KR20200074102A - Crispr 이펙터 시스템 기반 진단법 - Google Patents
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Abstract
본원에 제공되는 것은 측류 진단 장치 및 그 사용 방법이다. 장치는 기판 및 제 1 말단부를 포함하며, 제 1 말단부는 샘플 로딩 부분을 포함한다. 제 1 말단부는 검출가능한 리간드, CRISPR 이펙터 시스템, 검출 구성체, 비오틴 리간드를 포함하는 제 1 시험 밴드, 및 검출가능한 리간드에 대한 포획 분자를 포함하는 제 2 시험 밴드를 로딩한 제 1 영역을 추가로 포함할 수 있다. 검출 구성체는 제 1 말단부에 제 1 분자, 예컨대 FITC 및 제 2 말단부에 제 2 분자, 예컨대 FAM 을 갖는, RNA 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 샘플 로딩 부분을 샘플과 접촉시키는 것은 샘플이 기판의 샘플 로딩 부분으로부터 제 1 및 제 2 포획 영역을 향해 흐르게 하여, 검출가능한 신호를 생성하며, 이는 질환 상태의 지표이다.
Description
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2017 년 10 월 4 일에 출원한 미국 가출원 제 62/568,309 호; 2017 년 12 월 22 일에 출원한 미국 가출원 제 62/610,144 호; 2018 년 1 월 29 일에 출원한 미국 가출원 제 62/623,529 호; 및 2018 년 2 월 14 일에 출원한 미국 가출원 제 62/630,787 호를 우선권으로 주장한다. 상기 확인된 출원의 전체 내용은 참조로 완전히 본 명세서에 편입된다.
주정부 지원 연구에 관한 진술
본 발명은 미국 국립 보건원에서 수여하는 보조금 번호 MH110049 및 HL141201 하의 정부 지원으로 수행되었다. 정부는 본 발명에 대해 특정 권리를 갖는다.
기술 분야
본 명세서에 개시된 주제는 일반적으로 CRISPR 이펙터 시스템의 용도와 관련된 신속한 진단에 관한 것이다.
핵산은 생물학적 정보의 보편적인 특징이다. 휴대용 플랫폼 상에서 높은 감도와 단일-염기 특이도로 핵산을 신속하게 검출하는 능력은 수많은 질환에 대한 진단 및 모니터링을 혁신시시키고, 소중한 역학 정보를 제공하며, 일반화할 수 있는 과학 도구로서 역할을 하게 될 잠재력을 갖는다. 많은 방법들이 핵산을 검출하기 위해 개발되었지만 (Du et al., 2017; Green et al., 2014; Kumar et al., 2014; Pardee et al., 2014; Pardee et al., 2016; Urdea et al., 2006), 그들은 부득이하게 감도, 특이도, 간소함, 및 속도 간에 상호 절충을 겪게된다. 예를 들어, qPCR 접근법은 민감하지만 값비싸고 복잡한 장비에 의존하여, 실험실 상황에서 고도로 숙련된 작업자에게만 사용성이 제한된다. 휴대용 플랫폼과 등온 핵산 증폭을 조합한 신규 방법과 같은 다른 접근법들 (Du et al., 2017; Pardee et al., 2016)은 현장 진단 (POC) 상황에서 높은 검출 특이도를 제공하지만, 어느 정도 낮은 감도로 인해 제한된 적용성을 갖는다. 핵산 진단이 다양한 의료 적용분야와 관련성이 점차로 증가되고 있으므로, 저비용에서 높은 특이성 및 감도를 제공하는 검출 기술은 임상 및 기초 연구 상황 둘 모두에서 상당한 유용성을 가지게 될 것이다.
요약
하나의 양상에서, 본 발명은 기판을 포함하는 측류 장치를 제공한다. 기판은 제 1 말단부를 포함할 수 있고, 제 1 말단부는 샘플 로딩 부분을 포함한다. 제 1 말단부는 검출가능한 리간드, CRISPR 이펙터 시스템, 검출 구성체, 비오틴 리간드를 포함하는 제 1 시험 밴드, 및 검출가능한 리간드에 대한 포획 분자를 포함하는 제 2 시험 밴드를 로딩한 제 1 영역을 추가로 포함할 수 있다. 검출 구성체는 제 1 말단부에 제 1 분자 및 제 2 말단부에 제 2 분자를 갖는, RNA 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 제 1 분자는 FITC 일 수 있고 제 2 분자는 FAM 일 수 있다.
측류 장치는 RNA 또는 DNA 링커에 의해 연결된 제 1 분자 및 제 2 분자를 포함하는 절단가능한 리포터 구성체를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 제 1 분자는 FITC 일 수 있고 제 2 분자는 비오틴일 수 있거나, 반대도 가능하다. 측류 장치는 제 1 포획 영역을 추가로 포함할 수 있으며, 일부 실시형태에서 장치를 가로 질러 연장되는 제 1 수평선일 수 있다. 특정 실시형태에서, 제 1 포획 영역은 샘플 로딩 부분으로서 측류 기판의 동일한 말단부 상에 그리고 그곳에 근접하고, 리포터 구성체의 제 1 분자에 특이적으로 결합하는 제 1 결합제를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 제 1 결합제는 예를 들어 제 1 포획 영역에 고정되거나 다르게는 부동화된 항-FITC 항체와 같은 항체일 수 있다. 측류 장치는 일부 실시형태에서 제 1 결합 영역으로부터 측류 기판의 반대 말단부를 향해 위치되는 제 2 포획 영역을 추가로 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 제 2 포획 영역은 리포터 구성체의 제 2 분자에 특이적으로 결합하는 제 2 결합제를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 제 2 결합제는 예를 들어 제 2 포획 영역에 고정되거나 다르게는 부동화된 항-비오틴 항체와 같은 항체일 수 있다.
일부 실시형태에서, 검출가능한 리간드는 제 1 항체로 변형될 수 있는 금 나노입자일 수 있다. 구체적인 실시형태에서, 제 1 항체는 항-FITC 항체일 수 있다. 일부 실시형태에서, CRISPR 이펙터 시스템은 CRISPR 이펙터 단백질 및 하나 이상의 표적 서열에 결합하도록 구성된 하나 이상의 가이드 서열을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 기판은 예를 들어 종이 기판 또는 가요성 중합체 기재 기판과 같은 가요성 재료 기판일 수 있다.
특정 예시 실시형태에서, CRISPR 이펙터 단백질은 RNA-표적화 이펙터 단백질일 수 있다. 특정 실시형태에서, RNA 표적화 이펙터 단백질은 Cas13 일 수 있다. 특이적 실시형태에서, Cas13 은 Cas 1 유전자의 20 kb 이내에 존재할 수 있다. Cas13 이펙터 단백질은 하기로 이루어진 그룹에서 선택된 속의 유기체일 수 있다: 렙토트리키아 (Leptotrichia), 리스테리아 (Listeria), 코리네박터 (Corynebacter), 수테렐라 (Sutterella), 레지오넬라 (Legionella), 트레포네마 (Treponema), 필리팍토르 (Filifactor), 유박테리움 (Eubacterium), 스트렙토코커스 (Streptococcus), 락토바실러스 (Lactobacillus), 마이코플라스마 (Mycoplasma), 박테로이데스 (Bacteroides), 플라비이볼라 (Flaviivola), 플라보박테리움 (Flavobacterium), 스파에로차에타 (Sphaerochaeta), 아조스피릴럼 (Azospirillum), 글루콘아세토박터 (Gluconacetobacter), 네이세리아 (Neisseria), 로세부리아 (Roseburia), 파르비바큘럼 (Parvibaculum), 스타필로코커스 (Staphylococcus), 니트라티프락토 (Nitratifractor), 마이코플라스마 (Mycoplasma), 캄필로박터 (Campylobacter), 및 라크노스피라 (Lachnospira). 특이적 실시형태에서, C2c2 또는 Cas13b 이펙터 단백질은 하기로 이루어진 그룹에서 선택된 유기체로부터 유래될 수 있다: 렙토트리키아 샤히; 렙토트리키아 웨이데이 (Lw2); 리스테리아 실리게리; 라크노스피라과 박테리아 MA2020; 라크노스피라과 박테리아 NK4A179; [클로스트리듐] 아미노필럼 DSM 10710; 카르노박테리움 갈리나럼 DSM 4847; 카르노박테리움 갈리나럼 DSM 4847 (제 2 CRISPR 유전자좌); 팔루디박터 프로피오니시게네스 WB4; 리스테리아 웨이헨스테파넨시스 FSL R9-0317; 리스테리아과 박테리아 FSL M6-0635; 렙토트리키아 웨이데이 F0279; 로도박터 캡슐라터스 SB 1003; 로도박터 캡슐라터스 R121; 로도박터 캡슐라터스 DE442; 렙토트리키아 부칼리스 C-1013-b; 허르비닉스 헤미셀룰로실리티카; [유박테리움] 렉탈레; 유박테리아과 박테리아 CHKCI004; 블라우티아 sp. 마르세이유-P2398; 및 렙토트리키아 sp. 경구 분류군 879 str. F0557. 12 개의 추가의 비제한적인 예는 다음과 같다: 라크노스피라과 박테리아 NK4A144; 클로로플렉서스 아그레간스; 데메퀴나 아우란티아카; 탈라소스피라 sp. TSL5-1; 슈도부티리비브리오 sp. OR37; 부티리비브리오 sp. YAB3001; 블라우티아 sp. 마르세이유-P2398; 렙토트리키아 sp. 마르세이유-P3007; 박테로이데스 이후아에; 포르피로모나다과 박테리아 KH3CP3RA; 리스테리아 리파리아; 및 인솔리티스피릴럼 페레그리넘. 예시적 실시형태에서, C2c2 이펙터 단백질은 L. 웨이데이 (L. wadei) F0279 또는 L. 웨이데이 F0279 (Lw2) C2c2 이펙터 단백질이다.
특정의 예시 실시형태에서, CRISPR-Cas 이펙터 단백질은 Cas12 단백질, 예컨대 Cpf1 또는 C2c1 일 수 있다.
특정의 예시 실시형태에서, 어세이 또는 장치는 복합 Cas 13 오솔로그, 복합 Cas12 오솔로그, 또는 Cas13 및 Cas12 오솔로그의 조합을 포함할 수 있다.
하나 이상의 가이드 서열은 하나 이상의 가이드 RNA 를 포함할 수 있는데, 이것은 질환 상태를 진단하는 하나 이상의 표적 분자에 결합하도록 디자인될 수 있다. 이러한 질환 상태는 암, 자가면역 질환, 감염, 장기 질환, 혈액 질환, 면역계 질환, 뇌 및 신경계 질환, 내분비 질환, 임신 또는 출산 관련 질환, 유전성 질환, 또는 환경적으로 획득된 질환을 포함할 수 있으나 반드시 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시형태에서, 질환 상태는 바람직하게는 병원체 또는 세포 중에, 항생제 또는 약제 저항성 또는 감수성 유전자 또는 전사물 또는 폴리펩티드의 존재 또는 부재를 특징으로 할 수 있다.
특정 실시형태에서 감염은 바이러스, 박테리아, 진균, 원충, 또는 기생충에 의해 초래될 수 있다. 감염이 바이러스성인 실시형태에서, 이것은 DNA 바이러스에 의해 초래될 수 있다. 특정 실시형태에서, DNA 바이러스는 미오바이러스과 (Myoviridae), 포도바이러스과 (Podoviridae), 시포바이러스과 (Siphoviridae), 알로헤르페스바이러스과 (Alloherpesviridae), 헤르페스바이러스과 (Herpesviridae) (인간 헤르페스 바이러스, 및 바리셀라 조스터 바이러스 포함), 말로코헤르페스바이러스과 (Malocoherpesviridae), 리포트릭스바이러스과 (Lipothrixviridae), 루디바이러스과 (Rudiviridae), 아데노바이러스과 (Adenoviridae), 암풀라바이러스과 (Ampullaviridae), 아스코바이러스과 (Ascoviridae), 아스파바이러스과 (Asfarviridae) (아프리카 돼지 열병 바이러스 포함), 배큘로바이러스과 (Baculoviridae), 시카우다바이러스과 (Cicaudaviridae), 클라바바이러스과 (Clavaviridae), 코르티코바이러스과 (Corticoviridae), 푸셀로바이러스과 (Fuselloviridae), 글로불로바이러스과 (Globuloviridae), 구타바이러스과 (Guttaviridae), 히트로사바이러스과 (Hytrosaviridae), 이리도바이러스과 (Iridoviridae), 마세이유바이러스과 (Maseilleviridae), 미미바이러스과 (Mimiviridae), 누디바이러스과 (Nudiviridae), 니마바이러스과 (Nimaviridae), 판도라바이러스과 (Pandoraviridae), 파필로마바이러스과 (Papillomaviridae), 피코드나바이러스과 (Phycodnaviridae), 플라스마바이러스과, 폴리드나바이러스, 폴리오마바이러스과 (Polyomaviridae) (원숭이 바이러스 40, JC 바이러스, BK 바이러스 포함), 폭스바이러스과 (Poxviridae) (우두 및 천연두 포함), 스파에롤리포바이러스과 (Sphaerolipoviridae), 텍티바이러스과 (Tectiviridae), 투리바이러스과 (Turriviridae), 디노드나바이러스, 살터프로바이러스 또는 리지도바이러스의 일원을 포함할 수 있으나, 반드시 이에 제한되지는 않는다.
바이러스 감염은 또한 이중-가닥 RNA 바이러스, 포지티브 센스 RNA 바이러스, 네거티브 센스 RNA 바이러스, 레트로바이러스, 또는 이의 조합에 의해 초래될 수 있다. 바이러스 감염은 추가로 코로나바이러스과 (Coronaviridae) 바이러스, 피코르나바이러스과 (Picornaviridae) 바이러스, 칼리시바이러스과 (Caliciviridae) 바이러스, 플라비바이러스과 (Flaviviridae) 바이러스, 토가바이러스과 (Togaviridae) 바이러스, 보르나바이러스과 (Bornaviridae), 필로바이러스과 (Filoviridae), 파라믹소바이러스과 (Paramyxoviridae), 뉴모바이러스과 (Pneumoviridae), 라브도바이러스과 (Rhabdoviridae), 아레나바이러스과 (Arenaviridae,), 부니아바이러스과 (Bunyaviridae), 오르쏘믹소바이러스과 (Orthomyxoviridae), 또는 델타바이러스에 의해 초래될 수 있다. 바이러스 감염은 추가로 코로나바이러스, SARS, 폴리오바이러스, 리노바이러스, A형 간염 바이러스, 노르워크 바이러스, 황열병 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, C형 간염 바이러스, 뎅기열 바이러스, 지카 바이러스, 루벨라 바이러스, 로스 리버 바이러스, 신드비스 바이러스, 치쿤구니아 바이러스, 보르나병 바이러스, 에볼라 바이러스, 마르부르그 바이러스, 홍역 바이러스, 유행성 이하선염 바이러스, 니파바이러스, 헨드라 바이러스, 뉴캐슬병 바이러스, 인간 호흡기 세포융합 바이러스, 공수병 바이러스, 라싸 바이러스, 한타바이러스, 크림-콩고 출혈열 바이러스, 인플루엔자, 또는 D형 간염 바이러스에 의해 초래될 수 있다.
다른 실시형태에서 감염은 사실상 바이러스성일 수 있다. 박테리아 감염을 초래하는 박테리아는 제한 없이, 아시네토박터 (Acinetobacter) 종, 악티노바실러스 (Actinobacillus) 종, 악티노마이세테스 (Actinomycetes) 종, 악티노마이세스 (Actinomyces) 종, 애로코커스 (Aerococcus) 종, 애로모나스 (Aeromonas) 종, 아나플라스마 (Anaplasma) 종, 알칼리게네스 (Alcaligenes) 종, 바실러스 (Bacillus) 종, 박테리오데스 (Bacteriodes) 종, 바르토넬라 (Bartonella) 종, 비피도박테리움 (Bifidobacterium) 종, 보르데텔라 (Bordetella) 종, 보렐리아 (Borrelia) 종, 브루셀라 (Brucella) 종, 버크홀데리아 (Burkholderia) 종, 캄필로박터 (Campylobacter) 종, 카프노사이토파가 (Capnocytophaga) 종, 클라미디아 (Chlamydia) 종, 시트로박터 (Citrobacter) 종, 콕시엘라 (Coxiella) 종, 코린박테리움 (Corynbacterium) 종, 클로스트리듐 (Clostridium) 종, 에이케넬라 (Eikenella) 종, 엔테로박터 (Enterobacter) 종, 에스케리치아 (Escherichia) 종, 엔테로코커스 (Enterococcus) 종, 엘리키아 (Ehlichia) 종, 에피더모피톤 (Epidermophyton) 종, 에리시펠로트릭스 (Erysipelothrix) 종, 유박테리움 (Eubacterium) 종, 프란시셀라 (Francisella) 종, 푸소박테리움 (Fusobacterium) 종, 가드네렐라 (Gardnerella) 종, 제멜라 (Gemella) 종, 헤모필러스 (Haemophilus) 종, 헬리코박터 (Helicobacter) 종, 킨겔라 (Kingella) 종, 클렙시엘라 (Klebsiella) 종, 락토바실러스 (Lactobacillus) 종, 락토코커스 (Lactococcus) 종, 리스테리아 (Listeria) 종, 렙토스피라 (Leptospira) 종, 레지오넬라 (Legionella) 종, 렙토스피라 (Leptospira) 종, 류코노스토크 (Leuconostoc) 종, 만헤이미아 (Mannheimia) 종, 마이코스포럼 (Microsporum) 종, 마이크로코커스 (Micrococcus) 종, 모라셀라 (Moraxella) 종, 모르가넬 (Morganell) 종, 모빌룬커스 (Mobiluncus) 종, 마이크로코커스 (Micrococcus) 종, 마이코박테리움 (Mycobacterium) 종, 마이코플라즘 (Mycoplasm) 종, 노카르디아 (Nocardia) 종, 네이세리아 (Neisseria) 종, 파스퇴렐라 (Pasteurelaa) 종, 페디오코커스 (Pediococcus) 종, 펩토스트렙토코커스 (Peptostreptococcus) 종, 피티로스포럼 (Pityrosporum) 종, 플레시오모나스 (Plesiomonas) 종, 프레보텔라 (Prevotella) 종, 포르피로모나스 (Porphyromonas) 종, 프로테우스 (Proteus) 종, 프로비덴시아 (Providencia) 종, 슈도모나스 (Pseudomonas) 종, 프로피오니박테리움 (Propionibacteriums) 종, 로도코커스 (Rhodococcus) 종, 리케치아 (Rickettsia) 종, 로도코커스 (Rhodococcus) 종, 세라티아 (Serratia) 종, 스테노트로포모나스 (Stenotrophomonas) 종, 살모넬라 (Salmonella) 종, 세라티아 (Serratia) 종, 시겔라 (Shigella) 종, 스타필로코커스 (Staphylococcus) 종, 스트렙토코커스 (Streptococcus) 종, 스피릴럼 (Spirillum) 종, 스트렙토바실러스 (Streptobacillus) 종, 트레포네마 (Treponema) 종, 트로페리마 (Tropheryma) 종, 트리코피톤 (Trichophyton) 종, 우레아플라즈마 (Ureaplasma) 종, 베일로넬라 (Veillonella) 종, 비브리오 (Vibrio) 종, 여시니아 (Yersinia) 종, 잔토모나스 (Xanthomonas) 종, 또는 이의 조합을 포함할 수 있다.
다른 실시형태에서, 감염은 진균성일 수 있고, 제한 없이, 아스퍼질러스 (Aspergillus), 블라스토마이세스 (Blastomyces), 칸디다증 (Candidiasis), 콕시디오이데스 진균증 (Coccidiodomycosis), 크립토코커스 네오포르만스 (Cryptococcus neoformans), 크립토코커스 가티 (Cryptococcus gatti), sp. 히스토플라즈마 (Histoplasma) sp. (예컨대, 히스토플라즈마 캅슐라텀 (Histoplasma capsulatum)), 뉴모시스티스 (Pneumocystis) sp. (예컨대 뉴모시스티스 지로베시 (Pneumocystis jirovecii)), 스타키보트리스 (Stachybotrys) (예컨대 스타키보트리스 카르타럼 (Stachybotrys chartarum)), 모균증 (Mucroymcosis), 스포로트릭스 (Sporothrix), 진균성 안구 감염 백선, 엑세로힐럼 (Exserohilum), 클라도스포리움 (Cladosporium), 제오트리컴 (Geotrichum), 사카로마이세스 (Saccharomyces), 한세눌라 (Hansenula) 종, 칸디다 (Candida) 종, 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces) 종, 데바리오마이세스 (Debaryomyces) 종, 피키아 (Pichia) 종, 페니실리움 (Penicillium) 종, 클라도스포리움 (Cladosporium) 종, 비쏘클라미스 (Byssochlamys) 종 또는 이의 조합과 같은 진균에 의해 초래될 수 있다.
다른 실시형태에서, 감염은 원생동물, 예컨대 유글레노조아 (Euglenozoa), 헤테롤로보세아 (Heterolobosea), 디플로모나디다 (Diplomonadida), 아메보조아 (Amoebozoa), 블라스토시스틱 (Blastocystic), 아피콤플렉사 (Apicomplexa), 또는 이의 조합에 의해 초래될 수 있다.
다른 실시형태에서, 감염은 기생충, 예컨대 제한 없이, 트리파노소마 크루지 (Trypanosoma cruzi) (샤가스병), T. 브루세이 감비엔스 (T. brucei gambiense), T. 브루세이 로데시엔스 (T. brucei rhodesiense), 리슈마니아 브라질리엔시스 (Leishmania braziliensis), L. 인판텀 (L. infantum), L. 멕시카나 (L. mexicana), L. 마조르 (L. major), L. 트로피카 (L. tropica), L. 도노바니 (L. donovani), 내글레리아 파울러리 (Naegleria fowleri), 지아르디아 인테스티날리스 (Giardia intestinalis) (G. 람블리아 (G. lamblia), G. 두오데날리스 (G. duodenalis)), 칸타메바 카스텔라니 (Canthamoeba castellanii), 발라무티아 마드릴라리스 (Balamuthia madrillaris), 엔타메바 히스톨리티카 (Entamoeba histolytica), 블라스토시스틱 호미니스 (Blastocystic hominis), 바베시아 미크로티 (Babesia microti), 클립토스포리듐 파르븀 (Cryptosporidium parvum), 시클로스포라 카이에타넨시스 (Cyclospora cayetanensis), 플라스모듐 팔시파럼 (Plasmodium falciparum), P. 비박스 (P. vivax), P. 오발레 (P. ovale), P. 말라리아에 (P. malariae), 및 톡소플라즈마 곤디 (Toxoplasma gondii) 또는 이의 조합에 의해 초래될 수 있다.
일부 실시형태에서, 샘플은 생물학적 샘플 또는 환경 샘플일 수 있다. 생물학적 샘플은 제한 없이, 혈액, 혈장, 혈청, 소변, 대변, 객담, 점액, 림프액, 활액, 담즙, 복수, 흉수, 장액종, 타액, 뇌척수액, 안방수 또는 유리체액, 또는 임의의 신체 분비액, 여출액, 삼출액 (예를 들어, 농양 또는 임의의 다른 감염 또는 염증 부위로부터 얻은 체액), 또는 관절 (예를 들어, 정상 관절, 또는 류마티스성 관절염, 골관절염, 통풍성 또는 화농성 관절염과 같은 질환을 앓는 관절)로부터 얻은 체액, 또는 피부 또는 점막 표면의 스왑 (swab) 을 포함할 수 있다.
특정 실시형태에서, 환경 샘플은 제한 없이, 음식물 샘플, 종이 표면, 패브릭, 금속 표면, 목재 표면, 플라스틱 표면, 토양 샘플, 담수 샘플, 폐수 샘플, 염수 샘플, 또는 이의 조합으로부터 수득된 샘플을 포함할 수 있다.
또다른 양상에서, 본 발명은 제 1 말단부를 갖는 기판을 포함하는 측류 장치를 제공하며, 여기서 제 1 말단부는 샘플 로딩 부분 및 검출가능한 리간드, 2 개 이상의 CRISPR 이펙터 시스템, 2 개 이상의 검출 구성체, 각각 제 1 결합제를 포함하는 하나 이상의 제 1 포획 영역, 각각 제 2 결합제를 포함하는 2 개 이상의 제 2 포획 영역이 로딩된 제 1 영역을 포함하고, 여기서 2 개 이상의 CRISPR 이펙터 시스템 각각은 CRISPR 이펙터 단백질 및 하나 이상의 가이드 서열을 포함하며, 각각의 가이드 서열은 하나 이상의 표적 분자에 결합하도록 구성된다.
일부 실시형태에서, 2 개 이상의 검출 구성체 각각은 제 1 말단부에 제 1 분자 및 제 2 말단부에 제 2 분자를 갖는, RNA 또는 DNA 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 특정 실시형태에서, 측류 장치는 2 개의 CRISPR 이펙터 시스템 및 2 개의 검출 구성체를 포함할 수 있다. 좀 더 특정한 실시형태에서, 측류 장치는 4 개의 CRISPR 이펙터 시스템 및 4 개의 검출 구성체를 포함할 수 있다.
샘플 로딩 부분은 하나 이상의 표적 분자를 증폭시키기 위해 하나 이상의 증폭 시약을 추가로 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 제 1 검출 구성체는 제 1 분자로서 FAM 을 포함하고 제 2 제 2 분자로서 비오틴을, 또는 그 반대를 포함하고, 제 2 검출 구성체는 제 1 분자로서 FAM 을 포함하고 제 2 분자로서 디곡시제닌 (DIG), 또는 그 반대를 포함한다. 일부 실시형태에서, CRISPR 이펙터 단백질은 RNA-표적화 이펙터 단백질이다. 일부 실시형태에서, RNA-표적화 이펙터 단백질은 C2c2 이다. 일부 실시형태에서, RNA-표적화 이펙터 단백질은 Cas13b 이다.
일부 실시형태에서, 제 1 검출 구성체는 제 1 분자로서 Tye665 및 제 2 분자로서 Alexa-fluor-488 을, 또는 그 반대를 포함할 수 있고; 제 2 검출 구성체는 제 1 분자로서 Tye665 및 제 2 분자로서 FAM 을, 또는 그 반대를 포함할 수 있고; 제 3 검출 구성체는 제 1 분자로서 Tye665 및 제 2 분자로서 비오틴을, 또는 그 반대를 포함할 수 있고; 제 4 검출 구성체는 제 1 분자로서 Tye665 및 제 2 분자로서 DIG 를, 또는 그 반대를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, CRISPR 이펙터 단백질은 RNA-표적화 또는 DNA-표적화 이펙터 단백질일 수 있다. RNA 표적화 이펙터는 C2c2 또는 Cas13b 일 수 있다. 일부 실시형태에서, DNA-표적화 이펙터 단백질은 Cas12a 이다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 샘플을 본원에 기재된 측류 장치의 제 1 말단부와 접촉시키는 단계를 포함하는, 샘플에서 표적 핵산을 검출하는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 샘플은 장치의 샘플 로딩 부분과 접촉하고, 샘플은 기판의 샘플 로딩 부분으로부터 제 1 및 제 2 캡처 영역을 향해 흐르고, 따라서 검출가능한 신호를 생성한다.
샘플은 액체 샘플일 수 있거나, 수성 용매에 용해될 수 있다. 샘플이 표적 핵산을 함유하지 않는 실시형태에서, 검출가능한 신호는 제 1 포획 영역에 나타난다. 샘플이 표적 핵산을 함유하는 실시형태에서, 검출가능한 신호는 제 2 포획 영역에 나타난다. 표적 핵산의 존재는 전형적으로 질환 상태의 지표이다.
예시 실시형태의 이들 및 다른 양상, 목적, 특징 및 이점은 예시된 예시 실시형태의 하기 상세한 설명을 고려하면 당업자에게 명백해 질 것이다.
도. 1 - 예시 C2c2 기반 CRISPR 이펙터 시스템의 개략도이다.
도. 2 - (A) 렙토트리치아 웨이데이 (Leptotrichia wadei) 유래의 CRISPR/C2c2 유전자좌의 개략도를 제공한다. LwC2c2 및 LshC2c2 시스템 유래의 대표적인 crRNA 구조가 제시된다. (SEQ. I.D. Nos. 220 및 221) (B) C2c2 활성에 대한 생체 내 박테리아 어세이의 개략도. 프로토스페이서는 암피실린-저항성 플라스미드에서 베타-락타마아제 유전자의 상류에 클로닝되고, 이 구성체는 표적화 또는 비-표적화 스페이서와 함께 C2c2 를 발현하는 이. 콜라이로 형질전환된다. 성공적인 형질전환체는 활성을 정량화하기 위해 계수된다. (C) 생체 내 활성에서 LwC2c2 및 LshC2c2 의 정량. (n = 2 생물학적 복제물; 막대는 평균 ± s.e.m. 을 나타냄) (D) LwC2c2 의 최종 크기 배제 겔 여과. (E) LwC2c2 단계적 정제의 쿠마시 블루 염색된 아크릴아미드 겔. (F) 상이한 PFS 표적에 대한 LwC2c2 의 활성. LwC2c2 는 스페이서 옆에 있는 가변 3' PFS 를 갖는 형광 RNA 에 대해 표적화되었고, 반응 생성물은 변성 겔 상에 시각화되었다. LwC2c2 는 G PFS 에 대한 약간의 선호도를 보여준다.
도. 3 - 4 가지 상이한 양의 단백질/crRNA (1:4, 1:16, 1:32, 1:64) 로 1 ㎍, 100 ng, 10 ng 및 1 ng 의 표적을 사용하여 상이한 희석에서 예시 차폐성 구성체의 검출을 보여준다 - (96+48)*2= 288 반응에서, 2 개 풀의 crRNA, crRNA 없음 조건, 기술적 복제물로, 3 시간에 걸쳐 5 분 간격으로 측정됨.
도. 4 - 4 가지 상이한 양의 단백질/crRNA (1:4, 1:16, 1:32, 1:64) 로 1 ㎍, 100 ng, 10 ng 및 1 ng 의 표적을 사용하여 상이한 희석에서 예시 차폐성 구성체의 검출을 보여준다 - (96+48)*2= 288 반응에서, 2 개 풀의 crRNA, crRNA 없음 조건, 기술적 복제물로, 3 시간에 걸쳐 5 분 간격으로 측정됨.
도. 5 - 4 가지 상이한 양의 단백질/crRNA (1:4, 1:16, 1:32, 1:64) 로 1 ㎍, 100 ng, 10 ng 및 1 ng 의 표적을 사용하여 상이한 희석에서 예시 차폐성 구성체의 검출을 보여준다 - (96+48)*2= 288 반응에서, 2 개 풀의 crRNA, crRNA 없음 조건, 기술적 복제물로, 3 시간에 걸쳐 5 분 간격으로 측정됨.
도. 6 - 4 가지 상이한 양의 단백질/crRNA (1:4, 1:16, 1:32, 1:64) 로 1 ㎍, 100 ng, 10 ng 및 1 ng 의 표적을 사용하여 상이한 희석에서 예시 차폐성 구성체의 검출을 보여준다 - (96+48)*2= 288 반응에서, 2 개 풀의 crRNA, crRNA 없음 조건, 기술적 복제물로, 3 시간에 걸쳐 5 분 간격으로 측정됨.
도. 7 - 특정 예시 실시형태에 따른, 차폐성 구성체 및 CRISPR 이펙터 단백질을 사용한 예시 검출 방식의 개략도를 제공한다.
도. 8 - 상이한 가이드 RNA 풀을 사용하여 표적을 검출할 때 시간에 따른 형광도 변화를 보여주는 일련의 그래프를 제공한다.
도. 9 - 다양한 농도의 CRISPR 이펙터 단백질에서 표적 RNA 의 상이한 희석에 걸쳐 검출된 정규화된 형광도를 보여주는 그래프를 제공한다.
도. 10 - NASBA 증폭 반응의 일반적인 단계를 보여주는 개략도이다.
도. 11 -3 개의 상이한 프라이머 세트로 NASBA 에 의해 증폭된 후 소광된 형광 프로브를 사용하여 C2c2 부수적 검출에 적용되는 핵산 표적 ssRNA 1 의 검출을 나타내는 그래프를 제공한다 (n=2 기술적 복제물; 막대는 평균 ± s.e.m. 을 나타냄).
도. 12 - 부수적 효과가 렌티바이러스 표적 RNA 의 존재를 검출하는데 사용될 수 있음을 보여주는 그래프를 제공한다.
도. 13 - 부수적 효과 및 NASBA 가 aM 농도에서 종을 검출할 수 있음을 입증하는 그래프를 제공한다.
도. 14 - 부수적 효과 및 NASBA 가 저 농도 샘플을 빠르게 식별함을 입증하는 그래프를 제공한다.
도. 15 - 특정 시점에서의 정규화된 형광도가 샘플 투입 농도의 예측치임을 보여준다. 증폭 없이 Cas13a 검출로부터의 형광도 측정은 투입 RNA 농도와 상관 관계가 있다 (n=2 생물학적 복제물; 막대는 평균 ± s.e.m. 을 나타냄).
도. 16 - 반응에 참여하는 성분을 보여주는, RPA 반응의 개략도를 제공한다.
도. 17 - SHERLOCK 의 개략도; 따라서 RPA 또는 RT-RPA 단계의 혼입을 통해 DNA 또는 RNA 표적 둘 다의 검출을 보여주는 개략도를 제공한다. 표적 RNA 의 인식시, 부수적 효과는 C2c2 가 절단 리포터를 절단하여 형광을 생성하게 한다. 단일-분자 양의 RNA 또는 DNA 를 리콤비나아제 폴리머라아제 증폭 (RPA) 을 통해 DNA 로 증폭시키고 전사하여 RNA 를 생성할 수 있으며, 이어서 이를 C2c2 에 의해 검출한다.
도. 18 - C2c2 부수적 검출을 통해 검출된 ssRNA 표적의 개략도를 제공한다 (SEQ. I.D. Nos. 222 및 223).
도. 19 - RPA 를 사용한 단일 분자 DNA 검출을 입증하는 일련의 그래프를 제공한다 (즉, C2c2 첨가 15 분 이내).
도. 20 - T7 폴리머라아제를 RPA 반응에 혼합하는 것이 DNA 검출에 악영향을 미치는 것을 입증하는 일련의 그래프를 제공한다.
도. 21 - 폴리머라아제를 RPA 반응에 혼합하는 것이 DNA 검출에 악영향을 미치지 않는 것을 입증하는 일련의 그래프를 제공한다.
도. 22 - RPA, T7 전사 및 C2c2 검출 반응이 동시에 인큐베이션될 때 호환가능하고 단일 분자 검출을 달성함을 입증하는 그래프를 제공한다 (n=2 기술적 복제물; 막대는 평균 ± s.e.m. 을 나타냄).
도. 23 - 빠른 RPA-RNA 시간 인큐베이션의 효능을 입증하는 일련의 그래프를 제공한다.
도. 24 - T7 폴리머라아제 양의 증가가 RPA-RNA 의 민감성을 증가시킨다는 것을 입증하는 일련의 그래프를 제공한다.
도. 25- 1.5x 효소와의 원-포트 반응을 사용한 RPA-DNA 검출 어세이 결과를 보여주는 일련의 그래프를 제공한다. 단일 분자 (2aM) 검출은 30 분 정도로 일찍 달성되었다.
도. 26 - RPA-DNA 원-포트 반응이 투입 농도에 비해 형광도의 정량적 감소를 나타내는 것을 입증하는 일련의 그래프를 제공한다. 피팅된 곡선은 표적 투입 농도와 출력 형광 사이의 관계를 밝혀낸다.
도. 27 - (A) 증폭 없이 RNA 의 C2c2 검출이 50 fM 이하의 농도에서 ssRNA 표적을 검출할 수 있음 (n = 2 기술적 복제물; 막대는 평균 ± s.e.m. 을 나타냄), 및 (B) RPA-C2c2 반응은 단일-분자 DNA 검출이 가능함 (n=4 기술적 복제물; 막대는 평균 ± s.e.m. 을 나타냄) 을 입증하는 일련의 그래프를 제공한다.
도. 28 - 특정 예시적인 실시형태에 따라 생성된 C2c2 신호가 종이 기판 상의 20 pM 표적을 검출할 수 있음을 입증하는 일련의 그래프를 제공한다.
도. 29 -특이적 RNAse 억제제가 종이 상의 배경 신호를 제거할 수 있음을 보여주는 그래프를 제공한다.
도. 30 은 유리 섬유 기판 상의 특정 예시 실시형태에 따른 시스템을 사용한 검출을 나타내는 일련의 그래프이다.
도. 31 -특정 예시 실시형태에 따른 (A) 지카 RNA 검출의 개략도를 제공하는 일련의 그래프를 제공한다. 렌티바이러스는 C2c2 부수적 검출에 의해 표적화된 지카 RNA 또는 상동 뎅기 RNA 단편으로 패키징되었다. 48 시간 후에 배지를 수확하고, 열 용해, RT-RPA 및 C2c2 검출에 적용하였다. (B) RT-RAP-C2c2 검출로는 지카 렌티바이러스 입자의 고도로 민감한 검출이 가능하다 (n=4 기술적 복제물, 2-테일 스튜던트 t-검정; *****, p<0.0001; 막대는 평균 ± s.e.m. 을 나타냄) (C) 특정 예시 실시형태에 따라, 종이 상의 동결-건조된 C2c2 를 사용한 지카 RNA 검출의 개략도. (D) 종이-기반 어세이로는 지카 렌티바이러스 입자의 고도로 민감한 검출이 가능하다 (n=4 기술적 복제물, 2-테일 스튜던트 t-검정; ****, p<0.0001; **, p<0.01, 막대는 평균 ± s.e.m. 을 나타냄).
도. 32 - (A) 인간 혈청에서 단리된 지카 RNA 의 C2c2 검출을 위한 개략도를 보여주는 일련의 그래프를 제공한다. 혈청 중의 지카 RNA 는 역전사, RNA 의 RNase H 분해, cDNA 의 RPA 및 C2c2 검출에 적용된다. (B) C2c2 는 인간 지카 혈청 샘플의 고도로 민감한 검출이 가능하다. 제시된 지카 RNA 의 농도는 qPCR 에 의해 확인되었다 (n=4 기술적 복제물, 2-테일 스튜던트 t-검정; ****, p < 0.0001; 막대는 평균 ± s.e.m. 을 나타냄).
도. 33 - (A) 동결-건조된 C2c2 가 저 펨토몰 범위에서 ssRNA 1 의 민감한 검출이 가능함을 보여주는 일련의 그래프를 제공한다. C2c2 는 액체 형태의 (B) 또는 동결 건조된 (C) 종이 상의 200pM ssRNA 1 표적을 신속하게 검출할 수 있다. 반응은 용액 (D) (n=3) 및 동결-건조된 형태 (E) (n=3) 중의 합성된 지카 RNA 단편의 민감한 검출이 가능하다. (F) 투입 농도와 검출된 형광도 사이의 유의한 상관 관계를 나타내는 인간 지카 cDNA 검출에 대한 정량적 곡선. (G) 다양한 양의 인간 혈청의 존재 하에 수행된 ssRNA 1 의 C2c2 검출 (달리 언급되지 않는 한, n=2 기술적 복제물; 막대는 평균 ± s.e.m. 을 나타냄).
도. 34 - (A) 범용 V3 RPA 프라이머 세트를 사용하여 박테리아 게놈 유래의 16S rRNA 유전자의 C2c2 검출에 대한 개략도, 및 (B) 특정 예시 실시형태에 따라 수행된 어세이를 사용하여 대장균 또는 P. 아에루기노사 gDNA 의 민감하고 특이적인 검출을 달성하는 능력 (n=4 기술적 복제물, 2-테일 스튜던트 t-검정; ****, p < 0.0001; 막대는 평균 ± s.e.m. 을 나타냄) 의 개략도를 제공한다. Ec, 대장균; Kp, 클렙시엘라 뉴모니애; Pa, 슈도모나스 아에루기노사; Mt, 마이코박테리움 투베르쿨로시스; Sa, 스타필로코쿠스 아우레우스.
도. 35 - (A) 클렙시엘라 뉴모니애의 4 가지 상이한 임상 단리물 유래의 2 개의 상이한 카르바페넴-저항성 유전자 (KPC 및 NDM-1) 의 검출 및 (B) 카르바페넴-저항성 유전자의 검출 (파트 A) 이 KPC 와 NDM-1 crRNA 어세이 사이의 신호 비율로서 정규화되는 것을 입증하는 일련의 그래프를 제공한다 (n=2 기술적 복제물, 2-테일 스튜던트 t-검정; ****, p <0.0001; 막대는 평균 ± s.e.m.을 나타냄).
도. 36 - (A) C2c2는 단일 미스매치에 민감하지 않지만, 부가적인 미스매치가 있는 crRNA 가 로딩될 때 표적 내 단일 뉴클레오티드 차이를 구별할 수 있음을 입증하는 일련의 그래프를 제공한다. ssRNA 표적 1-3 은 crRNA 의 다양한 위치에서 합성 미스매치를 함유하는 10 개의 스페이서와 함께, 11 개의 crRNA 로 검출되었다. 미스매치된 스페이서는 표적 1 의 절단 감소를 나타내지 않았지만, 미스매치 표적 2 및 3 의 절단 억제를 나타내었다 (SEQ. I.D. Nos. 224 내지 237). (B) 합성 미스매치가 있는 단일-염기 특이적 스페이서의 합리적인 설계 공정을 보여주는 개략도. 합성 미스매치는 SNP 또는 관심 염기에 근접하여 배치된다 (SEQ. I.D. Nos. 238 내지 242). (C) 균주 SNP 의 고도로 특이적인 검출은 절단된 (23 개 뉴클레오티드) crRNA 를 이용한 C2c2 검출을 사용하여 단 하나의 뉴클레오티드 만이 상이한 지카 아프리카 대 미국 RNA 표적의 차별을 허용한다 (n=2 기술적 복제물, 1-테일 스튜던트 t-검정; *, p < 0.05; ****, p < 0.0001; 막대는 평균 ± s.e.m. 을 나타냄).
도. 37 - 하기를 입증하는 일련의 그래프를 제공한다: (A) 지카 균주 표적 영역 및 검출에 사용된 crRNA 서열의 개략도 (SEQ. I.D. Nos. 243 내지 248). 표적 내의 SNP는 적색 또는 청색으로 강조 표시되고 가이드 서열 내의 합성 미스매치는 적색으로 표시된다. (B) 균주 SNP 의 고도로 특이적인 검출은 SHERLOCK 을 사용하여 지카 아프리카 대 미국 RNA 표적의 차별을 허용한다 (n=2 기술적 복제물, 2-테일 스튜던트 t-검정; ****, p < 0.0001; 막대는 평균 ± s.e.m. 을 나타냄). (SEQ. I.D. Nos. 249 내지 254). (C) 뎅기 균주 표적 영역 및 검출에 사용된 crRNA 서열의 개략도. 표적 내의 SNP는 적색 또는 청색으로 강조 표시되고 가이드 서열 내의 합성 미스매치는 적색으로 표시된다. (D) 균주 SNP 의 고도로 특이적인 검출은 SHERLOCK 을 사용하여 뎅기 균주 1 대 균주 3 RNA 표적의 차별을 허용한다 (n=2 기술적 복제물, 2-테일 스튜던트 t-검정; ****, p < 0.0001; 막대는 평균 ± s.e.m. 을 나타냄).
도. 38 - C2c2 로 검출된 인간 SNP 의 위치를 보여주는 (A) 서커스 플롯을 보여주는 일련의 그래프를 제공한다. (B) 특정 예시 실시형태에 따라 수행된 어세이는 인간 SNP 를 구별할 수 있다. SHERLOCK 은 인간 게놈 내의 4 개의 상이한 SNP 부위에서 4 개의 상이한 개체를 올바르게 유전형분석할 수 있다. 대립유전자-감지 crRNA 의 각각의 개체 및 정체성에 대한 유전자형은 각 플롯 아래에 주석으로 표시한다 (n=4 기술적 복제물; 2-테일 스튜던트 t-검정; *, p < 0.05; **, p < 0.01; ***, p < 0.001; ****, p < 0.0001; 막대는 평균 ± s.e.m. 을 나타냄). (C) 특정 예시 실시형태에 따른 cfDNA 의 검출 방법의 개략도 (예컨대, 암 돌연변이의 세포-무함유 DNA 검출). (D) EGFR L858R 및 BRAF V600E 를 검출하기 위한 예시적인 crRNA 서열 (SEQ. I.D. Nos. 255 내지 260). 세포-무함유 DNA 에서 암 돌연변이에 대해 2 개의 게놈 유전자좌의 서열을 어세이하였다. SNP 가 청색으로 강조된 표적 게놈 서열 및 합성 미스매치가 적색으로 색상 표시된 돌연변이체/야생형 감지 crRNA 서열이 도시되어 있다.
도. 39 - C2c2 가 EGFR L858R (C) 또는 BRAF V600E (B) 소수 대립유전자로부터의 모의 (mock) 세포-무함유 DNA 샘플 중의 돌연변이체 소수 대립유전자를 검출할 수 있다는 것을 입증하는 일련의 그래프를 제공한다 (n=4 기술적 복제물, 2-테일 스튜던트 t-검정; *, p<0.05; **, p<0.01, ****, P<0.0001; 막대는 ± s.e.m. 을 나타냄).
도. 40 - (A) 어세이가 rs5082 에서 유전자형을 구별할 수 있음 (n=4 기술적 복제물; *, p < 0.05; **, p < 0.01; ***, p < 0.001; ****, p < 0.0001; 막대는 평균 ± s.e.m. 을 나타냄). (B) 어세이가 원심분리, 변성 및 끓인 타액과 직접적으로 gDNA 중의 rs601338 에서 유전자형을 구별할 수 있음 (n=3 기술적 복제물; *, p < 0.05; 막대는 평균 ± s.e.m. 을 나타냄) 을 보여주는 일련의 그래프를 제공한다.
도. 41 -(A) 단일 미스매치만이 ssDNA 1 과 상이한 표적의 배경에서 ssDNA 1 에 수행된 예시 실시형태의 개략도. (B) 어세이가 미스매치된 배경 (ssDNA 와 단일 미스매치만 상이한 표적) 의 존재 하에 ssDNA 1 의 단일 뉴클레오티드 특이성 검출을 달성하는 것을 제공한다. 다양한 농도의 표적 DNA 를 하나의 미스매치로 배경 과량의 DNA 와 조합하고 어세이에 의해 검출하였다.
도. 42 는 상이한 염료 Cy5 를 갖는 차폐성 구성체가 효과적인 검출을 허용함을 보여주는 그래프이다.
도. 43 은 금 나노입자 비색계 어세이의 개략도이다. AuNP 는 DNA 링커 및 RNA 브릿지의 조합을 사용하여 응집된다. RNase 활성의 첨가 시, ssRNA 브릿지가 절단되고 AuNP 가 방출되어 특징적인 색상의 적색으로의 이동을 야기한다.
도. 44 는 520 nm 에서 분산된 나노입자의 색상의 이동을 검출하는 능력을 보여주는 그래프이다. 나노입자는 도 43 에 도시된 예시 실시형태에 기초하고 다양한 농도에서 RNase A 의 첨가를 사용하여 분산되었다.
도. 45 는 RNase 비색 시험이 정량적임을 보여주는 그래프이다.
도. 46 은 분산된 나노입자에서의 색상 이동이 시각적으로 검출가능함을 나타내는 마이크로 웰 플레이트의 사진이다.
도. 47 은 비색 이동이 종이 기판 상에서 가시화되는 것을 나타내는 사진이다. 유리 섬유 934-AH 상의 37℃ 에서 10 분 동안 시험을 수행하였다.
도. 48 은 단백질 또는 소형 분자의 검출을 위한 특정 예시 실시형태에 따른 입체형태 전환 앱타머의 개략도이다. (A) SEQ ID NO:261. 라이게이션 생성물 (B) 은 RNA-표적화 이펙터에 대한 완전한 표적으로서 사용되며, 이것은 라이게이션되지 않은 투입 생성물 (SEQ ID NO:262) 을 검출할 수 없다.
도. 49 는 앱타머-기반 라이게이션이 RPA-검출가능한 기질을 생성할 수 있음을 보여주는 겔의 이미지이다. 앱타머를 다양한 수준의 트롬빈과 함께 인큐베이션한 다음 프로브로 라이게이션시켰다. 라이게이션된 구성체를 3 분 RPA 반응을 위한 주형으로 사용하였다. 500 nM 트롬빈은 배경보다 증폭된 표적 수준이 상당히 높다.
도. 50 은 선택된 C2c2 오솔로그의 HEPN 도메인의 아미노산 서열을 나타낸다 (SEQ ID NO:263-292).
도. 51 RPA 증폭을 이용한 RNA 의 Cas13a 검출은 (SHERLOCK) ~ 2 aM 까지의 농도에서, Cas13a 단독보다 더 민감한 ssRNA 표적을 검출할 수 있다 (n=4 기술적 복제물; 막대는 평균 ± s.e.m. 을 나타냄).
도. 52 - Cas13a 검출은 바이러스 및 박테리아 병원체를 감지하는 데 사용될 수 있다. (A) 인간 임상 샘플로부터 단리된 ZIKV RNA 의 SHERLOCK 검출의 개략도. (B) SHERLOCK 은 인간 ZIKV-양성 혈청 (S) 또는 소변 (U) 샘플의 고도로 민감한 검출이 가능하다. 제시된 ZIKV RNA 의 대략적 농도는 qPCR 에 의해 결정되었다 (n=4 기술적 복제물, 2-테일 스튜던트 t-검정; ****, p < 0.0001; 막대는 평균 ± s.e.m. 을 나타냄; n.d., 검출되지 않음).
도. 53 -프라이머 세트 2 (도 11 의) 및 SHERLOCK 으로의 NASBA 에 의한 ssRNA 1 의 검출 비교 (n=2 기술적 복제물; 막대는 평균 ± s.e.m. 을 나타냄).
도. 54 RPA 및 단일-반응 SHERLOCK 을 이용한 핵산 증폭. (A) 도 1C 에서 사용된 희석에 대한 ssRNA 1 의 디지털-액적 PCR 정량. ddPCR 결과에 기초한 희석에 대한 조정된 농도는 막대 그래프 위에 제시된다. (B) 도 1D 에서 사용된 희석에 대한 ssDNA 1 의 디지털-액적 PCR 정량. ddPCR 결과에 기초한 희석에 대한 조정된 농도는 막대 그래프 위에 제시된다. (C) RPA, T7 전사 및 Cas13a 검출 반응은 양립가능하고 동시에 인큐베이션될 때 DNA 2 의 단일 분자 검출을 달성한다 (n=3 기술적 복제물, 2-테일 스튜던트 t-검정; n.s., 유의하지 않음; **, p < 0.01; ****, p < 0.0001; 막대는 평균 ± s.e.m. 을 나타냄).
도. 55 -다른 민감한 핵산 검출 도구와 SHERLOCK 의 비교. (A) 디지털-액적 PCR 을 이용한 ssDNA 1 희석 시리즈의 검출 분석 (n=4 기술적 복제물, 2-테일 스튜던트 t-검정; n.s., 유의하지 않음; *, p < 0.05; **, p < 0.01; ****, p < 0.0001; 적색 선은 평균을 나타내고, 막대는 평균 ± s.e.m. 을 나타낸다. 10-1 미만의 측정된 카피/μL 을 가진 샘플은 표시되지 않음). (B) 정량적 PCR 을 이용한 ssDNA 1 희석 시리즈의 검출 분석 (n=16 기술적 복제물, 2-테일 스튜던트 t-검정; n.s., 유의하지 않음; **, p < 0.01; ****, p < 0.0001; 적색 선은 평균을 나타내고, 막대는 평균 ± s.e.m. 을 나타낸다. 10-10 미만의 상대적 신호를 가진 샘플은 표시되지 않음). (C) SYBR Green II 로의 RPA 를 이용한 ssDNA 1 희석 시리즈의 검출 분석 (n=4 기술적 복제물, 2-테일 스튜던트 t-검정; *, p < 0.05; **, p < 0.01; 적색 선은 평균을 나타내고, 막대는 평균 ± s.e.m. 을 나타낸다. 100 미만의 상대적 신호를 가진 샘플은 표시되지 않음). (D) SHERLOCK 을 이용한 ssDNA 1 희석 시리즈의 검출 분석 (n=4 기술적 복제물, 2-테일 스튜던트 t-검정; **, p < 0.01; ****, p < 0.0001; 적색 선은 평균을 나타내고, 막대는 평균 ± s.e.m. 을 나타낸다. 100 미만의 상대적 신호를 가진 샘플은 표시되지 않음). (E) 4 가지 유형의 검출 방법에 대한 일련의 ssDNA 1 희석에 대한 변동 계수. (F) 4 가지 유형의 검출 방법에 대한 6e2, 6e1, 6e0 및 6e-1 ssDNA 1 희석에 대한 평균 변동 계수 백분율 (막대는 평균 ± s.e.m. 을 나타냄)
도. 56 -임상 박테리아 단리물에서 카르바파넴 저항성 검출. 클렙시엘라 뉴모니애 및 대장균 대조군의 5 가지 임상 단리물에서 2 개의 상이한 카르바파넴-저항성 유전자 (KPC 및 NDM-1) 의 검출 (n=4 기술적 복제물, 2-테일 스튜던트 t-검정; ****, p <0.0001; 막대는 평균 ± s.e.m.을 나타냄; n.d., 검출되지 않음).
도. 57 -표적 서열에서 절단된 스페이서 및 단일 미스매치에 대한 LwCas13a 민감성의 특징분석. (A) (B)-(G) 에서 사용된 절단된 스페이서 crRNA 의 서열. 또한, ssRNA 1 및 2 의 서열이 도시되어 있으며, 이는 단일 염기쌍 차이가 적색으로 강조 표시되어 있다. 합성 미스매치를 함유하는 crRNA 는 적색으로 표시된 미스매치 위치 (SEQ ID NO:293-304) 로 나타낸다. (B) 위치 1-7 에서 합성 미스매치를 갖는 28 nt 스페이서 crRNA 에 대한 ssRNA 1 및 2 상의 부수적 절단 활성 (n=4 기술적 복제물; 막대는 평균 ± s.e.m. 을 나타냄). (C) (B) 에서 시험된 crRNA 의 특이성 비율. 특이성 비율은 투입표적 (on-target) RNA (ssRNA 1) 부수적 절단 대 오프-표적 (off-target) RNA (ssRNA 2) 부수적 절단의 비율로서 계산된다 (n=4 기술적 복제물; 막대는 평균 ± s.e.m. 을 나타냄). (D) 위치 1-7 에서 합성 미스매치를 갖는 23 nt 스페이서 crRNA 에 대한 ssRNA 1 및 2 상의 부수적 절단 활성 (n=4 기술적 복제물; 막대는 평균 ± s.e.m. 을 나타냄). (E) (D) 에서 시험된 crRNA 의 특이성 비율. 특이성 비율은 투입표적 (on-target) RNA (ssRNA 1) 부수적 절단 대 오프-표적 (off-target) RNA (ssRNA 2) 부수적 절단의 비율로서 계산된다 (n=4 기술적 복제물; 막대는 평균 ± s.e.m. 을 나타냄). (F) 위치 1-7 에서 합성 미스매치를 갖는 20 nt 스페이서 crRNA 에 대한 ssRNA 1 및 2 상의 부수적 절단 활성 (n=4 기술적 복제물; 막대는 평균 ± s.e.m. 을 나타냄). (G) (F) 에서 시험된 crRNA 의 특이성 비율. 특이성 비율은 투입표적 (on-target) RNA (ssRNA 1) 부수적 절단 대 오프-표적 (off-target) RNA (ssRNA 2) 부수적 절단의 비율로서 계산된다 (n=4 기술적 복제물; 막대는 평균 ± s.e.m. 을 나타냄).
도. 58. - 표적 서열 내 돌연변이에 대한 이상적인 합성 미스매치 위치의 확인. (A) ssRNA 1 및 ssRNA 2 사이의 돌연변이를 검출하기 위한 이상적인 합성 미스매치 위치를 평가하기 위한 서열. 각각의 표적에 대해, 색상 표시된 (적색) 위치에서 합성 미스매치를 갖는 crRNA 가 시험된다. 각각의 합성 미스매치 crRNA 세트는 돌연변이 위치가 스페이서의 서열과 관련하여 위치에서 이동되도록 설계된다. 스페이서는 돌연변이가 스페이서 내 위치 3, 4, 5 및 6 에서 평가되도록 설계된다. SEQ ID NO:305-336이 표시되어 있다. (B) 다양한 위치에 합성 미스매치가 있는 crRNA 에 대한 ssRNA 1 및 2 의 부수적 절단 활성. 스페이서:표적 듀플렉스 영역 내의 위치 3, 4, 5 또는 6 에 돌연변이를 갖는 4 가지 crRNA 세트가 있다 (n=4 기술적 복제물; 막대는 평균 ± s.e.m. 을 나타냄). (C) (B) 에서 시험된 crRNA 의 특이성 비율. 특이성 비율은 투입표적 (on-target) RNA (ssRNA 1) 부수적 절단 대 오프-표적 (off-target) RNA (ssRNA 2) 부수적 절단의 비율로서 계산된다 (n=4 기술적 복제물; 막대는 평균 ± s.e.m. 을 나타냄).
도. 59 - 추가 유전자좌에서 SHERLOCK 을 사용한 유전형분석 및 삶은 타액에서 직접적 유전형분석. SHERLOCK 은 게놈 DNA 내의 rs601338 SNP 부위의 유전자형을 원심분리, 변성 및 끓인 타액으로부터 직접 구별할 수 있다 (n=4 기술적 복제물, 2-테일 스튜던트 t-검정; **, p < 0.01; ****, p < 0.001; 막대는 평균 ± s.e.m. 을 나타냄).
도. 60 - 인간 SNP 를 정확하게 유전형분석하기 위한 합성 유전형분석 표준 개발. (A) PCR-증폭된 유전자형 표준에 대해 비교한 4 명의 개체 각각에 대해 rs601338 SNP 부위에서 SHERLOCK 을 사용한 유전형분석 (n=4 기술적 복제물; 막대는 평균 ± s.e.m. 을 나타냄). (B) PCR-증폭된 유전자형 표준에 대해 비교한 4 명의 개체 각각에 대해 rs4363657 SNP 부위에서 SHERLOCK 을 사용한 유전형분석 (n=4 기술적 복제물; 막대는 평균 ± s.e.m. 을 나타냄). (C) rs601338 SNP 부위에서 각 개체 및 합성 표준에 대한 SHERLOCK 결과 사이의 컴퓨터로 계산된 p-값의 히트맵. 각각의 대립유전자-감지 crRNA 에 대한 히트맵이 제시되어 있다. 히트맵 컬러 맵은 무의미도 (p> 0.05) 가 적색이고 중요도 (p <0.05) 가 청색이 되도록 등급화된다 (n=4 기술적 복제물, 1-방식 ANOVA). (D) rs4363657 SNP 부위에서 각 개체 및 합성 표준에 대한 SHERLOCK 결과 사이의 컴퓨터로 계산된 p-값의 히트맵. 각각의 대립유전자-감지 crRNA 에 대한 히트맵이 제시되어 있다. 히트맵 컬러 맵은 무의미도 (p> 0.05) 가 적색이고 중요도 (p <0.05) 가 청색이 되도록 등급화된다 (n=4 기술적 복제물, 1-방식 ANOVA). (E) SHERLOCK 유전형분석의 p-값 히트맵 결과를 이해하기 위한 가이드. 개별 및 대립 유전자 합성 표준 사이의 p-값> 0.05 에 해당하는 대립유전자를 선택함으로써 유전형분석을 쉽게 호출할 수 있다. 적색 블록은 합성 표준 및 개체의 SHERLOCK 결과 사이의 중요하지 않은 차이, 따라서 유전자형-양성 결과에 해당한다. 청색 블록은 합성 표준 및 개체의 SHERLOCK 결과 사이의 중요한 차이, 따라서 유전자형-음성 결과에 해당한다.
도. 61 - 미스매치된 배경 표적의 작은 분획으로서 ssDNA 1 의 검출. 인간 게놈 DNA 의 배경 상의 ssDNA 1 의 희석 시리즈의 SHERLOCK 검출. 검출된 ssDNA 1 표적과 배경 게놈 DNA 사이에 서열 유사성이 없어야 한다는 점에 유의한다 (n=2 기술적 복제물; 막대는 평균 ± s.e.m. 을 나타냄).
도. 62 - 지카 바이러스 환자의 소변 (A) 또는 혈청 (B) 샘플은 95℃ (소변) 또는 65℃ (혈청) 에서 5 분 동안 열 불활성화되었다. 예시 실시형태에 따라, 1 마이크로리터의 불활성화된 소변 또는 혈청을 2 시간 RPA 반응에 대한 투입으로서 사용하고 이어서 3 시간 C2c2/Cas13a 검출 반응을 후속하였다. 오차 막대는 검출 반응에 대한 n=4 기술적 복제물에 기초하여 1 SD 를 나타낸다.
도. 63 - 지카 바이러스 환자의 소변 샘플은 95℃ 에서 5 분 동안 열 불활성화되었다. 예시 실시형태에 따라, 1 마이크로리터의 불활성화된 소변을 30 분 RPA 반응에 대한 투입으로서 사용하고 이어서 3 시간 (A) 또는 1 시간 (B) C2c2/Cas13 검출 반응을 후속하였다. 오차 막대는 검출 반응에 대한 n=4 기술적 복제물에 기초하여 1 SD 를 나타낸다.
도. 64 - 지카 바이러스 환자의 소변 샘플은 95℃ 에서 5 분 동안 열 불활성화되었다. 1 마이크로리터의 불활성화된 소변을 20 분 RPA 반응에 대한 투입으로서 사용하고 이어서 1 시간 C2c2/Cas13a 검출 반응을 후속하였다. 건강한 사람의 소변을 음성 대조군으로 사용했다. 오차 막대는 n=4 기술적 복제물 또는 검출 반응에 기초하여 1 SD 를 나타낸다.
도. 65 - 지카 바이러스 환자의 소변 샘플은 95℃ 에서 5 분 동안 열 불활성화되었다. 1 마이크로리터의 불활성화된 소변을 20 분 RPA 반응에 대한 투입으로서 사용하고 이어서 가이드 RNA 의 존재 또는 부재 하에 1 시간 C2c2/Cas13a 검출 반응을 후속하였다. 가이드를 함유하는 검출 반응으로부터 비-가이드 검출 반응에 대한 평균 형광 값을 빼서 데이터를 정규화한다. 건강한 사람의 소변을 음성 대조군으로 사용했다. 오차 막대는 검출 반응에 대한 n=4 기술적 복제물에 기초하여 1 SD 를 나타낸다.
도. 66 - 예시 실시형태에 따른, 4 개의 상이한 가이드 RNA 디자인을 갖는 2 개의 말라리아 특이적 표적의 검출을 보여준다. SEQ ID NO:337-348이 표시되어 있다.
도. 67 - 상이한 Cas13b 오솔로그의 편집 선호도를 보여주는 그래프를 제공한다. 핵심 (key) 에 대해서는 표 3 을 참조한다.
도. 68 - A) 편집 선호도가 다른 상이한 Cas13b 오솔로그를 사용하는 다중 어세이의 개략도, 및 B) Cas13b10 및 Cas13b5 를 사용하는 그러한 어세이의 가능성을 입증하는 데이터를 제공한다.
도. 69 - Cas13b5 (프레보텔라 sp. MA2106) 및 Cas13b9 (프레보텔라 intermedia) 오솔로그와의 이중 다중화를 보여주는 그래프를 제공한다. 이펙터 단백질 및 가이드 서열 둘 다는 상이한 형광 판독값 (폴리 U 530nm 및 폴리 A 485nm) 을 사용하는 동일한 반응에서 이중 다중화를 가능하게 하는 동일한 반응에 포함된다.
도. 70 -도 69 와 동일하나, 이 예에서는 Cas13a (Leptorichia wadei LwaCas13a) 오솔로그 및 Cas13b 오솔로그 (프레보텔라 sp. MA2016, Cas13b5) 를 사용하여 제공한다.
도. 71 -특정 예시 실시형태에 따라, 표적화의 견고성을 결정하기 위해 복합 가이드 서열로 표적 서열을 타일링하는 방법을 제공한다. SEQ ID NO:349 및 350 이 제시되어 있다.
도. 72 - 하이브리드화 연쇄 반응을 활성화시키기 위해, Cas13 이펙터 단백질이 개시제, 예를 들어 본원에 기재된 차폐성 구성체에 포함된 개시제를 잠금 해제하는데 사용될 수 있음을 보여주는 하이브리드 연쇄 반응 (HCR) 겔을 제공한다.
도. 73 - 복합 용해물에서 슈도모나스 아에루기노사를 검출하는 능력을 보여주는 데이터를 제공한다.
도. 74 - 은 특정 예시 실시형태에 따른 특정 Cas13 오솔로그의 이온 선호도를 보여주는 데이터를 제공한다. 모든 표적 농도는 (1 mM 및 10 mM) 의 이온 농도로 20 nM 투입이었다.
도. 75 - 는 Cas13b12 가 절단을 위해 1 mM 황산 아연을 선호도를 갖는 것을 보여주는 데이터를 제공한다.
도. 76 - 완충제 최적화가 polyA 리포터 상의 Cas13b5 의 신호 대 잡음을 증폭시킬 수 있음을 보여주는 데이터를 제공한다. 구 완충제는 40 mM Tris-HCL, 60 mM NaCl, 6 mM MgCl2, pH 7.3 을 포함한다. 신 완충제는 20 mM HEPES pH 6.8, 6 mM MgCl2 및 60 mM NaCl 을 포함한다.
도. 77 - 은 유형 VI-A/C Crispr 시스템 및 유형 VI-B1 및 B2 시스템의 개략도 뿐만 아니라 대표적인 Cas13b 오솔로그의 계통도를 제공한다.
도. 78 - 다양한 Cas13b 오솔로그의 상이한 뉴클레오티드에서 및 LwCas13a 에 대한 상대적 절단 활성을 제공한다.
도. 79 - 다양한 예시 Cas13 오솔로그의 상대적 민감성을 보여주는 그래프를 제공한다.
도. 80 -예시 실시형태를 사용하여 제프토 몰 (zM) 레벨의 검출을 달성하는 능력을 나타내는 그래프를 제공한다.
도. 81 - 상이한 편집 선호도 및 polyN 기반 차폐성 구성체를 갖는 Cas13 오솔로그를 사용하는 다중 어세이의 개략도를 제공한다.
도 82- 다양한 조건에서 프라이머 최적화 실험의 결과 및 슈도모나스 검출 결과를 보여주는 데이터를 제공한다.
도. 83 - 은 특정 예시 실시형태에 따른 측류 장치를 사용하여 획득된 측류 어세이 및 결과의 개략도를 제공한다.
도. 84 - 특정 예시 실시형태에 따른 측류 장치를 사용하여 특정 대두 얼룩을 검출하는 능력을 제공한다.
도. 85 - 측류 검출에 적합화시킨 SHERLOCK. (A) SHERLOCK을 사용한 측류 검출의 개략도. (B) 1시간의 LwaCas13a 반응으로 측류 SHERLOCK을 사용한 합성 지카 RNA의 검출. (C) (B)의 검출에서 밴드 강도의 정량.
도. 86 - 측류 SHERLOCK을 사용한 농업 및 현장 건강 관리 적용. (A) LwaCas13a 를 사용하여 CP4-EPSPS-개질된 (제초제 저항성) 또는 WT 대두 종자에서 CP4-EPSPS 제초제 저항성 유전자 또는 렉틴 대조군의 검출. (B) 제초제 저항성 또는 WT 대두에서 CP4-EPSPS 검출의 시간경과. (C) 제초제 저항성 또는 WT 대두에서 렉틴 검출의 시간경과. (D) LwaCas13a와 CP4-EPSPS 및 WT 종자의 혼합물의 CP4-EPSPS DNA 함량의 정량. (E) LwaCas13a 를 사용하여 CP4-EPSPS-개질된 또는 WT 대두 종자에서 CP4-EPSPS 제초제 저항성 유전자 또는 렉틴 대조군의 측류 검출. (F) (E)의 검출에서 밴드 강도의 정량. (G) L858R 또는 WT 암 돌연변이가 존재하는 환자-유래 세포-무함유 DNA 샘플에서 EGFR L858R 돌연변이의 검출. (H) L858R 또는 WT 암 돌연변이가 존재하는 환자-유래 세포-무함유 DNA 샘플에서 EGFR L858R 돌연변이의 측류 검출. (I) (H)의 검출에서 밴드 강도의 정량. (J) 엑손 19 결실 또는 WT 암 돌연변이가 존재하는 환자-유래 세포-무함유 DNA 샘플에서 EGFR 엑손 19 결실 돌연변이의 검출. (K) 엑손 19 결실 또는 WT 암 돌연변이가 존재하는 환자-유래 세포-무함유 DNA 샘플에서 EGFR 엑손 19 결실 돌연변이의 측류 검출. (L) (K)의 검출에서 밴드 강도의 정량.
도. 87 - 자기 비드-기반 측류 SHERLOCK. (A) SHERLOCK의 자기-비드 기반 측류 판독의 개략도. 부수적 활성은 비드에서 측류 리포터를 절단하여 검출할 수 있다. (B) 1시간의 LwaCas13a 반응으로 자기-비드 기반 측류 SHERLOCK을 사용한 합성 뎅기 RNA의 검출. (C) (B)의 검출에서 밴드 강도의 정량.
도. 88 - ssRNA1의 SHERLOCK 측류 검출. (A) 다양한 농도의 ssRNA 1 에서 측류 SHERLOCK을 사용하는 ssRNA 1의 검출. (B) (A)의 검출에서 밴드 강도의 정량.
도. 89 - 미정제 식물 추출물에서 CP4 및 렉틴 유전자의 SHERLOCK 측류 검출. (A) 10 분 RPA 및 20 분 부수적 검출로의 측류 SHERLOCK을 사용하는 직접 대두 미정제 추출물로부터 RR (CP4 EPSPS 유전자) 또는 렉틴의 검출. (B) 10 분 RPA 및 35 분 부수적 검출로의 측류 SHERLOCK을 사용하는 직접 대두 미정제 추출물로부터 RR (CP4 EPSPS 유전자) 또는 렉틴의 검출. (C) (A)의 검출에서 밴드 강도의 정량. (D) (B)의 검출에서 밴드 강도의 정량.
도. 90 - 합성 엑손 19 결실 샘플의 SHERLOCK 측류 검출. (A) LwaCas13a를 사용하는 엑손 19 결실 또는 WT 유전자형이 존재하는 합성 DNA 샘플에서 EGFR 엑손 19 결실 돌연변이의 검출. (B) LwaCas13a를 사용하는 엑손 19 결실 또는 WT 유전자형이 존재하는 합성 DNA 샘플에서 EGFR 엑손 19 결실 돌연변이의 측류 검출. (C) (B)의 검출에서 밴드 강도의 정량.
도. 91 - 은 SHERLOCK 으로의 대두 제초제 저항성 유전자의 검출을 예시한다. (A) 측류 스트립을 통해 정량적, 다중화 및 휴대용 방식으로 대두 이식유전자의 검출을 허용하는 빠른 게놈 DNA 추출 방법과 조합된 SHERLOCK의 개략도. (B) LwaCas13a 및 형광 리포터를 사용한 Roundup Ready (RR) 이식유전자 CP4 EPSPS 및 양성 대조군 유전자 렉틴의 SHERLOCK 검출. (C) 대두의 복합 혼합물에서 Roundup Ready (RR) 이식유전자 CP4 EPSPS의 백분율의 정량적 SHERLOCK 검출. (D) LwaCas13a 및 PsmCas13b와 2 색 SHERLOCK을 사용하여 CP4 EPSPS 이식유전자 및 렉틴의 샘플 내 복합 검출의 개략도. (E) LwaCas13a 및 PsmCas13b와 2 색 SHERLOCK을 사용하여 CP4 EPSPS 이식유전자 및 렉틴의 샘플 내 복합 검출. 대두의 렉틴 검출은 투입물 없는 물 대조군 샘플과 비교된다. (F) SHERLOCK 측류 스트립을 이용한 빠른 대두 이식유전자 검출의 개략도. (G) SHERLOCK 및 LwaCas13a를 사용하여 측류 스트립에서 30 분 이내에 CP4 EPSPS 이식유전자의 신속한 검출. (H) G의 측류 스트립으로부터의 샘플 밴드 강도의 정량.
도. 92 - 는 SHERLOCK을 이용한 식물 유전자 검출의 동역학을 예시한다. (A) 시간에 따른 RR 대두 및 야생형 (WT) 대두에서 SHERLOCK 및 LwaCas13a를 사용하는 Roundup Ready (RR) 이식유전자 CP4 EPSPS의 검출. (B) 시간에 따른 Roundup Ready (RR) 대두 및 야생형 (WT) 대두에서 SHERLOCK 및 LwaCas13a를 사용하는 렉틴 유전자의 검출.
도. 93 - 은 대두 집단 내 CP4 EPSPS 이식유전자의 정량적 SHERLOCK을 예시한다. (A) SHERLOCK 검출 반응의 상이한 시점에서 백분율 Roundup Ready (RR) 대두와 SHERLOCK 신호의 상관관계. (B) 30 분 시점 (a 에 도시된 바와 같이 최대 상관을 갖는 시점)에서 다양한 양의 Roundup Ready (RR) 대두를 함유하는 대두 혼합물로부터 CP4 EPSPS 이식유전자의 SHERLOCK 신호 검출. (C) 30 분 시점 (A 에 도시된 바와 같이 최대 상관을 갖는 시점)에서 다양한 양의 Roundup Ready (RR) 대두를 함유하는 대두 혼합물로부터 렉틴 유전자의 SHERLOCK 신호 검출.
도. 94 - 는 Csm6 신호 증폭에 의한 CP4 EPSPS 이식유전자의 SHERLOCK 검출을 예시한다. (A) LwaCas13a 및 EiCsm6 또는 LsCsm6을 사용한 신호 증폭으로의 Roundup Ready (RR) 이식유전자 CP4 EPSPS의 SHERLOCK 검출. (B) LwaCas13a에 의한 CP4 EPSPS 이식유전자의 SHERLOCK 검출의 EiCsm6 증폭의 동역학.
도. 95. - 금 나노입자 응집으로 RNase 활성의 비색 검출 결과를 제공한다. A) RNase 활성에 대한 금-나노입자 기반 비색 판독의 개략도. RNase 활성의 부재시, RNA 링커는 금 나노입자를 응집시켜, 적색을 상실한다. RNA 링커의 절단은 나노입자를 방출하고 적색 변화를 초래한다.
도. 96. - A) 는 특정 예시 실시형태에 따른 측류 검출의 개략도를 제공한다. B) 1시간의 LwaCas13 반응으로 측류 실시형태를 사용한 합성 ZIKA ssRNA의 검출. C) (B)의 검출에서 밴드 강도의 정량. C) (B)의 검출에서 밴드 강도의 정량. 환자 액체 생검 샘플로부터 치료적으로 관련된 EGFR 돌연변이의 측류 검출 개략도. E) L858R 또는 WT 암 돌연변이가 존재하는 환자-유래 세포-무함유 DNA 샘플에서 EGFR L858R 돌연변이의 검출. 값은 평균 +/- S.E.M으로 표시된다. F). L858R 또는 WT 대립유전자가 존재하는 환자-유래 세포-무함유 DNA 샘플에서 EGFR L858R 돌연변이의 측류 검출. G) (E)의 검출에서 밴드 강도의 정량. H) 엑손 19 결실 또는 WT 대립유전자가 존재하는 환자-유래 세포-무함유 DNA 샘플에서 EGFR 엑손 19 결실 돌연변이의 검출. 값은 평균 +/- S.E.M으로 표시된다. I) 엑손 19 결실 또는 WT 대립유전자가 존재하는 환자-유래 세포-무함유 DNA 샘플에서 EGFR 엑손 19 결실 돌연변이의 측류 검출. J) (H)의 검출에서 밴드 강도의 정량. K) DENV ssRNA의 EiCsm6-증강된 LwaCas13a 검출의 측류 판독 개략도. L) RPA에 의한 사전증폭없이 LwaCas13a와 조합한 합성 DENV RNA의 EiCsm6-증강된 측류 검출. 밴드 강도 정량은 우측에 표시된다.
도 97 - A) 다양한 농도에서 측류 실시형태를 사용하는 ssRNA 1의 검출. B) (A)의 검출에서 밴드 강도의 정량.
도. 98. 타액으로부터의 게놈 DNA의 원-포트 측류 유전형분석. A) 환자 타액으로부터의 게놈 DNA의 빠른 추출 및 원-포트 검출을 위한 개략도. B). 물 투입과 비교한 미정제 게놈 DNA 추출로부터 rs601338 유전자형의 검출. C). 미정제 게놈 DNA 추출에서 rs601338 유전자형의 측류 검출. D). (C)의 검출에서 밴드 강도의 정량. E) 미정제 타액으로부터 25 분 내에 환자 DNA의 검출
도. 99 - 합성 cfDNA 샘플의 SHERLOCK 측류 검출. A) LwaCas13a를 사용하는 엑손 19 결실 또는 WT 유전자형이 존재하는 합성 DNA 샘플에서 EGFT 엑손 19 결실 돌연변이의 검출. B) LwaCas13a를 사용하는 엑손 19 결실 또는 WT 유전자형이 존재하는 합성 DNA 샘플에서 EGFR 엑손 19 결실 돌연변이의 측류 검출. C) (B)의 검출에서 밴드 강도의 정량. D) LwaCas13a를 사용하는 엑손 19 결실 또는 WT 유전자형이 존재하는 4 명 환자 cfDNA 샘플에서 EGFR 엑손 19 결실 돌연변이의 검출. E) LwaCas13a를 사용하는 T790M 또는 WT 유전자형이 존재하는 합성 DNA 샘플에서 EGFR T790M 결실 돌연변이의 검출. K) LwaCas13a를 사용하는 T790M 또는 WT 유전자형을 갖는 환자 cfDNA 샘플에서 EGFR T790M 결실 돌연변이의 검출 (*, p<0.05; n.s, 유의하지 않음; 막대는 ± s.e.m.을 나타냄). 이 경우, 표적화된 서열분석에 의해 확인된, 환자 4의 T790M 대립유전자 분획은 0.6% 였다. 출원인은 여전히 민감성 및 특이적 토프 어세이로 인해 이 낮은 대립유전자 분획의 유의한 검출을 볼 수 있었으며, 0.1% 초과의 대립유전자 분획 샘플 검출을 보여주는 이전 결과와 비교하였다 (3). 부가적으로, RPA의 Bsu 폴리머라아제는 사이클 당 혼입된 염기 당 10-5 오차의 최소 오차율을 갖기 때문에 (25), 약 0.02% 의 앰플리콘이 감지될 돌연변이에서 오차를 함유할 것으로 예상된다. 야생형 앰플리콘 상에 올바른 돌연변이가 형성되면 거짓 신호가 검출될 것이기 때문에, 그러면 단지 0.0067% 의 앰플리콘이 돌연변이의 거짓 검출을 야기하는 돌연변이를 가질 것이다. 대부분의 환자는 cfDNA 돌연변이의 0.01% 대립유전자 분획을 갖지 않기 때문에, 이 오차율은 허용된다.
도. 100 - 상이한 리포터 조합에 의한 측류 Csm6-증강된 SHERLOCK. A) 다양한 리포터 디자인으로 Csm6-증강된 SHERLOCK의 측류 검출. sA: 단형-poly A 센서; lA: 장형 poly A 센서; sC: 단형 poly C 센서; lC: 장형 poly C 센서; sA/C: 단형 poly-A/C 센서; lA/C: 장형 poly-A/C 센서; M: 혼합 RNase alert-유사 센서. B) (A)의 검출에서 밴드 강도의 정량. C) 개별 RPA 및 IVT 단계에 의한 아실트랜스퍼라제 ssDNA의 EiCsm6-증강된 LwaCas13a SHERLOCK 검출의 측류 판독 개략도. D) LwasCas13a와 조합한 P. 애루지노사 아실트랜스퍼라제 유전자의 EiCsm6-증강된 측류 SHERLOCK. 밴드 강도 정량은 우측에 표시된다.
도. 101 -Casd13 오솔로그 절단에 대한 crRNA 스페이서 길이의 효과. A) 다양한 스페이서 길이의 ssRNA1-표적화 crRNA를 갖는 PsmCas13b의 절단 활성. B) 다양한 스페이서 길이의 ssRNA1-표적화 crRNA를 갖는 CcaCas13b의 절단 활성.
도. 102 - 디-뉴클레오티드 절단 선호도와 Cas13 패밀리의 관계. A) 여러 Cas13a 및 Cas13b 오솔로그 일원의 복합 단백질 서열 정렬에 기초한 단백질 서열 유사성 매트릭스. 클러스터링은 Euclidean 거리를 기준으로 제시된다. B) 여러 Cas13a 및 Cas13b 직접 반복 서열의 복합 서열 정렬에 기초한 직접 반복 서열 유사성 매트릭스. 클러스터링은 Euclidean 거리를 기준으로 제시된다. C) 디뉴클레오티드 모티프 리포터의 Cas13 절단 활성 염기 선호도의 클러스터링.
도. 103A 및 103B - 뎅기 용 Cas13b10 프로브 및 ssRNA1 용 LwaCas13a 프로브를 사용하는 뎅기 RNA 및 ssRNA1 에 대한 측류 어세이 결과를 보여준다.
도. 2 - (A) 렙토트리치아 웨이데이 (Leptotrichia wadei) 유래의 CRISPR/C2c2 유전자좌의 개략도를 제공한다. LwC2c2 및 LshC2c2 시스템 유래의 대표적인 crRNA 구조가 제시된다. (SEQ. I.D. Nos. 220 및 221) (B) C2c2 활성에 대한 생체 내 박테리아 어세이의 개략도. 프로토스페이서는 암피실린-저항성 플라스미드에서 베타-락타마아제 유전자의 상류에 클로닝되고, 이 구성체는 표적화 또는 비-표적화 스페이서와 함께 C2c2 를 발현하는 이. 콜라이로 형질전환된다. 성공적인 형질전환체는 활성을 정량화하기 위해 계수된다. (C) 생체 내 활성에서 LwC2c2 및 LshC2c2 의 정량. (n = 2 생물학적 복제물; 막대는 평균 ± s.e.m. 을 나타냄) (D) LwC2c2 의 최종 크기 배제 겔 여과. (E) LwC2c2 단계적 정제의 쿠마시 블루 염색된 아크릴아미드 겔. (F) 상이한 PFS 표적에 대한 LwC2c2 의 활성. LwC2c2 는 스페이서 옆에 있는 가변 3' PFS 를 갖는 형광 RNA 에 대해 표적화되었고, 반응 생성물은 변성 겔 상에 시각화되었다. LwC2c2 는 G PFS 에 대한 약간의 선호도를 보여준다.
도. 3 - 4 가지 상이한 양의 단백질/crRNA (1:4, 1:16, 1:32, 1:64) 로 1 ㎍, 100 ng, 10 ng 및 1 ng 의 표적을 사용하여 상이한 희석에서 예시 차폐성 구성체의 검출을 보여준다 - (96+48)*2= 288 반응에서, 2 개 풀의 crRNA, crRNA 없음 조건, 기술적 복제물로, 3 시간에 걸쳐 5 분 간격으로 측정됨.
도. 4 - 4 가지 상이한 양의 단백질/crRNA (1:4, 1:16, 1:32, 1:64) 로 1 ㎍, 100 ng, 10 ng 및 1 ng 의 표적을 사용하여 상이한 희석에서 예시 차폐성 구성체의 검출을 보여준다 - (96+48)*2= 288 반응에서, 2 개 풀의 crRNA, crRNA 없음 조건, 기술적 복제물로, 3 시간에 걸쳐 5 분 간격으로 측정됨.
도. 5 - 4 가지 상이한 양의 단백질/crRNA (1:4, 1:16, 1:32, 1:64) 로 1 ㎍, 100 ng, 10 ng 및 1 ng 의 표적을 사용하여 상이한 희석에서 예시 차폐성 구성체의 검출을 보여준다 - (96+48)*2= 288 반응에서, 2 개 풀의 crRNA, crRNA 없음 조건, 기술적 복제물로, 3 시간에 걸쳐 5 분 간격으로 측정됨.
도. 6 - 4 가지 상이한 양의 단백질/crRNA (1:4, 1:16, 1:32, 1:64) 로 1 ㎍, 100 ng, 10 ng 및 1 ng 의 표적을 사용하여 상이한 희석에서 예시 차폐성 구성체의 검출을 보여준다 - (96+48)*2= 288 반응에서, 2 개 풀의 crRNA, crRNA 없음 조건, 기술적 복제물로, 3 시간에 걸쳐 5 분 간격으로 측정됨.
도. 7 - 특정 예시 실시형태에 따른, 차폐성 구성체 및 CRISPR 이펙터 단백질을 사용한 예시 검출 방식의 개략도를 제공한다.
도. 8 - 상이한 가이드 RNA 풀을 사용하여 표적을 검출할 때 시간에 따른 형광도 변화를 보여주는 일련의 그래프를 제공한다.
도. 9 - 다양한 농도의 CRISPR 이펙터 단백질에서 표적 RNA 의 상이한 희석에 걸쳐 검출된 정규화된 형광도를 보여주는 그래프를 제공한다.
도. 10 - NASBA 증폭 반응의 일반적인 단계를 보여주는 개략도이다.
도. 11 -3 개의 상이한 프라이머 세트로 NASBA 에 의해 증폭된 후 소광된 형광 프로브를 사용하여 C2c2 부수적 검출에 적용되는 핵산 표적 ssRNA 1 의 검출을 나타내는 그래프를 제공한다 (n=2 기술적 복제물; 막대는 평균 ± s.e.m. 을 나타냄).
도. 12 - 부수적 효과가 렌티바이러스 표적 RNA 의 존재를 검출하는데 사용될 수 있음을 보여주는 그래프를 제공한다.
도. 13 - 부수적 효과 및 NASBA 가 aM 농도에서 종을 검출할 수 있음을 입증하는 그래프를 제공한다.
도. 14 - 부수적 효과 및 NASBA 가 저 농도 샘플을 빠르게 식별함을 입증하는 그래프를 제공한다.
도. 15 - 특정 시점에서의 정규화된 형광도가 샘플 투입 농도의 예측치임을 보여준다. 증폭 없이 Cas13a 검출로부터의 형광도 측정은 투입 RNA 농도와 상관 관계가 있다 (n=2 생물학적 복제물; 막대는 평균 ± s.e.m. 을 나타냄).
도. 16 - 반응에 참여하는 성분을 보여주는, RPA 반응의 개략도를 제공한다.
도. 17 - SHERLOCK 의 개략도; 따라서 RPA 또는 RT-RPA 단계의 혼입을 통해 DNA 또는 RNA 표적 둘 다의 검출을 보여주는 개략도를 제공한다. 표적 RNA 의 인식시, 부수적 효과는 C2c2 가 절단 리포터를 절단하여 형광을 생성하게 한다. 단일-분자 양의 RNA 또는 DNA 를 리콤비나아제 폴리머라아제 증폭 (RPA) 을 통해 DNA 로 증폭시키고 전사하여 RNA 를 생성할 수 있으며, 이어서 이를 C2c2 에 의해 검출한다.
도. 18 - C2c2 부수적 검출을 통해 검출된 ssRNA 표적의 개략도를 제공한다 (SEQ. I.D. Nos. 222 및 223).
도. 19 - RPA 를 사용한 단일 분자 DNA 검출을 입증하는 일련의 그래프를 제공한다 (즉, C2c2 첨가 15 분 이내).
도. 20 - T7 폴리머라아제를 RPA 반응에 혼합하는 것이 DNA 검출에 악영향을 미치는 것을 입증하는 일련의 그래프를 제공한다.
도. 21 - 폴리머라아제를 RPA 반응에 혼합하는 것이 DNA 검출에 악영향을 미치지 않는 것을 입증하는 일련의 그래프를 제공한다.
도. 22 - RPA, T7 전사 및 C2c2 검출 반응이 동시에 인큐베이션될 때 호환가능하고 단일 분자 검출을 달성함을 입증하는 그래프를 제공한다 (n=2 기술적 복제물; 막대는 평균 ± s.e.m. 을 나타냄).
도. 23 - 빠른 RPA-RNA 시간 인큐베이션의 효능을 입증하는 일련의 그래프를 제공한다.
도. 24 - T7 폴리머라아제 양의 증가가 RPA-RNA 의 민감성을 증가시킨다는 것을 입증하는 일련의 그래프를 제공한다.
도. 25- 1.5x 효소와의 원-포트 반응을 사용한 RPA-DNA 검출 어세이 결과를 보여주는 일련의 그래프를 제공한다. 단일 분자 (2aM) 검출은 30 분 정도로 일찍 달성되었다.
도. 26 - RPA-DNA 원-포트 반응이 투입 농도에 비해 형광도의 정량적 감소를 나타내는 것을 입증하는 일련의 그래프를 제공한다. 피팅된 곡선은 표적 투입 농도와 출력 형광 사이의 관계를 밝혀낸다.
도. 27 - (A) 증폭 없이 RNA 의 C2c2 검출이 50 fM 이하의 농도에서 ssRNA 표적을 검출할 수 있음 (n = 2 기술적 복제물; 막대는 평균 ± s.e.m. 을 나타냄), 및 (B) RPA-C2c2 반응은 단일-분자 DNA 검출이 가능함 (n=4 기술적 복제물; 막대는 평균 ± s.e.m. 을 나타냄) 을 입증하는 일련의 그래프를 제공한다.
도. 28 - 특정 예시적인 실시형태에 따라 생성된 C2c2 신호가 종이 기판 상의 20 pM 표적을 검출할 수 있음을 입증하는 일련의 그래프를 제공한다.
도. 29 -특이적 RNAse 억제제가 종이 상의 배경 신호를 제거할 수 있음을 보여주는 그래프를 제공한다.
도. 30 은 유리 섬유 기판 상의 특정 예시 실시형태에 따른 시스템을 사용한 검출을 나타내는 일련의 그래프이다.
도. 31 -특정 예시 실시형태에 따른 (A) 지카 RNA 검출의 개략도를 제공하는 일련의 그래프를 제공한다. 렌티바이러스는 C2c2 부수적 검출에 의해 표적화된 지카 RNA 또는 상동 뎅기 RNA 단편으로 패키징되었다. 48 시간 후에 배지를 수확하고, 열 용해, RT-RPA 및 C2c2 검출에 적용하였다. (B) RT-RAP-C2c2 검출로는 지카 렌티바이러스 입자의 고도로 민감한 검출이 가능하다 (n=4 기술적 복제물, 2-테일 스튜던트 t-검정; *****, p<0.0001; 막대는 평균 ± s.e.m. 을 나타냄) (C) 특정 예시 실시형태에 따라, 종이 상의 동결-건조된 C2c2 를 사용한 지카 RNA 검출의 개략도. (D) 종이-기반 어세이로는 지카 렌티바이러스 입자의 고도로 민감한 검출이 가능하다 (n=4 기술적 복제물, 2-테일 스튜던트 t-검정; ****, p<0.0001; **, p<0.01, 막대는 평균 ± s.e.m. 을 나타냄).
도. 32 - (A) 인간 혈청에서 단리된 지카 RNA 의 C2c2 검출을 위한 개략도를 보여주는 일련의 그래프를 제공한다. 혈청 중의 지카 RNA 는 역전사, RNA 의 RNase H 분해, cDNA 의 RPA 및 C2c2 검출에 적용된다. (B) C2c2 는 인간 지카 혈청 샘플의 고도로 민감한 검출이 가능하다. 제시된 지카 RNA 의 농도는 qPCR 에 의해 확인되었다 (n=4 기술적 복제물, 2-테일 스튜던트 t-검정; ****, p < 0.0001; 막대는 평균 ± s.e.m. 을 나타냄).
도. 33 - (A) 동결-건조된 C2c2 가 저 펨토몰 범위에서 ssRNA 1 의 민감한 검출이 가능함을 보여주는 일련의 그래프를 제공한다. C2c2 는 액체 형태의 (B) 또는 동결 건조된 (C) 종이 상의 200pM ssRNA 1 표적을 신속하게 검출할 수 있다. 반응은 용액 (D) (n=3) 및 동결-건조된 형태 (E) (n=3) 중의 합성된 지카 RNA 단편의 민감한 검출이 가능하다. (F) 투입 농도와 검출된 형광도 사이의 유의한 상관 관계를 나타내는 인간 지카 cDNA 검출에 대한 정량적 곡선. (G) 다양한 양의 인간 혈청의 존재 하에 수행된 ssRNA 1 의 C2c2 검출 (달리 언급되지 않는 한, n=2 기술적 복제물; 막대는 평균 ± s.e.m. 을 나타냄).
도. 34 - (A) 범용 V3 RPA 프라이머 세트를 사용하여 박테리아 게놈 유래의 16S rRNA 유전자의 C2c2 검출에 대한 개략도, 및 (B) 특정 예시 실시형태에 따라 수행된 어세이를 사용하여 대장균 또는 P. 아에루기노사 gDNA 의 민감하고 특이적인 검출을 달성하는 능력 (n=4 기술적 복제물, 2-테일 스튜던트 t-검정; ****, p < 0.0001; 막대는 평균 ± s.e.m. 을 나타냄) 의 개략도를 제공한다. Ec, 대장균; Kp, 클렙시엘라 뉴모니애; Pa, 슈도모나스 아에루기노사; Mt, 마이코박테리움 투베르쿨로시스; Sa, 스타필로코쿠스 아우레우스.
도. 35 - (A) 클렙시엘라 뉴모니애의 4 가지 상이한 임상 단리물 유래의 2 개의 상이한 카르바페넴-저항성 유전자 (KPC 및 NDM-1) 의 검출 및 (B) 카르바페넴-저항성 유전자의 검출 (파트 A) 이 KPC 와 NDM-1 crRNA 어세이 사이의 신호 비율로서 정규화되는 것을 입증하는 일련의 그래프를 제공한다 (n=2 기술적 복제물, 2-테일 스튜던트 t-검정; ****, p <0.0001; 막대는 평균 ± s.e.m.을 나타냄).
도. 36 - (A) C2c2는 단일 미스매치에 민감하지 않지만, 부가적인 미스매치가 있는 crRNA 가 로딩될 때 표적 내 단일 뉴클레오티드 차이를 구별할 수 있음을 입증하는 일련의 그래프를 제공한다. ssRNA 표적 1-3 은 crRNA 의 다양한 위치에서 합성 미스매치를 함유하는 10 개의 스페이서와 함께, 11 개의 crRNA 로 검출되었다. 미스매치된 스페이서는 표적 1 의 절단 감소를 나타내지 않았지만, 미스매치 표적 2 및 3 의 절단 억제를 나타내었다 (SEQ. I.D. Nos. 224 내지 237). (B) 합성 미스매치가 있는 단일-염기 특이적 스페이서의 합리적인 설계 공정을 보여주는 개략도. 합성 미스매치는 SNP 또는 관심 염기에 근접하여 배치된다 (SEQ. I.D. Nos. 238 내지 242). (C) 균주 SNP 의 고도로 특이적인 검출은 절단된 (23 개 뉴클레오티드) crRNA 를 이용한 C2c2 검출을 사용하여 단 하나의 뉴클레오티드 만이 상이한 지카 아프리카 대 미국 RNA 표적의 차별을 허용한다 (n=2 기술적 복제물, 1-테일 스튜던트 t-검정; *, p < 0.05; ****, p < 0.0001; 막대는 평균 ± s.e.m. 을 나타냄).
도. 37 - 하기를 입증하는 일련의 그래프를 제공한다: (A) 지카 균주 표적 영역 및 검출에 사용된 crRNA 서열의 개략도 (SEQ. I.D. Nos. 243 내지 248). 표적 내의 SNP는 적색 또는 청색으로 강조 표시되고 가이드 서열 내의 합성 미스매치는 적색으로 표시된다. (B) 균주 SNP 의 고도로 특이적인 검출은 SHERLOCK 을 사용하여 지카 아프리카 대 미국 RNA 표적의 차별을 허용한다 (n=2 기술적 복제물, 2-테일 스튜던트 t-검정; ****, p < 0.0001; 막대는 평균 ± s.e.m. 을 나타냄). (SEQ. I.D. Nos. 249 내지 254). (C) 뎅기 균주 표적 영역 및 검출에 사용된 crRNA 서열의 개략도. 표적 내의 SNP는 적색 또는 청색으로 강조 표시되고 가이드 서열 내의 합성 미스매치는 적색으로 표시된다. (D) 균주 SNP 의 고도로 특이적인 검출은 SHERLOCK 을 사용하여 뎅기 균주 1 대 균주 3 RNA 표적의 차별을 허용한다 (n=2 기술적 복제물, 2-테일 스튜던트 t-검정; ****, p < 0.0001; 막대는 평균 ± s.e.m. 을 나타냄).
도. 38 - C2c2 로 검출된 인간 SNP 의 위치를 보여주는 (A) 서커스 플롯을 보여주는 일련의 그래프를 제공한다. (B) 특정 예시 실시형태에 따라 수행된 어세이는 인간 SNP 를 구별할 수 있다. SHERLOCK 은 인간 게놈 내의 4 개의 상이한 SNP 부위에서 4 개의 상이한 개체를 올바르게 유전형분석할 수 있다. 대립유전자-감지 crRNA 의 각각의 개체 및 정체성에 대한 유전자형은 각 플롯 아래에 주석으로 표시한다 (n=4 기술적 복제물; 2-테일 스튜던트 t-검정; *, p < 0.05; **, p < 0.01; ***, p < 0.001; ****, p < 0.0001; 막대는 평균 ± s.e.m. 을 나타냄). (C) 특정 예시 실시형태에 따른 cfDNA 의 검출 방법의 개략도 (예컨대, 암 돌연변이의 세포-무함유 DNA 검출). (D) EGFR L858R 및 BRAF V600E 를 검출하기 위한 예시적인 crRNA 서열 (SEQ. I.D. Nos. 255 내지 260). 세포-무함유 DNA 에서 암 돌연변이에 대해 2 개의 게놈 유전자좌의 서열을 어세이하였다. SNP 가 청색으로 강조된 표적 게놈 서열 및 합성 미스매치가 적색으로 색상 표시된 돌연변이체/야생형 감지 crRNA 서열이 도시되어 있다.
도. 39 - C2c2 가 EGFR L858R (C) 또는 BRAF V600E (B) 소수 대립유전자로부터의 모의 (mock) 세포-무함유 DNA 샘플 중의 돌연변이체 소수 대립유전자를 검출할 수 있다는 것을 입증하는 일련의 그래프를 제공한다 (n=4 기술적 복제물, 2-테일 스튜던트 t-검정; *, p<0.05; **, p<0.01, ****, P<0.0001; 막대는 ± s.e.m. 을 나타냄).
도. 40 - (A) 어세이가 rs5082 에서 유전자형을 구별할 수 있음 (n=4 기술적 복제물; *, p < 0.05; **, p < 0.01; ***, p < 0.001; ****, p < 0.0001; 막대는 평균 ± s.e.m. 을 나타냄). (B) 어세이가 원심분리, 변성 및 끓인 타액과 직접적으로 gDNA 중의 rs601338 에서 유전자형을 구별할 수 있음 (n=3 기술적 복제물; *, p < 0.05; 막대는 평균 ± s.e.m. 을 나타냄) 을 보여주는 일련의 그래프를 제공한다.
도. 41 -(A) 단일 미스매치만이 ssDNA 1 과 상이한 표적의 배경에서 ssDNA 1 에 수행된 예시 실시형태의 개략도. (B) 어세이가 미스매치된 배경 (ssDNA 와 단일 미스매치만 상이한 표적) 의 존재 하에 ssDNA 1 의 단일 뉴클레오티드 특이성 검출을 달성하는 것을 제공한다. 다양한 농도의 표적 DNA 를 하나의 미스매치로 배경 과량의 DNA 와 조합하고 어세이에 의해 검출하였다.
도. 42 는 상이한 염료 Cy5 를 갖는 차폐성 구성체가 효과적인 검출을 허용함을 보여주는 그래프이다.
도. 43 은 금 나노입자 비색계 어세이의 개략도이다. AuNP 는 DNA 링커 및 RNA 브릿지의 조합을 사용하여 응집된다. RNase 활성의 첨가 시, ssRNA 브릿지가 절단되고 AuNP 가 방출되어 특징적인 색상의 적색으로의 이동을 야기한다.
도. 44 는 520 nm 에서 분산된 나노입자의 색상의 이동을 검출하는 능력을 보여주는 그래프이다. 나노입자는 도 43 에 도시된 예시 실시형태에 기초하고 다양한 농도에서 RNase A 의 첨가를 사용하여 분산되었다.
도. 45 는 RNase 비색 시험이 정량적임을 보여주는 그래프이다.
도. 46 은 분산된 나노입자에서의 색상 이동이 시각적으로 검출가능함을 나타내는 마이크로 웰 플레이트의 사진이다.
도. 47 은 비색 이동이 종이 기판 상에서 가시화되는 것을 나타내는 사진이다. 유리 섬유 934-AH 상의 37℃ 에서 10 분 동안 시험을 수행하였다.
도. 48 은 단백질 또는 소형 분자의 검출을 위한 특정 예시 실시형태에 따른 입체형태 전환 앱타머의 개략도이다. (A) SEQ ID NO:261. 라이게이션 생성물 (B) 은 RNA-표적화 이펙터에 대한 완전한 표적으로서 사용되며, 이것은 라이게이션되지 않은 투입 생성물 (SEQ ID NO:262) 을 검출할 수 없다.
도. 49 는 앱타머-기반 라이게이션이 RPA-검출가능한 기질을 생성할 수 있음을 보여주는 겔의 이미지이다. 앱타머를 다양한 수준의 트롬빈과 함께 인큐베이션한 다음 프로브로 라이게이션시켰다. 라이게이션된 구성체를 3 분 RPA 반응을 위한 주형으로 사용하였다. 500 nM 트롬빈은 배경보다 증폭된 표적 수준이 상당히 높다.
도. 50 은 선택된 C2c2 오솔로그의 HEPN 도메인의 아미노산 서열을 나타낸다 (SEQ ID NO:263-292).
도. 51 RPA 증폭을 이용한 RNA 의 Cas13a 검출은 (SHERLOCK) ~ 2 aM 까지의 농도에서, Cas13a 단독보다 더 민감한 ssRNA 표적을 검출할 수 있다 (n=4 기술적 복제물; 막대는 평균 ± s.e.m. 을 나타냄).
도. 52 - Cas13a 검출은 바이러스 및 박테리아 병원체를 감지하는 데 사용될 수 있다. (A) 인간 임상 샘플로부터 단리된 ZIKV RNA 의 SHERLOCK 검출의 개략도. (B) SHERLOCK 은 인간 ZIKV-양성 혈청 (S) 또는 소변 (U) 샘플의 고도로 민감한 검출이 가능하다. 제시된 ZIKV RNA 의 대략적 농도는 qPCR 에 의해 결정되었다 (n=4 기술적 복제물, 2-테일 스튜던트 t-검정; ****, p < 0.0001; 막대는 평균 ± s.e.m. 을 나타냄; n.d., 검출되지 않음).
도. 53 -프라이머 세트 2 (도 11 의) 및 SHERLOCK 으로의 NASBA 에 의한 ssRNA 1 의 검출 비교 (n=2 기술적 복제물; 막대는 평균 ± s.e.m. 을 나타냄).
도. 54 RPA 및 단일-반응 SHERLOCK 을 이용한 핵산 증폭. (A) 도 1C 에서 사용된 희석에 대한 ssRNA 1 의 디지털-액적 PCR 정량. ddPCR 결과에 기초한 희석에 대한 조정된 농도는 막대 그래프 위에 제시된다. (B) 도 1D 에서 사용된 희석에 대한 ssDNA 1 의 디지털-액적 PCR 정량. ddPCR 결과에 기초한 희석에 대한 조정된 농도는 막대 그래프 위에 제시된다. (C) RPA, T7 전사 및 Cas13a 검출 반응은 양립가능하고 동시에 인큐베이션될 때 DNA 2 의 단일 분자 검출을 달성한다 (n=3 기술적 복제물, 2-테일 스튜던트 t-검정; n.s., 유의하지 않음; **, p < 0.01; ****, p < 0.0001; 막대는 평균 ± s.e.m. 을 나타냄).
도. 55 -다른 민감한 핵산 검출 도구와 SHERLOCK 의 비교. (A) 디지털-액적 PCR 을 이용한 ssDNA 1 희석 시리즈의 검출 분석 (n=4 기술적 복제물, 2-테일 스튜던트 t-검정; n.s., 유의하지 않음; *, p < 0.05; **, p < 0.01; ****, p < 0.0001; 적색 선은 평균을 나타내고, 막대는 평균 ± s.e.m. 을 나타낸다. 10-1 미만의 측정된 카피/μL 을 가진 샘플은 표시되지 않음). (B) 정량적 PCR 을 이용한 ssDNA 1 희석 시리즈의 검출 분석 (n=16 기술적 복제물, 2-테일 스튜던트 t-검정; n.s., 유의하지 않음; **, p < 0.01; ****, p < 0.0001; 적색 선은 평균을 나타내고, 막대는 평균 ± s.e.m. 을 나타낸다. 10-10 미만의 상대적 신호를 가진 샘플은 표시되지 않음). (C) SYBR Green II 로의 RPA 를 이용한 ssDNA 1 희석 시리즈의 검출 분석 (n=4 기술적 복제물, 2-테일 스튜던트 t-검정; *, p < 0.05; **, p < 0.01; 적색 선은 평균을 나타내고, 막대는 평균 ± s.e.m. 을 나타낸다. 100 미만의 상대적 신호를 가진 샘플은 표시되지 않음). (D) SHERLOCK 을 이용한 ssDNA 1 희석 시리즈의 검출 분석 (n=4 기술적 복제물, 2-테일 스튜던트 t-검정; **, p < 0.01; ****, p < 0.0001; 적색 선은 평균을 나타내고, 막대는 평균 ± s.e.m. 을 나타낸다. 100 미만의 상대적 신호를 가진 샘플은 표시되지 않음). (E) 4 가지 유형의 검출 방법에 대한 일련의 ssDNA 1 희석에 대한 변동 계수. (F) 4 가지 유형의 검출 방법에 대한 6e2, 6e1, 6e0 및 6e-1 ssDNA 1 희석에 대한 평균 변동 계수 백분율 (막대는 평균 ± s.e.m. 을 나타냄)
도. 56 -임상 박테리아 단리물에서 카르바파넴 저항성 검출. 클렙시엘라 뉴모니애 및 대장균 대조군의 5 가지 임상 단리물에서 2 개의 상이한 카르바파넴-저항성 유전자 (KPC 및 NDM-1) 의 검출 (n=4 기술적 복제물, 2-테일 스튜던트 t-검정; ****, p <0.0001; 막대는 평균 ± s.e.m.을 나타냄; n.d., 검출되지 않음).
도. 57 -표적 서열에서 절단된 스페이서 및 단일 미스매치에 대한 LwCas13a 민감성의 특징분석. (A) (B)-(G) 에서 사용된 절단된 스페이서 crRNA 의 서열. 또한, ssRNA 1 및 2 의 서열이 도시되어 있으며, 이는 단일 염기쌍 차이가 적색으로 강조 표시되어 있다. 합성 미스매치를 함유하는 crRNA 는 적색으로 표시된 미스매치 위치 (SEQ ID NO:293-304) 로 나타낸다. (B) 위치 1-7 에서 합성 미스매치를 갖는 28 nt 스페이서 crRNA 에 대한 ssRNA 1 및 2 상의 부수적 절단 활성 (n=4 기술적 복제물; 막대는 평균 ± s.e.m. 을 나타냄). (C) (B) 에서 시험된 crRNA 의 특이성 비율. 특이성 비율은 투입표적 (on-target) RNA (ssRNA 1) 부수적 절단 대 오프-표적 (off-target) RNA (ssRNA 2) 부수적 절단의 비율로서 계산된다 (n=4 기술적 복제물; 막대는 평균 ± s.e.m. 을 나타냄). (D) 위치 1-7 에서 합성 미스매치를 갖는 23 nt 스페이서 crRNA 에 대한 ssRNA 1 및 2 상의 부수적 절단 활성 (n=4 기술적 복제물; 막대는 평균 ± s.e.m. 을 나타냄). (E) (D) 에서 시험된 crRNA 의 특이성 비율. 특이성 비율은 투입표적 (on-target) RNA (ssRNA 1) 부수적 절단 대 오프-표적 (off-target) RNA (ssRNA 2) 부수적 절단의 비율로서 계산된다 (n=4 기술적 복제물; 막대는 평균 ± s.e.m. 을 나타냄). (F) 위치 1-7 에서 합성 미스매치를 갖는 20 nt 스페이서 crRNA 에 대한 ssRNA 1 및 2 상의 부수적 절단 활성 (n=4 기술적 복제물; 막대는 평균 ± s.e.m. 을 나타냄). (G) (F) 에서 시험된 crRNA 의 특이성 비율. 특이성 비율은 투입표적 (on-target) RNA (ssRNA 1) 부수적 절단 대 오프-표적 (off-target) RNA (ssRNA 2) 부수적 절단의 비율로서 계산된다 (n=4 기술적 복제물; 막대는 평균 ± s.e.m. 을 나타냄).
도. 58. - 표적 서열 내 돌연변이에 대한 이상적인 합성 미스매치 위치의 확인. (A) ssRNA 1 및 ssRNA 2 사이의 돌연변이를 검출하기 위한 이상적인 합성 미스매치 위치를 평가하기 위한 서열. 각각의 표적에 대해, 색상 표시된 (적색) 위치에서 합성 미스매치를 갖는 crRNA 가 시험된다. 각각의 합성 미스매치 crRNA 세트는 돌연변이 위치가 스페이서의 서열과 관련하여 위치에서 이동되도록 설계된다. 스페이서는 돌연변이가 스페이서 내 위치 3, 4, 5 및 6 에서 평가되도록 설계된다. SEQ ID NO:305-336이 표시되어 있다. (B) 다양한 위치에 합성 미스매치가 있는 crRNA 에 대한 ssRNA 1 및 2 의 부수적 절단 활성. 스페이서:표적 듀플렉스 영역 내의 위치 3, 4, 5 또는 6 에 돌연변이를 갖는 4 가지 crRNA 세트가 있다 (n=4 기술적 복제물; 막대는 평균 ± s.e.m. 을 나타냄). (C) (B) 에서 시험된 crRNA 의 특이성 비율. 특이성 비율은 투입표적 (on-target) RNA (ssRNA 1) 부수적 절단 대 오프-표적 (off-target) RNA (ssRNA 2) 부수적 절단의 비율로서 계산된다 (n=4 기술적 복제물; 막대는 평균 ± s.e.m. 을 나타냄).
도. 59 - 추가 유전자좌에서 SHERLOCK 을 사용한 유전형분석 및 삶은 타액에서 직접적 유전형분석. SHERLOCK 은 게놈 DNA 내의 rs601338 SNP 부위의 유전자형을 원심분리, 변성 및 끓인 타액으로부터 직접 구별할 수 있다 (n=4 기술적 복제물, 2-테일 스튜던트 t-검정; **, p < 0.01; ****, p < 0.001; 막대는 평균 ± s.e.m. 을 나타냄).
도. 60 - 인간 SNP 를 정확하게 유전형분석하기 위한 합성 유전형분석 표준 개발. (A) PCR-증폭된 유전자형 표준에 대해 비교한 4 명의 개체 각각에 대해 rs601338 SNP 부위에서 SHERLOCK 을 사용한 유전형분석 (n=4 기술적 복제물; 막대는 평균 ± s.e.m. 을 나타냄). (B) PCR-증폭된 유전자형 표준에 대해 비교한 4 명의 개체 각각에 대해 rs4363657 SNP 부위에서 SHERLOCK 을 사용한 유전형분석 (n=4 기술적 복제물; 막대는 평균 ± s.e.m. 을 나타냄). (C) rs601338 SNP 부위에서 각 개체 및 합성 표준에 대한 SHERLOCK 결과 사이의 컴퓨터로 계산된 p-값의 히트맵. 각각의 대립유전자-감지 crRNA 에 대한 히트맵이 제시되어 있다. 히트맵 컬러 맵은 무의미도 (p> 0.05) 가 적색이고 중요도 (p <0.05) 가 청색이 되도록 등급화된다 (n=4 기술적 복제물, 1-방식 ANOVA). (D) rs4363657 SNP 부위에서 각 개체 및 합성 표준에 대한 SHERLOCK 결과 사이의 컴퓨터로 계산된 p-값의 히트맵. 각각의 대립유전자-감지 crRNA 에 대한 히트맵이 제시되어 있다. 히트맵 컬러 맵은 무의미도 (p> 0.05) 가 적색이고 중요도 (p <0.05) 가 청색이 되도록 등급화된다 (n=4 기술적 복제물, 1-방식 ANOVA). (E) SHERLOCK 유전형분석의 p-값 히트맵 결과를 이해하기 위한 가이드. 개별 및 대립 유전자 합성 표준 사이의 p-값> 0.05 에 해당하는 대립유전자를 선택함으로써 유전형분석을 쉽게 호출할 수 있다. 적색 블록은 합성 표준 및 개체의 SHERLOCK 결과 사이의 중요하지 않은 차이, 따라서 유전자형-양성 결과에 해당한다. 청색 블록은 합성 표준 및 개체의 SHERLOCK 결과 사이의 중요한 차이, 따라서 유전자형-음성 결과에 해당한다.
도. 61 - 미스매치된 배경 표적의 작은 분획으로서 ssDNA 1 의 검출. 인간 게놈 DNA 의 배경 상의 ssDNA 1 의 희석 시리즈의 SHERLOCK 검출. 검출된 ssDNA 1 표적과 배경 게놈 DNA 사이에 서열 유사성이 없어야 한다는 점에 유의한다 (n=2 기술적 복제물; 막대는 평균 ± s.e.m. 을 나타냄).
도. 62 - 지카 바이러스 환자의 소변 (A) 또는 혈청 (B) 샘플은 95℃ (소변) 또는 65℃ (혈청) 에서 5 분 동안 열 불활성화되었다. 예시 실시형태에 따라, 1 마이크로리터의 불활성화된 소변 또는 혈청을 2 시간 RPA 반응에 대한 투입으로서 사용하고 이어서 3 시간 C2c2/Cas13a 검출 반응을 후속하였다. 오차 막대는 검출 반응에 대한 n=4 기술적 복제물에 기초하여 1 SD 를 나타낸다.
도. 63 - 지카 바이러스 환자의 소변 샘플은 95℃ 에서 5 분 동안 열 불활성화되었다. 예시 실시형태에 따라, 1 마이크로리터의 불활성화된 소변을 30 분 RPA 반응에 대한 투입으로서 사용하고 이어서 3 시간 (A) 또는 1 시간 (B) C2c2/Cas13 검출 반응을 후속하였다. 오차 막대는 검출 반응에 대한 n=4 기술적 복제물에 기초하여 1 SD 를 나타낸다.
도. 64 - 지카 바이러스 환자의 소변 샘플은 95℃ 에서 5 분 동안 열 불활성화되었다. 1 마이크로리터의 불활성화된 소변을 20 분 RPA 반응에 대한 투입으로서 사용하고 이어서 1 시간 C2c2/Cas13a 검출 반응을 후속하였다. 건강한 사람의 소변을 음성 대조군으로 사용했다. 오차 막대는 n=4 기술적 복제물 또는 검출 반응에 기초하여 1 SD 를 나타낸다.
도. 65 - 지카 바이러스 환자의 소변 샘플은 95℃ 에서 5 분 동안 열 불활성화되었다. 1 마이크로리터의 불활성화된 소변을 20 분 RPA 반응에 대한 투입으로서 사용하고 이어서 가이드 RNA 의 존재 또는 부재 하에 1 시간 C2c2/Cas13a 검출 반응을 후속하였다. 가이드를 함유하는 검출 반응으로부터 비-가이드 검출 반응에 대한 평균 형광 값을 빼서 데이터를 정규화한다. 건강한 사람의 소변을 음성 대조군으로 사용했다. 오차 막대는 검출 반응에 대한 n=4 기술적 복제물에 기초하여 1 SD 를 나타낸다.
도. 66 - 예시 실시형태에 따른, 4 개의 상이한 가이드 RNA 디자인을 갖는 2 개의 말라리아 특이적 표적의 검출을 보여준다. SEQ ID NO:337-348이 표시되어 있다.
도. 67 - 상이한 Cas13b 오솔로그의 편집 선호도를 보여주는 그래프를 제공한다. 핵심 (key) 에 대해서는 표 3 을 참조한다.
도. 68 - A) 편집 선호도가 다른 상이한 Cas13b 오솔로그를 사용하는 다중 어세이의 개략도, 및 B) Cas13b10 및 Cas13b5 를 사용하는 그러한 어세이의 가능성을 입증하는 데이터를 제공한다.
도. 69 - Cas13b5 (프레보텔라 sp. MA2106) 및 Cas13b9 (프레보텔라 intermedia) 오솔로그와의 이중 다중화를 보여주는 그래프를 제공한다. 이펙터 단백질 및 가이드 서열 둘 다는 상이한 형광 판독값 (폴리 U 530nm 및 폴리 A 485nm) 을 사용하는 동일한 반응에서 이중 다중화를 가능하게 하는 동일한 반응에 포함된다.
도. 70 -도 69 와 동일하나, 이 예에서는 Cas13a (Leptorichia wadei LwaCas13a) 오솔로그 및 Cas13b 오솔로그 (프레보텔라 sp. MA2016, Cas13b5) 를 사용하여 제공한다.
도. 71 -특정 예시 실시형태에 따라, 표적화의 견고성을 결정하기 위해 복합 가이드 서열로 표적 서열을 타일링하는 방법을 제공한다. SEQ ID NO:349 및 350 이 제시되어 있다.
도. 72 - 하이브리드화 연쇄 반응을 활성화시키기 위해, Cas13 이펙터 단백질이 개시제, 예를 들어 본원에 기재된 차폐성 구성체에 포함된 개시제를 잠금 해제하는데 사용될 수 있음을 보여주는 하이브리드 연쇄 반응 (HCR) 겔을 제공한다.
도. 73 - 복합 용해물에서 슈도모나스 아에루기노사를 검출하는 능력을 보여주는 데이터를 제공한다.
도. 74 - 은 특정 예시 실시형태에 따른 특정 Cas13 오솔로그의 이온 선호도를 보여주는 데이터를 제공한다. 모든 표적 농도는 (1 mM 및 10 mM) 의 이온 농도로 20 nM 투입이었다.
도. 75 - 는 Cas13b12 가 절단을 위해 1 mM 황산 아연을 선호도를 갖는 것을 보여주는 데이터를 제공한다.
도. 76 - 완충제 최적화가 polyA 리포터 상의 Cas13b5 의 신호 대 잡음을 증폭시킬 수 있음을 보여주는 데이터를 제공한다. 구 완충제는 40 mM Tris-HCL, 60 mM NaCl, 6 mM MgCl2, pH 7.3 을 포함한다. 신 완충제는 20 mM HEPES pH 6.8, 6 mM MgCl2 및 60 mM NaCl 을 포함한다.
도. 77 - 은 유형 VI-A/C Crispr 시스템 및 유형 VI-B1 및 B2 시스템의 개략도 뿐만 아니라 대표적인 Cas13b 오솔로그의 계통도를 제공한다.
도. 78 - 다양한 Cas13b 오솔로그의 상이한 뉴클레오티드에서 및 LwCas13a 에 대한 상대적 절단 활성을 제공한다.
도. 79 - 다양한 예시 Cas13 오솔로그의 상대적 민감성을 보여주는 그래프를 제공한다.
도. 80 -예시 실시형태를 사용하여 제프토 몰 (zM) 레벨의 검출을 달성하는 능력을 나타내는 그래프를 제공한다.
도. 81 - 상이한 편집 선호도 및 polyN 기반 차폐성 구성체를 갖는 Cas13 오솔로그를 사용하는 다중 어세이의 개략도를 제공한다.
도 82- 다양한 조건에서 프라이머 최적화 실험의 결과 및 슈도모나스 검출 결과를 보여주는 데이터를 제공한다.
도. 83 - 은 특정 예시 실시형태에 따른 측류 장치를 사용하여 획득된 측류 어세이 및 결과의 개략도를 제공한다.
도. 84 - 특정 예시 실시형태에 따른 측류 장치를 사용하여 특정 대두 얼룩을 검출하는 능력을 제공한다.
도. 85 - 측류 검출에 적합화시킨 SHERLOCK. (A) SHERLOCK을 사용한 측류 검출의 개략도. (B) 1시간의 LwaCas13a 반응으로 측류 SHERLOCK을 사용한 합성 지카 RNA의 검출. (C) (B)의 검출에서 밴드 강도의 정량.
도. 86 - 측류 SHERLOCK을 사용한 농업 및 현장 건강 관리 적용. (A) LwaCas13a 를 사용하여 CP4-EPSPS-개질된 (제초제 저항성) 또는 WT 대두 종자에서 CP4-EPSPS 제초제 저항성 유전자 또는 렉틴 대조군의 검출. (B) 제초제 저항성 또는 WT 대두에서 CP4-EPSPS 검출의 시간경과. (C) 제초제 저항성 또는 WT 대두에서 렉틴 검출의 시간경과. (D) LwaCas13a와 CP4-EPSPS 및 WT 종자의 혼합물의 CP4-EPSPS DNA 함량의 정량. (E) LwaCas13a 를 사용하여 CP4-EPSPS-개질된 또는 WT 대두 종자에서 CP4-EPSPS 제초제 저항성 유전자 또는 렉틴 대조군의 측류 검출. (F) (E)의 검출에서 밴드 강도의 정량. (G) L858R 또는 WT 암 돌연변이가 존재하는 환자-유래 세포-무함유 DNA 샘플에서 EGFR L858R 돌연변이의 검출. (H) L858R 또는 WT 암 돌연변이가 존재하는 환자-유래 세포-무함유 DNA 샘플에서 EGFR L858R 돌연변이의 측류 검출. (I) (H)의 검출에서 밴드 강도의 정량. (J) 엑손 19 결실 또는 WT 암 돌연변이가 존재하는 환자-유래 세포-무함유 DNA 샘플에서 EGFR 엑손 19 결실 돌연변이의 검출. (K) 엑손 19 결실 또는 WT 암 돌연변이가 존재하는 환자-유래 세포-무함유 DNA 샘플에서 EGFR 엑손 19 결실 돌연변이의 측류 검출. (L) (K)의 검출에서 밴드 강도의 정량.
도. 87 - 자기 비드-기반 측류 SHERLOCK. (A) SHERLOCK의 자기-비드 기반 측류 판독의 개략도. 부수적 활성은 비드에서 측류 리포터를 절단하여 검출할 수 있다. (B) 1시간의 LwaCas13a 반응으로 자기-비드 기반 측류 SHERLOCK을 사용한 합성 뎅기 RNA의 검출. (C) (B)의 검출에서 밴드 강도의 정량.
도. 88 - ssRNA1의 SHERLOCK 측류 검출. (A) 다양한 농도의 ssRNA 1 에서 측류 SHERLOCK을 사용하는 ssRNA 1의 검출. (B) (A)의 검출에서 밴드 강도의 정량.
도. 89 - 미정제 식물 추출물에서 CP4 및 렉틴 유전자의 SHERLOCK 측류 검출. (A) 10 분 RPA 및 20 분 부수적 검출로의 측류 SHERLOCK을 사용하는 직접 대두 미정제 추출물로부터 RR (CP4 EPSPS 유전자) 또는 렉틴의 검출. (B) 10 분 RPA 및 35 분 부수적 검출로의 측류 SHERLOCK을 사용하는 직접 대두 미정제 추출물로부터 RR (CP4 EPSPS 유전자) 또는 렉틴의 검출. (C) (A)의 검출에서 밴드 강도의 정량. (D) (B)의 검출에서 밴드 강도의 정량.
도. 90 - 합성 엑손 19 결실 샘플의 SHERLOCK 측류 검출. (A) LwaCas13a를 사용하는 엑손 19 결실 또는 WT 유전자형이 존재하는 합성 DNA 샘플에서 EGFR 엑손 19 결실 돌연변이의 검출. (B) LwaCas13a를 사용하는 엑손 19 결실 또는 WT 유전자형이 존재하는 합성 DNA 샘플에서 EGFR 엑손 19 결실 돌연변이의 측류 검출. (C) (B)의 검출에서 밴드 강도의 정량.
도. 91 - 은 SHERLOCK 으로의 대두 제초제 저항성 유전자의 검출을 예시한다. (A) 측류 스트립을 통해 정량적, 다중화 및 휴대용 방식으로 대두 이식유전자의 검출을 허용하는 빠른 게놈 DNA 추출 방법과 조합된 SHERLOCK의 개략도. (B) LwaCas13a 및 형광 리포터를 사용한 Roundup Ready (RR) 이식유전자 CP4 EPSPS 및 양성 대조군 유전자 렉틴의 SHERLOCK 검출. (C) 대두의 복합 혼합물에서 Roundup Ready (RR) 이식유전자 CP4 EPSPS의 백분율의 정량적 SHERLOCK 검출. (D) LwaCas13a 및 PsmCas13b와 2 색 SHERLOCK을 사용하여 CP4 EPSPS 이식유전자 및 렉틴의 샘플 내 복합 검출의 개략도. (E) LwaCas13a 및 PsmCas13b와 2 색 SHERLOCK을 사용하여 CP4 EPSPS 이식유전자 및 렉틴의 샘플 내 복합 검출. 대두의 렉틴 검출은 투입물 없는 물 대조군 샘플과 비교된다. (F) SHERLOCK 측류 스트립을 이용한 빠른 대두 이식유전자 검출의 개략도. (G) SHERLOCK 및 LwaCas13a를 사용하여 측류 스트립에서 30 분 이내에 CP4 EPSPS 이식유전자의 신속한 검출. (H) G의 측류 스트립으로부터의 샘플 밴드 강도의 정량.
도. 92 - 는 SHERLOCK을 이용한 식물 유전자 검출의 동역학을 예시한다. (A) 시간에 따른 RR 대두 및 야생형 (WT) 대두에서 SHERLOCK 및 LwaCas13a를 사용하는 Roundup Ready (RR) 이식유전자 CP4 EPSPS의 검출. (B) 시간에 따른 Roundup Ready (RR) 대두 및 야생형 (WT) 대두에서 SHERLOCK 및 LwaCas13a를 사용하는 렉틴 유전자의 검출.
도. 93 - 은 대두 집단 내 CP4 EPSPS 이식유전자의 정량적 SHERLOCK을 예시한다. (A) SHERLOCK 검출 반응의 상이한 시점에서 백분율 Roundup Ready (RR) 대두와 SHERLOCK 신호의 상관관계. (B) 30 분 시점 (a 에 도시된 바와 같이 최대 상관을 갖는 시점)에서 다양한 양의 Roundup Ready (RR) 대두를 함유하는 대두 혼합물로부터 CP4 EPSPS 이식유전자의 SHERLOCK 신호 검출. (C) 30 분 시점 (A 에 도시된 바와 같이 최대 상관을 갖는 시점)에서 다양한 양의 Roundup Ready (RR) 대두를 함유하는 대두 혼합물로부터 렉틴 유전자의 SHERLOCK 신호 검출.
도. 94 - 는 Csm6 신호 증폭에 의한 CP4 EPSPS 이식유전자의 SHERLOCK 검출을 예시한다. (A) LwaCas13a 및 EiCsm6 또는 LsCsm6을 사용한 신호 증폭으로의 Roundup Ready (RR) 이식유전자 CP4 EPSPS의 SHERLOCK 검출. (B) LwaCas13a에 의한 CP4 EPSPS 이식유전자의 SHERLOCK 검출의 EiCsm6 증폭의 동역학.
도. 95. - 금 나노입자 응집으로 RNase 활성의 비색 검출 결과를 제공한다. A) RNase 활성에 대한 금-나노입자 기반 비색 판독의 개략도. RNase 활성의 부재시, RNA 링커는 금 나노입자를 응집시켜, 적색을 상실한다. RNA 링커의 절단은 나노입자를 방출하고 적색 변화를 초래한다.
도. 96. - A) 는 특정 예시 실시형태에 따른 측류 검출의 개략도를 제공한다. B) 1시간의 LwaCas13 반응으로 측류 실시형태를 사용한 합성 ZIKA ssRNA의 검출. C) (B)의 검출에서 밴드 강도의 정량. C) (B)의 검출에서 밴드 강도의 정량. 환자 액체 생검 샘플로부터 치료적으로 관련된 EGFR 돌연변이의 측류 검출 개략도. E) L858R 또는 WT 암 돌연변이가 존재하는 환자-유래 세포-무함유 DNA 샘플에서 EGFR L858R 돌연변이의 검출. 값은 평균 +/- S.E.M으로 표시된다. F). L858R 또는 WT 대립유전자가 존재하는 환자-유래 세포-무함유 DNA 샘플에서 EGFR L858R 돌연변이의 측류 검출. G) (E)의 검출에서 밴드 강도의 정량. H) 엑손 19 결실 또는 WT 대립유전자가 존재하는 환자-유래 세포-무함유 DNA 샘플에서 EGFR 엑손 19 결실 돌연변이의 검출. 값은 평균 +/- S.E.M으로 표시된다. I) 엑손 19 결실 또는 WT 대립유전자가 존재하는 환자-유래 세포-무함유 DNA 샘플에서 EGFR 엑손 19 결실 돌연변이의 측류 검출. J) (H)의 검출에서 밴드 강도의 정량. K) DENV ssRNA의 EiCsm6-증강된 LwaCas13a 검출의 측류 판독 개략도. L) RPA에 의한 사전증폭없이 LwaCas13a와 조합한 합성 DENV RNA의 EiCsm6-증강된 측류 검출. 밴드 강도 정량은 우측에 표시된다.
도 97 - A) 다양한 농도에서 측류 실시형태를 사용하는 ssRNA 1의 검출. B) (A)의 검출에서 밴드 강도의 정량.
도. 98. 타액으로부터의 게놈 DNA의 원-포트 측류 유전형분석. A) 환자 타액으로부터의 게놈 DNA의 빠른 추출 및 원-포트 검출을 위한 개략도. B). 물 투입과 비교한 미정제 게놈 DNA 추출로부터 rs601338 유전자형의 검출. C). 미정제 게놈 DNA 추출에서 rs601338 유전자형의 측류 검출. D). (C)의 검출에서 밴드 강도의 정량. E) 미정제 타액으로부터 25 분 내에 환자 DNA의 검출
도. 99 - 합성 cfDNA 샘플의 SHERLOCK 측류 검출. A) LwaCas13a를 사용하는 엑손 19 결실 또는 WT 유전자형이 존재하는 합성 DNA 샘플에서 EGFT 엑손 19 결실 돌연변이의 검출. B) LwaCas13a를 사용하는 엑손 19 결실 또는 WT 유전자형이 존재하는 합성 DNA 샘플에서 EGFR 엑손 19 결실 돌연변이의 측류 검출. C) (B)의 검출에서 밴드 강도의 정량. D) LwaCas13a를 사용하는 엑손 19 결실 또는 WT 유전자형이 존재하는 4 명 환자 cfDNA 샘플에서 EGFR 엑손 19 결실 돌연변이의 검출. E) LwaCas13a를 사용하는 T790M 또는 WT 유전자형이 존재하는 합성 DNA 샘플에서 EGFR T790M 결실 돌연변이의 검출. K) LwaCas13a를 사용하는 T790M 또는 WT 유전자형을 갖는 환자 cfDNA 샘플에서 EGFR T790M 결실 돌연변이의 검출 (*, p<0.05; n.s, 유의하지 않음; 막대는 ± s.e.m.을 나타냄). 이 경우, 표적화된 서열분석에 의해 확인된, 환자 4의 T790M 대립유전자 분획은 0.6% 였다. 출원인은 여전히 민감성 및 특이적 토프 어세이로 인해 이 낮은 대립유전자 분획의 유의한 검출을 볼 수 있었으며, 0.1% 초과의 대립유전자 분획 샘플 검출을 보여주는 이전 결과와 비교하였다 (3). 부가적으로, RPA의 Bsu 폴리머라아제는 사이클 당 혼입된 염기 당 10-5 오차의 최소 오차율을 갖기 때문에 (25), 약 0.02% 의 앰플리콘이 감지될 돌연변이에서 오차를 함유할 것으로 예상된다. 야생형 앰플리콘 상에 올바른 돌연변이가 형성되면 거짓 신호가 검출될 것이기 때문에, 그러면 단지 0.0067% 의 앰플리콘이 돌연변이의 거짓 검출을 야기하는 돌연변이를 가질 것이다. 대부분의 환자는 cfDNA 돌연변이의 0.01% 대립유전자 분획을 갖지 않기 때문에, 이 오차율은 허용된다.
도. 100 - 상이한 리포터 조합에 의한 측류 Csm6-증강된 SHERLOCK. A) 다양한 리포터 디자인으로 Csm6-증강된 SHERLOCK의 측류 검출. sA: 단형-poly A 센서; lA: 장형 poly A 센서; sC: 단형 poly C 센서; lC: 장형 poly C 센서; sA/C: 단형 poly-A/C 센서; lA/C: 장형 poly-A/C 센서; M: 혼합 RNase alert-유사 센서. B) (A)의 검출에서 밴드 강도의 정량. C) 개별 RPA 및 IVT 단계에 의한 아실트랜스퍼라제 ssDNA의 EiCsm6-증강된 LwaCas13a SHERLOCK 검출의 측류 판독 개략도. D) LwasCas13a와 조합한 P. 애루지노사 아실트랜스퍼라제 유전자의 EiCsm6-증강된 측류 SHERLOCK. 밴드 강도 정량은 우측에 표시된다.
도. 101 -Casd13 오솔로그 절단에 대한 crRNA 스페이서 길이의 효과. A) 다양한 스페이서 길이의 ssRNA1-표적화 crRNA를 갖는 PsmCas13b의 절단 활성. B) 다양한 스페이서 길이의 ssRNA1-표적화 crRNA를 갖는 CcaCas13b의 절단 활성.
