JP2020520967A - ウイルスベースの治療薬と修飾ポリ(β−アミノエステル)との複合体 - Google Patents
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Abstract
Description
Rojas et al., Journal of Controlled Release 237 (2016) 78-88では、中和抗体(NAb)に対するヒトアデノウイルス血清型5の保護メカニズムとしてのアルブミン結合の使用について記載している。
L1およびL2は、以下から成るグループから独立して選択される:
L3は、アルキレン、アルケニレン、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニレン、アリーレンまたはヘテロアリーレンからなる群から独立して選択され;または
L3の少なくとも1つの出現は、
ここで、T1は
ここで、LTは以下からなる群から独立して選択される:
式中、Rxは、水素、ハロゲン、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、シクロアルケニル、ヘテロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アシル、アリールまたはヘテロアリールからなる群から独立して選択され、残りのL3基は、アルキレン、アルケニレン、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニレン、アリーレンまたはヘテロアリーレンからなる群から各出現で独立して選択され;L4は、以下からなる群から独立して選択され、
R1およびR2およびRT(存在する場合)は、オリゴペプチドおよびRyから独立して選択され、
式中、R1およびR2およびRT(存在する場合)の少なくとも1つはオリゴペプチドであり、
Ryは、水素、ハロゲン、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、シクロアルケニル、ヘテロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アシル、アリールまたはヘテロアリールからなる群から選択され、
各R3は、水素、ハロゲン、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、シクロアルケニル、ヘテロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アシル、アリール、ヘテロアリール、およびポリアルキレングリコールからなる群から独立して選択され、前記ポリアルキレングリコールは、窒素原子に直接結合しているR3は、リンカー部分を介してR3が結合している窒素原子に付着または結合しており、前記リンカー部分は、アルキレン、シクロアルキレン、アルケニレン、シクロアルケニレン、ヘテロアルキレン、ヘテロシクロアルキレン、アリーレンまたはヘテロアリーレン基である;そして
nは5〜1,000の整数であり、
またはその薬学的に許容し得る塩との複合体を提供する。
ここで、T1は
L1およびL2は、以下から成る群から独立して選択される:
L3は、アルキレン、アルケニレン、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニレン、アリーレンまたはヘテロアリーレンからなる群から独立して選択され、または
L3の少なくとも1つの出現は、
ここで、T1は
R1およびR2およびRT(存在する場合)は、オリゴペプチドおよびRyから独立して選択され、
式中、R1およびR2およびRT(存在する場合)の少なくとも1つはオリゴペプチドであり、
Ryは、水素、ハロゲン、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、シクロアルケニル、ヘテロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アシル、アリールまたはヘテロアリールからなる群から選択され、
各R3は、水素、ハロゲン、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、シクロアルケニル、ヘテロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アシル、アリール、ヘテロアリール、およびポリアルキレングリコールからなる群から独立して選択され、前記ポリアルキレングリコールは、R3が結合する窒素原子に直接結合しているR3が結合する窒素原子にリンカー部分を介して取り付けされまたは結合し、ここで、前記リンカー部分は、アルキレン、シクロアルキレン、アルケニレン、シクロアルケニレン、ヘテロアルキレン、ヘテロシクロアルキレン、アリーレンまたはヘテロアリーレン基であり;
式中、少なくとも1つのR3基はポリアルキレングリコールであり;そして
nは5〜1,000の整数であり、またはその薬学的に許容し得る塩を提供する。
第2の側面のいくつかの実施態様において、L3の少なくとも1つの出現は、
ここで、T1は
本発明によれば、「オリゴペプチド」は、ペプチド結合によって一緒に連結された少なくとも3つのアミノ酸のストリングを含む。非天然アミノ酸(すなわち、天然には存在しないがポリペプチド鎖に組み込むことができる化合物)および/または当技術分野で知られているアミノ酸類似体が代わりに使用し得るけれども、そのようなペプチドは、天然アミノ酸のみを含むことが好ましい。また、そのようなペプチドにおける1つまたは複数のアミノ酸は、例えば、炭水化物基、リン酸基、ファルネシル基、イソファルネシル基、脂肪酸基、または結合、機能化、またはその他の修飾などのためのリンカーなどの化学単位の付加によって修飾され得る。本明細書で定義されるポリマー中のオリゴペプチドは、典型的には3〜20個のアミノ酸残基、より好ましくは3〜10個のアミノ酸残基、より好ましくは3〜6個のアミノ酸残基を含む。あるいは、本明細書で定義されるポリマー中のオリゴペプチドは、4〜20個のアミノ酸残基、より好ましくは4〜10個のアミノ酸残基、より好ましくは4〜6個のアミノ酸残基を含み得る。
式Iのポリマーにおいて、R1およびR2の両方がオリゴペプチドであるか、R1およびR2の1つがオリゴペプチドであり、R1およびR2の1つがRyである。
R1およびR2の一方がRyである場合、Ryは、好ましくは、水素、−(CH2)mNH2、−(CH2)mNHMe、−(CH2)mOH、−(CH2)mCH3、−(CH2)2(OCH2CH2)mNH2、(CH2)2(OCH2CH2)mOHおよび−(CH2)2(OCH2CH2)mCH3(式中、mはから1〜20、例えば1〜5の整数である)からなる群から選択される。好ましくは、Ryは、−(CH2)mNH2、−(CH2)mNHMeおよび−(CH2)2(OCH2CH2)mNH2からなる群から選択される。好ましくは、L1がNHまたはNRXであり、R1およびR2の一方がRyである場合、RyはR3とは異なる。
例えば、本発明のポリマーにおいて、R1およびR2の一方はCysArgArgArgであり、他方はH2N(CH2)3CH(CH3)CH2NH2に由来し得る。
特に好ましい実施態様では、L3は−CH2−、−(CH2)2−、−(CH2)3−、−(CH2)4−、−(CH2)5−および−(CH2)6−から選択される。
さらなる実施態様において、L3および/またはL5の1つまたは複数の炭素原子(特に前述の好ましい実施態様で定義される)は、−S−S−で置換されてもよい。この実施態様において、L3は好ましくは−(CH2)Z−S−S−(CH2)Z−から選択され、各zの値は独立して1〜4から選択され、好ましくは2〜3、好ましくは2であり、好ましくは各zの値は同じである。主ポリマー鎖に少なくとも1つのジスルフィド結合を含めると、標的細胞内でのウイルスベースの治療薬の開梱が容易になる。
好ましくは、各R3は、水素、−(CH2)PNH2、−(CH2)pNHMe、−(CH2)pOH、−(CH2)PCH3、−(CH2)2(OCH2CH2)qNH2、−(CH2)2(OCH2CH2)qOH、−(CH2)2(OCH2CH2)qCH3、およびポリアルキレングリコール、ここで、pは1〜20(好ましくは1〜5)の整数であり、qは1〜10の整数、例えば1〜5であり、前記ポリアルキレングリコールは、R3が結合する窒素原子に直接結合するか、またはリンカー部分を介してR3が結合する窒素原子に結合し、前記リンカー部分はアルキレン、シクロアルキレン、アルケニレンである、シクロアルケニレン、ヘテロアルキレン、ヘテロシクロアルキレン、アリーレンまたはヘテロアリーレン基である。本発明のいくつかの実施態様において、少なくとも1つのR3基は、ポリアルキレングリコール、好ましくはポリエチレングリコールである。いくつかの実施態様において、ポリアルキレングリコールである少なくとも1つのR3基をR3が結合する窒素原子に結合するリンカー部分は、アルキレン、アルケニレンまたはヘテロアルキレン基、好ましくはアルキレン基である。いくつかの実施態様において、リンカー部分は、3〜20個の炭素および/またはヘテロ原子の長さ、好ましくは4〜15個の炭素および/またはヘテロ原子の長さ、より好ましくは5〜10個の炭素および/またはヘテロ原子の長さである。
