KR20200056831A - 인플루엔자 바이러스 검출용 프라이머 세트, 이를 포함하는 검출용 키트 및 이를 이용한 검출 방법 - Google Patents

인플루엔자 바이러스 검출용 프라이머 세트, 이를 포함하는 검출용 키트 및 이를 이용한 검출 방법 Download PDF

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Abstract

서열번호 1 내지 서열번호 6에 기재된 염기서열을 포함하는 제1프라이머 세트 및 서열번호 7 내지 12에 기재된 염기서열을 포함하는 제2프라이머 세트를 포함하고, 상기 제1프라이머 세트는 인플루엔자 A의 핵산과 특이적으로 반응하고, 상기 제2프라이머 세트는 인플루엔자 B의 핵산과 특이적으로 반응하고, 루프-매개-등온증폭반응(LAMP)에 의해 생물학적 시료로부터 인플루엔자 A 또는 B를 동시에 검출하는, 인플루엔자 검출용 프라이머 세트, 이를 포함하는 키트 및 이를 이용한 검출방법을 제공한다.

Description

인플루엔자 바이러스 검출용 프라이머 세트, 이를 포함하는 검출용 키트 및 이를 이용한 검출 방법 {The primer set for detecting Influenza virus, a kit comprising the same, and detection method using the same}
서열번호 1 내지 서열번호 6에 기재된 염기서열을 포함하는 제1프라이머 세트 및 서열번호 7 내지 12에 기재된 염기서열을 포함하는 제2프라이머 세트를 포함하고, 상기 제1프라이머 세트는 인플루엔자 A의 핵산과 특이적으로 반응하고, 상기 제2프라이머 세트는 인플루엔자 B의 핵산과 특이적으로 반응하고, 루프-매개-등온증폭반응(LAMP)에 의해 생물학적 시료로부터 인플루엔자 A 또는 B를 동시에 검출하는, 인플루엔자 검출용 프라이머 세트, 이를 포함하는 검출용 키트 및 이를 이용한 검출 방법이 개시된다.
인플루엔자 감염("인플루엔자" 또는 "독감" 이라고도 함)은 전세계적으로 매년 3백만에서 5백만 건의 중병을 유발하여, 심하면 사망까지 이르게 하는 인간에게 알려진 가장 흔한 질병들 중 하나이다. 인플루엔자는 인구의 5 내지 15%에 영향을 미치는 계절성 유행병으로 빠르게 전염되고, 건강 관리 비용으로 갖는 부담 및 생산성 손실은 광범위하다. 또, 대다수의 건강한 사람이 감염된 경우, 수일간 앓고 회복하는 정도에 그칠 수 있으나, 노약자나 만성 질환자가 감염되면 합병증을 유발하여 입원 치료 및 사망에 이를 수도 있는 무서운 질환이다.
인플루엔자 바이러스는 바이러스성 호흡기 질환의 주요 원인인 병원체로서, 음성 센스 단일가닥 RNA(Negative sense ssRNA) 절편 8개를 게놈으로 갖는 바이러스이다. 또, 인플루엔자 바이러스는 전세계적으로 인류에게 심각한 치명상을 입히며, 이로 인한 경제적 손실 또한 막대하게 입히는 의학적으로 중요도가 높은 병원성 바이러스로, 인플루엔자 바이러스는 세그먼트 5(segment 5) 와 매트리스 단백질(matrix protein, M)의 항원성에 따라 A형, B형 및 C형 바이러스로 분류되며, 동일한 A형 바이러스는 NP나 M 단백질의 항원성이 같다. 그 중에서도, 인플루엔자 A형 및 B형의 인플루엔자 바이러스는 오소믹소바이러스(Orthomyxovirus)에 속하며, 이 중, A형은 다시 HA(Hemagglutinin) 단백질의 항원 특성에 따라 15개의 헤마글루티닌 타입 (H1형 내지 H15형), NA 단백질 항원 특성에 따라 9개의 뉴라미다제 아형(N1내지 N9형)으로 그 아형이 분류된다(Wiely DC and Skehel TT, Ann Rev Biochem, 56:365-394, 1987). 그 중에서도, 인간에서 단지 3개의 헤마글루틴 아형인 H1 내지 H3과 2개의 뉴라미다제 아형인 N1 및 N2 만이 안정적인 계통이 확립되었을 뿐이다 (Webby, R. J., and R. G. Webster. 2003. Are we ready for pandemic influenza? Science 302:1519-1522; Nicholson, K. G., Wood, J. M., & Zambon, M. (2003). Influenza.Lancet, 362 (9397), 1733-1745).
사람에서는 인플루엔자 A 및 B형 바이러스가 하기도 감염증을 포함한 질환을 유발하는 것으로 알려져 있는데, 특히, A형 감염에 의해서 유행기간 동안 매년 약 10,000 여명의 사망자가 발생할 수 있는 것으로 알려져 있다(Fleming DM et al., Br. Med. J. 311:290-291, 1995).
또한, 인플루엔자바이러스는 강한 전염성으로 인해, 인접한 지역으로의 확산속도가 매우 빠르므로, 이를 조기에 진단하고 대처하기 위한 신속한 검출방법이 요구되고 있다.
과거에는 인플루엔자 바이러스를 검출하는 방법으로, 단백질 항원 또는 유전자를 검출하는 방법 및 혈청학적 검사법 등이 이용되어 왔다. 이 중, 가장 기준이 되는 방법은 바이러스 분리 후에 간접 면역형광법이나 혈구응집억제시험법 등을 이용하여 동정하는 방법이지만, 최근에는 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction)과 같이 인플루엔자 바이러스 특이 유전자를 검출하는 분자생물학적인 진단법이 많이 사용되는 추세이다.
