CN103610705B - 高山绣线菊提取物在制备抗病毒药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种高山绣线菊提取物的新用途，该新用途是高山绣线菊提取物在制备抗病毒药物中的应用。所述高山绣线菊提取物是按如下方法制备的：以高山绣线菊为原料，先提取挥发油，再用浓度30%-75%乙醇提取，通过大孔吸附树脂、中性氧化铝纯化得到。本发明所提供的高山绣线菊提取物对制备抗病毒药物具有重要意义。

Description

高山绣线菊提取物在制备抗病毒药物中的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及一种中药材提取物在制备抗病毒药物中的应用，具体是涉及高山绣线菊提取物在制备抗病毒药物中的应用。

背景技术

目前大量使用抗生素引起的细菌耐药性不断上升已成为全世界共同关注的难题之一。尤其是金黄色葡萄球菌的耐药率已达90％以上。单纯疱疹病毒II型主要引起生殖器部位皮肤粘膜感染。病毒经呼吸道、口腔、生殖器粘膜以及破损皮肤进入体，潜居于人体正常粘膜、血液、唾液及感觉神经节细胞内。当机体抵抗力下降时，如发热、胃肠功能紊乱、月经、妊娠、病灶感染和情绪改变时，体内潜伏的HSV-II 被激活而发病。合成药物在单纯疱疹性的治疗中较肯定的抗病毒药物是阿昔洛韦（ACV），但近年来临床不断发现ACV 的耐药株，且耐药性随药物疗程的延长有增长趋势。

因此，开发新的高效低毒的抗菌、抗病毒药物具有广阔的前景，传统中药的多靶点作用机制、低毒副作用、易于代谢、无耐药性等优点使它成为筛选高效低毒的抗菌、抗病毒药物的热点。

高山绣线菊为蔷薇科植物高山绣线菊Spiraea alpina Turcz.的干燥花、叶。花期采集，晒干。收载于1998年《中华人民共和国卫生部药品标准 蒙药分册》性凉，味甘。具有清骨热，生津，止血，敛黄水之功效。用于治疮疡，黄水病，腹水，肺瘀血，子宫出血。为我国藏蒙等少数民族地区的常用药物。但有关高山绣线菊的基础研究尚十分有限，使该药材的后续推广和应用受到限制。现代研究表明，高山绣线菊含有生物碱类成分；高山绣线菊乙醇提取物对家蚕乙酰胆碱酯酶具有抑制作用，对纯酶的IC₅₀达到了0.091×10^-3g ·mL^-1，其他药理作用研究未见报道。

国内专利检索结果，未见高山绣线菊相关专利。

上述文献及专利等，尚未见高山绣线菊或高山绣线菊提取物抗菌、抗病毒作用研究的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供高山绣线菊提取物的在制备抗病毒药物中的应用。

本发明是通过如下技术方案实现的：

本发明所用高山绣线菊为蔷薇科植物高山绣线菊Spiraea alpina Turcz.的干燥花、叶。

本发明高山绣线菊提取物在制备抗病毒药物中的应用，所述高山绣线菊提取物的制备方法为:

（1）高山绣线菊，用浓度95%乙醇提取，滤过，得提取液A和药渣A，提取液A浓缩至无醇清膏，加入蒸馏水，进行水蒸汽蒸馏，收集馏出液，加入馏出液重量4%的β环糊精包合，低温冷藏，过滤，低温干燥，即得高山绣线菊挥发油包合物；

（2）将步骤（1）得到的药渣A用浓度30%-75%乙醇溶液作为溶剂，提取温度50℃-95℃，提取次数为1-3次，每次提取时间为1-4小时，每次溶剂用量为高山绣线菊重量的6-15倍；滤过，得提取液B和药渣B；提取液B，回收乙醇，浓缩至相对密度d=1.10-1.18，滤过，得药液C；