本発明のいくつかの化合物は、特定の幾何学的形態または立体異性形態で存在し得る。本発明は、シスおよびトランス異性体、RおよびS鏡像異性体、ジアステレオマー、(D)異性体、(L)異性体、それらのラセミ混合物、およびそれらの他の混合物を含むすべてのそのような化合物を本発明の範囲内に入るものとして意図する。追加の不斉炭素原子が、アルキル基などの置換基に存在していてもよい。すべてのそのような異性体、およびそれらの混合物は、本発明に含まれることが意図されている。
「ハロゲン」(または「ハロ」)という用語には、フッ素、塩素、臭素、およびヨウ素が含まれる。
「アルキル」という用語には、一価の直鎖または分岐鎖の飽和非環式ヒドロカルビル基が含まれる。アルキルは、適切には、メチル、エチル、n−プロピル、i−プロピルまたはt−ブチル基などのC1−10アルキル、またはC1−6アルキル、またはC1−4アルキルである。アルキルは置換されていてもよい。
「シクロアルキル」という用語は、一価の飽和環状ヒドロカルビル基を含む。シクロアルキルは、適切には、C3−10シクロアルキル、またはシクロペンチルおよびシクロヘキシルなどのC3−6シクロアルキルである。シクロアルキルは置換されていてもよい。
「アルコキシ」という用語は、アルキル−O−を意味する。
用語「アルキルアミノ」は、アルキル−NH−を意味する。
「アルキルチオ」という用語は、アルキル−S(O)t−を意味し、tは以下で定義される。
「シクロアルケニル」という用語は、少なくとも1つの炭素−炭素二重結合を有し、適切には炭素−炭素三重結合を持たない、一価の部分的に不飽和の環状ヒドロカルビル基を含む。シクロアルケニルは、適切には、C3−10シクロアルケニル、またはC5−10シクロアルケニル、例えば、シクロヘキセニルまたはベンゾシクロヘキシルである。シクロアルケニルは置換されていてもよい。
「アルキニル」という用語は、少なくとも1つの炭素−炭素三重結合を有し、適切には炭素−炭素二重結合を有さない、一価の直鎖または分岐鎖の不飽和非環式ヒドロカルビル基を含む。アルキニルは、適切にはC2−10アルキニル、またはC2−6アルキニル、またはC2−4アルキニルである。アルキニルは置換されていてもよい。
「アルケニレン」という用語は、少なくとも1つの炭素−炭素二重結合を有し、適切には炭素−炭素三重結合を有さない、二価の直鎖または分岐不飽和非環式ヒドロカルビル基を含む。アルケニレンは、適切にはC2−10アルケニレン、またはC2−6アルケニレン、またはC2−4アルケニレンである。アルケニレンは置換されていてもよい。
アリール基の他の例は、アセアントリレン、アセナフチレン、アセフェナントリレン、アントラセン、アズレン、クリセン、コロネン、フルオランテン、フルオレン、as−インダセン、s−インダセン、インデン、ナフタレン、オバレン、ペリレン、フェナレン、フェナントレン、ピセン、プレイアデン、ピレン、ピランスレンおよびルビセンである。
「アリールアルキル」という用語は、アリール基、例えばベンジルで置換されたアルキルを意味する。
「ヘテロアリール」という用語は、1つ以上の炭素原子がそれぞれO、S、NおよびNRNから独立して選択されるヘテロ原子で置き換えられたアリール基を含み、ここでRNは以下で定義される(および一実施態様においてHまたはアルキル(例えばC1−6アルキル)である)。ヘテロアリールは置換されていてもよい。
単環式ヘテロ芳香族基には、1、2、3または4個の環員がO、S、NまたはNRNから独立して選択される5〜6個の環員を含有するヘテロ芳香族基が含まれる。
5員単環式ヘテロアリール基の例は、ピロリル、フラニル、チオフェニル、ピラゾリル、イミダゾリル、イソキサゾリル、オキサゾリル、イソチアゾリル、チアゾリル、1,2,3−トリアゾリル、1,2,4−トリアゾリル、1,2,3−オキサジアゾリル、1,2,4−オキサジアゾリル、1,2,5−オキサジアゾリル、1,3,4−オキサジアゾリル、1,3,4−チアジアゾリル、ピリジル、ピリミジニル、ピリダジニル、ピラジニル、1,3,5−トリアジニル、1,2,4−トリアジニル、1,2,3−トリアジニルおよびテトラゾリルである。
6員単環式ヘテロアリール基の例は、ピリジニル、ピリダジニル、ピリミジニルおよびピラジニルである。
二環式ヘテロ芳香族基には、1、2、3、4またはそれ以上の環員がO、S、NまたはNRNから独立して選択される9〜14個の環員を含有する縮合環ヘテロ芳香族基が含まれる。
9員縮合環二環式ヘテロアリール基の例は、ベンゾフラニル、ベンゾチオフェニル、インドリル、ベンズイミダゾリル、インダゾリル、ベンゾトリアゾリル、ピロロ[2,3−b]ピリジニル、ピロロ[2,3−c]ピリジニル、ピロロ[3,2−c]ピリジニル、ピロロ[3,2−b]ピリジニル、イミダゾ[4,5−b]ピリジニル、イミダゾ[4,5−c]ピリジニル、ピラゾロ[4,3−d]ピリジニル、ピラゾロ[4,3−c]ピリジニル、ピラゾロ[3,4−c]ピリジニル、ピラゾロ[3,4−b]ピリジニル、イソインドリル、インダゾリル、プリニル、インドリニニル、イミダゾ[1,2−a]ピリジニル、イミダゾ[1,5−a]ピリジニル、ピラゾロ[1,2−a]ピリジニル、ピロロ[1,2−b]ピリダジニルおよびイミダゾ[1,2−c]ピリミジニルである。
10員二環式ヘテロアリール基は、= N−原子である1〜3個の環員を含有することができる(10個の環員の残りは炭素原子である)。
10員縮合環二環式ヘテロアリール基の例は、キノリニル、イソキノリニル、シンノリニル、キナゾリニル、キノキサリニル、フタラジニル、1,6−ナフチリジニル、1,7−ナフチリジニル、1,8−ナフチリジニル、1,5−ナフチリジニル、2,6−ナフチリジニル、2,7−ナフチリジニル、ピリド[3,2−d]ピリミジニル、ピリド[4,3−d]ピリミジニル、ピリド[3,4−d]ピリミジニル、ピリド[2,3−d]ピリミジニル、ピリド[2,3−b]ピラジニル、ピリド[3,4−b]ピラジニル、ピリミド[5,4−d]ピリミジニル、ピラジノ[2,3−b]ピラジニルおよびピリミド[4,5−d]ピリミジニルである。
アシル基の例には、アルキル−C(=O)−、シクロアルキル−C(=O)−、アルケニル−C(=O)−、シクロアルケニル−C(=O)−、ヘテロアルキル−C(=O)−、ヘテロシクロアルキル−C(=O)−、アリール−C(=O)−またはヘテロアリール−C(=O)−、特にアルキル−C(=O)−およびアリール−C(=O)−が含まれる。
特に明記しない限り、基の組み合わせは、本明細書では1つの部分、例えば、アリールアルキルと呼ばれ、最後に言及した基は、その部分が分子の残りに取り付けられた原子を含有している。
アルキル基または他の基の炭素原子がO、S(O)t、またはNで置き換えられている場合、その意味は次のとおりである:
−CH=は−N=に置き換えられる。
≡C−Hは≡Nに置き換えられる。または
−CH2−は−O−、−S(O)t、または−NRN−に置き換えられる。
上記の場合、RNはH、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、−C(O)−アルキル、−C(O)−アリール、−C(O)−ヘテロアリール、−S(O)t−アルキル、−S(O)t−アリールまたは−S(O)t−ヘテロアリールである。RNは、特に、H、アルキル(例えば、C1−6アルキル)またはシクロアルキル(例えば、C3−6シクロアルキル)であり得る。
上記の場合、tは独立して0、1または2、たとえば2である。通常、tは0である。
任意に置換された基(例えば、アルキル、シクロアルキル、アルコキシ、アルケニル、シクロアルケニル、アルキニル、アルキレン、アルケニレン、ヘテロアルキル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロアルケニル、ヘテロシクロアルケニル、ヘテロアルキニル、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニレン、アリール、アリールアルキル、アリールヘテロアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキルまたはヘテロアリールヘテロアルキル基など)は、置換または非置換であってもよく、または非置換であってもよい。通常、置換には、水素原子、または=0による置換の場合は、2つの水素原子の置換基による概念上の置換が含まれる。
置換される場合、一般に1〜3個の置換基、または1個または2個の置換基、または1個の置換基がある。
Zuは独立してO、S、NHまたはN(C1−6アルキル)である。
別の実施態様において、任意の置換基は、独立して、ハロゲン、−NO2、−CN、−CO2H、=O、−N(C1−6アルキル)2、−C1−6アルキル、−C3−6シクロアルキルまたは−C3−6ヘテロシクロアルキルである。
別の実施態様において、任意の置換基は、独立して、ハロゲン、−OH、NH2、NH(C1−6アルキル)、−N(C1−6アルキル)2、−C1−6アルキル、−C3−6シクロアルキルまたは−C3−6ヘテロシクロアルキルである。
「薬学的に許容し得る誘導体」という用語は、式Iのポリマーの薬学的に許容し得る塩、溶媒和物、水和物またはプロドラッグを含む。薬学的に許容し得る誘導体は、式Iのポリマーの薬学的に許容し得る塩、溶媒和物または水和物を適切にはいう。
