KR20200103347A - Composition for preventing or improving of skin wrinkle or skin photo-aging comprising fermented extract of Stevia rebaudiana and scoria as an active ingredient - Google Patents

Composition for preventing or improving of skin wrinkle or skin photo-aging comprising fermented extract of Stevia rebaudiana and scoria as an active ingredient Download PDF

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KR20200103347A KR1020190021694A KR20190021694A KR20200103347A KR 20200103347 A KR20200103347 A KR 20200103347A KR 1020190021694 A KR1020190021694 A KR 1020190021694A KR 20190021694 A KR20190021694 A KR 20190021694A KR 20200103347 A KR20200103347 A KR 20200103347A
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Abstract

The present invention relates to a composition for preventing or ameliorating skin wrinkles or skin photo-aging comprising a fermented extract of Stevia rebaudiana and scoria as an effective ingredient and, more specifically, to a composition for preventing or ameliorating skin wrinkles or skin photo-aging comprising a fermented product obtained by inoculating Lactobacillus plantarum and Lactobacillus brevis into a mixture between a water extract of Stevia rebaudiana and a hot water extract of scoria and fermenting the resulting product as an effective ingredient. The cosmetic composition of the present invention comprises a fermented extract of Stevia rebaudiana and scoria as an effective ingredient so as to effectively prevent or ameliorate skin wrinkles or skin photo-aging.

Description

스테비아 및 화산석 송이 추출발효물을 유효성분으로 함유하는 피부 주름 또는 피부 광노화의 예방 또는 개선용 조성물{Composition for preventing or improving of skin wrinkle or skin photo-aging comprising fermented extract of Stevia rebaudiana and scoria as an active ingredient}Composition for preventing or improving of skin wrinkle or skin photo-aging comprising fermented extract of Stevia rebaudiana and scoria as an active ingredient }

본 발명은 스테비아 및 화산석 송이 추출발효물을 유효성분으로 함유하는 피부 주름 또는 피부 광노화의 예방 또는 개선용 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 스테비아의 열수추출물 및 화산석 송이의 열수추출물의 혼합물에 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) 및 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis)를 접종하고 발효하여 수득한 발효물을 유효성분으로 함유하는 피부 주름 또는 피부 광노화의 예방 또는 개선용 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to a composition for preventing or improving skin wrinkles or skin photoaging containing stevia and volcanic stone extract and fermentation as active ingredients, and specifically, Lactobacillus planta in a mixture of the hot water extract of stevia and the hot water extract of volcanic stone Rum ( Lactobacillus plantarum ) and Lactobacillus brevis ( Lactobacillus brevis ) It relates to a composition for preventing or improving skin wrinkles or skin photoaging, containing a fermented product obtained by inoculation and fermentation as an active ingredient.

인간의 피부는 나이가 들어감에 따라 주름, 기미, 주근깨 등이 생성되며, 탄력이 감소하게 된다. 피부 노화의 원인은 섬유아세포의 수가 감소하고 그 작용이 저하되어 섬유성분(콜라겐)의 합성량이 줄어들고, 피부 내 수분이 손실됨에 따라 유발되는 내인성 노화(자연노화)와 외적으로 지속적인 자외선 노출에 의한 유해 작용에 의한 광노화로 나누어진다.As human skin ages, wrinkles, blemishes, and freckles are generated, and its elasticity decreases. The causes of skin aging are intrinsic aging (natural aging) caused by the decrease in the number of fibroblasts and a decrease in their action, resulting in a decrease in the amount of fibroblasts (collagen) synthesized, and the loss of moisture in the skin. It is divided into photoaging by action.

피부는 외측으로부터 표피, 진피, 피하 조직으로 구성되어 있다. 표피는 외부 자극이나 병원균의 침입을 방지하고, 체온, 수분을 조절하는 역할을 한다. 진피는 결합조직(connective tissue)으로 구성되며, 아교섬유(collagenous fibers)와 일부 탄력 섬유(elastic fibers)로 인해 피부를 탱탱하고 탄력있게 유지시켜주는 기능을 한다. 피하조직은 결체 조직으로 이루어진 층으로 여기에 존재하는 지방 세포들은 열을 보존하고 보호하는 완충 역할을 한다. 연구 결과에 따르면 자연 노화와 광노화된 피부를 비교하여 보았을 때 광에 의한 노화가 피부 노화에 보다 큰 영향을 미친다는 것이 밝혀졌다. 광노화의 경우 내인성 노화에 비하여 굵고 깊은 주름은 물론 잔주름도 많이 발생하고 일찍부터 관찰되는 특징을 가지고 있다. 또한 일반적으로 피부의 유연성을 주는 섬유 조직인 콜라겐이 피부 주름 형성에 가장 큰 영향을 미치는데, 진피 조직의 약 70%를 차지하는 주요 구성 요소이다. 콜라겐 섬유의 합성은 피부 노화가 진행되면서 급격히 감소하며, 또한 외부 환경에 의해 콜라겐 섬유가 변형되면서 피부에 주름이 생성되고 깊어지게 된다. 이러한 콜라겐의 분해에는 콜라겐 분해효소인 콜라게나아제(collagenase)가 관여한다.The skin is composed of epidermis, dermis, and subcutaneous tissue from the outside. The epidermis plays a role in preventing the invasion of external stimuli or pathogens, and regulating body temperature and moisture. The dermis is made up of connective tissue, and it functions to keep the skin elastic and elastic due to collagenous fibers and some elastic fibers. The subcutaneous tissue is a layer of connective tissue, and the fat cells present here act as a buffer to preserve and protect heat. According to the research results, when comparing natural aging and photoaging skin, it was found that light-induced aging had a greater effect on skin aging. In the case of photoaging, compared to endogenous aging, thick and deep wrinkles as well as fine wrinkles occur a lot and have a characteristic that is observed early. In addition, collagen, a fibrous tissue that generally gives flexibility to the skin, has the greatest effect on the formation of skin wrinkles, and is a major component that accounts for about 70% of the dermal tissue. Synthesis of collagen fibers decreases rapidly as skin aging progresses, and wrinkles are created and deepened in the skin as collagen fibers are deformed by the external environment. Collagenase, a collagenase, is involved in the degradation of collagen.

광노화는 태양광 중의 자외선에 의해 발생되는 것으로, 피부가 자외선에 노출되면 체내에서 활성산소(oxygen free radical)가 생성된다. 활성산소는 피부 세포 및 조직의 손상, 멜라닌 생성 증가, 표피의 각질화 등을 유발한다. 각질층이 손상을 입으면서 각질층의 두께가 증가하고, 자외선에 의해 진피층의 콜라겐 생성능이 감소하게 되면서 그 결과 진피층이 얇아져 굵고 깊은 주름이 생성된다.Photoaging is caused by ultraviolet rays in sunlight, and when the skin is exposed to ultraviolet rays, oxygen free radicals are generated in the body. Free radicals cause damage to skin cells and tissues, increase melanin production, and keratinization of the epidermis. As the stratum corneum is damaged, the thickness of the stratum corneum increases, and the ability to produce collagen in the dermal layer decreases by ultraviolet rays, as a result of which the dermis layer becomes thin, resulting in thick and deep wrinkles.