（3）将步骤（2）得到的药液C，通过大孔吸附树脂，先用水洗脱，再用浓度30%-95%的乙醇溶液洗脱，收集不同浓度乙醇洗脱液，浓缩干燥，即得高山绣线菊提取物A；

（4）将步骤（2）得到的药渣B，用浓度1%-5%盐酸溶液作为溶剂，提取温度60℃-80℃，提取次数为1-3次，每次提取时间为1-3小时，每次溶剂用量为高山绣线菊重量的10-15倍；滤过，合并提取液，浓缩干燥，得提取物，通过中性氧化铝柱纯化，用二氯甲烷-甲醇（10:1-6:4）梯度洗脱，收集二氯甲烷-甲醇（8:1-7:3）部分洗脱液，回收溶剂，浓缩，干燥，得高山绣线菊提取物B；

（5）上述高山绣线菊挥发油包合物、高山绣线菊提取物A、高山绣线菊提取物B，其中一种或两种或三种按一定比例混匀，即得本发明的高山绣线菊提取物。

高山绣线菊提取物的制备方法为：

（1）高山绣线菊，用浓度95%乙醇提取，滤过，得提取液A和药渣A，提取液A浓缩至无醇清膏，加入蒸馏水，进行水蒸汽蒸馏，收集馏出液，加入馏出液重量4%的β环糊精包合，低温冷藏，过滤，低温干燥，即得高山绣线菊挥发油包合物；

（2）将步骤（1）得到的药渣A用浓度30%-75%乙醇溶液作为溶剂，提取温度50℃-95℃，提取次数为1-3次，每次提取时间为1-4小时，每次溶剂用量为高山绣线菊重量的6-15倍；滤过，得提取液B和药渣B；提取液B，回收乙醇，浓缩至相对密度d=1.10-1.18，滤过，得药液C；

（3）将步骤（2）得到的药液C，通过大孔吸附树脂，先用水洗脱，再用浓度30%-95%的乙醇溶液洗脱，收集不同浓度乙醇洗脱液，浓缩干燥，即得高山绣线菊提取物A；

（4）将步骤（2）得到的药渣B，用浓度1%-5%盐酸溶液作为溶剂，提取温度60℃-80℃，提取次数为1-3次，每次提取时间为1-3小时，每次溶剂用量为高山绣线菊重量的10-15倍；滤过，合并提取液，浓缩干燥，得提取物，通过中性氧化铝柱纯化，用二氯甲烷-甲醇（10:1-6:4）梯度洗脱，收集二氯甲烷-甲醇（8:1-7:3）部分洗脱液，回收溶剂，浓缩，干燥，得高山绣线菊提取物B；

（5）上述高山绣线菊挥发油包合物、高山绣线菊提取物A、高山绣线菊提取物B混匀，即得本发明的高山绣线菊提取物。

优选的高山绣线菊提取物的制备方法为:

（1）高山绣线菊，用浓度95%乙醇提取，滤过，得提取液A和药渣A，提取液A浓缩至无醇清膏，加入蒸馏水，进行水蒸汽蒸馏，收集馏出液，加入馏出液重量4%的β环糊精包合，低温冷藏，过滤，低温干燥，即得高山绣线菊挥发油包合物；

（2）将步骤（1）得到的药渣A用浓度60%乙醇溶液作为溶剂，提取温度80℃，提取次数为2次，每次提取时间为2小时，每次溶剂用量为高山绣线菊重量的12倍；滤过，得提取液B和药渣B；提取液B，回收乙醇，浓缩至相对密度d=1.13，滤过，得药液C；

（3）将步骤（2）得到的药液C，通过ADS-3大孔吸附树脂，先用水洗脱，再用浓度80%的乙醇溶液洗脱，收集80%浓度乙醇洗脱液，浓缩干燥，即得高山绣线菊提取物A；

（4）将步骤（2）得到的药渣B，用浓度2%盐酸溶液作为溶剂，提取温度70℃，提取次数为2次，每次提取时间为2小时，每次溶剂用量为高山绣线菊重量的12倍；滤过，合并提取液，浓缩干燥，得提取物，通过中性氧化铝柱纯化，用二氯甲烷-甲醇（10:1-6:4）梯度洗脱，收集二氯甲烷-甲醇（8:1-7:3）部分洗脱液，回收溶剂，浓缩，干燥，得高山绣线菊提取物B；