塩基性基、例えばアミノ基を含む式Iのポリマーは、酸と薬学的に許容し得る塩を形成することができる。式Iのポリマーの薬学的に許容し得る酸付加塩には、ハロゲン化水素酸(例えば、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸)、硫酸、硝酸、リン酸などの無機酸の塩が含まれるが、これらに限定されない。式Iのポリマーの薬学的に許容し得る酸付加塩には、これらに限定されないが、有機酸の脂肪族、芳香族、カルボン酸およびスルホン酸類などの有機酸の塩が含まれてもよく、該有機酸の例には、ギ酸、酢酸、プロピオン酸または酪酸などの脂肪族モノカルボン酸;乳酸、クエン酸、酒石酸またはリンゴ酸などの脂肪族ヒドロキシ酸;マレイン酸またはコハク酸などのジカルボン酸;安息香酸、p−クロロ安息香酸、フェニル酢酸、ジフェニル酢酸、またはトリフェニル酢酸などの芳香族カルボン酸;o−ヒドロキシ安息香酸、p−ヒドロキシ安息香酸、1−ヒドロキシナフタレン−2−カルボン酸または3−ヒドロキシナフタレン−2−カルボン酸などの芳香族ヒドロキシル酸;メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、またはベンゼンスルホン酸などのスルホン酸が含まれる。式Iのポリマーの他の薬学的に許容し得る酸付加塩には、グリコール酸、グルクロン酸、フロン酸、グルタミン酸、アントラニル酸、サリチル酸、マンデル酸、エンボニック(パモ)酸、パントテン酸、ステアリン酸、スルファニル酸、アルゲン酸およびガラクツロン酸が含まれるが、これらに限定されない。式Iのポリマーが複数の塩基性基を含む場合、複数の塩、例えば式Iの化合物のジ−またはトリ塩を提供するために、複数の中心をプロトン化することができる。例えば、本明細書に記載される式Iのポリマーのハロゲン化水素酸塩は、モノヒドロハライド、ジヒドロハライドまたはトリヒドロハライドなどであり得る。塩には、これらに限定されないが、上に開示された酸のいずれかの添加から生じるものが含まれる。式Iのポリマーの一実施態様において、2つの塩基性基が酸付加塩を形成する。さらなる実施態様において、2つの付加塩対イオンは同じ種であり、例えば、ジヒドロクロリド、ジヒドロスルフィドなどである。典型的には、薬学的に許容し得る塩は、ジヒドロクロリドなどの塩化水素塩である。
酸と塩基の半塩、例えばヘミ硫酸塩も形成される場合がある。
薬学的に許容し得る塩のレビューについては、Stahl and Wermuth著、Handbook of Pharmaceutical Salts:Properties, Selection and Use (Wiley-VCH, Weinheim, Germany, 2002)を参照されたい。
ポリマーは、無定形から結晶形までの固体状態で存在し得る。そのような固体形態はすべて本発明に含まれる。
11C、18F、15O、13Nなどの陽電子放出同位体による置換は、基質受容体の占有率を調べるための陽電子放出トポグラフィー(PET)研究で役立つことができる。
ウイルスベースの治療薬は、治療での使用に適した任意のウイルスベクターであり得る。いくつかの実施態様において、ウイルスベースの治療薬は、全身性ウイルス遺伝子治療での使用に適している。いくつかの実施態様において、ウイルスベースの治療薬は腫瘍溶解性ウイルスベクターである。いくつかの実施態様において、ウイルスベースの治療薬はワクチンである。
ウイルスベースの治療薬は、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクター、またはレンチウイルスベクターなどのレトロウイルスベクターであり得る。いくつかの実施態様において、ウイルスベースの治療薬は、アデノウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルスベクター(AAV)である。いくつかの実施態様において、ウイルスベースの治療薬はアデノウイルスベクターである。いくつかの実施態様において、ウイルスベースの治療薬はアデノ随伴ウイルスベクターである。いくつかの実施態様において、ウイルスベースの治療薬は、レンチウイルスベクターなどのレトロウイルスベクターである。
いくつかの実施態様において、ウイルスベースの治療薬は、単純ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、水疱性口内炎ウイルスベクター、レオウイルスベクターおよびセムリキ森林ウイルスベクターから選択される。いくつかの実施態様において、ウイルスベースの治療薬は、単純ヘルペスウイルスベクターである。いくつかの実施態様において、ウイルスベースの治療薬はワクシニアウイルスベクターである。
好ましくは、ウイルスベースの治療薬はアデノウイルスベクターである。いくつかの実施態様において、ウイルスベースの治療薬は、AdNuPARmE1AおよびAduPARmE1Aを含む腫瘍溶解性アデノウイルスベクターである。いくつかの実施態様において、ウイルスベースの治療薬はAdNuPARmE1Aである。いくつかの実施態様において、ウイルスベースの治療薬はAduPARmE1Aである。
一実施態様において、ウイルスベースの治療剤の表面は、式Iのポリマーへの結合に適した結合部位を含み、ここで、そのオリゴペプチドまたは各オリゴペプチドはpH7で正味の正電荷を有する。一般に、ウイルスベースの治療薬の表面は負に帯電しており、式Iの正に帯電したポリマーと相互作用する。
別の実施態様において、ウイルスベースの治療薬の表面は、式Iのポリマーへの結合に適した結合部位を含み、ここで、そのオリゴペプチドまたは各オリゴペプチドはpH7で正味の負電荷を有する。
(i)中和抗体に対するウイルスベースの治療薬のマスキング能力;
(ii)ウイルスベースの治療薬による適応免疫応答の活性化の低下;
(iii)ウイルスベースの治療薬の血液循環時間の増加;
(iv)ウイルスベースの治療薬の肝臓親和性の減少;そして
(v)ウイルスベースの治療薬の腫瘍親和性の増加。
これらの特性の組合せ効果は、本発明の複合体により、既存の従来の使用レジメンよりもはるかに高い(例えば、少なくとも約10〜20倍大きい)ウイルスベースの治療薬の投与量を可能にすることである。
コーティングされたウイルスベースの治療薬
本発明は、本発明の側面のいずれかに従って、本明細書で定義される式Iのポリマーを含むか、またはそれからなるポリマー材料でコーティングされた、本明細書に記載のウイルスベースの治療薬を提供する。
いくつかの実施態様において、本発明は、少なくとも1つのポリマーが式IのPAG化またはPEG化ポリマーであり、および少なくとも1つのポリマーは、PAGまたはPEG部分を含まない、式Iの2つ以上の異なるポリマーの組み合わせでコーティングされた、本明細書に記載のウイルスベースの治療薬を提供する。
いくつかの実施態様において、本発明は、(i)R3C−C6−CR3(以下の実施例3Aを参照)および(ii)R3C−C6−CR3−PEG(下記の実施例5Aを参照)の組み合わせでコーティングされたウイルスベースの治療薬を提供し、好ましくは、ここで、ポリマー(i)および(ii)が65:35の比率で存在する。
いくつかの実施態様において、本発明は、本明細書で定義される式Iの1つ以上のポリマーを含むかまたはそれからなるポリマー材料でコーティングされた本明細書に記載のウイルスベースの治療薬を提供し、コーティングされたウイルスベースの治療薬はSAG−101以外である。
いくつかの実施態様において、本発明は、本明細書で定義される式Iの1つ以上のポリマーを含むか、またはそれからなるポリマー材料でコーティングされた本明細書に記載のウイルスベースの治療薬を提供し、ウイルスベースの治療薬は、単純ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルスベクター、水疱性口内炎ウイルスベクター、レオウイルスベクター、またはセムリキ森林ウイルスベクターである。
組成物は、式Iのポリマー材料でコーティングされたウイルスベースの治療薬を含有するナノ粒子および/または微粒子を含んでもよい。組成物は、式Iで定義される2つ以上の異なるポリマーを含んでもよい。例えば、組成物は、R1およびR2が両方ともCysLysLysLysである式Iのポリマーと、R1およびR2が両方ともCysHisHisHisである式Iのポリマーを含む。組成物は、R1およびR2が両方ともCysArgArgArgであり、ポリアルキレングリコール部分が存在しない式Iの第1のポリマーを、R1およびR2が両方ともCysArgArgArgであり、ポリアルキレングリコール部分が存在する式Iの第2のポリマー、例えば、R3C−C6−CR3−PEGまたはR3C−C6−CR3−連結PEGと組み合わせて含んでもよい。
本発明は、ナノ粒子に関して主に以下に議論される。議論は微粒子にも等しく適用されることが理解されるであろう。
(a)そのオリゴペプチドまたは各オリゴペプチドがpH7で正味の正電荷を有する式Iによるポリマー、および
(b)そのオリゴペプチドまたは各オリゴペプチドがpH7で正味の負電荷を有する式Iによるポリマー。
したがって、本発明は、上記のポリマー(a)および(b)の比率を変更することにより変化させることができる正味の表面電荷をナノ粒子に提供する。(a)と(b)の比率は、重量で1:99、5:95、10:90、25:75、50:50、75:25、90:10、95:5、または99:1になり得る。
そのようなナノ粒子は、ウイルスベースの治療薬のカプセル化に適しており、改善された薬理学的特性を示す。
さらに、pH7で正味の負電荷を持つオリゴペプチドで修飾されたポリマーを含めると、以下の身体的障壁との相互作用中に正味の表面電荷の変化が変化する可能性があるため、腸および肺粘膜などの複雑な身体的障壁を介したナノ粒子の送達が促進され得る。