최근 화학물질 등에 의한 피부 자극을 줄이기 위해 천연물을 사용한 제품의 개발이 활발하게 이루어지고 있으며, 또한 피부 손상이나 노화의 원인을 감소시켜 피부 건강을 개선할 수 있는 소재를 찾아내는 연구도 진행되고 있다.Recently, in order to reduce skin irritation caused by chemical substances, products using natural products are being actively developed, and research is also being conducted to find materials that can improve skin health by reducing the causes of skin damage or aging.

한편, 스테비아(Stevia, Stevia rebaudiana)는 잎이나 줄기에 저칼로리의 단 맛 성분이 포함되어 있어 다이어트 감미료에 이용된다. 스테비오사이드(stevioside)라고 하는 성분을 가지고 있어 설탕에 비해 200 ~ 300배의 단맛을 내며 칼로리는 1g 당 4칼로리로 매우 낮으며 독성이 없는 천연감미료로 당뇨병환자나 다이어트를 요하는 현대인의 필수품이라 할 수 있다. 스테비아사이드는 물이나 알코올에 잘 녹으며 내열성을 지니고 있고 독성이 없으므로, 샤베르, 추잉껌, 청량음료, 약품 등의 감미료로 쓰인다.On the other hand, Stevia (Stevia rebaudiana ) contains a low-calorie sweet-tasting ingredient in leaves or stems, so it is used as a diet sweetener. It has an ingredient called stevioside, so it tastes 200 to 300 times sweeter than sugar, and its calories are very low at 4 calories per gram, and it is a natural sweetener that is not toxic and is a necessity for diabetics and people who need diet. I can. Steviaside is well soluble in water or alcohol, has heat resistance, and is not toxic, so it is used as a sweetener for sherbers, chewing gum, soft drinks, and medicines.

화산석 송이(Scoria)는 우리나라 제주도에서만 있는 화산재의 일종으로, 제주 전역에 기생화산(오름) 생성 시 산출되는 것으로 알려져 있으며, 제주도 내 매장량은 200억㎥ 추정되고 있다. 화산석 송이는 천연 상태에서 원적외선 방사 92 ~ 93%, 탈취율 97%, 항균 곰팡이 99.9%의 대장균을 퇴치하는 성능을 가진 최고의 기능을 갖춘 천연소재이다. 원적외선은 피부를 3 ~ 5㎜까지 투과하여 세포기능을 활성화할 뿐만 아니라, 혈액순환을 촉진하고, 신진대사를 강화하며 조직의 재생력을 향상시킬 수 있다.Volcanic stone Scoria is a type of volcanic ash found only in Jeju Island, Korea, and is known to be produced when parasitic volcanoes (orum) are formed throughout Jeju, and the reserves of Jeju Island are estimated at 20 billion㎥. Volcanic stone pine is a natural material with the best functions with the ability to fight E. coli of 92-93% far-infrared radiation, 97% deodorization rate, and 99.9% antibacterial fungi in its natural state. Far-infrared rays penetrate the skin up to 3 to 5 mm and not only activate cell functions, but also promote blood circulation, strengthen metabolism, and improve tissue regeneration.

본 발명자는 이와 같은 스테비아 및 화산석 송이를 이용하여 피부에 유익한 물질을 생산할 수 있는 방법을 개발하고, 이를 피부 건강을 유지하기 위한 용도, 특히 피부 주름 또는 피부 광노화의 예방 또는 개선을 위한 용도의 화장료에 적용하고자 하였다.The inventors of the present invention have developed a method for producing substances that are beneficial to the skin by using such stevia and volcanic stone clusters, and this is used in cosmetics for use in maintaining skin health, particularly for preventing or improving skin wrinkles or skin photoaging. I wanted to apply.

대한민국 등록특허 제10-0620854호Korean Patent Registration No. 10-0620854 대한민국 등록특허 제10-1118156호Korean Patent Registration No. 10-1118156 대한민국 등록특허 제10-1066676호Korean Patent Registration No. 10-1066676 대한민국 등록특허 제10-0596316호Korean Patent Registration No. 10-0596316

본 발명의 주된 목적은 스테비아와 화산석 송이를 이용하여 피부 주름 또는 피부 광노화의 예방 또는 개선에 우수한 효과를 나타내는 화장료 조성물을 제공하는데 있다.The main object of the present invention is to provide a cosmetic composition exhibiting an excellent effect in preventing or improving skin wrinkles or skin photoaging by using stevia and volcanic stone clusters.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 스테비아의 열수추출물 및 화산석 송이의 열수추출물의 혼합물에 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) 및 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis)를 접종하고 발효하여 수득한 발효물을 유효성분으로 함유하는 피부 주름 또는 피부 광노화의 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다.According to one aspect of the present invention, the present invention is a fermented product obtained by inoculating and fermenting Lactobacillus plantarum and Lactobacillus brevis in a mixture of the hot water extract of stevia and the hot water extract of volcanic rock It provides a cosmetic composition for preventing or improving skin wrinkles or skin photoaging containing as an active ingredient.

본 발명의 화장료 조성물에 있어서, 상기 스테비아의 열수추출물은 스테비아 분쇄물에 10 내지 30배 중량의 물을 첨가하고 50 내지 100℃에서 추출하여 수득한 것이며, 상기 화산석 송이의 열수추출물은 화산석 송이의 분쇄물에 10 내지 30배 중량의 물을 첨가하고 110 내지 130℃에서 가압 추출하여 수득한 것이고, 상기 혼합물은 상기 스테비아의 열수추출물과 상기 화산석 송이의 열수추출물을 1 : 2 내지 2 : 1 중량비로 혼합한 것이 바람직하다.In the cosmetic composition of the present invention, the hot water extract of stevia is obtained by adding 10 to 30 times the weight of water to the pulverized stevia and extracting at 50 to 100°C, and the hot water extract of the volcanic stone is pulverized It is obtained by adding 10 to 30 times the weight of water to water and extracting under pressure at 110 to 130°C, and the mixture is a mixture of the hot water extract of the stevia and the hot water extract of the volcanic rock in a weight ratio of 1:2 to 2:1 One is preferred.

본 발명의 화장료 조성물에 있어서, 상기 발효는 35 내지 39℃에서 50 내지 200rpm으로 12 내지 36시간 진탕하여 이루어지는 것이 바람직하다.In the cosmetic composition of the present invention, the fermentation is preferably performed by shaking at 35 to 39°C at 50 to 200 rpm for 12 to 36 hours.

본 발명의 화장료 조성물은 스테비아 및 화산석 송이 추출발효물을 유효성분으로 함유하여 피부 주름 또는 피부 광노화를 효과적으로 예방 또는 개선할 수 있다.The cosmetic composition of the present invention can effectively prevent or improve skin wrinkles or skin photoaging by containing a fermented product extracted from stevia and volcanic stone as active ingredients.

도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 발효물 제조과정을 나타낸 것이다.
도 2는 피부섬유아세포에 UV를 조사하는 조건에서 본 발명의 발효물 처리에 따른 엘라스틴, 콜라겐 및 MMP-3의 발현에 대한 영향을 웨스턴블롯으로 조사한 결과이다.
1 shows a fermented product manufacturing process according to an embodiment of the present invention.
Figure 2 is a result of investigation of the effect on the expression of elastin, collagen, and MMP-3 according to the fermented product treatment of the present invention in a Western blot under the condition of irradiating the skin fibroblasts with UV.

