KR20140072291A

KR20140072291A - 주름개선용 의약 및 화장료 조성물

Info

Publication number: KR20140072291A
Application number: KR1020120137326A
Authority: KR
Inventors: 이태훈; 김재윤; 김범준; 김소영
Original assignee: (주)노바셀테크놀로지
Priority date: 2012-11-29
Filing date: 2012-11-29
Publication date: 2014-06-13

Abstract

본 발명은 보다 안전하고 효율적인 피부 주름개선을 위하여, 송이버섯 추출물을 유효성분으로 함유하는 주름개선용 의약 또는 화장료 조성물.

Description

주름개선용 의약 및 화장료 조성물{Anti-wrinkle pharmaceutical and cosmetic composition}

본 발명은 의약 및 화장료 조성물에 관한 것으로서, 더 상세하게는 주름개선용 의약 및 화장료 조성물에 관한 것이다.

피부는 항상 대기 중에 노출되어 있으며, 외부환경으로부터 인체를 보호해주는 중요한 기관으로서, 특히 태양광선의 자외선에 대한 피부노출은 피부 노화를 촉진시키는 요인이다. 피부노화는 두 가지로 구분되며 광 노화와 내인성 요인에 의한 노화로 구분된다. 이러한 노화 과정은 지질 과산화 및 단백질 분해효소의 활성화, 콜라겐과 엘라스틴의 사슬절단에 의한 주름 및 피부 탄력감소, 피부 건조 및 다양한 변화가 일어나게 된다. 피부 노화 과정을 방지 및 지연시키려는 수많은 항노화 화장품 개발이 이루어지고 있으며, 특히 피부 주름 형성에 관련이 있는 결합조직인 콜라겐 섬유(collagen fiber), 엘라스틴 섬유(elastic fiber)의 주름 완화와 개선을 위한 연구들이 진행되고 있다. 콜라겐은 진피조직 내에서 피부의 유연성과 탄력을 유지시키는 중요한 섬유조직으로서, 콜라겐 섬유의 합성은 피부 노화가 진행되면서 급격히 감소하는데 이러한 콜라겐의 감소는 분해를 촉진시키는 효소인 콜라게나아제(collagenase, MMP-1)에 의해서 주름이 생성된다. MMP(matrix metalloproteinase)는 금속단백 분해효소로서 피부내의 진피층 콜라겐 붕괴에 영향을 미치며, 특히 광노화에 매우 중요한 역할을 한다. 자외선 조사에 의해 활성화된 MMP는 TIMP(tissue inhibitors of metalloproteinase)와 같은 저해제에 의해 활성이 조절된다. 그리고 주름형성에 있어서 콜라겐 이외에 탄력섬유로 알려진 엘라스틴(elastin)은 피부의 탄력성을 좌우하는 주요 섬유 조직으로 엘라스틴 분해에 관여하는 효소인 엘라스타제(elastase)에 의해서 주름이 생성되는 것으로 보고되어 있다. 엘라스타아제는 연령이 증가하거나 자외선 등의 외부피부자극에 의해 과잉생성이 되면 과잉 생성된 엘라스타아제가 엘라스틴을 과도하게 분해시켜 콜라겐간 결합이 약화되어 콜라겐과 엘라스틴이 진피조직에서 형성하고 있는 그물망 구조가 깨어지고 피부가 처지면서 주름이 생성된다.

따라서, 주름형성 완화와 개선과 관련하여 콜라게나아제(collagenase), MMP, 엘라스타제(elastase) 등 주름 관련 효소를 억제시켜 주름형성을 억제를 위한 많은 연구가 진행되고 있다. 이러한 연구로는 망목주름담홍버섯 액체배양 추출물을 함유하는 주름개선 화장료 조성물에 관한 대한민국 등록특허 제868784호, 차가버섯 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 주름개선 화장료 조성물에 관한 대한민국 공개특허공보 제2005-00038112호 등이 있다.

