KR20200092518A - 식물추출물을 함유하는 세포보습, 세포간 보습, 피부 장벽보습에 효과적인 화장료 조성물 - Google Patents

식물추출물을 함유하는 세포보습, 세포간 보습, 피부 장벽보습에 효과적인 화장료 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 병아리콩(Cicer arietinum) 열매에 단백질 가수분해효소를 첨가하여 수득되는 가수분해물 추출물, 노랑만병초(Rhododendron Chrysanthum) 잎 추출물 및 송이버섯(Tricholoma Matsutake) 추출물을 함유하는 보습용 화장료 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 화장료 조성물은 세포 보습, 세포 간 보습 및 피부 장벽 보습에 뛰어난 효과를 발휘한다. 또한, 본 발명의 화장료 조성물은 천연물 소재를 이용하여 인체에 무해하며, 안정성이 우수하다.

Description

식물추출물을 함유하는 세포보습, 세포간 보습, 피부 장벽보습에 효과적인 화장료 조성물 {Cosmetic composition for improvement of cell moisturizing, intercellular moisturizing, and barrier moisturizing with plant extract}
본 발명은 식물추출물을 함유하는 세포보습, 세포간 보습, 피부 장벽보습에 효과적인 화장료 조성물에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 병아리콩(Cicer arietinum) 열매에 단백질 가수분해효소를 첨가하여 수득되는 가수분해물 추출물, 노랑만병초(Rhododendron Chrysanthum) 잎 추출물 및 송이버섯(Tricholoma Matsutake) 추출물을 함유하는 보습용 화장료 조성물에 관한 것이다.
피부는 외부환경으로부터 생체를 보호하는 보호막의 기능을 하는 기관으로서, 인체 내의 물, 전해질 등의 생체 성분의 손실을 방지하며, 동시에 외부로부터 유해물질의 침입을 막는 역할을 한다. 피부의 구조는 외부에서부터 순서대로 표피, 진피, 피하지방 조직의 3개 층으로 구분된다.
피부의 수분량은 진피층에서는 70% 정도이나 표피층으로 갈수록 감소하여 표피층에서는 약 10% 내지 30%가 된다. 표피층의 수분함량이 10% 이하가 되면 피부는 거칠어지고 신체의 보호기능을 잃게 되어 노화현상이 일어난다. 표피는 외부로부터 각질층, 과립층, 유극층, 기저층의 4개 층으로 구분되는데 각질층의 세포들은 벽돌과 같은 역할을 하고 각질세포 사이 세포 간의 지질들은 몰타르와 같은 역할로 피부 장벽을 이루고 있다.
또한, 건강한 사람의 각질세포에는 고농도의 자연보습인자 (Natural Moisturizing Factor, NMF)가 존재하며, 이는 피부의 수분함유를 돕는 기능을 한다. 하지만, 피부의 이러한 기능에도 불구하고, 실내난방, 오염된 대기 및 자외선 등의 외부 환경에 의한 외인성 노화, 내인성 노화 및 마찰, 면도 및 세안 등의 물리화학적 자극에 따른 피부 구성성분의 탈락으로 인하여 수분 불균형이 생겨 피부 건조가 유발된다. 이를 방지하기 위해 피부 보습제의 필요성이 중요시되고 있으며, 피부 보습 효능을 세포수준에서 확인하기 위한 다양한 연구가 진행되고 있다.
피부에서 각질세포층의 수분함량을 적절하게 유지하는 것은 매우 중요하다. 이를 위하여 화장품에는 피지와 유사한 성분이나 NMF 성분, 또는 폴리올과 같은 보습제 등이 첨가되어 사용된다. 예를 들어, 수용성 폴리올로서 수산기(OH group)가 3개 이상인 글리세린, 솔리톨 등은 뛰어난 보습력을 나타내나 끈적임이 심하여 사용할 때 불쾌감을 느끼게 하며, 수산기가 2개인 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜 등은 피부의 부작용이 발생하기도 한다. 또한, 다른 천연보습인자인 피롤리돈 카르복실산 나트륨(PCA-Na), 젖산나트륨(Sodium lactate), 요소 등은 전해성이 강해 화장료의 유화안정성을 해치는 문제점이 있으며, 아미노산, 콜라겐, 엘라스틴 등도 보습능력이 있다고 하나 그 보습능력에 한계가 있어 피부 보습력을 높이기 위한 천연물화장품 조성물에 대한 개발이 필요한 실정이다.
