KR20200107319A - 산딸나무 잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 항비만 조성물 - Google Patents
산딸나무 잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 항비만 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 산딸나무(Cornus kousa) 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 항비만 조성물 및 혈관신생 억제용 조성물을 제공한다.
Description
본 발명은 항비만 조성물에 관한 것으로서, 더 상세하게는 산딸나무 잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 항비만 조성물에 관한 것이다.
일반적으로 체질량 지수(BMI)가 30kg/m2를 초과하면 임상 비만(clinical obesity)으로 정의한다(Ogden CL et al., United States, 2011-2014. NCHS Data Brief, no. 201. Hyattsville, MD:National Center for Health Statistics, 2015.). 비만은 에너지 섭취와 소비의 불균형으로 인해 지방 조직에 트리글리세라이드(TG)가 과도하게 축적되어 발생하고(Iizuka Y et al., Toxicology Reports. 3:4-14. 2016) 당뇨병 및 심혈관 질환뿐만 아니라 뇌졸중, 골관절염, 수면 무호흡증, 암 및 염증과 같은 만성 질환을 포함하는 대사 질환의 발생을 촉진한다. 또한 췌장암, 간세포 암, 전립선 암, 위암 및 유방암을 비롯한 여러 유형의 암을 유발하는 고위험 요인이다. 비만 지방조직(obese adipose tissue)은 염증성 사이토카인 및 종양의 전이를 촉진하고 암을 유발할 수 있는 매개체를 생성하는데 지질생성(lipogenesis) 및 지방형성(adipogenesis)은 지방조직 내 지질의 생성 및 축적과 관련된 주요 과정으로 지방산 합성(fatty acid synthase, FAS), 지방산 결합 단백질(aP2), stearoyl-CoA desaturase-1(SCD-1), 지단백질 분해 효소 (LPL), CCAAT/enhancer-binding protein α (C/EBPα), peroxisome proliferator-activated receptor γ (PPARγ), 및 sterol regulatory element binding protein-1c(SREBP-1c)를 포함하는 신호분자(signaling molecules), 전사인자(tanscriptional factors) 및 다양한 유전자의 발현을 촉진하므로 이들은 비만 억제 및 치료의 주요 표적이 된다. 또한 활성화된 monophosphate kinase(AMPK)는 지질대사 및 지방형성에 강한 기여를 하나 phospho-AMPK (p-AMPK)는 지질합성과 지방형성과 역의 관계에 있다.
한편, 혈관형성(angiogenesis)은 지방조직의 팽창과 성장을 촉진하여 비만과 관련이 있는 새로운 혈관이 기존 혈관에서 형성되는 생리학적 과정(physiological process)이다. 이는 세포가 영양소와 산소를 만족스럽게 공급할 수 있는 가장 중요한 과정으로(Bronckaers A et al., PLoS ONE. 8(8): e71104. 2013) 정상적인 생리적 조건, 즉 배아의 생성, 상처 치유 및 생식 과정에서 발생하는 공통적인 현상이다. 그러나 병리학적인 혈관형성(pathological angiogenesis)은 종양의 성장 및 전이를 위한 신혈관 형성(neovascularization)을 유발하여 혈관 형성 의존성 암 및 자가 면역 질환을 유발한다. 악성 종양(malignant tumors)은 주위의 혈관을 이용하여 영양분을 섭취함으로써 성장을 유지할 수 있고 이러한 암세포는 순환계(circulatory system)와 연결되어 폐 및 간과 같은 다른 부위로 전이될 수 있다. 비만의 메카니즘은, 특히 지방의 팽창에 있어서의 염증 및 혈관형성의 역할을 이해하면 비만과 그 관련 질환을 조절할 수 있는 치료법이 될 수 있다.
산딸나무(Cornus kousa)는 층층나무과(Cornaceae)에 속하는 한국, 중국, 일본을 포함한 동아시아 고유 식물로 전통적으로 동양에서 식용 과일 및 치료 약으로 사용되어 왔다. 일부 연구에 따르면 산딸나무는 강력한 항산화 작용을 하는 안토시아닌 및 플라보노이드와 같은 화합물을 함유하고 있음이 밝혀졌으나(Seeram NP et al., J. Agric. Food Chem. 50: 2519-2523. 2002) 생물학적 활성에 대한 연구는 아직 미미한 실정이다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 포함하여 여러 문제점들을 해결하기 위한 것으로서, 산딸나무 에탄올 추출물에 포함되어 있는 안토시아닌의 강력한 혈관형성 억제 작용에 따라 부작용 없이 효율적으로 비만을 억제하는 산딸나무 잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 항비만 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다. 그러나 이러한 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 관점에 따르면, 산딸나무(Cornus kousa) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는, 항비만 조성물이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 산딸나무(Cornus kousa) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 혈관신생 억제용 조성물이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 산딸나무(Cornus kousa) 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는, 비만 개선용 건강기능식품이 제공된다.
상기한 바와 같이 이루어진 본 발명의 일 실시예에 따르면, 에탄올 잎 추출물의 안토시아닌 풍부 활성 분획을 이용하여 신생혈관형성억제 활성을 나타냄에 따라 비만을 효율적으로 감소시킬 수 있으므로 부작용이 없고 효과적인 비만 치료제의 생산을 구현할 수 있다. 물론 이러한 효과에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
도 1은 본 발명의 산딸나무(Cornus kousa) 잎 에탄올 추출물(ELECk)에서 수득한 안토시아닌 HPLC 정제 분획(AnT Fr)을 안토시아닌 화합물의 동정 및 GC-MS로 정량한 그래프이다.
도 2는 MTT 분석을 통해 HUVEC에 대한 EGCG 독성의 분석한 그래프이며, EGCG는 안토시아닌 풍부 활성 분획(AnT Fr)의 양성 대조군으로 사용하였고. 데이터는 평균값(n = 3)± SEM이고 데이터는 P <0.005에서 통계적으로 유의하다.
도 3은 MTT 분석을 통해 HUVEC에 대한 AnT Fr의 세포 생존력 및 독성을 분석한 그래프이다. HUVEC는 96 웰 미량정량판 플레이트의 EBM 배지에서 배양하였고, 부착 후 상이한 농도의 AnT Fr을 처리하였다. MTT 시약 첨가 후 웰의 흡광도를 확인하여 각 그룹에 대해 세포 생존력을 계산하였다.
도 4는 인간 적혈구에 대한 본 발명의 추출물(ELECk)의 AnT Fr의 용혈 효과를 분석한 그래프이다.
도 5는 신생혈관형성억제 활성을 효과를 확인하기 위해 본 발명의 AnT Fr를 HUVEC에 다양한 농도로 처리한 후 Oil Red O 염색하여 지질 축적을 촬영한 현미경 사진이다. a는 EGCG 50 ㎍ ml, b는 EGCG 50 μg/ml, c는 GW9662 10 μg/ml를 처리하였다.
