KR20200054137A - 바이러스 기반 치료제와 변형된 폴리(베타-아미노 에스테르)의 복합체 - Google Patents

바이러스 기반 치료제와 변형된 폴리(베타-아미노 에스테르)의 복합체 Download PDF

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KR20200054137A
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살바도르 보로스 고메즈
크리스티나 필라트 폰츠
파우 브루가다 비라
안나 카스칸테 시레라
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사게티스 바이오테크, 에스엘
인스티튜트 디＇인베스티가시온스 바이오메디퀘스 아우구스트 피 아이 수니에르
인스티튜트 퀴믹 데 사리아 세츠 펀다시오 프리바다
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Abstract

적어도 하나의 올리고펩티드로 변형된 폴리(베타-아미노 에스테르)(PBAE)인 중합체와 바이러스 기반 치료제의 복합체가 개시된다. 또한, 이러한 복합체를 사용한 치료 방법 및 상기 복합체를 캡슐화하여 나노입자를 형성하는 방법이 개시된다.

Description

바이러스 기반 치료제와 변형된 폴리(베타-아미노 에스테르)의 복합체
본 발명은 요법에서 바이러스 기반 치료제의 전달을 위한 벡터로서의 변형된 폴리(베타-아미노 에스테르)(PBAE)의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 변형된 폴리(베타-아미노 에스테르)와 바이러스 기반 치료제의 복합체 및 이러한 부가물을 사용한 특수한 치료 방법에 관한 것이다.
생체내에서 바이러스 기반 치료제를 전달하기 위한 안전하고 효율적인 벡터의 부재는 전신 유전자 요법의 성공에 대한 주요 장애로 남아있다. 주요 장애는 바이러스 벡터에 대한 항체의 높은 혈청-출현율(sero-prevalence) 및 바이러스 벡터의 자연적 간 향성(liver tropism) 및 간-매개 제거(clearance)이며, 이는 투여, 예를 들어 정맥내 투여 후 이들 제제의 가용 순환 용량을 상당히 감소시킨다. 환자에서 혈청 우세 집단을 촉진하는 방식으로 면역계를 우회하는 것이 바람직할 것이다. 치료 유용성(예를 들어, 종양 표적화)을 향상시키고 치료 효율을 개선하고 원치않는 부작용을 감소시키거나 제거하도록 바이러스 향성을 조작하는 것이 또한 바람직할 것이다.
WO-2014/136100-A는 폴리뉴클레오티드 전달 벡터로서 변형된 폴리(β-아미노 에스테르)(PBAE)를 설명하고 있지만, 바이러스 기반 치료제의 전달은 언급하고 있지 않다.
문헌[Rojas et al., Journal of Controlled Release 237 (2016) 78-88]은 중화 항체(NAb)에 대항한 인간 아데노바이러스 혈청형 5에 대한 보호 메커니즘으로서 알부민 결합의 사용을 설명하고 있다.
본 발명은 상기 언급된 문제들을 해결하고 생체내 바이러스 기반 치료제의 전달에서의 말단-변형된 PBAE의 용도를 제공한다. 본 발명은 또한 바이러스 기반 치료제와 말단-변형된 중합체의 복합체, 상기 복합체의 제조 방법, 이들 중합체를 포함하는 약물 전달 장치(예를 들어, 마이크로입자, 나노입자), 및 상기 복합체의 사용 방법을 제공한다.
말단-변형된 PBAE 중합체는 생분해성 기를 갖는다. 이러한 시스템의 폴리에스테르 성질은 이의 높은 생분해성 및 감소된 독성으로 인해 매력적인 생체적합성 프로파일을 제공한다. 이들 중합체는 많은 질환, 예컨대 암, 단일유전자 질환, 혈관 질환 및 감염성 질환의 치료에서 바이러스 전달 벡터로서의 용도를 갖는다. 이들 바이러스 전달 벡터의 다른 용도는 세포 및 생리학적 맥락 내에서 유전자 기능 또는 조절을 조사하기 위한 도구로서의 시험관내 연구일 수 있다.
제1 측면에서, 본 발명은 바이러스 기반 치료제와 화학식 I의 중합체 또는 약학적으로 허용되는 이의 염의 복합체를 제공한다.
[화학식 I]
Figure pct00001
상기 식에서,
L1 및 L2는
Figure pct00002
, O, S, NRX 및 결합으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고; 여기서, RX는 수소, 할로겐, 알킬, 사이클로알킬, 알케닐, 사이클로알케닐, 헤테로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아실, 아릴 또는 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;
L3은 알킬렌, 알케닐렌, 헤테로알킬렌, 헤테로알케닐렌, 아릴렌 또는 헤테로아릴렌으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되거나;
적어도 한 경우의 L3은
Figure pct00003
이고,
여기서, T1은
Figure pct00004
이고,
T2는 H, 알킬 또는
Figure pct00005
로부터 선택되고;
여기서, LT는
Figure pct00006
, O, S, NRX 및 결합으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고,
여기서, RX는 수소, 할로겐, 알킬, 사이클로알킬, 알케닐, 사이클로알케닐, 헤테로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아실, 아릴 또는 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고, 나머지 L3 기는 각각의 경우마다 알킬렌, 알케닐렌, 헤테로알킬렌, 헤테로알케닐렌, 아릴렌 또는 헤테로아릴렌으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;
L4는
Figure pct00007
및
Figure pct00008
로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;
L5는 알킬렌, 알케닐렌, 헤테로알킬렌, 헤테로알케닐렌, 아릴렌 또는 헤테로아릴렌으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;
R1 및 R2 및 RT(존재할 경우)는 올리고펩티드 및 Ry로부터 독립적으로 선택되고;
여기서, R1 및 R2 및 RT(존재할 경우) 중 적어도 하나는 올리고펩티드이고;
Ry는 수소, 할로겐, 알킬, 사이클로알킬, 알케닐, 사이클로알케닐, 헤테로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아실, 아릴 또는 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;
각각의 R3은 수소, 할로겐, 알킬, 사이클로알킬, 알케닐, 사이클로알케닐, 헤테로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아실, 아릴, 헤테로아릴 및 폴리알킬렌 글리콜로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고, 상기 폴리알킬렌 글리콜은 R3이 부착되는 질소 원자에 직접 결합되거나 R3이 부착되는 질소 원자에 링커 모이어티를 통해 결합되고, 상기 링커 모이어티는 알킬렌, 사이클로알킬렌, 알케닐렌, 사이클로알케닐렌, 헤테로알킬렌, 헤테로사이클로알킬렌, 아릴렌 또는 헤테로아릴렌 기이고;
n은 5 내지 1,000의 정수이다.
상기 제1 측면에 따르면, 일부 실시형태에서 적어도 하나의 R3 기는 폴리알킬렌 글리콜, 바람직하게는 폴리에틸렌 글리콜이다. 일부 실시형태에서, 폴리알킬렌 글리콜(예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜)은 R3이 부착되는 질소 원자에 직접 결합된다. 일부 실시형태에서, 폴리알킬렌 글리콜(예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜)은 R3이 부착되는 질소 원자에 링커 모이어티를 통해 결합된다. 바람직한 실시형태에서, 링커 모이어티는 알킬렌, 알케닐렌 또는 헤테로알킬렌 기이고, 보다 바람직하게는 링커 모이어티는 알킬렌 기이다. 일부 실시형태에서, 링커 모이어티는 3 내지 20개의 탄소 및/또는 헤테로원자의 길이, 바람직하게는 4 내지 15개의 탄소 및/또는 헤테로원자의 길이, 보다 바람직하게는 5 내지 10개의 탄소 및/또는 헤테로원자의 길이이다.
본 발명의 제1 측면의 일부 바람직한 실시형태에서, 적어도 하나의 R3 기는 폴리알킬렌 글리콜, 및 L4 기의 질소 원자에 직접 결합된 폴리알킬렌 글리콜(예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜)이다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 R3 기는 폴리알킬렌 글리콜, 및 L4 기의 질소 원자에 링커 모이어티를 통해 결합된 폴리알킬렌 글리콜(예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜)이다. 바람직한 실시형태에서, 링커 모이어티는 알킬렌, 알케닐렌 또는 헤테로알킬렌 기이고, 보다 바람직하게는 링커 모이어티는 알킬렌 기이다. 일부 실시형태에서, 링커 모이어티는 3 내지 20개의 탄소 및/또는 헤테로원자의 길이, 바람직하게는 4 내지 15개의 탄소 및/또는 헤테로원자의 길이, 보다 바람직하게는 5 내지 10개의 탄소 및/또는 헤테로원자의 길이이다.
제1 측면의 일부 실시형태에서, L3은 알킬렌, 알케닐렌, 헤테로알킬렌, 헤테로알케닐렌, 아릴렌 또는 헤테로아릴렌으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다.
제1 측면의 일부 실시형태에서, 적어도 한 경우의 L3은
Figure pct00009
이고,
여기서, T1은
Figure pct00010
이고
T2는 H, 알킬 또는
Figure pct00011
로부터 선택되고;
여기서, LT는
Figure pct00012
, O, S, NRX 및 결합으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고; 여기서, RX는 수소, 할로겐, 알킬, 사이클로알킬, 알케닐, 사이클로알케닐, 헤테로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아실, 아릴 또는 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고, 나머지 L3 기는 각각의 경우마다 알킬렌, 알케닐렌, 헤테로알킬렌, 헤테로알케닐렌, 아릴렌 또는 헤테로아릴렌으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다.
제2 측면에서, 본 발명은
L1 및 L2가
Figure pct00013
, O, S, NRX 및 결합으로부터 독립적으로 선택되고; 여기서, RX는 수소, 할로겐, 알킬, 사이클로알킬, 알케닐, 사이클로알케닐, 헤테로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아실, 아릴 또는 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;
L3이 알킬렌, 알케닐렌, 헤테로알킬렌, 헤테로알케닐렌, 아릴렌 또는 헤테로아릴렌으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되거나;
적어도 한 경우의 L3이
Figure pct00014
이고,
여기서 T1이
Figure pct00015
이고
T2가 H, 알킬 또는
Figure pct00016
로부터 선택되고;
여기서, LT가
Figure pct00017
, O, S, NRX 및 결합으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고, 여기서 RX가 수소, 할로겐, 알킬, 사이클로알킬, 알케닐, 사이클로알케닐, 헤테로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아실, 아릴 또는 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고, 나머지 L3 기는 각각의 경우마다 알킬렌, 알케닐렌, 헤테로알킬렌, 헤테로알케닐렌, 아릴렌 또는 헤테로아릴렌으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;
L4가
Figure pct00018
및
Figure pct00019
로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;
L5가 알킬렌, 알케닐렌, 헤테로알킬렌, 헤테로알케닐렌, 아릴렌 또는 헤테로아릴렌으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;
R1 및 R2 및 RT(존재할 경우)가 올리고펩티드 및 Ry로부터 독립적으로 선택되고;
여기서, R1 및 R2 및 RT(존재할 경우) 중 적어도 하나가 올리고펩티드이고;
Ry가 수소, 할로겐, 알킬, 사이클로알킬, 알케닐, 사이클로알케닐, 헤테로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아실, 아릴 또는 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;
각각의 R3이 수소, 할로겐, 알킬, 사이클로알킬, 알케닐, 사이클로알케닐, 헤테로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아실, 아릴, 헤테로아릴 및 폴리알킬렌 글리콜로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고, 여기서 상기 폴리알킬렌 글리콜이 R3이 부착되는 질소 원자에 직접 결합되거나 R3이 부착되는 질소 원자에 링커 모이어티를 통해 결합되고, 상기 링커 모이어티가 알킬렌, 사이클로알킬렌, 알케닐렌, 사이클로알케닐렌, 헤테로알킬렌, 헤테로사이클로알킬렌, 아릴렌 또는 헤테로아릴렌 기이고;
적어도 하나의 R3 기가 폴리알킬렌 글리콜이고;
n이 5 내지 1,000의 정수인 화학식 I의 중합체 또는 약학적으로 허용되는 이의 염을 제공한다.
적어도 하나의 R3 기가 폴리알킬렌 글리콜인 상기 제2 측면에 따르면, 폴리알킬렌 글리콜은 바람직하게는 폴리에틸렌 글리콜이다. 제2 측면의 일부 실시형태에서, 폴리알킬렌 글리콜(예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜)은 R3이 부착되는 질소 원자에 직접 결합된다. 일부 실시형태에서, 폴리알킬렌 글리콜(예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜)은 R3이 부착되는 질소 원자에 링커 모이어티를 통해 결합된다. 바람직한 실시형태에서, 링커 모이어티는 알킬렌, 알케닐렌 또는 헤테로알킬렌 기이고, 보다 바람직하게는 링커 모이어티는 알킬렌 기이다. 일부 실시형태에서, 링커 모이어티는 3 내지 20개의 탄소 및/또는 헤테로원자의 길이, 바람직하게는 4 내지 15개의 탄소 및/또는 헤테로원자이 길이, 보다 바람직하게는 5 내지 10개의 탄소 및/또는 헤테로원자의 길이이다.
본 발명의 제2 측면의 일부 바람직한 실시형태에서, 폴리알킬렌 글리콜(예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜)인 적어도 하나의 R3 기는 L4 기의 질소 원자에 직접 결합된다. 일부 실시형태에서, 폴리알킬렌 글리콜(예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜)인 적어도 하나의 R3 기는 L4 기의 질소 원자에 링커 모이어티를 통해 결합된다. 바람직한 실시형태에서, 링커 모이어티는 알킬렌, 알케닐렌 또는 헤테로알킬렌 기이고, 보다 바람직하게는 링커 모이어티는 알킬렌 기이다. 일부 실시형태에서, 링커 모이어티는 3 내지 20개의 탄소 및/또는 헤테로원자의 길이, 바람직하게는 4 내지 15개의 탄소 및/또는 헤테로원자의 길이, 보다 바람직하게는 5 내지 10개의 탄소 및/또는 헤테로원자의 길이이다.
제2 측면의 일부 실시형태에서 L3은 알킬렌, 알케닐렌, 헤테로알킬렌, 헤테로알케닐렌, 아릴렌 또는 헤테로아릴렌으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다.
제2 측면의 일부 실시형태에서 적어도 한 경우의 L3은
Figure pct00020
이고,
여기서, T1은
Figure pct00021
이고
T2는 H, 알킬 또는
Figure pct00022
이고;
여기서, LT는
Figure pct00023
, O, S, NRX 및 결합으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고; 여기서, RX는 수소, 할로겐, 알킬, 사이클로알킬, 알케닐, 사이클로알케닐, 헤테로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아실, 아릴 또는 헤테로아릴로부터 독립적으로 선택되고, 나머지 L3 기는 각각의 경우마다 알킬렌, 알케닐렌, 헤테로알킬렌, 헤테로알케닐렌, 아릴렌 또는 헤테로아릴렌으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다.
따라서, 본 발명의 복합체는 적어도 하나의 올리고펩티드로 말단-변형된 PBAE를 포함한다. 본 발명의 일부 실시형태에서, 본 발명의 복합체는 직접적으로 또는 링커를 통해 적어도 하나의 폴리알킬렌 글리콜 기(바람직하게는 폴리에틸렌 글리콜 기)로 치환되고 적어도 하나의 올리고펩티드로 말단-변형된 PBAE를 포함한다.
화학식 I의 중합체는 화학식 II의 디아크릴레이트 단량체를 화학식 L4H2의 치환된 아민과 반응시켜 화학식 III의 아크릴레이트 종결된 중간체를 형성함으로써 제조할 수 있다.
Figure pct00024
이어서, 말단 아크릴레이트 기와의 반응에 의해 기 R1L1 및 R2L2가 첨가되어 화학식 I의 중합체가 형성될 수 있다.
Figure pct00025
적어도 하나의 R3 기가 폴리알킬렌 글리콜 모이어티인 화학식 I의 중합체는 화학식 II의 디아크릴레이트 단량체와 화학식 L4H2의 치환된 아민을 반응시켜 유사한 방식으로 제조할 수 있으며, 여기서 상기 아민은 아민의 질소에 상기 정의된 링커 모이어티를 통해 임의로 결합된 폴리알킬렌 글리콜 모이어티로 치환된다.
각각의 L1 및 L2는 말단-변형 기 R1 및 R2가 PBAE 중합체에 커플링하는 것을 촉진하도록 선택된다. 각각의 L1 및 L2는 결합일 수 있으며, 예를 들어 이때 말단-변형 기는 말단 시스테인 잔기를 포함하는 올리고펩티드이다.
LT는 말단-변형 기 RT가 PBAE 중합체에 커플링하는 것을 촉진하도록 선택된다. LT는 결합일 수 있으며, 예를 들어 이때 말단-변형 기는 말단 시스테인 잔기를 포함하는 올리고펩티드이다.
RX는 수소, 알킬, 사이클로알킬, 알케닐, 사이클로알케닐, 헤테로알킬 및 헤테로사이클로알킬로 이루어진 군, 예를 들어 수소, 알킬 및 사이클로알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다.
반복 단위가 (꺾쇠괄호로) 표시되어 있는 본원에 개시된 화합물들에서, 꺾쇠괄호 내의 각 기(예를 들어, L3, L4)는 각 단일 반복 단위에 대해 제공된 정의들로부터 독립적으로 선택된다. 다시 말해서, 특정 중합체 내의 반복 단위가 동일할 필요는 없다.
올리고펩티드
본 발명에 따르면, "올리고펩티드"는 펩티드 결합에 의해 함께 연결된 적어도 3개의 일련의 아미노산을 포함한다. 이러한 펩티드는 바람직하게는 천연 아미노산만을 함유하지만, 비천연 아미노산(즉, 천연에서는 발생하지 않지만 폴리펩티드 쇄에 혼입될 수 있는 화합물) 및/또는 당업계에 공지된 아미노산 유사체가 대안적으로 사용될 수도 있다. 또한, 이러한 펩티드 내의 아미노산 중 하나 이상은 예를 들어 탄수화물 기, 포스페이트 기, 파르네실 기, 이소파르네실 기, 지방산 기, 또는 접합, 기능화 또는 기타 변형 등을 위한 링커와 같은 화학적 실체의 첨가에 의해 변형될 수 있다. 본원에 정의된 중합체 내의 올리고펩티드는 전형적으로 3 내지 20개의 아미노산 잔기, 보다 바람직하게는 3 내지 10개의 아미노산 잔기, 보다 바람직하게는 3 내지 6개의 아미노산 잔기를 포함한다. 대안적으로, 본원에 정의된 중합체 내의 올리고펩티드는 4 내지 20개의 아미노산 잔기, 보다 바람직하게는 4 내지 10개의 아미노산 잔기, 보다 바람직하게는 4 내지 6개의 아미노산 잔기를 포함할 수 있다.
화학식 I의 중합체에서, 상기 또는 각각의 올리고펩티드는 바람직하게는 pH 7에서 순 양전하를 갖는다. 상기 또는 각각의 올리고펩티드는 pH 7에서 양으로 하전된 천연 발생 아미노산, 즉 리신, 아르기닌 및 히스티딘을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 또는 각각의 올리고펩티드는 폴리리신, 폴리아르기닌 또는 폴리히스티딘으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고, 각각은 시스테인으로 종결될 수 있다.
