KR20200066613A - 치료 방법 - Google Patents

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조지나 제인 클라크
에드워드 알란 아바디르
신셩 주
지두어 리
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키라 바이오테크 피티와이 리미티드
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Abstract

본 발명은 대상체에서 림프종을 치료하는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 호지킨 림프종 (HL) 및 비-호지킨 림프종 (NHL)을 치료하기 위한 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 유효량의 CD83 결합 단백질을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 본 발명은 또한 대상체에서 림프종을 진단하고 평가하는 방법에 관한 것이다.

Description

치료 방법
본 발명은 대상체에서 림프종의 치료 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 호지킨 림프종 (HL) 그리고 미만성 대 B-세포 림프종 (DLBCL) 및 맨틀 세포 림프종 (MCL)과 같은 비-호지킨 림프종 (NHL)의 치료방법에 관한 것이다.
림프종은 림프구에서 발생하는 혈액 세포 종양이다. 림프종의 두 가지 주요 범주는 HL과 NHL이다.
HL은 호지킨 및 리드-스텐버그 세포 (HRS)로 인한 혈액 악성 종양이고, NHL에는 HL을 제외한 모든 림프종이 포함된다. 현재, HL을 앓고있는 환자는 다중 제제 화학 요법 및 방사선 요법으로 치료된다. HL에 대한 현재의 치료법은 상당한 성공률을 갖지만, 환자의 25%는 1차 또는 2차 화학 요법으로 다루기 힘들 때 질환 재발을 경험하고, 특히 이러한 요법을 견딜 수 없는 노인 환자에서 생존율이 상당히 낮다. NHL 치료요법은 HL 치료요법보다 성공률이 낮다. NHL 환자 2명 당 거의 1명이 DLBCL 형태의 림프종을 가지며, 5-10%가 MCL을 가질 것이다.
림프종 치료, 특히 위험 특성이 낮은 환자의 경우 새로운 표적 요법이 여전히 필요하다.
본 발명의 제 1 측면은 대상체에게 유효량의 CD83 결합 단백질을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 림프종을 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명의 대안적인 제 1 측면은 대상체에서 림프종을 치료하기 위한 의약의 제조에서 CD83 결합 단백질의 용도; 또는 대상체에서 림프종을 치료 또는 예방하는데 사용하기 위한 CD83 결합 단백질을 제공한다.
본 발명의 제 2 측면은 대상에게 유효량의 CD83 결합 단백질을 투여하는 단계를 포함하여 대상에서 HL을 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명의 대안적인 제 2 측면은 대상체에서 HL을 치료하기 위한 의약의 제조에서 CD83 결합 단백질의 사용; 또는 대상체에서 HL을 치료하는데 사용하기 위한 CD83 결합 단백질을 제공한다.
본 발명의 제 3 측면은 대상에게 유효량의 CD83 결합 단백질을 투여하는 것을 포함하는, 대상에서의 NHL의 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 대안적인 제 3 측면은 대상체에서 NHL을 치료하기 위한 의약의 제조에서 CD83 결합 단백질의 사용; 또는 대상체에서 NHL을 치료하는데 사용하기 위한 CD83 결합 단백질을 제공한다.
제 4 측면은 대상체에게 유효량의 CD83 결합 단백질을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 맨틀 세포 림프종 (MCL)을 치료하는 방법을 제공한다.
대안적인 제 4 측면은 대상체에서 MCL을 치료하기 위한 의약의 제조에서 CD83 결합 단백질의 사용; 또는 대상체에서 MCL을 치료하는데 사용하기위한 CD83 결합 단백질을 제공한다.
제 5 측면은 대상체에게 유효량의 CD83 결합 단백질을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 미만성 대 B-세포 림프종 (DLBCL)을 치료하는 방법을 제공한다.
대안적인 제 5 측면은 대상체에서 DLBCL을 치료하기 위한 의약의 제조에서 CD83 결합 단백질의 사용; 또는 대상체에서 DLBCL을 치료하는데 사용하기 위한 CD83 결합 단백질을 제공한다.
제 6 측면은 대상체에게 유효량의 CD83 항체 접합체를 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 DLBCL, MCL 또는 HL을 치료하는 방법을 제공한다.
대안적인 제 6 측면은 대상체에서 DLBCL, MCL 또는 HL을 치료하기위한 의약의 제조에서 CD83 항체 접합체의 사용; 또는 대상체에서 DLBCL, MCL 또는 HL을 치료하는데 사용하기 위한 CD83 항체 접합체를 제공한다.
제 7 측면은 대상체에게 유효량의 CD83 결합 단백질을 투여하는 것을 포함하여 대상체에서 DLBCL, MCL 또는 HL을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서 CD83 결합 단백질은 이중 특이적 T-세포 결합자이다.
대안적인 제 7 측면은 대상체에서 DLBCL, MCL 또는 HL을 치료하기위한 의약의 제조에서 CD83 결합 단백질의 사용을 제공하며, 여기서 CD83 결합 단백질은 이중 특이적 T-세포 결합자 (BiTE)이고; 또는 대상체에서 DLBCL, MCL 또는 HL을 치료하는데 사용하기 위한 CD83 결합 단백질 (여기서 CD83 결합 단백질은 이중 특이적 T-세포 결합자 (BiTE) 임)을 제공한다.
제 8 측면은 대상체에서 DLBCL, MCL 또는 HL을 치료하는 방법을 제공하는데, 이때 CAR T 세포는 CD83 결합 단백질을 포함하는 CAR T 세포의 유효량을 투여하는 단계를 포함한다.
대안적인 제 8 측면은 대상체에서 DLBCL, MCL 또는 HL을 치료하기위한 의약의 제조에서 CD83 결합 단백질을 포함하는 CAR T 세포의 사용; 또는 대상체에서 DLBCL, MCL 또는 HL의 치료에 사용하기 위한 CD83 결합 단백질을 포함하는 CAR-T 세포를 제공한다.
제 9 측면는 CD83이 대상체의 림프구에 의해 발현되는지를 결정하는 것을 포함하는, 대상체에서 림프종을 진단하는 방법을 제공한다.
제 10 측면은 대상체의 혈청에서 가용성 CD83 (sCD83)의 수준을 결정하는 것을 포함하여, 대상체에서 림프종의 중증도 또는 단계를 평가하는 방법을 제공한다.
제 11 측면은 CD83 결합 단백질 및 림프종을 치료하기 위해 CD83 결합 단백질을 사용하기 위한 설명서를 포함하는, 대상체에서 림프종을 치료하기 위한 키트를 제공한다.
도 1은 CD83이 HL 세포주에서 발현됨을 보여준다.
도 1(A)는 각각 HB15a-FITC, HB15e-FITC 또는 3C12C-FITC 항-CD83 mAb으로 염색된 KM-H2, L428 및 HDLM-2 림프종 세포주에서 CD83 발현의 유세포 분석에 의한 분석 결과를 보여주는 막대 그래프이다. 그레이 히스토그램, 이소 타입 대조군; 열린 히스토그램, 항-CD83 항체. CD30 염색은 양성 대조군에 사용하였다. 이 데이터는 비교 결과가 있는 3가지 독립적인 실험을 나타낸다. 도 1(B)는 KM-H2 세포에서 CD15, CD25, CD40 및 CD274 (PD-L1) 발현의 유세포 분석에 의한 분석 결과를 보여주는 막대 그래프이다.
도 2는 HL 환자 및 DLBCL을 갖는 환자의 상당 부분에서 HRS 세포 상에서 CD83이 발현됨을 보여준다.
도 2(A)는 항-CD83 및 항-CD30 항체 (어두운 영역)과 함께 HL의 파라핀 매립 림프절 생검 샘플의 염색을 보여주는 현미경 이미지 (x200 배율)이다. 대표적인 샘플 하나를 나타낸다. 도 2(B)는 항-CD20, 항-CD83 및 항-CD3 항체 (어두운 영역)과 함께 미만성 대 B-세포 림프종 (DLBCL) 환자로부터 파라핀 매립 림프절 생검 샘플의 염색을 보여주는 현미경 이미지 (x200 배율)이다. 도 2(C)는 HL 환자의 HRS 세포에서 CD83 발현 수준의 분석 결과를 보여주는 파이 차트이다 (n=35). 높음: 90% 초과의 HRS 세포에서 CD83 양성; 보통: 10-90% HRS 세포에서 CD83 양성; 낮음: 10% HRS 세포에서 CD83 양성. 도 2(D)는 높은 증폭 (x200 배율)을 갖는 도 2(C)에 언급된 각각의 발현 그룹의 하나의 대표적인 샘플의 이미지이다. 화살표는 CD83을 발현하는 HRS 세포를 나타낸다.
도 3은 HRS 세포에서 T 세포까지의 CD83 분자의 트로고시토시스 (trogocytosis)를 보여준다.
도 3(A)는 건강한 공여 PBMC로부터의 T 세포와 KM-H2 세포를 1:5의 비율로 4시간 동안 공배양한 후 CD3+ T 세포에서의 CD83 발현율을 나타내는 그래프이다. CD3+ T 세포에서의 CD83 발현은 유세포 분석에 의해 분석되었고, 데이터는 5개의 실험으로부터 얻은 것이다. 도 3(B)는 트랜스웰과 함께 또는 트랜스웰없이 4시간 동안 T 세포 및 KM-H2 세포의 공배양 후 CD3+ T 세포에서 CD83 발현을 보여주는 플롯이다. T 세포에서의 CD83 발현을 유세포 분석법에 의해 분석하였으며, 이는 3가지 대표적인 실험 중 하나이다. 도 3(C)는 CellVue Claret로 KM-H2 세포를 표지한 후 정제된 CD3+ T 세포와 5:1의 비율로 4시간 동안 공배양한 후 CD3+ T 세포에서 CellVue Claret (Claret) 발현을 보여주는 플롯이다. T 세포에서의 CellVue Claret 발현은 유세포 분석법으로 분석하였다. 3가지 실험을 나타내는 데이터이다. 도 3(D)는 4시간 동안 KM-H2 세포와 함께 공배양된 CD83+ 트로고시토시스된 (trogocytosed) T 세포에서 PD-1 (CD279) 발현 수준을 보여주는 그래프이다. 유세포 분석법 (n=4)에 의해 발현을 결정하였다. 일원 분산 분석의 p 값이 표시되었다. 도 3(E)는 KM-H2 세포와 4시간 동안 공배양된 후 트로고시토시스된 (trogocytosed) CD4+ T 또는 CD8+ T 세포에서 PD-1 발현 수준을 보여주는 그래프이다. 유세포 분석법 (n=4)에 의해 발현을 분석하였다. 일원 분산 분석의 p 값이 표시되었다. 도 3(F)는 유세포 분석을 사용하여 T 세포에서 PD-1 발현의 분석으로부터 수득된 대표적인 플롯이다.
도 4는 HL 세포에 의해 분비된 가용성 CD83 (sCD83)에 의해 T 세포 증식이 억제되고 3C12C의 첨가에 의해 sCD83 활성이 제거됨을 보여준다.
도 4(A)는 ELISA에 의한 KM-H2, L428 세포주 및 HL 환자로부터의 진단 혈청으로부터 상청액 (SN)에서 검출된 sCD83의 농도를 보여주는 그래프이다. Mann-Whitney t-test의 P 값이 표시되었다. 도 4(B)는 5일 동안 KM-H2의 25% SN 또는 추가로 3C12C (anti-CD83 mAb)(5μg/ml)의 존재 하에 CFSE로 표지되고 CD2/ CD3/CD28 마이크로비드 (3:1)로 자극된 정제된 T 세포에 대한 증식 지수 (PI)를 보여주는 그래프이다. 유세포 분석법에 의해 세포를 분석하고, 유동 조 (n=6)를 사용하여 총 CD3+, CD4+ 및 CD8+ T 세포에 대해 증식 지수 (PI)를 계산하였다. 일원 분산 분석의 P 값이 표시되었다. 도 4(C)는 상이한 부피 (v/v)의 KM-H2 상청액이 CD2/CD3CD28 마이크로비드-자극 CFSE 표지된 인간 T 세포에 첨가될 때 유세포 분석 결과를 보여주는 막대 그래프이다. 5일째에 T 세포를 수집하고 CFSE를 유세포 분석에 의해 분석하였다. PI 및 분할 지수 (DI)는 증식에 대한 지표로서 계산되었다. 3 개의 유사한 실험 중 하나의 대표 데이터가 표시되었다. 도 4(D)는 CD2/CD3/CD28 마이크로비드로 자극된 후 항체 3C12C를 갖거나 갖지 않는 25% (v/v) KM-H2 SN에서 배양된 CFSE 표지된 T 세포의 유세포 분석 결과를 보여주는 막대 그래프이다 (5 및 10μg/ml). T 세포 증식을 5일에 분석하였다. 도 4(E)는 CD2/CD3/CD28 마이크로비드로 자극된 다음 상이한 농도의 3C12C로만 배양된 CFSE 표지된 T 세포의 유세포 분석 결과를 보여주는 막대 그래프이다. 3C12C 단독은 CD2/CD3/CD28 마이크로비드 자극 후 CFSE 표지된 T 세포의 증식에 영향을 미치지 않았다.
도 5는 화학 요법 중 HL 환자에서 sCD83의 시간 경과를 보여준다.
도 5는 ELISA에 의해 검사된 상이한 화학 요법주기 동안 6명의 HL 환자의 혈청에서 sCD83 수준을 보여주는 그래프이다. 화살표는 PET 스캔이 수행된 시기를 나타내며 완전 반응 (CR), 부분 반응 (PR) 또는 진행성 질환 (PD)의 결과가 기록된다.
도 6은 시험관 내에서 3C12C 및 3C12C-모노메틸-아우리스타틴 E (MMAE)가 HL 세포주를 사멸시키는 것을 보여준다.
도 6(A)는 칼세인-AM으로 표지된 표적 세포 KM-H2 또는 L428이 37℃에서 3시간 동안 3C12C의 농도가 0㎍/ml부터 1㎍/ml까지 증가함에 따라 25:1의 E:T 비에서 이펙터 세포 (인간 PBMC)와 공동 배양될 때 세포 독성의 백분율을 나타내는 그래프이다. 방출된 칼세인의 형광 판독 (여기 485nm, 방출 538nm)을 위해 상청액을 수집 하였다. ADCC 활성을 계산하였다 (n=3). 도 6(B)는 3일동안 상이한 농도의 3C12C-MMAE를 갖는 KM-H2 또는 HL-60 세포의 배양 후 생존 세포의 수를 보여주는 그래프이다. 유세포 분석법에 의한 7AAD 염색에 의한 생존 세포. 최대 억제 농도의 절반 (IC50)이 도시되어 있다.
도 7은 3C12C가 비인간 영장류에서 B 세포를 감소시켰음을 보여준다.
0, 7, 14 및 21일에 5명의 비인간 영장류에 3C12C (1, 5, 10, 10 mg/kg, n=4) 또는 인간 IgG (10mg/kg, n=1)를 주사했다. 28일에 림프절 생검을 3C12C (10mg/kg) 및 대조군 처리된 동물로부터 채취하였다. 도 7(A)는 유세포 분석에 의한 5마리 동물의 PBMC로부터의 CD19+ B 세포의 수를 보여주는 그래프이다. 점선은 0일째의 기본 세포 수를 나타낸다. * 해당 동물에서 WBC가 극도로 높은 시점을 나타낸다. 도 7(B)는 파라핀 삽입된 림프절 생검 샘플에서 항-인간 CD20 mAb로 염색 된 세포를 보여주는 이미지이다. 10 mg/kg의 3C12C 또는 인간 IgG를 받은 동물로부터의 이미지가 도시되어 있으며, 전자는 B 세포의 감소를 나타낸다.
도 8은 RT-PCR에 의한 CD83 및 GAPDH mRNA의 증폭 후 HL 세포주 mRNA의 전기 영동 결과를 보여주는 이미지이다.
도 9는 KM-H2 세포와 공배양된 T 세포로부터 Treg 세포를 보여준다.
정제된 T 세포를 4시간 동안 1:5의 비로 KM-H2 세포와 공동 배양하였고, CD83+ T 세포에서 CD25+CD127 낮은 Treg 세포의 비율을 유세포 분석법에 의해 분석하였다. T 세포만의 배양 조건을 대조군으로 사용하였다. Treg 세포의 증가를 보이지 않는 3가지 실험 중 하나의 데이터.
도 10은 HL 라인의 상청액에서 IL-10 수준을 보여주는 그래프이다.
CBA IL-10 비드 분석으로 IL-10 수준을 측정하기 위해 KM-H2, L428 및 HDLM2의 상청액을 수집하였다. 낮은 수준이 시연되었다. PHA 활성화된 T 세포의 상청액을 양성 대조군으로 사용하였다.
도 11은 HL60 라인에서 CD83 발현을 보여주는 그래프이다.
HL60에서의 CD83 발현을 유세포 분석에 의해 마우스 항-인간 CD83 mAb HB15a, HB15e 또는 인간 항-인간 CD83 mAb 3C12C로 분석하였다. 회색으로 채워진 히스토그램은 CD83 항체에 대한 이소 타입 대조군이었다.
도 12는 3C12C가 사람이 아닌 영장류에서 안전하다는 것을 보여주는 그래프이다.
0, 7, 14, 21일째에 5명의 비인간 영장류 (Baboon)에 3C12C (1[TA1], 5[TA2], 10[TA3], 10[TA4]mg/kg, n=4) 또는 인간 IgG (10[CTR]mg/kg, n=1)가 주입되었다. 혈액 세포 수 (적혈구 (RBC), 백혈구 (WBC) 및 혈소판), 간 (ALP, AST 수준) 및 신장 기능 (크레아티닌 수준) 분석을 위해 혈액 및 혈청 샘플을 수집하였다. 10mg/kg의 3C12C 또는 인간 IgG를 받은 동물로부터의 데이터가 제시되었다. TA1 = 동물 수용 1mg/kg, TA2 = 동물 수용 5mg/kg, TA3 = 동물 수용 10mg/kg, TA4 = 동물 수용 10mg/kg, CTR = 10mg/kg 인간 IgG를 수용하는 대조 동물.
도 13은 환자의 MCL 및 FL에서 CD83 발현을 보여주는 현미경 이미지이다. MCL 환자 및 여포성 림프종 (FL) 환자로부터의 파라핀 매립 림프절 생검 샘플에서 CD83 발현 (암 영역)의 현미경 이미지 (x200 확대).
도 14는 3C12C-MMAE가 DLBCL 및 MCL 세포주를 사멸시키는 것을 보여준다.
DLBCL 라인 KARPASS-1106P 또는 MCL 라인 Mino 세포를 72시간 동안 상이한 농도의 3C12C-MMAE와 함께 인큐베이션한 다음, 생존 세포를 유세포 분석법에 의해 계수하였다. KM-K2 세포를 대조군으로 사용하였다. 최대 억제 농도의 절반 (IC50)이 도시되어 있다.
본 발명은 대상체에서 림프종을 치료하는 방법에 관한 것이다.
림프종은 림프구에서 발생하는 혈액 세포 종양 그룹이다. 림프종은 HL 또는 NHL 일 수 있다.