인플루엔자 바이러스의 분자진단 기술은 인플루엔자 바이러스의 형 및 아형을 구분하기 위해, 검체 시료로부터 바이러스 RNA를 추출한 후, 18개 내지 60개의 뉴클레오타이드로 이루어진 NP, M 또는 HA 등의 바이러스 유전자에 특이적인 프라이머(primer)나 유전자 프로브(probe)를 사용하여, 역전사 중합효소연쇄반응법(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR), NASBA(nucleic acid sequence based amplification), DNA칩 등을 통하여 해당 유전자를 검출하는 기술을 말한다(Fouchier et al., J. Clin. Microbiol., 38: 4096-4101,2000). 이와 같은, 인플루엔자 바이러스의 분자진단 효율을 높이기 위해서는 민감성과 특이성이 뛰어난 프라이머 또는 프로브를 제조하는 기술이 필수적으로 요구된다.
구체적으로 프라이머 또는 프로브의 민감성과 특이성은 상기 프라이머 또는 유전자 프로브의 염기서열이 인플루엔자 바이러스의 해당 염기서열과의 일치하는 정도에 따라 결정된다. 더 높은 민감성과 특이성을 위해서는, 다양한 인플루엔자 바이러스의 유전자를 비교하여 가장 보전되어 있으면서도 미세한 염기서열의 변이에 의해 민감성과 특이성이 영향을 받지 않는 프라이머를 설계할 필요가 있다. 그러나 지금까지 인플루엔자 바이러스 검출을 위해 공지된 프라이머를 살펴보면 소수의 인플루엔자 바이러스의 유전자를 근거로 설계되었거나, 특정 형의 바이러스의 아형을 검출하기 위한 것이 대부분이었다.
또, 지금까지 인플루엔자 B 바이러스와 관련한 연구는 다른 바이러스에 비해 상대적으로 연구 진행이 활발하지 않았다. 이는, 인플루엔자 B 바이러스가 사람 또는 물개만을 숙주로 삼아 인플루엔자를 발병시키는 바이러스이므로, 상대적으로 숙주의 범위가 좁기 때문에 유행성이 적었던 이유로 파악된다.
최근에는, 인플루엔자 A와 B가 동시에 유행하면서, 이중으로 감염되는 사례도 발견되고 있는데, 이러한 인플루엔자 이중 감염자는 독감 유행을 가속화 시킬 수 있고, 환자의 신체적인 증상도 심각해질 우려가 있으므로 이중 감염의 진단 역시 신속하게 이루어져야 할 필요가 있다.
그러나, 현재는 인플루엔자 A형(아형 포함) 및 인플루엔자 B형을 진단하기 위해서, 각각의 진단키트를 별도로 이용하는 번거로움이 있어, 환자로부터 시료를 채취하는 과정이 여러번 이뤄져야 한다. 또, 진단에 사용되는 키트의 종류가 많을수록 환자의 경제적인 부담이 커지게 되므로 실효성이 낮은 측면이 있다.
따라서, 여러 형 또는 아형의 인플루엔자 바이러스의 염기서열에 특이적으로 반응하는 프라이머 세트를 이용하여 인플루엔자 A형 또는 B형의 감염 여부만이 아니라, 상기 바이러스의 아형까지 진단할 수 있는 저비용의 효율적인 진단 기술이 요구되는 실정이다.
한국등록특허 제0796007호, “인플루엔자 바이러스 검출용 프라이머, 이를 이용한 검출방법 및 검출키트” (공개일: 2007.02.23) 한국공개특허 제2012-0024944호, “신종 인플루엔자 A형 바이러스 진단용 프라이머, 프로브, 이를 포함하는 키트 및 상기 키트를 이용한 진단 방법” (공개일: 2012.03.14)
Ryu SY. Influenza. Korean. J. Med. 2017;92(6):494-498. Tsugunori, N. et. al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Research. 2000;28:12. Norihiro, T. et. al. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of gene sequences and simple visual detection of products. Nature protocols. 2008;3:5. WHO. WHO information for molecular diagnosis of influenza virus - update. 2014;March
본 발명의 목적은 서열번호 1 내지 서열번호 6에 기재된 염기서열을 포함하는 제1프라이머 세트 및 서열번호 7 내지 12에 기재된 염기서열을 포함하는 제2프라이머 세트를 포함하고, 상기 제1프라이머 세트는 인플루엔자 A의 핵산과 특이적으로 반응하고, 상기 제2프라이머 세트는 인플루엔자 B의 핵산과 특이적으로 반응하고, 루프-매개-등온증폭반응(LAMP)에 의해 생물학적 시료로부터 인플루엔자 A 또는 B를 동시에 검출하는, 인플루엔자 검출용 프라이머 세트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 서열번호 1 내지 서열번호 6에 기재된 염기서열을 포함하는 제1프라이머 세트 및 서열번호 7 내지 12에 기재된 염기서열을 포함하는 제2프라이머 세트를 포함하고, 상기 제1프라이머 세트는 인플루엔자 A의 핵산과 특이적으로 반응하고, 상기 제2프라이머 세트는 인플루엔자 B의 핵산과 특이적으로 반응하고, 루프-매개-등온증폭반응(LAMP)을 이용하여 생물학적 시료로부터 인플루엔자 A 또는 B를 동시에 검출하는, 인플루엔자 검출용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 생물학적 시료로부터 RNA를 분리하는 단계; 상기 RNA를 주형으로 하고, 서열번호 1 내지 서열번호 6에 기재된 염기서열을 포함하는 제1프라이머 세트 및 서열번호 7 내지 12에 기재된 염기서열을 포함하는 제2프라이머 세트를 포함하고, 상기 제1프라이머 세트는 인플루엔자 A의 핵산과 특이적으로 반응하고, 상기 제2프라이머 세트는 인플루엔자 B의 핵산과 특이적으로 반응하고, 상기 제1프라이머 세트 및 제2프라이머 세트 중 어느 하나의 프라이머 세트와 특이적으로 결합하는 인플루엔자 A 또는 B의 검출이 가능하고, 상기 검출은, 루프-매개-등온증폭반응(LAMP)에 의한 것인 인플루엔자 검출용 프라이머 세트를 이용하여 증폭하는 단계; 및 상기 증폭 산물을 검출하는 단계; 를 포함하고, 상기 증폭은 루프-매개-등온증폭반응(LAMP)인, 인플루엔자 검출 방법을 제공하는 것이다.
