｌｉｇａｎｄ １、ＰＤ－Ｌ１）は、免疫チェックポイントであるプログラム細胞死－１（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｄｅａｔｈ－１、ＰＤ－１）のリガンドであり、Ｂ７ファミリーに属しており、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単核細胞、マクロファージ、ＤＣ細胞、内皮細胞、表皮細胞などを含む多種の免疫細胞の表面に誘導的に発現する。ＰＤ－Ｌ１は、ＰＤ－１と結合すると、主にＴ細胞の活性化の負の調節に関与し、免疫応答の強弱及び持続時間を調節することができる。ＰＤ－Ｌ１は、ＰＤ－１のリガンドに加えて、ＣＤ８０のリガンドとして、Ｔ細胞へ負の調節のシグナルを伝達し、Ｔ細胞の免疫寛容を誘導することができる（Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ Ｒｅｖ， ２０１３， １２（１１）：１０９１－１１００．Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ， ２０１３， ４：４８１．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ， ２０１２， １２（４）：２５２－２６４．Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｏｌ Ｍｅｄ．２０１５ Ｊａｎ；２１（１）：２４－３３．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１２ Ｄｅｃ １５；１８（２４）：６５８０－７．）。通常の場合、ＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－１は、生体組織の自己免疫寛容を誘導及び維持し、炎症反応の過程において免疫系が過度に活性化して自己組織を傷つけることを防止し、自己免疫疾患の発生を避けるのに積極的な作用を有することができる。病理的状況では、それは、腫瘍免疫及び多種の自己免疫疾患の発生及び発展過程に関与する。多くの研究によると、ＰＤ－Ｌ１は多種の腫瘍組織で高発現し、ＰＤ－１は腫瘍浸潤リンパ球で高発現し、且つＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－１の過剰な発現は臨床的な腫瘍の予後不良と密接に関連することが報告された（Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ａｇｅｎｔｓ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ．２０１５；１５（３）：３０７－１３．Ｈｅｍａｔｏｌ Ｏｎｃｏｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｈｅｒ．２０１４ Ｍａｒ；７（１）：１－１７．Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｏｌ Ｍｅｄ．２０１５ Ｊａｎ；２１（１）：２４－３３．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．２０１３ Ｊｕｌ ２５；３９（１）：６１－７３．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．２０１５ Ｊｕｎ １０；３３（１７）：１９７４－８２．）。ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体による、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１及びＣＤ８０／ＰＤ－Ｌ１の相互作用へのブロッキングは、臨床前の実験研究及び臨床において良好な抗腫瘍効果を示した。現在、ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体は、既に非小細胞肺癌や尿路上皮癌などの多くの腫瘍の治療に用いられることが承認されている。
４－１ＢＢ（ＣＤ１３７、ＴＮＦＲＳＦ９などとも称される）は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳ）の膜貫通型タンパク質の一つである。４－１ＢＢは、ＤＣ、活性化された単核細胞、ＮＫ細胞、好中球、好酸球及び肥満細胞上に発現する。４－１ＢＢＬ（ＣＤ１３７Ｌ）は、ＴＮＦスーパーファミリーの糖タンパク質メンバーであり、主に活性化されたＢ細胞、マクロファージ、樹状細胞、骨髄系細胞上に発現する。４－１ＢＢは、ＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞であり、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫ（Ｔ）細胞）、Ｂ細胞及び好中球での共刺激分子である。４－１ＢＢが４－１ＢＢＬと結合すると、細胞内のシグナル経路が活性化される。研究の結果から明らかなように、いくつかの４－１ＢＢアゴニストｍＡｂは、多くのモデルで共刺激分子の発現を増加させるとともに、細胞溶解性Ｔリンパ球の応答を顕著に増強させ、抗腫瘍効果を引き起こす。
そこで、当分野ではＰＤ－Ｌ１及び４－１ＢＢのシグナル経路を同時にブロッキングする新規治療薬を研究する必要がある。
本発明は、天然ＩｇＧの構造特徴を有し、且つ重鎖－軽鎖のミスマッチがない、ＰＤ－Ｌ１及び４－１ＢＢを同時にブロッキングすることができる、非常に安定な新規ヘテロダイマー二重機能性抗体及びその製造方法を提供し、この二重機能性抗体は、ＰＤ－Ｌ１及び４－１ＢＢを同時に高発現させる腫瘍細胞と選択的に結合する傾向があり、これにより、効率的且つ特異的な殺傷効果を発揮するとともに、毒性の低い副作用を有する。
本発明の第１の態様は、ＰＤ－Ｌ１と特異的に結合する第１の抗原結合機能領域及び４－１ＢＢと特異的に結合する第２の抗原結合機能領域を含む二重特異性抗体に関し、ここで、前記ＰＤ－Ｌ１と特異的に結合する第１の抗原結合機能領域は、
（Ａ）重鎖可変領域と、
（Ｂ）軽鎖可変領域と、を含み、
前記重鎖可変領域は、
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５に示すアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１と、
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６に示すアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２と、
（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７に示すアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３と、を含み、
前記軽鎖可変領域は、
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８に示すアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１と、
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９に示すアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２と、
（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０に示すアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３と、を含む。
いくつかの実施形態において、前記二重特異性抗体の４－１ＢＢと特異的に結合する第２の抗原結合機能領域は、
（Ａ）重鎖可変領域と、
（Ｂ）軽鎖可変領域と、を含み、
前記重鎖可変領域は、
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１に示すアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１と、
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２に示すアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２と、
（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３に示すアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３と、を含み、
前記軽鎖可変領域は、
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４に示すアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１と、
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５に示すアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２と、
（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６に示すアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３と、を含む。
いくつかの実施形態において、前記二重特異性抗体のＰＤ－Ｌ１と特異的に結合する第１の抗原結合機能領域は、
（Ａ）重鎖可変領域と、
（Ｂ）軽鎖可変領域と、を含み
前記重鎖可変領域は、
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５に示すアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１と、
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６に示すアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２と、
（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７に示すアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３と、を含み、
前記軽鎖可変領域は、
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８に示すアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１と、
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９に示すアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２と、
（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０に示すアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３と、を含み、
前記４－１ＢＢと特異的に結合する第２の抗原結合機能領域は、
（Ａ）重鎖可変領域と、
（Ｂ）軽鎖可変領域と、を含み、
前記重鎖可変領域は、
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１に示すアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１と、
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２に示すアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２と、
（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３に示すアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３と、を含み、
前記軽鎖可変領域は、
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４に示すアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１と、
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５に示すアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２と、
（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６に示すアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３と、を含む。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１５－２０に示すＰＤ－Ｌ１と特異的に結合する第１の抗原結合機能領域の６つのＣＤＲ配列及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２１－２６に示す４－１ＢＢと特異的に結合する第２の抗原結合機能領域の６つのＣＤＲ配列は、それぞれ本発明者がヒトＰＤ－Ｌ１と４－１ＢＢを抗原として、ハイブリドーマ技術を用いて得られたモノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖可変領域のＣＤＲであり、前記モノクローナル抗体は、従来技術で知られているＰＤ－Ｌ１抗体及び４－１ＢＢ抗体と異なり、且つ、例えばより高い結合特異性、抗腫瘍活性などのより高い生物学的活性を有する。
ＰＤ－Ｌ１と特異的に結合する第１の抗原結合機能領域の６つのＣＤＲ配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１５－２０に示す配列と少なくとも７０％の同一性、例えば少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又はそれ以上の同一性を有し、且つ対応する親配列の生物学的活性を保持し、又は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１５－２０に示す配列に対して、１つ又は複数、例えば１個、２個、３個又はそれ以上のアミノ酸残基を削除、置換及び／又は添加して得られた、対応する親配列の生物学的活性を保持したものである。
４－１ＢＢと特異的に結合する第２の抗原結合機能領域の６つのＣＤＲ配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２１－２６に示す配列と少なくとも７０％の同一性、例えば少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又はそれ以上の同一性を有し、且つ対応する親配列の生物学的活性を保持し、又は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２１－２６に示す配列に対して、１つ又は複数、例えば１個、２個、３個又はそれ以上のアミノ酸残基を削除、置換及び／又は添加して得られた、対応する親配列の生物学的活性を保持したものである。
いくつかの実施形態において、前記二重特異性抗体のＰＤ－Ｌ１と特異的に結合する第１の抗原結合機能領域は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示すアミノ酸配列を含むものであるか、又は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．６に示す配列と少なくとも７０％の同一性、例えば少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の同一性を有し、且つ対応する親配列の生物学的活性を保持しているものであるか、又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６に示す配列に対して、１つ又は複数、例えば１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個又はそれ以上のアミノ酸残基を削除、置換及び／又は添加して得られた、対応する親配列の生物学的活性を保持した変異体配列である。前記軽鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示すアミノ酸配列を含むものであるか、又は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２に示す配列と少なくとも７０％の同一性、例えば少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の同一性を有し、且つ対応する親配列の生物学的活性を保持しているものであるか、又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示す配列に対して、１つ又は複数、例えば１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個又はそれ以上のアミノ酸残基を削除、置換及び／又は添加して得られた、対応する親配列の生物学的活性を保持した変異体配列である。
いくつかの実施形態において、前記二重特異性抗体の４－１ＢＢと特異的に結合する第２の抗原結合機能領域は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示すアミノ酸配列を含むものであるか、又は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１２に示す配列と少なくとも７０％の同一性、例えば少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の同一性を有し、且つ対応する親配列の生物学的活性を保持しているものであるか、又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１２に示す配列に対して、１つ又は複数、例えば１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個又はそれ以上のアミノ酸残基を削除、置換及び／又は添加して得られた、対応する親配列の生物学的活性を保持した変異体配列である。前記軽鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示すアミノ酸配列を含むものであるか、又は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１０に示す配列と少なくとも７０％の同一性、例えば少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の同一性を有し、且つ対応する親配列の生物学的活性を保持しているものであるか、又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０に示す配列に対して、１つ又は複数、例えば１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個又はそれ以上のアミノ酸残基を削除、置換及び／又は添加して得られた、対応する親配列の生物学的活性を保持した変異体配列である。
いくつかの実施形態において、前記二重特異性抗体のＰＤ－Ｌ１と特異的に結合する第１の抗原結合機能領域は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示すアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示すアミノ酸配列を含む。また、４－１ＢＢと特異的に結合する前記第２の抗原結合機能領域は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示すアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示すアミノ酸配列を含む。
前記アミノ酸配列の組み合わせ方式は、生物学的法則に従うべきであり、即ち、軽鎖及び重鎖又は軽鎖及び重鎖の可変領域と抗原結合フラグメントが互いに合致すべきであり、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２とが互いに合致し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０とが互いに合致することは当業者に明らかである。
いくつかの実施形態において、前記二重特異性抗体の第１の抗原結合機能領域及び第２の抗原結合機能領域は、Ｆａｂフラグメント、ｓｃＦｖフラグメント及び可変ドメインフラグメントＦｖから選ばれる。
いくつかの実施形態において、前記二重特異性抗体の第１の抗原結合機能領域及び第２の抗原結合機能領域は、いずれもＦａｂフラグメントである。
いくつかの実施形態において、前記二重特異性抗体のＦａｂフラグメントは、異なる第１の重鎖可変領域及び第２の重鎖可変領域と、異なる第１の軽鎖可変領域及び第２の軽鎖可変領域と、を含む。
いくつかの実施形態において、前記二重特異性抗体の第１の抗原結合機能領域及び第２の抗原結合機能領域の一方は、Ｆａｂフラグメントであり、他方は、ｓｃＦｖである。
いくつかの実施形態において、前記二重特異性抗体は、第１のＦｃ鎖及び第２のＦｃ鎖と、ＰＤ－Ｌ１と特異的に結合できる第１の抗原結合機能領域及び４－１ＢＢと特異的に結合できる第２の抗原結合機能領域と、を含む。
ここで、前記第１のＦｃ鎖及び第２のＦｃ鎖は、いずれもアミノ酸の置換を含む免疫グロブリンＧのＦｃフラグメントであり、且つ、前記第１のＦｃ鎖と第２のＦｃ鎖は、共に、Ｆｃ受容体と結合できるヘテロダイマーを構成する。
ここで、前記第１のＦｃ鎖と第２のＦｃ鎖は、共有結合又はリンカーを介して前記第１の抗原結合機能領域と第２の抗原結合機能領域にそれぞれ連結されている。
且つ、前記第１のＦｃ鎖及び第２のＦｃ鎖のいずれか一方は、位置３６６及び位置３９９でのアミノ酸の置換を含み、他方は、位置３５１、位置４０７及び位置４０９でのアミノ酸の置換を含み、ここで、アミノ酸の位置は、Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスナンバリングシステムに従って番号付けされる。
いくつかの実施形態において、前記二重特異性抗体の第１のＦｃ鎖及び第２のＦｃ鎖のアミノ酸の置換は、以下の通りである。
ａ）Ｌ３５１Ｇ、Ｌ３５１Ｙ、Ｌ３５１Ｖ、Ｌ３５１Ｐ、Ｌ３５１Ｄ、Ｌ３５１Ｅ、Ｌ３５１Ｋ又はＬ３５１Ｗ；
ｂ）Ｔ３６６Ｌ、Ｔ３６６Ｐ、Ｔ３６６Ｗ又はＴ３６６Ｖ；
ｃ）Ｄ３９９Ｃ、Ｄ３９９Ｎ、Ｄ３９９Ｉ、Ｄ３９９Ｇ、Ｄ３９９Ｒ、Ｄ３９９Ｔ又はＤ３９９Ａ；
ｄ）Ｙ４０７Ｌ、Ｙ４０７Ａ、Ｙ４０７Ｐ、Ｙ４０７Ｆ、Ｙ４０７Ｔ又はＹ４０７Ｈ；及び
ｅ）Ｋ４０９Ｃ、Ｋ４０９Ｐ、Ｋ４０９Ｓ、Ｋ４０９Ｆ、Ｋ４０９Ｖ、Ｋ４０９Ｑ又はＫ４０９Ｒ。
いくつかの実施形態において、前記二重特異性抗体のアミノ酸の置換は、以下のものを含む。
ａ）第１のＦｃ鎖及び第２のＦｃ鎖のいずれか一方は、Ｔ３６６Ｌ及びＤ３９９Ｒの置換であり、他方は、Ｌ３５１Ｅ、Ｙ４０７Ｌ及びＫ４０９Ｖの置換である；
ｂ）第１のＦｃ鎖及び第２のＦｃ鎖のいずれか一方は、Ｔ３６６Ｌ及びＤ３９９Ｃの置換であり、他方は、Ｌ３５１Ｇ、Ｙ４０７Ｌ及びＫ４０９Ｃの置換である；
ｃ）第１のＦｃ鎖及び第２のＦｃ鎖のいずれか一方は、Ｔ３６６Ｌ及びＤ３９９Ｃの置換であり、他方は、Ｌ３５１Ｙ、Ｙ４０７Ａ及びＫ４０９Ｐの置換である；
ｄ）第１のＦｃ鎖及び第２のＦｃ鎖のいずれか一方は、Ｔ３６６Ｐ及びＤ３９９Ｎの置換であり、他方は、Ｌ３５１Ｖ、Ｙ４０７Ｐ及びＫ４０９Ｓの置換である；
ｅ）第１のＦｃ鎖及び第２のＦｃ鎖のいずれか一方は、Ｔ３６６Ｗ及びＤ３９９Ｇの置換であり、他方は、Ｌ３５１Ｄ、Ｙ４０７Ｐ及Ｋ４０９Ｓの置換である；
ｆ）第１のＦｃ鎖及び第２のＦｃ鎖のいずれか一方は、Ｔ３６６Ｐ及びＤ３９９Ｉの置換であり、他方は、Ｌ３５１Ｐ、Ｙ４０７Ｆ及びＫ４０９Ｆの置換である；
ｇ）第１のＦｃ鎖及び第２のＦｃ鎖のいずれか一方は、Ｔ３６６Ｖ及びＤ３９９Ｔの置換であり、他方は、Ｌ３５１Ｋ、Ｙ４０７Ｔ及びＫ４０９Ｑの置換である；
ｈ）第１のＦｃ鎖及び第２のＦｃ鎖のいずれか一方は、Ｔ３６６Ｌ及びＤ３９９Ａの置換であり、他方は、Ｌ３５１Ｗ、Ｙ４０７Ｈ及びＫ４０９Ｒの置換である。
いくつかの実施形態において、前記二重特異性抗体のアミノ酸の置換は、以下のものを含む。
ａ）第１のＦｃ鎖及び第２のＦｃ鎖のいずれか一方は、Ｔ３６６Ｌ及びＫ４０９Ｖの置換であり、他方は、Ｌ３５１Ｅ、Ｙ４０７Ｌ及びＤ３９９Ｒの置換である；
ｂ）第１のＦｃ鎖及び第２のＦｃ鎖のいずれか一方は、Ｔ３６６Ｌ及びＫ４０９Ｃの置換であり、他方は、Ｌ３５１Ｇ、Ｙ４０７Ｌ及びＤ３９９Ｃの置換である；
ｃ）第１のＦｃ鎖及び第２のＦｃ鎖のいずれか一方は、Ｔ３６６Ｌ及びＫ４０９Ｐの置換であり、他方は、Ｌ３５１Ｙ、Ｙ４０７Ａ及びＤ３９９Ｃの置換である；
ｄ）第１のＦｃ鎖及び第２のＦｃ鎖のいずれか一方は、Ｔ３６６Ｐ及びＫ４０９Ｓの置換であり、他方は、Ｌ３５１Ｖ、Ｙ４０７Ｐ及びＤ３９９Ｎの置換である；
ｅ）第１のＦｃ鎖及び第２のＦｃ鎖のいずれか一方は、Ｔ３６６Ｗ及びＫ４０９Ｓの置換であり、他方は、Ｌ３５１Ｄ、Ｙ４０７Ｐ及びＤ３９９Ｇの置換である；
ｆ）第１のＦｃ鎖及び第２のＦｃ鎖のいずれか一方は、Ｔ３６６Ｐ及びＫ４０９Ｆの置換であり、他方は、Ｌ３５１Ｐ、Ｙ４０７Ｆ及びＤ３９９Ｉの置換である；
ｇ）第１のＦｃ鎖及び第２のＦｃ鎖のいずれか一方は、Ｔ３６６Ｖ及びＫ４０９Ｑの置換であり、他方は、Ｌ３５１Ｋ、Ｙ４０７Ｔ及びＤ３９９Ｔの置換である；
ｈ）第１のＦｃ鎖及び第２のＦｃ鎖のいずれか一方は、Ｔ３６６Ｌ及びＫ４０９Ｒの置換であり、他方は、Ｌ３５１Ｗ、Ｙ４０７Ｈ及びＤ３９９Ａの置換である。
いくつかの実施形態において、前記二重特異性抗体の第１のＦｃ鎖及び第２のＦｃ鎖のいずれか一方のアミノ酸の置換は、Ｔ３６６Ｌ及びＤ３９９Ｒであり、他方のアミノ酸の置換は、Ｌ３５１Ｅ、Ｙ４０７Ｌ及びＫ４０９Ｖである。
いくつかの実施形態において、前記二重特異性抗体の第１のＦｃ鎖及び共有結合を介してそれに連結された第１の抗原結合機能領域並びに第２のＦｃ鎖及び共有結合を介してそれに連結された第２の抗原結合機能領域は、還元剤が存在する溶液中において、且つ、前記溶液中に前記第１のＦｃ鎖及び共有結合を介してそれに連結された第１の抗原結合機能領域と第２のＦｃ鎖及び共有結合を介してそれに連結された第２の抗原結合機能領域以外のポリペプチドが含まれていない場合、形成されたホモダイマーのすべてのポリペプチド鎖に基づく重量割合が、５０％未満、例えば４５％未満、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満又はそれ以下である。
いくつかの実施形態において、前記二重特異性抗体は、ＰＤ－Ｌ１と特異的に結合する第１の重鎖／第１の軽鎖のペアを含み、ここで、前記第１の重鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示すアミノ酸配列を含む重鎖定常領域と、を有する。前記第１の軽鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示すアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示すアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域と、を有する。
いくつかの実施形態において、前記二重特異性抗体は、４－１ＢＢと特異的に結合する第２の重鎖／第２の軽鎖のペアを含み、ここで、前記第２の重鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３に示すアミノ酸配列を含む重鎖定常領域と、を有する。前記第１の軽鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示すアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示すアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域と、を含む。
本発明の第２の態様は、前述したようなヘテロダイマー二重特異性抗体をコードする単離されたポリヌクレオチドに関する。
いくつかの実施形態において、第１の抗原結合機能領域のアミノ酸をコードするヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１及び５のヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態において、第２の抗原結合機能領域のアミノ酸をコードするヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１及び９のヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態において、第１の軽鎖及び第２の軽鎖のアミノ酸をコードするヌクレオチド配列は、いずれもＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態において、第１の重鎖及び第２の重鎖のいずれか一方のアミノ酸をコードするヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７のヌクレオチド配列を含み、他方のものをコードするヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３のヌクレオチド配列を含む。
本発明の第３の態様は、前述したような単離されたポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクターに関する。
いくつかの実施形態において、発現ベクターは、ｐＣＤＮＡに基づく改変により得られるプラスミドベクターＸ０ＧＣである。
本発明の第４の態様は、前述したような単離されたポリヌクレオチド又は前述したような組換え発現ベクターを含む宿主細胞に関する。
いくつかの実施形態において、前記宿主細胞は、ヒト胚性腎臓細胞ＨＥＫ２９３又はＨＥＫ２９３細胞に基づく改変により得られるＨＥＫ２９３Ｔ、ＨＥＫ２９３Ｅ、ＨＥＫ２９３Ｆ、ハムスター卵巣細胞ＣＨＯ又はＣＨＯ細胞に基づく改変により得られるＣＨＯ－Ｓ、ＣＨＯ－ｄｈｆｒ－、ＣＨＯ／ＤＧ４４、ＥｘｐｉＣＨＯ、大腸菌又は大腸菌に基づく改変により得られる大腸菌ＢＬ２１、ＢＬ２１（ＤＥ３）、Ｒｏｓｅｔｔａ、Ｏｒｉｇａｍｉ、酵母菌又は酵母に基づく改変により得られるピキア・パストリス、サッカロマイセス・セレビシエ、クルイベロマイセス・ラクティス、ハンセヌラ・ポリモルファ、昆虫細胞又は昆虫細胞に基づく改変により得られる細胞Ｈｉｇｈ５、ＳＦ９、植物細胞、哺乳動物の乳腺細胞、体細胞から選ばれる。
本発明の第５の態様は、前述したような二重特異性抗体又は前述したような単離されたポリヌクレオチド又は前述したような組換え発現ベクター又は前述したような宿主細胞、及び薬学的に許容される担体を含む組成物に関する。さらなる実施形態において、前記組成物は、少なくとも１種の第２の治療剤をさらに含み、好ましくは、前記第２の治療剤と、前記二重特異性抗体、単離されたポリヌクレオチド、組換え発現ベクター又は宿主細胞とは、前記組成物の異なる部分にあり、好ましくは、第２の治療剤は、抗ＰＤ－１抗体及び／又はＳＴＩＮＧアゴニストである。
本発明の第６の態様は、以下のステップを含む前述したような二重特異性抗体を生産する方法に関する。