도 6은 본 발명의 AnT Fr를 HUVEC에 다양한 농도로 처리한 후 튜브 형성 억제 활성을 관찰한 현미경 사진이다. a는 대조군(AnT Fr 무처리 군), b는 5 μg/mL, c는 30 μg/mL, d는 60 μg/mL 및 e는 100 μg/mL의 농도로 처리하였다.
도 7은 본 발명의 AnT Fr를 HUVEC에 다양한 농도(5, 30, 60 및 100 μg/mL)로 처리한 후 총 튜브 길이를 측정하여 튜브 형성 억제 활성을 분석한 그래프이다.
도 8은 본 발명의 AnT Fr를 HUVEC에 다양한 농도(5, 30, 60 및 100 μg/mL)로 처리한 후 실시간 정량 PCR을 통해 혈관형성(angiogenesis) 신호 전달 분자의 유전자 발현 수준을 분석한 겔 사진이다.
도 9는 본 발명의 AnT Fr를 3T3-L1 지방세포에 다양한 농도(5, 30, 50, 100, 120, 150 및 200 μg/mL)로 처리한 후 MTT 분석을 통해 생존능력을 분석한 그래프이다.
도 10은 본 발명의 AnT Fr를 3T3-L1 지방세포에 다양한 농도로 처리한 후 MTT 분석을 통해 EGCG(a) 및 GW9662(b) 독성을 분석한 그래프이다.
도 11은 본 발명의 AnT Fr를 3T3-L1 지방세포에 처리한 후 Oil Red O 염색 통해 T3-L1 세포의 지방 축적 저해활성을 관찰한 현미경사진이다.
도 12는 본 발명의 AnT Fr를 3T3-L1 지방세포에 처리한 후 지질액적을 Oil O Red 용매로 추출하여 3T3-L1의 지질 함량을 분석한 그래프이다.
도 13은 본 발명의 AnT Fr를 3T3-L1 지방세포에 처리한 후 지질생성(adipogenesis) 및 지방형성(lipogenesis) 관련 유전자의 발현을 RT-PCR을 통해 관찰한 겔 사진이다.
도 14는 본 발명의 AnT Fr를 3T3-L1 지방세포에 처리한 후 지질생성(adipogenesis) 및 지방형성(lipogenesis) 관련 신호 전달 단백질의 상대 mRNA 발현 수준을 분석한 그래프이다.
도 15는 본 발명의 AnT Fr를 3T3-L1 지방세포에 처리한 후 p-AMPK 활성화에 대한 AnT Fr의 효과를 관찰한 웨스턴 블랏 겔 사진이다.
도 16은 본 발명의 웨스턴 블랏 분석으로 측정된 phospho-AMPKα 단백질의 상대적 발현 수준을 분석한 그래프이다.
도 2는 MTT 분석을 통해 HUVEC에 대한 EGCG 독성의 분석한 그래프이며, EGCG는 안토시아닌 풍부 활성 분획(AnT Fr)의 양성 대조군으로 사용하였고. 데이터는 평균값(n = 3)± SEM이고 데이터는 P <0.005에서 통계적으로 유의하다.
도 3은 MTT 분석을 통해 HUVEC에 대한 AnT Fr의 세포 생존력 및 독성을 분석한 그래프이다. HUVEC는 96 웰 미량정량판 플레이트의 EBM 배지에서 배양하였고, 부착 후 상이한 농도의 AnT Fr을 처리하였다. MTT 시약 첨가 후 웰의 흡광도를 확인하여 각 그룹에 대해 세포 생존력을 계산하였다.
도 4는 인간 적혈구에 대한 본 발명의 추출물(ELECk)의 AnT Fr의 용혈 효과를 분석한 그래프이다.
도 5는 신생혈관형성억제 활성을 효과를 확인하기 위해 본 발명의 AnT Fr를 HUVEC에 다양한 농도로 처리한 후 Oil Red O 염색하여 지질 축적을 촬영한 현미경 사진이다. a는 EGCG 50 ㎍ ml, b는 EGCG 50 μg/ml, c는 GW9662 10 μg/ml를 처리하였다.
도 6은 본 발명의 AnT Fr를 HUVEC에 다양한 농도로 처리한 후 튜브 형성 억제 활성을 관찰한 현미경 사진이다. a는 대조군(AnT Fr 무처리 군), b는 5 μg/mL, c는 30 μg/mL, d는 60 μg/mL 및 e는 100 μg/mL의 농도로 처리하였다.
도 7은 본 발명의 AnT Fr를 HUVEC에 다양한 농도(5, 30, 60 및 100 μg/mL)로 처리한 후 총 튜브 길이를 측정하여 튜브 형성 억제 활성을 분석한 그래프이다.
도 8은 본 발명의 AnT Fr를 HUVEC에 다양한 농도(5, 30, 60 및 100 μg/mL)로 처리한 후 실시간 정량 PCR을 통해 혈관형성(angiogenesis) 신호 전달 분자의 유전자 발현 수준을 분석한 겔 사진이다.
도 9는 본 발명의 AnT Fr를 3T3-L1 지방세포에 다양한 농도(5, 30, 50, 100, 120, 150 및 200 μg/mL)로 처리한 후 MTT 분석을 통해 생존능력을 분석한 그래프이다.
도 10은 본 발명의 AnT Fr를 3T3-L1 지방세포에 다양한 농도로 처리한 후 MTT 분석을 통해 EGCG(a) 및 GW9662(b) 독성을 분석한 그래프이다.
도 11은 본 발명의 AnT Fr를 3T3-L1 지방세포에 처리한 후 Oil Red O 염색 통해 T3-L1 세포의 지방 축적 저해활성을 관찰한 현미경사진이다.
도 12는 본 발명의 AnT Fr를 3T3-L1 지방세포에 처리한 후 지질액적을 Oil O Red 용매로 추출하여 3T3-L1의 지질 함량을 분석한 그래프이다.
도 13은 본 발명의 AnT Fr를 3T3-L1 지방세포에 처리한 후 지질생성(adipogenesis) 및 지방형성(lipogenesis) 관련 유전자의 발현을 RT-PCR을 통해 관찰한 겔 사진이다.
도 14는 본 발명의 AnT Fr를 3T3-L1 지방세포에 처리한 후 지질생성(adipogenesis) 및 지방형성(lipogenesis) 관련 신호 전달 단백질의 상대 mRNA 발현 수준을 분석한 그래프이다.
도 15는 본 발명의 AnT Fr를 3T3-L1 지방세포에 처리한 후 p-AMPK 활성화에 대한 AnT Fr의 효과를 관찰한 웨스턴 블랏 겔 사진이다.
