KR20200035099A - 시아노박테리아 추출물, 이의 제조 방법 및 그 용도 - Google Patents

시아노박테리아 추출물, 이의 제조 방법 및 그 용도 Download PDF

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Abstract

본 개시는 엔테로바이러스 (EV), 호흡기 세포 융합 바이러스 (RSV), 인간 헤르페스바이러스 (HHV), 에볼라 바이러스, 돼지 유행성 설사 바이러스 (PEDV) 또는 돼지 생식기·호흡기 증후군 바이러스 (PRRSV)와 같은 광범위 스펙트럼의 바이러스에 대해 항바이러스 활성을 나타내는 다양한 시아노박테리아 추출물을 제공한다. 상기 시아노박테리아 추출물은 아트로스피라 막시마 (A. maxima) (또는 스피룰리나 막시마 (Spirulina maxima))의 바이오매스로부터 제조된다. 시아노박테리아 추출물의 제조 방법 및 시아노박테리아 추출물의 용도가 또한 본원에 개시된다.

Description

시아노박테리아 추출물, 이의 제조 방법 및 그 용도
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2017년 8월 30일자로 출원된 미국 가출원 제62/552,045호의 이점에 관한 것이고 이를 청구하며; 상기 출원의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
1. 발명의 분야
본 발명은 신규 시아노박테리아 추출물 (cyanobacterial extract), 이의 제조 방법 및 그 용도에 관한 것이다. 특히, 시아노박테리아 추출물은 엔테로바이러스 (EV), 호흡기 세포 융합 바이러스 (RSV), 인간 헤르페스바이러스 (HHV), 에볼라 바이러스, 돼지 유행성 설사 바이러스 (PEDV) 및 돼지 생식기·호흡기 증후군 바이러스 (PRRSV)와 같은 광범위 스펙트럼의 바이러스에 대해 항바이러스 활성을 나타낸다.
2. 관련 기술의 설명
시아노박테리아는 육지 및 담수, 기수 또는 해수에서 발견되는 미세 박테리아이다. 시아노박테리아는 산소성 광합성을 수행한다. 수생 시아노박테리아는 광합성적이기 때문에 보통 남조류로 불린다. 현재, 시아노박테리아 문으로 2,000 이상의 종이 기술되어 있다. 시아노박테리아는 항바이러스, 항박테리아, 항진균 및 항암 활성을 갖는 생물학적 활성 화합물의 풍부한 공급원으로 확인되었다. 시아노박테리아로부터 단리된 화합물은 폴리케타이드, 아미드, 알칼로이드, 지방산, 인돌 및 리포펩티드 그룹에 속한다. 원하는 치료 효과를 갖는 활성 추출물 분획 또는 화합물을 찾으려고 노력하고 있다.
스피룰리나 (Spirulina)는 아트로스피라 플라텐시스 (Arthrospira platensis) 및 아트로스피라 막시마 (A. maxima)의 건조 바이오매스로부터 제조된 식이 보충제를 지칭한다. 아트로스피라 막시마 (A. maxima) (또는 스피룰리나 막시마 (Spirulina maxima))는 알칼리성 염분 수역의 열대 또는 아열대 지역에서 발견된다. 예를 들어, 이것은 아프리카의 차드 호수와 멕시코의 텍스코코 호수에 흔하다. 이들 두 종은 한때 스피룰리나 (Spirulina) 속으로 분류되었다. 현재 분류 체계에 따르면 이들 두 계통에 대해 스피룰리나라는 이름은 부적절하고, 아트로스피라 플라텐시스와 아트로스피라 막시마는 아트로스피라 (Arthrospira) 속에 포함되는 것에 동의가 있지만, 구식 분류 체계가 오늘날에도 여전히 사용되고 있고, 그로부터 제조된 식이 보충제는 그의 대중적인 이름인 스피룰리나로 가장 자주 사용된다. 스피룰리나는 고대 아즈텍 시대부터 식량원으로 사용되어 오고 있다. 식이 보충제로 사용되는 경우 스피룰리나는 종종 단백질과 다당류가 풍부하고 B 비타민 및 식이 미네랄 (예: 철 및 망간)과 같은 수 많은 필수 영양소를 또한 함유하는 건조 분말로 제공된다.
엔테로바이러스 (EV)는 장을 통한 전달 경로에 의해 이름이 지어진 포지티브-센스 단일 가닥 RNA 바이러스의 속이다. EV는 최초에 그의 병인에 따라 폴리오바이러스, 콕사키 A 바이러스 (CA), 콕사키 B 바이러스 (CB) 및 에코바이러스로 분류되었다. 나중에 확인된 EV는 엔테로바이러스 뒤에 EV68, EV69, EV70, EV71과 같은 연속 번호가 붙어 명명되었다. 1998년 대만에서 인간 엔테로바이러스 71형 (EV71)이 처음 발생해 총 405건의 심각한 사례와 80건의 사망의 원인이 되었다. 중국에서, 2010년 EV71의 유행성 급증으로 170만 건 이상의 사례가 발생했으며 그 중 27,000명의 환자가 심각한 신경 합병증을 나타냈으며 905명이 사망하였다. EV71 감염은 손, 발 및 구강 질환 (HFMD)을 일으키는 것으로 알려져 있으며, 2011년부터 2014년까지 중국에서 수백만의 HFMD 사례가 보고되었다. 매년 EV71 감염으로 인해 중국에서 수백 명의 어린이가 사망하고 있다. 따라서, 관련 기술 분야에서 효과적인 백신 및 항-EV71 약물을 제공하는 것이 시급하다. 2014년 중국에서 3상의 임상 시험이 완료되었지만, 대만과 싱가포르에서는 각각 1상의 임상 시험만이 완료되었다. 백신 보호 효능은 EV71-유발성 HFMD에서 90% 이상, EV71-관련 질환에서 80% 이상이다. 그러나, EV71은 현재 4가지 유전자형 (A, B, C 및 D 유전자형)으로 분류되고 12개의 하위 유전자형으로 더 분류된다. 따라서, 다른 널리 퍼진 바이러스에 대한 단일 유전자형을 갖는 특정 균주로부터 유래된 EV71 백신의 종간 보호 효능은 불확실하다. 전술한 관점에서, EV71 예방 및 치료를 위한 광범위 스펙트럼의 항-EV71 또는 항-엔테로바이러스 약물이 중요하다.
호흡기 세포 융합 바이러스 (RSV)는 보통 가벼운 감기 유사 증상을 유발하는 일반적인 호흡기 바이러스이다. 미국에서는 영아의 60%가 첫 RSV 시즌에 감염되며 거의 모든 어린이가 2-3세까지 바이러스에 감염되게 될 것이다. RSV 감염자 중 2 내지 3%는 세기관지염으로 발달해 입원이 필요하다. RSV에 대한 새로운 백신의 개발에 대해 많은 연구가 진행되고 있지만 현재로서는 그에 대한 백신이 존재하지 않는다. 한편, RSV의 치료는 지원 조치에 제한되어 있다. 상업용 RSV 백신의 개발은 여전히 어려운 것으로 남아 있어 RSV 예방 및 치료를 위한 광범위한 항-RSV 약물이 중요하다.
인간 헤르페스바이러스 (HHV)는 인간을 감염시키는 DNA 바이러스이고, 단순 포진 바이러스 (HSV) 1 및 2 (HHV1 및 HHV2라고도 함), 수두 대상 포진 바이러스 (VZV 또는 HHV-3), 엡스타인-바 바이러스 (EBV 또는 HHV-4), 인간 거대 세포 바이러스 (HCMV 또는 HHV-5), 인간 헤르페스바이러스 6A 및 6B (HHV-6A 및 HHV-6B), 인간 헤르페스바이러스 7 (HHV-7) 및 카포시 육종 관련 헤르페스바이러스 (KSHV 또는 HHV-8)를 포함한다. 이 바이러스 그룹은 잠복성 및 재발성 감염이 특징이다. 일부 항바이러스 약물이 HHV 감염과 관련된 증상을 개선하는 것으로 알려져 있다; 그러나, 잠복 부위 (예를 들어, 뉴런, T 세포, B 세포 또는 단핵세포)로부터 HSV를 제거할 수 있는 약물은 없다.
에볼라 바이러스는 모노네가바이러스목 (Mononegavirales) 내로 분류된 필로바이러스과 (Filoviridae)에 속한다. 모노네가바이러스목의 바이러스 구성원은 선형, 비분절, 네거티브 센스, 단일 가닥 RNA 게놈으로 구성된 외피 바이러스이다. 에볼라 바이러스는 높은 사망률, 사람 간의 전파 가능성, 효과적인 백신 또는 항바이러스 요법이 없기 때문에, 생물 안전성 수준-4 (BSL-4) 병원체로 분류된다. 에볼라 백신의 포위 접종은 다소 효과적인 것으로 보이지만, 효능 정도가 불확실하다. 또한 아프리카 주변에서 돌아다니는 추가 에볼라 바이러스 균주가 있으며 바이러스 RNA 게놈의 유전자 돌연변이가 또한 효과적인 백신 개발을 더욱 어렵게 만든다. 따라서, 에볼라 감염을 치료 및/또는 예방하여 예상치 못한 응급 상황의 발생에 대비할 수 있도록 항에볼라 활성을 가지는 약제를 개발하는 것이 중요하다.
요약하면, 관련 기술에 바이러스 감염을 예방 및/또는 치료하기 위해 다양한 바이러스, 특히 엔테로바이러스, 호흡기 세포 융합 바이러스, 에볼라 바이러스, 돼지 유행성 설사 바이러스 및 돼지 생식기·호흡기 증후군 바이러스에 대한 광범위 스펙트럼의 항바이러스 약물에 대한 시급한 요구가 있다. 한편, 스피룰리나 추출물의 다양한 생물학적 또는 생리학적 특성이 일반적으로 보고되었거나 기술되어 있지만, 이들 바이러스에 대한 스피룰리나 추출물의 항바이러스 활성을 제안한 선행 증거는 없다.
발명의 요약
다음은 독자에게 기본적인 이해를 제공하기 위해 본 개시의 간략화된 요약을 제시한다. 이 요약은 본 개시의 포괄적인 개요가 아니며, 본 발명의 핵심/주요 요소를 식별하거나 본 발명의 범위를 정확하게 서술하지 않는다. 그것의 유일한 목적은 본원에 개시된 일부 개념을 이후에 제시되는 보다 상세한 설명에 대한 서두로서 간략화된 형태로 제시하기 위함이다.
제1 측면에서, 본 개시는 시아노박테리아 추출물, 특히 A. maxima로부터의 추출물 (이하, 아트로스피라 막시마 (A. maxima) 추출물 또는 AM 추출물로 약칭됨)에 관한 것이다. 본 AM 추출물은 전당 (total sugar)의 양의 증가 (특히 중성 및/또는 양으로 하전된 다당류)를 특징으로 하며, 이는 항바이러스 활성과 양의 상관 관계가 있다. 후술하는 바와 같이, 본 AM 추출물의 이러한 독특한 조성물은 광범위 바이러스에 대한 바람직한 항바이러스 활성으로 이어진다. 뿐만 아니라, 아래에 제공된 실험 데이터는 이 AM 추출물이 소화 효소로 처리 시에 여전히 만족스러운 항바이러스 활성을 유지한다는 것을 추가로 입증한다. 경구 섭취가 AM 추출물의 가장 일반적인 투여 경로이기 때문에, 소화 효소 처리 후 항바이러스 활성은 장 투여 (예를 들어, 경구 투여) 시에 AM 추출물이 첫 번째 통과 대사에서 생존하여 생체 내 항바이러스 효과를 이끌어 낼 가능성이 높음을 시사한다.
본 개시의 일부 실시양태에 따라, AM 추출물은 적어도 25% (wt%)의 전당을 포함한다. 예를 들어, 본 AM 추출물은 25-75% (wt%)의 전당을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, AM 추출물은 100 KD의 분자량 컷오프 (MWCO)를 갖는 여과막을 사용하여 얻을 수 있는 고 분자량 분획으로부터 유래된다.
특정 실시양태에서, AM 추출물은 추출물 중의 전당을 기준으로 적어도 60% (wt%)의 중성 및/또는 양으로 하전된 다당류를 포함한다. 임의로, 본 AM 추출물은 추출물 중의 전당을 기준으로 60-100% (wt%)의 중성 및/또는 양으로 하전된 다당류를 포함할 수 있다.
본 개시의 다양한 실시양태에 따라, AM 추출물은 주요 글리코실 성분으로서 람노스를 포함한다. 예를 들어, 람노스는 AM 추출물에서 모든 글리코실 성분의 적어도 30 몰%를 차지할 수 있다.
일부 실시양태에서, AM 추출물에서 다당류의 가장 풍부한 글리코실 연결은 3-rhap이다.