대한민국 특허공개번호 제10-2000-7000755호(공개일자 2001.03.15)에는, 병아리콩을 포함하는 피부 보호용 조성물이 기재되어 있다. 대한민국 특허공개번호 제10-2008-0057247호(공개일자 2009.12.29)에는, 창이자, 만병초 및 우엉의 혼합추출물을 함유하는 항염 및 자극완화 효과를 갖는 화장료 조성물이 기재되어 있다. 대한민국 특허공개번호 제10-2009-0102325호(공개일자 2009.10.27.)에는, 녹차 다당체 및 송이버섯추출물을 함유하는 항염 및 항산화용 화장료 조성물이 기재되어 있다. 대한민국 특허공개번호 제10-2012-0137326호(공개일자 2012.11.29)에는, 송이버섯추출물을 유효성분으로 함유하는 주름개선용 의약 또는 화장료 조성물이 기재되어 있다.
본 발명은 기존 보습용 화장료 조성물에 이용되는 화학물질의 문제점을 해결할 목적으로 인체에 무해하며, 안정성이 우수하고, 보습에 효과적인 천연물 소재의 화장료 조성물을 개발하여 제공하고자 한다.
본 발명은 병아리콩(Cicer arietinum) 열매에 단백질 가수분해효소를 첨가하여 수득되는 가수분해물 추출물, 노랑만병초(Rhododendron Chrysanthum) 잎 추출물 및 송이버섯(Tricholoma Matsutake) 추출물을 함유하는 피부 보습용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명의 화장료 조성물에 있어, 상기 보습은, 바람직하게 세포 보습, 세포 간 보습, 피부 장벽 보습 중 선택되는 어느 하나를 포함하는 것이 좋다.
본 발명의 화장료 조성물에 있어, 상기 추출물은, 바람직하게 용매 추출법, 초임계 추출법 및 초음파 추출법 중 선택되는 어느 하나의 추출법을 통해 추출하는 것이 좋다.
이때, 상기 용매 추출법은, 바람직하게 물, 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜, 글리세린, 아세톤, 에틸 아세테이트, 클로로포름, 부틸 아세테이트, 디에틸에테르, 디클로로메탄, 헥산 또는 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 추출용매를 이용하는 것이 좋다.
본 발명의 화장료 조성물은 세포 보습, 세포 간 보습 및 피부 장벽 보습에 뛰어난 효과를 발휘한다. 또한, 본 발명의 화장료 조성물은 천연물 소재를 이용하여 인체에 무해하며, 안정성이 우수하다.
도 1은 실시예 1, 비교예 1 내지 6의 추출물 또는 혼합물이 세포에 미치는 독성을 측정한 결과이다.
도 2는 실시예1, 비교예 1 내지 6의 추출물 또는 혼합물의 아쿠아포린(Aquaporin)-3 발현 조절을 통한 세포 보습 효과를 확인한 결과이다.
도 3은 실시예1, 비교예 1 내지 6의 추출물 또는 혼합물의 Claudin-1 발현 조절을 통한 피부장벽 보습 효과를 확인한 결과이다.
도 4는 실시예1, 비교예 1 내지 6의 추출물 또는 혼합물의 수분감소율을 나타낸 결과이다.
도 5는 제형예 1과 비교제형예 1의 경피 수분 손실량을 측정한 결과이다.
본 발명은 병아리콩(Cicer arietinum) 열매에 단백질 가수분해효소를 첨가하여 수득되는 가수분해물 추출물, 노랑만병초(Rhododendron Chrysanthum) 잎 추출물 및 송이버섯(Tricholoma Matsutake) 추출물을 함유하는 피부 보습용 화장료 조성물을 제공한다.
병아리콩(Cicer arietinum)은 콩과의 한해살이 풀로 중간에 병아리 부리처럼 튀어나온 부분이 있어서 병아리콩, 칙피(Check pea) 등의 이름으로 불린다. 기원전 7,500년부터 재배되었으며, 인류 역사상 가장 먼저 재배된 콩류 중 하나이다. 주로 건조한 기후에서도 잘 자라 중앙아메리카, 인도, 아프리카 등지에서 재배된다. 특히 병아리콩은 비타민과 미네랄이 풍부하며, 칼슘 함량이 높아 빈혈과 면역력 증진에 효과적이고 콜레스테롤 저하에도 도움을 준다.