그러나, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 해당 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 서열번호 1 내지 서열번호 6에 기재된 염기서열을 포함하는 제1프라이머 세트 및 서열번호 7 내지 12에 기재된 염기서열을 포함하는 제2프라이머 세트를 포함하고, 상기 제1프라이머 세트는 인플루엔자 A의 핵산과 특이적으로 반응하고, 상기 제2프라이머 세트는 인플루엔자 B의 핵산과 특이적으로 반응하고, 루프-매개-등온증폭반응(LAMP)에 의해 생물학적 시료로부터 인플루엔자 A 또는 B를 동시에 검출하는, 인플루엔자 검출용 프라이머 세트가 제공된다.
일 측에 따르면, 상기 루프-매개-등온증폭반응(LAMP)은, 역전사 루프-매개-등온증폭반응(RT-LAMP)일 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 제1프라이머 세트는, 인플루엔자 A 바이러스의 세그먼트 7(segment 7) 유전자에 표적하여 결합하는 것일 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 제2프라이머 세트는, 인플루엔자 B 바이러스의 세그먼트 5(segment 5) 유전자에 표적하여 결합하는 것일 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 생물학적 시료는, 혈액, 타액, 조직, 세포, 객담 및 소변으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것일 수 있다.
본 발명의 다른 일 실시예에 따르면, 서열번호 1 내지 서열번호 6에 기재된 염기서열을 포함하는 제1프라이머 세트 및 서열번호 7 내지 12에 기재된 염기서열을 포함하는 제2프라이머 세트를 포함하고, 상기 제1프라이머 세트는 인플루엔자 A의 핵산과 특이적으로 반응하고, 상기 제2프라이머 세트는 인플루엔자 B의 핵산과 특이적으로 반응하고, 루프-매개-등온증폭반응(LAMP)을 이용하여 생물학적 시료로부터 인플루엔자 A 또는 B를 동시에 검출하는, 인플루엔자 검출용 키트가 제공된다.
일 측에 따르면, 상기 루프-매개-등온증폭반응(LAMP)은, 역전사 루프-매개-등온증폭반응(RT-LAMP)일 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 제1프라이머 세트는, 인플루엔자 A 바이러스의 세그먼트 7(segment 7) 유전자에 표적하여 결합하는 것일 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 제2프라이머 세트는, 인플루엔자 B 바이러스의 세그먼트 5(segment 5) 유전자에 표적하여 결합하는 것일 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 생물학적 시료는, 혈액, 타액, 조직, 세포, 객담 및 소변으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 실시예에 따르면, 생물학적 시료로부터 RNA를 분리하는 단계; 상기 RNA를 주형으로 하고, 인플루엔자 검출용 프라이머 세트를 이용하여 증폭하되, 이 때의 인플루엔자 검출용 프라이머 세트는, 생물학적 시료로부터 바이러스를 검출함에 있어서, 서열번호 1 내지 서열번호 6에 기재된 염기서열을 포함하는 제1프라이머 세트 및 서열번호 7 내지 12에 기재된 염기서열을 포함하는 제2프라이머 세트를 포함하고, 상기 제1프라이머 세트는 인플루엔자 A의 핵산과 특이적으로 반응하고, 상기 제2프라이머 세트는 인플루엔자 B의 핵산과 특이적으로 반응하고, 상기 제1프라이머 세트 및 제2프라이머 세트 중 어느 하나의 프라이머 세트와 특이적으로 결합하는 인플루엔자 A 또는 B의 검출이 가능하고, 상기 검출은, 루프-매개-등온증폭반응(LAMP)에 의한 것인 인플루엔자 검출용 프라이머 세트인 증폭하는 단계; 및 상기 증폭 산물을 검출하는 단계; 를 포함하고, 상기 증폭은 루프-매개-등온증폭반응(LAMP)인, 인플루엔자 검출 방법이 제공된다.
일 측에 따르면, 상기 검출 방법은, 역전사 반응하는 단계; 를 더 포함할 수 있으며, 이 때, 루프-매개-등온증폭반응(LAMP)은, 역전사 루프-매개-등온증폭반응(RT-LAMP)일 수 있다.
본 발명을 이용하면, 인플루엔자 A 또는 B를 높은 민감도와 정확도로 구분하여 검출 할 수 있다. 또, 루프-매개-등온증폭반응을 이용함으로써, 일정 온도에서 반응이 진행되므로, 사용되는 기기의 제약이 적다. 또한, 별도의 전기영동 과정을 요하지 않아, 기존의 실시간 중합연쇄반응(RT-PCR)보다 신속한 검출이 가능하다는 장점이 있다.
그러나 본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
도 1은 제1프라이머 세트의 표적서열 위치 정보를 도시한 것이다.
도 2는 제2프라이머 세트의 표적서열 위치 정보를 도시한 것이다.
도 3은 제1프라이머 세트를 이용한 RT-LAMP의 민감도 테스트 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 제2프라이머 세트를 이용한 RT-LAMP 의 민감도 테스트 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 제1프라이머 세트 및 제2프라이머 세트 간의 상호 검출 테스트 결과를 나타낸 것이다.