특정 실시양태에서, AM은 20% (wt%) 미만의 단백질 함량을 포함한다.
다른 측면에서, 본 개시는 본 개시의 상기한 측면의 실시양태(들)에 따른 AM 추출물을 제조하는 방법에 관한 것이다. 본원에 제시된 특수한 추출 공정을 사용함으로써, 통상적인 추출 공정에 의해 수득된 추출물과 비교하여 증가된 당 함량 및/또는 감소된 단백질 함량을 갖는 AM 추출물을 생성할 수 있다.
본 개시의 특정 실시양태에 따라, AM 추출물의 제조 방법은 아트로스피라 막시마 (Arthrospira maxima) 바이오매스를 80-120 ℃의 열수에서 추출하여 조 혼합물을 수득하는 단계; 조 추출물로부터 고체 잔류물을 제거하여 열수 추출물을 수득하는 단계; 및 임의로, 열수 추출물을 건조시켜 열수 추출물 분말을 수득하는 단계를 포함한다. 열수 추출물은 냉수 추출과 같은 통상적인 추출 방법에 의해 수득된 추출물과 비교하여 당 함량이 풍부하고 단백질 함량이 적다.
추가의 임의적인 실시양태에서, 방법은 열수 추출물 또는 열수 추출물 분말을 포함하는 용액을 100 KD의 분자량 컷오프 값을 갖는 여과막을 사용해서 여과하여 고 분자량 분획을 수득하는 단계; 및 임의로 고 분자량 분획을 건조시켜 고 분자량 추출물 분말을 수득하는 단계를 포함한다. 본원에 제시된 실험 데이터는 고 분자량 추출물이 열수 추출물보다 훨씬 더 우수한 항바이러스 활성을 나타내는 반면, 저 분자량 추출물은 바이러스 감염을 억제하는데 효과적이지 않다는 것을 입증한다.
또한 임의로, 본 추출은 고 분자량 분획 또는 고 분자량 추출물 분말을 포함하는 용액에 음이온-교환 컬럼을 사용한 음이온-교환 크로마토그래피를 수행하는 단계; 음이온 교환 컬럼을 통해 흐르는 유출물을 수집하는 단계 (여기서, 유출물은 양으로 하전 및/또는 중성의 다당류가 풍부한 AM 추출물을 포함함); 음이온 교환 컬럼을 염 용액으로 용리시키고 용출물을 수집하는 단계 (여기서 용출물은 음으로 하전된 다당류가 풍부한 AM 추출물을 포함함); 및 임의로, 유출물 또는 용출물을 건조시켜 각각 양으로 하전되거나 중성의 다당류가 풍부한 추출물 분말 및 음으로 하전된 다당류가 풍부한 추출물 분말을 수득하는 단계를 더 포함한다. 양으로 하전 및/또는 중성의 다당류가 풍부한 AM 추출물은 고 분자량 추출물 및 음으로 하전된 다당류가 풍부한 AM 추출물보다 항바이러스 활성면에서 훨씬 더 효과적이다.
일부 실시양태에서, 음이온 교환 컬럼은 디에틸 아미노에틸 (DEAE) 기반 컬럼, 사차 아미노에틸 (QAE) 기반 컬럼 또는 트리메틸아미노 에탄 (TMAE) 기반 컬럼, 또는 다른 양으로 하전된 컬럼이다.
다른 측면에서, 본 개시는 바이러스 감염 또는 바이러스 감염에 의해 유발된 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 상기 바이러스 감염 또는 장애를 치료하는 방법에 관한 것이다. 본원에 제공된 실험 데이터는 본 개시의 상기 언급된 측면/실시양태(들)에 따른 AM 추출물이 엔테로바이러스 (EV), 호흡기 세포 융합 바이러스 (RSV), 에볼라 바이러스, 돼지 유행성 설사 바이러스 (PEDV) 및 돼지 생식기·호흡기 증후군 바이러스 (PRRSV)와 같은 광범위 바이러스에 대해 효과적이라고 입증한다.
본 개시의 일부 실시양태에 따라, 방법은 대상체에게 유효량의 본 AM 추출물을 투여하는 단계를 포함한다.
다양한 실시양태에서, 대상체는 인간을 포함한 포유동물이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 숙주 세포에서 특정 바이러스의 바이러스 복제를 억제하는 방법에 관한 것이다.
본 개시의 실시양태에 따라, 방법은 본 개시의 상기 언급된 측면/실시양태(들)에 따른 AM 추출물의 유효량에 숙주 세포를 노출시키는 단계를 포함한다. 다양한 실시양태에서, 방법은 시험관 내 또는 생체 내에서 수행될 수 있다. 숙주 세포는 포유동물 세포일 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 개시는 바이러스 감염 또는 바이러스 감염에 의해 유발된 장애를 치료하기 위한 영양 보조 또는 약학적 조성물에 관한 것이다.
일부 실시양태에 따라, 영양 보조 또는 약학적 조성물은 유효량의 AM 추출물 및 임의로 영양 보조 또는 약학상 허용되는 부형제를 포함한다.
본 발명은 또한 생체적합성 매트릭스와 이 생체적합성 매트릭스 내 또는 생체적합성 매트릭스의 표면에 걸쳐 분포된 AM 추출물을 포함하는 생체적합성 재료에 관한 것이다. 예를 들어, 생체적합성 재료는 겔 또는 스프레이 용액일 수 있으며, 생체적합성 비히클 및 생체적합성 비히클 내에 분포된 AM 추출물을 포함한다. 다른 예에서, 생체적합성 재료는 AM 추출물 겔 또는 용액으로 함침될 수 있는 흡수성 고체 지지체를 포함하는 패치일 수 있다. 또 다른 예에서, 생체적합성 재료의 패치의 한 표면은 접착층 내에 분포된 AM을 포함하는 접착층으로 코팅될 수 있다.
본 개시의 다른 측면에 또한 포함되는 대상은 바이러스 감염 또는 바이러스 감염에 의해 야기되는 장애의 치료에 사용하기 위한 의약의 제조에서의 AM 추출물의 용도, 및 바이러스 감염, 또는 상기 바이러스 감염으로 유발된 장애의 치료에 사용하기 위한 AM 추출물을 포함한다.
본 개시의 많은 수반되는 특징 및 이점은 첨부 도면과 관련하여 고려되는 다음의 상세한 설명을 참조함으로써 더 잘 이해될 것이다.
본 설명은 첨부 도면의 관점에서 다음의 상세한 설명을 읽음으로써 더 잘 이해될 것이며, 이들 도면에서,
도 1은 본 개시의 다양한 실시양태에 따른 다양한 AM 추출물의 제조 방법을 도시한 흐름도이다.
도 2A 내지 도 2C는 본 발명의 일 실시예에 따른 본 AM 추출물에서 다당류의 분자량 분포를 보여주는 크로마토그래프이다;
도 3A 및 도 3B는 본 발명의 일 실시예에 따른 본 AM 추출물에서 조성물 성분의 전하를 보여주는 크로마토그래프이다.
도 4A 및 도 4B는 본 개시의 일 실시예에 따른 첨가 시간 분석에 대한 도식 및 결과를 도시한 것이다.
도 4C 및 도 4D는 본 개시의 일 실시예에 따른 제거 시간 분석에 대한 도식 및 결과를 도시한 것이다.
도 4E는 본 개시의 일 실시예에 따른 플라크 형성 분석의 결과를 도시한 것이다.
도 5A 및 도 5B는 본 개시의 일 실시예에 따른 EV71/MP4 감염 ICR 마우스에 대한 SHD1의 치료 효능을 보여주는 것이다.
발명의 상세한 설명
첨부된 도면과 관련하여 아래에 제공되는 상세한 설명은 본 실시예의 설명으로서 의도된 것이며 본 실시예로 구성되거나 이용될 수 있는 유일한 형태를 나타내도록 의도되지 않는다. 본 설명은 실시예의 기능과 실시예를 구성하고 동작시키기 위한 일련의 단계들을 설명한다. 그러나, 동일하거나 동등한 기능 및 순서는 상이한 실시예에 의해 달성될 수 있다.
편의상, 명세서, 실시예 및 첨부된 청구범위에 사용된 특정 용어를 여기에 모아 놓았다. 본원에서 달리 정의되지 않는 한, 본 개시에 사용된 과학 및 기술 용어는 당업자가 일반적으로 이해하고 사용하는 의미를 가질 것이다. 문맥상 달리 요구되지 않는 한, 단수 용어는 동일한 의미의 복수 형태를 포함하고 복수 용어는 단수를 포함한다는 것이 이해될 것이다. 구체적으로, 본원 및 청구범위에 사용된 단수 형태는 문맥상 명백하게 다르게 지시되지 않는 한 복수 참조를 포함한다. 또한, 본원 및 청구범위에 사용된 용어 "적어도 하나" 및 "하나 이상"은 동일한 의미를 가지며, 1, 2, 3 또는 그 이상을 포함한다.
본 발명의 넓은 범위를 나타내는 수치 범위 및 파라미터는 근사치이지만, 특정 실시예에서 제시된 수치는 가능한 정확하게 보고되었다. 그러나, 임의의 수치값은 필히 각각의 시험 측정에서 발견된 표준 편차로 인한 특정 오차를 포함한다. 또한, 본원에 사용된 용어 "약"은 일반적으로 주어진 값 또는 범위의 10%, 5%, 1% 또는 0.5% 이내를 의미한다. 대안적으로, 용어 "약"은 당업자가 고려할 때 평균의 허용 가능한 표준 오차 내를 의미한다. 작업/실시예에서를 제외하고, 또는 달리 명시적으로 언급되지 않는 한, 본 명세서에 개시된 모든 수치 범위, 양, 값 및 백분율, 예컨대 물질의 양, 지속 시간, 온도, 작동 조건, 양의 비율 등은 모든 경우에 "약"이라는 용어에 의해 수식된 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 달리 지시되지 않는 한, 본 개시 및 첨부된 청구범위에 제시된 수치 파라미터는 필요에 따라 변할 수 있는 근사치이다. 적어도, 각각의 수치 파라미터는 최소한 보고된 유효 자릿수의 수에 비추어, 그리고 통상적인 반올림 기술을 적용하여 해석되어야 한다. 본원에서 범위는 하나의 종점에서 다른 종점까지, 또는 두 종점 사이로 표시될 수 있다. 달리 명시되지 않는 한, 본원에 개시된 모든 범위는 종점을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "치료" 및 "치료하는 것"은 방지 (예를 들어, 예방), 치유 또는 완화적 조치를 포함한다. 특히, 본원에 사용된 용어 "치료하는 것"은 의학적 상태, 의학적 상태와 관련된 증상, 의학적 상태에 이차적인 질환 또는 장애, 또는 의학적 상태에 대한 소인을 가지는 대상체에게 상기 특정 질환, 장애 및/또는 상태의 하나 이상의 증상 또는 특징을 부분적으로 또는 완전히 경감, 개선, 완화, 발병 지연, 진행 억제, 중증도 감소 및/또는 발생률을 감소시킬 목적으로 본 AM 추출물 또는 이를 포함하는 약학 조성물을 대상체에게 적용 또는 투여하는 것을 지칭한다. 치료제는 질환, 장애 및/또는 상태의 징후를 나타내지 않는 대상체 및/또는 질환, 장애 및/또는 상태의 초기 징후만을 나타내는 대상체에게 질환, 장애 및/또는 상태와 관련된 병태의 발생 위험을 낮출 목적으로 투여될 수 있다. 본 개시에서, 질환, 장애 및/또는 상태는 특정 바이러스로 인한 바이러스 감염 및 바이러스 감염과 관련되거나 또는 이로부터 유래된 질환, 장애 및/또는 상태를 포함하고자 한다. 바람직한 실시양태에서, 본 AM 추출물은 시험관 내 및 생체 내 모두에서 바이러스 복제를 억제하는 데 사용될 수 있다. 따라서, 본 치료 방법은 병원체가 숙주 유기체에서 검출될 수 없게 숙주 유기체에서 감염성 병원체를 실질적으로 박멸하기 위한 수단을 제공한다.
용어 "대상체" 및 "환자"는 본원에서 상호호환적으로 사용되며, 본 AM 추출물, 약학 조성물 및/또는 본 발명의 방법에 의해 치료될 수 있는 인간 종을 포함하는 동물을 의미하는 것으로 의도된다. "대상체" 또는 "환자"라는 용어는 하나의 성별이 구체적으로 지시되지 않는 한 남성 및 여성 성별을 모두 지칭하는 것으로 의도된다.
용어 "적용" 및 "투여"는 치료가 필요한 대상체에 대한 본 AM 추출물 또는 본 발명의 약학적 조성물의 적용을 의미하도록 본원에서 상호호환적으로 사용된다.