도 16은 본 발명의 웨스턴 블랏 분석으로 측정된 phospho-AMPKα 단백질의 상대적 발현 수준을 분석한 그래프이다.
용어의 정의:
본 문서에서 사용되는 용어 "산딸나무(Cornus kousa)"는 층층나무과(Cornaceae)에 속하는 낙엽 활엽수로 높이 7~12 m 정도로 통직하게 자라며 가지가 층층이 수평으로 퍼진다. 마주나게 달리는 잎은 난형 또는 타원형으로 가장자리에 파상의 톱니가 있거나 거의 밋밋하다. 일본, 중국 및 국내에서 자생하는 식물로서 한방에서 전통적으로 외상의 치료에 이용해왔다.
본 문서에서 사용되는 용어 "안토시아닌 풍부 활성분획"은 상기 산딸나무 잎 추출물을 크로마토그래피로 분리한 분획 중 안토시아닌이 풍부하게 포함된 분획을 의미하는데, 상기 크로마토그래피는 액체 크로마토그래피, 가스 크로마토그래피, 박막 크로마토그래피일 수 있고, 상기 액체 크로마토그래피는 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)인 것이 바람직하다. 산딸나무 잎 추출물은 내부에 포한된 다양한 색소의 영향으로 크로마토그래피 전개 시 색상분리가 일어날 수 있는데, 상기 안토시아닌 풍부 활성 분획은 색소인 안토시아닌의 색상이 나타나는 층을 수집한 분획일 수 있다. 상기 색상은 상기 추출물 또는 전개용매의 pH 조건에 따라 달라질 수 있는데, 빨간색, 보라색, 파란색 등 다양하게 나타날 수 있는데, 농도가 높을 경우에는 검정색으로 보일 수 있다.
본 문서에서 사용되는 용어 "혈관신생(angiogenesis)"은 새로운 혈관이 생성되는 과정을 말하며, 정상적인 생체 조건에서는 드물게 일어나지만, 배발생, 황체 형성 또는 상처치료 과정에서는 반드시 수반되는 과정이다. 일반적으로 혈관신생 촉진인자의 자극에 의하여 프로테아제로 인한 혈관 기저막의 분해, 혈관 내피세포의 이동, 증식 및 혈관 내피세포 분화에 의한 관강의 형성으로 혈관이 재구성되어 새로운 모세혈관이 생성되는 것으로 이루어진다.
발명의 상세한 설명:
본 발명의 일 관점에 따르면, 산딸나무(Cornus kousa) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는, 항비만 조성물이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 산딸나무(Cornus kousa) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는, 혈관신생 억제용 조성물이 제공된다.
상기 조성물에 있어서, 상기 추출물은 산딸나무의 잎, 가지, 뿌리 또는 열매로부터 제조한 것 일 수 있고 상기 추출물은 물, C1 내지 C4의 저급알코올 또는 이들의 혼합물로 추출한 것일 수 있으며 상기 저급알코올은 메탄올, 에탄올, 또는 프로판올일 수 있다.
상기 조성물에 있어서, 상기 추출물 또는 이의 분획물은 안토시아닌 풍부 활성 분획을 포함할 수 있고 상기 안토시아닌 풍부 활성 분획은 60 내지 80% 에탄올을 전개용매로 한 고성능 액체 크로마토그래피의 분획일 수 있다.
본 발명자들은 상기 고성능 액체 크로마토그래피를 이용한 분획 시 산딸나무 잎 추출물이 칼럼 내에서 전개되면서 색상분리가 일어나는데 그 중 검정색 분획에 안토시아닌이 풍부하게 포함되어 있음을 확인할 수 있었다. 따라서, 상기 안토시아닌 활성 분획은 전개용매로 60 내지 80% 에탄올을 이용하여 HPLC 수행시 분리되는 검정색 분획일 수 있다.
상기 조성물에 있어서, 상기 산딸나무 추출물은 산딸나무 잎을 건조 후 분쇄하여 분말을 제조하는 분말 제조단계; 상기 분말에 물을 첨가 후 환류시켜 유기용매로 추출하는 추출물 제조단계; 및 상기 추출물을 여과 후 정제하여 안토시아닌풍부 분획물을 수득하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다,
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 산딸나무(Cornus kousa) 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는, 비만 개선용 건강기능식품이 제공된다.
상기 건강기능식품에 있어서, 탕제, 드링크제, 산제, 환제, 캡슐, 정제 또는 젤리의 제형으로 제공될 수 있다.
암 환자 치료에 있어서 종래에는 화학요법제의 암치료제가 주로 이용되었으나 상기 화학요법제는 부작용, 내성 또는 재발 등의 부작용이 발생하였다. 이를 극복하기 위해 이상적 항암제 개발을 위해 최근에는 면역요법, 유전자치료, 내성억제, 신생혈관억제제 등의 생물학적 요법에 대한 연구가 활발히 진행되고 있으며 천연물유래 항암작용 후보물질의 개발이 시도되고 있다.
본 발명의 산딸나무(Cornus kousa) 추출물 또는 이의 분획물은 신생혈관 형성 억제능을 통해 항암제로도 개발이 가능하다. 신생혈관 억제제는 종양세포 성장에 필수 요소인 혈액, 산소, 영양분을 전달하는 혈관의 성장을 차단시켜 암세포만을 굶겨 죽이는 원리로 단독 또는 기존의 항암제와 병용투여로 항암 치료효과를 높일 수 있다. 따라서, 본 발명의 다른 일 관점에 따르면 산딸나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 암 치료제가 제공된다.
또한 산딸나무(Cornus kousa) 추출물 또는 이의 분획물은 신생혈관 형성 억제능을 통해 황반변성(Macular Degeneration)의 치료제로도 적용가능하다.
황반변성은 여러 가지 원인에 의해 망막의 황반부에 변성이 일어나 시력장애를 일으키는 질환으로 특히 연령-관련 황반변성(age-related macular degeneration, AMD)은 신생혈관 생성과 관련이 있는 것으로 보고 되었고(Eugene W.M. et al., Canadian Journal of Ophthalmology, Volume 40, Issue 3, Pages 352-368, 2005), 실제 신생혈관 형성 억제제인 pegaptanib 등이 황반변성 치료제로 미국 FDA에 의해 승인이 된 바 있다. 본 발명의 산딸나무(Cornus kousa) 추출물 또는 이의 분획물은 조직변화가 유도된 망막 및 맥락막에서 혈관신생을 효과적으로 억제하여 신생혈관에 의해 유도되는 황반변성을 예방하고 개선시키는 효과가 있다. 따라서 본 발명의 일 관점에 따르면, 산딸나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 황반변성 치료제가 제공된다.
본 발명의 조성물은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있는데, 비경구로 투여되는 경우, 정맥내 주사, 비강 내 흡입, 근육내 투여, 복강내 투여, 경피흡수 등 다양한 경로를 통해 투여하는 것이 가능하다.
