KR102202391B1 - 상처 치유 및 피부 병변 회복을 위한 알라닌-글루타민, 히알루론산, 귀리 추출물의 상승적 조합 및 조성물로서의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 바람직하게는 상처 치유 및 피부 병변 회복을 위한 디펩티드 L-알라닐-L-글루타민, 히알루론산 또는 이의 염 및 귀리 추출물을 포함하는 조합물에 관한 것이다.

Description

상처 치유 및 피부 병변 회복을 위한 알라닌-글루타민, 히알루론산, 귀리 추출물의 상승적 조합 및 조성물로서의 용도 {SYNERGISTIC COMBINATION OF ALANINE-GLUTAMINE, HYALURONIC ACID AND AN OAT EXTRACT AND THE USE THEREOF IN A COMPOSITION INTENDED FOR HEALING WOUNDS AND REPAIRING SKIN LESIONS}

본 발명은 바람직하게는 상처 치유 및 피부 병변 회복을 위한 디펩티드 L-알라닐-L-글루타민, 히알루론산 또는 이의 염 및 귀리 추출물을 포함하는 상승적 조합에 관한 것이다.

치유는 공격: 상처, 화상, 피부 작용, 외과 수술 이후 발생되는 일련의 국소적 방어 현상이다. 효소, 다양한 단백질, 히스타민 등 혈액과 조직으로부터의 많은 활성 물질은 이러한 현상 중에 방출된다. 치유는 혈액 응고, 출혈 중지가 제1 단계인 여러 단계를 포함한다. 혈액에서 백혈구가 죽은 세포를 제거한다. 다음 생존 세포는 증식되고 새로운 조직을 야기하는데, 외관은 병변의 위치에 따라 달라진다.

치유는 특히 영양, 대사, 내분비 또는 약물 등 많은 요인에 따라 달라진다; 영양 실조 또는 노인 환자의 경우 또는 장기간 코르티코이드를 섭취하는 경우 치유가 늦어진다. 연령에 따라, 피부 병변의 치유와 회복 개선 과정은 덜 효과적이고 진행이 더욱 느려진다.

피부 손상에 대한 신속하고 미적 회복을 위한 새로운 조성물을 제공할 필요성은 여전히 존재한다.

문헌에 기재된 경구 투여 디펩티드 L-알라닐-L-글루타민의 약리학적 특성들이 다양하다.

그 중에서도, 디펩티드 L-알라닐-L-글루타민은 운동 후 선수 회복을 돕기 위해 및 수술 후의 입원 기간을 줄이기 위해 경구 보충제로 사용된다.

또한 상기 디펩티드는 글루타민 공급을 필요로 하는 중환자의 정맥 영양제에 사용되는 표준 아미노산 용액 또는 다른 혼합물에 대한 보충제로 정맥 영양제로 추천된다.

실제로, 상피 세포의 이동은 배발생 및 치유와 같은 중요한 조직 회복의 진행 및 과정 단계이다.

세포 이동의 개시, 조정 및 중지 기작은 완전히 이해되지 않지만, 세포 이동의 주된 역할은 잘 확립되어 있다.

이러한 세포 과정을 자극할 수 있는 여러 조제 예컨대 특정 매트릭스 (matricial) 또는 세포질 단백질이 특정화되었다 SANTORO MM., GAUDINO G., Cellular and molecular facets of keratinocyte reepithelization during wound healing. EXP. CELL. RES. 304(1): 274-286, 2005) (WERNER S., GROSE R. Regulation of wound healing by growth factors and cytokines. PHYSIOL. REV. 83(3): 835-870, 2003) (STEFFENSEN B., AKKINEN L., LARIAVA H. Proteolytic events of wound healing-coordinated interactions among matrix metallopteinases (MMPs), integrins, and extracellular matrix molecules. CRIT. REV. ORAL BIOL. MED. 12(5): 373-398, 2001).

만성적 피부 염증 상태에서 상처 치유 동안에, 각질 세포는 "활성화"되어 이동 프로세스를 시작한다. 이후 세포는 한편으로는 세포외 기질과의 상호작용에 의해 다른 한편으로 세포-세포 상호작용에 의해 영향을 받는 표현형을 참조한다. (MCMILLAN J.R., AKIYAMA M., SHIMIZU H. Epidermal basement membrane zone component: ultrastructural distribution and molecular interactions. J DERM SC. 31:169-177, 2003).