본 발명의 조성물은 스테비아의 열수추출물 및 화산석 송이의 열수추출물의 혼합물에 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) 및 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis)를 접종하고 발효하여 수득한 발효물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 한다.The composition of the present invention contains a fermented product obtained by inoculating and fermenting Lactobacillus plantarum and Lactobacillus brevis in a mixture of the hot water extract of stevia and the hot water extract of volcanic rock as an active ingredient. It features.

본 발명에서 상기 스테비아는 어떤 부위든 사용 가능할 것으로 판단되나, 잎과 줄기 중에서 선택된 하나 이상의 재료를 사용하는 것이 바람직하다.In the present invention, it is determined that the stevia can be used in any part, but it is preferable to use at least one material selected from leaves and stems.

본 발명에서 상기 화산석 송이는 채취 지역에 상관없이 어떤 것이든 사용 가능할 것으로 판단되나, 우리나라 제주도에서 채취된 것을 사용하는 것이 바람직하다.In the present invention, it is determined that any of the volcanic rocks can be used irrespective of the collection area, but it is preferable to use those collected from Jeju Island in Korea.

본 발명에서 상기 스테비아의 열수추출물은 식물 재료로부터 물을 용매로 이용하여 가열하는 방법을 통해 유용성분을 추출하기 위한 통상적인 추출방법을 통해 수득할 수 있으나, 스테비아 분쇄물에 10 ~ 30배 중량의 물을 첨가하고 50 ~ 100℃에서 추출하여 수득하는 것이 바람직하다. 이때 추출시간은 12 ~ 36시간으로 하는 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는 스테비아 분쇄물에 15 ~ 25배 중량의 물을 첨가하고 80 ~ 100℃에서 20 ~ 30시간 동안 추출하여 수득하는 것이 좋다. 또한, 추출 후 여과를 통해 슬러지를 제거한 추출액의 상태로 사용하는 것이 바람직하다.In the present invention, the hot-water extract of stevia can be obtained through a conventional extraction method for extracting useful components through a method of heating using water as a solvent from a plant material, but 10 to 30 times the weight of the stevia pulverized product It is preferable to add water and extract at 50 to 100°C. At this time, the extraction time is preferably 12 to 36 hours. More preferably, 15 to 25 times the weight of water is added to the pulverized stevia and extracted at 80 to 100°C for 20 to 30 hours to obtain. In addition, it is preferable to use in the state of an extract from which sludge is removed through filtration after extraction.

본 발명에서 상기 화산석 송이의 열수추출물은 광물 재료로부터 물을 용매로 이용하여 가열하는 방법을 통해 유용성분을 추출하기 위한 통상적인 추출방법을 통해 수득할 수 있으나, 화산석 송이 분쇄물에 10 ~ 30배 중량의 물을 첨가하고 110 ~ 130℃에서 가압 추출하여 수득하는 것이 바람직하다. 이때 추출시간은 5 ~ 30분으로 하는 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는 화산석 송이 분쇄물에 15 ~ 25배 중량의 물을 첨가하고 115 ~ 125℃에서 10 ~ 20분 동안 가압 추출하여 수득하는 것이 좋다. 또한, 추출 후 여과를 통해 슬러지를 제거한 추출액의 상태로 사용하는 것이 바람직하다.In the present invention, the hot water extract of the volcanic rock can be obtained through a conventional extraction method for extracting useful components through a method of heating using water as a solvent from a mineral material, but 10 to 30 times the pulverized volcanic stone It is preferable to obtain by adding weight of water and extracting under pressure at 110 to 130°C. At this time, the extraction time is preferably 5 to 30 minutes. More preferably, 15 to 25 times the weight of water is added to the crushed volcanic stone, and it is obtained by pressure extraction at 115 to 125°C for 10 to 20 minutes. In addition, it is preferable to use in the state of an extract from which sludge is removed through filtration after extraction.

본 발명에서 상기 스테비아의 열수추출물 및 화산석 송이의 열수추출물의 혼합물은 상기 스테비아의 열수추출물과 상기 화산석 송이의 열수추출물을 혼합하는 방법으로 수득할 수 있으며, 이때 혼합 비율은 1 : 2 ~ 2 : 1 중량비로 하는 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는 혼합 비율을 1 : 1.5 ~ 1.5 : 1 중량비로 하는 것이 좋다.In the present invention, the mixture of the hot-water extract of stevia and the hot-water extract of volcanic rock can be obtained by mixing the hot-water extract of stevia and the hot-water extract of the volcanic rock, wherein the mixing ratio is 1: 2 to 2: 1 It is preferable to set it as a weight ratio. More preferably, the mixing ratio is 1: 1.5 to 1.5: 1 weight ratio.

상기 스테비아의 열수추출물 및 화산석 송이의 열수추출물의 혼합물은 발효과정에 발생할 수 있는 잡균의 증식으로 인한 잘못된 발효를 방지하기 위하여 발효균을 접종하기 전에 멸균하는 과정을 거치는 것이 바람직하다. 이때 멸균은 미세공 필터를 사용한 여과방법, 고온고압 가열 방법 등 통상적인 액체의 멸균방법을 사용할 수 있다.The mixture of the hot water extract of stevia and the hot water extract of volcanic rock is preferably sterilized before inoculation of the fermenting bacteria in order to prevent erroneous fermentation due to the growth of various bacteria that may occur during the fermentation process. At this time, sterilization may be performed using a conventional liquid sterilization method such as a filtration method using a micropore filter or a high temperature and high pressure heating method.

본 발명에서 발효균으로 락토바실러스 플란타럼 및 락토바실러스 브레비스를 사용하는데, 이때 락토바실러스 플란타럼 균주로 KCCM 12116, ATCC 14917, IFO 15891 또는 DSM 20174를 사용하는 것이 바람직하며, 락토바실러스 브레비스 균주로 KCCM 35464, ATCC 8287, IFO 3345 또는 DSM 20556을 사용하는 것이 바람직하다.In the present invention, Lactobacillus plantarum and Lactobacillus brevis are used as fermenting bacteria, in which case it is preferable to use KCCM 12116, ATCC 14917, IFO 15891 or DSM 20174 as the Lactobacillus plantarum strain, and KCCM as the Lactobacillus brevis strain It is preferred to use 35464, ATCC 8287, IFO 3345 or DSM 20556.