그러나 이러한 종래의 주름개선용 화장료 조성물은, 세포증식능을 가지고 있어서, 부작용을 유발할 수 있거나 유효 투여 농도가 높아서 과량을 사용해야 하는 문제점이 있었다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 포함하여 여러 문제점들을 해결하기 위한 것으로서, 보다 안전하면서도 효율적으로 피부 주름을 개선할 수 있는 의약 및 화장료 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다. 그러나 이러한 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 관점에 따르면, 송이버섯 추출물을 유효성분으로 함유하는 주름개선용 의약 조성물이 제공된다.

상기 의약 조성물에 있어서, 상기 송이버섯 추출물은 송이버섯 자실체 추출물 또는 송이버섯 균사체 추출물일 수 있다.

상기 주름개선용 의약 조성물에 있어서, 상기 송이버섯 추출물은 송이버섯 자실체 또는 균사체로부터 추출된 추출물 일 수 있으며, 추출용매로는 물을 비롯하여 메탄올, 에탄올 등 C1 내지 C4의 저급알코올 또는 그의 수용액을 사용할 수 있고, 상기 저급알코올 또는 그의 수용액으로 추출된 추출물을 N-헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트 및 부탄올의 순으로 순차분획한 후 용매를 제거한 어느 하나의 이상의 분획물일 수 있다. 더 구체적으로는 상기 송이버섯 추출물은 송이버섯 자실체 또는 균사체를 건조한 후 분쇄하는 분쇄단계, 상기 분쇄된 송이버섯 자실체 또는 균사체에 물, 상기 저급알코올 또는 상기 저급알코올 수용액을 가하여 진탕하는 진탕단계; 및 상기 진탕액을 원심분리하여 잔존물을 제거한 후 상등액을 건조시키는 건조단계를 통해 제조될 수 있으며, 상기 건조단계는 분무건조 또는 동결건조일 수 있다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 송이버섯 추출물을 유효성분으로 함유하는 주름개선용 화장료 조성물이 제공된다.

상기 주름개선용 화장료 조성물에 있어서, 상기 송이버섯 추출물은 송이버섯 자실체 추출물 또는 송이버섯 균사체 추출물일 수 있다.

상기 화장료 조성물에 있어서, 상기 송이버섯 추출물은 송이버섯 자실체 또는 균사체로부터 추출된 추출물 일 수 있으며, 추출용매로는 물을 비롯하여 메탄올, 에탄올 등 C1 내지 C4의 저급알코올 또는 그의 수용액을 사용할 수 있고, 상기 저급알코올 또는 그의 수용액으로 추출된 추출물을 N-헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트 및 부탄올의 순으로 순차분획한 후 용매를 제거한 어느 하나의 이상의 분획물일 수 있다. 더 구체적으로는 상기 송이버섯 추출물은 송이버섯 자실체 또는 균사체를 건조한 후 분쇄하는 분쇄단계, 상기 분쇄된 송이버섯 자실체 또는 균사체에 물, 상기 저급알코올 또는 상기 저급알코올 수용액을 가하여 진탕하는 진탕단계; 및 상기 진탕액을 원심분리하여 잔존물을 제거한 후 상등액을 건조시키는 건조단계를 통해 제조될 수 있으며, 상기 건조단계는 분무건조 또는 동결건조일 수 있다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 대상에게 약학적으로 유효한 양의 상기 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 상기 대상의 피부 주름 개선 또는 예방방법이 제공된다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 대상의 피부에 상기 화장료 조성물을 도포하는 단계를 포함하는 상기 대상의 피부 주름 개선 또는 예방을 위한 미용방법이 제공된다.