１）宿主細胞において前述したような単離されたポリヌクレオチド又は前述したような組換え発現ベクターをそれぞれ発現させるステップと、
２）宿主細胞においてそれぞれ発現されたタンパク質を還元するステップと、
３）還元されたタンパク質を混合した後、混合物を酸化するステップと、を含む。
いくつかの実施形態において、宿主細胞は、ヒト胚性腎臓細胞ＨＥＫ２９３又はＨＥＫ２９３細胞に基づく改変により得られるＨＥＫ２９３Ｔ、ＨＥＫ２９３Ｆ、ＨＥＫ２９３Ｆ、ハムスター卵巣細胞ＣＨＯ又はＣＨＯ細胞に基づく改変により得られるＣＨＯ－Ｓ、ＣＨＯ－ｄｈｆｒ－、ＣＨＯ／ＤＧ４４、ＥｘｐｉＣＨＯ、大腸菌又は大腸菌に基づく改変により得られる大腸菌ＢＬ２１、ＢＬ２１（ＤＥ３）、Ｒｏｓｅｔｔａ、Ｏｒｉｇａｍｉ、酵母菌又は酵母に基づく改変により得られるピキア・パストリス、サッカロマイセス・セレビシエ、クルイベロマイセス・ラクティス、ハンセヌラ・ポリモルファ、昆虫細胞又は昆虫細胞に基づく改変により得られるＨｉｇｈ５細胞、ＳＦ９細胞、植物細胞、哺乳動物の乳腺細胞、体細胞から選ばれる。
いくつかの実施形態において、還元ステップは、１）２－メルカプトエチルアミン、ジチオスレイトール、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン又はその他の化学誘導体から選ばれる還元剤の存在下で還元反応を行うステップと、２）還元剤を除去するステップと、を含む。いくつかの実施形態において、還元剤は、０．１ｍＭ又はそれ以上の濃度、例えば０．１ｍＭ、０．２ｍＭ、０．３ｍＭ、０．４ｍＭ、０．５ｍＭ又はそれ以上のジチオスレイトールであり、反応条件として、４℃で少なくとも３時間、例えば３．５時間、４時間、４．５時間、５時間、５．５時間、６時間又はそれ以上反応させる。
いくつかの実施形態において、酸化ステップは、空気中での酸化であるが、Ｌ－デヒドロアスコルビン酸又はその化学誘導体から選ばれる酸化剤の存在下で酸化反応を行うステップをさらに含む。いくつかの実施形態において、酸化剤は、０．５ｍＭ又はそれ以上の濃度、例えば０．６ｍＭ、０．７ｍＭ、０．８ｍＭ、０．９ｍＭ、１．０ｍＭ、１．２ｍＭ、１．５ｍＭ又はそれ以上のＬ－デヒドロアスコルビン酸であり、反応条件として、４℃で少なくとも５時間、例えば５時間、６時間、７時間、８時間、９時間又はそれ以上反応させる。
いくつかの実施形態において、前記方法は、単離及び精製のステップをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記単離及び精製は、カチオン交換樹脂、アニオン交換樹脂、逆相クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー及びそれらの組み合わせによるものを含む。
本発明の第７の態様は、被験者の疾患を予防及び／又は治療するための薬剤の製造における、前述したような二重特異性抗体、及び／又は前述したような単離されたポリヌクレオチド、及び／又は前述したような組換え発現ベクター、及び／又は前述したような宿主細胞、及び／又は前述したような組成物の使用に関する。
本発明の第８の態様は、被験者の疾患を予防及び／又は治療するための薬剤として使用する、前述したような二重特異性抗体、及び／又は前述したような単離されたポリヌクレオチド、及び／又は前述したような組換え発現ベクター、及び／又は前述したような宿主細胞、及び／又は前述したような組成物に関する。
本発明の第９の態様は、必要とする被験者に、前述したような二重特異性抗体、及び／又は前述したような単離されたポリヌクレオチド、及び／又は前述したような組換え発現ベクター、及び／又は前述したような宿主細胞、及び／又は前述したような組成物を投与するステップを含む、疾患を予防及び／又は治療する方法に関する。
いくつかの実施形態において、被験者は、哺乳動物であり、好ましくは、ヒトである。
いくつかの実施形態において、前記疾患は、白血病、リンパ腫、骨髄腫、脳腫瘍、頭頸部扁平上皮癌、非小細胞肺癌、鼻咽頭癌、食道癌、胃癌、膵臓腺癌、胆嚢癌、肝癌、結腸直腸癌、乳癌、卵巣癌、宮頸癌、子宮内膜癌、子宮肉腫、前立腺癌、膀胱癌、腎細胞癌、黒色腫、小細胞肺癌、骨癌から選ばれる。
言い換えれば、本発明は、天然ＩｇＧの特徴を有し、且つ重鎖－軽鎖のミスマッチがない、非常に安定な新規抗ＰＤ－Ｌ１／抗４－１ＢＢ天然抗体構造様ヘテロダイマー二重特異性抗体を設計した。本発明で製造された二重特異性抗体は、２種類のターゲット分子ＰＤ－Ｌ１及び４－１ＢＢと同時に結合することができ、複雑な疾患の治療に応用される場合、単一の治療剤よりも優れた効果を発揮することができ、且つ副作用がより小さい。また、複数の薬剤の併用療法に対して、この二重特異性抗体は、単一の治療分子であるので、患者や医療従事者にとって使用が容易となるだけでなく、複雑な新薬開発プロセスを簡略化している。
抗ＰＤ－Ｌ１発現産物の溶出ピークのクロマトグラムを示す。 抗４－１ＢＢ発現産物の溶出ピークのクロマトグラムを示す。 抗ＰＤ－Ｌ１／抗４－１ＢＢ二重特異性抗体分子の構造を示す。 １つの重鎖及び１つの軽鎖を含む半抗体分子の構造を示す。 １つの重鎖及び１つの軽鎖を含む半抗体分子のＳＥＣ－ＨＰＬＣ分析の結果を示す。ここで、図５のＡ及びＢは、それぞれ抗ＰＤ－Ｌ１半抗体分子及び抗４－１ＢＢ半抗体分子の結果を示す。 抗ＰＤ－Ｌ１／抗４－１ＢＢ二重特異性抗体分子のＳＥＣ－ＨＰＬＣ分析の結果を示す。 抗ＰＤ－Ｌ１／抗４－１ＢＢ二重特異性抗体分子のＣＥ分析の結果を示す。 図８のＡは、ＰＤ－Ｌ１に対する抗ＰＤ－Ｌ１／抗４－１ＢＢ二重特異性抗体の親和性を示し、図８のＢは、４－１ＢＢに対する抗ＰＤ－Ｌ１／抗４－１ＢＢ二重特異性抗体の親和性を示し、図８のＣは、４－１ＢＢに対する抗ＰＤ－Ｌ１／抗４－１ＢＢ二重特異性抗体の親和性を示す。 図９のＡは、抗ＰＤ－Ｌ１／抗４－１ＢＢ二重特異性抗体のＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１結合へのブロッキング活性を示し、図９のＢは、抗ＰＤ－Ｌ１／抗４－１ＢＢ二重特異性抗体のＰＤ－Ｌ１／ＣＤ８０結合へのブロッキング活性を示す。 抗ＰＤ－Ｌ１／抗４－１ＢＢ二重特異性抗体のＴ細胞への調節活性を示す。 抗ＰＤ－Ｌ１／抗４－１ＢＢ二重特異性抗体を介した４－１ＢＢアゴニスト活性を示す。 遺伝子ノックインマウス同種腫瘍モデルにおける抗ＰＤ－Ｌ１／抗４－１ＢＢ二重特異性抗体の抗腫瘍効果を示す。 ＢＡＬＢ／ｃ－ｈＰＤ１／ｈＰＤＬ１／ｈＣＤ１３７マウスの腫瘍体積の変化を示す。 ｈ４－１ＢＢ／ｈＰＤ－１マウスの腫瘍体積データを示す。
定義：
本明細書において、用語「抗体」は、最も広い意味で使用され、抗原結合部位を含むタンパク質を指し、様々な構造を有する天然抗体及び人工抗体を含み、完全抗体及び抗体の抗原結合フラグメントを含むが、これらに限定されない。
本明細書において、用語「二重特異性抗体」は、２種類の異なる生物分子上のエピトープと特異的に結合する抗原結合ドメインを含む。特別な説明がない限り、記載されている二重特異性抗体の名称における二重特異性抗体が結合する抗原の順序は任意である。即ち、いくつかの実施形態において、用語「抗ＰＤ－Ｌ１／４－１ＢＢ二重特異性抗体」と「抗４－１ＢＢ／ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体」は互換的に使用されてもよい。いくつかの実施形態において、二重特異性抗体は、２つの半抗体を含み、ここで、各半抗体は、単一の重鎖可変領域及び任意の重鎖定常領域の少なくとも一部と、単一の軽鎖可変領域及び任意の軽鎖定常領域の少なくとも一部と、を含む。いくつかの実施形態において、二重特異性抗体は、２つの半抗体を含み、ここで、各半抗体は、単一の重鎖可変領域及び単一の軽鎖可変領域を含み、且つ、１個超えの単一の重鎖可変領域を含まず、１個超えの単一の軽鎖可変領域を含まない。いくつかの実施形態において、二重特異性抗体は、２つの半抗体を含み、ここで、各半抗体は、単一の重鎖可変領域及び単一の軽鎖可変領域を含み、且つ、第１の半抗体は、第１の抗原と結合するが第２の抗原と結合せず、第２の半抗体は、第２の抗原と結合するが第１の抗原と結合しない。
用語「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ領域」又は「ＣＤＲ」（本明細書において超可変領域「ＨＶＲ」とは互換的に使用されてもよい）とは、抗体可変ドメインのうち、配列的に高度に変異し且つ構造的に決定されたループ（「超可変ループ」）を形成し及び／又は抗原接触残基（「抗原接触点」）を含有する領域を指す。ＣＤＲは、主に抗原エピトープとの結合を担当する。本明細書において、重鎖の３つのＣＤＲは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３と呼ばれ、軽鎖的３つのＣＤＲは、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３と呼ばれる。
異なるナンバリングスキームに基づいて得られた同一の抗体の可変領域のＣＤＲの境界は異なる可能性があることに留意されたい。即ち、異なるナンバリングスキームで定義される同一の抗体可変領域のＣＤＲ配列は異なる。このため、本発明で定義される特定のＣＤＲ配列を用いて抗体を限定する場合、前記抗体の範囲は、可変領域配列が前記特定のＣＤＲ配列を含むが、異なるスキーム（例えば、異なるナンバリングスキームの規則又は組み合わせ）を適用することによって、いわゆるＣＤＲの境界が本発明で定義される特定のＣＤＲの境界と異なる抗体をさらに含む。
「共有結合」とは、ヘテロダイマー二重特異性抗体において、２つのＦｃ鎖の間やいずれか１つのＦｃ鎖とそれに連結された抗原結合機能領域との間を、共有結合により連結させて１つの分子を形成することを指す。ここで、Ｆｃ鎖は、１つ又は複数の共有結合（例えば、ジスルフィド結合）により連結された第１の抗原結合機能領域と第２の抗原結合機能領域とを含み、この第１のＦｃ鎖及び第２のＦｃ鎖は、それぞれ共有結合（例えば、イミン結合又はアミド結合）を介して抗原結合機能領域に連結されている。
抗原結合機能領域とは、抗原などの標的分子と特異的に相互作用することができる領域を指す。その作用は、高度な選択性がある。通常、１つの標的分子を認識する配列は、他の分子の配列を認識することができない。代表的な抗原結合機能領域は、抗体可変領域、抗体可変領域の構造変異体、受容体結合ドメイン、リガンド結合ドメイン、又は酵素結合ドメインを含む。
１つ又は複数のジスルフィド結合による鎖間結合とは、１つ又は複数のジスルフィド結合により第１のＦｃ鎖と第２のＦｃ鎖とを連結させてヘテロダイマーフラグメントを形成することを意味する。本発明において、１つ又は複数のジスルフィド結合は、第１のＦｃ鎖及び第２のＦｃ鎖、又は第１のＦｃ鎖及び第２のＦｃ鎖並びにそれらに連結された抗原結合機能領域が同じ細胞において合成される場合に形成することができるか、又は第１のＦｃ鎖及び第２のＦｃ鎖、又は第１のＦｃ鎖及び第２のＦｃ鎖並びにそれらに連結された抗原結合機能領域が異なる細胞において別々に合成された後にインビトロ還元－酸化プロセスにより形成することができる。
第１のＦｃ鎖及び第２のＦｃ鎖とは、ジスルフィド結合を含む共有結合により形成された結合フラグメントを指し、各鎖は、少なくとも、免疫グロブリンの重鎖定常領域の一部を含む。また、前記第１のＦｃ鎖と第２のＦｃ鎖は、アミノ酸配列が異なり、少なくとも１つのアミノ酸が異なる。本発明の第１のＦｃ鎖及び第２のＦｃ鎖において、同じ鎖間に強力な反発力が存在する一方で、異なる鎖間に引力が存在するので、第１のＦｃ鎖及び第２のＦｃ鎖、又は第１のＦｃ鎖及び第２のＦｃ鎖並びにそれらに連結された抗原結合機能領域は、共に、細胞において発現されている場合、ヘテロダイマーを形成する傾向がある。第１のＦｃ鎖及び第２のＦｃ鎖、又は第１のＦｃ鎖及び第２のＦｃ鎖並びにそれらに連結された抗原結合機能領域が２つの宿主細胞において別々に発現される場合、第１のＦｃ鎖又は第１のＦｃ鎖及びそれに連結された抗原結合機能領域は、ホモダイマーを形成する傾向がなく、第２のＦｃ鎖又は第２のＦｃ鎖及びそれに連結された抗原結合機能領域は、ホモダイマーを形成する傾向がない。本発明において、第１のＦｃ鎖及び第２のＦｃ鎖、又は第１のＦｃ鎖及び第２のＦｃ鎖並びにそれらに連結された抗原結合機能領域は、還元剤の存在下で２つの宿主細胞において別々に発現される場合、ホモダイマーの割合は、５０％未満、即ち、モノマー（１つのＦｃ鎖又は１つのＦｃ鎖及びそれに連結された抗原結合機能領域）の割合は、５０％を超える。
免疫グロブリンは、比較的長く、比較的大きい相対分子量を有し、４５０～５５０個のアミノ酸残基を含み、５５０００Ｄａ～７００００Ｄａの間の相対分子量を有する２つの同じ重鎖と、比較的短く、比較的小さい相対分子量を有し、約２１０個のアミノ酸残基を含み、約２４０００Ｄａの相対分子量を有する２つの同じ軽鎖（Ｌ鎖）とを含む４つのポリペプチド鎖を有する対称構造を有する。Ｎ末端付近の約１１０個のアミノ酸の配列は、異なる免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖において大きく変化しており、可変領域（ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ、Ｖ領域）と呼ばれる。これに対して、Ｃ末端付近の残りのアミノ酸配列は、比較的安定であり、定常領域（ｃｏｎｓｔａｎｔ ｒｅｇｉｏｎ、Ｃ領域）と呼ばれる。抗体の各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書においてＶＨと略記する）及び重鎖定常領域（本明細書においてＣＨと略記する）から構成され、各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書においてＶＬと略記する）及び軽鎖定常領域（本明細書においてＣＬと略記する）から構成される。重鎖において、可変領域は、重鎖の長さの約１／４を占めるが、定常領域は、重鎖の長さの約３／４を占める。既知の五つのクラスのＩｇ、即ちＩｇＧ（γ）、ＩｇＡ（α）、ＩｇＤ（δ）、ＩｇＭ（μ）及びＩｇＥ（ε）に関しては、最初の３つのＩｇのＨ鎖には、３つの定常領域があり、即ち、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３からなる。最後の２つのタイプ（ＩｇＭ及びＩｇＥ）のＨ鎖には、１つのＶＨ領域及び４つの定常領域、即ち、ＣＨ１～ＣＨ４がある。定常領域は、免疫グロブリン分子のフレームワークでもあり、免疫反応を活性化する領域の１つでもある。本発明の実施例は、ＩｇＧに関するが、公知の方法により本発明の抗体のクラスを変換できることは当業者に明らかである。例えば、本発明の最初のＩｇＭ抗体は、クラスを本発明のＩｇＧ抗体に変換することができる。なお、クラス変換技術によりＩｇＧサブクラスを別のサブクラスに変換することができ、例えば、ＩｇＧｌをＩｇＧ２に変換することができる。このため、本発明の抗体のエフェクター機能は、様々な治療用途のために、アイソタイプ切り替えにより例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＥ又はＩｇＭ抗体に変換することができる。一実施例において、本発明の抗体は、ＩｇＧ１抗体、例えば、ＩｇＧ１，κである。
本発明において、定常領域の一部は、少なくとも第１のＦｃ鎖及び第２のＦｃ鎖が相互に作用する領域を含む。ＩｇＧについて、前記領域は、少なくともＧＬＮ３４７、ＴＹＲ３４９、ＴＨＲ３５０、ＬＥＵ３５１、ＳＥＲ３５４、ＡＲＧ３５５、ＡＳＰ３５６、ＧＬＵ３５７、ＬＹＳ３６０、ＳＥＲ３６４、ＴＨＲ３６６、ＬＥＵ３６８、ＬＹＳ３７０、ＡＳＮ３９０、ＬＹＳ３９２、ＴＨＲ３９４、ＰＲ０３９５、ＶＡＬ３９７、ＡＳＰ３９９、ＳＥＲ４００、ＰＨＥ４０５、ＴＹＲ４０７、ＬＹＳ４０９、ＬＹＳ４３９を含む、ＣＨ３領域に位置する一部のアミノ酸である。
「第１のＦｃ鎖及び第２のＦｃ鎖がそれぞれ共有結合又はリンカーを介して１つの抗原結合機能領域に連結されること」とは、第１のＦｃ鎖及び第２のＦｃ鎖がそれぞれ共有結合又はリンカーを介して１つの抗体の抗原結合フラグメント、又は抗原を認識できる単鎖抗体、又は抗原を認識できる他の抗体フラグメントの構造変異体、又はリガンドを認識できる受容体、又は受容体を認識できるリガンドに連結されることを指す。ここで、前記共有結合とは、化学結合の１種であり、２つ又は複数の原子がそれらの外側の電子を共有して、理想的には電子的飽和状態に達することにより、共有結合と呼ばれる比較的安定な化学構造を構成する。言い換えれば、共有結合とは、電子対を共有することにより原子間に形成される相互作用である。同じ元素又は異なる元素の原子は、いずれも共有結合を介して結合されてもよい。本発明の第１のＦｃ鎖と第２のＦｃ鎖との間の共有結合として、１つのアミノ酸分子のアミノ基と別のアミノ酸分子のカルボキシル基との間の脱水反応により形成されるアミド結合、エチレングリコール若しくはポリエチレングリコール、又は他の化合物、又はそのポリマーのアルデヒド基と１つのアミノ酸分子のアミノ基とから形成されるアミド結合若しくはイミン結合を含むが、これらに限定されない。ここで、リンカーは、共有結合により２つのポリペプチド鎖を連結することができるアミノ酸の配列又は化合物若しくは化合物のポリマーであり、ここで、アミノ酸の配列は、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳなどの小さなペプチドセグメントを含むが、これに限定されない。アミド結合を介して第１のＦｃ鎖又は第２のＦｃ鎖、及び抗原を認識できる単鎖抗体、又は抗原を認識できる他の抗体フラグメントの構造変異体を連結させることができる。
第１のＦｃ鎖及び第２のＦｃ鎖が各々のホモダイマーを形成するものではなくヘテロダイマーを形成する傾向があることとは、第１のＦｃ鎖及び第２のＦｃ鎖において、同じポリペプチド鎖間に反発力が存在する一方で、異なるポリペプチド鎖間に引力が存在するので、細胞において同時発現される場合、第１のＦｃ鎖及び第２のＦｃ鎖、又は第１のＦｃ鎖及び第２のＦｃ鎖並びにそれらに連結された抗原結合機能領域がヘテロダイマーを形成する傾向があることを指す。第１のＦｃ鎖及び第２のＦｃ鎖、又は第１のＦｃ鎖及び第２のＦｃ鎖並びにそれらに連結された抗原結合機能領域が２つの宿主細胞において別々に発現される場合、第１のＦｃ鎖又は第１のＦｃ鎖及びそれらに連結された抗原結合機能領域は、ホモダイマーを形成する傾向がなく、第２のＦｃ鎖又は第２のＦｃ鎖及びそれらに連結された抗原結合機能領域は、ホモダイマーを形成する傾向がない。
Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスナンバリングシステムとは、Ｋａｂａｔによる方法に基づいて抗体配列の各アミノ酸に番号を割り当てることを指し、このような各残基に番号を割り当てる方法は、当該技術分野における標準的な方法になっている。Ｋａｂａｔのスキームは、彼の研究を越えて、他の抗体に拡張することができる。保存されたアミノ酸に基づいて、目的抗体をＫａｂａｔにより同定されたコンセンサス配列のうちの１つと照合させる。本明細書において、特に断りがない限り、抗体のアミノ酸位置は、いずれもＫａｂａｔ ＥＵインデックスナンバリングシステムに基づいて番号を割り当てる。
Ｆｃドメインとは、エフェクター分子又は細胞と相互作用するＩｇの部分である、ＩｇのＣＨ２及びＣＨ３ドメインに対応するフラグメント結晶化可能な領域（ｆｒａｇｍｅｎｔ ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｂｌｅ、Ｆｃ）を指す。
免疫グロブリンＧ（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇ、ＩｇＧ）の略号であるＩｇＧは、血清中の主な抗体成分である。ヒトＩｇＧは、ＩｇＧ分子のｒ鎖における抗原性の相違に基づいて、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４の４つのサブクラスに分類される。
半抗体分子とは、抗体の１つの重鎖と１つの軽鎖により形成される構造であって、重鎖及び軽鎖が、共有結合を介して連結されてもされなくてもよいものを指し、抗原を認識する一価抗体構造である。
Ｆａｂフラグメントは、抗原結合フラグメント（ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｆ ａｎｔｉｇｅｎ ｂｉｎｄｉｎｇ、Ｆａｂ）であり、インタクトな軽鎖と重鎖のＶＨ及びＣＨＩドメインとから構成される、抗体分子の２つのアームに対応する分子認識配列である。ｓｃＦｖは、分子認識配列であり、抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を遺伝子工学的に改変して得られる抗体フラグメントの構造変異体である。膜受容体の細胞外領域は、分子認識配列である。膜受容体は、通常、対応する抗原又はリガンドを認識し結合することができる細胞の外部に位置する細胞外領域と、受容体を細胞の表面に固定する膜貫通領域と、キナーゼ活性を有するか又はシグナルを伝達することができる細胞の内部に位置する細胞内領域とを含む。細胞膜受容体のリガンドとは、膜受容体の細胞外領域によって認識し結合されるタンパク質、小さなペプチド又は化合物を指す。サイトカインは、免疫原、マイトジェン、又は他の刺激物により誘導される様々な細胞により生産される低分子量可溶性タンパク質であり、自然免疫、適応免疫、血球生成、細胞成長及び成人多能性幹細胞（ＡＰＳＣ）の調整、及び損傷組織の修復などの様々な機能を有する。サイトカインは、インターロイキン、インターフェロン、腫瘍壊死因子スーパーファミリー、コロニー刺激因子、ケモカイン、成長因子などに分類される。タンパク質発現タグとは、目的タンパク質のＮ末端又はＣ末端に付加される、小さなペプチド又は長いアミノ酸のいずれかであるアミノ酸配列を指す。タグの付加は、タンパク質の正しいフォールディング、タンパク質の単離及び精製、並びにタンパク質の細胞内分解の減少に有利であり得る。通常使用されるタグとして、ＨＡ、ＳＵＭＯ、Ｈｉｓ、ＧＳＴ、ＧＦＰ、及びＦｌａｇを含むが、これらに限定されない。
本発明のヘテロダイマー二重特異性抗体に適用可能な抗体には何ら制限はない。好ましくは、従来技術で知られている、疾患の治療及び／又は予防に使用可能な抗体は、いずれも本発明に使用されてもよい。
本発明のヘテロダイマー二重特異性抗体は、１つ又は複数の置換、欠失、付加、及び／又は挿入を有してもよい。例えば、いくつかのアミノ酸は、他のポリペプチド（例えば抗原）又は細胞への結合能力を著しく失うことなく、タンパク質構造中の他のアミノ酸と置換することができる。タンパク質の生物学的機能活性は、結合能力及びタンパク質の特徴によって決定されるので、タンパク質配列に対して、それらの生物学的効果又は活性を著しく失うことなく、いくつかのアミノ酸配列の置換を行うことができる。
多くの場合、ポリペプチド変異体は、１つ又は複数の保存的置換を含む。保存的置換とは、ペプチド化学の分野での当業者がポリペプチドの二次構造及び親水性が実質的に変化しないと予想できるような、類似の特徴を有する他のアミノ酸でのアミノ酸の置換を指す。
アミノ酸の置換は、通常、アミノ酸の側鎖置換基の相対的類似性、例えばそれらの疎水性、親水性、電荷、サイズなどに基づくものである。様々な前記特徴を考慮すると、例示的な置換は、当業者にとって公知のものであり、アルギニン及びリジン、グルタミン酸及びアスパラギン酸、セリン及びスレオニン、グルタミン及びアスパラギン、並びにバリン、ロイシン、及びイソロイシンを含む。
本発明で使用される用語「同一性」は、当該分野で通常知られている意味を有し、異なる配列間の同一性を測定するための規則及び基準も当業者に知られており、（必要に応じて、最大相同性％を達成するために）配列を整列させて間隙を導入した後のポリヌクレオチド又はポリペプチド配列変異体と非変異体配列との間の同じ残基のパーセンテージを指す。本発明において、同一性の限定が満足される場合、得られた変異体配列は、親配列が保有する生物学的活性を有することも必要とされる。上記の活性によって変異体配列をスクリーニングする方法及び手段は、当業者に公知のものである。当業者は、本明細書中で開示される教示から、このような変異体配列を容易に得ることができる。具体的な実施形態において、ポリヌクレオチド及びポリペプチド変異体は、本明細書中で記載されるポリヌクレオチド又はポリペプチドと、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％、又は少なくとも約９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％又は９９．９％のポリヌクレオチド若しくはポリペプチド同一性を有する。遺伝子コードの冗長性のために、これらの配列と同じアミノ酸配列をコードする変異体が存在する。
本発明の別の実施形態において、中程度から高度にストリンジェントな条件下で、本発明により提供されるポリヌクレオチド配列、又はそのフラグメント、又はその相補配列とハイブリダイズすることができるポリヌクレオチド組成物を提供する。ハイブリダイゼーション技術は、分子生物学の分野で公知である。説明の目的で、本発明のポリヌクレオチドと他のポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションのテストに好適な中程度にストリンジェントな条件は、５×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、１．０ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の溶液で予備洗浄し、５０℃～６０℃にて５×ＳＳＣの条件下で一晩ハイブリダイズし、そして０．１％ＳＤＳを含む２×、０．５×及び０．２×ＳＳＣで６５℃にて２回２０分間洗浄することを含む。当業者は、例えばハイブリダイゼーション溶液の塩含有量及び／又はハイブリダイゼーション温度を変えることによって、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを容易に操作し得ることを理解している。例えば、別の実施形態において、好適な高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件として、上記の条件が含まれるが、ハイブリダイゼーション温度を、例えば６０～６５℃又は６５～７０℃まで上昇させることが異なる。
本発明の宿主細胞は、外来遺伝子を発現させるためのすべての細胞であってもよく、大腸菌、酵母、昆虫細胞、植物細胞、哺乳動物細胞を含むが、これらに限定されない。
本発明のベクターは、例えば、プラスミド、ファージ、コスミド及びミニ染色体を含む、任意の種類の細胞又は生体中で複製できるベクターを含む。いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターは、ポリヌクレオチドの増殖（ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ）若しくは複製に適したベクター、又は本発明のポリペプチドの発現に適したベクターである。このようなベクターは、当該技術分野で知られており、市販されている。
「ベクター」は、シャトルベクター及び発現ベクターを含む。通常、プラスミド構築物は、細菌におけるプラスミド複製及び選択のための複製起点（例えば、ＣｏＥｌ複製起点）並びに選択マーカー（例えば、アンピシリン又はテトラサイクリン耐性）をさらに含む。「発現ベクター」とは、細菌又は真核細胞において抗体フラグメントを含む本発明の抗体を発現するために必要な制御配列又は調節要素を含むベクターを指す。
本発明のベクターは、外来遺伝子を発現させるためのすべてのベクターであってもよく、プラスミドベクターを含むが、これに限定されない。ここで、プラスミドベクターは、少なくとも複製起点、プロモーター、目的遺伝子、マルチクローニングサイト、選択マーカー遺伝子を含み、好ましくは、本発明に係るベクターは、例えばＸ０ＧＣベクターなどの、ｐＣＤＮＡに基づく改変により得られるプラスミドベクターを含むが、これらに限定されない。
本発明の組成物は、少なくとも１種の第２の治療剤をさらに含み、好ましくは、前記第２の治療剤と、前記二重特異性抗体、単離されたポリヌクレオチド、組換え発現ベクター又は宿主細胞とは、前記組成物の異なる部分にあり、好ましくは、第２の治療剤は、抗ＰＤ－１抗体及び／又はＳＴＩＮＧアゴニストである。
本発明の組成物に含まれる第２の治療剤は、特に限定されないが、本発明の二重特異性抗体、単離されたポリヌクレオチド、組換え発現ベクター又は宿主細胞と生理学的に相容性を有すればよい。生理学的に相容性を有することは、被験者に投与した時に過度の刺激、毒性などの不良反応が生じないことを指す。いくつかの実施形態において、前記第２の治療剤は、前記二重特異性抗体、単離されたポリヌクレオチド、組換え発現ベクター又は宿主細胞と混合物として前記組成物中に存在する。いくつかの実施形態において、前記第２の治療剤と前記二重特異性抗体、単離されたポリヌクレオチド、組換え発現ベクター又は宿主細胞は、前記組成物の異なる部分にある。前記組成物の異なる部分にあることは、前記組成物が、互いに単離された部分から構成されることを指す。前記互いに単離された部分は、異なる容器、例えば異なるバイアル、シリンジ、小管にあってもよいし、同一の容器中の互いに分離された異なる仕切り部にあってもよい。前記互いに単離された部分は、投与前に混合して投与してもよく、又は、一定の時間間隔、例えば５分間、１０分間、２０分間、３０分間、１時間、５時間、１２時間、２４時間、４８時間、１週間、１ヶ月又はそれ以上の時間間隔で順次投与する。前記第２の治療剤は、前記二重特異性抗体、単離されたポリヌクレオチド、組換え発現ベクター又は宿主細胞と同じ又は異なる疾患を治療するための薬剤であってもよく、例えば、いずれも白血病を治療するための薬剤であり、又は、一方が白血病を治療するためのものであるが、他方が結腸腫瘍を治療するためのものである。いくつかの実施形態において、第２の治療剤は、抗炎症剤、例えばＩＬ－６阻害剤、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ－α）阻害剤、インターフェロンγ（ＩＦＮ－γ）阻害剤、皮質ステロイド、抗ヒスタミン薬、解熱剤及び／又は抗生素を含む。いくつかの実施形態において、第２の治療剤は、第２の抗体、免疫治療剤、標的治療剤又は化学治療剤からなる群から選ばれる。
いくつかの実施形態において、第２の治療剤は、抗体であり、この抗体のターゲットは、ＣＤ４７、ＣＤ７０、ＣＤ２００、ＣＤ１５４、ＣＤ２２３（ＬＡＧ－３）、ＫＩＲ（キラー細胞免疫グロブリン様受容体）、ＧＩＴＲ、ＣＤ２０、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ８６、ＣＤ１６０、ＣＤ２５８、ＣＤ２７０、ＣＤ２７５、ＣＤ２７６、ＯＸ４０Ｌ、Ｂ７－Ｈ４、ＧＩＴＲＬ、４－１ＢＢＬ、ＣＤ３、ＣＤ２５、ＣＤ４８、ＣＤ６６ａ、ＣＤ８０、ＣＤ９４、ＣＤ９６、ＣＤ１１２、ＣＤ１１５、ＣＤ２０５、ＣＤ２２６、ＣＤ２４４、ＣＤ２６２、ＣＤ２８４、ＣＤ２８８、白血病阻止因子（ＬＩＦ）、ＴＮＦＳＦ１５、ＴＤＯ２、ＩＧＦ－１Ｒ、ＧＤ２、ＴＭＩＧＤ２、ＲＧＭＢ、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＮＬ２、Ｂｔｎ、ＴＩＧＩＴ、Ｓｉｇｌｅｃｓ（シアル酸結合Ｉｇ様レクチン、即ちＳＩＧＬＥＣ １５）、ＶＥＧＦＲ、ＩＬＴファミリー、ＭＩＣＡ、ＴＧＦβ、ＳＴＩＮＧ経路（インターフェロン遺伝子経路の刺激因子）、アルギナーゼ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＨＨＬＡ２、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＴＬＡ－４、ＢＴＬＡ、インドールアミン２、３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ、ＩＤＯ１）、ＴＩＭ３、Ａ２Ａアデノシン受容体（ＡＤＯ受容体）、ＣＤ３９、ＣＤ７３、ＣＤ２７、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＯＸ４０、ＴＮＦＳＦ２５、ＩＬ－１０、ガレクチン、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＤＮＡＭ１、ＤＡＰ１０、ＣＤ１６（ＣＤ１６ａ、ＣＤ１６ｂ又はこの両者）、ＣＲＴＡＭ、ＣＤ２７、ＰＳＧＬ１、ＣＤ９６、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄとも呼ばれる）、ＮＫｐ８０、ＣＤ２４４（ＳＬＡＭＦ４又は２Ｂ４とも呼ばれる）、ＳＬＡＭＦ６、ＳＬＡＭＦ７、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＫＩＲ２ＤＳ４、ＫＩＲ３ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＳ３、ＫＩＲ２ＤＳ５、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＣＤ９４、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ又はＣＤ１６０から選ばれる。