일 실시예에서, 림프종은 HL이다. 호지킨 림프종은 호지킨 및 리드-스텐버그 세포 (HRS 세포)의 존재를 특징으로 하는 림프종이다. HRS 세포는 전형적으로 눈에 띄는 핵과 CD45-, CD30+, CD15+ +/- 면역 표현형을 갖는 큰 이중핵 생성 세포로 식별된다. HRS 세포의 전형적인 특징은 큰 크기 (20-50 마이크로미터), 풍부함, 양쪽 성, 미세한 과립/균질 세포질; 호산구 핵과 두꺼운 핵막이 있는 두 개의 거울상 핵 (올빼미 눈)이다(크로마틴은 핵막 근처에 분포되어 있음).
다른 실시예에서, 림프종은 NHL이다. NHL은 HRS 세포를 포함하지 않는 림프종이다.
일 실시예에서, NHL은 MCL이다. 맨틀 세포 림프종은 정상적인 생식소 모낭을 둘러싸는 맨틀 영역 내의 CD5 양성 항원-유래 전-발아 센터 B 세포로 인해 B 세포 림프종의 아형이다. 맨틀 세포 림프종 세포는 일반적으로 cyclin D1을 과발현한다.
일 실시예에서, NHL은 미만성 대 B-세포 림프종 (DLBCL)이다.
다른 실시예에서, NHL 서브 타입은 CD83 양성 염색 세포주로부터의 여포성 림프종 (FL)이다. 전형적으로, 여포성 림프종은 CD83 양성 염색되고 세포막 상에 유도된 RNA 단백질을 포함하는 세포주로부터 유래된다.
림프종의 치료 방법은 대상체에게 유효량의 CD83 결합 단백질을 투여하는 것을 포함한다.
CD83은 단일 패스 형 I 막 단백질이며 면역 글로불린 슈퍼 패밀리의 구성원이다. CD83의 상이한 이소형을 인코딩하는 3 개의 인간 전사체 변이체가 확인되었다. 명명법의 목적 및 제한은 아니지만, 인간 CD83 (hCD83) 이소형의 아미노산 서열은 서열 번호 1 (NP_004224.1; 이소형 a), 서열 번호 2 (NP_001035370.1; 이소형 b ) 및 서열 번호 : 3 (NP_001238830.1; 이소형 c)에서 보여진다. 따라서, 일 예에서, 인간 CD83의 아미노산 서열은 서열 번호 1, 2 또는 3에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다. CD83의 상동체는 Pan troglodytes (XP_518248.2), Macaca mulatta (XP_001093591.1), Canis lupus familiaris (XP_852647.1), Bos Taurus (NP_001040055.1), Mus musculus (NP_033986.1), Rattus norvegicus (NP_001101880.1) 및 Gallus gallus (XP_418929.1)에서 발견된다.
CD83은 활성화된 수지상 세포 (DC)의 마커이며, 활성화된 B 세포, T 세포, 대식세포, 호중구 등에서도 발현된다. CD83의 막결합 형태 및 CD83의 가용성 형태 (sCD83)가 있다.
CD83 결합 단백질
CD83 결합 단백질은 CD83에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질이다. 용어 "CD83 결합 단백질"은 CD83에 특이적으로 결합 할 수 있는 단일 폴리펩티드 사슬 (즉, 펩티드 결합에 의해 연결된 일련의 연속 아미노산), 또는 서로 공유적으로 또는 비공유적으로 연결된 일련의 폴리펩티드 사슬 (즉, 폴리펩티드 복합체 또는 단백질)을 포함한다. 예를 들어, 일련의 폴리펩티드 사슬은 적합한 화학 또는 이황화 결합을 사용하여 공유적으로 연결될 수 있다. 비공유 결합의 예는 수소 결합, 이온 결합, 반 데르 발스 힘 및 소수성 상호 작용을 포함한다.
CD83 결합 단백질은 전형적으로 항원 결합 도메인을 포함한다. "항원 결합 도메인"은 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 항체의 영역이다. CD83 결합 단백질의 항원 결합 도메인은 CD83에 특이적으로 결합한다. 항원 결합 도메인은 전형적으로 항체의 중쇄 가변 영역의 상보성 결정 영역 (CDR) 1, 2 및/또는 3 및/또는 경쇄 가변 영역의 CDR 1, CDR2 및/또는 CDR3을 포함한다. 보다 전형적으로, 항원 결합 도메인은 항체의 중쇄 가변 영역의 CDR 1, 2 및 3, 및 경쇄 가변 영역의 CDR 1, 2 및 3을 포함한다. 더욱 전형적으로, 항원 결합 도메인은 항체의 중쇄 가변 영역 (VH) 및/또는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함한다. 항원 결합 도메인은 전체 항체의 맥락에서 존재할 필요는 없으며, 예를 들어, 격리 (예를 들어, 도메인 항체) 또는 다른 형태 (예를 들어, scFv) 일 수 있다.
"항체"는 항체의 Fv 영역 내에 함유된 항원 결합 도메인에 의해 하나 또는 소수의 밀접하게 관련된 항원 (예를 들어, CD83)에 특이적으로 결합 할 수 있는 단백질을 지칭한다. 항체는 4 개의 사슬 항체 (예를 들어, 2개의 경쇄 (L) 및 2개의 중쇄 (H), 재조합 또는 변형된 항체 (예를 들어, 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체, CDR-그라프팅된 항체, 영장류화 항체, 면역화 항체, 동인화 항체, 반항체 및 이중 특이적 항체)를 포함한다. 항체는 일반적으로 불변 도메인을 포함하며, 불변 도메인 또는 불변 단편 또는 단편 결정화 가능 (Fc)으로 배열 될 수 있다. 예시적인 형태의 항체는 그의 기본 단위로서 4쇄 구조를 포함한다. 전장 항체는 공유 결합된 2개의 중쇄 (각각 ~ 50 내지 70kDa) 및 2개의 경쇄 (각각 ~ 23kDa)를 포함한다. 경쇄는 일반적으로 가변 영역 (존재하는 경우) 및 불변 도메인을 포함하고 포유 동물에서 κ 경쇄 또는 λ 경쇄이다. 중쇄는 일반적으로 가변 영역 및 추가의 불변 도메인(들)에 힌지 영역에 의해 연결된 하나 또는 두 개의 불변 도메인(들)을 포함한다. 포유 동물의 중쇄는 하기 유형 α,δ,ε,γ 또는 μ 중 하나이다. 각각의 경쇄는 또한 중쇄 중 하나에 공유적으로 연결된다. 예를 들어, 2개의 중쇄 및 중쇄 및 경쇄는 사슬간 이황화 결합 및 비공유 상호 작용에 의해 함께 유지된다. 사슬간 이황화 결합의 수는 항체의 종류에 따라 다를 수 있다. 각각의 사슬은 N-말단 가변 영역 (각각 ~110 아미노산 길이인 VH 또는 VL) 및 C-말단에서 하나 이상의 불변 도메인을 갖는다. 경쇄의 불변 도메인 (길이가 ~110 아미노산 인 CL)은 중쇄의 제1불변 도메인 (길이가 330 내지 440 아미노산 인 CH1)과 정렬되고 이황화 결합된다. 경쇄 가변 영역은 중쇄의 가변 영역과 정렬된다. 항체 중쇄는 2개 이상의 추가 CH 도메인 (예 : CH2, CH3 등)을 포함할 수 있고 CH1 및 CH2 불변 도메인 사이의 힌지 영역을 포함할 수 있다. 항체는 임의의 유형 (예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 클래스 (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 서브 클래스일 수 있다. 일 예에서, 항체는 뮤린 (마우스 또는 래트) 항체 또는 영장류 (예컨대, 인간) 항체이다. 다양한 실시예에서, 항체는 인간화, 동인화, 키메라, CDR-그라프팅 또는 탈면역화된다.
본원에 사용된 "가변 영역"은 항원에 특이적으로 결합할 수 있고 상보성 결정 영역 (CDR),즉 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 프레임 워크 영역 (FR)의 아미노산 서열을 포함하는 본원에 정의된 바와 같은 항체의 경쇄 및/또는 중쇄의 부분을 지칭한다. 예를 들어, 가변 영역은 3개의 CDR과 함께 3개 또는 4개의 FR (예를 들어, FR1, FR2, FR3 및 임의로 FR4)을 포함한다. VH는 중쇄의 가변 영역을 지칭한다. VL은 경쇄의 가변 영역을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "상보성 결정 영역"(즉, CDR 1, CDR 2 및 CDR 3)은 존재하는 특정 항원 결합에 주요 기여인 항체 가변 영역의 아미노산 잔기를 지칭한다. 각각의 가변 영역 도메인 (VH 또는 VL)은 전형적으로 CDR1, CDR2 및 CDR3으로 식별 된 3개의 CDR 영역을 갖는다. 일 예에서, CDR 및 FR에 할당된 아미노산 위치는 면역학적 관심 단백질의 Kabat 서열에 따라 정의된다. National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1987 및 1991. (본 명세서에서 "Kabat 넘버링 시스템"으로도 지칭됨). 다른 예에서, CDR 및 FR에 할당된 아미노산 위치는 Enhanced Chothia Numbering Scheme (http://www.bioinfo.org.uk)에 따라 정의된다. Kabat의 넘버링 시스템에 따라 VH FR 및 CDR은 하기와 같이 위치된다: 잔기 1 내지 30 (FR1), 31 내지 35 (CDR1), 36 내지 49 (FR2), 50 내지 65 (CDR2), 66 내지 94 (FR3), 95 내지 102 (CDR3) 및 103 내지 113 (FR4). Kabat의 넘버링 시스템에 따라 VL FR 및 CDR은 하기와 같이 위치된다: 잔기 1 내지 23 (FR1), 24 내지 34 (CDR1), 35 내지 49 (FR2), 50 내지 56 (CDR2), 57 내지 88 (FR3), 89 내지 97 (CDR3) 및 98 내지 107 (FR4). 본 개시 내용은 Kabat의 넘버링 시스템에 의해 정의된 FR 및 CDR로 제한되지 않고, 표준 넘버링 시스템 또는 Chothia 및 Lesk J. Mol. Biol. 196: 901-917, 1987; Chothia et al., Nature 342 : 877-883, 1989; 및/또는 Al-Lazikani et al., J. Mol. Biol. 273 : 927-948, 1997의 넘버링 시스템; Honnegher와 Plukthun J. Mol. Biol. 309: 657-670, 2001의 넘버링 시스템; 또는 Giudicelli et al., Nucleic Acids Res. 25: 206-211 1997에서 논의된 IMGT 시스템을 포함하는 모든 넘버링 시스템을 포함한다. 일 예에서, CDR은 Kabat 넘버링 시스템에 따라 정의된다.
"프레임 워크 영역"(FR)은 CDR 잔기 이외의 가변 영역 잔기이다.
본원에 사용된 용어 "Fv"는 VL 및 VH가 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인을 갖는 복합체를 회합하고 형성하는 다중 폴리펩티드 또는 단일 폴리펩티드로 구성되는 모든 단백질을 지칭한다. 항원 결합 도메인을 형성하는 VH 및 VL은 단일 폴리펩티드 사슬 또는 상이한 폴리펩티드 사슬에 있을 수 있다. 또한, 본 개시 내용의 Fv (본 개시 내용의 임의의 단백질뿐만 아니라)는 동일한 항원에 결합하거나 결합하지 않을 수 있는 다수의 항원 결합 도메인을 가질 수 있다. 이 용어는 항체로부터 직접 유래된 단편뿐만 아니라 재조합 수단을 사용하여 생성된 이러한 단편에 상응하는 단백질을 포함하는 것으로 이해될 것이다. 예시적인 Fv 함유 폴리펩티드 또는 단백질은 Fab 단편, Fab '단편, F (ab') 단편, scFv, 디아 바디, 트리아 바디, 테트라 바디 또는 고차 복합체, 또는 불변 영역 또는 그의 도메인에 연결된 전술한 것 중 임의의 것을 포함한다. 예를 들어 CH2 또는 CH3 도메인, 예를 들어 CAR T 세포 구축물과 같은 다른 단백질을 포함하는 미니 바디이다.
"Fab 단편"은 면역 글로불린의 1가 항원-결합 단편으로 구성되며, 온전한 경쇄 및 중쇄의 일부로 구성된 단편을 생성하기 위해 효소 파파인으로 전체 항체의 소화에 의해 생성될 수 있거나 재조합 수단을 사용하여 제조될 수 있다.
항체의 "Fab'단편"은 전체 항체를 펩신으로 처리한 후 환원시켜, 온전한 경쇄 및 VH 및 단일 불변 도메인을 포함하는 중쇄의 일부로 이루어진 분자를 수득함으로써 수득될 수 있다. 이러한 방식으로 처리된 항체 당 2개의 Fab'단편이 수득된다. Fab'단편은 또한 재조합 수단에 의해 생성될 수 있다.
항체의 "F(ab')2 단편"은 2개의 이황화 결합에 의해 함께 보유된 2개의 Fab'단편의 이량체로 이루어지고, 후속 환원없이 전체 항체 분자를 효소 펩신으로 처리함으로써 수득된다.
"Fab2" 단편은 예를 들어 류신 지퍼 또는 CH3 도메인을 사용하여 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 재조합 단편이다.
"단일 사슬 Fv"또는 "scFv"는 경쇄의 가변 영역 및 중쇄의 가변 영역이 적합하고 유연한 폴리펩티드 링커에 의해 공유적으로 연결된 항체의 가변 영역 단편 (Fv)을 함유하는 재조합 분자이다.
본원에 사용된 바와 같이, CD83 결합 단백질 또는 이의 항원 결합 도메인과 항원의 상호 작용과 관련하여 용어 "결합"은 항원에서 상호 작용이 특정 구조 (예를 들어, 항원 결정기 또는 에피토프)의 존재에 의존한다는 것을 의미한다. 예를 들어, 항체는 일반적으로 단백질이 아닌 특정 단백질 구조를 인식하고 이에 결합한다. 항체가 에피토프 "A"에 결합하는 경우, 표지된 "A" 및 항체를 함유하는 반응에서 에피토프 "A"를 함유하는 분자 (또는 유리, 비표지된 "A")의 존재는 항체에 결합된 표지된 "A"의 양을 감소시킬 것이다.
특정 항원에 "특이적으로 결합하는" 또는 "특이적이도록 결합하는" 단백질은 대안적인 항원보다 더 자주, 보다 신속하게, 보다 큰 지속 시간 및/또는 특정 항원과 더 큰 친화도로 반응하거나 회합하는 단백질이다. 예를 들어, CD83에 특 적으로 결합하는 단백질은 다른 항원에 결합하는 것보다 더 큰 친화성, 결합성, 보다 용이하게 및/또는 더 긴 지속 시간으로 CD83에 결합한다. 한 예에서, CD83 결합 단백질의 항원에 대한 "특이적 결합"은 단백질이 100 nM 이하, 예컨대 50 nM 이하, 예를 들어 20 nM 이하 (예컨대 15 nM 이하 또는 10 nM 이하 또는 5 nM 이하 또는 1 nM 이하 또는 500 pM 이하 또는 400 pM 이하 또는 300 pM 이하 또는 200 pM 이하 또는 100 pM 이하)의 평형 상수 (KD)로 항원에 결합함을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "에피토프"(동의 "항원 결정기")는 항체의 항원 결합 도메인을 포함하는 단백질이 결합하는 항원의 영역을 의미한다. 이 용어는 단백질이 접촉하는 특정 잔기 또는 구조에 반드시 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 이 용어는 단백질에 의해 접촉된 아미노산에 걸친 영역 및/또는 이 영역 외부의 적어도 5 내지 10 또는 2 내지 5 또는 1 내지 3 개의 아미노산을 포함한다. 일부 예에서, 에피토프는 선형 일련의 아미노산이다. 에피토프는 또한 항원이 접힐 때, 즉 "구조적 에피토프"인 경우 서로 가까이 위치한 일련의 불연속 아미노산을 포함할 수 있다. 당업자는 용어 "에피토프"가 펩티드 또는 폴리펩티드로 제한되지 않음을 인식할 것이다. 예를 들어, 용어 "에피토프"는 당 측쇄, 포스포릴 측쇄 또는 설포닐 측쇄와 같은 분자의 화학적 활성 표면 그룹을 포함하고, 특정 예에서 특정 3차원 구조적 특성 및/또는 특정 전하 성질을 가질 수 있다. 에피토프 또는 이를 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드는 에피토프에 대한 항체를 생성하기 위해 동물에 투여될 수 있다.
상기 방법은 대상체에 의해 허용되고 CD83에 대해 높은 친화성을 갖는 임의의 CD83 결합 단백질을 사용할 수 있다. 본 발명의 방법에 사용하기에 적합한 CD83 결합 단백질은 CD83 결합 단백질을 확인하기 위해 항체 또는 항원 결합 도메인 (예를 들어, 가변 영역의 항체를 포함)을 포함하는 단백질의 라이브러리를 스크리닝함으로써 확인할 수 있다. CD83에 특이적으로 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하는 단백질의 라이브러리를 스크리닝하는 방법은 예를 들어 WO2014/117220 및 WO2016/061617에 기재되어 있다.
일 실시예에서, CD83 결합 단백질은 항체이다.
일 실시예에서, 항체는 다클론성 항체이다. 다클론성 항체는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 다클론성 항체는 포유 동물에서, 예를 들어 포유 동물을 면역시키기 위해 사용되는 항원성 조성물의 하나 이상의 주사에 의해 생길 수 있다. 전형적으로, 항원성 조성물은 다수의 정맥 내, 피하 또는 복강 내 주사에 의해 투여된다. 면역 프로토콜은 당업자에 의해 용이하게 선택될 수 있다. 다클론성 항체의 면역화 및 분리 방법은 예를 들어, Antibodies: a Laborartory Manual by E. Harlow and D. Lane, 1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, Chapter 5에 실려 있다.
일 실시예에서, CD83 결합 단백질은 단일 클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 단일클론 항체는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제조 될 수 있고, 예를 들어 Antibodies: A Laboratory Manual by E. Harlow and D. Lane, 1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, chapters 5-7에 기재되어 있다. 단일클론 항체는, 예를 들어, 마우스, 햄스터 또는 다른 적절한 숙주 동물을 항원으로 면역시켜 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 생성하거나 생성 할 수 있는 림프구를 유도함으로써 항원에 의해 제조될 수 있다. 항원은 전형적으로, 예를 들어 WO2016/061617에 기재된 것과 같은 CD83 단백질을 포함하는 항원 성 조성물을 투여함으로써 투여될 것이다. 일반적으로, 인간 기원의 세포가 필요한 경우 말초 혈액 림프구 ("PBL")가 사용되거나, 비인간 포유 동물 공급원이 필요한 경우 비장 세포 또는 림프절 세포가 사용된다. 이어서, 림프구를 폴리에틸렌 융합과 같은 적합한 융합제를 사용하여 불멸화된 세포주와 융합시켜 하이브리도마 세포를 형성한다. 불멸화된 세포주는 일반적으로 형질 전환된 포유 동물 세포, 특히 설치류, 소 및 인간 기원의 골수종 세포이다. 일반적으로, 랫트 또는 마우스 골수종 세포주가 사용된다. 하이브리도마 세포는 바람직하게는 융합되지 않은 불멸화 세포의 성장 또는 생존을 억제하는 하나 이상의 물질을 함유하는 적합한 배양 배지에서 배양될 수 있다. 예를 들어, 모 세포에 효소 하이포크산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 (HGPRT 또는 HPRT)가 없는 경우, 하이브리도마의 배양 배지는 전형적으로 하이포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘 ("HAT 배지")을 포함할 것이며, 이 물질은 HGPRT-결핍 세포의 성장을 막는다.
