이하, 실시예, 비교예, 제조예 및 비교제조예를 들어 본 발명의 구성 및 효과를 상세히 설명하나, 본 발명이 이들로 한정되는 것은 아니다.
<
실시예
1> 천연 식물 추출물 제조
창이자(현서약초시장) 30g, 만병초(현서약초시장) 30g 및 우엉(현서약초시장) 30g을 1,000g의 에탄올(대정화금 , 에탄올 함량 95% 이상)을 첨가하여 냉각 콘덴서가 달린 추출기에서 100℃로 8시간 끓여서 추출한 후 300메쉬 여과지로 여과하였다. 이후, 여과물을 1주일간 실온에서 방치하고, 침전물을 와트만 0.45㎛ 필터로 여과하였다. 그리고 감압 농축기를 이용하여 50℃에서 완전히 농축하여 약 30 g의 천연 식물 추출물을 제조하였다. 이 중 1 g을 각각 취하여 활성검색 시료로 하였다.
<실시예 2> 에틸 아세테이트 분획물 추출물의 제조
실시예 1에서 제조된 천연식물추출물 10g을 분별깔때기에 넣고, 증류수를 100g가한 후 동량의 헥산으로 2회 분획하였다. 이후, 수층에 에틸 아세테이트 100g을 가하여 세게 흔든 후에, 방치하여 에틸아세테이트 층을 감압 농축기로 60℃에서 농축하여 분획물을 약 5g을 제조하였다.
<실시예 3> 부탄올 분획물 추출물의 제조
실시예 1에서 제조된 천연식물추출물 10g을 분별깔때기에 넣고, 증류수를 100g가한 후 동량의 헥산으로 2회 분획하였다. 이후, 수층에 부탄올 100g을 가하여 세게 흔든 후에, 방치하여 부탄올 층을 감압 농축기로 60℃에서 농축하여 분획물을 약 5g을 제조하였다.
<
비교예
1> 창이자 추출물의 제조
창이자 30g을 취하여 에탄올 300g에 첨가하고 실시예1과 동일한 방법으로 추출하여 건조중량10g을 얻었다.
<비교예 2> 만병초 추출물의 제조
만병초 100g를 에탄올 1,000g에 첨가하여 비교예 1과 동일한 방법으로 하여 건조 중량 37.62g을 얻었다.
<
비교예
3> 우엉 추출물의 제조
우엉 100g을 에탄올 1,000g에 첨가하여비교예 1과 동일한 방법으로 하여 건조 중량 37g을 얻었다.
<
실험예
1> 염증 효과 확인
상기 실시예 1, 비교예 1, 비교예 2 및 비교예 3에서 제조된 추출물을 대상으로 쥐 대식세포(Mouse macrophage)인 RAW 264.7 세포(한국세포주은행)에 염증 유발 물질인 LPS(Lipopolysaccharide, sigma)를 인위적으로 처리한 후 일산화질소 생성량을 측정하여 염증 억제 효과가 있는지를 평가하였다.
96 well plate에 well당 2 x 1,000,000 세포가 되도록 분주한 다음, 24시간 동안 37℃, 5% CO2배양기(incubator)에서 배양하였다. 이후, 배지를 새로 교환해주고, LPS(1ug/ml)와 추출물(5, 10, 20, 50ppm 농도)을 투입한 후 24시간동안 배양하였다.
배양 후, 배지 상층액을 취해 13,000 rpm에서 3분 동안 원심 분리하여 상등액 만 모은 후, Griess reagent 시약[5 % 인산 중 1 % 술아닐아미드 (sulanilamide) 50 ㎕ + 0.2 % N-나프틸에틸렌디아민 2HCl 50 ㎕)]과 1:1로 반응시키고, 570nm에서 흡 광도를 측정하였다.
그 결과를 하기의 표1로 나타내었으며, quercetin을 positive control로 사용하여 이를 도1에 도식화하여 나타내었다.