또한 상기 본 발명의 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여된다. 본 문서에서 사용되는 용어 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 0.1 mg/kg 내지 1 g/kg의 용량으로 투여될 수 있으며, 더 바람직하게는 1 mg/kg 내지 500 mg/kg의 투여량으로 투여된다. 한편, 상기 투여량은 환자의 나이, 성별 및 상태에 따라 적절히 조절될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 세포치료제 또는 약학적 조성물은 일반적으로 사용되는 약학적으로 허용 가능한 담체와 함께 적합한 형태로 제형화될 수 있다. 약학적으로 허용되는 담체로는 예를 들면, 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등과 같은 비경구 투여용 담체 등이 있으며 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 또한 본 발명에 따른 세포치료용 조성물은 그 투여방법이나 제형에 따라 필요한 경우, 현탁제, 용해보조제, 안정화제, 등장화제, 보존제, 흡착방지제, 계면활성화제, 희석제, 부형제, pH 조정제, 무통화제, 완충제, 산화방지제 등을 적절히 포함할 수 있다. 상기에 예시된 것들을 비롯하여 본 발명에 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 최신판]에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다.
또한 본 발명의 약학적 조성물은 표적 환부로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수도 있다. 본 발명의 세포치료제 또는 약학적 조성물은 질환의 치료를 위하여 치료학적으로 유효한 양의 교차분화 연골세포를 포함할 수 있다. 상기 용어 '치료학적으로 유효한 양'은 연구자, 수의사, 의사 또는 기타임상에 의해 생각되는 조직계, 동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 유효 성분 또는 약학적 조성물의 양을 의미하는 것으로, 이는 치료되는 질환 또는 장애의 증상의 완화를 유도하는 양을 포함한다. 본 발명의 세포치료제 또는 약학적 조성물에 포함되는 줄기세포의 투여량은 원하는 효과에 따라 변화될 것임은 당업자에게 자명하다. 그러므로 본 발명의 약학적 조성물 내에 포함되는 줄기세포의 함량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 다른 성분의 함량, 제형의 종류, 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다.
일반적으로 지방 조직은 영양소를 공급하고 성장과 팽창을 위해 산소를 공급하는 하나 이상의 모세혈관으로 둘러싸여 있다. 그러나 신생혈관형성 활성(antiangiogenic activities)은 주로 혈관내피성장인자(VEGF/ VEGFR)와 관련이 있는데(McDonald DM et al., Nat. Med. 9: 713-725. 2003) 혈관형성을 조절하면 지방조직의 성장 및 확장을 억제하여 비만을 조절할 수 있다. 현재 사용 가능한 항-비만 의약품과 관련된 부작용을 극복하고 더 나은 예방 및 치료 옵션을 얻으려면 부작용이 최소화되거나 부작용이 없는 의약품이 필요하다(Tyler C et al., Opin. Cell Biol. 19: 612-617. 2007). 이에 따라 생체 활성 영양소와 함께 천연물을 사용하는 것이 비만을 방지하고 심지어 예방하는 효과적인 해결책으로 제안되어 왔고 사포닌(saponins), 폴리페놀(polyphenols), 플라본 (flavones), 카페인(caffeine)과 같은 다양한 식물 제품이 항-비만 활성을 나타낸다고 보고되었다. 따라서 조 추출물과 순수 천연 화합물을 비롯한 다양한 천연 제품이 체중 감소를 유발하고 식이 비만을 예방할 수 있으므로 향후 효과적이고 안전한 비만 치료제 개발을 위한 훌륭한 대체 전략이 될 수 있다.
이에 본 발명자들은 HUVEC 및 3T3-L1 세포에서 전통적으로 동양에서 치료 전통 의학으로 사용되었지만 종래 이에 대한 생물학적 활성에 대해서는 연구가 미미했던 산딸나무(Cornus kousa) 잎 에탄올 추출물에서 안토시아닌 풍부 활성 분획의 신생혈관형성억제 활성과 결합된 항-비만 활성을 평가하였다. 이를 위해 건조된 산딸나무 잎을 70% 에탄올로 추출하였고 에탄올 추출물을 비극성 거대 다공성 수지(non-polar macroporous resin)를 통해 용리시킨 후 HPLC로 정제하여 안토시아닌 풍부 활성 분획(AnT Fr)을 수득하였고 신생혈관형성억제 활성은 HUVECs에서 AnT Fr의 항 증식 효과에 의해 결정하였다. 또한 다양한 농도의 AnT Fr 존재 하에서, 3T3-L1 전 지방세포가 분화되도록 유도하였고 분화된 지방세포의 지질 축적은 Oil-Red O 염색법으로 정량화하였다. 그 결과, AnT Fr은 VEGRF2, PI3K, β-카테닌, NF-kB 및 Akt1을 농도 의존적으로 하향 조절을 통해 신생혈관형성억제 및 튜브 형성을 억제함으로써 신생혈관형성을 유의하게 억제하였고 AnT Fr은 3T3 세포에서 p-MPK에 대한 AMPK의 활성화를 정량화하였으며 웨스턴 블랏팅으로 발현되었으나 신호 단백질, PPARγ, CCAAT, C/EBPα, aP2, FAS 및 LPL을 촉진하는 지질생성 및 지방형성을 하향조절하여 지질 축적을 억제하였다. 따라서 본 발명자들은 산딸나무 에탄올 추출물 유래의 안토시아닌 분획이 지방생성을 하향조절하여 신생혈관형성억제 활성과 관련된 비만을 감소시키는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있는 것으로, 이하의 실시예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다.
실시예 1: 재료 준비
본 발명에서 사용된 식물 재료(안토시아닌 축적으로 붉게 변한 산딸나무 잎)는 가을시기에 농장(명인 신광수 차 농장, 순천, 전남, 한국)에서 수확하여 전처리 및 가공 과정을 거치지 않은 폴리에틸렌 봉지(1kg)에 자연 상태로 포장하였다. 산딸나무(Cornus kousa) 잎은 한국에 잘 알려져 있기 때문에 휴먼허브연구소(Human Herb Research Center, 한국)에서 식물 물질을 쉽게 확인할 수 있다.
실시예 2: 추출물 제조
본 발명자들은 상기 실시예 1에서 구한 산딸나무 잎을 증류수로 깨끗이 씻어서 말린 다음 포메이스 파우더(pomace powder)로 분쇄하였고 상기 분쇄한 분말 500 g을 60℃에서 8시간 동안 가열 맨틀(Global Lab GLHMP-F500)에서 환류시켜 70% 에탄올로 추출하였다. 상기 수득한 추출물을 막 여과 시스템(membrane filtration system)으로 여과하였고 상기 여과액을 회전식 진공 증발기(EYELA N-1000)로 50-60℃에서 농축하였으며 농축된 추출물을 동결 건조시켰다. 그 후 추출물의 일부를 -20℃에서 보관하였고, 나머지를 비극성 거대 다공성 수지(D101)로 추가 정제하였으며, 0.3N NaOH로 먼저 용출시킨 다음 100% 에탄올로 용출시켰다.