본 발명에서 상기 접종은 상기 발효균의 액체배양액을 상기 스테비아의 열수추출물 및 화산석 송이의 열수추출물의 혼합물에 첨가하는 방법으로 이루어질 수 있다. 이때 발효균의 액체배양액은 각 발효균이 생장할 수 있는 액체배지에 각 발효균을 접종하여 배양하는 방법으로 수득할 수 있다. 이때 배양은 MRS 액체배지에서 35 ~ 39℃, 50 ~ 200rpm으로 12 ~ 36시간 진탕배양하는 방법을 사용하는 것이 발효효율을 높이기 위해 바람직하다. 락토바실러스 플란타럼 및 락토바실러스 브레비스를 각각 별도로 배양하여 각각의 배양액을 열수추출물에 첨가할 수 있으며, 또한 두 균주를 함께 배양하더라도 서로의 생장에 악영향을 미치지 않으므로 하나의 액체배지에 두 균주를 함께 배양하고 수득한 배양액을 사용할 수도 있다. 두 균주를 별도로 배양한 배양액을 이용할 경우 각각 1 ~ 3%(v/v)로 첨가하는 것이 바람직하며, 두 균주를 함께 배양한 배양액을 이용할 경우 2 ~ 6%(v/v)로 첨가하는 것이 발효효율을 높이기 위해 바람직하다.In the present invention, the inoculation may be performed by adding the liquid culture solution of the fermenting bacteria to a mixture of the hot water extract of stevia and the hot water extract of volcanic rock. At this time, the liquid culture solution of the fermenting bacteria can be obtained by inoculating each fermenting bacteria into a liquid medium in which each fermenting bacteria can grow and culturing them. At this time, it is preferable to use a method of shaking culture for 12 to 36 hours at 35 to 39°C and 50 to 200 rpm in MRS liquid medium in order to increase fermentation efficiency. Lactobacillus plantarum and Lactobacillus brevis can be cultured separately and each culture solution can be added to the hot water extract. Also, even if the two strains are cultivated together, it does not adversely affect the growth of each other. It is also possible to use a culture solution obtained after culturing. When using a culture solution obtained by culturing two strains separately, it is preferable to add 1 to 3% (v/v), and when using a culture solution obtained by culturing two strains together, it is recommended to add 2 ~ 6% (v/v). It is desirable to increase fermentation efficiency.

본 발명에서 상기 발효는 상기 발효균이 접종된 열수추출물의 혼합물을 발효균의 생장 및 발효가 가능한 온도로 적절한 시간동안 유지하는 방법으로 이루어질 수 있다. 바람직하게는 35 ~ 39℃, 50 ~ 200rpm으로 12 ~ 36시간 진탕하여 발효하는 것이 좋다. 이에 따르면 보다 효율적인 발효가 이루어지도록 할 수 있다. 보다 바람직하게는 36 ~ 38℃, 100 ~ 140rpm으로 20 ~ 30시간 진탕하여 발효하는 것이 좋다.In the present invention, the fermentation may be performed by maintaining a mixture of the hot water extract inoculated with the fermenting bacteria at a temperature at which the fermenting bacteria can grow and ferment for an appropriate time. Preferably, it is good to ferment by shaking for 12 to 36 hours at 35 to 39°C, 50 to 200 rpm. According to this, more efficient fermentation can be achieved. More preferably, it is good to ferment by shaking at 36 to 38°C and 100 to 140 rpm for 20 to 30 hours.

보다 효율적인 발효를 위해 상기 열수추출물의 혼합물에 당과 질소원을 첨가하고 발효균을 접종하여 발효하는 것이 바람직하다. 당은 포도당과 같이 상기 발효균이 탄소원으로 이용할 수 있는 것을 사용할 수 있으며, 질소원은 효모추출물(yeast extract)과 같이 상기 발효균이 질소원으로 이용할 수 있는 것을 사용할 수 있다. 포도당을 사용할 경우, 상기 열수추출물의 혼합물에 0.1 내지 1%(w/v)로 첨가하는 것이 효율적인 발효를 위해 바람직하며, 효모추출물을 사용할 경우, 상기 열수추출물의 혼합물에 0.05 내지 0.4%(w/v)로 첨가하는 것이 효율적인 발효를 위해 바람직하다.For more efficient fermentation, it is preferable to ferment by adding sugar and nitrogen source to the mixture of the hot water extract and inoculating the fermentation bacteria. Sugar, such as glucose, that can be used by the fermenting bacteria as a carbon source may be used, and the nitrogen source can be used as a nitrogen source by the fermenting bacteria such as yeast extract. When using glucose, it is preferable to add 0.1 to 1% (w/v) to the mixture of the hot water extract for efficient fermentation, and when using the yeast extract, 0.05 to 0.4% (w/v) to the mixture of the hot water extract Addition to v) is preferred for efficient fermentation.

본 발명에서 상기와 같은 방법을 통해 제조된 발효물을 그대로 이용할 수 있으나, 여과하여 여과액을 수득하고, 농축 및 동결건조 과정을 통해 분말화하여 사용하는 것이 바람직하다.In the present invention, the fermented product prepared through the above method may be used as it is, but it is preferable to use it by filtration to obtain a filtrate, and to powder it through concentration and lyophilization.

본 발명의 화장료은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 형태로도 제조될 수 있으며, 화장료를 제조하는 과정 중에 상기 발효물을 첨가하는 방법으로 제조할 수 있다. 이때 발효물의 첨가량은 화장료의 종류, 형태, 목적, 제조방법 등을 고려하여 적절하게 선택될 수 있으며, 예를 들어 최종 화장료 중량을 기준으로 0.1 ~ 100중량%, 바람직하게는 1 ~ 50중량%, 더욱 바람직하게는 2 ~ 20중량%일 수 있다.The cosmetic of the present invention may be prepared in any form conventionally prepared in the art, and may be prepared by adding the fermented product during the manufacturing process of the cosmetic. At this time, the amount of fermentation added may be appropriately selected in consideration of the type, shape, purpose, and manufacturing method of the cosmetic, for example, 0.1 to 100% by weight, preferably 1 to 50% by weight, based on the final cosmetic weight, More preferably, it may be 2 to 20% by weight.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples. Since these examples are for illustrative purposes only, the scope of the present invention is not to be construed as being limited by these examples.

[실시예][Example]

1. 본 발명의 발효물 제조1. Preparation of the fermented product of the present invention

1-1. 스테비아 추출물 제조1-1. Stevia extract manufacturing

스테비아 잎 및 줄기를 수세한 후 상온에서 건조시키고 분쇄하여 조분쇄물 500g을 수득하였다. 상기 조분쇄물 100g을 20배 중량의 정제수에 침지하여 저온추출기에서 95℃로 24시간 동안 저온 열수추출하였다. 수득한 추출물을 와트만(Whatman) #5 여과지로 여과하는 방법으로 미생물 및 슬러지를 제거하여 추출액을 수득하였으며, 잔여 원료에 대해 동일한 방법으로 3회 반복 추출한 후 상온에서 냉각하였다.Stevia leaves and stems were washed with water, dried at room temperature, and pulverized to obtain 500 g of a coarse pulverized product. 100 g of the coarse pulverized product was immersed in 20 times the weight of purified water and extracted with low temperature hot water at 95° C. for 24 hours in a low temperature extractor. The obtained extract was filtered with Whatman #5 filter paper to remove microorganisms and sludge to obtain an extract, and the remaining raw materials were repeatedly extracted three times in the same manner and then cooled at room temperature.