本明細書において、活性剤のカプセル化効率とは、ウイルスベースの治療薬含有ナノ粒子の調製方法で使用される総活性剤の重量パーセントとしてのナノ粒子に組み込まれたウイルスベースの治療薬を言う。それは、通常は最大95%までで、より一般的には70%〜95%である。
本明細書において、「生体適合性」という用語は、有害な反応を引き起こすことなく生体に挿入または注入され得る物質として説明される。例えば、適切に制御できない炎症や免疫系による急性拒絶を引き起こさない。「生体適合性」は相対的な用語であり、生体組織と非常に適合性のある物質であってもある程度の免疫応答が期待されることが認識される。物質の生体適合性を評価するための生体外試験は、物質を細胞に曝露することである。生体適合性物質は、通常、中程度の濃度(たとえば、29μg/104細胞)で著しい細胞死(たとえば、>20%)を引き起こさない。
好ましくは、ナノ粒子の直径は約10から1000nm未満、より好ましくは約5から約500nm、より好ましくは約50から約400nm、より好ましくは約50から約150nmである。あるいは、ナノ粒子の直径は約1から約100nmである。一実施態様において、ナノ粒子は、10%未満、好ましくは5%未満、好ましくは1%未満の凝集度を示し、好ましくは、ナノ粒子は、透過型電子顕微鏡により測定されるように、実質的に非凝集である。
式Iのポリマーを合成する方法は、式IIの化合物(L3は上で定義したとおり)を式L4H2の化合物(L4は上で定義したとおり)と反応させて、以下に示される式IIのポリマーを生成するステップを含む。
式中、Raは上記で定義されたリストから各出現で独立して選択され、pは上記で定義されたとおりである。
式IIIの化合物にオリゴペプチドを取り付けるさらなる方法が、式IIIの末端アクリレート基での反応に適切な求核試薬を知っている当業者に利用可能であることが認識されるであろう。
本発明のさらなる側面によれば、全身性ウイルス遺伝子治療で使用するための本明細書で定義される複合体または組成物が提供されている。
本発明のさらなる側面によれば、がんの処置に使用するための本明細書で定義される複合体または組成物が提供されている。いくつかの実施態様において、がんは肝臓がんである。いくつかの実施態様において、がんは膵臓がんである。
ポリ(β−アミノエステル)は、文献に記載されている二段階の手順に従って合成された(例えば、Montserrat, N. et al. J. Biol. Chem. 286, 12417-12428 (2011))。最初に、第一級アミンとジアクリレート(アミン:ジアクリレートのモル比1:1.2の付加反応)により、アクリレート末端ポリマーを合成した。最後に、得られたアクリレート末端ポリマーを異なる種類のアミンおよびチオール含有部分でエンドキャッピング修飾することにより、PBAEが得られた。合成された構造は、1H−NMRおよびFT−IR分析により確認された。NMRスペクトルは400MHz Varian(Varian NMR Instruments, Claredon Hills, IL)で記録し、メタノール−d4を溶媒として使用した。IRスペクトルは、蒸着膜における溶媒としてメタノールを使用し、KBrビームスプリッターを備えたNicolet Magna 560(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)を使用して得られた。2つのGPC Ultrastyragelカラム、103および104A(5μm混合、300 mm x 19 mm、Waters Millipore Corporation, Milford, MA, US)およびTHFを移動相として装備したHewlett−Packard 1050シリーズHPLCシステムで分子量測定を実施した。分子量は、ポリスチレン標準の保持時間と比較して計算した。
1,4−ブタンジオールジアクリレート(8.96g、4.07x10−2mol)と5−アミノ−1−ペンタノール(3.5g、3.39x10−2mol)をバイアル中で混合した。混合物を90℃で24時間撹拌し、次いで、室温まで冷却し、わずかに黄色の粘性固体のアクリル酸エステル末端中間体を形成した(C32と命名)。中間体のC32は、後続の段階で使用する前に4℃にて保存した。
1H-NMR(CDCI3):6.40(dd、2H、J 17.3、1.5 Hz)、6.11(dd、2H、J 17.3、10.4 Hz)、5.82(dd、2H、J 10.4、1.5 Hz)、4.18(m、4H) 、4.08(m、32H)、3.61(m、16H)、2.76(m、32H、J 7.2 Hz)、2.41(m、48H)、1.69(m、32H)、1.56(m、8H )、1.49〜1.20(m、40H)および0.87(t、12H、J 6.9 Hz)ppm。
4−アミノ−1−ブタノールまたは5−アミノ−1−ペンタノールを、ヘキサン−1,6−ジイルジアクリレートとジスルファンジイルビス(エタン−2,1−ジイル)ジアクリレートの等モル混合物と重合させて、ジスルフィド結合を特徴とするアクリレート末端中間体を形成した。
一般に、オリゴペプチド修飾PBAEは、次のようにして得られた:アクリレート末端ポリマーC32またはC32SSおよびアミンまたはチオール末端オリゴペプチド(例えば、HS−Cys−Arg−Arg−Arg(CR3)、H2N−Arg−Arg−Arg(R3)またはHS−Cys−Glu−Glu−Glu(CE3)−他のオリゴペプチドは、標準の1文字コードを使用した同様の略語で示されている)をDMSO中1:2のモル比で混合した。混合物を室温で一晩撹拌し、ジエチルエーテル:アセトン(3:1)中で沈殿させることにより、生成ポリマーを得た。
1H-NMR (400 MHz, CD3OD, TMS) (ppm): δ = 4.41-4.33 (br, NH2-C(=O)-CH-NH-C(=O)-CH-NH-C(=O)-CH-NH-C(=O)-CH-CH2-, 4.11 (t, CH2-CH 2-O), 3.55 (t, CH2-CH 2-OH), 3.22 (br, NH2-C(=NH)-NH-CH 2-, OH-(CH2)4-CH 2-N-), 3.04 (t, CH2-CH 2-N-), 2.82 (dd, -CH 2-S-CH 2), 2.48 (br, -N-CH2-CH 2-C(=O)-O), 1.90 (m, NH2-C(=NH)-NH-(CH2)2-CH 2-CH-), 1.73 (br, -O-CH2-CH2-CH2-CH2-O), 1.69 (m, NH2-C(=NH)-NH-CH2-CH 2-CH2-), 1.56 (br, -CH 2-CH2-CH 2-CH2-OH), 1.39 (br, -N-(CH2)2-CH 2-(CH2)2-OH).
IR (蒸着フィルム): ν = 721, 799, 834, 1040, 1132, 1179 (C-O), 1201, 1397, 1459, 1541, 1675 (C=O, ペプチドアミドより), 1732 (C=O, エステルより), 2861, 2940, 3348 (N-H, O-H) cm-1
1H-NMR (400 MHz, CD3OD, TMS) (ppm): δ = 4.38-4.29 (br, NH2-(CH2) 4-CH-), 4.13 (t, CH2-CH 2-O-),3.73 (br,NH2-CH-CH2-S-), 3.55 (t, CH2-CH 2-OH), 2.94 (br, CH2-CH 2-N-, NH2-CH 2-(CH2)3-CH-), 2.81 (dd, -CH 2-S-CH 2), 2.57 (br, -N-CH2-CH 2-C(=O)-O), 1.85 (m, NH2-(CH2)3-CH 2-CH-), 1.74 (br, -O-CH2-CH2-CH2-CH2-O), 1.68 (m, NH2-CH2-CH 2-(CH2) 2-CH-), 1.54 (br, -CH 2-CH2-CH 2-CH2-OH), 1.37 (br, -N-(CH2)2-CH 2-(CH2)2-OH).
IR(蒸着フィルム):ν = 720, 799, 832, 1040, 1132, 1201 , 1335, 1403, 1467, 1539, 1674 (C=O, ペプチドアミドより), 1731 (C=O, エステルより, 2865, 2941 , 3336 (N-H, O-H) cm 1
1H-NMR (400 MHz, CD3OD, TMS) (ppm): δ = 8.0-7.0 (br -N(=CH)-NH-C(=CH)-) 4.61 -4.36 (br, -CH2-CH-), 4.16 (t, CH2-CH2-O-), 3.55 (t, CH2-CH2-OH), 3.18 (t, CH2-CH2-N-, 3.06 (dd, -CH2-CH-), 2.88 (br, OH-(CH2)4-CH2-N-), 2.82 (dd, -CH2-S-CH2-), 2.72 (br, -N-CH2-CH2-C(=O)-O), 1 .75 (br, -0-CH2-CH2-CH2-CH2-O), 1 .65 (m, NH2-CH2-CH2-(CH2)2-CH-), 1 .58 (br, -CH2-CH2-CH2-CH2-OH), 1 .40 (br, -N-(CH2)2-CH2-(CH2)2-OH).