상기한 바와 같이 이루어진 본 발명의 일 실시예에 따르면, 특별한 부작용 없이 대상의 피부의 형성된 주름을 개선하거나 주름형성을 예방할 수 있다. 물론 이러한 효과에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 송이버섯 추출물의 농도에 따른 섬유아세포의 세포생존도(A) 및 세포증식능(B)을 보여주는 그래프이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 송이버섯 추출물의 농도에 따른 엘라스타제 활성의 저해정도를 나타내는 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 송이버섯 추출물의 농도에 따른 TIMP-1(A) 및 트로포엘라스틴(B) 발현 정도를 RT-PCR 분석을 통해 확인한 결과를 나타내는 사진이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 송이버섯 추출물의 농도에 따른 TIMP-1 발현 양상을 웨스턴 블랏 분석을 통해 확인한 결과를 나타내는 사진이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 송이버섯 추출물을 섬유아세포에 처리한 후 트로포엘라스틴의 발현 양상을 면역세포화학분석을 통해 관찰한 결과를 나타내는 형광현미경 사진이다. 상단은 트로포엘라스틴을 염색한 결과이고, 중단은 DAPI에 의해 핵을 염색한 결과이며, 하단은 상단과 하단의 이미지를 중첩시킨 결과이다.

송이버섯(Tricholoma matsutake)은 분류학적으로 주름버섯목(Agaricales), 송이과(Tricholomataceae), 송이속(Tricholoma)에 속하며, 베타-글루칸(β-glucan) 등 다당류(polysaccharide) 성분이 함유되어 있어 항산화 기능 촉진, 면역력 강화, 콜레스테롤 저하, 혈당강하 및 항암활성 등의 기능이 있는 것으로 보고되어 있다. 최근 연구에서 송이버섯 추출물에 대한 피부 안전성을 확인하였으며, 피부에서의 효능에 대한 연구는 아직까지 보고된 적이 없었다.

이에 본 발명자들은 송이버섯 균사체 추출물을 이용하여 인간 섬유아세포에 처리한 결과, 세포독성이나 증식작용 없이(도 1 참조), 엘라스타아제 억제활성(도 2) 및 콜라겐분해효소의 억제제인 TIMP-1 및 엘라스틴의 전구체인 트로포엘라스틴의 발현을 증가시킴으로써(도 3 내지 5 참조), 피부주름의 생성의 억제를 위한 의약 또는 화장품 소재로 활용가능함을 확인하였다.

상기 송이버섯 추출물의 유효량은 환자의 환부의 종류, 적용부위, 처리회수, 처리시간, 제형, 환자의 상태, 보조제의 종류 등에 따라 변할 수 있다. 사용량은 특별히 한정되지 않지만, 0.01μg/kg/day 내지 1,000 mg/kg/day일일 수 있다. 상기 1일량은 1일에 1회, 또는 적당한 간격을 두고 하루에 2~3회에 나눠 투여해도 되고, 수일(數日) 간격으로 간헐(間歇)투여해도 된다.

본 발명의 조성물에서 상기 송이버섯 추출물은 조성물 총 중량에 대하여 0.1-100 중량%로 함유될 수 있다.

본 발명의 조성물은 약학적 조성물 또는 화장료 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 또한, 약학 조성물 또는 화장료 조성물의 제조에는 고체 또는 액체의 제제용 첨가물을 사용할 수 있다. 제제용 첨가물은 유기 또는 무기 중 어느 것이어도 된다.