이어서 상기에서 추가 정제된 추출물을 직경 10 cm, 길이 30 cm의 C-18 컬럼(Biotag, Inc., Sweden)을 이용한 HPLC로 분리하였는데, 우선, 10% MeOH로 칼럼을 활성화시킨 다음, 상기 추가 정제된 추출물을 적재한 후, 사전 전개용매로 10% EtOH를 사용하여 처음 나온 용출액은 폐기하였다. 그 후, 본 전개용매로 70% EtOH를 이용하여 용출시켰는데, 분리과정에서 여러가지 색상으로 색분리가 되었고, 그 중에서 검정색에 해당하는 활성 분획을 수득하였다. 그 후 안토시아닌 화합물의 분석 및 정량을 위해 GC-MS를 수행하였다.
실시예 3: 신생혈관형성억제 효과 분석
본 발명자들은 산딸나무 잎 에탄올 추출물(ELECk)에서 안토시아닌 풍부 활성 분획(AnT Fr)의 신생혈관형성억제 효과(anti-angiogenic activity)을 측정하기 위해 MTT (dimethyl thiazol diphenyl tetrazolium bromide) 분석법을 이용하여 상기 AnT Fr의 첫 번째 독성을 확인하였다. 안전한 용량(농도)을 결정한 후, HUVEC(인간제대정맥내피세포)의 증식 및 튜브 형성에 대한 억제 잠재력으로 신생혈관형성억제 활성을 평가하였다.
3-1: 세포 생존력 분석
본 발명자들은 세포 생존력 분석을 위해 안토시아닌이 풍부한 분획(AnT Fr)의 저장 용액(stock solution)은 1 mg/ml로 준비한 후 다양한 농도로 희석하였다. 또한 인간제대정맥내피세포주(HUVEC line)는 한국세포주은행(서울, 한국)에서 구입하였고 EGM-2 Single Quot Kit(Clonetics, USA)가 첨가된 EBM-2 배지(Clonetics, USA)에서 37℃ 및 가습된 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 세포 생존력은 MTT 분석에 의해 결정되었다. HUVECs(1ㅧ104 세포/웰)를 96-웰 플레이트에 접종한 다음, 24시간 동안 배양하였고, 다양한 농도(5, 10, 15, 20, 25, 30, 50, 100 및 200 ㎍/ml) AnT Fr을 37℃, 가습된 5% CO2 배양기에서 24시간 동안 처리하였으며 대조군은 AnT Fr을 처리하지 않았다. 그런 다음 0.5% MTT 용액(Sigma, MO, USA)을 배지에 첨가하였고 37℃에서 4시간 동안 배양하였다. 그 후, MTT 배지를 흡인 제거하고 DMSO(Sigma, MO, USA)를 각 웰에 첨가하였으며 15분 동안 유지하여 포르마잔 결정(formazan crystals)을 용해시켰다. 흡광도는 마이크로 플레이트 판독기 (Biochrom Ltd., Cambridge, UK)를 사용하여 540 nm의 파장에서 측정하였고 실험은 3회 반복 수행하였다.
3-2: 신생혈관형성억제 활성/튜브 형성 억제
본 발명자들은 AnT Fr의 신생혈관형성억제 활성을 측정하기 위해, 24-웰 배양 플레이트를 분석에 사용하였다. Matrigel(BD Bioscience, MA, US)로 150 μl/well로 코팅한 다음 37℃에서 1시간 동안 고체화(solidify)하였고 배지(2.5ㅧ104 세포/웰)에 현탁된 HUVEC를 Matrigel 코팅 웰에 첨가하였으며 37℃에서 4시간 동안 배양하였다. 그 후 다양한 농도(5, 20, 50, 100 μg/ml)의 AnT Fr을 웰에 첨가하였고 37℃에서 4시간 동안 배양하였다. 튜브 형성은 위상차 현미경(Nikon, Tokyo, Japan)을 사용하여 관찰하고 사진을 촬영하였다. 상기 5개의 사진에서 각 웰의 무작위 필드로 부터 관의 길이(tube lengths)를 수득하였고 Scion Image 소프트웨어(NIH, ML, USA)를 사용하여 분석했으며 AnT Fr의 혈관형성 억제효과 실험은 2회 이상 수행하였다.
3-3: 유전자 발현 수준 분석
본 발명자들은 혈관형성 단백질(신호 분자)의 발현에 대한 AnT Fr의 효과를 조사하기 위해 유전자 특이적 프라이머를 사용하여 RT-PCR 분석을 수행하였다. 이를 위해 HUVEC에서 신호 단백질을 지지하는 혈관형성의 발현(mRNA) 수준을 정량화하여 혈관 신생에 대한 AnT Fr의 효과를 측정하였다. 구체적으로 HUVEC는 6-웰 플레이트에서 0.3% FBS가 첨가된 EBM2 배지에서 배양 후 37℃, CO2 배양기에서 배양하였다. 그런 다음 상기 세포를 다양한 농도(5, 20, 50 및 100 μg/ml)의 AnT Fr로 처리하였고 CO2 배양기에서 24시간 동안 추가로 배양했다. 또한 총 RNA는 TRI 시약(Sigma Aldrich)을 사용하여 HUVEC로부터 분리하였고 RT-PCR을 위해 RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo Scientific)를 사용하여 총 RNA(2 μg)를 cDNA로 역전사시켰으며 관련 신호 분자의 mRNA의 유전자 발현 수준을 2회 이상 확인하였다. 상기 항-혈관형성 분석을 위한 PCR 증폭에 사용한 프라이머의 핵산서열을 하기 표 1에 요약하였다.