1-2. 화산석 송이 추출물 제조1-2. Manufacture of volcanic stone pine extract

화산석 송이를 수세한 후 상온에서 건조시키고 분쇄하여 조분쇄물 500g을 수득하였다. 상기 조분쇄물 100g을 20배 중량의 정제수에 침지하여 멸균기(autoclave)에서 121℃로 15분 동안 고온가압추출하였다. 수득한 추출물을 와트만(Whatman) #5 여과지로 여과하는 방법으로 슬러지를 제거하여 추출액을 수득하였으며, 잔여 원료에 대해 동일한 방법으로 3회 반복 추출한 후 상온에서 냉각하였다.After washing the volcanic stone with water, it was dried at room temperature and pulverized to obtain 500 g of a coarse pulverized product. 100 g of the coarse pulverized material was immersed in 20 times the weight of purified water and extracted by high-temperature pressurization at 121° C. for 15 minutes in an autoclave. The obtained extract was filtered through Whatman #5 filter paper to remove the sludge to obtain an extract, and the remaining raw materials were repeatedly extracted three times in the same manner, and then cooled at room temperature.

1-3. 발효미생물 준비1-3. Preparation of fermentation microorganisms

락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum)(KCCM 12116, ATCC 14917) 및 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis)(KCCM 35464, ATCC 8287)를 각각 MRS 액체배지에 접종하고 37℃에서 120rpm으로 15시간 진탕배양하였다. 이렇게 수득된 배양액을 이후 발효에 사용하였다. Lactobacillus plantarum ( Lactobacillus plantarum ) (KCCM 12116, ATCC 14917) and Lactobacillus brevis ( Lactobacillus brevis ) (KCCM 35464, ATCC 8287) were inoculated into MRS liquid medium, respectively, and cultured with shaking at 37°C at 120 rpm for 15 hours. The culture broth thus obtained was then used for fermentation.

1-4. 발효물 제조1-4. Fermentation production

상기 1-1의 스테비아 추출물 및 1-2의 화산석 송이 추출물을 1 : 1의 중량비로 혼합하고, 포도당을 0.4%(w/v)가 되도록, 효모추출물을 0.2%(w/v)가 되도록 첨가하여 발효배지를 제조하고, 121℃에서 15분간 멸균하였다. 여기에 상기 1-3의 균주 배양액을 각 균주 배양액 당 최종 2%(v/v)가 되도록 첨가하여 접종한 다음 37℃에서 120rpm으로 24시간 진탕발효하였다. 이렇게 수득된 발효물을 와트만(Whatman) #5 여과지로 여과, 농축 및 동결건조 과정을 거치고 분말화하여 이후의 실험에 사용하였다.Mixing the stevia extract of 1-1 and the volcanic rock extract of 1-2 in a weight ratio of 1:1, and adding the yeast extract to 0.2% (w/v) so that glucose is 0.4% (w/v) Thus, a fermentation medium was prepared and sterilized at 121°C for 15 minutes. Here, the strain culture solution of 1-3 was added and inoculated to a final 2% (v/v) per strain culture solution, followed by shaking fermentation at 37° C. at 120 rpm for 24 hours. The fermented product thus obtained was filtered, concentrated, and freeze-dried through Whatman #5 filter paper, and then powdered and used in subsequent experiments.

2. 항산화력2. Antioxidant power

2-1. DPPH 라디칼 소거능2-1. DPPH radical scavenging activity

상기 실시에 1의 발효물을 시료로 사용하여 DPPH 라디칼 소거 실험을 통해 항산화력을 조사하였다.Using the fermented product of Example 1 as a sample, antioxidant activity was investigated through a DPPH radical scavenging experiment.

DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)는 그 자체가 매우 안정한 프리라디칼(Free radical)로써, 517nm에서 특정적인 광흡수를 나타내는 진한 보라색의 화합물을 측정하며, 라디컬 소거활성이 있는 항산화제에 의해 정량적으로 탈색됨으로 인해 항산화 활성을 측정할 수 있다.DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) is a very stable free radical in itself. It measures a dark purple compound that exhibits specific light absorption at 517 nm. It is an antioxidant with radical scavenging activity. Antioxidant activity can be measured due to quantitative decolorization by.

농도별 시료 1㎖에 500μM DPPH 용액 1㎖를 첨가하여 교반한 후, 37℃ 암소에서 30분간 반응시켰다. 반응용액은 517nm에서 흡광도를 측정하여, 다음과 같은 radical scavenging activity를 계산하고 표 1에 나타내었다.After adding 1 ml of 500 μM DPPH solution to 1 ml of each concentration sample, the mixture was stirred, and then reacted in a dark place at 37° C. for 30 minutes. The reaction solution measured the absorbance at 517 nm, and the following radical scavenging activity was calculated and shown in Table 1.

Free radical scavenging activity(%) = (1-A/B) x 100Free radical scavenging activity(%) = (1-A/B) x 100

A : 시료첨가 흡광도, B : 시료무첨가 흡광도A: sample added absorbance, B: sample-free absorbance

시료sample 농도(㎎/㎖)Concentration (mg/ml) 항산화력 Antioxidant power DPPH radical 소거능(%)DPPH radical scavenging activity (%) IC50(㎎/㎖)IC 50 (mg/ml) 실시예 1의 발효물Fermented product of Example 1 0.100.10 8.808.80 0.6870.687 0.250.25 19.6919.69 0.500.50 38.0738.07 1.001.00 71.2571.25 비타민 CVitamin C 0.020.02 22.3422.34 0.0460.046 0.050.05 58.0258.02 0.100.10 100100 0.250.25 100100

* IC50값은 50% 라디컬 소거에 필요한 샘플의 농도를 의미함.* IC50 value refers to the concentration of the sample required for 50% radical elimination.

표 1과 같이, DPPH법에 의한 라디칼 소거력을 통한 항산화력을 비교한 결과, 본 발명의 발효물은 농도 의존적으로 우수한 항산화력을 나타냈다.As shown in Table 1, as a result of comparing the antioxidant power through radical scavenging power according to the DPPH method, the fermented product of the present invention exhibited excellent antioxidant power in a concentration-dependent manner.

2-2. SOD 유사 활성2-2. SOD-like activity

상기 실시예 1의 발효물을 시료로 사용하여 SOD 유사 활성 측정 실험을 통해 항산화력을 조사하였다.Using the fermented product of Example 1 as a sample, antioxidant activity was investigated through an experiment for measuring SOD-like activity.

SOD assay Kit-WST를 이용하여 제조사의 지시(메뉴얼)대로 측정하였으며, 96-well plate에 시료를 농도별로 넣고 WST-1(2-(4-iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5- (2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium, mono-sodium salt)과 잔틴산화효소(xanthine oxidase) working solution을 첨가한 후 37℃에서 20분간 인큐베이션한 다음 마이크로플레이트 리더(microplate reader)로 450nm에서 흡광도를 측정하여, 다음과 같은 활성산소종 소거능을 계산하고 표 2에 나타내었다.SOD assay Kit-WST was used to measure according to the manufacturer's instructions (manual), and the samples were put in a 96-well plate by concentration and WST-1(2-(4-iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5- (2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium, mono-sodium salt) and xanthine oxidase working solution were added, incubated at 37°C for 20 minutes, and then absorbance at 450nm with a microplate reader. By measuring, the following active oxygen species scavenging ability was calculated and shown in Table 2.