부형제로서는 예를 들면 유당, 자당, 백당, 포도당, 옥수수 전분(corn starch), 전분, 탈크, 소르비트, 결정 셀룰로오스, 덱스트린, 카올린, 탄산칼슘, 이산화규소 등을 들 수 있다. 결합제로서는 예를 들면 폴리비닐알코올, 폴리비닐에테르, 에틸셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 아라비아고무, 트래거캔스(tragacanth), 젤라틴, 셀락(shellac), 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 구연산칼슘, 덱스트린, 펙틴(pectin) 등을 들 수 있다. 활택제로서는 예를 들면 스테아린산마그네슘, 탈크, 폴리에틸렌글리콜, 실리카, 경화식물유 등을 들 수 있다. 착색제로서는 통상 의약품에 첨가하는 것이 허가되어 있는 것이라면 모두 사용할 수 있다. 이들의 정제, 과립제에는 당의(糖衣), 젤라틴코팅, 기타 필요에 따라 적절히 코팅할 수 있다. 또한, 필요에 따라 방부제, 항산화제 등을 첨가할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며(예: 문헌 [Remington's Pharmaceutical Science, 최신판; Mack Publishing Company, Easton PA), 제제의 형태는 특별히 한정되는 것은 아니나, 바람직하게는 외용제일 수 있다. 본 발명의 외용제에는 시트제, 액상도포제, 분무제, 로션제, 크림제, 파프제, 분제, 침투 패드제, 분무제, 수화겔을 포함한 겔제, 파스타제, 리니멘트제, 연고제, 에어로졸, 분말제, 현탁액제, 경피흡수제 등의 통상적인 외용제의 형태가 포함될 수 있다. 이들 제형은 모든 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌[Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania 18042(Chapter 87: Blaug, Seymour)에 기술되어 있다.

본 발명의 일례로, 상기 조성물을 피부에 직접 적용될 수 있다. 드레싱은 시판되고 있거나 통상적으로 알려져 있는 어떠한 것도 사용 가능하다. 시판되고 있는 드레싱의 예로는 컴필(Compeel), 듀우덤(Duoderm), 타가덤(Tagaderm) 및 옵사이트(Opsite)를 들 수 있다.

본 발명의 펩타이드 유도체가 화장료 조성물에 사용될 경우, 그 제형에 있어서 특별히 한정되는 바가 없으며 예를 들면, 유연화장수, 영양화장수, 마사지크림, 영양크림, 팩, 젤 또는 피부 점착타입 화장료의 제형을 갖는 화장료 조성물 일 수 있으며, 로션, 연고, 겔, 크림, 패취 또는 분무제와 같은 경피 투여형 제형일 수 있다.

본 발명의 조성물에서, 약제학상 또는 화장품 공전상 허용되는 담체로는 그의 제형에 따라 다르나, 바셀린, 유동 파라핀, 겔화 탄화수소(별명: 플라스티베이스) 등의 탄화수소류; 중쇄지방산 트리글리세라이드, 돈지, 하드 팻트, 카카오지 등의 동식물성 오일; 세탄올, 스테아릴알코올, 스테아린산, 팔미틴산이소프로필 등의 고급지방산 알코올 및 지방산 및 그의 에스테르류; 마크로골(폴리에틸렌글리콜), 1,3-부틸렌글리콜, 글리세롤, 젤라틴, 백당, 당알코올 등의 수용성 기제; 글리세린 지방산에스테르, 스테아린산폴리옥실, 폴리옥시에틸렌경화 피마자유 등의 유화제; 아크릴산에스테르, 알긴산나트륨 등의 점착제; 액화석유가스, 이산화탄소 등의 분사제; 파라옥시벤조산에스테르류 등의 방부제 등을 들 수 있으며, 본 발명의 외용제는 이들을 사용하여 통상의 방법에 따라 제조할 수 있다. 또한, 이들 이외에도 안정제, 향료, 착색제, pH 조정제, 희석제, 계면활성제, 보존제, 항산화제 등을 필요에 따라 배합할 수도 있다. 본 발명의 외용제는 사용은 통상의 방법에 의해 국소창상부에 도포 될 수 있다.

본 발명의 일례로, 본 발명에 따른 조성물은 본 발명의 일 실시예에 따른 송이버섯 추출물과 생리식염수를 일정한 부피비로 혼합하고 액상 도포제의 형태로 제형화될 수 있다. 본 발명의 일례로서, 본 발명에 따른 약학 조성물은 상기한 본 발명의 일 실시예에 다른 송이버섯 추출물과 수용성 연고기제를 혼합하고 여기에 생리식염수를 첨가하여 연고제의 형태로 제형화될 수 있다.