이하에서, 첨부된 도면을 참조하여 실시예들을 상세하게 설명한다. 그러나, 실시예들에는 다양한 변경이 가해질 수 있어서 특허출원의 권리 범위가 이러한 실시예들에 의해 제한되거나 한정되는 것은 아니다. 실시예들에 대한 모든 변경, 균등물 내지 대체물이 권리 범위에 포함되는 것으로 이해되어야 한다.
실시예에서 사용한 용어는 단지 설명을 목적으로 사용된 것으로, 한정하려는 의도로 해석되어서는 안된다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 실시예가 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
또한, 첨부 도면을 참조하여 설명함에 있어, 도면 부호에 관계없이 동일한 구성 요소는 동일한 참조부호를 부여하고 이에 대한 중복되는 설명은 생략하기로 한다. 실시예를 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 실시예의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
본 발명에서 사용되는 용어에 대하여 간단히 설명한다.
본 명세서에서 “프라이머”는 단일가닥의 뉴클레오타이드를 의미하는 것으로서, 폴리머레이즈를 이용한 핵산의 증폭 또는 합성반응에서 상기 폴리머레이즈 3' 말단에 뉴클레오타이드가 공유결합에 의해 추가되어 연장되는 핵산분자를 의미한다.
본 명세서에서 “인플루엔자”는 일반적으로 알려진 인플루엔자 바이러스로서, 뉴클레오캡시드 단백질, 매트리스 단백질, 혈구응집 단백질, 뉴라미니데이즈, 중합효소 단위체 A, B1, B2 및 비구조 단백질 1, 2를 코딩하는 음성의 단일가닥 RNA 절편을 게놈으로 가지고 있는 바이러스를 의미한다.
본 명세서에서 ”핵산”은 단일가닥 또는 이중 가닥의 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 임의의 형태의 하나 이상의 뉴클레오타이드를 포함하는 RNA 또는 DNA분자 또는 그 유사체 및 그 유도체를 포함하는 것이다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 서열번호 1 내지 서열번호 6에 기재된 염기서열을 포함하는 제1프라이머 세트 및 서열번호 7 내지 12에 기재된 염기서열을 포함하는 제2프라이머 세트를 포함하고, 상기 제1프라이머 세트는 인플루엔자 A의 핵산과 특이적으로 반응하고, 상기 제2프라이머 세트는 인플루엔자 B의 핵산과 특이적으로 반응하고, 루프-매개-등온증폭반응(LAMP)에 의해 생물학적 시료로부터 인플루엔자 A 또는 B를 동시에 검출하는, 인플루엔자 검출용 프라이머 세트가 제공된다.
일 측에 따르면, 상기 루프-매개-등온증폭반응(LAMP)은, 역전사 루프-매개-등온증폭반응(RT-LAMP)일 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 제1프라이머 세트는, 인플루엔자 A 바이러스의 세그먼트 7(segment 7) 유전자에 표적하여 결합하는 것일 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 제2프라이머 세트는, 인플루엔자 B 바이러스의 세그먼트 5(segment 5) 유전자에 표적하여 결합하는 것일 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 생물학적 시료는, 혈액, 타액, 조직, 세포, 객담 및 소변으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것일 수 있다.
본 발명의 다른 일 실시예에 따르면, 서열번호 1 내지 서열번호 6에 기재된 염기서열을 포함하는 제1프라이머 세트 및 서열번호 7 내지 12에 기재된 염기서열을 포함하는 제2프라이머 세트를 포함하고, 상기 제1프라이머 세트는 인플루엔자 A의 핵산과 특이적으로 반응하고, 상기 제2프라이머 세트는 인플루엔자 B의 핵산과 특이적으로 반응하고, 루프-매개-등온증폭반응(LAMP)을 이용하여 생물학적 시료로부터 인플루엔자 A 또는 B를 동시에 검출하는, 인플루엔자 검출용 키트가 제공된다.
일 측에 따르면, 상기 루프-매개-등온증폭반응(LAMP)은, 역전사 루프-매개-등온증폭반응(RT-LAMP)일 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 제1프라이머 세트는, 인플루엔자 A 바이러스의 세그먼트 7(segment 7) 유전자에 표적하여 결합하는 것일 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 제2프라이머 세트는, 인플루엔자 B 바이러스의 세그먼트 5(segment 5) 유전자에 표적하여 결합하는 것일 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 생물학적 시료는, 혈액, 타액, 조직, 세포, 객담 및 소변으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 실시예에 따르면, 생물학적 시료로부터 RNA를 분리하는 단계; 상기 RNA를 주형으로 하고, 생물학적 시료로부터 바이러스를 검출함에 있어서, 서열번호 1 내지 서열번호 6에 기재된 염기서열을 포함하는 제1프라이머 세트 및 서열번호 7 내지 12에 기재된 염기서열을 포함하는 제2프라이머 세트를 포함하고, 상기 제1프라이머 세트는 인플루엔자 A의 핵산과 특이적으로 반응하고, 상기 제2프라이머 세트는 인플루엔자 B의 핵산과 특이적으로 반응하고, 상기 제1프라이머 세트 및 제2프라이머 세트 중 어느 하나의 프라이머 세트와 특이적으로 결합하는 인플루엔자 A 또는 B의 검출이 가능하고, 상기 검출은, 루프-매개-등온증폭반응(LAMP)에 의한 것인 인플루엔자 검출용 프라이머 세트를 이용하여 증폭하는 단계; 및 상기 증폭 산물을 검출하는 단계; 를 포함하고, 상기 증폭은 루프-매개-등온증폭반응(LAMP)인, 인플루엔자 검출 방법이 제공된다.
일 측에 따르면, 상기 검출 방법은, 역전사 반응하는 단계; 를 더 포함할 수 있으며, 이 때, 루프-매개-등온증폭반응(LAMP)은, 역전사 루프-매개-등온증폭반응(RT-LAMP)일 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 생물학적 시료는, 혈액, 타액, 조직, 세포, 객담 및 소변으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것일 수 있다.