본원에 사용된 용어 "유효량"은 원하는 치료 반응을 산출하기에 충분한 본 AM 추출물의 양을 지칭한다. 유효량의 약제가 질환 또는 상태를 치유하는데 필수적이지 않지만, 질환 또는 상태의 발병을 지연, 방해 또는 예방하거나 질환 또는 상태 증상이 개선되도록 질환 또는 상태에 대한 치료를 제공할 것이다. 유효량은 지정된 기간 동안 1회, 2회 또는 그 이상 투여하기에 적합한 형태로 1, 2 또는 그 이상의 용량으로 분할될 수 있다. 특정 유효량 또는 충분량은 치료되는 특정 상태, 환자의 신체 상태(예를 들어, 환자의 체질량, 연령 또는 성별), 치료되는 포유동물 또는 동물의 타입, 치료 기간, 동반 요법의 특성 (존재하는 경우), 사용된 특정 제형 및 화합물 또는 그 유도체의 구조와 같은 인자에 따라 달라질 것이다. 유효량은 예를 들어 AM 추출물의 총 질량 (예를 들어, 그램, 밀리그램 또는 마이크로그램 단위) 또는 AM 추출물의 질량 대 체질량의 비율, 예를 들어 킬로그램 당 밀리그램 (mg/kg)으로 표시될 수 있다.
본원에 사용된 어구 "영양 보조 또는 약학상 허용되는 부형제"는 신체의 한 장기 또는 부분에서 신체의 다른 장기 또는 부분으로 대상 약제를 운반 또는 수송하는데 관여하는 물질, 조성물 또는 비히클, 예컨대 액체 또는 고체 충전제, 희석제, 담체, 용매 또는 캡슐화 물질을 의미한다. 각 부형제는 제형의 다른 성분과 상용성이라는 의미에서 "허용가능"해야 한다. 영양 보조 또는 약학적 제형은 본 발명의 AM 추출물을 하나 이상의 영양 보조 또는 약학상 허용되는 성분과 조합하여 함유한다. 부형제는 고체, 반고체 또는 액체 희석제, 크림 또는 캡슐 형태일 수 있다. 이들 영양 보조 또는 약학적 제제는 본 발명의 또 다른 목적이다. 일반적으로, AM 추출물의 양은 비경구 사용을 위한 제제에서 제제의 0.1 내지 95 중량%, 바람직하게는 0.2 내지 20 중량%, 및 경구 사용을 위한 제제에서 바람직하게는 1 내지 50 중량%이다. 본 발명의 방법의 임상 사용을 위해, 본 발명의 영양 보조 또는 약학적 조성물은 의도된 투여 경로, 예컨대 경구 투여에 적합한 제형으로 제형화된다.
본원에 사용된 용어 "바이오매스"는 A. maxima를 함유하는 배양물로부터 유래된 바이오매스를 의미한다. 이 용어에는 살아있는 유기체와 죽은 유기체뿐만 아니라, 이미 만들어졌거나, 건조, 냉동 또는 달리는 이전에 가공된 바이오매스가 포함된다.
본 개시는 적어도 부분적으로, 본 A. maxima 추출물 (AM 추출물)이 EV, RSV, HHV, 에볼라 바이러스, PEDV 및 PRRSV와 같은 광범위 바이러스에 의해 야기된 바이러스 감염을 억제할 수 있다는 발견에 기초한다. 전술한 관점에서, 본 개시는 특정 바이러스에 의해 야기된 바이러스 감염을 치료하는 방법을 제안한다. 본 개시의 일부 실시양태는 이러한 바이러스 감염에 의해 유발된 장애를 치료하는 방법에 관한 것이다. 본원에서 상기 바이러스 감염의 치료에 사용하기 위해서 뿐만 아니라 상기 치료 목적을 위한 의약의 제조에 사용하기 위한 상기 AM 추출물의 용도가 또한 제공된다. 의약 (즉, 약학적 조성물)은 물론 본 출원의 범위에 포함되는 대상이다.
본 개시의 일부 실시양태에 따라, AM 추출물은 당 함량이 풍부하다. 예를 들어, AM 추출물은 AM 추출물의 총 중량을 기준으로 적어도 25% (wt%), 예컨대 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75 및 80% (wt%)의 전당을 포함한다. 하기에 제공된 실험 데이터는 이러한 당이 풍부한 AM 추출물이 방대한 바이러스의 바이러스 복제를 억제하는데 효과적인 반면, 당 함량이 적은 통상적인 AM 추출물은 이러한 높은 수준의 항바이러스 활성을 나타내지 않음을 입증한다.
본 AM 추출물은 또한 종래의 AM 추출물과 비교하여 감소된 양의 단백질을 포함한다는 특징이 있다. 본 개시의 다양한 실시양태에 따라, AM 추출물의 단백질 수준은 AM 추출물의 총 중량을 기준으로 20% (wt%) 미만, 예컨대 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 및 20% (wt%)이다.
일부 추가 실시양태에 따라, AM 추출물은 분자 크기 분리 수단으로부터 얻을 수 있는 고 분자량 분획에서 유래된 고 분자량 AM 추출물이다. 일부 임의적인 실시양태에서, 고 분자량 분획은 100 KD의 분자량 컷오프 (MWCO)를 갖는 여과막으로 당이 풍부한 AM 추출물을 여과함으로써 얻어진다. 일반적으로, 여과막과 관련하여 MWCO는 여과 (또는 투석) 절차 동안 분자의 정의된 백분율 (예를 들어, 80, 85, 90 또는 95%)이 여과막에 의해 보유되는 최저 분자량 분자 (달톤 단위)를 지칭한다. 따라서, 고 분자량 분획은 저 분자량 분획과 비교하여 분자량이 100 KD 초과인 증가된 양의 성분을 포함한다. 하기 제시된 실험 데이터는 본 발명의 고 분자량 AM 추출물은 당이 풍부한 열수 추출물 또는 저 분자량 AM 추출물과 비교하여 보다 만족스러운 항바이러스 효능을 유도한다고 나타냈다.
추가의 실시양태에서, 고 분자량 AM 추출물은 전하 분리 수단을 사용하여 추가 정제된다. 예를 들어, 고 분자량 AM 추출물에 음이온 교환 크로마토그래피를 실시하여, 추출물 내 성분이 분자의 전하에 기초해 추가 분리되도록 한다. 음이온 교환 크로마토그래피는 양으로 하전 및/또는 중성의 다당류가 풍부한 분획 및 음으로 하전된 다당류가 풍부한 또 다른 분획을 생성한다. 이하에 포함된 실험 데이터는 주로 양으로 하전 및/또는 중성의 다당류를 갖는 AM 추출물이 고 분자량의 AM 추출물 및 주로 음으로 하전된 다당류를 갖는 AM 추출물과 비교하여 특정 바이러스의 바이러스 복제를 억제하는데 더 효과적임을 확실히 한다.
본 개시의 다양한 실시양태에 따라, 고 분자량 AM 추출물은 추출물 중 전당을 기준으로 적어도 60% (wt%)의 중성 및/또는 양으로 하전된 다당류를 포함한다. 예를 들어, 중성 및/또는 양으로 하전된 다당류는 추출물 내 전당의 60-100 (wt%)를 차지할 수 있다. 예를 들어, AM 추출물은 전당 함량을 기준으로 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100 (wt%)의 중성 및/또는 양으로 하전된 다당류를 포함할 수 있다.
본 개시의 특정 실시양태에 따라, 람노스는 AM 추출물에서 다당류를 구성하는 글리코실 성분 중 주요 글리코실 성분이다. 일부 임의적인 실시양태에서, AM 추출물은 AM 추출물 내 총 글리코실 성분을 기준으로 적어도 30 몰%의 람노스를 갖는다. 예를 들어, 람노스의 몰 퍼센트는 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 45, 46, 48, 50, 52, 54, 55, 56, 58, 60, 62, 64, 65, 66, 68 또는 70 몰%일 수 있다.
또한, 본 개시의 일부 실시양태에 따라, 다당류에 존재하는 가장 풍부한 글리코실 연결은 3-rhap이다. 예를 들어, 하나의 실시예에서, 람노스 잔기의 절반 이상이 3-rhap 연결을 갖는다.
알 수 있는 바와 같이, 다양한 AM 추출물이 본원에 기술되어 있다. 일부 청구된 AM 추출물이 다른 청구된 AM 추출물보다 더 우수한 항바이러스 활성을 나타낼 수 있더라도, 이들 당이 풍부한 AM 추출물은 당 함량이 더 높으면 더 높은 항바이러스 활성을 생성한다. 또한, 아래에 제공된 실험 데이터는 본 AM 추출물이 소화 효소로 치료 시에 여전히 만족스러운 항바이러스 활성을 유지하여 이들이 생체 내에서 원하는 항바이러스 효과를 일으킬 수 있음을 시사한다. 또한, 경구 섭취된 AM 추출물의 생체이용률 및/또는 효능을 향상시키기 위해 본 AM 추출물을 제형화하기 위한 많은 수단 및 기술이 당 업계에 공지되었다.
상술한 AM 추출물 이외에도, 본 개시는 또한 이러한 AM 추출물을 제조하는 방법을 제공한다. 이 방법은 열수 추출 단계를 특징으로 하며, 이는 AM 추출물의 전당 함량을 증가시키고 항바이러스 활성을 향상시킨다. 본 방법은 또한 AM 추출물을 정제하여 증대된 항바이러스 활성을 갖는 다양한 AM 추출물을 수득하기 위한 추가 단계를 포함한다.
본 개시의 다양한 실시양태에 따른 예시적인 추출 공정이 도 1에 도시된 흐름도를 참조하여 설명된다. 본 개시의 일부 실시양태에 따라, 추출 공정은 열수에서 A. maxima 바이오매스를 추출하여 조 추출물을 수득하는 단계 (단계 110)를 포함한다. 예를 들어, 바이오매스는 먼저 물 (예를 들어, 증류수 또는 이중 증류수)에 현탁된 후, 일정 시간 동안 대략 80 ℃ 내지 120 ℃로 가열될 수 있다. 예를 들어, 현탁액은 약 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 또는 120 ℃로 가열될 수 있다. 다양한 실시양태에 따라, 열 추출 단계 (110)는 적어도 1 시간, 예를 들어 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5 또는 4 시간 동안 지속될 수 있다. 일부 실시양태에서, 열 추출 시간은 훨씬 더 길 수 있다.
추출에 적합한 A. maxima 바이오매스는 배양 시스템으로부터 추출된 살아있는 A. maxima 유기체를 포함한다. 대안적으로, A. maxima 바이오매스는 건조된 (예를 들어, 동결 건조, 공기 건조 또는 분무 건조에 의해) 것과 같은 죽은 A. maxima 유기체일 수 있다. 본원에 제공된 일부 실시양태에 따라, 건조된 A. maxima 바이오매스는 이중 증류수 (d.d.수)에 10% (w/v%)의 농도로 현탁된다. 그러나, 당업자에 의해 이해될 수 있는 바와 같이, 현탁액 중 바이오매스의 농도는 1% (w/v%) 내지 30% (w/v%), 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30% (w/v%)일 수 있다.
추출 공정은 또한 조 추출물 중의 고체 잔류물이 제거되는 단계 (120)을 포함한다. 고체 잔류물을 제거하기 위한 한 가지 일반적인 방법은 원심분리이다. 예를 들어, 조 추출물을 1,000 내지 5,000 rpm (예를 들어, 1,000, 1,500, 2,000, 2,500, 3,000, 3,500, 4,000, 4,500 또는 5,000 rpm)에서 충분한 시간 (예를 들어, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50 분) 동안 원심분리시킬 수 있다.
조 추출물로부터 고체 잔류물을 제거한 후, 열수 AM 추출물 (예를 들어, 원심분리관으로부터 수집된 상등액)을 얻을 수 있다. 후술하는 바와 같이, 열수 추출물 (예를 들어, 하기 실시예에 따른 SH 추출물)은 냉수 추출 (FE-L-APO)에 의해 제조된 종래의 추출물과 비교하여 증가된 당 함량을 포함한다. 또한, 열수 추출물의 단백질 수준은 냉수 추출물의 단백질 수준보다 적다.
임의적인 실시양태에서, 수성 열수 추출물을 건조시켜 열수 추출 분말을 수득할 수 있다. 예를 들어, 수성 열수 추출물은 자유-건조, 분무-건조 또는 공기-건조되거나 임의의 적절하거나 동등한 수단에 의해 건조될 수 있다.
알 수 있는 바와 같이, 수성 형태의 열수 추출물 및 건조된 열수 추출물 분말 모두 본 개시 내의 "A. maxima 추출물" 범위에 있으며, 둘 다 본원에 기재된 영양 보조 또는 약학적 조성물을 제조하는데 사용될 수 있다.