그러나, 본 발명의 약제학적 조성물의 상기 사용량은 투여 경로, 대상의 연령, 성별, 체중, 주름의 정도, 주름의 종류 및 부위, 처리회수, 처리시간, 제형, 환자의 상태, 보조제의 종류 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되는 것이므로 상기 유효량은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 아니 된다.

아울러, 본 발명의 일 실시예에 따른 조성물은 피부 충전제의 제형으로 제공될 수 있다. '피부 충전제(dermal filler)' 또는 '필러(dermal filler)'는 피부조직과 유사한 성분으로 특정부위에 삽입되어 연부조직을 확장시킴으로써 주름개선이나 윤곽교정 등에 사용되는 물질을 의미한다. 연조직 확장에는 주사가능한 물질로서 콜라겐이 흔히 사용된다. 또한, 단백질, 지방, 히알루론산 (HA), 폴리알코올 및 카르복시메틸셀룰로오스, 덱스트란과 같은 기타 폴리머를 비롯한 수많은 다른 물질들이 주사용 피부 충전물로서 사용되어 오고 있다. 콜라겐을 주성분으로 하는 피부 충전제로는, 돼지 콜라겐을 주성분으로 하는 EVOLENCE 30(ColBar LifeScience사 피부 충전제의 상표명), 소 콜라겐을 주성분으로 하는 Zyderm이나 Zyplast(이상 Inamed사 피부 충전제의 상표명), 인간 콜라겐을 주성분으로 하는 CosmoDerm이나 CosmoPlast(이상 Inamed사 피부 충전제의 상표명) 등이 알려져 있다. 히알루론산을 주성분으로 하는 것으로는 Rofilan(Rofil/Philoderm사 피부 충전제의 상표명), Perlane, Restylane(이상 Medicis/Q-Med AB사 피부 충전제의 상표명), Teosyal(Teoxane SA사 피부 충전제의 상표명), Surgiderm(Corneal Laboratoire사 피부 충전제의 상표명) 등이 있다. 본 발명의 일 실시태양에 따른 피부 충전제는 공지의 피부 충전제에 본 발명의 일 실시예에 따른 펩타이드를 적량 적재하거나 상기 펩타이드를 피부 충전제의 골격이 되는 고분자에 공유결합 또는 비공유결합에 의해 결합시킴으로써 제조될 수 있다.

이하, 실시예 및 실험예를 통해 본 발명을 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예 및 실험예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있는 것으로, 이하의 실시예 및 실험예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다.

실시예: 송이버섯 균사체 추출물의 제조

송이버섯 균사체 건조물(20 g)을 분쇄한 후 1 L의 물에 첨가하고 진탕배양기에서 37℃에서 24시간 동안 진탕시켰다. 이를 2500 rpm으로 10분간 원심분리하여 상등액만 취하고 상기 상등액으로 다시 6000 xg로 10분간 원심분리한 후 다시 상등액만 취해 이를 동결건조기로 건조시켰으며, 사용전에 물에 용해시켜 20 mg/ml의 보관용액(stock solution)으로 제조하였다.

실험예 1: 세포생존도 및 증식 분석

분석에 사용한 세포는 인간 섬유아세포(CCD-25Sk human fibroblasts)로 American Type Culture Collection(ATCC, Rockville, USA)에서 구입하였으며, 상기 섬유아세포를 37℃, 5%의 CO₂, 10%의 우태아혈청(FBS), 50 μg/mL의 스트렙토마이신 및 50 U/mL의 페니실린을 첨가한 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM, Gibo, USA)에서 배양하였다.