바람직한 실시형태에서, 상기 또는 각각의 올리고펩티드는 화학식 IV의 화합물이다.
[화학식 IV]
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상기 식에서,
p는 2 내지 19, 전형적으로 3 내지 9 또는 3 내지 5의 정수이고, Ra는 각 경우마다 H2NC(=NH)-NH(CH2)3-, H2N(CH2)4- 또는 (1H-이미다졸-4-일)-CH2-로 이루어진 군으로부터 선택된다.
상기 또는 각각의 올리고펩티드가 화학식 IV이 화합물인 경우, 상기 또는 각각의 올리고펩티드를 중합체에 연결시키는 L1 및/또는 L2(및/또는 LT, 존재하는 경우)는 결합이고 말단 시스테인 잔기는 상기 또는 각각의 올리고펩티드를 화학식 III의 아크릴레이트 종결된 중간체에 커플링시키는 수단을 제공한다. 티올 작용기는 이중 결합에 더 빠르고 효율적이며 더 쉽게 제어되는 첨가를 제공한다. 대조적으로, 상기 또는 각각의 올리고펩티드가 커플링을 위한 아민 작용기로 종결되는 경우, 커플링 단계에서 과량의 이 화합물이 필요하다.
화학식 I의 중합체에서, 상기 또는 각각의 올리고펩티드는 pH 7에서 순 음전하를 가질 수 있다. 상기 또는 각각의 올리고펩티드는 pH 7에서 음으로 하전된 천연 발생 아미노산, 즉 아스파르트산 및 글루탐산을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 또는 각각의 올리고펩티드는 폴리아스파르트산 및 폴리글루탐산으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고, 각각은 시스테인으로 종결될 수 있다. 이러한 실시형태에서, 상기 또는 각각의 올리고펩티드는 p가 2 내지 19, 전형적으로는 3 내지 9 또는 3 내지 5의 정수이고 Ra가 H02C(CH2)2- 또는 H02C-CH2-인 화학식 IV의 화합물일 수 있다. 이러한 경우에는, 말단 시스테인 잔기가 상기 또는 각각의 올리고펩티드를 화학식 IV의 아크릴레이트 종결된 중간체에 커플링시키는 수단을 제공하므로, 상기 또는 각각의 올리고펩티드를 중합체에 연결시키는 L1 및/또는 L2는 결합이다.
대안적으로, 상기 또는 각각의 올리고펩티드는 pH 7에서 음으로 하전된 천연 발생 아미노산과 pH 7에서 양으로 하전된 천연 발생 아미노산의 혼합물을 포함할 수 있다.
화학식 I의 중합체에서, 상기 또는 각각의 올리고펩티드는 소수성일 수 있다. 상기 또는 각각의 올리고펩티드는 소수성인 천연 발생 아미노산, 예컨대 발린, 류신, 이소류신, 메티오닌, 트립토판, 페닐알라닌, 시스테인, 티로신 및 알린을 포함할 수 있고; 특히, 상기 또는 각각의 올리고펩티드는 발린, 류신, 이소류신, 메티오닌, 트립토판 및 페닐알라닌을 포함할 수 있다.
화학식 I의 중합체에서, 상기 또는 각각의 올리고펩티드는 친수성일 수 있다. 상기 또는 각각의 올리고펩티드는 친수성인 천연 발생 아미노산, 예컨대 세린, 트레오닌, 시스테인, 아스파라긴 및 글루타민을 포함할 수 있고 pH 7에서 하전된 천연 발생 아미노산을 추가로 포함할 수 있다.
치환체
화학식 I의 중합체에서, R1과 R2는 둘 다 올리고펩티드이거나, R1 및 R2 중 하나는 올리고펩티드이고 R1 및 R2 중 하나는 Ry이다.
R1 및 R2 중 하나가 Ry인 경우, Ry는 바람직하게는 수소, -(CH2)mNH2, -(CH2)mNHMe, -(CH2)mOH, -(CH2)mCH3, -(CH2)2(OCH2CH2)mNH2, -(CH2)2(OCH2CH2)mOH 및 -(CH2)2(OCH2CH2)mCH3으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 m은 1 내지 20, 예를 들어 1 내지 5의 정수이다. 바람직하게는, Ry는 -(CH2)mNH2, -(CH2)mNHMe 및 -(CH2)2(OCH2CH2)mNH2로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다. 바람직하게는, L1이 NH 또는 NRX이고 R1 및 R2 중 하나가 Ry인 경우, Ry는 R3과 상이하다.
중합체는 비대칭일 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 중합체에서, R1 및 R2 중 하나는 올리고펩티드일 수 있고 나머지는 Ry일 수 있다. 대안적으로, R1 및 R2는 각각 상이한 올리고펩티드일 수 있다. RT가 존재하는 중합체에서, R1, R2 및 하나 또는 두 경우의 RT로부터 선택된 적어도 하나는 올리고펩티드일 수 있고, R1, R2 및 하나 또는 두 경우의 RT로부터 선택된 나머지 기는 Ry일 수 있다. 대안적으로, R1, R2 및 하나 또는 두 경우의 RT는 각각 상이한 올리고펩티드일 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 중합체에서 R1 및 R2 중 하나는 CysArgArgArg일 수 있고 나머지는 H2N(CH2)3CH(CH3)CH2NH2로부터 유래할 수 있다.
L3 및 L5는 알킬렌, 알케닐렌, 헤테로알킬렌 또는 헤테로알케닐렌으로부터 독립적으로 선택될 수 있고 폴리에틸렌 글리콜 링커를 포함할 수 있다. 상기 알킬렌, 알케닐렌, 헤테로알킬렌 또는 헤테로알케닐렌 모이어티는 1 내지 20개의 탄소 원자, 바람직하게는 1 내지 12개의 탄소 원자, 보다 바람직하게는 1 내지 6개의 탄소 원자일 수 있다. 상기 폴리에틸렌 글리콜 링커는 3 내지 25개 원자의 길이, 바람직하게는 3 내지 18개 원자의 길이일 수 있다.
바람직한 실시형태에서, L3 및 L5는 바람직하게는 1 내지 12개의 탄소 원자, 보다 바람직하게는 1 내지 6개의 탄소 원자, 보다 바람직하게는 3 내지 5개의 탄소 원자 및 바람직한 실시형태에서 4개의 탄소 원자의 알킬렌 모이어티로부터 독립적으로 선택될 수 있다.
특히 바람직한 실시형태에서, L3은 -CH2-, -(CH2)2-, -(CH2)3-, -(CH2)4-, -(CH2)5- 및 -(CH2)6-로부터 독립적으로 선택될 수 있다.
추가의 실시형태에서, L3 및/또는 L5 내의 하나 이상의 탄소 원자(특히 상기 언급한 바람직한 실시형태에서 정의된 바와 같음)는 -S-S-로 대체될 수 있다. 이러한 실시형태에서, L3은 바람직하게는 -(CH2)Z-S-S-(CH2)Z-로부터 선택되고, 여기서 각 z의 값은 1 내지 4 및 바람직하게는 2 내지 3 및 바람직하게는 2로부터 독립적으로 선택되고, 바람직하게는 각 z의 값은 동일하다. 주요 중합체 쇄 내에 적어도 하나의 이황화 결합의 포함은 표적 세포 내부에서의 바이러스 기반 치료제 흡수를 촉진할 수 있다.
바람직하게는, L4 는 -N(R3)-로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다.
바람직하게는, 각각의 R3은 수소, -(CH2)pNH2, -(CH2)pNHMe, -(CH2)pOH, -(CH2)pCH3, -(CH2)2(OCH2CH2)qNH2, -(CH2)2(OCH2CH2)qOH, -(CH2)2(OCH2CH2)qCH3 및 폴리알킬렌 글리콜로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고, 여기서 p는 1 내지 20(바람직하게는 1 내지 5)의 정수이고, q는 1 내지 10, 예를 들어 1 내지 5의 정수이고, 상기 폴리알킬렌 글리콜은 R3이 부착되는 질소 원자에 직접 결합되거나 R3이 부착되는 질소 원자에 링커 모이어티를 통해 결합되고, 여기서 상기 링커 모이어티는 알킬렌, 사이클로알킬렌, 알케닐렌, 사이클로알케닐렌, 헤테로알킬렌, 헤테로사이클로알킬렌, 아릴렌 또는 헤테로아릴렌 기이다. 본 발명의 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 R3 기는 폴리알킬렌 글리콜, 바람직하게는 폴리에틸렌 글리콜이다. 일부 실시형태에서, 폴리알킬렌 글리콜인 적어도 하나의 R3 기를 R3이 결합되는 질소 원자에 연결시키는 링커 모이어티는 알킬렌, 알케닐렌 또는 헤테로알킬렌 기, 바람직하게는 알킬렌 기이다. 일부 실시형태에서, 링커 모이어티는 3 내지 20개의 탄소 및/또는 헤테로원자의 길이, 바람직하게는 4 내지 15개의 탄소 및/또는 헤테로원자의 길이, 보다 바람직하게는 5 내지 10개의 탄소 및/또는 헤테로원자의 길이이다.
상기 화학식 I 또는 화학식 III에서, n은 바람직하게는 10 내지 700, 보다 바람직하게는 20 내지 500이다. 화학식 I 또는 화학식 III의 중합체의 분자량은 바람직하게는 500 내지 150,000 g/mol, 보다 바람직하게는 700 내지 100,000 g/mol, 보다 바람직하게는 2,000 내지 50,000 g/mol, 보다 바람직하게는 5,000 내지 40,000 g/mol이다. 적어도 하나의 R3 기가 폴리알킬렌 글리콜(예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜)인 실시형태에서, 화학식 I 또는 화학식 III이 중합체의 분자량은 바람직하게는 2,500 내지 150,000 g/mol, 보다 바람직하게는 2,700 내지 100,000 g/mol, 보다 바람직하게는 4,000 내지 50,000 g/mol, 보다 바람직하게는 7,000 내지 40,000 g/mol이다.
본 발명의 화합물
본 발명의 특정의 화합물은 특정한 기하 또는 입체이성질체 형태로 존재할 수 있다. 본 발명은 시스- 및 트랜스-이성질체, R- 및 S-거울상이성질체, 부분입체이성질체, (D)-이성질체, (L)-이성질체, 이들의 라세미 혼합물, 및 이들의 기타 혼합물을 포함하는 모든 이러한 화합물을 본 발명의 범주 내에 속하는 것으로서 구상한다. 추가적인 비대칭 탄소 원자가 알킬 기와 같은 치환체 내에 존재할 수 있다. 모든 이러한 이성질체뿐만 아니라 이들의 혼합물이 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다.
임의의 다양한 이성질체 비를 함유하는 이성질체 혼합물이 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 예를 들어, 2개의 이성질체만이 조합되는 경우, 50:50, 60:40, 70:30, 80:20, 90:10, 95:5, 96:4, 97:3, 98:2 또는 99:1 이성질체 비를 함유하는 혼합물 모두가 본 발명에 의해 구상된다. 당업자는 더욱 복합적인 이성질체 혼합물에 대해 유사한 비가 구상된다는 것을 쉽게 인지할 것이다.
화학적 기
"할로겐"(또는 "할로")이라는 용어는 불소, 염소, 브롬 및 요오드를 포함한다.
"알킬"이라는 용어는 1가의 선형 또는 분지형, 포화, 비환식(acyclic) 탄화수소 기를 포함한다. 알킬은 적합하게는 C1-10알킬 또는 C1-6알킬 또는 C1-4알킬, 예컨대 메틸, 에틸, n-프로필, i-프로필 또는 t-부틸 기이다. 알킬은 치환될 수 있다.
"사이클로알킬"이라는 용어는 1가의 포화 사이클릭 탄화수소 기를 포함한다. 사이클로알킬은 적합하게는 C3-10사이클로알킬 또는 C3-6사이클로알킬, 예컨대 사이클로펜틸 및 사이클로헥실이다. 사이클로알킬은 치환될 수 있다.
"알콕시"라는 용어는 알킬-O-를 의미한다.
"알킬아미노"라는 용어는 알킬-NH-를 의미한다.
"알킬티오"라는 용어는 알킬-S(O)t-를 의미하며, 여기서 t는 하기에서 정의된다.
"알케닐"이라는 용어는 적어도 하나의 탄소-탄소 이중 결합을 갖고 적합하게는 탄소-탄소 삼중 결합을 갖지 않는 1가의 선형 또는 분지형, 불포화, 비환식 탄화수소 기를 포함한다. 알케닐은 적합하게는 C2-10알케닐 또는 C2-6알케닐 또는 C2-4알케닐이다. 알케닐은 치환될 수 있다.
"사이클로알케닐"이라는 용어는 적어도 하나의 탄소-탄소 이중 결합을 갖고 적합하게는 탄소-탄소 삼중 결합을 갖지 않는 1가의 부분적으로 불포화된 사이클릭 탄화수소 기를 포함한다. 사이클로알케닐은 적합하게는 C3-10사이클로알케닐 또는 C5-10사이클로알케닐, 예를 들어 사이클로헥세닐 또는 벤조사이클로헥실이다. 사이클로알케닐은 치환될 수 있다.
"알키닐"이라는 용어는 적어도 하나의 탄소-탄소 삼중 결합을 갖고 적합하게는 탄소-탄소 이중 결합을 갖지 않는 1가의 선형 또는 분지형, 불포화, 비환식 탄화수소 기를 포함한다. 알키닐은 적합하게는 C2-10알키닐 또는 C2-6알키닐 또는 C2-4알키닐이다. 알키닐은 치환될 수 있다.
"알킬렌"이라는 용어는 2가의 선형 또는 분지형, 포화, 비환식 탄화수소 기를 포함한다. 알킬렌은 적합하게는 C1-10알킬렌 또는 C1-6알킬렌 또는 C1-4알킬렌, 예컨대 메틸렌, 에틸렌, n-프로필렌, i-프로필렌 또는 t-부틸렌 기이다. 알킬렌은 치환될 수 있다.
"알케닐렌"이라는 용어는 적어도 하나의 탄소-탄소 이중 결합을 갖고 적합하게는 탄소-탄소 삼중 결합을 갖지 않는 2가의 선형 또는 분지형, 불포화, 비환식 탄화수소 기를 포함한다. 알케닐렌은 적합하게는 C2-10알케닐렌 또는 C2-6알케닐렌 또는 C2-4알케닐렌이다. 알케닐렌은 치환될 수 있다.
"헤테로알킬"이라는 용어는 20개 이하의 탄소 원자 또는 10개 이하의 탄소 원자 또는 2개 이하의 탄소 원자 또는 1개의 탄소 원자가 O, S(O)t 또는 N으로 각각 독립적으로 교체되어 있고, 단 알킬 탄소 원자 적어도 하나가 잔존하는 알킬 기, 예를 들어 C1-65알킬 기, C1-17알킬 기 또는 C1-10알킬 기를 포함한다. 헤테로알킬 기는 C-연결 또는 헤테로-연결될 수 있고, 즉 분자의 나머지에 탄소 원자를 통해 또는 O, S(O)t 또는 N을 통해 연결될 수 있으며, 여기서 t는 하기에서 정의된다. 헤테로알킬은 치환될 수 있다.
"헤테로사이클로알킬"이라는 용어는 10개 이하의 탄소 원자 또는 2개 이하의 탄소 원자 또는 1개의 탄소 원자가 O, S(O)t 또는 N으로 각각 독립적으로 교체되어 있고, 단 사이클로알킬 탄소 원자 중 적어도 하나가 잔존하는 사이클로알킬 기를 포함한다. 헤테로사이클로알킬 기의 예는 옥시라닐, 티아라닐, 아지리디닐, 옥세타닐, 티아타닐, 아제티디닐, 테트라하이드로푸라닐, 테트라하이드로티오페닐, 피롤리디닐, 테트라하이드로피라닐, 테트라하이드로티오피라닐, 피페리디닐, 1,4-디옥사닐, 1,4-옥사티아닐, 모르폴리닐, 1,4-디티아닐, 피페라지닐, 1,4-아자티아닐, 옥세파닐, 티에파닐, 아제파닐, 1,4-디옥세파닐, 1,4-옥사티에파닐, 1,4-옥사아제파닐, 1,4-디티에파닐, 1,4-티에아제파닐 및 1,4-디아제파닐을 포함한다. 헤테로사이클로알킬 기는 C-연결 또는 N-연결될 수 있고, 즉 분자의 나머지에 탄소 원자를 통해 또는 질소 원자를 통해 연결될 수 있다. 헤테로사이클로알킬은 치환될 수 있다.
"헤테로알케닐"이라는 용어는 20개 이하의 탄소 원자 또는 10개 이하의 탄소 원자 또는 2개 이하의 탄소 원자 또는 1개의 탄소 원자가 O, S(O)t 또는 N으로 각각 독립적으로 교체되어 있고, 단 알케닐 탄소 원자 중 적어도 하나가 잔존하는 알케닐 기, 예를 들어 C1-65알케닐 기, C1-17알케닐 기 또는 C1-10알케닐 기를 포함한다. 헤테로알케닐 기는 C-연결 또는 헤테로-연결될 수 있고, 즉 분자의 나머지에 탄소 원자를 통해 또는 O, S(O)t 또는 N을 통해 연결될 수 있다. 헤테로알케닐은 치환될 수 있다
"헤테로사이클로알케닐"이라는 용어는 3개 이하의 탄소 원자 또는 2개 이하의 탄소 원자 또는 1개의 탄소 원자가 O, S(O)t 또는 N으로 각각 독립적으로 교체되어 있고, 단 사이클로알케닐 탄소 원자 중 적어도 하나가 잔존하는 사이클로알케닐 기를 포함한다. 헤테로사이클로알케닐 기의 예는 3,4-디하이드로-2H-피라닐, 5-6-디하이드로-2H-피라닐, 2H-피라닐, 1,2,3,4-테트라하이드로피리디닐 및 1,2,5,6-테트라하이드로피리디닐을 포함한다. 헤테로사이클로알케닐 기는 C-연결 또는 N-연결될 수 있고, 즉 분자의 나머지에 탄소 원자를 통해 또는 질소 원자를 통해 연결될 수 있다. 헤테로사이클로알케닐은 치환될 수 있다.
"헤테로알키닐"이라는 용어는 20개 이하의 탄소 원자 또는 10개 이하의 탄소 원자 또는 2개 이하의 탄소 원자 또는 1개의 탄소 원자가 O, S(O)t 또는 N으로 각각 독립적으로 교체되어 있고, 단 알키닐 탄소 원자 중 적어도 하나가 잔존하는 알키닐 기, 예를 들어 C1-65알키닐 기, C1-17알키닐 기 또는 C1-10알키닐 기를 포함한다. 헤테로알키닐 기는 C-연결 또는 헤테로-연결될 수 있고, 즉 분자의 나머지에 탄소 원자를 통해 또는 O, S(O)t 또는 N을 통해 연결될 수 있다. 헤테로알키닐은 치환될 수 있다.