도. 102 - 디-뉴클레오티드 절단 선호도와 Cas13 패밀리의 관계. A) 여러 Cas13a 및 Cas13b 오솔로그 일원의 복합 단백질 서열 정렬에 기초한 단백질 서열 유사성 매트릭스. 클러스터링은 Euclidean 거리를 기준으로 제시된다. B) 여러 Cas13a 및 Cas13b 직접 반복 서열의 복합 서열 정렬에 기초한 직접 반복 서열 유사성 매트릭스. 클러스터링은 Euclidean 거리를 기준으로 제시된다. C) 디뉴클레오티드 모티프 리포터의 Cas13 절단 활성 염기 선호도의 클러스터링.
도. 103A 및 103B - 뎅기 용 Cas13b10 프로브 및 ssRNA1 용 LwaCas13a 프로브를 사용하는 뎅기 RNA 및 ssRNA1 에 대한 측류 어세이 결과를 보여준다.
일반 정의
달리 정의하지 않으면, 본 명세서에서 사용되는 기술 및 과학 용어는 본 개시가 속하는 분야의 당업자가 통상적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 분자 생물학에서 일반적인 용어와 기술의 정의는 하기 문헌에서 찾을 수 있다: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition (1989) (Sambrook, Fritsch, and Maniatis); Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th edition (2012) (Green and Sambrook); Current Protocols in Molecular Biology (1987) (F.M. Ausubel et al. eds.); the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.): PCR 2: A Practical Approach (1995) (M.J. MacPherson, B.D. Hames, and G.R. Taylor eds.): Antibodies, A Laboratory Manual (1988) (Harlow and Lane, eds.): Antibodies A Laboratory Manual, 2nd edition 2013 (E.A. Greenfield ed.); Animal Cell Culture (1987) (R.I. Freshney, ed.); Benjamin Lewin, Genes IX, published by Jones and Bartlet, 2008 (ISBN 0763752223); Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, published by Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0632021829); Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, published by VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 9780471185710); Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed., J. Wiley & Sons (New York, N.Y. 1994), March, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 4th ed., John Wiley & Sons (New York, N.Y. 1992); 및 Marten H. Hofker and Jan van Deursen, Transgenic Mouse Methods and Protocols, 2nd edition (2011).
본원에서 사용되는 단수 형태는 문맥이 명확하게 다르게 지시하지 않는 한 단수 및 복수 대상 모두를 포함한다.
용어 "선택적" 또는 "선택적으로"는 후속적인 기재된 사건, 상황 또는 치환체가 일어날 수도 있고 또는 일어나지 않을 수도 있다는 것과, 설명이 사건 또는 상황이 일어나는 예 및 일어나지 않는 예를 포함한다는 것을 의미한다.
종말점에 의한 수치적 범위의 열거는 각각의 범위뿐만 아니라 열거된 종말점 내에 포함된 모든 수치 및 분수를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "약" 또는 "대략"은, 측정 가능한 값, 예컨대 매개변수, 양, 일시적 지속기간 등을 언급할 때, 구체화된 값의 변형 및 구체화된 값으로부터의 변형, 예컨대 이러한 변형이 개시된 발명에서 수행되기에 적절하다면, 구체화된 값의 변형 및 구체화된 값으로부터의 +/-10% 이하, +/-5% 이하, +/-1% 이하 및 +/-0.1% 이하의 변형을 포함하는 것을 의미한다. 수식어 "약" 또는 "대략" 그 자체가 지칭하는 값은 또한 구체적이고, 바람직하게 개시된다는 것이 이해되어야 한다.
본 명세서 전체적으로 "하나의 실시형태", "실시형태", "예시적 실시형태"에 대한 언급은 실시형태와 관련하여 기재된 특정 특성, 구조 또는 특징이 본 발명의 적어도 하나의 실시형태에 포함된다는 것을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체적으로 다양한 곳에서 어구 "하나의 실시형태에서", "실시형태에서" 또는 "예시적 실시형태"의 출현은 동일한 실시형태에 관해 모두 필수적이지는 않지만, 필수적일 수도 있다. 더 나아가, 특정 특성, 구조 또는 특징은 하나 이상의 실시형태에서 본 개시내용으로부터 당업자에게 명백한 바와 같이, 임의의 적합한 방식으로 조합될 수 있다. 더 나아가, 본 명세서에 기재된 일부 실시형태는 일부 특성을 포함하지만, 다른 실시형태에 포함된 다른 특성은 포함하지 않지만, 상이한 실시형태의 특성의 조합은 본 발명의 범주 내인 것을 의미한다. 예를 들어, 첨부하는 청구범위에서, 임의의 청구된 실시형태는 임의의 조합으로 사용될 수 있다.
"C2c2" 는 이제 "Cas13a" 로 지칭되고, 달리 표시되지 않는 한, 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
본 명세서에서 인용되는 모든 출판물, 공개 특허 문서, 및 특허 출원은 각각의 개별 출판물, 공개 특허 문서, 또는 특허 출원이 참조로 편입된다고 특별히 개별적으로 표시한 바와 동일한 정도로 참조로 본 명세서에 편입된다.
개관
본원에 개시된 실시형태는 아토몰 (attomolar) 민감성을 갖는 강력한 CRISPR-기반 진단을 제공하기 위해 RNA 또는 DNA 표적화 이펙터를 이용한다. 본원에 개시된 실시형태는 필적하는 수준의 민감성으로 DNA 및 RNA 둘 다를 검출할 수 있고, 단일 염기쌍 차이에 기초하여 표적을 비-표적과 구별할 수 있다. 게다가, 본원에 개시된 실시형태는 편리한 분배 및 관리 시점 (POC) 적용을 위해 동결-건조된 형태로 제조될 수 있다. 이러한 실시형태는 예를 들어, 바이러스 검출, 박테리아 균주 타이핑, 민감성 유전형분석 및 질환-연관 세포-무함유 DNA의 검출을 포함하는 인간 건강의 다중 시나리오에 유용하다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 병원체 (예를 들어, 캄필로박터 제주니 (Campylobacter jejuni), 클로스트리듐 퍼프린젠스 (Clostridium perfringens), 살모넬라 (Salmonella) spp., 에스케리치아 콜라이 (Escherichia coli), 바실러스 세레우스 (Bacillus cereus), 리스테리아 모노시토게네스 (Listeria monocytogenes), 시겔라 (Shigella) spp., 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcal aureus), 스타필로코커스 엔테리티스 (Staphylococcal enteritis), 스트렙토코커스 (Streptococcus), 비브리오 콜레라 (Vibrio cholerae), 비브리오 파라해몰리티커스 (Vibrio parahaemolyticus), 비브리오 벌니피커스 (Vibrio vulnificus), 여시니아 엔테로콜리티카 (Yersinia enterocolitica) 및 여시니아 슈도튜버큘로시스 (Yersinia pseudotuberculosis), 브루셀라 (Brucella) spp., 코리네박테리움 울세란스 (Corynebacterium ulcerans), 콕시엘라 부르네티이 (Coxiella burnetii), 또는 플레시오모나스 시겔로이데스 (Plesiomonas shigelloides))에 특이적인 가이드 RNA를 사용하는 식품유래 병원체의 신속한 검출을 위해 사용된다.
일 양상에서, 본원에 개시된 실시형태는 CRISPR 시스템, 상응하는 표적 분자에 결합하도록 설계된 하나 이상의 가이드 RNA, 리포터 구성체 및 샘플 중의 표적 핵산 분자를 증폭시키는 임의의 증폭 시약을 포함하는 핵산 검출 시스템에 관한 것이다. 리포터 구성체는 활성화된 CRISPR 이펙터 단백질에 의해 절단될 수 있는 올리고뉴클레오티드 성분 (DNA 또는 RNA)을 포함하는 분자이다. 올리고뉴클레오티드 성분의 조성은 일반적일 수 있는데, 즉 표적 분자와 동일하지 않을 수 있다. 리포터 구성체는 미절단된 구성체에서 검출가능한 양성 신호의 생성을 방지하거나 차폐성하지만, 절단될 때 양성의 검출가능한 신호의 생성을 허용하거나 촉진하도록 구성된다. 본 발명의 맥락에서, 리포터 구성체는 RNA 또는 DNA 핵산 링커에 의해 연결된 제 1 분자 및 제 2 분자를 포함한다. RNA 또는 DNA 링커의 사용은 사용된 CRISPR 이펙터 단백질(들)이 RNA 또는 DNA 부수적 활성을 갖는 지에 따라 좌우될 것이다. 제 1 및 제 2 분자는 일반적으로 결합 쌍의 일부이며, 다른 결합 파트너는 하기에 보다 상세히 기술되는 바와 같이 측류 기판에 부착된다. 시스템은 제 2 분자에 특이적으로 결합하고 검출가능한 표지를 추가로 포함하는 검출제를 추가로 포함한다.
참조 용이성을 위해, 이들 시스템은 본원에서 SHERLOCK 시스템으로 지칭될 수 있고, 반응은 SHERLOCK 반응으로서 촉진된다. 표적 분자가 샘플에 존재하는 경우, 상응하는 가이드 분자는 표적 분자와 하이브리드화함으로써 CRSIPR Cas/가이드 복합체를 표적 분자로 안내하여, CRISPR 이펙터 단백질의 뉴클레아제 활성을 유발할 것이다. 이 활성화된 CRISPR 이펙터 단백질은 표적 분자 둘 다를 절단한 다음 RNA 구성체의 링커 부분을 비-특이적으로 절단할 것이다.
본원에 개시된 실시형태는 SHERLOCK 시스템을 포함하는 측류 검출 장치에 관한 것이다. 장치는 SHERLOCK 반응을 검출하기 위한 측류 기판을 포함할 수 있다. 측류 어세이에 사용하기에 적합한 기판은 당 업계에 공지되어 있다. 이들은 제한 없이, 셀룰로스 및/또는 유리 섬유로 만들어진 막 또는 패드, 폴리에스테르, 니트로셀룰로스 또는 흡수성 패드를 포함할 수 있다 (J Saudi Chem Soc 19(6):689-705; 2015). SHERLOCK 시스템, 즉 하나 이상의 CRISPR 시스템 및 상응하는 리포터 구성체는 전형적으로 측류 기판의 하나의 말단부 상의, 측류 기판의 규정된 시약 부분에서 측류 기판에 추가된다. 본 발명의 문맥에서 사용되는 리포터 구성체는 RNA 또는 DNA 링커에 의해 연결된 제 1 분자 및 제 2 분자를 포함한다. 측류 기판은 샘플 부분을 추가로 포함한다. 샘플 부분은 시약 부분과 동일하거나, 이에 연속적이거나, 이에 인접할 수 있다. 측류 스트립은 제 1 포획 라인, 전형적으로 장치를 가로 질러 흐르는 수평 라인을 포함하지만, 다른 구성이 가능하다. 제 1 포획 영역은 샘플 로딩 부분과 측류 기판의 동일한 말단부에 근접하고 그 위에 있다. 리포터 구성체의 제 1 분자에 특이적으로 결합하는 제 1 결합제는 제 1 포획 영역에 고정되거나 다르게는 부동화된다. 제 2 포획 영역은 제 1 결합 영역으로부터 측류 기판의 반대 말단부를 향해 위치한다. 제 2 결합제는 제 2 포획 영역에 고정되거나 다르게는 부동화된다. 제 2 결합제는 리포터 구성체의 제 2 분자에 특이적으로 결합하거나, 또는 제 2 결합제는 검출가능한 리간드에 결합할 수 있다. 예를 들어, 검출가능한 리간드는 콜로이드 입자와 같은 입자일 수 있고, 이것이 응집될 때 시각적으로 검출될 수 있다. 입자는 리포터 구성체 상의 제 2 분자에 특이적으로 결합하는 항체로 변형될 수 있다. 리포터 구성체가 절단되지 않으면, 이는 제 1 결합 영역에서 검출가능한 리간드의 축적을 촉진할 것이다. 리포터 구성체가 절단되면, 검출가능한 리간드가 방출되어 제 2 결합 영역으로 흐른다. 이러한 실시형태에서, 제 2 결합제는 검출가능한 리간드 상의 항체 상의 검출가능한 리간드를 특이적으로 또는 비특이적으로 결합할 수 있는 작용제이다. 이러한 실시형태에 대한 적합한 결합제의 예는 단백질 A 및 단백질 G 를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
측면 지지 기판은 하우징 내에 위치될 수 있다 (참고, 예를 들어, "Rapid Lateral Flow Test Strips" Merck Millipore 2013). 하우징은 샘플을 로딩하기 위한 적어도 하나의 개구부 및 제 1 및 제 2 포획 영역에서 생성된 검출가능한 신호의 판독을 허용하는 제 2 단일 개구부 또는 별도의 개구부를 포함할 수 있다.
SHERLOCK 시스템은 측류 기판으로 동결-건조되고 즉시 사용 가능한 장치로서 패키징될 수 있거나, 또는 SHERLOCK 시스템은 장치를 사용할 때 측류 기판의 시약 부분에 첨가될 수 있다. 스크리닝될 샘플은 측류 기판의 샘플 로딩 부분에 로딩된다. 샘플은 액체 샘플 또는 적절한 용매, 일반적으로 수성에 용해된 샘플이어야 한다. 액체 샘플은 SHERLOCK 반응이 일어날 수 있도록 SHERLOCK 시약을 재구성한다. 액체 샘플은 기판의 샘플 부분으로부터 제 1 및 제 2 포획 영역을 향해 흐르기 시작한다. 온전한 리포터 구성체는 제 1 결합제와 제 1 분자 사이의 결합에 의해 제 1 포획 영역에서 결합된다. 마찬가지로, 검출제는 온전한 리포터 구성체 상의 제 2 분자에 결합함으로써 제 1 결합 영역에서 수집을 시작할 것이다. 표적 분자(들) 이 샘플에 존재하는 경우, CRISPR 이펙터 단백질 부수적 효과가 활성화된다. 활성화된 CRISPR 이펙터 단백질이 결합된 리포터 구성체와 접촉하게 되면, 리포터 구성체는 절단되어 제 2 분자를 방출하여 제 2 결합 영역을 향하여 측류 기판 아래로 더 흐른다. 이어서 방출된 제 2 분자는 제 2 결합제에 결합함으로써 제 2 포획 영역에서 포획되며, 여기서 추가의 검출제는 또한 제 2 분자에 결합함으로써 축적될 수 있다. 따라서, 표적 분자(들) 이 샘플에 존재하지 않으면, 검출가능한 신호는 제 1 포획 영역에 나타날 것이고, 표적 분자(들) 이 샘플에 존재하면, 검출가능한 신호는 제 2 포획 영역의 위치에 나타날 것이다.
특이적 결합-통합 분자는 본 발명에서 사용될 수 있는 결합 쌍의 임의의 일원을 포함한다. 이러한 결합 쌍은 당업자에게 공지되어 있으며, 항체-항원 쌍, 효소-기질 쌍, 수용체-리간드 쌍 및 스트렙타비딘-비오틴을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 이러한 공지된 결합 쌍 외에, 신규한 결합 쌍이 구체적으로 설계될 수 있다. 결합 쌍의 특징은 결합 쌍의 두 일원 사이의 결합이다.
한쪽 말단에 분자를 갖는 올리고뉴클레오티드 링커는 CRISPR 이펙터 단백질이 DNA 부수적 활성 (Cpf1 및 C2c1)을 갖는 경우 DNA를, 또는 CRISPR 이펙터 단백질이 RNA 부수적 활성을 갖는 경우 RNA를 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오티드 링커는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있으며, 특정 실시형태에서, 이들은 RNA 및 DNA 영역 둘 다를 함유할 수 있다. 올리고뉴클레오티드 링커는 다양한 길이, 예컨대 5-10 뉴클레오티드, 10-20 뉴클레오티드, 20-50 뉴클레오티드 또는 그 이상의 것일 수 있다.
일부 실시형태에서, 폴리펩티드 식별자 요소는 친화성 태그, 예컨대 헤마글루티닌 (HA) 태그, Myc 태그, FLAG 태그, V5 태그, 키틴 결합 단백질 (CBP) 태그, 말토오스-결합 단백질 (MBP) 태그, GST 태그, 폴리-His 태그, 및 형광 단백질 (예를 들어, 녹색 형광 단백질 (GFP), 황색 형광 단백질 (YFP), 시안 형광 단백질 (CFP), dsRed, mCherry, Kaede, Kindling 및 이들의 유도체, FLAG 태그, Myc 태그, AU1 태그, T7 태그, OLLAS 태그, Glu-Glu 태그, VSV 태그 또는 이들의 조합을 포함한다. 다른 친화성 태그는 당분야에 잘 공지되어 있다. 이러한 표지는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 (예를 들어, 특정 친화력 태그를 인식하는 항체와 같은 특이적 결합제를 사용하여) 검출 및/또는 단리될 수 있다. 이러한 특이적 결합제 (예를 들어, 항체)는 예를 들어 동위원소 표지와 같은 검출가능한 표지 및/또는 본원에 기재된 것과 같은 핵산 바코드를 추가로 함유할 수 있다.
예를 들면, 측류 스트립은 색상을 통해 RNAse (예를 들어, Cas13a) 검출을 가능하게 한다. RNA 리포터는 5' 말단에 부착된 제 1 분자 (예컨대 예를 들면 FITC) 및 3' 말단에 부착된 제 2 분자 (예컨대 예를 들면 바이오틴)를 갖도록 변형된다 (또는 반대도 같음). 측류 스트립은 항-제 1 분자 (예를 들어, 항-FITC) 항체가 제 1 라인에서 하이브리드화되고 항-제 2 분자 (예를 들어, 항-바이오틴) 항체는 제 2 하류 라인에서 하이브리드화되는 2개 포획 라인을 갖도록 디자인된다. SHERLOCK 반응물이 스트립 아래로 흐르면서, 미절단된 리포터는 제 1 포획 라인에서 항-제 1 분자 항체에 결합하게 되는 한편, 절단된 리포터는 제 2 분자를 방출하게 되고 제 2 포획 라인에서 제 2 분자 결합을 가능하게 한다. 예를 들면 나노입자, 예컨대 금 나노입자에 접합된, 제 2 분자 샌드위치 항체는 제 1 또는 제 2 라인에서 임의의 제 2 분자에 결합하게 될 것이고 그 결과 강력한 판독치/신호 (예를 들어, 색상)를 야기시키게 될 것이다. 리포터가 더 절단되면서, 더 많은 신호가 제 2 포획 라인에서 축적되어지고 적은 신호가 제 1 라인에서 나타나게 될 것이다. 일정한 양상에서, 본 발명은 핵산 또는 폴리펩티드를 검출하기 위해서 본 명세서에 기술된 바와 같은 플로우 스트립의 사용에 관한 것이다. 일정한 양상에서, 본 발명은 본 명세서에 정의된 바와 같은 플로우 스트립으로 핵산 또는 폴리펩티드를 검출하기 위한 방법, 예를 들어 (측면) 흐름 시험법 또는 (측면) 흐름 면역크로마토그래피 어세이에 관한 것이다.
특정 예시 실시형태에서, 측류 장치는 샘플의 적용을 위한 제 1 말단부를 포함하는 측류 기판을 포함한다. 제 1 영역에는 본원에 개시된 것과 같은 검출가능한 리간드, 예를 들어 금 나노입자가 로딩된다. 금 나노입자는 항-FITC 항체와 같은 제 1 항체로 변형될 수 있다. 제 1 영역은 또한 검출 구성체를 포함한다. 하나의 예시 실시형태에서, 본원에 기재된 RNA 검출 구성체 및 CRISPR 이펙터 시스템 (CRISPR 이펙터 단백질 및 하나 이상의 표적 서열에 결합하도록 구성된 하나 이상의 가이드 서열). 하나의 예시 실시형태에서, 그리고 추가 예시의 목적으로, RNA 구성체는 검출 구성체의 제 1 말단부 상에 FAM 분자 및 검출 구성체의 제 2 말단부 상에 비오틴을 포함할 수 있다. 측류 기판의 제 1 말단부로부터의 용액 유동의 상류는 제 1 시험 밴드이다. 시험 밴드는 비오틴 리간드를 포함할 수 있다. 따라서, RNA 검출 구성체가 그것의 개시 상태, 즉 표적의 부재 시에 존재하는 경우, 제 1 말단부 상의 FAM 분자는 금 나노입자 상의 항-FITC 항체에 결합할 것이고, RNA 구성체의 제 2 말단부 상의 비오틴은 비오틴 리간드에 결합하여 검출가능한 리간드가 제 1 시험에서 축적되어 검출가능한 신호를 생성할 것이다. 제 1 밴드에서 검출가능한 신호의 생성은 표적 리간드의 부재를 나타낸다. 표적의 존재 하에, CRISPR 이펙터 복합체 형태 및 CRISPR 이펙터 단백질은 활성화되어 RND 검출 구성체의 절단을 초래한다. 온전한 RNA 검출 구성체의 부재 하에, 콜로이드 금은 제 2 스트립을 지나 흐를 것이다. 측류 장치는 제 1 밴드의 상류에 제 2 밴드를 포함할 수 있다. 제 2 밴드는 항체-표지된 콜로이드 금 분자에 결합할 수 있는 분자, 예를 들어 콜로이드 금 상에 토끼 항-FTIC 항체를 결합시킬 수 있는 항-토끼 항체를 포함할 수 있다. 따라서, 하나 이상의 표적의 존재 하에, 검출가능한 리간드는 제 2 밴드에 축적되어, 샘플 중의 하나 이상의 표적의 존재를 나타낸다.
Microbial Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) 및 CRISPR-연관 (CRISPR-Cas) 적응 면역 시스템은 프로그램가능한 엔도뉴클레아제, 예컨대 Cas9 및 Cpf1 을 포함한다 (Shmakov et al., 2017; Zetsche et al., 2015). Cas9 및 Cpf1 모두가 DNA 를 표적하지만, 단일 이펙터 RNA-가이드 Rnase 가 최근에 발견되었고 (Shmakov et al., 2015), 특이적 RNA 감지용 플랫폼을 제공하는 C2c2 를 포함하여, 특성화되었다 (Abudayyeh et al., 2016; Smargon et al., 2017). RNA-가이드 RNase는 표적 RNA를 절단하기 위해 CRISPR RNA (crRNA)를 사용하여 쉽고 편리하게 재프로그램될 수 있다. 그의 DNA 표적만을 절단하는 DNA 엔도뉴클레아제 Cas9 및 Cpf1 과는 달리, C2c2 와 같은 RNA-가이드 Rnase 는 RNA 표적을 절단한 후에도 활성을 유지하여, 근접한 비-표적화된 RNA 의 "부수적" 절단을 초래한다 (Abudayyeh et al., 2016). 이 crRNA-프로그램된 부수적 RNA 절단 활성은 판독으로서 작용할 수 있는 생체 내 프로그램된 세포 사멸 또는 시험관 내 비특이적 RNA 분해를 촉발함으로써 특이적 RNA 의 존재를 검출하기 위해 RNA-가이드 Rnase 를 사용할 기회를 제시한다 (Abudayyeh et al., 2016; East-Seletsky et al., 2016). 부수적 활성은 다른 CRISPR Cas 효소에서도 확인되었다 [Cpf1 및 C2c1 부수적 활성에 대한 인용을 제공하기 위한 리드 플래그].
CRISPR 이펙터 단백질
일반적으로, 본 명세서, 및 문헌 예컨대 WO 2014/093622 (PCT/US2013/074667)에서 사용되는 CRISPR-Cas 또는 CRISPR 시스템은 Cas 유전자를 코딩하는 서열, tracr (trans-activating CRISPR) 서열 (예를 들어, tracrRNA 또는 활성 부분 tracrRNA), tracr-mate 서열 (내생성 CRISPR 시스템의 경우에 "직접 반복부" 및 tracrRNA-프로세싱된 부분 직접 반복부 포괄), 가이드 서열 (내생성 CRISPR 시스템의 경우에 "스페이서"라고도 함), 또는 그 용어가 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "RNA(들)" (예를 들어, Cas를 가이드하는 RNA(들), 예컨대 Cas9, 예를 들어 CRISPR RNA 및 트랜스활성화 (tracr) RNA 또는 단일 가이드 RNA (sgRNA) (키메라 RNA)) 또는 CRISPR 유전자좌 유래 다른 서열 및 전사물을 포함하여, CRISPR-연관 ("Cas") 유전자의 발현 또는 활성 유도에 관여되는 전사물 및 다른 엘리먼트를 집합적으로 언급한다. 일반적으로, CRISPR 시스템은 표적 서열의 부위에서 CRISPR 복합체의 형성을 촉진하는 엘리먼트(내생의 CRISPR 시스템의 맥락에서 프로토스페이서(protospacer)로서도 지칭됨)에 의해 특징지어진다. CRISPR 단백질이 C2c2 단백질인 경우에, tracrRNA는 요구되지 않는다. C2c2 는 Abudayyeh et al. (2016) "C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector"; Science; DOI: 10.1126/science.aaf5573; 및 Shmakov et al. (2015) "Discovery and Functional Characterization of Diverse Class 2 CRISPR-Cas Systems", Molecular Cell, DOI: dx.doi.org/10.1016/j.molcel.2015.10.008 에 기재되어 있고; 이들은 전체가 본원에 참고로 포함된다. Cas13b 는 Smargon et al. (2017) "Cas13b Is a Type VI-B CRISPR-Associated RNA-Guided RNases Differentially Regulated by Accessory Proteins Csx27 and Csx28," Molecular Cell. 65, 1-13; dx.doi.org/10.1016/j.molcel.2016.12.023. 에 기재되어 있고; 이들은 전체가 본원에 참고로 포함된다.
특정 실시형태에서 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM) 또는 PAM-유사 모티프는 관심 표적 유전자좌로 본 명세서에 개시된 바와 같은 이펙터 단백질 복합체의 결합을 유도한다. 일부 실시형태에서, PAM는 5' PAM (즉, 프로토스페이서의 5' 말단의 업스트림에 위치) 일 수 있다. 다른 실시형태에서, PAM는 3' PAM (즉, 프로토스페이서의 5' 말단의 다운스트림에 위치) 일 수 있다. 용어 "PAM"은 용어 "PFS" 또는 "프로토스페이서 측접 부위" 또는 "프로토스페이서 측접 서열"과 상호교환적으로 사용될 수 있다.
바람직한 실시형태에서, CRISPR 이펙터 단백질은 3' PAM을 인식할 수 있다. 특정 실시형태에서, CRISPR 이펙터 단백질은 H가 A, C 또는 U 인 5'H 인 3 'PAM을 인식할 수 있다. 특정 실시형태에서, 이펙터 단백질은 렙토트리키아 샤이이 C2c2p 일 수 있고, 보다 바람직하게는 렙토트리키아 샤이이 DSM 19757 C2c2 일 수 있으며, 3 'PAM은 5'H이다.
CRISPR 복합체의 형성의 맥락에서, "표적 서열"은 가이드 서열이 상보성을 갖도록 디자인된 서열을 지칭하며, 여기서, 표적 서열과 가이드 서열 간의 하이브리드화는 CRISPR 복합체의 형성을 증진시킨다. 표적 서열은 RNA 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 용어 "표적 RNA"는 표적 서열이거나 또는 그를 포함하는 RNA 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 달리 말해서, 표적 RNA는 gRNA, 즉 가이드 서열의 일부분이 상보성을 갖도록 디자인되고 CRISPR 이펙터 단백질 및 gRNA를 포함하는 복합체에 의해 매개되는 이펙터 기능이 유도되게 하는 RNA 폴리뉴클레오티드 또는 RNA 폴리뉴클레오티드의 일부분일 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적 서열은 세포의 핵 또는 세포질에 위치된다.
CRISPR 이펙터 단백질, 특히 C2c2를 코딩하는 핵산 분자는 유리하게 코돈 최적화된 CRISPR 이펙터 단백질이다. 코돈 최적화 서열의 예는 이러한 예에서, 진핵생물, 예를 들어 인간 (인간에서 발현에 최적화), 또는 본 명세서에 기술된 바와 같은 다른 진핵생물, 동물 또는 포유동물에서의 발현을 위해 최적화된 서열이고, 예를 들어, WO 2014/093622 (PCT/US2013/074667)의 SaCas9 인간 코돈 최적화 서열을 참조한다. 이것이 바람직하지만, 다른 예가 가능하고 인간 이외의 숙주종에 대한 코돈 최적화, 또는 특별한 장기에 대한 코돈 최적화가 공지되어 있다는 것을 이해하게 될 것이다. 일부 실시형태에서, CRISPR 이펙터 단백질을 코딩하는 효소 코딩 서열은 특히 세포, 예컨대 진핵생물 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화된다. 진핵생물 세포는 제한없이, 인간, 또는 본 명세서에 기술된 바와 같은 인간이외의 진핵생물 또는 동물 또는 포유동물, 예를 들어 마우스, 래트, 토끼, 개, 가축 또는 인간이외의 포유동물 또는 영장류를 포함하여, 포유동물 또는 식물과 같은 특정한 유기체의 것일 수 있거나 또는 그로부터 유래될 수 있다. 일부 실시형태에서, 인간의 배선 유전자 정체성 (identity)을 변형시키는 방법 및/또는 인간 또는 동물에게 임의의 실질적인 의학적 이득없이 고통을 야기시킬 수도 있는 동물의 유전자 정체성을 변형시키는 방법, 및 그러한 방법으로 얻어진 동물은 배제할 수 있다. 일반적으로, 코돈 최적화는 천연 서열의 적어도 하나의 코돈 (예를 들어, 약 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 50개 이상의 코돈)을 천연 아미노산 서열을 유지하면서 숙주 세포의 유전자에서 보다 빈번하게 또는 가장 빈번하게 사용되는 코돈으로 치환시켜 관심 숙주 세포에서 증강된 발현을 위해 핵산 서열을 변형시키는 방법을 의미한다. 다양한 종은 특정한 아미노산의 일정 코돈에 대한 특정 편향성을 나타닌다. 코돈 편향성 (유기체 간 코돈 용법의 차이)은 종종 메신저 RNA (mRNA)의 번역 효율과 상관있고, 이것은 결과적으로 특히, 번역되는 코돈의 성질 및 특정한 전달 RNA (tRNA) 분자의 이용가능성에 의존한다고 여겨진다. 세포에서의 선택된 tRNA의 우세는 일반적으로 펩티드 합성에 가장 빈번하게 사용되는 코돈을 반영하는 것이다. 따라서, 유전자는 코돈 최적화를 기반으로 하여 주어진 유기체에서의 최적의 유전자 발현을 위해 맞춤화될 수 있다. 코돈 용법 표는 예를 들어 kazusa.orjp/codon/에서 입수가능한 "코돈 용법 데이타베이스"에서 쉽게 이용가능하고, 이들 표는 다양한 방식으로 개조될 수 있다. 문헌[Nakamura, Y., et al. "Codon usage tabulated from the international DNA sequence databases:status for the year 2000" Nucl. Acids Res. 28:292 (2000)]을 참조한다. 특정 숙주 세포에서의 발현을 위해 특정 서열을 코돈 최적화시키는 컴퓨터 알고리즘이 또한 이용 가능하며, 예를 들어 Gene Forge (Aptagen; Jacobus, PA) 이 또한 이용가능하다. 일부 실시형태에서, Cas를 인코딩하는 서열에서 하나 이상의 코돈 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 50, 또는 그 이상, 또는 모든 코돈)은 특정 아미노산에 대해 가장 빈번하게 사용되는 코돈에 해당된다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 방법은 하나 이상의 가이드 RNA를 인코딩하는 하나 이상의 핵산이 하나 이상의 관심 유전자의 프로모터를 포함하는 조절 요소와 세포에서 작동가능하게 연결되게 제공되거나 또는 도입된 C2c2 유전자이식 세포, 특히 C2c2 유전자이식 세포의 제공을 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용시, 용어 "Cas 유전자이식 세포"는 Cas 유전자가 게놈에 통합된 세포, 예컨대 진핵생물 세포를 의미한다. 세포의 성질, 유형 또는 기원은 본 발명에 따라 특별히 제한되지 않는다. 또한 Cas 이식유전자를 세포에 도입시키는 방법은 다양할 수 있고 당분야에 공지된 바와 같은 임의 방법일 수 있다. 특정 실시형태에서, Cas 유전자이식 세포는 단리된 세포에 Cas 이식유전자를 도입하여 수득된다. 일정 다른 실시형태에서, Cas 유전자이식 세포는 Cas 유전자이식 유기체로부터 세포를 단리하여 수득된다. 예로서, 제한없이, 본 명세서에서 언급시 Cas 유전자이식 세포는 유전자이식 진핵생물, 예컨대 Cas 넉인 진핵생물로부터 유래될 수 있다. 참조로 본 명세서에 편입된, WO 2014/093622 (PCT/US13/74667)를 참조한다. Rosa 유전자좌를 표적화하도록 지시된 Sangamo BioSciences, Inc.가 출원한 미국 특허 공개 제 20120017290호 및 20110265198호의 방법은 본 발명의 CRISPR Cas 시스템을 이용하도록 변형될 수 있다. Rosa 유전자좌를 표적화하는 것에 관한 셀렉티스(Cellectis)에 양도된 미국 공개 특허 출원 제 20130236946의 방법은 또한 본 발명의 CRISPR Cas 시스템을 이용하여 변형될 수 있다. Cas9 녹-인 마우스를 설명하는 Platt et. al. (Cell; 159(2):440-455 (2014)) 이 추가의 예로 참조되며, 이는 본원에 참고로 포함된다. Cas 이식유전자는 Lox-Stop-polyA-Lox(LSL) 카세트를 더 포함할 수 있어서 Cre 리콤비나아제에 의해 Cas 발현을 유도시킬 수 있다. 대안적으로, Cas 유전자이식 세포는 단리된 세포에서 Cas 이식유전자를 도입하여 수득될 수 있다. 이식유전자를 위한 전달 시스템은 당분야에 잘 공지되어 있다. 예로서, Cas 이식유전자는 역시 본 명세서의 다른 곳에 기술된 바와 같이, 벡터 (예, AAV, 아데노바이러스, 렌티바이러스) 및/또는 입자 및/또는 나노입자 전달을 통해 예를 들어 진핵생물 세포로 전달될 수 있다.
세포, 예컨대 본 명세서에서 언급시 Cas 유전자이식 세포는 표적 유전자좌에 Cas를 가이드할 수 있는 RNA와 복합체형성시 Cas의 서열 특이적 작용으로 발생되는 돌연변이 또는 통합된 Cas 유전자를 갖는 것 이외의 게놈 변경, 예컨대 예를 들어 하나 이상의 종양발생성 돌연변이를 더 포함할 수 있다는 것을 당업자는 이해할 것이다.
일정 측면에서, 본 발명은 예를 들어, Cas 및/또는 Cas를 표적 유전자좌로 가이드할 수 있는 RNA (즉, 가이드 RNA)를 세포에 전달하거나 또는 도입시킬뿐만 아니라, 이들 성분을 전파 (예를 들어, 원핵생물 세포에서)시킬 수 있는 벡터를 포함한다. 본원에 사용되는 바와 같이, "벡터"는 엔티티를 하나의 환경에서 또 다른 환경으로 전달하는 것을 허용 또는 촉진하는 도구이다. 이는 레플리콘, 예컨대 플라스미드, 파지, 또는 코스미드로, 또 다른 DNA 절편이 그 안에 삽입될 수 있어서, 삽입된 절편의 복제를 유발한다. 일반적으로, 벡터는 적절한 제어 엘리먼트와 관련되었을 때 복제가 가능하다. 일반적으로, 용어 "벡터"는 그것이 연결되어 있는 다른 핵산을 전달할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 벡터는 제한 없이, 단일 가닥, 이중 가닥 또는 부분 이중 가닥인 핵산 분자; 하나 이상의 자유 말단을 포함하는, 자유 말단을 포함하지 않는 (예 : 환형) 핵산 분자; DNA, RNA 또는 둘 다를 포함하는 핵산 분자; 및 당업계에 공지된 다른 종류의 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 하나의 유형의 벡터는 "플라스미드"이며, 이는 추가의 DNA 분절이 예를 들어, 표준 분자 클로닝 기술에 의해 삽입될 수 있는 환형 이중 가닥 DNA 루프를 지칭한다. 벡터의 다른 종류는 바이러스 벡터로서, 바이러스-유래된 DNA 또는 RNA 서열이 바이러스에 봉입되는 벡터에 존재한다(예를 들어, 레트로바이러스, 복제 결함 레트로바이러스, 아데노바이러스, 복제 결함 아데노바이러스, 및 아데노-연관 바이러스(AAV)). 바이러스 벡터는 또한 숙주 세포 내로의 트랜스펙션을 위한, 바이러스가 보유하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 특정 벡터는 그것이 도입된 숙주 세포에서 자율적 복제가 가능하다(예를 들어, 박테리아 복제 기원을 가진 박테리아 벡터 및 에피솜 포유동물 벡터). 다른 벡터(예를 들어, 비-에피솜 포유동물 벡터)는 숙주 세포 내로 도입시 숙주 세포의 게놈에 통합되며, 이에 의해 숙주 게놈과 함께 복제된다. 더욱이, 특정 벡터는 그것이 작동가능하게 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "발현 벡터"로 지칭된다. 재조합 DNA 기술에 유용한 통상적인 발현 벡터는 종종 플라스미드의 형태로 존재한다.
재조합 발현 벡터는 숙주 세포에서 핵산의 발현에 적합한 형태로 본 발명의 핵산을 포함할 수 있는데, 이는 재조합 발현 벡터가 하나 이상의 조절 요소를 포함하는 것을 의미하며, 하나 이상의 조절 요소는 발현에 사용될 숙주 세포에 기반하여 선택될 수 있고, 발현될 핵산 서열에 작동가능하게 연결된다. 재조합 발현 벡터 내에서, "작동가능하게 연결된"은 대상 뉴클레오티드 서열이 (예를 들어, 시험관내 전사/번역 시스템 내에서, 또는 벡터가 숙주 세포 내로 도입되는 경우 숙주 세포 내에서) 뉴클레오티드 서열의 발현을 가능하게 하는 방식으로 조절 요소(들)에 연결된 것을 의미하는 의도이다. 재조합 및 클로닝 방법에 관련하여, US 2004-0171156 A1호로서 2004년 9월 2일 간행된 미국 특허 출원 10/815,730호가 언급될 수 있으며, 이의 모든 내용은 그 전체로서 본원에 참조로 포함된다. 따라서, 본원에 개시된 실시형태는 또한 CRISPR 이펙터 시스템을 포함하는 유전자이식 세포를 포함할 수 있다. 특정 예시 실시형태에서, 유전자이식 세포는 개별 이산 부피로서 기능할 수 있다. 다시 말해서, 차폐성 구성체를 포함하는 샘플은, 예를 들어 적합한 전달 소포체로 세포로 전달 될 수 있고, 표적이 전달 소포체에 존재하면 CRISPR 이펙터가 활성화되고 검출가능한 신호가 생성된다.
벡터(들)는 조절 요소(들), 예, 프로모터(들)를 포함할 수 있다. 벡터(들)는 Cas 코딩 서열, 및/또는 단독을 포함할 수 있지만, 또한 가능하게 적어도 3 또는 8 또는 16 또는 32 또는 48 또는 50 가이드 RNA(들) (예, sgRNAs) 코딩 서열, 예컨대 1-2, 1-3, 1-4 1-5, 3-6, 3-7, 3-8, 3-9, 3-10, 3-8, 3-16, 3-30, 3-32, 3-48, 3-50 RNA(들) (예, sgRNA)를 포함할 수 있다. 각 RNA에 대한 프로모터가 있을 수 있는 (예, crRNA(들)) 단일 벡터에서, 유리하게는 약 16 초과의 RNA(들)이 있는 경우, 및 단일 벡터가 16 초과의 RNA(들)을 제공하는 경우, 하나 이상의 프로모터(들)는 하나를 초과하는 RNA(들) 의 발현을 구동시킬 수 있으며, 예를 들어 32 RNA(들) 가 존재할 때, 각각의 프로모터는 2 RNA(들) 의 발현을 구동시킬 수 있고, 48 RNA(들) 가 존재할 때, 각 프로모터는 3 RNA(들) 의 발현을 구동시킬 수 있다. 단순한 산술 및 잘 확립된 클로닝 프로토콜 및 본 개시내용의 교시를 통해서 당업자는 적합한 예시적 벡터 예컨대 AAV를 위한 RNA(들), 및 적합한 프로모터 예컨대 U6 프로모터에 관해 본 발명을 쉽게 실시할 수 있다. 예를 들어, AAV의 패키징 한계는 대략 4.7 kb이다. 단일 U6-gRNA의 길이 (클로닝용 제한효소 부위 포함)는 361 bp이다. 따라서, 당업자는 단일 벡터에 쉽게 약 12-16, 예를 들어, 13 U6-gRNA 카세트를 피팅시킬 수 있다. 이는 임의의 적합한 수단, 예컨대 TALE 조립에 사용되는 골든 게이트 전략을 통해 조립될 수 있다 (genome-engineering.org/taleffectors/). 당업자는 또한 탠덤 가이드 전략을 사용하여 U6-gRNA의 개수를 대략 1.5배 증가시킬 수 있고, 예를 들어 12 내지 16, 예를 들어, 13 내지 대략 18 내지 24, 예를 들어, 약 19개 U6-gRNA까지 증가시킬 수 있다. 따라서, 당업자는 단일 벡터, 예를 들어 AAV 벡터에 대략 18 내지 24, 예를 들어, 약 19개 프로모터-RNA, 예를 들어, U6-gRNA에 쉽게 도달할 수 있다. 벡터 내에 프로모터 및 RNA의 수를 증가시키기 위한 추가 수단은 절단성 서열에 의해 분리된 RNA의 어레이를 발현시키기 위해 단일 프로모터 (예, U6)를 사용하는 것이다. 그리고 벡터에 프로모터-RNA의 수를 증가시키기 위한 추가의 수단은 코딩 서열 또는 유전자의 인트론에 절단성 서열에 의해 분리된 프로모터-RNA의 어레이를 발현시키는 것이고, 이러한 예에서, 조직 특이적 방식으로 긴 RNA의 전사를 할 수 있고 발현을 증가시킬 수 있는, 폴리머라아제 II 프로모터를 사용하는 것이 유리하다 (예를 들어, nar.oxfordjournals.org/content/34/7/e53.short 및 nature.com/mt/journal/v16/n9/abs/mt2008144a.html 참조). 유리한 실시형태에서, AAV는 최대 약 50개 유전자를 표적화하는 U6 탠덤 gRNA를 패키징할 수 있다. 따라서, 당분야의 지식 및 본 개시의 교시로부터 당업자는 임의의 과도한 실험없이, 본 명세서에 기술된 RNA 또는 가이드의 수와 특히 관련하여, 하나 이상의 프로모터에 작동적으로 또는 기능적으로 연결되거나 또는 그 제어 하에서 다수의 RNA 또는 가이드를 발현하는, 벡터(들), 예를 들어 단일 벡터를 쉽게 만들고 이용할 수 있다.
가이드 RNA(들) 코딩 서열 및/또는 Cas 코딩 서열은 조절 엘리먼트(들)에 기능적으로 또는 작동적으로 연결될 수 있어서 조절 엘리먼트(들)가 발현을 구동한다. 프로모터(들)는 항상성 프로모터(들) 및/또는 조건적 프로모터(들) 및/또는 유도성 프로모터(들) 및/또는 조직 특이적 프로모터(들)일 수 있다. 프로모터는 RNA 폴리머라아제, pol I, pol II, pol III, T7, U6, H1, 레트로바이러스 루이스 육종 바이러스 (RSV) LTR 프로모터, 사이토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터, SV40 프로모터, 디히드로폴레이트 리덕타제 프로모터, β-액틴 프로모터, 포스포글리세롤 키나제 (PGK) 프로모터, 및 EF1α 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 유리한 프로모터는 프로모터 U6이다.
일부 실시형태에서, 핵산-표적화 시스템의 하나 이상의 엘리먼트는 내인성 CRISPR RNA-표적화 시스템을 포함하는 특정 유기체로부터 유래한다. 일정 예의 실시형태에서, 이펙터 단백질 CRISPR RNA-표적화 시스템은 제한 없이 본원에 기재된 HEPN 도메인, 당분야에 공지된 HEPN 도메인, 및 공통 서열 모티프와 비교에 의해 HEPN 도메인으로 인식되는 도메인을 포함하여, 적어도 하나의 HEPN 도메인을 포함한다. 몇몇 이러한 도메인이 본 명세서에서 제공된다. 비제한적인 한 예에서, 공통 서열은 본 명세서에서 제공하는 C2c2 또는 Cas13b 오솔로그의 서열로부터 유래될 수 있다. 일정 예의 실시형태에서, 이펙터 단백질은 단일 HEPN 도메인을 포함한다. 일정한 다른 예의 실시형태에서, 이펙터 단백질은 2개의 HEPN 도메인을 포함한다.
일례의 실시형태에서, 이펙터 단백질은 RxxxxH 모티프 서열을 포함하는 하나 이상의 HEPN 도메인을 포함한다. RxxxxH 모티프 서열은 제한없이 본 명세서에 기술된 HEPN 도메인 또는 당분야에 공지된 HEPN 도메인 유래일 수 있다. RxxxxH 모티프 서열은 둘 이상의 HEPN 도메인을 조합하여 생성된 모티프 서열을 더 포함한다. 언급된 바와 같이, 공통 서열은 발명의 명칭 "Novel CRISPR Enzymes and Systems"의 미국 가출원 번호 62/432,240, 발명의 명칭 "Novel Type VI CRISPR Orthologs and Systems"로 2017년 3월 15일 출원된 미국 가출원 번호62/471,710, 및 발명의 명칭 "Novel Type VI CRISPR Orthologs and Systmes"로 2017년 4월 12일 출원되고 대리인 문서 번호 47627-05-2133으로 표지된 미국 가출원에 개시된 오솔로그의 서열로부터 유래될 수 있다.
본 발명의 하나의 실시형태에서, HEPN 도메인은 R{N/H/K}X1X2X3H (SEQ ID NO:351)의 서열을 포함하는 적어도 하나의 RxxxxH 모티프를 포함한다. 본 발명의 하나의 실시형태에서, HEPN 도메인은 R{N/H}X1X2X3H (SEQ ID NO:352)의 서열을 포함하는 RxxxxH 모티프를 포함한다. 본 발명의 하나의 실시형태에서, HEPN 도메인은 R{N/K}X1X2X3H (SEQ ID NO:353)의 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, X1 은 R, S, D, E, Q, N, G, Y, 또는 H 이다. 특정 실시형태에서, X2 는 I, S, T, V, 또는 L 이다. 특정 실시형태에서, X3 은 L, F, N, Y, V, I, S, D, E, 또는 A 이다.
본 발명에 따라 사용을 위한 추가의 이펙터는 예를 들어, 제한없이, cas1 유전자의 출발점으로부터 20 kb 및 cas1 유전자의 종료점으로부터 20 kb 영역 이내에서, cas1 유전자와 그들 근접성에 의해 확인될 수 있다. 특정 실시형태에서 이펙터 단백질은 적어도 하나의 HEPN 도메인 및 적어도 500개 아미노산을 포함하고, C2c2 이펙터 단백질은 Cas 유전자 또는 CRISPR 어레이의 상류 또는 하류 20 kb 이내의 원핵생물 게놈에 천연적으로 존재한다. Cas 단백질의 비제한적인 예는 Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9 (Csn1 및 Csx12라고도 공지됨), Cas10, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4, 이의 상동체, 또는 이의 변형된 형태를 포함한다. 일정 예의 실시형태에서, C2c2 이펙터 단백질은 Cas 1 유전자의 상류 또는 하류 20 kb 이내 원핵생물 게놈에 천연적으로 존재한다. 용어 "오솔로그" (orthologue 또는 ortholog라고도 함) 및 "상동체" (homologue 또는 homolog라고도 함)는 당분야에 충분히 공지되어 있다. 추가 지침에 의해서, 본 명세서에서 사용되는 단백질의 "상동체"는 상동성인 단백질과 동일하거나 또는 유사한 기능을 수행하는 동일 종의 단백질이다. 상동성 단백질은 구조적으로 관련될 필요가 없거나, 또는 오직 부분적으로 구조적으로 관련된다. 본 명세서에서 사용되는 단백질의 "오솔로그"는 오솔로그인 단백질과 동일하거나 또는 유사한 기능을 수행하는 상이한 종의 단백질이다. 오솔로그 단백질은 구조적으로 관련될 필요가 없거나, 또는 오직 부분적으로 구조적으로 관련된다.
특정 실시형태에서, 유형 VI RNA-표적화 Cas 효소는 C2c2이다. 다른 예시적인 실시형태에서, 유형 VI RNA-표적화 Cas 효소는 Cas 13b이다. 특정한 실시형태에서, 유형 VI 단백질, 예컨대 본원에 언급되는 바와 같은 C2c2의 상동체 또는 오솔로그는 유형 VI 단백질 예컨대 C2c2 (임의의 렙토트리키아 샤히 C2c2, 라크노스피라과 박테리아 MA2020 C2c2, 라크노스피라과 박테리아 NK4A179 C2c2, 클로스트리듐 아미노필럼 (DSM 10710) C2c2, 카르노박테리움 갈리나럼 (DSM 4847) C2c2, 팔루디박터 프로피오니시게네스 (WB4) C2c2, 리스테리아 웨이헨스테파넨시스 (FSL R9-0317) C2c2, 리스테리아과 박테리아 (FSL M6-0635) C2c2, 리스테리아 뉴요켄시스 (Listeria newyorkensis) (FSL M6-0635) C2c2, 렙토트리키아 웨이데이 (F0279) C2c2, 로도박터 캡슐라터스 (SB 1003) C2c2, 로도박터 캡슐라터스 (R121) C2c2, 로도박터 캡슐라터스 (DE442) C2c2, 렙토트리키아 웨이데이 (Lw2) C2c2, 또는 리스테리아 실리게리 C2c2의 야생형 서열 기반)와 적어도 30%, 또는 적어도 40%, 또는 적어도 50%, 또는 적어도 60%, 또는 적어도 70%, 또는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 85%, 보다 더 바람직하게는 적어도 90%, 예컨대 예를 들어 적어도 95%의 서열 상동성 또는 동일성을 갖는다. 추가 실시형태에서, 본 명세서에 언급된 바와 같은 C2c2와 같은 유형 VI 단백질의 상동체 또는 오솔로그는 야생형 C2c2 (임의의 렙토트리키아 샤히 C2c2, 라크노스피라과 박테리아 MA2020 C2c2, 라크노스피라과 박테리아 NK4A179 C2c2, 클로스트리듐 아미노필럼 (DSM 10710) C2c2, 카르노박테리움 갈리나럼 (DSM 4847) C2c2, 팔루디박터 프로피오니시게네스 (WB4) C2c2, 리스테리아 웨이헨스테파넨시스 (FSL R9-0317) C2c2, 리스테리아과 박테리아 (FSL M6-0635) C2c2, 리스테리아 뉴요켄시스 (FSL M6-0635) C2c2, 렙토트리키아 웨이데이 (F0279) C2c2, 로도박터 캡슐라터스 (SB 1003) C2c2, 로도박터 캡슐라터스 (R121) C2c2, 로도박터 캡슐라터스 (DE442) C2c2, 렙토트리키아 웨이데이 (Lw2) C2c2, 또는 리스테리아 실리게리 C2c2의 야생형 서열 기반)와 적어도 30%, 또는 적어도 40%, 또는 적어도 50%, 또는 적어도 60%, 또는 적어도 70%, 또는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 85%, 보다 더 바람직하게는 적어도 90%, 예컨대 예를 들어, 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는다.
일정한 다른 예의 실시형태에서, CRISPR 시스템 이펙터 단백질은 C2c2 뉴클레아제이다. C2c2의 활성은 2개 HEPN 도메인의 존재에 의존할 수 있다. 이들은 RNase 도메인, 즉 RNA를 절단하는 뉴클레아제 (특히 엔도뉴클레아제)인 것으로 확인되었다. C2c2 HEPN은 또한 DNA, 또는 잠재적으로 DNA 및/또는 RNA를 표적화할 수 있다. C2c2의 HEPN 도메인이 그들의 야생형 형태로, 적어도 RNA에 결합하여 절단시킬 수 있다는 것을 기초로, C2c2 이펙터 단백질이 RNase 기능을 갖는 것이 바람직하다. C2c2 CRISPR 시스템과 관련하여, 2016년 6월 17일에 출원된 미국 가출원 번호 62/351,662 및 2016년 8월 17일에 출원된 미국 가출원 번호62/376,377을 참조한다. 또한 2016년 6월 17일 출원된 미국 가출원 62/351,803을 참조한다. 또한, 브로드 연구소 번호 10035.PA4 및 대리인 서류 번호 47627.03.2133을 보유하는 2016년 12월 8일 출원된 발명의 명칭 "Novel Crispr Enzymes and Systems"의 미국 가출원을 참조한다. 또한 하기 문헌을 참고한다: East-Seletsky et al. "Two distinct RNase activities of CRISPR-C2c2 enable guide-RNA processing and RNA detection" Nature doi:10/1038/nature19802 및 Abudayyeh et al. "C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA targeting CRISPR effector" bioRxiv doi:10.1101/054742.
CRISPR 시스템에서 RNase 기능은 공지되어 있으며, 예를 들어 mRNA 표적화는 일정 유형 III CRISPR-Cas 시스템의 경우에 보고되었고 (Hale et al., 2014, Genes Dev, vol. 28, 2432-2443; Hale et al., 2009, Cell, vol. 139, 945-956; Peng et al., 2015, Nucleic Aids research, vol. 43, 406-417) 상당한 장점을 제공한다. 스타필로코커스 에피더미스 (Staphylococcus epidermis) 유형 III-A 시스템에서, 표적 전역의 전사는 그 결과로 Cas10-Csm 리보뉴클레오단백질 이펙터 단백질 복합체 내의 독립적인 활성 부위에 의해 매개되는, 표적 DNA 및 이의 전사물의 절단을 야기시킨다 (Samai et al., 2015, Cell, vol. 151, 1164-1174). 본 발명의 이펙터 단백질을 통한 CRISPR-Cas 시스템, 조성물 또는 RNA의 표적화 방법이 따라서 제공된다.
하나의 실시형태에서, Cas 단백질은 제한없이 렙토트리키아, 리스테리아, 코리네박터, 수테렐라, 레지오넬라, 트레포네마, 필리팍토르, 유박테리움, 스트렙토코커스, 락토바실러스, 마이코플라스마, 박테로이데스, 플라비이볼라, 플라보박테리움, 스파에로차에타, 아조스피릴럼, 글루콘아세토박터, 네이세리아, 로세부리아, 파르비바큘럼, 스타필로코커스, 니트라티프락토, 마이코플라스마 및 캄필로박터를 포함하는 속의 유기체의 C2c2 오솔로그일 수 있다. 이러한 속의 유기체 종은 달리 본 명세서에서 논의될 수 있다.
CRISPR-Cas 시스템 효소의 오솔로그를 식별하는 일부 방법은 관심 게놈에서 tracr 서열을 식별하는 단계를 포함할 수 있다. tracr 서열의 식별은 하기의 단계들과 관련될 수 있다: CRISPR 효소를 포함하는 CRISPR 영역을 식별하기 위해 데이타베이스에서 직접 반복부 또는 tracr 메이트 서열에 대한 검색 단계. 센스 및 안티센스 양쪽 방향으로 CRISPR 효소에 측접하는 CRISPR 영역에서 상동성 서열의 검색 단계. 전사 종결인자 및 2차 구조의 조사. 직접 반복부 또는 tracr 메이트 서열은 아니지만 직접 반복부 또는 tracr 메이트 서열과 50% 초과의 동일성을 갖는 잠재적 tracr 서열로서 임의 서열을 식별하는 단계. 잠재적 tracr 서열을 선택하고 그와 회합되는 전사 종결인자 서열을 분석하는 단계.
본 명세서에 기술된 임의의 기능성이 다수의 오솔로그 유래 단편을 포함하는 키메라 효소를 포함하여, 다른 오솔로그 유래 CRISPR 효소로 조작될 수 있다는 것을 이해하게 될 것이다. 이러한 오솔로그의 예는 본 명세서의 다른 부분에 기술되어 있다. 따라서, 키메라 효소는 제한없이 렙토트리키아, 리스테리아, 코리네박터, 수테렐라, 레지오넬라, 트레포네마, 필리팍토르, 유박테리움, 스트렙토코커스, 락토바실러스, 마이코플라스마, 박테로이데스, 플라비이볼라, 플라보박테리움, 스파에로차에타, 아조스피릴룸, 글루콘아세토박터, 네이세리아, 로세부리아, 파르비바큘럼, 스타필로코커스, 니트라티프락토, 마이코플라스마 및 캄필로박터를 포함하는 유기체의 CRISPR 효소 오솔로그의 단편을 포함할 수 있다. 키메라 효소는 제 1 단편 및 제 2 단편을 포함할 수 있고, 단편은 본 명세서에 언급된 속의 유기체 또는 본 명세서에 언급된 종의 유기체의 CRISPR 효소 오솔로그의 것일 수 있으며, 유리하게 단편은 상이한 종의 CRISPR 효소 오솔로그로부터 유래된다.
실시형태에서, 본 명세서에서 언급되는 바와 같은 C2c2 단백질은 또한 C2c2의 기능성 변이체 또는 이의 상동체 또는 오솔로그를 포괄한다. 본 명세서에서 사용 시 단백질의 "기능성 변이체"는 그 단백질의 활성을 적어도 부분적으로 보유하는 그러한 단백질의 변이체를 의미한다. 기능적 변이체는 다형체 등을 포함하여, 돌연변이체(이는 삽입, 결실, 또는 치환 돌연변이체일 수 있음)를 포함할 수 있다. 또한, 기능적 변이체 내에는 또 다른, 보통 관련되지 않은, 핵산, 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드와 이러한 단백질의 융합 생성물이 포함된다. 기능적 변이체는 천연적으로 발생할 수 있거나 인공적일 수 있다. 유리한 실시형태는 조작되거나 또는 비천연 발생된 유형 VI RNA-표적화 이펙터 단백질을 포함할 수 있다.
하나의 실시형태에서, C2c2 또는 이의 오솔로그 또는 상동체를 코딩하는 핵산 분자(들)는 진핵생물 세포에서 발현을 위해 코돈-최적화될 수 있다. 진핵생물은 본 명세서에서 논의되는 바와 같을 수 있다. 핵산 분자(들)는 조작될 수 있거나 또는 비천연 발생일 수 있다.
하나의 실시형태에서, C2c2 또는 이의 오솔로그 또는 상동체는 하나 이상의 돌연변이를 가질 수 있다 (그에 따라 이를 코딩하는 핵산 분자(들)는 돌연변이(들)를 가질 수 있음). 돌연변이는 인공적으로 도입된 돌연변이일 수 있고 제한없이 촉매성 도메인에 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다. Cas9 효소에 대한 촉매성 도메인의 예는 제한없이 RuvC I, RuvC II, RuvC III 및 HNH 도메인을 포함할 수 있다.
하나의 실시형태에서, C2c2 또는 이의 오솔로그 또는 상동체는 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다. 돌연변이는 인공적으로 도입된 돌연변이일 수 있고 제한없이 촉매성 도메인에 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다. Cas 효소에 대한 촉매성 도메인의 예는 제한없이 HEPN 도메인을 포함할 수 있다.
하나의 실시형태에서, C2c2 또는 이의 오솔로그 또는 상동체는 기능성 도메인에 작동적으로 연결되거나 또는 융합된 일반 핵산 결합 단백질로서 사용될 수 있다. 예시적인 기능성 도메인은 제한없이 번역 개시인자, 번역 활성인자, 번역 억제인자, 뉴클레아제, 특히 리보뉴클레아제, 스플라이시오솜, 비드, 광 유도성/제어성 도메인 또는 화학 유도성/제어성 도메인을 포함할 수 있다.
특정 예시 실시형태에서, C2c2 이펙터 단백질은 렙토트리키아, 리스테리아, 코리네박터, 수테렐라, 레지오넬라, 트레포네마, 필리팩토르, 유박테리움, 스트렙토코커스, 락토바실러스, 마이코플라스마, 박테로이데스, 플라비이볼라, 플라보박테리움, 스파에로차에타, 아조스피릴룸, 글루콘아세토박터, 네이세리아, 로세부리아, 파르비바큘럼, 스타필로코커스, 니트라티프락토, 마이코플라스마, 및 캄필로박터로 이루어진 군으로부터 선택된 유기체로부터 유래될 수 있다.
특정 실시형태에서, 이펙터 단백질은 리스테리아 sp. C2c2p, 바람직하게는 리스테리아 시리게리아 C2c2p, 더 바람직하게는 리스테리아 시리게리아 혈청형 1/2b str. SLCC3954 C2c2p 일 수 있고, crRNA 서열은 길이가 44 내지 47 개의 뉴클레오티드일 수 있으며, 5 '29-nt 직접 반복부 (DR) 및 15-nt 내지 18-nt 스페이서를 갖는다.
특정 실시형태에서, 이펙터 단백질은 렙토트리키아 sp. C2c2p, 바람직하게 렙토트리키아 샤히 C2c2p, 보다 바람직하게 렙토트리키아 샤히 DSM 19757 C2c2p일 수 있고, crRNA 서열은 적어도 24 nt의 5' 직접 반복부, 예컨대 5' 24-28-nt 직접 반복부 (DR) 및 적어도 14 nt의 스페이서, 예컨대 14-nt 내지 28-nt 스페이서, 또는 적어도 18 nt의 스페이서, 예컨대 19 nt, 20 nt, 21 nt, 22 nt, 또는 그 이상의 nt, 예컨대 18-28 nt, 19-28 nt, 20-28 nt, 21-28 nt, 또는 22-28 nt의 스페이서를 갖는, 42 내지 58개 뉴클레오티드 길이일 수 있다.
특정 예시 실시형태에서, 이펙터 단백질은 렙토트리키아 sp., 렙토트리키아 웨이데이 F0279, 또는 리스테리아 sp., 바람직하게 리스테리아 뉴요켄시스 FSL M6-0635일 수 있다.
특정 예시 실시형태에서, 본 발명의 C2c2 이펙터 단백질은, 제한 없이, 하기 21 가지 오솔로그 종 (다중 CRISPR 유전자좌 포함)을 포함한다: 렙토트리키아 샤히; 렙토트리키아 웨이데이 (Lw2); 리스테리아 실리게리 라크노스피라과 박테리아 MA2020; 라크노스피라과 박테리아 NK4A179; [클로스트리듐] 아미노필럼 DSM 10710; 카르노박테리움 갈리나럼 DSM 4847; 카르노박테리움 갈리나럼 DSM 4847 (제 2 CRISPR 유전자좌); 팔루디박터 프로피오니시게네스 WB4; 리스테리아 웨이헨스테파넨시스 FSL R9-0317; 리스테리아과 박테리아 FSL M6-0635; 렙토트리키아 웨이데이 F0279; 로도박터 캡슐라터스 SB 1003; 로도박터 캡슐라터스 R121; 로도박터 캡슐라터스 DE442; 렙토트리키아 부칼리스 C-1013-b; 허르비닉스 헤미셀룰로실리티카; [유박테리움] 렉탈레; 유박테리아과 박테리아 CHKCI004; 블라우티아 sp. 마르세이유-P2398; 및 렙토트리키아 sp. 경구 분류군 879 str. F0557. 12 개의 추가의 비제한적인 예는 다음과 같다: 라크노스피라과 박테리아 NK4A144; 클로로플렉서스 아그레간스; 데메퀴나 아우란티아카; 탈라소스피라 sp. TSL5-1; 슈도부티리비브리오 sp. OR37; 부티리비브리오 sp. YAB3001; 블라우티아 sp. 마르세이유-P2398; 렙토트리키아 sp. 마르세이유-P3007; 박테로이데스 이후아에; 포르피로모나다과 박테리아 KH3CP3RA; 리스테리아 리파리아; 및 인솔리티스피릴럼 페레그리넘.
특정 실시형태에서, 본 발명에 따른 C2c2 단백질은 하기 표에 기술된 바와 같은 오솔로그 중 하나이거나 또는 그로부터 유래되거나, 또는 하기 표에 기술된 바와 같은 오솔로그 중 둘 이상의 키메라 단백질이거나, 또는 이종성/기능성 도메인과 융합되거나 또는 융합되지 않고, 본 명세서의 다른 곳에 정의된 바와 같은 데드 C2c2, 분할 C2c2, 탈안정화 C2c2 등을 포함한, 하기 표에 기술된 바와 같은 오솔로그 중 하나의 돌연변이체 또는 변이체 (또는 키메라 돌연변이체 또는 변이체)이다.
특정 예시 실시형태에서, C2c2 이펙터 단백질은 하기 표 1로부터 선택된다.
표 1
상기 종의 야생형 단백질 서열은 하기 표 2에 열거되어 있다. 특정 실시형태에서 C2c2 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 제공된다.
표 2
본 발명의 하나의 실시형태에서, 렙토트리키아 샤히 C2c2, 라크노스피라과 박테리아 MA2020 C2c2, 라크노스피라과 박테리아 NK4A179 C2c2, 클로스트리듐 아미노필럼 (DSM 10710) C2c2, 카르노박테리움 갈리나럼 (DSM 4847) C2c2, 팔루디박터 프로피오니시게네스 (WB4) C2c2, 리스테리아 웨이헨스테파넨시스 (FSL R9-0317) C2c2, 리스테리아과 박테리아 (FSL M6-0635) C2c2, 리스테리아 뉴요켄시스 (FSL M6-0635) C2c2, 렙토트리키아 웨이데이 (F0279) C2c2, 로도박터 캡슐라터스 (SB 1003) C2c2, 로도박터 캡슐라터스 (R121) C2c2, 로도박터 캡슐라터스 (DE442) C2c2, 렙토트리키아 웨이데이 (Lw2) C2c2, 또는 리스테리아 실리게리 C2c2 중 임의의 야생형 서열과 적어도 80% 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 이펙터 단백질이 제공된다.
본 발명의 하나의 실시형태에서, 이펙터 단백질은 제한없이 본 명세서에 기술된 공통 서열을 포함하는 유형 VI 이펙터 단백질 공통 서열과 적어도 80% 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명에 따라서, 공통 서열은 제한없이 C2c2 기능을 매개하는 C2c2 오솔로그의 촉매성 잔기 및 HEPN 모티프를 포함하여, 보존된 아미노산 잔기 및 모티프의 위치를 찾는데 도움이 될 수 있는, 다수의 C2c2 오솔로그로부터 생성될 수 있다. Geneious 정렬을 사용하여 상기 언급된 33종 오솔로그로부터 생성시킨, 하나의 이러한 공통 서열은 하기 서열이다.
다른 비제한적인 예에서, 공통 서열의 생성 및 보존된 잔기의 식별을 보조하기 위한 서열 정렬 도구는 MUSCLE 정렬 도구 (www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/)이다. 예를 들어, MUSCLE을 사용하여, C2c2 오솔로그 중에서 보존된 하기 아미노산이 렙토트리키아 웨이데이 C2c2 에서 식별될 수 있다:K2; K5; V6; E301; L331; I335; N341; G351; K352; E375; L392; L396; D403; F446; I466; I470; R474 (HEPN); H475; H479 (HEPN), E508; P556; L561; I595; Y596; F600; Y669; I673; F681; L685; Y761; L676; L779; Y782; L836; D847; Y863; L869; I872; K879; I933; L954; I958; R961; Y965; E970; R971; D972; R1046 (HEPN), H1051 (HEPN), Y1075; D1076; K1078; K1080; I1083; I1090.
고도로 보존된 잔기를 나타내는 HEPN 도메인의 예시적인 서열 정렬이 도 50에 제시되어 있다.
특정 예시 실시형태에서, RNA-표적화 이펙터 단백질은 유형 VI-B 이펙터 단백질, 예컨대 Cas13b 및 그룹 29 또는 그룹 30 단백질이다. 특정 예시 실시형태에서, RNA-표적화 이펙터 단백질은 하나 이상의 HEPN 도메인을 포함한다. 특정 예시 실시형태에서, RNA-표적화 이펙터 단백질은 C-말단 HEPN 도메인, N-말단 HEPN 도메인, 또는 둘 모두를 포함한다. 본 발명의 맥락에서 사용될 수 있는 유형 VI-B 이펙터 단백질의 예와 관련하여, 하기를 참조한다: 미국 출원 번호 15/331,792, 제목 "Novel CRISPR Enzymes and Systems" (2016년 10월 21일 출원됨), 국제 특허 출원 번호 PCT/US2016/058302, 제목 "Novel CRISPR Enzymes and Systems" (2016년 10월 21일 출원됨), 및 Smargon et al. "Cas13b is a Type VI-B CRISPR-associated RNA-Guided RNase differentially regulated by accessory proteins Csx27 and Csx28" Molecular Cell, 65, 1-13 (2017); dx.doi.org/10.1016/j.molcel.2016.12.023, 및 미국 가출원 번호는 부여될 것임, 제목 "Novel Cas13b Orthologues CRISPR Enzymes and System" (2017년 3월 15일 출원됨). 특정한 실시형태에서, Cas13b 효소는 베르게이엘라 주헬컴으로부터 유래된다. 일정한 다른 예의 실시형태에서, 이펙터 단백질은 표 3에 열거된 임의 서열과 적어도 80%의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열이거나, 또는 그를 포함한다.
표 3
특정 예시 실시형태에서, Cas13b 오솔로그의 야생형 서열은 하기 표 4a 또는 4b에서 발견된다.
표 4a
표 4b
특정 예시 실시형태에서, RNA-표적화 이펙터 단백질은 미국 가출원 번호 62/525,165 (26, 2017 년 6 월 26 일에 출원됨), 및 PCT 출원 번호 US 2017/047193 (26, 2017 년 7 월 26 일에 출원됨) 에 기재된 Cas13c 이펙터 단백질이다. Cas13c의 예시 야생형 오솔로그 서열은 하기 표 5 에 제시된다.
표 5
Cas12 단백질
특정 예시적 실시형태에서, 어세이는 다수의 Cas12 오솔로그, 또는 하나 이상의 Cas13 오솔로그와 조합으로 하나 이상의 오솔로그를 포함할 수 있다. 특정 예시적 실시형태에서, Cas12 오솔로그는 Cpf1 오솔로그이다. 특정 기타 예시적 실시형태에서, Cas12 오솔로그는 C2c1 오솔로그이다.
Cpf1 오솔로그
본 발명은 서브유형 V-A 로서 나타내는 Cpf1 유전자좌에서 유래하는, Cpf1 이펙터 단백질의 용도를 포함한다. 여기서 이러한 이펙터 단백질은 또한 "Cpf1p", 예를 들어 Cpf1 단백질로서 지칭된다 (그리고 이러한 이펙터 단백질 또는 Cpf1 단백질 또는 Cpf1 유전자좌에서 유래하는 단백질은 또한 "CRISPR 효소" 로 불린다). 현재, 서브유형 V-A 유전자좌는 cas1, cas2, cpf1 로 나타낸 별개의 유전자 및 CRISPR 어레이를 포함한다. Cpf1 (CRISPR-연관 단백질 Cpf1, 서브유형 PREFRAN) 은 Cas9 의 특징적인 아르기닌-풍부 클러스터에 대응하는 부분과 함께 Cas9 의 해당하는 도메인에 상응하는 RuvC-유사 뉴클레아제 도메인을 함유하는 거대 단백질 (약 1300 개 아미노산) 이다. 그러나, Cpf1 은 모든 Cas9 단백질에 존재하는 HNH 뉴클레아제 도메인이 결핍되어 있고, RuvC-유사 도메인은 HNH 도메인을 포함하는 긴 삽입물을 함유하는 Cas9 와 달리 Cpf1 서열에서 연속적이다. 따라서, 특정 실시형태에서, CRISPR-Cas 효소는 RuvC-유사 뉴클레아제 도메인만을 포함한다.
RNA-가이드 Cpf1 의 프로그램 가능성, 특이성 및 부수적 활성은 또한 핵산의 비특이적 절단을 위한 이상적인 전환가능 뉴클레아제를 가능하게 한다. 한 실시형태에서, Cpf1 시스템은 RNA 의 부수적인 비특이적 절단을 제공하고 이용하도록 조작된다. 또 다른 실시형태에서, Cpf1 시스템은 ssDNA 의 부수적인 비특이적 절단을 제공하고 이용하도록 조작된다. 따라서, 조작된 Cpf1 시스템은 핵산 검출 및 전사체 조작을 위한 플랫폼을 제공한다. Cpf1 은 포유동물 전사물 녹다운 (transcript knockdown) 및 결합 도구로서 사용하기 위해 개발된다. Cpf1 은 서열 특이적 표적화된 DNA 결합에 의해 활성화될 때 RNA 및 ssDNA 의 강건한 부수적인 절단을 가능하게 한다.
용어 "오솔로그 (orthologue)" (본원에서 "오솔로그 (ortholog)" 로도 나타냄) 및 "상동체 (homologue)" (본원에서 "상동체 (homolog)" 로도 나타냄) 는 당업계에 널리 공지되어 있다. 추가 지침에 의해서, 본 명세서에서 사용되는 단백질의 "상동체" 는 이의 상동체인 단백질과 동일하거나 유사한 기능을 수행하는 동일 종의 단백질이다. 상동성 단백질은 구조적으로 관련될 필요가 없거나, 오직 부분적으로 구조적으로 관련된다. 본원에서 사용되는 바와 같은 단백질의 "오솔로그" 는 이의 오솔로그인 단백질과 동일하거나 유사한 기능을 수행하는 상이한 종의 단백질이다. 오솔로그 단백질은 구조적으로 관련될 필요가 없거나, 오직 부분적으로 구조적으로 관련된다. 상동체 및 오솔로그는 상동성 모델링 (예를 들어, Greer, Science vol. 228 (1985) 1055, 및 Blundell et al. Eur J Biochem vol 172 (1988), 513 참조) 또는 "구조적 BLAST" (Dey F, Cliff Zhang Q, Petrey D, Honig B. Toward a "structural BLAST": using structural relationships to infer function. Protein Sci. 2013 Apr;22(4):359-66. doi: 10.1002/pro.2225.) 에 의해 식별될 수 있다. 또한 CRISPR-Cas 유전자좌 분야에서의 적용을 위해 Shmakov et al. (2015) 을 참조한다. 상동성 단백질은 구조적으로 관련될 필요가 없거나, 오직 부분적으로 구조적으로 관련된다.
Cpf1 유전자는 여러 다양한 박테리아 게놈에서, 전형적으로 cas1, cas2 및 cas4 유전자 및 CRISPR 카세트를 갖는 동일한 유전자좌에서 발견된다 (예를 들어, 프란시셀라 cf. 노비시다 (Francisella cf. novicida) Fx1 의 FNFX1_1431-FNFX1_1428). 따라서, 이러한 추정 신규 CRISPR-Cas 시스템의 레이아웃은 유형 II-B 의 경우와 유사한 것으로 나타낸다. 또한 Cas9 와 유사하게, Cpf1 단백질은, 트랜스포존 ORF-B 에 대해 상동성이며 활성 RuvC-유사 뉴클레아제, 아르기닌-풍부 영역, 및 Zn 핑거 (Cas9 에 부재함) 를 포함하는 용이하게 식별가능한 C-말단 영역을 함유한다. 그러나 Cas9 와 달리, Cpf1 은 또한 CRISPR-Cas 내용 없이 여러 게놈에 존재하며, ORF-B 와의 그의 상대적으로 높은 유사성은 그것이 트랜스포존 성분일 수 있다는 것을 시사한다. 이것이 진정한 CRISPR-Cas 시스템이며 Cpf1 이 Cas9 의 기능적 유사체라면, 이는 신규한 CRISPR-Cas 유형, 즉, 유형 V 라는 것이 시사되었다 (CRISPR-Cas Systems. Makarova KS, Koonin EV. Methods Mol Biol. 2015;1311:47-75 의 주석 및 분류 참조). 그러나, 본원에서 기재한 바와 같이, Cpf1 은 서브유형 V-A 가 되는 것으로 나타나, 동일한 도메인 구조를 갖지 않으며 따라서 서브유형 V-B 가 되는 것으로 나타난 C2c1p 와 구별된다.
특정 실시형태에서, 이펙터 단백질은 스트렙토코커스 (Streptococcus), 캄필로박터 (Campylobacter), 니트라티프락토르 (Nitratifractor), 스타필로코커스 (Staphylococcus), 파비바쿨룸 (Parvibaculum), 로세부리아 (Roseburia), 네이세리아 (Neisseria), 글루콘아세토박터 (Gluconacetobacter), 아조스피릴룸 (Azospirillum), 스파에로케타 (Sphaerochaeta), 락토바실러스 (Lactobacillus), 유박테리움 (Eubacterium), 코리네박터 (Corynebacter), 카노박테리움 (Carnobacterium), 로도박터 (Rhodobacter), 리스테리아 (Listeria), 팔루디박터 (Paludibacter), 클로스트리디움 (Clostridium), 라크노스피라세 (Lachnospiraceae), 클로스트리디아리디움 (Clostridiaridium), 렙토트리키아 (Leptotrichia), 프란시셀라 (Francisella), 레지오넬라 (Legionella), 알리사이클로바실러스 (Alicyclobacillus), 메타노메티요필러스 (Methanomethyophilus), 포르피로모나스 (Porphyromonas), 프레보텔라 (Prevotella), 박테로이데테스 (Bacteroidetes), 헬코코커스 (Helcococcus), 렙토스피라 (Leptospira), 데술포비브리오 (Desulfovibrio), 데술포나트로눔 (Desulfonatronum), 오피투타세 (Opitutaceae), 투베리바실러스 (Tuberibacillus), 바실러스 (Bacillus), 브레비바실러스 (Brevibacilus), 메틸로박테리움 (Methylobacterium) 또는 액시드아미노코커스 (Acidaminococcus) 를 포함하는 속으로부터의 유기체로부터의 Cpf1 이펙터 단백질이다.
추가 특정 실시형태에서, Cpf1 이펙터 단백질은 S. 뮤탄스 (S. mutans), S. 아갈락티에 (S. agalactiae), S. 에퀴시밀리스 (S. equisimilis), S. 산귀니스 (S. sanguinis), S. 뉴모니아 (S. pneumonia); C. 제주니 (C. jejuni), C. 콜리 (C. coli); N. 살수기니스 (N. salsuginis), N. 테르가쿠스 (N. tergarcus); S. 아우리쿨라리스 (S. auricularis), S. 카르노서스 (S. carnosus); N. 메닝기티데스 (N. meningitides), N. 고노르호에 (N. gonorrhoeae); L. 모노사이토게네스 (L. monocytogenes), L. 이바노비 (L. ivanovii); C. 보툴리눔 (C. botulinum), C. 디피실 (C. difficile), C. 테타니 (C. tetani), C. 소르델리 (C. sordellii) 에서 선택되는 유기체로부터의 것이다.
이펙터 단백질은 제 1 이펙터 단백질 (예를 들어, Cpf1) 오솔로그로부터의 제 1 단편 및 제 2 이펙터 (예를 들어, Cpf1) 단백질 오솔로그로부터의 제 2 단편을 포함하는 키메라 이펙터 단백질을 포함할 수 있으며, 이때 제 1 이펙터 단백질 오솔로그와 제 2 이펙터 단백질 오솔로그는 상이하다. 제 1 및 제 2 이펙터 단백질 (예를 들어, Cpf1) 오솔로그 중 적어도 하나는 스트렙토코커스 (Streptococcus), 캄필로박터 (Campylobacter), 니트라티프락토르 (Nitratifractor), 스타필로코커스 (Staphylococcus), 파비바쿨룸 (Parvibaculum), 로세부리아 (Roseburia), 네이세리아 (Neisseria), 글루콘아세토박터 (Gluconacetobacter), 아조스피릴룸 (Azospirillum), 스파에로케타 (Sphaerochaeta), 락토바실러스 (Lactobacillus), 유박테리움 (Eubacterium), 코리네박터 (Corynebacter), 카노박테리움 (Carnobacterium), 로도박터 (Rhodobacter), 리스테리아 (Listeria), 팔루디박터 (Paludibacter), 클로스트리디움 (Clostridium), 라크노스피라세 (Lachnospiraceae), 클로스트리디아리디움 (Clostridiaridium), 렙토트리키아 (Leptotrichia), 프란시셀라 (Francisella), 레지오넬라 (Legionella), 알리사이클로바실러스 (Alicyclobacillus), 메타노메티요필러스 (Methanomethyophilus), 포르피로모나스 (Porphyromonas), 프레보텔라 (Prevotella), 박테로이데테스 (Bacteroidetes), 헬코코커스 (Helcococcus), 렙토스피라 (Letospira), 데술포비브리오 (Desulfovibrio), 데술포나트로눔 (Desulfonatronum), 오피투타세 (Opitutaceae), 투베리바실러스 (Tuberibacillus), 바실러스 (Bacillus), 브레비바실러스 (Brevibacilus), 메틸로박테리움 (Methylobacterium) 또는 액시드아미노코커스 (Acidaminococcus) 를 포함하는 유기체로부터의 이펙터 단백질 (예를 들어, Cpf1) 을 포함할 수 있는데; 예를 들어, 키메라 이펙터 단백질은 제 1 단편 및 제 2 단편을 포함하며 각각의 제 1 단편 및 제 2 단편은 스트렙토코커스 (Streptococcus), 캄필로박터 (Campylobacter), 니트라티프락토르 (Nitratifractor), 스타필로코커스 (Staphylococcus), 파비바쿨룸 (Parvibaculum), 로세부리아 (Roseburia), 네이세리아 (Neisseria), 글루콘아세토박터 (Gluconacetobacter), 아조스피릴룸 (Azospirillum), 스파에로케타 (Sphaerochaeta), 락토바실러스 (Lactobacillus), 유박테리움 (Eubacterium), 코리네박터 (Corynebacter), 카노박테리움 (Carnobacterium), 로도박터 (Rhodobacter), 리스테리아 (Listeria), 팔루디박터 (Paludibacter), 클로스트리디움 (Clostridium), 라크노스피라세 (Lachnospiraceae), 클로스트리디아리디움 (Clostridiaridium), 렙토트리키아 (Leptotrichia), 프란시셀라 (Francisella), 레지오넬라 (Legionella), 알리사이클로바실러스 (Alicyclobacillus), 메타노메티요필러스 (Methanomethyophilus), 포르피로모나스 (Porphyromonas), 프레보텔라 (Prevotella), 박테로이데테스 (Bacteroidetes), 헬코코커스 (Helcococcus), 렙토스피라 (Letospira), 데술포비브리오 (Desulfovibrio), 데술포나트로눔 (Desulfonatronum), 오피투타세 (Opitutaceae), 투베리바실러스 (Tuberibacillus), 바실러스 (Bacillus), 브레비바실러스 (Brevibacilus), 메틸로박테리움 (Methylobacterium) 또는 액시드아미노코커스 (Acidaminococcus) 를 포함하는 유기체의 Cpf1 에서 선택되고, 이때 제 1 단편 및 제 2 단편은 동일한 박테리아로부터의 것이 아니고; 예를 들어, 키메라 이펙터 단백질은 제 1 단편 및 제 2 단편을 포함하며 각각의 제 1 단편 및 제 2 단편은 S. 뮤탄스 (S. mutans), S. 아갈락티에 (S. agalactiae), S. 에퀴시밀리스 (S. equisimilis), S. 산귀니스 (S. sanguinis), S. 뉴모니아 (S. pneumonia); C. 제주니 (C. jejuni), C. 콜리 (C. coli); N. 살수기니스 (N. salsuginis), N. 테르가쿠스 (N. tergarcus); S. 아우리쿨라리스 (S. auricularis), S. 카르노서스 (S. carnosus); N. 메닝기티데스 (N. meningitides), N. 고노르호에 (N. gonorrhoeae); L. 모노사이토게네스 (L. monocytogenes), L. 이바노비 (L. ivanovii); C. 보툴리눔 (C. botulinum), C. 디피실 (C. difficile), C. 테타니 (C. tetani), C. 소르델리 (C. sordellii); 프란시셀라 투라렌시스 (Francisella tularensis) 1, 프레보텔라 알벤시스 (Prevotella albensis), 라크노스피라세 박테리움 (Lachnospiraceae bacterium) MC2017 1, 부티리비브리오 프로테오클라스티커스 (Butyrivibrio proteoclasticus), 페레그리니박테리아 박테리움 (Peregrinibacteria bacterium) GW2011_GWA2_33_10, 파르쿠박테리아 박테리움 (Parcubacteria bacterium) GW2011_GWC2_44_17, 스미텔라 sp. (Smithella sp.) SCADC, 액시드아미노코커스 sp. (Acidaminococcus sp.) BV3L6, 라크노스피라세 박테리움 (Lachnospiraceae bacterium) MA2020, 칸디다투스 메타노플라스마 테르미툼 (Candidatus Methanoplasma termitum), 유박테리움 엘리겐스 (Eubacterium eligens), 모락셀라 보보쿨리 (Moraxella bovoculi) 237, 렙토스피라 이나다이 (Leptospira inadai), 라크노스피라세 박테리움 (Lachnospiraceae bacterium) ND2006, 포르피로모나스 크레비오리카니스 (Porphyromonas crevioricanis) 3, 프레보텔라 디시엔스 (Prevotella disiens) 및 포르피로모나스 마카케 (Porphyromonas macacae) 의 Cpf1 에서 선택되고, 이때 제 1 단편 및 제 2 단편은 동일한 박테리아로부터의 것이 아니다.
보다 바람직한 실시형태에서, Cpf1p 는 프란시셀라 투라렌시스 (Francisella tularensis) 1, 프레보텔라 알벤시스 (Prevotella albensis), 라크노스피라세 박테리움 (Lachnospiraceae bacterium) MC2017 1, 부티리비브리오 프로테오클라스티커스 (Butyrivibrio proteoclasticus), 페레그리니박테리아 박테리움 (Peregrinibacteria bacterium) GW2011_GWA2_33_10, 파르쿠박테리아 박테리움 (Parcubacteria bacterium) GW2011_GWC2_44_17, 스미텔라 sp. (Smithella sp.) SCADC, 액시드아미노코커스 sp. (Acidaminococcus sp.) BV3L6, 라크노스피라세 박테리움 (Lachnospiraceae bacterium) MA2020, 칸디다투스 메타노플라스마 테르미툼 (Candidatus Methanoplasma termitum), 유박테리움 엘리겐스 (Eubacterium eligens), 모락셀라 보보쿨리 (Moraxella bovoculi) 237, 렙토스피라 이나다이 (Leptospira inadai), 라크노스피라세 박테리움 (Lachnospiraceae bacterium) ND2006, 포르피로모나스 크레비오리카니스 (Porphyromonas crevioricanis) 3, 프레보텔라 디시엔스 (Prevotella disiens) 및 포르피로모나스 마카케 (Porphyromonas macacae) 에서 선택되는 박테리아 종에서 유래한다. 특정 실시형태에서, Cpf1p 는 액시드아미노코커스 sp. (Acidaminococcus sp.) BV3L6, 라크노스피라세 박테리움 (Lachnospiraceae bacterium) MA2020 에서 선택되는 박테리아 종에서 유래한다. 특정 실시형태에서, 이펙터 단백질은 프란시셀라 투라렌시스 subsp. (Francisella tularensis subsp.) 노비시다 (novicida) 를 포함하나 이제 제한되지 않는, 프란시셀라 투라렌시스 (Francisella tularensis) 1 의 아종에서 유래한다.
일부 실시형태에서, Cpf1p 는 유박테리움 (Eubacterium) 의 속으로부터의 유기체에서 유래한다. 일부 실시형태에서, CRISPR 이펙터 단백질은 유박테리움 렉탈 (Eubacterium rectale) 의 박테리아 종으로부터의 유기체에서 유래한 Cpf1 단백질이다. 일부 실시형태에서, Cpf1 이펙터 단백질의 아미노산은 NCBI 참조 서열 WP_055225123.1, NCBI 참조 서열 WP_055237260.1, NCBI 참조 서열 WP_055272206.1, 또는 GenBank ID OLA16049.1 에 상응한다. 일부 실시형태에서, Cpf1 이펙터 단백질은 NCBI 참조 서열 WP_055225123.1, NCBI 참조 서열 WP_055237260.1, NCBI 참조 서열 WP_055272206.1, 또는 GenBank ID OLA16049.1 과 적어도 60%, 보다 특히 적어도 70, 예컨대 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 85%, 보다 더 바람직하게는 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95% 의 서열 상동성 또는 서열 동일성을 갖는다. 당업자는 이것이 Cpf1 단백질의 절두 형태를 포함하고, 이에 의해 절두 형태의 길이에 대해 서열 동일성이 결정된다는 것을 이해할 것이다. 일부 실시형태에서, Cpf1 이펙터는 TTTN 또는 CTTN 의 PAM 서열을 인식한다.
특정 실시형태에서, 본원에서 나타내는 바와 같은 Cpf1 의 상동체 또는 오솔로그는 Cpf1 과 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 85%, 보다 더 바람직하게는 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95% 의 서열 상동성 또는 동일성을 갖는다. 추가 실시형태에서, 본원에서 나타내는 바와 같은 Cpf1 의 상동체 또는 오솔로그는 야생형 Cpf1 과 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 85%, 보다 더 바람직하게는 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95% 의 서열 동일성을 갖는다. Cpf1 이 하나 이상의 돌연변이를 갖는 경우 (돌연변이됨), 본원에서 나타내는 바와 같은 상기 Cpf1 의 상동체 또는 오솔로그는 돌연변이된 Cpf1 과 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 85%, 보다 더 바람직하게는 적어도 90%, 예를 들어, 적어도 95% 의 서열 동일성을 갖는다.
한 실시형태에서, Cpf1 단백질은 액시드아미노코커스 sp. (Acidaminococcus sp.), 라크노스피라세 박테리움 (Lachnospiraceae bacterium) 또는 모락셀라 보보쿨리 (Moraxella bovoculi) 를 포함하나 이에 제한되지 않는 속의 유기체의 오솔로그일 수 있고; 특정 실시형태에서, 유형 V Cas 단백질은 액시드아미노코커스 sp. (Acidaminococcus sp.) BV3L6; 라크노스피라세 박테리움 (Lachnospiraceae bacterium) ND2006 (LbCpf1) 또는 모락셀라 보보쿨리 (Moraxella bovoculi) 237 을 포함하나 이에 제한되지 않는 종의 유기체의 오솔로그일 수 있다. 특정 실시형태에서, 본원에서 나타내는 바와 같은 Cpf1 의 상동체 또는 오솔로그는 본원에 개시된 Cpf1 서열 중 하나 이상과 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 85%, 보다 더 바람직하게는 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95% 의 서열 상동성 또는 동일성을 갖는다. 추가 실시형태에서, 본원에서 나타내는 바와 같은 Cpf 의 상동체 또는 오솔로그는 야생형 FnCpf1, AsCpf1 또는 LbCpf1 과 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 85%, 보다 더 바람직하게는 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95% 의 서열 동일성을 갖는다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 Cpf1 단백질은 FnCpf1, AsCpf1 또는 LbCpf1 과 적어도 60%, 보다 특히 적어도 70%, 예컨대 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 85%, 보다 더 바람직하게는 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95% 의 서열 상동성 또는 동일성을 갖는다. 추가 실시형태에서, 본원에서 나타내는 바와 같은 Cpf1 단백질은 야생형 AsCpf1 또는 LbCpf1 과 적어도 60%, 예컨대 적어도 70%, 보다 특히 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 85%, 보다 더 바람직하게는 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95% 의 서열 동일성을 갖는다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 Cpf1 단백질은 FnCpf1 과 60% 미만의 서열 동일성을 갖는다. 당업자는 이것이 Cpf1 단백질의 절두 형태를 포함하고, 이에 의해 절두 형태의 길이에 대해 서열 동일성이 결정된다는 것을 이해할 것이다.
C2c1 오솔로그
본 발명은 서브유형 V-B 로서 나타내는 C2c1 유전자좌에서 유래한, C2c1 이펙터 단백질의 용도를 포함한다. 본원에서 이러한 이펙터 단백질은 또한 "C2c1p", 예를 들어 C2c1 단백질 (이러한 이펙터 단백질 또는 C2c1 단백질 또는 C2c1 유전자좌에서 유래한 단백질은 또한 "CRISPR 효소" 로서 불림) 로서 지칭된다. 현재, 서브유형 V-B 유전자좌는 cas1-Cas4 융합, cas2, C2c1 로 나타낸 별개의 유전자 및 CRISPR 어레이를 포함한다. C2c1 (CRISPR-연관 단백질 C2c1) 은 Cas9 의 특징적인 아르기닌-풍부 클러스터에 대응하는 부분과 함께 Cas9 의 해당하는 도메인에 상응하는 RuvC-유사 뉴클레아제 도메인을 함유하는 거대 단백질 (약 1100 - 1300 개 아미노산) 이다. 그러나, C2c1 은 모든 Cas9 단백질에 존재하는 HNH 뉴클레아제 도메인이 결핍되어 있고, RuvC-유사 도메인은 HNH 도메인을 포함하는 긴 삽입물을 함유하는 Cas9 와 달리 C2c1 서열에서 연속적이다. 따라서, 특정 실시형태에서, CRISPR-Cas 효소는 RuvC-유사 뉴클레아제 도메인만을 포함한다.
C2c1 (Cas12b 로도 공지됨) 단백질은 RNA 가이드 뉴클레아제이다. 이의 절단은 tracr RNA 에 의존하여, 가이드 서열 및 직접 반복부를 포함하는 가이드 RNA 를 모집하는데, 여기서 가이드 서열은 표적 뉴클레오티드 서열과 하이브리드화하여 DNA/RNA 헤테로듀플렉스를 형성한다. 현재 연구를 기반으로 하여, C2c1 뉴클레아제 활성은 또한 PAM 서열의 인식에 의존한다. C2c1 PAM 서열은 T-풍부 서열이다. 일부 실시형태에서, PAM 서열은 5' TTN 3' 또는 5' ATTN 3' 이며, 여기서 N 은 임의의 뉴클레오티드이다. 특정 실시형태에서, PAM 서열은 5' TTC 3' 이다. 특정 실시형태에서, PAM 은 플라스모듐 팔시파룸 (Plasmodium falciparum) 의 서열 내에 있다.
C2c1 은 표적 유전자좌에서, 5' 오버행과 함께, 엇갈림 절단 (staggered cut), 또는 표적 서열의 PAM 원위 측에서 "점착성 말단 (sticky end)" 을 생성한다. 일부 실시형태에서, 5' 오버행은 7 nt 이다. [Lewis and Ke, Mol Cell. 2017 Feb 2;65(3):377-379] 을 참조한다.
본 발명은 C2c1 (유형 V-B; Cas12b) 이펙터 단백질 및 오솔로그를 제공한다. 용어 "오솔로그 (orthologue)" (본원에서 "오솔로그 (ortholog)" 로도 나타냄) 및 "상동체 (homologue)" (본원에서 "상동체 (homolog)" 로도 나타냄) 는 당업계에 널리 공지되어 있다. 추가 지침에 의해서, 본 명세서에서 사용되는 단백질의 "상동체" 는 이의 상동체인 단백질과 동일하거나 유사한 기능을 수행하는 동일 종의 단백질이다. 상동성 단백질은 구조적으로 관련될 필요가 없거나, 오직 부분적으로 구조적으로 관련된다. 본원에서 사용되는 바와 같은 단백질의 "오솔로그" 는 이의 오솔로그인 단백질과 동일하거나 유사한 기능을 수행하는 상이한 종의 단백질이다. 오솔로그 단백질은 구조적으로 관련될 필요가 없거나, 오직 부분적으로 구조적으로 관련된다. 상동체 및 오솔로그는 상동성 모델링 (예를 들어, Greer, Science vol. 228 (1985) 1055, 및 Blundell et al. Eur J Biochem vol 172 (1988), 513 참조) 또는 "구조적 BLAST" (Dey F, Cliff Zhang Q, Petrey D, Honig B. Toward a "structural BLAST": using structural relationships to infer function. Protein Sci. 2013 Apr;22(4):359-66. doi: 10.1002/pro.2225.) 에 의해 식별될 수 있다. 또한 CRISPR-Cas 유전자좌 분야에서의 적용을 위해 Shmakov et al. (2015) 을 참조한다. 상동성 단백질은 구조적으로 관련될 필요가 없거나, 오직 부분적으로 구조적으로 관련된다.
C2c1 유전자는 여러 다양한 박테리아 게놈에서, 전형적으로는 cas1, cas2 및 cas4 유전자 및 CRISPR 카세트를 갖는 동일한 유전자좌에서 발견된다. 따라서, 이러한 추정 신규 CRISPR-Cas 시스템의 레이아웃은 유형 II-B 의 경우와 유사한 것으로 나타난다. 또한 Cas9 와 유사하게, C2c1 단백질은 활성 RuvC-유사 뉴클레아제, 아르기닌-풍부 영역, 및 Zn 핑거 (Cas9 에 부재함) 를 함유한다.
특정 실시형태에서, 이펙터 단백질은 알리사이클로바실러스 (Alicyclobacillus), 데술포비브리오 (Desulfovibrio), 데술포나트로눔 (Desulfonatronum), 오피투타세 (Opitutaceae), 투베리바실러스 (Tuberibacillus), 바실러스 (Bacillus), 브레비바실러스 (Brevibacillus), 칸디다투스 (Candidatus), 데술파티랍디움 (Desulfatirhabdium), 시트로박터 (Citrobacter), 엘루시마이크로비아 (Elusimicrobia), 메틸로박테리움 (Methylobacterium), 옴니트로피카 (Omnitrophica), 피시스페레 (Phycisphaerae), 플랑크토마이세테스 (Planctomycetes), 스피로카에테스 (Spirochaetes), 및 베루코마이크로비아세 (Verrucomicrobiaceae) 를 포함하는 속으로부터의 유기체로부터의 C2c1 이펙터 단백질이다.
추가 특정 실시형태에서, C2c1 이펙터 단백질은 알리사이클로바실러스 액시도테레스트리스 (Alicyclobacillus acidoterrestris) (예를 들어, ATCC 49025), 알리사이클로바실러스 콘타미난스 (Alicyclobacillus contaminans) (예를 들어, DSM 17975), 알리사이클로바실러스 마크로스포란지두스 (Alicyclobacillus macrosporangiidus) (예를 들어, DSM 17980), 바실러스 히사시 (Bacillus hisashii) 균주 C4, 칸디다투스 린도우박테리아 박테리움 (Candidatus Lindowbacteria bacterium) RIFCSPLOWO2, 데술포비브리오 이노피나투스 (Desulfovibrio inopinatus) (예를 들어, DSM 10711), 데술포나트로눔 티오디스무탄스 (Desulfonatronum thiodismutans) (예를 들어, 균주 MLF-1), 엘루시마이크로비아 박테리움 (Elusimicrobia bacterium) RIFOXYA12, 옴니트로피카 WOR_2 박테리움 (Omnitrophica WOR_2 bacterium) RIFCSPHIGHO2, 오피투타세 박테리움 (Opitutaceae bacterium) TAV5, 피시스페레 박테리움 (Phycisphaerae bacterium) ST-NAGAB-D1, 플랑크토마이세테스 박테리움 (Planctomycetes bacterium) RBG_13_46_10, 스피로카에테스 박테리움 (Spirochaetes bacterium) GWB1_27_13, 베루코마이크로비아세 박테리움 (Verrucomicrobiaceae bacterium) UBA2429, 투베리바실러스 칼리두스 (Tuberibacillus calidus) (예를 들어, DSM 17572), 바실러스 써모아밀로보란스 (Bacillus thermoamylovorans) (예를 들어, 균주 B4166), 브레비바실러스 sp. (Brevibacillus sp.) CF112, 바실러스 sp. (Bacillus sp.) NSP2.1, 데술파티랍디움 부티라티보란스 (Desulfatirhabdium butyrativorans) (예를 들어, DSM 18734), 알리사이클로바실러스 허바리우스 (Alicyclobacillus herbarius) (예를 들어, DSM 13609), 시트로박터 프레운디 (Citrobacter freundii) (예를 들어, ATCC 8090), 브레비바실러스 아그리 (Brevibacillus agri) (예를 들어, BAB-2500), 메틸로박테리움 노둘란스 (Methylobacterium nodulans) (예를 들어, ORS 2060) 에서 선택되는 종으로부터의 것이다.
이펙터 단백질은 제 1 이펙터 단백질 (예를 들어, C2c1) 오솔로그로부터의 제 1 단편 및 제 2 이펙터 (예를 들어, C2c1) 단백질 오솔로그로부터의 제 2 단편을 포함하는 키메라 이펙터 단백질을 포함할 수 있으며, 이때 제 1 이펙터 단백질 오솔로그와 제 2 이펙터 단백질 오솔로그는 상이하다. 제 1 및 제 2 이펙터 단백질 (예를 들어, C2c1) 오솔로그 중 적어도 하나는 알리사이클로바실러스 (Alicyclobacillus), 데술포비브리오 (Desulfovibrio), 데술포나트로눔 (Desulfonatronum), 오피투타세 (Opitutaceae), 투베리바실러스 (Tuberibacillus), 바실러스 (Bacillus), 브레비바실러스 (Brevibacillus), 칸디다투스 (Candidatus), 데술파티랍디움 (Desulfatirhabdium), 엘루시마이크로비아 (Elusimicrobia), 시트로박터 (Citrobacter), 메틸로박테리움 (Methylobacterium), 옴니트로피카이 (Omnitrophicai), 피시스페레 (Phycisphaerae), 플랑크토마이세테스 (Planctomycetes), 스피로카에테스 (Spirochaetes), 및 베루코마이크로비아세 (Verrucomicrobiaceae) 를 포함하는 유기체로부터의 이펙터 단백질 (예를 들어, C2c1) 을 포함할 수 있고; 예를 들어, 키메라 이펙터 단백질은 제 1 단편 및 제 2 단편을 포함하며 여기서 각각의 제 1 및 제 2 단편은 알리사이클로바실러스 (Alicyclobacillus), 데술포비브리오 (Desulfovibrio), 데술포나트로눔 (Desulfonatronum), 오피투타세 (Opitutaceae), 투베리바실러스 (Tuberibacillus), 바실러스 (Bacillus), 브레비바실러스 (Brevibacillus), 칸디다투스 (Candidatus), 데술파티랍디움 (Desulfatirhabdium), 엘루시마이크로비아 (Elusimicrobia), 시트로박터 (Citrobacter), 메틸로박테리움 (Methylobacterium), 옴니트로피카이 (Omnitrophicai), 피시스페레 (Phycisphaerae), 플랑크토마이세테스 (Planctomycetes), 스피로카에테스 (Spirochaetes), 및 베루코마이크로비아세 (Verrucomicrobiaceae) 를 포함하는 유기체의 C2c1 에서 선택되고, 이때 제 1 단편 및 제 2 단편은 동일한 박테리아로부터의 것이 아니고; 예를 들어 키메라 이펙터 단백질은 제 1 단편 및 제 2 단편을 포함하며 여기서 각각의 제 1 및 제 2 단편은 알리사이클로바실러스 액시도테레스트리스 (Alicyclobacillus acidoterrestris) (예를 들어, ATCC 49025), 알리사이클로바실러스 콘타미난스 (Alicyclobacillus contaminans) (예를 들어, DSM 17975), 알리사이클로바실러스 마크로스포란지두스 (Alicyclobacillus macrosporangiidus) (예를 들어, DSM 17980), 바실러스 히사시 (Bacillus hisashii) 균주 C4, 칸디다투스 린도우박테리아 박테리움 (Candidatus Lindowbacteria bacterium) RIFCSPLOWO2, 데술포비브리오 이노피나투스 (Desulfovibrio inopinatus) (예를 들어, DSM 10711), 데술포나트로눔 티오디스무탄스 (Desulfonatronum thiodismutans) (예를 들어, 균주 MLF-1), 엘루시마이크로비아 박테리움 (Elusimicrobia bacterium) RIFOXYA12, 옴니트로피카 WOR_2 박테리움 (Omnitrophica WOR_2 bacterium) RIFCSPHIGHO2, 오피투타세 박테리움 (Opitutaceae bacterium) TAV5, 피시스페레 박테리움 (Phycisphaerae bacterium) ST-NAGAB-D1, 플랑크토마이세테스 박테리움 (Planctomycetes bacterium) RBG_13_46_10, 스피로카에테스 박테리움 (Spirochaetes bacterium) GWB1_27_13, 베루코마이크로비아세 박테리움 (Verrucomicrobiaceae bacterium) UBA2429, 투베리바실러스 칼리두스 (Tuberibacillus calidus) (예를 들어, DSM 17572), 바실러스 써모아밀로보란스 (Bacillus thermoamylovorans) (예를 들어, 균주 B4166), 브레비바실러스 sp. (Brevibacillus sp.) CF112, 바실러스 sp. (Bacillus sp.) NSP2.1, 데술파티랍디움 부티라티보란스 (Desulfatirhabdium butyrativorans) (예를 들어, DSM 18734), 알리사이클로바실러스 허바리우스 (Alicyclobacillus herbarius) (예를 들어, DSM 13609), 시트로박터 프레운디 (Citrobacter freundii) (예를 들어, ATCC 8090), 브레비바실러스 아그리 (Brevibacillus agri) (예를 들어, BAB-2500), 메틸로박테리움 노둘란스 (Methylobacterium nodulans) (예를 들어, ORS 2060) 의 C2c1 에서 선택되고, 이때 제 1 및 제 2 단편은 동일한 박테리아로부터의 것이 아니다.
보다 바람직한 실시형태에서, C2c1p 는 알리사이클로바실러스 액시도테레스트리스 (Alicyclobacillus acidoterrestris) (예를 들어, ATCC 49025), 알리사이클로바실러스 콘타미난스 (Alicyclobacillus contaminans) (예를 들어, DSM 17975), 알리사이클로바실러스 마크로스포란지두스 (Alicyclobacillus macrosporangiidus) (예를 들어, DSM 17980), 바실러스 히사시 (Bacillus hisashii) 균주 C4, 칸디다투스 린도우박테리아 박테리움 (Candidatus Lindowbacteria bacterium) RIFCSPLOWO2, 데술포비브리오 이노피나투스 (Desulfovibrio inopinatus) (예를 들어, DSM 10711), 데술포나트로눔 티오디스무탄스 (Desulfonatronum thiodismutans) (예를 들어, 균주 MLF-1), 엘루시마이크로비아 박테리움 (Elusimicrobia bacterium) RIFOXYA12, 옴니트로피카 WOR_2 박테리움 (Omnitrophica WOR_2 bacterium) RIFCSPHIGHO2, 오피투타세 박테리움 (Opitutaceae bacterium) TAV5, 피시스페레 박테리움 (Phycisphaerae bacterium) ST-NAGAB-D1, 플랑크토마이세테스 박테리움 (Planctomycetes bacterium) RBG_13_46_10, 스피로카에테스 박테리움 (Spirochaetes bacterium) GWB1_27_13, 베루코마이크로비아세 박테리움 (Verrucomicrobiaceae bacterium) UBA2429, 투베리바실러스 칼리두스 (Tuberibacillus calidus) (예를 들어, DSM 17572), 바실러스 써모아밀로보란스 (Bacillus thermoamylovorans) (예를 들어, 균주 B4166), 브레비바실러스 sp. (Brevibacillus sp.) CF112, 바실러스 sp. (Bacillus sp.) NSP2.1, 데술파티랍디움 부티라티보란스 (Desulfatirhabdium butyrativorans) (예를 들어, DSM 18734), 알리사이클로바실러스 허바리우스 (Alicyclobacillus herbarius) (예를 들어, DSM 13609), 시트로박터 프레운디 (Citrobacter freundii) (예를 들어, ATCC 8090), 브레비바실러스 아그리 (Brevibacillus agri) (예를 들어, BAB-2500), 메틸로박테리움 노둘란스 (Methylobacterium nodulans) (예를 들어, ORS 2060) 에서 선택되는 박테리아 종에서 유래한다. 특정 실시형태에서, C2c1p 는 알리사이클로바실러스 액시도테레스트리스 (Alicyclobacillus acidoterrestris) (예를 들어, ATCC 49025), 알리사이클로바실러스 콘타미난스 (Alicyclobacillus contaminans) (예를 들어, DSM 17975) 에서 선택되는 박테리아 종에서 유래한다.
특정 실시형태에서, 본원에서 나타내는 바와 같은 C2c1 의 상동체 또는 오솔로그는 C2c1 과 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 85%, 보다 더 바람직하게는 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95% 의 서열 상동성 또는 동일성을 갖는다. 추가 실시형태에서, 본원에서 나타내는 바와 같은 C2c1 의 상동체 또는 오솔로그는 야생형 C2c1 과 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 85%, 보다 더 바람직하게는 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95% 의 서열 동일성을 갖는다. C2c1 이 하나 이상의 돌연변이를 갖는 경우 (돌연변이됨), 본원에서 나타내는 바와 같은 상기 C2c1 의 상동체 또는 오솔로그는 돌연변이된 C2c1 과 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 85%, 보다 더 바람직하게는 적어도 90%, 예를 들어, 적어도 95% 의 서열 동일성을 갖는다.
한 실시형태에서, C2c1 단백질은 알리사이클로바실러스 (Alicyclobacillus), 데술포비브리오 (Desulfovibrio), 데술포나트로눔 (Desulfonatronum), 오피투타세 (Opitutaceae), 투베리바실러스 (Tuberibacillus), 바실러스 (Bacillus), 브레비바실러스 (Brevibacillus), 칸디다투스 (Candidatus), 데술파티랍디움 (Desulfatirhabdium), 엘루시마이크로비아 (Elusimicrobia), 시트로박터 (Citrobacter), 메틸로박테리움 (Methylobacterium), 옴니트로피카이 (Omnitrophicai), 피시스페레 (Phycisphaerae), 플랑크토마이세테스 (Planctomycetes), 스피로카에테스 (Spirochaetes), 및 베루코마이크로비아세 (Verrucomicrobiaceae) 를 포함하나 이에 제한되지 않는 속의 유기체의 오솔로그일 수 있고; 특정 실시형태에서, 유형 V Cas 단백질은 알리사이클로바실러스 액시도테레스트리스 (Alicyclobacillus acidoterrestris) (예를 들어, ATCC 49025), 알리사이클로바실러스 콘타미난스 (Alicyclobacillus contaminans) (예를 들어, DSM 17975), 알리사이클로바실러스 마크로스포란지두스 (Alicyclobacillus macrosporangiidus) (예를 들어, DSM 17980), 바실러스 히사시 (Bacillus hisashii) 균주 C4, 칸디다투스 린도우박테리아 박테리움 (Candidatus Lindowbacteria bacterium) RIFCSPLOWO2, 데술포비브리오 이노피나투스 (Desulfovibrio inopinatus) (예를 들어, DSM 10711), 데술포나트로눔 티오디스무탄스 (Desulfonatronum thiodismutans) (예를 들어, 균주 MLF-1), 엘루시마이크로비아 박테리움 (Elusimicrobia bacterium) RIFOXYA12, 옴니트로피카 WOR_2 박테리움 (Omnitrophica WOR_2 bacterium) RIFCSPHIGHO2, 오피투타세 박테리움 (Opitutaceae bacterium) TAV5, 피시스페레 박테리움 (Phycisphaerae bacterium) ST-NAGAB-D1, 플랑크토마이세테스 박테리움 (Planctomycetes bacterium) RBG_13_46_10, 스피로카에테스 박테리움 (Spirochaetes bacterium) GWB1_27_13, 베루코마이크로비아세 박테리움 (Verrucomicrobiaceae bacterium) UBA2429, 투베리바실러스 칼리두스 (Tuberibacillus calidus) (예를 들어, DSM 17572), 바실러스 써모아밀로보란스 (Bacillus thermoamylovorans) (예를 들어, 균주 B4166), 브레비바실러스 sp. (Brevibacillus sp.) CF112, 바실러스 sp. (Bacillus sp.) NSP2.1, 데술파티랍디움 부티라티보란스 (Desulfatirhabdium butyrativorans) (예를 들어, DSM 18734), 알리사이클로바실러스 허바리우스 (Alicyclobacillus herbarius) (예를 들어, DSM 13609), 시트로박터 프레운디 (Citrobacter freundii) (예를 들어, ATCC 8090), 브레비바실러스 아그리 (Brevibacillus agri) (예를 들어, BAB-2500), 메틸로박테리움 노둘란스 (Methylobacterium nodulans) (예를 들어, ORS 2060) 를 포함하나 이에 제한되지 않는 종의 유기체의 오솔로그일 수 있다. 특정 실시형태에서, 본원에서 나타내는 바와 같은 C2c1 의 상동체 또는 오솔로그는 본원에 개시된 C2c1 서열 중 하나 이상과 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 85%, 보다 더 바람직하게는 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95% 의 서열 상동성 또는 동일성을 갖는다. 추가 실시형태에서, 본원에서 나타내는 바와 같은 C2c1 의 상동체 또는 오솔로그는 야생형 AacC2c1 또는 BthC2c1 과 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 85%, 보다 더 바람직하게는 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95% 의 서열 동일성을 갖는다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 C2c1 단백질은 AacC2c1 또는 BthC2c1 과 적어도 60%, 보다 특히 적어도 70%, 예컨대 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 85%, 보다 더 바람직하게는 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95% 의 서열 상동성 또는 동일성을 갖는다. 추가 실시형태에서, 본원에서 나타내는 바와 같은 C2c1 단백질은 야생형 AacC2c1 과 적어도 60%, 예컨대 적어도 70%, 보다 특히 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 85%, 보다 더 바람직하게는 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95% 의 서열 동일성을 갖는다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 C2c1 단백질은 AacC2c1 과 60% 미만의 서열 동일성을 갖는다. 당업자는 이것이 C2c1 단백질의 절두 형태를 포함하고, 이에 의해 절두 형태의 길이에 대해 서열 동일성이 결정된다는 것을 이해할 것이다.
RNA-가이드 C2c1 의 프로그램 가능성, 특이성 및 부수적 활성은 또한 핵산의 비특이적 절단을 위한 이상적인 전환가능 뉴클레아제를 가능하게 한다. 한 실시형태에서, C2c1 시스템은 RNA 의 부수적인 비특이적 절단을 제공하고 이용하도록 조작된다. 또 다른 실시형태에서, C2c1 시스템은 ssDNA 의 부수적인 비특이적 절단을 제공하고 이용하도록 조작된다. 따라서, 조작된 C2c1 시스템은 핵산 검출 및 전사체 조작, 및 세포 사멸 유도를 위한 플랫폼을 제공한다. C2c1 은 포유동물 전사물 녹다운 및 결합 도구로서 사용하기 위해 개발된다. C2c1 은 서열 특이적 표적화된 DNA 결합에 의해 활성화될 때 RNA 및 ssDNA 의 강건한 부수적인 절단을 가능하게 한다.
한 실시형태에서, C2c1 시스템은 비정상 DNA 서열의 존재에 의해 구별될 수 있는 세포의 서브세트에서 RNA 를 비-특이적으로 절단하도록, 예를 들어 비정상 DNA 의 절단이 불완전하거나 비효과적일 수 있도록 조작된다. 하나의 비-제한적인 예에서, 암 세포에 존재하고 세포 형질전환을 유도하는 DNA 전좌가 표적화된다. 염색체 DNA 를 거치고 복구되는 세포의 소집단이 생존할 수 있는 반면, 비특이적인 부수적 리보뉴클레아제 활성은 유리하게는 잠재적 생존자의 세포 사멸을 초래한다.
부수적인 활성은 많은 임상 진단에 유용한 SHERLOCK 으로 불리는 매우 민감하고 특이적인 핵산 검출 플랫폼에 최근 활용되었다 (Gootenberg, J. S. et al. Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2. Science 356, 438-442 (2017)).
본 발명에 따르면, 조작된 C2c1 시스템은 DNA 또는 RNA 엔도뉴클레아제 활성에 최적화되어 있으며 포유동물 세포에서 발현될 수 있고 세포에서 리포터 분자 또는 전사체를 효과적으로 녹다운시키는 것을 목표로 한다.
가이드 서열
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "가이드 서열", "crRNA", "가이드 RNA" 또는 "단일 가이드 RNA" 또는 "gRNA" 는 표적 핵산 서열과 하이브리드화하고 표적 핵산 서열에 대한 가이드 서열 및 CRISPR 이펙터 단백질을 포함하는 RNA-표적화 복합체의 서열-특이적 결합을 유도하는 표적 핵산 서열과 충분한 상보성을 갖는 임의의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 일부 예시적 실시형태에서, 적합한 정렬 알고리즘을 이용하여 최적으로 정렬될 때 상보성 정도는 약 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97.5%, 99% 이상이다. 최적의 정렬은 서열을 정렬하기에 적합한 임의의 알고리즘의 사용으로 결정될 수 있으며, 그의 비제한적인 예는 스미스-워터만 (Smith-Waterman) 알고리즘, 니들만-분쉬 (Needleman-Wunsch) 알고리즘, 버로우즈-휠러 트랜스폼 (Burrows-Wheeler Transform) 에 기초한 알고리즘 (예를 들어, 버로우즈 휠러 얼라이너 (Burrows Wheeler Aligner)), ClustalW, Clustal X, BLAT, Novoalign (Novocraft Technologies: www.novocraft.com 에서 이용가능함), ELAND (Illumina, San Diego, CA), SOAP (soap.genomics.org.cn 에서 이용가능) 및 Maq (maq.sourceforge.net 에서 이용가능) 를 포함한다. 표적 핵산 서열에 대한 핵산-표적화 복합체의 서열-특이적 결합을 유도하는 (핵산-표적화 가이드 RNA 내의) 가이드 서열의 능력은 임의의 적합한 어세이에 의해 평가될 수 있다. 예를 들어, 시험될 가이드 서열을 비롯한 핵산-표적화 복합체를 형성하는 데 충분한 핵산-표적화 CRISPR 시스템의 성분은 상응하는 표적 핵산 서열을 갖는 숙주 세포에, 예컨대, 핵산-표적화 복합체 성분을 인코딩하는 벡터에 의한 트랜스펙션, 이후 표적 핵산 서열 내의 우선적인 표적화 (예를 들어, 절단) 평가에 의해, 예컨대, 본원에서 기재된 바와 같은 Surveyor 어세이에 의해 제공될 수 있다. 유사하게는, 표적 핵산 서열의 절단은 시험될 가이드 서열 및 시험 가이드 서열과 상이한 대조군 가이드 서열을 비롯한, 핵산-표적화 복합체 성분인 표적 핵산 서열을 제공함으로써, 그리고 시험 가이드 서열과 대조군 가이드 서열 반응 사이의 표적 서열에서 결합 또는 절단 비율을 비교함으로써 시험 튜브에서 평가될 수 있다. 다른 어세이가 가능하며, 당업자에게 떠오를 것이다. 임의의 표적 핵산 서열을 표적화하기 위해 가이드 서열, 및 그에 따른 핵산-표적화 가이드가 선택될 수 있다. 표적 서열은 DNA 일 수 있다. 표적 서열은 임의의 RNA 서열일 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적 서열은 메신저 RNA (mRNA), 프리 (pre)-mRNA, 리보솜 RNA (rRNA), 전달 RNA (tRNA), 마이크로-RNA (miRNA), 소형 간섭 RNA (siRNA), 소형 핵 RNA (snRNA), 소형 인 RNA (snoRNA), 이중 가닥 RNA (dsRNA), 비-코딩 RNA (ncRNA), 긴 비-코딩 RNA (lncRNA), 및 소형 세포질 RNA (scRNA) 로 이루어진 군으로부터 선택되는 RNA 분자 내 서열일 수 있다. 일부 바람직한 실시형태에서, 표적 서열은 mRNA, 프리-mRNA, 및 rRNA 로 이루어진 군으로부터 선택되는 RNA 분자 내 서열일 수 있다. 일부 바람직한 실시형태에서, 표적 서열은 ncRNA, 및 lncRNA 로 이루어진 군으로부터 선택되는 RNA 분자 내 서열일 수 있다. 일부 보다 바람직한 실시형태에서, 표적 서열은 mRNA 분자 또는 프리-mRNA 분자 내 서열일 수 있다.
일부 실시형태에서, 핵산-표적화 가이드는 핵산-표적화 가이드 내에서 2차 구조 정도를 감소시키도록 선택된다. 일부 실시형태에서, 최적으로 폴딩될 때 핵산-표적화 가이드의 뉴클레오티드의 약 75%, 50%, 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 1% 이하가 자기-상보성 염기 짝짓기에 참여한다. 최적의 폴딩은 임의의 적합한 폴리뉴클레오티드 폴딩 알고리즘에 의해 결정될 수 있다. 일부 프로그램은 깁스 (Gibbs) 자유 에너지의 계산을 기반으로 한다. 한 가지 이러한 알고리즘의 예는 Zuker 및 Stiegler (Nucleic Acids Res. 9 (1981), 133-148) 가 기술한 바와 같은 mFold 이다. 또 다른 예의 폴딩 알고리즘은 중심 구조 예측 알고리즘을 사용하여, 비엔나 대학의 이론 화학 연구소 (Institute for Theoretical Chemistry at the University of Vienna) 에서 개발한 온라인 웹서버 RNAfold 이다 (예를 들어, [A.R. Gruber et al., 2008, Cell 106(1): 23-24]; 및 [PA Carr and GM Church, 2009, Nature Biotechnology 27(12): 1151-62] 참조).
특정 실시형태에서, 가이드 RNA 또는 crRNA 는 직접 반복 (DR) 서열 및 가이드 서열 또는 스페이서 서열을 포함할 수 있거나, 그로 본질적으로 이루어질 수 있거나, 그로 이루어진다. 특정 실시형태에서, 가이드 RNA 또는 crRNA 는 가이드 서열 또는 스페이서 서열에 융합되거나 연결된 직접 반복 서열을 포함할 수 있거나, 본질적으로 그로 이루어질 수 있거나, 그로 이루어질 수 있다. 특정 실시형태에서, 직접 반복 서열은 가이드 서열 또는 스페이서 서열의 상류 (즉, 5') 에 위치될 수 있다. 다른 실시형태에서, 직접 반복 서열은 가이드 서열 또는 스페이서 서열의 하류 (즉, 3') 에 위치될 수 있다.
특정 실시형태에서, crRNA 는 스템 루프, 바람직하게 단일 스템 루프를 포함한다. 특정 실시형태에서, 직접 반복 서열은 스템 루프, 바람직하게 단일 스템 루프를 형성한다.
특정 실시형태에서, 가이드 RNA 의 스페이서 길이는 15 내지 35 nt 이다. 특정 실시형태에서, 가이드 RNA 의 스페이서 길이는 적어도 15 개 뉴클레오티드이다. 특정 실시형태에서, 스페이서 길이는 15 내지 17 nt, 예를 들어, 15, 16 또는 17 nt, 17 내지 20 nt, 예를 들어, 17, 18, 19 또는 20 nt, 20 내지 24 nt, 예를 들어, 20, 21, 22, 23 또는 24 nt, 23 내지 25 nt, 예를 들어, 23, 24 또는 25 nt, 24 내지 27 nt, 예를 들어, 24, 25, 26 또는 27 nt, 27-30 nt, 예를 들어, 27, 28, 29 또는 30 nt, 30-35 nt, 예를 들어, 30, 31, 32, 33, 34 또는 35 nt, 또는 35 nt 이상이다.
일반적으로, CRISPR-Cas, CRISPR-Cas9 또는 CRISPR 시스템은 앞서 언급한 문헌, 예컨대 WO 2014/093622 (PCT/US2013/074667) 에서 사용되는 바와 같을 수 있고, Cas 유전자, CRISPR-Cas9 의 경우 특히 Cas9 유전자를 인코딩하는 서열, tracr (전사-활성화 CRISPR) 서열 (예를 들어, tracrRNA 또는 활성 부분 tracrRNA), tracr-메이트 서열 ("직접 반복부" 및 내인성 CRISPR 시스템과 관련하여 tracrRNA-가공 부분적 직접 반복부를 포함), 가이드 서열 (또한 내인성 CRISPR 시스템과 관련하여 "스페이서" 로서 지칭됨), 또는 본원에서 사용되는 바와 같은 용어인 "RNA(들)" (예를 들어, 가이드 Cas9 에 대한 RNA(들), 예를 들어, CRISPR RNA 및 전사 활성화 (tracr) RNA 또는 단일 가이드 RNA (sgRNA) (키메라 RNA)), 또는 CRISPR 유전자좌로부터의 다른 서열 및 전사체를 비롯하여, CRISPR-연관 ("Cas") 유전자의 발현에 연루되거나 또는 이들 유전자의 활성을 유도하는 전사체 및 다른 요소를 총괄적으로 지칭한다. 일반적으로, CRISPR 시스템은 표적 서열 (내인성 CRISPR 시스템의 경우 프로토스페이서라고도 함) 의 부위에서 CRISPR 복합체의 형성을 촉진하는 요소를 특징으로 한다. CRISPR 복합체의 형성 상황에서, "표적 서열" 은 가이드 서열이 상보성을 갖도록 디자인되는 서열을 의미하고, 여기서 표적 서열과 가이드 서열 간 하이브리드화는 CRISPR 복합체의 형성을 촉진한다. 표적 서열에 대한 상보성이 절단 활성에 중요한 가이드 서열의 섹션은 본 명세서에서 시드 (seed) 서열로서 지칭된다. 표적 서열은 임의의 폴리뉴클레오티드, 예컨대 DNA 또는 RNA 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적 서열은 세포의 핵 또는 세포질에 위치되고, 미토콘드리아, 세포기관, 소수포, 리포좀 또는 세포 내에 존재하는 입자에서의 또는 이들로부터의 핵산을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 특히 비-핵 용도를 위해, NLS 는 바람직하지 않다. 일부 실시형태에서, CRISPR 시스템은 하나 이상의 핵 유출 신호 (NES) 를 포함한다. 일부 실시형태에서, CRISPR 시스템은 하나 이상의 NLS 및 하나 이상의 NES 를 포함한다. 일부 실시형태에서, 하기 기준 중 임의의 것 또는 모두를 충족시키는 반복 모티프를 탐색함으로써, 직접 반복부가 가상 환경에서 (in silico) 식별될 수 있다: 1. 유형 II CRISPR 유전자좌에 측접하는 게놈 서열의 2Kb 윈도우에서 발견됨; 2. 20 내지 50 bp 범위임; 및 3. 20 내지 50 bp 간격을 둠. 일부 실시형태에서, 이들 기준 중 2 가지, 예를 들어 1 과 2, 2 와 3, 또는 1 과 3 이 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 3 가지 기준 모두가 사용될 수 있다.
본 발명의 실시형태에서, 용어 가이드 서열 및 가이드 RNA, 즉, 표적 게놈 유전자좌에 Cas 를 유도할 수 있는 RNA 는 앞서 언급한 인용된 문헌, 예컨대 WO 2014/093622 (PCT/US2013/074667) 에서와 같이 상호교환가능하게 사용된다. 일반적으로, 가이드 서열은 표적 서열과 하이브리드화하기 위해 표적 폴리뉴클레오티드 서열과 충분한 상보성 및 표적 서열에 대한 CRISPR 복합체의 직접 서열-특이적 결합을 갖는 임의의 폴리뉴클레오티드 서열이다. 일부 실시형태에서, 적합한 정렬 알고리즘을 사용해 최적으로 정렬시, 가이드 서열과 이의 상응하는 표적 서열 사이의 상보성 정도는 약 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97.5%, 99% 이상이다. 최적의 정렬은 서열을 정렬하기에 적합한 임의의 알고리즘의 사용으로 결정될 수 있으며, 그의 비제한적인 예는 스미스-워터만 (Smith-Waterman) 알고리즘, 니들만-분쉬 (Needleman-Wunsch) 알고리즘, 버로우즈-휠러 트랜스폼 (Burrows-Wheeler Transform) 에 기초한 알고리즘 (예를 들어, 버로우즈 휠러 얼라이너 (Burrows Wheeler Aligner)), ClustalW, Clustal X, BLAT, Novoalign (Novocraft Technologies: www.novocraft.com 에서 이용가능함), ELAND (Illumina, San Diego, CA), SOAP (soap.genomics.org.cn 에서 이용가능) 및 Maq (maq.sourceforge.net 에서 이용가능) 를 포함한다. 일부 실시형태에서, 가이드 서열은 약 about 5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 75 개 이상의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시형태에서, 가이드 서열은 약 75, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 12 개 이하의 뉴클레오티드 길이이다. 바람직하게는, 가이드 서열은 10 내지 30 개 뉴클레오티드 길이이다. 표적 서열에 대한 CRISPR 복합체의 서열-특이적 결합을 유도하는 가이드 서열의 능력은 임의의 적합한 어세이를 통해 평가될 수 있다. 예를 들어, 시험될 가이드 서열을 비롯한 핵산-표적화 복합체를 형성하는 데 충분한 CRISPR 시스템의 성분은 상응하는 표적 핵산 서열을 갖는 숙주 세포에, 예컨대, CRISPR 서열의 성분을 인코딩하는 벡터에 의한 트랜스펙션, 이후 표적 서열 내의 우선적인 절단의 평가에 의해, 예컨대, 본원에서 기재된 바와 같은 Surveyor 어세이에 의해 제공될 수 있다. 유사하게는, 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 절단은 시험될 가이드 서열 및 시험 가이드 서열과 상이한 대조군 가이드 서열을 비롯한 CRISPR 복합체 성분인 표적 서열을 제공함으로써, 그리고 시험 가이드 서열 반응과 대조군 가이드 서열 반응 사이에 표적 서열에서의 결합 또는 절단율을 비교함으로써, 시험 튜브에서 평가될 수 있다.
CRISPR-Cas 시스템의 일부 실시형태에서, 가이드 서열과 이에 상응하는 표적 서열 사이의 상보성 정도는 약 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97.5%, 99%, 또는 100% 이상일 수 있고; 가이드 또는 RNA 또는 sgRNA 는 약 5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 75 개 이상의 뉴클레오티드 길이일 수 있거나; 가이드 또는 RNA 또는 sgRNA 는 약 75, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 12 개 이하의 뉴클레오티드 길이일 수 있고; 유리하게는 tracr RNA 는 30 또는 50 개 뉴클레오티드 길이이다. 그러나, 본 발명의 양상은 오프-표적 상호작용을 감소시키는 것이고, 예를 들어 낮은 상보성을 갖는 표적 서열과 상호작용하는 가이드를 감소시키는 것이다. 실제로, 예에서, 80% 내지 약 95% 상보성, 예를 들어, 83%-84% 또는 88-89% 또는 94-95% 초과의 상보성을 갖는 오프-표적 서열과 표적 서열을 구별할 수 있는 CRISPR-Cas 시스템을 생성시키는 돌연변이를 포함한다는 것을 보여준다 (예를 들어, 18 개 뉴클레오티드를 갖는 표적과 1, 2 또는 3 개 미스매치를 갖는 18 개 뉴클레오티드의 오프-표적을 구별함). 따라서, 본 발명의 상황에서, 가이드 서열과 이의 상응하는 표적 서열 사이의 상보성 정도는 94.5% 또는 95% 또는 95.5% 또는 96% 또는 96.5% 또는 97% 또는 97.5% 또는 98% 또는 98.5% 또는 99% 또는 99.5% 또는 99.9%, 또는 100% 초과이다. 오프 표적은 서열과 가이드 사이에, 100% 또는 99.9% 또는 99.5% 또는 99% 또는 99% 또는 98.5% 또는 98% 또는 97.5% 또는 97% 또는 96.5% 또는 96% 또는 95.5% 또는 95% 또는 94.5% 또는 94% 또는 93% 또는 92% 또는 91% 또는 90% 또는 89% 또는 88% 또는 87% 또는 86% 또는 85% 또는 84% 또는 83% 또는 82% 또는 81% 또는 80% 미만의 상보성이며, 오프 타겟이 서열과 가이드 사이에, 100% 또는 99.9% 또는 99.5% 또는 99% 또는 99% 또는 98.5% 또는 98% 또는 97.5% 또는 97% 또는 96.5% 또는 96% 또는 95.5% 또는 95% 또는 94.5% 의 상보성인 것이 유리하다.