노랑만병초(Rhododendron Chrysanthum)는 진달래과의 쌍떡잎식물로 민간요법에서 고혈압, 저혈압, 당뇨병, 신경통, 양기부족 등 만병을 다스리는 놀라운 효험을 가진다고 해서 만병초라는 이름으로 불린다. 노랑만병초는 주로 설안산, 백두산과 같은 고산지대에서 군락을 이루어 자라며, 중국, 일본, 러시아에도 분포하고 있다.
송이버섯(Tricholoma Matsutake)은 주름버섯목 송이과에 속하는 버섯으로 소나무에서 자생하는 생육 조건을 지니고 있다. 중국 북부, 한반도, 일본 등에서 볼 수 있으며, 송이버섯은 칼륨, 마그네슘 등 무기질과 그 외에도 베타글루칸 및 비타민 등 다양한 영양분이 풍부하여 항암치료에 도움을 준다고 알려졌다. 또한, 자연산 송이버섯에 비해 칼륨이 약 2배, 칼슘이 약 3배 정도 더 많이 들어 있어 뼈와 관절 건강에 도움을 준다.
본 발명의 화장료 조성물에 있어, 상기 보습은, 바람직하게 세포 보습, 세포 간 보습, 피부 장벽 보습 중 선택되는 어느 하나를 포함하는 것이 좋다. 본 발명에 따른 병아리콩 가수분해 추출물, 노랑만병초 잎 추출물 및 송이버섯추출물을 포함하는 피부 보습용 화장료 조성물은 Aquaporin-3 및 Claudin-1 발현 확인을 통해 피부 세포 및 층막 보습에 우수한 효과를 보임을 하기 실험을 통해 확인하였다. 또한, 수분보유능에도 탁월한 효능을 보였다. 따라서 병아리콩(Cicer arietinum) 열매에 단백질 가수분해효소를 첨가하여 수득되는 가수분해물 추출물, 노랑만병초(Rhododendron Chrysanthum) 잎 추출물 및 송이버섯(Tricholoma Matsutake) 추출물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물을 활용하여 우수한 피부 보습 효과를 갖는 다양한 제형으로 제공될 수 있다.
한편, 아쿠아포린 (Aquaporin, AQP)은 세포막에서 물의 수송을 담당하는 막단백질의 일종으로 이온과 용질의 이동을 방해하면서 선택적으로 세포 안팎으로 물 분자의 출입을 조절하는 수분통로로 알려졌다. 포유류에는 13개의 AQP (AQP-0 내지 AQP-12)이 존재하는데, AQP-1, 2, 4, 5 및 8은 주로 물을 선택적으로 운반하며, AQP-3, 7, 9 및 10은 물뿐만 아니라 글리세롤과 다른 작은 용질들을 운반하는 기능을 한다고 알려졌다. 특히, AQP-3는 표피의 기저층 각질형성세포에서 발현되는 것으로 보고되어 있으며, 각질형성세포에서 AQP-3의 활성화는 피부 깊숙이 수분을 전달하여 우수한 피부보습효과를 얻을 수 있으리라 기대할 수 있다.
한편, 피부 내 보습 능력은 피부 장벽의 기능과 긴밀한 관계를 가지고 있으며, 피부 장벽기능은 노화 및 외부 자극에 의해 파괴될 수 있다. 피부 장벽 손상은 직접적인 피부 수분량 감소와 주름 생성을 유발하고, 이를 해결하기 위한 많은 연구가 진행되고 있다. 그 중 층을 구성하는 주된 세포인 각질형성세포 간의 밀착연접(tight junction, TJ)이 중요한 요인으로 작용하고 있다.
밀착연접은 세포 간 부착을 연계하여 인체 내부의 수분 손실 및 외부 유해 물질의 침입을 막는 역할을 수행한다. 밀착연접 단백질로는 Occludin, Claudin, ZO-1 등이 알려졌으며, 대부분의 밀착연접 단백질은 표피의 과립세포층의 사이에 존재한다. 그 중 막투과단백질인 Claudin-1은 고리 형태의 구조로 이루어져 세포 사이의 공간을 단단히 채워 세포 간 간격을 조절함으로써 수분의 이동 경로를 효율적으로 차단한다. 최근, 연구결과를 통해 Claudin-1이 피부 장벽 기능에 있어 중요한 역할을 담당하고 있으며, 이는 피부 층막 보습에 영향을 미치는 것으로 보고되었다.