본 발명의 인플루엔자 검출용 프라이머 세트는, 루프-매개-등온증폭반응(LAMP)에 의해 인플루엔자 A 또는 B의 핵산에 특이적으로 결합하여 검출할 수 있는 제1프라이머 세트 및 제2프라이머 세트를 포함하고 있다.
상기 제1프라이머 세트 및 제2프라이머 세트는 루프-매개-등온증폭반응(LAMP)용 프라이머 세트로, 각각 6개의 프라이머가 하나의 세트를 이루고 있다. 상기 6개의 프라이머는 각각 F3, B3, FIP, BIP, BLP 및 FLP이며, 구체적으로는, 제1프라이머 세트는 서열번호 1 내지 6의 순으로, 제2프라이머 세트는 서열번호 7 내지 12의 순으로 각각 F3, B3, FIP, BIP, BLP 및 FLP 이다. 이 때, 서열번호 1 내지 6 및 서열번호 7 내지 12의 염기서열은 실시예 3의 표 1에 기재된 서열과 같으며, 인플루엔자 A/B형 뿐만 아니라, 아형까지도 모두 검출할 수 있도록 제작된 것이다.
상기 제1프라이머 세트의 프라이머는 인플루엔자 A의 특정 염기서열에 표적 반응하는 염기서열을 포함하여 제작된 것으로, 구체적으로는 인플루엔자 A 바이러스의 세그먼트 7(segment 7) 유전자를 표적 서열로 하며, 상기 표적 서열의 위치 정보는 도 1에 도시된 바와 같다.
상기 제2프라이머 세트의 프라이머는 인플루엔자 B의 특정 염기서열에 표적 반응하는 염기서열을 포함하여 제작된 것으로, 구체적으로는 인플루엔자 B 바이러스의 세그먼트 5(segment 5) 유전자를 표적 서열로 하며, 상기 표적 서열의 위치 정보는 도2에 도시된 바와 같다.
상기 도 1 및 도 2에 각각 도시된 표적 서열 중 파란색으로 표시된 부분은 돌연변이되는 염기를 나타낸 것이며, 상기 돌연변이된 염기는 인플루엔자 바이러스의 아형에 따른 종별 염기서열 변이점으로써, 본 발명의 프라이머는 각 종별 인플루엔자 바이러스의 모든 아형을 포함하여 인플루엔자 A 및 B에 특이적으로 결합할 수 있다.
LAMP는 등온조건에서 높은 민감도와 특이성으로 표적 핵산을 증폭할 수 있는 핵산 증폭 방법 (Notomi, T. etal. 2000. Loop-Mediated Isothermal Amplification of DNA. Nucleic Acids Res 28, E63)으로 가닥교체(strand displacement) 활성을 갖는 DNA 폴리머라제 및 표적 핵산의 여러 부위에서 특이적으로 고안된 최소 4개 내지 6개의 프라이머 세트가 사용된다. 표준 LAMP 반응에는 4종류의 다음과 같은 프라이머가 사용된다. FIP (forward inner primer), BIP (backward inner primer), F3 (forward outer primer) 및 B3 (backward outer primer)가 하나의 세트에 포함되어야 LAMP 반응으로 검출을 진행할 수 있으며, 가속 프라이머를 추가로 포함할 수도 있다. 본 발명의 프라이머 세트는, 신속한 LAMP 반응(Accelerated LAMP)을 위해서 가속 프라이머로 FLP (Loop F primer) 및 BLP (Loop B primer)를 추가로 포함하여, 총 6개의 프라이머를 포함하는 프라이머 세트를 구성하였다.
루프-매개-등온증폭반응(LAMP)은 RT-PCR (reverse transcription-LAMP), 예를 들면, 표적 RNA를 역전사하는 동시에 LAMP에 의하여 증폭 하는 단일-단계(one-step) RT-LAMP일 수 있거나, 실시간 PCR (realtime LAMP) 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
상기 루프-매개-등온증폭반응(LAMP)은, 역전사 루프-매개-등온증폭반응(RT-LAMP)일 수 있다.
통상적으로 DNA를 검출하는 경우에는 루프-매개-등온증폭반응을 이용하여 검출할 수 있으나, RNA를 검출하는 경우에는 역전사반응이 더 필요하게 된다. 따라서, RNA로 이루어진 바이러스를 검출하기 위해서는 역전사 루프-매개-등온증폭반응(RT-LAMP)를 이용함이 더 바람직하다.
역전사 루프-매개-등온증폭반응은, 등온증폭반응용 조성물을 포함하며, 역전사 반응을 위한 추가 조성물을 더 포함할 수 있다. 상기 역전사 루프-매개-등온증폭반응용 조성물은 반응완충액, 중합효소, 템플레이트 RNA(Template RNA) 을 더 포함할 수 있다.
또, 검출의 편의성을 높이기 위해, 검출용 표지 화합물이 더 함유될 수도 있다. 이 때, 표지되는 화합물은 증폭과정에서 증폭산물에 포함되거나, 증폭산물에 물리적으로 삽입되어 통상적인 방식으로 증폭산물의 밀도, 농도, 양 등을 확인할 수 있는 화합물, 생체 분자 또는 생체 분자 유사체 등일 수 있으며, FAM, VIC, TET, JOE, HEX, CY3, CY5, ROX, RED610, TEXAS RED, RED670, TYE563 및 NED 등의 형광 염료(Fluorescent Dye)가 사용될 수도 있다. 후술하는 실시예에서는 작업의 용이성, 검출 민감도 등을 고려하여 표지 화합물로 형광 염료를 사용하였으나, 표지 화합물은 앞서 열거한 물질 중 경우에 따라 자유롭게 선택될 수 있으며, 특별히 제한되는 바는 아니다. 이외에도 등온증폭반응 또는 역전사 등온증폭반응을 수행하는데 부수적으로 필요한 도구나 시약 등이 더 포함될 수 있다. 상술한 내용은 검출용 조성물의 일부만을 열거한 것이며, 본 발명에 이용되는 반응용 조성물 또는 검출용 조성물이 이에 특별히 제한되는 바는 아니다.