활성산소종 소거능(%) = [1-(시험구 흡광도/대조구 흡광도)] x 100Active oxygen species scavenging ability (%) = [1-(Test area absorbance/Control area absorbance)] x 100

시료sample 농도(㎎/㎖)Concentration (mg/ml) 활성산소종 소거능(%)Active oxygen species scavenging ability (%)
실시예 1의 발효물

Fermented product of Example 1
0.100.10 8.808.80
0.250.25 10.6910.69 0.500.50 20.0720.07 1.001.00 21.3621.36

표 2와 같이, SOD 유사 활성 측정을 통한 항산화력을 조사한 결과, 본 발명의 발효물은 농도 의존적으로 우수한 항산화력을 나타냈다.As shown in Table 2, as a result of examining the antioxidant power through SOD-like activity measurement, the fermented product of the present invention exhibited excellent antioxidant power in a concentration-dependent manner.

3. 세포 독성3. Cytotoxicity

상기 실시예 1의 발효물을 시료로 사용하여 WST-1 assay 방법을 통해 세포 독성을 조사하였다.Using the fermented product of Example 1 as a sample, cytotoxicity was investigated through the WST-1 assay method.

CD986sk fibroblast cell line을 96-well cell culture plate에 1×105cells/well의 농도로 분주하고 10% FBS, 1% penicillin streptomycin이 포함된 IMDM 배지에서 37℃, 5% CO₂ 조건으로 24시간 동안에 배양하였다. 세포가 완전히 부착된 것을 확인하고 PBS로 12회 세척한 후 상기 실시예 1의 발효물 시료를 각각 12.5㎍/㎖, 25㎍/㎖, 50㎍/㎖, 100㎍/㎖, 200㎍/㎖, 400㎍/㎖의 농도별로 100㎕씩 처리하여 37℃, 5% CO₂ incubator에서 24시간 동안 배양하였다. 이때 대조군(-)은 IMDM(no phenol red)만 처리해서 24시간 동안 37℃, 5% CO₂ incubator에서 배양하였다. Blank는 WST-1 용액의 background control 설정을 위해 대조군(-)과 동일하게 처리하였다. 이후 PBS로 세포를 2회 세척하여 blank를 제외하고 IMDM(no phenol red)에 10배로 희석된 WST-1 용액을 100㎕/well로 처리해서 50분 배양한 후 microplate reader를 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정하였다. Blank working solution의 구성은 WST-1 용액 대신에 멸균수를 IMDM(no phenol red)으로 10배 희석하여 처리되었다. 흡광도를 측정하여, 다음과 같은 세포생존률을 계산하고 표 3에 나타내었다.Dispense the CD986sk fibroblast cell line into a 96-well cell culture plate at a concentration of 1×10 5 cells/well and incubate for 24 hours in IMDM medium containing 10% FBS and 1% penicillin streptomycin at 37°C and 5% CO₂. I did. After confirming that the cells were completely attached, and washed 12 times with PBS, the fermented product samples of Example 1 were respectively 12.5 µg/ml, 25 µg/ml, 50 µg/ml, 100 µg/ml, 200 µg/ml, 100 µl of each concentration of 400µg/ml was treated and incubated for 24 hours in a 5% CO₂ incubator at 37°C. At this time, the control group (-) was treated with only IMDM (no phenol red) and incubated in a 5% CO₂ incubator at 37°C for 24 hours. Blank was treated in the same manner as the control (-) to set the background control of the WST-1 solution. After washing the cells twice with PBS, excluding the blank, the WST-1 solution diluted 10-fold in IMDM (no phenol red) was treated with 100 µl/well and incubated for 50 minutes, and the absorbance at 450 nm was measured using a microplate reader. Measured. The composition of the blank working solution was treated by diluting 10 times sterilized water with IMDM (no phenol red) instead of the WST-1 solution. By measuring the absorbance, the following cell viability was calculated and shown in Table 3.

세포생존률(%) = [(시료처리군의 흡광도/시료무처리군의 흡광도)] x 100Cell viability (%) = [(absorbance of sample treated group/absorbance of no sample treated group)] x 100

시료sample 농도(㎎/㎖)Concentration (mg/ml) 세포생존률(%)Cell viability (%)

실시예 1의 발효물


Fermented product of Example 1
12.512.5 103.25103.25
2525 100100 5050 98.5098.50 100100 9090 200200 8888 400400 5454

표 3과 같이, 본 발명의 발효물은 50㎍/㎖의 농도까지는 세포생존률 약 98%로 세포독성이 거의 없으며, 200㎍/㎖의 농도까지도 큰 세포독성이 없는 것으로 나타났다. 그러나, 400㎍/㎖ 이상의 농도에서는 세포독성이 있는 것으로 나타났다.As shown in Table 3, the fermented product of the present invention showed almost no cytotoxicity with a cell viability of about 98% up to a concentration of 50 µg/ml, and no significant cytotoxicity even at a concentration of 200 µg/ml. However, it was found to be cytotoxic at a concentration of 400 μg/ml or more.

4. 콜라게나제(MMP-1)의 발현 억제 효과4. Effect of inhibiting the expression of collagenase (MMP-1)

상기 실시예 1의 발효물을 시료로 사용하여 MMP-1(Matrix methaloprotease-1)의 발현 저해 활성을 조사하였다.The fermentation product of Example 1 was used as a sample to investigate the activity of inhibiting expression of Matrix methaloprotease-1 (MMP-1).

피부세포의 결합조직을 구성하는 성분 중 콜라겐(collagen)은 피부 건조 중량의 90%를 차지하는 주요 구성 단백질이다. 콜라겐 분해는 결합 조직의 탄력 저하와 주름 생성 등에 직접적인 영향을 미치게 된다. MMP-1은 콜라겐에 특이적으로 작용하는 단백질 분해 효소(protease)로써, MMP-1을 억제하여 콜라겐의 분해를 감소시키면, 피부 조직의 탄력을 유지하고 주름 생성을 예방할 수 있다.Among the components constituting the connective tissue of skin cells, collagen is a major constituent protein that accounts for 90% of the dry weight of the skin. Collagen degradation directly affects the elasticity of connective tissue and wrinkle formation. MMP-1 is a protease that acts specifically on collagen, and by inhibiting MMP-1 to reduce the breakdown of collagen, it can maintain the elasticity of skin tissue and prevent wrinkle formation.

MMP-1 저해 활성을 갖는 물질은 콜라겐을 보호하여 기계적 특성을 유지시켜 탄력과 피부가 늘어지는 것을 방지하기 때문에 시료에 대한 MMP-1 저해 활성을 측정하여 활성을 갖는 시료는 주름을 개선하고 탄력있는 피부를 위한 화장품 개발에 유용하게 사용될 수 있는 것으로 평가할 수 있다.Substances with MMP-1 inhibitory activity protect collagen and maintain mechanical properties to prevent elasticity and skin sagging, so the MMP-1 inhibitory activity of the sample is measured to improve wrinkles and elasticity. It can be evaluated as being useful in developing cosmetics for skin.