상처 층의 기저 층 각질세포는 상처로 이동하고 이를 덮는다. 실제로, 각질세포는 피브로넥틴, 피부 사이 콜라겐 (유형 1), 콜라겐 IV와 기저 라미나의 라미닌 5와 접촉하여 활성된다. 이들은 또한 TGFβ, TGFα 및 EGF와 같은 특정 폴리펩티드 성장 인자에 의해 조절된다. 또한 사이토카인 (IL1, TNFα) 및 케모카인 (RANTES 및 IL8)은 각질 세포 활성화 이후, 상처의 재 상피화 속도 증가에 기여한다 (SZABO I., WETZEL M.A., ROGERS TJ. Cell-Density-Regulated Chemotactic Responsiveness of Keratinocytes In Vitro. J INVEST DERMATOL 117:1083-1090, 2001).

본 발명에서, 본 발명자들은 놀랍게도 국소 경로로 사용되는 디펩티드 L-알라닐-L-글루타민은 재생 특성: 각질 세포에 이동 작용에 기초하여 피부에 대한 생물학적 활성을 가지고 있음을 보였다.

또한, 본 발명자들은 디펩티드가 귀리 추출물, 히알루론산과 조합될 때 활성이 크게 증폭되는 것을 보였다.

특히, 본 발명자들은 귀리 추출물, 보다 구체적으로 귀리 모종 (seedling) 추출물, 히알루론산 또는 이의 염, 및 L-알라닐-L-글루타민인 세 가지 구성 요소 사이의 각질 세포 이동에 대한 상승 효과의 존재를 입증하였다.

이러한 활성은 조직 재생 및 피부 병변의 치유에 특히 유리하다.

도면은 각질 세포 이동에 대한 귀리 모종 추출물 / 히알루론산 및 L-알라닐-L-글루타민 및 이들 조합물 효과를 나타낸 것이다.

본 발명은 L-알라닐-L-글루타민, 히알루론산 또는 이의 염 및 귀리 추출물을 포함하는 배합물에 관한 것이다.

용어 "L 알라닌"이란 α-아미노프로피온산으로도 알려진 (S)-2-아미노프로피온산을 말한다. L-알라닌은 약간의 무극성 및 소수성의 중성 아미노산이다.

용어 "L-글루타민"은 2-글루타람산을 의미한다. L 글루타민은 준-필수 아미노산, 비-대전된 극성 및 친수성 아미노산이다.

본 발명의 특정 실시예에서, 조합물은 고분자량의 히알루론산 또는 이의 염을 포함한다. 바람직하게는, 분자량이 50,000 내지 750,000 Da, 바람직하게는 250,000 내지 450,000 Da이다.

히알루론산 염은 바람직하게는 히알루론산나트륨이다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 히알루론산염 분자량은 50,000 내지 750,000 Da, 바람직하게는 250,000 내지 450,000 Da이다.

본 발명의 일 실시예에서, 바람직하게는 WO 2010/054879에 기재된 바와 같이 귀리 추출물 귀리 모종에서 얻어진다.

"귀리 모종"이란 본 발명에서, 출수 전 즉 발아 후 단계 (발아 후 약 2주 내지 2 개월)를 의미하며 줄기 신장의 단계에서 출수까지를 제외한다. "줄기 신장"이란 개화 전에 줄기 신장 및 이삭이 올라오는 성상기를 의미한다. 귀리 모종의 추출물의 구성 요소로 특허출원 WO2010/054879에 이차 대사 산물이 설명되고: 플라보노이드 및 아베나코시드 유형의 사포닌. 상기 추출물은 2~15% 플라보노이드 및 A 및 B 아베나코시드 0.2~2 %의 존재에 의해 특정된다.

귀리 추출물의 제조 방법은 다음과 같다:

- 귀리 일부, 바람직하게는 귀리 모종 건조 및 분쇄

- 케톤, 에스테르, C1-C4 알코올 및 이러한 용매의 임의의 비율로 혼화되는 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 유기 용매에서 추출, 및

- 원심 분리 또는 여과.

바람직하게는, 본 발명 방법의 유기 용매는 아세톤, 메틸 에틸 케톤, 메틸 이소부틸 케톤, 에틸 아세테이트, C1-C4에 알코올 및 이러한 용매의 임의의 비율로 혼화되는 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된다.

추출 단계로부터 얻어지는 찌꺼기는 원심 분리 또는 여과에 의해 추출물로부터 분리하고, 건조 추출물을 획득할 때까지 용액을 농축한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 지지체 (support)는 추출 건조물에 대하여 질량 비율로 1-75%까지 건조 공정 중에 첨가될 수 있다. 지지체는 당 예컨대 말토덱스트린, 락토오스, 실리카 또는 기타 화장용으로 허용 가능한 담체일 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시예에서, 용액을 농축하여 60-80%의 건조 물질 및 바람직하게는 70 % 건조 물질을 포함하는 워트 (wort)를 수득한다.