| 유전자 | 핵산서열(5'->3') | 크기 | Gene bank 접근번호 | 서열번호 |
| VEGFR-2 | 포워드:AGG TTG CGT GTT CTT CGA GT | 934 | NM_002253.2 | 1 |
| 리버스:CCC AAA GTG CTG GGT TTT TA | 2 | |||
| PI3K | 포워드:CGT GTG CCA TTT GTT TTG AC | 536 | NM_006218.2 | 3 |
| 리버스:TCA AAC CCT GTT TGC GTT TAC | 4 | |||
| NF-kB | 포워드:TGG TCA GCT CCC TTC TCT GT | 521 | NM_001145138.1 | 5 |
| 리버스:GCC AGC TTG GCA ACA GAT | 6 | |||
| AKT-1 | 포워드:CCG ATT CAC GTA GGG AAA TG | 529 | NM_005163.2 | 7 |
| 리버스:AGC GTC GAA AAG GTC AAG TG | 8 | |||
| β-Catenin | 포워드:GGT GGG CTG GTA TCT CAG AA | 629 | NM_001098209.1 | 9 |
| 리버스:GGC AAC TGG TAA ACT GTC CAA | 10 | |||
| β-actin | 포워드:CTC CTG AGC GCA AGT ACT CC | 632 | NM_001101.3 | 11 |
| 리버스:ACA TCT CAA GTT GGG GGA CA | 12 |
실시예 4: 항-비만 활성 분석
본 발명자들은 마우스 배아 3T3-L1 전-지방 세포를 사용하여 항-비만 활성을 측정하였다. 구체적으로 세포 생존력은 MTT 분석에 의해 결정되었다. 상기 3T3-L1 세포의 지질 액적(lipid droplets)은 다양한 농도의 AnT Fr 처리 조건에서 분화되었고 지방세포(adipocytes)를 Oil Red O 염색법으로 추출하고 분광 광도계로 정량하였다.
4-1: MTT 분석
본 발명자들은 MTT 분석을 이용하여 3T3-L1 세포에 대한 AnT fr의 독성을 결정하였다. 구체적으로 3T3-L1 세포를 1 x 104 세포/웰의 밀도로 96-웰 플레이트에 파종하였고 37℃, 24시간 동안 가습되는 5% CO2 배양기에서 유지하였다. 그 후 상기 세포를 다양한 농도의 AnT Fr(5, 10, 15, 20, 25, 30, 50, 100 및 200 ㎍/ml)로 24시간 동안 처리하였고 각 웰에 DMSO(dimethyl sulfoxide, Sigma)를 첨가하여 포르마잔 결정(formazan crystals)을 용해시켰다. 이어서, 마이크로 플레이트 판독기(Biochrom Ltd., UK) 상에서 540 nm의 파장으로 흡광도를 판독하였고 세포 생존율(%)을 계산하여 대조군과 비교하였으며 실험은 두 번 반복 수행하였다.
4-2: Oil Red O 염색 분석
본 발명자들은 항-비만 활성 측정을 위해 Oil Red O 염색 분석을 수행하였다. 구체적으로 3T3-L1 세포를 6-웰 플레이트에서 배양하였고 2일 후 또는 세포의 confluency가 80%에 도달했을 때, 배지를 분화 유도 배지(10 ㎍/㎖ 인슐린, 1 mM dexamethasone, 0.5 mM Isobutyl-1-methylxanthine)로 교체하였다. 그 후 세포의 분열을 억제하기 위해 24시간 동안 상태를 유지하였고 2일 후, 배양 배지를 유지 배지(10 ㎍/인슐린이 첨가된 DMEM 배지)로 대체하였으며 2일 또는 최대 8일마다 유지 배지(maintenance media)로 배양하였다. 상기 유도 배지 및 유지 배지에 AnT Fr 샘플을 처리하였고 GW9662(10 ㎍/㎖)는 강력한 길항제인 PPARγ가 지방생성을 억제하므로 양성 대조군으로 첨가하였다. 피딩 단계(feeding phase) 8일 후, 세포를 PBS로 세척하였고 포르말린(10 %)으로 1시간 동안 고정시켰다. 그 후 세포를 60% 이소-프로판올로 다시 세척하였고 Oil Red O 용액을 첨가하였다. 이어서 세포를 37℃에서 3시간 동안 배양하였고 증류수로 4회 세척하고 건조시킨 후, 이소프로판올로 세척하여 염색 염료(staining dye)를 추출하였다. 세포 내에서의 지질 축적에 대한 AnT fr의 효과는 각 실험군의 추출된 Oil Red O 용액을 위상차 현미경으로 5개의 임의 부위에서 촬영하여 결정하였고 추출된 Oil Red O 용액의 흡광도는 분광 광도계를 사용하여 520 nm의 파장에서 측정하였다. 또한 3T3-L1 침착물(deposits)에서 지질 입자(트리글리 세라이드) 축적의 정량화 실험을 2회 수행하였다.
4-3: 유전자 발현 수준 분석
본 발명자들은 유전자 특이적인 프라이머를 이용한 RT-PCR 분석을 통해 지질생성(adipogenesis) 및 지방형성(lipogenesis) 관련 유전자와 신호 분자의 mRNA 발현 수준에 대한 AnT Fr의 억제 효과를 조사하였다. 구체적으로 3T3-L1 세포를 6-웰 플레이트에서 10% FBS가 첨가된 DMEM 배지에서 배양 후 CO2 배양기에서 37℃조건으로 다양한 농도의 AnT Fr로 처리한 다음 24시간 동안 배양했다. 총 RNA는 TRI 시약(Sigma Aldrich)을 사용하여 DNase 처리한 후 3T3-L1 세포로부터 분리하였고 NanoDrop 2000 분광 광도계로 정량화하였다. 그 후 Revert Aid Premium First Strand cDNA 합성 키트(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 총 RNA(500 ng)로부터 cDNA를 제조하였고 cDNA는 Nano Drop 분광 광도계에서 흡광도를 확인하여 정량 하였다. 이어서 상기 cDNA를 유전자 특이적 프라이머가 있는 실시간 qPCR에 사용하였고 전기영동 후 아가로즈겔에서 DNA 밴드를 수득하였으며 RT-PCR 분석 실험은 2회 이상 반복 수행하였다. 상기 항-비만 활성 분석을 위한 PCR 증폭에 사용한 프라이머의 핵산서열을 하기 표 2에 요약하였다.