본 발명의 검출에 이용되는 생물학적 시료는 전형적으로 인간을 포함하는 포유류의 액상 또는 세포 또는 조직 시료로, 예를 들면, 전혈, 혈장, 혈청, 림프액, 소변, 타액, 눈물, 코인두 분비물, 모유를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 혈액, 세포 또는 조직의 분획이나 유도물을 포함할 수 있으며, 세포 자체 또는 세포나 조직의 융해물이 사용될 수 있다.
상기 생물학적 시료는, 건조된 형태의 액상 또는 조직시료가 이용될 수 있다. 이러한 생물학적 시료는 검출을 수행하기 전에, 인플루엔자 검출이 필요한 통상의 시료 수득방법에 의해 대상체로부터 직접 수득된 것이거나, 종전에 미리 분리되어 보관된 것일 수 있다. 혹은, 인플루엔자 검출이 필요한 대상으로부터 수득된 조직이나 세포 또는 인비트로 세포 배양물이 사용될 수도 있으나, 이에 제한되는 바는 아니다. 다른 예로, 상기 생물학적 시료는 상술한 세포 또는 조직시료로부터 분리된 핵산이 시료로서 사용될 수 있다. 이 때, 분리하는 과정에서 다양한 순도로 분리되는 당업계에서 사용되는 생물학적인 분리방법이 동원될 수 있다.
보다 구체적인 설명은 이하의 실시예를 통해 후술하도록 한다.
실시예 1. 바이러스 핵산 추출
인플루엔자 바이러스 A 및B의 핵산을 확보하기 위해 인플루엔자 A 바이러스를 질병관리본부에서 구입하였으며, 인플루엔자 A의 아형인 H3N1, H1N1 및 인플루엔자 B 바이러스의 경우에는 환자의 체액 샘플에서 분리한 것을 이용하였다.
인플루엔자 A 및 B 바이러스의 RNA는 Qiagen 사의 QIAamp® 키트(Viral RNA KIT)를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라서 추출하였다. 또한, 검출한계를 확인하기 위해 해당 위치를 함유하고 있는 DNA 서열을 합성하여 Copy 넘버를 측정한 후, DNA 분해효소 및 RNA 분해효소가 존재하지 않는 증류수로 희석하여 사용하였다. 테스트에 사용된 핵산은 비 사용시 -50 ℃에 보관하였다.
실시예 2. 인플루엔자 검출용 프라이머 세트의 제작
인플루엔자 바이러스 A 및 B의 염기서열을 바탕으로 하기의 표 1과 같이 디자인된 인플루엔자 바이러스 검출용 프라이머 세트를 제작하였다. 실시예 1에서 추출한 인플루엔자 A 및 B의 핵산의 염기서열을 이용하여, 2종의 프라이머 세트를 제작하였다. 먼저, 제1프라이머 세트는 인플루엔자 A 의 아형까지 검출할 수 있는 인플루엔자 A 검출용 프라이머 세트이고, 제2프라이머 세트는 인플루엔자 B를 검출할 수 있는 인플루엔자 B 검출용 프라이머 세트이다. 두 세트 모두는 루프 매개 등온증폭반응에 이용하기 위해 각각 6개의 프라이머로 구성되었으며, 두 세트를 모두 이용하여 인플루엔자 A 또는 B를 동시에 검출할 수 있을 것으로 예상되었다.
서열
번호		 프라이머 염기서열(5'-3') 타깃
유전자		 길이
1
인플루엔자 A
검출용
프라이머
(제1프라이머 세트)		 F3 TTGCWGGRAARAAYACMGA
인플루엔자 A
세그먼트7
(segment 7) 		19
2 B3 ATRTTRTTTGGRTCHCCATTYC 22
3 FIP TCCCCTTAGTCAGAGGTGACAGTCTYGAGGCWCTCATGGA 40
4 BIP TTRGGRTTTGTRTTCACGCTCACATTDAGGGCATTYTGRACAA 43
5 BLP CGTGCCCAGTGAGCGAGG 18
6 FLP GATTGGTCTTGTCTTTAGCCAT 22
7
인플루엔자 B
검출용
프라이머
(제2프라이머 세트)		 F3 GAGCTGCCTATGAAGACC
인플루엔자 B
세그먼트5
(segment 5)		 18
8 B3 CGTCTCCACCTACTTCGT 18
9 FIP GAACATGGAAACCCTTGCATTTTAAGTTTTGTCTGCATTAACAGGC 46
10 BIP GAACAGRTRGAAGGAATGGGRGCGATCTGGTCATTGGAGCC 41
11 BLP TGCTGATCTAGGCTTGAATTCTGT 24
12 FLP AGCTCTGATGTCCATCAAGCTCC 23
실시예 3. LAMP 혼합물 조성 및 반응 조건
상기 표 1의 인플루엔자 검출용 프라이머 세트의 검출 효능을 실험하기 위해, RT-PCR을 이용한 공지된 검출 방법과 비교실험을 진행하였다.
비교를 위해, 먼저 하기의 표 2와 같이 RT-PCR용 프라이머 세트를 준비하였다.