다음으로, 단계 (130)에서, 열수 추출물 (또는 열수 추출물 분말)에 분자 크기 분리가 수행된다 (단계 (130)). 예를 들어, 열수 추출물을 100 KD의 분자량 컷오프 (MWCO)를 갖는 반투과성 막으로 여과하여, 열수 추출물을 저 분자량 분획과 고 분자량 분획으로 분리할 수 있다. 이러한 방식으로, 고 분자량 분획은 100 KD 초과의 분자량을 갖는 성분을 증가된 양으로 포함하는 반면, 저 분자량 분획은 100 KD 미만의 분자량을 갖는 성분을 증가된 양으로 포함한다. 하기 제시된 실험 데이터는, 고 분자량 추출물 (예를 들어, 하기 실시예에 따른 SH1 추출물)이 당이 풍부한 열수 추출물 또는 저 분자량 AM 추출물과 비교하여 더 나은 항바이러스 효능을 유도한다는 것을 보여준다.
열수 추출 분말이 여과를 위한 출발 물질로서 사용되는 경우, 열수 추출 분말은 여과 전에 먼저 적절한 양 (10 내지 50 배)의 d.d.수와 혼합된다. 예를 들어, 물 함량은 건조된 열수 추출물 분말의 중량에 대해 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50 배일 수 있다.
여과 공정은 제조사의 지시에 따라 수행될 수 있으며, 작업자는 상황에 따라 재량껏 특정 변형이 필요한지의 여부를 결정할 수 있다.
상기 설명된 열수 추출물과 같이, 고 분자량 추출물을 건조시켜 고 분자량 추출물 분말을 생성할 수 있다. 수성 형태 및 고체 분말 형태의 생성물 모두가 본원에 기재된 AM 추출물로서 사용하기에 적합하다.
이어서, 단계 (140)에서, 고 분자량 추출물 (또는 고 분자량 추출물 분말)의 성분을 분자의 전하에 기초해 추가 분리한다. 본 개시의 실시양태에 따라, 전하 분리는 음이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 수행된다. 예를 들어, 음이온 교환 크로마토그래피는 디에틸 아미노에틸 (DEAE) 기반 컬럼, 사차 아미노에틸 (QAE) 기반 컬럼 또는 트리메틸아미노 에탄 (TMAE) 기반 컬럼, 또는 다른 양으로 하전된 컬럼을 사용할 수 있다.
일부 임의적인 실시양태에서, 고 분자량 추출물 (또는 고 분자량 추출물 분말을 함유하는 용액)의 염도를 먼저 약 0.5 내지 2.0% (예를 들어, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9 또는 2.0%)로 조정할 수 있다. 고 분자량 추출물 분말은 열수 추출물 분말에 대해 전술한 것과 유사한 방식으로 희석될 수 있다. 일부 경우에, 고 분자량 추출물 분말은 50 배 초과로, 예컨대 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100 배 또는 이를 초과해서 희석될 수 있다.
또한 임의로, (염도 조정의 유무에 관계없이) 수용액을 원심분리에 의해 추가로 처리하여 고체 잔류물을 제거한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 수용액은 5,000 내지 10,000 rpm (예를 들어, 5,000, 5,500, 6,000, 6,500, 7,000, 7,500, 8,000, 8,500, 9,000, 9,500 또는 10,000 rpm)에서 충분한 시간 (예를 들어, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50 분) 동안 원심분리된다.
음이온 교환 크로마토그래피는 제조사의 지시에 따라 수행될 수 있으며, 물론 필요에 따라 적절한 변형이 행해질 수 있다.
일반적인 크로마토그래피 관행에 따라, 컬럼을 먼저 적절한 양의 d.d.수로 헹구고, 이어서 크로마토그래피 샘플 (즉, 전처리된 수성 AM 추출물)을 컬럼에 통과시켜 초기 유출물을 수집한다. 임의로, 컬럼을 d.d.수로 다시 헹굴 수 있으며, 컬럼을 통과하는 2차 유출물을 수집하여 초기 유출물과 결합시킨다. 초기, 2차 및 결합된 유출물은 개별적으로 또는 집합적으로 양으로 하전 및/또는 중성의 다당류가 풍부한 AM 추출물로서 지칭되며, 이러한 AM 추출물로부터 수득된 건조된 분말은 양으로 하전 또는 중성의 다당류가 풍부한 추출물이다.
이어서, 컬럼을 적합한 부피의 염 용액 (예를 들어, 1M NaCl)으로 용리시킨다; 이 단계에서 수집된 용출물은 음전하 다당류가 풍부한 AM 추출물이고, 이러한 AM 추출물로부터 얻어진 건조 분말은 음전하 다당류가 풍부한 추출물 분말이다.
음이온-교환 크로마토그래피 동안 사용된 일부 염 또는 산물은 세포 독성일 수 있고, 따라서 일부 임의적인 실시양태에서, 양으로 하전 및/또는 중성의 다당류가 풍부한 AM 추출물 및 음으로 하전된 다당류가 풍부한 AM 추출물을 건조시키기 전에 다른 분자 크기 분리를 거쳐 추출물로부터 염을 제거한다.
하기 실험 데이터는 양으로 하전 및/또는 중성의 다당류가 풍부한 AM 추출물 (예를 들어, 일부 실시예에 따른 SHD1 추출물)이 고 분자량 추출물 (예를 들어, SH1 추출물) 또는 음으로 하전된 다당류가 풍부한 AM 추출물 (예를 들어, 일부 실시예에 따른 SHR1 추출물)보다 항바이러스 활성이 더 강력하다는 것을 나타낸다
알 수 있는 바와 같이, 양으로 하전 및/또는 중성의 다당류가 풍부한 AM 추출물 및 음으로 하전된 다당류가 풍부한 AM 추출물 뿐 아니라, 이로부터 유래된 분말은 본 발명의 AM 추출물의 범위 내에 있다.
본 개시의 일부 실시양태에 따라, 방법은 바이러스 감염 또는 바이러스 감염과 관련된 장애를 치료하기 위해 대상체에게 유효량의 본 AM 추출물을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 대상체에서의 바이러스 복제가 투여된 AM 추출물에 의해 실질적으로 억제되어 대상체에서의 바이러스 감염을 근절시킬 수 있다.
당업자가 알 수 있는 바와 같이, 유효량은 치료되는 특정 상태, 상태의 중증도, 개별 환자 파라미터 (연령, 신체 상태, 크기, 성별 및 체중 포함), 치료 기간, 동반 요법 (있는 경우)의 특성, 특정 투여 경로 및 의료 관계자의 지식 및 전문 기술 내의 유사 요인과 같은 많은 요인에 따라 달라질 것이다. 본 개시의 일부 실시양태에 따라, 본 AM 추출물의 유효량은 인간 대상체에 대해 1 일 체중 Kg 당 0.01 내지 1,000 mg, 예를 들어 1 일 0.01, 0.02, 0.03, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990 또는 1,000 mg/Kg 체중이다.
특정 실시양태에 따라, EV 감염을 치료하기 위한 본 AM 추출물의 유효량은 마우스의 경우 0.375 내지 125 mg/kg/일; 바람직하게는 1 내지 60 mg/kg/일; 더욱 바람직하게는 3 내지 30 mg/kg/일이다. 예를 들어, 마우스에 대한 1 일 용량은 0.375, 0.75, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120 또는 125 mg/kg이다.
특정 실시양태에 따라, 대상체는 성인 인간이고, EV 감염을 치료하기 위한 본 AM 추출물의 유효량은 0.01 내지 10 mg/kg/일; 바람직하게는 0.8 내지 4.8 mg/kg/일; 더욱 바람직하게는 0.24 내지 2.4 mg/kg/일이다. 예를 들어, 인간 대상체에 대한 1 일 용량은 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.12, 0.15, 0.2, 0.24, 0.25, 0.3, 0.35, 0.4, 0.45, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.4, 2.5, 3, 3.5, 3.6, 4, 4.5, 4.8, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 또는 10 mg/kg일 수 있다. 알 수 있는 바와 같이, 본 AM 추출물 또는 이를 포함하는 약학적 조성물에 대한 인간 등가 용량 (HEQ)은 하기 실시예에 제공된 동물 용량을 기초로 당업자가 계산할 수 있다. 예를 들어, 인간 대상체에 사용하기 위한 최대 안전한 복용량을 추정하는데 미국식품의약국(FDA)에서 "Estimating the Maximum Safe Starting Dose in Initial Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers (July 2005)"라는 표제로 공개한 산업적 지침을 따를 수 있다. 예를 들어, 상기 언급된 인간 대상체에 대한 유효량의 범위는 60 kg 인간을 가정하여 상기 FDA 지침의 표 1에 제공된 전환 계수를 사용하여 래트에 대한 유효 투여량으로부터 도출된다.
본 AM 추출물은 전신 (예를 들어, 경구 또는 i.p.) 또는 국소 (경막 또는 경 점막) 경로를 통해 투여될 수 있다.
본 개시의 일부 실시양태에 따라, 방법은 소독제로서 바이러스 감염을 예방 또는 치료하기 위해 공기에 분무하거나, 또는 대상체에게 AM 추출물의 유효 농도를 분무하는 단계를 포함한다. 제형 중 AM 추출물의 농도는 1 내지 100000 ug/ml일 수 있다.
본 개시의 일부 실시양태에 따라, 방법은 바이러스 감염 또는 바이러스 감염과 관련된 장애, 예컨대 HSV-1/2로 인한 헤르페스 또는 엔테로바이러스로 인한 수족구 병을 치료하기 위해 AM 추출물의 유효 농도를 대상체에게 국소적으로 분무 또는 패치하는 단계를 포함한다. 제형은 또한 생체적합성 매트릭스와, 그 매트릭스 내 또는 매트릭스의 표면에 걸쳐 분포된 AM 추출물을 포함하는 젤리 또는 연고 형태의 생체적합성 재료일 수 있다. 제형 중 AM 추출물의 농도는 1 내지 100000 ug/ml일 수 있다.
예를 들어, 본 AM 추출물은 영양 보조 또는 약학상 허용되는 부형제와 함께 원하는 투여 방식에 적합한 영양 보조 또는 약학적 조성물로 제형화될 수 있다. 본원에 개시되고 청구된 본 발명의 개념(들)에 따라 제조된 특정 영양 보조 또는 약학적 조성물은 환자에게 경구 투여하기에 적합한 단일 단위 투여 형태이다. 본 영양 보조 또는 약학적 조성물은 고체, 반고체 또는 액체 형태로 제형화될 수 있다. 상기 언급된 투여 경로에 적합한 투여 형태의 예로는 정제, 카플렛, 캡슐, 카세, 트로키, 로젠지, 분말, 용액, 분산액, 현탁액 (예를 들어, 수성 또는 비수성 액체 현탁액, 수중유 에멀젼 또는 유중수 액체 에멀젼) 및 엘릭시르를 들 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 이해할 수 있는 바와 같이, 이들 영양 보조 또는 약학적 조성물 또한 본 발명의 범위 내에 있다.
특정의 임의적인 실시양태에 따라, 영양 보조 또는 약학상 허용되는 부형제의 예에는 전분, 사이클로덱스트린, 말토덱스트린, 메틸셀룰로스, 카보메톡시 셀룰로스 및 잔탄검이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 또한, 본 영양 보조 또는 약학적 조성물은 다음 성분 중 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다: 용매, 분산 매질, 코팅제, 계면활성제, 항산화제, 보존제 (예를 들어, 항균제, 항진균제), 등장제, 접착 지연제, 안정화제, 겔, 결합제, 부형제, 붕해제, 윤활제, 감미제, 향미 제 및 염료.
본 AM 추출물을 포함하는 영양 보조 조성물의 경우, 추가의 영양 성분, 예컨대 비타민, 미네랄, 섬유질, 지방산 또는 아미노산을 추가로 포함할 수 있다.
다양한 실시양태에서, 대상체는 본 개시의 치료 방법으로 혜택을 받을 수 있는 포유동물이다. 본원에 사용된 "포유동물"은 인간; 영장류(예: 원숭이 및 침팬지); 개, 고양이, 토끼, 돼지, 양, 염소, 젖소, 말 및 소와 같은 가축 및 농장 동물; 동물원, 스포츠 또는 애완 동물; 및 마우스, 랫트 및 기니피그와 같은 설치류를 포함하는 포유동물류의 모든 구성원들을 지칭한다. 예시적인 실시양태에서, 환자는 인간이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 방법은 본 AM 추출물의 투여 전, 동시 또는 후에 바이러스 감염의 증상을 치료 또는 개선하기 위한 유효량의 약제를 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
하기 실시예는 본 발명의 특정 측면을 설명하고 당업자가 본 발명을 실시하는 것을 돕기 위해 제공된다. 이들 실시예는 어떠한 방식으로도 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 간주되지 않는다. 추가의 설명없이, 당업자는 본원의 설명에 기초하여 본 발명을 최대한 활용할 수 있을 것으로 생각된다.