いくつかの実施形態において、抗体は、抗ＰＤ－１抗体である。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ－１抗体は、ニボルマブ（ｎｉｖｏｌｕｍａｂ）、ペムブロリズマブ（ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）、セミプリマブ（ｃｅｍｉｐｌｉｍａｂ）、カムレリズマブ（Ｃａｍｒｅｌｉｚｕｍａｂ）、トリパリマブ（Ｔｏｒｉｐａｌｉｍａｂ）、シンチリマブ（ｓｉｎｔｉｌｉｍａｂ）、チスレリズマブ（ｔｉｓｌｅｌｉｚｕｍａｂ）、ペンプリマブ（Ｐｅｎｐｕｌｉｍａｂ）又はジンベレリマブ（ｚｉｍｂｅｒｅｌｉｍａｂ）である。
いくつかの実施形態において、第２の治療剤は、免疫治療剤である。免疫治療剤の非限定的な実施例として、抗体、小分子免疫調節剤、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞（ＤＣ）、養子細胞移植（ＡＣＴ）、免疫チェックポイント調節剤、サイトカイン、癌ワクチン、アジュバント、腫瘍溶解性ウイルス又はそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、免疫治療剤は、ＳＴＩＮＧアゴニストである。
いくつかの実施形態において、第２の治療剤は、標的治療剤である。「標的治療剤」とは、１種又は複数種の発がん性シグナル伝達タンパク質（例えば、細胞の成長及び生存に関与するもの）を特異的に標的にして阻害する分子を指す。このような標的治療剤の非限定的な実施例として、チロシンキナーゼ阻害剤（例えばイマチニブ（ｉｍａｔｉｎｉｂ、ＧＬＥＥＶＥＣ（登録商標））、ゲフィチニブ（ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ、ＩＲＥＳＳＡ（登録商標））、エルロチニブ（ｅｒｌｏｔｉｎｉｂ、ＴＡＲＣＥＶＡ（登録商標））、ソラフェニブ（ｓｏｒａｆｅｎｉｂ、ＮＥＸＡＶＡＲ（登録商標））、スニチニブ（ｓｕｎｉｔｉｎｉｂ、ＳＵＴＥＮＴ（登録商標））、ダサチニブ（ｄａｓａｔｉｎｉｂ、ＳＰＲＹＣＬ（登録商標））、ラパチニブ（ｌａｐａｔｉｎｉｂ、ＴＹＫＥＲＢ（登録商標））、ニロチニブ（ｎｉｌｏｔｉｎｉｂ、ＴＡＳＩＧＮＡ（登録商標））、ボルテゾミブ（ｂｏｒｔｅｚｏｍｉｂ、ＶＥＬＪＡＮＺ（登録商標））、タモキシフェン（ｔａｍｏｘｉｆｅｎ、ＮＯＬＶＡＤＥＸ（登録商標））、トファシチニブ（ｔｏｆａｃｉｔｉｎｉｂ、ＸＥＬＪＡＮＺ（登録商標））、ＡＬＫ阻害剤（例えばクリゾチニブ）、Ｂｃｌ－２阻害剤（例えばオバトクラックス（Ｏｂａｔｏｃｌａｘ）、ナビトクラックス（Ｎａｖｉｔｏｃｌａｘ）、ゴシポール）、ＰＡＲＰ阻害剤（例えばイニパリブ、オラパリブ）、ＰＩ３Ｋ阻害剤（例えばペリホシン）、アパチニブ、ＡＮ－１５２、Ｂｒａｆ阻害剤（例えばトラメチニブ、ＭＥＫ１６２）、ＣＤＫ阻害剤（例えばＰＤ－０３３２９９１、ＬＥＥ０１１）、Ｈｓｐ９０阻害剤（サリノマイシン、ＶＡＬ－０８３））；小分子薬物コンジュゲート（例えば、ビンタフォリド）；セリン－スレオニンキナーゼ阻害剤（例えば、テムシロリムス（ＴＯＲＩＳＥＬ（登録商標））、エベロリムス（ＡＦＩＮＩＴＯＲ（登録商標））、ベムラフェニブ（ＺＥＬＢＯＲＡＦ（登録商標））、トラメチニブ（ＭＥＫＩＮＩＳＴ（登録商標））、ダブラフェニブ（ＴＡＦＩＮＬＡＲ（登録商標））；抗体（例えば、抗ＣＤ２０抗体（例えば、リツキシマブ（ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標））、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体（例えば、トラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）））、アレムツズマブ（ＣＡＭＰＡＴＨ（登録商標））、抗ＥＧＦＲ抗体（例えば、セツキシマブ、パニツムマブ）、抗ＶＥＧＦ抗体（例えば、ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）））；抗体複合体、例えば抗体薬物複合体（ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ、ＡＤＣ）、免疫刺激抗体複合体（Ｉｍｍｕｎｅ－ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、ＩＳＡＣ）、抗体-オリゴヌクレオチド複合体（Ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ、ＡＯＣ）を含む。いくつかの実施形態において、抗体コンジュゲートは、ＡＤＣ類薬剤である。ＡＤＣ類薬剤の非限定的な実施例として、Ｈｅｒ２－ＡＤＣ、Ｔｒｏｐ２－ＡＤＣ、ＣＤ２２－ＡＤＣ、ＢＣＭＡ－ＡＤＣ、ＣＤ１９－ＡＤＣ、Ｎｅｃｔｉｎ－４－ＡＤＣを含む。
いくつかの実施例において、第２の治療剤は、化学治療剤であり、化学治療剤の非限定的な実施例として、例えば、テパディナ、ＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標）、シクロホスファミドといったアルキル化剤；テモゾロミド；例えばブスルファン、インプロスルファン、ピポスルファンといったアルキルスルホネート；例えばベンゾドパ、カルボコン、メツレデパ、ウレデパといったアジリジン類；ヘキサメチルメラミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスファミド、トリエチレンチオホスファミド、トリメチロールメラミンを含むエチレンイミン類及びメチルメラミン類；アセトゲニン（特にブラタシン及びブラタシノン）；カンプトテシン（合成類縁物質であるトポテカンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン（ｃａｌｌｙｓｔａｔｉｎ）；ＣＣ－１０６５（アドゼレシン、カルゼルシン及びビセレシン合成類縁物質を含む）；クリプトフィシン（特にクリプトフィシン１及びクリプトフィシン８）；アプリシアトキシン；デュオカルマイシン（合成類縁物質ＫＷ－２１８９及びＣＢ１－ＴＭ１を含む）；エリュテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチイン；スポンギスタチン；例えばクロランブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イソシクロホスファミド、ジクロロエチルメチルアミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩（ｍｅｃｈｌｏｒｅｔｈａｍｉｎｅ ｏｘｉｄｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、メルファラン、ノベムビチン（ｎｏｖｅｍｂｉｃｈｉｎ）、フェネステリン、プレドニマスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタードといったメクロレタミン；例えばカルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチンといったニトロソウレア類；例えばエンジイン類抗生物質（例えば、カリケアミシン、特にカリケアミシンγ１１及びカリケアミシンω１１（例えば、Ａｇｎｅｗ，Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，３３：１８３ １８６（１９９４）を参照されたい）といった抗生物質類；ジネミシンＡを含むジネミシン；例えばクロロホスホネートといったジホスホネート類；エスペラミシン、ネオカルジノスタチンクロモホア及び関連するクロモプロテイン系エンジイン類抗生物質クロモホア）；アクラシノマイシン類、アクチノマイシン、アントラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、アクチノマイシンＣ、カラビシン（ｃａｒａｂｉｃｉｎ）、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノマイシン、デトルビシン、６－ジアゾ－５－オキソ－Ｌ－ノルロイシン、ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標）、ドキソルビシン（モルホリノドキソルビシン、シアノモルホリノドキソルビシン、２－ピロリニル－ドキソルビシン及びデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、例えばマイトマイシンＣ、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポルフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラマイシン（ｑｕｅｌａｍｙｃｉｎ）、ロドルビシン、ルフォクロモマイシン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾリレビシンといったマイトマイシン；例えばメトトレキサート及び５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）といった代謝拮抗剤類；例えばデノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサートといった葉酸類縁物質；例えばフルダラビン、６－メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンといったプリン類縁物質；例えばアンシタビン、アザシチジン、６－アザウリジン、カルモフール、シタラビン、デオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジンといったピリミジン類縁物質；例えばカルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンといったアンドロゲン類；例えばアミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンといった抗アドレナリン類；例えばフォリン酸といった葉酸補充剤；アセグラトン；アルドホスファミド・グリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビスアントレン；エダトレキサート；デフォファミン；デメコルシン；ジアジクオン；エフロルニチン；エリプチニウムアセタート；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシカルバミド；レンチナン；ロニダミン；例えばメイタンシン及びアンサミトシンといったマイタンシノイド類；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フエナメッ卜；ピラルビシン；ロソキサントロン；ポドフィリン酸；２－エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）多糖類複合体（ＪＨＳ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇ．）；ラゾキサン；リゾマイシン（ｒｈｉｚｏｍｙｃｉｎ）；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン（ｔｒｉａｚｉｑｕｏｎｅ）；２，２’，２’’－トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特にＴ－２トキシン、ベルカリンＡ（ＶｅｒｒｕｃａｒｉｎＡ）、ロリジンＡ及びアングイジン）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ジブロモマンニトール；ジブロモズルシトール；ピポプロマン；ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）；シタラビン（「Ａｒａ－Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；例えばＴＡＸＯＬ（登録商標）（パクリタキセル；Ｂｒｉｓｔｏｌ Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、Ｎ．Ｊ．）、ＡＢＲＡＸＡＮＥ（登録商標）（クレモフォールを含まず、パクリタキセルのアルブミン工学的ナノ粒子製剤（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐａｒｔｎｅｒｓ、Ｓｃｈａｕｍｂｅｒｇ、１１１．）及びＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）ドセタキセル（Ｒｈｏｎｅ－Ｐｏｕｌｅｎｃ Ｒｏｒｅｒ、Ａｎｔｏｎｙ、フランス）といったパクリタキセル類縁物質；クロランブシル；ＧＥＭＺＡＲ（登録商標）ゲムシタビン；６－チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；例えばシスプラチン、オキサリプラチン及びカルボプラチンといったプラチナ類縁物質；ビンブラスチン；プラチナ；エトポシド（ＶＰ－１６）；イソシクロホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン（ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ）；ノバントロン；テニポシド；エダトレキサート；ダウノルビシン；アミノプテリン；カペシタビン；イバンドロナート；イリノテカン（Ｃａｍｐｔｏｓａｒ、ＣＰＴ－１１）（イリノテカンと５－ＦＵ及びホルミルテトラヒドロ葉酸を含む治療法）；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；例えばレチノイン酸といったレチノイド；カペシタビン；コンブレタスタチン；ホルミルテトラヒドロ葉酸（ＬＶ）；オキサリプラチン治療法（ＦＯＬＦＯＸ）を含むオキサリプラチン；ラパチニブ（ＴＹＫＥＲＢ）；ＰＫＣ－α、Ｒａｆ、Ｈ－Ｒａｓ、ＥＧＦＲ阻害剤（例えば、タルセバ（ＴＡＲＣＥＶＡ（登録商標））及び細胞増殖を減少させるＶＥＧＦ－Ａ及び上記のいずれかの物質の薬学的に許容される塩、酸又は誘導体を含む。
本発明の被験者は、鳥類、爬行動物、哺乳動物などを含む。好ましくは、哺乳動物は、げっ歯類の動物、霊長類動物を含み、より好ましくは、霊長類動物は、ヒトを含む。
本発明に係る疾患の範囲は、腫瘍を含むが、これらに限定されない。好ましくは、前記腫瘍は、白血病、リンパ腫、骨髄腫、脳腫瘍、頭頸部扁平上皮癌、非小細胞肺癌、鼻咽頭癌、食道癌、胃癌、膵臓腺癌、胆嚢癌、肝癌、結腸直腸癌、乳癌、卵巣癌、宮頸癌、子宮内膜癌、子宮肉腫、前立腺癌、膀胱癌、腎細胞癌、黒色腫、小細胞肺癌、骨癌を含む。
薬学的に許容される担体とは、薬学分野における一般的な医薬担体、例えば、希釈剤、賦形剤、水など、デンプン、ショ糖、乳糖、微晶セルロースなどの充填剤、セルロース誘導体、アルギン酸塩、ゼラチン及びポリビニルピロリドンなどの結合剤、グリセリンなどの湿潤剤、カルボキシメチルデンプンナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、架橋カルボキシメチルセルロース、寒天、炭酸カルシウム及び炭酸水素ナトリウムなどの崩壊剤、四級アンモニウム化合物などの吸収促進剤、ヘキサデカノール、ドデシル硫酸ナトリウムなどの界面活性剤、カオリナイト、ベントナイトなどの吸着担体、タルク粉末、ステアリン酸カルシウム及びステアリン酸マグネシウム、微粉化シリカゲル及びポリエチレングリコールなどの潤滑剤を指す。さらに、例えば香味料や甘味料などの他のアジュバントを組成物に添加してもよい。
以下、下記の非限定的な実施例により本発明をさらに説明する。本発明の要旨から逸脱することなく本発明に対して様々な修正を行うことができることは、当業者に知られている。このような修正も本発明の範囲内に含まれる。
以下の実験方法は、特に説明しない限り、いずれも通常の方法である。使用された実験材料は、特に説明しない限り、商業的企業から容易に入手することができる。本発明の以下の実施例で使用される各抗体は、いずれも市販の標準的抗体である。
実施例１ 抗ＰＤ－Ｌ１／抗４－１ＢＢヘテロダイマー抗体分子のベクターの構築
それぞれ抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体の重鎖及び軽鎖を含むＸ０ＧＣ発現ベクターを構築した。軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示され、アミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示される。軽鎖定常領域のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示され、アミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示される。重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示され、アミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示され、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示され、アミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示される。ＰＣＲ法により軽鎖可変領域及び軽鎖定常領域、重鎖可変領域及び重鎖定常領域をそれぞれ増幅した。本願の全てのＰＣＲ反応において、ＮＥＢ社のＰｈｕｓｉｏｎハイフィテリティＤＮＡポリメラーゼ（Ｆ－５３０Ｌ）を使用した。ＰＣＲプライマーを、塩基対の相補性の原則及び酵素切断部位の要件に従って従来通りに設計した。反応系としては、いずれも、８．９μＬのＨ２Ｏ、５×ＰｈｕｓｉｏｎハイフィテリティＤＮＡポリメラーゼ緩衝液４μＬ、４μＬの１ｍＭ ｄＮＴＰ、１μＬの上流プライマー、１μＬの下流プライマー、０．１μＬのＰｈｕｓｉｏｎハイフィテリティＤＮＡポリメラーゼ及び１μＬのテンプレートであった。可変領域及び定常領域のＰＣＲ産物を１．５％アガロースゲル電気泳動にかけた後、ＤＮＡ回収キット（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ａ９２８２、以下同様）により対応するフラグメントを回収した。回収した可変領域フラグメント及び定常領域フラグメントをテンプレートとして、可変領域の上流プライマー及び定常領域の下流プライマーを使用してさらなるＰＣＲ反応を行い、その後、対応するフラグメントを回収し、軽鎖又は重鎖の完全長フラグメントを得た。Ｘ０ＧＣベクター及完全長フラグメントをＥｃｏＲＩ（Ｔｈｅｒｍｏ、カタログ番号ＦＤ０２７５）及びＨｉｎｄＩＩＩ（Ｔｈｅｒｍｏ、カタログ番号ＦＤ０５０５）で酵素切断を行った。酵素切断反応系は、６μＬの１０×緩衝液、それぞれ２μＬのＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ、ゲルから回収された４０μＬの完全長フラグメント、及び１０μＬのＨ２Ｏであり、酵素切断反応系を３７℃で１時間反応させた。酵素切断産物をＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ、カタログ番号ＥＬ００１１）（以下同様）でライゲーションした反応系は、１μＬの１０×リガーゼ緩衝液、０．５μＬのリガーゼ、ゲルから回収された完全長フラグメント７．５μＬ、ゲルから回収されたＸ０ＧＣベクター１μＬであり、ライゲーションを２２℃で３０ｍｉｎ実施した。ライゲーション産物でＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αコンピテントセル（Ｔｉａｎｇｅｎ、ＣＢ１０４、以下同様）の形質転換を行った。それぞれ真核細胞において抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体の重鎖及び軽鎖を発現させるために、抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体の重鎖及び軽鎖のＸ０ＧＣ発現ベクターを得た。
本発明は、抗ヒト４－１ＢＢ抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域配列をそれぞれ含むＸ０ＧＣ発現ベクターを同時に構築した。軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９に示され、アミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示される。軽鎖定常領域のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３に示され、アミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示される。重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１１に示され、アミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示される。重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１３に示され、アミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４に示される。それぞれ真核細胞において抗ヒト４－１ＢＢ抗体の重鎖及び軽鎖を発現させるために、抗ヒト４－１ＢＢ抗体の重鎖及び軽鎖のＸ０ＧＣ発現ベクターを得た。
実施例２ 抗ＰＤ－Ｌ１／抗４－１ＢＢヘテロダイマー抗体分子の発現
抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体の重鎖及び軽鎖を含む発現ベクターをＥｘｐｉＣＨＯ細胞（ＥｘｐｉＣＨＯＴＭ細胞、カタログ番号Ａ２９１２７、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にコトランスフェクションした。また、抗ヒト４－１ＢＢ抗体の重鎖及び軽鎖を含む発現ベクターをＥｘｐｉＣＨＯ細胞にもコトランスフェクションした。
トランスフェクションの前日に、細胞を３．５×１０６細胞／ｍＬの接種密度で接種した。トランスフェクションの当日に、新鮮なＥｘｐｉＣＨＯ発現培地（ＥｘｐｉＣＨＯＴＭ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ、カタログ番号Ａ２９１００－０１、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で細胞を６×１０６細胞／ｍＬの希釈密度で希釈した。トランスフェクション体積に従ってプラスミドを取り出し、プラスミドの最終濃度を０．５μｇ／ｍＬとし、ＯｐｔｉＰＲＯＴＭ ＳＦＭ培地（ＯｐｔｉＰＲＯＴＭ ＳＦＭ、カタログ番号１２３０９－０１９、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でプラスミドをトランスフェクション体積の４％になるように希釈し、転倒混和した。６．４倍のプラスミドの量のＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ トランスフェクション試薬（ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ ＣＨＯ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ、カタログ番号Ａ２９１２９、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を取り出し、ＯｐｔｉＰＲＯＴＭ ＳＦＭ培地でトランスフェクション試薬をトランスフェクション体積の４％になるように希釈し、転倒混和した。希釈後のトランスフェクション試薬を希釈されたプラスミドに加えて、穏やかに混合し、室温で１～５ｍｉｎ静置し、細胞に徐々に滴下した。その後、細胞インキュベータ（ＣＯ２濃度は８％）に入れ、シェーカーで１２５ｒｐｍ、３７℃にて２０時間インキュベートした。０．００６倍のトランスフェクション体積のＥｘｐｉＣＨＯＴＭ エンハンサー（ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ ＣＨＯ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ、カタログ番号Ａ２９１２９、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び０．２４倍のトランスフェクション体積のＥｘｐｉＣＨＯＴＭ Ｆｅｅｄ（ＥｘｐｉＣＨＯＴＭ Ｆｅｅｄ、カタログ番号Ａ２９１０１－０２、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を細胞に徐々に滴下した。１２５ｒｐｍのシェーカーに入れて３２℃でインキュベートした。遠心により１０日間トランスフェクションした細胞培養上清を収集した。
Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａの方法により発現量を測定した。クロマトグラフィーカラムによる精製の前に、０．２２μｍのろ過膜膜によるろ過により沈殿を除去した。このステップを４℃で行った。
実施例３ 抗ＰＤ－Ｌ１／抗４－１ＢＢヘテロダイマー抗体分子発現産物の精製
ＡＫＴＡ ｅｘｐｌｏｒｅｒ １００型タンパク質精製システム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）及びアフィニティークロマトグラフィーカラムＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により室温で精製を行った。まず、クロマトグラフィーカラムを移動相Ａ（２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．４）で平衡化し、ベースラインを安定化させた後、上記のように処理した細胞の上清をロードし、ロードした後、移動相Ａを平衡化のために使用した。サンプルは、それぞれ抗ＰＤ－Ｌ１発現産物及び抗４－１ＢＢ発現産物であった。その後、２～３カラム容積の移動相Ｂ（１Ｍ塩化ナトリウムを含む移動相Ａ）でカラムを洗浄してから、２～３カラム容積の移動相Ａで洗浄し、その後、５カラム容積の移動相Ｃ（１００ｍＭグリシン、ｐＨ３．５）で溶出させ、溶出ピーク、即ち目的タンパク質のピークを収集した。抗ＰＤ－Ｌ１発現産物の溶出ピークのクロマトグラムを図１に示し、抗４－１ＢＢ発現産物の溶出ピークを図２に示す。示された溶出ピーク（図示した灰色領域）を収集し、且つ、１ＭのＴｒｉｓアルカリ溶液を滴下することにより、ｐＨを７．２に調整し、ＮａＣｌを最終濃度が０．１５Ｍになるように添加し、無菌化濾過した後、２～８℃で貯蔵した。
実施例４ 抗ＰＤ－Ｌ１／抗４－１ＢＢヘテロダイマー抗体分子の製造及び精製
抗ＰＤ－Ｌ１／抗４－１ＢＢヘテロダイマー抗体分子の構造を図３に示す。
上記のＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）による方法により精製された産物に対してインビトロ組換えを行うことにより、ヘテロダイマーを得た。まず、上述のようにして精製し収集したタンパク質溶液をシステインで還元する過程において、ジスルフィド結合が切断され、抗ＰＤ－Ｌ１及び抗４－１ＢＢ産物中に含まれるホモダイマー抗体分子のヒンジ領域中のジスルフィド結合も切断されて、１つの重鎖及び１つの軽鎖を含む半抗体分子を形成し、構造を図４に示す。還元サンプルを、移動相の緩衝液に１ｍＭのＤＴＴ還元剤が含まれるＳＥＣ－ＨＰＬＣ（ｓｈｏｄｅｘ、ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｗ－８０３）で分析し、結果を図５のＡ及びＢにそれぞれ示し、抗ＰＤ－Ｌ１及び抗４－１ＢＢのホモダイマー分子の割合は、いずれも１０％未満であり、半抗体分子の割合は、いずれも９０％超であった。
その後、還元された抗ＰＤ－Ｌ１及び抗４－１ＢＢ半抗体分子を等モル比で混合し、室温で０．５時間組換え反応を行い、組換えの過程において、抗ＰＤ－Ｌ１及び抗４－１ＢＢ半抗体分子の両方を含むヘテロダイマー二重特異性抗体を、抗ＰＤ－Ｌ１及び抗４－１ＢＢ半抗体分子からＣＨ２－ＣＨ３間の非共有結合性相互作用を介して形成し、次いで、タンパク質溶液を限外ろ過により濃縮し（１０ｋＤａの公称カットオフ分子量）、溶液を２０ｍＭのリン酸塩緩衝液、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．１ｍＭのシスチンに置換し、室温で酸化反応を一晩行い、ヘテロダイマー二重特異性抗体のジスルフィド結合を再形成させた。
上記の抗ＰＤ－Ｌ１及び抗４－１ＢＢ発現産物を還元酸化して得られた抗ＰＤ－Ｌ１／抗４－１ＢＢヘテロダイマー抗体分子を限外ろ過により濃縮し（１０ｋＤａの公称カットオフ分子量）、溶液を２０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に置換した。ＡＫＴＡ ｅｘｐｌｏｒｅｒ １００型タンパク質精製システム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）及びイオンクロマトグラフィーカラムＰｏｒｏｓ ＸＳ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）により精製を室温で行った。まず、クロマトグラフィーカラムを移動相Ａ（２０ｍＭのクエン酸、ｐＨ６．０）で平衡化し、ベースラインを安定化させた後、上述のように処理したタンパク質溶液をロードし、ロードした後、移動相Ａを平衡化のために使用した。その後、カラムを１５カラム容積でＡ（２０ｍＭのクエン酸、ｐＨ６．０）からＢ（２０ｍＭのクエン酸、２００ｍＭアルギニン、ｐＨ６．０）（０％Ｂ～１００％Ｂ、８０ｍｉｎ）の勾配にて洗浄した。主な溶出ピークを収集し、収集したタンパク質溶液を限外ろ過により濃縮し（１０ｋＤａの公称カットオフ分子量）、溶液を２０ｍＭのクエン酸、１４０ｍＭのアルギニン（ｐＨ６．０）に置換し、ろ過して滅菌し、０．０２％Ｔｗｅｅｎ８０を加え、４℃で保存した。精製された抗ＰＤ－Ｌ１／抗４－１ＢＢヘテロダイマー抗体分子ＢＨ３１２０ｈに対してＳＥＣ－ＨＰＬＣによる純度分析を行い、結果を図６に示し、純度は、９８．５４％である。ＣＥ分析を行ったところ、結果を図７に示し、純度は、９６．４４％である。
実施例５ 抗ＰＤ－Ｌ１／抗４－１ＢＢヘテロダイマー抗体の標的結合活性
酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）により抗ＰＤ－Ｌ１／抗４－１ＢＢヘテロダイマー抗体と単一の抗原との結合能力を測定した。具体的な実施過程は、以下の通りである。ｐＨ＝９．６の炭酸塩緩衝溶液を使用して、１００μＬ／ウェルで１μｇ／ｍＬのコーティング濃度にて、９６ウェル高吸着型ＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｓｔａｒ、カタログ番号４２５９２）に組換えヒトＰＤ－Ｌ１（北京シノバイオロジカル社、カタログ番号１００８４－Ｈ０８Ｈ）又はヒト４－１ＢＢ（北京シノバイオロジカル社、カタログ番号１００４１－Ｈ０８Ｈ）をコーティングした。コーティングを４℃で一晩行った。ＰＢＳＴで５回洗浄した。１％のＢＳＡを含むＰＢＳＴで３００μＬ／ウェルにてブロッキングし、２５℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで５回洗浄した。１％のＢＳＡを含むＰＢＳＴで段階希釈したヘテロダイマー抗体サンプル及び対照を１００μＬ／ウェルで添加し、２５℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで５回洗浄した。次いで、１％のＢＳＡを含むＰＢＳＴで１：１００００にて希釈した、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識した抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、カタログ番号ＡＰ３０９Ｐ）を１００μＬ／ウェルで添加し、２５℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで５回洗浄した。発色基質ＴＭＢを１００μＬ／ウェルで添加し、室温で１０分間発色させた。１ＭのＨ２ＳＯ４を１００μＬ／ウェルで添加することにより、発色を停止させた。４５０ｎｍでの吸光度をマイクロプレートリーダーで読み取った。
同時に、ＧＳ－Ｈ２／４－１ＢＢ細胞により、抗ＰＤ－Ｌ１／抗４－１ＢＢヘテロダイマー抗体と４－１ＢＢ抗原との結合能力を測定した。具体的な実施過程は、以下の通りである。ＧＳ－Ｈ２／４－１ＢＢ細胞（ジェンスクリプトから購入）を収集し、２％のＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ、カタログ番号ＳＨ３００８４．０３）を含む冷たいＤＰＢＳ（ＧＩＢＣＯ、カタログ番号１４１９０－１３６）で一回洗浄した。ＧＳ－Ｈ２／４－１ＢＢを、２％のＦＢＳを含む冷たいＤＰＢＳに５×１０６個の細胞／ｍＬの密度で再懸濁させた。フローサイトメトリー用各チューブに１００μＬの細胞懸濁液を加え、同時に、１００μＬの段階希釈されたヘテロダイマー抗体サンプル及び対照を加えた。フローサイトメトリー用チューブを氷上で３０分間インキュベートした。２％のＦＢＳを含むＤＰＢＳで２回洗浄した。２％のＦＢＳを含む４８８Ａ－Ｆａｂ－抗ヒトＩｇＧ（最終濃度は５μｇ／ｍＬ）の冷たいＤＰＢＳ２００μＬに再懸濁させた。氷上で、遮光で３０分間インキュベートした。２％のＦＢＳを含むＤＰＢＳで２回洗浄した。５００μＬの冷たいＤＰＢＳに再懸濁させた。この細胞懸濁液をフローサイトメトリー（ＢＤ、ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ）で検出分析し、細胞中の蛍光強度を読み取った。
結果を図８のＡに示す。抗ＰＤ－Ｌ１／抗４－１ＢＢヘテロダイマー抗体ＢＨ３１２０ｈは、ＰＤ－Ｌ１に対して高い親和性を有し、ＰＤ－Ｌ１二価モノクローナル抗体の抗原結合活性よりやや弱い。図８のＢに示すように、抗ＰＤ－Ｌ１／抗４－１ＢＢヘテロダイマー抗体ＢＨ３１２０ｈは、４－１ＢＢに対する親和性が低く、４－１ＢＢ二価モノクローナル抗体の抗原結合活性より弱い。図８のＣに示すように、抗ＰＤ－Ｌ１／抗４－１ＢＢヘテロダイマー抗体ＢＨ３１２０ｈは、４－１ＢＢに対する親和性が高く、抗４－１ＢＢ二価モノクローナル抗体の抗原結合活性より強い。
実施例６ 抗ＰＤ－Ｌ１／抗４－１ＢＢヘテロダイマー抗体のリガンド－受容体結合へのブロッキング活性
ＰＤ－Ｌ１とＰＤ－１やＣＤ８０との結合へのブロッキング活性に対する検出の過程は、以下の通りである。ｐＨ＝９．６の炭酸塩緩衝溶液を使用して、１００μＬ／ウェルのコーティング量で１μｇ／ｍＬのコーティング濃度にて、９６ウェル高吸着型ＥＬＩＳＡプレート上に組換えヒトＰＤ－Ｌ１－Ｆｃ（株式会社アクロバイオシステムズ（北京）、カタログ番号ＰＤ１－Ｈ５２５８）をコーティングした。コーティングを４℃で一晩行った。ＰＢＳＴで５回洗浄した。１％のＢＳＡを含むＰＢＳＴで３００μＬ／ウェルにてブロッキングし、２５℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで５回洗浄した。１％のＢＳＡを含むＰＢＳＴで段階希釈したヘテロダイマー抗体サンプル及び対照を５０μＬ／ウェルで添加し、且つ、ビオチンで標識したＰＤ－１－Ｆｃ（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｈａｎｍｉ Ｐｈａｒｍ社）５０μＬを加え、濃度を４０ｎＭとし（最終濃度は２０ｎＭ）、又は、ビオチンで標識したＣＤ８０－Ｆｃ（株式会社アクロバイオシステムズ（北京）、カタログ番号Ｂ７１－Ｈ８２Ｆ２）５０μＬを加え、濃度を１００ｎＭとし（最終濃度は５０ｎＭ）、２５℃で９０分間インキュベートした。ＰＢＳＴで５回洗浄した。次いで、１％のＢＳＡを含むＰＢＳＴで１：１０００にて希釈した、Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－ＨＲＰ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、カタログ番号５５４０６６）を１００μＬ／ウェルで加え、２５℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで５回洗浄した。発色基質ＴＭＢを１００μＬ／ウェルで添加し、室温で１０分間発色させた。１ＭのＨ２ＳＯ４を１００μＬ／ウェルで添加することにより、発色を停止させた。４５０ｎｍでの吸光度をマイクロプレートリーダーで読み取った。
結果を図９のＡに示す。抗ＰＤ－Ｌ１／抗４－１ＢＢヘテロダイマー抗体ＢＨ３１２０ｈは、ＰＤ－Ｌ１とＰＤ－１との結合をブロッキングすることができ、抗ＰＤ－Ｌ１二価モノクローナル抗体よりやや弱い。図９のＢに示すように、抗ＰＤ－Ｌ１／抗４－１ＢＢヘテロダイマー抗体ＢＨ３１２０ｈは、ＰＤ－Ｌ１とＣＤ８０との結合をブロッキングすることができる。
実施例７ 抗ＰＤ－Ｌ１／抗４－１ＢＢヘテロダイマー抗体のＴ細胞への調節活性
混合リンパ球反応（ＭＬＲ）により抗ＰＤ－Ｌ１／抗４－１ＢＢヘテロダイマー抗体のＴ細胞免疫反応への調節活性を測定した。
ヒト樹状細胞（ＤＣ）の取得：Ｍｏｎｏｃｙｔｅ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ、カタログ番号１３００９１１５３）の取扱説明書を参照してヒト単核細胞を単離した。簡単に言えば、まず、ＤＰＢＳ（ＧＩＢＣＯ、カタログ番号１４１９０－１３６）でＰＢＭＣ（Ａｌｌｃｅｌｌｓ、カタログ番号ＰＢ０００５－Ｃ）を一回洗浄してから、ＰＢＭＣを１０７細胞当たり４０μＬの単離用緩衝液（ＰＢＳは２ｍＭのＥＤＴＡ及び０．５％のＢＳＡを含み、ｐＨ＝７．２）で再懸濁させ（以下の使用量は、いずれも１０７細胞で計算される）、且つ、１０μＬのＦｃＲブロッキング試薬及び１０μＬのＢｉｏｔｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃｏｃｋｔａｉｌ（ビオチン標識抗体の混合物）を加え、４℃で５分間インキュベートした。さらに３０μＬの単離用緩衝液及び２０μＬのＡｎｔｉ－Ｂｉｏｔｉｎ ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ（抗ビオチンマイクロビーズ）を加え、４℃で１０分間インキュベートした。ＭＡＣＳ単離カラムを通過させて、ヒト単核細胞を得た。ヒト単核細胞を５×１０６／ｍＬの細胞密度で無血清ＲＰＭＩ １６４０培地（ＧＩＢＣＯ、カタログ番号２２４００－０８９）に再懸濁させ、細胞培養瓶に接種し、完全培地（１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ １６４０）にインキュベートし、且つ、２００ｎｇ／ｍＬのＧＭ－ＣＳＦ（北京シノバイオロジカル社、カタログ番号１００１５－ＨＮＡＨ）及び１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ－４（北京シノバイオロジカル社、カタログ番号１１８４６－ＨＮＡＥ）を加えた。３日間インキュベートし、培養液を交換し、さらに３日間インキュベートした。その後、培地を２００ｎｇ／ｍＬのＧＭ－ＣＳＦ、１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ－４及び２０ｎｇ／ｍＬのＴＮＦ－α（北京シノバイオロジカル社、カタログ番号１０６０２－ＨＮＡＥ）を含む完全培地（１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ １６４０）に交換し、１日間インキュベートして、ＤＣ細胞を得た。
ヒトＴ細胞の取得：ヒトＰＢＭＣ細胞を蘇生して収集し、このＰＢＭＣと、ＤＣ細胞を誘導するＰＢＭＣが異なる個体に由来することを保証した。Ｐａｎ Ｔ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ、カタログ番号１３００９６５３５）の取扱説明書を参照してヒトＴ細胞を単離した。簡単に言えば、まず、ＤＰＢＳでＰＢＭＣを一回洗浄してから、ＰＢＭＣを１０７細胞当たり４０μＬの単離用緩衝液（ＰＢＳは２ｍＭのＥＤＴＡ及び０．５％のＢＳＡを含む、ｐＨ＝７．２）で再懸濁させ（以下の使用量は、いずれも１０７細胞で計算される）、且つ、１０μＬのＰａｎ Ｔ ｃｅｌｌ Ｂｉｏｔｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｐａｎ Ｔ細胞ビオチン標識抗体の混合物）を加え、４℃で５分間インキュベートした。さらに３０μＬの単離用緩衝液及び２０μＬのＰａｎ Ｔ ｃｅｌｌ ＭｉｃｒｏＢｅａｄ Ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｐａｎ Ｔ細胞マイクロビーズ混合物）を加え、４℃で１０分間インキュベートした。ＭＡＣＳ単離カラムを通過させて、Ｔ細胞を得た。
収集したヒトＤＣ細胞及びヒトＴ細胞を完全培地（１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ １６４０）に再懸濁させ、９６ウェルプレートに接種した。接種されたＤＣ細胞及びＴ細胞をそれぞれ１×１０４個の細胞／ウェル、１×１０５個の細胞／ウェルとし、混合してインキュベートした。さらに、完全培地で段階希釈されたヘテロダイマー抗体サンプル及び対照を加えた。培養プレートを３７℃で二酸化炭素インキュベータに置いて５日間インキュベートした。インキュベート終了後、ウェル内の上清を取り出し、ＩＬ－２検出キット（ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ、カタログ番号ＥＬＨ－ＩＬ２）を用いて説明書に従ってサイトカインの含有量を検出した。簡単に言えば、１００μＬの標準品及び希釈済みのサンプルをサンプル検出用プレートに加え、２５℃で２．５時間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴで５回洗浄し、ビオチンで標識した検出抗体１００μＬを加え、２５℃で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴで５回洗浄し、その後、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識したストレプトアビジンを１００μＬ／ウェルで加え、２５℃で４５分間インキュベートした。ＰＢＳＴで５回洗浄した。発色基質ＴＭＢを１００μＬ／ウェルで添加し、室温で１０分間発色させた。１ＭのＨ２ＳＯ４を１００μＬ／ウェルで添加することにより、発色を停止させた。４５０ｎｍでの吸光度をマイクロプレートリーダーで読み取った。
結果を図１０に示す。ヒトＴ細胞は、同種異体ＤＣ細胞からの刺激によって、活性化されてＩＬ－２を分泌した。抗ＰＤ－Ｌ１及び抗４－１ＢＢ二価抗体を加えることにより、Ｔ細胞への活性化を増強させ、サイトカインの分泌を促進させた。抗ＰＤ－Ｌ１／抗４－１ＢＢヘテロダイマー抗体ＢＨ３１２０ｈも強いＴ細胞への調節活性を示し、サイトカインＩＬ－２の分泌を著しく促進させた。
実施例８ 抗ＰＤ－Ｌ１／抗４－１ＢＢヘテロダイマー抗体を介した４－１ＢＢアゴニスト活性
ＧＳ－Ｈ２／４－１ＢＢ細胞（ジェンスクリプトから購入）を収集し、２％のＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ、カタログ番号ＳＨ３００８４．０３）を含むＭＥＭ＋Ｇｌｕ培地（ＧＩＢＣＯ、カタログ番号４１０９０１０１）で一回洗浄した。ＧＳ－Ｈ２／４－１ＢＢを、２％のＦＢＳを含むＭＥＭ＋Ｇｌｕ培地に１×１０５個の細胞／ｍＬの密度で再懸濁させた。９６ウェル平底細胞培養プレート（Ｃｏｓｔａｒ、カタログ番号３５９９）を取り、細胞懸濁液を１００μＬ／ウェルで添加し、培養プレートを３７℃で二酸化炭素インキュベータに置いて２時間インキュベートして、細胞を培養プレートに接着させた。ヘテロダイマー抗体サンプル及び対照を、２％のＦＢＳを含むＭＥＭ＋Ｇｌｕ培地に希釈して、ＧＳ－Ｈ２／４－１ＢＢ細胞を敷いた細胞培養プレートに５０μＬ加えた。同時に、ＤＬＤ－１／ＰＤ－Ｌ１細胞（ＤＬＤ－１は中国科学院から購入）を収集し、２％のＦＢＳを含むＭＥＭ＋Ｇｌｕ培地で１×１０５個の細胞／ｍＬの細胞懸濁液を調製し、５０μＬ採取してＧＳ－Ｈ２／４－１ＢＢ細胞を敷いた、ヘテロダイマー抗体サンプル及び対照を加えた細胞培養プレートに加えた。細胞培養プレートを３７℃で二酸化炭素インキュベータに置いて２４時間インキュベートし、細胞培養上清を採取し、ＩＬ－８検出キット（達科為社（Ｄａｋｅｗｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏ., Ｌｔｄ.）、カタログ番号１１１０８０２）を用いて説明書に従ってサイトカインの含有量を検出した。簡単に言えば、１００μＬの標準品及び希釈済みのサンプルをサンプル検出用プレートに加え、同時に、ビオチンで標識した検出抗体を５０μＬ加え、２５℃で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴで５回洗浄し、その後、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識したストレプトアビジンを１００μＬ／ウェルで加え、２５℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで５回洗浄した。発色基質ＴＭＢを１００μＬ／ウェルで添加し、室温で１０分間発色させた。１ＭのＨ２ＳＯ４を１００μＬ／ウェルで添加することにより、発色を停止させた。４５０ｎｍでの吸光度をマイクロプレートリーダーで読み取った。
結果を図１１に示す。抗４－１ＢＢ二価モノクローナル抗体を添加することにより、ある程度のＧＳ－Ｈ２／４－１ＢＢ細胞の活性化を誘導して、少量のＩＬ－８を分泌させることができる一方、抗ＰＤ－Ｌ１二価抗体を添加しても、ＧＳ－Ｈ２／４－１ＢＢ細胞を活性化することができない。これに対して、抗ＰＤ－Ｌ１／抗４－１ＢＢヘテロダイマー抗体ＢＨ３１２０ｈは、ＤＬＤ－１／ＰＤ－Ｌ１細胞上のＰＤ－Ｌ１とＧＳ－Ｈ２／４－１ＢＢ細胞上の４－１ＢＢと架橋することができ、これにより、４－１ＢＢをクラスター化させてＧＳ－Ｈ２／４－１ＢＢ細胞を強く活性化させ、大量のＩＬ－８を発生させた。
実施例９ 抗ＰＤ－Ｌ１／抗４－１ＢＢヘテロダイマー抗体の遺伝子ノックインマウスでの抗ＭＣ３８腫瘍薬力学的研究
６～８週齢の雌ｈＰＤ－Ｌ１／ｈ４－１ＢＢ二重標的ヒト化マウス（マウス由来のＰＤ－Ｌ１及び４－１ＢＢがノックアウトされ、ヒト由来のＰＤ－Ｌ１及び４－１ＢＢが過剰発現している。江蘇バイオサイトジェン社）を実験材料として使用した。マウスを環境に１週間適応させた後、マウス１匹につき、５×１０５個のＭＣ３８／ｈＰＤ－Ｌ１マウス結腸腫瘍細胞（ＭＣ３８は、Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｓｈｕｎｒａｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏ., Ｌｔｄ(上海舜冉)から購入）を右側の背部に皮下接種した。腫瘍体積が約１００ｍｍ３まで達した場合、腫瘍体積によって、担癌マウスを６匹ずつ群分けた。それぞれ溶媒（ＤＰＢＳ、ＧＩＢＣＯ、カタログ番号１４１９０－１３６）、抗ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体３５ｎｍｏｌ／ｋｇ、抗４－１ＢＢモノクローナル抗体３５ｎｍｏｌ／ｋｇ及び抗ＰＤ－Ｌ１／抗４－１ＢＢヘテロダイマー抗体７０ｎｍｏｌ／ｋｇ（モノクローナル抗体が二価抗体であることを考慮したところ、二重特異性抗体の抗ＰＤ－Ｌ１、抗４－１ＢＢがいずれも一価である）を週３回、２週連続投与した。投与方式は、腹腔内注投与であった。投与日から腫瘍体積を週に２回測量し、その長径ａ、短径ｂを測量した。腫瘍体積の計算式は、腫瘍体積（ｍｍ３）＝（ａ×ｂ２）／２である。腫瘍体積の測量の持続時間は４週間であり、即ち、投与を中止した後、さらに２週間観察した。
結果を図１２に示す。同種腫瘍モデルにおいて、抗ＰＤ－Ｌ１／抗４－１ＢＢヘテロダイマー抗体ＢＨ３１２０ｈは、抗ＰＤ－Ｌ１二価抗体及び抗４－１ＢＢ二価抗体よりも強い抗腫瘍効果を有する。
実施例１０ 抗ＰＤ－Ｌ１／抗４－１ＢＢヘテロダイマー抗体と抗ＰＤ－１抗体の併用による遺伝子ノックインマウスでの抗ＣＴ－２６腫瘍薬力学的研究
動物として、６～８週齢の雌ｈＰＤ１／ｈＰＤＬ１／ｈＣＤ１３７三重標的ヒト化マウス（江蘇集萃薬康社）を選択した。マウスを環境に１週間適応させた後、マウス１匹につき、５×１０５個のＣＴ－２６／ｈＰＤ－Ｌ１マウス結腸腫瘍細胞（江蘇集萃薬康社）を右頸の背部に皮下接種した。腫瘍体積が約１００ｍｍ３まで達した場合、腫瘍体積によってランダムに群分けた。それぞれ溶媒（ＤＰＢＳ）、抗ＰＤ－Ｌ１／４－１ＢＢ二重抗体１０ｍｇ／ｋｇ、抗ＰＤ－１モノクローナル抗体（ＢＨ２９１７ｂ）５ｍｇ／ｋｇ及び併用群（１０＋５ｍｇ／ｋｇ）を２日毎に１回、４回連続投与した。投与方式は、腹腔内投与であった。投与日から腫瘍体積を週に３回測量し、その長径及び短径の値を記録し、以下の式に従って腫瘍体積を計算した。腫瘍体積＝［（短径＾２×長径）／２］。腫瘍成長に対する阻害率は、以下の式に従って計算した。腫瘍成長に対する阻害率＝［１－ＲＴＶ（実験群）／ＲＴＶ（対照群）］×１００％。ＲＴＶ：相対腫瘍体積、ＲＴＶ＝Ｖｔ／Ｖ０、Ｖｔ：時間ｔにおける腫瘍体積、Ｖ０：初期腫瘍体積。結果を図１３に示す。同種腫瘍モデルにおいて、抗ＰＤ－Ｌ１／抗４－１ＢＢヘテロダイマー抗体ＢＨ３１２０と抗ＰＤ－１抗体とを併用する場合、より良好な相乗的な抗腫瘍活性を示した。ＣＴ－２６－ｈＰＤ－Ｌ１細胞を接種してから２０日後、対照群に比べて、ＢＨ２９１７ｂ（５ｍｇ／ｋｇ）及びＢＨ３１２０（１０ｍｇ／ｋｇ）場合の腫瘍体積はいずれも減少し、腫瘍成長に対する阻害率は、それぞれ４４．１％及び３７．３％であった。ＢＨ３１２０＋ＢＨ２９１７ｂ（１０＋５ｍｇ／ｋｇ）の場合は、腫瘍の増殖を著しく阻害することができ、腫瘍成長に対する阻害率は、７９．６％であった。ｔ検定により分析したところ、ＢＨ３１２０（１０ｍｇ／ｋｇ）の場合に比べて、併用療法群では腫瘍体積は著しく減少し、且つ統計学的に有意な差がある（Ｐ＜０．０５）。ＢＨ２９１７ｂ（５ｍｇ／ｋｇ）群に比べて、併用療法群での腫瘍体積は減少したが、統計学的に有意な差がない（Ｐ＞０．０５）。
実施例１１ 抗ＰＤ－Ｌ１／抗４－１ＢＢヘテロダイマー抗体と抗ＰＤ－１抗体の併用による遺伝子ノックインマウスでの抗ＭＣ３８腫瘍薬力学的研究
動物として、６～８週齢の雌ｈＰＤ１／ｈＣＤ１３７二重標的ヒト化マウス（江蘇集萃薬康社及びバイオサイトジェン社）を選択した。マウスを環境に１週間適応させた後、マウス１匹につき、１×１０６個のＭＣ３８／ｈＰＤ－Ｌ１マウス結腸腫瘍細胞（江蘇集萃薬康社）を右頸の背部に皮下接種した。腫瘍体積が約１００ｍｍ３まで達した場合、腫瘍体積によってランダムに群分けた。それぞれ溶媒（ＤＰＢＳ）、抗ＰＤ－Ｌ１／４－１ＢＢ二重抗体１及び３ｍｇ／ｋｇ、抗ＰＤ－１モノクローナル抗体（ＢＨ２９１７ｂ）５ｍｇ／ｋｇ及び併用群（１＋５ｍｇ／ｋｇ）を週に２回、６回連続投与した。投与方式は、腹腔内投与であった。投与日から腫瘍体積を週に３回測量し、その長径及び短径の値を記録し、以下の式に従って腫瘍体積を計算した。腫瘍体積＝［（短径＾２×長径）／２］。腫瘍成長に対する阻害率は、以下の式に従って計算した：腫瘍成長に対する阻害率＝［１－ＲＴＶ（実験群）／ＲＴＶ（対照群）］×１００％。ＲＴＶ：相対腫瘍体積、ＲＴＶ＝Ｖｔ／Ｖ０、Ｖｔ：時間ｔにおける腫瘍体積、Ｖ０：初期腫瘍体積。結果を図１４に示す。同種腫瘍モデルにおいて、抗ＰＤ－Ｌ１／抗４－１ＢＢヘテロダイマー抗体ＢＨ３１２０と抗ＰＤ－１抗体とを併用する場合、より良好な相乗的な抗腫瘍活性を示した。ｈＰＤ－Ｌ１／ＭＣ３８細胞を接種してから３３日後、抗体単剤療法群では、一定の腫瘍阻害作用を有し、且つ用量依存性を有し、腫瘍成長に対する阻害率は、それぞれ、ＢＨ２９１７ｂ（５ｍｇ／ｋｇ）の場合は７６．５８％、ＢＨ３１２０（３ｍｇ／ｋｇ）の場合は４７．０７％、ＢＨ３１２０（１ｍｇ／ｋｇ）の場合は３０．９５％であった。ＢＨ３１２０＋ＢＨ２９１７ｂ（１＋５ｍｇ／ｋｇ）の併用療法では、腫瘍の増殖を著しく阻害し、ＴＧＩＴＶ％は、１２２．４０％であった。ｔ検定により分析したところ、ＢＨ３１２０（１ｍｇ／ｋｇ）群に比べて、統計学的に有意な差があり（Ｐ＜０．０５）、ＢＨ２９１７ｂ（５ｍｇ／ｋｇ）群に比べて統計学的に有意な差がある（Ｐ＜０．０１）。
本発明は、抗ＰＤ－Ｌ１／抗４－１ＢＢ天然抗体構造様ヘテロダイマー二重特異性抗体及びその製造方法に関する。具体的には、本発明は、天然ＩｇＧの特徴を有し、且つ重鎖－軽鎖のミスマッチがない、非常に安定なヘテロダイマー抗ＰＤ－Ｌ１／抗４－１ＢＢ二重特異性抗体及びその製造方法を提供する。
プログラム細胞死リガンド－１（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｄｅａｔｈ ｌｉｇａｎｄ １、ＰＤ－Ｌ１）は、免疫チェックポイントであるプログラム細胞死－１（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｄｅａｔｈ－１、ＰＤ－１）のリガンドであり、Ｂ７ファミリーに属しており、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単核細胞、マクロファージ、ＤＣ細胞、内皮細胞、表皮細胞などを含む多種の免疫細胞の表面に誘導的に発現する。ＰＤ－Ｌ１は、ＰＤ－１と結合すると、主にＴ細胞の活性化の負の調節に関与し、免疫応答の強弱及び持続時間を調節することができる。ＰＤ－Ｌ１は、ＰＤ－１のリガンドに加えて、ＣＤ８０のリガンドとして、Ｔ細胞へ負の調節のシグナルを伝達し、Ｔ細胞の免疫寛容を誘導することができる（Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ Ｒｅｖ， ２０１３， １２（１１）：１０９１－１１００．Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ， ２０１３， ４：４８１．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ， ２０１２， １２（４）：２５２－２６４．Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｏｌ Ｍｅｄ．２０１５ Ｊａｎ；２１（１）：２４－３３．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１２ Ｄｅｃ １５；１８（２４）：６５８０－７．）。通常の場合、ＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－１は、生体組織の自己免疫寛容を誘導及び維持し、炎症反応の過程において免疫系が過度に活性化して自己組織を傷つけることを防止し、自己免疫疾患の発生を避けるのに積極的な作用を有することができる。病理的状況では、それは、腫瘍免疫及び多種の自己免疫疾患の発生及び発展過程に関与する。多くの研究によると、ＰＤ－Ｌ１は多種の腫瘍組織で高発現し、ＰＤ－１は腫瘍浸潤リンパ球で高発現し、且つＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－１の過剰な発現は臨床的な腫瘍の予後不良と密接に関連することが報告された（Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ａｇｅｎｔｓ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ．２０１５；１５（３）：３０７－１３．Ｈｅｍａｔｏｌ Ｏｎｃｏｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｈｅｒ．２０１４ Ｍａｒ；７（１）：１－１７．Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｏｌ Ｍｅｄ．２０１５ Ｊａｎ；２１（１）：２４－３３．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．２０１３ Ｊｕｌ ２５；３９（１）：６１－７３．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．２０１５ Ｊｕｎ １０；３３（１７）：１９７４－８２．）。ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体による、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１及びＣＤ８０／ＰＤ－Ｌ１の相互作用へのブロッキングは、臨床前の実験研究及び臨床において良好な抗腫瘍効果を示した。現在、ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体は、既に非小細胞肺癌や尿路上皮癌などの多くの腫瘍の治療に用いられることが承認されている。
４－１ＢＢ（ＣＤ１３７、ＴＮＦＲＳＦ９などとも称される）は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）の膜貫通型タンパク質の一つである。４－１ＢＢは、ＤＣ、活性化された単核細胞、ＮＫ細胞、好中球、好酸球及び肥満細胞上に発現する。４－１ＢＢＬ（ＣＤ１３７Ｌ）は、ＴＮＦスーパーファミリーの糖タンパク質メンバーであり、主に活性化されたＢ細胞、マクロファージ、樹状細胞、骨髄系細胞上に発現する。４－１ＢＢは、ＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞であり、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫ（Ｔ）細胞）、Ｂ細胞及び好中球での共刺激分子である。４－１ＢＢが４－１ＢＢＬと結合すると、細胞内のシグナル経路が活性化される。研究の結果から明らかなように、いくつかの４－１ＢＢアゴニストｍＡｂは、多くのモデルで共刺激分子の発現を増加させるとともに、細胞溶解性Ｔリンパ球の応答を顕著に増強させ、抗腫瘍効果を引き起こす。
そこで、当分野ではＰＤ－Ｌ１及び４－１ＢＢと同時に結合する新規治療薬を研究する必要がある。
本発明は、天然ＩｇＧの構造特徴を有し、且つ重鎖－軽鎖のミスマッチがない、ＰＤ－Ｌ１及び４－１ＢＢと同時に結合することができる、非常に安定な新規ヘテロダイマー二重機能性抗体及びその製造方法を提供し、この二重機能性抗体は、ＰＤ－Ｌ１を高発現させる腫瘍細胞及び４－１ＢＢを発現させるＴ細胞と同時に結合する傾向があり、これにより、効率的且つ特異的な殺傷効果を発揮するとともに、毒性の低い副作用を有する。
本発明の第１の態様は、ＰＤ－Ｌ１と特異的に結合する第１の抗原結合機能領域及び４－１ＢＢと特異的に結合する第２の抗原結合機能領域を含む二重特異性抗体に関し、ここで、前記ＰＤ－Ｌ１と特異的に結合する第１の抗原結合機能領域は、
（Ａ）重鎖可変領域と、
（Ｂ）軽鎖可変領域と、を含み、
前記重鎖可変領域は、
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５に示すアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１と、
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６に示すアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２と、
（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７に示すアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３と、を含み、
前記軽鎖可変領域は、
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８に示すアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１と、
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９に示すアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２と、
（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０に示すアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３と、を含む。
いくつかの実施形態において、前記二重特異性抗体の４－１ＢＢと特異的に結合する第２の抗原結合機能領域は、
（Ａ）重鎖可変領域と、
（Ｂ）軽鎖可変領域と、を含み、
前記重鎖可変領域は、
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１に示すアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１と、
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２に示すアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２と、
（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３に示すアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３と、を含み、
前記軽鎖可変領域は、
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４に示すアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１と、
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５に示すアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２と、
（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６に示すアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３と、を含む。