본 발명의 화장료 조성물에 있어, 상기 추출물은, 바람직하게 용매 추출법, 초임계 추출법 및 초음파 추출법 중 선택되는 어느 하나의 추출법을 통해 추출하는 것이 좋다. 이때, 상기 용매 추출법은, 바람직하게 물, 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜, 글리세린, 아세톤, 에틸 아세테이트, 클로로포름, 부틸 아세테이트, 디에틸에테르, 디클로로메탄, 헥산 또는 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 추출용매를 이용하는 것이 좋다. 특히, 본 발명에서는 병아리콩(Cicer arietinum) 열매에 단백질 가수분해효소를 첨가하여 수득되는 가수분해물의 에탄올 추출물, 노랑만병초(Rhododendron Chrysanthum) 잎 에탄올 추출물 및 송이버섯(Tricholoma Matsutake) 에탄올 추출물에서 그 보습효능이 매우 우수하였으며 (미도시), 상기 추출물을 각각 동일한 비율로 혼합하였을 시, 매우 우수한 보습효과를 나타냄을 하기 실험을 통해 확인할 수 있었다.
한편, 본 발명에 있어, 상기 혼합 추출물은, 바람직하게 화장료 조성물 전체 중량에 대하여 0.0001~30.0중량%가 함유되는 것이 좋다. 더욱 바람직하게는 화장료 조성물 전체 중량에 대해서 0.01~10중량% 함유되는 것이 좋다. 혼합 추출물의 함량이 0.0001중량% 미만인 경우에는 피부 보습효과가 미미하고, 30.0중량% 초과할 경우 함유량 증가에 따른 뚜렷한 효과가 증가하지 않는다.
한편, 본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효성분으로서 본 발명의 혼합 추출물 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다.
본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 팩, 마사지크림 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소 결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 계면활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물이 비누, 계면활성제 함유 클렌징 제형 또는 계면활성제 비함유 클렌징 제형일 경우, 피부에 도포한 후 닦아내거나 떼거나 물로 씻어낼 수도 있다. 구체적인 예로서, 상기 비누는 액상비누, 가루비누, 고형비누 및 오일비누이며, 상기 계면활성제 함유 클렌징 제형은 클렌징 폼, 클렌징 워터, 클렌징 수건 및 클렌징 팩이며, 상기 계면활성제 비 함유 클렌징 제형은 클렌징크림, 클렌징 로션, 클렌징 워터 및 클렌징 겔이며, 이에 한정되는 것은 아니다.
이하, 본 발명의 구성을 하기 실시예 및 실험예를 통해 구체적으로 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예 및 실험예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.
[ 제조예 1: 병아리콩 ( Cicer arietinum ) 열매 가수분해물의 에탄올 추출물의 제조]
병아리콩(Cicer arietinum) 열매 100g을 분쇄하여, 이 분쇄물에 정제수 600㎖와 단백질분해효소(protease) 0.1g을 첨가하여 50℃에서 3시간 동안 반응시켰다. 이후, 70% 에탄올 500㎖를 첨가한 다음 25℃ 온도에서 48시간씩 2회 침지한 후, 여과지 No.2(Whatman)로 여과하였다. 그 후, 감압 농축하여 '병아리콩 열매 가수분해물의 에탄올 추출물'을 제조하였다.
[ 제조예 2: 노랑만병초( Rhododendron chrysanthum ) 잎 에탄올 추출물의 제조]
음건한 만병초(Rhododendron chrysanthum)의 잎 100g을 분쇄하여, 이 분쇄물에 70% 에탄올 500㎖를 첨가한 다음 60℃ 온도에서 24시간 동안 추출하였다. 이후, 상기 추출물을 400메쉬(mesh) 여과포로 여과한 후, 여과지 No.2(Whatman)로 재여과하였다. 그 후, 감압 농축하여 '노랑만병초 잎 에탄올 추출물'을 제조하였다.
[제조예 3: 송이버섯( Tricholoma matsutake ) 에탄올 추출물의 제조]
송이버섯(Tricholoma matsutake) 100g을 분쇄하여, 이 분쇄물에 70% 에탄올 500㎖를 첨가한 다음 60℃ 온도에서 24시간 동안 추출하였다. 이후, 상기 추출물을 400메쉬(mesh) 여과포로 여과한 후, 여과지 No.2(Whatman)로 재여과하였다. 그 후, 감압 농축하여 '송이버섯 에탄올 추출물'을 제조하였다.