（5）上述高山绣线菊挥发油包合物、高山绣线菊提取物A、高山绣线菊提取物B混匀，即得本发明的高山绣线菊提取物。

本发明的高山绣线菊提取物制备方法，其特征在于：所采用的大孔吸附树脂为HP20大孔吸附树脂、ADS-3大孔吸附树脂、ADS-17大孔吸附树脂。

本发明的高山绣线菊高山绣线菊提取物A、高山绣线菊提取物B、高山绣线菊挥发油包合物在制备抗病毒药物中的应用。

本发明的高山绣线菊提取物与化学药或中药或天然药物组成的抗病毒药物。

本发明的高山绣线菊提取物A、高山绣线菊提取物B、高山绣线菊挥发油包合物与化学药或中药或天然药物组成的抗病毒药物。

本发明的高山绣线菊提取物，通过加入药剂学允许的各种辅料，制成药剂学上的片剂、颗粒剂、胶囊等口服剂型。

本发明的高山绣线菊提取物通过多组分，多环节、多途径地发挥协同作用而表现出抗病毒功效，对HSV-II 侵入细胞的阻断作用和直接杀灭病毒是高山绣线菊体外抗病毒的主要作用途径。HSV-II 是有包膜的病毒，最外层的包膜由脂质和糖蛋白组成，其中任何一种成分改变，即可使包膜变性，从而灭活病毒。实验结果表明高山绣线菊各提取物对HSV-II 的直接灭活作用较强，尤其是高山绣线菊提取物和高山绣线菊提取物A直接灭活HSV-II 的作用比ACV 更加显著。HSV-II 侵入细胞的阻断作用研究表明，高山绣线菊提取物不仅有抗病毒活性，还具有一定程度保护细胞防止病毒侵入的作用。利用HSV-II 脑炎模型研究高山绣线菊提取物对HSV-II 感染小鼠的保护作用，结果表明高山绣线菊提取物表现出一定的抗病毒活性。

具体实施方式

下面通过具体实验例和实施例对高山绣线菊提取物在制备抗病毒药物中的应用做进一步说明，但不限于本发明。

实施例1：高山绣线菊提取物的制备

（1）高山绣线菊18kg，用浓度95%乙醇提取，滤过，得提取液A和药渣A，提取液A浓缩至无醇清膏，加入蒸馏水，进行水蒸汽蒸馏，收集馏出液，加入馏出液重量4%的β环糊精包合，低温冷藏，过滤，低温干燥，即得高山绣线菊挥发油包合物；

（2）将步骤（1）得到的药渣A用浓度60%乙醇溶液作为溶剂，提取温度80℃，提取次数为2次，每次提取时间为2小时，每次溶剂用量为高山绣线菊重量的12倍；滤过，得提取液B和药渣B；提取液B，回收乙醇，浓缩至相对密度d=1.13，滤过，得药液C；

（3）将步骤（2）得到的药液C，通过ADS-3大孔吸附树脂，先用水洗脱，再用浓度80%的乙醇溶液洗脱，收集80%浓度乙醇洗脱液，浓缩干燥，即得高山绣线菊提取物A；

（4）将步骤（2）得到的药渣B，用浓度2%盐酸溶液作为溶剂，提取温度70℃，提取次数为2次，每次提取时间为2小时，每次溶剂用量为高山绣线菊重量的12倍；滤过，合并提取液，浓缩干燥，得提取物，通过中性氧化铝柱纯化，用二氯甲烷-甲醇（10:1-6:4）梯度洗脱，收集二氯甲烷-甲醇（8:1-7:3）部分洗脱液，回收溶剂，浓缩，干燥，得高山绣线菊提取物B；

（5）上述高山绣线菊挥发油包合物、高山绣线菊提取物A、高山绣线菊提取物B混匀，即得本发明的高山绣线菊提取物。

实施例2：高山绣线菊提取物的制备

（1）高山绣线菊15kg，用浓度95%乙醇提取，滤过，得提取液A和药渣A，提取液A浓缩至无醇清膏，加入蒸馏水，进行水蒸汽蒸馏，收集馏出液，加入馏出液重量4%的β环糊精包合，低温冷藏，过滤，低温干燥，即得高山绣线菊挥发油包合物；

