KR20200111588A

KR20200111588A - 인산화당 에피머 효소

Info

Publication number: KR20200111588A
Application number: KR1020190031514A
Authority: KR
Inventors: 허진솔; 김혜정; 박종진; 최은수; 양은주; 오덕근
Original assignee: 주식회사 삼양사; 건국대학교 산학협력단
Priority date: 2019-03-19
Filing date: 2019-03-19
Publication date: 2020-09-29
Also published as: KR102256624B1

Abstract

본 발명을 프럭토오스-6-포스페이트(과당 6-인산)의 에피머화 효소 단백질, 상기 효소 단백질을 암호화하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터 및 형질전환 균주, 상기 균주를 이용한 케토헥소오스 생산용 조성물에 관한 것이다.

Description

인산화당 에피머 효소{Epimerase enzyme of phosphorylated saccharide}

본 발명은 인산화당, 예를 들면 프럭토오스-6-포스페이트(과당 6-인산)의 에피머화 효소 단백질, 상기 효소 단백질을 암호화하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터 및 형질전환 균주, 상기 균주를 이용한 케토헥소오스 생산용 조성물에 관한 것이다.

인산화당의 에피머화 효소는 다양한 인산화 당에 있는 탄소에 결합된 에피머화 효소로서, 케토헥소오스-6-포스페이트 에피머화 효소는 C3 또는 C4를 에피머화 할 수 있다. 상기 케토헥소오스는 프럭토오스 (fructose), 알룰로스, 소르보오스 (sorbose), 및 타가토오스 (tagatose)로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상의 케토헥소오스일 수 있다.

프럭토오스-6-포스페이트의 에피머화 효소는 3-에피머화 효소와 4-에피머화 효소를 포함한다. 구체적으로, 알룰로스-3-에피머화 효소(D-알룰로스-3-epimerase, EC 5.1.3.30)는 과당(D-fructose)을 3-에피머화(3-epimerization, 3번 탄소 에피머화)하여 알룰로스-6-포스페이트를 생산하고, 타가토스-4-에피머화 효소(D-tagatose-4-epimerase, EC 5.1.3.31)는 과당(D-fructose)을 4-에피머화(4-epimerization, 4번 탄소 에피머화)함으로써 타가토스 6-포스페이트를 생산할 수 있는 효소이다.

상기 효소를 사용하여 프럭토오스(과당)에서 알룰로스 또는 타가토스를 생산하는 경우, 기질로 사용하는 과당과 산물인 알룰로스 또는 타가토스 간의 일정 수준의 반응평형이 존재하여 최종 전환율이 20 내지 35% 수준밖에 되지 않는다. 따라서, 위 효소를 이용한 단일 반응을 통해서 고순도 알룰로스 또는 타가토스를 제조하고자 할 경우, 최종 반응액에서 과당을 분리하여 제거하는 추가 공정이 필요하다.

Chan 등(2008. Biochemistry. 47:9608-9617)은 프럭토오스-6-포스페이트 및 알룰로스-6-포스페이트에 대해서 3-에피머화 반응을 수행할 수 있는 Streptococcus pyogenes 유래의 리불로스-5-포스페이트-3-에피머화 효소 및 E.coli 유래의 알룰로스-6-포스페이트-3-에피머화 효소를 보고하였다. 그러나 상기 효소는 열안정성이 좋지 않은 특성으로 인해 산업적으로 사용하기에는 적합하지 않은 특성을 가지고 있다.

산업적으로 과당을 원료로 하여 케토헥소오스를 제조하고자 하는 경우에, 사용되는 효소는 산업적 생산조건, 특히 열안정성이 높으며, 최대한 높은 전환율을 가져야 하며, 또한 당을 기질로 사용하므로 당의 갈변화가 알칼리 조건에서 쉽게 일어나므로 가급적 당의 갈변이 방지되는 전환 반응 조건을 충족할 필요가 있다.

따라서, 산업적으로 사용하기에는 적합한 기질 전환율, 효소의 열안정성, 및 효소 반응조건을 적어도 하나 이상 만족하며, 과당을 원료로 하여 케토헥소오스를 제조하는 효소 및 이를 이용한 케토헥소오스의 생산 방법이 절실히 필요한 실정이다.

본 발명의 일 예는 인산화당, 예를 들면 프럭토오스-6-포스페이트의 에피머화 효소 단백질, 상기 효소 단백질을 암호화하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터 및 형질전환 균주에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 일 예는, 인산화당, 예를 들면 프럭토오스-6-포스페이트의 에피머화 효소 단백질, 상기 효소를 발현하는 균주의 균체, 상기 균주의 배양물, 상기 균체의 파쇄물 또는 이들의 추출물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 프럭토오스-6-포스페이트을 기질로 사용하여 케토헥소오스, 예를 들면 알룰로스 또는 타가토스를 생산하는 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 추가 일 예는, 인산화당, 예를 들면 프럭토오스-6-포스페이트의 에피머화 효소 단백질, 상기 효소를 발현하는 균주의 균체, 상기 균주의 배양물, 상기 균체의 파쇄물, 파쇄물의 상등액 및 이들의 추출물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을, 프럭토오스-6-포스페이트와 접촉하는 단계를 포함하는, 프럭토오스-6-포스페이트을 기질로 사용하여 케토헥소오스, 예를 들면 알룰로스 또는 타가토스를 생산하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에 따른 알룰로스 또는 타가토스 생산 방법은 미생물로부터 얻은 효소를 이용하므로 환경 친화적이며, 간단한 효소 반응으로부터 프락토스로부터 타가토스 또는 알룰로스 생산을 이전에 없던 방법으로 전환시키고, 생산경비를 크게 줄이는 한편 생산 효과를 극대화할 수 있다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 예는 서열번호 1, 3, 5, 또는 7 의 아미노산 서열과 서열 상동성이 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상 또는 99% 이상인 아미노산 서열을 포함하는 프럭토오스-6-포스페이트의 에피머화 효소 단백질에 관한 것이다.

본 발명의 구체적인 일 예는 서열번호 1 또는 3의 아미노산 서열을 포함하는 프럭토오스-6-포스페이트 4-에피머화 효소(fructose-6-phosphate 4-epimerase)를 제공한다.

본 발명의 구체적인 추가 일 예는 서열번호 5 또는 7의 아미노산 서열을 포함하는 프럭토오스-6-포스페이트 3-에피머화 효소(fructose-6-phosphate 3-epimerase)를 제공한다.

상기 프럭토오스-6-포스페이트 에피머화 효소는 서열번호 2, 4, 6, 또는 8의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 것일 수 있고, 또한 서열번호 2, 4, 6, 또는 8의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 90%, 95%, 97% 또는 99% 상동성을 가지는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 것일 수 있다.

상기에서 용어 "상동성"은 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 일치하는 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 본 명세서에서, 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 동일하거나 유사한 활성을 가지는 그의 상동성 서열이 "% 상동성"으로 표시된다.

본 발명에 따른 프럭토오스-6-포스페이트 에피머화 효소는, 프럭토오스-6-포스페이트(fructose 6-phosphate)의 에피머화 반응을 촉매하며, 구체적으로 프럭토오스-6-포스페이트의 3-에피머화 반응을 수행하여 알룰로스-6-포스페이트로 전환하거나, 4-에피머화 반응을 수행하여 타가토스-6-포스페이트로 전환할 수 있다.

본 발명에 따른 프럭토오스-6-포스페이트 4-에피머화 효소 단백질은 Pseudomonas sabulinigri 또는 Thermococcus guaymasensis 유래의 효소일 수 있다.

본 발명의 일 예에 따른 프럭토오스-6-포스페이트 4-에피머화 효소는 Pseudomonas sabulinigri 에서 유래된 것일 수 있다. 구체적으로, Pseudomonas sabulinigri 유래 프럭토오스-6-포스페이트 4-에피머화 효소는 서열번호 1 의 아미노산 서열과 서열 상동성이 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상 또는 99% 이상인 아미노산 서열을 포함하는 프럭토오스-6-포스페이트의 에피머화 효소 단백질에 관한 것이거나, 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열 또는 상기 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 90%, 95%, 97% 또는 99%의 서열 상동성을 가지는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 것일 수 있다.

상기 Pseudomonas sabulinigri 유래 프럭토오스-6-포스페이트 4-에피머화 효소의 반응 온도 범위는 40 내지 65℃, 40 내지 60℃, 45 내지 65℃, 45 내지 60℃, 50 내지 65℃ 또는50 내지 60℃ 일 수 있다. 상기 최적 온도는, 예컨대, pH 8.0 조건에서 10분간 반응 진행 시의 결과일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, Pseudomonas sabulinigri 유래 프럭토오스-6-포스페이트 4-에피머화 효소의 반응 pH 조건은 pH 6 내지 9, pH 7내지 9, pH 7 내지 8.5, 또는 pH 7 내지 8일 수 있다. 상기 최적 pH는 예컨대, 50℃ 조건에서 10분간 반응 진행의 결과일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 Pseudomonas sabulinigri 유래 프럭토오스-6-포스페이트 4-에피머화 효소는 프럭토오스-6-포스페이트를 기질로 하여 타가토스-6-포스페이트의 최대 전환율이 높은 장점이 있다. 구체적으로, 상기 4-에피머화 효소는 pH 8.0, 50 ℃조건에서 상기 전환율은 70% 이상, 70 내지 99.9%, 75 내지 99.9%, 80 내지 99.9%, 80 내지 98%, 80 내지 96%, 80 내지 94%, 80 내지 92%, 또는 80 내지 90%일 수 있으며, 예를 들면 85.6%일 수 있다.