"헤테로알킬렌"이라는 용어는 20개 이하의 탄소 원자 또는 10개 이하의 탄소 원자 또는 2개 이하의 탄소 원자 또 1개의 탄소 원자가 O, S(O)t 또는 N으로 각각 독립적으로 교체되어 있고, 단 알킬렌 탄소 원자 중 적어도 하나가 잔존하는 알킬렌 기, 예를 들어 C1-65알킬렌 기, C1-17알킬렌 기 또는 C1-10알킬렌 기를 포함한다. 헤테로알키닐렌은 치환될 수 있다.
"헤테로알케닐렌"이라는 용어는 20개 이하의 탄소 원자 또는 10개 이하의 탄소 원자 또는 2개 이하의 탄소 원자 또 1개의 탄소 원자가 O, S(O)t 또는 N으로 각각 독립적으로 교체되어 있고, 단 알케닐렌 탄소 원자 중 적어도 하나가 잔존하는 알케닐렌 기, 예를 들어 C1-65알케닐렌 기, C1-17알케닐렌 기 또는 C1-10알케닐렌 기를 포함한다. 헤테로알케닐렌은 치환될 수 있다.
"아릴"이라는 용어는 1가의 방향족, 사이클릭 탄화수소 기, 예컨대 페닐 또는 나프틸(예를 들어, 1-나프틸 또는 2-나프틸)을 포함한다. 일반적으로, 아릴 기는 모노사이클릭 또는 폴리사이클릭 융합 환 방향족 기일 수 있다. 바람직한 아릴은 C6-C14아릴이다. 아릴은 치환될 수 있다.
아릴 기의 기타 예는 아세안트릴렌, 아세나프틸렌, 아세페난트릴렌, 안트라센, 아줄렌, 크리센, 코로넨, 플루오란텐, 플루오렌, as-인다센, s-인다센, 인덴, 나프탈렌, 오발렌, 페릴렌, 페날렌, 페난트렌, 피센, 플레이아덴, 피렌, 피란트렌 및 루비센의 1가 유도체이다.
"아릴알킬"이라는 용어는 아릴 기로 치환된 알킬, 예를 들어 벤질을 의미한다.
"헤테로아릴"이라는 용어는 하나 이상의 탄소 원자가 O, S, N 및 NRN로부터 독립적으로 선택된 헤테로원자로 각각 교체된 아릴 기를 포함하며, 여기서 RN은 하기에서 정의된다(일 실시형태에서 H 또는 알킬(예를 들어, C1-6알킬)이다). 헤테로아릴은 치환될 수 있다.
일반적으로, 헤테로아릴 기는 모노사이클릭 또는 폴리사이클릭(예를 들어, 바이사이클릭(bicyclic)) 융합 환 헤테로방향족 기일 수 있다. 전형적으로, 헤테로아릴 기는 5 내지 14개의 환 구성원(바람직하게는 5 내지 10개의 구성원)을 함유하고, 여기서 1개, 2개, 3개 또는 4개의 환 구성원은 독립적으로 O, S, N 및 NRN으로부터 선택된다. 헤테로아릴 기는 적합하게는 5원, 6원, 9원 또는 10원, 예를 들어 5원 모노사이클릭, 6원 모노사이클릭, 9원 융합 환 바이사이클릭 또는 10원 융합 환 바이사이클릭이다.
모노사이클릭 헤테로방향족 기는 5 내지 6개의 환 구성원을 함유하고 여기서 1개, 2개, 3개 또는 4개의 환 구성원이 O, S, N 및 NRN으로부터 독립적으로 선택되는 헤테로방향족 기를 포함한다.
5원 모노사이클릭 헤테로아릴 기는 -NRN- 기, -O- 원자 또는 -S- 원자인 환 구성원 1개를 함유할 수 있고 =N- 원자인 환 구성원 1 내지 3개(예를 들어, 1개 또는 2개의 환 구성원)를 임의로 함유할 수 있다(여기서, 5개의 환 구성원의 나머지는 탄소 원자이다).
5원 모노사이클릭 헤테로아릴 기의 예는 피롤릴, 푸라닐, 티오페닐, 피라졸릴, 이미다졸릴, 이속사졸릴, 옥사졸릴, 이소티아졸릴, 티아졸릴, 1,2,3 트리아졸릴, 1,2,4 트리아졸릴, 1,2,3 옥사디아졸릴, 1,2,4 옥사디아졸릴, 1,2,5 옥사디아졸릴, 1,3,4 옥사디아졸릴, 1,3,4 티아디아졸릴, 피리딜, 피리미디닐, 피리다지닐, 피라지닐, 1,3,5 트리아지닐, 1,2,4 트리아지닐, 1,2,3 트리아지닐 및 테트라졸릴이다.
6원 모노사이클릭 헤테로아릴 기의 예는 피리디닐, 피리다지닐, 피리미디닐 및 피라지닐이다.
6원 모노사이클릭 헤테로아릴 기는 =N- 원자인 환 구성원 1개 또는 2개를 함유한다(여기서, 6개의 환 구성원의 나머지는 탄소 원자이다).
바이사이클릭 헤테로방향족 기는 9 내지 14개의 환 구성원을 함유하고 여기서 1개, 2개, 3개, 4개 이상의 환 구성원이 독립적으로 O, S, N 또는 NRN으로부터 선택되는 융합-환 헤테로방향족 기를 포함한다.
9원 바이사이클릭 헤테로아릴 기는 -NRN- 기, -O- 원자 또는 -S- 원자인 환 구성원 1개를 함유할 수 있고, =N- 원자인 환 구성원 1 내지 3개(예를 들어, 1개 또는 2개의 환 구성원)를 임의로 함유할 수 있다(여기서, 9개의 환 구성원의 나머지는 탄소 원자이다).
9원 융합-환 바이사이클릭 헤테로아릴 기의 예는 벤조푸라닐, 벤조티오페닐, 인돌릴, 벤즈이미다졸릴, 인다졸릴, 벤조트리아졸릴, 피롤로[2,3-b]피리디닐, 피롤로[2,3-c]피리디닐, 피롤로[3,2-c]피리디닐, 피롤로[3,2b]피리디닐, 이미다조[4,5-b]피리디닐, 이미다조[4,5-c]피리디닐, 피라졸로[4,3-d]피리디닐, 피라졸로[4,3-c]피리디닐, 피라졸로[3,4-c]피리디닐, 피라졸로[3,4-b]피리디닐, 이소인돌릴, 인다졸릴, 푸리닐, 인돌리니닐, 이미다조[1,2-a]피리디닐, 이미다조[1,5-a]피리디닐, 피라졸로[1,2-a]피리디닐, 피롤로[1,2-b]피리다지닐 및 이미다조[1,2-c]피리미디닐이다.
10원 바이사이클릭 헤테로아릴 기는 =N- 원자인 환 구성원 1 내지 3개를 함유할 수 있다(여기서, 10개의 환 구성원의 나머지는 탄소 원자이다).
10원 융합-환 바이사이클릭 헤테로아릴 기의 예는 퀴놀리닐, 이소퀴놀리닐, 신놀리닐, 퀴나졸리닐, 퀴녹살리닐, 프탈라지닐, 1,6-나프티리디닐, 1,7-나프티리디닐, 1,8-나프티리디닐, 1,5-나프티리디닐, 2,6-나프티리디닐, 2,7-나프티리디닐, 피리도[3,2-d]피리미디닐, 피리도[4,3-d]피리미디닐, 피리도[3,4-d]피리미디닐, 피리도[2,3-d]피리미디닐, 피리도[2,3-b]피라지닐, 피리도[3,4-b]피라지닐, 피리미도[5,4-d]피리미디닐, 피라지노[2,3-b]피라지닐 및 피리미도[4,5-d]피리미디닐이다.
"헤테로아릴알킬"이라는 용어는 헤테로아릴 기로 치환된 알킬을 의미한다.
아실 기의 예는 알킬-C(=O)-, 사이클로알킬-C(=O)-, 알케닐-C(=O)-, 사이클로알케닐-C(=O)-, 헤테로알킬-C(=O)-, 헤테로사이클로알킬-C(=O)-, 아릴-C(=O)- 또는 헤테로아릴-C(=O)-, 특히 알킬-C(=O)- 및 아릴-C(=O)-을 포함한다
달리 명시적으로 지시되지 않는 한, 기들의 조합이 본원에서 하나의 모이어티, 예를 들어 아릴알킬로서 지칭되는 경우, 모이어티가 분자의 나머지에 부착되도록 하는 원자를 마지막에 언급된 기가 함유한다.
알킬 기 또는 기타 기의 탄소 원자가 O, S(O)t 또는 N으로 교체되는 것이 언급되는 경우, 다음의 것들이 의도된다:
Figure pct00027
이
Figure pct00028
로 교체됨;
-CH=가 -N=으로 교체됨;
≡C-H가 ≡N으로 교체됨; 또는
-CH2-가 -O-, -S(O)t- 또는 -NRN-으로 교체됨.
설명을 위해, 상기 언급된 헤테로원자 함유 기(예컨대, 헤테로알킬 등)과 관련하여, 탄소 원자의 개수가 제공되는 경우, 예를 들어 C3-6헤테로알킬의 경우, 3 내지 6개의 쇄 탄소 원자 중 하나 이상이 O, S(O)t 또는 N으로 교체된 C3-6알킬에 기초한 기가 의도된다. 따라서, C3-6헤테로알킬 기는 예를 들어 3 내지 6개 미만의 쇄 탄소 원자를 함유할 것이다.
상기 언급된 경우에, RN은 H, 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, -C(O)-알킬, -C(O)-아릴, -C(O)-헤테로아릴, -S(O)t-알킬, -S(O)t-아릴 또는 -S(O)t-헤테로아릴이다. RN은 특히 H, 알킬(예를 들어 C1-6알킬) 또는 사이클로알킬(예를 들어 C3-6사이클로알킬)일 수 있다.
상기 언급된 경우에, t는 독립적으로 0, 1 또는 2, 예를 들어 2이다. 전형적으로, t는 0이다.
기가 적어도 2개의 치환될 수 있는 위치를 갖는 경우, 이러한 기는 알킬렌 또는 헤테로알킬렌 쇄의 양쪽 말단에 의해 치환되어 사이클릭 모이어티를 형성할 수 있다.
임의로 치환된 기(예를 들어, 알킬, 사이클로알킬, 알콕시, 알케닐, 사이클로알케닐, 알키닐, 알킬렌, 알케닐렌, 헤테로알킬, 헤테로사이클로알킬, 헤테로알케닐, 헤테로사이클로알케닐, 헤테로알키닐, 헤테로알킬렌, 헤테로알케닐렌, 아릴, 아릴알킬, 아릴헤테로알킬, 헤테로아릴, 헤테로아릴알킬 또는 헤테로아릴헤테로알킬 기 등)는 치환되거나 치환되지 않을 수 있거나, 치환되지 않을 수 있다. 전형적으로, 치환은 1개의 수소 원자의 1개의 치환기로의 개념적 치환을 수반하거나, =O으로의 치환의 경우에는 2개의 수소 원자를 수반한다.
치환되는 경우에, 일반적으로 1 내지 3개의 치환체 또는 1개 또는 2개의 치환체 또는 1개의 치환체가 있을 것이다.
임의적인 치환체(들)는 독립적으로 할로겐, 트리할로메틸, 트리할로에틸, -OH, -NH2, -NO2, -CN, -N+(C1-6알킬)2O-, -CO2H, -CO2C1-6알킬, -SO3H, -SOC1-6알킬, -SO2C1-6알킬, -SO3C1-6알킬, -OC(=O)OC1-6알킬, -C(=O)H, -C(=O)C1-6알킬, -OC(=O)C1-6알킬, =O, -NH(C1-6알킬), -N(C1-6알킬)2, -C(=O)NH2, -C(=O)N(C1-6알킬)2, -N(C1-6알킬)C(=O)O(C1-6알킬), -N(C1-6알킬)C(=O)N(C1-6알킬)2, -OC(=O)N(C1-6알킬)2, -N(C1-6알킬)C(=O)C1-6알킬, -C(=S)N(C1-6알킬)2, -N(C1-6알킬)C(=S)C1-6알킬, -SO2N(C1-6알킬)2, -N(C1-6알킬)SO2C1-6알킬, -N(C1-6알킬)C(=S)N(C1-6알킬)2, -N(C1-6알킬)SO2N(C1-6알킬)2, -C1-6알킬, -C1-6헤테로알킬, -C3-6사이클로알킬, -C3-6헤테로사이클로알킬, -C2-6알케닐, -C2-6헤테로알케닐, -C3-6사이클로알케닐, -C3-6헤테로사이클로알케닐, -C2-6알키닐, -C2-6헤테로알키닐, -Zu-C1-6알킬, -Zu-C3-6사이클로알킬, -Zu-C2-6알케닐, -Zu-C3-6사이클로알케닐 또는 -Zu-C2-6알키닐이며, 여기서 Zu는 독립적으로 O, S, NH 또는 N(C1-6알킬)이다.
또 다른 실시형태에서, 임의적 치환체(들)는 독립적으로 할로겐, 트리할로메틸, 트리할로에틸, -NO2, -CN, -N+(C1-6알킬)2O-, -CO2H, -SO3H, -SOC1-6알킬, -SO2C1-6알킬, -C(=O)H, -C(=O)C1-6알킬, =O, -N(C1-6알킬)2, -C(=O)NH2, -C1-6알킬, -C3-6사이클로알킬, -C3-6헤테로사이클로알킬, -ZuC1-6알킬 또는 -Zu-C3-6사이클로알킬이며, 여기서 Zu는 상기 정의되어 있다.
또 다른 실시형태에서, 임의적 치환체(들)는 독립적으로 할로겐, 트리할로메틸, -NO2, -CN, -CO2H, -C(=O)C1-6알킬, =O, -N(C1-6알킬)2, -C(=O)NH2, -C1-6알킬, -C3-6사이클로알킬, -C3-6헤테로사이클로알킬, -ZuC1-6알킬 또는 -Zu-C3-6사이클로알킬이며, 여기서 Zu는 상기에 정의되어 있다.
또 다른 실시형태에서, 임의적 치환체(들)는 독립적으로 할로겐, -NO2, -CN, -CO2H, =O, -N(C1-6알킬)2, -C1-6알킬, -C3-6사이클로알킬 또는 -C3-6헤테로사이클로알킬이다.
또 다른 실시형태에서, 임의적 치환체(들)는 독립적으로 할로겐, -OH, NH2, NH(C1-6알킬), -N(C1-6알킬)2, -C1-6알킬, -C3-6사이클로알킬 또는 -C3-6헤테로사이클로알킬이다.
"폴리알킬렌 글리콜"(PAG)이라는 용어는 화학식 H-[0-CyH2y]x-OH의 화합물, 예컨대 H-[0-CH2-CH2]x-OH(폴리에틸렌 글리콜 또는 PEG) 및 H-[0-CH(CH3)-CH2]x-OH(폴리프로필렌 글리콜)을 지칭한다. 본 발명의 화합물에서 발견되는 경우, PAG는 탄소 원자와 말단 하이드록실 기 중 하나 사이의 결합에 의해 결합되고, 예를 들어 PEG의 경우 치환체는 H-[0-CH2-CH2]x-일 수 있다. 본 발명의 화합물에서 사용되는 폴리알킬렌 글리콜은, 달리 정의하지 않는 한 분자량이 500 내지 20,000 g/mol, 바람직하게는 1,000 내지 10,000 g/mol, 보다 바람직하게는 2,000 내지 5,000 g/mol, 보다 바람직하게는 2,000 내지 3,500 g/mol일 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "화학식 I의 중합체"라는 용어는 이의 약학적으로 허용되는 유도체 및 다형체, 이성질체 및 동위원소로 표지된 변이체를 포함한다.
"약학적으로 허용되는 유도체"라는 용어는 화학식 I의 중합체의 임의의 약학적으로 허용되는 염, 용매화물, 수화물 또는 프로드럭을 포함한다. 약학적으로 허용되는 유도체는 적합하게는 화학식 I의 중합체의 약학적으로 허용되는 염, 용매화물 또는 수화물을 지칭한다.
"약학적으로 허용되는 염"이라는 용어는 무기 산 또는 유기 산 및 염기를 포함하여 약학적으로 허용되는 비독성 산 또는 염기로부터 제조된 염을 포함한다.
염기성 기, 예를 들어 아미노 기를 함유하는 화학식 I의 중합체는 산과 함께 약학적으로 허용되는 염을 형성할 수 있다. 화학식 I의 중합체의 약학적으로 허용되는 산 부가 염은 무기 산, 예컨대 할로겐화수소산(예를 들어, 염화수소산, 브롬화수소산 및 요오드화수소산), 황산, 질산 및 인산의 염을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 화학식 I의 중합체의 약학적으로 허용되는 산 부가 염은 유기 산, 예컨대 지방족, 방향족, 카르복실 및 설폰 부류의 유기 산의 염을 포함하지만, 이에 한정되지 않고, 이러한 산의 예는 지방족 모노카르복실산, 예컨대 포름산, 아세트산, 프로피온산 또는 부티르산; 지방족 하이드록시산, 예컨대 락트산, 시트르산, 타르타르산 또는 말산; 디카르복실산, 예컨대 말레산 또는 석신산; 방향족 카르복실산, 예컨대 벤조산, p-클로로벤조산, 페닐아세트산, 디페닐아세트산 또는 트리페닐아세트산; 방향족 하이드록실 산, 예컨대 o-하이드록시벤조산, p-하이드록시벤조산, 1-하이드록시나프탈렌-2-카르복실산 또는 3-하이드록시나프탈렌-2-카르복실산; 및 설폰산, 예컨대 메탄설폰산, 에탄설폰산 또는 벤젠설폰산을 포함한다. 화학식 I의 다른 중합체의 약학적으로 허용되는 산 부가 염은 글리콜산, 글루쿠론산, 푸론산, 글루탐산, 안트라닐산, 살리실산, 만델산, 엠본산(파모산), 판토텐산, 스테아르산, 설파닐산, 알겐산 및 갈락투론산의 염을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 화학식 I의 중합체가 다수의 염기성 기를 포함하는 경우, 다수의 중심이 양성자화되어 다수의 염, 예를 들어 화학식 I의 화합물의 이염 또는 삼염을 제공할 수 있다. 예를 들어, 본원에 설명된 바와 같은 화학식 I의 중합체의 할로겐화수소산 염은 모노하이드로할라이드, 디하이드로할라이드 또는 트리할로할라이드 등일 수 있다. 이러한 염은 상기 개시된 산 중 임의의 것의 첨가로부터 생성된 것들을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 화학식 I의 중합체의 일 실시형태에서, 2개의 염기성 기가 산 부가 염을 형성한다. 추가적인 실시형태에서, 2개의 부가 염 카운터이온은 동일한 종, 예를 들어 디하이드로클로라이드, 디하이드로설피드 등이다. 전형적으로, 약학적으로 허용되는 염은 하이드로클로라이드 염, 예컨대 디하이드로클로라이드 염이다.