피부섬유아세포(CCD986sk fibroblast cell line)를 2×105 cells/dish의 농도로 분주하고 37℃, 5% CO₂ incubator에서 48시간 배양하였다. 세포를 PBS로 세척한 후 FBS가 포함되지 않은 IMDM(no phenol red)에 희석된 실시예 1의 발효물을 12.5㎍/㎖, 25㎍/㎖, 50㎍/㎖, 100㎍/㎖, 200㎍/㎖, 400㎍/㎖의 농도로 3㎖씩 첨가하여 37℃, 5% CO₂ incubator에서 24시간 배양하였다. 그 다음 Cell Lysis Buffer를 이용하여 세포를 용해한 후 Human MMP-1 ELISA kit assay (LSBio, LS-F4960)에 사용하였다.Skin fibroblast cells (CCD986sk fibroblast cell line) were dispensed at a concentration of 2×10 5 cells/dish and cultured in a 5% CO₂ incubator at 37°C for 48 hours. After washing the cells with PBS, the fermented product of Example 1 diluted in IMDM (no phenol red) containing no FBS was 12.5 µg/ml, 25 µg/ml, 50 µg/ml, 100 µg/ml, and 200 µg /Ml, 400µg/ml, 3 ml each was added and incubated for 24 hours in a 5% CO₂ incubator at 37°C. Then, cells were lysed using Cell Lysis Buffer and used in Human MMP-1 ELISA kit assay (LSBio, LS-F4960).

Kit의 96-well plate에 시료, standard, blank에 해당하는 샘플을 100㎕씩 처리하고 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. Detection reagent A를 100㎕씩 처리한 후 3회 세척하고 Detection reagent B를 100㎕씩 처리하였다. 이후 5회 세척하고, TMB substrate solution을 90㎕씩 20분 동안 처리한 후 stop solution으로 반응을 정지시키고 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군은 에피갈로카테킨 갈레이트(epigallocatechin gallate, EGCG)로 하여 비교실험을 진행하였다.100 µl of samples corresponding to the samples, standard, and blank were treated in a 96-well plate of the kit, and incubated at 37° C. for 1 hour. Detection reagent A was treated with 100µl each, washed three times, and detection reagent B was treated with 100µl each. After washing 5 times, 90 µl of TMB substrate solution was treated for 20 minutes, and the reaction was stopped with a stop solution, and absorbance was measured at 450 nm. As a control group, a comparative experiment was conducted using epigallocatechin gallate (EGCG).

MMP-1 발현 억제율(%) = [(시료처리군의 흡광도/시료무처리군의 흡광도)] x 100MMP-1 expression inhibition rate (%) = [(absorbance of sample treated group/absorbance of no sample treated group)] x 100

시료sample 농도(㎎/㎖)Concentration (mg/ml) MMP-1 발현 억제율(%)MMP-1 expression inhibition rate (%) 실시예 1의 발효물Fermented product of Example 1 12.512.5 3030 2525 4040 5050 7070 100100 7777 200200 9090 EGCG(대조군)EGCG (control) 12.512.5 1010 2525 2020 5050 2727 100100 3838 200200 4848

표 4와 같이, 본 발명의 발효물은 양성대조군으로 사용한 에피갈로카테킨 갈레이트 보다도 피부섬유아세포에서 MMP-1의 발현을 억제하는 효과가 우수하며 이러한 효과가 농도의존적인 것으로 나타났다. 이는 본 발명의 발효물이 피부섬유아세포의 MMP-1의 발현을 억제하여 피부의 주름 생성을 효과적으로 억제하거나, 피부의 탄력을 유지시킬 수 있음을 의미한다.As shown in Table 4, the fermented product of the present invention is superior to epigallocatechin gallate used as a positive control, and has a better effect of inhibiting the expression of MMP-1 in skin fibroblasts, and this effect was found to be concentration dependent. This means that the fermented product of the present invention inhibits the expression of MMP-1 in skin fibroblasts, effectively inhibiting the formation of wrinkles in the skin or maintaining the elasticity of the skin.

5. UV 조사 조건에서 콜라게나제(MMP-1)의 분비 억제 효과5. Effect of inhibiting the secretion of collagenase (MMP-1) under UV irradiation conditions

상기 실시예 1의 발효물을 시료로 사용하여 UV 조사에 의해 피부섬유아세포에서 MMP-1이 과도하게 분비하는 현상을 억제하는 활성에 대해 조사하였다.Using the fermented product of Example 1 as a sample, the activity of inhibiting excessive secretion of MMP-1 from skin fibroblasts was investigated by UV irradiation.

UV는 UV4X 조사장치(제조사 정도비앤피)를 사용하여 조사하였고, 피부섬유아세포는 상기 실시예 4와 같은 방법으로 준비하였다. UV 조사 전에 배지를 제거한 후 phosphate buffered saline(PBS)으로 세척하여 배지 내 serum 성분을 제거하고, 50mJ/㎠로 UV-B를 조사하였다. 세포외로 분비된 MMP-1의 활성을 측정하기 위해 피부섬유아세포에 상기 실시예 1의 발효물을 농도별로 처리하고 50mJ/㎠로 UV-B를 조사한 다음 발효물 처리에 따른 효능을 평가하였다. 발효물의 최종 농도가 각각 12.5㎍/㎖, 25㎍/㎖, 50㎍/㎖, 100㎍/㎖, 200㎍/㎖가 되도록 희석하여 처리한 지 24시간 경과한 후 분비된 MMP-1의 양을 평가하였다. MMP-1은 배양 상층액을 수거하여 enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) kits(Biotrak, Buckinghamshire, UK)를 이용하여 평가하였으며 각각 측정된 MMP-1의 양은 총 단백질 양으로 보정하였다.UV was irradiated using a UV4X irradiation device (manufacturer Dodo B&P), and skin fibroblasts were prepared in the same manner as in Example 4. After removing the medium before UV irradiation, the serum component in the medium was removed by washing with phosphate buffered saline (PBS), and UV-B was irradiated with 50mJ/cm2. In order to measure the activity of MMP-1 secreted extracellularly, the fermented product of Example 1 was treated by concentration on skin fibroblasts, and UV-B was irradiated at 50 mJ/cm 2, and then the efficacy of the fermentation treatment was evaluated. The amount of MMP-1 secreted after 24 hours of treatment was diluted so that the final concentration of the fermented product was 12.5 µg/ml, 25 µg/ml, 50 µg/ml, 100 µg/ml, and 200 µg/ml, respectively. Evaluated. MMP-1 was evaluated by collecting the culture supernatant and using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kits (Biotrak, Buckinghamshire, UK), and each measured amount of MMP-1 was corrected to the total protein amount.

시료sample 농도(㎎/㎖)Concentration (mg/ml) MMP-1(ng/㎖)MMP-1 (ng/ml) 실시예 1의 발효물Fermented product of Example 1 12.512.5 3737 2525 3535 5050 17.517.5 100100 1212 200200 11.811.8 자외선 B 조사UV B irradiation -- 4646

표 5와 같이, 본 발명의 발효물은 UV 조사에 의해 MMP-1이 과도하게 분비되는 것을 억제하는 효과가 우수하며, 이러한 효과가 농도의존적인 것으로 나타났다. 이는 본 발명의 발효물이 UV에 의한 피부 광노화 및 피부 주름 생성을 효과적으로 억제할 수 있음을 의미한다.As shown in Table 5, the fermented product of the present invention has an excellent effect of inhibiting excessive secretion of MMP-1 by UV irradiation, and this effect was found to be concentration dependent. This means that the fermented product of the present invention can effectively inhibit skin photoaging and skin wrinkles caused by UV.