본 발명의 일 예에 따른 프럭토오스-6-포스페이트 4-에피머화 효소는 Thermococcus guaymasensis 에서 유래되며, 구체적으로, 서열번호 3 의 아미노산 서열과 서열 상동성이 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상 또는 99% 이상인 아미노산 서열을 포함하는 프럭토오스-6-포스페이트의 에피머화 효소 단백질에 관한 것이거나, 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열 또는 상기 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 90%, 95%, 97% 또는 99% 상동성을 가지는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 것일 수 있다.

상기 Thermococcus guaymasensis 유래 프럭토오스-6-포스페이트 4-에피머화 효소의 반응온도는 80 내지 95℃, 또는 85 내지 95℃일 수 있으며, 구체적으로 85 내지 90℃ 일 수 있다. 상기 최적 온도는, 예컨대, pH 8.0 조건에서 30분간 반응 진행 시의 결과일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, Thermococcus guaymasensis 유래 프럭토오스-6-포스페이트 4-에피머화 효소의 반응 pH 조건은 pH 6 내지 9, pH 7내지 9, pH 7 내지 8.5, 또는 pH 7 내지 8일 수 있다. 상기 최적 pH는 예컨대, 90℃ 조건에서 30분간 반응 진행의 결과일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 Thermococcus guaymasensis 유래 프럭토오스-6-포스페이트 4-에피머화 효소는 반응온도는 80 내지 95℃로서 매우 높아 열안정성이 높은 장점이 있다. 구체적으로, 상기 4-에피머화효소는 최적온도가 90℃로 매우 높으며, 60℃ 반감기도 80시간 내지 110시간, 예를 들면 103 시간으로 열안정성이 우수하다.

본 발명에 따른 프럭토오스-6-포스페이트 3-에피머화 효소 단백질은 Geobacillus thermodenitripicans 또는 Novibacillus thermophiles 유래의 효소일 수 있다.

본 발명의 일 예에 따른 프럭토오스-6-포스페이트 3-에피머화 효소는 Geobacillus thermodenitripicans 에서 유래된 것일 수 있다. 구체적으로, Geobacillus thermodenitripicans 유래 프럭토오스-6-포스페이트 3-에피머화 효소는 서열번호 5 의 아미노산 서열과 서열 상동성이 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상 또는 99% 이상인 아미노산 서열을 포함하는 프럭토오스-6-포스페이트의 에피머화 효소 단백질에 관한 것이거나, 서열번호 6의 뉴클레오티드 서열 또는 상기 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 90%, 95%, 97% 또는 99% 상동성을 가지는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 것일 수 있다.

상기 Geobacillus thermodenitripicans 유래 프럭토오스-6-포스페이트 3-에피머화 효소의 반응 온도는, 40 내지 80℃, 50 내지 80℃, 60 내지 80℃, 또는 65 내지 75℃ 일 수 있다. 상기 최적 온도는, 예컨대, pH 5.0 조건에서 10분간 반응 진행 시의 결과일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, Geobacillus thermodenitripicans 유래 프럭토오스-6-포스페이트 3-에피머화 효소의 반응 pH 범위는, pH 4 내지 7, pH 4 내지 6, pH 5 내지 7, 또는 pH 5 내지 6, 또는 pH 4.5 내지 5.5일 수 있다. 상기 최적 pH는 예컨대, 70℃ 조건에서 10분간 반응 진행의 결과일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 Geobacillus thermodenitripicans 유래 프럭토오스-6-포스페이트 3-에피머화 효소는 효소의 반응 pH 범위는, pH 4내지 7, pH 4 내지 6, pH 5 내지 7, 또는 pH 5 내지 6, 또는 pH 4.5 내지 5.5로서 알칼리 조건이 아니므로, 알칼리 반응 조건에서 기질 및 산물인 당의 갈변화하는 문제점을 방지할 수 있는 반응조건을 충족하여 산업화 규모에 적용할 수 있는 장점이 있다.

상기 프럭토오스-6-포스페이트3-에피머화 효소는 Novibacillus thermophiles 에서 유래된 것일 수 있다. 구체적으로, Novibacillus thermophiles 유래 프럭토오스-6-포스페이트 3-에피머화 효소는 서열번호 7 의 아미노산 서열과 서열 상동성이 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상 또는 99% 이상인 아미노산 서열을 포함하는 프럭토오스-6-포스페이트의 에피머화 효소 단백질에 관한 것이거나, 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열 또는 상기 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 90%, 95%, 97% 또는 99% 상동성을 가지는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 것일 수 있다.

상기 Novibacillus thermophiles 유래 프럭토오스-6-포스페이트 3-에피머화 효소의 상기 최적 온도는, 40 내지 80℃, 40 내지 70℃, 45 내지 70℃, 또는 50 내지 70℃ 일 수 있다. 상기 최적 온도는, 예컨대, pH 5.0 조건에서 10분간 반응 진행 시의 결과일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, Novibacillus thermophiles 유래 프럭토오스-6-포스페이트 3-에피머화 효소의 반응 pH 범위는 pH 4내지 7, pH 4 내지 6, pH 5 내지 7, 또는 pH 5 내지 6, 또는 pH 4.5 내지 5.5일 수 있다. 상기 최적 pH는 예컨대, 50℃ 조건에서 10분간 반응 진행의 결과일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 Novibacillus thermophiles 유래 프럭토오스-6-포스페이트 3-에피머화 효소는 효소의 반응 pH 범위는, pH 4 내지 7, pH 4 내지 6, 4 내지 5.5, pH 5 내지 7, pH 5 내지 6, 또는 pH 4.5 내지 5.5로서 알칼리 조건이 아닐 뿐만 아니라, 최적 pH가 5이며, 알룰로스6-포스페이트의 최대 전환율이 80% 이상, 80 내지 99.9%, 80 내지 96%, 80 내지 94%, 80 내지 92%, 또는 80 내지 90% 일 수 있으며, 예를 들면88%일 수 있다. 기질 및 산물인 당의 갈변화를 방지할 수 있으며, 더욱이 알칼리 조건에서 높은 전환율을 가지고 있어, 산업화 규모에 적용할 수 있는 장점이 있다.

본 발명의 추가 예로서, 본 출원의 프럭토오스-6-포스페이트 에피머화 효소를 암호화하는 핵산을 제공한다. 본 발명에 따른 프럭토오스-6-포스페이트 에피머화 효소를 암호화하는 핵산의 구체적인 일 예는, 상기 프럭토오스-6-포스페이트 에피머화 효소는 서열번호 2, 4, 6, 또는 8의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 것일 수 있고, 또한 서열번호 2, 4, 6, 또는 8의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 90%, 95%, 97% 또는 99% 상동성을 가지는 뉴클레오티드 서열일 수 있다.

본 발명은 또 다른 하나의 양태로서, 본 출원의 프럭토오스-6-포스페이트 에피머화 효소를 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터 또는 형질전환체를 제공한다.

본 출원에서 용어 "형질전환"은 표적 단백질을 암호화하는 핵산 포함하는 벡터를 숙주세포 내에 도입하여 숙주세포 내에서 상기 핵산이 암호화하는 단백질이 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 핵산은 숙주세포 내에서 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하거나 상관없이 이들 모두를 포함할 수 있다. 또한, 상기 핵산은 표적 단백질을 암호화하는 DNA 및 RNA를 포함한다. 상기 핵산은 숙주세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로 도입되는 것이든 상관없다. 예를 들면, 상기 핵산은 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트 (expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 핵산에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터 (promoter), 전사 종결신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함할 수 있다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 핵산은 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있으며, 이에 한정되지 않는다.

또한, 상기에서 용어 "작동 가능하게 연결"된 것이란 본 출원의 목적 단백질을 암호화하는 핵산의 전사를 개시 및 매개하도록 하는 프로모터 서열과 상기 유전자 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다.

본 출원의 벡터를 형질전환 시키는 방법은 핵산을 세포 내로 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 숙주세포에 따라 당 분야에서 공지된 바와 같이 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘(CaPO4) 침전, 염화칼슘(CaCl2) 침전, 미세주입법(microinjection), 폴리에틸렌 글리콜(PEG)법, DEAE-덱스트란법, 양이온 리포좀법, 및 초산 리튬-DMSO법 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 숙주 세포로는 DNA의 도입효율이 높고, 도입된 DNA의 발현 효율이 높은 숙주를 사용하는 것이 좋은데, 예를 들어 대장균일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명은 또 다른 하나의 양태로서, 본 발명에 따른 프럭토오스-6-포스페이트 에피머화 효소, 프럭토오스-6-포스페이트 에피머화 효소를 생산하는 균주의 균체, 배양물, 파쇄물, 파쇄물의 상등액 및 이들의 추출물로 이루어진 군에서 선택된 1 이상을 포함하는 케토헥소오스, 예를 들면 알룰로스 또는 타가토스 생산용 조성물을 제공한다.