CD83 단백질에 대한 항체의 초기 상승 후, 항체는 서열화되고 후속적으로 인간화 항체와 같은 키메라 항체를 생성하기 위해 재조합 기술에 의해 제조될 수 있다. 뮤린 항체 및 항체 단편의 키메라화는 당업자에게 공지되어 있다. 키메라화된 단일클론 항체로부터 유래된 항체 성분의 사용은 뮤린 서열의 면역원성과 관련된 잠재적 문제를 감소시킨다.
뮤린 항체로부터의 가변 도메인은 당업계에 공지된 통상적인 기술을 사용하여 클로닝될 수 있고, 예를 들어 Sambrook and Russell, Eds, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed, vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001에 기재되어 있다. 일반적으로, 뮤린 항체에 대한 가변 경쇄 및 가변 중쇄 서열은 RT-PCR, 5'-RACE 및 cDNA 라이브러리 스크리닝과 같은 다양한 분자 클로닝 절차에 의해 수득될 수 있다. 키메라 항체는 한 종, 전형적으로 마우스 항체로부터 유래된 항체의 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함하는 가변 영역을 포함하는 항체 단백질이며, 항체 분자의 불변 도메인은 다른 종, 예컨대 인간으로부터 유래된다.
일부 실시예에서, CD83 결합 단백질은 인간화된 항체이다. 인간화 항체는 키메라 항체의 한 형태이고, 한 종의 항체 (예를 들어, 마우스 항체)로부터의 항체 CDR이 마우스 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 사슬로부터 인간 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 (예를 들어, 골격 영역 서열)으로 전달된다. 항체 분자의 불변 도메인은 인간 항체의 불변 도메인에서 유래된다.
CD83 결합 단백질은 키메라 항체일 수 있다. 본원에 기재된 방법에 사용하기위한 키메라 항체는 CD83 단백질에 특이적으로 결합하는 뮤린 mAb의 상보성 결정 영역 (CDR), 및 전형적으로 프레임 워크 영역 (FR)을 포함한다. 키메라 항체는 인간 항체의 경쇄 및 중쇄 불변 영역을 포함할 수 있다. 키메라화된 단일클론 항체로부터 유래된 항체 성분의 사용은 뮤린 불변 영역의 면역원성과 관련된 잠재적 문제를 감소시킨다. 뮤린 항체 및 항체 단편의 인간화는 당업자에게 공지되어 있고, 예를 들어 US5225539; US6054297; and US7566771에 기재되어 있다. 예를 들어, 인간화 단일클론 항체는 쥐 면역 글로불린의 중쇄 및 경쇄 가변 사슬로부터 뮤린 상보성 결정 영역을 인간 가변 도메인으로 전달하고, 뮤린 대응물의 프레임 워크 영역에서 인간 잔기를 치환함으로써 생성 될 수 있다. 인간 불변 영역 서열 외에 인간 프레임 워크 영역 서열의 사용은 HAMA 반응을 유도할 가능성을 추가로 감소시킨다. 다양한 잘 확립된 기술에 의해 혈청 및 하이브리도마 배양물로부터 항체를 분리 및 정제할 수 있다. 이러한 분리 기술에는 Protein-A Sepharose를 사용한 친화성 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피 및 이온 교환 크로마토그래피가 포함된다. 예를 들어, Coligan의 2.7.1-2.7.12 페이지 및 2.9.1-2.9.3 페이지 참조. 또한, Baines et al., "Purification of Immunoglobulin G (IgG)," in Methods in Molecular Biology, vol. 10, pages 79-104 (The Humana Press, Inc. 1992) 참조.
일부 실시예에서, CD83 결합 단백질은 완전히 인간화된 단일클론 항체이다. 반면, 인간화된 항체는 키메라 항체의 한 형태이고, 한 종의 항체 (예를 들어, 마우스 항체)로부터의 항체 CDR이 마우스 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 사슬로부터 인간 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 (예를 들어, 골격 영역 서열)으로 전달된다. 항체 분자의 불변 도메인은 인간 항체의 불변 도메인에서 유래된다.
CD83을 표적화하는 항체는 당업자에게 널리 공지된 다양한 기술에 의해 특징 지워질 수 있다. 예를 들어, CD83에 특이적으로 결합하는 항체의 능력은 예를 들어 간접 효소 면역 분석, 유세포 분석, ELISA 또는 웨스턴 블롯 분석을 사용하여 확인할 수 있다.
CD83 결합 단백질은 전형적으로 CD83에 특이적으로 결합하는 항체의 중쇄 및/또는 경쇄의 가변 영역을 포함한다. 가변 중쇄 및/또는 경쇄의 일부는 Fv 단편과 같은 별도의 폴리펩티드 사슬에 있거나, 경쇄 및 중쇄 가변 영역이 펩티드 링커 ("scFv 단백질")에 의해 연결된 단일 폴리펩티드 사슬에 있을 수 있다. 일 실시예에서, CD83 결합 단백질은 항체의 항원 결합 단편이다. 항체의 항원 결합 단편은 항체의 항원 결합 도메인을 포함한다. 항원 결합 단편의 예는 F(ab')2, Fab', Fab, Fv, sFv, scFv 등을 포함한다. 전형적으로, 항원 결합 단편은 가변 중쇄 및/또는 가변 경쇄의 CDR1, 2 및/또는 3 영역을 포함한다. 보다 전형적으로, 항원 결합 단편은 가변 중쇄 및/또는 가변 경쇄의 CDR1, 2 및 3 영역을 포함한다. 더욱 전형적으로, 항원 결합 단편은 가변 중쇄의 CDR1, 2 및 3 영역 및 가변 경쇄의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다. 특정 에피토프를 인식하는 항원 결합 단편은 공지된 기술에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, F(ab')2 단편은 항체 분자의 펩신 분해에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, Coligan의 2.8.1-2.8.10 and 2.10.-2.10.4쪽에 이러한 또는 다른 방법들이 기재되어 있다. 대안적으로, Fab' 발현 라이브러리는 원하는 특이성으로 Fab'단편을 빠르고 쉽게 식별할 수 있도록 구성될 수 있다.
일부 실시예에서, CD83 결합 단백질은 단일 사슬 Fv 분자 (scFv)이다. 단일 쇄 Fv 분자 (scFv)는 VL 도메인 및 VH 도메인을 포함한다. VL 및 VH 도메인은 전형적으로 펩티드 링커 (L)에 의해 공유 연결되고 접힘으로써 항원 결합 부위를 형성한다. VH 및 VL 영역은 함께 직접 연결될 수 있지만, 당업자는 영역이 하나 이상의 아미노산으로 구성된 펩티드 링커에 의해 분리될 수 있음을 이해할 것이다. 펩티드 링커 및 이들의 용도는 당업계에 공지되어 있다. 일반적으로, 펩티드 링커는 영역을 결합시키거나 V.sub.H와 V.sub.L 사이의 일부 최소 거리 또는 다른 공간적 관계를 유지하는 것 이외의 특정한 생물학적 활성을 갖지 않을 것이다. 그러나, 펩티드 링커의 구성 아미노산은 폴딩, 순 전하 또는 소수성과 같은 분자의 일부 특성에 영향을 주도록 선택될 수 있다. 단일 사슬 Fv (scFv) 항체는 임의로 50개 이하의 아미노산, 일반적으로 40개 이하의 아미노산, 바람직하게는 30개 이하의 아미노산, 보다 바람직하게는 20개 이하의 아미노산의 펩티드 링커를 포함한다.
scFv 항체를 제조하는 방법은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 US5260203에 기재되어 왔다. 예를 들어, 면역화된 동물로부터의 B 세포로부터의 mRNA, 또는 인간 공여자 패널로부터 정제된 B 림프구로부터 수득된 mRNA를 분리하고 cDNA를 제조한다. 면역 글로불린의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역에 특이적인 프라이머를 사용하여 cDNA를 증폭시킨다. PCR 산물을 정제하고 핵산 서열을 결합시킨다. 링커 펩티드가 필요한 경우, 펩티드를 암호화하는 핵산 서열이 중쇄 및 경쇄 핵산 서열 사이에 삽입된다. scFv를 암호화하는 핵산을 벡터에 삽입하고 적절한 숙주 세포에서 발현시킨다. 원하는 항원에 특이적으로 결합하는 scFv는 전형적으로 파지 디스플레이 라이브러리의 패닝에 의해 발견된다. 패닝은 여러 방법 중 하나로 수행할 수 있다. 패닝은 표면에서 원하는 항원을 발현하는 세포를 사용하거나 원하는 항원으로 코팅된 고체 표면을 사용하여 편리하게 수행될 수 있다. 편리하게는, 표면은 자기 비드일 수 있다. 결합되지 않은 파지를 고체 표면에서 세척하고 결합된 파지를 용출시킨다.
다른 항원 결합 단편을 제조하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 항원 결합 단편은 또한 전장 항체의 단백질 가수 분해 가수 분해 또는 E.Coli 또는 단편을 코딩하는 DNA의 다른 숙주에서의 발현에 의해 제조될 수 있다. 항체 단편은 통상적인 방법에 의해 전장 항체의 펩신 또는 파파인 소화에 의해 수득될 수 있다. 예를 들어, 항체 단편은 펩신에 의한 항체의 효소적 절단에 의해 생성되어 F(ab')2로 표시된 대략 100Kd 단편을 제공할 수 있다. 이 단편은 싸이올 환원제, 및 선택적으로 이황화 결합의 절단으로 인한 설프하이드릴기에 대한 차단기를 사용하여 추가로 절단되어 대략 50Kd Fab'1가 단편을 생성할 수 있다. 대안적으로, 파파인을 사용한 효소적 절단은 2 개의 1가 Fab 단편 및 Fc 단편을 직접 생성한다.
단편이 온전한 항체에 의해 인식되는 에피토프에 결합하는 한, 경쇄 단편뿐만 아니라 단편의 분할을 형성하기 위한 중쇄의 분리와 같은 항체 절단의 다른 방법 또는 다른 효소적, 화학적 또는 유전적 기술이 사용될 수 있다.
일 실시예에서, CD83 결합 단백질은 이중 특이적 항체이다. 이중 특이적 항체는 2개 이상의 상이한 항원에 대한 결합 특이성을 갖거나 동일한 항원상의 2개의 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 단일 클론, 바람직하게는 인간 또는 인간화 된 항체이다.
일부 실시예에서, 이중 특이적 항체는 이중 특이적 T 세포 결합자이다. 이중 특이적 T 세포 관여자 (BiTE)는 인공 이중 특이적 단일 클론 항체의 부류이다. BiTE는 전형적으로 단일 펩티드 사슬 상에 상이한 항체의 2개의 단일 사슬 가변 단편 (scFv) 또는 4개의 상이한 유전자로부터의 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질이다. scFv 중 하나는 종양 항원 (예를 들어, 본원에 기재된 CD83 표적)에 결합하고 다른 하나는 일반적으로 CD3 수용체를 통해 T 세포와 같은 이펙터 세포에 결합한다. 이중 특이적 항체의 제조 방법은 예를 들어 Laszlo et al. Blood. 2014 Jan 23; 123(4): 554-561; Loffler, Blood (2000), 95: 2098-103에 기재되어 있다.
다른 실시예에서, CD83 결합 단백질은 키메라 항원 수용체 T 세포 (CAR T 세포)에 대한 키메라 항원 수용체이다. 이와 관련하여, 신호 전달 분자와 함께 항원 결합 도메인, 예컨대 scFv를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 사용하여 T 세포를 형질 도입하여 CAR T 세포를 생성시킬 수 있다. CAR T 세포에서 발현된 항원 결합 도메인은 비-MHC 제한 방식으로 항원을 인식할 수 있다. 따라서, T 세포의 표면에서, 예를 들어 본원에 기재된 항-CD83 항체의 항원 결합 도메인을 코딩하는 scFv의 발현은 림프종 세포에서 CD83을 표적화하는데 효과적일 수 있다. CAR T 세포의 제조 방법은 당업계에 공지되어 있고, Shannon et al. Blood, 25 June 2015 Volume 125, No. 26: 4017-4023; O'Hear et al. (2015) Haematologica; 100(3): 336-344에 기재되어 있다.
일 실시예에서, CD83 결합 단백질은 인간 단일클론 항체일 수 있다. 인간 단일클론 항체는 인간 면역 시스템으로부터 유전자를 운반하는 이식 유전자를 가진 마우스를 면역시킴으로써 생성되거나 파지 인간 scFv 라이브러리로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 재배열되지 않은 인간 중쇄 및 경쇄 면역 글로불린 서열을 코딩하는 인간 면역 글로불린 유전자좌를 함유하는 마우스는 면역되어 인간 단일 클론 항체를 생성할 수 있다. 인간 항체 생산을 위한 이식 유전자를 가진 마우스의 예는 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어, Lonberg et al. (1994) Nature 368: 856-859; Kellermann et al. (2002) Curr. Opin. Biotechnol. 13: 593-597; Tomizuka et al. (2000) PNAS 97: 722-727에 기재되어 있다.
일 실시예에서, CD83 결합 단백질은 완전 인간 항체이다. 이러한 항체는 인간 scFv로부터 생산될 수 있고 인간 항체로부터 일정한 도메인을 갖는 항체로 재 포맷될 수 있다. 예를 들어, 인간 공여자 패널로부터 정제된 B 림프구로부터 수득된 mRNA를 사용하여 본원에 기재된 바와 같은 인간 scFv를 생성할 수 있다. 인간 항체는 scFv 서열에 함유된 중쇄 및 경쇄 가변 영역에 중쇄 및 경쇄 불변 영역을 첨가함으로써 제조될 수 있다.
본원에 기재된 항체는 에피토프에 대한 교차 경쟁을 평가함으로써 동일한 에피토프에 결합하는 항체 또는 중첩 에피토프와 같은 다른 CD83 결합 단백질을 분리하는데 사용될 수 있다. 본원에 기재된 항체 또는 항원 결합 단편과의 교차 경쟁은 BIAcore 분석, 유세포 분석, ELISA 분석과 같은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 평가될 수 있다. 본 발명의 방법에 사용하기에 적합한 CD83 결합 단백질의 예는 항-CD83 항체 HB15a (Beckman 및 Coulter에서 이용 가능), HB15e (STEMCELL Technologies에서 이용 가능), WO2014/117220에 기재된 단일 클론 항체 3C12, 3C12B, 3C12C, 3C12D 및 3C12E를 포함하고, WO2016/061617에 기재된 단일 클론 항체 1F7 또는 이의 유도체를 포함한다.
일 실시예에서, CD83 결합 단백질은 다음을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH)을 포함한다:
(i) 서열 번호 10으로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 서열; 또는
(ii) 서열 번호 10으로 표시되는 아미노산 서열의 3개의 상보성 결정 영역 (CDR).
일 실시예에서, CD83 결합 단백질은 다음을 포함한다:
(a) 다음을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH):
(i) 서열 번호 10으로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 서열; 또는
(ii) 서열 번호 10으로 표시되는 아미노산 서열의 3개의 상보성 결정 영역 (CDR); 과
(b) 다음을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL):
(i) 서열 번호 12, 13, 11, 14 또는 15에 나타낸 아미노산 서열 중 어느 하나와 적어도 90% 동일한 서열; 또는
(ii) 서열 번호 12, 13, 11, 14 또는 15에 나타낸 아미노산 서열 중 어느 하나의 3개의 상보성 결정 영역 (CDR); 또는
(iii) 서열 번호 40에 나타낸 컨센서스 서열 또는
(iii) CDR1, CDR2 또는 CDR3의 아미노산 서열이 서열 번호 37, 38 또는 39에 나타낸 공통 서열 인 3개의 CDR.
일 실시예에서, CD83 결합 단백질은 다음을 포함하는 항원 결합 도메인을 포함한다:
(a) 다음을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH):
(i) 서열 번호 10으로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 서열; 또는
(ii) 서열 번호 10으로 표시되는 아미노산 서열의 3개의 상보성 결정 영역 (CDR); 과
(b) 다음을 포함하는 경쇄 가변 영역:
(i) 서열 번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 서열, 서열 번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 서열 및 서열 번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 서열.
일 실시예에서, CD83 결합 단백질은 다음을 포함하는 항원 결합 도메인을 포함한다:
(a) 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 서열, 서열 번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 서열 및 서열 번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 과
(b) 서열 번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 서열, 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 서열 및 서열 번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역.
일 실시예에서, CD83 결합 단백질은 서열 번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 서열 번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함하는 항원 결합 도메인을 포함한다.
일 실시예에서, CD83 결합 단백질은 WO2014/117220에 기재된 바와 같은 단일클론 항체 3C12C이다.
다양한 다른 실시예에서, CD83 결합 단백질은 다음을 포함하는 항원 결합 도메인을 포함한다:
(i) 서열 번호 10에 나타낸 바와 같은 VH 서열 및 서열 번호 12에 나타낸 바와 같은 VL 서열; 또는
(ii) 서열 번호 10에 나타낸 바와 같은 VH 서열 및 서열 번호 13에 나타난 바와 같은 VL 서열; 또는
(iii) 서열 번호 10에 나타낸 바와 같은 VH 서열 및 서열 번호 14에 나타난 바와 같은 VL 서열; 또는
(iv) 서열 번호 10에 나타낸 바와 같은 VH 서열 및 서열 번호 15에 나타낸 바와 같은 VL 서열; 또는
(v) 서열 번호 21에 나타낸 바와 같은 중쇄 서열 및 서열 번호 16에 나타낸 바와 같은 경쇄 서열; 또는
(vi) 서열 번호 21에 나타낸 바와 같은 중쇄 서열 및 서열 번호 17에 나타난 바와 같은 경쇄 서열; 또는
(vi) 서열 번호 21에 나타낸 바와 같은 중쇄 서열 및 서열 번호 18에 나타난 바와 같은 경쇄 서열; 또는
(vii) 서열 번호 21에 나타낸 바와 같은 중쇄 서열 및 서열 번호 19에 나타난 바와 같은 경쇄 서열; 또는
(viii) 서열 번호 21에 나타낸 바와 같은 중쇄 서열 및 서열 번호 20에 나타난 바와 같은 경쇄 서열; 또는
(ix) 서열 번호 22에 나타낸 바와 같은 VH 서열 및 서열 번호 23에 나타낸 바와 같은 VL 서열; 또는
(x) 서열 번호 22에 나타낸 바와 같은 VH 서열 및 서열 번호 24에 나타난 바와 같은 VL 서열; 또는
(xi) 서열 번호 22에 나타낸 바와 같은 VH 서열 및 서열 번호 25에 나타낸 바와 같은 VL 서열;
(xii) 서열 번호 22에 나타낸 바와 같은 VH 서열 및 서열 번호 26에 나타낸 바와 같은 VL 서열;
(viii) 서열 번호 22에 나타낸 바와 같은 VH 서열 및 서열 번호 27에 나타낸 바와 같은 VL 서열;
(viii) 서열 번호 22에 나타낸 바와 같은 VH 서열 및 서열 번호 28에 나타난 바와 같은 VL 서열;
(viii) 서열 번호 22에 나타낸 바와 같은 VH 서열 및 서열 번호 29에 나타낸 것과 같은 VL 서열;
(viii) 서열 번호 22에 나타낸 바와 같은 VH 서열 및 서열 번호 30에 나타낸 바와 같은 VL 서열;
(viii) 서열 번호 22에 나타낸 바와 같은 VH 서열 및 서열 번호 31에 나타난 바와 같은 VL 서열;
(viii) 서열 번호 22에 나타낸 바와 같은 VH 서열 및 서열 번호 32에 나타난 VL 서열;
(viii) 서열 번호 22에 나타낸 바와 같은 VH 서열 및 서열 번호 33에 나타낸 바와 같은 VL 서열; 또는
(viii) 서열 번호 22에 나타낸 VH 서열 및 서열 번호 34에 나타낸 VL 서열; 또는
(vix) 서열 번호 35에 나타낸 바와 같은 중쇄 서열 및 서열 번호 36에 나타낸 바와 같은 경쇄 서열.