농도 (ppm) |
억제율(%)1) |
비교예1 |
비교예2 |
비교예3 |
실시예1 |
quercetin |
5 |
4.8 |
3.8 |
5.5 |
10.0 |
18.6 |
10 |
12.3 |
9.7 |
10.2 |
15.4 |
32.1 |
20 |
21.1 |
25.2 |
20.3 |
45.3 |
46.8 |
50 |
31.6 |
35.6 |
32.2 |
52.1 |
|
케르세틴(quercetin)은 플라보노이드로써 항염,항산화 작용을 한다고 보고되어 있기에, 대조군으로 많이 사용한다.
1) 억제율(%) = (1-(S-Sb)/(C-Cb)) x 100, S: Sample test absorbance, Sb: Sample blank absorbance, C: Positive control absorbance, Cb:Negative control absorbance
식에 의해 계산되었다.
상기 표 1 및 도 1로부터 본 발명의 창이자, 만병초 및 우엉 혼합추출물이 동일한 농도의 창이자 추출물, 만병초 추출물 또는 우엉 추출물에 비하여 일산화질소 생성을 감소시켜, 염증으로부터의 세포 보호 효과가 우수함을 확인하였다.
<실험예 2> 피부자극완화 효과 확인
상기 실시예 2, 비교예 1, 비교예 2 및 비교예3에서 제조된 추출물의 세포 실험을 통해 감소한 베타-헥소사미니다제 분비 양을 측정하여 항염 및 피부자극완화 효과를 평가하였다.
RBL-2H3 세포(ATCC)를 10% fetal bovine serum(FBS)를 함유한 DMEM(Dulbecco' modified Eagle medium, Gibco)에 현탁시킨 후 24 well plate에 각 well당 2 x 1,000,000 세포가 들어가도록 처리한 다음 각 well당 100ng/ml의 mouse monoclonal IgE로 감작시킨 후 5% CO2 배양기(incubator)에서 24 시간동안 배양하였다. 세포를 well당 Tyrode buffer 500ul를 사용하여 헹구어내고, Tyrode buffer 160 ul를 첨가 후 37℃, 5% CO2 배양기(incubator)에서 15분 동안 배양한다.
10, 20, 50, 100ppm의 농도로 추출물을 처리한 후 37℃, 5% CO2 배양기(incubator)에서 15분간 배양하고, 한 시간 동안 DNP-BSA 100ng/ml(Sigma)을 처리하였다. 10분간 ice bath에 두어 반응을 정지시키고 원심 분리하였다. 상층액에 기질로서 1mM p-니트로페닐l-N-아세틸-β-D-글루코스아미니드(p-nitrophenyl-N-acetyl-β-D-glucosaminide) 50ul 처리한 후 37℃, 5% CO2 배양기(incubator)에서 한 시간 동안 배양한 후 1M Na2CO3완충용액 (sodium carbonate buffer)를 넣어 반응을 정지시킨다. ELISA reader를 사용하여 405nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과를 하기의 표2로 나타내었으며, 이를 도2에 도식화하여 나타내었다.
농도 (ppm) |
억제율(%)1 ) |
비교예1 |
비교예2 |
비교예3 |
실시예2 |
quercetin |
10 |
4.6 |
5.2 |
2.3 |
5.9 |
11.2 |
20 |
9.9 |
8.7 |
9.5 |
14.2 |
16.9 |
50 |
18.6 |
15.8 |
18.9 |
24.5 |
25.4 |
100 |
22.8 |
19.8 |
21.1 |
29.8 |
|
1) 억제율(%) = (1-(S-Sb)/(C-Cb)) x 100, S: Sample test absorbance, Sb: Sample blank absorbance, C: Positive control absorbance, Cb:Negative control absorbance 식에 의해 계산되었다.)
상기 표 2 및 도 2로부터 본 발명의 창이자, 만병초 및 우엉 혼합추출물이 동일한 농도의 창이자 추출물, 만병초 추출물 또는 우엉 추출물에 비하여 베타-헥소사미니다제의 방출양을 감소시킴을 확인할 수 있었다. 따라서 본 발명의 추출물이 단일 성분 추출물에 비해 피부자극완화 효과가 우수함을 확인하였다.