상기 케토헥소오스 생산용 조성물을 이용하여 케토헥소오스, 예를 들면 알룰로스 또는 타가토스 생산하는 경우 효소 또는 효소를 생산하는 미생물을 이용한 반응 온도 및 반응 pH 조건은 상기 효소의 반응온도 및 반응 pH 조건에서 상술한 바와 같다.

상기 케토헥소오스 생산용 조성물은, 프럭토오스를 프럭토오스-6-포스페이트로 전환하는 헥소카이네이즈 효소, 상기 효소를 생산하는 미생물 또는 이의 배양물을 추가로 포함할 수 있다. 상기 프럭토오스-6-포스페이트는 프럭토오스 또는 프럭토오스 함유 물질을 헥소카이네이즈 처리하여 얻은 것이 바람직하나 다른 화학적 합성방법 등에 의하여 제공되는 경우에도 본 발명의 보호범위에 포함된다.

상기 케토헥소오스 생산용 조성물은, 알룰로스-6-포스페이트 또는 타가토스-6-포스페이트에서 탈인산화 반응을 수행하는 파이테이즈(phytase), 예를 들면 타가토스-6-포스페이트의 탈인산화 효소 (tagatose-6-phosphate phosphatase) 및/또는 알룰로스-6-포스페이트의 탈인산화 효소(allulose-6-phosphate phosphatase) 를 추가로 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 아니한다.

또한, 상기 케토헥소오스 생산용 조성물은 타가토스-6-포스페이트의 탈인산화 효소 (tagatose-6-phosphate phosphatase), 상기 타가토스-6-포스페이트의 탈인산화 효소를 발현하는 미생물 또는 상기 타가토스-6-포스페이트 탈인산화 효소를 발현하는 미생물의 배양물을 추가적으로 포함할 수 있다.

상기 케토헥소오스 생산용 조성물은, 알룰로스-6-포스페이트의 탈인산화 효소(allulose-6-phosphate phosphatase), 상기 알룰로스-6-포스페이트의 탈인산화 효소를 발현하는 미생물 또는 상기 알룰로스-6-포스페이트 탈인산화 효소를 발현하는 미생물의 배양물을 추가적으로 포함할 수 있다.

상기 균주의 배양물은 상기 프럭토오스-6-포스페이트 에피머화 효소를 생산하는 균주로부터 생산된 효소를 포함하는 것으로, 상기 균주를 포함하거나 포함하지 않는 cell-free 형태일 수 있다. 상기 파쇄물은 상기 프럭토오스-6-포스페이트 에피머화 효소를 생산하는 균주를 파쇄한 파쇄물 또는 상기 파쇄물을 원심분리하여 얻어진 상등액을 의미하는 것으로 상기 프럭토오스-6-포스페이트 에피머화 효소를 생산하는 균주로부터 생산된 효소를 포함하는 것이다. 본 명세서에 있어서, 별도의 언급이 없는 한, 사용되는 프럭토오스-6-포스페이트 에피머화 효소를 생산하는 균주는 상기 균주의 균체, 상기 균주의 배양물, 상기 균체의 파쇄물, 상기 파쇄물의 상등액, 및 이들의 추출물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 의미하는 것으로 사용된다.

본 발명은 추가로 본 발명에 따른 프럭토오스-6-포스페이트 에피머화 효소, 프럭토오스-6-포스페이트 에피머화 효소를 생산하는 균주의 균체, 배양물, 파쇄물, 파쇄물의 상등액, 및 이들의 추출물로 이루어진 군에서 선택된 1 이상과 과당-6-인산를 반응하는 단계를 포함하는, 프럭토오스-6-포스페이트로부터 타가토스 또는 알룰로스를 생산하는 방법을 제공한다.

상기 케토헥소오스 생산용 조성물을 이용하여 케토헥소오스, 예를 들면 알룰로스-6-포스페이트 또는 타가토스-6-포스페이트 생산하는 효소 또는 효소를 생산하는 미생물을 이용한 반응 온도 및 반응 pH 조건은 상기 효소의 반응온도 및 반응 pH 조건에서 상술한 바와 같다.

상기 방법은, 헥소키나제(hexokinase)를 이용하여, 프럭토오스 또는 프럭토오스 함유 물질로부터 프럭토오스-6-포스페이트를 제조하는 단계를 추가로 포함할 수 있거나, 및/또는 탈인산화효소를 이를 발현하는 미생물, 또는 상기 미생물의 배양물을 접촉시켜 포스페이트를 제거하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

상기 포스페이트를 제거하는 단계는, 알룰로스-6-포스페이트 탈인산화 효소(allulose-6-phosphate phosphatase), 상기 알룰로스-6-포스페이트 탈인산화 효소를 발현하는 미생물 또는 상기 알룰로스-6-포스페이트 탈인산화 효소를 발현하는 미생물의 배양물을 이용하여 수행하여 알룰로스를 제조할 수 있다. 또는, 상기 포스페이트를 제거하는 단계는, 타가토스-6-포스페이트에 phytase, 이를 발현하는 미생물, 또는 상기 미생물의 배양물을 접촉시켜, 상기 타가토스-6-포스페이트를 타가토스로 전환하는 단계를 수행하여, 타가토스를 제조할 수 있다.

본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 포스페이트를 제거하는 방법은 타가토스 6-포스페이트에 파이테이즈, 예를 들면 타가토스-6-포스페이트의 탈인산화 효소 및/또는 알룰로스-6-포스페이트의 탈인산화 효소를 작용시켜 타가토스로 전환하는 단계를 더욱 포함할 수 있다. 상기 타가토스 6-포스페이트 또는 알룰로스 6-포스페이트는 다른 효소 또는 화학적인 방법 등에 의하여 인산기가 제거될 수도 있다.

이와 같은 방법으로 생산된 알룰로스 또는 타가토스는 기능성 식품 및 의약품에 첨가되어 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 프럭토오스-6-포스페이트 에피머화 효소는 높은 효소 전환율, 산성 또는 중성의 반응 pH 조건 및 높은 열안성성의 특성 중 적어도 하나 이상을 충족하므로, 산업적 규모로 프럭토오스-6-포스페이트에피머화 효소를 이용한 케토헥소오스의 생산에 유용하게 이용할 수 있다.

도 1a 내지 1b는 프럭토오스-6-포스페이트의 4-에피머화 효소 단백질의 발현 및 정제를 확인한 전기영동 사진이다.
도 2a 내지 2b는 프럭토오스-6-포스페이트의 4-에피머화 효소 단백질의 온도 특성을 분석한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 3a 내지 3b는 프럭토오스-6-포스페이트의 4-에피머화 효소 단백질의 pH 특성을 분석한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 4a 내지 4b는 프럭토오스-6-포스페이트의 4-에피머화 효소 단백질의 열안정성 특성을 분석한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 5a 내지 5b는 프럭토오스-6-포스페이트의 4-에피머화 효소 단백질의 시간에 따른 전환 반응 결과를 보여주는 그래프이다.
도 6a 및 6b는 프럭토오스-6-포스페이트의 3-에피머화 효소 단백질의 발현 및 정제를 확인한 전기영동 사진이다.
도 7a 내지 7b는 프럭토오스-6-포스페이트의 3-에피머화 효소 단백질의 온도 특성을 분석한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 8a 내지 8b는 프럭토오스-6-포스페이트의 3-에피머화 효소 단백질의 pH 특성을 분석한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 9a 내지 9b는 프럭토오스-6-포스페이트의 3-에피머화 효소 단백질의 열안정성 특성을 분석한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 10a 내지 10b는 프럭토오스-6-포스페이트의 3-에피머화 효소 단백질의 시간에 따른 전환 반응 결과를 보여주는 그래프이다.

본 발명은 하기 실시예를 들어 더욱 자세히 설명할 것이나, 하기 실시예로 권리범위가 한정되는 의도는 아니다.

실시예 1: 타가토스-6-포스페이트 전환 효소의 생산

Pseudomonas sabulinigri (PS) 및 Thermococcus guaymasensis (TG) 균주로부터 유래한 aldolase (ALD) 유전자를 분리 후, 각 ALD DNA 염기서열을 기본으로 하여 primer를 고안하여 PCR을 실시하여 해당 유전자의 염기서열을 증폭하였다. PCR 증폭에 사용된 정방향 서열과 역방향 프라이머 서열은 하기와 같다.