산성 기, 예를 들어 카르복실 기를 함유하는 화학식 I의 중합체는 염기와 함께 약학적으로 허용되는 염을 형성할 수 있다. 화학식 I의 중합체의 약학적으로 허용되는 염기성 염은 금속 염, 예컨대 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염(예를 들어, 나트륨, 칼륨, 마그네슘 또는 칼슘 염) 및 아연 또는 알루미늄 염을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 화학식 I의 중합체의 약학적으로 허용되는 염기성 염은 암모니아 또는 약학적으로 허용되는 유기 아민 또는 헤테로사이클릭 염기, 예컨대 에탄올아민(예를 들어 디에탄올아민), 벤질아민, N-메틸-글루카민, 아미노산(예를 들어 리신) 또는 피리딘으로 형성된 염을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
산 및 염기의 헤미염(hemisalt), 예를 들어 헤미설페이트 염이 또한 형성될 수 있다.
화학식 I의 중합체의 약학적으로 허용되는 염은 당업계에 주지된 방법에 의해 제조될 수 있다.
약학적으로 허용되는 염의 검토를 위해, 문헌[Stahl and Wermuth, Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection and Use (Wiley-VCH, Weinheim, Germany, 2002)]을 참조한다.
화학식 I의 중합체는 용매화되지 않은 형태 및 용매화된 형태 둘 다로 존재할 수 있다. "용매화물"이라는 용어는 중합체 및 하나 이상의 약학적으로 허용되는 용매 분자, 예컨대 물 또는 C1-6 알콜, 예를 들어 에탄올을 포함하는 분자 복합체를 포함한다. "수화물"이라는 용어는 용매가 물인 "용매화물"을 의미한다.
본 중합체는 무정형 내지 결정질 형태의 고체 상태로 존재할 수 있다. 모든 이같은 고체 형태가 본 발명에 포함된다.
본 중합체는 시스- 및 트랜스-형태, E- 및 Z-형태, R-, S- 및 메조(meso)-형태, 케토- 및 에놀-형태를 포함하지만 이에 한정되지 않는, 하나 이상의 기하, 광학, 거울상이성질체, 부분입체이성질체 및 호변이성질체 형태로 존재할 수 있다. 이러한 모든 이성질체 형태가 본 발명에 포함된다. 이성질체 형태는 이성질체 면에서 순수하거나 농축된 형태뿐만 아니라, 이성질체들의 혼합물(예를 들어, 라세미 또는 부분입체이성질체 혼합물)로 존재할 수 있다.
본 발명은 하나 이상의 원자가 원자 번호는 동일하지만 원자 질량 또는 질량수는 자연에서 일반적으로 발견되는 원자 질량 또는 질량수와 상이한 원자로 교체된, 약학적으로 허용되는 동위원소로 표지된 화학식 I의 중합체를 포함한다.
본 발명의 화합물에 포함되기에 적합한 동위원소의 예는 수소의 동위원소, 예컨대 2H 및 3H, 탄소의 동위원소, 예컨대 11C, 13C 및 14C, 염소의 동위원소, 예컨대 36Cl, 불소의 동위원소, 예컨대 18F, 요오드의 동위원소, 예컨대 123I 및 125I, 질소의 동위원소, 예컨대 13N 및 15N, 산소의 동위원소, 예컨대 15O, 17O 및 18O, 인의 동위원소, 예컨대 32P, 및 황의 동위원소, 예컨대 35S를 포함한다. 특정한 동위원소로 표지된 화학식 I의 중합체, 예를 들어 방사성 동위원소가 혼입된 중합체가 약물 및/또는 기질 조직 분포 연구에서 유용하다. 방사성 동위원소 3H 및 14C는 이의 혼입 용이성 및 준비된 검출 수단 면에서 이러한 목적에 특히 유용하다.
양전자 방출 동위원소, 예컨대 11C, 18F, 15O 및 13N으로의 치환이 기질 수용체 점유를 검사하기 위한 양전자 방출 단층촬영(PET) 연구에서 유용할 수 있다.
동위원소로 표지된 화학식 I의 중합체는 일반적으로 당업자에게 공지된 통상적인 기술에 의해 또는 이전에 사용된 표지되지 않은 시약 대신에 동위원소로 표지된 적합한 시약을 사용하여 본원에 설명된 것과 유사한 공정에 의해 제조될 수 있다.
본원에서 설명한 바와 같이, 중합체가 임의의 개수의 치환체 또는 기능적 모이어티로 치환될 수 있다는 것이 이해될 것이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 치환된("임의로"라는 용어가 선행하든지 아니든지 간에) 및 치환체라는 용어는, 당업자가 이해하는 바와 같이, 모든 원자의 원자가가 유지되는 것을 조건으로 한 작용기를 또 다른 작용기로 변화시키는 능력을 지칭한다. 임의의 소정의 구조 내의 1개를 초과하는 위치가 특정된 군으로부터 선택된 1개를 초과하는 치환체로 치환될 수 있는 경우, 치환체는 모든 위치에서 동일하거나 상이할 수 있다. 또한 치환체는 추가로 치환될 수 있다(예를 들어, 아릴 기 치환체는 자신을 제외한 또 다른 치환기, 예컨대 또 다른 아릴 기를 지닐 수 있고, 이는 하나 이상의 위치에서 불소로 추가로 치환됨).
본원에서 사용되는 바와 같은 티오하이드록실 또는 티올이라는 용어는 화학식 -SH의 기를 지칭한다.
바이러스 기반 치료제
바이러스 기반 치료제는 요법에 사용하기에 적합한 임의의 바이러스 벡터일 수 있다. 일부 실시형태에서, 바이러스 기반 치료제는 전신 바이러스 유전자 요법에 사용하기에 적합하다. 일부 실시형태에서, 바이러스 기반 치료제는 종양용해성 바이러스 벡터이다. 일부 실시형태에서, 바이러스 기반 치료제는 백신이다.
바이러스 기반 치료제는 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터, 또는 렌티바이러스 벡터와 같은 레트로바이러스 벡터일 수 있다. 일부 실시형태에서, 바이러스 기반 치료제는 아데노바이러스 벡터 또는 아데노-관련 바이러스 벡터(AAV)이다. 일부 실시형태에서, 바이러스 기반 치료제는 아데노바이러스 벡터이다. 일부 실시형태에서, 바이러스 기반 치료제는 아데노-관련 바이러스 벡터이다. 일부 실시형태에서, 바이러스 기반 치료제는 렌티바이러스 벡터와 같은 레트로바이러스 벡터이다.
일부 실시형태에서, 바이러스는 레트로바이러스 벡터 이외의, 요법에 사용하기에 적합한 임의의 바이러스 벡터이다. 일부 실시형태에서, 바이러스는 렌티바이러스 벡터 이외의 요법에 사용하기에 적합한 임의의 바이러스 벡터이다. 일부 실시형태에서, 바이러스는 종양용해성 아데노바이러스 AdNuPARmE1A 또는 AduPARmE1A 이외의, 요법에서 사용하기에 적합한 임의의 바이러스 벡터이다.
일부 실시형태에서, 바이러스 기반 치료제는 단순포진 바이러스 벡터, 백시 니아 바이러스 벡터, 수포성 구내염 바이러스 벡터, 레오바이러스 벡터 및 셈리키삼림열 바이러스(Semliki forest virus) 벡터로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 바이러스 기반 치료제는 단순포진 바이러스 벡터이다. 일부 실시형태에서, 바이러스 기반 치료제는 백시니아 바이러스 벡터이다.
바람직하게는, 바이러스 기반 치료제는 아데노바이러스 벡터이다. 일부 실시형태에서, 바이러스 기반 치료제는 AdNuPARmE1A 및 AduPARmE1A를 포함하는 종양용해성 아데노바이러스 벡터이다. 일부 실시형태에서, 바이러스 기반 치료제는 AdNuPARmE1A이다. 일부 실시형태에서, 바이러스 기반 치료제는 AduPARmE1A이다.
일부 실시형태에서, 바이러스 기반 치료제는 외피, 예를 들어 렌티바이러스 벡터이다. 일부 실시형태에서, 바이러스 기반 치료제는 외피 비보유, 예를 들어 아데노바이러스 벡터이다.
일 실시형태에서, 바이러스 기반 치료제의 표면은 상기 또는 각각의 올리고펩티드가 pH 7에서 순 양전하를 갖는 화학식 I의 중합체에 결합하기에 적합한 결합 부위를 포함한다. 일반적으로, 바이러스 기반 치료제의 표면은 음으로 하전되고 화학식 I의 양으로 하전된 중합체와 상호작용한다
대안적인 실시형태에서, 바이러스 기반 치료제의 표면은 상기 또는 각각의 올리고펩티드가 pH 7에서 순 음전하를 갖는 화학식 I의 중합체에 결합하기에 적합한 결합 부위를 포함한다.
본 발명의 복합체에서, 바이러스 기반 치료제는 바람직하게는, 예를 들어 수소 결합, 정전기적 상호작용 또는 물리적 캡슐화에 의해 화학식 I의 중합체에 비공유 결합되며, 전형적으로 상호작용은 정전기적이다. 바람직하게는, 바이러스 기반 치료제 및 화학식 I의 중합체는 쌍극자-쌍극자 상호작용, 이온-쌍극자 상호작용, 이온-유도 쌍극자 상호작용 및/또는 수소 결합으로부터 선택된 하나 이상의 상호작용에 의해 연결된다. 바이러스 기반 치료제(들)는 나노입자 내에 적합하게 캡슐화된다.
일부 실시형태에서, 바이러스 기반 치료제의 표면은 음으로 하전되고 본 발명의 중합체는 바이러스 표면과 쉽게 상호작용하는 고도로 양-하전된 말단 단부, 중합체와 바이러스 입자 간의 상호작용을 안정화시키는 데 도움이 되는 약간 양-하전된 중합체 골격 및 중합체와 바이러스 외피의 지질 성분과의 상호작용을 가능하게 하는 소수성 측쇄를 특징으로 한다.
본 발명의 복합체는 예기치 않게 하기 특성들 중 하나 이상 및 바람직하게는 모두를 제공한다:
(i) 중화 항체에 대항한 바이러스 기반 치료제의 차단 능력;
(ii) 바이러스 기반 치료제에 의한 적응 면역 반응의 낮은 활성화;
(iii) 바이러스 기반 치료제의 혈액 순환 시간의 증가;
(iv) 바이러스 기반 치료제의 간 향성의 감소; 및
(v) 바이러스 기반 치료제의 종양 향성의 증가
이러한 특성들의 조합 효과는 본 발명의 복합체가 기존의 종래 처방보다 훨씬 더 높은(예를 들어, 아마도 적어도 약 10 내지 20배) 바이러스 기반 치료제의 투여량을 사용할 수 있게 한다는 것이다.
제3 측면에서, 본 발명은 본 발명의 이전 측면들 중 어느 하나에서 상기 정의된 바와 같은 화학식 I의 중합체(들)를 포함하거나 이로 이루어진 중합체 물질로 코팅된 바이러스 기반 치료제를 포함하는 조성물을 제공한다.
코팅된 바이러스 기반 치료제
본 발명은 본 발명의 측면 중 임의의 것에 따라 본원에 정의된 바와 같은 화학식 I의 중합체(들)를 포함하거나 이로 이루어진 중합체 물질로 코팅된, 본원에 설명된 바이러스 기반 치료제를 제공한다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 중합체 중 적어도 하나가 PAG화 또는 PEG화된 화학식 I의 중합체이고 중합체 중 적어도 하나가 PAG 또는 PEG 모이어티를 함유하지 않는 2종 이상의 상이한 화학식 I의 중합체들의 조합으로 코팅된, 본원에 설명된 바와 같은 바이러스 기반 치료제를 제공한다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 본 발명의 측면 중 임의의 것에 따라 본원에 정의된 바와 같은 화학식 I의 중합체(들)를 포함하거나 이로 이루어진 중합체 물질로 코팅된 아데노바이러스 AdNuPARmE1A(하기 실시예 9 및 실시예 10을 참조)를 제공한다. 일부 실시형태에서, 중합체 물질은 본원에서 정의된 바와 같거나 본원에서 상기 설명된 바와 같은 2종의 상이한 화학식 I의 중합체들의 조합이다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 (i) R3C-C6-CR3(하기 실시예 3A 참조)과 (ii) R3C-C6-CR3-PEG(하기 실시예 5A 참조)의 조합물로 코팅된 바이러스 기반 치료제를 제공하며, 여기서 바람직하게는 중합체(i)와 중합체(ii)는 65:35의 비로 존재한다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 (i) R3C-C6-CR3(하기 실시예 3A 참조)과 (ii) R3C-C6-CR3-PEG(하기 실시예 5A 참조)의 조합물로 코팅된 아데노바이러스 AdNuPARmE1A(하기 실시예 9 및 실시예 10 참조)를 제공하고, 여기서 중합체(i) 및 중합체(ii)는 65:35의 비로 존재한다. 이러한 코팅된 바이러스 기반 치료제는 SAG-101로서 지칭된다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 본원에 정의된 바와 같은 하나 이상의 화학식 I의 중합체(들)를 포함하거나 이로 이루어진 중합체 물질로 코팅된 바이러스 기반 치료제를 제공하며, 여기서 상기 코팅된 바이러스 기반 치료제는 SAG-101 이외의 것이다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 본원에 정의된 바와 같은 하나 이상의 화학식 I의 중합체(들)를 포함하거나 이로 이루어진 중합체 물질로 코팅된 본원에 설명된 바이러스 기반 치료제로서, 레트로바이러스 벡터(예컨대, 렌티바이러스 벡터), 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스 벡터, 단순포진 바이러스 벡터, 백시니아 바이러스 벡터, 수포성 구내염 바이러스 벡터, 레오바이러스 벡터 또는 셈리키 삼림열 바이러스 벡터인 바이러스 기반 치료제를 제공한다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 본원에 정의된 바와 같은 하나 이상의 화학식 I의 중합체(들)를 포함하거나 이로 이루어진 중합체 물질로 코팅된 본원에 설명된 바이러스 기반 치료제로서, 레트로바이러스 벡터 이외의, 요법에 사용하기에 적합한 임의의 바이러스 벡터이며, 예를 들어 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스 벡터, 단순포진 바이러스 벡터, 백시니아 바이러스 벡터, 수포성 구내염 바이러스 벡터, 레오바이러스 벡터 또는 셈리키 삼림열 바이러스 벡터이며, 예를 들어 아데노바이러스 벡터 또는 아데노-관련 바이러스 벡터인 바이러스 기반 치료제를 제공한다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 본원에 정의된 바와 같은 하나 이상의 화학식 I의 중합체(들)를 포함하거나 이로 이루어진 중합체 물질로 코팅된 본원에 설명된 바이러스 기반 치료제로서, 렌티바이러스 벡터 이외의, 요법에 사용하기에 적합한 임의의 바이러스 벡터이며, 예를 들어 레트로바이러스 벡터(렌티바이러스 벡터 이외), 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스 벡터, 단순포진 바이러스 벡터, 백시니아 바이러스 벡터, 수포성 구내염 바이러스 벡터, 레오바이러스 벡터 또는 셈리키 삼림열 바이러스 벡터이며, 예를 들어 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스 벡터, 또는 렌티바이러스 벡터 이외의 레트로바이러스 벡터인 바이러스 기반 치료제를 제공한다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 본원에 정의된 바와 같은 하나 이상의 화학식 I의 중합체(들)를 포함하거나 이로 이루어진 중합체 물질로 코팅된 본원에 설명된 바이러스 기반 치료제로서, 아데노바이러스 벡터 이외의, 요법에 사용하기에 적합한 임의의 바이러스 벡터이며, 예를 들어 레트로바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스 벡터, 단순포진 바이러스 벡터, 백시니아 바이러스 벡터, 수포성 구내염 바이러스 벡터, 레오바이러스 벡터 또는 셈리키 삼림열 바이러스 벡터이며, 예를 들어 아데노-관련 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터인 바이러스 기반 치료제를 제공한다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 본원에 정의된 바와 같은 하나 이상의 화학식 I의 중합체(들)를 포함하거나 이로 이루어진 중합체 물질로 코팅된 본원에 설명된 바이러스 기반 치료제로서, 아데노바이러스 AdNuPARmE1A 이외의, 요법에 사용하기에 적합한 임의의 바이러스 벡터인 바이러스 기반 치료제를 제공한다.
일부 실시형태에서 본 발명은 본원에 정의된 바와 같은 하나 이상의 화학식 I의 중합체(들)를 포함하거나 이로 이루어진 중합체 물질로 코팅된 본원에 설명된 바이러스 기반 치료제로서, 단순포진 바이러스 벡터, 백시니아 바이러스 벡터, 수포성 구내염 바이러스 벡터, 레오바이러스 벡터 또는 셈리키 삼림열 바이러스 벡터인 바이러스 기반 치료제를 제공한다.
나노입자
조성물은 화학식 I의 중합체 물질로 코팅된 바이러스 기반 치료제를 함유하는 나노입자 및/또는 마이크로입자를 포함할 수 있다. 조성물은 2종 이상의 상이한 화학식 I에 정의된 바와 같은 중합체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 조성물은 R1 및 R2가 둘 다 CysLysLysLys인 화학식 I의 중합체 및 R1 및 R2가 둘 다 CysHisHisHis인 화학식 I의 중합체를 포함할 수 있다. 조성물은 R1 및 R2가 둘 다 CysArgArgArg이고 폴리알킬렌 글리콜 모이어티가 존재하지 않는 화학식 I의 제1 중합체와 함께, R1 및 R2가 둘 다 CysArgArgArg이고 폴리알킬렌 글리콜 모이어티가 존재하는 화학식 I의 제2 중합체, 예를 들어 R3C-C6-CR3-PEG 또는 R3C-C6-CR3-linkPEG를 포함할 수 있다.
본 발명은 이하 주로 나노입자와 관련하여 논의된다. 이러한 논의가 마이크로입자에 동등하게 적용된다는 것이 이해될 것이다.
나노입자는 바이러스 기반 치료제 및 상기 또는 각각의 올리고펩티드가 pH 7에서 순 양전하를 갖는 화학식 I의 중합체를 포함할 수 있다. 양으로 하전된 올리고펩티드는 나노입자 형성 과정 동안 음으로 하전된 바이러스 기반 치료제와 상호작용하고 나노입자 내의 바이러스 기반 치료제의 캡슐화를 촉진한다.
나노입자는 상기 또는 각각의 올리고펩티드가 pH 7에서 순 음전하를 갖는 화학식 I의 중합체 및 pH 7에서 순 양전하를 갖는 바이러스 기반 치료제를 포함할 수 있다. 음으로 하전된 올리고펩티드는 나노입자 형성 과정 동안 양으로 하전된 바이러스 기반 치료제와 상호작용하고 나노입자 내의 바이러스 기반 치료제의 캡슐화를 촉진한다.
나노입자는 임의로 상이한 화학식 I의 중합체들의 혼합물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 나노입자는
(a) 상기 또는 각각의 올리고펩티드가 pH 7에서 순 양전하를 갖는 화학식 I에 따른 중합체; 및
(b) 상기 또는 각각의 올리고펩티드가 pH 7에서 순 음전하를 갖는 화학식 I에 따른 중합체
를 포함할 수 있다.
따라서, 본 발명은 상기 중합체(a) 및 중합체(b)의 비율을 변형시킴으로써 변할 수 있는 순 표면 전하를 갖는 나노입자를 제공한다. (a) 대 (b)의 비는 중량을 기준으로 하여 1:99, 5:95, 10:90, 25:75, 50:50, 75:25, 90:10, 95:5 또는 99:1일 수 있다 .