いくつかの実施形態において、前記二重特異性抗体のＰＤ－Ｌ１と特異的に結合する第１の抗原結合機能領域は、
（Ａ）重鎖可変領域と、
（Ｂ）軽鎖可変領域と、を含み
前記重鎖可変領域は、
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５に示すアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１と、
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６に示すアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２と、
（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７に示すアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３と、を含み、
前記軽鎖可変領域は、
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８に示すアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１と、
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９に示すアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２と、
（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０に示すアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３と、を含み、
前記４－１ＢＢと特異的に結合する第２の抗原結合機能領域は、
（Ａ）重鎖可変領域と、
（Ｂ）軽鎖可変領域と、を含み、
前記重鎖可変領域は、
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１に示すアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１と、
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２に示すアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２と、
（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３に示すアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３と、を含み、
前記軽鎖可変領域は、
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４に示すアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１と、
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５に示すアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２と、
（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６に示すアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３と、を含む。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１５－２０に示すＰＤ－Ｌ１と特異的に結合する第１の抗原結合機能領域の６つのＣＤＲ配列及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２１－２６に示す４－１ＢＢと特異的に結合する第２の抗原結合機能領域の６つのＣＤＲ配列は、それぞれ本発明者がヒトＰＤ－Ｌ１と４－１ＢＢを抗原として、ハイブリドーマ技術を用いて得られたモノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖可変領域のＣＤＲであり、前記モノクローナル抗体は、従来技術で知られているＰＤ－Ｌ１抗体及び４－１ＢＢ抗体と異なり、且つ、例えばより高い結合特異性、抗腫瘍活性などのより高い生物学的活性を有する。
ＰＤ－Ｌ１と特異的に結合する第１の抗原結合機能領域の６つのＣＤＲ配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１５－２０に示す配列と少なくとも７０％の同一性、例えば少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又はそれ以上の同一性を有し、且つ対応する親配列の生物学的活性を保持し、又は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１５－２０に示す配列に対して、１つ又は複数、例えば１個、２個、３個又はそれ以上のアミノ酸残基を削除、置換及び／又は添加して得られた、対応する親配列の生物学的活性を保持したものである。
４－１ＢＢと特異的に結合する第２の抗原結合機能領域の６つのＣＤＲ配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２１－２６に示す配列と少なくとも７０％の同一性、例えば少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又はそれ以上の同一性を有し、且つ対応する親配列の生物学的活性を保持し、又は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２１－２６に示す配列に対して、１つ又は複数、例えば１個、２個、３個又はそれ以上のアミノ酸残基を削除、置換及び／又は添加して得られた、対応する親配列の生物学的活性を保持したものである。
いくつかの実施形態において、前記二重特異性抗体のＰＤ－Ｌ１と特異的に結合する第１の抗原結合機能領域は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示すアミノ酸配列を含むものであるか、又は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．６に示す配列と少なくとも７０％の同一性、例えば少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の同一性を有し、且つ対応する親配列の生物学的活性を保持しているものであるか、又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６に示す配列に対して、１つ又は複数、例えば１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個又はそれ以上のアミノ酸残基を削除、置換及び／又は添加して得られた、対応する親配列の生物学的活性を保持した変異体配列である。前記軽鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示すアミノ酸配列を含むものであるか、又は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２に示す配列と少なくとも７０％の同一性、例えば少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の同一性を有し、且つ対応する親配列の生物学的活性を保持しているものであるか、又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示す配列に対して、１つ又は複数、例えば１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個又はそれ以上のアミノ酸残基を削除、置換及び／又は添加して得られた、対応する親配列の生物学的活性を保持した変異体配列である。
いくつかの実施形態において、前記二重特異性抗体の４－１ＢＢと特異的に結合する第２の抗原結合機能領域は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示すアミノ酸配列を含むものであるか、又は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１２に示す配列と少なくとも７０％の同一性、例えば少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の同一性を有し、且つ対応する親配列の生物学的活性を保持しているものであるか、又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１２に示す配列に対して、１つ又は複数、例えば１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個又はそれ以上のアミノ酸残基を削除、置換及び／又は添加して得られた、対応する親配列の生物学的活性を保持した変異体配列である。前記軽鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示すアミノ酸配列を含むものであるか、又は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１０に示す配列と少なくとも７０％の同一性、例えば少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の同一性を有し、且つ対応する親配列の生物学的活性を保持しているものであるか、又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０に示す配列に対して、１つ又は複数、例えば１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個又はそれ以上のアミノ酸残基を削除、置換及び／又は添加して得られた、対応する親配列の生物学的活性を保持した変異体配列である。
いくつかの実施形態において、前記二重特異性抗体のＰＤ－Ｌ１と特異的に結合する第１の抗原結合機能領域は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示すアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示すアミノ酸配列を含む。また、４－１ＢＢと特異的に結合する前記第２の抗原結合機能領域は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示すアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示すアミノ酸配列を含む。
前記アミノ酸配列の組み合わせ方式は、生物学的法則に従うべきであり、即ち、軽鎖及び重鎖又は軽鎖及び重鎖の可変領域と抗原結合フラグメントが互いに合致すべきであり、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２とが互いに合致し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０とが互いに合致することは当業者に明らかである。
いくつかの実施形態において、前記二重特異性抗体の第１の抗原結合機能領域及び第２の抗原結合機能領域は、Ｆａｂフラグメント、ｓｃＦｖフラグメント及び可変ドメインフラグメントＦｖから選ばれる。
いくつかの実施形態において、前記二重特異性抗体の第１の抗原結合機能領域及び第２の抗原結合機能領域は、いずれもＦａｂフラグメントである。
いくつかの実施形態において、前記二重特異性抗体のＦａｂフラグメントは、異なる第１の重鎖可変領域及び第２の重鎖可変領域と、異なる第１の軽鎖可変領域及び第２の軽鎖可変領域と、を含む。
いくつかの実施形態において、前記二重特異性抗体の第１の抗原結合機能領域及び第２の抗原結合機能領域の一方は、Ｆａｂフラグメントであり、他方は、ｓｃＦｖである。
いくつかの実施形態において、前記二重特異性抗体は、第１のＦｃ鎖及び第２のＦｃ鎖と、ＰＤ－Ｌ１と特異的に結合できる第１の抗原結合機能領域及び４－１ＢＢと特異的に結合できる第２の抗原結合機能領域と、を含む。
ここで、前記第１のＦｃ鎖及び第２のＦｃ鎖は、いずれもアミノ酸の置換を含む免疫グロブリンＧのＦｃフラグメントであり、且つ、前記第１のＦｃ鎖と第２のＦｃ鎖は、共に、Ｆｃ受容体と結合できるヘテロダイマーを構成する。
ここで、前記第１のＦｃ鎖と第２のＦｃ鎖は、共有結合又はリンカーを介して前記第１の抗原結合機能領域と第２の抗原結合機能領域にそれぞれ連結されている。
且つ、前記第１のＦｃ鎖及び第２のＦｃ鎖のいずれか一方は、位置３６６及び位置３９９でのアミノ酸の置換を含み、他方は、位置３５１、位置４０７及び位置４０９でのアミノ酸の置換を含み、ここで、アミノ酸の位置は、Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスナンバリングシステムに従って番号付けされる。
いくつかの実施形態において、前記二重特異性抗体の第１のＦｃ鎖及び第２のＦｃ鎖のアミノ酸の置換は、以下の通りである。
ａ）Ｌ３５１Ｇ、Ｌ３５１Ｙ、Ｌ３５１Ｖ、Ｌ３５１Ｐ、Ｌ３５１Ｄ、Ｌ３５１Ｅ、Ｌ３５１Ｋ又はＬ３５１Ｗ；
ｂ）Ｔ３６６Ｌ、Ｔ３６６Ｐ、Ｔ３６６Ｗ又はＴ３６６Ｖ；
ｃ）Ｄ３９９Ｃ、Ｄ３９９Ｎ、Ｄ３９９Ｉ、Ｄ３９９Ｇ、Ｄ３９９Ｒ、Ｄ３９９Ｔ又はＤ３９９Ａ；
ｄ）Ｙ４０７Ｌ、Ｙ４０７Ａ、Ｙ４０７Ｐ、Ｙ４０７Ｆ、Ｙ４０７Ｔ又はＹ４０７Ｈ；及び
ｅ）Ｋ４０９Ｃ、Ｋ４０９Ｐ、Ｋ４０９Ｓ、Ｋ４０９Ｆ、Ｋ４０９Ｖ、Ｋ４０９Ｑ又はＫ４０９Ｒ。
いくつかの実施形態において、前記二重特異性抗体のアミノ酸の置換は、以下のものを含む。
ａ）第１のＦｃ鎖及び第２のＦｃ鎖のいずれか一方は、Ｔ３６６Ｌ及びＤ３９９Ｒの置換であり、他方は、Ｌ３５１Ｅ、Ｙ４０７Ｌ及びＫ４０９Ｖの置換である；
ｂ）第１のＦｃ鎖及び第２のＦｃ鎖のいずれか一方は、Ｔ３６６Ｌ及びＤ３９９Ｃの置換であり、他方は、Ｌ３５１Ｇ、Ｙ４０７Ｌ及びＫ４０９Ｃの置換である；
ｃ）第１のＦｃ鎖及び第２のＦｃ鎖のいずれか一方は、Ｔ３６６Ｌ及びＤ３９９Ｃの置換であり、他方は、Ｌ３５１Ｙ、Ｙ４０７Ａ及びＫ４０９Ｐの置換である；
ｄ）第１のＦｃ鎖及び第２のＦｃ鎖のいずれか一方は、Ｔ３６６Ｐ及びＤ３９９Ｎの置換であり、他方は、Ｌ３５１Ｖ、Ｙ４０７Ｐ及びＫ４０９Ｓの置換である；
ｅ）第１のＦｃ鎖及び第２のＦｃ鎖のいずれか一方は、Ｔ３６６Ｗ及びＤ３９９Ｇの置換であり、他方は、Ｌ３５１Ｄ、Ｙ４０７Ｐ及Ｋ４０９Ｓの置換である；
ｆ）第１のＦｃ鎖及び第２のＦｃ鎖のいずれか一方は、Ｔ３６６Ｐ及びＤ３９９Ｉの置換であり、他方は、Ｌ３５１Ｐ、Ｙ４０７Ｆ及びＫ４０９Ｆの置換である；
ｇ）第１のＦｃ鎖及び第２のＦｃ鎖のいずれか一方は、Ｔ３６６Ｖ及びＤ３９９Ｔの置換であり、他方は、Ｌ３５１Ｋ、Ｙ４０７Ｔ及びＫ４０９Ｑの置換である；
ｈ）第１のＦｃ鎖及び第２のＦｃ鎖のいずれか一方は、Ｔ３６６Ｌ及びＤ３９９Ａの置換であり、他方は、Ｌ３５１Ｗ、Ｙ４０７Ｈ及びＫ４０９Ｒの置換である。
いくつかの実施形態において、前記二重特異性抗体のアミノ酸の置換は、以下のものを含む。
ａ）第１のＦｃ鎖及び第２のＦｃ鎖のいずれか一方は、Ｔ３６６Ｌ及びＫ４０９Ｖの置換であり、他方は、Ｌ３５１Ｅ、Ｙ４０７Ｌ及びＤ３９９Ｒの置換である；
ｂ）第１のＦｃ鎖及び第２のＦｃ鎖のいずれか一方は、Ｔ３６６Ｌ及びＫ４０９Ｃの置換であり、他方は、Ｌ３５１Ｇ、Ｙ４０７Ｌ及びＤ３９９Ｃの置換である；
ｃ）第１のＦｃ鎖及び第２のＦｃ鎖のいずれか一方は、Ｔ３６６Ｌ及びＫ４０９Ｐの置換であり、他方は、Ｌ３５１Ｙ、Ｙ４０７Ａ及びＤ３９９Ｃの置換である；
ｄ）第１のＦｃ鎖及び第２のＦｃ鎖のいずれか一方は、Ｔ３６６Ｐ及びＫ４０９Ｓの置換であり、他方は、Ｌ３５１Ｖ、Ｙ４０７Ｐ及びＤ３９９Ｎの置換である；
ｅ）第１のＦｃ鎖及び第２のＦｃ鎖のいずれか一方は、Ｔ３６６Ｗ及びＫ４０９Ｓの置換であり、他方は、Ｌ３５１Ｄ、Ｙ４０７Ｐ及びＤ３９９Ｇの置換である；
ｆ）第１のＦｃ鎖及び第２のＦｃ鎖のいずれか一方は、Ｔ３６６Ｐ及びＫ４０９Ｆの置換であり、他方は、Ｌ３５１Ｐ、Ｙ４０７Ｆ及びＤ３９９Ｉの置換である；
ｇ）第１のＦｃ鎖及び第２のＦｃ鎖のいずれか一方は、Ｔ３６６Ｖ及びＫ４０９Ｑの置換であり、他方は、Ｌ３５１Ｋ、Ｙ４０７Ｔ及びＤ３９９Ｔの置換である；
ｈ）第１のＦｃ鎖及び第２のＦｃ鎖のいずれか一方は、Ｔ３６６Ｌ及びＫ４０９Ｒの置換であり、他方は、Ｌ３５１Ｗ、Ｙ４０７Ｈ及びＤ３９９Ａの置換である。
いくつかの実施形態において、前記二重特異性抗体の第１のＦｃ鎖及び第２のＦｃ鎖のいずれか一方のアミノ酸の置換は、Ｔ３６６Ｌ及びＤ３９９Ｒであり、他方のアミノ酸の置換は、Ｌ３５１Ｅ、Ｙ４０７Ｌ及びＫ４０９Ｖである。
いくつかの実施形態において、前記二重特異性抗体の第１のＦｃ鎖及び共有結合を介してそれに連結された第１の抗原結合機能領域並びに第２のＦｃ鎖及び共有結合を介してそれに連結された第２の抗原結合機能領域は、還元剤が存在する溶液中において、且つ、前記溶液中に前記第１のＦｃ鎖及び共有結合を介してそれに連結された第１の抗原結合機能領域と第２のＦｃ鎖及び共有結合を介してそれに連結された第２の抗原結合機能領域以外のポリペプチドが含まれていない場合、形成されたホモダイマーのすべてのポリペプチド鎖に基づく重量割合が、５０％未満、例えば４５％未満、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満又はそれ以下である。
いくつかの実施形態において、前記二重特異性抗体は、ＰＤ－Ｌ１と特異的に結合する第１の重鎖／第１の軽鎖のペアを含み、ここで、前記第１の重鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示すアミノ酸配列を含む重鎖定常領域と、を有する。前記第１の軽鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示すアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示すアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域と、を有する。
いくつかの実施形態において、前記二重特異性抗体は、４－１ＢＢと特異的に結合する第２の重鎖／第２の軽鎖のペアを含み、ここで、前記第２の重鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４に示すアミノ酸配列を含む重鎖定常領域と、を有する。前記第１の軽鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示すアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示すアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域と、を含む。
本発明の第２の態様は、前述したようなヘテロダイマー二重特異性抗体をコードする単離されたポリヌクレオチドに関する。
いくつかの実施形態において、第１の抗原結合機能領域のアミノ酸をコードするヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１及び５のヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態において、第２の抗原結合機能領域のアミノ酸をコードするヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１及び９のヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態において、第１の軽鎖及び第２の軽鎖のアミノ酸をコードするヌクレオチド配列は、いずれもＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態において、第１の重鎖及び第２の重鎖のいずれか一方のアミノ酸をコードするヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７のヌクレオチド配列を含み、他方のものをコードするヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３のヌクレオチド配列を含む。
本発明の第３の態様は、前述したような単離されたポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクターに関する。
いくつかの実施形態において、発現ベクターは、ｐＣＤＮＡに基づく改変により得られるプラスミドベクターＸ０ＧＣである。
本発明の第４の態様は、前述したような単離されたポリヌクレオチド又は前述したような組換え発現ベクターを含む宿主細胞に関する。
いくつかの実施形態において、前記宿主細胞は、ヒト胚性腎臓細胞ＨＥＫ２９３又はＨＥＫ２９３細胞に基づく改変により得られるＨＥＫ２９３Ｔ、ＨＥＫ２９３Ｅ、ＨＥＫ２９３Ｆ、ハムスター卵巣細胞ＣＨＯ又はＣＨＯ細胞に基づく改変により得られるＣＨＯ－Ｓ、ＣＨＯ－ｄｈｆｒ－、ＣＨＯ／ＤＧ４４、ＥｘｐｉＣＨＯ、大腸菌又は大腸菌に基づく改変により得られる大腸菌ＢＬ２１、ＢＬ２１（ＤＥ３）、Ｒｏｓｅｔｔａ、Ｏｒｉｇａｍｉ、酵母菌又は酵母に基づく改変により得られるピキア・パストリス、サッカロマイセス・セレビシエ、クルイベロマイセス・ラクティス、ハンセヌラ・ポリモルファ、昆虫細胞又は昆虫細胞に基づく改変により得られる細胞Ｈｉｇｈ５、ＳＦ９、植物細胞、哺乳動物の乳腺細胞、体細胞から選ばれる。
本発明の第５の態様は、前述したような二重特異性抗体又は前述したような単離されたポリヌクレオチド又は前述したような組換え発現ベクター又は前述したような宿主細胞、及び薬学的に許容される担体を含む組成物に関する。さらなる実施形態において、前記組成物は、少なくとも１種の第２の治療剤をさらに含み、好ましくは、前記第２の治療剤と、前記二重特異性抗体、単離されたポリヌクレオチド、組換え発現ベクター又は宿主細胞とは、前記組成物の異なる部分にあり、好ましくは、第２の治療剤は、抗ＰＤ－１抗体及び／又はＳＴＩＮＧアゴニストである。
本発明の第６の態様は、以下のステップを含む前述したような二重特異性抗体を生産する方法に関する。
１）宿主細胞において前述したような単離されたポリヌクレオチド又は前述したような組換え発現ベクターをそれぞれ発現させるステップと、
２）宿主細胞においてそれぞれ発現されたタンパク質を還元するステップと、
３）還元されたタンパク質を混合した後、混合物を酸化するステップと、を含む。
いくつかの実施形態において、宿主細胞は、ヒト胚性腎臓細胞ＨＥＫ２９３又はＨＥＫ２９３細胞に基づく改変により得られるＨＥＫ２９３Ｔ、ＨＥＫ２９３Ｆ、ＨＥＫ２９３Ｆ、ハムスター卵巣細胞ＣＨＯ又はＣＨＯ細胞に基づく改変により得られるＣＨＯ－Ｓ、ＣＨＯ－ｄｈｆｒ－、ＣＨＯ／ＤＧ４４、ＥｘｐｉＣＨＯ、大腸菌又は大腸菌に基づく改変により得られる大腸菌ＢＬ２１、ＢＬ２１（ＤＥ３）、Ｒｏｓｅｔｔａ、Ｏｒｉｇａｍｉ、酵母菌又は酵母に基づく改変により得られるピキア・パストリス、サッカロマイセス・セレビシエ、クルイベロマイセス・ラクティス、ハンセヌラ・ポリモルファ、昆虫細胞又は昆虫細胞に基づく改変により得られるＨｉｇｈ５細胞、ＳＦ９細胞、植物細胞、哺乳動物の乳腺細胞、体細胞から選ばれる。
いくつかの実施形態において、還元ステップは、１）２－メルカプトエチルアミン、ジチオスレイトール、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン又はその他の化学誘導体から選ばれる還元剤の存在下で還元反応を行うステップと、２）還元剤を除去するステップと、を含む。いくつかの実施形態において、還元剤は、０．１ｍＭ又はそれ以上の濃度、例えば０．１ｍＭ、０．２ｍＭ、０．３ｍＭ、０．４ｍＭ、０．５ｍＭ又はそれ以上のジチオスレイトールであり、反応条件として、４℃で少なくとも３時間、例えば３．５時間、４時間、４．５時間、５時間、５．５時間、６時間又はそれ以上反応させる。
いくつかの実施形態において、酸化ステップは、空気中での酸化であるが、Ｌ－デヒドロアスコルビン酸又はその化学誘導体から選ばれる酸化剤の存在下で酸化反応を行うステップをさらに含む。いくつかの実施形態において、酸化剤は、０．５ｍＭ又はそれ以上の濃度、例えば０．６ｍＭ、０．７ｍＭ、０．８ｍＭ、０．９ｍＭ、１．０ｍＭ、１．２ｍＭ、１．５ｍＭ又はそれ以上のＬ－デヒドロアスコルビン酸であり、反応条件として、４℃で少なくとも５時間、例えば５時間、６時間、７時間、８時間、９時間又はそれ以上反応させる。
いくつかの実施形態において、前記方法は、単離及び精製のステップをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記単離及び精製は、カチオン交換樹脂、アニオン交換樹脂、逆相クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー及びそれらの組み合わせによるものを含む。
本発明の第７の態様は、被験者の疾患を予防及び／又は治療するための薬剤の製造における、前述したような二重特異性抗体、及び／又は前述したような単離されたポリヌクレオチド、及び／又は前述したような組換え発現ベクター、及び／又は前述したような宿主細胞、及び／又は前述したような組成物の使用に関する。
本発明の第８の態様は、被験者の疾患を予防及び／又は治療するための薬剤として使用する、前述したような二重特異性抗体、及び／又は前述したような単離されたポリヌクレオチド、及び／又は前述したような組換え発現ベクター、及び／又は前述したような宿主細胞、及び／又は前述したような組成物に関する。
本発明の第９の態様は、必要とする被験者に、前述したような二重特異性抗体、及び／又は前述したような単離されたポリヌクレオチド、及び／又は前述したような組換え発現ベクター、及び／又は前述したような宿主細胞、及び／又は前述したような組成物を投与するステップを含む、疾患を予防及び／又は治療する方法に関する。
いくつかの実施形態において、被験者は、哺乳動物であり、好ましくは、ヒトである。
いくつかの実施形態において、前記疾患は、白血病、リンパ腫、骨髄腫、脳腫瘍、頭頸部扁平上皮癌、非小細胞肺癌、鼻咽頭癌、食道癌、胃癌、膵臓腺癌、胆嚢癌、肝癌、結腸直腸癌、乳癌、卵巣癌、宮頸癌、子宮内膜癌、子宮肉腫、前立腺癌、膀胱癌、腎細胞癌、黒色腫、小細胞肺癌、骨癌から選ばれる。
言い換えれば、本発明は、天然ＩｇＧの特徴を有し、且つ重鎖－軽鎖のミスマッチがない、非常に安定な新規抗ＰＤ－Ｌ１／抗４－１ＢＢ天然抗体構造様ヘテロダイマー二重特異性抗体を設計した。本発明で製造された二重特異性抗体は、２種類のターゲット分子ＰＤ－Ｌ１及び４－１ＢＢと同時に結合することができ、複雑な疾患の治療に応用される場合、単一の治療剤よりも優れた効果を発揮することができ、且つ副作用がより小さい。また、複数の薬剤の併用療法に対して、この二重特異性抗体は、単一の治療分子であるので、患者や医療従事者にとって使用が容易となるだけでなく、複雑な新薬開発プロセスを簡略化している。
抗ＰＤ－Ｌ１発現産物の溶出ピークのクロマトグラムを示す。 抗４－１ＢＢ発現産物の溶出ピークのクロマトグラムを示す。 抗ＰＤ－Ｌ１／抗４－１ＢＢ二重特異性抗体分子の構造を示す。 １つの重鎖及び１つの軽鎖を含む半抗体分子の構造を示す。 １つの重鎖及び１つの軽鎖を含む半抗体分子のＳＥＣ－ＨＰＬＣ分析の結果を示す。ここで、図５のＡ及びＢは、それぞれ抗ＰＤ－Ｌ１半抗体分子及び抗４－１ＢＢ半抗体分子の結果を示す。 抗ＰＤ－Ｌ１／抗４－１ＢＢ二重特異性抗体分子のＳＥＣ－ＨＰＬＣ分析の結果を示す。 抗ＰＤ－Ｌ１／抗４－１ＢＢ二重特異性抗体分子のＣＥ分析の結果を示す。 図８のＡは、ＰＤ－Ｌ１に対する抗ＰＤ－Ｌ１／抗４－１ＢＢ二重特異性抗体の親和性を示し、図８のＢは、４－１ＢＢに対する抗ＰＤ－Ｌ１／抗４－１ＢＢ二重特異性抗体の親和性を示し、図８のＣは、４－１ＢＢに対する抗ＰＤ－Ｌ１／抗４－１ＢＢ二重特異性抗体の親和性を示す。 図９のＡは、抗ＰＤ－Ｌ１／抗４－１ＢＢ二重特異性抗体のＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１結合へのブロッキング活性を示し、図９のＢは、抗ＰＤ－Ｌ１／抗４－１ＢＢ二重特異性抗体のＰＤ－Ｌ１／ＣＤ８０結合へのブロッキング活性を示す。 抗ＰＤ－Ｌ１／抗４－１ＢＢ二重特異性抗体のＴ細胞への調節活性を示す。 抗ＰＤ－Ｌ１／抗４－１ＢＢ二重特異性抗体を介した４－１ＢＢアゴニスト活性を示す。 遺伝子ノックインマウス同種腫瘍モデルにおける抗ＰＤ－Ｌ１／抗４－１ＢＢ二重特異性抗体の抗腫瘍効果を示す。 ＢＡＬＢ／ｃ－ｈＰＤ１／ｈＰＤＬ１／ｈＣＤ１３７マウスの腫瘍体積の変化を示す。 ｈ４－１ＢＢ／ｈＰＤ－１マウスの腫瘍体積データを示す。
定義：
本明細書において、用語「抗体」は、最も広い意味で使用され、抗原結合部位を含むタンパク質を指し、様々な構造を有する天然抗体及び人工抗体を含み、完全抗体及び抗体の抗原結合フラグメントを含むが、これらに限定されない。
本明細書において、用語「二重特異性抗体」は、２種類の異なる生物分子上のエピトープと特異的に結合する抗原結合ドメインを含む。特別な説明がない限り、記載されている二重特異性抗体の名称における二重特異性抗体が結合する抗原の順序は任意である。即ち、いくつかの実施形態において、用語「抗ＰＤ－Ｌ１／４－１ＢＢ二重特異性抗体」と「抗４－１ＢＢ／ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体」は互換的に使用されてもよい。いくつかの実施形態において、二重特異性抗体は、２つの半抗体を含み、ここで、各半抗体は、単一の重鎖可変領域及び任意の重鎖定常領域の少なくとも一部と、単一の軽鎖可変領域及び任意の軽鎖定常領域の少なくとも一部と、を含む。いくつかの実施形態において、二重特異性抗体は、２つの半抗体を含み、ここで、各半抗体は、単一の重鎖可変領域及び単一の軽鎖可変領域を含み、且つ、１個超えの単一の重鎖可変領域を含まず、１個超えの単一の軽鎖可変領域を含まない。いくつかの実施形態において、二重特異性抗体は、２つの半抗体を含み、ここで、各半抗体は、単一の重鎖可変領域及び単一の軽鎖可変領域を含み、且つ、第１の半抗体は、第１の抗原と結合するが第２の抗原と結合せず、第２の半抗体は、第２の抗原と結合するが第１の抗原と結合しない。
用語「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ領域」又は「ＣＤＲ」（本明細書において超可変領域「ＨＶＲ」とは互換的に使用されてもよい）とは、抗体可変ドメインのうち、配列的に高度に変異し且つ構造的に決定されたループ（「超可変ループ」）を形成し及び／又は抗原接触残基（「抗原接触点」）を含有する領域を指す。ＣＤＲは、主に抗原エピトープとの結合を担当する。本明細書において、重鎖の３つのＣＤＲは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３と呼ばれ、軽鎖的３つのＣＤＲは、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３と呼ばれる。
異なるナンバリングスキームに基づいて得られた同一の抗体の可変領域のＣＤＲの境界は異なる可能性があることに留意されたい。即ち、異なるナンバリングスキームで定義される同一の抗体可変領域のＣＤＲ配列は異なる。このため、本発明で定義される特定のＣＤＲ配列を用いて抗体を限定する場合、前記抗体の範囲は、可変領域配列が前記特定のＣＤＲ配列を含むが、異なるスキーム（例えば、異なるナンバリングスキームの規則又は組み合わせ）を適用することによって、いわゆるＣＤＲの境界が本発明で定義される特定のＣＤＲの境界と異なる抗体をさらに含む。