프라이머명	서열 (5'->3')	서열 번호
PS-ALD-F	CCGCATATGGCCCTGATCAGCCTGC	9
PS-ALD-R	TCGGCTCGAGGTTGATCTTGGGGTCCAGTTC	10
TG-ALD-F	CCGCATATGGCAGTTGGAGACAAGATA	11
TG-ALD-R	TCGGCTCGAGCTCGATGTCCTCAAAGCGC	12

대량으로 얻은 ALD 유전자는 제한효소 NdeⅠ과 XhoⅠ을 사용하여 vec28a에 삽입하여 ALD를 제작하였고, 대장균 ER2566균주에 형질전환하여 사용하였다.

효소의 단백질 발현을 위한 재조합 E. coli는 500 ml의 LB배지와 50 μg/ml의 kanamycin 및 ampicillin을 함유한 플라스크에서 200rpm, 37℃로 배양하였다. 박테리아의 흡광도가 600 nm에서 0.6~0.8에 도달할 때, IPTG를 ALD 및 RP3E 발현을 tor pET 유도하기 위하여 최종농도 0.1 mM 로 첨가한 후 그 배양액을 10시간 동안 16 ℃에서 150 rpm으로 교반하면서 배양하였다.

Pseudomonas sabulinigri의 ALD 효소 (PS-ALD)의 생산 및 정제를 위해, 배양된 PS-ALD를 50 mM KH₂PO₄, 300 mM KCl, 5 mM immidazole을 첨가하여 세포 용액을 sonicator로 파쇄하였다. 세포 파쇄물은 다시 13,000×g로 4 ℃에서 10 min 동안 원심분리하고, 세포 pellet을 제거한 후 세포 상등액만을 얻어 filtering 후 profinia 에 his-tag을 이용한 흡착 컬럼을 장착하여 PS-ALD 를 분리하였다. 회수한 PS-ALD 에 최종 1 mM MgSO₄ 를37 ℃에서 30 min간 처리 후 사용하였다. 효소의 expression 및 정제는 0.5 mg/ml로 확인을 하였다. SDS-PAGE gel 분석을 통해 Pseudomonas sabulinigri (PS)의 ALD 효소(PS-ALD)의 발현 및 정제를 확인한 결과는 도 1a에 나타냈다.

Thermococcus guaymasensis (TG)의 ALD 효소 (TG-ALD)의 생산 및 정제를 위해, 배양된 TG-ALD를 100 mM citrate/phosphate buffer pH8을 첨가하여 세포 용액을 sonicator로 파쇄하였다. 세포 파쇄물은 다시 13,000×g로 4 ℃ 에서 10 min 동안 원심분리하고, 세포 pellet을 제거한 후 세포 상등액만을 얻어 70 ℃ 에서 10 min간 heat정제하여 filtering 후 회수한 TG-ALD 에 최종 1 mM MgSO₄ 를 37 ℃에서 30 min간 처리 후 사용하였다. 효소의 expression 및 정제는 0.5 mg/ml로 확인을 하였다. SDS-PAGE gel 분석을 통해 확인한 Thermococcus guaymasensis (TG)의 ALD 효소 (TG-ALD)의 발현 및 정제를 도 1b 에 나타낸다.

실시예 2: 효소의 온도 특성 분석

ALD 효소에 대한 온도 효과를 조사하기 위하여, 기질 10mM fructose-6-phosphate와 enzyme을 포함한 50 mM citrate/phosphate buffer pH8에서 40-95 ℃ 온도에서 실험을 진행하였다.

PS-ALD 의 tagatose-6-phosphate 생산에 대한 최적 온도를 조사하기 위하여 기질10mM fructose-6-phosphate와 0.05 mg/ml 의 enzyme을 포함한 50 mM citrate/phosphate buffer pH8, 40-80 ℃ 온도에서 10 min 동안 실험을 진행하였다. 실험결과 온도 50 ℃에서 최적임을 확인하였다. PS-ALD 의 tagatose-6-phosphate 생산에 대한 온도 특성을 도 2a에 나타냈다.

TG-ALD 의 tagatose-6-phosphate 생산에 대한 최적 온도를 조사하기 위하여 기질 10 mM fructose-6-phosphate와 1.0 mg/ml의 enzyme을 포함한 50 mM citrate/phosphate buffer pH 8, 50-95 ℃ 온도에서 30 min 동안 실험을 진행하였다. 실험결과 온도 90 ℃에서 최적임을 확인하였다. TG-ALD 의 tagatose-6-phosphate 생산에 대한 온도 특성을 도 2b에 나타냈다.

실시예 3: 효소의 pH 특성 분석

ALD 효소에 대한 pH 효과를 조사하기 위하여 기질 10mM fructose-6-phosphate와 enzyme을 포함한 50 mM citrate/phosphate buffer pH4~8, 50 mM Tris-HCl buffer pH8~9 각 효소의 최적 온도에서 실험을 진행하였다.

PS-ALD 의 tagatose-6-phosphate 생산에 대한 최적pH를 조사하기 위하여 기질 10 mM fructose-6-phosphate와 0.05 mg/ml 의 enzyme을 포함한 50 mM citrate/phosphate buffer pH4~8 및 50 mM Tris-HCl buffer pH8~9, 온도 50 ℃에서 10 min 동안 실험을 진행하였다. 실험결과 pH8에서 최적임을 확인하였다. PS-ALD 의 tagatose-6-phosphate 생산에 대한 pH 특성을 도 3a에 나타냈다.

TG-ALD 의 tagatose-6-phosphate 생산에 대한 최적pH를 조사하기 위하여 기질 10 mM fructose-6-phosphate와 1.0 mg/ml 의 enzyme을 포함한 50 mM citrate/phosphate buffer pH6~8 및 50 mM Tris-HCl buffer pH8~9, 온도 90 ℃에서 30 min 동안 실험을 진행하였다. 실험결과 pH8에서 최적임을 확인하였다. TG-ALD 의 tagatose-6-phosphate 생산에 대한 pH 특성을 도 3b에 나타냈다.

실시예 4: 열안정성 (Thermostability) 분석

ALD 효소에 대한 열안정성을 조사하기 위하여 기질 10mM fructose-6-phosphate와 enzyme을 포함한 각 enzyme의 최적 온도와 pH에서 실험을 진행하였다.

PS-ALD 에 대한 열안정성을 조사하기 위하여 기질 10mM fructose-6-phosphate와 0.05 mg/ml 의 enzyme을 포함한 50 mM citrate/phosphate buffer pH8, 온도 40-70 ℃에서 10 min 동안 실험을 진행하였다. 실험결과 열안정성 반감기는 40 ℃에서 31 h, 50 ℃에서 15 h, 60 ℃에서 10 h, 70 ℃에서 9 h이었다. PS-ALD 의 tagatose-6-phosphate 생산에 대한 열안정성 특성을 도 4a에 나타냈다.

TG-ALD에 대한 열안정성을 조사하기 위하여 기질 10mM fructose-6-phosphate와 1.0 mg/ml의 enzyme을 포함한 50 mM citrate/phosphate buffer pH8, 온도 60-95 ℃에서 30 min 동안 실험을 진행하였다. 실험결과 열안정성 반감기는 60 ℃에서 103 h, 75 ℃에서 82 h, 80 ℃에서 69 h, 85 ℃에서 66 h, 90 ℃에서 49 h, 95 ℃에서 45 h이었다. TG-ALD의 tagatose-6-phosphate 생산에 대한 열안정성 특성을 도 4b에 나타냈다.

실시예 5: 효소의 Time-course

Fructose-6-phosphate에 대한 ALD의 conversion을 확인하기 위해 기질 10mg/ml fructose-6-phosphate와 최적 조건에서 실험을 진행하였다. (최적 온도가 60 ℃가 넘어가는 균주는 60 ℃로 고정하여 실험을 진행하였다.)

PS-ALD 를 이용하여 fructose-6-phosphate에 대하여 tagatose-6-phosphate의 conversion을 확인하기 위해 기질 10mg/ml fructose-6-phosphate와 0.05 mg/ml 의enzyme을 포함한 50 mM citrate/phosphate buffer pH8, 온도 50 ℃에서 실험을 진행하였다. 실험결과 10 mg/ml 기질에서 12 h 동안 85.6 % conversion을 확인하였다. PS-ALD의 tagatose-6-phosphate 생산에 대한 특성을 도 5a에 나타냈다.

TG-ALD 를 이용하여 fructose-6-phosphate에 대하여 tagatose-6-phosphate의 conversion을 확인하기 위해 기질 10 mg/ml fructose-6-phosphate와 1.0 mg/ml 의enzyme을 포함한 50 mM citrate/phosphate buffer pH8, 온도 60 ℃에서 실험을 진행하였다. (최적온도는 90 ℃이지만 갈변현상으로 time course는 60 ℃에서 진행) 실험결과 10 mg/ml 기질에서 24 h 동안 64.7 % conversion을 확인하였다. TG-ALD 의 tagatose-6-phosphate 생산에 대한 특성을 도 5b에 나타냈다.