가이드 변형
특정 실시형태에서, 본 발명의 가이드는 비-자연 발생 핵산 및/또는 비-자연 발생 뉴클레오티드 및/또는 뉴클레오티드 유사체, 및/또는 화학적 변형을 포함한다. 비-자연 발생 핵산을 예를 들어, 자연 발생 뉴클레오티드 및 비-자연 발생 뉴클레오티드의 혼합물을 포함할 수 있다. 비-자연 발생 뉴클레오티드 및/또는 뉴클레오티드 유사체는 리보오스, 포스페이트, 및/또는 염기 모이어티에서 변형될 수 있다. 본 발명의 한 실시형태에서, 가이드 핵산은 리보뉴클레오티드 및 비-리보뉴클레오티드를 포함한다. 하나의 이러한 실시형태에서, 가이드는 하나 이상의 리보뉴클레오티드 및 하나 이상의 데옥시리보뉴클레오티드를 포함한다. 본 발명의 한 실시형태에서, 가이드는 하나 이상의 비-자연 발생 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체, 예컨대 포스포로티오에이트 결합, 보라노포스페이트 결합이 있는 뉴클레오티드, 리보오스 고리의 2' 및 4' 탄소 사이에 메틸렌 브릿지를 포함하는 잠금 핵산 (LNA) 뉴클레오티드, 또는 브릿징된 핵산 (BNA) 을 포함한다. 변형된 뉴클레오티드의 다른 예는 2'-O-메틸 유사체, 2'-데옥시 유사체, 2-티오유리딘 유사체, N6-메틸아데노신 유사체, 또는 2'-플루오로 유사체를 포함한다. 변형된 염기의 추가 예는 2-아미노푸린, 5-브로모-우리딘, 슈도우리딘 (Ψ), N1-메틸슈도우리딘 (me1Ψ), 5-메톡시우리딘 (5moU), 이노신, 7-메틸구아노신을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 가이드 RNA 화학적 변형의 예는 하나 이상의 말단 뉴클레오티드에서 2'-O-메틸 (M), 2'-O-메틸-3'-포스포로티오에이트 (MS), 포스포로티오에이트 (PS), S-제약 (constrained) 에틸 (cEt), 또는 2'-O-메틸-3'-티오PACE (MSP) 의 혼입을 포함하지만 이것으로 제한되지 않는다. 이러한 화학적으로 변형된 가이드는, 투입표적 대 오프-표적 특이성이 예측가능하지 않다고 해도, 비변형 가이드에 비해 증가된 안정성 및 증가된 활성을 포함할 수 있다. (Hendel, 2015, Nat Biotechnol. 33(9):985-9, doi: 10.1038/nbt.3290, 2015 년 6 월 29 일에 온라인 출간; Ragdarm et al., 0215, PNAS, E7110-E7111; Allerson et al., J. Med. Chem. 2005, 48:901-904; Bramsen et al., Front. Genet., 2012, 3:154; Deng et al., PNAS, 2015, 112:11870-11875; Sharma et al., MedChemComm., 2014, 5:1454-1471; Hendel et al., Nat. Biotechnol. (2015) 33(9): 985-989; Li et al., Nature Biomedical Engineering, 2017, 1, 0066 DOI:10.1038/s41551-017-0066 참조). 일부 실시형태에서, 가이드 RNA의 5' 및/또는 3' 말단은 형광 염료, 폴리에틸렌 글리콜, 콜레스테롤, 단백질 또는 검출 표지를 비롯한, 다양한 기능적 모이어티에 의해 변형된다. (Kelly et al., 2016, J. Biotech. 233:74-83 참조). 특정 실시형태에서, 가이드는 표적 DNA 에 결합하는 영역 내에 리보뉴클레오티드 및 Cas9, Cpf1, 또는 C2c1 에 결합하는 영역 내에 하나 이상의 데옥시리보뉴클레오티드 및/또는 뉴클레오티드 유사체를 포함한다. 본 발명의 한 실시형태에서, 데옥시리보뉴클레오티드 및/또는 뉴클레오티드 유사체는 조작된 가이드 구조, 예컨대, 제한 없이 5' 및/또는 3' 말단, 스템-루프 영역, 및 시드 영역에 혼입된다. 특정 실시형태에서, 변형은 스템-루프 영역의 5'-핸들에 있지 않다. 가이드의 스템-루프 영역의 5'-핸들에서의 화학적 변형은 그 기능을 소멸시킬 수 있다 (Li, et al., Nature Biomedical Engineering, 2017, 1:0066 참조). 특정 실시형태에서, 가이드의 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50 또는 75 개 뉴클레오티드가 화학적으로 변형된다. 일부 실시형태에서, 가이드의 3 '또는 5' 말단에서 3-5 개 뉴클레오티드가 화학적으로 변형된다. 일부 실시형태에서, 2'-F 변형과 같은 작은 변형만이 시드 영역에 도입된다. 일부 실시형태에서, 2'-F 변형은 가이드의 3 '말단에 도입된다. 특정 실시형태에서, 가이드의 5' 및/또는 3' 말단에 3 내지 5 개의 뉴클레오티드가 2'-O-메틸 (M), 2'-O-메틸-3'-포스포로티오에이트 (MS), S-제약 에틸(cEt), 또는 2'-O-메틸-3'-티오PACE (MSP) 로 화학적으로 변형된다. 이러한 변형은 게놈 편집 효율을 향상시킬 수 있다 (Hendel et al., Nat. Biotechnol. (2015) 33(9): 985-989 참조). 특정 실시형태에서, 가이드의 포스포디에스테르 결합 모두는 유전자 붕괴 수준을 향상시키기 위해 포스포로티오에이트 (PS) 로 치환된다. 특정 실시형태에서, 가이드의 5' 및/또는 3' 말단에서 5 개 초과의 뉴클레오티드는 2'-O-Me, 2'-F 또는 S-제약 에틸 (cEt) 로 화학적으로 변형된다. 이러한 화학적으로 변형된 가이드는 향상된 유전자 붕괴 수준을 매개할 수 있다 (Ragdarm et al., 0215, PNAS, E7110-E7111 참조). 본 발명의 한 실시형태에서, 가이드는 그의 3' 및/또는 5' 말단에서 화학적 모이어티를 포함하도록 변형된다. 이러한 모이어티는 아민, 아지드, 알킨, 티오, 디벤조시클로옥틴 (DBCO), 또는 로다민을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 특정 실시형태에서, 화학적 모이어티는 링커, 예컨대 알킬 사슬에 의해 가이드에 접합된다. 특정 실시형태에서, 변형된 가이드의 화학적 모이어티는 다른 분자, 예컨대 DNA, RNA, 단백질 또는 나노입자에 가이드를 부착시키는데 사용될 수 있다. 이러한 화학적으로 변형된 가이드는 CRISPR 시스템에 의해 유전자 편집된 세포를 식별하거나 농축시키는데 사용될 수 있다 (Lee et al., eLife, 2017, 6:e25312, DOI:10.7554 참조).
특정 실시형태에서, 본원에서 제공되는 바와 같은 CRISPR 시스템은 가이드 서열을 포함하는 crRNA 또는 유사한 폴리뉴클레오티드를 사용할 수 있고, 여기서 폴리뉴클레오티드는 RNA, DNA 또는 RNA 및 DNA 의 혼합물이고/이거나, 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 뉴클레오티드 유사체를 포함한다. 서열은 벌지 (bulge), 헤어핀 또는 스템 루프 구조와 같은 천연 crRNA 의 구조를 비제한적으로 포함하는 임의의 구조를 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 가이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드는 RNA 또는 DNA 서열일 수 있는 제 2 폴리 뉴클레오티드 서열과 듀플렉스를 형성한다.
특정 실시형태에서, 화학적으로 변형된 가이드 RNA 가 사용된다. 가이드 RNA 화학 변형의 예로는, 이로 제한되지는 않지만, 하나 이상의 말단 뉴클레오티드에서 2'-O-메틸 (M), 2'-O-메틸 3'포스포로티오에이트 (MS), 또는 2'-O-메틸 3'티오PACE (MSP) 의 혼입을 포함한다. 이러한 화학적으로 변형된 가이드 RNA 는, 투입표적 대 오프-표적 특이성이 예측가능하지 않다고 해도, 비변형 가이드 RNA 에 비해 증가된 안정성 및 증가된 활성을 포함할 수 있다. (Hendel, 2015, Nat Biotechnol. 33(9):985-9, doi: 10.1038/nbt.3290 (2015 년 6 월 29 일 온라인 출간) 참조). 화학적으로 변형된 가이드 RNA 는 포스포로티오에이트 결합 및 리보오스 고리의 2' 및 4' 탄소 사이에 메틸렌 브릿지를 포함하는 잠금 핵산 (LNA) 뉴클레오티드를 갖는 RNA 를 추가로 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.
일부 실시형태에서, 가이드 서열은 약 5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 75 개 이상의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시형태에서, 가이드 서열은 약 75, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 12 개 이하의 뉴클레오티드 길이이다. 바람직하게, 가이드 서열은 10 내지 30 개 뉴클레오티드 길이이다. 표적 서열에 대한 CRISPR 복합체의 서열-특이적 결합을 유도하는 가이드 서열의 능력은 임의의 적합한 어세이를 통해 평가될 수 있다. 예를 들어, 시험될 가이드 서열을 비롯한 CRISPR 복합체를 형성하는데 충분한 CRISPR 시스템의 성분은 상응하는 표적 서열을 갖는 숙주 세포에, 예컨대 CRISPR 서열의 성분을 인코딩하는 벡터에 의한 트랜스펙션, 이후 표적 서열 내의 우선적인 절단의 평가에 의해, 예컨대 Surveyor 어세이에 의해 제공될 수 있다. 유사하게는, 표적 RNA 의 절단은 시험될 가이드 서열 및 시험 가이드 서열과 상이한 대조군 가이드 서열을 비롯한 CRISPR 복합체 성분인 표적 서열을 제공함으로써, 그리고 시험 가이드 서열 반응과 대조군 가이드 서열 반응 사이에 표적 서열에서의 결합 또는 절단율을 비교함으로써, 시험 튜브에서 평가될 수 있다. 다른 어세이가 가능하고, 당업자에게 존재할 수 있다.
일부 실시형태에서, 가이드에 대한 변형은 화학적 변형, 삽입, 결실 또는 분할이다. 일부 실시형태에서, 화학적 변형은 2'-O-메틸 (M) 유사체, 2'-데옥시 유사체, 2-티오우리딘 유사체, N6-메틸아데노신 유사체, 2'-플루오로 유사체, 2-아미노푸린, 5-브로모-우리딘, 슈도우리딘 (Ψ), N1-메틸슈도우리딘 (me1Ψ), 5-메톡시우리딘(5moU), 이노신, 7-메틸구아노신, 2'-O-메틸-3'-포스포로티오에이트 (MS), S-제약 에틸 (cEt), 포스포로티오에이트 (PS), 또는 2'-O-메틸-3'-티오PACE (MSP) 의 혼입을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시형태에서, 가이드는 포스포로티오에이트 변형 중 하나 이상을 포함한다. 특정 실시형태에서, 가이드의 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 25 개 뉴클레오티드가 화학적으로 변형된다. 특정 실시형태에서, 시드 영역에서 하나 이상의 뉴클레오티드가 화학적으로 변형된다. 특정 실시형태에서, 3'-말단에서 하나 이상의 뉴클레오티드가 화학적으로 변형된다. 특정 실시형태에서, 5'-핸들에서 어떠한 뉴클레오티드 서열도 화학적으로 변형되지 않는다. 일부 실시형태에서, 시드 영역에서의 화학적 변형은 작은 변형, 예컨대, 2'-플루오로 유사체의 혼입이다. 구체적 실시형태에서, 시드 영역의 하나의 뉴클레오티드는 2'-플루오로 유사체로 대체된다. 일부 실시형태에서, 3'-말단에서 5 또는 10 개 뉴클레오티드가 화학적으로 변형된다. Cpf1 CrRNA 의 3'-말단에서의 이러한 화학적 변형은 유전자 절단 효율을 개선시킨다 (Li, et al., Nature Biomedical Engineering, 2017, 1:0066 참조). 구체적 실시형태에서, 3’-말단 내의 5 개 뉴클레오티드는 2'-플루오로 유사체로 대체된다. 구체적 실시형태에서, 3’-말단 내의 10 개 뉴클레오티드는 2'-플루오로 유사체로 대체된다. 구체적 실시형태에서, 3’-말단 내의 5 개 뉴클레오티드는 2'-O-메틸 (M) 유사체로 대체된다.
일부 실시형태에서, 가이드의 5'-핸들의 루프가 변형된다. 일부 실시형태에서, 가이드의 5'-핸들의 루프는 결실, 삽입, 분할 또는 화학적 변형을 갖도록 변형된다. 특정 실시형태에서, 루프는 3, 4 또는 5 개 뉴클레오티드를 포함한다. 특정 실시형태에서, 루프는 UCUU, UUUU, UAUU, 또는 UGUU 의 서열을 포함한다.
가이드 서열, 및 그로 인한 핵산-표적화 가이드 RNA 는 임의의 표적 핵산 서열을 표적화하기 위해 선택될 수 있다. CRISPR 복합체의 형성 상황에서, "표적 서열"은 가이드 서열이 상보성을 갖도록 디자인되는 서열을 의미하고, 여기서 표적 서열과 가이드 서열 사이의 하이브리드화는 CRISPR 복합체의 형성을 촉진한다. 표적 서열은 RNA 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 용어 "표적 RNA" 는 표적 서열이거나 그를 포함하는 RNA 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 달리 말해서, 표적 RNA 는 gRNA, 즉 가이드 서열의 일부분이 상보성을 갖도록 디자인되고 CRISPR 이펙터 단백질 및 gRNA 를 포함하는 복합체에 의해 매개되는 이펙터 기능이 유도되게 하는 RNA 폴리뉴클레오티드 또는 RNA 폴리뉴클레오티드의 일부분일 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적 서열은 세포의 핵 또는 세포질에 위치된다. 표적 서열은 DNA 일 수 있다. 표적 서열은 임의의 RNA 서열일 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적 서열은 메신저 RNA (mRNA), 프리 (pre)-mRNA, 리보솜 RNA (rRNA), 전달 RNA (tRNA), 마이크로-RNA (miRNA), 소형 간섭 RNA (siRNA), 소형 핵 RNA (snRNA), 소형 인 RNA (snoRNA), 이중 가닥 RNA (dsRNA), 비-코딩 RNA (ncRNA), 긴 비-코딩 RNA (lncRNA), 및 소형 세포질 RNA (scRNA) 로 이루어진 군으로부터 선택되는 RNA 분자 내 서열일 수 있다. 일부 바람직한 실시형태에서, 표적 서열은 mRNA, 프리-mRNA, 및 rRNA 로 이루어진 군으로부터 선택되는 RNA 분자 내 서열일 수 있다. 일부 바람직한 실시형태에서, 표적 서열은 ncRNA, 및 lncRNA 로 이루어진 군으로부터 선택되는 RNA 분자 내 서열일 수 있다. 일부 보다 바람직한 실시형태에서, 표적 서열은 mRNA 분자 또는 프리-mRNA 분자 내 서열일 수 있다.
특정 실시형태에서, 가이드 RNA 의 스페이서 길이는 28 개 미만의 뉴클레오티드이다. 특정 실시형태에서, 가이드 RNA 의 스페이서 길이는 적어도 18 개 뉴클레오티드 및 28 개 미만의 뉴클레오티드이다. 특정 실시형태에서, 가이드 RNA 의 스페이서 길이는 19 내지 28 개 뉴클레오티드이다. 특정 실시형태에서, 가이드 RNA 의 스페이서 길이는 19 내지 25 개 뉴클레오티드이다. 특정 실시형태에서, 가이드 RNA 의 스페이서 길이는 20 개 뉴클레오티드이다. 특정 실시형태에서, 가이드 RNA 의 스페이서 길이는 23 개 뉴클레오티드이다. 특정 실시형태에서, 가이드 RNA 의 스페이서 길이는 25 개 뉴클레오티드이다.
특정 실시형태에서, 절단 효율의 조절은 스페이서/표적을 따라 미스매치의 위치를 포함하여, 스페이서 서열 및 표적 서열 간에 미스매치, 예를 들어 하나 이상의 미스매치, 예컨대 1 또는 2 개 미스매치의 도입에 의해 활용될 수 있다. 예를 들어 보다 중심 (즉, 3' 또는 5' 가 아님) 에 이중 미스매치가 존재할수록, 절단 효율이 보다 영향받는다. 따라서, 스페이서를 따라서 미스매치 위치를 선택함으로써, 절단 효율이 조절될 수 있다. 예로서, 표적의 100% 미만의 절단이 바람직하면 (예를 들어, 세포 개체군에서), 스페이서 및 표적 서열 간에 하나 이상, 예컨대 바람직하게는 2 개 미스매치가 스페이서 서열에 도입될 수 있다. 미스매치 위치의 스페이서를 따라서 보다 중심일수록, 절단 백분율은 더 낮다.
특정 예시적 실시형태에서, 절단 효율은 단일 뉴클레오티드, 예컨대 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP), 변이, 또는 (점) 돌연변이가 다른 둘 이상의 표적을 구별할 수 있는 단일 가이드를 디자인하기 위해 활용될 수 있다. CRISPR 이펙터는 SNP (또는 다른 단일 뉴클레오티드 변이) 에 대한 감도를 감소시킬 수 있고 일정한 수준의 효율로 SNP 표적을 계속 절단할 수 있다. 따라서, 2 개 표적, 또는 표적 세트의 경우에, 가이드 RNA 는 표적 중 하나와 상보적인 뉴클레오티드 서열, 즉 투입표적 SNP 를 갖도록 디자인될 수 있다. 가이드 RNA 는 합성 미스매치를 갖도록 더욱 디자인된다. 본원에서 사용되는 바와 같은 "합성 미스매치" 는 자연 발생 SNP 의 상류 또는 하류에 도입되는 비-자연 발생 미스매치, 예컨대 상류 또는 하류에 도입되는 5 개 이하의 뉴클레오티드, 예를 들어 상류 또는 하류에 도입되는 4, 3, 2, 또는 1 개의 뉴클레오티드, 바람직하게는 상류 또는 하류에 도입되는 3 개 이하의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 상류 또는 하류에 도입되는 2 개 이하의 뉴클레오티드, 가장 바람직하게는 상류 또는 하류에 도입되는 1 개 뉴클레오티드 (즉, SNP 에 인접) 를 의미한다. CRISPR 이펙터가 온-표적 SNP 에 결합할 때, 오직 단일 미스매치가 합성 미스매치와 함께 형성될 것이고, CRISPR 이펙터는 계속 활성화될 것이며 검출가능한 신호가 생성될 것이다. 가이드 RNA 가 오프-표적 SNP 와 하이브리드화될 때, SNP 로부터의 미스매치 및 합성 미스매치의, 2 개 미스매치가 형성될 것이고, 검출가능한 신호는 발생되지 않을 것이다. 따라서, 본원에 개시된 시스템은 개체군 내에서 SNP 를 구별하도록 디자인될 것이다. 예를 들어, 시스템은 단일 SNP 가 상이한 병원성 균주를 구별하거나 또는 일정한 질환 특이적 SNP, 예컨대 비제한적으로, 질환 연관된 SNP, 예컨대 비제한적으로, 암 연관된 SNP 를 검출하는데 사용될 수 있다.
특정 실시형태에서, 가이드 RNA 는 SNP 가 스페이서 서열의 (5' 말단에서 시작하여) 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30 에 위치되도록 디자인된다. 특정 실시형태에서, 가이드 RNA 는 SNP 가 스페이서 서열의 (5' 말단에서 시작하여) 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 9 에 위치되도록 디자인된다. 특정 실시형태에서, 가이드 RNA 는 SNP 가 스페이서 서열의 (5' 말단에서 시작하여) 위치 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7 에 위치되도록 디자인된다. 특정 실시형태에서, 가이드 RNA 는 SNP 가 스페이서 서열의 (5' 말단에서 시작하여) 위치 3, 4, 5, 또는 6 에 위치되도록 디자인된다. 특정 실시형태에서, 가이드 RNA 는 SNP 가 스페이서 서열의 (5' 말단에서 시작하여) 위치 3 에 위치되도록 디자인된다.
특정 실시형태에서, 가이드 RNA 는 미스매치 (예를 들어, 합성 미스매치, 즉 SNP 이외의 추가 돌연변이) 가 스페이서 서열의 (5' 말단에서 시작하여) 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 250, 26, 27, 28, 29, 또는 30 에 위치되도록 디자인된다. 특정 실시형태에서, 가이드 RNA 는 미스매치가 스페이서 서열의 (5' 말단에서 시작하여) 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 9 에 위치되도록 디자인된다. 특정 실시형태에서, 가이드 RNA 는 미스매치가 스페이서 서열의 (5' 말단에서 시작하여) 위치 4, 5, 6, 또는 7 에 위치되도록 디자인된다. 특정 실시형태에서, 가이드 RNA 는 미스매치가 스페이서 서열의 (5' 말단에서 시작하여) 위치 5 에 위치하도록 디자인된다.
특정 실시형태에서, 가이드 RNA 는 미스매치가 SNP 의 상류 2 개 뉴클레오티드 (즉, 하나의 개재 뉴클레오티드) 에 위치되도록 디자인된다.
특정 실시형태에서, 가이드 RNA 는 미스매치가 SNP 의 하류 2 개 뉴클레오티드 (즉, 하나의 개재 뉴클레오티드) 에 위치되도록 디자인된다.
특정 실시형태에서, 가이드 RNA 는 미스매치가 스페이서 서열의 (5' 말단에서 시작하여) 위치 5 에 위치되도록, 그리고 SNP 가 스페이서 서열의 (5' 말단에서 시작하여) 위치 3 에 위치되도록 디자인된다.
본원에서 기재된 실시형태는 본원에서 토의된 바와 같이 벡터를 세포에 전달하는 단계를 포함하는 본원에 토의된 바와 같은 진핵생물 세포 (시험관내, 즉 단리된 진핵생물 세포) 에서 하나 이상의 뉴클레오티드 변형을 유도하는 것을 이해한다. 돌연변이(들) 는 가이드(들) RNA(들) 를 통해서 세포(들) 의 각 표적 서열에서 하나 이상의 뉴클레오티드의 도입, 결실 또는 치환을 포함할 수 있다. 돌연변이는 가이드(들) RNA(들) 를 통해서 상기 세포(들) 의 각 표적 서열에서 1-75 개 뉴클레오티드의 도입, 결실 또는 치환을 포함할 수 있다. 돌연변이는 가이드(들) RNA(들) 를 통해서 상기 세포(들) 의 각 표적 서열에서 1, 5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 또는 75 개 뉴클레오티드의 도입, 결실 또는 치환을 포함할 수 있다. 돌연변이는 가이드(들) RNA(들) 를 통해서 상기 세포(들) 의 각 표적 서열에서 5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 또는 75 개 뉴클레오티드의 도입, 결실 또는 치환을 포함할 수 있다. 돌연변이는 가이드(들) RNA(들) 를 통해서 상기 세포(들) 의 각 표적 서열에 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 또는 75 개 뉴클레오티드의 도입, 결실 또는 치환을 포함한다. 돌연변이는 가이드(들) RNA(들) 를 통해서 상기 세포(들) 의 각 표적 서열에 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 또는 75 개 뉴클레오티드의 도입, 결실 또는 치환을 포함할 수 있다. 돌연변이는 가이드(들) RNA(들) 를 통해서 상기 세포(들) 의 각 표적 서열에 40, 45, 50, 75, 100, 200, 300, 400 또는 500 개 뉴클레오티드의 도입, 결실 또는 치환을 포함할 수 있다.
전형적으로, 내인성 CRISPR 시스템의 상황에서, CRISPR 복합체 (표적 서열과 하이브리드화하고 하나 이상의 Cas 단백질과 복합체를 형성하는 가이드 서열 포함) 의 형성은 그 결과로 표적 서열 내 또는 그 근처 (예를 들어, 표적 서열로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 50 개 이상의 염기쌍 이내) 에서 절단을 일으키지만, 특히 RNA 표적의 경우에, 예를 들어 2차 구조에 의존적일 수 있다.
신호 증폭 CRISPR 이펙터 단백질
특정 예시적 실시형태에서, 신호 증폭 CRISPR 이펙터 단백질은 유형 III-A CRISPR-Cas 시스템 이펙터 단백질이다. 특정 예시적 실시형태에서, 유형 III-A CRISPR-Cas 이펙터 단백질은 Csm6 이다. Csm6 은 다중단백질 Csm 이펙터 복합체와 함께 기능하지만, 그 복합체의 일부는 아니다 (예를 들어, US20170198286 A1; WO2016035044A1; [M. Kazlauskiene et al., Science 10.1126/science.aao0100 (2017)]; 및 [Niewoehner et al. 2017, bioRxiv 프리프린트가 2017 년 6 월 23 일에 최초로 포스팅됨; doi: dx.doi.org/10.1101/153262] 참조).
스타필로코커스 에피더미스 (Staphylococcus epidermidis) 에서, Csm 복합체 (SeCsm) 는 Cas10, Csm2, Csm3, Csm4, 및 Csm5 단백질로 구성된다. 유형 III-A CRISPR-Cas 시스템은 스트렙토코커스 써모필러스 (Streptococcus thermophilus) (St) 에 대한 Csm 복합체를 사용하여 시험관내 및 세포 둘 모두에서 RNA 절단 활성을 갖는다는 것이 입증되었다 (예를 들어, US20170198286 A1 참조).
유형 III-A CRISPR-Cas 시스템은 스트렙토코커스 써모필러스 (Streptococcus thermophilus) (GenBank KM222358), DGCC7710 (GenBank AWVZ01000003), LMD-9 (GenBank NC008532), 스타필로코커스 에피더미스 (Staphylococcus epidermidis) RP62a (GenBank NC002976), 엔테로코커스 이탈리커스 (Enterococcus italicus) DSM15952 (GenBank AEPV01000074), 락토코커스 락티스 (Lactococcus lactis) DGCC7167 (GenBank JX524189) 및 술폴로버스 솔파타리커스 (Sulfolobus solfataricus) P2 (GenBank AE006641) 을 포함한다. DGCC8004 의 유형 III-A 시스템은 CRISPR2 어레이에 측접된 10 개 Cas 유전자를 함유하고, cast, cas2, cas6, cas10, csm2, csm3, csm4, csm5, csm6 and csm6' 유전자를 포함한다. DGCC8004 CRISPR2 유전자좌는 DGCC7710 (GenBank AWVZ00000000, (Horvath and Barrangou, 2010)) 및 LMD-9 (GenBank NC_008532, (Makarova et al., 2006)) 의 것과 유사한 유전자 배열을 공유한다. 주요한 차이는 DGCC8004 의 추가 csm6' 유전자이다. DGCC8004 의 Csm6' 단백질은 386 aa 를 포함하고 428 aa Csm6 단백질과 34% 아미노산 동일성을 보여, 서열 분기 이후 가능한 고대 유전자 복제 사건을 시사한다. 대조적으로, DGCC7710 은 csm6 의 전방에 오직 짧은 117-nt ORF 만을 함유한다. DGCC8004 의 CRISPR2 와 연관된 Cas/Csm 단백질은 DGCC7710 및 LMD-9 의 상응하는 단백질과 상동성 (~70% 동일성을 공유하는, Csm2 단백질을 제외하고, 90% 초과의 aa 동일성) 이다. S. 에피더미스 (S. epidermidis) RP62a (GenBank NC002976, (Marraffini and Sontheimer, 2008)), 엔테로코커스 이탈리커스 (Enterococcus italicus) DSM15952 (GenBank AEPV01000074, (Millen et al., 2012)) 및 락토코커스 락티스 (Lactococcus lactis) DGCC7167 (GenBank JX524189, (Millen et al., 2012)) 을 포함하여, 다른 실험적으로 특징규명된 유형 III-A 시스템은 DGCC8004 와 cas10-csm2-csm3-csm4-csm5-csm6 유전자 클러스터의 보존된 배열을 공유하는 반면, cas6 및 cast/cas2 유전자의 위치는 일부 균주에서 상이하다. S. 솔파타리커스 (S. solfataricus) P2 (GenBank AE006641) 의 유형 III-A CRISPR-Cas 유전자좌는 상이한 유전자 구성을 가지며 DGCC8004 의 Cas/Csm 오솔로그와 낮은 단백질 서열 유사성을 보인다. 주목할만하게, Csm3 단백질은 상이한 균주에 걸쳐 Cas/Csm 단백질 간에 가장 보존되며 5 카피의 Csm3 파라로그가 S. 솔파타리커스 (S. solfataricus) 에 존재한다. S. 에피더미스 (S. epidermidis), E. 이탈리커스 (E. italicus) 및 L. 락티스 (L. lactis) 의 반복 서열은 동일한 길이 (36 nt) 이지만, 뉴클레오티드 보존은 반복부의 3' 말단 및 팔린드롬 부분에 국한된다. crRNA 5'-핸들에 기여할 수 있는, 반복부의 8 nt 3'-말단 서열은 S. 써모필러스 (S. thermophilus), S. 에피더미스 (S. epidermidis), E. 이탈리커스 (E. italicus) 및 L. 락티스 (L. lactis) 간에 ACGRRAAC 공통부를 보이지만 S. 솔파타리커스 (S. solfataricus) 와는 상이하다 (AUUGAAG (Rouillon et al., 2013)).
Csm6 은 ssRNA-특이적 엔도리보뉴클레아제인 것으로 확인되었고 이러한 활성의 구조적 기초가 결정되었다 (Niewoehner and Jinek, 2016, Structural basis for the endoribonuclease activity of the type III-A CRISPR-associated protein Csm6. RNA 22:318-329).
일부 실시형태에서, 본 발명의 핵산-표적화 시스템의 하나 이상의 요소는 내인성 CRISPR RNA-표적화 시스템을 포함하는 특정 유기체로부터 유래된다. 특정 실시형태에서, CRISPR RNA-표적화 시스템은 Csm6 단백질, Csm6 오솔로그, 또는 Csm6-유사 단백질을 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, Csm6 의 논의는 또한 Csm6 단백질, Csm6 오솔로그, 또는 Csm6-유사 단백질을 의미한다. Csm6 오솔로그는 본원에서 기재되고 당분야에 공지된 바와 같은 유기체에서 발견될 수 있다 (예를 들어, WO2016035044A1 및 Niewoehner and Jinek, 2016 참조). 예시적인 Csm6 오솔로그는 T. 써모필러스 (T. thermophilus) (TtCsm6, GI:55978335), S. 에피더미스 (S. epidermidis) (SeCsm6, GI:488416649), S. 뮤탄스 (S. mutans) (SmCsm6, GI:24379650), S. 써모필러스 (S. thermophiles) (StCsm6, GI:585230687), 및 P. 푸리오서스 (P. furiosus) Csx1 (PfCsx1, GI:33359545) 를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 특정 실시형태에서, 본 발명에 유용한 Csm6 단백질은 적어도 하나의 N-말단 CARF (CRISPR-associated Rossman fold) 도메인 및 적어도 하나의 C-말단 HEPN 도메인 (higher eukaryotes and prokaryotes nucleotide-binding domain) 을 포함한다. 특정 실시형태에서, Csm6 단백질은 이량체를 형성한다. 특정 실시형태에서, HEPN 도메인의 이량체화는 리보뉴클레아제 활성 부위의 형성을 야기시킨다. 특정 실시형태에서, CARF 도메인의 이량체 계면은 양전기 포켓을 포함한다. 이론에 국한되지 않지만, 포켓은 리보뉴클레아제 활성의 알로스테릭 제어를 위한 리간드-결합 부위로서 기능할 수 있다.
특정 예시적 실시형태에서, 본원에 기재된 CRISPR-기반 검출 시스템은 본원에 기재된 HEPN 도메인, 당분야에 공지 (Niewoehner and Jinek, 2016) 된 HEPN 도메인, 및 공통 서열 모티프와 비교에 의해 HEPN 도메인으로 인식되는 도메인을 비제한적으로 포함하여, 적어도 하나의 HEPN 도메인을 포함하는 Csm6 단백질을 포함한다. 몇몇 이러한 도메인이 본원에서 제공된다. 비제한적인 한 예에서, 공통 서열은 본원에서 제공되는 C2c2 또는 Cas13b 오솔로그의 서열로부터 유래될 수 있다. 특정 예시적 실시형태에서, Csm6 단백질은 단일 HEPN 도메인을 포함한다. 특정 기타 예시적 실시형태에서, Csm6 단백질은 2 개의 HEPN 도메인을 포함한다.
한 예시적 실시형태에서, Csm6 단백질은 RxxxxH 모티프 서열을 포함하는 하나 이상의 HEPN 도메인을 포함한다. RxxxxH 모티프 서열은 비제한적으로, 본원에 기재된 HEPN 도메인 또는 당분야에 공지된 HEPN 도메인 유래일 수 있다. RxxxxH 모티프 서열은 둘 이상의 HEPN 도메인을 조합하여 생성된 모티프 서열을 더 포함한다. 언급된 바와 같이, 공통 서열은 본원에서 개시된 오솔로그의 서열로부터 유래될 수 있다. 특정 실시형태에서, HEPN 도메인은 보존된 R-X4-6-H 모티프를 포함한다 (Anantharaman et al., Biol Direct. 2013 Jun 15; 8:15; and Kim et al., Proteins. 2013 Feb; 81(2):261-70).
본 발명의 한 실시형태에서, HEPN 도메인은 R{N/H/K}X1X2X3H 의 서열을 포함하는 적어도 하나의 RxxxxH 모티프를 포함한다. 본 발명의 한 실시형태에서, HEPN 도메인은 R{N/H}X1X2X3H 의 서열을 포함하는 RxxxxH 모티프를 포함한다. 본 발명의 한 실시형태에서, HEPN 도메인은 R{N/K}X1X2X3H 의 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, X1 은 R, S, D, E, Q, N, G, Y, 또는 H 이다. 특정 실시형태에서, X2 는 I, S, T, V, 또는 L 이다. 특정 실시형태에서, X3 은 L, F, N, Y, V, I, S, D, E, 또는 A 이다.
CARF 도메인 및 CARF 도메인에 대한 공통 서열이 기재된 바 있다 (예를 들어, Makarova et al., Front Genet. 2014; 5: 102 참조). 특정 실시형태에서, Csm6 은 β-헤어핀을 형성하는 코어 가닥-5 및 가닥-6 을 갖는 6-가닥 로스만 (Rossmann)-유사 폴드를 포함하는 코어 도메인을 포함하는 적어도 하나의 CARF 도메인을 포함한다. 주요한 서열 보존 영역은 코어 도메인의 가닥-1 및 가닥-4 와 연관된다. 특정 실시형태에서, 가닥-1 의 말단은 전형적으로 알콜 측쇄 (S/T) 를 갖는, 극성 잔기를 특징으로 한다. 특정 실시형태에서, 가닥-4 의 바로 하류는 바람직하게는 [DN]X[ST]XXX[RK] 서명 (SEQ ID NO:430) 과 연관된, 고도로 보존된 염기성 잔기 (K/R) 이다. 특정 실시형태에서, Csm6 은 절두되어서 N-말단 CARF 도메인 (예를 들어, TtCsm6 의 아미노산 1-190 또는 오솔로그 Csm6 단백질의 균등한 잔기) 이 제거된다.
특정 실시형태에서, Csm6 은 적어도 하나의 6H 도메인을 포함한다 (Niewoehner and Jinek, 2016). TtCsm6 폴리펩티드 사슬의 6H 도메인 (잔기 191-292) 은 5 개 α-헬릭스로 이루어지고 시계-방향 솔레노이드 도메인을 형성한다. 이론에 국한되지 않지만, 일부 오솔로그는 6H 도메인을 갖지 않을 수 있으므로, 이러한 도메인은 본 발명의 Csm6 단백질의 활성에 요구되지 않는다.
Csm6 은 침략자 RNA 전사물을 분해하는 독립형 리보뉴클레아제로서 기능하여 간섭에 기여하는 것으로 확인되었다. Csm6 단백질은 유형 III 간섭 복합체에 의해 생성되는 제 2 메신저를 통해 활성화된다. 유형 III 간섭 복합체에 의한 표적 RNA 결합 시에, Cas10 서브유닛은 ATP 를 시클릭 올리고아데닐레이트 생성물로 전환시키고, 이의 CARF 도메인에 결합하여 Csm6 을 알로스테릭하게 활성화시킨다. 알로스테릭 활성화를 제거한 CARF 도메인 돌연변이는 생체내에서 Csm6 활성, 및 Csm6 의 Cas10 Palm 도메인 표현형 모사 (phenocopy) 상실의 돌연변이를 억제한다 (M. Kazlauskiene et al., 2017; 및 Niewoehner et al. 2017).
특정 예시적 실시형태에서, 신호 증폭 CRISPR 이펙터 단백질은 활성화된 CRISPR 검출 단백질이 활성화 서열을 절단시킬 때 활성화된다. 활성화 서열은 하기에 더욱 구체적으로 상술된다. 활성화 서열의 절단 생성물은 신호 증폭 CRISPR 이펙터 단백질의 별개 활성, 예컨대 RNA 뉴클레아제 활성을 활성화시킨다. 예를 들어, Csm6 은 활성화되면, Cas13 효소의 부수적인 효과와 무차별적으로 유사하게 RNA 를 절단한다. 따라서, 리포터 구성체의 검출 이펙터 변형 이외에도, 활성화된 신호 증폭 CRISPR 이펙터 단백질은 또한 신호 발생을 더 증강시키기 위해 리포터 구성체를 변형시킨다. 특정 실시형태에서, Csm6 은 다른 CRISPR 효소 (예를 들어, Cas13) 와 함께 제공될 때 활성화된다. 특정 실시형태에서, Csm6 은 Cas13 과 함께 사용될 때 상승 효과를 생성시킬 수 있어서, Cas13 부수적 활성이 크게 증가된다. 이론에 국한되지 않지만, Cas13 의 농도는 Csm6 가 또한 어세이 (예를 들어, 현장 진단 어세이 (point of care assay)) 에 포함될 때 어세이에서 크게 감소될 수 있다. 따라서, Cas13 진단 어세이에 Csm6 첨가는 어세이의 감도를 증가시키고 비용을 감소시키기 위해 사용될 수 있다.
특정 예시적 실시형태에서, 하나 이상의 신호 증폭 이펙터 단백질은 표 6 에서 선택된다.
표 6
CRISPR 이펙터는 종종 활성을 조절하기 위해 추가적인 성분과 상호작용하고, 유형 VI-B CRISPR 시스템은 종종 간섭-조절 단백질 Csx27 및 Csx28 을 보유하며, Csx28 동시-발현은 Cas13b 단백질의 생체내 간섭 활성을 증가시키는 것으로 입증되었다. 특정 실시형태에서, 하나 이상의 신호 증폭 CRISPR 이펙터 단백질은 Csx28 또는 Csx27 을 포함한다.
표적의 증폭
특정 예시적 실시형태에서, 표적 RNA 및/또는 DNA 는 CRISPR 이펙터 단백질을 활성화시키기 전에 증폭될 수 있다. 임의의 적합한 RNA 또는 DNA 증폭 기술이 사용될 수 있다. 특정 예시적 실시형태에서, RNA 또는 DNA 증폭은 등온 증폭이다. 특정 예시적 실시형태에서, 등온 증폭은 핵산 서열-기반 증폭 (NASBA), 리콤비나아제 폴리머라아제 증폭 (RPA), 루프-매개 등온 증폭 (LAMP), 가닥 전위 증폭 (SDA), 헬리카아제-의존적 증폭 (HDA), 또는 닉킹 효소 증폭 반응 (NEAR) 일 수 있다. 특정 예시적 실시형태에서, 비-등온 증폭 방법은 PCR, 다중 전위 증폭 (MDA), 롤링 써클 증폭 (RCA), 리가아제 연쇄 반응 (LCR), 또는 세분화 증폭 방법 (RAM) 을 비제한적으로 포함하는 것이 사용될 수 있다.
특정 예시적 실시형태에서, RNA 또는 DNA 증폭은 RNA/DNA 듀플렉스를 형성하기 위해 서열-특이적 역방향 프라이머에 의한 표적 RNA 의 역전사에 의해 개시되는 핵산 서열-기반 증폭 NASBA 이다. 그 다음으로 RNase H 는 RNA 주형을 분해하는데 사용되어서, 프로모터, 예컨대 T7 프로모터를 함유하는 전방향 프라이머가 결합되어 상보성 가닥의 연장을 개시할 수 있고, 이중-가닥 DNA 생성물이 생성된다. DNA 주형의 RNA 폴리머라아제 프로모터-매개 전사가 표적 RNA 서열의 카피를 생성시킨다. 중요한 것은, 신규 표적 RNA 각각이 가이드 RNA 에 의해 검출될 수 있고 그리하여 어세이의 감도를 더 증강시킬 수 있다는 것이다. 그런 다음, 가이드 RNA 에 의한 표적 RNA 의 결합이 CRISPR 이펙터 단백질의 활성화를 야기시키고 방법은 상기 약술된 대로 진행된다. NASBA 반응은 예를 들어 대략 41℃ 의 중간 등온 조건 하에서 진행될 수 있다는 추가의 장점을 가져서, 임상 실험실로부터 멀리 떨어진 현장에서 조기 및 직접 검출을 위해 배치된 시스템 및 장치에 적합하다.
특정 기타 예시적 실시형태에서, 리콤비나아제 폴리머라아제 증폭 (RPA) 반응은 표적 핵산을 증폭시키는데 사용될 수 있다. RPA 반응은 듀플렉스 DNA 의 상동성 서열과 서열-특이적 프라이머의 쌍을 형성할 수 있는 리콤비나아제를 이용한다. 표적 DNA 가 존재하면, DNA 증폭이 개시되고 다른 샘플 조작 예컨대 열 사이클 또는 화학적 용융이 필요하지 않다. 전체 RPA 증폭 시스템은 건조된 제제로서 안정하고 냉동 없이 안전하게 수송될 수 있다. RPA 반응은 또한 37-42℃ 의 최적 반응 온도로 등온 온도에서 실행될 수 있다. 서열 특이적 프라이머는 검출할 표적 핵산 서열을 포함하는 서열이 증폭되도록 디자인된다. 특정 예시적 실시형태에서, RNA 폴리머라아제 프로모터, 예컨대 T7 프로모터는 프라이머 중 하나에 첨가된다. 그 결과로 표적 서열 및 RNA 폴리머라아제 프로모터를 포함하는 증폭된 이중-가닥 DNA 생성물이 얻어진다. RPA 반응 이후, 또는 그 동안, RNA 폴리머라아제가 첨가되어 이중-가닥 DNA 주형으로부터 RNA 를 생성시키게 될 것이다. 이어서, 증폭된 표적 RNA 가 그 다음으로 CRISPR 이펙터 시스템에 의해 검출될 수 있다. 이러한 방식으로 표적 DNA 는 본원에 개시된 실시형태를 사용하여 검출될 수 있다. RPA 반응은 또한 표적 RNA 를 증폭시키는데 사용될 수 있다. 표적 RNA 는 먼저 역전사효소를 사용해 cDNA 로 전환되고, 그 다음으로 제 2 가닥 DNA 합성이 후속되며, 이 시점에 RPA 반응은 상기 약술된 대로 진행된다.
따라서 특정 예시적 실시형태에서, 본원에 개시된 시스템은 증폭 시약을 포함할 수 있다. 핵산의 증폭에 유용한 상이한 성분 또는 시약은 본원에 기재되어 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 증폭 시약은 완충제, 예컨대 Tris 완충제를 포함할 수 있다. Tris 완충제는 예를 들어, 1 mM, 2 mM, 3 mM, 4 mM, 5 mM, 6 mM, 7 mM, 8 mM, 9 mM, 10 mM, 11 mM, 12 mM, 13 mM, 14 mM, 15 mM, 25 mM, 50 mM, 75 mM, 1 M 등의 농도를 포함하나 이에 제한되지 않는, 바람직한 적용 또는 용도에 적절한 임의의 농도에서 사용될 수 있다. 당업자는 완충제 예컨대 본 발명에서 사용을 위한 Tri s의 적절한 농도를 결정할 수 있을 것이다.
염, 예컨대 마그네슘 클로라이드 (MgCl2), 포타슘 클로라이드 (KCl), 또는 소듐 클로라이드 (NaCl) 가 핵산 단편의 증폭을 개선시키기 위해서, 증폭 반응, 예컨대 PCR 에 포함될 수 있다. 염 농도가 특정한 반응 및 적용분야에 의존적일 것이지만, 일부 실시형태에서, 특정한 크기의 핵산 단편은 특정한 염 농도에서 최적의 결과를 생성시킬 수 있다. 바람직한 결과를 생성시키기 위해서, 더 큰 생성물은 변경된 염 농도, 전형적으로 더 낮은 염을 요구할 수 있는 한편, 더 작은 생성물의 증폭은 더 높은 염 농도에서 보다 양호한 결과를 생성시킬 수 있다. 당업자는 염 농도의 변경과 함께, 염의 존재 및/또는 농도가 생물학적 또는 화학적 반응의 엄격도를 변경시킬 수 있고, 그러므로 본원에서 기재된 바와 같이 본 발명의 반응을 위해 적절한 조건을 제공하는 임의의 염을 사용할 수 있다는 것을 이해하게 될 것이다.
생물학적 또는 화학적 반응의 다른 성분은 세포 안의 물질의 분석을 위해 세포를 파쇄하거나 용해시키기 위해 세포 용해 성분을 포함할 수 있다. 세포 용해 성분은 세제, 상기 기재된 바와 같은 염, 예컨대 NaCl, KCl, 암모늄 술페이트 [(NH4)2SO4], 또는 다른 것들을 포함할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에 적절할 수 있는 세제는 Triton X-100, 소듐 도데실 술페이트 (SDS), CHAPS (3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판술포네이트), 에틸 트리메틸 암모늄 브로마이드, 노닐 페녹시폴리에톡실에탄올 (NP-40) 을 포함할 수 있다. 세제의 농도는 특정 적용분야에 의존적일 수 있고, 일부 경우에서 반응에 특이적일 수 있다. 증폭 반응은 예컨대 100 nM, 150 nM, 200 nM, 250 nM, 300 nM, 350 nM, 400 nM, 450 nM, 500 nM, 550 nM, 600 nM, 650 nM, 700 nM, 750 nM, 800 nM, 850 nM, 900 nM, 950 nM, 1 mM, 2 mM, 3 mM, 4 mM, 5 mM, 6 mM, 7 mM, 8 mM, 9 mM, 10 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM, 50 mM, 60 mM, 70 mM, 80 mM, 90 mM, 100 mM, 150 mM, 200 mM, 250 mM, 300 mM, 350 mM, 400 mM, 450 mM, 500 mM 등의 농도를 비제한적으로 포함하여, 본 발명에 적절한 임의 농도로 사용되는 dNTP 및 핵산 프라이머를 포함할 수 있다. 마찬가지로, 본 발명에 따라서 유용한 폴리머라아제는 Taq 폴리머라아제, Q5 폴리머라아제 등을 포함하는, 당분야에 공지되어 있고 본 발명에서 유용한 임의의 특이적이거나 또는 일반적인 폴리머라아제일 수 있다.
일부 실시형태에서, 본원에서 기재된 바와 같은 증폭 시약은 핫-스타트 증폭에서 사용하기에 적절할 수 있다. 핫 스타트 증폭은 어댑터 분자 또는 올리고의 이량체화를 감소시키거나 제거시키기 위해서, 또는 달리 원치않는 증폭 생성물 또는 인공물을 방지하고 바람직한 생성물의 최적 증폭을 수득하기 위해서 일부 실시형태에서 유리할 수 있다. 증폭에 사용하기 위한 본원에 기재된 많은 성분이 또한 핫-스타트 증폭에서 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 핫-스타트 증폭에서 사용하기에 적절한 시약 또는 성분은 적절하다면 조성물 성분 중 하나 이상 대신에 사용될 수 있다. 예를 들어, 폴리머라아제 또는 다른 시약은 특정한 온도 또는 다른 반응 조건에서 바람직한 활성을 나타내는 것이 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 시약은 핫-스타트 증폭에서 사용하기 위해 디자인되거나 최적화된 것을 사용할 수 있으며, 예를 들어, 폴리머라아제는 전위 이후 또는 특정한 온도에 도달 이후에 활성화될 수 있다. 이러한 폴리머라아제는 항체-기반 또는 압타머-기반일 수 있다. 본원에서 기재된 바와 같은 폴리머라아제는 당분야에 공지되어 있다. 이러한 시약의 예는 핫-스타트 폴리머라아제, 핫-스타트 dNTP, 및 광-케이징된 dNTP 를 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 이러한 시약은 공지되어 있고 당분야에서 입수가능하다. 당업자는 개별 시약에 적절하게 최적 온도를 결정할 수 있을 것이다.
핵산의 증폭은 특별한 열 사이클 기계 또는 장비를 사용하여 수행될 수 있고, 단일 반응으로 또는 대량으로 수행될 수 있어, 임의의 바람직한 횟수의 반응이 동시에 수행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 증폭은 미세유체 또는 로봇식 장치를 사용해 수행될 수 있거나, 바람직한 증폭을 달성하도록 온도의 수동 변경을 사용해 수행될 수도 있다. 일부 실시형태에서, 특정한 적용분야 또는 재료를 위한 최적 반응 조건을 수득하기 위해 최적화가 수행될 수 있다. 당업자는 충분한 증폭이 수득되도록 반응 조건을 이해하게 될 것이고 최적화시킬 수 있을 것이다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 방법 또는 시스템에 의한 DNA 의 검출은 검출 전에 (증폭된) DNA를 RNA 로 전사시키는 것을 필요로 한다.
검출가능한 양성 신호의 증진
특정 예시적 실시형태에서, 검출가능한 양성 신호를 더 증폭시키는 추가의 변형이 도입될 수 있다. 예를 들어, 활성화된 CRISPR 이펙터 단백질 부수적 활성화는 2차 표적 또는 추가적인 가이드 서열, 또는 돌 모두를 생성시키는데 사용될 수 있다. 한 예시적 실시형태에서, 반응 용액은 높은 농도에서 스파이크되는 2차 표적을 함유할 것이다. 2차 표적은 1차 표적 (즉, 어세이가 그를 검출하도록 디자인되는 표적) 과 구별될 수 있으며, 특정 경우에는 모든 반응 부피에 걸쳐 공통적일 수 있다. 2차 표적에 대한 2차 가이드 서열은 예를 들어 RNA 루프를 갖는 헤어핀과 같은 2차 구조적 특성에 의해 보호될 수 있으며, 2차 표적 또는 CRISPR 이펙터 단백질에 결합할 수 없다. 활성화된 CRISPR 이펙터 단백질에 의한 보호기의 절단 (즉, 용액 중 1차 표적(들) 과의 복합체 형성에 의한 활성화 후) 및 용액 중 자유 CRISPR 이펙터 단백질과의 복합체 형성 및 2차 표적에서의 스파이크된 것으로부터의 활성화가 있다. 특정 기타 예시적 실시형태에서, 유사한 개념이 2차 표적 및 보호된 2차 표적에 대한 자유 가이드 서열과 함께 사용된다. 2차 표적의 보호기 절단은 추가적인 CRISPR 이펙터 단백질, 가이드 서열, 2차 표적 서열이 형성되게 할 것이다. 또 다른 예시적 실시형태에서, 1차 표적(들) 에 의한 CRISPR 이펙터 단백질의 활성화는 보호된 또는 원형화된 프라이머를 절단하는데 사용될 수 있으며, 이어서 2차 가이드 서열, 2차 표적, 또는 둘 모두에 대한 주형에 대해, 본원에 개시된 것들과 같은 등온 증폭 반응이 수행되도록 방출될 것이다. 이러한 증폭된 주형의 후속 전사는 더 많은 2차 가이드 서열 및/또는 2차 표적 서열을 생성시켜, 이후 추가적인 CRISPR 이펙터 단백질 부수적 활성화를 생성시킬 것이다.
예시적 방법 및 어세이
어세이 플랫폼의 저비용 및 적응성은 그 자체로 (i) 일반적인 RNA/DNA 정량, (ii) 신속한, 복합 RNA/DNA 발현 검출, 및 (iii) 임상 및 환경적 샘플 둘 모두에서 표적 핵산, 펩티드의 민감한 검출을 포함하는 수많은 적용을 부여한다. 추가적으로, 본원에 개시된 시스템은 생물학적 환경, 예컨대 세포 내에서 전사물의 검출을 위해 개조될 수 있다. 본원에서 기재된 CRISPR 이펙터의 고도로 특이적인 성질을 고려하면, 살아있는 세포에서 전사물 또는 질환-연관 돌연변이의 대립유전자 특이적 발현을 추적하는 것이 가능할 수 있다.
특정 예시적 실시형태에서, 단일 표적에 특이적인 단일 가이드 서열이 개별 부피에 위치된다. 각 부피는 상이한 샘플 또는 동일한 샘플의 분취액을 수용할 수 있다. 특정 예시적 실시형태에서, 개별 표적에 대한 각각의 다수의 가이드 서열은 단일 웰에 위치될 수 있어서, 다수의 표적이 상이한 웰에서 스크리닝될 수 있다. 단일 부피에서 다수의 가이드 RNA 를 검출하기 위해서, 특정 예시적 실시형태에서, 상이한 특이성을 갖는 다수의 이펙터 단백질이 사용될 수 있다. 예를 들어, 상이한 서열 특이성을 갖는 상이한 오솔로그가 사용될 수 있다. 예를 들어, 하나의 오솔로그는 A 를 우선적으로 절단할 수 있는 한편, 다른 것은 C, G, U/T 를 우선적으로 절단할 수 있다. 따라서, 단일 뉴클레오티드의 전부이거나, 그의 실질적으로 일부분을 포함하는 차폐성 구성체는 각각 상이한 형광단을 갖는 것이 발생될 수 있어, 상이한 파장에서 검출될 수 있다. 이러한 방식으로, 최대 4 가지의 상이한 표적이 단일 개별 이산 부피에서 스크리닝될 수 있다. 특정 예시적 실시형태에서, 동일 부류의 CRISPR 이펙터 단백질로부터의 상이한 오솔로그, 예컨대 2 개의 Cas13a 오솔로그, 2 개의 Cas13b 오솔로그, 또는 2 개의 Cas13 오솔로그가 사용될 수 있다. 각종 Cas13 단백질의 뉴클레오티드 선호도를 도 67 에 나타낸다. 특정 기타 예시적 실시형태에서, 상이한 뉴클레오티드 편집 선호도를 갖는 상이한 오솔로그, 예컨대 Cas13a 및 Cas13b 오솔로그, 또는 Cas13a 및 Cas13c 오솔로그, 또는 Cas13b 오솔로그 및 Cas13c 오솔로그 등이 사용될 수 있다. 특정 예시적 실시형태에서, polyU 선호도를 갖는 Cas13 단백질 및 polyA 선호도를 갖는 Cas13b 단백질이 사용된다. 특정 예시적 실시형태에서, polyU 선호도를 갖는 Cas13b 단백질은 프레보텔라 인터메디아 (Prevotella intermedia) Cas13b 이고, polyA 선호도를 갖는 Cas13b 단백질은 프레보텔라 sp. (Prevotella sp.) MA2106 Cas13b 단백질이다. 특정 예시적 실시형태에서, polyU 선호도를 갖는 Cas13 단백질은 렙토트리키아 웨이데이 (Leptotrichia wadei) Cas13a 단백질이고, polyA 선호도를 갖는 Cas13 단백질은 프레보텔라 sp. (Prevotella sp.) MA2106 Cas13b 단백질이다.
본원에서 입증하는 바와 같이, CRISPR 이펙터 시스템은 표적 분자의 아토몰라 농도에 이르기까지 검출할 수 있다. 예를 들어, 도 13, 14, 19, 22 및 하기 기재된 실시예를 참조한다. 상기 시스템의 감도로 인해, 신속하고 민감한 검출이 요구되는 많은 적용분야가 본원에 개시된 실시형태로부터 이득을 얻을 수 있고, 본 발명의 범주 내에 속하는 것으로 간주된다. 예시적인 어세이 및 적용분야는 하기에 더욱 상세하게 기재된다.
미생물 적용분야
특정 예시적 실시형태에서, 본원에 개시된 시스템, 장치 및 방법은 샘플, 예컨대 대상체로부터 수득된 생물학적 샘플 중 하나 이상의 미생물원의 존재를 검출하는 것에 관한 것이다. 특정 예시적 실시형태에서, 미생물은 박테리아, 진균, 효모, 원충, 기생충, 또는 바이러스일 수 있다. 따라서, 본원에 개시된 방법은 미생물 종의 신속한 식별, 미생물 단백질 (항원), 항체, 항체 유전자의 존재의 모니터링, 일정 표현형 (예를 들어, 박테리아 내성) 의 검출, 질환 진행 및/또는 대발생의 모니터링, 및 항생제 스크리닝을 요구하는 다른 방법과 (또는 조합하여) 다른 방법에서 사용을 위해 적합화될 수 있다. 본원에 개시된 실시형태의 신속하고 민감한 진단 능력, 단일 뉴클레오티드 편차에 이르는, 미생물 종 유형의 검출, 및 POC 장치로서 배치되는 능력으로 인해, 본원에 개시된 실시형태는 가이드 치료 계획, 예컨대 적절한 항생제 또는 항바이러스제의 선택에 사용될 수 있다. 본원에 개시된 실시형태는 또한 미생물 오염의 존재에 대해 환경적 샘플 (공기, 물, 표면, 식품 등) 을 스크리닝하는데 사용될 수 있다.
미생물 종, 예컨대 박테리아, 바이러스, 진균, 효모 또는 기생충 종 등을 식별하는 방법을 개시한다. 본원에 개시된 특정 실시형태는 단일 샘플 내에서, 또는 다수 샘플에 걸쳐 미생물 종을 식별하고 구별하여, 많은 상이한 미생물의 인식을 가능하게 하는 방법 및 시스템을 기재한다. 본 발명은 샘플 중 표적 핵산 서열의 존재를 검출하여, 생물학적 또는 환경적 샘플 중에서 하나 이상의 유기체, 예를 들어, 박테리아, 바이러스, 효모, 원충, 및 진균 또는 이의 조합 중 2종 이상을 구별하고, 병원체의 검출을 가능하게 한다. 샘플로부터 수득된 양성 신호는 미생물의 존재를 의미한다. 다수 미생물은 하나를 초과하는 이펙터 단백질의 사용을 적용하여, 본 발명의 방법 및 시스템을 사용해 동시에 식별될 수 있고, 여기서 각각의 이펙터 단백질은 특이적 미생물 표적 서열을 표적으로 한다. 이러한 방식으로, 임의 수의 미생물을 한번에 검출할 수 있는 다층 분석을 특정한 대상체에 대해 수행할 수 있다. 일부 실시형태에서, 다수 미생물의 동시 검출은 하나 이상의 미생물 종을 식별할 수 있는 프로브의 세트를 사용하여 수행할 수 있다.
샘플의 멀티플렉스 분석은 샘플의 대규모 검출을 가능하게 하여 분석 시간 및 비용을 절감한다. 그러나, 멀티플렉스 분석은 종종 생물학적 샘플의 이용가능성에 의해 제한된다. 그러나 본 발명에 따라서, 멀티플렉스 분석의 대안은 다수 이펙터 단백질을 단일 샘플에 첨가할 수 있고 각각의 차폐성 구성체는 개별 소광제 염료와 조합할 수 있도록 수행될 수 있다. 이러한 경우, 양성 신호는 단일 샘플 중 복합 검출을 위해 개별적으로 각각의 소광제 염료로부터 수득될 수 있다.
본원에서는 샘플 중 하나 이상의 유기체의 둘 이상의 종을 구별하기 위한 방법이 개시된다. 이 방법은 또한 샘플 중 하나 이상의 유기체의 하나 이상의 종을 검출할 수 있게 한다.
미생물 검출
일부 실시형태에서, 샘플 중 미생물을 검출하기 위한 방법은 샘플 또는 샘플의 세트를 하나 이상의 개별 이산 부피에 분배하는 단계로서, 개별 이산 부피는 본원에 기재된 바와 같은 CRISPR 시스템을 포함하는 것인 단계; 하나 이상의 가이드 RNA 와 하나 이상의 미생물-특이적 표적의 결합을 허용하기 위해 충분한 조건 하에서 샘플 또는 샘플의 세트를 인큐베이션시키는 단계; 하나 이상의 가이드 RNA 와 하나 이상의 표적 분자의 결합을 통해서 CRISPR 이펙터 단백질을 활성화시키는 단계로서, CRISPR 이펙터 단백질의 활성화는 그 결과로 RNA-기반 차폐성 구성체의 변형을 야기하여 검출가능한 양성 신호가 발생되는 것인 단계; 및 검출가능한 양성 신호를 검출하는 단계로서, 검출가능한 양성 신호의 검출은 샘플 중 하나 이상의 표적 분자의 존재를 의미하는 것인 단계를 포함한다. 하나 이상의 표적 분자는 둘 이상의 미생물 종/균주를 서로 구별하는데 사용될 수 있는 표적 뉴클레오티드 티드 서열을 포함하는 mRNA, gDNA (코딩 또는 비-코딩), trRNA, 또는 RNA 일 수 있다. 가이드 RNA 는 표적 서열을 검출하도록 디자인될 수 있다. 본원에 개시된 실시형태는 또한 가이드 RNA 와 표적 RNA 서열 간 하이브리드화를 개선시키는 특정 단계들을 또한 이용할 수 있다. 리보핵산 하이브리드화를 향상시키는 방법은, 본원에 참조로 포함되는 발명의 명칭 "Enhanced Methods of Ribonucleic Acid Hybridization" 의 WO 2015/085194 에 개시되어 있다. 미생물-특이적 표적은 RNA 또는 DNA 또는 단백질일 수 있다. DNA 방법은 본원에 기재된 바와 같은 RNA 폴리머라아제 프로모터를 도입하는 DNA 프라이머의 사용을 더 포함할 수 있다. 표적이 단백질인 경우, 방법은 본원에 기재된 단백질 검출에 특이적인 단계 및 압타머를 이용하게 될 것이다.
단일 뉴클레오티드 변이체의 검출
일부 실시형태에서, 하나 이상의 식별된 표적 서열은 본원에 기재된 바와 같은 표적 서열에 특이적이고 그에 결합하는 가이드 RNA 를 사용해 검출될 수 있다. 본 발명의 시스템 및 방법은 상이한 미생물 종에 존재하는 단일 뉴클레오티드 다형성을 구별할 수 있고, 그러므로, 본 발명에 따른 다수 가이드 RNA 의 사용은 종 간 구별에 사용될 수 있는 표적 서열의 수를 더 확장시키거나 개선시킬 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 하나 이상의 가이드 RNA 는 종, 속, 과, 목, 강, 문, 계, 또는 표현형, 또는 이의 조합으로 미생물을 구별할 수 있다.
rRNA 서열 기반 검출
특정 예시적 실시형태에서, 본원에 개시된 장치, 시스템, 및 방법은 샘플 중 다수 미생물 종을 구별하는데 사용될 수 있다. 특정 예시적 실시형태에서, 식별은 16S, 23S, 및 5S 서브유닛을 포함하는, 리보솜 RNA 서열을 기반으로 할 수 있다. 관련 rRNA 서열을 식별하기 위한 방법은 미국 공개 특허 출원 번호 2017/0029872 에 개시되어 있다. 특정 예시적 실시형태에서, 가이드 RNA 의 세트는 각각의 종 또는 균주에 고유한 가변 영역에 의해 각각의 종을 구별하도록 디자인될 수 있다. 가이드 RNA 는 속, 과, 목, 강, 문 또는 계 수준, 또는 이의 조합으로 미생물을 구별하는 RNA 유전자를 표적화하도록 디자인될 수 있다. I증폭이 사용되는 특정 예시적 실시형태에서, 증폭 프라이머의 세트는 리보솜 RNA 서열의 측접하는 불변 영역에 대해 디자인될 수 있고 가이드 RNA 는 가변 내부 영역에 의해 각각의 종을 구별하도록 디자인될 수 있다. 특정 예시적 실시형태에서, 프라이머 및 가이드 RNA 는 각각 16S 서브유닛 내 보존 및 가변 영역에 대해 디자인될 수 있다. 종 또는 종의 서브세트에 걸쳐 고유하게 가변적인 다른 유전자 또는 게놈 영역 예컨대 RecA 유전자 패밀리, RNA 폴리머라아제 β 서브유닛이 또한 사용될 수 있다. 다른 적합한 계통 마커, 및 이를 식별하기 위한 방법은 예를 들어, [Wu et al. arXiv:1307.8690 [q-bio.GN]] 에서 토의된다.
특정 예시적 실시형태에서, 방법 또는 진단은 동시에 다수의 계통 및/또는 표현형 수준에 걸쳐 미생물을 스크리닝하도록 디자인된다. 예를 들어, 방법 또는 진단은 상이한 가이드 RNA 와 다수의 CRISPR 시스템의 사용을 포함할 수 있다. 가이드 RNA 의 제 1 세트는 예를 들어 마이코박테리아, 그람 양성, 및 그람 음성 박테리아를 구별할 수 있다. 이들 일반 부류는 더욱 세분화될 수 있다. 예를 들어, 가이드 RNA 는 그람 음성 박테리아 내에서 장내 및 비-장내 박테리아를 구별하는 방법 또는 진단에서 디자인되어 사용될 수 있다. 가이드 RNA 의 제 2 세트는 속 또는 종 수준에서 미생물을 구별하도록 디자인될 수 있다. 따라서, 그들 부류 중 하나 내에 속하는 소정 샘플 중에서 식별되는 박테리아 종의 각각의 속으로 모든 마이코박테리아, 그람 양성, 그람 음성 (장내 및 비-장내로 더 분류됨) 을 식별하는 매트릭스가 생성될 수 있다. 전술한 내용은 단지 예시의 목적이다. 다른 미생물 유형을 분류하기 위한 다른 수단이 또한 고려되고 상기 기재된 일반 구조를 따르게 될 것이다.
약제 내성에 대한 스크리닝
특정 예시적 실시형태에서, 본원에 개시된 장치, 시스템 및 방법은 관심 미생물 유전자, 예를 들어 항생제 및/또는 항바이러스 내성 유전자에 대해 스크리닝하는데 사용될 수 있다. 가이드 RNA 는 기지의 관심 유전자를 구별하도록 디자인될 수 있다. 이후에, 임상 샘플을 포함하는 샘플은 이러한 유전자의 검출을 위해 본원에 개시된 실시형태를 사용하여 스크리닝될 수 있다. POC 에서 약제 내성에 대해 스크리닝하는 능력은 적절한 치료 계획을 선택하는데 있어 대단한 이득을 가지게 된다. 특정 예시적 실시형태에서, 항생제 내성 유전자는 KPC, NDM1, CTX-M15, OXA-48 을 포함하는, 카르바페네마아제이다. 다른 항생제 내성 유전자가 공지되어 있고, 예를 들어 종합 항생제 내성 데이타베이스 (Comprehensive Antibiotic Resistance Database) 에서 발견될 수 있다 (Jia et al. "CARD 2017: expansion and model-centric curation of the Comprehensive Antibiotic Resistance Database." Nucleic Acids Research, 45, D566-573).
리바비린은 수많은 RNA 바이러스를 공격하는 효과적인 항바이러스제이다. 몇몇 임상적으로 중요한 바이러스는 구제역 바이러스 (doi:10.1128/JVI.03594-13); 폴리오 바이러스 (Pfeifer and Kirkegaard. PNAS, 100(12):7289-7294, 2003); 및 C형 간염 바이러스 (Pfeiffer and Kirkegaard, J. Virol. 79(4):2346-2355, 2005) 를 포함하여, 리바비린 내성을 진화시켜왔다. 많은 다른 지속성 RNA 바이러스, 예컨대 간염 바이러스 및 HIV 는 현존하는 항바이러스 약제에 대한 내성을 진화시켜왔다: B형 간염 바이러스 (라미부딘, 테노포비어, 엔테카비어) (doi:10/1002/hep22900); C형 간염 바이러스 (텔라프레비어, BILN2061, ITMN-191, SCh6, 보세프레비어, AG-021541, ACH-806) (doi:10.1002/hep.22549); 및 HIV (다제 내성 돌연변이) (hivb.standford.edu). 본원에 개시된 실시형태는 특히 이러한 변이체를 검출하는데 사용될 수 있다.
약제 내성 이외에도, LCMV 의 지속성 대 급성 감염 (doi:10.1073/pnas.1019304108), 및 에볼라의 증가된 감염성 (Diehl et al. Cell. 2016, 167(4):1088-1098) 과 같은, 본원에 개시된 실시형태로 검출할 수 있는 수많은 임상적으로 관련된 돌연변이가 존재한다.
본원의 다른 곳에 기재된 바와 같이, 밀접하게 관련된 미생물 종 (예를 들어, 소정 표적 서열에 오직 단일 뉴클레오티드 편차만 가짐) 은 gRNA 내 합성 미스매치의 도입에 의해 구별될 수 있다.
세트 커버 접근법
특정 실시형태에서, 예를 들어, 미생물의 정의된 세트 내의 모든 미생물 종을 식별할 수 있는 가이드 RNA 의 세트가 디자인된다. 특정 예시적 실시형태에서 이러한 방법이 기재되며; 본원에 기재된 바와 같은 가이드 RNA 를 생성시키기 위한 방법은 본원에 참조로 포함되는 WO 2017/040316 에 개시된 방법과 비교할 수 있다. WO 2017040316 에 기재된 바와 같이, 세트 커버 해법은 전체 표적 서열 또는 표적 서열의 세트, 예를 들어 게놈 서열의 세트를 커버하는데 필요한 최소 수의 표적 서열 프로브 또는 가이드 RNA 를 식별할 수 있다. 세트 커버 접근법은 전형적으로 20 내지 50 개 염기쌍 범위에서, 프라이머 및/또는 마이크로어레이 프로브를 식별하기 위해 이전에 사용되어왔다. 예를 들어, 하기 문헌들을 참조한다: Pearson et al., cs.virginia.edu/~robins/papers/primers_dam11_final.pdf., Jabado et al. Nucleic Acids Res. 2006 34(22):6605-11, Jabado et al. Nucleic Acids Res. 2008, 36(1):e3 doi10.1093/nar/gkm1106, Duitama et al. Nucleic Acids Res. 2009, 37(8):2483-2492, Phillippy et al. BMC Bioinformatics. 2009, 10:293 doi:10.1186/1471-2105-10-293. 그러나, 이러한 접근법은 일반적으로 각각의 프라이머/프로브를 k-량체로서 처리하는 단계 및 정확한 매치를 검색하는 단계 또는 서픽스 어레이를 사용하여 부정확한 매치를 허용하는 단계를 포함하였다. 또한, 방법은 일반적으로 각각의 투입 서열이 오직 하나의 프라이머 또는 프로브에 의해 결합되는 것을 필요로 하고, 서열을 따라서 이러한 결합의 위치가 비관련적이도록 프라이머 또는 프로브를 선택하여 하이브리드화를 검출하는 2원 접근법을 취한다. 대안적인 방법은 표적 게놈을 사전-정의된 윈도우로 나누고 효과적으로 각각의 윈도우를 2원 접근법 하에서 개별 투입 서열로서 처리할 수 있으며, 즉, 이들은 소정 프로브 또는 가이드 RNA 가 각각의 윈도우 내에서 결합하는지 여부를 결정하고 모든 윈도우가 일부 프로브 또는 가이드 RNA 의 상태에 의해 결합되는 것을 요구한다. 효과적으로, 이들 접근법은 전체 투입 서열 또는 투입 서열의 사전-정의된 윈도우로서 세트 커버 문제 내 "유니버스" 의 각 요소를 처리하고, 각각의 요소는 요소 내에서 프로브 또는 가이드 RNA 의 시작이 결합된다면 "커버됨" 으로 간주된다. 이들 접근법은 상이한 프로브 또는 가이드 RNA 디자인이 소정 표적 서열을 커버하도록 허용되는 유동성을 제한한다.
대조적으로, 본원에 개시된 실시형태는 더 긴 프로브 또는 가이드 RNA 길이, 예를 들어, 하이브리드 선택 서열분석에 적합한 70 bp 내지 200 bp 의 범위의 길이를 검출하는 것에 관한 것이다. 또한, 본원에 개시된 방법은 대량 및/또는 가변적 표적 서열 세트에서 모든 종 및/또는 균주 서열의 검출 서열분석을 식별하고 용이하게 할 수 있는 프로브 또는 가이드 RNA 세트를 한정할 수 있는 범-표적 서열 접근법을 취하도록 적용될 수 있다. 예를 들어, 본원에 개시된 방법은 단일 어세이에서 다수의 상이한 바이러스, 또는 소정 바이러스의 모든 변이체를 식별하는데 사용될 수 있다. 더 나아가, 본원에 개시된 방법은 세트 커버 문제에서 "유니버스" 의 각각의 요소를 표적 서열의 뉴클레오티드인 것으로서 처리하고, 각각의 요소는 요소를 포함하는 표적 게놈의 일부 분절에 프로브 또는 가이드 RNA 가 결합하는 한, "커버됨" 으로 간주된다. 이들 유형의 세트 커버 방법은 이전 방법의 2원 접근법 대신에 사용될 수 있고, 본원에 개시된 방법은 어떻게 프로브 또는 가이드 RNA 가 표적 서열과 하이브리드화할 수 있는지에 대한 더 양호한 모델이 된다. 단지 소정 가이드 RNA 서열이 소정 윈도우에 결합하는지 또는 결합하지 않는지를 질문하기보다는, 이러한 접근법은 하이브리드화 패턴을 검출하는데 사용될 수 있으며, 즉, 소정 프로브 또는 가이드 RNA 가 표적 서열 또는 표적 서열들에 결합하는 경우, 샘플로부터의 농축 및 임의의 그리고 모든 표적 서열의 서열분석을 가능하게 하기에 충분한 정도로 표적 서열의 세트를 커버하기 위해 필요한 프로브 또는 가이드 RNA 의 최소 개수를 그들 하이브리드화 패턴으로부터 결정한다. 이들 하이브리드화 패턴은 기능 상실을 최소화하는 특정 매개변수를 한정하고, 그리하여 예를 들어, 각각의 종의 다양성을 반영하기 위해서, 매개변수를 각각의 종에 대해 다양화시킬 수 있는 방식을 비롯하여, 프로브 또는 가이드 RNA 디자인 상황에서 이전에 적용된 것과 같은, 세트 커버 해법의 간단한 적용을 사용해 획득할 수 없는 계산적으로 효율적인 방식으로 최소의 프로브 또는 가이드 RNA 의 식별을 가능하게 한다.
다수 전사물 존재도를 검출하는 능력은 특정한 표현형을 의미하는 고유한 미생물 서명의 생성을 가능하게 할 수 있다. 다양한 기계 학습 기술은 유전자 서명을 유래시키는데 사용될 수 있다. 따라서, CRISPR 시스템의 가이드 RNA 는 특정 표현형을 검출하기 위해 유전자 서명에 의해 한정되는 바이오마커의 상대적 수준을 식별 및/또는 정량하는데 사용될 수 있다. 특정 예시적 실시형태에서, 유전자 서명은 항생제에 대한 감수성, 항생제에 대한 내성, 또는 이의 조합을 의미한다.
본 발명의 한 양상에서, 방법은 하나 이상의 병원체를 검출하는 단계를 포함한다. 이러한 방식으로, 개별 미생물에 의한 대상체의 감염 간 구별이 얻어질 수 있다. 일부 실시형태에서, 이러한 구별은 특별한 질환, 예를 들어, 질환의 상이한 변이형의 임상의에 의한 검출 또는 진단을 가능하게 할 수 있다. 바람직하게는 병원체 서열은 병원체의 게놈 또는 이의 단편이다. 방법은 병원체의 진화를 결정하는 단계를 더 포함할 수 있다. 병원체의 진화를 결정하는 단계는 병원체 돌연변이, 예를 들어 뉴클레오티드 결실, 뉴클레오티드 삽입, 뉴클레오티드 치환의 식별을 포함할 수 있다. 후자 중에서, 비-동의성, 동의성, 및 비-코딩 치환이 존재한다. 돌연변이는 대발생 동안 보다 빈번하게 비-동의성이다. 방법은 상기 기재된 바와 같이 분석된 2 개 병원체 서열 간 치환율을 결정하는 단계를 더 포함할 수 있다. 돌연변이가 유해하거나 심지어 적응성인지 여부는 기능적 분석을 필요로 하지만, 비-동의성 돌연변이의 속도는 이러한 유행병의 계속적인 진행이 병원체 적응의 기회를 제공할 수 있다는 것을 시사하므로, 신속한 격리의 필요성을 강조한다. 따라서, 방법은 바이러스 적응의 위험성을 평가하는 단계를 더 포함할 수 있고, 여기서 비-동의성 돌연변이의 수를 결정한다 (Gire, et al., Science 345, 1369, 2014).
미생물 대발생의 모니터링
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 바와 같은 CRISPR 시스템 또는 이의 사용 방법은 병원체 대발생의 진화를 결정하기 위해 사용될 수 있다. 방법은 하나 이상의 대상체 유래의 다수 개의 샘플로부터 하나 이상의 표적 서열을 검출하는 단계를 포함할 수 있고, 여기서 표적 서열은 대발생을 야기하는 미생물 유래의 서열이다. 이러한 방법은 병원체 전파의 패턴, 또는 병원체에 의해 야기되는 질환 대발생에 관여하는 기전을 결정하는 단계를 더 포함할 수 있다.
병원체 전파의 패턴은 병원체의 천연 병원소로부터의 계속적인 신규 전파 또는 천연 병원소로부터의 단일 전파 후 대상체 대 대상체 전파 (예를 들어, 인간 대 인간 전파) 또는 이 둘의 혼합을 포함할 수 있다. 한 실시형태에서, 병원체 전파는 박테리아 또는 바이러스 전파일 수 있고, 이러한 경우, 표적 서열은 바람직하게는 미생물 게놈 또는 이의 단편이다. 한 실시형태에서, 병원체 전파의 패턴은 병원체 전파의 조기 패턴, 즉 병원체 대발생의 시작 시의 패턴이다. 대발생의 시작 시 병원체 전파의 패턴 결정은 가능한 가장 빠른 시점에 대발생을 중단시킬 가능성을 증가시키고, 그리하여 지역 및 국가간 전파 확률을 감소시킨다.
병원체 전파의 패턴을 결정하는 단계는 본원에 기재된 방법에 따라 병원체 서열을 검출하는 단계를 포함할 수 있다. 병원체 전파의 패턴을 결정하는 단계는 대상체 간 병원체 서열의 공유된 숙주내 변이를 검출하는 단계 및 공유된 숙주내 변이가 시간적 패턴을 보이는지 여부를 결정하는 단계를 더 포함할 수 있다. 관찰된 숙주내 및 숙주간 변이의 패턴은 전파 및 역학에 관한 중요한 통찰을 제공한다 (Gire, et al., 2014).
시간적 패턴을 보이는 대상체 간 공유된 숙주내 변이의 검출은, 다수 공급원으로부터의 대상체 감염 (중복감염), 샘플 오염 재발성 돌연변이 (돌연변이의 강화를 위한 균형 선택의 존재 또는 부재 하), 또는 전파 사슬의 초기에 돌연변이에 의해 발생된 약간의 발산된 바이러스의 동시-전파에 의해 설명될 수 있기 때문에, 대상체 간 (특히 인간 사이) 의 전파 관련성을 나타낸다 (Park, et al., Cell 161(7):1516-1526, 2015). 대상체 간 공유된 숙주내 변이의 검출은 공통 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP) 위치에 위치하는 숙주내 변이체의 검출을 포함할 수 있다. 공통 (SNP) 위치에 위치된 숙주내 변이체의 양성 검출은 숙주내 변이체에 대한 주요 설명으로서 중복감염 및 오염을 의미한다. 중복감염 및 오염은 숙주간 변이체로서 나타나는 SNP 빈도를 기반으로 구별될 수 있다 (Park, et al., 2015). 그렇지 않으면 중복감염 및 오염은 배제시킬 수 있다. 이 후자의 경우에, 대상체 간 공유된 숙주내 변이의 검출은 동의성 및 비-동의성 변이체의 빈도를 평가하는 단계 및 동의성 및 비-동의성 변이체의 빈도를 서로 비교하는 단계를 더 포함할 수 있다. 비-동의성 돌연변이는 단백질의 아미노산을 변경시키는 돌연변이이고, 그 결과로 자연 선택을 겪은 미생물에서 생물학적 변화를 야기시킬 가능성이 있다. 동의성 치환은 아미노산 서열을 변경시키지 않는다. 동의성 및 비-동의성 변이체의 동일한 빈도는 중성적으로 진화하는 숙주내 변이체를 의미한다. 동의성 및 비-동의성 변이체의 빈도가 다른 경우, 숙주내 변이체는 균형 선택에 의해 유지될 가능성이 있다. 동의성 및 비-동의성 변이체의 빈도가 낮은 경우, 이것은 재발성 돌연변이를 의미한다. 동의성 및 비-동의성 변이체의 빈도가 높은 경우, 이것은 동시-전파를 의미한다 (Park, et al., 2015).
에볼라 바이러스처럼, 라싸 바이러스 (LASV) 는 사망률이 높은 출혈열을 야기시킬 수 있다. Andersen et al. 은 임상 및 설치류 병원소 샘플로부터 거의 200 종의 LASV 서열의 게놈 카탈로그를 생성시켰다 (Andersen, et al., Cell Volume 162, Issue 4, p 738-750, 13 August 2015) Andersen et al. 은 2013-2015 년 EVD 유행병이 인간-대-인간 전파에 의해 자극된데 반해, LASV 감염은 주로 병원소-대-인간 감염에 의한다는 것을 보여준다. Andersen et al. 은 서아프리카 전역에서 LASV 의 확산을 밝혀주었으며 이러한 이동은 LASV 게놈 존재비, 사망률, 코돈 적응, 및 번역 효율의 변화가 수반되었다는 것을 보여준다. 방법은 제 1 병원체 서열을 제 2 병원체 서열과 계통발생적으로 비교하는 단계, 및 제 1 및 제 2 병원체 서열 간 계통발생적 연결성이 존재하는지 여부를 결정하는 단계를 더 포함할 수 있다. 제 2 병원체 서열은 초기 참조 서열일 수 있다. 계통발생적 연결성이 존재한다면, 방법은 제 1 병원체 서열의 계통발생을 제 2 병원체 서열에 기원시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 따라서, 제 1 병원체 서열의 계통을 구축하는 것이 가능하다 (Park, et al., 2015).
방법은 돌연변이가 유해성 또는 적응성인지 여부를 결정하는 단계를 더 포함할 수 있다. 유해성 돌연변이는 전파-손상 바이러스 및 종말 감염 (dead-end infection) 을 의미하고, 따라서 정상적으로 오직 개별 대상체에만 존재한다. 하나의 개별 대상체에 고유한 돌연변이는 계통수의 외부 분지에서 발생되는 것들인데 반해, 내부 분지 돌연변이는 다수 샘플 (즉, 다수 대상체) 에 존재하는 것들이다. 더 높은 비율의 비-동의성 치환은 계통수의 외부 분지를 특징으로 한다 (Park, et al., 2015).
계통수의 내부 분지에서, 선택은 유해성 돌연변이를 여과시켜 버릴 더 많은 기회를 가졌었다. 정의에 의해, 내부 분지는 다수의 후손 계통을 생성시켰고, 따라서 적응 비용으로 돌연변이를 포함시킬 가능성이 덜 할 수 있다. 따라서, 더 낮은 비율의 비-동의성 치환은 내부 분지를 의미한다 (Park, et al., 2015).
적응도에 대한 영향이 덜 할 가능성이 있는, 동의성 돌연변이는 내부 및 외부 분지 상에서 보다 비슷한 빈도로 발생하였다 (Park, et al., 2015).
서열분석된 표적 서열, 예컨대 바이러스 게놈을 분석하여, 2014 년 에볼라 대발생 동안과 같은 유행병 에피소드의 중증도에 대한 원인이 되는 기전을 발견하는 것이 가능하다. 예를 들어, 이전 대발생 유래의 모든 20 종 게놈에 대해서 2014 년 대발생의 게놈의 계통발생적 비교를 만든 Gire et al. 은 2014 년 서아프리카 바이러스가 지난 십여년 내에 중앙 아프리카로부터 확산된 가능성이 있다는 것을 제안한다. 다른 에볼라 바이러스 게놈으로부터의 분기를 이용하여 계통발생을 기원시키는 것은 문제가 있었다 (6, 13). 그러나, 가장 오래된 대발생에 대해 계통수를 기원시키는 것은 샘플 날짜와 뿌리부터 첨단까지의 거리 사이에 강력한 상관성을 밝혀주었고, 치환율은 연간 부위 당 8 X 10-4 였다 (13). 이것은 가장 최근의 대발생 3 건의 계통이 모두 대략 2004 년 경에, 대체로 동일한 시점에 공통 조상으로부터 분기되었다는 것을 시사하며, 이는 각각의 대발생이 이의 천연 병원소의 동일한 유전적으로 다양한 바이러스 개체군으로부터의 독립적인 동물원성 감염 사건을 나타낸다는 가설을 뒷받침한다. 이들은 또한 2014 년 EBOV 대발생이 천연 병원소로부터의 단일 전파와 그 이후 대발생 동안 인간 대 인간 전파에 의해 야기되었을 것임을 발견하였다. 그들 결과는 또한 시에라리온에서의 유행병 에피소드가 대략 동일 시점에 기니로부터의 2 종의 유전적으로 별개인 바이러스의 유입에 기인하였을 것임을 시사한다 (Gire, et al., 2014).
특히 인간 대 인간 전파 덕분에, 라싸 바이러스가 이의 원점으로부터 어떻게 확산되었는가를 결정하고 심지어 이러한 확산 400 년의 역사를 역추적하는 것이 또한 가능하였다 (Andersen, et al., Cell 162(4):738-50, 2015).
2013-2015 년 EBOV 대발생 동안 필요했던 작업 및 대발생 현장에서 의료진이 직면했던 어려움과 관련하여, 보다 일반적으로, 본 발명의 방법은 소수의 선택된 프로브를 사용하여 서열분석을 수행하는 것을 가능하게 만들어서 서열분석을 가속화시킬 수 있고, 따라서 샘플 채취부터 결과 입수까지 필요한 시간을 단축시킬 수 있다. 또한, 키트 및 시스템은 현장에서 사용가능하게 디자인될 수 있어서 환자의 진단이 샘플을 국가 또는 세계의 다른 부분으로 수송하거나 또는 발송할 필요없이 쉽게 수행될 수 있다.
상기 기재된 임의의 방법에서, 표적 서열 또는 이의 단편의 서열분석은 상기 기재된 임의의 서열분석 방법을 사용할 수 있다. 또한, 표적 서열 또는 이의 단편의 서열분석은 근실시간 서열분석일 수 있다. 표적 서열 또는 이의 단편의 서열분석은 이전에 기재된 방법에 따라 수행될 수 있다 (실험 절차: [Matranga et al., 2014]; 및 [Gire, et al., 2014]). 표적 서열 또는 이의 단편의 서열분석은 다수 개의 표적 서열의 병행 서열분석을 포함할 수 있다. 표적 서열 또는 이의 단편의 서열분석은 Illumina 서열분석을 포함할 수 있다.
선택된 프로브 중 하나 이상과 하이브리드화하는 표적 서열 또는 이의 단편의 분석은 식별 분석일 수 있는데, 표적 서열 또는 이의 단편과 선택된 프로브의 하이브리드화는 샘플 내의 표적 서열의 존재를 의미한다.
현재, 1차 진단은 환자가 갖고 있는 증상을 기반으로 한다. 그러나, 다양한 질환은 동일한 증상을 공유할 수 있어, 진단은 통계에 많이 의존한다. 예를 들어, 말라리아는 감기-유사 증상: 두통, 발열, 오한, 관절통, 구토, 용혈성 빈혈, 황달, 소변 중 헤모글로빈, 망막 손상, 및 경련을 촉발시킨다. 이들 증상은 또한 패혈증, 위장염, 및 바이러스 질환에서 공통이다. 그들 중에서, 에볼라 출혈열은 하기의 증상: 발열, 인후염, 근육통, 두통, 구토, 설사, 발진, 간 및 신장 기능 감소, 내부 및 외부 출혈을 갖는다.
환자가 예를 들어 열대 아프리카의 의료단에 출석했을 때, 기초 진단은 통계적으로 아프리카의 지역 내에서 말라리아가 가장 개연성있는 질환이기 때문에 말라리아로 결론내릴 것이다. 그러한 결과로 환자가 실제로 그 질환에 걸리지 않았을지라도 말라리아에 대해 치료받게 되어 결국 환자는 올바르게 치료되지 않게 된다. 이러한 올바른 치료의 부족은 특히 환자가 걸린 질환이 빠른 진화를 나타낼 때 생명 위협적일 수 있다. 환자에게 제공된 치료가 비효과적이고, 올바른 진단을 해서 환자에게 적절한 치료를 투여하는 것을 의료진이 깨닫기 전에 너무 늦을 수도 있다.
본 발명의 방법은 이러한 상황에 대한 해결책을 제공한다. 실제로, 가이드 RNA 의 개수는 극적으로 감소될 수 있기 때문에, 이는 다수의 질환, 예를 들어 바이러스 감염을 동시에 진단할 수 있도록, 단일 칩 상에, 각각의 군이 하나의 질환에 대해 특이적인, 군들로 나뉘는 선택된 프로브를 제공하는 것을 가능하게 만든다. 본 발명 덕분에, 3 종이 넘는 질환을 단일 칩 상에서 진단할 수 있고, 바람직하게는 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 종을 초과하는 질환을 동시에, 바람직하게는 소정 지리적 영역의 개체군 내에서 가장 일반적으로 발병되는 것인 질환을 진단할 수 있다. 선택된 프로브의 각각의 군이 진단된 질환 중 하나에 대해 특이적이므로, 보다 정확한 진단을 수행할 수 있고, 따라서 환자에게 부적절한 치료를 투여할 위험성이 감소된다.
다른 경우, 바이러스 감염과 같은 질환은 임의의 증상없이 발병될 수 있거나, 증상을 야기하지만 환자가 의료진에게 출석하기 전에 소멸되었다. 이러한 경우, 환자는 임의의 의료 지원을 찾지 않거나 출석날 증상의 부재로 인해 진단이 복잡해진다.
본 발명은 또한 핵산, 예컨대 미가공, 비정제 샘플 중 mRNA 와 같은 핵산의 검출을 기반으로 질환의 진단, 병원체의 식별 및 치료의 최적화를 위한 다른 방법과 함께 사용될 수 있다.
본 발명의 방법은 또한 이러한 상황을 해결하기 위한 강력한 도구를 제공한다. 실제로, 각각의 군이 소정 지역의 개체군 내에서 발병된 가장 일반적인 질환 중 하나에 특이적인, 선택된 가이드 RNA 의 다수 군이 단일 진단 내에 포함되므로, 의료진은 오직 환자로부터 채취된 생물학적 샘플을 칩과 접촉시키는 것만을 필요로 한다. 칩의 판독은 환자가 걸린 질환을 밝혀준다.
일부 경우, 환자는 특정 증상의 진단을 위해 의료진에게 출석한다. 본 발명의 방법은 어떠한 질환이 이들 증상을 야기시켰는지를 식별할뿐만 아니라 동시에 환자가 자각하지 못한 또 다른 질환을 앓고 있는지 여부를 결정하는 것을 가능하게 만든다.
이러한 정보는 대발생의 기전을 찾을 때 최고로 중요할 것이다. 실제로, 동일한 바이러스를 갖는 환자 군은 또한 대상체 대 대상체 전파 연결성을 시사하는 시간적 패턴을 보인다.
미생물 유전자 교란 스크리닝
특정 예시적 실시형태에서, 본원에 개시된 CRISPR 시스템은 미생물 유전적 교란을 스크리닝하는데 사용될 수 있다. 이러한 방법은 예를 들어 미생물 경로 및 기능적 네트워크를 설계하기 위해 유용할 수 있다. 미생물 세포는 유전자 변형될 수 있고 그런 후에 상이한 실험 조건 하에서 스크리닝될 수 있다. 상기 기재된 바와 같이, 본 명세서에서 개시된 실시형태는 복합적 방식으로 단일 개별 이산 부피에서 단일 표적, 또는 단일 샘플에서 다수 표적 분자에 대해 스크리닝할 수 있다. 유전자 변형된 미생물은 특정한 미생물 세포 또는 미생물 세포의 개체군에 의해 운반되는 특정한 유전자 변형을 식별하는 핵산 바코드 서열을 포함하도록 변형될 수 있다. 바코드는 식별자로서 사용되는 뉴클레오티드의 짧은 서열 (예를 들어, DNA, RNA, 또는 이의 조합) 이다. 핵산 바코드는 4-100 개 뉴클레오티드의 길이를 가질 수 있고 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있다. 바코드로 세포를 식별하기 위한 방법은 당분야에 공지되어 있다. 따라서, 본원에 기재된 CRISPR 이펙터 시스템의 가이드 RNA 는 바코드를 검출하는데 사용될 수 있다. 양성 검출가능 신호의 검출은 샘플에서 특정한 유전자 변형의 존재를 의미한다. 본원에 개시된 방법은 시험되는 실험 조건 하에서 유전자 변형의 효과를 의미하는 상보성 유전자형 또는 표현형 판독을 검출하는 다른 방법과 조합될 수 있다. 스크리닝하려는 유전자 변형은 유전자 녹-인, 유전자 녹-아웃, 역위, 전좌, 전이, 또는 하나 이상의 뉴클레오티드 삽입, 결실, 치환, 돌연변이, 또는 기능적 결과 예컨대 변경된 단백질 안정성 또는 검출을 갖는 에피토프를 인코딩하는 핵산의 첨가를 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 유사한 방식으로, 본원에 기재된 방법은 유전자 조절 요소 및 유전자 발현 모듈의 특별한 배열의 기능성을 스크리닝하기 위해 합성 생물학 적용분야에서 사용될 수 있다.
특정 예시적 실시형태에서, 방법은 하이포모르프 (hypomorph) 를 스크리닝하는데 사용될 수 있다. 하이포모르프의 생성 및 핵심 박테리아 기능적 유전자의 식별에서 그들의 용도 및 신규 항생제 치료제의 식별은 본원에 참조로 포함되는, 2016 년 11 월 4 일 출원한 발명의 명칭 "Multiplex High-Resolution Detection of Micro-organism Strains, Related Kits, Diagnostic Methods and Screening Assays" 의 PCT/US2016/060730 에 개시된 바와 같다.
상이한 실험 조건은 상이한 화학제, 화학제의 조합, 상이한 농도의 화학제 또는 화학제의 조합, 화학제 또는 화학제의 조합에 대한 상이한 노출 기간, 상이한 물리적 변수, 또는 모두에 대한 미생물 세포의 노출을 포함할 수 있다. 특정 예시적 실시형태에서, 화학제는 항생제 또는 항바이러스제이다. 스크리닝하려는 상이한 물리적 매개변수는 상이한 온도, 대기압, 상이한 대기 및 비-대기 가스 농도, 상이한 pH 수준, 상이한 배양 배지 조성, 또는 이의 조합을 포함할 수 있다.
환경적 샘플의 스크리닝
본원에 개시된 방법은 또한 표적 핵산 또는 폴리펩티드의 존재를 검출하여 오염에 대해 환경적 샘플을 스크리닝하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 본 발명은 미생물을 검출하는 방법을 제공하고, 이 방법은 본원에 기재된 바와 같은 CRISPR 시스템을 샘플에 노출시키는 단계; 하나 이상의 가이드 RNA 와 하나 이상의 미생물-특이적 표적 RNA 또는 하나 이상의 트리거 RNA 의 결합을 통해 RNA 이펙터 단백질을 활성화시켜, 검출가능한 양성 신호를 생성시키는 단계를 포함한다. 양성 신호가 검출될 수 있고 샘플 중 하나 이상의 미생물의 존재를 의미한다. 일부 실시형태에서, CRISPR 시스템은 본원에 기재된 바와 같이 기판 상에 존재할 수 있고, 기판은 샘플에 노출될 수 있다. 다른 실시형태에서, 동일한 CRISPR 시스템, 및/또는 상이한 CRISPR 시스템이 기판 상의 다수의 별개 위치에 적용될 수 있다. 추가 실시형태에서, 상이한 CRISPR 시스템은 각각의 위치에서 상이한 미생물을 검출할 수 있다. 상기 더욱 상술한 바와 같이, 기판은 예를 들어 종이 기판, 패브릭 기판, 또는 가요성 중합체-기반 기판을 비제한적으로 포함하는, 가요성 재료 기판일 수 있다.
본 발명에 따라서, 기판은 샘플채취하려는 유체 중에 기판을 일시적으로 함침시키거나, 기판에 시험하려는 유체를 도포하거나, 시험하려는 표면을 기판과 접촉시켜서, 수동적으로 샘플에 노출될 수 있다. 기판에 샘플을 도입하는 임의의 수단이 적절하게 사용될 수 있다.
본원에서 기재된 바와 같이, 본 발명에서 사용을 위한 샘플은 생물학적 또는 환경적 샘플, 예컨대 식품 샘플 (신선 과일 또는 채소, 육류), 음료 샘플, 종이 표면, 패브릭 표면, 금속 표면, 목재 표면, 플라스틱 표면, 토양 샘플, 담수 샘플, 폐수 샘플, 염수 샘플, 대기 공기 또는 다른 가스 샘플에의 노출, 또는 이의 조합일 수 있다. 예를 들어, 금속, 목재, 플라스틱, 고무 등을 비제한적으로 포함하는 임의의 재료로 만들어진 가정용/상업적/산업적 표면을 면봉으로 닦아서 오염을 시험할 수 있다. 토양 샘플은 환경적 목적 및/또는 인간, 동물 또는 식물 질환 검사를 위해, 병원성 박테리아 또는 기생충, 또는 다른 미생물의 존재에 대해 시험될 수 있다. 물 샘플 예컨대 담수 샘플, 폐수 샘플, 또는 염수 샘플은 예를 들어, 크립토스포리디움 파르븀 (Cryptosporidium parvum), 지아르디아 람블리아 (Giardia lamblia), 또는 다른 미생물 오염의 존재를 검출하기 위해, 청정도 및 안정성, 및/또는 휴대성에 대해 평가될 수 있다. 추가 실시형태에서, 생물학적 샘플은 조직 샘플, 타액, 혈액, 혈장, 혈청, 대변, 소변, 객담, 점액질, 림프, 활액, 뇌척수액, 복수, 흉수, 혈청종, 고름, 또는 피부 또는 점막 표면의 스왑을 비제한적으로 포함하는 공급원으로부터 수득될 수 있다. 일부 특정한 실시형태에서, 환경적 샘플 또는 생물학적 샘플은 미가공 샘플일 수 있고/있거나 하나 이상의 표적 분자는 방법의 적용 이전에 샘플로부터 정제되지 않을 수 있거나 증폭되지 않을 수 있다. 미생물의 식별은 임의의 많은 적용분야에서 유용하고/하거나 필요할 수 있고, 따라서 당업자가 적절하다고 여기는 임의 출처 유래의 임의 유형의 샘플이 본 발명에 따라서 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 레스토랑 또는 다른 식품 제공처에서 박테리아, 예컨대 E. 콜라이 (E. coli) 에 의한 식품 오염의 점검; 식품 표면; 살모넬라 (Salmonella), 캄필로박터 (Campylobacter), 또는 E. 콜라이 (E. coli) 와 같은 병원체에 대한 물 검사; 또한 제조사 및 규제 기관이 육류원의 순도를 결정하기 위한 식품 품질 점검; 병원체 예컨대 레지오넬라 (Legionella) 에 의한 공기 오염의 확인; 페디오코커스 (Pediococcus) 및 락토바실러스 (Lactobacillus) 와 같은 병원체에 의한 맥주의 오염 또는 부패 여부 점검; 제조 동안 박테리아 또는 진균에 의한 살균 또는 미살균 치즈의 오염이 있다.
본 발명에 따른 미생물은 식품 또는 소모성 제품 부패를 초래하는 미생물 또는 병원성 미생물일 수 있다. 병원성 미생물은 병원성일 수 있거나 아니면 인간, 동물 또는 식물에게 바람직하지 않을 수 있다. 인간 또는 동물 목적을 위해, 미생물은 질환을 야기할 수 있거나 질병을 일으킬 수 있다. 본 발명의 동물 또는 수의학적 적용은 미생물에 감염된 동물을 식별할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 방법 및 시스템은 켄넬 코프, 공수병 바이러스, 및 심장사상충을 포함하나 이에 제한되지 않는 병원체를 갖는 반려동물을 식별할 수 있다. 다른 실시형태에서, 본 발명의 방법 및 시스템은 육종 목적으로 친자 감별에 사용될 수 있다. 식물 미생물은 식물에 유해하거나 질환을 초래할 수 있고, 수확량을 감소시킬 수 있거나, 색상, 맛, 견실성, 냄새와 같은 특성을 변경시킬 수 있다. 식품 또는 소비성 오염 목적의 경우, 미생물은 식품 또는 소모성 제품의 맛, 냄새, 색상, 견실성 또는 다른 상업적 특성에 부정적으로 영향을 미칠 수 있다. 특정 예시적 실시형태에서, 미생물은 박테리아 종이다. 박테리아는 정신친화성 (psychotroph), 대장균형, 락트산 박테리아, 또는 포자-형성 박테리아일 수 있다. 특정 예시적 실시형태에서, 박테리아는 질환 또는 질병을 야기하거나, 아니면 원치않는 생성물 또는 특성을 일으키는 임의의 박테리아 종일 수 있다. 본 발명에 따른 박테리아는 인간, 동물 또는 식물에 병원성일 수 있다.
샘플 유형
본원에서 개시된 방법에서 사용하기에 적절한 샘플은 유기체 또는 이의 일부분, 예컨대 식물, 동물, 박테리아 등으로부터 수득된 임의의 통상적인 생물학적 샘플을 포함한다. 특정 실시형태에서, 생물학적 샘플은 동물 대상체, 예컨대 인간 대상체로부터 수득된다. 생물학적 샘플은 단일 세포 유기체, 예컨대 박테리아, 효모, 원충, 및 아메바 등, 다세포 유기체 (예컨대 식물 또는 동물로서, 건강하거나 또는 외관상 건강한 인간 대상체 또는 진단 또는 검사해야 하는 병태 또는 질환, 예컨대 병원성 미생물, 예컨대 병원성 박테리아 또는 바이러스에 의한 감염에 걸린 인간 환자 유래 샘플 포함) 를 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 살아있는 유기체로부터 수득되거나, 그로부터 배출되거나, 그에 의해 분비되는 임의의 고형 또는 유체 샘플이다. 예를 들어, 생물학적 샘플은 예를 들어, 혈액, 혈장, 혈청, 소변, 대변, 객담, 점액질, 림프액, 활액, 담즙, 복수, 흉수, 혈청종, 타액, 뇌척수액, 수양액 또는 유리체액, 또는 임의의 신체 분비물, 여출액, 삼출액 (예를 들어, 농양 또는 감염 또는 염증의 임의의 다른 부위로부터 수득된 유체), 또는 관절로부터 수득된 유체 (예를 들어, 정상 관절 또는 질환, 예컨대 류마티스성 관절염, 골관절염, 통풍성 또는 화농성 관절염에 걸린 관절), 또는 피부 또는 점막 표면의 스왑으로부터 수득된 생물학적 유체일 수 있다.
샘플은 또한 임의의 장기 또는 조직으로부터 수득된 샘플 (생검 또는 부검 표본, 예컨대 종양 생검 포함) 일 수 있거나 세포 (1차 세포 또는 배양 세포이건 무관) 또는 임의 세포, 조직 또는 장기에 의해 조건화된 배지를 포함할 수 있다. 예시적인 샘플은 세포, 세포 용해물, 혈액 도말 샘플, 세포원심분리 제조물, 세포학 도말 샘플, 체액 (예를 들어, 혈액, 혈장, 혈청, 타액, 객담, 소변, 기관지폐포 세척액, 정액 등), 조직 생검 (예를 들어, 종양 생검), 세침 흡인물, 및/또는 조직 절편 (예를 들어, 크라이오스태트 조직 절편 및/또는 파라핀-포매 조직 절편) 을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 다른 예에서, 샘플은 순환성 종양 세포 (세포 표면 마커에 의해 식별할 수 있음) 를 포함한다. 특정 예에서, 샘플은 직접적으로 (예를 들어, 신선 또는 냉동) 사용되거나, 사용 전에, 예를 들어 고정 (예를 들어, 포르말린 사용) 및/또는 왁스 포매 (예컨대 포르말린-고정 파라핀-포매 (FFPE) 조직 샘플) 에 의해 조작될 수 있다. 대상체로부터 조직을 수득하는 임의의 방법이 이용될 수 있고, 사용되는 방법의 선택은 다양한 인자들 예컨대 조직의 유형, 대상체의 연령, 또는 의사가 이용가능한 절차에 따라 좌우될 것임을 이해하게 될 것이다. 이러한 샘플의 획득을 위한 표준 기술은 당분야에서 입수가능하다. 예를 들어, [Schluger et al., J. Exp. Med. 176:1327-33 (1992)]; [Bigby et al., Am. Rev. Respir. Dis. 133:515-18 (1986)]; [Kovacs et al., NEJM 318:589-93 (1988)]; 및 [Ognibene et al., Am. Rev. Respir. Dis. 129:929-32 (1984)] 를 참조한다.
다른 실시형태에서, 샘플은 환경적 샘플, 예컨대 물, 토양, 또는 표면 예컨대 산업적 또는 의학적 표면일 수 있다. 일부 실시형태에서, 미국 공개 특허 출원 번호 2013/0190196 에 개시된 바와 같은 방법은 고도의 감도 및 특이도로 미가공 세포 샘플로부터 직접적으로 유래된, 핵산 서명, 특히 RNA 수준의 검출에 적용될 수 있다. 각각의 관심 병원체에 특이적인 서열은 BLAST 소프트웨어에 의해 다른 유기체의 모든 코딩 서열과 관심 병원체 유래 코딩 서열을 비교하여 식별되거나 선택될 수 있다.
본 개시물의 몇몇 실시형태는 임상적 혈액 샘플을 성공적으로 분획화하기 위해 당분야에 공지된 절차 및 접근법의 사용을 포함한다. 예를 들어, 본원에 그의 개시물 전체가 참조로 포함되는, [Han Wei Hou et al., Microfluidic Devices for Blood Fractionation, Micromachines 2011, 2, 319-343]; [Ali Asgar S. Bhagat et al., Dean Flow Fractionation (DFF) Isolation of Circulating Tumor Cells (CTCs) from Blood, 15th International Conference on Miniaturized Systems for Chemistry and Life Sciences, October 2-6, 2011, Seattle, WA]; 및 국제 공개 특허 출원 번호 WO2011109762 에 기재된 절차를 참조한다. 혈액 샘플은 검사 목적을 위해 샘플 크기를 증가시키도록 일반적으로 배양으로 확장된다. 본 발명의 일부 실시형태에서, 혈액 또는 다른 생물학적 샘플은 배양에 의한 확장 필요없이 본원에서 기재된 바와 같은 방법에서 사용될 수 있다.
또한, 본 개시물의 몇몇 실시형태는 본원에 그의 개시물 전체가 참조로 포함되는, [Han Wei Hou et al., Pathogen Isolation from Whole Blood Using Spiral Microchannel, Case No. 15995JR, Massachusetts Institute of Technology, manuscript in preparation] 에 기재된 바와 같이, 나선형 마이크로채널을 사용하여 전혈로부터 병원체를 성공적으로 단리하기 위해 당분야에 공지된 절차 및 접근법의 사용을 포함한다.
본원에서 개시된 실시형태의 증가된 감도로 인해, 특정 예시적 실시형태에서, 어세이 및 방법은 검출하려는 표적 분자를 샘플로부터 더 분획화시키거나 또는 정제시키지 않는 샘플 또는 미가공 샘플에 대해 수행될 수 있다.
예시적 미생물
본원에 개시된 실시형태는 수많은 상이한 미생물을 검출하는데 사용될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 미생물은 박테리아, 진균, 원충, 기생충 및 바이러스를 포함한다.
박테리아
다음은 본원에서 개시된 실시형태를 사용하여 검출될 수 있는 미생물 유형의 예시적인 목록을 제공한다. 특정 예시적 실시형태에서, 미생물은 박테리아이다. 개시된 방법에 따라 검출될 수 있는 박테리아의 예는 그 중에서도, 아시네토박터 바우마니 (Acinetobacter baumanii), 악티노바실러스 sp. (Actinobacillus sp.), 악티노마이세테스 (Actinomycetes), 악티노마이세스 sp. (Actinomyces sp.) (예컨대 악티노마이세스 이스라엘리 (Actinomyces israelii) 및 악티노마이세스 나에슬룬디 (Actinomyces naeslundii)), 아에로모나스 sp. (Aeromonas sp.) (예컨대 아에로모나스 히드로필라 (Aeromonas hydrophila), 아에로모나스 베로니 비오바르 소브리아 (Aeromonas veronii biovar sobria (아에로모나스 소브리아 (Aeromonas sobria)), 및 아에로모나스 카비에 (Aeromonas caviae)), 아나플라스마 파고시토필룸 (Anaplasma phagocytophilum), 아나플라스마 마르기날레 (Anaplasma marginale), 알칼리게네스 자일로속시단스 (Alcaligenes xylosoxidans), 아시네토박터 바우마니 (Acinetobacter baumanii), 악티노바실러스 악티노마이세템코미탄스 (Actinobacillus actinomycetemcomitans), 바실러스 sp. (Bacillus sp.) (예컨대 바실러스 안트라시스 (Bacillus anthracis), 바실러스 세레우스 (Bacillus cereus), 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis), 바실러스 투린기엔시스 (Bacillus thuringiensis), 및 바실러스 스테아로써모필러스 (Bacillus stearothermophilus)), 박테로이데스 sp. (Bacteroides sp.) (예컨대 박테로이데스 프라질리스 (Bacteroides fragilis)), 바르토넬라 sp. (Bartonella sp.) (예컨대 바르토넬라 바실리포르미스 (Bartonella bacilliformis) 및 바르토넬라 헨셀레 (Bartonella henselae)), 비피도박테리움 sp. (Bifidobacterium sp.), 보데텔라 sp. (Bordetella sp.) (예컨대 보데텔라 퍼투시스 (Bordetella pertussis), 보데텔라 파라퍼투시스 (Bordetella parapertussis), 및 보데텔라 브론치셉티카 (Bordetella bronchiseptica)), 보렐리아 sp. (Borrelia sp.) (예컨대 보렐리아 레쿠렌티스 (Borrelia recurrentis), 및 보렐리아 부르그도르페리 (Borrelia burgdorferi)), 브루셀라 sp. (Brucella sp.) (예컨대 브루셀라 아보르투스 (Brucella abortus), 브루셀라 카니스 (Brucella canis), 브루셀라 멜린텐시스 (Brucella melintensis) 및 브루셀라 수이스 (Brucella suis)), 버크홀데리아 sp. (Burkholderia sp.) (예컨대 버크홀데리아 슈도말레이 (Burkholderia pseudomallei) 및 버크홀데리아 세파시아 (Burkholderia cepacia)), 캄필로박터 sp. (Campylobacter sp.) (예컨대 캄필로박터 제주니 (Campylobacter jejuni), 캄필로박터 콜리 (Campylobacter coli), 캄필로박터 라리 (Campylobacter lari) 및 캄필로박터 페투스 (Campylobacter fetus)), 카프노사이토파가 sp. (Capnocytophaga sp.), 카르디오박테리움 호미니스 (Cardiobacterium hominis), 클라미디아 트라초마티스 (Chlamydia trachomatis), 클라미도필라 뉴모니에 (Chlamydophila pneumoniae), 클라미도필라 시타시 (Chlamydophila psittaci), 시트로박터 sp. (Citrobacter sp.) 콕시엘라 부르네티 (Coxiella burnetii), 코리네박테리움 sp. (Corynebacterium sp.) (예컨대, 코리네박테리움 디프테리에 (Corynebacterium diphtheriae), 코리네박테리움 제이케움 (Corynebacterium jeikeum) 및 코리네박테리움 (Corynebacterium)), 클로스트리디움 sp. (Clostridium sp.) (예컨대 클로스트리디움 퍼프린겐스 (Clostridium perfringens), 클로스트리디움 디피실 (Clostridium difficile), 클로스트리디움 보툴리눔 (Clostridium botulinum) 및 클로스트리디움 테타니 (Clostridium tetani)), 에이케넬라 코로덴스 (Eikenella corrodens), 엔테로박터 sp. (Enterobacter sp.) (예컨대 엔테로박터 아에로게네스 (Enterobacter aerogenes), 엔테로박터 아글로메란스 (Enterobacter agglomerans), 엔테로박터 클로아카에 (Enterobacter cloacae) 및 에스케리키아 콜리 (Escherichia coli) (기회감염성 에스케리키아 콜리, 예컨대 장 독소형 E. 콜리 (E. coli), 세포 침입성 E. 콜리, 장 병원성 E. 콜리, 장 출혈성 E. 콜리, 장 집합성 E. 콜리 및 요로감염성 E. 콜리 포함), 엔테로코커스 sp. (Enterococcus sp.) (예컨대 엔테로코커스 파에칼리스 (Enterococcus faecalis) 및 엔테로코커스 파에시움 (Enterococcus faecium)), 에를리키아 sp. (Ehrlichia sp.) (예컨대 에를리키아 차펜시아 (Ehrlichia chafeensia) 및 에를리키아 카니스 (Ehrlichia canis)), 에피더모피톤 플로코숨 (Epidermophyton floccosum), 에리시펠로트릭스 루시오파티에 (Erysipelothrix rhusiopathiae), 유박테리움 sp. (Eubacterium sp.), 프란시셀라 투라렌시스 (Francisella tularensis), 푸소박테리움 누클레아툼 (Fusobacterium nucleatum), 가르드네렐라 바지날리스 (Gardnerella vaginalis), 게멜라 모르빌로룸 (Gemella morbillorum), 헤모필러스 sp. (Haemophilus sp.) (예컨대 헤모필러스 인플루엔자에 (Haemophilus influenzae), 헤모필러스 두크레이 (Haemophilus ducreyi), 헤모필러스 아에집티우스 (Haemophilus aegyptius), 헤모필러스 파라인플루엔자에 (Haemophilus parainfluenzae), 헤모필러스 헤모리티커스 (Haemophilus haemolyticus) 및 헤모필러스 파라헤모리티커스 (Haemophilus parahaemolyticus)), 헬리코박터 sp. (Helicobacter sp.) (예컨대 헬리코박터 파이로리 (Helicobacter pylori), 헬리코박터 시나에디 (Helicobacter cinaedi) 및 헬리코박터 페넬리아에 (Helicobacter fennelliae)), 킨젤라 킨지이 (Kingella kingii), 크렙시엘라 sp. (Klebsiella sp.) (예컨대 크렙시엘라 뉴모니에 (Klebsiella pneumoniae), 크렙시엘라 그라누로마티스 (Klebsiella granulomatis) 및 크렙시엘라 옥시토카 (Klebsiella oxytoca)), 락토바실러스 sp. (Lactobacillus sp.), 리스테리아 모노사이토게네스 (Listeria monocytogenes), 렙토스피라 인테로간스 (Leptospira interrogans), 레지오넬라 뉴모필라 (Legionella pneumophila), 렙토스피라 인테로간스 (Leptospira interrogans), 펩토스트렙토코커스 sp. (Peptostreptococcus sp.), 만헤이미아 헤모리티카 (Mannheimia hemolytica), 마이크로스포룸 카니스 (Microsporum canis), 모락셀라 카타랄리스 (Moraxella catarrhalis), 모르가넬라 sp. (Morganella sp.), 모빌룬커스 sp. (Mobiluncus sp.), 마이크로코커스 sp. (Micrococcus sp.), 마이코박테리움 sp. (Mycobacterium sp.) (예컨대 마이코박테리움 렙프라에 (Mycobacterium leprae), 마이코박테리움 투버쿨로시스 (Mycobacterium tuberculosis), 마이코박테리움 파라투버쿨로시스 (Mycobacterium paratuberculosis), 마이코박테리움 인트라셀루라레 (Mycobacterium intracellulare), 마이코박테리움 아비움 (Mycobacterium avium), 마이코박테리움 보비스 (Mycobacterium bovis), 및 마이코박테리움 마리눔 (Mycobacterium marinum)), 마이코플라즈마 sp. (Mycoplasma sp.) (예컨대 마이코플라즈마 뉴모니에 (Mycoplasma pneumoniae), 마이코플라즈마 호미니스 (Mycoplasma hominis), 및 마이코플라즈마 게니탈리움 (Mycoplasma genitalium)), 노카르디아 sp. (Nocardia sp.) (예컨대 노카르디아 아스테로이데스 (Nocardia asteroides), 노카르디아 시리아시조르지아 (Nocardia cyriacigeorgica) 및 노카르디아 브라실리엔시스 (Nocardia brasiliensis)), 네이세리아 sp. (Neisseria sp.) (예컨대 네이세리아 고노로에아에 (Neisseria gonorrhoeae) 및 네이세리아 메닌기티디스 (Neisseria meningitidis)), 파스튜렐라 물토시다 (Pasteurella multocida), 피티로스포룸 오르비쿨라레 (Pityrosporum orbiculare) (말라세지아 푸르푸르 (Malassezia furfur)), 플레시오모나스 시겔로이데스 (Plesiomonas shigelloides), 프레보텔라 sp. (Prevotella sp.), 포르피로모나스 sp. (Porphyromonas sp.), 프레보텔라 멜라니노게니카 (Prevotella melaninogenica), 프로테우스 sp. (Proteus sp.) (예컨대 프로테우스 불가리스 (Proteus vulgaris) 및 프로테우스 미라빌리스 (Proteus mirabilis)), 프로비덴시아 sp. (Providencia sp.) (예컨대 프로비덴시아 알칼리파시엔스 (Providencia alcalifaciens), 프로비덴시아 레트게리 (Providencia rettgeri) 및 프로비덴시아 스투아르티 (Providencia stuartii)), 슈도모나스 아에루기노사 (Pseudomonas aeruginosa), 프로피오니박테리움 아크네스 (Propionibacterium acnes), 로도코커스 에퀴 (Rhodococcus equi), 리케치아 sp. (Rickettsia sp.) (예컨대 리케치아 리케치 (Rickettsia rickettsii), 리케치아 아카리 (Rickettsia akari) 및 리케치아 프로와제키 (Rickettsia prowazekii), 오리엔티아 츠츠가무시 (Orientia tsutsugamushi) (이전: 리케치아 츠츠가무시 (Rickettsia tsutsugamushi)) 및 리케치아 티피 (Rickettsia typhi)), 로도코커스 sp. (Rhodococcus sp.), 세라티아 마르세센스 (Serratia marcescens), 스테노트로포모나스 말토필리아 (Stenotrophomonas maltophilia), 살모넬라 sp. (Salmonella sp.) (예컨대 살모넬라 엔테리카 (Salmonella enterica), 살모넬라 티피 (Salmonella typhi), 살모넬라 파라티피 (Salmonella paratyphi), 살모넬라 엔테리티디스 (Salmonella enteritidis), 살모넬라 초레라수이스 (Salmonella cholerasuis) 및 살모넬라 티피무리움 (Salmonella typhimurium)), 세라티아 sp. (Serratia sp.) (예컨대 세라티아 마르세산스 (Serratia marcesans) 및 세라티아 리퀴파시엔스 (Serratia liquifaciens)), 시겔라 sp. (Shigella sp.) (예컨대 시겔라 디센테리에 (Shigella dysenteriae), 시겔라 플렉스네리 (Shigella flexneri), 시겔라 보이디 (Shigella boydii) 및 시겔라 소네이 (Shigella sonnei)), 스타필로코커스 sp. (Staphylococcus sp.) (예컨대 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus), 스타필로코커스 에피더미스 (Staphylococcus epidermidis), 스타필로코커스 헤모리티커스 (Staphylococcus hemolyticus), 스타필로코커스 사프로피티커스 (Staphylococcus saprophyticus), 스트렙토코커스 sp. (Streptococcus sp.) (예컨대 스트렙토코커스 스트렙토코커스 뉴모니에 (Streptococcus pneumoniae) (예를 들어 클로람페니콜-내성 혈청형 4 스트렙토코커스 뉴모니에, 스펙티노마이신-내성 혈청형 6B 스트렙토코커스 뉴모니에, 스트렙토마이신-내성 혈청형 9V 스트렙토코커스 뉴모니에, 에리트로마이신-내성 혈청형 14 스트렙토코커스 뉴모니에, 옵토친-내성 혈청형 14 스트렙토코커스 뉴모니에, 리팜피신-내성 혈청형 18C 스트렙토코커스 뉴모니에, 테트라사이클린-내성 혈청형 19F 스트렙토코커스 뉴모니에, 페니실린-내성 혈청형 19F 스트렙토코커스 뉴모니에, 및 트리메토프림-내성 혈청형 23F 스트렙토코커스 뉴모니에, 클로람페니콜-내성 혈청형 4 스트렙토코커스 뉴모니에, 스펙티노마이신-내성 혈청형 6B 스트렙토코커스 뉴모니에, 스트렙토마이신-내성 혈청형 9V 스트렙토코커스 뉴모니에, 옵토친-내성 혈청형 14 스트렙토코커스 뉴모니에, 리팜피신-내성 혈청형 18C 스트렙토코커스 뉴모니에, 페니실린-내성 혈청형 19F 스트렙토코커스 뉴모니에, 또는 트리메토프림-내성 혈청형 23F 스트렙토코커스 뉴모니에), 스트렙토코커스 아가락티에 (Streptococcus agalactiae), 스트렙토코커스 무탄스 (Streptococcus mutans), 스트렙토코커스 피오게네스 (Streptococcus pyogenes), 군 A 스트렙토코키 (streptococci), 스트렙토코커스 피오게네스, 군 B 스트렙토코키, 스트렙토코커스 아가락티에, 군 C 스트렙토코키, 스트렙토코커스 안지노서스 (Streptococcus anginosus), 스트렙토코커스 에퀴스밀리스 (Streptococcus equismilis), 군 D 스트렙토코키, 스트렙토코커스 보비스 (Streptococcus bovis), 군 F 스트렙토코키, 및 스트렙토코커스 안지노서스 (Streptococcus anginosus), 군 G 스트렙토코키, 스피릴룸 미너스 (Spirillum minus), 스트렙토바실러스 모닐리포르미 (Streptobacillus moniliformi), 트레포네마 sp. (Treponema sp.) (예컨대 트레포네마 카라테움 (Treponema carateum), 트레포네마 페테누에 (Treponema petenue), 트레포네마 팔리둠 (Treponema pallidum) 및 트레포네마 엔데미쿰 (Treponema endemicum)), 트리초피톤 루브룸 (Trichophyton rubrum), T. 멘타그로피테스 (T. mentagrophytes), 트로페리마 휘펠리 (Tropheryma whippelii), 우레아플라스마 우레아리티쿰 (Ureaplasma urealyticum), 베일로넬라 sp. (Veillonella sp.), 비브리오 sp. (Vibrio sp.) (예컨대 비브리오 콜레라에 (Vibrio cholerae), 비브리오 파라헤모리티커스 (Vibrio parahemolyticus), 비브리오 불니피커스 (Vibrio vulnificus), 비브리오 파라헤모리티커스 (Vibrio parahaemolyticus), 비브리오 불니피커스 (Vibrio vulnificus), 비브리오 알기노리티커스 (Vibrio alginolyticus), 비브리오 미미커스 (Vibrio mimicus), 비브리오 홀리사에 (Vibrio hollisae), 비브리오 플루비알리스 (Vibrio fluvialis), 비브리오 메크니코비 (Vibrio metchnikovii), 비브리오 담셀라 (Vibrio damsela) 및 비브리오 푸르니시 (Vibrio furnisii)), 예르시니아 sp. (Yersinia sp.) (예컨대 예르시니아 엔테로콜리티카 (Yersinia enterocolitica), 예르시니아 페스티스 (Yersinia pestis), 및 예르시니아 슈도투버쿨로시스 (Yersinia pseudotuberculosis)) 및 잔토모나스 말토필리아 (Xanthomonas maltophilia) 중 임의의 하나 이상 (또는 이의 임의의 조합) 을 비제한적으로 포함한다.
진균
특정 예시적 실시형태에서, 미생물은 진균 또는 진균 종이다. 개시된 방법에 따라 검출할 수 있는 진균의 예는 아스퍼질러스 (Aspergillus), 블라스토마이세스 (Blastomyces), 칸디다증 (Candidiasis), 콕시디오이데스 진균증 (Coccidiodomycosis), 크립토코커스 네오포르만스 (Cryptococcus neoformans), 크립토코커스 가티, sp. (Cryptococcus gatti, sp.), 히스토플라스마 sp. (Histoplasma sp.) (예컨대 히스토플라스마 캡술라텀 (Histoplasma capsulatum)), 뉴모시스티스 sp. (Pneumocystis sp.) (예컨대 뉴모시스티스 지로벡시이 (Pneumocystis jirovecii)), 스타키보트리스 (Stachybotrys) (예컨대 스타키보트리스 카르타럼 (Stachybotrys chartarum)), 모균증 (Mucroymcosis), 스포로트릭스 (Sporothrix), 진균성 안구 감염 백선, 엑세로힐럼 (Exserohilum), 클라도스포리움 (Cladosporium) 중 임의의 하나 이상 (또는 이의 임의의 조합) 을 비제한적으로 포함한다.
특정 예시적 실시형태에서, 진균은 효모이다. 개시된 방법에 따라 검출할 수 있는 효모의 예는 아스퍼질러스 (Aspergillus) 종 (예컨대 아스퍼질러스 푸미가터스 (Aspergillus fumigatus), 아스퍼질러스 플라버스 (Aspergillus flavus) 및 아스퍼질러스 클라바터스 (Aspergillus clavatus)), 크립토코커스 sp. (Cryptococcus sp.) (예컨대 크립토코커스 네오포르만스 (Cryptococcus neoformans), 크립토코커스 가티 (Cryptococcus gattii), 크립토코커스 라우렌티이 (Cryptococcus laurentii) 및 크립토코커스 알비더스 (Cryptococcus albidus)), 제오트리컴 (Geotrichum) 종, 사카로마이세스 (Saccharomyces) 종, 한세눌라 (Hansenula) 종, 칸디다 종 (예컨대 칸디다 알비칸스 (Candida albicans), 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces) 종, 데바리오마이세스 (Debaryomyces) 종, 피키아 (Pichia) 종, 또는 이의 조합 중 하나 이상 (또는 이의 임의의 조합) 을 비제한적으로 포함한다. 특정 예시적 실시형태에서, 진균은 곰팡이이다. 곰팡이의 예는 페니실리움 (Penicillium) 종, 클라도스포리움 (Cladosporium) 종, 비소클라미스 (Byssochlamys) 종, 또는 이의 조합을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
원충
특정 예시적 실시형태에서, 미생물은 원충이다. 개시된 방법 및 장치에 따라 검출할 수 있는 원충의 예는 유글레노조아 (Euglenozoa), 헤테로로보세아 (Heterolobosea), 디플로모나디다 (Diplomonadida), 아메보조아 (Amoebozoa), 블라스토시스틱 (Blastocystic), 및 아피콤플렉사 (Apicomplexa) 중 임의의 하나 이상 (또는 이의 임의의 조합) 을 비제한적으로 포함한다. 예시적인 유글레노조아 (Euglenoza) 는 트리파노소마 크루지 (Trypanosoma cruzi) (샤가스 병), T. 브루세이 감비엔스 (T. brucei gambiense), T. 브루세이 로데시엔스 (T. brucei rhodesiense), 리슈마니아 브라질리엔시스 (Leishmania braziliensis), L. 인판텀 (L. infantum), L. 멕시카나 (L. mexicana), L. 마조르 (L. major), L. 트로피카 (L. tropica), 및 L. 도노바니 (L. donovani) 를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 예시적인 헤테로로보세아 (Heterolobosea) 는 내글레리아 파울러리 (Naegleria fowleri) 를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 예시적인 디플로모나디드 (Diplomonadid) 는 지아르디아 인테스티날리스 (Giardia intestinalis) (G. 람블리아 (G. lamblia), G. 듀오데날리스 (G. duodenalis)) 를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 예시적인 아메보조아 (Amoebozoa) 는 아칸타메바 카스텔라니이 (Acanthamoeba castellanii), 발라무티아 마드릴라리스 (Balamuthia madrillaris), 엔타메바 히스톨리티카 (Entamoeba histolytica) 를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 예시적인 블라스토시스트 (Blastocystis) 는 블라스토시스틱 호미니스 (Blastocystic hominis) 를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 예시적인 아피콤플렉사 (Apicomplexa) 는 바베시아 미크로티 (Babesia microti), 크립토스포리디움 파르븀 (Cryptosporidium parvum), 시클로스포라 카예타넨시스 (Cyclospora cayetanensis), 플라스모듐 팔시파룸 (Plasmodium falciparum), P. 비박스 (P. vivax), P. 오발 (P. ovale), P. 말라리에 (P. malariae), 및 톡소플라즈마 곤디이 (Toxoplasma gondii), 바베시아 미크로티 (Babesia microti), 크립토스포리디움 파르븀 (Cryptosporidium parvum), 시클로스포라 카예타넨시스 (Cyclospora cayetanensis), 플라스모듐 팔시파룸 (Plasmodium falciparum), P. 비박스 (P. vivax), P. 오발 (P. ovale), P. 말라리에 (P. malariae), 및 톡소플라즈마 곤디이 (Toxoplasma gondii) 를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.
기생충
특정 예시적 실시형태에서, 미생물은 기생충이다. 개시된 방법에 따라 검출할 수 있는 기생충의 예는 온코세르카 (Onchocerca) 종 및 플라스모듐 (Plasmodium) 종 중 하나 이상 (또는 이의 임의의 조합) 을 비제한적으로 포함한다.
바이러스
특정 예시적 실시형태에서, 본원에서 개시된 시스템, 장치, 및 방법은 샘플에서 바이러스를 검출하는 것에 관한 것이다. 본원에 개시된 실시형태는 (예를 들어, 대상체 또는 식물의) 바이러스 감염을 검출하거나, 단일 뉴클레오티드 다형성이 상이한 바이러스 균주를 포함하여, 바이러스 균주의 결정에 사용될 수 있다. 바이러스는 DNA 바이러스, RNA 바이러스, 또는 레트로바이러스일 수 있다. 본 발명으로 유용한 바이러스의 비제한적인 예는 에볼라, 홍역, SARS, 치쿤구니아, 간염, 마르부르크, 황열, MERS, 뎅기, 라싸, 인플루엔자, 랩도바이러스 또는 HIV 를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 간염 바이러스는 A 형 바이러스, B 형 바이러스 또는 C 형 바이러스를 포함할 수 있다. 인플루엔자 바이러스는 예를 들어, A 형 인플루엔자 또는 B 형 인플루엔자를 포함할 수 있다. HIV 는 HIV 1 또는 HIV 2 를 포함할 수 있다. 특정 예시적 실시형태에서, 바이러스 서열은 인간 호흡기 세포융합 바이러스, 수단 에볼라 바이러스, 분디분교 바이러스, 타이 포레스트 에볼라 바이러스, 레스톤 에볼라 바이러스, 아키모타, 애데스 플라비바이러스, 아구아카테 바이러스, 아까바네 바이러스, 알레티노피드 렙타레나바이러스, 알파우아요 맘마레나바이러스, 아마파리 엠마레나 바이러스, 안데스 바이러스, 아포이 바이러스, 아라반 바이러스, 아로아 바이러스, 아룸워트 바이러스, 대서양 연어 파라믹소바이러스, 오스트레일리아 박쥐 릿사바이러스, 조류 보르나바이러스, 조류 메타뉴모바이러스, 조류 파라믹소바이러스, 펭귄 또는 포클랜드섬 바이러스, BK 폴리오마바이러스, 바가자 바이러스, 반나 바이러스, 박쥐 헤페바이러스, 박쥐 사포바이러스, 베어 캐년 맘마레나바이러스, 베일롱 바이러스, 베타코로노아바이러스, 베타파필로마바이러스 1-6, 반자 바이러스, 보켈로 박쥐 릿사바이러스, 보르나병 바이러스, 버번 바이러스, 소 헤파시바이러스, 소 파라인플루엔자 바이러스 3, 소 호흡기 세포융합 바이러스, 브라조란 바이러스, 부니암웨라 바이러스, 칼리시바이러스과 바이러스, 캘리포니아 뇌염 바이러스, 칸디루 바이러스, 개 디스템퍼 바이러스, 개 뉴모바이러스, 체다 바이러스, 세포융합제 바이러스, 세타시안 모르빌리바이러스, 찬디푸라 바이러스, 챠오양 바이러스, 차파레 맘마레나바이러스, 치쿤구니아 바이러스, 콜로버스 원숭이 파필로마바이러스, 콜로라도 진드기열 바이러스, 우두 바이러스, 크림-콩고 출혈열 바이러스, 쿨렉스 플라비바이러스, 쿠픽시 맘마레나바이러스, 뎅기 바이러스, 도브라바-벨그라데 바이러스, 동강 바이러스, 두그베 바이러스, 듀벤헤이즈 바이러스, 동부 말 뇌염 바이러스, 엔테베 박쥐 바이러스, 장바이러스 A-D, 유럽 박쥐 릿사바이러스 1-2, 이야크 바이러스, 고양이 모빌리바이러스, 페르-드-랑스 파라믹소바이러스, 피츠로이 리버 바이러스, 플라비바이러스과 바이러스, 플렉살 맘마레나바이러스, GB 바이러스 C, 가이로 바이러스, 제미서큘러바이러스, 거위 파라믹소바이러스 SF02, 그레이트 아일랜드 바이러스, 구아나리토 맘마레나바이러스, 한탄 바이러스, 한타바이러스 Z10, 하트랜드 바이러스, 헨드라 바이러스, A/B/C/E 형 간염 바이러스, 델타형 간염 바이러스, 인간 보카바이러스, 인간 코로나바이러스, 인간 내인성 레트로바이러스 K, 인간 장 코로나바이러스, 인간 생식기-연관 원형 DNA 바이러스-1, 인간 헤르페스바이러스 1-8, 인간 면역결핍 바이러스 1/2, 인간 마스타데노바이러스 A-G, 인간 파필로마바이러스, 인간 파라인플루엔자 바이러스 1-4, 인간 파라에코바이러스, 인간 피코비르나바이러스, 인간 스마코바이러스, 이코마 릿사바이러스, 일헤우스 바이러스, 인플루엔자 A-C, 입피 맘마레나바이러스, 이르쿠트 바이러스, J-바이러스, JC 폴리오마바이러스, 일본 뇌염 바이러스, 후닌 맘마레나바이러스, KI 폴리오마바이러스, 카디피로 바이러스, 카미티 리버 바이러스, 케두구 바이러스, 후잔트 바이러스, 코코베라 바이러스, 키아사누 삼림병 바이러스, 라고스 박쥐 바이러스, 란가트 바이러스, 라싸 맘마레나바이러스, 라티노 맘마레나바이러스, 레오파즈 힐 바이러스, 랴오닝 바이러스, 류간 바이러스, 로우비 바이러스, 루핑 일 바이러스, 룰요 맘마레나바이러스, 루나 맘마레나바이러스, 렁크 바이러스, 림프구성 맥락수막염 맘마레나바이러스, 릿사바이러스 오제르노에, MSSI2＼.225 바이러스, 마츄포 맘마레나바이러스, 마마스트로바이러스 1, 만자닐라 바이러스, 마푸에라 바이러스, 마르부르그 바이러스, 마야로 바이러스, 홍역 바이러스, 메낭글 바이러스, 메르카데오 바이러스, 메르켈 세포 폴리오마바이러스, 중동 호흡기 증후군 코로나바이러스, 모발라 맘마레나바이러스, 모독 바이러스, 모이장 바이러스, 모콜로 바이러스, 원두증 바이러스, 몬타나 미오티스 류코엔찰리티스 바이러스, 모페이아 라사 바이러스 재편성체 29, 모페이아 맘마레나바이러스, 모로고로 바이러스, 모스만 바이러스, 유행성이하선염 바이러스, 쥐과 폐렴 바이러스, 머레이 밸리 뇌염 바이러스, 나리바 바이러스, 뉴캐슬병 바이러스, 니파 바이러스, 노르워크 바이러스, 노르웨이 박쥐 헤파시바이러스, 은타야 바이러스, 오니옹-니옹 바이러스, 올리베로스 맘마레나바이러스, 옴스크 출혈열 바이러스, 오로퓨스 바이러스, 파라인플루엔자 바이러스 5, 파라나 맘마레나바이러스, 파라마타 리버 바이러스, 가성 우역 바이러스, 피찬드 맘마레나바이러스, 피코르나바이러스과 바이러스, 피리탈 맘마레나바이러스, 피시헤페바이러스 A, 돼지 파라인플루엔자 바이러스 1, 돼지 루불라바이러스, 파와산 바이러스, 영장류 T-림프친화성 바이러스 1-2, 영장류 적혈파보바이러스 1, 푼타 토로 바이러스, 푸울말라 바이러스, 꽝빈 바이러스, 공수병 바이러스, 라즈단 바이러스, 파충류 보르나바이러스 1, 리노바이러스 A-B, 리프트 밸리 발열 바이러스, 우역 바이러스, 리오 브라보 바이러스, 설치류 토크 테노 바이러스, 설치류 헤파시바이러스, 로스 리버 바이러스, 로타바이러스 A-I, 로얄 팜 바이러스, 루벨라 바이러스, 사비아 맘마레나바이러스, 세일럼 바이러스, 모래파리열 나폴리 바이러스, 모래파리열 시칠리아 바이러스, 사포로 바이러스, 사투페리 바이러스, 물개 아넬로바이러스, 셈리키 포레스트 바이러스, 센다이 바이러스, 서울 바이러스, 세픽 바이러스, 중증 급성 호흡기 증후군-관련 코로나바이러스, 혈소판감소증 증후군 수반 중증 발열 바이러스, 샤몬다 바이러스, 시모니 박쥐 바이러스, 슈니 바이러스, 심부 바이러스, 원숭이 토크 테노 바이러스, 시미언 바이러스 40-41, 신 놈브레 바이러스, 신드비스 바이러스, 소형 아넬로바이러스, 소수가 바이러스, 스페인 염소 뇌염 바이러스, 스폰드웨니 바이러스, 세인트 루이스 뇌염 바이러스, 선샤인 바이러스, TTV-유사 미니 바이러스, 타카리브 맘마레나바이러스, 타일라 바이러스, 타마나 박쥐 바이러스, 타미아미 맘마레나바이러스, 템부수 바이러스, 토고토 바이러스, 토타팔라얌 바이러스, 진드기-매개 뇌염 바이러스, 티오만 바이러스, 토가바이러스과 바이러스, 토크 테노 카니스 바이러스, 토크 테노 두루쿨리 바이러스, 토크 테노 펠리스 바이러스, 토크 테노 미디 바이러스, 토크 테노 수스 바이러스, 토크 테노 타마린 바이러스, 토크 테노 바이러스, 토크 테노 잘로퍼스 바이러스, 투호코 바이러스, 툴라 바이러스, 투파이아 파라믹소바이러스, 우수투 바이러스, 유우쿠니에미 바이러스, 백시니아 바이러스, 바리올라 바이러스, 베네수엘라 말 뇌염 바이러스, 수포성 구내염 인디아나 바이러스, WU 폴리오마바이러스, 웨셀스브론 바이러스, 서부 코카시안 박쥐 바이러스, 웨스트나일 바이러스, 서부 말 뇌염 바이러스, 화이트워터 아로요 맘마레나바이러스, 황열병 바이러스, 요코세 바이러스, 유그 보그다노박 바이러스, 자이르 에볼라바이러스, 지카 바이러스, 또는 자이고사카로마이세스 바일리 바이러스 Z 바이러스 서열일 수 있다. 검출할 수 있는 RNA 바이러스의 예는 코로나바이러스과 바이러스, 피코르나바이러스과 바이러스, 칼리시바이러스과 바이러스, 플라비바이러스과 바이러스, 토가바이러스과 바이러스, 보르나바이러스과, 필로바이러스과, 파라믹소바이러스과, 뉴모바이러스과, 랩도바이러스과, 아레나바이러스과, 부니아바이러스과, 오르쏘믹소바이러스과, 또는 델타바이러스 중 하나 이상 (또는 이의 임의의 조합) 을 포함한다. 특정 예시적 실시형태에서, 바이러스는 코로나바이러스, SARS, 폴리오바이러스, 리노바이러스, A 형 간염 바이러스, 노르워크 바이러스, 황열병 바이러스, 웨스트나일 바이러스, C 형 간염 바이러스, 뎅기열 바이러스, 지카 바이러스, 루벨라 바이러스, 로스 리버 바이러스, 신드비스 바이러스, 치쿤구니아 바이러스, 보르나병 바이러스, 에볼라 바이러스, 마르부르그 바이러스, 홍역 바이러스, 유행성이하선염 바이러스, 니파 바이러스, 헨드라 바이러스, 뉴캐슬병 바이러스, 인간 호흡기 세포융합 바이러스, 공수병 바이러스, 라싸 바이러스, 한타바이러스, 크림-콩고 출혈열 바이러스, 인플루엔자, 또는 D 형 간염 바이러스이다.