이러한 나노입자는 바이러스 기반 치료제 캡슐화에 적합하고 개선된 약리학 적 특성을 나타낸다.
일부 실시형태에서, 상기 또는 각각의 올리고펩티드가 pH 7에서 순 양전하를 갖는 화학식 I에 따른 중합체는 상기 또는 각각의 올리고펩티드가 pH 7에서 순 음전하를 갖는 화학식 I에 따른 중합체와 조합하여 사용될 수 있다.
추가로, pH 7에서 순 음전하를 갖는 올리고펩티드로 변형된 중합체를 포함하는 것은 복잡한 신체 장벽, 예컨대 장 및 폐 점막을 통과하여 나노입자를 전달하는 것을 촉진하는데, 표면 순전하 변화가 이러한 장벽과의 상호작용 동안 변할 수 있기 때문이다.
나노입자는 바이러스 기반 치료제와 조합된 2종 이상의 상이한 화학식 I의 중합체들의 혼합물을 포함할 수 있다. 나노입자는 PAG화 또는 PEG화된 화학식 I의 제1 중합체와 PAG화 또는 PEG화되지 않은 화학식 I의 제2 중합체의 조합을 포함 할 수 있다. 예를 들어, 나노입자는 (i) 폴리알킬렌 글리콜인 적어도 하나의 R3 기를 특징으로 하는 본 발명의 이전 측면에서 정의된 바와 같은 중합체를 (ii) 폴리알킬렌 글리콜인 R3 기를 특징으로 하지 않는 제2 중합체와 조합하여 포함할 수 있다. 2종의 상이한 중합체(i) 및 중합체(ii)의 비는 중량 또는 용적을 기준으로 하여 1:99, 5:95, 10:90, 25:75, 35:65, 50:50, 65:35, 75:25, 90:10, 95:5 또는 99:1일 수 있다. 일 실시형태에서, 중합체(i) 및 중합체(ii)의 비는 25:75 내지 45:55, 바람직하게는 35:65(v/v)이다.
본 발명의 나노입자는 높은 활성제 함량 및 높은 캡슐화 효율로 형성될 수 있다.
본원에서, 활성제 캡슐화 효율은 바이러스 기반 치료제-함유 나노입자의 제조 방법에서 사용된 전체 활성제의 중량 백분율로서의 나노입자 내로 혼입된 바이러스 기반 치료제를 지칭한다. 이는 전형적으로 95% 이하이고, 더욱 전형적으로는 70% 내지 95%이다.
본원에서, 바이러스 기반 치료제 포획율은 바이러스제가 적재된 나노입자 내의 바이러스제의 중량 백분율을 지칭한다. 바이러스 기반 치료제 포획율은 바람직하게는 적어도 2중량%, 보다 바람직하게는 적어도 5중량%, 보다 바람직하게는 적어도 10중량% 및 전형적으로는 2중량% 내지 20중량%, 보다 바람직하게는 5중량% 내지 20중량%, 보다 바람직하게는 10중량% 내지 20중량%의 범위이다.
조성물이 나노입자를 포함하는 경우, 바람직하게는, 나노입자는 조성물의 약 1중량% 내지 약 90중량%를 구성한다. 보다 바람직하게는, 나노입자는 조성물의 약 5중량% 내지 약 50중량%, 보다 바람직하게는 약 10% 내지 약 30%를 구성한다. 조성물은 비히클을 추가로 포함할 수 있다. 비히클은 당업계에 공지된 바와 같은 임의의 약학적으로 허용되는 희석제 또는 부형제일 수 있다. 비히클은 전형적으로 약리학적으로 불활성이다. 바람직하게는, 비히클은 극성 액체이다. 특히 바람직한 비히클은 물, 및 염 및/또는 완충제를 함유하는 생리학적으로 허용되는 수용액, 예를 들어 식염수 또는 포스페이트-완충 식염수를 포함한다. 임의로, 비히클은 생물학적 유체이다. 보관을 위해 또는 폐 또는 코 투여용 분말, 주입용 현탁액을 위한 분말 또는 경구 투여용 정제 또는 캡슐제를 제공하기 위해, 예를 들어 동결건조, 증발 또는 원심분리에 의해 액체 비히클이 제거될 수 있다.
본원에 설명된 조성물의 투여는 경구, 설하, 피하, 정맥내, 종양내, 비강내, 국소, 경피, 복강내, 근육내, 폐내, 질, 직장 또는 안내 투여 방식을 포함하지만 이에 한정되지 않는, 이러한 조성물에 대해 허용되는 임의의 투여 방식을 통해 이루어질 수 있다. 일부 실시형태에서, 경구 또는 비경구 투여가 사용된다. 일부 실시형태에서, 조성물은 정맥내 또는 종양내 투여된다.
나노입자는 생체적합성이고, 이의 사용 환경에 충분히 저항성이어서, 원하는 표적에 도달하여 원하는 생리학적 효과를 달성할 수 있도록 포유동물 신체 내로의 진입 후에 충분한 양의 나노입자가 실질적으로 온전하게 유지된다. 본원에 설명된 중합체는 생체적합성이고 바람직하게는 생분해성이다.
본원에서, '생분해성'이라는 용어는 유해 반응을 야기하지 않으면서 살아 있는 대상체 내로 삽입 또는 주입될 수 있는 물질을 서술한다. 예를 들어, 이는 적절하게 제어될 수 없는 면역계에 의한 염증 또는 급성 거부를 야기하지 않는다. "생체적합성"은 상대적인 용어이며, 살아 있는 조직과 고도로 상용성인 물질에 대해서도 어느 정도의 면역 반응이 예상되어야 한다는 것이 이해될 것이다. 물질의 생체적합성을 평가하는 시험관내 시험은 물질을 세포에 노출시키는 것이고; 생체적합성 물질은 전형적으로 중등도의 농도(예를 들어, 29 ㎍/104개의 세포)에서 유의적인 세포 사멸(예를 들어, > 20%)을 초래하지 않을 것이다.
본원에서, '생분해성'이라는 용어는 유의적인 독성 효과 없이 세포에 의해 재사용되거나 제거될 수 있는 단량체 및/또는 기타 비-중합체성 모이어티를 형성하도록 생리학적 환경에서 분해되는 중합체를 서술한다. 분해는 예를 들어 효소 활성 또는 세포 기구에 의한 생물학적 분해일 수 있거나, 화학적 분해, 전형적으로는 생리학적 조건 하에 일어나는 화학적 과정일 수 있다. 중합체의 분해는 사용된 중합체 또는 공중합체에 따라 다양한 속도로 발생하고, 반감기가 대략 수일, 수주, 수개월 또는 수년일 수 있다. 성분들은 바람직하게는 생체내에서 염증 또는 기타 유해 효과를 유도하지 않는다. 특정의 바람직한 실시형태에서, 생분해성 화합물을 분해하는 것에 의존하는 화학 반응은 촉매되지 않는다.
본원에서, '나노입자'라는 용어는 직경이 약 1 내지 약 1000 nm 미만인 고체 입자를 지칭한다. 본원에서, '마이크로입자'라는 용어는 직경이 약 1 ㎛ 내지 약 100 ㎛인 고체 입자를 지칭한다. 당업계에 공지된 방법, 바람직하게는 동적 광 산란으로 본 발명의 나노입자의 평균 직경을 결정할 수 있다. 특히, 본 발명은 표준 시험 방법 ISO 22412:2008(누적률 방법 A.1.3.2)에 따라, 여과수로 적절하게 희석된 샘플 및 적합한 장치, 예컨대 Malvern Instruments(영국)의 Zetasizer™ 장치를 사용하여 90°의 산란 각도 및 25℃의 온도에서 동적 광 산란으로 분석했을 때 직경이 약 1 내지 약 1000 nm 미만인 고체 입자인 나노입자에 관한 것이다. 입자의 직경이 x nm라고 했을 때, 일반적으로 이러한 평균 주위에 입자가 분포될 것이지만, 입자 수의 적어도 50%(예를 들어 >60%, >70%, >80%, >90%, 또는 이를 초과)는 직경이 x±20% 범위 내일 것이다. 본 발명의 나노입자의 직경은 주사 전자 현미경법으로 측정될 수도 있다.
바람직하게는, 나노입자의 직경은 약 10 내지 약 1000 nm 미만, 보다 바람직하게는 약 5 내지 약 500 nm, 보다 바람직하게는 약 50 내지 약 400 nm, 보다 바람직하게는 약 50 내지 약 150 nm이다. 대안적으로, 나노입자의 직경은 약 1 내지 약 100 nm이다. 일 실시형태에서, 투과 전자 현미경으로 결정시, 나노입자는 10% 미만, 바람직하게는 5% 미만, 바람직하게는 1% 미만의 응집도를 나타내고, 바람직하게는 나노입자는 실질적으로 응집되지 않는다.
본 발명은 화학식 I의 중합체의 매트릭스에 바이러스 기반 치료제를 캡슐화하는 방법으로서, 바이러스 기반 치료제를 제공하는 단계; 중합체를 제공하는 단계; 및 바이러스 기반 치료제와 중합체를 적합한 조건 하에 접촉시켜 나노입자를 형성시키는 단계를 포함하는 방법을 추가로 제공한다. 특히, 바이러스 기반 치료제 및 중합체를 원하는 비를 수득하기에 적절한 농도로 용액에서 혼합하고, 천천히 혼합한 후, 실온에서 약 30분 동안 항온배양하여 바이러스의 음의 표면 전하와 중합체의 양전하 사이에 정전기적 상호작용할 수 있도록 하여 형성할 수 있다. 중합체-바이러스 복합체는 이제 사용할 준비가 된다.
합성 방법
화학식 I의 중합체의 합성 방법은, 하기 나타낸 바와 같이, L3이 상기 정의한 바와 같은 화학식 II의 화합물을 L4가 상기 정의한 바와 같은 화학식 L4H2의 화합물과 반응시켜 화학식 II의 중합체를 제조하는 단계를 포함한다.
Figure pct00029
화합물 III의 화합물을 추가로 화학식 IV의 화합물과 반응시켜서 화학식 V의 화합물을 형성한다:
[화학식 V]
Figure pct00030
상기 식에서,
p 및 Ra는 각 경우마다 상기 정의된 목록으로부터 독립적으로 선택된다. 일부 경우에, 각 경우의 p는 동일하고, Ra 기는 황 연결로부터 출발하는 Ra 기의 순서가 화합물의 각 말단에서 동일하도록 선택되고, 즉, p 및 Ra는 중합체가 L4에 대해 2배 대칭을 갖도록 선택된다.
상기 단계에 대한 대안으로서, 화학식 III의 화합물을 Ry가 상기 정의된 바와 같은 화학식 H2NRy의 화합물과 추가로 반응시키고, 화학식 IV의 화합물 및 생성된 혼합물을 분리시켜 화학식 VI의 화합물을 수득한다.
[화학식 VI]
Figure pct00031
상기 식에서, Ra는 각 경우마다 상기 정의된 목록으로부터 독립적으로 선택되고, p는 상기 정의된 바와 같다.
화학식 III의 말단 아크릴레이트 기에서의 반응에 적절한 친핵체를 알고 있을 당업자가 올리고펩티드를 III의 화합물에 부착시키는 추가의 방법을 이용할 수 있다는 것은 인지될 것이다.
본 발명의 추가 측면에 따르면, 의약에서 사용하기 위한 본원에 정의된 바와 같은 복합체 또는 조성물이 제공된다.
본 발명의 추가 측면에 따르면, 전신 바이러스 유전자 요법에서 사용하기 위한 본원에 정의된 바와 같은 복합체 또는 조성물이 제공된다.
본 발명의 추가 측면에 따르면, 암 치료에서 사용하기 위한 본원에 정의된 바와 같은 복합체 또는 조성물이 제공된다. 일부 실시형태에서, 암은 간암이다. 일부 실시형태에서, 암은 췌장암이다.
도 1은 응고 분석법의 결과를 도시한다.
도 2는 혈소판 활성화를 결정하는 분석법의 결과를 도시한다. 중합체 분석법은 도 2의 "중합체" 및 "중합체 + ADP" 결과 각각에 좌측 막대로서 도시되어 있다. DMSO 분석법은 도 2의 "중합체" 및 "중합체 + ADP" 결과 각각에 우측 막대로서 도시되어 있다.
도 3은 종양용해성 아데노바이러스 AdNuPARmE1A의 개략도를 나타낸다.
도 4는 아데노바이러스 AduPARmE1A 및 AdNuPARmE1A의 개략도를 나타낸다.
도 5는 본 발명에 따른 중합체 코팅이 없는 바이러스(1) 및 결합 항체에 의해 공격을 받은 동일한 바이러스(2)를 도시한다.
도 6은 본 발명에 따른 중합체 코팅(3)으로 코팅된 바이러스(1)를 도시한다. 중합체 코팅의 존재로 인해 항체(4)는 바이러스에 결합할 수 없다.
도 7은 중화 항체에 대항한 PBAE 중합체의 차단 능력을 결정하는 분석법의 결과를 도시한다.
도 8은 적응 면역 반응의 활성화를 결정하는 분석법의 결과, 특히 하기에서 논의되는 ND50의 결정을 도시한다.
도 9는 혈액 순환 동역학을 결정하는 분석법의 결과를 도시한다.
도 10은 간 향성을 결정하는 분석법의 결과를 도시하며, 여기서 RLU는 상대 광 단위(relative light unit)를 지칭한다.
도 11은 종양 향성을 결정하는 분석법의 결과를 도시하며, 여기서 RLU는 상대 광 단위를 지칭한다.
도 12는 실시예 16에 제시된 항-종양 활성 연구의 프로토콜을 도시한다.
도 13은 실시예 16에서 수행된 연구의 결과를 도시한다.
도 14는 실시예 16에서 수행된 연구의 결과를 도시한다.
도 15는 실시예 17에서 수행된 연구의 결과를 도시한다.
도 16은 실시예 17에서 수행된 연구의 결과를 도시한다.
도 17은 실시예 17에서 수행된 연구의 결과를 도시한다.
도 18은 실시예 17에서 수행된 연구의 결과를 도시한다.
도 19는 SAG-101의 투과 전자 현미경 사진을 도시한다.
도 20은 실시예 19에서 수행된 연구의 결과를 도시한다.
도 21은 실시예 20의 나노입자의 주사 전자 현미경 사진을 도시한다.
본 발명은 하기의 실시예에 의해 추가로 설명된다. 실시예가 설명의 목적만을 위한 것이고, 상기 설명한 바와 같은 본 발명을 한정하도록 의도되지 않는다는 것이 이해될 것이다. 본 발명의 범주를 벗어나지 않으면서 세부사항의 변형이 이루어질 수 있다.
실시예
실시예 1 : PBAE 중합체의 합성
폴리(β-아미노에스테르)를 문헌(예를 들어, Montserrat, N. et al. J. Biol. Chem. 286, 12417-12428 (2011))에 설명된 다음의 2단계 절차에 따라 합성하였다. 먼저, 1급 아민과 디아크릴레이트를 (아민:디아크릴레이트의 1:1.2 몰비에서) 첨가 반응시켜 아크릴레이트-종결된 중합체를 합성하였다. 마지막으로, 생성된 아크릴레이트-종결된 중합체를 상이한 종류의 아민- 및 티올-함유 모이어티로 말단-캡핑 변형시켜 PBAE를 수득하였다. 합성된 구조를 1H-NMR 및 FT-IR 분석으로 확인하였다. NMR 스펙트럼을 400 MHz Varian(Varian NMR Instruments, 일리노이주 클레어돈 힐스)으로 기록하고 메탄올-d4를 용매로서 사용하였다. IR 스펙트럼은 증착 필름에서 용매로서 메탄올을 사용하고 KBr 빔 스플리터와 함께 Nicolet Magna 560(Thermo Fisher Scientific, 매사추세츠주 월섬)을 사용하여 수득하였다. 분자량 측정은 2개의 GPC Ultrastyragel 컬럼, 103 및 104 Å(5 μm 혼합, 300 mm×19 mm, Waters Millipore Corporation, 미국 매사추세츠주 밀포드) 및 이동상으로서 THF가 구비된 Hewlett-Packard 1050 시리즈 HPLC 시스템에서 수행하였다. 폴리스티렌 표준의 체류 시간과 비교하여 분자량을 계산하였다.
실시예 2 : 아크릴레이트 종결된 중간체(C32)의 합성
1,4-부탄디올 디아크릴레이트(8.96g, 4.07×10-2mol) 및 5-아미노-1-펜탄올(3.5g, 3.39×10-2mol)을 바이알에서 혼합하였다. 혼합물을 90℃에서 24시간 동안 교반한 다음, 실온으로 냉각시켜 담황색 점성 고체, 아크릴레이트-종결된 중간체(C32로 지정)를 형성하였다. 중간체 C32를 후속 단계에서 사용하기 전에 4℃에서 저장하였다.
Figure pct00032
실시예 2A : 아크릴레이트 종결된 중간체(C6)의 합성
Figure pct00033
환저 플라스크에서 5-아미노-1-펜탄올(3.9g, 38 mmol), 헥실아민(3.8g, 38mmol) 및 1,4-부탄디올 디아크릴레이트(18 g, 82 mmol)를 혼합하고 반응물을 질소 하에 90℃에서 18시간 동안 교반하였다. 실온으로 냉각시킨 후, 생성물(C6으로 지정)을 황색 오일(25 g, n = 8, Mw = 2300)로서 수집하였다. 생성물을 NMR 및 GPC로 분석하였다.
1H-NMR (CDCl3): 6.40 (dd, 2H, J 17.3, 1.5 Hz), 6.11 (dd, 2H, J 17.3, 10.4 Hz), 5.82 (dd, 2H, J 10.4, 1.5 Hz), 4.18 (m, 4H), 4.08 (m, 32 H), 3.61 (m, 16H), 2.76 (m, 32H, J 7.2 Hz), 2.41 (m, 48H), 1.69 (m, 32H), 1.56 (m, 8H), 1.49-1.20 (m, 40H) 및 0.87 (t, 12H, J 6.9 Hz) ppm.
실시예 2B : 이황화 결합을 특징으로 하는 아크릴레이트 종결된 중간체의 합성
4-아미노-1-부탄올 또는 5-아미노-1-펜탄올을 헥산-1,6-디일 디아크릴레이트 및 디설판디일비스(에탄-2,1-디일)디아크릴레이트의 등몰 혼합물로 중합하여 이황화 결합을 특징으로 하는 아크릴레이트 종결된 중가체를 형성하였다.
실시예 3 : 올리고펩티드로 말단-변형된 PBAE의 합성
일반적으로, 올리고펩티드-변형된 PBAE는 다음과 같이 수득되었다: 아크릴레이트-종결된 중합체 C32 또는 C32SS 및 아민- 또는 티올-종결된 올리고펩티드(예를 들어, HS-Cys-Arg-Arg-Arg(CR3), H2N-Arg-Arg-Arg(R3) 또는 HS-Cys-Glu-Glu-Glu(CE3)-다른 올리고펩티드는 표준 1문자 코드를 사용하여 유사한 약어로 표시함)를 DMSO 중에서 1:2 몰비로 혼합하였다. 혼합물을 실온에서 밤새 교반하고, 생성된 중합체를 디에틸 에테르:아세톤(3:1)에 침전시켜 수득하였다.