연번 프라이머 염기서열(5'-3')
1
인플루엔자 A
qRT-PCR 프라이머		 F primer AGATGAGTCTTCTAACCGAGGTCG
2 R primer TGACAGRATYGGTCTTGTCTTTAGCCAYTCCA
3 Probe TCAGGCCCCCTCAAAGCCGAG
4 WHO
인플루엔자 B
qRT-PCR 프라이머		 F primer TACACAGCAAAAAGACCC
5 R primer TCCACTCCCTTTCTCCCC
6 Probe ACACCCCCAGACCAGATGA
본 발명의 프라이머 세트를 이용한 실험1(원스텝 RT-LAMP검출실험)과 종래의 방법을 이용한 실험 2(RT-PCR 검출실험)을 비교하기 위해, 각 실험용 혼합물은 하기의 표3과 같이 조성하였으며, 각 실험의 반응조건 및 시간은 하기의 표 4와 같이 진행되었다.
실험 1. 원스텝 RT-LAMP검출실험 실험 2. RT-PCR 검출실험
구분 부피 구분 부피
2X 반응용버퍼 12.5 μl 5X 반응용버퍼 5 μl
효소 버퍼 1 μl 효소 버퍼 2 μl
형광 염료 1 μl - -
프라이머
(FIP, BIP, FLP, BLP)		 각 최종 농도
80 nM		 프라이머 F 최종 농도 300 nM
프라이머 R 최종 농도 300 nM
프라이머(F3, B3) 각 최종 농도
100 nM
프로브 P 최종 농도 200 nM
템플레이트 RNA 5 μl 템플레이트 RNA 1 μl
- - 증류수 10 μl
전체부피 25 μl 전체부피 25 μl
상기 표 3의 반응용 조성물 중, 실험 1에 이용된 2X 반응용 버퍼, 효소 버퍼 및 형광 염료는 EIKEN에서 구입했고, 실험 2에 이용된 5X 반응용 버퍼 및 효소 버퍼는 Solgent에서 구입했다. 위의 조성물을 이용하여 실험 1 및 실험 2를 진행하였으며, 이 때 두 실험의 증폭 반응의 온도 조건 및 소요시간은 하기의 표 4와 같다.
실험 1. 원스텝 RT-LAMP검출실험 실험 2. RT-PCR 검출실험
온도 반응시간 온도(단계별) 반응시간
65 ℃ 1분 60 Cycle 50 ℃ 20 분
95 ℃ 10 분
80 ℃ 5분 95 ℃ 20초 45 Cycle
55 ℃ 20초
72 ℃ 20초
전체반응시간 75분 전체반응시간 115분
표 4를 보면, 전체반응 시간이 실험2에 비해 실험1에서 약 40분 가량 짧아, 본 발명의 방법을 이용하면 검출 반응이 보다 신속하게 일어남을 확인할 수 있었다. 추후 실시예에 나온 RT-PCR과 RT-LAMP의 테스트는 모두 위 실험방법을 사용한다.
실시예 4. 인플루엔자 A/B 바이러스 균주 검출 및 효능 비교
위 실험의 추출된 RNA 검체를 대상으로 한 상기 실험 1 및 실험 2의 검출 시간 비교를 위해, Flu A와 Flu B에 있어 동일한 배양 검체를 사용하고, 실험 1, 실험 2는 각각 표1, 표2에 기재된 프라이머 세트를 이용하였다. 또, 실험 1 및 실험2는 상기 표 4에 기재된 방법으로 실험을 실시하여 Ct-value 값을 확인하였으며, 각 실험에서의 형광검출의 양성을 의미하는 값인 Ct-value 값은 하기의 표5와 같았다. 표 5의 데이터로부터 Ct-value 값의 양성을 확인하였으며, 이로부터 동일한 시료상의 인플루엔자 A 및 B의 검출시간은 RT-PCR에 비해 RT-LAMP가 빠르다는 것을 확인하였다.
Ct-value
실험 1 실험2
Flu A 26.14 19.27
Flu B 12.49 26.51
실시예 5. 검출한계 테스트
인플루엔자 A/B에 대한 양성 대조군(positive control)을 각각 제작하고, 각각의 양성 대조군을 희석하여 표 1의 프라이머 세트의 민감도를 확인하였다. 확인을 위한 테스트 결과는 도 3 및 도 4에 도시한 바와 같으며, 도 3은 상기 인플루엔자 A의 검출한계를, 도 4는 상기 인플루엔자 B의 검출한계를 테스트한 결과를 나타낸 것이다. 각 실험에서 양성 대조군은 100부터 109까지 희석농도가 다른 총 10개의 버전으로 나누어 진행했으며, 각각의 Ct-value는 하기의 표 6과 같았다.
연번 Copies/μl Ct-value
인플루엔자 A 인플루엔자 B
1 109 31.07 10.97
2 108 34.96 12.11
3 107 41.17 13.15
4 106 50.16 14.21
5 105 50.1 16.23
6 104 N/A 17.37
7 103 N/A 20.5
8 102 N/A N/A
9 101 N/A N/A
10 100 N/A N/A
상기 표 6은, 인플루엔자 A/B 유전자의 뉴클레오단백질(Nucleoprotein) 부분을 삽입한 합성된 DNA(양성대조물질)에 대해 10분의 1의 희석배수를 이용하여 농도별 분석능을 검증한 것으로, 표 6을 보면, 인플루엔자 A는 105 카피에서, 인플루엔자 B는 103 카피에서 검출한계를 나타내는 것으로 확인되었다.
실시예 6. 교차 반응 테스트
추출된 RNA 검체를 대상으로 한 RT-LAMP에서 인플루엔자 A/B 바이러스의 각 서열에 대한 특이적인 반응을 확인하기 위해 상호 교차 반응을 실시하였다. 하기의 표 7 및 도 5에 도시된 바와 같이 상호 교차 반응 및 비특이적인 반응에 대한 결과는 없음을 확인하였다.