丸底フラスコで、ジメチルスルホキシド(1.1mL)にPBAE C6(113mg、0.054mmol)を溶かした溶液とジメチルスルホキシド(1mL)中のCRRRペプチド水和物(99mg、0.13mmol)溶液を混合した。反応物を窒素下室温で24時間撹拌した。反応混合物をジエチルエーテル−アセトン(7:3)上に加え、白色沈殿物を得た。懸濁液を4000rpmで10分間遠心分離し、溶媒を除去した。固体をジエチルエーテル−アセトン(7:3)で2回洗浄し、真空下で乾燥させて、白色の固体(233mg)を得た。生成物をNMR(MeOD)で分析し、構造は一致していた。
−ペプチドCHHHを含むPBAE H3C−C6−CH3。
−ペプチドCKKKを含むPBAE K3C−C6−CK3。
−ペプチドCDDDを含むPBAE D3C−C6−CD3。
−ペプチドCEEEを含むPBAE E3C−C6−CE3。
PBAE R3C−C6−CR3の合成に関する上記の手順は、PBAEで使用し得る。
以下の合成用C32:
−ペプチドCRRRを持つPBAE R3C−C32−CR3。
−ペプチドCHHHを持つPBAE H3C−C32−CH3。
−ペプチドCKKKを持つPBAE K3C−C32−CK3。
−ペプチドCDDDを持つPBAE D3C−C32−CD3。
−ペプチドCEEEを持つPBAE E3C−C32−CE3。
一般に、非対称オリゴペプチド修飾PBAEは次のようにして得られた。アクリレート末端ポリマーC32(またはC32SS)およびアミン末端またはチオール末端オリゴペプチド(例えば、CR3、R3、CE3)をDMSO中でモル比1:1で混合した。混合物を室温で一晩撹拌した。等モル量の第2アミンまたはチオール末端オリゴペプチド、または第1アミンを添加し、混合物を室温で一晩撹拌した。生成した非対称PBAEポリマーは、ジエチルエーテル/アセトン(3:1)における沈殿により得られた。
非対称末端修飾B3−C32−CR3 PBAEを得るための以下の合成手順を例として示す:DMSO(2mL)中の中間体C32(0.15g、0.075mmol)の溶液をDMSO(1ml)中のオリゴペプチドCys−Arg−Arg−Arg(CR3; 0.055g、0.075mmol)の対応する溶液と混合し、室温で一晩攪拌した。続いて、2−メチル−1,5−ペンタンジアミン(0.017g、0.02ml、0.15mmol)を、DMSO中、室温で4時間混合物に加えた。非対称末端修飾ポリマーB3−C32−CR3とB3−C32−B3およびR3C−C32−CR3の混合物は、ジエチルエーテル/アセトン(3:1)で一晩沈殿させることにより得られた。非対称末端修飾ポリマーB3−C32−CR3は、標準的な方法で混合物から分離し得る。
ステップ1:MeO−PEG−COOHの合成
MeO−PEG(5g、Mw=2000、2.5mmol)および無水コハク酸(0.275g、2.75mmol)のジクロロメタン(5mL)溶液に、トリエチルアミン(0.174mL、1.25mmol)を加えた。反応混合物を室温で4時間撹拌し、1M HCl(1ml)で2回洗浄した。有機相をブラインで2回洗浄し、MgSO4で乾燥させた。固体を濾別し、溶媒を真空下で蒸発させて、白色固体(4.47g)を得た。生成物をNMR(CDCl3)で分析し、構造は一致していた。
5−アミノ−1−ペンタノール(0.525g、5.1mmol)およびトリエチルアミン(0.779mL、5.6mmol)のジクロロメタン(16mL)溶液に、二炭酸ジ−tert−ブチル(1.1g、5.1mmol)のジクロロメタン(5mL)溶液を加えた。混合物を室温で1時間撹拌した後、0.5M HCl(1ml)で3回洗浄した。有機相をMgSO4で乾燥させた。固体を濾別し、溶媒を真空下で蒸発させて、白色の固体(1.3g)を得た。生成物をNMR(CDCl3)で分析し、構造は一致していた。
MeO−PEG−COOH(1g、0.49mmol)のジクロロメタン(14mL)溶液に、ジシクロヘキシルカルボジイミド(151mg、0.74mmol)およびN,N‘−ジメチルアミノピリジン(9mg、0.074mmol)を加えた。5分後、ジクロロメタン(1mL)中のN−boc 5−アミノ−1−ペンタノール(100mg、0.49mmol)の溶液を混合物に加えた。反応混合物を室温で6時間撹拌し、次いで固体を濾別した。溶媒を真空下で蒸発させ、残留物をジエチルエーテル(5mL)で3回洗浄した。生成物を真空下で乾燥させて、白色固体(0.940g)を得た。化合物をNMR(CDCl3)で分析したところ、構造は予想される構造と一致していた。
MeO−PEG−NHBoc(464mg、0.21mmol)のジクロロメタン(3mL)溶液に、0℃でトリフルオロ酢酸(1.2mL)を加えた。反応混合物を0℃で10分間撹拌した後、室温で2時間撹拌した。溶媒を真空下で減少させ、残渣をジエチルエーテル(5mL)で2回洗浄した。生成物をジクロロメタン(8mL)に溶解し、0.5M NaOH(1ml)で2回洗浄した。有機相をブラインで洗浄し、MgSO4で乾燥させた。固体を濾別し、溶媒を真空下で蒸発させて、白色固体を得た(319mg)。生成物をNMR(CDCl3)で分析し、構造は予想される構造と一致していた。
丸底フラスコ中で、PBAE C6−PEG(92mg、0.022mmol)のジメチルスルホキシド(1.2mL)溶液とペプチドCRRRクロルハイドレート(40mg、0.054mmol)のジメチルスルホキシド(1.1mL)溶液を混合した。反応物を窒素下室温で20時間撹拌した。反応混合物をジエチルエーテル−アセトン(7:3)上に加え、白色沈殿物を得た。懸濁液を4000rpmで10分間遠心分離し、溶媒を除去した。固体をジエチルエーテル−アセトン(7:3)で2回洗浄し、真空下で乾燥させて、白色固体(133mg)を得た。生成物をNMR(MeOD)で分析し、構造は一致していた。
ステップ1:メトキシ化PEG酸の合成
1.メトキシ化PEG(5g、2.5mmol)を丸底フラスコに加える。
2.フラスコにジクロロメタン(5mL)を追加する。
3.無水コハク酸(0.275g、2.75mmol)を溶液に加える。
4.混合物にトリエチルアミン(0.174mL、1.25mmol)を添加する。
5.次に、混合物を室温で4時間攪拌する。
6.混合物の反応液を1M HCl(1ml)で2回洗浄する。
7.溶液をブラインで2回洗浄する。
8.有機相をMgSO4で乾燥させる。
9.固体をろ過し、真空下で溶媒を蒸発させる。
2.チューブにジクロロメタン(1.5mL)を添加する。
3.ジシクロヘキシルカルボジイミド(34mg、0.17mmol)を溶液に加える。
4.溶液を室温で20分間撹拌する。
5.C6 PBAE(200mg、0.099mmol)の溶液をジクロロメタン(1mL)に加える。
6.次に、混合物を室温で20時間撹拌する。
7.固体をろ過し、真空下で溶媒を蒸発させる。
2.−80℃にて溶液を凍結し、ペプチドを凍結乾燥させる。
3.C6−連結PEG PBAE(114mg、0.027mmol)のジメチルスルホキシド(0.8mL)溶液を調製する。
4.Cys−Arg−Arg−Arg(50mg、0.068mmol)のジメチルスルホキシド(0.8mL)溶液を調製する。
5.ねじタップチューブ中で2つの溶液を混合する。
6.混合溶液を室温で20時間撹拌する。
7.混合物を7:3のジエチルエーテル/アセトン(8mL)滴下する。
8.懸濁液を4000rpmで10分間遠心分離し、溶媒を除去します。
9.7:3のジエチルエーテル/アセトン(4mL)で固体を2回洗浄する。
10.真空下で製品を乾燥させる。
11.ジメチルスルホキシド中100mg/mLの製品の溶液を作る。
さまざまなオリゴペプチド末端修飾PBAEのライブラリーは、ジアクリレートに一級アミンを加えてから末端修飾することにより合成された。式Iに従って、表1に示されたオリゴペプチド末端修飾PBAEを合成した。
凝固カスケードは一般に3つの経路に分けられる。3つの凝固経路に対する本願に記載のポリマーの効果は、3つの代表的なパラメーターを測定することにより評価された。具体的には、内因性経路は活性化部分トロンボプラスチン時間によって測定され、外因性経路はプロトロンビン時間によって測定され、最終的な共有経路はトロンビン時間を測定することによって評価された。凝固因子の本発明に記載のポリマーとの結合または枯渇により凝固カスケードに誘発される可能性のある変化を評価して、血塊形成を形成するのに必要な時間を測定した。
図1に示すように、ポリマーは、試験したどの濃度でも凝固時間に有意な変化を誘発しなかった。凝固時間は、355μg/mL、213μg/mLおよび106.5μg/mLでのポリマーの暴露後、通常の限界内であった。ポリマーは、テストした最高濃度でプロトロンビン時間(PT)を短縮し、それは陰性対照に関して統計的に有意であった。
血小板の活性化には内皮細胞、白血球、その他の血小板の脱顆粒と活性化が伴い、最終的に血栓の形成を引き起こす。血小板は、一次止血に関与する小さな無核円盤状細胞である。それらの内部構造と膜は、血小板の活性化において中心的な役割を果たす。血小板活性化の最も信頼できるマーカーの1つはCD62Pである。これは、血小板に特異的なセレクチンタンパク質であり、静止血小板の内部α顆粒性膜に発現している。この受容体は、活性化された内皮細胞の表面上の血小板のテザリングと回転を媒介する。血小板の活性化と顆粒分泌により、α顆粒性膜は外部形質膜と融合し、CD62P抗原は活性化された血小板の表面に発現される。