24-웰 배양용기에 섬유아세포 4.0×10⁴ cells를 분주한 후, 5%의 CO₂, 37℃ 하에서 24 시간 동안 배양하여 세포를 배양용기 바닥에 부착시켰다. 다음날 우태아혈청을 제거한 배지로 교환한 다음 다시 24 시간 동안 배양한 후, 상기 실시예에서 추출된 송이버섯균사체 추출물(Tricholoma matsutake Mycelium, 이하, 'TMM'으로 약칭함)을 농도별로 처리하고 다시 24 시간 동안 배양하여 MTT 분석으로 세포독성을 측정하였다. 세포 증식도는 상기 섬유아세포를 72시간 동안 배양하여 MTT 분석을 통해 측정하였다. 발색시약을 96-well plate에 200 μL씩 분주하고 ELISA reader를 사용하여 540 nm에서 흡광도를 측정한 후, TMM을 처리하지 않은 군을 대조군으로 하여 상대적인 세포독성 및 증식율을 계산하였다.

그 결과, 도 1에서 나타난 바와 같이, 본 발명의 일 실시예에 따른 TMM은 고농도로 처리하더라도 세포사멸이나 비정상적인 세포증식을 유발하지 않는 안전한 물질임을 확인할 수 있었다.

실험예 2: 엘라스타제 발현 분석

본 발명자들은 엘라스타제 활성의 측정을 위하여 섬유아세포의 균질액에 상기 실시예에서 추출한 다양한 농도(0.1 ∼ 100 μg/ml)의 TMM을 처리한 후 엘라스타제 효소활성을 측정하였다(Nakagawa et al., Skin Res., 29:793-797, 1987).

섬유아세포 균질액은 배양된 섬유아세포에 0.1 % Triton X-100이 함유된 0.2 M Tris-HCl(pH 8.0)을 첨가한 후 초음파 분쇄기를 통하여 섬유아세포를 용해시킨 후 3,000 rpm에서 20 min 동안 원심 분리하여 엘라스타제가 포함되어 있는 상층액을 취함으로써 제조하였고, 단백질 총량을 정량하였다. 효소 활성의 측정을 위하여 먼저 섬유아세포로부터 분리된 엘라스타제가 포함된 상층액를 분주하여 최종 단백질 농도가 200 μg/mL가 될 수 있도록 보관용액(stock solution)을 만들어 이를 96-웰 플레이트의 각가의 웰에 50 μL씩 분주한 후, 46 μL의 0.2 M Tris-HCl 완충액을 넣어 반응 조건을 만든 다음, 최종 처리농도가 0.1 ~ 100 μg/ml 이 되도록 TMM 1 μL를 각 웰에 첨가하였다. 여기에 엘라스타제의 특이적인 기질인 STANA(N-succinyl-tri-alanyl-p-nitroaniline, Peptide Institute Inc., Japan) 50mM를 각 웰 마다 3 μL씩 첨가하였다. 상기 반응물을 37℃에서 반응시키면서 매 30 분마다 405 nm에서 흡광도를 측정하여 아무것도 처리하지 않은 웰을 음성대조군으로 하여 상대적인 엘라스타제 활성도를 계산하였다. 양성대조군으로 섬유아세포 생성 엘라스타제의 특이적 억제제인 포스포라미돈(phosphoramidon, Sigma-Aldrich, USA)을 사용하였다.

그 결과, 도 2에서 나타난 바와 같이, 본 발명의 실시예에 따른 송이버섯 균사체 추출물은 10 μg/ml의 농도에서부터 농도 의존적으로 섬유아세포 균질액에 포함된 엘라스타제의 활성을 유의하게 억제하였으며(IC₅₀= 10 μg/ml), 특히 100 μg/ml 처리시에는 엘라스타제 저해율이 81.4ㅁ3.9%에 이르러, 양상대조군인 10 μM 포스파라미돈(89.6ㅁ7.8%)에 버금가는 효과를 나타냈다.