（2）将步骤（1）得到的药渣A用浓度30%乙醇溶液作为溶剂，提取温度95℃，提取次数为1次，每次提取时间为4小时，每次溶剂用量为高山绣线菊重量的15倍；滤过，得提取液B和药渣B；提取液B，回收乙醇，浓缩至相对密度d=1.18，滤过，得药液C；

（3）将步骤（2）得到的药液C，通过HP20大孔吸附树脂，先用水洗脱，再用浓度30%的乙醇溶液洗脱，收集30%浓度乙醇洗脱液，浓缩干燥，即得高山绣线菊提取物A；

（4）将步骤（2）得到的药渣B，用浓度5%盐酸溶液作为溶剂，提取温度60℃，提取次数为3次，每次提取时间为1小时，每次溶剂用量为高山绣线菊重量的10倍；滤过，合并提取液，浓缩干燥，得提取物，通过中性氧化铝柱纯化，用二氯甲烷-甲醇（10:1-6:4）梯度洗脱，收集二氯甲烷-甲醇（8:1-7:3）部分洗脱液，回收溶剂，浓缩，干燥，得高山绣线菊提取物B；

（5）上述高山绣线菊挥发油包合物、高山绣线菊提取物A、高山绣线菊提取物B混匀，即得本发明的高山绣线菊提取物。

实施例3：高山绣线菊提取物及单体化合物制备

（1）高山绣线菊20kg，用浓度95%乙醇提取，滤过，得提取液A和药渣A，提取液A浓缩至无醇清膏，加入蒸馏水，进行水蒸汽蒸馏，收集馏出液，加入馏出液重量4%的β环糊精包合，低温冷藏，过滤，低温干燥，即得高山绣线菊挥发油包合物；

（2）将步骤（1）得到的药渣A用浓度75%乙醇溶液作为溶剂，提取温度50℃，提取次数为3次，每次提取时间为1小时，每次溶剂用量为高山绣线菊重量的6倍；滤过，得提取液B和药渣B；提取液B，回收乙醇，浓缩至相对密度d=1.10，滤过，得药液C；

（3）将步骤（2）得到的药液C，通过ADS-17大孔吸附树脂，先用水洗脱，再用浓度95%的乙醇溶液洗脱，收集95%浓度乙醇洗脱液，浓缩干燥，即得高山绣线菊提取物A；

（4）将步骤（2）得到的药渣B，用浓度1%盐酸溶液作为溶剂，提取温度80℃，提取次数为1次，每次提取时间为3小时，每次溶剂用量为高山绣线菊重量的15倍；滤过，合并提取液，浓缩干燥，得提取物，通过中性氧化铝柱纯化，用二氯甲烷-甲醇（10:1-6:4）梯度洗脱，收集二氯甲烷-甲醇（8:1-7:3）部分洗脱液，回收溶剂，浓缩，干燥，得高山绣线菊提取物B；

（5）上述高山绣线菊挥发油包合物、高山绣线菊提取物A、高山绣线菊提取物B混匀，即得本发明的高山绣线菊提取物。

实施例4:高山绣线菊提取物片的制备

取实施例1高山绣线菊提取物245g，加入淀粉70g，混匀，制粒，干燥，加微晶纤维素21.5g，硬脂酸镁2.5g，混匀，压制成1000片, 即得高山绣线菊提取物片。