構造
ノッチ応答遺伝子は、プロモーター領域のCSL転写因子を認識するDNA結合ドメインによって特徴付けられる。二重の「配列ペア」CSL結合部位(SPS)の存在は、頭と頭を向き、16ntで分離されていることにより、Notch転写複合体の二量体化が促進され、Hes1(Nam Y、Sliz P、Pear WS、Aster JC、Blacklow SC. 高次ノッチ複合体の協同的アセンブリは、転写を誘発するスイッチとして機能する。Proc Natl Acad Sci USA. 2007; 104:2103-2108)などのノッチ標的遺伝子の転写活性化に導く。
AdNuPARmE1Aは、ノッチシグナル伝達活性化(SPS)に応答する3つの配列で設計された合成プロモーターと、E1A発現を制御する最小uPARプロモーターを含有する。さらに、成長ホルモン境界領域(SINEB2)から214 bpの短い散在核要素B2は、uPARプロモーターの上流に挿入され、絶縁体配列として機能し、ITRウイルスプロモーターによるE1Aの如何なる可能な非特異的転写活性化をも回避し、それは腫瘍選択性を低下させる。E1Aアデノウイルス遺伝子の発現は、3xSPSuPARmプロモーターによって制御される。SINEB2絶縁体配列は、プロモーター配列の上流にクローニングされた(図3を参照)。
腫瘍溶解性アデノウイルスAdNuPARmE1Aは、最初に3xSPSuPARmプロモーターをpShuttleベクターにクローニングし、プロモーターの上流にSINEB2絶縁体を挿入してpShSINE3xSPSuPARmE1Aを生成することにより生成される。pShSINE3xSPSuPARmE1Aベクターのアデノウイルスゲノムとの相同組換えは、標準プロトコルに続いて行われ、pAdNuPARmE1Aを生成する。次に、組換えゲノムをHEK293細胞にトランスフェクトし、A549細胞で増幅し、標準塩化セシウムバンディング(Mato-Berciano A1、Raimondi G、Mariandi MV、Alemany R、Montoliu L、Fillat C. ノッチ感受性でuPAR−生成された腫瘍溶解性アデノウイルスは、膵臓腫瘍の成長を効果的に抑制し、ゲムシタビンおよびnab−パクリタキセルとの相乗的な抗癌効果を引き起こす。Oncotarget. 2017; 8(14) 22700-22715)によって精製される。
a)物理的粒子濃度(vp/ml)は光学密度の読み取り(OD260)によって測定される。
b)プラーク形成単位(pfu/ml)は、抗ヘキソン染色ベースの方法によってHEK293細胞で測定される。
E1A遺伝子発現がuPARプロモーターによって制御されている腫瘍溶解性AdNuPARmE1Aウイルスが生成された。コザック配列は、その複製能を高めるためにE1A遺伝子の上流で設計された(mRNA分子上のこの配列は、タンパク質がそのmRNA分子によってそこからコードされる、翻訳開始部位としてリボソームによって認識される)。エンハンサー抑制絶縁体活性を持つ筋強直性ジストロフィー遺伝子座(DM−1)からのDNA断片をuPARプロモーターの上流に導入して、アデノウイルスゲノムのエンハンサーおよび転写ユニットから分離した(図4を参照)。
AdNuPARmE1Aには、構造は同じであるが、uPARプロモーターの短いバージョン、およびノッチ細胞内ドメイン(NICD)に結合できる3つの応答要素を有する(図2を参照)。
複合体を準備する前の考慮事項
ウイルスストックはvp/mlおよびpfu/mlで滴定する必要があり、vp/pfu間の比率は100未満でなければならない。この品質許容基準に達していない場合、ウイルス産生を繰り返す必要がある。この手順を進める前に、物理的なVp/ml力価を確認する必要がある。
使用される主な製剤は、比率が65/35のR3C−C6−CR3/R3C−C6−CR3−PEGであるが、このプロトコルは他の製剤を使用する際に適合させることができる。唯一必要なのは、4e6分子PBAE/vpの比率を維持することである。
1.−80℃フリーザーから2μlのウイルスアリコートを取る(アデノウイルスベクターの凍結融解プロセスは、感染効率を失うため推奨されない。このため、ウイルスを産生する場合は、使用する分画のみを解凍するために、少量のアリコートに分割することを強く推奨する)。ウイルスは氷上で非常にゆっくり解凍する必要がある。
2.両方のポリマーを解凍し、65/35 v/vで混合物を調製する。ポリマー混合物は−20℃で保存できる。
3.インビトロで使用する被覆ウイルスを調製する場合、2μlのアリコート全体が被覆される。PBS(2μlのウイルス+98μl PBS)でウイルスストックの1/50希釈液を調製する。もたらされた溶液にはVSと標識される。
4.以下の式1に従ってVSのすべてのウイルス粒子をコーティングするために必要なポリマーの量(μl PBAEストック)を計算する。
6.PSをVSに追加し、少なくとも10回ゆっくりとピペッティングしてPSとVSを混合する。
7.サンプルを室温で30分間インキュベートして、ウイルスの負の表面電荷とポリマーの正の電荷間の静電相互作用を可能にする。
8.これで、得られた力価が100倍希釈されたことを考慮して、サンプルを使用する準備が整った。完全な培地で希釈して、目的の作業濃度に到達できる。
1.n0匹の動物(4匹ごとに1匹を超える動物を伴う)と投与量(通常、尾静脈からの100μlボーラス注射で4x1010vp/動物静脈内注射)を考慮して、必要な合計VPを計算する。
2.必要なウイルスストックの容量(Vstock)を計算して、0.9%の塩化ナトリウムの生理食塩水1mlの最終容量に4e11 VPs/mlの注射液を調製する。(注射液の濃度は、作業用量に依存する。この場合、4x1010VP/動物)
3.すべてのウイルス粒子をコーティングするのに必要なPBAEストック溶液の総容量を計算する。
5.0.9%の生理食塩水を計算された容量のウイルスストックと混合して、最終容量が200μlになるようにウイルス溶液(VS)を調製する。
6.PSをVSに追加し、少なくとも10回ゆっくりとピペッティングしてPSとVSを混合する。
7.サンプルを室温で30分間インキュベートして、ウイルスの負の表面電荷とポリマーの正の電荷間の静電相互作用を可能にする。
8.600μlの0.9%生理食塩水を加え、5回ゆっくりとピペッティングにて混合する。
9.サンプルを注入する準備ができた(たとえば、サンプルは8匹の動物を処理できる)。
抗腫瘍活性の結果(実施例16)を除くすべての非臨床データは、2つのレポーター遺伝子GFPとルシフェラーゼを発現するAdTrackluc(AdTL)と呼ばれる組換え血清型5アデノウイルスで得られた。さらに、in vivoの研究では、このウイルスは2つの異なるポリマーコーティングと組み合わされた。100%R3C−C6−CR3コーティングに対応するC6AdおよびCPEGAdは、65%R3C−C6−CR3と35%R3C−C6−CR3−PEGの組み合わせを表す。
抗Ad5中和抗体(Nabs)からアデノウイルスを保護するのに最適なポリマーの組み合わせを決定するために、ウイルス粒子をR3C−C6−CR3とH3C−C6−CH3およびR3C−C6−CR3−PEGポリマーの異なる組み合わせでコーティングし、次に、裸のサンプルと被覆されたサンプルをNabsと30分間インキュベートした。裸のアデノウイルスをサンプル対照として使用した。次に、ウイルス調製物(MOI 50)を、1.5x104個のPANC−1細胞を含有する96ウェルプレートに加えた。2時間後、培地を交換し、細胞を48時間インキュベートした。最後に、GPF陽性細胞をフローサイトメトリー分析により定量化した。
テストしたポリマーの組み合わせは次のとおりである。
裸の被覆されたウイルス粒子が、2回の静脈内投与後に適応免疫応答を活性化する方法も検討された。C57BL/6Jマウス(n=6)は3つのグループに分割された(裸のAd、R3C−C6−CR3 Ad、およびR3C−C6−CR3−35%PEG−Ad)。1x1010vp/動物を0および14日目にC57BL/6Jマウスの尾静脈に注射し(n=5)、1週間後の21日目に動物を屠殺し、心内穿刺により血液を採取した。次に、血清を抽出し、熱不活化し、裸のアデノウイルスの存在下で中和アッセイを行うために血清を使用した。
各サンプルの抗体濃度を比較するために、各抗血清の中和希釈50(ND50)を計算した。ウイルス形質導入の半分を中和するために必要な血清の希釈として定義されるND50は、次のように決定された。裸のAds(MOI 0.25)を、裸のまたはコーティングしたAdsで免疫されたマウスの血清の連続希釈液とともに96ウェルプレートで1時間インキュベートした。次に、1x105個のHEK293細胞を各ウェルに加えた。24時間後、ルシフェラーゼ活性を定量化し、ND50を計算した。
図8に示すように、CPEGAdを注射した動物は、裸のAdを注射した動物よりも3倍少ない中和血清を産生し、CPEGコーティング戦略(65%R3CーC6−CR3+35%R3C−C6−CR3−PEG)が、適応免疫応答の活性化を減少させたことを示した。C6Adの場合、この違いはそれほど顕著ではなかった。