실시예 6: 효소의 기질 활성 분석

6-1: PS-ALD

Fructose-6-phosphate에 대한 PS-ALD 의 초기 활성을 확인하기 위해 10mM fructose-6-phosphate와 0.05 mg/ml 의 enzyme을 포함한 50 mM citrate/phosphate buffer pH8, 온도 50 ℃ 10 min 동안 실험을 진행하였다. Specific activity는 3,469 μmol/min/mg이었다.

Fructose-6-phosphate에 대한 PS-ALD 의 최대 전환을 확인하기 위해 10mM fructose-6-phosphate와 0.05 mg/ml 의 enzyme을 포함한 50 mM citrate/phosphate buffer pH8, 온도 50 ℃ 12 h 동안 실험을 진행하였다. 10 mM 기질에서 12 h동안 98 % conversion을 확인하였다.

6-2: TG-ALD

Fructose-6-phosphate에 대한 TG-ALD 의 초기 활성을 확인하기 위해 10mM fructose-6-phosphate와 1.0 mg/ml 의 enzyme을 포함한 50 mM citrate/phosphate buffer pH8, 온도 60 ℃ 30 min동안 실험을 진행하였다. Specific activity는 50 μmol/min/mg이었다.

Fructose-6-phosphate에 대한 TG-ALD 의 최대 전환을 확인하기 위해 10mM fructose-6-phosphate와 1.0 mg/ml 의 enzyme을 포함한 50 mM citrate/phosphate buffer pH8, 온도 60 ℃ 24 h 동안 실험을 진행하였다. 실험결과 10 mM 기질에서 24 h동안 81 % conversion을 확인하였다.

실시예 7: 효소의 당전환 산물의 분석

7-1: 전환산물 분석 방법

Product는 정량분석만 수행하였으며, 정량분석은 Bio-LC를 이용하여 standard시약들의 fructose-6-phosphate, tagatose-6-phosphate, allulose-6-phosphate의 농도를 변화시키고 이에 따른 peak area의 양을 이용하여 calibration curve를 만든 후, 반응액의 peak area의 양으로 calibration curve를 사용하여 농도로 변환시겼다. Dionex CarnoPac PA1(Thermo scientific사)컬럼을 사용하여 40 ℃에 200 mM NaOH: 1M C₂H₃NaO₂: TDW(45:35:20)를 이동상으로 1.0 ml/min 유속으로 흘려주면서 fructose-6-phosphate, tagatose-6-phosphate, allulose-6-phosphate를 검출하였다.

실시예 8: 알룰로스-6-포스페이트 전환 효소의 생산

Geobacillus thermodenitripicans (GT) 및 Novibacillus thermophiles (NT) 균주로부터 유래한 ribulose-5-phosphate-3-epimerase (RP3E) 유전자를 분리 후, 각 RP3E DNA 염기서열을 기본으로 하여 primer를 고안하여 PCR을 실시하여 해당 유전자의 염기서열을 증폭하였다. PCR 증폭에 사용된 정방향 서열과 역방향 프라이머 서열은 하기와 같다.

프라이머명	서열 (5'->3')	서열 번호
GT-RP3E-F	CCGCATATGATTCGGATTGCGCCATC	13
GT-RP3E-R	TCGGCTCGAGTCTGGTGCATACTTCACGG	14
NT-RP3E-F	CCGCATATGATTGTAACGGCCCCGTC	15
NT-RP3E-R	TCGGCTCGAGTATCGCACCCTCTACTCG	16

PCR 증폭으로 대량으로 얻은 RP3E 유전자는 제한효소 NdeⅠ과 XhoⅠ을 사용하여 vector pET21a에 삽입하여 RP3E를 제작하였고, 대장균 ER2566균주에 형질전환하여 사용하였다.

Geobacillus thermodenitripicans의 ribulose-5-phosphate-3-epimerase 효소 (GT-RP3E)의 생산 및 정제를 위해, 배양된 GT-RP3E를 50 mM KH₂PO₄, 300 mM KCl, 5 mM immidazole을 첨가하여 세포 용액을 sonicator로 파쇄하였다. 세포 파쇄물은 다시 13,000xg로 4 ℃에서 10 min 동안 원심분리하고, 세포 pellet을 제거한 후 세포 상등액만을 얻어 filtering 후 profinia 에 his-tag을 이용한 흡착 컬럼을 장착하여 GT-RP3E를 분리하였다. 회수한 GT-RP3E 에 최종 1mM MgSO₄ 를37 ℃에서 30 min간 처리 후 사용하였다. 효소의 expression 및 정제는 0.5 mg/ml로 확인을 하였다. SDS-PAGE gel 분석을 통하여 GT-P3E의 발현 및 정제를 도 6a 에 나타낸다.

배양된 NT-RP3E를 50 mM KH₂PO₄, 300 mM KCl, 5 mM immidazole을 첨가하여 세포 용액을 sonicator로 파쇄하였다. 세포 파쇄물은 다시 13,000×g로 4 ℃에서 10 min 동안 원심분리하고, 세포 pellet을 제거한 후 세포 상등액만을 얻어 filtering 후 profinia 에 his-tag을 이용한 흡착 컬럼을 장착하여 NT-RP3E를 분리하였다. 회수한 NT-RP3E에 최종 1 mM MgSO₄ 를 37 ℃에서 30 min간 처리 후 사용하였다. SDS-PAGE gel 분석을 통하여 NT-RP3E의 발현 및 정제를 도 6b 에 나타낸다.

실시예 9: 효소의 온도 특성 분석

효소의 온도 특성을 조사하기 위하여, 기질10mM fructose-6-phosphate와 enzyme을 포함한 50 mM citrate/phosphate buffer pH8에서 40-95 ℃ 온도에서 실험을 진행하였다.

GT-RP3E의 알룰로스-6-포스페이트 생산에 대한 최적 온도를 조사하기 위하여 기질10mM fructose-6-phosphate와 0.1 mg/ml 의 enzyme을 포함한 50 mM citrate/phosphate buffer pH 5, 40-80 ℃ 온도에서 10 min 동안 실험을 진행하였다. 실험결과 온도 70 ℃에서 최적임을 확인하였다. GT-RP3E 의 알룰로스-6-포스페이트 생산에 대한 온도 특성을 도 7a에 나타냈다.

NT-RP3E 의 알룰로스-6-포스페이트 생산에 대한 최적 온도를 조사하기 위하여 기질10mM fructose-6-phosphate와 0.1 mg/ml 의 enzyme을 포함한 50 mM citrate/phosphate buffer pH 5, 40-80 ℃ 온도에서 10 min 동안 실험을 진행하였다. 실험결과 온도 50 ℃에서 최적임을 확인하였다. NT-RP3E 의 알룰로스-6-포스페이트 생산에 대한 온도 특성을 도 7b에 나타냈다.

실시예 10: 효소의 pH 특성 분석

RP3E 효소에 대한 pH 효과를 조사하기 위하여 기질10mM fructose-6-phosphate와 enzyme을 포함한 50 mM citrate/phosphate buffer pH4~8, 50 mM Tris-HCl buffer pH8~9 각 효소의 최적 온도에서 실험을 진행하였다.GT-RP3E의 알룰로스-6-포스페이트 생산에 대한 최적 pH를 조사하기 위하여 기질10mM fructose-6-phosphate와 0.1 mg/ml 의 enzyme을 포함한 50 mM citrate/phosphate buffer pH4~8, 온도70 ℃에서 10 min 동안 실험을 진행하였다. 실험결과 pH 5에서 최적임을 확인하였다. GT-RP3E 의 알룰로스-6-포스페이트 생산에 대한 pH 특성을 도 8a에 나타냈다.

NT-RP3E 의 알룰로스-6-포스페이트 생산에 대한 최적 pH를 조사하기 위하여 기질10mM fructose-6-phosphate와 0.1 mg/ml 의enzyme을 포함한 50 mM citrate/phosphate buffer pH 4~8, 온도 50 ℃에서 10 min 동안 실험을 진행하였다. 실험결과 pH 5에서 최적임을 확인하였다. NT-RP3E 의 알룰로스-6-포스페이트 생산에 대한 pH 특성을 도 8b에 나타냈다.

실시예 11: 열안정성 (Thermostability) 분석

RP3E 효소에 대한 열안정성을 조사하기 위하여 기질10mM fructose-6-phosphate와 enzyme을 포함한 각 enzyme의 최적 온도와 pH에서 실험을 진행하였다.

GT-RP3E에 대한 열안정성을 조사하기 위하여 기질10mM fructose-6-phosphate와 0.1 mg/ml 의 enzyme을 포함한 50 mM citrate/phosphate buffer pH 5, 온도 50-80 ℃에서 10 min 동안 실험을 진행하였다. 실험결과 열안정성 반감기는 50 ℃에서 50 h, 60 ℃에서 44 h, 70 ℃에서 32 h, 80 ℃에서 20 h이었다. GT-RP3E 의 알룰로스-6-포스페이트 생산에 대한 열안정성 특성을 도 9a에 나타냈다.