「共有結合」とは、ヘテロダイマー二重特異性抗体において、２つのＦｃ鎖の間やいずれか１つのＦｃ鎖とそれに連結された抗原結合機能領域との間を、共有結合により連結させて１つの分子を形成することを指す。ここで、Ｆｃ鎖は、１つ又は複数の共有結合（例えば、ジスルフィド結合）により連結された第１の抗原結合機能領域と第２の抗原結合機能領域とを含み、この第１のＦｃ鎖及び第２のＦｃ鎖は、それぞれ共有結合（例えば、イミン結合又はアミド結合）を介して抗原結合機能領域に連結されている。
抗原結合機能領域とは、抗原などの標的分子と特異的に相互作用することができる領域を指す。その作用は、高度な選択性がある。通常、１つの標的分子を認識する配列は、他の分子の配列を認識することができない。代表的な抗原結合機能領域は、抗体可変領域、抗体可変領域の構造変異体、受容体結合ドメイン、リガンド結合ドメイン、又は酵素結合ドメインを含む。
１つ又は複数のジスルフィド結合による鎖間結合とは、１つ又は複数のジスルフィド結合により第１のＦｃ鎖と第２のＦｃ鎖とを連結させてヘテロダイマーフラグメントを形成することを意味する。本発明において、１つ又は複数のジスルフィド結合は、第１のＦｃ鎖及び第２のＦｃ鎖、又は第１のＦｃ鎖及び第２のＦｃ鎖並びにそれらに連結された抗原結合機能領域が同じ細胞において合成される場合に形成することができるか、又は第１のＦｃ鎖及び第２のＦｃ鎖、又は第１のＦｃ鎖及び第２のＦｃ鎖並びにそれらに連結された抗原結合機能領域が異なる細胞において別々に合成された後にインビトロ還元－酸化プロセスにより形成することができる。
第１のＦｃ鎖及び第２のＦｃ鎖とは、ジスルフィド結合を含む共有結合により形成された結合フラグメントを指し、各鎖は、少なくとも、免疫グロブリンの重鎖定常領域の一部を含む。また、前記第１のＦｃ鎖と第２のＦｃ鎖は、アミノ酸配列が異なり、少なくとも１つのアミノ酸が異なる。本発明の第１のＦｃ鎖及び第２のＦｃ鎖において、同じ鎖間に強力な反発力が存在する一方で、異なる鎖間に引力が存在するので、第１のＦｃ鎖及び第２のＦｃ鎖、又は第１のＦｃ鎖及び第２のＦｃ鎖並びにそれらに連結された抗原結合機能領域は、共に、細胞において発現されている場合、ヘテロダイマーを形成する傾向がある。第１のＦｃ鎖及び第２のＦｃ鎖、又は第１のＦｃ鎖及び第２のＦｃ鎖並びにそれらに連結された抗原結合機能領域が２つの宿主細胞において別々に発現される場合、第１のＦｃ鎖又は第１のＦｃ鎖及びそれに連結された抗原結合機能領域は、ホモダイマーを形成する傾向がなく、第２のＦｃ鎖又は第２のＦｃ鎖及びそれに連結された抗原結合機能領域は、ホモダイマーを形成する傾向がない。本発明において、第１のＦｃ鎖及び第２のＦｃ鎖、又は第１のＦｃ鎖及び第２のＦｃ鎖並びにそれらに連結された抗原結合機能領域は、還元剤の存在下で２つの宿主細胞において別々に発現される場合、ホモダイマーの割合は、５０％未満、即ち、モノマー（１つのＦｃ鎖又は１つのＦｃ鎖及びそれに連結された抗原結合機能領域）の割合は、５０％を超える。
免疫グロブリンは、比較的長く、比較的大きい相対分子量を有し、４５０～５５０個のアミノ酸残基を含み、５５０００Ｄａ～７００００Ｄａの間の相対分子量を有する２つの同じ重鎖と、比較的短く、比較的小さい相対分子量を有し、約２１０個のアミノ酸残基を含み、約２４０００Ｄａの相対分子量を有する２つの同じ軽鎖（Ｌ鎖）とを含む４つのポリペプチド鎖を有する対称構造を有する。Ｎ末端付近の約１１０個のアミノ酸の配列は、異なる免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖において大きく変化しており、可変領域（ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ、Ｖ領域）と呼ばれる。これに対して、Ｃ末端付近の残りのアミノ酸配列は、比較的安定であり、定常領域（ｃｏｎｓｔａｎｔ ｒｅｇｉｏｎ、Ｃ領域）と呼ばれる。抗体の各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書においてＶＨと略記する）及び重鎖定常領域（本明細書においてＣＨと略記する）から構成され、各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書においてＶＬと略記する）及び軽鎖定常領域（本明細書においてＣＬと略記する）から構成される。重鎖において、可変領域は、重鎖の長さの約１／４を占めるが、定常領域は、重鎖の長さの約３／４を占める。既知の五つのクラスのＩｇ、即ちＩｇＧ（γ）、ＩｇＡ（α）、ＩｇＤ（δ）、ＩｇＭ（μ）及びＩｇＥ（ε）に関しては、最初の３つのＩｇのＨ鎖には、３つの定常領域があり、即ち、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３からなる。最後の２つのタイプ（ＩｇＭ及びＩｇＥ）のＨ鎖には、１つのＶＨ領域及び４つの定常領域、即ち、ＣＨ１～ＣＨ４がある。定常領域は、免疫グロブリン分子のフレームワークでもあり、免疫反応を活性化する領域の１つでもある。本発明の実施例は、ＩｇＧに関するが、公知の方法により本発明の抗体のクラスを変換できることは当業者に明らかである。例えば、本発明の最初のＩｇＭ抗体は、クラスを本発明のＩｇＧ抗体に変換することができる。なお、クラス変換技術によりＩｇＧサブクラスを別のサブクラスに変換することができ、例えば、ＩｇＧｌをＩｇＧ２に変換することができる。このため、本発明の抗体のエフェクター機能は、様々な治療用途のために、アイソタイプ切り替えにより例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＥ又はＩｇＭ抗体に変換することができる。一実施例において、本発明の抗体は、ＩｇＧ１抗体、例えば、ＩｇＧ１，κである。
本発明において、定常領域の一部は、少なくとも第１のＦｃ鎖及び第２のＦｃ鎖が相互に作用する領域を含む。ＩｇＧについて、前記領域は、少なくともＧＬＮ３４７、ＴＹＲ３４９、ＴＨＲ３５０、ＬＥＵ３５１、ＳＥＲ３５４、ＡＲＧ３５５、ＡＳＰ３５６、ＧＬＵ３５７、ＬＹＳ３６０、ＳＥＲ３６４、ＴＨＲ３６６、ＬＥＵ３６８、ＬＹＳ３７０、ＡＳＮ３９０、ＬＹＳ３９２、ＴＨＲ３９４、ＰＲ０３９５、ＶＡＬ３９７、ＡＳＰ３９９、ＳＥＲ４００、ＰＨＥ４０５、ＴＹＲ４０７、ＬＹＳ４０９、ＬＹＳ４３９を含む、ＣＨ３領域に位置する一部のアミノ酸である。
「第１のＦｃ鎖及び第２のＦｃ鎖がそれぞれ共有結合又はリンカーを介して１つの抗原結合機能領域に連結されること」とは、第１のＦｃ鎖及び第２のＦｃ鎖がそれぞれ共有結合又はリンカーを介して１つの抗体の抗原結合フラグメント、又は抗原を認識できる単鎖抗体、又は抗原を認識できる他の抗体フラグメントの構造変異体、又はリガンドを認識できる受容体、又は受容体を認識できるリガンドに連結されることを指す。ここで、前記共有結合とは、化学結合の１種であり、２つ又は複数の原子がそれらの外側の電子を共有して、理想的には電子的飽和状態に達することにより、共有結合と呼ばれる比較的安定な化学構造を構成する。言い換えれば、共有結合とは、電子対を共有することにより原子間に形成される相互作用である。同じ元素又は異なる元素の原子は、いずれも共有結合を介して結合されてもよい。本発明の第１のＦｃ鎖と第２のＦｃ鎖との間の共有結合として、１つのアミノ酸分子のアミノ基と別のアミノ酸分子のカルボキシル基との間の脱水反応により形成されるアミド結合、エチレングリコール若しくはポリエチレングリコール、又は他の化合物、又はそのポリマーのアルデヒド基と１つのアミノ酸分子のアミノ基とから形成されるアミド結合若しくはイミン結合を含むが、これらに限定されない。ここで、リンカーは、共有結合により２つのポリペプチド鎖を連結することができるアミノ酸の配列又は化合物若しくは化合物のポリマーであり、ここで、アミノ酸の配列は、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳなどの小さなペプチドセグメントを含むが、これに限定されない。アミド結合を介して第１のＦｃ鎖又は第２のＦｃ鎖、及び抗原を認識できる単鎖抗体、又は抗原を認識できる他の抗体フラグメントの構造変異体を連結させることができる。
第１のＦｃ鎖及び第２のＦｃ鎖が各々のホモダイマーを形成するものではなくヘテロダイマーを形成する傾向があることとは、第１のＦｃ鎖及び第２のＦｃ鎖において、同じポリペプチド鎖間に反発力が存在する一方で、異なるポリペプチド鎖間に引力が存在するので、細胞において同時発現される場合、第１のＦｃ鎖及び第２のＦｃ鎖、又は第１のＦｃ鎖及び第２のＦｃ鎖並びにそれらに連結された抗原結合機能領域がヘテロダイマーを形成する傾向があることを指す。第１のＦｃ鎖及び第２のＦｃ鎖、又は第１のＦｃ鎖及び第２のＦｃ鎖並びにそれらに連結された抗原結合機能領域が２つの宿主細胞において別々に発現される場合、第１のＦｃ鎖又は第１のＦｃ鎖及びそれらに連結された抗原結合機能領域は、ホモダイマーを形成する傾向がなく、第２のＦｃ鎖又は第２のＦｃ鎖及びそれらに連結された抗原結合機能領域は、ホモダイマーを形成する傾向がない。
Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスナンバリングシステムとは、Ｋａｂａｔによる方法に基づいて抗体配列の各アミノ酸に番号を割り当てることを指し、このような各残基に番号を割り当てる方法は、当該技術分野における標準的な方法になっている。Ｋａｂａｔのスキームは、彼の研究を越えて、他の抗体に拡張することができる。保存されたアミノ酸に基づいて、目的抗体をＫａｂａｔにより同定されたコンセンサス配列のうちの１つと照合させる。本明細書において、特に断りがない限り、抗体のアミノ酸位置は、いずれもＫａｂａｔ ＥＵインデックスナンバリングシステムに基づいて番号を割り当てる。
Ｆｃドメインとは、エフェクター分子又は細胞と相互作用するＩｇの部分である、ＩｇのＣＨ２及びＣＨ３ドメインに対応するフラグメント結晶化可能な領域（ｆｒａｇｍｅｎｔ ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｂｌｅ、Ｆｃ）を指す。
免疫グロブリンＧ（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇ、ＩｇＧ）の略号であるＩｇＧは、血清中の主な抗体成分である。ヒトＩｇＧは、ＩｇＧ分子のｒ鎖における抗原性の相違に基づいて、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４の４つのサブクラスに分類される。
半抗体分子とは、抗体の１つの重鎖と１つの軽鎖により形成される構造であって、重鎖及び軽鎖が、共有結合を介して連結されてもされなくてもよいものを指し、抗原を認識する一価抗体構造である。
Ｆａｂフラグメントは、抗原結合フラグメント（ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｆ ａｎｔｉｇｅｎ ｂｉｎｄｉｎｇ、Ｆａｂ）であり、インタクトな軽鎖と重鎖のＶＨ及びＣＨＩドメインとから構成される、抗体分子の２つのアームに対応する分子認識配列である。ｓｃＦｖは、分子認識配列であり、抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を遺伝子工学的に改変して得られる抗体フラグメントの構造変異体である。膜受容体の細胞外領域は、分子認識配列である。膜受容体は、通常、対応する抗原又はリガンドを認識し結合することができる細胞の外部に位置する細胞外領域と、受容体を細胞の表面に固定する膜貫通領域と、キナーゼ活性を有するか又はシグナルを伝達することができる細胞の内部に位置する細胞内領域とを含む。細胞膜受容体のリガンドとは、膜受容体の細胞外領域によって認識し結合されるタンパク質、小さなペプチド又は化合物を指す。サイトカインは、免疫原、マイトジェン、又は他の刺激物により誘導される様々な細胞により生産される低分子量可溶性タンパク質であり、自然免疫、適応免疫、血球生成、細胞成長及び成人多能性幹細胞（ＡＰＳＣ）の調整、及び損傷組織の修復などの様々な機能を有する。サイトカインは、インターロイキン、インターフェロン、腫瘍壊死因子スーパーファミリー、コロニー刺激因子、ケモカイン、成長因子などに分類される。タンパク質発現タグとは、目的タンパク質のＮ末端又はＣ末端に付加される、小さなペプチド又は長いアミノ酸のいずれかであるアミノ酸配列を指す。タグの付加は、タンパク質の正しいフォールディング、タンパク質の単離及び精製、並びにタンパク質の細胞内分解の減少に有利であり得る。通常使用されるタグとして、ＨＡ、ＳＵＭＯ、Ｈｉｓ、ＧＳＴ、ＧＦＰ、及びＦｌａｇを含むが、これらに限定されない。
本発明のヘテロダイマー二重特異性抗体に適用可能な抗体には何ら制限はない。好ましくは、従来技術で知られている、疾患の治療及び／又は予防に使用可能な抗体は、いずれも本発明に使用されてもよい。
本発明のヘテロダイマー二重特異性抗体は、１つ又は複数の置換、欠失、付加、及び／又は挿入を有してもよい。例えば、いくつかのアミノ酸は、他のポリペプチド（例えば抗原）又は細胞への結合能力を著しく失うことなく、タンパク質構造中の他のアミノ酸と置換することができる。タンパク質の生物学的機能活性は、結合能力及びタンパク質の特徴によって決定されるので、タンパク質配列に対して、それらの生物学的効果又は活性を著しく失うことなく、いくつかのアミノ酸配列の置換を行うことができる。
多くの場合、ポリペプチド変異体は、１つ又は複数の保存的置換を含む。保存的置換とは、ペプチド化学の分野での当業者がポリペプチドの二次構造及び親水性が実質的に変化しないと予想できるような、類似の特徴を有する他のアミノ酸でのアミノ酸の置換を指す。
アミノ酸の置換は、通常、アミノ酸の側鎖置換基の相対的類似性、例えばそれらの疎水性、親水性、電荷、サイズなどに基づくものである。様々な前記特徴を考慮すると、例示的な置換は、当業者にとって公知のものであり、アルギニン及びリジン、グルタミン酸及びアスパラギン酸、セリン及びスレオニン、グルタミン及びアスパラギン、並びにバリン、ロイシン、及びイソロイシンを含む。
本発明で使用される用語「同一性」は、当該分野で通常知られている意味を有し、異なる配列間の同一性を測定するための規則及び基準も当業者に知られており、（必要に応じて、最大相同性％を達成するために）配列を整列させて間隙を導入した後のポリヌクレオチド又はポリペプチド配列変異体と非変異体配列との間の同じ残基のパーセンテージを指す。本発明において、同一性の限定が満足される場合、得られた変異体配列は、親配列が保有する生物学的活性を有することも必要とされる。上記の活性によって変異体配列をスクリーニングする方法及び手段は、当業者に公知のものである。当業者は、本明細書中で開示される教示から、このような変異体配列を容易に得ることができる。具体的な実施形態において、ポリヌクレオチド及びポリペプチド変異体は、本明細書中で記載されるポリヌクレオチド又はポリペプチドと、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％、又は少なくとも約９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％又は９９．９％のポリヌクレオチド若しくはポリペプチド同一性を有する。遺伝子コードの冗長性のために、これらの配列と同じアミノ酸配列をコードする変異体が存在する。
本発明の別の実施形態において、中程度から高度にストリンジェントな条件下で、本発明により提供されるポリヌクレオチド配列、又はそのフラグメント、又はその相補配列とハイブリダイズすることができるポリヌクレオチド組成物を提供する。ハイブリダイゼーション技術は、分子生物学の分野で公知である。説明の目的で、本発明のポリヌクレオチドと他のポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションのテストに好適な中程度にストリンジェントな条件は、５×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、１．０ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の溶液で予備洗浄し、５０℃～６０℃にて５×ＳＳＣの条件下で一晩ハイブリダイズし、そして０．１％ＳＤＳを含む２×、０．５×及び０．２×ＳＳＣで６５℃にて２回２０分間洗浄することを含む。当業者は、例えばハイブリダイゼーション溶液の塩含有量及び／又はハイブリダイゼーション温度を変えることによって、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを容易に操作し得ることを理解している。例えば、別の実施形態において、好適な高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件として、上記の条件が含まれるが、ハイブリダイゼーション温度を、例えば６０～６５℃又は６５～７０℃まで上昇させることが異なる。
本発明の宿主細胞は、外来遺伝子を発現させるためのすべての細胞であってもよく、大腸菌、酵母、昆虫細胞、植物細胞、哺乳動物細胞を含むが、これらに限定されない。
本発明のベクターは、例えば、プラスミド、ファージ、コスミド及びミニ染色体を含む、任意の種類の細胞又は生体中で複製できるベクターを含む。いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターは、ポリヌクレオチドの増殖（ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ）若しくは複製に適したベクター、又は本発明のポリペプチドの発現に適したベクターである。このようなベクターは、当該技術分野で知られており、市販されている。
「ベクター」は、シャトルベクター及び発現ベクターを含む。通常、プラスミド構築物は、細菌におけるプラスミド複製及び選択のための複製起点（例えば、ＣｏＥｌ複製起点）並びに選択マーカー（例えば、アンピシリン又はテトラサイクリン耐性）をさらに含む。「発現ベクター」とは、細菌又は真核細胞において抗体フラグメントを含む本発明の抗体を発現するために必要な制御配列又は調節要素を含むベクターを指す。
本発明のベクターは、外来遺伝子を発現させるためのすべてのベクターであってもよく、プラスミドベクターを含むが、これに限定されない。ここで、プラスミドベクターは、少なくとも複製起点、プロモーター、目的遺伝子、マルチクローニングサイト、選択マーカー遺伝子を含み、好ましくは、本発明に係るベクターは、例えばＸ０ＧＣベクターなどの、ｐＣＤＮＡに基づく改変により得られるプラスミドベクターを含むが、これらに限定されない。
本発明の組成物は、少なくとも１種の第２の治療剤をさらに含み、好ましくは、前記第２の治療剤と、前記二重特異性抗体、単離されたポリヌクレオチド、組換え発現ベクター又は宿主細胞とは、前記組成物の異なる部分にあり、好ましくは、第２の治療剤は、抗ＰＤ－１抗体及び／又はＳＴＩＮＧアゴニストである。
本発明の組成物に含まれる第２の治療剤は、特に限定されないが、本発明の二重特異性抗体、単離されたポリヌクレオチド、組換え発現ベクター又は宿主細胞と生理学的に相容性を有すればよい。生理学的に相容性を有することは、被験者に投与した時に過度の刺激、毒性などの不良反応が生じないことを指す。いくつかの実施形態において、前記第２の治療剤は、前記二重特異性抗体、単離されたポリヌクレオチド、組換え発現ベクター又は宿主細胞と混合物として前記組成物中に存在する。いくつかの実施形態において、前記第２の治療剤と前記二重特異性抗体、単離されたポリヌクレオチド、組換え発現ベクター又は宿主細胞は、前記組成物の異なる部分にある。前記組成物の異なる部分にあることは、前記組成物が、互いに単離された部分から構成されることを指す。前記互いに単離された部分は、異なる容器、例えば異なるバイアル、シリンジ、小管にあってもよいし、同一の容器中の互いに分離された異なる仕切り部にあってもよい。前記互いに単離された部分は、投与前に混合して投与してもよく、又は、一定の時間間隔、例えば５分間、１０分間、２０分間、３０分間、１時間、５時間、１２時間、２４時間、４８時間、１週間、１ヶ月又はそれ以上の時間間隔で順次投与する。前記第２の治療剤は、前記二重特異性抗体、単離されたポリヌクレオチド、組換え発現ベクター又は宿主細胞と同じ又は異なる疾患を治療するための薬剤であってもよく、例えば、いずれも白血病を治療するための薬剤であり、又は、一方が白血病を治療するためのものであるが、他方が結腸腫瘍を治療するためのものである。いくつかの実施形態において、第２の治療剤は、抗炎症剤、例えばＩＬ－６阻害剤、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ－α）阻害剤、インターフェロンγ（ＩＦＮ－γ）阻害剤、皮質ステロイド、抗ヒスタミン薬、解熱剤及び／又は抗生素を含む。いくつかの実施形態において、第２の治療剤は、第２の抗体、免疫治療剤、標的治療剤又は化学治療剤からなる群から選ばれる。
いくつかの実施形態において、第２の治療剤は、抗体であり、この抗体のターゲットは、ＣＤ４７、ＣＤ７０、ＣＤ２００、ＣＤ１５４、ＣＤ２２３（ＬＡＧ－３）、ＫＩＲ（キラー細胞免疫グロブリン様受容体）、ＧＩＴＲ、ＣＤ２０、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ８６、ＣＤ１６０、ＣＤ２５８、ＣＤ２７０、ＣＤ２７５、ＣＤ２７６、ＯＸ４０Ｌ、Ｂ７－Ｈ４、ＧＩＴＲＬ、４－１ＢＢＬ、ＣＤ３、ＣＤ２５、ＣＤ４８、ＣＤ６６ａ、ＣＤ８０、ＣＤ９４、ＣＤ９６、ＣＤ１１２、ＣＤ１１５、ＣＤ２０５、ＣＤ２２６、ＣＤ２４４、ＣＤ２６２、ＣＤ２８４、ＣＤ２８８、白血病阻止因子（ＬＩＦ）、ＴＮＦＳＦ１５、ＴＤＯ２、ＩＧＦ－１Ｒ、ＧＤ２、ＴＭＩＧＤ２、ＲＧＭＢ、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＮＬ２、Ｂｔｎ、ＴＩＧＩＴ、Ｓｉｇｌｅｃｓ（シアル酸結合Ｉｇ様レクチン、即ちＳＩＧＬＥＣ １５）、ＶＥＧＦＲ、ＩＬＴファミリー、ＭＩＣＡ、ＴＧＦβ、ＳＴＩＮＧ経路（インターフェロン遺伝子経路の刺激因子）、アルギナーゼ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＨＨＬＡ２、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＴＬＡ－４、ＢＴＬＡ、インドールアミン２、３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ、ＩＤＯ１）、ＴＩＭ３、Ａ２Ａアデノシン受容体（ＡＤＯ受容体）、ＣＤ３９、ＣＤ７３、ＣＤ２７、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＯＸ４０、ＴＮＦＳＦ２５、ＩＬ－１０、ガレクチン、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＤＮＡＭ１、ＤＡＰ１０、ＣＤ１６（ＣＤ１６ａ、ＣＤ１６ｂ又はこの両者）、ＣＲＴＡＭ、ＣＤ２７、ＰＳＧＬ１、ＣＤ９６、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄとも呼ばれる）、ＮＫｐ８０、ＣＤ２４４（ＳＬＡＭＦ４又は２Ｂ４とも呼ばれる）、ＳＬＡＭＦ６、ＳＬＡＭＦ７、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＫＩＲ２ＤＳ４、ＫＩＲ３ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＳ３、ＫＩＲ２ＤＳ５、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＣＤ９４、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ又はＣＤ１６０から選ばれる。
いくつかの実施形態において、抗体は、抗ＰＤ－１抗体である。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ－１抗体は、ニボルマブ（ｎｉｖｏｌｕｍａｂ）、ペムブロリズマブ（ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）、セミプリマブ（ｃｅｍｉｐｌｉｍａｂ）、カムレリズマブ（Ｃａｍｒｅｌｉｚｕｍａｂ）、トリパリマブ（Ｔｏｒｉｐａｌｉｍａｂ）、シンチリマブ（ｓｉｎｔｉｌｉｍａｂ）、チスレリズマブ（ｔｉｓｌｅｌｉｚｕｍａｂ）、ペンプリマブ（Ｐｅｎｐｕｌｉｍａｂ）又はジンベレリマブ（ｚｉｍｂｅｒｅｌｉｍａｂ）である。
いくつかの実施形態において、第２の治療剤は、免疫治療剤である。免疫治療剤の非限定的な実施例として、抗体、小分子免疫調節剤、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞（ＤＣ）、養子細胞移植（ＡＣＴ）、免疫チェックポイント調節剤、サイトカイン、癌ワクチン、アジュバント、腫瘍溶解性ウイルス又はそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、免疫治療剤は、ＳＴＩＮＧアゴニストである。
いくつかの実施形態において、第２の治療剤は、標的治療剤である。「標的治療剤」とは、１種又は複数種の発がん性シグナル伝達タンパク質（例えば、細胞の成長及び生存に関与するもの）を特異的に標的にして阻害する分子を指す。このような標的治療剤の非限定的な実施例として、チロシンキナーゼ阻害剤（例えばイマチニブ（ｉｍａｔｉｎｉｂ、ＧＬＥＥＶＥＣ（登録商標））、ゲフィチニブ（ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ、ＩＲＥＳＳＡ（登録商標））、エルロチニブ（ｅｒｌｏｔｉｎｉｂ、ＴＡＲＣＥＶＡ（登録商標））、ソラフェニブ（ｓｏｒａｆｅｎｉｂ、ＮＥＸＡＶＡＲ（登録商標））、スニチニブ（ｓｕｎｉｔｉｎｉｂ、ＳＵＴＥＮＴ（登録商標））、ダサチニブ（ｄａｓａｔｉｎｉｂ、ＳＰＲＹＣＬ（登録商標））、ラパチニブ（ｌａｐａｔｉｎｉｂ、ＴＹＫＥＲＢ（登録商標））、ニロチニブ（ｎｉｌｏｔｉｎｉｂ、ＴＡＳＩＧＮＡ（登録商標））、ボルテゾミブ（ｂｏｒｔｅｚｏｍｉｂ、ＶＥＬＪＡＮＺ（登録商標））、タモキシフェン（ｔａｍｏｘｉｆｅｎ、ＮＯＬＶＡＤＥＸ（登録商標））、トファシチニブ（ｔｏｆａｃｉｔｉｎｉｂ、ＸＥＬＪＡＮＺ（登録商標））、ＡＬＫ阻害剤（例えばクリゾチニブ）、Ｂｃｌ－２阻害剤（例えばオバトクラックス（Ｏｂａｔｏｃｌａｘ）、ナビトクラックス（Ｎａｖｉｔｏｃｌａｘ）、ゴシポール）、ＰＡＲＰ阻害剤（例えばイニパリブ、オラパリブ）、ＰＩ３Ｋ阻害剤（例えばペリホシン）、アパチニブ、ＡＮ－１５２、Ｂｒａｆ阻害剤（例えばトラメチニブ、ＭＥＫ１６２）、ＣＤＫ阻害剤（例えばＰＤ－０３３２９９１、ＬＥＥ０１１）、Ｈｓｐ９０阻害剤（サリノマイシン、ＶＡＬ－０８３））；小分子薬物コンジュゲート（例えば、ビンタフォリド）；セリン－スレオニンキナーゼ阻害剤（例えば、テムシロリムス（ＴＯＲＩＳＥＬ（登録商標））、エベロリムス（ＡＦＩＮＩＴＯＲ（登録商標））、ベムラフェニブ（ＺＥＬＢＯＲＡＦ（登録商標））、トラメチニブ（ＭＥＫＩＮＩＳＴ（登録商標））、ダブラフェニブ（ＴＡＦＩＮＬＡＲ（登録商標））；抗体（例えば、抗ＣＤ２０抗体（例えば、リツキシマブ（ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標））、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体（例えば、トラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）））、アレムツズマブ（ＣＡＭＰＡＴＨ（登録商標））、抗ＥＧＦＲ抗体（例えば、セツキシマブ、パニツムマブ）、抗ＶＥＧＦ抗体（例えば、ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）））；抗体複合体、例えば抗体薬物複合体（ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ、ＡＤＣ）、免疫刺激抗体複合体（Ｉｍｍｕｎｅ－ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、ＩＳＡＣ）、抗体-オリゴヌクレオチド複合体（Ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ、ＡＯＣ）を含む。いくつかの実施形態において、抗体コンジュゲートは、ＡＤＣ類薬剤である。ＡＤＣ類薬剤の非限定的な実施例として、Ｈｅｒ２－ＡＤＣ、Ｔｒｏｐ２－ＡＤＣ、ＣＤ２２－ＡＤＣ、ＢＣＭＡ－ＡＤＣ、ＣＤ１９－ＡＤＣ、Ｎｅｃｔｉｎ－４－ＡＤＣを含む。