[ 실시예 1, 비교예 1 내지 6: 병아리콩 ( Cicer arietinum ) 열매 가수분해물 의 에탄올 추출물, 노랑만병초 잎 에탄올 추출물 및 송이버섯 에탄올 추출물의 혼합물의 제조]
상기 제조예 1 내지 3에서 제조한, 병아리콩(Cicer arietinum) 열매 가수분해물의 에탄올 추출물, 노랑만병초 잎 에탄올 추출물 및 송이버섯 에탄올 추출물의 혼합물을 하기 표 1의 조성 비율로 혼합하여, DMSO에 100㎎/㎖의 농도로 녹여 하기 실험에 사용하였다.
성분 실시예 1 비교예 1 비교예 2 비교예 3 비교예 4 비교예 5 비교예 6
병아리콩 열매 가수분해물의 에탄올 추출물 1 3 - - 1.5 1.5 -
노랑만병초 잎 에탄올 추출물 1 - 3 - 1.5 - 1.5
송이버섯 에탄올 추출물 1 - - 3 - 1.5 1.5
[ 실험예 1: 세포 생존율 측정]
본 실험에서는 상기 실시예 1 및 비교예 1 내지 6의 추출물 또는 혼합물이 세포에 미치는 독성을 측정하고자 하였다. MTT(3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2-5- diphenyl tetrazolium bromide) 시약을 이용하여 세포 생존율을 측정하였다.
인간각질형성세포(HaCaT, keratinocyte)를 96웰 플레이트에 2×104 cells/well의 농도로 분주하여, 37℃, 5% CO2 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 배지를 제거하고, 상기 실시예 1 및 비교예 1 내지 6에서 수득한 추출물 또는 혼합물을 1-100 ㎍/㎖의 농도로 계열 희석하여 24시간 동안 배양하였다. 그 후, 5㎎/㎖로 녹인 MTT 시약을 20㎕ 넣고, 37℃, 5% CO2 조건에서 2시간 동안 반응시켰다. 배지를 완전히 제거한 뒤, 생성된 포르마잔(formazan)을 DMSO 100㎕를 넣어 완전히 녹아준 뒤, 540nm에서 흡광도를 측정하였다.
실험 결과, 실시예 1의 혼합물과 비교예 1 내지 6의 추출물 또는 혼합물은 100㎍/㎖의 농도까지 세포독성을 보이지 않았다 (도 1). 도 1은 실시예 1, 비교예 1 내지 6의 추출물 또는 혼합물이 세포에 미치는 독성을 측정한 결과이다.
[ 실험예 2: 아쿠아포린 ( Aquaporin )-3 발현 확인을 통한 세포 보습 효과 확인]
세포수준에서의 보습효과를 평가하기 위하여 세포 내 수분 흡수에 관여하는 채널인 AQP-3에 대한 실시예 1 및 비교예 1 내지 6의 추출물 또는 혼합물의 영향을 확인하였다. 양성 대조군으로는 덱사메타존(Dexamethasone)을 사용하였다.
HaCaT 세포를 6웰 플레이트에 분주하고 80% 정도 세포가 찼을 때 배지에 실시예 1 및 비교예 1 내지 6의 추출물 또는 혼합물을 100㎍/㎖의 농도로 처리하였다. 이후, 24시간 동안 배양시킨 뒤, 세포를 수집한 후 1×세포 용해 버퍼(cell lysis buffer)를 이용하여 단백질을 분리하였다. 그 후, BCA 어세이(assay)로 단백질을 정량하여 일정량의 단백질을 10% SDS-PAGE 겔에서 전기영동 시켰다. 이후, PVDF 멤브레인에 전이(transfer)시켜 5% 스킴밀크(skim milk)를 이용하여 1시간 동안 블록킹(blocking)하였다. 1차 항체(AQP-3, Santa cruz, USA)를 4℃에서 오버나잇(over night) 반응시킨 후, HRP가 결합된 2차 항체를 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 그 후, TBS/T로 세척하고 ECL 반응 키트를 이용하여 Chemi Doc기기로 밴드를 확인하였다. 각 밴드의 정량화는 베타-액틴(β-actin)의 발현을 기준으로 정량하여 AQP-3 발현량을 계산하였다.