하나의 측면에서, 서열 번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 서열 번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함하는 유효량의 CD83 결합 단백질을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 림프종을 치료하는 방법이 제공된다.
또 다른 측면은 서열 번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 서열 번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함하는 유효량의 CD83 결합 단백질을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 HL을 치료하는 방법을 제공한다.
또 다른 측면은 서열 번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 서열 번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함하는 유효량의 CD83 결합 단백질을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 외투 세포 림프종의 치료 방법을 제공한다.
또 다른 측면은 서열 번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 서열 번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함하는 유효량의 CD83 결합 단백질을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 DLBCL을 치료하는 방법을 제공한다.
본원에 기술된 항체의 경쇄 및 중쇄를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 예는 서열 41-59에 제시되어 있다.
서열 목록의 요약은 다음과 같다.
서열 번호 서열 설명
1 인간 CD83 이소형 a의 아미노산 서열
2 인간 CD83 이소형 b의 아미노산 서열
3 인간 CD83 이소형 c의 아미노산 서열
4 mAb 3C12.C의 중쇄 CDR 1의 아미노산 서열
5 mAb 3C12.C의 중쇄 CDR 2의 아미노산 서열
6 mAb 3C12.C의 중쇄 CDR 3의 아미노산 서열
7 mAb 3C12.C의 경쇄 CDR 1의 아미노산 서열
8 mAb 3C12.C의 경쇄 CDR 2의 아미노산 서열
9 mAb 3C12.C의 경쇄 CDR 3의 아미노산 서열
10 mAb 3C12.C의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열
11 mAb 3C12.C의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열
12 mAb 3C12의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열
13 mAb 3C12.B의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열
14 mAb 3C12.D의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열
15 mAb 3C12.E의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열
16 mAb 3C12의 경쇄의 아미노산 서열
17 mAb 3C12.B의 경쇄의 아미노산 서열
18 mAb 3C12.C의 경쇄의 아미노산 서열
19 mAb 3C12.D의 경쇄의 아미노산 서열
20 mAb 3C12.E의 경쇄의 아미노산 서열
21 mAb 3C12의 중쇄의 아미노산 서열
22 mAb 1F7의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열
23 mAb 1F7의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열
24 hFab4.1의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열
25 hFab4.2의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열
26 hFab4.3의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열
27 hFab4.4의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열
28 hFab4.5의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열
29 hFab4.7의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열
30 hFab4.8의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열
31 hFab4.9의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열
32 hFab4.10의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열
33 hFab4.12의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열
34 hFab4.18의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열
35 mAb 1F7의 중쇄의 아미노산 서열
36 mAb 1F7의 경쇄의 아미노산 서열
37 3C12의 CDR1의 VL 공통 서열의 아미노산 서열 및 유도체
38 3C12의 CDR2의 VL 공통 서열의 아미노산 서열 및 유도체
39 3C12의 CDR3의 VL 공통 서열의 아미노산 서열 및 유도체
40 3C12의 VL 공통 서열 및 유도체의 아미노산 서열
41 3C12 중쇄의 뉴클레오티드 서열
42 3C12 경쇄의 뉴클레오티드 서열
43 3C12.B 경쇄의 뉴클레오티드 서열
44 3C12.C 경쇄의 뉴클레오티드 서열
45 3C12.D 경쇄의 뉴클레오티드 서열
46 3C12.F 경쇄의 뉴클레오티드 서열
47 1F7 중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열
48 1F7 경쇄의 뉴클레오티드 서열
49 hFab4.1 경쇄의 뉴클레오티드 서열
50 hFab4.2 경쇄의 뉴클레오티드 서열
51 hFab4.3 경쇄의 뉴클레오티드 서열
52 hFab4.4 경쇄의 뉴클레오티드 서열
53 hFab4.5 경쇄의 뉴클레오티드 서열
54 hFab4.7 경쇄의 뉴클레오티드 서열
55 hFab4.8 경쇄의 뉴클레오티드 서열
56 hFab4.9 경쇄의 뉴클레오티드 서열
57 hFab4.10 경쇄의 뉴클레오티드 서열
58 hFab4.12 경쇄의 뉴클레오티드 서열
59 hFab4.18 경쇄의 뉴클레오티드 서열
실시예에 추가로 기재된 바와 같이, 본 발명자들은 또한 항-인간 CD83 단일클론 항체 및 그의 독소 접합체의 사멸 효과를 분석하고 비인간 영장류 시험에서 이들의 안전성을 시험하였다.
효과기 기능
일 실시예에서, CD83 결합 단백질은 효과기 기능을 유도할 수 있다.
본원에 기재된 바와 같이, "효과기 기능"은 항체가 결합된 세포를 사멸시키는 항체의 생물학적 활성 (예를 들어, Fc 영역에 결합하는 세포 또는 단백질에 의해 매개됨)을 지칭한다. 항체에 의해 유도된 효과기 기능의 예는 보체 의존적 세포 독성 (CDC); 항체-의존-세포-매개 세포 독성 (ADCC); 항체-의존성 세포-포식 작용 (ADCP); 및 B 세포 활성화를 포함한다.
"항체-의존-세포-매개 세포 독성" 또는 "ADCC"는 결합된 항체의 Fc 영역을 인식하는 Fc 수용체를 갖는 효과기 세포 (예를 들어, 자연살해("NK") 세포, 호중구 및/또는 대식세포)에 의한 항체-결합 표적 세포의 용해를 지칭한다. 관심있는 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위해, 시험관 내 ADCC 분석이 수행될 수 있다. 이러한 분석에 유용한 효과기 세포는 말초 혈액 단핵 세포 ("PBMC") 및 NK 세포를 포함한다.
한 실시예에서, CD83 결합 단백질은 ADCC 및/또는 CDC와 같은 효과기 기능을 유도할 수 있는 방식으로 세포 표면의 CD83에 결합한다.
다른 실시예에서, CD83 결합 단백질은 항체의 중쇄의 특정 아미노산의 변경 또는 항체 중쇄의 탄수화물 부분의 변경에 의해 효과기 기능의 유도를 개선하도록 조작되었다.
효과기 기능을 결정하는 방법은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 Hellstrom et al. Proc. Natl Acad. Sci. USA 83: 7059-7063, 1986 and Bruggemann et al., J. Exp. Med. 166: 1351-1361, 1987; US7317091; Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202: 163, 1996)에 기재되어 있다. 면역 글로불린에 의해 유도된 ADCC의 수준을 평가하기 위한 다른 분석은 유세포 분석을 위한 ACTI ™ 비 방사성 세포 독성 분석 (CellTechnology, Inc. CA, USA) 또는 CytoTox 96® 비 방사성 세포 독성 분석 (Promega, WI, USA)을 포함한다.
면역접합
일 실시예에서, CD83 결합 단백질은 면역 접합체이다. 본원에 사용된 면역 접합체는 치료 부분 및/또는 진단 부분과 같은 부분에 접합된 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다.
일 실시예에서, CD83 결합 단백질은 치료 부분를 포함하는 면역 접합체이다. 치료 부분은 질환의 치료에 유용한 화합물, 분자 또는 원자이다. 치료 부분의 예는 화학 독성제와 같은, 세포 독성제와 같은 약물; 프로아폽토시스제; 방사성 동위 원소; 면역 독소이다. 세포 독성제는 세포에 독성이 있는 화합물이다. 세포 독성제의 예는 독소루비신, 시클로포스파미드, 메토트렉세이트, 머스틴, 빈크리스틴, 프로카르자닌, 프레드니솔론, 블레오마이신, 빈블라스틴, 다카르바진, 시클로포스파미드, 프로카르바진, 파클리탁셀, 이리노테칸, 젬시타빈, 플루오로우라실, 시타라핀, 오조가미신, 아드리아미신, 에토포사이드, 멜팔란, 미토마이신 C, 클로라무일, 다우노루비신를 포함한다. 방사성 동위 원소의 예는 인-32, 구리-67, 비소-77, 로듐-105, 팔라듐-109,은-111, 주석-121, 요오드-125, 요오드-131, 홀륨-166, 루테튬-177, 레늄-186, 이리듐-194, 금-199, 아스타튬-211, 이트륨-90 및 비스무트-212를 포함한다. 면역 독소의 예는 for example, Wayne et al. (2016) Blood, 123: 2470-2477에 기재되어 있고, 예를 들어 다이프테리아 톡신 A, 리신-dgA, 슈도모나스 엑소톡신 A, 글로닌, 리포좀, 입자 또는 실제로 독소 전달을 포함한다.
일 실시예에서, CD83 결합 단백질은 진단 부분을 포함하는 면역 접합체이다. 진단 부분은 항체 또는 항원 결합 단편이 그의 표적 항원에 결합하는 것을 검출하는데 유용한 화합물, 분자 또는 원자이다. 진단 부분은 자기 공명 영상 (MRI) 또는 양전자 방출 단층 촬영 (PET)을 위해 조영제인 방사성 핵종 또는 비 방사선 핵 (예: 자기 공명 영상, 컴퓨터 단층 촬영 또는 초음파)을 포함할 수 있다. 진단 부분은 예를 들어, 방사성 동위 원소, 염료 (예: 비토인-스트렘타비딘 복합체와 같은), 조영제, 형광 화합물 또는 분자 및 강화제 (예: 상자성 이온)를 포함한다. 한 실시예에서, 진단 부분은 방사성 동위 원소, 자기 공명 영상에 사용하기 위한 증강제 및 형광성 화합물로 이루어진 군에서 선택된다. 항체 성분을 방사성 금속 또는 상자성 이온과 함께 로딩하기 위해, 이온 결합을 위한 다수의 킬레이트기가 부착된 긴 꼬리를 갖는 시약과 이를 반응시킬 필요가 있을 수 있다. 이러한 꼬리는 폴리라이신, 다당류, 또는 킬레이트 그룹 (예를 들어, 에틸렌다이아민테트라아세트산 (EDTA), 다이에틸렌트라이아민펜타아세트산 (DTPA), DOTA, NOTA, NETA, 포르피린, 폴리아민, 크라운 에테르, 비스-싸이오세미카르바존, 폴리옥심 및 이 목적에 유용한 것으로 알려진 유사한 기)에 결합 될 수 있는 펜던트 그룹을 갖는 다른 유도체화되거나 유도체화 가능한 사슬과 같은 중합체일 수 있다. 킬레이트는 표준 화학을 사용하여 항체에 결합된다. 킬레이트는 일반적으로 면역 반응성의 최소 손실 및 최소 응집 및/또는 내부 가교로 분자에 대한 결합의 형성을 가능하게 하는 기에 의해 항체에 연결된다.
치료 및 진단 부분을 항체 또는 항원 결합 단편에 접합시키는 방법은 당업계에 공지되어 있다.
본원에 기재된 CD83 결합 단백질은 전형적으로 대상체에게 투여하기 위한 제약 조성물로 제제화된다. 전형적으로, 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체로 제형화된 CD83 결합 단백질을 포함한다. "제약상 허용되는 담체"는 이것이 조성물의 다른 성분과 상용성이고 대상체에게 해롭지 않음을 의미한다. 상기 조성물은 제약 제제 분야에 잘 알려진 기술과 같은 기술에 따라 예를 들어, 통상적인 액체 비히클 또는 희석제, 및 원하는 투여 방식 (예를 들어, 부형제, 결합제, 보존제, 안정제, 향료 등)에 적합한 유형의 제약 첨가제를 사용함으로써 하기 기재된 다른 치료제를 함유할 수 있으며, 공식화될 수 있다(예를 들어, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Ed., 2005, Lippincott Williams & Wilkins 참조).
CD83 결합 단백질을 포함하는 약제학적 조성물은 전형적으로 멸균 주사용 수성 현탁액의 형태이다. 이 현탁액은 공지된 기술에 따라 제형화될 수 있고 활성 물질을 수성 현탁액의 제조에 적합한 부형제와 혼합하여 함유한다. 이러한 부형제는 현탁제, 예를 들어 소듐 카르복시메틸셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 하이드록시-프로필메틸셀룰로오스, 소듐 알기네이트, 폴리비닐-피롤리돈, 검 트라가칸스 그리고 검 아카시아를 포함할 수 있다; 분산제 또는 습윤제는 자연 발생 포스파타이드 (예를 들어, 레시틴) 또는 지방산과 알킬렌 옥사이드의 축합 생성물 (예를 들어, 폴리옥시에틸렌 스테아레이트) 또는 에틸렉 옥사이드와 장사슬 지방족 알코올의 축합 생성물 (예를 들어, 헵타데카에틸렌옥시세타놀) 또는 에틸렌 옥사이드와 지방산 및 헥시톨로부터 유도된 부분 에스테르와의 축합 생성물 (예를 들어, 폴리옥시에틸렌 소비톨 모노올레아트) 또는 에틸렌 옥사이드와 지방산 및 헥시톨 무수물로부터 유도된 부분 에스테르와의 축합 생성물 (예를 들어, 폴리에틸렌 소르비탄 모노올레아트)일 수 있다. 수성 현탁액은 또한 하나 이상의 보존제 (예를 들어, 에틸, 또는 n-프로필, p-하이드록시벤조에이트, 하나 이상의 착색제, 하나 이상의 향미제, 및 수크로스 또는 사카린과 같은 하나 이상의 감미제) 를 함유할 수 있다.
멸균 주사용 제제는 또한 비 독성 비경구적으로 허용되는 희석제 또는 용매, 예를 들어 1,3- 부탄디올 중의 용액으로서 멸균 주사용 용액 또는 현탁액일 수 있다. 사용될 수 있는 허용되는 비히클 및 용매 중에는 물, 링거액 및 등장성 염화나트륨 용액이 있다. 또한, 멸균 고정 유가 용매 또는 현탁 매질로서 통상적으로 사용된다. 이를 위해, 합성 모노글리세라이드 또는 디글리세라이드를 포함하는 임의의 블랜드 고정유가 사용될 수 있다. 또한, 올레산과 같은 지방산은 주사용 제제의 제조에 사용된다.
약제학적 조성물은 임의의 적합한 수단, 전형적으로 비경구로 (예를 들어, 피하, 정맥 내, 근육 내, (내) 경피 내, 또는 체외 주사 또는 주입 기술 (예를 들어, 멸균 주 사용 수용액 또는 현탁액))에 의해 투여될 수 있다; 비독성의 약제학적으로 허용되는 비히클 또는 희석제를 함유하는 투여 단위 제형으로. CD83 결합 단백질은 예를 들어 즉시 방출 또는 연장 방출에 적합한 형태로 투여될 수 있다. 즉시 방출 또는 연장 방출은 화합물을 포함하는 적합한 약제학적 조성물의 사용, 특히 연장 방출의 경우 피하 임플란트 또는 삼투 펌프와 같은 장치의 사용에 의해 달성될 수 있다.
대상체에게 투여하기 위한 제약 조성물은 편리하게 투여 단위 형태로 제공될 수 있고 제약 분야에 널리 공지된 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 일반적으로, 약학 조성물은 화합물을 액체 담체와 균일하고 친밀하게 가져옴으로써 제조된다. 약제학적 조성물에서, 활성 화합물은 질환의 과정 또는 상태에 대해 원하는 효과를 생성하기에 충분한 양으로 포함된다. 본원에 사용된 용어 "조성물"은 특정 성분을 특정 양으로 포함하는 제품뿐만 아니라 특정 성분을 특정 양으로 조합하여 직접 또는 간접적으로 생성되는 임의의 제품을 포함한다.
일반적으로, 용어 "치료하는" 은 원하는 약리학적 및/또는 생리학적 효과를 얻기 위해 대상체, 조직 또는 세포에 영향을 미치는 것을 의미하며, 다음을 포함한다: (a) 질환에 걸리기 쉽지만 아직 진단을 받지 않은 대상에서 질환이 발생하는 것을 방지하는 것; (b) 질병을 억제하는 것, 즉 그 진행을 저지하는 것; 또는 (c) 질병의 영향을 완화시키거나 완화시키는 것, 즉 질병의 영향을 회귀시키는 것. 한 실시예에서, 치료는 수용자 대상체에서 악성 림프구의 수를 감소시킨 결과를 달성한다.
용어 "대상체"는 본 방법에 의한 치료를 필요로 하는 질환을 갖는 임의의 동물을 지칭한다. 인간과 같은 영장류 외에, 다양한 다른 포유 동물이 본 발명의 방법을 사용하여 치료될 수 있다. 예를 들어, 소, 양, 염소, 말, 개, 고양이, 기니피그, 쥐 또는 다른 소, 양, 말, 개, 고양이, 설치류 또는 쥐과 같은 포유 동물을 치료할 수 있다.
"유효량"이라는 용어는 연구원, 수의사, 의사 또는 다른 임상의가 찾는 조직, 시스템, 동물 또는 인간의 생물학적 또는 의학적 반응을 유발할 CD83 결합 단백질의 양을 의미한다.
림프종의 치료 또는 예방에서, 적절한 투여량 수준은 일반적으로 투여량 당 환자 체중 kg 당 약 0.01 내지 50mg일 것이다. 바람직하게는, 투여량 수준은 투여 당 약 0.1 내지 약 25mg/kg이고; 보다 바람직하게는 용량 당 약 0.5 내지 약 10 mg/kg. 적합한 투여량 수준은 용량 당 약 0.01 내지 25mg/kg, 용량 당 약 0.05 내지 10mg/kg, 또는 용량 당 약 0.1 내지 5mg/kg일 수 있다. 이 범위 내에서, 투여량은 투여 당 0.05 내지 0.5, 0.5 내지 5 또는 5 내지 5mg/kg일 수 있다. 복용량은 한 번 또는 여러 번 투여될 수 있다. 임의의 특정 환자에 대한 특정 용량 수준 및 용량의 빈도는 변할 수 있고 사용된 특정 화합물의 활성, 대사 안정성 및 해당 화합물의 작용 시간, 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 식이, 투여 방식 및 투여 시간, 배설 속도, 약물 조합, 특정 상태의 중증도 및 요법을 받는 숙주을 포함한 다양한 인자에 의존할 것으로 이해될 것이다.
일부 예에서, CD83 결합 단백질 또는 다른 활성 성분이 초기에 후속 용량에 사용되는 것보다 더 낮은 용량으로 투여되는 용량 증가 요법이 사용된다. 이 투여량 요법은 대상체가 초기에 부작용을 겪는 경우에 유용하다.