NT-RP3E에 대한 열안정성을 조사하기 위하여 기질10mM fructose-6-phosphate와 0.1 mg/ml 의enzyme을 포함한 50 mM citrate/phosphate buffer pH 5, 온도 40-70 ℃에서 10 min 동안 실험을 진행하였다. 실험결과 열안정성 반감기는 40 ℃에서 85 h, 50 ℃에서 17 h, 60 ℃에서 13 h, 70 ℃에서 11 h이었다. NT-RP3E 의 알룰로스-6-포스페이트 생산에 대한 열안정성 특성을 도 9b에 나타냈다.

실시예 12: 효소의 Time-course

Fructose-6-phosphate에 대한 RP3E 의 conversion을 확인하기 위해 기질10mg/ml fructose-6-phosphate와 최적 조건에서 실험을 진행하였다. (최적 온도가 60 ℃가 넘어가는 균주는 60 ℃로 고정하여 실험을 진행하였다.)

GT-RP3E 를 이용하여 fructose-6-phosphate에 대하여 알룰로스-6-포스페이트 의 conversion을 확인하기 위해 기질10 mg/ml fructose-6-phosphate와 0.1 mg/ml 의 enzyme을 포함한 50 mM citrate/phosphate buffer pH 5, 온도 60 ℃에서 실험을 진행하였다. (최적온도는 70 ℃이지만 갈변현상으로 time course는 60 ℃에서 진행) 실험결과 10 mg/ml 기질에서 22 h 동안 45 % conversion을 확인하였다. GT-RP3E 의 알룰로스-6-포스페이트 생산에 대한 특성을 도 10a에 나타냈다.

NT-RP3E를 이용하여 fructose-6-phosphate에 대하여 알룰로스-6-포스페이트의 conversion을 확인하기 위해 기질10 mg/ml fructose-6-phosphate와 0.1 mg/ml 의 enzyme을 포함한 50 mM citrate/phosphate buffer pH 5, 온도 50 ℃에서 실험을 진행하였다. 실험결과 10 mg/ml 기질에서 20 h 동안 88 % conversion을 확인하였다. NT-RP3E 의 알룰로스-6-포스페이트 생산에 대한 특성을 도 10b에 나타냈다.

실시예 13: 효소의 기질 활성 분석

Fructose-6-phosphate에 대한 GT-RP3E의 초기 활성을 확인하기 위해 10mM fructose-6-phosphate와 0.1 mg/ml 의 enzyme을 포함한 50 mM citrate/phosphate buffer pH 5, 온도 60 ℃ 10 min동안 실험을 진행하였다. Specific activity는 1,077 μmol/min/mg이었다.

Fructose-6-phosphate에 대한 GT-RP3E의 최대 전환을 확인하기 위해 10mM fructose-6-phosphate와 0.1 mg/ml 의enzyme을 포함한 50 mM citrate/phosphate buffer pH 5, 온도 60 ℃ 24 h 동안 실험을 진행하였다. 실험결과 10 mM 기질에서 22 h동안 41 % conversion을 확인하였다.

Fructose-6-phosphate에 대한 NT-RP3E의 초기 활성을 확인하기 위해 10mM fructose-6-phosphate와 0.1 mg/ml 의 enzyme을 포함한 50 mM citrate/phosphate buffer pH 5, 온도 50 ℃ 30 min동안 실험을 진행하였다. Specific activity는 776 μmol/min/mg이었다.

Fructose-6-phosphate에 대한 NT-RP3E의 최대 전환을 확인하기 위해 10mM fructose-6-phosphate와 0.1 mg/ml 의 효소를 포함한 50 mM citrate/phosphate buffer pH 5, 온도 50 ℃ 20 h 동안 실험을 진행하였다. 실험결과 10 mM 기질에서 20 h동안 80 % conversion을 확인하였다.