실험 결과, 양성대조군인 덱사메타존은 약 32%의 AQP-3 발현이 증가하였고, 실시예 1의 혼합물은 100㎍/㎖ 농도에서 약 44.7%의 AQP-3 발현이 증가하였다. 비교예 1의 추출물은 20.5%, 비교예 4의 혼합물은 18.7%, 비교예 5의 혼합물은 21%의 AQP-3 발현을 증가시켰다. 그 외의 비교예 2, 3의 추출물 및 비교예 6의 혼합물에서는 AQP-3 발현에 유의한 증가가 나타나지 않았다. 상기 결과에 따라, 실시예 1의 혼합물이 세포 보습에 가장 효과적임을 확인할 수 있었다 (도 2). 도 2는 실시예1, 비교예 1 내지 6의 추출물 또는 혼합물의 아쿠아포린(Aquaporin)-3 발현 조절을 통한 세포 보습 효과를 확인한 결과이다.
[ 실험예 3: Claudin -1 발현 확인을 통한 피부장벽 보습 효과 확인]
피부 내부의 수분 손실에 관여하는 Claudin-1에 대한 상기 실시예 1 및 비교예 1 내지 6의 추출물 또는 혼합물의 층막 보습 효과를 다음과 같은 방법으로 측정하였다.
HaCaT 세포를 6웰 플레이트에 분주하고 80% 정도 세포가 찼을 때 배지에 실시예 1 및 비교예 1 내지 6의 추출물 또는 혼합물을 100㎍/㎖의 농도로 처리하였다. 이후, 24시간 동안 배양시킨 뒤, 세포를 수집한 후 1×세포 용해 버퍼(cell lysis buffer)를 이용하여 단백질을 분리하였다. 그 후, BCA 어세이(assay)로 단백질을 정량하여 일정량의 단백질을 10% SDS-PAGE 겔에서 전기영동 시켰다. 이후, PVDF 멤브레인에 전이(transfer)시켜 5% 스킴밀크(skim milk)를 이용하여 1시간 동안 블록킹(blocking)하였다. 1차 항체(Claudin-1, cell signaling, USA)를 4℃에서 오버나잇(over night) 반응시킨 후, HRP가 결합된 2차 항체를 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 그 후, TBS/T로 세척하고 ECL 반응 키트를 이용하여 Chemi Doc기기로 밴드를 확인하였다. 각 밴드의 정량화는 베타-액틴(β-actin)의 발현을 기준으로 정량하여 Claudin-1 발현량을 계산하였다.
실험 결과, 실시예 1의 혼합물은 100㎍/㎖ 농도에서 약 39.6% Claudin-1 발현이 증가하였다. 한편, 비교예 1 및 비교예 3의 추출물 비교예 4 내지 6의 혼합물의 경우, Claudin-1 발현이 약간 증가하는 것으로 확인하였으며, 비교예 2의 추출물의 경우 Claudin-1 발현에 유의한 증가가 나타나지 않았다. 따라서, 피부 층막 보습에 실시예 1의 혼합물이 가장 효과적임을 확인할 수 있었다 (도 3). 도 3은 실시예1, 비교예 1 내지 6의 추출물 또는 혼합물의 Claudin-1 발현 조절을 통한 피부장벽 보습 효과를 확인한 결과이다.
[ 실험예 4: 수분 보유(Water Holding)능 확인]
본 실험에서는 상기 실시예 1 및 비교예 1 내지 6의 추출물 또는 혼합물에 히아루론산(Hyaluronic acid: HA)을 첨가한 용액을 비교 샘플로 하여 수분 보유 능력(Water holding capacity)을 측정하고자 하였다.
일정한 온도에서 실험이 진행되었으며, 상기의 실시예 1 및 비교예 1 내지 6의 추출물 또는 혼합물을 페트리디쉬에 각 20㎖씩 넣어 준 뒤, 0, 2, 4, 6, 12 및 24시간 후 정밀 저울로 무게를 측정하여 하기 표 2에 기록하였다. 실험 결과, 실시예 1의 혼합물이 비교예 1 내지 6의 추출물 또는 혼합물과 비교하였을 때, 실시예 1의 혼합물이 물과의 결합력이 우수하여 증발된 수분의 양이 가장 적은 것을 확인할 수 있었다 (도 4). 도 4는 실시예1, 비교예 1 내지 6의 추출물 또는 혼합물의 수분감소율을 나타낸 결과이다.