치료에 적절하게 반응하지 않는 대상체의 경우, 일주일에 여러번 투여될 수있다. 대안적으로 또는 추가로, 증가하는 용량이 투여될 수 있다.
하나 이상의 CD83 결합 단백질은 단독으로 또는 다른 약물 또는 제제와 함께 (전, 동시 또는 후) 적절한 경로에 의해 대상에게 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 개시 내용의 CD83 결합 단백질은 예를 들어, 림프종의 치료에 전형적으로 사용되는 하나 이상의 화학 요법 제와 같은 하나 이상의 제제와 조합하여 투여될 수 있다. 림프종의 치료에 적합한 화학 요법 제의 예는 독소루비신, 블레오마이신, 빈블라 스틴, 데카르바진, 에토포시드, 시클로포스파미드, 빈크리스틴, 프로카르바진, 카르무스틴, 에토포시드, 시타라빈, 멜팔란, 클로람부실, 젬시타비브, 시플라틴 또는 이들의 조합을 포함한다. 림프종 치료를 위한 화학 요법 제 조합물에는 ABVD (독소루비신, 블레오마이신, 빈블라스틴 및 다카바진), ChlVPP (클로불부실, 빈블라스틴, 프로카르바진 및 프레드니손), ESHAP (에토포시드, 메틸프레드니솔론, 시타라빈 및 시스테플라틴), BEAM (카르무스틴, 에토포시드, 사이타라빈 및 멜팔란), BEACOPP (블레오마이신, 에토포시드, 독소루비신, 시클로포스파미드, 빈크리스틴, 프로카르바진 및 프레드니솔론)을 포함한다.
일부 실시예에서, CD83 결합 단백질은 림프종의 치료에 효과적일 수 있는 하나 이상의 다른 결합 단백질과 조합하여 투여될 수 있다. 예를 들어, CD83 결합 단백질은 PD-1 및/또는 항-PD1 및/또는 항-PD-L1 항체와 같은 PD-L1 결합 단백질과 조합하여 (전, 동시 또는 후) 투여될 수 있다. 항-PD1 또는 항-PD-L1 항체의 예는 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 니볼루맙 (Bristol-Myers Squibb), 펨브롤리주맙 (Merck) 및 아테졸리주맙 (Roche)을 포함한다.
진단 및 평가
CD83 결합 단백질은 림프종을 진단 또는 평가하는데 사용될 수 있다.
한 측면에서, 본 발명은 대상체의 혈청에서 sCD83의 수준을 결정하는 것을 포함하여 대상체에서 림프종을 진단하는 방법을 제공한다. 림프종으로 고통받는 대상체의 혈청에서 sCD83의 수준은 림프종으로 고통받지 않는 대상체에서 CD83의 수준에 비해 상승된다.
또 다른 측면은 대상체의 혈청에서 sCD83의 수준을 결정하고 대상체의 혈청에서 sCD83의 수준을 림프종으로 고통받지 않거나 알려진 중증의 림프종으로 고통받지 않는 대상체에서의 sCD83의 수준과 비교하는 것을 포함하는, 림프종의 중증도 또는 단계를 진단 또는 평가하는 방법을 제공한다.
추가 측면은 치료 전, 치료 중 및/또는 치료 후 피험자의 혈청에서 sCD83의 수준을 결정하고, 치료 전 sCD83 수준으로 치료 전, 치료 중 및/또는 후에 sCD83의 수준을 비교하는 것을 포함하여, 대상체가 림프종 치료에 반응하는지 여부를 결정하는 방법을 제공한다. 여기서, 대상체는 치료 중 및/또는 후에 sCD83의 수준이 치료 전 sCD83의 수준에 비해 감소될 때 치료에 반응하고 있다.
실시예에 기재된 바와 같이:
-CD83 항체는 HL 림프절 생검 샘플에서 종양 세포에 결합하고;
-HL 환자의 혈청은 분비 CD83 (sCD83)을 함유하고;
-환자의 혈청에서 sCD83의 수준은 임상 반응에 해당한다.
본 발명자들은 환자의 혈청에서 분비 된 CD83의 수준이 림프종의 중증도와 관련이 있음을 발견하였다. 실시예에 기술된 바와 같이, 호지킨 림프종을 앓고 있는 대상체는 림프종을 앓지 않는 대상체와 비교하여 높은 수준의 sCD83을 나타낸다. 또한, 호지킨 림프종을 앓고있는 대상체는 치료 후 sCD83 혈청 수준과 비교하여 화학 요법 치료 전 림프종을 감소시키기 위해 혈청에서 sCD83의 수준이 더 높으며, 이는 혈청 sCD83의 감소가 질병 중증도와 관련이 있음을 나타낸다.
본 발명의 CD83 결합 단백질, 예를 들어, 본원에 논의된 바와 같이 검출 가능한 표지에 접합된 CD83 결합 단백질을 사용하여 하기 분석을 수행할 수 있다. 본원에 기재된 분석법에 의한 CD83의 검출은 상태를 진단 또는 예후에 유용하다.
면역 분석은 대상체의 상태를 진단하거나 샘플에서 CD83을 검출하기 위한 예시적인 분석 포맷이다. 본 개시 내용은 웨스턴 블롯팅, 효소-결합 면역 흡착 분석 (ELISA), 형광-연결 면역 흡착 분석 (FLISA), 경쟁 분석, 방사선 면역 분석, 측면 흐름 면역 분석, 통과 면역 분석, 전기 화학 발광 분석, 네필로메트릭 기반의 분석, 탁도계 기반 분석 및 형광 활성화 세포 분류 (FACS) 기반 분석을 고려한다.
적합한 면역 분석의 한 형태는 예를 들어 ELISA이다.
한 형태에서, 이러한 분석은 CD83 결합 단백질을 고체 매트릭스, 예를 들어 폴리스티렌 또는 폴리카보네이트 마이크로웰 또는 딥스틱, 막 또는 유리 지지체 (예를 들어, 유리 슬라이드) 상에 고정시키는 것을 포함한다. 이어서 시험 샘플을 CD83 결합 단백질과 직접 접촉시키고 샘플 중의 CD83을 결합시키거나 포획한다. 샘플에서 결합되지 않은 단백질을 제거하기 위해 세척 한 후, 별개의 에피토프에서 CD83에 결합하는 단백질은 포획된 CD83과 직접 접촉하게 된다. 이 검출기 단백질은 일반적으로 ELISA의 경우 예를 들어 효소 (예를 들어, 고추냉이 퍼옥시다제 (HRP), 알칼리성 포스파타제 (AP) 또는 β-갈락토시다제와 같은 검출 가능한 리포터 분자로 표지된다. 대안적으로, 검출기 단백질에 결합하는 제 2 표지된 단백질이 사용될 수 있다. 결합되지 않은 단백질을 제거하기 위해 세척한 후, 검출 가능한 리포터 분자는 과산화수소, TMB, 또는 톨루이딘, 또는 5-브로모-4-클로로-3-인돌-베타-D-갈락토피라노사이드 (x-gal) 와 같은 ELISA의 경우 기질의 첨가에 의해 검출된다. 물론, 고정화된 (캡처) 단백질 및 검출기 단백질은 반대 방식으로 사용될 수 있다.
그 후, 샘플에서 항원의 수준은 공지된 양의 마커를 사용하여 또는 표준 샘플과 비교하여 생성된 표준 곡선을 사용하여 결정된다.
상기 기재된 분석법은 검출의 기초로서 화학 발광 또는 전기 화학 발광을 사용하도록 쉽게 변형된다.
당업자에게 명백한 바와 같이, 면역 흡착제 분석에 기초한 다른 검출 방법이 본 발명의 성능에 유용하다. 예를 들어, 검출을 위한 방사성 표지, 또는 검출을 위한 금 표지 (예를 들어, 콜로이드성 금), 또는 검출을 위한 NAD+를 캡슐화하는 리포좀 또는 아크리디늄 연결 면역 흡착 분석법을 사용하여 상기 설명에 기초한 면역 흡착 방법이 있다. 본 개시 내용의 일부 예에서, CD83의 수준은 표면 플라즈몬 공명 검출기 또는 생체 발광법 (예를 들어, BIAcore™, GE Healthcare, Piscataway, N.J.), 예를 들어 US7205159에 기재된 유동 통과 장치, 마이크로 또는 나노 면역 분석 장치 (예를 들어, US7271007에 기술됨), 측면 유동 장치 (예를 들어, US20040228761 또는 US20040265926에 기술됨), 형광 분극 면역 분석 (FPIA, 예를 들어 US4593089 또는 US4751190에 기술됨) 또는 면역 투과법 분석 (예를 들어, US5571728 또는 US6248597에 기술됨)을 사용하여 측정된다.
림프종을 진단 또는 평가하는 방법은 림프종을 치료하는 단계를 추가로 포함 할 수 있다. 한 실시예에서, 림프종은 본원에 기재된 림프종의 치료 방법을 사용하여 치료된다.
본원에는 본원에 기술된 CD83 결합 단백질을 포함하고, 전형적으로 림프종의 치료 또는 진단을 위한 설명서를 포함하는 키트가 개시된다. 한 실시예에서, 키트는 하나 이상의 용기에 CD83 결합 단백질을 포함한다. 다른 실시예에서, 키트는 본원에 기재된 CD83 결합 단백질을 하나 이상의 용기 및 림프종의 치료에 유용한 하나 이상의 다른 치료제를 포함한다. 다른 실시예에서, 키트는 본원에 기술된 CD83 결합 단백질을 하나 이상의 용기 및 하나 이상의 다른 진단 부분에 포함한다.
본 명세서 전체에서, 달리 구체적으로 언급되지 않거나 문맥상 달리 요구되지 않는 한, 단일 단계, 물질의 조성, 단계의 집단 또는 물질의 군의 구성은 이들 단계, 물질 조성, 단계 그룹 또는 물질 조성 그룹 중 하나 및 복수 (즉, 하나 이상)를 포함하는 것으로 간주되어야 한다. 따라서, 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 단수 형태 "a", "an"및 "the"는 문맥상 명백하게 다르게 지시하지 않는 한 복수의 측면을 포함한다. 예를 들어, "a"는 단일뿐만 아니라 둘 이상을 포함하고; "an"에 대한 언급은 단일뿐만 아니라 둘 이상을 포함하고; "the"에 대한 언급은 단일 및 둘 이상 등을 포함한다.
표현 언어 또는 필요한 의미로 인해 문맥상 달리 요구되는 경우를 제외하고, 본 명세서 전체에서 "포함하다"또는 "포함하다"또는 "포함하는"과 같은 변형은 포괄적인 의미로 사용된다. 즉 언급된 특징의 존재를 명시하기 위해, 그러나 본 발명의 다양한 실시 예에서 추가 특징의 존재 또는 추가를 배제하지는 않는다.
본 명세서에 기재된 본 개시의 각각의 예는 달리 구체적으로 언급되지 않는 한 각각의 모든 다른 예에 준용된다.
당업자는 본 명세서의 개시가 구체적으로 기술된 것 이외의 변형 및 수정에 영향을 받기 쉽다는 것을 이해할 것이다. 본 개시는 이러한 모든 변형 및 수정을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 개시 내용은 또한 본 명세서에서 언급되거나 지시된 모든 단계, 특징, 조성물 및 화합물, 개별적으로 또는 집합적으로, 및 임의의 및 모든 조합 또는 상기 단계 또는 특징 중 임의의 둘 이상을 포함한다.
본 개시는 단지 예시의 목적으로 의도된 본 명세서에 기술된 특정 예에 의해 범위가 제한되지 않아야 한다. 기능적으로 동등한 제품, 조성물 및 방법은 본원에 기술된 바와 같이 본 발명의 범주 내에 명확하게 포함된다.
실시예
재료 및 방법
림프종 조직 섹션 및 혈장 샘플
최초 진단시 35HL, 20DLBCL 및 21MCL 환자로부터 얻은 보관 파라핀 삽입 림프절 생검은 헬싱키 선언과 일치하는 시드니 지역 보건 지구 (SLHD) 인간 연구 윤리위원회 (HREC)의 승인 후 분석되었다. 35명의 HL 환자는 WHO/REAL 분류 하에서 결절성 경화증, 혼합 세포성, 림프구가 풍부한 고전, 불특정 고전 또는 결절성 림프구 우세 HL의 조직학적 진단을 받았다 (Swerdlow et al. Blood 2016; 127(20): 2375-2390). 진단 및 화학 요법 동안 6명의 HL 및 3명의 DLBCL 환자로부터 수집된 혈장 샘플은 SLHD HREC에 의해 승인되었다. 양전자 방출 단층 촬영 (PET) 스캔은 HL 환자에서 2-3주기의 치료 후에 수행되었다. MCL 세포주 Mino (ATCC® CRL3000TM)는 ATCC로부터 구입하였다. DLBCL 라인 Karpass-1106p는 Cellbank Australia에서 구입했다.
인간 혈액 세포 및 세포주 배양
SLHD HREC의 승인 하에 건강한 공여자 (HD)로부터 정맥혈을 수집하였다. 인간 PBMC를 Ficoll-Paque-PLUS (GE Healthcare)에서 원심 분리하여 분리하였다. 공급 업체의 지침에 따라 EasySep Human T 세포 분리 키트 (STEMCELL Technologies)를 사용하여 PBMC에서 T 세포를 분리했다. 이 연구에 사용된 세포주는 HL 세포주 KM-H2, L428 및 HDLM-2 (독일 쾰른 대학 Volker Diehl 교수의 선물)였다. HL-60 세포주는 크라이스트 처치 혈액학 연구 그룹 (Christchurch Hematology Research Group)으로부터 얻었다. 10% 태아 송아지 혈청, 2mM 글루타맥스™, 100U/ml 페니실린, 100μg/ml 스트렙토마이신, 1mM 소듐 피루베이트, 10mM HEPES, 10μM β-머캅토에탄올 (Thermo Fisher Scientific)을 함유하는 완전한 RPMI 배지를 실험 내내 세포 배양에 사용하였다.
유세포 분석
다음의 항체가 사용되었다: CD3-Alexa Fluor (AF)700, CD4-Phycoerythrin (PE)-CF594, CD15-Violet (V)450, CD19-V450, CD20-V421, CD30-PE, CD40-PE-Cy7, CD279 (PD-1)-Brilliant Violet (BV)786, CD274 (PD-L1)-PE-Cy7 (모두 BD Biosciences), CD25-BV421 및 CD107-PE-Cy7 (Biolegend). 마우스 항-인간 CD83 단일 클론 항체 (mAbs), HB15a-Fluorescein Isothiocyanate (FITC)는 Beckman and Coulter에서, HB15e-FITC는 BD Biosciences에서 얻었다. 3C12C는 파지 디스플레이 라이브러리로부터 선택되고 친화성을 개선하기 위해 경쇄 셔플링에 의해 추가로 조작 된 인간 IgG1 항-인간 CD83 mAb이다 (WO2014/117220에 기재됨). 이소 타입 대조군 항체는 마우스 IgG1 카파-FITC, 마우스 IgG2b-FITC (BD Biosciences) 및 인간 IgG1 카파(Sigma Aldrich)를 포함하였다. 데이터를 Fortessa X20 유세포 분석기 (BD Biosciences)에서 수집하고 FlowJoV9 & 10 소프트웨어 (TreeStar)로 분석했다.
면역 형광 염색
KM-H2, L428 또는 HDLM-2 세포 (105 세포)를 라이신 코팅된 현미경 슬라이드 상에 세포 방사시켰다. 세포를 고정하고 밤새 -20 ℃에서 아세톤으로 투과시켰다. 이어서 PBS/1 % BSA에서 재수화시키고 10% 염소 혈청 (Sigma Aldrich)으로 차단하였다. 세포는 1 차 항체: HB15a (Bechman and Coulter), HB15e (STEMCELL Technologies) 또는 3C12C 항-CD83 항체에 이어 염소 항-마우스 IgG-AF647 (HB15a, HB15e) 또는 염소 항-인간 IgG-AF488 3C12C의 경우) (Thermo Fisher Scientific)로 염색되었다. 핵을 4', 6-디아미디노-2-페닐인돌 이염산염 (DAPI, Thermo Fisher Scientific)으로 염색하였다. 레이저 주사공초점 현미경 (Leica SP8) 및 Image J (National Institutes of Health)를 사용하여 생성된 합성 이미지를 사용하여 세포를 시각화하였다.
면역 조직 화학
면역 조직 화학 이중 염색은 HL, MCL 또는 BLBCL 환자 또는 비인간 영장류로부터의 인간 림프절의 포르말린 고정 파라핀 매립 생검 조직의 3μm 섹션에서 수행되었다. 사용된 주요 항체는 마우스 항-인간 CD20 (Dako), CD83 mAb (F5, Santa Cruz Biotechnology), CD30 (Dako)이고, 염색은 3,3'-디아미노벤지딘 (DAB)으로 시각화하기 위해 본드 폴리머 리파이너 검출 키트를 사용하여 라이카 본드 III 오토 테이너 (Leica Biosystems)에서 수행되었다. Olympus labSens 소프트웨어 (Olympus)를 사용하여 Olympus PP71 카메라로 Olympus BX51 현미경으로 이미지를 촬영했다.
트로고시토시스 (Trogocytosis) 분석
KM-H2 세포를 1:5의 비로 4시간 동안 인간 PBMC로부터 정제된 CD3+ T 세포와 함께 배양하였다. T 세포에서의 CD83 발현은 HB15a mAb를 사용하는 유세포 분석에 의해 분석되었다. 형광 이미징을 위해, KM-H2 세포를 CellVue Claret Far Red 형광 세포 링커 키트 (Sigma-Aldrich)로 라벨링하고 5:1의 비율로 4시간 동안 CD3+ T 세포와 공배양하였다. 이어서, 세포를 비오티닐화된 마우스 항-인간 CD3 mAb (BD Bioscience) 및 스트렙다비닌-AF488 (Thermo Fisher Scientific)로 염색하였다. 일부 실험에서, 배양 동안 0.4μm 트랜스웰 삽입물 (Corning)을 사용하여 T 세포를 KM-H2 세포로부터 분리하였다. T 세포에서의 CD83 발현은 4시간 배양 후 유세포 분석에 의해 분석되었다.
T 세포 증식 분석
인간 PBMC로부터 단리된 T 세포를 5nM 카르복시플루오레세인 N-히드록시숙신이미딜 에스테르 (CFSE; Sigma-Aldrich)로 표지하고 5일 동안 KM-H2으로부터의 상청액 존재하에 항-CD2/CD3/CD28 T 세포 활성화/팽창 키트 (Miltenyi Biotec)로 자극하였다. 세포는 Fortessa (BD Bioscience)상에서 유세포 분석에 의해 분석되었다. 증식 지수 (PI) 및 분할 지수 (DI)는 FlowJo V9 (TreeStar)로 분석되었다.
sCD83 및 IL-10 분석
KM-H2, L428의 배양 상청액 또는 HL 환자의 혈청 중 인간 sCD83을 3.9pg / ml의 검출 한계를 갖는 제조사의 지시에 따라 ELISA (Sino Biological Inc)에 의해 분석하였다. 간략하게, 96 웰 플레이트를 제공된 CD83 포획 mAb로 밤새 코팅하였다. 배양 상청액, 환자 혈장 또는 재조합 CD83-Fc 표준 (sCD83 ELISA 키트로부터)을 2시간 동안 배양하고, 마이크로플레이트 리더 (PerkinElmer)에서 450nM에서 읽히는 마우스 항-인간 CD83-HRP 및 테트라메틸벤지딘 (Sigma-Aldrich) 기질 용액을 사용하여 sCD83을 검출하였다. 세포주 상청액 중의 IL-10 수준을 세포 계량 비드 어레이 (CBA; BD Bioscience)로 분석하였다.