6. UV 조사 조건에서 엘라스틴, 콜라겐 및 MMP-3의 발현에 대한 영향6. Effect on the expression of elastin, collagen and MMP-3 under UV irradiation conditions

상기 실시예 1의 발효물을 시료로 사용하여 UV 조사 조건에서 피부의 노화, 주름, 탄력과 밀접한 관련이 있는 엘라스틴, 콜라겐 및 MMP-3의 발현에 대한 영향을 웨스턴블롯을 통해 조사하였다.Using the fermented product of Example 1 as a sample, the effect on the expression of elastin, collagen and MMP-3, which are closely related to aging, wrinkles, and elasticity of the skin under UV irradiation conditions, was investigated through Western blot.

UV 조사, 피부섬유아세포의 준비, 발효물의 처리는 상기 실시예 5와 같은 방법으로 하되, 발효물의 처리 농도는 10㎍/㎖, 50㎍/㎖, 100㎍/㎖, 200㎍/㎖, 300㎍/㎖, 500㎍/㎖으로 하였다.UV irradiation, preparation of skin fibroblasts, and treatment of the fermented product were performed in the same manner as in Example 5, but the treatment concentration of the fermented product was 10 µg/ml, 50 µg/ml, 100 µg/ml, 200 µg/ml, and 300 µg /Ml, 500 µg/ml.

실시예 1의 발효물 처리 및 UV-B 조사 후 24시간 경과한 총 세포를 RiPA 완충용액(Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, USA)에 용균시켰다. 원심분리 후 세포 용균물의 총 단백질량을 Lowry method(BioRad Laboratories, Hercules, CA)를 사용하여 측정하였다. 동량의 단백질(15㎍)을 함유하는 분취량의 상등액을 10% SDS-PAGE 겔에 전기영동하고 니트로셀룰로스막(Amersham Pharmacia Biotech., England, UK)으로 옮긴 후, 0.1% Tween 20(TBS-T)을 함유하는 TBS에 용해된 5% 스킴밀크로 1시간 동안 차단시키고 일차항체(monoclonal mouse aniti-human antibody, Santa Cruz Biotech., Santa Cruz, CA, USA)와 혼성화시켰다. 모든 일차 모노클로날 항체를 1:1000 비율로 TBS-T로 희석시켰다. 결합된 항체를 실온에서 1시간 동안 이차항체인 donkey anti-goat horseradish peroxidase(Jackson ImmunoResearch Lab., West Grove, PA, USA)를 1000배 희석하여 반응시켰다. Nitrocellulose membrane에 전이된 단백질은 Supersignal West pico chemiluminescence(Pierce Biotech., Rockford, IL, USA)로 검출하여 X-ray필름(Konica Co., Tokyo, Japan)으로 촬영하였다.Total cells 24 hours after the fermentation treatment and UV-B irradiation of Example 1 were lysed in a RiPA buffer (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, USA). After centrifugation, the total protein amount of the cell lysate was measured using the Lowry method (BioRad Laboratories, Hercules, CA). An aliquot of the supernatant containing the same amount of protein (15 μg) was electrophoresed on a 10% SDS-PAGE gel and transferred to a nitrocellulose membrane (Amersham Pharmacia Biotech., England, UK), followed by 0.1% Tween 20 (TBS-T). ) Containing 5% skim milk dissolved in TBS for 1 hour and hybridized with a primary antibody (monoclonal mouse aniti-human antibody, Santa Cruz Biotech., Santa Cruz, CA, USA). All primary monoclonal antibodies were diluted with TBS-T in a 1:1000 ratio. The bound antibody was reacted with a secondary antibody, donkey anti-goat horseradish peroxidase (Jackson ImmunoResearch Lab., West Grove, PA, USA) diluted 1000 times for 1 hour at room temperature. The protein transferred to the nitrocellulose membrane was detected with Supersignal West pico chemiluminescence (Pierce Biotech., Rockford, IL, USA) and photographed with an X-ray film (Konica Co., Tokyo, Japan).

이의 결과, 도 2와 같이 본 발명의 발효물을 처리함으로써 엘라스틴 및 콜라겐 수치가 발효물 처리 농도 300㎍/㎖까지 농도의존적으로 증가하였다. MMP-3 콜라게나아제 단백질 수치는 본 발명의 발효물을 처리함으로써 농도의존적으로 감소하였다. 이는 본 발명의 발효물이 엘라스틴 및 콜라겐의 발현을 증가시키고 MMP-3의 발현을 저하시킴으로써, UV에 의한 피부 광노화 및 피부 주름 생성을 효과적으로 억제할 수 있음을 의미한다.As a result, by treating the fermented product of the present invention as shown in FIG. 2, the levels of elastin and collagen were increased in a concentration-dependent manner up to the fermented product treatment concentration of 300 μg/ml. MMP-3 collagenase protein levels were decreased in a concentration-dependent manner by treating the fermented product of the present invention. This means that the fermented product of the present invention increases the expression of elastin and collagen and decreases the expression of MMP-3, thereby effectively inhibiting skin photoaging and skin wrinkles caused by UV.

Claims (3)

스테비아의 열수추출물 및 화산석 송이의 열수추출물의 혼합물에 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) 및 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis)를 접종하고 발효하여 수득한 발효물을 유효성분으로 함유하는 피부 주름 또는 피부 광노화의 예방 또는 개선용 화장료 조성물.Skin wrinkles or skin photoaging containing fermented products obtained by inoculating and fermenting Lactobacillus plantarum and Lactobacillus brevis in a mixture of the hot water extract of stevia and the hot water extract of volcanic rock Cosmetic composition for the prevention or improvement of. 제 1항에 있어서,
상기 스테비아의 열수추출물은 스테비아 분쇄물에 10 내지 30배 중량의 물을 첨가하고 50 내지 100℃에서 추출하여 수득한 것이며,
상기 화산석 송이의 열수추출물은 화산석 송이의 분쇄물에 10 내지 30배 중량의 물을 첨가하고 110 내지 130℃에서 가압 추출하여 수득한 것이고,
상기 혼합물은 상기 스테비아의 열수추출물과 상기 화산석 송이의 열수추출물을 1 : 2 내지 2 : 1 중량비로 혼합한 것임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
The method of claim 1,
The hot water extract of stevia is obtained by adding 10 to 30 times the weight of water to the pulverized stevia and extracting at 50 to 100°C,
The hot water extract of the volcanic rock is obtained by adding 10 to 30 times the weight of water to the pulverized product of the volcanic rock and extracting under pressure at 110 to 130°C,
The mixture is a cosmetic composition, characterized in that the mixture of the hot water extract of the stevia and the hot water extract of the volcanic stone cluster in a weight ratio of 1:2 to 2:1.
제 1항에 있어서,
상기 발효는 35 내지 39℃에서 50 내지 200rpm으로 12 내지 36시간 진탕하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
The method of claim 1,
The fermentation is a cosmetic composition, characterized in that made by shaking for 12 to 36 hours at 50 to 200 rpm at 35 to 39 ℃.
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