실험예 3: TIMP-1 및 트로포엘라스틴 발현 분석

본 발명자들은 본 발명이 일 실시예에 따라 추출된 TMM이 인간 섬유아세포에서 주름방지 효과가 있는지 확인하기 위해서, 다양한 농도의 TMM에 의한 TIMP-1 및 트로포엘라스틴(tropoelastin)의 발현 정도를 결정하였다. TIMP-1의 발현 정도는 RT-PCR과 웨스턴블랏 분석을 통해 분석하였고, 트로포엘라스틴 발현 정도는 RT-PCR과 면역세포화학분석을 통해 수행하였다. 먼저 RT-PCR을 위해, 24-웰 배양용기에 배양중인 섬유아세포에 각각 0, 1, 10 및 100 μg/ml의 TMM을 72시간 처리하여 배양한 후, 세포로부터 총 RNA를 RNA 분리 키트(RNeasy mini kit, Qiagen Inc., Valencia, USA)를 이용하여 추출하였다. RNA의 순도와 무결성은 A₂₆₀/A₂₈₀ 비율을 측정함으로써 확인하였고, 섬유아세포로부터 추출된 총 RNA 1μ을 RT-PCR 키트(AccuPower^TM RT-PCR Premix, Bioneer, Korea)를 이용하여 역전사시켰고, 생성된 cDNA는 하기의 프라이머들을 이용하여 증폭시켰다:

TIMP-1(481 bp product)

포워드: 5'-CCGTCCACAAGCAATGAGT-3'(서열번호 1)

리버스: 5'-CCGTCCACAAGCAATGAGT-3'(서열번호 2)

트로포엘라스틴(288 bp product)

포워드: 5'-AAAGCAGCAGCAAAGTTCGG-3'(서열번호 3),

리버스: 5'-ACCTGGGACAACTGGAATCC-3'(서열번호 4);

GAPDH(546 bp product)

포워드: 5'-ATTGTTGCCATCAATGACCC-3'(서열번호 5),

리버스: 5'-AGTAGAGGCAGGGATGATGT-3'(서열번호 6).

PCR 산물은 1.5% 아가로스 겔(agarose gel)에서 전기영동하고 브롬화 에티디움(ethidium bromide)으로 염색하여 자외선 아래에서 관찰하였다.

그 결과 도 3의 A에 도시된 바와 같이, TIMP-1의 발현이 TMM의 농도 의존적인 양상으로 증가하였고, 도 3의 B에 도시된 바와 같이, 트로포엘라스틴 역시 농도의존적인 양상으로 발현이 증가함을 알 수 있었다.

웨스턴블랏 분석의 경우, 0, 1, 10 및 100 μg/ml의 TMM으로 72시간 동안 처리한 섬유아세포를 세포파쇄액(150 mM sodium, chloride, 1.0% NP-40, 50 mM Tris, pH 8.0)으로 분쇄하여, 10% 폴리아크릴아마이드 겔 상에서 전기영동을 수행한 후, 니트로셀룰로오스막에 전기적으로 전이시켰다. 단백질이 전이된 니트로셀룰로오스막을 차단용액(TBST에 용해된 5% 무지방 분유)으로 차단한 후, 항-TIMP-1 마우스 항체(1:200, Abcam Inc., USA)로 1차 처리하였다. 1차항체가 처리된 막을 세척하고, HRP-결합 항-마우스 토끼 2차항체(Santa Cruz Biotechnolopgy, USA)를 처리한 후 세척하였다. 세척이 완료된 막에 HRP 발색시약인 SuperSignal West Pico chemiluminescence substrate(PIERCE Biotechnology Inc., Rockford, IL, USA)를 처리하여 발색반응을 유도하였다.

그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 단백질 수준에서도 농도의존적인 TIMP-1의 증가양상을 확인할 수 있었다.