<
실험예
3> 안전성 확인
실시예1을 사용하여 본 발명 추출물의 안전성 실험을 하였다. Human fibroblast cell line(cascade)을 1x103 cell/well의 농도로 접시에 파종하였다. 10% FBS(Gibco)가 함유된 동물세포배양 배지를 이용하여 37℃, 5% CO2 배양 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 다양한 농도의 실시예1 및 녹차 추출물(대조예1: 녹차 100g을 에탄올 1,000g에 첨가하여 비교예 1과 동일한 방법으로 하여 건조 중량 33g을 얻었다.)을 각각 에탄올에 녹여 배지와 혼합한 후 200㎕씩 로딩 한 후 37℃, 5% CO2 배양 조건에서 72시간 동안 배양한 후, 배지 200㎕에 MTT 용액 50㎕를 로딩하여 5시간 배양하였다. 배양 후 MTT 용액을 제거한 다음 에탄올 200㎕를 넣고 540㎚에서 흡광도를 측정하였다.
상기 방법에 따라 실시예 1 및 대조예 1의 추출물을 95%에탄올 1ml에 녹여 0.1 ㎍/㎖, 1 ㎍/㎖, 10 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖, 1000 ㎍/㎖ 농도별로 안전성을 측정하였다. 그 실험결과는 하기의 표3과 같다.
반응액 중에 함유시킨 시료의 농도(㎍/㎖) |
안전성 효과(%) |
혼합추출물(실시예1) |
녹차 추출물(대조예1) |
0.1 |
99.3 |
98.4 |
1 |
99.8 |
97.4 |
10 |
99.2 |
95.1 |
100 |
99.4 |
93.2 |
일반적으로 천연추출물의 농도를 증가시키면 피부세포에 대한 안전성은 미미하게 떨어지지만 실시예1의 안전성 효과는 떨어지지 않음을 볼 수 있다. 따라서 상기 결과로부터 본 발명에 의한 창이자, 만병초, 우엉으로 구성된 혼합추출물(실시예1)이 녹차 추출물(대조예1)보다 우수한 안전성을 가짐을 확인할 수 있었다.
<
실험예
4> 피부자극 완화 효과 확인
A. 피부자극 완화 효과 실험을 위한 처방예 제조
본 발명의 피부자극 완화 효과를 확인하기위하여, 하기의 표4의 성분으로 구성된 처방예1, 처방예2, 처방예3, 처방예4, 처방예5의 화장료 조성물을 제조하였다.
번호 |
원료 |
처방예1 |
처방예2 |
처방예3 |
처방예4 |
처방예5 |
1 |
창이자 추출물(비교예1) |
3.0 |
|
|
|
|
2 |
만병초 추출물(비교예2) |
|
3.0 |
|
|
|
3 |
우엉 추출물(비교예3) |
|
|
3.0 |
|
|
4 |
창이자, 만병초, 우엉의 혼합추출물 (실시예1) |
|
|
|
3.0 |
|
5 |
리포폴리사카라이드(대조예2) |
|
|
|
|
3.0 |
6 |
스테아린산 |
2.0 |
2.0 |
2.0 |
2.0 |
2.0 |
7 |
세토스테아릴알콜 |
1.0 |
1.0 |
1.0 |
1.0 |
1.0 |
8 |
글리세릴모노스테아레이트 |
2.0 |
2.0 |
2.0 |
2.0 |
2.0 |
9 |
폴리옥시에틸렌소르비탄모노스테아레이트 |
1.2 |
1.2 |
1.2 |
1.2 |
1.2 |
10 |
솔비탄세스퀴올레이트 |
0.3 |
0.3 |
0.3 |
0.3 |
0.3 |
11 |
세레신 |
0.2 |
0.2 |
0.2 |
0.2 |
0.2 |
12 |
밀납 |
1.0 |
1.0 |
1.0 |
1.0 |
1.0 |
13 |
유동파라핀 |
3.0 |
3.0 |
3.0 |
3.0 |
3.0 |
14 |
스쿠알란 |
5.0 |
5.0 |
5.0 |
5.0 |
5.0 |
15 |
카프릴릭/카프릭트리글리세라이드 |
3.0 |
3.0 |
3.0 |
3.0 |
3.0 |
16 |
카르복시비닐폴리머 |
0.2 |
0.2 |
0.2 |
0.2 |
0.2 |
17 |
부틸렌글리콜 |
4.0 |
4.0 |
4.0 |
4.0 |
4.0 |
18 |
글리세린 |
4.0 |
4.0 |
4.0 |
4.0 |
4.0 |
19 |
트리에탄올아민 |
0.5 |
0.5 |
0.5 |
0.5 |
0.5 |
20 |
정제수 |
to 100 |
to 100 |
to 100 |
to 100 |
to 100 |
상기 표에서 처방 1, 2, 3, 4 및 5는 다음과 같은 방법으로 제조되었다.