(a) 트리-아르기닌 말단-변형된 PBAE를 수득하기 위한 다음 합성 절차가 예로서 제시된다: 상기 실시예 2에서 설명한 바와 같이 중간체 C32를 제조하였다. DMSO(2 ml) 중 중간체 C32(0.15 g, 0.075 mmol)의 용액을 DMSO(1 mL) 중 상응하는 올리고펩티드(Cys-Arg-Arg-Arg(CR3; 0.11 g, 0.15 mmol)) 용액과 각각 적절한 몰비 1:2로 혼합하였다. 이 혼합물을 실온에서 밤새 교반한 다음, 디에틸 에테르/아세톤(3:1)에 침전시켰다.
Figure pct00034
IR(증착 필름): v = 721, 801, 834, 951, 1029, 1133 (C-O), 1201, 1421, 1466, 1542, 1672 (C=0, 펩티드 아미드로부터), 1731 (C=0, 에스테르로부터), 2858, 2941, 3182, 3343 (N-H, O-H) cm-1
Figure pct00035
(b) 트리-리신 변형된 올리고펩티드(K3C-C32-CK3)를 동일한 프로토콜에 따라 제조하고 다음과 같이 특성규명하였다:
IR (증착 필름): v = 721, 799, 834, 1040, 1132, 1179 (C-O), 1201, 1397, 1459, 1541, 1675 (C=0, 펩티드 아미드로부터), 1732 (C=0, 에스테르로부터), 2861, 2940, 3348 (N-H, O-H) cm-1
Figure pct00036
(c) 트리-히스티딘 변형된 올리고펩티드(H3C-C32-CH3)를 동일한 프로토콜에 따라 제조하고 다음과 같이 특성규명하였다:
IR (증착 필름): v = 720, 799, 832, 1040, 1132, 1201, 1335, 1403, 1467, 1539, 1674 (C=0, 펩티드 아미드로부터), 1731 (C=0, 에스테르로부터), 2865, 2941, 3336 (N-H, O-H) cm-1
Figure pct00037
실시예 3A : 올리고펩티드로 말단-변형된 PBAE(R3C-C6-CR3)의 합성
Figure pct00038
펩티드의 염산염을 수득하기 위해, 20mL의 0.1M HCl을 펩티드 CRRR(200 mg)에 첨가하고 용액을 동결건조시켰다.
환저 플라스크에서 디메틸 설폭사이드(1.1 mL) 중의 PBAE C6(113 mg, 0.054 mmol) 용액 및 디메틸 설폭사이드(1.1 mL) 중의 펩티드 CRRR 염산염(99 mg, 0.13 mmol) 용액을 혼합하였다. 반응물을 실온에서 질소 하에 24시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 디에틸 에테르-아세톤(7:3) 위에 첨가하고 백색 침전물을 수득하였다. 현탁액을 4000 rpm에서 10분 동안 원심분리하고 용매를 제거하였다. 고체를 디에틸 에테르-아세톤(7:3)으로 2회 세척하고 진공 하에 건조시켜 백색 고체(233 mg)를 수득하였다. 생성물을 NMR(MeOD)로 분석하였고, 구조가 일치하였다.
실시예 3B : 올리고펩티드로 말단-변형된 기타 PBAE의 합성
Figure pct00039
PBAE R3C-C6-CR3의 합성에 대해 설명한 동일한 절차를 다음의 합성을 위해 PBAE C6과 함께 사용하였다:
- 펩티드 CHHH를 갖는 PBAE H3C-C6-CH3.
- 펩티드 CKKK를 갖는 PBAE K3C-C6-CK3.
- 펩티드 CDDD를 갖는 PBAE D3C-C6-CD3.
- 펩티드 CEEE를 갖는 PBAE E3C-C6-CE3.
실시예 3C: 올리고펩티드로 말단-변형된 기타 PBAR의 합성
PBAE R3C-C6-CR3의 합성에 대해 상기 설명한 절차를 다음의 합성을 위해 PBAE C32와 함께 사용하였다:
- 펩티드 CRRR을 갖는 PBAE R3C-C32-CR3.
- 펩티드 CHHH를 갖는 PBAE H3C-C32-CH3.
- 펩티드 CKKK를 갖는 PBAE K3C-C32-CK3.
- 펩티드 CDDD를 갖는 PBAE D3C-C32-CD3.
- 펩티드 CEEE를 갖는 PBAE E3C-C32-CE3.
실시예 4: 비대칭 말단 변형을 갖는 PBAE의 합성
일반적으로, 비대칭 올리고펩티드-변형된 PBAE는 다음과 같이 수득되었다: 아크릴레이트-종결된 중합체 C32(또는 C32SS) 및 아민- 또는 티올-종결된 올리고펩티드(예를 들어, CR3, R3 또는 CE3)를 DMSO 중에 1:1 몰비로 혼합하였다. 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 등몰량의 2급 아민- 또는 티올-종결된 올리고펩티드 또는 1급 아민을 첨가하고 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 디에틸 에테르/아세톤(3:1)에 침전시켜 생성된 비대칭 PBAE 중합체를 수득하였다.
비대칭 말단-변형된 B3-C32-CR3 PBAE를 수득하기 위한 다음의 합성 절차를 예로서 제시한다: DMSO(2 ml) 중 중간체 C32(0.15 g, 0.075 mmol)의 용액을 DMSO (1 ml) 중 상응하는 올리고펩티드 Cys-Arg-Arg-Arg(CR3; 0.055 g, 0.075 mmol) 용액과 혼합하고 실온에서 밤새 교반하였다. 이어서, 2-메틸-1,5-펜탄디아민(0.017 g, 0.02 ml, 0.15 mmol)을 DMSO 중에서 실온에서 4시간 동안 혼합물에 첨가하였다. 디에틸 에테르/아세톤(3:1)에 밤새 침전시켜 비대칭 말단-변형된 중합체 B3-C32-CR3과 B3-C32-B3 및 R3C-C32-CR3의 혼합물을 수득하였다. 비대칭 말단-변형된 중합체 B3-C32-CR3은 표준 방법에 의해 혼합물로부터 분리될 수 있다.
Figure pct00040
실시예 5A : PEG 변형된 PBAE의 합성
단계 1: MeO-PEG-COOH의 합성
디클로로메탄(5 mL) 중의 MeO-PEG(5 g, Mw = 2000, 2.5 mmol) 및 석신산 무수물(0.275 g, 2.75 mmol)의 용액에 트리에틸아민(0.174 mL, 1.25 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 4시간 동안 교반하고 1 M HCl(1 ml)로 2회 세척하였다. 유기 상을 염수로 2회 세척하고 MgSO4에서 건조시켰다. 고체를 여과 제거하고, 용매를 진공 하에 증발시켜 백색 고체(4.47 g)를 수득하였다. 생성물을 NMR(CDCl3)로 분석하였고 구조가 일치하였다.
단계 2: N-boc 5-아미노-1-펜탄올의 합성
디클로로메탄(1.6 mL) 중 5-아미노-1-펜탄올(0.525 g, 5.1 mmol) 및 트리에틸아민(0.779 mL, 5.6 mmol)의 용액에 디클로로메탄(5 mL) 중 디-tert-부틸 디카르보네이트(1.1 g, 5.1 mmol)의 용액을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반한 다음, 0.5 M HCl(1 ml)로 3회 세척하였다. 유기상을 MgSO4에서 건조시켰다. 고체를 여과 제거하고, 용매를 진공 하에 증발시켜 백색 고체(1.3 g)를 수득하였다. 생성물을 NMR(CDCl3)로 분석하였고 구조가 일치하였다.
단계 3: MeO-PEG-NHBoc의 합성
디클로로메탄(14 mL) 중의 MeO-PEG-COOH(1 g, 0.49 mmol) 용액에 디사이클로로헥실카르보디이미드(151 mg, 0.74 mmol) 및 N,N'-디메틸아미노피리딘(9 mg, 0.074 mmol)을 첨가하였다. 5분 후, 디클로로메탄(1 mL) 중의 N-boc 5-아미노-1-펜탄올(100 mg, 0.49 mmol)의 용액을 혼합물에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 6시간 동안 교반한 다음, 고체를 여과 제거하였다. 용매를 진공 하에 증발시키고 잔사를 디에틸 에테르(5 mL)로 3회 세척하였다. 생성물을 진공 하에 건조시켜 백색 고체(0.940 g)를 수득하였다. 화합물을 NMR(CDCl3)로 분석하였고, 구조는 예상된 구조와 일치하였다.
단계 4: MeO-PEG-NH2의 합성
디클로로메탄(3 mL) 중의 MeO-PEG-NHBoc(464 mg, 0.21 mmol)의 용액에 트리플루오로아세트산(1.2 mL)을 0℃에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 0℃에서 10분 동안 교반한 다음, 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 용매를 진공 하에 감소시키고 잔사를 디에틸 에테르(5 mL)로 2회 세척하였다. 생성물을 디클로로메탄(8 mL)에 용해시키고 0.5 M NaOH(1 ml)로 2회 세척하였다. 유기 상을 염수로 세척하고 MgSO4에서 건조시켰다. 고체를 여과 제거하고, 용매를 진공 하에 증발시켜 백색 고체(319 mg)를 수득하였다. 생성물을 NMR(CDCl3)로 분석하였고, 구조는 예상된 구조와 일치하였다.
단계 5: PBAE C6-PEG의 합성
Figure pct00041
5-아미노-1-펜탄올(42 mg, 0.41 mmol), 헥실아민(41 mg, 0.41 mmol) 및 MeO-PEG-NH2(314 mg, 0.14 mmol)를 디클로로메탄(2 mL)에 혼합하고, 용매를 진공 하에 감소시켰다. 잔사에 1,4-부탄디올 디아크릴레이트(198 mg, 1 mmol)를 첨가하고, 반응 혼합물을 질소 하에 90℃에서 18시간 동안 교반하였다. 실온으로 냉각시킨 후, 생성물을 황색 고체로서 수집하였다(527 mg, n = 7). 생성물을 NMR(CDCl3)로 분석하였고, 구조는 일치하였다.
1H-NMR (CDCl3): 6.40 (dd, 2H, J 17.3, 1.5 Hz), 6.11 (dd, 2H, J 17.3, 10.4 Hz), 5.82 (dd, 2H, J 10.4, 1 .5 Hz), 4.18 (m, 4H), 4.08 (m, 28 H), 3.63 (m, -OCH2-CH2O-, PEG), 3.37 (s, CH3O-, PEG), 2.76 (m, 28H), 2.43 (m, 42H), 1.80-1.20 (m) 및 0.87 (t, 12H, J 6.9 Hz) ppm.
단계 6: PBAE R3C-C6-CR3-PEG의 합성
Figure pct00042
펩티드의 염산염을 수득하기 위해, 15 mL의 0.1 M HCl을 펩티드 CRRR(150 mg)에 첨가하고 용액을 동결건조시켰다.
환저 플라스크에서 디메틸 설폭사이드(1.2 mL) 중의 PBAE C6-PEG(92 mg, 0.022 mmol)의 용액 및 디메틸 설폭사이드(1.1 mL) 중의 펩티드 CRRR 염산염(40 mg, 0.054 mmol)의 용액을 혼합하였다. 반응물을 질소 하에 실온에서 20시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 디에틸 에테르-아세톤(7:3) 위에 첨가하고 백색 침전물을 수득하였다. 현탁액을 4000 rpm에서 10분 동안 원심분리하고 용매를 제거하였다. 고체를 디에틸 에테르-아세톤(7:3)으로 2회 세척하고 진공 하에 건조시켜 백색 고체(133 mg)를 수득하였다. 생성물을 NMR(MeOD)로 분석하였고, 구조가 일치하였다.
실시예 5B : PEG가 링커 모이어티를 통해 PBAE에 결합된 PEG 변형된 PBAE의 합성
단계 1: 메톡시-PEG 산의 합성
1. 환저 플라스크에 메톡시-PEG(5g, 2.5mmol)를 첨가한다.
2. 상기 플라스크에 디클로로메탄(5 mL)을 첨가한다.
3. 석신산 무수물(0.275 g, 2.75 mmol)을 용액에 첨가한다.
4. 트리에틸아민(0.174mL, 1.25mmol)을 혼합물에 첨가한다.
5. 이어서, 혼합물을 실온에서 4시간 동안 교반한다.
6. 혼합 반응물을 1 M HCl(1 ml)로 2회 세척한다.
7. 용액을 염수로 2회 세척한다.
8. MgSO4상에서 유기상을 건조시킨다.
9. 고체를 여과 제거하고 진공 하에 용매를 증발시켰다.
단계 2: 에스테르화 반응
Figure pct00043
1. 스크류 탭 튜브에 메톡시-PEG 산(230 mg, 0.11 mmol)을 첨가한다.
2. 상기 튜브에 디클로로메탄(1.5mL)을 첨가한다.
3. 용액에 디사이클로헥실카르보디이미드(34 mg, 0.17 mmol)를 첨가한다.
4. 용액을 실온에서 20분 동안 교반한다.
5. 디클로로메탄(1 mL) 중의 C6 PBAE(200 mg, 0.099 mmol)의 용액을 첨가한다.
6. 이어서, 혼합물을 실온에서 20시간 동안 교반한다.
7. 고체를 여과 제거하고 진공 하에 용매를 증발시켰다.
단계 3: 펩타이드와의 반응
Figure pct00044
1. 펩티드 Cys-Arg-Arg-Arg(200 mg)에 0.1 M HCl(20 mL)을 첨가한다.
2. 용액을 -80℃에서 동결시키고 펩티드를 동결건조시킨다.
3. 디메틸설폭사이드(0.8 mL) 중의 C6-linkPEG PBAE(114 mg, 0.027 mmol)의 용액을 제조한다.
4. 디메틸설폭사이드(0.8 mL) 중의 Cys-Arg-Arg-Arg(50 mg, 0.068 mmol)의 용액을 제조한다.
5. 스크류 탭 튜브에서 두 용액을 혼합한다.
6. 혼합 용액을 실온에서 20시간 동안 교반한다.
7. 혼합물을 7:3 디에틸 에테르/아세톤(8 mL)에 적가한다.
8. 현탁액을 4000 rpm에서 10분 동안 원심분리하고 용매를 제거한다.
9. 고체를 7:3 디에틸 에테르/아세톤(4 mL)으로 2회 세척한다.
10. 생성물을 진공 하에 건조시킨다.
11. 디메틸 설폭사이드 중의 100 mg/mL의 생성물의 용액을 제조한다.
실시예 6 : 화합물 라이브러리
1급 아민을 디아크릴레이트에 첨가한 후 말단 변형시켜 상이한 올리고펩티드 말단-변형된 PBAE의 라이브러리를 합성하였다. 화학식 I에 따라, 표 1에 나타낸 올리고펩티드 말단-변형된 PBAE를 합성하였다.
Figure pct00045
Figure pct00046
Figure pct00047
Figure pct00048
실시예 7 : 응고 분석
응고 캐스케이드는 일반적으로 3가지 경로로 나뉜다. 3가지 응고 경로에 미치는 본 출원에 설명된 중합체의 효과는 3가지의 대표적인 파라미터를 측정함으로써 평가하였다. 구체적으로, 내인성 경로는 부분 활성화 트롬보플라스틴 시간에 의해 측정하고, 외인성 경로는 프로트롬빈 시간에 의해 측정하고 최종 공통 경로는 트롬빈 시간을 측정함으로써 평가하였다. 응고 인자와 본 발명에 설명된 중합체와의 결합 또는 응고 인자의 고갈로 인한 응고 캐스케이드에서 유도된 가능한 변화는 응괴 형성을 형성하는데 필요한 시간을 측정하여 평가하였다.
사용된 중합체는 65%의 R3C-C6-CR3 및 35%의 R3C-C6-CR3-PEG를 함유한다. 355 ㎍/ml, 213 ㎍/ml 및 106.5 ㎍/ml의 3가지 상이한 농도를 연구하였다. 간단히 말하면, 중합체는 적어도 3명의 공여자로부터 인간 풀 혈장(pool plasma)과 함께 항온배양하였다. 응괴 형성은 초 단위로 측정하는 지혈 분석기를 사용하여 점도 기반 검출 시스템에 의해 검출하였다. 이 시스템은 샘플의 물리화학적 속성으로 인한 간섭을 피한다. 각 경로에 대한 참조 값은 다음과 같다: 부분 트롬보플라스틴 시간(APTT)≤34.1초, 프로트롬빈 시간(PT)≤13.4초 및 트롬빈 시간(TT)≤21초. 연장 정도에 대한 지침은 없지만, 일반적으로 정상 대조군 대비 2배 이상의 연장이 생리학적으로 유의적인 것으로 간주된다.
도 1에 도시된 바와 같이, 정상 대조군과 관련하여 풀링된 인간 혈장의 응고 시간(음성 대조군)에는 변화가 없었다. 기술의 내부 대조군으로서 정상 대조군 및 병리학적(비정상) 대조군을 사용하였다. 중합체 스톡을 DMSO에 용해시켰기 때문에, 용해의 대조군도 분석에 포함시켰다. DMSO 단독은 응고 시간의 변화를 나타내지 않았다.
도 1에 도시된 바와 같이, 중합체는 시험된 농도 중 어느 것에서도 응고 시간의 유의적인 변화를 유발하지 않았다. 응고 시간은 355 ㎍/ml, 213 ㎍/ml 및 106.5 ㎍/ml에서 중합체 노출 후 정상 한계치 내에 있었다. 중합체는 시험된 최고 농도에서 프로트롬빈 시간(PT)을 감소시키고 이것은 음성 대조군과 관련하여 통계적으로 유의적이었다.
실시예 8: 혈소판 활성화 분석
혈소판 활성화는 내피 세포, 백혈구 및 기타 혈소판의 탈과립화 및 활성화와 함께 오며, 이는 궁극적으로 혈전 형성을 유발한다. 혈소판은 1차 지혈에 관여하는 작은 무핵 원판상 세포이다. 이들의 내부 구조와 막은 혈소판 활성화에서 중심적인 역할을 한다. 혈소판 활성화를 위한 가장 신뢰할 수 있는 마커 중 하나는 CD62P이다. 이것은 혈소판-특이적 셀렉틴 단백질이며, 휴지기 혈소판의 내부 α-과립 막에서 발현된다. 이 수용체는 활성화된 내피 세포 표면상에서 혈소판의 일시부착(tethering) 및 회전(rolling)을 매개한다. 혈소판 활성화 및 과립 분비시, α- 과립 막은 외부 원형질막과 융합하고 CD62P 항원은 활성화된 혈소판의 표면에서 발현된다.
혈소판 활성화를 유도하거나 억제하는, 본 출원에 설명된 중합체의 효과는 유세포계측법에 의해 활성화된 혈소판 표면에서의 CD62P 발현에 의해 측정하였다. 사용된 중합체는 65%의 R3C-C6-CR3 및 35%의 R3C-C6-CR3-PEG를 함유하였다. 3가지 농도를 연구하였다: 355 ㎍/ml, 213 ㎍/ml 및 106.5 ㎍/ml. 결과는 기저 수준(음성 대조군)에 대해 정규화하였다. 음성 대조군에 대해 상대 형광 강도가 2.0을 초과한 경우 결과는 양성으로 간주되었다.