비교예: 냉수 AM 추출물의 제조 및 조성 분석
건조된 A. maxima 바이오매스 (10 g)를 d.d.수 (100 ml)에 교반하면서 현탁시켰다. 현탁액을 0 ℃ 이하의 냉장고에 적어도 8 시간 두어 현탁액을 얼음 덩어리 조각으로 동결시켰다. 얼음 덩어리를 0 내지 37 ℃에서 해동시키고 가벼운 진동 또는 교반으로 얼음 덩어리를 천천히 녹였다. 동결 및 해동 공정을 적어도 2 회 수행한 후, 해동된 현탁액을 1 시간 동안 고속으로 원심분리하여 고체 잔류물을 제거하였다. 이렇게 얻어진 냉수 AM 추출물을 FE-L-APO 추출물이라 한다. FE-L-APO 추출물을 동결 건조하여 추가 분석을 위한 FE-L-APO 분말을 수득하였다.
냉수 FE-L-APO 추출물을 분석하여 단백질 (소 혈청 알부민 (BSA)을 표준으로 사용하는 Bio-rad 단백질 분석 시약), 전당 (글루코스를 표준으로 사용하는 페놀-설프릭산 분석), 핵산 (OD260 흡광도), 물 (건조시 손실에 의해 결정됨) 및 회분 (600 ℃에서 7 시간 동안 소각에 의해 결정됨)의 중량% (wt%)를 결정하고, 각각의 결과를 표 1에 나타내었다. (3 개의 독립적 배치로부터 평균 ± SD로 표시됨).
FE-L-APO 추출물의 조성 분석
함량 (wt%)
단백질
전당
핵산
물
회분
기타 		39.33 ± 5.6
11.79 ± 5.7
19.29 ±2.7
5 ± 1
1.2 ± 0.3
23.39
FE-L-APO 추출물의 글리코실 조성을 가스 크로마토그래피-질량 분석법 (GS-MC)으로 결정하고, FE-L-APO 추출물의 세 배치에 대한 결과를 표 2에 요약하였다.
Figure pct00001
FE-L-APO 추출물을 알로피코시아닌 (APC), C-피코시아닌 (C-PC), FE-L-APO (H) 및 FE-L-APO (T) 분획들로 추가 분리하였다. APC 및 CPC 분획은 FE-L-APO 추출물을 추가로 DEAE 및 HA 컬럼 분리하여 얻은 단백질 분획이었다. FE-L-APO (H) 및 FE-L-APO (T) 분획은 다당류 분획이었다. 단백질 분획을 변성시키고 원심분리에 의해 단백질 분획을 분리하기 위해 FE-L-APO의 열수 추출에 의해 FE-L-APO (H) 추출물을 제조하였다. FE-L-APO 추출물의 단백질 함량을 트리클로로아세트산으로 변성시키고 원심분리로 단백질 분획을 침전 및 분리하여 FE-L-APO (T) 추출물을 제조하였다.
열수 AM 추출물의 제조 및 조성 분석
건조된 A. maxima 바이오매스 (10 g)를 d.d.수 (100 ml)에 교반하면서 현탁시켰다. 현탁액을 적어도 1 시간 동안 약 80 ℃ 내지 120 ℃로 가열하여 조 추출물을 수득하였다. 조 추출물을 3,500 rpm에서 약 20 내지 30 분 동안 원심분리하였고, 이렇게 수집된 상등액이 열수 AM 추출물 (SH 추출물)이다. 수성 SH 추출물을 동결 건조하여 추가 분석을 위한 SH 분말을 수득하였다.
분자 크기 분리를 위해, SH 분말을 10 내지 50 배의 d.d.수에서 용해시킨 후, Ultracel-100 멤브레인 (MWCO: 100 KD)을 사용하여 Amicon Ultra-15 원심분리 여과 장치로 여과하였다. 보유 분획 (즉, 샘플 측 내에 보유된 것)을 고 분자량 AM 추출물 (SH1 추출물)로 수집하고, 동결 건조하여 후속 사용을 위한 SH1 분말을 수득하였다.
전하 분리를 위해, DEAE 겔 (Sepharose™ Fast Flow)을 음이온 교환 크로마토그래피에 사용하였다. 간략하게, SH1 분말을 d.d.수에 적어도 50 배 희석으로 용해시키고, 희석액 50 mL에 NaCl 0.4 내지 0.5 g을 첨가하여 염도를 0.8 내지 1.0%로 조정하였다. 이어서, 희석제를 8,000 rpm에서 30 분 동안 원심분리하고, 상등액을 1-μm 메쉬로 여과하여 불순물을 제거함으로써 크로마토그래피를 위한 샘플 용액을 수득하였다. 200 ml DEAE 겔을 사용하여 제조된 DEAE 컬럼을 먼저 5 내지 10 컬럼 부피 (CV)의 d.d.수로 평형화시켰다. 그 후, 샘플 용액 (50 ml)을 4 ml/분의 유속으로 컬럼에 주입하고, 컬럼을 통해 흐른 초기 유출물을 수집하였다. 이어서, 컬럼을 500 mL의 d.d.수로 헹구고, 컬럼을 통과하는 유출물을 2차 유출물로서 수집하였다. 초기 유출물 및 2차 유출물을 합하여 양으로 하전 및/또는 중성의 다당류가 풍부한 AM 추출물 (SHD1 추출물)을 수득하였다. 세정 후, 1 내지 3CV의 1M NaCl로 DEAE 컬럼을 용리시키고, 용출물을 수집한 뒤, 음전하 다당류가 풍부한 AM 추출물 (SHR1 추출물)을 수득하였다.
이어서, 수성 SHD1 및 SHR1 추출물을 각각 Ultracel-100 멤브레인을 사용하여 Amicon Ultra-15 원심분리 여과 장치로 여과하여 이로부터 염 및 다른 불순물을 제거하였다. 이어서, 보유 분획을 동결 건조시켜 추가 분석을 위한 SHD1 분말 및 SHR1 분말을 수득하였다.
SH 분말, SH1 분말, SHD1 분말 및 SHR1 분말에 대해 전당 함량 (AM 추출물의 단당류 조성물을 표준으로 사용하는 페놀-설프릭산 분석), 산 당 함량 (글루쿠론산을 표준으로 사용하는 m-하이드록시디페닐 방법), 데옥시당 (람노스를 표준으로 사용하는 메틸펜토스 측정 분석), 핵산 (OD260 흡광도), 총 단백질 (BSA를 표준으로 사용하는 Bio-rad 단백질 분석 시약); 조지방 (A.O.A.C-960.39), 물 (건조시 손실에 의해 결정됨) 및 회분 (600 ℃에서 7 시간 동안 소각에 의해 결정됨)을 포함하는 일련의 조성 분석을 행하고, 각각의 결과를 표 3에 나타내었다.
AM 추출물의 조성 분석 (중량%, wt%)
SH SH1 SHD1
산성 당
데옥시 당
전당
핵산
단백질(BIO-RAD)
조 지방
물
회분		 2.97
8.53
29.52
19.54
5.88
미량
5 내지 7
시험 결과 없음		 3.22
10.73
31.59
18.77
6.29
미량
5 내지 7
시험 결과 없음		 5.53
27.03
61.05
4.98
1.93
미량
5 내지 7
시험 결과 없음
또, 고성능 크기 배제 크로마토그래피 (HPSEC)를 이용하여 전당 함량에서 다당류를 분리한 다음, 그 분획의 분자 질량을 굴절률 (RI) 검출로 측정하였다. 간략하게, TSK 겔 G4000PW 컬럼 (7.5 mm × 30 cm) 및 TSK 겔 G3000PW 컬럼 (7.5 mm × 30 cm)과 결합된 TSK 가드 컬럼 PWH (7.5 mm × 7.5 cm)를 사용하여 다당류를 분리하였다. 0.02% NaN3을 함유하는 0.3N NaNO3을 사용하여 0.5 mL/분의 유속으로 컬럼을 용리시켰다. 도 2A, 도 2B 및 도 2C는 각각 SH 추출물, SH1 추출물 및 SHD1 추출물에서의 다당류의 분자량 분포 곡선을 나타내며, 정량 결과는 표 4 내지 표 6에 요약되어 있다.
SH 추출물의 분자량 분포
피크 MW DPw 피크 면적 백분율 (%)
A
B
C
D
E
F
G
H
I
J
K
L		 1104367.8
597417.5
303789.7
153091.2
13734.4
7683.3
3698.5
2182.2
1376.5
684.3
398.8
185.0		 6816.97
3687.65
1875.13
944.90
84.67
47.32
22.72
13.36
8.39
4.11
2.35
1.09		 14.32
2.49
12.82
2.85
4.36
4.16
9.17
8.47
23.11
8.60
7.37
2.29
도 2A 및 표 4에 제공된 데이터에 따르면, SH 추출물 분말에서 다당류의 대략 2/3가 100 KD 미만의 분자량을 가졌다. 한편, 고 분자량 AM 추출물로부터 유래된 SH1 추출물 분말의 경우에는, 분자량이 100 KD보다 큰 다당류가 전당 함량의 거의 절반을 차지하였다 (도 2B 및 표 5 참조).
SH1 추출물의 분자량 분포
피크 MW DPw 피크 면적 백분율 (%)
A
B
C
D
E
F
G
H
I
J
K
L		 1099926.5
573379.5
316191.0
153105.0
14066.1
7131.0
4106.7
2256.0
1282.0
670.3
398.8
183.5		 6789.56
4156.55
1951.69
944.98
86.72
43.91
25.24
13.81
7.80
4.03
2.35
1.33		 18.63
5.90
18.67
5.10
0.59
4.00
5.56
13.06
16.15
6.95
3.52
1.86
고 분자량 SH1 분말을 음이온-교환 크로마토그래피로 추가 처리하여 얻어진, 주로 양으로 하전 및 중성의 다당류를 갖는 분획은 고 분자량 다당류를 더 많이 가졌다. 도 2C 및 표 6의 데이터는 SHD1 추출물 분말에서 75%를 초과한 다당류가 100 KD 초과의 분자량을 가진다는 것을 나타낸다.
SHD1 추출물의 분자량 분포
피크 MW DPw 피크 면적 백분율 (%)
A
B
C
D
E
F
G
H
I		 1023005.0
523071.5
393198.4
206803.6
143597.4
64782.8
20795.2
2946.0
787.0		 6314.73
3228.73
2427.04
1276.45
886.29
399.78
128.25
18.07
4.75		 16.23
11.32
18.04
14.66
14.74
10.56
6.60
4.64
3.21
본 AM 추출물의 단당류 조성을 펄스 전류 측정 검출 (HPAEC-PAD)을 갖춘 고성능 음이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 분석하고, 각각의 결과를 표 7에 나타내었다 (3 개의 독립적 배치로부터 평균 ± SD로 표시됨).
Figure pct00002
* Fuc: 푸코스, Rha: 람노스, Ara: 아라비노스, Gal: 갈락토스, Glc: 글루코스, Man: 만노스 및 Glc A: 글루쿠론산.
* Gal A, 갈락투론산은 모든 샘플에서 검출할 수 없었다.
표 7의 데이터는 본 발명에 따른 세 열수 AM 추출물에서 가장 풍부한 단당류가 람노스였으며, 이는 총 단당류를 기준으로 약 40 내지 60 몰%를 차지함을 보여준다. 대조적으로, 표 2의 데이터는 냉수 추출을 사용하여 제조된 추출물에서 가장 풍부한 단당류는 만노스 (약 46 내지 56 몰%)이고 람노스가 두 번째로 풍부한다는 (약 18 내지 27 몰%) 것을 보여준다. 한편, 만노스는 본 열수 추출 기반 AM 추출물에서 소량 (5 몰% 미만) 만을 구성한다.
SHD1 추출물 분말을 글리코실 연결 분석에 추가로 적용하였다. 간략하게, 일련의 퍼메틸화, 가수분해, NaBD4에 의한 환원 및 아세틸화 후, GC-MS 스펙트럼을 사용하여 글리코실 연결을 해석하고, 생성된 O-메틸화 알디톨 아세테이트 생성물의 HP5-MS 컬럼에서의 체류 지수를 기록하였다. 결과는 표 8에 요약되어 있다.
표 8의 데이터는 가장 중요한 글리코실 연결이 3-rhap 연결 (32.59%)이고, 이어 4-rhap (14.76%) 및 2,3-rhap (6.12%)임을 나타낸다. 함께, 상위 세 글리코실 연결이 글리코실 연결의 절반 이상을 차지한다.