본 발명의 특정 실시예에서, 본 발명에 의한 조합물의 히알루론산 / 귀리 추출물 / L-알라닐-L-글루타민 중량비는 각각 2/1/3 내지 2/1/5이다.

다른 실시예에서, 히알루론산, 귀리 모종 추출물 및 L-알라닐-L-글루타민의 중량비가 각각 2/1/4이다.

다른 바람직한 실시예에서, 본 발명에 따른 조성물은 히알루론산 / 귀리 모종 추출물/ L-알라닐-L-글루타민을 각각 2/1/4 비율로 포함한다.

본 발명의 또 다른 목적은 피부의 무결성과 품질을 복원하기 위하여 피부 회복을 촉진하는 신규 한 화장품 또는 피부과 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 따른 조성물은 피부 또는 화장품 활성 성분으로 상기 히알루론산, 귀리 추출물 및 L-알라닐-L-글루타민의 조합물을 포함하고 하나 이상의 피부과 또는 화장품에 허용되는 부형제를 포함한다.

본 발명의 바람직한 실시예에서, 조성물은 국소 적용된다.

피부학적 (약학적) 또는 화장품에서 적용되는 부형제는 밀크, 크림, 연고, 오일, 로션, 젤, 거품 젤, 고약, 스프레이 등의 형태로 국소 도포 조성물을 얻기 위해 당업자에게 공지된 것 중에서 임의의 부형제가 될 수 있다.

바람직한 실시예에서, 상기 조성물은 크림, 연고의 형태일 것이다.

일 실시예에서, 본 발명에 따른 조성물은 하나 이상의 다른 활성 성분을 포함한다.

본 발명에 있어서, "활성 성분"이란 피부학적 또는 화장품 특성을 가지는 임의의 물질이다.

이러한 다른 활성 성분, 특히 치유제, 진정제, 항소양제, 노화-방지제, 주름-방지제, 자유 라디칼, 항-UV제, 진피 거대분자 합성 또는 에너지 대사 자극제, 보습제, 항균제, 항진균제, 소염제, 마취제로 우리어진 군으로부터 선택될 수 있다.

바람직하게는, 치유제 및/또는 진정제가 사용된다.

마지막으로, 본 발명의 다른 목적은 피부 병변의 치료 및 치료를 위한 히알루론산, 귀리 추출물 및 L-알라닐-L-글루타민의 조합에 기초한 조성물의 용도에 관한 것이다.

본 발명은, 각질 세포 이동을 촉진시키기 위한 조성물의 제조를 위한 본 발명에 따른 히알루론산, 귀리 모종 추출물 및 L-알라닐-L-글루타민의 조합물에 관한 것이다.

본 발명에 따른 조성물은 손상 피부의 치료를 위한 것이다:

- 침습적 행위 / 치료: 봉합, 냉동 요법, 레이저 절제, 중간 또는 강한 박피, 주사 요법, 소파술 유무에 관계없이 외과적 수술 (절제, 면도) 후.

- 표면 상처 또는 화??상에 외상 후.

- (피부 회복을 완료까지), 피부 회복을 촉진하는, 장기 사용되는 치료 제품을 필요로 하는 표면 작용 (비 침습적) 후.

- 약간의 외형 변형, 표피 손상, 일광 화상 후.

본 발명에 의한 피부 및 점막 병변 치료는 특히 상처, 봉합, 찰과상, 긁힌 자국, 박리, 수술 흉터 또는 피부 성형 수술 행위, 표피 화상, 일광 화상의 치료를 포함할 수 있다,

본 발명은 또한 피부 치료 및 회복을 개선하기 위한 본 발명에 따른 화장 조성물의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 범위를 제한하지 않는 하기 예시를 독해하면 더욱 이해될 것이다.

각질 세포의 이동에 대한 약리학적 평가

본 시험의 목적은 각질 세포의 이동에 히알루론산, 귀리 모종의 추출물, L-알라닐-L-글루타민 및 이들의 조합물 효과를 평가하는 것으로 Oris Cell Migration Assay kit (Platypus Technologies)를 사용하였다.

생물학적 재료

문헌에서 참조 모델로 자주 언급되는 자발적 불멸화 HaCaT 인간 각질 세포주를 사용하였다.

세포 이동 프로토콜

세포 이동 연구에 사용되는 프로토콜은 세포 과정의 소형화 및 정량화가 가능한 - 96 웰 키트, Oris Cell Migration Assay (Platypus technologies - TEBU)를 사용하였다.