Time
(시간) 		Vehicle
(HA) 		실시예 1 비교예 1 비교예 2 비교예 3 비교예 4 비교예 5 비교예 6
0 22228.5 21770.1 23109.8 23551.5 23576.0 23109.8 24737.3 22793.4
2 21217.1 21336.2 22509.6 22612.5 22785.5 22623.8 24061.5 21907.9
4 19886.1 20648.1 21287.6 21301.4 21280.6 21621.1 22831.5 20843.7
6 18296.9 19474.2 19446.4 19419.2 19685.7 20018.4 21045.3 19203.4
12 16474.7 18640.2 17890.7 17768.7 17969.9 18660.2 19446.7 17651.7
24 13719.2 17041.4 15579.9 14941.5 15385.7 16306.7 17098.9 15145.8
[ 제형예 1: 화장료 조성물의 제조]
상기 실시예 1의 혼합물인, 병아리콩(Cicer arietinum) 열매 가수분해물의 에탄올 추출물, 노랑만병초 잎 에탄올 추출물 및 송이버섯 에탄올 추출물이 각각 0.1 중량% 포함된 화장료 조성물을 하기 표 3의 조성으로 제조하여 이를 제형예 1라 하였으며, 대조군으로 비교제형예 1을 제조하였다.
성분 제형예 1
( 중량% ) 		비교제형예 1
( 중량% )
병아리콩 열매 가수분해물의 에탄올 추출물 0.1 -
노랑만병초 잎 에탄올 추출물 0.1 -
송이버섯 에탄올 추출물 0.1 -
1,3-BG 10.0 10.0
글리세린 5.1 5.1
프로필렌글리콜 4.2 4.2
토코페릴아세테이트 3.0 3.0
유동파라핀 4.6 4.6
트리에탄올아민 1.0 1.0
스쿠알란 3.1 3.1
마카다미아너트오일 2.5 2.5
폴리솔베이트 1.6 1.6
솔비탄세스퀴롤레이트 1.6 1.6
프로필파라벤 0.6 0.6
카르복실비닐폴리머 1.5 1.5
향 미량 미량
방부제 미량 미량
정제수 잔량 잔량
계 100.0 100.0
[ 실험예 5: 경피 수분 손실량 측정]
본 실험에서는 상기 제형예 1의 경피 수분 손실량(TEWL, trans epidermal water loss)을 확인하고자 하였다. 경피 수분 손실량은 피부의 장벽기능이 상실되었을 때, 피부 내부의 수분이 증발되는 것을 의미한다. 수분 증발량의 평가는 시간당 단위면적에서 증발하는 g/m2으로 표시된다.
테이프를 이용하여 팔 하박부 안쪽의 피부를 스트래핑 방법으로 피부의 각질을 인위적으로 제거한 후, 상기 제형예 1 및 비교제형예 1을 도포하였다. 도포 후 1, 2, 4 및 6시간 후에 경피 수분 손실량 측정기(Tewameter TM 210, Courage and Khazaka, Germany)를 이용하여 피부의 수분 증발량을 측정하였으며, 그 결과를 표 4에 나타내었다.
(단위: g/m 2 /h) 0 h 1 h 2 h 4 h 6 h
제형예 1 17.25 8.9 8.2 7.5 6.4
비교제형예 1 17.20 15.2 14.8 12.4 11.5
실험 결과, 제형예 1은 비교제형예 1에 비하여 경표피 수분 손실이 매우 낮음을 확인할 수 있었다 (도 5). 도 5는 제형예 1과 비교제형예 1의 경피 수분 손실량을 측정한 결과이다.

Claims (4)

  1. 병아리콩(Cicer arietinum) 열매에 단백질 가수분해효소를 첨가하여 수득되는 가수분해물 추출물, 노랑만병초(Rhododendron Chrysanthum) 잎 추출물 및 송이버섯(Tricholoma Matsutake) 추출물을 함유하는 피부 보습용 화장료 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 보습은,
    세포 보습, 세포 간 보습, 피부 장벽 보습 중 선택되는 어느 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 피부 보습용 화장료 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 추출은,
    용매 추출법, 초임계 추출법 및 초음파 추출법 중 선택되는 어느 하나의 추출법을 통해 추출하는 것을 특징으로 하는 피부 보습용 화장료 조성물.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 용매 추출법은,
    물, 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜, 글리세린, 아세톤, 에틸 아세테이트, 클로로포름, 부틸 아세테이트, 디에틸에테르, 디클로로메탄, 헥산 또는 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 추출용매를 이용하는 것을 특징으로 하는 피부 보습용 화장료 조성물.
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