SHD1 추출물의 글리코실 연결
연결 당 조성 (%) 피크 면적 (%)
푸코스 T-fucp
3-fucp
2,3-fucp 		8.9 4.28
3.33
1.28
람노스 2-rhap
3-rhap
4-rhap
2,3-rhap
3,4-rhap 		63.3 4.89
32.59
14.76
6.12
4.92
아라비노스 3-arap 4.7 4.7
갈락토스 T-galp
6-galp
2,6-galp 		7.7 6.19
0.87
0.66
글루코스 T-glcp
2-glcp
4-glcp
6-glcp
4,6-glcp 		13.0 1.06
1.65
1.97
5.36
2.92
만노스 1.2
자일로스 1.3
SHD1 분말을 DEAE 컬럼 크로마토그래피에 다시 적용하여 이들의 전하 밀도에 기초하여 성분들을 추가로 분리하였다. 결과를 도 3A (전당 함량) 및 도 3B (SHD1에 대한 중량(%), 모든 당에 대한 우론산의 함량)의 크로마토그래프에 나타내었다. 크로마토그래피로부터의 유출물 및 용출물의 조성 분석을 상기한 바와 같이 분석하고, 결과를 표 9에 요약하였다.
SHD1 추출물의 DEAE 분획의 조성 분석
분획 SHD1에 대한 W (%) 우론산 (%)
SHD1-유출물
SHD1-용출물		 22.8%
77.2%		 nd
29.85
실시예 3: 엔테로바이러스에 대한 AM 추출물의 항바이러스 활성
AM 추출물의 항바이러스 효능 및 세포 독성을 각각 중화 시험 및 MTT 분석에 의해 조사하였다. 달리 명시되지 않는 한, 결과는 4 개의 웰로부터의 평균 ± SD로 표시된다.
RD 세포를 10% 소태아 혈청 (FBS)이 보충된 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM)에서 성장시켰다. EV71/TWN/4643/1998은 Jen-Ren Wang, National Cheng Kung University (대만, 타이난)로부터 입수하였으며; EV71의 원형인 EV71/CA/BrCr/1970은 ATCC로부터 입수하였다 (ATCC 수탁 번호: VR 784). EV71/TWN/1743/1998 및 TWN/2231/1998.
중화 시험을 위해, RD 세포에서 엔테로바이러스에 의해 유도된 세포 변성 효과의 억제를 측정하였다. 96-웰 플레이트에서 단층의 RD 세포 (6,000 세포/웰)를 EV71 바이러스로 감염시키고, 일련의 농도의 AM 추출물로 처리하였다. 접착을 위해, 세포를 37 ℃에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다; 흡착 후, 감염된 세포 플레이트를 37 ℃에서 48 시간 동안 50 ㎕의 DMEM으로 오버레이하였다. 이어서, 실온에서 1 시간 동안 0.5% 포름알데히드 100 ㎕를 첨가하여 플레이트를 고정시켰다. 그 후, 포름알데히드를 제거하고, 샘플을 실온에서 15 분 동안 0.1% 크리스탈 바이올렛으로 염색하였다. 플레이트를 세척 후 건조시키고, 각 웰의 세포 밀도를 570 nm에서 측정하였다. 바이러스 단독 음성 대조군에 비해 바이러스-유발 세포 변성 효과를 50% 감소시키기 위해 AM 추출물에 필요한 농도를 50% 유효 용량 (EC50)으로 표시하였다.
MTT 분석을 위해, RD 세포를 96-웰 마이크로플레이트에 시딩하고 (30,000 세포/웰), 가습 인큐베이터에서 24 시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서 배양 배지를 0.048 내지 50 mg/ml 범위의 농도로 AM 추출물을 함유하는 배지로 교체하였다. AM 추출물없이 DMEM에서 배양된 음성 대조군 및 세포도 배양 배지도 포함하지 않는 블랭크 그룹도 포함시켰다. 세포를 72 시간 동안 인큐베이션한 후, 배양 배지를 버리고 20 ㎕의 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨브로마이드 (MTT) 용액 (DMEM 중 1 mg/mL)을 각 월에 첨가하였다. 세포를 4 시간 더 인큐베이션한 다음, MTT 용액을 제거하였다. 이어서, 이소프로판올 중 0.04N HCl 200 ㎕를 각 웰에 첨가하여 포르마잔 결정을 용해시켰다. 이어서 플레이트를 570 nm에서 마이크로플레이트 판독기 (BIOtAK, Bristol, UK)로 판독하였다 (OD570). 비처리 대조군과 비교하여 50% 세포 사멸을 초래하는 농도인 CC50을 레드-뮌히 (Reed-Muench) 법에 따라 계산하였다.
아래 표 10에 본 AM 추출물 및 냉수 추출물의 EC50 및 CC50, 선택성 지수 (SI), CC50 대 EC50의 비를 요약하였다.
EV71/TW/4643/1998에 대한 AM 추출물의 항바이러스 활성
샘플 EC50 (μg/ml) CC50 (μg/ml) SI
FE-L-APO
SH
SH1
SHD1
SHR1		 76 ± 0
21 ± 3
8 ± 0
3 ± 0.15
13 ± 089		 >25000
>25000
>25000
>25000
>25000		 >329
>1190
>3125
>8333
>1923
표 10의 데이터는 본 개시에 따른 AM 추출물 (예를 들어, SH, SH1, SHD1 및 SHR1 추출물)이 종래 FE-L-APO 추출물에 비해 상당히 낮은 EC50 값에 의해 예증되는 바와 같이 더 우수한 항바이러스 효능을 나타냄을 입증한다. 비교예 및 실시예 1에서 상기 제시된 조성 분석을 참조하면, 본 AM 추출물의 항바이러스 활성은 주로 그 안의 다당류 함량으로부터 기인하는 것으로 추측된다. SH와 SH1 추출물 사이의 항바이러스 활성의 비교로 고 분자량 (예를 들어, 100 KD 초과)의 다당류 함량이 바이러스 감염을 억제하는데 보다 효과적일 것이라는 것이 추가로 밝혀졌다. 또한, 중성 및 양으로 하전된 다당류 함량은 모든 시험 그룹 중에서 EC50 값이 가장 낮기 때문에 더 강력하다.
주로 음으로 하전된 다당류를 갖는 SHR1 추출물의 EC50 값이 SH1 추출물 및 SHD1 추출물의 EC50 값보다 높지만, SH 추출물의 EC50 값보다는 낮음에 주목해야 한다. 이러한 결과는 고 분자량 (예를 들어, 100 KD 초과)을 갖는 다당류가 EV 감염으로부터 숙주 세포를 보호하는데 더욱 효과적일 것임을 다시 한번 제시한다. 한편, 본 발명의 결과는 또한 주로 저 분자량 성분 (예를 들어, 분자량이 100 KD 미만인 분자)을 함유하는 분획이 EV71에 대해 항바이러스 활성을 갖지 않는다는 것을 나타냄을 제시한다 (데이터는 나타내지 않음).
또한, 표 10의 데이터는 모든 본 AM 추출물이 1,000을 초과하는 선택 지수로 EV 바이러스에 대해 매우 선택적이지만 RD 세포에 대해서는 그렇지 않다는 것을 나타내며, 이는 이러한 AM 추출물이 그의 유효 투여량에서 세포 독성이 아님을 제시한다.
상기 제조된 SHD1-유출 분획 및 SHD1-용리 분획에 대해 항바이러스 효능을 결정하기 위해 중화 시험을 수행하였다. 2 회 중복 실험의 결과가 표 11에 요약되어 있다. 표 11의 데이터는 SHD1 추출물의 성분이 표면 전하 밀도에 기초하여 추가로 분리되는 경우, 주로 양으로 하전 및 중성의 성분을 갖는 분획 (SHD1-유출물)이 주로 음전하 성분을 갖는 분획 (SHD1-용출물)보다 EV 감염으로부터 숙주 세포를 보호하는데 더 효과적이었음을 제시한다. 다른 한편으로, SHD1-용출물 내 대부분의 성분은 분자량이 100 KD를 초과하기 때문에 (이 분획은 SH1 및 SHD1 추출물로부터 유래되었으므로), SHD1-용출물의 EC50 값은 SH 추출물의 EC50 값보다 낮았다.
EV71/TW/4643/1998에 대한 AM 추출물의 항바이러스 활성
샘플 EC50 1 (μg/ml) EC50 2 (μg/ml) EC50 (μg/ml)
SHD1
SHD1-유출물
SHD1-용출물		 2.82
2.24
14.51		 2.39
2.61
16.42		 2.61 ± 0.30
2.43 ± 0.26
15.47 ± 1.35
감염 초기 단계에서 엔테로바이러스 감염의 임상 증상은 HFMD 및 헤르판기나 (herpangina)를 포함한다. 상기 증상은 다른 엔테로바이러스로 인한 감염에 공통적이다. 따라서, 광범위 스펙트럼의 항-엔테로바이러스 효능을 갖는 항바이러스 AM 추출물을 제공하는 것이 바람직하다. EV71/4643 이외에, 중화 테스트로 EV71/CA/BrCr/1970 (유전자형 A), EV71/TWN/1743/1998 (유전자형 B), EV71/TW/2231/1998 (유전자형 C), 콕사키 A6, 콕사키 A10, 콕사키 A16, 콕사키 B3, 인플루엔자 바이러스, 단순 헤르페스 1 형 및 2 형 (HSV-1, HSV-2)에 대한 SHD1 추출물의 항바이러스 효과도 또한 평가하고, 결과를 표 12에 요약하였다 (세 독립적인 중복 실험으로부터의 평균 ± SD로 표시됨). 콕사키바이러스 A6, A10, A16, B3, HSV-1 및 HSV-2는 장궁 메모리얼 병원 (Chang Gung Memorial Hospital) (대만 린코우 소재)의 임상 바이러스학 실험실 (ClinicalVirology Laboratory)에서 임상 표본으로부터 단리되었다.
다양한 바이러스에 대한 SHD1 추출물의 항바이러스 활성
바이러스 EC50 (μg/ml) CC50 (μg/ml) SI
EV71/BrCr (유전자형 A)
EV71/1743 (유전자형 B)
EV71/2231 (유전자형 C)
EV71/4643 (유전자형 C)
콕사키 A6
콕사키 A10
콕사키 A16
콕사키 B3
인플루엔자 A/WSN/33
HSV-1
HSV-2		 27
14
13
3 ± 0.15
>1000
5.72 ± 0.14
1.31 ± 0.05
667 ± 9
333 ± 77
21.37 ± 1.82
2.21 ± 0.04		 >25000
>25000
>25000
>25000
>25000
>25000
>25000
>25000
>25000
>25000
>25000		 >925.9
>1785.7
>1923.0
>8333
N/A
>4370
>19083
>37.4
>75
>1170
>11312
표 12의 데이터는 예외로 본 SHD1이 다양한 EV 바이러스 균주에 대해 만족스러운 억제 효능 및 선택성을 나타냄을 제시한다. 또한, 본 SHD1 추출물은 콕사키 A10, 콕사키 A16, HSV-1 및 HSV-2를 억제하는데 매우 효과적이다. HSV-1 (86.58 ± 11.91 μg/ml) 및 HSV-2 (10.03 ± 0.54 μg/ml)에 대한 SHR1의 EC50 값이 SHD1의 값보다 높고 이는 HSV-1 및 HSV-2의 바이러스 감염을 억제하는 데에 SHD1 추출물이 보다 효과적임을 나타낸다. 또한, 콕사키 B3 및 인플루엔자 A/WSN/33에 대한 SHD1 추출물의 EC50도 허용 가능하였다.
본 AM 추출물에 의해 표적화된 바이러스 수명 주기의 가능한 단계(들)를 결정하기 위해, 첨가 시간 및 제거 시간 분석을 수행하였다.
첨가 시간 분석 (도 4A 참조)을 위해, 시점 -1에서, 6-웰 플레이트 내의 RD 세포를 EV71/TW/4643/1998 바이러스와 접촉시키고 (다중 감염도 (MOI) = 2), 1 시간 접착 시간을 준 후, 시점 "0"을 감염 시간으로 지정하였다. RD 세포를 6 μg/ml의 SHD1 추출물로 지시된 간격으로 처리하였다. 감염 8 시간 후에 상등액 및 펠렛을 수거하고, 플라크 분석에 의해 바이러스 수율을 측정하였다. 도 4B에 요약된 결과는 SHD1 추출물이 바이러스 감염의 초기 단계에 바이러스 복제를 유의하게 억제 함을 나타낸다. 감염 전 2 시간 (시점 -2) 및 1 시간 (시점 -1)에 SHD1 추출물을 첨가하였을 때, SHD1은 바이러스 대조군과 비교하여 바이러스 수율을 89% 및 90% 약화시킬 수 있었다. 한편, 감염 시점 (시점 0) 및 감염 후 1 시간, 3 시간 및 5 시간에 첨가된 SHD1 추출물에 대해, 각 그룹의 억제 효능은 각각 단 24%, 13%, 11% 및 18%였다.