いくつかの実施例において、第２の治療剤は、化学治療剤であり、化学治療剤の非限定的な実施例として、例えば、テパディナ、ＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標）、シクロホスファミドといったアルキル化剤；テモゾロミド；例えばブスルファン、インプロスルファン、ピポスルファンといったアルキルスルホネート；例えばベンゾドパ、カルボコン、メツレデパ、ウレデパといったアジリジン類；ヘキサメチルメラミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスファミド、トリエチレンチオホスファミド、トリメチロールメラミンを含むエチレンイミン類及びメチルメラミン類；アセトゲニン（特にブラタシン及びブラタシノン）；カンプトテシン（合成類縁物質であるトポテカンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン（ｃａｌｌｙｓｔａｔｉｎ）；ＣＣ－１０６５（アドゼレシン、カルゼルシン及びビセレシン合成類縁物質を含む）；クリプトフィシン（特にクリプトフィシン１及びクリプトフィシン８）；アプリシアトキシン；デュオカルマイシン（合成類縁物質ＫＷ－２１８９及びＣＢ１－ＴＭ１を含む）；エリュテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチイン；スポンギスタチン；例えばクロランブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イソシクロホスファミド、ジクロロエチルメチルアミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩（ｍｅｃｈｌｏｒｅｔｈａｍｉｎｅ ｏｘｉｄｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、メルファラン、ノベムビチン（ｎｏｖｅｍｂｉｃｈｉｎ）、フェネステリン、プレドニマスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタードといったメクロレタミン；例えばカルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチンといったニトロソウレア類；例えばエンジイン類抗生物質（例えば、カリケアミシン、特にカリケアミシンγ１１及びカリケアミシンω１１（例えば、Ａｇｎｅｗ，Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，３３：１８３ １８６（１９９４）を参照されたい）といった抗生物質類；ジネミシンＡを含むジネミシン；例えばクロロホスホネートといったジホスホネート類；エスペラミシン、ネオカルジノスタチンクロモホア及び関連するクロモプロテイン系エンジイン類抗生物質クロモホア）；アクラシノマイシン類、アクチノマイシン、アントラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、アクチノマイシンＣ、カラビシン（ｃａｒａｂｉｃｉｎ）、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノマイシン、デトルビシン、６－ジアゾ－５－オキソ－Ｌ－ノルロイシン、ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標）、ドキソルビシン（モルホリノドキソルビシン、シアノモルホリノドキソルビシン、２－ピロリニル－ドキソルビシン及びデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、例えばマイトマイシンＣ、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポルフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラマイシン（ｑｕｅｌａｍｙｃｉｎ）、ロドルビシン、ルフォクロモマイシン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾリレビシンといったマイトマイシン；例えばメトトレキサート及び５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）といった代謝拮抗剤類；例えばデノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサートといった葉酸類縁物質；例えばフルダラビン、６－メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンといったプリン類縁物質；例えばアンシタビン、アザシチジン、６－アザウリジン、カルモフール、シタラビン、デオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジンといったピリミジン類縁物質；例えばカルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンといったアンドロゲン類；例えばアミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンといった抗アドレナリン類；例えばフォリン酸といった葉酸補充剤；アセグラトン；アルドホスファミド・グリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビスアントレン；エダトレキサート；デフォファミン；デメコルシン；ジアジクオン；エフロルニチン；エリプチニウムアセタート；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシカルバミド；レンチナン；ロニダミン；例えばメイタンシン及びアンサミトシンといったマイタンシノイド類；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フエナメッ卜；ピラルビシン；ロソキサントロン；ポドフィリン酸；２－エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）多糖類複合体（ＪＨＳ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇ．）；ラゾキサン；リゾマイシン（ｒｈｉｚｏｍｙｃｉｎ）；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン（ｔｒｉａｚｉｑｕｏｎｅ）；２，２’，２’’－トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特にＴ－２トキシン、ベルカリンＡ（ＶｅｒｒｕｃａｒｉｎＡ）、ロリジンＡ及びアングイジン）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ジブロモマンニトール；ジブロモズルシトール；ピポプロマン；ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）；シタラビン（「Ａｒａ－Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；例えばＴＡＸＯＬ（登録商標）（パクリタキセル；Ｂｒｉｓｔｏｌ Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、Ｎ．Ｊ．）、ＡＢＲＡＸＡＮＥ（登録商標）（クレモフォールを含まず、パクリタキセルのアルブミン工学的ナノ粒子製剤（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐａｒｔｎｅｒｓ、Ｓｃｈａｕｍｂｅｒｇ、１１１．）及びＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）ドセタキセル（Ｒｈｏｎｅ－Ｐｏｕｌｅｎｃ Ｒｏｒｅｒ、Ａｎｔｏｎｙ、フランス）といったパクリタキセル類縁物質；クロランブシル；ＧＥＭＺＡＲ（登録商標）ゲムシタビン；６－チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；例えばシスプラチン、オキサリプラチン及びカルボプラチンといったプラチナ類縁物質；ビンブラスチン；プラチナ；エトポシド（ＶＰ－１６）；イソシクロホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン（ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ）；ノバントロン；テニポシド；エダトレキサート；ダウノルビシン；アミノプテリン；カペシタビン；イバンドロナート；イリノテカン（Ｃａｍｐｔｏｓａｒ、ＣＰＴ－１１）（イリノテカンと５－ＦＵ及びホルミルテトラヒドロ葉酸を含む治療法）；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；例えばレチノイン酸といったレチノイド；カペシタビン；コンブレタスタチン；ホルミルテトラヒドロ葉酸（ＬＶ）；オキサリプラチン治療法（ＦＯＬＦＯＸ）を含むオキサリプラチン；ラパチニブ（ＴＹＫＥＲＢ）；ＰＫＣ－α、Ｒａｆ、Ｈ－Ｒａｓ、ＥＧＦＲ阻害剤（例えば、タルセバ（ＴＡＲＣＥＶＡ（登録商標））及び細胞増殖を減少させるＶＥＧＦ－Ａ及び上記のいずれかの物質の薬学的に許容される塩、酸又は誘導体を含む。
本発明の被験者は、鳥類、爬行動物、哺乳動物などを含む。好ましくは、哺乳動物は、げっ歯類の動物、霊長類動物を含み、より好ましくは、霊長類動物は、ヒトを含む。
本発明に係る疾患の範囲は、腫瘍を含むが、これらに限定されない。好ましくは、前記腫瘍は、白血病、リンパ腫、骨髄腫、脳腫瘍、頭頸部扁平上皮癌、非小細胞肺癌、鼻咽頭癌、食道癌、胃癌、膵臓腺癌、胆嚢癌、肝癌、結腸直腸癌、乳癌、卵巣癌、宮頸癌、子宮内膜癌、子宮肉腫、前立腺癌、膀胱癌、腎細胞癌、黒色腫、小細胞肺癌、骨癌を含む。
薬学的に許容される担体とは、薬学分野における一般的な医薬担体、例えば、希釈剤、賦形剤、水など、デンプン、ショ糖、乳糖、微晶セルロースなどの充填剤、セルロース誘導体、アルギン酸塩、ゼラチン及びポリビニルピロリドンなどの結合剤、グリセリンなどの湿潤剤、カルボキシメチルデンプンナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、架橋カルボキシメチルセルロース、寒天、炭酸カルシウム及び炭酸水素ナトリウムなどの崩壊剤、四級アンモニウム化合物などの吸収促進剤、ヘキサデカノール、ドデシル硫酸ナトリウムなどの界面活性剤、カオリナイト、ベントナイトなどの吸着担体、タルク粉末、ステアリン酸カルシウム及びステアリン酸マグネシウム、微粉化シリカゲル及びポリエチレングリコールなどの潤滑剤を指す。さらに、例えば香味料や甘味料などの他のアジュバントを組成物に添加してもよい。
以下、下記の非限定的な実施例により本発明をさらに説明する。本発明の要旨から逸脱することなく本発明に対して様々な修正を行うことができることは、当業者に知られている。このような修正も本発明の範囲内に含まれる。
以下の実験方法は、特に説明しない限り、いずれも通常の方法である。使用された実験材料は、特に説明しない限り、商業的企業から容易に入手することができる。本発明の以下の実施例で使用される各抗体は、いずれも市販の標準的抗体である。
実施例１ 抗ＰＤ－Ｌ１／抗４－１ＢＢヘテロダイマー抗体分子のベクターの構築
それぞれ抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体の重鎖及び軽鎖を含むＸ０ＧＣ発現ベクターを構築した。軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示され、アミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示される。軽鎖定常領域のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示され、アミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示される。重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示され、アミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示され、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示され、アミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示される。ＰＣＲ法により軽鎖可変領域及び軽鎖定常領域、重鎖可変領域及び重鎖定常領域をそれぞれ増幅した。本願の全てのＰＣＲ反応において、ＮＥＢ社のＰｈｕｓｉｏｎハイフィテリティＤＮＡポリメラーゼ（Ｆ－５３０Ｌ）を使用した。ＰＣＲプライマーを、塩基対の相補性の原則及び酵素切断部位の要件に従って従来通りに設計した。反応系としては、いずれも、８．９μＬのＨ２Ｏ、５×ＰｈｕｓｉｏｎハイフィテリティＤＮＡポリメラーゼ緩衝液４μＬ、４μＬの１ｍＭ ｄＮＴＰ、１μＬの上流プライマー、１μＬの下流プライマー、０．１μＬのＰｈｕｓｉｏｎハイフィテリティＤＮＡポリメラーゼ及び１μＬのテンプレートであった。可変領域及び定常領域のＰＣＲ産物を１．５％アガロースゲル電気泳動にかけた後、ＤＮＡ回収キット（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ａ９２８２、以下同様）により対応するフラグメントを回収した。回収した可変領域フラグメント及び定常領域フラグメントをテンプレートとして、可変領域の上流プライマー及び定常領域の下流プライマーを使用してさらなるＰＣＲ反応を行い、その後、対応するフラグメントを回収し、軽鎖又は重鎖の完全長フラグメントを得た。Ｘ０ＧＣベクター及完全長フラグメントをＥｃｏＲＩ（Ｔｈｅｒｍｏ、カタログ番号ＦＤ０２７５）及びＨｉｎｄＩＩＩ（Ｔｈｅｒｍｏ、カタログ番号ＦＤ０５０５）で酵素切断を行った。酵素切断反応系は、６μＬの１０×緩衝液、それぞれ２μＬのＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ、ゲルから回収された４０μＬの完全長フラグメント、及び１０μＬのＨ２Ｏであり、酵素切断反応系を３７℃で１時間反応させた。酵素切断産物をＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ、カタログ番号ＥＬ００１１）（以下同様）でライゲーションした反応系は、１μＬの１０×リガーゼ緩衝液、０．５μＬのリガーゼ、ゲルから回収された完全長フラグメント７．５μＬ、ゲルから回収されたＸ０ＧＣベクター１μＬであり、ライゲーションを２２℃で３０ｍｉｎ実施した。ライゲーション産物でＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αコンピテントセル（Ｔｉａｎｇｅｎ、ＣＢ１０４、以下同様）の形質転換を行った。それぞれ真核細胞において抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体の重鎖及び軽鎖を発現させるために、抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体の重鎖及び軽鎖のＸ０ＧＣ発現ベクターを得た。
本発明は、抗ヒト４－１ＢＢ抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域配列をそれぞれ含むＸ０ＧＣ発現ベクターを同時に構築した。軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９に示され、アミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示される。軽鎖定常領域のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３に示され、アミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示される。重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１１に示され、アミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示される。重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１３に示され、アミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４に示される。それぞれ真核細胞において抗ヒト４－１ＢＢ抗体の重鎖及び軽鎖を発現させるために、抗ヒト４－１ＢＢ抗体の重鎖及び軽鎖のＸ０ＧＣ発現ベクターを得た。
実施例２ 抗ＰＤ－Ｌ１／抗４－１ＢＢヘテロダイマー抗体分子の発現
抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体の重鎖及び軽鎖を含む発現ベクターをＥｘｐｉＣＨＯ細胞（ＥｘｐｉＣＨＯＴＭ細胞、カタログ番号Ａ２９１２７、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にコトランスフェクションした。また、抗ヒト４－１ＢＢ抗体の重鎖及び軽鎖を含む発現ベクターをＥｘｐｉＣＨＯ細胞にもコトランスフェクションした。
トランスフェクションの前日に、細胞を３．５×１０６細胞／ｍＬの接種密度で接種した。トランスフェクションの当日に、新鮮なＥｘｐｉＣＨＯ発現培地（ＥｘｐｉＣＨＯＴＭ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ、カタログ番号Ａ２９１００－０１、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で細胞を６×１０６細胞／ｍＬの希釈密度で希釈した。トランスフェクション体積に従ってプラスミドを取り出し、プラスミドの最終濃度を０．５μｇ／ｍＬとし、ＯｐｔｉＰＲＯＴＭ ＳＦＭ培地（ＯｐｔｉＰＲＯＴＭ ＳＦＭ、カタログ番号１２３０９－０１９、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でプラスミドをトランスフェクション体積の４％になるように希釈し、転倒混和した。６．４倍のプラスミドの量のＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ トランスフェクション試薬（ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ ＣＨＯ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ、カタログ番号Ａ２９１２９、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を取り出し、ＯｐｔｉＰＲＯＴＭ ＳＦＭ培地でトランスフェクション試薬をトランスフェクション体積の４％になるように希釈し、転倒混和した。希釈後のトランスフェクション試薬を希釈されたプラスミドに加えて、穏やかに混合し、室温で１～５ｍｉｎ静置し、細胞に徐々に滴下した。その後、細胞インキュベータ（ＣＯ２濃度は８％）に入れ、シェーカーで１２５ｒｐｍ、３７℃にて２０時間インキュベートした。０．００６倍のトランスフェクション体積のＥｘｐｉＣＨＯＴＭ エンハンサー（ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ ＣＨＯ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ、カタログ番号Ａ２９１２９、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び０．２４倍のトランスフェクション体積のＥｘｐｉＣＨＯＴＭ Ｆｅｅｄ（ＥｘｐｉＣＨＯＴＭ Ｆｅｅｄ、カタログ番号Ａ２９１０１－０２、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を細胞に徐々に滴下した。１２５ｒｐｍのシェーカーに入れて３２℃でインキュベートした。遠心により１０日間トランスフェクションした細胞培養上清を収集した。
Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａの方法により発現量を測定した。クロマトグラフィーカラムによる精製の前に、０．２２μｍのろ過膜膜によるろ過により沈殿を除去した。このステップを４℃で行った。
実施例３ 抗ＰＤ－Ｌ１／抗４－１ＢＢヘテロダイマー抗体分子発現産物の精製
ＡＫＴＡ ｅｘｐｌｏｒｅｒ １００型タンパク質精製システム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）及びアフィニティークロマトグラフィーカラムＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により室温で精製を行った。まず、クロマトグラフィーカラムを移動相Ａ（２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．４）で平衡化し、ベースラインを安定化させた後、上記のように処理した細胞の上清をロードし、ロードした後、移動相Ａを平衡化のために使用した。サンプルは、それぞれ抗ＰＤ－Ｌ１発現産物及び抗４－１ＢＢ発現産物であった。その後、２～３カラム容積の移動相Ｂ（１Ｍ塩化ナトリウムを含む移動相Ａ）でカラムを洗浄してから、２～３カラム容積の移動相Ａで洗浄し、その後、５カラム容積の移動相Ｃ（１００ｍＭグリシン、ｐＨ３．５）で溶出させ、溶出ピーク、即ち目的タンパク質のピークを収集した。抗ＰＤ－Ｌ１発現産物の溶出ピークのクロマトグラムを図１に示し、抗４－１ＢＢ発現産物の溶出ピークを図２に示す。示された溶出ピーク（図示した灰色領域）を収集し、且つ、１ＭのＴｒｉｓアルカリ溶液を滴下することにより、ｐＨを７．２に調整し、ＮａＣｌを最終濃度が０．１５Ｍになるように添加し、無菌化濾過した後、２～８℃で貯蔵した。
実施例４ 抗ＰＤ－Ｌ１／抗４－１ＢＢヘテロダイマー抗体分子の製造及び精製
抗ＰＤ－Ｌ１／抗４－１ＢＢヘテロダイマー抗体分子の構造を図３に示す。
上記のＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）による方法により精製された産物に対してインビトロ組換えを行うことにより、ヘテロダイマーを得た。まず、上述のようにして精製し収集したタンパク質溶液をシステインで還元する過程において、ジスルフィド結合が切断され、抗ＰＤ－Ｌ１及び抗４－１ＢＢ産物中に含まれるホモダイマー抗体分子のヒンジ領域中のジスルフィド結合も切断されて、１つの重鎖及び１つの軽鎖を含む半抗体分子を形成し、構造を図４に示す。還元サンプルを、移動相の緩衝液に１ｍＭのＤＴＴ還元剤が含まれるＳＥＣ－ＨＰＬＣ（ｓｈｏｄｅｘ、ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｗ－８０３）で分析し、結果を図５のＡ及びＢにそれぞれ示し、抗ＰＤ－Ｌ１及び抗４－１ＢＢのホモダイマー分子の割合は、いずれも１０％未満であり、半抗体分子の割合は、いずれも９０％超であった。
その後、還元された抗ＰＤ－Ｌ１及び抗４－１ＢＢ半抗体分子を等モル比で混合し、室温で０．５時間組換え反応を行い、組換えの過程において、抗ＰＤ－Ｌ１及び抗４－１ＢＢ半抗体分子の両方を含むヘテロダイマー二重特異性抗体を、抗ＰＤ－Ｌ１及び抗４－１ＢＢ半抗体分子からＣＨ２－ＣＨ３間の非共有結合性相互作用を介して形成し、次いで、タンパク質溶液を限外ろ過により濃縮し（１０ｋＤａの公称カットオフ分子量）、溶液を２０ｍＭのリン酸塩緩衝液、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．１ｍＭのシスチンに置換し、室温で酸化反応を一晩行い、ヘテロダイマー二重特異性抗体のジスルフィド結合を再形成させた。
上記の抗ＰＤ－Ｌ１及び抗４－１ＢＢ発現産物を還元酸化して得られた抗ＰＤ－Ｌ１／抗４－１ＢＢヘテロダイマー抗体分子を限外ろ過により濃縮し（１０ｋＤａの公称カットオフ分子量）、溶液を２０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に置換した。ＡＫＴＡ ｅｘｐｌｏｒｅｒ １００型タンパク質精製システム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）及びイオンクロマトグラフィーカラムＰｏｒｏｓ ＸＳ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）により精製を室温で行った。まず、クロマトグラフィーカラムを移動相Ａ（２０ｍＭのクエン酸、ｐＨ６．０）で平衡化し、ベースラインを安定化させた後、上述のように処理したタンパク質溶液をロードし、ロードした後、移動相Ａを平衡化のために使用した。その後、カラムを１５カラム容積でＡ（２０ｍＭのクエン酸、ｐＨ６．０）からＢ（２０ｍＭのクエン酸、２００ｍＭアルギニン、ｐＨ６．０）（０％Ｂ～１００％Ｂ、８０ｍｉｎ）の勾配にて洗浄した。主な溶出ピークを収集し、収集したタンパク質溶液を限外ろ過により濃縮し（１０ｋＤａの公称カットオフ分子量）、溶液を２０ｍＭのクエン酸、１４０ｍＭのアルギニン（ｐＨ６．０）に置換し、ろ過して滅菌し、０．０２％Ｔｗｅｅｎ８０を加え、４℃で保存した。精製された抗ＰＤ－Ｌ１／抗４－１ＢＢヘテロダイマー抗体分子ＢＨ３１２０ｈに対してＳＥＣ－ＨＰＬＣによる純度分析を行い、結果を図６に示し、純度は、９８．５４％である。ＣＥ分析を行ったところ、結果を図７に示し、純度は、９６．４４％である。
実施例５ 抗ＰＤ－Ｌ１／抗４－１ＢＢヘテロダイマー抗体の標的結合活性
酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）により抗ＰＤ－Ｌ１／抗４－１ＢＢヘテロダイマー抗体と単一の抗原との結合能力を測定した。具体的な実施過程は、以下の通りである。ｐＨ＝９．６の炭酸塩緩衝溶液を使用して、１００μＬ／ウェルで１μｇ／ｍＬのコーティング濃度にて、９６ウェル高吸着型ＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｓｔａｒ、カタログ番号４２５９２）に組換えヒトＰＤ－Ｌ１（北京シノバイオロジカル社、カタログ番号１００８４－Ｈ０８Ｈ）又はヒト４－１ＢＢ（北京シノバイオロジカル社、カタログ番号１００４１－Ｈ０８Ｈ）をコーティングした。コーティングを４℃で一晩行った。ＰＢＳＴで５回洗浄した。１％のＢＳＡを含むＰＢＳＴで３００μＬ／ウェルにてブロッキングし、２５℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで５回洗浄した。１％のＢＳＡを含むＰＢＳＴで段階希釈したヘテロダイマー抗体サンプル及び対照を１００μＬ／ウェルで添加し、２５℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで５回洗浄した。次いで、１％のＢＳＡを含むＰＢＳＴで１：１００００にて希釈した、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識した抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、カタログ番号ＡＰ３０９Ｐ）を１００μＬ／ウェルで添加し、２５℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで５回洗浄した。発色基質ＴＭＢを１００μＬ／ウェルで添加し、室温で１０分間発色させた。１ＭのＨ２ＳＯ４を１００μＬ／ウェルで添加することにより、発色を停止させた。４５０ｎｍでの吸光度をマイクロプレートリーダーで読み取った。
同時に、ＧＳ－Ｈ２／４－１ＢＢ細胞により、抗ＰＤ－Ｌ１／抗４－１ＢＢヘテロダイマー抗体と４－１ＢＢ抗原との結合能力を測定した。具体的な実施過程は、以下の通りである。ＧＳ－Ｈ２／４－１ＢＢ細胞（ジェンスクリプトから購入）を収集し、２％のＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ、カタログ番号ＳＨ３００８４．０３）を含む冷たいＤＰＢＳ（ＧＩＢＣＯ、カタログ番号１４１９０－１３６）で一回洗浄した。ＧＳ－Ｈ２／４－１ＢＢを、２％のＦＢＳを含む冷たいＤＰＢＳに５×１０６個の細胞／ｍＬの密度で再懸濁させた。フローサイトメトリー用各チューブに１００μＬの細胞懸濁液を加え、同時に、１００μＬの段階希釈されたヘテロダイマー抗体サンプル及び対照を加えた。フローサイトメトリー用チューブを氷上で３０分間インキュベートした。２％のＦＢＳを含むＤＰＢＳで２回洗浄した。２％のＦＢＳを含む４８８Ａ－Ｆａｂ－抗ヒトＩｇＧ（最終濃度は５μｇ／ｍＬ）の冷たいＤＰＢＳ２００μＬに再懸濁させた。氷上で、遮光で３０分間インキュベートした。２％のＦＢＳを含むＤＰＢＳで２回洗浄した。５００μＬの冷たいＤＰＢＳに再懸濁させた。この細胞懸濁液をフローサイトメトリー（ＢＤ、ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ）で検出分析し、細胞中の蛍光強度を読み取った。
結果を図８のＡに示す。抗ＰＤ－Ｌ１／抗４－１ＢＢヘテロダイマー抗体ＢＨ３１２０ｈは、ＰＤ－Ｌ１に対して高い親和性を有し、ＰＤ－Ｌ１二価モノクローナル抗体の抗原結合活性よりやや弱い。図８のＢに示すように、抗ＰＤ－Ｌ１／抗４－１ＢＢヘテロダイマー抗体ＢＨ３１２０ｈは、４－１ＢＢに対する親和性が低く、４－１ＢＢ二価モノクローナル抗体の抗原結合活性より弱い。図８のＣに示すように、抗ＰＤ－Ｌ１／抗４－１ＢＢヘテロダイマー抗体ＢＨ３１２０ｈは、４－１ＢＢに対する親和性が高く、抗４－１ＢＢ二価モノクローナル抗体の抗原結合活性より強い。
実施例６ 抗ＰＤ－Ｌ１／抗４－１ＢＢヘテロダイマー抗体のリガンド－受容体結合へのブロッキング活性
ＰＤ－Ｌ１とＰＤ－１やＣＤ８０との結合へのブロッキング活性に対する検出の過程は、以下の通りである。ｐＨ＝９．６の炭酸塩緩衝溶液を使用して、１００μＬ／ウェルのコーティング量で１μｇ／ｍＬのコーティング濃度にて、９６ウェル高吸着型ＥＬＩＳＡプレート上に組換えヒトＰＤ－Ｌ１－Ｆｃ（株式会社アクロバイオシステムズ（北京）、カタログ番号ＰＤ１－Ｈ５２５８）をコーティングした。コーティングを４℃で一晩行った。ＰＢＳＴで５回洗浄した。１％のＢＳＡを含むＰＢＳＴで３００μＬ／ウェルにてブロッキングし、２５℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで５回洗浄した。１％のＢＳＡを含むＰＢＳＴで段階希釈したヘテロダイマー抗体サンプル及び対照を５０μＬ／ウェルで添加し、且つ、ビオチンで標識したＰＤ－１－Ｆｃ（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｈａｎｍｉ Ｐｈａｒｍ社）５０μＬを加え、濃度を４０ｎＭとし（最終濃度は２０ｎＭ）、又は、ビオチンで標識したＣＤ８０－Ｆｃ（株式会社アクロバイオシステムズ（北京）、カタログ番号Ｂ７１－Ｈ８２Ｆ２）５０μＬを加え、濃度を１００ｎＭとし（最終濃度は５０ｎＭ）、２５℃で９０分間インキュベートした。ＰＢＳＴで５回洗浄した。次いで、１％のＢＳＡを含むＰＢＳＴで１：１０００にて希釈した、Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－ＨＲＰ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、カタログ番号５５４０６６）を１００μＬ／ウェルで加え、２５℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで５回洗浄した。発色基質ＴＭＢを１００μＬ／ウェルで添加し、室温で１０分間発色させた。１ＭのＨ２ＳＯ４を１００μＬ／ウェルで添加することにより、発色を停止させた。４５０ｎｍでの吸光度をマイクロプレートリーダーで読み取った。
結果を図９のＡに示す。抗ＰＤ－Ｌ１／抗４－１ＢＢヘテロダイマー抗体ＢＨ３１２０ｈは、ＰＤ－Ｌ１とＰＤ－１との結合をブロッキングすることができ、抗ＰＤ－Ｌ１二価モノクローナル抗体よりやや弱い。図９のＢに示すように、抗ＰＤ－Ｌ１／抗４－１ＢＢヘテロダイマー抗体ＢＨ３１２０ｈは、ＰＤ－Ｌ１とＣＤ８０との結合をブロッキングすることができる。
実施例７ 抗ＰＤ－Ｌ１／抗４－１ＢＢヘテロダイマー抗体のＴ細胞への調節活性
混合リンパ球反応（ＭＬＲ）により抗ＰＤ－Ｌ１／抗４－１ＢＢヘテロダイマー抗体のＴ細胞免疫反応への調節活性を測定した。
ヒト樹状細胞（ＤＣ）の取得：Ｍｏｎｏｃｙｔｅ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ、カタログ番号１３００９１１５３）の取扱説明書を参照してヒト単核細胞を単離した。簡単に言えば、まず、ＤＰＢＳ（ＧＩＢＣＯ、カタログ番号１４１９０－１３６）でＰＢＭＣ（Ａｌｌｃｅｌｌｓ、カタログ番号ＰＢ０００５－Ｃ）を一回洗浄してから、ＰＢＭＣを１０７細胞当たり４０μＬの単離用緩衝液（ＰＢＳは２ｍＭのＥＤＴＡ及び０．５％のＢＳＡを含み、ｐＨ＝７．２）で再懸濁させ（以下の使用量は、いずれも１０７細胞で計算される）、且つ、１０μＬのＦｃＲブロッキング試薬及び１０μＬのＢｉｏｔｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃｏｃｋｔａｉｌ（ビオチン標識抗体の混合物）を加え、４℃で５分間インキュベートした。さらに３０μＬの単離用緩衝液及び２０μＬのＡｎｔｉ－Ｂｉｏｔｉｎ ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ（抗ビオチンマイクロビーズ）を加え、４℃で１０分間インキュベートした。ＭＡＣＳ単離カラムを通過させて、ヒト単核細胞を得た。ヒト単核細胞を５×１０６／ｍＬの細胞密度で無血清ＲＰＭＩ １６４０培地（ＧＩＢＣＯ、カタログ番号２２４００－０８９）に再懸濁させ、細胞培養瓶に接種し、完全培地（１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ １６４０）にインキュベートし、且つ、２００ｎｇ／ｍＬのＧＭ－ＣＳＦ（北京シノバイオロジカル社、カタログ番号１００１５－ＨＮＡＨ）及び１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ－４（北京シノバイオロジカル社、カタログ番号１１８４６－ＨＮＡＥ）を加えた。３日間インキュベートし、培養液を交換し、さらに３日間インキュベートした。その後、培地を２００ｎｇ／ｍＬのＧＭ－ＣＳＦ、１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ－４及び２０ｎｇ／ｍＬのＴＮＦ－α（北京シノバイオロジカル社、カタログ番号１０６０２－ＨＮＡＥ）を含む完全培地（１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ １６４０）に交換し、１日間インキュベートして、ＤＣ細胞を得た。