实施例5：高山绣线菊提取物颗粒的制备

取实施例2高山绣线菊提取物235g，加入糊精95g，蔗糖35g，混匀，制粒，干燥，整粒，即得高山绣线菊提取物颗粒。

实施例6：高山绣线菊提取物胶囊的制备

取实施例3高山绣线菊提取物255g，加入淀粉65g，混匀，制粒，干燥，整粒，装胶囊1000粒，即得高山绣线菊提取物胶囊。

实验例1：高山绣线菊提取物抗菌作用

 1.菌种和培养基

 实验菌种由山东省疾病控制中心和山东省临床检验中心提供。列表如下：

实验用培养基：细菌MH 培养基，真菌PDA 培养基均购自中国药品生物制品检定所。

2.抑菌效果检测方法：

2.1 抑菌效果用杯碟法测定抑菌圈大小

活化菌液用无菌生理盐水稀释至10⁵～10⁶cfu/ml 备用。加0.2ml菌液至干燥的MH 培养基平板，涂匀。放置5min，使培养基充分吸收菌液。每个平板放置已灭菌的牛津杯6个，放置5min，使牛津杯紧密吸附于培养基表面。牛津杯中加入0.1g/ml水提物100ul。阳性对照用左氧氟沙星和氟康唑。阳性对照细菌用浓度均为40μg/ml 左氧氟沙星，白色念珠菌用浓度均为200μg/ml 氟康唑，均加100ul。阴性对照加无菌水。然后将平板置于37℃恒温培养箱培养24h(白色念珠球菌48h)，出用卡尺量取抑菌圈直径，计算平均值，用抑菌圈直径D 表示抑菌活性。抑菌效果判断标准为：D≤8mm为不敏感，8mm＜D≤13mm为低度敏感，13mm＜D≤19mm为中度敏感，D＞19mm为高度敏感。

2.2 最小抑菌浓度MIC 的测定采用微量稀释板法

试验菌液浓度为10⁶cfu/ml。吸取稀释好的菌液加于96 孔细胞培养板中，每孔100ul，每种药物100ul，依次对比稀释10 孔，最后一孔不加药物( 仅加培养基和细菌) 加入稀释菌液100ul，为细菌生长对照孔。留一列孔不加细菌( 仅加培养基和药物) 作药物对照孔，阳性对照用左氧氟沙星和氟康唑，按说明做倍比稀释。置于振荡器上振荡1min，使孔内溶液充分混匀后，微孔板加盖并放在铺有湿纱布的方形搪瓷盘中，于37℃温箱中孵育24h( 白色念珠球菌48h)，眼观无细菌生长孔所含最低药物浓度即为最小抑菌浓度。

3. 抑菌效果

表1 不同高山绣线菊提取物抑菌圈(mm)

 注：a、高山绣线菊提取物、高山绣线菊挥发油提取物、高山绣线菊提取物A、高山绣线菊提取物B加入量为1mg/杯，b、阳性对照细菌用浓度均为40μg/ml 左氧氟沙星，白色念珠菌用浓度均为200μg/ml 氟康唑，均加100ul。5％DMSO 为阴性对照。

表2 ：不同高山绣线菊提取物最小抑菌浓度(MIC)( 单位mg/ml)

注：阳性对照细菌用左氧氟沙星，白色念珠菌用氟康唑，均加100ul。5％ DMSO 为阴性对照。

 结果表明：高山绣线菊提取物具有广谱抗菌和杀菌作用。对革兰氏阳性菌：金黄色葡萄球菌、耐药性表皮葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、枯草杆菌；革兰氏阴性细菌：大肠杆菌、粪肠球菌；深部感染真菌白色念珠菌都有杀灭和抑制生长的作用，具有重要的实践意义和应用价值，可在制备有抑菌和/ 或杀菌作用的食品、保健品、化妆品和药品中应用。

实验例2 ：高山绣线菊提取物抗病毒作用。

1、实验材料

    病毒：HSV-II 型(3 代)20110913，兰州生物制品研究所疫苗研究室提供(herpessimplex virus，HSV-II)

细胞：非洲绿猴肾细胞(Vero 细胞) 兰州生物制品研究所提供。培养用DMEM 培养基+7％牛血清。

动物：清洁级昆明小鼠，雌雄各半，体重18-22g，购于兰州生物制品研究所动物房。

药物及试剂：噻唑蓝(MTT，Fluka Biochemika 公司)，二甲基亚砜(dimethylsulfoxide，DMSO，Sigma 公司生产)，DMEM(GIBCO 公司)，标准新生牛血清( 中美合资兰州民海生物工程有限公司)，注射用阿昔洛韦(ACV，9-(2- 羟乙氧甲基-) 鸟嘌呤，武汉普生制药有限公司，生产批号110811 国药准字H42020129)。高山绣线菊提取物、高山绣线菊挥发油提取物、高山绣线菊提取物A、高山绣线菊提取物B，均为实施例1方法制备得到，批号分别为：20110208、20110209、20110210、20110211。

2、实验方法

2.1 体外实验。

2.1.1 药物细胞毒性测定(MTT 法)