본 시험의 원리는 96 웰 플레이트의 중심을 향하는 세포 이동을 연구하는 것이다. 2mm 직경의 검출 영역을 만들기 위하여 웰 스토퍼를 배치한다. 이어서 세포가 주위 표면에 부착했을 때 스토퍼를 제거하고 세포가 검출 영역으로 이동할 수 있도록 한다. 스토퍼 없이 활성 성분들을 함유한 플레이트를 37 °C에서 24 시간 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) 0% FCS (소 태아 혈청)에서 배양하였다. 스토퍼가 있었던 영역에서 세포의 양은 세포의 이동을 평가하기 위해 분석된다. 마스크를 이용하여 이 영역에 세포를 관찰하고 계수한다. 각 조건에서, 평균은 약 6 ~ 8 웰에서 결정된다.

세포는 무-FCS 배지에서 배양하였다.

생성물 시험

- EGF: 33 ng / ㎖,

- 귀리 모종 추출물: 10 또는 30 ㎍ / ㎖,

추출물의 제조:

추출 용매 아세톤 / 물 (80/20) 100 ㎖로 분쇄 모종의 10g을 추출 (V / V).

여과 및 찌꺼기를 추출 용매로 세척.

아세톤을 증발시키고 수성 상을 취함.

여과. 건조에 의한 농축으로 건조 추출물을 수득.

- 히알루론산나트륨 (MW 250 내지 450 kDa): 20 또는 60 ㎍ / ㎖,

- L-알라닐-L-글루타민: 40 또는 90g / ㎖.

결과 분석

결과는 다음과 같이 표현된다:

- 이동된 세포의 양에 비례하는 형광 강도 (FI)에서.

- 대조 0 % FCS에 대한 상대 백분율로.

FI처리

------------------- X (100)

FI 대조 0% FCS

통계 분석

Dunnett 시험에 의한 통계 분석은 원시 이동 값에 대하여 수행하였다. 본 시험은 다른 조건에 대해 얻어진 결과의 유의성을 나타내는 "P 값"을 준다. 유의 수준을 설정하였다:

p <0.05 (* 유의)

P <0.01 (** 아주 유의)

P <0.001 (*** 매우 유의)

P> 0.05 (유의하지 않음).

결과

단독으로 또는 조합하여 각질 세포 이동에 대한 귀리 모종 추출물, 히알루론산 및 L-알라닐-L-글루타민의 상이한 농도 결과를 표 1 및 2와 하나의 도면에 나타낸다. 본 그래프에 나타낸 형광 강도 값은 독립적인 3회 조작의 대표적인 실험 과정에서 6-8 회 측정된 값의 평균에 해당한다.

DMEM의 존재 및 0 % FCS에서, EGF 실험의 양성 대조군은 각질 세포 이동을 유도한다. 이러한 실험 조건 하에서, 귀리 모종 추출물 (10 또는 30 ㎍ / ㎖) 단독 및 히알루론산염 (20 또는 60 ㎍ / ㎖) 단독으로는 각화 세포의 이동에 유의한 영향을 미치지 않았다. 한편 이들 조합물은 이동 증가 추세를 보인다: 시험 농도에 따라 대조군 대비 + 45 % 또는 +27 % (표 1 및 2).

L-알라닐-L-글루타민 단독으로 농도 의존적으로 각질 세포 이동을 유도한다. 이러한 유도는 양성 대조군 EGF보다 더욱 중요하다. 3 활성 성분들의 조합은 - 귀리 모종 추출물, 히알루론산 및 L-알라닐-L-글루타민 - 매우 중요하고 통계적으로 유의한 방식으로 각질 세포 이동을 유도한다. 표 1 및 표 2 및 도 1은 이러한 조합이 대조군에 비해 통계적으로 유의하지만, 이들은 또한 귀리 모종 추출물 및 히알루론산 단독으로 또는 이들의 조합과 비교하여도 통계적으로 유의하다.

도 1은 각질 세포 이동에 대한 귀리 모종의 건조 추출물 (ES), 히알루론산 (AH), L-알라닐-글루타민 (Ala-Glu) 및 이들 조합의 효과를 나타낸다. 백분율은 대조군에 비해 추가 활성 비율에 해당된다.

표 1: 귀리 모종의 건조 추출물 (ES), 히알루론산 (HA), L-알라닐-L-글루타민 (A-G) 및 이들 조합의 각질 세포 이동에 대한 영향.

SD: 표준 편차, ** P < 0.01 대 대조군.