裸のウイルス粒子と被覆されたウイルス粒子の血液循環動態を比較するために、CC57BL/6Jマウスの尾静脈に1x1010vp/動物を注射した(n=5)。裸のAd、C6Ad、CPEGAdの3つのグループが設立され、注射後の2つの時点、2分と10分で伏在静脈から血液サンプルが抽出された。次に、各血液サンプルからゲノムDNA抽出を実行し、qPCRによってヘキソン特異的プライマーを使用してウイルスゲノム/μlを定量した。
血液循環動態は以下のように決定された。各血液サンプルからゲノムDNAを抽出し、qPCRによりヘキソン特異的プライマーを使用してウイルスゲノムコピーを定量化した。100%の状態(注入された用量に相当)は、DNA抽出の前に投与された用量をマウスの全血2mlで希釈することにより分析された。曲線下の面積を2分から10分まで計算し、倍率変化を変換しました。
図9に示すように、被覆されたウイルス粒子、特にCPEGの組み合わせで被覆された粒子では、循環時間が改善されました。特に、2分から10分までの曲線下面積は、裸のウイルスアデノウイルスと比較して3倍大きかった。
アデノウイルスに関連する主な問題の1つは、肝臓に対する高い親和性であり、これが重大な肝毒性の原因となっている。本発明のポリマーコーティングがこの自然な挙動を減少させることができるかどうかを判定するために、1x1010vpの裸および被覆された(C6AdおよびCPEGAd)アデノウイルスをC57BL/6Jマウス(n=5)の尾静脈に投与し、5日後、全身生物発光画像を撮影し、裸のAdで処理したマウスまたは2つの異なるポリマー(C6Ad、CPEGAd)でコーティングしたマウスの肝臓ホモジネートからルシフェラーゼ活性を定量した。
図10が示すように、両方のタイプの被覆されたウイルス粒子は、肝細胞の形質導入能力を大幅に低下させ、ポリマーコーティングが実際に天然のアデノウイルス親和性を変更できることを示している。
被覆されたAdで観察された肝臓の親和性の減少が腫瘍を有するマウスでも起こるかどうかを決定するために、以下の検討が行われた。(ヒト膵臓腺癌に由来する)1×105PANC−1細胞を免疫不全のBalb/Cのnu/nuマウスに皮下投与し、腫瘍が約150mm3の体積に達した場合、裸のおよび被覆された(C6AdとCPEGAd)のアデノウイルスを1×1010vpだけ尾静脈に投与した(n=6)。注射の5日後、動物を屠殺し、ルシフェラーゼ活性(レポーター遺伝子として使用)を、裸のAdまたは2つの異なるポリマー(C6Ad、CPEGAd)のいずれかでコーティングしたAdで処理したマウスの腫瘍および肝臓ホモジネートから定量された。
図11に見られるように、以前に観察された肝臓での有意な形質導入の減少とは別に、AdがCPEGと名付けられたポリマーコーティングで被覆された場合、腫瘍の著しい感染症の増加が検出された。この傾向は、おそらく製剤にPEGが含まれていないため、C6Adでは観察されなかった。全体として、これらの結果は、裸のAdと比較してCPEGAdが投与されたとき、腫瘍−肝臓比の著しい増加に導いた。
2つの異なる被覆された組換えアデノウイルス(AdTL)、C6AdおよびCPEGAdで得られたデータによると、R3C−C6−CR3の65%+R3C−C6−CR3−PEGの35%からなる後者のコーティングが、SAG−101を形成するための腫瘍溶解性アデノウイルスAdNuPARmE1Aと組み合わすように選択された。
ウイルスの治療効果に対するポリマーコーティングの効果を検討するために、腫瘍を持つマウスでの有効性の検討が行われた。特に、全身投与後の被覆AdNuPARmE1A(SAG−101)の効力は、裸のまたは免疫前マウスのAdNuPARmE1Aのそれと比較された。ヌードマウスに予め免疫状態を生成するために、C57BL6マウスからの抗Ad中和血清の注射によってマウスを受動的に免疫化した(ヌードマウス担持皮下PANC−1腫瘍は、PBS(ナイーブな群)または抗Ad5中和マウス血清(免疫前群)のいずれかで腹腔内注射した)。翌日、ナイーブなまたは受動的に免疫化されたヌードマウス担持PANC−1腫瘍は、PBSまたは4×1010VPの裸のまたは被覆されたAdNuPARmE1A(SAG−101)で静脈内注射され(n=8)、そうして腫瘍体積をモニターした。図12は、AdNuPARmE1Aの治療効果に対するポリマーコーティングの効果を決定するために行われたこの実験のプロトコルをまとめたものである。各グループはn=8であった。
1.抗体によって中和される減少傾向;
2.デノボ適応免疫応答生成能力の低下;
3.血流動態の改善;そして
4.腫瘍の形質導入の利益に対して、肝臓親和性が減少する。
被覆されたAdNuPARmE1A(SAG−101)の毒性を研究するために、マウスでの毒性研究を行った。コーティングは、65%R3C−C6−CR3と35%R3C−C6−CR3−PEGの組み合わせを表すCPEGAdで構成されていた。静脈内投与後のSAG−101の用量を、免疫適格性BALB/cマウスにおける裸のAdNuPARmE1A(Ad)の用量と比較した。免疫適格マウスに、PBS、4x1010vpの裸またはコーティングAdNuPARmE1A(すなわち「低用量」)、または7.5x1010vpの裸またはコーティングAdNuPARmE1A(すなわち「高用量」)を静脈内注射した。
図15に示すように、高用量の裸AdNuPARmEI(Ad)を投与されたマウスは注射後5日目に重要な体重減少を示したが、体重の有意な変化(p>0.05)は群間で観察されなかった。高用量のSAG−101を投与されたグループは体重の減少を示し、低毒性が被覆されたウイルス粒子と関連していることを示している。
血清酵素トランスアミナーゼ活性は、ウイルスIV注射後7日目に決定された。具体的には、アスパラギン酸トランスアミナーゼ(AST)およびアラニントランスアミナーゼ(ALT)レベルは、心内穿刺から採取した血液から測定された。
アミノトランスフェラーゼ(AST、ALT)は一般に血清中で分析して、肝臓の損傷と肝臓のウイルス感染の可能性を評価および監視する。これらの酵素は、おそらく損傷した細胞からの漏出の結果として、多くの形態の肝疾患で上昇する。ALTは主に肝臓で見られるが、腎臓、心臓、筋肉、膵臓でも少量見られる。ASTは肝臓に存在するが、筋肉を含む他の組織にもかなりの量が存在する。
図16に示すように、トランスアミナーゼレベルは、高用量の裸のウイルス(AdNu)を投与した場合に有意に(* p<0.05)高く、肝臓の損傷を示している。この効果は、同じ用量のSAG−101を投与されたマウスでは観察されなかった。したがって、実験データは、被覆されたウイルス粒子がトランスアミナーゼレベルの低下をもたらすことを示している。
ヘモグラム分析と血小板数を実施した。血小板数は、1日目から7日目まで1日おきにマウスの尾静脈からの血液抽出に基づいていた。図17Bに示すように、裸のAdNuPARmE1A(Ad)または被覆されたAdNuPARmE1A(CPEGAd)を投与されたマウス間で、7日目にヘモグラムの有意な変化は検出されなかった。
さらに、図17Aに示すように、血小板減少症は観察されなかった。裸のAdNuPARmE1A(Ad)または被覆されたAdNuPARmE1A(SAG101)を投与されたマウスの血小板数に有意差はなかった。
サイトカインのレベルが測定された。注射後6時間と3日で、血液アリコートを収集し、Luminex xMAP(R)テクノロジープラットフォームを使用してサイトカイン濃度を評価した。
図18に示すように、裸のAdNuPARmE1AおよびSAG−101の投与後、サイトカインのレベルに有意な差は観察されず、SAG−101ポリマーがウイルスの毒性を増加させなかったことを示している。
図19Aは、低倍率(スケールバー20μm)でSAG−101を示すTEM顕微鏡写真を提供し、図19Bは、高倍率(スケールバー200nm)でSAG−101を示すTEM顕微鏡写真を提供する。図19Aおよび19Bに見られるように、低倍率でサンプルを分析したときに大きな凝集体は観察されなかった。
アデノ随伴ウイルス(AAV)粒子は、65%のR3C−C6−CR3 + 35%R3C−C6−CR3−PEGポリマーでコーティングされた。適切なコーティング濃度、すなわちAAVとポリマーの適切な比率を決定するために、表面電荷の変化を評価することにより、ポリマーコーティングの形成を追跡した。
AAVの表面は負に帯電している(図20Aおよび20Bに見られるように)が、使用したポリマーは正味の正電荷を提供した。したがって、ポリマーがウイルスを効果的に覆うと、複合体の表面電荷は正になった。したがって、この表面電荷の変化は、ポリマーコーティングの形成を追跡するために評価された。表面電荷の変化を追跡するために、さまざまな比率がテストされた。図20Bは、表面電荷測定のプラトーを示している。したがって、追加のポリマーの追加は非論理的であった。図20Aでは、表面電荷の漸進的な変化を確認するために、近接したポリマー/ウイルス比をテストした。
図20からわかるように、1e−9μg PBAE/AAVウイルス粒子(VP)以上の比率を使用した場合、正のZ電位値測定で示されるように、正の表面が観察され、それは、AAV粒子がコーティングされたことを示している。図20Bからわかるように、遊離ポリマーのZ電位値の測定値の変動は、AAVのコーティングを形成するときの値と比較して非常に高くなっている。