특정 예시적 실시형태에서, 바이러스는 담배 모자이크 바이러스 (TMV), 토마토 반점 위조 바이러스 (TSWV), 오이 모자이크 바이러스 (CMV), 감자 바이러스 Y (PVY), RT 바이러스 콜리플라워 모자이크 바이러스 (CaMV), 자두 곰보 바이러스 (PPV), 브롬 모자이크 바이러스 (BMV), 감자 바이러스 X (PVX), 감귤 트리스테자 바이러스 (CTV), 보리 황화 위축 바이러스 (BYDV), 감자 잎말림 바이러스 (PLRV), 토마토 덤불 위축 바이러스 (TBSV), 벼 퉁그로 구형 바이러스 (RTSV), 벼 누렁 얼룩 바이러스 (RYMV), 흰잎 벼 바이러스 (RHBV), 옥수수 라야도 피노 바이러스 (MRFV), 옥수수 난장이 모자이크 바이러스 (MDMV), 사탕수수 모자이크 바이러스 (SCMV), 고구마 모틀 바이러스 (SPFMV), 고구마 선켄 베인 클로스테로바이러스 (SPSVV), 포도 부채잎 바이러스 (GFLV), 포도 바이러스 A (GVA), 포도 바이러스 B (GVB), 포도 잎반점 바이러스 (GFkV), 포도 잎말림-연관 바이러스-1, 포도 잎말림-연관 바이러스-2, 및 포도 잎말림-연관 바이러스-3 (GLRaV-1, GLRaV-2, 및 GLRaV-3), 아라비스 모자이크 바이러스 (ArMV), 또는 루페스트리스 고접병-연관 바이러스 (RSPaV) 를 포함하는 군으로부터 선택되는 식물 바이러스일 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 표적 RNA 분자는 상기 병원체의 일부이거나 상기 병원체의 DNA 분자로부터 전사된다. 예를 들어, 표적 서열은 RNA 바이러스의 게놈에 포함될 수 있다. CRISPR 이펙터 단백질은 상기 병원체가 상기 식물을 감염시키거나 감염시켰다면, 상기 식물 중 상기 병원체의 상기 표적 RNA 분자를 가수분해시키는 것이 더 바람직하다. 따라서 CRISPR 시스템 (또는 이의 완료에 필요한 부분) 이 치료적으로, 즉 감염이 일어난 이후에, 또는 예방적으로, 즉 감염이 일어나기 전에 적용되는 경우 둘 모두에서, 식물 병원체 유래 표적 RNA 분자를 절단할 수 있는 것이 바람직하다.
특정 예시적 실시형태에서, 바이러스는 레트로바이러스일 수 있다. 본원에 개시된 실시형태를 사용하여 검출할 수 있는 예시적인 레트로바이러스는 알파레트로바이러스, 베타레트로바이러스, 감마레트로바이러스, 델타레트로바이러스, 엡실론레트로바이러스, 렌티바이러스, 스푸마바이러스의 바이러스 속, 또는 메타바이러스과, 슈도바이러스과, 및 레트로바이로스과 (HIV 포함), 헤파드나바이러스과 (B 형 간염 바이러스 바이러스 포함), 및 콜리모바이러스과 (콜리플라워 모자이크 바이러스 포함) 의 바이러스과 중 하나 이상 또는 이의 임의의 조합을 포함한다.
특정 예시적 실시형태에서, 바이러스는 DNA 바이러스이다. 본원에 개시된 실시형태를 사용하여 검출할 수 있는 예시적인 DNA 바이러스는 그 중에서도, 미오바이러스과, 포도바이러스과, 시포바이러스과, 알로헤르페스바이러스과, 헤르페스바이러스과 (인간 헤르페스 바이러스 및 바리셀라 조스터 바이러스 포함), 말로코헤르페스바이러스과, 리포트릭스바이러스과, 루디바이러스과, 아데노바이러스과, 암풀라바이러스과, 아스코바이러스과, 아스파르바이러스과 (아프리카 돼지 열병 바이러스 포함), 배큘로바이러스과, 시카우다바이러스과, 클라바바이러스과, 코르티코바이러스과, 푸셀로바이러스과, 글로불로바이러스과, 굿타바이러스과, 히트로사바이러스과, 이리도바이러스과, 마르세이유바이러스과, 미미바이러스과, 누디바이러스과, 니마바이러스과, 판도라바이러스과, 파필로마바이러스과, 피코드나바이러스과, 플라스마바이러스과, 폴리드나바이러스, 폴리오마바이러스과 (시미언 바이러스 40, JC 바이러스, BK 바이러스 포함), 폭스바이러스과 (우두 및 천연두 포함), 스파에롤리포바이러스과, 텍티바이러스과, 투리바이러스과, 디노드나바이러스, 살터프로바이러스, 리지도바이러스의 바이러스과 중 하나 이상 (또는 이의 임의의 조합) 을 포함한다. 일부 실시형태에서, 박테리아 감염을 갖는 것으로 의심되는 대상체에서 종-특이적 박테리아 감염을 진단하는 방법은 대상체로부터 박테리아 리보솜 리보핵산을 포함하는 샘플을 수득하는 단계; 샘플을 기재된 하나 이상의 프로브와 접촉시키는 단계, 및 샘플에 존재하는 박테리아 리보솜 리보핵산 서열과 프로브 간 하이브리드화를 검출하는 단계로서 설명되고, 여기서 하이브리드화의 검출은 대상체가 에스케리키아 콜라이 (Escherichia coli), 클렙시엘라 뉴모니아 (Klebsiella pneumoniae), 슈도모나스 애루지노사 (Pseudomonas aeruginosa), 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus), 아시네토박터 바우마니 (Acinetobacter baumannii), 칸디다 알비칸스 (Candida albicans), 엔테로박터 클로아카에 (Enterobacter cloacae), 엔테로코커스 파에칼리스 (Enterococcus faecalis), 엔테로코커스 파에시움 (Enterococcus faecium), 프로테우스 미라빌리스 (Proteus mirabilis), 스타필로코커스 아갈락티아 (Staphylococcus agalactiae), 또는 스타필로코커스 말토필리아 (Staphylococcus maltophilia) 또는 이의 조합으로 감염된 것을 의미한다.
말라리아 검출 및 모니터링
말라리아는 플라스모듐 (Plasmodium) 기생충에 의해 야기되는 모기-매개 병상이다. 이 기생충은 감염된 암컷 아노펠레스 (Anopheles) 모기에게 물리는 것을 통해 사람에게 확산된다. 5 종의 플라스모듐 종이 인간에서 말라리아를 야기시킨다: 플라스모듐 팔시파룸 (Plasmodium falciparum), 플라스모듐 비박스 (Plasmodium vivax), 플라스모듐 오발 (Plasmodium ovale), 플라스모듐 말라리에 (Plasmodium malariae), 및 플라스모듐 크노우레시 (Plasmodium knowlesi). 그들 중에서, 세계 보건 기구 (WHO) 에 따르면, 플라스모듐 팔시파룸 및 플라스모듐 비박스가 가장 큰 위협의 원인이다. P. 팔시파룸 (P. falciparum) 은 아프리카 대륙에서 가장 우세한 말라리아 기생충이고 전세계적으로 대부분의 말라리아-관련 사망의 원인이다. P. 비박스 (P. vivax) 는 사하라 사막 남부 아프리카 외부의 대부분의 국가에서 우세한 말라리아 기생충이다.
2015 년에, 91 개 국가 및 지역에서 말라리아 전파가 계속 진행되었었다. 최근 WHO 가 추산한 바에 따르면, 2015 년에 2 억 1,200 만 건의 말라리아가 발생하였고, 429 000 명이 사망하였다. 말라리아 전파가 높은 지역에서, 5 세 이하의 어린이가 특히 감염, 질병 및 사망에 걸리기 쉽고, 전체 말라리아 사망 중 2/3 (70%) 이상이 이 연령군에서 발생한다. 2010 년 내지 2015 년 사이에, 5 세 이하 말라리아 사망률은 전세계적으로 29% 로 감소되었다. 그러나, 말라리아는 2 분마다 어린이의 생명을 앗아가서, 여전히 5 세 이하 어린이의 주요 사망인자로 남아있다.
WHO 가 설명하는 바와 같이, 말라리아는 급성 열병이다. 비면역 개체에서, 증상은 감염성 모기 물림 이후 7 일 또는 그 이후에 나타난다. 최초 증상 - 발열, 두통, 오한 및 구토 - 은 약할 수 있어서 말라리아로 인식하는 것이 어려울 수 있지만, 24 시간 이내에 치료하지 않으면, P. 팔시파룸 말라리아는 중증 질병으로 진행될 수 있고, 종종 사망을 초래할 수 있다.
중증 말라리아에 걸린 어린이에게는 빈번하게 하기 증상 중 하나 이상이 발생된다: 중증 빈혈증, 대사성 산증과 관련된 호흡 곤란, 또는 뇌 말라리아. 성인에서, 다기관 관여가 또한 빈번하다. 말라리아 풍토병 지역에서, 사람들은 부분 면역성이 생겨서, 무증상성 감염이 발생될 수 있다.
신속하고 효율적인 진단 검사의 개발은 공중 위생과 높은 관련성이 있다. 실제로, 말라리아의 조기 진단 및 치료는 질환을 감소시키고 사망을 방지할 뿐만 아니라 말라리아 전파를 감소시키는데 기여한다. WHO 권고에 따라서, 의심되는 말라리아의 모든 사례는 치료 투여 전에 기생충-기반 진단 검사 (특히 신속한 진단 검사 사용) 를 사용하여 확진되어야만 한다 (["WHO Guidelines for the treatment of malaria", 제 3 판, 2015 년 4 월 출간] 참조).
항말라리아 요법에 대한 내성은 치료 전략을 대폭적으로 감소시키는 중대한 건강 문제를 의미한다. 실제로, WHO 웹사이트에 보고된 바와 같이, 이전 세대 약물, 예컨대 클로로퀸 및 술파독신/피리메타민 (SP) 에 대한 P. 팔시파룸의 내성은 1950 년대 및 1960 년대에 널리 퍼지게 되었고, 말라리아 방제 노력을 약화시키고 어린이 생존 획득을 후퇴시켰다. 따라서, WHO 는 항말라리아 약제 내성의 일상적인 모니터링을 권고한다. 실제로, 정확한 진단은 부적절한 치료를 피할 수 있고 항말라리아 약물에 대한 내성 확대를 제한할 수 있다.
이러한 맥락에서, 2015 년 5 월에 세계 보건 총회가 채택한 - 말라리아 2016-2030 에 대한 WHO 세계 기술 전략 (WHO Global Technical Strategy for Malaria 2016-2030) 은 모든 말라리아-풍토병 국가에 기술적 체계를 제공한다. 이것은 그들이 말라리아 방제 및 박멸에 대한 작업을 하면서 지역 및 국가 프로그램을 안내 및 지원하고자 하는 것이다. 전략은 다음을 포함하여, 야심적이지만 달성가능한 세계적 목표를 설정한다:
ㆍ 2030 년까지 적어도 90% 까지 말라리아 사례 발병률 감소.
ㆍ 2030 년까지 적어도 90% 까지 말라리아 사망률 감소.
ㆍ 2030 년까지 적어도 35 개 국가에서 말라리아 박멸.
ㆍ 모든 말라리아 청정 국가에서 말라리아의 부활 방지.
이러한 전략은 2 년에 걸친 광범위한 협의 과정의 결과였으며 70 개 회원국의 400 명이 넘는 기술 전문가의 참여가 수반되었다. I이것은 3 가지 핵심 축을 기반으로 한다:
ㆍ 말라리아, 예방, 진단 및 치료에 대한 보편적 접근 보장;
ㆍ 말라리아, 예방, 진단 및 치료에 대한 보편적 접근 보장
ㆍ 말라리아 감시를 핵심 개입으로 전환.
플라스모듐에 대한 치료는 아릴-아미노 알코올 예컨대 퀴닌 또는 퀴닌 유도체 예컨대 클로로퀸, 아모디아퀸, 메플로퀸, 피페라퀸, 루메판트린, 프리마퀸; 친유성 히드록시나프토퀴논 유사체, 예컨대 아토바퀀; 항엽산 약제, 예컨대 술파 약제 술파독신, 답손 및 피리메타민; 프로구아닐; 아토바퀀/프로구아닐 병용; 아테미신 약제; 및 이의 조합을 포함한다.
모기-매개 병원체의 존재에 대해 진단하는 표적 서열은 그 게놈 유래 서열을 포함하여, 플라스모듐 (Plasmodium), 특히 인간에 영향을 미치는 플라스모디아 (Plasmodia) 종 예컨대 플라스모듐 팔시파룸 (Plasmodium falciparum), 플라스모듐 비박스 (Plasmodium vivax), 플라스모듐 오발 (Plasmodium ovale), 플라스모듐 말라리에 (Plasmodium malariae), 및 플라스모듐 크노우레시 (Plasmodium knowlesi) 의 존재에 대해 진단하는 서열을 포함한다.
플라스모듐, 특히 인간에 영향을 미치는 플라스모디아 종, 예컨대 플라스모듐 팔시파룸, 플라스모듐 비박스, 플라스모듐 오발, 플라스모듐 말라리에, 및 플라스모듐 크노우레시에 대한 치료에 대한 약제 내성을 모니터링하기 위한 진단하는 표적 서열.
추가 표적 서열은 플라스모듐 기생충에게 필수적인 생물학적 과정에 관여되는 단백질 및 특히 수송체 단백질, 예컨대 약제/대사산물 수송체 패밀리 유래 단백질, 기질 전좌에 관여되는 ATP-결합 카세트 (ABC) 단백질, 예컨대 ABC 수송체 C 서브패밀리 또는 Na+/H+ 교환체, 막 글루타티온 S-트랜스퍼라아제; 폴레이트 경로에 관여되는 단백질, 예컨대 디히드로프테로에이트 신타아제, 디히드로폴레이트 리덕타아제 활성 또는 디히드로폴레이트 리덕타아제-티미딜레이트 신타아제; 및 내부 미토콘트리아 막에 걸친 양자의 전좌에 관여되는 단백질 및 특히 시토크롬 b 복합체를 코딩하는 표적 분자/핵산 분자를 포함하는 서열을 포함한다. 추가의 표적은 또한 헴 폴리머라아제를 코딩하는 유전자(들) 를 포함할 수 있다.
추가 표적 서열은 P. 팔시파룸 클로로퀸 내성 수송체 유전자 (pfcrt), P. 팔시파룸 다제 내성 수송체 1 (pfmdr1), P. 팔시파룸 다제 내성-연관된 단백질 유전자 (Pfmrp), P. 팔시파룸 Na+/H+ 교환체 유전자 (pfnhe), P. 팔시파룸 이출 단백질 1 을 코딩하는 유전자, P. 팔시파룸 Ca2+ 수송 6 (pfatp6); P. 팔시파룸 디히드로프테로에이트 신타아제 (pfdhps), 디히드로폴레이트 리덕타아제 활성 (pfdhpr) 및 디히드로폴레이트 리덕타아제-티미딜레이트 신타아제 (pfdhfr) 유전자, 시토크롬 b 유전자, gtp 시클로히드롤라아제 및 Kelch13 (K13) 유전자를 비롯하여 다른 플라스모듐 종에서 그들의 기능적 이종성 유전자로부터 선택될 수 있는, 필수적인 생물학적 과정에 관여되는 단백질을 코딩하는 표적 분자/핵산 분자를 포함한다.
수많은 돌연변이, 특히 단일 점 돌연변이는 현행 치료의 표적이며 특별한 내성 표현형과 연관된 단백질에서 식별되었다. 따라서, 본 발명은 모기-매개 기생충, 예컨대 플라스모듐의 다양한 내성 표현형의 검출을 가능하게 한다.
본 발명은 표적 핵산/분자에서 하나 이상의 돌연변이(들) 및 특히 하나 이상의 단일 뉴클레오티드 다형성을 검출하는 것을 가능하게 한다. 따라서, 하기의 돌연변이 중 임의의 하나 또는 그들의 조합은 약제 내성 마커로서 사용될 수 있으며 본 발명에 따라 검출될 수 있다.
P. 팔시파룸 K13 의 단일 점 돌연변이는 위치 252, 441, 446, 449, 458, 493, 539, 543, 553, 561, 568, 574, 578, 580, 675, 476, 469, 481, 522, 537, 538, 579, 584 및 719 에서 하기의 단일 점 돌연변이, 및 특히 돌연변이 E252Q, P441L, F446I, G449A, N458Y, Y493H, R539T, I543T, P553L, R561H, V568G, P574L, A578S, C580Y, A675V, M476I; C469Y; A481V; S522C; N537I; N537D; G538V; M579I; D584V; 및 H719N 을 포함한다. 이들 돌연변이는 일반적으로 아르테미신 약제 내성 표현형과 연관된다 (Artemisinin and artemisinin-based combination therapy resistance, April 2016 WHO/HTM/GMP/2016.5).
P. 팔시파룸 디히드로폴레이트 리덕타아제 (DHFR) (PfDHFR-TS, PFD0830w) 에서, 중요한 다형성은 위치 108, 51, 59 및 164 에 돌연변이, 특히 피리메타민에 대한 내성을 조정하는 108D, 164L, 51I 및 59R 을 포함한다. 다른 다형성은 또한 술파독신에 대한 내성과 연관된 437G, 581G, 540E, 436A 및 613S 를 포함한다. 추가적인 관찰된 돌연변이는 Ser108Asn, Asn51Ile, Cys59Arg, Ile164Leu, Cys50Arg, Ile164Leu, Asn188Lys, Ser189Arg 및 Val213Ala, Ser108Thr 및 Ala16Val 을 포함한다. 돌연변이 Ser108Asn, Asn51Ile, Cys59Arg, Ile164Leu, Cys50Arg, Ile164Leu 는 특히 피리메타민 기반 요법 및/또는 클로로구아닌-답손 병용 요법 내성과 연관된다. 시클로구아닐 내성은 이중 돌연변이 Ser108Thr 및 Ala16Val 과 연관되는 것으로 보인다. dhfr 의 증폭은 또한 내성, 특히 피리메타민 내성과 높은 관련성이 있을 수 있다.
P. 팔시파룸 디히드로프테로에이트 신타아제 (DHPS) (PfDHPS, PF08_0095) 에서, 중요한 다형성은 위치 436, 437, 581 및 613 에서의 돌연변이 Ser436Ala/Phe, Ala437Gly, Lys540Glu, Ala581Gly 및 Ala613Thr/Ser 을 포함한다. 위치 581 및/또는 613 의 다형성은 또한 술파독신-피리메타민 기반 요법에 대한 내성과 연관되었다.
P. 팔시파룸 클로로퀸-내성 수송체 (PfCRT) 에서, 위치 76 의 다형성, 특히 돌연변이 Lys76Thr 은 클로로퀸에 대한 내성과 연관된다. 추가 다형성은 클로로퀸 내성과 연관될 수 있는 Cys72Ser, Met74Ile, Asn75Glu, Ala220Ser, Gln271Glu, Asn326Ser, Ile356Thr 및 Arg371Ile 를 포함한다. PfCRT 는 또한 잔기 S33, S411 및 T416 에서 인산화되고, 이것은 단백질의 특이성 또는 수송 활성을 조절할 수 있다.
P. 팔시파룸 다제-내성 수송체 1 (PfMDR1) (PFE1150w) 에서, 위치 86, 184, 1034, 1042 에서의 다형성, 특히 Asn86Tyr, Tyr184-Phe, Ser1034Cys, Asn1042Asp 및 Asp1246Tyr 이 식별되었고 루메판트린, 아르테미시닌, 퀴닌, 메플로퀸, 할로판트린 및 클로로퀸에 대한 감수성에 영향을 미친다고 보고되었다. 추가적으로, PfMDR1 의 증폭은 루메판트린, 아르테미시닌, 퀴닌, 메플로퀸 및 할로판트린에 대한 감소된 감수성과 연관되고, PfMDR1 의 탈증폭은 클로로퀸 내성의 증가를 초래한다. pfmdr1 의 증폭이 또한 검출될 수 있다. PfMDR1 의 인산화 상태가 또한 높은 관련성이 있다.
P. 팔시파룸 다제-내성 연관 단백질 (PfMRP) (유전자 참조 PFA0590w) 에서, 위치 191 및/또는 437 에서의 다형성, 예컨대 Y191H 및 A437S 가 식별되었고 클로로퀸 내성 표현형과 연관되었다.
P. 팔시파룸 NA+/H+ 교환체 (PfNHE) (ref PF13_0019) 에서, 미세부수체 ms4670 에서 DNNND 의 증가된 반복성은 퀴닌 내성에 대한 마커일 수 있다.
시토크롬 be 유전자 (cytb, mal_mito_3) 에 의해 인코딩되는 시토크롬 b 단백질의 유비퀴놀 결합 부위를 변경시키는 돌연변이는 아토바퀀 내성과 연관된다. 위치 26, 268, 276, 133 및 280 의 돌연변이, 특히 Tyr26Asn, Tyr268Ser, M1331 및 G280D 는 아토바퀀 내성과 연관될 수 있다.
예를 들어 P. 비박스에서, Pf MDR1 의 상동체인 PvMDR1 의 돌연변이는 클로로퀸 내성와 연관되는데, 특히 위치 976 의 다형성 예컨대 돌연변이 Y976F 이다.
상기 돌연변이는 단백질 서열과 관련하여 정의된다. 그러나, 당업자는 또한 핵산 표적 서열로서 식별되는, SNPS 를 포함하는, 상응하는 돌연변이를 결정할 수 있다.
다른 식별된 약제-내성 마커는 예를 들어, 그 내용이 본원에 참조로 포함되는, ["Susceptibility of Plasmodium falciparum to antimalarial drugs (1996-2004)"; WHO; Artemisinin and artemisinin-based combination therapy resistance (April 2016 WHO/HTM/GMP/2016.5); "Drug-resistant malaria: molecular mechanisms and implications for public health" FEBS Lett. 2011 Jun 6;585(11):1551-62. doi:10.1016/j.febslet.2011.04.042. Epub 2011 Apr 23. Review. PubMed PMID: 21530510] 에 기재된 바와 같이 당분야에 공지되어 있다.
본 발명에 따라 검출할 수 있는 폴리펩티드와 관련하여, 본원에 언급된 모든 유전자의 유전자 생성물은 표적으로서 사용될 수 있다. 상응하게, 이러한 폴리펩티드는 종 식별, 유형분석 및/또는 약제 내성의 검출에 사용될 수 있다는 것이 고려된다.
특정 예시적 실시형태에서, 본원에 개시된 시스템, 장치 및 방법은 샘플, 예컨대 대상체로부터 수득된 생물학적 샘플 중의 하나 이상의 모기-매개 기생충의 존재를 검출하는 것에 관한 것이다. 특정 예시적 실시형태에서, 기생충은 종 플라스모듐 팔시파룸, 플라스모듐 비박스, 플라스모듐 오발, 플라스모듐 말라리에 또는 플라스모듐 크노우레시로부터 선택될 수 있다. 따라서, 본원에 개시된 방법은 기생충 종의 신속 식별, 기생충의 존재 및 기생충 형태 (예를 들어 다양한 단계의 감염 및 기생충 생활-주기, 예컨대 적혈구-외부 주기, 적혈구내 주기, 포자생식 주기에 상응; 기생충 형태는 메로조이트, 스포로조이트, 스키존트, 가메토사이트를 포함) 의 모니터링; 특정 표현형 (예를 들어, 병원체 약제 내성) 의 검출, 질환 진행 및/또는 대발생의 모니터링, 및 치료 (약제) 스크리닝을 필요로 하는 다른 방법과 함께 다른 방법에서 (또는 조합으로) 사용을 위해 적합화될 수 있다. 또한, 말라리아의 경우, 감염성 물림 이후에 장시간이 지나갈 수 있는데, 즉 환자가 증상을 보이지 않는 긴 인큐베이션 기간이 지날 수 있다. 유사하게, 예방적 치료는 증상의 출현을 지연시킬 수 있고, 장기간의 무증상 기간이 또한 재발 전에 관찰될 수 있다. 이러한 지연은 오진단 또는 지연 진단을 쉽게 초래할 수 있고, 따라서 치료의 유효성을 손상시킬 수 있다.
본원에 개시된 실시형태의 신속하고 민감한 진단 능력, 단일 뉴클레오티드 편차에 이르는, 기생충 유형의 검출, 및 POC 장치로서 배치되는 능력으로 인해, 본원에 개시된 실시형태는 치료 계획, 예컨대 적절한 치료 과정의 선택을 가이드하는데 사용될 수 있다. 본원에 개시된 실시형태는 또한 기생충의 존재 및 유형분석을 위해 환경적 샘플 (모기 개체군 등) 을 스크리닝하는데 사용될 수 있다. 실시형태는 또한 모기-매개 기생충 및 다른 모기-매개 병원체를 동시에 검출하도록 변형될 수 있다. 일부 예에서, 말라리아 및 다른 모기-매개 병원체는 초기에 유사한 증상으로 존재할 수 있다. 따라서, 신속하게 감염 유형을 구별하는 능력은 중요한 치료 결정을 가이드할 수 있다. 말라리아와 함께 검출될 수 있는 다른 모기-매개 병원체는 뎅기, 웨스트나일 바이러스, 치쿤구니아, 황열, 필라리아증, 일본 뇌염, 세인트 루이스 뇌염, 서부 말 뇌염, 동부 말 뇌염, 베네수엘라 말 뇌염, 라크로스 뇌염, 및 지카를 포함한다.
특정 예시적 실시형태에서, 본원에 개시된 장치, 시스템 및 방법은 샘플 중의 다수의 모기-매개 기생충 종을 구별하는데 사용될 수 있다. 특정 예시적 실시형태에서, 식별은 18S, 16S, 23S, 및 5S 서브유닛을 포함하는, 리보솜 RNA 서열을 기반으로 할 수 있다. 특정 예시적 실시형태에서, 식별은 게놈에 다수 카피로 존재하는 유전자, 예컨대 CYTB 와 같은 미토콘트리아 유전자의 서열을 기반으로 할 수 있다. 특정 예시적 실시형태에서, 식별은 고도로 발현되고/되거나 고도로 보존된 유전자 예컨대 GAPDH, 히스톤 H2B, 에놀라아제, 또는 LDH 의 서열을 기반으로 할 수 있다. 관련 rRNA 서열을 식별하기 위한 방법은 미국 공개 특허 출원 번호 2017/0029872 에 개시되어 있다. 특정 예시적 실시형태에서, 가이드 RNA 의 세트는 각각의 종 또는 균주에 고유한 가변 영역에 의해 각각의 종을 구별하도록 디자인될 수 있다. 가이드 RNA 는 또한 속, 과, 목, 강, 문, 계 수준, 또는 이의 조합으로 미생물을 구별하는 RNA 유전자를 표적화하도록 디자인될 수 있다. 증폭이 사용되는 특정 예시적 실시형태에서, 증폭 프라이머의 세트는 리보솜 RNA 서열의 측접하는 불변 영역에 대해 디자인될 수 있고 가이드 RNA 는 가변 내부 영역에 의해 각각의 종을 구별하도록 디자인될 수 있다. 특정 예시적 실시형태에서, 프라이머 및 가이드 RNA 는 각각 16S 서브유닛 내 보존 및 가변 영역에 대해 디자인될 수 있다. 종 또는 종의 서브세트에 걸쳐 고유하게 가변적인 다른 유전자 또는 게놈 영역 예컨대 RecA 유전자 패밀리, RNA 폴리머라아제 β 서브유닛이 또한 사용될 수 있다. 다른 적합한 계통 마커, 및 이를 식별하기 위한 방법은 예를 들어, [Wu et al. arXiv:1307.8690 [q-bio.GN]] 에서 토의된다.
특정 예시적 실시형태에서, 종 식별은 게놈에 다수 카피로 존재하는 유전자, 예컨대 CYTB 와 같은 미토콘드리아 유전자를 기반으로 수행될 수 있다. 특정 예시적 실시형태에서, 종 식별은 고도로 발현되고/되거나 고도로 보존된 유전자 예컨대 GAPDH, 히스톤 H2B, 에놀라아제, 또는 LDH 를 기반으로 수행될 수 있다.
특정 예시적 실시형태에서, 방법 또는 진단은 다수의 계통발생 및/또는 표현형 수준에 걸쳐서 동시에 모기-매개 기생충을 스크리닝하도록 디자인된다. 예를 들어, 방법 또는 진단은 상이한 가이드 RNA 와 다수의 CRISPR 시스템의 사용을 포함할 수 있다. 가이드 RNA 의 제 1 세트는 예를 들어 플라스모듐 팔시파룸 또는 플라스모듐 비박스를 구별할 수 있다. 이들 일반 부류는 더욱 세분화될 수 있다. 예를 들어, 가이드 RNA 는 일반적으로 또는 특별한 약제 또는 약제의 조합에 대해서, 약제-내성 균주를 구별하는 방법 또는 진단으로 디자인되어 사용될 수 있다. 가이드 RNA 의 제 2 세트는 종 수준에서 미생물을 구별하도록 디자인될 수 있다. 따라서, 매트릭스는 약제 내성에 따라서 더욱 분류되는, 모든 모기-매개 기생충 종 또는 아종을 식별하도록 생성될 수 있다. 전술한 내용은 단지 예시의 목적이다. 모기-매개 기생충의 다른 유형을 분류하기 위한 다른 수단이 또한 고려되며, 상기 기재된 일반 구조를 따를 수 있다.
특정 예시적 실시형태에서, 본원에 개시된 장치, 시스템 및 방법은 관심 모기-매개 기생충 유전자, 예를 들어 약제 내성 유전자에 대해서 스크리닝하는데 사용될 수 있다. 가이드 RNA 는 기지의 관심 유전자들을 구별하도록 디자인될 수 있다. 임상 샘플을 포함하는, 샘플들은 이후에 하나 이상의 이러한 유전자의 검출을 위해 본원에 개시된 실시형태를 사용하여 스크리닝될 수 있다. POC 에서 약제 내성에 대해 스크리닝하는 능력은 적절한 치료 계획을 선택하는데 있어 대단한 이득을 가지게 된다. 특정 예시적 실시형태에서, 약제 내성 유전자는 단백질 예컨대 수송체 단백질, 예컨대 약제/대사산물 수송체 패밀리 유래 단백질, 기질 전좌에 관여하는 ATP-결합 카세트 (ABC) 단백질, 예컨대 ABC 수송체 C 서브패밀리 또는 Na+/H+ 교환체; 폴레이트 경로에 관여하는 단백질, 예컨대 디히드로프테로에이트 신타아제, 디히드로폴레이트 리덕타아제 활성 또는 디히드로폴레이트 리덕타아제-티미딜레이트 신타아제; 및 내부 미토콘트리아 막에 걸쳐 양자의 전좌에 관여하는 단백질, 특히 시토크롬 b 복합체를 인코딩하는 유전자이다. 추가의 표적은 또한 헴 폴리머라아제를 코딩하는 유전자(들) 를 포함할 수 있다. 특정 예시적 실시형태에서, 약제 내성 유전자는 P. 팔시파룸 클로로퀸 내성 수송체 유전자 (pfcrt), P. 팔시파룸 다제 내성 수송체 1 (pfmdr1), P. 팔시파룸 다제 내성-연관된 단백질 유전자 (Pfmrp), P. 팔시파룸 Na+/H+ 교환체 유전자 (pfnhe), P. 팔시파룸 Ca2+ 수송 ATPase 6 (pfatp6), P. 팔시파룸 디히드로프테로에이트 신타아제 (pfdhps), 디히드로폴레이트 리덕타아제 활성 (pfdhpr) 및 디히드로폴레이트 리덕타아제-티미딜레이트 신타아제 (pfdhfr) 유전자, 시토크롬 b 유전자, GTP 시클로히드롤라아제 및 Kelch13 (K13) 유전자를 비롯하여 다른 플라스모듐 종의 그들의 기능적 이종성 유전자로부터 선택된다. 다른 식별된 약제-내성 마커는 예를 들어, 그 내용이 본원에 참조로 포함되는, ["Susceptibility of Plasmodium falciparum to antimalarial drugs (1996-2004)"; WHO; Artemisinin and artemisinin-based combination therapy resistance (April 2016 WHO/HTM/GMP/2016.5); "Drug-resistant malaria: molecular mechanisms and implications for public health" FEBS Lett. 2011 Jun 6;585(11):1551-62. doi:10.1016/j.febslet.2011.04.042. Epub 2011 Apr 23. Review. PubMed PMID: 21530510] 에 기재된 바와 같이 당분야에 공지되어 있다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 바와 같은 CRISPR 시스템, 검출 시스템 또는 이의 사용 방법은 모기-매개 기생충 대발생의 진화를 결정하기 위해 사용될 수 있다. 방법은 하나 이상의 대상체 유래의 다수 개 샘플로부터 하나 이상의 표적 서열을 검출하는 단계로서, 표적 서열은 모기-매개 기생충 확산 또는 대발생으로부터의 서열인 단계를 포함할 수 있다. 이러한 방법은 모기-매개 기생충 전파의 패턴, 또는 모기-매개 기생충에 의해 야기된 질환 대발생에 관여하는 기전을 결정하는 단계를 더 포함할 수 있다. 샘플은 하나 이상의 인간으로부터 유래될 수 있고/있거나, 하나 이상의 모기로부터 유래될 수 있다.
병원체 전파의 패턴은 모기-매개 기생충의 천연 병원소로부터 계속되는 신규 전파 또는 천연 병원소로부터 단일 전파 이후 다른 전파 (예를 들어, 모기에 교차로) 또는 이 둘의 혼합을 포함할 수 있다. 한 실시형태에서, 표적 서열은 바람직하게는 모기-매개 기생충 게놈 내 서열 또는 이의 단편이다. 한 실시형태에서, 모기-매개 기생충 전파의 패턴은 모기-매개 기생충 전파의 초기 패턴, 즉 모기-매개 기생충 대발생의 시작시의 것이다. 대발생의 시작시에 모기-매개 기생충 전파의 패턴 결정은 가능한 가장 빠른 시간에 대발생을 중단시킬 가능성을 증가시키고 그리하여 지역 및 국가간 전파 확률을 감소시킨다.
모기-매개 기생충 전파의 패턴 결정은 본원에 기재된 방법에 따라 모기-매개 기생충 서열을 검출하는 단계를 포함할 수 있다. 병원체 전파의 패턴을 결정하는 단계는 대상체 간 모기-매개 기생충 서열의 공유된 숙주내 변이를 검출하는 단계 및 공유된 숙주내 변이가 시간적 패턴을 보이는지 여부를 결정하는 단계를 더 포함할 수 있다. 관찰된 숙주내 및 숙주간 변이의 패턴은 전파 및 역학에 관한 중요한 통찰을 제공한다 (Gire, et al., 2014).
본원에 개시된 다른 샘플 유형에 추가로, 샘플은 하나 이상의 모기로부터 유래될 수 있고, 예를 들어 샘플은 모기 타액을 포함할 수 있다.
바이오마커 검출
특정 예시 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 시스템, 장치 및 방법은 바이오마커 검출에 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 개시된 시스템, 장치 및 방법은 SNP 검출 및/또는 유전형분석에 사용될 수 있다. 본 명세서에 개시된 시스템, 장치 및 방법은 또한 이상 유전자 발현을 특징으로 하는 임의의 질환 상태 또는 장애의 검출에 사용될 수 있다. 이상 유전자 발현은 발현된 유전자, 발현의 위치 및 발현도에서의 이상성을 포함한다. 다른 질환 중에서도 심혈관, 면역 장애, 및 암과 관련된 다수의 전사물 또는 단백질 마커가 검출될 수 있다. 특정 예시 실시형태에서, 본 명세서에서 개시된 실시형태는 용해를 포함하는 질환, 예컨대 간 섬유증 및 억제성/폐색성 폐 질환의 세포-무함유 DNA 검출에 사용될 수 있다. 특정 예시 실시형태에서, 실시형태는 세포-무함유 DNA 의 태아기 검사를 위한 보다 빠르고 보다 휴대가능한 검출에 이용될 수 있다. 본 명세서에서 개시된 실시형태는 특히 심혈관 건강, 지질/대사성 서명, 인종성 식별, 친부 매칭, 인간 ID (예를 들어, SNP 서명의 범죄 데이타베이스에 용의자 대조) 와 연관된 상이한 SNP 의 패널을 스크리닝하기 위해 사용될 수 있다. 본 명세서에서 개시된 실시형태는 또한 암 종양과 관련되고 그로부터 방출되는 돌연변이의 세포-무함유 DNA 검출에 사용될 수 있다. 본 명세서에서 개시된 실시형태는 또한 예를 들어, 소정 육류 제품에서 상이한 동물원의 신속한 검출을 제공하여, 육류 품질의 검출에도 사용될 수 있다. 본 명세서에서 개시된 실시형태는 DNA 와 관련된 유전자 편집 또는 GMO 의 검출을 위해 사용될 수 있다. 본 명세서의 다른 곳에 기술된 바와 같이, 밀접하게 관련된 유전자형/대립 유전자 또는 바이오마커 (예를 들어, 소정 표적 서열에 오직 단일 뉴클레오티드 편차를 가짐) 는 gRNA 에 합성 미스매치의 도입에 의해 구별될 수 있다.
일 양상에서, 본 발명은 샘플에서 표적 핵산을 검출하기 위한 방법에 관한 것으로서, 이 방법은
샘플 또는 샘플의 세트를 하나 이상의 개별 이산 부피에 분배하는 단계로서, 개별 이산 부피는 본 명세서에 기술된 바와 같이 본 발명에 따른 CRISPR 시스템을 포함하는 것인 단계;
샘플 또는 샘플의 세트를 하나 이상의 가이드 RNA 와 하나 이상의 표적 분자의 결합을 허용하기 위해 충분한 조건 하에서 인큐베이션시키는 단계;
하나 이상의 가이드 RNA 와 하나 이상의 표적 분자의 결합을 통해서 CRISPR 이펙터 단백질을 활성화시키는 단계로서, CRISPR 이펙터 단백질의 활성화는 그 결과로 RNA-기반 차폐성 구성체의 변형을 야기시켜 검출가능한 양성 신호가 발생되는 것인 단계; 및
검출가능한 양성 신호를 검출하는 단계로서, 검출가능한 양성 신호의 검출은 샘플 중 하나 이상의 표적 분자의 존재를 의미하는 것인 단계.
바이오마커 샘플 유형
본 명세서에 기술된 어세이의 민감성은 표적 핵산이 희석되거나 샘플 재료가 제한적인 샘플을 포함하여, 광범위하게 다양한 생물학적 샘플 중 표적 핵산의 검출에 충분히 적합하다. 바이오마커 스크리닝은 제한없이, 타액, 소변, 혈액, 대변, 객담, 및 뇌척수 유체를 포함하는, 수많은 샘플 유형에 대해 수행될 수 있다. 본 명세서에서 개시된 실시형태는 또한 유전자의 상향조절 및/또는 하향조절을 검출하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 샘플은 오직 과발현된 유전자만 어세이의 검출 한계값 이상으로 남도록 연속 희석될 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 발명은 생물학적 유체 (예를 들어, 소변, 혈액 혈청 또는 혈청, 객담, 뇌척수 유체) 의 샘플을 수득하는 단계, 및 DNA 를 추출하는 단계를 제공한다. 검출하려는 돌연변이체 뉴클레오티드 서열은 거대 분자의 분획일 수 있거나, 또는 초기에 별개 분자로서 존재할 수 있다.
특정 실시형태에서, DNA 는 암 환자의 혈장/혈청으로부터 단리된다. 비교를 위해서, DNA 샘플은 신생물 조직으로부터 단리되고 제 2 샘플은 동일 환자 유래 비신생물성 조직 (대조군), 예를 들어 림프구로부터 단리될 수 있다. 비신생물성 조직은 상이한 장기 출처로부터 유래될 수 있거나 또는 신생물성 조직과 동일한 유형일 수 있다. 특정 실시형태에서, 혈액 샘플을 채혈하고 혈장은 원심분리를 통해서 혈액 세포로부터 즉시 분리시킨다. 혈청은 여과될 수 있고 DNA 추출 전에 동결 저장될 수 있다.
특정 예시 실시형태에서, 표적 핵산은 미가공 또는 미처리된 샘플, 예컨대 혈청, 혈청, 타액, 뇌척수액, 객담, 또는 소변으로부터 직접 검출된다. 특정 예시 실시형태에서, 표적 핵산은 세포-무함유 DNA 이다.
순환성 종양 세포
하나의 실시형태에서, 순환성 세포 (예를 들어, 순환성 종양 세포 (CTC)) 는 본 발명으로 어세이될 수 있다. 본 명세서에 기술된 임의 방법에서 사용을 위한 순환성 종양 세포 (CTC) 의 단리가 수행될 수 있다. 본 발명에서 사용할 수 있는 순환성 세포의 특이적이고 민감한 검출 및 포획을 달성하는 예시적인 기술은 설명된 바 있다 (Mostert B, et al., Circulating tumor cells (CTCs): detection methods and their clinical relevance in breast cancer. Cancer Treat Rev. 2009;35:463-474; 및 Talasaz AH, et al., Isolating highly enriched populations of circulating epithelial cells and other rare cells from blood using a magnetic sweeper device. Proc Natl Acad Sci U S A. 2009; 106:3970-3975). 105-106 말초 혈액 단핵 세포의 배경에서 하나 정도로 적은 CTC 가 존재할 수 있다 (Ross A A, et al., Detection and viability of tumor cells in peripheral blood stem cell collections from breast cancer patients using immunocytochemical and clonogenic assay techniques. Blood. 1993,82:2605-2610). CellSearch® 플랫폼은 EPCAM-발현 상피 세포를 농축하기 위해 상피 세포 부착 분자 (EpCAM) 에 대한 항체로 코팅된 면역자성 비드를 사용하고, 그 이후에 면역 염색하여 사이토케라틴 염색의 존재 및 백혈구 마커 CD45 의 부재를 확인하여 포획 세포가 상피 종양 세포인 것을 확인한다 (Momburg F, et al., Immunohistochemical study of the expression of a Mr 34,000 human epithelium-specific surface glycoprotein in normal and malignant tissues. Cancer Res. 1987;47:2883-2891; 및 Allard WJ, et al., Tumor cells circulate in the peripheral blood of all major carcinomas but not in healthy subjects or patients with nonmalignant diseases. Clin Cancer Res. 2004; 10:6897-6904). 포획된 세포의 수는 진행성 질환을 갖는 유방, 직결장 및 전립선 암 환자에 대한 예후 중요성을 갖는 것을 유망하게 입증했다 (Cohen SJ, et al., J Clin Oncol. 2008;26:3213-3221; Cristofanilli M, et al. N Engl J Med. 2004;351:781-791; Cristofanilli M, et al., J Clin Oncol. 2005;23: 1420-1430; 및 de Bono JS, et al. Clin Cancer Res. 2008; 14:6302-6309).
본 발명은 또한 CTC-칩 기술로 CTC 를 단리하기 위해 제공된다. CTC-칩은 CTC 가 결합하는 항-EpCAM 항체가 코팅된 수천개의 마이크로포스트를 함유하는 챔버를 통해서 혈액이 흐르는 미세유체 기반 CTC 포획 장치이다 (Nagrath S, et al. Isolation of rare circulating tumor cells in Cancer patients by microchip technology. Nature. 2007;450: 1235-1239). CTC-칩은 CellSearch® 시스템과 비교하여 CTC 계측치 및 순도의 유의한 증가를 제공하고 (Maheswaran S, et al. Detection of mutations in EGFR in circulating lung-cancer cells, N Engl J Med. 2008;359:366-377), 양쪽 플랫폼은 후속 분자 분석에 사용될 수 있다.
세포-무함유 염색질
특정 실시형태에서, 세포-무함유 크로마틴 단편을 본 발명에 따라서 단리하고 분석한다. 뉴클레오솜은 건강한 개체를 비롯하여 질환 상태에 의해 영향받은 개체의 혈청에서 검출될 수 있다 (Stroun et al., Annals of the New York Academy of Sciences 906: 161-168 (2000)). 게다가, 뉴클레오솜의 혈청 농도는 양성 및 악성 질환, 예컨대 암 및 자가면역 질환을 앓는 환자에서 상당히 더 높다 (Holdenrieder et al (2001) Int J Cancer 95, 1 14-120, Trejo-Becerril et al (2003) Int J Cancer 104, 663-668; Kuroi et al 1999 Breast Cancer 6, 361-364; Kuroi et al (2001) Int j Oncology 19, 143-148; Amoura et al (1997) Arth Rheum 40, 2217-2225; Williams et al (2001) J Rheumatol 28, 81-94). 이론에 국한하려는 것은 아니나, 종양 보유 환자에서 뉴클레오솜의 고농도는 증식하는 종양에서 자발적으로 발생되는, 아폽토시스로부터 유래된다. 혈액에서 순환하는 뉴클레오솜은 고유하게 변형된 히스톤을 함유한다. 예를 들어, 미국 공개 특허 출원 번호 2005/0069931 (2005년 3월 31 일) 은 질환의 진단 지시자로서 특이적 히스톤 N-말단 변형에 대해 유도된 항체의 사용에 관한 것으로서, 진단/스크리닝 목적을 위해 수반된 DNA 의 정제 및 분석을 촉진하기 위해 환자의 혈액 또는 혈청 샘플로부터 뉴클레오솜을 단리하기 위해 이러한 히스톤-특이적 항체를 적용한다. 따라서, 본 발명은 예를 들어, 종양 돌연변이를 검출하고 모니터링하기 위해서 염색질 결합된 DNA 를 사용할 수 있다. 변형된 히스톤과 회합된 DNA 의 식별은 질환 및 선천적 결함의 진단 마커로서 제공될 수 있다.
따라서, 다른 실시형태에서, 단리된 염색질 단편은 순환성 염색질, 바람직하게 순환성 모노 및 올리고뉴클레오솜으로부터 유래된다. 단리된 염색질 단편은 생물학적 샘플로부터 유래될 수 있다. 생물학적 샘플은 이를 필요로 하는 대상체 또는 환자로부터 유래될 수 있다. 생물학적 샘플은 혈청, 혈장, 림프, 혈액, 혈액 분획, 소변, 활액, 척추액, 타액, 순환성 종양 세포 또는 점액일 수 있다.
세포-무함유 DNA (cfDNA)
특정 실시형태에서, 본 발명은 세포-무함유 DNA (cfDNA) 를 검출하는데 사용될 수 있다. 혈장 또는 혈청 중 세포-무함유 DNA 는 비침습성 진단 도구로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 세포-무함유 태아 DNA 를 연구했고 비호환성 RhD 인자의 검사, X-연결된 유전자 질병에 대한 성별 결정, 단일 유전자 질병에 대한 검사, 자간전증의 식별에 대해 최적화되었다. 예를 들어, 모계 혈장에서 cfDNA 의 태아 세포 분획의 시퀀싱은 태아 염색체 이수성과 연관된 카피수 변화를 검출하기 위한 신뢰할 만한 접근법이다. 다른 예의 경우, 암 환자로부터 단리된 cfDNA 는 치료 결정과 관련된 핵심 유전자에서 돌연변이를 검출하는데 사용되었다.
특정 예시 실시형태에서, 본 개시 내용은 환자 샘플로부터 직접적으로 cfDNA 를 검출하는 것을 제공한다. 일정한 다른 예의 실시형태에서, 본 개시 내용은 표적 cfDNA 를 검출하기 전에 상기 개시된 농축 실시형태를 사용하여 cfDNA 를 농축시키는 것을 제공한다.
엑소솜
하나의 실시형태에서, 엑소솜은 본 발명에 의해 어세이될 수 있다. 엑소솜은 RNA 를 함유하는 것으로 확인된 소형 세포외 소포체이다. 초원심분리, 여과, 화학적 침전, 크기 배제 크로마토그래피, 및 미세유체학에 의한 엑소솜의 단리는 당분야에 공지되어 있다. 하나의 실시형태에서 엑소솜은 엑소솜 바이오마커를 사용해 정제된다. 생물학적 샘플로부터 엑소솜의 단리 및 정제는 임의의 공지 방법으로 수행될 수 있다 (예를 들어, WO2016172598A1 참조).
SNP 검출 및 유전형분석
특정 실시형태에서, 본 발명은 생물학적 샘플 중에 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP) 의 존재를 검출하는데 사용될 수 있다. SNP는 출산 검사 (예를 들어, 성별 결정, 태아 결함) 에 관한 것일 수 있다. 그들은 범죄 수사에 관한 것일 수 있다. 하나의 실시형태에서, 범죄 수사의 용의자는 본 발명에 의해 식별될 수 있다. 이론에 국한하려는 것은 아니나, 핵산 기반 법의학 증거는 검사되는 샘플이 제한적일 수 있으므로 용의자 또는 피해자의 유전 물질을 검출하는데 이용할 수 있는 가장 민감한 어세이를 요구할 수 있다.
다른 실시형태에서, 질환과 연관된 SNP는 본 발명에 의해 포괄된다. 질환과 연관된 SNP는 당분야에서 충분히 공지되어 있고 당업자가 적합한 가이드 RNA 를 설계하기 위해 본 발명의 방법을 적용할 수 있다 (예를 들어, www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar?term=human%5Borgn%5D 참조).
일 양상에서, 본 발명은 유전형분석, 예컨대 SNP 유전형분석을 위한 방법에 관한 것으로서, 이 방법은
샘플 또는 샘플의 세트를 하나 이상의 개별 이산 부피에 분배하는 단계로서, 개별 이산 부피는 본 명세서에 기술된 바와 같이 본 발명에 따른 CRISPR 시스템을 포함하는 것인 단계;
샘플 또는 샘플의 세트를 하나 이상의 가이드 RNA 와 하나 이상의 표적 분자의 결합을 허용하기 위해 충분한 조건 하에서 인큐베이션시키는 단계;
하나 이상의 가이드 RNA 와 하나 이상의 표적 분자의 결합을 통해서 CRISPR 이펙터 단백질을 활성화시키는 단계로서, CRISPR 이펙터 단백질의 활성화는 그 결과로 RNA-기반 차폐성 구성체의 변형을 야기시켜 검출가능한 양성 신호가 발생되는 것인 단계; 및
검출가능한 양성 신호를 검출하는 단계로서, 검출가능한 양성 신호의 검출은 샘플 중에 특정한 유전자형을 특징으로 하는 하나 이상의 표적 분자의 존재를 의미하는 것인 단계를 포함한다.
특정 실시형태에서, 검출가능한 신호는 예컨대 예를 들면 도 60 의 일례의 실시형태에 예시된 바와 같은, 하나 이상의 표준 신호, 바람직하게 합성 표준 신호와 (예를 들어, 신호 강도의 비교에 의해) 비교된다. 특정 실시형태에서, 표준물은 특정한 유전자형이거나 또는 그에 상응한다. 특정 실시형태에서, 표준물은 특정한 SNP 또는 다른 (단일) 뉴클레오티드 변이를 포함한다. 특정 실시형태에서, 표준물은 (PCR-증폭된) 유전자형 표준물이다. 특정 실시형태에서, 표준물은 DNA 이거나 또는 그를 포함한다. 특정 실시형태에서, 표준물은 RNA 이거나 또는 그를 포함한다. 특정 실시형태에서, 표준물은 DNA 로부터 전사된 RNA 이거나 또는 그를 포함한다. 특정 실시형태에서, 표준물은 RNA 로부터 역전사된 DNA 이거나 또는 그를 포함한다. 특정 실시형태에서, 검출가능한 신호는 하나 이상의 표준물과 비교되고, 그 각각은 기지의 유전자형, 예컨대 SNP 또는 다른 (단일) 뉴클레오티드 변이에 상응한다. 특정 실시형태에서, 검출가능한 신호는 하나 이상의 표준 신호와 비교되고 비교는 1-방식 또는 2-방식 ANOVA 등에 의한, 통계 분석, 예컨대 모수 또는 비모수 통계 분석을 포함한다. 특정 실시형태에서, 검출가능한 신호는 하나 이상의 표준 신호와 비교되고 검출가능한 신호가 표준으로부터 (통계적으로) 유의하게 벗어나지 않는 경우에, 그 표현형은 상기 표준에 상응하는 유전자형으로서 결정된다.
다른 실시형태에서, 본 발명은 응급 약물유전체학에 대한 신속한 유전형분석을 가능하게 한다. 하나의 실시형태에서, 단일 의료 현장 (point-of-care) 어세이가 응급실로 옮겨온 환자를 유전자분석하는데 사용될 수 있다. 환자는 혈액 응고를 갖는 것으로 의심될 수 있고 응급의는 투여하기 위한 혈액 희석제의 용량을 결정하는 것이 필요하다. 예시적인 실시형태에서, 본 발명은 마커 예컨대 VKORC1, CYP2C9, 및 CYP2C19 의 유전자분석을 기반으로 심근경색 또는 졸중 치료 동안 혈액 희석제의 투여를 위한 지침을 제공할 수 있다. 하나의 실시형태에서, 혈액 희석제는 항응고제 와파린이다 (Holford, NH (December 1986). "Clinical Pharmacokinetics and Pharmacodynamics of Warfarin Understanding the Dose-Effect Relationship". Clinical Pharmacokinetics. Springer International Publishing. 11 (6): 483-504). 혈액 응고와 연관된 유전자는 당분야에 공지되어 있다 (예를 들어, US20060166239A1; Litin SC, Gastineau DA (1995) "Current concepts in anticoagulant therapy". Mayo Clin. Proc. 70 (3): 266-72; 및 Rusdiana et al., Responsiveness to low-dose warfarin associated with genetic variants of VKORC1, CYP2C9, CYP2C19, and CYP4F2 in an Indonesian population. Eur J Clin Pharmacol. 2013 Mar;69(3):395-405 참조). 특히, VKORC1 1639 (또는 3673) 단일-뉴클레오티드 다형성에서, 공통 ("야생형") G 대립 유전자는 A 대립 유전자로 치환된다. A 대립 유전자 (또는 "A 일배체형") 를 갖는 사람은 G 대립 유전자 (또는 "비-A 일배체형") 를 갖는 사람보다 VKORC1 을 덜 생성시킨다. 이들 변이체의 출현율은 또한 인종에 따라 다양하며, 백인 중 37% 및 아프리카인의 14% 가 A 대립 유전자를 보유한다. 최종 결과는 응고 인자의 감소된 수이고, 그에 따라 응고 능력의 감소이다.
특정 예시 실시형태에서, 환자에서 SNP 를 검출하기 위한 유전 물질의 이용가능성은 DNA 또는 RNA 샘플의 증폭없이 SNP 를 검출하는 것을 가능하게 한다. 유전형분석의 경우에서, 시험되는 생물학적 샘플은 쉽게 수득된다. 특정 예시 실시형태에서, 본 발명의 인큐베이션 시간은 단축될 수 있다. 어세이는 효소 반응이 발생되는데 필요한 시간 기간에 수행될 수 있다. 당업자는 5분 동안 생물학적 반응 (예를 들어, 5분 라이게이션) 을 수행할 수 있다. 본 발명은 혈액으로부터 DNA 를 수득하기 위해서 자동화 DNA 추출 장치를 사용할 수 있다. 다음으로 DNA 는 이펙터 단백질에 대한 표적 분자를 생성시키는 반응에 첨가될 수 있다. 표적 분자가 생성되면 즉시, 차폐제가 절단되어 신호가 검출될 수 있다. 예시적인 실시형태에서, 본 발명은 약제 (예를 들어, 혈액 희석제) 를 투여하기 전에 유전자형을 결정하기 위해 PCR 신속 진단을 가능하게 한다. 증폭 단계가 사용되는 경우에서, 모든 반응은 한 단계 과정으로 동일 반응에서 일어난다. 바람직한 실시형태에서, POC 어세이는 한 시간 미만, 바람직하게 10분, 20분, 30분, 40분, 또는 50분으로 수행될 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 시스템, 장치 및 방법은 장형 논코딩 RNA (lncRNA) 의 존재 또는 발현도를 검출하기 위해 사용될 수 있다. 일정한 lncRNA 의 발현은 질환 상태 및/또는 약제 내성과 연관된다. 특히 일정한 lncRNA (예를 들어, TCONS_00011252, NR_034078, TCONS_00010506, TCONS_00026344, TCONS_00015940, TCONS_00028298, TCONS_00026380, TCONS_0009861, TCONS_00026521, TCONS_00016127, NR_125939, NR_033834, TCONS_00021026, TCONS_00006579, NR_109890, 및 NR_026873) 는 암 치료에 대한 내성, 예컨대 흑색종 (예를 들어, 결절성 흑색종, 악성 흑색점, 악성 흑색점 흑색종, 말단 흑자 흑색종, 표재 확산 흑색종, 점막 흑색종, 용종양 흑색종, 섬유조직형성 흑색종, 무멜라닌성 흑색종, 및 연조직 흑색종) 을 치료하기 위한 하나 이상의 BRAF 억제제 (예를 들어, 베무라페닙, 다브라페닙, 소라페닙, GDC-0879, PLX-4720, 및 LGX818) 에 대한 내성과 연관된다. 본 명세서에 기술된 다양한 실시형태를 사용하는 lncRNA 의 검출은 질환 진단 및/또는 치료 옵션의 선택을 용이하게 할 수 있다.
하나의 실시형태에서, 본 발명은 특히 요법의 신속한 투여가 치료 결과에 중요한 상황에서, 가이드 DNA- 또는 RNA-표적화 요법 (예를 들어, CRISPR, TALE, 징크 핑커 단백질, RNAi) 을 가이드할 수 있다.
LOH 검출
암 세포는 정상 세포와 비교했을 때 유전 물질 (DNA) 의 상실을 겪는다. 전부는 아니지만, 거의 전부의 암이 겪는 유전자 물질의 이러한 결실은 "이형접합성의 상실" (LOH) 이라고 한다. 이형접합성의 상실 (LOH) 은 전체 유전자 및 주변 염색체 영역의 상실을 일으키는 총 염색체 사건이다. 이형접합성의 상실은 암에서의 일반적인 발생이고, 이것은 상실된 영역의 기능적 종양 억제인자 유전자의 부재를 의미할 수 있다. 그러나, 상실은 여전히 염색체 쌍의 나머지 염색체 상에 남은 하나의 기능성 유전자가 존재하기 때문에 침묵될 수 있다. 종양 억제인자 유전자의 나머지 카피는 점 돌연변이에 의해 불활성화될 수 있어서, 종양 억제인자 유전자의 상실을 초래할 수 있다. 암 세포 유래 유전 물질의 상실은 그 결과로 염색체 상의 특정한 유전자좌에서 세포 생존능 또는 세포 성장에 필수적인 유전자의 둘 이상의 대립 유전자 중 하나의 선택적 상실을 야기시킬 수 있다.
"LOH 마커" 는 정상 세포와 비교했을 때, 암 또는 다른 질환과 연관된 결실, 변경, 또는 증폭의, 미세부수체 유전자좌로부터의 DNA 이다. LOH 마커는 종종 종양 억제인자 유전자 또는 다른, 일반적으로 종양 관련 유전자의 상실과 연관된다.
용어 "미세부수체" 는 인간 게놈에 광범위하게 분포된 DNA 의 짧은 반복 서열을 의미한다. 미세부수체는 2 내지 5개 뉴클레오티드 길이의 범위인 직렬로 반복되는 (즉, 인접한) DNA 모티프의 부분이고, 전형적으로 5-50회 반복된다. 예를 들어, 서열 TATATATATA (SEQ ID NO: 431) 은 디뉴클레오티드 미세부수체이고, GTCGTCGTCGTCGTC (SEQ ID NO: 432) 는 트리뉴클레오티드 미세부수체이다 (A 는 아데닌이고, G 는 구아닌이고, C 는 시토신이고, T 는 티민임). 이러한 미세부수체의 반복 길이에서 체세포 변경은 종양의 특징적인 특성을 대표하는 것으로 확인되었다. 가이드 RNA 는 이러한 미세부수체를 검출하도록 설계될 수 있다. 뿐만 아니라, 본 발명은 검출가능한 신호의 정량을 기반으로 증폭 및 결실뿐만 아니라, 반복 길이에서의 변경을 검출하는데 사용될 수 있다. 일정한 미세부수체는 유전자의 조절 측접 또는 인트론 영역에, 또는 직접적으로 유전자의 코돈에 위치된다. 이러한 경우에서 미세부수체 돌연변이는 표현형 변화 및 질환, 특히 트리플렛 확장 질환, 예컨대 취약 X 증후군 및 헌팅톤 질환을 초래할 수 있다.
특별한 염색체 영역 상의 빈번한 이형접합성의 상실 (LOH) 는 많은 종류의 악성종에서 보고되었다. 특별한 염색체 영역 상의 대립 유전자 상실은 다양한 악성종에서 관찰되는 가장 일반적인 유전자 변형이며, 따라서 미세부수체 분석은 체액 유래 시료, 예컨대 폐암의 경우 객담 및 방광암의 경우 소변에서 암 세포의 DNA 를 검출하기 위해 적용되었다 (Rouleau, et al. Nature 363, 515-521 (1993); 및 Latif, et al. Science 260, 1317-1320 (1993)). 더욱이, 가용성 DNA 의 두드러지게 증가된 농도가 암 및 일부 다른 질환을 갖는 개체의 혈장에 존재하고, 이것은 세포-무함유 혈청 또는 혈장이 미세부수체 비정상성을 갖는 암 DNA 를 검출하는데 사용될 수 있다는 것이 확고해졌다 (Kamp, et al. Science 264, 436-440 (1994); 및 Steck, et al. Nat Genet. 15(4), 356-362 (1997)). 2개 그룹은 소세포 폐암 또는 두경부 암을 갖는 제한된 수의 환자의 혈장 또는 혈청에서 미세부수체 변경을 보고했다 (Hahn, et al. Science 271, 350-353 (1996); and Miozzo, et al. Cancer Res. 56, 2285-2288 (1996)). 흑색종 환자의 혈청 및 종양에서 이형접합성의 상실의 검출이 또한 이전에 확인되었다 (예를 들어, 미국 특허 번호 US6465177B1 참조).
따라서, 암을 앓고 있거나 또는 암의 위험성이 있는 대상체에서 LOH 마커를 검출하는 것이 유리하다. 본 발명은 종양 세포에서 LOH 를 검출하는데 사용될 수 있다. 하나의 실시형태에서, 순환성 종양 세포는 생물학적 샘플로서 사용될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 혈청 또는 혈장으로부터 수득된 세포-무함유 DNA 는 LOH 를 비침습적으로 검출 및/또는 모니터링하는데 사용된다. 다른 실시형태에서, 생물학적 샘플은 본 명세서에 기술된 임의 샘플 (예를 들어, 방광암에 대한 소변 샘플) 일 수 있다. 이론에 국한하려는 것은 아니나, 본 발명은 임의의 종래 방법과 비교하여 개선된 민감성으로 LOH 마커를 검출하는데 사용될 수 있고, 따라서, 돌연변이 사건의 조기 검출을 제공한다. 하나의 실시형태에서, LOH 는 생물학적 유체에서 검출되는 반면, LOH 의 존재는 암의 발생과 연관된다. 본 명세서에 기술된 방법 및 시스템은 암과 연관된 특별한 대립 유전자의 LOH 를 검출하기 위한 비침습성의 신속하고 정확한 방법을 제공함으로써, 종래 기술, 예컨대 PCR 또는 조직 생검에 비해 상당한 진보를 나타낸다. 따라서, 본 발명은 화학예방, 화학요법, 면역요법 또는 다른 치료를 겪은 고위험 환자를 모니터링하고 고위험 집단을 스크리닝하기 위해 사용할 수 있는 방법 및 시스템을 제공한다.
본 발명의 방법은 오직 체액 예컨대 혈액으로부터의 DNA 추출만을 필요로 하기 때문에, 임의 시점에 반복적으로 한 환자에 대해 수행될 수 있다. 혈액은 수술 이전 또는 이후; 치료, 예컨대 화학요법, 방사선 요법, 유전자 요법 또는 면역요법 이전, 그 동안, 및 이후; 또는 질환 진행, 안정, 또는 재발에 대한 치료 후 추적 조사 동안 채혈되어 LOH 에 대해 모니터링된다. 이론에 국한하려는 것은 아니지만, 본 발명의 방법은 또한 LOH 마커가 개별 환자의 종양에 특이적이므로 그 환자에게 특이적인 LOH 마커에 의해 준임상 질환 존재 또는 재발을 검출하는데 사용될 수 있다. 본 발명은 또한 다수 전이가 존재한다면 종양 특이적 LOH 마커를 사용해 검출될 수 있다.
후성적 변형의 검출
암 또는 암 진행을 의미하는 히스톤 변이, DNA 변형, 및 히스톤 변형이 본 발명에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 미국 공개 특허 출원 20140206014는 암 샘플이 건강한 대상체와 비교하여 상승된 뉴클레오솜 H2AZ, 마크로H2A1.1, 5-메틸시토신, P-H2AX(Ser139) 수준을 갖는다고 기술하고 있다. 개체에 암 세포의 존재는 암 세포의 증가된 아폽토시스의 결과로서 혈중 세포-무함유 뉴클레오솜의 더 높은 수준을 생성시킬 수 있다. 하나의 실시형태에서, 아폽토시스와 연관된 마커에 대해 유도된 항체, 예컨대 H2B Ser 14(P) 가 아폽토시스된 신생물 세포로부터 방출된 단일 뉴클레오솜을 확인하는데 사용될 수 있다. 따라서, 종양 세포로부터 발생된 DNA 는 높은 민감도 및 정확도로 본 발명에 따라 유리하게 분석될 수 있다.
태아기 스크리닝
특정 실시형태에서, 본 발명의 방법 및 시스템은 태아기 스크리닝에서 사용될 수 있다. 특정 실시형태에서, 세포-무함유 DNA 는 태아기 스크리닝의 방법에서 사용된다. 특정 실시형태에서, 단일 뉴클레오솜 또는 올리고뉴클레오솜과 연관된 DNA 는 본 발명으로 검출될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 단일 뉴클레오솜 또는 올리고뉴클레오솜과 연관된 DNA 의 검출은 태아기 스크리닝을 위해 사용된다. 특정 실시형태에서, 세포-무함유 염색질 단편은 태아기 스크리닝의 방법에서 사용된다.
태아기 진단 또는 태아기 스크리닝은 태어나기 전 태아 또는 배아에서 질환 또는 병태의 검사를 의미한다. 목적은 선천성 결손증 예컨대 신경관 결손, 다운 증후군, 염색체 이상, 유전적 장애 및 다른 병태, 예컨대 이분 척추, 구개열, 테이 삭스 병, 겸상 적혈구 빈혈증, 탈라세미아, 낭포성 섬유증, 근이영양증, 및 취약 X 증후군을 검출하는 것이다. 스크리닝은 또한 태아 성별 판별에 사용될 수도 있다. 공통 검사 절차는 양수천자, 목덜미 투명대 초음파를 포함한 초음파검사, 혈청 마커 검사, 또는 유전자 스크리닝을 포함한다. 일부 경우에서, 검사는 태아가 유산될 것인지 여부를 결정하도록 투여되지만, 의사 및 환자는 이것이 또한 고위험 임신을 조기에 진단하는데 유용하다는 것을 확인하여 신생아가 적절한 관리를 받을 수 있는 3차 요양 병원에서 출산 일정을 잡을 수 있다.
산모의 혈액에 존재하는 태아 세포가 있고, 이들 세포는 태아 DNA-기반 진단을 위한 태아 염색체의 잠재적인 공급원이 존재한다는 것은 알려져 있었다. 추가적으로, 태아 DNA 는 산모 혈액 중 총 DNA 의 약 2 내지 10% 범위이다. 현재 이용가능한 태아 유전자 검사는 일반적으로 침습성 시술이 관여된다. 예를 들어, 임신 대략 10 내지 12주인 임산부에게 수행된 융모막 채취법 (CVS) 및 대략 14-16주에 수행된 양수천자는 모두 태아에서 염색체 이상성을 검사하기 위한 샘플을 수득하기 위해 침습성 시술을 포함한다. 이들 채취 시술을 통해 수득된 태아 세포는 일반적으로 세포유전 또는 형광성 제자리 하이브리드화 (FISH) 분석을 사용해 염색체 이상성에 대해 검사된다. 세포-무함유 태아 DNA 는 임신 6주 정도로 조기에 임산부의 혈장 및 혈청에 존재하는 것으로 확인되었고, 농도는 임신 동안 상승하여 출산전에 최고이다. 이들 세포는 임신 초기에 나타나므로, 그들은 정확하고, 비침습적인, 제 1 삼분기 검사의 기초를 형성할 수 있다. 이론에 국한하려는 것은 아니나, 본 발명은 소량의 태아 DNA 를 검출하는데 전례없는 민감도를 제공한다. 이록에 국한하려는 것은 아니나, 풍부한 양의 산모 DNA 가 일반적으로 관심 태아 DNA 와 함께 부수적으로 회수되므로, 태아 DNA 정량 및 돌연변이 검출에서 민감도가 감소된다. 본 발명은 예상치않게 높은 민감도의 어세이를 통해서 이러한 문제를 극복한다.
히스톤의 H3 부류는 4종의 상이한 단백질 유형으로 이루어진다: 주요 유형, H3.1 및 H3.2; 대체 유형, H3.3; 및 고환 특이적 변이, H3t. H3.1 및 H3.2 은 밀접하게 관련되지만, 오직 Ser96 에서만 상이하고, H3.1 은 적어도 5개 아미노산 위치에서 H3.3 과 상이하다. 또한, H3.1 은 간, 신장 및 심장을 포함한 성인 조직에서 이의 존재와 비교하여, 태아 간에 고도로 농축되어 있다. 성인 인간 조직에서, H3.3 변이체는 H3.1 변이체보다 더 풍부한데 반해, 태아 간의 경우 그 반대가 사실이다. 본 발명은 태아 및 산모 세포 및/또는 태아 핵산을 모두 포함하는 산모의 생물학적 샘플에서 태아 뉴클레오솜 및 태아 핵산을 검출하기 위해 이들 차이를 이용할 수 있다.
하나의 실시형태에서, 태아 뉴클레오솜은 혈액으로부터 수득될 수 있다. 다른 실시형태에서, 태아 뉴클레오솜은 자궁경관 점액성 샘플로부터 수득된다. 특정 실시형태에서, 자궁경관 점액성 샘플은 임신의 제 2 삼분기의 초기 또는 임신의 제 1 삼분기의 후기에 임산부로부터의 세척액 또는 면봉으로 닦아서 수득된다. 샘플은 점액에 포획된 DNA 를 방출시키기 위해 인큐베이터에 놓여질 수 있다. 인큐베이터는 37℃ 로 설정될 수 있다. 샘플은 대략 15분 내지 30분 동안 흔들어줄 수 있다. 점액은 DNA 를 방출시키는 목적을 위해 뮤시나제로 더 용해될 수 있다. 샘플은 또한 태아뉴클레오솜을 방출시키도록 아폽토시스를 유도하기 위해서, 당분야에 충분히 공지된 바와 같이, 화학적 처리와 같은 조건이 가해질 수 있다. 따라서, 자궁경관 점액성 샘플은 아폽토시스를 유도하는 작용제로 처리될 수 있고, 그리하여 태아 뉴클레오솜이 방출된다. 순환성 태아 DNA 의 농축과 관련하여, 미국 공개 특허 출원 번호 20070243549 및 20100240054 를 참조한다. 본 발명은 오직 소량의 뉴클레오솜 또는 DNA 가 태아로부터 기원할 수 있는 경우에 태아기 스크리닝에 방법 및 시스템을 적용할 때 특히 유리하다.
본 발명에 따른 태아기 스크리닝은 제한없이, 세염색체증 13, 세염색체증 16, 세염색체증 18, 클라인펠터 증후군 (47, XXY), (47, XYY) 및 (47, XXX), 터너 증후군, 다운 증후군 (세염색체증 21), 낭포성 섬유증, 헌팅톤 질환, 베타 탈라세미아, 근긴장성 이영양증, 겸상 적혈구 빈혈증, 포르피린증, 취약-X 염색체-증후군, 로버트슨 전좌증, 안젤만 증후군, 디조지 증후군 및 울프-허쉬호른 증후군을 포함하는 질환을 위한 것일 수 있다.
본 발명의 몇몇 추가 양상은 미국 국립 보건원의 웹사이트 상에 주제 세부 항목 유전적 장애 (health.nih.gov/topic/Genetic Disorders 의 웹사이트) 에 기술된 광범위한 유전 질환과 연관된 결손을 진단, 예후 및/또는 치료하는 것에 관한 것이다.
암 및 암 약제 내성 검출
특정 실시형태에서, 본 발명은 암과 연관된 유전자 및 돌연변이를 검출하는데 사용될 수 있다. 특정 실시형태에서, 내성과 연관된 돌연변이가 검출된다. 내성 종양 세포의 증폭 또는 종양 세포의 클론 개체군에서 내성 돌연변이의 출현이 치료 동안 발생될 수 있다 (예를 들어, Burger JA, et al., Clonal evolution in patients with chronic lymphocytic leukaemia developing resistance to BTK inhibition. Nat Commun. 2016 May 20;7:11589; Landau DA, et al., Mutations driving CLL and their evolution in progression and relapse. Nature. 2015 Oct 22;526(7574):525-30; Landau DA, et al., Clonal evolution in hematological malignancies and therapeutic implications. Leukemia. 2014 Jan;28(1):34-43; 및 Landau DA, et al., Evolution and impact of subclonal mutations in chronic lymphocytic leukemia. Cell. 2013 Feb 14;152(4):714-26 참조). 따라서, 이러한 돌연변이의 검출은 고도로 민감한 어세이를 요구하고 모니터링은 반복적인 생검을 필요로 한다. 반복적인 생검은 불편하고, 침습적이며 값비싸다. 내성 돌연변이는 당분야에 공지된 종래 방법을 사용하여 혈액 샘플 또는 다른 비침습적으로 채취된 생물학적 샘플 (예를 들어, 혈액, 타액, 소변) 에서 검출하는 것이 어려울 수 있다. 내성 돌연변이는 화학요법, 표적화 요법, 또는 면역요법에 대한 내성과 연관된 돌연변이를 의미할 수 있다.
특정 실시형태에서, 돌연변이는 암 진행을 검출하는데 사용될 수 있는 개별 암에서 발생된다. 하나의 실시형태에서, 종양에 대항하는 T-세포 세포용해성 활성과 관련된 돌연변이가 특성분석되었고 본 발명에 의해 검출될 수 있다 (예를 들어, Rooney et al., Molecular and genetic properties of tumors associated with local immune cytolytic activity, Cell. 2015 January 15; 160(1-2): 48-61 참조). 개별 맞춤 요법이 이들 돌연변이의 검출을 기반으로 환자를 위해 개발될 수 있다 (예를 들어, WO2016100975A1 참조). 특정 실시형태에서, 세포용해성 활성과 연관된 암 특이적 돌연변이는 CASP8, B2M, PIK3CA, SMC1A, ARID5B, TET2, ALPK2, COL5A1, TP53, DNER, NCOR1, MORC4, CIC, IRF6, MYOCD, ANKLE1, CNKSR1, NF1, SOS1, ARID2, CUL4B, DDX3X, FUBP1, TCP11L2, HLA-A, B 또는 C, CSNK2A1, MET, ASXL1, PD-L1, PD-L2, IDO1, IDO2, ALOX12B 및 ALOX15B 로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자 내 돌연변이, 또는 카피수 획득일 수 있고, 임의의 하기 염색체 밴드에 영향을 미치는 전체-염색체 사건은 배제시킨다: 6q16.1q21, 6q22.31q24.1, 6q25.1q26, 7p11.2q11.1, 8p23.1, 8p11.23p11.21 (IDO1, IDO2 함유), 9p24.2p23 (PDL1, PDL2 함유), 10p15.3, 10p15.1p13, 11p14.1, 12p13.32p13.2, 17p13.1 (ALOX12B, ALOX15B 함유), 및 22q11.1q11.21.
특정 실시형태에서, 본 발명은 치료 과정 동안 및 치료가 완료된 후 암 돌연변이 (예를 들어, 내성 돌연변이) 를 검출하기 위해 사용된다. 본 발명의 민감도는 치료 동안 발생된 클론 돌연변이의 비침습성 검출을 가능하게 할 수 있고 질환의 재발을 검출하는데 사용될 수 있다.
특정 예시 실시형태에서, 마이크로RNA (miRNA) 및/또는 차등적으로 발현된 miRNA 의 miRNA 서명의 검출은 암의 진행을 검출하거나 또는 모니터링하고/하거나 암 요법에 대한 약제 내성을 검출하는데 사용될 수 있다. 예로서, Nadal 등 (Nature Scientific Reports, (2015) doi:10.1038/srep12464) 은 미소세포 폐암 (NSCLC) 을 검출하는데 사용할 수 있는 mRNA 서명을 기술하고 있다.
특정 예시 실시형태에서, 세포의 클론 하위개체군 내 내성 돌연변이의 존재는 치료 계획을 결정하는데 사용될 수 있다. 다른 실시형태에서, 환자를 치료하기 위한 개별 맞춤 요법은 공통 종양 돌연변이를 기반으로 투여될 수 있다. 특정 실시형태에서, 공통 돌연변이는 치료에 대응하여 발생되고 약제 내성을 초래한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 돌연변이를 획득한 세포 또는 이러한 약제 내성 돌연변이를 보유하는 세포의 증폭에 대해 환자를 모니터링하는데 사용될 수 있다.
다양한 화학요법제, 특히 표적화 요법 예컨대 티로신 키나제 억제제에 의한 치료는 빈번하게 치료제의 활성에 저항하는 표적 분자 내 신규 돌연변이를 초래한다. 이러한 내성을 극복하기 위한 다중 전략은 이들 돌연변이에 의해 영향받지 않는 2세대 요법의 개발 및 내성 돌연변이의 하류에서 작용하는 것들을 포함하는 다중 작용제에 의한 치료를 포함하는 것들이 평가 중에 있다. 일례의 실시형태에서, 표적화 브루톤 티로신 키나제 (BTK) 를 표적화하고 CLL 및 일정 림프종에 사용되는 분자인, 이브루티닙에 대한 공통 돌연변이는 위치 481 (BTK/C481S) 에서 시스테인의 세린으로의 변화이다. 상피 성장 인자 수용체 (EGFR) 의 티로신 키나제 도메인을 표적으로 하는 엘로티닙은 폐암의 치료에서 일반적으로 사용되며, 내성 종양이 요법 이후에 변함없이 발생된다. 내성 클론에서 발견되는 공통 돌연변이는 위치 790 에서 트레오닌의 메티오닌으로의 돌연변이이다.
본 발명으로 검출될 수 있는 공통 내성 돌연변이 및 암 환자의 개체군 간에 공유되는 비침묵 돌연변이는 당분야에 공지되어 있다 (예를 들어, WO/2016/187508 참조). 특정 실시형태에서, 약제 내성 돌연변이는 이브루티닙, 엘로티닙, 이마티닙, 제피티닙, 크리조티닙, 트라스투주맙, 베무라페닙, RAF/MEK, 체크 포인트 차단 요법, 또는 항에스트로겐 요법을 사용한 치료에 의해 유도될 수 있다. 특정 실시형태에서, 암 특이적 돌연변이는 프로그램된 사멸-리간드 1 (PD-L1), 안드로겐 수용체 (AR), 브루톤 티로신 키나제 (BTK), 상피 성장 인자 수용체 (EGFR), BCR-Abl, c-kit, PIK3CA, HER2, EML4-ALK, KRAS, ALK, ROS1, AKT1, BRAF, MEK1, MEK2, NRAS, RAC1, 및 ESR1 로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질을 코딩하는 하나 이상의 유전자에 존재한다.
면역 체크포인트는 면역 반응을 둔화시키거나 또는 중지시키고 면역 세포의 비제어 활성에 의한 과도한 조직 손상을 방지하는 억제성 경로이다. 특정 실시형태에서, 표적화된 면역 체크포인트는 프로그램된 사멸-1 (PD-1 또는 CD279) 유전자 (PDCD1) 이다. 다른 실시형태에서, 표적화된 면역 체크포인트는 세포독성 T-림프구-연관 항원 (CTLA-4) 이다. 추가의 실시형태에서, 표적화된 면역 체크포인트는 CD28 및 CTLA4 Ig 수퍼패밀리의 다른 구성원 예컨대 BTLA, LAG3, ICOS, PDL1 또는 KIR 이다. 더욱 추가의 실시형태에서, 표적화된 면역 체크포인트는 TNFR 수퍼패밀리의 구성원 예컨대 CD40, OX40, CD137, GITR, CD27 또는 TIM-3 이다.
최근에, 종양 및 그들 미세환경에서 유전자 발현은 단일 세포 수준에서 특성분석되었다 (예를 들어, Tirosh, et al. Dissecting the multicellular ecosystem of metastatic melanoma by single cell RNA-seq. Science 352, 189-196, doi:10.1126/science.aad0501 (2016)); Tirosh et al., Single-cell RNA-seq supports a developmental hierarchy in human oligodendroglioma. Nature. 2016 Nov 10;539(7628):309-313. doi: 10.1038/nature20123. Epub 2016 Nov 2; 및 국제 공개 특허 출원 번호 WO 2017004153 A1 참조). 특정 실시형태에서, 유전자 서명은 본 발명을 사용해 검출될 수 있다. 하나의 실시형태에서, 보체 유전자가 종양 미세환경에서 모니터링되거나 또는 검출된다. 하나의 실시형태에서 MITF 및 AXL 프로그램이 모니터링되거나 또는 검출된다. 하나의 실시형태에서, 종양 특이적 줄기 세포 또는 전구체 세포 서명이 검출된다. 이러한 서명은 면역 반응의 상태 및 종양의 상태를 의미한다. 특정 실시형태에서, 증식, 치료에 대한 내성 및 면역 세포의 존재비 관점에서 종양의 상태를 검출할 수 있다.
따라서, 특정 실시형태에서, 본 발명은 특히 질환 재발 또는 공통 내성 돌 연변이의 발생을 모니터링하기 위해, 순환성 DNA, 예컨대 종양 DNA 에 대한 저비용의 신속한, 복합 암 검출 패널을 제공한다.
면역요법 응용
본 명세서에서 개시된 실시형태는 또한 추가 면역요법 상황에서 유용할 수 있다. 예를 들면, 일부 실시형태에서, 대상체에서 면역 반응을 진단, 예후화 및/또는 병기구분하는 방법은 하나 이상의 바이오마커의 발현, 활성 및/또는 기능의 제 1 수준을 검출하는 단계 및 검출된 수준을 대조군 수준과 비교하는 단계를 포함하고 여기서 검출된 수준과 대조군 수준의 차이는 대상체에서 면역 반응의 존재를 의미한다.
특정 실시형태에서, 본 발명은 종양 침윤성 림프구 (TIL) 의 기능이상 또는 활성화를 결정하는데 사용될 수 있다. TIL 은 기지 방법을 사용하여 종양으로부터 단리될 수 있다. TIL 은 양자 세포 전달 요법에서 그들을 사용할 수 있는지 여부를 결정하기 위해 분석될 수 있다. 추가적으로, 키메라 항원 수용체 T 세포 (CAR T 세포) 는 그들을 대상체에게 투여하기 전에 기능이상 또는 활성화의 서명에 대해 분석될 수 있다. 기능이상 및 활성화된 T 세포에 대한 예시적인 서명은 기술되어 있다 (예를 들어, Singer M, et al., A Distinct Gene Module for Dysfunction Uncoupled from Activation in Tumor-Infiltrating T Cells. Cell. 2016 Sep 8;166(6):1500-1511.e9. doi: 10.1016/j.cell.2016.08.052 참조).
일부 실시형태에서, C2c2 는 면역 세포, 예컨대 T 세포 (예를 들어, CD8+ 및/또는 CD4+ T 세포) 의 상태를 평가하는데 사용된다. 특히, T 세포 활성화 및/또는 기능이상은 예를 들어 T 세포 상태 중 하나 이상과 연관된 유전자 또는 유전자 서명을 기반으로 결정될 수 있다. 이러한 방식으로, C2c2 는 T 세포의 하나 이상의 하위개체군의 존재를 결정하는데 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, C2c2 는 진단 어세이에서 사용될 수 있거나 또는 환자가 면역요법 또는 다른 유형의 요법을 투여하기에 적합한지 여부를 결정하는 방법으로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 유전자 또는 바이오마커 서명의 검출은 환자가 소정 치료에 반응하는지 여부, 또는 환자가 반응하지 않으면, 이것이 T 세포 기능이상에 기인하는 것인지 여부를 결정하기 위해 C2c2 를 통해서 수행할 수 있다. 이러한 검출은 환자가 수용하기에 최고로 적합한 유형의 요법에 관해 유용한 정보를 준다. 예를 들어, 환자가 면역요법을 수용하는지 여부.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 시스템 및 어세이는 임상의가 요법 (예를 들어, 양자 세포 전달 (ACT) 요법) 에 대한 환자의 반응이 세포 기능이상에 기인하는지 여부, 및 그렇다면 바이오마커 서명에 걸친 상향조절 및 하향조절의 수준이 문제를 해결할 수 있게 할 것인지 여부를 확인할 수 있게 한다. 예를 들어, ACT 를 받은 환자가 비반응성이면, ACT 의 일부로서 투여된 세포는 세포 활성화 및/또는 기능이상 상태와 연관된 것으로 알려진 바이오마커 서명의 상대적 발현도를 결정하기 위해 본 명세서에 개시된 어세이를 통해 어세이될 수 있다. 특정한 억제성 수용체 또는 분자가 ACT 세포에서 상향조절되면, 환자는 그 수용체 또는 분자의 억제제로 처치될 수 있다. 특정한 자극성 수용체 또는 분자가 ACT 세포에서 하향 조절되면, 환자는 그 수용체 또는 분자의 효현제로 처치될 수 있다.
특정 예시 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 시스템, 방법 및 장치는 특정한 세포 유형, 세포 표현형, 또는 세포 상태를 식별하는 유전자 서명을 스크리닝하는데 사용될 수 있다. 유사하게, 압축적 감지와 같은 방법의 사용을 통해서, 본 명세서에서 개시된 실시형태는 전사체를 검출하는데 사용될 수 있다. 유전자 발현 데이타는 고도로 구조화되어서, 일부 유전자의 발현도는 다른 것들의 발현도를 예측한다. 유전자 발현 데이타가 고도로 구조적이라는 지식은 시스템에서 자유도의 수가 적다는 가정을 가능하게 하고, 이것은 상대적 유전자 존재비의 계산을 위한 기초가 희박하다고 가정하는 것을 가능케 한다. 어떠한 유전자가 상호작용할 것인가에 대한 임의의 특별한 지식없이 출원인이 언더샘플링하면서 비선형 상호작용 조건을 회복할 수 있게 하는 몇몇 생물학적 동기 부여 가설을 만드는 것이 가능하다. 특히, 출원인이 유전자 상호작용을 저순위, 희박, 또는 이들의 조합이라고 가정한다면, 자유도의 진짜 수가 완전한 조합적 확장에 비해 작고, 이것은 출원인이 상대적으로 작은 수의 교란으로 지표를 추론할 수 있게 한다. 이들 가정으로 작업하여, 압축 감지 및 매트릭스 완성의 분석 이론을 사용하여 언더샘플링된 조합적 교란 실험을 설계할 수 있다. 또한, 커넬-학습 프레임워크를 사용하여 임의의 개별 상호작용 계수를 직접적으로 학습하지 않고 조합적 교란의 예측 함수를 구축하여 언더샘플링을 적용할 수 있다. 압축 감지는 포괄적인 유전자-발현 프로파일을 수득하기 위해서 검출하려는 표적 전사물의 최소 수를 확인하기 위한 방식을 제공한다. 압축 감지를 위한 방법은 참조로 본 명세서에 편입시킨, 2016년 10월 27일 출원된 PCT/US2016/059230 "Systems and Methods for Determining Relative Abundances of Biomolecules" 에 개시되어 있다. 최소 전사물 표적 세트를 식별하기 위해 압축 감지와 같은 방법을 사용하게 되는 경우라면, 상응하는 가이드 RNA 의 세트는 상기 전사물을 검출하도록 설계될 수 있다. 따라서, 특정 예시 실시형태에서, 세포의 유전자-발현 프로파일을 수득하기 위한 방법은 본 명세서에 개시된 실시형태를 사용하여, 세포 또는 세포 개체군의 유전자-발현 프로파일을 제공하는 최소 전사물 세트를 검출하는 단계를 포함한다.
핵산 태그화된 항목 검출
대안적으로, 본 명세서에 기술된 실시형태는 핵산 식별자를 검출하는데 사용될 수 있다. 핵산 식별자는 특정한 물품을 식별하는데 사용될 수 있는 논-코딩 핵산이다. 일례의 핵산 식별자, 예컨대 DNA 워터마크는 Heider and Barnekow. "DNA watermarks: A proof of concept" BMC Molecular Biology 9:40 (2008) 에 기술되어 있다. 핵산 식별자는 또한 핵산 바코드일 수 있다. 핵산 기반 바코드는 회합된 분자, 예컨대 표적 분자 및/또는 표적 핵산에 대한 식별자로서 사용되는 짧은 뉴클레오티드 서열 (예를 들어, DNA, RNA, 또는 이의 조합) 이다. 핵산 바코드는 적어도, 예를 들어, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100개 뉴클레오티드의 길이를 가질 수 있고, 단일-가닥 형태일 수 있거나 또는 이중-가닥 형태일 수 있다. 하나 이상의 핵산 바코드는 표적 분자 및/또는 표적 핵산에 부착, 또는 "태그화" 될 수 있다. 이러한 부착은 직접적 (예를 들어, 표적 분자에 바코드의 공유 또는 비공유 결합) 일 수 있거나 또는 간접적 (예를 들어, 추가 분자, 예를 들어, 특이적 결합제, 예컨대 항체 (또는 다른 단백질) 또는 바코드 수용 어댑터 (또는 다른 핵산 분자) 를 통해서) 일 수 있다. 표적 분자 및/또는 표적 핵산은 조합적인 방식으로 다수 핵산 바코드, 예컨대 핵산 바코드 콘카테머로 표지될 수 있다. 전형적으로, 핵산 바코드는 특정한 구획 (예를 들어, 이산 부피) 으로부터, 특정한 물리적 특성 (예를 들어, 친화성, 길이, 서열 등) 을 갖는 것으로, 또는 일정한 치료 조건을 겪은 것으로, 표적 분자 및/또는 표적 핵산을 식별하는데 사용된다. 표적 분자 및/또는 표적 핵산은 모든 이들 특성 (및 그 이상) 에 관한 정보를 제공하도록 다수의 핵산 바코드와 회합될 수 있다. 핵산-바코드를 생성시키는 방법은 예를 들어, 국제 공개 특허 출원 번호 WO/2014/047561 에 개시되어 있다.
효소
본 출원은 RNA 절단 및 검출의 상이한 적용분야에 특히 적합하게 만드는 강건한 활성을 입증한 C2c2 의 오솔로그를 더 제공한다. 이들 적용분아는 제한없이 본 명세서에 기술된 것들을 포함한다. 보다 특히, 시험된 다른 것들보다 강력한 활성을 갖는 것으로 입증된 오솔로그는 유기체 렙토트리키아 웨이데이로부터 식별된 C2c2 오솔로그 (LwC2c2) 이다. 따라서 본 출원은 관심 표적 유전자좌를 변형시키기 위한 방법을 제공하고, 이 방법은 C2c2 이펙터 단백질, 보다 특히 본 명세서에 기술된 바와 같이 증가된 활성을 갖는 C2c2 이펙터 단백질 및 하나 이상의 핵산 성분을 포함하는 비천연 발생되거나 또는 조작된 조성물을 상기 유전자좌에 전달하는 단계를 포함하고, 여기서 적어도 하나 이상의 핵산 성분은 조작되고, 하나 이상의 핵산 성분은 복합체를 관심 표적으로 유도시키고 이펙터 단백질은 하나 이상의 핵산 성분과 복합체를 형성하며 복합체는 관심 표적 유전자좌에 결합한다. 특정한 실시형태에서, 관심 표적 유전자좌는 RNA 를 포함한다. 본 출원은 RNA 서열 특이적 간섭, RNA 서열 특이적 유전자 조절, RNA 또는 RNA 생성물 또는 lincRNA 또는 논-코딩 RNA, 또는 핵 RNA, 또는 mRNA 의 스크리닝, 돌연변이유발법, 형광 제자리 하이브리드화, 또는 브리딩에서 증가된 활성을 갖는 Cc2 이펙터 단백질의 용도를 더 제공한다.
본 발명은 하기 실시예에서 더욱 설명되지만, 이것이 청구항에 기술된 본 발명의 범주를 제한하지는 않는다.
실시예
실시예 1: 일반 프로토콜
DNA 및 RNA 에 대한 C2c2 진단 시험을 수행하는 두 가지 방법이 있다. 이 프로토콜은 또한 검출 앱타머의 전달 후 단백질 검출 변이체와 함께 사용될 수 있다. 첫번째는 증폭과 C2c2 검출이 별도로 수행되는 2 단계 반응이다. 두번째에서는 모든 것이 하나의 반응으로 조합되며, 이것을 2-단계 반응이라고 한다. 더 높은 농도의 샘플에는 증폭이 필요하지 않을 수 있으므로 증폭 기능이 내장되어 있지 않은 별도의 C2c2 프로토콜을 사용하는 것이 좋다는 점이 중요하다.
CRISPR 이펙터 단독 - 증폭 없음:
표 7
반응 완충액: 40 mM Tris-HCl, 60 mM NaCl, pH 7.3
이 반응을 37℃ 에서 20 분 - 3 시간 동안 수행한다. 여기: 485 ㎚/20 ㎚, 방출: 528 ㎚/20 ㎚ 로 판독한다. 단일 분자 민감도에 대한 신호는 20 분에 시작될 수 있지만 물론 반응 시간이 길수록 민감도는 더 높다.
2 단계 반응:
표 8
RPA 증폭 믹스
이 반응을 함께 혼합한 다음 동결 건조 효소 믹스의 2 내지 3 개 튜브를 재현탁한다. 믹스에 5 ㎕ 의 280 mM MgAc 를 첨가하여 반응을 시작한다. 10-20 분 동안 반응을 수행한다. 각 반응은 20 ㎕ 이므로 최대 5 회의 반응에 충분하다.
표 9
C2C2 검출 믹스
반응 완충액: 40 mM Tris-HCl, 60 mM NaCl, pH 7.3
이를 20 분 - 3 시간 동안 수행한다. 단일 분자 민감도를 보기 위해 최소 탐지 시간은 약 20 분이다. 더 오래 동안 반응을 수행하는 것만으로도 민감도가 향상된다.
표 10
원 포트 (one pot) 반응:
참조된 NEB 키트는 HighScribe T7 High Yield Kit 이다. 완충액을 재현탁시키기 위해서, 1.5x 농도를 사용한다: 동결 건조된 기질의 세 개의 튜브를 59 ㎕ 의 완충액에 재현탁시키고, 상기 믹스에 사용한다. 각각의 반응은 20 ㎕ 이며, 이는 5 회의 반응에 충분하다. 이 반응에 관하여 단일 분자 민감도가 이미 30-40 min 에 관찰되었다.
실시예 2 - 렙토트리키아 웨이데이 (
LEPTOTRICHIA WADEI
) 로부터의 C2C2 는 DNA 및 RNA 의 높은 민감도 특이적 검출을 매개한다
신속한, 비싸지 않은, 및 민감한 핵산 검출은 의료 현장 병원체 검출, 유전형분석, 및 질환 모니터링을 보조할 수 있다. RNA-가이드, RNA-표적화 CRISPR 이펙터 Cas13a (이전에 C2c2 로서 알려짐) 는 표적 인지시에 난잡한 RNAse 활성의 "부수적 효과 (collateral effect)" 를 나타낸다. 우리는 Cas13a 의 부수적 효과와 등온 증폭을 조합하여 CRISPR-기반 진단 (CRISPR-Dx) 을 확립하여, 신속한 DNA 또는 RNA 검출에 아토몰 (attomolar) 민감도 및 단일-염기 미스매치 특이성을 제공한다. 우리는, SHERLOCK (특이적 높은 민감도 효소 리포터 (Specific High Sensitivity Enzymatic Reporter) UnLOCKing) 으로 명명되는, 이 Cas13a-기반 분자 검출 플랫폼을 사용하여 지카 (Zika) 및 뎅기 (Dengue) 바이러스의 특이적 균주를 검출하고, 병원성 박테리아를 구별하고, 인간 DNA 를 유전자형분석하고, 세포-무함유 종양 DNA 돌연변이를 식별한다. 또한, SHERLOCK 반응 시약은 콜드-체인 독립 및 장기간 저장을 위해 동결건조될 수 있고, 현장 적용을 위해 서류상으로 용이하게 재구성될 수 있다.
휴대용 플랫폼에서 높은 민감도 및 단일-염기 미스매치 특이성을 갖는 핵산을 신속하게 검출하는 능력은 질병 진단 및 모니터링, 역학 및 일반적인 실험실 작업에 도움이 될 수 있다. 핵산을 검출하기 위한 방법이 존재하지만 (1-6), 민감도, 특이성, 단순성, 비용 및 속도간에 절충점이 있다. 미생물 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문 반복서열 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) (CRISPR) 및 CRISPR-연관 (CRISPR-Cas) 적응 면역 시스템은 CRISPR-기반 진단 (CRISPR-Dx) 에 활용할 수 있는 프로그램가능한 엔도뉴클레아제를 포함한다. 일부 Cas 효소는 DNA (7, 8) 를 표적화하지만, 단일 이펙터 RNA-가이드 RNases, 예컨대 Cas13a (이전에 C2c2 로서 알려짐) (8) 는, CRISPR RNAs (crRNAs) (9-11) 로 재프로그래밍되어 특이적 RNA 센싱을 위한 플랫폼을 제공한다. 그것의 RNA 표적의 인지시에, 활성화된 Cas13a 는 인근의 비-표적화되는 RNA 의 "부수적" 절단 (10) 에 참여한다. 상기 crRNA-프로그램된 부수적 절단 활성은 생체 내에서 프로그램된 세포 사멸 (10) 을 유발하거나 시험관 내에서 표지된 RNA (10, 12) 의 비특이적 분해에 의해 Cas13a 가 특정 RNA 의 존재를 검출할 수 있게 한다. 여기에서 우리는, 표적의 실시간 검출을 가능하게 하는, SHERLOCK (Specific High Sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing), 핵산 증폭 및 상업적 리포터 RNA (12) 의 Cas13a-매개되는 부수적 절단에 기초하여 아토몰 민감도로 시험관 내 핵산 검출 플랫폼을 기재한다 (도 17).
방법
발현을 위한 C2c2 유전자좌 및 단백질의 클로닝
박테리아 생체내 효율 어세이를 위해, 렙토트리키아 웨이데이 (Leptotrichia wadei) F0279 및 렙토트리키아 샤히이 (Leptotrichia shahii) 로부터의 C2c2 단백질을 포유동물 발현을 위한 코돈-최적화된 유전자로서 주문하고 (Genscript, Jiangsu, China), 베타-락타마아제 표적화 또는 비-표적화 스페이서의 측면에 있는 상응하는 직접 반복체를 따라 pACYC184 백본 내로 클로닝했다. 스페이서 발현을 J23119 프로모터에 의해 추진했다.
단백질 정제를 위해, 동물 코돈-최적화된 C2c2 단백질을 단백질 정제를 위한 박테리아 발현 벡터 (6x His/Twin Strep SUMO, Ilya Finkelstein 로부터 기증품으로서 받은, pET-기반 발현 벡터) 내로 클로닝했다.
박테리아 생체내 C2c2 효율 어세이
LwC2c2 및 LshC2c2 생체내 효율 플라스미드 및 이전에 기재된 베타-락타마아제 플라스미드 (Abudayyeh 2016) 를 NovaBlue Singles Competent Cells (Millipore) 내로 각각 90 ng 및 25 ng 으로 동시형질전환시켰다. 형질전환 후에, 세포의 희석물을 암피실린 및 클로람피콜 LB-아가 플레이트 내로 플레이팅하고, 37℃ 에서 하룻밤 인큐베이션했다. 다음 날에 콜로니를 계수했다.
핵산 표적 및 crRNA 제조
핵산 표적을 KAPA Hifi Hot Start (Kapa Biosystems) 로 PCR 증폭시키고, 겔 추출하고, MinElute 겔 추출 키트 (Qiagen) 로 정제했다. 정제된 dsDNA 는 T7 폴리머라아제와 밤새 30℃ 에서 HiScribe T7 Quick High Yield RNA Synthesis 키트 (New England Biolabs) 를 사용해 인큐베이션시켰고, RNA 는 MEGAclear Transcription Clean-up 키트 (Thermo Fisher) 를 사용해 정제했다.
crRNA 의 제조를 위해, 구성체를 T7 프로모터 서열이 첨부된 DNA 로서 주문했다 (Integrated DNA Technologies). crRNA DNA 를 짧은 T7 프라이머 (최종 농도 10uM) 에 어닐링하고, T7 폴리머라아제와 하룻밤 37℃ 에서 HiScribe T7 Quick High Yield RNA Synthesis 키트 (New England Biolabs) 를 사용하여 인큐베이션했다. crRNA 는 추가로 이소프로판올 (Sigma) 을 1.8x 보충하고, 2x 비율의 비드 대 반응 부피로 RNAXP 클린 비드 (Beckman Coulter) 를 사용하여 정제했다.
NASBA 등온 증폭
NASBA 반응의 세부사항은 [Pardee 2016] 에 기재되어 있다. 20 ㎕ 총 반응 부피를 위해, 6.7 ㎕ 의 반응 완충액 (Life Sciences, NECB-24), 3.3 ㎕ 의 Nucleotide Mix (Life Sciences, NECN-24), 0.5 ㎕ 의 뉴클레아제-비함유 물, 0.4 ㎕ 의 12.5 μM NASBA 프라이머, 0.1 ㎕ 의 RNase 억제제 (Roche, 03335402001) 및 4 ㎕ 의 RNA 앰플리콘 (또는 음성 대조군의 경우에 물) 을 4℃ 에서 조립하고, 65℃ 에서 2 min 동안 및 그 후 41℃ 에서 10 min 동안 인큐베이션했다. 5 ㎕ 의 효소 믹스 (Life Sciences, NEC-1-24) 를 각각의 반응에 첨가하고, 반응 혼합물을 41℃ 에서 2 hr 동안 인큐베이션했다. 사용된 NASBA 프라이머는 5'-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGGGATCCTCTAGAAATATGGATT-3' (SEQ ID NO: 16) 및 5'-CTCGTATGTTGTGTGGAATTGT-3' (SEQ ID NO: 17) 였고, 밑줄친 부분은 T7 프로모터 서열을 나타낸다.
리콤비나아제 폴리머라아제 증폭
RPA 용 프라이머는 앰플리콘 크기 (100 내지 140 nt), 프라이머 용융 온도 (54℃ 내지 67℃) 및 프라이머 크기 (30 내지 35 nt) 를 제외하고, 디폴트 매개변수를 사용하여 NCBI Primer blast 를 사용해 설계했다. 그 다음으로 프라이머는 DNA (Integrated DNA Technologies) 로 주문했다.
RPA 및 RT-RPA 반응 수행은 280 mM MgAc 를 주형 투입 이전에 첨가한 것을 제외하고, 각각 TwistAmp® Basic 또는 TwistAmp® Basic RT (TwistDx) 에서 지시한 바와 같이 했다. 반응은 달리 설명하지 않으면, 1 ㎕ 의 투입량으로 2시간 동안 37℃ 에서 수행했다.
LwC2c2 단백질 정제:
C2c2 박테리아 발현 벡터로 Rosetta™2(DE3) pLysS Singles Competent Cells (Millipore) 를 형질전환시켰다. 16 ㎖ 스타터 배양물을 Terrific Broth 4 성장 배지 (12 g/L 트립톤, 24 g/L 효소 추출물, 9.4 g/L K2HPO, 2.2 g/L KH2PO4, Sigma) (TB) 에서 성장시키고, 이것을 사용하여 4L 의 TB 를 접종하고, 이를 37℃, 300 RPM 에서 0.6 의 OD600 까지 인큐베이션했다. 이 시점에, 단백질 발현은 500 μM 의 최종 농도로 IPTG (Sigma) 를 보충하여 유도시켰고, 세포를 단백질 발현을 위해서 16시간 동안 18℃ 로 냉각시켰다. 이어서 세포를 5200g, 15 분, 4 ℃ 에서 원심분리했다. 세포 펠렛을 수확하고 후속 정제를 위해 -80 ℃ 에서 저장했다.
단백질 정제의 모든 후속 단계는 4℃ 에서 수행했다. 세포 펠렛을 으깨고, 프로테아제 억제제 (Complete Ultra EDTA-비함유 정제), 라이소자임, 및 벤조나아제를 보충한 용해 완충액 (20mM Tris-HCl, 500mM NaCl, 1mM DTT, pH 8.0) 에 재현탁시키고, 그에 뒤이어 초음파처리 (Sonifier 450, Branson, Danbury, CT) 를 하기 조건으로 수행했다: 1 초 온 (on) 및 2 초 오프 (off) 동안 진폭 100 및 총 초음파처리 시간 10 분. 용해물을 1 시간 동안 4 ℃ 에서 10,000g 에서 원심분리에 의해 맑게 하고, 상청액을 Stericup 0.22 마이크론 필터 (EMD Millipore) 를 통해 여과했다. 여과된 상청액을 StrepTactin Sepharose (GE) 에 도포했고 1시간 동안 회전하면서 인큐베이션시킨 후에 용해 완충액으로 3회 단백질-결합된 StrepTactin 수지를 세척했다. 수지는 250 유닛의 SUMO 프로테아제 (ThermoFisher) 와 함께 SUMO 분해 완충액 (30 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl 1 mM DTT, 0.15% Igepal (NP-40), pH 8.0) 에 재현탁시켰고 밤새 4℃ 에서 회전시키면서 인큐베이션했다. 소화를 SDS-PAGE 및 Commassie Blue 염색에 의해 확인하고, 단백질 용리액을 수지를 스핀 다운시켜 단리했다. 단백질을 5 ㎖ HiTrap SP HP 양이온 교환 컬럼 (GE Healthcare Life Sciences) 상에 FPLC (AKTA PURE, GE Healthcare Life Sciences) 를 통해 로딩했고, 용리 완충액 (20mM Tris-HCl, 1mM DTT, 5% 글리세롤, pH 8.0) 중 130 mM 내지 2M NaCl 의 염 농도구배로 용리했다. 최종 분획은 SDS-PAGE 를 통해서 LwC2c2 의 존재에 대해 시험되었고, 단백질을 함유하는 분획을 풀링하여 원심분리용 필터 유닛을 통해 1 ㎖ 까지 S200 완충액 (10mM HEPES, 1M NaCl, 5mM MgCl2, 2mM DTT, pH 7.0) 중에서 농축시켰다. 농축된 단백질은 겔 여과 컬럼 (Superdex®200 Increase 10/300 GL, GE Healthcare Life Sciences) 상에 FPLC 를 통해 로딩했다. 겔 여과로부터 생성된 분획을 SDS-PAGE 에 의해 분석했고, LwC2c2 를 함유하는 분획을 풀링하고 저장 완충액 (600mM NaCl, 50mM Tris-HCl pH 7.5, 5% 글리세롤, 2mM DTT) 으로 완충액 교환하고, 저장을 위해 -80℃ 에서 동결시켰다.
LwC2c2 부수적 검출
검출 어세이를, 다르게 명시되지 않으면, 뉴클레아제 어세이 완충액 (40mM Tris-HCl, 60mM NaCl, 6mM MgCl2, pH 7.3) 중에서 45nM 정제된 LwC2c2, 22.5nM crRNA, 125nM 기질 리포터 (Thermo Scientific RNAse Alert v2), 2㎕ 쥐과동물 RNase 억제제, 100ng 의 배경 전체 RNA 및 다양한 양의 투입 핵산 표적으로 수행했다. 투입이 RPA 반응으로부터의 T7 프로모터를 포함하는 증폭된 DNA 인 경우에, 상기 C2c2 반응을 변경하여 1mM ATP, 1mM GTP, 1mM UTP, 1mM CTP 및 0.6㎕ T7 폴리머라아제 믹스 (NEB) 를 포함시켰다. 반응은 형광 동역학을 5분마다 측정하면서 형광 플레이트 판독기 (BioTek) 상에서 1-3시간 동안 (달리 표시하지 않으면) 37℃ 에서 진행되도록 했다.
상기 반응 조건과 RPA 증폭 믹스를 통합시킴으로써, RPA-DNA 증폭, DNA 에서 RNA 로의 T7 폴리머라아제 전환 및 C2c2 검출을 조합하는, 원-포트 반응을 수행했다. 간략히, 50㎕ 원-포트 어세이는 0.48μM 정방향 프라이머, 0.48μM 역방향 프라이머, 1x RPA 재수화 완충액, 다양한 양의 DNA 투입, 45nM LwC2c2 재조합 단백질, 22.5nM crRNA, 250ng 배경 전체 RNA, 200nM 기질 리포터 (RNase alert v2), 4㎕ RNase 억제제, 2mM ATP, 2mM GTP, 2mM UTP, 2mM CTP, 1㎕ T7 폴리머라아제 믹스, 5mM MgCl2, 및 14mM MgAc 로 이루어졌다.
TaqMan 프로브를 사용하는 정량적 PCR (qPCR) 분석
SHERLOCK 정량화와 다른 확립된 방법을 비교하기 위해서, ssDNA 1 의 희석 시리즈에 대한 qPCR 을 수행했다. TaqMan 프로브 및 프라이머 세트 (하기 서열) 를 ssDNA 1 에 대해 설계하고, IDT 로 합성했다. 어세이를 TaqMan Fast Advanced Master Mix (Thermo Fisher) 를 사용하여 수행하고, Roche LightCycler 480 에서 측정했다.
표 11. qPCR 프라이머/프로브 서열의 표.
SYBR Green II 를 사용하는 실시간 RPA
SHERLOCK 정량화와 다른 확립된 방법을 비교하기 위해서, 우리는 ssDNA 1 의 희석 시리즈에 대해 RPA 를 수행했다. DNA 의 축적을 실시간으로 정량화하기 위해서, 우리는 1x SYBR Green II (Thermo Fisher) 를 위에 기재된 전형적 RPA 반응 혼합물에 첨가했으며, 이는 핵산의 양과 상관관계가 있는 형광 신호를 제공한다. 형광 동역학을 5분 마다 측정하면서 1 hr 동안 37℃ 에서 형광 플레이트 판독기 (BioTek) 상에서 반응이 진행되도록 했다.
렌티바이러스 제조 및 가공
렌티바이러스 제조 및 가공은 이전에 알려진 방법에 기초했다. 간략히, HeBS-CaCl2 방법을 사용하여 10 ㎍ 지카 또는 뎅기 RNA 단편을 포함하는 pSB700 유도체, 7.5 ㎍ psPAX2, 및 2.5 ㎍ pMD2.G 로 HEK293FT 세포 (Life Technologies, R7007) 를 트랜스펙션시켰다. 10% FBS, 1% 페니실린-스트렙토마이신 및 4 mM GlutaMAX (ThermoFisher Scientific) 이 보충된 DMEM 로 배지를 교환한 후 28 hr 에, 상청액을 0.45 ㎛ 시린지 필터를 사용하여 여과했다. ViralBind Lentivirus Purification Kit (Cell Biolabs, VPK-104) 및 Lenti-X Concentrator (Clontech, 631231) 를 사용하여 상청액으로부터 렌티바이러스를 정제 및 제조했다. QuickTiter Lentivirus Kit (Cell Biolabs, VPK-112) 를 사용하여 바이러스 농도를 정량화했다. 바이러스 샘플을 7% 인간 혈청 (Sigma, H4522) 내에 스파이킹하고, 95 ℃ 로 2 min 동안 가열하고, RPA 로의 투입으로서 사용했다.
지카 인간 혈청 샘플의 단리 및 cDNA 정제
의심되는 지카 양성 인간 혈청 또는 소변 샘플을 AVL 완충액 (Qiagen) 으로 불활성화시키고, RNA 의 단리를 QIAamp Viral RNA 미니키트 (Qiagen) 로 달성했다. 단리된 RNA 를, 랜덤 프라이머, dNTPs, 및 샘플 RNA 를 혼합한 후에 7 분 동안 70℃ 에서 가열 변성을 수행함으로써 cDNA 로 전환시켰다. 변성된 RNA 를 그 후 22-25℃ 에서 10 분, 50℃ 에서 45 분, 55℃ 에서 15 분, 및 80℃ 에서 10 분 동안 Superscript III (Invitrogen) 인큐베이션하여 역전사했다. cDNA 를 그 후 20 분 동안 37℃ 에서 RNAse H (New England Biolabs) 와 인큐베이션하여 RNA:cDNA 하이브리드 중 RNA 를 파괴했다.
인간 타액으로부터 게놈 DNA 추출
채취 전 30분에 음식 또는 음료 섭취를 제한한 자원자로부터 2 ㎖ 의 타액을 채취했다. 그 다음으로 샘플은 키트 프로토콜에 따라 추천한 대로 QIAamp® DNA Blood Mini Kit (Qiagen) 를 사용해 처리했다. 끓인 타액 샘플의 경우에, 400 ㎕ 의 인산 완충 식염수 (Sigma) 를 100 ㎕ 의 자원자 타액에 첨가하고, 5 min 동안 1800 g 에서 원심분리했다. 상청액을 기울여 따라내고, 0.2% Triton X-100 (Sigma) 를 함유하는 인산 완충 식염수에 펠렛을 재현탁시키고, 그 후 95℃ 에서 5 min 동안 인큐베이션했다. 1 ㎕ 의 샘플을 RPA 반응 내로의 직접 투입으로서 사용했다.
동결-건조 및 종이 침적
유리 섬유 필터 종이 (Whatman, 1827-021) 를 90 min 동안 오토클레이브하고 (Consolidated Stills and Sterilizers, MKII), 5% 뉴클레아제-비함유 BSA (EMD Millipore, 126609-10GM) 에서 하룻밤 차단했다. 종이를 뉴클레아제-비함유 물 (Life technologies, AM9932) 로 1 회 헹군 후에, 4 % RNAsecure™ (Life technologies, AM7006) 와 함께 60℃ 에서 20 min 동안 인큐베이션하고, 뉴클레아제-비함유 물로 3 회 더 헹궜다. 처리된 종이를 사용 전에 핫 플레이트 (Cole-Parmer, IKA C-Mag HS7) 상에서 20 min 동안 80℃ 에서 건조시켰다. 1.8 ㎕ 의 이전에 명시된 C2c2 반응 혼합물을 검은색, 투명 바닥 384-웰 플레이트 (Corning, 3544) 에 배치된 디스크 (2 mm) 상에 놓았다. 동결-건조된 시험을 위해서, 반응 혼합물 디스크를 함유하는 플레이트를 액체 질소에서 급속 동결시키고, Pardee et al (2) 에 기재된 바와 같이 하룻밤 동결-건조시켰다. RPA 샘플을 뉴클레아제-비함유 물에 1:10 희석하고, 1.8 ㎕ 의 혼합물을 종이 디스크 상에 로딩하고, 37℃ 에서 플레이트 판독기 (BioTek Neo) 를 사용하여 인큐베이션했다.
박테리아 게놈 DNA 추출
CRE 검출을 수반하는 실험을 위해, 박테리아 배양물을 라이소제니 브로쓰 (LB) 에서 중앙-로그기까지 성장시키고, 그 후 펠렛화하고, Qiagen DNeasy Blood and Tissue Kit 를 사용하는 gDNA 추출 및 정제에 적용하며, 이 때 그람 음성 또는 그람 양성 박테리아에 대한 제조사의 프로토콜을 적절히 사용한다. gDNA 를 Qubit 형광계에서 Quant-It dsDNA 어세이에 의해 정량화하고, 그것의 품질을 Nanodrop 분광광도계에서 200-300 ㎚ 흡광도 스펙트럼을 통해 평가했다.
대장균 (E. coli) 과 슈도모나스 애루지노사 (Pseudomonas aeruginosa) 사이를 구별하는 실험을 위해, 박테리아 배양물을 루리아-베르타니 (Luria-Bertani) (LB) 브로쓰에서 초기 정지기까지 성장시켰다. 1.0 ㎖ 의 대장균 및 슈도모나스 애루지노사 둘 모두를 휴대용 PureLyse 박테리아 gDNA 추출 키트 (Claremont BioSolutions) 를 사용하여 가공했다. 1X 결합 완충액을 박테리아 배양물에 첨가하고, 그 후 배터리 구동 용해 카트리지에 3 분 동안 통과시켰다. 물 중 0.5X 결합 완충액을 세정 용액으로서 사용했고, 그 후 150 ㎕ 의 물로 용출했다.
디지털 액적 PCR 정량
도 1C 에서 사용되는 ssDNA 1 및 ssRNA 1 표준 희석물의 농도를 확인하기 위해서, 우리는 디지털 액적 (digital-액적) PCR (ddPCR) 을 수행했다. DNA 정량화의 경우, ssDNA 1 서열을 표적화하도록 설계된 PrimeTime qPCR 프로브/프라이머 어세이와 프로브용 ddPCR Supermix (dUTP 없음) 를 사용하여 액적을 만들었다. RNA 정량화를 위해서, ssRNA 1 서열을 표적화하도록 설계된 PrimeTime qPCR 프로브/프라이머 어세이와 프로브용 원-스텝 RT-ddPCR 키트를 사용하여 액적을 만들었다. 액적을 두 경우 모두 QX200 액적 생성기 (BioRad) 를 사용하여 생성하고, PCR 플레이트로 옮겼다. 액적-기반 증폭을 키트의 프로토콜에 기술된 대로 열순환기에서 수행했고, 핵산 농도를 이후에 QX200 액적 판독기 상에서 측정을 통해 확인했다.
인간 유전형분석을 위한 합성 표준
인간 샘플 유전자형의 정확한 호칭을 위한 표준을 생성하기 위해서, 우리는 SNP 표적 근처의 프라이머를 설계하여 두 개의 동형접합체 유전자형 각각을 나타내는 인간 게놈 DNA 로부터 ~200 bp 영역을 증폭시켰다. 그 후 동형접합체 표준을 1:1 비로 혼합함으로써 이형접합체 표준을 만들었다. 그 후 이들 표준을 등가 게놈 농도 (~0.56 fg/㎕) 까지 희석했고, 실제 인간 샘플과 함께 SHERLOCK 을 위한 투입으로서 사용했다.
종양 돌연변이체 세포-무함유-DNA (cfDNA) 의 검출
실제 환자 cfDNA 샘플을 모의하는 가짜 cfDNA 표준을 상업적 판매회사 (Horizon Discovery Group) 로부터 구입했다 이들 표준은 BRAF V600E 및 EGFR L858R 돌연변이체 둘 모두의 경우에 4 개의 대립형질 분획 (100% WT 및 0.1%, 1%, 및 5% 돌연변이체) 으로서 제공되었다. 3 ㎕ 의 이들 표준은 SHERLOCK 을 위한 투입으로서 제공되었다.
형광도 데이타의 분석
배경치 차감 형광도 데이타를 계산하기 위해서, 샘플의 초기 형광도를 차감하여 상이한 조건 간 비교를 가능하게 했다. 배경 조건 (투입 또는 crRNA 가 부재하는 조건) 에 대한 형광도를 샘플에서 차감하여 배경치 차감 형광도를 생성시켰다.
각각의 가이드를 가이드 값의 합계로 나눗셈함으로써 SNP 또는 균주 구별을 위한 가이드 비를 계산하여, 샘플-대-샘플 전체 변동을 조정했다. 다음과 같이 샘플-대-샘플 전체 변동에 대해 조정하기 위해서 SNP 또는 균주 구별을 위한 crRNA 비를 계산했다:
식에서 Ai 및 Bi 는 소정 개체에서, 각각 대립 유전자 A 또는 대립 유전자 B 를 감지하는 crRNA 의 기술적 복제 i 에 대한 SHERLOCK 강도 값을 의미한다. 전형적으로 우리는 crRNA 당 4개의 기술적 복제를 가지므로, m 및 n 은 4 와 동등하고 분모는 소정 SNP 유전자좌 및 개체에 대한 모든 8개의 crRNA SHERLOCK 강도 값의 총합과 동등하다. 2개의 crRNA 가 존재하기 때문에, 개체에 대한 각각의 crRNA 전반에서 crRNA 비율 평균은 항상 총합이 2 일 것이다. 그러므로, 이상적인 동형접합 경우에, 양성 대립 유전자 crRNA 에 대한 평균 crRNA 비율은 2 일 것이고 음성 대립 유전자 crRNA 에 대한 평균 crRNA 비율은 0 일 것이다. 이상적인 이형접합 경우에, 각각의 2개 crRNA 에 대한 평균 crRNA 비율은 1 일 것이다.
LwCas13a 절단 요건의 특성분석.
프로토스페이서 측면 자리 (PFS) 는 Cas13a 에 의한 강력한 리보뉴클레아제 활성에 요구되는 표적 자리 근처에 존재하는 특이적 모티프이다. PFS 는 표적 자리의 3' 말단에 위치하고, 이전에 LshCas13a 에 대해 우리 그룹에 의해 H (G 가 아님) 로서 특성분석되었다 (1). 이 모티프는 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM), DNA표적화 Class 2 시스템을 위한 제한 서열과 유사하지만, 그것은 내생적 시스템에서 CRISPR 유전자좌의 자가표적화를 방지하는데에는 관여하지 않으므로 기능적으로는 상이하다. Cas13a 의 미래의 구조 연구는 아마도 Cas13a:crRNA 표적 복합체 형성 및 절단 활성에 대한 PFS 의 중요성을 설명해줄 것이다.
우리는 대장균으로부터 재조합 LwCas13a 단백질을 정제했고 (도 2D-E), 각각의 가능한 프로토스페이서 측면 자리 (PFS) 뉴클레오티드 (A, U, C 또는 G) 로 173-nt ssRNA 를 절단하는 그것의 능력을 어세이했다 (도 2F). LshCas13a 와 유사하게, LwCas13a 는 A, U, 또는 C PFS 가 있는 표적을 강력하게 절단할 수 있으며, G PFS 가 있는 ssRNA 에 대한 활성은 더 낮다. 우리는 G PFS 가 있는 ssRNA 1 에 대한 더 약한 활성을 보지만, 우리는 G PFS 모티프가 있는 두 개의 표적 자리에 대한 강력한 검출을 여전히 본다 (표 3; rs601338 crRNA 및 지카 표적화 crRNA 2). 아마도 H PFS 가 모든 상황에서 요구되지는 않을 것이며, 많은 경우에 G PFS 로 강한 절단 또는 부수적 활성이 달성될 수 있을 것이다.
리콤비나아제 폴리머라아제 증폭 (RPA) 및 기타 등온 증폭 전략의 논의.
리콤비나아제 폴리머라아제 증폭 (RPA) 은 세 개의 본질적 효소: 리콤비나아제, 단일-가닥 DNA-결합 단백질 (SSBs), 및 가닥 변위 폴리머라아제로 이루어지는 등온 증폭 기술이다. 효소는 모두 대략 37℃ 의 일정한 온도에서 기능하므로 온도 조절을 요구하지 않음으로써, RPA 는 다른 증폭 전략, 특히 폴리머라아제 연쇄 반응 (PCR) 에 존재하는 많은 기술적 곤란성을 극복한다. RPA 는 이중-가닥 주형의 전체 용융 및 프라이머 어닐링을 위한 온도 사이클링을 생체내 DNA 복제 및 수선에 의해 촉진되는 효소 접근법으로 대체한다. 리콤비나아제-프라이머 복합체는 이중-가닥 DNA 를 스캔하고, 상보적 자리에서 가닥 교환을 촉진한다. 가닥 교환은 SSB 에 의해 안정화되어, 프라이머가 결합된 상태로 유지되게 한다. 리콤비나아제의 자발적 분해가 그것의 ADP-결합된 상태에서 일어나서, 가닥-대체 폴리머라아제가 침입하여 프라이머를 연장하는 것을 허용하며, 의료 현장 및 현장 상황에서 이용가능하지 않은 복합체 기구 없이 증폭을 가능하게 한다. 온도 범위 37-42℃ 에서 이 과정의 주기적 반복은 지수 DNA 증폭을 초래한다. 공개된 원래의 제형은 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) Pol I (Bsu) 를 가닥-전위 폴리머라아제로서, T4 uvsX 를 리콤비나아제로서, 및 T4 gp32 를 단일-가닥 DNA 결합 단백질로서 사용하지만 (2), 이 연구에서 사용되는 TwistDx 에 의해 판매되는 현재의 제형에 어떤 성분이 존재하는지는 분명하지 않다.
부가적으로, RPA 는 다수의 제한을 가질 수 있다:
1) Cas13a 검출은 정량적이지만 (도 15), 실시간 RPA 정량화는 리콤비나아제가 모든 이용가능한 ATP 를 사용했을 때 그것의 신속한 포화 때문에 어려울 수 있다. 실시간 PCR 은 주기적으로 증폭하는 능력 때문에 정량적이지만, RPA 는 증폭 속도를 엄격히 제어하는 메카니즘을 갖지 않는다. 증폭 속도를 감소시키는 특정 조정, 예컨대 이용가능한 마그네슘 또는 프라이머 농도의 감소, 반응 온도의 저하, 또는 비효율적 프라이머의 설계가 수행될 수 있다. 도 31, 32, 및 52 에서와 같이, 우리는 정량적 SHERLOCK 의 일부 경우를 보지만, 항상 그런 것은 아니며, 주형에 따라 좌우된다.
2) RPA 효율은 프라이머 설계에 민감할 수 있다. 제조사는 전형적으로 더 긴 프라이머를 설계하여 효율적 리콤비나아제 결합을 평균 GC 함량 (40-60%) 으로 보장하고 ~ 100 프라이머 쌍을 스크리닝하여 높은 민감도 프라이머 쌍을 찾을 것을 권장한다. 우리는 SHERLOCK 으로 아토몰 시험을 단일 분자 민감도로 달성하기 위해서 우리가 두 개의 프라이머 쌍을 설계하기만 하면 된다는 것을 발견했다. 이 강건성은 아마도 앰플리콘 증폭에서 임의의 비효율을 상쇄시키는 구성적 활성 Cas13a 부수적 활성에 의한 신호의 부가적 증폭으로 인한 것일 것이다. 이 품질은 특히 도 34 에서의 우리의 박테리아 병원체 식별에 중요하다. 박테리아 게놈에서 16S rRNA 유전자 자리와 같이 고도로 구조화된 영역을 증폭하여 이슈가 실험되었으며, 그 이유는 RPA 에서 용융 단계가 수반되지 않기 때문이다. 따라서, 프라이머에서 이차 구조는 이슈가 되며, 증폭 효율 및 그에 따라 민감도를 제한한다. 이들 RPA-특이적 이슈에도 불구하고 Cas13a 로부터의 부가적 신호 증폭 때문에 본원에 공개된 실시형태는 성공적일 것으로 여겨진다.
3) 증폭 서열 길이는 효율적 RPA 를 위해 짧아야 한다 (100-200 bp). 대부분의 응용에서, 이는 중요한 이슈가 아니고, 아마도 심지어는 유리할 것이다 (예를 들어, 평균 단편 크기가 160 bp 인 cfDNA 검출). 때때로 큰 앰플리콘 길이가 중요하며, 예컨대 범용 프라이머가 박테리아 검출에 요구되고 구별을 위한 SNP 가 넓은 영역에 걸쳐 퍼져 있을 때 그러하다.
SHERLOCK 의 모듈성은 T7 전사 및 Cas13a 검출 전에 임의의 증폭 기술, 심지어는 비-등온 접근법이 사용되는 것을 허용한다. 이 모듈성은 단일 반응에서 T7 및 Cas13a 단계의 상용성에 의해 가능해지며, T7 프로모터를 갖는 임의의 증폭된 DNA 투입에 대해 검출이 수행되는 것을 허용한다. RPA 를 사용하기 전에, 핵산 서열 기반 증폭 (NASBA) (3, 4) 을 우리의 검출 어세이에서 시도했다 (도 10). 그러나 NASBA 는 Cas13a 의 민감도를 크게 개선하지는 않았다 (도 11 및 53). 검출 전에 이용될 수 있었던 다른 증폭 기술은 PCR, 루프 매개되는 등온 증폭 (LAMP) (5), 가닥 변위 증폭 (SDA) (6), 헬리카아제-의존적 증폭 (HDA) (7), 및 절단 효소 증폭 반응 (NEAR) (8) 을 포함한다. 임의의 등온 기술을 바꾸는 능력은 SHERLOCK 이 임의의 하나의 증폭 기술의의 특이적 제한을 극복하는 것을 가능하게 해준다.
조작된 미스매치의 설계.
우리는 이전에 LshCas13a 표적 절단은 표적:crRNA 듀플렉스에 둘 이상의 미스매치가 존재할 때 감소되나 단일 미스매치에 의해서는 상대적으로 영향을 받지 않는 것, 우리가 LwCas13a 부수적 절단에 관해 확인한 관찰을 보였다 (도 36A). 우리는 부가적 돌연변이를 crRNA 스페이서 서열에 도입함으로써, 부가적 미스매치 (총 두 개의 미스매치) 가 존재하는 표적에 대한 부수적 절단을 불안정하게 만드면서도, 온-표적 부수적 절단은 오직 단일 미스매치가 존재하므로 유지할 수 있다는 가설을 세웠다. 증가된 특이성을 조작하는 가능성을 시험하기 위해서, 우리는 ssRNA 1 을 표적화하는 다수의 crRNA 를 설계했고, crRNA 의 길이를 따라 미스매치를 포함시켜서 (도 36A) 온-표적 부수적 절단을 최적화하고 단일 미스매치 만큼 상이한 표적의 부수적 절단을 최소화했다. 우리는 이들 미스매치가 ssRNA 1 의 부수적 절단을 감소시키지 않았으나, 부가적 미스매치를 포함하는 표적 (ssRNA 2) 에 대한 신호를 유의하게 감소시켰다는 것을 관찰했다. ssRNA 1 과 ssRNA 2 사이를 가장 잘 구별한 설계된 crRNA 는 ssRNA 2 미스매치 가까이에 합성 미스매치를 포함했으며, 사실상 "버블 (bubble)", 또는 왜곡 (distortion) 을 혼성화된 RNA 에서 생성했다. 합성 미스매치 및 표적에 존재하는 부가적 미스매치의 조화 (즉, 이중 미스매치) 에 의해 야기되는 민감도의 상실은 구성적 또는 인근의 이중 미스매치에 대한 LshCas13a 및 LwCas13a 의 민감도와 일치하고, 단일-뉴클레오티드 구별을 가능하게 하는 crRNA 의 합리적인 설계를 위한 기초를 제시한다 (도 36B).