| 유전자 | 핵산서열(5'->3') | 크기 | Gene bank 접근번호 | 서열번호 |
| SREBP | 포워드:TTG CAC CAG AGA GCA TTT TG | 593 | NM_033218.1 | 13 |
| 리버스:GAA AAT GAG AGG CTG GTT GC | 14 | |||
| C/EBPα | 포워드:TTA CAA CAG GCC AGG TTT CC | 629 | NM_007678.3 | 15 |
| 리버스:CCA CAG GGG TGT GTG TAT GA | 16 | |||
| PPARγ | 포워드:CTG GCC TCC CTG ATG AAT AA | 393 | NM_001127330.1 | 17 |
| 리버스:GGG TGA AGG CTC ATG TCT GT | 18 | |||
| aP2 | 포워드:CAG CCT TTC TCA CCT GGA AG | 352 | NM_024406.2 | 19 |
| 리버스:TCG ACT TTC CAT CCC ACT TC | 20 | |||
| FAS | 포워드:AAA GGA CCT GCC CAA TCT CT | 245 | NM_007988.3 | 21 |
| 리버스:TGA TCA AAC TCA GGC TGC AC | 22 | |||
| LPL | 포워드:AAG CCC CAC AAG TGT AGT CG | 402 | NM_008509.2 | 23 |
| 리버스:CGG ACA CAA AGT TAG CAC CA | 24 | |||
| Actin | 포워드:GTT GGT TGG AGC AAA CAT CC | 151 | NM_007393.3 | 25 |
| 리버스:GAG GGT GAG GGA CTT CCT GT | 26 |
실시예 5: 웨스턴 블랏 분석
본 발명자들은 웨스턴 블랏 분석을 위해 분화 후의 3T3-L1 지방세포를 준 숙성(sub confluency)하에 수확하였고, PBS 완충액으로 세척하였으며, 페닐메틸술포닐 플루오라이드(phenylmethylsulphonyl fluoride) 및 프로테아제 억제제 칵테일(protease inhibitor cocktail)을 포함하는 방사성면역침전분석 완충액(Sigma-Aldrich, MO, USA)으로 용해시켰다. 그 후 세포 용해물(cell lysates)을 초음파처리한 다음 원심분리하였고 상등액을 수집하였으며 상등액의 단백질 농도를 BCA 단백질 분석 시약(Pierce, Rockford, IL, USA)으로 측정하였다. 상기 각 샘플에 대한 30 μg 단백질을 10% SDS-PAGE로 분리하였고 니트로 셀룰로오스 멤브레인(Bio-Rad, Hercules, CA)으로 이송하였다. 이어서, 상기 멤브레인을 3% 소 혈청 알부민을 포함하는 트리스-완충 식염수(TBS)-Tween 20 용액에서 차단시켰다. 결합 후 상기 멤브레인을 4℃에서 AMPK, phospho-AMPKα(Cell Signaling Technology, Danvers, MA) 및 β-actin (Santa Cruz, CA) 일차 항체와 함께 밤새 배양하였다. 그 후 2차 항체를 서양 고추냉이 퍼옥시다아제 및 단백질 밴드를 시각화하기 위한 향상된 화학 발광(Amersham Bioscience, UK)에 접합시켰고 실험은 2번 반복 수행하였다.
실험예 1: 안토시아닌 풍부 활성 분획(AnT Fr)의 분석 및 정량화
본 발명자들은 산딸나무(Cornus kousa) 잎 에탄올 추출물(ELECk)에서 수득한 안토시아닌 풍부 활성 분획(AnT Fr)을 안토시아닌 화합물의 동정 및 정량을 위해 GC-MS에 적용하였다. 그 결과 도 1에 나타난 바와 같이 GC-MS에 의해 동정되고 정량된 본 발명의 추출물의 안토시아닌 풍부 활성 분획(AnT Fr)의 약 90.05%를 나타내는 3가지 주요 화합물 및 함량은 미량성분과 함께 각각 cyanidin 3-글루코시드(27.23%, a), delphinidin 3-글루코시드(36.54%, b) 및 pelargonidin 3-글루코시드(26.32%, c)로 나타났다.
실험예 2: 항-혈관형성 활성
2-1: MTT 분석
본 발명의 안토시아닌 풍부 활성 분획(AnT Fr)의 신생혈관형성억제 분석은 HUVEC를 사용하여 같은 수의 세포를 가진 96-웰 미량정량판(microtiter plate)에서 다양한 농도의 AnT Fr를 처리하여 증식시켰다. AnT Fr로 처리하지 않은 HUVCE를 포함하는 플레이트의 웰을 음성 대조군으로 사용하였고 EGCG(Epigallocatechin gallate)를 양성 대조군(50 μg/ml)으로 사용하였다.
그 결과, HUVEC에 대한 EGCG의 독성은 먼저 MTT 분석에 의해 결정되었는데 본 발명의 AnT Fr은 HUVEC에서 100 μg/ml 농도까지 독성을 나타내지 않았다(도 2 및 3). 상기 AnT Fr의 안전한(무독) 농도를 사용하여 인간 적혈구에 대한 용혈효과를 측정한 결과 실험에서 사용된 AnT Fr의 농도는 240분 동안 배양 후 용혈효과를 나타내지 않아 정상세포에 대한 안토시아닌 풍부 활성 분획(AnT)의 안전성을 확인하였다(도 4).
2-2: 신생혈관형성억제 활성/튜브 형성 억제 활성
본 발명자들은 매트리젤(matrigel)의 HUVEC에 의한 관형 구조(tubular structure) 형성에 대한 억제 효과를 측정함으로써 AnT Fr의 항-혈관형성 효과를 조사하였다. HUVECs는 96-웰 미세정량판에서 성장시켰고 confluency에 도달한 후, 다양한 농도(5, 30, 60 및 100 μg/mL)의 AnT Fr으로 처리하였다. 상기 AnT Fr의 영향으로 매트리젤에서 증식하여 관상 구조물을 만들도록 허용하였고 AnT Fr 처리에 따라 증식된 각 실험군, 음성 대조군 및 양성대조군의 HUVEC를 위상차 역전 현미경(Nikon, Tokyo, Japan) 및 Scion Image 소프트웨어(NIH, ML, USA)를 이용하여 무작위로 5곳을 촬영하였다(도 5).
그 결과, 매트리젤에서의 HUVECs 증식에 대한 AnT Fr의 상이한 농도 효과가 결정되었다(도 6). 또한, 총 튜브 길이를 각 농도에 대해 계산하였고 대조군과 비교한 결과 AnT Fr이 농도 의존적으로 HUVEC의 증식을 유의하게 억제하고 총 튜브 길이는 AnT Fr의 농도가 증가함에 따라 감소하는 것으로 나타났다(도 7). 총 튜브 길이는 대조군에서 가장 높았는데 이는 ELECk의 최고 농도(즉, 100㎍/ml)로 처리된 실험군에서 가장 낮았으므로 ELECk에 의한 HUVEC의 혈관형성 억제가 농도-의존적임을 말해준다.
2-3: RT-PCR 분석
본 발명자들은 HUVEC에서 AnT Fr의 신생혈관형성억제 활성의 기전을 RT-PCR로 분석하였다. 총 RNA는 실험군 및 대조군 세포로부터 추출하였고 cDNA로 역전사시켰다. 상기 생성된 cDNA는 유전자 특이적 프라이머를 사용하여 실시간 PCR을 수행하였고 겔 전기영동 후 Gel doc에 의해 밴드를 수득함으로써 생성물을 시각화하였다.
그 결과, AnT Fr은 VEGFR2, PI3k, Akt 및 Nf-Kb와 같은 혈관형성 신호 분자의 발현 수준을 농도 의존적으로 유의하게 감소시키는 것으로 나타났다(도 8). AnT Fr(즉, 100 ㎍/ml)의 가장 안전한 고 농도는 신호 단백질 및 혈관형성의 전사 인자를 억제함으로써 HUVEC에서 혈관형성 과정에서 가장 높은 억제를 보였다.