将细胞悬液以8×10⁵/ml 密度接种于96 孔细胞培养板中，每孔200μl，37℃，5％CO₂，100％相对湿度培养24h。高山绣线菊提取物、高山绣线菊挥发油提取物、高山绣线菊提取物A、高山绣线菊提取物B均倍比稀释至以下6 个浓度：16，8，4，2，1，0.5mg/ml，加入细胞悬液孔中，每一药物浓度重复4 孔，另设正常细胞对照。相同条件下继续培养33h，观察细胞病变(CPE) 情况，并以MTT 法检测细胞存活率。

2.1.2 病毒毒力测定( 蚀斑法)

将细胞悬液以8×10⁵/ml 密度接种于24 孔细胞培养板中，每孔1mL，37℃，5％ CO₂，100％相对湿度培养24h。病毒稀释至以下6 个浓度：10^-3，10^-4，10^-5，10^-6，10^-7，10^-8，加入细胞悬液孔中，每一药物浓度重复4 孔，另设正常细胞对照，甲基纤维素覆盖物覆盖，相同条件下继续培养72h，结晶紫染色，计数。

感染性病毒量(PFU/ml) ＝ ( 每孔内斑数/ 每孔接种病毒量ml)× 病毒稀释倍数。

2.1.3 药物对HSV-II 侵入细胞的阻断作用( 蚀斑法)

将供试品液与HSV-II 等体积混合，以此病毒药物混合液感染Vero 细胞。37℃，5％CO₂ 吸附90min，洗涤，加细胞维持液置37℃，5％CO₂ 培养。每日观察CPE，72h 后以蚀斑法检测病毒抑制率。采用治疗指数(TI) 作为评价指标来衡量药物对病毒的抑制效力。治疗指数(TI) ＝半数毒性浓度(TC₅₀)/ 半数抑制浓(IC₅₀)。每一药物浓度重复4 孔，同时设置正常细胞对照、药物对照及病毒对照。

2.1.4 药物对HSV-II 的直接灭活作用( 蚀斑法)

将供试品液与HSV-II 等体积混合，37℃作用90min 后，以此病毒药物混合液感染Vero 细胞。37℃，5％ CO₂ 吸附90min，洗涤，同上法培养与检查。

2.1.5 药物对病毒颗粒增殖的抑制作用( 蚀斑法)

将病毒感染细胞，吸附90min 后洗涤，加入不同浓度的供试品液，同上法培养与检查。病毒抑制率(％)＝(病毒对照组平均出斑数-给药试验组平均出斑数)/病毒对照组平均出斑数

2.2 体内实验。

2.2.1 药物对小鼠的急性毒性测定

清洁级昆明种小鼠随机分组，每组6只，雌雄各半。根据体外实验结果，选择抑制HSV-II 生物合成活性较好的总提取物，以400，500，625，800，1000，1250mg/kg 剂量灌胃给药，另设阴性对照组，给予等体积的生理盐水。正常进食进水，连续观察10d，记录小鼠死亡情况并计算LD₅₀。

2.2.2 病毒脑腔模型毒力测定

清洁级昆明种小鼠随机分组每组10只，雌雄各半。感染部位常规消毒后，经右脑室注射病毒，病毒稀释至以下6个浓度：10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-6，10^-7，感染剂量为每只0.05mL。正常进食进水，连续观察10d，记录小鼠死亡情况并用Reed-Muench 法计算LD₅₀。

2.2.3 药物对脑腔感染HSV-II 小鼠的保护作用

清洁级昆明种小鼠随机分组每组10 只，雌雄各半。感染部位常规消毒后，经右脑室注射病毒，病毒感染后24h，给药治疗。按药物LD₅₀的1/2～1/4作为药物体内实验的高实验剂量，LD₅₀的1/12～1/16作为低实验剂量，每药物设高低2个剂量组。不用药物的对照组( 病毒对照组、正常对照组)，连续灌胃给药5d，观察动物发病和死亡情况，连续30d。

3、实验结果

3.1 体外实验。

3.1.1. 药物细胞毒性测定

表3 不同高山绣线菊提取物对Vero 细胞的毒性( 单位：mg/ml)