ZIKV 및 DENV 균주의 미스매치 검출을 위해, 우리의 전장 crRNA 는 두 개의 미스매치를 함유했다 (도 37A,B). 균주 사이의 높은 서열 분기로 인해, 우리는 두 개의 게놈 사이에 오직 단일 뉴클레오티드 차이가 있는 28 nt 의 연속 스트레치를 찾을 수 없었다. 그러나, 우리는 더 짧은 crRNA 가 여전히 기능적일 수 있다고 예측했고, 합성 미스매치를 스페이서 서열에 및 오직 하나의 미스매치를 표적 서열에 포함하는 두 개의 ZIKV 균주에서 표적에 대한 더 짧은 23nt crRNA 를 설계했다. 이들 crRNA 는 여전히 ZIKV 의 아프리카 및 아메리카 균주를 구별할 수 있었다 (도 36C). 23 nt 및 20 nt crRNA 의 후속적 시험은 스페이서 길이의 감소가 활성은 감소시키나 단일 미스매치를 구별하는 능력은 유지 또는 향상시킨다는 것을 보여준다 (도 57A-G). 어떻게 합성 미스매치가 도입되어 단일-뉴클레오티드 돌연변이 구별을 촉진하는가를 더 잘 이해하기 위해서, 우리는 세 개의 상이한 스페이서 길이: 28, 23, 및 20 nt 에서 스페이서의 첫번째 일곱 개 위치에 걸쳐 합성 미스매치를 도입했다 (도 57A). 세번째 위치에 돌연변이가 있는 표적에 대해, LwCas13a 는 합성 미스매치가 스페이서의 위치 5 에 존재할 때 최대 특이성을 보이며, 그와 함께 더 짧은 스페이서 길이에서 개선된 특이성을 보이지만, 온-표적 활성의 더 낮은 수준을 보인다 (도 57B-G). 우리는 또한 위치 3-6 에 걸쳐 표적 돌연변이를 이동시켰고, 돌연변이 주변의 스페이서에 합성 미스매치 도입했다 (도 58).
합성 표준을 사용하는 SHERLOCK 에 의한 유전형분석.
SNP 유전자좌의 PCR 증폭으로부터 생성된 합성 표준의 평가는 유전자형의 정확한 식별을 허용한다 (도 60A,B). 개체의 샘플 및 합성 표준 SHERLOCK 결과 사이의 모든 비교 (ANOVA) 를 컴퓨터로 계산함으로써, 각각의 개체의 유전자형은 가장 유사한 SHERLOCK 검출 강도를 갖는 합성 표준을 찾아서 식별될 수 있다 (도 60C,D). 이 SHERLOCK 유전형분석 접근법은 임의의 SNP 유전자좌에 일반화될 수 있다 (도 60E).
SHERLOCK 은 알맞은, 적응가능한 CRISPR-Dx 플랫폼이다.
SHERLOCK 의 비용 분석을 위해, crRNA 의 합성을 위한 DNA 주형, RPA 에서 사용되는 프라이머, 보통 완충액 (MgCl2, Tris HCl, 글리세롤, NaCl, DTT), 유리 미세섬유 필터 종이, 및 RNAsecure 시약을 포함하는, 비용이 무시할 만한 것으로 확인된 시약을 제외했다. DNA 주형의 경우에, IDT 로부터의 울트라머 합성은 40 회 시험관내 전사 반응을 위한 재료를 ~$70 에 제공하며 (각각은 ~10,000 반응에 충분하다), crRNA 합성에 무시할 만한 비용을 더한다. RPA 프라이머의 경우에, 30 nt DNA 프라이머의 25 nmole IDT 합성은 ~$10 에 구입될 수 있으며, 5000 회 SHERLOCK 반응에 적당한 재료를 제공한다. 유리 미세섬유 종이는 $0.50/시트에 입수가능하며, 이는 수백 회의 SHERLOCK 반응에 충분하다. 4% RNAsecure 시약은 비용이 $7.20/㎖ 이며, 이는 500 회 시험에 충분하다.
또한, 종이-기반 어세이를 제외한, 모든 실험에서, 384-웰 플레이트 (Corning 3544) 를, $0.036/반응의 비용으로 사용했다. 무시할 수 있는 비용 때문에, 이는 전체 비용 분석에 포함되지 않았다. 부가적으로, SHERLOCK-POC 는 플라스틱 용기의 사용을 요구하지 않으며, 그 이유는 그것이 종이에서 용이하게 수행될 수 있기 때문이다. 본원에서 사용되는 SHERLOCK 에 관한 판독 방법은 필터 세트 또는 단색광분석기가 구비된 플레이트 판독기였다. 자본 투자로서, 판독기의 비용은 계산에 포함되지 않았으며, 그 이유는 기구에서 다 많은 반응이 실행됨에 따라 비용이 가파르게 감소하고 무시할 수 있기 때문이다. POC 응용의 경우에, 더 저렴한 휴대용 대안물, 예컨대 손에 들고 쓰는 분광광도계 (9) 또는 휴대용 전자 판독기 (4) 가 사용될 수 있으며, 이는 기기 장치의 비용을 <$200 까지 감소시킨다. 이들 더 많은 휴대용 솔루션은 부피가 더 큰 기구에 비해 판독의 속도 및 용이성을 감소시키는 한편, 더 넓은 용도를 허용할 것이다.
결과
본원에 기재된 어세이 및 시스템은 일반적으로 증폭 및 검출의 2-단계 과정을 포함할 수 있다. 첫번째 단계 동안, 핵산 샘플, RNA 또는 DNA 는, 예를 들어 등온 증폭에 의해, 증폭된다. 두번째 단계 동안, 증폭된 DNA 는 RNA 로 전사되고, 후속적으로 CRISPR 이펙터, 예컨대 C2c2, 및 표적 핵산 서열의 존재를 검출하도록 프로그램된 crRNA 와 함께 인큐베이션했다. 검출을 가능하게 하기 위해서, 소광된 형광단으로 표지된 리포터 RNA 를 반응에 첨가한다. 리포터 RNA 의 부수적 절단은 형광단의 미-소광을 초래하고, 핵산 표적의 실시간 검출을 허용한다 (도 17A).
강력한 신호 검출을 달성하기 위해서, 유기체 렙토트리키아 웨이데이로부터 C2c2 의 오르소로그 (LwC2c2) 를 식별하고 평가했다. LwC2c2 단백질의 활성을, 그것을 대장균에서 합성 CRISPR 어레이에 따라 발현시키고, 베타-락타마아제 mRNA 내의 표적 자리를 절단하도록 프로그래밍하여, 암피실린 선별 하에 박테리아의 죽음을 초래함으로써 평가했다 (도 2B). LshC2c2 유전자좌에서보다 LwC2c2 유전자좌에서 살아 남은 대장균 콜로니가 더 적게 관찰되었으며, 이는 LwC2c2 오르소로그의 더 높은 절단 활성을 입증한다 (도 2C). 그 후 인간-코된 최적화된 LwC2c2 단백질을 대장균으로부터 정제하고 (도 2D-E), 173-nt ssRNA 를 절단하는 그것의 능력을 상이한 프로토스페이서 측면 자리 (PFS) 뉴클레오티드로 어세이했다 (도 2F). LwC2c2 는 가능한 네 개의 PFS 표적 각각을 절단할 수 있었으며, G PFS 가 존재하는 ssRNA 에 대한 활성이 약간 더 낮았다.
LwC2c2 RNase 부수적 활성의 실시간 측정을 상업적으로 입수가능한 RNA 형광 플레이트 판독기를 사용하여 측정했다 (도 17A). LwC2c2 활성의 기준선 민감도를 확인하기 위해서, LwC2c2 를 ssRNA 표적 1 (ssRNA 1) 및 ssRNA 표적 내의 자리에 상보적인 crRNA 와, RNA 센서 프로브와 함께 인큐베이션했다 (도 18). 이는 민감도 ~50 fM 을 초래했으며 (도 27A), 이는, 다른 최근의 핵산 검출 기술 (Pardee et al., 2014) 보다는 더 민감하지만, 서브펨토몰 검출 성능을 요구하는 많은 진단 응용에는 충분히 민감하지 않다 (Barletta et al., 2004; Emmadi et al., 2011; Rissin et al., 2010; Song et al., 2013).
민감도를 증가시키기 위해서, LwC2c2 와의 인큐베이션 전에 등온 증폭 단계를 부가했다. LwC2c2-매개되는 검출과 이전에 사용된 등온 증폭 접근법 예컨대 핵산 서열 기반 증폭 (NASBA) (Compton, 1991; Pardee et al., 2016) 의 결합은 민감도를 어느 정도 개선했다 (도 11). 대안적 등온 증폭 접근법, 리콤비나아제 폴리머라아제 증폭 (RPA) (Piepenburg et al., 2006) 을 시험했으며, 이는 2 시간 내에 DNA 를 지수적으로 증폭시키는데 사용될 수 있다. T7 RNA 폴리머라아제 프로모터를 RPA 프라이머 상에 부가함으로써, LwC2c2 에 의한 후속적 검출을 위해 증폭된 DNA 를 RNA 로 전환시킬 수 있다 (도 17). 따라서, 특정예 실시형태에서, 어세이는 RPA 에 의한 증폭, DNA 에서 RNA 로의 T7 RNA 폴리머라아제 전환, 및 소광된 리포터로부터의 형광의 C2c2 잠금해제에 의한 RNA 의 후속적 검출의 조합을 포함한다.
ssRNA 1 의 합성된 DNA 버전에 실시예 방법을 사용하여, 1-10 분자/반응 범위의 아토몰 민감도를 달성하는 것이 가능했다 (도 27B, 왼쪽). 검출의 정확도를 확인하기 위해서, 투입 DNA 의 농도를 디지털-액적 PCR 로 검증했고, 최저 검출가능한 표적 농도 (2 aM) 는 ㎕ 당 단일 분자의 농도에서였다는 것을 확인했다. 역전사 단계의 부가로, RPA 는 또한 RNA 를 dsDNA 형태로 증폭시킬 수 있으며, 우리가 ssRNA 1 에 대한 아토몰 민감도를 달성하는 것을 허용한다 (27B, 오른쪽). 유사하게, RNA 표적의 농도를 디지털-액적 PCR 에 의해 확인했다. 실시예 방법이 POC 진단 시험으로서 기능할 실행가능성을 평가하기 위해서, 모든 성분 - RPA, T7 폴리머라아제 증폭, 및 LwC2c2 검출 - 이 단일 반응에서 기능하는 능력을 시험했고, 어세이의 원-포트 버전으로 아토몰 민감도로 밝혀졌다 (도 22).
어세이는 액체에서 또는 종이 상에서 민감한 바이러스 검출을 할 수 있다
다음으로 어세이가 높은 민감도를 요구하는 감염성 질환 응용에서 효과적일지 여부 및 휴대용 진단으로부터 유익을 얻을 수 있는지 여부를 확인했다. 모델 시스템에서 검출을 시험하기 위해서, 지카 바이러스 게놈의 RNA 단편을 보유하는 렌티바이러스 및 관련되는 플라비바이러스 뎅기 (Dejnirattisai et al., 2016) 를 생산했고, 바이러스 입자의 수를 정량화했다 (도 31A). 거짓 (mock) 바이러스의 수준이 2 aM 까지 검출되었다. 동시에, 지카 및 뎅기 RNA 단편을 함유하는 이들 프록시 (proxy) 바이러스 사이의 명확한 구별을 보여주는 것이 또한 가능했다 (도 31B). 어세이가 분포를 위한 콜드 체인에 대한 의존성을 제거하는 동결-건조와 상용성인지 여부를 확인하기 위해서, 반응 성분을 동결-건조시켰다. 샘플을 사용하여 동결건조된 성분을 재수화시킨 후에, 20 fM 의 ssRNA 1 가 검출되었다 (도 33A). 자원-부족 및 POC 상황은 유용성의 용이함을 위한 종이 시험으로부터 유익을 얻을 것이기 때문에, 유리 섬유 종이 상에서 C2c2 검출의 활성을 또한 평가했고 종이-스포팅된 (spotted) C2c2 반응이 표적 검출 능력이 있다는 것을 발견했다 (도 33B). 동결-건조 및 종이-스포팅 (spotting) 조합으로, C2c2 검출 반응은 ssRNA 1 의 민감한 검출을 초래했다 (도 33C). 용액 중 LwC2c2 와 동결-건조된 LwC2c2 사이의 합성 지카 바이러스 RNA 단편의 검출에 관해 유사한 수준의 민감도가 또한 관찰되었으며, 동결-건조된 SHERLOCK 의 강력함 및 신속한, POC 지카 바이러스 진단의 잠재성을 입증했다 (도 33D-E). 이를 위해서, 어세이의 POC 변이형의 능력을 시험하여 지카 RNA 를 뎅기 RNA 로부터 구별하는 능력을 확인했다 (도 31C). 종이-스포팅 및 동결건조는 판독의 절대 신호를 약간 감소시켰지만, 어세이는 20 aM 만큼 낮은 농도의 모의 지카 바이러스를 여전히 유의하게 검출했으며 (도 31D), 이는 뎅기 제어 서열을 갖는 모의 바이러스의 검출과 비교된다.
인간에서의 지카 바이러스 RNA 수준은 환자 타액 중 3 x 106 카피/㎖ (4.9 fM) 및 환자 혈청 중 7.2 x 105 카피/㎖ (1.2 fM) 만큼 낮은 것으로 보고되었다 (Barzon et al., 2016; Gourinat et al., 2015; Lanciotti et al., 2008). 수득된 환자 샘플로부터, 1.25 x 103 카피/㎖ (2.1 aM) 만큼 낮은 농도가 관찰되었다. 어세이가 저-역가 임상 단리물의 지카 바이러스 검출 능력이 있는지 여부를 평가하기 위해서, 바이러스 RNA 를 환자로부터 추출하고 역전사하고 결과적인 cDNA 를 어세이를 위한 투입으로서 사용했다 (도 32A). 지카 인간 혈청 샘플에 관한 유의한 검출이 1.25 카피/㎕ (2.1 aM) 까지의 농도에서 관찰되었다 (도 32B). 게다가, 환자 샘플로부터의 신호는 지카 바이러스 RNA 카피 수를 예측했고, 바이러스 로드 (load) 를 예측하는데 사용될 수 있었다 (도 31F). 핵산 정제가 이용불가능한 질환 상황에 관한 넓은 적용가능성을 시험하기 위해서, 인간 혈청 내로 스파이킹된 ssRNA 1 의 검출을 시험했고, 2% 미만의 혈청 수준에서 어세이가 활성화되었다는 것을 확인했다 (도 33G).
박테리아 병원체 구별 및 유전자 구별
박테리아 병원체를 구별하는데 사용될 수 있는지 여부를 확인하기 위해서, 보존된 측면 영역은 범용 RPA 프라이머가 박테리아 종 전체에 걸쳐 사용되는 것을 허용하고 가변 내부 영역은 종의 구별을 허용하므로, 16S V3 영역을 초기 표적으로서 선별했다. 병원성 균주 및 단리된 대장균 및 슈도모나스 애루지노사 gDNA 에 대해 5 가지 가능한 표적화 crRNA 의 패널을 설계했다 (도 34A). 어세이는 대장균 또는 슈도모나스 애루지노사 gDNA 를 구별하는 능력이 있었고, 다른 종의 crRNA 에 대해 낮은 배경 신호를 보였다 (도 34 A, B).
어세이는 또한 관심의 박테리아 유전자, 예컨대 항생제-내성 유전자를 신속하게 검출 및 구별하기 위해 적합화될 수 있다. 카르바페넴-내성 엔테로박테리아 (CRE) 는 커다란 최근 생겨난 공중 위생 도전이다 (Gupta et al., 2011). 어세이가 카르바페넴-내성 유전자를 검출하는 능력, 및 시험이 상이한 카르바페넴-내성 유전자 사이를 구별할 수 있는지 여부를 평가했다. 클레브시엘라 뉴모니아 (Klebsiella pneumonia) 를 클레브시엘라 뉴모니아 카르바페네마아제 (Klebsiella pneumoniae carbapenemase) (KPC) 또는 뉴델리 메탈로-베타-락타마아제 1 (New Delhi metallo-beta-lactamase 1) (NDM-1) 내성 유전자를 보유하는 임상 단리물로부터 수득했고, 유전자 사이를 구별하는 crRNA 를 설계했다. 모든 CRE 는 이들 내성 유전자를 결여하는 박테리아에 대해 유의한 신호를 가졌고 (도 35A), 우리는 내성의 KPC 및 NDM-1 균주를 유의하게 구별할 수 있었다 (도 35B).
CRISPR RNA-가이드 RNase 의 단일-염기 미스매치 특이성
특정 CRISPR RNA-가이드 RNase 오르소로그, 예컨대 LshC2c2 는 단일-염기 미스매치를 쉽게 구별하지 않는다는 것이 밝혀졌다. (Abudayyeh et al., 2016) 본원에서 입증되는 바와 같이, LwC2c2 는 또한 이 특색을 공유한다 (도 37A). LwC2c2 절단의 특이성을 증가시키기 위해서, crRNA:표적 듀플렉스에 합성 미스매치를 도입하기 위한 시스템을 개발했으며, 이것은 미스매치에 대한 총 민감도를 증가시키고 단일-염기 미스매치 민감도를 가능하게 한다. 표적 1 에 대한 다수의 crRNA 를 설계했고, crRNA 의 길이를 따라 미스매치를 포함시켜서 (도 37A) 온-표적 부수적 절단을 최적화하고 단일 미스매치 만큼 상이한 표적의 절단을 최소화했다. 이들 미스매치는 ssRNA 표적 1 의 절단 효율을 감소시키지 않았으나, 부가적 미스매치를 포함하는 표적 (ssRNA 표적 2) 에 대한 신호를 유의하게 감소시켰다. 표적 1 과 표적 2 사이를 가장 잘 구별한 설계된 crRNA 는 표적 2 미스매치 가까이에 합성 미스매치를 포함했으며, 사실상 "버블" 을 생성했다. 합성 미스매치 및 표적에 존재하는 부가적 미스매치 (즉, 이중 미스매치) 의 조화에 의해 야기되는 민감도의 상실은 구성적 또는 인근의 이중 미스매치에 대한 LshC2c2 의 민감도와 일치하고 (Abudayyeh et al., 2016), 단일-뉴클레오티드 구별을 가능하게 하는 crRNA 의 합리적인 설계를 위한 포맷을 제시한다 (도 37B).
C2c2 가 단일-염기 미스매치를 인지하도록 조작될 수 있음을 입증한 후, 이 조작된 특이성이 밀접하게 관련된 바이러스 병원체 사이를 구별하는데 사용될 수 있는지 여부를 확인했다. 지카 바이러스의 아프리카 또는 아메리카 균주 (도 37A) 및 뎅기 바이러스의 균주 1 또는 3 (도 37C) 을 검출하도록 다수의 crRNA 를 설계했다. 이들 crRNA 는 스페이서 서열에 합성 미스매치를 포함했으며, 합성 미스 매치로 인해 온-표적 균주에 듀플렉스화될 때 단일 버블이 야기된다. 그러나, 합성 미스매치 스페이서가 오프-표적 균주에 듀플렉스화될 때, 합성 미스매치 및 SNP 미스매치로 인해 2 개의 버블이 형성된다. 합성 미스매치 crRNA 는 상응하는 균주를 오프-표적 균주보다 현저히 더 높은 신호로 검출하여 강력한 균주 구별을 가능하게 했다 (도 37B, 37D). 균주 사이의 상당한 서열 유사성으로 인해, 단일-뉴클레오티드 균주 구별을 보여주기 위해서 두 개의 게놈 사이에 오직 단일 뉴클레오티드 차이가 있는 28 nt 의 연속 스트레치를 찾을 수 없었다. 그러나, 더 짧은 crRNA 가 여전히 기능적일 수 있다고 예측했고 (그것이 LshC2c2 와 함께일 때) (Abudayyeh et al., 2016), 합성 미스매치를 스페이서 서열에 및 오직 하나의 미스매치를 표적 서열에 포함하는 두 개의 지카 균주에서 표적에 대한 더 짧은 23-nt crRNA 를 설계했다. 이들 crRNA 는 여전히 지카의 아프리카 및 아메리카 균주를 높은 민감도로 구별할 수 있었다 (도 36C).
타액에서 정제된 DNA 를 사용하는 신속한 유전형분석
사람의 타액으로부터의 신속한 유전형분석은 응급 약물유전체학적 상황에서 또는 가정 진단에 유용할 수 있다. 유전형분석에 관해 본원에 개시된 구체예의 잠재성을 입증하기 위해, 23andMe 유전자형 데이터를 골드 표준으로 사용하여 C2c2 검출을 벤치마킹하기 위해 5 개의 유전자좌가 선택되었다 (Eriksson et al., 2010) (도 38A). 5 개의 유전자좌는 스타틴 또는 아세트아미노펜과 같은 약물에 대한 민감성, 노로 바이러스 감수성 및 심장 질환 위험을 포함하여 광범위한 기능적 연관성에 걸쳐있다 (표 12).
표 12 : 시험된 SNP 변형체
4 명의 인간 대상으로부터의 타액을 수집하고 1 시간 미만 내에 간단한 시판 키트를 사용하여 게놈 DNA 를 정제했다. 4 명의 대상은 5 개의 유전자좌에 걸쳐 다양한 유전자형 세트를 가졌으며, 유전형분석 어세이를 벤치마킹하기에 충분한 넓은 샘플 공간을 제공했다. 5 개의 SNP 유전자좌 각각에 대해, 적절한 프라이머로 RPA 를 사용하여 대상체의 게놈 DNA 를 증폭시킨 후, 2 개의 가능한 대립 유전자 중 하나를 특이적으로 검출하도록 설계된 crRNA 쌍 및 LwC2c2 로 검출 했다 (도 38B). 어세이는 대립 유전자를 높은 유의성으로 구별하고 동형접합 및 이형접합 유전자형 둘 모두를 추론하기에 충분히 특이적이었다. DNA 추출 프로토콜이 검출 전에 타액에 대해 수행되었기 때문에, 어세이가 추가 추출없이 5 분 동안 95℃ 로 가열된 타액을 사용하여 POC 유전자형분석에 더 적합하게 만들어질 수 있는지 여부를 확인하기 위해 어세이를 시험했다. 어세이는 타액이 5 분 동안 가열된 후 후속 증폭 및 C2c2 검출을 받은 2 명의 환자를 정확하게 유전자형분석할 수 있었다 (도 40B).
낮은 대립 유전자 분획에서 cfDNA 의 암성 돌연변이의 검출
어세이는 표적에서의 단일 뉴클레오티드 차이에 대해 매우 특이적이기 때문에, 어세이가 세포-무함유 DNA (cfDNA) 에서 암 돌연변이를 검출하기에 충분히 민감한지 여부를 확인하기 위한 시험이 고안되었다. cfDNA 단편은 야생형 cfDNA 단편의 작은 백분율 (0.1 % ~ 5 %) 이다 (Bettegowda et al., 2014; Newman et al., 2014; Olmedillas Lopez et al., 2016; Qin et al., 2016). cfDNA 분야에서 중요한 도전 과제는 이러한 돌연변이를 탐지하는 것이며, 그 이유는 일반적으로 혈액에서 배경에서 높은 수준의 비-돌연변이 DNA 가 존재하는 경우에 이러한 돌연변이를 발견하기 어렵기 때문이다 (Bettegowda et al., 2014; Newman et al., 2014; Qin et al., 2016). POC cfDNA 암 검사는 암의 정기적인 스크리닝에, 특히 차도의 위험이 있는 환자에게 또한 유용할 것이다.
야생형 배경에서 돌연변이체 DNA 를 검출하는 어세이의 능력은 crsRNA 표적 부위에서 단일 돌연변이로 ssDNA1 의 배경에 dsDNA 표적 1 을 희석함으로써 확인되었다 (도 41A-B). LwC2c2 는 dsDNA 1 을 배경 dsDNA 의 0.1 % 만큼 낮은 수준까지 및 dsDNA 1 의 아토몰 농도 내에서 감지할 수 있었다. 이 결과는 배경 돌연변이체 dsDNA 1 의 LwC2c2 절단이 0.1 % 대립 유전자 분획에서 온-표적 dsDNA 의 강력한 검출을 가능하게 하기에 충분히 낮다는 것을 보여준다. 0.1 % 보다 낮은 수준에서는, 배경 활동이 문제가 될 수 있으므로, 올바른 표적의 추가의 유의한 검출을 막는다.
어세이는 임상적으로 관련된 범위에서 대립 유전자 분획을 갖는 합성 표적을 감지할 수 있기 때문에, 어세이가 cfDNA 에서 암 돌연변이를 검출할 수 있는지 여부를 평가했다. 두 가지 다른 암 돌연변이, EGFR L858R 및 BRAF V600E 에 대한 RPA 프라이머가 설계되었으며 상용 cfDNA 표준을 시험할 실제 인간 cfDNA 샘플과 유사한 5 %, 1 % 및 0.1 % 의 대립 유전자 분획과 함께 사용했다. 돌연변이체 대립 유전자를 야생형 대립 유전자와 구별 할 수 있는 한 쌍의 crRNA 를 사용하여 (도 38C), 돌연변이체 유전자좌 둘 다에 대한 0.1 % 대립 유전자 분획의 검출이 달성되었다 (도 39 AB).
논의
C2c2 의 자연적 특성을 등온 증폭 및 소광된 형광 프로브와 조합함으로써, 본 명세서에 개시된 어세이 및 시스템은 RNA 및 DNA 를 검출하는 다목적 강력한 방법이고, 감염성 질환 적용 및 신속한 유전자형분석을 포함하는 다양한 신속한 진단에 적합한 것으로 입증되었다. 본 명세서에 개시된 분석 및 시스템의 주요 이점은 새로운 POC 시험을 며칠 만에 최저 $0.6/시험으로 재설계 및 합성할 수 있다는 것이다.
다수의 인간 질환 적용은 단일 미스매치를 검출하는 능력을 필요로 하기 때문에, crRNA 의 스페이서 서열에 합성 미스매치를 도입함으로써 crRNA 를 표적 서열의 단일 미스매치에 대해 고도로 특이적이도록 조작하기 위해 합리적인 접근법이 개발되었다. CRISPR 이펙터로 특이성을 달성하기 위한 다른 접근 방식은 수십 가지 가이드 설계에 대한 스크리닝 기반 방법에 의존한다 (Chavez et al., 2016). 설계된 미스매치 crRNA 를 사용하여, 단일 미스매치만큼 상이한 부위에서의 지카 및 뎅기 바이러스 균주의 구별, 인간 타액 gDNA 로부터의 SNP 의 신속한 유전자형분석, 및 cfDNA 샘플에서의 암 돌연변이의 검출이 입증되었다.
어세이 플랫폼의 저렴한 비용 및 적응성은 (i) Taqman 과 같은 특이적 qPCR 분석 대신에 일반적인 RNA/DNA 정량화 경험, (ii) 마이크로어레이와 유사한 신속한 다중화 RNA 발현 검출, 및 (iii) 다른 민감한 검출 응용, 예컨대 식품의 다른 공급원으로부터의 핵산 오염의 검출을 포함한 추가 응용에 적합하다. 또한, C2c2 는 세포와 같은 생물학적 환경 내에서 전 사체의 검출에 잠재적으로 사용될 수 있고, C2c2 검출의 매우 특이적인 성질을 고려해 볼 때, 간 세포에서 전사체의 대립 유전자 특이적 발현 또는 질병 관련 돌연변이를 추적하는 것이 가능할 수 있다. 앱타머의 광범위한 이용가능성으로 인해, 앱타머에 의한 단백질 검출을 RPA 를 위한 암호화된 증폭 부위의 노출 및 이어서 C2c2 검출과 결합함으로써 단백질을 감지하는 것이 또한 가능할 수 있다.
CRISPR-Cas13a/C2c2 를 이용한 핵산 검출: 아토몰 민감도 및 단일 뉴클레오티드 특이성
강력한 신호 검출을 달성하기 위해, 렙토트리키아 웨이데이 (Leptotrichia wadei) 로부터의 Cas13a 의 오르소로그 (LwCas13a) 를 확인했으며, 이는 렙토트리키아 샤히 (Leptotrichia shahii) Cas13a (LshCas13a) (10) 에 비해 더 큰 RNA-가이드 RNase 활성을 나타낸다 (도 2, 또한 상기 "LwCas13a 절단 요건의 특성분석" 참조). ssRNA 표적 1 (ssRNA 1), crRNA 및 리포터 (소광된 형광 RNA) 와 함께 인큐베이션된 LwCas13a (도 18) (13) 는 ~ 50 fM 의 검출 민감도를 제공했으며 (도 51, 15), 이는 많은 진단 응용에 충분히 민감하지 않다 (12, 14-16). 따라서 우리는 Cas13a 기반 검출을 다른 등온 증폭 단계 (도 10, 11, 53, 16) 와 조합하는 방법을 탐구했다 (17, 18). 탐구된 방법 중, 리콤비나아제 폴리머라아제 증폭 (RPA) (18) 이 최대 민감도를 제공했고, L7Cas13a 에 의한 후속 검출을 위해 증폭된 DNA 를 RNA 로 변환하기 위해 T7 전사와 결합될 수 있다 (또한 상기 "리콤비나아제 폴리머라아제 증폭 (RPA) 및 기타 등온 증폭 전략의 논의." 참조). 우리는 RPA 에 의한 증폭, 증폭된 DNA 의 RNA 로의 T7 RNA 폴리머라아제 전사, 및 리포터 신호의 Cas13a 부수적 RNA 절단-매개 방출에 의한 표적 RNA 의 검출의 이러한 조합을 SHERLOCK 으로서 언급한다.
우리는 먼저 RNA (역전사와 결합될 때) 또는 DNA 표적의 검출에 대한 SHERLOCK 의 민감도를 확인했다. 우리는 디지털-액적 PCR (ddPCR) 에 의해 검증된 바와 같이 RNA 와 DNA 에 대한 단일 분자 민감도를 달성했다 (도 27, 51, 54A, B). 모든 SHERLOCK 구성 요소를 단일 반응으로 조합할 때 아토몰 민감도가 유지되어, 이 플랫폼의 POC (point-of-care) 진단으로서의 실행가능성을 입증했다 (도 54C). SHERLOCK 은 2 개의 확립된 민감한 핵산 검출 접근법, ddPCR 및 정량적 PCR (qPCR) 과 유사한 수준의 민감도를 가지고 있는 반면, RPA 단독은 낮은 수준의 표적을 검출하기에 충분히 민감하지 않았다 (도 55A-D). 또한, SHERLOCK 은 반복 실험에 걸친 변동 계수에 의해 측정될 때 ddPCR, qPCR 및 RPA 보다 변동이 적다 (도 55E-F).
다음으로 SHERLOCK 이 높은 민감도를 요구하는 전염성 질환 응용에 효과적인지 여부를 조사했다. 본 발명자들은 지카 바이러스 (ZIKV) 또는 관련 플라비바이러스 뎅기 (DENV) (19) 의 게놈 단편을 보유하는 렌티바이러스를 생산했다 (도 31A). SHERLOCK 은 바이러스 입자를 2 aM 까지 검출했으며 ZIKV 와 DENV 를 구별할 수 있었다 (도 31B). 현장에서 SHERLOCK 의 잠재적인 사용을 탐구하기 위해, 우리는 먼저 동결 건조된 후 재수화된 Cas13acrRNA 복합체 (20) 가 20 fM 의 비증폭 ssRNA 1 을 검출할 수 있고 (도 33A) 유리 섬유 종이에서도 표적 검출이 가능함을 입증했다 (도 33B). SHERLOCK 의 다른 성분들도 동결 건조가 가능하다: RPA 는 상온에서 동결 건조된 시약으로 제공되며, 우리는 이전에 T7 폴리머라아제가 동결 건조를 견딜 수 있음을 입증했다 (2). 동결-건조 및 종이-스포팅 (spotting) 조합으로, Cas13a 검출 반응은 수성 반응으로서 ssRNA 1 의 비슷한 수준의 민감한 검출을 초래했다 (도 33C-E). 종이-스포팅 및 동결 건조는 판독의 절대 신호를 약간 감소시켰지만, SHERLOCK (도 31C) 은 20 aM 의 낮은 농도에서 모의 ZIKV 바이러스를 쉽게 검출할 수 있었다 (도 31D). SHERLOCK 은 또한 역가가 2 x 103 카피/㎖ (3.2 aM) 만큼 낮을 수 있는 임상 단리물 (혈청, 소변 또는 타액) 에서 ZIKV 를 탐지할 수 있다 (21). 환자 혈청 또는 소변 샘플에서 추출하여 cDNA 로 역전사된 ZIKV RNA (도 32E 및 52A) 는 qPCR 에 의해 검증된 바와 같이 1.25 x 103 카피/㎖ (2.1 aM) 까지의 농도에서 검출될 수 있었다 (도 32F 및 52B). 게다가, 환자 샘플로부터의 신호는 ZIKV RNA 카피 수를 예측했고, 바이러스 로드 (load) 를 예측하는데 사용될 수 있었다 (도 33F). 핵산 정제 없이 샘플 검출을 시뮬레이션하기 위해, 본 발명자들은 인간 혈청으로 스파이킹된 ssRNA 1 의 검출을 측정했고, Cas13a 는 2% 혈청을 함유하는 반응에서 RNA 를 검출할 수 있음을 발견했다 (도 33G). CRISPR-dx 에 대한 또 다른 중요한 역학 응용은 박테리아 병원체의 식별 및 특정 박테리아 유전자의 검출이다. 우리는 보존된 측면 영역이 보편적인 RPA 프라이머가 박테리아 종에 걸쳐 사용될 수 있고 가변 내부 영역이 종의 분화를 허용하는 16S rRNA 유전자 V3 영역을 표적으로 삼았다. 대장균 및 슈도모나스 애루지노사에서 단리된 gDNA 및 다른 병원성 균주에 대한 5 가지 가능한 표적화 crRNA 의 패널에서 (도 34A), SHERLOCK 은 균주를 올바르게 유전자형분석했으며 낮은 교차 반응성을 보였다 (도 34B). 또한, SHERLOCK 을 사용하여 두 가지 상이한 내성 유전자: 클레브시엘라 뉴모니애 카르바페네마아제 (KPC) 와 뉴 델리 메탈로-베타-락타마아제 1 (NDM-1) (ND) 로 클레브시엘라 뉴모니애의 임상 단리물 사이를 구별할 수 있었다 (도 56).
SHERLOCK 의 특이성을 증가시키기 위해서, 우리는 LwCas13a 가 단일-염기 미스매치 만큼 상이한 표적 사이를 구별할 수 있게 하는 crRNA:표적 듀플렉스에 합성 미스매치를 도입했다 (도 36A, B; 상기 "조작된 미스매치의 설계" 참조). 우리는 ZIKV 의 아프리카 또는 미국 균주 (도 37A) 와 DENV 의 균주 1 또는 3 을 검출하기 위해 스페이서 서열에 합성 미스매치가 있는 여러 crRNA 를 설계했다 (도 37C). 합성 미스매치 crRNA 는 오프-표적 균주보다 유의하게 더 높은 신호 (양측 스튜던트 t-검정; p < 0.01) 로 상응하는 균주를 검출하여 단일 미스매치에 기초한 강력한 균주 구별을 가능하게 한다 (도 37B, D, 36C). 추가의 특성분석은 Cas13a 검출이 돌연변이가 스페이서의 위치 3 에 있고 합성 미스매치가 위치 5 에 있을 때 온-표적 민감도를 유지하면서 최대 특이성을 달성한다는 것을 밝혀냈다 (도 57 및 58). 단일-염기 차이를 검출하는 능력은 신속한 인간 유전형분석을 위해 SHERLOCK 을 사용할 수 있는 기회를 열어준다. 우리는 다양한 건강 관련 단일-뉴클레오티드 다형성 (SNP) 에 걸쳐 5 개의 유전자좌를 선택하고 (표 1), 이들 SNP 에서 23andMe 유전자형 데이터를 골드 표준으로 사용하여 SHERLOCK 검출을 벤치마킹했다 (23) (도 38A). 우리는 관심 있는 유전자좌에 걸쳐 다양한 유전자형을 가진 4 명의 인간 대상으로부터 타액을 수집했고, 5 분 동안 상업적인 칼럼 정제 또는 직접 가열을 통해 게놈 DNA 를 추출했다 (20). SHERLOCK 은 동형접합 및 이형접합 유전자형 둘 모두를 추론하기에 충분한 특이성 및 높은 유의성으로 대립 유전자를 구별했다 (도 38B, 40, 59, 60; 상기 "합성 표준을 사용하는 SHERLOCK 에 의한 유전형분석" 참조). 마지막으로, 우리는 SHERLOCK 이 세포-무함유 (cf) DNA 단편에서 낮은 빈도 암 돌연변이를 검출할 수 있는지 여부를 확인하고자 했으며, 이는 환자 혈액에서 높은 수준의 야생형 DNA 로 인해 어려움을 겪고 있다 (24-26). 우리는 먼저 SHERLOCK 이 게놈 DNA 의 배경에 희석된 아토몰 농도에서 ssDNA 1 을 검출할 수 있음을 발견했다 (도 61). 다음으로, 우리는 SHERLOCK 이 또한 임상적으로 관련된 범위에 있는 배경 DNA 의 0.1% 만큼 낮은 수준에서 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP)-함유 대립 유전자 (도 41A, B) 를 검출할 수 있음을 발견했다. 우리는 SHERLOCK 이 0.1% 만큼 낮은 대립 유전자 분획을 가진 모의 cfDNA 샘플에서 두 가지 다른 암 돌연변이, EGFR L858R 및 BRAF V600E 를 검출할 수 있음을 입증했다 (도 38, 39) (20).
SHERLOCK 플랫폼은 (i) TaqMan 과 같은 특이적 qPCR 분석 대신에 일반적인 RNA/DNA 정량화, (ii) 신속한 다중화 RNA 발현 검출, 및 (iii) 다른 민감한 검출 응용, 예컨대 핵산 오염의 검출을 포함한 추가 응용에 적합하다. 또한, Cas13a 는 생물학적 환경 내에서 전사체를 잠재적으로 검출하고, 생세포에서 전사체의 대립 유전자-특이적 발현 또는 질환 관련 돌연변이를 추적 할 수 있었다. 우리는 SHERLOCK 이 RNA 및 DNA 를 검출하는 다목적 강력한 방법이며, 감염성 질환 응용 및 민감한 유전형분석을 포함한 신속한 진단에 적합하다는 것을 보여주었다. 시험된 거의 모든 crRNA 가 높은 민감도 및 특이성을 보였기 때문에, SHERLOCK 종이 시험은 며칠 만에 $0.61/시험 (또한 상기 "SHERLOCK 은 알맞은, 적응가능한 CRISPR-Dx 플랫폼이다" 참조) 만큼 낮게 신뢰성 있게 재설계 및 합성할 수 있다. 이들 특성은 CRISPR-Dx 의 힘을 강조하고, 생물학적 분자의 신속하고 강력하며 민감한 검출을 위한 새로운 길을 열어준다.
표 13: 사용된 RPA 프라이머
표 14: 사용된 crRNA 서열
표 15: 이 실시예에서 사용된 RNA 및 DNA 표적
표 16: 이 실시예에서 사용된 플라스미드
실시예 3 - 측류 종이 스트립을 사용하는 SHERLOCK 검출
측류 기반 기술은 시각적 판독 및 검출 속도로 인해 의료 현장에서 광범위하게 채택되었다. 우리는 RNase 활성을 FAM 및 비오틴을 보유하는 비드-고정된 리포터의 방출과 결합하여 상용 측류 스트립에서 탐지할 수 있는 시스템을 개발했다 (도 87A). 우리는 형광 기반 판독과 비교하여 감소된 민감도로이긴 하지만 이 접근법이 SHERLOCK 활성을 신뢰할 수 있게 검출할 수 있음을 발견했다 (도 87B, C).
우리는 FAM-비오틴 리포터의 방출보다는 파괴에 기반한 대안적인 측류 판독을 설계했다. 풍부한 리포터는 스트립의 첫번째 라인에 비색 항-FAM 항체를 축적하여 두번째 라인의 단백질 A 에 대한 항체의 결합을 방지한다; 리포터의 절단은 첫번째 라인에서 축적을 감소시키고 두번째 라인에서 신호를 발생시킨다 (도 85A). 우리는 지카 및 뎅기 ssRNA 의 시각적 검출을 위해 이 디자인을 시험했으며, 10 aM 조건 (도 85B, C 및 도 88A, B) 까지의 민감도로 90 분 이내에 검출이 가능하다는 것을 발견했으며, 이는 측류 판독이 여러 표적에 강력하다는 것을 입증한다.
실시예 4 - 대두 검출 및 암 진단을 위한 측류의 적용
측류 SHERLOCK 의 유용성을 추가로 입증하기 위해, 우리는 시스템을 농업 및 건강 관련 생명공학 시나리오에 적용했다. 유전자 변형 대두의 검출은 규제적 관점과 회사에서 콩 사용을 모니터링하는데 중요하다. 본 발명자들은 변형 식물이 제초제 Roundup 에 대한 내성을 갖도록 하는 아그로박테리움 튜메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens) 균주 CP4 로부터의 5-에놀피루불시키메이트-3-포스페이트 신타아제의 제초제 내성 형태, CP4-EPSPS 유전자를 유전형분석하기 위한 SHERLOCK 분석법을 설계했다. 우리는 CP4-EPSPS 또는 렉틴, 야생형 대두에 존재하는 유전자를 감지하는 crRNA 를 설계했고, 5 분 미만이 걸리는 빠른 미정제 추출 프로토콜을 사용하여 Roundup Ready 및 야생형 대두 둘 모두에서 DNA 를 수확했다. 우리는 SHERLOCK 이 빠른 시간 (~ 20 분) 에 미정제 추출로부터 매우 적은 배경으로 RR 콩을 성공적으로 유전형분석할 수 있음을 발견했다. 또한, 정량적 SHERLOCK 을 사용하여, 우리는 야생형과 RR 콩의 혼합물에서 RR 콩의 백분율을 정확하게 예측할 수 있었다. GMO 검출은 현장에서 의료 현장 기술로 가장 적용가능할 것이기 때문에, 우리는 측류에 대해 SHERLOCK 분석을 적응시켰고, 시각적 판독을 사용하여 종이 스트립에서 콩을 민감하게 유전형분석할 수 있음을 발견했다. 또한, 측류 판독은 30 분의 총 인큐베이션 시간으로 빠른 검출이 가능하여, 종이에서 시각적으로 강력한 SHERLOCK 검출이 가능하다 (도 89).
SHERLOCKv1 으로, 우리는 암 돌연변이의 검출을 보여주는 세포-무함유 DNA 표준에 대해 기술을 검증했다. SHERLOCKv2 로, 우리는 환자 혈액 샘플에서 암 돌연변이를 검출하는데 관심이 있었으며, 이것은 cfDNA 는 일반적으로 ~1ng/㎕ 의 매우 낮은 농도이고 검출할 실제 돌연변이는 이 0.1%-5% 의 작은 부분이기 때문에 어렵다. 본 발명자들은 EGFR L858R 돌연변이를 검출하기 위한 SHERLOCK 분석을 설계했고, 돌연변이를 보유하는 환자 및 돌연변이가 없는 환자로부터 cfDNA 를 단리했다. 우리는 SHERLOCK 이 돌연변이를 성공적으로 검출할 수 있었으며 (도 86G), 시각적 판독으로 측면 플로우 종이 스트립을 사용하여 검출이 달성될 수 있음을 발견했다 (도 86H, I). 우리는 또한 폐암과 관련된 전형적인 EGFR 엑손 19 결실 (5 개 아미노산) 을 검출하기 위해 SHERLOCK 분석법을 설계했으며, SHERLOCK 은 형광 (도 86J 및 도 90A) 을 통해 그리고 측류 스트립에서 이 게놈 변경을 민감하게 검출할 수 있음을 발견했다 (도 86K, L 및 도 90B, C).
실시예 5 - CRISPR-CAS13 을 사용하는 식물 유전자의 핵산 검출
방법
Cas13 및 Csm6 오솔로그의 단백질 발현 및 정제
LwaCas13a 발현 및 정제를 이전에 기재된 바와 같이 수행했다 (Gootenberg et al. Science 356:438-442 (2017)). PsmCas13b 및 Csm6 오솔로그는 변형된 프로토콜에 따라 발현 및 정제했다. 간략하게, 박테리아 발현 벡터로 Rosetta™ 2(DE3) pLysS Singles Competent Cells (Millipore) 를 형질전환시켰다. 12.5 ㎖ 의 출발 배양물을 Terrific Broth 4 성장 배지 (Sigma) (TB) 에서 밤새 성장시켰고, 이것을 사용하여 0.5 의 OD600 까지 37℃ 및 300 RPM 에서 성장을 위해 4 L 의 TB 에 접종했다. 이 시점에, 단백질 발현은 500 μM 의 최종 농도로 IPTG (Sigma) 를 보충하여 유도시켰고, 세포를 단백질 발현을 위해서 16시간 동안 18℃ 로 냉각시켰다. 그 다음으로 세포를 5000 g 에서 15분 동안 4℃ 에서 원심분리시켰다. 세포 펠렛을 수확했고 후속 정제를 위해 -80℃ 에서 저장했다.
단백질 정제의 모든 후속 단계는 4℃ 에서 수행했다. 세포 펠렛을 분쇄했고, 프로테아제 억제제 (Complete Ultra EDTA-비함유 정제), 리소자임 (500 ㎍/1 ㎖), 및 벤조나아제가 보충된 용해 완충액 (20 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 1 mM DTT, pH 8.0) 에 재현탁시킨 후에, LM20 미세유동화기 시스템을 사용하여 27,000 PSI 에서 고압 세포 파괴를 수행했다. 용해물을 1 hr 동안 4°C 에서 10,000 g 에서 원심분리에 의해 맑게 했다. 상청액을 5 ㎖ 의 StrepTactin 세파로스 (GE) 에 적용했고, 1시간 동안 회전하면서 인큐베이션시킨 후에, 단백질-결합된 StrepTactin 수지를 용해 완충액에서 3회 세척했다. 수지를 250 유닛의 SUMO 프로테아제 (250 ㎎/㎖) 와 함께 SUMO 소화 완충액 (30 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl 1 mM DTT, 0.15% Igepal (NP-40), pH 8.0) 에 재현탁시켰고, 밤새 4℃ 에서 회전시키면서 인큐베이션했다. 현탁액을 용리용 컬럼에 적용했고, 중력류에 의해 수지로부터 분리했다. 단백질 용리를 최대화시키기 위해서 1 컬럼 부피의 용리 완충액으로 수지를 2회 세척했다. 용리액을 양이온 교환 완충액 (20 mM HEPES, 1 mM DTT, 5% 글리세롤, pH 7.0; EiCsm6 및 LsCsm6 의 경우 pH 7.5) 에서 희석하여 양이온 교환 크로마토그래피용 조제물 중 염 농도를 250 mM 까지 낮추었다.
양이온 교환 및 겔 여과 정제를 위해서, 단백질을 5 ㎖ HiTrap SP HP 양이온 교환 컬럼 (GE Healthcare Life Sciences) 상에 FPLC (AKTA PURE, GE Healthcare Life Sciences) 를 통해서 로딩했고, 용리 완충액 (20 mM HEPES, 1 mM DTT, 5% 글리세롤, pH 7.0) 중 250 mM 내지 2M NaCl 의 염 농도구배로 용리했다. 생성된 분획을 SDS-PAGE 에 의해 재조합 단백질의 존재에 대해 시험했고, 단백질을 함유하는 분획을 풀링하여 원심분리용 필터 유닛 (Millipore 50MWCO) 을 통해 S200 완충액 (10 mM HEPES, 1 M NaCl, 5 mM MgCl2, 2 mM DTT, pH 7.0) 중 1 ㎖ 까지 농축시켰다. 농축된 단백질은 겔 여과 컬럼 (Superdex® 200 Increase 10/300 GL, GE Healthcare Life Sciences) 상에 FPLC 를 통해 로딩했다. 겔 여과로부터의 최종 분획을 SDS-PAGE 에 의해 분석했고, 단백질을 함유하는 분획을 풀링하고 저장 완충액 (600 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 7.5, 5% 글리세롤, 2mM DTT) 으로 완충액 교환시키고, 저장을 위해 -80℃ 에서 동결시켰다.
이 연구에서 정제된 모든 단백질에 대한 수탁 번호 및 플라스미드 맵은 표 17 에서 입수가능하다.
표 17. 이 연구에서 사용된 단백질 서열.
대두로부터의 미정제 핵산 추출.
전술한 바와 같이 신속한 핵산 추출을 수행했다 (Wang et al. Anal Chem 89:4413-4418 (2017)). 간략히, 20 ㎎ 의 분쇄된 대두를 200 ㎕ 의 추출 완충액 (500 mM NaOH 및 10 mM EDTA) 에 첨가하고, 5 초 동안 볼텍싱하고, 실온에서 1 분 동안 인큐베이션했다. 상청액의 1:10 희석 후, 추출된 게놈 DNA 0.4 ㎕ 를 20 ㎕ RPA 반응에 첨가하고 SHERLOCK 에 사용했다.
crRNA 제조.
crRNA 의 제조를 위해, 구성체를 T7 프로모터 서열이 첨부된 울트라머 DNA 로서 주문했다 (Integrated DNA Technologies). crRNA DNA 를 짧은 T7 프라이머 (최종 농도 10 μM) 와 어닐링시켰고, T7 폴리머라아제와 밤새 37℃ 에서 HiScribe T7 Quick High Yield RNA Synthesis 키트 (New England Biolabs) 를 사용하여 인큐베이션했다. crRNA 를 추가로 이소프로판올 (Sigma) 을 1.8x 보충하고, 2x 비율의 비드 대 반응 부피로 RNAXP 클린 비드 (Beckman Coulter) 를 사용하여 정제했다.
이 연구에서 사용된 모든 crRNA 서열은 표 18 에서 입수가능하다. SEQ ID NO:433-441 에서 보여지며, 완전한 crRNA 서열은 SEQ ID NO:433 에 제시되고, 스페이서 서열은 SEQ ID NO:434 에 제시되고, 직접 반복부는 SEQ ID NO:435 에 제시된다. 나머지 서열 식별자는 동일한 패턴을 따른다.
표 18. 이 연구에서 사용된 crRNA 서열.
리콤비나아제 폴리머라아제 증폭 (RPA)
RPA 용 프라이머를 NCBI Primer-BLAST24 를 사용하여 앰플리콘 크기 (100 내지 140 nt), 프라이머 용융 온도 (54℃ 내지 67℃), 및 프라이머 크기 (30 내지 35 nt) 를 제외하고는 디폴트 매개변수를 사용하여 설계했다. 그 다음으로 프라이머를 DNA (Integrated DNA Technologies) 로서 주문했다.
RPA 반응 수행은 280 mM MgAc 를 투입 주형 이전에 첨가한 것을 제외하고는 TwistAmp® Basic (TwistDx) 에서 지시한 바와 같이 했다. 달리 설명하지 않으면, 반응은 1 ㎕ 의 투입량으로 1 분동안 37℃ 에서 수행했다.
핵산의 SHERLOCK 정량을 위해, RPA 프라이머 농도는 더 낮은 240nM 농도에서 시험되었다.
다수 표적을 RPA 로 증폭시키는 경우에, 프라이머 농도는 480 nM 의 최종 농도로 조정했다. 즉, 2개 프라이머 쌍의 경우 120 nM 의 각 프라이머가 듀플렉스 검출에 첨가되었다.
이 연구에서 사용된 모든 RPA 는 표 19 에서 입수가능하다. SEQ ID NO:442-447 에서 보여지며, 정방향 프라이머 서열은 SEQ ID NO:442 및 445 에 제시되고, T7RNAP 프로모터 서열이 있는 정방향 프라이머 서열은 SEQ ID NO:443 및 446 에 제시되고, 역방향 프라이머 서열은 SEQ ID NO:444 및 447 에 제시된다.
표 19. 이 연구에서 사용된 RPA 프라이머.
형광 절단 어세이
검출 어세이는 45 nM 정제된 Cas13, 22.5 nM crRNA, 소광된 형광 RNA 리포터 (125nM RNAse Alert v2, Thermo Scientific, 동종중합체 및 디-뉴클레오티드 리포터 (IDT); polyA Trilink 리포터의 경우 250 nM), 0.5 ㎕ 쥐과동물 RNase 억제제 (New England Biolabs), 25 ng 의 배경 전체 인간 RNA (HEK293FT 배양물로부터 정제됨), 및 다양한 양의 투입 핵산 표적을 사용하여, 달리 표시하지 않으면, 뉴클레아제 어세이 완충액 (20 mM HEPES, 60 mM NaCl, 6 mM MgCl2, pH 6.8) 에서 수행했다. 반응은 형광 동역학을 5분 마다 측정하면서 형광 플레이트 판독기 (BioTek) 상에서 30 분 - 3시간 동안 37℃ 에서 (달리 표시하지 않으면) 진행되도록 했다.
이 연구에서 사용된 모든 절단 리포터는 표 20 에서 이용가능하다. SEQ ID NO:448-451 이 보여진다.
표 20. 이 연구에서 사용된 RPA 프라이머.
SHERLOCK 핵산 검출
검출 어세이는 뉴클레아제 어세이 완충액 (20 mM HEPES, 60 mM NaCl, 6 mM MgCl2, pH 6.8) 중 45 nM 정제된 Cas13, 22.5 nM crRNA, 소광된 형광 RNA 리포터 (125nM RNAse Alert v2 및 poly A Trilink 리포터의 경우 250 nM), 0.5 ㎕ 쥐과동물 RNase 억제제 (New England Biolabs), 25 ng 의 배경 전체 인간 RNA (HEK293FT 배양물로부터 정제됨), 및 1 ㎕ 의 RPA 반응물, rNTP 믹스 (1 mM 최종, NEB), 0.6 ㎕ T7 폴리머라아제 (Lucigen) 및 3 mM MgCl2 를 사용해 수행했다. 반응은 형광 동역학을 5분 마다 측정하면서 형광 플레이트 판독기 (BioTek) 상에서 30 분 - 3시간 동안 37℃ 에서 (달리 표시하지 않으면) 진행되도록 했다.
Cas13-Csm6 형광 절단 어세이
Cas13-Csm6 조합된 형광 절단 어세이는 하기와 같이 변형하여 표준 Cas13 형광 절단 반응에 대해 기술된 바와 같이 수행했다. 달리 표시하지 않으면 Csm6 단백질은 400 nM 의 Csm6 형광 리포터 및 500 nM Csm6 활성제에 10 nM 최종 농도로 첨가되었다. Csm6 활성에 의한 rRNA 의 간섭 때문에, IVT 는 RPA 사전-증폭 단계에서 수행되었고, 그 다음으로 1 ㎕ 의 이 반응물을 Cas13-Csm6 절단 어세이에 투입으로서 첨가했다.
이 연구에서 사용된 모든 Csm6 활성제는 표 21 (SEQ ID NO:452) 에서 입수가능하다.
표 21. 이 연구에서 사용된 Csm6 활성화제 서열.
FAM-비오틴 리포터를 사용한 Cas13 활성의 측류 판독
측류 검출을 위해, 달리 지시되지 않는 한, RPA 를 10 분 동안 수행하고, SHERLOCK-LwaCas13a 반응을 20 분 동안 수행했고, 형광 리포터를 1uM 최종 농도의 FAM-RNA-비오틴 리포터로 대체한 것을 제외하고는 위에 제시된 바와 같이 반응을 설정했다. 인큐베이션 후에, 전체 20 ㎕ LwaCas13a 반응물을 100 ㎕ 의 HybriDetect 1 어세이 완충액 (Milenia) 에 첨가했고, HybriDetect 1 측류 스트립 (Milenia) 상에 흘려주었다.
결과
SHERLOCK 은 부수적 효과로 언급되는 Cas13 의 조건부 난잡한 RNase 활성을 활용하며 (Abudayyeh et al. Science 353, aaf5573, doi:10.1126/science.aaf5573 (2016)), 여기서 Cas13 효소는 표적 RNA 인지시에 용액 중 비-CRISPR RNA (crRNA) 표적화되는 RNA 종을 절단한다. Cas13 을 소광된 형광 RNA 리포터 (Abudayyeh et al. Science 353, aaf5573, doi:10.1126/science.aaf5573 (2016); East-Seletsky et al. Nature 538:270-273 (2016)) 또는 RNA 측류 리포터 (Gootenberg et al.) 와 조합함으로써, SHERLOCK 은 표적 핵산 종의 Cas13 인지시에 형광 또는 비색 측류 판독값을 생성할 수 있다. 우리는 가장 최근에 동일-샘플 멀티플렉싱, 측류 시각적 판독, 정량화 및 신호 검출의 Csm6 증폭을 조합하는 SHERLOCKv2 플랫폼을 개발했다 (Gootenberg et al.). 여기에서, 우리는 GMO 의 감시를 위한 대두 유전형분석 및 형질 정량에 초점을 맞추어, 농업 응용 프로그램에 특화된 SHERLOCKv2 방법을 개발한다.
대두 형질의 검출은 식량 공급에서 GMO 형질의 전세계 감시에 중요하며, 가장 일반적인 형질인 Roundup Ready (RR) 내성 유전자의 검출을 위한 다수의 검출 방법이 개발되었다 (Wang et al. Food Control 29:213-220 (2013); Wu et al. Int J Mol Sci 13:1919-1932 92012); Guan et al. Food Anal Method 3:313-320 (2010)). 그러나, 이들 방법은 기구화, 아토몰 농도 초과의 열악한 민감도 및 30 분 초과의 인큐베이션 시간을 포함하여 다수의 한계를 겪고 있다. SHERLOCK 을 사용하여 대두 형질 검출을 위한 CRISPR-기반 진단을 가능하게 하기 위해, 우리는 먼저 사전 DNA 정제 없이 직접 SHERLOCK 검출을 허용하는 대두 (글라이신 맥스 (Glycine max)) 종자에 대한 빠른 DNA 추출 전략을 확립했다 (도 91A). 간단한 수공구로 분쇄된 종자 물질을 생산하고 이 물질을 추출 용액에 재수화시킴로써, 우리는 RPA 에 의한 게놈 DNA 및 핵산 사전 증폭의 효율적인 추출을 달성했다. 본 발명자들은 Roundup 에 대한 내성을 제공하는 아그로박테리움 종 균주 CP4 로부터의 효소 5-에놀피루빌시키메이트-3-포스페이트 신타아제 (EPSPS) 를 인코딩하는 유전자 (CP4 EPSPS) 에 대한 crRNA, 및 대조군으로서 하우스키핑 유전자 렉틴을 설계함으로써 검출을 위한 Cas13 어세이를 개발했다. 우리는 사전 증폭된 조 대두 추출물에 대한 형광을 통한 Cas13 검출이 RR 대두에서만 CP4 EPSPS 유전자를 정확하게 확인할 수 있음을 발견했다 (도 91B, 도 92A-B). 이종 혼합물에서 GM 종자 함량을 정량화하는 SHERLOCK 의 능력을 평가하기 위해, 야생형과 RR 대두의 조합으로부터 CP4 EPSPS 를 정량화하도록 SHERLOCK 을 최적화했다. 종자 혼합물로부터 단리된 게놈 DNA 를 사용하여, 우리는 CP4 EPSPS 이식유전자 양의 20 % 차이를 구별하고 30 분 내에 GM 함량 추정을 위한 표준 곡선을 확립할 수 있었다 (도 91C, 도 93A-C).
렉틴 또는 다른 하우스키핑 유전자의 동시 검출은 양성 대조군으로서 및 로딩 정규화를 위해 중요하지만, 특히 샘플 양이 제한적이거나 DNA 함량이 분취량 사이에서 변하는 경우에, 각각의 개별 crRNA 에 대해 반응을 수행하는 것은 불편하다. Cas13 오솔로그의 염기 절단 선호도를 특성분석함으로써, 우리는 상호 배타적인 염기 선호도를 갖는 오솔로그를 발견하여, 상이한 스펙트럼 채널에서 직교 리포터에 의해 부수적 절단이 측정될 수 있게 했다 (Gootenberg et al.) (도 91D). 따라서 우리는 폴리우리딘 RNA 리포터를 사용하는 LwaCas13a 및 폴리아데닌 리포터를 사용하는 PsmCas13b 에 대한 분석을 개발했다. CP4 EPSPS 유전자에 상보적인 LwaCas13a crRNA 및 렉틴 유전자에 대한 PsmCas13b crRNA 를 사용하여, 우리는 동일한 반응에서 두 유전자를 모두 검출할 수 있었고, RR 대두를 CP4 EPSPS 유전자를 갖는 것으로 정확하게 분류할 수 있었다 (도 91E). 렉틴의 샘플 내 검출은 내성 이식유전자가 검출되지 않더라도 대두 물질이 존재하는지 확인할 수 있게 한다.
많은 현장 응용에서, 형광 신호의 판독을 위한 기기가 입수가능하지 않을 수 있다. 보다 쉬운 시각적 검출을 위해, 우리는 소광된 형광 RNA 리포터를 반대쪽 끝에 비오틴과 FAM 으로 기능화된 RNA 로 교체함으로써 측류 스트립-기반 판독과 호환되게 SHERLOCKv2 (Gootenberg et al.) 에서 리포터를 만들었다 (도 91F). 리포터 RNA 절단이 없으면, RNA 리포터는 스트렙타비딘 라인에서 흡착되고 금 나노입자로 표지된 항-FAM 항체를 포획한다. RNA 리포터가 부수 효과에 의해 파괴되는 경우에, 항체는 제 2 포획 라인으로 흐를 것이다. 빠른 RR 대두 검출로 이 개념을 입증하기 위해, 우리는 10 분 내에 조 대두 추출물로부터 RPA 로 CP4 EPSPS 이식 유전자를 사전 증폭한 다음 20 분 내에 측류 RNA 리포터로 LwaCas13a 검출 반응을 수행하여, 유전자이식 RR 종자로부터의 DNA 에서만 측류 신호를 생성했다 (도 91G, H).
우리는 또한 유형 III CRISPR 관련 엔도리보뉴클레아제 Csm6 (Kazlauskiene et al. Science 357:605-609 (2017); Niewoehner et al. Nature 548:543-548 92017)) 를 SHERLOCK 반응 (Gootenberg et al.) 과 조합함으로써 CP4 EPSPS 유전자의 신호 검출이 향상될 수 있다는 것을 발견했다 (도 94). LwaCas13a 부수적 활성을 사용하여 2', 3' 사이클릭 포스페이트가 있는 헥사데닐레이트 기질을 생성하여 Csm6 절단 활성을 자극함으로써, 우리는 EiCsm6 및 LsCsm6 을 모두 활성화하여 SHERLOCK 분석에서 신호 증폭 및 그에 따른 더 큰 신호 검출을 야기할 수 있다 (도 94).
요약하자면, SHERLOCK 기술은 전세계의 GMO 형질 감시 및 식물 병원체 또는 해충의 빠른 조기 발견을 포함하여 많은 생명공학 및 농업 분야에 유용한 플랫폼을 제공한다.
실시예 6
SHERLOCK 의 또다른 목표는 추가의 기기를 요구하지 않는 활성의 시각적 판독을 엔지니어링하는 것이었다. 출원인은 먼저 금 나노입자 클러스터 분해에 기초한 비색 RNase 리포터를 시험했지만 (20, 21), 이 특정 상황에서의 판독은 달성될 수 있는 Cas13 부수적 활성 이상의 수준의 RNase 활성을 요구했다 (도 95). 그 후, 출원인은 FAM-비오틴 리포터의 파괴에 기초한 측류 판독을 설계하여, 상업용 측류 스트립에서의 검출을 허용하였다. 풍부한 리포터는 스트립의 첫번째 라인에 항-FAM 항체-금 나노입자 접합체를 축적하여, 두번째 라인의 단백질 A 에 대한 항체-금 접합체의 결합을 방지한다; 리포터의 절단은 첫번째 라인에서 축적을 감소시키고 두번째 라인에서 신호를 발생시킨다 (도 96). 본 발명자들은 ZIKV 또는 DENV ssRNA 의 기구 없는 검출을 위해 이 디자인을 시험했고, 2 aM 조건까지의 민감도로 90 분 이내에 검출이 가능하다는 것을 발견했다 (도 96 및 도 97). 또한, 출원인은 인간 타액으로부터 신속한 게놈 DNA 추출 (<10 분) 을 수행할 수 있고 형광에 의해 23 분 미만 및 측류에 의해 2 시간 내에 신속한 유전형분석을 위해 정제 없이 이를 SHERLOCK 에 직접 투입할 수 있음을 발견했다 (도 98). 이는 샘플 정제 없이 원-포트 분석에서 전체 SHERLOCK 반응이 수행되는 폐쇄 튜브 분석 포맷을 예시한다.
출원인은 또한 비소세포 폐암 (NSCLC) 환자의 액체 생검에서 돌연변이 검출을 위한 빠른 휴대용 종이 시험을 만들기 위해 시스템을 적용했다. 본 출원인은 EGFR L858R 돌연변이 또는 엑손 19 결실 (5 개 아미노산) 을 검출하기 위해 SHERLOCK 검정을 설계했고, 이들 돌연변이가 있거나 없는 환자로부터 cfDNA 를 단리했으며 (도 96), 이는 표적화되는 시퀀싱에 의해 확인되는 바와 같다 (표 28). SHERLOCK 은 형광 기반 판독 (도 96) 및 측류 기반 판독 (도 96 및 도 99) 둘 다에서 이들 돌연변이를 성공적으로 검출했다. 형광 기반 SHERLOCK 은 또한 합성 및 환자 cfDNA 액체 생검 샘플에서 상이한 공통 EGFR 돌연변이, T790M 을 검출할 수 있었다 (도 99 (e)(f)).
검출의 강건성을 개선시키고 거짓 양성 판독 가능성을 감소시키기 위해서, 출원인은 측류 상에서 Cas13 검출과 Csm6 을 조합했다 (도 96). 출원인은 Csm6 및 활성제의 존재 하에서 다양한 서열 및 길이의 측류 리포터를 시험했고, 장형 A-C 리포터가 강력한 절단 신호를 나타냄을 발견했다 (도 100A, B). 출원인은 증폭을 위해 오직 Csm6 에 의존하는 (즉, RPA 부재 하에서) DENV ssRNA 의 신속한 검출을 위해 Cas13 측류 리포터와 조합하여 이 리포터를 사용했다 (도 96(L)). 출원인은 이후에 RPA, Cas13/Csm6, 및 측류 판독을 조합하여 아실트랜스퍼라제 표적을 검출했고, Csm6 에 의해 제공된 신호의 증가가 배경치를 감소시키면서 측류에 의한 보다 신속한 검출을 가능하게 했다는 것을 확인했다 (도 100C-D).
재료 및 방법
Cas13 및 Csm6 오솔로그의 단백질 발현 및 정제
LwaCas13a 발현 및 정제는 약간 변형하여 이전에 기술된 대로 (3) 수행했고 하기에 상술한다. LbuCas13a, LbaCas13a, Cas13b 및 Csm6 오솔로그는 변형 프로토콜에 따라 발현시켰고 정제했다. 간략하게, 박테리아 발현 벡터로 Rosetta™ 2(DE3)pLysS Singles Competent Cells (Millipore) 를 형질전환시켰다. 12.5 ㎖ 의 출발 배양물을 Terrific Broth 4 성장 배지 (Sigma) (TB) 에서 밤새 성장시켰고, 이것을 사용하여 0.5 의 OD600 까지 37℃ 및 300 RPM 에서 성장을 위해 4 L 의 TB 에 접종했다. 이 시점에, 500 μM 의 최종 농도로 IPTG (Sigma) 를 보충하여 단백질 발현을 유도했고, 단백질 발현을 위해 세포를 16시간 동안 18℃ 로 냉각시켰다. 그 다음으로 세포를 5000 g 에서 15분 동안 4℃ 에서 원심분리했다. 세포 펠렛을 수확했고 후속 정제를 위해 -80℃ 에서 저장했다.
단백질 정제의 모든 후속 단계는 4℃ 에서 수행했다. 세포 펠렛을 분쇄했고 프로테아제 억제제 (Complete Ultra EDTA-비함유 정제), 리소자임 (500 ㎍/1 ㎖), 및 벤조나제가 보충된 용해 완충액 (20 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 1 mM DTT, pH 8.0) 에 재현탁시킨 후에 LM20 미세유동화기 시스템을 사용하여 27,000 PSI 에서 고압 세포 파괴를 수행했다. 용해물은 1시간 동안 4℃ 에서 10,000 g로 원심분리하여 맑게 만들었다. 상청액을 5 ㎖ 의 StrepTactin 세파로스 (GE) 에 적용했고, 1시간 동안 회전하면서 인큐베이션시킨 후에, 단백질-결합된 StrepTactin 수지를 용해 완충액에서 3회 세척했다. 수지는 250 유닛의 SUMO 프로테아제 (250 ㎎/㎖) 와 함께 SUMO 분해 완충액 (30 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl 1 mM DTT, 0.15% Igepal (NP-40), pH 8.0) 에 재현탁시켰고 밤새 4℃ 에서 회전시키면서 인큐베이션했다. 현탁액을 용리용 컬럼에 적용했고, 중력류에 의해 수지로부터 분리했다. 단백질 용리를 최대화시키기 위해서 1 컬럼 부피의 용리 완충액으로 수지를 2회 세척했다. 용리액은 양이온 교환 완충액 (20 mM HEPES, 1 mM DTT, 5% 글리세롤, pH 7.0; LbuCas13a, LbaCas13a, EiCsm6, LsCsm6, TtCsm6 의 경우 pH 7.5) 으로 희석하여 250 mM 까지 양이온 교환 크로마토그래피 용 조제물 중 염 농도를 낮춰주었다.
양이온 교환 및 겔 여과 정제를 위해서, 단백질은 5 ㎖ 의 HiTrap SP HP 양이온 교환 컬럼 (GE Healthcare Life Sciences) 상에 FPLC (AKTA PURE, GE Healthcare Life Sciences) 를 통해서 로딩했고 250 mM 내지 2M NaCl 의 염 농도구배로 용리 완충액 (20 mM HEPES, 1 mM DTT, 5% 글리세롤, pH 7.0; LbuCas13a, LbaCas13a 의 경우 pH 7.5) 으로 용리했다.
최종 분획은 SDS-PAGE 를 통해서 재조합 단백질의 존재에 대해 시험되었고, 단백질을 함유하는 분획을 풀링하여 원심분리용 필터 유닛 (Millipore 50MWCO) 을 통해 1 ㎖ 까지 S200 완충액 (10 mM HEPES, 1 M NaCl, 5 mM MgCl2, 2 mM DTT, pH 7.0) 중에서 농축시켰다. 농축된 단백질은 겔 여과 컬럼 (Superdex® 200 Increase 10/300 GL, GE Healthcare Life Sciences) 상에 FPLC 를 통해 로딩했다. 겔 여과로부터의 최종 분획을 SDS-PAGE 에 의해 분석했고, 단백질을 함유하는 분획을 풀링하고 저장 완충액 (600 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 7.5, 5% 글리세롤, 2mM DTT) 으로 완충액 교환하고, 저장을 위해 -80℃ 에서 동결시켰다.
이 연구에서 정제된 모든 단백질에 대한 수탁 번호 및 플라스미드 맵은 표 22 에서 입수가능하다.
핵산 표적 및 crRNA 제조
Cas12a 및 게놈 DNA 검출을 위한 핵산 표적을 NEBNext PCR 마스터 믹스를 사용해 PCR 증폭시키고, 겔 추출하고, MinElute 겔 추출 키트 (Qiagen) 를 사용하여 정제했다. RNA 기반 검출의 경우, 정제된 dsDNA 는 T7 폴리머라아제와 밤새 30℃ 에서 HiScribe T7 Quick High Yield RNA Synthesis 키트 (New England Biolabs) 를 사용해 인큐베이션했고, RNA 는 MEGAclear 전사 클린-업 키트 (Thermo Fisher) 를 사용해 정제했다.
crRNA 제조는 약간 변형하여 이전에 기술된 바와 같이 (3) 수행했고 하기에 상술된다. crRNA 의 제조를 위해, 구성체를 T7 프로모터 서열이 첨부된 울트라머 DNA 로서 주문했다 (Integrated DNA Technologies). crRNA DNA 는 짧은 T7 프라이머 (최종 농도 10 μM) 와 어닐링시켰고 T7 폴리머라아제와 밤새 37℃ 에서 HiScribe T7 Quick High Yield RNA Synthesis 키트 (New England Biolabs) 를 사용하여 인큐베이션했다. crRNA 는 추가로 이소프로판올 (Sigma) 을 1.8x 보충하고, 2x 비율의 비드 대 반응 부피로 RNAXP 클린 비드 (Beckman Coulter) 를 사용하여 정제했다.
이 연구에서 사용된 모든 crRNA 서열은 표 23 에서 입수가능하다. 표 23 은 SEQ ID NO:453-827 을 열거하며, SEQ ID NO:453 은 완전한 crRNA 서열을 나타고, SEQ ID NO:454 는 스페이서를 나타내고, SEQ ID NO:455 는 LwaCas13a 에 대한 직접 반복부를 나타낸다. 표에서 나머지 서열 식별자는 동일한 패턴을 따른다. 이 연구에서 사용된 모든 DNA 및 RNA 표적 서열은 표 24 에서 입수가능하다.
RPA 용 프라이머는 앰플리콘 크기 (100 내지 140 nt), 프라이머 용융 온도 (54℃ 내지 67℃), 및 프라이머 크기 (30 내지 35 nt) 를 제외하고, 디폴트 매개변수를 사용하여 NCBI Primer-BLAST(27) 를 사용해 설계했다. 그 다음으로 프라이머를 DNA (Integrated DNA Technologies) 로서 주문했다.
RPA 및 RT-RPA 반응 수행은 280 mM MgAc 를 투입 주형 이전에 첨가한 것을 제외하고, 각각 TwistAmp® Basic 또는 TwistAmp® Basic RT (TwistDx) 에서 지시한 바와 같이 했다. 반응은 달리 설명하지 않으면, 1 ㎕ 의 투입량으로 1시간 동안 37℃ 에서 수행했다.
핵산의 SHERLOCK 정량을 위해, RPA 프라이머 농도를 표준 농도 (480 nM 최종) 및 더 낮은 농도 (240 nM, 120 nM, 60 nM, 24 nM) 에서 시험하여 최적 농도를 찾아냈다. RPA 반응을 20분 동안 더 수행했다.
다수 표적을 RPA 로 증폭시키는 경우에, 프라이머 농도를 480 nM 의 최종 농도로 조정했다. 즉, 2개 프라이머 쌍의 경우 120 nM 의 각 프라이머가 듀플렉스 검출에 첨가되었다.
이 연구에서 사용된 모든 RPA 는 표 25 에서 입수가능하다. SEQ ID NO:841-870 이 보여지며, SEQ ID NO:841 은 정방향 프라이머 서열을 나타내고, SEQ ID NO:842 는 T7 RNAP 프로모터가 있는 정방향 프라이머 서열을 나타내고, SEQ ID NO:843 은 DENV ssRNA 에 대한 역방향 프라이머 서열을 나타낸다. 나머지 서열 식별자는 동일한 패턴을 따른다.
형광 절단 어세이
검출 어세이는 약간 변형하여 이전에 (3) 기술된 바와 같이 수행했고 그 절차를 하기에 상술한다. 검출 어세이는 45 nM 정제된 Cas13, 22.5 nM crRNA, 소광된 형광 RNA 리포터 (125nM RNAse Alert v2, Thermo Scientific, 동종중합체 및 디-뉴클레오티드 리포터 (IDT); polyA Trilink 리포터의 경우 250 nM), 0.5 ㎕ 쥐과동물 RNase 억제제 (New England Biolabs), 25 ng 의 배경 전체 인간 RNA (HEK293FT 배양물로부터 정제됨), 및 다양한 양의 투입 핵산 표적을 사용하여, 달리 표시하지 않으면, 뉴클레아제 어세이 완충액 (20 mM HEPES, 60 mM NaCl, 6 mM MgCl2, pH 6.8) 에서 수행했다. Csm6 형광 절단 반응의 경우, 단백질은 10 nM 최종 농도로, 뉴클레아제 어세이 완충액 (20 mM HEPES, 60 mM NaCl, 6 mM MgCl2, pH 6.8) 중 500 nM 의 2', 3' 사이클릭 포스페이트 올리고아데닐레이트, 250 nM 의 형광 리포터 및 0.5 ㎕ 쥐과동물 RNase 억제제와 함께 사용했다. 반응은 형광 동역학을 5분 마다 측정하면서 형광 플레이트 판독기 (BioTek) 상에서 1-3시간 동안 (달리 표시하지 않으면) 37℃ 에서 진행되도록 했다. AsCas12a 를 수반하는 반응에서, IDT 로부터의 재조합 단백질을 사용하여 45 nM AsCas12a 가 포함되었다. 멀티플렉스 반응의 경우에, 45 nM 의 각 단백질 및 22.5 nM 의 각 crRNA 가 반응에 사용되었다.
이 연구에서 사용된 모든 절단 리포터는 표 26 에서 이용가능하다. 10 뉴클레오티드 길이 이상의 서열을 나타내는, SEQ ID NO:871-877 이 제시되어 있다. 10 뉴클레오티드보다 짧은 서열에는 서열 식별자가 할당되지 않았다.
SHERLOCK 핵산 검출
검출 어세이는 뉴클레아제 어세이 완충액 (20 mM HEPES, 60 mM NaCl, 6 mM MgCl2, pH 6.8) 중 45 nM 정제된 Cas13, 22.5 nM crRNA, 소광된 형광 RNA 리포터 (125nM RNAse Alert v2, Thermo Scientific, 동종중합체 및 디-뉴클레오티드 리포터 (IDT); polyA Trilink 리포터의 경우 250 nM), 0.5 ㎕ 쥐과동물 RNase 억제제 (New England Biolabs), 25 ng 의 배경 전체 인간 RNA (HEK293FT 배양물로부터 정제됨), 및 1 ㎕ 의 RPA 반응물, rNTP 믹스 (1mM 최종, NEB), 0.6 ㎕ T7 폴리머라아제 (Lucigen) 및 3mM MgCl2 을 사용하여 수행했다. 반응은 형광 동역학을 5분 마다 측정하면서 형광 플레이트 판독기 (BioTek) 상에서 1-3시간 동안 37℃ 에서 (달리 표시하지 않으면) 진행되도록 했다.
원-포트 핵산 검출의 경우, 검출 어세이는 약간 변형하여 이전에 (3) 기술된 바와 같이 수행했다. 단일 100 ㎕ 조합 반응 어세이는 0.48 μM 정방향 프라이머, 0.48 μM 역방향 프라이머, 1x RPA 재수화 완충액, 다양한 양의 DNA 투입, 45 nM LwCas13a 재조합 단백질, 22.5 nM crRNA, 125 ng 배경 전체 인간 인간 RNA, 125 nM 기질 리포터 (RNase alert v2), 2.5 ㎕ 쥐과동물 RNase 억제제 (New England Biolabs), 2 mM ATP, 2 mM GTP, 2 mM UTP, 2 mM CTP, 1 ㎕ T7 폴리머라아제 믹스 (Lucigen), 5 mM MgCl2, 및 14 mM MgAc 로 이루어졌다. 반응은 형광 동역학을 5분 마다 측정하면서 형광 플레이트 판독기 (BioTek) 상에서 1-3시간 동안 37℃ 에서 (달리 표시하지 않으면) 진행되도록 했다. 측류 판독의 경우, 20 ㎕ 의 조합 반응물을 100 ㎕ 의 HybriDetect 1 어세이 완충액 (Milenia) 에 첨가했고 HybriDetect 1 측류 스트립 (Milenia) 상에서 수행했다.
절단 단편 분석을 위한 핵산 표지화
표적 RNA 는 상기 기술된 바와 같이 시험관내에서 dsDNA 주형으로부터 전사시키고 정제했다. 시험관내 절단 반응을 다음과 같이 변형하여 형광 절단 반응에 대해 상기 기술된 바와 같이 수행했다. 형광성 리포터는 1 ㎍ RNA 표적으로 대체했고 배경 RNA 는 사용하지 않았다. 절단 반응을 5분 (LwaCas13a) 또는 1시간 (PsmCas13b) 동안 37℃ 에서 수행했다. 절단 반응물을 RNA clean & concentrator-5 키트 (Zymo Research) 를 사용하여 정제했고 10 ㎕ 의 UltraPure 물 (Gibco) 에서 용리했다. 절단 반응물을 5'EndTag 표지화 반응 (Vector Laboratories) 키트 프로토콜에 따라서 10 ㎍ 의 말레이미드 IRDye 800CW (Licor) 로 추가로 표지화했다. Cas13 절단에 의해 생성된 5' 말단을 확인하기 위해서, 프로토콜을 수정하여 알칼리 포스파타제 (AP) 처리를 수행하거나 또는 오직 5'-OH 함유 RNA 종만을 표지화하기 위해 UltraPure 물로 대체한 한편, 소화되지 않은 트리포스포릴화 (PPP) RNA 종은 AP 처리가 수행된 경우에만 표지된다.
고해상도 절단 단편 분석을 위한 질량 분광법
Cas13 부수적 RNase 활성에 의해 생성된 절단 말단을 질량 분광법에 의해 확인하기 위해서, 시험관내 절단 반응을 상기 기술된 바와 같이 다음과 같이 변형하여 수행했다. Cas13 RNA 표적은 1 nM 최종 농도로, Csm6 활성제는 3μM 최종 농도로 사용했고, 배경 RNA 는 사용하지 않았다. 대조군 반응의 경우에, Cas13 표적을 UltraPure 물로 대체하거나, 또는 표준 시험관내 절단 반응물을 Cas13 표적, Cas13 단백질 및 Cas13 crRNA 의 부재 하에서 2',3' 사이클릭 포스페이트 활성제를 함유하는 헥사아데닐레이트와 인큐베이션했다. 절단 반응은 1시간 동안 37℃ 에서 수행했고, New England Biolabs siRNA 정제 프로토콜을 사용하여 정제했다. 간략하게, 1/10 부피의 3 M NaOAc, 2 ㎕ 의 RNase-비함유 Glycoblue (Thermofisher) 및 3x 부피의 냉 95% 에탄올을 첨가했고, -20℃ 에서 2시간 동안 정치시키고, 15분 동안 14,000g 에서 원심분리했다. 상청액을 제거하고, 2x 부피의 80% EtOH 을 첨가하고, 10분 동안 실온에서 인큐베이션했다. 상청액을 따라내고, 샘플을 5분 동안 14,000g 에서 원심분리했다. 펠렛을 자연 건조시킨 후에, 50 ㎕ 의 UltraGrade 물을 첨가하고 질량 분광 분석을 위해 드라이 아이스 상에 운반했다.
질량 분광 분석을 위해서, 샘플을 UltraGrade 물로 1:1 희석했고 Agilent 1290 HPLC 와 결합된 음이온 방식으로 Bruker Impact II q-TOF 질량 분광계에서 분석했다. 이동상 A 로서 물 중 0.1% 암모늄 히드록시드 v/v 및 이동상 B 로서 아세토니트릴을 사용하여 PLRP-S 컬럼 (50 mm, 5 ㎛ 입자 크기, 1000 옹스트롬 포어 크기 PLRP-S 컬럼, 2.1 mm ID) 에 10 ㎕ 를 주입했다. 유속은 0.3 ㎖/분에서 계속 일정하게 유지했다. 이동상 조성은 0% B 에서 시작했고 처음 2분 동안 유지되었다. 이 시점 이후에, 조성은 다음 8분에 걸쳐 100% B 로 변화되었고 1분 동안 유지되었다. 그 다음으로 조성은 0.1분에 걸쳐 0% B 로 돌아갔고, 그 후 4.9분 동안 유지되어 컬럼이 시작 조건으로 다시 평형화될 수 있게 했다. 질량 분광계는 큰 MW 이온에 대해 조율되었고, 데이타는 m/z 400-5000 사이에서 획득되었다. 질량 분광계로부터의 전체 데이타세트는 소듐 포르메이트의 주입을 사용하여 m/z 에 의해 보정되었다. 음으로 하전된 이온 데이타로부터 계산된 중성 질량 스펙트럼을 생성시키기 위해서 MaxEnt 디컨볼루션 알고리즘에 대해 허가된 Bruker Compass Data Analysis 4.3 을 사용해 데이타를 분석했다.
간 타액으로부터 게놈 DNA 추출
타액 DNA 추출은 약간 변형하여 이전에 기술된 대로 (3) 수행했고 하기에 상술된다. 수집 전에 30분에 음식 또는 음료 섭취를 제한한 자원자로부터 2 ㎖ 의 타액을 수집했다. 그 다음으로 샘플은 QIAamp® DNA Blood Mini Kit (Qiagen) 를 사용하여 키트 프로토콜에 의해 권장되는 바와 같이 처리했다. 끓인 타액 샘플의 경우, 400 ㎕ 의 포스페이트 완충 염수 (Sigma) 를 100 ㎕ 의 자원자 타액에 첨가했고 5분 동안 1800 g 에서 원심분리했다. 상청액을 따라내고 펠렛을 0.2% Triton X-100 (Sigma) 함유 포스페이트 완충 염수에 재현탁한 후에, 95℃ 에서 5분 동안 인큐베이션했다. 1 ㎕ 의 샘플을 RPA 반응물 내로의 직접 투입으로서 사용했다.
디지털 액적 PCR 정량
ddPCR 정량은 약간 변형하여 이전에 (3) 기술된 대로 수행했고 하기에 상술한다. 표적 희석물의 농도를 확인하기 위해서, 우리는 디지털-액적 PCR (ddPCR) 을 수행했다. DNA 정량의 경우, 표적 서열에 대해 설계된 PrimeTime qPCR 프로브/프라이머 어세이 (IDT) 와 프로브용 ddPCR Supermix (dUTP 없음) (BioRad) 를 사용해 액적을 만들었다. RNA 정량의 경우, 표적 서열에 대해 설계된 PrimeTime qPCR 프로브/프라이머 어세이와 프로브용 원-스텝 RT-ddPCR 키트를 사용해 액적을 만들었다. 액적은 두 경우 모두 QX200 액적 생성기 (BioRad) 를 사용해 생성시켜서 PCR 플레이트로 옮겼다. 액적-기반 증폭은 키트 프로토콜에 기술된 대로 열순환기에서 수행했고 핵산 농도는 이후에 QX200 액적 판독기 상에서 측정을 통해 확인했다.
Cas13-Csm6 형광 절단 어세이
Cas13-Csm6 조합된 형광 절단 어세이는 하기와 같이 변형하여 표준 Cas13 형광 절단 반응에 대해 기술된 바와 같이 수행했다. 달리 표시하지 않으면 Csm6 단백질은 400 nM 의 Csm6 형광 리포터 및 500 nM Csm6 활성제에 10 nM 최종 농도로 첨가되었다. Cas13 을 Csm6 부수적 RNase 활성과 구별하기 위해서, 2종의 구별되는 형광단이 형광 검출에 사용되었다 (FAM 및 HEX). Csm6 활성에 의한 rRNA 의 간섭 때문에, IVT 는 RPA 사전-증폭 단계에서 수행되었고 그 다음으로 1 ㎕ 의 이 반응물을 투입으로서 Cas13-Csm6 절단 어세이에 첨가했다.
우리가 3-단계 Cas13-Csm6 절단 어세이를 시험한 경우에, RPA 는 다양한 시간 동안 상기에 논의된 바와 같이 정상적으로 수행되었고 그 다음으로 다양한 시간 동안 정상적인 IVT 반응에 투입으로서 사용되었다. 이어서, 1 ㎕ 의 IVT 가 이전 단락에 기술된 Cas13-Csm6 반응에 투입으로서 사용되었다. 이 연구에서 사용된 모든 Csm6 활성제는 표 27 에서 입수가능하다.
라이브러리를 사용한 모티프 발견 스크린
Cas13 절단 선호도를 스크리닝하기 위해서, 시험관내 RNA 절단 반응은 하기와 같이 변형하여 상기 기술된 대로 설정되었다. Cas13 표적은 20 nM 로 사용되었고, 형광 리포터는 NGS 라이브러리 준비를 위한 DNA 핸들이 측접된 무작위 리보뉴클레오티드의 6-합체 스트레치를 함유하는 1 μM 의 DNA-RNA 올리고뉴클레오티드 (IDT) 로 대체되었다. 반응은 (달리 표시하지 않으면) 60분 동안 37℃ 에서 수행되었다. 반응물은 Zymo oligo-clean & concentrator-5 키트 (Zymo research) 를 사용하여 정제했고 15 ㎕ 의 UltraPure 물이 용리에 사용되었다. 10 ㎕ 의 정제된 반응물이 DNA 핸들에 결합하는 유전자-특이적 프라이머를 사용한 역전사에 사용되었다.
역전사 (RT) 는 45분 동안 42℃ 에서 qScript Flex cDNA-키트 (quantabio) 프로토콜에 따라서 수행되었다. 절단 효율 및 생성물 순도를 평가하기 위해서, RT-반응물을 물에 1:10 희석했고 Small RNA 키트에 로딩하여 Bioanalyzer 2100 (Agilent) 상에서 수행했다. 4 마이크로리터의 RT-반응물을 제 1 라운드의 NGS 라이브러리 제조에 사용했다. NEBNext (NEB) 를 사용하여, 최종 625 nM 의 정방향 프라이머 및 625 nM 의 역방향 프라이머의 믹스를 사용하여 98℃ 에서 3분 초기 변성, 98℃ 에서 10s 사이클 변성, 63℃ 에서 10s 어닐링, 72℃ 에서 20s 연장 및 72℃ 에서 2분 최종 연장의 15사이클 동안 제 1 가닥 cDNA 를 증폭시켰다.
2 마이크로리터의 제 1 라운드 PCR 반응물을 제 2 라운드 PCR 증폭에 사용하여 NGS 시퀀싱을 위한 Illumina-상용성 인덱스 (NEB) 에 부착시켰다. 동일한 NEBNext PCR 프로토콜을 증폭에 사용했다. PCR 생성물은 아가로스 겔-전기영동 (2% Sybr Gold E-Gel Invitrogen System) 으로 분석했고 5 ㎕ 의 각 반응물을 풀링했다. 풀링된 샘플을 겔 추출하고, Qubit DNA 2.0 DNA 높은 민감도 키트로 정량했으며, 4 nM 최종 농도로 정규화했다. 최종 라이브러리는 2 pM 로 희석했고 75-사이클 키트를 사용해 NextSeq 500 Illumina 시스템에서 시퀀싱했다.
모티프 스크린 분석
무작위 모티프 라이브러리 스크린으로부터 바람직한 모티프의 감손을 분석하기 위해서, 6-합체 영역을 서열 데이타로부터 추출했고 각 샘플에 대한 전체 판독 계측치에 대해 정규화시켰다. 그 다음으로, 실험 조건 및 대응 대조군 간에, 위계측치를 조정하여, log 비율을 생성시켰다. Cas13 실험의 경우, 대응 대조군은 표적 RNA 를 첨가하지 았았고, Csm6 및 RNase A 실험의 경우에, 대응 대조군은 효소를 갖지 않았다. Log 비율 분포 모양을 사용하여 농축된 모티프에 대한 컷오프를 결정했다. 그 다음으로 농축된 모니프를 사용하여 1-, 2-, 또는 3- 뉴클레오티드 조합의 발생을 확인했다. 모티프 logo 는 Weblogo3(26) 을 사용하여 생성시켰다.
Cas13 단백질 및 crRNA 직접 반복부의 계통수 분석
오솔로그 클러스터링을 연구하기 위해서, Cas13a 및 Cas13b 단백질 서열을 사용하여 Geneious 의 MUSCLE 에서 다중 서열 정렬을 생성시킨 후에 heatmap.2 함수로 유클리드 거리 R 를 사용해 클러스터링했다. 직접 반복부 클러스터링을 연구하기 위해서, Cas13a 및 Cas13b 직접 반복부 서열을 사용해 Geneious 에서 Geneious 알고리즘을 사용하여 다중 서열 정렬을 생성시켰고 그 이후에 heatmap.2 함수로 유클리드 거리 R 를 사용해 클러스터링했다. 디-뉴클레오티드 모티프 선호도를 기반으로 오솔로그의 클러스터링을 조사하기 위해서, heatmap.2 함수로 유클리드 거리 R 를 사용해 절단 활성 매트릭스를 클러스터링했다.
금 나노입자 비색
RNA 올리고는 5' 및 3' 말단에 티올이 있는 IDT 로부터 합성했다 (서열에 관한 표 26). 티올 기를 탈보호시키기 위해서, 20 mM 최종 농도의 올리고는 100 mM DTT 를 함유하는 150 mM 소듐 포스페이트 중에서 2시간 동안 실온에서 환원시켰다. 그 다음으로 올리고는 세파덱스 NAP-5 컬럼 (GE Healthcare) 을 사용하여 700 ㎕ 물의 최종 부피로 정제했다. 앞서 기술된 바와 같이 (2), 10 μM 의 환원된 올리고는 280 ㎕ 내지 600 ㎕ 부피의 2.32 nM 15 ㎚-금 나노입자 (Ted Pella) 에 첨가했고, 올리고 대 나노입자의 비율은 2000:1 이다. 후속하여, 10 ㎕ 의 pH 8.3 인 1 M Tris-HCl 및 90 ㎕ 의 1 M NaCl 을 올리고-나노입자 혼합물에 첨가했고 18시간 동안 실온에서 회전하면서 인큐베이션했다. 18시간 후에, 추가 1 M Tris-HCl (5 ㎕, pH 8.3) 을 5 M NaCl (50 ㎕) 과 첨가했고 이것을 추가 15시간 동안 실온에서 회전하면서 인큐베이션했다. 인큐베이션 이후에, 최종 용액을 25분 동안 22,000g 에서 원심분리했다. 상청액을 따라내고 접합된 나노입자를 50 ㎕ 의 200 mM NaCl 에 재현탁시켰다.
나노입자는 RNase 민감도에 대해서 RNase A 어세이를 사용해 시험했다. 다양한 양의 RNase A (Thermo Fischer) 를 20 ㎕ 의 총 반응 부피로 1x RNase A 완충액 및 6 ㎕ 의 접합된 나노입자에 첨가했다. 520 ㎚ 에서의 흡광도를 플레이트 분광광도계를 사용하여 3시간 동안 5분 마다 모니터링했다.
FAM-비오틴 리포터를 사용한 Cas13 활성의 측류 판독
FAM-RNA-비오틴 리포터의 절단을 기반으로 하는 측류의 경우에, 비-RPA LwaCas13a 반응 또는 SHERLOCK-LwaCas13a 반응은 1시간 동안, 달리 표시하지 않으면, 1 μM 최종 농도의 FAM-RNA-비오틴 리포터를 사용해 수행했다. 인큐베이션 이후에, 20 ㎕ LwaCas13a 반응 상청액을 100 ㎕ 의 HybriDetect 1 어세이 완충액 (Milenia) 에 첨가했고 HybriDetect 1 측류 스트립 (Milenia) 상에 흘려주었다.
REPAIR 구성체의 클로닝, 포유동물 세포 트랜스펙션, RNA 단리 및 REPAIR 용 NGS 라이브러리 제조
APC 돌연변이의 복귀 자극용 구성체 및 REPAIR 용 가이드 구성체는 이전에 (23) 기술된 대로 클로닝했다. 간략하게, APC:c.1262G>A 돌연변이를 중심으로 96 nt 서열을 설계했고 발현 벡터 하에 골든 게이트 클로닝했으며, 해당 가이드 서열은 PspCas13b 가이드용 U6 발현 벡터에 골든 게이트 클로닝했다. 환자 샘플을 모의하기 위해서, Lipofectamine 2000 (Invitrogen) 을 사용해 300 ng 의 돌연변이체 또는 야생형 APC 발현 벡터로 HEK293FT 세포를 트랜스펙션시켰고, 트랜스펙션 후 2 일에 Qiamp DNA Blood Midi 키트 (Qiagen) 를 제조사의 설명서에 따라 사용해 DNA 를 수확했다. 20 ng 의 DNA 를 SHERLOCK-LwaCas13a 반응에 투입으로서 사용했다.
REPAIR 시스템을 사용한 RNA 교정은 이전에 (23) 기술된 대로 수행했다: 150 ng 의 dPspCas13b-ADAR(DD)E488Q, 200 ng 의 가이드 벡터, 및 30 ng 의 APC 발현 벡터를 동시-트랜스펙션시켰고, RNA 트랜스펙션 후 2 일에 제조사의 설명서에 따라서 RNeasy Plus Mini 키트 (Qiagen) 를 사용해 수확했다. 30 ng 의 RNA 를 SHERLOCK-LwaCas13a 반응에 투입으로서 사용했다. 이 연구에서 REPAIR RNA 편집에 사용된 모든 플라스미드는 표 29 에서 이용가능하다.
RNA 편집 분획은 이전에 기술된 대로 NGS 에 의해 독립적으로 확인했다. RNA 는 서열 특이적 프라이머를 사용하여 qScript Flex 키트 (Quanta Biosciences) 로 역전사시켰다. 제 1 가닥 cDNA 는 NEBNext High Fidelity 2X PCR 마스터믹스 (New England Biosciences) 와 최종 625 nM 의 정방향 프라이머 및 625 nM 의 역방향 프라이머의 믹스를 사용하여 98℃ 에서 3분 초기 변성, 98℃ 에서 10초 사이클 변성, 65℃ 에서 30초 어닐링, 72℃ 에서 30초 연장 및 72℃ 에서 2분 최종 연장의 15 사이클 동안 증폭시켰다. 2 마이크로리터의 제 1 라운드 PCR 반응물을 제 2 라운드 PCR 증폭에 사용하여, 18사이클로 동일 프로토콜을 사용해, NEBNext 와, NGS 시퀀싱용 Illumina-상용성 인덱스를 부착시켰다. PCR 생성물은 아가로스 겔 전기영동 (2% Sybr Gold E-Gel Invitrogen) 으로 분석했고 5 ㎕ 의 각 반응물을 풀링했다. 풀링된 샘플을 겔 추출했고, Qubit DNA 2.0 DNA 높은 민감도 키트로 정량했으며, 4 nM 최종 농도로 정규화했고, 300 사이클 v2 MiSeq 키트 (Illumina) 를 사용해 판독했다.
SHERLOCK 형광도 데이타의 분석
SHERLOCK 형광 분석은 약간 변형하여 이전에 (3) 기술된 대로 수행했고 하기에 상술한다. 배경치 차감 형광도 데이타를 계산하기 위해서, 샘플의 초기 형광도를 차감하여 상이한 조건간 비교를 가능하게 했다. 배경 조건 (투입 또는 crRNA 가 부재하는 조건) 에 대한 형광도를 샘플에서 차감하여 배경치 차감 형광도를 생성시켰다.
SNP 구별을 위한 crRNA 비율은 다음과 같이 샘플 대 샘플 전체 변동성을 조정하기 위해 계산되었다:
식에서 Ai 및 Bi 는 소정 개체에서, 각각 대립 유전자 A 또는 대립 유전자 B 를 감지하는 crRNA 의 기술적 복제 i 에 대한 SHERLOCK 강도 값을 의미한다. 전형적으로 우리는 crRNA 당 4개의 기술적 복제를 가지므로, m 및 n 은 4 와 동등하고 분모는 소정 SNP 유전자좌 및 개체에 대한 모든 8개의 crRNA SHERLOCK 강도 값의 총합과 동등하다. 2개의 crRNA 가 존재하기 때문에, 개체에 대한 각각의 crRNA 전반에서 crRNA 비율 평균은 항상 총합이 2 일 것이다. 그러므로, 이상적인 동형접합 경우에, 양성 대립 유전자 crRNA 에 대한 평균 crRNA 비율은 2 일 것이고 음성 대립 유전자 crRNA 에 대한 평균 crRNA 비율은 0 일 것이다. 이상적인 이형접합 경우에, 각각의 2개 crRNA 에 대한 평균 crRNA 비율은 1 일 것이다. SHERLOCKv2 에서, 우리는 상이한 색상 채널에서 Ai 및 Bi 를 측정하여 유전자형분석을 수행하기 때문에 480-색상 채널의 강도 값과 일치되도록 530-색상 채널을 6 까지 조정했다.
표적 부재 하에서 Cas13 오솔로그의 무차별적 절단
Cas13 패밀리의 일부 구성원, 예컨대 PinCas13b 및 LbuCas13a 는 표적 존재 또는 부재 하에서 무차별적 절단이 입증되고, 이러한 배경치 활성은 디-뉴클레오티드 리포터 의존적이다 (도 101). 이러한 배경치 활성은 또한 LbuCas13a 의 경우에 스페이서 의존적이었다. 일부 리포터에서, U 및 A 염기 선호도는 단백질 또는 DR 유사성 내에 클러스터링되었다. 흥미롭게도, 여기서 확인된 디-뉴클레오티드 선호도는 직접 반복부 유사성 또는 단백질 유사성으로부터 클러스터링된 Cas13 패밀리와 상응하지 않았다 (도 101).
PsmCas13b 및 CcaCas13b 를 위한 crRNA 설계의 특성분석
PsmCas13b 및 CcaCas13b 에 의한 검출에 최적인 crRNA 를 확인하기 위해서, 우리는 34-12 nt 의 crRNA 스페이서 길이를 시험했고 PsmCas13b 는 30 의 스페이서 길이에서 피크 민감도를 가진데 반해서, CcaCas13b 는 28 nt 의 스페이서 길이 이상에서 동등한 민감도를 가져서, Cas13 활성 평가를 위해 30 nt 스페이서의 사용을 정당화했다. LwaCas13a 와 비교하여 CcaCas13b 및 PsmCas13b 의 표적화의 강건성을 더욱 조사하기 위해서, 우리는 ssRNA 1 에 걸쳐 고르게 간격을 둔 11종의 상이한 crRNA 를 설계했고 LwaCas13a 부수적 활성은 crRNA 설계에 대해 강건했고, 그에 반해 CcaCas13b 및 PsmCas13b 둘 모두는 상이한 crRNA 에 걸쳐 활성에서 더 많은 가변성을 보였다는 것을 확인했다.
추가의 직교성 모티프에 대한 무작위 라이브러리 모티프 스크리닝Cas13a 및 Cas13b 오솔로그의 절단 선호도의 다양성을 더욱 조사하기 위해서, 우리는 부수적 엔도뉴클레아제 활성에 바람직한 모티프를 특성분석하기 위해 라이브러리-기반 접근법을 개발했다. 우리는 일정한 DNA 핸들이 측접된 축퇴성 6-합체 RNA 리포터를 사용하여서, 미절단된 서열의 증폭 및 판독을 가능하게 했다. 이 라이브러리와 Cas13 효소의 인큐베이션 결과 표적 RNA 의 첨가에 의존적인 검출가능한 절단 패턴이 야기되었고 (도 S12B), 이들 반응으로부터 감소된 모티프의 시퀀싱은 절단에 바람직한 모티프의 개체군을 의미하는 분해 시간 동안 라이브러리의 비대칭의 증가를 밝혀주었다. 고도로 감소된 모티프로부터의 서열 logo 및 쌍별 염기 선호도는 LwaCas13a 및 CcaCas13b 에 대해 관찰된 U-선호도 및 PsmCas13b 의 A-선호도를 재현했다. 우리는 연구 결과들을 검증하기 위해 스크린으로부터 결정된 상위 모티프로부터 리포터를 합성했고, LwaCas13a, CcaCas13a, 및 PsmCas13b 가 모도 그들의 가장 고도로 바람직한 모티프를 절단했다는 것을 확인했다. 우리는 또한 다른 것이 아닌, 오직 하나의 오솔로그에 대해 절단일 보인 다수 서열을 확인했고, 이것은 디-뉴클레오티드 모티프로부터 대안적인 직교적 판독을 가능하게 할 수 있었다. 상이한 표적과 인큐베이션된 LwaCas13a 는 유사한 절단 모티프 선호도를 생성시켜서, 부수적 활성의 염기 선호도가 표적 서열과 무관하게 일관적이라는 것을 의미했다.
LwaCas13a 절단 시 활성제 생성물의 검증
질량 분광법을 사용하여, 우리는 LwaCas13a 분해가 Csm6 활성화에 대해 예상되는 사이클릭-포스페이트 종결된 생성물을 생성시켰다는 것을 검증했다. 활성화는 폴리-U 에 의한 5' 보호 및 내부 폴리-U 트랙을 포함하는 다른 활성화 설계가 표적 RNA 의 존재 하에서 독점적으로 Csm6 을 활성화시키는데 덜 효과적이었으므로 (아마도 LwaCas13a 가 UA 모티프에 대해 적은 활성을 가지고 5' 보호가 Csm6 의 활성화를 방지하는데 비효과적이기 때문에), 폴리 U 에 의한 3' 보호된 설계의 경우에 가장 효과적이었다.
RPA 및 Csm6 반응의 조합을 위한 최적화
Csm6-증강과 RPA 사전-증폭의 조합이 신호 및 민감도를 증가시키게 되므로, 우리는 RPA 와의 조합에 필요한 시험관내 전사 성분의 존재 하에서 활성에 대해 Csm6 을 시험했다. 우리는 마그네슘 및 유리 rNTP 둘 모두가 사이클릭 포스페이트 활성제의 존재 하에서 Csm6 의 뉴클레아제 활성을 감소시켰다는 것을 확인했다 (도 S33A). 용액 중 rNTP 의 양 감소는 전사되는 RNA 의 양을 감소시켰고, 그러므로 증가된 리포터 또는 활성제 농도가 존재하더라도, Cas13a 에 의한 Csm6 활성화에 음성적 효과를 가졌다.
표 22. 이 연구에서 정제된 Cas13 및 Csm6 단백질.
표 23. 이 연구에서 사용된 crRNA (SEQ ID NO:453-827).
표 24. 이 연구에서 사용된 RNA 및 DNA 표적 (SEQ ID NO:828-840).
표 25. 이 연구에서 사용된 RPA 프라이머 (SEQ ID NO:841-870).
표 26. 이 연구에서 사용된 절단 리포터 (SEQ ID NO:871-877).
표 27. 이 연구에서 사용된 Csm6 활성화제.
표 28. 이 연구에서 사용된 cfDNA 샘플의 대립유전자 분획
표 29. 이 연구에서 사용된 REPAIR 플라스미드
표 30. SHERLOCKv1 및 SHERLOCKv2 의 비교
본 실시예에 대한 참고문헌
실시예 7 - 멀티플렉스 측류
2-플렉스 측류에 대한 개념
이 개념에는 두 가지 프로브가 포함된다: FAM-T*A*rArUG*C*-Biotin (LwaCas13a 절단) 및 FAM-T*A*rUrAG*C*-DIG (CcaCas13b10 절단). 이 프로브는 듀얼 플렉스 측류 스트립 상의 항-DIG 라인과 스트렙타비딘 라인에 결합될 것이다. 하나는 형광을 스캔하고, 부수적 활성에 상응하는 라인 강도의 감소를 검출하여 표적 서열의 존재를 표적화할 수 있다. 다른 모티프 또는 프로브 (PsmCas13b의 경우 폴리 A 및 Cas12 감지의 경우 DNA 센서)도 사용할 수 있다.
뎅기 RNA 및 ssRNA1에 대한 2-플렉스 측류 어세이
본 어세이에서, 2 종의 프로브를 이용했다:
· FAM-T*A*rArUG*C*-Biotin (LwaCas13a 절단) - ssRNA 1 감지
· FAM-T*A*rUrAG*C*-DIG (CcaCas13b10 절단) - 뎅기 RNA 감지
결과를 도 103A 및 103B 에 나타낸다.
4-플렉스 측류 어세이
출원인은 4 개의 라인과 4 개의 표적을 동시에 검출할 수 있는 측류 스트립을 설계하고 합성했다.
사용된 프로브는 다음과 같았다:
· /5TYE665/T*A*rArUG*C*/3AlexF488N/ - LwaCas13a
· /5TYE665/T*A*rUrAG*C*/36-FAM/ - CcaCas13b
· /5TYE665/rArArArArA/3Bio/ - PsmCas13b
· /5TYE665/AAAAA/3Dig_N/ - AsCas12a
스트립에는 최대 4 개의 표적을 탐지할 수 있는 항-Alexa-fluor-488, 항-FAM, 스트렙타비딘 및 항-Dig 라인이 포함된다. Tye665 염료가 감지되고 라인 형광 강도가 감소하면 표적 존재를 나타낼 것이다.
추가 실시형태는 다음의 번호가 매겨진 단락에 개시된다:
1. 제 1 말단부를 포함하는 기판을 포함하는 측류 장치로서, 여기서 제 1 말단부는 샘플 로딩 부분 및 검출가능한 리간드, CRISPR 이펙터 시스템, 검출 구성체, 제 1 결합제를 포함하는 제 1 포획 영역, 및 제 2 결합제를 포함하는 제 2 포획 영역이 로딩된 제 1 영역을 포함하고, 여기서 CRISPR 이펙터 시스템은 CRISPR 이펙터 단백질 및 하나 이상의 가이드 서열을 포함하며, 각각의 가이드 서열은 하나 이상의 표적 분자에 결합하도록 구성되는, 측류 장치.
2. 제 1 단락에 있어서, 검출 구성체가 제 1 말단부에 제 1 분자 및 제 2 말단부에 제 2 분자를 갖는, RNA 또는 DNA 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 측류 장치.
3. 제 1 또는 제 2 단락에 있어서, 샘플 로딩 부분이 하나 이상의 표적 분자를 증폭시키기 위한 하나 이상의 증폭 시약을 추가로 포함하는, 측류 장치.
4. 제 3 단락에 있어서, 하나 이상의 표적 RNA 분자를 증폭시키기 위한 시약이 핵산 서열-기반 증폭 (NASBA), 리콤비나아제 폴리머라아제 증폭 (RPA), 루프-매개 등온 증폭 (LAMP), 가닥 전위 증폭 (SDA), 헬리카제-의존적 증폭 (HDA), 닉킹 효소 증폭 반응 (NEAR), PCR, 다중 전위 증폭 (MDA), 롤링 써클 증폭 (RCA), 리가제 연쇄 반응 (LCR), 또는 세분화 증폭 방법 (RAM)을 포함하는, 측류 장치.
5. 제 2 단락에 있어서, 제 1 분자가 FITC이고 제 2 분자가 비오틴이거나 그 반대인, 측류 장치.
6. 제 5 단락에 있어서, 제 1 포획 영역이 샘플 로딩 부분과 측류 기판의 동일한 말단부에 근접하고 그 위에 있는, 측류 장치.
7. 제 5 또는 제 6 단락에 있어서, 제 1 포획 영역이 리포터 구성체의 제 1 분자에 특이적으로 결합하는 제 1 결합제를 포함하는, 측류 장치.
8. 제 7 단락에 있어서, 제 1 결합제가 제 1 포획 영역에 고정되거나 다르게는 부동화된 항체인, 측류 장치.
9. 제 1 내지 제 8 단락 중 어느 하나에 있어서, 제 2 포획 영역이 제 1 결합 영역으로부터 측류 기판의 반대 말단부를 향해 위치하는, 측류 장치.
10. 제 9 단락에 있어서, 제 2 포획 영역이 리포터 구성체, 또는 검출가능한 리간드의 제 2 분자에 특이적으로 결합하는 제 2 결합제를 포함하는, 측류 장치.
11. 제 10 단락에 있어서, 제 2 결합제가 제 2 포획 영역에 고정되거나 다르게는 부동화된 항체 또는 항체-결합 단백질인, 측류 장치.
12. 제 1 내지 제 11 단락 중 어느 하나에 있어서, 검출가능한 리간드가 금 나노입자인, 측류 장치.
13. 제 12 단락에 있어서, 금 나노입자가 검출 구성체의 제 2 분자에 특이적으로 결합하는 결합제로 변형되는, 측류 장치.
14. 제 13 단락에 있어서, 제 1 항체가 항-FITC 항체인, 측류 장치.
15. 제 8 단락에 있어서, 항체가 항-FITC 항체인, 측류 장치.
16. 제 8 단락에 있어서, 항체가 항-비오틴 항체인, 측류 장치.
17. 제 1 내지 제 16 단락 중 어느 하나에 있어서, 기판이 가요성 재료 기판인, 측류 장치.
18. 제 1 내지 제 17 단락 중 어느 하나에 있어서, 가요성 재료 기판이 종이 기판 또는 가요성 중합체 기반 기판인, 측류 장치.
19. 제 18 단락에 있어서, CRISPR 이펙터 단백질이 RNA-표적화 이펙터 단백질, DNA-표적화 단백질 또는 이의 조합인, 측류 장치.
20. 제 19 단락에 있어서, RNA-표적화 이펙터 단백질이 Cas13 인, 측류 장치.
21. 제 20 단락에 있어서, Cas13 이펙터 단백질이 하기로 이루어지는 군에서 선택된 속의 유기체로부터 유래되는, 측류 장치: 렙토트리키아 (Leptotrichia), 리스테리아 (Listeria), 코리네박터 (Corynebacter), 수테렐라 (Sutterella), 레지오넬라 (Legionella), 트레포네마 (Treponema), 필리팍토르 (Filifactor), 유박테리움 (Eubacterium), 스트렙토코커스 (Streptococcus), 락토바실러스 (Lactobacillus), 마이코플라스마 (Mycoplasma), 박테로이데스 (Bacteroides), 플라비이볼라 (Flaviivola), 플라보박테리움 (Flavobacterium), 스파에로차에타 (Sphaerochaeta), 아조스피릴럼 (Azospirillum), 글루콘아세토박터 (Gluconacetobacter), 네이세리아 (Neisseria), 로세부리아 (Roseburia), 파르비바큘럼 (Parvibaculum), 스타필로코커스 (Staphylococcus), 니트라티프락토 (Nitratifractor), 마이코플라스마 (Mycoplasma), 캄필로박터 (Campylobacter), 및 라크노스피라 (Lachnospira).
22. 제 21 단락에 있어서, Cas13 이펙터 단백질이 하기로 이루어지는 군에서 선택된 유기체로부터 유래되는, 측류 장치: 렙토트리키아 샤히; 렙토트리키아 웨이데이 (Lw2); 리스테리아 실리게리; 라크노스피라과 박테리아 MA2020; 라크노스피라과 박테리아 NK4A179; [클로스트리듐] 아미노필럼 DSM 10710; 카르노박테리움 갈리나럼 DSM 4847; 카르노박테리움 갈리나럼 DSM 4847 (제 2 CRISPR 유전자좌); 팔루디박터 프로피오니시게네스 WB4; 리스테리아 웨이헨스테파넨시스 FSL R9-0317; 리스테리아과 박테리아 FSL M6-0635; 렙토트리키아 웨이데이 F0279; 로도박터 캡슐라터스 SB 1003; 로도박터 캡슐라터스 R121; 로도박터 캡슐라터스 DE442; 렙토트리키아 부칼리스 C-1013-b; 허르비닉스 헤미셀룰로실리티카; [유박테리움] 렉탈레; 유박테리아과 박테리아 CHKCI004; 블라우티아 sp. 마르세이유-P2398; 및 렙토트리키아 sp. 경구 분류군 879 str. F0557. 12 개의 추가의 비제한적인 예는 다음과 같다: 라크노스피라과 박테리아 NK4A144; 클로로플렉서스 아그레간스; 데메퀴나 아우란티아카; 탈라소스피라 sp. TSL5-1; 슈도부티리비브리오 sp. OR37; 부티리비브리오 sp. YAB3001; 블라우티아 sp. 마르세이유-P2398; 렙토트리키아 sp. 마르세이유-P3007; 박테로이데스 이후아에; 포르피로모나다과 박테리아 KH3CP3RA; 리스테리아 리파리아; 및 인솔리티스피릴럼 페레그리넘.
23. 제 22 단락에 있어서, C2c2 이펙터 단백질이 L. 웨이데이 (L. wadei) F0279 또는 L. 웨이데이 F0279 (Lw2) C2c2 이펙터 단백질인, 측류 장치.
24. 제 19 단락에 있어서, DNA-표적화 이펙터 단백질이 Cas12 인, 측류 장치.
25. 제 24 단락에 있어서, Ca12 가 Cpf1, C2c1, 또는 이의 조합인, 측류 장치.
26. 제 1 내지 제 25 단락 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 가이드 서열이 질환 상태를 진단하기 위한 것인, 측류 장치.
27. 제 26 단락에 있어서, 질환 상태가 암인, 측류 장치.
28. 제 26 단락에 있어서, 질환 상태가 자가면역 질환인, 측류 장치.
29. 제 26 단락에 있어서, 질환 상태가 감염인, 측류 장치.
30. 제 29 단락에 있어서, 감염이 바이러스, 박테리아, 진균, 원충, 또는 기생충에 의해 초래되는, 측류 장치.
31. 제 30 단락에 있어서, 감염이 바이러스 감염인, 측류 장치.
32. 제 31 단락에 있어서, 바이러스 감염이 DNA 바이러스에 의해 초래되는, 측류 장치.
33. 제 32 단락에 있어서, DNA 바이러스가 미오바이러스과 (Myoviridae), 포도바이러스과 (Podoviridae), 시포바이러스과 (Siphoviridae), 알로헤르페스바이러스과 (Alloherpesviridae), 헤르페스바이러스과 (Herpesviridae) (인간 헤르페스 바이러스, 및 바리셀라 조스터 바이러스 포함), 말로코헤르페스바이러스과 (Malocoherpesviridae), 리포트릭스바이러스과 (Lipothrixviridae), 루디바이러스과 (Rudiviridae), 아데노바이러스과 (Adenoviridae), 암풀라바이러스과 (Ampullaviridae), 아스코바이러스과 (Ascoviridae), 아스파바이러스과 (Asfarviridae) (아프리카 돼지 열병 바이러스 포함), 배큘로바이러스과 (Baculoviridae), 시카우다바이러스과 (Cicaudaviridae), 클라바바이러스과 (Clavaviridae), 코르티코바이러스과 (Corticoviridae), 푸셀로바이러스과 (Fuselloviridae), 글로불로바이러스과 (Globuloviridae), 구타바이러스과 (Guttaviridae), 히트로사바이러스과 (Hytrosaviridae), 이리도바이러스과 (Iridoviridae), 마세이유바이러스과 (Maseilleviridae), 미미바이러스과 (Mimiviridae), 누디바이러스과 (Nudiviridae), 니마바이러스과 (Nimaviridae), 판도라바이러스과 (Pandoraviridae), 파필로마바이러스과 (Papillomaviridae), 피코드나바이러스과 (Phycodnaviridae), 플라스마바이러스과, 폴리드나바이러스, 폴리오마바이러스과 (Polyomaviridae) (원숭이 바이러스 40, JC 바이러스, BK 바이러스 포함), 폭스바이러스과 (Poxviridae) (우두 및 천연두 포함), 스파에롤리포바이러스과 (Sphaerolipoviridae), 텍티바이러스과 (Tectiviridae), 투리바이러스과 (Turriviridae), 디노드나바이러스, 살터프로바이러스, 리지도바이러스인, 측류 장치.
34. 제 31 단락에 있어서, 바이러스 감염이 이중-가닥 RNA 바이러스, 포지티브 센스 RNA 바이러스, 네거티브 센스 RNA 바이러스, 레트로바이러스, 또는 이의 조합에 의해 초래되는, 측류 장치.
35. 제 34 단락에 있어서, 바이러스 감염이 코로나바이러스과 (Coronaviridae) 바이러스, 피코르나바이러스과 (Picornaviridae) 바이러스, 칼리시바이러스과 (Caliciviridae) 바이러스, 플라비바이러스과 (Flaviviridae) 바이러스, 토가바이러스과 (Togaviridae) 바이러스, 보르나바이러스과 (Bornaviridae), 필로바이러스과 (Filoviridae), 파라믹소바이러스과 (Paramyxoviridae), 뉴모바이러스과 (Pneumoviridae), 라브도바이러스과 (Rhabdoviridae), 아레나바이러스과 (Arenaviridae,), 부니아바이러스과 (Bunyaviridae), 오르쏘믹소바이러스과 (Orthomyxoviridae), 또는 델타바이러스에 의해 초래되는, 측류 장치.
36. 제 35 단락에 있어서, 바이러스 감염이 코로나바이러스, SARS, 폴리오바이러스, 리노바이러스, A형 간염 바이러스, 노르워크 바이러스, 황열병 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, C형 간염 바이러스, 뎅기열 바이러스, 지카 바이러스, 루벨라 바이러스, 로스 리버 바이러스, 신드비스 바이러스, 치쿤구니아 바이러스, 보르나병 바이러스, 에볼라 바이러스, 마르부르그 바이러스, 홍역 바이러스, 유행성 이하선염 바이러스, 니파바이러스, 헨드라 바이러스, 뉴캐슬병 바이러스, 인간 호흡기 세포융합 바이러스, 공수병 바이러스, 라싸 바이러스, 한타바이러스, 크림-콩고 출혈열 바이러스, 인플루엔자, 또는 D형 간염 바이러스에 의해 초래되는, 측류 장치.
37. 제 30 단락에 있어서, 감염이 박테리아 감염인, 측류 장치.
38. 제 37 단락에 있어서, 박테리아 감염을 초래하는 박테리아가 아시네토박터 (Acinetobacter) 종, 악티노바실러스 (Actinobacillus) 종, 악티노마이세테스 (Actinomycetes) 종, 악티노마이세스 (Actinomyces) 종, 애로코커스 (Aerococcus) 종, 애로모나스 (Aeromonas) 종, 아나플라스마 (Anaplasma) 종, 알칼리게네스 (Alcaligenes) 종, 바실러스 (Bacillus) 종, 박테리오데스 (Bacteriodes) 종, 바르토넬라 (Bartonella) 종, 비피도박테리움 (Bifidobacterium) 종, 보르데텔라 (Bordetella) 종, 보렐리아 (Borrelia) 종, 브루셀라 (Brucella) 종, 버크홀데리아 (Burkholderia) 종, 캄필로박터 (Campylobacter) 종, 카프노사이토파가 (Capnocytophaga) 종, 클라미디아 (Chlamydia) 종, 시트로박터 (Citrobacter) 종, 콕시엘라 (Coxiella) 종, 코린박테리움 (Corynbacterium) 종, 클로스트리듐 (Clostridium) 종, 에이케넬라 (Eikenella) 종, 엔테로박터 (Enterobacter) 종, 에스케리치아 (Escherichia) 종, 엔테로코커스 (Enterococcus) 종, 엘리키아 (Ehlichia) 종, 에피더모피톤 (Epidermophyton) 종, 에리시펠로트릭스 (Erysipelothrix) 종, 유박테리움 (Eubacterium) 종, 프란시셀라 (Francisella) 종, 푸소박테리움 (Fusobacterium) 종, 가드네렐라 (Gardnerella) 종, 제멜라 (Gemella) 종, 헤모필러스 (Haemophilus) 종, 헬리코박터 (Helicobacter) 종, 킨겔라 (Kingella) 종, 클렙시엘라 (Klebsiella) 종, 락토바실러스 (Lactobacillus) 종, 락토코커스 (Lactococcus) 종, 리스테리아 (Listeria) 종, 렙토스피라 (Leptospira) 종, 레지오넬라 (Legionella) 종, 렙토스피라 (Leptospira) 종, 류코노스토크 (Leuconostoc) 종, 만헤이미아 (Mannheimia) 종, 마이코스포럼 (Microsporum) 종, 마이크로코커스 (Micrococcus) 종, 모라셀라 (Moraxella) 종, 모르가넬 (Morganell) 종, 모빌룬커스 (Mobiluncus) 종, 마이크로코커스 (Micrococcus) 종, 마이코박테리움 (Mycobacterium) 종, 마이코플라즘 (Mycoplasm) 종, 노카르디아 (Nocardia) 종, 네이세리아 (Neisseria) 종, 파스퇴렐라 (Pasteurelaa) 종, 페디오코커스 (Pediococcus) 종, 펩토스트렙토코커스 (Peptostreptococcus) 종, 피티로스포럼 (Pityrosporum) 종, 플레시오모나스 (Plesiomonas) 종, 프레보텔라 (Prevotella) 종, 포르피로모나스 (Porphyromonas) 종, 프로테우스 (Proteus) 종, 프로비덴시아 (Providencia) 종, 슈도모나스 (Pseudomonas) 종, 프로피오니박테리움 (Propionibacteriums) 종, 로도코커스 (Rhodococcus) 종, 리케치아 (Rickettsia) 종, 로도코커스 (Rhodococcus) 종, 세라티아 (Serratia) 종, 스테노트로포모나스 (Stenotrophomonas) 종, 살모넬라 (Salmonella) 종, 세라티아 (Serratia) 종, 시겔라 (Shigella) 종, 스타필로코커스 (Staphylococcus) 종, 스트렙토코커스 (Streptococcus) 종, 스피릴럼 (Spirillum) 종, 스트렙토바실러스 (Streptobacillus) 종, 트레포네마 (Treponema) 종, 트로페리마 (Tropheryma) 종, 트리코피톤 (Trichophyton) 종, 우레아플라즈마 (Ureaplasma) 종, 베일로넬라 (Veillonella) 종, 비브리오 (Vibrio) 종, 여시니아 (Yersinia) 종, 잔토모나스 (Xanthomonas) 종, 또는 이의 조합인, 측류 장치.
39. 제 30 단락에 있어서, 감염이 진균에 의해 초래되는, 측류 장치.
40. 제 39 단락에 있어서, 진균이 아스퍼질러스 (Aspergillus), 블라스토마이세스 (Blastomyces), 칸디다증 (Candidiasis), 콕시디오이데스 진균증 (Coccidiodomycosis), 크립토코커스 네오포르만스 (Cryptococcus neoformans), 크립토코커스 가티 (Cryptococcus gatti), sp. 히스토플라즈마 (Histoplasma) sp. (예컨대, 히스토플라즈마 캅슐라텀 (Histoplasma capsulatum)), 뉴모시스티스 (Pneumocystis) sp. (예컨대 뉴모시스티스 지로베시 (Pneumocystis jirovecii)), 스타키보트리스 (Stachybotrys) (예컨대 스타키보트리스 카르타럼 (Stachybotrys chartarum)), 모균증 (Mucroymcosis), 스포로트릭스 (Sporothrix), 진균성 안구 감염 백선, 엑세로힐럼 (Exserohilum), 클라도스포리움 (Cladosporium), 제오트리컴 (Geotrichum), 사카로마이세스 (Saccharomyces), 한세눌라 (Hansenula) 종, 칸디다 (Candida) 종, 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces) 종, 데바리오마이세스 (Debaryomyces) 종, 피키아 (Pichia) 종, 페니실리움 (Penicillium) 종, 클라도스포리움 (Cladosporium) 종, 비쏘클라미스 (Byssochlamys) 종 또는 이의 조합인, 측류 장치.
41. 제 30 단락에 있어서, 감염이 원충에 의해 초래되는, 측류 장치.
42. 제 41 단락에 있어서, 원충이 유글레노조아 (Euglenozoa), 헤테롤로보세아 (Heterolobosea), 디플로모나디다 (Diplomonadida), 아메보조아 (Amoebozoa), 블라스토시스틱 (Blastocystic), 아피콤플렉사 (Apicomplexa), 또는 이의 조합인, 측류 장치.
43. 제 30 단락에 있어서, 감염이 기생충에 의해 초래되는, 측류 장치.
44. 제 43 단락에 있어서, 기생충이 트리파노소마 크루지 (Trypanosoma cruzi) (샤가스병), T. 브루세이 감비엔스 (T. brucei gambiense), T. 브루세이 로데시엔스 (T. brucei rhodesiense), 리슈마니아 브라질리엔시스 (Leishmania braziliensis), L. 인판텀 (L. infantum), L. 멕시카나 (L. mexicana), L. 마조르 (L. major), L. 트로피카 (L. tropica), L. 도노바니 (L. donovani), 내글레리아 파울러리 (Naegleria fowleri), 지아르디아 인테스티날리스 (Giardia intestinalis) (G. 람블리아 (G. lamblia), G. 두오데날리스 (G. duodenalis)), 칸타메바 카스텔라니 (Canthamoeba castellanii), 발라무티아 마드릴라리스 (Balamuthia madrillaris), 엔타메바 히스톨리티카 (Entamoeba histolytica), 블라스토시스틱 호미니스 (Blastocystic hominis), 바베시아 미크로티 (Babesia microti), 클립토스포리듐 파르븀 (Cryptosporidium parvum), 시클로스포라 카이에타넨시스 (Cyclospora cayetanensis), 플라스모듐 팔시파럼 (Plasmodium falciparum), P. 비박스 (P. vivax), P. 오발레 (P. ovale), P. 말라리아에 (P. malariae), 및 톡소플라즈마 곤디 (Toxoplasma gondii) 또는 이의 조합인, 측류 장치.
45. 제 1 내지 제 44 단락 중 어느 하나에 있어서, 샘플이 생물학적 샘플 또는 환경 샘플인, 측류 장치.
46. 제 45 단락에 있어서, 생물학적 샘플이 혈액, 혈장, 혈청, 소변, 대변, 객담, 점액, 림프액, 활액, 담즙, 복수, 흉수, 장액종, 타액, 뇌척수액, 안방수 또는 유리체액, 또는 임의의 신체 분비액, 여출액, 삼출액 (예를 들어, 농양 또는 임의의 다른 감염 또는 염증 부위로부터 얻은 체액), 또는 관절 (예를 들어, 정상 관절, 또는 류마티스성 관절염, 골관절염, 통풍성 또는 화농성 관절염과 같은 질환을 앓는 관절)로부터 얻은 체액, 또는 피부 또는 점막 표면의 스왑 (swab) 인, 측류 장치.
47. 제 45 단락에 있어서, 환경 샘플이 음식물 샘플, 종이 표면, 패브릭, 금속 표면, 목재 표면, 플라스틱 표면, 토양 샘플, 담수 샘플, 폐수 샘플, 염수 샘플, 또는 이의 조합으로부터 수득되는, 측류 장치.
48. 제 31 단락에 있어서, 질환 상태가 감염, 장기 질환, 혈액 질환, 면역계 질환, 암, 뇌 및 신경계 질환, 내분비 질환, 임신 또는 출산 관련 질환, 유전 질환, 또는 환경적-획득 질환인, 측류 장치.
49. 제 26 단락에 있어서, 상기 질환 상태가 바람직하게는 병원체 또는 세포 중에, 항생제 또는 약제 내성 또는 감수성 유전자 또는 전사물 또는 폴리펩티드의 존재 또는 부재를 특징으로 하는, 측류 장치.
50. 제 49 단락에 있어서, 하나 이상의 가이드 분자가 생물학적 재료를 확인하는, 측류 장치.
51. 제 50 단락에 있어서, 생물학적 재료가 유전적으로 개질된 재료인, 측류 장치.
52. 제 51 단락에 있어서, 유전적으로 개질된 재료가 유전적으로 개질된 식물인, 측류 장치.
53. 제 2 단락에 있어서, 제 1 분자가 FITC 이고 제 2 분자가 FAM 인, 측류 장치.
54. 제 35 단락에 있어서, 바이러스 감염이 뎅기열 바이러스에 의해 초래되는, 측류 장치.
55. 제 1 말단부를 포함하는 기판을 포함하는 측류 장치로서, 여기서 제 1 말단부는 샘플 로딩 부분 및 검출가능한 리간드, 2 개 이상의 CRISPR 이펙터 시스템, 2 개 이상의 검출 구성체, 각각 제 1 결합제를 포함하는 하나 이상의 제 1 포획 영역, 각각 제 2 결합제를 포함하는 2 개 이상의 제 2 포획 영역이 로딩된 제 1 영역을 포함하고, 여기서 2 개 이상의 CRISPR 이펙터 시스템 각각은 CRISPR 이펙터 단백질 및 하나 이상의 가이드 서열을 포함하며, 각각의 가이드 서열은 하나 이상의 표적 분자에 결합하도록 구성되는, 측류 장치.
56. 제 55 단락에 있어서, 2 개 이상의 검출 구성체 각각은 제 1 말단부에 제 1 분자 및 제 2 말단부에 제 2 분자를 갖는, RNA 또는 DNA 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 측류 장치.
57. 제 56 단락에 있어서, 2 개의 CRISPR 이펙터 시스템 및 2 개의 검출 구성체를 포함하는, 측류 장치.
58. 제 56 단락에 있어서, 4 개의 CRISPR 이펙터 시스템 및 4 개의 검출 구성체를 포함하는, 측류 장치.
59. 제 55 내지 제 58 단락 중 어느 하나에 있어서, 샘플 로딩 부분이 하나 이상의 표적 분자를 증폭시키기 위한 하나 이상의 증폭 시약을 추가로 포함하는, 측류 장치.
60. 제 57 단락에 있어서, 제 1 검출 구성체는 제 1 분자로서 FAM 및 제 2 분자로서 비오틴을, 또는 그 반대를 포함하고, 제 2 검출 구성체는 제 1 분자로서 FAM 및 제 2 분자로서 디곡시제닌 (DIG), 또는 그 반대를 포함하는, 측류 장치.
61. 제 60 단락에 있어서, CRISPR 이펙터 단백질이 RNA-표적화 이펙터 단백질인, 측류 장치.
62. 제 61 단락에 있어서, RNA-표적화 이펙터 단백질이 C2c2 인, 측류 장치.
63. 제 19 단락에 있어서, RNA-표적화 이펙터 단백질이 Cas13b 인, 측류 장치.
64. 제 58 단락에 있어서, 제 1 검출 구성체는 제 1 분자로서 Tye665 및 제 2 분자로서 Alexa-fluor-488 을, 또는 그 반대를 포함하고; 제 2 검출 구성체는 제 1 분자로서 Tye665 및 제 2 분자로서 FAM 을, 또는 그 반대를 포함하고; 제 3 검출 구성체는 제 1 분자로서 Tye665 및 제 2 분자로서 비오틴을, 또는 그 반대를 포함하고; 제 4 검출 구성체는 제 1 분자로서 Tye665 및 제 2 분자로서 DIG 를, 또는 그 반대를 포함하는, 측류 장치.