도 2에 도시된 바와 같이, 중합체는 혈소판-풍부 혈장(PRP)의 풀과 함께 항온배양하였을 때 시험된 농도 중 어느 것에서도 혈소판 활성화를 유도하지 않았다. 중합체 스톡이 DMSO에 용해되었기 때문에, 용해의 대조군도 분석에 포함시켰다. 도 2에 도시된 바와 같이, DMSO는 혈소판 활성화를 유도하지 않았다.
혈소판 활성화에 미치는 중합체의 잠재적인 억제 효과의 대조로서, ADP(아데노신 포스페이트)로 분석을 수행하였다. 중합체는 ADP의 존재 하에 혈소판 활성화를 억제하지 않았다. 본 결과는 본 출원에 설명된 중합체가 시험된 조건 하에 혈소판 활성화를 유도하거나 억제하지 않음을 시사한다.
실시예 9 : AdNuPARmE1A 바이러스
구조
노치(Notch)-반응성 유전자는 프로모터 영역 내에서 CSL 전사 인자를 인식하는 DNA-결합 도메인을 특징으로 한다. "헤드-투-헤드(head-to-head)"로 배향되고 16nt에 의해 분리된 이중 "서열-쌍" CSL-결합 부위(SPS)의 존재는 노치 전사 복합체의 이량체화를 촉진하여, Hes1과 같은 노치 표적 유전자의 전사 활성화를 초래한다(Nam Y, Sliz P, Pear WS, Aster JC, Blacklow SC. Cooperative assembly of higher-order Notch complexes functions as a switch to induce transcription. Proc Natl Acad Sci USA. 2007; 104:2103-2108).
AdNuPARmE1A는 Notch 신호 활성화(SPS)에 반응하는 3개의 서열로 조작된 합성 프로모터 및 E1A 발현을 제어하는 최소 uPAR 프로모터를 함유한다. 더욱이, 성장 호르몬 경계 영역(SINEB2)으로부터의 214 bp 짧은 산재된 핵 요소 B2는 UPAR 프로모터의 상류에 삽입되어, 종양 선택성의 감소를 초래할 수 있는 ITR 바이러스 프로모터에 의한 E1A의 임의의 가능한 비특이적 전사 활성화를 피하기 위해 인슐레이터(insulator) 서열로서 작용한다. E1A 아데노바이러스 유전자의 발현은 3xSPSuPARm 프로모터에 의해 제어된다. SINEB2 인슐레이터 서열은 프로모터 서열의 상류에 클로닝하였다(도 3 참조).
생산 및 분석
먼저 3xSPSuPARm 프로모터를 p셔틀 벡터에 클로닝하고 SINEB2 인슐레이터를 프로모터의 상류에 삽입하여 pShSINE3xSPSuPARmE1A를 생성함으로써 종양용해성 아데노바이러스 AdNuPARmE1A를 생성한다. pShSINE3xSPSuPARmE1A 벡터와 상동성 재조합 아데노바이러스 게놈의 상동성 재조합을 표준 프로토콜에 따라 수행하여 pAdNuPARmE1A를 생성한다. 이어서, 재조합 게놈을 HEK293 세포에 형질감염시키고 A549 세포에서서 증폭시키고 표준 염화세슘 밴딩(Mato-Berciano A1, Raimondi G, Maliandi MV, Alemany R, Montoliu L, Fillat C)에 의해 정제한다. NOTCH-민감성 uPAR-조절된 종양용해성 아데노바이러스는 췌장 종양 성장을 효과적으로 억제하고 젬시타빈 및 냅-파클리탁셀(nab-paclitaxel)과의 상승작용적 항암 효과를 유발한다(Oncotarget. 2017; 8(14) 22700-22715).
아데노바이러스 농도는 2가지 상이한 방법으로 결정한다.
a) 물리적 입자 농도(vp/ml)를 광학 밀도 판독(OD260)에 의해 결정한다.
b) 플라크 형성 단위(pfu/ml)를 항-헥손 염색 기반 방법에 의해 HEK293 세포에서 결정한다.
실시예 10 : AduPARmE1A 및 AdNuPARmE1A 바이러스
E1A 유전자 발현이 uPAR 프로모터에 의해 조절되는 종양용해성 AduPARmE1A 바이러스를 생성하였다. 코작(Kozak) 서열을 E1A 유전자의 상류에서 조작하여 이의 복제 효능을 증가시켰다(MRNA 분자상에서 이 서열은 리보솜에 의해 번역 개시 부위로서 인식되며, 이로부터 단백질이 mRNA 분자에 의해 코딩된다). 인핸서-차단 인슐레이터 활성을 갖는, 이영양성근긴장증 유전자좌(DM-1)로부터의 DNA 단편을 uPAR 프로모터의 상류에 도입하여, 이를 아데노바이러스 게놈으로부터의 인핸서 및 전사 단위로부터 단리시켰다(도 4 참조).
AdNuPARmE1A는 더 짧은 버전의 uPAR 프로모터의 및 노치 세포내 도메인(NICD)에 결합할 수 있는 3개의 반응성 요소 외에는 동일한 구조를 갖는다(도 2 참조).
실시예 11 : 중합체-바이러스 복합체의 형성 및 특성규명
복합체를 제조하기 전 고려사항
바이러스 스톡은 vp/ml 및 pfu/ml 단위로 역가 측정해야 하며 vp/pfu 사이의 비는 100 미만이어야 한다. 이러한 품질 허용 기준에 도달하지 않으면, 바이러스 생산은 반복해야 할 필요가 있다. 이러한 절차를 진행하기 전에 물리적 Vp/ml 역가가 필요하다.
사용된 주요 제형은 비가 65/35인 R3C-C6-CR3/R3C-C6-CR3-PEG이지만, 이 프로토콜을 다른 제형을 사용하도록 맞게 조정할 수 있다. 유일한 것은 4e6 분자 PBAE/vp의 비를 유지하는 것입니다.
시험관내 규모를 위한 절차
1. -80℃ 냉동고로부터 2 ㎕ 바이러스 분취량을 취한다(아데노바이러스 벡터의 동결-해동 과정은 감염 효율을 잃기 때문에 권장되지 않는다. 이러한 이유로, 바이러스를 생산할 때는 사용하려는 분획만을 해동하기 위해 이것을 작은 분취량으로 분취하는 것이 강력히 권장된다). 바이러스는 얼음 위에서 매우 천천히 해동시켜야 한다.
2. 두 중합체를 모두 해동시키고 혼합물을 65/35 v/v에서 제조한다. 중합체 혼합물은 -20℃에서 저장할 수 있다.
3. 시험관내에서 사용될 코팅된 바이러스를 제조할 때, 전체 2 ㎕ 분취량을 코팅한다. PBS(2 ㎕의 바이러스 + 98 ㎕ PBS) 중에서 바이러스 스톡의 1/50 희석액을 제조한다. 생성된 용액은 VS로서 표지한다.
4. VS에서 모든 바이러스 입자를 코팅하는데 필요한 중합체의 양(㎕ PBAE 스톡)을 다음 수학식 1에 따라 계산한다.
Figure pct00049
VPt는 VP/ml의 물리적 역가를 나타낸다.
5. PBS와 계산된 용적의 PBAE 스톡을 최종 부피가 100㎕가 되도록 혼합하여 중합체 용액(PS)을 제조한다.
6. VS에 PS를 첨가하고 천천히 상하로 적어도 10회 피펫팅하여 PS와 VS를 혼합한다.
7. 바이러스의 음의 표면 전하와 중합체의 양 전하 사이의 정전기적 상호작용을 가능하게 하기 위해 샘플을 실온에서 30분 동안 항온배양한다.
8. 결과적인 역가가 100배 희석된 것을 고려하면, 이제 샘플을 사용할 준비가되었다. 이것은 원하는 작동 농도에 도달하기 위해 완전한 매질로 희석될 수 있다.
생체내 규모를 위한 절차
1. 동물의 n°(4마리 동물마다 1 마리 초과 동물) 및 용량(전형적으로 꼬리 정맥을 통해 100 ㎕ 볼러스(bolus) 주사로 정맥내 주사되는 4×1010 vp/동물)을 고려하여 필요한 총 VP를 계산한다.
2. 최종 용적의 1 ml 생리 식염수 용액 0.9% 염화나트륨 중의 4e11 VP/ml의 주사액을 제조하기 위해 필요한 바이러스 스톡(V스톡)의 용적을 계산한다. (주사액의 농도는 작동 용량에 의존하며, 이 경우에는 4×1010 vp/동물이다)
3. 모든 바이러스 입자를 코팅하는데 필요한 PBAE 스톡 용액의 총량을 계산한다.
Figure pct00050
4. 0.9 % 식염수와 계산된 용적의 PBAE 스톡을 최종 용적이 200 ㎕가 되도록 혼합하여 중합체 용액(PS)을 제조한다.
5. 0.9 % 식염수와 계산된 용적의 바이러스 스톡을 최종 부피가 200 ㎕가 되도록 혼합하여 바이러스 용액(VS)을 제조한다.
6. VS에 PS를 첨가하고 천천히 상하로 적어도 10회 피펫팅하여 PS와 VS를 혼합한다.
7. 바이러스의 음의 표면 전하와 중합체의 양 전하 사이의 정전기적 상호작용을 가능하게 하기 위해 샘플을 실온에서 30분 동안 항온배양한다.
8. 600 ㎕의 0.9% 식염수를 첨가하고 5회 천천히 피펫팅하여 혼합한다.
9. 샘플은 주사할 준비가 되었다(예를 들어, 샘플은 8마리의 동물을 처리할 수 있다).
실시예 12 내지 16
항종양 활성 결과(실시예 16)를 제외한 모든 비임상 데이터는 2개의 리포터 유전자, GFP 및 루시퍼라제를 발현하는 AdTrackluc(AdTL)라 불리는 재조합 혈청형 5 아데노바이러스로 수득되었다. 또한, 생체내 연구에서 상기 바이러스를 2가지 상이한 중합체 코팅: 100% R3C-C6-CR3 코팅에 상응하는 C6Ad 및 65% R3C-C6-CR3와 35% R3C-C6-CR3-PEG의 조합물을 나타내는 CPEGAd와 조합하였다.
실시예 12 : 중화 항체에 대한 차단 용량
어떠한 중합체 조합이 항-Ad5 중화 항체(Nab)로부터 아데노바이러스를 보호하는 가장 최상의 것인지 결정하기 위해, 바이러스 입자를 R3C-C6-CR3과 H3C-C6-CH3 및 R3C-C6-CR3-PEG 중합체의 상이한 조합물로 코팅하고, 나출형(naked) 샘플 및 코팅된 샘플을 30분 동안 Nab와 함께 항온배양하였다. 나출형 아데노바이러스를 샘플 대조군으로서 사용하였다. 이어서, 바이러스 제제(MOI 50)를 1,5×104 PANC-1 세포를 함유하는 96웰 플레이트에 첨가하였다. 2시간 후, 배지를 교체하고, 세포를 48시간 동안 항온배양하였다. 마지막으로, GPF 양성 세포를 유세포계측 분석에 의해 정량하였다.
시험된 중합체 조합은 다음과 같다:
Figure pct00051
도 7에 도시된 바와 같이, 나출형 아데노바이러스를 중화 항체(+나출형)의 존재 하에 항온배양할 때 이들의 형질도입 능력은 80%에서 55%로 유의적으로 감소된다. 상이한 코팅 조합 중에서, 65%의 R3C-C6-CR3 및 35%의 R3C-C6-CR3-PEG를 함유하는 하나의 코팅(그래프에서 C6CR3-35%로 명명됨)이 항-Ad5 중화 항체에 대한 탁월한 보호를 제공하는 것으로 관찰되었다(사각형으로 강조된 단일 결과를 참조). 또한, 코팅은 바이러스의 감염성을 감소시켰을 뿐만 아니라, 이의 효능의 증가를 유도하였다(더 큰 사각형으로 강조된 다수의 결과를 참조).
실시예 13: 적응 면역 반응의 활성화
나출형 바이러스 입자 및 코팅된 바이러스 입자가 2회 정맥내 투여 후 적응 면역 반응을 활성화시킨 방법을 또한 연구하였다. C57BL/6J 마우스(n = 6)를 세 그룹으로 나누었다(나출형 Ad, R3C-C6-CR3 Ad 및 R3C-C6-CR3-35% PEG-Ad). 0일 및 14일차에 C57BL/6J 마우스의 꼬리 정맥에 1×1010 vp /동물을 주사하고(n = 5), 1주일 후, 21일차에 동물을 희생시키고 심장내 천자에 의해 채혈하였다. 그 다음, 혈청을 추출하고 열 불활성화시키고, 나출형 아데노바이러스의 존재 하에 이를 사용하여 중화 분석을 수행하였다.
각 샘플의 항체 농도를 비교하기 위해, 각 항-혈청에 대한 중화 희석율 50(ND50)을 계산하였다. 바이러스 형질도입의 절반을 중화하기 위해 필요한 혈청의 희석율로서 정의되는 ND50은 다음과 같이 결정하였다. 나출형 Ad(MOI 0.25)를 나출형 Ad 또는 코팅된 Ad로 면역화된 마우스로부터의 혈청의 연속 희석액과 함께 96웰 플레이트에서 1시간 동안 항온배양하였다. 이어서, 1×105 HEK293 세포를 각 웰에 첨가하였다. 24시간 후, 루시퍼라제 활성을 정량하고 ND50을 계산하였다.
도 8에 도시된 바와 같이, CPEGAd가 주사된 동물은 나출형 Ad가 주사된 동물보다 3배 적은 중화 혈청을 생성하였는데, 이는 CPEG-코팅 전략(65% R3C-C6-CR3 + 35% R3C-C6-CR3-PEG)이 적응 면역 반응의 활성화를 감소시켰음을 나타낸다. C6Ad의 경우에, 이러한 차이는 덜 두드러졌다.
실시예 14 : 혈액 순환 시간의 증가
나출형 바이러스 입자 및 코팅된 바이러스 입자의 혈액 순환 동역학을 비교하기 위해, CC57BL/6J 마우스의 꼬리 정맥에 1×1010 vp /동물을 주사하였다(n = 5). 나출형-Ad, C6Ad 및 CPEGAd의 세 군을 확립하고, 혈액 샘플을 주사 후 2개의 시점: 2분 및 10분에 복재 정맥으로부터 추출하였다. 그 다음, 각각의 혈액 샘플로부터 게놈 DNA 추출을 수행하고 헥손 특이적 프라이머를 사용하여 qPCR에 의해 바이러스 게놈/μl을 정량하였다.
혈액 순환 동역학은 다음과 같이 결정하였다. 각각의 혈액 샘플로부터 게놈 DNA를 추출하고 헥손 특이적 프라이머를 사용하여 qPCR에 의해 바이러스 게놈 카피를 정량하였다. 100% 조건(주사된 용량과 동등)은 DNA 추출 전에 2 ml의 전체 마우스 혈액에 투여 용량을 희석함으로써 분석하였다. 2분부터 10분까지의 곡선하 면적을 계산하고 배수 변화로 전환하였다.
도 9에 도시된 바와 같이, 코팅된 바이러스 입자, 특히 CPEG 조합물로 코팅된 입자는 순환 시간이 개선되었다. 특히, 이들의 2분부터 10분까지의 곡선하 면적은 나출형 바이러스 아데노바이러스와 비교할 때 3배 더 컸다.
실시예 15A : 간 향성
아데노바이러스와 관련된 주요 문제 중 하나는 이의 간에 대한 향상이 높다는 것이며, 이는 이의 상당한 간독성을 담당한다. 본 발명의 중합체 코팅이 이러한 자연적 거동을 감소시킬 수 있는지를 결정하기 위해, 1×1010 vp의 나출형 아데노바이러스 및 코팅된(C6Ad 및 CPEGAd) 아데노바이러스를 C57BL/6J 마우스(n = 5)의 꼬리 정맥에 투여하고, 5일 후 전신 생물발광 영상을 촬영하고, 나출형 Ad 또는 2종의 상이한 중합체(C6Ad, CPEGAd)로 코팅된 Ad로 처리된 마우스의 간 균질물로부터 루시퍼라제 활성을 정량하였다.
도 10에 도시된 바와 같이, 두 유형의 코팅된 바이러스 입자는 모두 간세포 형질도입 능력을 유의적으로 감소시켰으며, 이는 중합체 코팅이 실제로 자연적 아데노바이러스 향성을 변형시킬 수 있음을 나타낸다.
실시예 15B : 종양 향성
코팅된 Ad에서 관찰된 감소된 간 향성이 종양 보유 마우스에서도 발생하는지를 결정하기 위해, 다음 연구를 수행하였다. 1×106 PANC-1 세포(인간 췌장 선암종으로부터 유래)를 면역결핍 Balb/C nu/nu 마우스에 피하 투여하였고, 종양이 약 150mm3에 도달하면, 1×1010 vp의 나출형 아데노바이러스 및 코팅된(C6Ad 및 CPEGAd) 아데노바이러스를 꼬리 정맥에 투여하였다(n = 6). 주사 후 5일차에, 동물을 희생시키고, 루시퍼라제 활성(리포터 유전자로서 사용됨)을 나출형 Ad 또는 2종의 상이한 중합체(C6Ad, CPEGAd) 중 하나로 코팅된 Ad로 처리된 마우스의 종양 및 간 균질물로부터 정량하였다.
간에서 이전에 관찰된 유의적인 형질도입 감소를 제외하고는, 도 11에 도시된 바와 같이, Ad가 CPEG라는 중합체 코팅으로 코팅될 때 종양에서 현저한 증가된 감염이 검출되었다. 이러한 경향은 아마도 제형 중에 PEG가 없기 때문에 C6Ad에서는 관찰되지 않았다. 전체적으로, 이러한 결과들은 CPEGAd가 투여될 때 나출형 Ad와 비교하여 유의적으로 증가된 종양-간 비로 이어졌다.
실시예 16 : 항종양 활성의 증가
2종의 상이한 코팅된 재조합 아데노바이러스(AdTL), C6Ad 및 CPEGAd로 수득된 데이터에 따라, 65%의 R3C-C6-CR3 + 35% R3C-C6-CR3-PEG로 이루어진 후자의 코팅은 SAG-101을 형성하기 위해 종양용해성 아데노바이러스 AdNuPARmE1A와 조합되도록 선택하였다.
바이러스의 치료 효과에 미치는 중합체 코팅의 효과를 연구하기 위해, 종양 보유 마우스에서의 효능 연구를 수행하였다. 특히, 전신 투여 후 코팅된 AdNuPARmE1A(SAG-101)의 효능을 나이브(naive) 또는 면역전 마우스에서의 AdNuPARmE1A의 효능과 비교하였다. 누드 마우스에서 면역전 상태를 생성하기 위해, 마우스를 C57BL6 마우스로부터의 항-Ad5 중화 혈청을 복강내 주사하여 수동적으로 면역화시켰다(피하 PANC-1 종양을 보유하는 누드 마우스에게 PBS(나이브 군) 또는 항-Ad5 중화 마우스 혈청(면역전 군)을 복강내 주사하였다). 다음날, PANC-1 종양을 보유한 나이브 또는 수동 면역화된 누드 마우스에게 PBS 또는 4×1010 vp의 나출형 또는 코팅된 AdNuPARmE1A(SAG-101)(n = 8)을 정맥내 주사하고 종양 체적을 모니터링하였다. 도 12는 AdNuPARmE1A의 치료 효과에 미치는 중합체 코팅의 효과를 결정하기 위해 수행된 본 실험의 프로토콜을 요약한 것이다. 각 군은 n = 8이었다.