<110> Samyang corporation <120> Epimerase enzyme of phosphorylated saccharide <130> DPP20190003KR <160> 16 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 354 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fructose-6-phosphate 4-epimerase(PsALD) <400> 1 Met Ala Leu Ile Ser Leu Arg Gln Met Leu Asp His Ala Ala Glu Tyr 1 5 10 15 Gly Tyr Gly Val Pro Ala Phe Asn Val Asn Asn Leu Glu Gln Met Arg 20 25 30 Ala Ile Met Glu Ala Ala Asp Lys Thr Asp Ser Pro Val Ile Val Gln 35 40 45 Ala Ser Ala Gly Ala Arg Lys Tyr Ala Gly Ala Pro Phe Leu Arg His 50 55 60 Leu Ile Leu Ala Ala Ile Glu Glu Phe Pro His Ile Pro Val Cys Met 65 70 75 80 His Gln Asp His Gly Thr Ser Pro Ala Val Cys Gln Arg Ser Ile Gln 85 90 95 Leu Gly Phe Ser Ser Val Met Met Asp Gly Ser Leu Gly Glu Asp Gly 100 105 110 Lys Thr Pro Thr Ser Tyr Glu Tyr Asn Val Asp Val Thr Arg Arg Thr 115 120 125 Val Glu Met Ala His Ala Cys Gly Val Ser Val Glu Gly Glu Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Gly Ser Leu Glu Thr Gly Met Ala Gly Glu Glu Asp Gly Ile 145 150 155 160 Gly Ala Glu Gly Val Leu Asp His Ser Gln Met Leu Thr Asp Pro Glu 165 170 175 Glu Ala Ala Asp Phe Val Lys Gln Thr Gly Val Asp Ala Leu Ala Ile 180 185 190 Ala Ile Gly Thr Ser His Gly Ala Tyr Lys Phe Thr Arg Pro Pro Thr 195 200 205 Gly Asp Ile Leu Ala Ile Glu Gln Ile Lys Ala Ile His Gln Arg Ile 210 215 220 Pro Asp Thr His Leu Val Met His Gly Ser Ser Ser Val Pro Gln Glu 225 230 235 240 Trp Leu Lys Ile Ile Asn Glu Phe Gly Gly Glu Ile Pro Glu Thr Tyr 245 250 255 Gly Val Pro Val Glu Glu Ile Val Glu Gly Ile Lys Phe Gly Val Arg 260 265 270 Lys Val Asn Ile Asp Thr Asp Leu Arg Leu Ala Ser Thr Gly Ala Val 275 280 285 Arg Arg Phe Met Ala Gln Asn Pro Ala Glu Phe Asp Pro Arg Lys Phe 290 295 300 Leu Ala Lys Thr Val Asp Ala Met Arg Asp Ile Cys Ile Ala Arg Tyr 305 310 315 320 Glu Ala Phe Gly Thr Ala Gly Asn Ala Ser Lys Ile Lys Pro Ile Cys 325 330 335 Leu Asp Asp Met Phe Glu Arg Tyr Ala Arg Gly Glu Leu Asp Pro Lys 340 345 350 Ile Asn <210> 2 <211> 1065 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fructose-6-phosphate 4-epimerase(PsALD) <400> 2 atggccctga tcagcctgcg ccagatgctc gaccacgccg ccgaatacgg ctacggcgtg 60 cccgcgttca acgtcaacaa cctggagcag atgcgcgcca tcatggaagc ggccgacaag 120 accgactccc cggtcatcgt gcaagcctcg gccggcgcgc gcaaatatgc cggcgccccg 180 tttctgcgtc acctgattct ggcggcgatc gaagagtttc cgcacattcc ggtgtgtatg 240 caccaggacc acggcaccag cccggcggtc tgccaacgtt ccatccagct gggcttctcc 300 tcggtaatga tggacggttc gctgggtgaa gacggcaaga cgccgaccag ctacgagtac 360 aacgtcgacg taacccgtcg taccgttgaa atggcgcacg cctgcggtgt gtccgtagaa 420 ggtgagctgg gctgcctggg tagtctggaa accggtatgg ccggtgaaga agacggcatt 480 ggcgccgagg gtgtgctgga tcacagccag atgctgactg atccggaaga agccgccgac 540 ttcgtcaagc agaccggcgt tgacgccctg gcaattgcca tcggcaccag ccacggtgct 600 tacaagttca cccgtccgcc gaccggcgat atcctcgcca tcgagcagat caaggcgatc 660 catcagcgca ttcccgatac ccacctggtc atgcacggct cctcttccgt gccgcaggag 720 tggctgaaga tcatcaacga atttggtggc gaaattccgg aaacctacgg tgtgccggtg 780 gaagaaatcg ttgagggcat caagtttggc gtgcgcaagg tcaacatcga taccgacctg 840 cgtctggctt caaccggtgc ggtacgtcgc ttcatggcgc agaacccggc cgaattcgac 900 ccgcgcaagt tcctcgccaa gaccgtcgat gccatgcgcg acatctgtat cgcgcggtac 960 gaagcctttg gcaccgcggg caacgcctcc aagatcaagc cgatctgcct ggatgacatg 1020 ttcgagcgct acgcgcgcgg tgaactggac cccaagatca actaa 1065 <210> 3 <211> 375 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fructose-6-phosphate 4-epimerase(TgALD) <400> 3 Met Ala Val Gly Asp Lys Ile Thr Ile Ser Val Ile Lys Ala Asp Ile 1 5 10 15 Gly Gly Trp Pro Gly His Ser Arg Val His Pro Gln Leu Val Glu Thr 20 25 30 Ala Glu Glu Val Leu Ala Lys Ala Gln Glu Glu Gly Thr Leu Ile Asp 35 40 45 Phe Tyr Val Ala Thr Cys Gly Asp Asp Leu Gln Leu Ile Met Thr His 50 55 60 Lys Lys Gly Val Asp Ser Ser Glu Ile His Gly Leu Ala Trp Arg Thr 65 70 75 80 Phe Glu Glu Ala Thr Lys Val Ala Lys Glu Leu Gly Leu Tyr Gly Ala 85 90 95 Gly Gln Asp Leu Leu Lys Asp Ala Phe Ser Gly Asn Val Arg Gly Met 100 105 110 Gly Pro Gly Val Ala Glu Met Glu Ile Thr Leu Arg Lys Ser Glu Pro 115 120 125 Val Val Thr Phe His Met Asp Lys Thr Glu Pro Gly Ala Phe Asn Leu 130 135 140 Pro Ile Phe Arg Met Phe Ala Asp Pro Phe Asn Thr Ala Gly Leu Val 145 150 155 160 Ile Asp Pro Lys Met His Met Gly Phe Arg Phe Glu Val Trp Asp Ile 165 170 175 Leu Lys His Lys Arg Val Ile Leu Ser Thr Pro Glu Glu Leu Tyr Asp 180 185 190 Leu Leu Ala Leu Ile Gly Ala Lys Ser Arg Tyr Val Ile Lys Arg Val 195 200 205 Phe Pro Lys Glu Gly His Pro Ile Pro Lys Asp Glu Pro Val Ala Val 210 215 220 Val Ser Thr Glu Lys Leu Tyr Glu Ile Ala Gly Glu Tyr Val Gly Lys 225 230 235 240 Asp Asp Pro Val Ala Ile Val Arg Ala Gln Ser Gly Leu Pro Ala Leu 245 250 255 Gly Glu Val Leu Glu Pro Phe Ala Phe Pro His Leu Val Ser Gly Trp 260 265 270 Met Arg Gly Ser His Asn Gly Pro Ile Met Pro Val Pro Met His Gln 275 280 285 Ala Asn Pro Thr Arg Phe Asp Gly Pro Pro Arg Val Val Ala Leu Gly 290 295 300 Trp Gln Ile Ser Pro Glu Gly Lys Leu Val Gly Pro Val Asp Leu Phe 305 310 315 320 Asp Asp Pro Ala Phe Asp Tyr Ala Arg Gln Lys Ala Leu Glu Ile Thr 325 330 335 Asp Tyr Met Arg Arg His Gly Pro Phe Glu Pro His Arg Leu Pro Leu 340 345 350 Glu Glu Met Glu Tyr Thr Thr Leu Pro Gly Val Leu Lys Arg Leu Glu 355 360 365 Glu Arg Phe Glu Asp Ile Glu 370 375 <210> 4 <211> 1128 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fructose-6-phosphate 4-epimerase(TgALD) <400> 4 atggcagttg gagacaagat aacgattagt gtaattaagg cagacatcgg cggctggccg 60 ggccattcaa gggttcaccc ccaactcgtc gagaccgccg aggaggttct cgccaaggcc 120 caggaggagg gtaccctaat agacttctac gtcgccacct gcggcgacga ccttcagctc 180 atcatgactc acaagaaggg cgttgacagc tccgagatac acggcctcgc atggaggacc 240 ttcgaggagg ccaccaaggt cgcaaaggag cttggcctct acggagccgg tcaggacctc 300 ctcaaagatg cattcagcgg aaacgtccgc ggaatgggcc cgggcgttgc cgagatggag 360 ataacgctga ggaagagcga gccggtggta accttccaca tggacaagac cgagcctggc 420 gcgtttaacc tcccgatatt caggatgttc gccgacccgt tcaacaccgc tggcctcgtc 480 atagacccca agatgcacat gggcttccgc tttgaggtct gggacatact caagcacaag 540 agggttatcc tcagcacccc agaggagctc tacgatctcc tcgccctcat aggagctaag 600 agccgctacg taatcaagcg cgtcttcccg aaggagggcc acccaattcc aaaggacgag 660 ccggtagctg ttgtaagcac agagaagctc tacgagattg caggggaata cgtcggcaag 720 gacgatccgg ttgcgatagt tagggcccag agcgggctcc ctgccctcgg agaagtcctt 780 gagcccttcg ccttcccgca cctcgtcagc ggctggatga ggggaagcca caacggcccg 840 ataatgcccg tcccgatgca ccaggccaac ccgacaaggt tcgacggccc gccgagggtt 900 gtcgctctcg gctggcagat cagcccagaa ggaaagctcg tcggcccggt tgacctcttc 960 gacgacccgg cctttgacta cgccaggcag aaggcccttg agattacgga ttacatgcgc 1020 agacacggcc cgttcgagcc ccacaggctc ccgctcgagg aaatggagta caccaccctg 1080 cccggcgtgc tgaagaggct tgaggagcgc tttgaggaca tcgagtga 1128 <210> 5 <211> 218 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fructose-6-phosphate 4-epimerase(GtRP3E) <400> 5 Met Ile Arg Ile Ala Pro Ser Ile Leu Ser Ala Asp Phe Ala Arg Leu 1 5 10 15 Ala Glu Glu Ile Arg Ser Val Glu Glu Gly Gly Ala Asp Trp Ile His 20 25 30 Val Asp Val Met Asp Gly His Phe Val Pro Asn Leu Thr Leu Gly Pro 35 40 45 Pro Ile Val Ala Ala Ile Arg Pro Val Thr Lys Leu Pro Leu Asp Val 50 55 60 His Leu Met Ile Thr Asp Pro Asp Arg Tyr Ile Pro Ala Phe Val Glu 65 70 75 80 Ala Gly Ala Asp Leu Ile Ser Val His Val Glu Ala Cys Val His Leu 85 90 95 His Arg Thr Ile His Phe Ile Lys Glu Gln Gly Val Lys Ala Gly Val 100 105 110 Val Leu Asn Pro His Thr Pro Val Asp Met Ile Arg His Val Ile Ala 115 120 125 Asp Val Asp Leu Val Leu Leu Met Ser Val Asn Pro Gly Phe Gly Gly 130 135 140 Gln Ala Phe Ile Pro Ala Val Val Pro Lys Ile Arg Glu Val Ala Arg 145 150 155 160 Leu Ala Asn Glu Gln Asn Lys Lys Ile Asp Ile Glu Val Asp Gly Gly 165 170 175 Val Asn Ala Lys Thr Ala Pro Leu Cys Val Glu Ala Gly Ala Asn Val 180 185 190 Leu Val Ala Gly Ser Ala Ile Tyr Asn Asn Pro Asp Arg Ala Ala Ala 195 200 205 Ile Arg Ala Leu Arg Glu Val Cys Thr Arg 210 215 <210> 6 <211> 654 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fructose-6-phosphate 3-epimerase(GtRP3E) <400> 6 atgattcgga ttgcgccatc gattttatcg gccgactttg cccgtttggc cgaagagatt 60 cgttctgttg aagaaggtgg ggccgactgg attcatgttg atgtaatgga cggacatttt 120 gtgccgaact tgacgctcgg tccgccgatt gtggctgcca ttcgtccagt gacgaagctg 180 ccgttggacg tccatttaat gatcactgat ccggaccgat atattccagc atttgtcgag 240 gcgggggctg atctcatttc cgtccatgtc gaggcgtgtg tgcatttgca tcggacgatc 300 cattttatta aagaacaagg cgtcaaagca ggagtcgtgt taaacccgca tacgccggtt 360 gacatgatcc gacatgtaat tgccgatgtt gatctcgttt tattgatgtc ggtcaaccca 420 gggtttggag gacaggcgtt tattccggct gtggtgccga aaatccgcga ggttgctcgg 480 ctggctaatg agcagaacaa gaagatcgat attgaggtgg atggcggtgt caacgcgaaa 540 acggcgccgc tttgcgtcga agcaggtgcc aacgtgcttg ttgctggatc agccatttac 600 aataatcccg acagggcggc cgccattcgc gctctccgtg aagtatgcac caga 654 <210> 7 <211> 219 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fructose-6-phosphate 3-epimerase(NtRP3E) <400> 7 Met Ile Val Thr Ala Pro Ser Ile Leu Ser Ala Asp Phe Ala Lys Leu 1 5 10 15 Gly Asp Glu Ile Ala Asp Val Glu Lys Gly Gly Ala Asp Trp Ile His 20 25 30 Val Asp Val Met Asp Gly His Phe Val Pro Asn Ile Thr Ile Gly Pro 35 40 45 Leu Ile Val Glu Ala Ile Arg Pro Arg Thr Ser Leu Pro Leu Asp Val 50 55 60 His Leu Met Ile Ala Asn Pro Asp Gln Tyr Ile Glu Ser Phe Val Lys 65 70 75 80 Ser Gly Ala Asp Trp Val Thr Val His Gln Glu Ala Ser Pro His Leu 85 90 95 His Arg Thr Ile His Lys Ile Lys Glu His Gly Val Arg Ala Gly Val 100 105 110 Ala Leu Asn Pro Ala Thr Pro Leu Ser Ala Ile Glu Tyr Val Leu Glu 115 120 125 Asp Leu Asp Met Val Leu Ile Met Thr Val Asn Pro Gly Phe Gly Gly 130 135 140 Gln Thr Phe Ile Arg Ser Thr Leu Pro Lys Ile Arg Ala Leu Arg Gln 145 150 155 160 Met Ala Glu Glu Lys Gly Leu Ser Leu Asn Ile Glu Val Asp Gly Gly 165 170 175 Ile Asn Glu Gln Thr Ala Cys Asp Ala Val His His Gly Ala Asn Val 180 185 190 Leu Val Ala Gly Ser Tyr Ile Phe Gly Ala Ser Asp Arg Arg Thr Lys 195 200 205 Ile Gln Ser Leu Lys Arg Val Glu Gly Ala Ile 210 215 <210> 8 <211> 657 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fructose-6-phosphate 3-epimerase(NtRP3E) <400> 8 atgattgtaa cggccccgtc gatactctct gccgactttg cgaagttagg ggatgaaata 60 gcagatgttg aaaagggagg ggcggactgg atacacgtgg acgtgatgga cgggcatttt 120 gtccccaaca ttaccatcgg ccccctcatc gttgaagcca tccggccccg cacgtcgttg 180 ccgctcgacg ttcatttgat gattgcgaat cctgaccagt acatcgaatc gtttgtcaag 240 agcggggcag attgggtgac ggttcaccag gaggcgtcgc cgcacttgca ccggaccatt 300 cacaaaatta aggagcacgg tgttcgcgcc ggtgtggcac taaacccggc gacgccgctg 360 tcagccatcg agtacgtgct agaagacctt gacatggtgc tcatcatgac ggtcaaccct 420 ggatttgggg ggcaaacgtt tattcggtcc acccttccga aaatccgcgc cttgcgtcaa 480 atggcagagg agaaggggct ctcactcaac attgaagtgg atggaggcat aaacgaacag 540 acggcttgcg atgcagtcca tcacggcgcc aatgtgctgg tcgccgggtc gtacattttc 600 ggagcatcag accgccggac aaaaatccaa tcgttaaaac gagtagaggg tgcgata 657 <210> 9 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer PS-ALD-F <400> 9 ccgcatatgg ccctgatcag cctgc 25 <210> 10 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer PS-ALD-R <400> 10 tcggctcgag gttgatcttg gggtccagtt c 31 <210> 11 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer TG-ALD-F <400> 11 ccgcatatgg cagttggaga caagata 27 <210> 12 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer TG-ALD-R <400> 12 tcggctcgag ctcgatgtcc tcaaagcgc 29 <210> 13 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer GT-RP3E-F <400> 13 ccgcatatga ttcggattgc gccatc 26 <210> 14 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer GT-RP3E-R <400> 14 tcggctcgag tctggtgcat acttcacgg 29 <210> 15 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer NT-RP3E-F <400> 15 ccgcatatga ttgtaacggc cccgtc 26 <210> 16 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer NT-RP3E-R <400> 16 tcggctcgag tatcgcaccc tctactcg 28