제거 시간 분석 (도 4C 참조)을 위해, 세포를 감염시키기 전에 6 μg/ml의 SHD1을 첨가하였다. 배양 배지를 새로운 E2 배지로 교체하여 AM 추출물을 지시된 간격으로 제거하였다. 8 시간 후에 세포를 수거하고 바이러스 수율을 플라크 분석에 의해 측정하였다. 결과는 도 4D에 요약되어 있다. 도 4D에 따르면, SHD1 추출물이 시점 -1에서 (예를 들어, 바이러스 부착 전) 제거되었을 때, 바이러스 수율은 바이러스 대조군에 대해 114%였다. 한편, SHD1 추출물이 "0", "+1", "+3" 및 "+5"시점에서 제거되었을 때, 바이러스 수율은 각각 단 20%, 20%, 20% 및 16%였다.
종합하면, 이들 결과는 본 AM 추출물 (예를 들어, SHD1 추출물)이 EV 감염의 초기 단계에서 유의한 억제 효과를 나타냈음을 제시한다.
본 AM 추출물의 억제 효과가 EV 바이러스에 직접 작용하여 (예를 들어, 바이러스 자체를 제거함) 발생하는지 또는 초기 감염 과정에 작용하여 (예를 들어, 바이러스와 숙주 세포 간의 상호 작용을 방해함) 발생하는 지를 추가로 밝히기 위해 하기 분석을 수행하였다.
초기 단계 동안, 1×105 P.F.U.의 EV71/TW/4643/1998을 24 μg/ml의 SHD1 추출물과 함께, 또는 SHD1 추출물없이 실온에서 3 시간 동안 혼합하였다. 이어서, 제2 단계에서, 혼합물을 플라크 분석 전에 10,000 배 희석하였다.
도 4E에 요약된 결과는 SHD1 처리 그룹에서 바이러스 수율은 SHD1 추출물로 처리하지 않은 대조군에 대해 114%임을 나타낸다. 알 수 있는 바와 같이, SHD1-처리 그룹에서, 바이러스는 먼저 추출물의 EC50 (약 2-3 μg/ml)보다 높은 농도 (24 μg/ml)에서 SHD1 추출물로 처리되었고, 희석 후, SHD1 추출물의 농도는 그의 EC50보다 훨씬 낮았다. 따라서, SHD1 추출물이 EV 바이러스 자체에 직접 작용하였다면, 대부분의 바이러스는 고용량 SHD1 추출물의 초기 치료시 감염 능력을 상실할 것이기 때문에 처리 그룹에서 바이러스 수율은 현저히 줄어들 것이다. 그러나, 플라크 분석 결과는 달리 제시한다. SHD1 처리 그룹에서 관찰된 상당한 바이러스 수율은 SHD1 추출물이 EV 바이러스 자체에 작용하지 않았음을 나타낸다.
희석 후 SHD1-처리 그룹에서의 플라크 형성 능력으로부터 판단하고, 첨가 시간 및 제거 시간 분석으로부터의 결과를 고려해 볼 때, 본 AM 추출물이 부착 또는 접착 단계와 같은 바이러스 감염의 초기 과정을 방해할 가능성이 더 높을 것으로 보인다.
실시예 4: EV71/MP4 감염 ICR 마우스에 대한 SHD1의 치료 효능
0 일에, EV71/MP4 (3.0 × 106 PFU/마우스)를 i.p. 경로를 통해 10 일령 ICR 마우스에 접종하였다. 접종 1 시간 후, 마우스에 i.p. 주사를 통해 0.375, 0.75, 1.5 또는 3 mg/kg/일의 SHD1 추출물을 투여하거나, 1, 5 또는 50 mg/kg/일의 SHD1 추출물을 10 일 연속 하루 한 번 경구 투여하였다. 임상 점수 및 생존율을 15 일 동안 (0 일에서 14 일까지) 모니터링하였다; 결과가 도 5A (SHD1 추출물의 주사에 대한 것) 및 도 5B (SHD1 추출물의 경구 투여에 대한 것)에 요약되었다. 임상 점수 "0"은 건강함, "1"은 약함, "2"는 한쪽 다리의 마비, "3"은 두 다리의 마비, "4"는 사망을 의미한다.
도 5A의 데이터는 비히클-처리된 대조군 마우스와 비교하여 1.5 또는 3 mg/kg/일의 SHD1 추출물로 처리된 마우스가 더 우수한 임상 점수를 나타냄을 입증한다. 한편, 경구 투여 그룹의 경우, 5 mg/kg의 SHD1 추출물이 제공된 마우스는 비히클-처리된 마우스에 비해 약간 개선된 반면, 50 mg/kg의 SHD1 추출물로 처리된 마우스에서는 현저한 개선이 관찰되었다. 또한, 시험된 용량에 대한 치료 효능에 관해 유의한 용량-의존적 반응은 없었다.
실시예 5: 호흡기 세포 융합 바이러스에 대한 AM 추출물의 항바이러스 활성
숙주 세포로서 MA-104 세포를 사용하여 일차 세포 변성 효과 (CPE) 감소 분석으로 RSV 바이러스에 대한 본 AM 추출물의 항바이러스 활성 (EC50)을 조사하였다. 뉴트럴 레드 (NR) 기반 시험관 내 독성 분석법을 사용하여 CC50을 측정하였다.
표 13에 요약된 데이터는 본 SH1 추출물이 RSV 감염에 대해 3.55 배 더 보호적임을 나타낸다.
RSV에 대한 AM 추출물의 항바이러스 활성
샘플 EC50 (μg/ml) CC50 (μg/ml) SI
FE-L-APO
SH1 (SP-100KD)
SHR1
SHD1		 611 ± 8
211
325±10
91.5 ± 5.5		 >10000
>10000
>10000
10000		 >59
>476
>30
>109
실시예 6: 에볼라 바이러스에 대한 AM 추출물의 항바이러스 활성
숙주 세포로서 베로 CCL81 (Vero CCL81) 세포를 사용하는 플라크 감소 분석법으로 본 AM 추출물의 항-에볼라 활성 (EC50)을 측정하고; 뉴트럴 레드 (NR) 기반 시험관 내 독성 분석법을 사용하여 CC50을 측정하였다. 본 실시예에서는, 종래 FE-L-APO 추출물 및 항바이러스제인 파비피라비르가 대조군으로서 사용되었다.
결과는 표 14에 요약된 바와 같이, SH1 추출물이 20을 초과한 선택 지수로 500 μg/ml의 EC50에서 에볼라 바이러스의 감염을 억제하였고, 에볼라 바이러스에 대한 FE-L-APO의 EC50은 270이고 선택 지수는 37을 초과하였음을 보여준다.
에볼라 바이러스/자이르에 대한 AM 추출물의 항바이러스 활성
샘플 EC50 (μg/ml) CC50 (μg/ml) SI
FE-L-APO
SH1 (SP-100 KD)
파비피라비르 (양성 대조군)		 270
500
96 μM		 >10000
>10000
>1000 μM		 >37
>20
>10
항-에볼라 활성과 AM 추출물의 분획 성분 사이의 관계를 추가로 명확히 밝히기 위해, FE-L-APO 추출물로부터의 알로피코시아닌 (APC), C-피코시아닌 (C-PC), FE-L-APO (H), 및 FE-L-APO (T) 분획, 및 SH1으로부터의 SHD1 및 SHR1 분획으로 처리된 에볼라로 감염된 CellTiter96 (MTS) 세포를 실시간 폴리머라제 연쇄 반응을 사용하여 바이러스 수율 감소 분석을 수행하였다.
표 15에 요약된 데이터는 알로피코시아닌 분획이 4 개의 FE-L-APO 분획 중 에볼라 감염을 억제하는데 가장 효과적이었음을 나타낸다. 반면, SHD1의 EC50은 SHR1의 EC50보다 현저히 낮았다. 또한, SHR1 및 SHD1 분획 모두 4 개의 FE-L-APO 분획보다 에볼라 감염 억제에 더 효과적이었다.
데이터는 또한 SHD1 및 SHR1 추출물이 각각 9.99 μg/ml 및 30.4 μg/ml에서 EC90 (바이러스 복제가 90% 억제됨)을 달성했음을 보여준다. 대조적으로, 모든 FE-L-APO 분획에 대한 EC90은 400 μg/ml를 초과하였다.
에볼라 바이러스/자이르에 대한 추가 분획의 항바이러스 활성
샘플 EC50 (μg/ml) EC90 (μg/ml) CC50 (μg/ml) SI SI90 *
알로피코시아닌
C-피코시아닌
FE-L-APO (H)
FE-L-APO (T)
SHD1
SHR1
E64D (양성 대조군)		 1.77
242
149
>400
1.35
9.1
<1.26 μM		 >400
>400
>400
>400
9.99
30.4
5.69 μM		 >400
>400
>400
>400
>400
>400
>400 μM		 >226
>2
>3
--
>296
>44
>317		 --
--
--
--
>40
>13
>70
* SI90: 선택성 지수, CC50 대 EC90 비.
실시예 7: 돼지 유행성 설사 바이러스에 대한 AM 추출물의 항바이러스 활성
본 실시예서는 돼지 유행성 설사 바이러스 (PEDV)에 대한 AM 추출물의 억제 활성을 조사하였다. 본 실시예에서, AM 추출물을 먼저 바이러스와 혼합하였다. 구체적으로, DMEM (50 ㎕/웰), 50 ㎕의 FE-L-APO (2 mg/ml) 또는 SH (20 mg/ml), 및 1,000 PFU, 100 PFU, 또는 10 PFU를 함유하는 PEDV 바이러스 용액 100 ㎕/웰을 96-웰 플레이트의 각 웰에 순차적으로 첨가하였다. 양성 대조군의 경우에는, 100 ㎕/웰 DMEM을 100 ㎕/웰의 상이한 바이러스 농도와 혼합한 반면, 음성 대조군에서는 200 ㎕의 DMEM을 사용하였다. 이어서, 플레이트를 37 ℃에서 60 분 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 각 웰로부터의 혼합물 (200 ㎕)을 밤새 배양된 베로 세포 (1×105 세포/웰)를 함유하는 96-웰 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 이어서 플레이트를 37 ℃에서 5 일 동안 인큐베이션하였다. 일차 세포 변성 효과를 측정하고 결과를 표 16에 요약하였다.
결과 (3 회 중복)는 세포가 1,000 PFU, 100PFU, 10 PFU 바이러스에서 FE-L-APO의 존재시 바이러스 플라크의 형성을 억제할 수 없음을 보여준다. 한편, SH 추출물은 양성 대조군에 비해 베로 세포에서 PEDV 바이러스 플라크를 55-75%까지 현저히 감소시켰다.
돼지 유행성 설사 바이러스 억제 시험
PFU
1,000 100 10
FE-L-APO 1002
1010
1006		 102
104
105		 13
12
9
SH 450
467
462		 34
25
30		 5
3
4
양성 대조군 1002
1005
998		 100
103
102		 9
12
11
음성 대조군 0 0 0
실시예 8: 돼지 생식기·호흡기 증후군 바이러스에 대한 AM 추출물의 항바이러스 활성
본 시험에서는, 돼지 생식기·호흡기 증후군 바이러스 (PRRSV)에 대한 본 AM 추출물의 억제 활성을 조사하였다. 본 실시예에서, AM 추출물을 먼저 숙주 세포와 혼합하였다. 간략하게, 베로 세포 (1×105 세포/웰)를 96-웰 플레이트에서 밤새 배양하였다. 그 후, 50 ㎕의 FE-L-APO (2 mg/ml) 및 SH (20 mg/ml)를 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 37 ℃에서 60 분 동안 유지하였다. 이어서, 1,000 PFU, 100 PFU 또는 10 PFU를 함유하는 PRRSV 바이러스 용액 (100 ㎕/웰)을 각 웰에 첨가하였다. 양성 대조군의 경우에는, 100 ㎕/웰 DMEM을 100 ㎕/웰의 상이한 농도의 바이러스와 혼합한 반면, 음성 대조군에서는 200 ㎕의 DMEM을 사용하였다. 이어서 플레이트를 37 ℃에서 5 일 동안 인큐베이션하고, 일차 세포 변성 효과를 매일 측정하였다.
결과 (3 회 중복)는 표 17에 요약된 바와 같이, 추출물을 첨가하기 전에 세포가 PRRSV 1,000 PFU로 감염된 경우, FE-L-APO 추출물도 SH 추출물도 바이러스 감염을 억제하는 데에 효과적일 수 없음을 나타낸다. 그러나, 100 PFU의 PRRSV로 감염된 세포에 대해, 본 SH 추출물은 숙주 세포의 90% 이상을 PRRSV 감염으로부터 보호하였다.