실험예 3: 항-비만 활성
본 발명의 AnT Fr의 항-비만 효과는 AnT Fr의 항-지질생성(anti-adipogenic) 및 항-지방형성(anti-lipogenic)을 통한 항-고지혈증(antihyperlipidemic) 활성을 분석하였다.
3-1: MTT 분석
먼저, 항-고지혈증 활성을 분석하기 위해, 먼저 3T3-L1 세포주를 사용하였고 안전하고 독성이 있는 농도 수준을 결정하기 위해 MTT로 세포 생존력 분석을 수행했다. 그 결과, AnT Fr은 최대 100 μg/ml 농도에서 3T3 -L1 세포에 대한 독성을 나타내지 않았고 농도가 100 μg/ml보다 높으면 3T3 -L1 세포의 생존율을 감소시키는 것으로 나타났다(도 9). 따라서 AnT Fr의 안전한 농도는 추가 실험을 위해 최대 100 μg/ml로 결정되었다. 또한, 양성 대조군 EGCG 및 GW9662의 3T3-L1 세포에 대한 독성은 추가 실험에 사용하기 전에 MTT 분석으로 결정하였다(도 10).
3-2: Oil Red O 염색 분석
본 발명자들은 Oil Red O 염색을 위해 미성숙 3T3-L1 세포를 다양한 농도(무독성 수준)의 AnT Fr를 처리하여 DMEM 배지에서 분화시켰다. 성숙한 3T3-L1 세포에 축적된 지질 액적은 위상차 역전 현미경(Nikon, Tokyo, Japan) 및 Scion Image 소프트웨어(NIH, ML, USA)를 이용하여 5개의 무작위 사이트에서 촬영하였다. 세포에 축적된 지질 액적(lipid droplets)을 Oil Red O 염색액으로 추출하였고 상기 추출한 Oil Red O 염색의 흡광도를 확인하여 분광 광도계로 정량하였다.
그 결과, Oil Red O 염색액에서 지질 액적의 사진은 AnT Fr 농도가 증가함에 따라 지질 축적이 현저하게 감소함을 확인하였다(도 11). AnT Fr은 대조군과 비교하여 분화된 3T3-L1 지방세포에서 농도 의존적 방식으로 지질 축적을 억제하였고 AnT Fr의 최고 농도는 양성 대조군인 GW9662와 거의 동일하게 3T3-L1 세포에서 지질 축적을 억제하는 것으로 나타났다(도 12).
3-3: RT-PCR
본 발명자들은 3T3-L1의 증식과 지질 축적에 대한 AnT Fr의 항-고지혈 작용의 기전을 RT-PCR로 분석하였다. 다양한 농도의 AnT Fr 존재 하에서 증식된 3T3-L1 세포로부터 총 RNA를 분리하였고 역전사 중합 효소 연쇄 반응에 의해 RNA를 cDNA에 역전사시킨 후 유전자 특이적 프라이머를 이용하여 실시간 qPCR로 DNA로 변환시켰다. 그 후 겔 전기영동 후 Gel doc으로 밴드를 수득하여 생성물을 시각화하였다.
그 결과, AnT Fr의 처리가 PPARγ, C/EBPα, aP2 및 SREBP-1c와 같은 지질생성 또는 지방형성 관련 유전자 및 신호 분자의 발현 수준을 농도 의존적으로 현저히 억제하는 것으로 나타났다(도 13 및 14).
실험예 4: p-AMPK의 활성
본 발명자들은 AnT Fr 처리에 의한 p-AMPK의 활성화는 웨스턴 블롯 분석으로 측정하였다. 먼저, 3T3-L1 지방세포는 다양한 농도의 AnT Fr으로 처리하여 분화시켰고 단백질을 방사성면역침전분석 완충액으로 추출하였으며 농도를 BCA 단백질 분석 시약(Pierce, Rockford, IL, USA)으로 측정하였다. SDS-PAGE로 분리된 단백질을 4℃에서 AMPK, phospho-AMPKα (Cell Signaling Technology, Danvers, MA) 및 β-actin(Santa Cruz, CA) 일차 항체와 함께 밤새 배양한 다음 니트로 셀룰로오스 멤브레인에 옮겼다. 2차 항체는 서양 고추냉이 퍼옥시다아제에 결합되었으며 단백질 밴드를 시각화하기 위해 화학 발광 (chemiluminescence) Amersham Bioscience, UK를 강화시켰다.
그 결과, AMPK 및 대조군으로 선택한 베타-액틴 수준과 비교하여 AnT Fr의 농도가 증가함에 따라 p-APMK의 발현 수준은 증가하는 것으로 나타났다(도 15 및 16).
결론적으로, 본 발명의 산딸나무 잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 항비만 조성물은 안토시아닌 풍부 활성 분획이 우수한 신생혈관형성억제 효과 및 항-비만 활성을 나타내므로 종래 항-비만 의약품과 관련된 부작용을 극복하고 비만을 효율적으로 억제하는 효과적이고 안전한 비만 치료제 개발을 위한 훌륭한 대체 전략으로 비만 치료 또는 조절을 위한 영양제 및 약학 제형의 후보물질로 활용가능하다.
본 발명은 상술한 실시예 및 실험예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예 및 실험예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.
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Claims (10)
- 산딸나무(Cornus kousa) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는, 항비만 조성물.
- 산딸나무(Cornus kousa) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는, 혈관신생 억제용 조성물.
- 제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 추출물은 산딸나무의 잎, 가지, 뿌리 또는 열매로부터 제조한 것인. 조성물. - 제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 추출물은 물, C1 내지 C4의 저급알코올 또는 이들의 혼합물로 추출한 것인, 조성물. - 제4항에 있어서,
상기 저급알코올은 메탄올, 에탄올, 또는 프로판올인, 조성물. - 제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 추출물 또는 이의 분획물은 안토시아닌 풍부 활성 분획을 포함하는, 조성물. - 제6항에 있어서,
상기 안토시아닌 풍부 활성 분획은 60 내지 80% 에탄올을 전개용매로 한 고성능 액체 크로마토그래피의 분획인, 조성물. - 제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 산딸나무 추출물은
산딸나무 잎을 건조 후 분쇄하여 분말을 제조하는 분말 제조단계;
상기 분말에 물을 첨가 후 환류시켜 유기용매로 추출하는 추출물 제조단계; 및
상기 추출물을 여과 후 정제하여 안토시아닌풍부 분획물을 수득하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조되는, 조성물. - 산딸나무(Cornus kousa) 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는, 비만 개선용 건강기능식품.
- 제9항에 있어서,
탕제, 드링크제, 산제, 환제, 캡슐, 정제 또는 젤리의 제형으로 제공되는 건강기능식품.
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