성분 14, 15, 16, 18번을 혼합 교반하면서 80~85℃사이로 가열하여 제조부에 투입한 후 유화기를 작용시키고 성분 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13번을 80~85℃사이로 가열하여 용해한 후 성분 17번을 투입 교반하여 제조부에 투입하고 유화시켰다. 유화가 끝나면 교반기를 이용하여 교반하면서 35℃까지 냉각하고 성분 1(처방 1), 2(처방2), 3(처방3), 4(처방4), 5(처방5)번을 각각 투입하여 25℃까지 냉각한 뒤 숙성시켜, 처방1, 처방2, 처방3, 처방4 및 처방5를 제조하였다.
B. 피부완화 효과 실험
누드 마우스[BALB/C sic-nu/nu mouse(12-17g, ♀)에 0.5%의 컴파운드 48/80(아토피 유도물질), Sigma)을 오른쪽 어깨에 주사한 후 1시간 동안 긁는 횟수를 측정하였다. 그 다음 24시간 후에 12마리의 쥐에 상기 표4의 처방예 1, 2, 3, 4, 5를 각각 100 ul씩 왼쪽 어깨에 주사하고 10분 뒤에 동일한 자리에 0.5% 컴파운드 48/80을 50 ul 주사하여 한 시간 동안 긁는 횟수를 측정하였다. 0.5%의 컴파운드 48/80만을 주사하였을 때의 긁는 횟수를 100%로 환산하여 기준 공통 횟수로 하고 이에 대하여 시료 및 컴파운드 48/80을 주사한 후 긁은 횟수를 공통기준횟수에 비교하여 아래 표 5에 나타내었다.
처방예1 |
처방예2 |
처방예3 |
처방예4 |
처방예5 |
83 |
78 |
80 |
45 |
100 |
따라서, 본발명의 혼합추출물이 단일 성분 추출물에 비해 피부자극완화 효과가 대략 2배가량 향상된 것을 확인할 수 있었다.
<
제제예
> 창이자, 만병초, 우엉의 혼합추출물을 함유한
화장료
제조
<
제제예
1> 화장수 제조
실시예 1의 추출물을 함유한 화장수(스킨로션) 1kg을 다음과 같이 제조하였다.
번호 |
원 료 |
함량(중량%) |
1 |
창이자, 만병초, 우엉 혼합추출물(실시예1) |
2.0 |
2 |
글리세린 |
3.0 |
3 |
부틸렌글리콜 |
3.0 |
4 |
프로필렌글리콜 |
1.0 |
5 |
피피지-26-부테스-26/피이지-40 히드로게네이티드 캐스터오일 |
1.1 |
6 |
에탄올 |
8.0 |
7 |
트리에탄올아민 |
0.2 |
8 |
방부제 |
미량 |
9 |
색소 |
미량 |
10 |
향료 |
미량 |
11 |
정제수 |
to 100 |
50g의 성분 11번에 성분 2, 3, 4 및 8번을 순서대로 투입하고 교반하여 25℃에서 용해시켰다. 그 후, 성분 5번을 60℃ 정도로 가열하여 용해시킨 후, 성분 10번을 투입, 교반하여 용해한 후 잔량의 성분 11번에 투입한다. 마지막으로 성분 1,6,7 및 9번을 투입하여 충분히 교반한 뒤 숙성시켜 표제의 화장수를 제조하였다.
<
제제예
2> 영양로션 제조
실시예 1의 추출물을 함유한 영양로션 1kg을 다음과 같이 제조하였다.