65. 제 64 단락에 있어서, CRISPR 이펙터 단백질이 RNA-표적화 또는 DNA-표적화 이펙터 단백질인, 측류 장치.
66. 제 65 단락에 있어서, RNA 표적화 이펙터가 C2c2 인, 측류 장치.
67. 제 65 단락에 있어서, RNA 표적화 이펙터가 Cas13b 인, 측류 장치.
68. 제 65 단락에 있어서, DNA-표적화 이펙터 단백질이 Cas12a 인, 측류 장치.
69. 샘플을 샘플 로딩 부분을 포함하는 제 1 내지 제 68 단락 중 어느 한 항에 따른 측류 장치의 제 1 말단부와 접촉시키는 단계를 포함하는, 샘플에서 표적 핵산을 검출하는 방법으로서; 샘플은 기판의 샘플 로딩 부분으로부터 제 1 및 제 2 포획 영역을 향해 흐르고 검출가능한 신호를 생성하는, 검출 방법.
70. 제 54 단락에 있어서, 샘플이 액체 샘플이거나, 샘플이 수성 용매에 용해된, 검출 방법.
71. 제 54 또는 55 단락에 있어서, 샘플이 표적 핵산을 함유하지 않는, 검출 방법.
72. 제 56 단락에 있어서, 검출가능한 신호가 제 1 포획 영역에서 나타나는, 검출 방법.
73. 제 54 또는 55 단락에 있어서, 샘플이 표적 핵산을 함유하는, 검출 방법.
74. 제 58 단락에 있어서, 검출가능한 신호가 제 2 포획 영역에서 나타나는, 검출 방법.
75. 제 58 또는 제 59 단락에 있어서, 표적 핵산의 존재가 질환 상태의 지표인, 검출 방법.
***
본 발명의 기술된 방법, 약학 조성물 및 키트의 다양한 변형 및 이형은 본 발명의 범주 및 사조를 벗어나지 않고 당업자에게 분명해질 것이다. 본 발명이 특별한 실시형태와 함께 기술되어 있지만, 더욱 변형될 수 있고 청구되는 본 발명이 이러한 특별한 실시형태에 과도하게 제한되어서는 안된다는 것을 이해하게 될 것이다. 실제로, 당업자에게 자명한 본 발명을 수행하기 위해 기술된 방식의 다양한 변형은 본 발명의 범주 내에 포함하고자 한다. 본 출원은 일반적으로 본 발명의 원리에 따른 본 발명의 임의의 이형, 용도, 또는 개조를 포괄하고자 하고 본 개시내용으로부터의 이러한 이탈의 포함은 본 발명이 속하는 분야 내에서 공지의 통상적인 관례 내이고 이전에 기재된 본 명세서의 본질적인 특성에 적용될 수 있다.
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<212> PRT
<213> L. shahii
<400> 1
Met Gly Asn Leu Phe Gly His Lys Arg Trp Tyr Glu Val Arg Asp Lys
1 5 10 15
Lys Asp Phe Lys Ile Lys Arg Lys Val Lys Val Lys Arg Asn Tyr Asp
20 25 30
Gly Asn Lys Tyr Ile Leu Asn Ile Asn Glu Asn Asn Asn Lys Glu Lys
35 40 45
Ile Asp Asn Asn Lys Phe Ile Arg Lys Tyr Ile Asn Tyr Lys Lys Asn
50 55 60
Asp Asn Ile Leu Lys Glu Phe Thr Arg Lys Phe His Ala Gly Asn Ile
65 70 75 80
Leu Phe Lys Leu Lys Gly Lys Glu Gly Ile Ile Arg Ile Glu Asn Asn
85 90 95
Asp Asp Phe Leu Glu Thr Glu Glu Val Val Leu Tyr Ile Glu Ala Tyr
100 105 110
Gly Lys Ser Glu Lys Leu Lys Ala Leu Gly Ile Thr Lys Lys Lys Ile
115 120 125
Ile Asp Glu Ala Ile Arg Gln Gly Ile Thr Lys Asp Asp Lys Lys Ile
130 135 140
Glu Ile Lys Arg Gln Glu Asn Glu Glu Glu Ile Glu Ile Asp Ile Arg
145 150 155 160
Asp Glu Tyr Thr Asn Lys Thr Leu Asn Asp Cys Ser Ile Ile Leu Arg
165 170 175
Ile Ile Glu Asn Asp Glu Leu Glu Thr Lys Lys Ser Ile Tyr Glu Ile
180 185 190
Phe Lys Asn Ile Asn Met Ser Leu Tyr Lys Ile Ile Glu Lys Ile Ile
195 200 205
Glu Asn Glu Thr Glu Lys Val Phe Glu Asn Arg Tyr Tyr Glu Glu His
210 215 220
Leu Arg Glu Lys Leu Leu Lys Asp Asp Lys Ile Asp Val Ile Leu Thr
225 230 235 240
Asn Phe Met Glu Ile Arg Glu Lys Ile Lys Ser Asn Leu Glu Ile Leu
245 250 255
Gly Phe Val Lys Phe Tyr Leu Asn Val Gly Gly Asp Lys Lys Lys Ser
260 265 270
Lys Asn Lys Lys Met Leu Val Glu Lys Ile Leu Asn Ile Asn Val Asp
275 280 285
Leu Thr Val Glu Asp Ile Ala Asp Phe Val Ile Lys Glu Leu Glu Phe
290 295 300
Trp Asn Ile Thr Lys Arg Ile Glu Lys Val Lys Lys Val Asn Asn Glu
305 310 315 320
Phe Leu Glu Lys Arg Arg Asn Arg Thr Tyr Ile Lys Ser Tyr Val Leu
325 330 335
Leu Asp Lys His Glu Lys Phe Lys Ile Glu Arg Glu Asn Lys Lys Asp
340 345 350
Lys Ile Val Lys Phe Phe Val Glu Asn Ile Lys Asn Asn Ser Ile Lys
355 360 365
Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Ala Glu Phe Lys Ile Asp Glu Leu Ile
370 375 380
Lys Lys Leu Glu Lys Glu Leu Lys Lys Gly Asn Cys Asp Thr Glu Ile
385 390 395 400
Phe Gly Ile Phe Lys Lys His Tyr Lys Val Asn Phe Asp Ser Lys Lys
405 410 415
Phe Ser Lys Lys Ser Asp Glu Glu Lys Glu Leu Tyr Lys Ile Ile Tyr
420 425 430
Arg Tyr Leu Lys Gly Arg Ile Glu Lys Ile Leu Val Asn Glu Gln Lys
435 440 445
Val Arg Leu Lys Lys Met Glu Lys Ile Glu Ile Glu Lys Ile Leu Asn
450 455 460
Glu Ser Ile Leu Ser Glu Lys Ile Leu Lys Arg Val Lys Gln Tyr Thr
465 470 475 480
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Glu Leu Asp Leu Glu Leu Ile Thr Phe Phe Ala Ser Thr Asn Met Glu
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Leu Asn Lys Ile Phe Ser Arg Glu Asn Ile Asn Asn Asp Glu Asn Ile
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Asp Phe Phe Gly Gly Asp Arg Glu Lys Asn Tyr Val Leu Asp Lys Lys
545 550 555 560
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Gln Asn Leu Lys Ile Ser Asp Glu Glu Val Ser Lys Ala Leu Asn Leu
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Ile Lys Ile Ser Glu Glu Asn Asn Asn Asp Ile Lys Tyr Leu Pro Ser
660 665 670
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Asn Tyr Tyr Lys Asn Ala Gln Ile Ser Ala Ser Lys Gly Asn Asn Lys
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835 840 845
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Lys Phe Leu Phe Asn Ile Asp Gly Lys Asn Ile Arg Lys Asn Lys Ile
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<211> 1197
<212> PRT
<213> L. wadei
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Pro Asp Asn Ala Ser Glu Glu Glu Asn Arg Ile Arg Arg Glu Asn Leu
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Ser Leu Lys Tyr Ser Phe Glu Glu Asn Lys Ala Asn Tyr Gln Lys Ile
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Asn Lys Leu Leu Asn Lys Leu Asp Thr Tyr Val Arg Asn Cys Gly Lys
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435 440 445
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Asn Ile Asp Glu Ala Ile Ser Ser Ile Arg His Gly Ile Val His Phe
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Asn Tyr Tyr Glu Lys Asp Val Ile Ile Lys Tyr Leu Lys Asn Thr Lys
530 535 540
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Leu Tyr Asn Lys Ile Glu Asp Leu Arg Asn Thr Leu Lys Phe Phe Trp
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Ser Val Pro Lys Asp Lys Glu Glu Lys Asp Ala Gln Ile Tyr Leu Leu
580 585 590
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Met Ile Asn Asn Gln Asp Lys Glu Glu Lys Asn Thr Tyr Ile Asp Phe
660 665 670
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675 680 685
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Ile Leu Lys Asn Tyr Glu Lys His Asn Arg Asn Lys Glu Ile Pro His
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Leu Asn Leu Asp Asn Asn Arg Val Thr Glu Asp Phe Glu Leu Glu Ala
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Arg Lys Glu Leu Lys Lys Phe Asp Thr Asn Lys Ile Tyr Phe Asp Gly
835 840 845
Glu Asn Ile Ile Lys His Arg Ala Phe Tyr Asn Ile Lys Lys Tyr Gly
850 855 860
Met Leu Asn Leu Leu Glu Lys Ile Ala Asp Lys Ala Lys Tyr Lys Ile
865 870 875 880
Ser Leu Lys Glu Leu Lys Glu Tyr Ser Asn Lys Lys Asn Glu Ile Glu
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Leu Lys Asn Leu Lys Lys Lys Lys Leu Met Thr Asp Arg Asn Ser Glu
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Glu Leu Cys Glu Leu Val Lys Val Met Phe Glu Tyr Lys Ala Leu Glu
1140 1145 1150
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Pro Asp Tyr Ala Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala
1185 1190 1195
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<213> Listeria seeligeri
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Phe Cys Asp Tyr Met Tyr Asn Arg Arg Glu Lys Lys Ile Ile Glu Val
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Ile Ser Arg Asp Lys Asn Gly Gly Lys Leu Val Tyr Glu Asn Glu Met
50 55 60
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Lys Lys Leu Val His Gly Leu Leu Gln Glu Asn Ser Gln Glu Lys Ile
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Lys Val Ser Asp Val Thr Lys Leu Asn Ile Ser Asn Phe Leu Asn His
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Ser Leu Lys Lys Gln Gln Gly Thr Phe Ile Cys Trp Glu Ser Phe Ser
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Lys Asp Met Glu Leu Tyr Ile Asn Trp Ala Glu Asn Tyr Ile Ser Ser
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Asn Gln Phe Asn Ile Glu Ile Arg Lys His Leu Glu Thr Tyr Phe Pro
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Ile Lys Lys Thr Asn Arg Lys Val Gly Asp Ile Arg Asn Leu Glu Ile
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340 345 350
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355 360 365
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Ile His Leu Lys Lys His Ser Trp Lys Lys Phe Phe Asn Asn Pro Thr
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755 760 765
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770 775 780
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<211> 1340
<212> PRT
<213> Lachnospiraceae
<400> 4
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Tyr Glu Glu Asn Arg Ser Arg Cys Arg Lys Gln Asn Ile Asn Tyr Tyr
325 330 335
Arg Ser Ala Leu Asn Tyr Ala Lys Asn Asn Thr Ser Gly Ile Phe Glu
340 345 350
Asn Glu Asp Ser Asn His Phe Trp Ile His Leu Ile Glu Asn Glu Val
355 360 365
Glu Arg Leu Tyr Asn Gly Ile Glu Asn Gly Glu Glu Phe Lys Phe Glu
370 375 380
Thr Gly Tyr Ile Ser Glu Lys Val Trp Lys Ala Val Ile Asn His Leu
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Ser Ile Lys Tyr Ile Ala Leu Gly Lys Ala Val Tyr Asn Tyr Ala Met
405 410 415
Lys Glu Leu Ser Ser Pro Gly Asp Ile Glu Pro Gly Lys Ile Asp Asp
420 425 430
Ser Tyr Ile Asn Gly Ile Thr Ser Phe Asp Tyr Glu Ile Ile Lys Ala
435 440 445
Glu Glu Ser Leu Gln Arg Asp Ile Ser Met Asn Val Val Phe Ala Thr
450 455 460
Asn Tyr Leu Ala Cys Ala Thr Val Asp Thr Asp Lys Asp Phe Leu Leu
465 470 475 480
Phe Ser Lys Glu Asp Ile Arg Ser Cys Thr Lys Lys Asp Gly Asn Leu
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Phe Cys Glu Glu Tyr Leu Lys Asp Asp Lys Asp Ala Leu Glu Leu Leu
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Gly Lys Leu Phe Glu Glu Asp Cys Asn Arg Ala Ala Arg Ile Glu Lys
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Ser Ser Leu Ser Glu Gln Arg Ile Thr Pro Lys Phe Thr Asp Ser Lys
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Ala Asp Ser Phe Lys Gln Ala Val Val Tyr Tyr Gly Lys Ala Ile Gly
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Leu Gln Ser Ala Phe Trp Glu Tyr Leu Asp Glu Asn Lys Glu Ile Tyr
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Glu Asp Phe Ile Ala Asn Tyr Ser Ser Gln Gln Tyr Lys Lys Leu Val
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<212> PRT
<213> Lachnospiraceae bacterium
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1235 1240 1245
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1250 1255 1260
Gly Lys Lys Ile Thr Cys Lys Ala Arg Ala Gln Ile Glu Ile Ala Glu
1265 1270 1275 1280
Asn Gly Met Arg Ser Glu Asp Phe Thr Tyr Lys Leu Ser Asp Gly Lys
1285 1290 1295
Lys Asn Ile Ser Thr Cys Met Ile Ala Ala Arg Asp Gln Lys Tyr Leu
1300 1305 1310
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1315 1320 1325
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Asp His Lys Leu Lys Val Glu Ser Leu Glu Pro Lys Lys Ile Tyr His
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Leu Gly Ser Ser Ala Lys Asp Lys Pro Glu Tyr Gln Tyr Cys Thr Asn
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Lys Lys
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<212> PRT
<213> Listeria weihenstephanensis
<400> 10
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180 185 190
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Gln Gln Phe Lys Asn Ala Val Tyr His Tyr Val Leu Glu Gln Gly Lys
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Lys Ser Ile Leu Lys Ile Lys Gly Phe Glu Phe Glu Pro Asn Asn Met
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Lys Tyr Thr Asp Ser Asp Met Gln Lys Leu Met Asp Lys Asp Ile Ala
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Lys Ile Pro Asp Phe Ile Glu Glu Lys Leu Lys Ser Ser Gly Ile Ile
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Arg Phe Tyr Ser His Asp Lys Leu Gln Ser Ile Trp Glu Met Lys Gln
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Arg Val Tyr Ala Lys Gly His Asp Tyr Gln Thr Ser Lys Asn Arg Tyr
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Tyr Asp Leu Gly Leu Thr Thr Phe Asp Ile Leu Glu Tyr Gly Glu Glu
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<213> Listeriaceae bacterium
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<212> PRT
<213> Rhodobacter capsulatus
<400> 13
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<213> Artificial Sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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<211> 22
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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60
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60
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cugaaag 67
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gugaaag 67
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aauccau 67
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aauccau 67
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<400> 88
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aauccau 67
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gcuguuc 67
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gccguuc 67
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uuuaugu 67
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gc 62
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<220>
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<212> RNA
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<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacg gguacuucau gaugccagcu 60
gc 62
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<212> RNA
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<220>
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ggguacuuca ugaugccagc ugc 23
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<212> RNA
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<220>
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<400> 112
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacg gguuguucau gaugccagcu 60
gc 62
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 113
ggguuguuca ugaugccagc ugc 23
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 114
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacu acuacgcuuc agccuacugc 60
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 116
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacu auuacgcuuc agccuacugc 60
aaaucca 67
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 117
uauuacgcuu cagccuacug caaaucca 28
<210> 118
<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 118
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auccuau 67
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 119
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 120
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacg auagaaaugu ccuuuuccca 60
auccuau 67
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 121
gauagaaaug uccuuuuccc aauccuau 28
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 122
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaaca ccgacucuuu uuuguauuuc 60
caguaga 67
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 123
accgacucuu uuuuguauuu ccaguaga 28
<210> 124
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 124
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaaca cugacucuuu uuuguauuuc 60
caguaga 67
<210> 125
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 125
acugacucuu uuuuguauuu ccaguaga 28
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 126
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacc uacaccuucu accaccaccu 60
ccgccag 67
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<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 127
cuacaccuuc uaccaccacc uccgccag 28
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<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 128
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacc ugcaccuucu accaccaccu 60
ccgccag 67
<210> 129
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 129
cugcaccuuc uaccaccacc uccgccag 28
<210> 130
<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 130
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacg agagcaacag gaagcaggau 60
uccaagu 67
<210> 131
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 131
gagagcaaca ggaagcagga uuccaagu 28
<210> 132
<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 132
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacg aaagcaacag gaagcaggau 60
uccaagu 67
<210> 133
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 133
gaaagcaaca ggaagcagga uuccaagu 28
<210> 134
<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 134
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacc caggccaaaa ucugugaucu 60
ugacaug 67
<210> 135
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 135
ccaggccaaa aucugugauc uugacaug 28
<210> 136
<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 136
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacc ccggccaaaa ucugugaucu 60
ugacaug 67
<210> 137
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 137
cccggccaaa aucugugauc uugacaug 28
<210> 138
<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 138
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacu caguguagcu agaccaaaau 60
caccuau 67
<210> 139
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 139
ucaguguagc uagaccaaaa ucaccuau 28
<210> 140
<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 140
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacu cuguguagcu agaccaaaau 60
caccuau 67
<210> 141
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 141
ucuguguagc uagaccaaaa ucaccuau 28
<210> 142
<211> 62
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 142
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaaca agauugcugu ucuaccaagu 60
aa 62
<210> 143
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 143
aagauugcug uucuaccaag uaa 23
<210> 144
<211> 62
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 144
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacu ugauugcugu ucuaccaagu 60
aa 62
<210> 145
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 145
uugauugcug uucuaccaag uaa 23
<210> 146
<211> 62
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 146
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacu aguuugcugu ucuaccaagu 60
aa 62
<210> 147
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 147
uaguuugcug uucuaccaag uaa 23
<210> 148
<211> 62
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 148
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacu agaaugcugu ucuaccaagu 60
aa 62
<210> 149
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 149
uagaaugcug uucuaccaag uaa 23
<210> 150
<211> 62
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 150
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacu agauagcugu ucuaccaagu 60
aa 62
<210> 151
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 151
uagauagcug uucuaccaag uaa 23
<210> 152
<211> 62
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 152
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacu agauuccugu ucuaccaagu 60
aa 62
<210> 153
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 153
uagauuccug uucuaccaag uaa 23
<210> 154
<211> 59
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 154
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaaca agauugcugu ucuaccaag 59
<210> 155
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 155
aagauugcug uucuaccaag 20
<210> 156
<211> 59
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 156
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacu ugauugcugu ucuaccaag 59
<210> 157
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 157
uugauugcug uucuaccaag 20
<210> 158
<211> 59
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 158
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacu aguuugcugu ucuaccaag 59
<210> 159
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 159
uaguuugcug uucuaccaag 20
<210> 160
<211> 59
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 160
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacu agaaugcugu ucuaccaag 59
<210> 161
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 161
uagaaugcug uucuaccaag 20
<210> 162
<211> 59
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 162
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacu agauagcugu ucuaccaag 59
<210> 163
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 163
uagauagcug uucuaccaag 20
<210> 164
<211> 59
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 164
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacu agauuccugu ucuaccaag 59
<210> 165
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 165
uagauuccug uucuaccaag 20
<210> 166
<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 166
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacc uagauugcug uucuaccaag 60
uaaucca 67
<210> 167
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 167
cuagauugcu guucuaccaa guaaucca 28
<210> 168
<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 168
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacg aagauugcug uucuaccaag 60
uaaucca 67
<210> 169
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 169
gaagauugcu guucuaccaa guaaucca 28
<210> 170
<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 170
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacg uugauugcug uucuaccaag 60
uaaucca 67
<210> 171
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 171
guugauugcu guucuaccaa guaaucca 28
<210> 172
<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 172
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacg uaguuugcug uucuaccaag 60
uaaucca 67
<210> 173
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 173
guaguuugcu guucuaccaa guaaucca 28
<210> 174
<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 174
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacg uagaaugcug uucuaccaag 60
uaaucca 67
<210> 175
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 175
guagaaugcu guucuaccaa guaaucca 28
<210> 176
<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 176
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacg uagauagcug uucuaccaag 60
uaaucca 67
<210> 177
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 177
guagauagcu guucuaccaa guaaucca 28
<210> 178
<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 178
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaaca cuagauugcu guucuaccaa 60
guaaucc 67
<210> 179
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 179
acuagauugc uguucuacca aguaaucc 28
<210> 180
<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 180
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaaca gaagauugcu guucuaccaa 60
guaaucc 67
<210> 181
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 181
agaagauugc uguucuacca aguaaucc 28
<210> 182
<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 182
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaaca guugauugcu guucuaccaa 60
guaaucc 67
<210> 183
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 183
aguugauugc uguucuacca aguaaucc 28
<210> 184
<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 184
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaaca guaguuugcu guucuaccaa 60
guaaucc 67
<210> 185
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 185
aguaguuugc uguucuacca aguaaucc 28
<210> 186
<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 186
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaaca guagaaugcu guucuaccaa 60
guaaucc 67
<210> 187
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 187
aguagaaugc uguucuacca aguaaucc 28
<210> 188
<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 188
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaaca guagauagcu guucuaccaa 60
guaaucc 67
<210> 189
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 189
aguagauagc uguucuacca aguaaucc 28
<210> 190
<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 190
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacg acuagauugc uguucuacca 60
aguaauc 67
<210> 191
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 191
gacuagauug cuguucuacc aaguaauc 28
<210> 192
<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 192
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacg agaagauugc uguucuacca 60
aguaauc 67
<210> 193
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 193
gagaagauug cuguucuacc aaguaauc 28
<210> 194
<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 194
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacg aguugauugc uguucuacca 60
aguaauc 67
<210> 195
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 195
gaguugauug cuguucuacc aaguaauc 28
<210> 196
<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 196
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacg aguaguuugc uguucuacca 60
aguaauc 67
<210> 197
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 197
gaguaguuug cuguucuacc aaguaauc 28
<210> 198
<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 198
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacg aguagaaugc uguucuacca 60
aguaauc 67
<210> 199
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 199
gaguagaaug cuguucuacc aaguaauc 28
<210> 200
<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 200
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacg aguagauagc uguucuacca 60
aguaauc 67
<210> 201
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 201
gaguagauag cuguucuacc aaguaauc 28
<210> 202
<211> 176
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 202
gggggccagu gaauucgagc ucgguacccg gggauccucu agaaauaugg auuacuuggu 60
agaacagcaa ucuacucgac cugcaggcau gcaagcuugg cguaaucaug gucauagcug 120
uuuccugugu uuauccgcuc acaauuccac acaacauacg agccggaagc auaaag 176
<210> 203
<211> 176
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 203
gggggccagu gaauucgagc ucgguacccg gggauccucu agaaauaugg auuacuuggu 60
agaacagcaa ucuagucgac cugcaggcau gcaagcuugg cguaaucaug gucauagcug 120
uuuccugugu uuauccgcuc acaauuccac acaacauacg agccggaagc auaaag 176
<210> 204
<211> 176
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 204
gggggccagu gaauucgagc ucgguacccg gggauccucu agaaauaugg auuacuuggu 60
agaacagcaa ucuaaucgac cugcaggcau gcaagcuugg cguaaucaug gucauagcug 120
uuuccugugu uuauccgcuc acaauuccac acaacauacg agccggaagc auaaag 176
<210> 205
<211> 176
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 205
gggggccagu gaauucgagc ucgguacccg gggauccucu agaaauaugg auuacuuggu 60
agaacagcaa ucuauucgac cugcaggcau gcaagcuugg cguaaucaug gucauagcug 120
uuuccugugu uuauccgcuc acaauuccac acaacauacg agccggaagc auaaag 176
<210> 206
<211> 173
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 206
ggccagtgaa ttcgagctcg gtacccgggg atcctctaga aatatggatt acttggtaga 60
acagcaatct actcgacctg caggcatgca agcttggcgt aatcatggtc atagctgttt 120
cctgtgttta tccgctcaca attccacaca acatacgagc cggaagcata aag 173
<210> 207
<211> 189
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 207
gagtacgtcc gcttcaccgg ctacccctgc tcctggacct tctaccacca cctccgccag 60
gagatcctcc aggagttcac cctgcacgac cacgtgcggg aggaggccca gaagttcctg 120
cggggcctgc aggtgaacgg gagccggccg ggcacctttg taggggtcca tgttcgccga 180
ggggactat 189
<210> 208
<211> 334
<212> RNA
<213> Zika virus
<400> 208
agcuggagug uuguuuggua ugggcaaagg gaugccauuc uacgcauggg acuuuggagu 60
cccgcugcua augauagguu gcuacucaca auuaacaccc cugacccuaa uaguggccau 120
cauuuugcuc guggcgcacu acauguacuu gaucccaggg cugcaggcag cagcugcgcg 180
ugcugcccag aagagaacgg cagcuggcau caugaagaac ccuguugugg auggaauagu 240
ggugacugac auugacacaa ugacaauuga cccccaagug gagaaaaaga ugggacaggu 300
gcuacucaua gcaguagccg ucuccagcgc caua 334
<210> 209
<211> 334
<212> RNA
<213> Dengue virus
<400> 209
ggcagcuaua uugaugggac uugacaaggg auggccaaua ucgaagaugg acauaggagu 60
uccacuucuc gccuuagggu gcuauuccca ggugaaccca uugacacuga cagcggcggu 120
guugauguua guggcucauu augccauaau uggaccagga cugcaagcaa aggccacuag 180
agaagcucaa aaaaggacag cggccggaau aaugaaaaau ccaaccguag acgggauugu 240
ugcaauagac uuggauccug ugguuuauga uacaaaauuu gaaaaacagc uaggccaaau 300
aauguuacug auacuuugua caucacagau ccuc 334
<210> 210
<211> 337
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 210
gggagcugga guguuguuug guaugggcaa agggaugcca uucuacgcau gggacuuugg 60
agucccgcug cuaaugauag guugcuacuc acaauuaaca ccccugaccc uaauaguggc 120
caucauuuug cucguggcgc acuacaugua cuugauccca gggcugcagg cagcagcugc 180
gcgugcugcc cagaagagaa cggcagcugg caucaugaag aacccuguug uggauggaau 240
aguggugacu gacauugaca caaugacaau ugacccccaa guggagaaaa agaugggaca 300
ggugcuacuc auagcaguag ccgucuccag cgccaua 337
<210> 211
<211> 173
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 211
gggaaccuug auaguggcua ucauucugcu uguggcacac uauauguacu ugaucccagg 60
ccuacaggca gcagcagcgc gugcugccca gaagagaaca gcagcuggca ucaugaagaa 120
ucccguugug gauggaauag ugguaacuga cauugacaca augacaauug acc 173
<210> 212
<211> 173
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 212
ggggacccua auaguggcca ucauuuugcu cguggcgcac uacauguacu ugaucccagg 60
gcugcaggca gcagcugcgc gugcugccca gaagagaacg gcagcuggca ucaugaagaa 120
cccuguugug gauggaauag uggugacuga cauugacaca augacaauug acc 173
<210> 213
<211> 136
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 213
gggaguacau auucaggggc caaccucuca acaaugacga agaccaugcu cacuggacag 60
aagcaaaaau gcugcuggac aacaucaaca caccagaagg gauuauacca gcucucuuug 120
aaccagaaag ggagaa 136
<210> 214
<211> 173
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 214
gggaguacau uuacauggga cagccuucaa acaacgauga ggaucacgcu cauuggacag 60
aagcaaaaau gcuccuugac aacauaaaca caccagaagg gauuauccca gcccucuuug 120
agccggagag aggaaaaagu gcagcaauag acggggaaua cagacugcgg ggu 173
<210> 215
<211> 176
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 215
gggggccagu gaauucgagc ucgguacccg gggauccucu agaaauaugg auuacuuggu 60
agaacagcaa uguacucgac cugcaggcau gcaagcuugg cguaaucaug gucauagcug 120
uuuccugugu uuauccgcuc acaauuccac acaacauacg agccggaagc auaaag 176
<210> 216
<211> 176
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 216
gggggccagu gaauucgagc ucgguacccg gggauccucu agaaauaugg auuacuuggu 60
agaacagcua uguacucgac cugcaggcau gcaagcuugg cguaaucaug gucauagcug 120
uuuccugugu uuauccgcuc acaauuccac acaacauacg agccggaagc auaaag 176
<210> 217
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 217
gtggaattgt gagcggataa ac 22
<210> 218
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 218
aacagcaatc tactcgacct g 21
<210> 219
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Probe
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)
<223> FAM dye
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(10)
<223> ZEN quencher
<220>
<221> misc_feature
<222> (28)
<223> 3' 3IABkFQ tag
<400> 219
aggaaacagc tatgaccatg attacgcc 28
<210> 220
<211> 64
<212> RNA
<213> Leptotrichia wadei
<220>
<221> misc_feature
<222> (37)..(64)
<223> n = any nucleotide
<400> 220
gauuuagacu accccaaaaa gcaaggggac uaaaacnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60
nnnn 64
<210> 221
<211> 56
<212> RNA
<213> Leptotrichia wadei
<220>
<221> misc_feature
<222> (29)..(56)
<223> n = any nucleotide
<400> 221
ccaccccaau aucgaagggg acuaaaacnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnn 56
<210> 222
<211> 70
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 222
uacccgggga uccucuagaa auauggauua cuugguagaa cagcaaucua cucgaccugc 60
aggcaugcaa 70
<210> 223
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 223
gcaaggggac taaaacuaga uugcuguucu accaaguaau ccau 44
<210> 224
<211> 10
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 224
tagattgctg 10
<210> 225
<211> 10
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 225
aagattgctg 10
<210> 226
<211> 10
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 226
ttgattgctg 10
<210> 227
<211> 10
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 227
tacattgctg 10
<210> 228
<211> 10
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 228
tagtttgctg 10
<210> 229
<211> 10
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 229
tagaatgctg 10
<210> 230
<211> 10
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 230
tagatagctg 10
<210> 231
<211> 10
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 231
tagattcctg 10
<210> 232
<211> 10
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 232
tagattggtg 10
<210> 233
<211> 10
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 233
tagattgcag 10
<210> 234
<211> 10
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 234
tagattgctc 10
<210> 235
<211> 10
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 235
atctaacgac 10
<210> 236
<211> 10
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 236
atgtaacgac 10
<210> 237
<211> 10
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 237
atgtatcgac 10
<210> 238
<211> 58
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 238
gugcugccca gaagagaaca gcagcuggca ucaugaagaa ucccguugug gauggaau 58
<210> 239
<211> 63
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 239
gauuuagacu accccaaaaa gcaaggggac uaaaacggau acucaugaug ccagcugcug 60
uuc 63
<210> 240
<211> 58
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 240
gugcugccca gaagagaaca gcagcuggca ucaugaagaa ucccguugug gauggaau 58
<210> 241
<211> 64
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 241
gauuuagacu accccaaaaa gcaaggggac uaaaacggau acuucaugau gccagcugcu 60
guuc 64
<210> 242
<211> 58
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 242
gugcugccca gaagagaacg gcagcuggca ucaugaagaa ccccguugug gauggaau 58
<210> 243
<211> 58
<212> RNA
<213> Zika virus
<400> 243
gugcugccca gaagagaaca gcagcuggca ucaugaagaa ucccguugug gauggaau 58
<210> 244
<211> 28
<212> RNA
<213> Zika virus
<400> 244
ggauuguuca ugaugccagc ugcuguuc 28
<210> 245
<211> 28
<212> RNA
<213> Zika virus
<400> 245
ggauacuuca ugaugccagc ugcuguuc 28
<210> 246
<211> 58
<212> RNA
<213> Zika virus
<400> 246
gugcugccca gaagagaacg gcagcuggca ucaugaagaa cccuguugug gauggaau 58
<210> 247
<211> 28
<212> RNA
<213> Zika virus
<400> 247
ggguacuuca ugaugccagc ugccguuc 28
<210> 248
<211> 28
<212> RNA
<213> Zika virus
<400> 248
ggguuguuca ugaugccagc ugccguuc 28
<210> 249
<211> 58
<212> RNA
<213> Dengue virus
<400> 249
aaaugcugcu ggacaacauc aacacaccag aagggauuau accagcucuc uuugaacc 58
<210> 250
<211> 28
<212> RNA
<213> Dengue virus
<400> 250
gguaaaaucc cuucuggugu guugaugu 28
<210> 251
<211> 28
<212> RNA
<213> Dengue virus
<400> 251
gguuuaaucc cuucuggugu guugaugu 28
<210> 252
<211> 58
<212> RNA
<213> Dengue virus
<400> 252
aaaugcuccu ugacaacaua aacacaccag aagggauuau cccagcccuc uuugagcc 58
<210> 253
<211> 28
<212> RNA
<213> Dengue virus
<400> 253
ggguuaaucc cuucuggugu guuuaugu 28
<210> 254
<211> 28
<212> RNA
<213> Dengue virus
<400> 254
gggaaaaucc cuucuggugu guuuaugu 28
<210> 255
<211> 39
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 255
caccgcagca ugucaagauc acagauuuug ggcgggcca 39
<210> 256
<211> 28
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 256
cccggccaaa aucugugauc uugacaug 28
<210> 257
<211> 28
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 257
ccaggccaaa aucugugauc uugacaug 28
<210> 258
<211> 39
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 258
caguaaaaau aggugauuuu ggucuagcua cagagaaau 39
<210> 259
<211> 28
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 259
ucuguguagc uagaccaaaa ucaccuau 28
<210> 260
<211> 28
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 260
ucagugaugc uagaccaaaa ucaccuau 28
<210> 261
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 261
tgtggttggt gtggttggtt catggtcata ttggtttttt ccaaccacag tctctgt 57
<210> 262
<211> 82
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 262
tgtggttggt gtggttggtt catggtcata ttggtttttt ccaaccacag tctctgtggt 60
tggtagtctc gaattgctct ct 82
<210> 263
<211> 18
<212> PRT
<213> Leptotrichia shahii
<400> 263
Ile Arg Lys Phe Ile Lys Ile Gly Thr Asn Glu Arg Asn Arg Ile Leu
1 5 10 15
His Ala
<210> 264
<211> 15
<212> PRT
<213> Leptotrichia shahii
<400> 264
Ser Ile Arg Asn Tyr Ile Ser His Phe Tyr Ile Val Arg Asn Pro
1 5 10 15
<210> 265
<211> 18
<212> PRT
<213> Lachnospiraceae bacterium
<400> 265
Leu Tyr Ser Leu Lys Ser Met Leu Tyr Ser Met Arg Asn Ser Ser Phe
1 5 10 15
His Phe
<210> 266
<211> 15
<212> PRT
<213> Lachnospiraceae bacterium
<400> 266
Ile Phe Arg Asn Glu Ile Asp His Phe His Tyr Phe Tyr Asp Arg
1 5 10 15
<210> 267
<211> 18
<212> PRT
<213> Lachnospiraceae
<400> 267
Leu Thr Asp Leu Lys Asp Val Ile Tyr Ser Met Arg Asn Asp Ser Phe
1 5 10 15
His Tyr
<210> 268
<211> 15
<212> PRT
<213> Lachnospiraceae
<400> 268
Glu Leu Arg Asn Tyr Ile Glu His Phe Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe
1 5 10 15
<210> 269
<211> 18
<212> PRT
<213> Clostridium aminophilum
<400> 269
Ala Asp Asp Leu Arg Lys Ala Ile Tyr Ser Leu Arg Asn Glu Thr Phe
1 5 10 15
His Phe
<210> 270
<211> 15
<212> PRT
<213> Clostridium aminophilum
<400> 270
Asp Val Arg Lys Tyr Val Asp His Phe Lys Tyr Tyr Ala Thr Ser
1 5 10 15
<210> 271
<211> 18
<212> PRT
<213> Carnobacterium gallinarum
<400> 271
Ile Trp Ala Leu Arg Gly Ser Val Gln Gln Ile Arg Asn Glu Ile Phe
1 5 10 15
His Ser
<210> 272
<211> 15
<212> PRT
<213> Carnobacterium gallinarum
<400> 272
Lys Ile Arg Asn Gln Thr Ala His Leu Ser Val Leu Gln Leu Glu
1 5 10 15
<210> 273
<211> 18
<212> PRT
<213> Carnobacterium gallinarum
<400> 273
Leu Trp Ala Ile Arg Gly Ala Val Gln Arg Val Arg Asn Gln Ile Phe
1 5 10 15
His Gln
<210> 274
<211> 15
<212> PRT
<213> Carnobacterium gallinarum
<400> 274
Glu Ile Arg Asn Asn Ile Ala His Leu His Val Leu Arg Asn Asp
1 5 10 15
<210> 275
<211> 18
<212> PRT
<213> Paludibacter proprionicigenes
<400> 275
Leu Trp Gly Ile Arg Gly Ala Val Gln Gln Ile Arg Asn Asn Val Asn
1 5 10 15
His Tyr
<210> 276
<211> 15
<212> PRT
<213> Paludibacter proprionicigenes
<400> 276
Asp Ile Arg Asn His Ile Ala His Phe Asn Tyr Leu Thr Lys Asp
1 5 10 15
<210> 277
<211> 18
<212> PRT
<213> Listeria weihenstephanensis
<400> 277
Ile Trp Ala Ile Arg Gly Ser Ile Gln Gln Ile Arg Asn Glu Val Tyr
1 5 10 15
His Cys
<210> 278
<211> 15
<212> PRT
<213> Listeria weihenstephanensis
<400> 278
Asn Ala Arg Asn His Ile Ala His Leu Asn Tyr Leu Ser Leu Lys
1 5 10 15
<210> 279
<211> 18
<212> PRT
<213> Listeriaceae bacterium
<400> 279
Ile Trp Ala Ile Arg Gly Ser Ile Gln Gln Ile Arg Asn Glu Val Tyr
1 5 10 15
His Cys
<210> 280
<211> 15
<212> PRT
<213> Listeriaceae bacterium
<400> 280
Asn Ala Arg Asn His Ile Ala His Leu Asn Tyr Leu Ser Leu Lys
1 5 10 15
<210> 281
<211> 18
<212> PRT
<213> Leptotrichia wadei
<400> 281
Phe Ala Asn Ile Asp Glu Ala Ile Ser Ser Ile Arg His Gly Ile Val
1 5 10 15
His Phe
<210> 282
<211> 15
<212> PRT
<213> Leptotrichia wadei
<400> 282
Tyr Ile Arg Asn Tyr Ile Ala His Phe Asn Tyr Ile Pro His Ala
1 5 10 15
<210> 283
<211> 18
<212> PRT
<213> Rodobacter capsulatus
<400> 283
Val Phe Ala Leu Leu Arg Tyr Leu Arg Gly Cys Arg Asn Gln Thr Phe
1 5 10 15
His Leu
<210> 284
<211> 15
<212> PRT
<213> Rhodobacter capsulatus
<400> 284
Gln Thr Arg Lys Asp Leu Ala His Phe Asn Val Leu Asp Arg Ala
1 5 10 15
<210> 285
<211> 18
<212> PRT
<213> Rhodobacter capsulatus
<400> 285
Val Phe Ala Leu Leu Arg Tyr Leu Arg Gly Cys Arg Asn Gln Thr Phe
1 5 10 15
His Leu
<210> 286
<211> 15
<212> PRT
<213> Rhodobacter capsulatus
<400> 286
Gln Thr Arg Lys Asp Leu Ala His Phe Asn Val Leu Asp Arg Ala
1 5 10 15
<210> 287
<211> 18
<212> PRT
<213> Rhodobacter capsulatus
<400> 287
Val Phe Ala Leu Leu Arg Tyr Leu Arg Gly Cys Arg Asn Gln Thr Phe
1 5 10 15
His Leu
<210> 288
<211> 15
<212> PRT
<213> Rhodobacter capsulatus
<400> 288
Gln Thr Arg Lys Asp Leu Ala His Phe Asn Val Leu Asp Arg Ala
1 5 10 15
<210> 289
<211> 18
<212> PRT
<213> L wadei
<400> 289
Phe Ala Asn Ile Asp Glu Ala Ile Ser Ser Ile Arg His Gly Ile Val
1 5 10 15
His Phe
<210> 290
<211> 15
<212> PRT
<213> L wadei
<400> 290
Tyr Ile Arg Asn Tyr Ile Ala His Phe Asn Tyr Ile Pro His Ala
1 5 10 15
<210> 291
<211> 18
<212> PRT
<213> Listeria seeligeri
<400> 291
Ser Trp Gly Leu Arg Gly Ala Ile Ala Pro Ile Arg Asn Glu Ile Ile
1 5 10 15
His Leu
<210> 292
<211> 15
<212> PRT
<213> Listeria seeligeri
<400> 292
Glu Lys Arg Asn Asn Ile Ser His Phe Asn Tyr Leu Asn Gly Gln
1 5 10 15
<210> 293
<211> 64
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 293
gauuuagacu accccaaaaa gcaaggggac uaaaacuaga uugcuguucu accaaguaau 60
ccau 64
<210> 294
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 294
uagauugcug uucuaccaag uaa 23
<210> 295
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 295
uagauugcug uucuaccaag 20
<210> 296
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 296
auggauuacu ugguagaaca gcaaucua 28
<210> 297
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 297
auggauuacu ugguagaaca gcaaugua 28
<210> 298
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 298
uagauugcug uucuacc 17
<210> 299
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 299
aagauugcug uucuacc 17
<210> 300
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 300
uugauugcug uucuacc 17
<210> 301
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 301
uaguuugcug uucuacc 17
<210> 302
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 302
uagaaugcug uucuacc 17
<210> 303
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 303
uagauagcug uucuacc 17
<210> 304
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 304
uagauuccug uucuacc 17
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<211> 30
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 305
auggauuacu uggugaacag caaucuacuc 30
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<211> 32
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 306
auggauuacu ugguagaaca gcaauguuac uc 32
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<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 307
aagauugcug uucuaccaag uaauccau 28
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<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 308
uugauugcug uucuaccaag uaauccau 28
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<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 309
uaguuugcug uucuaccaag uaauccau 28
<210> 310
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 310
uagaaugcug uucuaccaag uaauccau 28
<210> 311
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 311
uagauagcug uucuaccaag uaauccau 28
<210> 312
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 312
uagauuccug uucuaccaag uaauccau 28
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<211> 31
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 313
auggauaucu ugguagaaca gcaaucuacu c 31
<210> 314
<211> 31
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 314
auggauuacu ugguagaaca gcaauguacu c 31
<210> 315
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 315
cuagauugcu guucuaccaa guaaucca 28
<210> 316
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 316
gaagauugcu guucuaccaa guaaucca 28
<210> 317
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 317
guugauugcu guucuaccaa guaaucca 28
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<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 318
guaguuugcu guucuaccaa guaaucca 28
<210> 319
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 319
guagaaugcu guucuaccaa guaaucca 28
<210> 320
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 320
guagauagcu guucuaccaa guaaucca 28
<210> 321
<211> 31
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 321
auggauuacu ugguagaaca gcaaucuacu c 31
<210> 322
<211> 31
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 322
auggauuacu ugguagaaca gcaauguacu c 31
<210> 323
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 323
acuagauugc uguucuacca aguaaucc 28
<210> 324
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 324
agaagauugc uguucuacca aguaaucc 28
<210> 325
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 325
aguugauugc uguucuacca aguaaucc 28
<210> 326
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 326
aguaguuugc uguucuacca aguaaucc 28
<210> 327
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 327
aguagaaugc uguucuacca aguaaucc 28
<210> 328
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 328
aguagauagc uguucuacca aguaaucc 28
<210> 329
<211> 31
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 329
auggauuacu ugguagaaca gcaaucuacu c 31
<210> 330
<211> 31
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 330
auggauuacu ugguagaaca gcaauguacu c 31
<210> 331
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 331
gacuagauug cuguucuacc aaguaauc 28
<210> 332
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 332
gagaagauug cuguucuacc aaguaauc 28
<210> 333
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 333
gaguugauug cuguucuacc aaguaauc 28
<210> 334
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 334
gaguaguuug cuguucuacc aaguaauc 28
<210> 335
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 335
gaguagaaug cuguucuacc aaguaauc 28
<210> 336
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 336
gaguagauag cuguucuacc aaguaauc 28
<210> 337
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 337
gaaattaata cgactcacta tagggttatt gcaattatta atcttgaacg aggaatg 57
<210> 338
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 338
gaaattaata cgactcacta taggggattg acagattaat agctctttct tgatttc 57
<210> 339
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 339
atttttcttg tccaaacaat tcatcatatc tt 32
<210> 340
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 340
ttcaatttca aataagaata tagtgtactc gc 32
<210> 341
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 341
gaaattaata cgactcacta tagggttctt attagcagaa caaagaagtt taacaac 57
<210> 342
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 342
gaaattaata cgactcacta tagggatttt atgcaatgtt aaaaactgtt ccaagta 57
<210> 343
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 343
taattgacat ccaatccata ataaagcata ga 32
<210> 344
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 344
gaattatagt tgttaaactt ctttgttctg ct 32
<210> 345
<211> 89
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 345
cctagtaagc atgattcatc agattgtggt tttagtcccc ttcgtttttg gggtagtcta 60
aatcccctat agtgagtcgt attaatttc 89
<210> 346
<211> 89
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 346
ggatggtgat gcatggccgt ttttagttgt tttagtcccc ttcgtttttg gggtagtcta 60
aatcccctat agtgagtcgt attaatttc 89
<210> 347
<211> 89
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 347
caatttaaaa tgatttttgg tgctagaggt tttagtcccc ttcgtttttg gggtagtcta 60
aatcccctat agtgagtcgt attaatttc 89
<210> 348
<211> 89
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 348
gctggtttag taattgtatt attatcatgt tttagtcccc ttcgtttttg gggtagtcta 60
aatcccctat agtgagtcgt attaatttc 89
<210> 349
<211> 173
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 349
ggccagtgaa ttcgagctcg gtacccgggg atcctctaga aatatggatt acttggtaga 60
acagcaatct actcgacctg caggcatgca agcttggcgt aatcatggtc atagctgttt 120
cctgtgttta tccgctcaca attccacaca acatacgagc cggaagcata aag 173
<210> 350
<211> 173
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 350
ccggtcactt aagctcgagc catgggcccc taggagatct ttatacctaa tgaaccatct 60
tgtcgttaga tgagctggac gtccgtacgt tcgaaccgca ttatgaccag tatcgacaaa 120
ggacacaaat aggcgagtgt taaggtgtgt tgtatgctcg gccttcgtat ttc 173
<210> 351
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Peptide
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)
<223> Xaa = N or H or K
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)
<223> Xaa = R, S, D, E, Q, N, G, Y, or H
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)
<223> Xaa = I, S, T, V, or L
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)
<223> Xaa = L, F, N, Y, V, I, S, D, E, or A
<400> 351
Arg Xaa Xaa Xaa Xaa His
1 5
<210> 352
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Peptide
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)
<223> Xaa = N or H
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)
<223> Xaa = R, S, D, E, Q, N, G, Y, or H
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)
<223> Xaa = I, S, T, V, or L
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)
<223> Xaa = L, F, N, Y, V, I, S, D, E, or A
<400> 352
Arg Xaa Xaa Xaa Xaa His
1 5
<210> 353
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Peptide
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)
<223> Xaa = N or K
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)
<223> Xaa = R, S, D, E, Q, N, G, Y, or H
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)
<223> Xaa = I, S, T, V, or L
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)
<223> Xaa = L, F, N, Y, V, I, S, D, E, or A
<400> 353
Arg Xaa Xaa Xaa Xaa His
1 5
<210> 354
<211> 1159
<212> PRT
<213> Leptorichia buccalis
<400> 354
Met Lys Val Thr Lys Val Gly Gly Ile Ser His Lys Lys Tyr Thr Ser
1 5 10 15
Glu Gly Arg Leu Val Lys Ser Glu Ser Glu Glu Asn Arg Thr Asp Glu
20 25 30
Arg Leu Ser Ala Leu Leu Asn Met Arg Leu Asp Met Tyr Ile Lys Asn
35 40 45
Pro Ser Ser Thr Glu Thr Lys Glu Asn Gln Lys Arg Ile Gly Lys Leu
50 55 60
Lys Lys Phe Phe Ser Asn Lys Met Val Tyr Leu Lys Asp Asn Thr Leu
65 70 75 80
Ser Leu Lys Asn Gly Lys Lys Glu Asn Ile Asp Arg Glu Tyr Ser Glu
85 90 95
Thr Asp Ile Leu Glu Ser Asp Val Arg Asp Lys Lys Asn Phe Ala Val
100 105 110
Leu Lys Lys Ile Tyr Leu Asn Glu Asn Val Asn Ser Glu Glu Leu Glu
115 120 125
Val Phe Arg Asn Asp Ile Lys Lys Lys Leu Asn Lys Ile Asn Ser Leu
130 135 140
Lys Tyr Ser Phe Glu Lys Asn Lys Ala Asn Tyr Gln Lys Ile Asn Glu
145 150 155 160
Asn Asn Ile Glu Lys Val Glu Gly Lys Ser Lys Arg Asn Ile Ile Tyr
165 170 175
Asp Tyr Tyr Arg Glu Ser Ala Lys Arg Asp Ala Tyr Val Ser Asn Val
180 185 190
Lys Glu Ala Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Glu Glu Asp Ile Ala Lys Leu
195 200 205
Val Leu Glu Ile Glu Asn Leu Thr Lys Leu Glu Lys Tyr Lys Ile Arg
210 215 220
Glu Phe Tyr His Glu Ile Ile Gly Arg Lys Asn Asp Lys Glu Asn Phe
225 230 235 240
Ala Lys Ile Ile Tyr Glu Glu Ile Gln Asn Val Asn Asn Met Lys Glu
245 250 255
Leu Ile Glu Lys Val Pro Asp Met Ser Glu Leu Lys Lys Ser Gln Val
260 265 270
Phe Tyr Lys Tyr Tyr Leu Asp Lys Glu Glu Leu Asn Asp Lys Asn Ile
275 280 285
Lys Tyr Ala Phe Cys His Phe Val Glu Ile Glu Met Ser Gln Leu Leu
290 295 300
Lys Asn Tyr Val Tyr Lys Arg Leu Ser Asn Ile Ser Asn Asp Lys Ile
305 310 315 320
Lys Arg Ile Phe Glu Tyr Gln Asn Leu Lys Lys Leu Ile Glu Asn Lys
325 330 335
Leu Leu Asn Lys Leu Asp Thr Tyr Val Arg Asn Cys Gly Lys Tyr Asn
340 345 350
Tyr Tyr Leu Gln Asp Gly Glu Ile Ala Thr Ser Asp Phe Ile Ala Arg
355 360 365
Asn Arg Gln Asn Glu Ala Phe Leu Arg Asn Ile Ile Gly Val Ser Ser
370 375 380
Val Ala Tyr Phe Ser Leu Arg Asn Ile Leu Glu Thr Glu Asn Glu Asn
385 390 395 400
Asp Ile Thr Gly Arg Met Arg Gly Lys Thr Val Lys Asn Asn Lys Gly
405 410 415
Glu Glu Lys Tyr Val Ser Gly Glu Val Asp Lys Ile Tyr Asn Glu Asn
420 425 430
Lys Lys Asn Glu Val Lys Glu Asn Leu Lys Met Phe Tyr Ser Tyr Asp
435 440 445
Phe Asn Met Asp Asn Lys Asn Glu Ile Glu Asp Phe Phe Ala Asn Ile
450 455 460
Asp Glu Ala Ile Ser Ser Ile Arg His Gly Ile Val His Phe Asn Leu
465 470 475 480
Glu Leu Glu Gly Lys Asp Ile Phe Ala Phe Lys Asn Ile Ala Pro Ser
485 490 495
Glu Ile Ser Lys Lys Met Phe Gln Asn Glu Ile Asn Glu Lys Lys Leu
500 505 510
Lys Leu Lys Ile Phe Arg Gln Leu Asn Ser Ala Asn Val Phe Arg Tyr
515 520 525
Leu Glu Lys Tyr Lys Ile Leu Asn Tyr Leu Lys Arg Thr Arg Phe Glu
530 535 540
Phe Val Asn Lys Asn Ile Pro Phe Val Pro Ser Phe Thr Lys Leu Tyr
545 550 555 560
Ser Arg Ile Asp Asp Leu Lys Asn Ser Leu Gly Ile Tyr Trp Lys Thr
565 570 575
Pro Lys Thr Asn Asp Asp Asn Lys Thr Lys Glu Ile Ile Asp Ala Gln
580 585 590
Ile Tyr Leu Leu Lys Asn Ile Tyr Tyr Gly Glu Phe Leu Asn Tyr Phe
595 600 605
Met Ser Asn Asn Gly Asn Phe Phe Glu Ile Ser Lys Glu Ile Ile Glu
610 615 620
Leu Asn Lys Asn Asp Lys Arg Asn Leu Lys Thr Gly Phe Tyr Lys Leu
625 630 635 640
Gln Lys Phe Glu Asp Ile Gln Glu Lys Ile Pro Lys Glu Tyr Leu Ala
645 650 655
Asn Ile Gln Ser Leu Tyr Met Ile Asn Ala Gly Asn Gln Asp Glu Glu
660 665 670
Glu Lys Asp Thr Tyr Ile Asp Phe Ile Gln Lys Ile Phe Leu Lys Gly
675 680 685
Phe Met Thr Tyr Leu Ala Asn Asn Gly Arg Leu Ser Leu Ile Tyr Ile
690 695 700
Gly Ser Asp Glu Glu Thr Asn Thr Ser Leu Ala Glu Lys Lys Gln Glu
705 710 715 720
Phe Asp Lys Phe Leu Lys Lys Tyr Glu Gln Asn Asn Asn Ile Lys Ile
725 730 735
Pro Tyr Glu Ile Asn Glu Phe Leu Arg Glu Ile Lys Leu Gly Asn Ile
740 745 750
Leu Lys Tyr Thr Glu Arg Leu Asn Met Phe Tyr Leu Ile Leu Lys Leu
755 760 765
Leu Asn His Lys Glu Leu Thr Asn Leu Lys Gly Ser Leu Glu Lys Tyr
770 775 780
Gln Ser Ala Asn Lys Glu Glu Ala Phe Ser Asp Gln Leu Glu Leu Ile
785 790 795 800
Asn Leu Leu Asn Leu Asp Asn Asn Arg Val Thr Glu Asp Phe Glu Leu
805 810 815
Glu Ala Asp Glu Ile Gly Lys Phe Leu Asp Phe Asn Gly Asn Lys Val
820 825 830
Lys Asp Asn Lys Glu Leu Lys Lys Phe Asp Thr Asn Lys Ile Tyr Phe
835 840 845
Asp Gly Glu Asn Ile Ile Lys His Arg Ala Phe Tyr Asn Ile Lys Lys
850 855 860
Tyr Gly Met Leu Asn Leu Leu Glu Lys Ile Ala Asp Lys Ala Gly Tyr
865 870 875 880
Lys Ile Ser Ile Glu Glu Leu Lys Lys Tyr Ser Asn Lys Lys Asn Glu
885 890 895
Ile Glu Lys Asn His Lys Met Gln Glu Asn Leu His Arg Lys Tyr Ala
900 905 910
Arg Pro Arg Lys Asp Glu Lys Phe Thr Asp Glu Asp Tyr Glu Ser Tyr
915 920 925
Lys Gln Ala Ile Glu Asn Ile Glu Glu Tyr Thr His Leu Lys Asn Lys
930 935 940
Val Glu Phe Asn Glu Leu Asn Leu Leu Gln Gly Leu Leu Leu Arg Ile
945 950 955 960
Leu His Arg Leu Val Gly Tyr Thr Ser Ile Trp Glu Arg Asp Leu Arg
965 970 975
Phe Arg Leu Lys Gly Glu Phe Pro Glu Asn Gln Tyr Ile Glu Glu Ile
980 985 990
Phe Asn Phe Glu Asn Lys Lys Asn Val Lys Tyr Lys Gly Gly Gln Ile
995 1000 1005
Val Glu Lys Tyr Ile Lys Phe Tyr Lys Glu Leu His Gln Asn Asp Glu
1010 1015 1020
Val Lys Ile Asn Lys Tyr Ser Ser Ala Asn Ile Lys Val Leu Lys Gln
1025 1030 1035 1040
Glu Lys Lys Asp Leu Tyr Ile Arg Asn Tyr Ile Ala His Phe Asn Tyr
1045 1050 1055
Ile Pro His Ala Glu Ile Ser Leu Leu Glu Val Leu Glu Asn Leu Arg
1060 1065 1070
Lys Leu Leu Ser Tyr Asp Arg Lys Leu Lys Asn Ala Val Met Lys Ser
1075 1080 1085
Val Val Asp Ile Leu Lys Glu Tyr Gly Phe Val Ala Thr Phe Lys Ile
1090 1095 1100
Gly Ala Asp Lys Lys Ile Gly Ile Gln Thr Leu Glu Ser Glu Lys Ile
1105 1110 1115 1120
Val His Leu Lys Asn Leu Lys Lys Lys Lys Leu Met Thr Asp Arg Asn
1125 1130 1135
Ser Glu Glu Leu Cys Lys Leu Val Lys Ile Met Phe Glu Tyr Lys Met
1140 1145 1150
Glu Glu Lys Lys Ser Glu Asn
1155
<210> 355
<211> 1285
<212> PRT
<213> Herbinix hemicellulosilytica
<400> 355
Met Lys Leu Thr Arg Arg Arg Ile Ser Gly Asn Ser Val Asp Gln Lys
1 5 10 15
Ile Thr Ala Ala Phe Tyr Arg Asp Met Ser Gln Gly Leu Leu Tyr Tyr
20 25 30
Asp Ser Glu Asp Asn Asp Cys Thr Asp Lys Val Ile Glu Ser Met Asp
35 40 45
Phe Glu Arg Ser Trp Arg Gly Arg Ile Leu Lys Asn Gly Glu Asp Asp
50 55 60
Lys Asn Pro Phe Tyr Met Phe Val Lys Gly Leu Val Gly Ser Asn Asp
65 70 75 80
Lys Ile Val Cys Glu Pro Ile Asp Val Asp Ser Asp Pro Asp Asn Leu
85 90 95
Asp Ile Leu Ile Asn Lys Asn Leu Thr Gly Phe Gly Arg Asn Leu Lys
100 105 110
Ala Pro Asp Ser Asn Asp Thr Leu Glu Asn Leu Ile Arg Lys Ile Gln
115 120 125
Ala Gly Ile Pro Glu Glu Glu Val Leu Pro Glu Leu Lys Lys Ile Lys
130 135 140
Glu Met Ile Gln Lys Asp Ile Val Asn Arg Lys Glu Gln Leu Leu Lys
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Ser Ile Lys Asn Asn Arg Ile Pro Phe Ser Leu Glu Gly Ser Lys Leu
165 170 175
Val Pro Ser Thr Lys Lys Met Lys Trp Leu Phe Lys Leu Ile Asp Val
180 185 190
Pro Asn Lys Thr Phe Asn Glu Lys Met Leu Glu Lys Tyr Trp Glu Ile
195 200 205
Tyr Asp Tyr Asp Lys Leu Lys Ala Asn Ile Thr Asn Arg Leu Asp Lys
210 215 220
Thr Asp Lys Lys Ala Arg Ser Ile Ser Arg Ala Val Ser Glu Glu Leu
225 230 235 240
Arg Glu Tyr His Lys Asn Leu Arg Thr Asn Tyr Asn Arg Phe Val Ser
245 250 255
Gly Asp Arg Pro Ala Ala Gly Leu Asp Asn Gly Gly Ser Ala Lys Tyr
260 265 270
Asn Pro Asp Lys Glu Glu Phe Leu Leu Phe Leu Lys Glu Val Glu Gln
275 280 285
Tyr Phe Lys Lys Tyr Phe Pro Val Lys Ser Lys His Ser Asn Lys Ser
290 295 300
Lys Asp Lys Ser Leu Val Asp Lys Tyr Lys Asn Tyr Cys Ser Tyr Lys
305 310 315 320
Val Val Lys Lys Glu Val Asn Arg Ser Ile Ile Asn Gln Leu Val Ala
325 330 335
Gly Leu Ile Gln Gln Gly Lys Leu Leu Tyr Tyr Phe Tyr Tyr Asn Asp
340 345 350
Thr Trp Gln Glu Asp Phe Leu Asn Ser Tyr Gly Leu Ser Tyr Ile Gln
355 360 365
Val Glu Glu Ala Phe Lys Lys Ser Val Met Thr Ser Leu Ser Trp Gly
370 375 380
Ile Asn Arg Leu Thr Ser Phe Phe Ile Asp Asp Ser Asn Thr Val Lys
385 390 395 400
Phe Asp Asp Ile Thr Thr Lys Lys Ala Lys Glu Ala Ile Glu Ser Asn
405 410 415
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420 425 430
Glu Lys Leu Ala Phe Phe Tyr Pro Val Tyr Val Lys Asp Lys Lys Asp
435 440 445
Arg Pro Asp Asp Asp Ile Glu Asn Leu Ile Val Leu Val Lys Asn Ala
450 455 460
Ile Glu Ser Val Ser Tyr Leu Arg Asn Arg Thr Phe His Phe Lys Glu
465 470 475 480
Ser Ser Leu Leu Glu Leu Leu Lys Glu Leu Asp Asp Lys Asn Ser Gly
485 490 495
Gln Asn Lys Ile Asp Tyr Ser Val Ala Ala Glu Phe Ile Lys Arg Asp
500 505 510
Ile Glu Asn Leu Tyr Asp Val Phe Arg Glu Gln Ile Arg Ser Leu Gly
515 520 525
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530 535 540
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565 570 575
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Arg Ile Lys Leu Lys Ser Glu Lys Gln Asn Gly Lys Asp Ser Leu Tyr
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<400> 356
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Met Lys Asn Tyr Lys Trp Arg Glu Ala Cys Ser Lys Tyr Val Glu Ser
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Ser Gln Arg Ile Ile Asn Asp Val Ile Phe Tyr Ser Tyr Arg Lys Ala
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Lys Asn Lys Leu Arg Tyr Met Arg Lys Asn Glu Asp Ile Leu Lys Lys
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485 490 495
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565 570 575
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Asp Thr Leu Gly Lys Trp Tyr Ser Ala Cys Tyr Tyr Leu Leu Lys Glu
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755 760 765
Ala Asn Ala Phe Ala Asp Tyr Leu Lys Asn Asn Lys Asp Leu Phe Gly
770 775 780
Phe Ile Gly Lys Pro Phe Lys Ala Asn Glu Ile Arg Glu Ile Asp Lys
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Glu Gln Phe Leu Pro Asp Trp Thr Ser Arg Lys Tyr Glu Ala Leu Cys
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Ile Glu Val Ser Gly Ser Gln Glu Leu Gln Lys Trp Tyr Ile Val Gly
820 825 830
Lys Phe Leu Asn Ala Arg Ser Leu Asn Leu Met Val Gly Ser Met Arg
835 840 845
Ser Tyr Ile Gln Tyr Val Thr Asp Ile Lys Arg Arg Ala Ala Ser Ile
850 855 860
Gly Asn Glu Leu His Val Ser Val His Asp Val Glu Lys Val Glu Lys
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Lys Val Asp Glu Asn Ser Ile Lys Asp Ala Ile Leu Tyr Gln Ile Ile
1075 1080 1085
Gly Met Tyr Val Asn Gly Val Thr Val Tyr Ala Pro Glu Lys Asp Gly
1090 1095 1100
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Ser Ala Phe His Arg Tyr Ser Lys Tyr Leu Gly Leu Asn Glu Lys Thr
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Leu Tyr Asn Ala Gly Leu Glu Ile Phe Glu Val Val Ala Glu His Glu
1140 1145 1150
Asp Ile Ile Asn Leu Arg Asn Gly Ile Asp His Phe Lys Tyr Tyr Leu
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Gly Asp Tyr Arg Ser Met Leu Ser Ile Tyr Ser Glu Val Phe Asp Arg
1170 1175 1180
Phe Phe Thr Tyr Asp Ile Lys Tyr Gln Lys Asn Val Leu Asn Leu Leu
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Ser Gly Phe Lys Thr Ile Gly Glu Gln Thr Lys Pro Gly Ala Lys Leu
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Ser Ile Arg Ser Ile Lys Ser Asp Thr Phe Gln Tyr Lys Val Lys Gly
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Gly Thr Leu Ile Thr Asp Ala Lys Asp Glu Arg Tyr Leu Glu Thr Ile
1250 1255 1260
Arg Lys Ile Leu Tyr Tyr Ala Glu Asn Glu Glu Asp Asn Leu Lys Lys
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Ser Val Val Val Thr Asn Ala Asp Lys Tyr Glu Lys Asn Lys Glu Ser
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Arg Leu Ser Tyr Asn Pro Phe Ala Asn Leu Asn Phe Lys Leu Ser Asn
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<212> PRT
<213> Eubacteriaceae bacterium
<400> 357
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Lys Lys Gln Arg Leu Ser Lys Phe Lys Gly Arg Met Glu Asp Phe Val
130 135 140
Leu Ile Ala Leu Arg Lys Ser Leu Val Val Ser Thr Tyr Asn Gln Glu
145 150 155 160
Val Phe Asp Ser Arg Lys Ala Ala Thr Val Phe Leu Lys Asn Ile Gly
165 170 175
Lys Lys Asn Ile Ser Ala Asp Asp Glu Arg Gln Ile Lys Gln Leu Met
180 185 190
Ala Leu Ile Arg Glu Asp Tyr Asp Lys Trp Asn Pro Asp Lys Asp Ser
195 200 205
Ser Asp Lys Lys Glu Ser Ser Gly Thr Lys Val Ile Arg Ser Ile Glu
210 215 220
His Gln Asn Met Val Ile Gln Pro Glu Lys Asn Lys Leu Ser Leu Ser
225 230 235 240
Lys Ile Ser Asn Val Gly Lys Lys Thr Lys Thr Lys Gln Lys Glu Lys
245 250 255
Ala Gly Leu Asp Ala Phe Leu Lys Glu Tyr Ala Gln Ile Asp Glu Asn
260 265 270
Ser Arg Met Glu Tyr Leu Lys Lys Leu Arg Arg Leu Leu Asp Thr Tyr
275 280 285
Phe Ala Ala Pro Ser Ser Tyr Ile Lys Gly Ala Ala Val Ser Leu Pro
290 295 300
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Ala Ala Lys Lys Val Asn Ile Asn Phe Val Glu Ile Pro Glu Ser Leu
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Leu Asn Ala Glu Gln Asn Asn Asn Lys Ile Asn Lys Val Glu Gln Glu
340 345 350
His Ser Leu Glu Gln Leu Arg Thr Asp Ile Arg Arg Arg Asn Ile Thr
355 360 365
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385 390 395 400
Glu Asn Ala Val Glu Arg Ile Leu Lys Lys Cys Asn Val Gly Thr Leu
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Phe Lys Leu Arg Ile Gly Tyr Leu Ser Glu Lys Val Trp Lys Asp Met
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Leu Asn Leu Leu Ser Ile Lys Tyr Ile Ala Leu Gly Lys Ala Val Tyr
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675 680 685
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Phe Lys Glu Val Tyr Tyr Asn Leu Phe Leu Gln Asp Ser Ser Ala Lys
705 710 715 720
Ala Leu Phe Glu Lys Ala Val Lys Ala Leu Lys Gly Ala Asp Lys Lys
725 730 735
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740 745 750
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755 760 765
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770 775 780
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835 840 845
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850 855 860
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865 870 875 880
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885 890 895
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945 950 955 960
Ser Ala Leu Leu Ala Phe Ser Asn Glu Gly Lys Ile Asp Leu Tyr Val
965 970 975
Asp Ala Ser Asn Pro Lys Val Asn Arg Asn Ile Ile Gln Ala Lys Leu
980 985 990
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995 1000 1005
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Lys Asn Lys Gly Asp Glu Val Ser Trp Glu Glu Gln Gln Lys Ile Leu
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Glu Tyr Gln Lys Leu Lys Asn Arg Val Glu Leu Arg Asp Leu Ser Glu
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Tyr Gly Glu Leu Ile Asn Glu Leu Leu Gly Gln Leu Ile Asn Trp Ser
1060 1065 1070
Tyr Leu Arg Glu Arg Asp Leu Leu Tyr Phe Gln Leu Gly Phe His Tyr
1075 1080 1085
Ser Cys Leu Met Asn Glu Ser Lys Lys Pro Asp Ala Tyr Lys Thr Ile
1090 1095 1100
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1105 1110 1115 1120
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1125 1130 1135
Leu Lys Pro Gln Cys Lys Thr Gly Ser Ala Gly Gln Lys Ile Arg Ala
1140 1145 1150
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1155 1160 1165
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1170 1175 1180
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1185 1190 1195 1200
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1205 1210 1215
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1220 1225 1230
Leu Leu Arg His Asn Val Ile Ile Lys Pro Ile Ile Ser Lys Asp Lys
1235 1240 1245
Lys Glu Val Gly Arg Gly Lys Met Lys Asp Arg Ala Ala Phe Leu Leu
1250 1255 1260
Glu Glu Val Ser Ser Asp Arg Phe Thr Tyr Lys Val Lys Glu Gly Glu
1265 1270 1275 1280
Arg Lys Ile Asp Ala Lys Asn Arg Leu Tyr Leu Glu Thr Val Arg Asp
1285 1290 1295
Ile Leu Tyr Phe Pro Asn Arg Ala Val Asn Asp Lys Gly Glu Asp Val
1300 1305 1310
Ile Ile Cys Ser Lys Lys Ala Gln Asp Leu Asn Glu Lys Lys Ala Asp
1315 1320 1325
Arg Asp Lys Asn His Asp Lys Ser Lys Asp Thr Asn Gln Lys Lys Glu
1330 1335 1340
Gly Lys Asn Gln Glu Glu Lys Ser Glu Asn Lys Glu Pro Tyr Ser Asp
1345 1350 1355 1360
Arg Met Thr Trp Lys Pro Phe Ala Gly Ile Lys Leu Glu
1365 1370
<210> 358
<211> 1276
<212> PRT
<213> Blautia species
<400> 358
Met Lys Ile Ser Lys Val Asp His Val Lys Ser Gly Ile Asp Gln Lys
1 5 10 15
Leu Ser Ser Gln Arg Gly Met Leu Tyr Lys Gln Pro Gln Lys Lys Tyr
20 25 30
Glu Gly Lys Gln Leu Glu Glu His Val Arg Asn Leu Ser Arg Lys Ala
35 40 45
Lys Ala Leu Tyr Gln Val Phe Pro Val Ser Gly Asn Ser Lys Met Glu
50 55 60
Lys Glu Leu Gln Ile Ile Asn Ser Phe Ile Lys Asn Ile Leu Leu Arg
65 70 75 80
Leu Asp Ser Gly Lys Thr Ser Glu Glu Ile Val Gly Tyr Ile Asn Thr
85 90 95
Tyr Ser Val Ala Ser Gln Ile Ser Gly Asp His Ile Gln Glu Leu Val
100 105 110
Asp Gln His Leu Lys Glu Ser Leu Arg Lys Tyr Thr Cys Val Gly Asp
115 120 125
Lys Arg Ile Tyr Val Pro Asp Ile Ile Val Ala Leu Leu Lys Ser Lys
130 135 140
Phe Asn Ser Glu Thr Leu Gln Tyr Asp Asn Ser Glu Leu Lys Ile Leu
145 150 155 160
Ile Asp Phe Ile Arg Glu Asp Tyr Leu Lys Glu Lys Gln Ile Lys Gln
165 170 175
Ile Val His Ser Ile Glu Asn Asn Ser Thr Pro Leu Arg Ile Ala Glu
180 185 190
Ile Asn Gly Gln Lys Arg Leu Ile Pro Ala Asn Val Asp Asn Pro Lys
195 200 205
Lys Ser Tyr Ile Phe Glu Phe Leu Lys Glu Tyr Ala Gln Ser Asp Pro
210 215 220
Lys Gly Gln Glu Ser Leu Leu Gln His Met Arg Tyr Leu Ile Leu Leu
225 230 235 240
Tyr Leu Tyr Gly Pro Asp Lys Ile Thr Asp Asp Tyr Cys Glu Glu Ile
245 250 255
Glu Ala Trp Asn Phe Gly Ser Ile Val Met Asp Asn Glu Gln Leu Phe
260 265 270
Ser Glu Glu Ala Ser Met Leu Ile Gln Asp Arg Ile Tyr Val Asn Gln
275 280 285
Gln Ile Glu Glu Gly Arg Gln Ser Lys Asp Thr Ala Lys Val Lys Lys
290 295 300
Asn Lys Ser Lys Tyr Arg Met Leu Gly Asp Lys Ile Glu His Ser Ile
305 310 315 320
Asn Glu Ser Val Val Lys His Tyr Gln Glu Ala Cys Lys Ala Val Glu
325 330 335
Glu Lys Asp Ile Pro Trp Ile Lys Tyr Ile Ser Asp His Val Met Ser
340 345 350
Val Tyr Ser Ser Lys Asn Arg Val Asp Leu Asp Lys Leu Ser Leu Pro
355 360 365
Tyr Leu Ala Lys Asn Thr Trp Asn Thr Trp Ile Ser Phe Ile Ala Met
370 375 380
Lys Tyr Val Asp Met Gly Lys Gly Val Tyr His Phe Ala Met Ser Asp
385 390 395 400
Val Asp Lys Val Gly Lys Gln Asp Asn Leu Ile Ile Gly Gln Ile Asp
405 410 415
Pro Lys Phe Ser Asp Gly Ile Ser Ser Phe Asp Tyr Glu Arg Ile Lys
420 425 430
Ala Glu Asp Asp Leu His Arg Ser Met Ser Gly Tyr Ile Ala Phe Ala
435 440 445
Val Asn Asn Phe Ala Arg Ala Ile Cys Ser Asp Glu Phe Arg Lys Lys
450 455 460
Asn Arg Lys Glu Asp Val Leu Thr Val Gly Leu Asp Glu Ile Pro Leu
465 470 475 480
Tyr Asp Asn Val Lys Arg Lys Leu Leu Gln Tyr Phe Gly Gly Ala Ser
485 490 495
Asn Trp Asp Asp Ser Ile Ile Asp Ile Ile Asp Asp Lys Asp Leu Val
500 505 510
Ala Cys Ile Lys Glu Asn Leu Tyr Val Ala Arg Asn Val Asn Phe His
515 520 525
Phe Ala Gly Ser Glu Lys Val Gln Lys Lys Gln Asp Asp Ile Leu Glu
530 535 540
Glu Ile Val Arg Lys Glu Thr Arg Asp Ile Gly Lys His Tyr Arg Lys
545 550 555 560
Val Phe Tyr Ser Asn Asn Val Ala Val Phe Tyr Cys Asp Glu Asp Ile
565 570 575
Ile Lys Leu Met Asn His Leu Tyr Gln Arg Glu Lys Pro Tyr Gln Ala
580 585 590
Gln Ile Pro Ser Tyr Asn Lys Val Ile Ser Lys Thr Tyr Leu Pro Asp
595 600 605
Leu Ile Phe Met Leu Leu Lys Gly Lys Asn Arg Thr Lys Ile Ser Asp
610 615 620
Pro Ser Ile Met Asn Met Phe Arg Gly Thr Phe Tyr Phe Leu Leu Lys
625 630 635 640
Glu Ile Tyr Tyr Asn Asp Phe Leu Gln Ala Ser Asn Leu Lys Glu Met
645 650 655
Phe Cys Glu Gly Leu Lys Asn Asn Val Lys Asn Lys Lys Ser Glu Lys
660 665 670
Pro Tyr Gln Asn Phe Met Arg Arg Phe Glu Glu Leu Glu Asn Met Gly
675 680 685
Met Asp Phe Gly Glu Ile Cys Gln Gln Ile Met Thr Asp Tyr Glu Gln
690 695 700
Gln Asn Lys Gln Lys Lys Lys Thr Ala Thr Ala Val Met Ser Glu Lys
705 710 715 720
Asp Lys Lys Ile Arg Thr Leu Asp Asn Asp Thr Gln Lys Tyr Lys His
725 730 735
Phe Arg Thr Leu Leu Tyr Ile Gly Leu Arg Glu Ala Phe Ile Ile Tyr
740 745 750
Leu Lys Asp Glu Lys Asn Lys Glu Trp Tyr Glu Phe Leu Arg Glu Pro
755 760 765
Val Lys Arg Glu Gln Pro Glu Glu Lys Glu Phe Val Asn Lys Trp Lys
770 775 780
Leu Asn Gln Tyr Ser Asp Cys Ser Glu Leu Ile Leu Lys Asp Ser Leu
785 790 795 800
Ala Ala Ala Trp Tyr Val Val Ala His Phe Ile Asn Gln Ala Gln Leu
805 810 815
Asn His Leu Ile Gly Asp Ile Lys Asn Tyr Ile Gln Phe Ile Ser Asp
820 825 830
Ile Asp Arg Arg Ala Lys Ser Thr Gly Asn Pro Val Ser Glu Ser Thr
835 840 845
Glu Ile Gln Ile Glu Arg Tyr Arg Lys Ile Leu Arg Val Leu Glu Phe
850 855 860
Ala Lys Phe Phe Cys Gly Gln Ile Thr Asn Val Leu Thr Asp Tyr Tyr
865 870 875 880
Gln Asp Glu Asn Asp Phe Ser Thr His Val Gly His Tyr Val Lys Phe
885 890 895
Glu Lys Lys Asn Met Glu Pro Ala His Ala Leu Gln Ala Phe Ser Asn
900 905 910
Ser Leu Tyr Ala Cys Gly Lys Glu Lys Lys Lys Ala Gly Phe Tyr Tyr
915 920 925
Asp Gly Met Asn Pro Ile Val Asn Arg Asn Ile Thr Leu Ala Ser Met
930 935 940
Tyr Gly Asn Lys Lys Leu Leu Glu Asn Ala Met Asn Pro Val Thr Glu
945 950 955 960
Gln Asp Ile Arg Lys Tyr Tyr Ser Leu Met Ala Glu Leu Asp Ser Val
965 970 975
Leu Lys Asn Gly Ala Val Cys Lys Ser Glu Asp Glu Gln Lys Asn Leu
980 985 990
Arg His Phe Gln Asn Leu Lys Asn Arg Ile Glu Leu Val Asp Val Leu
995 1000 1005
Thr Leu Ser Glu Leu Val Asn Asp Leu Val Ala Gln Leu Ile Gly Trp
1010 1015 1020
Val Tyr Ile Arg Glu Arg Asp Met Met Tyr Leu Gln Leu Gly Leu His
1025 1030 1035 1040
Tyr Ile Lys Leu Tyr Phe Thr Asp Ser Val Ala Glu Asp Ser Tyr Leu
1045 1050 1055
Arg Thr Leu Asp Leu Glu Glu Gly Ser Ile Ala Asp Gly Ala Val Leu
1060 1065 1070
Tyr Gln Ile Ala Ser Leu Tyr Ser Phe Asn Leu Pro Met Tyr Val Lys
1075 1080 1085
Pro Asn Lys Ser Ser Val Tyr Cys Lys Lys His Val Asn Ser Val Ala
1090 1095 1100
Thr Lys Phe Asp Ile Phe Glu Lys Glu Tyr Cys Asn Gly Asp Glu Thr
1105 1110 1115 1120
Val Ile Glu Asn Gly Leu Arg Leu Phe Glu Asn Ile Asn Leu His Lys
1125 1130 1135
Asp Met Val Lys Phe Arg Asp Tyr Leu Ala His Phe Lys Tyr Phe Ala
1140 1145 1150
Lys Leu Asp Glu Ser Ile Leu Glu Leu Tyr Ser Lys Ala Tyr Asp Phe
1155 1160 1165
Phe Phe Ser Tyr Asn Ile Lys Leu Lys Lys Ser Val Ser Tyr Val Leu
1170 1175 1180
Thr Asn Val Leu Leu Ser Tyr Phe Ile Asn Ala Lys Leu Ser Phe Ser
1185 1190 1195 1200
Thr Tyr Lys Ser Ser Gly Asn Lys Thr Val Gln His Arg Thr Thr Lys
1205 1210 1215
Ile Ser Val Val Ala Gln Thr Asp Tyr Phe Thr Tyr Lys Leu Arg Ser
1220 1225 1230
Ile Val Lys Asn Lys Asn Gly Val Glu Ser Ile Glu Asn Asp Asp Arg
1235 1240 1245
Arg Cys Glu Val Val Asn Ile Ala Ala Arg Asp Lys Glu Phe Val Asp
1250 1255 1260
Glu Val Cys Asn Val Ile Asn Tyr Asn Ser Asp Lys
1265 1270 1275
<210> 359
<211> 1385
<212> PRT
<213> Leptotrichia species
<400> 359
Met Gly Asn Leu Phe Gly His Lys Arg Trp Tyr Glu Val Arg Asp Lys
1 5 10 15
Lys Asp Phe Lys Ile Lys Arg Lys Val Lys Val Lys Arg Asn Tyr Asp
20 25 30
Gly Asn Lys Tyr Ile Leu Asn Ile Asn Glu Asn Asn Asn Lys Glu Lys
35 40 45
Ile Asp Asn Asn Lys Phe Ile Gly Glu Phe Val Asn Tyr Lys Lys Asn
50 55 60
Asn Asn Val Leu Lys Glu Phe Lys Arg Lys Phe His Ala Gly Asn Ile
65 70 75 80
Leu Phe Lys Leu Lys Gly Lys Glu Glu Ile Ile Arg Ile Glu Asn Asn
85 90 95
Asp Asp Phe Leu Glu Thr Glu Glu Val Val Leu Tyr Ile Glu Val Tyr
100 105 110
Gly Lys Ser Glu Lys Leu Lys Ala Leu Glu Ile Thr Lys Lys Lys Ile
115 120 125
Ile Asp Glu Ala Ile Arg Gln Gly Ile Thr Lys Asp Asp Lys Lys Ile
130 135 140
Glu Ile Lys Arg Gln Glu Asn Glu Glu Glu Ile Glu Ile Asp Ile Arg
145 150 155 160
Asp Glu Tyr Thr Asn Lys Thr Leu Asn Asp Cys Ser Ile Ile Leu Arg
165 170 175
Ile Ile Glu Asn Asp Glu Leu Glu Thr Lys Lys Ser Ile Tyr Glu Ile
180 185 190
Phe Lys Asn Ile Asn Met Ser Leu Tyr Lys Ile Ile Glu Lys Ile Ile
195 200 205
Glu Asn Glu Thr Glu Lys Val Phe Glu Asn Arg Tyr Tyr Glu Glu His
210 215 220
Leu Arg Glu Lys Leu Leu Lys Asp Asn Lys Ile Asp Val Ile Leu Thr
225 230 235 240
Asn Phe Met Glu Ile Arg Glu Lys Ile Lys Ser Asn Leu Glu Ile Met
245 250 255
Gly Phe Val Lys Phe Tyr Leu Asn Val Ser Gly Asp Lys Lys Lys Ser
260 265 270
Glu Asn Lys Lys Met Phe Val Glu Lys Ile Leu Asn Thr Asn Val Asp
275 280 285
Leu Thr Val Glu Asp Ile Val Asp Phe Ile Val Lys Glu Leu Lys Phe
290 295 300
Trp Asn Ile Thr Lys Arg Ile Glu Lys Val Lys Lys Phe Asn Asn Glu
305 310 315 320
Phe Leu Glu Asn Arg Arg Asn Arg Thr Tyr Ile Lys Ser Tyr Val Leu
325 330 335
Leu Asp Lys His Glu Lys Phe Lys Ile Glu Arg Glu Asn Lys Lys Asp
340 345 350
Lys Ile Val Lys Phe Phe Val Glu Asn Ile Lys Asn Asn Ser Ile Lys
355 360 365
Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Ala Glu Phe Lys Ile Asn Glu Leu Ile
370 375 380
Lys Lys Leu Glu Lys Glu Leu Lys Lys Gly Asn Cys Asp Thr Glu Ile
385 390 395 400
Phe Gly Ile Phe Lys Lys His Tyr Lys Val Asn Phe Asp Ser Lys Lys
405 410 415
Phe Ser Asn Lys Ser Asp Glu Glu Lys Glu Leu Tyr Lys Ile Ile Tyr
420 425 430
Arg Tyr Leu Lys Gly Arg Ile Glu Lys Ile Leu Val Asn Glu Gln Lys
435 440 445
Val Arg Leu Lys Lys Met Glu Lys Ile Glu Ile Glu Lys Ile Leu Asn
450 455 460
Glu Ser Ile Leu Ser Glu Lys Ile Leu Lys Arg Val Lys Gln Tyr Thr
465 470 475 480
Leu Glu His Ile Met Tyr Leu Gly Lys Leu Arg His Asn Asp Ile Val
485 490 495
Lys Met Thr Val Asn Thr Asp Asp Phe Ser Arg Leu His Ala Lys Glu
500 505 510
Glu Leu Asp Leu Glu Leu Ile Thr Phe Phe Ala Ser Thr Asn Met Glu
515 520 525
Leu Asn Lys Ile Phe Asn Gly Lys Glu Lys Val Thr Asp Phe Phe Gly
530 535 540
Phe Asn Leu Asn Gly Gln Lys Ile Thr Leu Lys Glu Lys Val Pro Ser
545 550 555 560
Phe Lys Leu Asn Ile Leu Lys Lys Leu Asn Phe Ile Asn Asn Glu Asn
565 570 575
Asn Ile Asp Glu Lys Leu Ser His Phe Tyr Ser Phe Gln Lys Glu Gly
580 585 590
Tyr Leu Leu Arg Asn Lys Ile Leu His Asn Ser Tyr Gly Asn Ile Gln
595 600 605
Glu Thr Lys Asn Leu Lys Gly Glu Tyr Glu Asn Val Glu Lys Leu Ile
610 615 620
Lys Glu Leu Lys Val Ser Asp Glu Glu Ile Ser Lys Ser Leu Ser Leu
625 630 635 640
Asp Val Ile Phe Glu Gly Lys Val Asp Ile Ile Asn Lys Ile Asn Ser
645 650 655
Leu Lys Ile Gly Glu Tyr Lys Asp Lys Lys Tyr Leu Pro Ser Phe Ser
660 665 670
Lys Ile Val Leu Glu Ile Thr Arg Lys Phe Arg Glu Ile Asn Lys Asp
675 680 685
Lys Leu Phe Asp Ile Glu Ser Glu Lys Ile Ile Leu Asn Ala Val Lys
690 695 700
Tyr Val Asn Lys Ile Leu Tyr Glu Lys Ile Thr Ser Asn Glu Glu Asn
705 710 715 720
Glu Phe Leu Lys Thr Leu Pro Asp Lys Leu Val Lys Lys Ser Asn Asn
725 730 735
Lys Lys Glu Asn Lys Asn Leu Leu Ser Ile Glu Glu Tyr Tyr Lys Asn
740 745 750
Ala Gln Val Ser Ser Ser Lys Gly Asp Lys Lys Ala Ile Lys Lys Tyr
755 760 765
Gln Asn Lys Val Thr Asn Ala Tyr Leu Glu Tyr Leu Glu Asn Thr Phe
770 775 780
Thr Glu Ile Ile Asp Phe Ser Lys Phe Asn Leu Asn Tyr Asp Glu Ile
785 790 795 800
Lys Thr Lys Ile Glu Glu Arg Lys Asp Asn Lys Ser Lys Ile Ile Ile
805 810 815
Asp Ser Ile Ser Thr Asn Ile Asn Ile Thr Asn Asp Ile Glu Tyr Ile
820 825 830
Ile Ser Ile Phe Ala Leu Leu Asn Ser Asn Thr Tyr Ile Asn Lys Ile
835 840 845
Arg Asn Arg Phe Phe Ala Thr Ser Val Trp Leu Glu Lys Gln Asn Gly
850 855 860
Thr Lys Glu Tyr Asp Tyr Glu Asn Ile Ile Ser Ile Leu Asp Glu Val
865 870 875 880
Leu Leu Ile Asn Leu Leu Arg Glu Asn Asn Ile Thr Asp Ile Leu Asp
885 890 895
Leu Lys Asn Ala Ile Ile Asp Ala Lys Ile Val Glu Asn Asp Glu Thr
900 905 910
Tyr Ile Lys Asn Tyr Ile Phe Glu Ser Asn Glu Glu Lys Leu Lys Lys
915 920 925
Arg Leu Phe Cys Glu Glu Leu Val Asp Lys Glu Asp Ile Arg Lys Ile
930 935 940
Phe Glu Asp Glu Asn Phe Lys Phe Lys Ser Phe Ile Lys Lys Asn Glu
945 950 955 960
Ile Gly Asn Phe Lys Ile Asn Phe Gly Ile Leu Ser Asn Leu Glu Cys
965 970 975
Asn Ser Glu Val Glu Ala Lys Lys Ile Ile Gly Lys Asn Ser Lys Lys
980 985 990
Leu Glu Ser Phe Ile Gln Asn Ile Ile Asp Glu Tyr Lys Ser Asn Ile
995 1000 1005
Arg Thr Leu Phe Ser Ser Glu Phe Leu Glu Lys Tyr Lys Glu Glu Ile
1010 1015 1020
Asp Asn Leu Val Glu Asp Thr Glu Ser Glu Asn Lys Asn Lys Phe Glu
1025 1030 1035 1040
Lys Ile Tyr Tyr Pro Lys Glu His Lys Asn Glu Leu Tyr Ile Tyr Lys
1045 1050 1055
Lys Asn Leu Phe Leu Asn Ile Gly Asn Pro Asn Phe Asp Lys Ile Tyr
1060 1065 1070
Gly Leu Ile Ser Lys Asp Ile Lys Asn Val Asp Thr Lys Ile Leu Phe
1075 1080 1085
Asp Asp Asp Ile Lys Lys Asn Lys Ile Ser Glu Ile Asp Ala Ile Leu
1090 1095 1100
Lys Asn Leu Asn Asp Lys Leu Asn Gly Tyr Ser Asn Asp Tyr Lys Ala
1105 1110 1115 1120
Lys Tyr Val Asn Lys Leu Lys Glu Asn Asp Asp Phe Phe Ala Lys Asn
1125 1130 1135
Ile Gln Asn Glu Asn Tyr Ser Ser Phe Gly Glu Phe Glu Lys Asp Tyr
1140 1145 1150
Asn Lys Val Ser Glu Tyr Lys Lys Ile Arg Asp Leu Val Glu Phe Asn
1155 1160 1165
Tyr Leu Asn Lys Ile Glu Ser Tyr Leu Ile Asp Ile Asn Trp Lys Leu
1170 1175 1180
Ala Ile Gln Met Ala Arg Phe Glu Arg Asp Met His Tyr Ile Val Asn
1185 1190 1195 1200
Gly Leu Arg Glu Leu Gly Ile Ile Lys Leu Ser Gly Tyr Asn Thr Gly
1205 1210 1215
Ile Ser Arg Ala Tyr Pro Lys Arg Asn Gly Ser Asp Gly Phe Tyr Thr
1220 1225 1230
Thr Thr Ala Tyr Tyr Lys Phe Phe Asp Glu Glu Ser Tyr Lys Lys Phe
1235 1240 1245
Glu Lys Ile Cys Tyr Gly Phe Gly Ile Asp Leu Ser Glu Asn Ser Glu
1250 1255 1260
Ile Asn Lys Pro Glu Asn Glu Ser Ile Arg Asn Tyr Ile Ser His Phe
1265 1270 1275 1280
Tyr Ile Val Arg Asn Pro Phe Ala Asp Tyr Ser Ile Ala Glu Gln Ile
1285 1290 1295
Asp Arg Val Ser Asn Leu Leu Ser Tyr Ser Thr Arg Tyr Asn Asn Ser
1300 1305 1310
Thr Tyr Ala Ser Val Phe Glu Val Phe Lys Lys Asp Val Asn Leu Asp
1315 1320 1325
Tyr Asp Glu Leu Lys Lys Lys Phe Arg Leu Ile Gly Asn Asn Asp Ile
1330 1335 1340
Leu Glu Arg Leu Met Lys Pro Lys Lys Val Ser Val Leu Glu Leu Glu
1345 1350 1355 1360
Ser Tyr Asn Ser Asp Tyr Ile Lys Asn Leu Ile Ile Glu Leu Leu Thr
1365 1370 1375
Lys Ile Glu Asn Thr Asn Asp Thr Leu
1380 1385
<210> 360
<211> 500
<212> PRT
<213> Chloroflexus aggregans
<400> 360
Met Thr Asp Gln Val Arg Arg Glu Glu Val Ala Ala Gly Glu Leu Ala
1 5 10 15
Asp Thr Pro Leu Ala Ala Ala Gln Thr Pro Ala Ala Asp Ala Ala Val
20 25 30
Ala Ala Thr Pro Ala Pro Ala Glu Ala Val Ala Pro Thr Pro Glu Gln
35 40 45
Ala Val Asp Gln Pro Ala Thr Thr Gly Glu Ser Glu Ala Pro Val Thr
50 55 60
Thr Ala Gln Ala Ala Ala His Glu Ala Glu Pro Ala Glu Ala Thr Gly
65 70 75 80
Ala Ser Phe Thr Pro Val Ser Glu Gln Gln Pro Gln Lys Pro Arg Arg
85 90 95
Leu Lys Asp Leu Gln Pro Gly Met Glu Leu Glu Gly Lys Val Thr Ser
100 105 110
Ile Ala Leu Tyr Gly Ile Phe Val Asp Val Gly Val Gly Arg Asp Gly
115 120 125
Leu Val His Ile Ser Glu Met Ser Asp Arg Arg Ile Asp Thr Pro Ser
130 135 140
Glu Leu Val Gln Ile Gly Asp Thr Val Lys Val Trp Val Lys Ser Val
145 150 155 160
Asp Leu Asp Ala Arg Arg Ile Ser Leu Thr Met Leu Asn Pro Ser Arg
165 170 175
Gly Glu Lys Pro Arg Arg Ser Arg Gln Ser Gln Pro Ala Gln Pro Gln
180 185 190
Pro Arg Arg Gln Glu Val Asp Arg Glu Lys Leu Ala Ser Leu Lys Val
195 200 205
Gly Glu Ile Val Glu Gly Val Ile Thr Gly Phe Ala Pro Phe Gly Ala
210 215 220
Phe Ala Asp Ile Gly Val Gly Lys Asp Gly Leu Ile His Ile Ser Glu
225 230 235 240
Leu Ser Glu Gly Arg Val Glu Lys Pro Glu Asp Ala Val Lys Val Gly
245 250 255
Glu Arg Tyr Gln Phe Lys Val Leu Glu Ile Asp Gly Glu Gly Thr Arg
260 265 270
Ile Ser Leu Ser Leu Arg Arg Ala Gln Arg Thr Gln Arg Met Gln Gln
275 280 285
Leu Glu Pro Gly Gln Ile Ile Glu Gly Thr Val Ser Gly Ile Ala Thr
290 295 300
Phe Gly Ala Phe Val Asp Ile Gly Val Gly Arg Asp Gly Leu Val His
305 310 315 320
Ile Ser Ala Leu Ala Pro His Arg Val Ala Lys Val Glu Asp Val Val
325 330 335
Lys Val Gly Asp Lys Val Lys Val Lys Val Leu Gly Val Asp Pro Gln
340 345 350
Ser Lys Arg Ile Ser Leu Thr Met Arg Leu Glu Glu Glu Gln Pro Ala
355 360 365
Thr Thr Ala Gly Asp Glu Ala Ala Glu Pro Ala Glu Glu Val Thr Pro
370 375 380
Thr Arg Arg Gly Asn Leu Glu Arg Phe Ala Ala Ala Ala Gln Thr Ala
385 390 395 400
Arg Glu Arg Ser Glu Arg Gly Glu Arg Ser Glu Arg Gly Glu Arg Arg
405 410 415
Glu Arg Arg Glu Arg Arg Pro Ala Gln Ser Ser Pro Asp Thr Tyr Ile
420 425 430
Val Gly Glu Asp Asp Asp Glu Ser Phe Glu Gly Asn Ala Thr Ile Glu
435 440 445
Asp Leu Leu Thr Lys Phe Gly Gly Ser Ser Ser Arg Arg Asp Arg Asp
450 455 460
Arg Arg Arg Arg His Glu Asp Asp Asp Asp Glu Glu Met Glu Arg Pro
465 470 475 480
Ser Asn Arg Arg Gln Arg Glu Ala Ile Arg Arg Thr Leu Gln Gln Ile
485 490 495
Gly Tyr Asp Glu
500
<210> 361
<211> 249
<212> PRT
<213> Demequina aurantiaca
<400> 361
Met Asp Leu Thr Trp His Ala Leu Leu Ile Leu Phe Ile Val Ala Leu
1 5 10 15
Leu Ala Gly Phe Leu Asp Thr Leu Ala Gly Gly Gly Gly Leu Leu Thr
20 25 30
Val Pro Ala Leu Leu Leu Thr Gly Ile Pro Pro Leu Gln Ala Leu Gly
35 40 45
Thr Asn Lys Leu Gln Ser Ser Phe Gly Thr Gly Met Ala Thr Tyr Gln
50 55 60
Val Ile Arg Lys Lys Arg Val His Trp Arg Asp Val Arg Trp Pro Met
65 70 75 80
Val Trp Ala Phe Leu Gly Ser Ala Ala Gly Ala Val Ala Val Gln Phe
85 90 95
Ile Asp Thr Asp Ala Leu Leu Ile Ile Ile Pro Val Val Leu Ala Leu
100 105 110
Val Ala Ala Tyr Phe Leu Phe Val Pro Lys Ser His Leu Pro Pro Pro
115 120 125
Glu Pro Arg Met Ser Asp Pro Ala Tyr Glu Ala Thr Leu Val Pro Ile
130 135 140
Ile Gly Ala Tyr Asp Gly Ala Phe Gly Pro Gly Thr Gly Ser Leu Tyr
145 150 155 160
Ala Leu Ser Gly Val Ala Leu Arg Ala Lys Thr Leu Val Gln Ser Thr
165 170 175
Ala Ile Ala Lys Thr Leu Asn Phe Ala Thr Asn Phe Ala Ala Leu Leu
180 185 190
Val Phe Ala Phe Ala Gly His Met Leu Trp Thr Val Gly Ala Val Met
195 200 205
Ile Ala Gly Gln Leu Ile Gly Ala Tyr Ala Gly Ser His Met Leu Phe
210 215 220
Arg Val Asn Pro Leu Val Leu Arg Val Leu Ile Val Val Met Ser Leu
225 230 235 240
Gly Met Leu Ile Arg Val Leu Leu Asp
245
<210> 362
<211> 1235
<212> PRT
<213> Thalassospira species
<400> 362
Met Arg Ile Ile Lys Pro Tyr Gly Arg Ser His Val Glu Gly Val Ala
1 5 10 15
Thr Gln Glu Pro Arg Arg Lys Leu Arg Leu Asn Ser Ser Pro Asp Ile
20 25 30
Ser Arg Asp Ile Pro Gly Phe Ala Gln Ser His Asp Ala Leu Ile Ile
35 40 45
Ala Gln Trp Ile Ser Ala Ile Asp Lys Ile Ala Thr Lys Pro Lys Pro
50 55 60
Asp Lys Lys Pro Thr Gln Ala Gln Ile Asn Leu Arg Thr Thr Leu Gly
65 70 75 80
Asp Ala Ala Trp Gln His Val Met Ala Glu Asn Leu Leu Pro Ala Ala
85 90 95
Thr Asp Pro Ala Ile Arg Glu Lys Leu His Leu Ile Trp Gln Ser Lys
100 105 110
Ile Ala Pro Trp Gly Thr Ala Arg Pro Gln Ala Glu Lys Asp Gly Lys
115 120 125
Pro Thr Pro Lys Gly Gly Trp Tyr Glu Arg Phe Cys Gly Val Leu Ser
130 135 140
Pro Glu Ala Ile Thr Gln Asn Val Ala Arg Gln Ile Ala Lys Asp Ile
145 150 155 160
Tyr Asp His Leu His Val Ala Ala Lys Arg Lys Gly Arg Glu Pro Ala
165 170 175
Lys Gln Gly Glu Ser Ser Asn Lys Pro Gly Lys Phe Lys Pro Asp Arg
180 185 190
Lys Arg Gly Leu Ile Glu Glu Arg Ala Glu Ser Ile Ala Lys Asn Ala
195 200 205
Leu Arg Pro Gly Ser His Ala Pro Cys Pro Trp Gly Pro Asp Asp Gln
210 215 220
Ala Thr Tyr Glu Gln Ala Gly Asp Val Ala Gly Gln Ile Tyr Ala Ala
225 230 235 240
Ala Arg Asp Cys Leu Glu Glu Lys Lys Arg Arg Ser Gly Asn Arg Asn
245 250 255
Thr Ser Ser Val Gln Tyr Leu Pro Arg Asp Leu Ala Ala Lys Ile Leu
260 265 270
Tyr Ala Gln Tyr Gly Arg Val Phe Gly Pro Asp Thr Thr Ile Lys Ala
275 280 285
Ala Leu Asp Glu Gln Pro Ser Leu Phe Ala Leu His Lys Ala Ile Lys
290 295 300
Asp Cys Tyr His Arg Leu Ile Asn Asp Ala Arg Lys Arg Asp Ile Leu
305 310 315 320
Arg Ile Leu Pro Arg Asn Met Ala Ala Leu Phe Arg Leu Val Arg Ala
325 330 335
Gln Tyr Asp Asn Arg Asp Ile Asn Ala Leu Ile Arg Leu Gly Lys Val
340 345 350
Ile His Tyr His Ala Ser Glu Gln Gly Lys Ser Glu His His Gly Ile
355 360 365
Arg Asp Tyr Trp Pro Ser Gln Gln Asp Ile Gln Asn Ser Arg Phe Trp
370 375 380
Gly Ser Asp Gly Gln Ala Asp Ile Lys Arg His Glu Ala Phe Ser Arg
385 390 395 400
Ile Trp Arg His Ile Ile Ala Leu Ala Ser Arg Thr Leu His Asp Trp
405 410 415
Ala Asp Pro His Ser Gln Lys Phe Ser Gly Glu Asn Asp Asp Ile Leu
420 425 430
Leu Leu Ala Lys Asp Ala Ile Glu Asp Asp Val Phe Lys Ala Gly His
435 440 445
Tyr Glu Arg Lys Cys Asp Val Leu Phe Gly Ala Gln Ala Ser Leu Phe
450 455 460
Cys Gly Ala Glu Asp Phe Glu Lys Ala Ile Leu Lys Gln Ala Ile Thr
465 470 475 480
Gly Thr Gly Asn Leu Arg Asn Ala Thr Phe His Phe Lys Gly Lys Val
485 490 495
Arg Phe Glu Lys Glu Leu Gln Glu Leu Thr Lys Asp Val Pro Val Glu
500 505 510
Val Gln Ser Ala Ile Ala Ala Leu Trp Gln Lys Asp Ala Glu Gly Arg
515 520 525
Thr Arg Gln Ile Ala Glu Thr Leu Gln Ala Val Leu Ala Gly His Phe
530 535 540
Leu Thr Glu Glu Gln Asn Arg His Ile Phe Ala Ala Leu Thr Ala Ala
545 550 555 560
Met Ala Gln Pro Gly Asp Val Pro Leu Pro Arg Leu Arg Arg Val Leu
565 570 575
Ala Arg His Asp Ser Ile Cys Gln Arg Gly Arg Ile Leu Pro Leu Ser
580 585 590
Pro Cys Pro Asp Arg Ala Lys Leu Glu Glu Ser Pro Ala Leu Thr Cys
595 600 605
Gln Tyr Thr Val Leu Lys Met Leu Tyr Asp Gly Pro Phe Arg Ala Trp
610 615 620
Leu Ala Gln Gln Asn Ser Thr Ile Leu Asn His Tyr Ile Asp Ser Thr
625 630 635 640
Ile Ala Arg Thr Asp Lys Ala Ala Arg Asp Met Asn Gly Arg Lys Leu
645 650 655
Ala Gln Ala Glu Lys Asp Leu Ile Thr Ser Arg Ala Ala Asp Leu Pro
660 665 670
Arg Leu Ser Val Asp Glu Lys Met Gly Asp Phe Leu Ala Arg Leu Thr
675 680 685
Ala Ala Thr Ala Thr Glu Met Arg Val Gln Arg Gly Tyr Gln Ser Asp
690 695 700
Gly Glu Asn Ala Gln Lys Gln Ala Ala Phe Ile Gly Gln Phe Glu Cys
705 710 715 720
Asp Val Ile Gly Arg Ala Phe Ala Asp Phe Leu Asn Gln Ser Gly Phe
725 730 735
Asp Phe Val Leu Lys Leu Lys Ala Asp Thr Pro Gln Pro Asp Ala Ala
740 745 750
Gln Cys Asp Val Thr Ala Leu Ile Ala Pro Asp Asp Ile Ser Val Ser
755 760 765
Pro Pro Gln Ala Trp Gln Gln Val Leu Tyr Phe Ile Leu His Leu Val
770 775 780
Pro Val Asp Asp Ala Ser His Leu Leu His Gln Ile Arg Lys Trp Gln
785 790 795 800
Val Leu Glu Gly Lys Glu Lys Pro Ala Gln Ile Ala His Asp Val Gln
805 810 815
Ser Val Leu Met Leu Tyr Leu Asp Met His Asp Ala Lys Phe Thr Gly
820 825 830
Gly Ala Ala Leu His Gly Ile Glu Lys Phe Ala Glu Phe Phe Ala His
835 840 845
Ala Ala Asp Phe Arg Ala Val Phe Pro Pro Gln Ser Leu Gln Asp Gln
850 855 860
Asp Arg Ser Ile Pro Arg Arg Gly Leu Arg Glu Ile Val Arg Phe Gly
865 870 875 880
His Leu Pro Leu Leu Gln His Met Ser Gly Thr Val Gln Ile Thr His
885 890 895
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900 905 910
Met Ser Pro Ile Ala Arg Arg Gln Lys Gln Arg Glu Glu Leu His Ala
915 920 925
Leu Ala Val Glu Arg Thr Ala Arg Phe Arg Asn Ala Asp Leu Gln Asn
930 935 940
Tyr Met His Ala Leu Val Asp Val Ile Lys His Arg Gln Leu Ser Ala
945 950 955 960
Gln Val Thr Leu Ser Asp Gln Val Arg Leu His Arg Leu Met Met Gly
965 970 975
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980 985 990
Tyr Phe Val Val Leu Ala Leu Leu Tyr His His Gly Ala Thr Pro Asp
995 1000 1005
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1010 1015 1020
Val Ala Ala Leu Lys Pro Lys Asn Arg Lys Ala Ala Ala Pro Val Gly
1025 1030 1035 1040
Val Phe Asp Asp Leu Asp His Tyr Gly Ile Tyr Gln Asp Asp Arg Gln
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Ser Ile Arg Asn Gly Leu Ser His Phe Asn Met Leu Arg Gly Gly Lys
1060 1065 1070
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1075 1080 1085
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Met Val Glu Arg Val Val Gln Leu Phe Ala Ala Gln Val Gln Lys Arg
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Gln Asp Gln Lys Gly Lys Asn Gly Ile His Thr His Asn Gly Trp Ser
1205 1210 1215
Lys Thr Glu Lys Lys Arg Arg Pro Ser Arg Glu Asn Arg Lys Gly Asn
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His Glu Asn
1235
<210> 363
<211> 1312
<212> PRT
<213> Pseudobutyrivibrio species
<400> 363
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1 5 10 15
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Arg Ala Ser Lys Asp Leu Ala Lys Val Val Asn Lys Ala Ile Gly Asn
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Glu Lys Lys Leu Ile Val Asn Lys Asp Ile Ile Asp Glu Ala Cys Ser
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305 310 315 320
Arg Ala Leu Ala Tyr Ala Asn Glu Asn Pro Asp Val Phe Phe Ser Asp
325 330 335
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340 345 350
Arg Ile Tyr Gly His Ile Asn Asn Asn Thr Gly Asp Tyr Lys Tyr Gln
355 360 365
Leu Gly Tyr Leu Ser Glu Lys Val Trp Lys Gly Ile Ile Asn Tyr Leu
370 375 380
Ser Ile Lys Tyr Ile Ala Glu Gly Lys Ala Val Tyr Asn Tyr Ala Met
385 390 395 400
Asn Ala Leu Ala Lys Asp Asn Asn Ser Asn Ala Phe Gly Lys Leu Asp
405 410 415
Glu Lys Phe Val Asn Gly Ile Thr Ser Phe Glu Tyr Glu Arg Ile Lys
420 425 430
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435 440 445
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450 455 460
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485 490 495
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500 505 510
Leu Leu Asp Asp Leu Arg Lys Met Ile Tyr Ser Leu Arg Asn Ser Ser
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530 535 540
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565 570 575
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645 650 655
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660 665 670
Asp Gln Lys Leu Lys Ser Glu Arg Asn Ala His Lys Asn Phe Lys Glu
675 680 685
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705 710 715 720
Val Ile Ser Ala Arg Thr Lys Asp Gly Asp Lys Leu Ile Tyr Lys His
725 730 735
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740 745 750
Leu Glu Lys Asn Ile Asn Thr Tyr Gly Phe Leu Lys Lys Pro Lys Leu
755 760 765
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770 775 780
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785 790 795 800
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805 810 815
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820 825 830
Ala Arg Arg Ala Lys Gln Thr Gly Asn Asn Leu Ser Asn Asp Asn Ile
835 840 845
Ala Trp Asp Val Lys Asn Ile Ile Gln Ile Phe Asp Val Cys Thr Lys
850 855 860
Leu Asn Gly Val Thr Ser Asn Ile Leu Glu Asp Tyr Phe Asp Asp Gly
865 870 875 880
Asp Asp Tyr Ala Arg Tyr Leu Lys Asn Phe Val Asp Tyr Thr Asn Lys
885 890 895
Asn Asn Asp His Ser Ala Thr Leu Leu Gly Asp Phe Cys Ala Lys Glu
900 905 910
Ile Asp Gly Ile Lys Ile Gly Ile Tyr His Asp Gly Thr Asn Pro Ile
915 920 925
Val Asn Arg Asn Ile Ile Gln Cys Lys Leu Tyr Gly Ala Thr Gly Ile
930 935 940
Ile Ser Asp Leu Thr Lys Asp Gly Ser Ile Leu Ser Val Asp Tyr Glu
945 950 955 960
Ile Ile Lys Lys Tyr Met Gln Met Gln Lys Glu Ile Lys Val Tyr Gln
965 970 975
Gln Lys Gly Ile Cys Lys Thr Lys Glu Glu Gln Gln Asn Leu Lys Lys
980 985 990
Tyr Gln Glu Leu Lys Asn Ile Val Glu Leu Arg Asn Ile Ile Asp Tyr
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Ser Glu Ile Leu Asp Glu Leu Gln Gly Gln Leu Ile Asn Trp Gly Tyr
1010 1015 1020
Leu Arg Glu Arg Asp Leu Met Tyr Phe Gln Leu Gly Phe His Tyr Leu
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Cys Leu His Asn Glu Ser Lys Lys Pro Val Gly Tyr Asn Asn Ala Gly
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Asp Ile Ser Gly Ala Val Leu Tyr Gln Ile Val Ala Met Tyr Thr Asn
1060 1065 1070
Gly Leu Ser Leu Ile Asp Ala Asn Gly Lys Ser Lys Lys Asn Ala Lys
1075 1080 1085
Ala Ser Ala Gly Ala Lys Val Gly Ser Phe Cys Ser Tyr Ser Lys Glu
1090 1095 1100
Ile Arg Gly Val Asp Lys Asp Thr Lys Glu Asp Asp Asp Pro Ile Tyr
1105 1110 1115 1120
Leu Ala Gly Val Glu Leu Phe Glu Asn Ile Asn Glu His Gln Gln Cys
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Ile Asn Leu Arg Asn Tyr Ile Glu His Phe His Tyr Tyr Ala Lys His
1140 1145 1150
Asp Arg Ser Met Leu Asp Leu Tyr Ser Glu Val Phe Asp Arg Phe Phe
1155 1160 1165
Thr Tyr Asp Met Lys Tyr Thr Lys Asn Val Pro Asn Met Met Tyr Asn
1170 1175 1180
Ile Leu Leu Gln His Leu Val Val Pro Ala Phe Glu Phe Gly Ser Ser
1185 1190 1195 1200
Glu Lys Arg Leu Asp Asp Asn Asp Glu Gln Thr Lys Pro Arg Ala Met
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Phe Thr Leu Arg Glu Lys Asn Gly Leu Ser Ser Glu Gln Phe Thr Tyr
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Arg Leu Gly Asp Gly Asn Ser Thr Val Lys Leu Ser Ala Arg Gly Asp
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Asp Tyr Leu Arg Ala Val Ala Ser Leu Leu Tyr Tyr Pro Asp Arg Ala
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Pro Glu Gly Leu Ile Arg Asp Ala Glu Ala Glu Asp Lys Phe Ala Lys
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Ile Asn His Ser Asn Pro Lys Ser Asp Asn Arg Asn Asn Arg Gly Asn
1285 1290 1295
Phe Lys Asn Pro Lys Val Gln Trp Tyr Asn Asn Lys Thr Lys Arg Lys
1300 1305 1310
<210> 364
<211> 1276
<212> PRT
<213> Blautia species
<400> 364
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1 5 10 15
Leu Ser Ser Gln Arg Gly Met Leu Tyr Lys Gln Pro Gln Lys Lys Tyr
20 25 30
Glu Gly Lys Gln Leu Glu Glu His Val Arg Asn Leu Ser Arg Lys Ala
35 40 45
Lys Ala Leu Tyr Gln Val Phe Pro Val Ser Gly Asn Ser Lys Met Glu
50 55 60
Lys Glu Leu Gln Ile Ile Asn Ser Phe Ile Lys Asn Ile Leu Leu Arg
65 70 75 80
Leu Asp Ser Gly Lys Thr Ser Glu Glu Ile Val Gly Tyr Ile Asn Thr
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Lys Arg Ile Tyr Val Pro Asp Ile Ile Val Ala Leu Leu Lys Ser Lys
130 135 140
Phe Asn Ser Glu Thr Leu Gln Tyr Asp Asn Ser Glu Leu Lys Ile Leu
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Ile Asp Phe Ile Arg Glu Asp Tyr Leu Lys Glu Lys Gln Ile Lys Gln
165 170 175
Ile Val His Ser Ile Glu Asn Asn Ser Thr Pro Leu Arg Ile Ala Glu
180 185 190
Ile Asn Gly Gln Lys Arg Leu Ile Pro Ala Asn Val Asp Asn Pro Lys
195 200 205
Lys Ser Tyr Ile Phe Glu Phe Leu Lys Glu Tyr Ala Gln Ser Asp Pro
210 215 220
Lys Gly Gln Glu Ser Leu Leu Gln His Met Arg Tyr Leu Ile Leu Leu
225 230 235 240
Tyr Leu Tyr Gly Pro Asp Lys Ile Thr Asp Asp Tyr Cys Glu Glu Ile
245 250 255
Glu Ala Trp Asn Phe Gly Ser Ile Val Met Asp Asn Glu Gln Leu Phe
260 265 270
Ser Glu Glu Ala Ser Met Leu Ile Gln Asp Arg Ile Tyr Val Asn Gln
275 280 285
Gln Ile Glu Glu Gly Arg Gln Ser Lys Asp Thr Ala Lys Val Lys Lys
290 295 300
Asn Lys Ser Lys Tyr Arg Met Leu Gly Asp Lys Ile Glu His Ser Ile
305 310 315 320
Asn Glu Ser Val Val Lys His Tyr Gln Glu Ala Cys Lys Ala Val Glu
325 330 335
Glu Lys Asp Ile Pro Trp Ile Lys Tyr Ile Ser Asp His Val Met Ser
340 345 350
Val Tyr Ser Ser Lys Asn Arg Val Asp Leu Asp Lys Leu Ser Leu Pro
355 360 365
Tyr Leu Ala Lys Asn Thr Trp Asn Thr Trp Ile Ser Phe Ile Ala Met
370 375 380
Lys Tyr Val Asp Met Gly Lys Gly Val Tyr His Phe Ala Met Ser Asp
385 390 395 400
Val Asp Lys Val Gly Lys Gln Asp Asn Leu Ile Ile Gly Gln Ile Asp
405 410 415
Pro Lys Phe Ser Asp Gly Ile Ser Ser Phe Asp Tyr Glu Arg Ile Lys
420 425 430
Ala Glu Asp Asp Leu His Arg Ser Met Ser Gly Tyr Ile Ala Phe Ala
435 440 445
Val Asn Asn Phe Ala Arg Ala Ile Cys Ser Asp Glu Phe Arg Lys Lys
450 455 460
Asn Arg Lys Glu Asp Val Leu Thr Val Gly Leu Asp Glu Ile Pro Leu
465 470 475 480
Tyr Asp Asn Val Lys Arg Lys Leu Leu Gln Tyr Phe Gly Gly Ala Ser
485 490 495
Asn Trp Asp Asp Ser Ile Ile Asp Ile Ile Asp Asp Lys Asp Leu Val
500 505 510
Ala Cys Ile Lys Glu Asn Leu Tyr Val Ala Arg Asn Val Asn Phe His
515 520 525
Phe Ala Gly Ser Glu Lys Val Gln Lys Lys Gln Asp Asp Ile Leu Glu
530 535 540
Glu Ile Val Arg Lys Glu Thr Arg Asp Ile Gly Lys His Tyr Arg Lys
545 550 555 560
Val Phe Tyr Ser Asn Asn Val Ala Val Phe Tyr Cys Asp Glu Asp Ile
565 570 575
Ile Lys Leu Met Asn His Leu Tyr Gln Arg Glu Lys Pro Tyr Gln Ala
580 585 590
Gln Ile Pro Ser Tyr Asn Lys Val Ile Ser Lys Thr Tyr Leu Pro Asp
595 600 605
Leu Ile Phe Met Leu Leu Lys Gly Lys Asn Arg Thr Lys Ile Ser Asp
610 615 620
Pro Ser Ile Met Asn Met Phe Arg Gly Thr Phe Tyr Phe Leu Leu Lys
625 630 635 640
Glu Ile Tyr Tyr Asn Asp Phe Leu Gln Ala Ser Asn Leu Lys Glu Met
645 650 655
Phe Cys Glu Gly Leu Lys Asn Asn Val Lys Asn Lys Lys Ser Glu Lys
660 665 670
Pro Tyr Gln Asn Phe Met Arg Arg Phe Glu Glu Leu Glu Asn Met Gly
675 680 685
Met Asp Phe Gly Glu Ile Cys Gln Gln Ile Met Thr Asp Tyr Glu Gln
690 695 700
Gln Asn Lys Gln Lys Lys Lys Thr Ala Thr Ala Val Met Ser Glu Lys
705 710 715 720
Asp Lys Lys Ile Arg Thr Leu Asp Asn Asp Thr Gln Lys Tyr Lys His
725 730 735
Phe Arg Thr Leu Leu Tyr Ile Gly Leu Arg Glu Ala Phe Ile Ile Tyr
740 745 750
Leu Lys Asp Glu Lys Asn Lys Glu Trp Tyr Glu Phe Leu Arg Glu Pro
755 760 765
Val Lys Arg Glu Gln Pro Glu Glu Lys Glu Phe Val Asn Lys Trp Lys
770 775 780
Leu Asn Gln Tyr Ser Asp Cys Ser Glu Leu Ile Leu Lys Asp Ser Leu
785 790 795 800
Ala Ala Ala Trp Tyr Val Val Ala His Phe Ile Asn Gln Ala Gln Leu
805 810 815
Asn His Leu Ile Gly Asp Ile Lys Asn Tyr Ile Gln Phe Ile Ser Asp
820 825 830
Ile Asp Arg Arg Ala Lys Ser Thr Gly Asn Pro Val Ser Glu Ser Thr
835 840 845
Glu Ile Gln Ile Glu Arg Tyr Arg Lys Ile Leu Arg Val Leu Glu Phe
850 855 860
Ala Lys Phe Phe Cys Gly Gln Ile Thr Asn Val Leu Thr Asp Tyr Tyr
865 870 875 880
Gln Asp Glu Asn Asp Phe Ser Thr His Val Gly His Tyr Val Lys Phe
885 890 895
Glu Lys Lys Asn Met Glu Pro Ala His Ala Leu Gln Ala Phe Ser Asn
900 905 910
Ser Leu Tyr Ala Cys Gly Lys Glu Lys Lys Lys Ala Gly Phe Tyr Tyr
915 920 925
Asp Gly Met Asn Pro Ile Val Asn Arg Asn Ile Thr Leu Ala Ser Met
930 935 940
Tyr Gly Asn Lys Lys Leu Leu Glu Asn Ala Met Asn Pro Val Thr Glu
945 950 955 960
Gln Asp Ile Arg Lys Tyr Tyr Ser Leu Met Ala Glu Leu Asp Ser Val
965 970 975
Leu Lys Asn Gly Ala Val Cys Lys Ser Glu Asp Glu Gln Lys Asn Leu
980 985 990
Arg His Phe Gln Asn Leu Lys Asn Arg Ile Glu Leu Val Asp Val Leu
995 1000 1005
Thr Leu Ser Glu Leu Val Asn Asp Leu Val Ala Gln Leu Ile Gly Trp
1010 1015 1020
Val Tyr Ile Arg Glu Arg Asp Met Met Tyr Leu Gln Leu Gly Leu His
1025 1030 1035 1040
Tyr Ile Lys Leu Tyr Phe Thr Asp Ser Val Ala Glu Asp Ser Tyr Leu
1045 1050 1055
Arg Thr Leu Asp Leu Glu Glu Gly Ser Ile Ala Asp Gly Ala Val Leu
1060 1065 1070
Tyr Gln Ile Ala Ser Leu Tyr Ser Phe Asn Leu Pro Met Tyr Val Lys
1075 1080 1085
Pro Asn Lys Ser Ser Val Tyr Cys Lys Lys His Val Asn Ser Val Ala
1090 1095 1100
Thr Lys Phe Asp Ile Phe Glu Lys Glu Tyr Cys Asn Gly Asp Glu Thr
1105 1110 1115 1120
Val Ile Glu Asn Gly Leu Arg Leu Phe Glu Asn Ile Asn Leu His Lys
1125 1130 1135
Asp Met Val Lys Phe Arg Asp Tyr Leu Ala His Phe Lys Tyr Phe Ala
1140 1145 1150
Lys Leu Asp Glu Ser Ile Leu Glu Leu Tyr Ser Lys Ala Tyr Asp Phe
1155 1160 1165
Phe Phe Ser Tyr Asn Ile Lys Leu Lys Lys Ser Val Ser Tyr Val Leu
1170 1175 1180
Thr Asn Val Leu Leu Ser Tyr Phe Ile Asn Ala Lys Leu Ser Phe Ser
1185 1190 1195 1200
Thr Tyr Lys Ser Ser Gly Asn Lys Thr Val Gln His Arg Thr Thr Lys
1205 1210 1215
Ile Ser Val Val Ala Gln Thr Asp Tyr Phe Thr Tyr Lys Leu Arg Ser
1220 1225 1230
Ile Val Lys Asn Lys Asn Gly Val Glu Ser Ile Glu Asn Asp Asp Arg
1235 1240 1245
Arg Cys Glu Val Val Asn Ile Ala Ala Arg Asp Lys Glu Phe Val Asp
1250 1255 1260
Glu Val Cys Asn Val Ile Asn Tyr Asn Ser Asp Lys
1265 1270 1275
<210> 365
<211> 1168
<212> PRT
<213> Leptotrichia species
<400> 365
Met Lys Ile Thr Lys Ile Asp Gly Ile Ser His Lys Lys Tyr Ile Lys
1 5 10 15
Glu Gly Lys Leu Val Lys Ser Thr Ser Glu Glu Asn Lys Thr Asp Glu
20 25 30
Arg Leu Ser Glu Leu Leu Thr Ile Arg Leu Asp Thr Tyr Ile Lys Asn
35 40 45
Pro Asp Asn Ala Ser Glu Glu Glu Asn Arg Ile Arg Arg Glu Asn Leu
50 55 60
Lys Glu Phe Phe Ser Asn Lys Val Leu Tyr Leu Lys Asp Gly Ile Leu
65 70 75 80
Tyr Leu Lys Asp Arg Arg Glu Lys Asn Gln Leu Gln Asn Lys Asn Tyr
85 90 95
Ser Glu Glu Asp Ile Ser Glu Tyr Asp Leu Lys Asn Lys Asn Asn Phe
100 105 110
Leu Val Leu Lys Lys Ile Leu Leu Asn Glu Asp Ile Asn Ser Glu Glu
115 120 125
Leu Glu Ile Phe Arg Asn Asp Phe Glu Lys Lys Leu Asp Lys Ile Asn
130 135 140
Ser Leu Lys Tyr Ser Leu Glu Glu Asn Lys Ala Asn Tyr Gln Lys Ile
145 150 155 160
Asn Glu Asn Asn Ile Lys Lys Val Glu Gly Lys Ser Lys Arg Asn Ile
165 170 175
Phe Tyr Asn Tyr Tyr Lys Asp Ser Ala Lys Arg Asn Asp Tyr Ile Asn
180 185 190
Asn Ile Gln Glu Ala Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Lys Glu Asp Ile Glu
195 200 205
Asn Leu Phe Phe Leu Ile Glu Asn Ser Lys Lys His Glu Lys Tyr Lys
210 215 220
Ile Arg Glu Cys Tyr His Lys Ile Ile Gly Arg Lys Asn Asp Lys Glu
225 230 235 240
Asn Phe Ala Thr Ile Ile Tyr Glu Glu Ile Gln Asn Val Asn Asn Met
245 250 255
Lys Glu Leu Ile Glu Lys Val Pro Asn Val Ser Glu Leu Lys Lys Ser
260 265 270