ヒトＴ細胞の取得：ヒトＰＢＭＣ細胞を蘇生して収集し、このＰＢＭＣと、ＤＣ細胞を誘導するＰＢＭＣが異なる個体に由来することを保証した。Ｐａｎ Ｔ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ、カタログ番号１３００９６５３５）の取扱説明書を参照してヒトＴ細胞を単離した。簡単に言えば、まず、ＤＰＢＳでＰＢＭＣを一回洗浄してから、ＰＢＭＣを１０７細胞当たり４０μＬの単離用緩衝液（ＰＢＳは２ｍＭのＥＤＴＡ及び０．５％のＢＳＡを含む、ｐＨ＝７．２）で再懸濁させ（以下の使用量は、いずれも１０７細胞で計算される）、且つ、１０μＬのＰａｎ Ｔ ｃｅｌｌ Ｂｉｏｔｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｐａｎ Ｔ細胞ビオチン標識抗体の混合物）を加え、４℃で５分間インキュベートした。さらに３０μＬの単離用緩衝液及び２０μＬのＰａｎ Ｔ ｃｅｌｌ ＭｉｃｒｏＢｅａｄ Ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｐａｎ Ｔ細胞マイクロビーズ混合物）を加え、４℃で１０分間インキュベートした。ＭＡＣＳ単離カラムを通過させて、Ｔ細胞を得た。
収集したヒトＤＣ細胞及びヒトＴ細胞を完全培地（１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ １６４０）に再懸濁させ、９６ウェルプレートに接種した。接種されたＤＣ細胞及びＴ細胞をそれぞれ１×１０４個の細胞／ウェル、１×１０５個の細胞／ウェルとし、混合してインキュベートした。さらに、完全培地で段階希釈されたヘテロダイマー抗体サンプル及び対照を加えた。培養プレートを３７℃で二酸化炭素インキュベータに置いて５日間インキュベートした。インキュベート終了後、ウェル内の上清を取り出し、ＩＬ－２検出キット（ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ、カタログ番号ＥＬＨ－ＩＬ２）を用いて説明書に従ってサイトカインの含有量を検出した。簡単に言えば、１００μＬの標準品及び希釈済みのサンプルをサンプル検出用プレートに加え、２５℃で２．５時間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴで５回洗浄し、ビオチンで標識した検出抗体１００μＬを加え、２５℃で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴで５回洗浄し、その後、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識したストレプトアビジンを１００μＬ／ウェルで加え、２５℃で４５分間インキュベートした。ＰＢＳＴで５回洗浄した。発色基質ＴＭＢを１００μＬ／ウェルで添加し、室温で１０分間発色させた。１ＭのＨ２ＳＯ４を１００μＬ／ウェルで添加することにより、発色を停止させた。４５０ｎｍでの吸光度をマイクロプレートリーダーで読み取った。
結果を図１０に示す。ヒトＴ細胞は、同種異体ＤＣ細胞からの刺激によって、活性化されてＩＬ－２を分泌した。抗ＰＤ－Ｌ１及び抗４－１ＢＢ二価抗体を加えることにより、Ｔ細胞への活性化を増強させ、サイトカインの分泌を促進させた。抗ＰＤ－Ｌ１／抗４－１ＢＢヘテロダイマー抗体ＢＨ３１２０ｈも強いＴ細胞への調節活性を示し、サイトカインＩＬ－２の分泌を著しく促進させた。
実施例８ 抗ＰＤ－Ｌ１／抗４－１ＢＢヘテロダイマー抗体を介した４－１ＢＢアゴニスト活性
ＧＳ－Ｈ２／４－１ＢＢ細胞（ジェンスクリプトから購入）を収集し、２％のＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ、カタログ番号ＳＨ３００８４．０３）を含むＭＥＭ＋Ｇｌｕ培地（ＧＩＢＣＯ、カタログ番号４１０９０１０１）で一回洗浄した。ＧＳ－Ｈ２／４－１ＢＢを、２％のＦＢＳを含むＭＥＭ＋Ｇｌｕ培地に１×１０５個の細胞／ｍＬの密度で再懸濁させた。９６ウェル平底細胞培養プレート（Ｃｏｓｔａｒ、カタログ番号３５９９）を取り、細胞懸濁液を１００μＬ／ウェルで添加し、培養プレートを３７℃で二酸化炭素インキュベータに置いて２時間インキュベートして、細胞を培養プレートに接着させた。ヘテロダイマー抗体サンプル及び対照を、２％のＦＢＳを含むＭＥＭ＋Ｇｌｕ培地に希釈して、ＧＳ－Ｈ２／４－１ＢＢ細胞を敷いた細胞培養プレートに５０μＬ加えた。同時に、ＤＬＤ－１／ＰＤ－Ｌ１細胞（ＤＬＤ－１は中国科学院から購入）を収集し、２％のＦＢＳを含むＭＥＭ＋Ｇｌｕ培地で１×１０５個の細胞／ｍＬの細胞懸濁液を調製し、５０μＬ採取してＧＳ－Ｈ２／４－１ＢＢ細胞を敷いた、ヘテロダイマー抗体サンプル及び対照を加えた細胞培養プレートに加えた。細胞培養プレートを３７℃で二酸化炭素インキュベータに置いて２４時間インキュベートし、細胞培養上清を採取し、ＩＬ－８検出キット（達科為社（Ｄａｋｅｗｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏ., Ｌｔｄ.）、カタログ番号１１１０８０２）を用いて説明書に従ってサイトカインの含有量を検出した。簡単に言えば、１００μＬの標準品及び希釈済みのサンプルをサンプル検出用プレートに加え、同時に、ビオチンで標識した検出抗体を５０μＬ加え、２５℃で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴで５回洗浄し、その後、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識したストレプトアビジンを１００μＬ／ウェルで加え、２５℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで５回洗浄した。発色基質ＴＭＢを１００μＬ／ウェルで添加し、室温で１０分間発色させた。１ＭのＨ２ＳＯ４を１００μＬ／ウェルで添加することにより、発色を停止させた。４５０ｎｍでの吸光度をマイクロプレートリーダーで読み取った。
結果を図１１に示す。抗４－１ＢＢ二価モノクローナル抗体を添加することにより、ある程度のＧＳ－Ｈ２／４－１ＢＢ細胞の活性化を誘導して、少量のＩＬ－８を分泌させることができる一方、抗ＰＤ－Ｌ１二価抗体を添加しても、ＧＳ－Ｈ２／４－１ＢＢ細胞を活性化することができない。これに対して、抗ＰＤ－Ｌ１／抗４－１ＢＢヘテロダイマー抗体ＢＨ３１２０ｈは、ＤＬＤ－１／ＰＤ－Ｌ１細胞上のＰＤ－Ｌ１とＧＳ－Ｈ２／４－１ＢＢ細胞上の４－１ＢＢと架橋することができ、これにより、４－１ＢＢをクラスター化させてＧＳ－Ｈ２／４－１ＢＢ細胞を強く活性化させ、大量のＩＬ－８を発生させた。
実施例９ 抗ＰＤ－Ｌ１／抗４－１ＢＢヘテロダイマー抗体の遺伝子ノックインマウスでの抗ＭＣ３８腫瘍薬力学的研究
６～８週齢の雌ｈＰＤ－Ｌ１／ｈ４－１ＢＢ二重標的ヒト化マウス（マウス由来のＰＤ－Ｌ１及び４－１ＢＢがノックアウトされ、ヒト由来のＰＤ－Ｌ１及び４－１ＢＢが過剰発現している。江蘇バイオサイトジェン社）を実験材料として使用した。マウスを環境に１週間適応させた後、マウス１匹につき、５×１０５個のＭＣ３８／ｈＰＤ－Ｌ１マウス結腸腫瘍細胞（ＭＣ３８は、Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｓｈｕｎｒａｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏ., Ｌｔｄ(上海舜冉)から購入）を右側の背部に皮下接種した。腫瘍体積が約１００ｍｍ３まで達した場合、腫瘍体積によって、担癌マウスを６匹ずつ群分けた。それぞれ溶媒（ＤＰＢＳ、ＧＩＢＣＯ、カタログ番号１４１９０－１３６）、抗ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体３５ｎｍｏｌ／ｋｇ、抗４－１ＢＢモノクローナル抗体３５ｎｍｏｌ／ｋｇ及び抗ＰＤ－Ｌ１／抗４－１ＢＢヘテロダイマー抗体７０ｎｍｏｌ／ｋｇ（モノクローナル抗体が二価抗体であることを考慮したところ、二重特異性抗体の抗ＰＤ－Ｌ１、抗４－１ＢＢがいずれも一価である）を週３回、２週連続投与した。投与方式は、腹腔内注投与であった。投与日から腫瘍体積を週に２回測量し、その長径ａ、短径ｂを測量した。腫瘍体積の計算式は、腫瘍体積（ｍｍ３）＝（ａ×ｂ２）／２である。腫瘍体積の測量の持続時間は４週間であり、即ち、投与を中止した後、さらに２週間観察した。
結果を図１２に示す。同種腫瘍モデルにおいて、抗ＰＤ－Ｌ１／抗４－１ＢＢヘテロダイマー抗体ＢＨ３１２０ｈは、抗ＰＤ－Ｌ１二価抗体及び抗４－１ＢＢ二価抗体よりも強い抗腫瘍効果を有する。
実施例１０ 抗ＰＤ－Ｌ１／抗４－１ＢＢヘテロダイマー抗体と抗ＰＤ－１抗体の併用による遺伝子ノックインマウスでの抗ＣＴ－２６腫瘍薬力学的研究
動物として、６～８週齢の雌ｈＰＤ１／ｈＰＤＬ１／ｈＣＤ１３７三重標的ヒト化マウス（江蘇集萃薬康社）を選択した。マウスを環境に１週間適応させた後、マウス１匹につき、５×１０５個のＣＴ－２６／ｈＰＤ－Ｌ１マウス結腸腫瘍細胞（江蘇集萃薬康社）を右頸の背部に皮下接種した。腫瘍体積が約１００ｍｍ３まで達した場合、腫瘍体積によってランダムに群分けた。それぞれ溶媒（ＤＰＢＳ）、抗ＰＤ－Ｌ１／４－１ＢＢ二重抗体１０ｍｇ／ｋｇ、抗ＰＤ－１モノクローナル抗体（ＢＨ２９１７ｂ）５ｍｇ／ｋｇ及び併用群（１０＋５ｍｇ／ｋｇ）を２日毎に１回、４回連続投与した。投与方式は、腹腔内投与であった。投与日から腫瘍体積を週に３回測量し、その長径及び短径の値を記録し、以下の式に従って腫瘍体積を計算した。腫瘍体積＝［（短径＾２×長径）／２］。腫瘍成長に対する阻害率は、以下の式に従って計算した。腫瘍成長に対する阻害率＝［１－ＲＴＶ（実験群）／ＲＴＶ（対照群）］×１００％。ＲＴＶ：相対腫瘍体積、ＲＴＶ＝Ｖｔ／Ｖ０、Ｖｔ：時間ｔにおける腫瘍体積、Ｖ０：初期腫瘍体積。結果を図１３に示す。同種腫瘍モデルにおいて、抗ＰＤ－Ｌ１／抗４－１ＢＢヘテロダイマー抗体ＢＨ３１２０と抗ＰＤ－１抗体とを併用する場合、より良好な相乗的な抗腫瘍活性を示した。ＣＴ－２６－ｈＰＤ－Ｌ１細胞を接種してから２０日後、対照群に比べて、ＢＨ２９１７ｂ（５ｍｇ／ｋｇ）及びＢＨ３１２０（１０ｍｇ／ｋｇ）場合の腫瘍体積はいずれも減少し、腫瘍成長に対する阻害率は、それぞれ４４．１％及び３７．３％であった。ＢＨ３１２０＋ＢＨ２９１７ｂ（１０＋５ｍｇ／ｋｇ）の場合は、腫瘍の増殖を著しく阻害することができ、腫瘍成長に対する阻害率は、７９．６％であった。ｔ検定により分析したところ、ＢＨ３１２０（１０ｍｇ／ｋｇ）の場合に比べて、併用療法群では腫瘍体積は著しく減少し、且つ統計学的に有意な差がある（Ｐ＜０．０５）。ＢＨ２９１７ｂ（５ｍｇ／ｋｇ）群に比べて、併用療法群での腫瘍体積は減少したが、統計学的に有意な差がない（Ｐ＞０．０５）。
実施例１１ 抗ＰＤ－Ｌ１／抗４－１ＢＢヘテロダイマー抗体と抗ＰＤ－１抗体の併用による遺伝子ノックインマウスでの抗ＭＣ３８腫瘍薬力学的研究
動物として、６～８週齢の雌ｈＰＤ１／ｈＣＤ１３７二重標的ヒト化マウス（江蘇集萃薬康社及びバイオサイトジェン社）を選択した。マウスを環境に１週間適応させた後、マウス１匹につき、１×１０６個のＭＣ３８／ｈＰＤ－Ｌ１マウス結腸腫瘍細胞（江蘇集萃薬康社）を右頸の背部に皮下接種した。腫瘍体積が約１００ｍｍ３まで達した場合、腫瘍体積によってランダムに群分けた。それぞれ溶媒（ＤＰＢＳ）、抗ＰＤ－Ｌ１／４－１ＢＢ二重抗体１及び３ｍｇ／ｋｇ、抗ＰＤ－１モノクローナル抗体（ＢＨ２９１７ｂ）５ｍｇ／ｋｇ及び併用群（１＋５ｍｇ／ｋｇ）を週に２回、６回連続投与した。投与方式は、腹腔内投与であった。投与日から腫瘍体積を週に３回測量し、その長径及び短径の値を記録し、以下の式に従って腫瘍体積を計算した。腫瘍体積＝［（短径＾２×長径）／２］。腫瘍成長に対する阻害率は、以下の式に従って計算した：腫瘍成長に対する阻害率＝［１－ＲＴＶ（実験群）／ＲＴＶ（対照群）］×１００％。ＲＴＶ：相対腫瘍体積、ＲＴＶ＝Ｖｔ／Ｖ０、Ｖｔ：時間ｔにおける腫瘍体積、Ｖ０：初期腫瘍体積。結果を図１４に示す。同種腫瘍モデルにおいて、抗ＰＤ－Ｌ１／抗４－１ＢＢヘテロダイマー抗体ＢＨ３１２０と抗ＰＤ－１抗体とを併用する場合、より良好な相乗的な抗腫瘍活性を示した。ｈＰＤ－Ｌ１／ＭＣ３８細胞を接種してから３３日後、抗体単剤療法群では、一定の腫瘍阻害作用を有し、且つ用量依存性を有し、腫瘍成長に対する阻害率は、それぞれ、ＢＨ２９１７ｂ（５ｍｇ／ｋｇ）の場合は７６．５８％、ＢＨ３１２０（３ｍｇ／ｋｇ）の場合は４７．０７％、ＢＨ３１２０（１ｍｇ／ｋｇ）の場合は３０．９５％であった。ＢＨ３１２０＋ＢＨ２９１７ｂ（１＋５ｍｇ／ｋｇ）の併用療法では、腫瘍の増殖を著しく阻害し、ＴＧＩＴＶ％は、１２２．４０％であった。ｔ検定により分析したところ、ＢＨ３１２０（１ｍｇ／ｋｇ）群に比べて、統計学的に有意な差があり（Ｐ＜０．０５）、ＢＨ２９１７ｂ（５ｍｇ／ｋｇ）群に比べて統計学的に有意な差がある（Ｐ＜０．０１）。

Claims (29)

  1. ＰＤ－Ｌ１と特異的に結合する第１の抗原結合機能領域及び４－１ＢＢと特異的に結合する第２の抗原結合機能領域を含む二重特異性抗体であって、
    前記ＰＤ－Ｌ１と特異的に結合する第１の抗原結合機能領域は、
    （Ａ）重鎖可変領域と、
    （Ｂ）軽鎖可変領域と、を含み、
    前記重鎖可変領域は、
    （ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５に示すアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１と、
    （ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６に示すアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２と、
    （ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７に示すアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３と、を含み、
    前記軽鎖可変領域は、
    （ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８に示すアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１と、
    （ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９に示すアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２と、
    （ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０に示すアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３と、を含む、
    二重特異性抗体。
  2. ４－１ＢＢと特異的に結合する前記第２の抗原結合機能領域は、
    （Ａ）重鎖可変領域と、
    （Ｂ）軽鎖可変領域と、を含み、
    前記重鎖可変領域は、
    （ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１に示すアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１と、
    （ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２に示すアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２と、
    （ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３に示すアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３と、を含み、
    前記軽鎖可変領域は、
    （ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４に示すアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１と、
    （ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５に示すアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２と、
    （ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６に示すアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３と、を含む、
    請求項１に記載の二重特異性抗体。
  3. 前記ＰＤ－Ｌ１と特異的に結合する第１の抗原結合機能領域は、
    （Ａ）重鎖可変領域と、
    （Ｂ）軽鎖可変領域と、を含み、
    前記重鎖可変領域は、
    （ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５に示すアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１と、
    （ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６に示すアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２と、
    （ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７に示すアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３と、を含み、
    前記軽鎖可変領域は、
    （ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８に示すアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１と、
    （ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９に示すアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２と、
    （ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０に示すアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３と、を含み、
    前記４－１ＢＢと特異的に結合する第２の抗原結合機能領域は、
    （Ａ）重鎖可変領域と、
    （Ｂ）軽鎖可変領域と、を含み、
    前記重鎖可変領域は、
    （ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１に示すアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１と、
    （ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２に示すアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２と、
    （ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３に示すアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３と、を含み、
    前記軽鎖可変領域は、
    （ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４に示すアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１と、
    （ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５に示すアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２と、
    （ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６に示すアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３と、を含む、
    請求項１又は２に記載の二重特異性抗体。
  4. ＰＤ－Ｌ１と特異的に結合する前記第１の抗原結合機能領域は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示すアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示すアミノ酸配列を含む、請求項１から請求項３のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
  5. ４－１ＢＢと特異的に結合する前記第２の抗原結合機能領域は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示すアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示すアミノ酸配列を含む、請求項１から請求項４のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
  6. ＰＤ－Ｌ１と特異的に結合する前記第１の抗原結合機能領域は、
    重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示すアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示すアミノ酸配列を含み、
    ４－１ＢＢと特異的に結合する前記第２の抗原結合機能領域は、
    重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示すアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示すアミノ酸配列を含む、
    請求項１から請求項５のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
  7. 第１の抗原結合機能領域及び第２の抗原結合機能領域は、Ｆａｂフラグメント、ｓｃＦｖフラグメント及び可変ドメインフラグメントＦｖから選ばれる、請求項１から請求項６のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
  8. 第１の抗原結合機能領域及び第２の抗原結合機能領域は、いずれもＦａｂフラグメントである、請求項１から請求項７のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
  9. 前記Ｆａｂフラグメントは、異なる第１の重鎖可変領域及び第２の重鎖可変領域と、異なる第１の軽鎖可変領域及び第２の軽鎖可変領域と、を含む、請求項１から請求項８のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
  10. 第１の抗原結合機能領域及び第２の抗原結合機能領域の一方は、Ｆａｂフラグメントであり、他方は、ｓｃＦｖである、請求項１から請求項９のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
  11. 第１のＦｃ鎖及び第２のＦｃ鎖を含む二重特異性抗体であって、
    前記第１のＦｃ鎖及び第２のＦｃ鎖は、いずれもアミノ酸の置換を含む免疫グロブリンＧのＦｃフラグメントであり、且つ、前記第１のＦｃ鎖と第２のＦｃ鎖は、共に、Ｆｃ受容体と結合できるヘテロダイマーを構成し、
    前記第１のＦｃ鎖と第２のＦｃ鎖は、共有結合又はリンカーを介して前記第１の抗原結合機能領域と第２の抗原結合機能領域にそれぞれ連結されており、
    且つ、前記第１のＦｃ鎖及び第２のＦｃ鎖のいずれか一方は、位置３６６及び位置３９９でのＴ３６６Ｌ及びＤ３９９Ｒのアミノ酸置換を含み、他方は、位置３５１、位置４０７及び位置４０９でのＬ３５１Ｅ、Ｙ４０７Ｌ及びＫ４０９Ｖのアミノ酸置換を含み、アミノ酸の位置は、Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスナンバリングシステムに従って番号付けされる、
    請求項１から請求項１０のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
  12. 第１のＦｃ鎖及び共有結合を介してそれに連結された第１の抗原結合機能領域並びに第２のＦｃ鎖及び共有結合を介してそれに連結された第２の抗原結合機能領域は、還元剤が存在する溶液中において、且つ、前記溶液中に前記第１のＦｃ鎖及び共有結合を介してそれに連結された第１の抗原結合機能領域と第２のＦｃ鎖及び共有結合を介してそれに連結された第２の抗原結合機能領域以外のポリペプチドが含まれていない場合、形成されたホモダイマーのすべてのポリペプチド鎖に基づく重量割合が、５０％未満である、請求項１から請求項１１のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
  13. ＰＤ－Ｌ１と特異的に結合する第１の重鎖／第１の軽鎖のペアを含む二重特異性抗体であって、
    前記第１の重鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示すアミノ酸配列を含む重鎖定常領域と、を有し、
    前記第１の軽鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示すアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示すアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域と、を有する、
    請求項１から請求項１２のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
  14. ４－１ＢＢと特異的に結合する第２の重鎖／第２の軽鎖のペアを含む二重特異性抗体であって、
    前記第２の重鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４に示すアミノ酸配列を含む重鎖定常領域と、を有し、
    前記第１の軽鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示すアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示すアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域と、を有する、
    請求項１から請求項１３のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
  15. 請求項１から請求項１４のいずれか１項に記載の二重特異性抗体をコードする単離されたポリヌクレオチド。
  16. 請求項１５に記載の単離されたポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクター。
  17. 請求項１５に記載の単離されたポリヌクレオチド又は請求項１６に記載の組換え発現ベクターを含む宿主細胞。
  18. ヒト胚性腎臓細胞ＨＥＫ２９３又はＨＥＫ２９３細胞に基づく改変により得られるＨＥＫ２９３Ｔ、ＨＥＫ２９３Ｅ、ＨＥＫ２９３Ｆ、ハムスター卵巣細胞ＣＨＯ又はＣＨＯ細胞に基づく改変により得られるＣＨＯ－Ｓ、ＣＨＯ－ｄｈｆｒ－、ＣＨＯ／ＤＧ４４、ＥｘｐｉＣＨＯ、大腸菌又は大腸菌に基づく改変により得られる大腸菌ＢＬ２１、ＢＬ２１（ＤＥ３）、Ｒｏｓｅｔｔａ、Ｏｒｉｇａｍｉ、酵母菌又は酵母に基づく改変により得られるピキア・パストリス、サッカロマイセス・セレビシエ、クルイベロマイセス・ラクティス、ハンセヌラ・ポリモルファ、昆虫細胞又は昆虫細胞に基づく改変により得られる細胞Ｈｉｇｈ５、ＳＦ９、植物細胞、哺乳動物の乳腺細胞、体細胞から選ばれる、請求項１７に記載の宿主細胞。
  19. 請求項１から請求項１４のいずれか１項に記載の二重特異性抗体又は請求項１５に記載の単離されたポリヌクレオチド又は請求項１６に記載の組換え発現ベクター又は請求項１７又は１８に記載の宿主細胞、及び薬学的に許容される担体を含む、組成物。
  20. 少なくとも１種の第２の治療剤をさらに含み、
    好ましくは、前記第２の治療剤と、前記二重特異性抗体、単離されたポリヌクレオチド、組換え発現ベクター又は宿主細胞とは、前記組成物の異なる部分にあり、
    好ましくは、第２の治療剤は、第２の抗体、免疫治療剤、標的治療剤又は化学治療剤からなる群から選ばれ、
    好ましくは、第２の治療剤は、抗ＰＤ－１抗体及び／又はＳＴＩＮＧアゴニストである、請求項１９に記載の組成物。
  21. １）宿主細胞において請求項１５に記載の単離されたポリヌクレオチド又は請求項１６に記載の組換え発現ベクターをそれぞれ発現させるステップと、
    ２）宿主細胞においてそれぞれ発現されたタンパク質を還元するステップと、
    ３）還元されたタンパク質を混合した後、混合物を酸化するステップと、を含む、
    請求項１から請求項１４のいずれか１項に記載の二重特異性抗体を生産する方法。
  22. 還元ステップは、１）２－メルカプトエチルアミン、ジチオスレイトール、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン又はその他の化学誘導体から選ばれる還元剤の存在下で還元反応を行うステップと、２）還元剤を除去するステップと、を含む、請求項２１に記載の方法。
  23. 酸化ステップは、空気中での酸化であり、Ｌ－デヒドロアスコルビン酸又はその化学誘導体から選ばれる酸化剤の存在下で酸化反応を行うステップをさらに含む、請求項２１又は２２に記載の方法。
  24. 単離及び精製のステップをさらに含む、請求項２１から請求項２３のいずれか１項に記載の方法。
  25. 被験者の疾患を予防及び／又は治療するための薬剤の製造における、請求項１から請求項１４のいずれか１項に記載の二重特異性抗体、及び／又は請求項１５に記載の単離されたポリヌクレオチド、及び／又は請求項１６に記載の組換え発現ベクター、及び／又は請求項１７又は１８に記載の宿主細胞、及び／又は請求項１９又は２０に記載の組成物の使用。
  26. 被験者の疾患を予防及び／又は治療するための薬剤として使用する、請求項１から請求項１４のいずれか１項に記載の二重特異性抗体、及び／又は請求項１５に記載の単離されたポリヌクレオチド、及び／又は請求項１６に記載の組換え発現ベクター、及び／又は請求項１７又は１８に記載の宿主細胞、及び／又は請求項１９又は２０に記載の組成物。
  27. 必要とする被験者に、請求項１から請求項１４のいずれか１項に記載のヘテロダイマー二重特異性抗体、及び／又は請求項１５に記載の単離されたポリヌクレオチド、及び／又は請求項１６に記載の組換え発現ベクター、及び／又は請求項１７又は１８に記載の宿主細胞、及び／又は請求項１９又は２０に記載の組成物を投与するステップを含む、疾患を予防及び／又は治療する方法。
  28. 被験者は、哺乳動物であり、好ましくは、ヒトである、
    請求項２５に記載の使用、請求項２６に記載のヘテロダイマー二重特異性抗体、単離されたポリヌクレオチド、組換え発現ベクター、宿主細胞又は組成物、又は請求項２７に記載の方法。
  29. 前記疾患は、白血病、リンパ腫、骨髄腫、脳腫瘍、頭頸部扁平上皮癌、非小細胞肺癌、鼻咽頭癌、食道癌、胃癌、膵臓腺癌、胆嚢癌、肝癌、結腸直腸癌、乳癌、卵巣癌、宮頸癌、子宮内膜癌、子宮肉腫、前立腺癌、膀胱癌、腎細胞癌、黒色腫、小細胞肺癌、骨癌から選ばれる、請求項２５に記載の使用、請求項２６に記載のヘテロダイマー二重特異性抗体、単離されたポリヌクレオチド、組換え発現ベクター、宿主細胞又は組成物、又は請求項２７に記載の方法。
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