그룹	농도	평균 ± SD	% 이동
대조		1850 ± 504	100
EGF	33 ng/ml	2569 ± 554	216
귀리 모종 건조 추출물 (ES)	10 μg/ml	1748 ± 681	84
히알루론산 (AH)	20 μg/ml	1939 ± 438	114
알라닐 글루타민 (Ala-Glu)	40 μg/ml	2471 ± 788	200
ES + AH	10 + 20 μg/ml	2129 ± 190	145
ES + AH + A-G	10 + 20 + 40 μg/ml	4211 ± 541	480 **

표 2: 귀리 모종의 건조 추출물 (ES), 히알루론산 (HA), L-알라닐-L-글루타민 (A-G) 및 이들 조합의 각질 세포 이동에 대한 영향.

SD: 표준 편차, * P < 0.05, **p < 0.01 대 대조군.

그룹	농도	평균 ± SD	% 이동
대조		1729 ± 384	100
EGF	33 ng/ml	3553 ± 1556	301 *
ES	30 μg/ml	1386 ± 226	62
AH	60 μg/ml	1735 ± 488	101
A-G	90 μg/ml	2586 ± 1092	194
ES + AH	30 + 60 μg/ml	1152 ± 541	127
ES + AH + A-G	30 + 60 + 90 μg/ml	2877 ± 1024	317 **

따라서, 귀리 모종 추출물, 히알루론산 또는 이의 염 및 L-알라닐-L-글루타민의 조합은 상승적으로 각질 세포의 이동을 증가시킨다. 이러한 결과는 화장품 또는 피부과 치료에 이러한 조합물 사용이 가능하다는 것을 확인한 것이다.

조성물 예시: 수중유 에멀젼

		비율	기능
수성 상	물	QS100%
	아세톤으로 추출, 여과, 및 70%의 건조 물질의 워트가 수득될 때까지 농축하여 얻은 귀리 추출물	0.1 - 3%	활성 성분
	분자량 250-400kDa의 히알루론산나트륨	0.05 - 1%	활성 성분
	L-알라닐-L-글루타민	0.1 - 1%	활성 성분
	글리세린	1 - 30%	보습제
	헥실렌 글리콜	0.1 - 7%	글리콜
오일 상	세테아릴 글루코시드	0.1 - 1%	유화제
	세테아릴 알코올	0.9 - 4%	유화제
	스테아르산	0.5 - 4%	점조인자
	글리세릴 스테아레이트	0.1 - 4%	점조인자
	식물 오일	0.1 - 10%	연화제
	부티로스페르뭄 파르키 (Butyrospermum Parkii) (쉐어) 버터	0.1 - 10%	연화제
	실리콘	0.1 - 5%	연화제

Claims (11)

1. L-알라닐-L-글루타민, 히알루론산 또는 이의 염 및 귀리 추출물을 포함하고, 상처, 봉합, 찰과상, 긁힌 자국, 박리, 수술 흉터 또는 피부 성형 의료 행위, 표피 화상, 일광 화상 치료용인, 조합물.
2. 제 1 항에 있어서, 히알루론산은 히알루론산나트륨 염 형태인 것을 특징으로 하는, 조합물.
3. 제 2 항에 있어서, 히알루론산 염의 분자량이 50,000 내지 750,000 Da 인 것을 특징으로 하는, 조합물.
4. 제 1 항에 있어서, 귀리 추출물은 귀리 모종 (seedling)으로부터 획득되는 것을 특징으로 하는, 조합물.
5. 제 4 항에 있어서, 히알루론산 / 귀리 모종 추출물 / L-알라닐-L-글루타민 중량비는 2/1/3 내지 2/1/5인 것을 특징으로 하는, 조합물.
6. 제 5 항에 있어서, 히알루론산 / 귀리 모종 추출물 / L-알라닐-L-글루타민 중량비는 2/1/4 인 것을 특징으로 하는, 조합물.
7. 제 1 항에 있어서, 각질 세포 이동을 촉진하기 위하여 국소 적용되는, 조합물.
8. 제 1 항에 있어서, 피부 병변을 치료하기 위하여 국소 적용되는, 조합물.
9. 제 1 항에 있어서, 피부 치유와 회복 개선을 위하여 국소 적용되는, 조합물.
10. 활성 성분으로 제1항에 의한 조합물과, 피부학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하고, 상처, 봉합, 찰과상, 긁힌 자국, 박리, 수술 흉터 또는 피부 성형 의료 행위, 표피 화상, 일광 화상 치료용인, 피부과 조성물.
11. 활성 성분으로 L-알라닐-L-글루타민, 히알루론산 또는 이의 염 및 귀리 추출물을 포함하는 조합물과, 화장용으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 화장품 조성물.

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