항체 의존성 세포 세포 독성 (ADCC) 분석
KM-H2, L428 또는 HDLM-2 세포를 표적 세포로 사용하고 30분 동안 37℃에서 25μM 칼세인-AM (Life Technologies)으로 표지하고 인간 PBMC를 효과기 세포로 사용하였다. 25:1의 E:T 비에서 효과기 세포 및 표적 세포 (웰 당 5x103)를 다양한 농도의 3C12C와 함께 37℃에서 3시간 동안 3배 배양하거나 또는 항-CD20 항체인 Rituximab (Roche)을 대조 배양하였다. ELISA Reader (Perkin Elmer)를 사용하여 방출된 칼세인 (여기 485nm, 방출 538nm)을 측정하기 위해 상청액을 수집하였다. 특이적 세포 분해의 백분율은 다음의 공식을 사용하여 계산되었다: 특이적 용해 백분율 = [E/T (샘플)-E/T (자발적)]/[T (전체)-T (자발적)] x 100, 여기서 T (자발적) = 표적만, E/T (자발적) = 효과기 + 표적, T (전체) = 표적 + 용해.
모노메틸 아우리스타틴 E (3C12C-MMAE)와 3C12C 컨쥬게이션 및 CD83+ 세포주에서의 세포 독성
3C12C-MMAE를 생산하기 위해, 리소좀 카텝신 B 절단성 자가-절발 디펩티드 (ValCit) 말레이미드 링커를 아우리스타틴 E로부터 Brentuximab Vedotin28과 유사한 방법을 사용하여 부분적으로 환원된 3C12C로 접합시키기 위해 아우리스타틴 E로부터 제조하였다. HL 세포에서 3C12C-MMAE의 세포 독성 활성을 3일 동안 CD83+ 림프종 세포 또는 CD83- (특이성을 위해) HL-60 세포주와 다양한 농도의 컨쥬게이트를 배양함으로써 시험관 내에서 분석하였다. 유세포 분석법을 사용하여 7-아미노-액 티노마이신 D (7AAD, Thermo Fisher Scientific) 염색에 의해 생존성을 평가하였다.
PCR 분석
RNA를 TRIzol (Life Technologies)로 추출하고 cDNA를 제조업체의 프로토콜에 따라 SuperScript® III First-Strand Synthesis 키트 및 랜덤 6량체 프라이머 (Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 100ng RNA에서 전사했다. 특정 면역 집단으로부터의 cDNA를 인간 CD83 엑손 2 정방향 프라이머 5'-AGGTTCCCTACACGGTCTCC-3' 및 엑손 5 역 프라이머 5'-AAGATACTCTGTAGCCGTGCAAAC-3'을 사용하여 PCR에 의해 증폭시켰다. GAPDH 하우스 키핑 유전자 5'-ATGGGGAAGGTGAAGGTCGGA-3'(forward) 및 5'-AGGGGCCATCCACAGTCTTCTG-3' (reverse)에 대한 프라이머를 내인성 대조군으로 사용하였다. 증폭된 단편을 2% 아가로스 (Thermo Fisher Scientific) 겔에서 분리하였다.
비인간 영장류에서의 3C12C 시험
SLHD 동물 연구 윤리위원회는 5명의 비인간 영장류 (Papio Hamadryas baboon)에 대한 연구를 승인했으며, 이 연구는 0, 7, 14, 21일에 정맥 내 인간-IgG (Intragam, CSL) (10mg/kg) 또는 3C12C mAb (1, 5, 10, 10mg/kg)를 받는 것이다. CELL-DYN 사파이어 자동 혈액 카운터 (Abbott)를 사용하여 혈액 계수를 수행하였다. PBMC는 Fortessa X20 유세포 분석기 (BD Biosciences)에서 DC, T 및 B 세포를 포함하는 면역 세포 집단에 대해 분석되었다. Cobas 8000 (Roche)을 사용하여 56 일까지 매주 수집된 혈청 샘플에서 ALP, AST 및 크레아티닌 (Cr)을 측정하여 간 및 신장 기능을 평가하였다. 면역 조직학적 염색을 위해 28일에 3C12C (10mg/kg) 또는 인간 IgG (10mg/kg) 처리된 동물로부터 림프절을 취하였다.
통계 분석
통계 분석은 Prism 6.0 (GraphPad Software)을 사용하여 수행되었다. 달리 명시되지 않는 한 평균의 표준 오차가 표시된다. 다중-비교를 위해 온실-가이저 보정을 갖는 Mann-Whitney t-검정 또는 일원 분산 분석 검정을 설명된대로 사용하였다. p <0.05와의 차이는 유의한 것으로 간주되었다.
결과
1. HL 환자의 림프절 생검에서의 HL 세포주 및 HRS에서 CD83이 발현됨
마우스 항-인간 항체 HB15a, HB15e 및 잠재적 치료용 인간 항-인간 CD83 항체 3C12C를 사용하여 CD83의 발현을 분석하였다. CD83의 발현은 KM-H2, L428 및 HDLM-2 림프종 세포주에서 유세포 분석에 의해 분석되었고, 이들은 각각 HB15a-FITC, HB15e-FITC 또는 3C12C-FITC 항-CD83 mAb로 염색되었다. KM-H2 세포는 모든 항체로 염색된 대부분의 세포 표면 CD83을 발현하는 반면, L428 및 HDLM-2 라인은 CD83을 덜 발현하였다. 세 라인 모두 CD30을 나타냈다 (도 1A). CD15, CD25, CD40 및 CD274 (PD-L1)는 KM-H2 세포에서 발현되었다 (도 1B). 이 데이터는 KM-H2 세포에서 공초점 CD83 염색 및 3 개의 HL 라인에서 RT-PCR에 의한 CD83 mRNA 전사체의 검출에 의해 확인되었다 (도 8).
다음으로, 35 명의 HL 환자의 파라핀 매립 림프절 생검에서 CD83 발현을 분석하였다. HRS 세포는 CD30+로 확인되었다 (도 2A). HL 환자의 8/35 (22.9 %) 생검은 HRS 세포에서 높은 수준의 CD83을 발현하고 (> 90 % 양성), 21/26 (60 %)은 중간 수준 (10-90 % 양성), 그리고 6/35 (17.1 %)는 낮은 수준의 CD83 (<10 % 양성)을 나타냈다 (도 2C). 아형 분석은 결절성 경화증 (NS) HL에서 81%의 HRS 세포가 CD83 높거나 보통이고 85.7%는 혼합된 세포성 (MC) HL에서 CD83 높거나 보통임을 나타냈다. 단계 I-II HL의 대부분 (90%)은 CD83 높거나 중간 정도였고, 단계 III-IV에서 61.5 % HL은 CD83 높거나 중간 정도였다.
CD83 발현은 또한 MCL 및 DLBCL 환자의 파라핀 매립 림프절 생검에서 분석되었다. DLBCL 환자의 생검은 높은 수준의 CD83 및 CD20 및 낮은 수준의 CD3의 발현을 나타냈다 (도 2B). 맨틀 세포 림프종 환자로부터의 생검은 또한 높은 수준의 CD83의 발현을 보여주었다 (도 13).
CD83은 HL 세포에서 T 세포로 트로고시토시스됨 (trogocytosed)
우리는 CD83이 트로고시토시스 (trogocytosis)를 통해 DC 막에서 T 세포로 전달될 수 있음을 이전에 발견했다 (Ju X et al. Journal of immunology 2016; 197 (12) : 4613-4625). HL 세포주와 T 세포 사이에서 유사한 트로고시토시스 (trogocytosis)가 관찰되었다. 이들 두 세포 유형이 4시간 동안 공동 배양된 경우, CD83 표면 발현은 T 세포에서 5-12 % 사이로 증가하였고 (도 3A; p = 0.004), 반면 CDM은 KM-H2 세포의 부재하에 T 세포에서 검출되지 않았다. 또한, 배양중 T 및 KM-H2 세포를 0.4㎛ 트랜스웰 필터에 의해 분리하면 트로고시토시스 (trogocytosis)가 방지되었다 (도 3B). 막 전송을 포함하는 트로고시토시스 (trogocytosis)를 확인하기 위해 KM-H2 세포는 형광 염료 (CellVue Claret)로 표시되고, CD3+ T 세포와 공동 배양되었다. KM-H2 세포에서 T 세포로의 세포막 전이는 유세포 분석법 (도 3C) 및 공초점 현미경에 의해 확인되었다. 4시간 내에 KMH2 및 T 세포의 공배양 동안 CD4+ 및 CD8+ T 세포 비에서 차이가 발생하지 않았다. 그러나, CD83+ T 세포는 CD83- T 세포 (p=0.048) 및 KM-H2없이 배양된 T 세포 (p=0.005)보다 상당히 높은 수준의 PD-1을 발현 하였다 (도 3D). PD-1의 증가는 비-트로고시토스된 (non-trogocytosed) CD83-T 세포보다 트로고시토시스된 (trogocytosed) CD83+CD4+ T 세포에서 유의하게 더 높았다 (p=0.049). 대조적으로, KM-H2 공동-배양된 CD4+ 및 CD8+ T 세포 모두가 혼자 배양된 T 세포보다 PD-1 발현이 더 높았음에도 불구하고, CD83+ 및 CD83-CD8+ T 세포간에 PD-1 발현의 차이는 보이지 않았다 (p=0.185)(그림 3E, F). CD83+CD4+ T 세포는 비-트로고시토시스된 (non-torogocytosed) CD4+ T 세포와 동일한 비율의 Treg를 가졌다 (도 9).
HL 세포주로부터의 상청액은 T 세포 증식을 억제함
높은 수준의 sCD83은 높은 수준의 표면 CD83과 일치하는 KM-H2 (460.6±11.8pg/ml) 및 L428 (200.8±53.2pg/ml)의 상청액에서 발견되었다 (그림 4A). HL 환자는 건강한 공여자 (HD)보다 진단시 혈청 sCD83 (360.5±54.82pg/ml, n=10)이 유의하게 더 높았다 (52.6±9.5pg/ml. 도 4A). 흥미롭게도, 매우 낮은 IL-10 수준이 모든 3개의 HL 세포주의 상청액에 존재했다 (도 10).
그런 다음 T 세포 기능에 대한 KM-H2 세포 상청액의 효과를 테스트했다. sCD83을 함유한 KM-H2 상청액은 용량-의존적 방식으로 T 세포 증식을 억제하였다 (도 4B-4E). CD8+ T 세포의 증식만이 KM-H2 상청액에 의해 억제된 것으로 보였으며 (p=0.09), CD4+ T 세포 증식은 아니었다 (p=0.732) (도 4B). 항-CD83 항체, 3C12C의 투여는 KM-H2 상청액의 억제 효과를 부분적으로 제거하였다 (도 4B, 4C 및 4D). 3C12C 단독은 T 세포 증식에 영향을 미치지 않았다 (도 4E).
HL 환자 혈청 sCD83은 PET 스캔에 의한 완전 또는 부분 반응과 상관된 정상 수준으로 감소함
우리는 6명의 환자에 대한 순차적 화학 요법 동안 HL 환자에서 순환 sCD83의 변화를 모니터링했다. 모든 환자는 3-6주기의 화학 요법을 받았으며 5명은 PET 스캔을 통해 완전 반응 (CR)을, 한 명은 부분 반응 (PR)을 달성했다 (그림 5).
환자 #1 및 2에서 PET 스캔에 의해 기록된 화학 요법에 대한 CR을 가졌을 때 혈청 sCD83이 감소하여 정상 수준으로 복귀하였다. 환자 #3 및 6에서, PET 스캔이 CR을 나타내었을 때 혈청 sCD83 수준은 여전히 상승하였지만 화학 요법의 1회 추가주기 후에 정상화되었다. 환자 #4는 PET 스캔에 의해 사이클 5 이전에 PR을 보여 주었지만, 혈청 sCD83 수준은 사이클 5 동안 사이클 6의 정상 범위에 도달하여 CR과 일치하여 감소하기 시작했다. 환자 #5에서의 PET 스캔은 사이클 2 후 진행성 질환 (PD)을 나타내었지만, 상응하는 sCD83이 정상으로 감소했을 때 화학 요법의 또 다른 2 사이클 후 PR을 나타내었다.
3C12C, ADCC를 통해 HL 세포주 제거함
항-CD83 mAb, 3C12C의 ADCC 활성을 3개의 HL 라인: KM-H2, L428 및 HDLM-2에서 시험 하였다. 3C12C가 KM-H2와 L428을 효율적으로 죽인 반면, HDLM-2는 이에 대해 상대적으로 내성이 있었다 (그림 6A). 추가의 잠재적인 치료적 응용을 조사하기 위해, 3C12C 독소-접합체 (3C12C-MMAE)를 생성하였다. 시험관 내에서, 3C12C-MMAE는 CD83-HL-60 세포보다 CD83+ KM-H2 세포를 더 효율적으로 사멸시켰다 (도 6B).
3C12C의 투여는 마우스 및 비인간 영장류 (NHP)에서 안전함
비인간 영장류에서 3C12C의 용량 증가 연구를 수행했다. 5마리의 개코 원숭이에 3C12C (0, 7, 14 및 21일에 1, 5, 10mg/kg)를 정맥 내 주사하였다. 주사 후 84일 동안 추적 관찰 동안 부작용이 기록되지 않았다. 우리는 매주 혈액 수와 생화학을 평가하고 유세포 분석 또는 면역 조직학에 의해 다른 면역 세포 집단을 모니터링했다. 3C12C의 투여는 혈액 세포 수 (WBC, RBC 및 혈소판), 간 (ALP 및 AST) 또는 신장 (크레아티닌) 기능에 영향을 미치지 않았다 (그림 12). CD4+/CD8+ T 세포의 총 T 세포 수, 비는 모두 84일까지 정상으로 유지되었다 (데이터는 나타내지 않음). 그러나, 다른 CD83+ 표적 세포 (활성화 된 DC 및 활성화 된 B 세포)가 감소되었다는 3C12C 효능의 증거가 있었다. 마우스에 3C12C의 정맥 내 투여는 유세포 분석에 의해 결정된 바와 같이 혈액 및 림프절 B 세포의 감소를 초래하였다 (도 7A). 또한, 림프절의 B 세포 영역은 대조군 인간 IgG 동물 (10mg/kg;도 7B)과 비교하여 3C12C 처리된 동물 (10mg / kg)에서 감소되었다.
MCL 및 FL CD83 염색
MCL의 항-CD83 항체로 염색하면 강한 확산 막 및 세포질 염색이 나타난다. 또한 DLBCL과 마찬가지로 강한 점상 염색이 있다 (그림 13 [MCL]). 52.2% MCL 생검 샘플은 CD83의 높은 또는 중간 수준을 나타냈다 (n=21). FL은 여포 주변 및 내부의 반응성 B 세포의 항-CD83 염색을 나타낸다. FL의 확산 염색은 없다 (그림 13 [FL]).
3C12C-MMAE, DLBCL 및 MCL 세포주 사멸
DLBCL 및 MCL 세포주에 대한 3C12C-MMAE 접합체의 효과를 결정하기 위해, DLBCL 계통 KARPASS-1106P 또는 MCL 계통 Mino 세포를 72시간 동안 상이한 농도의 3C12C-MMAE와 인큐베이션하였고, 생존 세포를 유세포 분석법에 의해 계수하였다. KM-K2 세포를 대조군으로 사용하였다. 계산된 최대 억제 농도의 절반 (IC50)와 함께 각각의 세포주 Mino, KM-H2 및 Karlasss에 대한 항체 접합체 농도가 증가한 생존 세포 수의 도표가 그림 14에 나와 있다. HL 계통 KM-H2와 유사한, DLBCL 및 MCL 계통은 72시간 배양 후 3C12C-MMAE에 의해 효과적으로 사멸되었다 (도 14).
요약:
HL 세포주 및 1차 HL, DLBCL 및 MCL 조직에서 CD83의 높은 발현은 CD83이 좋은 치료 표적임을 나타낸다.
HL 종양 세포는 CD83을 발현하고 일부 주변 T 세포는 종양 세포로부터 표면 CD83 분자를 획득할 수 있다. CD83+ T 세포의 80%는 공-억제 분자의 높은 발현, 예를 들어 PD-1인 CD4+ T 세포였다. HL 환자의 침윤성 T 림프구는 항원에 대해 저 반응성이다. PD-1 및 PD-1 리간드 상호 작용은 호지킨 림프종의 면역 억제 미세 환경에 기여한다. 시험관 내에서 KM-H2로부터 T 세포로 옮겨진 CD83은 LN 생검 샘플의 림프구, 특히 CD83 고발현 환자에서의 림프구 상에서 CD83의 발현이 발견되는 것과 일치한다. 이러한 CD83+ T 세포는 탈진하거나 세포사멸 (PD-1 높음) 될 수 있으며, 이는 KM-H2 세포가 CD83을 통한 면역 감시를 피하는 또 다른 메커니즘일 수 있다. 이는 PD-1 억제제와 조합된 CD83 표적 요법이 아마도 임상 반응을 추가로 향상시킬 것임을 나타낸다.
HL 세포의 상청액 (SN)은 T 세포 증식을 억제한다 (KM-H2의 SN은 Treg를 유도하지 않음, 데이터는 표시되지 않음), HL 세포는 높은 sCD83을 SN으로 분비하고 sCD83은 건강한 공여자보다 HL 환자 혈청에서 더 높게 검출되었다. 3C12C는 sCD83에 결합함으로써 이러한 억제를 부분적으로 폐지한다. SN의 sCD83은 IL-10이 아닌 그러한 억제 효과에서 중요한 역할을 한다. 3C12C는 시험관 내 및 생체 내에서 비활성화된 DC, 3C12C 결실 활성화된 DC로부터 Treg 유도의 간접 효과일 수 있는 일시적인 Treg (NHP 시험 데이터로부터)를 유도 할 수 있지만, 시험관 내 Treg의 억제 기능에 영향을 미치지 않았다. 대조적으로, PD-1 억제제 (Nivolumab)는 CD8+ T 세포의 Treg 억제 기능을 직접 제한하고 Nivolumab을 제공받는 마우스에서 CD8/Treg 및 CD4 Teffs/Treg의 비율을 증가시켰다.
SN의 다른 사이토카인 또는 용해성 인자도 억제 효과 (예를 들어, sCD30)에 영향을 줄 수 있다. CD30 분자 (sCD30)의 85kDa 가용성 형태는 시험관 내 및 생체 내 CD30+ 세포에 의해 방출되는 것으로 나타났다. 활성화된 T 세포, 특히 CD4+ T 세포는 또한 sCD30을 분비하였다.
HL 환자의 sCD83 수준은 질병 상태 및 치료 반응과 관련이 있다. 따라서, sCD83 수준은 진단 및 예후 바이오마커일 수 있다.