供试品液对Vero 细胞的毒性作用表现为细胞增殖缓慢、颗粒较多、折光性差、形态改变、部分细胞破碎脱落。由于细胞代谢活性降低或死亡，MTT 法检测到的活细胞数减少。

3.1.2 病毒毒力测定( 蚀斑法)

Vero 细胞对HSV-II 较敏感，HSV-II 感染所致的Vero 细胞细胞病变效应CPE 特征为圆缩肿胀、相互融合形成葡萄串状或星状，甚至部分细胞脱落，形成病灶。蚀斑计数得HSV-II 型(3 代)20110913 感染性病毒量(PFU/ml) 为10^7.57PFU/ml，该HSV-II 病毒采用10^-5时每孔出斑数约为40 个，容易计数，故采用10^-5 作为后续实验的病毒稀释度。

3.1.3对HSV-II 侵入细胞的阻断作用

表4 不同高山绣线菊提取物对HSV-II 侵入Vero 细胞的阻断作用。

3.1.4对HSV-II 的直接杀伤作用

表5 不同高山绣线菊提取物对HSV-II 的直接灭活作用。

3.1.5对HSV-II 病毒颗粒增殖的抑制作用( 蚀斑法)

表6. 不同高山绣线菊提取物对HSV-II 病毒颗粒增殖的抑制作用。

高山绣线菊提取物通过多组分，多环节、多途径地发挥协同作用而表现出抗病毒功效，对HSV-II 侵入细胞的阻断作用和直接杀灭病毒是高山绣线菊体外抗病毒的主要作用途径。HSV-II 是有包膜的病毒，最外层的包膜由脂质和糖蛋白组成，其中任何一种成分改变，即可使包膜变性，从而灭活病毒。实验结果表明高山绣线菊各提取物对HSV-II 的直接灭活作用较强，尤其是高山绣线菊提取物和高山绣线菊提取物A直接灭活HSV-II 的作用比ACV 更加显著。HSV-II 侵入细胞的阻断作用研究表明，高山绣线菊提取物不仅有抗病毒活性，还具有一定程度保护细胞防止病毒侵入的作用。

Claims (3)

1.高山绣线菊提取物在制备抗HSV-                                               病毒药物中的应用，所述高山绣线菊提取物的制备方法为:

（1）高山绣线菊，用浓度95%乙醇提取，滤过，得提取液A和药渣A，提取液A浓缩至无醇清膏，加入蒸馏水，进行水蒸汽蒸馏，收集馏出液，加入馏出液重量4%的β环糊精包合，低温冷藏，过滤，低温干燥，即得高山绣线菊挥发油包合物；

（2）将步骤（1）得到的药渣A用浓度60%乙醇溶液作为溶剂，提取温度80℃，提取次数为2次，每次提取时间为2小时，每次溶剂用量为高山绣线菊重量的12倍；滤过，得提取液B和药渣B；提取液B，回收乙醇，浓缩至相对密度1.13，滤过，得药液C；

（3）将步骤（2）得到的药液C，通过ADS-3大孔吸附树脂，先用水洗脱，再用浓度80%的乙醇溶液洗脱，收集80%浓度乙醇洗脱液，浓缩干燥，即得高山绣线菊提取物A；

（4）将步骤（2）得到的药渣B，用浓度2%盐酸溶液作为溶剂，提取温度70℃，提取次数为2次，每次提取时间为2小时，每次溶剂用量为高山绣线菊重量的12倍；滤过，合并提取液，浓缩干燥，得提取物，通过中性氧化铝柱纯化，用份数比10:1-6:4的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱，收集份数比8:1-7:3的二氯甲烷-甲醇部分洗脱液，回收溶剂，浓缩，干燥，得高山绣线菊提取物B；

（5）上述高山绣线菊挥发油包合物、高山绣线菊提取物A、高山绣线菊提取物B混匀，即得高山绣线菊提取物。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的高山绣线菊提取物与化学药或中药或天然药物组成的抗HSV-病毒药物。

3.据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的高山绣线菊提取物，通过加入药剂学允许的各种辅料，制成药剂学上口服的片剂、颗粒剂、胶囊。