번호 |
원 료 |
함량(중량%) |
1 |
창이자, 만병초, 우엉 혼합추출물(
실시예1
)
|
2.0 |
2 |
시토스테롤 |
1.5 |
3 |
폴리글리세릴 2-올레이트 |
1.2 |
4 |
세라마이드 |
0.2 |
5 |
세테아레스-4 |
1.0 |
6 |
콜레스테롤 |
1.2 |
7 |
디세틸포스페이트 |
0.5 |
8 |
부틸렌글리콜 |
5.0 |
9 |
선플라워오일 |
3.0 |
10 |
카르복시비닐폴리머 |
0.2 |
11 |
산탄검 |
0.1 |
12 |
방부제 |
미량 |
13 |
향료 |
미량 |
14 |
정제수 |
to 100 |
성분 2, 3, 4, 5, 및 6을 25℃에서 균질화한 것에 성분 1, 7, 8 및 14를 혼합하고, 균질화 한 후 성분 9를 50℃에서 서서히 첨가하여 균질화하였다. 그 후, 성분 10, 11, 12, 13을 투입하여 분산시켜 안정화시킨 후, 숙성시켜 표제의 영양로션을 제조하였다.
<
제제예
3> 영양크림 제조
실시예 1의 혼합물을 함유한 영양크림 1kg을 다음과 같이 제조하였다.
번호 |
원 료 |
함량(중량%) |
1 |
창이자, 만병초, 우엉의 혼합추출물(
실시예1
)
|
2.0 |
2 |
시토스테롤 |
1.5 |
3 |
폴리글리세틸 2-올레이트 |
1.5 |
4 |
세라마이드 |
0.5 |
5 |
세테아레스-4 |
1.8 |
6 |
콜레스테롤 |
2.5 |
7 |
디세틸포스페이트 |
0.5 |
8 |
부틸렌를리콜 |
4.0 |
9 |
선플라워오일 |
8.0 |
10 |
카르복시비닐폴리머 |
0.4 |
11 |
트리에탄올아민 |
0.4 |
12 |
방부제 |
미량 |
13 |
향료 |
미량 |
14 |
정제수 |
to 100 |
성분 2, 3, 4, 5 및 6을 25℃에서 균질화한 비이온계 양친매성 지질과 성분 1, 7, 8, 및 14를 혼합하고, 50℃에서 균질화 한 후 성분 9를 서서히 첨가하여 균질화하였다. 그 후, 성분 10, 11, 12, 13을 투입하여 분산시켜 안정화한 다음 숙성시켜, 표제의 영양크림을 제조하였다.
<
제제예
4> 에센스 제제
실시예 1의 혼합추출물을 함유한 에센스 1kg을 다음과 같이 제조하였다.
번호 |
원 료 |
함량(중량%) |
1 |
한련초 및 사상자 혼합추출물(실시예1) |
2.0 |
2 |
시토 스테롤 |
1.5 |
3 |
씨12-20애씨드피이지-8에스텔 |
1.5 |
4 |
세라마이드 |
0.4 |
5 |
세테스-4 |
1.1 |
6 |
콜레스테롤 |
1.4 |
7 |
디세틸포스페이트 |
0.5 |
8 |
부틸렌글리콜 |
5.0 |
9 |
썬플라워씨드오일 |
12.0 |
10 |
사이클로메치콘 |
0.3 |
11 |
카르복시비닐폴리머 |
0.2 |
12 |
산탄검 |
0.1 |
13 |
방부제 |
미량 |
14 |
항료 |
잔량 |
15 |
정제수 |
to 100 |
성분 2, 3, 4, 5 및 6을 25℃에서 균질화한 비이온계 양친매성 지질과 성분 1, 7, 8 및 15를 혼합하고 균질화하여 마이크로플루이다이져를 통과시킨 후 이어 성분 9를 서서히 첨가하여 균질화한 후 다시 마이크로플루이다이져에 재차 통과시켰다. 그 후, 성분 10, 11, 12, 13, 14을 투입하여 분산시켜 안정화하고 숙성시켜 표제의 화장료 조성물인 에센스를 제조하였다.