RNA 검체 샘플 Ct-value
인플루엔자 A 검출용 프라이머 세트 인플루엔자 B 검출용 프라이머 세트
Flu A(질본) 34.63 N/A
H1N1(2009) 22.01 N/A
H3N1 35.54 N/A
Flu B N/A 13.03
hsRNA(Non-infected human serum RNA) N/A N/A
D.W N/A N/A
이상과 같이 실시예들이 비록 한정된 도면에 의해 설명되었으나, 해당 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기를 기초로 다양한 기술적 수정 및 변형을 적용할 수 있다. 예를 들어, 설명된 기술들이 설명된 방법과 다른 순서로 수행되거나, 및/또는 설명된 구성요소들이 설명된 방법과 다른 형태로 결합 또는 조합되거나, 다른 구성요소 또는 균등물에 의하여 대치되거나 치환되더라도 적절한 결과가 달성될 수 있다.그러므로, 다른 구현들, 다른 실시예들 및 특허청구범위와 균등한 것들도 후술하는 청구범위의 범위에 속한다.
<110> KOREA UNIVERSITY FOUNDATION <120> The primer set for detecting Influenza virus, a kit comprising the same, and detection method using the same <160> 12 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FluA primer F3 <400> 1 ttgcwggraa raayacmga 19 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FluA primer B3 <400> 2 atrttrtttg grtchccatt yc 22 <210> 3 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FluA primer FIP <400> 3 tccccttagt cagaggtgac agtctygagg cwctcatgga 40 <210> 4 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FluA primer BIP <400> 4 ttrggrtttg trttcacgct cacattdagg gcattytgra caa 43 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FluA primer FLP <400> 5 gattggtctt gtctttagcc at 22 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FluA primer BLP <400> 6 cgtgcccagt gagcgagg 18 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FluB primer F3 <400> 7 gagctgccta tgaagacc 18 <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FluB primer B3 <400> 8 cgtctccacc tacttcgt 18 <210> 9 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FluB primer FIP <400> 9 gaacatggaa acccttgcat tttaagtttt gtctgcatta acaggc 46 <210> 10 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FluB primer BIP <400> 10 gaacagrtrg aaggaatggg rgcgatctgg tcattggagc c 41 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FluB primer FLP <400> 11 agctctgatg tccatcaagc tcc 23 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FluB primer BLP <400> 12 tgctgatcta ggcttgaatt ctgt 24

Claims (12)

  1. 서열번호 1 내지 서열번호 6에 기재된 염기서열을 포함하는 제1프라이머 세트 및 서열번호 7 내지 12에 기재된 염기서열을 포함하는 제2프라이머 세트를 포함하고,
    상기 제1프라이머 세트는 인플루엔자 A의 핵산과 특이적으로 반응하고,
    상기 제2프라이머 세트는 인플루엔자 B의 핵산과 특이적으로 반응하고,
    루프-매개-등온증폭반응(LAMP)에 의해 생물학적 시료로부터 인플루엔자 A 또는 B를 동시에 검출하는, 인플루엔자 검출용 프라이머 세트.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 루프-매개-등온증폭반응(LAMP)은, 역전사 루프-매개-등온증폭반응(RT-LAMP)인, 인플루엔자 검출용 프라이머 세트.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 제1프라이머 세트는, 인플루엔자 A 바이러스의 세그먼트 7(segment 7) 유전자에 특이적으로 결합하는, 인플루엔자 검출용 프라이머 세트.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 제2프라이머 세트는, 인플루엔자 B 바이러스의 세그먼트 5(segment 5) 유전자에 특이적으로 결합하는, 인플루엔자 검출용 프라이머 세트.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 생물학적 시료는, 혈액, 타액, 조직, 세포, 객담 및 소변으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인, 인플루엔자 검출용 프라이머 세트.
  6. 서열번호 1 내지 서열번호 6에 기재된 염기서열을 포함하는 제1프라이머 세트 및 서열번호 7 내지 12에 기재된 염기서열을 포함하는 제2프라이머 세트를 포함하고,
    상기 제1프라이머 세트는 인플루엔자 A의 핵산과 특이적으로 반응하고,
    상기 제2프라이머 세트는 인플루엔자 B의 핵산과 특이적으로 반응하고,
    루프-매개-등온증폭반응(LAMP)을 이용하여 생물학적 시료로부터 인플루엔자 A 또는 B를 동시에 검출하는, 인플루엔자 검출용 키트.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 루프-매개-등온증폭반응(LAMP)은, 역전사 루프-매개-등온증폭반응(RT-LAMP)인, 인플루엔자 검출용 프라이머 세트.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 제1프라이머 세트는, 인플루엔자 A 바이러스의 세그먼트 7(segment 7) 유전자에 표적하여 결합하는, 인플루엔자 검출용 키트.
  9. 제6항에 있어서,
    상기 제2프라이머 세트는, 인플루엔자 B 바이러스의 세그먼트 5(segment 5) 유전자에 표적하여 결합하는, 인플루엔자 검출용 키트.
  10. 제6항에 있어서,
    상기 생물학적 시료는, 혈액, 타액, 조직, 세포, 객담 및 소변으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인, 인플루엔자 검출용 프라이머 키트.
  11. 생물학적 시료로부터 RNA를 분리하는 단계;
    상기 RNA를 주형으로 하고, 제1항의 인플루엔자 검출용 프라이머 세트를 이용하여 증폭하는 단계; 및
    상기 증폭 산물을 검출하는 단계;
    를 포함하고,
    상기 증폭은 루프-매개-등온증폭반응(LAMP)인, 인플루엔자 검출 방법.
  12. 제11항에 있어서,
    역전사 반응하는 단계;
    를 더 포함하고,
    상기 루프-매개-등온증폭반응(LAMP)은, 역전사 루프-매개-등온증폭반응(RT-LAMP)인, 인플루엔자 검출 방법.
KR1020180141023A 2018-11-15 2018-11-15 인플루엔자 바이러스 검출용 프라이머 세트, 이를 포함하는 검출용 키트 및 이를 이용한 검출 방법 KR102174967B1 (ko)

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