항-CD83 항체, 3C12C 및 CD83mAb 약물 복합체는 시험관 내에서 HRS 세포, DLBCL 및 MCL 세포를 사멸시킨다. NHP 시험에서, 인간 항 CD83 mAb 3C12C는 혈액 세포 수, 간 및 신장 기능에 대한 부작용없이 안전하며, 효능 및 안전성 프로파일은 CD83 항체를 HL에 대한 효과적인 치료 항체의 또 다른 후보로서 만든다.
<110> NewSouth Innovations Limited Dendrocyte Bitech Pty Ltd <120> Tretament method <130> P105820.AU <160> 59 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 205 <212> PRT <213> human <400> 1 Met Ser Arg Gly Leu Gln Leu Leu Leu Leu Ser Cys Ala Tyr Ser Leu 1 5 10 15 Ala Pro Ala Thr Pro Glu Val Lys Val Ala Cys Ser Glu Asp Val Asp 20 25 30 Leu Pro Cys Thr Ala Pro Trp Asp Pro Gln Val Pro Tyr Thr Val Ser 35 40 45 Trp Val Lys Leu Leu Glu Gly Gly Glu Glu Arg Met Glu Thr Pro Gln 50 55 60 Glu Asp His Leu Arg Gly Gln His Tyr His Gln Lys Gly Gln Asn Gly 65 70 75 80 Ser Phe Asp Ala Pro Asn Glu Arg Pro Tyr Ser Leu Lys Ile Arg Asn 85 90 95 Thr Thr Ser Cys Asn Ser Gly Thr Tyr Arg Cys Thr Leu Gln Asp Pro 100 105 110 Asp Gly Gln Arg Asn Leu Ser Gly Lys Val Ile Leu Arg Val Thr Gly 115 120 125 Cys Pro Ala Gln Arg Lys Glu Glu Thr Phe Lys Lys Tyr Arg Ala Glu 130 135 140 Ile Val Leu Leu Leu Ala Leu Val Ile Phe Tyr Leu Thr Leu Ile Ile 145 150 155 160 Phe Thr Cys Lys Phe Ala Arg Leu Gln Ser Ile Phe Pro Asp Phe Ser 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Artificial Sequence <220> <223> VH amino acid sequence of 1F7 <400> 22 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Ala Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ala Val Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Phe Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Pro Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Gly Gly Leu Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro 115 120 125 Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val 130 135 140 Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala 145 150 155 160 Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly 165 170 175 Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly 180 185 190 Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn 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PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain VL amino acid sequence of hFab4.3 <400> 26 Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly Gln Pro Ala 1 5 10 15 Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Ile His Ser Asp Gly Asn 20 25 30 Thr Tyr Leu Asp Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Arg Arg 35 40 45 Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Asp Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile Ser Arg Val 65 70 75 80 Glu Ala Glu Asp Ile Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala Thr His Trp 85 90 95 Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 110 <210> 27 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain VL amino acid sequence of hFab4.4 <400> 27 Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly Gln Pro Ala 1 5 10 15 Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Asp Ser Ala Gly Asn 20 25 30 Thr Phe Leu His Trp Phe His Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Arg Arg 35 40 45 Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Asp Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val 65 70 75 80 Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Gly Thr His Trp 85 90 95 Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 110 <210> 28 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain VL amino acid sequence of hFab4.5 <400> 28 Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly Gln Pro Ala 1 5 10 15 Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Val Asp Ser Asp Gly Asn 20 25 30 Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Arg Arg 35 40 45 Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Asp Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val 65 70 75 80 Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Gly Thr His Trp 85 90 95 Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 110 <210> 29 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain VL amino acid sequence of hFab4.7 <400> 29 Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly Gln Pro Ala 1 5 10 15 Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asp Gly Asn 20 25 30 Met Tyr Leu Asn Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Arg Arg 35 40 45 Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Asp Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val 65 70 75 80 Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala Thr Gln Pro 85 90 95 Thr Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 110 <210> 30 <211> 105 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain VL amino acid sequence of hFab4.8 <400> 30 Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val 1 5 10 15 Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn Trp 20 25 30 Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala 35 40 45 Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe 65 70 75 80 Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Tyr Ser Trp Pro Arg Thr Phe Gly 85 90 95 Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 31 <211> 105 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain VL amino acid sequence of hFab4.9 <400> 31 Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly His Pro Val 1 5 10 15 Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Leu Ile Ser Tyr Leu Asn Trp 20 25 30 Tyr His Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala 35 40 45 Ser Ile Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asn Phe 65 70 75 80 Ala Ser Tyr Tyr Cys Gln His Thr Asp Ser Phe Pro Arg Thr Phe Gly 85 90 95 His Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 32 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain VL amino acid sequence of hFab4.10 <400> 32 Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln Gly Val Thr 1 5 10 15 Ile Ser Cys Arg Gly Ser Thr Ser Asn Ile Gly Asn Asn Val Val Asn 20 25 30 Trp Tyr Gln His Val Pro Gly Ser Ala Pro Lys Leu Leu Ile Trp Ser 35 40 45 Asn Ile Gln Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys 50 55 60 Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln Ser Glu Asp 65 70 75 80 Glu Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Val Trp Asp Asp Gly Leu Ala Gly Trp 85 90 95 Val Phe Gly Gly Gly Thr Thr Val Thr Val Leu Ser 100 105 <210> 33 <211> 105 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain VL amino acid sequence of hFab4.12 <400> 33 Met Thr Gln Ala Pro Val Val Ser Val Ala Leu Glu Gln Thr Val Arg 1 5 10 15 Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Ala Ile Tyr Tyr Asp Phe Trp Tyr 20 25 30 Gln His Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr Gly Lys Asn 35 40 45 Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro His Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Asn 50 55 60 Thr Asp Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp 65 70 75 80 Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn His Trp Val Phe Gly 85 90 95 Gly Gly Thr Asn Leu Thr Val Leu Gly 100 105 <210> 34 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain VL amino acid sequence of hFab4.18 <400> 34 Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly Gln Pro Ala 1 5 10 15 Ser Ile Ser Cys Lys Ser Asn Gln Ser Leu Val His Ser Asp Gly Asn 20 25 30 Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Arg Arg 35 40 45 Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Asp Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Asn Arg Val 65 70 75 80 Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Gly Thr Gln Trp 85 90 95 Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Asp Ile Lys Arg 100 105 110 <210> 35 <211> 237 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IF7 heavy chain amino acid sequence <400> 35 Gln Pro Ala Met Ala Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Ala Val 1 5 10 15 Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe 20 25 30 Thr Phe Ser Thr Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys 35 40 45 Gly Leu Glu Trp Val Ala Ala Val Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr 50 55 60 Tyr Ala Asp Phe Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Pro 65 70 75 80 Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Asp Asp Thr 85 90 95 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Gly Gly Leu Asp Ile Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Ala 210 215 220 Ala Ala His His His His His His Gly Pro Gln Ile Arg 225 230 235 <210> 36 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of IF7 light chain <400> 36 Leu Thr Gln Pro Pro Pro Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln Arg Val Thr 1 5 10 15 Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Thr Val Asn 20 25 30 Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly 35 40 45 Asn Asp Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Ala Ser Lys 50 55 60 Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln Ser Glu Asp 65 70 75 80 Glu Ala His Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Gly Ser Leu Asn Gly Gly 85 90 95 Val Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys 100 105 110 Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln 115 120 125 Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly 130 135 140 Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly 145 150 155 160 Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala 165 170 175 Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser 180 185 190 Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val 195 200 205 Ala Pro Thr Glu Cys Ser 210 <210> 37 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> consensus sequence of CDR1 of 3C12 <220> <221> VARIANT <222> (2) <223> A or T <220> <221> VARIANT <222> (7) <223> K or S or R <220> <221> VARIANT <222> (8) <223> N or S <220> <221> VARIANT <222> (9) <223> Y or H or W <220> <221> VARIANT <222> (10) <223> F or L <400> 37 Arg Xaa Ser Gln Gly Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Ala 1 5 10 <210> 38 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL consensus sequence of CDR2 of 3C12 <220> <221> VARIANT <222> (2) <223> T or A <220> <221> VARIANT <222> (4) <223> N or S or T <400> 38 Ala Xaa Ser Xaa Leu Gln Ser 1 5 <210> 39 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL consensus sequence of CDR3 of 3C12 <220> <221> VARIANT <222> (2) <223> Q or K <220> <221> VARIANT <222> (3) <223> L or V or C <220> <221> VARIANT <222> (4) <223> G or N or D or S <220> <221> VARIANT <222> (5) <223> A or S or R <220> <221> VARIANT <222> (6) <223> Y or F or A <220> <221> VARIANT <222> (8) <223> Y or L <400> 39 Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Xaa Thr 1 5 <210> 40 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL consensus sequence of 3C12 <220> <221> VARIANT <222> (2) <223> I or V <220> <221> VARIANT <222> (3) <223> V or Q <220> <221> VARIANT <222> (4) <223> M or L <220> <221> VARIANT <222> (10) <223> L or F or S <220> <221> VARIANT <222> (15) <223> L or I or V <220> <221> VARIANT <222> (20) <223> T or S <220> <221> VARIANT <222> (25) <223> A or T <220> <221> VARIANT <222> (30) <223> K or S or R <220> <221> VARIANT <222> (31) <223> N or S <220> <221> VARIANT <222> (32) <223> Y or H or W <220> <221> VARIANT <222> (33) <223> F or L <220> <221> VARIANT <222> (39) <223> R or K <220> <221> VARIANT <222> (43) <223> A or V <220> <221> VARIANT <222> (51) <223> T or A <220> <221> VARIANT <222> (53) <223> N or S or T <220> <221> VARIANT <222> (66) <223> G or R <220> <221> VARIANT <222> (70) <223> E or D or H <220> <221> VARIANT <222> (79) <223> Q or H <220> <221> VARIANT <222> (81) <223> E or D <220> <221> VARIANT <222> (83) <223> F or I or V <220> <221> VARIANT <222> (90) <223> Q or K <220> <221> VARIANT <222> (91) <223> L or V or C <220> <221> VARIANT <222> (92) <223> G or N or D or S <220> <221> VARIANT <222> (93) <223> A or S or R <220> <221> VARIANT <222> (94) <223> Y or F or A <220> <221> VARIANT <222> (96) <223> L or Y <220> <221> VARIANT <222> (100) <223> G or Q <220> <221> VARIANT <222> (103) <223> K or R <220> <221> VARIANT <222> (104) <223> L or V <400> 40 Glu Xaa Xaa Xaa Thr Gln Ser Pro Ser Xaa Leu Ser Ala Ser Xaa Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Xaa Ile Thr Cys Arg Xaa Ser Gln Gly Ile Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Ala Trp Tyr Gln Gln Xaa Pro Gly Lys Xaa Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Xaa Ser Xaa Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Xaa Ser Gly Thr Xaa Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Xaa Pro 65 70 75 80 Xaa Asp Xaa Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Xaa 85 90 95 Thr Phe Gly Xaa Gly Thr Xaa Xaa Glu Leu Lys 100 105 <210> 41 <211> 1401 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3C12 heavy chain <400> 41 atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctacaggtgt ccactccgag 60 gtgcagctgc aggagtcggg gggaggcgtg gtccagcctg ggaggtccct gagactctcc 120 tgtgcagcct ctggattcac cttcagtagc tatgctatgc actgggtccg ccaggctcca 180 ggcaaggggc tggagtgggt ggcagttata tcatatgatg gaagcaataa atactacgca 240 gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gctgtatctg 300 caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gctatgtatt actgtgcgag acactactac 360 tacggtatgg acgtctgggg ccaagggacc acgctcaccg tgtcctccgc ctccaccaag 420 ggcccttccg tgttccctct ggccccttcc tccaagtcca cctccggcgg caccgccgct 480 ctgggctgcc tggtgaagga ctacttccct gagcctgtga ccgtgtcctg gaactctggc 540 gccctgacct ctggcgtgca cacctttcct gctgtcctgc agtcctccgg cctgtactcc 600 ctgtcctccg tggtgaccgt gccttcctcc tccctgggca cccagaccta catctgcaac 660 gtgaaccaca agccttccaa caccaaggtg gacaagaagg tggagcctaa gtcctgcgac 720 aagacccaca cctgccctcc ctgccctgcc cctgagctgc tgggcggacc ctccgtgttc 780 ctgttccctc ctaagcctaa ggacaccctg atgatctccc ggacccctga ggtgacctgc 840 gtggtggtgg acgtgtccca cgaggatcct gaggtgaagt tcaattggta cgtggacggc 900 gtggaggtgc acaacgccaa gaccaagcct cgggaagagc agtacaactc cacctaccgg 960 gtggtgtctg tgctgaccgt gctgcaccag gactggctga acggcaagga atacaagtgc 1020 aaggtgtcca acaaggccct gcctgctccc atcgagaaga ccatctccaa ggccaagggc 1080 cagcctcgcg agcctcaggt gtataccctg cctccctccc gggacgagct gaccaagaac 1140 caggtgtccc tgacctgtct ggtgaagggc ttctaccctt ccgatatcgc cgtggagtgg 1200 gagtccaacg gccagcctga gaacaactac aagaccaccc ctcctgtgct ggactccgac 1260 ggctccttct tcctgtactc caagctgacc gtggacaagt cccggtggca gcagggcaac 1320 gtgttctcct gctccgtgat gcacgaggcc ctgcacaacc actacaccca gaagtccctg 1380 tccctgtctc ctggcaagtg a 1401 <210> 42 <211> 702 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3C12 light chain <400> 42 atgggctggt cctgcatcat cctgtttctg gtggccaccg ccaccggcgt gcactccgag 60 atcgtgatga cccagtctcc atccctcctg tctgcttctt taggagacag agtcaccatc 120 acttgtcggg ccagtcaggg cattaagaat tattttgcct ggtatcagca aagaccaggg 180 aaagccccta agctcctgat ctatgctaca tccaatttgc aaagtggggt cccatcacga 240 ttcagcggca gtggatctgg gacagaattc actctgacaa tcagcagcct gcagcctgaa 300 gattttgcaa cttactattg tcaacaactt ggcgcttacc cactcacttt cggcgggggg 360 accaagctgg aactcaagcg gaccgtggcc gctccttccg tgttcatctt ccctccctcc 420 gacgagcagc tgaagtccgg caccgcctcc gtggtgtgcc tgctgaacaa cttctaccct 480 cgggaggcca aggtgcagtg gaaggtggac aacgccctgc agtccggcaa ctcccaggaa 540 tccgtcaccg agcaggactc caaggactct acctactccc tgtcctccac cctgaccctg 600 tccaaggccg actacgagaa gcacaaggtg tacgcctgcg aagtgaccca ccagggcctg 660 tcctctcccg tgaccaagtc cttcaaccgg ggcgagtgct ga 702 <210> 43 <211> 702 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3C12.B light chain <400> 43 atgggctggt cctgcatcat cctgtttctg gtggccaccg ccaccggcgt gcactccgag 60 gttgtgatga cccagtcccc cagcttcctg tccgcctcta tcggcgaccg ggtgtccatc 120 acctgtcgga cctcccaggg catctccaac cacctggcct ggtatcagca gaagcccggc 180 aaggccccca agctgctgat ctacgccgcc tccagcctgc agtccggcgt gccatccaga 240 ttctccggct ccggcagcgg caccgacttc accctgacca tcagctccct gcagcccgag 300 gatatcgcca cctactactg ccagcaggtg aactcctacc cctacacctt cggccagggg 360 acacgactgg agctcaagcg gaccgtggcc gctccttccg tgttcatctt ccctccctcc 420 gacgagcagc tgaagtccgg caccgcctcc gtggtgtgcc tgctgaacaa cttctaccct 480 cgggaggcca aggtgcagtg gaaggtggac aacgccctgc agtccggcaa ctcccaggaa 540 tccgtcaccg agcaggactc caaggactct acctactccc tgtcctccac cctgaccctg 600 tccaaggccg actacgagaa gcacaaggtg tacgcctgcg aagtgaccca ccagggcctg 660 tcctctcccg tgaccaagtc cttcaaccgg ggcgagtgct ga 702 <210> 44 <211> 702 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3C12C light chain <400> 44 atgggctggt cctgcatcat cctgtttctg gtggccaccg ccaccggcgt gcactccgag 60 attgtgctga ctcagtcccc ctccagcctg tccgcctccg tgggcgacag agtgaccatc 120 acctgtcggg cctcccaggg catccggaac tacctggcct ggtatcagca