도 13에 도시된 바와 같이, 식염수 대조군 및 사전-면역화된 나출형 바이러스 군과 비교하여 3개의 처리군(나출형 및 코팅된 나이브 AdNuPARmE1A 및 사전-면역화된 코팅된 AdNuPARmE1A)에서 종양 성장의 유의적인 감소가 관찰되었다 (결과는 평균 +/- SEM(* p <0.05; ** p <0.01; *** p <0.001)으로 표시됨). 중요하게는, 사전-면역화된 코팅된 군은 나이브 나출형 바이러스와 비교할 때 매우 유사한 효과를 보여주었으며, 이는 중합체 코팅이 기존의 중화 항체로부터 바이러스를 보호하였음을 나타낸다. 게다가, 나이브 코팅된 군은 나이브 나출형 군보다 더 유의적으로 효과적이었다. 시험된 각 군에 대한 중간 생존기간 결과 및 시간 경과에 따른 생존율의 변화의 개요는 도 14에 제시되어 있다.
실험 데이터는 코팅된 바이러스 입자가 예기치 않게 다음 특성들을 나타냄을 입증한다:
1. 항체에 의해 중화되는 경향의 감소;
2. 드노보 적응 면역 반응 생성 능력의 감소;
3. 혈류 동역학의 개선; 및
4. 간 향성 대 종양 형질도입의 이익의 감소
실시예 17:
코팅된 AdNuPARmE1A(SAG-101)의 독성을 연구하기 위해, 마우스에서 독성 연구를 수행하였다. 코팅은 65% R3C-C6-CR3 및 35% R3C-C6-CR3-PEG의 조합을 나타내는 CPEGAd로 이루어졌다. 정맥내 투여 후의 SAG-101의 용량을 면역적격 BALB/c 마우스에서 나출형 AdNuPARmE1A(Ad)의 용량과 비교하였다. 면역적격 마우스에게 PBS 또는 4×1010 vp의 나출형 또는 코팅된 AdNuPARmE1A(즉, "저 용량") 또는 7.5×1010 vp의 나출형 또는 코팅된 AdNuPARmE1A(즉, "고 용량")를 정맥내 주사하였다.
실시예 17A : 체중
도 15에 도시된 바와 같이, 고 용량의 나출형 AdNuPARmE1(Ad)을 투여받은 마우스가 주사 후 5일차에 중요한 체중 감소를 나타냈지만, 군들 간에 체중의 유의적인(p> 0.05) 변화는 관찰되지 않았다. 고 용량 SAG-101을 투여받은 군은 체중 감소를 보였으며, 이는 적은 독성이 코팅된 바이러스 입자와 관련이 있었음을 나타낸다.
실시예 17B : 트랜스아미나제 수준
바이러스 IV 주사 후 7일차에 혈청 효소 트랜스아미나제 활성을 측정하였다. 구체적으로는, 아스파르테이트 트랜스아미나제(AST) 및 알라닌 트랜스아미나제(ALT) 수준을 심장내 천자로부터 채취한 혈액으로부터 측정하였다.
간 손상 및 간의 가능한 바이러스 감염을 평가하고 모니터링하기 위해 일반적으로 아미노트랜스퍼라제(AST, ALT)가 혈청 중에서 분석된다. 이들 효소는 아마도 손상된 세포로부터의 누출로 인해 많은 형태의 간 질환에서 상승되어 있을 것이다. ALT는 주로 간에서 발견되지만, 신장, 심장, 근육 및 췌장에서도 소량으로 발견된다. AST는 간에 존재하지만 근육을 비롯한 다른 조직에도 상당량으로 존재한다.
도 16에 도시된 바와 같이, 고 용량의 나출형 바이러스(AdNu)를 투여했을 때 트랜스아미나제 수준이 유의적으로(*p<0.05) 더 높았고, 이는 간 손상을 나타낸다. 이러한 효과는 동일한 용량의 SAG-101을 투여받은 마우스에서는 관찰되지 않았다. 따라서, 실험 데이터는 코팅된 바이러스 입자가 트랜스아미나제 수준의 감소를 제공한다는 것을 입증한다.
실시예 17C : 혈액상(hemogram) 및 혈소판 계수
혈액상 분석 및 혈소판 계수를 수행하였다. 혈소판 계수는 1일차부터 7일차까지 격일로 마우스의 꼬리 정맥으로부터의 혈액 추출에 기반하였다. 도 17b에 도시된 바와 같이, 7일차에 나출형 AdNuPARmE1A (Ad) 또는 코팅된 AdNuPARmE1A (CPEGAd)를 투여받은 마우스들 간에 혈액상의 유의적인 변화는 검출되지 않았다.
또한, 도 17a에 도시된 바와 같이 혈소판감소증은 관찰되지 않았다. 나출형 AdNuPARmE1A (Ad) 또는 코팅된 AdNuPARmE1A (SAG101)를 투여받은 마우스들에서 혈소판 수 간에 유의차가 없었다.
실시예 17D : 사이토카인 정량
사이토카인의 수준을 측정하였다. 주사 후 6시간 및 3일차에, 혈액 분취량을 수집하고, Luminex xMAP® 기술 플랫폼을 사용하여 사이토카인 농도를 평가하였다. 도 18에 도시된 바와 같이, 나출형 AdNuPARmE1A 및 SAG-101의 투여 후에 사이토카인 수준의 유의적인 차이는 관찰되지 않았으며, 이는 SAG-101 중합체가 바이러스의 독성을 증가시키지 않았음을 나타낸다.
실시예 18 : TEM 현미경 사진
도 19a는 저배율(스케일 바 20μm)에서 SAG-101을 보여주는 TEM 현미경 사진을 제공하고, 도 19b는 고배율(스케일 바 200nm)에서 SAG-101을 보여주는 TEM 현미경 사진을 제공한다. 도 19a 및 도 19b에서 관찰된 바와 같이, 저배율에서 샘플을 분석할 때 큰 응집체는 관찰되지 않았다.
실시예 19: 표면 전하 변화
아데노-관련 바이러스(AAV) 입자를 65%의 R3C-C6-CR3 + 35% R3C-C6-CR3-PEG 중합체로 코팅하였다. 적합한 코팅 농도, 즉 AAV 대 중합체의 적합한 비를 결정하기 위해 표면 전하 변화를 평가함으로써 중합체 코팅 형성을 추적하였다.
AAV의 표면은 음으로 하전된 반면(도 20a 및 도 20b에서 볼 수 있는 바와 같이), 사용된 중합체는 순 양전하를 제공하였다. 따라서, 일단 중합체가 바이러스를 효과적으로 덮으면, 복합체의 표면 전하는 양성이었다. 따라서, 이러한 표면 전하 변화를 평가하여 중합체 코팅 형성을 추적하였다. 이의 표면 전하 변화를 따르기 위해 다른 비를 시험하였다. 도 20b는 표면 전하 측정치의 플래토(plateau)를 도시한다. 따라서, 추가의 중합체를 첨가하는 것은 비논리적이었다. 도 20a에서, 표면 전하의 점진적인 변화를 보기 위해 더 가까운 간격의 중합체/바이러스 비를 시험하였다.
도 20에서 알 수 있는 바와 같이, 1e-9 ㎍ PBAE/AAV 바이러스 입자(VP) 이상의 비가 사용될 때, 양의 Z 전위 값 측정으로 나타난 바와 같이 양의 표면이 관찰되었으며, 이는 AAV 입자가 코팅되었음을 나타낸다. 도 20b에서 알 수 있는 바와 같이, 유리 중합체에 대한 Z 전위 값 측정의 가변성은 AAV의 코팅을 형성할 때의 값에 비해 매우 높다.
실시예 20: 주사 전자 현미경
아데노-관련 바이러스(AAV) 입자("나출형 AAV"), 100% R3C-C6-CR3 코팅에 상응하는 C6Ad로 코팅된 AAV 입자 및 65% R3C-C6과 35% R3C-C6-CR3-PEG의 조합을 나타내는 CPEGAd로 코팅된 AAB 입자를 도 21에 도시된 바와 같이 주사 전자 현미경에 의해 특성규명하였다. 간단히 말하면, 200 ㎕의 각 샘플(나출형 바이러스 및 코팅된 바이러스)을 1011 vp/ml의 최종 농도(최적의 시각화를 얻기 위해 필요한 농도 임)에서 (다른 실시예에 설명된 바와 같이) 제조하였다. 샘플을 그리드 상에 침착시키고 1분 동안 항온배양하였다. 그 다음, 샘플에 40초 동안 금으로 빛을 조사하여 그 위에 박층을 생성하였다. 마지막으로, 샘플을 전계 방출 주사 전자 현미경으로 분석하였다.
추가로, 주사 전자 현미경을 사용하여 나노입자 직경(nm 단위)을 결정하였다.
Figure pct00052
응집체의 존재로 인해 C6-AAV 나노입자에 대해 더 넓은 분포가 나타난다. 상기 데이터로 나타난 바와 같이, 모든 응집체는 500 nm보다 작았으므로 이 샘플은 정맥내 투여를 위해서도 사용될 수 있다.

Claims (29)

  1. 바이러스 기반 치료제와 화학식 I의 중합체 또는 약학적으로 허용되는 이의 염의 복합체.
    [화학식 I]
    Figure pct00053

    상기 식에서,
    각각의 L1 및 L2는
    Figure pct00054
    , O, S, NRX 및 결합으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고; 여기서, RX는 수소, 할로겐, 알킬, 사이클로알킬, 알케닐, 사이클로알케닐, 헤테로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아실, 아릴 또는 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;
    L3은 알킬렌, 알케닐렌, 헤테로알킬렌, 헤테로알케닐렌, 아릴렌 또는 헤테로아릴렌으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되거나;
    적어도 한 경우의 L3은
    Figure pct00055
    이고,
    여기서, T1은
    Figure pct00056
    이고,
    T2는 H, 알킬 또는
    Figure pct00057
    로부터 선택되고;
    여기서, LT는
    Figure pct00058
    , O, S, NRX 및 결합으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고, 여기서, RX는 수소, 할로겐, 알킬, 사이클로알킬, 알케닐, 사이클로알케닐, 헤테로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아실, 아릴 또는 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고, 나머지 L3 기는 각각의 경우마다 알킬렌, 알케닐렌, 헤테로알킬렌, 헤테로알케닐렌, 아릴렌 또는 헤테로아릴렌으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;
    L4는
    Figure pct00059
    및
    Figure pct00060
    로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    L5는 알킬렌, 알케닐렌, 헤테로알킬렌, 헤테로알케닐렌, 아릴렌 또는 헤테로아릴렌으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;
    R1 및 R2 및 RT(존재할 경우)는 올리고펩티드 및 Ry로부터 독립적으로 선택되고;
    여기서, R1 및 R2 및 RT(존재할 경우) 중 적어도 하나는 올리고펩티드이고;
    Ry는 수소, 할로겐, 알킬, 사이클로알킬, 알케닐, 사이클로알케닐, 헤테로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아실, 아릴 또는 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    각각의 R3은 수소, 할로겐, 알킬, 사이클로알킬, 알케닐, 사이클로알케닐, 헤테로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아실, 아릴, 헤테로아릴 및 폴리알킬렌 글리콜로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고, 상기 폴리알킬렌 글리콜은 R3이 부착되는 질소 원자에 직접 결합되거나 R3이 부착되는 질소 원자에 링커 모이어티를 통해 결합되고, 상기 링커 모이어티는 알킬렌, 사이클로알킬렌, 알케닐렌, 사이클로알케닐렌, 헤테로알킬렌, 헤테로사이클로알킬렌, 아릴렌 또는 헤테로아릴렌 기이고;
    n은 5 내지 1,000의 정수이다.
  2. 제1항에 있어서, L3은 알킬렌, 알케닐렌, 헤테로알킬렌, 헤테로알케닐렌, 아릴렌 또는 헤테로아릴렌으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는, 복합체.
  3. 제1항에 있어서, 적어도 한 경우의 L3이
    Figure pct00061
    이고,
    여기서, T1이
    Figure pct00062
    이고,
    T2가 H, 알킬 또는
    Figure pct00063
    로부터 선택되고;
    여기서, LT가
    Figure pct00064
    , O, S, NRX 및 결합으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고; 여기서, RX가 수소, 할로겐, 알킬, 사이클로알킬, 알케닐, 사이클로알케닐, 헤테로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아실, 아릴 또는 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고, 나머지 L3 기가 각각의 경우마다 알킬렌, 알케닐렌, 헤테로알킬렌, 헤테로알케닐렌, 아릴렌 또는 헤테로아릴렌으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는, 복합체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 R3 기가 폴리알킬렌 글리콜, 바람직하게는 폴리에틸렌 글리콜인, 복합체.
  5. 제4항에 있어서, 폴리알킬렌 글리콜인 적어도 하나의 R3 기가 L4 기의 질소 원자에 직접 또는 링커 모이어티를 통해 결합되는, 복합체.
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서, 폴리알킬렌 글리콜인 적어도 하나의 R3 기가 이것이 부착되는 질소 원자에 알킬렌, 알케닐렌 또는 헤테로알킬렌 기인 링커 모이어티를 통해 결합되는, 복합체.
  7. 제4항 또는 제5항에 있어서, 폴리알킬렌 글리콜인 적어도 하나의 R3 기가 이것이 부착되는 질소 원자에 직접 결합되는, 복합체.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 또는 각각의 올리고펩티드가 3 내지 20개의 아미노산 잔기를 포함하는, 복합체.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 또는 각각의 올리고펩티드가 pH 7에서 순 양전하를 갖는, 복합체.
  10. 제9항에 있어서, 상기 또는 각각의 올리고펩티드가 리신, 아르기닌 및 히스티딘으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기를 포함하는, 복합체.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 또는 각각의 올리고펩티드가 화학식 VII의 화합물인, 복합체.
    [화학식 VII]
    Figure pct00065

    상기 식에서,
    p는 2 내지 19의 정수이고, Ra는 각 경우마다 H2NC(=NH)-NH(CH2)3-, H2N(CH2)4- 또는 (1H-이미다졸-4-일)-CH2-로 이루어진 군으로부터 선택된다.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, R1과 R2가 둘 다 올리고펩티드인, 복합체.
  13. 제12항에 있어서, R1 및 R2가 상이한 올리고펩티드인, 복합체.
  14. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, R1 및 R2 중 하나가 올리고펩티드이고, R1 및 R2 중 하나가 Ry인, 복합체.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, n이 10 내지 700 또는 20 내지 500인, 복합체.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, Ry가 수소, -(CH2)mNH2, -(CH2)mNHMe, -(CH2)mOH, -(CH2)mCH3, -(CH2)2(OCH2CH2)mNH2, -(CH2)2(OCH2CH2)mOH 또는 -(CH2)2(OCH2CH2)mCH3으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 m이 1 내지 20의 정수인, 복합체.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 L3이 -C1-10 알킬렌-(S-S)q-C1-10 알킬렌-이고, 여기서 q가 0 또는 1인, 복합체.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 R3이 수소, C1-6 알킬, C1-6 알케닐, C1-6 알키닐, C1-6 하이드록시알킬, 하이드록실, C1-6 알콕시, 할로겐, 아릴, 헤테로사이클릭, 헤테로아릴, 시아노, -02C-C1-6알킬, 카르바모일, -C02H, -C02-C1-6알킬, C1-6 알킬티오에테르, 티올, 우레이도 및 폴리알킬렌 글리콜로부터 독립적으로 선택되고, 상기 폴리알킬렌 글리콜이 R3이 부착되는 질소 원자에 직접 결합되거나 R3이 부착되는 질소 원자에 링커 모이어티를 통해 결합되고, 상기 링커 모이어티가 알킬렌, 사이클로알킬렌, 알케닐렌, 사이클로알케닐렌, 헤테로알킬렌, 헤테로사이클로알킬렌, 아릴렌 또는 헤테로아릴렌 기인, 복합체.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, L4가 -N(R3)-으로부터 선택되고 /되거나 L3이 C1-6 알킬렌 기로부터 선택되는, 복합체.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 R3 기가 폴리에틸렌 글리콜인, 복합체.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 정의된 화학식 I의 중합체(들)를 포함하거나 이로 이루어진 중합체 물질로 코팅된 바이러스 기반 치료제를 포함하는 조성물.
  22. 제21항에 있어서, 상기 조성물이 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 정의된 화학식 I의 중합체(들)를 포함하거나 이로 이루어진 중합체 물질로 코팅된 바이러스 기반 치료제를 함유하는 나노입자를 포함하는, 조성물.
  23. 바이러스 기반 치료제 및 중합체(들)이 비공유 결합되는, 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 복합체 또는 제21항 또는 제22항의 조성물.
  24. 상기 바이러스 기반 치료제의 표면이 상기 또는 각각의 올리고펩티드가 pH 7에서 순 양전하를 갖는 화학식 I의 중합체에 결합하기에 적합한 결합 부위를 포함하는, 제1항 내지 제20항 또는 제23항 중 어느 한 항의 복합체 또는 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항의 조성물.
  25. 바이러스 기반 치료제가 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 단순포진 바이러스 벡터, 백시니아 바이러스 벡터, 소포성 구내염 바이러스 벡터, 레오바이러스 벡터 또는 셈리키 삼림열 바이러스(Semliki forest virus) 벡터로부터 선택되는, 제1항 내지 제20항, 제23항 또는 제24항 중 어느 한 항의 복합체 또는 제21항 내지 제24항 중 어느 한 항의 조성물.
  26. 제25항에 있어서, 바이러스 기반 치료제가 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 렌티바이러스 벡터로부터 선택되고, 바람직하게는 바이러스 기반 치료제가 아데노바이러스 벡터 또는 아데노-관련 바이러스 벡터인, 복합체 또는 조성물.
  27. 의약에서 사용하기 위한 제1항 내지 제20항 또는 제23항 내지 제26항 중 어느 한 항에 따른 복합체 또는 제21항 내지 제26항 중 어느 한 항에 따른 조성물.
  28. 전신 바이러스 유전자 요법, 특히 암, 특히 간암 또는 췌장암의 치료에서 사용하기 위한 제1항 내지 제20항 또는 제23항 내지 제26항 중 어느 한 항에 따른 복합체 또는 제21항 내지 제26항 중 어느 한 항에 따른 조성물.
  29. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 바이러스 기반 치료제와 화학식 I의 중합체 하나 이상의 복합체를 캡슐화하여 나노입자를 형성하는 방법으로서, 바이러스 기반 치료제를 제공하는 단계; 화학식 I의 중합체(들)를 제공하는 단계; 및 바이러스 기반 치료제와 중합체(들)를 적합한 조건 하에 접촉시켜 나노입자를 형성하는 단계를 포함하는 방법.
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