アデノ随伴ウイルス(AAV)粒子(「裸のAAV」)、100%R3C−C6−CR3コーティングに対応するC6Adで被覆されたAAV粒子、および65%R3C−C6−CR3と35%R3C−C6−CR3−PEGの組み合わせを表すCPEGAdで被覆されたAAB粒子は、図21に示すように、走査型電子顕微鏡で特徴付けされた。簡単に説明すると、各サンプル(裸のウイルスと被覆されたウイルス)200μlを1011vp/mlの最終濃度(最適な可視化を得るために必要な濃度)で調製した(他の例で説明)。サンプルをグリッドに置き、そこで1分間インキュベートした。次に、それらに40秒間金を照射して、それらの上に薄い層を作成した。最後に、それらを電界放出型走査電子顕微鏡で分析した。
Claims (29)
- 式Iのポリマー:
L3は、アルキレン、アルケニレン、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニレン、アリーレンまたはヘテロアリーレンからなる群から独立して選択され;または
L3の少なくとも1つの出現は
ここで、T1は
式中、LTは以下からなる群から独立して選択される:
L4は、
L5は、アルキレン、アルケニレン、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニレン、アリーレンまたはヘテロアリーレンからなる群から独立して選択され;
R1およびR2およびRT(存在する場合)は、オリゴペプチドおよびRyから独立して選択される;
式中、R1およびR2およびRT(存在する場合)の少なくとも1つはオリゴペプチドであり;
および、ここで、Ryは、水素、ハロゲン、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、シクロアルケニル、ヘテロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アシル、アリールまたはヘテロアリールからなる群から選択され;
各R3は、水素、ハロゲン、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、シクロアルケニル、ヘテロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アシル、アリール、ヘテロアリールおよびポリアルキレングリコールからなる群から独立して選択され、前記ポリアルキレングリコールはR3が取り付けられているか結合している窒素原子に直接結合されているか、リンカー部分を介してR3が取り付けられているか結合している窒素原子に結合し、ここで、前記リンカー部分は、アルキレン、シクロアルキレン、アルケニレン、シクロアルケニレン、ヘテロアルキレン、ヘテロシクロアルキレン、アリーレンまたはヘテロアリーレン基であり、そして
nは5〜1,000の整数である、
またはその薬学的に許容し得る塩と、ウイルスベースの治療薬との複合体。 - L3が、アルキレン、アルケニレン、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニレン、アリーレンまたはヘテロアリーレンからなる群から独立して選択される、請求項1に記載の複合体。
- L3の少なくとも1つの出現が、
ここで、T1は
式中、LTは以下からなる群から独立して選択される:
- 少なくとも1つのR3基がポリアルキレングリコール、好ましくはポリエチレングリコールである、請求項1〜3のいずれか一項に記載の複合体。
- 少なくとも1つのR3基がポリアルキレングリコールである場合、そのR3基はL4基の窒素原子に直接またはリンカー部分を介して結合している、請求項4に記載の複合体。
- 少なくとも1つのR3基がポリアルキレングリコールである場合、そのR3基は、アルキレン、アルケニレンまたはヘテロアルキレン基であるリンカー部分を介して取り付けられている窒素原子に結合している、請求項4または5に記載の複合体。
- 少なくとも1つのR3基がポリアルキレングリコールである場合、R3基はそれが取り付けられている窒素原子に直接結合している、請求項4または請求項5に記載の複合体。
- 前記オリゴペプチドまたは各オリゴペプチドが3〜20個のアミノ酸残基を含む、請求項1〜7のいずれか一項に記載の複合体。
- 前記オリゴペプチドまたは各オリゴペプチドがpH7で正味の正電荷を有する、請求項1〜8のいずれか一項に記載の複合体。
- 前記オリゴペプチドまたは各オリゴペプチドが、リジン、アルギニンおよびヒスチジンからなる群から選択されるアミノ酸残基を含む、請求項9に記載の複合体。
- 前記オリゴペプチドまたは各オリゴペプチドが式VII:
で表される化合物である、請求項1〜10のいずれか一項に記載の複合体。 - R1およびR2が両方ともオリゴペプチドである、請求項1〜11のいずれか一項に記載の複合体。
- R1およびR2が異なるオリゴペプチドである、請求項12に記載の複合体。
- R1およびR2の一方がオリゴペプチドであり、R1およびR2の一方がRyである、請求項1〜11のいずれか一項に記載の複合体。
- nが10〜700、または20〜500である、請求項1から14のいずれか一項に記載の複合体。
- Ryが、水素、−(CH2)mNH2、−(CH2)mNHMe、−(CH2)mOH、−(CH2)mCH3、(CH2)2(OCH2CH2)mNH2、−(CH2)2(OCH2CH2)mOHまたは−(CH2)2(OCH2CH2)mCH3(mは1〜20の整数))からなる群から選択される、請求項1〜15のいずれか一項に記載の複合体。
- 各L3は独立して−C1−10アルキレン−(S−S)qC1−10アルキレン(qは0または1)からなる群から選択される、請求項1〜16のいずれか一項に記載の複合体。
- 各R3は、独立して、水素、C1−6アルキル、C1−6アルケニル、C1−6アルキニル、C1−6ヒドロキシアルキル、ヒドロキシル、C1−6アルコキシ、ハロゲン、アリール、複素環、ヘテロアリール、シアノ、−O2C−C1−6アルキル、カルバモイル、−CO2H、−CO2−C1−6アルキル、C1−6アルキルチオエーテル、チオール、ウレイド、およびポリアルキレングリコール、ここで、前記ポリアルキレングリコールは、R3が取り付けられているか結合する窒素原子に直接結合するか、リンカー部分を介してR3が取り付けられているか結合する窒素原子に結合し、ここで、前記リンカー部分は、アルキレン、シクロアルキレン、アルケニレン、シクロアルケニレン、ヘテロアルキレン、ヘテロシクロアルキレン、アリーレンまたはヘテロアリーレン基から選択される、請求項1〜17のいずれか一項に記載の複合体。
- L4は、−N(R3)−から選択されるか、および/またはL3は、C1−6アルキレン基から選択される、請求項1〜18のいずれか一項に記載の複合体。
- 少なくとも1つのR3基がポリエチレングリコールである、請求項1〜19のいずれか一項に記載の複合体。
- 請求項1〜20のいずれか一項で定義される式Iのポリマーを含むかまたはそれからなるポリマー材料でコーティングされたウイルスベースの治療薬を含む組成物。
- 前記組成物が、請求項1〜20のいずれか一項で定義される式Iのポリマーを含むかまたはそれからなるポリマー材料でコーティングされたウイルスベースの治療薬を含有するナノ粒子を含む、請求項21に記載の組成物。
- 前記ウイルスベースの治療薬と前記ポリマーが非共有的に結合している、請求項1〜20のいずれか一項に記載の複合体、または請求項21または22に記載の組成物。
- 前記ウイルスベースの治療薬の表面が、式Iのポリマーへの結合に適した結合部位を含み、前記オリゴペプチドまたは各オリゴペプチドがpH7で正味の正電荷を持つ、請求項1〜20または23のいずれか一項に記載の複合体、または請求項21〜23のいずれか一項に記載の組成物。
- ウイルスベースの治療薬が、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、水疱性口内炎ウイルスベクター、レオウイルスベクター、またはセムリキ森林ウイルスベクターから選択される、請求項1〜20または23〜24のいずれか一項に記載の複合体、または請求項21〜24のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ウイルスベースの治療薬が、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、およびレンチウイルスベクターから選択され、好ましくは、前記ウイルスベースの治療薬がアデノウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルスベクターである、請求項25記載の複合体または組成物。
- 医薬品に使用するための、請求項1〜20または23〜26のいずれか一項に記載の複合体、または請求項21〜26のいずれか一項に記載の組成物。
- 全身性ウイルス遺伝子治療、特にがん、特に肝臓がんまたは膵臓がんの処置に使用するための、請求項1〜20または23〜26のいずれか一項に記載の複合体、または請求項21〜26のいずれか一項に記載の組成物。
- ナノ粒子を形成するために、ウイルスベースの治療薬と請求項1〜20のいずれか一項に記載の式Iの1つ以上のポリマーとの複合体をカプセル化する方法であって、ウイルスベースの治療薬を提供すること、式(I)のポリマーを提供すること、およびナノ粒子を形成するのに適した条件下で前記ウイルスベースの治療薬と前記ポリマーとを接触させることを含む前記方法。
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