돼지 생식기·호흡기 증후군 바이러스 억제 시험 I
PFU
1000 100 10
FE-L-APO 1001
1020
1012		 20
18
28		 1
2
1
SH 998
995
1003		 6
5
3		 7
6
9
양성 대조군 1003
1005
1003		 105
102
106		 10
12
9
음성 대조군 0 0 0
본 시험에서, AM 추출물을 먼저 PRRSV와 혼합하였다. 간략하게, AM 추출물을 먼저 바이러스와 혼합하였다. 구체적으로, DMEM (50 ㎕/웰), 50 ㎕의 FE-L-APO (2 mg/ml) 또는 SH (20 mg/ml), 및 1,000 PFU, 100 PFU, 또는 10-PFU를 함유하는 100 ㎕/웰의 PRRSV 바이러스 용액을 96-웰 플레이트의 각 웰에 순차적으로 첨가하였다. 양성 대조군의 경우에는, 100 ㎕/웰 DMEM을 상이한 바이러스 농도의 100 ㎕/웰과 혼합한 반면, 음성 대조군에서는 200 ㎕의 DMEM을 사용하였다. 이어서, 플레이트를 37 ℃에서 60 분 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 각 웰로부터의 혼합물 (200 ㎕)을 밤새 배양된 베로 세포 (1×105 세포/웰)를 함유하는 96-웰 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 이어서 플레이트를 37 ℃에서 5 일 동안 인큐베이션하였다. 일차 세포 변성 효과를 측정하고 결과를 표 18에 요약하였다.
결과는 바이러스가 본 SH 추출물로 전처리된 경우, 세포가 고농도의 PRRSV 바이러스 (예를 들어, 1,000 PFU)로 감염된 경우에도 바이러스 감염 효능이 약 50% 감소되었음을 입증한다. 또한, 세포가 더 낮은 농도의 PRRSV (예를 들어, 100 또는 10 PFU)로 감염된 경우에도, PRRSV 감염의 총 억제가 달성되었다.
돼지 생식기·호흡기 증후군 바이러스 억제 시험 II
PFU
1,000 100 10
FE-L-APO 679
691
698		 0
0
0		 0
0
0
SH 510
520
493		 0
0
0		 0
0
0
양성 대조군 1004
1007
999		 106
104
101		 8
12
11
음성 대조군 0 0 0
실시예 9: 소화 효소 처리 후 AM 추출물의 항바이러스 활성
본 실시예에서, 본 AM 추출물을 소화 효소로 처리하고, AM 추출물이 경구 섭취 시에 그의 항바이러스 활성을 상실할 것인지를 밝히기 위해 EC50을 결정하였다.
SH 분말을 실온에서 d.d.수에 용해시키고, pH를 6으로 조정하였다. α-아밀라제 (100 ㎕/1 g 샘플)를 95 ℃ 수조 (진탕 속도: 40 rpm)에서 SH 용액에 30 분 동안 첨가하여 (1-4)-α-D-글루칸을 소화시켰다. 이어서 샘플을 실온으로 냉각시키고, 6N NaOH를 첨가하여 pH를 7.5로 조정하였다. 프로테아제 (50 mg/1 g 샘플)를 60 ℃ 수조 (진탕 속도: 40 rpm) 중의 샘플에 30 분 동안 첨가하여 단백질 내용물을 제거하였다. 샘플을 다시 실온으로 냉각시키고, 6N HCl을 첨가하여 pH를 4.5로 조정하였다. 아밀로글루코시다제 (300 ㎕/1 g 샘플)를 60 ℃ 수조 (진탕 속도: 40 rpm) 중의 샘플에 30 분 동안 첨가하여 α-D-1,4 ｀1,6 글루칸을 소화시켰다. 효소 활성을 억제하기 위해, 샘플을 30 분 동안 100 ℃로 가열한 다음, 실온으로 냉각시켰다. 샘플을 3,500 rpm에서 30 분 동안 원심분리하였다. 상등액을 4 부피의 알콜로 침전시키고, 침전물을 SH-EA 샘플로서 수집하였다. SH 및 SH-EA 샘플을 상술된 바와 같이 중화 시험에 적용하여 RD 세포에서 EV71/TW/4643/1998에 의해 유도된 세포 변성 효과의 억제를 측정하였다.
표 19에 요약된 데이터는 SH-EA (즉, 다양한 소화 효소로 처리된 SH 추출물)가 SH 추출물보다 EC50이 더 낮음을 나타낸다. 이들 데이터는 본 SH 추출물이 소화된 후에도 바람직한 항바이러스 활성을 유도할 수 있음을 제시한다. 따라서, 장 투여 (예를 들어, 경구 투여) 시, AM 추출물은 생체 내에서 항바이러스 활성을 유지할 가능성이 매우 높다.
소화 효소 처리 후 AM 추출물의 항바이러스 활성
샘플 EC50 (μg/ml)
SH
SH-EA		 14.25 ± 0.35
10.62 ± 0.24
상기 실시양태들에 대한 설명은 단지 예로서 주어진 것이고 다양한 변형이 당업자에 의해 이루어질 수 있다는 것이 이해될 것이다. 상기 명세서, 실시예 및 데이터는 본 발명의 예시적인 실시양태의 구조 및 사용에 대한 완전한 설명을 제공한다. 본 발명의 다양한 실시양태가 어느 정도 특정하게, 또는 하나 이상의 개별 실시양태를 참조하여 위에서 설명되었지만, 당업자라면 본 발명의 사상 또는 범위를 벗어나지 않고 개시된 실시양태를 상당히 변경시킬 수 있을 것이다.

Claims (29)

  1. AM 추출물 중에 적어도 25% (wt%)의 전당 (total sugar)을 포함하는 아트로스피라 막시마 (Arthrospira maxima) 추출물 (AM 추출물).
  2. 제1항에 있어서, AM 추출물 중의 전당 함량이 25 내지 75% (wt%)인, AM 추출물.
  3. 제1항에 있어서, AM 추출물이 분자량 컷오프 (MWCO)가 100 KD인 여과막을 사용하여 수득할 수 있는 고 분자량 분획으로부터 유래되는, AM 추출물.
  4. 제1항에 있어서, AM 추출물이 추출물 중 전당을 기준으로 적어도 60% (wt%)의 중성 및/또는 양으로 하전된 다당류를 포함하는, AM 추출물.
  5. 제4항에 있어서, 추출물 중 전당을 기준으로 중성 및/또는 양으로 하전된 다당류의 함량이 60 내지 100% (wt%)인, AM 추출물.
  6. 제1항에 있어서, AM 추출물이 람노스를 주요 글리코실 성분으로 포함하는, AM 추출물.
  7. 제6항에 있어서, AM 추출물이 적어도 30 몰%의 람노스를 포함하는, AM 추출물.
  8. 제1항에 있어서, AM 추출물이 추출물 중 전당을 기준으로 적어도 60% (wt%)의 중성 및/또는 양으로 하전된 다당류 및 적어도 30 몰%의 람노스를 포함하는, AM 추출물.
  9. 제1항에 있어서, 가장 풍부한 글리코실 연결이 3-rhap인, AM 추출물.
  10. 제1항에 있어서, AM 추출물이 분자량 컷오프 (MWCO)가 100 KD인 여과막을 사용하여 수득할 수 있는 고 분자량 분획으로부터 유래되고, 추출물 중 전당을 기준으로 적어도 60% (wt%)의 중성 및/또는 양으로 하전된 다당류를 포함하는, AM 추출물.
  11. 아트로스피라 막시마 (Arthrospira maxima) 바이오매스를 80-120 ℃의 열수에서 추출하여 조 추출물을 수득하는 단계;
    상기 조 추출물로부터 고체 잔류물을 제거하여 열수 추출물을 수득하는 단계; 및
    임의로, 열수 추출물을 건조시켜 열수 추출물 분말을 수득하는 단계를 포함하는,
    제1항에 따른 AM 추출물의 제조 방법.
  12. 제11항에 있어서,
    열수 추출물 또는 열수 추출물 분말을 포함하는 용액을 분자량 컷오프 값이 100 KD인 여과막을 사용해 여과하여 고 분자량 분획을 수득하는 단계; 및
    임의로, 고 분자량 분획을 건조시켜 고 분자량 추출물 분말을 수득하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  13. 제12항에 있어서,
    고 분자량 분획 또는 고 분자량 추출물 분말을 포함하는 용액을 음이온-교환 컬럼을 사용한 음이온-교환 크로마토그래피에 적용하는 단계;
    음이온 교환 컬럼을 통해 흐르는, 양으로 하전 및/또는 중성의 다당류가 풍부한 AM 추출물을 포함하는 유출물을 수집하는 단계;
    음이온 교환 컬럼을 염 용액으로 용리시켜 음으로 하전된 다당류가 풍부한 AM 추출물을 포함하는 용출물을 수집하는 단계; 및
    임의로, 유출물 또는 용출물을 각각 건조시켜 양으로 하전되거나 중성의 다당류가 풍부한 추출물 분말 및 음으로 하전된 다당류가 풍부한 추출물 분말을 수득하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  14. 제13항에 있어서, 음이온 교환 컬럼이 디에틸 아미노에틸 (DEAE) 기반 컬럼, 사차 아미노에틸 (QAE) 기반 컬럼 또는 트리메틸아미노 에탄 (TMAE) 기반 컬럼인, 방법.
  15. 엔테로바이러스 (EV), 호흡기 세포 융합 바이러스 (RSV), 인간 헤르페스바이러스 (HHV), 에볼라 바이러스, 돼지 유행성 설사 바이러스 (PEDV) 또는 돼지 생식기·호흡기 증후군 바이러스 (PRRSV)로 인한 바이러스 감염, 또는 상기 바이러스 감염으로 유발된 장애의 치료에 사용하기 위한 의약 제조에서의 제1항 내지 제10 항중 어느 한 항에 따른 AM 추출물의 용도.
  16. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 엔테로바이러스 (EV), 호흡기 세포 융합 바이러스 (RSV), 인간 헤르페스바이러스 (HHV), 에볼라 바이러스, 돼지 유행성 설사 바이러스 (PEDV) 또는 돼지 생식기·호흡기 증후군 바이러스 (PRRSV)로 인한 바이러스 감염, 또는 상기 바이러스 감염으로 유발된 장애의 치료에 사용하기 AM 추출물.
  17. 영양 보조적으로 허용되는 부형제 및 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 AM 추출물을 포함하는 영양 보조 조성물.
  18. 제1항 내지 제10항중 어느 한 항에 따른 AM 추출물 및 약학상 허용되는 부형제를 포함하는, 엔테로바이러스 (EV), 호흡기 세포 융합 바이러스 (RSV), 인간 헤르페스바이러스 (HHV), 에볼라 바이러스, 돼지 유행성 설사 바이러스 (PEDV) 또는 돼지 생식기·호흡기 증후군 바이러스 (PRRSV)로 인한 바이러스 감염, 또는 상기 바이러스 감염으로 유발된 장애를 치료하기 위한 약학 조성물.
  19. 고체 지지체와, 이 고체 지지체의 한 표면 상에 코팅된 접착층을 포함하고, 상기 접착층은 제1항 내지 제10항중 어느 한 항에 따른 AM 추출물을 포함하는 생체적합성 드레싱.
  20. 제1항 내지 제10항중 어느 한 항에 따른 AM 추출물의 유효량을 바이러스 감염의 치료가 필요한 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 상기 대상체에서 엔테로바이러스 (EV), 호흡기 세포 융합 바이러스 (RSV), 인간 헤르페스바이러스 (HHV), 에볼라 바이러스, 돼지 유행성 설사 바이러스 (PEDV) 또는 돼지 생식기·호흡기 증후군 바이러스 (PRRSV)로 인한 바이러스 감염, 또는 상기 바이러스 감염으로 유발된 장애를 치료하는 방법.
  21. 제20항에 있어서, 대상체가 포유동물인, 방법.
  22. 제21항에 있어서, 대상체가 인간인, 방법.
  23. 제20항에 있어서, AM 추출물이 전신적으로 투여되는, 방법.
  24. 제20항에 있어서, AM 추출물이 국소적으로 투여되는, 방법.
  25. 숙주 세포를 제1항 내지 제10항중 어느 한 항에 따른 AM 추출물의 유효량에 노출시키는 단계를 포함하는, 상기 숙주 세포에서 엔테로바이러스 (EV), 호흡기 세포 융합 바이러스 (RSV), 인간 헤르페스바이러스 (HHV), 에볼라 바이러스, 돼지 유행성 설사 바이러스 (PEDV) 또는 돼지 생식기·호흡기 증후군 바이러스 (PRRSV)의 바이러스 복제를 억제하는 방법.
  26. 제25항에 있어서, 숙주 세포가 포유동물 숙주 세포인, 방법.
  27. 제25항에 있어서, 숙주 세포가 살아있는 대상체에 존재하는, 방법.
  28. 제27항에 있어서, 대상체가 포유동물인, 방법.
  29. 제28항에 있어서, 대상체가 인간인, 방법.
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