Gln Val Phe Tyr Lys Tyr Tyr Leu Asn Lys Glu Lys Leu Asn Asp Glu
275 280 285
Asn Ile Lys Tyr Val Phe Cys His Phe Val Glu Ile Glu Met Ser Lys
290 295 300
Leu Leu Lys Asn Tyr Val Tyr Lys Lys Pro Ser Asn Ile Ser Asn Asp
305 310 315 320
Lys Val Lys Arg Ile Phe Glu Tyr Gln Ser Leu Lys Lys Leu Ile Glu
325 330 335
Asn Lys Leu Leu Asn Lys Leu Asp Thr Tyr Val Arg Asn Cys Gly Lys
340 345 350
Tyr Ser Phe Tyr Leu Gln Asp Gly Glu Ile Ala Thr Ser Asp Phe Ile
355 360 365
Val Gly Asn Arg Gln Asn Glu Ala Phe Leu Arg Asn Ile Ile Gly Val
370 375 380
Ser Ser Thr Ala Tyr Phe Ser Leu Arg Asn Ile Leu Glu Thr Glu Asn
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Glu Asn Asp Ile Thr Gly Arg Met Arg Gly Lys Thr Val Lys Asn Asn
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Lys Gly Glu Glu Lys Tyr Ile Ser Gly Glu Ile Asp Lys Leu Tyr Asp
420 425 430
Asn Asn Lys Gln Asn Glu Val Lys Lys Asn Leu Lys Met Phe Tyr Ser
435 440 445
Tyr Asp Phe Asn Met Asn Ser Lys Lys Glu Ile Glu Asp Phe Phe Ser
450 455 460
Asn Ile Asp Glu Ala Ile Ser Ser Ile Arg His Gly Ile Val His Phe
465 470 475 480
Asn Leu Glu Leu Glu Gly Lys Asp Ile Phe Thr Phe Lys Asn Ile Val
485 490 495
Pro Ser Gln Ile Ser Lys Lys Met Phe His Asp Glu Ile Asn Glu Lys
500 505 510
Lys Leu Lys Leu Lys Ile Phe Lys Gln Leu Asn Ser Ala Asn Val Phe
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Tyr Ile Gly Ser Asp Glu Glu Thr Asn Thr Ser Leu Ala Glu Lys Lys
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Leu Arg Lys Leu Leu Ser Tyr Asp Arg Lys Leu Lys Asn Ala Ile Met
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Val Lys Val Met Phe Glu Tyr Lys Met Lys Glu Lys Lys Ser Glu Asn
1155 1160 1165
<210> 366
<211> 1138
<212> PRT
<213> Bacteroides ihuae
<400> 366
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1 5 10 15
Lys Met Val Leu Ile His Arg Lys Val Gly Glu Gly Thr Leu Val Leu
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Asp Lys Ser Phe Glu Leu Ser Leu Leu Lys Gln Thr Leu Val Ser Glu
50 55 60
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Cys Leu Ser Cys Lys Gln Arg Glu Lys Arg Leu Lys Glu Val Arg Gly
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Pro Lys Leu Arg Asn Glu Phe Thr Phe Lys Asp Val Asn Lys Gln Val
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Asn Gln Ala Ile Tyr Tyr Leu Lys Val Glu Thr Leu Lys Glu Arg Leu
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435 440 445
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545 550 555 560
Tyr Leu Met Leu Ile Gly Gly Arg Val Ala Asn Ser Thr Val Thr Lys
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Lys Glu Tyr Leu Ser Phe Phe Ile Lys Gly Asn Glu Ser Glu Asn Thr
805 810 815
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Tyr Ser Pro Ile Glu Leu Ile Arg Lys Tyr Gly Thr Leu Glu Leu Leu
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885 890 895
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900 905 910
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915 920 925
Leu His Asn Leu Val Ile Gln Ile Leu Ser Arg Met Ala Arg Phe Ile
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Ala Leu Trp Asp Arg Asp Phe Val Leu Leu Asp Ala Ser Arg Ala Asn
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Asp Asp Tyr Lys Leu Leu Ser Phe Phe Asn Phe Arg Asp Phe Ile Asn
965 970 975
Ala Lys Lys Thr Lys Thr Asp Asp Glu Leu Leu Ala Glu Phe Gly Ser
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Leu Met Val Glu Cys Ile Glu Ala Lys Arg Ser Phe Tyr Gln Lys Val
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His Tyr Asn Tyr Ile Ser Lys Thr Ala Lys Cys Ser Leu Phe Glu Met
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Ile Ile Lys Leu Arg Thr Leu Met Tyr Tyr Asp Arg Lys Leu Arg Asn
1060 1065 1070
Ala Val Val Lys Ser Ile Ala Asn Val Phe Asp Gln Asn Gly Met Val
1075 1080 1085
Leu Gln Leu Ser Leu Asp Asp Ser His Glu Leu Lys Val Asp Lys Val
1090 1095 1100
Ile Ser Lys Arg Ile Val His Leu Lys Asn Asn Asn Ile Met Thr Asp
1105 1110 1115 1120
Gln Val Pro Glu Glu Tyr Tyr Lys Ile Cys Arg Arg Leu Leu Glu Met
1125 1130 1135
Lys Lys
<210> 367
<211> 204
<212> PRT
<213> Listeria riparia
<400> 367
Met His Asp Ala Trp Ala Glu Asn Pro Lys Lys Pro Gln Ser Asp Ala
1 5 10 15
Phe Leu Lys Glu Tyr Lys Ala Cys Cys Glu Ala Ile Asp Thr Tyr Asn
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Trp His Lys Asn Lys Ala Thr Leu Val Tyr Val Asn Glu Leu His His
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Leu Leu Ile Asp Ile Leu Gly Arg Leu Val Gly Tyr Val Ala Ile Ala
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Ser Leu Ile Asp Leu Leu Asp Lys His Gly Met Cys Val Val Phe Ala
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Asn Leu Lys Asn Asn Lys His Arg Leu Val Ile Ala Ser Leu Lys Pro
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Lys Lys Ile Glu Thr Phe Lys Trp Lys Lys Ile Lys
195 200
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<212> PRT
<213> Insolitispirillum peregrinum
<400> 368
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Pro Gln Asp Ala Gln Pro Leu Arg Ser Leu Gln Arg Gln Asn Gly Thr
20 25 30
Phe Asp Val Ala Glu Phe Ser Arg Arg His Pro Glu Leu Val Leu Ala
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50 55 60
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145 150 155 160
Arg Ala Asn Gly Gly Gln Pro Lys Gly Lys Gly Val Ile Glu His Arg
165 170 175
Ala Leu Thr Ile Gln Asn Gly Thr Leu Leu His His His Gln Ser Glu
180 185 190
Lys Ala Gly Pro Leu Pro Glu Asp Trp Ser Thr Tyr Arg Ala Asp Glu
195 200 205
Leu Val Ser Thr Ile Gly Lys Asp Ala Arg Trp Ile Lys Val Ala Ala
210 215 220
Ser Leu Tyr Gln His Tyr Gly Arg Ile Phe Gly Pro Thr Thr Pro Ile
225 230 235 240
Ser Glu Ala Gln Thr Arg Pro Glu Phe Val Leu His Thr Ala Val Lys
245 250 255
Ala Tyr Tyr Arg Arg Leu Phe Lys Glu Arg Lys Leu Pro Ala Glu Arg
260 265 270
Leu Glu Arg Leu Leu Pro Arg Thr Gly Glu Ala Leu Arg His Ala Val
275 280 285
Thr Val Gln His Gly Asn Arg Ser Leu Ala Asp Ala Val Arg Ile Gly
290 295 300
Lys Ile Leu His Tyr Gly Trp Leu Gln Asn Gly Glu Pro Asp Pro Trp
305 310 315 320
Pro Asp Asp Ala Ala Leu Tyr Ser Ser Arg Tyr Trp Gly Ser Asp Gly
325 330 335
Gln Thr Asp Ile Lys His Ser Glu Ala Val Ser Arg Val Trp Arg Arg
340 345 350
Ala Leu Thr Ala Ala Gln Arg Thr Leu Thr Ser Trp Leu Tyr Pro Ala
355 360 365
Gly Thr Asp Ala Gly Asp Ile Leu Leu Ile Gly Gln Lys Pro Asp Ser
370 375 380
Ile Asp Arg Asn Arg Leu Pro Leu Leu Tyr Gly Asp Ser Thr Arg His
385 390 395 400
Trp Thr Arg Ser Pro Gly Asp Val Trp Leu Phe Leu Lys Gln Thr Leu
405 410 415
Glu Asn Leu Arg Asn Ser Ser Phe His Phe Lys Thr Leu Ser Ala Phe
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435 440 445
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Gly Ala Gly Thr Gly Leu Arg Trp Asp Asp Trp Gln Val Phe Phe Asp
755 760 765
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Ser His Arg Leu Pro Leu Arg Gly Leu Arg Glu Val Leu Arg Phe Gly
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885 890 895
Gly Leu Trp Glu Arg Asp Leu Thr Phe Val Thr Leu Tyr Glu Ala His
900 905 910
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Gln Ile Arg Asn Asp Phe Ala His Phe Asn Met Leu Gln Gln Gly Lys
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1010 1015 1020
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1025 1030 1035 1040
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1045 1050 1055
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1060 1065 1070
Ser Ala Thr Lys Lys Ser Asp Lys Ile Arg
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<220>
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<220>
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<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (22)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<400> 369
Met Lys Ile Ser Lys Val Xaa Xaa Xaa Val Xaa Lys Lys Xaa Xaa Xaa
1 5 10 15
Gly Lys Leu Xaa Lys Xaa Val Asn Glu Arg Asn Arg Xaa Ala Lys Arg
20 25 30
Leu Ser Asn Xaa Leu Asx Lys Tyr Ile Xaa Xaa Ile Asp Lys Ile Xaa
35 40 45
Lys Lys Glu Xaa Xaa Lys Lys Phe Xaa Ala Xaa Glu Glu Ile Thr Leu
50 55 60
Lys Leu Asn Gln Xaa Xaa Xaa Asx Xaa Leu Xaa Lys Ala Xaa Xaa Asp
65 70 75 80
Leu Arg Lys Asp Asn Xaa Tyr Ser Xaa Xaa Lys Lys Ile Leu His Asn
85 90 95
Glu Asp Ile Asn Xaa Glu Glu Xaa Glu Leu Leu Ile Asn Asp Xaa Leu
100 105 110
Glu Lys Leu Xaa Lys Ile Glu Ser Xaa Lys Tyr Ser Tyr Gln Lys Xaa
115 120 125
Xaa Xaa Asn Tyr Xaa Met Ser Val Gln Glu His Ser Lys Lys Ser Ile
130 135 140
Xaa Arg Ile Xaa Glu Ser Ala Lys Arg Asn Lys Glu Ala Leu Asp Lys
145 150 155 160
Phe Leu Lys Glu Tyr Ala Xaa Leu Asp Pro Arg Met Glu Xaa Leu Ala
165 170 175
Lys Leu Arg Lys Leu Leu Glu Leu Tyr Phe Tyr Phe Lys Asn Asp Xaa
180 185 190
Ile Xaa Xaa Glu Glu Glu Xaa Asn Val Xaa Xaa His Lys Xaa Leu Lys
195 200 205
Glu Asn His Pro Asp Phe Val Glu Xaa Xaa Xaa Asn Lys Glu Asn Ala
210 215 220
Glu Leu Asn Xaa Tyr Ala Ile Glu Xaa Lys Lys Xaa Leu Lys Tyr Tyr
225 230 235 240
Phe Pro Xaa Lys Xaa Ala Lys Asn Ser Asn Asp Lys Ile Phe Glu Lys
245 250 255
Gln Glu Leu Lys Lys Xaa Trp Ile His Gln Xaa Glu Asn Ala Val Glu
260 265 270
Arg Ile Leu Leu Xaa Xaa Gly Lys Val Xaa Tyr Lys Leu Gln Xaa Gly
275 280 285
Tyr Leu Ala Glu Leu Trp Lys Ile Arg Ile Asn Glu Ile Phe Ile Lys
290 295 300
Tyr Ile Xaa Val Gly Lys Ala Val Ala Xaa Phe Ala Leu Arg Asn Xaa
305 310 315 320
Xaa Lys Asx Glu Asn Asp Ile Leu Gly Gly Lys Ile Xaa Lys Lys Leu
325 330 335
Asn Gly Ile Thr Ser Phe Xaa Tyr Glu Lys Ile Lys Ala Glu Glu Ile
340 345 350
Leu Gln Arg Glu Xaa Ala Val Glu Val Ala Phe Ala Ala Asn Xaa Leu
355 360 365
Tyr Ala Xaa Asp Leu Xaa Xaa Ile Arg Xaa Ser Ile Leu Gln Phe Phe
370 375 380
Gly Gly Ala Ser Asn Trp Asp Xaa Phe Leu Phe Phe His Phe Ala Thr
385 390 395 400
Ser Xaa Ile Ser Asp Lys Lys Trp Asn Ala Glu Leu Ile Xaa Xaa Lys
405 410 415
Lys Xaa Gly Leu Val Ile Arg Glu Lys Leu Tyr Ser Asn Asn Val Ala
420 425 430
Met Phe Tyr Ser Lys Asp Asp Leu Glu Lys Leu Leu Asn Xaa Leu Xaa
435 440 445
Xaa Phe Xaa Leu Arg Ala Ser Gln Val Pro Ser Phe Lys Lys Val Tyr
450 455 460
Val Arg Xaa Asx Phe Pro Gln Asn Leu Leu Lys Lys Phe Asn Asp Glu
465 470 475 480
Lys Asp Asp Glu Ala Tyr Ser Ala Xaa Tyr Tyr Leu Leu Lys Glu Ile
485 490 495
Tyr Tyr Asn Xaa Phe Leu Pro Tyr Phe Ser Ala Asn Asn Xaa Phe Phe
500 505 510
Phe Xaa Val Lys Asn Leu Val Leu Lys Ala Asn Lys Asp Lys Phe Xaa
515 520 525
Xaa Ala Phe Xaa Asp Ile Arg Glu Met Asn Xaa Gly Ser Pro Ile Glu
530 535 540
Tyr Leu Xaa Xaa Thr Gln Xaa Asn Xaa Xaa Asn Glu Gly Arg Lys Lys
545 550 555 560
Glu Glu Lys Glu Xaa Asp Phe Ile Lys Phe Leu Leu Gln Ile Phe Xaa
565 570 575
Lys Gly Phe Asp Asp Tyr Leu Lys Asn Asn Xaa Xaa Phe Ile Leu Lys
580 585 590
Phe Ile Pro Glu Pro Thr Glu Xaa Ile Glu Ile Xaa Xaa Glu Leu Gln
595 600 605
Ala Trp Tyr Ile Val Gly Lys Phe Leu Asn Ala Arg Lys Xaa Asn Leu
610 615 620
Leu Gly Xaa Phe Xaa Ser Tyr Leu Lys Leu Leu Asp Asp Ile Glu Leu
625 630 635 640
Arg Ala Leu Arg Asn Glu Asn Ile Lys Tyr Gln Ser Ser Asn Xaa Glu
645 650 655
Lys Glu Val Leu Glu Xaa Cys Leu Glu Leu Ile Gly Leu Leu Ser Leu
660 665 670
Asp Leu Asn Asp Tyr Phe Asx Asp Glu Xaa Asp Phe Ala Xaa Tyr Xaa
675 680 685
Gly Lys Xaa Leu Asp Phe Glu Lys Lys Xaa Met Lys Asp Leu Ala Glu
690 695 700
Leu Xaa Pro Tyr Asp Gln Asn Asp Gly Glu Asn Pro Ile Val Asn Arg
705 710 715 720
Asn Ile Xaa Leu Ala Lys Lys Tyr Gly Thr Leu Asn Leu Leu Glu Lys
725 730 735
Xaa Xaa Asp Lys Val Ser Glu Lys Glu Ile Lys Glu Tyr Tyr Glu Leu
740 745 750
Lys Lys Glu Ile Glu Glu Tyr Xaa Xaa Lys Gly Glu Glu Leu His Glu
755 760 765
Glu Trp Xaa Gln Xaa Lys Asn Arg Val Glu Xaa Arg Asp Ile Leu Glu
770 775 780
Tyr Xaa Glu Glu Leu Xaa Gly Gln Ile Ile Asn Tyr Asn Xaa Leu Xaa
785 790 795 800
Asn Lys Val Leu Leu Tyr Phe Gln Leu Gly Leu His Tyr Leu Leu Leu
805 810 815
Asp Ile Leu Gly Arg Leu Val Gly Tyr Thr Gly Ile Trp Glu Arg Asp
820 825 830
Ala Xaa Leu Tyr Gln Ile Ala Ala Met Tyr Xaa Asn Gly Leu Pro Glu
835 840 845
Tyr Ile Xaa Xaa Lys Lys Asn Asp Lys Tyr Lys Asp Gly Gln Ile Val
850 855 860
Gly Xaa Lys Ile Asn Xaa Phe Lys Xaa Asp Lys Lys Xaa Leu Tyr Asn
865 870 875 880
Ala Gly Leu Glu Leu Phe Glu Asn Xaa Asn Glu His Lys Asn Ile Xaa
885 890 895
Ile Arg Asn Tyr Ile Ala His Phe Asn Tyr Leu Ser Lys Ala Glu Ser
900 905 910
Ser Leu Leu Xaa Tyr Ser Glu Asn Leu Arg Xaa Leu Phe Ser Tyr Asp
915 920 925
Arg Lys Leu Lys Asn Ala Val Xaa Lys Ser Leu Ile Asn Ile Leu Leu
930 935 940
Arg His Gly Met Val Leu Lys Phe Lys Phe Gly Thr Asp Lys Lys Ser
945 950 955 960
Val Xaa Ile Arg Ser Xaa Lys Lys Ile Xaa His Leu Lys Ser Ile Ala
965 970 975
Lys Lys Leu Tyr Tyr Pro Glu Val Xaa Val Ser Lys Glu Tyr Cys Lys
980 985 990
Leu Val Lys Xaa Leu Leu Lys Tyr Lys
995 1000
<210> 370
<211> 1224
<212> PRT
<213> Bergeyella zoohelcum
<400> 370
Met Glu Asn Lys Thr Ser Leu Gly Asn Asn Ile Tyr Tyr Asn Pro Phe
1 5 10 15
Lys Pro Gln Asp Lys Ser Tyr Phe Ala Gly Tyr Phe Asn Ala Ala Met
20 25 30
Glu Asn Thr Asp Ser Val Phe Arg Glu Leu Gly Lys Arg Leu Lys Gly
35 40 45
Lys Glu Tyr Thr Ser Glu Asn Phe Phe Asp Ala Ile Phe Lys Glu Asn
50 55 60
Ile Ser Leu Val Glu Tyr Glu Arg Tyr Val Lys Leu Leu Ser Asp Tyr
65 70 75 80
Phe Pro Met Ala Arg Leu Leu Asp Lys Lys Glu Val Pro Ile Lys Glu
85 90 95
Arg Lys Glu Asn Phe Lys Lys Asn Phe Lys Gly Ile Ile Lys Ala Val
100 105 110
Arg Asp Leu Arg Asn Phe Tyr Thr His Lys Glu His Gly Glu Val Glu
115 120 125
Ile Thr Asp Glu Ile Phe Gly Val Leu Asp Glu Met Leu Lys Ser Thr
130 135 140
Val Leu Thr Val Lys Lys Lys Lys Val Lys Thr Asp Lys Thr Lys Glu
145 150 155 160
Ile Leu Lys Lys Ser Ile Glu Lys Gln Leu Asp Ile Leu Cys Gln Lys
165 170 175
Lys Leu Glu Tyr Leu Arg Asp Thr Ala Arg Lys Ile Glu Glu Lys Arg
180 185 190
Arg Asn Gln Arg Glu Arg Gly Glu Lys Glu Leu Val Ala Pro Phe Lys
195 200 205
Tyr Ser Asp Lys Arg Asp Asp Leu Ile Ala Ala Ile Tyr Asn Asp Ala
210 215 220
Phe Asp Val Tyr Ile Asp Lys Lys Lys Asp Ser Leu Lys Glu Ser Ser
225 230 235 240
Lys Ala Lys Tyr Asn Thr Lys Ser Asp Pro Gln Gln Glu Glu Gly Asp
245 250 255
Leu Lys Ile Pro Ile Ser Lys Asn Gly Val Val Phe Leu Leu Ser Leu
260 265 270
Phe Leu Thr Lys Gln Glu Ile His Ala Phe Lys Ser Lys Ile Ala Gly
275 280 285
Phe Lys Ala Thr Val Ile Asp Glu Ala Thr Val Ser Glu Ala Thr Val
290 295 300
Ser His Gly Lys Asn Ser Ile Cys Phe Met Ala Thr His Glu Ile Phe
305 310 315 320
Ser His Leu Ala Tyr Lys Lys Leu Lys Arg Lys Val Arg Thr Ala Glu
325 330 335
Ile Asn Tyr Gly Glu Ala Glu Asn Ala Glu Gln Leu Ser Val Tyr Ala
340 345 350
Lys Glu Thr Leu Met Met Gln Met Leu Asp Glu Leu Ser Lys Val Pro
355 360 365
Asp Val Val Tyr Gln Asn Leu Ser Glu Asp Val Gln Lys Thr Phe Ile
370 375 380
Glu Asp Trp Asn Glu Tyr Leu Lys Glu Asn Asn Gly Asp Val Gly Thr
385 390 395 400
Met Glu Glu Glu Gln Val Ile His Pro Val Ile Arg Lys Arg Tyr Glu
405 410 415
Asp Lys Phe Asn Tyr Phe Ala Ile Arg Phe Leu Asp Glu Phe Ala Gln
420 425 430
Phe Pro Thr Leu Arg Phe Gln Val His Leu Gly Asn Tyr Leu His Asp
435 440 445
Ser Arg Pro Lys Glu Asn Leu Ile Ser Asp Arg Arg Ile Lys Glu Lys
450 455 460
Ile Thr Val Phe Gly Arg Leu Ser Glu Leu Glu His Lys Lys Ala Leu
465 470 475 480
Phe Ile Lys Asn Thr Glu Thr Asn Glu Asp Arg Glu His Tyr Trp Glu
485 490 495
Ile Phe Pro Asn Pro Asn Tyr Asp Phe Pro Lys Glu Asn Ile Ser Val
500 505 510
Asn Asp Lys Asp Phe Pro Ile Ala Gly Ser Ile Leu Asp Arg Glu Lys
515 520 525
Gln Pro Val Ala Gly Lys Ile Gly Ile Lys Val Lys Leu Leu Asn Gln
530 535 540
Gln Tyr Val Ser Glu Val Asp Lys Ala Val Lys Ala His Gln Leu Lys
545 550 555 560
Gln Arg Lys Ala Ser Lys Pro Ser Ile Gln Asn Ile Ile Glu Glu Ile
565 570 575
Val Pro Ile Asn Glu Ser Asn Pro Lys Glu Ala Ile Val Phe Gly Gly
580 585 590
Gln Pro Thr Ala Tyr Leu Ser Met Asn Asp Ile His Ser Ile Leu Tyr
595 600 605
Glu Phe Phe Asp Lys Trp Glu Lys Lys Lys Glu Lys Leu Glu Lys Lys
610 615 620
Gly Glu Lys Glu Leu Arg Lys Glu Ile Gly Lys Glu Leu Glu Lys Lys
625 630 635 640
Ile Val Gly Lys Ile Gln Ala Gln Ile Gln Gln Ile Ile Asp Lys Asp
645 650 655
Thr Asn Ala Lys Ile Leu Lys Pro Tyr Gln Asp Gly Asn Ser Thr Ala
660 665 670
Ile Asp Lys Glu Lys Leu Ile Lys Asp Leu Lys Gln Glu Gln Asn Ile
675 680 685
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Gln Gln Lys Tyr Leu Tyr Gln Phe Tyr Thr Cys Tyr Leu Asp Lys Arg
820 825 830
Leu Glu Tyr Ile Ser Gly Leu Val Gln Gln Ala Glu Asn Phe Lys Ser
835 840 845
Glu Asn Lys Val Phe Lys Lys Val Glu Asn Glu Cys Phe Lys Phe Leu
850 855 860
Lys Lys Gln Asn Tyr Thr His Lys Glu Leu Asp Ala Arg Val Gln Ser
865 870 875 880
Ile Leu Gly Tyr Pro Ile Phe Leu Glu Arg Gly Phe Met Asp Glu Lys
885 890 895
Pro Thr Ile Ile Lys Gly Lys Thr Phe Lys Gly Asn Glu Ala Leu Phe
900 905 910
Ala Asp Trp Phe Arg Tyr Tyr Lys Glu Tyr Gln Asn Phe Gln Thr Phe
915 920 925
Tyr Asp Thr Glu Asn Tyr Pro Leu Val Glu Leu Glu Lys Lys Gln Ala
930 935 940
Asp Arg Lys Arg Lys Thr Lys Ile Tyr Gln Gln Lys Lys Asn Asp Val
945 950 955 960
Phe Thr Leu Leu Met Ala Lys His Ile Phe Lys Ser Val Phe Lys Gln
965 970 975
Asp Ser Ile Asp Gln Phe Ser Leu Glu Asp Leu Tyr Gln Ser Arg Glu
980 985 990
Glu Arg Leu Gly Asn Gln Glu Arg Ala Arg Gln Thr Gly Glu Arg Asn
995 1000 1005
Thr Asn Tyr Ile Trp Asn Lys Thr Val Asp Leu Lys Leu Cys Asp Gly
1010 1015 1020
Lys Ile Thr Val Glu Asn Val Lys Leu Lys Asn Val Gly Asp Phe Ile
1025 1030 1035 1040
Lys Tyr Glu Tyr Asp Gln Arg Val Gln Ala Phe Leu Lys Tyr Glu Glu
1045 1050 1055
Asn Ile Glu Trp Gln Ala Phe Leu Ile Lys Glu Ser Lys Glu Glu Glu
1060 1065 1070
Asn Tyr Pro Tyr Val Val Glu Arg Glu Ile Glu Gln Tyr Glu Lys Val
1075 1080 1085
Arg Arg Glu Glu Leu Leu Lys Glu Val His Leu Ile Glu Glu Tyr Ile
1090 1095 1100
Leu Glu Lys Val Lys Asp Lys Glu Ile Leu Lys Lys Gly Asp Asn Gln
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Asn Phe Lys Tyr Tyr Ile Leu Asn Gly Leu Leu Lys Gln Leu Lys Asn
1125 1130 1135
Glu Asp Val Glu Ser Tyr Lys Val Phe Asn Leu Asn Thr Glu Pro Glu
1140 1145 1150
Asp Val Asn Ile Asn Gln Leu Lys Gln Glu Ala Thr Asp Leu Glu Gln
1155 1160 1165
Lys Ala Phe Val Leu Thr Tyr Ile Arg Asn Lys Phe Ala His Asn Gln
1170 1175 1180
Leu Pro Lys Lys Glu Phe Trp Asp Tyr Cys Gln Glu Lys Tyr Gly Lys
1185 1190 1195 1200
Ile Glu Lys Glu Lys Thr Tyr Ala Glu Tyr Phe Ala Glu Val Phe Lys
1205 1210 1215
Lys Glu Lys Glu Ala Leu Ile Lys
1220
<210> 371
<211> 1126
<212> PRT
<213> Prevotella intermedia
<400> 371
Met Glu Asp Asp Lys Lys Thr Thr Asp Ser Ile Arg Tyr Glu Leu Lys
1 5 10 15
Asp Lys His Phe Trp Ala Ala Phe Leu Asn Leu Ala Arg His Asn Val
20 25 30
Tyr Ile Thr Val Asn His Ile Asn Lys Ile Leu Glu Glu Gly Glu Ile
35 40 45
Asn Arg Asp Gly Tyr Glu Thr Thr Leu Lys Asn Thr Trp Asn Glu Ile
50 55 60
Lys Asp Ile Asn Lys Lys Asp Arg Leu Ser Lys Leu Ile Ile Lys His
65 70 75 80
Phe Pro Phe Leu Glu Ala Ala Thr Tyr Arg Leu Asn Pro Thr Asp Thr
85 90 95
Thr Lys Gln Lys Glu Glu Lys Gln Ala Glu Ala Gln Ser Leu Glu Ser
100 105 110
Leu Arg Lys Ser Phe Phe Val Phe Ile Tyr Lys Leu Arg Asp Leu Arg
115 120 125
Asn His Tyr Ser His Tyr Lys His Ser Lys Ser Leu Glu Arg Pro Lys
130 135 140
Phe Glu Glu Gly Leu Leu Glu Lys Met Tyr Asn Ile Phe Asn Ala Ser
145 150 155 160
Ile Arg Leu Val Lys Glu Asp Tyr Gln Tyr Asn Lys Asp Ile Asn Pro
165 170 175
Asp Glu Asp Phe Lys His Leu Asp Arg Thr Glu Glu Glu Phe Asn Tyr
180 185 190
Tyr Phe Thr Lys Asp Asn Glu Gly Asn Ile Thr Glu Ser Gly Leu Leu
195 200 205
Phe Phe Val Ser Leu Phe Leu Glu Lys Lys Asp Ala Ile Trp Met Gln
210 215 220
Gln Lys Leu Arg Gly Phe Lys Asp Asn Arg Glu Asn Lys Lys Lys Met
225 230 235 240
Thr Asn Glu Val Phe Cys Arg Ser Arg Met Leu Leu Pro Lys Leu Arg
245 250 255
Leu Gln Ser Thr Gln Thr Gln Asp Trp Ile Leu Leu Asp Met Leu Asn
260 265 270
Glu Leu Ile Arg Cys Pro Lys Ser Leu Tyr Glu Arg Leu Arg Glu Glu
275 280 285
Asp Arg Glu Lys Phe Arg Val Pro Ile Glu Ile Ala Asp Glu Asp Tyr
290 295 300
Asp Ala Glu Gln Glu Pro Phe Lys Asn Thr Leu Val Arg His Gln Asp
305 310 315 320
Arg Phe Pro Tyr Phe Ala Leu Arg Tyr Phe Asp Tyr Asn Glu Ile Phe
325 330 335
Thr Asn Leu Arg Phe Gln Ile Asp Leu Gly Thr Tyr His Phe Ser Ile
340 345 350
Tyr Lys Lys Gln Ile Gly Asp Tyr Lys Glu Ser His His Leu Thr His
355 360 365
Lys Leu Tyr Gly Phe Glu Arg Ile Gln Glu Phe Thr Lys Gln Asn Arg
370 375 380
Pro Asp Glu Trp Arg Lys Phe Val Lys Thr Phe Asn Ser Phe Glu Thr
385 390 395 400
Ser Lys Glu Pro Tyr Ile Pro Glu Thr Thr Pro His Tyr His Leu Glu
405 410 415
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420 425 430
Pro Ser Leu Lys Thr Asn Ser Glu Lys Asn Glu Lys Ser Lys Tyr Lys
435 440 445
Leu Asp Lys Ser Phe Gln Ala Glu Ala Phe Leu Ser Val His Glu Leu
450 455 460
Leu Pro Met Met Phe Tyr Tyr Leu Leu Leu Lys Thr Glu Asn Thr Asp
465 470 475 480
Asn Asp Asn Glu Ile Glu Thr Lys Lys Lys Glu Asn Lys Asn Asp Lys
485 490 495
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500 505 510
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515 520 525
Asp Glu Leu Glu Glu Tyr Cys Lys Gly Lys Asp Ile Glu Ile Gly His
530 535 540
Leu Pro Lys Gln Met Ile Ala Ile Leu Lys Asp Glu His Lys Val Met
545 550 555 560
Ala Thr Glu Ala Glu Arg Lys Gln Glu Glu Met Leu Val Asp Val Gln
565 570 575
Lys Ser Leu Glu Ser Leu Asp Asn Gln Ile Asn Glu Glu Ile Glu Asn
580 585 590
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595 600 605
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Gly Lys Pro Leu Asn Asn Ser Lys Ala Asn Ser Thr Glu Tyr Gln Leu
625 630 635 640
Leu Gln Arg Thr Leu Ala Phe Phe Gly Ser Glu His Glu Arg Leu Ala
645 650 655
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660 665 670
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675 680 685
Tyr Arg Ser Tyr Leu Glu Ala Lys Lys Asn Phe Leu Glu Ser Leu Lys
690 695 700
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705 710 715 720
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725 730 735
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740 745 750
His Arg Glu Asn Ile Thr Val Ala Glu Leu Lys Arg Val Gly Leu Val
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Ala Lys Val Ile Pro Leu Phe Phe Ser Glu Glu Tyr Lys Asp Ser Val
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Asp Glu Lys Asn Phe Leu Asn Cys Glu Glu Arg Arg Glu Leu Leu Arg
805 810 815
Lys Lys Lys Asp Glu Phe Lys Lys Met Thr Asp Lys Glu Lys Glu Glu
820 825 830
Asn Pro Ser Tyr Leu Glu Phe Lys Ser Trp Asn Lys Phe Glu Arg Glu
835 840 845
Leu Arg Leu Val Arg Asn Gln Asp Ile Val Thr Trp Leu Leu Cys Met
850 855 860
Glu Leu Phe Asn Lys Lys Lys Ile Lys Glu Leu Asn Val Glu Lys Ile
865 870 875 880
Tyr Leu Lys Asn Ile Asn Thr Asn Thr Thr Lys Lys Glu Lys Asn Thr
885 890 895
Glu Glu Lys Asn Gly Glu Glu Lys Asn Ile Lys Glu Lys Asn Asn Ile
900 905 910
Leu Asn Arg Ile Met Pro Met Arg Leu Pro Ile Lys Val Tyr Gly Arg
915 920 925
Glu Asn Phe Ser Lys Asn Lys Lys Lys Lys Ile Arg Arg Asn Thr Phe
930 935 940
Phe Thr Val Tyr Ile Glu Glu Lys Gly Thr Lys Leu Leu Lys Gln Gly
945 950 955 960
Asn Phe Lys Ala Leu Glu Arg Asp Arg Arg Leu Gly Gly Leu Phe Ser
965 970 975
Phe Val Lys Thr Pro Ser Lys Ala Glu Ser Lys Ser Asn Thr Ile Ser
980 985 990
Lys Leu Arg Val Glu Tyr Glu Leu Gly Glu Tyr Gln Lys Ala Arg Ile
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Glu Ile Ile Lys Asp Met Leu Ala Leu Glu Lys Thr Leu Ile Asp Lys
1010 1015 1020
Tyr Asn Ser Leu Asp Thr Asp Asn Phe Asn Lys Met Leu Thr Asp Trp
1025 1030 1035 1040
Leu Glu Leu Lys Gly Glu Pro Asp Lys Ala Ser Phe Gln Asn Asp Val
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Asp Leu Leu Ile Ala Val Arg Asn Ala Phe Ser His Asn Gln Tyr Pro
1060 1065 1070
Met Arg Asn Arg Ile Ala Phe Ala Asn Ile Asn Pro Phe Ser Leu Ser
1075 1080 1085
Ser Ala Asn Thr Ser Glu Glu Lys Gly Leu Gly Ile Ala Asn Gln Leu
1090 1095 1100
Lys Asp Lys Thr His Lys Thr Ile Glu Lys Ile Ile Glu Ile Glu Lys
1105 1110 1115 1120
Pro Ile Glu Thr Lys Glu
1125
<210> 372
<211> 1127
<212> PRT
<213> Prevotella buccae
<400> 372
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1 5 10 15
Phe Ala Phe Pro Lys Tyr Ile Thr Ile Met Glu Asn Lys Glu Lys Pro
20 25 30
Glu Pro Ile Tyr Tyr Glu Leu Thr Asp Lys His Phe Trp Ala Ala Phe
35 40 45
Leu Asn Leu Ala Arg His Asn Val Tyr Thr Thr Ile Asn His Ile Asn
50 55 60
Arg Arg Leu Glu Ile Ala Glu Leu Lys Asp Asp Gly Tyr Met Met Gly
65 70 75 80
Ile Lys Gly Ser Trp Asn Glu Gln Ala Lys Lys Leu Asp Lys Lys Val
85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
Glu Lys Glu Gln Ser Glu Ala Leu Ser Leu Asn Asn Leu Lys Asn Val
130 135 140
Leu Phe Ile Phe Leu Glu Lys Leu Gln Val Leu Arg Asn Tyr Tyr Ser
145 150 155 160
His Tyr Lys Tyr Ser Glu Glu Ser Pro Lys Pro Ile Phe Glu Thr Ser
165 170 175
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195 200 205
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210 215 220
Asp Ser Pro Asn Phe His Tyr His Phe Ala Asp Lys Glu Gly Asn Met
225 230 235 240
Thr Ile Ala Gly Leu Leu Phe Phe Val Ser Leu Phe Leu Asp Lys Lys
245 250 255
Asp Ala Ile Trp Met Gln Lys Lys Leu Lys Gly Phe Lys Asp Gly Arg
260 265 270
Asn Leu Arg Glu Gln Met Thr Asn Glu Val Phe Cys Arg Ser Arg Ile
275 280 285
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305 310 315 320
Glu Arg Leu Arg Glu Lys Asp Arg Glu Ser Phe Lys Val Pro Phe Asp
325 330 335
Ile Phe Ser Asp Asp Tyr Asn Ala Glu Glu Glu Pro Phe Lys Asn Thr
340 345 350
Leu Val Arg His Gln Asp Arg Phe Pro Tyr Phe Val Leu Arg Tyr Phe
355 360 365
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370 375 380
Thr Tyr His Phe Ser Ile Tyr Asn Lys Arg Ile Gly Asp Glu Asp Glu
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Val Arg His Leu Thr His His Leu Tyr Gly Phe Ala Arg Ile Gln Asp
405 410 415
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420 425 430
Leu Asp His Phe Glu Thr Ser Gln Glu Pro Tyr Ile Ser Lys Thr Ala
435 440 445
Pro His Tyr His Leu Glu Asn Glu Lys Ile Gly Ile Lys Phe Cys Ser
450 455 460
Ala His Asn Asn Leu Phe Pro Ser Leu Gln Thr Asp Lys Thr Cys Asn
465 470 475 480
Gly Arg Ser Lys Phe Asn Leu Gly Thr Gln Phe Thr Ala Glu Ala Phe
485 490 495
Leu Ser Val His Glu Leu Leu Pro Met Met Phe Tyr Tyr Leu Leu Leu
500 505 510
Thr Lys Asp Tyr Ser Arg Lys Glu Ser Ala Asp Lys Val Glu Gly Ile
515 520 525
Ile Arg Lys Glu Ile Ser Asn Ile Tyr Ala Ile Tyr Asp Ala Phe Ala
530 535 540
Asn Asn Glu Ile Asn Ser Ile Ala Asp Leu Thr Arg Arg Leu Gln Asn
545 550 555 560
Thr Asn Ile Leu Gln Gly His Leu Pro Lys Gln Met Ile Ser Ile Leu
565 570 575
Lys Gly Arg Gln Lys Asp Met Gly Lys Glu Ala Glu Arg Lys Ile Gly
580 585 590
Glu Met Ile Asp Asp Thr Gln Arg Arg Leu Asp Leu Leu Cys Lys Gln
595 600 605
Thr Asn Gln Lys Ile Arg Ile Gly Lys Arg Asn Ala Gly Leu Leu Lys
610 615 620
Ser Gly Lys Ile Ala Asp Trp Leu Val Asn Asp Met Met Arg Phe Gln
625 630 635 640
Pro Val Gln Lys Asp Gln Asn Asn Ile Pro Ile Asn Asn Ser Lys Ala
645 650 655
Asn Ser Thr Glu Tyr Arg Met Leu Gln Arg Ala Leu Ala Leu Phe Gly
660 665 670
Ser Glu Asn Phe Arg Leu Lys Ala Tyr Phe Asn Gln Met Asn Leu Val
675 680 685
Gly Asn Asp Asn Pro His Pro Phe Leu Ala Glu Thr Gln Trp Glu His
690 695 700
Gln Thr Asn Ile Leu Ser Phe Tyr Arg Asn Tyr Leu Glu Ala Arg Lys
705 710 715 720
Lys Tyr Leu Lys Gly Leu Lys Pro Gln Asn Trp Lys Gln Tyr Gln His
725 730 735
Phe Leu Ile Leu Lys Val Gln Lys Thr Asn Arg Asn Thr Leu Val Thr
740 745 750
Gly Trp Lys Asn Ser Phe Asn Leu Pro Arg Gly Ile Phe Thr Gln Pro
755 760 765
Ile Arg Glu Trp Phe Glu Lys His Asn Asn Ser Lys Arg Ile Tyr Asp
770 775 780
Gln Ile Leu Ser Phe Asp Arg Val Gly Phe Val Ala Lys Ala Ile Pro
785 790 795 800
Leu Tyr Phe Ala Glu Glu Tyr Lys Asp Asn Val Gln Pro Phe Tyr Asp
805 810 815
Tyr Pro Phe Asn Ile Gly Asn Arg Leu Lys Pro Lys Lys Arg Gln Phe
820 825 830
Leu Asp Lys Lys Glu Arg Val Glu Leu Trp Gln Lys Asn Lys Glu Leu
835 840 845
Phe Lys Asn Tyr Pro Ser Glu Lys Lys Lys Thr Asp Leu Ala Tyr Leu
850 855 860
Asp Phe Leu Ser Trp Lys Lys Phe Glu Arg Glu Leu Arg Leu Ile Lys
865 870 875 880
Asn Gln Asp Ile Val Thr Trp Leu Met Phe Lys Glu Leu Phe Asn Met
885 890 895
Ala Thr Val Glu Gly Leu Lys Ile Gly Glu Ile His Leu Arg Asp Ile
900 905 910
Asp Thr Asn Thr Ala Asn Glu Glu Ser Asn Asn Ile Leu Asn Arg Ile
915 920 925
Met Pro Met Lys Leu Pro Val Lys Thr Tyr Glu Thr Asp Asn Lys Gly
930 935 940
Asn Ile Leu Lys Glu Arg Pro Leu Ala Thr Phe Tyr Ile Glu Glu Thr
945 950 955 960
Glu Thr Lys Val Leu Lys Gln Gly Asn Phe Lys Ala Leu Val Lys Asp
965 970 975
Arg Arg Leu Asn Gly Leu Phe Ser Phe Ala Glu Thr Thr Asp Leu Asn
980 985 990
Leu Glu Glu His Pro Ile Ser Lys Leu Ser Val Asp Leu Glu Leu Ile
995 1000 1005
Lys Tyr Gln Thr Thr Arg Ile Ser Ile Phe Glu Met Thr Leu Gly Leu
1010 1015 1020
Glu Lys Lys Leu Ile Asp Lys Tyr Ser Thr Leu Pro Thr Asp Ser Phe
1025 1030 1035 1040
Arg Asn Met Leu Glu Arg Trp Leu Gln Cys Lys Ala Asn Arg Pro Glu
1045 1050 1055
Leu Lys Asn Tyr Val Asn Ser Leu Ile Ala Val Arg Asn Ala Phe Ser
1060 1065 1070
His Asn Gln Tyr Pro Met Tyr Asp Ala Thr Leu Phe Ala Glu Val Lys
1075 1080 1085
Lys Phe Thr Leu Phe Pro Ser Val Asp Thr Lys Lys Ile Glu Leu Asn
1090 1095 1100
Ile Ala Pro Gln Leu Leu Glu Ile Val Gly Lys Ala Ile Lys Glu Ile
1105 1110 1115 1120
Glu Lys Ser Glu Asn Lys Asn
1125
<210> 373
<211> 1135
<212> PRT
<213> Porphyromonas gingivalis
<400> 373
Met Asn Thr Val Pro Ala Ser Glu Asn Lys Gly Gln Ser Arg Thr Val
1 5 10 15
Glu Asp Asp Pro Gln Tyr Phe Gly Leu Tyr Leu Asn Leu Ala Arg Glu
20 25 30
Asn Leu Ile Glu Val Glu Ser His Val Arg Ile Lys Phe Gly Lys Lys
35 40 45
Lys Leu Asn Glu Glu Ser Leu Lys Gln Ser Leu Leu Cys Asp His Leu
50 55 60
Leu Ser Val Asp Arg Trp Thr Lys Val Tyr Gly His Ser Arg Arg Tyr
65 70 75 80
Leu Pro Phe Leu His Tyr Phe Asp Pro Asp Ser Gln Ile Glu Lys Asp
85 90 95
His Asp Ser Lys Thr Gly Val Asp Pro Asp Ser Ala Gln Arg Leu Ile
100 105 110
Arg Glu Leu Tyr Ser Leu Leu Asp Phe Leu Arg Asn Asp Phe Ser His
115 120 125
Asn Arg Leu Asp Gly Thr Thr Phe Glu His Leu Glu Val Ser Pro Asp
130 135 140
Ile Ser Ser Phe Ile Thr Gly Thr Tyr Ser Leu Ala Cys Gly Arg Ala
145 150 155 160
Gln Ser Arg Phe Ala Val Phe Phe Lys Pro Asp Asp Phe Val Leu Ala
165 170 175
Lys Asn Arg Lys Glu Gln Leu Ile Ser Val Ala Asp Gly Lys Glu Cys
180 185 190
Leu Thr Val Ser Gly Phe Ala Phe Phe Ile Cys Leu Phe Leu Asp Arg
195 200 205
Glu Gln Ala Ser Gly Met Leu Ser Arg Ile Arg Gly Phe Lys Arg Thr
210 215 220
Asp Glu Asn Trp Ala Arg Ala Val His Glu Thr Phe Cys Asp Leu Cys
225 230 235 240
Ile Arg His Pro His Asp Arg Leu Glu Ser Ser Asn Thr Lys Glu Ala
245 250 255
Leu Leu Leu Asp Met Leu Asn Glu Leu Asn Arg Cys Pro Arg Ile Leu
260 265 270
Tyr Asp Met Leu Pro Glu Glu Glu Arg Ala Gln Phe Leu Pro Ala Leu
275 280 285
Asp Glu Asn Ser Met Asn Asn Leu Ser Glu Asn Ser Leu Asp Glu Glu
290 295 300
Ser Arg Leu Leu Trp Asp Gly Ser Ser Asp Trp Ala Glu Ala Leu Thr
305 310 315 320
Lys Arg Ile Arg His Gln Asp Arg Phe Pro Tyr Leu Met Leu Arg Phe
325 330 335
Ile Glu Glu Met Asp Leu Leu Lys Gly Ile Arg Phe Arg Val Asp Leu
340 345 350
Gly Glu Ile Glu Leu Asp Ser Tyr Ser Lys Lys Val Gly Arg Asn Gly
355 360 365
Glu Tyr Asp Arg Thr Ile Thr Asp His Ala Leu Ala Phe Gly Lys Leu
370 375 380
Ser Asp Phe Gln Asn Glu Glu Glu Val Ser Arg Met Ile Ser Gly Glu
385 390 395 400
Ala Ser Tyr Pro Val Arg Phe Ser Leu Phe Ala Pro Arg Tyr Ala Ile
405 410 415
Tyr Asp Asn Lys Ile Gly Tyr Cys His Thr Ser Asp Pro Val Tyr Pro
420 425 430
Lys Ser Lys Thr Gly Glu Lys Arg Ala Leu Ser Asn Pro Gln Ser Met
435 440 445
Gly Phe Ile Ser Val His Asp Leu Arg Lys Leu Leu Leu Met Glu Leu
450 455 460
Leu Cys Glu Gly Ser Phe Ser Arg Met Gln Ser Asp Phe Leu Arg Lys
465 470 475 480
Ala Asn Arg Ile Leu Asp Glu Thr Ala Glu Gly Lys Leu Gln Phe Ser
485 490 495
Ala Leu Phe Pro Glu Met Arg His Arg Phe Ile Pro Pro Gln Asn Pro
500 505 510
Lys Ser Lys Asp Arg Arg Glu Lys Ala Glu Thr Thr Leu Glu Lys Tyr
515 520 525
Lys Gln Glu Ile Lys Gly Arg Lys Asp Lys Leu Asn Ser Gln Leu Leu
530 535 540
Ser Ala Phe Asp Met Asp Gln Arg Gln Leu Pro Ser Arg Leu Leu Asp
545 550 555 560
Glu Trp Met Asn Ile Arg Pro Ala Ser His Ser Val Lys Leu Arg Thr
565 570 575
Tyr Val Lys Gln Leu Asn Glu Asp Cys Arg Leu Arg Leu Arg Lys Phe
580 585 590
Arg Lys Asp Gly Asp Gly Lys Ala Arg Ala Ile Pro Leu Val Gly Glu
595 600 605
Met Ala Thr Phe Leu Ser Gln Asp Ile Val Arg Met Ile Ile Ser Glu
610 615 620
Glu Thr Lys Lys Leu Ile Thr Ser Ala Tyr Tyr Asn Glu Met Gln Arg
625 630 635 640
Ser Leu Ala Gln Tyr Ala Gly Glu Glu Asn Arg Arg Gln Phe Arg Ala
645 650 655
Ile Val Ala Glu Leu Arg Leu Leu Asp Pro Ser Ser Gly His Pro Phe
660 665 670
Leu Ser Ala Thr Met Glu Thr Ala His Arg Tyr Thr Glu Gly Phe Tyr
675 680 685
Lys Cys Tyr Leu Glu Lys Lys Arg Glu Trp Leu Ala Lys Ile Phe Tyr
690 695 700
Arg Pro Glu Gln Asp Glu Asn Thr Lys Arg Arg Ile Ser Val Phe Phe
705 710 715 720
Val Pro Asp Gly Glu Ala Arg Lys Leu Leu Pro Leu Leu Ile Arg Arg
725 730 735
Arg Met Lys Glu Gln Asn Asp Leu Gln Asp Trp Ile Arg Asn Lys Gln
740 745 750
Ala His Pro Ile Asp Leu Pro Ser His Leu Phe Asp Ser Lys Val Met
755 760 765
Glu Leu Leu Lys Val Lys Asp Gly Lys Lys Lys Trp Asn Glu Ala Phe
770 775 780
Lys Asp Trp Trp Ser Thr Lys Tyr Pro Asp Gly Met Gln Pro Phe Tyr
785 790 795 800
Gly Leu Arg Arg Glu Leu Asn Ile His Gly Lys Ser Val Ser Tyr Ile
805 810 815
Pro Ser Asp Gly Lys Lys Phe Ala Asp Cys Tyr Thr His Leu Met Glu
820 825 830
Lys Thr Val Arg Asp Lys Lys Arg Glu Leu Arg Thr Ala Gly Lys Pro
835 840 845
Val Pro Pro Asp Leu Ala Ala Asp Ile Lys Arg Ser Phe His Arg Ala
850 855 860
Val Asn Glu Arg Glu Phe Met Leu Arg Leu Val Gln Glu Asp Asp Arg
865 870 875 880
Leu Met Leu Met Ala Ile Asn Lys Met Met Thr Asp Arg Glu Glu Asp
885 890 895
Ile Leu Pro Gly Leu Lys Asn Ile Asp Ser Ile Leu Asp Glu Glu Asn
900 905 910
Gln Phe Ser Leu Ala Val His Ala Lys Val Leu Glu Lys Glu Gly Glu
915 920 925
Gly Gly Asp Asn Ser Leu Ser Leu Val Pro Ala Thr Ile Glu Ile Lys
930 935 940
Ser Lys Arg Lys Asp Trp Ser Lys Tyr Ile Arg Tyr Arg Tyr Asp Arg
945 950 955 960
Arg Val Pro Gly Leu Met Ser His Phe Pro Glu His Lys Ala Thr Leu
965 970 975
Asp Glu Val Lys Thr Leu Leu Gly Glu Tyr Asp Arg Cys Arg Ile Lys
980 985 990
Ile Phe Asp Trp Ala Phe Ala Leu Glu Gly Ala Ile Met Ser Asp Arg
995 1000 1005
Asp Leu Lys Pro Tyr Leu His Glu Ser Ser Ser Arg Glu Gly Lys Ser
1010 1015 1020
Gly Glu His Ser Thr Leu Val Lys Met Leu Val Glu Lys Lys Gly Cys
1025 1030 1035 1040
Leu Thr Pro Asp Glu Ser Gln Tyr Leu Ile Leu Ile Arg Asn Lys Ala
1045 1050 1055
Ala His Asn Gln Phe Pro Cys Ala Ala Glu Met Pro Leu Ile Tyr Arg
1060 1065 1070
Asp Val Ser Ala Lys Val Gly Ser Ile Glu Gly Ser Ser Ala Lys Asp
1075 1080 1085
Leu Pro Glu Gly Ser Ser Leu Val Asp Ser Leu Trp Lys Lys Tyr Glu
1090 1095 1100
Met Ile Ile Arg Lys Ile Leu Pro Ile Leu Asp Pro Glu Asn Arg Phe
1105 1110 1115 1120
Phe Gly Lys Leu Leu Asn Asn Met Ser Gln Pro Ile Asn Asp Leu
1125 1130 1135
<210> 374
<211> 1115
<212> PRT
<213> Bacteroides pyogenes
<400> 374
Met Glu Ser Ile Lys Asn Ser Gln Lys Ser Thr Gly Lys Thr Leu Gln
1 5 10 15
Lys Asp Pro Pro Tyr Phe Gly Leu Tyr Leu Asn Met Ala Leu Leu Asn
20 25 30
Val Arg Lys Val Glu Asn His Ile Arg Lys Trp Leu Gly Asp Val Ala
35 40 45
Leu Leu Pro Glu Lys Ser Gly Phe His Ser Leu Leu Thr Thr Asp Asn
50 55 60
Leu Ser Ser Ala Lys Trp Thr Arg Phe Tyr Tyr Lys Ser Arg Lys Phe
65 70 75 80
Leu Pro Phe Leu Glu Met Phe Asp Ser Asp Lys Lys Ser Tyr Glu Asn
85 90 95
Arg Arg Glu Thr Ala Glu Cys Leu Asp Thr Ile Asp Arg Gln Lys Ile
100 105 110
Ser Ser Leu Leu Lys Glu Val Tyr Gly Lys Leu Gln Asp Ile Arg Asn
115 120 125
Ala Phe Ser His Tyr His Ile Asp Asp Gln Ser Val Lys His Thr Ala
130 135 140
Leu Ile Ile Ser Ser Glu Met His Arg Phe Ile Glu Asn Ala Tyr Ser
145 150 155 160
Phe Ala Leu Gln Lys Thr Arg Ala Arg Phe Thr Gly Val Phe Val Glu
165 170 175
Thr Asp Phe Leu Gln Ala Glu Glu Lys Gly Asp Asn Lys Lys Phe Phe
180 185 190
Ala Ile Gly Gly Asn Glu Gly Ile Lys Leu Lys Asp Asn Ala Leu Ile
195 200 205
Phe Leu Ile Cys Leu Phe Leu Asp Arg Glu Glu Ala Phe Lys Phe Leu
210 215 220
Ser Arg Ala Thr Gly Phe Lys Ser Thr Lys Glu Lys Gly Phe Leu Ala
225 230 235 240
Val Arg Glu Thr Phe Cys Ala Leu Cys Cys Arg Gln Pro His Glu Arg
245 250 255
Leu Leu Ser Val Asn Pro Arg Glu Ala Leu Leu Met Asp Met Leu Asn
260 265 270
Glu Leu Asn Arg Cys Pro Asp Ile Leu Phe Glu Met Leu Asp Glu Lys
275 280 285
Asp Gln Lys Ser Phe Leu Pro Leu Leu Gly Glu Glu Glu Gln Ala His
290 295 300
Ile Leu Glu Asn Ser Leu Asn Asp Glu Leu Cys Glu Ala Ile Asp Asp
305 310 315 320
Pro Phe Glu Met Ile Ala Ser Leu Ser Lys Arg Val Arg Tyr Lys Asn
325 330 335
Arg Phe Pro Tyr Leu Met Leu Arg Tyr Ile Glu Glu Lys Asn Leu Leu
340 345 350
Pro Phe Ile Arg Phe Arg Ile Asp Leu Gly Cys Leu Glu Leu Ala Ser
355 360 365
Tyr Pro Lys Lys Met Gly Glu Glu Asn Asn Tyr Glu Arg Ser Val Thr
370 375 380
Asp His Ala Met Ala Phe Gly Arg Leu Thr Asp Phe His Asn Glu Asp
385 390 395 400
Ala Val Leu Gln Gln Ile Thr Lys Gly Ile Thr Asp Glu Val Arg Phe
405 410 415
Ser Leu Tyr Ala Pro Arg Tyr Ala Ile Tyr Asn Asn Lys Ile Gly Phe
420 425 430
Val Arg Thr Ser Gly Ser Asp Lys Ile Ser Phe Pro Thr Leu Lys Lys
435 440 445
Lys Gly Gly Glu Gly His Cys Val Ala Tyr Thr Leu Gln Asn Thr Lys
450 455 460
Ser Phe Gly Phe Ile Ser Ile Tyr Asp Leu Arg Lys Ile Leu Leu Leu
465 470 475 480
Ser Phe Leu Asp Lys Asp Lys Ala Lys Asn Ile Val Ser Gly Leu Leu
485 490 495
Glu Gln Cys Glu Lys His Trp Lys Asp Leu Ser Glu Asn Leu Phe Asp
500 505 510
Ala Ile Arg Thr Glu Leu Gln Lys Glu Phe Pro Val Pro Leu Ile Arg
515 520 525
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530 535 540
Ala Asp Lys Gln Glu Lys Tyr Glu Ser Glu Phe Glu Arg Arg Lys Glu
545 550 555 560
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565 570 575
Pro Arg Arg Met Ile Asp Glu Trp Leu Asn Val Leu Pro Thr Ser Arg
580 585 590
Glu Lys Lys Leu Lys Gly Tyr Val Glu Thr Leu Lys Leu Asp Cys Arg
595 600 605
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610 615 620
Pro Pro Arg Ile Gly Glu Met Ala Thr Asp Leu Ala Lys Asp Ile Ile
625 630 635 640
Arg Met Val Ile Asp Gln Gly Val Lys Gln Arg Ile Thr Ser Ala Tyr
645 650 655
Tyr Ser Glu Ile Gln Arg Cys Leu Ala Gln Tyr Ala Gly Asp Asp Asn
660 665 670
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675 680 685
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705 710 715 720
Leu Glu Ala Thr Phe Tyr Pro Ala Ala Ser Pro Lys Arg Val Pro Arg
725 730 735
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740 745 750
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755 760 765
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770 775 780
Ile Cys Arg Leu Leu Lys Asp Lys Ile Gly Lys Glu Pro Ser Gly Lys
785 790 795 800
Leu Lys Trp Asn Glu Met Phe Lys Leu Tyr Trp Asp Lys Glu Phe Pro
805 810 815
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820 825 830
Asp Lys Val Val Glu Tyr Glu Tyr Ser Glu Glu Gly Gly Asn Tyr Lys
835 840 845
Lys Tyr Tyr Glu Ala Leu Ile Asp Glu Val Val Arg Gln Lys Ile Ser
850 855 860
Ser Ser Lys Glu Lys Ser Lys Leu Gln Val Glu Asp Leu Thr Leu Ser
865 870 875 880
Val Arg Arg Val Phe Lys Arg Ala Ile Asn Glu Lys Glu Tyr Gln Leu
885 890 895
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900 905 910
Leu Tyr Asp Trp Lys Glu Ala Gln Leu Asp Leu Asp Lys Ile Asp Asn
915 920 925
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930 935 940
Gly Gln Pro Asp Ala Val Ile Lys Ala Glu Cys Lys Leu Lys Asp Val
945 950 955 960
Ser Lys Leu Met Arg Tyr Cys Tyr Asp Gly Arg Val Lys Gly Leu Met
965 970 975
Pro Tyr Phe Ala Asn His Glu Ala Thr Gln Glu Gln Val Glu Met Glu
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Leu Arg His Tyr Glu Asp His Arg Arg Arg Val Phe Asn Trp Val Phe
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Arg Lys Ala Ser Leu Val Ser Glu Glu Glu Tyr Glu Phe Leu Val His
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Lys Leu Pro Pro Asn Val Thr Ser Gly Phe Cys Glu Cys Ile Trp Ser
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Lys Tyr Lys Ala Ile Ile Cys Arg Ile Ile Pro Phe Ile Asp Pro Glu
1090 1095 1100
Arg Arg Phe Phe Gly Lys Leu Leu Glu Gln Lys
1105 1110 1115
<210> 375
<211> 953
<212> PRT
<213> Alistipes species
<400> 375
Met Ser Asn Glu Ile Gly Ala Phe Arg Glu His Gln Phe Ala Tyr Ala
1 5 10 15
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50 55 60
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Asp Lys Ala Tyr Ser Thr Glu Glu Val Lys Val Ile Val Thr Asp Leu
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Val Arg Arg Leu Cys Phe Tyr Arg Asn Tyr Phe Ser His Cys Phe Tyr
100 105 110
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Ala Arg Tyr Arg Leu Leu Ile Arg Glu Lys Asp Lys Phe Pro Tyr Tyr
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Leu Met Arg Tyr Ile Val Asp Phe Gly Val Leu Pro Cys Ile Thr Phe
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Lys Gln Asn Asp Tyr Ser Thr Lys Glu Gly Arg Gly Gln Phe His Tyr
305 310 315 320
Gln Asp Ala Ala Val Ala Gln Glu Glu Arg Cys Tyr Asn Phe Val Val
325 330 335
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340 345 350
Val Arg Ile Ser Glu Leu Gln Gly Thr Ile Ser Val Glu Glu Leu Arg
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Asn Met Val Tyr Ala Ser Ile Asn Gly Lys Asp Val Asn Lys Ser Val
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420 425 430
Glu Leu Arg Arg Glu Leu Arg Lys Leu Leu Pro Lys Arg Val Cys Asp
435 440 445
Leu Leu Ser Asn Arg Phe Asp Cys Ser Glu Gly Val Ser Ala Val Glu
450 455 460
Lys Arg Leu Lys Ala Ile Leu Leu Arg His Glu Gln Leu Leu Leu Ser
465 470 475 480
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485 490 495
Leu Tyr Leu Phe Phe Ser Asp Asp Glu Lys Phe Arg Gln Gln Pro Thr
500 505 510
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515 520 525
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530 535 540
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545 550 555 560
Ala Thr Ser Leu His Gly Leu Tyr Met Leu Cys Leu Lys Gly Thr Val
565 570 575
Glu Trp Cys Arg Lys Gln Leu Met Ser Ile Gly Lys Gly Thr Ala Lys
580 585 590
Val Glu Ala Ile Ala Asp Arg Val Gly Leu Lys Leu Tyr Asp Lys Leu
595 600 605
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610 615 620
Met His Gly Tyr Ala Ala Ala Ala Thr Pro Lys Pro Lys Ala Gln Ala
625 630 635 640
Ala Ile Pro Ser Lys Leu Thr Glu Leu Arg Phe Tyr Ser Phe Leu Gly
645 650 655
Lys Arg Glu Met Ser Phe Ala Ala Phe Ile Arg Gln Asp Lys Lys Ala
660 665 670
Gln Lys Leu Trp Leu Arg Asn Phe Tyr Thr Val Glu Asn Ile Lys Thr
675 680 685
Leu Gln Lys Arg Gln Ala Ala Ala Asp Ala Ala Cys Lys Lys Leu Tyr
690 695 700
Asn Leu Val Gly Glu Val Glu Arg Val His Thr Asn Asp Lys Val Leu
705 710 715 720
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725 730 735
Lys Cys Ala Val Thr Leu Asp Asn Pro Glu Arg Gln Gln Lys Leu Ala
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Asp Val Tyr Glu Val Gln Asn Ala Trp Leu Ser Ile Arg Phe Asp Asp
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Leu Asp Phe Thr Leu Thr His Val Asn Leu Ser Asn Leu Arg Lys Ala
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Tyr Asn Leu Ile Pro Arg Lys His Ile Leu Ala Phe Lys Glu Tyr Leu
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Thr Ser Trp Leu Lys Glu Asn His Ser Glu Ser Ser Ile Glu Arg Glu
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Ala Ala Thr Met Met Leu Leu Asp Val Glu Arg Lys Leu Leu Ser Phe
850 855 860
Leu Leu Asp Glu Arg Arg Lys Ala Ile Ile Glu Tyr Gly Lys Phe Ile
865 870 875 880
Pro Phe Ser Ala Leu Val Lys Glu Cys Arg Leu Ala Asp Ala Gly Leu
885 890 895
Cys Gly Ile Arg Asn Asp Val Leu His Asp Asn Val Ile Ser Tyr Ala
900 905 910
Asp Ala Ile Gly Lys Leu Ser Ala Tyr Phe Pro Lys Glu Ala Ser Glu
915 920 925
Ala Val Glu Tyr Ile Arg Arg Thr Lys Glu Val Arg Glu Gln Arg Arg
930 935 940
Glu Glu Leu Met Ala Asn Ser Ser Gln
945 950
<210> 376
<211> 1322
<212> PRT
<213> Prevotella species
<400> 376
Met Ser Lys Glu Cys Lys Lys Gln Arg Gln Glu Lys Lys Arg Arg Leu
1 5 10 15
Gln Lys Ala Asn Phe Ser Ile Ser Leu Thr Gly Lys His Val Phe Gly
20 25 30
Ala Tyr Phe Asn Met Ala Arg Thr Asn Phe Val Lys Thr Ile Asn Tyr
35 40 45
Ile Leu Pro Ile Ala Gly Val Arg Gly Asn Tyr Ser Glu Asn Gln Ile
50 55 60
Asn Lys Met Leu His Ala Leu Phe Leu Ile Gln Ala Gly Arg Asn Glu
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Glu Leu Thr Thr Glu Gln Lys Gln Trp Glu Lys Lys Leu Arg Leu Asn
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Pro Glu Gln Gln Thr Lys Phe Gln Lys Leu Leu Phe Lys His Phe Pro
100 105 110
Val Leu Gly Pro Met Met Ala Asp Val Ala Asp His Lys Ala Tyr Leu
115 120 125
Asn Lys Lys Lys Ser Thr Val Gln Thr Glu Asp Glu Thr Phe Ala Met
130 135 140
Leu Lys Gly Val Ser Leu Ala Asp Cys Leu Asp Ile Ile Cys Leu Met
145 150 155 160
Ala Asp Thr Leu Thr Glu Cys Arg Asn Phe Tyr Thr His Lys Asp Pro
165 170 175
Tyr Asn Lys Pro Ser Gln Leu Ala Asp Gln Tyr Leu His Gln Glu Met
180 185 190
Ile Ala Lys Lys Leu Asp Lys Val Val Val Ala Ser Arg Arg Ile Leu
195 200 205
Lys Asp Arg Glu Gly Leu Ser Val Asn Glu Val Glu Phe Leu Thr Gly
210 215 220
Ile Asp His Leu His Gln Glu Val Leu Lys Asp Glu Phe Gly Asn Ala
225 230 235 240
Lys Val Lys Asp Gly Lys Val Met Lys Thr Phe Val Glu Tyr Asp Asp
245 250 255
Phe Tyr Phe Lys Ile Ser Gly Lys Arg Leu Val Asn Gly Tyr Thr Val
260 265 270
Thr Thr Lys Asp Asp Lys Pro Val Asn Val Asn Thr Met Leu Pro Ala
275 280 285
Leu Ser Asp Phe Gly Leu Leu Tyr Phe Cys Val Leu Phe Leu Ser Lys
290 295 300
Pro Tyr Ala Lys Leu Phe Ile Asp Glu Val Arg Leu Phe Glu Tyr Ser
305 310 315 320
Pro Phe Asp Asp Lys Glu Asn Met Ile Met Ser Glu Met Leu Ser Ile
325 330 335
Tyr Arg Ile Arg Thr Pro Arg Leu His Lys Ile Asp Ser His Asp Ser
340 345 350
Lys Ala Thr Leu Ala Met Asp Ile Phe Gly Glu Leu Arg Arg Cys Pro
355 360 365
Met Glu Leu Tyr Asn Leu Leu Asp Lys Asn Ala Gly Gln Pro Phe Phe
370 375 380
His Asp Glu Val Lys His Pro Asn Ser His Thr Pro Asp Val Ser Lys
385 390 395 400
Arg Leu Arg Tyr Asp Asp Arg Phe Pro Thr Leu Ala Leu Arg Tyr Ile
405 410 415
Asp Glu Thr Glu Leu Phe Lys Arg Ile Arg Phe Gln Leu Gln Leu Gly
420 425 430
Ser Phe Arg Tyr Lys Phe Tyr Asp Lys Glu Asn Cys Ile Asp Gly Arg
435 440 445
Val Arg Val Arg Arg Ile Gln Lys Glu Ile Asn Gly Tyr Gly Arg Met
450 455 460
Gln Glu Val Ala Asp Lys Arg Met Asp Lys Trp Gly Asp Leu Ile Gln
465 470 475 480
Lys Arg Glu Glu Arg Ser Val Lys Leu Glu His Glu Glu Leu Tyr Ile
485 490 495
Asn Leu Asp Gln Phe Leu Glu Asp Thr Ala Asp Ser Thr Pro Tyr Val
500 505 510
Thr Asp Arg Arg Pro Ala Tyr Asn Ile His Ala Asn Arg Ile Gly Leu
515 520 525
Tyr Trp Glu Asp Ser Gln Asn Pro Lys Gln Tyr Lys Val Phe Asp Glu
530 535 540
Asn Gly Met Tyr Ile Pro Glu Leu Val Val Thr Glu Asp Lys Lys Ala
545 550 555 560
Pro Ile Lys Met Pro Ala Pro Arg Cys Ala Leu Ser Val Tyr Asp Leu
565 570 575
Pro Ala Met Leu Phe Tyr Glu Tyr Leu Arg Glu Gln Gln Asp Asn Glu
580 585 590
Phe Pro Ser Ala Glu Gln Val Ile Ile Glu Tyr Glu Asp Asp Tyr Arg
595 600 605
Lys Phe Phe Lys Ala Val Ala Glu Gly Lys Leu Lys Pro Phe Lys Arg
610 615 620
Pro Lys Glu Phe Arg Asp Phe Leu Lys Lys Glu Tyr Pro Lys Leu Arg
625 630 635 640
Met Ala Asp Ile Pro Lys Lys Leu Gln Leu Phe Leu Cys Ser His Gly
645 650 655
Leu Cys Tyr Asn Asn Lys Pro Glu Thr Val Tyr Glu Arg Leu Asp Arg
660 665 670
Leu Thr Leu Gln His Leu Glu Glu Arg Glu Leu His Ile Gln Asn Arg
675 680 685
Leu Glu His Tyr Gln Lys Asp Arg Asp Met Ile Gly Asn Lys Asp Asn
690 695 700
Gln Tyr Gly Lys Lys Ser Phe Ser Asp Val Arg His Gly Ala Leu Ala
705 710 715 720
Arg Tyr Leu Ala Gln Ser Met Met Glu Trp Gln Pro Thr Lys Leu Lys
725 730 735
Asp Lys Glu Lys Gly His Asp Lys Leu Thr Gly Leu Asn Tyr Asn Val
740 745 750
Leu Thr Ala Tyr Leu Ala Thr Tyr Gly His Pro Gln Val Pro Glu Glu
755 760 765
Gly Phe Thr Pro Arg Thr Leu Glu Gln Val Leu Ile Asn Ala His Leu
770 775 780
Ile Gly Gly Ser Asn Pro His Pro Phe Ile Asn Lys Val Leu Ala Leu
785 790 795 800
Gly Asn Arg Asn Ile Glu Glu Leu Tyr Leu His Tyr Leu Glu Glu Glu
805 810 815
Leu Lys His Ile Arg Ser Arg Ile Gln Ser Leu Ser Ser Asn Pro Ser
820 825 830
Asp Lys Ala Leu Ser Ala Leu Pro Phe Ile His His Asp Arg Met Arg
835 840 845
Tyr His Glu Arg Thr Ser Glu Glu Met Met Ala Leu Ala Ala Arg Tyr
850 855 860
Thr Thr Ile Gln Leu Pro Asp Gly Leu Phe Thr Pro Tyr Ile Leu Glu
865 870 875 880
Ile Leu Gln Lys His Tyr Thr Glu Asn Ser Asp Leu Gln Asn Ala Leu
885 890 895
Ser Gln Asp Val Pro Val Lys Leu Asn Pro Thr Cys Asn Ala Ala Tyr
900 905 910
Leu Ile Thr Leu Phe Tyr Gln Thr Val Leu Lys Asp Asn Ala Gln Pro
915 920 925
Phe Tyr Leu Ser Asp Lys Thr Tyr Thr Arg Asn Lys Asp Gly Glu Lys
930 935 940
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945 950 955 960
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965 970 975
Leu Thr Ser Asp Glu Ile Gln Glu Arg Leu Ser Ala Lys Leu Leu Asp
980 985 990
Gly Asp Gly Asn Pro Val Pro Glu Val Gly Glu Lys Gly Lys Pro Ala
995 1000 1005
Thr Asp Ser Gln Gly Asn Thr Ile Trp Lys Arg Arg Ile Tyr Ser Glu
1010 1015 1020
Val Asp Asp Tyr Ala Glu Lys Leu Thr Asp Arg Asp Met Lys Ile Ser
1025 1030 1035 1040
Phe Lys Gly Glu Trp Glu Lys Leu Pro Arg Trp Lys Gln Asp Lys Ile
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Ile Lys Arg Arg Asp Glu Thr Arg Arg Gln Met Arg Asp Glu Leu Leu
1060 1065 1070
Gln Arg Met Pro Arg Tyr Ile Arg Asp Ile Lys Asp Asn Glu Arg Thr
1075 1080 1085
Leu Arg Arg Tyr Lys Thr Gln Asp Met Val Leu Phe Leu Leu Ala Glu
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Lys Met Phe Thr Asn Ile Ile Ser Glu Gln Ser Ser Glu Phe Asn Trp
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Lys Gln Met Arg Leu Ser Lys Val Cys Asn Glu Ala Phe Leu Arg Gln
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1250 1255 1260
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Asn Ala Phe Ser His Asn Ser Tyr Asn Ile Asp Phe Ser Leu Ile Lys
1285 1290 1295
Asp Val Lys His Leu Pro Glu Val Ala Lys Gly Ile Leu Gln His Leu
1300 1305 1310
Gln Ser Met Leu Gly Val Glu Ile Thr Lys
1315 1320
<210> 377
<211> 1322
<212> PRT
<213> Prevotella species
<400> 377
Met Ser Lys Glu Cys Lys Lys Gln Arg Gln Glu Lys Lys Arg Arg Leu
1 5 10 15
Gln Lys Ala Asn Phe Ser Ile Ser Leu Thr Gly Lys His Val Phe Gly
20 25 30
Ala Tyr Phe Asn Met Ala Arg Thr Asn Phe Val Lys Thr Ile Asn Tyr
35 40 45
Ile Leu Pro Ile Ala Gly Val Arg Gly Asn Tyr Ser Glu Asn Gln Ile
50 55 60
Asn Lys Met Leu His Ala Leu Phe Leu Ile Gln Ala Gly Arg Asn Glu
65 70 75 80
Glu Leu Thr Thr Glu Gln Lys Gln Trp Glu Lys Lys Leu Arg Leu Asn
85 90 95
Pro Glu Gln Gln Thr Lys Phe Gln Lys Leu Leu Phe Lys His Phe Pro
100 105 110
Val Leu Gly Pro Met Met Ala Asp Val Ala Asp His Lys Ala Tyr Leu
115 120 125
Asn Lys Lys Lys Ser Thr Val Gln Thr Glu Asp Glu Thr Phe Ala Met
130 135 140
Leu Lys Gly Val Ser Leu Ala Asp Cys Leu Asp Ile Ile Cys Leu Met
145 150 155 160
Ala Asp Thr Leu Thr Glu Cys Arg Asn Phe Tyr Thr His Lys Asp Pro
165 170 175
Tyr Asn Lys Pro Ser Gln Leu Ala Asp Gln Tyr Leu His Gln Glu Met
180 185 190
Ile Ala Lys Lys Leu Asp Lys Val Val Val Ala Ser Arg Arg Ile Leu
195 200 205
Lys Asp Arg Glu Gly Leu Ser Val Asn Glu Val Glu Phe Leu Thr Gly
210 215 220
Ile Asp His Leu His Gln Glu Val Leu Lys Asp Glu Phe Gly Asn Ala
225 230 235 240
Lys Val Lys Asp Gly Lys Val Met Lys Thr Phe Val Glu Tyr Asp Asp
245 250 255
Phe Tyr Phe Lys Ile Ser Gly Lys Arg Leu Val Asn Gly Tyr Thr Val
260 265 270
Thr Thr Lys Asp Asp Lys Pro Val Asn Val Asn Thr Met Leu Pro Ala
275 280 285
Leu Ser Asp Phe Gly Leu Leu Tyr Phe Cys Val Leu Phe Leu Ser Lys
290 295 300
Pro Tyr Ala Lys Leu Phe Ile Asp Glu Val Arg Leu Phe Glu Tyr Ser
305 310 315 320
Pro Phe Asp Asp Lys Glu Asn Met Ile Met Ser Glu Met Leu Ser Ile
325 330 335
Tyr Arg Ile Arg Thr Pro Arg Leu His Lys Ile Asp Ser His Asp Ser
340 345 350
Lys Ala Thr Leu Ala Met Asp Ile Phe Gly Glu Leu Arg Arg Cys Pro
355 360 365
Met Glu Leu Tyr Asn Leu Leu Asp Lys Asn Ala Gly Gln Pro Phe Phe
370 375 380
His Asp Glu Val Lys His Pro Asn Ser His Thr Pro Asp Val Ser Lys
385 390 395 400
Arg Leu Arg Tyr Asp Asp Arg Phe Pro Thr Leu Ala Leu Arg Tyr Ile
405 410 415
Asp Glu Thr Glu Leu Phe Lys Arg Ile Arg Phe Gln Leu Gln Leu Gly
420 425 430
Ser Phe Arg Tyr Lys Phe Tyr Asp Lys Glu Asn Cys Ile Asp Gly Arg
435 440 445
Val Arg Val Arg Arg Ile Gln Lys Glu Ile Asn Gly Tyr Gly Arg Met
450 455 460
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465 470 475 480
Lys Arg Glu Glu Arg Ser Val Lys Leu Glu His Glu Glu Leu Tyr Ile
485 490 495
Asn Leu Asp Gln Phe Leu Glu Asp Thr Ala Asp Ser Thr Pro Tyr Val
500 505 510
Thr Asp Arg Arg Pro Ala Tyr Asn Ile His Ala Asn Arg Ile Gly Leu
515 520 525
Tyr Trp Glu Asp Ser Gln Asn Pro Lys Gln Tyr Lys Val Phe Asp Glu
530 535 540
Asn Gly Met Tyr Ile Pro Glu Leu Val Val Thr Glu Asp Lys Lys Ala
545 550 555 560
Pro Ile Lys Met Pro Ala Pro Arg Cys Ala Leu Ser Val Tyr Asp Leu
565 570 575
Pro Ala Met Leu Phe Tyr Glu Tyr Leu Arg Glu Gln Gln Asp Asn Glu
580 585 590
Phe Pro Ser Ala Glu Gln Val Ile Ile Glu Tyr Glu Asp Asp Tyr Arg
595 600 605
Lys Phe Phe Lys Ala Val Ala Glu Gly Lys Leu Lys Pro Phe Lys Arg
610 615 620
Pro Lys Glu Phe Arg Asp Phe Leu Lys Lys Glu Tyr Pro Lys Leu Arg
625 630 635 640
Met Ala Asp Ile Pro Lys Lys Leu Gln Leu Phe Leu Cys Ser His Gly
645 650 655
Leu Cys Tyr Asn Asn Lys Pro Glu Thr Val Tyr Glu Arg Leu Asp Arg
660 665 670
Leu Thr Leu Gln His Leu Glu Glu Arg Glu Leu His Ile Gln Asn Arg
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Leu Glu His Tyr Gln Lys Asp Arg Asp Met Ile Gly Asn Lys Asp Asn
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Gln Tyr Gly Lys Lys Ser Phe Ser Asp Val Arg His Gly Ala Leu Ala
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Asp Lys Glu Lys Gly His Asp Lys Leu Thr Gly Leu Asn Tyr Asn Val
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Leu Thr Ala Tyr Leu Ala Thr Tyr Gly His Pro Gln Val Pro Glu Glu
755 760 765
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770 775 780
Ile Gly Gly Ser Asn Pro His Pro Phe Ile Asn Lys Val Leu Ala Leu
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Gly Asn Arg Asn Ile Glu Glu Leu Tyr Leu His Tyr Leu Glu Glu Glu
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Leu Lys His Ile Arg Ser Arg Ile Gln Ser Leu Ser Ser Asn Pro Ser
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835 840 845
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850 855 860
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865 870 875 880
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930 935 940
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945 950 955 960
Asn Asn Asn Lys Lys Asp Thr Phe Pro Phe Glu Met Ile Pro Leu Phe
965 970 975
Leu Thr Ser Asp Glu Ile Gln Glu Arg Leu Ser Ala Lys Leu Leu Asp
980 985 990
Gly Asp Gly Asn Pro Val Pro Glu Val Gly Glu Lys Gly Lys Pro Ala
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Leu Met Ser Glu Leu Ala Ala Tyr Asp Gln Tyr Arg Ser Thr Ile Phe
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Met Leu Ile Gln Ser Ile Glu Asn Leu Ile Ile Thr Asn Asn Ala Val
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Leu Asp Asp Pro Asp Ala Asp Gly Phe Trp Val Arg Glu Asp Leu Pro
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Lys Arg Asn Asn Phe Ala Ser Leu Leu Glu Leu Ile Asn Gln Leu Asn
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Asn Ala Phe Ser His Asn Ser Tyr Asn Ile Asp Phe Ser Leu Ile Lys
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Asp Val Lys His Leu Pro Glu Val Ala Lys Gly Ile Leu Gln His Leu
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Gln Ser Met Leu Gly Val Glu Ile Thr Lys
1315 1320
<210> 378
<211> 1095
<212> PRT
<213> Riemerella anatipestifer
<400> 378
Met Glu Lys Pro Leu Leu Pro Asn Val Tyr Thr Leu Lys His Lys Phe
1 5 10 15
Phe Trp Gly Ala Phe Leu Asn Ile Ala Arg His Asn Ala Phe Ile Thr
20 25 30
Ile Cys His Ile Asn Glu Gln Leu Gly Leu Lys Thr Pro Ser Asn Asp
35 40 45
Asp Lys Ile Val Asp Val Val Cys Glu Thr Trp Asn Asn Ile Leu Asn
50 55 60
Asn Asp His Asp Leu Leu Lys Lys Ser Gln Leu Thr Glu Leu Ile Leu
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100 105 110
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130 135 140
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Lys His Leu Tyr Lys Ala Phe Asp Ala Ser Leu Arg Met Val Lys Glu
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180 185 190
Leu Asn Arg Lys Gly Lys Asn Lys Gln Asp Asn Pro Asp Phe Asn Arg
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Tyr Arg Phe Glu Lys Asp Gly Phe Phe Thr Glu Ser Gly Leu Leu Phe
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Phe Thr Asn Leu Phe Leu Asp Lys Arg Asp Ala Tyr Trp Met Leu Lys
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Lys Val Ser Gly Phe Lys Ala Ser His Lys Gln Arg Glu Lys Met Thr
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Glu Ser Arg Tyr Asp His Asn Gln Met Leu Leu Asp Met Leu Ser Glu
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Leu Ser Arg Cys Pro Lys Leu Leu Tyr Glu Lys Leu Ser Glu Glu Asn
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Ser Ile Arg Phe Gln Val Asp Leu Gly Thr Tyr His Tyr Cys Ile Tyr
355 360 365
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405 410 415
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420 425 430
Asn Lys Ile Gly Phe Arg Leu Gly Thr Ser Lys Glu Leu Tyr Pro Ser
435 440 445
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450 455 460
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545 550 555 560
Ala Glu Thr Lys Leu Leu Ser His Arg Leu Asn Thr Lys Leu Lys Ser
565 570 575
Ser Pro Lys Leu Gly Lys Arg Arg Glu Lys Leu Ile Lys Thr Gly Val
580 585 590
Leu Ala Asp Trp Leu Val Lys Asp Phe Met Arg Phe Gln Pro Val Ala
595 600 605
Tyr Asp Ala Gln Asn Gln Pro Ile Lys Ser Ser Lys Ala Asn Ser Thr
610 615 620
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625 630 635 640
Asn Arg Leu Glu Gly Tyr Phe Lys Gln Thr Asn Leu Ile Gly Asn Thr
645 650 655
Asn Pro His Pro Phe Leu Asn Lys Phe Asn Trp Lys Ala Cys Arg Asn
660 665 670
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675 680 685
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Leu Lys Ile Pro Lys Glu Asn Arg Lys Asn Leu Val Lys Gly Trp Glu
705 710 715 720
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Tyr Phe Lys Glu Lys Tyr Gln Asp Lys His Gln Ser Phe Tyr Asn Leu
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785 790 795 800
Tyr Glu Tyr Trp Gln Gln Asn Lys Pro Gln Ser Pro Thr Glu Ser Gln
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820 825 830
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835 840 845
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850 855 860
Lys Glu Leu Asn Leu Asn Tyr His Gln Leu Lys Leu Glu Asn Leu Ala
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885 890 895
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900 905 910
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915 920 925
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930 935 940
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980 985 990
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1090 1095
<210> 379
<211> 1124
<212> PRT
<213> Prevotella aurantiaca
<400> 379
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1 5 10 15
Asp Lys His Phe Trp Ala Ala Phe Leu Asn Leu Ala Arg His Asn Val
20 25 30
Tyr Ile Thr Ile Asn His Ile Asn Lys Leu Leu Glu Ile Arg Glu Ile
35 40 45
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50 55 60
Asn Lys Asp Leu Asn Gln Lys Ala Arg Leu Arg Glu Leu Met Thr Lys
65 70 75 80
His Phe Pro Phe Leu Glu Thr Ala Ile Tyr Thr Lys Asn Lys Glu Asp
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100 105 110
Ser Leu Lys Asp Cys Leu Phe Leu Phe Leu Asp Lys Leu Gln Glu Ala
115 120 125
Arg Asn Tyr Tyr Ser His Tyr Lys Tyr Ser Glu Phe Ser Lys Glu Pro
130 135 140
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145 150 155 160
Asn Ile Gln Leu Val Ile Asn Asp Tyr Gln His Asn Lys Asp Ile Asn
165 170 175
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180 185 190
Ser Phe Ala Asp Asn Glu Gly Asn Ile Thr Glu Ser Gly Leu Leu Phe
195 200 205
Phe Val Ser Leu Phe Leu Glu Lys Lys Asp Ala Ile Trp Met Gln Gln
210 215 220
Lys Leu Asn Gly Phe Lys Asp Asn Leu Glu Asn Lys Lys Lys Met Thr
225 230 235 240
His Glu Val Phe Cys Arg Ser Arg Ile Leu Met Pro Lys Leu Arg Leu
245 250 255
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Leu Ile Arg Cys Pro Lys Ser Leu Tyr Glu Arg Leu Gln Gly Asp Asp
275 280 285
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290 295 300
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Phe Pro Tyr Phe Val Leu Arg Tyr Phe Asp Tyr Asn Glu Ile Phe Lys
325 330 335
Asn Leu Arg Phe Gln Ile Asp Leu Gly Thr Tyr His Phe Ser Ile Tyr
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385 390 395 400
Asn Lys Arg Tyr Ile Ser Glu Thr Thr Pro His Tyr His Leu Glu Asn
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435 440 445
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465 470 475 480
Asp Glu Ile Asn Ala Ser Ile Val Glu Gly Phe Ile Lys Arg Glu Ile
485 490 495
Arg Asn Ile Phe Lys Leu Tyr Asp Ala Phe Ala Asn Gly Glu Ile Asn
500 505 510
Asn Ile Asp Asp Leu Glu Lys Tyr Cys Ala Asp Lys Gly Ile Pro Lys
515 520 525
Arg His Leu Pro Lys Gln Met Val Ala Ile Leu Tyr Asp Glu His Lys
530 535 540
Asp Met Val Lys Glu Ala Lys Arg Lys Gln Lys Glu Met Val Lys Asp
545 550 555 560
Thr Lys Lys Leu Leu Ala Thr Leu Glu Lys Gln Thr Gln Lys Glu Lys
565 570 575
Glu Asp Asp Gly Arg Asn Val Lys Leu Leu Lys Ser Gly Glu Ile Ala
580 585 590
Arg Trp Leu Val Asn Asp Met Met Arg Phe Gln Pro Val Gln Lys Asp
595 600 605
Asn Glu Gly Lys Pro Leu Asn Asn Ser Lys Ala Asn Ser Thr Glu Tyr
610 615 620
Gln Met Leu Gln Arg Ser Leu Ala Leu Tyr Asn Asn Glu Glu Lys Pro
625 630 635 640
Thr Arg Tyr Phe Arg Gln Val Asn Leu Ile Glu Ser Asn Asn Pro His
645 650 655
Pro Phe Leu Lys Trp Thr Lys Trp Glu Glu Cys Asn Asn Ile Leu Thr
660 665 670
Phe Tyr Tyr Ser Tyr Leu Thr Lys Lys Ile Glu Phe Leu Asn Lys Leu
675 680 685
Lys Pro Glu Asp Trp Lys Lys Asn Gln Tyr Phe Leu Lys Leu Lys Glu
690 695 700
Pro Lys Thr Asn Arg Glu Thr Leu Val Gln Gly Trp Lys Asn Gly Phe
705 710 715 720
Asn Leu Pro Arg Gly Ile Phe Thr Glu Pro Ile Arg Glu Trp Phe Lys
725 730 735
Arg His Gln Asn Asn Ser Lys Glu Tyr Glu Lys Val Glu Ala Leu Asp
740 745 750
Arg Val Gly Leu Val Thr Lys Val Ile Pro Leu Phe Phe Lys Glu Glu
755 760 765
Tyr Phe Lys Asp Lys Glu Glu Asn Phe Lys Glu Asp Thr Gln Lys Glu
770 775 780
Ile Asn Asp Cys Val Gln Pro Phe Tyr Asn Phe Pro Tyr Asn Val Gly
785 790 795 800
Asn Ile His Lys Pro Lys Glu Lys Asp Phe Leu His Arg Glu Glu Arg
805 810 815
Ile Glu Leu Trp Asp Lys Lys Lys Asp Lys Phe Lys Gly Tyr Lys Glu
820 825 830
Lys Ile Lys Ser Lys Lys Leu Thr Glu Lys Asp Lys Glu Glu Phe Arg
835 840 845
Ser Tyr Leu Glu Phe Gln Ser Trp Asn Lys Phe Glu Arg Glu Leu Arg
850 855 860
Leu Val Arg Asn Gln Asp Ile Val Thr Trp Leu Leu Cys Lys Glu Leu
865 870 875 880
Ile Asp Lys Leu Lys Ile Asp Glu Leu Asn Ile Glu Glu Leu Lys Lys
885 890 895
Leu Arg Leu Asn Asn Ile Asp Thr Asp Thr Ala Lys Lys Glu Lys Asn
900 905 910
Asn Ile Leu Asn Arg Val Met Pro Met Glu Leu Pro Val Thr Val Tyr
915 920 925
Glu Ile Asp Asp Ser His Lys Ile Val Lys Asp Lys Pro Leu His Thr
930 935 940
Ile Tyr Ile Lys Glu Ala Glu Thr Lys Leu Leu Lys Gln Gly Asn Phe
945 950 955 960
Lys Ala Leu Val Lys Asp Arg Arg Leu Asn Gly Leu Phe Ser Phe Val
965 970 975
Lys Thr Asn Ser Glu Ala Glu Ser Lys Arg Asn Pro Ile Ser Lys Leu
980 985 990
Arg Val Glu Tyr Glu Leu Gly Glu Tyr Gln Glu Ala Arg Ile Glu Ile
995 1000 1005
Ile Gln Asp Met Leu Ala Leu Glu Glu Lys Leu Ile Asn Lys Tyr Lys
1010 1015 1020
Asp Leu Pro Thr Asn Lys Phe Ser Glu Met Leu Asn Ser Trp Leu Glu
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Gly Lys Asp Glu Ala Asp Lys Ala Arg Phe Gln Asn Asp Val Asp Phe
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Leu Ile Ala Val Arg Asn Ala Phe Ser His Asn Gln Tyr Pro Met His
1060 1065 1070
Asn Lys Ile Glu Phe Ala Asn Ile Lys Pro Phe Ser Leu Tyr Thr Ala
1075 1080 1085
Asn Asn Ser Glu Glu Lys Gly Leu Gly Ile Ala Asn Gln Leu Lys Asp
1090 1095 1100
Lys Thr Lys Glu Thr Thr Asp Lys Ile Lys Lys Ile Glu Lys Pro Ile
1105 1110 1115 1120
Glu Thr Lys Glu
<210> 380
<211> 1151
<212> PRT
<213> Prevotella saccharolytica
<400> 380
Met Glu Asp Lys Pro Phe Trp Ala Ala Phe Phe Asn Leu Ala Arg His
1 5 10 15
Asn Val Tyr Leu Thr Val Asn His Ile Asn Lys Leu Leu Asp Leu Glu
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Lys Leu Tyr Asp Glu Gly Lys His Lys Glu Ile Phe Glu Arg Glu Asp
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Ile Phe Asn Ile Ser Asp Asp Val Met Asn Asp Ala Asn Ser Asn Gly
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100 105 110
Thr Ile Asp Lys Asp Lys Arg Ser Thr Ser Thr Ser Asn Asp Ser Leu
115 120 125
Lys Gln Thr Gly Glu Gly Asp Ile Asn Asp Leu Leu Ser Leu Ser Asn
130 135 140
Val Lys Ser Met Phe Phe Arg Leu Leu Gln Ile Leu Glu Gln Leu Arg
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165 170 175
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Val Asn Lys Val Lys Glu Asp Tyr Ser Ser Asn Ser Val Ile Asp Pro
195 200 205
Asn Thr Ser Phe Ser His Leu Ile Tyr Lys Asp Glu Gln Gly Lys Ile
210 215 220
Lys Pro Cys Arg Tyr Pro Phe Thr Ser Lys Asp Gly Ser Ile Asn Ala
225 230 235 240
Phe Gly Leu Leu Phe Phe Val Ser Leu Phe Leu Glu Lys Gln Asp Ser
245 250 255
Ile Trp Met Gln Lys Lys Ile Pro Gly Phe Lys Lys Ala Ser Glu Asn
260 265 270
Tyr Met Lys Met Thr Asn Glu Val Phe Cys Arg Asn His Ile Leu Leu
275 280 285
Pro Lys Ile Arg Leu Glu Thr Val Tyr Asp Lys Asp Trp Met Leu Leu
290 295 300
Asp Met Leu Asn Glu Val Val Arg Cys Pro Leu Ser Leu Tyr Lys Arg
305 310 315 320
Leu Thr Pro Ala Ala Gln Asn Lys Phe Lys Val Pro Glu Lys Ser Ser
325 330 335
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340 345 350
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385 390 395 400
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405 410 415
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420 425 430
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565 570 575
Ile Gly His Leu Pro Lys Gln Met Ile Asp Leu Leu Lys Gly His Gln
580 585 590
Arg Asp Met Leu Lys Ala Val Glu Gln Lys Lys Ala Met Leu Ile Lys
595 600 605
Asp Thr Glu Arg Arg Leu Lys Leu Leu Asp Lys Gln Leu Lys Gln Glu
610 615 620
Thr Asp Val Ala Ala Lys Asn Thr Gly Thr Leu Leu Lys Asn Gly Gln
625 630 635 640
Ile Ala Asp Trp Leu Val Asn Asp Met Met Arg Phe Gln Pro Val Lys
645 650 655
Arg Asp Lys Glu Gly Asn Pro Ile Asn Cys Ser Lys Ala Asn Ser Thr
660 665 670
Glu Tyr Gln Met Leu Gln Arg Ala Phe Ala Phe Tyr Ala Thr Asp Ser
675 680 685
Cys Arg Leu Ser Arg Tyr Phe Thr Gln Leu His Leu Ile His Ser Asp
690 695 700
Asn Ser His Leu Phe Leu Ser Arg Phe Glu Tyr Asp Lys Gln Pro Asn
705 710 715 720
Leu Ile Ala Phe Tyr Ala Ala Tyr Leu Lys Ala Lys Leu Glu Phe Leu
725 730 735
Asn Glu Leu Gln Pro Gln Asn Trp Ala Ser Asp Asn Tyr Phe Leu Leu
740 745 750
Leu Arg Ala Pro Lys Asn Asp Arg Gln Lys Leu Ala Glu Gly Trp Lys
755 760 765
Asn Gly Phe Asn Leu Pro Arg Gly Leu Phe Thr Glu Lys Ile Lys Thr
770 775 780
Trp Phe Asn Glu His Lys Thr Ile Val Asp Ile Ser Asp Cys Asp Ile
785 790 795 800
Phe Lys Asn Arg Val Gly Gln Val Ala Arg Leu Ile Pro Val Phe Phe
805 810 815
Asp Lys Lys Phe Lys Asp His Ser Gln Pro Phe Tyr Arg Tyr Asp Phe
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Asn Val Gly Asn Val Ser Lys Pro Thr Glu Ala Asn Tyr Leu Ser Lys
835 840 845
Gly Lys Arg Glu Glu Leu Phe Lys Ser Tyr Gln Asn Lys Phe Lys Asn
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Asn Ile Pro Ala Glu Lys Thr Lys Glu Tyr Arg Glu Tyr Lys Asn Phe
865 870 875 880
Ser Leu Trp Lys Lys Phe Glu Arg Glu Leu Arg Leu Ile Lys Asn Gln
885 890 895
Asp Ile Leu Ile Trp Leu Met Cys Lys Asn Leu Phe Asp Glu Lys Ile
900 905 910
Lys Pro Lys Lys Asp Ile Leu Glu Pro Arg Ile Ala Val Ser Tyr Ile
915 920 925
Lys Leu Asp Ser Leu Gln Thr Asn Thr Ser Thr Ala Gly Ser Leu Asn
930 935 940
Ala Leu Ala Lys Val Val Pro Met Thr Leu Ala Ile His Ile Asp Ser
945 950 955 960
Pro Lys Pro Lys Gly Lys Ala Gly Asn Asn Glu Lys Glu Asn Lys Glu
965 970 975
Phe Thr Val Tyr Ile Lys Glu Glu Gly Thr Lys Leu Leu Lys Trp Gly
980 985 990
Asn Phe Lys Thr Leu Leu Ala Asp Arg Arg Ile Lys Gly Leu Phe Ser
995 1000 1005
Tyr Ile Glu His Asp Asp Ile Asp Leu Lys Gln His Pro Leu Thr Lys
1010 1015 1020
Arg Arg Val Asp Leu Glu Leu Asp Leu Tyr Gln Thr Cys Arg Ile Asp
1025 1030 1035 1040
Ile Phe Gln Gln Thr Leu Gly Leu Glu Ala Gln Leu Leu Asp Lys Tyr
1045 1050 1055
Ser Asp Leu Asn Thr Asp Asn Phe Tyr Gln Met Leu Ile Gly Trp Arg
1060 1065 1070
Lys Lys Glu Gly Ile Pro Arg Asn Ile Lys Glu Asp Thr Asp Phe Leu
1075 1080 1085
Lys Asp Val Arg Asn Ala Phe Ser His Asn Gln Tyr Pro Asp Ser Lys
1090 1095 1100
Lys Ile Ala Phe Arg Arg Ile Arg Lys Phe Asn Pro Lys Glu Leu Ile
1105 1110 1115 1120
Leu Glu Glu Glu Glu Gly Leu Gly Ile Ala Thr Gln Met Tyr Lys Glu
1125 1130 1135
Val Glu Lys Val Val Asn Arg Ile Lys Arg Ile Glu Leu Phe Asp
1140 1145 1150
<210> 381
<211> 1159
<212> PRT
<213> Myroides odoratimimus
<400> 381
Met Lys Asp Ile Leu Thr Thr Asp Thr Thr Glu Lys Gln Asn Arg Phe
1 5 10 15
Tyr Ser His Lys Ile Ala Asp Lys Tyr Phe Phe Gly Gly Tyr Phe Asn
20 25 30
Leu Ala Ser Asn Asn Ile Tyr Glu Val Phe Glu Glu Val Asn Lys Arg
35 40 45
Asn Thr Phe Gly Lys Leu Ala Lys Arg Asp Asn Gly Asn Leu Lys Asn
50 55 60
Tyr Ile Ile His Val Phe Lys Asp Glu Leu Ser Ile Ser Asp Phe Glu
65 70 75 80
Lys Arg Val Ala Ile Phe Ala Ser Tyr Phe Pro Ile Leu Glu Thr Val
85 90 95
Asp Lys Lys Ser Ile Lys Glu Arg Asn Arg Thr Ile Asp Leu Thr Leu
100 105 110
Ser Gln Arg Ile Arg Gln Phe Arg Glu Met Leu Ile Ser Leu Val Thr
115 120 125
Ala Val Asp Gln Leu Arg Asn Phe Tyr Thr His Tyr His His Ser Asp
130 135 140
Ile Val Ile Glu Asn Lys Val Leu Asp Phe Leu Asn Ser Ser Phe Val
145 150 155 160
Ser Thr Ala Leu His Val Lys Asp Lys Tyr Leu Lys Thr Asp Lys Thr
165 170 175
Lys Glu Phe Leu Lys Glu Thr Ile Ala Ala Glu Leu Asp Ile Leu Ile
180 185 190
Glu Ala Tyr Lys Lys Lys Gln Ile Glu Lys Lys Asn Thr Arg Phe Lys
195 200 205
Ala Asn Lys Arg Glu Asp Ile Leu Asn Ala Ile Tyr Asn Glu Ala Phe
210 215 220
Trp Ser Phe Ile Asn Asp Lys Asp Lys Asp Lys Asp Lys Glu Thr Val
225 230 235 240
Val Ala Lys Gly Ala Asp Ala Tyr Phe Glu Lys Asn His His Lys Ser
245 250 255
Asn Asp Pro Asp Phe Ala Leu Asn Ile Ser Glu Lys Gly Ile Val Tyr
260 265 270
Leu Leu Ser Phe Phe Leu Thr Asn Lys Glu Met Asp Ser Leu Lys Ala
275 280 285
Asn Leu Thr Gly Phe Lys Gly Lys Val Asp Arg Glu Ser Gly Asn Ser
290 295 300
Ile Lys Tyr Met Ala Thr Gln Arg Ile Tyr Ser Phe His Thr Tyr Arg
305 310 315 320
Gly Leu Lys Gln Lys Ile Arg Thr Ser Glu Glu Gly Val Lys Glu Thr
325 330 335
Leu Leu Met Gln Met Ile Asp Glu Leu Ser Lys Val Pro Asn Val Val
340 345 350
Tyr Gln His Leu Ser Thr Thr Gln Gln Asn Ser Phe Ile Glu Asp Trp
355 360 365
Asn Glu Tyr Tyr Lys Asp Tyr Glu Asp Asp Val Glu Thr Asp Asp Leu
370 375 380
Ser Arg Val Ile His Pro Val Ile Arg Lys Arg Tyr Glu Asp Arg Phe
385 390 395 400
Asn Tyr Phe Ala Ile Arg Phe Leu Asp Glu Phe Phe Asp Phe Pro Thr
405 410 415
Leu Arg Phe Gln Val His Leu Gly Asp Tyr Val His Asp Arg Arg Thr
420 425 430
Lys Gln Leu Gly Lys Val Glu Ser Asp Arg Ile Ile Lys Glu Lys Val
435 440 445
Thr Val Phe Ala Arg Leu Lys Asp Ile Asn Ser Ala Lys Ala Ser Tyr
450 455 460
Phe His Ser Leu Glu Glu Gln Asp Lys Glu Glu Leu Asp Asn Lys Trp
465 470 475 480
Thr Leu Phe Pro Asn Pro Ser Tyr Asp Phe Pro Lys Glu His Thr Leu
485 490 495
Gln His Gln Gly Glu Gln Lys Asn Ala Gly Lys Ile Gly Ile Tyr Val
500 505 510
Lys Leu Arg Asp Thr Gln Tyr Lys Glu Lys Ala Ala Leu Glu Glu Ala
515 520 525
Arg Lys Ser Leu Asn Pro Lys Glu Arg Ser Ala Thr Lys Ala Ser Lys
530 535 540
Tyr Asp Ile Ile Thr Gln Ile Ile Glu Ala Asn Asp Asn Val Lys Ser
545 550 555 560
Glu Lys Pro Leu Val Phe Thr Gly Gln Pro Ile Ala Tyr Leu Ser Met
565 570 575
Asn Asp Ile His Ser Met Leu Phe Ser Leu Leu Thr Asp Asn Ala Glu
580 585 590
Leu Lys Lys Thr Pro Glu Glu Val Glu Ala Lys Leu Ile Asp Gln Ile
595 600 605
Gly Lys Gln Ile Asn Glu Ile Leu Ser Lys Asp Thr Asp Thr Lys Ile
610 615 620
Leu Lys Lys Tyr Lys Asp Asn Asp Leu Lys Glu Thr Asp Thr Asp Lys
625 630 635 640
Ile Thr Arg Asp Leu Ala Arg Asp Lys Glu Glu Ile Glu Lys Leu Ile
645 650 655
Leu Glu Gln Lys Gln Arg Ala Asp Asp Tyr Asn Tyr Thr Ser Ser Thr
660 665 670
Lys Phe Asn Ile Asp Lys Ser Arg Lys Arg Lys His Leu Leu Phe Asn
675 680 685
Ala Glu Lys Gly Lys Ile Gly Val Trp Leu Ala Asn Asp Ile Lys Arg
690 695 700
Phe Met Phe Lys Glu Ser Lys Ser Lys Trp Lys Gly Tyr Gln His Thr
705 710 715 720
Glu Leu Gln Lys Leu Phe Ala Tyr Phe Asp Thr Ser Lys Ser Asp Leu
725 730 735
Glu Leu Ile Leu Ser Asn Met Val Met Val Lys Asp Tyr Pro Ile Glu
740 745 750
Leu Ile Asp Leu Val Lys Lys Ser Arg Thr Leu Val Asp Phe Leu Asn
755 760 765
Lys Tyr Leu Glu Ala Arg Leu Glu Tyr Ile Glu Asn Val Ile Thr Arg
770 775 780
Val Lys Asn Ser Ile Gly Thr Pro Gln Phe Lys Thr Val Arg Lys Glu
785 790 795 800
Cys Phe Thr Phe Leu Lys Lys Ser Asn Tyr Thr Val Val Ser Leu Asp
805 810 815
Lys Gln Val Glu Arg Ile Leu Ser Met Pro Leu Phe Ile Glu Arg Gly
820 825 830
Phe Met Asp Asp Lys Pro Thr Met Leu Glu Gly Lys Ser Tyr Lys Gln
835 840 845
His Lys Glu Lys Phe Ala Asp Trp Phe Val His Tyr Lys Glu Asn Ser
850 855 860
Asn Tyr Gln Asn Phe Tyr Asp Thr Glu Val Tyr Glu Ile Thr Thr Glu
865 870 875 880
Asp Lys Arg Glu Lys Ala Lys Val Thr Lys Lys Ile Lys Gln Gln Gln
885 890 895
Lys Asn Asp Val Phe Thr Leu Met Met Val Asn Tyr Met Leu Glu Glu
900 905 910
Val Leu Lys Leu Ser Ser Asn Asp Arg Leu Ser Leu Asn Glu Leu Tyr
915 920 925
Gln Thr Lys Glu Glu Arg Ile Val Asn Lys Gln Val Ala Lys Asp Thr
930 935 940
Gln Glu Arg Asn Lys Asn Tyr Ile Trp Asn Lys Val Val Asp Leu Gln
945 950 955 960
Leu Cys Asp Gly Leu Val His Ile Asp Asn Val Lys Leu Lys Asp Ile
965 970 975
Gly Asn Phe Arg Lys Tyr Glu Asn Asp Ser Arg Val Lys Glu Phe Leu
980 985 990
Thr Tyr Gln Ser Asp Ile Val Trp Ser Ala Tyr Leu Ser Asn Glu Val
995 1000 1005
Asp Ser Asn Lys Leu Tyr Val Ile Glu Arg Gln Leu Asp Asn Tyr Glu
1010 1015 1020
Ser Ile Arg Ser Lys Glu Leu Leu Lys Glu Val Gln Glu Ile Glu Cys
1025 1030 1035 1040
Ser Val Tyr Asn Gln Val Ala Asn Lys Glu Ser Leu Lys Gln Ser Gly
1045 1050 1055
Asn Glu Asn Phe Lys Gln Tyr Val Leu Gln Gly Leu Leu Pro Ile Gly
1060 1065 1070
Met Asp Val Arg Glu Met Leu Ile Leu Ser Thr Asp Val Lys Phe Lys
1075 1080 1085
Lys Glu Glu Ile Ile Gln Leu Gly Gln Ala Gly Glu Val Glu Gln Asp
1090 1095 1100
Leu Tyr Ser Leu Ile Tyr Ile Arg Asn Lys Phe Ala His Asn Gln Leu
1105 1110 1115 1120
Pro Ile Lys Glu Phe Phe Asp Phe Cys Glu Asn Asn Tyr Arg Ser Ile
1125 1130 1135
Ser Asp Asn Glu Tyr Tyr Ala Glu Tyr Tyr Met Glu Ile Phe Arg Ser
1140 1145 1150
Ile Lys Glu Lys Tyr Ala Asn
1155
<210> 382
<211> 1120
<212> PRT
<213> Prevotella intermedia
<400> 382
Met Glu Asp Asp Lys Lys Thr Thr Asp Ser Ile Arg Tyr Glu Leu Lys
1 5 10 15
Asp Lys His Phe Trp Ala Ala Phe Leu Asn Leu Ala Arg His Asn Val
20 25 30
Tyr Ile Thr Val Asn His Ile Asn Lys Ile Leu Glu Glu Asp Glu Ile
35 40 45
Asn Arg Asp Gly Tyr Glu Asn Thr Leu Glu Asn Ser Trp Asn Glu Ile
50 55 60
Lys Asp Ile Asn Lys Lys Asp Arg Leu Ser Lys Leu Ile Ile Lys His
65 70 75 80
Phe Pro Phe Leu Glu Ala Thr Thr Tyr Arg Gln Asn Pro Thr Asp Thr
85 90 95
Thr Lys Gln Lys Glu Glu Lys Gln Ala Glu Ala Gln Ser Leu Glu Ser
100 105 110
Leu Lys Lys Ser Phe Phe Val Phe Ile Tyr Lys Leu Arg Asp Leu Arg
115 120 125
Asn His Tyr Ser His Tyr Lys His Ser Lys Ser Leu Glu Arg Pro Lys
130 135 140
Phe Glu Glu Asp Leu Gln Asn Lys Met Tyr Asn Ile Phe Asp Val Ser
145 150 155 160
Ile Gln Phe Val Lys Glu Asp Tyr Lys His Asn Thr Asp Ile Asn Pro
165 170 175
Lys Lys Asp Phe Lys His Leu Asp Arg Lys Arg Lys Gly Lys Phe His
180 185 190
Tyr Ser Phe Ala Asp Asn Glu Gly Asn Ile Thr Glu Ser Gly Leu Leu
195 200 205
Phe Phe Val Ser Leu Phe Leu Glu Lys Lys Asp Ala Ile Trp Val Gln
210 215 220
Lys Lys Leu Glu Gly Phe Lys Cys Ser Asn Lys Ser Tyr Gln Lys Met
225 230 235 240
Thr Asn Glu Val Phe Cys Arg Ser Arg Met Leu Leu Pro Lys Leu Arg
245 250 255
Leu Glu Ser Thr Gln Thr Gln Asp Trp Ile Leu Leu Asp Met Leu Asn
260 265 270
Glu Leu Ile Arg Cys Pro Lys Ser Leu Tyr Glu Arg Leu Gln Gly Val
275 280 285
Asn Arg Lys Lys Phe Tyr Val Ser Phe Asp Pro Ala Asp Glu Asp Tyr
290 295 300
Asp Ala Glu Gln Glu Pro Phe Lys Asn Thr Leu Val Arg His Gln Asp
305 310 315 320
Arg Phe Pro Tyr Phe Ala Leu Arg Tyr Phe Asp Tyr Asn Glu Val Phe
325 330 335
Ala Asn Leu Arg Phe Gln Ile Asp Leu Gly Thr Tyr His Phe Ser Ile
340 345 350
Tyr Lys Lys Leu Ile Gly Gly Gln Lys Glu Asp Arg His Leu Thr His
355 360 365
Lys Leu Tyr Gly Phe Glu Arg Ile Gln Glu Phe Asp Lys Gln Asn Arg
370 375 380
Pro Asp Glu Trp Lys Ala Ile Val Lys Asp Ser Asp Thr Phe Lys Lys
385 390 395 400
Lys Glu Glu Lys Glu Glu Glu Lys Pro Tyr Ile Ser Glu Thr Thr Pro
405 410 415
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420 425 430
Asn Ile Trp Pro Ser Thr Gln Thr Glu Leu Thr Asn Asn Lys Arg Lys
435 440 445
Lys Tyr Asn Leu Gly Thr Ser Ile Lys Ala Glu Ala Phe Leu Ser Val
450 455 460
His Glu Leu Leu Pro Met Met Phe Tyr Tyr Leu Leu Leu Lys Thr Glu
465 470 475 480
Asn Thr Lys Asn Asp Asn Lys Val Gly Gly Lys Lys Glu Thr Lys Lys
485 490 495
Gln Gly Lys His Lys Ile Glu Ala Ile Ile Glu Ser Lys Ile Lys Asp
500 505 510
Ile Tyr Ala Leu Tyr Asp Ala Phe Ala Asn Gly Glu Ile Asn Ser Glu
515 520 525
Asp Glu Leu Lys Glu Tyr Leu Lys Gly Lys Asp Ile Lys Ile Val His
530 535 540
Leu Pro Lys Gln Met Ile Ala Ile Leu Lys Asn Glu His Lys Asp Met
545 550 555 560
Ala Glu Lys Ala Glu Ala Lys Gln Glu Lys Met Lys Leu Ala Thr Glu
565 570 575
Asn Arg Leu Lys Thr Leu Asp Lys Gln Leu Lys Gly Lys Ile Gln Asn
580 585 590
Gly Lys Arg Tyr Asn Ser Ala Pro Lys Ser Gly Glu Ile Ala Ser Trp
595 600 605
Leu Val Asn Asp Met Met Arg Phe Gln Pro Val Gln Lys Asp Glu Asn
610 615 620
Gly Glu Ser Leu Asn Asn Ser Lys Ala Asn Ser Thr Glu Tyr Gln Leu
625 630 635 640
Leu Gln Arg Thr Leu Ala Phe Phe Gly Ser Glu His Glu Arg Leu Ala
645 650 655
Pro Tyr Phe Lys Gln Thr Lys Leu Ile Glu Ser Ser Asn Pro His Pro
660 665 670
Phe Leu Asn Asp Thr Glu Trp Glu Lys Cys Ser Asn Ile Leu Ser Phe
675 680 685
Tyr Arg Ser Tyr Leu Lys Ala Arg Lys Asn Phe Leu Glu Ser Leu Lys
690 695 700
Pro Glu Asp Trp Glu Lys Asn Gln Tyr Phe Leu Met Leu Lys Glu Pro
705 710 715 720
Lys Thr Asn Arg Glu Thr Leu Val Gln Gly Trp Lys Asn Gly Phe Asn
725 730 735
Leu Pro Arg Gly Phe Phe Thr Glu Pro Ile Arg Lys Trp Phe Met Glu
740 745 750
His Trp Lys Ser Ile Lys Val Asp Asp Leu Lys Arg Val Gly Leu Val
755 760 765
Ala Lys Val Thr Pro Leu Phe Phe Ser Glu Lys Tyr Lys Asp Ser Val
770 775 780
Gln Pro Phe Tyr Asn Tyr Pro Phe Asn Val Gly Asp Val Asn Lys Pro
785 790 795 800
Lys Glu Glu Asp Phe Leu His Arg Glu Glu Arg Ile Glu Leu Trp Asp
805 810 815
Lys Lys Lys Asp Lys Phe Lys Gly Tyr Lys Ala Lys Lys Lys Phe Lys
820 825 830
Glu Met Thr Asp Lys Glu Lys Glu Glu His Arg Ser Tyr Leu Glu Phe
835 840 845
Gln Ser Trp Asn Lys Phe Glu Arg Glu Leu Arg Leu Val Arg Asn Gln
850 855 860
Asp Ile Val Thr Trp Leu Leu Cys Thr Glu Leu Ile Asp Lys Leu Lys
865 870 875 880
Ile Asp Glu Leu Asn Ile Lys Glu Leu Lys Lys Leu Arg Leu Lys Asp
885 890 895
Ile Asn Thr Asp Thr Ala Lys Lys Glu Lys Asn Asn Ile Leu Asn Arg
900 905 910
Val Met Pro Met Glu Leu Pro Val Thr Val Tyr Lys Val Asn Lys Gly
915 920 925
Gly Tyr Ile Ile Lys Asn Lys Pro Leu His Thr Ile Tyr Ile Lys Glu
930 935 940
Ala Glu Thr Lys Leu Leu Lys Gln Gly Asn Phe Lys Ala Leu Val Lys
945 950 955 960
Asp Arg Arg Leu Asn Gly Leu Phe Ser Phe Val Lys Thr Pro Ser Glu
965 970 975
Ala Glu Ser Glu Ser Asn Pro Ile Ser Lys Leu Arg Val Glu Tyr Glu
980 985 990
Leu Gly Lys Tyr Gln Asn Ala Arg Leu Asp Ile Ile Glu Asp Met Leu
995 1000 1005
Ala Leu Glu Lys Lys Leu Ile Asp Lys Tyr Asn Ser Leu Asp Thr Asp
1010 1015 1020
Asn Phe His Asn Met Leu Thr Gly Trp Leu Glu Leu Lys Gly Glu Ala
1025 1030 1035 1040
Lys Lys Ala Arg Phe Gln Asn Asp Val Lys Leu Leu Thr Ala Val Arg
1045 1050 1055
Asn Ala Phe Ser His Asn Gln Tyr Pro Met Tyr Asp Glu Asn Leu Phe
1060 1065 1070
Gly Asn Ile Glu Arg Phe Ser Leu Ser Ser Ser Asn Ile Ile Glu Ser
1075 1080 1085
Lys Gly Leu Asp Ile Ala Ala Lys Leu Lys Glu Glu Val Ser Lys Ala
1090 1095 1100
Ala Lys Lys Ile Gln Asn Glu Glu Asp Asn Lys Lys Glu Lys Glu Thr
1105 1110 1115 1120
<210> 383
<211> 1199
<212> PRT
<213> Capnocytophaga canimorsus
<400> 383
Met Lys Asn Ile Gln Arg Leu Gly Lys Gly Asn Glu Phe Ser Pro Phe
1 5 10 15
Lys Lys Glu Asp Lys Phe Tyr Phe Gly Gly Phe Leu Asn Leu Ala Asn
20 25 30
Asn Asn Ile Glu Asp Phe Phe Lys Glu Ile Ile Thr Arg Phe Gly Ile
35 40 45
Val Ile Thr Asp Glu Asn Lys Lys Pro Lys Glu Thr Phe Gly Glu Lys
50 55 60
Ile Leu Asn Glu Ile Phe Lys Lys Asp Ile Ser Ile Val Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys Trp Val Asn Ile Phe Ala Asp Tyr Phe Pro Phe Thr Lys Tyr Leu
85 90 95
Ser Leu Tyr Leu Glu Glu Met Gln Phe Lys Asn Arg Val Ile Cys Phe
100 105 110
Arg Asp Val Met Lys Glu Leu Leu Lys Thr Val Glu Ala Leu Arg Asn
115 120 125
Phe Tyr Thr His Tyr Asp His Glu Pro Ile Lys Ile Glu Asp Arg Val
130 135 140
Phe Tyr Phe Leu Asp Lys Val Leu Leu Asp Val Ser Leu Thr Val Lys
145 150 155 160
Asn Lys Tyr Leu Lys Thr Asp Lys Thr Lys Glu Phe Leu Asn Gln His
165 170 175
Ile Gly Glu Glu Leu Lys Glu Leu Cys Lys Gln Arg Lys Asp Tyr Leu
180 185 190
Val Gly Lys Gly Lys Arg Ile Asp Lys Glu Ser Glu Ile Ile Asn Gly
195 200 205
Ile Tyr Asn Asn Ala Phe Lys Asp Phe Ile Cys Lys Arg Glu Lys Gln
210 215 220
Asp Asp Lys Glu Asn His Asn Ser Val Glu Lys Ile Leu Cys Asn Lys
225 230 235 240
Glu Pro Gln Asn Lys Lys Gln Lys Ser Ser Ala Thr Val Trp Glu Leu
245 250 255
Cys Ser Lys Ser Ser Ser Lys Tyr Thr Glu Lys Ser Phe Pro Asn Arg
260 265 270
Glu Asn Asp Lys His Cys Leu Glu Val Pro Ile Ser Gln Lys Gly Ile
275 280 285
Val Phe Leu Leu Ser Phe Phe Leu Asn Lys Gly Glu Ile Tyr Ala Leu
290 295 300
Thr Ser Asn Ile Lys Gly Phe Lys Ala Lys Ile Thr Lys Glu Glu Pro
305 310 315 320
Val Thr Tyr Asp Lys Asn Ser Ile Arg Tyr Met Ala Thr His Arg Met
325 330 335
Phe Ser Phe Leu Ala Tyr Lys Gly Leu Lys Arg Lys Ile Arg Thr Ser
340 345 350
Glu Ile Asn Tyr Asn Glu Asp Gly Gln Ala Ser Ser Thr Tyr Glu Lys
355 360 365
Glu Thr Leu Met Leu Gln Met Leu Asp Glu Leu Asn Lys Val Pro Asp
370 375 380
Val Val Tyr Gln Asn Leu Ser Glu Asp Val Gln Lys Thr Phe Ile Glu
385 390 395 400
Asp Trp Asn Glu Tyr Leu Lys Glu Asn Asn Gly Asp Val Gly Thr Met
405 410 415
Glu Glu Glu Gln Val Ile His Pro Val Ile Arg Lys Arg Tyr Glu Asp
420 425 430
Lys Phe Asn Tyr Phe Ala Ile Arg Phe Leu Asp Glu Phe Ala Gln Phe
435 440 445
Pro Thr Leu Arg Phe Gln Val His Leu Gly Asn Tyr Leu Cys Asp Lys
450 455 460
Arg Thr Lys Gln Ile Cys Asp Thr Thr Thr Glu Arg Glu Val Lys Lys
465 470 475 480
Lys Ile Thr Val Phe Gly Arg Leu Ser Glu Leu Glu Asn Lys Lys Ala
485 490 495
Ile Phe Leu Asn Glu Arg Glu Glu Ile Lys Gly Trp Glu Val Phe Pro
500 505 510
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515 520 525
Asp Phe Pro Ile Val Gly Ser Ile Leu Asp Arg Glu Lys Gln Pro Val
530 535 540
Ser Asn Lys Ile Gly Ile Arg Val Lys Ile Ala Asp Glu Leu Gln Arg
545 550 555 560
Glu Ile Asp Lys Ala Ile Lys Glu Lys Lys Leu Arg Asn Pro Lys Asn
565 570 575
Arg Lys Ala Asn Gln Asp Glu Lys Gln Lys Glu Arg Leu Val Asn Glu
580 585 590
Ile Val Ser Thr Asn Ser Asn Glu Gln Gly Glu Pro Val Val Phe Ile
595 600 605
Gly Gln Pro Thr Ala Tyr Leu Ser Met Asn Asp Ile His Ser Val Leu
610 615 620
Tyr Glu Phe Leu Ile Asn Lys Ile Ser Gly Glu Ala Leu Glu Thr Lys
625 630 635 640
Ile Val Glu Lys Ile Glu Thr Gln Ile Lys Gln Ile Ile Gly Lys Asp
645 650 655
Ala Thr Thr Lys Ile Leu Lys Pro Tyr Thr Asn Ala Asn Ser Asn Ser
660 665 670
Ile Asn Arg Glu Lys Leu Leu Arg Asp Leu Glu Gln Glu Gln Gln Ile
675 680 685
Leu Lys Thr Leu Leu Glu Glu Gln Gln Gln Arg Glu Lys Asp Lys Lys
690 695 700
Asp Lys Lys Ser Lys Arg Lys His Glu Leu Tyr Pro Ser Glu Lys Gly
705 710 715 720
Lys Val Ala Val Trp Leu Ala Asn Asp Ile Lys Arg Phe Met Pro Lys
725 730 735
Ala Phe Lys Glu Gln Trp Arg Gly Tyr His His Ser Leu Leu Gln Lys
740 745 750
Tyr Leu Ala Tyr Tyr Glu Gln Ser Lys Glu Glu Leu Lys Asn Leu Leu
755 760 765
Pro Lys Glu Val Phe Lys His Phe Pro Phe Lys Leu Lys Gly Tyr Phe
770 775 780
Gln Gln Gln Tyr Leu Asn Gln Phe Tyr Thr Asp Tyr Leu Lys Arg Arg
785 790 795 800
Leu Ser Tyr Val Asn Glu Leu Leu Leu Asn Ile Gln Asn Phe Lys Asn
805 810 815
Asp Lys Asp Ala Leu Lys Ala Thr Glu Lys Glu Cys Phe Lys Phe Phe
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Arg Lys Gln Asn Tyr Ile Ile Asn Pro Ile Asn Ile Gln Ile Gln Ser
835 840 845
Ile Leu Val Tyr Pro Ile Phe Leu Lys Arg Gly Phe Leu Asp Glu Lys
850 855 860
Pro Thr Met Ile Asp Arg Glu Lys Phe Lys Glu Asn Lys Asp Thr Glu
865 870 875 880
Leu Ala Asp Trp Phe Met His Tyr Lys Asn Tyr Lys Glu Asp Asn Tyr
885 890 895
Gln Lys Phe Tyr Ala Tyr Pro Leu Glu Lys Val Glu Glu Lys Glu Lys
900 905 910
Phe Lys Arg Asn Lys Gln Ile Asn Lys Gln Lys Lys Asn Asp Val Tyr
915 920 925
Thr Leu Met Met Val Glu Tyr Ile Ile Gln Lys Ile Phe Gly Asp Lys
930 935 940
Phe Val Glu Glu Asn Pro Leu Val Leu Lys Gly Ile Phe Gln Ser Lys
945 950 955 960
Ala Glu Arg Gln Gln Asn Asn Thr His Ala Ala Thr Thr Gln Glu Arg
965 970 975
Asn Leu Asn Gly Ile Leu Asn Gln Pro Lys Asp Ile Lys Ile Gln Gly
980 985 990
Lys Ile Thr Val Lys Gly Val Lys Leu Lys Asp Ile Gly Asn Phe Arg
995 1000 1005
Lys Tyr Glu Ile Asp Gln Arg Val Asn Thr Phe Leu Asp Tyr Glu Pro
1010 1015 1020
Arg Lys Glu Trp Met Ala Tyr Leu Pro Asn Asp Trp Lys Glu Lys Glu
1025 1030 1035 1040
Lys Gln Gly Gln Leu Pro Pro Asn Asn Val Ile Asp Arg Gln Ile Ser
1045 1050 1055
Lys Tyr Glu Thr Val Arg Ser Lys Ile Leu Leu Lys Asp Val Gln Glu
1060 1065 1070
Leu Glu Lys Ile Ile Ser Asp Glu Ile Lys Glu Glu His Arg His Asp
1075 1080 1085
Leu Lys Gln Gly Lys Tyr Tyr Asn Phe Lys Tyr Tyr Ile Leu Asn Gly
1090 1095 1100
Leu Leu Arg Gln Leu Lys Asn Glu Asn Val Glu Asn Tyr Lys Val Phe
1105 1110 1115 1120
Lys Leu Asn Thr Asn Pro Glu Lys Val Asn Ile Thr Gln Leu Lys Gln
1125 1130 1135
Glu Ala Thr Asp Leu Glu Gln Lys Ala Phe Val Leu Thr Tyr Ile Arg
1140 1145 1150
Asn Lys Phe Ala His Asn Gln Leu Pro Lys Lys Glu Phe Trp Asp Tyr
1155 1160 1165
Cys Gln Glu Lys Tyr Gly Lys Ile Glu Lys Glu Lys Thr Tyr Ala Glu
1170 1175 1180
Tyr Phe Ala Glu Val Phe Lys Arg Glu Lys Glu Ala Leu Ile Lys
1185 1190 1195
<210> 384
<211> 1090
<212> PRT
<213> Prevotella species
<400> 384
Met Asn Ile Pro Ala Leu Val Glu Asn Gln Lys Lys Tyr Phe Gly Thr
1 5 10 15
Tyr Ser Val Met Ala Met Leu Asn Ala Gln Thr Val Leu Asp His Ile
20 25 30
Gln Lys Val Ala Asp Ile Glu Gly Glu Gln Asn Glu Asn Asn Glu Asn
35 40 45
Leu Trp Phe His Pro Val Met Ser His Leu Tyr Asn Ala Lys Asn Gly
50 55 60
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65 70 75 80
Ser Tyr Phe Pro Phe Leu Lys Ile Met Ala Glu Asn Gln Arg Glu Tyr
85 90 95
Ser Asn Gly Lys Tyr Lys Gln Asn Arg Val Glu Val Asn Ser Asn Asp
100 105 110
Ile Phe Glu Val Leu Lys Arg Ala Phe Gly Val Leu Lys Met Tyr Arg
115 120 125
Asp Leu Thr Asn His Tyr Lys Thr Tyr Glu Glu Lys Leu Asn Asp Gly
130 135 140
Cys Glu Phe Leu Thr Ser Thr Glu Gln Pro Leu Ser Gly Met Ile Asn
145 150 155 160
Asn Tyr Tyr Thr Val Ala Leu Arg Asn Met Asn Glu Arg Tyr Gly Tyr
165 170 175
Lys Thr Glu Asp Leu Ala Phe Ile Gln Asp Lys Arg Phe Lys Phe Val
180 185 190
Lys Asp Ala Tyr Gly Lys Lys Lys Ser Gln Val Asn Thr Gly Phe Phe
195 200 205
Leu Ser Leu Gln Asp Tyr Asn Gly Asp Thr Gln Lys Lys Leu His Leu
210 215 220
Ser Gly Val Gly Ile Ala Leu Leu Ile Cys Leu Phe Leu Asp Lys Gln
225 230 235 240
Tyr Ile Asn Ile Phe Leu Ser Arg Leu Pro Ile Phe Ser Ser Tyr Asn
245 250 255
Ala Gln Ser Glu Glu Arg Arg Ile Ile Ile Arg Ser Phe Gly Ile Asn
260 265 270
Ser Ile Lys Leu Pro Lys Asp Arg Ile His Ser Glu Lys Ser Asn Lys
275 280 285
Ser Val Ala Met Asp Met Leu Asn Glu Val Lys Arg Cys Pro Asp Glu
290 295 300
Leu Phe Thr Thr Leu Ser Ala Glu Lys Gln Ser Arg Phe Arg Ile Ile
305 310 315 320
Ser Asp Asp His Asn Glu Val Leu Met Lys Arg Ser Ser Asp Arg Phe
325 330 335
Val Pro Leu Leu Leu Gln Tyr Ile Asp Tyr Gly Lys Leu Phe Asp His
340 345 350
Ile Arg Phe His Val Asn Met Gly Lys Leu Arg Tyr Leu Leu Lys Ala
355 360 365
Asp Lys Thr Cys Ile Asp Gly Gln Thr Arg Val Arg Val Ile Glu Gln
370 375 380
Pro Leu Asn Gly Phe Gly Arg Leu Glu Glu Ala Glu Thr Met Arg Lys
385 390 395 400
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405 410 415
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420 425 430
Val Asp Thr Tyr Thr His Tyr Ile Leu Glu Asn Asn Lys Val Glu Met
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Asp Asp Arg Tyr Val Val Lys Thr Ile Pro Ser Cys Arg Met Ser Thr
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485 490 495
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515 520 525
Phe Gly Ile Ala Glu Ser Asp Leu Pro Gln Lys Ile Leu Asp Leu Ile
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545 550 555 560
Val Asp Asp Met Leu Thr Asp Thr Glu Arg Arg Ile Lys Arg Phe Lys
565 570 575
Asp Asp Arg Lys Ser Ile Arg Ser Ala Asp Asn Lys Met Gly Lys Arg
580 585 590
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595 600 605
Asp Ile Val Leu Phe Gln Pro Ser Val Asn Asp Gly Glu Asn Lys Ile
610 615 620
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625 630 635 640
Ser Gly Asp Asp Tyr Glu Ala Lys Gln Gln Phe Lys Leu Met Phe Glu
645 650 655
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755 760 765
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770 775 780
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785 790 795 800
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805 810 815
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820 825 830
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835 840 845
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850 855 860
Leu Asp Lys Arg Leu Ser Asn Ser Arg Asn Glu Tyr Gln Lys Ser Glu
865 870 875 880
Lys Val Ile Arg Arg Tyr Arg Val Gln Asp Ala Leu Leu Phe Leu Leu
885 890 895
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900 905 910
Lys Leu Lys Glu Ile Met Pro Asp Ala Glu Lys Gly Ile Leu Ser Glu
915 920 925
Ile Met Pro Met Ser Phe Thr Phe Glu Lys Gly Gly Lys Lys Tyr Thr
930 935 940
Ile Thr Ser Glu Gly Met Lys Leu Lys Asn Tyr Gly Asp Phe Phe Val
945 950 955 960
Leu Ala Ser Asp Lys Arg Ile Gly Asn Leu Leu Glu Leu Val Gly Ser
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Ile Asn Lys Glu Gln Ser Asp Ile Leu Arg Lys Ile Arg Asn Ala Phe
1045 1050 1055
Asp His Asn Asn Tyr Pro Asp Lys Gly Val Val Glu Ile Lys Ala Leu
1060 1065 1070
Pro Glu Ile Ala Met Ser Ile Lys Lys Ala Phe Gly Glu Tyr Ala Ile
1075 1080 1085
Met Lys
1090
<210> 385
<211> 1150
<212> PRT
<213> Flavobacterium branchiophilum
<400> 385
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1 5 10 15
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Phe Ser Ile Lys Leu Gln Lys Leu Ile Asn Ser Ile Arg Asn Ile Asn
100 105 110
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115 120 125
Ser Asn Val Phe His Phe Leu Lys Glu Ser Phe Glu Leu Ala Ile Ile
130 135 140
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145 150 155 160
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210 215 220
Met Leu Phe Leu Ile Thr Ile Phe Leu Tyr Lys Asn Glu Ala Asn His
225 230 235 240
Leu Leu Pro Lys Leu Tyr Asp Phe Lys Asn Asn Lys Ser Lys Gln Glu
245 250 255
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Glu Leu Asn Ser Asn Tyr Pro Ser Phe Ala Thr Asp Ile Gln Phe Lys
325 330 335
Lys Glu Ala Lys Ala Phe Leu Phe Ala Ser Asn Lys Lys Arg Asn Gln
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850 855 860
Leu Ser Ile Asp Gln Tyr Lys Thr Cys Gly Lys Leu Phe Asn Lys Leu
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Lys Ser Asn Lys Leu Glu Asp Cys Leu Leu Tyr Glu Ile Ala Tyr Asn
885 890 895
Tyr Ile Asp Lys Lys Asn Val His Lys Ile Asp Ile Gln Lys Ile Leu
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Ile Lys Asn Gln Asn Asn Leu Lys Ala Arg Phe Leu Ile Asp Leu Pro
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Leu Tyr Leu Ser Lys Asn Lys Ile Lys Lys Gly Lys Asp Ser Ala Gly
965 970 975
Tyr Glu Ile Ile Ile Lys Asn Asp Leu Glu Ile Glu Asp Ile Asn Thr
980 985 990
Ile Asn Asn Lys Ile Ile Asn Asp Ser Val Lys Phe Thr Glu Val Leu
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1010 1015 1020
Lys Asn Tyr Ile Asp Asn Ser Glu Ile Pro Ser Leu Lys Gln Phe Ser
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Phe Ile Lys Phe Lys His Asn Asn Phe Tyr Leu Asn Leu Phe Asn Lys
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Asn Glu Ser Lys Thr Ile Lys Asn Asp Lys Glu Val Lys Lys Asn Arg
1125 1130 1135
Val Leu Gln Lys Phe Ile Asn Gln Val Ile Leu Lys Lys Lys
1140 1145 1150
<210> 386
<211> 1159
<212> PRT
<213> Myroides odoratimimus
<400> 386
Met Lys Asp Ile Leu Thr Thr Asp Thr Thr Glu Lys Gln Asn Arg Phe
1 5 10 15
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100 105 110
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115 120 125
Ala Val Asp Gln Leu Arg Asn Phe Tyr Thr His Tyr His His Ser Asp
130 135 140
Ile Val Ile Glu Asn Lys Val Leu Asp Phe Leu Asn Ser Ser Phe Val
145 150 155 160
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180 185 190
Glu Ala Tyr Lys Lys Lys Gln Ile Glu Lys Lys Asn Thr Arg Phe Lys
195 200 205
Ala Asn Lys Arg Glu Asp Ile Leu Asn Ala Ile Tyr Asn Glu Ala Phe
210 215 220
Trp Ser Phe Ile Asn Asp Lys Asp Lys Asp Lys Asp Lys Glu Thr Val
225 230 235 240
Val Ala Lys Gly Ala Asp Ala Tyr Phe Glu Lys Asn His His Lys Ser
245 250 255
Asn Asp Pro Asp Phe Ala Leu Asn Ile Ser Glu Lys Gly Ile Val Tyr
260 265 270
Leu Leu Ser Phe Phe Leu Thr Asn Lys Glu Met Asp Ser Leu Lys Ala
275 280 285
Asn Leu Thr Gly Phe Lys Gly Lys Val Asp Arg Glu Ser Gly Asn Ser
290 295 300
Ile Lys Tyr Met Ala Thr Gln Arg Ile Tyr Ser Phe His Thr Tyr Arg
305 310 315 320
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325 330 335
Leu Leu Met Gln Met Ile Asp Glu Leu Ser Lys Val Pro Asn Val Val
340 345 350
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355 360 365
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385 390 395 400
Asn Tyr Phe Ala Ile Arg Phe Leu Asp Glu Phe Phe Asp Phe Pro Thr
405 410 415
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420 425 430
Lys Gln Leu Gly Lys Val Glu Ser Asp Arg Ile Ile Lys Glu Lys Val
435 440 445
Thr Val Phe Ala Arg Leu Lys Asp Ile Asn Ser Ala Lys Ala Ser Tyr
450 455 460
Phe His Ser Leu Glu Glu Gln Asp Lys Glu Glu Leu Asp Asn Lys Trp
465 470 475 480
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485 490 495
Gln His Gln Gly Glu Gln Lys Asn Ala Gly Lys Ile Gly Ile Tyr Val
500 505 510
Lys Leu Arg Asp Thr Gln Tyr Lys Glu Lys Ala Ala Leu Glu Glu Ala
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Glu Lys Pro Leu Val Phe Thr Gly Gln Pro Ile Ala Tyr Leu Ser Met
565 570 575
Asn Asp Ile His Ser Met Leu Phe Ser Leu Leu Thr Asp Asn Ala Glu
580 585 590
Leu Lys Lys Thr Pro Glu Glu Val Glu Ala Lys Leu Ile Asp Gln Ile
595 600 605
Gly Lys Gln Ile Asn Glu Ile Leu Ser Lys Asp Thr Asp Thr Lys Ile
610 615 620
Leu Lys Lys Tyr Lys Asp Asn Asp Leu Lys Glu Thr Asp Thr Asp Lys
625 630 635 640
Ile Thr Arg Asp Leu Ala Arg Asp Lys Glu Glu Ile Glu Lys Leu Ile
645 650 655
Leu Glu Gln Lys Gln Arg Ala Asp Asp Tyr Asn Tyr Thr Ser Ser Thr
660 665 670
Lys Phe Asn Ile Asp Lys Ser Arg Lys Arg Lys His Leu Leu Phe Asn
675 680 685
Ala Glu Lys Gly Lys Ile Gly Val Trp Leu Ala Asn Asp Ile Lys Arg
690 695 700
Phe Met Phe Lys Glu Ser Lys Ser Lys Trp Lys Gly Tyr Gln His Ile
705 710 715 720
Glu Leu Gln Lys Leu Phe Ala Tyr Phe Asp Thr Ser Lys Ser Asp Leu
725 730 735
Glu Leu Ile Leu Ser Asn Met Val Met Val Lys Asp Tyr Pro Ile Glu
740 745 750
Leu Ile Asp Leu Val Lys Lys Ser Arg Thr Leu Val Asp Phe Leu Asn
755 760 765
Lys Tyr Leu Glu Ala Arg Leu Glu Tyr Ile Glu Asn Val Ile Thr Arg
770 775 780
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785 790 795 800
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805 810 815
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820 825 830
Phe Met Asp Asp Lys Pro Thr Met Leu Glu Gly Lys Ser Tyr Lys Gln
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His Lys Glu Lys Phe Ala Asp Trp Phe Val His Tyr Lys Glu Asn Ser
850 855 860
Asn Tyr Gln Asn Phe Tyr Asp Thr Glu Val Tyr Glu Ile Thr Thr Glu
865 870 875 880
Asp Lys Arg Glu Lys Ala Lys Val Thr Lys Lys Ile Lys Gln Gln Gln
885 890 895
Lys Asn Asp Val Phe Thr Leu Met Met Val Asn Tyr Met Leu Glu Glu
900 905 910
Val Leu Lys Leu Ser Ser Asn Asp Arg Leu Ser Leu Asn Glu Leu Tyr
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965 970 975
Gly Asn Phe Arg Lys Tyr Glu Asn Asp Ser Arg Val Lys Glu Phe Leu
980 985 990
Thr Tyr Gln Ser Asp Ile Val Trp Ser Ala Tyr Leu Ser Asn Glu Val
995 1000 1005
Asp Ser Asn Lys Leu Tyr Val Ile Glu Arg Gln Leu Asp Asn Tyr Glu
1010 1015 1020
Ser Ile Arg Ser Lys Glu Leu Leu Lys Glu Val Gln Glu Ile Glu Cys
1025 1030 1035 1040
Ser Val Tyr Asn Gln Val Ala Asn Lys Glu Ser Leu Lys Gln Ser Gly
1045 1050 1055
Asn Glu Asn Phe Lys Gln Tyr Val Leu Gln Gly Leu Leu Pro Ile Gly
1060 1065 1070
Met Asp Val Arg Glu Met Leu Ile Leu Ser Thr Asp Val Lys Phe Lys
1075 1080 1085
Lys Glu Glu Ile Ile Gln Leu Gly Gln Ala Gly Glu Val Glu Gln Asp
1090 1095 1100
Leu Tyr Ser Leu Ile Tyr Ile Arg Asn Lys Phe Ala His Asn Gln Leu
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Pro Ile Lys Glu Phe Phe Asp Phe Cys Glu Asn Asn Tyr Arg Ser Ile
1125 1130 1135
Ser Asp Asn Glu Tyr Tyr Ala Glu Tyr Tyr Met Glu Ile Phe Arg Ser
1140 1145 1150
Ile Lys Glu Lys Tyr Ala Asn
1155
<210> 387
<211> 1214
<212> PRT
<213> Flavobacterium columnare
<400> 387
Met Ser Ser Lys Asn Glu Ser Tyr Asn Lys Gln Lys Thr Phe Asn His
1 5 10 15
Tyr Lys Gln Glu Asp Lys Tyr Phe Phe Gly Gly Phe Leu Asn Asn Ala
20 25 30
Asp Asp Asn Leu Arg Gln Val Gly Lys Glu Phe Lys Thr Arg Ile Asn
35 40 45
Phe Asn His Asn Asn Asn Glu Leu Ala Ser Val Phe Lys Asp Tyr Phe
50 55 60
Asn Lys Glu Lys Ser Val Ala Lys Arg Glu His Ala Leu Asn Leu Leu
65 70 75 80
Ser Asn Tyr Phe Pro Val Leu Glu Arg Ile Gln Lys His Thr Asn His
85 90 95
Asn Phe Glu Gln Thr Arg Glu Ile Phe Glu Leu Leu Leu Asp Thr Ile
100 105 110
Lys Lys Leu Arg Asp Tyr Tyr Thr His His Tyr His Lys Pro Ile Thr
115 120 125
Ile Asn Pro Lys Ile Tyr Asp Phe Leu Asp Asp Thr Leu Leu Asp Val
130 135 140
Leu Ile Thr Ile Lys Lys Lys Lys Val Lys Asn Asp Thr Ser Arg Glu
145 150 155 160
Leu Leu Lys Glu Lys Leu Arg Pro Glu Leu Thr Gln Leu Lys Asn Gln
165 170 175
Lys Arg Glu Glu Leu Ile Lys Lys Gly Lys Lys Leu Leu Glu Glu Asn
180 185 190
Leu Glu Asn Ala Val Phe Asn His Cys Leu Ile Pro Phe Leu Glu Glu
195 200 205
Asn Lys Thr Asp Asp Lys Gln Asn Lys Thr Val Ser Leu Arg Lys Tyr
210 215 220
Arg Lys Ser Lys Pro Asn Glu Glu Thr Ser Ile Thr Leu Thr Gln Ser
225 230 235 240
Gly Leu Val Phe Leu Met Ser Phe Phe Leu His Arg Lys Glu Phe Gln
245 250 255
Val Phe Thr Ser Gly Leu Glu Arg Phe Lys Ala Lys Val Asn Thr Ile
260 265 270
Lys Glu Glu Glu Ile Ser Leu Asn Lys Asn Asn Ile Val Tyr Met Ile
275 280 285
Thr His Trp Ser Tyr Ser Tyr Tyr Asn Phe Lys Gly Leu Lys His Arg
290 295 300
Ile Lys Thr Asp Gln Gly Val Ser Thr Leu Glu Gln Asn Asn Thr Thr
305 310 315 320
His Ser Leu Thr Asn Thr Asn Thr Lys Glu Ala Leu Leu Thr Gln Ile
325 330 335
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340 345 350
Glu Lys Gln Gln Lys Glu Phe Glu Glu Asp Ile Asn Glu Tyr Met Arg
355 360 365
Glu Asn Pro Glu Asn Glu Asp Ser Thr Phe Ser Ser Ile Val Ser His
370 375 380
Lys Val Ile Arg Lys Arg Tyr Glu Asn Lys Phe Asn Tyr Phe Ala Met
385 390 395 400
Arg Phe Leu Asp Glu Tyr Ala Glu Leu Pro Thr Leu Arg Phe Met Val
405 410 415
Asn Phe Gly Asp Tyr Ile Lys Asp Arg Gln Lys Lys Ile Leu Glu Ser
420 425 430
Ile Gln Phe Asp Ser Glu Arg Ile Ile Lys Lys Glu Ile His Leu Phe
435 440 445
Glu Lys Leu Ser Leu Val Thr Glu Tyr Lys Lys Asn Val Tyr Leu Lys
450 455 460
Glu Thr Ser Asn Ile Asp Leu Ser Arg Phe Pro Leu Phe Pro Asn Pro
465 470 475 480
Ser Tyr Val Met Ala Asn Asn Asn Ile Pro Phe Tyr Ile Asp Ser Arg
485 490 495
Ser Asn Asn Leu Asp Glu Tyr Leu Asn Gln Lys Lys Lys Ala Gln Ser
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Gln Asn Lys Lys Arg Asn Leu Thr Phe Glu Lys Tyr Asn Lys Glu Gln
515 520 525