gaaacccggc 180 aaggtgccca agctgctgat ctacgccacc tccaccctgc agtccggcgt gccctcccgg 240 ttctctggct ccagatccgg caccgagttc accctgacca tctccagcct gcaccccgag 300 gacttcgcca cctactactg ccagcaggtg gaccggttcc cctacacctt cggccagggg 360 accaaggtgg aactcaagcg gaccgtggcc gctccttccg tgttcatctt ccctccctcc 420 gacgagcagc tgaagtccgg caccgcctcc gtggtgtgcc tgctgaacaa cttctaccct 480 cgggaggcca aggtgcagtg gaaggtggac aacgccctgc agtccggcaa ctcccaggaa 540 tccgtcaccg agcaggactc caaggactct acctactccc tgtcctccac cctgaccctg 600 tccaaggccg actacgagaa gcacaaggtg tacgcctgcg aagtgaccca ccagggcctg 660 tcctctcccg tgaccaagtc cttcaaccgg ggcgagtgct ga 702 <210> 45 <211> 702 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3C12D light chain <400> 45 atgggctggt cctgcatcat cctgtttctg gtggccaccg ccaccggcgt gcactccgag 60 atccagatga cccagtcccc ctccagcctg tccgcctctg tgggcgacag agtgaccatc 120 acctgtcggg cctcccaggg catctccagc tggctggcct ggtatcagca gaagcccggc 180 aaggccccca agctgctgat ctacgccgcc agctccctgc agtccggcgt gccatccaga 240 ttctccggct ccggcagcgg caccgagttc accctgacca tctccagcct gcagcccgac 300 gacttcgcca cctactactg ccagaagctg tcctcctacc cctacacctt cggcggaggg 360 accaaggtgg aactcaagcg gaccgtggcc gctccttccg tgttcatctt ccctccctcc 420 gacgagcagc tgaagtccgg caccgcctcc gtggtgtgcc tgctgaacaa cttctaccct 480 cgggaggcca aggtgcagtg gaaggtggac aacgccctgc agtccggcaa ctcccaggaa 540 tccgtcaccg agcaggactc caaggactct acctactccc tgtcctccac cctgaccctg 600 tccaaggccg actacgagaa gcacaaggtg tacgcctgcg aagtgaccca ccagggcctg 660 tcctctcccg tgaccaagtc cttcaaccgg ggcgagtgct ga 702 <210> 46 <211> 702 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3C12E light chain <400> 46 atgggctggt cctgcatcat cctgtttctg gtggccaccg ccaccggcgt gcactccgag 60 attgtgctga ctcagtcccc ctccagcctg tccgcctccg tgggcgacag agtgaccatc 120 acctgtcggg cctcccaggg catctccaac tacctggcct ggtatcagca gaaacccggc 180 aaggtgccca agctgctgat ctacgccgcc tccaccctgc agtccggcgt gccatccaga 240 ttctccggct ccggcagcgg cacccacttc accctgacca tctccagcct gcagcccgag 300 gacgtggcca cctactactg ccagaagtgc aactccgccc cctacacctt cggccagggg 360 accaaggtgg aactcaagcg gaccgtggcc gctccttccg tgttcatctt ccctccctcc 420 gacgagcagc tgaagtccgg caccgcctcc gtggtgtgcc tgctgaacaa cttctaccct 480 cgggaggcca aggtgcagtg gaaggtggac aacgccctgc agtccggcaa ctcccaggaa 540 tccgtcaccg agcaggactc caaggactct acctactccc tgtcctccac cctgaccctg 600 tccaaggccg actacgagaa gcacaaggtg tacgcctgcg aagtgaccca ccagggcctg 660 tcctctcccg tgaccaagtc cttcaaccgg ggcgagtgct ga 702 <210> 47 <211> 663 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain Vh region of 1F7 <400> 47 gaggtccagc tggtacagtc tggtggagcc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt acctatggca tgcactgggt ccgccaggct 120 ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagct gtatcatatg atggaagtaa taaatactat 180 gcagacttcg tgaaggggcg attcaccatc tccagagaca atcccaagaa caccctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgatgac acggccgtat attactgtgc ccgcagaggt 300 ggtcttgata tctggggcca agggaccacg gtcaccgtct caagcgcctc caccaagggc 360 ccatcggtct tccccctggc accctcctcc aagagcacct ctgggggcac agcggccctg 420 ggctgcctgg tcaaggacta cttccccgaa ccggtgacgg tgtcgtggaa ctcaggcgcc 480 ctgaccagcg gcgtccacac cttcccggct gtcctacagt cctcaggact ctactccctc 540 agcagcgtag tgaccgtgcc ctccagcagc ttgggcaccc agacctacat ctgcaacgtg 600 aatcacaagc ccagcaacac caaggtggac aagaaagttg agcccaaatc ttgtgcggcc 660 gca 663 <210> 48 <211> 648 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1F7 light chain <400> 48 ctgactcagc cacccccagc gtctgggacc cccgggcaga gggtcaccat ctcttgttct 60 ggaagcagct ccaacatcgg aagtaatact gtaaactggt accagcaact cccaggaacg 120 gcccccaaac tcctcattta tggtaatgat cagcggccct caggggtccc tgaccgattc 180 tctgcctcca agtctggcac ctcagcctcc ctggccatca gtgggctcca gtctgaggat 240 gaggctcatt attattgtgc agcatgggat ggcagtctga atggtggtgt gatattcggc 300 ggagggacca aggtgaccgt cctgggtcag cccaaggctg ccccctcggt cactctgttc 360 ccaccctcct ctgaggagct tcaagccaac aaggccacac tggtgtgtct cataagtgac 420 ttctacccgg gagccgtgac agtggcctgg aaggcagata gcagccccgt caaggcggga 480 gtggagacca ccaaaccctc caaacagagc aacaacaagt acgcggccag cagctacctg 540 agcctgacgc ccgagcagtg gaagtcccac agaagctaca gctgccaggt cacgcatgaa 600 gggagcaccg tggagaagac agtggcccct acagaatgtt cataataa 648 <210> 49 <211> 648 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hFab4.1 light chain <400> 49 gtgacgcagc cgccctcagc gtctgggacc cccgggcaga gggtcaccat ctcttgttct 60 gggagcagct ccaacatcgg aactaatcct gtaaactggt accagcagct cccaggaacg 120 gcccccaaac tcctcatcta tactactgat cagcggccct caggggtccc tgaccgcttc 180 tctggctcca agtctggcac ctcagcctcc ctggccatca gtgggctcca gtctgaggat 240 gaggctgatt attactgtgc agcatgggat gacagcctga gtggccttta tgtcttcggg 300 actgggacca aggtcaccgt cctcggtcag cccaaggcca accccactgt cactctgttc 360 ccgccctcct ctgaggagct ccaagccaac aaggccacac tagtgtgtct gatcagtgac 420 ttctacccgg gagctgtgac agtggcctgg aaggcagatg gcagccccgt caaggcggga 480 gtggagacca ccaaaccctc caaacagagc aacaacaagt acgcggccag cagctacctg 540 agcctgacgc ccgagcagtg gaagtcccac agaagctaca gctgccaggt cacgcatgaa 600 gggagcaccg tggagaagac agtggcccct gcagaatgct cttaataa 648 <210> 50 <211> 651 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hFab4.2 light chain <400> 50 atgacccaca ctccattgtc tctgtccgtc 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tataaggttt ctaaccggga ctctggggtc 180 ccagacagat tcagcggcag tgggtccggc actgatttca cactgagaat cagcagggtg 240 gaggctgagg atattggggt gtattactgc atgcaagcta cacactggcc tcggacgttc 300 ggccagggga ccaaggtgga aatcaaacga actgtggctg caccatctgt cttcatcttc 360 ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga actgcctctg ttgtgtgcct gctgaataac 420 ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg aaggtggata acgccctcca atcgggtaac 480 tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc aaggacagca cctacagcct cagcagcacc 540 ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa cacaaagtct acgcctgcga agtcacccat 600 cagggcctga gctcgcccgt cacaaagagc ttcaacaggg gagagtgtta ataa 654 <210> 52 <211> 654 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hFab4.4 light chain <400> 52 atgactcagt ctccactctc cctgcccgtc acccttggac agccggcctc catctcctgc 60 aggtctagtc aaagcctcgt agacagtgct ggaaacacct tcttgcattg gtttcaccag 120 aggccaggcc aatctccaag gcgcctaatt tataaggttt ctaaccggga ctctggggtc 180 ccagacagat tcagcggcag tgggtcaggc actgatttca cactgaaaat cagcagggtg 240 gaggctgagg atgttggggt ttattactgt atgcaaggta cacactggcc ccggacgttc 300 ggccaaggga ccaaggtgga aatcaaacga actgtggctg caccatctgt cttcatcttc 360 ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga actgcctctg ttgtgtgcct gctgaataac 420 ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg aaggtggata acgccctcca atcgggtaac 480 tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc aaggacagca cctacagcct cagcagcacc 540 ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa cacaaagtct acgcctgcga agtcacccat 600 cagggcctga gctcgcccgt cacaaagagc ttcaacaggg gagagtgtta ataa 654 <210> 53 <211> 654 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hFab4.5 light chain <400> 53 ctgactcagt ctccactctc cctgcccgtc acccttggac agccggcctc catctcctgc 60 aagtctagtc aaagcctcgt agacagtgat ggaaacacct acttgaattg gtttcagcag 120 aggccaggcc aatctccaag gcgcctaatt tataaggttt ctaaccggga ctctggggtc 180 ccagacagat tcagcggcag tgggtcaggc actgatttca cactgaaaat cagcagggtg 240 gaggctgagg atgttggggt ttattactgc atgcaaggta cacactggcc tcggacgttc 300 ggccaaggga ccaaggtgga aatcaaacga actgtggctg caccatctgt cttcatcttc 360 ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga actgcctctg ttgtgtgcct gctgaataac 420 ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg aaggtggata acgccctcca atcgggtaac 480 tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc aaggacagca cctacagcct cagcagcacc 540 ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa cacaaagtct acgcctgcga agtcacccat 600 cagggcctga gctcgcccgt cacaaagagc ttcaacaggg gagagtgtta ataa 654 <210> 54 <211> 693 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hFab4.7 light chain <400> 54 atgactcagt ctccactctc cctgcccgtc acccttggac agccggcctc catctcctgc 60 aggtctagtc aaagcctcgt acacagtgat ggaaacatgt acttgaattg gtttcagcag 120 aggccaggcc aatctccaag gcgcctaatt tataaggttt ctaaccggga ctctggggtc 180 ccagacagat tcagcggcag tgggtcaggc acagatttta cactgaaaat cagcagagtg 240 gaggctgagg atgttggggt ttattactgc atgcaagcta cacagcccac gtggacgttc 300 ggccaaggga ccaagctgga gatcaaacga actgtggctg caccatctgt cttcatcttc 360 ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga actgcctctg ttgtgtgcct gctgaataac 420 ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg aaggtggata acgccctcca atcgggtaac 480 tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc aaggacagca cctacagcct cagcagcacc 540 ctgacgctga gcaaaagcag actacgagaa acacaaagtc tacgcctgcg aagtcaccca 600 tcagggcctg agctcgcccg tcacaaagag cttcaacagg ggagagtgtt aataaggcgc 660 gccaattcta tttcaaggag acagtcataa tga 693 <210> 55 <211> 677 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hFab4.8 light chain <400> 55 atgacccagt ctccatcctc cctgtctgca tctgtaggag acagagtcac catcacttgc 60 caggcgagtc aggacattag caactattta aattggtatc agcagaaacc agggaaagcc 120 cctaagctcc tgatctacga tgcatccaat ttggaaacag gggtcccatc aaggttcagt 180 ggaagtggat ctgggacaga ttttactttc accatcagca gcctgcaacc tgacgatttt 240 gcaacttact actgtcaaca gacttacagt tggcctcgga cttttggcca ggggaccaag 300 ctggagatca aacgaactgt ggctgcacca tctgtcttca tcttcccgcc atctgatgag 360 cagttgaaat ctggaactgc ctctgttgtg tgcctgctga ataacttcta tcccagagag 420 gccaaagtac agtggaaggt ggataacgcc ctccaatcgg gtaactccca ggagagtgtc 480 acagagcagg acagcaagga cagcacctac agcctcagca gcaccctgac gctgagcaaa 540 gcagactacg agaaacacaa agtctacgcc tgcgaagtca cccatcaggg cctgagctcg 600 cccgtcacaa agagcttcaa caggggagag tgttaataag gcgcgccaat tctatttcaa 660 ggagacagtc ataatga 677 <210> 56 <211> 639 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hFab4.9 light chain <400> 56 atgacccagt ctccatcctc cctgtccgca tctgtaggac acccagtcac catcacttgc 60 cgggcaagtc aaagccttat cagctattta aattggtatc accagaaacc agggaaagcc 120 cctaagctcc tgatctatgc ggcatccatt ttgcaaagtg gggtcccatc aaggttcagt 180 ggcagtggat ctgggacaga tttcactctc accatcagca gtctgcaacc tgaaaatttt 240 gcaagttact actgtcaaca taccgacagt ttccctcgga cgttcggcca cgggaccaag 300 gtggaaatca aacgaactgt ggctgcacca tctgtcttca tcttcccgcc atctgatgac 360 cagttgaaat ctggaactgc ctccgttgtg tgcctgctga ataacttcta tcccaaaaag 420 gccaaagtac aatggaaggt ggataacgcc ctcgagtcgg gtaactccca ggagagtgtc 480 acagagcagg acgtcaagga cagcacctac agcctcagca gcaccctgac gctgagcaaa 540 gccggactac gagaaaccaa agtctacgcc tgcgaagtca cccatctgcg aactgagctc 600 tcccgtcaca aagagcttca caggggagag tgttaataa 639 <210> 57 <211> 645 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hFab4.10 light chain <400> 57 ctgactcagc ccccctcagc gtctgggacc cccgggcagg gtgtcaccat ctcctgtcgt 60 ggaagcacct ccaacatcgg aaataatgtt gttaattggt atcaacatgt cccgggatcg 120 gcccccaaac tcctcatctg gagtaatatt cagcggccct cagggattcc tgaccgattc 180 tctggctcca agtctggcac ctcagcctcc ctggccatca gtggacttca gtctgaagat 240 gaggctgttt attactgtgc agtctgggat gacggcctgg ctggttgggt gttcggcgga 300 gggaccacgg tgaccgtcct aagtcagccc aaggctgccc cctcggtcac tctgttcccg 360 ccctcctctg aggagcttca agccaacaag gccacactgg tgtgtctcat aagtgacttc 420 tacccgggag ccgtgacagt ggcctggaag gcagatagca gccccgtcaa ggcgggagtg 480 gagaccacca caccctccaa acaaagcaac aacaagtacg cggccagcag ctacctgagc 540 ctgacgcctg agcagtggaa gtcccacaaa agctacagct gccaggtcac gcatgaaggg 600 agcaccgtgg agaagacagt ggcccctaca gaatgttcat aataa 645 <210> 58 <211> 639 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hFab4.12 light chain <400> 58 atgactcagg cccctgttgt gtcggtggcc ttggaacaaa cagtcaggat cacatgccaa 60 ggagacagcc tagcaatcta 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actgatttca cactgaaaat caacagggtg 240 gaggctgagg atgttggggt ttattactgc atgcaaggta cacagtggcc tcggactttt 300 ggccagggga ccaagctgga catcaaacga actgtggctg caccatctgt cttcatcttc 360 ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga actgcctctg ttgtgtgcct gctgaataac 420 ttctatccca cagaggccaa agtacagtgg aaggtggata acgccctcca atcgggtaac 480 tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc aaggacagca cctacagcct cagcagcacc 540 ctgacgctga gcaaagcaaa ctacaagaaa cacaaagtct acgcctgcga agtcacccat 600 cagggcctga cctcgcccgt cacaaagagc ttcaacaagg gagagtgtta ataa 654

Claims (23)

  1. 대상체에게 유효량의 CD83 결합 단백질을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 림프종을 치료하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 림프종이 호지킨 림프종 (HL)인 방법.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 림프종이 비-호지킨 림프종 (NHL)인 방법.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 비-호지킨 림프종 (NHL)이 맨틀 세포 림프종 (MCL)인 방법.
  5. 제 3항에 있어서, 상기 비-호지킨 림프종 (NHL)이 미만성 대 B-세포 림프종 (DLBCL)인 방법.
  6. 제 3항에 있어서, 상기 비-호지킨 림프종 (NHL)이 여포성 림프종 (FL)인 방법.
  7. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CD83 결합 단백질이 하기를 포함하는 항원 결합 도메인을 포함하는 것인 방법:
    (a) 다음을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH):
    (i) 서열 번호 10으로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 서열; 또는
    (ii) 서열 번호 10으로 표시되는 아미노산 서열의 3개의 상보성 결정 영역 (CDR); 과
    (b) 다음을 포함하는 경쇄 가변 영역:
    (ii) 서열 번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 서열, 서열 번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 서열 및 서열 번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 서열.
  8. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CD83 결합 단백질이 하기를 포함하는 항원 결합 도메인을 포함하는 것인 방법:
    (a) 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 서열, 서열 번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 서열 및 서열 번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 과
    (b) 서열 번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 서열, 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 서열 및 서열 번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역.
  9. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CD83 결합 단백질이 서열 번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 서열 번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함하는 항원 결합 도메인을 포함하는 것인 방법.
  10. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CD83 결합 단백질이 하기를 포함하는 항원 결합 도메인을 포함하는 것인 방법:
    (i) 서열 번호 10으로 표시되는 VH 서열 및 서열 번호 12로 표시되는 VL 서열; 또는
    (ii) 서열 번호 10으로 표시되는 VH 서열 및 서열 번호 13으로 표시되는 VL 서열; 또는
    (iii) 서열 번호 10으로 표시되는 VH 서열 및 서열 번호 14로 표시되는 VL 서열; 또는
    (iv) 서열 번호 10으로 표시되는 VH 서열 및 서열 번호 15로 표시되는 VL 서열; 또는
    (v) 서열 번호 21로 표시되는 중쇄 서열 및 서열 번호 16으로 표시되는 경쇄 서열; 또는
    (vi) 서열 번호 21로 표시되는 중쇄 서열 및 서열 번호 17로 표시되는 경쇄 서열; 또는
    (vi) 서열 번호 21로 표시되는 중쇄 서열 및 서열 번호 18로 표시되는 경쇄 서열; 또는
    (vii) 서열 번호 21로 표시되는 중쇄 서열 및 서열 번호 19로 표시되는 경쇄 서열; 또는
    (viii) 서열 번호 21로 표시되는 중쇄 서열 및 서열 번호 20으로 표시되는 경쇄 서열; 또는
    (ix) 서열 번호 22로 표시되는 VH 서열 및 서열 번호 23으로 표시되는 VL 서열; 또는
    (x) 서열 번호 22로 표시되는 VH 서열 및 서열 번호 24로 표시되는 VL 서열; 또는
    (xi) 서열 번호 22로 표시되는 VH 서열 및 서열 번호 25로 표시되는 VL 서열;
    (xii) 서열 번호 22로 표시되는 VH 서열 및 서열 번호 26으로 표시되는 VL 서열;
    (viii) 서열 번호 22로 표시되는 VH 서열 및 서열 번호 27로 표시되는 VL 서열;
    (viii) 서열 번호 22로 표시되는 VH 서열 및 서열 번호 28로 표시되는 VL 서열;
    (viii) 서열 번호 22로 표시되는 VH 서열 및 서열 번호 29로 표시되는 VL 서열;
    (viii) 서열 번호 22로 표시되는 VH 서열 및 서열 번호 30으로 표시되는 VL 서열;
    (viii) 서열 번호 22로 표시되는 VH 서열 및 서열 번호 31로 표시되는 VL 서열;
    (viii) 서열 번호 22로 표시되는 VH 서열 및 서열 번호 32로 표시되는 VL 서열;
    (viii) 서열 번호 22로 표시되는 VH 서열 및 서열 번호 33으로 표시되는 VL 서열; 또는
    (viii) 서열 번호 22로 표시되는 VH 서열 및 서열 번호 34로 표시되는 VL 서열; 또는
    (vix) 서열 번호 35로 표시되는 중쇄 서열 및 서열 번호 36으로 표시되는 경쇄 서열.
  11. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CD83 결합 단백질이 항체인 방법.
  12. 제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CD83 결합 단백질이 단일 클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편인 방법.
  13. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CD83 결합 단백질이 Fab, Fab', F(ab') 2, Fab2 및 scFv로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  14. 제 12항에 있어서, 상기 단일 클론 항체가 3C12C인 방법.
  15. 제 1항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CD83 결합 단백질이 부분으로 활용되는 것인 방법.
  16. 제 15항에 있어서, 상기 부분이 치료 또는 진단 부분인 방법.
  17. 림프종을 앓지 않거나 알려진 중증의 림프종을 앓고 있지 않은 대상체에서의 sCD83의 수준에 대하여 대상체의 혈청에서의 sCD83의 수준을 비교하는 것을 포함하는, 림프종의 심각성 또는 단계를 진단 또는 평가하는 방법.
  18. 치료 전, 치료 중 및/또는 치료 후 피험자의 혈청에서 sCD83의 수준을 결정하는 단계; 및
    치료 전 및/또는 후의 sCD83의 수준이 치료 전의 sCD83의 수준에 비해 감소될 때 대상체는 치료에 반응하는 점에서, 치료 중 및 / 또는 치료 후의 sCD83의 수준을 치료 전의 sCD83의 수준과 비교하는 단계;를 포함하는, 대상체가 림프종 치료에 반응하는지 여부를 결정하는 방법.
  19. 제 17항 또는 제 18항에 있어서, 상기 림프종은 호지킨 림프종 (HL)인 방법.
  20. 제 17항 또는 제 18항에 있어서, 상기 림프종은 비-호지킨 림프종 (NHL)인 방법.
  21. 제 20항에 있어서, 상기 비-호지킨 림프종 (NHL)은 미만성 대 B-세포 림프종 (DLBCL)인 방법.
  22. 제 20항에 있어서, 상기 비-호지킨 림프종 (NHL)은 맨틀 세포 림프종 (MCL)인 방법.
  23. CD83 결합 단백질 및 림프종을 치료하기 위한 CD83 결합 단백질의 사용 설명서를 포함하는, 대상체에서의 림프종 치료용 키트.

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