Claims

프럭토오스-6-포스페이트(fructose 6-phosphate)의 에피머화 효소 단백질.
제1항에 있어서, 상기 에피머화 효소는 프럭토오스-6-포스페이트(Fructose-6-phosphate)를 타가토스-6-포스페이트(tagatose-6-phosphate)로 전환시키는 4-에피머화 효소인 효소 단백질
제2항에 있어서, 상기 효소는 서열번호 1 또는 3의 아미노산 서열과 70% 이상의 아미노산 서열 상동성 (identity)을 가지는 것인 효소 단백질.
제2항에 있어서, 상기 효소는 서열번호 2 또는 4의 뉴클레오타이드 서열과 과 70% 이상의 뉴클레오타이드 서열 상동성 (identity)을 가지는 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화되는 것인 효소 단백질.
제2항에 있어서, 상기 효소는 Pseudomonas sabulinigri 에서 유래되며, 하기 특성 중에서 선택된 1종 이상의 특성을 갖는 것인 효소 단백질:
40 내지 65℃의 효소 반응 온도,
pH 6 내지 9의 효소 반응 pH, 및
타가토스-6-포스페이트의 전환율이 70%이상임.
제2항에 있어서, 상기 효소는 Thermococcus guaymasensis 에서 유래되며, 하기 특성 중에서 선택된 1종 이상의 특성을 갖는 것인 효소 단백질:
80 내지 95℃의 효소 반응 온도,
pH 6 내지 9의 효소 반응 pH, 및
60℃에서 반감기가 80시간 내지 110시간임.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 에피머화 효소를 암호화하는 핵산 분자.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 에피머화 효소를 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 형질전환체.
제2항 내지 제6항 중 어느 한항에 따른 에피머화 효소, 상기 효소를 발현하는 미생물 균주, 상기 균주의 균체, 상기 균주의 배양물, 상기 균체의 파쇄물, 상기 파쇄물의 상등액, 및 상기 균체, 배양물, 파쇄물 및 상등액의 추출물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 타가토스 생산용 조성물.
제2항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 효소 단백질을 이용하여, Fructose-6-phosphate를 tagatose-6-phosphate로 전환시키는 단계를 포함하는, 타가토스를 제조하는 방법.
제10항에 있어서, 상기 Fructose-6-phosphate를 tagatose-6-phosphate로 전환시키는 단계는 pH 범위가 pH 6 내지 9에서 수행되는 것인 방법.
제10항에 있어서, 헥소키나제(hexokinase)를 이용하여, 프럭토오스 또는 프럭토오스 함유 물질로부터 프럭토오스-6-포스페이트를 제조하는 단계를 추가로 수행하는 것인 방법.
제10항에 있어서, 상기 타가토스-6-포스페이트에 타가토스-6-포스페이트 탈인산화효소, 이를 발현하는 미생물, 또는 상기 미생물의 배양물을 접촉시켜, 상기 타가토스-6-포스페이트를 타가토스로 전환하는 단계를 추가적으로 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 에피머화 효소는 프럭토오스-6-포스페이트(Fructose-6-phosphate)를 알룰로스-6-포스페이트 (allulose-6-phosphate)로 전환시키는 3-에피머화 효소인 효소 단백질.
제14항에 있어서, 상기 효소는 서열번호 5 또는 7의 아미노산 서열과 70% 이상의 서열 상동성 (identity)을 가지는 것인 효소 단백질.
제14항에 있어서, 상기 효소는 서열번호 6 또는 8의 뉴클레오타이드 서열과 70% 이상의 서열 상동성 (identity)을 가지는 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화되는 것인 효소 단백질.
제14항에 있어서, 상기 효소는 효소 반응 pH가 4 내지 7의 범위를 갖는 것인 효소 단백질.
제14항에 있어서, 상기 효소는 Geobacillus thermodenitripicans 에서 유래되며, 하기 특성 중에서 선택된 1종 이상의 특성을 갖는 것인 효소 단백질:
40 내지 80℃의 효소 반응 온도, 및
pH 4 내지 7의 효소 반응 pH.
제14항에 있어서, 상기 효소는 Novibacillus thermophiles 에서 유래되며, 하기 특성 중에서 선택된 1종 이상의 특성을 갖는 것인 효소 단백질:
40 내지 80℃의 효소 반응 온도,
pH 4 내지 7의 효소 반응 pH, 및
알룰로스-6-포스페이트의 전환율이 80 %이상임.
제14항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 에피머화 효소를 암호화하는 핵산 분자.
제14항 내지 제19항 중 어느 한항에 따른 에피머화 효소를 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 형질전환체.
제14항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 에피머화 효소, 상기 효소를 발현하는 미생물 균주, 상기 균주의 균체, 상기 균주의 배양물, 상기 균체의 파쇄물, 상기 파쇄물의 상등액, 및 상기 균체, 배양물, 파쇄물 및 상등액의 추출물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 알룰로스 생산용 조성물.
제14항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 효소 단백질을 이용하여, Fructose-6-phosphate를 allulose-6-phosphate로 전환시키는 단계를 포함하는, 알룰로스를 제조하는 방법.
제23항에 있어서, 헥소키나제(hexokinase)를 이용하여, 프럭토오스 또는 프럭토오스 함유 물질로부터 프럭토오스-6-포스페이트를 제조하는 단계를 추가로 수행하는 것인, 방법.
제24항에 있어서, 상기 알룰로스-6-포스페이트에 파이타제(phytase), 이를 발현하는 미생물, 또는 상기 미생물의 배양물을 접촉시켜, 상기 알룰로스-6-포스페이트를 알룰로스로 전환하는 단계를 추가적으로 포함하는 방법.