Ser Lys Asp Ala Ile Ile Ala Met Leu Gln Lys Glu Ile Gly Val Lys
530 535 540
Asp Leu Gln Gln Arg Ser Thr Ile Gly Leu Leu Ser Cys Asn Glu Leu
545 550 555 560
Pro Ser Met Leu Tyr Glu Val Ile Val Lys Asp Ile Lys Gly Ala Glu
565 570 575
Leu Glu Asn Lys Ile Ala Gln Lys Ile Arg Glu Gln Tyr Gln Ser Ile
580 585 590
Arg Asp Phe Thr Leu Asp Ser Pro Gln Lys Asp Asn Ile Pro Thr Thr
595 600 605
Leu Ile Lys Thr Ile Asn Thr Asp Ser Ser Val Thr Phe Glu Asn Gln
610 615 620
Pro Ile Asp Ile Pro Arg Leu Lys Asn Ala Leu Gln Lys Glu Leu Thr
625 630 635 640
Leu Thr Gln Glu Lys Leu Leu Asn Val Lys Glu His Glu Ile Glu Val
645 650 655
Asp Asn Tyr Asn Arg Asn Lys Asn Thr Tyr Lys Phe Lys Asn Gln Pro
660 665 670
Lys Asn Lys Val Asp Asp Lys Lys Leu Gln Arg Lys Tyr Val Phe Tyr
675 680 685
Arg Asn Glu Ile Arg Gln Glu Ala Asn Trp Leu Ala Ser Asp Leu Ile
690 695 700
His Phe Met Lys Asn Lys Ser Leu Trp Lys Gly Tyr Met His Asn Glu
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Leu Gln Ser Phe Leu Ala Phe Phe Glu Asp Lys Lys Asn Asp Cys Ile
725 730 735
Ala Leu Leu Glu Thr Val Phe Asn Leu Lys Glu Asp Cys Ile Leu Thr
740 745 750
Lys Gly Leu Lys Asn Leu Phe Leu Lys His Gly Asn Phe Ile Asp Phe
755 760 765
Tyr Lys Glu Tyr Leu Lys Leu Lys Glu Asp Phe Leu Ser Thr Glu Ser
770 775 780
Thr Phe Leu Glu Asn Gly Phe Ile Gly Leu Pro Pro Lys Ile Leu Lys
785 790 795 800
Lys Glu Leu Ser Lys Arg Leu Lys Tyr Ile Phe Ile Val Phe Gln Lys
805 810 815
Arg Gln Phe Ile Ile Lys Glu Leu Glu Glu Lys Lys Asn Asn Leu Tyr
820 825 830
Ala Asp Ala Ile Asn Leu Ser Arg Gly Ile Phe Asp Glu Lys Pro Thr
835 840 845
Met Ile Pro Phe Lys Lys Pro Asn Pro Asp Glu Phe Ala Ser Trp Phe
850 855 860
Val Ala Ser Tyr Gln Tyr Asn Asn Tyr Gln Ser Phe Tyr Glu Leu Thr
865 870 875 880
Pro Asp Ile Val Glu Arg Asp Lys Lys Lys Lys Tyr Lys Asn Leu Arg
885 890 895
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900 905 910
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915 920 925
Ser Asp Phe Tyr Val Ser Lys Ala Glu Arg Glu Lys Ile Lys Ala Asp
930 935 940
Ala Lys Ala Tyr Gln Lys Leu Asn Asp Ser Ser Leu Trp Asn Lys Val
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Ile His Leu Ser Leu Gln Asn Asn Arg Ile Thr Ala Asn Pro Lys Leu
965 970 975
Lys Asp Ile Gly Lys Tyr Lys Arg Ala Leu Gln Asp Glu Lys Ile Ala
980 985 990
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995 1000 1005
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1010 1015 1020
Leu Asn Met Glu Leu Gln Glu Tyr Glu Lys Val Arg Ser Lys Glu Leu
1025 1030 1035 1040
Leu Lys Gln Val Gln Glu Leu Glu Lys Lys Ile Leu Asp Lys Phe Tyr
1045 1050 1055
Asp Phe Ser Asn Asn Ala Ser His Pro Glu Asp Leu Glu Ile Glu Asp
1060 1065 1070
Lys Lys Gly Lys Arg His Pro Asn Phe Lys Leu Tyr Ile Thr Lys Ala
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Leu Leu Lys Asn Glu Ser Glu Ile Ile Asn Leu Glu Asn Ile Asp Ile
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<211> 1119
<212> PRT
<213> Porphyromonas gingivalis
<400> 388
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1 5 10 15
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Ala Tyr Ile Thr Leu Ala His Ile Asp Arg Gln Leu Ala Tyr Ser Lys
35 40 45
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Lys Asn Leu Asp Asn Asp Leu Glu Arg Lys Ala Arg Leu Arg Ser Leu
65 70 75 80
Ile Leu Lys His Phe Ser Phe Leu Glu Gly Ala Ala Tyr Gly Lys Lys
85 90 95
Leu Phe Glu Ser Gln Ser Ser Gly Asn Lys Ser Ser Lys Lys Lys Glu
100 105 110
Leu Ser Lys Lys Glu Lys Glu Glu Leu Gln Ala Asn Ala Leu Ser Leu
115 120 125
Asp Asn Leu Lys Ser Ile Leu Phe Asp Phe Leu Gln Lys Leu Lys Asp
130 135 140
Phe Arg Asn Tyr Tyr Ser His Tyr Arg His Pro Glu Ser Ser Glu Leu
145 150 155 160
Pro Leu Phe Asp Gly Asn Met Leu Gln Arg Leu Tyr Asn Val Phe Asp
165 170 175
Val Ser Val Gln Arg Val Lys Arg Asp His Glu His Asn Asp Lys Val
180 185 190
Asp Pro His Arg His Phe Asn His Leu Val Arg Lys Gly Lys Lys Asp
195 200 205
Lys Tyr Gly Asn Asn Asp Asn Pro Phe Phe Lys His His Phe Val Asp
210 215 220
Arg Glu Gly Thr Val Thr Glu Ala Gly Leu Leu Phe Phe Val Ser Leu
225 230 235 240
Phe Leu Glu Lys Arg Asp Ala Ile Trp Met Gln Lys Lys Ile Arg Gly
245 250 255
Phe Lys Gly Gly Thr Glu Ala Tyr Gln Gln Met Thr Asn Glu Val Phe
260 265 270
Cys Arg Ser Arg Ile Ser Leu Pro Lys Leu Lys Leu Glu Ser Leu Arg
275 280 285
Thr Asp Asp Trp Met Leu Leu Asp Met Leu Asn Glu Leu Val Arg Cys
290 295 300
Pro Lys Ser Leu Tyr Asp Arg Leu Arg Glu Glu Asp Arg Ala Arg Phe
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Arg Val Pro Val Asp Ile Leu Ser Asp Glu Asp Asp Thr Asp Gly Thr
325 330 335
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Pro Tyr Phe Ala Leu Arg Tyr Phe Asp Leu Lys Lys Val Phe Thr Ser
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Met Met Phe Tyr Tyr Phe Leu Leu Arg Glu Lys Tyr Ser Glu Glu Val
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545 550 555 560
Pro Arg Gln Met Ile Ala Ile Leu Ser Gln Glu His Lys Asp Met Glu
565 570 575
Glu Lys Val Arg Lys Lys Leu Gln Glu Met Ile Ala Asp Thr Asp His
580 585 590
Arg Leu Asp Met Leu Asp Arg Gln Thr Asp Arg Lys Ile Arg Ile Gly
595 600 605
Arg Lys Asn Ala Gly Leu Pro Lys Ser Gly Val Val Ala Asp Trp Leu
610 615 620
Val Arg Asp Met Met Arg Phe Gln Pro Val Ala Lys Asp Thr Ser Gly
625 630 635 640
Lys Pro Leu Asn Asn Ser Lys Ala Asn Ser Thr Glu Tyr Arg Met Leu
645 650 655
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Ser Asp Arg Val Glu Asn His Arg Phe Leu Leu Leu Lys Glu Pro Lys
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Thr Asp Arg Gln Thr Leu Val Ala Gly Trp Lys Gly Glu Phe His Leu
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885 890 895
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Arg Ala Asp Ser Arg Gly His Val His Lys Glu Gln Ala Pro Leu Ala
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1090 1095 1100
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<213> Porphyromonas species
<400> 389
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Phe Leu Glu Lys Arg Asp Ala Ile Trp Met Gln Lys Lys Ile Arg Gly
245 250 255
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Cys Arg Ser Arg Ile Ser Leu Pro Lys Leu Lys Leu Glu Ser Leu Arg
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450 455 460
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485 490 495
Met Met Phe Tyr Tyr Phe Leu Leu Arg Glu Lys Tyr Ser Glu Glu Val
500 505 510
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515 520 525
Tyr Ala Ile Tyr Asp Ala Phe Ala Arg Asp Glu Ile Asn Thr Leu Lys
530 535 540
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545 550 555 560
Pro Lys Gln Met Ile Gly Ile Leu Ser Gln Glu Arg Lys Asp Met Glu
565 570 575
Glu Lys Val Arg Lys Lys Leu Gln Glu Met Ile Ala Asp Thr Asp His
580 585 590
Arg Leu Asp Met Leu Asp Arg Gln Thr Asp Arg Lys Ile Arg Ile Gly
595 600 605
Arg Lys Asn Ala Gly Leu Pro Lys Ser Gly Val Ile Ala Asp Trp Leu
610 615 620
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625 630 635 640
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645 650 655
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660 665 670
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Arg Ser Tyr Leu Arg Ala Arg Lys Ala Phe Leu Glu Arg Ile Gly Arg
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Ser Asp Arg Val Glu Asn Cys Pro Phe Leu Leu Leu Lys Glu Pro Lys
725 730 735
Thr Asp Arg Gln Thr Leu Val Ala Gly Trp Lys Gly Glu Phe His Leu
740 745 750
Pro Arg Gly Ile Phe Thr Glu Ala Val Arg Asp Cys Leu Ile Glu Met
755 760 765
Gly Tyr Asp Glu Val Gly Ser Tyr Arg Glu Val Gly Phe Met Ala Lys
770 775 780
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Phe Tyr Asp Ser Pro Phe Asn Val Gly Asn Ser Leu Lys Pro Lys Lys
805 810 815
Gly Arg Phe Leu Ser Lys Glu Asp Arg Ala Glu Glu Trp Glu Arg Gly
820 825 830
Lys Glu Arg Phe Arg Asp Leu Glu Ala Trp Ser His Ser Ala Ala Arg
835 840 845
Arg Ile Lys Asp Ala Phe Ala Gly Ile Glu Tyr Ala Ser Pro Gly Asn
850 855 860
Lys Lys Lys Ile Glu Gln Leu Leu Arg Asp Leu Ser Leu Trp Glu Ala
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Phe Glu Ser Lys Leu Lys Val Arg Ala Asp Lys Ile Asn Leu Ala Lys
885 890 895
Leu Lys Lys Glu Ile Leu Glu Ala Gln Glu His Pro Tyr His Asp Phe
900 905 910
Lys Ser Trp Gln Lys Phe Glu Arg Glu Leu Arg Leu Val Lys Asn Gln
915 920 925
Asp Ile Ile Thr Trp Met Met Cys Arg Asp Leu Met Glu Glu Asn Lys
930 935 940
Val Glu Gly Leu Asp Thr Gly Thr Leu Tyr Leu Lys Asp Ile Arg Pro
945 950 955 960
Asn Val Gln Glu Gln Gly Ser Leu Asn Val Leu Asn Arg Val Lys Pro
965 970 975
Met Arg Leu Pro Val Val Val Tyr Arg Ala Asp Ser Arg Gly His Val
980 985 990
His Lys Glu Glu Ala Pro Leu Ala Thr Val Tyr Ile Glu Glu Arg Asp
995 1000 1005
Thr Lys Leu Leu Lys Gln Gly Asn Phe Lys Ser Phe Val Lys Asp Arg
1010 1015 1020
Arg Leu Asn Gly Leu Phe Ser Phe Val Asp Thr Gly Gly Leu Ala Met
1025 1030 1035 1040
Glu Gln Tyr Pro Ile Ser Lys Leu Arg Val Glu Tyr Glu Leu Ala Lys
1045 1050 1055
Tyr Gln Thr Ala Arg Val Cys Val Phe Glu Leu Thr Leu Arg Leu Glu
1060 1065 1070
Glu Ser Leu Leu Ser Arg Tyr Pro His Leu Pro Asp Glu Ser Phe Arg
1075 1080 1085
Glu Met Leu Glu Ser Trp Ser Asp Pro Leu Leu Ala Lys Trp Pro Glu
1090 1095 1100
Leu His Gly Lys Val Arg Leu Leu Ile Ala Val Arg Asn Ala Phe Ser
1105 1110 1115 1120
His Asn Gln Tyr Pro Met Tyr Asp Glu Ala Val Phe Ser Ser Ile Arg
1125 1130 1135
Lys Tyr Asp Pro Ser Ser Pro Asp Ala Ile Glu Glu Arg Met Gly Leu
1140 1145 1150
Asn Ile Ala His Arg Leu Ser Glu Glu Val Lys Gln Ala Lys Glu Thr
1155 1160 1165
Val Glu Arg Ile Ile Gln Ala
1170 1175
<210> 390
<211> 1132
<212> PRT
<213> Prevotella intermedia
<400> 390
Met Glu Asp Asp Lys Lys Thr Lys Glu Ser Thr Asn Met Leu Asp Asn
1 5 10 15
Lys His Phe Trp Ala Ala Phe Leu Asn Leu Ala Arg His Asn Val Tyr
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Ile Thr Val Asn His Ile Asn Lys Val Leu Glu Leu Lys Asn Lys Lys
35 40 45
Asp Gln Asp Ile Ile Ile Asp Asn Asp Gln Asp Ile Leu Ala Ile Lys
50 55 60
Thr His Trp Glu Lys Val Asn Gly Asp Leu Asn Lys Thr Glu Arg Leu
65 70 75 80
Arg Glu Leu Met Thr Lys His Phe Pro Phe Leu Glu Thr Ala Ile Tyr
85 90 95
Thr Lys Asn Lys Glu Asp Lys Glu Glu Val Lys Gln Glu Lys Gln Ala
100 105 110
Lys Ala Gln Ser Phe Asp Ser Leu Lys His Cys Leu Phe Leu Phe Leu
115 120 125
Glu Lys Leu Gln Glu Ala Arg Asn Tyr Tyr Ser His Tyr Lys Tyr Ser
130 135 140
Glu Ser Thr Lys Glu Pro Met Leu Glu Lys Glu Leu Leu Lys Lys Met
145 150 155 160
Tyr Asn Ile Phe Asp Asp Asn Ile Gln Leu Val Ile Lys Asp Tyr Gln
165 170 175
His Asn Lys Asp Ile Asn Pro Asp Glu Asp Phe Lys His Leu Asp Arg
180 185 190
Thr Glu Glu Glu Phe Asn Tyr Tyr Phe Thr Thr Asn Lys Lys Gly Asn
195 200 205
Ile Thr Ala Ser Gly Leu Leu Phe Phe Val Ser Leu Phe Leu Glu Lys
210 215 220
Lys Asp Ala Ile Trp Met Gln Gln Lys Leu Arg Gly Phe Lys Asp Asn
225 230 235 240
Arg Glu Ser Lys Lys Lys Met Thr His Glu Val Phe Cys Arg Ser Arg
245 250 255
Met Leu Leu Pro Lys Leu Arg Leu Glu Ser Thr Gln Thr Gln Asp Trp
260 265 270
Ile Leu Leu Asp Met Leu Asn Glu Leu Ile Arg Cys Pro Lys Ser Leu
275 280 285
Tyr Glu Arg Leu Gln Gly Glu Tyr Arg Lys Lys Phe Asn Val Pro Phe
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Asp Ser Ala Asp Glu Asp Tyr Asp Ala Glu Gln Glu Pro Phe Lys Asn
305 310 315 320
Thr Leu Val Arg His Gln Asp Arg Phe Pro Tyr Phe Ala Leu Arg Tyr
325 330 335
Phe Asp Tyr Asn Glu Ile Phe Thr Asn Leu Arg Phe Gln Ile Asp Leu
340 345 350
Gly Thr Tyr His Phe Ser Ile Tyr Lys Lys Leu Ile Gly Gly Gln Lys
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Glu Asp Arg His Leu Thr His Lys Leu Tyr Gly Phe Glu Arg Ile Gln
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Glu Phe Ala Lys Gln Asn Arg Thr Asp Glu Trp Lys Ala Ile Val Lys
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530 535 540
Ala Ile Leu Tyr Asp Glu His Lys Asp Met Ala Glu Glu Ala Lys Arg
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Lys Gln Lys Glu Met Val Lys Asp Thr Lys Lys Leu Leu Ala Thr Leu
565 570 575
Glu Lys Gln Thr Gln Gly Glu Ile Glu Asp Gly Gly Arg Asn Ile Arg
580 585 590
Leu Leu Lys Ser Gly Glu Ile Ala Arg Trp Leu Val Asn Asp Met Met
595 600 605
Arg Phe Gln Pro Val Gln Lys Asp Asn Glu Gly Asn Pro Leu Asn Asn
610 615 620
Ser Lys Ala Asn Ser Thr Glu Tyr Gln Met Leu Gln Arg Ser Leu Ala
625 630 635 640
Leu Tyr Asn Lys Glu Glu Lys Pro Thr Arg Tyr Phe Arg Gln Val Asn
645 650 655
Leu Ile Asn Ser Ser Asn Pro His Pro Phe Leu Lys Trp Thr Lys Trp
660 665 670
Glu Glu Cys Asn Asn Ile Leu Ser Phe Tyr Arg Ser Tyr Leu Thr Lys
675 680 685
Lys Ile Glu Phe Leu Asn Lys Leu Lys Pro Glu Asp Trp Glu Lys Asn
690 695 700
Gln Tyr Phe Leu Lys Leu Lys Glu Pro Lys Thr Asn Arg Glu Thr Leu
705 710 715 720
Val Gln Gly Trp Lys Asn Gly Phe Asn Leu Pro Arg Gly Ile Phe Thr
725 730 735
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Thr Trp Leu Leu Cys Thr Glu Leu Ile Asp Lys Leu Lys Val Glu Gly
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Leu Asn Val Glu Glu Leu Lys Lys Leu Arg Leu Lys Asp Ile Asp Thr
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Asp Thr Ala Lys Gln Glu Lys Asn Asn Ile Leu Asn Arg Val Met Pro
915 920 925
Met Gln Leu Pro Val Thr Val Tyr Glu Ile Asp Asp Ser His Asn Ile
930 935 940
Val Lys Asp Arg Pro Leu His Thr Val Tyr Ile Glu Glu Thr Lys Thr
945 950 955 960
Lys Leu Leu Lys Gln Gly Asn Phe Lys Ala Leu Val Lys Asp Arg Arg
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Leu Asn Gly Leu Phe Ser Phe Val Asp Thr Ser Ser Glu Thr Glu Leu
980 985 990
Lys Ser Asn Pro Ile Ser Lys Ser Leu Val Glu Tyr Glu Leu Gly Glu
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Tyr Gln Asn Ala Arg Ile Glu Thr Ile Lys Asp Met Leu Leu Leu Glu
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Glu Thr Leu Ile Glu Lys Tyr Lys Thr Leu Pro Thr Asp Asn Phe Ser
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Arg Phe Gln Asn Asp Val Lys Leu Leu Val Ala Val Arg Asn Ala Phe
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Ser His Asn Gln Tyr Pro Met Arg Asn Arg Ile Ala Phe Ala Asn Ile
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Asn Pro Phe Ser Leu Ser Ser Ala Asp Thr Ser Glu Glu Lys Lys Leu
1090 1095 1100
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Ile Ile Glu Ile Glu Lys Pro Ile Glu Thr Lys Glu
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<210> 391
<211> 1134
<212> PRT
<213> Prevotella intermedia
<400> 391
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1 5 10 15
Asp Asn Lys His Phe Trp Ala Ala Phe Leu Asn Leu Ala Arg His Asn
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Val Tyr Ile Thr Val Asn His Ile Asn Lys Val Leu Glu Leu Lys Asn
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Lys Lys Asp Gln Asp Ile Ile Ile Asp Asn Asp Gln Asp Ile Leu Ala
50 55 60
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65 70 75 80
Arg Leu Arg Glu Leu Met Thr Lys His Phe Pro Phe Leu Glu Thr Ala
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Ile Tyr Thr Lys Asn Lys Glu Asp Lys Glu Glu Val Lys Gln Glu Lys
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115 120 125
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130 135 140
Tyr Ser Glu Ser Thr Lys Glu Pro Met Leu Glu Lys Glu Leu Leu Lys
145 150 155 160
Lys Met Tyr Asn Ile Phe Asp Asp Asn Ile Gln Leu Val Ile Lys Asp
165 170 175
Tyr Gln His Asn Lys Asp Ile Asn Pro Asp Glu Asp Phe Lys His Leu
180 185 190
Asp Arg Thr Glu Glu Glu Phe Asn Tyr Tyr Phe Thr Thr Asn Lys Lys
195 200 205
Gly Asn Ile Thr Ala Ser Gly Leu Leu Phe Phe Val Ser Leu Phe Leu
210 215 220
Glu Lys Lys Asp Ala Ile Trp Met Gln Gln Lys Leu Arg Gly Phe Lys
225 230 235 240
Asp Asn Arg Glu Ser Lys Lys Lys Met Thr His Glu Val Phe Cys Arg
245 250 255
Ser Arg Met Leu Leu Pro Lys Leu Arg Leu Glu Ser Thr Gln Thr Gln
260 265 270
Asp Trp Ile Leu Leu Asp Met Leu Asn Glu Leu Ile Arg Cys Pro Lys
275 280 285
Ser Leu Tyr Glu Arg Leu Gln Gly Glu Tyr Arg Lys Lys Phe Asn Val
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Pro Phe Asp Ser Ala Asp Glu Asp Tyr Asp Ala Glu Gln Glu Pro Phe
305 310 315 320
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325 330 335
Arg Tyr Phe Asp Tyr Asn Glu Ile Phe Thr Asn Leu Arg Phe Gln Ile
340 345 350
Asp Leu Gly Thr Tyr His Phe Ser Ile Tyr Lys Lys Leu Ile Gly Gly
355 360 365
Gln Lys Glu Asp Arg His Leu Thr His Lys Leu Tyr Gly Phe Glu Arg
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385 390 395 400
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405 410 415
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435 440 445
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530 535 540
Met Val Ala Ile Leu Tyr Asp Glu His Lys Asp Met Ala Glu Glu Ala
545 550 555 560
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580 585 590
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595 600 605
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Lys Lys Tyr Lys Phe Lys Gly Tyr Lys Ala Lys Val Lys Ser Lys Lys
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945 950 955 960
Lys Thr Lys Leu Leu Lys Gln Gly Asn Phe Lys Ala Leu Val Lys Asp
965 970 975
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980 985 990
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Lys Leu Asp Ile Ala Asn Gln Leu Lys Asp Lys Thr His Lys Ile Ile
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<210> 392
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<212> PRT
<213> Prevotella intermedia
<400> 392
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325 330 335
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435 440 445
Asn Asn Glu Lys Ser Lys Tyr Lys Leu Asp Lys Gln Tyr Gln Ala Glu
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485 490 495
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500 505 510
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530 535 540
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565 570 575
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580 585 590
Arg Leu Leu Lys Ser Gly Glu Ile Ala Arg Trp Leu Val Asn Asp Met
595 600 605
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610 615 620
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645 650 655
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660 665 670
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675 680 685
Lys Lys Ile Glu Phe Leu Asn Lys Leu Lys Pro Glu Asp Trp Glu Lys
690 695 700
Asn Gln Tyr Phe Leu Lys Leu Lys Glu Pro Lys Thr Asn Arg Glu Thr
705 710 715 720
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725 730 735
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740 745 750
Glu Tyr Glu Lys Val Glu Ala Leu Asp Arg Val Gly Leu Val Thr Lys
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850 855 860
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885 890 895
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915 920 925
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930 935 940
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945 950 955 960
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980 985 990
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995 1000 1005
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1010 1015 1020
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1025 1030 1035 1040
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1045 1050 1055
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1060 1065 1070
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1075 1080 1085
Ile Asn Pro Phe Ser Leu Ser Ser Ala Asp Thr Ser Glu Glu Lys Lys
1090 1095 1100
Leu Asp Ile Ala Asn Gln Leu Lys Asp Lys Thr His Lys Ile Ile Lys
1105 1110 1115 1120
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1125 1130
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<212> PRT
<213> Prevotella buccae
<400> 393
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195 200 205
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225 230 235 240
Thr Ile Ala Gly Leu Leu Phe Phe Val Ser Leu Phe Leu Asp Lys Lys
245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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305 310 315 320
Glu Arg Leu Arg Glu Lys Asp Arg Glu Ser Phe Lys Val Pro Phe Asp
325 330 335
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340 345 350
Leu Val Arg His Gln Asp Arg Phe Pro Tyr Phe Val Leu Arg Tyr Phe
355 360 365
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Leu Asp His Phe Glu Thr Ser Gln Glu Pro Tyr Ile Ser Lys Thr Ala
435 440 445
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595 600 605
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850 855 860
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885 890 895
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945 950 955 960
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965 970 975
Arg Arg Leu Asn Gly Leu Phe Ser Phe Ala Glu Thr Thr Asp Leu Asn
980 985 990
Leu Glu Glu His Pro Ile Ser Lys Leu Ser Val Asp Leu Glu Leu Ile
995 1000 1005
Lys Tyr Gln Thr Thr Arg Ile Ser Ile Phe Glu Met Thr Leu Gly Leu
1010 1015 1020
Glu Lys Lys Leu Ile Asp Lys Tyr Ser Thr Leu Pro Thr Asp Ser Phe
1025 1030 1035 1040
Arg Asn Met Leu Glu Arg Trp Leu Gln Cys Lys Ala Asn Arg Pro Glu
1045 1050 1055
Leu Lys Asn Tyr Val Asn Ser Leu Ile Ala Val Arg Asn Ala Phe Ser
1060 1065 1070
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1075 1080 1085
Lys Phe Thr Leu Phe Pro Ser Val Asp Thr Lys Lys Ile Glu Leu Asn
1090 1095 1100
Ile Ala Pro Gln Leu Leu Glu Ile Val Gly Lys Ala Ile Lys Glu Ile
1105 1110 1115 1120
Glu Lys Ser Glu Asn Lys Asn
1125
<210> 394
<211> 1125
<212> PRT
<213> Prevotella pallens
<400> 394
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35 40 45
Glu Ile Asn Arg Asp Gly Tyr Glu Asn Thr Leu Glu Lys Ser Trp Asn
50 55 60
Glu Ile Lys Asp Ile Asn Lys Lys Asp Arg Leu Ser Lys Leu Ile Ile
65 70 75 80
Lys His Phe Pro Phe Leu Glu Val Thr Thr Tyr Gln Arg Asn Ser Ala
85 90 95
Asp Thr Thr Lys Gln Lys Glu Glu Lys Gln Ala Glu Ala Gln Ser Leu
100 105 110
Glu Ser Leu Lys Lys Ser Phe Phe Val Phe Ile Tyr Lys Leu Arg Asp
115 120 125
Leu Arg Asn His Tyr Ser His Tyr Lys His Ser Lys Ser Leu Glu Arg
130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
Lys Thr Glu Glu Asp Phe Lys His Leu Asp Arg Lys Gly Gln Phe Lys
180 185 190
Tyr Ser Phe Ala Asp Asn Glu Gly Asn Ile Thr Glu Ser Gly Leu Leu
195 200 205
Phe Phe Val Ser Leu Phe Leu Glu Lys Lys Asp Ala Ile Trp Val Gln
210 215 220
Lys Lys Leu Glu Gly Phe Lys Cys Ser Asn Glu Ser Tyr Gln Lys Met
225 230 235 240
Thr Asn Glu Val Phe Cys Arg Ser Arg Met Leu Leu Pro Lys Leu Arg
245 250 255
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Asp Leu Asn Ser Ala Phe Arg Glu Phe His Phe Asp Lys Phe Tyr Glu
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Lys Tyr Leu Ile Lys Arg Asp Glu Ile Leu Glu Gly Phe Lys Ser Phe
740 745 750
Ile Ser Asn Phe Lys Asp Glu Pro Lys Leu Leu Lys Lys Gly Ile Lys
755 760 765
Asp Ile Tyr Arg Val Phe Asp Lys Arg Tyr Tyr Ile Ile Lys Ser Thr
770 775 780
Asn Ala Gln Lys Glu Gln Leu Leu Ser Lys Pro Ile Cys Leu Pro Arg
785 790 795 800
Gly Ile Phe Asp Asn Lys Pro Thr Tyr Ile Glu Gly Val Lys Val Glu
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Ser Asn Ser Ala Leu Phe Ala Asp Trp Tyr Gln Tyr Thr Tyr Ser Asp
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Lys His Glu Phe Gln Ser Phe Tyr Asp Met Pro Arg Asp Tyr Lys Glu
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Gln Phe Glu Lys Phe Glu Leu Asn Asn Ile Lys Ser Ile Gln Asn Lys
850 855 860
Lys Asn Leu Asn Lys Ser Asp Lys Phe Ile Tyr Phe Arg Tyr Lys Gln
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Asp Leu Lys Ile Lys Gln Ile Lys Ser Gln Asp Leu Phe Ile Lys Leu
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Met Val Asp Glu Leu Phe Asn Val Val Phe Lys Asn Asn Ile Glu Leu
900 905 910
Asn Leu Lys Lys Leu Tyr Gln Thr Ser Asp Glu Arg Phe Lys Asn Gln
915 920 925
Leu Ile Ala Asp Val Gln Lys Asn Arg Glu Lys Gly Asp Thr Ser Asp
930 935 940
Asn Lys Met Asn Glu Asn Phe Ile Trp Asn Met Thr Ile Pro Leu Ser
945 950 955 960
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965 970 975
Gly Lys Phe Arg Lys Leu Glu Thr Asp Asp Lys Val Ile Gln Leu Leu
980 985 990
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1075 1080 1085
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Leu Ile His Val Arg Asn Lys Phe Gly His Asn Gln Leu Pro Lys Leu
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<400> 398
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130 135 140
Glu Ile Lys Lys Leu Lys Lys Lys Asp Asp Lys Thr Gln Gln Leu Leu
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Asn Lys Asn Leu Ser Glu Glu Tyr Asp Ile Arg Tyr Gln Gln Gln Ile
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180 185 190
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225 230 235 240
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260 265 270
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675 680 685
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690 695 700
Gly Trp Ile Ile Asn Ser Phe Val Lys Asn Arg Ser Phe Glu Tyr Phe
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Ser Lys Asn Ser Ile His Tyr Ser Arg Thr Ser Gln Leu Glu Leu Ile
850 855 860
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885 890 895
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900 905 910
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Asp Ile Gly Lys Phe Asn Arg Phe Leu Leu Asp Asp Lys Val Lys Thr
965 970 975
Leu Leu Ser Tyr Asn Glu Asp Lys Val Trp Asn Lys Asn Asp Leu Asp
980 985 990
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Leu Glu Asn Leu Asn Glu Thr His Phe Lys Asn Leu Ser Phe Gln Glu
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<212> PRT
<213> Chryseobacterium ureilyticum
<400> 400
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145 150 155 160
Asn Leu Ser Glu Glu Leu Asp Phe Arg Tyr Gln Glu Gln Leu Glu Arg
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Leu Arg Lys Leu Lys Ser Glu Gly Lys Lys Val Asp Leu Arg Asp Thr
180 185 190
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195 200 205
Phe Lys Asp Ala Glu Asp Phe Lys Pro Thr Val Ser Tyr Ser Ser Tyr
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Tyr Tyr Asp Ser Asp Thr Ala Glu Asn Gly Ile Ser Ile Ser Gln Ser
225 230 235 240
Gly Leu Leu Phe Leu Leu Ser Met Phe Leu Gly Arg Arg Glu Met Glu
245 250 255
Asp Leu Lys Ser Arg Val Arg Gly Phe Lys Ala Arg Ile Ile Lys His
260 265 270
Glu Glu Gln His Val Ser Gly Leu Lys Phe Met Ala Thr His Trp Val
275 280 285
Phe Ser Glu Phe Cys Phe Lys Gly Ile Lys Thr Arg Leu Asn Ala Asp
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Tyr His Glu Glu Thr Leu Leu Ile Gln Leu Ile Asp Glu Leu Ser Lys
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Val Pro Asp Glu Leu Tyr Arg Ser Phe Asp Val Ala Thr Arg Glu Arg
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Phe Ile Glu Asp Ile Asn Glu Tyr Ile Arg Asp Gly Lys Glu Asp Lys
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385 390 395 400
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545 550 555 560
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595 600 605
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675 680 685
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690 695 700
Gly Trp Val Met Asn Ser Phe Ala Arg Asp Asn Thr Phe Asp Gly Phe
705 710 715 720
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740 745 750
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755 760 765
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770 775 780
Ile Phe Pro Arg Gly Ile Phe Asp Asp Lys Pro Thr Phe Lys Lys Gly
785 790 795 800
Val Gln Val Ser Glu Glu Pro Glu Ala Phe Ala Asp Trp Tyr Ser Tyr
805 810 815
Gly Tyr Asp Val Lys His Lys Phe Gln Glu Phe Tyr Ala Trp Asp Arg
820 825 830
Asp Tyr Glu Glu Leu Leu Arg Glu Glu Leu Glu Lys Asp Thr Ala Phe
835 840 845
Thr Lys Asn Ser Ile His Tyr Ser Arg Glu Ser Gln Ile Glu Leu Leu
850 855 860
Ala Lys Lys Gln Asp Leu Lys Val Lys Lys Val Arg Ile Gln Asp Leu
865 870 875 880
Tyr Leu Lys Leu Met Ala Glu Phe Leu Phe Glu Asn Val Phe Gly His
885 890 895
Glu Leu Ala Leu Pro Leu Asp Gln Phe Tyr Leu Thr Gln Glu Glu Arg
900 905 910
Leu Lys Gln Glu Gln Glu Ala Ile Val Gln Ser Gln Arg Pro Lys Gly
915 920 925
Asp Asp Ser Pro Asn Ile Val Lys Glu Asn Phe Ile Trp Ser Lys Thr
930 935 940
Ile Pro Phe Lys Ser Gly Arg Val Phe Glu Pro Asn Val Lys Leu Lys
945 950 955 960
Asp Ile Gly Lys Phe Arg Asn Leu Leu Thr Asp Glu Lys Val Asp Ile
965 970 975
Leu Leu Ser Tyr Asn Asn Thr Glu Ile Gly Lys Gln Val Ile Glu Asn
980 985 990
Glu Leu Ile Ile Gly Ala Gly Ser Tyr Glu Phe Ile Arg Arg Glu Gln
995 1000 1005
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1010 1015 1020
Arg Gly Met Gly Val Pro Ile Arg Leu Asn Leu Lys
1025 1030 1035
<210> 401
<211> 953
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> Cas13b orthologue
<400> 401
Met Ser Asn Glu Ile Gly Ala Phe Arg Glu His Gln Phe Ala Tyr Ala
1 5 10 15
Pro Gly Asn Glu Lys Gln Glu Glu Ala Thr Phe Ala Thr Tyr Phe Asn
20 25 30
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225 230 235 240
His Glu Val Phe Cys Arg Ser Arg Ile Leu Met Pro Lys Leu Arg Leu
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Glu Ser Thr Gln Thr Gln Asp Trp Ile Leu Leu Asp Met Leu Asn Glu
260 265 270
Leu Ile Arg Cys Pro Lys Ser Leu Tyr Glu Arg Leu Gln Gly Asp Asp
275 280 285
Arg Glu Lys Phe Lys Val Pro Phe Asp Pro Ala Asp Glu Asp Tyr Asn
290 295 300
Ala Glu Gln Glu Pro Phe Lys Asn Thr Leu Ile Arg His Gln Asp Arg
305 310 315 320
Phe Pro Tyr Phe Val Leu Arg Tyr Phe Asp Tyr Asn Glu Ile Phe Lys
325 330 335
Asn Leu Arg Phe Gln Ile Asp Leu Gly Thr Tyr His Phe Ser Ile Tyr
340 345 350
Lys Lys Leu Ile Gly Gly Gln Lys Glu Asp Arg His Leu Thr His Lys
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Leu Tyr Gly Phe Glu Arg Ile Gln Glu Phe Ala Lys Gln Asn Arg Pro
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385 390 395 400
Asn Lys Arg Tyr Ile Ser Glu Thr Thr Pro His Tyr His Leu Glu Asn
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Ser Leu Lys Thr Asn Asp Glu Asn Asn Glu Lys Ser Lys Tyr Lys Leu
435 440 445
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530 535 540
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545 550 555 560
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565 570 575
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580 585 590
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610 615 620
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625 630 635 640
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645 650 655
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785 790 795 800
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<210> 409
<211> 1125
<212> PRT
<213> Prevotella pallens
<400> 409
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1 5 10 15
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850 855 860
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1075 1080 1085
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<210> 410
<211> 1125
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 410
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1 5 10 15
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Thr Leu Val Arg His Gln Asp Arg Phe Pro Tyr Phe Ala Leu Arg Tyr
325 330 335
Phe Asp Tyr Asn Glu Ile Phe Thr Asn Leu Arg Phe Gln Ile Asp Leu
340 345 350
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355 360 365
Glu Asp Arg His Leu Thr His Lys Leu Tyr Gly Phe Glu Arg Ile Gln
370 375 380
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405 410 415
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420 425 430
Asn Gly Asn Lys Glu Ile Trp Pro Ser Leu Lys Thr Asn Gly Glu Asn
435 440 445
Asn Glu Lys Ser Lys Tyr Lys Leu Asp Lys Pro Tyr Gln Ala Glu Ala
450 455 460
Phe Leu Ser Val His Glu Leu Leu Pro Met Met Phe Tyr Tyr Leu Leu
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485 490 495
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530 535 540
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Leu Leu Lys Ser Gly Glu Ile Ala Arg Trp Leu Val Asn Asp Met Met
595 600 605
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610 615 620
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645 650 655
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740 745 750
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770 775 780
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785 790 795 800
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820 825 830
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835 840 845
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850 855 860
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Leu Ile Asp Lys Met Lys Val Glu Gly Leu Asn Val Glu Glu Leu Gln
885 890 895
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900 905 910
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930 935 940
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945 950 955 960
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965 970 975
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980 985 990
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1125
<210> 411
<211> 1126
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> Cas13b orthologue
<400> 411
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1 5 10 15
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20 25 30
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145 150 155 160
Ile Arg Leu Val Lys Glu Asp Tyr Gln Tyr Asn Lys Asp Ile Asn Pro
165 170 175
Asp Glu Asp Phe Lys His Leu Asp Arg Thr Glu Glu Glu Phe Asn Tyr
180 185 190
Tyr Phe Thr Lys Asp Asn Glu Gly Asn Ile Thr Glu Ser Gly Leu Leu
195 200 205
Phe Phe Val Ser Leu Phe Leu Glu Lys Lys Asp Ala Ile Trp Met Gln
210 215 220
Gln Lys Leu Arg Gly Phe Lys Asp Asn Arg Glu Asn Lys Lys Lys Met
225 230 235 240
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385 390 395 400
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435 440 445
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465 470 475 480
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Asp Glu Leu Glu Glu Tyr Cys Lys Gly Lys Asp Ile Glu Ile Gly His
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Leu Pro Lys Gln Met Ile Ala Ile Leu Lys Asp Glu His Lys Val Met
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Ala Thr Glu Ala Glu Arg Lys Gln Glu Glu Met Leu Val Asp Val Gln
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Lys Ser Leu Glu Ser Leu Asp Asn Gln Ile Asn Glu Glu Ile Glu Asn
580 585 590
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595 600 605
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Tyr Arg Ser Tyr Leu Glu Ala Lys Lys Asn Phe Leu Glu Ser Leu Lys
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Lys Asp Arg Glu Gly Leu Ser Val Asn Glu Val Glu Phe Leu Thr Gly
210 215 220
Ile Asp His Leu His Gln Glu Val Leu Lys Asp Glu Phe Gly Asn Ala
225 230 235 240
Lys Val Lys Asp Gly Lys Val Met Lys Thr Phe Val Glu Tyr Asp Asp
245 250 255
Phe Tyr Phe Lys Ile Ser Gly Lys Arg Leu Val Asn Gly Tyr Thr Val
260 265 270
Thr Thr Lys Asp Asp Lys Pro Val Asn Val Asn Thr Met Leu Pro Ala
275 280 285
Leu Ser Asp Phe Gly Leu Leu Tyr Phe Cys Val Leu Phe Leu Ser Lys
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Pro Tyr Ala Lys Leu Phe Ile Asp Glu Val Arg Leu Phe Glu Tyr Ser
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<213> Bergeyella zoohelcum
<400> 458
gttggaactg ctctcatttt ggagggtaat cacaac 36
<210> 459
<211> 66
<212> DNA
<213> Prevotella intermedia
<400> 459
ctaccaagta atccatattt ctagaggatc gttgcatctg cctgctgttt gcaaggtaaa 60
aacaac 66
<210> 460
<211> 30
<212> DNA
<213> Prevotella intermedia
<400> 460
ctaccaagta atccatattt ctagaggatc 30
<210> 461
<211> 36
<212> DNA
<213> Prevotella intermedia
<400> 461
gttgcatctg cctgctgttt gcaaggtaaa aacaac 36
<210> 462
<211> 66
<212> DNA
<213> Prevotella buccae
<400> 462
ctaccaagta atccatattt ctagaggatc gttgcatctg ccttcttttt gaaaggtaaa 60
aacaac 66
<210> 463
<211> 30
<212> DNA
<213> Prevotella buccae
<400> 463
ctaccaagta atccatattt ctagaggatc 30
<210> 464
<211> 36
<212> DNA
<213> Prevotella buccae
<400> 464
gttgcatctg ccttcttttt gaaaggtaaa aacaac 36
<210> 465
<211> 66
<212> DNA
<213> Alistipes species
<400> 465
ctaccaagta atccatattt ctagaggatc gctgttatat ccttaccttt gtaagggaag 60
tacagc 66
<210> 466
<211> 30
<212> DNA
<213> Alistipes species
<400> 466
ctaccaagta atccatattt ctagaggatc 30
<210> 467
<211> 36
<212> DNA
<213> Alistipes species
<400> 467
gctgttatat ccttaccttt gtaagggaag tacagc 36
<210> 468
<211> 66
<212> DNA
<213> Prevotella species
<400> 468
ctaccaagta atccatattt ctagaggatc gttgtagaag cttatcgttt ggataggtat 60
gacaac 66
<210> 469
<211> 30
<212> DNA
<213> Prevotella species
<400> 469
ctaccaagta atccatattt ctagaggatc 30
<210> 470
<211> 36
<212> DNA
<213> Prevotella species
<400> 470
gttgtagaag cttatcgttt ggataggtat gacaac 36
<210> 471
<211> 66
<212> DNA
<213> Riemerella anatipestifer
<400> 471
ctaccaagta atccatattt ctagaggatc gttgggactg ctctcacttt gaagggtatt 60
cacaac 66
<210> 472
<211> 30
<212> DNA
<213> Riemerella anatipestifer
<400> 472
ctaccaagta atccatattt ctagaggatc 30
<210> 473
<211> 36
<212> DNA
<213> Riemerella anatipestifer
<400> 473
gttgggactg ctctcacttt gaagggtatt cacaac 36
<210> 474
<211> 66
<212> DNA
<213> Prevotella aurantiaca
<400> 474
ctaccaagta atccatattt ctagaggatc gttgtatctg ccttctgttt gaaaggtaaa 60
aacaac 66
<210> 475
<211> 30
<212> DNA
<213> Prevotella aurantiaca
<400> 475
ctaccaagta atccatattt ctagaggatc 30
<210> 476
<211> 36
<212> DNA
<213> Prevotella aurantiaca
<400> 476
gttgtatctg ccttctgttt gaaaggtaaa aacaac 36
<210> 477
<211> 66
<212> DNA
<213> Prevotella saccharolytica
<400> 477
ctaccaagta atccatattt ctagaggatc gttgtgtcta cctccttttt gagaggtaaa 60
aacagc 66
<210> 478
<211> 30
<212> DNA
<213> Prevotella saccharolytica
<400> 478
ctaccaagta atccatattt ctagaggatc 30
<210> 479
<211> 36
<212> DNA
<213> Prevotella saccharolytica
<400> 479
gttgtgtcta cctccttttt gagaggtaaa aacagc 36
<210> 480
<211> 66
<212> DNA
<213> Prevotella intermedia
<400> 480
ctaccaagta atccatattt ctagaggatc gttgcatctg cctgctgttt gcaaggtaaa 60
aacaac 66
<210> 481
<211> 30
<212> DNA
<213> Prevotella intermedia
<400> 481
ctaccaagta atccatattt ctagaggatc 30
<210> 482
<211> 36
<212> DNA
<213> Prevotella intermedia
<400> 482
gttgcatctg cctgctgttt gcaaggtaaa aacaac 36
<210> 483
<211> 66
<212> DNA
<213> Capnocytophaga canimorsus
<400> 483
ctaccaagta atccatattt ctagaggatc gttggaactg ctctcatttt ggagggtaat 60
cacaac 66
<210> 484
<211> 30
<212> DNA
<213> Capnocytophaga canimorsus
<400> 484
ctaccaagta atccatattt ctagaggatc 30
<210> 485
<211> 36
<212> DNA
<213> Capnocytophaga canimorsus
<400> 485
gttggaactg ctctcatttt ggagggtaat cacaac 36
<210> 486
<211> 66
<212> DNA
<213> Porphyromonas gulae
<400> 486
ctaccaagta atccatattt ctagaggatc gttggatcta ccctctattt gaagggtaca 60
cacaac 66
<210> 487
<211> 30
<212> DNA
<213> Porphyromonas gulae
<400> 487
ctaccaagta atccatattt ctagaggatc 30
<210> 488
<211> 36
<212> DNA
<213> Porphyromonas gulae
<400> 488
gttggatcta ccctctattt gaagggtaca cacaac 36
<210> 489
<211> 66
<212> DNA
<213> Prevotella species
<400> 489
ctaccaagta atccatattt ctagaggatc gttgtggaag gtccagtttt gaggggctat 60
tacaac 66
<210> 490
<211> 30
<212> DNA
<213> Prevotella species
<400> 490
ctaccaagta atccatattt ctagaggatc 30
<210> 491
<211> 36
<212> DNA
<213> Prevotella species
<400> 491
gttgtggaag gtccagtttt gaggggctat tacaac 36
<210> 492
<211> 66
<212> DNA
<213> Porphyromonas gingivalis
<400> 492
ctaccaagta atccatattt ctagaggatc gttggatcta ccctctattc gaagggtaca 60
cacaac 66
<210> 493
<211> 30
<212> DNA
<213> Porphyromonas gingivalis
<400> 493
ctaccaagta atccatattt ctagaggatc 30
<210> 494
<211> 36
<212> DNA
<213> Porphyromonas gingivalis
<400> 494
gttggatcta ccctctattc gaagggtaca cacaac 36
<210> 495
<211> 51
<212> DNA
<213> Prevotella intermedia
<400> 495
ctaccaagta atccatattt ctagaggatc gttgcatctg cctgctgttt g 51
<210> 496
<211> 30
<212> DNA
<213> Prevotella intermedia
<400> 496
ctaccaagta atccatattt ctagaggatc 30
<210> 497
<211> 36
<212> DNA
<213> Prevotella intermedia
<400> 497
gttgcatctg cctgctgttt gcaaggtaaa aacaac 36
<210> 498
<211> 64
<212> DNA
<213> Dengue virus
<400> 498
gatttagact accccaaaaa cgaaggggac taaaactgct tctgtccagt gagcatggtc 60
ttcg 64
<210> 499
<211> 28
<212> DNA
<213> Dengue virus
<400> 499
tgcttctgtc cagtgagcat ggtcttcg 28
<210> 500
<211> 36
<212> DNA
<213> Dengue virus
<400> 500
gatttagact accccaaaaa cgaaggggac taaaac 36
<210> 501
<211> 66
<212> DNA
<213> Dengue virus
<400> 501
tttgcttctg tccagtgagc atggtcttcg gttgtagaag cttatcgttt ggataggtat 60
gacaac 66
<210> 502
<211> 30
<212> DNA
<213> Dengue virus
<400> 502
tttgcttctg tccagtgagc atggtcttcg 30
<210> 503
<211> 36
<212> DNA
<213> Dengue virus
<400> 503
gttgtagaag cttatcgttt ggataggtat gacaac 36
<210> 504
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 504
taatttctac tcttgtagat ctgtgtttat ccgctcacaa 40
<210> 505
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 505
ctgtgtttat ccgctcacaa 20
<210> 506
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 506
taatttctac tcttgtagat 20
<210> 507
<211> 66
<212> DNA
<213> Prevotella species
<400> 507
atgctttgtt tcaggtgtat caaccaataa gttgtagaag cttatcgttt ggataggtat 60
gacaac 66
<210> 508
<211> 30
<212> DNA
<213> Prevotella species
<400> 508
atgctttgtt tcaggtgtat caaccaataa 30
<210> 509
<211> 36
<212> DNA
<213> Prevotella species
<400> 509
gttgtagaag cttatcgttt ggataggtat gacaac 36
<210> 510
<211> 64
<212> DNA
<213> Leptotrichia wadei
<400> 510
gatttagact accccaaaaa cgaaggggac taaaacagca cgctcacccg cgggttgcct 60
tcgg 64
<210> 511
<211> 28
<212> DNA
<213> Leptotrichia wadei
<400> 511
agcacgctca cccgcgggtt gccttcgg 28
<210> 512
<211> 36
<212> DNA
<213> Leptotrichia wadei
<400> 512
gatttagact accccaaaaa cgaaggggac taaaac 36
<210> 513
<211> 64
<212> DNA
<213> Zika virus
<400> 513
gatttagact accccaaaaa cgaaggggac taaaacactc cctagaacca cgacagtttg 60
cctt 64
<210> 514
<211> 28
<212> DNA
<213> Zika virus
<400> 514
actccctaga accacgacag tttgcctt 28
<210> 515
<211> 36
<212> DNA
<213> Zika virus
<400> 515
gatttagact accccaaaaa cgaaggggac taaaac 36
<210> 516
<211> 64
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 516
gatttagact accccaaaaa cgaaggggac taaaacccag gccaaaatct gtgatcttga 60
catg 64
<210> 517
<211> 28
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 517
ccaggccaaa atctgtgatc ttgacatg 28
<210> 518
<211> 36
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 518
gatttagact accccaaaaa cgaaggggac taaaac 36
<210> 519
<211> 64
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 519
gatttagact accccaaaaa cgaaggggac taaaaccccg gccaaaatct gtgatcttga 60
catg 64
<210> 520
<211> 28
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 520
cccggccaaa atctgtgatc ttgacatg 28
<210> 521
<211> 36
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 521
gatttagact accccaaaaa cgaaggggac taaaac 36
<210> 522
<211> 64
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 522
gatttagact accccaaaaa cgaaggggac taaaacgttg gctttcggag atgtcttgat 60
agcg 64
<210> 523
<211> 28
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 523
gttggctttc ggagatgtct tgatagcg 28
<210> 524
<211> 36
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 524
gatttagact accccaaaaa cgaaggggac taaaac 36
<210> 525
<211> 64
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 525
gatttagact accccaaaaa cgaaggggac taaaacgatg ttgcttctct taattccttg 60
atag 64
<210> 526
<211> 28
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 526
gatgttgctt ctcttaattc cttgatag 28
<210> 527
<211> 36
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 527
gatttagact accccaaaaa cgaaggggac taaaac 36
<210> 528
<211> 64
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 528
gatttagact accccaaaaa cgaaggggac taaaacccta tcaggtttca cagtaagcgc 60
gtat 64
<210> 529
<211> 28
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 529
cctatcaggt ttcacagtaa gcgcgtat 28
<210> 530
<211> 36
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 530
gatttagact accccaaaaa cgaaggggac taaaac 36
<210> 531
<211> 66
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 531
cctggttcat gagcttcctg ccactgccaa gttgtagaag cttatcgttt ggataggtat 60
gacaac 66
<210> 532
<211> 30
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 532
cctggttcat gagcttcctg ccactgccaa 30
<210> 533
<211> 36
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 533
gttgtagaag cttatcgttt ggataggtat gacaac 36
<210> 534
<211> 63
<212> DNA
<213> Dengue virus
<400> 534
gttgatgaga agagcccaag atagagggca ataactgctt ctgtccagtg agcatggtct 60
tcg 63
<210> 535
<211> 28
<212> DNA
<213> Dengue virus
<400> 535
tgcttctgtc cagtgagcat ggtcttcg 28
<210> 536
<211> 35
<212> DNA
<213> Dengue virus
<400> 536
gttgatgaga agagcccaag atagagggca ataac 35
<210> 537
<211> 66
<212> DNA
<213> Zika virus
<400> 537
tgactcccta gaaccacgac agtttgcctt gttgtagaag cttatcgttt ggataggtat 60
gacaac 66
<210> 538
<211> 30
<212> DNA
<213> Zika virus
<400> 538
tgactcccta gaaccacgac agtttgcctt 30
<210> 539
<211> 36
<212> DNA
<213> Zika virus
<400> 539
gttgtagaag cttatcgttt ggataggtat gacaac 36
<210> 540
<211> 63
<212> DNA
<213> Zika virus
<400> 540
gttgatgaga agagcccaag atagagggca ataacactcc ctagaaccac gacagtttgc 60
ctt 63
<210> 541
<211> 28
<212> DNA
<213> Zika virus
<400> 541
actccctaga accacgacag tttgcctt 28
<210> 542
<211> 35
<212> DNA
<213> Zika virus
<400> 542
gttgatgaga agagcccaag atagagggca ataac 35
<210> 543
<211> 59
<212> DNA
<213> Dengue virus
<400> 543
gaccacccca aaaatgaagg ggactaaaac atgcttctgt ccagtgagca tggtcttcg 59
<210> 544
<211> 28
<212> DNA
<213> Dengue virus
<400> 544
tgcttctgtc cagtgagcat ggtcttcg 28
<210> 545
<211> 31
<212> DNA
<213> Dengue virus
<400> 545
gaccacccca aaaatgaagg ggactaaaac a 31
<210> 546
<211> 59
<212> DNA
<213> Zika virus
<400> 546
gaccacccca aaaatgaagg ggactaaaac aactccctag aaccacgaca gtttgcctt 59
<210> 547
<211> 28
<212> DNA
<213> Zika virus
<400> 547
actccctaga accacgacag tttgcctt 28
<210> 548
<211> 31
<212> DNA
<213> Zika virus
<400> 548
gaccacccca aaaatgaagg ggactaaaac a 31
<210> 549
<211> 57
<212> DNA
<213> Dengue virus
<400> 549
gaccacccca aaaatgaagg ggactaaaac atgcttctgt ccagtgagca tggtctt 57
<210> 550
<211> 26
<212> DNA
<213> Dengue virus
<400> 550
tgcttctgtc cagtgagcat ggtctt 26
<210> 551
<211> 31
<212> DNA
<213> Dengue virus
<400> 551
gaccacccca aaaatgaagg ggactaaaac a 31
<210> 552
<211> 55
<212> DNA
<213> Dengue virus
<400> 552
gaccacccca aaaatgaagg ggactaaaac atgcttctgt ccagtgagca tggtc 55
<210> 553
<211> 24
<212> DNA
<213> Dengue virus
<400> 553
tgcttctgtc cagtgagcat ggtc 24
<210> 554
<211> 31
<212> DNA
<213> Dengue virus
<400> 554
gaccacccca aaaatgaagg ggactaaaac a 31
<210> 555
<211> 53
<212> DNA
<213> Dengue virus
<400> 555
gaccacccca aaaatgaagg ggactaaaac atgcttctgt ccagtgagca tgg 53
<210> 556
<211> 22
<212> DNA
<213> Dengue virus
<400> 556
tgcttctgtc cagtgagcat gg 22
<210> 557
<211> 31
<212> DNA
<213> Dengue virus
<400> 557
gaccacccca aaaatgaagg ggactaaaac a 31
<210> 558
<211> 51
<212> DNA
<213> Dengue virus
<400> 558
gaccacccca aaaatgaagg ggactaaaac atgcttctgt ccagtgagca t 51
<210> 559
<211> 20
<212> DNA
<213> Dengue virus
<400> 559
tgcttctgtc cagtgagcat 20
<210> 560
<211> 31
<212> DNA
<213> Dengue virus
<400> 560
gaccacccca aaaatgaagg ggactaaaac a 31
<210> 561
<211> 49
<212> DNA
<213> Dengue virus
<400> 561
gaccacccca aaaatgaagg ggactaaaac atgcttctgt ccagtgagc 49
<210> 562
<211> 18
<212> DNA
<213> Dengue virus
<400> 562
tgcttctgtc cagtgagc 18
<210> 563
<211> 31
<212> DNA
<213> Dengue virus
<400> 563
gaccacccca aaaatgaagg ggactaaaac a 31
<210> 564
<211> 70
<212> DNA
<213> Capnocytophaga canimorsus
<400> 564
tgttctacca agtaatccat atttctagag gatcgttgga actgctctca ttttggaggg 60
taatcacaac 70
<210> 565
<211> 34
<212> DNA
<213> Capnocytophaga canimorsus
<400> 565
tgttctacca agtaatccat atttctagag gatc 34
<210> 566
<211> 36
<212> DNA
<213> Capnocytophaga canimorsus
<400> 566
gttggaactg ctctcatttt ggagggtaat cacaac 36
<210> 567
<211> 69
<212> DNA
<213> Capnocytophaga canimorsus
<400> 567
gttctaccaa gtaatccata tttctagagg atcgttggaa ctgctctcat tttggagggt 60
aatcacaac 69
<210> 568
<211> 33
<212> DNA
<213> Capnocytophaga canimorsus
<400> 568
gttctaccaa gtaatccata tttctagagg atc 33
<210> 569
<211> 36
<212> DNA
<213> Capnocytophaga canimorsus
<400> 569
gttggaactg ctctcatttt ggagggtaat cacaac 36
<210> 570
<211> 68
<212> DNA
<213> Capnocytophaga canimorsus
<400> 570
ttctaccaag taatccatat ttctagagga tcgttggaac tgctctcatt ttggagggta 60
atcacaac 68
<210> 571
<211> 32
<212> DNA
<213> Capnocytophaga canimorsus
<400> 571
ttctaccaag taatccatat ttctagagga tc 32
<210> 572
<211> 36
<212> DNA
<213> Capnocytophaga canimorsus
<400> 572
gttggaactg ctctcatttt ggagggtaat cacaac 36
<210> 573
<211> 67
<212> DNA
<213> Capnocytophaga canimorsus
<400> 573
tctaccaagt aatccatatt tctagaggat cgttggaact gctctcattt tggagggtaa 60
tcacaac 67
<210> 574
<211> 31
<212> DNA
<213> Capnocytophaga canimorsus
<400> 574
tctaccaagt aatccatatt tctagaggat c 31
<210> 575
<211> 36
<212> DNA
<213> Capnocytophaga canimorsus
<400> 575
gttggaactg ctctcatttt ggagggtaat cacaac 36
<210> 576
<211> 66
<212> DNA
<213> Capnocytophaga canimorsus
<400> 576
ctaccaagta atccatattt ctagaggatc gttggaactg ctctcatttt ggagggtaat 60
cacaac 66
<210> 577
<211> 30
<212> DNA
<213> Capnocytophaga canimorsus
<400> 577
ctaccaagta atccatattt ctagaggatc 30
<210> 578
<211> 36
<212> DNA
<213> Capnocytophaga canimorsus
<400> 578
gttggaactg ctctcatttt ggagggtaat cacaac 36
<210> 579
<211> 65
<212> DNA
<213> Capnocytophaga canimorsus
<400> 579
taccaagtaa tccatatttc tagaggatcg ttggaactgc tctcattttg gagggtaatc 60
acaac 65
<210> 580
<211> 29
<212> DNA
<213> Capnocytophaga canimorsus
<400> 580
taccaagtaa tccatatttc tagaggatc 29
<210> 581
<211> 36
<212> DNA
<213> Capnocytophaga canimorsus
<400> 581
gttggaactg ctctcatttt ggagggtaat cacaac 36
<210> 582
<211> 64
<212> DNA
<213> Capnocytophaga canimorsus
<400> 582
accaagtaat ccatatttct agaggatcgt tggaactgct ctcattttgg agggtaatca 60
caac 64
<210> 583
<211> 28
<212> DNA
<213> Capnocytophaga canimorsus
<400> 583
accaagtaat ccatatttct agaggatc 28
<210> 584
<211> 36
<212> DNA
<213> Capnocytophaga canimorsus
<400> 584
gttggaactg ctctcatttt ggagggtaat cacaac 36
<210> 585
<211> 63
<212> DNA
<213> Capnocytophaga canimorsus
<400> 585
ccaagtaatc catatttcta gaggatcgtt ggaactgctc tcattttgga gggtaatcac 60
aac 63
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<211> 27
<212> DNA
<213> Capnocytophaga canimorsus
<400> 586
ccaagtaatc catatttcta gaggatc 27
<210> 587
<211> 36
<212> DNA
<213> Capnocytophaga canimorsus
<400> 587
gttggaactg ctctcatttt ggagggtaat cacaac 36
<210> 588
<211> 62
<212> DNA
<213> Capnocytophaga canimorsus
<400> 588
caagtaatcc atatttctag aggatcgttg gaactgctct cattttggag ggtaatcaca 60
ac 62
<210> 589
<211> 26
<212> DNA
<213> Capnocytophaga canimorsus
<400> 589
caagtaatcc atatttctag aggatc 26
<210> 590
<211> 36
<212> DNA
<213> Capnocytophaga canimorsus
<400> 590
gttggaactg ctctcatttt ggagggtaat cacaac 36
<210> 591
<211> 61
<212> DNA
<213> Capnocytophaga canimorsus
<400> 591
aagtaatcca tatttctaga ggatcgttgg aactgctctc attttggagg gtaatcacaa 60
c 61
<210> 592
<211> 25
<212> DNA
<213> Capnocytophaga canimorsus
<400> 592
aagtaatcca tatttctaga ggatc 25
<210> 593
<211> 36
<212> DNA
<213> Capnocytophaga canimorsus
<400> 593
gttggaactg ctctcatttt ggagggtaat cacaac 36
<210> 594
<211> 60
<212> DNA
<213> Capnocytophaga canimorsus
<400> 594
agtaatccat atttctagag gatcgttgga actgctctca ttttggaggg taatcacaac 60
60
<210> 595
<211> 24
<212> DNA
<213> Capnocytophaga canimorsus
<400> 595
agtaatccat atttctagag gatc 24
<210> 596
<211> 36
<212> DNA
<213> Capnocytophaga canimorsus
<400> 596
gttggaactg ctctcatttt ggagggtaat cacaac 36
<210> 597
<211> 59
<212> DNA
<213> Capnocytophaga canimorsus
<400> 597
gtaatccata tttctagagg atcgttggaa ctgctctcat tttggagggt aatcacaac 59
<210> 598
<211> 23
<212> DNA
<213> Capnocytophaga canimorsus
<400> 598
gtaatccata tttctagagg atc 23
<210> 599
<211> 36
<212> DNA
<213> Capnocytophaga canimorsus
<400> 599
gttggaactg ctctcatttt ggagggtaat cacaac 36
<210> 600
<211> 58
<212> DNA
<213> Capnocytophaga canimorsus
<400> 600
taatccatat ttctagagga tcgttggaac tgctctcatt ttggagggta atcacaac 58
<210> 601
<211> 22
<212> DNA
<213> Capnocytophaga canimorsus
<400> 601
taatccatat ttctagagga tc 22
<210> 602
<211> 36
<212> DNA
<213> Capnocytophaga canimorsus
<400> 602
gttggaactg ctctcatttt ggagggtaat cacaac 36
<210> 603
<211> 57
<212> DNA
<213> Capnocytophaga canimorsus
<400> 603
aatccatatt tctagaggat cgttggaact gctctcattt tggagggtaa tcacaac 57
<210> 604
<211> 21
<212> DNA
<213> Capnocytophaga canimorsus
<400> 604
aatccatatt tctagaggat c 21
<210> 605
<211> 36
<212> DNA
<213> Capnocytophaga canimorsus
<400> 605
gttggaactg ctctcatttt ggagggtaat cacaac 36
<210> 606
<211> 56
<212> DNA
<213> Capnocytophaga canimorsus
<400> 606
atccatattt ctagaggatc gttggaactg ctctcatttt ggagggtaat cacaac 56
<210> 607
<211> 20
<212> DNA
<213> Capnocytophaga canimorsus
<400> 607
atccatattt ctagaggatc 20
<210> 608
<211> 36
<212> DNA
<213> Capnocytophaga canimorsus
<400> 608
gttggaactg ctctcatttt ggagggtaat cacaac 36
<210> 609
<211> 55
<212> DNA
<213> Capnocytophaga canimorsus
<400> 609
tccatatttc tagaggatcg ttggaactgc tctcattttg gagggtaatc acaac 55
<210> 610
<211> 19
<212> DNA
<213> Capnocytophaga canimorsus
<400> 610
tccatatttc tagaggatc 19
<210> 611
<211> 36
<212> DNA
<213> Capnocytophaga canimorsus
<400> 611
gttggaactg ctctcatttt ggagggtaat cacaac 36
<210> 612
<211> 54
<212> DNA
<213> Capnocytophaga canimorsus
<400> 612
ccatatttct agaggatcgt tggaactgct ctcattttgg agggtaatca caac 54
<210> 613
<211> 18
<212> DNA
<213> Capnocytophaga canimorsus
<400> 613
ccatatttct agaggatc 18
<210> 614
<211> 36
<212> DNA
<213> Capnocytophaga canimorsus
<400> 614
gttggaactg ctctcatttt ggagggtaat cacaac 36
<210> 615
<211> 53
<212> DNA
<213> Capnocytophaga canimorsus
<400> 615
catatttcta gaggatcgtt ggaactgctc tcattttgga gggtaatcac aac 53
<210> 616
<211> 17
<212> DNA
<213> Capnocytophaga canimorsus
<400> 616
catatttcta gaggatc 17
<210> 617
<211> 36
<212> DNA
<213> Capnocytophaga canimorsus
<400> 617
gttggaactg ctctcatttt ggagggtaat cacaac 36
<210> 618
<211> 52
<212> DNA
<213> Capnocytophaga canimorsus
<400> 618
atatttctag aggatcgttg gaactgctct cattttggag ggtaatcaca ac 52
<210> 619
<211> 16
<212> DNA
<213> Capnocytophaga canimorsus
<400> 619
atatttctag aggatc 16
<210> 620
<211> 36
<212> DNA
<213> Capnocytophaga canimorsus
<400> 620
gttggaactg ctctcatttt ggagggtaat cacaac 36
<210> 621
<211> 51
<212> DNA
<213> Capnocytophaga canimorsus
<400> 621
tatttctaga ggatcgttgg aactgctctc attttggagg gtaatcacaa c 51
<210> 622
<211> 15
<212> DNA
<213> Capnocytophaga canimorsus
<400> 622
tatttctaga ggatc 15
<210> 623
<211> 36
<212> DNA
<213> Capnocytophaga canimorsus
<400> 623
gttggaactg ctctcatttt ggagggtaat cacaac 36
<210> 624
<211> 50
<212> DNA
<213> Capnocytophaga canimorsus
<400> 624
atttctagag gatcgttgga actgctctca ttttggaggg taatcacaac 50
<210> 625
<211> 14
<212> DNA
<213> Capnocytophaga canimorsus
<400> 625
atttctagag gatc 14
<210> 626
<211> 36
<212> DNA
<213> Capnocytophaga canimorsus
<400> 626
gttggaactg ctctcatttt ggagggtaat cacaac 36
<210> 627
<211> 49
<212> DNA
<213> Capnocytophaga canimorsus
<400> 627
tttctagagg atcgttggaa ctgctctcat tttggagggt aatcacaac 49
<210> 628
<211> 13
<212> DNA
<213> Capnocytophaga canimorsus
<400> 628
tttctagagg atc 13
<210> 629
<211> 36
<212> DNA
<213> Capnocytophaga canimorsus
<400> 629
gttggaactg ctctcatttt ggagggtaat cacaac 36
<210> 630
<211> 48
<212> DNA
<213> Capnocytophaga canimorsus
<400> 630
ttctagagga tcgttggaac tgctctcatt ttggagggta atcacaac 48
<210> 631
<211> 12
<212> DNA
<213> Capnocytophaga canimorsus
<400> 631
ttctagagga tc 12
<210> 632
<211> 36
<212> DNA
<213> Capnocytophaga canimorsus
<400> 632
gttggaactg ctctcatttt ggagggtaat cacaac 36
<210> 633
<211> 70
<212> DNA
<213> Prevotella species
<400> 633
tgttctacca agtaatccat atttctagag gatcgttgta gaagcttatc gtttggatag 60
gtatgacaac 70
<210> 634
<211> 34
<212> DNA
<213> Prevotella species
<400> 634
tgttctacca agtaatccat atttctagag gatc 34
<210> 635
<211> 36
<212> DNA
<213> Prevotella species
<400> 635
gttgtagaag cttatcgttt ggataggtat gacaac 36
<210> 636
<211> 69
<212> DNA
<213> Prevotella species
<400> 636
gttctaccaa gtaatccata tttctagagg atcgttgtag aagcttatcg tttggatagg 60
tatgacaac 69
<210> 637
<211> 33
<212> DNA
<213> Prevotella species
<400> 637
gttctaccaa gtaatccata tttctagagg atc 33
<210> 638
<211> 36
<212> DNA
<213> Prevotella species
<400> 638
gttgtagaag cttatcgttt ggataggtat gacaac 36
<210> 639
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<212> DNA
<213> Prevotella species
<400> 639
ttctaccaag taatccatat ttctagagga tcgttgtaga agcttatcgt ttggataggt 60
atgacaac 68
<210> 640
<211> 32
<212> DNA
<213> Prevotella species
<400> 640
ttctaccaag taatccatat ttctagagga tc 32
<210> 641
<211> 36
<212> DNA
<213> Prevotella species
<400> 641
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<210> 642
<211> 67
<212> DNA
<213> Prevotella species
<400> 642
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tgacaac 67
<210> 643
<211> 31
<212> DNA
<213> Prevotella species
<400> 643
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<211> 36
<212> DNA
<213> Prevotella species
<400> 644
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<212> DNA
<213> Prevotella species
<400> 645
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<211> 30
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ctaccaagta atccatattt ctagaggatc 30
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<211> 36
<212> DNA
<213> Prevotella species
<400> 647
gttgtagaag cttatcgttt ggataggtat gacaac 36
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<213> Prevotella species
<400> 648
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acaac 65
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<213> Prevotella species
<400> 649
taccaagtaa tccatatttc tagaggatc 29
<210> 650
<211> 36
<212> DNA
<213> Prevotella species
<400> 650
gttgtagaag cttatcgttt ggataggtat gacaac 36
<210> 651
<211> 64
<212> DNA
<213> Prevotella species
<400> 651
accaagtaat ccatatttct agaggatcgt tgtagaagct tatcgtttgg ataggtatga 60
caac 64
<210> 652
<211> 28
<212> DNA
<213> Prevotella species
<400> 652
accaagtaat ccatatttct agaggatc 28
<210> 653
<211> 36
<212> DNA
<213> Prevotella species
<400> 653
gttgtagaag cttatcgttt ggataggtat gacaac 36
<210> 654
<211> 63
<212> DNA
<213> Prevotella species
<400> 654
ccaagtaatc catatttcta gaggatcgtt gtagaagctt atcgtttgga taggtatgac 60
aac 63
<210> 655
<211> 27
<212> DNA
<213> Prevotella species
<400> 655
ccaagtaatc catatttcta gaggatc 27
<210> 656
<211> 36
<212> DNA
<213> Prevotella species
<400> 656
gttgtagaag cttatcgttt ggataggtat gacaac 36
<210> 657
<211> 62
<212> DNA
<213> Prevotella species
<400> 657
caagtaatcc atatttctag aggatcgttg tagaagctta tcgtttggat aggtatgaca 60
ac 62
<210> 658
<211> 26
<212> DNA
<213> Prevotella species
<400> 658
caagtaatcc atatttctag aggatc 26
<210> 659
<211> 36
<212> DNA
<213> Prevotella species
<400> 659
gttgtagaag cttatcgttt ggataggtat gacaac 36
<210> 660
<211> 61
<212> DNA
<213> Prevotella species
<400> 660
aagtaatcca tatttctaga ggatcgttgt agaagcttat cgtttggata ggtatgacaa 60
c 61
<210> 661
<211> 25
<212> DNA
<213> Prevotella species
<400> 661
aagtaatcca tatttctaga ggatc 25
<210> 662
<211> 36
<212> DNA
<213> Prevotella species
<400> 662
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<211> 60
<212> DNA
<213> Prevotella species
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60
<210> 664
<211> 24
<212> DNA
<213> Prevotella species
<400> 664
agtaatccat atttctagag gatc 24
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<211> 36
<212> DNA
<213> Prevotella species
<400> 665
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<210> 666
<211> 59
<212> DNA
<213> Prevotella species
<400> 666
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<210> 667
<211> 23
<212> DNA
<213> Prevotella species
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<211> 36
<212> DNA
<213> Prevotella species
<400> 668
gttgtagaag cttatcgttt ggataggtat gacaac 36
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<211> 58
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<213> Leptotrichia wadei
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<213> Leptotrichia wadei
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cata 64
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<213> Leptotrichia wadei
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tcta 64
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<213> Leptotrichia wadei
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<213> Leptotrichia wadei
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<213> Leptotrichia wadei
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<213> Leptotrichia wadei
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gatttagact accccaaaaa cgaaggggac taaaaccaca ggaaacagct atgaccatga 60
ttac 64
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gatttagact accccaaaaa cgaaggggac taaaac 36
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gatttagact accccaaaaa cgaaggggac taaaactgtg agcggataaa cacaggaaac 60
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gatttagact accccaaaaa cgaaggggac taaaac 36
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gatttagact accccaaaaa cgaaggggac taaaac 36
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<211> 64
<212> DNA
<213> Leptotrichia wadei
<400> 732
gatttagact accccaaaaa cgaaggggac taaaactgct tccggctcgt atgttgtgtg 60
gaat 64
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<213> Leptotrichia wadei
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<213> Leptotrichia wadei
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<212> DNA
<213> Capnocytophaga canimorsus
<400> 742
taccaagtaa tccatatttc tagaggatcc 30
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<213> Capnocytophaga canimorsus
<400> 743
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<212> DNA
<213> Capnocytophaga canimorsus
<400> 744
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<212> DNA
<213> Capnocytophaga canimorsus
<400> 745
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<213> Capnocytophaga canimorsus
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<213> Capnocytophaga canimorsus
<400> 747
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<213> Capnocytophaga canimorsus
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<213> Capnocytophaga canimorsus
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<213> Capnocytophaga canimorsus
<400> 750
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<212> DNA
<213> Capnocytophaga canimorsus
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acgccaagct tgcatgcctg caggtcgagt 30
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<212> DNA
<213> Capnocytophaga canimorsus
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<213> Capnocytophaga canimorsus
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<213> Capnocytophaga canimorsus
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<212> DNA
<213> Capnocytophaga canimorsus
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<213> Capnocytophaga canimorsus
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cacaac 66
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<211> 30
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<213> Capnocytophaga canimorsus
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aacacaggaa acagctatga ccatgattac 30
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<212> DNA
<213> Capnocytophaga canimorsus
<400> 758
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<212> DNA
<213> Capnocytophaga canimorsus
<400> 759
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cacaac 66
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<211> 30
<212> DNA
<213> Capnocytophaga canimorsus
<400> 760
attgtgagcg gataaacaca ggaaacagct 30
<210> 761
<211> 36
<212> DNA
<213> Capnocytophaga canimorsus
<400> 761
gttggaactg ctctcatttt ggagggtaat cacaac 36
<210> 762
<211> 66
<212> DNA
<213> Capnocytophaga canimorsus
<400> 762
gtatgttgtg tggaattgtg agcggataaa gttggaactg ctctcatttt ggagggtaat 60
cacaac 66
<210> 763
<211> 30
<212> DNA
<213> Capnocytophaga canimorsus
<400> 763
gtatgttgtg tggaattgtg agcggataaa 30
<210> 764
<211> 36
<212> DNA
<213> Capnocytophaga canimorsus
<400> 764
gttggaactg ctctcatttt ggagggtaat cacaac 36
<210> 765
<211> 66
<212> DNA
<213> Capnocytophaga canimorsus
<400> 765
tatgcttccg gctcgtatgt tgtgtggaat gttggaactg ctctcatttt ggagggtaat 60
cacaac 66
<210> 766
<211> 30
<212> DNA
<213> Capnocytophaga canimorsus
<400> 766
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<211> 36
<212> DNA
<213> Capnocytophaga canimorsus
<400> 767
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<213> Prevotella species
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<212> DNA
<213> Prevotella species
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<213> Prevotella species
<400> 774
taccaagtaa tccatatttc tagaggatcc gttgtagaag cttatcgttt ggataggtat 60
gacaac 66
<210> 775
<211> 30
<212> DNA
<213> Prevotella species
<400> 775
taccaagtaa tccatatttc tagaggatcc 30
<210> 776
<211> 36
<212> DNA
<213> Prevotella species
<400> 776
gttgtagaag cttatcgttt ggataggtat gacaac 36
<210> 777
<211> 66
<212> DNA
<213> Prevotella species
<400> 777
gtagattgct gttctaccaa gtaatccata gttgtagaag cttatcgttt ggataggtat 60
gacaac 66
<210> 778
<211> 30
<212> DNA
<213> Prevotella species
<400> 778
gtagattgct gttctaccaa gtaatccata 30
<210> 779
<211> 36
<212> DNA
<213> Prevotella species
<400> 779
gttgtagaag cttatcgttt ggataggtat gacaac 36
<210> 780
<211> 66
<212> DNA
<213> Prevotella species
<400> 780
tgcctgcagg tcgagtagat tgctgttcta gttgtagaag cttatcgttt ggataggtat 60
gacaac 66
<210> 781
<211> 30
<212> DNA
<213> Prevotella species
<400> 781
tgcctgcagg tcgagtagat tgctgttcta 30
<210> 782
<211> 36
<212> DNA
<213> Prevotella species
<400> 782
gttgtagaag cttatcgttt ggataggtat gacaac 36
<210> 783
<211> 66
<212> DNA
<213> Prevotella species
<400> 783
acgccaagct tgcatgcctg caggtcgagt gttgtagaag cttatcgttt ggataggtat 60
gacaac 66
<210> 784
<211> 30
<212> DNA
<213> Prevotella species
<400> 784
acgccaagct tgcatgcctg caggtcgagt 30
<210> 785
<211> 36
<212> DNA
<213> Prevotella species
<400> 785
gttgtagaag cttatcgttt ggataggtat gacaac 36
<210> 786
<211> 66
<212> DNA
<213> Prevotella species
<400> 786
ctatgaccat gattacgcca agcttgcatg gttgtagaag cttatcgttt ggataggtat 60
gacaac 66
<210> 787
<211> 30
<212> DNA
<213> Prevotella species
<400> 787
ctatgaccat gattacgcca agcttgcatg 30
<210> 788
<211> 36
<212> DNA
<213> Prevotella species
<400> 788
gttgtagaag cttatcgttt ggataggtat gacaac 36
<210> 789
<211> 66
<212> DNA
<213> Prevotella species
<400> 789
aacacaggaa acagctatga ccatgattac gttgtagaag cttatcgttt ggataggtat 60
gacaac 66
<210> 790
<211> 30
<212> DNA
<213> Prevotella species
<400> 790
aacacaggaa acagctatga ccatgattac 30
<210> 791
<211> 36
<212> DNA
<213> Prevotella species
<400> 791
gttgtagaag cttatcgttt ggataggtat gacaac 36
<210> 792
<211> 66
<212> DNA
<213> Prevotella species
<400> 792
attgtgagcg gataaacaca ggaaacagct gttgtagaag cttatcgttt ggataggtat 60
gacaac 66
<210> 793
<211> 30
<212> DNA
<213> Prevotella species
<400> 793
attgtgagcg gataaacaca ggaaacagct 30
<210> 794
<211> 36
<212> DNA
<213> Prevotella species
<400> 794
gttgtagaag cttatcgttt ggataggtat gacaac 36
<210> 795
<211> 66
<212> DNA
<213> Prevotella species
<400> 795
gtatgttgtg tggaattgtg agcggataaa gttgtagaag cttatcgttt ggataggtat 60
gacaac 66
<210> 796
<211> 30
<212> DNA
<213> Prevotella species
<400> 796
gtatgttgtg tggaattgtg agcggataaa 30
<210> 797
<211> 36
<212> DNA
<213> Prevotella species
<400> 797
gttgtagaag cttatcgttt ggataggtat gacaac 36
<210> 798
<211> 66
<212> DNA
<213> Prevotella species
<400> 798
tatgcttccg gctcgtatgt tgtgtggaat gttgtagaag cttatcgttt ggataggtat 60
gacaac 66
<210> 799
<211> 30
<212> DNA
<213> Prevotella species
<400> 799
tatgcttccg gctcgtatgt tgtgtggaat 30
<210> 800
<211> 36
<212> DNA
<213> Prevotella species
<400> 800
gttgtagaag cttatcgttt ggataggtat gacaac 36
<210> 801
<211> 66
<212> DNA
<213> Zika virus
<400> 801
cttgaactct accagtgctt ctttgttgtt gttggaactg ctctcatttt ggagggtaat 60
cacaac 66
<210> 802
<211> 30
<212> DNA
<213> Zika virus
<400> 802
cttgaactct accagtgctt ctttgttgtt 30
<210> 803
<211> 36
<212> DNA
<213> Zika virus
<400> 803
gttggaactg ctctcatttt ggagggtaat cacaac 36
<210> 804
<211> 66
<212> DNA
<213> Dengue virus
<400> 804
tttgcttctg tccagtgagc atggtcttcg gttggaactg ctctcatttt ggagggtaat 60
cacaac 66
<210> 805
<211> 30
<212> DNA
<213> Dengue virus
<400> 805
tttgcttctg tccagtgagc atggtcttcg 30
<210> 806
<211> 36
<212> DNA
<213> Dengue virus
<400> 806
gttggaactg ctctcatttt ggagggtaat cacaac 36
<210> 807
<211> 65
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 807
ccgcttcacc ggctacccct gctccaagag ttgtagaagc ttatcgtttg gataggtatg 60
acaac 65
<210> 808
<211> 29
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 808
ccgcttcacc ggctacccct gctccaaga 29
<210> 809
<211> 36
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 809
gttgtagaag cttatcgttt ggataggtat gacaac 36
<210> 810
<211> 64
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 810
gatttagact accccaaaaa cgaaggggac taaaacctgc accttctacc accacctccg 60
ccag 64
<210> 811
<211> 28
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 811
ctgcaccttc taccaccacc tccgccag 28
<210> 812
<211> 36
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 812
gatttagact accccaaaaa cgaaggggac taaaac 36
<210> 813
<211> 64
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 813
gatttagact accccaaaaa cgaaggggac taaaactaga ttgctgttct accaagtaat 60
ccat 64
<210> 814
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 814
tagattgctg ttctaccaag taatccat 28
<210> 815
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 815
gatttagact accccaaaaa cgaaggggac taaaac 36
<210> 816
<211> 64
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 816
gatttagact accccaaaaa cgaaggggac taaaacgcaa gatgagctgc acggtggagg 60
tgag 64
<210> 817
<211> 28
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 817
gcaagatgag ctgcacggtg gaggtgag 28
<210> 818
<211> 36
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 818
gatttagact accccaaaaa cgaaggggac taaaac 36
<210> 819
<211> 64
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 819
gatttagact accccaaaaa cgaaggggac taaaacgcgt catgagctgc acggtggagg 60
tgag 64
<210> 820
<211> 28
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 820
gcgtcatgag ctgcacggtg gaggtgag 28
<210> 821
<211> 36
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 821
gatttagact accccaaaaa cgaaggggac taaaac 36
<210> 822
<211> 66
<212> DNA
<213> Prevotella species
<400> 822
tagattgctg ttctaccaag taatccatat gttgtagaag cttatcgttt ggataggtat 60
gacaac 66
<210> 823
<211> 30
<212> DNA
<213> Prevotella species
<400> 823
tagattgctg ttctaccaag taatccatat 30
<210> 824
<211> 36
<212> DNA
<213> Prevotella species
<400> 824
gttgtagaag cttatcgttt ggataggtat gacaac 36
<210> 825
<211> 64
<212> DNA
<213> Leptotrichia wadei
<400> 825
gatttagact accccaaaaa cgaaggggac taaaacgatt gctgttctac caagtaatcc 60
atat 64
<210> 826
<211> 28
<212> DNA
<213> Leptotrichia wadei
<400> 826
gattgctgtt ctaccaagta atccatat 28
<210> 827
<211> 36
<212> DNA
<213> Leptotrichia wadei
<400> 827
gatttagact accccaaaaa cgaaggggac taaaac 36
<210> 828
<211> 170
<212> RNA
<213> Dengue virus
<400> 828
aguacauauu caggggccaa ccucucaaca augacgaaga ccaugcucac uggacagaag 60
caaaaaugcu gcuggacaac aucaacacac cagaagggau uauaccagcu cucuuugaac 120
cagaaaggga gaagucagcc gccauagacg gugaauaccg ccugaagggu 170
<210> 829
<211> 173
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 829
ggccagtgaa ttcgagctcg gtacccgggg atcctctaga aatatggatt acttggtaga 60
acagcaatct actcgacctg caggcatgca agcttggcgt aatcatggtc atagctgttt 120
cctgtgttta tccgctcaca attccacaca acatacgagc cggaagcata aag 173
<210> 830
<211> 174
<212> RNA
<213> Zika virus
<400> 830
gacaccggaa cuccacacug gaacaacaaa gaagcacugg uagaguucaa ggacgcacau 60
gccaaaaggc aaacugucgu gguucuaggg agucaagaag gagcaguuca cacggcccuu 120
gcuggagcuc uggaggcuga gauggauggu gcaaagggaa ggcuguccuc uggc 174
<210> 831
<211> 190
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 831
ttaattaaag cgattgatgg tgatactgtt aaattaatgt acaaaggtca accaatgaca 60
ttcagactat tattggttga tacacctgaa acaaagcatc ctaaaaaagg tgtagagaaa 120
tatggtcctg aagcaagtgc atttacgaaa aagatggtag aaaatgcaaa gaaaattgaa 180
gtcgagtttg 190
<210> 832
<211> 190
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 832
ggggaggatg tcgggcgcgc acgttttccc ttcgctgagc acgctgcgcg cgtcgcctac 60
gtgaatgcgc tgttcgatgc gttggccgaa ggcaacccgc gggtgagcgt gctcgacccc 120
tccagcgtgc tctgcgatgg cctggattgt ttcgccgaac gtgatggctg gtcgctgtac 180
atggataaca 190
<210> 833
<211> 173
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 833
ggccagugaa uucgagcucg guacccgggg auccucuaga aauauggauu acuugguaga 60
acagcaaucu acucgaccug caggcaugca agcuuggcgu aaucaugguc auagcuguuu 120
ccuguguuua uccgcucaca auuccacaca acauacgagc cggaagcaua aag 173
<210> 834
<211> 66
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (29)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (31)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (33)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (35)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (37)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (39)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 834
ttcctgtgaa gctaaagaag gagaatgrnr nrnrnrnrnt attgatagca gctgtggcac 60
ctgcac 66
<210> 835
<211> 182
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 835
tgccagttaa cgtcttcctt ctctctctgt catagggact ctggatccca gaaggtgaga 60
aagttaaaat tcccgtcgct atcaagacat ctccgaaagc caacaaggaa atcctcgatg 120
tgagtttctg ctttgctgtg tgggggtcca tggctctgaa cctcaggccc accttttctc 180
at 182
<210> 836
<211> 197
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 836
tgccagttaa cgtcttcctt ctctctctgt catagggact ctggatccca gaaggtgaga 60
aagttaaaat tcccgtcgct atcaaggaat taagagaagc aacatctccg aaagccaaca 120
aggaaatcct cgatgtgagt ttctgctttg ctgtgtgggg gtccatggct ctgaacctca 180
ggcccacctt ttctcat 197
<210> 837
<211> 194
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 837
cctccctcca ggaagcctac gtgatggcca gcgtggacaa cccccacgtg tgccgcctgc 60
tgggcatctg cctcacctcc accgtgcagc tcatcatgca gctcatgccc ttcggctgcc 120
tcctggacta tgtccgggaa cacaaagaca atattggctc ccagtacctg ctcaactggt 180
gtgtgcagat cgca 194
<210> 838
<211> 194
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 838
cctccctcca ggaagcctac gtgatggcca gcgtggacaa cccccacgtg tgccgcctgc 60
tgggcatctg cctcacctcc accgtgcagc tcatcacgca gctcatgccc ttcggctgcc 120
tcctggacta tgtccgggaa cacaaagaca atattggctc ccagtacctg ctcaactggt 180
gtgtgcagat cgca 194
<210> 839
<211> 171
<212> RNA
<213> Leptotrichia wadei
<400> 839
uagguguucc acaggguagc cagcagcauc cugcgaugca aauauggauu acuugguaga 60
acagcaaucu aauccggaac auaauggugc agggcgcuga cuuccgcguu uguuuuaaau 120
caaacacgga aaccgaagac cauucauguu guugcugccg gaagcauaaa g 171
<210> 840
<211> 171
<212> RNA
<213> Prevotella species
<400> 840
uagguguucc acaggguagc cagcagcauc cugcgaugca aauauggauu acuugguaga 60
acagcaaucu aauccggaac auaauggugc agggcgcuga cuuccgcguu ugaaaaaaaa 120
caaacacgga aaccgaagac cauucauguu guugcugccg gaagcauaaa g 171
<210> 841
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 841
gtacatattc aggggccaac ctctc 25
<210> 842
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 842
gaaattaata cgactcacta taggggtaca tattcagggg ccaacctctc 50
<210> 843
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 843
tttctggttc aaagagagct ggtat 25
<210> 844
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 844
tgtacaaagg tcaaccaatg acattcag 28
<210> 845
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 845
gaaattaata cgactcacta tagggtgtac aaaggtcaac caatgacatt cag 53
<210> 846
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 846
tgcacttgct tcaggaccat atttc 25
<210> 847
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 847
ctacgtgaat gcgctgttcg atg 23
<210> 848
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 848
gaaattaata cgactcacta tagggctacg tgaatgcgct gttcgatg 48
<210> 849
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 849
gaaacaatcc aggccatcgc agag 24
<210> 850
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 850
tctggatccc agaaggtgag aaagttaaaa 30
<210> 851
<211> 55
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 851
gaaattaata cgactcacta tagggtctgg atcccagaag gtgagaaagt taaaa 55
<210> 852
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 852
ccacacagca aagcagaaac tcacatcgag 30
<210> 853
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 853
tctggatccc agaaggtgag aaagttaaaa 30
<210> 854
<211> 55
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 854
gaaattaata cgactcacta tagggtctgg atcccagaag gtgagaaagt taaaa 55
<210> 855
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 855
ccacacagca aagcagaaac tcacatcgag 30
<210> 856
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 856
agggccgcca ctccaccggc ggcatggatg ag 32
<210> 857
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 857
gaaattaata cgactcacta tagggagggc cgccactcca ccggcggcat ggatgag 57
<210> 858
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 858
gaagagttct tcacctttac tcacggatcc tcc 33
<210> 859
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 859
ccacactgga acaacaaaga agcac 25
<210> 860
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 860
gaaattaata cgactcacta tagggccaca ctggaacaac aaagaagcac 50
<210> 861
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 861
acagccttcc ctttgcacca tccatctcag 30
<210> 862
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 862
atagtcccct cggcgaacat ggacccctac aa 32
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<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 863
gaaattaata cgactcacta tagggatagt cccctcggcg aacatggacc cctacaa 57
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<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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gagtacgtcc gcttcaccgg ctacccctgc tc 32
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<212> DNA
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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atcctctaga aatatggatt acttggtaga acag 34
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<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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aattctaata cgactcacta tagggatcct ctagaaatat ggattacttg gtagaacag 59
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<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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gataaacaca ggaaacagct atgaccatga ttacg 35
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<212> DNA
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ccccacgtgt gccgcctgct gggcatctgc 30
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<212> DNA
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<220>
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gaaattaata cgactcacta tagggcccca cgtgtgccgc ctgctgggca tctgc 55
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<211> 30
<212> DNA
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<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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atattgtctt tgtgttcccg gacatagtcc 30
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<212> RNA
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<220>
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aauggcaaau ggca 14
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<212> DNA
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<220>
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<223> RNA nucleotide
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ttcctgtgaa gctaaagaag gagaatgnnn nnntattgat agcagctgtg gcacctgcac 60
60
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<220>
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cucccuaaua acaauuuaua acuauuccua cccuuuccca aaaaaa 46
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<222> (47)
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agagcatcac catgatcctg uuuuuuuutg ctcggatatc tcgacta 47
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<212> RNA
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<220>
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cccccccccc cc 12
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<220>
<221> misc_feature
<222> (12)
<223> 3' biotin tag
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acacacacac ac 12
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<211> 1175
<212> PRT
<213> Porphyromonas gulae
<400> 878
Met Thr Glu Gln Ser Glu Arg Pro Tyr Asn Gly Thr Tyr Tyr Thr Leu
1 5 10 15
Glu Asp Lys His Phe Trp Ala Ala Phe Leu Asn Leu Ala Arg His Asn
20 25 30
Ala Tyr Ile Thr Leu Thr His Ile Asp Arg Gln Leu Ala Tyr Ser Lys
35 40 45
Ala Asp Ile Thr Asn Asp Gln Asp Val Leu Ser Phe Lys Ala Leu Trp
50 55 60
Lys Asn Phe Asp Asn Asp Leu Glu Arg Lys Ser Arg Leu Arg Ser Leu
65 70 75 80
Ile Leu Lys His Phe Ser Phe Leu Glu Gly Ala Ala Tyr Gly Lys Lys
85 90 95
Leu Phe Glu Ser Lys Ser Ser Gly Asn Lys Ser Ser Lys Asn Lys Glu
100 105 110
Leu Thr Lys Lys Glu Lys Glu Glu Leu Gln Ala Asn Ala Leu Ser Leu
115 120 125
Asp Asn Leu Lys Ser Ile Leu Phe Asp Phe Leu Gln Lys Leu Lys Asp
130 135 140
Phe Arg Asn Tyr Tyr Ser His Tyr Arg His Ser Gly Ser Ser Glu Leu
145 150 155 160
Pro Leu Phe Asp Gly Asn Met Leu Gln Arg Leu Tyr Asn Val Phe Asp
165 170 175
Val Ser Val Gln Arg Val Lys Ile Asp His Glu His Asn Asp Glu Val
180 185 190
Asp Pro His Tyr His Phe Asn His Leu Val Arg Lys Gly Lys Lys Asp
195 200 205
Arg Tyr Gly His Asn Asp Asn Pro Ser Phe Lys His His Phe Val Asp
210 215 220
Gly Glu Gly Met Val Thr Glu Ala Gly Leu Leu Phe Phe Val Ser Leu
225 230 235 240
Phe Leu Glu Lys Arg Asp Ala Ile Trp Met Gln Lys Lys Ile Arg Gly
245 250 255
Phe Lys Gly Gly Thr Glu Thr Tyr Gln Gln Met Thr Asn Glu Val Phe
260 265 270
Cys Arg Ser Arg Ile Ser Leu Pro Lys Leu Lys Leu Glu Ser Leu Arg
275 280 285
Met Asp Asp Trp Met Leu Leu Asp Met Leu Asn Glu Leu Val Arg Cys
290 295 300
Pro Lys Pro Leu Tyr Asp Arg Leu Arg Glu Asp Asp Arg Ala Cys Phe
305 310 315 320
Arg Val Pro Val Asp Ile Leu Pro Asp Glu Asp Asp Thr Asp Gly Gly
325 330 335
Gly Glu Asp Pro Phe Lys Asn Thr Leu Val Arg His Gln Asp Arg Phe
340 345 350
Pro Tyr Phe Ala Leu Arg Tyr Phe Asp Leu Lys Lys Val Phe Thr Ser
355 360 365
Leu Arg Phe His Ile Asp Leu Gly Thr Tyr His Phe Ala Ile Tyr Lys
370 375 380
Lys Met Ile Gly Glu Gln Pro Glu Asp Arg His Leu Thr Arg Asn Leu
385 390 395 400
Tyr Gly Phe Gly Arg Ile Gln Asp Phe Ala Glu Glu His Arg Pro Glu
405 410 415
Glu Trp Lys Arg Leu Val Arg Asp Leu Asp Tyr Phe Glu Thr Gly Asp
420 425 430
Lys Pro Tyr Ile Ser Gln Thr Ser Pro His Tyr His Ile Glu Lys Gly
435 440 445
Lys Ile Gly Leu Arg Phe Met Pro Glu Gly Gln His Leu Trp Pro Ser
450 455 460
Pro Glu Val Gly Thr Thr Arg Thr Gly Arg Ser Lys Tyr Ala Gln Asp
465 470 475 480
Lys Arg Leu Thr Ala Glu Ala Phe Leu Ser Val His Glu Leu Met Pro
485 490 495
Met Met Phe Tyr Tyr Phe Leu Leu Arg Glu Lys Tyr Ser Glu Glu Val
500 505 510
Ser Ala Glu Arg Val Gln Gly Arg Ile Lys Arg Val Ile Glu Asp Val
515 520 525
Tyr Ala Val Tyr Asp Ala Phe Ala Arg Asp Glu Ile Asn Thr Arg Asp
530 535 540
Glu Leu Asp Ala Cys Leu Ala Asp Lys Gly Ile Arg Arg Gly His Leu
545 550 555 560
Pro Arg Gln Met Ile Ala Ile Leu Ser Gln Glu His Lys Asp Met Glu
565 570 575
Glu Lys Ile Arg Lys Lys Leu Gln Glu Met Met Ala Asp Thr Asp His
580 585 590
Arg Leu Asp Met Leu Asp Arg Gln Thr Asp Arg Lys Ile Arg Ile Gly
595 600 605
Arg Lys Asn Ala Gly Leu Pro Lys Ser Gly Val Ile Ala Asp Trp Leu
610 615 620
Val Arg Asp Met Met Arg Phe Gln Pro Val Ala Lys Asp Ala Ser Gly
625 630 635 640
Lys Pro Leu Asn Asn Ser Lys Ala Asn Ser Thr Glu Tyr Arg Met Leu
645 650 655
Gln Arg Ala Leu Ala Leu Phe Gly Gly Glu Lys Glu Arg Leu Thr Pro
660 665 670
Tyr Phe Arg Gln Met Asn Leu Thr Gly Gly Asn Asn Pro His Pro Phe
675 680 685
Leu His Glu Thr Arg Trp Glu Ser His Thr Asn Ile Leu Ser Phe Tyr
690 695 700
Arg Ser Tyr Leu Arg Ala Arg Lys Ala Phe Leu Glu Arg Ile Gly Arg
705 710 715 720
Ser Asp Arg Val Glu Asn Arg Pro Phe Leu Leu Leu Lys Glu Pro Lys
725 730 735
Thr Asp Arg Gln Thr Leu Val Ala Gly Trp Lys Gly Glu Phe His Leu
740 745 750
Pro Arg Gly Ile Phe Thr Glu Ala Val Arg Asp Cys Leu Ile Glu Met
755 760 765
Gly His Asp Glu Val Ala Ser Tyr Lys Glu Val Gly Phe Met Ala Lys
770 775 780
Ala Val Pro Leu Tyr Phe Glu Arg Ala Cys Glu Asp Arg Val Gln Pro
785 790 795 800
Phe Tyr Asp Ser Pro Phe Asn Val Gly Asn Ser Leu Lys Pro Lys Lys
805 810 815
Gly Arg Phe Leu Ser Lys Glu Glu Arg Ala Glu Glu Trp Glu Arg Gly
820 825 830
Lys Glu Arg Phe Arg Asp Leu Glu Ala Trp Ser Tyr Ser Ala Ala Arg
835 840 845
Arg Ile Glu Asp Ala Phe Ala Gly Ile Glu Tyr Ala Ser Pro Gly Asn
850 855 860
Lys Lys Lys Ile Glu Gln Leu Leu Arg Asp Leu Ser Leu Trp Glu Ala
865 870 875 880
Phe Glu Ser Lys Leu Lys Val Arg Ala Asp Arg Ile Asn Leu Ala Lys
885 890 895
Leu Lys Lys Glu Ile Leu Glu Ala Gln Glu His Pro Tyr His Asp Phe
900 905 910
Lys Ser Trp Gln Lys Phe Glu Arg Glu Leu Arg Leu Val Lys Asn Gln
915 920 925
Asp Ile Ile Thr Trp Met Met Cys Arg Asp Leu Met Glu Glu Asn Lys
930 935 940
Val Glu Gly Leu Asp Thr Gly Thr Leu Tyr Leu Lys Asp Ile Arg Pro
945 950 955 960
Asn Val Gln Glu Gln Gly Ser Leu Asn Val Leu Asn Arg Val Lys Pro
965 970 975
Met Arg Leu Pro Val Val Val Tyr Arg Ala Asp Ser Arg Gly His Val
980 985 990
His Lys Glu Glu Ala Pro Leu Ala Thr Val Tyr Ile Glu Glu Arg Asp
995 1000 1005
Thr Lys Leu Leu Lys Gln Gly Asn Phe Lys Ser Phe Val Lys Asp Arg
1010 1015 1020
Arg Leu Asn Gly Leu Phe Ser Phe Val Asp Thr Gly Gly Leu Ala Met
1025 1030 1035 1040
Glu Gln Tyr Pro Ile Ser Lys Leu Arg Val Glu Tyr Glu Leu Ala Lys
1045 1050 1055
Tyr Gln Thr Ala Arg Val Cys Val Phe Glu Leu Thr Leu Arg Leu Glu
1060 1065 1070
Glu Ser Leu Leu Thr Arg Tyr Pro His Leu Pro Asp Glu Ser Phe Arg
1075 1080 1085
Glu Met Leu Glu Ser Trp Ser Asp Pro Leu Leu Ala Lys Trp Pro Glu
1090 1095 1100
Leu His Gly Lys Val Arg Leu Leu Ile Ala Val Arg Asn Ala Phe Ser
1105 1110 1115 1120
His Asn Gln Tyr Pro Met Tyr Asp Glu Ala Val Phe Ser Ser Ile Arg
1125 1130 1135
Lys Tyr Asp Pro Ser Ser Pro Asp Ala Ile Glu Glu Arg Met Gly Leu
1140 1145 1150
Asn Ile Ala His Arg Leu Ser Glu Glu Val Lys Gln Ala Lys Glu Thr
1155 1160 1165
Val Glu Arg Ile Ile Gln Ala
1170 1175
Claims (75)
- 제 1 말단부를 포함하는 기판을 포함하는 측류 장치로서, 여기서 제 1 말단부는 샘플 로딩 부분 및 검출가능한 리간드, CRISPR 이펙터 시스템, 검출 구성체, 제 1 결합제를 포함하는 제 1 포획 영역, 및 제 2 결합제를 포함하는 제 2 포획 영역이 로딩된 제 1 영역을 포함하고, 여기서 CRISPR 이펙터 시스템은 CRISPR 이펙터 단백질 및 하나 이상의 가이드 서열을 포함하며, 각각의 가이드 서열은 하나 이상의 표적 분자에 결합하도록 구성되는, 측류 장치.
- 제 1 항에 있어서, 검출 구성체가 제 1 말단부에 제 1 분자 및 제 2 말단부에 제 2 분자를 갖는, RNA 또는 DNA 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 측류 장치.
- 제 1 항에 있어서, 샘플 로딩 부분이 하나 이상의 표적 분자를 증폭시키기 위한 하나 이상의 증폭 시약을 추가로 포함하는, 측류 장치.
- 제 3 항에 있어서, 하나 이상의 표적 RNA 분자를 증폭시키기 위한 시약이 핵산 서열-기반 증폭 (NASBA), 리콤비나아제 폴리머라아제 증폭 (RPA), 루프-매개 등온 증폭 (LAMP), 가닥 전위 증폭 (SDA), 헬리카제-의존적 증폭 (HDA), 닉킹 효소 증폭 반응 (NEAR), PCR, 다중 전위 증폭 (MDA), 롤링 써클 증폭 (RCA), 리가제 연쇄 반응 (LCR), 또는 세분화 증폭 방법 (RAM)을 포함하는, 측류 장치.
- 제 2 항에 있어서, 제 1 분자가 FITC이고 제 2 분자가 비오틴이거나 그 반대인, 측류 장치.
- 제 5 항에 있어서, 제 1 포획 영역이 샘플 로딩 부분과 측류 기판의 동일한 말단부에 근접하고 그 위에 있는, 측류 장치.
- 제 5 항에 있어서, 제 1 포획 영역이 리포터 구성체의 제 1 분자에 특이적으로 결합하는 제 1 결합제를 포함하는, 측류 장치.
- 제 7 항에 있어서, 제 1 결합제가 제 1 포획 영역에 고정되거나 다르게는 부동화된 항체인, 측류 장치.
- 제 1 항에 있어서, 제 2 포획 영역이 제 1 결합 영역으로부터 측류 기판의 반대 말단부를 향해 위치하는, 측류 장치.
- 제 9 항에 있어서, 제 2 포획 영역이 리포터 구성체, 또는 검출가능한 리간드의 제 2 분자에 특이적으로 결합하는 제 2 결합제를 포함하는, 측류 장치.
- 제 10 항에 있어서, 제 2 결합제가 제 2 포획 영역에 고정되거나 다르게는 부동화된 항체 또는 항체-결합 단백질인, 측류 장치.
- 제 1 항에 있어서, 검출가능한 리간드가 금 나노입자인, 측류 장치.
- 제 12 항에 있어서, 금 나노입자가 검출 구성체의 제 2 분자에 특이적으로 결합하는 결합제로 변형되는, 측류 장치.
- 제 13 항에 있어서, 제 1 항체가 항-FITC 항체인, 측류 장치.
- 제 8 항에 있어서, 항체가 항-FITC 항체인, 측류 장치.
- 제 8 항에 있어서, 항체가 항-비오틴 항체인, 측류 장치.
- 제 1 항에 있어서, 기판이 가요성 재료 기판인, 측류 장치.
- 제 1 항에 있어서, 가요성 재료 기판이 종이 기판 또는 가요성 중합체 기반 기판인, 측류 장치.
- 제 18 항에 있어서, CRISPR 이펙터 단백질이 RNA-표적화 이펙터 단백질, DNA-표적화 단백질 또는 이의 조합인, 측류 장치.
- 제 19 항에 있어서, RNA-표적화 이펙터 단백질이 Cas13 인, 측류 장치.
- 제 20 항에 있어서, Cas13 이펙터 단백질이 하기로 이루어지는 군에서 선택된 속의 유기체로부터 유래되는, 측류 장치: 렙토트리키아 (Leptotrichia), 리스테리아 (Listeria), 코리네박터 (Corynebacter), 수테렐라 (Sutterella), 레지오넬라 (Legionella), 트레포네마 (Treponema), 필리팍토르 (Filifactor), 유박테리움 (Eubacterium), 스트렙토코커스 (Streptococcus), 락토바실러스 (Lactobacillus), 마이코플라스마 (Mycoplasma), 박테로이데스 (Bacteroides), 플라비이볼라 (Flaviivola), 플라보박테리움 (Flavobacterium), 스파에로차에타 (Sphaerochaeta), 아조스피릴럼 (Azospirillum), 글루콘아세토박터 (Gluconacetobacter), 네이세리아 (Neisseria), 로세부리아 (Roseburia), 파르비바큘럼 (Parvibaculum), 스타필로코커스 (Staphylococcus), 니트라티프락토 (Nitratifractor), 마이코플라스마 (Mycoplasma), 캄필로박터 (Campylobacter), 및 라크노스피라 (Lachnospira).
- 제 21 항에 있어서, Cas13 이펙터 단백질이 하기로 이루어지는 군에서 선택된 유기체로부터 유래되는, 측류 장치: 렙토트리키아 샤히; 렙토트리키아 웨이데이 (Lw2); 리스테리아 실리게리; 라크노스피라과 박테리아 MA2020; 라크노스피라과 박테리아 NK4A179; [클로스트리듐] 아미노필럼 DSM 10710; 카르노박테리움 갈리나럼 DSM 4847; 카르노박테리움 갈리나럼 DSM 4847 (제 2 CRISPR 유전자좌); 팔루디박터 프로피오니시게네스 WB4; 리스테리아 웨이헨스테파넨시스 FSL R9-0317; 리스테리아과 박테리아 FSL M6-0635; 렙토트리키아 웨이데이 F0279; 로도박터 캡슐라터스 SB 1003; 로도박터 캡슐라터스 R121; 로도박터 캡슐라터스 DE442; 렙토트리키아 부칼리스 C-1013-b; 허르비닉스 헤미셀룰로실리티카; [유박테리움] 렉탈레; 유박테리아과 박테리아 CHKCI004; 블라우티아 sp. 마르세이유-P2398; 및 렙토트리키아 sp. 경구 분류군 879 str. F0557. 12 개의 추가의 비제한적인 예는 다음과 같다: 라크노스피라과 박테리아 NK4A144; 클로로플렉서스 아그레간스; 데메퀴나 아우란티아카; 탈라소스피라 sp. TSL5-1; 슈도부티리비브리오 sp. OR37; 부티리비브리오 sp. YAB3001; 블라우티아 sp. 마르세이유-P2398; 렙토트리키아 sp. 마르세이유-P3007; 박테로이데스 이후아에; 포르피로모나다과 박테리아 KH3CP3RA; 리스테리아 리파리아; 및 인솔리티스피릴럼 페레그리넘.
- 제 22 항에 있어서, C2c2 이펙터 단백질이 L. 웨이데이 (L. wadei) F0279 또는 L. 웨이데이 F0279 (Lw2) C2c2 이펙터 단백질인, 측류 장치.
- 제 19 항에 있어서, DNA-표적화 이펙터 단백질이 Cas12 인, 측류 장치.
- 제 24 항에 있어서, Ca12 가 Cpf1, C2c1, 또는 이의 조합인, 측류 장치.
- 제 1 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 가이드 서열이 질환 상태를 진단하기 위한 것인, 측류 장치.
- 제 26 항에 있어서, 질환 상태가 암인, 측류 장치.
- 제 26 항에 있어서, 질환 상태가 자가면역 질환인, 측류 장치.
- 제 26 항에 있어서, 질환 상태가 감염인, 측류 장치.
- 제 29 항에 있어서, 감염이 바이러스, 박테리아, 진균, 원충, 또는 기생충에 의해 초래되는, 측류 장치.
- 제 30 항에 있어서, 감염이 바이러스 감염인, 측류 장치.
- 제 31 항에 있어서, 바이러스 감염이 DNA 바이러스에 의해 초래되는, 측류 장치.
- 제 32 항에 있어서, DNA 바이러스가 미오바이러스과 (Myoviridae), 포도바이러스과 (Podoviridae), 시포바이러스과 (Siphoviridae), 알로헤르페스바이러스과 (Alloherpesviridae), 헤르페스바이러스과 (Herpesviridae) (인간 헤르페스 바이러스, 및 바리셀라 조스터 바이러스 포함), 말로코헤르페스바이러스과 (Malocoherpesviridae), 리포트릭스바이러스과 (Lipothrixviridae), 루디바이러스과 (Rudiviridae), 아데노바이러스과 (Adenoviridae), 암풀라바이러스과 (Ampullaviridae), 아스코바이러스과 (Ascoviridae), 아스파바이러스과 (Asfarviridae) (아프리카 돼지 열병 바이러스 포함), 배큘로바이러스과 (Baculoviridae), 시카우다바이러스과 (Cicaudaviridae), 클라바바이러스과 (Clavaviridae), 코르티코바이러스과 (Corticoviridae), 푸셀로바이러스과 (Fuselloviridae), 글로불로바이러스과 (Globuloviridae), 구타바이러스과 (Guttaviridae), 히트로사바이러스과 (Hytrosaviridae), 이리도바이러스과 (Iridoviridae), 마세이유바이러스과 (Maseilleviridae), 미미바이러스과 (Mimiviridae), 누디바이러스과 (Nudiviridae), 니마바이러스과 (Nimaviridae), 판도라바이러스과 (Pandoraviridae), 파필로마바이러스과 (Papillomaviridae), 피코드나바이러스과 (Phycodnaviridae), 플라스마바이러스과, 폴리드나바이러스, 폴리오마바이러스과 (Polyomaviridae) (원숭이 바이러스 40, JC 바이러스, BK 바이러스 포함), 폭스바이러스과 (Poxviridae) (우두 및 천연두 포함), 스파에롤리포바이러스과 (Sphaerolipoviridae), 텍티바이러스과 (Tectiviridae), 투리바이러스과 (Turriviridae), 디노드나바이러스, 살터프로바이러스, 리지도바이러스인, 측류 장치.
- 제 31 항에 있어서, 바이러스 감염이 이중-가닥 RNA 바이러스, 포지티브 센스 RNA 바이러스, 네거티브 센스 RNA 바이러스, 레트로바이러스, 또는 이의 조합에 의해 초래되는, 측류 장치.
- 제 34 항에 있어서, 바이러스 감염이 코로나바이러스과 (Coronaviridae) 바이러스, 피코르나바이러스과 (Picornaviridae) 바이러스, 칼리시바이러스과 (Caliciviridae) 바이러스, 플라비바이러스과 (Flaviviridae) 바이러스, 토가바이러스과 (Togaviridae) 바이러스, 보르나바이러스과 (Bornaviridae), 필로바이러스과 (Filoviridae), 파라믹소바이러스과 (Paramyxoviridae), 뉴모바이러스과 (Pneumoviridae), 라브도바이러스과 (Rhabdoviridae), 아레나바이러스과 (Arenaviridae,), 부니아바이러스과 (Bunyaviridae), 오르쏘믹소바이러스과 (Orthomyxoviridae), 또는 델타바이러스에 의해 초래되는, 측류 장치.
- 제 35 항에 있어서, 바이러스 감염이 코로나바이러스, SARS, 폴리오바이러스, 리노바이러스, A형 간염 바이러스, 노르워크 바이러스, 황열병 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, C형 간염 바이러스, 뎅기열 바이러스, 지카 바이러스, 루벨라 바이러스, 로스 리버 바이러스, 신드비스 바이러스, 치쿤구니아 바이러스, 보르나병 바이러스, 에볼라 바이러스, 마르부르그 바이러스, 홍역 바이러스, 유행성 이하선염 바이러스, 니파바이러스, 헨드라 바이러스, 뉴캐슬병 바이러스, 인간 호흡기 세포융합 바이러스, 공수병 바이러스, 라싸 바이러스, 한타바이러스, 크림-콩고 출혈열 바이러스, 인플루엔자, 또는 D형 간염 바이러스에 의해 초래되는, 측류 장치.
- 제 30 항에 있어서, 감염이 박테리아 감염인, 측류 장치.
- 제 37 항에 있어서, 박테리아 감염을 초래하는 박테리아가 아시네토박터 (Acinetobacter) 종, 악티노바실러스 (Actinobacillus) 종, 악티노마이세테스 (Actinomycetes) 종, 악티노마이세스 (Actinomyces) 종, 애로코커스 (Aerococcus) 종, 애로모나스 (Aeromonas) 종, 아나플라스마 (Anaplasma) 종, 알칼리게네스 (Alcaligenes) 종, 바실러스 (Bacillus) 종, 박테리오데스 (Bacteriodes) 종, 바르토넬라 (Bartonella) 종, 비피도박테리움 (Bifidobacterium) 종, 보르데텔라 (Bordetella) 종, 보렐리아 (Borrelia) 종, 브루셀라 (Brucella) 종, 버크홀데리아 (Burkholderia) 종, 캄필로박터 (Campylobacter) 종, 카프노사이토파가 (Capnocytophaga) 종, 클라미디아 (Chlamydia) 종, 시트로박터 (Citrobacter) 종, 콕시엘라 (Coxiella) 종, 코린박테리움 (Corynbacterium) 종, 클로스트리듐 (Clostridium) 종, 에이케넬라 (Eikenella) 종, 엔테로박터 (Enterobacter) 종, 에스케리치아 (Escherichia) 종, 엔테로코커스 (Enterococcus) 종, 엘리키아 (Ehlichia) 종, 에피더모피톤 (Epidermophyton) 종, 에리시펠로트릭스 (Erysipelothrix) 종, 유박테리움 (Eubacterium) 종, 프란시셀라 (Francisella) 종, 푸소박테리움 (Fusobacterium) 종, 가드네렐라 (Gardnerella) 종, 제멜라 (Gemella) 종, 헤모필러스 (Haemophilus) 종, 헬리코박터 (Helicobacter) 종, 킨겔라 (Kingella) 종, 클렙시엘라 (Klebsiella) 종, 락토바실러스 (Lactobacillus) 종, 락토코커스 (Lactococcus) 종, 리스테리아 (Listeria) 종, 렙토스피라 (Leptospira) 종, 레지오넬라 (Legionella) 종, 렙토스피라 (Leptospira) 종, 류코노스토크 (Leuconostoc) 종, 만헤이미아 (Mannheimia) 종, 마이코스포럼 (Microsporum) 종, 마이크로코커스 (Micrococcus) 종, 모라셀라 (Moraxella) 종, 모르가넬 (Morganell) 종, 모빌룬커스 (Mobiluncus) 종, 마이크로코커스 (Micrococcus) 종, 마이코박테리움 (Mycobacterium) 종, 마이코플라즘 (Mycoplasm) 종, 노카르디아 (Nocardia) 종, 네이세리아 (Neisseria) 종, 파스퇴렐라 (Pasteurelaa) 종, 페디오코커스 (Pediococcus) 종, 펩토스트렙토코커스 (Peptostreptococcus) 종, 피티로스포럼 (Pityrosporum) 종, 플레시오모나스 (Plesiomonas) 종, 프레보텔라 (Prevotella) 종, 포르피로모나스 (Porphyromonas) 종, 프로테우스 (Proteus) 종, 프로비덴시아 (Providencia) 종, 슈도모나스 (Pseudomonas) 종, 프로피오니박테리움 (Propionibacteriums) 종, 로도코커스 (Rhodococcus) 종, 리케치아 (Rickettsia) 종, 로도코커스 (Rhodococcus) 종, 세라티아 (Serratia) 종, 스테노트로포모나스 (Stenotrophomonas) 종, 살모넬라 (Salmonella) 종, 세라티아 (Serratia) 종, 시겔라 (Shigella) 종, 스타필로코커스 (Staphylococcus) 종, 스트렙토코커스 (Streptococcus) 종, 스피릴럼 (Spirillum) 종, 스트렙토바실러스 (Streptobacillus) 종, 트레포네마 (Treponema) 종, 트로페리마 (Tropheryma) 종, 트리코피톤 (Trichophyton) 종, 우레아플라즈마 (Ureaplasma) 종, 베일로넬라 (Veillonella) 종, 비브리오 (Vibrio) 종, 여시니아 (Yersinia) 종, 잔토모나스 (Xanthomonas) 종, 또는 이의 조합인, 측류 장치.
- 제 30 항에 있어서, 감염이 진균에 의해 초래되는, 측류 장치.
- 제 39 항에 있어서, 진균이 아스퍼질러스 (Aspergillus), 블라스토마이세스 (Blastomyces), 칸디다증 (Candidiasis), 콕시디오이데스 진균증 (Coccidiodomycosis), 크립토코커스 네오포르만스 (Cryptococcus neoformans), 크립토코커스 가티 (Cryptococcus gatti), sp. 히스토플라즈마 (Histoplasma) sp. (예컨대, 히스토플라즈마 캅슐라텀 (Histoplasma capsulatum)), 뉴모시스티스 (Pneumocystis) sp. (예컨대 뉴모시스티스 지로베시 (Pneumocystis jirovecii)), 스타키보트리스 (Stachybotrys) (예컨대 스타키보트리스 카르타럼 (Stachybotrys chartarum)), 모균증 (Mucroymcosis), 스포로트릭스 (Sporothrix), 진균성 안구 감염 백선, 엑세로힐럼 (Exserohilum), 클라도스포리움 (Cladosporium), 제오트리컴 (Geotrichum), 사카로마이세스 (Saccharomyces), 한세눌라 (Hansenula) 종, 칸디다 (Candida) 종, 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces) 종, 데바리오마이세스 (Debaryomyces) 종, 피키아 (Pichia) 종, 페니실리움 (Penicillium) 종, 클라도스포리움 (Cladosporium) 종, 비쏘클라미스 (Byssochlamys) 종 또는 이의 조합인, 측류 장치.
- 제 30 항에 있어서, 감염이 원충에 의해 초래되는, 측류 장치.
- 제 41 항에 있어서, 원충이 유글레노조아 (Euglenozoa), 헤테롤로보세아 (Heterolobosea), 디플로모나디다 (Diplomonadida), 아메보조아 (Amoebozoa), 블라스토시스틱 (Blastocystic), 아피콤플렉사 (Apicomplexa), 또는 이의 조합인, 측류 장치.
- 제 30 항에 있어서, 감염이 기생충에 의해 초래되는, 측류 장치.
- 제 43 항에 있어서, 기생충이 트리파노소마 크루지 (Trypanosoma cruzi) (샤가스병), T. 브루세이 감비엔스 (T. brucei gambiense), T. 브루세이 로데시엔스 (T. brucei rhodesiense), 리슈마니아 브라질리엔시스 (Leishmania braziliensis), L. 인판텀 (L. infantum), L. 멕시카나 (L. mexicana), L. 마조르 (L. major), L. 트로피카 (L. tropica), L. 도노바니 (L. donovani), 내글레리아 파울러리 (Naegleria fowleri), 지아르디아 인테스티날리스 (Giardia intestinalis) (G. 람블리아 (G. lamblia), G. 두오데날리스 (G. duodenalis)), 칸타메바 카스텔라니 (Canthamoeba castellanii), 발라무티아 마드릴라리스 (Balamuthia madrillaris), 엔타메바 히스톨리티카 (Entamoeba histolytica), 블라스토시스틱 호미니스 (Blastocystic hominis), 바베시아 미크로티 (Babesia microti), 클립토스포리듐 파르븀 (Cryptosporidium parvum), 시클로스포라 카이에타넨시스 (Cyclospora cayetanensis), 플라스모듐 팔시파럼 (Plasmodium falciparum), P. 비박스 (P. vivax), P. 오발레 (P. ovale), P. 말라리아에 (P. malariae), 및 톡소플라즈마 곤디 (Toxoplasma gondii) 또는 이의 조합인, 측류 장치.
- 제 1 항에 있어서, 샘플이 생물학적 샘플 또는 환경 샘플인, 측류 장치.
- 제 45 항에 있어서, 생물학적 샘플이 혈액, 혈장, 혈청, 소변, 대변, 객담, 점액, 림프액, 활액, 담즙, 복수, 흉수, 장액종, 타액, 뇌척수액, 안방수 또는 유리체액, 또는 임의의 신체 분비액, 여출액, 삼출액 (예를 들어, 농양 또는 임의의 다른 감염 또는 염증 부위로부터 얻은 체액), 또는 관절 (예를 들어, 정상 관절, 또는 류마티스성 관절염, 골관절염, 통풍성 또는 화농성 관절염과 같은 질환을 앓는 관절)로부터 얻은 체액, 또는 피부 또는 점막 표면의 스왑 (swab) 인, 측류 장치.
- 제 45 항에 있어서, 환경 샘플이 음식물 샘플, 종이 표면, 패브릭, 금속 표면, 목재 표면, 플라스틱 표면, 토양 샘플, 담수 샘플, 폐수 샘플, 염수 샘플, 또는 이의 조합으로부터 수득되는, 측류 장치.
- 제 31 항에 있어서, 질환 상태가 감염, 장기 질환, 혈액 질환, 면역계 질환, 암, 뇌 및 신경계 질환, 내분비 질환, 임신 또는 출산 관련 질환, 유전 질환, 또는 환경적-획득 질환인, 측류 장치.
- 제 26 항에 있어서, 상기 질환 상태가 바람직하게는 병원체 또는 세포 중에, 항생제 또는 약제 내성 또는 감수성 유전자 또는 전사물 또는 폴리펩티드의 존재 또는 부재를 특징으로 하는, 측류 장치.
- 제 49 항에 있어서, 하나 이상의 가이드 분자가 생물학적 재료를 확인하는, 측류 장치.
- 제 50 항에 있어서, 생물학적 재료가 유전적으로 개질된 재료인, 측류 장치.
- 제 51 항에 있어서, 유전적으로 개질된 재료가 유전적으로 개질된 식물인, 측류 장치.
- 제 2 항에 있어서, 제 1 분자가 FITC 이고 제 2 분자가 FAM 인, 측류 장치.
- 제 35 항에 있어서, 바이러스 감염이 뎅기열 바이러스에 의해 초래되는, 측류 장치.
- 제 1 말단부를 포함하는 기판을 포함하는 측류 장치로서, 여기서 제 1 말단부는 샘플 로딩 부분 및 검출가능한 리간드, 2 개 이상의 CRISPR 이펙터 시스템, 2 개 이상의 검출 구성체, 각각 제 1 결합제를 포함하는 하나 이상의 제 1 포획 영역, 각각 제 2 결합제를 포함하는 2 개 이상의 제 2 포획 영역이 로딩된 제 1 영역을 포함하고, 여기서 2 개 이상의 CRISPR 이펙터 시스템 각각은 CRISPR 이펙터 단백질 및 하나 이상의 가이드 서열을 포함하며, 각각의 가이드 서열은 하나 이상의 표적 분자에 결합하도록 구성되는, 측류 장치.
- 제 55 항에 있어서, 2 개 이상의 검출 구성체 각각은 제 1 말단부에 제 1 분자 및 제 2 말단부에 제 2 분자를 갖는, RNA 또는 DNA 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 측류 장치.
- 제 56 항에 있어서, 2 개의 CRISPR 이펙터 시스템 및 2 개의 검출 구성체를 포함하는, 측류 장치.
- 제 56 항에 있어서, 4 개의 CRISPR 이펙터 시스템 및 4 개의 검출 구성체를 포함하는, 측류 장치.
- 제 55 항에 있어서, 샘플 로딩 부분이 하나 이상의 표적 분자를 증폭시키기 위한 하나 이상의 증폭 시약을 추가로 포함하는, 측류 장치.
- 제 57 항에 있어서, 제 1 검출 구성체는 제 1 분자로서 FAM 및 제 2 분자로서 비오틴을, 또는 그 반대를 포함하고, 제 2 검출 구성체는 제 1 분자로서 FAM 및 제 2 분자로서 디곡시제닌 (DIG), 또는 그 반대를 포함하는, 측류 장치.
- 제 60 항에 있어서, CRISPR 이펙터 단백질이 RNA-표적화 이펙터 단백질인, 측류 장치.
- 제 61 항에 있어서, RNA-표적화 이펙터 단백질이 C2c2 인, 측류 장치.
- 제 19 항에 있어서, RNA-표적화 이펙터 단백질이 Cas13b 인, 측류 장치.
- 제 58 항에 있어서, 제 1 검출 구성체는 제 1 분자로서 Tye665 및 제 2 분자로서 Alexa-fluor-488 을, 또는 그 반대를 포함하고; 제 2 검출 구성체는 제 1 분자로서 Tye665 및 제 2 분자로서 FAM 을, 또는 그 반대를 포함하고; 제 3 검출 구성체는 제 1 분자로서 Tye665 및 제 2 분자로서 비오틴을, 또는 그 반대를 포함하고; 제 4 검출 구성체는 제 1 분자로서 Tye665 및 제 2 분자로서 DIG 를, 또는 그 반대를 포함하는, 측류 장치.
- 제 64 항에 있어서, CRISPR 이펙터 단백질이 RNA-표적화 또는 DNA-표적화 이펙터 단백질인, 측류 장치.
- 제 65 항에 있어서, RNA 표적화 이펙터가 C2c2 인, 측류 장치.
- 제 65 항에 있어서, RNA 표적화 이펙터가 Cas13b 인, 측류 장치.
- 제 65 항에 있어서, DNA-표적화 이펙터 단백질이 Cas12a 인, 측류 장치.
- 샘플을 샘플 로딩 부분을 포함하는 제 1 항 내지 제 53 항 중 어느 한 항에 따른 측류 장치의 제 1 말단부와 접촉시키는 단계를 포함하는, 샘플에서 표적 핵산을 검출하는 방법으로서; 샘플은 기판의 샘플 로딩 부분으로부터 제 1 및 제 2 포획 영역을 향해 흐르고 검출가능한 신호를 생성하는, 검출 방법.
- 제 54 항에 있어서, 샘플이 액체 샘플이거나, 샘플이 수성 용매에 용해된, 검출 방법.
- 제 54 항에 있어서, 샘플이 표적 핵산을 함유하지 않는, 검출 방법.
- 제 56 항에 있어서, 검출가능한 신호가 제 1 포획 영역에서 나타나는, 검출 방법.
- 제 54 항에 있어서, 샘플이 표적 핵산을 함유하는, 검출 방법.
- 제 58 항에 있어서, 검출가능한 신호가 제 2 포획 영역에서 나타나는, 검출 방법.
- 제 58 항 또는 제 59 항에 있어서, 표적 핵산의 존재가 질환 상태의 지표인, 검출 방법.
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