아울러, 상기에서 확인된 트로포엘라스틴의 발현 증가가 mRNA 수준에서 그치는 것이 아니라, 단백질 수준에서도 일어나는 현상인지 확인하기 위해, 본 발명자들은은 면연세포화학분석(immunocytochemistry)을 통해, 섬유아세포에서의 트로포엘라스틴의 발현 양상을 분석하였다. 구체적으로, 5ㅧ10⁴의 섬유아세포를 poly-L-lysine(0.01%, Sigma-Aldrich, USA)으로 사전 코팅된 글래스커버 슬립 상에 분주하여 24시간 동안 배양하였다. 그런 후 상기 세포를 4% 파라포름알데히드로 상온에서 30분간 고정한 후, 세포들은 PBS로 세척하고 0.01% Triton X-100(Sigma-Aldrich, USA)으로 10분간 처리하였다. 그런 다음 세포들은 5% 우혈청 알부민(BSA, Sigma-Aldrich, USA)로 30분간 차단시킨 후, 1:100으로 희석된 토끼 항-트로토엘라스틴 항체(Abcam Inc., USA)로 4℃에서 밤새 반응시켰다. 반응이 끝난 후, 세포를 세척하고 FITC-표지 항-토끼 IgG 염소 이차항체(Santa Cruz Biotechnology, USA)로 2시간 동안 반응시킨 후 1μg/ml의 DAPI(4,6-diamino-2-phenylidole, PIERCE Biotechnology Inc., USA)로 10분간 핵을 염색하여, 형광현미경을 통해 관찰하였다.

그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, TMM 비처리 대조군에 비해, TMM을 100 μg/ml로 처리한 섬유아세포에서 트로포엘라스틴의 발현이 증가됨을 확인할 수 있었다.

따라서, 상기 결과는 TMM 처리 세포에서 TIMP-1 및 트로포엘라스틴의 발현의 증가라는 우리의 관찰결과를 뒷받침하며, 이로부터 이러한 현상이 섬유아세포에서 MMP의 하향조절에 의해 매개됨을 시사하는 것이다.

상술한 모든 실험은 3회 이상 반복하여 평균값과 표준오차를 구하고 Student's t-테스트에 의해 p-값이 0.05 미만인 경우 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.

본 발명은 상술한 실시예 및 실험예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.

<110> NOVACELL TECHNOLOGY INC. <120> Anti-wrinkle pharmaceutical and cosmetic composition <130> PD12-0606 <160> 6 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Foward primer for TIMP-1 <400> 1 ctgttgttgc tgtggctgat a 21 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for TIMP-1 <400> 2 ccgtccacaa gcaatgagt 19 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Foward primer for tropoelastin <400> 3 aaagcagcag caaagttcgg 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for tropoelastin <400> 4 acctgggaca actggaatcc 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for GAPDH <400> 5 attgttgcca tcaatgaccc 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for GAPDH <400> 6 agtagaggca gggatgatgt 20

Claims

송이버섯 추출물을 유효성분으로 함유하는 주름개선용 의약 조성물.
제1항에 있어서,
상기 송이버섯 추출물은 송이버섯 균사체 추출물인, 주름개선용 의약 조성물.
제1항에 있어서,
상기 송이버섯 추출물은 물, C1-C4의 저급알코올 또는 상기 저급알코올의 수용액을 용매로 하여 추출된 것인, 주름개선 의약 조성물.
송이버섯 추출물을 유효성분으로 함유하는 주름개선용 화장료 조성물.
제4항에 있어서,
상기 송이버섯 추출물은 송이버섯 균사체 추출물인, 주름개선용 화장료 조성물.
제4항에 있어서,
상기 송이버섯 추출물은 물, C1-C4의 저급알코올 또는 상기 저급알코올의 수용액을 용매로 하여 추출된 것인, 주름개선용 화장료 조성물.
대상에게 약학적으로 유효한 양의 제1항의 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 상기 대상의 피부 주름 개선 또는 예방방법이 제공된다.
대상의 피부에 상기 화장료 조성물을 도포하는 단계를 포함하는 상기 대상의 피부 주름 개선 또는 예방을 위한 미용방법.